KR100351620B1 - 3차 결정구조의 내열성 효소 - Google Patents
3차 결정구조의 내열성 효소 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100351620B1 KR100351620B1 KR1019990027826A KR19990027826A KR100351620B1 KR 100351620 B1 KR100351620 B1 KR 100351620B1 KR 1019990027826 A KR1019990027826 A KR 1019990027826A KR 19990027826 A KR19990027826 A KR 19990027826A KR 100351620 B1 KR100351620 B1 KR 100351620B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- enzyme
- phytase
- affinity
- calcium binding
- calcium
- Prior art date
Links
- 239000013078 crystal Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title abstract description 52
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title abstract description 52
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims abstract description 20
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 15
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 claims description 41
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 claims description 39
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 claims description 21
- 101000608734 Helianthus annuus 11 kDa late embryogenesis abundant protein Proteins 0.000 claims description 5
- SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 2-methylpentane-2,4-diol Chemical compound CC(O)CC(C)(C)O SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 abstract description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 abstract description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 47
- IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N Inositol-hexakisphosphate Chemical compound OP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 27
- 235000002949 phytic acid Nutrition 0.000 description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 8
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 8
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 7
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Phytic acid Natural products OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 6
- 229940068041 phytic acid Drugs 0.000 description 6
- 239000000467 phytic acid Substances 0.000 description 6
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 5
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 3
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 3
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 3
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 3
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 3
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 3
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000195628 Chlorophyta Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000206572 Rhodophyta Species 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- INAPMGSXUVUWAF-QWBQGLJISA-N 1D-myo-inositol 2-phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O INAPMGSXUVUWAF-QWBQGLJISA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- INAPMGSXUVUWAF-UHFFFAOYSA-N D-myo-inositol 2-monophosphate Natural products OC1C(O)C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C1O INAPMGSXUVUWAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N [(2r,3s,5r,6r)-2,3,4,5,6-pentahydroxycyclohexyl] dihydrogen phosphate Chemical compound OC1[C@H](O)[C@@H](O)C(OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003625 amylolytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 hexaphosphate Chemical compound 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- NIFIFKQPDTWWGU-UHFFFAOYSA-N pyrite Chemical compound [Fe+2].[S-][S-] NIFIFKQPDTWWGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052683 pyrite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011028 pyrite Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 3차 결정구조의 내열성 효소에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 4 내지 5개의 안티-페러럴 β-스트랜드(anti-parallel β-strand)로 구성된 블레이드 6개의 내부에 3개의 고친화 칼슘부위(high-affinity calcium binding site)와 3개의 저친화 칼슘부위(low-affinity calcium binding site)를 포함하는 프로펠러 형태의 3차 결정구조를 지닌 내열성 효소(thermo-stable enzyme)에 관한 것이다. 따라서, 상기의 Ca2+결합 부위 모티프를 이용하면 열 안정성이 매우 높은 단백질 합성에 응용할 수 있으며, 또한 3차 구조로부터 추정되는 효소의 활성부위 또한 최근에 연구되는 단백질 공학기술로 이러한 효소활성 부위를 가진 새로운 효소를 창출하는 데 매우 유용하게 응용할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 3차 결정구조의 내열성 효소에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 4 내지 5개의 안티-페러럴 β-스트랜드(anti-parallel β-strand)로 구성된 블레이드 6개의 내부에 3개의 고친화 칼슘부위(high-affinity calcium binding site)와 3개의 저친화 칼슘부위(low-affinity calcium binding site)를 포함하는 프로펠러 형태의 3차 결정구조를 지닌 내열성 효소(thermo-stable enzyme)에 관한 것이다.
