CN1944641A - 高纯度糜蛋白酶的制备方法 - Google Patents

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本发明涉及亲和层析法生产高纯度糜蛋白酶的制备方法，该制备方法包括以下工艺步骤：(1)生产用直接原料：新鲜冷冻牛胰或猪胰；(2)原料粉碎、提取蛋白；(3)分级盐析、酶原结晶；(4)粗品酶解；(5)亲和层析分离纯化；(6)超滤浓缩除菌；(7)真空冷冻干燥得到成品。与现有技术相比，本发明已建立起一套规模化生产的生产工艺，体现出了亲和层析法制备糜蛋白酶的高效性、专一性，有利于生产工艺的简化可控，减少了生产成本，大大提高了产品品质(效价达到1400单位/毫克以上)，从而极大地提高了产品的市场竞争力。

Description

高纯度糜蛋白酶的制备方法
技术领域
本发明涉及一种糜蛋白酶的制备方法，具体地说是涉及一种采用亲和层析工艺从糜蛋白酶原生产高纯度糜蛋白酶的制备方法；属于生物制药领域，涉及到药用蛋白酶的生化分离技术。
背景技术
糜蛋白酶是从牛胰腺或猪胰腺中分离纯化得到的一种蛋白酶。它在药理和临床上的功用主要有两方面：一、消炎：对各种炎症、炎性水肿、血肿、溃疡及血栓等有较好疗效。二、抗癌：能促进抗癌药物向病灶渗透，促使化疗药物发挥作用，有报道在抗癌增效上有效率超过50％，局部大剂量使用时作用更强。大剂量使用可治疗多种肿瘤，如乳腺癌、宫颈癌、胃癌等，并且无任何毒副作用或不良反应。
国内提取糜蛋白酶的工艺长期以来一直采用多重结晶结合透析的工艺，多重结晶工艺复杂、纯化能力弱，透析工艺耗时长、不便于规模化生产，以这种传统工艺生产的产品活性一般在800-1000单位/毫克，最高只能达到1200单位/毫克左右。中国药典会根据国内现有的技术水平，不得不将本产品的质量标准定为活性不低于800单位/毫克，低于美国药典的标准(＞1000单位/毫克)。
根据分析，糜蛋白酶工艺未获得重大突破的原因有三：一是生产厂家的工艺惯性，工艺一旦稳定不轻易变动；二是几年前糜蛋白酶在临床上的应用主要是用作雾化吸入治疗上呼吸道炎症等，对产品的质量要求没有那么高；三是亲和层析技术本身的技术难度使得开发以亲和层析工艺来制备糜蛋白酶的技术不是那么容易。
可是近年来，国际研究发现，糜蛋白酶可以用作肿瘤治疗的有效辅助药物，帮助抗肿瘤药物到达靶位点，这个应用使得国际市场上对本产品的需求不断扩大，而从质量要求上却更加严格，要求产品有更好的品质：效价必须大于1400单位/毫克。以传统工艺生产的糜蛋白酶显然已经不能满足这种需求。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种工艺稳定、质量可靠的高纯度糜蛋白酶制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：高纯度糜蛋白酶的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下工艺步骤：
(1)原料的选取：
选取新鲜冷冻牛胰或猪胰；
(2)原料粉碎、提取蛋白：
用粉碎机将冷冻原料直接粉碎成浆状，加入2～5倍体积预冷的0.25N硫酸溶液，在2～8℃冷库中搅拌提取3～5小时，放置过夜；次日将提取液进行固液分离，分离后的残渣装袋后按照环保要求处理，在清液中加入硫酸铵至30％饱和度，并加入少量硅藻土助滤，在2～8℃冷库中放置过夜后过滤，得到的清液即为提取液；
(3)分级盐析、酶原结晶：
在提取液中再补充硫酸铵至70％饱和度，在2～8℃冷库中放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀；
用1～5倍重量的冰水溶解上述沉淀，加入0.1～1倍重量的饱和硫酸铵溶液，调节pH至4～6，在20～30℃下保温静置40～60小时使糜蛋白酶原充分结晶，过滤得到糜蛋白酶原粗品，滤液回收；
(4)粗品酶解：
粗品用5～15倍体积的去离子水溶解，调节pH到8.0，在每升溶解液中加入3～10mg高纯胰蛋白酶，在2～8℃冷库中酶解40～60小时，酶解后的溶液离心得到酶解液；
(5)亲和层析分离纯化：
以进口GE Health凝胶介质为基础，接上慈菇蛋白酶抑制剂作为配基得到亲和层析介质，将该亲和层析介质装柱，用层析缓冲液进行平衡；平衡后直接用酶解液上样，控制流速在25～35cm/h；上样完毕，用上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD280值小于0.1，保留穿透，测定穿透中的糜蛋白酶活性；换用洗脱液洗脱，流速为40～60cm/h，收集洗脱峰；
(6)超滤浓缩除菌：
采用超滤膜系统进行浓缩，将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌；
(7)真空冷冻干燥得到成品：
采用真空冷冻干燥技术，将酶液直接冷冻干燥，得到成品。
所述的步骤(2)中，固液分离采用的装置为机电一体化箱式板框过滤设备。
所述的步骤(2)(3)中，硫酸铵采用试剂级进行盐析，盐析的条件为30％～70％硫酸铵饱和度。
所述的步骤(3)中的滤液可供制胰蛋白酶原用。
