KR100319539B1 - 신규한 트레할로스 생합성효소 융합유전자와 융합효소단백질 및 이를 이용한 트레할로스의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 브레비박테리움 (Brevibacterium helvolum ATCC 11822)에서 트레할로스 생합성효소를 암호화하는 두 개의 유전자를 융합한 새로운 융합유전자 및 그로부터 합성되는 새로운 트레할로스 생합성 융합효소단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명을 통하여 제조한 융합유전자로부터 합성되는 융합효소단백질을 이용한 트레할로스 합성방법을 제공하는 것이다. 본 발명에서 제조한 트레할로스 생합성효 소 융합유전자의 구조유전자 부분은 4,095bp이며, 두 개의 효소 단백질이 융합된 형태로 암호화하고 있다. 융합유전자의 첫번째 유전자 부위는 말토올리고실트레할로스합성효소 유전자 부분이고, 두번째 유전자 부위는 말토올리고실트레할로스 가수분해효소 유전자이다. 이로부터 번역되는 융합효소단백질은 말토올리고실트레할로스 합성가수분해효소(BvMTSHase)이며, 아미노산 1,365개로 구성된 약 150kDa의 분자량을 갖는 융합효소단백질이다. 이 융합효소단백질은 말토올리고실트레할로스 합성 및 가수분해 반응을 동시에 할 수 있는 융합효소단백질이다. 이 융합유전자를 발현벡터에 재조합한 후, 대장균에서 과다발현하고 재조합 융합효소단백질을 순수 분리하여 이들이 말토올리고당 및 전분으로부터 트레할로스를 생산하는 효소로 작용함을 실험실적 조건에서 확인하였다. 본 발명에서 제조한 융합유전자 및 그로부터 번역되어 생성되는 융합효소단백질은 자연에 존재하지 않는 새로운 것이고, 기존에 보고된 두가지 효소를 이용하여 트레할로스를 생합성하는 효소와는 다른, 두가지 반응을 동시에 할 수 있는 하나의 새로운 융합효소단백질이다.

Description

신규한 트레할로스 생합성효소 융합유전자와 융합효소단백질 및 이를 이용한 트레할로스의 생산방법{Novel trehalose synthase fusion gene and fusion protein and process for preparation of trehalose therefrom}

본 발명은 브레비박테리움(Brevibacterium helvolum)에서 분리한 트레할로스 생합성 효소 유전자를 융합하여 새로운 유전자를 제조하고, 이로부터 발현되는 새로운 트레할로스 생합성 융합효소를 이용하여 트레할로스를 생산하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 브레비박테리움(Brevibacterium helvolum ATCC 11822)에서 발현되는 트레할로스 생합성효소를 암호화하는 두가지 유전자를 유전자 수준에서 융합하여 하나의 유전자로 제조하였으며, 그로부터 번역되는 트레할로스 생합성 융합효소와, 이를 이용하여 다양한 기질, 특히 전분에서 효과적으로 트레할로스를 생산하는 것이다.

트레할로스(α-D-glucopyranosyl-[1-1]-α-D-glucopyranose)는 곤충, 세균, 곰팡이, 효모 그리고 일부 식물체 등에서 발견되는 비환원성 이당류이다 (참조: Elbein, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 30:227-256, (1974)). 트레할로스는 환원성 탄수화물의 저장 형태이기도 하지만 주로 영양분의 고갈, 고온, 건조, 산소결핍, 삼투압 등 다양한 종류의 바람직하지 못한 물리적 화학적 외부 충격에서비롯되는 나쁜 영향으로부터 세포를 보호하는 역할을 하는 것으로 여겨진다 (참조: Eleutherio et al., Cryobiology, 30:591-596, (1993)). 트레할로스는 건조 과정에서 단백질과 세포막의 인지질과 수소 결합을 하여 세포 구조를 그대로 유지하게해 주며 식품의 경우 고유의 풍미, 색상, 질감 등을 유지할 수 있게 한다 (참조: Crowe et al., Science, 223:701-703, (1984)). 따라서 건조 식품의 경우 색과 풍미를 보존하는 식품 첨가제로서 이용할 수 있을 뿐만 아니라 가용 수분을 감소시킴으로서 식품의 저장성을 향상시킬 수 있기도 하다. 트레할로스 생합성 반응 경로는 효모와 대장균에서 가장 잘 알려져 있는데, 이들의 유전자는 이미 분리가 되었고 그 구조도 결정이 되었다 (참조: De Virgilio et al., Eur. J. Biochem., 212: 315-323, (1993); Kaasen et al., Gene, 145: 9-15, (1994)). 이외에도 Rhizobium sp. 등 근류균에서 트레할로스 합성활성이 측정되었다 (참조: Mueller et al., Physiol. Plant, 90: 86-92,(1994)). 현재 트레할로스는 효모 배양액에서 추출하여 식품 첨가제로 일부 사용하고 있는데 그 가격이 고가여서 실용화가 되지 않고 있다. 따라서 본 연구에서는 트레할로스를 생합성하는 새로운 유전자를 분리하고, 이 유전자를 대량발현시켜서 얻은 효소를 이용하여 트레할로스 합성의 효율을 높이고자하는 목적을 달성하기 위하여, 브레비박테리움 (Brevibacterium helvolum ATCC 11822) 으로부터 트레할로스 생합성효소 유전자를 분리하였다.

본 발명자들은 트레할로스 생합성 효소를 연구하던 중 브레비박테리움(Brevibacterium helvolum ATCC 11822)이 트레할로스를 생산하는 것을 알았으며, 브레비박테리움에 존재하는 트레할로스 생합성효소는 포도당이 α(1→4) 결합으로 여러개 연결되어있는 말토올리고당(maltooligosaccharide)의 환원말단으로부터 트레할로스를 합성할 수 있는 성질을 가지며, 이미 이의 유전자를 분리하였다. 첫번째 유전자는 브레비박테리움 말토올리고실트레할로스 합성효소 (Brevibacterium maltooligosyltrehalose synthase: BvMTSase) 유전자이고, 이로부터 번역되는 브레비박테리움 말토올리고실트레할로스 합성효소(BvMTSase)는 말토올리고당(maltooligosaccharide)의 환원말단에 존재하는 α(1→4)글리코시딕 결합을 α(1→1) 글리코시딕 결합으로 전환시켜 말토올리고실 트레할로스(maltooligosyl trehalose)를 생성한다. 두번째 유전자는 브레비박테리움 말토올리고실트레할로스 가수분해효소 (Brevibacterium maltooligosyl trehalose trehalohydrolase: BvMTHase) 유전자이고, 이로부터 번역되는 브레비박테리움 말토올리고실트레할로스 가수분해효소 (BvMTHase)는 BvMTSase에 의해 생성된 말토올리고실 트레할로스의 말토올리고실 부위와 트레할로스 부위간의 α(1→4) 글리코시딕 결합을 가수분해시켜 포도당의 단위가 2개 적어진 말토올리고당과 트레할로스를 생성한다. 그러나 이들는 2개의 유전자로 구성되어 있고, 트레할로스의 생산을 위하여는 두가지 효소를 각각 생산, 반응하여야한다.