오늘날, 고도로 산업화된 사회에서 목적물질에 대한 보다 경제적인 생산방법의 연구는 그 가치가 더욱 증대되었으며, 따라서, 보다 경제적일 뿐만 아니라 활성이 높은 효소에 대한 개발의 필요성이 날로 높아지고 있다. 그러한 예로, 내열성 효소(thermo-stable enzyme)가 있으며, 이러한 내열성 효소로서 특히, 파이테이즈는 동물의 소화생리에 적합하고 사료제조시 효소의 잔존활성이 뛰어나 유용성이높으며 파이틱에시드(Phytic acid)를 분해하여 포스페이트(Phosphate)와 포스페이트 이노시톨(Phosphate inositol) 및 이노시톨을 만드는 효소이다. 파이틱에시드는 가축의 사료로 사용하는 곡물의 인 함량의 50 ∼ 70%를 차지하지만, 닭, 돼지와 같은 단위가축은 생체 내에 파이틱에시드를 분해하는 파이테이즈의 결핍으로 식물성 인의 이용률이 극히 낮을 뿐 아니라, 소화되지 못한 파이틱에시드는 상수원 등에 방류되어 심각한 환경오염원으로 작용하며, 소호수의 녹조, 바다의 적조현상을 유발하는 주요인으로 작용한다. 또한, 파이틱에시드는 단위동물에 중요한 미량광물질(Ca, Mg, Mn, Zn, Fe), 아미노산, 비타민 등과 결합하여 동물생체에서 흡수되지 않고 배출되어 사료에 존재하는 영양분의 손실뿐 아니라, 중요한 영양분이 불용성 인 형태로 상수원에 배출되어 유해 미생물, 녹조 및 적조 등의 증식을 가속화하는 심각한 환경오염을 유발시킨다. 따라서, 파이테이즈를 단위가축에 급여할 경우, 단위 동물이 사료내의 불용성 인을 이용할 수 있어, 사료 중에 첨가하는 무기태인 투여 양을 감소시키는 경제적인 이익과 동시에 중요한 미량 생체활성물질의 이용성을 증진시키며, 동물 분으로 배출되는 인의 함량의 감소로 인한 환경오염을 방지하는 지구환경 보호차원에서 중요한 의미를 가진다.
그러나, 현재까지 개발된 파이테이즈는 파이틱에시드의 6개의 인산을 분해하는 인의 개수가 한정될 뿐 아니라, 곰팡이에서 생산하는 대부분의 파이테이즈는 배양기간의 장기화로 경제적 생산에 난점이 있으며, 또한, 곰팡이에서 생산된 파이테이즈가 단위동물의 소화생리에 잘 맞지 않아서 단위동물에 첨가시, 효소역가의 실활 등으로 사용에 한계성을 가져왔다. 일반적으로, 파이테이트는 동물의 소화관내에서 분해되어 분해된 인이 소장에서 흡수된다고 알려져 있으며, 이로 인해서 내산성이 요구되며 소화효소가 작용하는 소장에서 효소작용이 활발한 중성 파이테이즈가 유리하고, 파이테이즈를 동물사료에 첨가시 고온에서 펠레팅(Pelleing)을 하기 때문에 열에 안정성이 높은 효소개발이 필요하다.
따라서, 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 지금까지 유럽을 중심으로 파이테이즈의 연구[A.H.J.Ullah 등 1994, K.C.Ehrich, 1994, C.S.Piddington, 1993]가 진행되어 왔다. 그러한 예로, 동물에 대한 파이테이즈의 효과연구[L.G.Young 등 1993, X.G.Lei 등 1994, Z.Mroz 등 1994]와 파이테이즈의 구조에 관한 연구[D. Kostrewa 등 1997] 등이 진행되어 왔다. 특히, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래 파이테이즈는 3' 파이테이트(phytate)를 우선 분해 후에 다른 위치의 인을 분해하는 기작도 밝혀져 있다. 또한, 본 발명의 발명자들도 파이테이트(phytate)의 인산기의 위치에 관계없이 인을 분해하는 특성이 있는 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens) DS-11이 생산하는 신규 파이테이즈(Phytase)를 개발하였고, 이 파이테이즈가 기존 파이테이즈와 비교하여 동물의 소화생리에 적합하고, 고온에서 사료제조시 효소의 잔존활성이 뛰어난 특성을 가진 파이테이즈를 확보하여 신규성이 있다고 판단되여, 한국과학기술원 부설 생명공학연구소내 유전공학센터에 기탁하고 수탁번호 KCTC 0231BP를 부여받았으며, 또한, 대한민국 특허번호 제169913호(1998)와 PCT/KR 98/00056, 미국특허출원 09/142,621, 카나다 특허출원 2,249,014 및 일본국 특허출원 평9-532479호를 부여 받았다. 그리고, 이 특허균주인 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B.amyloliquefaciens) DS-11의 파이테이즈 유전자를 클로닝(Cloning)하여 결정된 염기서열(DNA sequences: U85968)의 신규성이 인정되어 대한민국 특허출원번호 제97-10948호로 출원하였다.
그러나, 상기와 같은 효소의 개발에도 불구하고, 이렇게 외형상 표현되는 효소의 특성 이외의 결정구조와 같은 객관적인 특성을 확인함으로써, 이를 기초로 단백질 공학기술에 응용하여 열에 보다 안정하고, 활성이 더욱 개선된 내열성 효소의 개발 필요성이 절실히 대두되었다.
