SA517380867B1 - عديد ببتيدات لعامل vii قصير التأثير - Google Patents

Abstract

يتم الكشف عن عديد الببتيدات من العامل VII الذي له تأثير قصير. يكون عمر النصف القصير مرغوب من أجل معالجة نزيف حاد واضطرابات مماثلة. تعديل sialylation و/أو glycosylation للعامل VII والأشكال المختلفة منه ينتج ببتيدات مفيدة في علاج حالات النزيف الحاد. الشكل 23

Description

عديد ببتيدات لعامل ‎VIE‏ قصير التأثير ‎SHORT-ACTING FACTOR VII POLYPEPTIDES‏ الوصف الكامل خلفية الاختراع أن هذا الطلب عبارة عن طلب جزئي من الطلب رقم 515360668 والذي تم إيداعه في المملكة ‎dp pall‏ السعودية بتاريخ 06 / 09 / 1436ه الموافق 23 / 06 / 2015 م. تتوافر هنا أشكال مختلفة ‎jias Jalal‏ أدمى ‎VII (Human coagulation Factor)‏ وعديد نيكلوتيدات ‎(polynucleotides)‏ يشفر هذه الأشكال المختلفة؛ نواقل ‎(vectors)‏ وخلايا عائل ‎(host cells)‏ تشمل وتُظهر الأشكال المختلفة. طرق للحصول عليها؛ طرق استخدام الأشكال المختلفة؛ تركيبات الأشكال المختلفة؛ وسمات مبتكرة إضافية متعلقة بها. تخثر الدم ‎(blood coagulation)‏ هو عملية تتكون من تفاعل بيني معقد لمكونات دم (أو عوامل) متعددة الذي يؤدي في النهاية إلى جلطة ‎(fibrin clot) fibrin‏ بصفة عامة؛ تكون 0 مكونات الدم؛ التي تشارك ‎lad‏ يشير إليه على أنه 'سلسلة ‎"(cascade)‏ التخثر؛ بروتينات خاملة إنزيميا ‎(enzymatically inactive proteins)‏ (طلائع الإنزيم (بروتينات تصبح إنزيمات تحت شروط خاصة) ‎(proenzymes)‏ أو مولدات للإنزيم (مواد تتحول إلى إنزيمات تحت شروط خاصة) (270109605)) التي تتحول إلى إنزيمات محللة للبروتين عن طريق تأثير مُنشط ‎(activator)‏ (الذي يكون بذاته عامل تخثر مُنشط). يشار بصفة عامة إلى عوامل التخثر التي 5 تخضع لهذا التحول على أنها "عوامل نشطة ‎"(active factors)‏ وتحدد بإضافة الحرف ‎“a”‏ إلى اسم عامل التخثر (مثلا عامل ‎.)/١18‏ ‏بدء عملية توقف نزف الدم يسببه بصورة غير مباشرة تشكيل معقد بين عامل نسيج؛ المُعرض إلى الدورة الدموية بعد إصابة جدار الوعاء الدموي؛ وعامل ‎(Vila‏ الموجود فى الدورة الدموية بكمية تقابل ‎Mga‏ 71 من إجمالي ‎ABS‏ بروتين العامل ‎VII‏ يُثبت هذا المعقد مع الخلية 0 الحاملة لعامل بالنسيج ويحول العوامل ‎IX‏ وكا إلى الأشكال النشطة منه العامل ‎IXa‏ والعامل ‎Xa‏

على سطح الخلية. العامل ‎Xa‏ يحول ‎prothrombin‏ إلى ‎thrombin‏ على الخلية الحاملة لعامل بالنسيج؛ الذي ينشط العامل ‎VI‏ العامل /اء العامل ‎XI‏ والعامل ‎XI‏ علاوة على ذلك؛ الكمية المحدودة من ‎thrombin‏ المتشكل في هذه الخطوة الأولية من توقف نزف الدم تُنشط أيضا الصفائح الدموية. بعد تأثير ‎thrombin‏ على الصفائح الدموية؛ فإن الصفائح الدموية تُغير الشكل وتُظهر ليبيدات فوسفورية ‎(Phospholipids)‏ مشحونة على سطحها. سطح الصفيحة الدموية المُنشط يُشكل قالب ‎(template)‏ من أجل تنشيط عامل ‎X‏ إضافي وتولد ‎thrombin‏ كامل. يحدث تنشيط عامل ‎X‏ إضافي على سطح الصفيحة الدموية المُنشط من خلال معقد عامل ‎IXa‏ ‏وعامل ‎Villa‏ المتشكل على سطح الصفيحة الدموية النشطة؛ ويعدئذ العامل ‎Xa‏ يحول ‎prothrombin‏ إلى ‎Law thrombin‏ لا يزال على السطح. بعدئذ فإن ‎thrombin‏ يحول

‎fibrinogen 0‏ إلى 0000؛ الذي يكون غير قابل للذويان والذي يُثبت سدادة الصفيحة الدموية ‎(platelet plug)‏ المبدئية. تقتصر هذه العملية على موقع تعرض عامل النسيج بذلك تقل خطورة التنشيط النظامي من نظام التخثر ‎-(coagulation system)‏ في السنوات الأخيرة؛ تم العثور على عامل ‎VII‏ وعامل نسيج ليكونوا العوامل البادئة الأساسية لتخثر الدم.

‏15 ينتج العامل ‎Vila‏ من المصدر الأولي له؛ العامل ‎VI‏ الذي يتم تخليقه في الكبد ‎Sots‏ ‏في الدم حيث يتم تدويره كبروتين سكري ‎(glycoprotein)‏ فردي السلسلة (وزن جزيثي جرامي حوالي 50000 دالتون). يكون للعامل ‎VIE‏ من النوع البري حسب الاستخدام هنا ترتيب حمض أميني وترتيب نيكلوتيد تم الكشف عنهما في الشكلين 1 و2. يعني المصطلح "عامل ‎VIE‏ ‎"(Factor VII)‏ أن يشمل عديد الببتيدات للعامل ‎VIE‏ في شكلها غير المشتق (الشكل المولد

‏20 لاللإنزيم) بالإضافة إلى المعالجين بالتحلل البروتيني أو بغير ذلك لإنتاج الأشكال النشطة حيويا الخاصة بهاء التي يُشار إليها على أنها العامل ‎Vila‏ ينشق نموذجيا العامل ‎VII‏ من النوع البري بين المتخلفات 152 و153 لإنتاج العامل ‎Ma‏

‏يتحول العامل ‎VIE‏ في المعمل إلى العامل ‎Vila‏ الذي له شكل ذو سلسلتين عن طريق العامل ‎Xa‏ العامل ‎Xlla‏ العامل ‎(Xa‏ أو ‎thrombin‏ مثل العديد من بروتينات البلازما الأخرى

‏5 المتدخلة في توقف نزيف الدم؛ يعتمد العامل ‎VIE‏ على فيتامين ‎K‏ بالنسبة إلى نشاطه؛ المطلوب

من أجل ‎gamma—carboxylation‏ للعديد من متخلفات ‎All glutamic acid‏ تكون عنقودية بالقرب من الطرف ‎amino‏ للبروتين. تتطلب ‎glutamic acids‏ المجرى لها ‎gamma-‏ ‎carboxylation‏ من أجل التفاعل البيني الذي يحثه أيون الفلز للعامل ‎VIE‏ مع الليبيدات الفوسفورية. في وجود عامل نسيج؛ فإن الليبيدات الفوسفورية؛ أيونات الكالسيوم؛ العامل 1/118 ذو سلسلتين يُنشط العامل ‎X‏ أو العامل ‎IX‏ سريعا عن طريق التحلل ‎ang ll‏ المحدود. يكون العامل 8 غُرضة للانشفاق بالتحلل البروتيني؛ مما يزيد من عدد منتجات الانحلال التي لا يكون لها نشاط تجلط. تم نشر الأشكال المختلفة للعامل ‎VIE‏ التي لها ترتيب حمض أميني مشتق من العامل ‎VIE‏ ‏من النوع البري عن طريق استبدال» ‎da‏ و/أو إقحام واحد أو أكثر من الأحماض الأمينية. على سببيل المثال» يتعلق ‎Dickinson‏ وآخرون: ‎(Proc.

Natl.

Acad.

Sci USA (1996) 93, 14379-14384)‏ بالأشكال المختلفة للعامل ‎VII‏ حيث أنه تم استبدال ‎(Met298 (Glu296 Vall58 Lys157‏ ‎(Ser336 (Asp334‏ أو ‎Lys227‏ على حدة عن طريق 818. يتعلق ‎Iwanaga‏ وآخرون: ‎(Thromb.

Haemost. (supplement August 1999), 466, abstract 1474)‏ بالأشكال المختلفة للعامل ‎Vila‏ حيث يتم حذف المتخلفات 320-316 أو تستبدل المتخلفات 322-311 مع المتخلفات المقابلة من ‎trypsin‏ يتعلق منشور طلب براءة الاختراع الأمريكية رقم: 5 ر(11) لدى ‎Bolt‏ وآخرين بالأشكال المختلفة لعامل ‎VI‏ له استبدال تمزق ‎glycosylation‏ سواء عند ‎N145‏ أو ‎(N322‏ أو عند كل من 0145 5 ‎.N322‏ يذكر ‎Toso‏ ‏وآخرون سلسلة من الدراسات التى لها وظيفة بناء للعامل ‎VII‏ معتمدة على الطفرات طبيعية 0 الوجود. تتضمن بروتينات العامل ‎VII‏ التخليقي الطفري ‎(E385K (T324M‏ وبروتيني العامل ‎VII‏ الطفري ينقصهما ترتيبات أب ‎glycosylation‏ سواء فى السلسلة الثقيلة للعامل ‎VII‏ ‎(N322Q)‏ أو السلسلة الخفيفة للعامل ‎(N145Q) VII‏ ‎Toso et al., “Lack of Heavy Chain Glycosylation in Patient with Factor VII‏ ‎Deficiency Not Responsible for Mutant FVlla Activity,” Blood, vol. 96, no.‏

‎part 2 (16 Nov. 2000), p. 79b (42nd Annual Meeting of the American‏ ,11 ‎Society of Hematology).‏ تحتوي معظم الببتيدات والبروتينات طبيعية الوجود على أجزاء ‎carbohydrate‏ مرتبطة مع الببتيد أو البروتين من خلال وصلات خاصة بعدد منتقى من الأحماض الأمينية بمحازاة طول الببتيد الأولى أو سلسلة البروتين. بالتالي؛ يسمى العديد من الببتيدات والبروتينات طبيعية الوجود "ببتيدات سكرية ‎'(glycopeptides)‏ أو "بروتينات سكرية ‎(glycoproteins)‏ على التوالي. تباين النمط ‎glycosylation‏ على أي ببتيد أو بروتين محدد يمكن أن يؤثر على وظيفة هذا الببتيد أو البروتين. على سبيل المثال؛ ‎glycans oly‏ المتصل مع !ا على بروتين أو ببتيد يمكن أن ‎jig‏ على الخواص المتنوعة للببتيد أو البروتين» متضمنة قابلية التعرض إلى ‎protease‏ الحركة 0 داخل الخلية؛ الإفرازء استهداف النسيج؛ ‎jae‏ النصف الحيوي؛ والتولد المضاد ‎(antigenicity)‏ ‏للببتيد أو البروتين في خلية أو كائن متعضي. تبديل واحد أو أكثر من هذه الخصائص يمكن أن يؤثر على فعالية ببتيد أو بروتين في وضعه الطبيعي؛ ويمكن أن يؤثر على فعالية الببتيد أو البروتين كعامل علاجي في الحالات التي يتولد فيها الببتيد أو البروتين لهذا الغرض. يُعرف البناء ‎carbohydrate‏ المرتبط مع سلسلة الببتيد أو البروتين على أنه جزيء ‎“glycan” 5‏ وجود البناء ‎glycan‏ الخاص على ببتيد أو بروتين يؤثر على خصائص قابلية ذويان وتكتل الببتيد أو البروتين» تضاعف سلسلة الببتيد أو البروتين الأولية؛ وبالتالي؛ النشاط الوظيفي أو الإنزيمي الخاص ‎cay‏ مقاومة الببتيد أو البروتين للهجوم المحلل للبروتين؛ والتحكم في التحليل البروتيني الذي يؤدي إلى تحول الأشكال الخامدة للببتيد أو البروتين إلى أشكال نشطة. على سبيل المثال» ‎Jig‏ متخلفات ‎sialic acid‏ الطرفية الموجودة على الجزيء ‎glycan‏ على طول عمر 0 نصف البتيد أو البروتين في نظام الدورة الدموية بالكائن الثديي. تُزال عموما بشكل أسرع الببتيدات والبروتينات التي لا تحتوي ‎glycans‏ الخاصة بها على متخلفات ‎sialic acid‏ طرفية من الدورة الدموية عن طريق الكبد. البنيات ‎glycan‏ التي تم العثور عليها في الببتيدات السكرية والبروتينات السكرية طبيعية الوجود تنقسم نموذجيا إلى فئتين» ‎glycans‏ متصلة مع ‎glycans yg N‏ متصلة 0©. يحتوي العامل ‎Vila 5‏ من النوع البري على موقعين ‎glycosylation‏ متصلين ‎N‏ ومتصلين ‎Glycosylation .O‏

المتصل مع ‎N‏ هو التعديل التساهمي الأكثر شيوعا في حقيقيات النواة ‎(eukaryotes)‏ تحدث 00 المتصل مع ‎N‏ عند ترتيب التوافق ‎(Asn—X-Ser[Thr‏ حيث يرتبط ‎glycan‏ ‏مع مجموعة ‎amine‏ من ‎asparagine‏ ويمثل ‎X‏ أي حمض أميني باستثناء ‎proline‏ ‏5 المتصلة مع ‎N‏ تعتمد على ‎i‏ الشائع ‎«pentasaccharide‏ 2 رعخلا6ا6) 203اال الذي يُمكن تعديله إضافيا عن طريق إضافة 101058003811065 ‎«galactose (N-acetyl galactosamine (Ji.‏ ‎«neuraminic acid‏ ‎«fructose (N-acetylglucosamine‏ 118011056 و0056ل1. قد يرتبط اللّب ‎Man3(GIcNAc)2‏ مع ‎monosaccharides‏ متنوعة متضمنة ‎sialic acids‏ طرفية من خلال ‎N-acetylglucosamine 0‏ عند ‎Asn‏ في ترتيب التوافق ‎AAsn-X-Ser/Thr‏ التعديل عن ‎Gob‏ ‏الترجمة المشتركة للمعقد كيميائيا يقوم بالعديد من الأغراض ويؤثر على حيوية البروتين بطرق متنوعة متضمنة تضاعف مناسب» ‎dang‏ مجموعة وظيفية؛ ومعدلات التصفية. تم اقتراح مجموعة واسعة من الطرق في الفن لتخصيص نمط ‎glycosylation‏ للببتيد أو البروتين» متضمنة تلك الموصوفة في براءة الاختراع الأمريكية رقم: 8008252 إلى ‎DeFrees‏ ‏5 وآخرين. غالبا يتطلب تحفيز وتحسين سلسلة من التخثر في كائن. تم استخدام العامل ‎Vila‏ للتحكم في اضطرابات النزف التي تسببها عيوب عامل التجلط (مثلا؛ الناعور (مرض النزف الوراثي) ‎(haemophilia)‏ هو أو قصور في عوامل التخثر ا أو ‎(Vil‏ أو مثبطات عامل التجلط. يتم الموافقة على عامل ‎Vila‏ تخليقي» مصنوع ومُباع عن طريق ‎Novo Nordisk‏ تحت الاسم 0 التجاري ‎(NovoSeven®‏ على سبيل المثال من أجل ‎dallas‏ نزيف الحلقات ‎(episodes)‏ في مرض الناعور ‎A‏ أو 8 مع مثبطات للعامل ‎VIE‏ أو العامل ‎IX‏ وفي مرضى يعانون من الناعور المكتسب؛ منع النزيف في التدخلات الجراحية أو الإجراءات الجائرة في مرضى الناعور ‎A‏ أو 8 مع مثبطات للعامل ‎VI‏ أو العامل ‎IX‏ وفي مرضى يعانون من الناعور المكتسب؛ معالجة نزيف الحلقات في مرضى لديهم قصور العامل ‎VIE‏ الخلقي ومنع النزيف في التدخلات الجراحية أو 5 الإجراءات الجائرة في مرضى يعانون من قصور العامل ‎VIE‏ الخلقي. تكشف براءة الاختراع

الأمريكية رقم: 5180583 إلى ‎Hedner‏ عن استخدام عامل ‎Vila‏ للتحكم في النزيف الزائد في حالات لا تسببها عيوب عامل تجلط أو مثبطات عامل تجلط. يكشف ‎Hedner‏ عن علاج اضطرابات النزيف التي تسببها على سبيل المثال وظيفة صفائح دموية ‎Halls‏ نقص الصفائح ‎dasa‏ أو مرض ‎«von Willebrand 5‏ وعن تركيبات لهذه الاستخدامات. هناك حاجة لمعالجة النزيف من اضطرابات لا تسببها عيوب عامل التجلط الخلقية أو الناشئة

أو مثبطات لعوامل التجلط. أوضحت العديد من الدراسات السريرية فعالية العامل ‎Vila‏ التخليقي في التحكم في حالات النزيف. مع ذلك؛ هناك مشاكل متعلقة بزيادة حالات الانسداد التجلطي غير المرغوية من استخدام هذا الجزيء. النزيف هو مشكلة رئيسية في العديد من الاضطرابات؛ مثلا فيما

0 يتعلق بالجراحة؛ والمضاعفات بعد الجراحة؛ ازدراعات الجذع والأعضاء؛ النزيف الدموي داخل الجمجمة؛ تمدد الأوعية الدموية بالأووطي؛ الصدمات؛ أو الجرعة الزائدة من بعض مضادات التخثر. الوصف العام للاختراع

الغرض هو ‎dallas‏ اضطرابات النزيف والحلقات مع عديد الببتيدات من العامل ‎VIE‏ الذي

له تأثير قصير. أحد أغراض الدراسة الحالية هو توفير تركيبات من عديد الببتيدات من العامل ‎VIE‏

(وع بري أو شكل مختلف) التي لها تأثير قصيرء تتميز بواحد أو أكثر من التجارب الدوائية الحركية ‎fie‏ عمر ‎Chal‏ قصير. الغرض هو توفير جزيء من العامل ‎VIE‏ له ‎da‏ منخفضة من أجل حالات التجلط خارج الموقع المستهدف وإطار زمن المعالجة. الغرض هو توفير عديد الببتيدات من العامل ‎VII‏ (نوع بري أو شكل مختلف) مع تصفية مُحسّنة نظرا لأنماط ‎glycosylation‏ المُعذلة.

