CN102876652A - 一种蚓激酶干粉的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蚓激酶干粉的制备方法，该方法包括如下步骤：将冷冻后的鲜蚓室温化冻，制浆，生物酶处理，离心经过滤膜澄清，超滤去除小分子杂蛋白，再经过滤膜二次澄清，调节pH值，经阴离子交换层析，得澄清液浓缩超滤，澄清过滤，冻干，得到蚓激酶干粉。本发明提供的蚓激酶干粉制备方法，具有制备方法质量可控性和稳定性高，分阶段、可控的收集目标物，提高蚓激酶的总活性收率，收率稳定，降低制备成本，减少层析介质污染，且易于大规模工业化生产等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种蚓激酶干粉的制备方法，是一种利用生物酶解技术规模化生产蚓激酶干粉的方法，属于生物制药领域。
背景技术
蚓激酶粉是一种以鲜蚯蚓为原料的生物提取药品，其为淡黄色至黄褐色粉末。本药品为一组蛋白水解酶，包含纤维蛋白溶酶和纤维蛋白溶酶原激活剂成分，使过高的纤维蛋白原和血小板凝集率降低，改善症状并防止病情发展的作用，适用于缺血性脑血管病的治疗及预防。临床试验证明，本药的胶囊剂对缺血性脑血管病、中风瘫痪肢体及语言障碍的恢复效果显著，是一种安全的口服纤溶药物。治疗后病人血浆中的纤维蛋白原浓度降低，优球蛋白溶解时间明显好转，同时全血粘度、血浆粘度降低，并且能够缓解病人的血小板聚集功能的增强。药理作用明显，副作用少，如百奥蚓激酶肠溶胶囊（国药准字H11021129）。抗血栓药物市场的集中度很高，蚓激酶在最新的抗血栓药物主要品种医院市场份额的排名中位列第五。目前国内的蚓激酶生产具有简单粗放、自动化程度低、环保压力大、蚓激酶质量标准比较低等特点。这些特点限制了蚓激酶的规模化生产，不利于蚓激酶产品质量的提高，不能很好的满足我国重大疾病防治和医药产业发展的需求。
如专利（ZL03146692.3）公开了采用包括阴离子交换层析、超滤、凝胶过滤脱盐等分离方法获得达电泳级的蛋白酶，生产成本较高，质量控制复杂。专利（ZL200410039186.8）公开了提高蚓激酶有效组分含量的方法，但是总活性不高，收率变化大。以上方法由于缺少有效的前处理方法，层析前中间体纯度低，层析载量低，介质污染严重，再生频繁，并且生产规模小，成本高，产品总活性收率低。
发明内容
本发明的目的是提供一种蚓激酶粉的制备方法，适合自动化大生产，用于生产降纤药物的原料。本发明采用生物酶解方法降低反应体系黏度，快速高效地进行固液分离，通过调节pH值选择目标蛋白，层析前除去可溶性杂质；提高层析介质的交换容量，延长其使用寿命，降低成本，扩大自动化生产规模，实现自动化的现代生物生产。
本发明的进一步目的是提供生物酶类自动化、高收率的生产线。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：
一种蚓激酶干粉的制备方法，包括如下步骤：
1)蚯蚓清洗和解冻：将鲜蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后贮存在冷库中备用；将冻蚓室温放置自然化冻；
2)制浆：加入蚯蚓体积的0.5～2倍的水，将经步骤1)化冻后的蚯蚓粉碎，制成匀浆；
3)生物酶处理：将步骤2)得到的匀浆在30～40℃，优选35～40℃保温，同时加入中性蛋白酶，按蚯蚓重量的0.1%～0.3%加入匀浆液中，保温静置2～6小时，优选保温静置2～4小时；
4)离心：将步骤3)的匀浆液定量的加水稀释，最终定容体积至2～3.5倍，通过蝶片式离心机除去其中的粗渣；
5)澄清：经步骤4)除渣后的的离心液，输入到膜过滤系统内，加水洗涤，得到一次澄清液；
6)超滤：步骤5)得到的澄清液采用中空纤维柱超滤，得到超滤液；
