JPH02238879A - Ｎ―ポリオシル―ポリペプチド - Google Patents

Ｎ―ポリオシル―ポリペプチド

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JPH02238879A
JPH02238879A JP1131227A JP13122789A JPH02238879A JP H02238879 A JPH02238879 A JP H02238879A JP 1131227 A JP1131227 A JP 1131227A JP 13122789 A JP13122789 A JP 13122789A JP H02238879 A JPH02238879 A JP H02238879A
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Jean-Claude Lormeau
ジヤン―クロード・ロルモー
Jean Choay
ジヤン・シヨアイ
Maurice Petitou
モーリス・プテイトウ
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、還元末端を介してしかベプチド物質（ｓｕｂ
ｓｔａｎｃｅｓ　ｐｅｐｔｉｄｉｑｕｅｓ）に固定され
なレ）生体適合性（ｂｉｏａｏｅ＋ｐａｔｉｂｌｅ）ポ
リオシド鎖（ｃｈａｉｎｅｓｐｏｌｙｏｓｉｄｉｑｕｅ
ｓ）への共有結合によって修飾したべブチド物質に係わ
る．本発明はまた、前述のごとき修飾ベプチド物質の製
造方法、該物質を含む医薬組成物、及び該組成物の治療
用途にも係わる．ポリペプチドは生体内での安定性に乏
しいことの多い物質であり、特にタンパク質、より特定
的には酵素の場合にはその傾向が顕著である．ポリベプ
チドを含む組成物は経時的に活性を失い、薬剤としてヒ
トに投与すると短時間で異化される．従ってその生物学
的半減期は雉い． これらの問題を解決するために、これまで様々な方法が
使用されきた．その代表的なものは高分子鎖への共有結
合である．高分子鎖としてはヒドロキシル化線状脂肪族
鎖、例えばポリエチレングリコールもしくはボリプロビ
レングリコール（ＰＥ（；もしくはＰＰＧ）、又はデキ
ストランタイプのポリオシド（ｐｏｌｙｏｓｉｄｅｓ）
が使用され、結合は処理方法に応じてヒドロキシル基と
タンパク質のアミン基もしくはカルボキシル基との間、
又はポリオシドのカルボキシル基とポリペプチドのメル
カプト（スルフヒドリル》基もしくはアミノ基との間で
行われる（＾．１／．Ｍａｘｉｍｅｎｋｏ他著、Ｖｏｐ
ｒ．　Ｍｅｄ．　Ｋｈｉｍ．１９Ｂ５，３１．１２−２
０，Ｃ＾１９８５，世，１７１７０７ｋ）　，その後、
特定のグリコサミノグリカン、即ちコンドロイチン硫酸
を高分子鎖として使用することが欧州特許第２４２　４
１８号で提案された．この先行特許の方法では、コンド
ロイチン硫酸の残りの力ルボキシル基とタンパク質のア
ミノ基との間にアミド結合を樹立することによって前記
結合を生起させる． また、欧州特許第０２８５８６５号では、ヘモグロビン
をグリコサミノグリカンのフラグメントに共有結合させ
ることが提案された．但しこの場合は、グリコサミノグ
リカンがその硫酸基及びカルボキシル基を介してヘモグ
ロビンとの間にイオン結合を形成することができ、その
結果ヘモグロビンの立体構造が変化して酸素保持能力が
向上するという周知の事実を理由にグリコサミノグリカ
ンが選択されている．従って、ポリペプチドとポリオシ
ドとの間には必然的な相互作用が存在することになる．
これは、本発明の目的とは異なる極めて特殊な事例であ
る． これらの先行技術の操作では、ＰＥＧもしくはＰＰＧタ
イプの高分子鎖であれ、デキストランタイプのポリオシ
ドであれ、又はコンドロイチン硫酸であれ、各高分子鎖
毎に複数の結合点が存在するため、結合したタンパク質
の三次構造が変化して活性が低下する。
三次構造とは、アミノ酸鎖を三次元的に折りたたんで生
物学的活性のある安定した生来の立体構造にしたもので
ある。
そこで、ポリベプチドの三次構造をより確実に保持しな
がら、ポリペプチドのｉｎ　ｖｉｖｏの薬理学的特性及
び薬物動力学的特性とｉｎ　ｖｉｔｒｏの安定性とを改
善できるような方法の研究が注目されるようになった。
本発明では、ポリオシド鎖の末端に存在する又は発生さ
せた単一のアルデヒド基を用いて、ポリオシド鎖をその
一点でベプチド鎖にグラフトさせることができる。
周知のように、いわゆる糖類、特に多糖類は、下記の図
式（＾） に従って対応アルデヒド横遣（線状即ち開放）との間の
平衡を保つヘミアセタール楕造（環状即ち閉鎖）を有す
ることを特徴とする。
前記式中、Ｒは例えばヒドロキシル又は遊離もしくは硫
酸化アミノ基であり、前記平衡は天然糖類の場合にはほ
ぼ完全に左方へ片寄っている。
これも周知のことであるが、多糖を解重合するための或
る種の方法、特に以後「亜硝酸解重合」と称する亜硝酸
の作用による解重合は、オシド単位を変化させる。例え
ば、ヘパリンのグリコシド単位は亜硝酸解重合により下
記の図式（Ｂ）に従って２，５−アンヒドロマンノシド
単位に変換される二この２．５−アンヒドロマンノシド
単位はアルデヒド基を有する。
この亜硝酸解重合法によって、殆どの分子種の末端に前
記２．５−アンヒドロマンノース基を有する、従ってア
ルデヒド基を有する低分子量ヘバリンの製造が可能にな
った。
ここに至って、多糖をポリペプチドと反応させると、前
記多糖のアルデヒド部分が前記ポリベプチドの遊離アミ
ンと反応してシッフ多塩基（ｐｏｌｙｂａｓｅ　ｄｅ　
Ｓｃｈｉｆｆ）を形成することが判明した。この反応で
は前記図式（＾）の平衡が右方に移動し、シック多塩基
が形成される。
前記図式（Ｂ）に従い亜硝酸解重合によって得た多糖類
を用いても同様の反応が生起し、シッフ多塩基が短時間
のうちに十分な収率で形成されることも判明した。
また、ポリオシドが還元末端を１つしかもたないため結
合はこの末端でしか生起し得す、従ってポリペプチドの
三次構造が保持される。
更に、シッフ多塩基を還元すると、生理学的媒質中で安
定しており、ポリペプチドの薬物動力学的特性を改善す
る多糖／ポリペプチド複合体が得られることも判明した
。これらの複合体は場合によってはポリペプチドの活性
を高レベルで有する。
また、還元剤の存在下で多糖をポリペプチドと反応させ
ると、中間体のシッフ多塩基の分離を行わずに多糖／ボ
リペブチド複合体が極めて高い収率で直接得られること
も判明した。
本発明は、その目的の１つとして、下記の式（１）（オ
シド−２’　−ＣＨ２−．ＮＨ）ｎＰ’　　　（１）で
示されるＮ−ポリオシルーポリペプチド、又は場合によ
っては該Ｎ−ポリオシルーボリペブチドの医薬的に許容
し得る塩の１つを提供する．前記式中、 Ｐ゜はポリペプチドＰの分子中に元々存在するｎ個の遊
離アミン基に由来するｎ個のＮＨ基に結合したポリベプ
チドＰのｎ価基である．但しヘモグロビンの一価基では
ない． Ｚ゜は天然の又は亜硝酸解重合によって生じたアルデヒ
ド形態の多糖オシド−Ｚの単位Ｚからアルデヒド基を除
いた還元末端糖単位である．オシド（Ｏｓｉｄｅ）は多
糖オシド−Ｚの残りの部分である． ｎは２〜３０の整数である． 前記式（１）中Ｐ″は、有利には、グリコシル化もしく
は非グリコシル化ペプチドホルモン、グリコシル化もし
くは非グリコシル化毒素、酵素及び酵素阻害物質の中か
ら選択したポリペプチドＰのｎ価基である． 本明細書中のポリペプチドｒ　ｐ　４は下記の式（ＩＩ
）ど（ＮＨｚ）糟　　　　　　（Ｉ！） で簡単に示される． 前記式中、Ｐ゜はポリペプチドＰのｍ個の遊離ＮＨ２基
と結合したｍ価基であり、前記ｍ個のＮ１｛２基は末端
アミノ基及びポリベブチドに含まれるリシンのε位に位
置する（ｍ４）個のアミン基である．前記式（ＩＩ）中
、ｍはシップ多塩基の形成に使用できるアミン基の総数
を表すが、結合はこれらのアミノ基のうちの一部分、即
ち「ｎ」個についてしか生じない．単位Ｚのアルデヒド
基と反応したアミノ基に結合したｎ価基は以後Ｐ゛と称
する．本明細書では、「原子価（ｖａｌｅｎｃｅ）　」
の概念を関連基又は関連構造の自由（原予価》結合まで
広げて使用する．例えば、ｍ価又はｎ僅の基Ｐ゛は前述
のごときｍ個又はｎＷＡの自由（原子価）結合を有する
ポリベプチドＰの残基であり、下記の二価構遣Ｉａ”、
Ｉｂ”及びＩｄ”については説明の必要もないであろう
．本明細書中の多糖は下記の式（ＩＩＩ）オシド−Ｚ　
　　　　　　（ＩＩＩ） で簡単に示される． 前記式中、Ｚは前記多糖の天然の又は亜硝酸解重合によ
って生じたアルデヒド形態の還元末端糖単位であり、オ
シドは前記多糖の鎖の残りの部分である． 一価基オシド−Ｚ゛−は、前述のごとき多糖オシド−２
から単位Ｚのアルデヒド基を除いた残基を表す．より特
定的には、式（１）中のオシド−は、生体適合性天然物
質に由来しアグリコン残基をもたない「ポリオシド」と
も称する多糖オシド−ｚ（ＩＩＩ）の基を表す．このオ
シド−は還元末端糖単位Ｚをもたない． 本明細書で使用する「生体適合性」という用語は、分子
量が好ましくは１００，０００以下、特に１　，２００
〜ｓｏ，ｏｏｏの天然多糖、並びにその誘導体もしくは
類似体くアナローグ）の特性を意味する．これらの物質
の成分は晴乳類の生体中に自然に存在するものであり、
従って容易に代謝、排出できる。
天然の生体適合性物質に由来するポリオシドとしては、
ＲＪ．Ｊｅａｎｌｏｚ著＾ｒｔｈｒｉｔｉｓ　ａｎｄ　
Ｒｈｅｕｎ＋ａｔｉｓｍ，１９６０，３，２３３−２３
７及びＢ．Ｃａｓｕ著八ｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｃａｒ
ｂｏ−ｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８５，４３．５１−１
３４に記載のようなグリコサミノグリカンが有利である
． 前記式（１）中のオシドは、ヘパリン、ヘパリンフラグ
メント、コンドロイチン４−Ｓ硫酸、コンドロイチン６
−Ｓ硫酸、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の中から選
