PT90655B - Processo de preparacao de n-poliosilpolipeptidos, dos seus intermediarios e de composicoes farmaceuticas contendo aqueles compostos - Google Patents

Processo de preparacao de n-poliosilpolipeptidos, dos seus intermediarios e de composicoes farmaceuticas contendo aqueles compostos Download PDF

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Description

MEMORIA DESCRITIVA presente invento refere-se a substâncias polipeptídicas modificadas por ligação covalente a cadeias poliosídicas biocompatíveis, estando estas últimas fixadas à substância peptidica apenas pela sua extremidade redutora. 0 invento refere-se também a um processo de preparação das substâncias peptídicas modificadas em questão bem como de composiçoes farmacêuticas que as conte nham e ao seu uso em terapêutica.
Os polipéptidos, sobretudo quando se trata de proteínas e mais particularmente de enzimas, são produtos muitas vezes pouco estáveis no organismo. As preparações que os contêm perdem a sua actividade com o tempo e, quando são administradas ao homem como medicamento, são rapidamente catabolizados; a sua semi-vida é a_s sim de curta duração.
Diversos meios foram já utilizados para tentar ultrapassar esses inconvenientes mais particularmente a ligação covalente a cadeias macromoleculares. Entre estas últimas, utilizaram-se cadeias alifáticas lineares hidroxiladas, tais como o polietileno-glicol ou o polipropileno-glicol (PEG ou PPG) ou poliosidos do tipo dextrano, efectuando-se as ligações entre os grupos hidroxilados e, consoante os processos, os grupos aminados ou carboxilados das proteínas ou entre os grupos carboxilados do paliosido e os grupos sulfidrilo ou amido do polipéptido (A.V. Maximenko et al., Vopr. Med. Khim. 19B5, Jl, 12-20, CA 1985, 103, 171707k).
Mais recentemente, propôs-se igualmente a utilização como cadeia macromolecular de uma glicosaminoglicana particular, a con droitina-sulfato, patente europeia 242 416. As ligaçães propostas são efectuadas por estabelecimento de ligações amida entre os grupos carboxilados das condroitina-sulfatos e os grupos amino das proteínas.
Por outro lado, propôs-se a ligação de modo covalente da hemoglobina a fragmentos de glucosaminoglicana, patente europeia
0265865. Neste caso, as glicosaminoglicanas foram escolhidas po_r que se conhecia a sua capacidade de formar, com a hemoglobina,
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0354 Ε
-3através das seus grupos sulfato e carboxilo, ligações iónicas que modificam a conformação daquela com vista a aumentar a sua capac_i dade retenção de oxigénio. Há assim uma interacção necessária e_n tre o polipéptido e o poliósido, o que constitui um caso muito particular em oposição ao objectivo do presente invento.
Trata-se de cadeias macromoleculares do tipo PEC ou PPG, de poliosidos tipo dextrana ou de condroitina-sulfatos, existem, para cada cadeia macromolecular nos trabalhos descritos, vários pontos de ligação, o que provoca uma modificação na estrutura te_r ciária da proteína ligada e uma diminuição da sua actividade.
Chama-se estrutura terciária ao arranjo tridimensional da cadeia de aminoácidos que se traduz numa conformação nativa, está^ vel e activa biologicamente.
Foi então útil procurar um método que permitisse respeitar em grande parte a estrutura terciária dos polipéptidos, confe rindo-lhes simultaneamente características farmacológicas e farma cocinéticas in vivo melhoradas e uma melhor estabilidade in vitro
De acordo com o presente invento, é possível efectuar um enxerto da cadeia poliosídica sobre a cadeia peptídica num ponto único da referida cadeia poliosídica por recurso a um grupo al de_£ do único presente ou gerado na extremidade da cadeia polisídica.
Sabe-se que os açúcares, em geral, e os polissacarídeos, em particular, são caracterizados por uma estrutura hemiacetálica (cíclica ou fechada) em equilíbrio com uma estrutura aldeídica correspondente (linear ou aberta) segundo o esquema (A)
sendo R por exemplo um hidroxilo ou um grupo amino livre ou sulfa tado, estando o referido equilíbrio, nos açúcares naturais, quase totalmente deslocado para a esquerda.
Sabe-se ainda que certos métodos de despolimerização de
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-4polissacarídeos , nomeadamente a despolimerização por acção do áci do nitroso, designada a seguir por despolimerização nitrosa, conduzem à transformação de unidades osidicas. Assim, por exemplo as unidades glicosídicas de heparina, são transformadas, pela de_s polimerização nitrosa, em unidades 2,5-anidromanosídicas segundo o Esquema (B)
CHO apresentando a referida unidade 2,5-anidromanosídica um grupo aldeldico.
A técnica de despolimerização nitrosa permitiu preparar heparinas de baixo peso molecular possuindo na extremidade, da maioria das espécies, 2,5-anidromanose, portanto um grupo aldeíd_i co.
Verificou-se agora que fazendo reagir um polissacarideo com um polipéptido, a forma aldeídica do referido polissacarideo reage com as aminas livres do referido polipéptido para dar um poli-base de Schiff. Esta reacção comporta o deslocamento do equilíbrio do Esquema A acima indicado em direcção à direita e à formação da poli-base de Schiff.
Verificou-se ainda que a mesma reacção teve lugar com po1issacarídeos obtidos por despolimerização nitrosa de acordo com o Esquema B acima indicado e que a poli-base de Schiff se forma rapidamente com rendimentos satisfatórios.
Mais ainda, como os poliosidos só têm uma extremidade redu tora, a ligação não pode dar-se senão ao nível dessa extremidade, sendo assim conservada a estrutura terciária do polipéptido.
Verificou-se ainda que por redução das poli-bases de
Schiff se obtêm conjugados polissacarídeo/polipéptido que são estáveis em meio fisiológico e que conferem ao polipéptido uma melhor farmacocinética. Nalguns casos, estes conjugados possuem um
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-5grau superior de actividade em relação ao polipéptido.
Verificou-se posteriormente que fazendo reagir o polissacarideo com o polipéptido na presença de um agente redutor, se obtém directamente o conjugado polissacarldeo/polipéptido, sem isolar a poli-base de Schiff intermediária, com óptimos rendimentos .
Assim, o presente invento refere-se, segundo um dos seus aspectos, a um N-poliosil-polipéptido de fórmula (Ósido-Z·-CH29NH-)pP’ (I) no qual
- P' é o radical n-valente de um polipéptido P ligado aos n grupos NH provenientes de n grupos amino livres presentes origi. nalmente na molécula de P, sendo P' diferente do radical monovalente da hemoglobina;
- Z' é a unidade terminal sacarídica redutora do polissaz carídeo Osido-Z na sua forma aldeídica, natural ou proveniente da despolimerização nitrosa, privada do grupo aldeídico de Z;
Z z
- Osido é o residuo do polissacarídeo Osido-Z;
- n é um número inteiro de 2 a 30;
ou, se for caso disso, um dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
Na fórmula I acima referida, P’ é, com vantagem, o radical n-valente de um polipéptido P escolhida de entre as hormonas peptídicas glicosiladas ou não, as toxinas glicosiladas ou não, as enzimas e os inibidores de enzimas.
Na presente descrição, o polipéptido designado por P, é representado esquematicamente pela fórmula p°(NH2)m (11) em que P° é o radical m-valente do polipéptido P ao qual estão l_i gados os seus m grupos funcionais NH2 livres, sendo os referidos m grupos funcionais NH^ 0 grupo amino terminal e os (m-l) grupos
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-6amino em posição epsilon das lisinas contidas no polipéptido.
Na fórmula II acima referida, m representa a totalidade dos grupos amino disponíveis para a formação das poli-bases de Schiff, mas a ligação não se dá senão num certo número, designado por n, desses grupos amino; o radical n-valente ligado aos grp pos amino que reage com o grupo aldeído de Z é aqui designado por P*.
Entende-se que, na presente descrição o conceito alargado de valência se refere às ligaçães livres dos radicais ou das es. truturas em causa. Assim o radical P* m-valente ou n-valente é o resíduo do polipéptido P com as suas m ou n ligaçães livres tal como ilustradas acima e as estruturas bivalentes Ia, lb, Ic e Id abaixo indicados explicam-se por si próprias.
Na presente descrição, o polissacarídeo é esquematicamente representado pela fórmula
Osido-Z (UI) sendo Z a unidade sacarídica terminal redutora do referido polissacarídeo na sua forma aldeídica natural ou proveniente de uma des. polimerização nitrosa e sendo ósido o resíduo da cadeia do re f er_i do polissacarídeo.
radical monovalente Osido-Z'- representa o polissacaríz deo Dsido-Z tal como definido acima, privado do grupo aldeídico de Z.
z
Mais particularmente, na fórmula I Osido representa o raz dical de um polissacarídeo Osido-Z (III), denominado igualmente por poliosido, proveniente de substâncias naturais biocompatíueis, sem resíduos aglíconas, estando o referido poliósido privado de uma unidade sacarídica terminal redutora (z).
termo biocompativel tal como utilizado na presente descrição designa a propriedade dos polissacarídeos naturais, com um peso molecular, de preferência, de preferência, inferior a 100 000, nomeadamente compreendido entre 1 200 e 50 000, e dos seus derivados ou análogos cujos constituintes se encontram natu69 290
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-7ralmente no organismo dos mamíferos e que, devido a este facto, pci dem ser facilmente metabolizados e eliminados.
E vantajoso que o poliósido proveniente de substâncias na turais biocompatíveis seja um glicosaminoglicano tal como definido por R.W. Oeanloz, Arthritis and Reumatism, 1960, _3, 233-237 e por B. Casu, Advances in Carbohidrate Chemistry and Biochemistry, 1985, 43, 51-134.
Preferencialmente, na fórmula I acima referida, ósido representa o radical de um glicosaminoglicano Osido-Z escolhido de entre a heparina, os fragmentos de heparina, o ccndroitina-4-S-sul. fato, o condroitina-6-S-sulfato, a heparana-sulfato e a dermatona -sulfato, livre da unidade terminal redutora 2.
