CN106929497B - 一种尿激酶的分离纯化方法 - Google Patents

一种尿激酶的分离纯化方法 Download PDF

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Abstract

本申请属于尿激酶的纯化技术领域，具体涉及一种尿激酶的分离纯化方法。该方法包括如下步骤：1)尿激酶粗品的制备；2)尿激酶的纯化；所述的步骤2)包括如下步骤：将步骤1)制得的尿激酶粗品溶解后的澄清液经葡聚糖微球柱和/或琼脂糖微球柱进行纯化。本申请提供的分离纯化方法，可同时提高尿激酶比活性达至2万IU/mg蛋白以上，收率达75‑87％，大小分子尿激酶的比例大于85％；而且，由于尿激酶的分离纯化过程中避免使用强酸强碱，减少了环境污染。

Description

一种尿激酶的分离纯化方法
技术领域
本发明属于尿激酶纯化技术领域，具体涉及一种尿激酶的分离纯化方法。
背景技术
尿激酶(简称UK)是一种碱性蛋白酶，由肾脏产生，主要存在于人及哺乳动物尿中，人尿平均含量5-6iu/ml。它是一种丝氨酸蛋白酶，能够特异性的识别纤维蛋白溶酶原，并催化其转变成纤维蛋白溶酶。此酶可使不溶的纤维蛋白分解成可溶的小肽，从而使血栓溶解。因此，临床上UK常被用于溶解血栓，预防和控制心肌梗死、高血压、动脉硬化等。尿激酶有多种分子量形式，主要以两种形式存在，一种是高分子量(54700，HUK)尿激酶，另一种是低分子量(31300，LUK)尿激酶。两种分子量形式的UK的作用机制相同，并且对合成底物N-乙酞甘氨酞-L-赖氨酸甲脂(简称AGLME)有相同的动力学常数。但由于HUK对纤溶酶原的亲合力较LUK高，而且在血液中的半衰期长，溶栓效果是LUK的2-3倍，所以研究制备高比活大分子的HUK的纯化方法更有实际意义。
目前，从发表的专利和文章来看，从尿液中提取尿激酶主要有3种方法：(1)发泡法，即以高速搅拌使酶液发泡，然后使泡沫液化，加入硫酸铵使尿激酶沉淀；(2)沉淀剂法，在尿液中加入沉淀剂，使尿激酶沉淀，尿激酶则保留在沉淀中；(3)吸附剂法，此法应用最多，选择适当的吸附剂，有选择的吸附尿激酶，如724树脂法，文献《用大孔离子交换树脂从人尿中提取尿激酶》公开了利用羧酸型阴离子交换树脂从人尿中提取尿激酶的方法。所得尿激酶的回收率为85％，比活达573.0IU/mg。
对于尿激酶的纯化，则主要采用层析柱方法进行分离纯化，如文献《亲和层析法纯化尿激酶》即公开了一种以琼脂糖凝胶为载体，对氨基苯甲脒为配基，采用亲和柱纯化尿激酶的方法，该方法中尿激酶的活性回收率为62.96％。该方法特异性强、纯化效果好，但酶的活性回收率低，远无法满足临床需要。
中国专利申请2015107824933《一种尿激酶分离纯化方法》即公开了一种利用凝胶柱纯化尿激酶的方法。该方法避免使用强酸强碱，能有效分离内毒素，同时保证尿激酶不被破坏，分离效果能达到药典标准要求，收率在97％以上，但该方法只能除去粗品中的内毒素，但大小分子尿激酶的比不到60％，无法满足临床应用的需要。
发明内容
为了提高尿激酶的比活性和收率，本申请的目的是提供一种尿激酶的分离纯化方法，该方法包括如下步骤：
1)尿激酶粗品的制备
2)尿激酶的纯化
所述的步骤2)包括如下步骤：将步骤1)制得的尿激酶粗品溶解后的澄清液经葡聚糖微球柱和/或琼脂糖微球柱进行纯化。
优选地，所述步骤2)中澄清液的尿激酶浓度为(2×106-5×106)IU/L。
优选地，所述步骤2)中澄清液以60-100mL/min的速度流经葡聚糖微球柱和/或琼脂糖微球柱；进一步优选为80-100mL/min；原因在于，速度低于60mL/min或超过100mL/min均会影响纯化得到的尿激酶的比活性。
优选地，所述步骤2)中澄清液与柱体积比为(15-20)：1。
优选地，所述步骤2)中澄清液经葡聚糖微球柱和/或琼脂糖微球柱后利用0.2-0.3MNaCl、PH6.5-7.5的磷酸缓冲液进行洗脱。所述步骤2)中澄清液经葡聚糖微球柱和/或琼脂糖微球柱包括：①所述澄清液至少一次经葡聚糖微球柱或琼脂糖微球柱纯化；②所述澄清液至少一次依次经葡聚糖微球柱和琼脂糖微球柱纯化；③所述澄清液至少一次经葡聚糖微球和琼脂糖微球混合柱纯化。
