JP2019213540A - 短時間作用性第ｖｉｉ因子ポリペプチド - Google Patents

Abstract

【課題】短時間作用性第ＶＩＩ因子ペプチドの提供。【解決手段】短縮した半減期は、急性出血および類似の障害の治療に望ましい。第ＶＩＩ因子およびその変異体のシアリル化および／またはグリコシル化の修飾により、急性出血の状態の治療に有用なペプチドが産生された。ヒト凝固第ＶＩＩ因子変異体およびこのような変異体をコードするポリヌクレオチド、このような変異体を含みかつ発現するベクターおよび宿主細胞、このような変異体を得る方法、このような変異体を使用する方法、変異体の組成物、ならびにこれらに関連する追加の発明の特徴が提供される。【選択図】図３

Description

関連出願の相互参照
本出願は、これによりその全体が参照により組み込まれる、２０１２年１２月２４日出
願の米国特許出願第６１／７４５６７４号および２０１３年３月１５日出願の米国特許出
願第６１／７８７０２６号の優先権を主張するものである。
ヒト凝固第ＶＩＩ因子変異体およびこのような変異体をコードするポリヌクレオチド、
このような変異体を含みかつ発現するベクターおよび宿主細胞、このような変異体を得る
方法、このような変異体を使用する方法、変異体の組成物、ならびにこれらに関連する追
加の発明の特徴が本明細書で提供される。

血液凝固は、最終的にフィブリン凝塊をもたらす種々の血液成分（または因子）の複雑
な相互作用からなる過程である。一般的に、凝固「カスケード」と呼ばれているものに参
加する血液成分は、活性化因子（それ自体活性化凝固因子である）の作用によってタンパ
ク質分解酵素に変換される酵素的に不活性なタンパク質（酵素前駆体または酵素原）であ
る。このような変換を受けた凝固因子は、一般的に「活性因子」と呼ばれ、凝固因子の名
称に文字「ａ」を付加することによって示される（例えば、第ＶＩＩａ因子）。

止血過程の開始は、血管壁への損傷後の循環血に暴露した組織因子と、全第ＶＩＩ因子
タンパク質質量の約１％に相当する量で循環中に存在する第ＶＩＩａ因子との間の複合体
の形成によって媒介される。この複合体は、組織因子保有細胞に固定され、細胞表面で第
ＩＸ因子および第Ｘ因子をその活性型である第ＩＸａ因子および第Ｘａ因子に変換する。
第Ｘａ因子は、組織因子保有細胞上でプロトロンビンをトロンビンに変換し、トロンビン
が第ＶＩＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＸＩ因子および第ＸＩＩＩ因子を活性化する。さらに、
止血のこの初期ステップで形成される限られた量のトロンビンは血小板も活性化する。血
小板に対するトロンビンの作用の後、血小板は形状を変化させ、帯電リン脂質をその表面
上に露出する。この活性化血小板表面が、さらなる第Ｘ因子活性化および完全なトロンビ
ン産生のための鋳型を形成する。活性化血小板表面上でのさらなる第Ｘ因子活性化が、活
性化血小板の表面上に形成した第ＩＸａ因子および第ＶＩＩＩａ因子複合体を介して起こ
り、次いで、第Ｘａ因子がまだ表面上にありながら、プロトロンビンをトロンビンに変換
する。次いで、トロンビンがフィリブリノーゲンをフィブリンに変換し、フィブリンは不
溶性であり、初期血小板血栓を安定化する。この過程は組織因子露出部位に局在し、それ
によって、凝固系の全身活性化のリスクを最小化する。近年、第ＶＩＩ因子および組織因
子が血液凝固の主な開始因子であることが分かった。

第ＶＩＩａ因子はその前駆体である第ＶＩＩ因子から産生され、第ＶＩＩ因子は肝臓で
合成されて、血液中に分泌され、ここで単鎖糖タンパク質（分子量約５００００Ｄａ）と
して循環する。本明細書で使用される野生型第ＶＩＩ因子は、図１および図２に開示され
るアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を有する。「第ＶＩＩ因子」という用語は、その
未切断型（酵素原型）の第ＶＩＩ因子ポリペプチドならびに第ＶＩＩａ因子と呼ばれ得る
それぞれの生理活性型を産するようタンパク質分解的にまたは別の方法で処理されたもの
を包含するものとする。野生型第ＶＩＩ因子は、典型的には残基１５２と残基１５３との
間で切断されて第ＶＩＩａ因子を産生する。

第ＶＩＩ因子はインビトロで第Ｘａ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＩＸａ因子またはトロン
ビンによって二本鎖型の第ＶＩＩａ因子に変換される。止血に関与するいくつかの他の血
漿タンパク質のように、第ＶＩＩ因子は、タンパク質のアミノ末端の近くにクラスター化
する複数のグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化に必要とされるその活性についてビタ
ミンＫに依存する。これらのγ−カルボキシル化グルタミン酸は、金属イオンによって誘
導される第ＶＩＩ因子とリン脂質の相互作用に必要とされる。組織因子、リン脂質および
カルシウムイオンの存在下で、二本鎖第ＶＩＩａ因子は限られたタンパク質分解によって
第Ｘ因子または第ＩＸ因子を迅速に活性化する。第ＶＩＩａ因子はタンパク質分解切断を
受けやすく、凝固活性を有さないいくつかの分解産物をもたらす。

１個または複数のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入による野生型第ＶＩＩ因子
由来のアミノ酸配列を有する第ＶＩＩ因子変異体が公開されている。例えば、Ｄｉｃｋｉ
ｎｓｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９６）９３、１４３
７９〜１４３８４）は、Ｌｙｓ１５７、Ｖａｌ１５８、Ｇｌｕ２９６、Ｍｅｔ２９８、Ａ
ｓｐ３３４、Ｓｅｒ３３６またはＬｙｓ２２７が個々にＡｌａによって置き換えられた第
ＶＩＩ因子変異体に関する。Ｉｗａｎａｇａら（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．（１９
９９年８月補遺）、４６６、要約１４７４）は、残基３１６〜３２０が欠失しているまた
は残基３１１〜３２２がトリプシンから対応する残基で置き換えられている第ＶＩＩａ因
子変異体に関する。Ｂｏｌｔらの米国特許出願公開第２００８／００５８２５５号明細書
は、Ｎ１４５もしくはＮ３２２のいずれか、またはＮ１４５とＮ３２２の両方にグリコシ
ル化を破壊する置換を有する第ＶＩＩ因子変異体に関する。Ｔｏｓｏらは、天然の変異に
基づく一連の第ＶＩＩ因子の構造−機能研究を報告した。変異型組換え第ＶＩＩ因子タン
パク質はＴ３２４Ｍ、Ｅ３８５Ｋ、および第ＶＩＩ因子重鎖（Ｎ３２２Ｑ）または第ＶＩ
Ｉ因子軽鎖（Ｎ１４５Ｑ）のいずれかにおいてグリコシル化コア配列を欠く２つの変異型
第ＶＩＩ因子タンパク質を含んでいた。Ｔｏｓｏら、「Ｌａｃｋ ｏｆ Ｈｅａｖｙ Ｃ
ｈａｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｆａｃｔｏ
ｒ ＶＩＩ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｎｏｔ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ Ｍｕｔ
ａｎｔ ＦＶＩＩａ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｂｌｏｏｄ、第９６巻、第１１号、第２部（
２０００年１１月１６日）、７９ｂ頁（第４２回米国血液学会）。

ほとんどの天然ペプチドおよびタンパク質は、主要なペプチドまたはタンパク質鎖の長
さに沿った選ばれた数のアミノ酸への特異的な結合を介してペプチドまたはタンパク質に
結合した炭水化物部分を含有している。したがって、多くの天然ペプチドおよびタンパク
質をそれぞれ「糖ペプチド」または「糖タンパク質」と呼ぶ。任意の所与のペプチドまた
はタンパク質上のグリコシル化パターンの変異性が、そのペプチドまたはタンパク質の機
能に影響を及ぼし得る。例えば、ペプチドまたはタンパク質上のＮ結合型グリカンの構造
が、細胞または生物中のペプチドまたはタンパク質のプロテアーゼ感受性、細胞内輸送、
分泌、組織標的化、生物学的半減期および抗原性を含む、ペプチドまたはタンパク質の種
々の特性に影響を及ぼし得る。これらの特性の１つまたは複数の変化は、その自然環境で
のペプチドまたはタンパク質の有効性に影響を及ぼし、またペプチドまたはタンパク質が
その目的のために産生された状況において治療剤としてのペプチドまたはタンパク質の有
効性に影響を及ぼし得る。

ペプチドまたはタンパク質鎖に結合した炭水化物構造は「グリカン」分子として知られ
ている。ペプチドまたはタンパク質上に存在する特異的なグリカン構造は、ペプチドまた
はタンパク質の溶解度および凝集特性、主要ペプチドまたはタンパク質鎖の折り畳み、そ
れゆえ、その機能または酵素活性、タンパク質分解攻撃に対するペプチドまたはタンパク
質の抵抗性、およびペプチドまたはタンパク質の不活性型の活性型への変換をもたらすタ
ンパク質分解の制御に影響を及ぼす。例えば、グリカン分子上に存在する末端シアル酸残
基は、哺乳動物循環系中のペプチドまたはタンパク質の半減期の長さに影響を及ぼす。そ
のグリカンが末端シアル酸残基を含有しないペプチドおよびタンパク質は、一般的に肝臓
によって循環からより迅速に除去される。

天然糖ペプチドおよび糖タンパク質に見られるグリカン構造は、典型的にはＮ結合型お
よびＯ結合型グリカンの２つのクラスに分けられる。野生型第ＶＩＩａ因子は、２つのＮ
結合型および２つのＯ結合型グリコシル化部位を含有する。Ｎ結合型グリコシル化が真核
生物において最も一般的な共有結合修飾である。Ｎ結合型グリコシル化はコンセンサス配
列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒで起こり、グリカンがアスパラギンのアミノ基に結合し、
Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸を表す。Ｎ結合型グリカンは共通のコア五糖Ｍａｎ_３
（ＧｌｃＮＡｃ）_２に基づき、これはＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、ノイ
ラミン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、フルクトース、マンノースおよびフコースなどの
単糖の付加によってさらに修飾され得る。末端シアル酸を含む種々の単糖を有するＭａｎ
_３（ＧｌｃＮＡｃ）_２は、Ｎ−アセチルグルコサミンを介してＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈ
ｒコンセンサス配列中のＡｓｎに結合され得る。この化学的に複雑な同時翻訳修飾が多く
の目的に叶い、適切な折り畳み、官能基配向およびクリアランス速度を含む様々な方法で
タンパク質の生物学に影響を及ぼす。

ＤｅＦｒｅｅｓらの米国特許第８００８２５２号明細書に記載されているものを含む、
ペプチドまたはタンパク質のグリコシル化パターンをカスタマイズするための種々の方法
が当技術分野で提案されてきた。

対象の凝固カスケードを刺激または改善することが通常は望ましい。凝固因子欠乏（例
えば、血友病ＡおよびＢ、または凝固第ＸＩ因子もしくは第ＶＩＩ因子の欠乏）または凝
固因子阻害因子によって引き起こされる出血性障害を制御するために第ＶＩＩａ因子が使
用されてきた。商品名ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）でＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋによ
って製造および販売されている組換え第ＶＩＩａ因子が、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因
子に対する阻害因子による血友病ＡまたはＢ患者、および後天性血友病の患者の出血性エ
ピソードの治療；第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子に対する阻害因子による血友病Ａまた
はＢ患者、および後天性血友病の患者の外科的介入または侵襲的手技における出血の予防
；先天性第ＶＩＩ因子欠乏症の患者における出血性エピソードの治療、ならびに先天性第
ＶＩＩ因子欠乏症の患者の外科的介入または侵襲的手技における出血の予防のために承認
されている。Ｈｅｄｎｅｒの米国特許第５１８０５８３号明細書は、凝固因子欠損または
凝固因子阻害因子によって引き起こされていない状況における過度の出血を制御するため
に第ＶＩＩａ因子を用いることを開示している。Ｈｅｄｎｅｒは、例えば、欠陥のある血
小板機能、血小板減少またはフォンウィルブランド病によって引き起こされる出血性障害
を治療すること、およびこれらの用途のための組成物を開示している。

先天性もしくは後天性凝固因子欠乏または凝固因子に対する阻害因子によって引き起こ
されていない障害からの出血を治療する必要性がある。いくつかの臨床試験によって、組
換え第ＶＩＩａ因子が出血を制御する有効性が証明された。しかしながら、この分子の使
用から生じる望ましくない血栓塞栓性イベントの増加が懸念される。出血は、例えば、手
術、手術、茎および臓器移植後の合併症、頭蓋内出血、大動脈瘤、および外傷、または過
量の特定の抗凝固薬と関連する多くの障害における主要な課題である。

米国特許出願公開第２００８／００５８２５５号明細書 米国特許第８００８２５２号明細書 米国特許第５１８０５８３号明細書

Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９６）９３、１４３７９〜１４３８４） Ｉｗａｎａｇａら（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．（１９９９年８月補遺）、４６６、要約１４７４） Ｔｏｓｏら、「Ｌａｃｋ ｏｆ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｎｏｔ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ Ｍｕｔａｎｔ ＦＶＩＩａ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｂｌｏｏｄ、第９６巻、第１１号、第２部（２０００年１１月１６日）、７９ｂ頁（第４２回米国血液学会）

短時間作用性の第ＶＩＩ因子ポリペプチドにより出血性障害およびエピソードを治療す
ることが目的である。本研究の１つの目的は、短縮された半減期などの１つまたは複数の
薬物動態学的形質によって特徴付けられる、短時間作用性の第ＶＩＩ因子ポリペプチド（
野生型または変異体）の組成物を提供することである。標的部位および治療時間枠外での
血栓性イベントの機会が減少したこのような第ＶＩＩ因子分子を提供することが目的であ
る。変化したグリコシル化パターンによりクリアランスが増強した第ＶＩＩ因子ポリペプ
チド（野生型または変異体）を提供することが目的である。

本明細書では、配列番号１６のアミノ酸配列に関して少なくとも２つの配列変化を有す
るアミノ酸配列を含み、少なくとも２つの配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換
したグルタミン残基、および（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基であ
り；かつ組成物中の抱合型シアル酸のモルとＮ結合型グリカンのモルの比が０．０５未満
、０．１未満、１．０未満、２．０未満、３．０未満、４．０未満、５．０未満または６
．０未満である変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物が記載される。本明細書では、
配列番号１６のアミノ酸配列に関して少なくとも２つの配列変化を有するアミノ酸配列を
含み、少なくとも２つの配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残
基、および（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基であり；かつＮ結合型
グリカン１モル当たりの抱合型シアル酸のモルの比が（１）０〜５；（２）０〜４；（３
）０〜３；（４）０〜２；（５）０〜１および（６）０〜０．５からなる群から選択され
る範囲内にある変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物も記載される。

本明細書では、配列番号１６のアミノ酸配列に関して少なくとも２つの配列変化を有す
るアミノ酸配列を含み、少なくとも２つの配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換
したグルタミン残基、および（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基であ
り、ポリペプチドが０．０５未満、０．１未満、１．０未満、２．０未満、３．０未満、
４．０未満、５．０未満または６．０未満の抱合型シアル酸のモルとＮ結合型グリカンの
モルの比を有する単離変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物も記載される。本明細書
では、配列番号１６（野生型第ＶＩＩ因子）のアミノ酸配列を含み、かつ組成物中の抱合
型シアル酸のモルとＮ結合型グリカンのモルの比が（１）１〜５；（２）１〜４；（３）
１〜３；（４）１〜２；および（５）０．５〜１からなる群から選択される範囲内にある
；または抱合型シアル酸が検出不可能である第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物も記載さ
れる。

本明細書では、
（１）配列番号１６の配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配列を含む
ポリペプチドであって、配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残
基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、および（３）１４５位のＮ
結合型グリコシル化が破壊されるような配列変化からなるポリペプチド；
（２）配列番号１６の配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配列を含む
ポリペプチドであって、配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残
基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、および（３）３２２位のＮ
結合型グリコシル化が破壊されるような配列変化からなるポリペプチド；
（３）配列番号１６のアミノ酸配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配
列を含むポリペプチドであって、配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグル
タミン残基、および（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、および（３
）１４５位および３２２位のＮ結合型グリコシル化が破壊されるような配列変化からなる
ポリペプチド；
（４）配列番号１６のアミノ酸配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配
列を含むポリペプチドであって、配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグル
タミン残基、および（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基からなり、１
４５位および３２２位がアスパラギンであり、かつ結合したＮ結合型グリコシル化を有す
るポリペプチド；
（５）配列番号１６のアミノ酸配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配
列を含むポリペプチドであって、配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグル
タミン残基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、（３）３４位のア
ラニン残基に置換したグルタミン酸残基、（４）３６位のアルギニン残基に置換したグル
タミン酸残基、および（５）１４５位のＮ結合型グリコシル化が破壊されるような配列変
化からなるポリペプチド；
（６）配列番号１６のアミノ酸配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配
列を含むポリペプチドであって、配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグル
タミン残基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、（３）３４位のア
ラニン残基に置換したグルタミン酸残基、（４）３６位のアルギニン残基に置換したグル
タミン酸残基、および（５）３２２位のＮ結合型グリコシル化が破壊されるような配列変
化からなるポリペプチド；
（７）配列番号１６のアミノ酸配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配
列を含むポリペプチドであって、配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグル
タミン残基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、（３）３４位のア
ラニン残基に置換したグルタミン酸残基、（４）３６位のアルギニン残基に置換したグル
タミン酸残基、および（５）１４５位および３２２位のＮ結合型グリコシル化が破壊され
るような配列変化からなるポリペプチド；および
（８）配列番号１６のアミノ酸配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配
列を含むポリペプチドであって、配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグル
タミン残基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、（３）３４位のア
ラニン残基に置換したグルタミン酸残基、および（４）３６位のアルギニン残基に置換し
たグルタミン酸残基からなり、１４５位および３２２位がアスパラギンであり、かつ結合
したＮ結合型グリコシル化を有するポリペプチド
からなる群から選択される単離変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドも記載される。

本明細書では、シアル酸と第ＶＩＩ因子ポリペプチドの抱合が減少した第ＶＩＩ因子ポ
リペプチドも記載される。特定の例では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドが変化したグリコシ
ル化パターンをもたらす変異形ポリペプチドである。他の例では、第ＶＩＩ因子ポリペプ
チドがシアル酸の抱合が減少した野生型第ＶＩＩ因子ポリペプチドである。特定の実施形
態では、減少したシリカ酸抱合が、シアリダーゼ酵素によるポリペプチドの処理によって
果たされ得る。他の実施形態では、減少したシアル酸抱合が、ペプチドのシアリル化が部
分的または完全に欠乏した細胞系で組換え第ＶＩＩ因子ポリペプチドを産生することによ
って果たされ得る。さらなる実施形態では、減少したシアル酸結合が、細胞系で組換え第
ＶＩＩ因子ポリペプチドと、組換えまたは外因性シアリダーゼ酵素を同時発現することに
よって果たされ得る。