Num aspecto particular e vantajoso da invenção, o N-polio sil-polipéptido provém de um glicosaminoglicano do tipo heparínico Osido-Z, cujo símbolo Z representa a parte terminal redutora de uma cadeia de heparina que foi sujeita a uma despolimerização nitrosa. Ele é representado pela fórmula (la) seguinte
Osido
ι (Ia) que corresponde à fórmula (i), sendo o grupo entre as linhas a tracejado o radical Z’ e sendo R^ H ou S0^~.
Na fórmula (la) acima, Osido designa, de acordo com um a_s pecto preferencial do presente invento, o radical proveniente de uma heparina, representada pela fórmula
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na qual R^ representa hidrogénio ou um grupo Ξ0^ , R^ representa um grupo acetilo ou um grupo SO^ e p é 4 a 24.
Entende-se que o valor de p, no radical (la·), é tal que representa o número de unidades dissacarldicas de fragmentos de heparina provenientes de umadespolimerização nitrosa da heparina natural, em misturas tendo, vantajosamente, uma massa molecular média situada entre 2 000 e B 000 daltons, de preferência cerca de 4 500 daltons ou cerca de 2 500 daltons.
Num outro aspecto particular do invento, o N-poliosil-poz lipéptido proveniente de um polissacarídeo Osido-Z em que o símbo lo Z representa a extremidade redutora terminal natural de um gl_i cosaminoglicano do tipo heparlnico. Ele é representado pela fórmula l(b) seguinte: ' ι
I
Osido —I
I
(Ib) que corresponde à fórmula I, sendo o grupo entre as linhas a tracejado o radical Z', sendo R. H ou S0 , sendo R H, S0 ou acez -L -z 2 3 tilo e sendo Osido o resto da cadeia heparlnica.
Na fórmula (ib) acima, R2 representa de preferência S0^~ ou acetilo e Osido representa de preferência o radical (la1), no
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0354 Ε /
/
-9qual ρ é 10 a 100, senda o valor de p tal que representa o número de unidades dissacarídicas que constituem as misturas de cadeias presentes na heparina natural.
Num outro aspecto particular do invento, o N-poliosil-poz lipéptido provém de um polissacarídeo Osido-Z em que o símbolo Z representa a extremidade redutora terminal de um glicosaminoglica. no do tipo condroitina ou dermatana-sulfato. Ele é representado pela fórmula (ic) seguinte:
z
Osido
NHP ' (Ic) que corresponde à fórmula I, sendo o grupo entre as linhas a tracejado o radical Z', sendo um dos R^ H e o outro S0^_ e sendo 0s_i do 0 resto da cadeia da condroitina-sulfato- ou da dermatana-sulfato.
z
Na fórmula (ic) acima, o radical Osido é representado pe1 a fórmula (Ic')
·( Ic ’) onde um dos R^ representa o hidrogénio e o outro um grupo SO^-
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-10ρ é 10 a 100, sendo o valor de p tal que representa o número de unidades dissacarídicas que formam as misturas de cadeias presentes na condroitina-sulfato ou dermatana-sulfato.
Num outro aspecto particular do invento, o N-poliosil-poX lipéptido provém de um polissacarideo Osido-Z que sofreu uma despolimerização em condições tais que a cadeia possui um número de unidades ímpar onde a unidade 2 redutora representa um ácido uróni co, ácido D-glucurónico ou L-idurónico. Ele é então representado pela fórmula (ld) seguinte:
P' (Id) que corresponde à fórmula (I), sendo o grupo entre as linhas a
X tracejado o radical Z', sendo R, H ou S0^~ e sendo Osido o resto da cadeia polissacarídica.
presente invento compreende igualmente os compostos de fórmula (la) e (ib) acima indicados, nos quais Osido representa o resto dos fragmentos de heparina, homogéneos no que diz respeito à sua massa molecular (fórmula Ia’, p = 1-10) e contendo eventual, mente o local de fixação da antitrombina III. Ele compreende aijn da compostos de fórmula Ib acima referenciados, em que Osido representa o resto de um oligossacarídeo de síntese (fórmula Ia', p - 1-16). Nas fórmulas (la), (Ib), (ic) e (id) acima referencija das, o radical Z' pode ser melhor representado pelas estruturas bivalentes respectivas seguintes:
CH 0R I 2 1
CHOH (Ib»)
-O-CH-CH-CHQH NHR2
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0354 Ε
-11ij:h2 or± fHOH
CHOR.
I 1
-0-CH-CH- e
I
NHCOCH^ (Ic)
COO
I
CHOH
I
O-CH-CH-CHI I OH ORX (Id) nas quais R^ e R£ são tal como definido acima e a estereoconfiguração é a da unidade terminal redutora Z.
Como se indicou atrás, na fórmula I acima, P’ é conveniejn temente o radical n-valente de um polipéptido escolhido de entre as proteínas, as hormonas peptídicas glicosiladas ou não, as tox_i nas glicosiladas ou não, as enzimas e os inibidores de enzimas, sendo o referido polipéptido P natural ou quimicamente modificado ou obtido por recombinação genética.
Por exemplo, P' pode ser o radical n-valente de uma hormo na peptídica como uma hormona de crescimento glicosilada ou não, nomeadamente a hormona de crescimento humano (hGH), o factor libejn tador da hormona de crescimento (CRF), humano ou animal, natural ou quimicamente modificado, ou um fragmento activo, por exemplo o CRF 1-44 ou o GRF 1-29, ou ainda o factor de crescimento das célçj las epiteliais (GGF) ou o factor de crescimento dos fibroblastos (FGF) ou a s omotoatatina, ou ainda uma citocina como uma interleu. cina, de preferência a interleucina 2 (IL-2), glicosilada ou não.
Do mesmo modo, P' pode ser o radical n-valente de uma toxina, glicosilada ou não, nomeadamente as proteínas ou glicoproteínas inibidoras dos ribossomas, por exemplo a ricina, a cadeia A da ricina, a gelonina, a tricosantina ou ainda a tricoquinina.
P' pode igualmente ser o radical n-valente de uma enzima trombolítica tal como a uroquinase, a estreptoquinase, o activador tissular do plasminogénio (tpA) , a pro-uroquinase, naturais, quimicamente modificados ou obtidos por combinação genética ou a
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0354 Ε .2
-12superoxidesdismutase.
Ρ' pode ainda ser ο radical n-ualente de um polipéptido P inibidor de enzimas, tal como a hirudina, a aprotinina, a alfa-1-antitripsina ou a antitrombina III.
De uma maneira preferencial, o N-poliosil-polipéptido do inuento corresponde à fórmula (la) acima referida, na qual P' é o resíduo de uma molécula de uroquinase e n é um número de 3 a 10, em particular de 2 a 4.
Num outro aspecto preferencial do inuento, P' é o radical de uma molécula de actiuador tissular do plasminogénio (tPA) e n é um número de 3 a 8, de preferência de 8 ou 5.
Noutro aspecto ainda preferencial, P' ô o resíduo de uma molécula de estreptoquinase e n é inferior ou igual a 4, de prefe rência de 2 a 4.
E euidente que P' pode ser o radical n-ualente de qualquer outra substância peptídica desde que ela possua os grupos amino liures que permitem a ligação coualente como o poliosido.
De acordo com outro dos seus aspectos, o presente inuento tem por objecto um processo de preparação do N-poliosil-polipépti do do inuento por enxerto coualente das unidades amina liures de uma substância peptídica P sobre as cadeias poliosídicas de origem natural não compreendendo, cada uma, mais do que um grupo aldeídico susceptíuel de reagir com uma unidade amina.
Nais particularmente, o presente inuento refere-se a um processo para a preparação de um N-poliosil-polipéptido de fórmula (i) acima referida, caracterizado por se tratar um polipéptido P representado pela fórmula
P°(NH2)m (II) no qual P° é o radical m-ualente do polipéptido P ao qual estão l_i gados os seus m grupos funcionais NH2 liures, sendo os referidos m grupos funcionais NH2 o grupo amino terminal e os grupos amino epsilon das (m-l) lisinas contidas no polipéptido, com um excesso de um poliosido representado pela fórmula
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-13Osido-Z (111) sendo Z a unidade sacaridica terminal redutora do referido polissacarídeo na sua forma aldeídica natural ou proveniente de uma despolimerização nitrosa e sendo ósido o resto da cadeia do referido polissacarídeo e se submeter a poli-base de Schiff assim obtida de fórmula ( Ósido-Z '—CH=N—) rP ' (IV) na qual o radical monovalente Osido-Z’- representa o polissacaríX deo Osido-Z, tal como definido acima, privado do grupo aldeídico de Z, e P' e n são tais como se definiu acima, a uma redução com um cianoboro-hidreto.
De forma preferencial, os poliósidos naturais biocompatíX veis Osido-Z utilizados como produtos de partida III são glicosaminoglicanos tal como se definiu acima (GAGs), nomeadamente substâncias constituídas por cadeias nas quais se alternam ácidos uró nicos (ácido D-glucurónico ou ácido L-idurónico) e açúcares amina dos, podendo estes últimos ser glucosaminas quando se trata de glicosaminoglicanos do tipo heparínico ou galactosaminas quando se trata de glicosaminoglicanos do tipo condroitina-sulf ato, a s_a ber a condroitina-4-S-sulfato, a condroitina-6-S-sulfato e a dermatana-sul f ato, podendo os grupos carboxilados das unidades osídj. cas dos referidos GAGs ser salificados ou esterificados, sendo os grupos hidroxilo diversamente substituídas por grupos funcionais, de preferência grupos sulfato e sendo os grupos aminados substituídos por grupos sulfato ou por grupos acetilados.
Tais GAGs são constituídos por uma mistura de cadeias heterogéneas no que diz respeito aos seus pesos moleculares, podendo estes variar de 1 800 a 50 000 daltons e relativamente à posição e ao número dos seus grupos funcionais.
Preferencialmente, o poliósido de partida III é um glicosaminoglicano, escolhido entre a heparina, os fragmentos de heparina, a condroitina-4-S-sulfato, a condroitina-6-S-sulfato, a heparana-sulfato e a dermatana-sulfato, privado da unidade terminal
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-14redutora Z.