توصف هنا تركيبة من عديد الببتيدات من العامل ‎VIE‏ المختلفة؛ التي يشمل ‎gd‏ عديد الببتيد من العامل ‎VIE‏ المختلف ترتيب حمض أميني له تعديلين ترتيب على الأقل بالنسبة إلى ترتيب الحمض الأميني من تعريف الترتيب رقم: 16 حيث يكون تعديلين الترتيب على الأقل هما )1( متخلف ‎glutamine‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎proline‏ في الموضع 10؛ و(2) متخلف ‎glutamic acid‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎lysine‏ في الموضع 32؛ وحيث تكون نسبة جزيئات

‎sialic acid‏ المتقارن إلى جزيئات ‎glycan‏ المتصل مع لا في التركيبة أقل من 0.05؛ أقل من 1) أقل من 1» أقل من 2؛ أقل من 3؛ أقل من ‎ed‏ أقل من 5 أو أقل من 6. أيضا توصف هنا تركيبة من عديد الببتيدات من العامل ‎VIE‏ المختلفة التي يشمل فيها عديد الببتيد من العامل ‎VIE‏ ‏المختلف ترتيب حمض أميني له تعديلين ترتيب على الأقل بالنسبة إلى ترتيب الحمض الأميني من تعريف الترتيب رقم: 16 حيث يكون تعديلين الترتيب على الأقل هما )1( متخلف ‎glutamine‏ ‏مستبدل من أجل المتخلف ‎proline‏ في الموضع ¢10 و(2) متخلف ‎glutamic acid‏ مستبدل من أجل المتخلف 5806لا في الموضع 32؛ وحيث تكون نسبة جزيئات ‎sialic acid‏ المتقارن ‎JS‏ ‏جزيء من ‎glycan‏ المتصل مع لا في نطاق منتقى من المجموعة المتكونة (1) من صفر إلى 5؛ (2) من صفر إلى 4؛ (3) من صفر إلى 3؛ (4) من صفر إلى 2؛ (5) من صفر إلى 1 و(6) من صفر إلى 0.5 يوصف هنا أيضا عديد ببتيد من العامل ‎VIE‏ مختلف الشكل معزول يشمل ترتيب حمض أميني له تعديلين ترتيب على الأقل بالنسبة إلى ترتيب الحمض الأميني من تعريف الترتيب رقم: ‎Gua (16‏ يكون تعديلين الترتيب على الأقل هما )1( متخلف ‎glutamine‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎proline‏ في الموضع ¢10 و(2) متخلف ‎glutamic acid‏ مستبدل من أجل المتخلف 5 5106لا في الموضع 32؛ ‎Cua‏ يكون عديد الببتيد له نسبة جزيئات ‎sialic acid‏ المتقارن إلى جزيئات ‎glycan‏ المتصل مع لا أقل من 0.05؛ أقل من 0.1؛ أقل من 1»؛ أقل من 2؛ أقل من 3( أقل من 4؛ أقل من 5 أو أقل من 6. أيضا توصف هنا تركيبة من عديد الببتيدات من العامل ‎VI‏ حيث يشتمل عديد الببتيدات من العامل ‎VIE‏ على ترتيب الحمض الأميني من تعريف الترتيب رقم: 16 (عامل ‎VII‏ من نوع بري) وتكون نسبة جزيئات ‎sialic acid‏ المتقارن إلى جزيئات ‎glycan 20‏ المتصل مع ‎AN‏ التركيبة داخل نطاق منتقى من المجموعة المتكونة (1) من 1 إلى 5؛ (2) من 1 إلى 4؛ (3) من 1 إلى 3؛ (4) من 1 إلى 2؛ و(5) من 0.5 إلى 1؛ أو لا يمكن الكشف عن ‎sialic acid‏ المتقارن. يوصف هنا أيضا عديد ببتيد من العامل ‎VII‏ مختلف معزول منتقى من المجموعة المتكونة من:

(1) عديد ببتيد يشمل ترتيب حمض أميني من عامل ‎VIE‏ به تعديلات ترتيب بالنسبة إلى ترتيب من تعريف الترتيب رقم: 16؛ ‎Gua‏ تتكون تعديلات الترتيب من (1) متخلف ‎glutamine‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎proline‏ في الموضع 10 )2( متخلف ‎glutamic acid‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎lysine‏ في الموضع 32؛ و(3) تعديل ترتيب بحيث تتمزق ‎glycosylation‏ المتصلة مع ‎N‏ عند الموضع 145؛ (2) عديد ببتيد يشمل ترتيب حمض أميني من عامل ‎VIE‏ به تعديلات ترتيب بالنسبة إلى ترتيب من تعريف الترتيب رقم: 16؛ ‎Gua‏ تتكون تعديلات الترتيب من (1) متخلف ‎glutamine‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎proline‏ في الموضع 10 )2( متخلف ‎glutamic acid‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎lysine‏ في الموضع 32؛ و(3) تعديل ترتيب بحيث تتمزق ‎glycosylation‏ المتصلة 0 مع ‎N‏ عند الموضع 322؛ (3) عديد ببتيد يشمل ترتيب حمض أميني من عامل ‎VIE‏ به تعديلات ترتيب بالنسبة إلى ترتيب حمض أميني من تعريف الترتيب رقم: 16؛ حيث تتكون تعديلات الترتيب من (1) متخلف ‎glutamine‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎proline‏ في الموضع ¢10 و(2) متخلف ‎glutamic‏ ‎acid‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎lysine‏ الموضع 32؛ و(3) تعديلات ترتيب بحيث تتمزق ‎glycosylation 5‏ المتصلة مع ‎N‏ عند المواضع 145 و322؛ (4) عديد ببتيد يشمل ترتيب حمض أميني من عامل ‎VIE‏ به تعديلات ترتيب بالنسبة إلى ترتيب حمض أميني من تعريف الترتيب رقم: 16؛ حيث تتكون تعديلات الترتيب من (1) متخلف ‎glutamine‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎proline‏ في الموضع ¢10 و(2) متخلف ‎glutamic‏ ‏0 مستبدل من أجل المتخلف ‎lysine‏ في الموضع 32؛ بحيث تكون المواضع 145 و322 0 هي 26 ولها ‎glycosylation‏ متصلة مع ‎N‏ مرتبطة؛ (5) عديد ببتيد يشمل ترتيب حمض أميني من عامل ‎VIE‏ به تعديلات ترتيب بالنسبة إلى ترتيب حمض أميني من تعريف الترتيب رقم: 16؛ حيث تتكون تعديلات الترتيب من (1) متخلف ‎glutamine‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎proline‏ في الموضع 10؛ )2( متخلف ‎glutamic‏ ‏0 مستبدل من أجل المتخلف ‎lysine‏ الموضع 32 )3( متخلف

‎glutamic acid‏ مستبدل من أجل المتخلف 8180106 في الموضع 34؛ (4) متخلف ‎glutamic acid‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎arginine‏ في الموضع 36؛ و(5) تعديل ترتيب بحيث تتمزق ‎glycosylation‏ المتصلة مع ‎N‏ عند الموضع 145؛ (6) عديد ببتيد يشمل ترتيب حمض أميني من عامل ‎VIE‏ به تعديلات ترتيب بالنسبة إلى ترتيب حمض أميني من تعريف الترتيب رقم: 16؛ حيث تتكون تعديلات الترتيب من (1) متخلف ‎glutamine‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎proline‏ في الموضع 10؛ )2( متخلف ‎glutamic‏ ‏0 مستبدل من أجل المتخلف ‎lysine‏ الموضع 32 )3( متخلف ‎glutamic acid‏ مستبدل من أجل المتخلف 8180106 في الموضع 34؛ (4) متخلف ‎glutamic acid‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎arginine‏ في الموضع 36؛ و(5) تعديل ترتيب 0 بحيث تتمزق ‎glycosylation‏ المتصلة مع ‎N‏ عند الموضع 322؛ (7) عديد ببتيد يشمل ترتيب حمض أميني من عامل ‎VIE‏ به تعديلات ترتيب بالنسبة إلى ترتيب حمض أميني من تعريف الترتيب رقم: 16؛ حيث تتكون تعديلات الترتيب من (1) متخلف ‎glutamine‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎proline‏ في الموضع 10؛ )2( متخلف ‎glutamic‏ ‏0 مستبدل من أجل المتخلف ‎lysine‏ الموضع 32 )3( متخلف ‎glutamic acid 5‏ مستبدل من أجل المتخلف 8180106 في الموضع 34؛ (4) متخلف ‎glutamic acid‏ مستبدل من أجل المتخلف 81900106 في الموضع 36؛ و(5) تعديلات ترتيب بحيث تتمزق ‎glycosylation‏ المتصلة مع ‎N‏ عند المواضع 145 و322؛ و (8) عديد ببتيد يشمل ترتيب حمض أميني من عامل ‎VIE‏ به تعديلات ترتيب بالنسبة إلى ترتيب حمض أميني من تعريف الترتيب رقم: 16؛ حيث تتكون تعديلات الترتيب من (1) متخلف ‎glutamine 0‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎proline‏ في الموضع 10؛ )2( متخلف ‎glutamic‏ ‏0 مستبدل من أجل المتخلف ‎lysine‏ الموضع 32 )3( متخلف ‎glutamic acid‏ مستبدل من أجل المتخلف 8180106 في الموضع 34؛ و(4) متخلف ‎glutamic acid‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎arginine‏ في الموضع 36؛ بحيث تكون المواضع 145 3225 هي ‎asparagine‏ ولها ‎glycosylation‏ متصلة مع ‎N‏ مرتبطة.

يوصف هنا أيضا عديد الببتيدات من العامل ‎VIE‏ له اقتران منخفض من ‎sialic acid‏ مع عديد ببتيد من العامل |١/ا.‏ في أمثلة خاصة؛ عديد الببتيد من العامل ‎VIE‏ هو عديد ببتيد مختلف ينتج نمط ‎glycosylation‏ مُعدّل. في الأمثلة الأخرى؛ يكون عديد الببتيد من العامل ‎VIE‏ هو عديد ببتيد من عامل ‎VII‏ من نوع بري الذي يقلل اقتران ‎sialic acid‏ في تجسيدات خاصة؛ يمكن أن يتحقق تقليل اقتران ‎silica acid‏ عن طريق معالجة عديد الببتيد مع إنزيم ‎-sialidase‏ في تجسيدات أخرى» يمكن أن يتحقق تقليل اقتران ‎silica acid‏ عن طريق إنتاج عديد الببتيدات من العامل ‎VIE‏ التخليقي في خط خلية الذي يكون ناقص ‎Wis‏ أو ‎WS‏ في ‎sialylation‏ الببتيدات. في تجسيدات إضافية؛ يمكن أن يتحقق تقليل اقتران ‎silica acid‏ عن طريق الإظهار المشترك لعديد الببتيد من العامل ‎VIE‏ التخليقي وإنزيم ‎sialidase‏ تخليقي أو خارجي المنشاً في خط خلية.

توصف أيضا طريقة لعلاج كائن ثديي لديه مرض أو اضطراب حيث يكون تشكيل جلطة دموية ‎cage ge‏ تشمل إعطاء كائن ثديي بحاجة لذلك كمية مؤثرة من عديد ببتيد العامل ‎VI‏ الذي له اقتران ‎sialic acid‏ منخفض. في تجسيدات خاصة؛ تكون نسبة جزيثات ‎sialic acid‏ المقترن إلى جزيئات ‎glycan‏ المتصل مع لا أقل من 0.05. في تجسيدات أخرى؛ يشمل عديد الببتيد من العامل ‎VIE‏ ترتيب حمض أميني من تعريف الترتيب رقم: 16. في تجسيدات أيضا يشمل عديد

5 الببتيد من العامل ‎VIE‏ عامل ‎VIE‏ من النوع البري. في تجسيدات إضافية؛ ينتقى المرض أو الاضطراب المراد معالجته من المجموعة المتكونة من النزيف الدموي؛ نزيف معدي معوي؛ نزيف غير متحكم ‎odd‏ نزيف في كائن ثديي يخضع لعملية ازدراع أو بتر أو جراحة؛ نزيف من الدوالي؛ نقص الصفائح الدموية؛ الناعور» نزيف دموي بالجمجمة؛ تمدد الأوعية الدموية بالأورطي؛ وخلال إعطاء مضاد للتخثر.

يتم الكشف أدناه بالتفصيل عن أشكال مختلفة؛ تركيبات» طرق ومنتجات وعمليات متعلقة بها إضافية. شرح مختصر للرسومات

الأشكال 1()-1(ح): توضح ترتيبات نيكلوتيد من أجل ثلاثة جزيئات من العامل ‎VIE‏ ‏المستخدمة في الطلب الحالي. ”7/1“ هو شكل مختلف لعامل ‎VIE‏ آدمي به أربع طفرات حمض

— 2 1 — أميني بالنسبة إلى ترتيب الحمض الأميني الآدمي من النوع البري من تعريف الترتيب رقم: 116 ‎"V2" L(V253N 5 110611 (K32E (P10Q)‏ هو شكل مختلف لعامل ‎VIE‏ = به ست طفرات حمض أميني بالنسبة إلى ترتيب الحمض الأميني الآدمي من النوع البري من تعريف الترتيب رقم: 16: ‎(R36E (A34E (K32E (P10Q)‏ 11061 ولا253/). يوضح شكل 1 أيضا ترتيبات نيكلوتيد من أجل بنيات متنوعة مستخدمة فى الأمثلة. شكل 2: يوضح ترتيبات حمض أميني من أجل ثلاثة جزيئات من العامل ‎VIE‏ المستخدمة في الطلب الحالي. يكون العامل ‎VIE‏ الأدمي من النوع البري حسب الاستخدام هنا له ترتيب حمض أميني من تعريف الترتيب رقم: 16. 1/ له ترتيب الحمض ‎١‏ لأميني من تعريف الترتيب رقم: ‎AT‏ ‎V2‏ له ترتيب الحمض الأميني من تعريف الترتيب رقم: 18. في ‎V2 5 ١/1‏ توضح تغيرات 0 العامل ‎VIE‏ من النوع البري من تعريف الترتيب رقم: 16 بالخط العريض. شكل 3: هو مخطط يصور ثلاثة جزيئات للعامل ‎VIE‏ المستخدمة فى الأمثلة من الطلب الحالي. يتضح ارتباط ‎glycans‏ عند مواقع ‎.N—glycosylation‏ من أجل تصوير ‎«glycans‏ ‎Jia‏ المريع المصمت ‎Jia «N-acetylglucosamine‏ الشكل البيضاوي المظلل ‎(mannose‏ ‏يمثل الشكل البيضاوي المفتوح ‎(galactose‏ يمثل الشكل المعين القاتم ‎sialic acid‏ (معروف 5 أيضا على أنه ‎(N-acetylneuraminic acid‏ ويمثل المثلث المغلق ‎fucose‏ يكون البناء ‎glycan‏ هو تصوير باستخدام شكل مختلف ممكن لأجل ‎glycan‏ ولا يُمثل ‎glycan‏ مُقاس فعليا. شكل 4: هو مخطط يصور ‎glycan‏ متصل مع ‎N‏ يوضح الارتباط عند 8517 في ترتيب التوافق ‎JAsn—-X-Ser/Thr‏ يتم توضيح الأب ‎Man3(GIcNAc)2‏ مع ‎monosaccharides‏ ‏0 متنوعة متضمنة ‎sialic acids‏ الطرفية. الأشكال المختلفة للعامل ‎VIE‏ المتمثلة بالإشارة إلى 2/. شكل 6: هو جدول لجزيئات العامل ‎VIE‏ ذات ‎glycosylation‏ منخفضة.

— 3 1 — شكل 17 يوضح نتائج طريقة ‎LC-MS‏ لتعيين ‎sialic acid‏ المتبقي على السلسلة الثقيلة من 2/ بعد إزالة ‎sialylation‏ طبقا لشروط التجرية. شكل 8: يوضح تحليل إزالة ‎sialylated V2‏ من أجل محتوى ‎sialic acid‏ شكل 9: يوضح نتائج اختبار تنشيط ‎FX‏ ليبيد فوسفوري . شكل 10: يوضح نتائج اختبار ‎PL-TGA‏ على بروتينات مُزالة ‎sialylated‏ ‏شكل 11: يوضح إظهار أشكال مختلفة من عامل ‎VII‏ ذات ‎glycosylation‏ منخفضة. شكل 12: هو جدول يوضح تحديد 'النشاط الخاص ‎"(specific activity)‏ لأشكال مختلفة ‎FVII‏ ذات ‎Jif glycosylation‏ باستخدام مواد طافية لاستقبال حامل الجين من العائل. شكل 13: يوضح نتائج اختبار ‎PL-TGA‏ على شكل مختلف 01/018121 ذو ‎glycosylation 10‏ منخفضة منقى. شكل 14: يوضح تصفية خلية كبدية في المعمل لأجل 2/ مُزال ‎sialylated‏ مقارنة مع عامل ‎VI‏ من نوع بري. شكل 15: يوضح نتائج تصفية خلية كبدية في المعمل مع الأشكال المختلفة من العامل ‎VII‏ لا تُظهر الأشكال المختلفة ذات ‎glycosylation‏ المنخفضة زيادة فى التصفية فى هذا 5 النموذج. تقترح هذه النتيجة آلية تصفية مختلفة من أجل هذه الجزيئات من المستخدم عن طريق 2 مزال ‎sialylated‏ ‏شكل 16: يوضح نتائج دراسة دوائية حركية في جرذ. تكون أعمار نصف 2/ مُزال ‎sialylated‏ و1/ مُزال ‎sialylated‏ أقصر ‎Lissa‏ من الجزيئات الأصلية غير المُعدّلة الخاصة بها في جرذان ‎Sprague Dawley‏ كما هى مقاسة عن طريق تحليل ‎MIE Jala ELISA‏ شكل 17: يوضح نتائج دراسة دوائية حركية في فئران ‎HemA‏ ‏شكل 18: يوضح دراسة فعالية ‎V2‏ مُزال ‎sialylated‏ في فتران ‎HemA‏

— 1 4-

شكل 19: يوضح دراسة فعالية ‎V2‏ مُزال ‎sialylated‏ في نموذج ‎HemA‏ 11/1 .

شكل 20: يوضح نتائج توليد ‎alas —thrombin‏ (1/17 “)111000510 في ‎Ob‏ ‎HemA‏ مع ‎V2‏ مُزال ‎sialylated‏ مقارنة مع العامل ‎ME‏

شكل 21: يوضح دراسة فعالية ‎V2‏ مُزال ‎sialylated‏ في فئران تخثر- مكون.

شكل 22: يوضح تصفية خلية كبدية في المعمل لعامل ‎VII‏ من نوع بري مُزال sialic acid ‏من نوع بري به تخثر طبيعي من‎ VI ‏مقارنة مع عامل‎ )01//1 Vila) sialylated

شكل 23 . يوضح نتائج دراسة قطع ذيل في فثران مصروعة بعامل النسيج ا = ‎(TFKI)‏ من أجل ‎dWT Vila‏ مقارنة مع عامل ‎VII‏ من نوع بري. وجد أن عامل ‎VII‏ مُزال 40 أكثر فعالية بشكل ملحوظ من عامل ‎VIE‏ من نوع بري.

شكل 24: يوضح نتائج تحليل ‎ELISA‏ لمعقدات ‎Thrombin‏ مضاد ‎Thrombin‏

‎(TAT)‏ بعد إعطاء سواء 1/118 ‎WT‏ أو عامل ‎VIL‏ من نوع بري.

‏شكل 25: يوضح نتائج تشكيل جلطة ‎(thrombus)‏ في نموذج جلطة 6013. الجرعة المعطاة من ‎AWT Vila‏ تنتج تشكيل خثرة منخفض بدرجة كبيرة مقارنة مع عامل ‎VII‏ من نوع بري.

‏15 شكل 26: يوضح انجذابات الارتباط الواضحة لأجل ‎Vila‏ 01//1 وعامل ‎VIE‏ من نوع

‏بري من أجل عامل نسيج قابل للذويان كما هي مقاسة عن طريق طبقة تحتية مولدة للفلور.

‏شكل 27: يوضح تحويل العامل ‎JX‏ العامل ‎Xa‏ عن طريق معقد من عامل نسيج قابل للذويان وسواء ‎Vila‏ 01//1 أو العامل ‎VIE‏ من النوع البري. الوصف التفصيلي: بري أو شكل مختلف) للحد من مضاعفات الجلطة في معالجة نزيف حاد. ‎Lad‏ يتم وصف عديد ببتيدات من عامل ‎VIE‏ مع اقتران ‎sialic acid‏ منخفض. يتم إضافيا وصف أشكال مختلفة من

عامل ‎VI‏ تخليقي مع تصفية مُحسّنة من الدم وخفض 5558 الفعالية. يكون لهذه الأشكال المختلفة عمر نصف أقصر في الجسم الحي من العامل ‎VII‏ من النوع البري التخليقي»؛ نظرا لأنماط 0007 المُعدلة. أيضا يتم وصف طرق إنتاج واستخدام عديد ببتيدات من عامل ‎VIE‏ ‏قصيرة التأثير. لتوضيح العامل ‎(glycosylation 5 VII‏ تتوافر الأشكال 3 و4. يوضح شكل 3 تخطيطيا ثلاثة أمثلة على جزيئات العامل ‎VIE‏ مجالات سيطرة خاصة بها. العامل ‎VIE‏ هو بروتين متكون من ‎(EGF (Gla‏ ومجال سيطرة حفزي ومتكون من 2 ‎Glycans‏ متصلين ‎N145) N‏ و81322). يكون ‎VI‏ هو شكل مختلف لعامل ‎VII‏ به أريع طفرات ‎(K32E (P10Q)‏ 110611 ‎(V253N‏ يكون ‎V2‏ هو شكل مختلف ‎VII dala‏ به ست طفرات ‎A343 32 P10Q)‏ ‎(R36E 0‏ !11061 1/25311). يكون لكل من ‎V2 3 VI‏ انجذابية زائدة لصفائح دموية مُنشطة ويحتويان على اثنين من مواقع ‎N-glycosylation‏ إضافية ينتج عنهما أعمار نصف أطول مقارنة مع العامل ‎VI‏ من نوع بري. يعتقد أنه يؤخذ في الاعتبار الطفرتين الموجودتين بمفردهما في ‎(A34E, R36E) 2‏ من أجل استقلاله عن النسيج- العامل. يوضح شكل 4 تخطيطيا مثال على ‎glycan‏ متصل مع ‎N‏ يوضح الارتباط عند ‎ASN‏ في 5 ترتيب التوافق ‎Asn-X-Ser/Thr‏ يتم توضيح الأب ‎Man3(GleNac)2‏ مع ‎Monosaccharides‏ متنوعة متضمنة ‎sialic acids‏ طرفية. تتوافر هنا طرق تحضير عديد ببتيد من عامل ‎gee AVI‏ نصف قصير مرغوب. يتوافر هنا اثنان من الطرق العامة لتصنيع عديد ببتيد من عامل ‎VIE‏ قصير التأثير؛ يمكن أن تستخدم هذه الطرق بصورة منفصلة أو في اتحاد. كما هو موضح تخطيطيا في شكل 5 باستخدام مثال واحد لشكل مختلف من عامل ‎VI‏ يمكن معالجة شكل مختلف من عامل ‎VII‏ ذو ‎glycosylation‏ عن طريق إزالة ‎sialylation‏ أو إزالة ‎glycosylation‏ لتعديل نمط ‎glycosylation‏ للشكل المختلف وبالتالي تعديل؛ ويفضل تقصير؛ عمر ‎Chall‏ الخاص به. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة من أجل ‎sialylate all)‏ من عديد ببتيد لعامل ‎VIE‏ من نوع بري.