7)澄清：经步骤6)超滤后的溶液经泵再次打入膜过滤系统，加水洗涤，加水1～2次，得到二次澄清液；
8)调节PH：配制0.5～1M的氢氧化钠溶液，调整步骤7)得到的澄清液至pH6.5～8.5，用PH计监测；
9)层析分离：采用阴离子交换层析柱分离步骤8)调整PH值后的澄清液，用0.3～0.9M的磷酸盐溶液梯度洗脱，洗脱液颜色变成酒红色时开始收集，洗脱至料液变清澈，颜色呈柠檬黄色或桔黄色为止；
10)超滤浓缩：将步骤9)得到的洗脱液经中空纤维柱或自动化层析超滤系统超滤，除盐脱水，且溶液电导率≦0.2×103μs/cm合格；
11)澄清过滤：采用纸浆板板框过滤装置，滤除步骤10)得到的浓缩液中的悬浮物质，得到澄清液；
12)冻干：在洁净区将步骤11)的澄清液于－30～－40℃下冷冻10小时,继续升温至40～45℃干燥得到蚓激酶干粉。
其中，所述步骤2)至步骤8)是完整的预处理过程。
在一个优选的实施方式中，所述步骤3)中的中性蛋白酶，为，但不限于，选自菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、沙雷肽酶和端肽酶中的一种或者多种。更优选，所述中性蛋白酶为沙雷肽酶和端肽酶中的一种或多种。
在一个优选的实施方式中，所述步骤3)采用的生物酶是中性蛋白酶，按蚯蚓重量的0.1%～0.3%加入，生物酶处理温度30～40℃，保温静置2.0～6.0小时。
在一个优选的实施方式中，所述步骤5)中的膜过滤系统操作条件为：操作压力为0.12MPa、洗脱液流速小于1.6M3/hr。
在一个优选的实施方式中，所述步骤6)超滤是采用标准截流分子量为5K～10K，优选8K的立式膜中空纤维柱进行的。
在一个优选的实施方式中，所述步骤8)调整pH6.5～8.5预取代磷酸盐洗脱来获取目标蛋白。
在一个优选的实施方式中，所述步骤12)是将步骤11)的澄清液用冷冻干燥法得到蚓激酶干粉。
在一个优选的实施方式中，所述步骤8)调节澄清液至pH7.0～8.5。
本发明提供的方法与已有的技术相比，通过有效的前处理，提高了中间体的纯度收率，直接提高层析介质的工作能力，扩大了生产规模。同时，在生产规模扩大的情况下，保证了生产周期没有明显变化。其优点在于本发明采用生物酶解及调节pH值的技术，可以有效的降低匀浆液的粘度，同时获得目标蛋白物，通过反复超滤除去悬浮颗粒物及小分子蛋白、核酸等杂质，不同阶段的收集目标蛋白，获得总活性较高、纯度较高的蚓激酶干粉，减少了其它方法生产的蚓激酶粉引起的环保处理、在线监控存在死角等问题；而且本发明提供放大生产可能性。
附图说明
图1.蚓激酶现有生产工艺路线流程图
图2.改进后的本发明的生产工艺路线流程图
具体实施方式
原料和来源
本申请所用菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、沙雷肽酶和端肽酶购自安琪酵母股份有限公司。
实施例1
1)蚯蚓清洗和解冻：将鲜蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后贮存在冷库中备用；将800kg冻蚓室温放置自然化冻；
2)制浆：加入蚯蚓体积的1.0倍的水于匀浆罐内，倒入完全解冻的蚯蚓，用匀浆机将蚯蚓粉碎，匀浆2.0小时，形成匀浆液；
3)生物酶处理：于步骤2)的匀浆液中，按蚯蚓重量的0.1%的量加入沙雷肽酶，控制在35℃，保温静置6小时；
4)离心：将步骤3)的匀浆液定量的加水稀释，最终定容体积至2.5吨，通过蝶片式离心机除去其中的粗渣；
5)澄清：经步骤4)除渣后的的离心液，输入到膜过滤系统内，加水洗涤，每次加水500L洗涤，加水3次，得到一次澄清液；