进一步优选地，所述步骤1)尿激酶粗品的制备方法，具体步骤如下：
a)男性尿液，在10℃以下，调节pH8.5，静置2小时，弃去沉淀，得上清液；
b)取上清液，调pH5.0-5.5酸化，得酸化尿，通过硅藻土柱进行吸附；
c)5℃冷水洗柱，以0.02％氨水、0.2-0.5M氯化钠溶液进行洗脱，得洗脱液1；
d)洗脱液1于pH4-5的条件下上CM-C柱，然后用PH11.5-11.8的氨水和0.2-0.5M氯化钠溶液进行洗脱，得洗脱液2，洗脱液2冻干即得尿激酶粗品。
进一步优选地，步骤1)尿激酶粗品的制备方法，具体步骤如下：
a1)男性尿液，调节pH6.0-6.9，加入724树脂进行吸附，吸附完全后用PH6.5-6.8的5％NaCl溶液进行洗脱，得洗脱液X；
b1)洗脱液X经pH2.5的20％NaCl溶液盐析，沉淀、离心后得盐析物1；
c1)用pH7.5-8.0的氨水溶解所述盐析物1，所得溶液再次用PH8.0-8.5的硫铵溶液盐析，得盐析物2；
d1)用pH7.5的氨水溶液溶解所述盐析物2，调pH6.4，加入724树脂进行吸附，吸附完全后用pH6.5的磷酸和0.5MNaCl缓冲液进行洗脱，得洗脱液Y，洗脱液Y冻干即得尿激酶粗品。
所述尿激酶粗品也可由现有技术的其它方法制得。
更进一步优选地，所述葡聚糖微球为离子交换高流速葡聚糖微球，选自CM-葡聚糖微球、DEAE-葡聚糖微球、QAE-葡聚糖微球、SE-葡聚糖微球和SP-葡聚糖微球中的一种；
所述琼脂糖微球选自CM-琼脂糖微球、DEAE-琼脂糖微球、QAE-琼脂糖微球、SE-琼脂糖微球和SP-琼脂糖微球中的一种。
更进一步优选地，所述步骤2)的包括如下步骤：
21)用pH6.5-8的无热源水溶解尿激酶粗品得浓度为(2×105-3×105)IU/L的澄清液；
22)用pH7.5-8.5的磷酸缓冲液平衡葡聚糖微球柱和/或琼脂糖微球柱；
23)将所述澄清液以80-100mL/min的速度流经葡聚糖微球柱和/或琼脂糖微球柱上柱，然后以0.2-0.3M NaCl、PH6.5-7.5的磷酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液后干燥，得纯化尿激酶，
所述纯化尿激酶比活性达2万IU/mg蛋白以上，收率达75-87％，大小分子尿激酶的比例大于85％。
本发明还提供了一种尿激酶制剂，其活性成分为由上述分离纯化方法制得的尿激酶。
优选地，所述制剂为冻干粉或水针剂；进一步优选地，所述水针剂为注射液。所述尿激酶制剂可采用现有技术中尿激酶制剂的制备方法制得。
本发明还提供了一种由上述分离纯化方法制得的尿激酶在制备预防和/或治疗血管血栓用药物中的用途。
优选地，所述血管血栓形出现于疾病中的至少一种：急性心肌梗塞、脑血栓、肺静脉血栓、下肢静脉血栓、高血压和动脉硬化。
本申请提供的尿激酶的分离纯化方法，与现有技术相比，具有以下优点：
(1)本申请提供的避免尿激酶的纯化方法，可同时提高尿激酶比活性达至2万IU/mg蛋白以上，收率达75-87％，大小分子尿激酶的比例大于85％。
(2)由于在尿激酶的纯化过程中避免使用了强酸强碱，减少了环境污染。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步阐述。这些实施例仅是出于解释说明的目的，而不限制本发明的范围和实质。
实施例1
一种尿激酶的分离纯化方法，其包括如下步骤：
1)尿激酶粗品的制备
a)男性尿液，在10℃以下，调节pH8.5，静置2小时，弃去沉淀，得上清液；
b)取上清液，调pH5.0-5.3酸化，得酸化尿，通过硅藻土柱进行吸附；
c)5℃冷水洗柱，以0.02％氨水和0.2M氯化钠溶液进行洗脱，得洗脱液1；
d)洗脱液1于pH4-4.2的条件下上CM-C柱，然后用PH11.5-11.8的氨水和0.3M氯化钠溶液进行洗脱，得洗脱液2，洗脱液2冻干即得尿激酶粗品。