이에, 본 발명의 발명자들은 열에 보다 안정하면서도 효소의 활성 또한 더욱 개선된 내열성 효소를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 재조합 벡터에서 생산되는 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens) DS-11이 생산하는 신규 파이테이즈(Phytase)의 X선 결정(X-ray crystal)을 확보하고, 이 X선 결정(X-ray crystal)으로부터 단백질 3차원 구조 및 그로부터 활성부위를 규명하였으며, 이 구조로부터 단백질의 열 안정성 및 효소 활성에 관련된 Ca2+결합부위를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 4 내지 5개의 안티-페러럴 β-스트랜드(anti-parallel β-strand)로 구성된 블레이드(blade) 6개의 내부에 3개의 고친화 칼슘 결합부위(high-affinity calcium binding site) 및 3개의 저친화 칼슘결합부위(low-affinity calcium binding site)를 포함하는 프로펠러 형태의 내열성 효소(thermo-stable enzyme)를 제공하는 것이다.
도 1은 재조합 파이테이즈의 X-선 결정(X-ray cystal)을 나타낸 것이다.
도 2는 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens) DS-11 유래 파이테이즈의 3차원적 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens) DS-11 유래 파이테이즈의 3차원적 구조에서 활성부위 클라프트(active site claft)를 나타낸 것이다.
도 4는 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens) DS-11 유래 파이테이즈의 3차원적 구조에서 고친화 칼슘 결합부위(high-affinity calcium binding sites)를 나타낸 것이다.
도 5는 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens) DS-11 유래 파이테이즈의 3차원적 구조에서 저친화 칼슘 결합부위(low-affinity calcium binding sites)를 나타낸 것이다.
도 6은 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens) DS-11 유래 파이테이즈의 3차원적 구조에서 추정되는 기질 결합부위(putative substrate bindingsites)를 나타낸 것이다.
도 7은 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens) DS-11 유래 파이테이즈의 3차원적 구조에서 칼슘이온과 열안정성에 관한 것을 나타낸 것이다.
도 8은 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens) DS-11 유래 파이테이즈의 3차원적 구조에서 저친화 칼슘이온과 효소의 활성에 관한 것을 나타낸 것이다.
본 발명은 4 내지 5개의 안티-페러럴 β-스트랜드(anti-parallel β-strand)로 구성된 블레이드(blade) 6개의 내부에 3개의 고친화 칼슘 결합부위(high-affinity calcium binding site) 및 3개의 저친화 칼슘 결합부위(low-affinity calcium binding site)를 포함하는 프로펠러 형태의 내열성 효소(thermo-stable enzyme)에 관한 것이다.
이와 같은, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
우선, 본 발명의 상기와 같은 결정구조를 지닌 효소의 예로, 파이테이즈(phytase)가 있다. 이러한 파이테이즈는 각 블레이드의 4번째 스트랜드(4th strand)가 다음 블레이드의 첫 번째 스트랜드(1st strand)의 상단부와 연결되어 6개의 블레이드가 프로펠러 형태로 구성된 것으로서, 각각의 블레이드는 4 내지 5개의 안티-페러럴 β-스트랜드(anti-parallel β-strand)로 구성되어 있다.
또한, 이들 블레이드 내부에는 3개의 고친화 칼슘 결합부위(high-affinity calcium binding site) 및 3개의 저친화 칼슘 결합부위(low-affinity calcium binding site)를 포함하고 있다. 여기서, 고친화 칼슘 결합부위는 2개의 칼슘이온이 6번째 블레이드 부근의 '이중 클라스프(double clasp)'의 중앙에 위치하며, Ca1과 Ca2는 브릿징 암(bridging arm)으로 작용하는 Asp308 카르복실레이트에서 바이-칼슘센터(bi-calcium center)를 형성하여 정전기적인 상호작용으로 '이중 클라스프(double clasp)'를 강화하여서, 프로펠러 구조의 환상정열을 더욱 안정화시키며, 또한 Ca3는 Asp56 카르복실레이트와 상호작용을 하며, 파이테이즈 구조내부를 안정화시키므로써, 효소의 내열성을 더욱 강화시킨다. 그리고, 저친화 칼슘 결합부위는 3개의 칼슘결합부위가 있으며, 여기에 Ca4는 Asp55와 Glu211의 카르복실레이트 그룹, Asn99와 Asn100의 사이드 체인 산소원자(side chain oxygen atom)와 배위결합을 하고 있으며, 물분자와 상호작용을 한다. 또한, Ca5는 Glu227의 카르복실레이트 그룹과 Tyr159의 하이드록실 그룹과 배위결합을 하며, 그리고 Ca4와 함께 Glu211의 카르복실레이트와 물분자를 공유하여 배위결합을 한다. Ca6은 Asp258, Glu260, Gln279의 카르복실레이트 그룹들과 배위결합을 하며, 물분자는 Glu211, Asp314와 상호작용을 한다. 즉, Ca4, Ca5, Ca6의 결합은 무질서한 단백질 사이드 체인(protein side chain)들을 질서 정연한 상태로 전환시키고, 높은 네거티브 활성부위(highly negative active site)를 소수성(hydrophobic)의 활성부위로 전환시켜 기질이 파이테이즈와의 결합에 유리하게 작용하여 효소의 촉매활성을 상승시키는 작용을 나타낸다.
