KR100351620B1 - 3차 결정구조의 내열성 효소 - Google Patents

3차 결정구조의 내열성 효소 Download PDF

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Abstract

본 발명은 3차 결정구조의 내열성 효소에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 4 내지 5개의 안티-페러럴 β-스트랜드(anti-parallel β-strand)로 구성된 블레이드 6개의 내부에 3개의 고친화 칼슘부위(high-affinity calcium binding site)와 3개의 저친화 칼슘부위(low-affinity calcium binding site)를 포함하는 프로펠러 형태의 3차 결정구조를 지닌 내열성 효소(thermo-stable enzyme)에 관한 것이다. 따라서, 상기의 Ca2+결합 부위 모티프를 이용하면 열 안정성이 매우 높은 단백질 합성에 응용할 수 있으며, 또한 3차 구조로부터 추정되는 효소의 활성부위 또한 최근에 연구되는 단백질 공학기술로 이러한 효소활성 부위를 가진 새로운 효소를 창출하는 데 매우 유용하게 응용할 수 있는 효과가 있다.

Description

3차 결정구조의 내열성 효소{A thermo-stable enzyme with 2.1Å crystal structure}
본 발명은 3차 결정구조의 내열성 효소에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 4 내지 5개의 안티-페러럴 β-스트랜드(anti-parallel β-strand)로 구성된 블레이드 6개의 내부에 3개의 고친화 칼슘부위(high-affinity calcium binding site)와 3개의 저친화 칼슘부위(low-affinity calcium binding site)를 포함하는 프로펠러 형태의 3차 결정구조를 지닌 내열성 효소(thermo-stable enzyme)에 관한 것이다.
오늘날, 고도로 산업화된 사회에서 목적물질에 대한 보다 경제적인 생산방법의 연구는 그 가치가 더욱 증대되었으며, 따라서, 보다 경제적일 뿐만 아니라 활성이 높은 효소에 대한 개발의 필요성이 날로 높아지고 있다. 그러한 예로, 내열성 효소(thermo-stable enzyme)가 있으며, 이러한 내열성 효소로서 특히, 파이테이즈는 동물의 소화생리에 적합하고 사료제조시 효소의 잔존활성이 뛰어나 유용성이높으며 파이틱에시드(Phytic acid)를 분해하여 포스페이트(Phosphate)와 포스페이트 이노시톨(Phosphate inositol) 및 이노시톨을 만드는 효소이다. 파이틱에시드는 가축의 사료로 사용하는 곡물의 인 함량의 50 ∼ 70%를 차지하지만, 닭, 돼지와 같은 단위가축은 생체 내에 파이틱에시드를 분해하는 파이테이즈의 결핍으로 식물성 인의 이용률이 극히 낮을 뿐 아니라, 소화되지 못한 파이틱에시드는 상수원 등에 방류되어 심각한 환경오염원으로 작용하며, 소호수의 녹조, 바다의 적조현상을 유발하는 주요인으로 작용한다. 또한, 파이틱에시드는 단위동물에 중요한 미량광물질(Ca, Mg, Mn, Zn, Fe), 아미노산, 비타민 등과 결합하여 동물생체에서 흡수되지 않고 배출되어 사료에 존재하는 영양분의 손실뿐 아니라, 중요한 영양분이 불용성 인 형태로 상수원에 배출되어 유해 미생물, 녹조 및 적조 등의 증식을 가속화하는 심각한 환경오염을 유발시킨다. 따라서, 파이테이즈를 단위가축에 급여할 경우, 단위 동물이 사료내의 불용성 인을 이용할 수 있어, 사료 중에 첨가하는 무기태인 투여 양을 감소시키는 경제적인 이익과 동시에 중요한 미량 생체활성물질의 이용성을 증진시키며, 동물 분으로 배출되는 인의 함량의 감소로 인한 환경오염을 방지하는 지구환경 보호차원에서 중요한 의미를 가진다.