血餅形成が望ましい疾患または障害を有する哺乳動物を治療する方法であって、有効量
のシアル酸抱合が減少した第ＶＩＩ因子ポリペプチドをそれを必要とする哺乳動物に投与
するステップを含む方法も記載される。特定の実施形態では、抱合型シアル酸のモルとＮ
結合型グリカンのモルの比が０．０５未満である。他の実施形態では、第ＶＩＩ因子ポリ
ペプチドが配列番号１６のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、第ＶＩＩ因子ポ
リペプチドが野生型第ＶＩＩ因子を含む。追加の実施形態では、治療されている疾患また
は障害が、出血、胃腸出血、制御されない出血、移植または切除または手術を受けている
哺乳動物の出血、静脈瘤出血、血小板減少症、血友病、頭蓋内出血、大動脈瘤、および抗
凝固薬の過剰投与からなる群から選択される。

さらなる変異体、組成物、方法ならびに関連する産物およびプロセスを以下で詳細に開
示する。

本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。 本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。 本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。 本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。 本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。 本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。 本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。 本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。 本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのアミノ酸配列を示す図である。本明細書で使用される野生型ヒト第ＶＩＩ因子は配列番号１６のアミノ酸配列を有する。Ｖ１は配列番号１７のアミノ酸配列を有する。Ｖ２は配列番号１８のアミノ酸配列を有する。Ｖ１およびＶ２において、配列番号１６の野生型第ＶＩＩ因子からの変化を太字で示す。 本出願の実施例で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子を示す模式図である。Ｎ−グリコシル化部位におけるグリカンの結合を示している。グリカンを描写するために、実線の箱はＮ−アセチルグルコサミンを表し、斜線のついた楕円形はマンノースを表し、あいた楕円形はガラクトースを表し、濃い菱形はシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸としても知られている）を表し、閉じた三角形はフコースを表す。グリカン構造はグリカンの１つの可能な変異体を用いた描写であるが、実際に測定されるグリカンを表していない。 Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒコンセンサス配列中のＡｓｎにおける結合を示すＮ結合型グリカンを示す概略図である。末端シアル酸を含む種々の単糖を有するＭａｎ_３（ＧｌｃＮＡｃ）_２コアを示している。 Ｖ２に関して例示される、第ＶＩＩ因子変異体の半減期を減少させるために本開示で使用される２つのアプローチを示す概略図である。 ヒポグリコシル化（ｈｙｐｏｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）第ＶＩＩ因子分子の表である。 実験の条件による脱シアリル化後のＶ２の重鎖上に残っているシアル酸を同定するためのＬＣ−ＭＳ法の結果を示す図である。 シアル酸含量についての脱シアリル化Ｖ２の分析を示す図である。 リン脂質ＦＸ活性化アッセイの結果を示す図である。 脱シアリル化タンパク質に対するＰＬ−ＴＧＡアッセイの結果を示す図である。 ヒポグリコシル化第ＶＩＩ因子変異体の発現を示す図である。 トランスフェクション上清を用いたヒポグリコシル化ＦＶＩＩ変異体の「特異的活性」の測定を示す表である。 精製したヒポグリコシル化変異体ｐＭＢ１２１に対するＰＬ−ＴＧＡアッセイの結果を示す図である。 野生型第ＶＩＩ因子と比較した脱シアリル化Ｖ２のインビトロ肝細胞クリアランスを示す図である。 第ＶＩＩ因子変異体によるインビトロ肝細胞クリアランスの結果を示す図である。ヒポグリコシル化変異体は、このモデルでクリアランスの増加を示さなかった。この結果は、これらの分子についての脱シアリル化Ｖ２によって利用されるクリアランス機構とは異なるクリアランス機構を示唆している。 ラットにおける薬物動態試験結果を示す図である。脱シアリル化Ｖ２およびＶ１の半減期は、第ＶＩＩ因子ＥＬＩＳＡによって測定されるようにスプラーグドーリーラットにおいてその未修飾親分子よりも有意に短かった。 ＨｅｍＡマウスにおける薬物動態試験結果を示す図である。 ＨｅｍＡマウスにおける脱シアリル化Ｖ２有効性試験を示す図である。 ＴＶＴ ＨｅｍＡモデルにおける脱シアリル化Ｖ２有効性試験を示す図である。 第ＶＩＩ因子と比較した脱シアリル化Ｖ２を有するＨｅｍＡマウスにおけるトロンビン−抗トロンビン（「ＴＡＴ」）産生の結果を示す図である。 凝固能力のあるマウスにおける脱シアリル化Ｖ２有効性試験を示す図である。 シアル酸の正常な抱合を有する野生型第ＶＩＩ因子と比較した脱シアリル化野生型第ＶＩＩ因子（ｄＷＴ ＶＩＩａ）のインビトロ肝細胞クリアランスを示す図である。 野生型第ＶＩＩ因子と比較したｄＷＴ ＶＩＩａについてのヒト組織因子ノックイン（ＴＦＫＩ）マウスの尾切断試験結果を示す図である。脱シアリル化第ＶＩＩ因子は、野生型第ＶＩＩ因子よりも有意に効果的であることが分かった。 ｄＷＴ ＶＩＩａまたは野生型第ＶＩＩ因子のいずれかの投与後のトロンビン抗トロンビン（ＴＡＴ）複合体のＥＬＩＳＡ分析の結果を示す図である。 ＦｅＣｌ_３血栓症モデルにおける血栓形成の分析の結果を示す図である。所与の用量のｄＷＴ ＶＩＩａは、野生型第ＶＩＩ因子と比較して大いに減少した血栓形成をもたらした。 蛍光原基質によって測定される可溶性組織因子に対するｄＷＴ ＶＩＩａおよび野生型第ＶＩＩ因子の見かけの結合親和性を示す図である。 可溶性組織因子と、ｄＷＴ ＶＩＩａまたは野生型第ＶＩＩ因子のいずれかの複合体による第Ｘ因子の第Ｘａ因子への変換を示す図である。

急性出血の治療において血栓性合併症を制限するために組換え第ＶＩＩ因子ポリペプチ
ド（野生型または変異体）の薬物動態を調節する方法が本明細書で記載される。シアル酸
抱合が減少した第ＶＩＩ因子ポリペプチドも記載される。血液からのクリアランスが増強
し、有効性の持続期間が減少した組換え第ＶＩＩ因子の変異体がさらに記載される。この
ような変異体は、変化したグリコシル化パターンにより、組換え野生型第ＶＩＩ因子より
も短いインビボでの半減期を有する。このような短時間作用性第ＶＩＩ因子ポリペプチド
を製造および使用する方法も記載される。

第ＶＩＩ因子およびグリコシル化を説明するために、図３および図４を提供する。図３
は、そのドメインを有する第ＶＩＩ因子分子の３つの例を模式的に示している。第ＶＩＩ
因子は、Ｇｌａ、ＥＧＦおよび触媒ドメインからなり、かつ２個のＮ結合型グリカン（Ｎ
１４５およびＮ３２２）を含有するタンパク質である。Ｖ１は４個の変異（Ｐ１０Ｑ、Ｋ
３２Ｅ、Ｔ１０６Ｎ、Ｖ２５３Ｎ）を有する第ＶＩＩ因子変異体である。Ｖ２は６個の変
異（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４３、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６Ｎ、Ｖ２５３Ｎ）を有する第Ｖ
ＩＩ因子変異体である。Ｖ１およびＶ２は共に活性化血小板に対する増加した親和性を有
し、野生型第ＶＩＩ因子と比べて長い半減期をもたらすさらに２個のＮ−グリコシル化部
位を含有する。Ｖ２にのみ見られる２個の突然変異（Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ）は、その組織
因子非依存性を説明すると考えられている。

図４は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒコンセンサス配列中のＡｓｎにおける結合を示す
Ｎ結合型グリカンの例を模式的に示している。末端シアル酸を含む種々の単糖を有するＭ
ａｎ_３（ＧｌｃＮａｃ）_２コアを示している。

所望の短い半減期を有する第ＶＩＩ因子ポリペプチドを調製する方法が本明細書で提供
される。短時間作用性第ＶＩＩ因子ポリペプチドを製造するための２つの一般的な方法が
提供され、これらの方法を別々にまたは組み合わせて用いることができる。第ＶＩＩ因子
変異体の一例を用いて図５に模式的に示されるように、グリコシル化第ＶＩＩ因子変異体
を、脱シアリル化または脱グリコシル化によって処理して変異体のグリコシル化パターン
を変化させ、それによって、その半減期を変化、好ましくは短縮することができる。この
方法を用いて野生型第ＶＩＩ因子ポリペプチドを脱シアリル化することもできるだろう。

脱シアリル化は、当技術分野で既知の任意の方法によって起こり得る。適切な方法の例
としては、それだけに限らないが、ノイラミニダーゼ−アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ
Ｎ５２５４）を含むシアリダーゼ、ならびにＧＩ：４０４７９およびＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ
．２３８（１）、３１〜３４（１９８８）で同定されたウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）のノイラミニダーゼを含む脱シアリル化するよう機能
する任意の既知の酵素と接触させることによる酵素的脱シアリル化が挙げられる。このよ
うな脱シアリル化は、部分的に精製した組換え第ＶＩＩ因子ポリペプチドを適切な条件下
インビトロでシアリダーゼと接触させること、または組換え第ＶＩＩ因子ポリペプチドを
発現している宿主細胞中でのシアリダーゼの同時発現によって達成され得る。インビトロ
での接触は、部分的脱シアリル化のみが起こるような持続時間となり得る。例えば、所望
の半減期を第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物中０．５〜１モルの抱合型シアル酸と一定
モルのＮ結合型グリカンの比を有する分子から得ることができる場合、完全な脱シアリル
化が起こる前の限られた期間シアリダーゼと接触させることが推奨される。部分的脱シア
リル化は、修飾シアリダーゼを使用すること、第ＶＩＩ因子ポリペプチドをシアリダーゼ
の完全な機能を遅くするもしくは損なう条件下でシアリダーゼと接触させること、または
部分的脱シアリル化ポリペプチドのみ産生する当業者に明らかな他の方法によっても得ら
れ得る。部分的脱シアリル化は、完全に脱シアリル化された基準調製物中の抱合型シアル
酸とグリカンの比との比較によって測定され得る。

脱シアリル化はまた、シアル酸付加に必要とされる１種または複数の細胞成分を欠くま
たは欠乏している細胞系での第ＶＩＩ因子ポリペプチド（野生型または変異体）の発現を
通しても達成され得る。特定の細胞系はシアリル化を減少させるまたは除去するよう修飾
されているまたはされ得る。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）起源の
Ｌｅｃ２細胞は、野生型細胞よりおよそ１０倍少ないシアル酸を含む糖タンパク質を産生
する。グリカンの脱シアリル化は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を含む肝
臓受容体によって活発に排除され得る分子をもたらし、この理由のために、半減期が短縮
すると考えられる。

第２のアプローチは、第ＶＩＩ因子変異体を脱グリコシル化し、それによって半減期が
短縮した分子を得るというものである。グリコシル化の減少によって、腎クリアランス（
５０〜６０Ｋｄカットオフ、Ｃａｌｉｃｅｔｉ ＰおよびＶｅｒｏｎｅｓｅ ＦＭ、「Ｐ
ｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅ
ｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃ
ｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２００３；５５（１０
）：１２６１〜７７、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｔ ら、「Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ
ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ ｉｎ ｒａｔ ｒｅｎａｌ ｔｕｂｕｌａｒ
ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ」、Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９９７；８（４）：
５８６〜９５、Ｃｈｏｉ ＨＳら、「Ｒｅｎａｌ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｑｕａｎ
ｔｕｍ ｄｏｔｓ」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７；２５（１０）：１１６
５〜７０に概説）、表面電荷および等電点（ｐＩ）電荷（糖タンパク質循環の増加と関連
していた、Ｂｙｒｎｅ Ｂ．ら、「Ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄｓ：ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔ
ｅ ｍｏｉｅｔｉｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ａｎｄ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ」、Ｄｒｕｇ Ｄｉ
ｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２００７；１２（７〜８）：３１９の概説参照）、および
任意の数の血漿プロテアーゼからの少ない糖タンパク質媒介保護（Ｔｏｎ Ｇ．ら、２０
０５、Ｎｉｅ Ｙら、２００６）を通して第ＶＩＩ因子のクリアランスが増強される。

本明細書で使用される脱グリコシル化は、限定されないが、基準第ＶＩＩ因子ポリペプ
チドと比較して変化したアミノ酸配列をもたらす第ＶＩＩ因子ポリペプチドの遺伝子改変
を含み、この変化によりＮ結合型グリコシル化部位が除去される。例えば、第ＶＩＩ因子
変異体は、Ｎ結合型グリカンコンセンサス配列、すなわち、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ
（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸を表す）に必要とされる１個または複数のアミノ酸
残基でのグリコシル化を破壊する変化により作成され得る。本明細書で使用する場合、第
ＶＩＩ因子アミノ酸配列の「グリコシル化を破壊する変化」とは、１個または複数のアミ
ノ酸残基の置換、付加または欠失をもたらし、かつＮ結合型グリコシル化のための１つま
たは複数の部位の喪失をもたらす野生型第ＶＩＩ因子に関する変化を指す。例えば、Ｎ結
合型グリコシル化部位は、共に野生型第ＶＩＩ因子中に存在するＮ１４５および／または
Ｎ３２２を、任意のアミノ酸（天然または非天然）で置き換えることによって除去され得
る。グリコシル化部位は、グリコシル化を破壊するよう変化させた場合に活性に及ぼす影
響が最小であることが確認されるべきである。別の例では、脱グリコシル化が、グリコシ
ル化のための機構を欠く細胞系での第ＶＩＩ因子ポリペプチド（野生型または変異体）の
発現によって起こり得る。例えば、細菌細胞はグリコシル化のための細胞機構を欠くので
、細菌細胞で産生される第ＶＩＩ因子は、完全に非グリコシル化されていると予想される
。別の実施形態では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、末端グリコシル化酵素を欠く、また
はこのような酵素を有しているが、１個または複数が野生型細胞系で見られるものより小
さい活性を有する細胞系で産生される。例えば、Ａｐｐａ Ｒ．ら、２０１、Ｎａｒｉｔ
ａ Ｍら、１９９８、Ｓｅｅｓｔｅｄら、２０１０を参照されたい。別の実施形態では、
第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、グリカンの合成もしくは第ＶＩＩ因子への結合に関与する
酵素の欠損、またはＣＭＰ−シアル酸トランスポーターの合成に関与する酵素の欠損を持
つ細胞系で産生される。別の実施形態では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドをデグリコシラー
ゼ（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）または脱グリコシル化する化学物質で処理する。

シアリダーゼ、デグリコシラーゼまたは第ＶＩＩ因子ポリペプチドからグリカンを減少
させるもしくは除去する化学物質による処理は、発現、精製または精製後に起こり得る。

一実施形態では、第ＶＩＩ因子変異体Ｖ１（Ｎ３２２、Ｎ１４５）または第ＶＩＩ因子
変異体Ｖ２（Ｎ３２２、Ｎ１４５、Ｎ１０６、Ｎ２５３）中のＮ結合型グリコシル化部位
の少なくとも１つを、活性に対する最小限の影響で選択的に除去した。Ｎ−グリカン部位
を、Ｎ−グリカンコンセンサス配列を破壊することによって、ＤＮＡレベルで消した。Ｎ
（アスパラギン）コドンの除去およびＱ（グルタミン）コドンによる置換によってこれを
行った。図６は、ヒポグリコシル化変異体の例を示す表である。グリコシル化変異体を、
野生型第ＶＩＩ因子（本明細書では「Ｆ７」と呼ぶ）、Ｖ１およびＶ２骨格で作成した。
Ｖ１およびＶ２中の操作したＮ−グリカン部位（Ｎ１０６、Ｎ２５３）をその野生型配列
（Ｔ１０６、Ｖ２５３）に戻した。変異体ｐＭＢ１１３、ｐＭＢ１１７およびｐＭＢ１２
１はそれぞれ２個の内因性Ｎ−グリコシル化部位（Ｎ１４５、Ｎ３２２）を含有する野生
型第ＶＩＩ因子、Ｖ１およびＶ２構築物である。図６の他の全ての変異体は、ＮからＱへ
の変異（Ｎ１４５Ｑ、Ｎ３２２Ｑ）を導入することによって除去された内因性Ｎ−グリカ
ン部位の一方または両方を有していた。この脱グリコシル化アプローチによりより速いク
リアランスがもたらされる。

本開示の一態様では、脱グリコシル化および脱シアリル化を組み合わせて、所望の短縮
した半減期を有する第ＶＩＩ因子ポリペプチドを得る。例えば、第ＶＩＩ因子分子を遺伝
子組換えして、野生型第ＶＩＩ因子中に存在する２つを超える追加のＮ結合型グリコシル
化部位を含めることができる。次いで、本明細書に記載される方法の１つを用いて、この
変異体を脱シアリル化することができる。次いで、得られた分子は、末端シアル酸を含ま
ない各Ｎ結合型グリコシル化部位でグリカン構造を保持し得る。本明細書で報告される実
験で、出願人らは、有するＮ結合型グリコシル化部位が少ない類似の脱シアリル化第ＶＩ
Ｉ因子変異体よりも速い排除時間を有する変異体を報告する。同様に、野生型第ＶＩＩ因
子に見られる２つのＮ結合型グリコシル化部位のみを有する第ＶＩＩ因子ポリペプチドを
、これらの部位の１つで脱グリコシル化し、次いで、脱シアリル化に供することができる
。シアル酸を欠く１個のＮ結合型グリカンを有する得られた第ＶＩＩ因子変異体は、本明
細書で報告される実験証拠に基づいて、第２のＮ結合型グリコシル化部位を欠いていない
類似の第ＶＩＩ因子ポリペプチドとは異なる薬物動態を有する。

定義および実施形態
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、一般的
に本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。一般
的に、本明細書で使用される命名法ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学、および核
酸化学およびハイブリダイゼーションの実験室手順は、当技術分野で周知でありかつ一般
的に使用されているものである。核酸およびポリペプチド合成のために標準的な技術を使
用する。本明細書で使用される命名法ならびに下記の分析化学および有機合成の実験室手
順は、当技術分野で周知でありかつ一般的に使用されているものである。化学合成および
化学分析のために標準的な技術またはその修正を使用する。遺伝子操作に使用される手順
は周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．
Ｙ．に見出され得る。

「シアル酸」または「シアリル」という用語は、九炭素カルボキシル化糖のファミリー
のいずれかのメンバーを指す。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセ
チル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ
−Ｄ−ガラクトノヌロピラノース（ｇａｌａｃｔｏｎｏｎｕｌｏｐｙｒａｎｏｓ）−１−
オン酸（通常Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃまたはＮＡＮＡと略される））である。

「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用され、
モノマーがアミノ酸であり、かつアミド結合を通して結合されているポリマーを指す。さ
らに、非天然アミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニン
も含まれる。遺伝子コードされていないアミノ酸も本明細書で開示される技術で使用する
ことができる。さらに、反応性基、グリコシル化部位、ポリマー、治療部分、生体分子な
どを含むよう修飾されたアミノ酸も使用することができる。本明細書で使用されるアミノ
酸の全てはＤ−またはＬ−異性体のいずれであってもよい。Ｌ−異性体が一般的に好まし
い。本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、グリコシル化
と非グリコシル化両方のポリペプチドおよびタンパク質をそれぞれ指す。

「アミノ酸」という用語は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に
機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝暗号によっ
てコードされているもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリ
ン、γ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリンである。「アミノ酸類似体」は
、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ酸および
Ｒ基に結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン
スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾Ｒ基（
例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化
学構造を保持している。「アミノ酸模倣体」は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なるが
、天然アミノ酸と同様に機能する構造を有する化学化合物を指す。

