BR112015015182B1

BR112015015182B1 - Variante polipeptídica isolada do fator vii, seu método de preparação e seu uso, e composições farmacêuticas e seus usos

Info

Publication number: BR112015015182B1
Application number: BR112015015182-5A
Authority: BR
Inventors: Maxine Bauzon; Terry Hermiston
Original assignee: Coagulant Therapeutics Corporation
Priority date: 2012-12-24
Filing date: 2013-12-23
Publication date: 2023-12-26
Also published as: TW202026309A; NZ749488A; DK2938351T3; US20230295596A1; EP2938351B8; SG10201710593UA; BR112015015182A2; KR102047235B1; CA3185756A1; ES2746116T3; TW201431876A; EP2938351A4; PE20151206A1; ES2936485T3; PL3572090T3; JP6363677B2; US20140363419A1; US20160376578A1; MX2015007712A; ES2747726T3

Abstract

polipeptídeos do fator vii de ação curta. são divulgados peptídeos do fator vii de ação curta. é desejável uma semi-vida reduzida para tratamento de hemorragia aguda e distúrbios semelhantes. a modificação da sialilação e/ou glicosilação do fator vii e variantes do mesmo produziram peptídeos úteis no tratamento de condições patológicas de hemorragia aguda.

Description

[001] Referência cruzada com pedidos de patente relacionados

[002] Este pedido de patente reivindica prioridade do Pedido de Patente N°de Série US 61/745,674, depositado em 24 de Dezembro de 2012, e Pedido de Patente N° de SérieUS 61/787,026, depositado em 15 de Março de 2013, e que são aqui incorporados na íntegra a título de referência.

ÂMBITO DA DIVULGAÇÃO

[003] São apresentadas as variantes do Fator VII de coagulação humana e os polinucleótidos que codificam essas variantes, vetores e células hospedeiras e que expressam essas variantes, métodos para obter tais variantes, métodos de utilização de tais variantes, composições das variantes e características da invenção adicionais relacionadas com as mesmas.

ANTECEDENTES

[004] A coagulação do sangue é um processo que consiste de uma interação complexa de vários componentes (ou Fatores) sanguíneos que resultam eventualmente em um coágulo de fibrina. Normalmente, os componentes sanguíneos, que participam no que foi referido como "cascata" da coagulação, são proteínas enzimaticamente inativas (proenzimas ou zimógenos) que são convertidas em enzimas proteolíticas pela ação de um ativador (o qual é ele próprio um Fator de coagulação ativado). Os Fatores de coagulação que foram submetidos a tal conversão são normalmente referidos como "Fatores ativos" e são designados pela adição da letra "a" ao nome do Fator coagulante (por ex. Fator VIIa).

[005] A iniciação do processo hemostático é mediada pela formação de um complexo entre o Fator Tecidual, o qual é exposto à circulação sanguínea a seguir a lesão na parede do vaso, e o Fator VIIa o qual se encontra presente na circulação em uma quantidade correspondente a cerca de 1% da massa total da proteína do Fator VII. Este complexo é ancorado à célula que suporta o Fator tecidual e converte os Fatores IX e X nas suas formas ativas de Fator IXa e Fator Xa na superfície da célula. Fator Xa converte a protrombina para trombina na célula que suporta o Fator tecidual, o qual activa o Fator VIII, Fator V, Fator XI e Fator XIII. Para além disso, a quantidade limitada de trombina formada nesta fase inicial de hemóstase activa igualmente as plaquetas. No seguimento da ação da trombina nas plaquetas, as plaquetas mudam de forma e expõem fosfolípidos carregados na sua superfície. Esta superfície de plaquetas ativada forma o modelo para adicional ativação do Fator X e a geração total da trombina. A ativação adicional do Fator X na superfície da plaqueta ativada ocorre por meio de um complexo de Fator IXa e Fator VIIIa formado na superfície da plaqueta ativada e o Fator Xa converte depois a protrombina em trombina enquanto ainda na superfície. A trombina converte depois o fibrogénio em fibrina, o qual é insolúvel e que estabiliza o tampão inicial da plaqueta. Este processo é localizado no local de exposição do Fator tecidual, minimizando assim o risco de uma ativação sistêmica do sistema de coagulação. Em anos recentes, foi constatado que o Fator VII e Fator tecidual eram os iniciadores principais da coagulação sanguínea.

[006] O Fator VIIa é produzido a partir do seu percursor, Fator VII, o qual é sintetizado no fígado e segregado para o sangue onde circula como uma glicoproteína de cadeia simples (peso molecular de aproximadamente 50,000 Da). Fator VII do tipo selvagem, tal como presentemente utilizado, possui a sequência de aminoácidos e a sequência de nucleótidos divulgada nas Figuras 1 e 2. Pretende-se que o termo "Fator VII" inclua polipeptídeos do Fator VII na sua forma não clivada (a forma de zimogénio) assim como aqueles que foram processados proteoliticamente, ou de outra forma, para obter as suas respectivas formas bioativas, que podem ser referidas como Fator VIIa. Fator VII do tipo selvagem é tipicamente clivado entre resíduos 152 e 153 para produzir Fator VIIa.

[007] Fator VII é convertido in vitro no Fator VIIa de forma de cadeia dupla pelo Fator Xa, Fator XIIa, Fator IXa ou trombina. Tal como outras proteínas do plasma envolvidas na hemóstase, o Fator VII está dependente da vitamina K para a sua atividade, a qual é necessária para a gama-carboxilação de resíduos múltiplos de ácido glutâmico que estão agrupados na proximidade dos terminais amino da proteína. Estes ácidos glutâmicos gama-carboxilados são necessários para a interação induzida por ião metálico do Fator VII com fosfolípidos. Na presença de Fator tecidual, fosfolípidos e ions de cálcio, o Fator VIIa de cadeia dupla activa rapidamente o Fator X ou Fator IX por proteólise limitada. O Fator VIIa é susceptível de clivagem proteolítica, dando lugar a um número de produtos de degradação que não possuem atividade coagulante.

[008] Foram publicadas variantes do Fator VII com sequências de aminoácidos derivadas de Fator VII do tipo selvagem por substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais aminoácidos. Por exemplo, Dickinson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci USA (1996) 93, 14379-14384) se refere a variantes do Fator VII, em que Lys157, Val158, Glu296, Met298, Asp334, Ser336, ou Lys227 foram individualmente substituídos por Ala. Iwanaga et al. (Thromb. Haemost. (suplemento de Agosto 1999), 466, resumo 1474) se refere a variantes do Fator VIIa em que os resíduos 316-320 são eliminados ou os resíduos 311-322 são substituídos com os resíduos de tripsina correspondentes. patente norte-americana App. Pub. 2008/0058255 A1 to Bolt et al. se refere a variantes do Fator VII com uma substituição que interrompe a glicosilação em N145 ou N322, ou em ambos N145 eN322. Toso et al. reportaram uma série de estudos da função estrutura do Fator VII com base em mutações de ocorrência natural. As proteínas do Fator VII mutantes recombinantes incluíam T324M, E385K e duas proteínas do Fator VII mutantes com falta de sequências nucleares de glicosilação na cadeia pesada de Fator VII (N322Q) ou na cadeia leve do Fator VII (N145Q). Toso et al., "Lack of Heavy Chain Glycosylation in Patient with Fator VII Deficiency Not Responsible for Mutant FVIIa Activity," Blood, vol. 96, no. 11, parte 2 (16 Nov 2000), p. 79b (42nd Annual Meeting of the American Society of Hematology - 42° Encontro Anual da Sociedade Americana de Hematologia).

[009] A maioria dos peptídeos e proteínas que ocorrem naturalmente contém frações de carboidratos anexadas ao peptídeo ou proteína por meio de ligações específicas a um número selecionado de aminoácidos ao longo do troço do peptídeo primário ou cadeia de proteínas. Assim, muitos peptídeos e proteínas que ocorrem naturalmente são denominados "glicopeptídeos" ou "glicoproteínas", respectivamente. A variabilidade do modelo de glicosilação em qualquer peptídeo ou proteína pode ter impacto na função desse peptídeo ou proteína. Por exemplo, a estrutura de glicanos com ligação N em um peptídeo ou proteína pode ter impacto em várias características do peptídeo ou proteína, incluindo a susceptibilidade da protease, tráfico intracelular, alvo tecidual, meia-vida biológica e antigenicidade do peptídeo ou proteína em uma célula ou organismo. A alteração de uma ou mais destas características pode afetar a eficácia de um peptídeo ou proteína na sua configuração natural e pode igualmente afetar a eficácia do peptídeo ou proteína como um agente terapêutico em situações em que o peptídeo ou proteína tenham sido gerados para esse fim.

[010] A estrutura de carboidratos anexada ao peptídeo ou cadeia da proteína é conhecida como uma molécula "glicano". A estrutura de glicanos específica presente em um peptídeo ou proteína afecta as características de solubilidade e de agregação do peptídeo ou proteína, a dobragem do peptídeo primário ou cadeia proteica e, por conseguinte, a sua atividade funcional ou enzimática, a resistência do peptídeo ou proteína para ataque proteolítico e o controle de proteólise que origina a conversão de formas inativas do peptídeo ou proteína em formas ativas. Por exemplo, resíduos de ácido siálico terminal presentes na molécula glicana afectam a duração da meia-vida do peptídeo ou proteína no sistema circulatório dos mamíferos. Peptídeos e proteínas cujos glicanos não contêm resíduos de ácido siálico terminal são normalmente mais rapidamente removidos da circulação pelo fígado.

[011] As estruturas de glicanos encontradas em glicopeptídeos e glicoproteínas que ocorrem naturalmente são tipicamente divididas em duas classes; glicanos com ligação N e de ligação a O. Fator VIIa de tipo selvagem contém dois locais de glicosilação com ligação N e dois com ligação O. A glicosilação com ligação N é a modificação covalente mais comum em eucariotas. A glicosilação com ligação N ocorre na sequência de consenso Asn-X-Ser/Thr, em que o glicano se liga ao grupo amina de asparagina e X representa qualquer aminoácido, com excepção de prolina. Glicanos com ligação N são baseados em um núcleo pentassacárido comum, Man3(GlcNAc)2, que pode ser ainda modificado pela adição de monossacarídeos, tais como N- acetilgalactosamina, galactose, ácido neuramínico, N- acetilglucosamina, fructose, manose e fucose. O núcleo Man3(GlcNAc)2 com vários monossacarídeos incluindo ácidos siálicos terminais podem ser anexados por meio de uma N-acetilglucosamina ao Asn na sequência de consenso Asn-X-Ser/Thr. Esta modificação co- translacional quimicamente complexa serve muitos fins e afecta a biologia da proteína em diversas formas, incluindo dobragem adequada, orientação funcional do grupo e taxas de eliminação.

[012] Foi proposta uma variedade de métodos na técnica para adaptar o modelo de glicosilação de um peptídeo ou proteína, incluindo aquelas descritas na patente norte-americana No. 8,008,252 de DeFrees et al.

[013] É frequentemente desejável estimular ou melhorar a cascata de coagulação em um indivíduo. Foi utilizado o Fator VIIa para controlar perturbações hemorrágicas causadas por deficiências do Fator de coagulação (por ex, hemofilia A e B ou deficiência dos Fatores de coagulação XI ou VII) ou inibidores do Fator de coagulação. Fator VIIa recombinante, produzido e vendido pela Novo Nordisk sob o nome comercial NovoSeven®, é aprovado para o tratamento de episódios hemorrágicos em doentes com hemofilia A ou B com inibidores para o Fator VIII ou Fator IX e em doentes com hemofilia adquirida; prevenção de hemorragia em intervenções cirúrgicas ou procedimentos invasivos em doentes com hemofilia A ou B com inibidores para o Fator VIII ou Fator IX e em doentes com hemofilia adquirida; tratamento de episódios hemorrágicos em doentes com deficiência congénita do Fator VII e prevenção de hemorragias em intervenções cirúrgicas ou procedimentos invasivos em doentes com deficiência congénita do Fator VII. A patente norte-americana No. 5,180,583 para Hedner divulga a utilização do Fator VIIa para controlar hemorragias excessivas em situações não causadas por defeitos do Fator coagulante ou inibidores do Fator coagulante. Hedner divulga o tratamento de perturbações hemorrágicas causadas, por exemplo, por uma função de plaqueta defeituosa, trombocitopenia ou doença de von Willebrand e composições para essas utilizações.

[014] Existe uma necessidade de tratar hemorragias de distúrbios não causados por deficiências congénitas ou de desenvolvimento do Fator de coagulação ou inibidores para Fatores de coagulação. Vários ensaios clínicos demonstraram a eficácia do Fator VIIa recombinante para controlar hemorragias. No entanto, existem preocupações relativamente a um aumento em eventos tromboembólicos indesejáveis a partir da utilização desta molécula. A hemorragia é um problema grave em muitos distúrbios, tal como em ligação com cirurgia, complicações pós cirurgia, transplante de células e órgãos, hemorragia intracraniana, aneurisma da aorta e trauma ou sobredosagem de determinados anti- coagulantes.

BREVE RESUMO

[015] É um objecto tratar distúrbios e episódios hemorrágicos com polipeptídeos de Fator VII que tenham curta duração. Um objecto do presente trabalho é facultar composições de polipeptídeos do Fator VII (tipo selvagem ou variante) que tenham actuação curta, caracterizados por uma ou mais propriedades farmacocinéticas, tais como, uma meia- vida reduzida. É objecto facultar uma molécula do Fator VII com oportunidade reduzida para eventos trombóticos fora do local alvo e o tratamento atempado. É objecto facultar polipeptídeos do Fator VII (tipo selvagem ou variante) com eliminação intensificada devido a modelos de glicosilação alterados.

[016] É presentemente descrita uma composição de variante polipeptídica do Fator VII, em que a variante polipeptídica do Fator VII inclui uma sequência de aminoácidos com, pelo menos, duas alterações de sequência relativamente à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, em que, pelo menos, as duas alterações de sequência são (1) um resíduo de glutamina substituído pelo resíduo de prolina na posição 10, e (2) um resíduo de ácido glutâmico substituído pelo resíduo de lisina na posição 32; e em que a proporção de mols de ácido siálico conjugado para mols de glicano com ligação N, na composição, seja inferior a 0,05, inferior e 0,1, inferior a 1,0, inferior a 2,0, inferior a 3,0, inferior a 4,0, inferior a 5,0 ou inferior a 6,0. É também presentemente descrita uma composição de variante polipeptídica do Fator VII, em que a variante polipeptídica do Fator VII inclui uma sequência de aminoácidos com, pelo menos, duas alterações de sequência relativamente à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, em que, pelo menos, as duas alterações de sequência são (1) um resíduo de glutamina substituído pelo resíduo de prolina na posição 10, e (2) um resíduo de ácido glutâmico substituído pelo resíduo de lisina na posição 32; e em que a proporção de mols de ácido siálico conjugado por mol de glicano com ligação N se encontra em uma ordem selecionada do grupo que consiste de (1) de 0 para 5;(2) de 0 para 4; (3) de 0 para 3; (4) de 0 para 2; (5) de 0 para 1 e (6) de 0 para 0,5.

[017] É também presentemente descrita uma variante polipeptídica do Fator VII que inclui uma sequência de aminoácidos com, pelo menos, duas alterações de sequência relativamente à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, em que, pelo menos, as duas alterações de sequência são (1) um resíduo de glutamina substituído pelo resíduo de prolina na posição 10, e (2) um resíduo de ácido glutâmico substituído pelo resíduo de lisina na posição 32; em que o polipeptídeo tem uma proporção de mols de ácido siálico conjugado para mols de glicano com ligação N inferior a 0,05, inferior e 0,1, inferior a 1,0, inferior a 2,0, inferior a 3,0, inferior a 4,0, inferior a 5,0 ou inferior a 6,0. Também presentemente descrita é uma composição de polipeptídeos do Fator VII, em que os polipeptídeos do Fator VII incluem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 (Fator VII do tipo selvagem) e a proporção de mols de ácido siálico conjugado para mols de glicano com ligação N na composição encontra-se na ordem selecionada do grupo que consiste de (1) de 1 para 5;(2) de 1 para 4; (3) de 1 para 3; (4) de 1 para 2; e (5) de 0.5 para 1; ou ácido siálico conjugado não é detectável.

[018] Também presentemente descrita é uma variante polipeptídica do Fator VII isolada selecionada do grupo que consiste de:

[019] um polipeptídeo que inclui uma sequência de aminoácidos do Fator VII com alterações de sequência relativamente à sequência SEQ ID NO: 16, em que as alterações da sequência consistem de (1) um resíduo de glutamina substituído por um resíduo de prolina na posição 10, (2) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de lisina na posição 32, e (3) uma alteração de sequência de forma a que a glicosilação com ligação N na posição 145 é interrompida.

[020] um polipeptídeo que inclui uma sequência de aminoácidos do Fator VII com alterações de sequência relativamente à sequência SEQ ID NO: 16, em que as alterações da sequência consistem de (1) um resíduo de glutamina substituído por um resíduo de prolina na posição 10, (2) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de lisina na posição 32, e (3) uma alteração de sequência de forma a que a glicosilação com ligação N na posição 322 é interrompida.

[021] um polipeptídeo que inclui uma sequência de aminoácidos do Fator VII com alterações de sequência relativamente à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, em que as alterações da sequência consistem de (1) um resíduo de glutamina substituído por um resíduo de prolina na posição 10, (2) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de lisina na posição 32, e (3) alterações de sequência de forma a que a glicosilação com ligação N nas posições 145 e 322 é interrompida.

[022] um polipeptídeo que inclui uma sequência de aminoácidos do Fator VII com alterações de sequência relativamente à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, em que as alterações da sequência consistem de (1) um resíduo de glutamina substituído por um resíduo de prolina na posição 10, (2) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de lisina na posição 32, em que as posições 145 e 322 são asparagina e estão anexadas a glicosilação de ligação a N.