Os compostos de partida III particularmente preferidos são os glicosaminoglicanos do tipo heparinico, quer dizer a heparina, a heparana-sulfato e os seus derivados obtidos por fraccionamento a partir da heparina ou da heparana-sulfato por hemi-sintese ou síntese. Tais poliosidos foram largamente descritos na literatura Pode tratar-se de produtos naturais obtidos por fraccionamento ou síntese, tais como os descritos nas patentes francesas 2 440 376 e 2 461 719 ou nas EP 84 999 e 113 599; pode tratar-se igualmente de produtos obtidos por despolimerizaçSo tal como os descritos nas patentes europeias 37 319, 40 144 e 181 252, ou ainda produtos sobre-sulfatados como os descritos na patente europeia 214 879 Num aspecto particularmente preferido do invento, utilizam-se mis. turas de fragmentos de heparina obtidos por despolimerização nitrosa, possuindo uma massa molecular inferior a 10 000 daltons, em particular aqueles que possuem uma massa molecular média entre 2 000 e 8 000 daltons ou aqueles que possuem uma massa molecular média de cerca de 4 500 daltons, ou ainda os que possuem uma massa molecular média de cerca de 2 500 daltons. Pode-se igualmente, preferencialmente, utilizar fragmentos de heparina homogéneos no que diz respeito à sua massa molecular, ou oligossacarídeos obtidos por síntese que sejam homogéneos tanto no que respeita à sua massa molecular como à sua posição e número dos seus grupos funcionais. No seguimento do texto, a mistura de cadeias heparínicas obtidas por despolimerização nitrosa e com um peso molecular médio de 4 500 daltons, preparada como se descreve no exemplo la abaixo, será designada pela referência CY 216-CHO.
z
Um outro produto de partida vantajoso Osido-Z é a mistura de fragmentos de heparina obtida por despolimerização nitrosa e descrito na EP 37 319; ele é designado por CY 222-CHO.
Pode-se igualmente escolher, como poliósidos, derivados da heparina desprovidos de local de fixação à antitrombina III (AT 111) , tendo as cadeias de heparina sido fraccionadas de manei ra a eliminar as cadeias oligossacarídicas comportando o local de fixação ao AT III, recorrendo por exemplo a uma cromatografia de
290
0354 Ε ο*
-15afinidade sobre resina Sepharose-AT III ou a cromatografias de troca iónica, como se descreveu em E. Sache et al., Thromb. Res., 1982 , 25, 443-458, ou tendo esses locais sido destruídos, por exemplo, por despolimerização com ácido periódico e beta-eliminação exaustiva. Recorda-se aqui que a antitrombina III ou AT III é um inibidor plasmático da coagulação, activo sobre diferentes proteases plasmáticas e cuja actividade é fortemente aumentada com a heparina agindo como cofactor.
z
E evidente que as indicaçães anteriores são dadas unicamente a título de exemplo, mas que todo o poliosido natural descrito na literatura e possuindo as caracteristicas descritas pode ser utilizado.
As substâncias peptídicas P utilizadas no processo do pre sente invento podem ser hormonas peptídicas glicosiladas ou não, toxinas glicosiladas ou não, enzimas ou inibidores de enzimas naturais, quimicamente modificados ou obtidos por recombinação gené tica.
Noutro aspecto vantajoso do invento, as enzimas escolhidas são enzimas trombolíticas.
Dg uma maneira preferida, as enzimas trombolí ticas utiliza, das como produtos de partida são a uroquinase, a estreptoquinase, o activador tissular do plasminogénio, a pro-uroquinase e seus d_e rivados e análogos obtidos por recombinação genética ou por outro processo.
De uma maneira preferida, a ligação entre uma das unidades aminadas da substância peptídica P e da cadeia poliosídica 0s_i z
do-Z efectua-se ao nivel da unidade terminal da cadeia Osido-Z, tendo esta última sido sujeita a uma operação prévia de fragmenta ção por despolimerização.
De acordo com o presente invento, é possível produzir directamente uma cadeia poliosídica possuindo uma unidade hemi-acetè. lica situada na sua extremidade redutora. Esta unidade está com efeito na forma de equilibrio entre a forma cíclica (fechada) e a forma linear (aberta) e, à medida que é feito o consumo dos grupos aldeídicos, por ligação destes últimos aos grupos aminados da
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0354 Ε
-16substência peptídica Pt libertam-se novamente grupos aldeídicos. Este modo de proceder ê vantajoso quando o poliosido não possui glicosamina N-sulfato sensível ao ácido nitroso ou quando se pre tenda dispor de cadeias de massa molecular elevada. Contudo ela apresenta o inconveniente de necessitar de uma duração de reacção muito mais longa podendo ir até 10 a 15 dias. E portanto, de uma maneira geral, mais vantajoso utilizar um polissacarideo Osido-Z em que o grupo aldeídico tenha sido gerado por despolimerização segundo um método apropriado, por exemplo o do ácido nitroso.
*
Quando se utiliza, como produto de partida, um GAG Osido— Z em que a unidade terminal Z é um grupo 2,5-anidromanósico obti. da por despolimerização nitrosa segundo o Esquema (B) acima é pre ferivel que a reacção da ligação seja efectuada sobre o referido Osido-Z imediatamente após a sua preparação, de modo a evitar que o grupo aldeídico, notoriamente pouco estável, perca a sua reacti. vidade.
Na medida em que se pretender obter uma cadeia poliosídica do tipo heparínico desprovida de um local de fixação à antitrombina III, é vantajoso utilizar como produto de partida um GAC que tenha sido sujeito a uma despolimerização com ácido peri_ó dico, seguida de uma beta-elirninação exaustiva, permitindo este processo cortar preferencialmente a cadeia heparínica entre os carbonos nas posiçães 2 ou 3 de todos os ácidos urónicos não sulfatados tal como o GAG descrito por Casu et al., Arzneim, Eorsch./ /Drug Res., 1986, 36 (l), n. 4, 637-646. Sabe -se que uma tal unj. dade está presente no local de fixação da heparina à antitrombina III.
A quantidade de cadeias poliosídicas a produzir deve ser em bastante excesso em relação às cadeias peptídicas numa razão de 100 a 2 000 moles de Osido-Z por 1 mole de substância peptídica P. Este excesso é vantajosamente de 500 a 1 500 moles de Osido-Z por 1 mole da substância peptídica P. De preferência, quan* do se produz a uroquinase, utiliza-se 500 a 650 moles de Osido-Z por 1 mole de uroquinase; e, quando se produz o activador tissular do plasminogénio, utiliza-se de preferência 600 a 1 350 moles de Osido-Z por 1 mole de enzima.
□ 9 290
0354 Ε
-170 meio reaccional é um meio aquoso que deue estar desprodo de aminas primárias ou secundárias susceptiveis de interferir z
com a reacç3o de ligação entre o Osido-Z e o polipéptido P. De modo vantajoso, o meio aquoso é um tampao tal como o tampao fosfa to ou bicarbonato ou qualquer outro tampSo susceptível de ser ajus tado ao pH apropriado por adiçao de um ácido mineral ou de um hidroxido alcalino. Eventualmente, pode adicionar-se um solvente orgânico miscível com a água tal como o etanol, a acetona, a ditne tilformamida.
Numa versão preferida do invento, utiliza-se um tampao fo^ fato 0,05 fl adicionado de cloreto de sódio. Adiciona-se, se necessário, polisorbato 80 (derivada do sorbitano monooleato ou tiueen) , por exemplo à razão de l/lO 000, permitindo este surfactan te evitar a absorção da substância peptídica P, sobre as superfícies.
pH do meio reaccional é escolhido de modo a que a amina esteja sob forma protonada, ele pode variar de 6 a 9, sendo de qualquer maneira vantajoso estar entre 7 e 8, de preferência perto da neutralidade.
A temperatura da reacção pode variar em função da substâ_n cia peptídica utilizada, ela situa-se vantajosamente entre + 290 e +3590 durante 2 a 15 dias. Opera-se de preferência a temperatura baixa, por exemplo a + 420, sobretudo quando a substância peptídica for uma enzima, sendo um grande número destas últimas termolábeis, o que é em particular o caso das enzimas trombolí ticas. D.e ve notar-se ainda que quando mais baixa é a temperatura mais lenta é a cinética da reacção. A duração da reacção será então variável de acordo com a temperatura escolhida. De maneira va nta j_o sa, deixa-se a reacção efectuar-se sob agitação a +490 durante 2 a 8 dias se o poliosido utilizado possuir um grupo aldeidico proveniente de uma despolimerização nitrosa. Em particular quando a substância peptídica preparada é uma enzima trombai!tica tal como a uroquinase, a pro-uroquinase ou o activador tissular de plasminogéneo, a manutenção da reacção a +490 durante uma duração de 3 a 5 dias permite obter um rendimento de enxerto satisfatório.
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0354 Ε
.../
-18Α poli-base de Schiff de fórmula (IV) assim obtida pode ser isolada segundo as técnicas conhecidas, por exemplo por prec_i pitação com um sal apropriado tal como o sulfato de amónio e sujeita a uma redução com um cianoboro-hidreto, tal como o cianoboro-hidreto de sódio.
A redução pode igualmente ser feita directamente num meio reaccionai, sem isolar a poli-base de Schiff.
X
E igualmente possível passar directamente aos compostos I z
por reacção do polipéptido P com o poliosido Osido-Z em presença de cianoboro-hidreto de sódio nas condições acima referidas.
Deste modo, a poli-base de Schiff intermediária é reduzida à medida que ela se forma e o produto I é isolado como o único produto final.
Para separar o conjugado assim obtido dos produtos que não reagiram, pode operar-se por precipitação, podendo esta operação efectuar-se por exemplo por meio de sulfato de amónio que se adiciona ao meio reaccionai em quantidade suficiente para saturar a solução, isto é à razão de cerca de 600 mg/ml. Deixa-se a seguir decantar e centrifuga-se.