그리고, 상기 블레이드 중 5번째 블레이드에는 엑스트라 β-스트랜드(extra β-strand)인 N-말단 조각(N-terminal segment)이 C-말단과 1 + 3 콤비네이션(combination)으로 연결되어 있어 β-스트랜드의 환상정열을 안정화시키고 있다.
따라서, 이상의 결과로부터 효소내의 칼슘 결합부위 및 활성부위에 대한 여러 모티프를 기초로 단백질 공학기술에 응용함으로써, 열에 보다 안정하면서도 촉매활성이 우수한 효소를 개발할 수 있는 효과가 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의거 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 바실러스 아밀로리퀘페이션스(
B. amyloliquefaciens
) DS-11 유래 파이테이즈의 분리 및 결정(crystal)의 제조
바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DS-11 유래 2.2 kb의 파이테이즈 유전자(phytase gene)가 삽입된 pJPK가 형질전환된 바실러스 서브스틸리스(Bcillus substilis) DB104를 신조성 LB배지에서 20시간 배양 원심분리 후 배양 상등액을 취하였다. 배양 상등액을 아세톤 침전(50% v/v) 후 20mM 칼슘이 함유된 효소액을 70℃에서 5분간 열처리후 불순물을 제거후, 슈퍼덱스 200HR 겔투과 크로마토그래피(Superdex 200HR gel permeation chromatography)를 이용하여 99% 이상의 순수한 파이테이즈를 정제하였다. 그리고, 파이테이즈(phytase, 40 mg/ml)의 초기 결정(crystal)을 탐색을 위해 24개의 웰 린브로 플레이트(24-well Linbro plates)를 이용하여 핸딩-드롭 증기확산법(handing-drop vapor-diffusion)을 사용하였다. 최적의 결정화 조건은 4℃, 20% 2-메틸-2,4-펜탄디올이 함유된 0.1 M MES 버퍼(pH 6.5)에서 0.4 × 0.4 × 0.5 mm 크기의 파이테이즈 결정을 확보하였으며, 이 결정의 특성은 a=50.4, b=64.1, c=104.2Å의 단위 셀(unit cell)이며, P212121의 스페이스 그룹으로 된 파이테이즈 한 분자가 비대칭 단위(asymmetric unit)를 이루는 2.1Å 고해상도의 데이타를 획득하였고, 그 결과를 다음 도 1에 나타내었다.
실시예 2 : 바실러스 아밀로리퀘페이션스(
Bacillus amyloliquefaciens
) DS-11 유래 파이테이즈의 3차원적 구조
바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DS-11 유래 파이테이즈의 3차원적 구조는 6개의 블레이드(blade)로 이루어진 프로펠러 형태의 구조이며, 효소의 열안정성에 관련된 고친화 칼슘결합 부위와 효소의 촉매활성에 관련된 저친화 칼슘결합부위를 도 2에 나타내었고, 또한, 효소의 활성부위가 전체적인 3차원 구조에서 클라프트(claft)를 상단에 나타내었으며, 이부위에 저친화 칼슘결합 부위가 있으며, 이부위가 효소의 활성부위(active site)이며 다음 도 3에 나타내었다.
이상의 도 2 및 도 3으로부터 알 수 있듯이, 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DS-11 유래 파이테이즈의 3차원적 구조는 6개의 블레이드(blade)로 이루어진 프로펠러 형태의 구조이다. 각 블레이드는 형태학적으로 동일하게 서로 연결된 안티-페러럴 β-스트랜드(anti-parallel β-strand)로 구성되어 있다. 각 블레이드의 4번째 스트랜드는 다음 블레이드의 첫 번째 스트랜드의 상단부와 연결되어 6개의 블레이드가 프로펠러 형태로 구성되어 있으며, 중심부에는 잘 정돈된 물분자가 결합되어 있다. 또한, C-말단의 1 + 3 콤비네이션(combination)뿐 아니라, N-말단 조각(N-terminal segment)이 5번째 블레이드에 연결되어 여분의 엑스트라 β-스트랜드(extra β-strand)를 형성하여 파이테이즈의 전체구조를 안정화하는 '이중 클라스프(double clasp)'형태의 매우 안정한 구조를 이루고 있다. 이 효소의 구조에서 효소활성 부위로 추정되는 기질 결합부위인 클라프트(claft)는 '상부'쪽에 위치하고, 다른 끝 부분인 '하부'는 평평한 구조이다.
