CN1657098A - 蚓激酶干粉的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蚓激酶干粉的制备方法，该方法包括如下步骤：将活蚯蚓用水清洗后，置于糖或氯化钠中，在室温下静置，剌激蚯蚓将其消化道内的分泌物吐尽；然后加入蚯蚓体积的1～8倍的水，进行细胞破碎，制成的匀浆经过除渣、澄清处理后，采用阴离子交换层析柱或亲和层析柱分离，收集活性峰部分的流出液，浓缩脱盐后再过滤、除菌；将得到的澄清液于－30～－40℃下冷冻；然后在真空下干燥，得到蚓激酶干粉，或是在无菌条件下将澄清液于喷雾干燥机内，经压缩空气雾化后脱水，得到蚓激酶干粉。该方法得到的蚓激酶干粉中有效组分含量高、质量易控、且易于大规模工业生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种蚓激酶干粉的制备方法。
技术背景
蚓激酶干粉是一种以活蚯蚓为原料的生物药品，其为微黄色粉末。本药品为多组分酶制剂，包含纤维蛋白溶酶(plasmin)和纤维蛋白溶酶原激活剂(plasminogenActivator)成分，具有直接溶解纤维蛋白和激活酶原间接溶解蛋白的作用。适用于治疗心、脑血管栓塞性疾病以及预防纤维蛋白原增高和血小板聚集率增高的疾病。临床试验证明，本药的胶囊剂对缺血性脑血管病、中风瘫痪肢体及语言障碍的恢复效果显著，是一种安全的纤溶药物。治疗后病人纤维蛋白原明显下降至正常水平，优球蛋白溶解时间明显缩短，全血粘度明显降低，并缓解病人血小板聚集功能的增强，对老年人患心、脑血管病具有明显的预防作用。
目前用来制备蚓激酶干粉的方法，都是以活蚯蚓为原料，大多是采用将蚯蚓除污后，在太阳下脱水，然后直接磨成粉末使用，这种方法虽然简单，但是除污过程会使得药效部分流失，而且得到的蚯蚓干粉易霉烂、变质。申请号为88106168.9的专利公开了一种生产干蚯蚓粉的方法，该方法使用水或略带酸性的水溶液来将活蚯蚓除污，然后将此活蚯蚓湿磨，冻干，然后在80℃，低于10mmHg的真空下干燥，制成干蚯蚓粉。此方法的缺陷在于用此方法制得的干蚯蚓粉有效组分含量低，杂质较多，易引起一些与冶疗目的不一致的副作用。
发明内容
本发明的目的在于克服已有技术制备的蚓激酶干粉中有效组分含量低，杂质较多的缺陷，从而提供一种可以使得产品蚓激酶干粉中有效组分含量高、质量易控、且易于大规模工业生产的蚓激酶干粉的制备方法。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：
本发明提供一种蚓激酶干粉的制备方法，包括如下步骤：
1)蚯蚓清洗：将活蚯蚓用水清洗后，按每公斤蚯蚓加入0.1～0.3公斤糖，或0.2～0.4公斤氯化钠，在室温下搅拌均匀，静置20～40分钟，刺激蚯蚓将其消化道内的分泌物吐尽，然后用30～50℃的温水将蚯蚓身上的糖或氯化钠及污物洗去；
2)制浆：加入蚯蚓体积的1～8倍的水，用珠磨、胶体磨机或高压匀浆机将经步骤1)清洗过的蚯蚓进行细胞破碎，制成匀浆；
3)除渣：将步骤2)得到的匀浆通过过滤或离心除去其中的粗渣；
4)澄清：经步骤3)除渣后的匀浆液，采用高速离心机或微孔膜过滤器处理，得到澄清液；
5)分离：采用阴离子交换层析柱或亲和层析柱分离步骤4)得到的蚯蚓澄清液，用0.01～0.8M的醋酸盐溶液、磷酸盐溶液及0.01～1.8M的氯化钠溶液洗脱，收集活性峰部分的层析流出液；