6)超滤：采用中空纤维柱超滤处理步骤5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3次，超滤2次，得到超滤液；其中超滤是采用标准截流分子量为8K的立式膜中空纤维柱进行的；
7)澄清：步骤6)得到的超滤液经泵再次打入膜过滤系统，每次加水300L，分2次加水洗涤过滤，得到二次澄清液；
8)调整pH值：采用pH计监测，用0.5M的氢氧化钠溶液13L调节步骤7）的澄清液的pH至7.0；
9)层析分离：采用阴离子交换层析柱分离步骤8)调整PH值后的澄清液，用0.3～0.9M的磷酸盐溶液梯度洗脱，洗脱液颜色变成酒红色时开始收集，洗脱至料液变清澈，颜色呈柠檬黄色或桔黄色为止；
10)超滤浓缩：将步骤9)得到的洗脱液经中空纤维柱或自动化层析超滤系统超滤，除盐脱水、小分子物质，且溶液电导率≦0.2×103μs/cm合格，得到浓缩液；
11)澄清过滤：采用纸浆板板框过滤装置，滤除步骤10)得到的浓缩液中的悬浮物质，得到三次澄清液；
12)冻干：在洁净区将步骤11)的澄清液于－38℃下冷冻10小时，继续升温至42℃干燥得到4.8Kg蚓激酶冻干粉，收率6.0Kg/T，其含水量为5.6%，酶活力21000IU/mg。
实施例2
1)蚯蚓清洗和解冻：将鲜蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后贮存在冷库中备用；将800kg冻蚓室温放置自然化冻；
2)制浆：加入蚯蚓体积的1.0倍的水于匀浆罐内，倒入完全解冻的蚯蚓，用匀浆机将蚯蚓粉碎，匀浆2.0小时，形成匀浆液；
3)生物酶处理：于步骤2)的匀浆液中，按蚯蚓重量的0.1%的量加入菠萝蛋白酶，控制在35℃，保温静置6小时；
4)离心：将步骤3)的匀浆液定量的加水稀释，最终定容体积至2.5吨，通过蝶片式离心机除去其中的粗渣；
5)澄清：经步骤4)除渣后的的离心液，输入到膜过滤系统内，加水洗涤，每次加水500L洗涤，加水3次，得到一次澄清液；
6)超滤：采用中空纤维柱超滤处理步骤5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3次，超滤2次，得到超滤液；其中超滤采用与实施例1相同的立式膜中空纤维柱进行；
7)澄清：步骤6)得到的超滤液经泵再次打入膜过滤系统，每次加水300L，分2次加水洗涤过滤，得到二次澄清液；
8)调整pH值：采用pH计监测，用0.5M的氢氧化钠溶液13L调节步骤7）的澄清液的pH至7.0；
9)层析分离：采用阴离子交换层析柱分离步骤8)调整PH值后的澄清液，用0.3～0.9M的磷酸盐溶液梯度洗脱，洗脱液颜色变成酒红色时开始收集，洗脱至料液变清澈，颜色呈柠檬黄色或桔黄为止；
10)超滤浓缩：将步骤9)得到的洗脱液经中空纤维柱或自动化层析超滤系统超滤，除盐脱水、小分子物质，且溶液电导率合格，得到浓缩液；
11)澄清过滤：采用纸浆板板框过滤装置，滤除10)得到的浓缩液中的悬浮物质，得到三次澄清液；
12)冻干：在洁净区将步骤11)的澄清液于－38℃下冷冻10小时，继续升温至42℃干燥得到4.8Kg蚓激酶冻干粉，收率6.0Kg/T，其含水量为5.5%，酶活力15200IU/mg。
实施例3
1)蚯蚓清洗和解冻：将鲜蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后贮存在冷库中备用；将800kg冻蚓室温放置自然化冻；
2)制浆：加入蚯蚓体积的1.0倍的水于匀浆罐内，倒入完全解冻的蚯蚓，用匀浆机将蚯蚓粉碎，匀浆2.0小时，形成匀浆液；
3)生物酶处理：于步骤2)的匀浆液中，按蚯蚓重量的0.1%的量加入木瓜蛋白酶，控制在35℃，保温静置6小时；
4)离心：将步骤3)的匀浆液定量的加水稀释，最终定容体积至2.5吨，通过蝶片式离心机除去其中的粗渣；