قد تحدث إزالة 581/8100 بواسطة أي طريقة معروفة في الفن. تتضمن أمثلة على طرق مناسبة إزالة ‎sialylation‏ إنزيمية بالاتصال مع أي إنزيم معروف الذي يعمل على ‎sialylate allyl‏ متضمن؛ بدون تحديد» ‎sialidases‏ تتضمن خرزات ‎(Sigma neuraminidase-agarose‏ ‎N5254)‏ ويتحدد ‎neuraminidase‏ من ‎Clostridium perfringens‏ عند ‎G1:40479‏ وفي: ‎FEBS Lett. 238 (1), 31-34 (1988). 5‏

قد تتحقق ‎sialylation ally]‏ عن طريق اتصال عديد ببتيد من عامل ‎VIE‏ تخليقي منقى جزئيا مع 6 في المعمل تحت شروط مناسبة»؛ أو عن طريق الإظهار المشترك لأجل ‎sialidase‏ ‏في خلية العائل التي تُظهر عديد ببتيد لعامل ‎VIE‏ التخليقي. قد يكون للاتصال في المعمل فترة يحدث فيها إزالة ‎sialylation‏ جزئية فقط. على سبيل المثال؛ عند الحصول على عمر نصف

0 مرغوب من جزيء جرامي له نسبة من 0.5 إلى 1 جزيء ‎sialic acid‏ مقترن إلى جزيئات 7 متصل مع لا في تركيبة عديد الببتيدات من العامل ‎VIE‏ عندئذ يوصى بالاتصال مع ‎sialidase‏ لفترة زمنية محددة قبل حدوث إزالة ‎sialylation‏ كاملة. يمكن ‎Lad‏ الحصول على ‎sialylation a)‏ جزئية باستخدام ‎(Jia sialidase‏ عن طريق اتصال عديد ببتيد من العامل ‎VI‏ مع ‎sialidase‏ تحت شروط تبطيء أو تضعف الوظيفة الكاملة لأجل ‎«sialidase‏ أو

بواسطة طرق أخرى واضحة لهؤلاء المهرة في الفن لإنتاج عديد ببتيدات مُزالة ‎sialylation‏ جزثيا. قد تقاس ‎sialylation all)‏ جزئية مقارنة مع نسبة ‎sialic acid‏ المقترن مع ‎glycan‏ في مستحضر مرجعي ذو إزالة ‎sialylation‏ بالكامل.

قد تتحقق أيضا إزالة ‎sialylation‏ من خلال إظهار عديد ببتيد من العامل ‎VII‏ (نوع بري

أو شكل مختلف) في خط خلية يفتقر أو ينقصه واحد أو أكثر من المكونات الخلوية المطلوبة

لإضافة ‎acid‏ 16ل5:8. تم أو قد يتم تعديل خطوط خلايا محددة لتقليل أو إزالة ‎.sialylation‏ على سبيل المثال؛ فإن خلايا 1662 مع أصل مبيض هامستر صيني ‎(Chinese hamster ovary)‏ ‎(“CHO”)‏ تنتج بروتينات سكربة لها تقريبا عشر أضعاف ‎sialic acid‏ أقل من الخلية من النوع البري. يعتقد أن إزالة 518/1800 من 9/080 ينتج عنها جزيء جرامي يمكن تصفيته بصورة نشطة عن طريق مستقبلات كبد متضمنة مستقبل بروتين سكري ‎Asialo‏

‎(ASGPR) (Asialoglycoprotein Receptor) 5‏ ولهذا السبب فإنه ‎jee pall‏ النصف.

الطريقة الثانية هي إزالة ‎glycosylate‏ لشكل مختلف من عامل ‎VII‏ وبالتالي الحصول على جزيء جرامي له ‎jee‏ نصف قصير. خفض ‎glycosylation‏ يُحسّن من تصفية العامل ‎VIE‏ ‏من خلال تصفية كلوية (القطع 60-50 كيلو دالتون؛ راجع: ‎Caliceti P and Veronese FM, “Pharmacokinetic and biodistribution‏ ‎properties of poly(ethylene glycol)—protein conjugates,” Adv Drug Deliv. 5‏ ‎Rev. 2003;55(10):1261-77, Weinstein T et al., “Distribution of‏ ‎glycosaminoglycans in rat renal tubular epithelium,” J Am Soc Nephrol.‏ ‎Choi HS et al., “Renal clearance of quantum dots,”‏ ,1997:8(4):586-95 ‎Nat Biotechnol. 2007;25(10):1165-70),‏ 0 التغير في شحنة السطح ونقطة تساوي الكهربية ‎(pl) (isoelectric point)‏ (المتعلق بزيادة تدوير البروتين السكري؛ انظر المرجع: ‎Byrne 8. et al., “Sialic acids: carbohydrate moieties that influence the‏ ‎biological and physical properties of biopharmaceutical proteins and living‏ ‎cells,” Drug Discovery Today 2007;12(7-8):319),‏ ومن خلال حماية يسببها بصورة غير مباشرة بروتين سكري أقل من أي عدد من ‎proteases‏ ‏البلازما: (2006 ‎.(Ton G., et al., 2005, Nie Y et al.,‏ تتضمن إزالة ‎glycosylation‏ حسب الاستخدام هناء بدون تحديد؛ تعديل جيني لعديد ببتيد من عامل ‎VIE‏ الذي ينتج ‎die‏ ترتيب حمض أميني متغير مقارنة مع عديد ببتيد من عامل ‎VIE‏ ‏مرجعي؛ هذا التغيير يُزيل موقع ‎glycosylation‏ متصل مع لا. على سبيل المثال» يمكن ‎zl‏ ‏0 شكل مختلف من عامل ‎VIE‏ مع تغيير تمزق ‎glycosylation‏ عند واحد أو أكثر من متخلفات الحمض الأميني المطلوية من أجل ترتيب التوافق ‎glycan‏ المتصل مع ‎N‏ أي؛ -2(-0قم8/ ‎Jia X Cus Ser/Thr‏ أي حمض أميني باستثناء ‎proline‏ حسب الاستخدام هنا يشير "تغيير تمزق ‎alteration) glycosylation‏ 7005/18101-015000109ا9)" لترتيب حمض أميني بعامل ‎VII‏ إلى تغيير بالنسبة إلى عامل ‎VII‏ من نوع بري الذي يؤدي إلى استبدال» إضافة؛ أو

حذف واحد أو أكثر من متخلفات الحمض الأميني والذي يؤدي إلى فقد واحد أو أكثر من مواقع 07 متصلة مع ‎WN‏ على سبيل المثال؛ قد تُزال مواقع ‎glycosylation‏ المتصلة مع ‎N‏ عن طريق استبدال ‎N145‏ و/أو 01322 يقدم كل منهما عامل ‎VII‏ من نوع بري؛ مع أي حمض أميني (طبيعي الوجود أو غير طبيعي الوجود). يجب أن تتحدد مواقع ‎glycosylation‏ ‏5 بحيث يكون لها أدنى تأثير على النشاط عند التغيير لتمزق 7005/18100ا9. في مثال آخر؛ قد تجرى إزالة ‎glycosylation‏ عن طريق إظهار عديد ببتيد من العامل ‎VIE‏ (نوع بري أو شكل مختلف) في خط خلية تنقصه الآلية من أجل ‎glycosylation‏ على سبيل المثال؛ من المتوقع أن العامل ‎VII‏ الناتج في خلايا بكتيرية لا يجرى له ‎glycosylation‏ بالكامل لأن الخلايا البكتيرية تنقصها الآلية الخلوية من أجل ‎glycosylation‏ في تجسيد ‎AT‏ ينتج عديد الببتيد من العامل 0 ١لا‏ في خط خلية تنقصه إنزيمات ‎glycosylation‏ طرفية أو يكون له هذه الإنزيمات لكن يكون لواحد أو أكثر نشاط أقل من الموجود في خط خلية من النوع البري. انظرء على سبيل المثال: ‎Appa R. et al., 201, Narita M et al., 1998, Seested et al., 2010.‏ في تجسيد ‎AT‏ ¢ ينتج عديد ببتيد من العامل ‎VIE‏ في خط خلية تضم عيب في إنزيم مشترك في تخليق أو ارتباط ‎glycan‏ مع عامل ‎VII‏ أو عامل في إنزيم مشترك في تخليق ناقل ‎.CMP-sialic 800 5‏ في تجسيد آخرء يُعالج عديد الببتيد من العامل ‎VIE‏ مع إزالة ‎glycosylase‏ أو مواد كيميائية لإزائة ‎.glycosylate‏ ‏قد تحدث المعالجة عن طريق ‎«sialidase‏ إزالة ‎(glycosylase‏ او مواد كيميائية لتقليل أو ‎glycans ally)‏ من عديد ببتيد من العامل ‎VII‏ أثناء إظهار؛ تنقية؛ أو تتقية لاحقة. في تجسيد واحد» يُزال بصورة انتقائية واحد على الأقل من مواقع ‎glycosylation‏ متصلة مع لا في الشكل المختلف ‎VI‏ من العامل ‎(N322, N145) VIE‏ أو الشكل المختلف ‎V2‏ من العامل ‎(N322, N145, N106, N253) VII‏ بأدنى تأثير على النشاط. يُزال الموقع ‎N=‏ ‏0 عند مستوى ‎DNA‏ عن طريق تمزق ترتيب التوافق 680/اا9-ل1. يجرى هذا عن طريق إزالة الكودون ‎(Asparagine) N‏ واستبداله مع الكودون ‎(Glutamine) Q‏ شكل 6 هو جدول يوضح أمثلة على أشكال مختلفة ذات ‎glycosylation‏ منخفضة. تكون الأشكال المختلفة ذات

‎le glycosylation‏ هياكل العامل ‎VIE‏ من نوع بري (يشار إليها هنا على أنها ‎M1 (FT‏ و1/2. تتم ‎sale)‏ مواقع ‎N-Glycan‏ المعدلة هندسيا ‎(N106, N253)‏ في ‎V1‏ و2/ مرة أخرى إلى ترتيب من نوع بري خاص بها ‎V253)‏ ,1106). تكون الأشكال المختلفة ‎(pMB117 pMB113‏ و 01/8121 هي بنيات عامل ‎VD VI‏ و2/ من نوع بري محتوية على التوالي على موقعين ‎N-glycosylation‏ ‏داخليين المنشاً ‎(N145, N322)‏ يكون لكل الأشكال الأخرى المختلفة في الشكل 6 واحد أو كل من مواقع ‎N-glycan‏ داخلية ‎Lid)‏ الخاصة بها المُزالة عن طريق إدخال الطفرات لا إلى © ‎.(N145Q, N322Q)‏ ينتج عن طريقة ‎glycosylation aly)‏ تصفية أسرع. في جانب واحد من الكشف الحالي» تتحد ‎glycosylation ally]‏ وإزالة ‎sialylation‏ لتؤدي إلى عديد ببتيدات من العامل ‎VIE‏ لها أعمار نصف قصيرة مرغوية. على سبيل ‎Jal)‏ يمكن تعديل الجزيء الجرامي للعامل ‎VIE‏ تعديلا هندسيا ليتضمن مواقع ‎glycosylation‏ متصلة مع ‎N‏ ‏إضافية وراء الاثنين الموجودين في العامل ‎VIE‏ من النوع البري. بعدئذ يمكن إزالة ‎sialylation‏ ‏للشكل المختلف باستخدام واحدة من الطرق الموصوفة هنا. بعدئذ يمكن أن يحافظ الجزيء الجرامي 5 الناتج على بناء ‎glycan‏ عند كل موقع ‎glycosylation‏ متصل مع ‎N‏ بدون ‎sialic acid‏ الطرفي. في التجارب المذكورة هناء يذكر أصحاب الطلب أن هذه الأشكال المختلفة لها زمن إزالة أسرع من شكل مختلف لعامل ‎VII‏ مُزال ‎sialylated‏ مشابه له مواقع ‎glycosylation‏ متصلة مع ‎N‏ أقل. بصورة مماثلة؛ قد تجرى إزالة ‎glycosylation‏ على عديد ببتيد للعامل ‎VII‏ الذي له فقط موقعين ‎glycosylation‏ متصلين لا الموجودين في العامل ‎VII‏ من النوع البري عند واحد من هذه 0 المواقع ويعدئذ يخضع إلى إزالة 5817/18100. يكون للشكل المختلف من العامل ‎VIE‏ الناتج 07 متصل مع ‎N‏ واحد ينقصه ‎sialic acid‏ حركيات دوائية مختلفة عن عديد الببتيد من العامل ‎VII‏ المماثل الذي لا ينقصه موقع ‎glycosylation‏ متصل مع لا ثان اعتمادا على الدليل التجريبي المقرر هنا. التعريفات والتجسيدات

ما لم يحدد بخلاف ذلك؛ يكون لكل المصطلحات التقنية والعلمية المستخدمة عموما هنا نفس المعنى كما هو مفهوم بصورة شائعة عن طريق أحد المهرة العاديين في الفن الذي ينتمي إليه هذا الكشف. بصفة عامة؛ تكون التسمية المستخدمة هنا والإجراءات المعملية في مزرعة الخلية؛ وحلوم ‎dsl‏ الجزبئية؛ الكيمياء العضوية؛ وكيمياء الحمض النووي والتهجين هي المعروفة جيدا والمستخدمة بصورة شائعة في الفن. تستخدم التقنيات القياسية من أجل تخليق الحمض النووي وعديد الببتيد. تكون التسمية المستخدمة هنا والإجراءات المعملية في الكيمياء التحليلية والتخليق العضوي الموصوفين أدناه معروفة جيدا والمستخدمة بصورة شائعة في الفن. تستخدم التقنيات القياسية» أو تعديلات منهاء من أجل التخليقات الكيميائية والتحليلات الكيميائية. الإجراءات المستخدمة من أجل المعالجة الهندسية الوراثية معروفة جيدا ويمكن العثور ‎cle‏ على سبيل 0 المثالء في: ‎Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring‏ ‎Harbor, N.Y.‏ يشير المصطلح ‎“sialic acid”‏ أو ‎“sialyl”‏ إلى أي عضو من عائلة سكريات 0 بها تسع ذرات كريون. العضو الأكثر شيوعا من العائلة ‎sialic acid‏ هو ‎N-‏ ‎2-keto-5-acetamido-3,5-dideoxy-D—-glycero-D-) acetyl-neuraminic acid 5‏ ‎galactononulopyranos—-1-onic acid‏ (غالبا مختصر على أنه ‎NeuAc «(NeuSAc‏ أو خلاطاا)). تستخدم المصطلحات "عديد ببتيد ‎"(polypeptide)‏ و'بروتين ‎"(protein)‏ بصورة قابلة للتبادل وتشير إلى بوليمر ‎Cua (polymer)‏ تكون المونومرات ‎(monomers)‏ هي أحماض 0 أمينية ومتصلة معا خلال روابط ‎amide‏ بصورة إضافية؛ تتضمن أيضا الأحماض الأمينية غير الطبيعية؛ على سبيل المثال» ‎(phenylglycine «B-alanine‏ و ‎.homoarginine‏ يمكن أيضا استخدام الأحماض الأمينية غير مشفرة الجين مع التقنية المعلن عنها هنا. علاوة على ذلك؛ يمكن ‎Lad‏ استخدام الأحماض الأمينية التي تم تعديلها لتتضمن المجموعات التفاعلية؛ مواقع 007 بوليمرات؛ أجزاء علاجية؛ جزيئات حيوية؛ إلخ. يمكن أيضا أن تكون كل من 5 الأحماض الأمينية المستخدمة هنا سواء أيزومر 00 أو ا. يفضل عموما الأيزومر !. حسب

الاستخدام ‎cba‏ يشير "عديد ببتيد ‎(polypeptide)‏ و'بروتين ‎(protein)‏ إلى عديد ببتيدات وبروتينات ‎glycosylated‏ وغير ‎«glycosylated‏ على التوالي. يشير المصطلح "حمض أميني ‎acid)‏ 800100)" إلى أحماض أمينية طبيعية الوجود وتخليقية؛ بالإضافة إلى ممائلات حمض أميني ومحاكيات حمض أميني التي تعمل بطريقة مماثة للأحماض الأمينية طبيعية الوجود. الأحماض الأمينية طبيعية الوجود هي المشفرة عن طريق الكود الجيني؛ بالإضافة إلى الأحماض الأمينية المُعدّلة لاحقاء على سبيل المثال؛ ‎.O-phosphoserine 5 cy—carboxyglutamate hydroxyproline‏ تشير 'مماثلات الحمض الأميني ‎"(amino acid analogs)‏ إلى المركبات التي لها نفس البناء الكيميائي القاعدي كحمض أميني طبيعي الوجود؛ أي؛ كريون » المرتبط مع هيدروجين؛ مجموعة ‎carboxyl 0‏ مجموعة ‎<@MINO‏ ومجموعة ‎<homoserine Mic (R‏ 10116116176 ‎.methionine methyl sulfonium (methionine sulfoxide‏ يكون لهذه المماثلات مجموعات ‎R‏ مُعدّلة (مثلا ‎(norleucine‏ أو هياكل ببتيد مُعدّلة؛ لكن تحافظ على نفس البناء الكيميائي القاعدي كحمض أميني طبيعي الوجود. تشير 'محاكيات حمض أميني ‎acid‏ 80100) ‎'Mimetics)‏ إلى مركبات كيميائية لها بناء مختلف عن البناء الكيميائي العام لحمض أميني؛ 5 لكنها تعمل بطريقة مماثلة لحمض أميني طبيعي الوجود. يتحدد المصطلح ‎jee!‏ النصف ‎(half-life)‏ أو 11/27“ حسب الاستخدام هنا في سياق إعطاء عقار عديد ببتيد أو بروتين إلى مريض؛ على أنه الزمن المطلوب من أجل تركيز بلازما من عقار في مريض ليقل بمقدار النصف. يمكن أن يتحدد عمر النصف في حيوانات الاختبار» على سبيل المثال» عن طريق إعطاء 0 جرعة من ‎Joa‏ 250-25 ميكروجرام/ كجم من المستحضر؛ الحصول على عينات بلازما عند أزمنة محددة مسبقا بعد الإعطاء؛ وتحديد محتوى عديد الببتيد بالعامل ‎VIE‏ في العينات باستخدام واحد أو أكثر من اختبار التجلط (أو أي اختبار حيوي)؛ اختبار مناعي؛ أو مكافيء. يمكن أيضا توضيح البيانات بشكل بياني ويعدئذ تتحدد الإتاحة الحيوية على أنها المساحة تحت المنحنى. في الأمثلة الخاصة»؛ تستخدم نماذج جرذ أو ‎Jl‏ من أجل قياسات عمر النصف. تشير الإتاحة الحيوية 5 النسبية لعديد الببتيد من العامل ‎VIE‏ أو تركيبة منه إلى نسبة المساحة تحت منحنى عديد الببتيد