그러나, 현재까지 개발된 파이테이즈는 파이틱에시드의 6개의 인산을 분해하는 인의 개수가 한정될 뿐 아니라, 곰팡이에서 생산하는 대부분의 파이테이즈는 배양기간의 장기화로 경제적 생산에 난점이 있으며, 또한, 곰팡이에서 생산된 파이테이즈가 단위동물의 소화생리에 잘 맞지 않아서 단위동물에 첨가시, 효소역가의 실활 등으로 사용에 한계성을 가져왔다. 일반적으로, 파이테이트는 동물의 소화관내에서 분해되어 분해된 인이 소장에서 흡수된다고 알려져 있으며, 이로 인해서 내산성이 요구되며 소화효소가 작용하는 소장에서 효소작용이 활발한 중성 파이테이즈가 유리하고, 파이테이즈를 동물사료에 첨가시 고온에서 펠레팅(Pelleing)을 하기 때문에 열에 안정성이 높은 효소개발이 필요하다.
따라서, 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 지금까지 유럽을 중심으로 파이테이즈의 연구[A.H.J.Ullah 등 1994, K.C.Ehrich, 1994, C.S.Piddington, 1993]가 진행되어 왔다. 그러한 예로, 동물에 대한 파이테이즈의 효과연구[L.G.Young 등 1993, X.G.Lei 등 1994, Z.Mroz 등 1994]와 파이테이즈의 구조에 관한 연구[D. Kostrewa 등 1997] 등이 진행되어 왔다. 특히, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래 파이테이즈는 3' 파이테이트(phytate)를 우선 분해 후에 다른 위치의 인을 분해하는 기작도 밝혀져 있다. 또한, 본 발명의 발명자들도 파이테이트(phytate)의 인산기의 위치에 관계없이 인을 분해하는 특성이 있는 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens) DS-11이 생산하는 신규 파이테이즈(Phytase)를 개발하였고, 이 파이테이즈가 기존 파이테이즈와 비교하여 동물의 소화생리에 적합하고, 고온에서 사료제조시 효소의 잔존활성이 뛰어난 특성을 가진 파이테이즈를 확보하여 신규성이 있다고 판단되여, 한국과학기술원 부설 생명공학연구소내 유전공학센터에 기탁하고 수탁번호 KCTC 0231BP를 부여받았으며, 또한, 대한민국 특허번호 제169913호(1998)와 PCT/KR 98/00056, 미국특허출원 09/142,621, 카나다 특허출원 2,249,014 및 일본국 특허출원 평9-532479호를 부여 받았다. 그리고, 이 특허균주인 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B.amyloliquefaciens) DS-11의 파이테이즈 유전자를 클로닝(Cloning)하여 결정된 염기서열(DNA sequences: U85968)의 신규성이 인정되어 대한민국 특허출원번호 제97-10948호로 출원하였다.
그러나, 상기와 같은 효소의 개발에도 불구하고, 이렇게 외형상 표현되는 효소의 특성 이외의 결정구조와 같은 객관적인 특성을 확인함으로써, 이를 기초로 단백질 공학기술에 응용하여 열에 보다 안정하고, 활성이 더욱 개선된 내열성 효소의 개발 필요성이 절실히 대두되었다.
이에, 본 발명의 발명자들은 열에 보다 안정하면서도 효소의 활성 또한 더욱 개선된 내열성 효소를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 재조합 벡터에서 생산되는 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens) DS-11이 생산하는 신규 파이테이즈(Phytase)의 X선 결정(X-ray crystal)을 확보하고, 이 X선 결정(X-ray crystal)으로부터 단백질 3차원 구조 및 그로부터 활성부위를 규명하였으며, 이 구조로부터 단백질의 열 안정성 및 효소 활성에 관련된 Ca2+결합부위를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 4 내지 5개의 안티-페러럴 β-스트랜드(anti-parallel β-strand)로 구성된 블레이드(blade) 6개의 내부에 3개의 고친화 칼슘 결합부위(high-affinity calcium binding site) 및 3개의 저친화 칼슘결합부위(low-affinity calcium binding site)를 포함하는 프로펠러 형태의 내열성 효소(thermo-stable enzyme)를 제공하는 것이다.