5)澄清：经步骤4)除渣后的的离心液，输入到膜过滤系统内，加水洗涤，每次加水500L洗涤，加水3次，得到一次澄清液；
6)超滤：采用中空纤维柱超滤处理步骤5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3次，超滤2次，得到超滤液；其中超滤采用与实施例1相同的立式膜中空纤维柱进行；
7)澄清：步骤6)得到的超滤液经泵再次打入膜过滤系统，每次加水300L，分2次加水洗涤过滤，得到二次澄清液；
8)调整pH值：采用pH计监测，用0.5M的氢氧化钠溶液13L调节步骤7）的澄清液的pH至7.0；
9)层析分离：采用阴离子交换层析柱分离步骤8)调整PH值后的澄清液，用0.3～0.9M的磷酸盐溶液梯度洗脱，洗脱液颜色变成酒红色时开始收集，洗脱至料液变清澈，颜色呈柠檬黄色或桔黄为止；
10)超滤浓缩：将步骤9)得到的洗脱液经中空纤维柱或自动化层析超滤系统超滤，除盐脱水、小分子物质，且溶液电导率合格，得到浓缩液；
11)澄清过滤：采用纸浆板板框过滤装置，滤除10)得到的浓缩液中的悬浮物质，得到三次澄清液；
12)冻干：在洁净区将步骤11)的澄清液于－38℃下冷冻10小时，继续升温至42℃干燥得到4.8Kg蚓激酶冻干粉，收率6.0Kg/T，其含水量为5.6%，酶活力15000IU/mg。
实施例4
1)蚯蚓清洗和解冻：将鲜蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后贮存在冷库中备用；将800kg冻蚓室温放置自然化冻；
2)制浆：加入蚯蚓体积的1.0倍的水于匀浆罐内，倒入完全解冻的蚯蚓，用匀浆机将蚯蚓粉碎，匀浆2.0小时，形成匀浆液；
3)生物酶处理：于步骤2)的匀浆液中，按蚯蚓重量的0.1%的量加入端肽酶，控制在35℃，保温静置6小时；
4)离心：将步骤3)的匀浆液定量的加水稀释，最终定容体积至2.5吨，通过蝶片式离心机除去其中的粗渣；
5)澄清：经步骤4)除渣后的的离心液，输入到膜过滤系统内，加水洗涤，每次加水500L洗涤，加水3次，得到一次澄清液；
6)超滤：采用中空纤维柱超滤处理步骤5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3次，超滤2次，得到超滤液；其中超滤采用与实施例1相同的立式膜中空纤维柱进行；
7)澄清：步骤6)得到的超滤液经泵再次打入膜过滤系统，每次加水300L，分2次加水洗涤过滤，得到二次澄清液；
8)调整pH值：采用pH计监测，用0.5M的氢氧化钠溶液13L调节步骤7）的澄清液的pH至7.0；
9)层析分离：采用阴离子交换层析柱分离步骤8)调整PH值后的澄清液，用0.3～0.9M的磷酸盐溶液梯度洗脱，洗脱液颜色变成酒红色时开始收集，洗脱至料液变清澈，颜色呈柠檬黄色或桔黄为止；
10)超滤浓缩：将步骤9)得到的洗脱液经中空纤维柱或自动化层析超滤系统超滤，除盐脱水、小分子物质，且溶液电导率合格，得到浓缩液；
11)澄清过滤：采用纸浆板板框过滤装置，滤除10)得到的浓缩液中的悬浮物质，得到三次澄清液；
12)冻干：在洁净区将步骤11)的澄清液于－38℃下冷冻10小时，继续升温至42℃干燥得到4.8Kg蚓激酶冻干粉，收率6.0Kg/T，其含水量为5.6%，酶活力20000IU/mg。
实施例5
1)蚯蚓清洗和解冻：将鲜蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后贮存在冷库中备用；将800kg冻蚓室温放置自然化冻；
2)制浆：加入蚯蚓体积的1.0倍的水于匀浆罐内，倒入完全解冻的蚯蚓，用匀浆机将蚯蚓粉碎，匀浆2.0小时，形成匀浆液；
3)生物酶处理：于步骤2)的匀浆液中，按蚯蚓重量的0.3%的量加入端肽酶，控制在40℃，保温静置3小时；