択したグリコサミノグリカンたるオシド−Ｚから還元末
端単位Ｚを除いた基を表すのが好ましい． 本発明の有利な特定Ｎ−ポリオシルーポリペプチドの１
つは、単位Ｚが亜硝酸解重合にかけられたヘパリン頷の
還元末端単位を表す場合のヘパリン系グリコサミノグリ
カンたるオシド−Ｚに由来する。
このＮ−ポリオシル−ポリペプチドは式（１）に対応す
る下記の式（Ｉａ）で示される： 前記式中、点線の間の基は基２′であり、Ｒ＋はＨ又は
ＳＯ，−である。
本発明の好ましい実施態様の１つでは、前記式（Ｉａ）
中のオシドがヘパリンに由来する下記の式（Ｉａ’．）
の基を表す： 前記式中、Ｒ１は水素又はＳＯ３−基を表し、Ｒ２はア
セチル基又はＳ０３一基を表し、ｐは４〜２４である。
基（Ｉａ’　）中のｐは勿論、天然ヘパリンの亜硝酸解
重合によって生じるヘパリンフラグメントの、平均分子
量が有利には２０００〜８０００タルトン、好ましくは
約４５００ダルトン又は約２５００ダルトンの混合物に
おける二糖単位の数を表すような値を有する。
本発明の別の特定Ｎ−ポリオシル−ポリペプチドは、単
位Ｚがヘパリンタイブのグリコサミノグリカンの天然還
元末端単位を表す場合の多糖オシド−２に由来する。こ
のＮ−ポリオシル−ポリペプチドは式（１）に対応する
下記の式（Ｉｂ）で示される：応する下記の式（Ｉｃ）
で示される． 前記式中、点線の間の基は基Ｚ″であり、Ｒ１はＨ又は
ＳＯ，−であり、Ｒ２はＨ，ＳＯ３一又はアセチルであ
り、オシドはヘパリン鎖の残りの部分である。
前記式（Ｉｂ）中、Ｒ２は好ましくはＳＯ，一又はアセ
チルを表し、オシドは好ましくはｐが１０〜１００の場
合の基（Ｉａ’　）を表す。ｐの値は、天然ヘパリン中
に存在する鎖の混合物を形成する二糖単位の数を表すよ
うな値である。
本発明の更に別の特定Ｎ−ポリオシル−ポリペプチドは
、単位Ｚがコンドロイチン硫酸又はデルマタン硫酸タイ
プのグリコサミノグリカンの天然還元末端単位を表す場
合の多糖オシド−Ｚに由来する．このＮ−ポリオシルー
ポリペプチドは、式（Ｉ）に対前記式中、点線の間の基
は基２゜であり、Ｒ１の一方はＨ、他方はＳＯ）−であ
り、オシドはコンドロイチン硫酸又はデルマタン硫酸の
鎖の残りの部分である。
前記式（Ｉｃ）中の基オシドは下記の式（Ｉｃ“）で示
される： 前記式中、Ｒ１の一方は水素、他方はＳ０３−基であり
、ｐは１０〜１００であり、ｐの値はコンドロイチン硫
酸又はデルマタン硫酸中に存在する鎖の混合物を形成す
る二糖単位の数を表すような値である．本発明の別の特
定Ｎ−ポリオシル−ポリペプチドは、ウロン酸、Ｄ−グ
ルクロン酸又はＬ−イズロン酸を表す還元単位Ｚをもち
鎖中に奇数個の単位が存在することになるような条件で
解重合にかけた多糖オシド−Ｚに由来する．このＮ−ポ
リオシルーポリベプチドは、式（１）に対応する下記の
式（Ｉｄ）で示される： 本発明は、オシドが、分子量に関して均質であり（式１
ａ″、ｐ＝ｔ〜１０）且つ任意にアンチトロンビンＩＩ
Ｉへの固定部位を有するヘパリンフラグメントの残りの
部分を表す場合の前記式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）の化合物
にも係わる．本発明は更に、オシドが合成オリゴ糖の残
りの部分を表す（式１ａ’、ｐ＝１〜６》場合の前記式
（Ｉｂ）で示される化合物にも係わる．前記式（Ｉａ）
、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）及び（Ｉｄ）中の基Ｚ゜は、夫々
下記の二価構造で示すことができる．前記式中、点線の
間の基は基Ｚ′であり、Ｒ１はＨ又はＳＯ，一であり、
オシドは多糖鎖・の残りの部分である． Ｃ｝Ｉ２０Ｒ． 前記式中、Ｒ１及びＲ２は前述の意味を表し、立体構造
は還元末端単位Ｚのそれである． 前述のごとく、前記式（１）中のＰ″は有利には、タン
パク質、グリコシル化もしくは非グリコシル化ベブチド
ホルモン、グリコシル化もしくは非グリコシル化毒素、
酵素及び酵素阻害物質の中から選択したポリベプチドＰ
のｎ価基である．前記ポリペプチドＰは天然のもの、化
学的に修飾したもの、又は遺伝子組換えによって得たも
のである．例えばＰ′は、グリコシル化もしくは非グリ
コシル化成長ホルモン、特にヒト成長ホルモン（ｈＧＨ
）、ヒトもしくは動物の天然もしくは化学的に修飾した
成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）もしくは活性フラグメ
ント、例えば（：ＲＦ　１−４４もしくはＧＲＦ　１−
２９、あるいは上皮成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞成
長因子（Ｆ（；Ｆ）、ソマトスタチン、又はグリコシル
化もしくは非グリコシル化サイトカイニン、例えばイン
ターロイキン、好ましくはインターロイキン２（ＩＬ−
２）のようなペプチドホルモンのｎ価基であり得る． Ｐ゛はまな、グリコシル化もしくは非グリコシル化毒素
、特にリポソームを阻害するタンパク質もしくはグリコ
タンパク質、例えばリシン、リジンＡｌ、ゲロニン（ｇ
Ｉ！１ｏｎｉｎｅ）、トリコサンチン（ｔｒｉｃｈｏｓ
ａｎ，ｔｉｎｅ）又はトリコカイニン（ｔｒｉｃｈｏ−
ｋｉｎｉｎｅ）のｎ価基でもあり得る．Ｐ′は更に天然
の、もしくは化学的に修飾した、又は遺伝子組換えによ
って得たウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラ
スミノーゲン活性化因子（ＬＰΔ）、プロウロキナーゼ
のような血栓溶解酵素、あるいはスーパーオキシドジス
ムターゼのｎ価基でもあり得る。
Ｐ′はまた、酵素阻害ポリペプチドＰ、例えばヒルジン
、アブロチニン、α−１−アンチトリプシン又はアンチ
トロンビンｒｌｌのｎ価基でもあり得る．本発明のＮ−
ポリオシルーボリペブチドは有利には、Ｐ″がウロキナ
ーゼ分子の残基であり、ｎが６以下、好ましくは６、４
又は３である前記式（Ｉａ）に対応する。
本発明の別の有利な実施態様では、Ｐ゛が組織ブラスミ
ノーゲン活性化因子（ｔＰ＾）の分子の残基であり、ｎ
が１０以下、好ましくは９、８又は５である。
更に別の有利な実施態様では、Ｐ゜がストレプｌ〜キナ
ーゼ分子の残基であり、ｎが４以下、特に２〜４である
。
勿論、Ｐ゜はポリオシドとの共有結合を可能にする［ア
ミノ基を有する限り、他の任意のベプチド物質のｎ価基
であり得る．但し、ヘモグロビンの一価の残基以外のも
のである． 本発明は、別の目的として、ペプチド物質Ｐの遊離アミ
ン単位をアミン単位と反応し得るアルデヒド基を１つず
つしかもたない複数の天然のポリオシド鎮に共有グラフ
ト結合（ｇｒｅｆｆａｇｅ　ｃｏｖａｌｅｒ＋ｊ）させ
ることによって本発明のＮ−ポリオシルーボリペブチド
を製造する方法も提供する。
本発明はより特定的には、前記式（１）のＮ−ポリオシ
ル−ポリペプチドの製造方法であって、下記の式（ＩＩ
） Ｐ”（ＮＨｚ）ｍ　　　　　　　　　（ＩＩ）？式中、
Ｐ゜はポリペプチドＰのｍ個の遊離官能基ＮＨ２と結合
したｍ価基であり、前記ｍ個の官能基Ｎｉｌ■は末端ア
ミノ基及び前記ポリペプチド中に存在する（ｍ−１）個
のりシンのε位のアミノ基である］で示されるポリベブ
チドＰを、下記の式（ＩＩＩ）オシド−Ｚ　　　　　　
（ＩＩＩ） ［式中、Ｚはこの多糖の天然の又は亜硝酸解重合によっ
て得たアルデヒド形態の還元末端糖単位であり、オシド
は前記多糖の鎖の残りの部分である］で示される過剰量
のポリオシドで処理し、その結果得られる下記の式（Ｉ
Ｖ） （オシド−Ｚ’　−ＣＩＩ＝Ｎ−）ｎＰ’　　　　　（
ＩＶ）［式中、一価基オシド−２″一は前述のごとき多
糖オシド−Ｚから単位Ｚのアルデヒド基を除いた基を表
し、Ｐ′及びｎは前述の意味を表す］ のシッフ多塩基をシアノホウ水素化物（ｃｙａｎｏ−ｂ
ｏｒｏｈｙｄｒｕｒｅ）で還元することを特徴とする方
法を提供する． 出発物質ＩＩＩとして使用する生体適合性天然ポリオシ
ドたるオシド−２は、有利には、前述のごときグリコサ
ミノグリカン（ＧＡＧｓ）、特にウロン酸〈Ｄ−グルク
ロン酸又はＬ−イズロン酸》とアミン糖とを交互に配置
した状態で含む鎖からなる物質である。
前記アミン糖はヘパリン系グリコサミノグリカンの場合
にはグルコサミンであり得、又はコンドロイチン硫酸、
即ちコンドロイチン４−Ｓ硫酸、コンドロイチン６−Ｓ
硫酸及びデルマタン硫酸のタイプのグリコサミノグリカ
ンの場合にはガラクトサミンであり得る．前記ＧΔＧｓ
のオシド単位のカルボキシル基は塩化又はエステル化し
得、ヒドロキシル基は官能基、好ましくは硫酸基で様々
に置換し得、アミノ基は硫酸基又はアセチル基で置換し
得る。
このようなＧＡＧｓは、分子量並びに官能基の位置及び
数に関して不均質な鎖の混合物からなる。これらの鎖の
分子量は１，８００〜５０　，　０００ダルトンの範囲
で変化し得る。
出発ポリオシドＩＩＩはヘパリン、ヘパリンフラグメン
ト、コンドロイチン４−Ｓ硫酸、コンドロイチン６−Ｓ
硫酸、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の中から選択し
たグリコサミノグリカンであるのが好ましい． 特に好ましい出発化合物ＩＩＩはヘパリンタイプのグリ
コサミノグリカン、即ちヘパリン、ヘバラン硫酸及びヘ
パリンもしくはヘバラン硫酸からの分画又は半合成もし
くは合成によって得た誘導体である。この種のポリオシ
ドは文献に広く記述されている。このポリオシドは分画
又は合成によって得た天然物質、例えば仏国特許第２，
４４０，３７６号及び第２　，４６１　，７１９号又は
ＥＰ　８４　９９９及び１１３　５９９に記載のような
物質であり得る．このポリオシドはまた、解重合によっ
て得た物質、例えば欧州特許第３７　３１９号、第４０
　１４４号及び第１８１　２５２号に記載のような物買
、又は欧州特許第２１４　８７９号に記載のような過硫
酸化物質であり得る。本発明の特に好ましい実施態様で
は、亜硝酸解重合によって得た分子量１０，０００ダル
トン以下、特に平均分子量２，０００〜８，０００ダル