위와 같이 한가지 이상의 효소를 이용하여야 하는 경우 각각의 효소를 생산하고 반응하여 최종 산물을 생산하는데, 각각의 효소는 항상 반응에 필요한 일정 농도로 생산하여야 하므로 최종생성물의 양에 제약이 있을 수 있고, 생산양의 일관성을 유지하기 힘들다. 최근 발달한 유전자 재조합 기술을 이용하면 두 개의 유전자를 하나의 유전자로 융합하여, 두 개의 효소가 하나의 효소 단백질로 융합되어있는 형태로 생산이 가능하다. 그러나 많은 경우 융합유전자로부터 융합단백질은 만들어지나, 융합단백질이 두 가지 효소활성을 동시에 가지며, 또한 각각의 효소반응에 비해 반응속도 등이 우수한 경우는 그 예가 많지 않다. 본 발명에서는 두 개의 유전자를 유전자 조작방법을 이용하여 하나의 새로운 유전자로 제조하였고, 이로부터 합성되는 트레할로스 생합성효소를 하나의 새로운 융합효소로 조제하였다. 이렇게 합성된 융합효소는 각각의 효소활성을 모두 가지고 있었고, 각각의 효소를 이용하여 트레할로스를 합성하는 경우에 비하여 효소반응을 1단계로 줄일 수 있었으며, 트레할로스 합성효율도 각각의 효소를 사용한 경우보다 더 증가하였다.

본 발명의 주된 목적은 브레비박테리움 (Brevibacterium helvolum ATCC 11822) 으로부터 분리한 트레할로스 생합성효소의 두가지 유전자들을 융합하여 새로운 하나의 유전자로 만들었으며, 이 융합유전자로부터 얻어지는 새로운 트레할로스 생합성 융합효소단백질들을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명을 통하여 제조합 융합유전자로부터 얻어지는 융합효소단백질을 이용하여 트레할로스의 효과적 합성방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용을 상세히 설명하고자 한다.

제 1도는 BvMTSase 유전자와 BvMTHase 유전자를 융합하여 BvMTSHase 융합유전자를 제조하는 방법을 도식화한 것이다.

제 2도는 BvMTSHase 융합유전자의 염기서열 및 그로부터 번역되는 융합효소단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.

제 3도는 BvMTSHase 융합유전자를 대장균에서 대량 발현시킨 후 융합효소단백질을 분리하고 SDS-PAGE 방법으로 확인한 결과이다.

제 4도는 제 3도에서 분리한 융합효소단백질을 이용하여 트레할로스 합성반응을 실시하고 얇은막크로마토그래피 방법에 의해 트레할로스의 합성을 확인한 결과이다.

제 5도는 제 3도에서 순수분리한 융합효소단백질을 사용하여 전분을 기질로 트레할로스 합성반응을 실시하고 얇은막크로마토그래피 방법에 의해 트레할로스의 합성을 확인한 결과이다.

제 6도는 제 5도의 반응물 중 융합효소단백질을 사용하여 전분을 기질로 트레할로스 합성반응을 실시하고 24시간 반응물을 HPIC 방법에 의해 트레할로스의 합성을 확인하고 정량한 결과이다.

제 7도는 제 5도의 반응물 중 융합효소단백질과 알파-아밀라제 효소를 혼합 사용하여 전분을 기질로 트레할로스 합성반응을 실시하고 24시간 반응물을 HPIC 방법에 의해 트레할로스의 합성을 확인하고 정량한 결과이다.

본 발명은 유전자 융합하는 단계; 융합유전자로부터 융합단백질의 발현 및 순수 분리 단계; 융합단백질을 이용하여 트레할로스 합성하는 단계; 및 전분으로부터 트레할로스를 합성하는 단계로 이루어진다.

본 발명자들은 이미 브레비박테리움 (Brevibacterium helvolum ATCC 11822)으로부터 두가지 트레할로스 생합성 관련 효소유전자를 분리하였다. 첫번째 유전자는 구조유전자 부분이 2,328bp인 브레비박테리움 말토올리고실트레할로스 합성효소(Brevibacterium maltooligosyltrehalose synthase: BvMTSase) 유전자이고, 이로부터 번역되는 브레비박테리움 말토올리고실트레할로스 합성효소(BvMTSase)는 아미노산 776개로 구성된 약 85.8kDa의 분자량을 갖는 단백질이다. 이 효소는 말토올리고당(maltooligosaccharide)의 환원말단에 존재하는 α(1→4)글리코시딕 결합을 α(1→1) 글리코시딕 결합으로 전환시켜 말토올리고실 트레할로스(maltooligosyl trehalose)를 생성한다. 두번째 유전자는 구조유전자 부분이 1,767bp 인 브레비박테리움 말토올리고실트레할로스 가수분해효소 (Brevibacterium maltooligosyl trehalose trehalohydrolase: BvMTHase) 유전자이고, 이로부터 번역되는 브레비박테리움 말토올리고실트레할로스 가수분해효소 (BvMTHase)는 아미노산 589개로 구성된 약 64.2kDa의 분자량을 갖는 단백질이다. 이 효소는 BvMTSase에 의해 생성된 말토올리고실 트레할로스의 말토올리고실 부위와 트레할로스 부위간의 α(1→4) 글리코시딕 결합을 가수분해시켜 포도당의 단위가 2개 적어진 말토올리고당과 트레할로스를 생성한다. 그러나 이들은 2개의 유전자로 구성되어 있고, 트레할로스의 생산을 위하여는 두가지 효소를 각각 생산하여 각각의 서로 다른 반응으로 생산해야 함으로, 트레할로스 생산효율이 한가지 효소를 이용하는 경우보다 떨어질 것으로 생각되었다. 따라서 본 발명에서는 두 개의 유전자를 polymerase chain reaction(PCR) 및 유전자 재조합방법을 이용하여 하나의 유전자로 제조하였고, 이로부터 합성되는 트레할로스 생합성효소를 하나의 융합효소 (BvMTSHase) 로 조제하였다.

