CN101302505B - 一种分离提取糜蛋白酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种分离提取糜蛋白酶的方法，包括：将牛胰腺粉碎、过滤，提取滤液；对滤液去除杂蛋白，精制浓缩；加入硫酸铵并用氢氧化钠调pH值进行培养使糜蛋白酶原析出结晶；对上述培养物进行抽滤，提取出糜蛋白酶原，培养物抽滤液回收待用，加入胰蛋白酶使其酶解激活，经过滤后得第一半成品溶液；用CM-sopharoseFF凝胶介质装层析柱，用乙酸缓冲液进行平衡，平衡后用培养物抽滤液上样，用平衡液洗柱，洗至流出液OD ₂₈₀值小于0.1，换用磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液洗脱，收集洗脱峰，所得溶液即为第二半成品；合并第一半成品和第二半成品，脱盐浓缩，除菌过滤，冷冻真空干燥，即得糜蛋白酶成品。本发明解决了亲和层析介质昂贵，可重复使用次数少的缺点，适用于规模化大生产。

Description

一种分离提取糜蛋白酶的方法

技术领域

本发明涉及一种糜蛋白酶的分离提取方法；属于生物制药领域，涉及到药用蛋白酶的生化分离技术。

背景技术

糜蛋白酶是从牛胰腺或猪胰腺中分离纯化得到的一种蛋白酶。它在药理和临床上的功用主要有两方面：一、消炎：对各种炎症、炎性水肿、血肿、溃疡及血栓等有较好疗效。二、抗癌：能促进抗癌药物向病灶渗透，促使化疗药物发挥作用，有报道在抗癌增效上有效率超过50％，局部大剂量使用时作用更强。大剂量使用可治疗多种肿瘤，如乳腺癌、宫颈癌、胃癌等，并且无任何毒副作用或不良反应。

中国专利CN1944641A公开了一种糜蛋白酶的制备方法，采用亲和层析工艺从糜蛋白酶原生产高纯度糜蛋白酶。该方法是使用粉碎机粉碎原料，原料粒径约为3mm，包含在细胞内的内源性糜蛋白酶不能充分释放，糜蛋白酶的产量相对较低。在粗制阶段，该制备方法是通过30％饱和度(某种溶液的饱和度是指，在100g该溶液中溶质在溶液中所占质量分数，一般情况下，一种溶液的饱和度在同一温度下不会变，要想使不饱和溶液饱和度增加可以选择增加溶质，在刚好有晶体析出时，就是溶液刚好饱和的时候)硫酸铵和70％饱和度硫酸铵进行分级盐析，过程中需要使用大量的硫酸铵沉淀剂，不利于环境保护；而且操作程序复杂，生产成本较高；截取的目标物也不十分准确。在酶原粗品酶解激活阶段，该制备方法是加入激活剂后在2～8℃冷库中酶解40～607小时，由于糜蛋白酶干态稳定，溶液状态很不稳定，尤其当PH值为8左右时极易自溶，因此酶解时间过长不仅不利于目标蛋白的充分激活，还会导致激活的糜蛋白酶因自溶变性而失去活性。具有在固定时间内产品活性由低到高，再由高到低出现衰减的缺点；酶解操作不够准确、科学；工作时间较长。在精制阶段，该制备方法是将结晶后的粗品酶解，激活后用亲和层析介质进行分离纯化，但是亲和层析介质昂贵，可重复使用次数少，介质的使用量大，不适于规模化大生产。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种分离提取糜蛋白酶的方法，该方法能够解决亲和层析介质昂贵，可重复使用次数少的缺点；能够减轻层析工序负担，减少介质的使用量，不仅减少投资和生产成本，又能获得高比活糜蛋白酶，适用于规模化大生产。

为实现上述目的，本发明提供一种分离提取糜蛋白酶的方法，该方法包括如下步骤：

1)将牛胰腺粉碎、过滤，提取滤液；

2)对滤液去除杂蛋白，精制浓缩；

3)将精制浓缩液加入硫酸铵，并用氢氧化钠调节PH值进行培养使糜蛋白酶原析出结晶；

4)对上述培养物进行抽滤，提取出糜蛋白酶原，培养物抽滤液回收待用，加入胰蛋白酶使其酶解激活，经过滤后得第一半成品溶液；

5)用CM-sopharoseFF凝胶介质装层析柱，用0.02mol/L乙酸缓冲液进行平衡，平衡后用上一步培养物抽滤液直接上样，用上述平衡液洗柱，洗至流出液OD₂₈₀值小于0.1，换用0.02mol/L磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液洗脱，收集洗脱峰，所得溶液即为第二半成品；

6)合并第一半成品和第二半成品，用5KD中空纤维超滤器脱盐浓缩，用0.22μm除菌滤器除菌过滤，冷冻真空干燥，即得糜蛋白酶成品。

进一步，所述步骤1)具体为：

选取新鲜冷冻牛胰腺，经切片机切片后，进行超微粉碎，加入3～6倍体积0.125mol/L H₂SO₄溶液，在5～15℃冷媒液保护下，搅拌过夜，加入适量助滤剂，通过压滤方式进行固液分离。