6)浓缩脱盐：将步骤5)收集的层析液过滤以除去无机盐和小分子物质，脱去大部分水，使蛋白浓度达到20g/L，且浓缩液电导率≤0.15×103μs/cm时结束脱盐，得到除盐浓缩液；
7)澄清过滤：采用孔径为0.45～2μm的深层微孔膜或折叠式膜微孔膜过滤装置，滤除步骤6)得到的除盐浓缩液中的悬浮颗粒，得到澄清液；
8)除菌：采用0.22μm的除菌滤膜过滤装置及辐照装置处理步骤7)的澄清液，除去菌体；
9)干燥：在无菌条件下将步骤8)除菌后的澄清液于-30～-40℃下冷冻8～12小时；然后在0.2mmHg的真空度下，升温至25～30℃，干燥10小时；继续升温至36～38℃，真空干燥14～15小时，得到蚓激酶干粉。
所述步骤1)的糖包括砂糖、棉白糖、冰糖。
所述步骤3)的过滤是采用滤网孔径为5～20mm的不锈钢过滤器过滤。
所述步骤5)的阴离子交换层析柱为DEAE-离子交换层析柱。
所述步骤5)的亲和层析柱为DEAE Affi Gel Blue三嗪染料亲和层析柱。
所述步骤5)的醋酸盐包括醋酸钠、醋酸钾。
所述步骤5)的磷酸盐溶液包括磷酸氢二钠、磷酸氢二钾。
所述步骤6)的过滤是采用标准截流分子量为0.5～50K的平板膜、卷式膜或中空纤维超滤装置进行的。
所述的步骤9)也可以是在无菌条件下将步骤8)除菌后的澄清液用泵打入喷雾干燥机内，经压缩空气雾化后在150～250℃热风中脱水，得到蚓激酶干粉。
本发明提供的方法与与已有技术相比，其优点在于本发明采用高速离心机及微孔膜分离技术，可以有效去除匀浆液中的悬浮颗粒物及脂类，然后通过离子交换层析和亲和层析分离技术，可以有效去除杂蛋白、核酸等杂质，因而所得蚓激酶干粉纯度高，减少了其它方法因所产蚯蚓干粉杂质含量高而引起的其它问题；而且本发明提供的方法易于工业放大。
具体实施方式
实施例1、
1)蚯蚓清洗：将10公斤活蚯蚓用水清洗后，按每公斤蚯蚓加入0.2公斤棉白糖，在室温下搅拌均匀，静置40分钟，剌激蚯蚓将其消化道内的分泌物吐尽，然后用30℃的温水将蚯蚓身上的糖及污物洗去；
2)制浆：加入蚯蚓体积的1倍的水，用高压匀浆机将经步骤1)清洗过的蚯蚓进行细胞破碎30分钟，制成匀浆；
3)除渣：将步骤2)得到的匀浆用滤网孔径为5mm的不锈钢过滤器过滤，除去匀浆中的粗渣；
4)澄清：经步骤3)除渣后的匀浆液，采用高速离心机处理2小时，得到澄清液；
5)分离：采用DEAE-离子交换层析柱分离步骤4)得到的蚯蚓澄清液，用0.01M的醋酸钠溶液洗脱，收集活性峰部分(第2个峰)的层析流出液；
6)浓缩脱盐：采用标准截流分子量为0.5K的平板膜超滤装置过滤步骤5)收集的层析液，滤除无机盐和小分子物质，脱去大部分水，使蛋白浓度达到20g/L，浓缩液电导率≤0.15×103μs/cm时结束脱盐，得到除盐浓缩液；
7)澄清过滤：采用孔径为2μm的深层微孔膜过滤装置，滤除步骤6)得到的除盐浓缩液中的悬浮颗粒，得到澄清液；
8)除菌：采用0.22μm的除菌滤膜过滤装置及辐照装置辐照8小时处理步骤7)的澄清液，除去菌体；
9)干燥：在无菌条件下将步骤8)除菌后的澄清液于-30℃下冷冻8小时；然后在0.2mmHg的真空度下，升温至25℃，干燥10小时；继续升温至36℃，真空干燥15小时，得到65g蚓激酶干粉，其含水量为7.5％、蛋白质含量为60％、酶活力为15000U/mg。
实施例2、
1)蚯蚓清洗：将10公斤活蚯蚓用水清洗后，按每公斤蚯蚓氯化钠0.3公斤的比例加入氯化钠，在室温下搅拌均匀后静置40分钟，刺激蚯蚓将其消化道内的分泌物吐尽，然后用40℃的温水将蚯蚓身上的氯化钠及污物洗去；