Esta operação pode ser repetida após a recolha do precipi, tado, adicionando nouamente sulfato de amónio nas mesmas condições.
Pode-se também vantajosamente concentrar o conjugado abt_i do numa membrana de ultrafiltração do tipo Amicon YM10 ou YM30, sendo a membrana escolhida em função do peso molecular da conjuga do.
Para recuperar o N-poliosil-polipéptido sob forma pura, efectua-se uma permeaçâo num gel com a ajuda de um gel escolhido eni função da natureza e tamanho do polipéptido. A filtração com gel efectua-se com vantagem numa coluna contendo um gel de tipo ultrogel, por exemplo o que é vendido pela Société IBF (França) com o nome Ultrogel AcA 44 ou o que é vendido por Pharmacia com o nq mede Sephacryl^ S 200.
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0354 Ε
-19Segundo um modo de realização vantajoso, dissolve-se o precipitado obtido na etapa precedente num tampão adequado ã subs tância peptidica P preparada, coloca-se em seguida a solução na coluna que foi previamente equilibrada com o auxilio do mesmo tampão. A filtração em gel ê seguida por meio de um espectrofotó metro a 280 nm e o pico de proteína é recuperado. Ele contém a totalidade do produto, do qual se efectua em seguida a caracterização e doseamento.
As poli-bases de Schiff de fórmula (IV), acima referidas, são produtos novos que representam os intermediários chave na pre paração de N-poliosil-polipéptidos de fórmula (I). Elas constituem portanto um aspecto ulterior da presente invenção.
De uma maneira preferencial, na fórmula (IV) acima refer_i
Z Z da, Osido representa o radical de um glicosaminoglicano Osido-Z, escolhido de entre a heparina, os fragmentos de heparina, a condroiti na-4-S-sulfato, a condroitina-6-S-sulfato, a heparana-sulfa to e a dermatana-sulfato, privado da unidade terminal redutora Z.
Particularmente vantajosa são as poli-bases de Schiff pro z ““ venientes de um polissacarídeo Osido-Z em que a unidade Z representa a unidade terminal redutora de uma cadeia de glicosaminogli cano heparínico que tenha sido sujeito a uma despolimerização nitrosa. Ela é representada pela fórmula (iVa) seguinte:
que corresponde à fórmula (IV), sendo o grupo entre as linhas a tracejado o radical Z' e sendo R^ H ou S0^ .
Num outro aspecto particular da invenção, a poli-base de z
Schiff provém de um polissacarídeo Osido-Z em que a unidade Z re69 290
0354 Ε
-20presenta a unidade terminal redutora natural de um gl icos ami nogl_i cano de tipo heparlnico. Ela é representada pela fórmula (il/b) seguinte:
P · (I Vb) n
que corresponde à fórmula (IV), sendo o grupo entre as linhas a tracejado o radical Z’, sendo R^ H ou S0^~, sendo R£ S0^~ ou Ac e sendo Osido o resto da cadeia heparlnica.
Noutro aspecto particular do invento a poli-base de Schiff z
provém de um polissacarídeo Osido-Z em que a unidade Z representa a unidade terminal redutora natural de um glicosaminoglicano do tipo condroitina-sulfato. Ela é representada pela fórmula (il/c) seguinte:
que corresponde à fórmula (IV), sendo o grupo entre as linhas a tracejado o radical Z *, sendo um de R^ H e o outro S0^~ e sendo Osido o resto da cadeia do tipo condroitina-sulfato.
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0354 Ε
-21- ·“
Noutro aspecto particular do invento, a poli-base de Schiff
X provém de um polissacarídeo Osido-Z que foi sujeito a uma despoLi merização em condiçães tais que a cadeia possui um número de unidades ímpar em que a unidade Z redutora representa o ácido urónico, ácido D-glucurónico ou L-idurónico. Ela é então representada pela fórmula (il/d) seguinte:
Osi do
P ' (Il/d) que corresponde à fórmula (IV), sendo o grupo entre as linhas a
X tracejado o radical Z’, sendo R^ H ou S0^~ θ sendo Osido o resto da cadeia polissacarídica.
De uma maneira vantajosa, a poli-base de Schiff do invento corresponde à fórmula (iVa) acima referida, na qual P' é uma mol_é cuia de uroquinase, e n é igual ou inferior a 6, de preferência 6, 4 ou 3.
Noutro exemplo vantajoso da invenção, P* é uma molécula de activador tissular de plasminogénio (tPA) e n é igual ou inferior a 10, de preferência 9, 8 ou 5.
Ainda noutro exemplo vantajoso do invento, P’ é uma molécula de estreptoquinase e n é um número inferior ou igual a 4, de preferência 2 a 4.
As poli-bases de Schiff (il/a), (lUb), (Il/c) e (iVd) acima referidas são transformadas, segundo o presente invento, nos N-pjo liosil-polipéptidos correspondentes (la), (lb), (ic) e (id) por redução com cianoboro-hidreto de sódio.
invento tem também como objectivo a utilização dos N69 290
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-22-poliosil-polipéptidos do invento como novos medicamentos, variari do as indicações terapêuticas em função das actividades partícula, res das substências peptídicas utilizadas para a preparação do N-poliosil-polipéptido. 0 invento refere-se em particular, segundo outro aspecto, a composições farmacêuticas contendo como substância activa uma quantidade eficaz de, pelo menos, um dos N-poliosil-polipép tidos do invento em associação com um veículo farm£ ceuticamente aceitável. Nomeadamente, nas composições farmacêuti, cas utilizáveis por via parenteral o veículo farmacêutico utiliza, do é um soluto clorado ou glucosado. As composições farmacêuticas em questão são utilizáveis por via intravenosa, intramuscular ou sub-cutânea, ou por perfusões.
Tais composições farmacêuticas podem conter de 5 a 100 mg por unidade de doseamento. De modo vantajoso, quando o polipépti. do utilizado é a uroquinase, o N-poliosil-polipéptido utilizado na composição farmacêutica está presente na razão de 0,2 a 2 mg por ml de preparação injectável. Quando o polipéptido utilizado for o activador tissular do plaminogénio, o N-poliosil-polipéptido utilizado na preparação injectável está presente à razão de 0,2 a 2 mg por ml de preparação injectável.
Noutra realização do invento as composições farmacêuticas são destinadas à administração por via oral e são associadas a veículos farmacêuticos apropriados à preparação de células, pastj. lhas, comprimidos.
Noutra realização do invento, as composições farmacêuticas são destinadas a aplicações tópicas e aspersões, supositórios, em associação com os excipientes farmacêuticos apropriados, pode igualmente tratar-se de um soluto isotónico de lágrimas para aplicação ocular, uma maneira geral sob toda a forma farmacêutica à disposição do farmacêutico.
invento refere-se igualmente a N-poliosil-polipéptidos do invento como reagente biológico novo. Em particular, segundo as substências peptídicas escolhidas, eles podem ser utilizados como reagentes enzimáticos ou como produto de diagnóstico ou para qualquer outro fim.
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-2 3- '
Α invenção não se limita aos aspectos mais particulares que foram descritos, ela abrange, pelo contrário, todas as varia_n tes e será melhor compreendida com o auxilio dos exemplos de apli. cação que se seguem.
Exemplo 1: preparação de um N-poliosil-polipéptido no qual P é uroquinase e Z-ósido é o CY 216-CHO.
A uroquinase utilizada é preparada a partir de urina huma na. Ela é constituída na sua maior parte por uroquinase do tipo 52 com um peso molecular de 54 000 daltons. Esta uroquinase exis. te no comércio. 0 seu titulo é de 85 700 ^jl/mg segundo a técnica descrita pela Farmacopeia Europeia (Ref. 43. edição). Experiência η®. 1:
(a) preparação da extremidade aldeídica por despolimerização da heparina:
o fragmento de heparina foi preparado da maneira seguinte:
colocaram-se em solução 500 g de heparina injectável, na forma de sal de sódio, em 4 500 ml de água desmineralizada, a uma temperatura de 189C. A razão YW/USP da heparina utilizada era próxima de 1, apresentando estes títulos um valor da ordem de 160-170.
A solução obtida foi colocada sob agitação enérgica, e o seu pH foi baixado a 2,5 por adição de ácido clorídrico concentra do. Adicionam-se então 15 g de nitrito de sódio dissolvido em 300 ml de água. 0 pH da reacção foi ajustado a 2,5 com ácido cio. rídrico concentrado e o volume total da solução foi levado a 5 000 ml. Deixou-se a reacção efectuar durante 45 minutos após o que se verificou a ausência de iães nitrosos residuais na solução reaccional, por exemplo, com utilização de papel indicador impregnado de iodeto de potássio amidado (desenvolvimento de uma coloração azul-violácea na presença de iães NO^-).
Deixa-se a reacção prosseguir até ao desaparecimento total dos iães nitrosos na ausência de reacção ao papel iodo-amida do, efectuando-se controlos todos os 3 ou 4 minutos.
Logo que estes controlos se tornavam negativos, a reac69 290
0354 Ε
-24ção foi considerada como tendo sido completada.
Os produtos da reacção são recuperados por adição de 10 litros de etanol. Após 48 horas de repouso, o produto foi decantado e eliminou-se o sobrenadante.
precipitado foi redissolvido em 9 litros de água desmineralizada.
Adicionou-se 100 g de cloreto de sódio, e baixou-se o pH da solução até 3,8 com auxilio de ácido clorídrico concentrado. 0 volume foi ajustado exactamente a 10 litros por auxílio de água desmineralizada e adicionaram-se sob agitação enérgica 10 litros de etanol. Deixou-se repousar 48 horas. Separou-se o sobrenadan te por intermédio de um sifão que se regeita. 0 precipitado foi recuperado, lavado com etanol, triturado, seco sob vácuo.