융합유전자로부터 번역되어 얻어지는 BvMTSHase를 이용하여 트레할로스를 합성할 수 있는지 확인하기 위하여 융합유전자를 대장균에서 발현시키고, 발현된 융합 효소단백질을 순수 분리한 후 트레할로스 합성능을 검정하였다. 융합유전자의 구조유전자부분을 분리하고 대장균에서의 발현벡터인 pRSET 플라스미드에 삽입하여 융합 효소단백질의 발현을 유도하였다. 발현된 융합 효소단백질은 Ni²⁺-NTA-agarose 흡착 겔 크로마토그래피를 이용하여 순수분리하였고 SDS-PAGE 전기영동을 이용하여 융합 효소단백질이 발현됨을 확인하였다. 분리한 융합 효소단백질의 트레할로스 합성능을 검정하기 위하여 여러 가지 말토올리고당을 기질로하여 트레할로스 합성반응을 실시하였다. 그 결과, 홀수개의 포도당 단위로 되어있는 말토올리고당들은 최종 반응물이 트레할로스와 말토트리오스(maltotriose, G3)이며, 말토트리오스는 더이상 가수분해되지 않았다. 짝수개의 포도당 단위로 되어있는 말토올리고당들은 최종 반응물이 트레할로스와 말토테트라오스(maltotetraose, G4)이며, 말토테트라오스를 장시간 반응하였을 경우 소량만이 트레할로스와 말토스(maltose)로 전환됨을 알 수 있었다. 순수 분리한 융합 효소단백질이 전분(soluble starch)과는 어떻게 반응하는지를 알아보기 위하여 전분을 기질로 하여 트레할로스 합성반응을 실시하였다. 그 결과, 전분으로부터 트레할로스를 합성하는 것을 확인하였으며, 이 경우 각각의 효소단백질을 사용하여 반응한 경우에 비하여 트레할로스의 생산 수율이 더높은 것을 확인하였다. 따라서 이 방법에 의해 전분으로부터 트레할로스를 대량 생산할 수 있는 방법을 개발하였다.

이하, 본 발명은 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하나 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지는 않는다.

실시예 1 : 트레할로스 생합성 유전자의 융합

본 발명자들은 이미 브레비박테리움 (Brevibacterium helvolum ATCC 11822)으로부터 두가지 트레할로스 생합성 관련 효소유전자를 분리하였다. 첫번째 유전자는 구조유전자 부분이 2,328bp인 브레비박테리움 말토올리고실트레할로스 합성효소(Brevibacterium maltooligosyltrehalose synthase: BvMTSase) 유전자이고, 이로부터 번역되는 브레비박테리움 말토올리고실트레할로스 합성효소(BvMTSase)는 아미노산 776개로 구성된 약 85.8kDa의 분자량을 갖는 단백질이다. 이 효소는 말토올리고당(maltooligosaccharide)의 환원말단에 존재하는 α(1→4)글리코시딕 결합을 α(1→1) 글리코시딕 결합으로 전환시켜 말토올리고실 트레할로스(maltooligosyltrehalose)를 생성한다. 두번째 유전자는 구조유전자 부분이 1,767bp 인 브레비박테리움 말토올리고실트레할로스 가수분해효소 (Brevibacterium maltooligosyltrehalose trehalohydrolase: BvMTHase) 유전자이고, 이로부터 번역되는 브레비박테리움 말토올리고실트레할로스 가수분해효소 (BvMTHase)는 아미노산 589개로 구성된 약 64.2kDa의 분자량을 갖는 단백질이다. 이 효소는 BvMTSase에 의해 생성된 말토올리고실 트레할로스의 말토올리고실 부위와 트레할로스 부위간의 α(1→4) 글리코시딕 결합을 가수분해시켜 포도당의 단위가 2개 적어진 말토올리고당과 트레할로스를 생성한다. 그러나 이들은 2개의 유전자로 구성되어 있고, 트레할로스의 생산을 위하여는 두가지 효소를 각각 생산하여 각각의 서로 다른 반응으로 생산해야 한다. 따라서 본 발명에서는 두 개의 유전자를 polymerase chain reaction (PCR) 및 유전자 재조합방법을 이용하여 하나의 유전자로 제조하였고, 이로부터 합성되는 트레할로스 생합성효소를 하나의 융합효소 (BvMTSHase) 로 조제하였다.

제 1도는 BvMTSase 및 BvMTHase 유전자를 polymerase chain reaction (PCR)및 유전자 재조합 기술을 이용하여 하나의 BvMTSHase 융합 유전자를 제조하는 과정을 나타낸 것이다. BvMTSase 및 BvMTHase 유전자는 1개의 염기가 중첩되어 있는 유전자 구조를 가지고 있는데, 이 유전자를 발현시키면 BvMTSase 효소단백질은 단백질로서 발현이 가능하나, BvMTHase 효소단백질은 전혀 다른 단백질이 만들어지고, 또한 중간에서 단백질 합성이 끝나는 불완전한 효소단백질이 합성된다. 그러므로 각각의 유전자를 분리하여 각각의 효소단백질을 제조해야하는 어려움이 있다. 두개의 유전자가 중첩되지 않는 하나의 융합유전자로 제조하기 위하여 제 1도에 나타낸 것과 같은 oligonucleotide primer를 합성하고, PCR 방법을 이용하여 A 염기가 하나 더 삽입된 융합유전자를 제조하였다. BvMTSHase 융합유전자는 BvMTSase 유전자의 번역종결부위가 없어지고 BvMTSase 의 마지막 아미노산 다음에 BvMTHase 유전자의 번역개시부위가 연결되어 있는 융합유전자의 구조를 가진다. 제 2도는 제조된 BvMTSHase 융합유전자의 염기서열 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열을 나타낸다. 본 발명에서 제조한 트레할로스 생합성효소 융합유전자의 구조유전자 부분은4,095bp이며, 두 개의 효소 단백질이 융합된 형태로 암호화하고 있다. 융합유전자의 첫번째 유전자 부위는 BvMTSase 유전자 부분이고, 두번째 유전자 부위는 BvMTHase 유전자이다. 이로부터 번역되는 융합효소단백질은 말토올리고실트레할로스 합성가수분해효소(BvMTSHase)이며, 아미노산 1,365개로 구성된 약 150KDa의 분자량을 갖는 융합효소단백질이다.