도 1은 재조합 파이테이즈의 X-선 결정(X-ray cystal)을 나타낸 것이다.
도 2는 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens) DS-11 유래 파이테이즈의 3차원적 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens) DS-11 유래 파이테이즈의 3차원적 구조에서 활성부위 클라프트(active site claft)를 나타낸 것이다.
도 4는 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens) DS-11 유래 파이테이즈의 3차원적 구조에서 고친화 칼슘 결합부위(high-affinity calcium binding sites)를 나타낸 것이다.
도 5는 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens) DS-11 유래 파이테이즈의 3차원적 구조에서 저친화 칼슘 결합부위(low-affinity calcium binding sites)를 나타낸 것이다.
도 6은 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens) DS-11 유래 파이테이즈의 3차원적 구조에서 추정되는 기질 결합부위(putative substrate bindingsites)를 나타낸 것이다.
도 7은 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens) DS-11 유래 파이테이즈의 3차원적 구조에서 칼슘이온과 열안정성에 관한 것을 나타낸 것이다.
도 8은 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens) DS-11 유래 파이테이즈의 3차원적 구조에서 저친화 칼슘이온과 효소의 활성에 관한 것을 나타낸 것이다.
본 발명은 4 내지 5개의 안티-페러럴 β-스트랜드(anti-parallel β-strand)로 구성된 블레이드(blade) 6개의 내부에 3개의 고친화 칼슘 결합부위(high-affinity calcium binding site) 및 3개의 저친화 칼슘 결합부위(low-affinity calcium binding site)를 포함하는 프로펠러 형태의 내열성 효소(thermo-stable enzyme)에 관한 것이다.
이와 같은, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
우선, 본 발명의 상기와 같은 결정구조를 지닌 효소의 예로, 파이테이즈(phytase)가 있다. 이러한 파이테이즈는 각 블레이드의 4번째 스트랜드(4th strand)가 다음 블레이드의 첫 번째 스트랜드(1st strand)의 상단부와 연결되어 6개의 블레이드가 프로펠러 형태로 구성된 것으로서, 각각의 블레이드는 4 내지 5개의 안티-페러럴 β-스트랜드(anti-parallel β-strand)로 구성되어 있다.
또한, 이들 블레이드 내부에는 3개의 고친화 칼슘 결합부위(high-affinity calcium binding site) 및 3개의 저친화 칼슘 결합부위(low-affinity calcium binding site)를 포함하고 있다. 여기서, 고친화 칼슘 결합부위는 2개의 칼슘이온이 6번째 블레이드 부근의 '이중 클라스프(double clasp)'의 중앙에 위치하며, Ca1과 Ca2는 브릿징 암(bridging arm)으로 작용하는 Asp308 카르복실레이트에서 바이-칼슘센터(bi-calcium center)를 형성하여 정전기적인 상호작용으로 '이중 클라스프(double clasp)'를 강화하여서, 프로펠러 구조의 환상정열을 더욱 안정화시키며, 또한 Ca3는 Asp56 카르복실레이트와 상호작용을 하며, 파이테이즈 구조내부를 안정화시키므로써, 효소의 내열성을 더욱 강화시킨다. 그리고, 저친화 칼슘 결합부위는 3개의 칼슘결합부위가 있으며, 여기에 Ca4는 Asp55와 Glu211의 카르복실레이트 그룹, Asn99와 Asn100의 사이드 체인 산소원자(side chain oxygen atom)와 배위결합을 하고 있으며, 물분자와 상호작용을 한다. 또한, Ca5는 Glu227의 카르복실레이트 그룹과 Tyr159의 하이드록실 그룹과 배위결합을 하며, 그리고 Ca4와 함께 Glu211의 카르복실레이트와 물분자를 공유하여 배위결합을 한다. Ca6은 Asp258, Glu260, Gln279의 카르복실레이트 그룹들과 배위결합을 하며, 물분자는 Glu211, Asp314와 상호작용을 한다. 즉, Ca4, Ca5, Ca6의 결합은 무질서한 단백질 사이드 체인(protein side chain)들을 질서 정연한 상태로 전환시키고, 높은 네거티브 활성부위(highly negative active site)를 소수성(hydrophobic)의 활성부위로 전환시켜 기질이 파이테이즈와의 결합에 유리하게 작용하여 효소의 촉매활성을 상승시키는 작용을 나타낸다.