ポリペプチドまたはタンパク質薬物を患者に投与する文脈において本明細書で使用され
る「半減期」または「ｔ１／２」という用語は、患者における薬物の血漿中濃度が２分の
１低下するのに要する時間として定義される。

半減期は、例えば、約２５〜２５０μｇ／ｋｇの用量の製剤を投与し：投与後の所定の
時間に血漿試料を得て；凝固アッセイ（もしくは任意の生物検定）、免疫測定法または同
等の方法の１つまたは複数を用いて試料中の第ＶＩＩ因子ポリペプチドの含量を測定する
ことによって、試験動物で測定することができる。データを図表で表示し、次いで、生物
学的利用能を曲線下の面積として決定する。特定の例では、ラットまたはマウスモデルを
半減期測定に使用する。第ＶＩＩ因子ポリペプチドまたはその組成物の相対的生物学的利
用能は、短時間作用性第ＶＩＩ因子ポリペプチドの曲線下の面積と野生型第ＶＩＩ因子ま
たは別の適切なコンパレータポリペプチド（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉ
ｄｅ）もしくはタンパク質の曲線下の面積の比を指す。第ＶＩＩ因子の血液凝固活性を有
するいずれの第ＶＩＩ因子変異体も本明細書に記載される目的および方法に有用である。
本明細書で使用される第ＶＩＩ因子変異体はポリペプチドである。「変異形第ＶＩＩ因子
ポリペプチド」および「第ＶＩＩ因子変異体」という用語は本明細書で互換的に使用され
る。一実施形態では、第ＶＩＩ因子変異体が、１個または複数のアミノ酸の置換、欠失お
よび／または挿入による野生型第ＶＩＩ因子（配列番号１６）由来のアミノ酸配列を有す
る。アミノ酸置換の命名において、第１の文字はある位置で野生型ヒト第ＶＩＩ因子中に
存在するアミノ酸を表す。次の数字はヒト野生型第ＶＩＩ因子中の位置を表す。第２の文
字は野生型に見られるアミノ酸に置き換わるアミノ酸を表す。例えば、「Ｐ１０Ｑ」は、
アミノ酸１０位におけるプロリン（Ｐ）のグルタミン（Ｑ）による置換を表す。

特定の例では、第ＶＩＩ因子変異体がＰ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｔ１
０６ＮおよびＶ２５３Ｎからなる群から選択される１個または複数のアミノ酸置換を含む
。他の例では、第ＶＩＩ因子変異体がこれらの置換の少なくとも２、３、４、５または６
個を含む。さらなる例では、第ＶＩＩ因子変異体が配列番号１６のアミノ酸配列（野生型
ヒト第ＶＩＩ因子）に関して少なくとも２つの配列変化を有するアミノ酸配列を含み、少
なくとも２つの配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、およ
び（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基である。別の例では、第ＶＩＩ
因子変異体が配列番号１６のアミノ酸配列に関して少なくとも３つの配列変化を有するア
ミノ酸配列を含み、少なくとも３つの配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換した
グルタミン残基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、および（３）
３６位のアルギニン残基に置換したグルタミン酸残基である。さらなる例では、第ＶＩＩ
因子変異体が配列番号１６のアミノ酸配列に関して少なくとも４つの配列変化を有するア
ミノ酸配列を含み、少なくとも４つの配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換した
グルタミン残基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、（３）３６位
のアルギニン残基に置換したグルタミン酸残基、および（４）３４位のアラニン残基に置
換したグルタミン酸残基である。１つの特定の例では、第ＶＩＩ因子変異体が配列番号１
６のアミノ酸配列に関して少なくとも６つの配列変化を有するアミノ酸配列を含み、少な
くとも６つまたは６つの配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残
基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、（３）３６位のアルギニン
残基に置換したグルタミン酸残基、（４）３４位のアラニン残基に置換したグルタミン酸
残基、（５）１０６位のトレオニン残基に置換したアスパラギン残基、および（６）２５
３位のバリン残基に置換したアスパラギン残基である。別の特定の例では、第ＶＩＩ因子
変異体がこれらの６つの変化のみを含む。これらの変異体についてのさらなる詳細は、共
に全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｍａｘｙｇｅｎの国際公開第２００１
５８９３５号パンフレットおよびＰｅｄｅｒｓｅｎらの米国特許第７３７１５４３号明細
書に見出される。

本明細書に記載される第ＶＩＩ因子変異体は、出発ポリペプチドとして任意の機能的第
ＶＩＩ因子ポリペプチドを用いて設計することができる。特定の実施形態では、第ＶＩＩ
因子ポリペプチドがヒト第ＶＩＩ因子ポリペプチドである。さらなる実施形態では、第Ｖ
ＩＩ因子ポリペプチドが配列番号１６のヒト第ＶＩＩ因子ポリペプチド、またはその修飾
型もしくは対立遺伝子変異体である。有用な出発ポリペプチドには、第ＶＩＩ因子活性も
有する、野生型ヒト第ＶＩＩ因子の配列（配列番号１６）と少なくとも９９％、９８％、
９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、
８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、
７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、
６７％または６６％同一のアミノ酸配列を含む修飾または変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチ
ドも含まれる。さらに、特定の例では、本開示の変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドには、
第ＶＩＩ因子機能性を有し、かつ配列番号１６に関して本明細書で論じられるアミノ酸変
化の１つまたは複数も含有する、配列番号１６の配列と少なくとも約９９％、９８％、９
７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８
７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７
７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６
７％または６６％の同一性を有する任意のポリペプチドが含まれる。別の実施形態では、
第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、配列番号１６との９９％、９８％、９７％、９６％、９５
％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５
％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５
％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％または６６％超
の相同性および第ＶＩＩ因子活性を有し、かつ本明細書で言及されるアミノ酸変化の１つ
または複数も有するアミノ酸配列を含む。

本明細書で使用される第ＶＩＩ因子変異体には、野生型第ＶＩＩ因子のグリコシル化変
異体も含まれる。例えば、部分的脱シアリル化野生型第ＶＩＩ因子変異体およびその組成
物は野生型第ＶＩＩ因子よりも短い半減期を有するので有用となり得る。部分的または完
全脱シアリル化野生型第ＶＩＩ因子の医薬製剤ならびに第ＶＩＩ因子活性を有する短時間
作用性ポリペプチドから利益を得る本明細書に列挙される疾患の治療へのこのようなポリ
ペプチドおよび製剤の使用も本明細書で有用である。部分的または完全脱シアリル化は、
本明細書に記載されるように第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物中の抱合型シアル酸のモ
ルとＮ結合型グリカンのモルの比によって測定することができる。

本明細書中の第ＶＩＩ因子変異体をコードするヌクレオチド配列も有用である。一実施
形態では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、野生型第ＶＩＩ因子のヌクレオチド配列（配列
番号１）と全長にわたって少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％
、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％
、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％
、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％または６６％の同一性を有
し、かつ機能的第ＶＩＩ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列によってコード
されている。特定の例では、ヌクレオチド配列が配列番号１６に関して本明細書で論じら
れるアミノ酸変化の１つまたは複数を含有するポリペプチドもコードする。別の実施形態
では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、野生型第ＶＩＩ因子のヌクレオチド配列（配列番号
１）との９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、
９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、
８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、
７０％、６９％、６８％、６７％または６６％超の相同性を有し、かつ機能的第ＶＩＩ因
子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列によってコードされている。特定の例では
、ヌクレオチド配列が配列番号１６に関して本明細書で論じられるアミノ酸変化の１つま
たは複数を含有するポリペプチドもコードする。

同一性％値は、アミノ酸または核酸配列領域全体にわたって計算される。異なる配列を
比較するために、種々のアルゴリズムに基づく一連のプログラムが当業者に利用可能であ
る。少なくとも一実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性％が、ＥＭＢＯＳＳソフ
トウェアパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ、Ｒｉｃｅ，Ｐ．、Ｌｏｎｇ
ｄｅｎ，Ｉ．、およびＢｌｅａｓｂｙ，Ａ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １
６（６）、２７６〜２７７、２０００）のｎｅｅｄｌｅプログラムに組み込まれたＮｅｅ
ｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ １９７０、Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４〜４５３）を用いて、遠縁のタンパク質についてのＢ
ＬＯＳＵＭ ４５もしくはＰＡＭ２５０スコアリングマトリクスのいずれか、または近縁
のタンパク質についてのＢＬＯＳＵＭ ６２もしくはＰＡＭ１６０スコアリングマトリク
スのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ開始ペナル
ティおよび０．５、１、２、３、４、５または６のギャップ伸長ペナルティを用いて決定
される。ＥＭＢＯＳＳパッケージのローカルインストールのためのガイドならびにウェブ
サービスへのリンクは、ｅｍｂｏｓｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔに見出され得る
。ｎｅｅｄｌｅプログラムを用いて２つのアミノ酸配列を整列させるために使用されるパ
ラメータの非限定的例には、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス、１０のギャッ
プ開始ペナルティおよび０．５のギャップ伸長ペナルティを含むデフォルトパラメータが
ある。さらに別の実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性％が、ＥＭＢＯＳＳ
ソフトウェアパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ、Ｒｉｃｅ，Ｐ．、Ｌｏ
ｎｇｄｅｎ，Ｉ．、およびＢｌｅａｓｂｙ，Ａ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
１６（６）、２７６〜２７７、２０００）のｎｅｅｄｌｅプログラムを用いて、１６、
１４、１２、１０、８、６または４のギャップ開始ペナルティおよび０．５、１、２、３
、４、５または６のギャップ伸長ペナルティと共にＥＤＮＡＦＵＬＬスコアリングマトリ
クスを用いて決定される。ｎｅｅｄｌｅプログラムを用いて２つのアミノ酸配列を整列さ
せるために使用されるパラメータの非限定的例には、ＥＤＮＡＦＵＬＬスコアリングマト
リクス、１０のギャップ開始ペナルティおよび０．５のギャップ伸長ペナルティを含むデ
フォルトパラメータがある。核酸およびタンパク質配列を「クエリ配列」としてさらに使
用して公共データベースに対して検索を行って、例えば、他のファミリーメンバーまたは
関連配列を同定することができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃ
ｈｕｌ １９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０）のＢＬＡＳＴシリー
ズのプログラム（バージョン２．２）を用いて行うことができる。クエリ配列として本開
示の核酸配列を用いるＢＬＡＳＴを、デフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴｎ、ＢＬ
ＡＳＴｘまたはｔＢＬＡＳＴｘプログラムで行って、本開示の核酸配列によってコードさ
れる配列と相同なヌクレオチド配列（ＢＬＡＳＴｎ、ｔＢＬＡＳＴｘ）またはアミノ酸配
列（ＢＬＡＳＴｘ）のいずれかを得ることができる。クエリ配列として本開示の核酸配列
によってコードされるタンパク質配列を用いるＢＬＡＳＴを、デフォルトパラメータを用
いるＢＬＡＳＴｐまたはｔＢＬＡＳＴｎプログラムで行って、本開示の配列と相同なアミ
ノ酸配列（ＢＬＡＳＴｐ）または核酸配列（ｔＢＬＡＳＴｎ）のいずれかを得ることがで
きる。比較目的のためのギャップ化アラインメントを得るために、ＡＬｔｓｃｈｕｌら、
１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２に
記載されているように、デフォルトパラメータを用いるＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用
することができる。

本開示のポリヌクレオチドは上記ヌクレオチド配列から本質的になるまたは上記ヌクレ
オチド配列を含む。したがって、これらはさらなるヌクレオチド配列も含有することがで
きる。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドが、オープンリーディングフレームに加え
て、コード遺伝子領域の３’および／または５’末端にさらなる未翻訳配列、例えば、コ
ード領域の５’末端の上流の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８
０、９０、１００、２００、３００、４００、５００もしくはそれ以上のヌクレオチドの
配列および／またはコード遺伝子領域の３’末端の下流の少なくとも１０、２０、３０、
４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００もしく
はそれ以上のヌクレオチドの配列を含むことができる。さらに、ポリヌクレオチドは、融
合タンパク質の一方のパートナーが上に列挙されるヌクレオチド配列によってコードされ
ているポリペプチドである融合タンパク質をコードすることができる。このような融合タ
ンパク質は、精製目的のための検出可能なマーカーまたは補助尺度として働き得るいわゆ
る「タグ」を含むことができる。異なる目的のためのタグは当技術分野で周知であり、Ｆ
ＬＡＧタグ、６−ヒスチジンタグ、ＭＹＣタグなどを含む。一実施形態では、ポリヌクレ
オチドが、ヌクレオチド配列と作動可能に連結した発現制御配列をさらに含む。

特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドをコードする核酸配列を適切なベクタ
ーに挿入する。種々の目的に有用な多数のベクターが当技術分野で周知であり、当業者で
あれば所望の用途に適したベクターを容易に選択することができるだろう。特定の例では
、ベクターがクローニングベクターまたは発現ベクターであり得る。他の例では、ベクタ
ーがプラスミド、ウイルスベクター、コスミドまたは人工染色体であり得る。特定の例で
は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドをコードする核酸が、適切なプロモーターに隣接しておよ
び／またはその制御下に配置され得る。種々の目的に有用な多数のプロモーターが当技術
分野で周知であり、当業者であれば所望の用途に適したプロモーターを容易に選択するこ
とができるだろう。特定の例では、プロモーターが構成型プロモーター、誘導性プロモー
ターまたは組織特異的プロモーターであり得る。

特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドが細胞、組織または生物中で組換え産
生される。特定の実施形態では、このような組換え産生が、変異ポリペプチドをコードす
る核酸分子またはこのような核酸を含有するベクターで宿主細胞を形質転換またはトラン
スフェクトすることによって達成される。多数の形質転換およびトランスフェクション法
が当技術分野で周知であり、当業者であれば所望の用途に適した方法を容易に選択するこ
とができるだろう。

このような組換え産生を、任意の適切な宿主細胞、組織または生物を用いて達成するこ
ともできる。適切な細胞、組織および生物が当技術分野で周知であり、当業者であれば所
望の用途に適した宿主を容易に選択することができるだろう。いくつかの実施形態では、
宿主細胞が哺乳動物である。適切な哺乳動物細胞系の例には、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ １６５０）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１５７３；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９〜７２、１９７７）
、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １１２６８；ＤＳＭ ＡＣＣ ２４９４）および
ＨＥＫ２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｒ７９００７）細胞系がある。有用なＢＨＫ細
胞系は以下でＢＨＫ５７０細胞と呼ぶ、ｔｋ^３１ｔｓ１３ ＢＨＫ細胞系（参照により本
明細書に組み込まれている、ＷａｅｃｈｔｅｒおよびＢａｓｅｒｇａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：１１０６〜１１１０、１９８２）である。ＢＨＫ
５７０細胞系は、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１０３１４で、米国培養細胞系統保存機関、１
２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．２０８５２により寄
託された。ｔｋ⁻ｔｓ１３ ＢＨＫ細胞系も寄託番号ＣＲＬ１６３２で、ＡＴＣＣから入
手可能である。さらに、Ｒａｔ Ｈｅｐ Ｉ（ラット肝細胞癌；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６０
０）、Ｒａｔ Ｈｅｐ ＩＩ（ラット肝細胞癌；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５４８）、ＴＣＭＫ
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１３９）、ヒト肺（ＡＴＣＣ ＨＢ８０６５）、ＮＣＴＣ１４６９（
ＡＴＣＣ ＣＣＬ９．１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ Ｋ１（ＡＴＣＣ
ＣＣＩ６１）、ＤＵＫＸ細胞（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６〜４２２０、１９８０）およびＣＨＯ−Ｄ
Ｇ４４細胞（Ｕｒｌａｕｂら Ｃｅｌｌ ３３：４０５〜４１２、１９８３）を含む、い
くつかの他の細胞系を本開示中で使用することができる。

本明細書に定義され、組成物中のＮ結合型グリカン１モル当たりの抱合型シアル酸のモ
ルの比が０．０５未満、０．１未満、１．０未満、２．０未満、３．０未満、４．０未満
、５．０未満または６．０未満である第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物、あるいはＮ結
合型グリカン１モル当たりの抱合型シアル酸のモルの比が（１）０〜８；（２）０〜７；
（３）０〜６；（４）０〜５；（５）０〜４；（６）０〜３；（７）０〜２；（８）０〜
１および（９）０〜０．５からなる群から選択される範囲内、または１〜８、１〜７、１
〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２
〜３、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５およ
び０．１〜１の比である組成物が有用である。比は、糖タンパク質上のグリカンの数に対
する糖タンパク質に結合したシアル酸のモルの測定値である。グリカンの数とは、糖タン
パク質中のＮ結合型グリカンに結合した糖部分の数を指し、１つのＮ結合型グリコシル化
部位はこの比の目的のために本明細書で定義されるただ１つのグリカンを支持し得る。比
は、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．（カタログ番号４４００）によって販売されている
ようなシアル酸蛍光標識キットを用いて決定される。このようなシアル酸蛍光標識キット
は、部分的酸加水分解またはアルスロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａ
ｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）シアリダーゼなどのシアリダーゼの使用などによっ
て、結合糖タンパク質からシアル酸を放出するステップを含む。次いで、遊離シアル酸を
１，２−ジアミノ−４，５−メチレンオキシベンゼン（「ＤＭＢ」）などの発蛍光団で標
識する。次いで、標識シアル酸を、ＨＰＬＣを用いておよびピーク高さを較正曲線と比較
して、定量的に測定する。したがって、測定される比は、組成物の全第ＶＩＩ因子ポリペ
プチドから放出されるグリカン１モル当たりのシアル酸のモルの比である。

一連の実施形態では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物または単離ポリペプチド自体
が、ヒトまたは哺乳動物血漿、例えば、マウスまたはラット血漿中で測定された場合、２
時間未満、１．５時間未満、１時間未満、．７５時間未満、．５時間未満、．２５時間未
満、０．１時間未満の半減期、あるいは合理的に測定することができないほど短い半減期
を有する。

本明細書で使用する場合、第ＶＩＩ因子活性は、当技術分野で周知のように、第ＶＩＩ
因子欠乏血漿およびトロンボプラスチンを用いて、製剤が血液凝固を促進する能力を測定
することによって定量化され得る生物活性である。特定の例では、第ＶＩＩ因子活性を有
する第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、同じ条件下で測定される場合、野生型第ＶＩＩ因子の
活性の少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少
なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％を示す。