トン、平均分子量約４，５００ダルトン、又は平均分子
量約２，５００ダルトンのヘパリンフラグメント混合物
を使用する．また、分子量に関して均質のヘパリンフラ
グメント、あるいは分子社と官能基の位置及び数とに関
して均質である合成によって得たオリゴ糖も有利゛に使
用し得る。
後述の実施例１ａの方法に従い亜硝酸解重合によって形
成される平均分子量４，５００ダルトンのヘパリン鎖混
合物を、以後符号ｒＣＹ　２１６−ＣＩＩＯ，で示す。
別の有利な出発物質オシド−ＺとしてはＥＰ　３７３１
９に記載のような亜硝酸解重合によって得られるヘパリ
ンフラグメント混合物が挙げられる。この物質は以後符
号ｒＣＹ　２２２−ＣＩＩＯ，で示す。
ポリオシドとしては更に、Ｅ．Ｓａｃｌ＋ｅ他著Ｔｈｒ
ｏｍｂ．Ｒｅｓ．，１９８２，２５，４４３−４５８に
記載のように、アンチトロンビンＩＩＩ（＾Ｔ　ＩＩＩ
）への固定部位を有するオリゴ糖鎖を除去すべく例えば
セファロース樹脂一＾Ｔ　ＩＩＩでのアフィニティクロ
マトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーを用
いてヘバリン鎖を分画するか、又は前記部位を例えば過
ヨウ素酸解重合及び完全なβ一脱離によって破壊するこ
とにより、アンチトロンビンＩＩＩ（＾Ｔ　ＩＩＩ）へ
の固定部位を除去したヘパリンの誘導体を使用し得る。
尚、アンチトロンビンＩＩＩ即ち＾Ｔ　ＩＩＩは血漿系
の凝集阻害物質であって種々の血漿プロテアーゼに作用
し、その活性は補因子として機能するヘパリンによって
大幅に増加する． 勿論、前記の説明は非限定的なものであり、ポリオシド
としては前述の特性をもつ文献に記載の任意の天然ポリ
オシド．を使用することができる．本発明の方法で使用
するペブチド物質Ｐは天然の、又は化学的に修飾した、
あるいは遺伝子組換えによって得たグリコシル化もしく
は非グリコシル化ベブチドホルモン、グリコシル化もし
くは非グリコシル化毒素、酵素又は酵素阻害物買であり
得る． 本発明の別の有利な実施態様では、酵素として血栓溶解
酵素を使用する． 出発物質として使用する血栓溶解酵素は好ましくは、ウ
ロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織ブラスミノーゲ
ン活性化因子、プロウロキナーゼ、並びに遺伝子組換え
もしくは他の任意の方法で得た前記物質の誘導体もしく
は類似体である。
有利には、ペプチド物質Ｐのアミン単位の１つとポリオ
シド鎖オシド−Ｚとの間の結合をオシド−Ｚ鎖の末端単
位で生起させる。前記オシド−２鎖は予め解重合による
フラグメンテーション（ｆｒａｇＩＩ＋ｅｎ−ｔａｔｉ
ｏｎ）にかけてもよく、又はかけなくてもよい。
本発明では、還元末端に位置する半アセタール単位を有
するポリオシド鎖を直接使用することができる．この単
位は実際、環状（閉鎖）構造と線状《開放）構造との間
で平衡状悪にあり、アルデヒド基とべブチド物質Ｐのア
ミ冫基との結合によってアルデヒド基が減少すると、そ
れに件って新しいアルデヒド基が遊離される．このよう
なプロセスはポリオシドが亜硝酸に反応するグルコサミ
ンＮ−硫酸をもたない場合、又は分子量の大きい鎖を処
理したい場合には有利である。但し、反応所要時間が長
く、１０〜１５日に達し得るという欠点がある．従って
通常は、適当な解重合方法、例えば亜硝酸解重合によっ
て発生させたアルデヒド基をもつ多糖オシド−Ｚを使用
する方が有利である。
前出の図式（Ｂ）に従い亜硝酸解重合によって生じた２
，５−アンヒドローマンノース基を末端単位Ｚとして含
むＧＡＧオシド−２を出発物質として使用する場合には
、周知のように安定性の小さいアルデヒド基が反応性を
失わないように、結合反応を前記オシド−Ｚの製造直後
に生起させるのが好ましい．アンチトロンビンＩＩＩへ
の固定部位をもたないヘパリンタイプのポリオシド鎖を
得たい場合には、過ヨウ素酸解重合にかけ次いで完全な
β一脱雛にかけたＧＡＧを出発物質として使用すると有
利である．この方法を用いると、Ｃａｓｕ他著＾ｒｚｎ
ｅｉ＋ｎ．Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ　Ｒｅｓ．，１９
８６．３６　（１），ｎ．４，６３７−６４６に全 記載のＧＡＧのように〆ての非硫酸化ウロン酸の２位及
び３位の炭素の間でヘパリン鎖を優先的に切断すること
ができる。周知のように、このような単位はヘパリンの
アンチトロンビンＩＩＩへの固定部位に存在する。
ポリオシド鎖の使用量は、ペプヂド物質Ｐ１モノレ当た
り１００〜２０００モノレのオシド−Ｚという比で、ペ
プチド鎖より遥かに多くしなければならない。
有利には、ベプチド物質Ｐ１モル当たり５００〜１５０
０モルのオシド−Ｚを使用する．ウロキナーゼを用いる
場合は、ウロキナーゼ１モル当たり５００〜６５０モル
のオシド−Ｚを使用するのが好ましい。組織プラスミノ
ーゲン活性化因子を用いる場合には、該酵素１モル当た
り６００〜．１３５０モルのオシド−Ｚを使用するのが
好ましい． 反応媒質はオシド−ＺとポリペプチドＰとの結合反応を
妨害し得る第１又は第２アミンを含まない水性媒質であ
る。このような水性媒質としては、リン酸バッファ又は
重炭酸バッファのようなバッファ又は無機酸もしくはア
ルカリ性水酸化物の添加によって適当なｐＨに調整でき
る他の任意のバッファを使用すると有利である．水と混
和し得る有機溶媒、例えばエタノール、アセトン、ジメ
チルホルムアミドも任意に加え得る． 本発明の好ましい実施態様の１つでは、塩化ナトリウム
を加えた０．０５Ｍリン酸バッファを使用する．必要で
あれば、ポリソルベート８０（モノオレイン酸ソルビタ
ン誘導体即ちＴｗｅｅｎ）を例えば１／１０，０００の
割合で加える．この界面活性剤はペブチド物質Ｐが表面
に吸着するのを防ぐ．前記反応媒質のｐｌｌは、アミン
がプロトン化形態を有するように選択する．その値は６
〜９であり得るが、有利には７〜８であり、好ましくは
中和に近い値にする。
反応温度は使用するペプチド物質に応じて変化し得、有
利には＋２℃〜＋３５℃で２〜１５日間反応させる。特
にペプチド物質が酵素の場合には、酵素の大部分が熱不
安定性であり、特に血栓溶解酵素は熱に弱いことから、
例えば＋４℃のような低温で操作するのが好ましい。但
し、温度が低ければ低いほど反応速度は遅くなる。従っ
て反応時間は選択した温度に応じて変化する。使用する
ポリオシドが亜硝酸解重合によって生じたアルデヒド基
を有する場合には、撹拌下＋４℃で２〜８日間反応させ
ると有利である。特に、使用するベプチド物質がウロキ
ナーゼ、プロウロキナーゼ又は組織ブラスミノーゲン活
性化因子のような血栓溶解酵素の場合には、反応を＋４
゜Ｃで３〜５日間生起させると十分なグラフト収率が得
られる。
このようにして得られる式（ｔＶ）のシツフ多塩基は公
知の方法、例えば硫酸アンモニウムのような適当な塩で
の沈澱処理によって分離することができ、且つ水素化シ
アノホウ素ナトリウムのようなシアノホウ水素化物で還
元し得る． この還元は、シッフ多塩基を分離せずに反応媒罠中で直
接行うこともできる。
また、ポリベプチドＰを前述の条件に従い水素化シアノ
ホウ素ナトリウムの存在下でポリオシド即ちオシド−２
と反応させることにより直接化合物Ｉにすることも可能
である． この場合はシッフ多塩基が形成と同時に還元され、物質
Ｉが唯一の最終生成物として分離される．このようにし
て形成された複合体を未反応生成物から分離するために
は、沈澱処理を行い得る．この処理は例えば硫酸アンモ
ニウを溶液の飽和に十分な量で、即ち約６００ｍｇ／ｍ
ｌの割合で反応媒質に加えることによって実施し得る．
その後は静置してデカンテーションを行い、次いで遠心
分離にかける。
この操作は沈澱物を回収した後で、硫酸アンモニウムを
同じ条件で新たに加えることによって繰り遅し行い得る
． また、有利な方法として、得られた複合体をΔｎｉｃｏ
ｎ’　ＹＭ　１０及びＹＭ　３０タイプの限外Ｐ過膜に
かけて濃縮することもできる。前記膜は複合体の分子量
に応じて選択する． Ｈ−ポリオシル−ポリペプチドを純粋な形態で回収する
ためには、ポリベブチドの性質及び大きさに応じて選択
したゲルを用いてゲル浸透クロマトグラフィーを行う。
ゲルｒ過は、例えばＩＢＦ社（フランス）から旧ｔｒｏ
ｇｅｌＲＡｃ＾４４の商品名で市販されているウルトロ
ゲルタイプのゲルを詰めたカラム、又はＰｈａｒｍａｃ
ｉａ社からＳｅｐｈａｃｒｙｌ’　Ｓ　２００の商品名
で市販されているカラムで行うと有利である．有利な実
施態様の１つでは、前記ステップで得た沈澱物を使用ベ
ブチド物質Ｐに適したバツファ中に溶解し、次いでこの
溶液を同じバツファで予め平衡処理したカラムに通す。
このゲルＰ過を２８ＯｎＩＩ１の分光光度計を用いて実
施し、タンパク質のピークを回収する．このピークは生
成物全体を含む。次いで、このピークを特性分析及び定
量にかける． 前記式（１ｖ）で示されるシッフ多塩基は、式（１）で
示されるＨ−ポリオシル−ポリペプチドの製造における
重要な中間体であり、新規物質である。従って、これら
の多塩基も本発明の範囲に含まれる。
前記式（ｍ中のオシドは、ヘパリン、ヘパリンフラグメ
ント、コンドロイチン４−Ｓ硫酸、コンドロイチン６−
Ｓ硫酸、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の中から選択
したグリコサミノグリカンたるオシド−２の還元末端単
位２のない基を表すのが好ましい． 特に有利なのは、単位Ｚが亜硝酸解重合にかけられなヘ
パリン系グリコサミノグリカン鎖の還元末端単位を表す
場合の多糖オシド−２に由来するシッフ多塩基である。
この多塩基は式（ｒｖ）に対応する下記の式（ＩＶａ）
で示される： 前記式中、点線の間の基は基Ｚ゜であり、Ｒ１はＨ又は
Ｓ（ｈ−である。
本発明の別の特定実施態様ではシッフ多塩基が、単位Ｚ
がヘパリンタイプのグリコサミノグリカンの天然還元末
端単位を表す場合の多糖オシド−Ｚに由来する。この多
塩基は式（ＩＶ）に対応する下記の式（ＩＶｂ）で示さ
れる： 前記式中、点線の間の基は基Ｚ゛であり、Ｒ＋はＨ又は