4)离心：将步骤3)的匀浆液定量的加水稀释，最终定容体积至2.5吨，通过蝶片式离心机除去其中的粗渣；
5)澄清：经步骤4)除渣后的的离心液，输入到膜过滤系统内，加水洗涤，每次加水500L洗涤，加水3次，得到一次澄清液；
6)超滤：采用中空纤维柱超滤处理步骤5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3次，超滤2次，得到超滤液；其中超滤采用与实施例1相同的立式膜中空纤维柱进行；
7)澄清：步骤6)得到的超滤液经泵再次打入膜过滤系统，每次加水300L，分2次加水洗涤过滤，得到二次澄清液；
8)调整pH值：采用pH计监测，用0.5M的氢氧化钠溶液13L调节步骤7）的澄清液的pH至8.5；
9)层析分离：采用阴离子交换层析柱分离步骤8)调整PH值后的澄清液，用0.3～0.9M的磷酸盐溶液梯度洗脱，洗脱液颜色变成酒红色时开始收集，洗脱至料液变清澈，颜色呈柠檬黄色或桔黄为止；
10)超滤浓缩：将步骤9)得到的洗脱液经中空纤维柱或自动化层析超滤系统超滤，除盐脱水、小分子物质，且溶液电导率合格，得到浓缩液；
11)澄清过滤：采用纸浆板板框过滤装置，滤除10)得到的浓缩液中的悬浮物质，得到三次澄清液；
12)冻干：在洁净区将步骤11)的澄清液于－38℃下冷冻10小时，继续升温至42℃干燥得到5.2Kg蚓激酶冻干粉，收率6.5Kg/T，其含水量为5.5%，酶活力20000IU/mg。
实施例6
1)蚯蚓清洗和解冻：将鲜蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后贮存在冷库中备用；将800kg冻蚓室温放置自然化冻；
2)制浆：加入蚯蚓体积的1.0倍的水于匀浆罐内，倒入完全解冻的蚯蚓，用匀浆机将蚯蚓粉碎，匀浆2.0小时，形成匀浆液；
3)生物酶处理：于步骤2)的匀浆液中，按蚯蚓重量的0.3%的量加入菠萝蛋白酶，控制在40℃，保温静置3小时；
4)离心：将步骤3)的匀浆液定量的加水稀释，最终定容体积至2.5吨，通过蝶片式离心机除去其中的粗渣；
5)澄清：经步骤4)除渣后的的离心液，输入到膜过滤系统内，加水洗涤，每次加水500L洗涤，加水3次，得到一次澄清液；
6)超滤：采用中空纤维柱超滤处理步骤5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3次，超滤2次，得到超滤液；其中超滤采用与实施例1相同的立式膜中空纤维柱进行；
7)澄清：步骤6)得到的超滤液经泵再次打入膜过滤系统，每次加水300L，分2次加水洗涤过滤，得到二次澄清液；
8)调整pH值：采用pH计监测，用0.5M的氢氧化钠溶液13L调节步骤7）的澄清液的pH至8.5；
9)层析分离：采用阴离子交换层析柱分离步骤8)调整PH值后的澄清液，用0.3～0.9M的磷酸盐溶液梯度洗脱，洗脱液颜色变成酒红色时开始收集，洗脱至料液变清澈，颜色呈柠檬黄色或桔黄为止；
10)超滤浓缩：将步骤9)得到的洗脱液经中空纤维柱或自动化层析超滤系统超滤，除盐脱水、小分子物质，且溶液电导率合格，得到浓缩液；
11)澄清过滤：采用纸浆板板框过滤装置，滤除10)得到的浓缩液中的悬浮物质，得到三次澄清液；
12)冻干：在洁净区将步骤11)的澄清液于－38℃下冷冻10小时，继续升温至42℃干燥得到5.2Kg蚓激酶冻干粉，收率6.5Kg/T，其含水量为5.3%，酶活力14300IU/mg。
实施例7
1)蚯蚓清洗和解冻：将鲜蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后贮存在冷库中备用；将800kg冻蚓室温放置自然化冻；
2)制浆：加入蚯蚓体积的1.0倍的水于匀浆罐内，倒入完全解冻的蚯蚓，用匀浆机将蚯蚓粉碎，匀浆2.0小时，形成匀浆液；