第ＶＩＩ因子ポリペプチドおよび第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含むその組成物と、薬学
的に許容される賦形剤または担体との医薬製剤も有用である。特定の例では、医薬製剤が
、例えば、静脈内、皮下または筋肉内投与などによる非経口投与用であり、投薬が単一ボ
ーラス用量、間欠投薬または連続静脈内注射としてのものとなり得る。局所投与も有用で
ある。一実施形態は、使用時に再構成される凍結乾燥製剤中に本明細書に記載される単離
第ＶＩＩ因子ポリペプチドまたは本明細書に記載される第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成
物を含む医薬製剤を含む。あるいは、医薬製剤は、再構成を要さない安定な液体の即時使
用可能な製剤であり得る。医薬製剤は、第ＶＩＩ因子ポリペプチド１、２、５または８ｍ
ｇの単回使用バイアル中の凍結乾燥粉末であり得る。ヒスチジンを含有する滅菌水などの
、指定量の液体による再構成後、最終溶液は、治療効果をもたらす任意の適切な量の第Ｖ
ＩＩ因子ポリペプチド、例えば、限定されないが、１ｍｇ／ｍＬ（１０００μｇ／ｍＬ）
、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１〜２ｍｇ／ｍＬ、１〜
３ｍｇ／ｍＬ、１〜５ｍｇ／ｍＬ、１〜１０ｍｇ／ｍＬ、０．５〜１ｍｇ／ｍＬまたは０
．５〜２ｍｇ／ｍＬの第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有することができる。患者への適切
な投与量は、例えば、患者の体重、治療している出血性障害またはエピソードの種類、お
よび使用している特定の第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性に基づいて当業者によって容易
に決定され得る。特定の例では、投薬が７０〜１１０μｇ／ｋｇ、７０〜９０μｇ／ｋｇ
または８０〜１００μｇ／ｋｇの範囲にあり、９０μｇ／ｋｇであり得る。凍結乾燥粉末
は、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン等などの水性担体を用いて再構
成され得る。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法は当業者に知られ
ているまたは明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎ
ｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ．（１９９０）により詳細に記載されている。外傷の場合に賢明
となり得るような局所適用は、スプレー、灌流、カテーテル、ステント、血管移植もしく
はステント、軟膏、または当技術分野で知られている他の製剤によって行うことができる
。特定の例では、局所投与が、第ＶＩＩ因子変異体を含む組成物で処理された、これを注
入された、これでコーティングされた、またはこれに浸漬された外科スポンジまたはコラ
ーゲンマトリクスなどの固体または半固体マトリクスを通してもよい。このようなマトリ
クスを調製する方法は当技術分野で周知であり（例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ／Ｈｅｍ
ｏｓｔａｓｉｓ １２：４４５、２００６参照）、当業者であれば適切な用量および組成
物を所与のマトリクスに適用する方法を容易に決定することができるだろう。

一実施形態では、本開示は第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含むキットに関する。特定の例
では、キットが適切な医薬組成物中に第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する即時使用可能
な液体を含有するバイアルを含有する。他の例では、キットが凍結乾燥第ＶＩＩ因子ポリ
ペプチドまたはポリペプチドを含む凍結乾燥製剤と、再構成用の希釈剤とも含有するバイ
アルを含有する。他の例では、キットが、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの局所製剤、例えば
、軟膏、スプレー、または液体、および局所製剤を患者への投与前に適用することができ
るスポンジまたは他の医療用マトリクスなどのマトリクスを含有する。

本明細書に記載される第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物も有用である。第ＶＩＩ因子
はその天然分解産物との混合で存在する。したがって、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成
物は、本明細書で列挙される完全アミノ酸配列の１つを有するポリペプチドと、本明細書
に記載されるものの部分的アミノ酸配列を有する分解産物とを含む。さらに、第ＶＩＩ因
子は糖タンパク質であるので、第ＶＩＩ因子の組成物は、組成物中の各糖タンパク質が他
のものと正確に同じグリコシル化を有するわけではない第ＶＩＩ因子ポリペプチドの不均
一な混合物を含有すると予想され得る。第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物または単離第
ＶＩＩ因子ポリペプチドへの言及は、個々のポリペプチドが異なるグリコシル化を有する
このようなポリペプチドの混合物を包含するものとし、したがって、「組成物」または「
単離第ＶＩＩ因子ポリペプチド」という用語は、ポリペプチド中にグリコシル化パターン
の不均一性を包含する。

本明細書に記載される第ＶＩＩ因子ポリペプチドおよび組成物は、血液凝固障害、およ
び血液凝固から利益を得る障害の治療、特に、野生型第ＶＩＩ因子よりも短い半減期を有
する薬物を用いた凝固に有用である。したがって、本明細書の第ＶＩＩ因子ポリペプチド
および組成物は、穿通性外傷性損傷；鈍的外傷性損傷；待機手術における出血；心臓手術
における出血；脊髄手術における出血；整形外科手術；神経外科手術；腫瘍学手術；分娩
後手術；月経過多；幹細胞移植における出血；肝移植における出血；消化管出血；肝硬変
の活発な静脈瘤出血；肝硬変の非静脈瘤出血；びまん性肺胞出血；大動脈瘤；脳内出血；
外傷性脳損傷；脳挫傷；ワルファリンの逆転；ヘパリンの逆転；抗凝固薬の逆転；抗血栓
薬の逆転；第ＶＩＩ因子欠乏症；火傷；阻害因子による血友病患者の予防；非肝硬変およ
び肝硬変患者のための部分肝切除；後天性血友病；特発性血小板減少性紫斑病；グランツ
マン血小板無力症；血小板輸血に対して難治性のグランツマン血小板無力症およびベルナ
ール−スリエ症候群に有用である。

本明細書では、第ＶＩＩ因子などの凝固因子の半減期を測定するのに有用なアッセイも
開示される。生存ラット肝細胞を血液凝固因子と共にインキュベートするステップと、試
験時点１で試料を取り出すステップと、試料中の細胞から上清を分離するステップと、試
料中の上清中の血液凝固因子の活性または量を定量化するステップとを含む、凝固因子の
半減期を測定する方法であって、血液凝固因子の活性または量が二抗体サンドイッチＥＬ
ＩＳＡアッセイを用いて測定される方法が存在する。本方法を異なる時点で繰り返して、
経時的な血液凝固因子の活性または量のプロットを作成してもよい。

［実施例］
脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを得る方法
ポリペプチドの酵素的脱シアリル化、シアリル化欠乏細胞系での第ＶＩＩ因子ポリペプ
チドの産生、および組換え細胞での第ＶＩＩ因子とシアリダーゼの同時発現を含む、多数
の方法を使用して脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチド（野生型と変異体の両方）を産
生した。

シアル酸欠乏細胞系の作成
内因性シアル酸を、３２種の酵素からなる複雑な経路を含む哺乳動物細胞で合成する（
ＷｉｃｋｒａｍａｓｉｎｇｈｅおよびＭｅｄｒａｎｏ ２０１１）。シアル酸の生合成は
、サイトゾル中で始まり、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎア
セチルマンノサミンキナーゼ（ＧＮＥ）、シアル酸９−リン酸シンターゼ（ＮＡＮＳ）お
よびシアル酸９−リン酸ホスファターゼ（ＮＡＮＰ）などのいくつかの酵素を伴い、ＵＤ
Ｐ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃ）をＮｅｕ５Ａｃに変換する。サ
イトゾル中のＮｅｕ５Ａｃは、核膜孔を通して核内に輸入され、ＣＭＰ−Ｓｉａシンター
ゼ（ＣＭＡＳ）と呼ばれる酵素によってＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃに変換される。合成された
ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃは、さらなる修飾およびゴルジ装置への抱合のために、核膜孔を介
してサイトゾル内に再度輸送される。サイトゾル中でのＮｅｕ５ＡｃのＮｅｕ５Ｇｃへの
変換は、酵素ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）によって触媒される。次
いで、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃおよびＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ｇｃが中央トランスゴルジの膜に位
置する疎水性３型膜輸送体、ＣＭＰ−シアル酸輸送体（ＳＬＣ３５Ａ１）を介してゴルジ
コンパートメントに輸送される。ＣＭＰ−シアル酸輸送体は、細胞シアリル化経路の重要
な要素である（Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇら １９９８）。この遺伝子のホモ接合性変異は、
マウスにおいて生後致死を引き起こす（ＭＧＩ ４．３２、Ｈｏｍｏｌｏｇｅｎｅ）。ヒ
トでは、ＳＬＣ３５Ａ１の変異がシアリル抱合体の減少または完全な喪失に関連している
。ＳＬＣ３５Ａ１におけるいくつかの挿入および欠失変異は、ヒトのグリコシル化の先天
性障害に関連し、神経系発達、凝固の欠陥、および免疫不全をもたらす（Ｍａｒｔｉｎｅ
ｚ−Ｄｕｎｃｋｅｒら、２００５）。いったんＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ／ＣＭＰ−Ｎｅｕ５
Ｇｃがゴルジ装置に輸送されると、これらは２０のメンバーを含むシアリルトランスフェ
ラーゼ（ＳＴ）ファミリー内の酵素によって炭水化物、糖タンパク質および糖脂質と抱合
する。

ＣＭＰ−シアル酸輸送体（ＳＬＣ３５Ａ１）はゴルジ装置でのシアル酸抱合を支持する
主要な分子であり、この輸送体タンパク質の変異は適切なシアリル化を欠くタンパク質の
合成につながる。脱シアリル化第ＶＩＩ因子を産生するために、ＣＭＰ−シアル酸輸送体
遺伝子ノックアウトを有する第ＶＩＩ因子産生細胞系を作成する。あるいは、治療分子上
のシアリル化が極めて低レベルまたは全くないタンパク質治療剤を産生する細胞系での第
ＶＩＩ因子変異体の発現によって、脱シアリル化を達成することができるだろう。この技
術を用いて患者においてＴ１／２が短い治療タンパク質を産生することができるだろう。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）起源を有するＬｅｃ２細胞を、それぞれの野生
型細胞よりもおよそ１０倍少ない糖タンパク質および糖脂質中のシアル酸を産生するとい
う特性により同定した（ＳｔａｎｌｅｙおよびＳｉｍｉｎｏｖｉｔｃｈ、１９７７、Ｓｔ
ａｎｌｅｙ、１９８０および１９８３）。後の研究により、Ｌｅｃ２変異体がインビトロ
アッセイにおいてＣＭＰ−シアル酸をゴルジ小胞の膜を横切って転位置させることができ
ない一方で、他のヌクレオチド誘導体の転位置は変異細胞において比較的正常であること
が示された（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒら、１９８４）。発現クローニングを用いることにより
、Ｌｅｃ２細胞からＣＭＰ−シアル酸輸送体をコードする遺伝子が報告された（Ｅｃｋｈ
ａｒｄｔら、１９９６）。さらなる調査により、ＣＭＰ−シアル酸輸送体遺伝子中のヌク
レオチド５７５〜７５１の欠失がＬｅｃ２表現型の原因であることが示された（Ｅｃｋｈ
ａｒｄｔら、１９９８）。例えば、例えば、１Ｅ３、６Ｂ２、８Ｇ８および９Ｄ３細胞の
場合のＣＭＰ−シアル酸輸送体遺伝子中の他の変異もＬｅｃ２表現型をもたらす（Ｅｃｋ
ｈａｒｄｔら、１９９８）。

実験１
この実験を、例えば、Ｌｅｃ２細胞の場合のＣＭＰ−シアル酸輸送体の遺伝子中の変異
が、正常なＣＨＯ細胞から発現される同じタンパク質と比較してシアリル化の欠乏した発
現組換えタンパク質（例えば、第ＶＩＩ因子）をもたらすかどうかを決定するよう設計す
る。

（１）Ｌｅｃ２細胞からの第ＶＩＩ因子などの組換えタンパク質の発現の試験 第ＶＩ
Ｉ因子変異遺伝子を含有する発現ベクター（例えば、ｐＭＢ１１７およびｐＭＢ１２１）
を正常なトランスフェクション条件下でＬｅｃ２細胞および正常なＣＨＯ細胞にトランス
フェクトする。これらの細胞の細胞培養からの第ＶＩＩ因子の発現レベルを、第ＶＩＩ因
子活性アッセイによって監視する。トランスフェクト細胞の培養をスケールアップし、培
養条件培地を第ＶＩＩ因子の精製のために回収する。

（２）正常なＣＨＯ細胞から発現した同じタンパク質と比較したＬｅｃ２細胞から発現
した精製第ＶＩＩ因子のシアル酸含量の試験 これらの条件培地からの第ＶＩＩ因子の精
製を、通常の第ＶＩＩ因子精製法にしたがって行う。Ｌｅｃ２細胞または正常なＣＨＯ細
胞のいずれかからの精製第ＶＩＩ因子を、精製第ＶＩＩ因子のシアル酸含量について分析
する。生物活性および薬物動態（ＰＫ）パラメータを本明細書に記載されるように分析す
る。

実験２
発現組換えタンパク質上にシアル酸を含まない第ＶＩＩ因子変異体を発現する製造細胞
系を作成するために、ＣＭＰ−シアル酸輸送体遺伝子を標的化して第ＶＩＩ因子を発現す
る細胞系（例えば、ＣＨＯ細胞系）を修飾する遺伝子欠失法を使用する。細胞でのシアリ
ル化を完全に阻害するために、序論で上に列挙されるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン
−２−エピメラーゼ／Ｎアセチルマンノサミンキナーゼ（ＧＮＥ）、シアル酸９−リン酸
シンターゼ（ＮＡＮＳ）、シアル酸９−リン酸ホスファターゼ（ＮＡＮＰ）およびＣＭＰ
−Ｓｉａシンターゼ（ＣＭＡＳ）などの他の標的を欠失させて、ＣＭＰ−シアル酸輸送体
のための基質を提供するＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ生合成の阻害を増強してもよい。

２つの遺伝子欠失技術、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＴＡＬＥヌクレアー
ゼ（ＴＡＬＥＮ）およびＳａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ／Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄ
ｒｉｃｈ製のＺＦＰヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を、ＣＭＰ−シアル酸輸送体遺伝子のノック
アウトまたはシアル酸合成経路の複数の遺伝子のノックアウトを行うために使用すること
ができる。

ＣＭＰ−シアル酸輸送体遺伝子ノックアウトを有する第ＶＩＩ因子発現細胞系を評価し
てＣＭＰ−シアル酸輸送体遺伝子の欠失を確認する。確認した細胞系を培養して第ＶＩＩ
因子を産生する。ＣＭＰ−シアル酸輸送体遺伝子欠失細胞系からの第ＶＩＩ因子を本明細
書に記載されているように精製および評価し、分子上のシアル酸含量について親第ＶＩＩ
因子発現細胞系からの第ＶＩＩ因子と比較する。

第ＶＩＩ因子と細菌シアリダーゼの同時発現による脱シアリアル化第ＶＩＩ因子の産生
ＦＶＩＩの脱シアリル化型を作成するために、本発明者らは、アルスロバクター・ウレ
アファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）シアリダーゼ（
ＡＵシアリダーゼ）（Ｎ−アセチルノイラミネートグリコヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１
．１８）由来の細菌シアリダーゼ変異体と共にＦＶＩＩを同時発現させた。ＣＨＯ細胞安
定に発現ＦＶＩＩ（例えば、Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４ＥおよびＲ３６Ｅ変異を有する
配列番号１６）を、ｐＪ６０８発現ベクターを用いてＡＵシアリダーゼでさらにトランス
フェクトした。発現したタンパク質は、タンパク質の分泌を促進する、Ｎ末端の成長ホル
モンシグナル配列を有する。培地中のシアリダーゼについての発色性アッセイによって検
出されるＡＵシアリダーゼを産生する安定なクローンを選択した。本発明者らはまた、細
胞が高レベルのＦＶＩＩタンパク質を発現し続けることを示した（これは、プローブとし
てＦＶＩＩ特異的抗体を用いる、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウエスタ
ンブロット法によって検出した）。レクチンブロッティングアッセイを用いて、本発明者
らは、精製ＦＶＩＩを用いて条件培地中のＦＶＩＩタンパク質上のシアル酸を検出するこ
とができなかった。対照的に、シアリダーゼでトランスフェクトしていない細胞由来の同
様のレベルの精製ＦＶＩＩは、強力なレクチン結合シグナルを示した。まとめると、本発
明者らのデータは、ＡＵシアリダーゼが、細胞によって同時発現したＦＶＩＩを効率的に
脱シアリル化するのに十分なレベルでＣＨＯ細胞培地中で発現したことを示している。

可溶性シアリダーゼ処理を用いた脱シアリル化第ＶＩＩ因子の酵素調製
以下の出発材料をこの実験に利用した：
第ＶＩＩ因子：２０ｍｇ野生型第ＶＩＩａ因子、濃度約１ｍｇ／ｍｌ
シアリダーゼ：２０μｇ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、５００００Ｕ／ｍｌ、Ｐ０７２０Ｌ、
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓから購入
緩衝液Ａ：２５ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．４
緩衝液Ｂ：２５ｍＭヒスチジン、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．４
ＦＶＩＩａ製剤緩衝液：２．３ｍｇ／ｍｌ塩化ナトリウム、１．５ｍｇ／ｍｌ塩化カル
シウム脱水物、１．３ｍｇ／ｍｌグリシルグリシン、０．１ｍｇ／ｍｌポリソルベート８
０、２５ｍｇ／ｍｌマンニトール、１０ｍｇ／ｍｌスクロース、０．５ｍｇ／ｍｌメチオ
ニン、１．６ｍｇ／ｍｌヒスチジン、ｐＨ６．０
精製カラム：５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム
これらの材料を用いて、以下の手順を行った：
１．ＦＶＩＩａ２０ｍｇ（約１ｍｇ／ｍｌ）に、シアリダーゼのシアリダーゼ２０μｇ
（０．２５ｍｇ／ｍｌ、１：１０００質量比）を添加する。

２．下記のように脱シアリル化ＦＶＩＩａをクロマトグラフィによって精製する前に、
反応物を室温で一晩（約１９時間）インキュベートする。

３．以下の通り、５ｍｌ ＨｉＴｒａｐＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラムで脱シア
リル化ＦＶＩＩａを精製する。

ａ）緩衝液Ａ（２５ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．４）５ＣＶを用い
てＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを平衡化する。

ｂ）カラムに適用する前に、ＦＶＩＩａおよびシアリダーゼ反応物を緩衝液Ａ２００ｍ
ｌで希釈し、ｐＨを６．４に調整する。

ｃ）Ａ２８０を監視しながら、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステムを用いて２．５ｍ
ｌ／分の流量で充填する。分画を通して流れを回収する。

ｄ）充填が完了した後、カラムを緩衝液Ａ １０ＣＶで洗浄する。

ｅ）カラムを０〜５０％緩衝液Ｂ（２５ｍＭヒスチジン、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．４
）２０ＣＶにより４０分間溶出する。ピーク分画を回収する（脱シアリル化ＮｏｖｏＳｅ
ｖｅｎ）。

ｆ）ピーク分画対ＦＶＩＩａ製剤緩衝液を４℃で一晩透析する。

ｇ）試料を−８０℃においてアリコートで凍結させる。

生成物はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ａＳＥＣによって高度に純粋であること、およびＦＶＩＩ
ａについての生物アッセイで活性であることが示された。シアル酸含量についてのアッセ
イにより残留シアル酸はないことが示され、重鎖のＬＣ−ＭＳ分析によりシアル酸の除去
以外のグリカン構造の有意な変化はないことが示された。

ノイラミニダーゼ−アガロースビーズを用いた脱シアリル化第ＶＩＩ因子の酵素調製
本明細書で使用される組換え野生型第ＶＩＩ因子は、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋから得
たＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）であり、本明細書では「Ｆ７」と呼ぶ。他の出発材料
は上記のＶ１およびＶ２である。

凍結出発材料を３７℃水浴で急速解凍し、プールした。タンパク質を遠心分離によって
２．５倍濃縮し、濃縮物をピペット操作によって穏やかに混合してタンパク質−フィルタ
界面での超濃縮（ｓｕｐｅｒ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）（凝集）を最小化した。