[023] um polipeptídeo que inclui uma sequência de aminoácidos do Fator VII com alterações de sequência relativamente à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, em que as alterações da sequência consistem de (1) um resíduo de glutamina substituído por um resíduo de prolina na posição 10, (2) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de lisina na posição 32, (3) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de alanina na posição 34, (4) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de arginina na posição 36 e (5) uma alteração de sequência de forma a que a glicosilação com ligação N na posição 145 é interrompida.

[024] um polipeptídeo que inclui uma sequência de aminoácidos do Fator VII com alterações de sequência relativamente à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, em que as alterações da sequência consistem de (1) um resíduo de glutamina substituído por um resíduo de prolina na posição 10, (2) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de lisina na posição 32, (3) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de alanina na posição 34, (4) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de arginina na posição 36 e (5) uma alteração de sequência de forma a que a glicosilação com ligação N na posição 322 é interrompida.

[025] um polipeptídeo que inclui uma sequência de aminoácidos do Fator VII com alterações de sequência relativamente à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, em que as alterações da sequência consistem de (1) um resíduo de glutamina substituído por um resíduo de prolina na posição 10, (2) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de lisina na posição 32, (3) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de alanina na posição 34, (4) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de arginina na posição 36 e (5) alterações de sequência de forma a que a glicosilação com ligação N nas posições 145 e 322 é interrompida. a. um polipeptídeo que inclui uma sequência de aminoácidos do Fator VII com alterações de sequência relativamente à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, em que as alterações da sequência consistem de (1) um resíduo de glutamina substituído por um resíduo de prolina na posição 10, (2) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de lisina na posição 32, (3) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de alanina na posição 34, e(4) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de arginina na posição 36, em que as posições 145 e 322 são asparagina e estão anexadas a glicosilação de ligação a N.

[026] Também presentemente descritos são os polipeptídeos do Fator VII que reduziram a conjugação de ácido sálico com o polipeptídeo do Fator VII. Em certos exemplos, o polipeptídeo do Fator VII é uma variante polipeptídica que produz um modelo de glicosilação alterada. Em outros exemplos, o polipeptídeo do Fator VII é um polipeptídeo do Fator VII do tipo selvagem que reduziu a conjugação de ácido siálico. Em determinadas realizações, a conjugação de ácido de sílica reduzida pode ser realizada por tratamento do polipeptídeo com uma enzima sialidase. Em outras realizações, a conjugação de ácido de sílica reduzida pode ser realizada ao se produzir polipeptídeos de Fator VII recombinante em uma linha celular que é parcialmente ou completamente deficiente em sialilação de peptídeos. Em outras realizações, a conjugação de ácido de sílica reduzida pode ser realizada ao se co-expressar o polipeptídeo do Fator VII recombinante e uma enzima sialidase recombinante ou exógena em uma linha celular.

[027] Também é descrito um método para tratar um mamífero com uma doença ou um distúrbio, em que é desejável a formação de coagulação sanguínea, incluindo a administração ao mamífero em necessidade de uma quantidade eficaz de polipeptídeo do Fator VII que tenha conjugação de ácido siálico reduzida. Em determinadas realizações, a proporção de mols de ácido siálico conjugado para mols de glicano com ligação N é inferior a 0,05. Em outras realizações, o polipeptídeo do Fator VII inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16. Em outras realizações, o polipeptídeo do Fator VII inclui Fator VII do tipo selvagem. Ainda em outras realizações, a doença ou distúrbio tratado é selecionado do grupo que consiste de uma hemorragia, hemorragia intestinal, hemorragia não controlada, hemorragia em mamífero submetido a transplante ou ressecção ou cirurgia, hemorragia variceal, trombocitopenia, hemofilia, hemorragia intracraniana, aneurisma da aorta e administração excessiva de um anticoagulante.

[028] Outras variantes, composições, métodos e produtos e processos relacionados são seguidamente divulgados em detalhe.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[029] FIGS. 1A-1H apresenta sequências de nucleótido para moléculas do Fator VII utilizadas no presente pedido de patente. "V1" é uma variante do Fator VII humano que tem quatro mutações de aminoácidos relativamente à sequência de aminoácidos humanos de tipo selvagem da SEQ ID NO: 16: P10Q+K32E+T106N+V253N. "V1" é uma variante do Fator VII humano que tem seis mutações de aminoácidos relativamente à sequência de aminoácidos humanos de tipo selvagem da SEQ ID NO: 16: (P10Q, K32E, A34E, R36E, T106N e V253N). FIG.1 mostra igualmente sequências de nucleótido para várias construções utilizadas nos exemplos.

[030] FIG. 2 apresenta sequências de aminoácidos para moléculas do Fator VII utilizadas no presente pedido de patente. Fator VII humano do tipo selvagem tal como presentemente utilizados têm a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16. V1 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17. V2 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. Em V1 e V2, as mudanças de Fator VII do tipo selvagem da SEQ ID NO: 16 são apresentadas a negrito.

[031] FIG. 3 é um esquema que descreve três moléculas de Fator VII utilizadas nos exemplos do presente pedido de patente. A ligação de glicanos a locais de N-glicosilação é apresentada. Para a representação de glicanos, uma caixa sólida representa N-acetilglucosamina, uma oval sombreada representa manose, uma oval aberta representa lactose, um diamante escuro representa ácido siálico (também conhecido como ácido N-acetilneuramínico) e um triângulo fechado representa fucose. A estrutura do glicano é uma representação que utiliza uma variante possível de um glicano e não representa um glicano actual avaliado.

[032] FIG. 4 é um esquema que representa um glicano com ligação N mostrando uma ligação a Asn na sequência de consenso Asn- X-Ser/Thr. O núcleo Man3(GlcNAc)2 com vários monossacarídeos incluindo ácidos siálicos terminais é apresentado.

[033] FIG. 5 é um esquema que representa duas abordagens utilizadas na presente divulgação para diminuir a meia-vida de variantes do Fator VII, exemplificadas com referência a V2.

[034] FIG. 6 é um quadro de moléculas de Fator VII hipoglicosiladas.

[035] FIG. 7 apresenta os resultados de um método LC-MS para identificar ácido siálico remanescente na cadeia pesada de V2 após desialilação de acordo com as condições da experiência.

[036] FIG. 8 apresenta a análise de V2 desialilada para conteúdos de ácido siálico.

[037] FIG. 9 apresenta os resultados de um ensaio de ativação do FX fosfolípido.

[038] FIG. 10 apresenta os resultados de um ensaio PL-TGA em proteínas desialiladas.

[039] FIG. 11 apresenta a expressão de variantes de Fator VII hipoglicosiladas.

[040] FIG. 12 é um quadro que apresenta determinação de "atividade específica" de variantes FVII hipoglicosiladas utilizando sobrenadantes de transfecção.

[041] FIG. 13 apresenta os resultados de um ensaio PL-TGA em uma variante pMB121 hipoglicosilada purificada.

[042] FIG. 14 apresenta eliminação de hepatócitos in vitro de V2 desialilada comparativamente ao Fator VII de tipo selvagem.

[043] FIG. 15 apresenta os resultados de eliminação de hepatócitos in vitro com variantes do Fator VII. As variantes hipoglicosiladas não divulga um aumento na eliminação deste modelo. Este resultado sugere um mecanismo de eliminação diferente para estas moléculas comparativamente ao utilizado pela V2 desialilado.

[044] FIG. 16 apresenta resultados de estudo farmacocinético em rato. Meia-vida das V2 e V1 desialiladas revelaram-se significativamente mais curtas do que das suas moléculas parentais não modificadas em ratos Sprague Dawley tal como avaliado por ELISA Fator VII .

[045] FIG. 17 apresenta resultados de estudo farmacocinético em ratinhos HemA.

[046] FIG. 18 apresenta um estudo de eficácia de V2 desialilado em ratinhos HemA.

[047] FIG. 19 apresenta um estudo de eficácia de V2 desialilado em um modelo TVT HemA.

[048] FIG. 20 apresenta os resultados de geração de trombina- antitrombina em ratinhos HemA com V2 desialilado comparativamente ao Fator VII.

[049] FIG. 21 apresenta um estudo de eficácia de V2 desialilado em ratinhos competentes em termos de coagulação.

[050] FIG. 22 apresenta eliminação de hepatócitos in vitro de Fator VII de tipo selvagem desialilado (dWT VIIa) comparativamente ao Fator VII de tipo selvagem com conjugação normal de ácido siálico.

[051] FIG. 23 apresenta resultados de estudo de corte da cauda em ratinhos knock-in (TFKI) de tecido humano para dWT VIIa comparativamente ao Fator VII de tipo selvagem. Constatou-se que o Fator VII desialilado era significativamente mais eficaz do que o Fator VII de tipo selvagem.

[052] FIG. 24 apresenta resultados de uma análise ELISA de complexos Trombina Anti Trombina (TAT) após administração de dWT VIIa ou Fator VII de tipo selvagem.

[053] FIG. 25 apresenta os resultados de uma análise de formação de trombo em um modelo de trombose FeCl3 . A dose administrada de dWT VIIa produziu formação de trombos altamente reduzida comparativamente ao Fator VII de tipo selvagem.

[054] FIG. 26 apresenta afinidades de ligação aparente de dWT VIIa e Fator VII de tipo selvagem para Fator tecidual solúvel tal como avaliado por um substracto fluorogênico .

[055] FIG. 27 apresenta a conversão de Fator X em Fator Xa por meio de um complexo do Fator tecidual solúvel e de dWT VIIa ou Fator VII de tipo selvagem.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[056] Métodos para modular a farmacocinética de polipeptídeos de Fator VII recombinante (de tipo selvagem ou variantes) para limitar complicações trombóticas em um tratamento de hemorragia aguda são presentemente descritos. São também descritos polipeptídeos de Fator VII com conjugação de ácido siálico reduzido. São ainda descritas variáveis de Fator VII recombinante com eliminação intensificada a partir do sangue e uma redução na duração de eficácia. Estas variantes têm uma meia-vida mais curta in vitro comparativamente ao Fator VII de tipo selvagem devido aos modelos de glicosilação alterada. São igualmente descritos métodos de produção e utilização de tais polipeptídeos de Fator VII de ação curta.

[057] Para explicar o Fator VII e glicosilação, são facultadas as FIGs. 3 e 4. FIG. 3 apresenta esquematicamente três exemplos de moléculas do Fator VII com seus domínios. Fator VII é uma proteína que consiste de Gla, EGF e domínio catalítico e contém e Glicanos com ligação N (N145 e N322). V1 é uma variante Fator VII com quatro mutações (P10Q, K32E, T106N, V253N). V1 é uma variante Fator VII com seis mutações (P10Q, K32E, A343, R36E, T106N, V253N). V1 e V2 ambas têm uma afinidade aumentada por plaquetas ativadas e contêm dois locais N-glicosilação adicionais que resultam em meia- vidas mais longas comparativamente ao Fator VII de tipo selvagem. Acredita-se que as duas mutações observadas apenas em V2 (A34E, R36E) contam para a sua independência Fator-tecido.

[058] FIG. 4 apresenta esquematicamente um exemplo de uma ligação de um glicano de ligação na Asn na sequência de consenso Asn- X-Ser/Thr. O núcleo Man3(GlcNAc)2 com vários monossacarídeos incluindo ácidos siálicos terminais é apresentado.

[059] São presentemente apresentados métodos para preparar um polipeptídeo do Fator VII com uma meia-vida curta desejada. São facultados dois métodos para preparar um polipeptídeo do Fator VII de curta ação, sendo que estes métodos podem ser utilizados separadamente ou em combinação. Tal como esquematicamente apresentado na FIG. 5, utilizando um exemplo de uma variante de Fator VII, uma variante de Fator VII glicosilado pode ser processada por desialilação ou deglicosilação para alterar o modelo de glicosilação da variante e, deste modo, alterar e preferencialmente reduzir a sua meia- vida. Este método poderia igualmente ser utilizado para desialilar um polipeptídeo do Fator VII de tipo selvagem.

[060] A imunização dos animais pode ser medida por qualquer método conhecido da técnica. Exemplos de métodos adequados incluem desialilação enzimática por contato com qualquer enzima conhecida que funcione para desialilar, incluindo, sem que tal constitua qualquer limitação, sialidases incluindo microesferas neuraminidase- agarose (Sigma N5254) e a neuraminidase de Clostridium perfringens identificada em GI:40479 e em FEBS Lett. 238 (1), 31-34 (1988). Esta desialilação pode ser conseguida por contato com um polipeptídio de Fator VII recombinante purificado com uma sialidase in vitro sob condições adequadas ou por co-expressão dana célula hospedeira que expressa o polipeptídeo do Fator VII recombinante. O contato in vitro pode ser de tal duração que ocorre apenas desialilação parcial. Recomenda-se, por exemplo - onde uma meia-vida desejável pode ser obtida a partir de uma molécula com um rácio de desde 0,5 a 1 mols de ácido siálico conjugado para de glicano com ligação N na composição do polipeptídeo do Fator VII, contactando assim com uma sialidase durante um período de tempo limitado antes de ocorrer a desialilação completa. Desialilação parcial pode ser igualmente obtida utilizando uma sialidase modificada, por contato do polipeptídeo do Fator VII com a sialidase sob condições que abrandam ou afectam o total funcionamento da sialidase ou por outros métodos aparentes para os especialistas na técnica para produzir apenas polipeptídeos parcialmente desialilados. Desialilação parcial pode ser avaliada por comparação para o rácio de ácido siálico conjugado para glicano em uma preparação de referência que tenha sido completamente desialilada.

[061] Desialilação pode ser igualmente obtida através da expressão do polipeptídeo do Fator VII (de tipo selvagem ou variante) em uma linha celular que careça de ou seja deficiente em um ou mais componentes celulares necessários para adição de ácido siálico. Certas linhas celulares foram ou poderão ser modificadas para reduzir ou remover a sialilação. Por exemplo, as células Lec2 com origem no ovário de hamster chinês ("CHO") produzem glicoproteínas com aproximadamente dez vezes menos ácido siálico do que a célula de tipo selvagem. Acredita-se que a desialilação de um glicano resulta em uma molécula que pode ser activamente eliminada por receptores do fígado, incluindo o Asialoglycoprotein Receptor (Receptor de Asiologlicoproteína) (ASGPR) e por este motivo reduz a meia-vida.

[062] A segunda abordagem é deglicosilar uma variante de Fator VII e, deste modo, obter uma molécula com uma meia-vida reduzida. Redução na glicosilação aumenta a eliminação do Fator VII através de eliminação renal (50-60Kd cut off, rev. em Caliceti P e Veronese FM, "Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)- protein conjugates," Adv Drug Deliv Rev. 2003;55(10):1261-77, Weinstein T et al., "Distribution of glycosaminoglycans in rat renal tubular epithelium," J Am Soc Nephrol. 1997;8(4):586-95, Choi HS et al., "Renal clearance of quantum dots," Nat Biotechnol. 2007;25(10):1165-70), carga de superfície e mudança do ponto isoeléctrico (pI) (o que foi relacionado com o aumento na circulação da glicoproteína, ver revisão em Byrne B. et al., "Ácidos Siálicos: frações de carboidratos que influenciam as propriedades biológicas e biofarmacêuticas e células vivas," Drug Discovery Today 2007;12(7- 8):319) e através de menor protecção mediada pela glicoproteína a partir de qualquer número de proteases do plasma (Ton G., et al., 2005, Nie Y et al., 2006 ).

[063] Deglicosilação, tal como presentemente utilizado inclui, sem que tal constitua qualquer limitação, uma modificação genética de um polipeptídeo do Fator VII que resulte em uma sequência aminoácida alterada comparativamente a polipeptídeo do Fator VII de referência, em que a alteração remove um local de glicosilação de ligação a N. Por exemplo, uma variante de Fator VII pode ser produzida com uma alteração de interrupção de glicosilação em um ou mais resíduos de aminoácidos necessários para a sequência de consenso do glicano de ligação a N, isto é, Asn-X-Ser/Thr em que X representa qualquer aminoácido excepto prolina. Tal como presentemente utilizado, uma "alteração de interrupção de glicosilação" de uma sequência de aminoácido do Fator VII se refere a uma alteração relativa ao Fator VII de tipo selvagem que resulta em uma substituição, adição ou exclusão de um ou mais resíduos de aminoácidos e que resulta em uma perda de um ou mais locais de glicosilação de ligação a N. Por exemplo, locais de glicosilação com ligação N podem ser removidos por substituição de N145 e/ou N322, ambos presentes no Fator VII de tipo selvagem, com qualquer aminoácido (que ocorre naturalmente ou não naturalmente). Locais de glicosilação deveriam ser identificados por terem efeito mínimo na atividade quando alterados para interromper a glicosilação. Em um outro exemplo, deglicosilação pode ocorrer por expressão do polipeptídeo do Fator VII (de tipo selvagem ou variante) em uma linha celular que careça de maquinaria para a glicosilação. Por exemplo, espera-se que o Fator VII produzido em células bacterianas seja completamente não glicosilado uma vez que as células bacterianas carecem da maquinaria celular para glicosilação. Em uma outra realização, o polipeptídeo do Fator VII é produzido em uma linha celular que carece de enzimas de glicosilação terminal ou que tem essas enzimas, sendo que uma ou mais possuem atividade menos à encontrada na linha celular de tipo selvagem. Ver, por ex., Appa R. et al., 201, Narita M et al., 1998, Seested et al., 2010. Em uma outra realização, o polipeptídeo do Fator VII é produzido em uma linha celular que acolhe um defeito em uma enzima envolvida na síntese ou ligação de um glicano ao Fator VII ou um defeito em uma enzima envolvida na síntese do transportador do ácido siálico-CPM. Em uma outra realização, o polipeptídeo do Fator VII é tratado com deglicosilase ou químicos para deglicosilase.

[064] Tratamento por sialidase, deglicosilase ou químicos para reduzir ou remover glicanos de um polipeptídeo do Fator VII pode ocorrer durante a expressão, purificação ou pós purificação.

