CN101137396A - 由无活性初始材料制备生物活性糖蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备包含糖蛋白和聚合物或所述聚合物的衍生物的偶联物的方法，其中该聚合物是羟烷基淀粉(HAS)，该方法包括以下步骤：a)在能够催化在糖蛋白和修饰的多元醇之间形成共价键的转移酶存在下，使所述糖蛋白与带有通过共价键与之连接的官能团Z的修饰的多元醇反应，产生与多元醇共价连接的糖蛋白，后者带有通过共价键与之连接的至少一个官能团Z，和b)使聚合物或其衍生物的至少一个官能团A与在步骤a)中添加到所述糖蛋白上的糖蛋白的至少一个官能团Z反应，由此形成共价键。
Description
引言
促红细胞生成素是一种分子量约为34,000Da的酸性糖蛋白激素。人促红细胞生成素是一种166个氨基酸的多肽，其作为单体天然存在(Lin等人，1985，PNAS 82，7580-7584，EP 148 605 B2，EP 411 678 B2)。例如，美国专利4,703,008描述了对编码促红细胞生成素的基因的鉴定、克隆和表达。例如，美国专利4,667,016描述了从支持含有重组促红细胞生成素质粒的哺乳动物细胞生长的细胞培养基中纯化重组促红细胞生成素。
在本技术领域中一般确信，EPO在体内的生物活性主要取决于EPO结合唾液酸的程度(参见，例如EP 428 267B1)。理论上，14个唾液酸分子可以结合到1分子EPO的糖侧链的末端，该糖侧链连接到N-和O-糖基化位点上。但是，在国际EPO标准制品(BRP-EPO标准批II)中，它是从中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中重组表达的人分子制品，存在具有10-14个或15个唾液酸残基的EPO同种型。为了保证EPO的适当的体内生物活性，其复合型N-聚糖部分的末端唾液酸掩蔽的半乳糖残基的数目是重要的。
对于用于药物应用的其他糖蛋白也是这样。糖蛋白如IFN-β、抗体、hcg、FSH和LH的体内生物活性也被认为依赖于唾液酸对其N-和O-聚糖的适当封端(capping)。
对于EPO，要从重组来源中获得显示足够高体内生物活性的高度唾液酸化的EPO制品，必须经过非常复杂的纯化步骤。因此，必须将细胞向培养基中分泌的显著高比例的总EPO与高活性形式的所需终产物分开。这将有利于利用低唾液酸化形式的EPO-和通常低唾液酸化形式的其他糖蛋白一它们通常因为不适合药物应用而被丢弃。
本发明描述了一种使这些低唾液酸化的糖蛋白制品可用于药物应用的温和方法。用酶将官能团引入糖蛋白内，随后在引入的官能团处进行共价HES-修饰，产生了修饰的糖蛋白，其具有与完全唾液酸化的糖蛋白形式相当或甚至更高的体内活性。本文利用人EPO作为实例描述了可以修饰严重缺乏末端唾液酸残基的EPO制品，产生了体内生物活性与每个EPO分子总共含有14个唾液酸的制品相当的制品。
发明详述
因此，本发明涉及一种制备包含糖蛋白和聚合物或所述聚合物的衍生物的偶联物的方法，其中该聚合物是羟烷基淀粉(HAS)，该方法包括步骤：
a)在能够催化在糖蛋白和如下所述修饰的多元醇之间形成共价键的转移酶存在下，使所述糖蛋白与带有通过共价键与之连接的官能团Z的修饰的多元醇反应，产生与多元醇共价连接的糖蛋白，后者带有通过共价键与之连接的至少一个官能团Z，和
b)使聚合物或其衍生物的至少一个官能团A与在步骤a)中添加到所述糖蛋白上的糖蛋白的至少一个官能团Z反应，由此形成共价键。
通常，官能团A和Z没有具体的限制，前提是A和Z反应可以形成共价键。例如可以想到以下基团A：
-C-C-双键或C-C-三键或芳香族C-C-键；
-硫基或羟基；
-烷基磺酸酰肼，芳基磺酸酰肼；
-1，2-二醇；
-1，2-氨基-硫醇；
-1，2-氨基醇；
-氨基-NH2或包含结构单元-NH-的氨基衍生物，例如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；
-羟氨基-O-NH2，或包含结构单元-O-NH-的羟氨基衍生物，例如羟烷基氨基、羟芳基氨基、羟芳烷基氨基或羟烷芳基氨基；
-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，其各包含结构单元-NH-O-；
-具有羰基、-Q-C(＝G)-M的残基，其中G是O或S，并且M是例如：
-- -OH或-SH；
-- 烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、或烷芳氧基；
-- 烷硫基、芳硫基、芳烷硫基、或烷芳硫基；
-- 烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基氧基；
-- 活化的酯，如羟胺的酯，其具有如N-羟基琥珀酰亚胺的亚胺结构或具有结构单元O-N，其中N是杂芳基化合物的一部分，或其中G＝0且Q不存在，如具有取代芳基残基如五氟苯基、对硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；
其中Q不存在或者是NH或杂原子，如S或O；
--NH-NH2，或-NH-NH-；
--NO2；
-腈基；
-羰基，如醛基或酮基或半缩醛基；
-羧基；
--N＝C＝0基或-N＝C＝S基；
-乙烯基卤化物基团，例如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基团或三氟甲磺酸酯(triflate)；
--C≡C-H；
--(C＝NH2l)-O烷基
--(C＝O)-CH2-Hal基团，其中Hal是Cl、Br、或I；
--CH＝CH-SO2-；
-包含-S-S-结构的二硫基；
-基团
-基团
因此，官能团Z是与官能团A、优选地与是上述官能团之一的官能团A能够形成共价化学键的基团。更优选地，Z选自上述基团。
优选地，步骤b)通过聚合物或其衍生物的至少一个官能团A与通过在步骤a)中引入基团Z而修饰的糖蛋白的至少一个官能团Z反应进行，由此形成共价键，其中Z选自氨基、硫醇基、醛基、半缩醛基、酮基、马来酰亚胺基和硫酯基。
更优选地，通过聚合物或其衍生物的至少一个官能团A与在步骤a)中添加到所述糖蛋白上的糖蛋白的至少一个官能团Z反应，进行步骤b)，由此形成共价键，其中Z选自氨基、硫醇基、醛基、半缩醛基、酮基、马来酰亚胺基和硫酯基，
-其中，若Z为醛基或酮基时，A包含与Z形成所述键的氨基，
-其中，若Z为氨基时，A选自反应性羧基和醛基、酮基或半缩醛基，
-其中，若Z为马来酰亚胺基时，A包含与Z形成所述键的硫醇基，
--其中，若A为醛基、酮基或半缩醛基时，该方法还包括通过以下方式向聚合物中引入A，以形成聚合物衍生物
---使聚合物与至少双官能化合物反应，其中一个官能团可与聚合物反应，其中至少另一个官能团为醛基、酮基或半缩醛基，或者是经进一步化学修饰后产生醛基、酮基或半缩醛基的官能团，或
---氧化该聚合物，产生至少一个、特别是至少两个醛基，或
--其中，若A为反应性羧基时，该方法还包括通过以下方式向聚合物中引入A，以形成聚合物衍生物
---选择性氧化聚合物的还原端，并活化所得的羧基，或
---使聚合物的未氧化的还原端与碳酸二酯反应，或
-其中，若Z为硫醇基时，A包含与Z形成所述键的
--马来酰亚胺基，或
--卤乙酰基。
官能团Z向糖蛋白的酶转移具有非常温和且避免了可能导致甲硫氨酸残基氧化和/或谷氨酰胺/天冬酰胺残基脱酰胺作用的氧化和/或酸性条件的优点。此外，通常不存在于蛋白质中的官能团Z可以与糖蛋白连接，从而使随后与官能团A的反应潜在地具有位点特异性。
与糖蛋白连接的官能团Z和与羟烷基淀粉连接的A选择为在温和条件下互相反应。特别是，
-若Z为醛基或酮基时，A包含与Z形成所述键的氨基，
-若Z为马来酰亚胺基时，A包含硫醇基，和
-若Z为氨基时，A选自反应性羧基和醛基、酮基或半缩醛基。
本发明的方法还包括向聚合物中引入官能团A，形成能够与在步骤a)添加官能团Z后修饰的糖蛋白反应的聚合物衍生物。
因此，在A为醛基、酮基或半缩醛基时，该方法还包括向聚合物中引入A，形成聚合物衍生物：
---使聚合物与至少双官能化合物反应，其中一个官能团可与聚合物反应，至少另一个官能团为醛基、酮基或半缩醛基，或者是经进一步化学修饰后产生醛基、酮基或半缩醛基的官能团，或
---氧化该聚合物，产生至少一个、特别是至少两个醛基，或
因此，若A为反应性羧基时，该方法还包括向聚合物中引入A，形成聚合物衍生物
---选择性氧化聚合物的还原端，并活化所得的羧基，或
---使聚合物的未氧化的还原端与碳酸二酯反应。
在Z为硫醇基时，A包含与Z形成所述键的马来酰亚胺基或卤乙酰基。在步骤a)中引入硫醇基Z优选地在以下情况下进行：其中糖蛋白本身没有可与基团A反应的游离硫醇基。例如，在分泌的糖蛋白中通常如此，其中通常所有半胱氨酸残基都参与了蛋白质内半胱氨酸桥键。
如果Z是马来酰亚胺基，则A包含与Z形成所述键的硫醇基。在步骤a)中引入马来酰亚胺基Z是一个优选实施方案，因为糖蛋白本身通常没有这样的可与A反应的官能团。
如果Z是氨基，则A包含反应性羧基、醛基、酮基或半缩醛基。在步骤a)中引入氨基，特别是其中Z是羟基氨基或酰肼基，是一个优选实施方案，因为糖蛋白本身通常没有可与A反应的这样的官能团。
本发明的方法的另一个优点是各个步骤和整个方法具有高产率。因此，本发明也涉及如上所述的方法，其中由步骤a)获得的修饰的糖蛋白有至少50％、优选至少75％、更优选至少90％在步骤b)中被转化为产物偶联物。该产物偶联物包含输入糖蛋白和聚合物或聚合物衍生物。该聚合物或聚合物衍生物可以与糖蛋白通过在修饰的多元醇的基团Z和聚合物或聚合物衍生物的基团A之间形成的共价键而连接。优选地，该聚合物或聚合物衍生物只与糖蛋白通过在修饰的多元醇的基团Z和聚合物或聚合物衍生物的基团A之间形成的共价键连接，即，该聚合物或聚合物衍生物只与通过将修饰的多元醇添加到糖蛋白上而提供的官能团反应。
因此，本发明也涉及如上所述的方法，其中在步骤a)中至少50％、更优选至少75％、更优选至少90％的初始一即未修饰的一糖蛋白被转化为修饰的糖蛋白一即与多元醇共价连接的糖蛋白，后者带有通过共价键与之连接的至少一个官能团Z。
要转移到糖蛋白上的多元醇底物和在转移酶反应中使用的转移酶可以是WO03/031464公开的所有多元醇和所有转移酶。本文使用的修饰的多元醇是任何修饰的但仍然是糖基转移酶的适当底物的多元醇。在一个优选实施方案中，修饰的多元醇是修饰的糖核苷酸，特别是修饰的岩藻糖-、葡萄糖-、甘露糖-、N-乙酰葡糖胺-、N-乙酰半乳糖胺-或半乳糖-核苷酸，更优选CMP-NeuAc、GDP-Man、UDP-GlcNAc、UDP-Gal-NAc、UDP-Glc、或GDP-Fuc。
修饰的多元醇，特别是修饰的糖核苷酸，可以带有直接连接到多元醇骨架的碳原子上的官能团Z(例如与葡萄糖残基的C6连接的硫醇基)，或者官能团Z可以通过连接分子连接。其中，连接分子可以是任选取代的直链、支链和/或环状烃残基。通常，所述烃残基具有至多60个碳原子，优选至多40个，更优选至多20个，更优选至多10个，更优选至多6个，特别优选至多4个碳原子。如果存在杂原子，该分隔基通常包含1至20个杂原子，优选1至8个，更优选1至6个，更优选1至4个，特别优选1至2个杂原子。优选0作为杂原子。烃残基可包含具有例如5至7个碳原子的任选分支的烷基链或芳基或环烷基，或者是芳烷基、烷芳基，其中烷基部份可以是直链和/或环状烷基。根据本发明一个甚至更优选的实施方案，连接体是具有4个碳原子的直链烃链。根据本发明另一个优选实施方案，连接体是具有4个碳原子和至少一个、优选一个杂原子、特别优选一个氧原子的直链烃链。这些修饰的和连接体修饰的多元醇可以通过有机化学合成法制备，例如，如″Carbohydrates inChemistry and Biology part I，Vols.1+2，B.Ernst，G.W.Hart andP.Sinay eds.Published 2000，Whiley-VCH Weinheim-NewYork-Chichester-Brisbane-Toron to，ISBN 3-527-29511-9中所述。
在本发明方法的步骤a)中有用的优选转移酶是EC 2.4.1类别的糖基转移酶，特别是其中该转移酶选自β1-4半乳糖基转移酶、β-1，3-半乳糖基转移酶、α-1，3-半乳糖基转移酶、GlcNAc-转移酶、甘露糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、岩藻糖基转移酶和唾液酸转移酶。
在本发明中，术语“糖基化蛋白”或“糖蛋白”，即具有“碳水化合物侧链”的蛋白质，是指包含碳水化合物部分如羟基醛或羟基酮的蛋白质，以及其化学修饰产物(参见
Chemielexikon；ThiemeVerlag Stuttgart，Germany，9th edition 1990，Volume9，pages2281-2285以及其中引用的文献)。此外，也指天然产生的碳水化合物片断如半乳糖、N-乙酰神经氨酸和N-乙酰半乳糖胺等的衍生物。
可以根据本发明偶联的优选糖蛋白说明如下：
促红细胞生成素：EPO可以是任何人来源的(参见，例如，Inoue，Wada，Takeuchi，1994，An improved method for the purificationof human erythropoietin with high in vivo activity from the urineof anemic patients，Biol.Pharm.Bull.17(2)，180-4；Miyake，Kung，Goldwasser，1977，Purification of human erythropoietin.，J.Biol.Chem.，252(15)，5558-64)或者另外一种哺乳动物来源的，并且可以通过从天然存在的来源(如人肾脏、人胚胎肝脏，或动物，优选猴肾)中纯化获得。此外，表述“促红细胞生成素”或“EPO”也包括EPO变体，其中一个或多个氨基酸(例如1-25个，优选1-10个，更优选1-5个，最优选1个或2个)已经被置换为另外的氨基酸，并显示促红细胞生成活性(参见，例如EP 640 619 Bl)。促红细胞生成活性的测定在本领域中有描述(关于体外活性的测定，参见，例如Fibi等人.，1991，Blood，77，1203 ff；Kitamura等人.，1989，J.Cell Phys.，140，323-334；关于EPO体内活性的测定，参见Ph.Eur.2001，911-917；Ph.Eur.2000，1316 Erythropoietini solutio concentrata，780-785；European Pharmacopoeia (1996/2000)；EuropeanPharmacopoeia，1996，Erythropoietin concentrated solution，Pharmaeuropa.，8，371-377；Fibi，Hermentin，Pauly，Lauffer，Zettlmeissl.，1995，N- and O-glycosylation muteins ofrecombinant human erythropoietin secreted from BHK-21 cells，Blood，85(5)，1229-36；(在第1、2、3天对雌性NMRI小鼠注射EPO和修饰的EPO型(等量50ng蛋白质/小鼠)，在第4天采集血样，测定网织红细胞))。关于EPO活性测定的其它出版物包括：Barbone，Aparicio，Anderson，Natarajan， Ritchie，1994，Reticulocytes measurementsasabioassay for erythropoietin，J.Pharm.Biomed.Anal.，12(4)，515-22；Bowen，Culligan，Beguin，Kendall，Villis，1994，Estimation of effective and totalerythropoiesis inmyelodysplasia using serum transferrin receptor anderythropoietin concentrations，with automated reticulocyteparameters，Leukemi，8(1)，151-5；Delorme，Lorenzini，Giffin，Martin，Jacobsen，Boone，Elliott，1992，Role of glycosylationon the secretion and biological activity of erythropoietin，Biochemistry，31(41)，9871-6；Higuchi，Oh-eda，Kuboniwa，Tomonoh，Shimonaka，Ochi，1992；Role of sugar chains in theexpression of the biological activity of human erythropoietin，J.Biol.Chem.，267(11)，7703-9；Yama guchi，Akai，Kawanishi，Ueda，Masuda，Sasaki，1991，Effects of site-directed removal ofN-glycosvlation sites in human erythropoietinon its productionand biological properties，J.Biol.Chem.，266(30)，20434-9；Takeuchi，Inoue，Strickl and，Kubota，Wada，Shimizu，Hoshi，Kozutsumi，Takasaki，Kobata，1989，Relationship between sugarchain structure and biological activity of recombinant humanerythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85(20)，7819-22；Kurtz，Eckardt，1989，Assay methods for erythropoietin，Nephron.，51(1)，11-4(German)；Zucali，Sulkowski，1985，Purification of human urinaryerythropoietin on controlled-poreglass and silicic acid，Exp.Hematol.，13(3)，833-7；Krystal，1983，Physical and biologicalcharacterization of erythroblast enhancing factor(EEF)，alateactingerythropoietic stimulator in serum distinct fromerythropoietin，Exp.Hematol.，11(1)，18-31。
HCG刺激卵巢合成对于维持妊娠重要的类固醇。它是胎盘分泌的异二聚体，具有共同的α链和独特的β链，β链提供对促甲状腺素、促黄体激素、促滤泡素和促性腺激素的生物特异性。它由妊娠期前三个月的胎盘产生。可以以商品名Novarel(Ferring)和Profasi(Serono)获得。HCG用作肥胖症的辅助治疗。β链含有两个N-糖基化位点和4个O-糖基化位点。HCG属于糖蛋白激素β链家族。HCG是由胎盘以及各种肿瘤释放的激素(″孕激素″)，但是局部产生，并且也在睾丸和其他组织内作用。它是糖蛋白激素(GPH)家族的一个成员，该家族的其他成员有垂体激素、促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)和促甲状腺激素(TSH)。其中每一种都是由共同的α单位和激素特异性的β单位组成的异二聚体。这些亚单位彼此部分同源，最主要是其三级结构上。最近对hCG晶体结构的阐述揭示所有这些亚单位与神经生长因子(NGF)、血小板来源生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGFβ)和与GPH无关的其他生长因子具有相同的所谓胱氨酸结基序。hCG的β亚单位非常类似于LH的β亚单位(Lapthorn，AJ，Harris，D.C.，Littlejohn，A，Lustbader，JW，Canfield，RE，Machin，KJ，Morgan，FJ，Isaacs，NW：Crystalstructure of human chorionic gonadotropin.Nature，369,455-461，1994)。
LH通过刺激睾丸和卵巢合成类固醇而促进精子发生和排卵。它由脑垂体分泌，是共同的α单位和独特的β链的异二聚体，β链提供对促甲状腺素、促黄体激素、促滤泡素和促性腺激素的生物特异性。LHB缺陷是性腺机能减退的一个原因，该疾病的特征是不育和假两性畸形。LH属于糖蛋白激素β链家族(Weisshaar G.，Hiyama J.，Renwick A.G.C.，Nimtz M.；″NMR investigations of the N-linked oligosaccharidesat individual glycosylation sites of human lutropin.″； Eur.J.Biochem.195：257-268(1991))。
FSH是共同的α单位和独特的β链的异二聚体，β链提供对促甲状腺素、促黄体激素、促滤泡素和促性腺激素的生物特异性。它以商品名Gonal-F或Metrodin HP(Serono)和Puregon(Organon)获得，并且用于治疗确诊为垂体机能减退或对氯米芬无响应的女性的不育；或者用于辅助受孕的超排卵治疗(如体外授精)。Metrodin HP也用于治疗男性的促性腺激素分泌不足的性腺机能减退，用于刺激精子发生(FujikiY.，Rathnam P.，Saxena B.B.；″Srudies on the disulfide bonds inhuman pituitary follicle-stimulating hormone.″；Biochim.Biophys.Acta 624：428-435(1980)，和Keene J.L.，Matzuk M.M.，Otani T.，Fauser B.C.J.M.， Galway A.B.，Hsueh A.J.W.，BoimeI.；″Expression of biologically active human follitropin inChinese hamster Ovary cells.″；J.Biol.Chem.264：4769-4775(1989))。
抗体融合蛋白已知是治疗剂，在临床试验上，例如增强和加强对抗乳腺癌的宿主防御系统。IL2、IL12、GM CSF和抗适当靶标的人IgG的Fc部分或单链可变区(scFv)的组合，例如，介导T细胞免疫刺激，具有靶向特异性，并且易于输送开发的单克隆抗体。一般而言，抗体融合蛋白在Fc—部分具有N—糖基化位点，在分子的细胞因子部分可能含有N—和O—糖基化位点(Antibody Fusion Proteins 312 pages Editor：Steven M.Chamow；Editor：AviAs hkenazi；John Wiley & Sons，Inc)。
白介素，特别是白介素2或6，由T细胞响应于抗原或有丝分裂原刺激而产生，该蛋白质是T细胞增殖和其他免疫应答调节的关键活性所需的。可以刺激B细胞、单核细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞、自然杀伤细胞、和神经胶质瘤细胞。白介素2与一种形式的T—细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)有关，这是由于涉及TNFRSF17和IL2的染色体易位t(4；16)(q26；p13)。它以商品名Proleucin(Chiron)获得，并且用于肾细胞癌或转移性黑素瘤患者。J.Biol. Chem.264：17368-17373(1989)。
白介素6是一种具有广泛生物功能的细胞因子：它在B细胞最终分化为Ig分泌细胞中起重要作用，它诱导骨髓瘤和浆细胞瘤生长，诱导神经细胞分化，在肝细胞中诱导急性期反应物。J.Mol.Cell.Immunol.4：203-211(1989)。
粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子是通过控制血液中2种相关白细胞群体即粒细胞和单核细胞-巨噬细胞的产生、分化和功能而在血细胞生成中起作用的细胞因子。G-CSF诱导粒细胞。切下信号肽的成熟蛋白的分子量为19046道尔顿。它含有单一的O-糖基化位点。G-CSF可以以Neupogen或Granulokine (Amgen/Roche)和Granocyte(Rhone-Poulenc)的商品名获得。G-CSF用于治疗中性粒细胞减少症(一种以血液中中性粒细胞数极少为特征的疾病)。
干扰素是介导对病毒感染和其他生物诱导物应答的抗病毒、抗增殖和免疫调节活性的细胞因子。例如，EP 0 218 825 Al给出了人干扰素β的氨基酸序列。干扰素β的有用的商业制品是Avonex和Rebif(IFNβ1a)。通过重组DNA技术，使用引入了人干扰素β基因的遗传工程中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，产生IFNβ1a。IFNβ1a的氨基酸序列与来源于天然成纤维细胞的人干扰素β的氨基酸序列相同。天然干扰素β和干扰素β1a在Asn80处糖基化，各自包含单个N-连接复合糖部分。干扰素β药物可以用于治疗复发—缓解型多发性硬化。