Ｖ２を、Ｖ２製剤緩衝液（ヒスチジン、ＣａＣｌ_２、トレハロース、メチオニンおよび
微量レベルのＴｗｅｅｎ（登録商標）−２０、ｐＨ６．４〜６．６を含有）からＭＥＳ緩
衝液（１０ｍＭ ＭＥＳ、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０、滅
菌濾過を含有）に緩衝液交換した。これを３つの方法の１つで達成した。第１の選択肢で
は、Ｖ２を、それぞれ３カラム体積のＭＥＳ緩衝液で３〜５回予洗したＮＡＰ−１０重力
流動カラム（ＧＥ、１７−０８５４−０１）を用いて緩衝液交換した。次いで、Ｖ２をカ
ラムに充填し、充填体積の１．５倍のＭＥＳ緩衝液で希釈した。第２の選択肢では、Ｖ２
を、ＭＥＳ緩衝液中での一晩の透析によって緩衝液交換した。透析カセットをＭＥＳ緩衝
液に予浸し、Ｖ２をシリンジによって３．５００ＭＷＣＯ ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ
カセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、６６１３０）に、滅菌濾過ＭＥＳ緩衝
液を含む１０Ｌピッチャー中４℃で一晩充填した。第３の選択肢では、Ｖ２を、Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ−２５（Ｓｉｇｍａ、Ｇ−２５−８０）ゲル濾過カラムを通してＭＥＳ緩衝
液に緩衝液交換し、ＭＥＳ緩衝液を用いて平衡化した。

緩衝液交換Ｖ２を、ノイラミニダーゼ−アガロース（Ｓｉｇｍａ Ｎ５２５４）を用い
て脱シアリル化した。アガロースビーズ産物を５０％スラリー混合物に供給し、硫酸アン
モニウム緩衝液中に保存し；ビーズをＭＥＳ緩衝液中３〜５回予洗し；ビーズ／緩衝液混
合物を４℃で３分間１０００ｒｃｆでの遠心分離によって分離し、上清液をピペットによ
って取り出して、捨てた。洗浄したビーズに、緩衝液交換Ｖ２を添加し、室温で１６〜２
２時間回転によって穏やかに混合した。タンパク質１ｍｇ当たり２．０８ｍＬの充填ビー
ズを脱シアリル化に使用し；より大規模の調製のために、これをタンパク質１ｍｇ当たり
０．２０８ｍＬのビーズまで１：１０減少させた。その後、脱シアリル化Ｖ２を遠心分離
によって回収し、ピペットで取り出した。ビーズを１回、１：１体積の新鮮なＭＥＳ緩衝
液中で回転によって５分間穏やかに洗浄し；洗浄混合物を前の通りに遠心分離し、上清を
Ｖ２と共にプールした。ビーズを、最終的に０．２ミクロンシリンジフィルタを通した滅
菌濾過によってまたは０．４５ミクロンフィルタを通した真空濾過によって除去した。

ＥｎｄｏＴｒａｐ ＨＤ樹脂（Ｈｙｇｌｏｓ）を用いて数ラウンドのエンドトキシン除
去を行った。樹脂をＭＥＳ緩衝液中３〜５回洗浄し、洗浄緩衝液を捨てた。２つのバッチ
で、洗浄樹脂１〜３ｍＬを、室温で一晩脱シアリル化Ｖ２と穏やかに混合した。樹脂を遠
心分離によって除去し、次いで、シリンジまたは真空フィルタを通して濾過した。

脱シアリル化Ｖ２を１０分サイクル間、Ｕｌｔｒａｃｅｌｓ中での遠心分離によって２
．１ｍｇ／ｍＬまで４．７５倍濃縮し；濃縮物をピペット操作によって穏やかに混合して
、タンパク質−フィルタ界面での凝集を減少させた。

脱シアリル化Ｖ２を、ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ排
除カラムを用いて高分子量種（および凝集したエンドトキシン）からさらに分離した。カ
ラムおよびＡＫＴＡ精製装置システムを０．１Ｎ ＮａＯＨ＋２０％ＥｔＯＨを用いて予
衛生化した。システムをｐＨ中和し、水ですすぎ、再構成しプールしたＶ２製剤緩衝液を
用いて平衡化した。数バッチの濃縮物を１２ｍＬ試料ループに手動で注入し、３ｍＬ／分
の流量でサイズ排除カラムに充填し；溶離液を回収し、Ｆｒａｃ−９００を用いてポリス
チレンチューブ（１７×１００ｍｍ、Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ、１４−９５６−６Ｄ）に
分画した。初期に、高分子量ピークが排除され、所望のＶ２分画をプールし、Ｃｈａｒｌ
ｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＥｎｄｏＳａｆｅ ＰＴＳおよびＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００
を用いてエンドトキシンレベルおよび濃度について試験した。Ｖ２緩衝液を用いて脱シア
リル化Ｖ２を溶出した。

５バッチのサイズ排除を行い、回収した溶離液を１バッチにプールし、これをＵｌｔｒ
ａｃｅｌｓ中１．０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。最終調製物を、０．２ミクロンシリンジフィ
ルタを通して滅菌濾過し、エンドトキシンおよび濃度について試験した。１ｍＬアリコー
トを標識２ｍＬチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、７２．６９４．００６）にピペットで入れ
、エタノール／ドライアイスバッチ中で急速凍結し、使用するまで−８０℃で標識ボック
スに保存した。

特性評価−タンパク質分析学およびインビトロアッセイ
最終調製材料ならびに未処理出発材料を、ＭＥＳ泳動緩衝液中４〜１２％ビス−トリス
ＮｕＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ ＮＰ０３３５ＢＯＸ）を用いたタンパク質ゲル分析および分
析的サイズ排除（ＴＳＫ３０００カラム；泳動緩衝液：２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１５
０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ６．８、流量：０．１５ｍｌ／分、蛍光検出）によって特性評価し
た。少量の試験試料を、第ＶＩＩ因子重鎖上のシアル酸含量についてＬＣ−ＭＳにより、
ならびに総タンパク質のＤＭＢ−標識シアル酸定量化について本明細書に論じられている
Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．キットを用いて分析した。活性を、リン脂質依存性第Ｘ
因子活性化およびトロンビン産生アッセイによって試験した。

シアル酸含量分析
ＬＣ−ＭＳ法を用いて、未処理対照および脱シアリル化第ＶＩＩ因子について第ＶＩＩ
因子の重鎖のＮ−グリカン上のシアル酸を同定した。タンパク質１０μｇを３７℃で３０
分間１０ｍＭ ＤＴＴ混合物を用いて還元し、次いで、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ Ｃａ
ｐｉｌｌａｒｙ ＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ：カラム：ＰＬＲＰ−Ｓ ８μｍ ４０００Ａ、０
．３×１５０ｍｍ、７５℃で分析した。緩衝系：Ａ：０．２％ギ酸＋０．０１％ＴＦＡを
含む水；Ｂ：０．２％ギ酸＋０．０１％ＴＦＡを含むＡＣＮ。勾配：５０μＬ／分、２分
で１０％Ｂ、２５分で９０％Ｂまで、９０％Ｂ洗浄５分、１０％Ｂ平衡化５分。

Ａｇｉｌｅｎｔ ６５２０Ｑ−ＴＯＦシステム：ＤｕａｌＥｓｉ源、ガス温度：３５０
℃、乾燥ガス：７ｐｓｉ、ネブライザ：１０ｐｓｉ、スキャン範囲：５００〜３０００ａ
ｍｕ、１スペクトル／秒。基準イオン：１２２１．９９０６３７および２４２１．９１３
９９ａｍｕ、５０ｐｐｍ窓、分１０００カウント。

結果を図７に報告する。

ＤＭＢ標識キットを用いたシアル酸定量化
シアル酸蛍光標識キット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．、カタログ番号４４００）
は、シアロ糖抱合体の定量的および高感度分析のためのものである。１，２−ジアミノ−
４，５−メチレンオキシベンゼン（ＤＭＢ）を用いたこのＨＰＬＣに基づくシアル酸蛍光
標識技術は、単純かつ高感度定量法である。この方法では、遊離シアル酸を、ＤＭＢによ
る標識後に逆相ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏｓｅｐＲ、Ｇｌｙｋｏ製、番号１−４７２７）によ
って分析する。

結論
Ｖ２重鎖は２つのＮ−グリコシル化部位を有する。Ｎ−グリカンはフコシル化された、
高度にシアリル化された、二、三および四構造である。脱シアリル化試料上に末端シアル
酸は見られず、このことは試料が十分に脱シアリル化されていること、および第ＶＩＩ因
子Ｎ−グリカン上のシアル酸の９９．９％超が除去されたことを示唆している。

ラット肝細胞を用いた半減期アッセイ
肝細胞の調製
凍結保存された初代培養ラット肝細胞をＣｅｌｌｚＤｉｒｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）から得た。およそ５００万個の細胞を含有する各バイアルを解凍し、細胞を解凍培地
１０ｍｌに添加し、引き続いて６０ｇで３分間遠心分離した。細胞をインキュベーション
培地＋０．２５％ＢＳＡ（約４ｍｌ）に再懸濁し、血球計数器を用いて細胞をカウントし
た。トリパンブルーによって染色して死細胞を同定した後、生細胞をカウントした。細胞
生存率は８０〜８２％であった。細胞を、カウント直後にクリアランスアッセイに使用し
た。

解凍培地：５００ｍｌウィリアムスＥ培地に添加したＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣＭ３０
００ Ｔｈａｗｉｎｇ／Ｐｌａｔｉｎｇ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｐａｃｋ。インキュベ
ーション培地：５００ｍｌウィリアムスＥ培地に添加したＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣＭ４
０００ Ｃｅｌｌ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｐａｃｋ。

インビトロ肝細胞クリアランスアッセイ
初代培養ラット肝細胞、１００万個生細胞／ｍｌを、エッペンドルフチューブ中で、Ｃ
ｅｌｌｚＤｉｒｅｃｔインキュベーション培地＋０．２５％ＢＳＡ中２５ｎｇ／ｍｌの種
々の第ＶＩＩ因子変異体と共にインキュベートし、１．２ｍｌの出発体積中、３７℃で穏
やかにくるくると回転して混合した。示される時点の各々で、混合物０．２５ｍｌを取り
出して、直ちに遠心分離して細胞をペレット化した（１０００ｒｐｍ、エッペンドルフ遠
心分離で３分）。清澄化上清０．１８ｍｌを取り出し、急速凍結し、−８０℃で一晩保管
した。翌日、上清中の第ＶＩＩ因子を、対応する精製変異タンパク質を標準として使用す
るＥＬＩＳＡアッセイを用いて定量化した。第ＶＩＩ因子変異体を培地中単独で３７℃で
２時間インキュベートした無細胞対照上清を０時点値として使用した。各インキュベーシ
ョンを３連で行った。固有クリアランス値を、インキュベーション体積および細胞数に関
して正規化した式ＣＬｉｎｔ＝０．６９３／インビトロＴ_１／２を用いて、Ｌｕら（Ｌｕ
ｒｅｆ．）の方法に基づいて計算した。プログラムＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（Ｐｈａｒｓｉ
ｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、インビトロ半
減期（Ｔ_１／２）を計算した。肝細胞インキュベーションからの上清を、二抗体サンドイ
ッチＥＬＩＳＡフォーマットを用いてアッセイした。０．１ｍｌ／ウェルの抗第ＶＩＩ因
子モノクローナル抗体（１．０μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ中）をＧｒｅｉｎｅｒ Ｍｉｃｒｏｌ
ｏｎ ６５５０６１ ９６ウェルプレートに添加した。４℃で一晩のインキュベーション
後、プレートを０．２ｍｌ／ウェルの１％カゼインブロッキング緩衝液（５０ｍＭトリス
ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０ ｐＨ７．２）を用いて３
７℃で１．５時間ブロッキングした。プレートを０．３ｍｌ／ウェルのＰＢＳ＋０．０５
％Ｔｗｅｅｎ ２０で（ＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ４０５プレート洗浄機を用いて）４回洗浄
し、次いで、関連第ＶＩＩ因子標準および未知試料をプレートに添加した。各肝細胞上清
０．１８ｍｌを、希釈緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％
カゼイン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０ ｐＨ７．２）０．１８ｍｌを添加することによ
って２倍希釈した。各希釈上清０．１０ｍｌを３連でＥＬＩＳＡプレートに添加した。希
釈緩衝液に希釈した対応する精製第ＶＩＩ因子変異体から標準を作成した。標準の２倍連
続希釈を希釈緩衝液に製造して、５０〜０．８ｎｇ／ｍｌ最終濃度範囲の希釈液を得た。
第ＶＩＩ因子標準および試料（０．１ｍｌ／ウェル）を室温（２１℃）で２時間インキュ
ベートした。プレートを上記のように４回洗浄し、次いで、ビオチン化検出抗体、希釈緩
衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％カゼイン、０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ ２０ ｐＨ７．２）中１μｇ／ｍｌを添加し（０．１ｍｌ／ウェル）、引き続
いて室温で１．５時間インキュベートした。プレートを上記のように４回洗浄し、次いで
、希釈緩衝液に１／１０００希釈したストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ
を添加し（０．１ｍｌ／ウェル）、引き続いて室温で１時間インキュベートした。プレー
トを再度洗浄し、Ｕｌｔｒａ−ＴＭＢを０．１ｍｌ／ウェル添加した。室温で１０〜１５
分間のインキュベーション後、０．０５ｍｌ／ウェルの２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を添加して反応
を停止した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ２プレー
トリーダーを用いて、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ５．４
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてデータ分析を行った。

凍結保存ラット肝細胞、解凍培地およびインキュベーション培地（ＣｅｌｌｚＤｉｒｅ
ｃｔ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉ
ｓｌａｎｄ、ＮＹ）製とした。１−Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ−ＴＭＢ（Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ）
基質、カタログ番号３４０２８はＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒ
ｄ、ＩＬ）製とした。ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ
）、カタログ番号ＤＹ９９８はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ
製とした。リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａ
ｄ、ＣＡ）製とした。スプラーグ−ドーリーラット血漿（５％クエン酸ナトリウム抗凝固
薬）はＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）製とした。Ｇｒｅｉｎ
ｅｒ Ｍｉｃｒｏｌｏｎプレート（カタログ番号６５５０６１）はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を通して得た。

脱グリコシル化変異体：分子変異体を得る方法
野生型第ＶＩＩａ因子は２個のＮ−グリカン（Ｎ３２２およびＮ１４５）を有し、Ｖ１
およびＶ２はそれぞれ４個のＮ−グリカン（Ｎ１０６、Ｎ１４５、Ｎ２５３、Ｎ３２２）
を有する。Ｖ１およびＶ２に見られるさらに２個のＮ−グリカン（Ｎ１０６、Ｎ２５３）
を、半減期を増加させるよう最初に設計した。本研究のために、これらの部位を野生型第
ＶＩＩ因子の内因性アミノ酸配列（Ｔ１０６、Ｖ２５３）に戻すことによって、除去する
。次いで、残りの２個の内因性Ｎ−グリカン部位（Ｎ１４５およびＮ３２２）を、これら
の部位でのＮ→Ｑ変異における操作によってＤＮＡレベルで除去した。（図６）
野生型第ＶＩＩ因子をｐｍＣＭＶにクローニングしてｐＭＢ１１３を作成した。ａａ１
４５または３２２位における単一のＮからＱへの変異を含有する挿入物ならびに二重変異
体（ａａ１４５および３２２）を合成し、ＸｂａＩおよびＰｍｌＩ部位を用いてｐＭＢ１
１３にクローニングしてクローンｐＭＢ１１４〜１１６を得た。次いで、Ｖ１およびＶ２
のＧｌａドメインをコードする挿入物を、ＡｓｃＩおよびＡｆｅＩを用いてｐＭＢ１１３
〜１１６にクローニングして、構築物ｐＭＢ１１７〜１２０（Ｖ１系変異体）およびｐＭ
Ｂ１２１〜１２４（Ｖ２系変異体）を得た。全ての構築物を配列確認した（ＭｃＬａｂ）
。哺乳動物細胞（ＣＨＯ由来細胞系）を、６ウェルフォーマットで、電気穿孔を介して各
構築物で一過的にトランスフェクトした。トランスフェクション４日後、上清を回収し、
発現についてウエスタンブロット法によって、引き続いて、ｈＦＶＩＩ ＥＬＩＳＡ（Ａ
ｓｓａｙＰｒｏ）およびＦＶＩＩ活性アッセイによってアッセイした。次いで、変異体の
サブセットを単細胞クローニングした。ｐＭＢ１２１と呼ぶＶ２ ２−Ｎグリカン変異体
を精製し、さらなる分析のために活性化した。

１０Ｌ ＷＡＶＥ発現からのＦＶＩＩａの精製／活性化の方法
方法の概要
数日にわたって行われる多段階プロセスを用いて、透析濾過した濃縮条件培地からのＦ
ＶＩＩの精製および活性化を達成した。最初に、培地を解凍し、遠心分離して、凍結／解
凍中に形成したかもしれない凝集体を除去する。ＣａＣｌ_２で溶出する陰イオン交換カラ
ム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を使用した擬似アフィニティ（ｐｓｕｅｄｏａｆｆｉｎｉ
ｔｙ）捕捉ステップを用いてＦＶＩＩタンパク質をさらに濃縮し、緩衝液を交換する。次
に、ヒドロキシアパタイトカラムを用いてＦＶＩＩタンパク質をさらに精製する。次いで
、より小型のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いて、ＦＶＩＩをｐＨ７．８〜８．２で
溶液中２４時間活性化する前にさらに精製する。ｐＨを４．０に低下させることによって
、活性化反応を停止する。最後に、ＦＶＩＩａを製剤緩衝液（ｐＨ６．５）に透析し、凍
結保存する。

最終的な精製タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ａＳＥＣ、ＥＬＩＳＡ、糖分析（ｇｌ
ｙｃｏａｎａｌｙｓｉｓ）、エンドトキシンおよびＦＶＩＩａ活性アッセイによって特性
評価する。

ＦＶＩＩ ＥＬＩＳＡ
Ｚｙｍｕｔｅｓｔ ＦＶＩＩ酵素結合免疫測定法（Ａｎｉａｒａ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓ
ｔｅｒ、Ｏｈｉｏ）。ＥＬＩＳＡは、９６ウェルマイクロプレートのウェルに結合したウ
サギ抗ＦＶＩＩポリクローナル抗体を用いた２部位免疫測定法である。試料を導入し、引
き続いて西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合したウサギ抗ＦＶＩＩポリクロー
ナル抗体を導入する。アッセイは製造業者の指示にしたがって行った。手短に言えば、試
料および較正物質を、９６ウェル丸底ポリプロピレン希釈プレート中アッセイ緩衝液に希
釈した。５０μＬアリコートの希釈試料を用意したウサギ抗ＦＶＩＩコーティングプレー
トに移し、室温で１５分間インキュベートした。２００μＬのＨＲＰ結合ウサギ抗ＦＶＩ
Ｉを添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを用意した洗浄緩衝液３００μ
Ｌで５回洗浄した。ＴＭＢを２００μＬ／ウェルで添加し、室温でおよそ５分間インキュ
ベートした。０．４５Ｍ硫酸５０μＬを導入することによって、反応を停止した。４５０
ｎｍで吸光度を読み取った。試料値を４パラメータ曲線当てはめを用いて作成したＶ２較
正曲線と比較することによって、第ＶＩＩ因子レベルを得た。