[065] Em uma realização, pelo menos um dos locais de glicosilação com ligação N na variante V1 do Fator VII (N322, N145) ou variante V2 do Fator VII (N322, N145, N106, N253) foi seletiva mente removido com um efeito mínimo na atividade. O local N-glicano foi obliterado no nível de ADN ao se interromper a sequência de consenso de N-glicano. Tal foi realizado pela remoção do codão N (asparagina) e substituição com o codão Q (Glutamina). FIG. 6 é um quadro que apresenta exemplos de variantes hipoglicosiladas. Variantes de glicosilação foram realizadas no Fator VII de tipo selvagem (presentemente referidas como "F7"), estruturas V1 e V2. Os locais N- Glicano manipulados (N106, N253) em V1 e V2 foram revertidos de novo para a sua sequência do tipo selvagem (T106, V253). Variantes pMB113, pMB117 e pMB121 são construções V1 e V2 do Fator VII de tipo selvagem, respectivamente que contêm os dois locais N- glicosilação endógenos (N145, N322). Todas as outras variantes na FIG. 6 tiveram um ou ambos dos seus locais N-glicano endógenos removidos por introdução de N em mutações Q (N145Q, N322Q). Esta abordagem de deglicosilação resulta em uma eliminação mais rápida.

[066] Em um aspecto da presente divulgação, deglicosilação e desialilação são combinadas para que os polipeptídeos do Fator VII tenham desejáveis meia-vidas reduzidas. Por exemplo, a molécula do Fator VII pode ser geneticamente modificada para incluir locais de glicosilação com ligação N adicionais para além dos dois presentes no Fator VII de tipo selvagem. A variante pode então ser desialilada utilizando um dos métodos presentemente descritos. A molécula resultante pode então reter a estrutura do glicano em cada local de glicosilação com ligação N sem o ácido siálico terminal. Em experiências presentemente reportadas, os Requerentes reportam estas variantes que têm um tempo de eliminação mais rápido comparativamente à variante do Fator VII desialilado que possuía menos locais de glicosilação de ligação a N. Semelhantemente, o polipeptídeo do Fator VII com apenas dois locais de glicosilação com ligação N encontrado no Fator VII de tipo selvagem pode ser deglicosilado em um destes locais e depois sujeito a desialilação. A variante do Fator VII resultante com um glicano com ligação N carecendo de ácido siálico possui uma farmacocinética diferente comparativamente ao polipeptídeo do Fator VUU que não carecia de um segundo local de glicosilação com ligação N com base na evidência experimental presentemente reportada. Definições e Realizações a. Salvo definido de outra forma, todas as técnicas e termos científicos presentemente utilizados têm normalmente o mesmo significado tal como comummente compreendido pelos especialistas na técnica a quem esta invenção pertence. Normalmente, a nomenclatura presentemente utilizada e os procedimentos laboratoriais na cultura de células, química orgânica e química do ácido nucleico e hibridação são bem conhecidos e vulgarmente empregues na técnica. Técnicas modelo são utilizadas para ácido nucleico e síntese de polipeptídeos. A nomenclatura presentemente utilizada e os procedimentos laboratoriais na química analítica e síntese orgânica seguidamente descritos são bem conhecidos e vulgarmente empregues na técnica. Técnicas modelo ou modificações das mesmas são utilizadas para sínteses químicas e análises químicas. Procedimentos utilizados para engenharia genética são bem conhecidos e podem ser encontrados, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.

[067] O termo "ácido siálico" ou "sialilo" se refere a qualquer membro de uma família de açúcares carboxilados de nove carbonos. O membro mais comum da família do ácido siálico é ácido de ácido N- acetil-neuramínico (2-ceto-5-acetamido-3,5-dideoxi-D-glicero-D- galactononulopiranos-1-ónico (frequentemente abreviado como Neu5Ac, NeuAc, ou NANA)).

[068] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são presentemente utilizados alternadamente e se referem a um polímero no qual os monómeros são aminoácidos e são juntos por meio de ligações amida. Adicionalmente, aminoácidos não naturais, por exemplo, β-alanina, fenilglicina e homoarginina são igualmente incluídos. Aminoácidos que não são codificados por gene podem ser igualmente utilizados com a tecnologia presentemente divulgada. Mais ainda, aminoácidos que foram modificados para incluir grupos reativos, locais de glicosilação, polímeros, frações terapêuticas, biomoléculas e semelhantes, podem igualmente ser utilizados. Todos os aminoácidos presentemente utilizados podem ser isómero D ou L. É normalmente preferido o isómero L. Tal como presentemente utilizado, "polipeptídeo" e "proteína" se refere a polipeptídeos e proteínas glicosiladas e não glicosiladas, respectivamente.

[069] O termo "aminoácido" se refere a aminoácidos que ocorrem de forma natural sintéticos, assim como a análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam duma forma semelhante relativamente aos aminoácidos que ocorrem naturalmente. Os aminoácidos que ocorrem de forma natural são aqueles codificados pelo código genético, assim como aqueles aminoácidos que são posteriormente modificados, por ex., hidroxipirolina, Y-carboxiglutamato e O-fosfoserina. Os "análogos de aminoácidos" se referem a compostos que possuem a mesma estrutura química básica como um aminoácido que ocorre naturalmente, isto é, um α-carbono que é ligado a um grupo hidrogénio, um grupo carboxilo, um grupo amino, um grupo R, por exemplo, homoserina, norleucina, metionina sulfóxido, metionina metilsulfónio. Estes análogos modificaram os grupos R (por ex., norleucina) ou modificaram as estruturas dos peptídeos, mas retêm, no entanto, a mesma estrutura química básica como um aminoácido que ocorre naturalmente. Os "miméticos de aminoácidos" se referem a compostos químicos que possuem uma estrutura diferente da estrutura química geral dum aminoácido, mas que funcionam de modo semelhante aos aminoácidos que ocorrem naturalmente.

[070] O termo "meia-vida" ou "t1/2," tal como presentemente utilizado no contexto de administração de um fármaco polipeptídico ou proteico a um doente, é definido como o tempo necessário para a concentração de plasma de um fármaco em um doente ser reduzido a metade.

[071] Meia-vida pode ser determinada em animais teste, por exemplo, administrando uma dose de 25-250 microgramas/kg da preparação; obtendo amostras de plasma a pré determinados momentos após administração e determinando o conteúdo do polipeptídeo do Fator VII nas amostras utilizando um ou mais de um ensaio de coagulação (ou qualquer bioensaio), uma imunoanálise ou equivalente. Os dados podem ser exibidos graficamente e depois a biodisponibilidade será determinada como a área sob a curva. Em determinados exemplos, os ratos ou modelos de murinos são utilizados para medições de meia-vida. Biodisponibilidade relativa de um polipeptídeo do Fator VII ou composição do mesmo se refere ao rácio da área sob a curva do polipeptídeo do Fator VII de ação curta comparativamente ao Fator de tipo selvagem ou outro polipeptídeo ou proteína comparador apropriado. Qualquer variante do Fator VII que contenha atividade coagulante sanguínea do Fator VII é útil para os propósitos e métodos presentemente descritos. Variantes do Fator VII tal como presentemente utilizados são polipeptídeos. Os termos "variante polipeptídica do Fator VII" e "variantes do Fator VII" são presentemente utilizados alternadamente. Em uma realização, as variantes do Fator VII possuem uma sequência aminoácida derivada do Fator VII de tipo selvagem (SEQ ID NO: 16) por substituição, exclusão e/ou inserção de um ou mais aminoácidos. Ao se designar substituições de aminoácidos, a primeira letra representa o aminoácido presente no Fator VII humano de tipo selvagem em uma posição. O número seguinte representa a posição em um Fator VII humano de tipo selvagem. A segunda letra representa o aminoácido que substitui o aminoácido encontrado no tipo selvagem. Por exemplo, "P10Q" representa uma substituição de glutamina (Q) por uma prolina (P) na posição 10 do aminoácido.

[072] Em determinados exemplos, a variante do Fator VII compreende uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste de P10Q, K32E, R36E, A34E, T106N e V253N. Em outros exemplos, a variante do Fator VII compreende, pelo menos, 2, 3, 4, 5, ou 6 destas substituições. Em outros exemplos, a variante do Fator VII inclui uma sequência de aminoácidos com, pelo menos, duas alterações de sequência relativamente à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 (Fator VII humano de tipo selvagem), em que, pelo menos, duas alterações de sequência são (1) um resíduo de glutamina substituído por um resíduo de prolina na posição 10, e (2) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de lisina na posição 32. Em outro exemplo, a variante do Fator VII inclui uma sequência de aminoácidos com, pelo menos, três alterações de sequência relativamente à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, em que pelo menos as três alterações da sequência são (1) um resíduo de glutamina substituído por um resíduo de prolina na posição 10, (2) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de lisina na posição 32, e (3) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de arginina na posição 36. Em um outro exemplo, a variante do Fator VII inclui uma sequência de aminoácidos com, pelo menos, quatro alterações de sequência relativamente à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, em que pelo menos as quatro alterações da sequência são (1) um resíduo de glutamina substituído por um resíduo de prolina na posição 10, (2) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de lisina na posição 32, (3) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de arginina na posição 36, e (4) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de alanina na posição 34. Em um exemplo particular, a variante do Fator VII inclui uma sequência de aminoácidos com, pelo menos, seis alterações de sequência relativamente à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, em que pelo menos as quatro alterações da sequência são (1) um resíduo de glutamina substituído por um resíduo de prolina na posição 10, (2) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de lisina na posição 32, (3) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de arginina na posição 36, (4) um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de alanina na posição 34, (5) um resíduo de asparagina substituído por um resíduo de treonina na posição 106, e (6) um resíduo de asparagina substituído por um resíduo de valina na posição 253. Em um outro exemplo particular, a variante de Fator VII compreende apenas estas seis alterações. Mais detalhes sobre estas variantes podem ser encontrados em WO 200158935 de Maxygen, e patente norte-americana No. 7,371,543 de Pedersen et al., ambas presentemente incorporadas na na íntegra a título de referência.

[073] As variantes de Fator VII presentemente descritas podem ser designadas utilizando qualquer polipeptídeo do Fator VII como polipeptídeo de partida. Em determinadas realizações, o polipeptídeo do Fator VII é um polipeptídeo do Fator VII humano. Em outras realizações, o polipeptídeo do Fator VII é o polipeptídeo do Fator VII humano de SEQ ID NO: 16, ou uma forma modificada ou variante alélica da mesma. Polipeptídeos de partida úteis incluem igualmente variantes polipeptídicas ou modificadas do Fator VII incluindo uma sequência aminoácida de, pelo menos, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, ou 66% idêntico à sequência do Fator VII humano de tipo selvagem (SEQ ID NO: 16) que também possui atividade do Fator VII. Ainda, em determinados exemplos, a variante polipeptídica do Fator VII da presente divulgação inclui qualquer polipeptídeo com, pelo menos, aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, ou 66% idêntico à sequência de (SEQ ID NO: 16 que possui funcionalidade do Fator VII e que contém igualmente uma ou mais das alterações de aminoácidos presentemente discutidas relativamente à SEQ ID NO: 16. Em uma outra realização, o polipeptídeo do Fator VII compreende uma sequência aminoácida com mais do que 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, ou 66% homologia para a SEQ ID NO: 16 e tem atividade do Fator VII e também uma ou mais alterações de aminoácidos presentemente referenciadas.

[074] As variantes do Fator VII, tal como presentemente, utilizadas incluem igualmente variantes de glicosilação de Fator VII de tipo selvagem. Por exemplo, uma variante do Fator VII de tipo selvagem parcialmente desialilada e composições das mesmas podem ser úteis pois possuem uma meia-vida mais curta comparativamente ao Fator VII de tipo selvagem. Também presentemente úteis são as formulações farmacêuticas de Fator VII de tipo selvagem parcial ou completamente desialiladas e utilização destes polipeptídeos e formulações no tratamento de doenças presentemente referidas que beneficiam de um polipeptídeo de curta ação com atividade de Fator VII. Desialilação parcial ou total pode ser medida pelo rácio de mols de ácido siálico conjugado para mols de glicano com ligação N em uma composição de polipeptídeos doo Fator VII, tal como presentemente descrito.

[075] As sequências nucleótidas que codificam presentemente as variantes de Fator VII são igualmente úteis. Em uma realização, os polipeptídeos do Fator VII são codificados por uma sequência nucleótida com, pelo menos, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, ou 66% identidade ao longo de todo o comprimento da sequência nucleótida do Fator VII de tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) e que codificam um polipeptídeo do Fator VII funcional. Em determinados exemplos, a sequência nucleótida codifica igualmente um polipeptídeo que contém uma ou mais das alterações de aminoácidos presentemente discutidas relativamente à SEQ ID NO: 16. Em uma outra realização, o polipeptídeo do Fator VII é codificado por uma sequência nucleótida com mais do que 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%,, ou 66% homologia para a sequência nucleótida do Fator VII de tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) e que codifica um polipeptídeo do Fator VII funcional. Em determinados exemplos, a sequência nucleótida codifica igualmente um polipeptídeo que contém uma ou mais das alterações de aminoácidos presentemente discutidas relativamente à SEQ ID NO: 16.

[076] Os valores de percentagem de identidade são calculados na região de sequência total de aminoácidos ou ácido nucleico. Encontra- se disponível uma série de programas sobre uma variedade de algoritmos, para o trabalhador especializado, para efeitos de comparação de sequências diferentes. Em, pelo menos, uma realização a percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinada utilizando o algoritmo de Needleman and Wunsch (Needleman 1970, J. Mol. Biol. (48):444-453), que foi incorporada no programa de seringas no pacote de software da EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice, P., Longden, I., and Bleasby, A, Trends in Genetics 16(6), 276-277, 2000), utilizando uma matriz de pontuação BLOSUM 45 ou PAM250 para proteínas distantemente relacionadas, ou uma matriz de pontuação BLOSUM 62 ou PAM160 para proteínas mais próximas, e uma penalização de espaço aberto de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e uma penalização de extensão de espaço de 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. Guias para instalação local do pacote EMBOSS bem como ligações para WEB-Services podem ser encontradas em emboss.sourceforge.net. Um exemplo não limitativo de parâmetros a ser utilizado para alinhamento de duas sequências de aminoácidos utilizando o programa de seringa são os parâmetros por defeito, incluindo a matriz de pontuação EBLOSUM62, uma penalização de espaço aberto de 10 e uma penalização de extensão de espaço de 0,5. Ainda em uma outra realização, a percentagem de identidade entre duas sequências de nucleótidos é determinada utilizada o programa de seringa no pacote de software EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice, P., Longden, I., and Bleasby, A, Trends in Genetics 16(6), 276-277, 2000), utilizando a matriz de pontuação EDNAFULL com uma penalização de espaço aberto de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e uma penalização de extensão de espaço de 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. Um exemplo não limitativo de parâmetros a ser utilizado para alinhamento de duas sequências de aminoácidos utilizando o programa de seringa são os parâmetros por defeito, incluindo a matriz de pontuação EDNAFULL, uma penalização de espaço aberto de 10 e uma penalização de extensão de espaço de 0,5. As sequências de ácido nucleico e de proteína podem ainda ser utilizadas como uma "sequência query" para realizar uma pesquisa em bases de dados públicas para, por exemplo, identificar outros membros da família ou sequências relacionadas. Estas pesquisas podem ser realizadas utilizando a série BLAST de programas (versão 2.2) de Altschul et al. (Altschul 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10). BLAST que utiliza sequências de ácido nucleico da presente divulgação como sequência query pode ser realizado com o programa BLASTn, BLASTx,ou tBLASTx utilizando parâmetros por defeito para obter sequências de nucleótidos (BLASTn, tBLASTx) ou sequências de aminoácidos (BLASTx) homólogas para sequências codificadas pelas sequências de ácido nucleico da presente divulgação. BLAST que utiliza sequências de proteínas codificadas pelas sequências de ácido nucleico da presente divulgação como sequência query pode ser realizado com o programa BLASTp ou tBLASTn utilizando parâmetros por defeito para obter sequências de aminoácidos (BLASTp) ou sequências de ácido nucleico (tBLASTn) homólogas para sequências da presente divulgação. Para obter alinhamentos intervalados para efeitos de comparação, pode utilizar-se GappedBLAST como descrito em Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402.

[077] Os polinucleótidos da presente divulgação consistem essencialmente das sequências de nucleótidos acima mencionadas ou compreendem as sequências de nucleótidos acima mencionadas. Deste modo, os polinucleótidos podem conter igualmente outras sequências de nucleótidos. Em determinadas sequências, o polinucleótido pode compreender, adicionalmente, para uma estrutura de leitura aberta, outra sequência não traduzida no término 3' e/ou 5' da região codificadora do gene, por exemplo, pelo menos, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, ou mais nucleótidos da sequência a montante do terminal 5' da região codificadora e/ou pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, ou mais nucleótidos da sequência a jusante do terminal 3' da região codificadora do gene. Mais ainda, os polinucleótidos podem codificar as proteínas de fusão, em que um parceiro da proteína de fusão é um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleótidos acima referida. Estas proteínas de fusão podem compreender as denominadas "tags" as quais podem servir como um marcador detectável ou como uma medida auxiliar para efeitos de purificação. Tags para efeitos diferentes são bem conhecidas na técnica e compreendem FLAG-tags, 6-histidina-tags, MYC-tags e semelhantes. Em uma realização, o polinucleótido compreende ainda uma sequência de controle de expressão operativamente ligada à sequência nucleótida.