单核细胞/巨噬细胞、类淋巴母细胞、成纤维细胞和许多不同细胞类型在由病毒、核酸、糖皮质激素和其他诱导物诱导后天然产生IFNα型。已知IFNα有至少23种不同的变体。各蛋白质的分子量在19-26kD之间，由长度为156-166或172个氨基酸的蛋白质组成。所有的IFNα亚型在115-151氨基酸位都具有一个共同的保守序列区，而氨基末端则是可变的。许多IFNα亚型的序列仅有1或2个位置不同。在1/98位和29/138位的半胱氨酸之间形成了二硫键。29/138的二硫键对于生物活性是必需的，而1/98的键则可以还原而不影响生物活性。所有的IFNα型包含潜在的糖基化位点。糖基化的IFNα形式在本发明中有用。
人IFN-γ是由活化的T、B和NK细胞产生的一种大约20kDa的因子，它是抗病毒和抗寄生虫细胞因子。该分子含有两个潜在的N-糖基化位点。IFN-γ与其他细胞因子如TNF-α协同抑制正常和转化的细胞的增殖。IFN-γ的免疫调节作用作用于广泛范围的表达高亲和力IFN-γ受体的细胞类型。IFN-γ的糖基化不影响其生物活性。可以以商品名Actimmune(Genentech)获得，用于降低与慢性肉芽肿病有关的严重感染的频率和严重程度(Am J Ther.1996 Feb；3(2)：109-114)。
抗凝血酶III(AT III)是一种抑制凝血酶和因子Xa的丝氨酸蛋白酶抑制剂(Travis，Annu.Rev.Biochem.52：655，1983)。对因子IXa、XIa、XIIa、tPA、尿激酶、胰岛素、纤维蛋白溶酶和激肽释放酶也有较低程度的抑制(Menache，Semin.Hematol.28：1，1991；Menache，Transfusion 32：580，1992；Lahiri，Arch.Biochem.Biophys.175：737，1976)。人AT III是在肝脏中合成的单链糖蛋白，有432个氨基酸，分子量(MW)大约为58.000D。它的正常的血浆浓度的范围是14-20mg/dL(Rosenberg，Rev.Hematol.2：351，1986：Murano，Thromb.Res.18：259，1980)。这种蛋白质含有三个二硫桥键(Cys 8-128，Cys 21-95，Cys 247-430)和四个N-连接的碳水化合物链(Asn 96，-135，-155，-192)，它们占整个分子量的15％(Franzen，J.Biol.Chem. 255：5090，1980；Peterson，ThePhysiological Inhibitions Of Blood Coagulation andFibrino1ysis，Elsevier/North-Holl and Biomedical Press 1979，p43)。AT III可以用传统的人血浆分离技术来制备。利用肝素对AT III的高亲和性的亲和色谱法(肝素-琼脂糖)和随后的病毒灭活热处理来实现从血浆中的分离。近来制备AT III的选择有重组生产技术，这种技术提供了一种更安全的途径来获得这种治疗蛋白(Levi，SeminThromb Hemost 27：405，2001)。ATrynTM是一种重组人AT III(rh ATIII)，是由Genzyme Transgenics Corp(GTC)通过转基因山羊得到的。在欧洲医院市场上已有下述AT III药物(Source：IMS-ATC group2001)：Kybernin(Aventis Behring)， AT III(Baxter，Grifols)，Atenativ(Pharmacia)，Aclotine(LFB)，Grifols(Anbin)。
因子VII参与蛋白水解酶的内在凝血级联并且通过激活凝血级联的外在途径促进止血作用。F VII通过较低的蛋白质水解而被因子Xa、因子XIIa、因子IXa、或者凝血酶转化成因子VIIa。在有组织因子和钙离子的时候，通过限定的蛋白质水解作用，因子VIIa使因子X转变成因子Xa。在有组织因子和钙的时候，因子VIIa也可以使因子IX转变成因子IXa。因子VII是一种维生素k依赖的糖蛋白，包含有406个氨基酸残基(MW 50KD)。因子VII从捐献的人血浆中通过常规提取法产生，或者最近用重组系统得到。Novo Nordisk用幼仓鼠肾(BHK)细胞来生产NovoSeven它表达为406个氨基酸的单链蛋白质，标称分子量为55kDa(Thim，L.等人，Biochemistry 27：7785-7793(1988))。该分子含有四个碳水化合物侧链，两个O-连接的碳水化合物侧链在Ser 52，60处，两个N-相连的碳水化合物侧链在Asn 145，322处(Thim，L.等人，Biochemistry 27：7785-7793(1988))。
因子VIII参与蛋白酶的内部的凝血级联，在因子IXa使因子X转变成活性形式的因子Xa的反应中起辅助因子的作用，因子Xa最终导致纤维蛋白凝块的形成。因子VIII稳定性的缺乏可以导致A型血友病，这是一种常见的隐性X-联锁的凝血障碍。因子VIII既可以通过常规提取法从捐献的人血浆中产生，也可以用近来的重组系统来产生。例如，Bayer利用幼仓鼠肾(BHK)细胞产生Kogenate，而Baxter利用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生其产品Rekombinate。其为2351个氨基酸的完全单链蛋白质，名义分子量为267kD(Toole等，1984，Nature 312：342)，或者是完全或部分去除了B-域的其他形式，这能获得更稳定的产物而且可以获得更高的收率(Bhattacharyya等.2003，CRIPS 4/3：2-8)。HES化的蛋白质具有轻度免疫原性，因此可以减少这种并发症。
因子IX是一种维生素K-依赖型血浆蛋白质，其通过在Ca(2+)离子、磷脂、和因子VIIIa存在下将因子X转变成它的活化形式参与血液凝固的内源性途径。因子Ix是一种分子量约为55,000Da、在单链中包含415个氨基酸的糖蛋白(Yoshtake S.等，Biochemistry 24：3736-3750(1985))。因子IX可以从捐献的人血浆中常规提取产生，也可以用近来的重组系统来生产。Wyeth使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生产了BeneFIX
。它具有与来源于血浆的因子IX的Ala148等位型相同的一级氨基酸序列，并且与内源性因子IX具有相似的结构和功能性质。该蛋白质包含8个糖侧链。在Ser 53，61位和苏氨酸159，169，172，179位有6个O—连接的糖侧链，在Asn 157，167位有2个N—连接的糖侧链(Yoshitake S.等，Biochemistry 24：3736-3750(1985)；Balland A.等，Eur J Biochem.1988；172(3)：565-72)。
人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)是对于造血祖细胞的调节和分化以及刺激成熟细胞群的功能活化所必需的早期作用因子，它已经在酵母、细菌、昆虫、植物和哺乳动物细胞中克隆和表达，产生的蛋白质在结构、组成、血清半衰期和体内功能方面均有不同(Donahue，R.E.； Wang，E.A.；Kaufman，R.J.； Foutch，L.；Leary，A.C.：Witek-Giannetti，J.S.；Metzeger，M.；Hewick，R.M.；Steinbrink，D.R.；Shaw，G.；Kamen，R.；Clark，S.C.Effects of N-linked carbohydrates on the in vivo propertiesof human GM-CSF.Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.1986，51，pp.685-692)。天然的和哺乳动物细胞来源的hGM-CSF是含有127个氨基酸的蛋白质，既含有N-聚糖又含有O-聚糖。这种淋巴因子由于其潜在的治疗髓细胞性白血病的作用和刺激免疫缺陷或受疾病或辐射或/和化学疗法抑制的患者中粒细胞和巨噬细胞产生而具有临床价值(综述：Moonen，P.；Mermod，J.J.；Ernst，J.F.；Hirschi，M.；DeLamarter，J.F.Increased biological activity ofdeglycosylated recombinanthuman granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor produced by yeastor animal cells.Proc.Natl.Acad.Sci.US.1987，84，pp.4428-4431)。GM-CSF制剂可以以商品名Leucine(Immunex)和Leucomax(Novartis)获得。GM-CSF制剂可以用于骨髓移植、骨髓移植失败或延迟、动员和自体外周血祖细胞移植后和患有急性骨髓性白血病的老年人的诱导化学治疗后的骨髓重建。
α-抗胰蛋白酶(AlAT，也称作α1-蛋白酶抑制剂)是一种蛋白酶抑制剂，其显示出可以抑制事实上所有哺乳动物的丝氨酸蛋白酶(Travis Ann.Rev.Biochem.52(1983)p.655)，包括中性白细胞弹性蛋白酶、凝血酶、因子Xa和XIa。AlAT是一种在肝中合成的具有394个氨基酸、分子量为53kD的单链糖蛋白。血浆浓度为1-1.3g/l。在整个蛋白中仅存在一个半胱氨酸，因此不会形成分子内二硫键。该分子含有占分子量12％的三个糖侧链(Asn 46，83,247)(Mega J Biol.Chem.255(1980)p.4057；Mega J.Biol.Chem.255(1980)p.4053；Carell FEBS Letters 135(1981)p.301；Hodges Biochemistry21(1982)p.2805)。其关键功能是对中性白细胞弹性蛋白酶的活性控制(Travis Ann.Rev.Biochem.52(1983)p.655)。不受控制的弹性蛋白酶活性会导致对上皮组织的攻击，造成不可挽回的损害。在灭活过程中，AlAT作为底物用于弹性蛋白酶与蛋白酶的活性中心的结合，接着通过形成复合物而使该蛋白酶灭活。缺乏AlAT会导致，例如，与肺上皮损害有关的肺气肿。AlAT中两种类型的糖侧链对于AlAT三个N-糖基化位点的分布在每个AlAT同种型中是不同的。AlAT的经典制备方法是使用不同的亲和层析步骤的人血浆分级分离技术。但是，较新的生产AlAT的方法是使用重组技术。PPL Therapeutics已经发展出了一种方法，允许从转基因绵羊的奶中回收重组人AlAT(rHAlAT)(OlmanBiochem.Soc.Symp.63(1998)p.141；Tebbutt Curr.Opin.Mol.Cher.2(2000)p.199；Carver Cytotechnology9(1992)p.77；Wright Biotechnology(NY)9(1991)p.830)。
组织型纤溶酶原活化因子(tPA)是一种在血块溶解中重要的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。当存在纤维蛋白凝块时，tPA将纤溶酶原转变成可以降解纤维蛋白的纤溶酶。当存在纤维蛋白时，tPA的活性增强，结果导致纤维蛋白特异性的纤溶酶原活化(M.W.Spellman，L.J.Basa，C.K.Leonard，J.A.Chakel，J.V.O＇Connor，The Journal ofBiological Chemistry 264(1989)p.14100)。纤溶酶溶解纤维蛋白，产生纤维蛋白降解产物。通过正反馈机制，纤溶蛋白通过刺激tPA介导的纤溶酶原活化促进其自身的降解(R.J.Stewart等.The Journal ofBiological Chemistry 275(2000)pp.10112-10120)。htPA是纤维蛋白溶解的生理活化剂，存在于不同类型的组织中。它是一种分子量约68kD的糖蛋白。在天然形式中，tPA以单链形式(单链组织型纤溶酶原活化剂，sctPA)存在，其可以通过在肽键Arg 275-Ile 276处的纤溶酶分裂转变成双链结构(双链组织型纤溶酶原活化剂，tctPA)。对于纤维蛋白溶解治疗，产生重组rtPA(重组组织型纤溶酶原活化剂)。不同类型的tPA在糖结构上显示结构差异。I型tPA在氨基酸Asn117、Asn184和Asn448位具有N—连接的寡糖。II型tPA在Asn117和Asn448处糖基化。这两种类型在Thr61位都包含O—连接的岩藻糖残基(K.Mori等.The Journal of Biological Chemistry 270(1995)pp.3261-3267)。多个结果表明，tPA的体内清除率会受到糖结构，特别是在Asnl 17位连接的高甘露醇寡糖的影响。提出的另一种清除机制包括肝细胞上的高亲和力受体识别在Thr61位O-连接的岩藻糖残基。TNK-tpA作为Tenecteplase
(Boehringer Ingelheim)上市，可以作为单一静脉推注药物施用，而tPA只能作为推注然后输注施用。
活化蛋白C(APC)是一种与严重脓毒症有关的凝血和炎症的调节因子。活化蛋白C是通过凝血酶与血栓调节蛋白偶合而由它的无活性前体(蛋白C)转变而成的。该复合物N-末端的短活化肽从蛋白质C的重链上脱落，形成活化蛋白C。Drotrecogin α(活化的)是一种重组人活化蛋白C(rhAPC)。它的氨基酸序列与来源于血浆的活化蛋白C相同，并具有相似的性质。在市场销售的活化蛋白C有EliLilly的Xigris
。它是在人细胞系(HEK293)中产生的，在该细胞系中引入了蛋白C表达载体。使用该细胞系是由于其具有进行正确系列的复合物翻译后修饰的能力，该翻译后修饰是功能性活性所需要的。重组人活化蛋白C是一种包含4个N-糖基化位点和12个二硫键的双链糖蛋白。其重链包含250个氨基酸，其中，7个残基是半胱氨酸，具有3个N-连接的糖基化位点(Asn-248，Asn-313和Asn-329)。这7个半胱氨酸残基在形成3个重链内二硫键和1个链间二硫键。轻链包含1个N-连接的糖基化位点(Asn-97)和17个半胱氨酸残基，形成8个轻链内二硫键和1个与重链的二硫键。活化蛋白C是一种属于丝氨酸蛋白酶家族的蛋白酶。它在调节凝血中发挥主要作用。活化蛋白C抗血栓功能的基础是它能够抑制凝血酶的功能。此外，活化蛋白C是一种与严重脓毒症相关的炎症的重要调节因子。由于其较短的生理和药代动力学半衰期，在临床应用于治疗脓毒症时，活化蛋白C按一定的速率连续地输注，以维持所需的血浆浓度。进行了一些尝试来改善活化蛋白C的药代动力学分布。例如D.T.Berg等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(2003)pp.4423-4428描述了一种具有延长的血浆半衰期的活化蛋白C工程变体。
作为糖基化蛋白，优选IFN β糖基化形式，如天然人IFN β或IFNBla，天然的或真核细胞来源的包含N-聚糖和O-聚糖的hGM-CSF，为包含4个糖基化位点的2-链糖蛋白的重组人活化蛋白C(rllAPC)，人tPA(htPA)或重组人tPA(rhtPA)，如在氨基酸Asn117、Asn184和Asn448处有N-连接寡糖的I型tPA，或者在Asn117和Asn448处被糖基化的II型tPA，血浆来源的AlAT或重组人AlAT(pdAlAT或rhAlAT)，重组人ATIII(rhAT III)，促红细胞生成素，因子VII，因子VIII和因子IX。
特别优选糖基化形式的EPO、IFN β、AT III和GM-CSF。本发明还涉及可以通过本发明的方法获得的偶联物。
在本发明中，术语“羟烷基淀粉”(HAS)指被至少一个羟烷基取代的淀粉衍生物。本发明的一种优选羟烷基淀粉具有根据式(I)的结构：
其中该淀粉分子的还原性末端呈非氧化型，末端糖单元呈半缩醛型，根据如溶剂的不同，该半缩醛型可以与醛型平衡。
本发明使用的术语羟烷基淀粉并不限于如通式(I)中为简便起见所示在末端糖部分包含羟烷基R1、R2和/或R3的化合物，也涉及其中在末端糖部分和/或淀粉分子HAS＇中其余部分的任何位置的至少一个羟基被羟烷基R1、R2、或R3取代的化合物。
羟烷基淀粉也可能包含两个或多个不同的羟烷基。
包含在HAS中的至少一个羟烷基可包含两个或多个羟基。根据一个优选的实施方案，包含在HAS中的至少一个羟烷基包含一个羟基。
术语“羟烷基淀粉”也包括其中烷基被单取代或多取代的衍生物。在本文中，优选烷基被卤素，特别是氟取代，或被芳基取代。此外，羟烷基的末端羟基也可被酯化或醚化。
此外，也可使用直链或支链的取代或未取代的烯基代替烷基。
羟烷基淀粉是淀粉的醚衍生物。除了所述醚衍生物外，本发明中也可使用其他淀粉衍生物。例如，可用包含酯化羟基的衍生物。这些衍生物可以是，例如含2-12个碳原子的未取代一元或二元羧酸或其取代衍生物的衍生物。特别有用的是含2-6个碳原子的未取代一元羧酸的衍生物，特别是乙酸的衍生物。本文中，优选乙酰基淀粉、丁酰基淀粉和丙酰基淀粉。
此外，优选含2-6个碳原子的未取代二元羧酸的衍生物。
对于二元羧酸的衍生物，该二元羧酸的第二个羧基也被酯化是有用的。此外，二元羧酸的单烷基酯的衍生物也适用于本发明。
对于取代的一元或二元羧酸，取代基优选地可与上述用于取代烷基残基的取代基相同。
淀粉的酯化技术是本领域公知的(参见，例如，Klemm D.等，Comprehensive Cellulose Chemistry Vol.2，1998，Whiley-VCH，Weinheim，New York，特别是4.4章，Esterification of Cellulose(ISBN 3-527-29489-9)。
根据本发明的一个优选的实施方案，使用根据上述通式(I)的羟烷基淀粉。
在通式(I)中，明确说明的糖环和以HAS＇表示的残基共同代表优选的羟烷基淀粉分子。HAS＇中包含的其他糖环结构可以与明确说明的糖环相同或不同。
通式(I)的残基R1、R2、和R3没有特别的限制。根据一个优选的实施方案，R1、R2、和R3分别独立地是氢或在各自的烷基残基中具有2到10个碳原子的羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基，或基团-(CH2CH2O)n-H，其中n是一个整数，优选1、2、3、4、5或6。优选氢和具有2到10个碳原子的羟烷基。更优选具有2到6个碳原子的羟烷基，更优选具有2到4个碳原子的羟烷基，甚至更优选具有2到4个碳原子的羟烷基。在一个优选实施方案中，通式(I)的残基R1、R2、和R3都是相同的基团-(CH2CH2O)n-H，其中其中n是一个整数，优选1、2或3。因此，“羟烷基淀粉”优选包括羟乙基淀粉、羟丙基淀粉和羟丁基淀粉，其中特别优选羟乙基淀粉和羟丙基淀粉，最优选羟乙基淀粉。
烷基、芳基、芳烷基和/或烷芳基可以是直链或支链的，并且任选地被适当取代。
因此，本发明也涉及一种如上所述的方法，其中R1、R2、和R3分别独立地是氢或含1到6个碳原子的直链或支链羟烷基。
因此，R1、R2、和R3优选地可以是羟乙基、羟戊基、羟丁基、羟丙基例如2-羟丙基、3-羟丙基、2-羟异丙基，羟乙基例如2-羟乙基，特别优选是氢和2-羟乙基。
因此，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中R1、R2、和R3分别独立地是氢或2-羟乙基，特别优选其中R1、R2、和R3中至少一个残基是2-羟乙基的实施方案。
羟乙基淀粉(HES)对于本发明所有的实施方案都是最优选的。
因此，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中聚合物为羟乙基淀粉，并且聚合物衍生物为羟乙基淀粉衍生物。
羟乙基淀粉(HES)是天然存在的支链淀粉的一种衍生物，可被体内的α-淀粉酶降解。HES是碳水化合物聚合物支链淀粉的一种取代衍生物，它在玉米淀粉中存在，浓度高达95％重量。HES显示有利的生物学性质，可以用作血容量替代剂，并且在临床上用于血液稀释治疗(Sommermeyer等人，1987，Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278；Weidler等人，1991，Arzneim.-Forschung/Drug Res.，41，494-498)。
支链淀粉由葡萄糖部分组成，其中主链中存在α-1，4-糖苷键，在分支位点处可见α-1，6-糖苷键。该分子的物理化学性质主要取决于糖苷键的类型。由于α-1，4-糖苷键具有切口，产生每圈大约有6个葡萄糖单体的螺旋结构。该聚合物的物理化学以及生物化学性质能够通过取代改变。羟乙基的引入可以通过碱性羟乙基化作用实现。通过改变反应条件，可以利用非取代葡萄糖单体中各羟基相对于羟乙基化的不同反应性。由于这一事实，技术人员能够有限程度地影响取代模式。
HES的主要特征在于分子量分布和取代程度。表述取代程度有两种可能的方式：
1.取代程度可表示为取代的葡萄糖单体相对于所有葡萄糖部分的比例。
2.取代程度可表示为摩尔取代程度，其表述的是每个葡萄糖部分的羟乙基数。
在本发明的内容中，以DS表示的取代程度涉及如上所述的摩尔取代程度(也可参见sommermeyer等，1987，Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278，如上述引用，特别是p.273)。
HES溶液以多分散组合物存在，其中各分子在聚合度、分支位点的数目和模式及取代模式上彼此不同。因此，HES是不同分子量的化合物的混合物。因此，特定的HES溶液由借助统计方式得到的平均分子量来确定。在本文中，Mn计算为基于分子数的算术平均值。可替代地，平均重量Mw(或MW)代表基于HES质量的单位。
在本发明的上下文中，羟乙基淀粉可优选具有1至300kD的平均分子量(平均重量)。羟乙基淀粉可进一步显示0.1到0.8的优选摩尔取代程度，对于羟乙基的C2∶C6取代的优选比例范围是2到20。
本发明的上下文中使用的术语“平均分子量”涉及用如Sommermeyer等，1987，Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278；和Weidler等，1991，Arzneim.-Forschung/Drug Res.，41，494-498所述的LALLS-(低角激光散射)-GPC方法确定的重量。另外，对于10kD或更小的平均分子量，可以用先前LALLS-GPC确定的标准值来进行校准。
根据本发明一个优选的实施方案，所使用的羟乙基淀粉的平均分子量为1到300kD，更优选2到200kD，更优选3到130kD，更优选4到100kD，最优选4到90kD。
平均分子量约130kD的HES的例子是取代程度为0.2到0.8，例如0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、或0.8，优选0.4到0.7，例如0.4、0.5、0.6、或0.7的HES。
平均分子量约130kD的HES的例子是来自Fresenius的Voluven
Voluven
是一种人造胶体，其用于例如在治疗和预防低血容量症的治疗适应症中进行容量置换。Voluven
的特征是平均分子量为130,000+/-20,000D，摩尔取代程度为0.4，C2∶C6的比例约9∶1。
因此，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中羟烷基淀粉是平均分子量为4到100kD，优选4到90kD，更优选4到70kD的羟乙基淀粉。
平均分子量的优选范围是例如，4至90kD，或10至90kD，或12至90kD，或18至90kD，或50至90kD，或70至90kD，或4至70kD，或10至70kD，或12至70kD，或18至70kD，或50至70kD，或4至50kD，或10至50kD，或12至50kD，或18至50kD，或4至18kD，或10至18kD，或12至18kD，或4至12kD，或10至12kD，或4至10kD。
根据本发明特别优选的实施方案，所使用的羟乙基淀粉的平均分子量范围在4kD以上和90kD以下，例如约10kD，或在9到10kD，或10到11kD或9到11kD的范围内，或约12kD，或在11到12kD或12到13kD或11到13kD的范围内，或约18kD，或在17到18kD或18到19kD或17到19kD的范围内，或约30kD，或在29到30kD或30到31kD的范围内，或约50kD，或在49到50kD或50到51kD或49到51kD的范围内。
至于所涉及的取代程度(DS)，DS优选至少0.1，更优选至少0.2，更优选至少0.4。DS的优选范围是0.1到3，更优选0.2到1.5，更优选0.3到1.0，更优选0.2到0.8，更优选0.3到0.8，甚至更优选0.4到0.8，更优选0.1到0.7，更优选0.2到0.7，更优选0.3到0.7，及更优选0.4到0.7。特别优选的DS的值是，例如0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7或0.8，更优选0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7或0.8，甚至更优选0.3，0.4，0.5，0.6，0.7或0.8，更优选0.4，0.5，0.6，0.7或0.8，例如特别优选0.4和0.7。