第ＶＩＩ因子発色アッセイ
Ｂｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩ発色アッセイ（Ａｎｉａｒａ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、
Ｏｈｉｏ）を使用した。発色アッセイ原理は、試料の第ＶＩＩ因子および製造業者によっ
て供給されたウサギトロンボプラスチン（組織因子）からなる酵素複合体の形成を伴う。
過剰に添加したＦＸをＦＸａに活性化し、今度はこれがＦＸａ特異的発色基質（ＳＸａ−
１１）を切断してｐＮＡを産生する。放出されたｐＮＡの量はＦＸａ活性に正比例する。
アッセイは製造業者の指示にしたがって行った。手短に言えば、試料および較正物質を、
９６ウェル丸底ポリプロピレン希釈プレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中
トリスＢＳＡアッセイ緩衝液に希釈した。キット試薬、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３ならびに９
６ウェル平底ポリスチレンアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を使用前に３７℃に加温し
た。試料および較正物質３０μＬを希釈プレートからアッセイプレートに移し、引き続い
て、試薬Ｒ２ ３０μＬ、次いで試薬Ｒ１ ６０μＬを移した。アッセイプレートを混合
し、ジルバプレート振盪装置（Ｂｏｅｋｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中３７℃で７分間
インキュベートした。Ｒ３ ６０μＬを添加し、吸光度の変化率（４０５ｎｍ／分におけ
るＯＤの変化）を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて３７℃で測定した。試料値を４パラメータ曲線
当てはめを用いて作成したＶ２較正曲線と比較することによって、第ＶＩＩ因子レベルを
得た。

リン脂質依存性トロンビン産生アッセイ
野生型ＦＶＩＩａと比較して、Ｇｌａドメインの修飾（Ｐ１０Ｑ／Ｋ３２Ｅ）により、
さらなるγ−カルボキシル化の結果としてＦＸ活性化、トロンビン産生、および陰イオン
性リン脂質または活性化血小板の存在下での全血凝固の効力が増加する。ＰＬ依存性ＴＧ
Ａを、陰イオン性リン脂質の存在下でのｒＦＶＩＩａ活性を測定するよう設計し、Ｔｈｒ
ｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ、ＢＶ製のトロンビン較正物質および基質試薬、ＦＬｕＣａキッ
トを用いて行った。２０％ホスファチジルセリン（ＰＳ）、４０％ホスファチジルエタノ
ールアミン（ＰＥ）および４０％ホスファチジルコリン（ＰＣ）で構成されるリン脂質（
ＰＬ）小胞は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ製とし、１００ｍＭ ＮａＣｌ
、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．２）中１０分間の超音波処理によって調製した。

ＰＬ小胞（５００μＭ）またはトロンビン較正物質２０μＬを９６ウェルプレートに分
配した。異なる濃度のｒＦＶＩＩａをヒトＨｅｍＡ血漿に希釈し、３連でＰＬ混合物に添
加し、３７℃に１０分間平衡化した。ＦｌｕＣａ溶液を添加することによって、トロンビ
ン産生反応を開始し、反応をＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ^ＢＶによって概説される較正
自動トロンボグラフィ（Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｇ
ｒａｐｈｙ）（ＣＡＴ）法にしたがって６０分間連続的に監視した。トロンビン較正物質
を用いてα_２−マクログロブリン活性について補正するＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ^Ｂ
Ｖ（３．４．０）ソフトウェアを用いて、データを取得および分析した。分析パラメータ
「ピーク高さ」は産生したトロンビンの最高レベルを表し、「内因性トロンビンポテンシ
ャル」（ＥＴＰ）は産生したトロンビンの総量に相当していた。Ｐｒｉｓｍ４．０（Ｇｒ
ａｐｈＰａｄ Ｉｎｃ）を用いた４パラメータ非線形曲線当てはめ法によってトロンビン
産生パラメータを分析した。

リン脂質依存性ＦＸ活性化アッセイ
ＰＬ依存性ＦＸ活性化アッセイを用いて、ＦＶＩＩａが組織因子を含まないリン脂質小
胞の存在下でＦＸを活性化する能力を測定した。第ＶＩＩａ因子またはＦＶＩＩａ変異体
を、リン脂質小胞の存在下でＦＸと共にインキュベートする。Ｓ−２７６５、ＦＸａにつ
いての発色基質を添加することによって、ＦＸの活性化を測定する。手短に言えば、較正
物質および試料をポリプロピレン丸底プレート中トリスＨＣｌ緩衝液に希釈する。４μｇ
／ｍＬ ＦＸ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）３０
μＬを９６ウェル平底ポリスチレンプレートの全ウェルに添加し、引き続いて２０：４０
：４０の重量％比のホスファチジルセリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジル
エタノールアミンからなるリン脂質小胞３０μＬを添加した。希釈試料および較正物質３
０μＬをＦＸ／リン脂質混合物に移した。プレートを密閉し、穏やかに混合し、３７℃で
２０〜２３時間インキュベートした。Ｓ−２７６５（ＤｉａＰｈａｒｍａ）の５ｍＭ溶液
４０μＬを全ウェルに添加した。プレートを密閉し、３７℃で６時間インキュベートした
。マイクロプレートリーダーにより４０５ｎｍで吸光度を読み取った。試料のＦＸ活性化
レベルをＦ７較正曲線と比較することによって、試料の活性を測定した。

ラットＰＫ試験動物、試験プロトコル（調製物の注入、血液および調製物のサンプリン
グ、ＥＬＩＳＡ、データ分析、動物の屠殺）。

タンパク質（Ｆ７、Ｖ２、Ｖ１、ｄＶ２およびｄＶ１）を０．１ｍｇ／ｋｇでスプラー
グドーリーラットに静脈内投与した。血漿試料を、投与１分後に始めて採取し、ＦＶＩＩ
ＥＬＩＳＡによって分析した。

ＨｅｍＡ−ＰＫ試験
タンパク質（Ｆ７、ｄＶ１）を１．０ｍｇ／ＫｇでＨｅｍＡマウスに静脈内投与した。
血漿試料を、投与５分後に始めて採取し、ＦＶＩＩ ＥＬＩＳＡおよびｓＴＦ−ＰＴアッ
セイによって分析した。

血漿試料に対するＦＶＩＩ ＥＬＩＳＡ
材料
ＦＶＩＩａに対するモノクローナル抗体を使用した。１つのモノクローナル抗体をさら
にビオチン化した。精製ＦＶＩＩａ変異体（野生型または脱シアリル化）をアッセイ較正
物質およびアッセイ対照として使用する。ブロッキング緩衝液は３０ｍＭトリスｐＨ７．
２、６０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０３％Ｔｗｅｅｎ ２０中１％（ｗ／Ｖ）カゼインである
。アッセイ希釈緩衝液（ＡＤＢ）は、０．１％（ｗ／ｖ）カゼイン、５０ｍＭトリスｐＨ
７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０である。アッセイ洗浄緩衝液
はＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０である。免疫測定プレートはＧｒｅｉｎｅｒ Ｍ
ｉｃｒｏｌｏｎ高結合プレート（番号６５５０６１）である。ストレプトアビジン−西洋
わさびペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製である。ＨＲＰ基
質Ｕｌｔｒａ−ＴＭＢはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｐｉｅｒｃｅ製である。ブランクマ
ウス血漿は商業的に（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）または社内供給源を通してＣＤ１
またはＨｅｍＡマウスから得た。他の全ての材料（カゼイン、トリス、ＮａＣｌ、Ｔｗｅ
ｅｎ−２０、ＰＢＳ、硫酸）は試薬等級の品質のものである。

ＦＶＩＩａサンドイッチ免疫測定の方法
９６ウェルアッセイプレートを、４℃で一晩、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの、ＦＶＩＩａに
対する抗体０．１ｍｌ／ウェルでコーティングする。プレートを吸引し、回転させながら
（１５０ｒｐｍ）室温で少なくとも２時間０．２ｍｌ／ウェルのブロッキング緩衝液でブ
ロッキングする。ブロッキング後、ウェルを４×０．３ｍｌ／ウェルの洗浄緩衝液で洗浄
する。ＦＶＩＩａ試料または標準をＡＤＢ中５％血漿の最終濃度に１：２０希釈し、回転
させながら室温で少なくとも１．５時間０．１ｍｌ／ウェルでインキュベートする。全て
の標準、対照および試料を３連ウェルで測定する。前記の通りプレートを洗浄した後、Ｆ
ＶＩＩａに対するビオチン化抗体をＡＤＢ中４２ｎｇ／ｍｌ、０．１ｍｌ／ウェルで添加
し、プレートを回転させながら室温で少なくとも１時間インキュベートする。プレートを
洗浄し、引き続いてストレプトアビジン−ＨＲＰ、ＡＤＢ中１：１０００と共にインキュ
ベートし、回転させながら室温で少なくとも１時間インキュベートする。最終的なプレー
ト洗浄後、ウェルを０．１ｍｌ／ウェルのＵｌｔｒａ−ＴＭＢで展開し、０．０５ｍｌ／
ウェルの２Ｍ硫酸を用いて反応を停止する。停止した反応物をＯＤ−４５０ｎｍで読み取
り、データを分析および較正する。アッセイについての定量下限値（ＬＬＯＱ）は、典型
的には１００％血漿中１５〜３０ｎｇ／ｍｌのＦＶＩＩａである。

ｒＦＶＩＩａ活性を測定するための可溶性組織因子（ｓＴＦ）に基づく修正ＰＴアッセ
イ
プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイを行って、ＨｅｍＡマウスエキソビボ血漿試料中
のヒトｒＦＶＩＩａの活性を測定した。

手短に言えば、ａＰＴＴ緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５ＭトリスｐＨ７．５
、０．１％ＢＳＡ）中１０％のＨｅｍＡマウス血漿および５０％のヒトＦＶＩＩ欠乏血漿
（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｉｎｃ）を含有する試料５０μＬをｓＴＦ−ＰＴ試薬５０μ
Ｌと混合し、３７℃で３０秒間インキュベートした。ｓＴＦ−ＰＴ試薬は１体積の２μＭ
組換えヒト可溶性ＴＦ（ｓＴＦ_{１−２２１}）および１体積の８μＭリン脂質小胞（ＰＳ^２
０：ＰＣ^４０：ＰＥ^４０）で構成されていた。２５ｍＭのＣａＣｌ_２ ５０μＬを添加す
ることによって凝固を開始し、凝固時間をＳＴＡ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙ
ｚｅｒ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ Ｉｎｃ）で記録した。標準は、２００か
ら０．７８ｎｇ／ｍＬまで２倍連続希釈したｒＦＶＩＩａ（ｗｔ−ｒＦＶＩＩまたは修飾
ｒＦＶＩＩａ変異体）からなっていた。

血友病Ａ（ＨｅｍＡ）マウスにおける脱シアリル化Ｖ２の有効性
急性尾切断有効性試験
失血量を測定するために、マウスをイソフルランで麻酔し、尾を１５ｍｌプラスチック
チューブ中３７〜３８℃に加温した０．９％生理食塩水に１０分間入れた。尾をメスによ
って先端から４ｍｍで切断し、直ちに生理食塩水１０ｍｌを含有する別の予め加温した１
５ｍｌプラスチックチューブに戻し入れた。マウスを４０分にわたって自由に出血させた
。脱シアリル化Ｖ２およびＦ７を、尾切断損傷の５分後または１５分および３０分前に静
脈内投与した。血液回収前後のチューブを秤量することによって重量測定で失血量を定量
化した。

尾静脈切断有効性（ＴＶＴ）試験
ＨｅｍＡマウスに、尾静脈切断損傷の１時間前または５分後に尾静脈注射によって脱シ
アリル化Ｖ２またはＦ７を投与した。適切な麻酔を使用した。尾静脈を１１番メスの直線
刃を用いて切断し、タイマーを開始した。次いで、マウスを４×８インチ加熱パッドの上
部に置かれた白色紙寝具（Ｖｅｒｓｉ−Ｄｒｉ（商標））を含む個々の清潔なケージに戻
した。動物の活動状態を次の９時間にわたって１時間毎におよび２４時間の時点で監視し
た。活動レベル低下の兆候を示したマウスを監視フォームに書き留め、過剰な失血の兆候
を示したマウスを直ちに安楽死させた。

ＨｅｍＡマウス血漿におけるトロンビン−抗トロンビン（ＴＡＴ）アッセイ
試薬：
（１）捕捉抗体：Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、カタログ番号ＴＡＴ−
ＥＩＡ−Ｃの抗トロンビンポリクローナル抗体；（２）検出抗体：Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、カタログ番号ＴＡＴ−ＥＩＡ−ＤのＨＲＰ抱合抗ＡＴ−ＩＩＩポ
リクローナル抗体、（３）アッセイ希釈液：Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ
、カタログ番号ＴＡＴ−ＥＩＡ−Ｄ、（４）ＨＲＰ基質：Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ、Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１２２１６、（５）α−トロンビン：Ｅｎｚｙｍｅ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、カタログ番号ＨＴ−１００２ａ、−８０℃で保管、（６）Ａ
Ｔ−ＩＩＩ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、カタログ番号ＨＡＴ、−８０
℃で保管、（７）ＢＳＡ：Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−７０３０；（８）ＡＴ−ＩＩＩ
欠乏血漿：Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓから購入、カタログ：ＡＴ−ＤＰ
、−８０℃で保管。

緩衝液
（１）ＴＡＴ標準緩衝液：２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ
、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５Ｕ／ｍｌヘパリン；（２）コーティング緩衝液：１錠剤の
重炭酸塩＋１００ｍｌ ｄＨ２０、４℃で保管；（３）ブロッキング緩衝液：２％ＢＳＡ
−ＰＢＳ；（４）試料希釈緩衝液：０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加、濾過および分割し、−２０℃で
保管；（５）基質緩衝液：５ｍｇ／ｍＬ Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ５０μＬ、３％Ｈ２Ｏ２
２０μｌをＰＢＳ緩衝液に添加する。混合し、プレートに添加する前に新たに調製する
；（６）１μＭ ＴＡＴ標準ストックの調製：１．３６ｍｇ／ｍｌのヒトＡＴ−ＩＩＩ
１００μＬおよび３．２８ｍｇ／ｍＬのヒトトロンビン５．９３μＬをＴＡＴ緩衝液４１
９μＬに添加し、混合し、３７℃で１０〜２０分間インキュベートする；（７）６０ｎＭ
ＴＡＴ標準ストックの調製：１μＭ ＴＡＴ複合体５０μＬをＡＴ−ＩＩＩ欠乏血漿７
８３μＬに添加し、混合する。５０μＬ／バイアルに分割し、−８０℃で保管する。

アッセイ手順
１．抗トロンビンｐＡｂ（捕捉抗体）を重炭酸塩緩衝液に希釈する（１：１００希釈：
１つの９６ウェルプレートについて、抗体１１０μＬを重炭酸塩緩衝液１１ｍＬに添加す
る）。

２．希釈コーティング抗体１００μＬを２ＨＢ Ｉｍｍｕｌｏｎ ９６ウェルプレート
上の各ウェルに添加する。プレートを穏やかに叩いて確実に全ての液体がプレートの底を
覆うようにする。プレートを密閉し、４℃で一晩インキュベートする。

３．自動プレート洗浄機において３００μＬ洗浄緩衝液で４回洗浄する。最後の洗浄後
、プレートを反転させ、清潔なペーパータオルに軽く叩きつける。

４．ブロッキング緩衝液（２％ＢＳＡ−ＰＢＳ）１５０μＬを各ウェルに添加する。プ
レートを密閉し、室温で１．５時間インキュベートする。

５．自動プレート洗浄機を用いて３００μＬ洗浄緩衝液で４回洗浄する。最後の洗浄後
、プレートを反転させ、清潔なペーパータオルに軽く叩きつける。

６．標準、試料およびＱＣ１００μＬを各ウェルに３連で添加し、プレートを室温で２
時間室温でインキュベートする。

７．自動プレート洗浄機を用いて３００μＬ洗浄緩衝液で４回洗浄する。最後の洗浄後
、プレートを反転させ、清潔なペーパータオルに軽く叩きつける。

８．ＨＲＰ−検出抗体１００μＬ（１／１００、抗体１１０μＬを抱合体希釈液１１ｍ
Ｌに添加する）を各ウェルに添加する。プレートを密閉し、室温で１時間インキュベート
する。

９．自動プレート洗浄機を用いて３００μＬ洗浄緩衝液で４回洗浄する。最後の洗浄後
、プレートを反転させ、清潔なペーパータオルに軽く叩きつける。

１０．Ａｍｐｌｅｘ Ｒｄ基質７０μＬ（新たに調製）を各ウェルに添加する。

１１．プレートを室温で暗所に置き、１５〜３０分間インキュベートする。

１２．ＯＤ４８５ｎｍ／５９５ｎｍでプレートを読み取る。

１３．標準を４パラメータ曲線当てはめでプロットする；対照および各試料の濃度を各
ＥＬＩＳＡプレートの標準から計算した。

凝固能力のあるマウスにおける脱シアリル化Ｖ２の有効性
急性尾切断試験を行って凝固能力のあるマウスにおけるｄＶ２の有効性を測定した。凝
固能力のあるマウスをイソフルランで麻酔し、尾を１５ｍｌプラスチックチューブ中３７
〜３８℃に加温した０．９％生理食塩水に１０分間入れた。５ｍｇ／ｋｇ組織プラスミノ
ーゲン活性化因子（ｔＰＡ）の静脈内投与後、尾をメスによって先端から５０ｍｍで切断
し、生理食塩水１０ｍｌを含有する別の予め加温した１５ｍｌプラスチックチューブに戻
し入れた。脱シアリル化Ｖ２およびＦ７を尾切断損傷直後に静脈内投与した。マウスを４
５分にわたって自由に出血させた。血液回収前後のチューブを秤量することによって重量
測定で失血量を定量化した。

結果
脱シアリル化または脱グリコシル化タンパク質のインビトロ特性評価
ｄＶ２の重鎖をＬＣ−ＴＯＦ ＭＳによって分析した。分析により、重鎖上のＮ−グリ
カンがシアリダーゼ処理後にシアル酸を含有していないことが示された。軽鎖に対するこ
のような分析は、Ｇｌａドメインの存在によって困難にされた。処理分子のシアル酸含量
の全般的な状況を得るために、シアル酸蛍光標識を行った。この方法により、シアル酸の
９９．９％超が脱シアリル化プロセス中にＶ２上で除去されることが示された。図７は、
シアル酸含量についての脱シアリル化Ｖ２の分析を示している。ＬＣ−ＴＯＦ ＭＳ分析
およびシアル酸蛍光標識を利用した。シアル酸含量分析をｄＶ１に対しても同様に行うと
同様の結果が得られた（データ不掲載）。脱シアリル化分子を、リン脂質依存性Ｘａ活性
化とリン脂質依存性ＴＧＡアッセイの両方によって活性について試験した。ＰＬ−Ｘａお
よびＰＬ−ＴＧＡアッセイにより、脱シアリル化後のタンパク質の活性が低下しないこと
が証明された（図９および図１０参照）。図９は、脱シアリル化タンパク質に対するＰＬ
−ＦＸａ活性化アッセイを示している。脱シアリル化Ｖ１およびＶ２（ｄＶ１、ｄＶ２）
を、リン脂質ＦＸａ活性化アッセイを用いて活性について試験した。両脱シアリル化タン
パク質が、このアッセイでその未修飾親分子と比較してわずかに高い活性を有した。図１
０は、脱シアリル化タンパク質に対するＰＬ−ＴＧＡアッセイを示している。ＰＬ−ＴＧ
Ａによって、ｄＶ２およびｄＶ１は、その未修飾親分子に対してわずかに増加した活性を
示した。結果をＦ７に正規化した。

