CN104419695A - 糜蛋白酶原的仿生亲和材料的制备及糜蛋白酶纯化方法 - Google Patents

糜蛋白酶原的仿生亲和材料的制备及糜蛋白酶纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种糜蛋白酶原仿生亲和材料的制备及糜蛋白酶纯化方法，包括下列步骤：(1)基础层析介质与三氯三氮嗪反应活化后，分别与L-缬氨酸以及对氨基苯磺酸反应，合成仿生亲和分离材料；(2)用制备的仿生亲和分离材料纯化糜蛋白酶原，将含有糜蛋白酶原的样品流过该亲和层析柱，糜蛋白酶原吸附在亲和层析柱上，冲洗亲和层析柱，不吸附在亲和层析柱上的杂蛋白被除去，然后变换缓冲液条件，将结合的糜蛋白酶原洗脱下来。(3)用胰蛋白酶进行糜蛋白酶原的激活。本发明能够高效率、低成本的大规模生产高酶活的糜蛋白酶。

Description

糜蛋白酶原的仿生亲和材料的制备及糜蛋白酶纯化方法
技术领域
本发明涉及的是一种生物医药技术领域的纯化方法。特别是一种糜蛋白酶原仿生亲和材料的制备及糜蛋白酶的纯化方法。
背景技术
糜蛋白酶是从胰腺中分离纯化得到的一种蛋白酶。它在药理及临床上的功用主要有1.用于创伤或手术后伤口愈合、抗炎及防止局部水肿、积血、扭伤血肿、乳房手术后浮肿、中耳炎、鼻炎等。2.对眼球睫状韧带有选择性松解作用，可用于白内障摘除，使晶状体比较容易地移去。3.使粘稠的痰液稀化，便于咳出，对脓性和非脓性痰液均有效。
在动物胰脏中含有大量的酶，大多数以酶原非活性的形式存在，经胰蛋白酶激活后形成具有活性的酶，此外在动物胰脏中大部分的酶为丝氨酸蛋白酶家族，特别是胰蛋白酶原与糜蛋白酶原的理化性质相近，难以将二者分离。目前国际上通用的动物组织提取药用蛋白工艺是基于传统的盐析、沉淀等方式，这种工艺提取特异性差，操作过程目标产品损失大，以这种传统工艺生产的产品活性一般在800-1000单位/毫克，最高只能达到1200单位/毫克左右。从市场上采购的通用纯化介质和纯化技术，如超滤、分子筛凝胶层析、离子交换凝胶层析、疏水凝胶层析。由于这些纯化介质和方法的纯化效率低、往往需要多介质与多个步骤组合才能达到产品质量要求，生产步骤的增多导致产品总回收率降低，生产成本升高，纯化工段成本可高达总生产成本60％-80％。加之这类介质多由国际公司定价并且每年以15％提价，造成蛋白纯化工艺升级慢，工艺成本高，难以形成产业化，严重制约资源的充分利用。
经对现有技术文献的检索发现，从动物胰脏中提取纯化糜蛋白酶的方法有多种，多为硫酸铵沉淀，阳离子交换和阴离子交换层析，超滤等，如中国专利102618523A一种糜蛋白酶的纯化；中国专利101302505A一种分离提取糜蛋白酶的方法；由于采用多步提取纯化，导致糜蛋白酶的回收率低，酶活性不高；有专利报道采用亲和层析技术进行糜蛋白酶的纯化，如中国专利1807612A一种糜胰蛋白酶的制备方法，以卵粘蛋白作为亲和配基，由于这种亲和配基成本较高，且使用寿命较短，糜蛋白酶的生产成本高，不利于工业上的放大进行。
因此，有必要开发效率高、成本低、生产步骤更简便的糜蛋白酶原分离材料和和生产工艺。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种糜蛋白酶原仿生亲和材料及糜蛋白酶的纯化方法，使其克服糜蛋白酶大规模纯化中的缺点，在大规模分离纯化时步骤少、成本低、效率高，利用糜蛋白酶原专一的亲和配位体，可快速、简便、低成本、大批量纯化糜蛋白酶。
因此本发明的目的在于提供糜蛋白酶原特异性的亲和配基，制备糜蛋白酶原仿生亲和材料；
本发明的另一个目的在于建立糜蛋白酶层析纯化方法，保证在大规模分离纯化时，高效的提取糜蛋白酶。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明以基础层析介质为原料制备仿生亲和分离材料，用制备的仿生亲和分离材料纯化糜蛋白酶原。
本发明包括以下步骤
(1)在基础层析介质上进行固相合成，制备仿生亲和分离材料；
合成糜蛋白酶原专一的亲和分离材料，首先以带氨基的基础层析介质，或用常规化学方法对基础层析介质进行衍生化，带上氨基，与三氯三氮嗪反应活化，然后与L-缬氨酸和对氨基苯磺酸反应，合成亲和分离材料。
(2)用制备的仿生亲和分离材料纯化糜蛋白酶；
用上述合成的亲和层析介质制备成亲和层析柱，将胰脏提取液上清流过该亲和层析柱，糜蛋白酶原吸附在亲和层析柱上，未结合的其它蛋白被洗去，改变换缓冲液条件将结合的糜蛋白酶原洗脱下来，得到高纯糜蛋白酶原。