2)制浆：加入蚯蚓体积的8倍的水，用珠磨将经步骤1)清洗过的蚯蚓进行细胞破碎，制成匀浆；
3)除渣：将步骤2)得到的匀浆用离心机除去匀浆中的粗渣；
4)澄清：经步骤3)除渣后的匀浆液，采用高速离心机处理2小时，得到澄清液；
5)分离：采用DEAE-离子交换层析柱分离步骤4)得到的蚯蚓澄清液，用0.01M的醋酸钾溶液洗脱，收集活性峰部分(第2个峰)的层析流出液；
6)浓缩脱盐：采用标准截流分子量为50K的中空纤维膜超滤装置过滤步骤5)收集的层析液，滤除无机盐和小分子物质，脱去大部分水，使蛋白浓度达到20g/L，浓缩液电导率≤0.15×103μs/cm时结束脱盐，得到除盐浓缩液；
7)澄清过滤：采用孔径为0.45μm折叠式微孔滤膜过滤器，滤除步骤6)得到的除盐浓缩液中的悬浮颗粒，得到澄清液；
8)除菌：采用0.22μm的除菌滤膜过滤装置及辐照装置辐照8小时处理步骤7)的澄清液，除去菌体；
9)干燥：在无菌条件下将步骤8)除菌后的澄清液于-40℃下冷冻12小时；然后在0.2mmHg的真空度下，升温至30℃，干燥10小时；继续升温至38℃，真空干燥14小时，得到65g蚓激酶干粉，其含水量为7.6％、蛋白质含量为64％、酶活力为16000U/mg。
实施例3、
1)蚯蚓清洗：将10公斤活蚯蚓用水清洗后，按每公斤蚯蚓加入0.3公斤砂糖，在室温下搅拌均匀，静置20分钟，刺激蚯蚓将其消化道内的分泌物吐尽，然后用50℃的温水将蚯蚓身上的糖及污物洗去；
2)制浆：加入蚯蚓体积的6倍的水，用胶体磨机将经步骤1)清洗过的蚯蚓进行细胞破碎30分钟，制成匀浆；
3)除渣：将步骤2)得到的匀浆用滤网孔径为20mm的不锈钢过滤器过滤，除去匀浆中的粗渣；
4)澄清：经步骤3)除渣后的匀浆液，采用微孔膜过滤器处理2小时，得到澄清液；
5)分离：采用DEAE Affi Gel Blue三嗪染料亲和层析柱分离步骤4)得到的蚯蚓澄清液，用0.5M的醋酸钠溶液洗脱，收集活性峰部分(第2个峰)的层析流出液；
6)浓缩脱盐：采用标准截流分子量为20K的卷式膜超滤装置过滤步骤5)收集的层析液，滤除无机盐和小分子物质，脱去大部分水，使蛋白浓度达到20g/L，浓缩液电导率≤0.15×103μs/cm时结束脱盐，得到除盐浓缩液；
7)澄清过滤：采用孔径为1μm的深层微孔膜过滤装置，滤除步骤6)得到的除盐浓缩液中的悬浮颗粒，得到澄清液；
8)除菌：采用0.22μm的除菌滤膜过滤装置及辐照装置辐照8小时处理步骤7)的澄清液，除去菌体；
9)干燥：在无菌条件下将步骤8)除菌后的澄清液于-35℃下冷冻10小时；然后在0.2mmHg的真空度下，升温至28℃，干燥10小时；继续升温至37℃，真空干燥15小时，得到65g蚓激酶干粉，其含水量为7.3％、蛋白质含量为65％、酶活力为17000U/mg。
实施例4、
1)蚯蚓清洗：将10公斤活蚯蚓用水清洗后，按每公斤蚯蚓加入0.1公斤冰糖，在室温下搅拌均匀，静置30分钟，刺激蚯蚓将其消化道内的分泌物吐尽，然后用40℃的温水将蚯蚓身上的糖及污物洗去；
2)制浆：加入蚯蚓体积的5倍的水，用胶体磨机将经步骤1)清洗过的蚯蚓进行细胞破碎30分钟，制成匀浆；
3)除渣：将步骤2)得到的匀浆用滤网孔径为5mm的不锈钢过滤器过滤，除去匀浆中的粗渣；
4)澄清：经步骤3)除渣后的匀浆液，采用微孔膜过滤器处理2小时，得到澄清液；
5)分离：采用DEAE Affi Gel Blue三嗪染料亲和层析柱分离步骤4)得到的蚯蚓澄清液，用0.8M的磷酸氢二钠溶液溶液洗脱，收集活性峰部分(第2个峰)的层析流出液；