2)尿激酶的纯化
21)用pH6.5的无热源水溶解尿激酶粗品得浓度为2×105IU/L的澄清液；
22)用pH7.5的磷酸缓冲液平衡葡聚糖微球柱；
23)将21)步骤的澄清液以80mL/min的速度流经CM-葡聚糖微球柱上柱，其中，澄清液与柱体积比为15:1，然后以0.2M NaCl、PH6.5-6.7的磷酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液后干燥，得纯化尿激酶。
经测定、计算，所得纯化尿激酶比活性为2.6万IU/mg蛋白，收率达85％，大小分子尿激酶的比例为93％。
实施例2
一种尿激酶的分离纯化方法，其包括如下步骤：
与实施例1的区别仅在于，步骤23)中，将21)步骤的澄清液以80mL/min的速度流经CM-琼脂糖微球柱。
经测定、计算，所得纯化尿激酶比活性为2.3万IU/mg蛋白，收率达87％，大小分子尿激酶的比例为86％。
实施例3
一种尿激酶的分离纯化方法，其包括如下步骤：
与实施例1的区别仅在于，步骤23)中，将21)步骤的澄清液以80mL/min的速度依次流经CM-葡聚糖微球柱和CM-琼脂糖微球柱。
经测定、计算，所得纯化尿激酶比活性为2.2万IU/mg蛋白，收率达84％，大小分子尿激酶的比例为90％。
实施例4
一种尿激酶的分离纯化方法，其包括如下步骤：
与实施例1的区别仅在于，步骤23)中，澄清液与柱体积比为20:1。
经测定、计算，所得纯化尿激酶比活性为2万IU/mg蛋白，收率达85％，大小分子尿激酶的比例为85％。
对比例1
一种尿激酶的分离纯化方法，其包括如下步骤：
与实施例1的区别仅在于，将21)步骤的澄清液以50mL/min的速度流经CM-葡聚糖微球柱。
经测定、计算，所得纯化尿激酶比活性为2.8万IU/mg蛋白，收率达68％，大小分子尿激酶的比例为70％。
对比例2
一种尿激酶的分离纯化方法，其包括如下步骤：
与实施例1的区别仅在于，步骤23)中，澄清液与柱体积比为10:1。
经测定、计算，所得纯化尿激酶比活性为1.5万IU/mg蛋白，收率达65％，大小分子尿激酶的比例为84％。
对比例3
一种尿激酶的分离纯化方法，其包括如下步骤：
与实施例1的区别仅在于，将21)步骤的澄清液以80mL/min的速度流经阴离子交换树脂。
经测定、计算，所得纯化尿激酶比活性为1.3万IU/mg蛋白，收率达55％，大小分子尿激酶的比例为60％。
对比例4
一种尿激酶的分离纯化方法，其包括如下步骤：
与实施例1的区别仅在于，将21)步骤的澄清液以80mL/min的速度流经大孔交换树脂。
经测定、计算，所得纯化尿激酶比活性为1.4万IU/mg蛋白，收率达58％，大小分子尿激酶的比例为65％。
上述实施例仅作为解释本发明的目的，本发明的范围不受此限制。对本领域的技术人员来说所做的修改是显而易见的，本发明仅受所附权利要求范围的限制。

Claims (2)

1.一种尿激酶的分离纯化方法，其包括如下步骤：
1）尿激酶粗品的制备
2）尿激酶的纯化
所述的步骤2）包括如下步骤：
将步骤1）制得的尿激酶粗品溶解后的澄清液以80mL／min的速度经CM-葡聚糖微球柱进行纯化；所述澄清液与柱体积比为15：1；
所述澄清液经CM-葡聚糖微球柱后利用0.2M NaCl、PH6.5-6.7的磷酸缓冲液进行洗脱。
2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，所述步骤1）尿激酶粗品的制备方法，具体步骤如下：
a)男性尿液，在10℃以下，调节 pH8.5，静置2小时，弃去沉淀，得上清液；
b)取上清液，调pH5.0-5.5酸化，得酸化尿，通过硅藻土柱进行吸附；
c)5℃冷水洗柱，以0.02% 氨水和氯化钠进行洗脱，得洗脱液1；
d) 洗脱液1于pH4-5的条件下上CM-C柱，然后用PH11.5-11.8的氨水和氯化钠溶液进行洗脱，得洗脱液2，洗脱液2冻干即得尿激酶粗品。
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