실험예 1 : 바실러스 아밀로리퀘페이션스(
Bacillus amyloliquefaciens
) DS-11 유래 파이테이즈의 고친화 칼슘결합부위(High-affinity calcium binding sites)
바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DS-11 유래 파이테이즈의 고친화 칼슘결합부위는 정제시 투석한 파이테이즈(native phytase) 와 중금속 유도체에서 결정화한 결정을 이상 산란(anomalous scattering; SA)을 가진 다중 동형 변환(multiple iosmorphous replasement; MIR)로 결정하였다. 그 결과, 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DS11 유래 파이테이즈의 구조에는 3개의 칼슘이온이 결합하는 부위를 확인하였고, 그 결과를 다음 도 4에 나타내었다. 즉, 도 4에 따르면, 2개의 칼슘이온은 6번째 블레이드 부근의 '이중 클라스프(double clasp)'의 중앙에 위치하며, Ca1과 Ca2는 브릿징 형태(bridging arm)로 작용하는 Asp308 카르복실레이트(carboxylate)에서 바이-칼슘센터(bi-calcium center)를 형성하고 있다. 이들 칼슘은 정전기적인 상호작용으로 '이중 클라스프(doubleclasp)'를 강화하여서, 프로펠러 구조의 환상정열을 더욱 안정화시키고, Ca3는 Asp56 카르복실레이트와 상호작용을 하며, 파이테이즈 구조내부를 안정화시킴으로써, 효소의 열 안정성을 강화시켰다.
실험예 2 : 바실러스 아밀로리퀘페이션스(
Bacillus amyloliquefaciens
) DS-11 유래 파이테이즈의 저친화 칼슘 결합 부위(Low-affinity calcium binding sites)
바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DS-11 유래 파이테이즈의 구조에서 활성 부위는 β-스트랜드 사이에 많은 루프(loop)로 구성된 분자의 한쪽 끝에서 발견되며, 네거티브 사이드 체인(negative side chain)들로만 구성된 홀로우 클라프트(hallow claft)가 있다. 그리고, 이러한 파이테이즈가 완전한 활성을 위해서 칼슘이온을 필요로 한다. 따라서, 효소활성에 필요한 칼슘 결합부위를 확인하기 위하여 4mM CaCl2를 함유하는 결정화 조건을 이용하여 상기 실험예 1에서와 동일한 방법으로 또 다른 3개의 칼슘 결합부위를 가진 결정을 확보하였다. 그리고, 이들 결과를 다음 도 5에 나타내었다.
도 5의 결과에 따르면, 이들 3개의 칼슘 이온들은 중심의 Ca5에서 5.2 Å 거리의 Ca4와 4.1 Å 거리의 Ca6이 트리아딕 칼슘센터(triadic calcium center)를 이루고 있다. Ca4는 Asp55와 Glu211의 카르복실레이트 그룹(carboxylate group), Asn99와 Asn100의 사이드 체인 산소원자(side chain oxygen atom)와 배위결합을 하고 있으며, 그리고 물분자 (Wat1)와 상호작용을 한다. Ca5는 Glu227의 카르복실레이트 그룹과 Tyr159의 하이드록실 그룹과 배위결합을 하며, 그리고 Ca4와 함께 Glu211의 카르복실레이트와 물분자를 공유하여 배위결합을 한다. Ca6은 Asp258, Glu260, Gln279의 카르복실레이트 그룹들과 배위결합을 한다. 또한, 물분자는 Glu211, Asp314와 상호작용을 한다. Ca4, Ca5, Ca6의 결합은 무질서한 단백질 사이드 체인(protein side chain)들을 질서 정연한 상태로 전환시킨다. 이러한 칼슘결합은 높은 네거티브 활성부위(highly negative active site)를 소수성(hydrophobic)의 활성부위로 전환시켜 이 효소의 기질인 파이테이즈와의 결합이 유리하게 작용하여 효소의 활성을 나타낸다.