6)浓缩脱盐：采用标准截流分子量为20K的平板膜超滤装置过滤步骤5)收集的层析液，滤除无机盐和小分子物质，脱去大部分水，使蛋白浓度达到20g/L，浓缩液电导率≤0.15×103μs/cm时结束脱盐，得到除盐浓缩液；
7)澄清过滤：采用孔径为1μm的深层微孔膜过滤装置，滤除步骤6)得到的除盐浓缩液中的悬浮颗粒，得到澄清液；
8)除菌：采用0.22μm的除菌滤膜过滤装置及辐照装置辐照8小时处理步骤7)的澄清液，除去菌体；
9)干燥：在无菌条件下将步骤8)除菌后的澄清液用泵打入喷雾干燥机内，经压缩空气雾化后在150℃的热风中脱水，得到65g蚓激酶干粉，其含水量为7.5％、蛋白质含量为64％、酶活力为16500U/mg。
实施例5、
1)蚯蚓清洗：将10公斤活蚯蚓用水清洗后，按每公斤蚯蚓氯化钠0.4公斤的比例加入氯化钠，在室温下搅拌均匀后静置20分钟，刺激蚯蚓将其消化道内的分泌物吐尽，然后用50℃的温水将蚯蚓身上的氯化钠及污物洗去；
2)制浆：加入蚯蚓体积的4倍的水，用高压匀浆机将经步骤1)清洗过的蚯蚓进行细胞破碎，制成匀浆；
3)除渣：将步骤2)得到的匀浆用离心机除去匀浆中的粗渣；
4)澄清：经步骤3)除渣后的匀浆液，采用高速离心机处理2小时，得到澄清液；
5)分离：采用DEAE Affi Gel Blue三嗪染料亲和层析柱分离步骤4)得到的蚯蚓澄清液，用0.8M的氯化钠溶液洗脱，收集活性峰部分(第2个峰)的层析流出液；
6)浓缩脱盐：采用标准截流分子量为20K的中空纤维超滤装置过滤步骤5)收集的层析液，滤除无机盐和小分子物质，脱去大部分水，使蛋白浓度达到20g/L，浓缩液电导率≤0.15×103μs/cm时结束脱盐，得到除盐浓缩液；
7)澄清过滤：采用孔径为1.2μm的深层微孔膜过滤装置，滤除步骤6)得到的除盐浓缩液中的悬浮颗粒，得到澄清液；
8)除菌：采用0.22μm的除菌滤膜过滤装置及辐照装置辐照8小时处理步骤7)的澄清液，除去菌体；
9)干燥：在无菌条件下将步骤8)除菌后的澄清液用泵打入喷雾干燥机内，经压缩空气雾化后在250℃的热风中脱水，得到66g蚓激酶干粉，其含水量为7.1％、蛋白质含量为63％、酶活力为16500U/mg。
实施例6、
1)蚯蚓清洗：将10公斤活蚯蚓用水清洗后，按每公斤蚯蚓氯化钠0.2公斤的比例加入氯化钠，在室温下搅拌均匀后静置40分钟，刺激蚯蚓将其消化道内的分泌物吐尽，然后用30℃的温水将蚯蚓身上的氯化钠及污物洗去；
2)制浆：加入蚯蚓体积的1倍的水，用胶体磨机将经步骤1)清洗过的蚯蚓进行细胞破碎，制成匀浆；
3)除渣：将步骤2)得到的匀浆用离心机除去匀浆中的粗渣；
4)澄清：经步骤3)除渣后的匀浆液，采用高速离心机处理2小时，得到澄清液；
5)分离：采用DEAE离子交换层析柱分离步骤4)得到的蚯蚓澄清液，用0.01M的氯化钠溶液洗脱，收集活性峰部分(第2个峰)的层析流出液；
6)浓缩脱盐：采用标准截流分子量为15K的卷式膜超滤装置过滤步骤5)收集的层析液，滤除无机盐和小分子物质，脱去大部分水，使蛋白浓度达到20g/L，浓缩液电导率≤0.15×103μs/cm时结束脱盐，得到除盐浓缩液；
7)澄清过滤：采用孔径为0.8μm的折叠式膜微孔膜过滤装置，滤除步骤6)得到的除盐浓缩液中的悬浮颗粒，得到澄清液；
8)除菌：采用0.22μm的除菌滤膜过滤装置及辐照装置辐照8小时处理步骤7)的澄清液，除去菌体；