[078] Em determinadas realizações, uma sequência de ácido nucleico codificadora do polipeptídeo do Fator VII é introduzida em um vetor adequado. Inúmeros vetores úteis para vários propósitos são bem conhecidos na técnica e os especialistas na técnica serão capazes de prontamente selecionar um vetor apropriado para a sua aplicação desejada. Em determinados exemplos, o vetor pode ser o vetor de clonagem ou uma expressão de vetor. Em outros exemplos, o vetor pode ser um plasmídeo, um vetor viral, um cosmídeo ou um cromossoma artificial. Em determinados exemplos, o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo do Fator VII pode ser colocado adjacente a e/ou sob o controle de um promotor apropriado. Inúmeros promotores úteis para vários propósitos são bem conhecidos na técnica e os especialistas na técnica estarão capazes a prontamente selecionar um promotor apropriado para a sua aplicação desejada. Em determinados exemplos, o promotor pode ser um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor específico tecidual.

[079] Em determinadas realizações, os polipeptídeos do Fator VII são recombinantemente produzidos em uma linha celular, tecido ou organismo. Em determinadas realizações, esta produção recombinante é conseguida por transformação ou transfecção de uma célula hospedeira com uma molécula de ácido nucleico que codifica a variante polipeptídica ou um vetor que contém esse ácido nucleico. Inúmeros métodos de transformação e transfecção são bem conhecidos na técnica e os especialistas na técnica serão capazes de prontamente selecionar um método apropriado para a sua aplicação desejada.

[080] Esta produção recombinante pode igualmente ser conseguida utilizando qualquer célula hospedeira, tecido ou organismo apropriado. Células, tecidos e organismos adequados são bem conhecidos na técnica e os especialistas na técnica estarão capazes a prontamente selecionar um hospedeiro apropriado para a sua aplicação desejada. Em algumas realizações, a célula hospedeira é um mamífero. Exemplos de linhas celulares adequadas de mamíferos são COS-1 (ATCC CRL 1650), rim de hamster bebé (BHK), HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977), HEK293T (ATCC CRL 11268; DSM ACC 2494), e linhas celulares HEK293F (Invitrogen R79007). Uma linha celular BHK útil é a linha celular tk31 ts13 BHK (Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982, presentemente incorporada a título de referência), doravante referida como células BHK 570. A linha celular BHK 570 foi depositada junto da American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, Md. 20852, sob ATCC número de acesso CRL 10314. Uma linha celular tk- ts13 BHK encontra-se igualmente disponível em ATCC sob número de acesso CRL 1632. Para além disso, um número de outras linhas celulares podem ser utilizadas dentro da presente divulgação, incluindo células Rat Hep I (Rat hepatoma; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (Rat hepatoma; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), pulmão Humano (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), CHO (ATCC CCL 61), CHO K1 (ATCC CCI61), DUKX (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980) e células CHO- DG44 (Urlaub et al. Cell, 33: 405-412, 1983).

[081] Composições de polipeptídeos do Fator VII são úteis em que os polipeptídeos são definidos como presentemente e o rácio de ácido siálico conjugado por mol de glicano com ligação N na composição é inferior a 0,05, inferior a 0,1, inferior a 1,0, inferior a 2,0, inferior a 3,0, inferior a 4,0, inferior a 5,0 ou inferior a 6,0, ou composições em que o rácio de mols de ácido siálico conjugado por mol de glicano com ligação N se encontra dentro da ordem selecionada do grupo que consiste de (1) de 0 para 8; (2) de 0 para 7; (3) de 0 para 6; (4) de 0 para 5; (5) de 0 para 4; (6) de 0 para 3; (7) de 0 para 2; (8) de 0 para 1 e (9) de 0 para 0,5, ou rácios de 1 para 8, 1 para 7, 1 para 6, 1 para 5, 1 para 4, 1 para 3, 1 para 2, 2 para 8, 2 para 7, 2 para 6, 2 para 5, 2 para 4, 2 para 3, 3 para 8, 3 para 7, 3 para 6, 3 para 5, 3 para 4, 4 para 8, 4 para 7, 4 para 6, 4 para 5 e 0,1 para 1. O rácio é uma medição dos mols de ácido siálico ligado a uma glicoproteína relativamente ao número de glicanos na glicoproteína. O número de glicanos se refere ao número de frações de açúcar ligadas ao glicano com ligação N na glicoproteína, em que um local de glicosilação de ligação N pode suportar apenas um glicano tal como presentemente definido para esfeitos deste rácio. O rácio é determinado utilizando um kit de marcação por fluorescência de ácido siálico tal como o comercializado pela Takara Bio Inc. (cat. #4400). Este kit de marcação por fluorescência de ácido siálico inclui uma fase de libertação do ácido siálico da glicoproteína ligada, tal como por hidrólise parcial ou por utilização de sialidase, tal como sialidase Arthrobacter ureafaciens. Os ácidos siálicos livres são então etiquetados com um fluoróforo, tal como 1,2-diamino-4,5-metileneoxibenzeno ("DMB"). Os ácidos siálicos livres etiquetados são depois quantitativamente medidos utilizando HPLC e comparando as alturas de pico com uma curva de calibração. Deste modo, o rácio medido é um rácio de mols de ácido siálico por mol de glicano liberto dos polipeptídeos do Fator VII da composição.

[082] Em uma série de realizações, as composições dos polipeptídeos do Fator VII ou os próprios polipeptídeos isolados têm uma meia-vida tal como medido no plasma humano ou de mamíferos, por exemplo, plasma de murinos ou ratos, de menos do que 2 horas, menos do que 1,5 horas, menos do que 1 hora, menos do que 0,75 horas, menos do que 0,5 horas, menos do que 0,25 horas, menos do que 0,1 horas ou tão menos que não seja razoavelmente medível.

[083] Tal como presentemente utilizado, a atividade do Fator VII é uma atividade biológica que pode ser quantificada pela medição da capacidade de uma preparação para promover a coagulação do sangue, utilizando plasma deficiente do Fator VII e tromblopastina, tal como é bem conhecido na técnica. Em certos exemplos, um polipeptídeo do Fator VII com atividade do Fator VII apresenta, pelo menos 25%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% da atividade do Fator VII de tipo selvagem tal como medido sob as mesmas condições.

[084] Formulações farmacêuticas dos polipeptídeos do Fator VII e composições dos mesmos que compreendem o polipeptídeo do Fator VII e um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável podem ser úteis. Em determinados exemplos, as formulações farmacêuticas são para administração parentérica, tal como administração intravenosa, subcutânea ou intramuscular e a dosagem pode ser como uma dose de bolus único, dosagem intermitente ou como uma infusão intravenosa contínua. As formulações tópicas são igualmente úteis. Uma realização compreende uma formulação farmacêutica que inclui um polipeptídeo de Fator VII isolado como presentemente descrito, ou que inclui uma composição de polipeptídeos do Fator VII tal como presentemente descrito em uma preparação liofilizada que é reconstituída no momento de utilização. Alternativamente, a formulação farmacêutica pode ser uma formulação pronta a utilizar de líquido estável que não requer reconstituição. A formulação farmacêutica pode ser um pó liofilizado em frascos de utilização única de 1, 2, 5 ou 8 mg do polipeptídeo do Fator VII. Após reconstituição com um volume especificado de líquido, tal como água estéril contendo histidina, a solução final pode conter uma quantidade adequada do polipeptídeo do Fator VII que produz um efeito terapêutico, tal como, sem que tal constitua qualquer limitação, 1 mg/mL (1000 microgramas/mL), 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 1-2 mg/mL, 1-3 mg/mL, 1-5 mg/mL, 1-10 mg/mL, 0,5-1 mg/mL, ou 0,5-2 mg/mL do polipeptídeo do Fator VII. A dosagem própria para administração a um doente pode ser prontamente determinada por indivíduos especialistas na técnica com base, por exemplo, no peso do doente, tipo de distúrbio ou episódio hemorrágico a ser tratado e na atividade do polipeptídeo do Fator VII particular a ser empregue. Em determinados exemplos, a dosagem pode encontrar-se na ordem de 70100 microgramas/kg, 70-90 microgramas/kg ou 80-100 microgramas/kg e ainda 90 microgramas/kg. O pó liofilizado pode ser reconstituído com um veículo aquoso, tal como água, água tamponada, 0,4% salina 0,3% glicina, etc. Métodos actuais para preparar composições parentericamente administráveis serão conhecidas ou aparentes para os especialistas na técnica e são descritas em maior detalhe em, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1990). Aplicação tópica, tal como pode ser aconselhável em caso de trauma, pode ser realizada por meio de pulverização, perfusão, catéteres, stent, enxerto vascular ou stent, unguento ou outra preparação conhecida na técnica. Em determinados exemplos, administração tópica pode ser realizada por meio de uma matriz comercializada ou semi-sólida, tal como uma esponja cirúrgica ou matriz de colagénio, que foi tratada com, infusão com, revestida com ou embebida em uma composição Métodos para preparar estas matrizes são bem conhecidas na técnica (ver, por ex. Thrombosis/Hemostasis 12:445, 2006) e especialistas terão capacidade para prontamente determinar uma dose apropriada e método de aplicação da composição em uma determinada matriz.

[085] Em uma realização, a presente divulgação se refere a kits que compreendem o polipeptídeo do Fator VII. Em determinados exemplos, o kit contém um frasco que contém líquido pronto a utilizar que contém o polipeptídeo do Fator VII em uma composição farmacêutica adequada. Em outros exemplos, o kit contém um frasco com polipeptídeo do Fator VII liofilizado ou uma formulação liofilizada que compreende o polipeptídeo e também um diluente para reconstituição. Em outros exemplos, o kit contém uma formulação tópica do polipeptídeo do Fator VII, por exemplo, um unguento, pulverizador ou líquido e uma matriz, tal como uma esponja ou outra matriz médica para a qual a formulação tópica pode ser aplicada antes de administração ao doente.

[086] Composições dos polipeptídeos do Fator VII presentemente descritos são igualmente úteis. Fator VII existe em mistura com os seus produtos de degradação natural. Consequentemente, uma composição de polipeptídeo do Fator VII inclui polipeptídeos com uma das sequências completas de aminoácidos como presentemente referido e produtos de degradação com sequências parciais de aminoácidos das presentemente descritas. Para além disso, e porque o Fator VII é uma glicoproteína, estima-se que as composições do Fator VII contenham uma mistura heterogénea de polipeptídeos do Fator VII em que cada glicoproteína na composição não tem exactamente a mesma glicosilação comparativamente a outras. A referência a composições dos polipeptídeos do Fator VII ou polipeptídeos do Fator VII isolados significa incluir misturas desses polipeptídeos em que os polipeptídeos individuais têm uma glicosilação diferente e, deste modo, os termos "composição" ou polipeptídeo do Fator VII isolado" incluem uma heterogeneidade de modelos de glicosilação dentro dos polipeptídeos.

[087] Os polipeptídeos do Fator VII e composições presentemente descritas são úteis para o tratamento de distúrbios de coagulação do sangue e aqueles distúrbios que beneficiam da coagulação do sangue e, particularmente, para coagulação com um fármaco com uma meia- vida mais curta que o Fator VII de tipo selvagem. Consequentemente, os polipeptídeos do Fator VII e composições presentes são úteis para penetrar lesões traumáticas; lesões traumáticas cegas; hemorragia em cirurgia programada; hemorragia em cirurgia cardíaca; hemorragia em cirurgia da coluna; cirurgia ortopédica; neurocirurgia; cirurgia oncológica; cirurgia pós-parto; menorragia; hemorragia no transplante de células estaminais; hemorragia no transplante de fígado; hemorragia gastrointestinal; hemorragia variceal activa em cirrose; hemorragia não variceal em cirrose; hemorragia alveolar difusa; aneurisma da aorta; hemorragia intracerebral; lesão em traumatismo craniano; contusão cerebral; inversão de warfarina; inversão de heparina; inversão de anticoagulantes; inversão de anti-trombóticos; deficiência do Fator VII; queimaduras; profilaxia em doentes com hemofilia com inibidores; hepatectomia parcial para doentes não cirróticos e cirróticos; hemofilia adquirida; púrpura trombocitopénica idiopática; Trombastenia de Glanzmann; Trombastenia refractária de Glanzmann para transfusão de plaquetas e Síndrome de Bernard-Soulier.

[088] É igualmente presentemente divulgado um ensaio útil para medição da meia-vida dos Fatores de coagulação tal como o Fator VII. Existe um método para determinar a meia-vida de um Fator coagulante que inclui células hepatócitas de rato possíveis de incubar com um Fator de coagulação de sangue, removendo uma amostra no ponto 1 do momento do teste, separando sobrenadante das células na amostra e quantificando a atividade ou quantidade do Fator de coagulação do sangue no sobrenadante na amostra, em que a atividade ou quantidade de Fator de coagulação do sangue é determinado utilizando um ensaio ELISA tipo sanduíche de anticorpo duplo. O método pode ser repetido em pontos de tempo diferentes para desenvolver um lote de atividade ou quantidade de Fator de coagulação de sangue ao longo do tempo.

EXEMPLOS Métodos para Obter Polipeptídeos de Fator VII Desializados

[089] Foram empregues numerosos métodos para gerar polipeptídeos de Fator VII desializados (tanto de tipo selvagem como variantes), incluindo desialização enzimática do polipeptídeo, produção do polipeptídeo de Fator VII em uma linhagem de células deficiente em sialilação e co-expressão do Fator VII e uma sialidase em uma célula recombinante.

Geração de uma Linhagem de Células Deficiente em Ácido Siálico

[090] O ácido siálico endógeno é sintetizado em células de mamífero envolvendo uma via complexa que consiste em 32 enzimas (Wickramasinghe and Medrano 2011). A biossíntese do ácido siálico tem início no citosol, convertendo UDP-N-acetilglucosamina (UDP- GlcNAc) em Neu5Ac, envolvendo várias enzimas, tais como a UDP-N- acetilglucosamina-2-epimerase/Nacetilmanosamina quinase (GNE), ácido siálico 9-fosfato sintase (NANS) e ácido siálico 9-fosfato fosfatase (NANP). Neu5Ac no citosol é importado para o núcleo através dos respectivos poros e convertido em CMP-Neu5Ac por uma enzima designada CMP-Sia sintase (CMAS). O CMP-Neu5Ac sintetizado é novamente transportado de volta para o citosol através dos poros do núcleo para prosseguir a modificação e conjugação no aparelho de Golgi. A conversão de Neu5Ac em Neu5Gc, no citosol é catalizada pela enzima CMP-NeuAc-hidroxilase (CMAH). Depois CMP-Neu5Ac e CMP- Neu5Gc são transportados para o compartimento de Golgi através de um transportador de membrana hidrofóbico tipo 3, transportador CMP- ácido siálico (SLC35A1), localizado na membrana do trans-Golgi mediano. O transportador CMP-ácido siálico é um elemento fundamental na via de sialilação celular (Hirschberg, et al. 1998). Uma mutação homozigótica deste gene provoca uma letalidade pós-natal no ratinho (MGI 4.32, Homologene). Em mutações humanas em SLC35A1 estão associados à redução ou total ausência de conjugados sialilo. Algumas mutações de inserção e eliminação em SLC35A1 estão associadas a perturbações congénitas da glicosamina em seres humanos, conducentes a defeitos no desenvolvimento do sistema nervoso, coagulação e deficiências imunitárias (Martinez-Duncker, et al., 2005). Depois de transportado CMP-Neu5Ac/CMP-Neu5Gc para o aparelho de Golgi, são conjugados com carboidratos, glicoproteínas e glicolípidos por enzima da família da sialiltransferase (ST) com 20 membros.

[091] O transportador de ácido siálico CMP (SLC35A1) é a molécula chave que suporta a conjugação do ácido siálico no aparelho de Golgi e mutações desta proteína transportadora conduzem à síntese de proteínas sem a sialilação adequada. Para produzir Fator VII desializado, produz-se uma linhagem de células de produção de Fator VII com o gene transportador CMP-ácido siálico knockout. Em alternativa, a desialização pode ser alcançada através da expressão da variante Fator VII na linhagem de células que produz agentes terapêuticos proteicos com um baixo nível de sialilação ou sem sialilação nas moléculas terapêuticas. Esta tecnologia pode ser utilizada para produzir proteínas terapêuticas com T1/2 curto nos doentes.

[092] Foi identificada uma célula Lec2 com origem em ovário de hamster chinês (CHO) com a propriedade de produzir aproximadamente 10 vezes menos ácido siálico nas glicoproteínas e glicolípidos do que as células respectivas de tipo selvagem (Stanley e Siminovitch, 1977, Stanley, 1980 e 1983). Um estudo posterior revelou que os mutantes Lec2 eram incapazes de translocar CMP-ácido siálico através das membranas das vesículas de Golgi em um ensaio in vitro, enquanto a translocação de outros derivados de nucleótido eram comparativamente normais em células mutantes (Deutscher, et al., 1984). Através da utilização da clonagem de expressão, relatou-se o gene codificador do transportador CMP-ácido siálico de células Lec2 (Eckhardt et al., 1996). Outras pesquisas indicaram que a eliminação dos nucleótidos 575751 no gene transportador CMP-ácido siálico foi responsável pelo fenotipo Lec2 (Eckhardt, et al., 1998). Outras mutações no gene transportador CMP-ácido siálico, tal como no caso de células 1E3, 6B2, 8G8 e 9D3, conduziram também ao fenotipo Lec2 (Eckhardt, et al., 1998).

Experiência 1

[093] Esta experiência foi concebida para determinar se a mutação no gene do transportador CMP-ácido siálico, tal como no caso das células Lec2, resulta em proteína recombinante expressa (por ex. Fator VII) deficiente em sialilação em comparação com a mesma proteína expressa a partir de células CHO normais. (1) Ensaio da expressão de proteína recombinante, tal como Fator VII de células Lec2. Vetores de expressão contendo o gene variante Fator VII (por ex. pMB117 e pMB121) são transfectados para células Lec2 e células CHO normais, em condições de transfecção normais. Os níveis de expressão do Fator VII da cultura celular destas células são monitorizados por um ensaio de atividade do Fator VII. A cultura das células transfectadas é ampliada e o meio condicionado de cultura é colhido para a purificação do Fator VII. (2) Ensaio do teor de ácido siálico de Fator VII purificado, expresso de células Lec2, em comparação com a mesma proteína expressa a partir de células CHO normais. A purificação do Fator VII a partir deste meio condicionado é executada segundo os métodos de purificação de Fator VII normais. O teor de ácido siálico do Fator VII purificado tanto de células Lec2 como de células CHO normais é analisado. A atividade biológica e parâmetros de farmacocinética (PK) são analisados como presentemente descrito.