실시예 2 : 대장균에서의 BvMTSHase 융합유전자의 발현 및 순수분리

실시예 1에서 제조합 융합유전자로부터 번역되는 BvMTSHase 융합효소단백질을 이용하여 트레할로스를 합성할 수 있는지 확인하기 위하여 융합 유전자를 대장균에서 발현시키고, 발현된 융합 효소단백질을 순수 분리한 후 트레할로스 합성능을 검정하였다. 융합유전자의 구조유전자부분을 분리하고 대장균에서의 발현벡터인 pRSET 플라스미드에 삽입하였다. 이렇게 제조된 재조합 플라스미드(pRBvMTSH)로 대장균 BL21을 형질전환시키고, 12시간 배양한 후, IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside)를 최종농도 1mM이 되도록 첨가하고 4시간 더 배양하여 융합효소단백질의 발현을 유도하였다. 발현된 융합 효소단백질은 Ni²⁺-NTA-agarose 흡착 겔 크로마토그래피를 이용하여 순수분리하였다. 제 3도는 발현된 융합 효소단백질을 SDS-PAGE 전기영동하여 확인한 결과이다. 제 3도 M은 단백질분자량마커이고, 제 3도의 1,2는 BvMTHase 및 BvMTSase 유전자를 포함하는 pRBvMTH 및 pRBvMTS 플라스미드를 대장균에서 유도발현시키고, 발현된 각각의 효소단백질을 Ni²⁺-NTA-agarose 흡착 겔 크로마토그래피를 이용하여 순수분리한 결과이다. 제 3도의 3은 BvMTSHase유전자를 포함하는 pRBvMTSH 플라스미드를 대장균에서 유도발현시키고, 발현된 융합효소단백질을 Ni²⁺-NTA-agarose 흡착 겔 크로마토그래피를 이용하여 순수분리한 결과이다. 제 3도의 3에서 보듯이 BvMTSHase 융합유전자를 포함하는 pRBvMTSH 플라스미드를 대장균에서 유도발현시킨 경우, BvMTSHase 융합효소단백질은 특이적으로 다량 발현되었으며 발현된 융합효소단백질은 Ni²⁺-NTA-agarose 흡착 겔 크로마토그래피를 이용하여 순수분리가 가능하였다.

실시예 3 : BvMTSHase 융합효소단백질을 이용한 트레할로스 합성 및 기질 특이성

순수 분리한 BvMTSHase 융합 효소단백질의 트레할로스 합성능 및 기질 특이성을 알아보기 위하여 여려가지 말토올리고당을 기질로하여 트레할로스 합성실험을 실시하였다. 반응조건은 50mM 인산완충용액(pH 7.0) 조건하에서 여러가지 말토올리고당을 1mM의 농도로 첨가하고 500ng의 순수분리한 효소를 첨가하여 전체 반응부피를 100ul로 하였다. 이를 37℃에서 1시간 반응시키고, 95℃에서 10분동안 처리하여 반응을 종결하였다. 제 4도는 여러 가지 말토올리고당을 기질로하여 트레할로스 합성실험을 실시한 후 얇은막크로마토그래피 방법에 의해 트레할로스 합성을 확인한 결과이다. 제 4도의 S는 기준물질로서 글루코스(glucose, G1), 트레할로스(trehalose, T), 말토오스(maltose, G2), 말토트리오스(maltotriose, G3), 말토테트라오스(maltotetraose, G4), 말토펜타오스(maltopentaose, G5)의 혼합물이다. 제 4도의 G3부터 M까지는 각각 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스, 말토올리고당혼합물을 각각 기질로 사용하여트레할로스 합성실험을 실시한 결과이다. 제 4도에서 보듯이 5개 이상 홀수개의 포도당 단위로 되어있는 말토올리고당들(제 4도 G5, G7)은 최종 반응물이 트레할로스와 말토트리오스(G3)이며, 말토트리오스는 더 이상 가수분해되지 않았다. 6개 이상 짝수개의 포도당 단위로 되어있는 말토올리고당(제 4도 G6)은 최종 반응물이 트레할로스와 말토테트라오스(G4)이며, 말토테트라오스를 장시간 반응하였을 경우 소량만이 트레할로스와 말토스(maltose)로 전환됨을 알 수 있었다.

실시예 4 : 전분으로부터의 트레할로스 합성

전분을 이용한 트레할로스 합성 방법을 개발하기 위하여 수용성 전분(soluble starch)을 기질로 사용하고 반응시간을 24시간까지 연장하였다. 반응조건은 50mM 인산완충용액(pH 7.0) 조건하에서 1% 수용성 전분을 기질로 첨가하고 순수분리한 융합효소(BvMTSHase)를 1㎍을 첨가하여 전체 반응부피를 100ul로 하였다. 이를 37℃에서 24시간까지 반응시키고, 95℃에서 10분동안 처리하여 반응을 종결하였다. 제 5도는 전분을 기질로 사용하여 트레할로스 합성반응을 실시하고 얇은막크로마토그래피 방법에 의해 트레할로스의 합성을 확인한 결과이다. 제 5도의 S는 기준물질로서 글루코스(glucose, G1), 트레할로스(trehalose, T), 말토오스(maltose, G2), 말토트리오스(maltotriose, G3), 말토테트라오스(maltopentaose, G4), 말토펜타오스(maltopentaose, G5)의 혼합물이다. 제 5도 [-Amylase] 에서 보듯이 반응을 24시간까지 트레할로스 합성반응을 진행하였을 경우 반응시간에 따라 전분으로부터 합성되는 트레할로스의 양이 증가됨을 확인하였다. 제 6도는 제 5도 [-Amylase]의 24시간 반응물을 HPIC 방법에 의해합성된 트레할로스를 확인하고 합성된 트레할로스의 양을 정량한 결과이다. 제 6도에서 보듯이 24시간 반응 후에 전분의 약 30%가 트레할로스로 전환되었음을 확인하였다.