Obtêm-se 230 gramas de produto CY 216-CHO com as características seguintes:
Titulo USP = 52 ^i/mg
Título Yin et Wsssler = 225 ytj/mg
Peso molecular médio = 4 000 a 5 000 daltons (b) Ligação da uroquinase com o CY 216-CHO:
colocaram-se em solução 700 mg de uroquinase com um titulo de 60 000 000 unidades internacionais em 900 ml de tampão fosfato 0,05M, NaCl 0,5M, pH 7. Adicionaram-se 42 g de CY 216-CHO e 3 g de cianoboro-hidreto de sódio (NaBHjCN). Reajustou-se o pH a 7 com soda 2N e deixou-se reagir durante 5 dias sob agitação, à temperatura de + 42C.
(c) Precipitação:
adicionaram-se em seguida 600 mg/ml de sulfato de amónio ( (NH^^SO^) e deixou -se decantar, após o que se centrifugou a 15 000-20 000 rpm durante 10 minutos. Recuperou-se o resíduo que se redissolveu em 50 ml do mesmo tampão fosfato efectuando-se uma segunda precipitação nas mesmas condições.
(d) Filtração em gel:
o produto recuperado na etapa precedente foi recolocado
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0354 Ε
-25em solução no mesmo tampão fosfato e foi depositado numa coluna n
Ultrogel AcA 44 (Pharmacia, Suécia) com 10 x 100 cm. A operação foi seguida em espectrofotómetro a 280 nm e recuperou-se o pico de proteína. 0 pico correspondia a 51 000 000 de uroquinase, ou seja um rendimento em actividade de 85%.
(e) Caracterização do produto:
estudou-se a taxa de ligação do produto, doseando as proteínas pelo método do Azul de Coomassie (S.M. Read e D.H. Northco te, Ann. Biochem, 1981, 116, 53-54) e o CY 216-CHO pelo método do carbazol (doseamento dos ácidos urónicos, R. Bitter e H. Muir, Ann. Biochem. 1962 , .4, 300-334).
Os resultados foram calculados para um PM médio de 4 500 daltons no que se refere ao CY 216-CHO e de 54 000 daltons no que se refere à uroquinase. Obtiveram-se 5 moles de CY 216-CHO por cada mole de uroquinase.
produto assim obtido tem a referência IC 1857. Experiência nS. 2:
foram realizados diferentes parâmetros operatórios:
1§. série de experiências-pH básico
- Variação da duração de reacção:
CY 216-CHO Uroquinase NaCNBH3 T ampão T emperatura
Resultados:
500 mg (lll ^M) 20 mg (0,18 ^M) 50 mg fosfato K 0,2 M, 42 C ensaios fazendo variar certos pH 9
Duração
d. 5 d. 7 d.
Razão molar OY 216-CHO-UK no conjuqado
- 3/1
3/1
3/1
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0354 Ε
-262-. série de experiências-pH neutro:
- l/ariaç^o da temperatura:
CY 216-CHO Uroquinase NaCNSH-j T ampão Duração
1400 mg (311 /1) mg (0,54 ^M)
100 mg fosfato Na 0,05 M, pH 7, NaCl 0,5 M 5 dias
Resultados:
Temperatura
C 202 C
Razão molar CY 216-CH0-UK no conjugado
6/1
6/1
Na primeira série de experiências acima referidas, operou: -se a uma razão molar de 617, a um pK básico e a uma temperatura de + 42C. Nestas condiçães, a taxa de ligação á a mesma, isto é moles de CY 216-CHO para 1 mole de uroquinase, e o rendimento em actividade enzimática é de 100%.
Na segunda série de experiências acima referidas em que a razão molar e as quantidades de agente redutor foram sensivelmente as mesmas, mas onde o pH utilizado é neutro, o resultado da l_i z
gação foi superior ao obtido a um pH básico. E o mesmo a operar a + 42C ou a + 20SC. Contudo, o rendimento em actividade enzimática foi superior a baixa temperatura, respectivamente 05% em vez de 60>ό da actividade teórica.
Experiência n2, 3:
efectuou-se um ensaio em que se substitui a etapa (c) de precipitação com sulfato de amónio por uma concentração de conjugado numa membrana de ultrafiltração sob pressão de azoto.
Neste ensaio, a uroquinase utilizada tinha um título de 70 000 ^i/mg. Ela encontrava-se na forma de uma solução concentrada que se submeteu a uma precipitação em sulfato de amónio a fim de se atingirem condiçães favoráveis para a ligação.
290
0354 Ε 1 A’-
-27(a) Preparação da extremidade aldeídica fragmento de heparina CY 216-CHO foi preparado como se descreveu acima (experiência n2. l).
(b) Ligação da uroquinase ao CY 216-CHO
1. Precipitação com sulfato de amónio da solução concentrada de uroquinase
Precipitavam-se 660 ml de uroquinase com sulfato de amónio (NH^^SO^ à razão de 550 g/l, levando -se o pH a 3,5 com o auxilio de ^SO^ diluído.
Deixou-se repousar uma hora a 42C e centrifugou-se a 7000 rpm durante 30 minutos e depois a 15 000 rpm durante 15 minutos.
precipitado obtido foi dissolvido em água destilada até um volume de 80 ml, ao qual se adicionou 54 ml de tampão fosfato 0,05M, NaCl D,5M, pH 7.
2. Ligação com o CY 216-CHO
Diluiu-se 33 ml da solução de uroquinase obtida acima, ou seja 140 mg de uroquinase, até um volume da 150 ml com a ajuda do tampão utilizado acima. Adicionou-se sob agitação magnética 7 g de CY 216-CHO e 0,5 g de NaBH-jCN. Ajustou-se o pH a 7 com a ajuda de soda 2N e deixou-se reagir durante 5 dias sob agitação lenta a + 4^C.
(c) Concentração sobre membrana de ultrafiltração
A fim de separar os produtos que reagiram dos que não rea giram, a solução obtida na etapa precedente foi concentrada sob membrana Amicon YM 10 (Amico, France) sob pressão de azoto.
(d) Filtração em gel produto recuperado na etapa precedente foi recolocado em solução no mesmo tampão fosfato e foi colocado numa coluna Ultrogel AcA 44 (Pharmacia, Suécia) de 10 x 100 cm. A operação foi seguida ao espectrofotómetro e recuperou-se 0 pico de proteína. Este pico corresponde a uma actividade específica de 60000 yw-i/mg, ou seja um rendimento em actividade de 85%.
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0354 Ε
-28(e) Caracterização do produto
A taxa de ligação do produto é calculada doseando as proteínas pelo método do Azul de Coomassie (ref. acima) e o CY 216-CHO pelo método do carbazole (ref. acima).
Os resultados, calculados para um PM médio de 4 500 Daltons para o CY 216-CHO e de 54 000 Daltons para a uroquinase, deram uma razão de 6 moles de CY 216-CHO para uma mole de uroquinase. 0 produto assim obtido tem a referência IC2026.
Ele é liofilizado após diluição em água destilada a + 4SC de modo a obter uma concentração em NaCl próxima de 0,15M e adição de manitol à razão de 10 mg/ml.
Exemplo 2: preparação de um N-poliosil-polipéptido no qual P é
0 tPA e Z-6sido é o CY 216 CHO
0 tPA utilizado possuia um peso molecular de 60 000 dal-
tons e titulo de 550 000 yul/mg. A actividade do produto foi tes-
tada sobre uma placa de fibrina de acordo com a técnica de Ploug
e Kjeldgaard (Biochim. Biophys Acta, 1957, 24 , 278-282).
Experiência n9. 1:
(a) preparação da extremidade aldeídica fragmento de heparina CY 216-CHO foi preparado como se descreveu no Exemplo 1 acima referido.
(b) Ligação do tPA ao CY 216-CHO
Colocaram-se em solução 2 mg de tPA em 3 ml de tampão fosfato 0,05M, NaCl 1M, tiueen 1 p. 10 0D0, pH 7. Adicionaram-se 200 mg de CY 216-CHO e 8 mg de NaCNBH-j. Ajustou-se o pH a 7 com algumas gotas de ácido clorídrico IN. Deixou-se reagir durante 5 dias sob agitação à temperatura de + 42C.
Neste estádio, o rendimento de ligação era de 90/ (recup_e ração de 990 000 yul). Isto mostra bem que a técnica de ligação não altera a actividade enzimática.
(c) Precipitação com sulfato de amónio
Separaram-se os produtos que reagiram dos que não reagiram
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0354 Ε
-2 9por uma precipitação com sulfato de amónio. Adicionau-se ao meio reaccionai 650 mg/ml de (NH^^SO . Deixou-se decantar durante 8 horas após o que se centrifugou a 15 000-20 000 rpm durante uma meia-hora a + 42C. 0 precipitado formado foi recuperado.
Efectuou-se em seguida uma segunda precipitação. Para tal redissolveu-se o precipitado, antes formado, recuperado em 3 ml de água destilada e adicionou-se de novo 650 mg/ml de (NH^)2S0^ deixando-se novamente decantar durante 8 horas. Centrifugau-se a 18 000 rpm durante uma meia-hora a +420.
precipitado formado foi recuperado e dissolvido em 5 ml de tampão fosfato 0,05M, NaCl 1M, tu/een 1 p. 10 000, pH 7.
(d) Caracterização do produto:
recolheu-se uma alíquota de 0,2 ml da solução obtida precedentemente. Efectuou-se uma filtração em gel numa coluna de
R
Sephacryl S 200 (Pharmacia, Suécia) (100 cm x 2,5 cm) equilibrada com soda 0,2N, concentração necessária para recuperar o tPA.
Recuperou-se o pico de proteínas β doseou-se as proteínas pelo mé todo do Azul de Coomassie (ref. acima) e o CY 216-CHO pelo método do carbazol (dosagem dos ácidos urónicos, ref. acima).