실험예 3 : 바실러스 아밀로리퀘페이션스(
Bacillus amyloliquefaciens
) DS-11 유래 파이테이즈의 기질 흡착부위(Putative substrate binding sites)
20mM Tris/HCl, pH 7.0에서 파이테이즈의 기질인 미오-이노시톨, 헥사포스페이트, 미오-이노시톨 1-모노포스페이트, 미오-이노시톨 2-모노포스페이트, 4-모노포스페이트를 2mM의 농도로 하여 37℃에서 15분 반응 후 효소의 활성을 측정하였다. 그 결과, DS11 유래 파이테이즈는 1,2,4,번 위치에 phosphate를 27%, 28%, 40%의 활성을 나타내었다. 이결과를 표 1에 나타내었다. 그리고 도 6은 정전기적인 음이온인 파이테이트가 정전기적으로 양이온을 나타내는 아미노산인 Lys76, Lys77, Lys179과 결합 가능하다는 것을 나타내었다.
이상의 결과인 표 1과 도 6으로부터 알 수 있듯이, 효소의 활성부위에 결합하는 칼슘이온들은 활성부위에 인접한 Lys76, Lys77, Lys179와 함께 기질인 파이테이즈가 결합하기 유리한 정전기적(electrostatic) 환경으로 전환된다. 파이테이즈의 인산기는 Ca4와 Ca5사이에 결합하며, 인접한 인산기는 어떤 정전기적 반발 또는 입체 충돌(steric crash)도 없이 Ca5와 Ca6 사이에 결합할 수 있다. 이 기질-결합 모드(substrate-binding mode)에서, 3개의 라이신(lysine) 잔기는 파이테이즈의 3개의 다른 인산기들과 잘 결합할 수 있다. 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DS11 유래 파이테이즈의 구조에서는 물분자 (Wat1)가 Ca4와 Ca5와 배위결합을 하고 있으며, 이 물분자 (Wat1)가 파이테이즈의 인산기를 직접 공격하여 분해한다. 그리고, 효소의 노출된 활성부위와 파이테이트-결합 모델(phytate-binding model)은 이 효소가 파이테이즈의 6개 인산기 모두 분해할 수 있다는 것을 보여준다.
실험예 4: Ca
2+
와 파이테이즈 구조의 열 안정성
바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DS-11유래 파이테이즈의 열 안정성에 있어 Ca2+의 영향은 1 ℃/min의 속도로 주사차 열량계(differential scanning calorimetry)를 이용하여 결정하였다. 5%(w/v)의 파이테이즈 샘플에 1 mM CaCl2, 2mM EDTA, 5 mM CaCl2를 첨가 후 실험을 수행하였고, 그 결과를 다음 도 7과 도 8에 나타내었다.
이상의 도 7 및 도 8의 결과에 따르면, EDTA의 첨가는 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DS11 유래 파이테이즈의 칼슘을 제거하였고, 그 결과 파이테이즈의 Tm이 78.1℃에서 59.1℃로 급격하게 감소하였다. 이로부터 파이테이즈의 고친화 칼슘 결합부위(high-affinity calcium binding site)가 열 안정성에 중요한 역할을 한다는 사실을 알 수 있었다. 또한, 5mM 칼슘의 첨가는 파이테이즈의 저친화 칼슘 결합부위(low-affinity calcium binding site)에 또 다른 3개의 칼슘이 결합한 상태로서, 이들 저친화 칼슘 결합부위(low-affinity calcium binding site)에 결합한 칼슘들은 파이테이즈의 Tm을 약 2.1℃ 증가시키키고 있는 바, 이로부터 저친화 칼슘 결합부위(low-affinity calcium binding site)는 효소의 활성에 중요한 역할을 수행함을 알 수 있었다. 따라서, 이상의 결과로부터 고친화 칼슘 결합부위(high-affinity calcium binding site)에 결합한 칼슘은 53%의 루프(loop)를 가지는 프로펠러 구조의 열 안정성을 증가시키는 반면에 저친화 칼슘 결합부위(low-affinity calcium binding site)에 결합한 칼슘은 효소의 촉매활성에관여하는 것을 보여준다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 4 내지 5개의 안티-페러럴 β-스트랜드(anti-parallel β-strand)로 구성된 블레이드 6개로 이루어진 프로펠러 형태의 내열성 효소에 관한 것으로서, 이러한 본 발명에 따르면, 6-블레이드 형태의 스캐폴드(scafold)가 효소의 매우 높은 열안정성을 가진 구조이며, 칼슘이온이 '이중 클라스프(double-clasp)'와 중앙 채널(central channel)에서 여러 펩티드 조각들을 견고하게 결합함으로써, 효소에게 높은 열안정성을 부여할 뿐만 아니라, 기질이 결합하기에 매우 불리한 네거티브 전하를 뛴 효소의 활성부위를 정전기적으로 유리한 환경으로 전환시킴으로써, 효소활성을 강화시키는데 매우 중요한 역할을 한다. 따라서, 상기의 Ca2+결합 부위 모티프를 이용하면 열 안정성이 매우 높은 단백질 합성에 응용 할 수 있으며, 또한 3차 구조로부터 추정되는 효소의 활성부위 또한 최근에 연구되는 단백질 공학기술로 이러한 효소활성 부위를 가진 새로운 효소를 창출하는 데 매우 유용하게 응용할 수 있는 효과가 있다.