进一步，所述步骤2)具体为：

取压滤液通过40KD中空纤维超滤柱去除杂蛋白，超滤液再通过10KD中空纤维超滤柱进一步精制浓缩。

进一步，所述步骤3)具体为：将精制浓缩液加入硫酸铵干粉至70％饱和度溶液调节PH值为3～6，在20～35℃条件下静置培养30～50小时，使糜蛋白酶原充分析出结晶。

进一步，所述步骤4)具体为：

对得到的培养物进行抽滤，所得滤饼即为糜蛋白酶原，抽滤液回收待用；将糜蛋白酶原用4倍纯化水溶解，完全溶解后按每公斤滤饼加入10ml体积的比例加入0.25mol/L的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，用NaOH调整PH到7.6，按每升溶液加入4～12mg高比活胰蛋白酶，于2～8℃条件下酶解，每隔20分钟监测溶液活性，当糜蛋白酶活性达到1500u/mg时用HCl调PH值为3～3.5，溶液回复稳定状态，即终止激活，将溶液在0.5～2kg负压条件下用布氏漏斗减压、抽滤，滤饼弃之，溶液即为第一半成品。

本发明在原料粉碎、提取阶段使用高压匀浆机对原料进行超微粉碎，可达到细胞破壁的程度，使包含在细胞内的内源性糜蛋白酶充分释放，提高糜蛋白酶的产量。在粗制阶段，使用40KD和10KD超滤器进行超滤，截留分子量为10000～40000的目标蛋白，大大减少硫酸铵沉淀剂的用量，有利于环境保护；简化操作程序，降低生产成本；以分子量为标准截取蛋白，目标物更为准确。在酶原粗品酶解激活阶段，是在2～8℃条件下，加入高比活激活剂并定时监测溶液活性，当糜蛋白酶比活达到1500u/mg终止酶解，大大提高糜蛋白酶的活性，达到1500u/mg以上；按照分子激活规律进行酶解，操作更为准确、科学；大大缩短工作时间，降低生产成本。在精制阶段，是结晶后将培养物进行抽滤，滤饼溶解、激活、酶解后即为第一半成品，滤液用CM-sopharoseFF层析介质进行分离纯化，洗脱液得第二半成品，第一半成品和第二半成品合并后脱盐、浓缩、除菌过滤、冷冻真空干燥后得成品，解决了亲和层析介质昂贵，可重复使用次数少的缺点；减轻层析工序负担，减少介质的使用量，不仅减少投资和生产成本，又能获得高比活糜蛋白酶，适用于规模化大生产。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

图1为本发明实施例1和实施例2的流程图。

具体实施方式

实施例1：

①在6000L反应罐中配制4000L 0.125mol/L的硫酸溶液。将-18℃到-20℃冷库保存新鲜牛胰1000kg用切片机切成片状，再用高压匀浆机粉碎成浆液，加入上述反应罐中，在反应罐夹套中加入5～15℃冷媒液保护，搅拌提取24小时，提取完成后，加入助滤剂搅匀，将提取液泵入40m²板框压滤机，进行液固分离。分离后固体残渣装袋按环保要求处理。所得清液应澄清，无混浊，泵入超滤罐。用40KD超滤器对超滤罐中液体进行超滤分离。超滤结束后，再用10KD超滤器对上述超滤液进行超滤，全部液体超滤结束后，获得液体320L，加入固体硫酸铵至70％饱和度，用NaOH调整PH值至5.0±0.5放入方盘中，置28℃温室，孵育40小时，析出结晶。

②将结晶好的蛋白液取出，用真空减压抽滤机抽滤。滤饼即为糜蛋白原4.1kg，滤液主要为胰蛋白酶和糜蛋白酶的半激活液76L。

③滤饼用16L纯化水溶解，完全溶解后加入40ml 0.25mol/L的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，用NaOH调整PH值至7.6，加入100mg高比活胰蛋白酶(3000u/mg以上)，于2～8℃条件下酶解，每隔20分钟监测溶液活性，当糜蛋白酶活性达到1500u/mg时，用HCl调PH3.2，终止激活，将溶液在0.5～2kg负压条件下用真空减压抽滤机减压抽滤，滤饼弃之，滤液即为第一半成品。

④用150L CM-sopharoseFF凝胶介质装层析柱，用300L 0.02mol/L乙酸缓冲液进行平衡，平衡后用第②步滤液上样，用300L上述平衡液洗柱，洗至流出液OD₂₈₀值小于0.1，换用0.02mol/L磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液洗脱，收集洗脱峰60L，所得溶液即为第二半成品。