所述的步骤(4)中，酶解使用的胰蛋白酶为高纯度的胰蛋白酶，活性＞3300u/mg。
所述的步骤(5)中，层析缓冲液为：0.1M Tris-HCl，pH8.0缓冲液，洗脱液为：0.1mol/L甲酸-0.05mol/LKCl，pH2.2缓冲液。
所述的步骤(6)中，超滤膜的截流分子量为10000；
所述的步骤(7)中，真空冷冻干燥工序中酶液的冷冻温度为-40℃以下。
所述的步骤(7)中的成品效价大于1400单位/毫克。
基于发明者十几年来从事生化产品分离纯化的研发和生产经验，特别是在亲和层析工艺上的自有技术，综合分析相关产品的文献和专利资料，经过小试、中试和规模化生产，最终采用以慈姑蛋白酶抑制剂为配基的亲和层析技术，结合自动化过滤和超滤技术，旨在以工业化的高效手段稳定地生产高纯度糜蛋白酶(效价＞1400单位/毫克)，以符合国际市场的需求。
本发明的技术方法，已建立起一套生产规模的制备工艺，体现出了亲和层析法生产糜蛋白酶的优越性，有利于工艺的简化和质量的可控，降低了生产成本，提高了产品品质，以较高的收率得到纯度很高的产品(＞1400单位/毫克)，大大提高了产品的市场竞争力。
附图说明
图1为本发明工艺流程图。
具体实施方式
本发明将通过以下具体实施例来说明本技术的实施过程。并根据中国药典2005年版第二部的相应方法测定酶解液中糜蛋白酶的效价，进行质量跟踪。
实施例1
取新鲜冷冻牛胰150公斤，这些牛胰是从专业畜牧或肉业公司采购，有良好的品质保障和齐全的动物检疫证明，原料的运输采用冷藏运输，保存条件为冷冻保存，用粉碎机将冷冻原料直接粉碎。加入450L预冷的0.25N硫酸溶液，转移到1吨搅拌容器中，在4℃冷库中搅拌提取3小时，放置过夜。次日用板框过滤设备过滤，而非传统工艺的布袋压滤，分离后的残渣装袋后按照环保要求处理，得到的清液搅拌加入硫酸铵至30％饱和度，并加入少量硅藻土助滤，在4℃冷库中放置过夜后过滤得到提取液。在提取液中补充硫酸铵至70％饱和度，在4℃冷库中放置过夜，次日吸取上清液弃去，离心得到沉淀7.5公斤。用11.25L冰水溶解沉淀，再加3.75公斤的饱和硫酸铵溶液，调节pH至5.0。在25℃下保温静置48小时，过滤得到酶原粗品4.5公斤。粗品用45L去离子水溶解，调节pH到8.0，再加入225mg胰蛋白酶(效价：3400单位/毫克，这样酶解的专一性高，可以取得很好的酶解效果)，在4℃冷库中酶解48小时。离心得到酶解液。将20L自制的亲和层析介质装柱，用60L0.1MTris-Hcl，pH8.0缓冲液进行平衡；平衡后直接用酶解液上样，控制流速在30cm/小时；上样完毕，用60L上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD280值小于0.1。换用0.1mol/L甲酸-0.05mol/LKCl，pH2.2缓冲液洗脱，流速为50cm/小时，收集洗脱峰40L。用这种创新的亲和层析纯化方法，可以一步纯化糜蛋白酶，是生产高纯度糜蛋白酶的关键。用截流量10000的超滤膜系统进行超滤浓缩，浓缩至5L，将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌。除菌后的酶液装冻干盘，采用真空冷冻干燥技术，将酶液直接冷冻干燥，得到成品。成品取样，参照中国药典2005年版第二部的要求，进行全项测定，全项指标完全符合中国药典的要求，酶活力达到1550单位/毫克。
实施例2
取新鲜冷冻牛胰450公斤，用粉碎机将冷冻原料直接粉碎成浆。加入1350L预冷的0.25N硫酸溶液，转移到2吨搅拌容器中，在4℃冷库中搅拌提取5小时，放置过夜。次日用板框过滤设备过滤，分离后的残渣装袋后按照环保要求处理，在清液中搅拌加入硫酸铵至30％饱和度，并加入少量硅藻土助滤，在4℃冷库中放置过夜后过滤得到提取液。在提取液中再补充硫酸铵至70％饱和度，在4℃冷库中放置过夜，次日吸取上清液弃去，离心得到沉淀23公斤。用34.5L冰水溶解沉淀，再加11.5公斤的饱和硫酸铵溶液，调节pH至5.0。在25℃下保温静置48小时，过滤得到酶原粗品13.5公斤。粗品用135L去离子水溶解，调节pH到8.0，再加入675mg胰蛋白酶(效价：3400单位/毫克)，在4℃冷库中酶解48小时。离心得到酶解液。将50L自制的亲和层析介质装柱，用150L0.1MTris-Hcl，pH8.0缓冲液进行平衡；平衡后直接用酶解液上样，控制流速在30cm/小时；上样完毕，用150L上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD280值小于0.1。换用0.1mol/L甲酸-0.05mol/LKCl，pH2.2缓冲液洗脱，流速为50cm/小时，收集洗脱峰100L。用截流量10000的超滤膜系统进行超滤浓缩，浓缩至12L，将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌。除菌后的酶液装冻干盘，采用真空冷冻干燥技术，将酶液直接冷冻干燥，得到成品。成品取样，参照中国药典2005年版第二部的要求，进行全项测定，全项指标完全符合中国药典的要求，酶活力达到1535单位/毫克。