至于摩尔取代程度(DS)的上限，其值可以高达3.0，例如也可以是0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0，优选小于2.0的值，更优选小于1.5的值，更优选小于1.0的值，例如0.7、0.8、或0.9。
因此，摩尔取代程度的优选范围是0.1到 2，或0.1到1.5，或0.1到1.0，或0.1到0.9，或0.1到 0.8。摩尔取代程度的更优选范围是0.2到2，或0.2到1.5，或0.2到1.0，或0.2到0.9，或0.2到0.8。摩尔取代程度的更优选范围是0.3到2，或0.3到1.5，或0.3到1.0，或0.3到0.9，或0.3到0.8。摩尔取代程度甚至更优选的范围是0.4到2，或0.4到1.5，或0.4到1.0，或0.4到0.9，或0.4到0.8。
在本发明的上下文中，摩尔取代程度的一个给定值，例如0.8，可以是该确定值，或者可以理解成0.75到0.8 4的范围。因此，例如，给定值0.1可以是确定值0.1或者0.05到0.14的范围，给定值0.4可以是确定值0.4或者0.35到0.44的范围，给定值0.7可以是确定值0.7或者0.65到0.74的范围。
羟烷基淀粉，优选羟乙基淀粉的分子量和其取代程度DS的特别优选组合是例如，10kD和0.4，或10kD和0.7，或12kD和0.4，或12kD和0.7，或18kD和0.4，或18kD和0.7，或30kD和0.4，或30kD和0.7，或50kD和0.4，或50kD和0.7或100kD和0.7。
关于C2∶C6的取代比例，所述取代优选在2到20的范围内，更优选2到15，甚至更优选3到12。
根据本发明的另一个实施方案，也可使用平均分子量不同和/或取代程度不同和/或C2∶C6的取代比例不同的羟乙基淀粉的混合物。因此，所使用的羟乙基淀粉的混合物可具有不同平均分子量和不同取代程度和不同C2∶C6的取代比例，或者具有不同平均分子量和不同取代程度和相同或大约相同的C2∶C6的取代比例，或者具有不同平均分子量和相同或大约相同的取代程度和不同的C2∶C6的取代比例，或者具有相同或大约相同的平均分子量和不同取代程度和不同C2∶C6的取代比例，或者具有不同平均分子量和相同或大约相同的取代程度和相同或大约相同的C2∶C6的取代比例，或者具有相同或大约相同的平均分子量和不同取代程度和相同或大约相同的C2∶C6的取代比例，或者具有相同或大约相同的平均分子量和相同或大约相同的取代程度和不同的C2∶C6的取代比例，或者具有大约相同的平均分子量和大约相同的取代程度和大约相同的C2∶C6的取代比例。
在根据本发明的不同偶联物和/或不同方法中，可使用不同的羟烷基淀粉，优选不同的羟乙基淀粉，和/或不同的羟烷基淀粉的混合物，优选不同的羟乙基淀粉的混合物。
在另一优选实施方案中，包含官能团A的聚合物或聚合物衍生物与在制备上述偶联物的方法的步骤a)中引入糖蛋白的修饰的多元醇连接。
因此，在真核细胞中产生的蛋白质的寡糖模式已在翻译后糖基化，与人源蛋白质不同。此外，许多糖基化蛋白质并没有所需数量的末端唾液酸残基来遮蔽其它碳水化合物部分，如半乳糖残基。然而，这些其它碳水化合物部分，如半乳糖残基，如果未被遮蔽，则可能会引起一些缺点，例如，在该蛋白质作为药物的用途中，该蛋白质的血浆半衰期可能会缩短。现已惊讶地发现，通过提供一种由羟烷基淀粉聚合物，优选羟乙基淀粉聚合物形成的蛋白质偶联物，可以至少克服上述缺点，该聚合物通过本发明的温和方法直接或通过至少一个连接化合物，如一个或两个连接化合物，与蛋白质的碳水化合物侧链中碳水化合物部分共价连接。因此，认为通过将羟烷基淀粉聚合物或其衍生物，优选羟乙基淀粉聚合物或其衍生物，与糖基化蛋白质的至少一条碳水化合物侧链通过修饰的多元醇偶联，可弥补碳水化合物侧链上适当末端碳水化合物残基的缺乏。根据本发明另一方面，提供一种由羟烷基淀粉聚合物或其衍生物，优选羟乙基淀粉聚合物或其衍生物，与如上述氧化的碳水化合物部分偶联的偶联物，不仅可弥补上述缺点，而且所提供的蛋白质偶联物在所需应用领域上，具有比相应的天然蛋白质更好的特性。因此，本发明的各偶联物对蛋白质具有弥补，甚至协同的效果。甚至与人类蛋白质相同或本身是人类蛋白质的蛋白质也可能在天然碳水化合物部分不具有所需数量的适当遮蔽的末端碳水化合物残基，如唾液酸残基。在这种情况下，提供由羟烷基淀粉聚合物或其衍生物，优选羟乙基淀粉聚合物或其衍生物与如上所述经酶引入的修饰的多元醇偶联形成的各偶联物不仅可克服及弥补人工制备的蛋白质的缺点，而且可改善天然蛋白质的特性。关于与引入的修饰的多元醇偶联的羟烷基淀粉优选羟乙基淀粉或其衍生物的官能团，可提到下文中所公开的官能团A。该一般概念不仅适用于糖基化G-CSF，原则上也适用于所有缺乏末端碳水化合物残基的糖基化蛋白质。其中可提到促红细胞生成素(EPO)、IFN β、GM-CSF、APC、tPA、AlAT、AT III、HCG、LH、FSH、抗体融合蛋白、治疗性抗体、白介素特别是白介素2或6、IFN-α、CSF、因子VII、因子VIII、因子IX。
因此，本发明也涉及羟烷基淀粉，优选羟乙基淀粉，或其衍生物在弥补蛋白质中天然存在的或翻译后连接的碳水化合物部分所缺乏的末端碳水化合物残基，优选唾液酸残基中的用途，包括将淀粉或其衍生物与通过酶法添加到糖蛋白上的至少一个修饰的多元醇共价偶联。
因此，本发明也涉及一种弥补在蛋白质中天然存在的或翻译后连接的碳水化合物部分上所缺乏的末端碳水化合物残基，优选唾液酸残基的方法，包括将羟烷基淀粉，优选羟乙基淀粉或其衍生物与通过酶法添加到糖蛋白上的至少一个修饰的多元醇共价偶联。
此外，本发明也涉及一种由羟烷基淀粉，优选羟乙基淀粉，或其衍生物，与通过酶法添加到糖蛋白上的至少一个修饰的多元醇共价连接所形成的偶联物，该糖蛋白从天然来源中分离或在真核细胞如哺乳动物、昆虫或酵母细胞中表达产生，该通过酶法添加到糖蛋白上的至少一个修饰的多元醇具有至少一个官能团Z，其中该偶联物在所需应用领域，优选在作为药物的应用中，具有与相应的未修饰的蛋白质相同或更优的特性。
根据本发明的一个优选实施方案，修饰的多元醇的官能团Z为醛基、半缩醛基或酮基。因此本发明涉及如上所述的方法和偶联物，其中修饰的多元醇的官能团Z是醛基、半缩醛基或酮基。
如果修饰的多元醇的官能团Z是醛基、半缩醛基或酮基，则聚合物或其衍生物的官能团A包含基于结构-NH-的氨基。
因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中能够与聚合物的任选氧化的还原性末端反应的官能团A包含基于结构-NH-的氨基。
根据本发明一个优选实施方案，官能团A是具有结构R＇-NH-的基团，其中R＇为氢或烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基，其中环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基可直接连接到NH基团上，或者根据另一实施方案，可通过氧桥连接到NH基团上。烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基可被适当取代。优选的取代基可以是卤素，如F、Cl或Br。特别优选的残基R＇是氢、烷基和烷氧基，甚至更优选的是氢和未取代的烷基和烷氧基。
在烷基和烷氧基中，优选含1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。更优选的是甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。特别优选的是甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特别优选甲基或甲氧基。
因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中R＇为氢或甲基或甲氧基。
根据本发明另一个优选实施方案，官能团A具有结构R＇-NH-R″-，其中R″优选包含结构单元-NH-和/或结构单元-(C＝G)-，其中G为O或S，和/或结构单元-SO2-。根据更优选的实施方案，官能团R″选自：
其中如果G出现两次，则分别独立地是O或S。因此，优选的包含氨基-NH2的官能团A是，例如，
其中G为O或S，并且如果出现两次，则分别独立地是O或S，R＇为甲基。
特别优选的包含氨基的官能团A是氨基氧基
特别优选H2N-O-，和酰肼基
其中G优选为0。
因此，本发明也涉及一种如上所述的方法，其中修饰的多元醇的官能团Z是醛基、半缩醛基或酮基，官能团A是氨基氧基或酰肼基。根据本发明一个特别优选的实施方案，A是氨基氧基。
因此，本发明也涉及一种如上所述的偶联物，其中修饰的多元醇的官能团Z是醛基或酮基，官能团A是氨基氧基或酰肼基。根据本发明一个特别优选的实施方案，A是氨基氧基。
当聚合物或聚合物衍生物的氨基氧基与在步骤a)中已经转移到糖蛋白上的修饰的多元醇的醛基或酮基反应时，形成肟键。
因此，本发明也涉及上述偶联物，其中在修饰的多元醇和聚合物或聚合物衍生物之间的共价键是由修饰的多元醇的官能团Z同聚合物或聚合物衍生物的官能团A反应得到的肟键，所述官能团Z是醛基、半缩醛基或酮基，所述官能团A是氨氧基。
当聚合物或聚合物衍生物的酰肼基与修饰的多元醇的醛基或酮基反应时，形成腙连接。
因此，本发明也涉及一种如上所述的偶联物，其中修饰的多元醇与聚合物或其聚合物衍生物之间的共价连接是修饰的多元醇的官能团Z(该官能团Z为醛基、半缩醛基或酮基)与聚合物或聚合物衍生物的官能团A(该官能团A为酰肼基)反应所形成的腙连接。
为了向聚合物中引入官能团A，只要产生包含官能团A的聚合物衍生物，没有具体限制。
根据本发明一个优选实施方案，通过使聚合物与至少双官能化合物反应将官能团A引入聚合物中，其中一个官能团能够与聚合物中至少一个官能团反应，至少双官能化合物中至少另一个官能团是官能团A或者可经化学修饰形成官能团A。
根据另一个优选实施方案，聚合物与至少双官能化合物在其任选氧化的还原端反应。
如果聚合物与其未氧化的还原端反应时，该聚合物优选具有如下结构
其中式(I)中包括非氧化的还原端的醛型。
如果聚合物与其氧化的还原端反应时，该聚合物优选具有如式(IIa)的结构
和/或如式(IIb)的结构
聚合物，优选羟乙基淀粉的还原端的氧化反应可根据产生具有上述结构(IIa)和/或(IIb)的化合物的各种方法或方法组合进行。
虽然氧化可根据所有产生羟烷基淀粉的氧化的还原端的一种或多种适当方法进行，但优选利用如DE 196 28 705 A1所述的碱性碘溶液进行，该文献的内容(实施例A，第9栏，第6至24行)在此引入作为参考。
可以使用可与羟烷基淀粉的任选氧化的还原端形成化学键的各官能团作为可与聚合物中任选氧化的还原端反应的至少双官能化合物的官能团。
根据本发明一个优选实施方案，该官能团包含化学结构-NH-。
因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中至少双官能化合物的官能团(该官能团能够与聚合物的任选氧化的还原端反应)包含结构-NH-。
根据本发明一个优选实施方案，所述至少双官能化合物的该官能团是具有结构R＇-NH-的基团，其中R＇为氢或烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基，其中环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基可直接连接到NH基团上，或者根据另一实施方案，可通过氧桥连接到NH基团上。烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基可被适当取代。优选的取代基可以是卤素，如F、Cl或Br。特别优选的残基R＇是氢、烷基和烷氧基，甚至更优选的是氢和未取代的烷基和烷氧基。
在烷基和烷氧基中，优选含1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。更优选的是甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。特别优选的是甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特别优选甲基或甲氧基。
因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中R＇为氢或甲基或甲氧基。
根据本发明另一个优选实施方案，至少双官能化合物的官能团具有结构R＇-NH-R″-，其中R″优选包含结构单元-NH-和/或结构单元-(C＝G)-，其中G为O或S，和/或结构单元-SO2-。根据更优选实施方案，官能团R″选自：
其中如果G出现两次，则分别独立地是O或S。
因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中至少双官能化合物的官能团(该官能团能够与聚合物的任选氧化的还原端反应)选自：
其中G为O或S，并且如果出现两次，则分别独立地是O或S，R＇为甲基。
根据本发明一个甚至更优选的实施方案，至少双官能化合物的官能团(该官能团能够与聚合物的任选氧化的还原端反应，且包含氨基)是氨基氧基
特别优选H2N-O-，或者是酰肼基
其中G优选为O。
因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中修饰的多元醇的官能团Z为醛基、半缩醛基或酮基，且该至少双官能化合物的官能团(该官能团能够与聚合物的任选氧化的还原端反应)为氨基氧基或酰肼基，优选氨基氧基。
因此，本发明也涉及一种如上所述的偶联物，其中修饰的多元醇的官能团Z为醛基、半缩醛基或酮基，且该至少双官能化合物的官能团(该官能团能够与聚合物的任选氧化的还原端反应)为氨基氧基或酰肼基，优选氨基氧基。
根据本发明另一个优选实施方案，该至少双官能化合物与聚合物的未氧化的还原端反应。
根据本发明另一个优选实施方案，可与聚合物的任选氧化的还原端反应的至少双官能化合物包含官能团A。
该至少双官能化合物可先与聚合物反应，产生的聚合物衍生物随后通过官能团A与蛋白质反应。也可能该至少双官能化合物首先通过官能团A与修饰的多元醇反应，产生修饰的糖蛋白衍生物，接着通过包含在蛋白质衍生物中的至少双官能化合物残基的至少一个官能团与聚合物反应。
根据本发明一个优选实施方案，该至少双官能化合物首先与聚合物反应。
因此，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，该方法还包括使聚合物的未氧化的还原端与包含能够与聚合物的未氧化的还原端反应的官能团与基团A的至少双官能连接化合物反应，然后包含A的聚合物衍生物与包含Z的修饰的多元醇反应。
可利用任何合适的间隔基将可与聚合物反应的至少双官能连接化合物的官能团与可与修饰的多元醇的官能团Z反应的至少双官能连接化合物的官能团A分隔开来。其中间隔基可为任选取代的直链、支链和/或环状烃残基。通常，该烃残基具有至多60个碳原子，优选至多40个，更优选至多20个，更优选至多10个，更优选至多6个，特别优选至多4个碳原子。如果存在杂原子，该分隔基通常包含1至20个杂原子，优选1至8个，更优选1至6个，更优选1至4个，特别优选1至2个杂原子。优选O作为杂原子。烃残基可包含具有例如5至7个碳原子的任选分支的烷基链或芳基或环烷基，或者是芳烷基、烷芳基，其中烷基部份可以是直链和/或环状烷基。根据本发明一个甚至更优选的实施方案，官能团被具有4个碳原子的直链烃链分隔开来。根据本发明另一个优选实施方案，官能团被具有4个碳原子和至少一个，优选一个杂原子，特别优选一个氧原子的直链烃链分隔开来。
根据另一优选实施方案，该至少双官能连接化合物是同型双官能连接化合物。因此，本发明也涉及一种制备如上所述偶联物的方法，其中该至少双官能连接化合物是同型双官能化合物。
因此，对于连接化合物的上述优选官能团，所述同型双官能连接化合物优选包含两个氨基氧基H2N-O-或两个氨基氧基R＇-O-NH-或两个酰肼基H2N-NH-(C＝G)-，优选氨基氧基H2N-O-和酰肼基H2N-NH-(C＝O)-，特别优选氨基氧基H2N-O-。
在含有两个酰肼基H2N-NH-(C＝O)-的所有可以想到的同型双官能化合物中，优选酰肼，其中两个酰肼基被一个烃残基分隔开，该烃残基具有至多60个，优选至多40个，更优选至多20个，更优选至多10个，更优选至多6个，特别优选至多4个碳原子。更优选地，该烃残基具有1至4个碳原子，如1、2、3或4个碳原子。最优选地，该烃残基具有4个碳原子。因此，优选如下式的同型双官能化合物。
在其中修饰的多元醇的醛基或酮基与包含两个酰肼基H2N-NH-(C＝O)-的化合物反应的上述实施方案中，特别优选的羟乙基淀粉是，例如：平均分子量约10kD且DS约0.4的羟乙基淀粉。也可以是，例如，平均分子量约10kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约30kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约30kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约100kD且DS约0.7的羟乙基淀粉。对于平均分子量和DS的这些组合中的每一个，也优选约0.8的DS值。
根据本发明的一个更优选的实施方案，双官能连接化合物是碳酰肼。
在其中蛋白质的醛基或酮基与碳酰肼反应的上述实施方案中，特别优选的羟乙基淀粉是，例如：平均分子量约10kD且DS约0.4的羟乙基淀粉。也可以是，例如，平均分子量约10kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约30kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约30kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约100kD且DS约0.7的羟乙基淀粉。对于平均分子量和DS的这些组合中的每一个，也优选约0.8的DS值。
如上所述，本发明也涉及如上所述的方法和偶联物，其中至少双官能连接化合物是同型双官能化合物，并且包含两个氨基氧基。因此，本发明也涉及如上所述的方法和偶联物，其中至少双官能连接化合物是同型双官能化合物，并且包含两个氨基氧基H2N-O-。
如上所述，聚合物优选地在其反应前未氧化的还原端与双官能连接化合物反应。因此，包含两个氨基氧基H2N-O-的优选同型双官能化合物与聚合物反应，产生包含肟连接的聚合物衍生物。
因此，由于修饰的多元醇的官能团Z是优选与聚合物衍生物的氨基氧基反应的醛、半缩醛或酮基，因此本发明也涉及如上所述的偶联物，该偶联物包含聚合物和糖蛋白，其中聚合物和修饰的多元醇各自通过肟或环状缩醛胺键与连接化合物共价连接。
在所有可以想到的包含两个氨基氧基H2N-O-的同型双官能化合物中，优选如下双官能化合物，其中两个氨基氧基利用一个烃残基分隔开，该烃残基具有1至60个，优选1至40个，更优选1至20个，更优选1至10个，更优选1至6个，特别优选1至4个碳原子。更优选地，该烃残基具有1至4个碳原子，如1、2、3或4个碳原子。最优选地，该烃残基具有4个碳原子。甚至更优选地，该烃残基具有至少一个杂原子，更优选一个杂原子，最优选一个氧原子。特别优选如下式的化合物O-[2-(2-氨基氧-乙氧基)-乙基]羟胺。
因此，本发明涉及一种如上所述的偶联物，该偶联物具有如下式的结构
和/或
HAS＇优选为HES＇。特别优选的羟乙基淀粉是，例如：平均分子量约10kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约10kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约30kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约30kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约100kD且DS约0.7的羟乙基淀粉。对于平均分子量和DS的这些组合中的每一个，也优选约0.8的DS值。
在其中修饰的多元醇的醛基或酮基与聚合物或聚合物衍生物的羟基氨基反应的上述实施方案中，特别优选的羟乙基淀粉是，例如：平均分子量约10kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约10kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD且DS约0.7的羟乙基淀粉。例如，也可以是平均分子量约12kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约30kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约30kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约100kD且DS约0.7的羟乙基淀粉。对于平均分子量和DS的这些组合中的每一个，也优选约0.8的DS值。
作为糖蛋白，优选促红细胞生成素(EPO)、IFN β、G-CSF、GM-CSF、APC、tPA、AlAT、AT III、HCG、LH、FSH、IL-15、抗体融合蛋白、治疗性抗体、白介素特别是白介素2或6、IFN-α、IFN-γ、CSF、因子VII、因子VIII和因子IX。
聚合物的未氧化的还原端与连接化合物的反应优选在水性系统中进行，特别是在该连接化合物是包含两个氨基氧基H2N-O-的同型双官能连接化合物时。
用于本发明的术语″水性系统″是指溶剂或溶剂混合物中的含水量为占所涉及溶剂重量的至少10％重量比，优选至少50％重量比，更优选至少80％重量比，甚至更优选至少90％重量比，或者可达100％重量比。优选的反应介质是水。
根据另一个实施方案，可以使用至少另一种可溶解HAS，优选HES的溶剂。这些溶剂的实例是例如DMF、二甲基乙酰胺或DMSO。
对于反应期间所采用的温度没有具体限制，只要反应产生所需的聚合物衍生物即可。
如果聚合物与包含两个氨基氧基H2N-O-的同型双官能连接化合物反应，优选与O-[2-(2-氨基氧-乙氧基)-乙基]羟胺反应，温度优选为0至45℃，更优选4至37℃，特别优选15至25℃。
聚合物与包含两个氨基氧基H2N-O-的同型双官能连接化合物，优选O-[2-(2-氨基氧-乙氧基)-乙基]羟胺的反应时间可根据具体需要调整，通常在1小时至7天的范围内，优选1小时至3天的范围内，更优选2小时至48小时。
聚合物与包含两个氨基氧基H2N-O-的同型双官能连接化合物，优选O-[2-(2-氨基氧-乙氧基)-乙基]羟胺的反应pH值可根据具体需要如反应物的化学性质来调整。pH值优选为4.5至6.5。
上述反应条件的具体实例是例如：反应温度约25℃，及pH约5.5。
反应混合物的合适pH值可通过添加至少一种适当的缓冲液来调节。优选的缓冲液可以是乙酸钠缓冲液、磷酸盐或硼酸盐缓冲液。
一旦形成包含聚合物和与之连接的双官能连接化合物的聚合物衍生物，即可采用至少一种合适的方法，将其从反应混合物中分离出来。必要时，该聚合物衍生物可先沉淀，再采用至少一种合适的方法分离。
如果先使聚合物衍生物沉淀，则可能(例如)在适当温度下，使反应混合物与至少一种溶剂或溶剂混合物接触，该溶剂或溶剂混合物不同于反应混合物中的溶剂或溶剂混合物，例如是适当体积/体积比如l/l v/v的丙酮/乙醇混合物，或者是异丙醇，适当的温度是-20至50℃或0至25℃。根据使用水性介质、优选水作为溶剂的本发明一个特别优选的实施方案，反应混合物与2-丙醇和混合物在优选-20至+50℃，特别优选0至25℃的温度下接触。
聚合物衍生物的分离可以采用可包括一个或多个步骤的合适方法进行。根据本发明一个优选实施方案，首先利用合适的方法，如离心或过滤法，从反应混合物或反应混合物与例如2—丙醇水性混合物的混合物中分离聚合物衍生物。第二步，分离的聚合物衍生物可进一步处理，如透析、离心过滤或加压过滤、离子交换层析、反向层析、HPLC、MPLC、凝胶过滤和/或冷冻干燥等后处理。根据本发明一个甚至更优选的实施方案，首先优选相对于水透析所分离的聚合物衍生物，然后冷冻干燥，直到反应产物的溶剂含量足够低，符合产物所需要求。冷冻干燥可在20至35℃，优选20至30℃的温度下进行。
这样分离的聚合物衍生物再进一步通过官能团A与修饰的多元醇的官能团Z反应，其中Z为醛基、半缩醛基或酮基。在A是氨基氧基H2N-O-而在聚合物衍生物与修饰的多元醇之间产生肟连接的特别优选的情况中，反应优选在水性介质中，优选在水中，优选在0至40℃，更优选1至25℃，特别优选15至25℃，或1至15℃的温度下进行。反应介质的pH值优选为4至10，更优选5至9，特别优选5至7。反应时间优选为1至72小时，更优选1至48小时，特别优选4至24小时。
偶联物可进一步处理，如透析、离心过滤或加压过滤、离子交换层析、反向层析、HPLC、MPLC、凝胶过滤和/或冷冻干燥等后处理。
本发明涉及一种如上所述的方法，其中多元醇的官能团Z与官能团A通过根据式(I)的化学残基连接，
其中Y是选自O和S的杂原子，所述方法包括将反应基Z(是硫酯基-(C＝Y)-S-R＇)与基团Z(是α-Xβ-氨基)反应，
其中R＇选自氢、任选适当取代的直链、分支和/或环形的烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基，优选苄基。