Ｓ０３−であり、Ｒ２はＳＯ，一又は＾Ｃであり、オシ
ドはヘパリン鎖の残りの部分である． 本発明の別の特定実施態様ではシツフ多塩基が、単位Ｚ
がコンドロイチン硫酸タイプのグリコサミノグリカンの
天然還元末端単位を表す場合の多糖オシド−２に由来す
る。この多塩基は式（ｍに対応する下記の式（ＩＶｃ）
によって示される：前記式中、点線間の基は基Ｚ゜であ
り、Ｒ１の一方はＨ、他方はＳ０３−であり、オシドは
コンドロイチン硫酸タイプの鎖の残りの部分である． 本発明の別の特定実施態様ではシッフ多塩基が、ウロン
酸、Ｄ−グルクロン酸又はＬ−イズロン酸を表す還元単
位Ｚをもち鎖中に奇数個の単位が存在することになるよ
うな条件で解重合にかけた多糖オシド−２に由来する．
この多塩基は式（ｍに対応する下記の式（ＩＶｄ）で示
される： 前記式中、点線間の基は基Ｚ゛であり、Ｒ１はトＩ又は
ＳＯ，一であり、オシドは多糖鎖の残りの部分である。
本発明のシッフ多塩基は、Ｐ゜がウロキナーゼ分子であ
り、ｎが６以下、好ましくは６、４又は３である場合の
前記式（ＩＶａ）に対応するのが有利である．本発明の
別の有利な実施態様では、Ｐ′が組織プラスミノーゲン
活性化因子（ｔｐ＾）の分子であり、ｎが１０以下、好
ましくは９、８又は５である．本発明の更に別の有利な
実施態様では、Ｐ゛がス１・レプトキナーゼ分子であり
、ｎが４以下、好ましくは２〜４の数である． 本発明では、前述のシッフ多塩基（ＩＶａ）、（ＩＶｂ
）、（ＩＶｃ）及び（ＩＶｄ）を水素化シアノホウ素ナ
トリウムで還元することによって対応Ｎ−ボリオシルー
ポリペプチド（Ｉａ）、（！ｂ）、（Ｉｃ）及び（！ｄ
）に変換する．本発明は、新規の医薬としての本発明の
Ｎ−ポリオシルーボリペブチドの使用にも係わる。治療
上の適応症は、Ｎ−ポリオシル−ポリペプチドの製造に
使用されるベブチド物質に特有の活性に応じて異なる．
本発明は特に、本発明のＮ−ポリオシルボリペブチドの
うち少なくとも１種類を活性成分として有効量だけ製薬
的に許容し得るベヒクルと組合わせたものを含む医薬組
成物に係わる。特に、腸管外投与によって使用し得る医
薬組成物の場合は、塩化物（例えば塩化ナトリウム）含
有又はグルコース含有溶質をベヒクルとして使用する。
この種の医薬組成物は、静脈注射、筋内注射又は皮下注
射によって、あるいは潅注で使用し得る。
これらの医薬組成物は単位用量当たり活性成分を５〜１
００ＩＩ＋ｇを含み得る．使用するポリベプチドがウロ
キナーゼの場合には、医薬組成物中のＮ−ポリオシルー
ボリペブチド使用量を注射用組成物１ｍｌ当たり０．２
〜２ｍｇにする．使用するポリペプチドが組織プラスミ
ノーゲン活性化因子の場合には、注射用組成物中のＮ−
ポリオシルーボリペブチド使用量を該注射用組成物ＩＩ
ｌｌ当たり０．２〜２ｍｇにする。
本発明の別の実施態様では、前記医薬組成物をカプセル
及び錠剤の製造に適した製薬ベヒクルとの組合わせによ
って経口投与に適した形態で形成する． 本発明の別の実施態様では、前記医薬組成物を適当な製
薬賦形剤との組合わせによって、局所使用、噴霧、坐薬
に適した形態で形成する。前記医薬組成物はまた、涙と
等張の溶質を含む眼への投与に適した形態に形成するこ
ともできる。この種の医薬組成物は通常、薬剤師によっ
て選択される任意の薬剤形態を有する。
本発明は、新規の生物学的試薬としての本発明のＮ−ポ
リオシルーボリベブチドにも係わる。本発明のＮ−ポリ
オシルーボリペブチドは特に、選択したペプチド物質に
応じて、酵素試薬又は診断用物質として使用でき、ある
いはその他の任意の用途に使用し得る。
本発明は以上説明してきた特定実施態様には限定されず
、その範囲内で様々な変形が可能である。
以下に実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明する。
使用するウロキナーゼはヒトの尿から製造する。
このウロキナーゼは大部分が分子量５４，０００ダルト
ンの５２タイプのウロキナーゼがらなる。この種のウロ
キナーゼは市販されている。その力価はＰｈａｒｍａｃ
ｏｐｌ！ｅ　Ｅｕｒｏｐ６ｅｎｎｅ（Ｒｅｆ．第４版）
に記載の方法によれば８５７００　ｉｕ／ｔａｇである
。
え１Ｌ （ａ）ヘパリンの解重合によるアルデヒド末端基の形成
： ヘパリンフラグメントを下記の方法で形成した： ナトリウム塩形悪の注射可能ヘバリン５００ｇを、温度
１８℃で４５００ｍ　ｌの蒸留水中に溶解する。使用ヘ
パリンのＹＷ／ＵＳＰ比は約１であり、これらの力価は
約１６０〜１７０の値を有する． 得られた溶液を強く撹拌し、そのｐＨを濃塩酸の？加に
よって２．５に下げる．次いで、亜硝酸ナトリウム１５
ｇを水３００ｍ　ｌ中に溶解する。この反応のｐｌｌを
濃塩酸の添加によって２．５に調整し、溶液の総量を５
０００ｍｌにする．反゜応を４５分間生起させ、その後
例えばヨウ化カリウムを含浸させた澱粉含有試験紙を用
いて、前記反応溶液中に亜硝酸イオンが残留しているか
否かを確認する（ＮＯ■−イオンが存在すれば試験紙＆
＆が青紫に発色する）．検査を３〜４分おきに行い、亜
硝酸イオンが完全に消失して澱粉含有ヨウ素試験紙に反
応が見られなくなるまで反応を続ける． 検査結果が陰性になれば、反応は終了したものとみなさ
れる． エタノール１０１を加え、４８時間静置してデカンテー
ションを行い、上澄みを除去して沈澱物即ち反応生成物
を回収する． 前記沈澱物を蒸留水９１中に再溶解する。
塩化ナトリウム１００．を加え、この溶液のｐＨを濃塩
酸の添加によって３．８に下げる．蒸留水を用いて前記
溶液の量を正確に１０１にし、強く撹拌しながら１０１
のエタノールを加える．４８時間静置する。
上澄みをサイポンで吸上げて除去する．沈澱物を回収し
、エタノールで洗浄し、真空下で乾燥させる。
下記の特性をもつ生成物ＣＹ　２１６−ＣＩ｛０が２３
０ｇ得られる； ＵＳＰ力価＝　　５２　ｉｕ／ｍｇ Ｙｉｎ及び１４ｅｓｓｌｅｒ力価−２２５　ｉｕ／Ｂ平
均分子量　　　　＝　４０００〜５０００ダルトン。
（ｂ）ウロキ＋−ゼトｃＹ　２１Ｂ−ＣＩＩＯとの結合
：力価ａｏ，ｏｏｏ，ｏｏｏｒＢ際単位（ｉｕ）ノウロ
キナーゼ７００ｍｇ　ヲ、ＮａＣＩ　０．５Ｍ、ｐｌｌ
７（７）　０．０５８　ＩＪ　ン酸バッファ９００ｍ　
ｌ中に溶解すル，　４２ｇノＣＹ　２１６−ＣＩＩＯ及
び３ｇ（７）水素化シアノホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ
．ＣＮ）を加える．２ＮソーダでｐＨを７に再調整し、
撹拌しながら温度＋４℃で５日間反応させる． （ｃ）沈澱処理： その後、硫酸アンモニウム（（Ｎｉｌ＜）２ｓｏ＜）６
００ｍｇ／ｍ１を加え、静置してデカン．テーションを
行い、次いで１５，０００−２０．００Ｏｒｐｍで１０
分間遠心分離にかける。沈澱物を回収して前記バッファ
と同じリン酸バッファ５０ｍ　Ｉ中に再溶解し、前記と
同じ条件で２回目の沈澱処理を行う。
（ｄ）ゲル枦過： 前記ステップで回収した生成物を前記と同じリン酸バッ
ファ中に再溶解して、１０ｃｍｘ　１００ｃｍのＵｌｔ
ｒｏｇｅｌ″＾Ｃ＾４４（スエーデン、Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ社）カラムに通す．この操作を２８０ｎｍの分光光
度計を用いて実施し、タンパク質のピークを回収する．
このピークは５１，０００，０００　ｉｕのウロキナー
ゼ、即ち８５％の活性収率に対応する． （ｅ）生成物の特性分析： クーマシーブルーを用いる方法（Ｓ．Ｍ．Ｒｅａｄ及び
Ｄ．｝１．Ｎｏｒｔｈｃｏｔｅ著＾ｎｎ．　　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，１９８１，１１６．５３−８４冫でタンパク
質を定量し、且つカルバゾールを用いる方法（ウロン酸
の定量、Ｒ．Ｂｉｔｔｅｒ及びＨ．Ｍｕｉｒ著＾ｎｎ．
ロｉｏｃｂｅｍ．，１９６２，４，３３０−３３４）で
ＣＹ　２１６−ＣＩＩＯを定量することによって、生成
物の結合率を調べる。
ＣＹ　２１Ｂ−ＣＩＩＯに関しては平均分子量４，５０
０ダルトンで計算し、ウロキナーゼに関しては平均分子
量５４，０００ダルトンで計算すると、ウロキナーゼ１
モル当たり５モルのＣＹ　２１６−ＣＩＩＯという結果
が得られる・． このようにして得た生成物を符号ＩＣ　１８７５で表す
． 実ｍ 揉作パラメータの一部を変えて種々の試験を行った． ｌ　ルーズの　　　　　　　Ｈ： 反応持続時間を変えて操作する： ＣＹ　２１６−ＣＩＩＯ　　５００ｍｇ（１１１ｕＭ）
ウロキナーゼ　２０Ｂ（０．１８１Ｍ）ＮａＣＮＢＩｌ
ｓ　　　　　　５０ｍｇバッファ　　　０．２Ｍ，ｐＨ
９のリン酸ｋバッファ温度 周釆一二 打ｔ』１圓一 ３日 ５日 ７日 ２グループの 温度を変えて操作するコ ＣＹ　２１６−ＣＨ０　　１４００翰ｇ（３１１μＨ）
ウロキナーゼ　３０ｍｇ（０．５４μＭ）ＮａＣＮＢＨ
ｚ　　　　１００ｍｇ のＣＹ　２１６−ＣＨＯ　ＵＫモル ３／１ ３／１ ３／Ｉ Ｈ： ４℃ バッフｙ　　　　０．０５Ｍ，ｐＨ７，ＮａＣＩ　０．
５Ｍのリン酸Ｎａバッファ 持続時間　　　５日間 ＬＬ： ＬＬ　　　　　　　”　　　ノＣＹ　２１６−ＣＨＯ　
ＵＫモル４℃　　　　　　　　　　　　６／１ ２０℃　　　　　　　　　　　　６／１前記第１グルー
プの実験では、モル比６１７、塩基性ｐＨ及び温度＋４
゜Ｃで操作を行う．この条件では、結合率がウロキナー
ゼ１モルに対し３モルのＣＹ　２１６−ＣＨＯで変わら
ず、酵素活性収率は１００％である．前記第２グループ
の実験では、モル比及び還元剤の量はほぼ同じであるが
、ｐｌ＋は中性にして操作を行う．この場合の結合率は
塩基性ｐＨを使用した場合より高い．この結果は操作温
度が＋４℃でも又は＋２０℃でも同じである．但し、酵
素活性収率は温度を低くした時の方が大きく、夫々活性
計算値の８５％及び６０％である． えｌ１ 硫酸アンモニウムによる沈澱処理ステップ（Ｃ）に代え
て、窒素圧カ下の限外Ｐ過膜で複合体を濃縮する燥作を
行いながら、試験を実施した。
この試験では、力価７０，０００ｉｕ／ｍｇのウロキナ
ーゼを使用する。このウロキナーゼは濃縮溶液の形態を