그리고, 상기 블레이드 중 5번째 블레이드에는 엑스트라 β-스트랜드(extra β-strand)인 N-말단 조각(N-terminal segment)이 C-말단과 1 + 3 콤비네이션(combination)으로 연결되어 있어 β-스트랜드의 환상정열을 안정화시키고 있다.
따라서, 이상의 결과로부터 효소내의 칼슘 결합부위 및 활성부위에 대한 여러 모티프를 기초로 단백질 공학기술에 응용함으로써, 열에 보다 안정하면서도 촉매활성이 우수한 효소를 개발할 수 있는 효과가 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의거 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 바실러스 아밀로리퀘페이션스( B. amyloliquefaciens ) DS-11 유래 파이테이즈의 분리 및 결정(crystal)의 제조
바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DS-11 유래 2.2 kb의 파이테이즈 유전자(phytase gene)가 삽입된 pJPK가 형질전환된 바실러스 서브스틸리스(Bcillus substilis) DB104를 신조성 LB배지에서 20시간 배양 원심분리 후 배양 상등액을 취하였다. 배양 상등액을 아세톤 침전(50% v/v) 후 20mM 칼슘이 함유된 효소액을 70℃에서 5분간 열처리후 불순물을 제거후, 슈퍼덱스 200HR 겔투과 크로마토그래피(Superdex 200HR gel permeation chromatography)를 이용하여 99% 이상의 순수한 파이테이즈를 정제하였다. 그리고, 파이테이즈(phytase, 40 mg/ml)의 초기 결정(crystal)을 탐색을 위해 24개의 웰 린브로 플레이트(24-well Linbro plates)를 이용하여 핸딩-드롭 증기확산법(handing-drop vapor-diffusion)을 사용하였다. 최적의 결정화 조건은 4℃, 20% 2-메틸-2,4-펜탄디올이 함유된 0.1 M MES 버퍼(pH 6.5)에서 0.4 × 0.4 × 0.5 mm 크기의 파이테이즈 결정을 확보하였으며, 이 결정의 특성은 a=50.4, b=64.1, c=104.2Å의 단위 셀(unit cell)이며, P212121의 스페이스 그룹으로 된 파이테이즈 한 분자가 비대칭 단위(asymmetric unit)를 이루는 2.1Å 고해상도의 데이타를 획득하였고, 그 결과를 다음 도 1에 나타내었다.
실시예 2 : 바실러스 아밀로리퀘페이션스( Bacillus amyloliquefaciens ) DS-11 유래 파이테이즈의 3차원적 구조
바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DS-11 유래 파이테이즈의 3차원적 구조는 6개의 블레이드(blade)로 이루어진 프로펠러 형태의 구조이며, 효소의 열안정성에 관련된 고친화 칼슘결합 부위와 효소의 촉매활성에 관련된 저친화 칼슘결합부위를 도 2에 나타내었고, 또한, 효소의 활성부위가 전체적인 3차원 구조에서 클라프트(claft)를 상단에 나타내었으며, 이부위에 저친화 칼슘결합 부위가 있으며, 이부위가 효소의 활성부위(active site)이며 다음 도 3에 나타내었다.