Experiência 2

[094] Para produzir uma linhagem de células produtora, para expressar uma variante de Fator VII sem ácido siálico nas proteínas recombinantes expressas, são empregues métodos de eliminação de genes orientados contra o gene transportador de CMP-ácido siálico, para modificar uma linhagem de células que expressa o Fator VII (por ex. a linhagem de células CHO). Para inibir completamente a sialilação na célula, podem ser opcionalmente eliminados outros alvos, tais como UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerase/Nacetilmanosamina quinase (GNE), ácido siálico 9-fosfato sintase (NANS), ácido siálico 9-fosfato fosfatase (NANP) e CMP-Sia sintase (CMAS), como indicados anteriormente, na introdução, de forma a intensificar a inibição da biossíntese de CMP-Neu5Ac, o que proporciona o substrato para o transportador de CMP-ácido siálico.

[095] Podem ser empregues duas tecnologias de eliminação genética, TALE nucleases (TALENs) da Life Technologies e ZFP Nucleases (ZFNs) da Sangamo BioSciences/Sigma-Aldrich para executar a eliminação (knockout) do gene transportador CMP-ácido siálico, ou para a eliminação (knockout) de múltiplos genes na via de síntese do ácido siálico.

[096] A linhagem de células de expressão do Fator VII com o gene transportador de CMP-ácido siálico eliminado (knockout) é avaliada para confirmar a eliminação do gene transportador CMP-ácido siálico. A linhagem de células confirmada é cultivada para produzir o Fator VII. O Fator VII da linhagem de células com gene transportador de CMP- ácido siálico eliminado é purificado e avaliado como presentemente se descreve e comparado com o Fator VII da linhagem de células de expressão Fator VII progenitora para determinar o teor de ácido siálico na molécula.

Produção de Fator VII Desializado mediante Co-Expressão do Fator VII e Sialidase Bacteriana.

[097] Para gerar uma forma desializada de FVII, procedemos à co- expressão de FVII conjuntamente com a variante sialidase bacteriana derivada da sialidase de Arthrobacter ureafaciens (AU sialidase) (N- acetilneuraminato de glico-hidrolase, EC 3.2.1.18). As células CHO que expressam de forma estável FVII (por ex. SEQ ID NO 16 com mutações P10Q, K32E, A34E e R36E) foram novamente transfectadas com AU sialidase, utilizando um vetor de expressão pJ608. A proteína expressa possui uma sequência de sinal da hormona de crescimento no N- terminal para promover a secreção da proteína. Foram selecionados clones estáveis que produziam AU sialidase como detectado por análise cromogênica para a sialidase no meio. Revelámos também que as células continuaram a expressar elevados níveis de proteína FVII, o que foi detectado por ELISA, SDS, PAGE e mancha de Western, utilizando anticorpos específicos de FVII como sonda. A utilização de um ensaio de coloração com lectina permitiu detectar ácido siálico em proteína FVII no meio de condicionamento, utilizando FVII purificado. Em contraste, níveis similares de FVII purificado, derivado de células que não foram transfectadas com sialidase, revelaram um forte sinal de ligação de lectina. Globalmente, os dados mostram que a AU sialidase foi expressa no meio de células CHO em níveis suficientes para desializar de forma eficiente o FVII que foi co-expresso pelas células.

Preparação Enzimática de Fator VII Desializado Utilizando um Tratamento de Sialidase Solúvel

[098] Foram utilizados os seguintes materiais de partida nesta experiência:

[099] Fator VII: 20 mg de Fator VIIa de tipo selvagem, concentração cerca de 1 mg/mL

[100] Sialidase: 20 ug, 0,25 mg/mL, 50000 U/mL, P0720L, adquirido junto da New England BioLabs

[101] Solução tampão A: 25 mM de histidina, 50 mM de NaCl, pH 6,4

[102] Solução tampão B: 25 mM de histidina, 1 M de NaCl, pH 6,4

[103] Formulação tampão VIIa: 2,3mg/mL de cloreto de sódio, 1 5 mg/mL de cloreto de cálcio desidratado, 1,3 mg/mL de glicilglicina, 0,1 mg/mL de polissorbato 80, 25 mg/mL de manitol, 10 mg/mL de sacarose, 0,5 mg/mL de metionina, 1,6 mg/mL de histidina, pH 6,0

[104] Coluna de purificação: Coluna 5 mL HiTrap Q Sepharose HP

[105] Com estes materiais foi executado o seguinte procedimento: 1. A 20 mg de FVIIa (cerca de1 mg/mL) adiciona-se 20 ug de sialidase (0,25 mg/mL, 1:1000 proporção em massa) de sialidase 2. Incubar a mistura reaccional à temperatura ambiente de um dia para outro (cerca de 19 h) antes de purificar por cromatografia FVIIa desializado como se descreve abaixo. 3. Purificar FVIIa desializado em colina de 5 mL HiTrapQ Sepharose HP como se segue: a) Equilibrar a coluna Q-Sepharose com 5 CV de tampão A (25 mM de ihstidina, 50 mM de NaCl, pH 6,4). b) Antes de aplicar na coluna, diluir o FVIIa e a reação de sialidase com 200 mL de tampão A e ajustar p pH a 6,4. c) Carregar a um caudal de 2,5 mL/min com um sistema AKTA Explorer, monitorizando sempre A280. Recolher o fluxo através da fração. d) Depois de completo o carregamento, lavar a coluna com 10CV de Tampão A. e) Eluir a coluna com 20CV de tampão B 0-50% (25 mM de histidina, NaCl 1M, pH 6,4) em 40 min. Recolher frações de pico (NovoSeven desializado) f) Dializar as frações pico contra tampão de formulação FVIIa a 4 °C de um dia para outro g) Congelar a amostra em alíquotas a -80 °C.

[106] Ficou demonstrado através de SDS-PAGE, aSEC que o produto é muito puro e activo em análises biológicas para FVIIa. As análises do teor de ácido siálico não revelaram qualquer ácido siálico residual e a análise LC-MS da cadeia pesada não revelou uma alteração significativa da estrutura glicano para além da remoção do ácido siálico.

Preparação Enzimática de Fator VII Desializado Utilizando Microesferas de Neuraminidase-Agarose

[107] O Fator VII de tipo selvagem recombinante, tal como presentemente utilizado, é NovoSeven®, obtido da Novo Nordisk e referido doravante como "F7". Outros materiais de partida são V1 e V2 como descrito supra.

[108] O material de partida congelado foi rapidamente descongelado em banho de água a 37 °C e reunido. A proteína foi concentrada 2,5 vezes por centrifugação; o concentrado foi misturado suavemente através de pipetação para minimizar qualquer super- concentração (agregação) na superfície de contato entre a proteína e o filtro.

[109] Foi trocado o tampão de V2, do tampão de formulação V2 (contendo histidina, CaCl2, trealose, metionina e vestígios de Tween®- 20, a pH 6,4) em tampão MES (contendo 10 mM de MES, 10mM de CaCl2, 50 mM dde NaCl, pH 6,0, esterilização por filtração). Esta operação foi realizada de uma de três formas. Em uma primeira opção, V2 foi submetido a troca de tampão com colunas de gravidade NAP-10 (GE, 17-0854-01) que foram previamente lavadas 3 a 5 vezes com 3 volumes da coluna com tampão MES de cada vez. V2 foi então carregado na coluna e eluído com 1,5 vezes o volume do carregamento em tampão MES. Em uma segunda opção, V2 foi submetido a troca do tampão através de diálise de um dia para outro em tampão MES. As cassetes de diálise foram pré-embebidas em tampão MES e o V2 foi carregado através de seringa em cassetes 3.500 MWCO slide-a-lyzer (Thermo Scientific, 66130) de um dia para outro a 4 °C em jarros de 10 L com tampão MES esterilizado por filtração. Na terceira opção, o V2 foi submetido a troca do tampão por tampão MES através de coluna de filtração em gel Sephadex G-25 (Sigma, G-25-80) e equilibrado com tampão MES.

[110] O V2 com o tampão trocado foi desializado com neuraminidase-agarose (Sigma N5254). O produto de microesferas de agarose é fornecido em uma mistura pastosa a 50%, guardada em tampão de sulfato de amónia; as microesferas foram pré-lavadas 3 a 5 vezes em tampão MES; a mistura microesferas/tampão foi separada por centrifugação a 1000 rpm durante 3 min a 4 °C e o líquido sobrenadante foi pipetado e eliminado. Adicionou-se às microesferas lavadas o V2 com tampão trocado e misturou.se suavemente por rotação à temperatura ambiente, durante 16 a 22 horas. 2,08 mL de microesferas compactadas por mg de proteína foram utilizados para a desialização; para uma preparação a uma maior escala, este valor foi reduzido 1:10, para 0,208 mL de microesferas por mg de proteína. Em seguida, o V2 desializado foi recuperado por centrifugação e retirado com uma pipeta. As microesferas foram lavadas uma vez suavemente durante 5 minutos por meio de rotação em 1:1 por volume de tampão MES fresco; a mistura de lavagem foi centrifugada como antes e o sobrenadante foi reunido como V2. As microesferas foram finalmente removidas ou por esterilização por filtração através de um filtro de seringa de 0,2 mícrones ou por filtração sob vácuo através de um filtro de 0,45 mícrones.

[111] Foram executados vários ciclos de remoção de endotoxina com resina EndoTrap HD (Hyglos). A resina foi lavada 3 a 5 vezes em tampão MES e descartou-se o tampão de lavagem. Em duas vezes misturou-se suavemente 1 a 3 mL de resina lavada com o V2 desializado de um dia para outro, à temperatura ambiente. A resina foi removida por centrifugação e depois foi filtrada através de filtro de seringa ou de vácuo.

[112] O V2 desializado foi concentrado 4,75 vezes para 2,1 mg/mL por meio de centrifugação em Ultracels, em ciclos de 10 minutos; os concentrados foram misturados suavemente, por pipetação, para reduzir qualquer agregação na superfície de contato proteína-filtro.

[113] O V2 desializado foi ainda separado das espécies de peso molecular elevado (e endotoxina agregada) com coluna de exclusão de tamanho HiLoad 26/60 Superdex 200. A coluna e o sistema purificador AKTA foi pré-desinfectado com NaOH 0,1N+ EtOH 20%. O pH do sistema foi neutralizado, enxaguado com água e equilibrado com tampão de formulação V2 reconstituído e reunido. Foram injetado s manualmente vários lotes de concentrado em um circuito de amostra de 12 mL e carregados em coluna de exclusão de tamanho, com um caudal de 3 mL/min; o eluído foi recuperado e fraccionado com um Frac-900 em tubos de poliestireno (17 x 100 mm, Fisherbrand, 14-956-6D). Foram excluídos picos de elevado peso molecular preliminares e as frações V2 desejadas foram reunidas e testadas quanto a níveis de endotoxina e concentração utilizando Charles River EndoSafe PTS and NanoDrop ND-1000. Foi utilizado tampão V2 para eluir o V2 desializado.

[114] Foram executados cinco lotes de exclusão de tamanho e os eluídos recolhidos foram reunidos em um só lote, que foi concentrado a 1,0 mg/mL em Ultracels. A preparação final foi submetida a filtração estéril através de filtros de seringa de 0,2 mícrones e foi testada quanto à endotoxina e concentração. Foram pipetadas alíquotas de 1 mL em tubos de ensaio rotulados de 2 mL (Sarstedt, 72.694.006), submetidas a congelação relâmpago em etanol/gelo seco e guardadas em uma caixa identificadas a -80°C até à utilização.

Caracterização - Dados Analíticos da Proteína e Análise In Vitro

[115] O material da preparação final, assim como o material de partida sem tratamento foram caracterizados por meio de análise do gel de proteína com 4-12% Bis-Tris NuPAGE (Novex NP0335BOX) em tampão contínuo MES e por análise por exclusão de tamanho (coluna TSK3000; tampão contínuo: 200 mM de KH2PO4, 150 mM de KCl, pH 6,8, caudal: 0,15 mL/min, detecção por fluorescência). Foi analisado o teor de ácido siálico de pequenas amostras por meio de LC-MS na cadeia pesada do Fator VII e foi também quantificada o ácido siálico marcado-DMB da proteína total com um conjunto Takara Bio Inc. já abordado neste documento. A atividade foi testada por ativação do Fator X dependente dos fosfolípidos e análises de geração de trombina.

Análise do Teor de Ácido Siálico

[116] Foi empregue um método LC-MS para identificar o ácido siálico do N-glicano da cadeia pesada do Fator VII para o controle sem tratamento e Fator VII desializado. 10 μg de proteína foram reduzidos com 10 mM de mistura DTT a 37oC durante 30 min e depois analisados em Agilent 1200 Capillary LC System: Coluna: PLRP-S 8 μm 4000A, 0,3x150 mm, 75°C. Sistemas tampão: A: Água com ácido fórmico 0,2% + TFA 0,01%; B: ACN com ácido fórmico 0,2% + TFA 0,01%. Gradiente: 50 μL/min, 10% B em 2 min, a 90% B em 25 min, 90% B lavagem 5 min, 10% B equilíbrio durante 5 min.

[117] Sistema Agilent 6520 Q-TOF: Fonte DualEsi, temp gás: 350°C, gás secagem: 7 psi, nebulizador: 10 psi, intervalo de detecção: 500-3000 amu, 1 spectro/s. Ions de referência: 1221.990637 e 2421.91399 amu, janela 50 ppm, Min 1000 contagens.

[118] Os resultados encontram-se apresentados na FIG. 7. Quantificação do Ácido Siálico com Conjunto de Marcação DMB

[119] Conjunto de Marcação por Fluorescência de Ácido Siálico (Takara Bio Inc., Cat#4400) destina-se à análise quantitativa e muito sensível de sialoglicoconjugados. Esta técnica de marcação por fluorescência de ácido siálico à base de HPLC, utilizando 1,2-diamino- 4,5-metilenoxibenzieno (DMB) é um método quantitativo simples e muito sensível. Neste método, ácidos siálico livres são analisados por HPLC de fase inversa (GlycosepR, from Glyko, # 1-4727) após marcação por DMB.

Conclusão

[120] A cadeia pesada V2 possui dois ponto de N-glicosilação. Os N-glicanos são estruturas bi, tri e tetra fucosiladas, fortemente sialiladas. Não foram encontrados ácidos siálicos terminais na amostra desializada, o que sugere que a amostra está totalmente desializada e que >99,9% do ácido siálico no Fator VII N-glicano foi removido.

[121] Análise da Meia-vida Utilizando Hepatócitos de Rato

Preparação dos Hepatócitos

[122] Foram obtidos hepatócitos de rato primários criopreservados da CellzDirect (Invitrogen). Cada frasco contendo aproximadamente 5 milhões de células foi descongelado e as células foram adicionadas a 10 mL de Meio Descongelante, seguido de centrifugação a 60 g durante 3 minutos. As células foram ressuspensas em Meio de Incubação + BSA a 0,25% (cerca de 4 mL) e as células foram contadas com um hematocitômetro. As células viáveis foram contadas após coloração com azul de tripano para identificar as células mortas. A viabilidade celular foi de 80-82%. As células foram utilizadas na análise de eliminação imediatamente após a contagem.

[123] Meio de descongelação: Invitrogen CM3000 Pacote de Suplemento Descongelação/Aplicação em Placas adicionado a 500 mL de meio de Williams E. Meio de Incubação: Invitrogen CM4000 Pacote de Suplemento de Manutenção de Células adicionado a 500 mL de meio de Williams E.