因此，本发明上下文中使用的术语“α-Xβ-氨基”是指亚乙基，其中X与碳原子键合，伯氨基与相邻的碳原子键合。
在根据上述通式(I)的化学部分中，基团-(C＝Y)来自于硫酯基-(C＝Y)-S-R＇，基团HN-CH-CH2-X来自于α-Xβ-氨基。
本发明也涉及如第20-34页所述的实施方案，其中基团Z和A的位点颠倒，特别是其中在本发明方法的步骤a)中引入糖蛋白中的官能团是含有氨基的基团，其中聚合物或聚合物衍生物的反应性基团Z是醛基、半缩醛基或酮基。特别优选基团Z选自如上所述的羟胺、肼、酰肼或酰肼衍生物。在其中Z是羟基氨基或酰肼基的情况下，在步骤b中使用的聚合物，例如HAS，不需要修饰，能够与步骤a)获得的糖蛋白形成共价键。
根据本发明的另一实施方案，修饰的多元醇的官能团Z是氨基，糖蛋白优选选自促红细胞生成素(EPO)、IFN β、G-CSF、GM-CSF、APC、tPA、AlAT、AT III、HCG、LH、FSH、IL-15、抗体融合蛋白、治疗性抗体、白介素特别是白介素2或6、IFN-α、IFN-γ、CSF、因子VII、因子VIII和因子IX。
因此，本发明涉及如上所述的方法和偶联物，其中蛋白质的官能团Z是氨基，该蛋白质选自促红细胞生成素(EPO)、IFN β、G-CSF、GM-CSF、APC、tPA、AlAT、AT III、HCG、LH、FSH、IL-15、抗体融合蛋白、治疗性抗体、白介素特别是白介素2或6、IFN-α、IFN-γ、CSF、因子VII、因子VIII和因子IX。
根据本发明的特别优选的实施方案，与为氨基的官能团Z反应的官能团A是反应性羧基。因此，本发明也涉及如上所述的方法和偶联物，其中官能团Z是氨基，聚合物或聚合物衍生物的官能团A是反应性羧基。在修饰的多元醇的氨基与聚合物或聚合物衍生物的反应性羧基反应的上述实施方案中，特别优选的羟乙基淀粉，例如是，平均分子量约10kD且DS约0.4的羟乙基淀粉。也可以是，例如，平均分子量约10kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约30kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约30kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD且DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD且DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约100kD且DS约0.7的羟乙基淀粉。对于平均分子量和DS的这些组合中的每一个，也优选约0.8的DS值。
反应性聚合物与在步骤a)中连接到糖蛋白上的修饰的多元醇的反应可通过将制备反应性聚合物的反应混合物与蛋白质的水溶液组合起来进行，即不分离反应性聚合物，其中包含至10％重量比，更优选至少30％，再更优选至少50％重量比的反应性聚合物。优选的蛋白质水溶液包含0.05至10％，更优选0.5至5％，特别优选0.5至2％重量比的蛋白质，优选pH为5.0至9.0，更优选6.0至9.0，特别优选7.5至8.5。
根据本发明，也可能使用至少一种合适的沉淀剂，如无水乙醇、异丙醇和/或丙酮，通过至少一个，优选多重沉淀法纯化反应性聚合物，产生包含至少10％，更优选至少30％，再更优选至少50％重量比的反应性聚合物的固体。
纯化的反应性聚合物可加至修饰的糖蛋白的水溶液中。也可以添加纯化的反应性聚合物溶液至修饰的糖蛋白的水溶液中。
根据本发明优选实施方案，反应性聚合物与蛋白质产生酰胺键的反应在0至40℃，更优选1至25℃，特别是15至25℃，或1至15℃的温度下进行，pH优选为7.0至9.0，优选7.5至9.0，特别优选7.5至8.5，反应时间优选为0.1至12小时，更优选0.5至5小时，更优选0.5至3小时，再更优选0.5至2小时，特别优选0.5至1小时，反应性聚合物酯：蛋白质的摩尔比优选为1∶1至70∶1，更优选5∶1至50∶1，特别优选10∶1至50∶1。
根据本发明的另一个特别优选的实施方案，与为氨基的官能团Z反应的官能团A是醛基、酮基或半缩醛基。因此，本发明涉及如上所述的方法和偶联物，其中官能团Z是氨基，聚合物或其衍生物的官能团A是醛基、酮基或半缩醛基。优选地该糖蛋白选自促红细胞生成素(EPO)、IFN β、G-CSF、GM-CSF、APC、tPA、AlAT、AT III、HCG、LH、FSH、IL-15、抗体融合蛋白、治疗性抗体、白介素特别是白介素2或6、IFN-α、IFN-γ、CSF、因子VII、因子VIII和因子IX。
根据一个特别优选的实施方案，官能团Z和官能团A通过还原胺化反应进行反应。
根据该优选实施方案，优选聚合物在其任选氧化的还原性末端与含有氨基M和官能团Q的至少双官能化合物反应，其中所述氨基M与聚合物的任选氧化的还原性末端反应，其中官能团Q经化学修饰产生含有官能团A衍生物的聚合物，官能团A衍生物与氨基Z通过还原胺化反应。
本发明中所用的术语“聚合物通过还原性末端反应”或“聚合物通过氧化的还原性末端反应”是指羟烷基淀粉主要通过其(选择性氧化的)还原性末端反应的过程。该聚合物是羟烷基淀粉，特别是羟乙基淀粉。
术语“主要通过其(选择性氧化的)还原性末端”是指这样的反应过程，它在统计学上多于50％，优选至少55％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％如95％、96％、97％、98％或99％的给定反应中所用的聚合物分子是通过每聚合物分子至少一个(选择性氧化的)还原性末端来反应的，其中通过至少一个还原性末端反应的给定的聚合物分子可以在相同的给定反应中通过至少一个更适合的官能团反应，这个官能团包含在所说的聚合物分子中，并且不是还原性末端。如果一个或更多的聚合物分子通过至少一个还原性末端反应，同时通过至少一个更适合的官能团反应，这种官能团包含在这(些)聚合物分子中并且不是还原性末端，则统计学上优选大于50％，优选至少55％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％如95％、96％、97％、98％或99％的这些聚合物分子的所有反应的官能团是还原性末端，所述官能团包括还原性末端。
本发明中使用的术语“还原性末端”涉及聚合物分子的末端醛基，它可以作为醛基和/或相应的缩醛形式存在。当还原性末端被氧化时，醛基或缩醛基团是羧基和/或相应内酯的形式。
至于官能团Q，可以提到以下官能团，其中：
-C-C-双键或C-C-三键或芳香族C-C-键；
-硫基或羟基；
-烷基磺酸酰肼、芳基磺酸酰肼；
-1，2-二元醇；
-1，2-氨基-硫醇类；
-1，2-氨基醇类；
-氨基-NH2或包含结构单位-NH-的氨基衍生物，如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；
-羟基氨基-O-NH2，或包含结构单位-O-NH-的羟基氨基的衍生物，如羟基烷基氨基、羟基芳基氨基、羟基芳烷基氨基或羟基烷芳基氨基；
-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，其各包含结构单位-NH-O-；
-具有羰基-Q-C(＝G)-M的残基，其中G为O或S，M为例如：
---OH或-SH；
--烷基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或烷芳基氧基；
--烷基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基或烷芳基硫基；
--烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基氧基；
--活化的酯，如羟胺的酯，其具有如N-羟基琥珀酰亚胺的亚胺结构或具有结构单位O-N，其中N为杂芳基化合物的一部份，或其中G＝O且Q不存在，如具有取代芳基残基如五氟苯基、对硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；
其中Q不存在或是NH或杂原子，如S或O；
--NH-NH2或-NH-NH-；
--NO2；
-腈基；
-羰基，如醛基或酮基；
-羧基；
--N＝C＝0基团或-N＝C＝S基团；
-乙烯基卤化物基团，如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基团或三氟甲磺酸根；
--C≡C-H；
--(C＝NH2Cl)-0烷基
--(C＝0)-CH2-Hal基团，其中Hal为Cl、Br或I；
--CH＝CH-SO2-；
-包含结构-S-S-的二硫化物基团；
-基团；
-基团
根据本发明的一个优选实施方案，术语“官能团Q”涉及包含化学结构-NH-的官能团Q，例如-NH2或包含结构单元-NH-的氨基的衍生物，如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基。
根据本发明一个优选实施方案，官能团M是具有结构R＇-NH-的基团，其中R＇为氢或烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基，其中环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基可直接连接到NH基团上，或者根据另一实施方案，可通过氧桥连接到NH基团上。烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基可被适当取代。优选的取代基可以是卤素，如F、Cl或Br。特别优选的残基R＇是氢、烷基和烷氧基，甚至更优选的是氢和未取代的烷基和烷氧基。
在烷基和烷氧基中，优选含1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。更优选的是甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。特别优选的是甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特别优选甲基或甲氧基。
根据本发明另一个实施方案，官能团M具有结构R＇-NH-R″-，其中R″优选包含结构单位-NH-和/或结构单位-(C＝G)-，其中G为O或S，和/或结构单位-SO2-。官能团R″的具体例子是：
其中如果G出现两次，则分别独立地是O或S。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法和偶联物，其中官能团M选自
其中G为O或S，并且如果出现两次，则分别独立地是O或S，R＇为甲基。
根据本发明一个特别优选的实施方案，官能团M是氨基-NH2。
根据第一选择，官能团M是氨基NH2，它与聚合物的氧化的还原端反应得到连接聚合物和包含M和Q的化合物的酰胺基。
根据第二选择，官能团M是氨基NH2，它通过还原胺化与聚合物的非氧化的还原端反应产生亚氨基，该基团进而优选氢化得到氨基，亚氨基和氨基分别连接聚合物和包含M和Q的化合物。在这种情况下，官能团Q可以为氨基。如果产生的聚合物衍生物接着通过如下文所述的羧基或活性羧基同至少双官能化合物反应，或者同将与氨基反应的至少双官能化合物的另一个基团反应，优选包含M和Q的化合物是仅包含一个氨基作为官能团的伯胺。在这种具体的情况下，尽管化合物包含仅一个官能团，但它被视为包含M和Q的双官能化合物，其中M是包含在将与聚合物还原性末端还原胺化的化合物中的氨基，并且其中Q是从还原胺化和之后的氢化得到的仲氨基。
根据第三选择，聚合物的非氧化的还原端通过还原胺化与氨水反应得到聚合物的末端亚氨基，该基团接着优选被氢化得到聚合物的末端氨基，即末端伯氨基。在这种具体情况下，氨水被看作包含有M和Q的双官能化合物，其中，M是包含在所用的氨水里的NH2，Q是由还原胺化和接下来的氢化得到的伯氨基。
术语“氨基Q”涉及一种官能团Q，其包括化学结构-NH-，例如-NH2-，或包含结构单元-NH-的氨基衍生物，例如氨烷基、氨芳基、氨芳烷基、或烷芳氨基。
根据本发明一个优选的实施方案，官能团Q是具有结构R＇-NH-的基团，其中R＇是氢或烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳环烷基、烷芳基或环烷芳基残基，其中该环烷基、芳基、芳烷基、芳环烷基、烷芳基或环烷芳基残基可以直接连接到NH基上，或者根据另一个实施方案，可以通过氧桥连接到NH基上。该烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳环烷基、烷芳基或环烷芳基残基可以被适当地取代。优选的取代基包括卤素，例如F、Cl或Br。特别优选的残基R＇是氢、烷基和烷氧基，甚至更优选氢和未取代的烷基和烷氧基。
在烷基和烷氧基中，优选含1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。更优选的是甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。特别优选的是甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特别优选甲基或甲氧基。
根据本发明的另一个实施方案，官能团Q具有R＇-NH-R″-结构，其中R″优选包含结构单元-NH-和/或结构单元-(C＝G)-，其中G是O或S，和/或结构单元-SO2-。根据更优选的实施方案，官能团R″选自
其中，如果G出现两次，则分别独立地是O或S。
因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中官能团Q选自：
其中G是O或S，并且如果出现两次，则分别独立地是O或S，并且R＇是甲基。
根据本发明一个特别优选的实施方案，官能团Q是氨基-NH2。
根据本发明另一个特别优选的实施方案，官能团M和Q都包含氨基-NH-。根据一个特别优选的实施方案，官能团M和Q都是氨基-NH2。
根据本发明一个优选的实施方案，该包含M和Q的化合物是同型双官能化合物，更优选是包含M和Q、最优选氨基-NH2作为官能团的同型双官能化合物，或根据另一个实施方案，是羟氨基-O-NH2，或基团
其中G优选是O。这些包含M和Q的化合物的实例是
或者
或者
在M和Q均为氨基-NH2的情况下，M和Q可以被适当的间隔基分隔开。其中间隔基可以是任选取代的直链、分支的和/或环形的烃残基。通常，烃残基含有从1到60，优选1到40，更优选从1到20，更优选从2到10，更优选从2到6，尤其优选从2到4个碳原子。如果存在杂原子，间隔基团包括通常从1到20，优选从1到8，尤其优选从1到4个杂原子。烃残基可以包含任选分支的烷基链或芳基或含有例如5到7个碳原子的环烷基，或是芳烷基、烷芳基，其中的烷基部分可以是直链的和/或环状烷基。根据一个甚至更优选的实施方案，烃残基是包含1到20、优选2到10、更优选2到6、尤其优选2到4个碳原子的烷基链。
因此，本发明也涉及上述方法和偶联物，其中聚合物同1，4-二氨基丁烷、1，3-二氨基丙烷或1，2-二氨基乙烷反应得到聚合物衍生物。
包含有M和Q的至少双官能化合物与聚合物的反应优选在以下条件下进行：温度从0到100℃、更优选从4到80℃、尤其优选从20到80℃；反应时间范围优选在4小时到7天，更优选10小时到5天，尤其优选17到4小时。至少双官能化合物：聚合物的摩尔比优选范围在10到200，特别是从50到100。
作为至少双官能化合物与聚合物的反应溶剂，优选至少一种非质子溶剂，特别优选无水非质子溶剂，其中水含量以重量计不超过0.5％，优选以重量计不超过0.1％。其中合适的溶剂是二甲基亚砜(DMSO)，N-甲基吡咯烷酮，二甲基乙酰胺(DMA)，二甲基甲酰胺(DMF)及其两种或更多种的混合物。
作为双官能化合物与聚合物的反应溶剂，也可以使用水性介质。
根据一个优选的实施方案，包含聚合物和至少双官能化合物的聚合物衍生物可以在游离的官能团Q上进行化学修饰，得到包含醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物。根据这种实施方式，聚合物衍生物优选同包含能与官能团Q反应的官能团以及醛基或酮基或半缩醛基的至少一个至少双官能化合物反应。
作为至少双官能化合物，包含醛基或酮基或半缩醛基以及能与聚合物衍生物的官能团Q形成键的至少一个官能团的化合物都是合适的。至少一个官能团是从像Q一样的官能团组中选择的并且能够与Q反应。在优选的情况下，Q是氨基-NH2，或是含有结构单元-NH-的氨基衍生物，如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷基芳氨基，优选使用除了含有醛基或酮基或半缩醛基之外，还含有至少一个羧基或至少一个活性羧基、优选一个羧基或一个活性羧基的化合物。醛基或酮基或半缩醛基和羧基或活性羧基可以被任何适当的间隔基分开。其中间隔是可任选取代的、直链的、分支的和/或环形的烃残基。通常，烃残基具有1-60，优选1-40，更优选最多1-20，更优选2-10，更优选2-6，尤其优选2-4个碳原子。如果存在杂原子，该间隔基团通常包含1到20，优选1到8，更优选1到4个杂原子。烃残基可能包含任选分支的烷基链或芳基基团或含有5到7个碳原子的环烷基，或是芳烷基，烷芳基，其中烷基部分是一个直链的和/或环烷基基团。
根据一个优选的实施方案，烃残基是含有2到6个碳原子、优选2到4个碳原子的烷基。在醛基或酮基与羧基之间没有碳原子也是可能的。另外，烃残基可以是取代的和未被取代的含有3到11个碳原子、优选3到6或3到5个碳原子的环状烃。当环烃被取代时，取代基可以选自取代或未取代的氨基或烷氧基。如果存在，取代基的数目优选1到3。另外，烷基和/或环状烃基可以包含一或多个杂原子，如O或S，特别选0。在这种情况下，优选存在1到3个，特别优选存在1到2个杂原子。在本文中优选的化合物选自下面的化合物：
R＝H、烷基、芳基、酰基、SiR’3
R’＝烷基、芳基
根据更优选的一个实施例，烃残基是含有5到7个、优选6个碳原子的芳基残基。烃残基最优选苯残基。根据这个优选的实施方案，羧基和醛基可以位于苯环的1，4-位、1，3-位或1，2-位，优选1，4-位。
作为反应性羧基，提到了活性酯，异硫代氰酸酯或异氰酸酯。优选的活性酯源自N-羟基琥珀酰亚胺类如N-羟基琥珀酰亚胺或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺，适当取代的苯酚如p-硝基酚，o，p-二硝基苯酚，o，o＇-二硝基苯酚，三氯苯酚如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚，三氟苯酚如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚，五氯苯酚，五氟苯酚，或羟吡咯例如羟基苯并三唑。尤其优选N-羟基琥珀酰亚胺类，尤其优选N-羟基琥珀酰亚胺和磺基-N-羟基琥珀酰亚胺。所有的醇都可以单独使用或两个或多个适当组合使用。作为活性酯，尤其优选五氟苯酯和N-羟基琥珀酰亚胺酯。
根据一个具体的实施例，可以与官能团Q形成化学键的官能团是活性羧基，其中，Q优选为NH2或包含结构单元-NH-的氨基的衍生物，如氨基芳基，氨基芳烷基，或烷芳基氨基，特别是NH2。
在这种情况下，能与官能团Q形成化学键并且为羧基的官能团适当的反应可以得到上面所说的活性羧基。因此，优选至少一个包含有羧基和醛基或酮基或半缩醛基的至少双官能化合物来进行反应，其中，羧基转变成活性羧基，产生的至少双官能化合物被纯化并与聚合物衍生物的官能团Q反应。
包含能反应得到反应性羧基的羧基的至少双官能化合物的具体实例是上文所列的化合物1到11。在本文中，术语“羧基”也涉及二羧酸化合物的内酯和内酐。
因此根据一个优选的实施方案，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中包含Q的聚合物衍生物进一步与甲酰苯甲酸反应，其中Q是氨基-NH2，或包含结构单元-NH-的氨基衍生物，例如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基。
根据另一个实施方案，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中包含Q的聚合物衍生物进一步与甲酰苯甲酸五氟苯基酯反应，其中Q是氨基。
根据另一个优选的实施方案，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该包含Q的聚合物衍生物进一步与甲酰苯甲酸N—羟基琥珀酰亚胺酯反应，其中Q是氨基。
根据另一个优选的实施方案，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中该包含Q的聚合物衍生物进一步与4-(4-甲酰-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸反应，其中Q是氨基。
根据另一个优选的实施方案，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中包含Q的聚合物衍生物与双官能化合物反应，其中该双官能化合物是选自α-酮基羧酸、唾液酸或其衍生物及磷酸吡哆醛的生物相容性化合物，其中Q是氨基。
对于α-酮基羧酸，优选是由氨基酸衍生的α-酮基羧酸，在大多数情况下可以在人体内发现。优选的由氨基酸衍生的α-酮基羧酸选自酮基-缬氨酸、酮基-亮氨酸、酮基-异亮氨酸和酮基-丙氨酸。α-酮基羧酸中的羧基与该聚合物的基团Q反应，其中Q为氨基。这样就形成了酰胺基。然后α-酮基羧酸剩余的游离酮基可以与蛋白质的官能团，特别是氨基反应。这样形成了可以氢化的亚氨基。
因此，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中包含Q的聚合物衍生物与α-酮基羧酸反应，其中Q是氨基。
至于唾液酸或其衍生物，优选其是生物相容性的。特别地，它们是在体内可以发现的N-和/或O-乙酰化的糖类。在一个优选的实施方案中，唾液酸是N-乙酰神经氨酸。由于吡喃糖结构，这些化合物显示出了所需要的刚性，以实现作为间隔基的功能。另一方面，通过选择性氧化向这些化合物中引入醛基也是可能的。在人体内可以发现唾液酸，例如在糖基化蛋白的聚糖链中作为末端单糖。
在一个优选的实施方案中，唾液酸可以被选择性氧化为醛基。
选择性氧化唾液酸的方法在本领域是已知的，例如L.W.Jaques，B.F.Riesco，W.Weltner，Carbohydrate Research，83(1980)，21-32和T.Masuda，S.Shibuya，M.Arai，S.Yoshida，T.Tomozawa，A.Ohno，M.Yamashita，T.Honda，Bioorganic&Medicinal ChemistryLetters，13(2003)，669-673。优选地可以在与聚合物的氨基反应前进行唾液酸的氧化。
然后该任选氧化的唾液酸经其羧酸基与聚合物的氨基反应。
所得到的化合物包含醛基，该醛基可以进一步通过还原氨基化作用与蛋白质的氨基反应。
因此，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中包含Q的聚合物衍生物与任选氧化的唾液酸反应，其中Q是氨基。
至于磷酸吡哆醛(PyP)，它是一种具有高度生物相容性的双官能化合物，也称作维生素B6。PyP是一种辅酶，其参与氨基酸侧链的氨基转移、脱羧、消旋化和很多的修饰。所有需要PyP的酶通过在氨基酸和辅酶之间形成希夫碱来发挥作用。
PyP的磷酸基可以与聚合物、优选羟烷基淀粉、特别是羟乙基淀粉的氨基反应形成磷酰胺。然后PyP的醛基可以与蛋白质的氨基反应，形成希夫碱，然后该希夫碱可以被还原。在一个优选的实施方案中，该偶联物的结构是HES-NH-P(O)2-O-(吡哆醛)-CH-NH-蛋白质。
在PyP的情况中，优选通过使用如上所述的二氨基化合物向该聚合物中引入该聚合物的官能团。
因此，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中包含Q的聚合物衍生物与磷酸吡哆醛反应，其中Q是氨基。
作为包含氨基和例如甲酰苯甲酸的聚合物衍生物的反应溶剂，优选至少一种非质子溶剂或至少一种极性溶剂。其中适当的溶剂包括水、二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中两种或多种的混合物。
作为包含氨基的聚合物衍生物和包含羧基的至少双官能化合物的反应溶剂，也可以使用水性介质。在本发明的上下文中使用的术语“水性介质”涉及一种溶剂或溶剂的混合物，以所包含溶剂的重量为基准，其包含水的含量为至少10％重量或至少20％重量或至少30％重量或至少40％重量或至少50％重量或至少60％重量或至少70％重量或至少80％重量或至少90％重量或高达100％重量。
该反应的温度优选是0到40℃，更优选0到25℃，特别优选15到25℃。反应时间优选0.5到24小时，特别优选1到17小时。
根据一个优选的实施方案，该反应在活化剂存在条件下进行。适当的活化剂包括，碳二亚胺类例如二异丙基碳二亚胺(DIC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，特别优选二异丙基碳二亚胺(DIC)。
用至少一种适当的方法从反应混合物中纯化所得到的聚合物衍生物。如果需要，可以在用至少一种适当的方法分离前沉淀该聚合物衍生物。