0s resultados foram calculados para um PM médio de 4 500 daltons no que se refere ao tPA. Obtiveram-se 8 moles de CY 216-CHO para 1 mole de tPA.
produto assim obtido tinha a referência IC 1903. Experiência n2. 2:
efectuou-se um ensaio fazendo variar a relação molar dos produtos empregues CY 216-CHO e tPA tPA 2 mg (0,022 ^M)
NaCNBH^ 8 mg
Tampão fosfato Na 0,05M, pH 7, NaCl 1 M, Tu/een 1 p. 10 000
Duração 5 dias
Temperatura 42C
290
0354 Ε ζ*
-30Razão molar CY 216-CHQ-tPA do conResultados jugado
CY 216-CHO: 200 mg (44 ^M) S/l
CY 216-CHO: 100 mg (22 ^M) 5/l
Constatou-se que com uma razão molar de 1346, se obteve um rendimento de ligação de 8 moles de CY 216-CHO para 1 mole de tPA , enquanto que com uma razão de metade, o rendimento de ligação baixou notavelmente, 5 para 1.
Experiência ηδ. 3:
efectuou-se em ensaio substituindo a etapa (c) de precip_i tação com sulfato de amónio por uma concentração de conjugado sobre uma membrana de ultrafiltração.
tPA utilizado era Activase (Genentech, USA), com um p£ so molecular de 75 000 daltons e um título de 580 000^i/mg. 5endo condicionado com uma certa quantidade de arginina, esta ê elimina, da por uma precipitação com sulfato de amónio para permitir a ligação.
Uma vez obtido o conjugado, ele foi recolocado em solução num tampão contendo arginina para permitir a sua liofilização em condiçães favoráveis.
(a) Preparação da extremidade aldeídica fragmento de heparina CY 216-CHO foi preparado como de.s crito acima no exemplo 1.
(b) Ligação do tPA ao CY 216-CHO
1. Precipitação prévia do tPA com sulfato de amónio para eliminar a arginina
Dissolveu-se um frasco de Activase (Genetech, USA) em 10 ml de água destilada.
Diluiram-se 5 ml dessa solução em 7,5 ml de água destilada. Adicionou-se sulfato de amónio (NH^^^SO^ à razão de 600 g/l e deixou-se repousar 15 minutos a + 42C. Após centrifugação a 18 000 rpm durante 15 minutos a + 42C, sendo o resíduo redissolvi69 290
0354 Ε
-31do em 20 ml de tampão fosfato 0,05M, NaCl IM, Tiueen B0, 1 p.
000, pH 7.
Repetiram-se duas vezes as operaçães de adição de sulfato de amónio e centrifugação após dissolução do resíduo no tampão acima referido, sendo os tempos de repouso de respectivamente 30 minutos e de uma noite a + 4SC. 0 último precipitado foi dissclto do em 20 ml do tampão utilizado acima.
2. Ligação do CY 216-CHO
Adicionou-se à solução acima 71 mg de NaBH^CN dissolvidos em 2 ml do mesmo tampão e 1778 mg de CY 216 dissolvido em 5 ml do mesmo tampão. Ajustou-se o pH a 7 com algumas gotas de NaOH 2N.
Deixou-se reagir sob agitação suave durante 4 dias a +420.
(c) Concentração sobre membrana de uitrafiltração
A fim de se separarem os produtos que reagiram dos que não reagiram, concentrou-se a solução obtida na etapa b) a 5 ml em membrana Amicon YM 30 (Amicon, France). Estes 5 ml foram diluídos até um volume de 50 ml com um tampão fosfato 0,05M, NaCl IM, Tujeen Θ0 1 p. 10 000, pH 7, e concentrados deptos novamente a 5 ml. Esta operação foi repetida 3 vezes. 0 último concentrado foi diluído a 20 ml com auxílio do tampão utilizado acima.
(d) Caracterização do produto
Recolheu-se 1 ml de concentrado diluído, obtido na etapa (c). Efectuou-se uma filtração em gel numa coluna de Sephacryl^ 5200 (Pharmacia, Suécia) (100 cm x 2,5 cm) equilibrada com soda 0,2N. A fracção proteica foi recuperada e dosearam-se as proteínas por intermédio do método do azul de Coomassie (ref. acima).
CY 216-CHO foi doseado pelo método do carbazole (doseamento de ácidos uronicos, ref. acima).
Os resultados calculados para um PM médio de 4 500 daltons para o CY 216-CHO e de 75 000 daltons para o tPA mostraram uma razão molar de 9/l.
produto assim obtido tinha a referência IC2025.
290
0354 Ε
-32Ele foi liofilizada após diluição num tampão contendo 1,7 g de L-arginina, 0,5 g de ácido fosfórico, 40 yj. de Tueen 80 a 10%, pH 6.
Exemplo 3: preparação de um N-poliosil-polipéptido no qual P é a estreptoquinase e Z-ósido é o CY 216-CHO
A estreptoquinase utilizada, disponível no comércio tem um peso molecular de 47 000 daltons e um título de 3 600 yAi/mg.
Antes da utilização, ela foi purificada por filtração em gel. Após dissolução num tampão (P0, 0,Q5M, NaCl 0,5M; pH 7) efectuou-se uma filtração em gel numa coluna Ultrogel ACA 44 (IBF, França) equilibrada com o mesmo tampão. As fracçães protej. cas foram recolhidas depois concentradas sobre membrana de ultrafiltração Amicon YM10.
(a) Preparação da extremidade aldeídica fragmento CY 216-CHO foi preparado como se descreveu acima no exemplo 3.
(b) Ligação da estreptoquinase ao CY 216-CHO
Dissolveu-se um frasco de estreptoquinase (250 OOO^i/fras. co) em 2 ml de tampão fosfato acima referido. A solução foi em seguida concentrada a 0,7 mg/ml, ou seja 0,14
Adicionaram-se então 2,78 mg de CY 216-CHO (ou seja cerca de 3,97 mg por mg de estreptoquinase) e 2,35 mg de NaBH^CN (ou se ja 3,35 mg por mg de estreptoquinase).
pH foi ajustada a 7 com a ajuda de algumas gotas de soda 2N e deixou-se reagir durante 3 dias a +4SC sob agitação suave.
(c) Filtração em gel
A solução obtida na etapa precedente foi colocada numa c_o luna Ultrogel ACA 44 (IBF, Franca) de dimensães 5 x 100 cm, previamente equilibrada no tampão fosfato utilizado acima, □ produto ligado foi detectado num espectrofotómetro a 280 nm e recuperado.
(d) Caracterização do produto
Dosearam-se as proteínas pelo método do azul de Coomassie
290
0354 Ε
-33(ref. acima) e o CY 216-CHO pelo mátada do carbazole (ref. acima).
Para um PM médio de 4 5DD Daltons para o CY 216-CHO e de 7 000 Daltons para a estreptoquinase, obteve-se uma razão de 2 rno les de CY 216-CHO para 1 mole de estreptoquinase.
produto assim obtido tem a referência IC2024.
Exemplo 4: actividade farmacológica in vitro dos produtos do invento
4.1 - Actividade enzimática do produto IC 1Θ57
A actividade da uroquinase do produto de ligação IC 1857 foi testada pela técnica de Ruyssen R. e lauuiers A. (Pharmaceuticals Enzymes, E. Story-Scientia, Gand, Belgium, 197B, 135-139) S£ bre um substrato sintético AGLME. 0 princípio do método consistiu em dosear ao pH Staat a hidrólise do N-alfa-acetil-glicina-L-lisina metil éster.
Ds resultados obtidas, comparados com os da uroquinase de partida foram os seguintes:
UK de partida: B7 5Q0 ynl/mg IC 1857 : 74 DOO yAl/mg
4.2 - Actividade enzimática do produto IC 1903
A actividade tPA do produto de ligação IC 1903 foi efectua. da sobre placa de fibrina de acordo com a técnica de Ploug e Kjeldgaard como se indicou acima. 0 princípio do método consiste em colocar uma alíquota da solução a dosear numa caixa de Petri à superfície da qual se formou um fio de fibrina contendo o seu pr_ó prio plasminogénio.
A actividade do produto a testar traduziu-se por zonas de lise do fio de fibrina proporcionais ã quantidade de tPA deposita do, relativamente a um padrão (padrão internacional da Organização Mundial de Saúde).
Os resultados obtidos, comparados com os do tPA de partida foram os seguintes:
tPA de partida IC 1903
550 000 ^2/mg 302 000 ^1/mh
290
0354 Ε
-344.3 - Actividade enzimãtica do produto IC 2026
A actividade da uroquinase do produto de ligação IC 2026 foi testada:
1) sobre o substrato sintético AGLME segundo a técnica de Ruyssen et Lauwers como se descreveu no parágrafo 4.1.
2) sobre uma placa de fibrina segundo a técnica de Ploug e Kjelgaard como se descreveu no parágrafo 4,2.
Os resultados obtidos para uroquinase de partida e para o produto IC 2026 , após liofilização destes 2 produtos, foram os se guintes:
AGLME Placa de fibrina
UK de partida /*i/mg 62 500 53 000
IC 2026 67 000 200 300
^κΐ/mg
Estes resultados mostram uma actividade fibrinolítica fo_r temente aumentada para o produto ligado.
4.4 - Actividade enzimãtica do produto IC 2025
A actividade do produto de ligação IC 2025 foi testada numa placa de fibrina de acordo com a técnica de Ploung e Kjelgaard como descrito no parágrafo 4.2.
Os resultados obtidos para o tPA de partida e para o produto IC 2025, após liofilização dos produtos foram os seguintes tPA de partida: 14 375 000 ^*i IC 2025 : 11 300 000
4.5 - Actividade enzimãtica do produto IC 2024
A actividade do produto IC 2024 foi testada segundo a técnica do coágulo. Neste método, determina-se a quantidade de plasmina formada, proveniente da transformação do plasminogénio
69290 0354 Ε
-35em plasmina pela estreptoquinase, medindo o tempo de lise de um coágulo de fibrina. Este tempo de lise foi determinado relativ_a mente a uma curva padrão.
protocolo utilizado é o seguinte: utilizou-se fibrinogénio bovino em solução a 125 mg/25 ml de tampão fosfato 20 mH, pH 7,2, trombina (Roche, França) em solução a 2 mg/5 ml do mesmo tampão, plasminogénio (Kabi, Suécia) em solução a 0,16 mg/ml de tampão e estreptoquinase (padrão interno) a 700^/(1)1, diluído a 5 y*i/ml ·
Preparou-se uma gama de padrão de 4 ^*i/ml a 1 ^.i/ml.