Análise de Eliminação de Hepatócitos In Vitro

[124] Hepatócitos primários de rato, 1 milhão de células viáveis por mL, foram incubados com 25 ng/mL de várias variantes de Fator VII em Meio de Incubação CellzDirect + 0,25% de BSA em tubos Eppendorf, submetidos a mistura com inversão a 37°C em um volume de partida de 1,2 mL. Em cada um dos momentos indicados, 0,25 mL da mistura foram removidos e imediatamente centrifugados para aglomerar as células (1000 rpm, 3 minutos em centrifuga de tubos Eppendorf). Foram removidos 0,18 mL do sobrenadante clarificado, foram rapidamente congelados e mantidos de um dia para outro a -80°C. No dia seguinte, o Fator VII nos sobrenadantes foi quantificado por meio de ELISA, tendo-se utilizado a proteína mutante purificada correspondente como padrão. Foram utilizados sobrenadantes de controle sem células, nos quais as variantes de Fator VII foram incubadas durante 2 horas a 37°C só em meio, como valores do momento zero. Cada incubação foi executada em triplicado. Os valores intrínsecos de eliminação foram calculados com base no método de Lu et al. (Lu ref.) utilizando a equação CLint = 0.693 / in vitro T1/2, normalizada para o volume de incubação e para o número de células. Calculou-se a meia-vida in vitro (T1/2) com o programa WinNonLin (Pharsight Corporation, Sunnyvale, CA). Os sobrenadantes das incubações de hepatócitos foram analisados utilizando um formato Duplo Anticorpo-Elisa e Sandwich- Elisa. 0,1 mL por poço de anticorpo monoclonal anti-Fator VII (1,0 μg/mL em PBS) foram adicionados a placas de 96 poços Greiner Microlon 655061. Após incubação de um dia para outro a 4 °C, as placas foram bloqueadas com 0,2 mL por poço com tampão de bloqueio caseína 1% (50 mM de TrisHCl, 100 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20, pH 7,2) durante 1,5 horas a 37°C. As placas foram lavadas por quatro vezes com 0,3 mL por poço PBS + 0,05% de Tween 20 (utilizando um lavador de placas BioTek ELx405) e depois foram adicionadas às placas amostras padrão e desconhecidas do Fator VII relevante. Diluíram-se 0,18 mL de cada sobrenadante de hepatócitos duas vezes através da adição de 0,18 mL do tampão de diluição (50 mM de TrisHCl, 100 mM NaCl, 0,1% de caseína, 0,05% de Tween 20, pH 7,2). Adicionaram-se 0,10 mL de cada sobrenadante diluído em triplicado à placa ELISA. Os padrões foram feitos a partir da variante do Fator VII purificado, diluído com tampão de diluição. As diluições em séries de duas vezes do padrão foram executadas em tampão de diluição para render diluições entre 50 e 0,8 ng/mL de concentração final. Os padrões e amostras de Fator VII (0,1 mL por poço) foram incubados 2 horas à temperatura ambiente (21°C). As placas foram lavadas quatro vezes, como anteriormente descrito, e depois adicionou-se anticorpo de detecção biotinilado, 1 μg/mL em tampão de diluição (50 mM de TrisHCl, 100 mM de NaCl, 0,1% de caseína, 0,05% de Tween 20 pH 7,2) (0,1 mL por poço) seguido de incubação durante 1,5 horas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas quatro vezes, como anteriormente descrito, e depois adicionou-se estreptovidina-peroxidase de rábano diluído em 1/1000 em tampão de diluição (0,1 mL por poço) seguido de incubação durante 1 horas à temperatura ambiente. As placas foram novamente lavadas e adicionou-se Ultra-TMB, 0,1 mL por poço. Após a incubação durante 10 a 15 minutos à temperatura ambiente, a reação foi parada com adição de 0,05 mL por poço de H2SO4 2 M. Procedeu-se a uma leitura da absorvância a 450 nm com um leitor de placas Molecular Devices Spectramax M2 A análise dos dados foi executada com Softmax Pro 5.4 (Molecular Devices).

[125] Os hepatócitos de rato criopreservados, o meio de descongelação e o meio de incubação (CellzDirect) eram da Invitrogen/Life Technologies (Grand Island, NI). Substrato 1-Step Ultra- TMB (One Step), no. do catálogo 34028, era da Thermo Scientific (Rockford, IL) estreptavidina-peroxidase de rábano (SA-HRP), no. do catálogo DY998, era da R&D Systems, Minneapolis, MN. A solução salina tamponada com fosfato, pH 7,2 era da Invitrogen (Carlsbad, CA). O plasma de ratos Sprague-Dawley (anticoagulante de 5% de citrato de sódio) era da Bioreclamation (Westbury, NI). As placas Greiner Microlon (n° cat. 655061) foram obtidas junto da Fisher Scientific (Pittsburgh, PA).

Métodos para obter Variantes Desglicosiladas: Variantes Moleculares

[126] O Fator VII de tipo selvagem possui dois N-glicanos (N322 e N145) e V1 e V2 possuem cada um 4 N-glicanos (N106, N145, N253, N322). Os 2 N-glicanos adicionais (N106, N253) que se encontram em V1 e V2 foram originalmente concebidos para aumentar a meia-vida. Para este trabalho, estes sítios são removidos através ide inversão de volta para a sequência de aminoácidos endógena do Fator VII de tipo selvagem (T106, V253). Os 2 locais N-glicano endógenos restantes (N145 e N322) foram depois removidos ao nível do ADN mediante modificação nas mutações N^Q nestes locais. (FIG. 6)

[127] O Fator VII de tipo selvagem foi clonado em pmCMV para preparar pMB113. Inserções contendo uma única mutação N a Q nas posições aa145 ou 322, assim como o duplo mutante (aa 145 e 322) foram sintetizados e clonados em pMB113 utilizando o local XbaI e Pm1I resultante nos clones pMB114-116. As inserções que codificam os domínios Gla de V1 e V2 foram depois clonadas em pMB113-116 utilizando AscI e AfeI e resultaram em construções pMB117-120 (variantes com base em V1) e pMB121-124 (variantes com base em V2). Foram verificadas as sequências de todas as construções (McLab). As células de mamífero (linhagem de células derivada de CHO) foram transfectadas provisoriamente através de eletroporação com cada construção em um formato de 6 poços. 4 dias após a transfecção recolheu-se o sobrenadante e analisou-se a expressão por Mancha de Western, seguido de hVII ELISA (AssayPro) e análise da atividade de FVII. Um subconjunto de variantes foi depois clonado em uma célula única. A variante de 2-N-glicano de V2, designada pMB121, foi purificada e ativada para análise mais detalhada.

[128] Método de Purificação/Ativação de FVIIa a partir de 10L WAVE Expression

Resumo do Método

[129] A purificação e ativação de FVII a partir de meios submetidos a diafiltração concentração condicionamento foi realizada com um processo multi-fásico que teve lugar ao longo de vários dias. Os meios são primeiro descongelados e centrifugados para remover qualquer agregado que possa ter formado durante a congelação/descongelação. Foi empregue uma fase de captura por pseudoafinidade, empregando uma coluna de permuta aniónica (Q-Spharose) eluída com CaCl2 para concentrar ainda mais a proteína FVII e para trocar o tampão. Em seguida foi utilizada uma coluna de hidroxiapatite para purificar mais a proteína FVII. É então utilizada uma coluna de Q-Sepharose mais pequena para purificar ainda mais FVII antes de ser ativada durante 24 horas em solução a pH 7,8 - 8,2. A reação de ativação foi parada reduzindo o pH para 4,0. O FVIIa é finalmente dializado em tampão de formulação (pH 6,5) e guardado congelado.

[130] A proteína purificada final é caracterizada por SDS-PAGE, aSEC, ELISA, glicoanálise, endotoxina e análise da atividade de

FVIIa. FVII ELISA

[131] Imunoensaio ligado a enzima Zymutest FVII (Aniara, West Chester, Ohio). O ELISA é um imunoensaio em dois locais com o anticorpo policlonal de coelho anti-FVII ligado aos poços de uma microplaca de 96 poços. A amostra é introduzida seguida de anticorpo policlonal coelho anti-FVII acoplado a peroxidase de rábano (HRP). Estas análises foram executadas segundo as instruções do fabricante. Em resumo, as amostras e o calibrador foram diluídos em tampão de análise, em uma placa de diluição de polipropileno de fundo redondo, com 96 poços Foram transferidas alíquotas de 50 μL da amostra diluída para se obter uma placa revestida com coelho anti-FVII e incubadas durante 15 minutos à temperatura ambiente. Adicionaram-se 200 μL de coelho anti-FVII acoplado a HRP e incubaram-se durante 1 hora à temperatura ambiente. A placa foi lavada 5 vezes com 300 μL do tampão de lavagem fornecido. Adicionou-se TMB a 200 μL/poço e incubou-se durante aproximadamente 5 minutos à temperatura ambiente. A reação foi parada mediante a introdução de 50 μL de ácido sulfúrico a 0,45 M. A absorvância foi lida a 450 nm. Os níveis de Fator VII foram derivados através da comparação de valores da amostra com uma curva de calibração V2 gerada utilizando um ajuste à curva de 4 parâmetros.

Análise Cromogênica do Fator VII

[132] Empregou-se a análise cromogênica Biophen FVII (Aniara, West Chester, Ohio) o princípio da análise cromogênica envolve a formação de um complexo enzimático constituído pelo Fator VII da amostra e tromboplastina de coelho (Fator tecidual) fornecido pelo fabricante. FX, adicionado em excesso, é ativado para FXa, que, por sua vez, cliva um substrato cromogênico específico FXa (SXa-11) gerador de pNA. A quantidade de pNA libertada é diretamente proporcional à atividade FXa. A análise foi executada segundo as instruções do fabricante. Em resumo, as amostras e o calibrador foram diluídos em tampão de análise Tris-BSA, em uma placa de diluição de polipropileno de fundo redondo, com 96 poços (Fisher Scientific). Os reagentes do conjunto, R1, R2, e R3 e uma placa de polistireno de fundo chato, de 96 poços (Costar) foram aquecidos a 37°C antes da utilização. 30 μL da amostra e o calibrador foram transferidos da placa de diluição para a placa de análise, seguido de 30 μL do reagente R2, depois 60 μL do reagente R1. A placa de análise foi misturada e incubada durante 7 minutos a 37°C em um agitador de placas modelo jitterbug (Boekel Scientific). Foram adicionados 60 μL de R3 e a taxa de alteração da absorvância (alteração de OD a 405 nm/min) foi medida a 37°C utilizando um leitor de microplacas SpectraMax Plus (Molecular Devices). Os níveis de Fator VII foram derivados através da comparação de valores da amostra com uma curva de calibração V2 gerada utilizando um ajuste à curva de 4 parâmetros.

Análise de Geração de Trombina Dependente do Fosfolípido

[133] Em comparação com FVIIa de tipo selvagem, a modificação do domínio Gla (P10Q/K32E) aumenta a potência em ativação FX, a geração de trombina e a coagulação global do sangue na presença de fosfolípidos aniónicos ou plaquetas ativadas em resultado de y- carboxilação adicional. TGA dependente de PL foi concebido para medir a atividade rFVIIa na presença de fosfolípidos aniónicos e foi executado utilizando o calibrador de trombina e o reagente de substrato FluCa-kit, da Thrombinoscope, BV. Vesículas de fosfolípidos (PL) constituídas por 20% de fosfatidilserina (PS), 40% de fosfatidiletanolamina (PE) e 40% de fosfatidilcolina (PC) eram da Avanti Polar Lipids e foram preparadas por sonicação em 10 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl (pH 7,2) durante 10 minutos.

[134] Dispensaram-se vinte μL de vesículas PL (500 μM) ou calibradores de trombina em placas de 96 poços. Foram diluídas concentrações variáveis de rFVIIa em plasma HemA humano, adicionadas em triplicado à mistura PL e equilibradas a 37°C durante 10 min. As reacções de geração de trombina foram iniciadas com a adição de solução FluCa e as reacções foram monitorizadas constantemente durante 60 minutos, permitindo o método de Trombografia Automática Calibrada (CAT) definida por ThrombinoscopeBV. Os dados adquiridos e analisados utilizando o software ThrombinoscopeBV (3.4.0), que corrigiram para uma atividade de macroglobulina α2 com um calibrador de trombina. O parâmetro de análise 'altura do pico' representava o nível máximo de trombina gerado, 'potencial de trombina endógena' (ETP) correspondia à quantidade total de trombina gerada. Os parâmetros de geração de trombina foram analisados com um método de ajuste da curva não linear, de 4 parâmetros, utilizando Prism 4.0 (GraphPad Inc).

Análise de Ativação FX Dependente do Fosfolípido

[135] A capacidade de FVIIa para activar FX na presença de vesículas de fosfolípido sem Fator tecidual foi medida com uma análise de ativação de FX dependente de PL. Incubam-se Fator VIIa ou variantes de FVIIa com FX na presença de vesículas de fosfolípido. A ativação de FX é medida mediante a adição de S-2765, um substrato cromogênico para FXa. Resumidamente, diluem-se calibrador e amostras em uma placa de fundo redondo, de polipropileno em tampão Trisd-HCl. 30 μL de FX 4 μg/mL (Haematologic Technologies Inc.) foram adicionados a todos os poços de uma placa de polistireno de fundo redondo, de 96 poços, seguido de 30 μL de vesículas de fosfolípidos que consistem em fosfatidilserina, fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina em uma proporção em peso de 20:40:40. Foram transferidos 30 μL de amostra diluída e calibrador para a mistura FX/fosfolípido. A placa foi selada, misturada suavemente e incubada durante 20 - 23 horas a 37°C. Adicionaram-se 40 μL de uma solução 5 mM de S-2765 (DiaPharma) a todos os poços. A placa foi selada e incubada durante 6 horas a 37 °C. A absorvância foi lida a 405 nm em um leitor de microplacas. Foi determinada a atividade das amostras através de comparação dos níveis de ativação FX das amostras com uma curva de calibração F7.

[136] Estudo rato PK, Protocolo do estudo (injec de preps, colheita de amostras de sangue e prep, ELISA, análise de dados, sacrifício dos animais).

[137] Foram administradas as proteínas (F7, V2, V1 , dV2 e dV1) por via intravenosa a 0,1 mg/kg em ratos Sprague Dawley Foram recolhidas amostras de plasma com início 1 min após a administração e foram analisadas por ELISA FVII.

[138] Estudo HemA-PK

[139] Foram administradas proteínas (F7, dV1) i.v. a 1,0 mg/kg em ratinhos HemA. Foram recolhidas amostras de plasma com início 5min após a administração e foram analisadas por ELISA FVII e análise sTF- PT.

[140] ELISA FVII em Amostras de Plasma

Materiais

[141] Foram utilizados anticorpos monoclonais contra FVIIa. Um anticorpo monoclonal adicional foi biotinilado. Foram utilizadas variantes de FVIIa purificado (tipo selvagem ou desializado) como calibradores de análise e controles de análise. O tampão de bloqueio é 1% (p/v) de caseína em 30 mM de Tris pH 7,2, 60 mM de NaCl, 0,03% de Tween- 20. O tampão de diluição de análise (ADB) é 0,1% (p/v) de caseína, 50 mM de Tris pH 7,2, NaCl 0,1 M, 0,05% de Tween-20. O tampão de lavagem é PBS + 0,05% Tween-20. As placas de imunoensaio são placas high-binding Greiner Microlon (#655061). A estreptavidina- peroxidase de rábano (SA-HRP) é da R&D Systems. Substrato HRP Ultra-TMB é da ThermoFisher Pierce. Foi obtido plasma de rato simples de ratinhos CD1 ou HemA, tanto comercialmente (Bioreclamation) ou através de fontes internas. Todos os outros materiais (caseína, Tris, NaCl, Tween-20, PBS, ácido sulfúrico) são de qualidade de nível de reagente.

Método para Imunoensaio sanduiche FVIIa

[142] Placas de análise de 96 poços foram revestidas com 0,1 mL/poço de anticorpo anti FVIIa, 1 μg/mL em PBS de um dia para outro a 4°C. As placas foram aspiradas e bloqueadas com 0,2 mL/poço de tampão de bloqueio durante pelo menos 2 h à temperatura ambiente com rotação (150 rpm). Após o bloqueio, os poços foram lavados 4 x 0,3 mL/poço de tampão de lavagem. As amostras ou padrões de FVIIa foram diluídos 1:20, até uma concentração final de 5% de plasma em ADB e incubadas 0,1mL/poço durante pelo menos 1,5 h à temperatura ambiente, com rotação. Todos os padrões, controles e amostras foram medidos em poços em triplicado. Depois de lavar as placas como anteriormente descrito, adicionou-se anticorpo contra FVIIa biotinilado, 42 ng/mL em ADB, 0,1 mL/poço e as placas foram incubadas durante pelo menos 1 hora a temperatura ambiente com rotação. As placas foram lavadas, seguido de incubação com estreptavidina-HRP, 1:1000 em ADB, incubando pelo menos 1 hora à temperatura ambiente com rotação. Após uma lavagem final da placa, os poços foram revelados com 0,1 mL/poço de Ultra-TMB, parando a reação com 0,05 mL/poço de ácido sulfúrico 2M. As reacções paradas são lidas a OD-450 nm e os dados são analisados e calibrados. O limite inferior da quantificação (LLOQ) para a análise é tipicamente de 15-30 ng/mL de FVIIa em plasma a 100%.

[143] Análise PT Modificada com Base em Fator Tecidual Solúvel (sTF) para Medir a Atividade rFVIIa

[144] Uma análise do tempo de protrombina (PT foi executada para medir a atividade de rFVIIa humano em amostras de plasma de ratinhos HemA ex vivo.

[145] Resumidamente, 50 μL de amostra contendo plasma de ratinho HemA a 10% e plasma deficiente em FVII humano a 50% (George King Inc) em tampão aPTT (NaCl 0,15 M, Tris 0,05 pH 7,5, BSA 0,1%) foram misturados com 50 μL de reagente sTF-PT e incubados a 37 °C durante 30 seg. O reagente sTF-PT era constituído por 1 volume de 2 μM de TF solúvel humano recombinante (sTF1-221) e 1 volume de 8 μM de vesículas de fosfolípido (PS20:PC40:PE40). A coagulação foi iniciada com a adição de 50 μL de 25 mM de CaCl2 e o tempo de coagulação foi registado em um Analisador de Coagulação STA (Diagnostica Stago Inc). Os padrões consistiam em rFVIIa (variantes wt- rFVII ou rFVIIa) diluídos 2 vezes em série a partir de 200 a 0,78 ng/mL.

[146] A eficácia de V2 desializado em ratinhos com hemofilia A (HemA)

Estudo de Eficácia em Corte da Cauda Agudo

[147] Para determinar a perda de sangue, os ratinhos foram anestesiados com isoflurano e as caudas foram colocadas em tubos de plástico de 15 mL com soro fisiológico a 0,9%, aquecido entre 37-38°C durante 10 min. A cauda foi cortada a 4 mm da ponta com bisturi e foi imediatamente recolocada em um tubo de plástico de 15 mL pré- aquecido separado, contendo 10 mL de soro fisiológico. O ratinho foi deixado sangrar livremente durante 40 min. V2 e F7 desializado foram doseados por via intravenosa, ou 5 minutos depois ou 15 e 30 minutos antes do corte da cauda. Foi quantificada a perda de sangue por gravimetria, pesando os tubos antes e depois da recolha do sangue.