如果首先沉淀该聚合物衍生物，可以例如将与该反应混合物所处的溶剂或溶剂混合物不同的至少一种溶剂或溶剂混合物和该反应混合物在适当的温度接触。根据本发明一个特别优选的实施方案，其中所使用的溶剂是水性介质，优选是水，该反应混合物与2-丙醇或丙酮和乙醇的混合物，优选1∶1的混合物(v/v)接触，这表示所述化合物为同样的体积，温度优选是-20到+50℃，特别优选是-20到25℃。
可以用包含一个或多个步骤的适当方法来进行聚合物衍生物的分离。根据本发明一个优选的实施方案，用适当的方法例如离心分离或过滤将该聚合物衍生物首先从该反应混合物或该反应混合物与例如水2-丙醇混合物的混合物中分离出来。第二步，可以对分离出来的聚合物衍生物进行进一步处理，例如后处理，如透析、离心过滤或加压过滤、离子交换色谱、反相色谱法、HPLC、MPLC、凝胶过滤和/或冷冻干燥。根据一个甚至更优选的实施方案，将分离出来的聚合物衍生物首先进行透析，优选在水中透析，然后冷冻干燥直至反应产物中的溶剂含量根据所需的产物规格显著地降低。冷冻干燥可以在20到35℃，优选20到30℃的温度下进行。
接着，所得到的具有醛基或酮基或半缩醛基的聚合物衍生物通过还原氨基化作用与蛋白质的氨基反应。
根据本发明的还原性胺化反应，其中聚合物或聚合物衍生物通过至少一个醛基或酮基或半缩醛基与修饰的糖蛋白的至少一个氨基共价连接，优选与在本发明方法的步骤a)中作为官能团Z引入的氨基共价连接，该反应优选在0至40℃，更优选0至25℃，特别4至21℃，特别优选0至21℃的温度下进行。优选反应时间为0.5至72小时，更优选2至48小时，特别优选4至7小时。优选水性介质作为反应溶剂。
因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中还原性胺化在0至21℃的温度下进行。
因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中还原性胺化在水性介质中进行。
因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中还原性胺化在0至21℃的温度下在水性介质中进行。
用于本发明中的术语″水性介质″是指一种溶剂或溶剂混合物，其中水含量占所涉及溶剂重量的至少10％重量比，更优选至少20％重量比，更优选至少30％重量比，更优选至少40％重量比，更优选至少50％重量比，更优选至少60％重量比，更优选至少70％重量比，更优选至少80％重量比，甚至更优选至少90％重量比或者可达100％重量比。优选的反应介质是水。
反应介质的pH值一般为4至9或4至8或4至7.3。根据本发明优选实施方案，该还原性胺化的反应pH低于10，优选低于7.5，优选7.3，更优选小于或等于7，最优选低于7，即在酸性范围内。因此，优选范围为3至低于7，更优选3.5至6.5，再更优选4至6，再更优选4.5至5.5，特别优选约5.0，即4.6或4.7或4.8或4.9或5.0或5.1或5.2或5.3或5.4。优选范围特别是3至6.9或3至6.5或3至6或3至5.5或3至5或3至4.5或3至4或3至3.5或3.5至6.9或3.5至6.5或3.5至6或3.5至5.5或3.5至5或3.5至4.5或3.5至4或4至6.9或4至6.5或4至6或4至5.5或4至5或4至4.5或4.5至6.9或4.5至6.5或4.5至6或4.5至5.5或4.5至5或5至6.9或5至6.5或5至6或5至5.5或5.5至6.9或5.5至6.5或5.5至6或6至6.9或6至6.5或6.5至6.9。
反应所使用的聚合物衍生物：蛋白质的摩尔比优选为200∶1至5∶1，更优选100∶1至10∶1，特别优选75∶1至20∶1。
本发明也涉及如上所述的实施方案，其中基团Z和A的位点颠倒，特别是其中在本发明方法的步骤a)中引入糖蛋白中的官能团是含有反应性羧基或醛基、半缩醛基或酮基的基团，其中聚合物或聚合物衍生物的反应性基团Z是氨基。特别优选基团A选自如上所述的羟胺、肼、酰肼或酰肼衍生物。
根据本发明的另一优选实施方案，将要与聚合物或聚合物衍生物的官能团A反应的修饰的多元醇的官能团Z是硫醇基。优选地，该糖蛋白选自促红细胞生成素(EPO)、IFNβ、G-CSF、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、HCG、LH、FSH、IL-15、抗体融合蛋白、治疗性抗体、白介素特别是白介素2或6、IFN-α、IFN-γ、CSF、因子VII、因子VIII和因子IX。
在步骤a)中通过在转移酶反应中利用硫醇修饰的多元醇引入硫醇基
根据第一个实施方案，蛋白质的官能团Z为硫醇基，聚合物的官能团A为卤素乙酰基，并且其中A的引入方法包括：聚合物在任选氧化的还原端与具有至少两个官能团且各包含氨基的至少双官能化合物反应，产生具有至少一个包含氨基的官能团的聚合物衍生物，该聚合物衍生物再与单卤素取代的乙酸和/或反应性单卤素取代的乙酸衍生物反应。
对于具有至少两个官能团且各包含氨基的至少双官能化合物，可以是所有可与聚合物的任选氧化的还原端反应产生聚合物衍生物的化合物，该聚合物衍生物包含可与单卤素取代的乙酸和/或反应性单卤素取代的乙酸衍生物反应的氨基。
根据优选实施方案，该至少双官能化合物的一个官能团(该官能团与聚合物的任选氧化的还原端反应)选自：
其中G为O或S，如果出现两次，其分别独立为O或S，R＇为甲基。
根据本发明特别优选的实施方案，该至少双官能化合物的官能团(该官能团与任选氧化的还原端反应)是氨基NH2。根据另一个优选实施方案，该官能团，最优选氨基，与聚合物的氧化的还原端反应。
根据本发明优选实施方案，该至少双官能化合物的官能团(该官能团与单卤素取代的乙酸和/或反应性单卤素取代的乙酸衍生物反应)是氨基-NH2。
该至少双官能化合物的官能团，优选均为氨基-NH2(该官能团与聚合物的任选氧化的还原端，优选氧化的还原端，和单卤素取代的乙酸和/或反应性单卤素取代的乙酸衍生物反应)，可利用任何合适的间隔基分隔。其中间隔基可以是任选取代的直链、分支和/或环状烃残基。合适的取代基特别是烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、卤素、羰基、酰基、羧基、羧基酯、羟基、硫基、烷氧基和/或烷硫基。通常，该烃残基具有1至60个，优选1至40个，更优选1至20个，更优选2至10个，更优选2至6个，特别优选2至4个碳原子。如果存在杂原子，该分隔基通常包含1至20个，优选1至8个，特别优选1至4个杂原子。该烃残基可包含具有例如5至7个碳原子的任选分支的烷基链或芳基或环烷基，或者是芳烷基、烷芳基，其中烷基部份可以是直链和/或环状烷基。根据甚至更优选的实施方案，该烃残基是具有1至20个，优选2至10个，特别优选2至8个碳原子的烷基链。因此，优选的至少双官能化合物是双官能氨基化合物，特别优选1，8—二氨基辛烷、1，7—二氨基庚烷、1，6-二氨基己烷、1，5-二氨基戊烷、1，4-二氨基丁烷、1，3-二氨基丙烷和1，2-二氨基乙烷。
根据另一个优选实施方案，该至少双官能化合物是二氨基聚乙二醇，优选如下式的二氨基聚乙二醇
H2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2其中m是整数，m优选为1、2、3或4。
因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中聚合物与1，8-二氨基辛烷、1，7-二氨基庚烷、1，6-二氨基己烷、1，5-二氨基戊烷、1，4-二氨基丁烷、1，3-二氨基丙烷和1，2-二氨基乙烷在其氧化的还原端反应，产生如下式的聚合物衍生物
其中n＝2、3、4、5、6、7或8，该聚合物特别优选的是HES。
因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中聚合物与H2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2在其氧化的还原端反应，其中m是1、2、3或4，产生如下式的聚合物衍生物
其中m＝1、2、3或4，且聚合物特别优选的是HES。聚合物，优选羟乙基淀粉的还原端的氧化可根据可产生具有结构(IIa)和/或(IIb)的化合物的各方法或方法组合进行。
虽然氧化可根据所有可产生羟烷基淀粉的氧化的还原端的一种或多种适当方法进行，但优选利用碱性碘溶液进行，例如DE 196 28 705A1所述，其内容(实施例A，第9栏，第6至24行)在此引用作为参考。
聚合物与至少双官能化合物反应产生的聚合物衍生物再与单卤素取代的乙酸和/或反应性单卤素取代的乙酸衍生物反应。
作为单卤素取代的乙酸或反应性酸，优选Cl-取代的、Br-取代的及I-取代的乙酸，特别优选乙酰氯。
如果使用卤素取代的酸本身，优选使酸与聚合物衍生物在活化剂的存在下反应。合适的活化剂特别是碳二亚胺类，如二异丙基碳二亚胺(DIC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，特别优选二环己基碳二亚胺(DCC)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。
因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中聚合物，优选HES，与二氨基化合物，优选含2至8个碳原子的二氨基烷或H2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2(其中m＝1、2、3或4)反应，所得聚合物衍生物再与Br取代和I取代的乙酸在活化剂，优选EDC的存在下反应。
因此，本发明也涉及一种如下式的聚合物衍生物
其中X＝Cl、Br或I，n＝2、3、4、5、6、7或8，该聚合物特别优选的是HES，或如下式的聚合物衍生物
其中X＝Cl、Br或I，m＝1、2、3或4，该聚合物特别优选的是HES。
聚合物衍生物与卤素取代的乙酸的反应优选在DMF或水性系统中，优选在水中，在优选3.5至5.5，更优选4.0至5.0，特别优选4.5至5.0的pH下，在优选4至30℃，更优选15至25℃，特别优选20至25℃的反应温度下进行，优选反应时间为1至8小时，更优选2至6小时，特别优选3至5小时。
包含包括聚合物的聚合物衍生物、至少双官能化合物和卤素取代乙酸的反应混合物可用于与从步骤a)获得的修饰的糖蛋白反应。根据本发明一个优选实施方案，优选采用超滤，然后沉淀，任选洗涤和真空干燥，从反应混合物中分离聚合物衍生物。
聚合物衍生物与蛋白质的反应优选在pH6.5至8.5，更优选7.0至8.5，特别优选7.5至8.5下；在优选4至30℃，更优选15至25℃，特别优选20至25℃的反应温度下进行；反应时间优选为0.5至8小时，更优选1至6小时，特别优选2至5小时。
聚合物衍生物与修饰的多元醇的硫醇基的反应在聚合物衍生物与连接到糖蛋白上的修饰的多元醇之间产生硫醚键。
因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中聚合物，优选HES，与二氨基化合物，优选含2至8个碳原子的二氨基烷或H2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2(其中m＝1、2、3或4)反应，所产生的聚合物衍生物再与Br取代和I取代的乙酸在活化剂的存在下，优选在EDC的存在下反应，所产生的聚合物衍生物再与蛋白质的硫醇基反应，产生在蛋白质与聚合物衍生物之间包含硫醚键的偶联物。
因此，本发明也涉及一种如下式的偶联物
其中n＝2，3，4，5，6，7或8，该聚合物特别优选的是HES，该糖蛋白选自促红细胞生成素(EPO)、IFN β、G-CSF、GM-CSF、APC、tPA、AlAT、AT III、HCG、LH、FSH、IL-15、抗体融合蛋白、治疗性抗体、白介素特别是白介素2或6、IFN-α、IFN-γ、CSF、因子VII、因子VIII和因子IX，硫原子来自于修饰的多元醇。
其中m＝1、2、3或4，该聚合物特别优选的是HES，该糖蛋白选自促红细胞生成素(EPO)、干扰素β、G-CSF、GM-CSF、APC、tPA、AlAT、AT III、HCG、LH、FSH、IL-15、抗体融合蛋白、治疗性抗体、白介素特别是白介素2或6、IFN-α、IFN-γ、CSF、因子VII、因子VIII和因子IX，硫原子来自于修饰的多元醇。
该羟乙基淀粉优选为平均分子量约10 kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约10kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约100kD，DS约0.7的羟乙基淀粉。对于这些平均分子量和DS的组合中的每一种，优选DS值约为0.8。
根据第二个实施方案，蛋白质的官能团Z是硫醇基，聚合物的官能团A包含马来酰亚胺基。
根据该实施方案，有数种可能性可产生偶联物。通常，聚合物在其任选氧化的还原端与至少一种至少双官能化合物反应，其中该至少双官能化合物包含一个可与该聚合物中任选氧化的还原端反应的官能团，和至少一个包含马来酰亚胺基或经化学修饰以产生包含马来酰亚胺基的聚合物衍生物的官能团。根据优选实施方案，该官能团经化学修饰，以产生包含马来酰亚胺基的聚合物衍生物。
因此，本发明涉及一种如上所述的方法和偶联物，其通过包含马来酰亚胺基的聚合物衍生物与蛋白质的硫醇基反应产生，该方法包括聚合物在其任选氧化的还原端与包含可与该任选氧化的还原端反应的官能团U的至少双官能化合物反应，该至少双官能化合物还包含可经化学修饰以产生马来酰亚胺基的官能团W，该方法还包括化学修饰官能团W，产生马来酰亚胺基。
官能团U可以是可与聚合物的任选氧化的还原端反应的各官能团。
根据本发明优选实施方案，官能团U包含化学结构-NH-。
因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中官能团U包含结构-NH-。
根据本发明一个优选实施方案，官能团U是具有结构R＇-NH-的基团，其中R＇是氢或烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基，其中环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基可直接连接到NH基团，或者根据另一个实施方案，可通过氧桥连接到NH基团。该烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基残基可被适当取代。优选的取代基可以是卤素，如F、Cl或Br。特别优选的残基R＇是氢、烷基和烷氧基，甚至更优选的是氢和未取代的烷基和烷氧基。
在烷基和烷氧基中，优选含1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。更优选甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。特别优选甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特别优选甲基或甲氧基。
因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中R＇是氢或甲基或甲氧基。
根据本发明另一个优选实施方案，官能团U具有结构R＇-NH-R″-，其中R″优选包含结构单位-NH-和/或结构单位-(C＝G)-，其中G为O或S，和/或结构单位-SO2-。
根据更优选的实施方案，官能团R″选自：
其中G为O或S，如果出现两次，其分别独立为O或S，R＇是甲基。
因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中官能团U选自：
其中G为O或S，如果出现两次，其分别独立为O或S，R＇是甲基。
根据本发明更优选的实施方案，U包含氨基-NH2。
根据本发明一个实施方案，通过包含W的聚合物衍生物与另一种包含可与W反应的官能团并且还包含马来酰亚胺基的至少双官能化合物反应，化学修饰该至少双官能化合物的官能团W。
对于官能团W和该另一种至少双官能化合物中可与W反应的官能团，可特别提到下列官能团：
-C-C-双键或C-C-三键或芳香族C-C-键；
-硫基或羟基；
-烷基磺酸酰肼、芳基磺酸酰肼；
-1，2-二元醇；
-1，2-氨基醇类；
-1，2-氨基-硫醇类；
-氨基-NH2或包含结构单位-NH-的氨基衍生物，如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；
-羟基氨基-O-NH2，或包含结构单位-O-NH-的羟基氨基的衍生物，如羟基烷基氨基、羟基芳基氨基、羟基芳烷基氨基或羟基烷芳基氨基；
-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，其各包含结构单位-NH-O-；
-具有羰基-Q-C(＝G)-M的残基，其中G为O或S，M为例如：
---OH或-SH；
--烷基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或烷芳基氧基；
--烷基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基或烷芳基硫基；
--烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基氧基；
--活化的酯，如羟胺的酯，其具有如N-羟基琥珀酰亚胺的亚胺结构或具有结构单位O-N，其中N为杂芳基化合物的一部份，或其中G＝O且Q不存在，如具有取代芳基残基如五氟苯基、对硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；
其中Q不存在或是NH或杂原子，如S或O；
--NH-NH2或-NH-NH-；
--NO2；
-腈基；
-羰基，如醛基或酮基；
-羧基；
--N＝C＝0基团或-N＝C＝S基团；
-乙烯基卤化物基团，如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基团或三氟甲磺酸根；
--C≡C-H：
--(C＝NH2Cl)-O烷基
--(C＝O)-CH2-Hal基团，其中Hal为Cl、Br或I；
--CH＝CH-SO2-；
-包含结构-S-S-的二硫化物基团；
-基团；
-基团
其中W和该另一种至少双官能化合物的官能团分别是可与上述一种基团形成化学键的基团。
根据本发明再更优选的实施方案，W包含氨基-NH2。
根据本发明优选实施方案，W和另一个官能团均是来自上列基团列表的基团。
根据本发明一个实施方案，这些官能团之一是硫基。在这个特别的例子中，该另一个官能团优选选自：
其中Hal是Cl、Br或I，优选Br或I。
根据本发明特别优选的实施方案，这些官能团之一选自反应性酯，如羟胺的酯，其具有亚胺结构如N—羟基琥珀酰亚胺，或具有结构单位O-N，其中N是杂芳基化合物的一部份，或者例如具有取代芳基残基，如五氟苯基、对硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物，或任选转化成反应性酯的羧基。在该特别的例子中，该另一个官能团包含化学结构-NH-。
根据本发明特别优选的实施方案，W包含结构-NH-，该另一种至少双官能化合物包含反应性酯和马来酰亚胺基。
关于包含结构-NH-的官能团W，可参见上述官能团，其中W可与U相同或不同。根据本发明优选实施方案，U与W相同。更优选地，U和W均包含氨基。特别优选地，U和W均为氨基-NH2。
根据本发明一个实施方案，聚合物可与包含U和W的至少双官能化合物在其未氧化的还原端在水性介质中反应。根据优选实施方案，其中U和W均为氨基，该反应采用具有氧化型还原端的聚合物，在至少一种非质子溶剂中，特别优选在水含量不超过0.5％重量比，优选不超过0.1％重量比的无水非质子溶剂中进行。合适的溶剂特别是二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中两种或多种的混合物。
特别在U和W均为氨基-NH2时，U和W可利用任何合适的间隔基分隔。其中间隔基可以是任选取代的直链、分支和/或环状烃残基。合适的取代基是烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、卤素、羰基、酰基、羧基、羧基酯、羟基、硫基、烷氧基和/或烷硫基。通常，该烃残基具有1至60个，优选1至40个，更优选1至20个，更优选2至10个，更优选2至6个，特别优选2至4个碳原子。如果存在杂原子，该分隔基通常包含1至20个，优选1至8个，特别优选1至4个杂原子。该烃残基可包含具有例如5至7个碳原子的任选分支的烷基链或芳基或环烷基，或者是芳烷基、烷芳基，其中烷基部份可以是直链和/或环状烷基。根据甚至更优选的实施方案，该烃残基是具有1至20个，优选2至10个，更优选2至6个，特别优选2至4个碳原子的烷基链。
因此，本发明也涉及一种如上所述的方法和偶联物，其中聚合物在其氧化的还原端与1，4-二氨基丁烷、1，3-二氨基丙烷或1，2-二氨基乙烷反应，产生如下式的聚合物衍生物
其中n＝2、3或4，该聚合物优选为HES。
根据上述优选实施方案，包含氨基的聚合物衍生物再与包含反应性酯基和马来酰亚胺基的至少双官能化合物反应。该反应性酯基和马来酰亚胺基可利用合适的间隔基分隔。关于该间隔基，可参见官能团U与W之间的间隔基。根据本发明优选实施方案，反应性酯基与马来酰亚胺基之间利用具有1至10个，优选1至8个，更优选1至6个，更优选1至4个，更优选1至2个，特别优选1个碳原子的烃链分隔。根据另一优选实施方案，该反应性酯是琥珀酰亚胺酯，根据特别优选的实施方案，该包含马来酰亚胺基和反应性酯基的至少双官能化合物是N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)琥珀酰亚胺酯。
因此，本发明也涉及一种如下式的聚合物衍生物
其中n＝2、3或4，聚合物优选为HES。
包含马来酰亚胺基的聚合物衍生物进一步与修饰的多元醇的硫醇基反应，产生包含通过硫醚基与修饰的多元醇连接的聚合物衍生物的偶联物。
因此，本发明也涉及包含糖蛋白、修饰的多元醇和聚合物的如下式的偶联物
其中n＝2、3或4，优选4，该聚合物特别优选的是HES，该糖蛋白选自促红细胞生成素(EPO)、IFNβ、G-CSF、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、HCG、LH、FSH、IL-15、抗体融合蛋白、治疗性抗体、白介素特别是白介素2或6、IFN-α、IFN-γ、CSF、因子VII、因子VIII和因子IX。
该羟乙基淀粉优选为平均分子量约10kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约10kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约12kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约18kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD，DS约0.4的羟乙基淀粉，或平均分子量约50kD，DS约0.7的羟乙基淀粉，，或平均分子量约100kD，DS约0.7的羟乙基淀粉。对于这些平均分子量和DS的组合中的每一种，优选DS值约为0.8。
包含马来酰亚胺基的聚合物衍生物与蛋白质的硫醇基的反应优选在缓冲的水性系统中进行，优选pH为5.5至8.5，更优选6至8，特别优选6.5至7.5，优选反应温度为0至40℃，更优选0至25℃，特别优选4至21℃，优选反应时间为0.5至24小时，更优选1至20小时，特别优选2至17小时。该反应混合物的合适pH值可通过添加至少一种合适的缓冲液来调节。优选的缓冲液可提到乙酸钠缓冲液、磷酸盐或硼酸盐缓冲液。
偶联物可进一步处理，如透析、离心过滤或加压过滤、离子交换层析、反向层析、HPLC、MPLC、凝胶过滤和/或冻干等后处理。
本发明也涉及一种包含糖蛋白和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物是羟烷基淀粉(HAS)，该糖蛋白选自促红细胞生成素(EPO)、IFN β、G-CSF、GM-CSF、APC、tPA、AlAT、AT III、HCG、LH、FSH、IL-15、抗体融合蛋白、治疗性抗体、白介素特别是白介素2或6、IFN-α、IFN-γ、CSF、因子VII、因子VIII和因子IX，所述偶联物具有如下式的结构
其中R1、R2和R3分别独立地是氢或具有2至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基，优选氢或羟基烷基，更优选氢或羟基乙基，
其中L是任选适当取代的直链、分支和/或环状烃残基，其任选包含至少一个杂原子，包含烷基、芳基、芳烷基、杂芳基和/或杂芳烷基部分，所述残基具有2至60个、优选2至40个、更优选2-20个、更优选2-10个碳原子，且
其中硫原子来自于修饰的多元醇的硫醇基。
本发明也涉及一种如上所述的偶联物，其中-L-是
-[(CRaRb)mG]n[CRcRd]。-
其中Ra、Rb、Rc、Rd分别独立地是氢、烷基、芳基，优选氢，其中G选自O和S，优选O，并且其中
m为1、2、3或4，最优选为2，其中m个CRaRb基团中的残基Ra与Rb可相同或不同；
n为1至20，优选1至10，更优选1、2、3或4；