(3)糜蛋白酶原激活。
洗脱下来的糜蛋白酶原经胰蛋白酶激活后，即得到糜蛋白酶。
在步骤(1)中，基础层析介质是葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚物、琼脂糖凝胶、琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物、聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠、纤维素珠和涂有化学活性基团的硅胶中的一种。
在步骤(2)中，亲和介质吸附糜蛋白酶原的条件为pH6-7，离子强度为0.0-0.3M的缓冲液；洗杂条件为pH6-7，离子强度为0.05M的缓冲液；洗脱条件为pH6-7，离子强度为0.5-1.0M的缓冲液。
在步骤(3)中，糜蛋白酶原激活的条件为pH7.6，按照(1∶10)(L：mg)比例加入胰蛋白酶，4℃，激活24-48h。
所述的仿生亲和分离材料，其结构是通过三氮嗪结构骨架作为间臂固定L-缬氨酸及对氨基苯磺酸基团。
所述的糜蛋白酶原，其原料为哺乳动物胰脏。
本发明克服了糜蛋白酶生产技术中的缺点，使糜蛋白酶生产分离纯化时步骤少，生产成本低，生产效率高，利用糜蛋白酶原专一的亲和分离材料，可快速、简便、低成本、大批量纯化糜蛋白酶。糜蛋白酶一步纯化的回收率＞60％，酶活＞1500U/mg，CT/T＞10。
附图说明
图1：1-氨基-Sepharose-3-缬氨酸-5-氨基苯磺酸-2，4，6-三氮嗪纯化糜蛋白酶原SDS-PAGE检测结果。
具体实施方式
本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，如起始材料NH2-Sepharose可以更换成葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚物、琼脂糖凝胶、琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物、聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠、纤维素珠和涂有化学活性基团的硅胶等，这些等价形式同样落于本发明的范围。
下面结合具体实例做进一步的阐述：
实施例1
一分离材料制备
取NH2-Sepharose(50mL)，依次用5倍体积的1M NaCl，10倍体积蒸馏水充分洗涤后，抽干转移至反应器皿中，加入一定量的冰水，在冰水浴中搅拌加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪(1～5g)，用饱和NaHCO3调节反应系统的pH在6～7之间，反应3小时后取出，依次用3×10倍体积的水/丙酮(0∶1，1∶3，1∶1，3∶1，1∶0)洗涤，得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪。
称取L-缬氨酸(3～5g)用去离子水溶解，与介质1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪混匀，用饱和NaHCO3调节pH在6～7之间，置于温度50℃中搅拌反应24小时。反应结束后，依次用3倍体积的1M NaCl，10倍体积蒸馏水充分洗涤，得到1-氨基-Sepharose-3-缬氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪，用20％乙醇储存待用。
取介质1-氨基-Sepharose-3-缬氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪(30mL)，并称取对氨基苯磺酸(3～5g)，用二甲亚砜和去离子水混合溶解，将溶液的pH调至5～8左右，较佳的pH7，倒入反应器与介质1-氨基-Sepharose-3-缬氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪混匀，放于温度为95℃的恒温环境下搅拌反应60小时。反应结束后，取出反应物，用4倍体积的NaCl，3倍体积的二甲亚砜洗涤，然后用10倍体积的去离子水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-缬氨酸-5-氨基苯磺酸-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料，用20％乙醇储存待用。