실시예 5: 알파-아밀라제를 이용한 전분으로부터의 트레할로스 합성 효율 증대

전분으로부터 트레할로스의 생산 효율을 높이기 위하여 수용성 전분(soluble starch)에 알파-아밀라제(α-amylase)를 처리하고 반응시간을 24시간까지 연장하였다. 반응조건은 50mM 인산완충용액(pH 7.0) 조건하에서 1% 수용성 전분을 기질로 첨가하고 0.05단위의 알파-아밀라제, 순수분리한 융합효소(BvMTSHase)를 1㎍을 첨가하여 전체 반응부피를 100ul로 하였다. 이를 37℃에서 24 시간까지 반응시키고, 95℃에서 10분동안 처리하여 반응을 종결하였다. 제 5도 [+Amylase] 에서 보듯이 알파-아밀라제를 첨가하고 24시간까지 트레할로스 합성반응을 진행하였을 경우 반응시간에 따라 전분으로부터 합성되는 트레할로스의 양이 알파-아밀라제를 첨가하지 않은 경우(제 5도, -Amylase)에 비하여 월등히 증가됨을 확인하였다. 제 7도는 제 5도 [+Amylase] 의 24시간 반응물을 HPIC 방법에 의해 합성된 트레할로스를 확인하고 합성된 트레할로스의 양을 정량한 결과이다. 제 7도에서 보듯이 24시간 반응 후에 전분의 약 70%가 트레할로스로 전환되었음을 확인하였고, 알파-아밀라제를 첨가하지 않은 경우(제 6도)에 비하여 약 230% 이상의 트레할로스 전환 효율이 증가하였다.

그러므로 본 발명에서 사용한 BvMTSHase 융합 효소단백질을 이용하면 BvMTSase 및 BvMTHase 각각의 효소를 이용하는 경우에 비하여 트레할로스를 한번의 반응으로 효과적으로 생산할 수 있다. 또한 수용성 전분을 알파-아밀라제 효소로 먼저 처리하여 말토올리고당으로 전환한 후 이를 기질로 사용하면, 트레할로스의 생산효율을 2배 이상 증가시켜서 트레할로스를 대량 생산할 수 있을 것이다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 브레비박테리움(Brevibacterium helvolum ATCC 11822)에서 트레할로스 생합성효소를 암호화하는 두 개의 유전자를 융합한 새로운 융합유전자 및 그로부터 합성되는 새로운 트레할로스 생합성 융합효소단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명을 통하여 제조한 융합유전자로부터 합성되는 융합효소단백질을 이용한 트레할로스 합성방법을 제공하는 것이다. 본 발명에서 제조한 트레할로스 생합성효소 융합유전자의 구조유전자 부분은 4,095bp이며, 두 개의 효소 단백질이 융합된 형태로 암호화하고 있다. 융합유전자의 첫번째 유전자 부위는 말토올리고실트레할로스 합성효소 유전자 부분이고, 두번째 유전자 부위는 말토올리고실트레할로스 가수분해효소 유전자이다. 이로부터 번역되는 융합효소단백질은 아미노산 1,365개로 구성된 약 150kDa의 분자량을 갖는 융합단백질이다. 이로부터 번역되는 융합효소단백질은 말토올리고실트레할로스 합성가수분해효소이며, 아미노산 1,365개로 구성된 약 150kDa의 분자량을 갖는 융합효소단백질이다. 이 융합효소단백질은 말토올리고실트레할로스 합성 및 가수분해 반응을 동시에 할 수 있는 융합효소단백질이다. 이 융합유전자를 발현벡터에 재조합한 후, 대장균에서 과다발현하고 재조합 융합효소단백질을 순수 분리하여 이들이 말토올리고당 및 전분으로부터 트레할로스를 생산하는 효소로 작용함을 실험실적 조건에서 확인하였다. 본 발명에서 제조한 융합유전자 및 그로부터 번역되어 생성되는 융합효소단백질은 자연에 존재하지 않는 새로운 것이고, 기존에 보고된 두가지 효소를 이용하여 트레할로스를 생합성하는 효소와는 다른, 두가지 반응을 동시에 할 수 있는 하나의 새로운 융합효소단백질이다.

서열목록

<110> CHOI, Yang-Do, KIM, Chung-Ho

<120> Novel trehalose synthase fusion gene and fusion protein

and process for preparation of trehalose therefrom

<210> 1

<211> 4098

<212> DNA

<213> Brevibacterium helvolum

<400> 1

1

atg aag act ccg gtc tcc act yac cgc ttt caa atc cgc acc agc ttc acc ctg ttc gac 60

gcc gct gaa cag gtc ccg tat ttg aag gac ctc cgc gtc cac tgg gtg ttc ctc tcg ccc 120

atc ctc acc gcg gaa aaa ggt tcg gaa cac ggt tac aac tca acc gat ccc tcc cccgtg 180

gac ccc gac cgt ggc ggg ccg aag gcc ctg cag gct ttg tcc aag gtg gcc cgc aaa cac 240

gga atg ggc gtc ctg ctg gac atc gtg acc aac cac gtc ggt gtg gcc act ccc gtg cag 300

aat ccc tgg tgg tgg tcc ctg ctc aag gag ggc cgc aaa tcg ccc tac gcg gaa gcg ttc 360

gac gtc gac tgg gac ctg ggc ggc gga aag gtc cgg ctg ccc atg ctg ggc tcg gac aac 420

aac ctg gac aac ctg gag gtc aag gac ggc aaa ctc cgc tac tac aac cac cgg tcg ttc 480

cgg ttg ggg aag gag aac agg gaa ggc gat tcc ctg cag gag gtg cac acc cgc cag cac 540

tac cag ctg atg gac tgg cgc cgc gcg gac gcc gag ctg aat tac gct cgt ttt ttg gcg 600

gtg acc acg ctg gcc ggc atc cgg gtg gag gaa ccg tct gtc ttc gag aag gtt cat gcc 660

gag gtg ggc cgg tgg ttc acc gag ggc ctg gtg gac ggg ttc cgc gtg gac cac ccg gac 720

gga ttc gcc gat ccc gac cgg tac ttc cgg tgg ttc aag gac gtc agc ggg ggc gcatac 780

gtc ctg gtg gag aaa atc ctg gag ccg ggc gaa gtg ctg ccg cag gac ttc gcc tgc gaa 840

ggc acc acc gga tac gac gca ctg gct gac gtg gac cgg gtc ttc gtt gac ccg gcg ggg 900

cag cag gcg ctg gac gca ctg gat gct tcc ctg cgg ggc acc tcc gaa ccc gcc gac tac 960

gcc gaa atg atc cgc ggc acc aag cgc atg atc gcc gac ggc atc ctg cgc tcc gag gtg 1020

ctg cgg ctg gcc cgg ctg gta cct gaa tcc cac ggt ttc agc gtt gac cag gca gcg gat 1080

cgc atc gcg gaa atc atc gca tcg ttc ccg gtg atc cgg tcc tac ctg ccg gtg ggc gcc 1140