o为1至20，优选1至10，更优选1、2、3、4、5，更优选1或2，最优选1，其中o个CRcRd基团中的残基Rc与Rd可相同或不同。
或者，
其中，
n 0，且
o 2至20，优选2至10，更优选2，3，4，5，6，7或8，其中o个CRcRd基团中的残基Rc与Rd可相同或不同。
本发明也涉及一种包含糖蛋白、修饰的多元醇和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，该糖蛋白选自促红细胞生成素(EPO)、IFN β、G-CSF、GM-CSF，APC，tPA，AlAT，AT III，HCG，LH，FSH、IL-15、抗体融合蛋白、治疗性抗体、白介素特别是白介素2或6、IFN-α、IFN-γ、CSF、因子VII、因子VIII和因子IX，所述偶联物具有如下式的结构
其中R1、R2和R3分别独立地是氢或具有2至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基，优选氢或羟基烷基，更优选氢或羟基乙基，
其中L是任选适当取代的直链、分支和/或环状烃残基，其任选包含至少一个杂原子，包含烷基、芳基、芳烷基、杂芳基和/或杂芳烷基部分，所述残基具有2至60个、优选2至40个、更优选2-20个、更优选2-10个碳原子，且
其中硫原子来自于修饰的多元醇的硫醇基。
本发明也涉及一种如上所述的偶联物，其中-L-是
-[(CRaRb)mG]n[CRcRd]。-
其中Ra、Rb、Rc、Rd分别独立地是氢、烷基、芳基，优选氢，其中G选自O和S，优选O，并且其中
m为1、2、3或4，最优选为2，其中m个CRaRb基团中的残基Ra与Rb可相同或不同；
n为1至20，优选1至10，更优选1、2、3或4；
o为1至20，优选1至10，更优选1、2、3、4、5，更优选1或2，最优选1，其中。个CRcRd基团中的残基Rc与Rd可相同或不同。
或者，
其中，
n 0，且
o 2至20，优选2至10，更优选2，3，4，5，6，7或8，其中。个CRcRd基团中的残基Rc与Rd可相同或不同。
本发明也涉及如上所述的偶联物，其中羟烷基淀粉是羟乙基淀粉。
本发明也涉及如上所述的偶联物，其中羟乙基淀粉的分子量为2至200kD，优选地4至130kD，更优选地4至70kD。
本发明也涉及如上所述的实施方案，其中基团Z和A的位点颠倒，即，其中在本发明方法的步骤a)中引入糖蛋白中的官能团Z是含有马来酰亚胺基或卤代乙酰基的基团，其中聚合物或聚合物衍生物的反应性基团A是硫醇基。
根据本发明的另一实施方案，修饰的多元醇的官能团Z是马来酰亚胺基，聚合物的官能团A包含硫醇基。
根据该实施方案，产生偶联物存在几个可能性。通常，聚合物在其任选氧化的还原端与至少一种至少双官能化合物反应，其中该至少双官能化合物包含一个可与该聚合物中任选氧化的还原端反应的官能团，和至少一个包含硫醇基的官能团A。可用于该实施方案的双官能化合物的例子可以选自：
其中n是整数，优选地1，2，3，4，5或6。如果聚合物，优选HES，与化合物3反应，则形成的共价键将是如上所述的肟。如果聚合物，优选HES，与化合物1反应，则优选地通过如上所述还原胺化反应。可替代地，任选选择性氧化的聚合物，优选HES，可以与化合物1反应，由此进行内酯环打开。如果聚合物，优选HES与化合物2反应，则优选通过还原胺化反应，然后例如用TCEP或DTT打开-S-S-键。如果任选选择性氧化的聚合物，优选HES，与化合物2反应，则优选地通过内酯环打开反应，然后例如用TCEP或DTT打开-S-S-键(对于n＝2和n＝3，上述结构可以按照Bauer等人.J.Or g.Chem.1965，30，949合成)。
修饰的多元醇的为马来酰亚胺基的官能团Z可以通过常规方法引入修饰的多元醇内。
因此，本发明涉及如上所述的方法和偶联物，该方法包括包含硫醇基的聚合物衍生物与蛋白质上修饰的多元醇的马来酰亚胺基反应，所述方法包括将聚合物在其任选氧化的还原性末端与至少双官能化合物反应，该至少双官能化合物能够与任选氧化的还原性末端反应的官能团U，至少双官能化合物还包含硫醇基，获得的HAS衍生物与含有马来酰亚胺基的蛋白质反应。
在制备本发明的偶联物的方法中，上述方法的转化率可以是至少50％，更优选至少70％，更优选至少80％，特别是95％，或者更高，如至少98％或99％。
根据另一方面，本发明涉及如上所述的偶联物，或可以通过如上所述的方法获得的偶联物，特别用于治疗人或动物体的方法。
本发明的偶联物的纯度可以是至少50％，更优选至少70％，更优选至少90％，特别是至少95％或至少99％。在一个最优选的实施方案中，偶联物的纯度可以是100％，即不含其他副产物。
因此，根据另一方面，本发明也涉及一种含有本发明的偶联物的组合物，其中该偶联物的含量可以是至少50wt-％，更优选至少70wt-％，更优选至少90wt-％，特别是至少95wt.-％或至少99wt.-％。在一个最优选的实施方案中，该组合物可以由偶联物组成，即偶联物的量为100wt.-％。
本发明特别温和的方法允许获得对偶联物的糖蛋白部分具有极小的氧化和/或脱酰胺作用引起的损害的偶联物。
特别是，至少80％的含有至少一个游离天冬酰胺和/或谷氨酰胺侧链的糖蛋白在最终偶联物中在所有天冬酰胺和谷氨酰胺侧链上保留完整的酰胺基。优选超过90％、超过95％或超过99％的糖蛋白在终偶联物中保持所有完整的酰胺基。最优选的是通过质谱分析在终偶联物中检测不到脱酰胺的谷氨酰胺和/或天冬酰胺残基。脱酰胺的天冬酰胺和/或谷氨酰胺残基的百分比可以通过LC-MS按照以下文献所述测定：″Usefulness of Glycopeptide Mapping by LiquidChromatography/Mass Spectrometry in Comparability Assessmentof glycoprotein Products″，Miyako Ohta，Nana Kawasaki，SatsukiItoh and Takao Hayakawa，Biologicals Volume 30， Issue3，September 2002，Pages 235-244。
特别地，至少80％的含有至少一个甲硫氨酸侧链的糖蛋白在最终偶联物中保持全部非氧化形式的甲硫氨酸残基。优选超过90％、超过95％或超过99％的糖蛋白在终偶联物中保持全部非氧化形式的甲硫氨酸残基。最优选的是通过质谱分析在终偶联物中检测不到氧化的甲硫氨酸残基。氧化的甲硫氨酸残基的百分比可以通过LC-MS按照以下文献所述测 定：″Usefulness of Glycopeptide Mapping by LiquidChromatography/Mass Spectrometry in Comparability Assessmentof Glycoprotein Products″，Miyako Ohta， Nana Kawasaki， SatsukiItoh and Takao Hayakawa，Biologicals Volume30，Issue3，September2002，Pages 235-244。
最优选地甲硫氨酸氧化和谷氨酰胺/天冬酰胺脱酰胺都得到避免。
此外，本发明涉及一种药物组合物，包含治疗有效量的如上所述的偶联物或用如上所述的方法得到的偶联物。
本发明的所有糖蛋白—HAS偶联物优选通过静脉内、皮下或肌肉内途径给药。所选择的具体途径取决于所要治疗的情况。优选地，该偶联物可以与适当的载体，例如本领域已知的载体(例如，在第一代/未修饰的无白蛋白或含白蛋白生物药物中用作赋形剂)、适当的稀释剂，例如用于静脉内、皮下或肌肉内给药的无菌溶液一起给药。所需要的剂量取决于所要治疗情况的严重性、患者的个体应答、所用的给药方法等等。本领域技术人员可以根据他的常规知识确定正确的剂量。
根据另一个方面，本发明也涉及如上所述的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，其中该蛋白质是因子VIII，在制备用于治疗A型血友病的药物中的应用。
根据另一个方面，本发明也涉及如上所述的HAS-AT III偶联物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白质偶联物，在制备用于治疗ATIII遗传性缺乏、静脉闭塞性疾病、烧伤和冠状动脉旁路移植(CABG)术中的肝素耐受、由外伤或胃肠手术导致的肠穿孔、弥散性血管内凝血(DIC)和/或败血症，和预防与通气治疗有关的微血块形成的药物中的应用。因此包含本发明HAS-AT III偶联物的该药物组合物可以用于上述目的。
根据另一个方面，本发明也涉及如上所述的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，其中该蛋白质是AlAT，在制备用于治疗肺气肿、囊性纤维化、特应性皮炎、和/或支气管炎的药物中的应用。因此包含本发明HAS-AlAT-偶联物的该药物组合物可以用于上述目的。
根据另一个方面，本发明也涉及如上所述的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，其中该蛋白质是tPA，在制备用于治疗心肌梗塞(心脏病发作)、血栓症、血栓栓塞或闭塞性疾病，特别是闭塞性动脉疾病的药物中的应用。
根据另一个方面，本发明也涉及如上所述的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，其中该蛋白质是APC，在制备用于治疗重度败血症、血栓症、血栓栓塞或闭塞性疾病，特别是闭塞性动脉疾病的药物中的应用。
根据另一个方面，本发明也涉及如上所述的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，其中该蛋白质是IFNα，在制备用于治疗白血病例如毛细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、癌症例如类癌瘤、恶性黑色素瘤和肝炎例如慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎的药物中的应用。
根据另一个方面，本发明也涉及如上所述的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，或用如上所述的方法得到的HAS-蛋白质偶联物，优选HES-蛋白质偶联物，其中该蛋白质是IFNβ，在制备用于治疗多发性硬化症，优选复发型多发性硬化症的药物中的应用。
本发明还涉及如上所述的GM-CSF-HAS偶联物在制备药物中的用途，该药物用于骨髓移植或患有急性骨髓性白血病老年人诱导性化学疗法之后，骨髓移植植入失败或延迟，动员以及在移植自体周边血液祖细胞之后的骨髓恢复。
本发明也涉及HAS-因子VII偶联物在制备用于和因子VIII或因子IX的抑制剂一起治疗血友病A或B患者发作的药物中的应用。
本发明也涉及HAS-因子IX偶联物在制备用于控制和预防血友病B(例如先天性因子IX缺乏或克里斯马斯病)患者的出血性发作，包括控制和预防在外科环境中的出血的药物中的应用。
本发明还涉及转移酶在上述温和的偶联物制备方法中的应用，特别是在该方法中酶氧化和/或侧链脱酰胺得到避免。
本发明还涉及在糖蛋白和聚合物或聚合物衍生物之间的形成偶联物的第二种温和方法。该第二种温和方法通过以下步骤产生了羟烷基淀粉(HAS)和糖蛋白(GPO)之间的偶联物：
a)提供包含至少一个，更优选至少两个末端半乳糖残基的GPO，
b)通过半乳糖氧化酶(或相关酶)的作用氧化末端半乳糖，形成包含反应性醛基的末端半乳糖残基，
c)提供能够与步骤b)获得的醛基形成共价键的修饰的HAS，和
d)步骤b)的GPO与步骤c)的HAS反应。这样产生了每分子糖蛋白包含一个或多个HAS分子的HAS-GPO，其中每个HAS与GPO通过糖蛋白的N—聚糖或O—聚糖的半乳糖部分偶联。这样获得的偶联物的聚糖包含至少一个不是唾液酸残基的末端糖部分。
由该第二种温和方法的步骤b)获得的具有氧化的半乳糖残基的GPO是本发明第一种温和方法的步骤b)的合适的底物。在此情况下官能团Z为醛基，因此聚合物或其衍生物的官能团A可以含有基于结构-NH-的氨基。因此由该第二种温和方法的步骤b)获得的具有氧化的半乳糖残基的GPO可以用于其中Z是醛基的任何方法中，如本文第22-35页所述。本发明因此也涉及由该第二种温和方法的步骤b)获得的具有氧化的半乳糖残基的GPO获得的所有HAS-GPO偶联物在第一种温和方法的步骤b)中的应用。
因此，本发明也涉及一种方法和通过其中Z是醛基的任何方法获得的偶联物，如本文第21-35页所述，特别是其中能够与聚合物的任何氧化的还原性末端反应的官能团A包含基于结构-NH-的氨基。。
优选地，GPO选自促红细胞生成素(EPO)、IFNβ、G-CSF、GM-CSF、APC、tPA、AlAT、AT III、HCG、LH、FSH、IL-15、抗体融合蛋白、治疗性抗体、白介素特别是白介素2或6、IFN-α、IFN-γ、CSF、因子VII、因子VIII和因子IX，优选地GPO是EPO，特别是具有人EPO氨基酸序列的EPO。
优选地，糖基化EPO通过重组产生。这包括在真核或原核细胞中产生，优选地在哺乳动物、昆虫、酵母、细菌细胞中或者在适于重组生产EPO的其它任何细胞类型中产生。此外，EPO也可以在转基因动物中(例如在体液中，如奶、血液等)、在转基因鸟特别是家禽优选在鸡的蛋中，或者在转基因植物中表达。
糖基化多肽的重组产生为本领域公知。通常包括用一种适当的表达载体转染宿主细胞，在能够生产多肽的条件下培养宿主细胞，以及从宿主细胞中纯化多肽。关于详细信息，参见例如Krystal，Pankratz，Farber，Smart，1986， Purification of human erythropoietin tohomogeneity by arapid five-step procedure，Blood，67(1)，71-9；Quelle， Caslake，Burkert，Wojchowski，1989，High-levelexpression and purification of a recombinant humanerythropoietin produced using a baculovirus vector，Blood，74(2)，652-7；EP 640 619 B1和EP 668 351 B1。
在一个优选实施方案中，EPO具有人EPO的氨基酸序列(见EP 148605 B2)。
EPO可以含有通过N-和/或O-连接的糖基化作用与EPO连接的一个或多个碳水化合物侧链(优选1-4个，优选4个)，即EPO被糖基化。当在真核细胞中生产EPO时，多肽通常在翻译后被糖基化。因此，在哺乳动物特别是在人、昆虫或酵母细胞内的生物合成过程中，碳水化合物侧链可以与EPO连接。优选地，EPO在宿主中产生，其聚糖缺乏用末端唾液酸残基封端，因此产生了末端半乳糖残基含量高的EPO。这种低唾液酸化的EPO可以直接用作本发明的第二种温和方法的初始材料。
由于用EPO作为本发明的偶联物的GPO的例子，当然也是用作偶联物形成的初始材料的其他GPO的低唾液酸化形式，本发明的第二种温和方法，可以在这些宿主中产生。特别优选的是选自促红细胞生成素(EPO)、IFNβ、G-CSF、GM-CSF、APC、tPA、AlAT、AT III、HCG、LH、FSH、IL-15、抗体融合蛋白、治疗性抗体、白介素特别是白介素2或6、IFN-α、IFN-γ、CSF、因子VII、因子VIII和因子IX的糖蛋白。
本发明的第二种温和方法(也是本发明第二种方法的步骤a和b与本发明第一种方法的步骤b的组合)也允许产生对偶联物的糖蛋白部分具有极小的因氧化和/或脱酰胺化引起的损害的偶联物。
特别是，至少80％的含有至少一个游离天冬酰胺和/或谷氨酰胺侧链的糖蛋白在最终偶联物中在所有天冬酰胺和谷氨酰胺侧链上保持完整的酰胺基。优选超过90％、超过95％或超过99％的糖蛋白在终偶联物中保持所有完整的酰胺基。最优选的是通过质谱分析在终偶联物中检测不到脱酰胺的谷氨酰胺和/或天冬酰胺残基。脱酰胺的天冬酰胺和/或谷氨酰胺残基的百分比可以通过LC-MS按照以下文献所述测定：″Usefulness of Glycopeptide Mapping by LiquidChromatography/Mass Spectrometry in Comparability Assessmentof Glycoprotein Products″，Miyako Ohta，Nana Kawasaki，SatsukiItoh and Takao Hayakawa，Biologicals Volume30，Issue3，September 2002，Pages 235-244。
特别地，至少80％的含有至少一个甲硫氨酸侧链的糖蛋白在最终偶联物中保持全部非氧化形式的甲硫氨酸残基。优选超过90％、超过95％或超过99％的糖蛋白在终偶联物中保持全部非氧化形式的甲硫氨酸残基。最优选的是通过质谱分析在终偶联物中检测不到氧化的甲硫氨酸残基。氧化的甲硫氨酸残基的百分比可以通过LC-MS按照以下文献所述测定：″Usefulness of Glycopeptide Mapping by LiquidChromatography/Mass Spectrometry in Comparability Assessmentof Glycoprote in Products″，Miyako Ohta，Nana Kawasaki，SatsukiItoh and Takao Hayakawa，Biologicals Volume30，Issue3，September 2002，Pages 235-244。
对于EPO，在Eur.Pha r.4thedition(01/2002：1316)pages1123-1128描述了通过肽作图的这种检测。
最优选地甲硫氨酸氧化和谷氨酰胺/天冬酰胺脱酰胺都得到避免。
HAS可以直接与GPO如EPO偶联，或者可替代地通过连接分子与其偶联。合适的连接分子在上文中描述。
根据本发明的HAS-GPO偶联物的一个优选实施方案，HAS与GPO通过连接的N-或O-聚糖的半乳糖残基偶联。
此外，HAS-GPO例如HAS-EPO也显示比用作偶联初始材料的GPO例如EPO(未偶联的GPO)更高的体内活性。测定体内生物活性的方法在本领域公知(见上文)。
如果将未偶联的EPO的体内活性设为100％，则HAS-EPO偶联物可能显示110％-300％、优选110％-200％、更优选110％-180％、或者110-150％、最优选110％-140％的体内活性。
与Amgen的高度唾液酸化的EPO相比(见EP 428 267 B1)，如果将高度唾液酸化EPO的体内活性设为100％，则HAS-EPO显示优选至少50％、更优选至少70％、更优选至少85％、或者至少95％、至少150％、至少200％或者至少300％的高度唾液酸化EPO的体内活性。最优选地，它显示至少95％的高度唾液酸化EPO的体内活性。
不希望被理论所束缚，本发明HAS-EPO偶联物的高体内生物活性可能是基于以下事实：该HAS-EPO偶联物在循环中保持的时间比未偶联的EPO更长，因为它较少被肝脏清除系统识别，并且由于分子量较高，肾清除减少。测定EPO在体内循环半衰期的方法在本领域公知(Sytkowski，Lunn，Davis，Feldman，Siekman，1998，Human erythropoietindimmers with markedly enhanced in vivo activity，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95(3)，1184-8)。
本发明还涉及用于治疗人或动物体的方法中的根据本发明的HAS-GPO例如HAS-EPO。
此外，本发明涉及一种含有本发明的HAS-GPO例如HAS-EPO的药物组合物。在一个优选实施方案中，该药物组合物还含有至少一种可用于促红细胞生成素治疗的药学上可接受的稀释剂、辅料或载体。优选地HAS-GPO的浓度大于1nM。更优选地，HAS-GPO构成了存在的总蛋白质的至少5％，优选大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、甚至大于50％。
本发明一个特别的优点是可以使用因为不适合在药物组合物中使用而丢弃的这种GPO制品。特别是，与所述GPO的完全唾液酸化形式相比具有大于70％体内生物活性的GPO，特别是EPO，作为初始材料在制备适合在药物组合物中使用的修饰GPO的方法中的用途。
对于EPO，这意味着甚至可以使用体内生物活性低于100000U/mg，或者甚至低于60000U/mg，如低于50000U/mg，或者甚至低于40000U/mg，如低于30000U/mg或低于20000U/mgEPO蛋白或者显示检测不到体内生物活性的的EPO制品作为初始材料，如按照欧洲药典4，Monography 01/2002：1316所述的程序使用normocytohaemic小鼠系统测定的。
本发明的GPO-HAS-偶联物显示体内生物活性与低唾液酸化的初始EPO相比明显提高。这种提高一般是1，5-25倍，一般2-10倍，大多数3-8倍。然而，应当指出，本发明的方法甚至可以将显示不可检测体内生物活性的低唾液酸化的形式转化为显示与完全唾液酸化GPO相当或更好的体内生物活性的GPO-HAS-偶联物。
如此处所用的“治疗有效量”是指对对特定疾病和给药方案提供治疗效果的量。促红细胞生成素同种型优选通过胃肠外途径给药。具体选择的给药途径依赖于所治疗的疾病。
对于EPO，促红细胞生成素同种型的给药优选地作为含有适当载体如人血清白蛋白、适当的稀释剂如缓冲盐溶液和/或适当辅料的制剂的一部分进行。需要的剂量是足以升高患者的血细胞比容的量，根据所治疗的疾病的严重程度、使用的给药方法等而不同。
本发明的EPO药物制剂治疗的目的优选地是提高血液中血红蛋白的值大于6.8mmol/l。为此，可以施用药物组合物，使血红蛋白值每周提高0.6mmol/l和1.6mmol/l。如果血红蛋白值大于8.7mmol/l，则优选地应当中断治疗，直到血红蛋白值低于8.1mmol/l。
本发明的组合物优选地在适合皮下或静脉或胃肠外注射的制剂中使用。为此，合适的赋形剂和载体是，例如磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯酸钠、聚山梨醇酯80、HAS和注射用水。该组合物可以每周施用三次，优选每周两次，更优选每周一次，最优选每两周一次。
优选地，该药物组合物以0.01-10μg/kg患者体重的量施用，更优选0.1-5μg/kg，0.1-1μg/kg或0.2-0.9μg/kg，最优选0.3-0.7μg/kg,最优选0.4-0.6μg/kg体重。
优选地，每次剂量通常施用10μg-200μg，优选15μg-100μg。
本发明还涉及本发明HAS-EPO在制备治疗贫血疾病或造血功能障碍疾病或与之有关疾病的药物中的应用。
本发明通过下列实施例进一步说明，它们绝非旨在限制本发明的范围。
附图简述
图1显示从通过酸处理除去唾液酸残基(2和3)或未经酸处理(1和4)的EPO制品获得的天然N-连接寡糖的HPAEC-PAD分析
1 代表来自EPO制品F98的总N-连接的寡糖
2 代表从EPO F99获得的寡糖
3 代表从EPO制品G02获得的寡糖
4 代表从EPO制品G04获得的寡糖
在图1中，黑体罗马数字代表以下：
O 代表中性寡糖部分，
I 代表单电荷的寡糖部分(1个唾液酸)，
II 代表双电荷的寡糖部分(2个唾液酸)，
III 代表三电荷的寡糖部分(3个唾液酸)，
IV 代表四电荷的寡糖部分(4个唾液酸)。
图2显示在如实施例B4所述用Galox氧化之前和之后的不同EPO制品的SDS page分析。凝胶电泳使用XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)系统。10％Bis-Tris凝胶(NP0301 BOX)和还原条件的MOPS SDS电泳缓冲液(均来自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)按照供应商说明使用。
各泳道代表：
MWStd： 蛋白质标记预染色的SDS-PAGE标准(Bio-RAD，cat.161-0305，lot 99393)；分子量标记从上至下为：109kD，94kD，51.7kD，35.9kD，29.5kD，21.8kD；
A和B：Galox之后(A)和之前(B)的EPO制品F98；
C和D：Galox之后(C)和之前(D)的EPO制品F99；
E和F：Galox之后(E)和之前(F)的EPO制品G01；
G和H：Galox之后(G)和之前(H)的EPO制品G02；
I和J：Galox之后(I)和之前(J)的EPO制品G03。
图3显示根据实施例3制备的HES-EPO偶联物的SDS page分析。凝胶电泳使用XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe,D)系统。10％Bis-Tris凝胶(NP 0301 BOX)和还原条件的MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)按照供应商说明使用。
各泳道代表：
A：蛋白质标记预染色的SDS-PAGE标准(Bio-RAD，cat.161-0305，lot 99393)；分子量标记从上至下为：109kD，94kD，51.7kD，35.9kD，29.5kD，21.8kD；
B：EPO制品F98
C：EPO制品F99
D：EPO制品G01
E：EPO制品G02
F：EPO制品G03
G：EPO制品G04
H：分子量标准(见泳道A).