二用亲和分离材料纯化糜蛋白酶原
选取新鲜冷冻的牛胰脏50g，将脂肪、结缔组织除去，绞碎成匀浆状，按固液比1∶2的比例加入冷冻的0.25M硫酸100mL，4℃搅拌提取1h，然后4℃静置过夜。次日匀浆液9800rpm，4℃离心10min，过滤除脂，得牛胰脏提取液清液。在第一次离心后沉淀物中，加入等体积的冷硫酸再提取一次，重复上述操作，合并两次上清液，过0.45μm膜除去不溶物。将1-氨基-Sepharose-3-缬氨酸-5-氨基苯磺酸-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(1mL)，装入层析柱(1*2.5cm)中。用10mL磷酸盐缓冲液(10mM，pH7)平衡后，把5mL上述上清液(调pH和电导率与磷酸盐缓冲液相同)加到柱上。用10mL磷酸盐缓冲液(10mM，pH7)洗去未吸附的物质后，然后用10mL磷酸盐(10mM，pH7，0.05M NaCl)洗去非特异性吸附的杂蛋白，再用10mL磷酸缓冲液(10mM，pH7，0.5MNaCl)洗脱，收集洗脱组分。用15％的变性还原SDS-PAGE检测糜蛋白酶原的纯度。洗脱样品调pH至7.6，按(1∶10)(L：mg)比例加入胰蛋白酶，4℃条件下放置24-48h，然后2010版《中华人民共和国药典》第二部糜蛋白酶活性测定方法测定糜蛋白酶活性为1800U/mg。
实验结果及附图说明
图1说明，1：Marker从上之下分子量依次为116KD，66.2KD，45KD，35KD，25KD，18.4KD，14.4KD；2：牛胰提取液；3-6：流穿液(pH7，10mM PB缓冲体系)；7：洗杂液(10mM，pH7，0.05M NaCl缓冲液体系)；8：洗脱液(10mM，pH7，0.5M NaCl缓冲液体系。
实施例2：
一分离材料制备
取NH2-Sepharose(50mL)，依次用5倍体积的1M NaCl，10倍体积蒸馏水充分洗涤后，抽干转移至反应器皿中，加入一定量的冰水，在冰水浴中搅拌加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪(1～5g)，用饱和NaHCO3调节反应系统的pH在6～7之间，反应3小时后取出，依次用3×10倍体积的水/丙酮(0∶1，1∶3，1∶1，3∶1，1∶0)洗涤，得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪。
称取L-缬氨酸(3～5g)用去离子水溶解，与介质1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪混匀，用饱和NaHCO3调节pH在6～7之间，置于温度50℃中搅拌反应24小时。反应结束后，依次用3倍体积的1M NaCl，10倍体积蒸馏水充分洗涤，得到1-氨基-Sepharose-3-缬氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪，用20％乙醇储存待用。
取介质1-氨基-Sepharose-3-缬氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪(30mL)，并称取对氨基苯磺酸(3～5g)，用二甲亚砜和去离子水混合溶解，将溶液的pH调至5～8左右，较佳的pH7，倒入反应器与介质1-氨基-Sepharose-3-缬氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪混匀，放于温度为95℃的恒温环境下搅拌反应60小时。反应结束后，取出反应物，用4倍体积的NaCl，3倍体积的二甲亚砜洗涤，然后用10倍体积的去离子水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-缬氨酸-5-氨基苯磺酸-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料，用20％乙醇储存待用。
二用亲和分离材料纯化糜蛋白酶原