gac gtc ctc aag gag gcg tgc gag tcc gcc gcc gcg cac cgg ccg gac ctg gag gtg gcg 1200

gtg gga acc ctc cag ccg ctg ctg ctg gat ccc gcc aaa ccc atc gcc atc cgg ttc cag 1260

cag acc tcc ggc atg gtc atg gcc aag ggc gtg gag gac acc gcg ttc tac cgc tac acc 1320

cgg ctg gac acg ctg acc gaa gtg ggc gct gag cct acc gag ttc gcg gtg tct ccgcag 1380

gag ttc cac cag cgg atg gag cgc cgt cag cag gag ctg ccg ctg tcc atg acc acg ttg 1440

tcc acc cac gac acc aag cgc agc gag gat gcc agg gcc cgg atc tcg gtc atc gct gaa 1500

ctg ccg gag gag tgg gcg gaa agg ctg gcg gaa ctg cgt aaa ctg gcg ccg atc ccg gac 1560

ggc ccg ttc gag aac ctg ctg tgg cag gca atc gtc ggc gcc tgg ccg gca agc cgg gaa 1620

cgg ctt cag ggt tac gcc gaa aag gca gcc cgg gag gcc ggc aac tcc acc aag tgg acc 1680

gac ccc aac gac acc ttc gag tcc aag gtg cag gcc gcc gtc gat gca gtc ttc gac gac 1740

gcc aag gtc gcc aag gtt ctc acg gac ttc gtg gcc cgg atc gct gcg ttt tcc gcg gcc 1800

aac tcg gtt tcc gcc aag ctg gtc cag ctg acc atg ccc ggc gtg cct gat gtg tac cag 1860

ggc agc gaa ctc tgg gaa cgc tcg ctc acg gaa ccg gac aac cgc cgc ccc ctg gac ttc 1920

ggt gcc cgg cag gaa gca ctg gca aag ctc caa ccc cgg tgc ctt gcc cga acg cgggca 1980

cag aag cgc acc aag ctt ctg gtc acc tcg cgg gca ctg cgc ctg cgc cgg gac cgg ccg 2040

gag ctg ttc cag ggg tac tcg ccg gtg aac gcc agc ggt gcc gcg gcg gac cac ctg ctc 2100

gcg ttc agc cgc gga aca gac gct gac tcc ggt gcc ctt acg ctg gcg acc cgg ctc ccc 2160

gcc gga ctg cag gcc ggc ggc ggc tgg cgg gac acc gcc gtc gac ctt ccc act gcc atg 2220

cgc gac gaa ctc acc ggg gcc agc tac gga ccc ggc cag gtt tcg gtc gcg gag gtg ctg 2280

ggt acc tac ccg gtg gcc ctg ctg gca cct gtg gat gga gaa aag gca atg acc ttg gtc 2340

aac gtt gga ccc gaa cgc ttt gat gtg tgg gcg ccg gat gtt tcg tcc gtg gtg ttg gtg 2400

gct gac ggc cgg cag tac ccc atg caa aaa aag gaa acg gcg ccc ggc tct gaa gga tgg 2460

tgg acg gcg tcc gac gcc ccc ccg aac ggt gat gtg gac tac ggc tac ctg ctg gac ggc 2520

aac acc acc cct gtc ccg gaa ccc cgc tcc cgc cgg ctc ccc gcc ggg gtc cac aatcat 2580

tcc cgg acc tac aat ccc ccc ccc tac cgt tgg cag gat tcc cgg tgg cgc ggc aag gaa 2640

ctg cag gga acc ctc atc tac caa ctc cat gtg ggc acc tcc acg ccc gat ggg acc ttg 2700

gac gcc gca ggg gag aag ctc agc tac ctg gtg gac ctg ggc atc gac ttc atc gaa ctg 2760

ctg ccg gtc aac ggc ttg aac gga acc cac aac tgg ggc tac gac ggc gtc cag tgg tac 2820

acc gtc cac gaa ggc tat ggc ggc cct gct gcg tac cag cgg ttc gtc gac gcc gcc cac 2880

gcc gca gga ctg ggc gtc atc cag gac gtg gtg tac aac cac ctg gga ctt agg ggc aac 2940

tac ttc cca aag ttg ggc ccg aac ctg aaa cag ggc gac gcc aac acc ttg ggt gat tcg 3000

gtg aac ttg gac ggg gcc ggt tcg gat gtg ttg cgg gaa tac atc ctg gac aac gcc gcc 3060

ctg tgg gtg ggg gac tac cac gtg gac ggg gtg gga ttc gat gcc gtg cac gcg gtg cgg 3120

gac gag agg gcc gtg cac atc ttg gag gac ctg gga gcc ttg ggc gac gct att tcgggt 3180

gag acc ggg ctg ccc aag acc ctc atc gcg gaa tcg gac ttc aac aac ccg cgc ctg atc 3240

tac ccc cgc gac gtg aac ggg tac ggt ctg gcg ggg cag tgg agt gac gac ttc cac acc 3300

cgc gtg cac gtc agc gtc agc ggc gaa acc acc ggt tac tac tcg gac ttc gaa tcc ctt 3360

gcc gtg ctg gcc aag gtg ctc aag gac ggg ttc ctg cac gac ggc agc tac tcc tgc ttc 3420

cgc gga cgg cac cac ggc cgg ccc atc aac cca tcg ttg gcc aac ccg gcg gcg ctg gtg 3480

gtc tgc aac cag aac cat gac cag atc ggc aac cgg gcc acg ggg gac agg ctg tcg cag 3540

tcg ctg tcc tac ggg cag ctg gct gtg gcg gcg gtg ctt acg ctg acc tcg ccg ttc acg 3600

ccc atg ctg ttc atg ggt gag gaa tac ggc gct tcc acg ccc tgg cag ttt ttc acc tcg 3660

cac ccc gaa ccg gag ctt ggt aag gcc acc gcg gaa ggc cgc atc aaa gaa ttc gag cgc 3720

atg ggg tgg gat ccc gcc gtc gtg cct gac ccg cag gac ccg gaa acc ttc aac cgctcc 3780

aag ctg gac tgg tcc gag gcc tcc acg ggt gac cat gcg cgg ctg ctg gag ctg tac aag 3840

tcg ctg acg gcg ctg cgc cgc gag cat ccg gac ctg gca gat ctc ggc ttt ggc cag acg 3900

gag gtt tcg ttc gac gac gac gcc ggc tgg ctg cgc ttc agg ccg gtc tcc gtg gag gtg 3960