Estudo da Eficácia da Trans-secção da Veia Caudal (TVT)

[148] Ratinhos HemA receberam uma dose de V2 ou F7 desializado por injecção na veia caudal 1 hora antes ou 5 min depois da lesão por trans-secção da veia caudal. Foi aplicada anestesia apropriada. A veia caudal foi trans-seccionada com um bisturi de lâmina reta #11 e foi iniciada a contagem do tempo. O ratinho foi devolvido à respectiva gaiola limpa individual com o fundo coberto por uma folha de papel branco (Versi-Dri™) aplicado sobre uma almofada térmica de 4x8 polegadas. Monitorizou-se hora a hora o estado da atividade do animal durante as 9 horas seguintes e no momento 24 h. Qualquer ratinho que revelasse sinais de redução do nível de atividade era apontado no formulário de monitorização e qualquer ratinho que revelasse sinais de hemorragia excessiva foi prontamente submetido a eutanásia.

Análise Trombina-Antitrombina (TAT em Plasma de Ratinho HemA Reagentes:

[149] (1) Anticorpo de captura: Anticorpo policlonal anti-trombina da Enzyme Research Labs, Cat#TAT-EIA-C.; (2) Anticorpo de detecção: anticorpo policlonal anti-AT-III conjugado com HRP da Enzyme Research Labs, Cat#TAT-EIA-D, (3) Diluente de análise da Enzyme Research Labs, Cat#TAT-EIA-D, (4) Substrato HRP: Amplex Red, Invitrogen, cat#A12216, (5) Alfa-trombina: da Enzyme Research Labs, Cat#HT-1002a, guardado a -80°C, (6) AT-III: da Enzyme Research Labs, Cat# HAT, guardado a -80oC, (7) BSA: da Sigma, Cat# A-7030; (8) Plasma deficiente AT-III: Adquirido junto da Enzyme Research Labs, Cat: AT-DP, guardado a -80oC. tampões (1) Tampão padrão TAT: 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 1 mM de EDTA, 0,05 U/mL de heparina; (2) Tampão de revestimento: 1 comprimido de bicarbonato + 100 mL de dH20, guardar a 4°C; (3) tampão de bloqueio: 2% BSA-PBS; (4) Tampão de diluição da amostra: adicionar 0,1 M de HEPES, pH 7,4, 0,15 M fr NaCl, 1% BSA, Tween 20 a 0,05%, filtro e alíquota, guardar a -20°C; (5) Tampão substrato: adicionar 50 μL de 5 mg/mL de Amplex Red, 20 μl de H2O2 3% a tampão PBS. Misturar preparado de fresco antes de adicionar às placas; (6) Preparação de 1 μM de caldo padrão TAT: adicionar 100 μL de AT-III humano a 1,36 mg/mL e 5,93 μL de trombina humana a 3,28 mg/mL a 419 μL de tampão TAT, misturar, incubar 10-20 min a 37°C; (7) Preparação de 60 nM de caldo padrão TAT: Adicionar 50 μL de complexo TAT 1 μM a 783 μL de plasma deficiente em AT-III, misturar. Alíquotas de 50 μL/frasco, guardar a -80°C. Procedimento de análise 1. Diluir anti-trombina pAb (anticorpo de captura) em tampão de bicarbonato (diluição 1:100: para uma placa de 96 poços, adicionar 100 μL de anticorpo a 11 mL de tampão bicarbonato). 2. Adicionar 100 μL de anticorpo de revestimento diluído a cada poço, em uma placa de 96 poços 2HB Immulon. Bater suavemente na placa para garantir que todo o líquido cobre o fundo da placa. Selar a placa e incubar de um dia para outro a 4°C. 3. Lavar 4 vezes com 300 μL de tampão de lavagem em um lavador de placas automático. Após a última lavagem, inverter a placa e bater contra uma toalha de papel limpa. 4. Adicionar 150 μL de tampão de bloqueio (BSA-PBS 2%) a cada poço. Selar a placa e incubar à temperatura ambiente durante 1,5 horas. 5. Lavar 4 vezes com 300 μL de tampão de lavagem com um lavador de placas automático. Após a última lavagem, inverter a placa e bater contra uma toalha de papel limpa. 6. Adicionar 100 μL de padrão, amostra e QC a cada poço em triplicado e incubar as placas à temperatura ambiente durante 2 horas, à temperatura ambiente 7. Lavar 4 vezes com 300 μL de tampão de lavagem com um lavador de placas automático. Após a última lavagem, inverter a placa e bater contra uma toalha de papel limpa. 8. Adicionar 100 μL de anticorpo de detecção HRP (1/100, adicionar 100 μL de anticorpo a 11 mL de diluente conjugado) a cada poço. Selar a placa e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente 9. Lavar 4 vezes com 300 μL de tampão de lavagem com um lavador de placas automático. Após a última lavagem, inverter a placa e bater contra uma toalha de papel limpa. 10. Adicionar 70 μL de substrato Amplex Rd (preparado de fresco) a cada poço. 11. Colocar a placa no escuro, à temperatura ambiente e incubar durante 15-30 min. 12. Proceder à leitura da placa a OD485nm/595nm. 13. Elaborar um gráfico dos padrões com ajuste de curva de [4] parâmetros; Concentração a partir de controles e de cada amostra foi calculada a partir do padrão em cada placa ELISA.

[150] A Eficácia de V2 Desializado em Ratinhos com Capacidade de Coagulação Normal

[151] Um estudo de corte da cauda agudo foi executado para determinar a eficácia de dV2 em ratinhos com capacidade de coagulação normal. Os ratinhos com capacidade de coagulação normal foram anestesiados com isoflurano e as caudas foram colocadas em tubos de plástico de 15 mL com soro fisiológico a 0,9% aquecido entre 37 e 38°C durante 10 min. Após administração iv de 5 mg/kg de ativador do plasminogênio tecidual (tPA), a cauda foi cortada a 50 mm da ponta com bisturi e foi recolocada em um tubo de plástico de 15 mL pré- aquecido separado, contendo 10 mL de soro fisiológico. Administrou-se por via intravenosa uma dose de V2 e F7 desializado imediatamente após o corte da cauda. O ratinho foi deixado sangrar livremente ao longo de 45 min. Foi quantificada a perda de sangue por gravimetria, pesando os tubos antes e depois da recolha do sangue.

Resultados Caracterização in vitro de Proteínas Desialiladas ou Deglicosiladas

[152] A cadeia pesada de dV2 foi analisada por LC-TOF MS. Análise mostrou que os Glicanos-N na cadeia pesada não continham ácido siálico pós tratamento sialidase. Esta análise na cadeia leve foi complicada pela presença do domínio Gla. Para se obter uma imagem global do conteúdo de ácido siálico da molécula de tratamento, foi realizada a marcação por fluorescência de Ácido Siálico. Este método mostrou que mais do que 99,9% de ácido siálico foi removido na V2 durante o processo de desialilação. FIG. 7 apresenta a análise de V2 desialilada para conteúdos de ácido siálico. Foi utilizado a análise LC- TOF-MS e Marcação por Fluorescência de Ácido Siálico. Análise do conteúdo de ácido siálico foi realizada na dV1 assim como com resultados semelhantes (dados não apresentados). As moléculas desialiladas foram testadas para atividade de ativação de Xa fosfolípida- dependente e ensaio TGA fosfolípido-dependente. Os ensaios PL-Xa e PL-TGA demonstraram que a atividade das proteínas pós desialilação não foi reduzida. (Ver FIG. 9 e FIG. 10). FIG. 9 mostra ensaio de ativação PL-FXa em proteínas desialiladas. V1 e V2 desialiladas (dV1, dV2) foram testadas para atividade utilizando ensaio de ativação FXA fosfolípido. Ambas as proteínas desialiladas revelaram atividade ligeiramente mais alta neste ensaio comparativamente às suas moléculas progenitoras não modificadas. FIG. 10 mostra ensaio PL- TGA em proteínas desialiladas. Por PL-TGA, dV2 e dV1 exibiram atividade ligeiramente aumentada sobre as suas moléculas progenitoras não modificadas. Resultados foram normalizados para F7.

[153] O ensaio PL-Xa mostrou consistentemente um aumento medível na atividade de dV2 e dV1 sobre as suas moléculas progenitoras não modificadas. A wtFVIIa hipoglicosilada e as moléculas V2 e V1 foram expressas (FIG. 11) e testadas como extratos de expressão em bruto tanto para expressão como atividade. FIG. 11 apresenta a expressão de variantes de FVII hipoglicosiladas. Foram analisadas amostas do meio 4 dias após eletroporação por expressão FVII. Análise Western blot utilizando um anticorpo do domínio anti-Gla apresenta uma expressão das variantes. A remoção de locais N-Glicano não parecem afetar atividade quando normalizados para níveis de expressão. FIG. 12 apresenta determinação de "atividade específica" de variantes FVII hipoglicosiladas utilizando sobrenadantes de transfecção. A atividade dos sobrenadantes de expressão em bruto das duas transfecções transientes das variantes hipoglicosiladas foi testada pelo ensaio de atividade Xa. Quando normalizada para expressão como medido pela ELISA, não foi notada qualquer redução na atividade como resultado de remoção de N-Glicano. Como esperado neste ensaio, as proteínas V1 e V7 apresentaram atividades semelhantes enquanto as moléculas V2 apresentaram uma atividade mais baixa, um resultado da sua TF-independência. Esta situação foi ainda demonstrada pelo ensaio de atividade PL-TGA realizado em V2 hipoglicosilada purificada com apenas 2N-Glicanos (N322 e N145) referido como pMB121. FIG. 13 apresenta ensaio PL-TGA em uma variante pMB121 hipoglicosilada purificada. Por ensaio PL-TGA, pMB1212 mostra atividade aumentada sobre F7 semelhante a V2 não modificada. Eliminação in vitro destas moléculas foi testada em um modelo de eliminação de hepatócitos. dV2 demonstrou uma eliminação semelhante neste modelo sobre V2 não modificada (FIG. 14), enquanto nenhum aumento ou aumento marginal na eliminação foi observado para as variantes hipoglicosiladas (FIG. 15).

Rat PK e HemA PK

[154] Estudos farmacocinéticos em ratos Sprague Dawley demonstraram que as proteínas desialiladas e hipoglicosiladas eliminaram significativamente mais rápido comparativamente às suas contrapartes não modificadas tal como medido por uma ELISA FVII. FIG. 16 mostra os resultados de ratos farmacocinéticos. Meia-vida das V2 e V1 desialiladas revelaram-se significativamente mais curtas do que das suas moléculas progenitoras não modificadas em ratos Sprague Dawley tal como avaliado por ELISA Fator VII. Isto foi verdade para V2 desialilada, V1 desialilada e pMB121 (V2 hipoglicosilada). A t1/2 para ambas as moléculas desialiladas foi inferior a 1 minuto enquanto a t1/2 das suas proteínas parentéricas foi de aproximadamente 2,5 horas. A eliminação da molécula pMB121 V2 hipoglicosilada foi equivalente à da F7 com uma t1/2 de 1,6 horas. O estudo PK em ratinhos HemA revelou um resultado similar ao dV2 e F7 com meia-vidas de aproximadamente 3 minutos e 2,6 horas, respectivamente (FIG. 17 (A)). A meia-vida curta foi confirmada pelo ensaio de coagulação sTF-PTT (FIG. 17 (B)). FIG. 17 mostra os resultados de HemA PK. A meia-vida de V2 desialilados foi significativamente mais curta comparativamente às suas moléculas progenitoras não modificadas em ratinhos HemA como medido pela A) FVII ELISA e B) ensaio sTF-PT.

Modelos de Eficácia HemA

[155] dV2 foi testada em ratinhos HemA para eficácia. Utilizando o modelo de corte da cauda HemA, dV2 revelou ser eficaz a uma dose de 1 mg/kg (bolus, iv). Por comparação, neste modelo, a dose de eficácia para F7 foi de 2,5 mg/kg (bolus, iv). Estes resultados demonstram que dV2 é mais eficaz que F7 (FIG. 18 (A)). Este modelo foi igualmente utilizado para mostrar que a eficácia de dV2 é eliminada mais rapidamente do que a de F7 (FIG. 18 (B)). FIG. 18 apresenta os resultados do estudo de eficácia de V2 desialilado em ratinhos HemA. Estudos com dV2 mostram que esta molécula é A) mais eficaz do que e B) possui eficácia de eliminação mais rápida do que F7 no modelo de corte da cauda de HemA.

[156] Utilizando o modelo TVT mais sensível, a eficácia de eliminação mais rápida de dV2 sobre F7 foi igualmente demonstrada e a dose eficaz confirmada. FIG. 19 apresenta um estudo de eficácia de dV2 em um modelo TVT HemA. Estudos TVT utilizando um modelo de eficácia (TVT) com maior sensibilidade confirmaram que dV2 tem uma eficácia de eliminação mais rápida do que F7. Medições Trombina Anti- Trombina (TAT) como um marcador de trombogenicidade realizada a 30 e 60 minutos após administração em ratinhos HemA revelou níveis significativamente mais baixos para dV2. FIG. 20 apresenta medições TAT. Em ratinhos HemA, dV2 administrada na sua dose eficaz (1 mg/kg) gerou menos Trombina Anti-Trombina (TAT) comparativamente à dose eficaz de F7 (2.5mg/kg). Estes dados, assumidos com os dados de eficácia, sugeririam que dV2 tem um índice terapêutica mais favorável que F7.

Eficácia em Ratinhos Competentes na Coagulação

[157] dV2 foi testada em ratinhos competentes na coagulação, tratados com tPA para eficácia. Utilizando o modelo de corte da cauda HemA, dV2 revelou ser eficaz a uma dose de -1mg/kg (bolus, iv). Por comparação, neste modelo, a dose de eficácia para F7 foi de 5mg/kg (bolus, iv). Estes resultados demonstram que dV2 é mais eficaz que F7 (FIG. 21). FIG. 21 apresenta os resultados do estudo de eficácia de V2 desialilado em ratinhos HemA.

Eliminação e Eficácia do Fator VII de Tipo Selvagem Desialilado (dWT VIIa)

[158] Fator VII de tipo selvagem desialilado (dWT VIIa) foi produzido como acima descrito utilizando NovoSeven® obtido da Novo Nordisk como o material de partida de Fator VII e desialilando esse polipeptídeo de partida utilizando enzima sialidase solúvel, tal como acima descrito. Foi constatado que a dWT VIIa tem uma pureza de >99% endotoxina baixa e nenhum ácido siálico detectável. Adicionalmente, análise de espectrometria de massa mostrou remoção seletiva de ácido siálico.

[159] A atividade deste material dWT VIIa foi analisada e comparada com o Fator VII de tipo selvagem utilizando o ensaio cromogênico Biophen FVII e ensaio PT modificado, tal como acima descrito. cada uma destas análises revelou que dWT VIIa tem uma atividade quase idêntica ao polipeptídeo do Fator VII de tipo selvagem.

[160] Eliminação de dWT VIIa e do Fator VII de tipo selvagem (1 mg/kg) foi igualmente analisada utilizando modelos de ratos e ratinhos knock-in com Fator de tecido humano (TFKI) . Tal como mostrado na Fig. 22, a meia-vida de dWT VIIa foi significativamente mais curta que o Fator VII de tipo selvagem e a eliminação (mL/h/kg) foi mais do que 40 vezes mais rápida.

[161] A eficácia de dWT VIIa em comparação com o Fator VII de tipo selvagem foi investigada utilizando ratinhos TFKI e o método de corte da cauda acima descrito. Resumidamente, 5 mg/kg tPA foi injetado por via intravenosa em ratinhos seguindo-se o corte da cauda 50 mm a contar da ponta. Fator VII de tipo selvagem (NovoSeven®) ou dWT VIIa foram depois injetado s por via intravenosa com dosagens que variavam de 1-6 mg/kg. O sangue foi depois colhido da cauda durante 45 minutos, com coágulos instáveis a ser interrompidos cada seis minutos ao longo do período da colheita. Tal como mostrado na Fig. 23, foi surpreendentemente constatado que o dWT VIIa era significativamente mais eficaz do que o Fator VII de tipo selvagem. Mais especificamente, uma dose de 3 mg/kg de dWT VIIa provocou uma perda de sangue reduzida comparativamente a uma dose de 6 mg/kg de Fator VII de tipo selvagem. Tendo em conta os resultados desta análise, foi determinado que 2 mg/kg dWT VIIa é uma dose bioequivalente a 6 mg/kg de Fator VII de tipo selvagem.

[162] A capacidade de dWT VIIa e Fator VII de tipo selvagem (NovoSeven®) causar coagulação sistêmica foi igualmente investigada pelo método Trombina Anti-Trombina (TAT) acima descrito. Os ratinhos foram tratados com doses bioequivalentes de dWT VIIa (2 mg/kg) e Fator VII de tipo selvagem (6 mg/kg) e depois a formação de complexos TAT foi avaliada por ELISA. Tal como mostrado na Fig. 24, o Fator VII de tipo selvagem da NovoSeven® deu lugar a um nível significativamente mais alto de TAT comparativamente a dWT VIIa. Considerando o fato de que dWT VIIa deu lugar apenas a níveis base de TAT, esta experiência sugere que esta dose de dWT VIIa não produz qualquer coagulação sistêmica observável, apesar do fato de que o polipeptídeo é tão eficaz como o Fator VII de tipo selvagem.

[163] Mais ainda, a capacidade de dWT VIIa e do Fator VII de tipo selvagem (NovoSeven®) causar a formação de trombos foi igualmente investigada em um modelo de trombose FeCl3. Os ratinhos foram tratados com doses bioequivalentes de dWT VIIa (2 mg/kg) e Fator VII de tipo selvagem (6 mg/kg) 15 minutos antes de iniciar o estudo trombose. Trombose foi iniciada com administração de uma solução de 3,25 % FeCl3 e depois a formação do trombo foi avaliada por Doppler durante 30 minutos. Os dados de fluxo de sangue foram registados em um fluxo de sangue versus gráfico de tempo e depois a percentagem da área sob a curva para a amostra de controle foi calculada para determinar a redução no fluxo de sangue provocado pela formação do trombo para cada grupo de tratamento com Fator VII. Tal como mostrado na Fig. 25, o Fator VII de tipo selvagem da NovoSeven® deu lugar a um nível significativamente mais baixo de fluxo de sangue (média aproximada de 40%) enquanto o dWT VIIa revelou quase nenhuma redução no fluxo de sangue (média >90%). Esta experiência demonstrou que a dose administrada de dWT VIIa produziu formação de trombos altamente reduzidos comparativamente ao Fator VII de tipo selvagem.