من العامل ‎VIE‏ قصير التأثير إلى العامل ‎VIE‏ من النوع البري أو عديد ببتيد أو بروتين مقارن مناسب آخر. يكون أي شكل متغاير من العامل ‎VIE‏ له نشاط تخثر دم من العامل ‎VIE‏ ‏مفيد للأغراض والطرق الموصوفة هنا. تكون الأشكال المختلفة للعامل ‎VII‏ حسب الاستخدام هنا هي عديد ببتيدات. تستخدم هنا بصورة قابلة للتبادل المصطلحات ‎ae”‏ ببتيدات من عامل ١لا‏ للشكل المختلف ‎"(variant Factor VII polypeptides)‏ و"أشكال مختلفة للعامل ‎VII‏ ‎"(Factor VII variants)‏ في تجسيد واحد؛ يكون للأشكال المختلفة من العامل ‎VIE‏ ترتيب حمض أميني مشتق من العامل ‎VIE‏ من النوع البري (تعريف الترتيب رقم: 16( عن طريق استبدال» ‎cada‏ و/أو إقحام واحد أو أكثر من الأحماض الأمينية. في تعيين استبدالات الحمض الأميني؛ يمثل الحرف الأول الحمض الأميني الموجود في عامل ‎VII‏ آدمي من النوع البري عند 0 موضع. يمثل الرقم التالي الموضع في العامل ‎FVII‏ من النوع البري الآدمي. يمثل الحرف الثاني الحمض الأميني باستبدال الحمض الأميني الموجود في النوع البري. على سبيل المثال؛ يمثل ‎“P10Q7‏ استبدال (©) ‎glutamine‏ من أجل ‎proline (P)‏ عند موضع الحمض الأميني 10. في أمثلة خاصة؛ يشمل الشكل المختلف للعامل ‎VIE‏ واحد أو أكثر من استبدالات الحمض الأميني المنتقاة من المجموعة المتكونة من ‎(A34E (R36E K32E P10Q‏ !11061 5 ول2538/. في أمثلة أخرى؛ يشمل الشكل المختلف للعامل ‎VII‏ على الأقل 2 3؛ 4؛ 5؛ أو 6 من هذه الاستبدالات. في أمثلة إضافية؛ يشمل الشكل المختلف للعامل ‎VIE‏ ترتيب حمض أميني له اثنين على الأقل من تغييرات الترتيب بالنسبة إلى ترتيب الحمض الأميني من تعريف الترتيب رقم: 6 (عامل ‎VII‏ آدمي من النوع البري)؛ حيث يكون اثنان على الأقل تغييرات الترتيب هما )1( متخلف ‎glutamine‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎proline‏ في الموضع 10؛ و(2) متخلف ‎glutamic acid 0‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎lysine‏ في الموضع 32. في مثال ‎AT‏ يشمل الشكل المختلف للعامل ‎VIE‏ ترتيب حمض أميني له على الأقل ثلاثة تغييرات ترتيب بالنسبة إلى ترتيب الحمض الأميني من تعريف الترتيب رقم: 16؛ حيث تكون تغييرات الترتيب الثلاثة على الأقل هم )1( متخلف ‎glutamine‏ مستبدل من أجل المتخلف 000108 في الموضع 10< (2) متخلف ‎glutamic acid‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎lysine‏ في الموضع 32؛ و(3) متخلف ‎glutamic acid 5‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎arginine‏ في الموضع 36. في مثال إضافي؛

يشمل الشكل المختلف للعامل ‎VII‏ ترتيب حمض أميني له على الأقل أربعة تغييرات ترتيب بالنسبة إلى ترتيب الحمض الأميني من تعريف الترتيب رقم: 16( حيث تكون تغييرات الترتيب الأربعة على الأقل هم )1( متخلف ‎glutamine‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎proline‏ في الموضع 10؛ )2( متخلف ‎glutamic acid‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎lysine‏ في الموضع 32؛ (3) متخلف ‎glutamic acid 5‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎arginine‏ الموضع 36؛ و(4) متخلف ‎glutamic acid‏ مستبدل من أجل المتخلف 8180106 في الموضع 34. في مثال واحد؛ يشمل الشكل المختلف للعامل ‎VIE‏ ترتيب حمض أميني له على الأقل ستة تغييرات ترتيب بالنسبة إلى ترتيب الحمض الأميني من تعريف الترتيب رقم: 16( حيث تكون تغييرات الترتيب الستة على الأقل هم )1( متخلف ‎glutamine‏ مستبدل من أجل المتخلف 000108 في الموضع 10< (2) 0 متخلف ‎glutamic acid‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎lysine‏ في الموضع 32 (3) متخلف ‎glutamic acid‏ مستبدل من أجل المتخلف 8910106 في الموضع 36 )4( متخلف ‎glutamic acid‏ مستبدل من أجل المتخلف 8180106 في الموضع 34؛ (5) متخلف 6 مستبدل من أجل المتخلف ‎threonine‏ في الموضع 106 و(6) متخلف ‎asparagine‏ مستبدل من أجل المتخلف ‎valine‏ في الموضع 253. في ‎JB‏ خاص آخرء يشمل الشكل المختلف للعامل ‎VIE‏ الستة تغييرات فقط. تم العثور على تفصيل أكثر عن هذه الأشكال المختلفة في الطلب الدولي رقم: 200158935 إلى ‎sels (Maxygen‏ الاختراع الأمريكية رقم: 7371543 إلى ‎Pedersen‏ وأخرين؛ يندمج كل منهما كمرجع بأكمله هنا. يمكن تعيين الأشكال المختلفة للعامل ‎VII‏ الموصوفة هنا باستخدام أي عديد ببتيد للعامل ‎VI‏ وظيفي كعديد ببتيد باديء. في تجسيدات خاصة؛ يكون عديد الببتيد للعامل ‎VIE‏ هو عديد 0 ببتيد لعامل ‎VII‏ آدمي. في تجسيدات إضافية؛ يكون عديد الببتيد للعامل ‎VIE‏ هو عديد الببتيد للعامل ‎VI‏ الآدمي من تعريف الترتيب رقم: 16؛ أو شكل مُعدّل أو شكل مختلف ‎allelic‏ منه. عديد الببتيدات البادئة المفيدة يتضمن أيضا عديد الببتيدات للعامل ‎VIE‏ المُعدّل أو المختلف المشتمل على ترتيب حمض أميني له تطابق على ‎JN‏ 799 798 297 796 95 4 3و9 92/¢ او 0و9 وق 88./« لق مقن دقن فقن 83./« 2ق 5 781 0ق 79 78ت ‎JT4 JTS JT6 JT‏ 73 72 71 70 069

8 267؛ أو 766 مع ترتيب عامل ‎VII‏ آدمي من النوع البري (تعريف الترتيب رقم: 16) الذي يكون له أيضا نشاط العامل ‎VII‏ إضافيا؛ في الأمثلة الخاصة؛ يتضمن عديد الببتيدات للعامل ‎VIE‏ المختلف من الكشف الحالي أي عديد ببتيد له تطابق على الأقل حوالي 799 798؛ 7 96 5و 4و 93 2و اوت 90د 89 88 387 6ق8ك 385

4ق 83 2ق لق 80 ‎JT2 1713 14 1715 76 171 718 LT‏ 1» 710 269 7268 767 أو 266 مع ترتيب من تعريف الترتيب رقم: 16 الذي يكون له وظيفية العامل ‎VIE‏ ويحتوي ‎Load‏ على واحد أو أكثر من تغييرات الحمض الأميني المناقشة هنا بالنسبة إلى تعريف الترتيب رقم: 16. في تجسيد آخر؛ يشمل عديد الببتيد من العامل ‎VIE‏ ترتيب حمض أميني له تجانس أكثر من 799 98 ‎JIT‏ 196« 95 94 93 92 291

0 490 189 88 87 86ل 85 84/« 383 782« 1ق 80 179 718ل 17 6 15 14 3713 72 71 70 69 168 267 أو 766 مع تعريف الترتيب رقم: 16 وله نشاط عامل ‎VI‏ وله أيضا واحد أو أكثر من تغييرات الحمض الأميني المشار إليها هنا.

تتضمن أيضا الأشكال المختلفة للعامل ‎VIE‏ حسب الاستخدام هنا أشكال مختلفة

‎glycosylation 5‏ لعامل ‎VIT‏ من النوع البري. على سبيل المثال» يمكن أن يكون العامل ‎VII‏ من النوع البري مُزال ‎sialylated‏ جزئيا وتركيبات منه مفيد لأن له عمر نصف أقصر من العامل ‎VIE‏ ‏من النوع البري. ‎Wiad‏ يكون من المفيد هنا المستحضرات الدوائية من عامل ‎VIE‏ من النوع البري مُزال ‎Wa sialylated‏ أو ‎WS‏ واستخدام عديد الببتيدات والمستحضرات في معالجة الأمراض المذكورة هنا التي تكون مفيدة من عديد ببتيد قصير التأثير له نشاط العامل ‎VI‏ يمكن قياس إزالة

‎silylation 0‏ الجزئية أو الكلية عن طريق نسبة جزيئات ‎sialic acid‏ المقترن إلى جزيئات 0 المتصل مع ل في تركيبة عديد ببتيدات من العامل ‎VIE‏ حسب الوصف هنا.

‏تكون أيضا ترتيبات نيكلوتيد التي تشفر الأشكال المختلفة من العامل ‎VII‏ مفيدة. في تجسيد واحد؛ يتم تشفير عديد الببتيدات من العامل ‎VIE‏ عن طريق ترتيب نيكلوتيد له تطابق على الأقل و49 98 97ت 96ت 395 94 93 92 191« 90 389 388 387 5 85-1286 4ق 183 82 81 80ل ‎STA 175 16 717 78 JT‏

3 1 271 270 269 £68 267؛ أو 766 عبر الطول الكامل مع ترتيب النيكلوتيد من العامل ‎VII‏ من النوع البري (تعريف الترتيب رقم: 1) والذي يشفر عديد ببتيد من عامل ‎VIE‏ ‏وظيفي. في أمثلة خاصة؛ يشفر أيضا ترتيب النيكلوتيد عديد ببتيد يحتوي على واحد أو أكثر من تغييرات الحمض الأميني المناقشة هنا بالنسبة إلى تعريف الترتيب رقم: 16. في تجسيد ‎AT‏ يتم تشفير عديد الببتيد من العامل ‎VII‏ عن طريق ترتيب نيكلوتيد له تجانس أكثر من 799 798؛ ‎J95 96 717‏ 4و دو ذو او 0و وق قق ل لقال 6ق 5ق 4 دق فقن اق ‎TTA JTS JT6 LTT 76 LT J80‏ 73 712 1 £70« 7269 268 267 أو 766 مع ترتيب النيكلوتيد من العامل ‎VIE‏ من النوع البري (تعريف الترتيب رقم: 1) والذي يشفر عديد ببتيد من عامل ‎VIE‏ وظيفي. في أمثلة خاصة؛ يشفر 0 أيضا ترتيب النيكلوتيد عديد ببتيد يحتوي على واحد أو أكثر من تغييرات الحمض الأميني المناقشة هنا بالنسبة إلى تعريف الترتيب رقم: 16. تُحسب قيم التطابق بالنسبة المئوية من خلال منطقة ترتيب الحمض الأميني أو الحمض النووي. تتاح سلسلة من البرامج المعتمدة على تشكيلة واسعة من اللوغاريتمات للعامل الماهر من أجل مقارنة الترتيبات المختلفة. في تجسيد واحد على الأقل؛ يتحدد التطابق بالنسبة ‎Asal)‏ بين 5 ترتيبين حمض أميني باستخدام اللوغاريتم ‎Needleman‏ و ‎:Wunsch‏ ‎(Needleman 1970, J.

Mol.

Biol. (48):444-453),‏ المندمج في البرنامج الإبري ‎(Needle program)‏ في مجموعة برمجيات ‎:EMBOSS‏ ‎(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice,‏ ‎P., Longden, ٠٠, and Bleasby, A, Trends in Genetics 16(6), 276-277,‏ ,)2000 سواء باستخدام مصفوفة تسجيل 45 ‎BLOSUM‏ أو ‎PAM250‏ من أجل بروتينات ذات الصلة بشكل بعيد؛ أو سواء مصفوفة تسجيل 62 ‎BLOSUM‏ أو ‎PAM160‏ من أجل بروتينات ذات الصلة بشكل أقربء وحد فتح فجوة ‎(gap opening penalty)‏ من 16 14 12 10 6؛ 6؛ أو 4 وحد تمدد فجوة ‎(gap extension penalty)‏ من 0.5» 1 2 3؛ 4 5؛ أو 6. يمكن

— 6 2 — العثور على أدلة من أجل التركيب الموضعي لحزمة ‎EMBOSS‏ بالإضافة إلى وصلات مع خدمات ‎ull‏ ‎(WEB-Services)‏ في الموقع: ‎.emboss.sourceforge.net‏ مثال غير محدد للمعايير المراد استخدامها من أجل اصطفاف ترتيبين حمض أميني باستخدام برنامج الإبرة هي المعايير الافتراضية؛ متضمنة مصفوفة التسجيل ‎(EBLOSUMO2‏ حد فتح فجوة من 10« وحد تمدد فجوة من 0.5. في تجسيد ‎AT‏ أيضاء يتحدد التطابق بالنسبة المئوية بين ترتيبين النيكلوتيد باستخدام برنامج إبرة في حزمة البرمجيات ‎:EMBOSS‏ ‎(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice,‏ ‎P., Longden, ٠٠, and Bleasby, A, Trends in Genetics 16(6), 276-277,‏ )2000 باستخدام مصفورفة التسجيل ‎EDNAFULL‏ مع حد فتح فجوة من 16 14 12 10 8 6 أو 4 وحد تمدد فجوة من د 321 قث أو 6. مثال غير محدد للمعايير المراد استخدامها من أجل اصطفاف ترتيبين حمض أميني باستخدام برنامج الإبرة هي المعايير الافتراضية؛ متضمنة مصفوفة التسجيل ‎(EDNAFULL‏ حد فتح فجوة من 10؛ وحد تمدد فجوة من 0.5. يمكن إضافيا 5 استخدام ترتيبات حمض نووي وبروتين على أنه 'ترتيب استعلامي ‎"(query sequence)‏ لإجراء بحث على قاعدة بيانات عامة؛ على سبيل ‎(JU‏ تعيين أعضاء العائلة الأخرى أو الترتيبات ذات الصلة. يمكن ‎Lad‏ إجراء هذه الأبحاث باستخدام سلسلة من البرامج ‎BLAST‏ (نسخة 2.2) من: ‎Altschul et al. (Altschul 1990, J.

Mol.

Biol. 215:403-»٠‏ ‎BLAST chal (Sa‏ باستخدام ترتيبات حمض نووي من الكشف الحالي كترتيب استعلامي مع 0 البرنامج ما ‎(BLASTx‏ أو ‎tBLASTX‏ باستخدام المعايير الافتراضية سواء للحصول على ترتيبات نيكلوتيد ‎(tBLASTX (BLASTN)‏ أو ترتيبات حمض أمينى ‎(BLASTX)‏ متجانسة مع الترتيبات المشفرة عن طريق ترتيبات الحمض النووي من الكشف الحالي. يمكن إجراء ‎BLAST‏ باستخدام ترتيبات بروتين المشفرة عن طريق ترتيبات الحمض النووي من الكشف الحالىي كترتيب استعلامي مع البرنامج ‎BLASTp‏ أو ‎BLASTN‏ باستخدام المعايير الافتراضية سواء

للحصول على ترتيبات حمض أميني ‎(BLASTP)‏ أو ترتيبات حمض نووي ‎(BLASTN)‏ ‏متجانسة مع ترتيبات الكشف الحالي. للحصول على اصطفافات متباعدة لأغراض المقارنة؛ يمكن استخدام ‎BLAST‏ متباعد باستخدام المعايير الافتراضية حسب الوصف في: ‎Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402.‏ عديد الببتيدات من الكشف الحالي سواء أن تتكون جوهريا من ترتيبات النيكلوتيد المذكورة أعلاه أو تشمل ترتيبات النيكلوتيد المذكورة أعلاه. بالتالي يمكن أن يحتوي على ترتيبات نيكلوتيد إضافية أيضا. في تجسيدات خاصة؛ يمكن أن يشمل عديد النيكلوتيد؛ بالإضافة إلى إطار قراءة مفتوح؛ ترتيب غير مترجم إضافي عند الطرف '3 و/أو عند الطرف '5 من منطقة التشفير؛ على سبيل المثال على الأقل 10 20 30 40« وى وى 70 80« 0ق 100 200 300 0 400؛ 500 أو نيكلوتيدات أكثر من الترتيب السابق للطرف '5 من منطقة جين التشفير و/أو على القل م 0 0 40« قي 60« 0 0ق 90 100 200 300 400« 500« أو نيكلوتيدات أكثر من الترتيب اللاحق للطرف '3 من منطقة جين التشفير. علاوة على ‎ld‏ ‏عديد الببتيدات يمكن أن يشفر بروتينات الالتحام حيث يكون شريك واحد من بروتين الالتحام هو عديد ببتيد مشفر عن طريق ترتيب النيكلوتيد المذكور أعلاه. يمكن أن تشمل بروتينات الالتحام ما 5 يسمى "بأجزاء ملحقة (1895)' التي تعمل كعلامة قابلة للكشف أو كمقياس مساعد من أجل أغراض التنقية. تعرف جيدا في الفن الأجزاء الملحقة للأغراض المختلفة وتشمل أجزاء ملحقة ‎(FLAG‏ أجزاء ملحقة 6-01580006؛ أجزاء ملحقة ‎(MYC‏ إلخ. في تجسيد واحد؛ يشمل عديد النيكلوتيد إضافيا ترتيب مقارن إظهار متصل تشغيليا مع ترتيب النيكلوتيد. في تجسيدات خاصة؛ يقحم ترتيب حمض نووي يشفر عديد ببتيد العامل ‎VIE‏ في ناقل 0 مناسب. تعرف جيدا في الفن النواقل المتعددة المفيدة لأغراض متنوعة ويكون المهرة في الفن قادرين على انتقاء ناقل مناسب بسهولة من أجل تطبيقه المرغوب. في تجسيدات خاصة؛ قد يكون الناقل هو ناقل نسخ أو ناقل إظهار. في أمثلة أخرى؛ قد يكون الناقل بلازميد؛ ناقل فيروسي؛ 0 )أو كروموسوم اصطناعي. في أمثلة خاصة؛ قد يوضع الحمض النووي الذي يشفر عديد ببتيد الناقل ‎VIE‏ بجوار و/أو أسفل مقارن معزز مناسب. تعرف جيدا في الفن معززات متنوعة 5 مفيدة لأغراض متنوعة ويكون المهرة في ‎Gall‏ قادرين على انتقاء معزز مناسب بسهولة من أجل

— 8 2 — تطبيقه المرغوب. في أمثلة خاصة؛ قد يكون المعزز هو معزز تكويني؛ معزز مُحث؛ أو معزز فى تجسيدات خاصة؛ ينتج عديد الببتيدات من العامل ‎VIE‏ بشكل تخليقى فى خلية؛ نسيج؛ أو عضو. في تجسيدات خاصة؛ يتحقق الإنتاج التخليقي عن طريق تحويل أو استقبال حامل الجين من خلية عائل مع جزيء حمض نووي يشفر عديد ببتيد من الشكل المختلف أو ناقل محتوي على حمض نووي. تعرف جيدا في الفن طرق متنوعة لتحويل واستقبال حامل الجين من العائل ويكون المهرة في الفن قادرين على انتقاء طريقة مناسبة بسهولة لتطبيقها المرغوب. يمكن أيضا تحقيق الإنتاج التخليقي باستخدام أي خلية عائل مناسبة؛ نسيج؛ أو عضو مناسب. تعرف جيدا فى الفن ‎(WIA‏ انسجة؛ واعضاء مناسبة ن المهرة فى الفن ‎yal‏ ‏ب. تعرف جيدا في الفن ‎(WDA‏ أنسجة؛ وأ بة ويكون المهرة في الفن قادرين على انتقاء عائل مناسب بسهولة لتطبيقها المرغوب . فى ‎a‏ التجسيدات ؛ تكون خلية ‎ila)‏ هى ثديية. إن أمثلة على خطوط خلية ثديية مناسبة هي خطوط خلية ‎(ATCC CRL COS-1‏ (1650؛ كلى هامستر رضيع ‎:HEK293 ((BHK) (baby hamster kidney)‏ ‎(ATCC CRL 1573; Graham et al., J.