이상의 도 2 및 도 3으로부터 알 수 있듯이, 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DS-11 유래 파이테이즈의 3차원적 구조는 6개의 블레이드(blade)로 이루어진 프로펠러 형태의 구조이다. 각 블레이드는 형태학적으로 동일하게 서로 연결된 안티-페러럴 β-스트랜드(anti-parallel β-strand)로 구성되어 있다. 각 블레이드의 4번째 스트랜드는 다음 블레이드의 첫 번째 스트랜드의 상단부와 연결되어 6개의 블레이드가 프로펠러 형태로 구성되어 있으며, 중심부에는 잘 정돈된 물분자가 결합되어 있다. 또한, C-말단의 1 + 3 콤비네이션(combination)뿐 아니라, N-말단 조각(N-terminal segment)이 5번째 블레이드에 연결되어 여분의 엑스트라 β-스트랜드(extra β-strand)를 형성하여 파이테이즈의 전체구조를 안정화하는 '이중 클라스프(double clasp)'형태의 매우 안정한 구조를 이루고 있다. 이 효소의 구조에서 효소활성 부위로 추정되는 기질 결합부위인 클라프트(claft)는 '상부'쪽에 위치하고, 다른 끝 부분인 '하부'는 평평한 구조이다.
실험예 1 : 바실러스 아밀로리퀘페이션스( Bacillus amyloliquefaciens ) DS-11 유래 파이테이즈의 고친화 칼슘결합부위(High-affinity calcium binding sites)
바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DS-11 유래 파이테이즈의 고친화 칼슘결합부위는 정제시 투석한 파이테이즈(native phytase) 와 중금속 유도체에서 결정화한 결정을 이상 산란(anomalous scattering; SA)을 가진 다중 동형 변환(multiple iosmorphous replasement; MIR)로 결정하였다. 그 결과, 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DS11 유래 파이테이즈의 구조에는 3개의 칼슘이온이 결합하는 부위를 확인하였고, 그 결과를 다음 도 4에 나타내었다. 즉, 도 4에 따르면, 2개의 칼슘이온은 6번째 블레이드 부근의 '이중 클라스프(double clasp)'의 중앙에 위치하며, Ca1과 Ca2는 브릿징 형태(bridging arm)로 작용하는 Asp308 카르복실레이트(carboxylate)에서 바이-칼슘센터(bi-calcium center)를 형성하고 있다. 이들 칼슘은 정전기적인 상호작용으로 '이중 클라스프(doubleclasp)'를 강화하여서, 프로펠러 구조의 환상정열을 더욱 안정화시키고, Ca3는 Asp56 카르복실레이트와 상호작용을 하며, 파이테이즈 구조내부를 안정화시킴으로써, 효소의 열 안정성을 강화시켰다.
실험예 2 : 바실러스 아밀로리퀘페이션스( Bacillus amyloliquefaciens ) DS-11 유래 파이테이즈의 저친화 칼슘 결합 부위(Low-affinity calcium binding sites)
바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DS-11 유래 파이테이즈의 구조에서 활성 부위는 β-스트랜드 사이에 많은 루프(loop)로 구성된 분자의 한쪽 끝에서 발견되며, 네거티브 사이드 체인(negative side chain)들로만 구성된 홀로우 클라프트(hallow claft)가 있다. 그리고, 이러한 파이테이즈가 완전한 활성을 위해서 칼슘이온을 필요로 한다. 따라서, 효소활성에 필요한 칼슘 결합부위를 확인하기 위하여 4mM CaCl2를 함유하는 결정화 조건을 이용하여 상기 실험예 1에서와 동일한 방법으로 또 다른 3개의 칼슘 결합부위를 가진 결정을 확보하였다. 그리고, 이들 결과를 다음 도 5에 나타내었다.