Claims (9)

1.高纯度糜蛋白酶的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下工艺步骤：
(1)原料的选取：
选取新鲜冷冻牛胰或猪胰；
(2)原料粉碎、提取蛋白：
用粉碎机将冷冻原料直接粉碎成浆状，加入2～5倍体积预冷的0.25N硫酸溶液，在2～8℃冷库中搅拌提取3～5小时，放置过夜；次日将提取液进行固液分离，分离后的残渣装袋后按照环保要求处理，在清液中加入硫酸铵至30％饱和度，并加入少量硅藻土助滤，在2～8℃冷库中放置过夜后过滤，得到的清液即为提取液；
(3)分级盐析、酶原结晶：
在提取液中再补充硫酸铵至70％饱和度，在2～8℃冷库中放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀；
用1～5倍重量的冰水溶解上述沉淀，加入0.1～1倍重量的饱和硫酸铵溶液，调节pH至4～6，在20～30℃下保温静置40～60小时使糜蛋白酶原充分结晶，过滤得到糜蛋白酶原粗品，滤液回收；
(4)粗品酶解：
粗品用5～15倍体积的去离子水溶解，调节pH到8.0，在每升溶解液中加入3～10mg高纯胰蛋白酶，在2～8℃冷库中酶解40～60小时，酶解后的溶液离心得到酶解液；
(5)亲和层析分离纯化：
以进口GE Health凝胶介质为基础，接上慈菇蛋白酶抑制剂作为配基得到亲和层析介质，将该亲和层析介质装柱，用层析缓冲液进行平衡；平衡后直接用酶解液上样，控制流速在25～35cm/h；上样完毕，用上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD280值小于0.1，保留穿透，测定穿透中的糜蛋白酶活性；换用洗脱液洗脱，流速为40～60cm/h，收集洗脱峰；
(6)超滤浓缩除菌：
采用超滤膜系统进行浓缩，将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌；
(7)真空冷冻干燥得到成品：
采用真空冷冻干燥技术，将酶液直接冷冻干燥，得到成品。
2.根据权利要求1所述的高纯度糜蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，固液分离采用的装置为机电一体化箱式板框过滤设备。
3.根据权利要求1所述的高纯度糜蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)(3)中，硫酸铵采用试剂级进行盐析，盐析的条件为30％～70％硫酸铵饱和度。
4.根据权利要求1所述的高纯度糜蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中的滤液可供制胰蛋白酶原用。
5.根据权利要求1所述的高纯度糜蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)中，酶解使用的胰蛋白酶为高纯度的胰蛋白酶，活性＞3300u/mg。
6.根据权利要求1所述的高纯度糜蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述的步骤(5)中，层析缓冲液为：0.1M Tris-HCl，pH8.0缓冲液，洗脱液为：0.1mol/L甲酸-0.05mol/L KCl，pH2.2缓冲液。
7.根据权利要求1所述的高纯度糜蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述的步骤(6)中，超滤膜的截流分子量为10000；
8.根据权利要求1所述的高纯度糜蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述的步骤(7)中，真空冷冻干燥工序中酶液的冷冻温度为-40℃以下。
9.根据权利要求1所述的高纯度糜蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述的步骤(7)中的成品效价大于1400单位/毫克。
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