Claims (6)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 순수 분리된 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens)DS11 유래의 파이테이즈(phytase, 40mg/ml)로서, 4℃에서 5mM 칼슘 및 20％ 2-메틸-2,4-펜탄디올이 함유된 0.1M MES 버퍼 (pH6.5)조건에서 생성된 결정구조(Crystal structure)가 4내지 5개의 안티-페러럴 β-스트랜드(anti-parallel β-strand)로 구성된 블레이드(blade) 6개의 내부에 3개의 고친화 칼슘 결합부위(high-affinity calcium binding site) 및 3개의 저친화 칼슘 결합부위(low-affinity calcium binding site)를 포함되 각 블레이드의 4번째 스트랜드(4th strand)가 다음 블레이드의 첫 번째 스트랜드(1st strand)의 상단부와 연결되어 상기 6개의 블레이드가 프로펠러 형태로 구성되어 있으며, C-말단과 1+3 콤비네이션(combination)을 이루는 N-말단조각(N-terminal segment)이 5번째 블레이드에 연결되어 여분의 엑스트라 β-스트랜드(extra β-strand)를 형성하고, 그 결정 형상이 P212121스페이스 그룹으로 결정화된 구조를 가지는 파이테이즈 결정(Crystal).
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019990027826A KR100351620B1 (ko) | 1999-07-09 | 1999-07-09 | 3차 결정구조의 내열성 효소 |
| JP2001509479A JP2003504047A (ja) | 1999-07-09 | 2000-01-04 | ２．１å結晶構造を有する新規耐熱性フィターゼ |
| EP00900932A EP1194530A1 (en) | 1999-07-09 | 2000-01-04 | A novel thermostable phytase with a 2.1 crystal structure |
| PCT/KR2000/000002 WO2001004275A1 (en) | 1999-07-09 | 2000-01-04 | A novel thermostable phytase with a 2.1 å crystal structure |
| US10/043,623 US6808909B2 (en) | 1999-07-09 | 2002-01-09 | Thermostable phytase with 2.1 Å . . . crystal structure |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019990027826A KR100351620B1 (ko) | 1999-07-09 | 1999-07-09 | 3차 결정구조의 내열성 효소 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20010009461A KR20010009461A (ko) | 2001-02-05 |
| KR100351620B1 true KR100351620B1 (ko) | 2002-09-10 |
Family
ID=19600785
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019990027826A KR100351620B1 (ko) | 1999-07-09 | 1999-07-09 | 3차 결정구조의 내열성 효소 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6808909B2 (ko) |
| EP (1) | EP1194530A1 (ko) |
| JP (1) | JP2003504047A (ko) |
| KR (1) | KR100351620B1 (ko) |
| WO (1) | WO2001004275A1 (ko) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4663370B2 (ja) * | 2005-03-30 | 2011-04-06 | 株式会社ヤクルト本社 | ホスホリパーゼｄの凍結保存方法及び耐凍結性ホスホリパーゼｄ組成物 |
| CN102649950B (zh) * | 2012-04-16 | 2013-05-22 | 盐城工学院 | 一种突变的中性植酸酶及其基因和用途 |
| CN111575210B (zh) * | 2020-05-26 | 2022-04-26 | 浙江工业大学 | 一种解淀粉芽孢杆菌zjb19161及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR19980074925A (ko) * | 1997-03-27 | 1998-11-05 | 박원훈 | 신규한 플라즈미드를 이용하여 형질전환시킨 균주 E. coli JM83/pKP2와 이로부터 생산된 피타제(Phytase) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE291897T1 (de) * | 1996-01-31 | 2005-04-15 | Cosmoferm Bv | Verwendung von zusammensetzungen mit stabilisierten enzymen |
| KR0169913B1 (ko) * | 1996-03-14 | 1999-01-15 | 김은영 | 신균주 바실러스속 ds11과 이로부터 생산되는 신규 파이타아제 |
| GB2316082A (en) * | 1996-08-13 | 1998-02-18 | Finnfeeds Int Ltd | Phytase |
| CA2231948C (en) * | 1997-03-25 | 2010-05-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Modified phytases |
| US5955310A (en) * | 1998-02-26 | 1999-09-21 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Methods for producing a polypeptide in a bacillus cell |
-
1999
- 1999-07-09 KR KR1019990027826A patent/KR100351620B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-01-04 JP JP2001509479A patent/JP2003504047A/ja active Pending
- 2000-01-04 EP EP00900932A patent/EP1194530A1/en not_active Ceased