有するため、結合に有利な状態を得るために、この溶液
を硫酸アンモニウムでの沈澱処理にかける。
（ａ）アルデヒド末端基の形成： ヘパリンフラグメントＣＹ　２１６−Ｃ｝１０を実験１
の方法で形成した。
（ｂ）ウロキナーゼとＣＹ　２１６−ＣＨＯとの結合：
硫酸アンモニウム（ＮＨ．）２Ｓｏ．を５５０ｇ／１の
割合で用いて、６６０ｍ　ｌのウロキナーゼを沈澱処理
する．希Ｈ．ＳＯ．でｐＨを３．５にする． ４℃で１時間静置し、７．００Ｏｒｐｍで３０分間、次
いで１５，ＯＯＯｒｐｍで１５分間遠心分離にかける．
得られた沈澱物を、溶液の量が８０１になるように蒸留
水に溶解し、これにＮａＣＩ　０．５Ｍ　；　ｐｌｌ７
の０．０５Ｍリン酸バッファ５４ｍ　ｌを加える。
２　．　　ＣＹ　２１６−ＣＩＩＯとの　Δ前記ステッ
プで形成したウロキナーゼ溶液３３＋ｎｌ、即ちウロキ
ナーゼ１４０ｍｇを、前記バッファで量が１５０１にな
るまで希釈する．磁気撹拌下で７８のＣＹ　２１６−Ｃ
ＨＯ及び０．５Ｈｃｒ）ＮａＢＨｐＣＮを加える，２Ｎ
ソーダでｐｌ１を７に調整し、＋４゜Ｃでゆっくり撹拌
しながら５日間反応させる。
（Ｃ）限外ｒ過膜での濃縮： 反応生成物を未反応物から分離すべく、前記ステップで
形成した溶液を窒素圧力下でＰ過膜＾ｉｉｃｏｎ’　Ｙ
ＭＩＯ（フランスＡＩＩｉｃｏ社）にかけて濃縮する． （ｄ）ゲルｒ過： 前記ステップで回収した生成物を前記と同じリン酸バッ
ファ中に再溶解し、１０　ｘ　１００ｃｍのＵｌｔｒｏ
ｇｅｌ”　Ａｃ＾４４（スエーデンＰｈａｒｍａｃｉａ
社）の力ラムに通す。この処理を分光光度計を用いて実
施し、タンパク質のピークを回収する。このピークは６
０，０００ｉｕ／ｍＨの比活性、即ち８５％の活性収率
に対応する． （ｅ）生成物の特性分析： クーマシーブルーを用いる方法（前出の文献参照）でタ
ンパク質を定量し且つカルバゾールを用いる方法（前出
の文献参照）でＣＹ　２１６−Ｃ■０を定量して、生成
物の結合率を計算する。
ＣＹ　２１６−ＣＩ｛０に関しては平均分子量４，５０
０ダルトン、ウロキナーゼに関しては平均分子量５４，
０００ダルトンで計算すると、ウロキナーゼ１モルに対
し６モルのＣＹ　２１６−ＣＩＩＯという比が得られる
。このようにして得た生成物を符号ＩＣ２０２６で示す
。
この生成物を＋４゜Ｃで蒸留水中に溶解してＮａＣ　Ｉ
濃度を約０．１５Ｍにし且つマンニトールを１０ｍＨ／
ｍｌで加えた後、凍結乾燥させる。
ｔｐ＾とじては分子量６０，０００ダルトン、力価５５
０，ＯＯＯｉｕ／ｍｇのものを使用する。生成物の活性
はＰｌｏｕｇ及びＫｊｅｌｄｇａａｒｄの方法（Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ＾ｃｔａ，１９５７，旺，
２７８−２８２）に従い、フィブリンプレート上で検査
する。
ＬＬＬ： （ａ＞アルデヒド末端基の形成： ヘパリンフラグメントＣＹ　２１６−ＣＩＯを実施例１
と同様に製造した． （ｂ）ｔｔ’＾とＣＹ　２１６−ＣＨＯとの結合：２Ｂ
のｔｐ八をＮａＣＩ　ＬＭ，Ｔｗｅｅｎ　１ｐ．１０，
０００，ｐＨ７の０．０５Ｍリン酸バッファ３−１中に
溶解する，　２００ｍｇのＣＹ　２１６−ＣＨＯと８１
ＩｌｇのＮａＣＮＢＨｓとを加える。ＩＮ塩酸を数滴添
加して、ｐｌ１を７に調整する．撹拌しながら＋４℃で
５日間反応させる。
この段階での結合率は９０％（回収量９９０，０００　
ｉｕ）である。この数値は、この結合方法が酵素活性を
変化させないことを意味する． （ｃ）硫酸アンモニウムによる沈澱処理：硫酸アンモニ
ウムでの沈澱処理によって、反応生成物を未反応物質か
ら分離する．反応媒質に６５０ｍｇ／＋＋＋　ｌの（Ｎ
｝１４）２ＳＯ４を加える。８時間静置してデカンテー
ションを行い、次いで＋４℃で３０分間１５，０００−
２０，ＯＯＯｒｐｍの遠心分離にかける．形成された沈
澱物を回収する． その後、２回目の沈澱処理を行う。そのためには、回収
した前記沈澱物を３ｍｌの蒸留水中に再溶解し、新たに
６５０ｍｇ／ｍｌの（ＮＨ　４　）　２　ＳＯ　４を加
え、更に８時間静置してデカンテーションを行う．＋４
℃で３０分間、１８．００Ｏｒｐｍの遠心分離にかける
．形成された沈澱物を回収して、ＮａＣＩ　ＬＭ，Ｔｗ
ｅｅｎ１ｐ．１０，０００，ｐＨ７のリン酸０．０５Ｍ
バッファ５醜１中に再溶解する． （ｄ）生成物の特性分析： 前記ステップで形成した溶液から０．２ａ＋Ｉのアリコ
ートを採取する。０．２Ｎソーダで平衡処理したＳｅｐ
ｌ＋ａｃｒｙｌ’　Ｓ　２００（スエーデン、Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社）のカラム（ｉｏｏｃｍ　ｘ　２　．５ｃ
ｍ）でゲル枦過にかける．これは、ｔＰ＾の回収に必要
な濃縮処理である。
ピークのタンパク質を回収し、クーマシーブルーを用い
る方法（前出の文献参照）でタンパク質を定量し、且つ
カルバゾールを用いる方法でＣＹ　２１８ＣＩＩＯを定
量する（ウｂン酸の定量、前出の文献参照）。
結果を、ｔｐ＾に関しては雫岑分子量６０，０００ダル
トン、ＣＹ　２１６−ＣＩＩＯに関しては平均分子量４
，５００ダル）・ンで計算する．ｔＰ＾１モル当たり８
モルのＣＹ２１６−ＣＩＩＯという結果が得られる。
このようにして得た生成物を符号ＩＣ　１９０３で表す
． 火】ビし 使用する物質、即ちＣＹ　２１６−ＣＨＯ及びｔｐ＾の
モル比を変えて試験を行った． ｔＰＡ　　　　　　　２ｍｇ（０．０３３ｕＭ）ＮａＣ
ＮＢＩｌ，　　　　　８ｍｇ バッ７　７　　　　ｐＨ７，ＮａＣＩ　ＩＮ，Ｔｗｅｅ
ｎ　１ｐ．１０，０００の０．０５Ｍリン酸Ｎａバッフ
ァ 反応持続時間　５日 温度　　　　　＋４℃ １ｌ： ＣＹ　２１６−Ｃ１１０：２００ｍｇ（４４ｕＮ）　　
　　　　　　８／ＩＣＹ　２１６−ＣＩＯ：ｌｏｏｍｇ
（２２ｕＮ）　　　　　　　　５／１この結果が示すよ
うに、モル比を１３４６にするとｔｐ＾１モル当たり８
モルのＣＹ　２１６−ＣＨＯという結合率が得られ、モ
ル比を半分にすると結合率が大幅に低下してｔｐ＾１モ
ル当たり５モルのＣＹ　２１６−ＣＨＯになる． 大１≦し 硫酸アンモニウムによる沈澱処理ステップ（Ｃ）に代え
て、限外枦過膜で複合体を濃縮する操作を行いながら試
験を実施した。
ｔｐ八としては分子量７５，０００ダルトン、力価５８
０，０００　ｉｕ／ｍｇの＾ｃｔｉｖａｓｅ’（米国Ｇ
ｅｎｅｎｔｅｃｈ社）を使用する．このｔｐ＾は或る量
のアルギニンでコンディショニングされているため、結
合が生起するように、前記アルギニンを硫酸アンモニウ
ムでの沈澱処理によって除去する。
複合体が得られたら、好ましい条件で凍結乾燥できるよ
うに、アルギニン含有バッファ中に溶解する。
（ａ）アルデヒド末端基の形成： ヘパリンフラグメントＣＹ　２１６−ＣＩＩＯを実施例
１の方法で製造した。
（ｂ）ｔｐ＾とＣＹ　２１８−Ｃ｝１０との．結合：１
瓶の＾ｃｔｉｖａｓｅＲ（米国Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）
を１０ｍｌの蒸留水中に溶解する． この溶液５−１を７、５１の蒸留水で希釈する．硫酸ア
ンモニウム（ＮＨ４）２ＳＯ４を６００ｇ／ｌの割合で
加え、＋４℃で１５分間靜置す゜る．＋４℃で１５分間
１８，０００ｒｐｍの遠心分離にかけた後、沈澱物をＮ
ａＣｌ　１８　；Ｔｗｅｅｎ　８０　１ｐ．１０，００
０　；　ｐＨ７の０．０５Ｍリン酸バッファ２０ｍ　ｌ
中に溶解する． 硫酸アンモニウム添加操作と、沈澱物を前記バッファ中
に溶解した後での遠心分離操作とを２回繰り返す．靜置
時間は＋４℃で夫々３０分及び一晩である．最後の沈澱
物を先に使用したバッファ２０−１中に溶解する． ２　．　ＣＹ　２１６−ＣＩＯ　の　ム：前記溶液に、
前記と同じバッファ２ｍｌ中に溶解した７１鵬ｇのＮａ
ＢＨｓＣＮと前記バッファ中５１に溶解した１フフ８Ｂ
のＣＹ　２１６とを加える，　ＮａＯＨ（２Ｎ）を数滴
加えてｐＨを７に調整する． ＋４℃でゆっくり撹拌しながら４日間反応させる。
（Ｃ）限外ｒ過膜での濃縮： 反応生成物を未反応物から分離すべく、ステップ（ｂ）
で得た溶液をＰ過膜＾ｍｉｃｏｎ’　ＹＭ３０（フラン
スＡｍｉｃｏｎ社》にかけて５ｍｌまで濃縮する．この
５１の溶液をＮａＣｌ　１８　；　Ｔｗｅｅｎ　８０　
１ｐ．１０，０００　；　ｐＨ７の０．０５Ｍリン酸バ
ッファで量が５０ａ＋　ｌになるまで希釈し、次いで再
び５１まで濃縮する．この操作を３回繰り返す．最後の
濃縮物を先に使用したバッファで２０１まで希釈する． （ｄ）生成物の特性分析： ステップ（ｃ）で得た希釈濃縮物からｌｍｌを採取する
，　０．２Ｎソーダで平衡処理したＳｅｐｈａｃｒｙｌ
”　Ｓ２００（スエーデンＰｈａｒｍａｃｉａ社）のカ
ラム（１００ｃｍｘ２．５ｃｍ）でゲル一過にかける．
タンパク質両分を回収し、クーマシーブルーを用いる．
方法（前出の文献参照）でタンパク質を定量する． ＣＹ　２１６−ＣＩＯはカルバゾールを用いる方法で定
量する（ウロン酸の定量、前出の文献参照》．ＣＹ　２
１６−ＣＨＯに関しては平均分子量４，５００ダルトン
で計算し、ｔｐ＾に関しては７５，０００ダルトンで計
算すると、９／１というモル比が得られる．このように
して得た生成物を符号ＩＣ２０２５で示す．この生成物
を１．７ｇのし−アルギニン、０．５ｇのリン酸、４０
，　ｌの１０％Ｔｗｅｅｎ８０を含むｐ１｛６のバッフ
ァで希釈した後で凍結乾燥させる． 使用するストレプトキナーゼは分子量４７，０００ダル
トン及び力価３，６００ｉｕ／論ｇの市販のストレプト
キナーゼである． このストレプトキナーゼは使用前にゲル一過によって精
製した．バッフ７　［ＰＯ４−　０．０５Ｍ　；　Ｎａ
ＣｌＯ．５Ｍ　．　ｐＨ７］中に溶解した後、これと同
じバッファで平衡処理した旧Ｌｒｏｇｅｌ”＾Ｃ＾４４
（フランスＩＢＦ社）のカラムでゲルｒ過を行う．タン
パク質画分を回収し、次いで＾ｓ＋ｉｃｏｎ　ＹＭＩＯ
限外ｒ過膜で濃縮する。
（ａ）アルデヒド末端基の形成： ＣＹ　２１６−ＣＨＯフラグメントを実施例１と同様に
製造した． （ｂ）ストレプトキナーゼとＣＹ　２１６−ＣＩＯとの