ＰＬ−Ｘａアッセイにより、その未修飾親分子に対するｄＶ２およびｄＶ１の活性の測
定可能な増加が一貫して示された。ヒポグリコシル化ｗｔＦＶＩＩａ、Ｖ２およびＶ１分
子を発現させ（図１１）、発現と活性の両方について粗製発現抽出物として試験した。図
１１は、ヒポグリコシル化ＦＶＩＩ変異体の発現を示している。電気穿孔４日後の培地試
料をＦＶＩＩ発現について分析した。抗Ｇｌａドメイン抗体を用いたウエスタンブロット
解析は、変異体の発現を示している。Ｎ−グリカン部位の除去は、発現レベルについて正
規化すると活性に影響を及ぼすように見えなかった。図１２は、トランスフェクション上
清を用いたヒポグリコシル化ＦＶＩＩ変異体の「特異的活性」の測定を示している。ヒポ
グリコシル化変異体の２つの一過性トランスフェクションからの粗製発現上清の活性をＸ
ａ活性化アッセイによって分析した。ＥＬＩＳＡによって測定される発現について正規化
すると、Ｎ−グリカン除去の結果としての活性の低下は認められなかった。このアッセイ
で予想されるように、Ｖ１およびＦ７タンパク質は類似の活性を有する一方で、Ｖ２分子
はそのＴＦ非依存性の結果である低い活性を有していた。このことは、ｐＭＢ１２１と呼
ばれる２個のＮ−グリカン（Ｎ３２２およびＮ１４５）のみを有する精製ヒポグリコシル
化Ｖ２に対して行ったＰＬ−ＴＧＡ活性アッセイによってさらに証明された。図１３は、
精製したヒポグリコシル化変異体ｐＭＢ１２１に対するＰＬ−ＴＧＡアッセイを示してい
る。ＰＬ−ＴＧＡアッセイによって、ｐＭＢ１２１２は未修飾Ｖ２と同様にＦ７に対して
増強した活性を示す。これらの分子のインビトロクリアランスを肝細胞クリアランスモデ
ルで試験した。ｄＶ２はこのモデルで未修飾Ｖ２に対して有意なクリアランスを証明した
（図１４）一方で、ヒポグリコシル化変異体についてはクリアランスの増加がほとんどま
たは全く見られなかった（図１５）。

ラットＰＫおよびＨｅｍＡ ＰＫ
スプラーグドーリーラットにおける薬物動態試験により、脱シアリル化およびヒポグリ
コシル化タンパク質がＦＶＩＩ ＥＬＩＳＡによって測定されるようにその未修飾対応物
よりも有意に速く排除された。図１６は、ラット薬物動態結果を示している。脱シアリル
化Ｖ２およびＶ１の半減期は、ＦＶＩＩ ＥＬＩＳＡによって測定されるようにスプラー
グドーリーラットにおいてその未修飾親分子よりも有意に短かった。これは、脱シアリル
化Ｖ２、脱シアリル化Ｖ１およびｐＭＢ１２１（ヒポグリコシル化Ｖ２）も同様であった
。両脱シアリル化分子についてのｔ１／２は１分未満であった一方で、その親タンパク質
のｔ１／２はおよそ２．５時間であった。ヒポグリコシル化Ｖ２分子ｐＭＢ１２１のクリ
アランスは、１．６時間のｔ１／２を有するＦ７のクリアランスと同等であった。Ｈｅｍ
ＡマウスにおけるＰＫ試験は、それぞれおよそ３分および２．６時間の半減期を有するｄ
Ｖ２およびＦ７と同様の結果を有した（図１７（Ａ））。ｓＴＦ−ＰＴＴ凝固アッセイに
よって短い半減期が確認された（図１７（Ｂ））。図１７は、ＨｅｍＡ ＰＫ結果を示し
ている。脱シアリル化Ｖ２の半減期は、ＨｅｍＡマウスにおいて、Ａ）ＦＶＩＩ ＥＬＩ
ＳＡおよびＢ）ｓＴＦ−ＰＴアッセイによって測定されるように、その未修飾親分子より
も有意に短かった。

ＨｅｍＡ有効性モデル
ｄＶ２を有効性についてＨｅｍＡマウスで試験した。ＨｅｍＡ尾切断モデルを用いると
、ｄＶ２は１ｍｇ／ｋｇの用量で（ボーラス、静脈内）効果的であることが示された。比
較して、このモデルでは、Ｆ７の効果的な用量は２．５ｍｇ／ｋｇ（ボーラス、静脈内）
であった。これらの結果により、ｄＶ２がＦ７よりも効果的であることが証明される（図
１８（Ａ））。このモデルを利用してｄＶ２の有効性がＦ７の有効性よりも速く消滅する
ことも示された（図１８（Ｂ））。図１８は、ＨｅｍＡマウスにおける脱シアリル化Ｖ２
有効性試験の結果を示している。ｄＶ２を用いた試験により、この分子が、ＨｅｍＡ尾切
断モデルにおいて、Ｆ７よりもＡ）効果的でありかつＢ）速い有効性クリアランスを有す
ることが示される。

より感受性のＴＶＴモデルを用いると、Ｆ７に対するｄＶ２のより速い有効性クリアラ
ンスも証明され、効果的な用量が確認された。図１９は、ＴＶＴ ＨｅｍＡモデルにおけ
るｄＶ２有効性試験を示している。より高い感受性を有する有効性モデル（ＴＶＴ）を用
いたＴＶＴ試験により、ｄＶ２がＦ７よりも速い有効性クリアランスを有することが確認
された。ＨｅｍＡマウスへの投与３０分後および６０分後に行った血栓形成性のマーカー
としてのトロンビン抗トロンビン（ＴＡＴ）測定により、ｄＶ２について有意に低いレベ
ルが示された。図２０はＴＡＴ測定を示している。ＨｅｍＡマウスでは、効果的な用量（
１ｍｇ／ｋｇ）で投与したｄＶ２が、効果的な用量のＦ７（２．５ｍｇ／ｋｇ）よりも少
ないトロンビン抗トロンビン（ＴＡＴ）を産生した。このデータは、有効性データと合わ
せて、ｄＶ２がＦ７よりも好都合な治療指数を有することを示唆しているだろう。

凝固能力のあるマウスにおける有効性
ｄＶ２を、有効性について、ｔＰＡ処理した凝固能力のあるマウスで試験した。尾切断
モデルを用いると、ｄＶ２は０．３〜１ｍｇ／ｋｇの用量で（ボーラス、静脈内）効果的
であることが示された。比較して、このモデルでは、Ｆ７の効果的な用量は５ｍｇ／ｋｇ
（ボーラス、静脈内）であった。これらの結果により、ｄＶ２がＦ７よりも効果的である
ことが証明される（図２１）。図２１は、ｔＰＡ処理した凝固能力のあるマウスにおける
脱シアリル化Ｖ２有効性試験の結果を示している。

脱シアリル化野生型第ＶＩＩ因子（ｄＷＴ ＶＩＩａ）のクリアランスおよび有効性
脱シアリル化野生型第ＶＩＩ因子（ｄＷＴ ＶＩＩａ）を、出発第ＶＩＩ因子材料とし
てＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋから得たＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を用いて、かつ上
記のように可溶性シアリダーゼ酵素を用いて出発ポリペプチドを脱シアリル化することに
よって上記のように産生した。ｄＷＴ ＶＩＩａは、９９％超の純度、低いエンドトキシ
ンを有し、検出可能なシアル酸を有さないことが分かった。さらに、質量分析により、シ
アル酸の選択的除去が示された。

このｄＷＴ ＶＩＩａ材料の活性を、上記のＢｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩ発色アッセイお
よび修正ＰＴアッセイを用いて分析し、野生型第ＶＩＩ因子と比較した。これらの分析の
各々により、ｄＷＴ ＶＩＩａが野生型第ＶＩＩ因子ポリペプチドとほぼ同一の活性を有
することが示された。

ｄＷＴ ＶＩＩａおよび野生型第ＶＩＩ因子（１ｍｇ／ｋｇ）のクリアランスも、ヒト
組織因子ノックイン（ＴＦＫＩ）マウスのマウスモデルを用いて分析および比較した。図
２２に示されるように、ｄＷＴ ＶＩＩａの半減期は野生型第ＶＩＩ因子よりも有意に短
く、クリアランス（ｍｌ／時間／ｋｇ）は４０倍速かった。

上記のＴＦＫＩマウスおよび尾切断法を用いて、野生型第ＶＩＩ因子と比較したｄＷＴ
ＶＩＩａの有効性を調査した。手短に言えば、５ｍｇ／ｋｇのｔＰＡをマウスに静脈内
注射し、引き続いて尾の先端から５０ｍｍを切り落とした。次いで、野生型第ＶＩＩ因子
（Ｎｏｖｏｓｅｖｅｎ（登録商標））またはｄＷＴ ＶＩＩａを１〜６ｍｇ／ｋｇに及ぶ
投与量で静脈内注射した。次いで、血液を４５分間尾から採取し、不安定な血餅を採取期
間全体にわたって６分毎に破壊した。図２３に示されるように、驚くべきことにｄＷＴ
ＶＩＩａは、野生型第ＶＩＩ因子よりも有意に効果的であることが分かった。より具体的
には、６ｍｇ／ｋｇ用量の野生型第ＶＩＩ因子と比較して、３ｍｇ／ｋｇ用量のｄＷＴ
ＶＩＩａにより失血減少が引き起こされた。この分析の結果を仮定すると、２ｍｇ／ｋｇ
のｄＷＴ ＶＩＩａが６ｍｇ／ｋｇの野生型第ＶＩＩ因子と生物学的同等用量であると決
定された。

ｄＷＴ ＶＩＩａおよび野生型第ＶＩＩ因子（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））が全
身性凝固を引き起こす能力も上記トロンビン抗トロンビン（ＴＡＴ）法によって調査した
。マウスを生物学的同等用量のｄＷＴ ＶＩＩａ（２ｍｇ／ｋｇ）および野生型第ＶＩＩ
因子（６ｍｇ／ｋｇ）で処理し、次いで、ＴＡＴ複合体の形成をＥＬＩＳＡによって測定
した。図２４に示されるように、野生型ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）第ＶＩＩ因子は
、ｄＷＴ ＶＩＩａよりも有意に高いレベルのＴＡＴを産生した。ｄＷＴ ＶＩＩａがベ
ースラインＴＡＴレベルのみを産生したという事実を仮定すると、この実験は、ポリペプ
チドが野生型第ＶＩＩ因子と同じくらい効果的であるという事実にもかかわらず、この用
量のｄＷＴ ＶＩＩａが観察可能な全身性凝固をもたらさないことを示唆している。

さらに、ｄＷＴ ＶＩＩａおよび野生型第ＶＩＩ因子（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標
））が血栓形成を引き起こす能力もＦｅＣｌ_３血栓症モデルで調査した。マウスを血栓症
試験の開始１５分前に生物学的同等用量のｄＷＴ ＶＩＩａ（２ｍｇ／ｋｇ）および野生
型第ＶＩＩ因子（６ｍｇ／ｋｇ）で処理した。次いで、３．２５％ＦｅＣｌ_３溶液の投与
によって血栓症を開始し、次いで、血栓形成をドップラーによって３０分間測定した。得
られた血流データを血流対時間のグラフにプロットし、次いで、対照試料についての曲線
下の面積の百分率を計算して、第ＶＩＩ因子処理群の各々について血栓形成によって引き
起こされた血流の低下を決定した。図２５に示されるように、野生型ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ
（登録商標）第ＶＩＩ因子は、血流の有意な減少（平均ほぼ４０％）をもたらした一方で
、ｄＷＴ ＶＩＩａは血流の低下をほぼ示さなかった（平均＞９０％）。この実験により
、所与の用量のｄＷＴ ＶＩＩａは、野生型第ＶＩＩ因子と比較して大いに減少した血栓
形成をもたらすことが証明された。

野生型第ＶＩＩ因子と比較したｄＷＴ ＶＩＩａの活性および有効性を、ＳＮ−１７ｃ
トリペプチド蛍光原基質（ＨＴＩ）を用いて、これらのペプチドの可溶性組織因子（ｓＴ
Ｆ）に対する見かけの結合親和性を調べることによってさらに調査した。図２６に示され
るように、この分析により、ｄＷＴ ＶＩＩａ（ｄＦ７）および野生型第ＶＩＩ因子（Ｆ
７）が同等のｓＴＦに対する見かけの結合親和性を有することが証明された。しかしなが
ら、図２７に示されるように、ｓＴＦ−第ＶＩＩ因子複合体（０．５ｍＭ 第ＶＩＩ因子
［ｄＷＴ ＶＩＩａまたは野生型］、１２５ｎＭ ｓＴＦ）の存在下で第Ｘ因子濃度を滴
定することによって、これらのペプチドが第Ｘ因子を活性化する能力を調べる実験モデル
では、ｄＷＴ ＶＩＩａおよび野生型第ＶＩＩ因子についてのミカエリスメンテン型反応
速度論により、ｄＷＴ ＶＩＩａ（ｄＦ７）が野生型第ＶＩＩ因子（Ｆ７）よりも有効に
（およそ２倍）第Ｘ因子を活性化することができることが証明される。このデータは、ｄ
ＷＴ ＶＩＩａがその野生型対応物よりも１つの第ＶＩＩ因子活性部位当たり多くの第Ｘ
因子を第Ｘａ因子に変換することができることを示唆している。

考察
急性出血の治療に効果的であるが、血栓形成性が低下した治療薬を開発する未だ対処さ
れていない医学的必要性が存在する。半減期が短い効果的な第ＶＩＩ因子ポリペプチドは
、急性出血に使用するのに適したより大きな治療窓を有する分子を潜在的にもたらすだろ
う。

Ｖ２およびＶ１は２つの第ＶＩＩａ因子変異体である（図１〜図３）。これらの変異体
は、活性化血小板に対する親和性を増加させ、Ｖ２の場合には、組織因子非依存性をもた
らすＧｌａドメインの変異を含有する。両変異体はさらに２個のＮ−グリコシル化部位も
有し、これにより野生型第ＶＩＩａ因子と比較して延長した半減期、血友病の治療に有利
な形質がもたらされる。しかしながら、急性出血のための治療剤としてのその使用は、半
減期の減少から利益を得るだろう。この修正により、オフターゲットの効果のリスクが低
下し、結果として、その治療指数が増加するだろう。本発明者らは、ここで、Ｖ２および
Ｖ１の炭水化物鎖上に存在するシアル酸の除去により、インビトロ肝細胞クリアランスモ
デルにおいて分子の有意に速いクリアランスがもたらされることを示した。ヒポグリコシ
ル化変異体はインビトロモデルではこれで速く排除されなかったが、このことは脱シアリ
ル化分子とヒポグリコシル化分子との間のクリアランスの機構が異なることを示唆してい
る。スプラーグドーリーラットで行ったインビボ試験により、脱シアリル化分子（ｄＶ２
およびｄＶ１）ならびにヒポグリコシル化変異体ｐＭＢ１２１が有意に減少した半減期を
有することが証明された。興味深いことに、脱シアリル化Ｖ２とＶ１の両方が、脱シアリ
ル化野生型ＦＶＩＩａについて報告されている速度と比較して増加したクリアランス速度
（Ａｐｐａら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ １０４．２／
２０１０）、そのさらに２個のＮ−グリカンにより得る特徴を有していた。この活性につ
いての１つの可能な理論は、本明細書で主張されるものに限定されないが、これらの余分
なＮ−グリカンが、脱シアリル化されて、ＡＳＧＰＲまたは類似の受容体のための追加の
リガンドとなり、より速いクリアランスを媒介するというものである。これらの分子の活
性は、インビトロ活性アッセイによって測定されるように、その親分子と比較して保持さ
れたまたは増加した。ｄＶ２のより速いクリアランスは、ＨｅｍＡマウスＰＫ試験におい
てインビボでさらに検証され、ＨｅｍＡ尾切り落としおよびＴＶＴ試験において効果的で
あることが示された。

さらに、野生型第ＶＩＩ因子の脱シアリル化によって、野生型よりもずっと急速に消滅
する第ＶＩＩ因子ポリペプチドが産生された一方で、多数の実験モデルにおいて示される
ように有効性が増加するという驚くべき結果も提供された。

第ＶＩＩａ因子または第ＶＩＩａ因子変異体のＮ−グリカンの除去またはＮ−グリカン
の単糖組成の修正により、より速く消滅する分子が得られる。これらの分子はインビボで
活性を保持し効果的である。これらの速く消滅する第ＶＩＩ ａ因子分子の開発は、急性
出血性適応症の治療に有益であるのみならず、潜在的に市場の種々の抗凝固薬の解毒薬と
なるだろう。