Gen.

Virol. 36:59-72, 1977)‏ ‎(Invitrogen HEK293F 5 (ATCC CRL 11268; DSM ACC 2494) HEK293T‏ ‎.R79007) 5‏ خط خلية ‎BHK‏ مفيد هو خط الخلية ‎:tk31 1513 BHK‏ ‎Waechter and Baserga, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 79:1106-1110,‏ ,1982 المندمج هنا كمرجع؛ يشار إليه هنا فيما بعد على أنه خلايا 570 ‎BHK‏ تم إيداع خط الخلية ‎BHK 570‏ مع؛ ‎American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, Md. 0‏ ,20852 تحت رقم الوصول ‎:CRL ATCC‏ 10314. يكون خط خلية ‎tk= 1513 BHK‏ متاح أيضا من ‎ATCC‏ تحت رقم الوصول ‎CRL‏ : 1632 إضافة ‎PER]‏ يمكن استخدام عدد من خطوط الخلية

الأخرى في الكشف ‎Mall‏ ¢ متضمنة | ‎Hep‏ جرذ (ورم كبدي بجرذ؛ 1600 ‎«(ATCC CRL‏ ‎Hep ١١‏ جرذ (ورم كبدي بجرذ: 1548 ‎(ATCC CCL 139) TCMK (ATCC CRL‏ رئة آمي )8065 ‎(ATCC CCL CHO (ATCC CCL 9.1) NCTC 1469 «(ATCC HB‏ ‎(ATCC 00161( CHO K1 61)‏ خلايا ‎:DUKX‏ ‎(Urlaub and Chasin, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 77:4216-4220, 1980) 5‏ وخلايا ‎.(Urlaub et al.

Cell 33: 405-412, 1983) CHO-DG44‏ تكون تركيبات من عديد ببتيدات عامل ‎VIE‏ مفيدة حيث يتحدد عديد ببتيدات من العامل ‎LS VII‏ هنا وتكون نسبة جزيئات ‎sialic acid‏ المقترن لكل جزيء ‎glycan‏ متصل مع ‎N‏ في التركيبة أقل من 0.05» أقل من 0.1؛ أقل من 1» أقل من 2؛ أقل من 3؛ أقل من 4؛ أقل من 5 0 أو أقل من 6 أو تركيبات حيث تكون نسبة جزيئات ‎sialic acid‏ المقترن لكل جزيء ‎glycan‏ ‏متصل مع لاا في نطاق منتقى من المجموعة المتكونة من (1) من صفر إلى 8؛ (2) من صفر إلى 7؛ (3) من صفر إلى 6؛ (4) من صفر إلى 5؛ (5) من صفر إلى 4؛ (6) من صفر إلى 3 ) من صفر إلى 2؛ (8) من صفر إلى 1 و(9) من صفر إلى 0.5؛ أو نسب من 1 إلى 8» 1 إلى 7 1 إلى 6» 1 إلى 5؛ 1 إلى 4 1 إلى 3 1 إلى 2؛ 2 إلى 8» 2 إلى 7 2 إلى 26 إلى 5؛ 2 إلى 4؛ 2 إلى 3؛ 3 إلى 6؛ 3 إلى 7 3 إلى 6؛ 3 إلى 5؛ 3 إلى 4؛ 4 إلى 8 إلى 7 4 إلى 6؛ 4 إلى 5؛ و0.1 إلى 1. تكون النسبة هي قياس جزيئات ‎sialic acid‏ المرتبط مع بروتين سكري بالنسبة إلى عدد ‎glycans‏ على البروتين السكري. يشير عدد ‎J) glycans‏ عدد أجزاء السكر المرتبطة مع ‎glycan‏ متصل مع لا في البروتين السكري؛ حيث موقع ‎glycosylation‏ متصل مع ‎N‏ واحد يمكنه فقط دعم ‎glycan‏ واحد كما تحدد هنا لأغراض 0 هذه النسبة. تتحدد النسبة باستخدام مجموعة تعليم إشعاع ‎sialic acid‏ مثلا المباع من قبل: ‎.Takara Bio Inc. (cat. #4400)‏ تتضمن ‎de gana‏ تعليم إشعاع ‎sialic acid‏ خطوة من أجل إطلاق ‎sialic acid‏ من البروتين السكري المرتبطء مثلا عن طريق تحلل مائي لحمض جزئي أو عن طريق استخدام ‎sialidase‏ ‎ureafaciens sialidase Si.‏ 11710580161. بعدئذ ‎sialic acids alas‏ الحر مع حامل فلور ‎(fluorophore) 5‏ مثلا ‎(“DMB”) 1,2-diamino—4,5-methyleneoxybenzene‏ بعدئذ يتم

قياس ‎sialic acids‏ المعلمة كميا باستخدام ‎HPLC‏ ومقارنة ارتفاعات الذروة مع منحنى معايرة. بالتالي» تكون النسبة المقاسة هي نسبة جزيئات ‎sialic acid‏ لكل جزيء جرامي ‎glycan‏ مطلق من كل عديد الببتيدات للعامل ‎VIE‏ من التركيبة.

في سلسلة واحدة من التجسيدات؛ يكون لتركيبات عديد الببتيدات للعامل ‎VIE‏ أو عديد

الببتيدات المعزولة بذاتها عمر نصف كما هو مقاس في بلازما آدمي أو كائن ثديي؛ على سبيل

المثال بلازما فأري أو جرذ؛ أقل من ساعتين؛ أقل من ساعة ونصف»؛ أقل من ساعة؛ أقل من 5 ساعة؛ أقل من 0.5 ساعة؛ أقل من 0.25 ساعة؛ أقل من 0.1 ساعة؛ أو قصير جدا بحيث لا يمكن قياسه بشكل معقول.

حسب الاستخدام هناء يكون نشاط العامل ‎VII‏ هو نشاط حيوي يمكن تحديد كميته عن

0 طريق قياس قدرة المستحضر على تعزيز تجلط الدم باستخدام بلازما ناقصة ‎VIE‏ ‎thromboplastin‏ كما هو معروف جيدا في الفن. في أمثلة خاصة؛ يوضح عديد ببتيد من عامل ‎VII‏ له نشاط عامل ‎VII‏ على الأقل 25 على الأقل 740 على الأقل 750؛ على الأقل 0. على الأقل 770 على الأقل 780 أو على الأقل 790 من نشاط العامل ‎VII‏ من النوع البري كما هو مقاس تحت نفس الشروط.

تكون المستحضرات الدوائية لعديد الببتيدات من العامل ‎VIE‏ وتركيبات منه المشتملة على عديد ببتيد من العامل ‎VII‏ ومادة مسوغة أو مادة حاملة مقبولة دوائيا مفيدة أيضا. في أمثلة خاصة؛ تكون المستحضرات الدوائية من أجل الإعطاء عن غير الطريق المعوي؛ مثلا إعطاء داخل ‎call‏ تحت الجلد أو داخل العضل؛ وقد يكون التجريع كجرعة قرص دواء فردي؛ تجريع متقطع؛ أو كتشريب مستمر داخل الوريد. قد تكون المستحضرات الموضعية مفيدة أيضا. يشمل

0 تجسيد واحد مستحضر دوائي مشتمل على عديد ببتيد من عامل ‎VIE‏ معزول حسب الوصف هناء أو مشتمل على تركيبة من عديد ببتيدات من عامل ‎VIE‏ حسب الوصف هنا؛ في مستحضر مجفد تم ‎sale]‏ تشكيله عند الاستخدام. بطريقة بديلة؛ يمكن أن يكون المستحضر الدوائي مستحضر سائل ثابت جاهز للاستخدام لا يتطلب إعادة تشكيل. يمكن أن يكون المستحضر الدوائي مسحوق مجفد في قارورات للاستخدام مرة واحدة بمقدار 1؛ 2؛ 5؛ أو 8 مجم من عديد ببتيد للعامل ‎VIE‏ بعد

5 إعادة التشكيل مع حجم خاص من ‎(lull‏ مثلا ماء معقم محتوي على 01580106 يمكن أن

يحتوي المحلول النهائي على أي كمية مناسبة من عديد ببتيد للعامل ‎VIE‏ الذي ينتج تأثير علاجي؛ مثلاء بدون تحديد؛ 1 مجم/ ملليلتر (1000 ميكروجرام/ ملليلتر)؛ 2 مجم/ ملليلتر» 3 مجم/ ملليلترء 4 مجم/ ملليلتر» 5 مجم/ ملليلتر؛ 2-1 مجم/ ملليلتر» 3-1 مجم/ ملليلتر» 5-1 مجم/ ‎sills fans 10-1 5‏ 1-0.5 مجم/ ملليلترء أو 2-0.5 مجم/ ملليلتر من عديد ببتيد للعامل ‎VII‏ يمكن أن تتحدد بسهولة الجرعة الممكنة للإعطاء إلى مريض عن طريق الشخص الماهر في الفن اعتمادا على؛ على سبيل المثال؛ وزن المريض» نوع اضطراب أو حدوث النزيف المراد معالجته؛ ونشاط عديد ببتيد من العامل ‎VIE‏ الخاص المراد استخدامه. في أمثلة خاصة؛ يمكن أن يكون التجريع في نطاق من 110-70 ميكروجرام/ كجم» 90-70 ميكروجرام/ كجم؛ أو 80- 0 100 ميكروجرام/ كجم ويمكن أن يكون 90 ميكروجرام/ كجم. قد يعاد تشكيل المسحوق المجفد مع مادة حاملة مائية؛ مثلا ‎cole‏ ماء ثابت الأس الهيدروجيني؛ 70.4 محلول ملحي» 70.3 68 إلخ. تعرف طرق فعلية من أجل تحضير تركيبات قابلة للإعطاء عن غير الطريق المعوي أو قد تكون واضحة للشخص الماهر في الفن ويتم وصفها بتفصيل أكثرء على سبيل ‎JEL‏ في:

Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing 15

Company, Easton, Pa. (1990). يمكن إجراء تطبيق موضعي؛ مثلا يفضل أن يكون في حالة رضحية؛ بواسطة رذاذ» إرواء؛ قسطرة؛ دعامة؛ رقعة أو دعامة وعائية؛ مرهم؛ أو مستحضر ‎AT‏ معروف في الفن. في أمثلة خاصة؛ قد يكون التطبيق الموضعي عن طريق نسيج بيني صلب أو شبه صلبء؛ مثلا إسفنجة 0 جراحية أو نسيج بيني كولاجين» الذي تم معالجته؛ تشريبه؛ تغليفه؛ أو نقعه في تركيبة تشمل الشكل المختلف للعامل ‎VIE‏ تعرف جيدا في الفن طرق تحضير قوالب؛ انظر مثلا: ‎Thrombosis/Hemostasis 12:445, 2006‏ ويكون الممارس الماهر قادر بسهولة على تحديد جرعة مناسبة وطريقة لتطبيق التركيبة على النسيج البيني المحدد.

في تجسيد واحد؛ يتعلق الكشف الحالي بمجموعات تشمل عديد ببتيد من العامل ||/ا. في أمثلة خاصة؛ تحتوي المجموعة على قارورة محتوية على سائل جاهز للاستخدام محتوي على عديد ببتيد للعامل ‎VI‏ في تركيبة دوائية مناسبة. في أمثلة ‎(gal‏ تحتوي المجموعة على قارورة محتوية على عديد ببتيد للعامل ‎VIE‏ المجفد؛ أو مستحضر مجفد مشتمل على عديد الببتيد؛ وأيضا مادة مخففة من ‎sale] PT‏ التشكيل. في أمثلة أخرى؛ تحتوي المجموعة على مستحضر موضعي من عديد ببتيد للعامل ‎VIE‏ على سبيل المثال؛ مرهم؛ رذاذء أو سائل؛ ونسيج بيني مثلا إسفنجة أو نسيج بيني طبي آخر يطبق عليه المستحضر الموضعي قبل الإعطاء إلى مريض. تكون تركيبات عديد الببتيدات للعامل ‎VII‏ الموصوفة هنا مفيدة أيضا. يوجد العامل ‎VIE‏ في خليط مع منتجات انحلال طبيعية خاصة به. طبقا ‎CN‏ تتضمن تركيبة عديد ببتيدات من عامل ‎VIE 10‏ عديد ببتيدات لها واحد من ترتيبات الحمض الأميني الكاملة كما هو مذكور هنا ومنتجات انحلال لها ترتيبات حمض أميني جزئي من الموصوفة هنا. علاوة على ذلك؛ بسبب أن العامل ‎VI‏ بروتين سكري» من المتوقع أن تحتوي تركيبات من العامل ‎VII‏ على خليط متغاير من عديد ببتيدات للعامل ‎VII‏ حيث لا يكون كل بروتين سكري في التركيبة له بالضبط نفس ‎Jie glycosylation‏ الأخرين. تعني الإشارة إلى تركيبات عديد ببتيدات عامل ‎JVI‏ عديد 5 ببتيدات عامل ‎VII‏ معزول أن تشمل خلطات من عديد ببتيدات حيث يكون لعديد الببتيدات الفردي ‎«aids glycosylation‏ وبالتالي ‎Jods‏ المصطلحات "تركيبة ‎"(composition)‏ أو "عديد ببتيد من عامل ‎VII‏ معزول ‎"(isolated Factor VII polypeptide)‏ تغاير أنماط ‎glycosylation‏ ‏داخل عديد الببتيدات. يكون عديد الببتيدات من العامل ‎VIE‏ والتركيبات الموصوفة هنا مفيدة من أجل معالجة 0 اضطرابات تجلط الدم؛ والاضطرابات المفيدة من تخثر الدم؛ وتحديدا من أجل التخثر مع عقار له عمر نصف أقصر من عامل ‎VII‏ من نوع بري. طبقا لذلك؛ يكون عديد الببتيدات من العامل ‎VIE‏ ‏والتركيبات الموصوفة هنا مفيدة من أجل النفاذ إلى الإصابة الرضحية؛ الإصابة الرضحية الحادة؛ النزيف في عملية جراحية اختيارية؛ النزيف في عملية جراحية بالقلب؛ النزيف في عملية جراحية بالعمود الفقري؛ عملية جراحية بالعظام؛ جراحة المخ والأعصاب» جراحة بعد الولادة؛ غزارة الطمث؛ 5 نزيف في ازدراع الخلية الجذعية؛ نزيف في ازدراع الكبد؛ نزيف معدي معوي؛ نزيف دوالي نشط؛

— 3 3 — فى تليف الكبد؛ نزيف غير الدوالى فى تليف الكبد؛ نزيف سنخية انتشاري؛ تمدد الأوعية الدموية بالأوورطي؛ مزيف دموي داخل المخ؛ إصابة رضحية بالمخ؛ كدمة دماغية؛ انعكاس 0/818150؛ انعكاس ‎heparin‏ انعكاس مضادات التخثر؛ انعكاس عوامل الوقاية من التجلط الوريدي؛ نقص العامل ‎VII‏ حروق؛ علاج وقائي لمرضى الناعور بمثبطات؛ استئصال كبدي جزئي لمرضى السبب؛ وهن الصفائح الدموية ‎¢Glanzmann‏ وهن الصفائح الدموية ‎Glanzmann‏ المقاوم ‎Jail‏ ‏الصفائح الدموية وعرض ‎.Bernard—Soulier‏ ‎Lad‏ يتم الكشف هنا عن اختبار مفيد لقياس عمر نصف عوامل التخثر مثلا العامل ‎MIE‏ ‏هناك طريقة لتحديد عمر نصف عامل التخثر تشمل تحضين خلايا كبدية بجرذ قابلة للحياة مع 0 عامل تخثر دم؛ إزالة عينة عند نقطة زمنية 1 من الاختبار؛ فصل المادة الطافية عن الخلايا في العينة وتحديد كمية النشاط أو كمية عامل تخثر الدم في المادة الطافية فى ‎dil)‏ حيث يتحدد ‎Jabal‏ أو كمية عامل تخثر الدم باستخدام اختبار ‎ELISA‏ لإقحام الجسم المضاد المزدوج. قد تكرر الطريقة عند نقاط زمنية مختلفة لتطوير مخطط النشاط أو كمية عامل تجلط الدم بمرور الوقت. ‎ad 5‏ طرق للحصول على عديد ببتيدات لعامل ‎VII‏ مُزال ‎sialylated‏ ‏تستخدم طرق متنوعة لتوليد عديد ببتيدات من العامل ‎VII‏ مُزال ‎JS) sialylated‏ من النوع البري والشكل المختلف)؛ متضمنة ‎sialylation dll)‏ إنزيمية لعديد الببتيد؛ إنتاج عديد ببتيد من العامل ‎VIE‏ فى خط خلية ناقص ‎csialylation‏ والإظهار المشترك لعامل ‎VII‏ و ‎sialidase‏ فى 0 خلية تخليقية. توليد خط خلية ناقص ‎Sialic Acid‏ يتم تخليق ‎sialic acid‏ داخلي ‎Lad)‏ في خلايا ثديية تشمل مسار معقد متكون من 32 إنزيم )2011 ‎(Wickramasinghe and Medrano‏ يبدأ التخليق الحيوي لأجل ‎sialic acid‏ في العصارة الخلوية يحول ‎(UDP-GIcNAc) UDP-N-acetylglucosamine‏ إلى

UDP-N-acetylglucosamine-2- is ‏يشمل العديد من الإنزيمات؛»‎ NeuSAc sialic acid 9-phosphate ‏(كالا6)‎ epimerase/Nacetylmannosamine kinase ‏يورد‎ -(NANP) sialic acid 9-phosphate phosphatase 4 ((NANS) synthase

CMP— ‏في العصارة الخلوية إلى النوية من خلال مسامات نووية وبتحول إلى‎ NeuSAc ‎NeuSAc 5‏ عن طريق إنزيم يسمى ‎(CMAS) CMP-Sia synthase‏ . ينقل مرة أخرى ‎CMP-Neu5Ac‏ المخلق إلى العصارة الخلوية من خلال مسامات نووية من أجل تعديل إضافي واقتران في الجهاز ‎Golgi‏ يتم تحفيز تحويل ‎NeuSAC‏ إلى ‎Neu5Ge‏ في العصارة الخلوية عن طريق الإنزيم ‎.(CMAH) CMP-NeuAc-hydroxylase‏ بعدئذ؛ ينقل ‎CMP-NeuSAc‏ ‎CMP-Neu5Ge‏ إلى القسم ‎Golgi‏ من خلال ناقل غشاء صاد للماء من نوع 3 ناقل ‎acid 0‏ 16ل1/0-518© ‎((SLC35A1)‏ واقع في الغشاء ‎Golgi‏ العابر المتوسط. يكون الناقل ‎CMP-sialic acid‏ هو عنصر أساسي في مسار ‎sialylation‏ الخلوية ‎(Hirschberg, et al.‏ (1998. طفرة متجانسة الزيجوت من هذا الجين تسبب الموت بعد الولادة في الفأر ‎(MGI 4.32, Homologene)‏ في الآدميين الطفرات في 5103571 يصاحبها خفض أو فقد كامل لمتقارنات الاا518. بعض طفرات الإقحام والإزالة في 51035781 يصاحبها اضطرابات ‏5 خلقية من ‎glycosylation‏ في آدميين ينتج عنها عيوب في تطوير الجهاز العصبي؛ تخثر؛ ونقص المناعة (2005 ‎.(Martinez-Duncker, et al.,‏ بمجرد نقل ‎CMP—-‏ ‎NeuSAc/CMP-Neu5Ge‏ إلى الجهاز ‎Golgi‏ يمكن اقترانهم مع الكريوهيدرات؛ البروتينات السكرية؛ والليبيدات السكرية عن طريق الإنزيمات في العائلة ‎(ST) sialyltransferase‏ مع 20 عضو . ‏20 يكون الناقل ‎(SLC35A1) CMP-sialic acid‏ هو الجزيء الأساسي المدعم لاقتران ‎sialic acid‏ في الجهاز ‎«Golgi‏ وتؤدي الطفرات مع البروتين الناقل إلى تخليق بروتينات تنقصها 007 مناسبة. لإنتاج عامل ‎VII‏ مُزال ‎«sialylated‏ ينتج خط خلية إنتاج عامل ‎VIE‏ مع صرع الجين الناقل ‎.CMP-sialic acid‏ بطريقة ‎«db‏ يمكن تحقيق إزالة ‎sialylation‏ عن طريق إظهار الشكل المختلف من العامل ‎VIE‏ في خط خلية ينتج علاجات بروتين مع مستوى