結合： １瓶のストレプトキナーゼ（２５０，ＯＯＯｉｕ／瓶）
を前記リン酸バッファ２１中に溶解する．次いでこの溶
液を０．７輪ｇ／ｍｌ、即ち０．１４μＨに．濃縮する
．２．７８ＢのＣＹ　２１６−ＣＨＯ（即ちストレプト
キナーゼ１ｍｇ当たり約３．９７ｍｇ）と２．３５Ｈの
ＮａＢＨｓＣＮ（即ちスｌ・レプトキナーゼｌｍｇ当た
り３．３５ｇｅｇ）とを加える．２Ｎソーダを数滴加え
てｐＨを７に調整し、ゆっくり撹拌しながら＋４℃で３
日間反応させる。
（ｃ）ゲルｒ過： 前記ステップで得た溶液を、先に使用したリン酸バッフ
ァで予め平衡処理した５ｘｌＯＯｃｍのＵｌｔｒｏｇｅ
ｌ’　Ａｃ＾４４（フランスＩＢＦ社）のカラムに通す
．結合生成物を２８０ｎｍの分光光度計で検出し、回収
する． （ｄ）生成物の特性分析： クーマシーブルーを用いる方法（前出の文献参照）でタ
ンパク質を定量し、カルバゾールを用いる方法（前出の
文献参照）でＣＹ　２１６−ＣＩＯを定量する。
ＣＹ　２１６−ＣＨＯに関しては平均分子量４，５００
ダルトン、ストレブトキナーゼに関しては平均分子量４
７，０００ダルトンで計算すると、ストレプトキナーゼ
１モルに対して２モルのＣＹ　２１６−ＣＩＩＯという
比が得られる． このようにして得た生成物を符号ＩＣ２０２４で示す。
結合生成物ＩＣ　１８５７のウロキナーゼ活性をＲｕｙ
ｓｓｅｎ　Ｒ．及びＬａｕｗｅｒｓ＾．の方法（Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉ−ｃａｌｓ　　Ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｅ．
Ｓｔｏｒｙ−ＳｃｉｅｎＬｉａ，Ｇａｎｄ，Ｂｅｌｇｉ
ｕｍ，１９７８．１３５−１３９）により合成基板八Ｇ
ＬＭＥ上で調べた．この方法の原理は、ＳＬａａｔ　ｐ
ＨでＮ−α−アセチルーグリシンーＬ−リジンメチルエ
ステルの加水分解を定量することにある。
得られた結果を出発ウロキナーゼと比較して下に示す： 出発ＵＫ　　：　　８７，５００　ｉｕ／ｍｇＩＣ　　
１８５７　二　　　７４，０００　　−ｉｕ／ｍｇ４．
２．　　　　　ＩＣ　１９０３の　　、・゛結合生成物
ＩＣ　１９０３のｔＰ＾活性を前述のごとくＰｌｏｕｌ
１及びＫｊｅｌｄｇａａｒｄの方法によりフイブリンプ
レート上で調べた．この方法の原理は、固有のプラスミ
ノーゲンを含むフイブリン糸をベトリ皿の表面に形成し
、この上に定量すべき溶液のアリコートを配置すること
にある． 被検生成物の活性は、ｔｐ＾配置量に比例するフイブリ
ン糸の溶解領域を標準（１゜Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ
Ｍｏｎｄｉａｌｅ　ｄｅ　ｌａ　Ｓａｎｔ６の国際標準
》と対比したもので表される． 得られた結果を出発ｔＰ＾と比較して下に示す：出発ｔ
Ｐ八：　　　　　５５０，０００　　ｉｕ／ＢＩＣ　１
９０３：　　　３０２，０００　ｉｕ／ｍｇ４．３．生
　　ＩＣ２０２６の　素ゞ 結合生成物ＩＣ２０２Ｂのウロキナーゼ活性を下記の方
法で調べた： １　）　４．１で記述したＲｕｙｓｓｅｎ及びＬａｕｗ
ｅｒｓの方法Ｇこ従い合成基板ＡＧＬＭＥ上で検査。
２　）　４．２で記述したＰｌｏｕｇ及びＫｊｅｌｇａ
ａｒｄの方法に従いフイブリンプレート上で検査。
凍結乾燥後の出発ウロキナーゼ及び生成物これらの結果
から明らかなように、該結合生成物は極めて高いフイブ
リン溶解活性を示す．４．４．生　　ＩＣ２０２５の　
　、′結合生成物ＩＣ２０２５の活性を４．２で記述し
たＰｌｏｕｇ及びＫｊｅｌｇａａｒｄの方法に従いフイ
ブリンプレート上で調べた． 乾燥凍結後の出発ｔＰ＾及び生成物ＩＣ２０２５に関し
て得られた結果は下記の通りである。
出発ｔｐ＾　　：　１４，３７５，０００　ｉｕＩＣ２
０２５　　　：　１１，３００，０００　ｉｕ４．５，
　　　　　ＩＣ２０２４の　　、・゛生成物ＩＣ２０２
４の活性を凝塊法（ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｄｅｃａｉｌ
ｌｏｔ）で調べた．この方法では、フィブリン凝塊の溶
解時間を測定することによって、ストレブトキナーゼに
よるプラスミノーゲンのブラスミンへの変換の結果形成
されるプラスミンの量を求める．前記溶解時間は標準曲
線との比較によって測定する． 操作手順は下記の通りである： ｐｉｔ７．２の２０ｍＭリン酸バッファ２５ｍ　ｌ当た
り１２５Ｂで溶解したウシフィブリノーゲンと、同じバ
ッファ５ｍｌ当たり２ｍｇで溶解したトロンビン（フラ
ンスＲｏｃｈｅ社）と、バッフ７１１１１当たり０　．
　１６ｍｇで溶解したプラスミノーゲン（スエーデンＫ
ａｂ　ｉ社》と、７００ｉｕ／＋１のストレプトキナー
ゼ（内部標準）を５　ｉｕ／ｉｆに希釈したものとを使
用する。
４　ｉｕ／ｍｌ　〜１　ｉｕ／ｍｌの範囲の凛準を作る
。
定量を行うために、１＋ａｌの試料（標準又は結合生成
物）と、Ｏ．ｌｍｌのトロンピンと、０．１ｍｌのブラ
スミノーゲンとを３７℃で１０分間湯煎にかけてインキ
ユベートし、次いでｌｍｌのフィブリノーゲンを５秒お
きに加える。
力価を計算するために、標準１ｍｌ当たりの単位数に対
して凝塊溶解時間（秒）の曲線を作成する．結合生成物
に関して得られた溶解．時間を前記曲線と比較すれば、
力価が得られる． 出発ストレプトキナーゼ及び生成物ＩＣ２０２４につい
て得られた結果は下記の通りである：出発ストレプトキ
ナーゼ：　７０，０００　ｕ／ｍｇＩＣ２０２４ ：　５０，４００　　ｕ／ｍｇ この実験は、ハムスターにトロンビンを注射し、その結
果生じる肺血栓によって誘発される呼吸困難の時間を測
定することからなる。
慄』葺Ｌ』一： ５匹の動物からなるロットを３組使用する：第１ロット
にはトロンビンのみを投与する。
第２ロットにはトロンビン及びＵＫ（７，０００ｉｕ／
ｋｇ）を投与する。
第３ロットにはトロンビン及びＩＣ　１８５７（７，０
００ｉｕ／ｋｇ）を投与する。
被検生成物はトロンビンの前に注射する。これらの物質
は濯注ボンプ（Ｐａｌｅｅｒ）を用いて静脈内注射する
。
呼吸困難を観察し、「急性困難」と「総合困難（ｄ６ｔ
ｒｅｓｓｅ　ｔｏｔａｌｅ）」とに分け、持続時間を測
定することによって定量する。
結果を、トロンビンのみを投与した対照に対する減少率
（％）として下記の表に示す。
結論として、複合体ＩＣ　１８５７を用いた場合の呼吸
困難減少率は、総合呼吸困難に関しても急性呼吸困難に
関しても、ウロキナーゼのみによって得られる減少率よ
り遥かに大きい゜ことが確認される．５，２．良ＩＬ脛
』目１ ＩＣ　１８５７の゛゛　　の　査 この実験の目的は、本発明の生成物即ちウロキナーゼ複
合体ＩＣ　１８５７の溶解活性と、該複合体の製造に使
用した標準ウロキナーゼの溶解活性とを調べ比較するこ
とにある。
操作手順は下記の通りである： この検査は動物を用いて１週間行った。
この実験は、血栓形成誘発物質の注射によって血栓形成
を誘発し、次いで外科用鉗子を用いて動物の頚静脈を一
時的に結紮することを特徴とする。
血栓形成誘発物質はプロトロンビン濃縮複合体（ＣＣＰ
）　（２５ｕ／ｋｇ）及びＲｕｓｓｅ　ｌまむし毒混合
物（ＶＶＲ）（０．０１ｕ／ｋｇ）である． 血栓形成誘発物質の循環時間は２０秒である。
２つの頚静脈を右側の！？脈から結紮する．静脈血行停
止時間は１０分間である．鉗子を標準的方法で開放する
ことにより血行を部゜分的に開始させる．＾ｇｎｅｌｌ
ｉ（Ｔｈｒｏｍｂ．　Ｒｅｓ．　１９Ｂ５，４０，７６
９−７７７）に従い標準的方法で被検生成物をマイクロ
ポンプでの標準的注入（３０秒）により注射する。次い
で頚静脈を切開し、血栓を即座に評価する。この評価は
右の静脈から始める。
血栓の評価は０〜４の数値基準に従って行う。Ｏは血塊
が無い場合に対応し、４は大きな血塊が１つ存在する場
合に対応する。溶解活性は溶解率で表す。即ち、溶解率
１００％は前記数値Ｏに対応し、溶解率Ｏ％は前記数値
４に対応する。
１５匹のウサギを含む２つのグループの一方に標準ウロ
キナーゼを投与し、他方に複合体ＩＣ　１８５７を投与
する。
得られた結果を下記の表に示す。この表では統計的に有
意な差異（ｐ＜０．０００１）が見られ、ＩＣ　１８５
７の方が優れていることが知見される。
混Ｕ 生来のｔｐ＾の作用の動力学的特性と、本発明の生成物
ＩＣ　１９０３（実施例２、実験１）の作用の動力学的
特性とを調べ比較した。
実験はウサギを用いて行った（生成物毎に６匹）．１Ｌ
へ１１１』： 麻酔にかけた各動物の左方頚動脈にカテーテルを挿入す
る。最初の２．５１の血液採取を時間０（Ｔ．０）、ク
エン酸塩３．８％、比１／１０で行う。
１０，０００単位／ｋｇの参照物質及びＩＣ　１９０３
を右の耳の周縁静脈に平均量０．５ｍｌで注射する。１
分、２分、３分、４分、５分、７分、１０分、１５分、
２０分、３０分、４５分及び６０分目に採取を行う．採
取した血液を全部遠心分離にかけて、血小板欠乏血漿（
ｐｐｐ）を回収し、Ｎ．Ｍ．Ｍａｒｓｈ他の方法（Ｔｈ
ｒｏｍｂ．　Ｈａｅｍｏｓｔ．，１９７７．３８，５４
５−５４６）及びＪ．Ｇｒａｍ他の方法（Ｔｈｒｏｍｂ
　．Ｒｅｓ．，１９８６，４９，７８１−７８９）を変
形した方法でオイグロプリンを沈澱させる．次いでこれ
らのオイグロプリンをウシフィプリンプレート上に配置
し、３７℃で１８時間放置した後で溶解面積を測定する
。
結』１： フィブリンプレート上に観察された溶解活性を下記の表
に示す。
ＩＬＬ　　　　　Ｌ皿頂汰　　　　ＩＣ　１９０３Ｔ．
０　　　　　　　　６１．６６±３５．４８Ｔ＋１分　
　　２４６．６６±６６．４９１＋２分　　　２１３．
１６±５０．５５１＋　３分　　　　　　１７０．１６
±４９．１１Ｔ＋４分　　　１７８．８３±７５．００
Ｔ＋５分　　　１５６．００±４０．６１Ｔ＋　７分　
　　　　１２３．００±３５．６０Ｔ＋１０分　　　　
　　１２３．２０±２９．５２車Ｔ＋１５分　　　１０
０．５０±２８．１４Ｔ＋２０分　　　　　１１１．６
０±１８．７４車Ｔ＋ａｏ分　　　　　　９２．００±
４６．００本Ｔ＋４５分　　　　　　１０４．００±５
３．７５車Ｔ＋６０分　　　１２１．６０±５８　．　