⑤将第一半成品与第二半成品合并，用5KD超滤膜脱盐、浓缩，浓缩至25L，通过0.22μm除菌滤器进行除菌过滤。

⑥除菌后的溶液装冻干盘，放入冷冻真空干燥机中冷冻干燥，得到成品，成品按中国药典2005版第二部标准进行全项检查，检查结果全部符合中国药典标准，糜蛋白酶活性达到1600u/mg。

实施例2：

①在5000L反应罐中配制2500L 0.125mol/L的硫酸溶液。将-18℃到-20℃冷库保存新鲜牛胰500kg用切片机切成片状，再用高压匀浆机粉碎成浆液。加入上述反应罐中，在反应罐夹套中加入5～15℃冷媒液保护，搅拌提取18小时，提取完成后，加入助滤剂搅匀，将提取液泵入30m²板框压滤机，进行液固分离。分离后固体残渣装袋按环保要求处理。所得清液应澄清，无混浊，泵入超滤罐。用40KD超滤器对超滤罐中液体进行超滤分离。超滤结束后，再用10KD超滤器对上述超滤液进行超滤，全部液体超滤结束后，获得液体160L，加入固体硫酸铵至70％饱和度，用NaOH调整PH值至5.0±0.5放入方盘中，置30℃温室，孵育35小时，析出结晶。

②将结晶好的蛋白液取出，用真空减压抽滤机抽滤。滤饼即为糜蛋白原2.5kg，滤液为胰蛋白酶和糜蛋白酶的半激活液35L。

③滤饼用10L纯化水溶解，完全溶解后加入25ml 0.25mol/L的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，用NaOH调整PH值至7.6，加入60mg高比活胰蛋白酶(3000u/mg以上)，于2～8℃条件下酶解，每隔20分钟监测溶液活性，当糜蛋白酶活性达到1500u/mg时，用HCl调PH3.2，终止激活，将溶液在0.5～2kg负压条件下用真空减压抽滤机减压抽滤，滤饼弃之，滤液即为第一半成品。

④用70L CM-sopharoseFF凝胶介质装层析柱，用140L 0.02mol/L乙酸缓冲液进行平衡，平衡后用第②步滤液上样，用140L上述平衡液洗柱，洗至流出液OD₂₈₀值小于0.1，换用0.02mol/L磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液洗脱，收集洗脱峰25L，所得溶液即为第二半成品。

⑤将第一半成品与第二半成品合并，用5KD超滤膜脱盐、浓缩，浓缩至13L，通过0.22μm除菌滤器进行除菌过滤。

⑥除菌后的溶液装冻干盘，放入冷冻真空干燥机中冷冻干燥，得到成品，成品按中国药典2005版第二部标准进行全项检查，检查结果全部符合中国药典标准，糜蛋白酶活性达到1600u/mg。

Claims (3)

1.一种分离提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1)将牛胰腺粉碎、过滤，提取滤液；

2)取压滤液通过40KD中空纤维超滤柱去除杂蛋白，超滤液再通过10KD中空纤维超滤柱进一步精制浓缩；

3)将精制浓缩液加入硫酸铵，并用氢氧化钠调节PH值进行培养使糜蛋白酶原析出结晶；

4)对得到的培养物进行抽滤，所得滤饼即为糜蛋白酶原，抽滤液回收待用；将糜蛋白酶原用4倍纯化水溶解，完全溶解后按每公斤滤饼加入10ml体积的比例加入0.25mol/L的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，用NaOH调整PH到7.6，按每升溶液加入4～12mg，3000u/mg以上的高比活胰蛋白酶，于2～8℃条件下酶解，每隔20分钟监测溶液活性，当糜蛋白酶活性达到1500u/mg时用HCl调PH值为3～3.5，溶液回复稳定状态，即终止激活，将溶液在0.5～2kg负压条件下用布氏漏斗减压、抽滤，滤饼弃之，溶液即为第一半成品；

5)用CM-sopharoseFF凝胶介质装层析柱，用0.02mol/L乙酸缓冲液进行平衡，平衡后用上一步培养物抽滤液直接上样，用上述平衡液洗柱，洗至流出液OD₂₈₀值小于0.1，换用0.02mol/L磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液洗脱，收集洗脱峰，所得溶液即为第二半成品；

6)合并第一半成品和第二半成品，用5KD中空纤维超滤器脱盐浓缩，用0.22μm除菌滤器除菌过滤，冷冻真空干燥，即得糜蛋白酶成品。

2.根据权利要求1所述的分离提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步骤1)具体为：

选取新鲜冷冻牛胰腺，经切片机切片后，进行超微粉碎，加入3～6倍体积0.125mol/L H₂SO₄溶液，在5～15℃冷媒液保护下，搅拌过夜，加入适量助滤剂，通过压滤方式进行固液分离。

3.根据权利要求1所述的分离提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步骤3)具体为：将精制浓缩液加入硫酸铵干粉至70％饱和度溶液调节PH值为3～6，在20～35℃条件下静置培养30～50小时，使糜蛋白酶原充分析出结晶。