도 5의 결과에 따르면, 이들 3개의 칼슘 이온들은 중심의 Ca5에서 5.2 Å 거리의 Ca4와 4.1 Å 거리의 Ca6이 트리아딕 칼슘센터(triadic calcium center)를 이루고 있다. Ca4는 Asp55와 Glu211의 카르복실레이트 그룹(carboxylate group), Asn99와 Asn100의 사이드 체인 산소원자(side chain oxygen atom)와 배위결합을 하고 있으며, 그리고 물분자 (Wat1)와 상호작용을 한다. Ca5는 Glu227의 카르복실레이트 그룹과 Tyr159의 하이드록실 그룹과 배위결합을 하며, 그리고 Ca4와 함께 Glu211의 카르복실레이트와 물분자를 공유하여 배위결합을 한다. Ca6은 Asp258, Glu260, Gln279의 카르복실레이트 그룹들과 배위결합을 한다. 또한, 물분자는 Glu211, Asp314와 상호작용을 한다. Ca4, Ca5, Ca6의 결합은 무질서한 단백질 사이드 체인(protein side chain)들을 질서 정연한 상태로 전환시킨다. 이러한 칼슘결합은 높은 네거티브 활성부위(highly negative active site)를 소수성(hydrophobic)의 활성부위로 전환시켜 이 효소의 기질인 파이테이즈와의 결합이 유리하게 작용하여 효소의 활성을 나타낸다.
실험예 3 : 바실러스 아밀로리퀘페이션스( Bacillus amyloliquefaciens ) DS-11 유래 파이테이즈의 기질 흡착부위(Putative substrate binding sites)
20mM Tris/HCl, pH 7.0에서 파이테이즈의 기질인 미오-이노시톨, 헥사포스페이트, 미오-이노시톨 1-모노포스페이트, 미오-이노시톨 2-모노포스페이트, 4-모노포스페이트를 2mM의 농도로 하여 37℃에서 15분 반응 후 효소의 활성을 측정하였다. 그 결과, DS11 유래 파이테이즈는 1,2,4,번 위치에 phosphate를 27%, 28%, 40%의 활성을 나타내었다. 이결과를 표 1에 나타내었다. 그리고 도 6은 정전기적인 음이온인 파이테이트가 정전기적으로 양이온을 나타내는 아미노산인 Lys76, Lys77, Lys179과 결합 가능하다는 것을 나타내었다.
이상의 결과인 표 1과 도 6으로부터 알 수 있듯이, 효소의 활성부위에 결합하는 칼슘이온들은 활성부위에 인접한 Lys76, Lys77, Lys179와 함께 기질인 파이테이즈가 결합하기 유리한 정전기적(electrostatic) 환경으로 전환된다. 파이테이즈의 인산기는 Ca4와 Ca5사이에 결합하며, 인접한 인산기는 어떤 정전기적 반발 또는 입체 충돌(steric crash)도 없이 Ca5와 Ca6 사이에 결합할 수 있다. 이 기질-결합 모드(substrate-binding mode)에서, 3개의 라이신(lysine) 잔기는 파이테이즈의 3개의 다른 인산기들과 잘 결합할 수 있다. 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DS11 유래 파이테이즈의 구조에서는 물분자 (Wat1)가 Ca4와 Ca5와 배위결합을 하고 있으며, 이 물분자 (Wat1)가 파이테이즈의 인산기를 직접 공격하여 분해한다. 그리고, 효소의 노출된 활성부위와 파이테이트-결합 모델(phytate-binding model)은 이 효소가 파이테이즈의 6개 인산기 모두 분해할 수 있다는 것을 보여준다.
실험예 4: Ca 2+ 와 파이테이즈 구조의 열 안정성
바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DS-11유래 파이테이즈의 열 안정성에 있어 Ca2+의 영향은 1 ℃/min의 속도로 주사차 열량계(differential scanning calorimetry)를 이용하여 결정하였다. 5%(w/v)의 파이테이즈 샘플에 1 mM CaCl2, 2mM EDTA, 5 mM CaCl2를 첨가 후 실험을 수행하였고, 그 결과를 다음 도 7과 도 8에 나타내었다.