— 5 3 — منخفض جدا أو بدون ‎silylation‏ على الجزيئات العلاجية. يمكن استخدام هذه التقنية لإنتاج بروتينات علاجية لها 11/2 قصير في المرضى. تتحد خلية ‎lec‏ مع مصدر مبيض هامستر صيني ‎(CHO)‏ لها خاصية إنتاج ‎sialic‏ ‏0 أقل بحوالى 10 اضعاف في البروتينات السكرية والليبيدات السكرية من ‎LAY‏ الخاصة من النوع ‎.(Stanley and Siminovitch, 1977, Stanley, 1980 and 1983) sll‏ أوضحت دراسة لاحقة أن طفرات ‎Lec?‏ غير قادرة على نقل ‎CMP-sialic acid‏ عبر أغشية حويصلات ‎Golgi‏ فى اختبار بالمعمل؛ بينما يكون نقل مشتقات النيكلوتيد الأخرى طبيعى نسبيا فى الخلايا الطفرية ‎(Deutscher, et al., 1984( 0‏ عن طريق استخدام نسخ الإظهار؛ ‎SN‏ الجين الذي يشفر الناقل ‎CMP-sialic acid‏ من خلايا ‎et al., 1996) Lec2‏ 5008+01). يشير البحث الإضافى إلى أن إزالة النيكلوتيدات 751-575 فى الجين الناقل ‎acid‏ 16ا61/0-518 تكون مناسبة للنوع الظاهري ‎(Eckhardt, et al., 1998) Lec2‏ تؤدي ‎Lad‏ الطفرات الأخرى في الجين الناقل ‎Mie «CMP-sialic acid‏ في حالة خلايا ‎(1E3‏ 682؛ 868؛ و9103 إلى النوع الظاهري ‎.(Eckhardt, et al., 1998) Lec2‏ التجرية 1 تصمم هذه التجرية لتحديد إذا كانت الطفرة في جين الناقل ‎acid‏ 16ا01/10-518؛ مثلا في ‎dls‏ الخلايا ‎Lec?‏ ينتج عنها برتين تخليقي ظاهر (مثلا؛ ‎(VII Jalal‏ ناقص في ‎sialylation‏ ‏20 )1( اختبار إظهار البروتين التخليقي؛ مثلا العامل ‎VII‏ من ‎WIA‏ 1862. تنقل نواقل الإظهار المحتوية على جين الشكل المختلف من العامل ‎(PMB121 5 pMB117 Die) VII‏ إلى خلايا ‎Lec?‏ وخلايا ‎CHO‏ طبيعية تحت شروط طبيعية لنقل حامل الجين من العائل. تراقب مستويات إظهار العامل ‎VIE‏ من مزرعة خلية لهذه الخلايا عن طريق اختبار نشاط العامل ‎VIE‏ يتم

توسيع نطاق مزرعة الخلايا الناقلة لحامل الجين من العائل وتجمع أوساط مزرعة متكيفة من أجل تنقية العامل ‎MIE‏ ‏)2( اختبار محتوى ‎sialic acid‏ من العامل ‎VII‏ المنقى الظاهر من ‎Lec2 WIA‏ مقارنة مع نفس البروتين الظاهر من خلايا ‎CHO‏ طبيعية. تجرى تنقية العامل ‎VII‏ من هذه الأوساط المتكيفة بعد طرق تثقية العامل ‎VIE‏ الطبيعية. يحلل العامل ‎VIE‏ المنقى سواء من ‎WA‏ 602 أو خلايا ‎CHO‏ طبيعية من أجل محتوى ‎sialic acid‏ من العامل ‎VIE‏ المنقى. يحلل النشاط الحيوي ومعايير الحركية الدوائية ‎(PK)‏ حسب الوصف هنا. تجربة 2 لإنتاج خط خلية تصنيع لإظهار الشكل المختلف للعامل ‎VII‏ بدون ‎sialic acid‏ على 0 البروتينات التخليقية الظاهرة؛ تستخدم طرق إزالة الجين مستهدفة الجين الناقل ‎CMP-sialic‏ ‏0 لتعديل خط خلية يظهر العامل ‎Ja) VII‏ خط خلية ‎(CHO‏ من أجل تثبيط ‎sialylation‏ ‏بالكامل في الخلية؛ اختياريا يمكن أيضا إزالة المستهدفات الأخرى؛ مثلا ‎UDP-N-‏ ‎«(GNE) acetylglucosamine-2-epimerase/Nacetylmannosamine kinase‏ ‎sialic acid 9—phosphate ((NANS) sialic acid 9-phosphate synthase‏ ‎((NANP) phosphatase 5‏ و ‎(CM As) CMP-Sia synthase‏ كما هو مذكور أعلاه في المقدمة؛ لتعزيز تثبيط التخليق الحيوي لأجل ‎CMP-Neu5AC‏ الذي يوفر طبقة تحتية من أجل الناقل ‎.CMP-sialic acid‏ يمكن أيضا استخدام تقنيتي إزالة ‎«(TALENSs) TALE nucleases «pall‏ من ‎Life Technologies‏ و68565ا6نل1 ‎(ZFNs) ZFP‏ من ‎Sangamo‏ ‎«BioSciences /Sigma-Aldrich 0‏ من أجل قتل الجين الناقل ‎«CMP-sialic acid‏ أو قتل الجينات المتعددة في مسار تخليق ‎.sialic acid‏ يتم تقييم خط خلية إظهار العامل ‎VIE‏ مع قتل الجين الناقل ‎CMP-sialic acid‏ للتأكيد على إزالة الجين الناقل ‎.CMP—sialic acid‏ يزرع خط الخلية المثبت لإنتاج العامل ‎VIE‏ ينقى

— 7 3 — العامل ‎VIE‏ من خط الخلية المُزال منه الجين الناقل ‎CMP-sialic acid‏ ويتم تقييمه حسب الوصف هنا وبقارن مع العامل ‎VIE‏ من خط خلية إظهار العامل ‎VIE‏ الأصلي من أجل محتوى ‎sialic acid‏ على الجزيء. إنتاج عامل ‎VII‏ مُزال ‎sialylated‏ عن طريق الإظهار المشترك للعامل ‎VII‏ و ‎Sialidase‏ بكتيري لتولديد شكل ‎FVII‏ مُزال ‎csialylated‏ تُظهر بصورة مشتركة ‎FVII‏ على شكل مختلف 6 بكتيري مشتق من ‎(AU sialidase) Arthrobacter ureafaciens sialidase‏ ‎.(N-acetylneuraminate glycohydrolase, EC 3.2.1.18)‏ ينقل إضافيا حامل الجين من العائل لأجل ‎FVII‏ لإظهار خلايا ‎CHO‏ بثبات ‎lie)‏ تعريف الترتيب رقم: 16 مع الطفرات 0 )؛ ‎(R36E 5 <A34E (K32E‏ مع ‎AU sialidase‏ باستخدام ‎Jal‏ إظهار 608ل0. يكون 0 للبروتين الظاهر ترتيب إشارة هرمون نمو عند الطرف لا لتعزيز إفراز البروتين. تنتقى النسخ الثابتة بحيث ينتج ‎AU sialidase‏ كما يكشف اختبار مولد اللون من أجل ‎sialidase‏ في الوسط. نوضح أيضا أن الخلايا تستمر في إظهار مستويات عالية من بروتين 7/11 الذي يتم الكشف ‎die‏ عن طريق اختبار ‎SDS PAGE (ELISA‏ وتبقع ‎(Western‏ باستخدام أجسام مضادة ‎FVII add‏ كالمجس . باستخدام اختبار تبقع ‎lectin‏ الا نكون قادرين على ‎asst‏ عن ‎sialic 200 5‏ على برتين 1/11 في أوساط التكيف باستخدام ‎FVII‏ منقى. على ‎(Sal)‏ توضح مستويات مماثلة من ‎FVII‏ منقى مشتق من ‎WIA‏ غير ناقلة لحامل الجين من العائل مع 686 إشارة ارتباط ‎lectin‏ قوية. معاء توضح البيانات الخاصة بنا أنه يتم إظهار نام 6 في وسط الخلية ‎CHO‏ عند مستويات كافية لإزالة ‎sialylate‏ بفعالية لأجل ‎FVII‏ ‏الذي يظهر بصورة مشتركة عن طريق الخلايا. 0 مستحضر إنزيمي من عامل ‎VII‏ مُزال ‎sialylated‏ باستخدام ‎Sialidase dallas‏ قابل للذويان تستخدم المواد البادئة التالية في هذا الاختبار التجريبي: عامل ‎VIE‏ 20 مجم عامل ‎Vila‏ من نوع بري» تركيز حوالي 1 مجم/ ملليلتر. ‎:Sialidase‏ 20 ميكروجرام؛ 0.25 مجم/ ‎phils‏ ¢ 50000 وحدة/ ملليلترء 007201 مشترى من ‎.New England BioLabs‏

— 8 3 — محلول مثبت أس هيدروجيني (أ): 25 ‎Ak‏ جزيئي ‎chistidine aha‏ 50 مللي جزيئي جرامي ‎(NaCl‏ أس هيدروجيني 6.4. محلول مثبت أس هيدروجيني (ب) : 25 مللي ‎Ey‏ جرامي ‎SH 1 histidine‏ جرامي ‎(NaCl‏ أس هيدروجيني 6.4.

مثبت أس هيدروجيني لمستحضر ‎:FVlla‏ 3 . 2 مجم/ ملليلتر كلوريد صوديوم ‘ 5 . 1 مجم/ ملليلتر ‎chloride dehydrate‏ 681610؛ 1.3 مجم/ ملليلتر ‎«glycylglycine‏ 0.1 مجم/ ملليلتر 80 0075010816 25 مجم/ ملليلتر ‎mannitol‏ 10 مجم/ ملليلتر ‎«sucrose‏ 0.5 مجم/ ملليلتر ‎(methionine‏ 1.6 مجم/ ملليلتر ‎chistidine‏ أس هيدروجيني 6.

عمود تنقية: عمود ‎HiTrap © Sepharose HP‏ سعته 5 ملليلتر. باستخدام هذه الموادء يجرى الإجراء التالى: 1. إلى 20 مجم من 1/118 (حوالي 1 مجم/ ملليلتر)» يضاف 20 ميكروجرام ‎sialidase‏ ‏)0.25 مجم/ ملليلترء نسبة كتلية 1: 1000( من ‎.sialidase‏ ‏2. يحضن التفاعل عند درجة حرارة الغرفة طوال الليل (حوالي 19 ساعة) قبل التنقية بواسطة تحليل كروماتوجرافى لأجل 71/118 مُزال ‎sialylated‏ كما هو موصوف أدناه. 5 3. ينقى ‎١1/١18‏ مُزال ‎sialylated‏ على عمود ‎HiTrapQ Sepharose HP‏ سعته 5 ملليلتر كما يلى: (أ) يتزن العمود ‎Q-Sepharose‏ مع 5 ‎CV‏ مثبت أس هيدروجيني (أ) )25 مللي جزيئي جرامي ‎AL 50 chistidine‏ جزيئئ جرامي ‎(NaCl‏ أس هيدروجيني 6.4). (ب) قبل التطبيق على العمود» يخفف تفاعل 1/118 و ‎sialidase‏ مع 200 ملليلتر مثبت أس 0 ميدروجيني (أ) ويضبط الأس الهيدروجيني إلى 6.4. (ج) يحمل عند معدل تدفق 2.5 ملليلتر/ ‎dads‏ باستخدام نظام ‎AKTA Explorer‏ بينما يراقب 0. يجمع التدفق من خلال الكسر.

— 9 3 — )3( بعد اكتمال التحميل؛ يغسل العمود مع 10 قوة حصان من مثبت أس هيدروجيني )1( (ه) يصفى العمود مع 20 قوة حصان من صفر-750 مثبت أس هيدروجيني (ب) (25 مللي جزيثي جرامى عمال كط 1 جزيثي جرامى ‎«NaCl‏ أس ‎gd‏ >( 6.4( فى 40 دقيقفة. تجمع كسور الذروة ‎.(Desialylated NovoSeven)‏ (و) تجرى ديلزة لكسور الذروة مقابل مثبت أس هيدروجيني لمستحضر 1/118 عند 40"مئوية طوال الليل. (ز) تجمد العينة عند -80"مئوية في قواسم تامة. يتضح المنتج على أنه ‎le‏ النقاء عن طريق ‎@SEC (SDS-PAGE‏ ونشط فى الاختبارات الحيوية من أجل 1/118 الاختبارات من أجل محتوى ‎sialic acid‏ لا توضح ‎sialic‏

0 800 متخلف وتحليل ‎LC-MS‏ لسلسة ثقيلة لا يوضح تغيير كبير في بناء ‎glycan‏ بخلاف ‎ah)‏ ‎.sialic acid‏ مستحضر إنزيمي من عامل ‎sialylated Jha VII‏ باستخدام خرزات ‎Neuraminidase—‏ ‎Agarose‏

عامل ‎VII‏ من نوع بري تخليقي حسب الاستخدام هنا هو ‎NovoSeven®‏ ناتج من

‎Novo Nordisk 5‏ وبشار ‎ad)‏ هنا على أنه ”7]". تكون المواد البادئة الأخرى ‎V1 a‏ و2/

‏حسب الوصف أعلاه.

‏تذاب بسرعة المادة البادئة المتجمدة فى حمام ماء درجة حرارته 7مثوية وتجمع. يركز البروتين 2.5 ضعف عن طريق الطرد المركزي؛ تخلط برفق المادة المركزة عن طريق التوزيع بأداة ماصة لتقليل أي تركيز فائق (تكتل) عند السطح البيني لبروتين المرشح.

‏20 تبادل مثبت الأس الهيدروجيني لأجل ‎V2‏ من مثبت أس هيدروجيني لمستحضر ‎V2‏ ‏خاص به (محتوي على 0150006 ‎«methionine trehalose «CaCl‏ ومستويات ضئيلة من 20-©17/660؛ عند أس هيدروجيني 6.6-6.4) إلى مثبت أس هيدروجيني ‎MES‏ (محتوي على 10 مللي

جزيثي جرامي ‎Ak 10 (MES‏ جزيثي جرامي ‎JA 50 «CaCl2‏ جزيئي جرامي ‎(NaCl‏ ‏أس هيدروجيني 6 مرشح بالتعقيم). يتحقق هذا بطريقة واحدة من الثلاث طرق. في الاختيار الأول؛ يتبادل مثبت الأس الهيدروجيني لأجل ‎V2‏ مع أعمدة تدفق ‎(gravity flow dE‏ ‎(GE, 17-0854-01( NAP-10 columns)‏ التي تغسل مسبقا 5-3 مرات مع 3 أحجام عمود بكل منها مثبت أس هيدروجيني ‎(MES‏ بعدئذ يحمل ‎V2‏ على العمود ويصفى 1.5 مرة مع

حجم حمل مثبت الأس الهيدروجيني ‎MES‏ في الاختيار الثاني؛ يتبادل مثبت الأس الهيدروجيني لأجل 1/2 عن طريق الديلزة طوال الليل في مثبت أس هيدروجيني ‎MES‏ تغمر مسبقا كاسيتات الديلزة في مثبت أس هيدروجيني ‎MES‏ ويحمل ‎V2‏ عن طريق حاقن إلى كاسيتات شريحة- أداة انحلال

‎(slide-a-lyzer cassettes) 0‏ 3.5 قطع جزيئي جرامي ‎(molecular weight cut-off)‏ ‎«(Thermo Scientific, 66130) (MWCO)‏ طوال الليل عند 4"مئوية في أباريق سعتها 10 لتر مع مثبت أس هيدروجيني ‎MES‏ مرشح بالتعقيم. في الاختيار الثالث؛ يتبادل مثبت الأس الهيدروجيني لأجل ‎V2‏ مع مثبت الأس الهيدروجيني ‎MES‏ من خلال عمود ترشيح هلام 6-25 ‎Sephadex‏

‏5 (6-25-80 ,519018)؛ ويتزن مع مثبت أس هيدروجيني ‎MES‏

‏تجرى إزالة ‎sialylation‏ على 72 متبادل مثبت الأس الهيدروجيني مع

‎750 ‏في‎ agarose ‏يزود منتج الخرزة‎ .)519018 N5254) neuraminidase-agarose ‏خليط ملاطء يخزن في مثبت أس هيدروجيني سلفات أمونيوم؛ تغسل الخرزات مسبقا 5-3 مرات‎ ‏يفصل خليط الخرزات/ مثبت الأس الهيدروجيني عن طريق‎ (MES ‏في مثبت أس هيدروجيني‎

‏0 الطرد المركزي عند 1000 قوة طرد مركزي نسبية ‎(rf) (relative centrifugal force)‏ لمدة 3 دقائق عند 4"مثوية؛ ويزال السائل الطافي بأداة ماصة ويتم التخلص منه. إلى الخرزات المغسولة؛ يضاف ‎V2‏ متبادل مثبت الأس الهيدروجيني ويخلط برفق عن طريق التدوير عند درجة حرارة الغرفة لمدة 16 إلى 22 ساعة. يستخدم 2.08 ملليلتر من الخرزات المعبأة لكل مجم بروتين من أجل إزالة 5817/18100؛ للتحضير على نطاق أوسع؛ يقل هذا بنسبة 1: 10؛ إلى 0.208 ملليلتر

‏5 .من الخرزات لكل مجم من البروتين. بعد ذلك» يسترجع ‎V2‏ مُزال ‎sialylated‏ عن طريق الطرد

المركزي وبسحب بأداة ماصة. تغسل الخرزات مرة واحدة برفق لمدة 5 دقائق عن طريق التدوير في ‎ :1‏ بالحجم من مثبت أس هيدروجيني ‎MES‏ حديث؛ يطرد مركزيا خليط الغسل كما سبق وتجمع المادة الطافية مع ‎V2‏ أخيرا تُزال الخرزات سواء عن طريق الترشيح بالتعقيم خلال مرشح حاقن 2 ميكرون أو عن طريق الترشيح بالشفط من خلال مرشح 0.45 ميكرون.

تجرى عدة دورات من إزالة توكسين داخلي مع راتنج ‎.(Hyglos) EndoTrap HD‏ يغسل الراتتج 5-3 مرات في مثبت أس هيدروجيني ‎MES‏ وبتم التخلص من مثبت الأس الهيدروجيني للغسل. في دفعتين» يخلط برفق 3-1 ملليلتر من الراتنج المغسول مع ‎V2‏ مُزال ‎sialylated‏ ‏طوال الليل عند درجة حرارة الغرفة. يُزال الراتنج عن طريق الطرد المركزي وبعدئذ يرشح من خلال حاقن أو مرشح شفط.

يركز 2/ المُزال ‎sialylated‏ 4.75 ضعف إلى 2.1 مجم/ ملليلتر عن طريق الطرد المركزي في ‎Ultracels‏ لدورات 10 دقائق؛ ‎Lalas‏ المواد المركزة برفق عن طريق التوزيع بأداة ‎dale‏ لتقليل أي تكتل عند السطح البيني لمرشح البروتين.