Para o doseamento, incubou-se durante 10 minutos num banho-maria a 375C 1 ml de amostra (amostra ou produto ligado), 0,1 ml de trombina e 0,1 ml de plasminogénio, aos quais se adicionou em seguida 1 ml de fibrinogénio de 5 em 5 segundos.
Para calcular o título, traçou-se a curva dos tempos de lise de coágulo (em segundos) em função do número de unidades/ml de padrão. 0 tempo de lise obtido para o produto ligado introduzido na curva permitiu deduzir o seu título.
0s resultados obtidos para a estreptoquinase de partida e para o produto IC 2024 foram os seguintes:
estreptoquinase de partida: 70 000 ^/mg IC 2024 : 50 400^/mg
Exemplo 5: actividade farmacológica in vivo de IC 1857
5.1 - Actividade in vivo sobre um modelo de distúrbio respiratório provocado, nos hamsters.
modelo utilizado consistiu em medir, no hamster, o tempo de distúrbio respiratório provocado por uma embolia pulmonar consecutiva a uma injecção de trombina.
Descrição do protocolo:
são utilizados três lotes de cinco animais:
- o primeiro lote recebeu só a trombina,
- o segundo lore recebeu a trombina + UK (7000 ^ul/kg)
290
0354 Ε
-36- . <'
- c terceiro lote recebeu a trombina + IC 1857 (7000 ^j/kg).
produto a testar foi injectado antes da injecção da trombina. Os produtos foram injectados por via intravenosa com a ajuda de uma bomba de perfusão (Palmer).
distúrbio pulmonar foi observado e quantificado por medida da duração do distúrbio, distinguindo odistúrbio agudo e o distúrbio total.
Os resultados que figuram no quadro a seguir são expressos em percentagem de redução relativamente à testemunha trombina.
T ratamento /o de redução de distúrbio total P /o de redução de distúrbio agudo P
Uroquinase 7 000 ^i/kg 36,5 <0,02 36,4 <0,005*
IC 1857
7 000 yui/kg 91,7 <0,001* 93,3 <0,001*
= fortemente significativo
Em conclusão, constata-se que a redução da distúrbio respiratório obtido com o conjugado IC 1857 ê muito mais importante que a que foi obtida apenas com a uroquinase, e que se trata do distúrbio total bem como do distúrbio agudo.
5.2 - Actividade trombolítica
Estudo da actividade lltica de IC 1857
A experiência realizada teve por objectivo estudar a act_i vidade lltica de um produto da invenção, o conjugado da uroquinase IC 1857 com a da uroquinase Standard utilizada para a sua preparação.
protocolo foi o seguinte:
o estudo foi realizado em animais x uma semana.
290
0354 Ε ,Λ
-370 modelo foi caracterizado pela indução de uma trombose por injecção de um agente indutor de trombose, seguida de uma ligação temporária das veias jugulares do animal com pinças cirúrgicas.
agente indutor de trombose é um complexo concentrado de protrombina (CCP) (25^u/kg) e .uma mistura de veneno de víbora Rus sei (l/l/R) (0,01 ^u/kg).
tempo de circulação do agente indutor da trombose foi de 20 segundos.
As duas veias jugulares são então apertadas com ligaduras, começando pela veia direita. A estase venosa durou 10 minutos. Iniciou-se um escoamento parcial abrindo as pinças de maneira Standard. 0s produtos do ensaio foram injectados por infusão Standard com uma microbomba (300 segundos) de uma maneira Standard de acordo com Agnelli (Thromb. Res. 1985, 4 0, 769-777). As veias jugulares foram seguidamente incisadas e as trombas avaliadas ime^ diatamente, comaçando pela veia direita.
0s trombos foram avaliados segundo os critérios numéricos de 0 a 4: 0 correspondendo à ausência de coágulo e 4 à presença de um coágulo grande único. A actividade lítica é expressa em percentagem de lise: 100% de lise correspondente ao grau 0 e 0% ao grau 4.
Dois grupos de 15 coelhos receberam um a uroquinase Standard e outro o conjugado IC 1857.
A tabela seguinte deu os resultados obtidos. Existe uma diferença estatística significativa (p <0,000l) a favor de IC 1857.
290
0354 Ε
-38Percentaqem de lise
1 3,3 5,0 1,3 67,5
2 3,4 15,0 1,8 55,0
3 4,0 0 2,7 32,5
4 4,0 0 3,0 25,0
5 3,5 12,5 1,8 55,0
6 2,9 17,5 1,9 75,0
7 1,8 55,0 2,0 50,0
8 3,6 10,0 1,6 60,0
9 2,3 42,5 0 100,0
10 2,8 30,0 0 100,0
11 3,1 22,5 1,7 57,5
12 2,7 32,5 1,9 52,5
13 2,9 23,5 2,3 42,5
14 2,6 35,0 2,8 30,0
15 3,0 25,0 1,0 75,0
x+lSD 3,1+0,6 22,0+15,1 1,7+0,9 58,5+21,
Exemplo 6: estudo farmacocinético
6.1 - Estudo farmacocinético de IC 1903
Estudou-se comparativamente a cinética de acção do tPA na tivo e a do produto preparado de acordo com o invento IC 1903 (Exemplo 2, experiência l). A experiência foi efectuada em coelhos (6 animais por produto).
Protocolo de estudo:
após anestesia, a artéria carotida esquerda de cada animal foi cateterizada. Uma primeira recolha de 2,5 ml de sangue foi praticada ao tempo 0 (T.O) sobre citrato 3,8% com a razão l/ /10.
A injecção de 10 000 unidades / kg de produto de referência e de IC 1903 foi efectuada na veia marginal da orelha direita, num volume médio de 0,5 ml. As recolhas foram efectuadas nos minutos 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 45 e 60. A totalidade do
290
0354 Ε
-39sangue foi centrifugada para recuperar o plasma pobre em plaquetas (PPP) e as englobinas foram precipitadas seguindo uma técnica modificada de N.A. Marsh et al. (Thromb. Haemost., 1977, 38, 545-546) e de 0. Gram et al. (Thromb. Res. 1986, 49, 781-789).
As englobinas foram em seguida depositadas sobre placas de fibri na bovina, as áreas de lise foram medidas após 18 horas a 3790.
Resultados:
a actividade lítica observada sobre placa de fibrina é apresentada abaixo:
Amostras tPA de referência IC 1903
T.o 61,66 +.
T + 1 min. 246,66 +.
T + 2 min. 213,16 i
T + 3 min. 170,16
T + 4 min. 176,83 +.
T + 5 min. 156,00 +.
T + 7 min. 123,00 +
T + 10 min. 123,20 ±
T + 15 min. 100,50 +.
T + 20 min. 111,60 ±
T + 30 min. 92,00 +_
T + 45 min. 104,00 +.
T + 60 min. 121,60 +
N. B, • · - superfície de lise em mm^
X número de animais = 5
XX número de animais = 3
XXX número de animais = 4
35,48 68,66 36,81
66,49 355,83 98,70
50,55 301,50 + 54,96
49,11 272,00 + 64,66
75,00 258,33 + 55,46
40,61 247,50 + 67,24
35,60 218,83 + 49,90
29,52* 197,66 + 45,39
28,14 160,33 + 43,66
18,74* 142,00 + 58,94*
46,00* 131,66 58,94**
53,75* 110,75 58,27***
58,75* 119,16 + 43,73
: média + SD
6.2 - Estudo farmacocinético de IC 1857
Estudou-se comparativamente a cinética de acção da uroquj. nase nativa e a do produto preparado segundo a invenção IC 1857 (Exemplo 1, experiência l). A experiência foi efectuada em coelhos (7 animais por produto).
290
0354 Ε
-40Protocolo do estudo:
os animais foram anestesiados como no exemplo 6.1 acima e efectuou-se uma primeira amostra no tempo T.O.
Os animais receberam em seguida 10 000 /</kg de produto de preferência e IC 1857, nas mesmas condiçBes que anteriormente. As amostras foram retiradas nos minutos 1, 5, 10, 15, 20 e 30. A totalidade do sangue foi centrifugada para recuperar o plasma e as amostras foram testadas em tubo de ensaio para avaliação da sua actividade amidolltica segundo a técnica descrita por Kabi.
A actividade lítica foi medida por densitometria e transposta para unidades de uroquinase, segundo uma curva padrão obtida por passagem nas mesmas condiçBes operatórias de um padrão de uroquinase.
Os resultados foram os seguintes:
Amostras UK de referência IC 1857
tf/ml y^/ml
T.O 0,0 0,0
T + 1 min 209,8 40,7 85,8 +. 10,2
T + 5 min. 84,6 + 25,7* 51,2 18,2
T + 10 min. 26,2 +. 15,4* 34,8 +. 11,6
T + 15 min. 8,6 ± 7,0 17,8 +. 9,1
T + 20 min. 4,1 +. 4,8* 16,5 +. 11,8
T + 30 min. 0,7 +. 1,3 5,2 + 5,3
N.B.: x número de animais = 6
XX número de animais = 5
Cons tatou -se uma farmacocinética alongada de IC 1857 em
relação à uroquinase de referência uma vez que para tempos de + 15 min., +20 min e +30 min., hã ainda uma actividade uroquinásica no plasma dos animais.
Exemplo 7: estudo toxicologico dos produtos do invento
Administraram-se IC 1857 e IC 1903 numainjecção única a ratos, por via intravenosa, a uma dose de 2 mg/kg. Os animais foram observados durante 8 dias e não apresentaram sinais de to69 290
0354 Ε
-41xicidade.
Como decorre do que se refere atrás, os produtos do inveja to apresentam um grande interesse como medicamentos. De facto, o método de ligação escolhido é particuiarmente vantajoso. A manutenção de uma configuração espacial apropriada da substância peptídica ligada permite conservar a actividade da substância activa e a conjugação a um suporte poliosídico acarreta um reforço de actividade e um prolongamento da mesma.