图4显示在用多肽N-糖苷酶除去N-连接的寡糖之前和之后，Q-Sepharose纯化的HES-修饰的EPO制品F98-G04的SDS page分析。凝胶电泳使用XCell Sure Lock Mini Cell(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)系统。10％Bis-Tris凝胶(NP 0301 BOX)和还原条件的MOPS SDS电泳缓冲液(均来自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，D)按照供应商说明使用。
各泳道代表：
MWStd道：蛋白质标记预染色的SDS-PAGE标准(Bio-RAD，cat.161-0305，lot 99393)；分子量标记从上至下为：109kD，94kD，51.7kD，35.9kD，29.5kD，21.8kD；
A和B：N-糖苷酶处理之前(A)和之后(B)的EPO制品F98；
C和D：N-糖苷酶处理之后(C)和之后(D)的EPO制品F99；
E和F：N-糖苷酶处理之前(E)和之后(F)的EPO制品G01；
G：未用N-糖苷酶处理的EPO BRP标准批II
H和I：N-糖苷酶处理之前(H)和之后(I)的EPO制品G02；
J和K：N-糖苷酶处理之前(J)和之后(K)的EPO制品G03。
L和M：N-糖苷酶处理之前(L)和之后(M)的EPO制品G04
N： 未用N-糖苷酶处理的EPO BRP标准批II
实施例
A.材料
A1. 化学试剂
H2SO4(#K027.1)，NaOH(#K02U)，二水合磷酸氢二钠(#4984.1)和二水合磷酸二氢钠(#T879.2)来自Carl Roth GmbH Karlsruhe，Germany，半乳糖-氧化酶(450单位；#7907)和过氧化氢酶(1，4mg/ml；55600units/mg；#C-3556)来自Sigma，L-甲硫氨酸(#64391)来自Fluka，蛋白酶抑制剂亮抑酶肽(#1017101)、抑胃肽(#253286)，抑肽酶(#236624)、TLCK(#874485)和Prefabloc SC(#429868)来自Roche。
当使用Prefabloc SC溶液时，在使用前新鲜制备。以下所述的量用来制备46μl蛋白酶抑制剂混合物(3μl亮抑酶肽1mg/ml水，15μl抑胃肽1mg/ml乙醇，0，5μl抑肽酶2mg/ml水，2，5μl TLCK 20mg/ml水，和25μl Pefabloc SC 40mg/ml水(新鲜溶液)。
B.方法
B1.EPO(糖蛋白)的有限/完全酸解过程(用于产生未掩蔽的(末端)半乳糖残基)
在低浓度缓冲液(20 mM磷酸钠，pH7.0)中的0.5-2.5mg/ml EPO在设定为80℃的水浴中加热；平行温育装有校准的温度计的小瓶；在温度达到75℃后，用1N H2SO4使样品用0.1N H2SO4处理。在该温度下温育0、4、10、60分钟，之后使用1N NaOH中和样品，并在水浴中冷却到0℃。样品或者立即用于下面的处理步骤或者在液氮中冷冻后贮存在-80℃。
B2.使用vivaspin浓缩器单元的缓冲液更换
在半乳糖氧化酶步骤之前，使用vivaspin浓缩器单元(10,000Da分子量阻断值(MWCO))将EPO-样品的缓冲液更换为20mM磷酸钠缓冲液pH7.2。6ml或20ml体积按照生产商建议用″Megafuge l.R″离心机(Kendro)或者类似的装置在4-8℃下以4000rpm处理。Vivaspin离心步骤至少进行3次，每次在离心前用20mM磷酸钠，pH7.2调节蛋白质样品。终EPO样品按照欧洲药典的SOP-AA-018-01/02方法浓缩。
B3.糖蛋白的唾液酸含量的测定
使用所述用于定量测定重组人EPO的唾液酸含量的方法(欧洲药典)，并按照SOP SOP-AA-052-01/00进行。对于水解60分钟的EPO的预期的低唾液酸值不进行修正。发现根据欧洲药典的比色试验比HPAEC-PAD作图得到较高的唾液酸含量值，这可能是由于该方法具有一定的非特异性。
B4.EPO样品的半乳糖-氧化酶处理
B4.1半乳糖氧化酶的预温育
商售半乳糖氧化酶可能含有蛋白酶，这些蛋白酶可以通过离子交换层析除去。或者，如下所述通过在上述蛋白酶抑制剂混合物的存在下预温育而使这些蛋白水解酶失活。
500μl份的半乳糖氧化酶400-450U/ml(按照生产商说明)与46μl蛋白酶抑制剂混合物混合，在37℃下温育1小时。
在这一温育步骤后，使用vivaspin浓缩器(10,000Da MWCO)部分除去蛋白酶抑制剂。预温育的半乳糖氧化酶用450μl20mM磷酸钠缓冲液pH7.2离心两次。然后用20mM磷酸钠缓冲液pH7.2漂洗浓缩器单元，并将溶液调节到450单位的半乳糖氧化酶/400μl。对于下面的步骤，每ml EPO样品使用在20mM磷酸钠缓冲液pH7.2中的23.5μl半乳糖氧化酶(450单位/400μl)(＝26.4单位)。
B4.2半乳糖-氧化酶反应
将EPO样品调节至终浓度为10mM甲硫氨酸(为了防止多肽氧化)、2.35μl过氧化氢酶(6200单位/200μl)，加入23.5μl预温育的半乳糖氧化酶，在37℃下温育12-18小时。温育后，取样品等份进行SDS-PAGE分析。然后对样品进行离子交换层析。
B5离子交换层析纯化EPO和EPO衍生物
EPO样品的纯化在室温下使用AKTA explorer 10系统(AmershamPharmacia Biotech)进行，该系统包括泵P-903、具有0.6ml室的混合器M-925、具有10mm流动单元和监测器UV-900、监测器pH/C-900、级分收集器Frac-900、进样环路2ml，以及Unicorn软件Version 3.21。柱子含有5ml Q-Sepharose Fast Flow，用10CV的缓冲液A(20mM N-吗啉代-丙烷硫酸/NaOH缓冲液，pH8.0)平衡。EPO样品用缓冲液A1∶10稀释，最后调节至pH7.8-8.2，用加样泵以1ml/min的流速加样。在用10ml缓冲液A冲洗样品泵后，进一步用6CV缓冲液A以1.0ml/min的流速洗柱。随后用4倍体积的20mM磷酸钠pH6，5；缓冲液B以0.8ml/min的流速在37分钟内以0-40％缓冲液C(0.5M NaCl，在20mM磷酸钠，pH 6，5)的陡梯度洗脱EPO。于206、260和280nm记录洗脱曲线。在完成洗脱后，柱子用25ml缓冲液C以1ml/min的流速再生。最后，用1M NaOH过柱60分钟，并用缓冲液C恢复，贮存，直到再次使用。含有EPO的3-4个级分库通过SDS-PAGE分析。
B6.在离子交换层析后从EPO中除去缓冲液盐
为了EPO浓缩和缓冲液更换以进行下一个HES修饰反应，在离子交换层析后获得的EPO样品进行如B2段所述类似的Vivaspin脱盐程序。EPO样品浓缩至3-5mg/ml终蛋白质浓度，用4倍体积的0.1M乙酸钠pH5.5稀释3倍，在每一稀释步骤后用Vivaspin浓缩器(6ml或20ml浓缩单位)以4000rpm再浓缩。然后从浓缩器单元中取出蛋白质，调节为2-4mg/ml。最后，得到的蛋白质浓度按照欧洲药典所述(OD280nm)测定。蛋白质在24小时内进行HES修饰，在此之前贮存在0℃的冰/水中。(为了更长时间地贮存样品，可能需要无菌过滤，或者，样品可以在用PBS调节为pH7.2后在液氮中冷冻后于-80℃冻存)。
B7 羟氨基HES50/0.7的合成
5g HES50/0.7 (Lot.304，MW＝47000D，DS＝0.76，SupramolParenteral Colloids GmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶解于40ml 0.1M乙酸钠缓冲液，pH5.2中，加入10mmol 0-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺。在22℃振荡26小时后，将反应混合物缓慢加到200ml冰冷的丙酮和乙醇的1∶1混合物中(v/v)。于0℃离心收集沉淀产物，用30ml冰冷的丙酮和乙醇的1∶1混合物中(v/v)洗涤，再溶解于50ml水中，用水透析2天(SnakeSkin透析管，阻断值为3.5kD，PerbioSciencesDeutschland GmbH，Bonn，D)，冻干。分离的产物的产率为79％。
B8 羟氨基HES50/0.7与EPO的偶联
向2.45ml步骤B6的氧化EPO在0.1M乙酸缓冲液，pH5.5中的溶液(1.633mg/ml)中加入2.45ml 333mg羟氨基HES 50/0.7(来自步骤B7)在相同缓冲液中的溶液，在22℃下轻轻振荡混合物23.5h。然后通过HPLC纯化反应混合物，并通过凝胶电泳分析。
B9.使用Vivaspin浓缩器更换缓冲液
HES-修饰的EPO和来自适当对照温育的EPO用5ml Vivaspin浓缩器(10,000Da MWCO)进行缓冲液更换，如上所述于6℃以4000rpm离心。样品(1-5mg EPO蛋白)浓缩为0.5-1.5ml，用磷酸盐缓冲液(PBS)pH7.1+/-0.2稀释为5ml，通过离心浓缩10倍。每个样品进行浓缩和稀释循环三次。最后，取出样品，用0.5ml PBS洗涤浓缩器单元两次。样品以大约1.2mg/ml的蛋白质浓度在液氮中冷冻。如欧洲药典(Erythropoietin Concentrated Solution， 4th Edition，2002， pages1123-1128)所述，使用7.43的比吸光度值，通过测定280nm的吸光度，确定在终EPO溶液中的蛋白质浓度。可替代地，蛋白质浓度也可以使用国际BRP批II参照EPO制品作为标准，通过RP-HPLC测定。
B10.使用重组多肽N-糖苷酶(Roche，Penzberg，Germany)释放N-连接的寡糖
向在50mM磷酸钠缓冲液pH7.2中的200-600μg份的天然、完全或部分脱唾液酸化或半乳糖氧化酶处理的EPO样品中加入25μl重组多肽N—糖苷酶(Roche，Penzberg，Germany；250单位/250μl)。反应混合物在37℃下温育12-24小时。有时在开始温育后12-14小时加入5-10μl多肽N-糖苷酶。
N-糖苷结合的寡糖的释放通过在还原条件下对5-10μg蛋白质的SDS-PAGE分析来证实，然后用考马斯蓝(Carl Roth GmbH，Karlsruhe，Germany)对蛋白带染色，检测EPO蛋白带向脱-N-糖基化EPO形式的迁移位置的具体位移。
B11.通过RP-HPLC将N-连接的寡糖和HES-修饰的聚糖与脱-N-糖基化EPO蛋白分离
所有脱-N-糖基化EPO样品与HES-修饰的和未修饰的EPO蛋白样品的分离使用Dionex GmbH的HPLC-系统(Idstein，Germany)在室温下进行，该系统包括P680 A HPG泵、Degasys DG1210除气系统、自动加样器(自动样品注射器ASI-100)、250μl的进样环路、columnthermostatter department TCC 100，以及UV/Vis-Detektor UVD170U。对于较高含量的蛋白质(>1mg)，使用AKTA explorer 10系统，其装备有泵P-903、具有0.6ml室的混合器M-925、监测器pH/C-900、泵P-950(加样泵)，以及软件Unicorn Version 3.21。使用具有10mm流动单元的监测器UV-900检测280、220和206nm的峰。
将0.1-0.6mg HES化EPO的PNGase消化物加到EC 250/4.6Nucleosil 120-5 C4 RP柱(Macherey-Nagel，Germany Cat.Nr.720096.46)上，该柱具有前置柱，例如CC 8/4 Nucleosil 120-5C4，Macherey-Nagel，Kat.Nr.721889.40。
该柱用2-4CV的5％洗脱液B(0.1％TFA，90％乙腈)平衡。然后注射250μl脱-N-糖基化EPO形式的样品，用8ml 5％洗脱液B冲洗进样环路。用0.2CV的5％洗脱液B洗柱后，在18分钟内施加5％到50％洗脱液B的线性梯度。柱洗脱后继续使用66％洗脱液B的梯度(20分钟)，之后在3分钟里应用100％的洗脱液B，用100％洗脱液B洗柱5分钟。每1分钟收集级分(1ml)。
从流过液中回收未修饰的寡糖，对于HES化的EPO，从以浓度大约25％的洗脱液B洗脱下来的级分中回收。含有HES化的N-聚糖。蛋白质在53％洗脱液B浓度时洗脱到4-6ml中。
将含有寡糖的级分中和，并用speed-vac浓缩器浓缩，或冻干。聚糖样品用HyperCarb柱(100或200 mg)如下脱盐：在使用前，用在0.1％(v/v)TFA中的500μl 80％(v/v)乙腈洗柱三次，然后用500μl水洗三次。在上柱之前用水将样品稀释至终体积至少为300μl。用水严格洗涤。用含有0.1％(v/v)TFA的1.2ml 25％乙腈洗脱下寡糖。洗脱的寡糖用2 M NH4OH中和，并在Speed Va浓缩器中干燥。于-80℃在水中贮存，直到进一步使用。
将HES-修饰的N-聚糖中和并在speed vac浓缩器中干燥，或者冻干，它们用VIVaspin浓缩单元脱盐(5,000kDa阻断值)，将材料溶解在200-500μl水中，贮存至进一步分析应用。
结果
1 对完全唾液酸化EPO样品酸处理以除去末端唾液酸残基
药品级EPO样品如实施例B1所述处理，在不同时间点终止反应。样品F48a-II(产生终产物F99)处理60分钟。样品F48a-III进行10分钟酸处理(G01)，样品F48a-IV处理4分钟(G02)，样品F48a-V处理0分钟(G03)，样品F48a-VI不进行酸处理，作为对照(G04)。在如实施例B2所述缓冲液更换后，酸处理的EPO样品份如B10所述分析，并与样品GT012a-I进行比较，后者是具有极低体内生物活性的重组EPO制品的低唾液酸化的副组分。如图2所示，酸处理导致分子量位移(比较泳道C和D，E和F)，表明酸处理有效地除去了末端唾液酸残基。
2 RP-HPLC分离释放的N—聚糖与脱-N-糖基化EPO多肽
上述等份如B9所述进行缓冲液更换，如B10所述进行PNGase处理。通过RP-HPLC将脱-N-糖基化EPO形式与释放的N-聚糖分离(如实施例B11所述)，得到的寡糖部分进一步分析。对PNGase-处理的EPO形式进行RP-HPLC后，将获得的寡糖部分脱盐，如实施例B11所述将对应于0，5-3nmole的部分进行HPAEC-PAD分析。未处理的EPO的N-聚糖作图产生寡糖谱，如图1中的图4所示。基于HPAEC-PAD中的峰响应，在非唾液酸化聚糖区(12.5-18min)检测到0.5％的寡糖峰面积，在单唾液酸化聚糖区(21-25min)检测到1.3％的寡糖峰面积，在二唾液酸化区(26-30.5min)为11.3％，在三唾液酸化区(33-38min)为28.1％，在四唾液酸化的聚糖区(39-45min)为58.7％。
在F98样品(图1中的1)中，产生的N-聚糖如下洗脱：1.5％在非唾液酸化区，18.8％在单唾液酸化区，4-1.2％在二唾液酸化区，32.2％在三唾液酸化区，只有6.4％在四唾液酸化区。
这些值非常类似于酸介导地清除唾液酸4分钟的样品(G02，图1中的3)。在F98样品中，产生的N—聚糖洗脱如下：2.8％在非唾液酸化区，17.5％在一唾液酸化区，34.9％在二唾液酸化区，31.6％在三唾液酸化区，13.1％在四唾液酸化区。
与之相比较，60分钟的酸介导的唾液酸清除几乎完全除去了末端唾液酸残基(图1中的2)。在F99样品中，产生的N-聚糖洗脱如下：93％在非唾液酸化区，4.8％在单唾液酸化区，2.3％在在二唾液酸化区。在三唾液酸化区和四唾液酸化区区中的信号可以忽略。
通过上述HPAEC-PAD分析获得的样品的唾液酸含量值与使用欧洲药典标准方法获得的值有一定的偏离。用该方法获得的值在下表中给出：
表：用于随后的半乳糖氧化酶和HES修饰的EPO制品的唾液酸测定
样品名称 无菌过滤后nMol唾液酸样品描述
的最终样品/nMol EPO
名称
GT012a-I-1.2 F98 6，0 未处理的
GT012
0412-22/F48a-II-1.2 F99 0.5 60分钟酸解
0412-22/F48a-III-1.2 G01 3.0 10分钟酸解
0412-22/F48a-IV-1.2 G02 7.2 4分钟酸解
0412-22/F48a-V-1.2 G03 12 0分钟酸解
0412-22/F48a-VI-1.2 G04 12 未处理
令人感兴趣的是，未处理的样品GTO012a-I甚至在没有预先酸处理的情况下仍显示高度的低唾液酸化糖蛋白形式(图4)。这意味着这种形式可能含有末端半乳糖残基代替末端唾液酸残基。
3 在HES化准备中半乳糖氧化酶处理EPO样品
通过对纯化的和无菌过滤的终EPO制品进行比较SDS-PAGE分析，分析HES化的半乳糖氧化的EPO部分(在步骤B10后)。
从图3可以看出，样品B、C、D和E被有效地HES化。它们在SDS-PAGE中只有略微不同的分子量分布，这是由于除共价HES修饰以外它们的唾液酸含量不同。在样品E中，可见一条对应于微量非修饰EPO的模糊带。完全唾液酸化的EPO形式G03和G04(泳道F和G)未被HES修饰。样品F98和G02具有一些完全(四唾液酸化)N-聚糖，推测这些EPO制品中的一小部分在一个(或两个)N-糖基化位点处缺乏HES修饰，导致与F99和G01相比HES修饰的形式具有较低的分子量。
4.修饰的EPO形式在N-聚糖处的HES化
在半乳糖氧化酶处理及随后的缓冲液更换(步骤B6)后，将获得的EPO部分与羟氨基HES50/0.7(步骤B8)偶联，经缓冲液更换(步骤B9)准备进一步分析。在图4中，证实在N-聚糖处发生了HES-修饰。通过多肽N-糖苷酶(PNGase)处理(参见实施例B10)对样品等份进行脱-N-糖基化。将在PNGase处理之前和之后的5-10μg样品等份进行SDS-PAGE分析。如图4所示，样品F98、F99、G01、G02、G03和G04在与PNGase温育后产生O-糖基化EPO形式。脱-N-糖基化的EPO形式的SDS-PAGE图的变化是由于F98、F99、G01-G04中O-聚糖部分的脱唾液酸化的程度不同。
结论是，用半乳糖氧化酶氧化的EPO可以成功地进行HES化，甚至对于预先未用酸处理除去末端唾液酸残基的样品F98也是如此。因此，发现该EPO样品一具有低于正常的唾液酸含量的EPO制品一含有明显含量的末端暴露的半乳糖残基，在用半乳糖氧化酶处理后产生游离醛基，可以与含有氨基的HAS偶联。体内数据得出了该偶联物的比活性值约为200000U/mg，甚至高于EPO的完全唾液酸化形式(120000-130000U/mg)。因此可以将EPO的″废物″部分转化为适合治疗应用的高活性蛋白质。
Claims (115)
1.一种制备包含糖蛋白和聚合物或所述聚合物的衍生物的偶联物的方法，其中该聚合物是羟烷基淀粉(HAS)，该方法包括以下步骤：
a)在能够催化在该糖蛋白和如下修饰的多元醇之间形成共价键的转移酶存在下，使所述糖蛋白与带有通过共价键与之连接的官能团Z的修饰的多元醇反应，产生与多元醇共价连接的糖蛋白，后者带有通过共价键与之连接的至少一个官能团Z，和
b)使聚合物或其衍生物的至少一个官能团A与在步骤a)中添加到所述糖蛋白上的糖蛋白的至少一个官能团Z反应，由此形成共价键，
所述步骤b)优选地如下进行：
使聚合物或其衍生物的至少一个官能团A与在步骤a)中添加到所述糖蛋白上的糖蛋白的至少一个官能团Z反应，由此形成共价键，其中Z选自氨基、硫醇基、醛基、半缩醛基、酮基、马来酰亚胺基和硫酯基，
-其中，若Z为醛基或酮基时，A包含与Z形成所述键的氨基，
-其中，若Z为氨基时，A选自反应性羧基和醛基、酮基或半缩醛基，
-其中，若Z为马来酰亚胺基时，A包含与Z形成所述键的硫醇基，
--其中，若A为醛基、酮基或半缩醛基时，该方法还包括通过以下方式向聚合物中引入A，以形成聚合物衍生物：
---使聚合物与一种至少双官能化合物反应，其中一个官能团可与聚合物反应，至少另一个官能团为醛基、酮基或半缩醛基，或者是经进一步化学修饰后产生醛基、酮基或半缩醛基的官能团，或
---氧化该聚合物，产生至少一个、特别是至少两个醛基，或
--其中，若A为反应性羧基时，该方法还包括通过以下方式向聚合物中引入A，以形成聚合物衍生物：
---选择性氧化聚合物的还原性末端，并活化所得的羧基，或
---使聚合物的未氧化的还原端与碳酸二酯反应，或
-其中，若Z为硫醇基时，A包含与Z形成所述键的
--马来酰亚胺基，或
--卤乙酰基。
2.如权利要求1所述的方法，其中在步骤a)中，至少50％、更优选至少75％的初始糖蛋白被转化为与多元醇共价连接的糖蛋白，该多元醇带有通过共价键与之连接的至少一个官能团Z。
3.如权利要求1所述的方法，其中在步骤a)中修饰的多元醇是修饰的糖核苷酸，特别是修饰的岩藻糖-、葡萄糖-、甘露糖-、N-乙酰葡糖胺-、N-乙酰半乳糖胺-、唾液酸核苷酸或半乳糖-核苷酸，特别是CMP-NeuAc、GDP-Man、UDP-GlcNAc、UDP-GalNAc、UDP-Glc、或GDP-Fuc。
4.如权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述官能团Z选自酰肼基、羟胺、硫醇基、醛基、半缩醛基、酮基、马来酰亚胺基和硫酯基。
5.权利要求4的方法，其中所述官能团Z与糖核苷酸的C-6羟基通过连接分子连接，该连接分子例如是任选取代的直链、支链和/或环状烃残基。