يفصل إضافيا ‎V2‏ المُزال ‎sialylated‏ من أنواع وزن جزيئي جرامي أعلى (وتوكسين

داخلي متكتل) مع عمود مستثنى المقاس 200 ‎Superdex‏ 26/60 1111080. يُطهر مسبقا

5 العمود والنظام ‎AKTA ill‏ مع 0.1 عياري ‎[EtOH 720 + NaOH‏ يتعادل الأس الهيدروجيني للنظام؛ يشطف النظام بالماء؛ ويتزن مع مثبت أس هيدروجيني لمستحضر 2/ معاد تشكيله ومتجمع. تحقن يدويا دفعات متعددة من المادة المركزة في حلقة عينة 12 ملليلتر وتحمل على عمود مستثنى المقاس عند معدل تدفق 3 ملليلتر/ دقيقة؛ تسترجع مادة التصفية وتجزأ مع ‎Frac-900‏ في أنابيب ‎x 17) polystyrene‏ 100 مي 150610800 ‎.(14-956-6D‏

0 مبكراء تستثنى ذروات عالية الوزن الجزيئي الجرامي وتجمع الكسور ‎V2‏ المطلوبة وتختبر من أجل مستويات التوكسين الداخلي والتركيز باستخدام ‎Charles River 0005816 PTS‏ ‎.NanoDrop ND-1000‏ يستخدم مثبت الأس الهيدروجيني ‎١/2‏ لتصفية ‎V2‏ مُزال ‎.sialylated‏

تجرى خمس دفعات من استثناء المقاس وتجمع مواد التصفية المتجمعة في دفعة واحدة التي تركز إلى 1 مجم/ ملليلتر في 5ا8086ال. يرشح بالتعقيم المستحضر النهائي من خلال مرشحات حاقن 0.2 ميكرون ويختبر من أجل التوكسين الداخلي ‎Silly‏ + يوزع ‎slab‏ ماصة 1 ملليلتر من القواسم التامة في أنابيب معلمة سعتها 2 ملليلتر )72.694.006 ‎(Sarstedt,‏ يجمد

بالوميض في ‎fethanol dads‏ تلج جاف؛ ويخزن في صندوق معلم عند -80"مئوية حتى

الاستخدام. تمييز - تحليلات بروتين واختبار في المعمل

تتميز مادة التحضير النهائية بالإضافة إلى المادة البادئة غير المعالجة بتحليل هلام بروتين مع 712-4 ‎(Novex NPO335BOX) 815-105 NUPAGE‏ في مثبت أس

0 مهيدروجيني للتشغيل ‎MES‏ وباستثناء مقاس تحليلي (عمود ‎(TSK3000‏ مثبت أس هيدروجيني للتشغيل: 200 مللي جزيئي جرامي ‎KH2PO4‏ 150 مللي جزيئي جرامي ‎KOI‏ أس هيدروجيني 6.8 معدل تدفق: 0.15 مللليتر/ ‎dads‏ كشف استشعاع). تحلل عينات الاختبار الصغيرة بواسطة ‎LC-MS‏ من أجل محتوى ‎sialic acid‏ على سلسلة ثقيلة من العامل ‎VIE‏ بالإضافة إلى تحديد كمية ‎sialic acid‏ معلم مع ‎DMB‏ لإجمالي البروتين باستخدام المجموعة ‎Takara Bio‏

‎Inc. 5‏ المناقشة هنا. يختبر النشاط عن طريق تنشيط العامل ‎X‏ المعتمد على ليبيد فوسفوري واختبارات توليد ‎thrombin‏ ‏تحليل محتوى ‎Sialic Acid‏

‏تستخدم طريقة ‎LC-MS‏ لتعيين ‎sialic acid‏ على ‎N-glycan‏ من السلسلة الثقيلة للعامل ‎VIE‏ من أجل المقارن غير المعالج والعامل ‎VII‏ غير المُزال ‎sialylated‏ يختزل 10

‏0 ميكروجرام من البروتين مع 10 ‎Ada Me‏ جرامي من خليط ‎DTT‏ عند 37 "مئوية لمدة 30 دقيقة ويعدتذ يحلل على النظام ‎:Agilent 1200 Capillary LC‏ العمود: ‎PLRP=S‏ 8 ميكرومتر 4000 أنجستروم» 0.3 ‎cae 150 X‏ 75”مئوية. أنظمة مثبت أس هيدروجيني: (أ): ‎sk‏ مع 70.2 ‎¢TFA 70.01 + Formic Acid‏ (ب): ‎ACN‏ مع 70.2 ‎Formic Acid‏ +

— 3 4 — ‎TFA 70.01‏ مستوى متدرج: 50 ميكرولتر/ دقيقة؛ 710 (ب) في دقيقتين؛ إلى 790 (ب) في ‎«dads 5‏ 790 (ب) غسل 5 دقائق» 710 (ب) اتزان لمدة 5 دقيقة. نظام ‎Q-TOF‏ 6520 911601: مصدر ‎DualEsi‏ درجة حرارة غاز: 350 "مئوية؛ غاز تجفيف :7 رطل لكل ‎das‏ رذاذ :10 رطل لكل ‎das‏ نطاق الفحص : 3000-500 وحدة كتلة ‎cy)‏ 1 طيف/ ثانية. الأيونات المرجعية: 1221.990637 و2421.91399 وحدة كتلة ذرية؛ نافذة 50 جزءِ في المليون» عداد 1000 بحد أدنى. يذكر شكل 7 النتائج. تحديد كمية 8010 ‎Sialic‏ باستخدام مجموعة تعليم ‎DMB.‏ ‏تكون مجموعة تعليم استشعاعية ‎(Takara Bio Inc., Cat#4400) Sialic Acid‏ من أجل التحليل الكمي وعالى الحساسية بدرجة كبيرة لمتقارنات ‎.sialoglyco‏ تقنية التعليم الاستشعاعية ‎Sialic Acid‏ المعتمدة على ‎HPLC‏ باستخدام ‎1,2—-diamino—4,5—-‏ ‎(DMB) methyleneoxybenzene‏ هي طريقة كميّة بسيطة وحساسة بدرجة كبيرة. في هذه ‎da lal‏ تحلل ‎sialic acids‏ حرة عن طريق ‎HPLC‏ طور معكوس ‎(GlycosepR, from‏ ‎Glyko, # 1-4727)‏ بعد التعليم بواسطة ‎DMB‏ ‏5 الاستنتاج يكون للسلسلة الثقيلة ‎V2‏ موقعين ‎N—glycans .N—glycosylation‏ هى بنيات ثنائية؛ ثلاثية ورياعية ‎sialylated fucosylated‏ ثقيلة. لم يتم العثور على ‎sialic acids‏ طرفية في العينة المُزالة ‎csialylated‏ التي تقترح أن تكون العينة مُزالة ‎sialylated‏ بالكامل ‎aly‏ تمت ‎all)‏ > 9 من ‎sialic acid‏ على ‎N-glycan‏ من العامل ‎MIE‏ ‏20 اختبار عمر النصف باستخدام خلايا كبدية بجرذ تحضير الخلايا الكبدية

نحصل على خلايا ‎LAS‏ من جرذ رئيسي محفوظة بالتجميد من ‎CellzDirect‏ ‎1X5. (Invitrogen)‏ كل قارورة محتوية على تقريبا 5 مليون خلية وتضاف الخلايا إلى 10 ملليلتر من وسط الإذابة؛ يليها الطرد المركزي عند 60 ثقل نوعي لمدة 3 دقائق. يعاد تعليق الخلايا في وسط تحضين + 70.25 ‎BSA‏ (حوالي 4 ملليلتر) ‎ads‏ الخلايا باستخدام عداد الكريات ‎.(hemacytometer)‏ تعد الخلايا القابلة للحياة بعد التلطيخ مع أزرق ‎Trypan‏ لتعيين الخلايا الميتة. تكون قابلية حياة ‎WAY‏ بنسبة 782-80. تستخدم الخلايا في اختبار تصفية مباشرة بعد العد. وسط الإذابة: ‎Invitrogen CM3000 Thawing/Plating Supplement Pack‏ مضاف إلى 500 ملليلتر وسط ‎Williams E‏ وسط التحضين: ‎Invitrogen CM4000 Cell‏ ‎Maintenance Supplement Pack 0‏ مضاف إلى 500 ملليلتر وسط ‎Williams E‏ اختبار تصفية خلية كبدية في المعمل تحضن الخلايا الكبدية بجرذ رئيسي؛ 1 مليون خلية ‎ALE‏ للحياة لكل ملليلتر» مع 25 نانوجرام/ ملليلتر من العديد من الأشكال المختلفة للعامل ‎VII‏ في وسط تحضين ‎CellzDirect‏ + ‎(BSA 70.25‏ في أنابيب ‎Eppendorf‏ مع خلط نهائي برفق عند 37"مئوية في حجم باديء من 5 1.2 ملليلتر. عند كل من النقاط الزمنية المحددة؛ يُزال 0.25 ملليلتر من الخليط ويطرد مركزيا مباشرة لتكوير ‎LIAN‏ )1000 دورة في الدقيقة؛ 3 دقائق في الطرد المركزي ‎(Eppendorf‏ يُزال 8 مليلتر من المادة الطافية الموضحة؛ يجمد بسرعة ويخزن طوال الليل عند -860"مئوية. في اليوم التالي» تتحدد كمية العامل ‎VII‏ في المواد الطافية باستخدام اختبار ‎ELISA‏ الذي يستخدم فيه البروتين الطفري المنقى المقابل كمعيار. لا تستخدم مواد طافية مقارنة للخلية التي تحضن فيها 0 الأشكال المختلفة للعامل ‎VII‏ لمدة ساعتين عند 37"مئوية في وسط بمفرده كقيم للنقطة الزمنية صفر. يجرى كل تحضين في ثلاث نسخ. تحسب قيم التصفية الجوهرية اعتمادا على طريقة ‎Lu‏ ‏وآخرين ‎(Lu ref.)‏ باستخدام المعادلة: ‎Clint = 0.693 / in vitro T1/2,‏

تكون طبيعية من أجل حجم التحضين وعدد الخلايا. يحسب عمر النصف (11/2) في المعمل باستخدام البرنامج ‎Laas. (Pharsight Corporation, Sunnyvale, CA) WinNonLin‏ المواد الطافية من عمليات تحضين الخلية الكبدية باستخدام شكل ‎ELISA‏ لإقحام الجسم المضاد المزدوج. يضاف 0.1 ملليلتر لكل عين من الجسم المضاد أحادي النسخ مضاد للعامل ‎VII‏ )1

ميكروجرام/ ملليلتر؛ في ‎(PBS‏ إلى أطباق 655061 ‎Greiner Microlon‏ بها 96 عين. بعد التحضين طوال الليل عند 4"مئوية؛ تحجب الأطباق مع 0.2 ملليلتر لكل عين من 71 مثبت أس هيدروجيني مانع ‎casein‏ )50 مللي جزيئي جرامي ‎11157160١‏ 100 مللي جزيئي جرامي ‎«(NaCl‏ ‎Tween 20 70.05‏ أس هيدروجيني 7.2) لمدة ساعة ونصف عند 37"مئوية. تغسل الأطباق ‎ao)‏ مرات 0.3 ملليلتر لكل ‎Tween 20 70.05 + PBS (pe‏ (باستخدام أداة ‎Jue‏ أطباق

‎«(BioTek ELx405 0‏ ويعدئذ يضاف مقياس العامل ‎VIE‏ ذات الصلة والعينات غير المعروفة إلى الأطباق. يخفف 0.18 ملليلتر من كل مادة طافية بخلية كبدية ضعفين عن طريق إضافة 0.18 ملليلتر من مثبت أس هيدروجيني للتخفيف (50 مللي جزيئي جرامي ا7115110؛ 100 مللي جزيئي جرامي ‎Tween 20 70.05 «casein 70.1 (NaCl‏ أس هيدروجيني 7.2). يضاف 0.1 ملليلتر من كل ‎sale‏ طافية مخففة في ثلاث نسخ على الطبق ‎(ELISA‏ تجرى القياسات من الشكل

‏5 المختلف للعامل ‎VII‏ المنقى المقابل المخفف في مثبت أس هيدروجيني للتخفيف. يجرى ضعفين تخفيفات متسلسلة للمقياس في مثبت أس هيدروجيني للتخفيف لإنتاج تخفيفات في نطاق تركيز نهائي من 50 إلى 0.8 نانوجرام/ ملليلتر. تحضن قياسات العامل ‎VIE‏ والعينات (0.1 ملليلتر لكل عين) لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة (21"مثوية). تغسل الأطباق أريع مرات حسب الوصف ‎code]‏ ويعدئذ يضاف جسم مضاد للكشف ‎biotinylated‏ 1 ميكروجرام/ ملليلتر في مثبت أس

‏0 مهيدروجيني للتخفيف (50 ‎Ale‏ جزيئي جرامي ‎115110١‏ 100 مللي جزيئي جرامي ‎(NaCl‏

‏1 88800؛ 70.05 20 ‎Tween‏ أس هيدروجيني 7.2) (0.1 ملليلتر لكل عين) يليه التحضين لمدة ساعة ونصف عند درجة حرارة الغرفة. تغسل الأطباق أريع مرات حسب الوصف ‎code]‏ ويعدئذ يضاف ‎«ls Jad —Streptavidin peroxidase‏ يخفف 1000/1 في مثبت أس هيدروجيني للتخفيف (0.1 ملليلتر لكل عين) يليه التحضين لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة

‏5 الغرفة. تغسل الأطباق مرة أخرى ويضاف ‎(Ultra-TMB‏ 0.1 ملليلتر لكل عين. بعد التحضين لمدة 10 إلى 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة؛ يتوقف التفاعل بإضافة 0.05 ملليلتر لكل عين 2

جزيئي ‎(H2804 aha‏ يقرأ الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قاريء طبق ‎Molecular‏ ‎Spectramax 2‏ 0617/1065. يجرى تحليل البيانات باستخدام 5.4 ‎Softmax Pro‏ (أدوات جزيئية جرامية ‎.((Molecular Devices)‏ تكون الخلايا الكبدية لجرذ المحفوظة بالتجميد؛ وسط الإذابة؛ ووسط التحضين ‎(CellzDirect) 5‏ من ‎(Grand Island, NY) Invitrogen/Life Technologies‏ . تكون الطبقة التحتية ‎1-Step Ultra-TMB‏ (خطوة واحدة)»؛ رقم الفهرس: 34028( من ‎Thermo‏ ‎(Rockford, IL) Scientific‏ يكون ‎Jas —Streptavidin peroxidase‏ حار ‎«(SA-HRP)‏ ‏رقم الفهرس: 07998] من ‎.MN (Minneapolis (R&D Systems‏ يكون المحلول الملحي ثابت الأس الهيدروجيني مع الفوسفات؛ أس هيدروجيني 7.2 من ‎(Carlsbad, Invitrogen‏ ‎.CA) 0‏ تكون بلازما جرذ ‎Sprague-Dawley‏ (75 مضاد ‎(sodium citrate jas‏ من ‎(Westbury, NY) Bioreclamation‏ نحصل على أطباق ‎(cat. no.

Greiner Microlon‏ )655061 من خلال ‎.(Pittsburgh, PA) Fisher Scientific‏ طرق للحصول على أشكال مختلفة مُزالة ‎:glycosylated‏ أشكال مختلفة جزيئية جرامية يكون للعامل ‎Vila‏ من النوع البري اثنين ‎N322) N-glycans‏ و81145)؛ ويكون لكل من 0/1 و2/ أربعة من ‎(N106) N-glycans‏ 1145 1253 01322). يتعين أصليا 2 ‎N=‏ ‏5 إضافيين ‎(N235 (N106)‏ الموجودين في ‎VI‏ و72 لزيادة عمر النصف. لهذا الإجراء» تُزال هذه المواقع عن طريق استرجاعها مرة أخرى إلى ترتيب الحمض الأميني داخلي المنشاً للعامل ‎VII‏ من النوع البري ‎(T106)‏ 253/). بعدئذ يُزال موقعين ‎N=glycan‏ داخليين ‎(N322 5 N145) Lal‏ عند المستوى ‎DNA‏ عند طريق المعالجة الهندسية في الطفرات ‎N>Q‏ ‏0 عند هذه المواقع. (شكل 6). يستنسخ عامل ‎VII‏ من نوع بري إلى ‎pmCMV‏ لعمل ‎.pMBI13‏ تخلق مقحمات محتوية على طفرة من لا إلى © فردية عند المواضع 88145 أو 322 بالإضافة إلى الطفرة المزدوجة )145 88 و322) وتستنسخ إلى 00/8113 باستخدام الموقع ‎Pmll y Xbal‏ الناتج في النسخ ‎.pMB114-116‏ بعدئذ تستنسخ المقحمات التي تشفر مجالات السيطرة ‎Gla‏ من 1 و72 إلى

‎pMB113-116‏ باستخدام ‎Afel 5 Ascl‏ الناتجين في البنيات ‎pMB117-120‏ (أشكال مختلفة معتمدة على ‎pMB121-124 5 (V1‏ (أشكال مختلفة معتمدة على 2/). يتم التحقق من ترتيب كل البنيات ‎(McLab)‏ ينقل حامل الجين من العائل بخلايا ثديية ‎dad)‏ خلية مشتق من ‎(CHO‏ ‏بصورة عابرة من خلال التثقيب الكهربي مع كل بنية في شكل له 6 عيون. بعد 4 أيام من انتقال حامل الجين من العائل؛ تجمع المادة الطافية وتختبر عن طريق بقعة ‎Western‏ من أجل

الإظهار؛ ثم ‎(AssayPro) 1/11 ELISA‏ واختبار نشاط ‎(FVII‏ بعدئذ تستنسخ مجموعة فرعية من الأشكال المختلفة كخلية فردية. ينقى الشكل المختلف ‎V2 2-Nglycan‏ المشار إليه على أنه 1 وبتم تنشيطه من أجل تحليل إضافي. طريقة من أجل تنقية/ تنشيط 1/118 من إظهار ‎dase‏ 10 لتر

0 ملخص الطريقة متعددة الخطوات تجرى خلال عدة أيام. يُذاب الوسط أولا وبطرد مركزيا لإزالة أي تكتل يمكن تشكيله أثناء التجميد/ الإذابة. تستخدم خطوة التقاط انجذاب زائف باستخدام عمود تبادل أنيون ‎(Q-Sepharose)‏ مصفى مع 08012 لتركيز بروتين ‎FVII‏ إضافيا ولتغيير مثبت الأس

5 الهيدروجيني. بعد ذلك؛ يستخدم عمود ‎hydroxyapatite‏ لتنقية البروتين ‎FVII‏ إضافيا. بعدئذ يستخدم عمود ‎Q-Sepharose‏ أصغر لتنقية ‎FVII‏ إضافيا قبل تنشيطه بزمن 24 ساعة في محلول عند أس هيدروجيني 8.2-8. يتوقف تفاعل التنشيط عن طريق تقليل الأس الهيدروجيني إلى 4. أخيرا تجرى ديازة على 1/118 في مثبت أس هيدروجيني للمستحضر (أس هيدروجيني 6.5) ويخزن بالتجميد.