选取新鲜冷冻的羊胰脏50g，将脂肪、结缔组织除去，绞碎成匀浆状，按固液比1∶2的比例加入冷冻好的0.25M硫酸100mL，4℃搅拌提取1h，于4℃静置过夜。次日匀浆液9800rpm，4℃离心10min，过滤除脂，得羊胰脏提取液清液。第一次离心后沉淀物中，加入等体积的冷硫酸再提取一次，重复上述操作，合并两次上清液，过0.45μm膜除去不溶物。将1-氨基-Sepharose-3-缬氨酸-5-氨基苯磺酸-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(1mL)，装入层析柱(1*2.5cm)中。依次用磷酸钠缓冲液(10mM，pH7)平衡5-10CV，上样5mL(样品的pH及电导与磷酸盐缓冲液一致)，再用磷酸盐缓冲液(10M，pH7)洗至280nm光吸收至基线，然后用磷酸盐缓冲液(10mM，pH7，0.05M NaCl)洗杂，至280nm光吸收至基线。磷酸盐缓冲液(10mM，pH7，1M NaCl)洗脱结合的糜蛋白酶原，收集洗脱峰。用15％的变性还原SDS-PAGE检测糜蛋白酶原的纯度。洗脱样品调pH至7.6，按(1∶10)(L：mg)比例加入胰蛋白酶，4℃条件下放置24-48h，然后2010版《中华人民共和国药典》第二部糜蛋白酶活性测定方法测定糜蛋白酶活性为1100U/mg
实施例三：
选取新鲜冷冻的牛胰脏50g，将脂肪、结缔组织除去，绞碎成匀浆状，按固液比1∶2的比例加入冷冻好的0.25M硫酸100mL，4℃搅拌提取1h，于4℃静置过夜。次日匀浆液9800rpm，4℃离心10min，过滤除脂，得牛胰脏提取液清液。第一次离心后沉淀物中，加入等体积的冷硫酸再提取一次，重复上述操作，合并两次上清液，过0.45μm膜除去不溶物。将1-氨基-Sepharose-3-缬氨酸-5-氨基苯磺酸-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(1mL)，装入层析柱(1*2.5cm)中。依次用磷酸钠缓冲液(10mM，pH6)平衡5-10CV，然后上样5mL(样品的pH及电导与磷酸盐缓冲液一致)，然后依次用磷酸盐缓冲液(10mM，pH6)，磷酸盐缓冲液(10mM，pH6，0.05M NaCl)洗至280nm光吸收至基线。磷酸盐缓冲液(10mM，pH6，1M NaCl)洗脱结合的糜蛋白酶原，收集洗脱峰。用15％的变性还原SDS-PAGE检测糜蛋白酶原的纯度。洗脱样品调pH至7.6，按(1∶10)(L：mg)比例加入胰蛋白酶，4℃条件下放置24-48h，然后2010版《中华人民共和国药典》第二部糜蛋白酶活性测定方法测定糜蛋白酶活性为1000U/mg。

Claims (7)

1.一种糜蛋白酶原仿生亲和材料的制备及糜蛋白酶纯化方法，其特征在于，包括下列步骤： 
(1)仿生亲和分离材料结构是在基础层析介质上通过三氮嗪骨架作为间臂固定L-缬氨酸及对氨基苯磺酸； 
(2)用制备的仿生亲和分离材料纯化胰脏提取液上清； 
(3)用胰蛋白酶进行糜蛋白酶原的激活，得到糜蛋白酶。 
2.根据权利要求1所述的糜蛋白酶原仿生亲和材料的制备及糜蛋白酶纯化方法，其特征是，步骤(1)中，基础层析介质是葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚物、琼脂糖凝胶、琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物、聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠、纤维素珠和涂有化学活性基团的硅胶中的一种。 
3.根据权利要求1所述的糜蛋白酶原仿生亲和材料的制备及糜蛋白酶纯化方法，其特征是，在步骤(2)中，亲和介质吸附糜蛋白酶原的条件为为pH6-8，离子强度为0.0-0.3的缓冲液；洗脱条件为pH6-8，离子强度为0.5-1M的缓冲液。 
4.根据权利要求1所述的糜蛋白酶原仿生亲和材料的制备及糜蛋白酶纯化方法，其特征是，在步骤(3)中，胰蛋白酶激活糜蛋白酶酶原的条件为pH7.6，按照(1∶10)(L：mg)比例加入胰蛋白酶，4℃，激活24-48h。 
5.根据权利要求1所述的糜蛋白酶原仿生亲和材料的制备及糜蛋白酶纯化方法，其特征是，所述的仿生亲和分离材料，其合成的配体中含有三氮嗪，其合成的配体中含有缬氨酸的结构。 
6.根据权利要求1所述的糜蛋白酶原仿生亲和材料的制备及糜蛋白酶纯化方法，其特征是，所述的仿生亲和分离材料，其合成的配体中含有三氮嗪，其合成的配体中含有对氨基苯磺酸的结构。 
7.根据权利要求1所述的糜蛋白酶原仿生亲和材料的制备及糜蛋白酶纯化方法，其特征是，所述的糜蛋白酶原，其原料来源为哺乳动物胰脏。 
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