- 2000-01-04 WO PCT/KR2000/000002 patent/WO2001004275A1/en not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-01-09 US US10/043,623 patent/US6808909B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR19980074925A (ko) * | 1997-03-27 | 1998-11-05 | 박원훈 | 신규한 플라즈미드를 이용하여 형질전환시킨 균주 E. coli JM83/pKP2와 이로부터 생산된 피타제(Phytase) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20010009461A (ko) | 2001-02-05 |
| EP1194530A1 (en) | 2002-04-10 |
| JP2003504047A (ja) | 2003-02-04 |
| US6808909B2 (en) | 2004-10-26 |
| WO2001004275A1 (en) | 2001-01-18 |
| US20020142433A1 (en) | 2002-10-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Qasba et al. | Molecular divergence of lysozymes and α-lactalbumin | |
| JP2766621B2 (ja) | 組み換えｇ−ｃｓｆ | |
| Kohno et al. | Purification, characterization, and crystallization of two types of lipase from Rhizopus niveus | |
| BG98036A (bg) | Димер на молекулен вариант на аполипопротеин и метод за получаването му | |
| AU2007337150A1 (en) | Lipase variants for pharmaceutical use | |
| Nakano et al. | Purification and characterization of phytase from bran of Triticum aestivum L. cv. Nourin# 61 | |
| JP2001510983A (ja) | 熱安定性ホスファターゼ | |
| Litantra et al. | Expression and biochemical characterization of cold-adapted lipases from Antarctic Bacillus pumilus strains | |
| EP4065702A1 (en) | System and method for activating gene expression | |
| Pelzer-Reith et al. | Plant aldolase: cDNA and deduced amino-acid sequences of the chloroplast and cytosol enzyme from spinach | |
| ES2273414T3 (es) | Procedimiento para el corte de proteinas de fusion. | |
| KR100351620B1 (ko) | 3차 결정구조의 내열성 효소 | |
| CA2266421A1 (en) | Genes coding for a protein having glycoside transfer activity | |
| AU777906B2 (en) | Method of increasing the content of fatty acids in plant seeds | |
| Siksnys et al. | Structure and function of the tetrameric restriction enzymes | |
| JP2003500060A5 (ko) | ||
| JPH07213280A (ja) | 耐熱性エステラーゼ | |
| RU2814490C1 (ru) | Рекомбинантный штамм Yarrowia lipolytica - продуцент инкапсулированной фитазы Paenibacillus sp. | |
| CN105177037B (zh) | 利用双油体蛋白融合技术表达胶原蛋白 | |
| JPS6322190A (ja) | ヒトリゾチ−ムの遺伝子発現による製法 | |
| JP2001054383A (ja) | アセチルキシランエステラーゼ活性を有するタンパク質及びそれをコードするｄｎａ | |
| KR100319539B1 (ko) | 신규한 트레할로스 생합성효소 융합유전자와 융합효소단백질 및 이를 이용한 트레할로스의 생산방법 | |
| KR100310932B1 (ko) | Ｌ62 리파제를 생산하는 신균주 스타필로코커스 헤모리티커스 Ｌ62(ＫＣＴＣ 8957Ｐ) 및 형질전환된 대장균 ＢＬ21(ＤＥ3)/ｐＳＨＭＬ(ＫＣＴＣ 8956Ｐ)을 이용한 Ｌ62 리파제의 대량생산법 | |
| US7186795B2 (en) | Lactoferricin gene and transformant expressing lactoferricin | |
| JPH0568541A (ja) | 活性なエクストラセルラー・スーパーオキシドジスムターゼの製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 19990709 |
|
| PA0201 | Request for examination | ||
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20010627 Patent event code: PE09021S01D |
|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20020225 Patent event code: PE09021S01D |
|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20020625 |
|
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20020823 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20020826 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20050726 Start annual number: 4 End annual number: 4 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20060725 Start annual number: 5 End annual number: 5 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20070822 Start annual number: 6 End annual number: 6 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20080728 Year of fee payment: 7 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20080728 Start annual number: 7 End annual number: 7 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee | ||
| PC1903 | Unpaid annual fee |