７５＊注：溶解面積ＩＩＩＩＩ２＝平均値±ＳＤ本　　
動物数＝５ ■　動物数＝３ 本ロ　動物数＝４ ６８．６６±３６．８１ ３５５．８３±９８．７０ ３０１．５０±５４．９６ ２７２．００±６４．６６ ２５９．３３±５５．４６ ２４７．５０±６７．２４ ２１８．８３±４９．９０ １９７．６６±４５．３９ １６０．３３±４３．６６ １４２．００±５８．９４本 １３１．６６±５８．９４＊＊ １１０．７５±５８．２７本本本 １１９．１６±４３．７３ ６．２．　ＩＣ　１８５フの薬　　　　　　　査生来の
ウロキナーゼの作用の動力学的特性と、本発明の生成物
ＩＣ　１８５７（実施例１、実験１）の作用の動力学的
特性とを調べて比較した．実験はウサギを用いて行った
（各物質毎に７匹）。
挾ｊヱと｛訓−： 前記実施例６，１．のように動物に麻酔をかけてから時
間Ｔ．Ｏで最初の採血を行う。
次いで、前記と同じ条件で、動物に１０，０００単位／
ｋｇの参照物質及びＩＣ　１８５７を投与する．１分、
５分、１０分、１５分、２０分及び３０分目で採血を行
う。血液全部を遠心分離にかけて血漿を回収し、試料を
試験管で検査して、Ｋａｂ　ｉの方法によりアミド溶解
活性を評価する． この溶解活性は濃度計によって測定し、その測定値を、
ウロキナーゼ標準を同じ操作条件に移すことによって得
た較正曲線に従いウロキナーゼ単位に置き換える． 結果を下記の表に示す． 【１　　　１１賎恒ｈユ　　匡」堕Ｌ工亙団Ｔ．Ｏ　　
　　　　Ｏ，０　　　　　　　　０，ＯＴ＋　１分　　
　　　２０９．８±４０，７　　　　　　　　８５．８
±１０．２本本７＋　５分　　　８４．６±２５．７＊
　　　　５１．２！１８．２Ｔｒｉｏ分　　　　　　２
６．２上１５．４本　　　　　　３４．８±１１．６Ｔ
＋１５分　　　　　　　８．６±　７．０　　　　　　
　　１７．８±　９．１車＊Ｔ＋２０分　　　　　　　
　４．１±　４．８本　　　　　　　１６．５ｔｌｌ．
８Ｔ＋３０分　　　　０．７±１．３　　　　　５．２
±５．３注：本　動物数＝６ 本本動物数＝５ ＩＣ　１８５７の場合は時間＋１５分、＋２０分及び＋
３０分で動物の血漿中にまだウロキナーゼ活性が存在す
ることから、参照ウロキナーゼより長い持続性をもつ薬
物動力学的特性を有することが知見される． 及１九二：　　　の生　　の　　　　　査ＩＣ　１８５
７及びＩＣ　１９０３を２Ｂ／ｋＨの用量でマウスに一
回だけ静脈内注射した．これらの動物を８日間観察した
ところ、毒性の徴候は見られなかった．これらの結果か
ら明らかなように、本発明の生成物は医薬として極めて
有用である．実際、本発明で選択した結合方法は極めて
有利なものである．即ち、結合したペプチド物質が適当
な立体構造を維持するため該活性物質の活性が保持され
、またポリオシドからなる支持体への複合結合によって
前記活性物質の活性が増強されると共にその持続性が向
上するのである． 従って、ポリオシド系支持体に複合結合したウロキナー
ゼ及びプラスミノーゲン組織活性化因子のような血栓溶
解酵素は、血栓形成並びに形成されて間もない静脈血栓
及び動脈血栓の治療、例えば冠状血栓、肺血栓、静脈炎
、心筋梗塞の治療に使用し得る極めて優れた血栓溶解薬
を構成する．ＩＣ　１８５７、即ちウロキナーゼとヘパ
リンフラグメントとの複合体は、有利には、１，０００
〜ｉｏ，ｏｏｏｉｕ／ｋｇ／時、好ましくは２，０００
　〜４，０００　ｉｕ／ｋｇ／時の用量でヒトに投与し
得る。投与方法としては、継続的静脈内濯注、又はゆっ
くり時間をかけて行う静脈内注射を単独で又はプラスミ
ノーゲン処理と組合わせて使用する。

Claims (35)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）下記の式（ I ） （オシド−Ｚ′−ＣＨ＿２−ＮＨ＾−）＿ｎＰ′（ I
    ）［式中、 −Ｐ′はポリペプチドＰの分子中に元々存在するｎ個の
    遊離アミノ基に由来するｎ個のＮＨ基に結合したポリペ
    プチドＰのｎ価基であり、但しヘモグロビンの一価基で
    はなく、 −Ｚ′は天然の又は亜硝酸解重合によって生じたアルデ
    ヒド形態の多糖オシド−Ｚの単位Ｚからアルデヒド基を
    とった還元末端糖単位であり、 −オシドは多糖オシド−Ｚの残りの部分であり、ｎは２
    〜３０の整数である］ で示されるＨ−ポリオシル−ポリペプチド、又は該Ｎ−
    ポリオシル−ポリペプチドの医薬的に許容し得る塩の１
    つ。
  2. （２）Ｐ′が、グリコシル化もしくは非グリコシル化ペ
    プチドホルモン、グリコシル化もしくは非グリコシル化
    毒素、酵素及び酵素阻害物質の中から選択したポリペプ
    チドＰのｎ価基である請求項１に記載のＮ−ポリオシル
    −ポリペプチド。
  3. （３）式（ I ）中オシドが、ヘパリン、ヘパリンフラ
    グメント、コンドロイチン４−Ｓ硫酸、コンドロイチン
    ６−Ｓ硫酸、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の中から
    選択したグリコサミノグリカンたるオシド−Ｚから還元
    末端単位Ｚをとった基を表すことを特徴とするＮ−ポリ
    オシル−ポリペプチド。
  4. （４）式（ I ）中、 −Ｐ′及びｎが請求項１に記載の意味を表し、−Ｚ′が
    ヘパリンの亜硝酸解重合によって生じたアルデヒド形態
    のヘパリン系グリコサミノグリカンたるオシド−Ｚの還
    元末端糖単位であり、前記オシド−Ｚが平均分子量、２
    ０００〜８０００ダルトンのヘパリンフラグメント混合
    物からなり、 −オシドが多糖オシド−Ｚの残りの部分であることを特
    徴とする請求項１から３のいずれかに記載のＨ−ポリオ
    シル−ポリペプチド。
  5. （５）式（ I ）中、 −Ｐ′及びｎが請求項１に記載の意味を表し、−Ｚ′が
    ヘパリンの亜硝酸解重合によって生じたアルデヒド形態
    のヘパリン系グリコサミノグリカンたるオシド−Ｚの還
    元末端糖単位であり、前記オシド−Ｚが平均分子量約４
    ５００ダルトンのヘパリンフラグメント混合物からなり
    、 −オシドが多糖オシド−Ｚの残りの部分であることを特
    徴とする請求項１から４のいずれかに記載のＮ−ポリオ
    シル−ポリペプチド。
  6. （６）式（ I ）中、Ｚ′が下記の構造 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ＿１は水素又はＳＯ＿＾３−基である］を有
    することを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載
    のＮ−ポリオシル−ポリペプチド。
  7. （７）式（ I ）中、 −Ｐ′が血栓溶解酵素の分子中に元々存在するｎ個の遊
    離アミノ基に由来するｎ個のＮＨ基に結合した前記血栓
    溶解酵素のｎ価基であり、 ｎが２〜１０である ことを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載のＮ
    −ポリオシル−ポリペプチド。
  8. （８）式（ I ）中、 −Ｐ′がウロキナーゼの分子中に元々存在するｎ個の遊
    離アミノ基に由来するｎ個のＮＨ基に結合した前記ウロ
    キナーゼのｎ価基であり、 ｎが６以下、好ましくは６、４又は３であることを特徴
    とする請求項７に記載のＮ−ポリオシル−ポリペプチド
    。
  9. （９）式（ I ）中、 −Ｐ′がストレプトキナーゼの分子中に元々存在するｎ
    個の遊離アミノ基に由来するｎ個のＮＨ基に結合した前
    記ストレプトキナーゼのｎ価基であり、ｎが２〜４であ
    る ことを特徴とする請求項７に記載のＮ−ポリオシル−ポ
    リペプチド。
  10. （１０）式（ I ）中、 −Ｐ′がｔＰＡの分子中に元々存在するｎ個の遊離アミ
    ノ基に由来するｎ個のＮＨ基に結合した前記ｔＰＡのｎ
    価基であり、 ｎが３〜１０である ことを特徴とする請求項７に記載のＮ−ポリオシル−ポ
    リペプチド。
  11. （１１）下記の式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、 −Ｒ＿１は水素又はＳＯ＿３＾−基であり、−Ｒ＿２は
    アセチル基又はＳＯ＿３＾−基であり、−Ｐ′はウロキ
    ナーゼの分子中に元々存在する３つの遊離アミノ基に由
    来する３つのＮＨ基に結合した前記ウロキナーゼの三価
    基であり、 ｐは４〜２４であって、ＡＴIIIへの固定部位を含む亜
    硝酸解重合によって生じたヘパリンフラグメントの平均
    分子量約４５００ダルトンの混合物中における二糖単位
    の数を表す］ で示されるＮ−ポリオシル−ポリペプチド。
  12. （１２）下記の式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、 −Ｒ＿１は水素又はＳＯ＿３＾−基であり、−Ｒ＿２は
    アセチル基又はＳＯ＿３−基であり、−Ｐ′はｔＰＡの
    分子中に元々存在する５つの遊離アミノ基に由来する５
    つのＮＨ基に結合した前記ｔＰＡの五価基であり、 ｐは４〜２４であって、ＡＴIIIへの固定部位を含む亜
    硝酸解重合によって生じたヘパリンフラグメントの平均
    分子量約４５００ダルトンの混合物中における二糖単位
    の数を表す］ で示されるＮ−ポリオシル−ポリペプチド。
  13. （１３）下記の式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、 −Ｒ＿１は水素又はＳＯ＿３−基であり、 −Ｒ＿２はアセチル基又はＳＯ＿３−基であり、−Ｐ′
    はｔＰＡの分子中に元々存在する８つの遊離アミノ基に
    由来する８つのＮＨ基に結合した前記ｔＰＡの八価基で
    あり、 ｐは４〜２４であって、ＡＴIIIへの固定部位を含む亜
    硝酸解重合によって生じたヘパリンフラグメントの平均