ctc gtg aac ctg tca gac gcc aag gta cgg ctg gat gat gcg gca ggt gac ctc ctt ctg 4020

gcc acg gac gaa ggg aac cct ctg gac ggc ggg tcc ctc gcc ctg gtg ccg tgg agt gcc 4080

gcg gtc ctc aag tcc tga 4098

<210> 2

<211> 1365

<212> PRT

<213> Brevibacterium helvolum

<400> 2

Met Lys Thr Pro Val Ser Thr Tyr Arg Phe Gln Ile Arg Thr Ser Phe

1 5 10 15

Thr Leu Phe Asp Ala Ala Glu Gln Val Pro Tyr Leu Lys Asp Leu Arg

20 25 30

Val His Trp Val Phe Leu Ser Pro Ile Leu Thr Ala Glu Lys Gly Ser

35 40 45

Glu His Gly Tyr Asn Ser Thr Asp Pro Ser Pro Val Asp Pro Asp Arg

50 55 60

Gly Gly Pro Lys Ala Leu Gln Ala Leu Ser Lys Val Ala Arg Lys His

65 70 75 80

Gly Met Gly Val Leu Leu Asp Ile Val Thr Asn His Val Gly Val Ala

85 90 95

Thr Pro Val Gln Asn Pro Trp Trp Trp Ser Leu Leu Lys Glu Gly Arg

100 105 110

Lys Ser Pro Tyr Ala Glu Ala Phe Asp Val Asp Trp Asp Leu Gly Gly

115 120 125

Gly Lys Val Arg Leu Pro Met Leu Gly Ser Asp Asn Asn Leu Asp Asn

130 135 140

Leu Glu Val Lys Asp Gly Lys Leu Arg Tyr Tyr Asn His Arg Ser Phe

145 150 155 160

Arg Leu Gly Lys Glu Asn Arg Glu Gly Asp Ser Leu Gln Glu Val His

165 170 175

Thr Arg Gln His Tyr Gln Leu Met Asp Trp Arg Arg Ala Asp Ala Glu

180 185 190

Leu Asn Tyr Arg Arg Phe Leu Ala Val Thr Thr Leu Ala Gly Ile Arg

195 200 205

Val Glu Glu Pro Ser Val Phe Glu Lys Val His Ala Glu Val Gly Arg

210 215 220

Trp Phe Thr Glu Gly Leu Val Asp Gly Phe Arg Val Asp His Pro Asp

225 230 235 240

Gly Phe Ala Asp Pro Asp Arg Tyr Phe Arg Trp Phe Lys Asp Val Ser

245 250 255

Gly Gly Ala Tyr Val Leu Val Glu Lys Ile Leu Glu Pro Gly Glu Val

260 265 270

Leu Pro Gln Asp Phe Ala Cys Glu Gly Thr Thr Gly Tyr Asp Ala Leu

275 280 285

Ala Asp Val Asp Arg Val Phe Val Asp Pro Ala Gly Gln Gln Ala Leu

290 295 300

Asp Ala Leu Asp Ala Ser Leu Arg Gly Thr Ser Glu Pro Ala Asp Tyr

305 310 315 320

Ala Glu Met Ile Arg Gly Thr Lys Arg Met Ile Ala Asp Gly Ile Leu

325 330 335

Arg Ser Glu Val Leu Arg Leu Ala Arg Leu Val Pro Glu Ser His Gly

340 345 350

Phe Ser Val Asp Gln Ala Ala Asp Ala Ile Ala Glu Ile Ile Ala Ser

355 360 365

Phe Pro Val Tyr Arg Ser Tyr Leu Pro Val Gly Ala Asp Val Leu Lys

370 375 380

Glu Ala Cys Glu Ser Ala Ala Ala His Arg Pro Asp Leu Glu Val Ala

385 390 395 400

Val Gly Thr Leu Gln Pro Leu Leu Leu Asp Pro Ala Lys Pro Ile Ala

405 410 415

Ile Arg Phe Gln Gln Thr Ser Gly Met Val Met Ala Lys Gly Val Glu

420 425 430

Asp Thr Ala Phe Tyr Arg Tyr Thr Arg Leu Asp Thr Leu Thr Glu Val

435 440 445

Gly Ala Glu Pro Thr Glu Phe Ala Val Ser Pro Gln Glu Phe His Gln

450 455 460

Arg Met Glu Arg Arg Gln Gln Glu Leu Pro Leu Ser Met Thr Thr Leu

465 470 475 480

Ser Thr His Asp Thr Lys Arg Ser Glu Asp Ala Arg Ala Arg Ile Ser

485 490 495

Val Ile Ala Glu Leu Pro Glu Glu Trp Ala Glu Thr Leu Ala Glu Leu

500 505 510

Arg Lys Leu Ala Pro Ile Pro Asp Gly Pro Phe Glu Asn Leu Leu Trp

515 520 525

Gln Ala Ile Val Gly Ala Trp Pro Ala Ser Arg Glu Arg Leu Gln Gly

530 535 540

Tyr Ala Glu Lys Ala Ala Arg Glu Ala Gly Asn Ser Thr Lys Trp Thr

545 550 555 560

Asp Pro Asn Glu Asp Phe Glu Ser Lys Val Gln Ala Ala Val Asp Ala

565 570 575

Val Phe Asp Asp Ala Lys Val Ala Lys Val Leu Thr Asp Phe Val Ala

580 585 590

Arg Ile Ala Ala Phe Ser Ala Ala Asn Ser Val Ser Ala Lys Leu Val

595 600 605

Gln Leu Thr Met Pro Gly Val Pro Asp Val Tyr Gln Gly Ser Glu Leu

610 615 620

Trp Glu Arg Ser Leu Thr Glu Pro Asp Asn Arg Arg Pro Leu Asp Phe

625 630 635 640

Gly Ala Arg Gln Glu Ala Leu Ala Lys Leu Gln Pro Arg Cys Leu Ala

645 650 655

Arg Thr Arg Ala Gln Lys Arg Thr Lys Leu Leu Val Thr Ser Arg Ala

660 665 670

Leu Arg Leu Arg Arg Asp Arg Pro Glu Leu Phe Gln Gly Tyr Ser Pro

675 680 685

Val Asn Ala Ser Gly Ala Ala Ala Asp His Leu Leu Ala Phe Ser Arg

690 695 700