6.如上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述转移酶是EC 2.4.1类别的糖基转移酶，特别是其中该转移酶选自β1-4半乳糖基转移酶，β1-3半乳糖基转移酶、α1-3半乳糖基转移酶、GlcNAc-转移酶、甘露糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、岩藻糖基转移酶和唾液酸转移酶。
7.如上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述糖蛋白选自促红细胞生成素(EPO)、IFNβ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、ATIII、HCG、LH、FSH、抗体融合蛋白、治疗性抗体、白介素特别是白介素2或6、IFN-α、CSF、因子VII、因子VIII和因子IX。
8.如上述权利要求中任意一项所述的方法，其中在步骤b)中，在步骤a)后获得的修饰的糖蛋白有至少50％、更优选至少75％被转化为含有糖蛋白和聚合物或所述聚合物的衍生物的偶联物。
9.如上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述羟烷基淀粉是羟乙基淀粉。
10.如权利要求9所述的方法，其中羟乙基淀粉的分子量为2至200kD，优选4至130kD，更优选4至90kD。
11.如上述权利要求中任意一项所述的方法，该方法还包括在包含A的聚合物衍生物与包含Z的蛋白质反应之前使聚合物的未氧化的还原性末端与一种至少双官能连接化合物反应，该至少双官能连接化合物包含能够与聚合物的未氧化的还原性末端和基团A反应的官能团。
12.如上述权利要求中任意一项所述的方法，其中A是氨基氧基或酰肼基。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述至少双官能连接化合物是同型双官能化合物。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述同型双官能化合物包含两个氨基氧基。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述同型双官能化合物是O-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]羟胺。
16.如权利要求11-15中任意一项所述的方法，其中所述聚合物与至少双官能连接化合物的反应在水性介质中进行。
17.如权利要求14-16中任意一项所述的方法，其中所述聚合物与至少双官能连接化合物的反应产生肟键和/或氧基氨基键。
18.如上述权利要求中任意一项所述的方法，其中Z是氨基，所述蛋白质选自促红细胞生成素(EPO)、IFNβ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、AT III、HCG、LH、FSH、抗体融合蛋白、治疗性抗体、白介素特别是白介素2或6、IFN-α、CSF、因子VII、因子VIII和因子IX。
19.如权利要求18所述的方法，该方法还包括选择性氧化聚合物的还原性末端，并将氧化的聚合物在其氧化的还原性末端与N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯反应，产生包含反应性羧基A的聚合物衍生物。
20.如权利要求18所述的方法，该方法还包括将还原性末端未被氧化的聚合物的至少一个羟基与碳酸二酯反应，产生反应性羧基A。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述碳酸二酯是对称二酯。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述酯的醇部分选自N-羟基琥珀酰亚胺、磺酸化的N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基苯并三唑、和硝基-和卤素取代的苯酚。
23.如权利要求22所述的方法，其中卤素取代的苯酚选自硝基酚、二硝基酚、三氯苯酚、三氟苯酚、五氯苯酚和五氟苯酚。
24.如权利要求20-23中任意一项所述的方法，其中还原性末端未被氧化的聚合物的至少一个羟基与碳酸二酯反应形成反应性酯基A的反应在无水非质子极性溶剂中进行。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述溶剂为二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺或其混合物。
26.如权利要求18所述的方法，其中A是醛基、酮基或半缩醛基，该方法还包括使聚合物与至少双官能化合物的官能团M反应，生成聚合物衍生物，该至少双官能化合物还包含至少一个另外的官能团Q，该官能团Q是醛基、酮基或半缩醛基A。
27.如权利要求26所述的方法，其中M包含氨基。
28.如权利要求26所述的方法，其中A为醛基、酮基或半缩醛基，该方法还包括使聚合物与至少双官能化合物的官能团M反应，生成聚合物衍生物，该至少双官能化合物还包含至少一个另外的官能团Q，该官能团Q不是醛基、酮基或半缩醛基，该方法还包括使官能团Q与至少一种适当的化合物反应，生成含有醛基、酮基或半缩醛基A的聚合物衍生物。
29.如权利要求27所述的方法，其中M和Q含有氨基。
30.如权利要求28或29所述的方法，其中所述至少一种适当的化合物含有羧基，以及醛基、酮基或半缩醛基。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述至少一种适当的化合物为甲酰苯甲酸或4-(4-甲酰-3，5-二甲氧苯氧基)丁酸。
32.如权利要求28或29所述的方法，其中M含有氨基并且Q含有β-羟氨基。
33.如权利要求32所述的方法，其中聚合物在其氧化的还原性末端与至少双官能化合物的官能团M反应。
34.如权利要求32所述的方法，该方法还包括氧化β羟氨基以形成醛基。
35.如权利要求34所述的方法，其中通过使用高碘酸盐实现所述氧化反应。
36.如权利要求18所述的方法，其中使用高碘酸盐使聚合物进行开环氧化反应，以获得含有至少一个、特别是至少两个醛基A的聚合物衍生物。
37.如权利要求26至36中任意一项所述的方法，其中聚合物或聚合物衍生物与蛋白质的反应为还原胺化。
38.如权利要求37所述的方法，其中在NaCNBH3的存在下进行还原胺化。
39.如权利要求37或38所述的方法，其中在pH7或更低的pH下进行还原胺化。
40.如权利要求39所述的方法，其中pH为6或更低。
41.如权利要求37至40中任意一项所述的方法，其中还原胺化在0至25℃的温度下进行。
42.如权利要求37至41中任意一项所述的方法，其中在水性介质中进行还原胺化。
43.如权利要求1至11中任意一项所述的方法，其中Z为硫醇基。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述蛋白质选自促红细胞生成素(EPO)、IFNβ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、ATIII、HCG、LH、FSH、抗体融合蛋白、治疗性抗体、白介素特别是白介素2或6、IFN-α、CSF、因子VII、因子VIII和因子IX。
45.如权利要求42或43所述的方法，其中A含有卤代乙酰基，该方法进一步包括，使聚合物的任选氧化的还原性末端与含有至少两个均含氨基的官能团的至少双官能化合物反应，生成含有至少一个含氨基的官能团的聚合物衍生物，该方法进一步包括使聚合物衍生物与单卤素取代的乙酸和/或反应活性单卤素取代的乙酸衍生物反应。
46.如权利要求43所述的方法，其中所述卤素为Br或I。
47.如权利要求43-45中任意一项所述的方法，其中所述至少双官能化合物为含有2至10个碳原子的二氨基烷烃。
48.如权利要求43-45中任意一项所述的方法，其中所述至少双官能化合物为含有1至5个亚烷基单元的二氨基聚乙二醇。
49.如权利要求43或48中任意一项所述的方法，其中所述聚合物在其氧化的还原性末端与至少双官能化合物进行反应。
50.如权利要求43至48中任意一项所述的方法，其中所述含有卤乙酰基的聚合物衍生物与糖蛋白的反应在含有二甲基甲酰胺和水的混合物的溶剂存在下进行。
51.如权利要求43或44所述的方法，其中A含有马来酰亚胺基，该方法进一步包括使聚合物的任选氧化的还原性末端同含有能够与该任选氧化的还原性末端反应的官能团U的至少双官能化合物反应，所述至少双官能化合物进一步含有能够被化学修饰形成马来酰亚胺基的官能团W，该方法进一步包括化学修饰W以形成马来酰亚胺基。
52.如权利要求51所述的方法，其中U含有氨基。
53.如权利要求51或52所述的方法，其中W含有氨基。
54.如权利要求50至53任意一项所述的方法，其中含有W的聚合物衍生物同至少双官能化合物反应，其中至少双官能化合物含有能够与W反应的官能团，并且还含有马来酰亚胺基。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述至少双官能化合物为N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)琥珀酰亚胺酯。
56.一种包含可通过如权利要求1-55中任意一项所述的方法获得的偶联物的组合物，其中例如通过对糖蛋白的内切蛋白酶解消化物进行LC-ESI-MS分析显示，至少80％的包含至少一个游离天冬酰胺和/或谷氨酰胺侧链的糖蛋白在所有天冬酰胺和谷氨酰胺侧链中保留完整的酰胺基。
57.如权利要求56所述的组合物，其中A是反应性羧基，其中通过聚合物的至少一个羟基与碳酸二酯反应将A引入其还原性末端未被氧化的聚合物中，其中，所述偶联物包含一个聚合物分子和至少一个、特别是1-10个通过酰胺键与该聚合物连接的糖蛋白分子。
58.如权利要求57所述的组合物，其中所述蛋白质选自促红细胞生成素(EPO)、IFNβ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、ATIII、HCG、LH、FSH、抗体融合蛋白、治疗性抗体、白介素特别是白介素2或6、IFN-α、CSF、因子VII、因子VIII和因子IX。
59.用于治疗人或动物体的方法中的如权利要求56-58中任意一项所述的组合物。
60.一种药物组合物，其含有治疗有效量的可通过权利要求1至55任意一项所述的方法获得的偶联物，或如权利要求56-58中任意一项所述的组合物，特别是其中偶联物以大于1nM的浓度存在。
61.权利要求60所述的药物组合物，其进一步含有至少一种药学上可接受的稀释剂、辅料或载体，特别是其中所述偶联物构成了该药物组合物中总蛋白质的至少5％，更优选至少25％，甚至更优选超过50％。
62.如权利要求112所述的HAS-蛋白质偶联物、优选HES-蛋白质偶联物、或如权利要求56-58或113中任意一项所述的组合物-其中所述蛋白质为IFNα-在制备用于治疗下述疾病的药物中的用途：白血病，例如毛细胞白血病、慢性粒细胞性白血病、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤，癌症，例如类癌瘤、恶性黑素瘤，和肝炎，例如慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎。
63.如权利要求112所述的HAS-蛋白质偶联物、优选HES-蛋白质偶联物、或如权利要求56-58或113中任意一项所述的组合物在制备治疗多发性硬化症、优选复发型多发性硬化症的药物中的用途，其中所述蛋白质为IFNβ。
64.如权利要求112所述的HAS-蛋白质偶联物、优选HES-蛋白质偶联物、或如权利要求56-58或113中任意一项所述的组合物在制备用于以下状况的药物中的用途：骨髓移植或患有急性骨髓性白血病老年人诱导性化学疗法之后的骨髓恢复、骨髓移植植入失败或延迟、动员以及在移植自体外周血祖细胞之后的骨髓恢复，其中所述蛋白质为GM-CSF。
65.如权利要求112所述的HAS-蛋白质偶联物、优选HES-蛋白质偶联物、或如权利要求56-58或113中任意一项所述的组合物在制备治疗重度型脓毒症、血栓症、血栓栓塞或闭塞性疾病、特别是闭塞性动脉疾病的药物中的用途，其中所述蛋白质为APC。
66.如权利要求112所述的HAS-蛋白质偶联物、优选HES-蛋白质偶联物、或如权利要求56-58或113中任意一项所述的组合物在制备治疗心肌梗塞(心脏病发作)、血栓症、血栓栓塞或闭塞性疾病、特别是闭塞性动脉疾病的药物中的用途，其中所述蛋白质为tPA。
67.如权利要求112所述的HAS-蛋白质偶联物、优选HES-蛋白质偶联物、或如权利要求56-58或113中任意一项所述的组合物在制备治疗肺气肿、囊性纤维化、特应性皮炎和/或支气管炎的药物中的用途，其中所述蛋白质为A1AT。
68.如权利要求112所述的HAS-蛋白质偶联物、优选HES-蛋白质偶联物、或如权利要求56-58或113中任意一项所述的组合物在制备用于治疗遗传缺陷、静脉闭塞性疾病、烧伤和在冠状动脉旁路移植(CABG)手术中的肝素抗性、预防供氧治疗中形成微血凝块、治疗创伤或胃肠手术引起的内脏穿孔、弥散性血管内凝血(DIC)和/或脓毒症的药物中的用途，其中所述蛋白质为ATIII。
69.如权利要求112所述的HAS-蛋白质偶联物、优选HES-蛋白质偶联物、或如权利要求56-58或113中任意一项所述的组合物在制备与因子VIII和因子IX抑制剂一起治疗A或B型血友病患者发病的药物中的用途，其中所述蛋白质为因子VII。
70.如权利要求112所述的HAS-蛋白质偶联物、优选HES-蛋白质偶联物、或如权利要求56-58或113中任意一项所述的组合物在制备治疗A型血友病的药物中的用途，其中所述蛋白质为因子VIII。
71.如权利要求112所述的HAS-蛋白质偶联物、优选HES-蛋白质偶联物、或如权利要求56-58或113中任意一项所述的组合物在制备用于控制和预防B型血友病患者、优选先天性因子IX缺乏或克里斯马斯病患者的出血发作、包括控制和预防手术过程中出血的药物中的用途，其中所述蛋白质为因子IX。
72.如权利要求112所述的HAS-蛋白质偶联物、优选HES-蛋白质偶联物、或如权利要求56-58或113中任意一项所述的组合物在制备治疗贫血性疾病或造血功能障碍疾病或相关疾病的药物中的用途，其中所述蛋白质为EPO。
73.转移酶在制备包含糖蛋白和聚合物或其衍生物的偶联物中的用途，其中该聚合物是羟烷基淀粉(HAS)，其中该糖蛋白的基本上所有天冬酰胺和谷氨酰胺侧链保留完整的酰胺基团。
74.转移酶在制备包含糖蛋白和聚合物或其衍生物的偶联物中的用途，其中该聚合物是羟烷基淀粉(HAS)，其中该偶联物的甲硫氨酸侧链基本上都不是氧化形式。
75.一种羟烷基淀粉(HAS)-糖蛋白(GPO)偶联物(HAS-GPO)，其包含一个或多个HAS分子，其中每个HAS与GPO通过糖蛋白的N-或O-聚糖的半乳糖部分偶联，特别是其中所述N-或O-聚糖还包含至少一个不是唾液酸残基的末端糖部分。
76.权利要求75的HAS-GPO，其中GPO选自促红细胞生成素(EPO)、IFNβ、GM-CSF、APC、tPA、A1AT、ATIII、HCG、LH、FSH、抗体融合蛋白、治疗性抗体、白介素特别是白介素2或6、IFN-α、CSF、因子VII、因子VIII和因子IX，最优选地其中EPO具有人EPO的氨基酸序列。
77.权利要求75或76的HAS-GPO，其中GPO的基本上所有天冬酰胺和谷氨酰胺侧链保留完整的酰胺基团。
78.权利要求75-77中任意一项的HAS-GPO，其中GPO的甲硫氨酸侧链基本上都不是氧化形式。
79.权利要求75-78中任意一项的HAS-GPO，其中GPO包含至少一个N-聚糖或O-聚糖，该N-聚糖或O-聚糖含有至少一个末端半乳糖部分。
80.权利要求79的HAS-GPO，其中GPO是EPO，包含两个或三个N-聚糖，每一个N-聚糖包含至少两个末端半乳糖部分。
81.权利要求75-80中任意一项的HAS-GPO，其中GPO来源于哺乳动物、昆虫、酵母细胞或基因工程细胞，特别是来源于人细胞。
82.权利要求75-81中任意一项的HAS-GPO，其中HAS与GPO通过连接分子偶联。
83.权利要求75-82中任意一项的HAS-GPO，每个EPO分子包含1-12个，优选1-6或1-3个，最优选1-4个HAS分子。
84.权利要求75-83中任意一项的HAS-GPO，其中HAS选自羟乙基淀粉、羟丙基淀粉和羟丁基淀粉。
85.权利要求84的HAS-GPO，其中HAS是羟乙基淀粉(HES)。
86.权利要求85的HAS-EPO，其中HES的分子量为1-300kDa，优选5-100kDa。
87.权利要求85或86的HAS-EPO，其中HES显示摩尔取代程度为0.1-0.8，对于羟乙基，C2∶C6-取代比为2-20。
88.一种制备根据权利要求75-87中任意一项的羟烷基淀粉(HAS)-糖蛋白(GPO)偶联物(HAS-GPO)的方法，包括以下步骤：
a)提供包含至少两个为半乳糖残基的末端糖部分的GPO，
b)通过半乳糖氧化酶的作用氧化所述末端半乳糖，形成包含反应性醛基的末端半乳糖残基，
c)提供能够与步骤b)的GPO反应的修饰的HAS，和
d)使步骤b)的GPO与步骤c)的HAS反应，由此产生包含一个或多个HAS分子的HAS-GPO，其中每个HAS与GPO通过糖蛋白的N-聚糖或O-聚糖的半乳糖部分偶联，其中所述N-聚糖或O-聚糖还包含至少一个不是唾液酸残基的末端糖部分。
89.权利要求88的方法，其中GPO是EPO，特别是其中EPO具有人EPO的氨基酸序列。
90.权利要求88的方法，其中在权利要求13的方法之前和期间，GPO总是保持在pH3.0-9.0，由此产生HAS-GPO，其中GPO的基本上所有天冬酰胺和谷氨酰胺侧链保留完整的酰胺基团。
91.权利要求88-90中任意一项的方法，其中GPO来源于哺乳动物、昆虫、酵母细胞或基因工程细胞，特别是来源于人细胞。
92.权利要求90的方法，其中在部分或完全酶促除去末端唾液酸后氧化末端半乳糖单元。
93.权利要求91或92的方法，其中在步骤d)中，修饰的HAS与氧化的末端糖单元偶联。
94.权利要求88-93中任意一项的方法，其中修饰权利要求13的步骤c)的HAS，使其包含游离酰肼、羟胺或氨基脲官能团。
95.权利要求88-94中任意一项的方法，其中步骤d)在含水至少10％(重量)的反应介质中进行。
96.权利要求88-95中任意一项的方法，其中HAS通过连接分子与GPO、特别是与EPO偶联。
97.权利要求88-96中任意一项的方法，其中HAS是羟乙基淀粉、羟丙基淀粉或羟丁基淀粉，优选羟乙基淀粉(HES)。
98.权利要求97的方法，其中HES具有如权利要求86或87所述的性质。
99.可通过权利要求88-98中任意一项的方法获得的HAS-GPO。
100.权利要求99的HAS-GPO，特别是HAS-EPO，其具有如权利要求75-87任意一项所述的特征。
101.用于治疗人或动物体的方法的根据权利要求75-87、99或100中任意一项的HAS-GPO，特别是HAS-EPO。
102.一种药物组合物，其包含根据权利要求75-87、99或100中任意一项的HAS-GPO，特别是HAS-EPO，特别是其中HAS-GPO以高于1nM的浓度存在。
103.权利要求102的药物组合物，其还含有至少一种药学上可接受的载体，特别是其中HAS-GPO构成了该药物组合物中总蛋白质的至少5％，更优选至少25％，甚至更优选超过50％。
104.根据权利要求75-87、99或100中任意一项的HAS-EPO在制备治疗贫血性疾病或造血功能障碍疾病的药物中的用途。
105.具有低于40000U/mg蛋白质的体内生物活性的EPO作为初始材料在制备生物活性大于200000U/mg蛋白质的EPO的方法中的应用。
106.包含至少两个为半乳糖残基的末端糖部分的GPO作为初始材料在制备适用于药物组合物中的修饰GPO的方法中的应用。
107.与完全唾液酸化形式相比体内生物活性≥70％的GPO作为初始材料在制备适用于药物组合物中的修饰GPO的方法中的应用。
108.权利要求105-107中任意一项的应用，其中修饰的GPO是HAS-GPO，特别是HES-GPO，更特别地是HES-EPO。
109.一种制备适用于制备药物组合物的修饰GPO的方法，包括以下步骤：
a)提供蛋白质组合物，其中含有至少两个为半乳糖残基的末端糖部分的GPO部分占总蛋白质的至少10％，
b)通过半乳糖氧化酶的作用氧化末端半乳糖残基，形成包含反应性醛基的末端半乳糖残基，
c)提供能够与步骤b)的GPO反应的修饰的HAS，和
d)使步骤b)的GPO与步骤c)的HAS反应，由此产生适合在药物组合物中使用的HAS-GPO。
110.权利要求109的方法，其中修饰的GPO是HAS-GPO，特别是HES-GPO，更特别地是HES-EPO。
111.权利要求110的方法，其中EPO具有人EPO的氨基酸序列。
112.一种可通过权利要求1-55中任意一项的方法获得的偶联物。
113.一种组合物，其含有根据权利要求112的偶联物。
114.用于治疗人或动物体的方法的根据权利要求113的组合物。
115.用于治疗人或动物体的方法的根据权利要求112的偶联物。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080305 |