本発明は以下のものを含む。
（項１）
配列番号１６のアミノ酸に関して少なくとも２つの配列変化を有するアミノ酸配列を含み、前記少なくとも２つの配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、および（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基であり；Ｎ結合型グリカン１モル当たりの抱合型シアル酸のモルの比が（１）０〜５；（２）０〜４；（３）０〜３；（４）０〜２；（５）０〜１および（６）０〜０．５からなる群から選択される範囲内にある変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物。
（項２）
前記変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドが配列番号１６のアミノ酸配列に関して少なくとも４つの配列変化を含み、前記少なくとも４つの配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、（３）３６位のアルギニン残基に置換したグルタミン酸残基、および（４）３４位のアラニン残基に置換したグルタミン酸残基である、項１に記載の組成物。
（項３）
配列番号１６のアミノ酸に関して少なくとも２つの配列変化を有するアミノ酸配列を含み、前記少なくとも２つの配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、および（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基であり；０〜５．０の間の抱合型シアル酸のモルとＮ−結合型グリカンのモルの比を有する、単離変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチド。
（項４）
ａ）配列番号１６に関して３６位のアルギニン残基に置換したグルタミン酸残基、ｂ）配列番号１６に関して３４位のアラニン残基に置換したグルタミン酸残基、ｃ）配列番号１６に関して１０６位のトレオニン残基に置換したアスパラギン残基、およびｄ）配列番号１６に関して２５３位のバリン残基に置換したアスパラギン残基からなる群から選択される１つまたは複数の配列変化さらに含む、項３に記載の単離変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチド。
（項５）
ａ）配列番号１６に関して３６位のアルギニン残基に置換したグルタミン酸残基、ｂ）配列番号１６に関して３４位のアラニン残基に置換したグルタミン酸残基、ｃ）配列番号１６に関して１０６位のトレオニン残基に置換したアスパラギン残基、およびｄ）配列番号１６に関して２５３位のバリン残基に置換したアスパラギン残基からなる群から選択される２つ以上の配列変化さらに含む、項３に記載の単離変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチド。
（項６）
ａ）配列番号１６に関して３６位のアルギニン残基に置換したグルタミン酸残基、ｂ）配列番号１６に関して３４位のアラニン残基に置換したグルタミン酸残基、ｃ）配列番号１６に関して１０６位のトレオニン残基に置換したアスパラギン残基、およびｄ）配列番号１６に関して２５３位のバリン残基に置換したアスパラギン残基からなる群から選択される３つ以上の配列変化さらに含む、項３に記載の単離変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチド。
（項７）
ａ）配列番号１６に関して３６位のアルギニン残基に置換したグルタミン酸残基、ｂ）配列番号１６に関して３４位のアラニン残基に置換したグルタミン酸残基、ｃ）配列番号１６に関して１０６位のトレオニン残基に置換したアスパラギン残基、およびｄ）配列番号１６に関して２５３位のバリン残基に置換したアスパラギン残基からなる群から選択される４つ以上の配列変化さらに含む、項３に記載の単離変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチド。
（項８）
配列番号１６のアミノ酸配列を含み、かつ組成物中の抱合型シアル酸のモルとＮ結合型グリカンのモルの比が（ａ）１〜５；（ｂ）１〜４；（ｃ）１〜３；（ｄ）１〜２；および（ｅ）０．５〜１からなる群から選択される範囲内にある第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物。
（項９）
単離脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを調製する方法であって、
（１）シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを得るステップと；
（２）前記シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを、十分な量の共有結合シアル酸残基が前記シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドから除去されて、ａ）０．０５未満、ｂ）０．１未満、ｃ）１．０未満、ｄ）２．０未満、ｅ）３．０未満、ｆ）４．０未満、ｇ）５．０未満；およびｈ）６．０未満からなる群から選択される抱合型シアル酸のモルとＮ−結合型グリカンのモルの比を有する脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを産生するような条件下でシアリダーゼと接触させるステップと；
（３）それによって産生された前記脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを単離するステップと
を含む方法。
（項１０）
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが配列番号１６の野生型第ＶＩＩ因子配列を含む、項９に記載の方法。
（項１１）
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが配列番号１６に関して２つ以上の配列変化を含む変異配列を含む、項９に記載の方法。
（項１２）
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが配列番号１６に関して４つ以上の配列変化を含む変異配列を含む、項９に記載の方法。
（項１３）
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが配列番号１６に関して６つ以上の配列変化を含む変異配列を含む、項９に記載の方法。
（項１４）
単離脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを調製する方法であって、（１）ａ）０．０５未満、ｂ）０．１未満、ｃ）１．０未満、ｄ）２．０未満、ｅ）３．０未満、ｆ）４．０未満、ｇ）５．０未満；およびｈ）６．０未満からなる群から選択される抱合型シアル酸のモルとＮ−結合型グリカンのモルの比を有する脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを産生するように、ペプチドをシアル化する能力が欠乏した組換え細胞系で第ＶＩＩ因子ポリペプチドを産生するステップと；（２）それによって産生された前記脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを単離するステップとを含む方法。
（項１５）
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが配列番号１６の野生型第ＶＩＩ因子配列を含む、項１４に記載の方法。
（項１６）
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが配列番号１６に関して２つ以上の配列変化を含む変異配列を含む、項１４に記載の方法。
（項１７）
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが配列番号１６に関して４つ以上の配列変化を含む変異配列を含む、項１４に記載の方法。
（項１８）
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが配列番号１６に関して６つ以上の配列変化を含む変異配列を含む、項１４に記載の方法。
（項１９）
単離脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを調製する方法であって、
（１）組換え第ＶＩＩ因子ポリペプチドと組換えシアリダーゼ酵素を同時発現する組換え細胞系を作成するステップと；
（２）前記組換え細胞系を培養して前記組換え第ＶＩＩ因子ポリペプチドと前記組換えシアリダーゼ酵素の両方の発現を可能にし、前記組換えシアリダーゼ酵素が十分な量の共有結合シアル酸残基を除去して、ａ）０．０５未満、ｂ）０．１未満、ｃ）１．０未満、ｄ）２．０未満、ｅ）３．０未満、ｆ）４．０未満、ｇ）５．０未満；およびｈ）６．０未満からなる群から選択される抱合型シアル酸のモルとＮ−結合型グリカンのモルの比を有する脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを産生するステップと；
（３）それによって産生された前記脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを単離するステップと
を含む方法。
（項２０）
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが配列番号１６の野生型第ＶＩＩ因子配列を含む、項１９に記載の方法。
（項２１）
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが配列番号１６に関して２つ以上の配列変化を含む変異配列を含む、項１９に記載の方法。
（項２２）
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが配列番号１６に関して４つ以上の配列変化を含む変異配列を含む、項１９に記載の方法。
（項２３）
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが配列番号１６に関して６つ以上の配列変化を含む変異配列を含む、項１９に記載の方法。
（項２４）
（１）配列番号１６の配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、および（３）１４５位のＮ結合型グリコシル化が破壊されるような配列変化からなるポリペプチド；
（２）配列番号１６の配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、および（３）３２２位のＮ結合型グリコシル化が破壊されるような配列変化からなるポリペプチド；
（３）配列番号１６のアミノ酸配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、および（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、および（３）１４５位および３２２位のＮ結合型グリコシル化が破壊されるような配列変化からなるポリペプチド；
（４）配列番号１６のアミノ酸配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、および（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基からなり、１４５位および３２２位がアスパラギンであり、かつ結合したＮ結合型グリコシル化を有するポリペプチド；
（５）配列番号１６のアミノ酸配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、（３）３４位のアラニン残基に置換したグルタミン酸残基、（４）３６位のアルギニン残基に置換したグルタミン酸残基、および（５）１４５位のＮ結合型グリコシル化が破壊されるような配列変化からなるポリペプチド；
（６）配列番号１６のアミノ酸配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、（３）３４位のアラニン残基に置換したグルタミン酸残基、（４）３６位のアルギニン残基に置換したグルタミン酸残基、および（５）３２２位のＮ結合型グリコシル化が破壊されるような配列変化からなるポリペプチド；
（７）配列番号１６のアミノ酸配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、（３）３４位のアラニン残基に置換したグルタミン酸残基、（４）３６位のアルギニン残基に置換したグルタミン酸残基、および（５）１４５位および３２２位のＮ結合型グリコシル化が破壊されるような配列変化からなるポリペプチド；および
（８）配列番号１６のアミノ酸配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、（３）３４位のアラニン残基に置換したグルタミン酸残基、および（４）３６位のアルギニン残基に置換したグルタミン酸残基からなり、１４５位および３２２位がアスパラギンであり、かつ結合したＮ結合型グリコシル化を有するポリペプチド からなる群から選択される単離変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチド。
（項２５）
血餅形成が望ましい疾患または障害を有する哺乳動物を治療する方法であって、有効量の項１に記載の変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物をそれを必要とする哺乳動物に投与するステップを含み、前記疾患または障害が出血、胃腸出血、制御されない出血、移植または切除または手術を受けている哺乳動物の出血、静脈瘤出血、血小板減少症、血友病、頭蓋内出血、大動脈瘤、および抗凝固薬の過剰投与からなる群から選択される方法。
（項２６）
血餅形成が望ましい疾患または障害を有する哺乳動物を治療する方法であって、有効量の項３に記載の単離変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドをそれを必要とする哺乳動物に投与するステップを含み、前記疾患または障害が出血、胃腸出血、制御されない出血、移植または切除または手術を受けている哺乳動物の出血、静脈瘤出血、血小板減少症、血友病、頭蓋内出血、大動脈瘤、および抗凝固薬の過剰投与からなる群から選択される方法。
（項２７）
血餅形成が望ましい疾患または障害を有する哺乳動物を治療する方法であって、有効量の項８に記載の第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物をそれを必要とする哺乳動物に投与するステップを含み、前記疾患または障害が出血、胃腸出血、制御されない出血、移植または切除または手術を受けている哺乳動物の出血、静脈瘤出血、血小板減少症、血友病、頭蓋内出血、大動脈瘤、および抗凝固薬の過剰投与からなる群から選択される方法。
（項２８）
血餅形成が望ましい疾患または障害を有する哺乳動物を治療する方法であって、有効量の項９に記載の方法によって調製された単離脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含む組成物をそれを必要とする哺乳動物に投与するステップを含み、前記疾患または障害が出血、胃腸出血、制御されない出血、移植または切除または手術を受けている哺乳動物の出血、静脈瘤出血、血小板減少症、血友病、頭蓋内出血、大動脈瘤、および抗凝固薬の過剰投与からなる群から選択される方法。
（項２９）
血餅形成が望ましい疾患または障害を有する哺乳動物を治療する方法であって、有効量の項１４に記載の方法によって調製された単離脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含む組成物をそれを必要とする哺乳動物に投与するステップを含み、前記疾患または障害が出血、胃腸出血、制御されない出血、移植または切除または手術を受けている哺乳動物の出血、静脈瘤出血、血小板減少症、血友病、頭蓋内出血、大動脈瘤、および抗凝固薬の過剰投与からなる群から選択される方法。
（項３０）
血餅形成が望ましい疾患または障害を有する哺乳動物を治療する方法であって、有効量の項１９に記載の方法によって調製された単離脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含む組成物をそれを必要とする哺乳動物に投与するステップを含み、前記疾患または障害が出血、胃腸出血、制御されない出血、移植または切除または手術を受けている哺乳動物の出血、静脈瘤出血、血小板減少症、血友病、頭蓋内出血、大動脈瘤、および抗凝固薬の過剰投与からなる群から選択される方法。
（項３１）
出血、胃腸出血、制御されない出血、移植または切除または手術を受けている哺乳動物の出血、静脈瘤出血、血小板減少症、血友病、頭蓋内出血、大動脈瘤、および抗凝固薬の過剰投与からなる群から選択される疾患または障害の治療への項１に記載の変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物の使用。
（項３２）
出血、胃腸出血、制御されない出血、移植または切除または手術を受けている哺乳動物の出血、静脈瘤出血、血小板減少症、血友病、頭蓋内出血、大動脈瘤、および抗凝固薬の過剰投与からなる群から選択される疾患または障害の治療への項３に記載の単離変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドの使用。
（項３３）
出血、胃腸出血、制御されない出血、移植または切除または手術を受けている哺乳動物の出血、静脈瘤出血、血小板減少症、血友病、頭蓋内出血、大動脈瘤、および抗凝固薬の過剰投与からなる群から選択される疾患または障害の治療への項８に記載の第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物の使用。
（項３４）
出血、胃腸出血、制御されない出血、移植または切除または手術を受けている哺乳動物の出血、静脈瘤出血、血小板減少症、血友病、頭蓋内出血、大動脈瘤、および抗凝固薬の過剰投与からなる群から選択される疾患または障害の治療への項９に記載の方法によって調製された単離脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含む組成物の使用。
（項３５）
出血、胃腸出血、制御されない出血、移植または切除または手術を受けている哺乳動物の出血、静脈瘤出血、血小板減少症、血友病、頭蓋内出血、大動脈瘤、および抗凝固薬の過剰投与からなる群から選択される疾患または障害の治療への項１４に記載の方法によって調製された単離脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含む組成物の使用。
（項３６）
出血、胃腸出血、制御されない出血、移植または切除または手術を受けている哺乳動物の出血、静脈瘤出血、血小板減少症、血友病、頭蓋内出血、大動脈瘤、および抗凝固薬の過剰投与からなる群から選択される疾患または障害の治療への項１９に記載の方法によって調製された単離脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含む組成物の使用。
（項３７）
出血、胃腸出血、制御されない出血、移植または切除または手術を受けている哺乳動物の出血、静脈瘤出血、血小板減少症、血友病、頭蓋内出血、大動脈瘤、および抗凝固薬の過剰投与からなる群から選択される疾患または障害を治療するための医薬品の調製への項１に記載の変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物の使用。
（項３８）
出血、胃腸出血、制御されない出血、移植または切除または手術を受けている哺乳動物の出血、静脈瘤出血、血小板減少症、血友病、頭蓋内出血、大動脈瘤、および抗凝固薬の過剰投与からなる群から選択される疾患または障害を治療するための医薬品の調製への項３に記載の単離変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドの使用。
（項３９）
出血、胃腸出血、制御されない出血、移植または切除または手術を受けている哺乳動物の出血、静脈瘤出血、血小板減少症、血友病、頭蓋内出血、大動脈瘤、および抗凝固薬の過剰投与からなる群から選択される疾患または障害を治療するための医薬品の調製への項８に記載の第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物の使用。
（項４０）
出血、胃腸出血、制御されない出血、移植または切除または手術を受けている哺乳動物の出血、静脈瘤出血、血小板減少症、血友病、頭蓋内出血、大動脈瘤、および抗凝固薬の過剰投与からなる群から選択される疾患または障害を治療するための医薬品の調製への項９に記載の方法によって調製された単離脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含む組成物の使用。
（項４１）
出血、胃腸出血、制御されない出血、移植または切除または手術を受けている哺乳動物の出血、静脈瘤出血、血小板減少症、血友病、頭蓋内出血、大動脈瘤、および抗凝固薬の過剰投与からなる群から選択される疾患または障害を治療するための医薬品の調製への項１４に記載の方法によって調製された単離脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含む組成物の使用。
（項４２）
出血、胃腸出血、制御されない出血、移植または切除または手術を受けている哺乳動物の出血、静脈瘤出血、血小板減少症、血友病、頭蓋内出血、大動脈瘤、および抗凝固薬の過剰投与からなる群から選択される疾患または障害を治療するための医薬品の調製への項１９に記載の方法によって調製された単離脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含む組成物の使用。
（項４３）
項１に記載の変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
（項４４）
項３に記載の単離変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
（項４５）
項８に記載の第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
（項４６）
項９に記載の方法によって調製された単離脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
（項４７）
項１４に記載の方法によって調製された単離脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
（項４８）
項１９に記載の方法によって調製された単離脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
（項４９）
血餅形成が望ましい疾患または障害を有する哺乳動物を治療する方法であって、抱合型シアル酸のモルとＮ結合型グリカンのモルの比が０．０５未満である配列番号１６のアミノ酸配列を含む有効量の第ＶＩＩ因子ポリペプチドをそれを必要とする哺乳動物に投与するステップを含み、前記疾患または障害が出血、胃腸出血、制御されない出血、移植または切除または手術を受けている哺乳動物の出血、静脈瘤出血、血小板減少症、血友病、頭蓋内出血、大動脈瘤、および抗凝固薬の過剰投与からなる群から選択される方法。
（項５０）
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが検出可能な量の抱合型シアル酸を含有しない、項２９に記載の方法。

Claims (18)

1. 配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離された変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドであって、該変異形が、配列番号１６に関して１４５と３２２位のアミノ酸残基において野生型ヒト第ＶＩＩ因子のＮ結合型グリコシル化部位を含み、更に、配列番号１６の野生型第ＶＩＩ因子中に存在する２つを超える追加のＮ結合型グリコシル化部位を含み、ここで、該ポリペプチドにおけるＮ結合型グリカンのモルに対する抱合型シアル酸のモルの比が０から２．０であることを特徴とする前記変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチド。
2. アミノ酸置換Ｖ２５３Ｎを含む、請求項１に記載の単離された変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチド。
3. アミノ酸置換Ｔ１０６Ｎを含む、請求項１に記載の単離された変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチド。
4. Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｔ１０６Ｎ及びＶ２５３Ｎからなる群から選択される１または複数のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の単離された変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチド。
5. Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｔ１０６Ｎ及びＶ２５３Ｎからなる群から選択される２以上のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の単離された変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチド。
6. Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｔ１０６Ｎ及びＶ２５３Ｎからなる群から選択される３以上のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の単離された変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチド。
7. 配列変化Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６Ｎ及びＶ２５３Ｎを含む、請求項１に記載の単離された変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチド。
8. 同じ条件下で測定される場合に、野生型第ＶＩＩ因子に比較して少なくとも５０％の血液凝固を促進する活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の単離された変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチド。
9. Ｎ結合型グリカンのモルに対する抱合型シアル酸のモルの比が０から１．０である、請求項１から８のいずれか１項に記載の単離された変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチド。
10. Ｎ結合型グリカンのモルに対する抱合型シアル酸のモルの比が０から０．５である、請求項１から８のいずれか１項に記載の単離された変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチド。
11. 請求項１に記載の単離された変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドを調製する方法であって、
    （１）配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１６に関して１４５と３２２位のアミノ酸残基において野生型ヒト第ＶＩＩ因子のＮ結合型グリコシル化部位を含み、更に、配列番号１６の野生型第ＶＩＩ因子中に存在する２つを超える追加のＮ結合型グリコシル化部位を含むシアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを得るステップ、
    （２）十分な量の共有結合したシアル酸残基が該シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドから除去されて、Ｎ結合型グリカンのモルに対する抱合型シアル酸のモルの比が０から２．０である脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドが産生される条件下で、シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドをシアリダーゼと接触させるステップ、及び
    （３）産生された変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドを単離するステップを含む、前記方法。
12. 請求項１に記載の単離された変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドを調製する方法であって、
    （１）ペプチドをシアリル化する能力を欠乏し、その結果、Ｎ結合型グリカンのモルに対する抱合型シアル酸のモルの比が０から２．０である脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを産生する組換え細胞株において、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１６に関して１４５と３２２位のアミノ酸残基において野生型ヒト第ＶＩＩ因子のＮ結合型グリコシル化部位を含み、更に、配列番号１６の野生型第ＶＩＩ因子中に存在する２つを超える追加のＮ結合型グリコシル化部位を含む第ＶＩＩ因子ポリペプチドを産生するステップ、および
    （２）産生された変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドを単離するステップを含む、前記方法。
13. 請求項１に記載の単離された変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドを調製する方法であって、
    （１）（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１６に関して１４５と３２２位のアミノ酸残基において野生型ヒト第ＶＩＩ因子のＮ結合型グリコシル化部位を含み、更に、配列番号１６の野生型第ＶＩＩ因子中に存在する２つを超える追加のＮ結合型グリコシル化部位を含む組換え第ＶＩＩ因子ポリペプチドと（ｂ）組換えシアリダーゼ酵素を共発現する組換え細胞株を得るステップ、
    （２）該組換え細胞株を培養して組換え第ＶＩＩ因子ポリペプチドと組換えシアリダーゼ酵素の両方を発現させるステップであって、ここで、該組換えシアリダーゼ酵素が十分な量の共有結合したシアル酸残基を除去して、Ｎ結合型グリカンのモルに対する抱合型シアル酸のモルの比が０から２．０である脱シアリル化第ＶＩＩ因子を産生するステップ、および
    （３）産生された変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドを単離するステップを含む、前記方法。
14. 変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、１つがＶ２５３Ｎでありその他がＰ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ａ３４ＥおよびＴ１０６Ｎからなる群から選択される４以上の配列変化を含む変異形配列を含む、請求項１１、１２又は１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 請求項１から８のいずれか１項に記載の単離された変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドと医薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物。
16. 血餅形成が望ましい疾患または障害を治療するための医薬の製造における請求項１から８のいずれか１項に記載の単離された変異形ＶＩＩ因子ポリペプチドの使用であって、該疾患または障害が、出血、胃腸出血、制御されない出血、移植または切除または手術を受けている哺乳動物の出血、静脈瘤出血、血小板減少症、血友病、頭蓋内出血、大動脈瘤、凝固薬の過剰投与、穿通性外傷性損傷、鈍的外傷性損傷、待機手術における出血、心臓手術における出血、脊髄手術における出血、整形外科手術、神経外科手術、腫瘍学手術、分娩後手術、月経過多、幹細胞移植における出血、肝移植における出血、消化管出血、肝硬変の活発な静脈瘤出血、肝硬変の非静脈瘤出血、びまん性肺胞出血、大動脈瘤、脳内出血、外傷性脳損傷、脳挫傷、ワルファリンの逆転、ヘパリンの逆転、抗凝固薬の逆転、抗血栓薬の逆転、第ＶＩＩ因子欠乏症、火傷、阻害因子による血友病患者の予防、非肝硬変および肝硬変患者のための部分肝切除、後天性血友病、特発性血小板減少性紫斑病、グランツマン血小板無力症、血小板輸血に対して難治性のグランツマン血小板無力症およびベルナール−スリエ症候群からなる群から選択される、前記使用。
17. 疾患または障害が出血である請求項１６に記載の方法。
18. 配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列変化Ｐ１０ＱおよびＫ３２Ｅを含む単離された変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドであって、Ｎ結合型グリカンのモルに対する抱合型シアル酸のモルの比が０から１．０である前記変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチド。

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