9)干燥：在无菌条件下将步骤8)除菌后的澄清液用泵打入喷雾干燥机内，经压缩空气雾化后在200℃的热风中脱水，得到62g蚓激酶干粉，其含水量为7.0％、蛋白质含量为66％、酶活力为16800U/mg。
Claims (8)
1、一种蚓激酶干粉的制备方法，包括如下步骤：
1)蚯蚓清洗：将活蚯蚓用水清洗后，按每公斤蚯蚓加入0.1～0.3公斤糖，或0.2～0.4公斤氯化钠，在室温下搅拌均匀，静置20～40分钟，然后用30～50℃的温水将蚯蚓身上的糖或氯化钠及污物洗去；
2)制浆：加入蚯蚓体积的1～8倍的水，用珠磨、胶体磨机或高压匀浆机将经步骤1)清洗过的蚯蚓进行细胞破碎，制成匀浆；
3)除渣：将步骤2)得到的匀浆通过过滤或离心除去其中的粗渣；
4)澄清：经步骤3)除渣后的匀浆液，采用高速离心机或微孔膜过滤器处理，得到澄清液；
5)分离：采用阴离子交换层析柱或亲和层析柱分离步骤4)得到的蚯蚓澄清液，用0.01～0.8M的醋酸盐溶液、磷酸盐溶液及0.01～1.8M的氯化钠溶液洗脱，收集活性峰部分的层析流出液；
6)浓缩脱盐：将步骤5)收集的层析液过滤以除去无机盐和小分子物质，脱去大部分水，使蛋白浓度达到20g/L，且浓缩液电导率≤0.15×103μs/cm时结束脱盐，得到除盐浓缩液；
7)澄清过滤：采用孔径为0.45～2μm的深层微孔膜或折叠式膜微孔膜过滤装置，滤除步骤6)得到的除盐浓缩液中的悬浮颗粒，得到澄清液；
8)除菌：采用0.22μm的除菌滤膜过滤装置及辐照装置处理步骤7)的澄清液，除去菌体；
9)干燥：在无菌条件下将步骤8)除菌后的澄清液于-30～-40℃下冷冻8～12小时；然后在0.2mmHg的真空度下，升温至25～30℃，干燥10小时；继续升温至36～38℃，真空干燥14～15小时，得到蚓激酶干粉。
2、如权利要求1所述的蚓激酶干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤1)的糖包括砂糖、棉白糖、冰糖。
3、如权利要求1所述的蚓激酶干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤3)的过滤是采用滤网孔径为5～20mm的不锈钢过滤器过滤。
4、如权利要求1所述的蚓激酶干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤5)的阴离子交换层析柱为DEAE-离子交换层析柱。
5、如权利要求1所述的蚓激酶干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤5)的亲和层析柱为DEAE Affi Gel Blue三嗪染料亲和层析柱。
6、如权利要求1所述的蚓激酶干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤5)的醋酸盐包括醋酸钠、醋酸钾，磷酸盐溶液包括磷酸氢二钠、磷酸氢二钾。
7、如权利要求1所述的蚓激酶干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤6)的过滤是采用标准截流分子量为0.5～50K的平板膜、卷式膜或中空纤维超滤装置进行的。
8、如权利要求1所述的蚓激酶干粉的制备方法，其特征在于，所述的步骤9)是在无菌条件下将步骤8)除菌后的澄清液用泵打入喷雾干燥机内，经压缩空气雾化后在150～250℃热风中脱水，得到蚓激酶干粉。
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