    分子量約４５００の混合物中における二糖単位の数を表
    す］ で示されるＮ−ポリオシル−ポリペプチド。
  14. （１４）下記の式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、 Ｒ＿１は水素又はＳＯ＿３＾−基であり、 Ｒ＿２はアセチル基又はＳＯ＿３＾−基であり、Ｐ′は
    ｔＰＡの分子中に元々存在する９つの遊離アミノ基に由
    来する９つのＮＨ基に結合した前記ｔＰＡの九価基であ
    り、 ｐは４〜２４であって、ＡＴIIIへの固定部位を含む亜
    硝酸解重合によって生じたヘパリンフラグメントの平均
    分子量約４５００ダルトンの混合物中における二糖単位
    の数を表す］ で示されるＮ−ポリオシル−ポリペプチド。
  15. （１５）下記の式（II） Ｐ＾■（ＮＨ＿２）＿ｍ（II） ［式中、Ｐ＾■はポリペプチドＰのｍ個の遊離ＮＨ＿２
    基と結合したｍ価基であり、前記ｍ個のＮＨ＿２基は末
    端アミノ基及びポリペプチドに含まれる（ｍ−１）個の
    リシンのε位に位置するアミノ基である］ で示されるポリペプチドＰを、下記の式（III）オシド
    −Ｚ（III） ［式中、Ｚは多糖（III）の天然の又は亜硝酸解重合に
    よって生じたアルデヒド形態の還元末端糖単位であり、
    オシドは前記多糖の鎖の残りの部分である］ で示される過剰量のポリオシドで処理し、その結果得ら
    れる下記の式（IV） （オシド−Ｚ′−ＣＨ＝Ｎ−）ｎＰ′（IV）［式中、一
    価基オシド−Ｚ′−は前述のごとき多糖オシド−Ｚから
    単位Ｚのアルデヒド基がとれた基を表し、Ｐ′及びｎは
    請求項１に記載の意味を有する］のシッフ多塩基をシア
    ノホウ水素化物で還元することを特徴とする請求項１に
    記載のＮ−ポリオシル−ポリペプチドの製造方法。
  16. （１６）出発ポリオシド即ちオシド−Ｚとして、亜硝酸
    解重合によって得たヘパリンフラグメントの平均分子量
    ２０００〜８０００ダルトンの混合物を使用することを
    特徴とする請求項１５に記載の方法。
  17. （１７）出発ポリオシド即ちオシド−Ｚとして、亜硝酸
    解重合によって得たヘパリンフラグメントの平均分子量
    約４５００ダルトンの混合物を使用することを特徴とす
    る請求項１５又は１６に記載の方法。
  18. （１８）シアノホウ水素化物として水素化シアノホウ素
    ナトリウムを使用することを特徴とする請求項１５から
    １７のいずれかに記載の方法。
  19. （１９）シアノホウ水素化物として水素化シアノホウ素
    ナトリウムを使用し、Ｐ＾■（ＮＨ＿２）＿ｍとオシド
    −Ｚとの間の反応を前記水素化シアノホウ素ナトリウム
    の存在下で生起させて、最終Ｎ−ポリオシル−ポリペプ
    チドを直接形成することを特徴とする請求項１５から１
    ８のいずれかに記載の方法。
  20. （２０）下記の式（IV） （オシド−Ｚ′−ＣＨ＝Ｎ−）ｎＰ′（IV）［式中、 −Ｐ′はポリペプチドＰの分子中に元々存在するｎ個の
    遊離アミノ基に由来するｎ個のＮＨ基に結合したポリペ
    プチドＰのｎ価基であり、但しヘモグロビンの一価基で
    はなく、 −Ｚ′は天然の又は亜硝酸解重合によって生じたアルデ
    ヒド形態の多糖オシド−Ｚの単位Ｚからアルデヒド基を
    とった還元末端糖単位であり、 −オシドは多糖オシド−Ｚの残りの部分であり、ｎは２
    〜３０の整数である］ で示されるシッフ多塩基。
  21. （２１）Ｐ′が、グリコシル化もしくは非グリコシル化
    ペプチドホルモン、グリコシル化もしくは非グリコシル
    化毒素、酵素及び酵素阻害物質の中から選択したポリペ
    プチドＰのｎ価基であることを特徴とする請求項２０に
    記載のシッフ多塩基。
  22. （２２）式（IV）中オシドが、ヘパリン、ヘパリンフラ
    グメント、コンドロイチン４−Ｓ硫酸、コンドロイチン
    ６−Ｓ硫酸、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の中から
    選択したグリコサミノグリカンたるオシド−Ｚから還元
    末端単位Ｚをとった基を表すことを特徴とする請求項２
    ０又は２１に記載のシッフ多塩基。
  23. （２３）式（IV）中、 −Ｚ′がヘパリンの亜硝酸解重合によって生じたアルデ
    ヒド形態のヘパリン系グリコサミノグリカンたるオシド
    −Ｚの還元末端糖単位であり、−前記オシド−Ｚが平均
    分子量２０００〜８０００ダルトンのヘパリンフラグメ
    ント混合物からなり、オシドが多糖オシド−Ｚの残りの
    部分であることを特徴とする請求項２０に記載のシッフ
    多塩基。
  24. （２４）式（IV）中、 −Ｐ′及びｎが請求項２０に記載の意味を表し、−Ｚ′
    がヘパリンの亜硝酸解重合によって生じたアルデヒド形
    態のヘパリン系グリコサミノグリカンたるオシド−Ｚの
    還元末端糖単位であり、前記オシド−Ｚが平均分子量約
    ４５００ダルトンのヘパリンフラグメント混合物からな
    り、 オシドが多糖オシド−Ｚの残りの部分であることを特徴
    とする請求項２０に記載のシッフ多塩基。
  25. （２５）式（IV）中、Ｚ′が下記の構造 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ＿１は水素又はＳＯ＿３−基である］を有す
    ることを特徴とする請求項２０から２４のいずれかに記
    載のシッフ多塩基。
  26. （２６）式（IV）中、 −Ｐ′が血栓溶解酵素の分子中に元々存在するｎ個の遊
    離アミノ基に由来するｎ個のＮＨ基に結合した前記血栓
    溶解酵素のｎ価基であり、 ｎが２〜１０である ことを特徴とする請求項２０から２５のいずれかに記載
    のシッフ多塩基。
  27. （２７）式（IV）中、 −Ｐ′がウロキナーゼの分子中に元々存在するｎ個の遊
    離アミノ基に由来するｎ個のＮＨ基に結合した前記ウロ
    キナーゼのｎ価基であり、 ｎが６以下、好ましくは６、４又は３であることを特徴
    とする請求項２６に記載のシッフ多塩基。
  28. （２８）式（IV）中、 Ｐ′がストレプトキナーゼの分子中に元々存在するｎ個
    の遊離アミノ基に由来するｎ個のＮＨ基に結合した前記
    ストレプトキナーゼのｎ価基であり、ｎが２〜４である ことを特徴とする請求項２６に記載のシッフ多塩基。
  29. （２９）式（IV）中、 Ｐ′がｔＰＡの分子中に元々存在するｎ個の遊離アミノ
    基に由来するｎ個のＮＨ基に結合した前記ｔＰＡのｎ価
    基であり、 ｎが３〜１０である ことを特徴とする請求項２６に記載のシッフ多塩基。
  30. （３０）下記の式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、 Ｒ＿１は水素又はＳＯ＿３−基であり、 Ｒ＿２はアセチル基又はＳＯ＿３−基であり、Ｐ′はウ
    ロキナーゼの分子中に元々存在する３つの遊離アミノ基
    に由来する３つのＮＨ基に結合した前記ウロキナーゼの
    三価基であり、 ｐは４〜２４であって、ＡＴIIIへの固定部位を含む亜
    硝酸解重合によって生じたヘパリンフラグメントの平均
    分子量約４５００ダルトンの混合物中における二糖単位
    の数を表す］ で示されるシッフ多塩基。
  31. （３１）下記の式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、 −Ｒ＿１は水素又はＳＯ＿３−基であり、 −Ｒ＿２はアセチル基又はＳＯ＿３−基であり、Ｐ′は
    ｔＰＡの分子中に元々存在する５つの遊離アミノ基に由
    来する５つのＮＨ基に結合した前記ｔＰＡの五価基であ
    り、 ｐは４〜２４であって、ＡＴIIIへの固定部位を含む亜
    硝酸解重合によって生じたヘパリンフラグメントの平均
    分子量約４５００ダルトンの混合物中における二糖単位
    の数を表す］ で示されるシッフ多塩基。
  32. （３２）下記の式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、 −Ｒ＿１は水素又はＳＯ＿３−基であり、 −Ｒ＿２はアセチル基又はＳＯ＿３−基であり、Ｐ′は
    ｔＰＡの分子中に元々存在する８つの遊離アミノ基に由
    来する８つのＮＨ基に結合した前記ｔＰＡの八価基であ
    り、 ｐは４〜２４であって、ＡＴIIIへの固定部位を含む亜
    硝酸解重合によって生じたヘパリンフラグメントの平均
    分子量約４５００ダルトンの混合物中における二糖単位
    の数を表す］ で示されるシッフ多塩基。
  33. （３３）下記の式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、 −Ｒ＿１は水素又はＳＯ＿３−基であり、 −Ｒ＿２はアセチル基又はＳＯ＿３−基であり、−Ｐ′
    はｔＰＡの分子中に元々存在する９つの遊離アミノ基に
    由来する９つのＮＨ基に結合した前記ｔＰＡの九価基で
    あり、 ｐは４〜２４であって、ＡＴIIIへの固定部位を含む亜
    硝酸解重合によつて生じたヘパリンフラグメントの平均
    分子量約４５００ダルトンの混合物中における二糖単位
    の数を表す］ で示されるシッフ多塩基。
  34. （３４）活性物質として請求項１から１４のいずれかに
    記載のＮ−ポリオシル−ポリペプチドの少なくとも１つ
    を有効量だけ薬剤ビヒクルと組合わせて含むことを特徴
    とする医薬組成物。
  35. （３５）請求項１から１４のいずれかに記載の物質から
    なる生物学的試薬。
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