As enzimas trombolíticas tal como a uroquinase e o activador tissular do plasminogénio conjugadas ao suporte poliosídico constituem então um medicamento trombolítico a salientar que pod_e rá ser utilizado no tratamento de tromboses e embolias venosas e arteriais de formação recente, por exemplo as tromboses coronárias, as embolias pulmonares, as flebites e os enfartes do miocárdio.
De forma vantajosa, IC 1857, produto da conjugação da uro quinase com um fragmento de heparina poderá ser administrado ao homem à razão de 1 000 a 10 000 /xl/kg/hora, de preferência 2 000 a 4 000 ^ul/kg/hora, por perfusão intravenosa contínua ou injecção intravenosa lenta; isolada ou associada a um tratamento de plasminogénio.

Claims (16)

  1. reivindicaçBes
    1 - Processo para a preparação de um N-poliosilpolipéptido de fórmula (Ósido-Z'-CH2-NH-)nP' (I) em que
    - P' é o radical de valência n de um polipéptido P ligado aos n grupos NH provenientes de n grupos amino livres presentes originalmente na molécula de P, sendo P' diferente do radical monovalente da hemoglobina;
    - Z' é a unidade sacarídica terminal redutora do polissacarídeo ósido-Z na sua forma aldeidica, natural ou proveniente da despolimerização nitrosa, privada do grupo aldeidico de Z;
    - ósido é o resíduo do polissacarideo ósido-Z;
    - n é um número inteiro de 2 a 30 ou, quando for caso di_s so de um dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado por se tratar um polipéptido P representado pela fórmula
    P°(NH2)m (II) na qual P° é o radical de valência m do polipéptido P ao qual estão ligados os seus m grupos funcionais NH2 livres, sendo os refe ridos m grupos funcionais NH2 grupo terminal amino e os grupos amino em posição epsilon das (m-l) lisinas contidas no polipéptium do, com um excesso de/poliósido representado pela fórmula
    X
    Osido-Z (III) sendo Z a unidade sacarídica terminal redutora do referido polissacarídeo na sua forma aldeidica, natural ou proveniente de uma
    X despolimerização nitrosa e sendo Osido o resíduo de cadeia do referido polissacarideo e se submeter a polibase de Schiff assim obtida de fórmula (Ósido-Z’-CH=N-) P' n (IV)
    69 290
    0354 Ε /', ·'
    -43ζ na qual ο radical monovalente Osido-Z representa o polissacarídeo z
    Osido-Z como se definiu acima, privado do grupo aldeídico de Z e P' e n são como se definiu acima, a uma redução com um cianoboro-hidreto.
  2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza z
    do por se utilizar como poliósido Osido-Z de partida, um poliósido escolhido entre a heparina, os fragmentos de heparina, a condroitina-4-S-sulfato, a condroitina-6-S-sulfato, a heparana-sulfa to e a dermatana-sulfato.
  3. 3 - Processo para a preparação de um N-poliosil-polipépt_i do de fórmula I de acordo com a reivindicação 1 no qual:
    - P' e n são como se definiu na reivindicação 1;
    - Z é a unidade sacarídica terminal redutora de um glicoz saminoglicano do tipo heparlnico Osido-Z na sua forma aldeídica proveniente da despolimerização nitrosa da heparina;
    z z
    - Osido é o resíduo do polissacarídeo Osido-Z, caracteriz zado por se utilizar como poliósido Osido-Z de partida um poliós_i do constituído por uma mistura de fragmentos de heparina possuindo uma massa molecular entre 2000 e 8000 Daltons.
  4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracteriza z
    do por se usar, como poliósido Osido-Z de partida, uma mistura de fragmentos de heparina obtidos por despolimerização nitrosa, possuindo uma massa molecular média de cerca de 4500 Daltons.
  5. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado por conduzir α obtenção de um N-poliósilpolipáptido de fórmula I na qual Z' tem a estrutura onde R é hidrogénio ou um grupo S0^“.
  6. 6 - Processo de acordo com qualquer das reivindicaçães 1
    69 290
    0354 Ε
    -44a 5, caracterizado por o polipéptido P ser escolhido de entre as hormonas polipéptidicas glicosiladas ou não, as toxinas glicosiladas ou não, as enzimas e os inibidores de enzima.
  7. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o polipéptido P ser uma enzima trombolltica o que conduz a um N-poliosilpolipéptido de fórmula I na qual P 1 é o radical de valência n da dita enzima ligada aos n grupos NH provenientes de n grupos amino livres presentes originalmente na molécula da dita enzima trombolltica;
    - n é de 2 a 20.
  8. 8 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracteriza do por a enzima trombolltica ser a uroquinase, o que conduz a um N-poliosilpolipéptido de fórmula I no qual P’ é o radical de valência n da uroquinase ligada aos n grupos NH provenientes de n grupos amino livres presentes originalmente na molécula de uroqui nase referida;
    - n é igual ou inferior a 6, de preferência 6, 4 ou 3.
  9. 9 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracteriza do por a enzima trombolltica ser a estreptoquinase, o que conduz a um N-poliósilpolipéptido de fórmula I no qual P’ é o radical de valência n da estreptoquinase ligada aos n grupos NH provenientes de n grupos amino livres presentes originalmente na molécula de estreptoquinase referida;
    -néde2a4.
  10. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a enzima trombolltica ser o tPA, o que conduz a um N-poliosilpolipéptido de fórmula I no qual P' é o radical de valência n do tPA ligado aos n grupos NH provenientes de n grupos amino l_i vres presentes originalmente na molécula do referido tPA;
    - n é de 3 a 10.
  11. 11 - Processo de acordo com as reivindicaçães 4 e 8, caz racterizado por se utilizar como Qsido-Z uma mistura de fragmentos de heparina com uma massa molecular média de cerca de 4500 La_l
    69 290
    0354 Ε
    -45tons e como polipéptido P a uroquinase, o que conduz a um N-poliosilpolipéptido de fórmula ch2nhno qual é o hidrogénio ou um grupo SO^ , é um grupo acetilo ou um grupo S0^ ,
    - R.
    - R,
    - P' é o radical trivalente da uroquinase ligado aos 3 gru pos NH provenientes de 3 grupos amino livres presentes originalme_n te na molécula da uroquinase e
    - p, de 4 a 24, representa o número de unidades dissacarí_ dicas de fragmentos de heparina provenientes de uma despolimeriz_a ção nitrosa numa mistura com uma massa molecular média de cerca de 4500 Daltons e contendo o local de fixação ao AT III.
  12. 12 - Processo de acordo com as reivindicações 4 e 10, caracterizado por se utilizar como Osido-Z uma mistura de fragmentos de heparina com uma massa molecular média de cerca de 4500
    Daltons e como polipéptido P polipéptido de fórmula o tPA, o que conduz a um N-poliosil- ch2nh69 290
    0354 Ε
    -46na qual
    - Rj á o hidrogénio ou um grupo 50^ ,
    - R2 ê um grupo acetilo ou um grupo Ξ0^ ,
    - P' é o radical pentavalente do tPA ligado aos 5 grupos NH provenientes dos 5 grupos amino livres presentes originalmente na molécula de tPA, e
    - ρ, de 4 a 24, representa o número de unidades dissacar_l dicas de fragmentos de heparina provenientes de uma despolimeriz^ ção nitrosa numa mistura com uma massa molecular de cerca de 4500 Daltons e contendo o local de fixação ao AT III.
  13. 13 - Processo de acordo com as reivindicaçóes 4 e 10, caX racterizado por se utilizar como Osido-Z uma mistura de fragmentos de heparina com uma massa molecular média de cerca de 4500 Daltons e como polipéptido P 0 tPA, □ que conduz a um N-poliosilpolipéptido de fórmula em que
    - R^ é hidrogénio ou um grupo S0^ ,
    - R2 é um grupo acetilo ou um grupo 30^~,
    - P' é o radical octovalente do tPA ligado aos Θ grupos NH provenientes de 8 grupos amino livres presentes originalmente na molécula de tPA e
    - p, de 4 a 24, representa 0 número de unidades dissacari. dicas de fragmentos de heparina provenientes de uma despolimeriz_a ção nitrosa de uma mistura com uma massa molecular de cerca de 4500 Daltons e contendo local de fixação ao AT III.
    69 290
    0354 Ε
    -4714 - Processo de acordo com as reivindicações 4 e 10, caracterizado por se utilizar como 0sido-2 uma mistura de fragmentos de heparina com uma massa molecular média de cerca de 4500 Daltons e como polipéptido Ρ o tPA, o que conduz a um l\l-poliosilpolipéptido de fórmula no qual
    - Rj é o hidrogénio ou um grupo 5 0^ ,
    - F?2 é um grupo acetilo ou um grupo 50^~,
    - P' é o radical monovalente do tPA ligado aos 9 grupos NH provenientes de 9 grupos amino livres presentes originalmente na molécula de tPA, e
    - p, de 4 a 24, representa o número de unidades dissacar_I dicas de fragmentos de heparina provenientes de uma despolimeriza ção nitrosa numa mistura com uma massa molecular de cerca de 4500 Daltons e contendo o local de fixação ao AT III.
  14. 15 - Processo de acordo com qualquer das reivindicaçães 1 a 14, caracterizado por se utilizar como cianoboro-hidreto, d cia noborc-hidreto de sódio.
  15. 16 - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracteri zado por se utilizar, como cianoboro-hidreto, o cianoboro-hidreto de sódio, sendo a reacção entre P° (PJH2) e 0 Qsido-Z conduzida na presença do referido cianoboro-hidreto de sódio de modo a obter directamente 0 N-poliosilpolipéptido final.
    69 290
    0354 Ε
    -4817 - Processo de preparação de uma polibase de Schiff de fórmula IV de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se efectuar a reacção de um polipéptido P de fórmula II com um poli, ósido Osido-Z de fórmula III tais como foram definidos na reivi_n dicação 1.
  16. 18 - Processo de preparação de uma composição farmacÊuti ca, caracterizado por se associar, como substância activa um N-poliosilpolipéptido de fórmula I, preparado de acordo com as reivindicações 1 a 16, com um veiculo farmacêutico.
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