[164] A atividade e eficácia de dWT VIIa comparativamente ao Fator VII de tipo selvagem foi ainda investigada examinando as afinidades de ligação aparentes destes peptídeos para Fator tecidual solúvel (sTF) utilizando um substracto fluorogênico tripeptídico SN-17c (HTI). Tal como mostrado na Fig. 26, esta análise demonstrou que dWT VIIs (dF7) e Fator VII de tipo selvagem (F7) tinham afinidades de ligação aparente equivalentes para sTF. No entanto, tal como mostrado na Fig. 27, em um modelo experimental que examina a capacidade destes peptídeos ativarem o Fator VII por titulação da concentração do Fator X na presença de complexos de sTF-Fator VII (0,5 nM Fator VII [dWT VIIa ou tipo selvagem], 125 nM sTF), a cinética de Michaelis Menten para dWT VIIa e Fator VII de tipo selvagem mostram que a dWT VIIa (dF7) pode activar o Fator X de forma mais eficaz (aproximadamente duas vezes) do que o Fator VII de tipo selvagem (F7). Estes dados suegerem que a dWT VIIa tem capacidade para converter mais Fator X em Fator Xa pelo local activo do Fator VII do que a sua contraparte de tipo selvagem.

Discussão

[165] Existe uma necessidade médica não satisfeita de desenvolver um fármaco terapêutico que seja eficaz para o tratamento de hemorragia aguda mas com trombogenicidade reduzida. Um polipeptídeo do Fator VII eficaz com uma meia-vida curta resulta potencialmente em uma molécula com uma janela terapêutica maior adequada para a utilização em hemorragias agudas.

[166] V2 e V1 são duas variantes do Fator VIIa (FIGS. 1- 3). Estas variantes contêm mutações para os seus domínios Gla que aumentam a sua afinidade para plaquetas ativadas e, no cado de V2 resultam na independência do Fator tecidual. Ambas as variantes possuem igualmente dois locais adicionais de N-Glicosilação, o que resulta em uma meia-vida prolongada comparativamente ao Fator VIIa de tipo selvagem, uma característica que é vantajosa para o tratamento da hemofilia. No entanto, a sua utilização como tratamentos para hemorragia aguda beneficiaria de reduções na meia-vida. Esta modificação reduziria o risco de efeitos off-target (para além do alvo) e, consequentemente aumentaria o seu índice terapêutico. Mostrámos aqui que a remoção de ácido siálico presente em cadeias de carboidratos de V2 e V1 resultam na eliminação significativamente mais rápida das moléculas em um modelo de eliminação de hepatócitos in vitro. As variantes hipoglicosiladas não revelaram uma eliminação mais rápida neste modelo in vitro, o que sugere que o mecanismo de eliminação entre moléculas desialiladas e hipoglicosiladas é diferente. Estudos in vivo conduzidos em ratos Sprague Dawley demonstraram que as moléculas desialiladas (dV2 e dV1) bem como a variante pMB121 hipoglicosilada tinham reduzido significativamente a meia-vida. Interessante, V2 e V1 desialiladas tinham ambas taxas de eliminação aumentadas comparativamente à taxa reportada para FVIIa de tipo selvagem desialilado. (Appa et al, Thrombosis and Haemostasis 104.2/2010), uma característica que se pode dever aos seus 2 N- glicanos adicionais. Uma possível teoria para esta atividade, sem limitação do que é presentemente reivindicado, é que estes N-Glicanos extra poderiam, mediante desialilação, tornar-se ligandos adicionais para ASGPR ou receptor similar e mediar uma eliminação mais rápida. Atividades destes modelos foi retida ou aumentada em comparação com as suas moléculas progenitoras como medido por ensaios in vitro. Eliminação mais rápida de V2 foi ainda verificada in vivo em um estudo PK em ratos HemA e mostrou ser eficaz em estudos Hem de cauda cortada e TVT.

[167] Mais ainda, a desialilação do Fator VII de tipo selvagem produziu um polipeptídeo do Fator VII que foi eliminado muito mais rapidamente que o de tipo selvagem, facultando simultaneamente o resultado surpreendente de eficácia aumentada como mostrado em vários modelos experimentais.

[168] Remoção de N-glicanos ou modificação da composição monossacarídea dos N-glicanos do Fator VIIa ou variantes do Fator VIIa resulta em moléculas de eliminação mais rápidas. Estas moléculas retêm uma atividade e são eficazes in vitro. O desenvolvimento destas moléculas de Fator VII de eliminação rápida seria benéfico para o tratamento de indicações de hemorragia aguda assim como seria potencialmente um antidoto para vários anticoagulantes no mercado.

Claims

1. Variante polipeptídica isolada do Fator VII, caracterizada pelo fato de que é produzida em uma célula hospedeira de mamífero, em que o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e o polipeptídeo tem uma razão de moles de ácido siálico conjugado para moles de glicano N-ligado entre 0 e 2,0.

2. Variante polipeptídica isolada do Fator VII, caracterizada pelo fato de que é produzida em uma célula hospedeira de mamífero, em que o polipeptídeo consiste em uma sequência de aminoácidos apresentando duas alterações de sequência em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16, em que as duas alterações de sequência são: 1. ) um resíduo de glutamina substituindo o resíduo de prolina na posição 10, e 2. ) um resíduo de ácido glutâmico substituindo o resíduo de lisina na posição 32, e o polipeptídeo tem uma razão de moles de ácido siálico conjugado para moles de glicano N-ligado entre 0 e 2,0.

3. Variante polipeptídica isolada do Fator VII, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos da variante polipeptídica do Fator VII consiste em SEQ ID NO: 17.

4. Variante polipeptídica isolada do Fator VII, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a razão de moles de ácido siálico conjugado para moles de glicano N- ligado é inferior a 0,1.

5. Método para preparação da variante polipeptídica isolada do Fator VII, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende: (A) (1) obter um polipeptídeo de Fator VII sialilado que consiste em uma sequência de aminoácidos tendo SEQ ID NO: 17 ou uma sequência de aminoácidos tendo SEQ ID NO: 16 com duas alterações de sequência, em que as duas alterações de sequência de SEQ ID NO: 16 são (1) um resíduo de glutamina substituído pelo resíduo de prolina na posição 10, e (2) um resíduo de ácido glutâmico substituído pelo resíduo de lisina na posição 32; (2) contatar o polipeptídeo do Fator VII sialilado com sialidase sob condições tais que quantidades suficientes de resíduos de ácido siálico covalentemente ligados são removidos do polipeptídeo do Fator VII sialilado para produzir um polipeptídeo do Fator VII desialilado apresentando uma proporção de moles de ácido siálico conjugado para moles de glicano N-ligado entre 0 e 2,0; e (3) isolar a variante polipeptídica do Fator VII assim produzida; (B) (1) obter uma linhagem celular recombinante que coexpressa (a) um polipeptídeo do Fator VII recombinante que consiste em uma sequência de aminoácidos tendo SEQ ID NO: 17 ou uma sequência de aminoácidos tendo SEQ ID NO: 16 com duas alterações de sequência, em que as duas alterações de sequência de SEQ ID NO: 16 são (1) um resíduo de glutamina substituído pelo resíduo de prolina na posição 10, e (2) um resíduo de ácido glutâmico substituído pelo resíduo de lisina na posição 32, e (b) uma enzima sialidase recombinante; (2) cultivar a referida linhagem celular recombinante para permitir a expressão tanto do polipeptídeo do Fator VII recombinante quanto da enzima sialidase recombinante, sendo que a referida enzima sialidase recombinante remove quantidades suficientes de resíduos de ácido siálico covalentemente ligados para produzir um polipeptídeo do Fator VII desialilado com uma proporção de moles de ácido siálico conjugado a moles de glicano N-ligado entre 0 e 2,0; e (3) isolar a variante polipeptídica do Fator VII assim produzida; ou (C) (1) produzir um polipeptídeo do Fator VII que consiste em uma sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 17 ou uma sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 16 com duas alterações de sequência, em que as duas alterações de sequência da SEQ ID NO: 16 são (1) um resíduo de glutamina substituído pelo resíduo de prolina na posição 10, e (2) um resíduo de ácido glutâmico substituído pelo resíduo de lisina na posição 32, em uma linhagem celular recombinante que é deficiente em sua capacidade de sialilar peptídeos, de modo que produza um polipeptídeo de Fator VII dessialilado tendo uma proporção de moles de ácido siálico conjugado para moles de glicano ligado a N entre 0 e 2,0; e (2) isolar o polipeptídeo do Fator VII dessialilado assim produzido.

6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a variante polipeptídica isolada do Fator VII, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

7. Variante polipeptídica isolada do Fator VII, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio em que a formação de coágulo sanguíneo é desejável, sendo que a doença ou distúrbio é selecionada(o) do grupo que consiste em uma hemorragia, sangramento gastrointestinal, sangramento descontrolado, sangramento em um mamífero submetido a transplante ou ressecção ou cirurgia, sangramento por varizes, trombocitopenia, hemofilia, hemorragia intracraniana, aneurisma da aorta, administração excessiva de um anticoagulante, lesão traumática penetrante; lesão traumática contusa; sangramento em cirurgia eletiva; sangramento em cirurgia cardíaca; sangramento em cirurgia espinhal; cirurgia ortopédica; neurocirurgia; cirurgia oncológica; cirurgia pós-parto; menorragia; sangramento no transplante de células-tronco; sangramento no transplante de fígado; sangramento gastrointestinal; sangramento varicoso ativo na cirrose; sangramento não varicoso na cirrose; hemorragia alveolar difusa; aneurisma da aorta; hemorragia intracerebral; traumatismo craniano; contusão cerebral; reversão da varfarina; reversão da heparina; reversão de anticoagulantes; reversão de antitrombóticos; deficiência do fator VII; queimaduras; profilaxia em pacientes com hemofilia com inibidores; hepatectomia parcial para pacientes cirróticos e não cirróticos; hemofilia adquirida; púrpura trombocitopênica idiopática; Trombastenia de Glanzmann; Trombastenia de Glanzmann refratária à transfusão de plaquetas e síndrome de Bernard-Soulier.

8. Variante polipeptídica isolada do Fator VII, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que é para uso em uma hemorragia.

9. Uso de uma composição, como definida na reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para tratamento de uma doença ou distúrbio em que a coagulação do sangue é desejável.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é selecionada(o) do grupo que consiste em hemorragia, sangramento gastrointestinal, sangramento não controlado, sangramento em um mamífero submetido a transplante ou ressecção ou cirurgia, sangramento de varizes, trombocitopenia, hemofilia, hemorragia intracraniana, aórtica aneurisma, sobre administração de um anticoagulante, lesão traumática penetrante; lesão traumática contusa; sangramento em cirurgia eletiva; sangramento em cirurgia cardíaca; sangramento em cirurgia espinhal; cirurgia ortopédica; neurocirurgia; cirurgia oncológica; cirurgia pós-parto; menorragia; sangramento no transplante de células-tronco; sangramento no transplante de fígado; sangramento gastrointestinal; sangramento varicoso ativo na cirrose; sangramento não varicoso na cirrose; hemorragia alveolar difusa; aneurisma da aorta; hemorragia intracerebral; traumatismo craniano; contusão cerebral; reversão da varfarina; reversão da heparina; reversão de anticoagulantes; reversão de antitrombóticos; deficiência do fator VII; queimaduras; profilaxia em pacientes com hemofilia com inibidores; hepatectomia parcial para pacientes cirróticos e não cirróticos; hemofilia adquirida; púrpura trombocitopênica idiopática; Trombastenia de Glanzmann; Trombastenia de Glanzmann refratária à transfusão de plaquetas e síndrome de Bernard-Soulier.

11. Uso da variante polipeptídica isolada do Fator VII, como definida na reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para tratamento de uma doença ou distúrbio em que a coagulação do sangue é desejável.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é selecionada(o) do grupo que consiste em uma hemorragia, sangramento gastrointestinal, sangramento não controlado, sangramento em um mamífero submetido a transplante ou ressecção ou cirurgia, sangramento de varizes, trombocitopenia, hemofilia, hemorragia intracraniana, aórtica aneurisma, sobre administração de um anticoagulante, lesão traumática penetrante; lesão traumática contusa; sangramento em cirurgia eletiva; sangramento em cirurgia cardíaca; sangramento em cirurgia espinhal; cirurgia ortopédica; neurocirurgia; cirurgia oncológica; cirurgia pós- parto; menorragia; sangramento no transplante de células-tronco; sangramento no transplante de fígado; sangramento gastrointestinal; sangramento varicoso ativo na cirrose; sangramento não varicoso na cirrose; hemorragia alveolar difusa; aneurisma da aorta; hemorragia intracerebral; traumatismo crâniano; contusão cerebral; reversão da varfarina; reversão da heparina; reversão de anticoagulantes; reversão de antitrombóticos; Deficiência do fator VII; queimaduras; profilaxia em pacientes com hemofilia com inibidores; hepatectomia parcial para pacientes cirróticos e não cirróticos; hemofilia adquirida; púrpura trombocitopênica idiopática; Trombastenia de Glanzmann; Trombastenia de Glanzmann refratária à transfusão de plaquetas e síndrome de Bernard-Soulier.

13. Método para preparação da variante polipeptídica do Fator VII isolada, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende: (A) (1) obter um polipeptídeo de Fator VII sialilado que consiste em uma sequência de aminoácidos tendo SEQ ID NO: 17 ou uma sequência de aminoácidos tendo SEQ ID NO: 16 com duas alterações de sequência, em que as duas alterações de sequência de SEQ ID NO: 16 são (1) um resíduo de glutamina substituído pelo resíduo de prolina na posição 10, e (2) um resíduo de ácido glutâmico substituído pelo resíduo de lisina na posição 32; (2) contatar o polipeptídeo de Fator VII sialilado com sialidase sob condições tais que quantidades suficientes de resíduos de ácido siálico ligados covalentemente sejam removidas do polipeptídeo de Fator VII sialilado para produzir um polipeptídeo de Fator VII dessialilado tendo uma proporção de moles de ácido siálico conjugado para moles de Glicano N-ligado inferior a 0,1; e (3) isolar a variante polipeptídica do Factor VII assim produzida; (B) (1) obter uma linhagem celular recombinante que co- expressa (a) um polipeptídeo de Fator VII recombinante que consiste em uma sequência de aminoácidos tendo SEQ ID NO: 17 ou uma sequência de aminoácidos tendo SEQ ID NO: 16 com duas alterações de sequência, em que as duas alterações de sequência da SEQ ID NO: 16 são (1) um resíduo de glutamina substituído pelo resíduo de prolina na posição 10 e (2) um resíduo de ácido glutâmico substituído pelo resíduo de lisina na posição 32 e (b) uma enzima sialidase recombinante; (2) cultivar a referida linhagem celular recombinante para permitir a expressão tanto do polipeptídeo do Fator VII recombinante quanto da enzima sialidase recombinante, em que a referida enzima sialidase recombinante remove quantidades suficientes de resíduos de ácido siálico ligados covalentemente para produzir um polipeptídeo do Fator VII dessialilado tendo uma proporção de moles de ácido siálico conjugado em moles de glicano N-ligado inferior a 0,1; e (3) isolar a variante polipeptídica do Factor VII assim produzida; ou (C) (1) produzir um polipeptídeo do Fator VII que consiste em uma sequência de aminoácidos tendo SEQ ID NO: 17 ou uma sequência de aminoácidos tendo SEQ ID NO: 16 com duas alterações de sequência, em que as duas alterações de sequência de SEQ ID NO: 16 são (1) um resíduo de glutamina substituído pelo resíduo de prolina na posição 10 e (2) um resíduo de ácido glutâmico substituído pelo resíduo de lisina na posição 32, em uma linhagem celular recombinante que é deficiente em sua capacidade de sialilar peptídeos, de modo que produza um polipeptídeo do factor VII dessialilado possuindo uma proporção de moles de ácido siálico conjugado para moles de glicano N-ligado inferior a 0,1; e (2) isolar o polipeptídeo de Factor VII desialilado assim produzido.

14. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a variante polipeptídica do Fator VII isolada, como definida na reivindicação 4, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio em que a coagulação do sangue é desejável, em que a doença ou distúrbio é selecionada(o) do grupo que consiste em uma hemorragia, sangramento gastrointestinal, sangramento não controlado, sangramento em um mamífero submetido a transplante ou ressecção ou cirurgia, sangramento de varizes, trombocitopenia, hemofilia, hemorragia intracraniana, aórtica aneurisma, sobre administração de um anticoagulante, lesão traumática penetrante; lesão traumática contusa; sangramento em cirurgia eletiva; sangramento em cirurgia cardíaca; sangramento em cirurgia espinhal; cirurgia ortopédica; neurocirurgia; cirurgia oncológica; cirurgia pós-parto; menorragia; sangramento no transplante de células-tronco; sangramento no transplante de fígado; sangramento gastrointestinal; sangramento varicoso ativo na cirrose; sangramento não varicoso na cirrose; hemorragia alveolar difusa; aneurisma da aorta; hemorragia intracerebral; traumatismo craniano; contusão cerebral; reversão da varfarina; reversão da heparina; reversão de anticoagulantes; reversão de antitrombóticos; deficiência do fator VII; queimaduras; profilaxia em pacientes com hemofilia com inibidores; hepatectomia parcial para pacientes cirróticos e não cirróticos; hemofilia adquirida; púrpura trombocitopênica idiopática; Trombastenia de Glanzmann; Trombastenia de Glanzmann refratária à transfusão de plaquetas e síndrome de Bernard-Soulier.