Gly Thr Asp Ala Asp Ser Gly Ala Leu Thr Leu Ala Thr Arg Leu Pro

705 710 715 720

Ala Gly Leu Gln Ala Gly Gly Gly Trp Arg Asp Thr Ala Val Asp Leu

725 730 735

Pro Thr Ala Met Arg Asp Glu Leu Thr Gly Ala Ser Tyr Gly Pro Gly

740 745 750

Gln Val Ser Val Ala Glu Val Leu Gly Thr Tyr Pro Val Ala Leu Leu

755 760 765

Ala Pro Val Asp Gly Glu Lys Ala Met Thr Leu Val Asn Val Gly Pro

770 775 780

Glu Arg Phe Asp Val Trp Ala Pro Asp Val Ser Ser Val Val Leu Val

785 790 795 800

Ala Asp Gly Arg Gln Tyr Pro Met Gln Lys Lys Glu Thr Ala Pro Gly

805 810 815

Ser Glu Gly Trp Trp Thr Ala Ser Asp Ala Pro Pro Asn Gly Asp Val

820 825 830

Asp Tyr Gly Tyr Leu Leu Asp Gly Asn Thr Thr Pro Val Pro Glu Pro

835 840 845

Arg Ser Arg Arg Leu Pro Ala Gly Val His Asn His Ser Arg Thr Tyr

850 855 860

Asn Pro Pro Pro Tyr Arg Trp Gln Asp Ser Arg Trp Arg Gly Lys Glu

865 870 875 880

Leu Gln Gly Thr Leu Ile Tyr Gln Leu His Val Gly Thr Ser Thr Pro

885 890 895

Asp Gly Thr Leu Asp Ala Ala Gly Glu Lys Leu Ser Tyr Leu Val Asp

900 905 910

Leu Gly Ile Asp Phe Ile Glu Leu Leu Pro Val Asn Gly Phe Asn Gly

915 920 925

Thr His Asn Trp Gly Tyr Asp Gly Val Gln Trp Tyr Thr Val His Glu

930 935 940

Gly Tyr Gly Gly Pro Ala Ala Tyr Gln Arg Phe Val Asp Ala Ala His

945 950 955 960

Ala Ala Gly Leu Gly Val Ile Gln Asp Val Val Tyr Asn His Leu Gly

965 970 975

Leu Arg Gly Asn Tyr Phe Pro Lys Leu Gly Pro Asn Leu Lys Gln Gly

980 985 990

Asp Ala Asn Thr Leu Gly Asp Ser Val Asn Leu Asp Gly Ala Gly Ser

995 1000 1005

Asp Val Phe Arg Glu Tyr Ile Leu Asp Asn Ala Ala Leu Trp Val Gly

1010 1015 1020

Asp Tyr His Val Asp Gly Val Gly Phe Asp Ala Val His Ala Val Arg

1025 1030 1035 1040

Asp Glu Arg Ala Val His Ile Leu Glu Asp Leu Gly Ala Leu Gly Asp

1045 1050 1055

Ala Ile Ser Gly Glu Thr Gly Leu Pro Lys Thr Leu Ile Ala Glu Ser

1060 1065 1070

Asp Phe Asn Asn Pro Arg Leu Ile Tyr Pro Arg Asp Val Asn Gly Tyr

1075 1080 1085

Gly Leu Ala Gly Gln Trp Ser Asp Asp Phe His Thr Ala Val His Val

1090 1085 1100

Ser Val Ser Gly Glu Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Asp Phe Glu Ser Leu

1105 1110 1115 1120

Ala Val Leu Ala Lys Val Leu Lys Asp Gly Phe Leu His Asp Gly Ser

1125 1130 1135

Tyr Ser Ser Phe Arg Gly Arg His His Gly Arg Pro Ile Asn Pro Ser

1140 1145 1150

Leu Ala Asn Pro Ala Ala Leu Val Val Cys Asn Gln Asn His Asp Gln

1155 1160 1165

Ile Gly Asn Arg Ala Thr Gly Asp Arg Leu Ser Gln Ser Leu Ser Tyr

1170 1175 1180

Gly Gln Leu Ala Val Ala Ala Val Leu Thr Leu Thr Ser Pro Phe Thr

1185 1190 1195 1200

Pro Met Leu Phe Met Gly Glu Glu Tyr Gly Ala Ser Thr Pro Trp Gln

1205 1210 1215

Phe Phe Thr Ser His Pro Glu Pro Glu Leu Gly Lys Ala Thr Ala Glu

1220 1225 1230

Gly Arg Ile Lys Glu Phe Glu Arg Met Gly Trp Asp Pro Ala Val Val

1235 1240 1245

Pro Asp Pro Gln Asp Pro Glu Thr Phe Asn Arg Ser Lys Leu Asp Trp

1250 1255 1260

Ser Glu Ala Ser Thr Gly Asp His Ala Arg Leu Leu Glu Leu Tyr Lys

1265 1270 1275 1280

Ser Leu Thr Ala Leu Arg Arg Glu His Pro Asp Leu Ala Asp Leu Gly

1285 1290 1295

Phe Gly Gln Thr Glu Val Ser Phe Asp Asp Asp Ala Gly Trp Leu Arg

1300 1305 1310

Phe Arg Pro Val Ser Val Glu Val Leu Val Asn Leu Ser Asp Ala Lys

1315 1320 1325

Val Arg Leu Asp Asp Ala Ala Gly Asp Leu Leu Leu Ala Thr Asp Glu

1330 1335 1340

Gly Asn Pro Leu Asp Gly Gly Ser Leu Ala Leu Val Pro Trp Ser Ala

1345 1350 1355 1360

Ala Val Leu Lys Ser

1365

000

Claims (5)

1. 브레비박테리움 (Brevibacterium helvolum) 으로부터 분리된 BvMTSase 유전자와 BvMTHase 유전자를 융합하여 제조한 하기와 같은 염기서열을 가지는 트레할로스 생합성효소 융합구조유전자 :
2. 제 1항의 융합유전자의 구조유전자로부터 번역되는 하기와 같은 아미노산서열을 가지는 말토올리고실트레할로스 합성가수분해효소(BvMTSHase) 단백질 :
3. 제 1항의 융합유전자를 이용하여 제 2항의 융합효소단백질을 대량 생산하는 방법
4. 제 3항에서 생산한 융합효소단백질을 이용하여 전분에서 트레할로스를 생산하는 것을 특징으로하는 방법
5. 제 4항의 방법 중 전분에 알파-아밀라제를 처리하여 트레할로스 생산효율을 높이는 것을 특징으로 하는 방법