3)生物酶处理：于步骤2)的匀浆液中，按蚯蚓重量的0.3%的量加入木瓜蛋白酶，控制在40℃，保温静置3小时；
4)离心：将步骤3)的匀浆液定量的加水稀释，最终定容体积至2.5吨，通过蝶片式离心机除去其中的粗渣；
5)澄清：经步骤4)除渣后的的离心液，输入到膜过滤系统内，加水洗涤，每次加水500L洗涤，加水3次，得到一次澄清液；
6)超滤：采用中空纤维柱超滤处理步骤5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3次，超滤2次，得到超滤液；其中超滤采用与实施例1相同的立式膜中空纤维柱进行；
7)澄清：步骤6)得到的超滤液经泵再次打入膜过滤系统，每次加水300L，分2次加水洗涤过滤，得到二次澄清液；
8)调整pH值：采用pH计监测，用0.5M的氢氧化钠溶液13L调节步骤7）的澄清液的pH至8.5；
9)层析分离：采用阴离子交换层析柱分离步骤8)调整PH值后的澄清液，用0.3～0.9M的磷酸盐溶液梯度洗脱，洗脱液颜色变成酒红色时开始收集，洗脱至料液变清澈，颜色呈柠檬黄色或桔黄为止；
10)超滤浓缩：将步骤9)得到的洗脱液经中空纤维柱或自动化层析超滤系统超滤，除盐脱水、小分子物质，且溶液电导率合格，得到浓缩液；
11)澄清过滤：采用纸浆板板框过滤装置，滤除10)得到的浓缩液中的悬浮物质，得到三次澄清液；
12)冻干：在洁净区将步骤11)的澄清液于－38℃下冷冻10小时，继续升温至42℃干燥得到5.2Kg蚓激酶冻干粉，收率6.5Kg/T，其含水量为5.5%，酶活力14000IU/mg。
实施例8
1)蚯蚓清洗和解冻：将鲜蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后贮存在冷库中备用；将800kg冻蚓室温放置自然化冻；
2)制浆：加入蚯蚓体积的1.0倍的水于匀浆罐内，倒入完全解冻的蚯蚓，用匀浆机将蚯蚓粉碎，匀浆2.0小时，形成匀浆液；
3)生物酶处理：于步骤2)的匀浆液中，按蚯蚓重量的0.3%的量加入沙雷肽酶，控制在40℃，保温静置3小时；
4)离心：将步骤3)的匀浆液定量的加水稀释，最终定容体积至2.5吨，通过蝶片式离心机除去其中的粗渣；
5)澄清：经步骤4)除渣后的的离心液，输入到膜过滤系统内，加水洗涤，每次加水500L洗涤，加水3次，得到一次澄清液；
6)超滤：采用中空纤维柱超滤处理步骤5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3次，超滤2次，得到超滤液；其中超滤采用与实施例1相同的立式膜中空纤维柱进行；
7)澄清：步骤6)得到的超滤液经泵再次打入膜过滤系统，每次加水300L，分2次加水洗涤过滤，得到二次澄清液；
8)调整pH值：采用pH计监测，用0.5M的氢氧化钠溶液13L调节步骤7）的澄清液的pH至7.0；
9)层析分离：采用阴离子交换层析柱分离步骤8)调整PH值后的澄清液，用0.3～0.9M的磷酸盐溶液梯度洗脱，洗脱液颜色变成酒红色时开始收集，洗脱至料液变清澈，颜色呈柠檬黄色或桔黄为止；
10)超滤浓缩：将步骤9)得到的洗脱液经中空纤维柱或自动化层析超滤系统超滤，除盐脱水、小分子物质，且溶液电导率合格，得到浓缩液；
11)澄清过滤：采用纸浆板板框过滤装置，滤除步骤10)得到的浓缩液中的悬浮物质，得到三次澄清液；
12)冻干：在洁净区将步骤11)的澄清液于－38℃下冷冻10小时，继续升温至42℃干燥得到5.2g蚓激酶冻干粉，收率6.5Kg/T，其含水量为5.6%，酶活力20000IU/mg。
表1使用各生物蛋白酶的酶活力比较
从表1可以看出，使用实施例1–8的制备方法，获得的蚓激酶酶活力较高，其中特别是，使用沙雷肽酶和端肽酶的制备方法能够获得更优异的酶活力。