이상의 도 7 및 도 8의 결과에 따르면, EDTA의 첨가는 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DS11 유래 파이테이즈의 칼슘을 제거하였고, 그 결과 파이테이즈의 Tm이 78.1℃에서 59.1℃로 급격하게 감소하였다. 이로부터 파이테이즈의 고친화 칼슘 결합부위(high-affinity calcium binding site)가 열 안정성에 중요한 역할을 한다는 사실을 알 수 있었다. 또한, 5mM 칼슘의 첨가는 파이테이즈의 저친화 칼슘 결합부위(low-affinity calcium binding site)에 또 다른 3개의 칼슘이 결합한 상태로서, 이들 저친화 칼슘 결합부위(low-affinity calcium binding site)에 결합한 칼슘들은 파이테이즈의 Tm을 약 2.1℃ 증가시키키고 있는 바, 이로부터 저친화 칼슘 결합부위(low-affinity calcium binding site)는 효소의 활성에 중요한 역할을 수행함을 알 수 있었다. 따라서, 이상의 결과로부터 고친화 칼슘 결합부위(high-affinity calcium binding site)에 결합한 칼슘은 53%의 루프(loop)를 가지는 프로펠러 구조의 열 안정성을 증가시키는 반면에 저친화 칼슘 결합부위(low-affinity calcium binding site)에 결합한 칼슘은 효소의 촉매활성에관여하는 것을 보여준다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 4 내지 5개의 안티-페러럴 β-스트랜드(anti-parallel β-strand)로 구성된 블레이드 6개로 이루어진 프로펠러 형태의 내열성 효소에 관한 것으로서, 이러한 본 발명에 따르면, 6-블레이드 형태의 스캐폴드(scafold)가 효소의 매우 높은 열안정성을 가진 구조이며, 칼슘이온이 '이중 클라스프(double-clasp)'와 중앙 채널(central channel)에서 여러 펩티드 조각들을 견고하게 결합함으로써, 효소에게 높은 열안정성을 부여할 뿐만 아니라, 기질이 결합하기에 매우 불리한 네거티브 전하를 뛴 효소의 활성부위를 정전기적으로 유리한 환경으로 전환시킴으로써, 효소활성을 강화시키는데 매우 중요한 역할을 한다. 따라서, 상기의 Ca2+결합 부위 모티프를 이용하면 열 안정성이 매우 높은 단백질 합성에 응용 할 수 있으며, 또한 3차 구조로부터 추정되는 효소의 활성부위 또한 최근에 연구되는 단백질 공학기술로 이러한 효소활성 부위를 가진 새로운 효소를 창출하는 데 매우 유용하게 응용할 수 있는 효과가 있다.

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  6. 순수 분리된 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens)DS11 유래의 파이테이즈(phytase, 40mg/ml)로서, 4℃에서 5mM 칼슘 및 20％ 2-메틸-2,4-펜탄디올이 함유된 0.1M MES 버퍼 (pH6.5)조건에서 생성된 결정구조(Crystal structure)가 4내지 5개의 안티-페러럴 β-스트랜드(anti-parallel β-strand)로 구성된 블레이드(blade) 6개의 내부에 3개의 고친화 칼슘 결합부위(high-affinity calcium binding site) 및 3개의 저친화 칼슘 결합부위(low-affinity calcium binding site)를 포함되 각 블레이드의 4번째 스트랜드(4th strand)가 다음 블레이드의 첫 번째 스트랜드(1st strand)의 상단부와 연결되어 상기 6개의 블레이드가 프로펠러 형태로 구성되어 있으며, C-말단과 1+3 콤비네이션(combination)을 이루는 N-말단조각(N-terminal segment)이 5번째 블레이드에 연결되어 여분의 엑스트라 β-스트랜드(extra β-strand)를 형성하고, 그 결정 형상이 P212121스페이스 그룹으로 결정화된 구조를 가지는 파이테이즈 결정(Crystal).
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