本发明实施例4的制备方法与现有工艺比较，具有如下特征：
Claims (9)
1.一种蚓激酶干粉的制备方法，包括如下步骤：
1)蚯蚓清洗和解冻：将鲜蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后贮存在冷库中备用；将冻蚓室温放置自然化冻；
2)制浆：加入蚯蚓体积的0.5～2倍的水，将经步骤1)化冻后的蚯蚓粉碎，制成匀浆；
3)生物酶处理：将步骤2)得到的匀浆在30～40℃，优选35～40℃保温，同时加入中性蛋白酶，按蚯蚓重量的0.1%～0.3%加入匀浆液中，保温静置2～6小时，优选保温静置2～4小时；
4)离心：将步骤3)的匀浆液定量的加水稀释，最终定容体积至2～3.5倍，通过蝶片式离心机除去其中的粗渣；
5)澄清：经步骤4)除渣后的的离心液，输入到膜过滤系统内，加水洗涤，得到一次澄清液；
6)超滤：步骤5)得到的澄清液采用中空纤维柱超滤，得到超滤液；
7)澄清：经步骤6)超滤后的溶液经泵再次打入膜过滤系统，加水洗涤，得到二次澄清液；
8)调节PH：配制0.5～1M的氢氧化钠溶液，调整步骤7)得到的澄清液至pH6.5～8.5，用PH计监测；
9)层析分离：采用阴离子交换层析柱分离步骤8)调整PH值后的澄清液，用0.3～0.9M的磷酸盐溶液梯度洗脱，洗脱液颜色变成酒红色时开始收集，洗脱至料液变清澈，颜色呈柠檬黄色或桔黄色为止；
10)超滤浓缩：将步骤9)得到的洗脱液经中空纤维柱或自动化层析超滤系统超滤，除盐脱水，且溶液电导率≦0.2×103μs/cm合格；
11)澄清过滤：采用纸浆板板框过滤装置，滤除步骤10)得到的浓缩液中的悬浮物质，得到澄清液；
12)冻干：在洁净区将步骤11)的澄清液于－30～－40℃下冷冻10小时,继续升温至40～45℃干燥得到蚓激酶干粉。
2.前述任一项权利要求所述的蚓激酶干粉的制备方法，其特征在于，步骤3)中的所述生物酶为选自菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、沙雷肽酶和端肽酶中的一种或者多种。
3.前述任一项权利要求所述的蚓激酶干粉的制备方法，其特征在于，步骤3)中的所述生物酶为选自沙雷肽酶和端肽酶中的一种或者多种。
4.前述任一项权利要求所述的蚓激酶干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤3)于35～40℃保温静置2～6小时。
5.前述任一项权利要求所述的蚓激酶干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤3)于35～40℃保温静置2～4小时。
6.前述任一项权利要求所述的蚓激酶干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中的膜过滤系统操作条件为：操作压力为0.12MPa、洗脱液流速小于1.6M3/hr。
7.前述任一项权利要求所述的蚓激酶干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤6)超滤是采用标准截流分子量为5K～10K的立式膜中空纤维柱进行的。
8.前述任一项权利要求所述的蚓激酶干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤6)超滤是采用标准截流分子量为8K的立式膜中空纤维柱进行的。
9.前述任一项权利要求所述的蚓激酶干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤8)调节澄清液至pH7.0～8.5。
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