يتميز البروتين المنقى النهائي مع ‎(ELISA (@aSEC (SDS-PAGE‏ تحليل سكري؛ توكسين داخلى؛ واختبار نشاط ‎FVia‏ ‎FVII ELISA‏

اختبار مناعي متصل مع إنزيم ‎-(Aniara, West Chester, Ohio) Zymutest FVII‏ يكون ‎ELISA‏ هو اختبار مناعي ثنائي الموقع مع جسم مضاد متعدد النسخ ضد ‎FVIE‏ أرنب

— 8 4 — مرتبط مع العيون من طبق دقيق به 96 عين. يتم إدخال العينة بعد اقتران جسم مضاد متعدد النسخ ضد ‎yl FVII‏ مع ‎peroxidase‏ فجل حار ‎.(HRP) (horse radish peroxidase)‏ تجرى الاختبارات باتباع تعليمات الصانع. باختصار؛ تخفف العينات والمعيار في مثبت أس هيدروجيني للاختبار في طبق تخفيف ‎polypropylene‏ مستدير القاع به 96 عين. ينقل 50

ميكرولتر من القواسم التامة للعينة المخففة إلى طبق مغلف مع مضاد ‎FVII‏ الأرنب المتوافر وبحضن لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة. يضاف 200 ميكرولتر من مضاد ‎FVII‏ بأرنب مقترن مع ‎HRP‏ ويحضن لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة. يغسل الطبق 5 مرات مع 0 ميكرولتر من مثبت الأس الهيدروجيني للغسل المتوافر. يضاف ‎TMB‏ عند 200 ميكرولتر/ عين وبحضن لمدة تقريبا 5 دقائق عند درجة حرارة الغرفة. يتوقف التفاعل عن طريق إدخال 50

0 ميكرولتر 0.45 جزيئي جرامي ‎sulfuric acid‏ يقرأ الامتصاص عند 450 نانومتر. تشتق مستويات العامل ‎VIE‏ عن طريق مقارنة قيم العينة مع منحنى معايرة ‎V2‏ متولد باستخدام تناسب منحنى رباعي المعيار . اختبار مولد للون العامل ‎VII‏

يستخدم اختبار مولد للون ‎.(Aniara, West Chester, Ohio) Biophen FVII‏ يشمل

5 أساسيا الاختبار المولد للون تشكيل معقد إنزيم متكون من العامل ‎VIE‏ من العينة و ‎thromboplastin‏ أرنب ‎dele)‏ نسيج) متوفر عن طريق الصانع. يتم تنشيط ‎(FX‏ المضاف بفائض؛ ليكون ‎(FXa‏ الذي يشق في المقابل طبقة تحتية مولدة للون خاصة ‎(SXa-11) FXa‏ بتوليد ‎LNA‏ تكون كمية هلام المطلقة متناسبة مباشرة مع نشاط ‎JFXa‏ يجرى الاختبار باتباع تعليمات الصانع. باختصار»؛ تخفف العينات والمعيار في مثبت أس هيدروجيني للاختبار ‎Tris=—‏

0 858 في طبق تخفيف ‎polypropylene‏ مسطح القاع به 96 عين ‎.(Fisher Scientific)‏ تدفاً العوامل الكاشفة للمجموعة؛ ‎(R1‏ 42ا؛ و43 وطبق اختبار ‎polystyrene‏ مستدير القاع به 96 عين ‎(Costar)‏ إلى 37"مئوية قبل الاستخدام. ينقل 30 ميكرولتر من العينة والمعيار من طبق تخفيف إلى طبق اختبار يليه 30 ميكرولتر من العامل الكاشف ‎Baas R2‏ 60 ميكرولتر من العامل الكشف 41. يخلط طبق الاختبار

5 ويحضن لمدة 7 دقائق عند 37"مئوية في جهاز رج طبق يعمل بالاهتزاز ‎(Boekel‏

(50160110. يضاف 60 ميكرولتر من ‎R3‏ وبقاس معدل تغير الامتصاص (التغير في الكثافة البصرية ‎OD‏ عند 405 نانومتر/ الدقيقة) عند 37 "مئوية باستخدام قاريء طبق دقيق ‎(Molecular Devices) SpectraMax Plus‏ تشتق مستويات العامل ‎VII‏ عن طريق مقارنة قيم العينة مع منحنى المعايرة ‎V2‏ المتولد باستخدام تناسب منحنى ‎ely‏ المعيار. اختبار توليد ‎thrombin‏ معتمد ليبيد فوسفوري

مقارنة مع 1/118 من النوع البري؛ تعديل مجال السيطرة ‎(P10Q/K32E) Gla‏ يزيد من فعالية تنشيط ‎(FX‏ توليد ‎thrombin‏ وتجلط الدم بالكامل في وجود ليبيدات فوسفورية أنيونية أو صفائح دموية مُنشطة كنتيجة إلى ‎y—carboxylation‏ إضافية. يتعين ‎TGA‏ المعتمد على ‎PL‏ ‏لقياس نشاط 11/118 في وجود ليبيدات فوسفورية أنيونية ويجرى باستخدام معيار ‎thrombin‏

0 وعامل كاشف بالطبقة التحتية؛ مجموعة ‎(FluCa‏ من 110000100500086 /81. تكون حويصلات الليبيد الفوسفوري ‎(PL)‏ المتكونة من 720 ‎«(PS) phosphatidylserine‏ 740 ‎(PC) phosphatidylcholine 740 5 «(PE) phosphatidylethanolamine‏ من ليبيدات قطبية ‎Avanti‏ وتحضر عن طريق الصوتنة في 100 مللي جزيئي جرامي ‎(NaCl‏ 50 مللي جزيئي جرامي ‎Tris—HCI‏ (أس هيدروجيني 7.2) لمدة 10 دقائق.

يوزع 20 ميكرولتر من حويصلات ‎PL‏ )500 ميكروجزيئي جرامي) أو معايير ‎thrombin‏ على أطباق بها 96 عين. تخفف التركيزات المختلفة لأجل 21/118 إلى بلازما ‎HemA‏ آدمي؛ مضاف في ثلاث نسخ إلى الخليط ‎PL‏ ويتزن إلى 37"مئوية لمدة 10 دقائق. ‎fag‏ تفاعلات توليد ‎thrombin‏ بإضافة محلول ‎FluCa‏ وتراقب التفاعلات باستمرار لمدة 60 دقيقة باتباع

0 الطريقة ‎(CAT) Calibrated Automated Thrombography‏ المحددة عن طريق ‎ThrombinoscopeBY‏ .25 الحصول على البيانات وتحلل باستخدام برنامج ‎«ThrombinoscopeBV (3.4.0)‏ الذي يصحح نشاط 02- جلوبيولين كبير باستخدام معيار ‎thrombin‏ يمثل "ارتفاع ذروة ‎"(peak height)‏ معامل التحليل أقصى مستوى لأجل ‎thrombin‏ المتولد؛ "جهد

‎thrombin 5‏ داخلي المنشاً ‎(ETP) "(endogenous thrombin potential)‏ مقابل إجمالي كمية

— 5 0 —

77 المتولد. تتحلل معاملات توليد ‎thrombin‏ مع طريقة تناسب منحنى غير رباعي المعيار باستخدام ‎.(GraphPad Inc) Prism 0‏ اختبار تنشيط ‎FX‏ معتمد على ليبيد فوسفوري

تقاس قدرة ‎FVlla‏ على تنشيط ‎FX‏ فى وجود حويصلات ليبيد فوسفوري بدون عامل نسيج باستخدام اختبار تنشيط ‎FX‏ معتمد على ‎PL‏ تحضن الأشكال المختلفة للعامل ‎Vila‏ أى ‎FVila‏ ‏مع ‎FX‏ في وجود حويصلات ليبيد فوسفوري . يقاس تنشيط ‎FX‏ بإضافة 5-5 3 طبقة تحتية ‎salsa‏ للون من أجل ‎JFXa‏ باختصارء تخفف العينات والمعيار في مثبت أس هيدروجيني للاختبار في طبق ‎polypropylene‏ مستدير القاع ‎Tris=HCI‏ يضاف 30 ميكرولتر من 4 ميكروجرام/

0 لتر ‎(Haematologic Technologies Inc.) FX‏ إلى كل العيون من طبق ‎polystyrene‏ ‏مسطح القاع به 96 عين يليه 30 ميكرولتر من حويصلات ليبيد فوسفوري متكونة من ‎(phosphatidylserine‏ 6ا600/ا11810م05م» و ‎phosphatidylethanolamine‏ عند نسبة وزن7 من 20: 40: 40. ينقل 30 ميكرولتر من العينة المخففة والمعيار إلى خليط ‎[FX‏ ‏ليبيد فوسفوري . يحكم غلق الطبق يخلط برفق ؛ وبحض لمدة 23-20 ساعة عند 37 “مثوية .

5 يضاف 40 ميكرولتر من 5 ‎(Me‏ جزيئي جرامي محلول 5-2765 ‎(DiaPharma)‏ إلى كل العيون. يحكم غلق الطبق ويحضن لمدة 6 ساعات 37"مثوية. يقرأ الامتصاص عند 405 نانومتر في قاريء طبق دقيق. يتحدد نشاط العينات عن طريق مقارنة مستويات تنشيط ‎FX‏ للعينات مع منحنى المعايرة ‎FT‏ ‏حيوانات دراسة ‎PK‏ جرذ 3 بروتوكول الدراسة (حقن مستحضرات ؛ أخذ عينة دم ومستحضرء؛

‎(ELISA 20‏ تحليل بيانات؛ قتل الحيوانات).

‏تتحدد البروتينات ‎VI V2 (FT)‏ 01/2 و017/1) داخل الوريد عند 0.1 مجم/ كجم في جرذان ‎.Sprague Dawley‏ تؤخذ عينات البلازما بعد دقيقة واحدة من الإعطاء وتحلل عن طريق ‎FVII ELISA‏ دراسة ‎HemA-PK‏

تعطى البروتينات ‎(FT)‏ 01/1) داخل الوريد عند 1 مجم/ كجم إلى ‎HemA hid‏ تؤخذ عينات البلازما بداية من الإعطاء بعد 5 دقائق وتحلل عن طريق اختبار ‎STF—5 FVII ELISA‏ ‎PT‏ ‎FVII ELISA‏ على عينات بلازما المواد تستخدم الأجسام المضادة أحادية النسخ ضد 1//18. علاوة على ذلك تجرى 07 لجسم مضاد أحادي النسخ واحد. تستخدم أشكال مختلفة ‎FVIla‏ منقاة (من نوع بري أو مُزال ‎(biotinylation‏ كمعايير اختبارات ومقارنات اختبار. يكون مثبت أس هيدروجيني ‎pile‏ بنسبة 71 (وزن/ ‎casein (aaa‏ في 30 مللي جزيئي جرامي ا1115110 أس هيدروجيني 0 7.2 60 مللي جزيئي ‎Tween 20 70.03 (NaCl aha‏ يكون مثبت أس هيدروجيني لتخفيف الاختبار ‎(ADB)‏ بنسبة 70.1 (وزن/ حجم) ‎Ak 50 «casein‏ جزيئي جرامي ‎TrisHCI‏ أس هيدروجيني 7.2 0.1 جزيئي ‎Tween 20 70.05 (NaCl aha‏ يكون مثبت أس هيدروجيني لغسل الاختبار هو ‎Tween 20 70.05 + PBS‏ تكون أطباق الاختبار المناعي هي أطباق عالية الارتباط ‎Greiner Microlon 5‏ (#6655061). يكون ‎—Streptavidin peroxidase‏ فجل حار ‎(SA-‏ ‎HRP)‏ من ‎.R&D Systems‏ يكون ‎Ultra-TMB‏ للطبقة التحتية ‎HRP‏ من ‎.ThermoFisher Pierce‏ نحصل على بلازما فأر بدون عقار من فأر ‎CDI‏ أو ‎HemA‏ سواء تجاريا ‎(Bioreclamation)‏ أو من خلال مصادر داخلية. يكون لكل المواد ‎«casein) GAY)‏ ‎(sulfuric acid «PBS (Tween-20 «NaCl «Tris‏ لها جودة درجة عامل كاشف. طريقة لاختبار مناعي إقحام ‎FVila‏ ‎Calis‏ أطباق اختبار بها 96 عين مع 0.1 ملليلتر/ عين من جسم مضاد ضد 51/118 1 ميكروجرام/ ملليلتر في ‎(PBS‏ طوال الليل عند 4"مثوية. تثقب الأطباق مع 0.2 ملليلتر/ عين من مثبت أس هيدروجيني عائق لمدة على الأقل ساعتين عند درجة حرارة الغرفة مع الدوران )150 دورة في الدقيقة). بعد الحجب؛ تغسل العيون 4 ‎X‏ 0.3 ملليلتر من مثبت أس هيدروجيني للغسل.

تخفف معايير أو عينات 1/118 1: 20 إلى تركيز نهائي 75 بلازما في ‎ADB‏ ويحضن 0.1 ملليلتر/ عين لمدة على الأقل ساعة ونصف عند درجة حرارة الغرفة مع الدوران. تقاس كل المقاييس؛ المقارنات؛ والعينات في عيون من ثلاث نسخ بعد غسل الأطباق كما هو موصوف مسبقاء يضاف جسم مضاد ‎biotinylated‏ ضد 1/118 42 نانوجرام ملليلتر في ‎ADB‏ 0.1

ملليلتر/ عين» وتحضن الأطباق لمدة ساعة واحدة على الأقل عند درجة حرارة الغرفة مع الدوران. تغسل الأطباق؛ ثم تحضن مع 187/00-1140م508؛ 1: 1000 في ‎ADB‏ تحضن لمدة ساعة واحدة على الأقل عند درجة حرارة الغرفة مع الدوران. بعد الغسل النهائي للطبق؛ تتطور العيون مع 1 ملليلتر/ عين من ‎Ultra—TMB‏ يتوقف التفاعل مع 0.05 ملليلتر/ عين من 2 > جرامي ‎sulfuric acid‏ تقرأ تفاعلات التوقف عند كثافة بصرية 450 نانومتر؛ وتحلل البيانات

0 وتعاير. يكون الحد الأدنى لتعيين الكمية ‎(LLOQ) (lower limit of quantitation)‏ أجل الاختبار نموذجيا 30-15 نانوجرام/ ملليلتر 1/118 في 7100 بلازما. اختبار ‎Jak PT‏ معتمد على عامل نسيج قابل للذويان ‎(sTF) (Soluble Tissue Factor)‏ لقياس نشاط ‎rFVIla‏ ‏يجرى اختبار زمن ‎(PT) (Prothrombin Time) Prothrombin‏ لقياس نشاط ‎rFVila‏ ‏5 آدمي في عينات بلازما فأر ‎HemA‏ خارج الجسم الحي. باختصار؛ يخلط 50 ميكرولتر من ‎die‏ محتوية على 710 من بلازما فأر ‎HemA‏ ‏7250 من بلازما ناقصة ‎FVII‏ آدمية ‎(George King Inc)‏ في مثبت أس هيدروجيني ‎aPTT‏ ‎Juss 0.15)‏ جرامي ‎(NaCl‏ 0.05 جزيئي جرامي 5 أس هيدروجيني 7.5 70.1 ‎(BSA‏ ‏مع 50 ميكرولتر عامل كاشف 517-11 ويحضن عند 37 مئوية لمدة 30 ثانية. يتكون العامل الكاشف 8517-1 من 1 حجم من 2 ميكروجزيئي جرامي ‎TF‏ قابل للذويان آدمي تخليقي ‎(STF1-221)‏ وحجم 1 من 8 ميكروجزيئي جرامي حويصلات ليبيد فوسفوري (0520:0640:040). يبدأ التجلط عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من 25 مللي جزيئي جرامي 2 وسجل زمن التجلط على أداة تحليل تخثر ‎.(Diagnostica Stago Inc) STA‏ تتكون المعايير من 21/118 (أشكال مختلفة ‎IRVIN‏ من نوع بري أو 171/118 ‎(Jas‏ مخفف 5 ضعفين بالتسلسل من 200 إلى 0.78 نانوجرام/ ملليلتر.

— 3 5 — فعالية ‎V2‏ مُزال ‎sialylation‏ في فأر لديه الناعور ‎(HemA) (I)‏ دراسة فعالية قطع ذيل حاد لتحديد فقد الدم» تخدر الفئران مع ‎isoflurane‏ وتوضع الذيول في 70.9 محلول ملحي درجة حرارته 38-37"مثوية في أنابيب بلاستيكية سعتها 15 ‎pile‏ لمدة 10 دقائق. يقطع الذيل عند 4 مم من الطرف بواسطة مشرط ويوضع مرة أخرى مباشرة في أنبوب بلاستيك سعته 15 ملليلتر مدفاً مسبقا منتفصل محتوي على 10 ملليلتر محلول ملحي . يترك الفأر ‎apd‏ بحرية خلال 0 دقيقة. يجرع ‎F7‏ و2/ مُزال ‎sialylation‏ داخل الوريد سواء بعد 5 دقائق أو قبل 15 و30 دقيقة من الإصابة بقطع الذيل. تتحدد كمية فقد الدم ‎JED‏ عن طريق وزن الأنابيب قبل وبعد تجميع الدم. 0 دراسة فعالية بتر وريد الذيل ‎(TVT) (Tail Vein Transection)‏ تجرع ‎HemA (ly‏ مع 77 أو ‎V2‏ مُزال ‎sialylation‏ عن طريق حقن وريد الذيل قبل ساعة واحدة أو بعد 5 دقائق من الإصابة ببتر وريد الذيل. يستخدم مخدر مناسب. يبتر وريد الذيل بشفرة مستقيمة من مشرط 811 8؛ وببداً التوقيت. بعدئذ يسترجع الفأر إلى قفص نظيف فردي خاص به له فراش من ورقة بيضاء ) ™ ‎(Versi-Dri‏ موضوع على قمة وسادة تسخين 4 ‎X‏ 8 5 بوصة. تراقب حالة نشاط الحيوان كل ساعة لمدة 9 ساعات متتالية وعند نقطة زمنية من 24 ساعة. يلاحظ أي فأر يُظهر علامات خفض مستوى النشاط على نموذج الشاشة ويقتل مباشرة أي فأر يُظهر علامات فرط فقد الدم. اختبار ‎—Thrombin‏ ضد ‎(TAT) (Thrombin-Antithrombin) Thrombin‏ فى بلازما فأر ‎HemA‏ ‏0 العوامل الكاشفة: )1( جسم مضاد للالتقاط: جسم مضاد متعدد النسخ ضد 177000510 من ‎Enzyme‏ ‎«Cat#TAT-EIA-C. (Research Labs‏ (2) جسم مضاد للكشف: جسم مضاد متعدد النسخ ضد ‎ATI‏ مقترن مع ‎(HRP‏ من ‎(Enzyme Research Labs‏ ناحظطاع- 028118 )3(

مادة مخففة للاختبار: من ‎«Cat#TAT-EIA-D (Enzyme Research Labs‏ )4( طبقة تحتية ‎Alpha—Thrombin (5) «cat#A12216 «Invitrogen <Amplex Red :HRP‏ من ‎«Enzyme Research Labs‏ ‎«Cat#HT-1002a‏ مخزن عند 45°80« )6( ‎:AT-Il‏ من ‎«Enzyme Research Labs‏ ‎«Cath HAT 5‏ مخزن عند -60"مئوية؛ )7( ‎:BSA‏ من ‎¢Cat# 2-7030 «Sigma‏ )8( بلازما ناقصة ‎(ATI‏ تم شراءها من ‎«Cat: AT-DP (Enzyme Research Labs‏ مخزن عند - 0 مئوية. مثبتات أس هيدروجيني )1( مثبت أس هيدروجيني قياسي ‎(TAT‏ 20 مللي جزيئي ‎aba‏ ا105-110؛ أس 0 هيدروجيني 7.4 0.15 جزيئي جرامي ‎«(NaCl‏ 1 مللي جزيئي جرامي ‎(EDTA‏ 0.05 وحدة/ ‎theparin lil‏ )2( مثبت أس هيدروجيني للتغليف: 1 قرص ‎bi-carbonate‏ + 100 ملليلتر ‎«dH20‏ مخزن عند 4"مثوية؛ )3( مثبت أس هيدروجيني ‎pile‏ 72 085-/85؛ )4( مثبت أس هيدروجيني لتخفيف العينة: يضاف 0.1 جزيئي ‎(HEPES aba‏ أس هيدروجيني 7.4 0.15 جزيئي جرامي ‎BSA 71 «(NaCl‏ 70.05 110/66020؛ مرشح وقاسم تام؛ يخزن عند -20"مئوية؛ (5) مثبت أس هيدروجيني للطبقة التحتية: يضاف 50 ميكرولتر من 5 مجم/ ملليلتر ‎Red‏ *8ام800؛ 20 ميكرولتر من 73 1202 إلى مثبت أس هيدروجيني ‎PBS‏ يخلط يحضر حديثا قبل الإضافة إلى الأطباق؛ (6) تحضير 1 ميكروجزيئي جرامي مخزون قياسي ‎(TAT‏ يضاف 100 ميكرولتر من ‎ATI‏ آدمي عند 1.36 مجم/ ملليلتر و5.93 ميكرولتر ‎al thrombin‏ عند 3.28 مجم/ ملليلتر إلى 419 ميكرولتر مثبت أس هيدروجيني ‎TAT‏ ‏20 يخلط» يحضن لمدة 20-10 دقيقة عند 37 مئوية؛ )7( تحضير 60 نانوجزيئي جرامي مخزون قياسي 1/81: يضاف 50 ميكرولتر من معقد ‎TAT‏ إلى 783 ميكرولتر بلازما ناقصة ‎ATI‏ ‎cls‏ قاسم تام من 50 ميكرولتر/ قارورة؛ يخزن عند -80"مئوية. إجراء الاختبار

— 5 5 —

)1( يخفف ‎pAb‏ ضد ‎awa) thrombin‏ مضاد للالتقاط) في مثبت أس هيدروجيني ‎bicarbonate‏ (تخفيف 1: 100: من أجل طبق واحد به 96 عين؛ يضاف 110 ميكرولتر من جسم مضاد إلى 11 ملليلتر من مثبت أس هيدروجيني ‎(bicarbonate‏

‎2HB Immulon 5‏ به 96 عين. يزود الطبق بسدادة برفق لضمان تغطية قاع الطبق بالسائل جميعه. يحكم غلق الطبق ويحضن طوال الليل عند 4"مئوية.

‏(3) يغسل 4 مرات مع 300 ميكرولتر مثبت أس هيدروجيني للغسل في جهاز غسل طبق أوتوماتي. بعد الغسل الأخير؛ يقلب الطبق ويُسد بمنديل ورقي نظيف.

‏)4( يضاف 150 ميكرولتر مثبت أس هيدروجيني ‎(BSA-PBS 72( wile‏ إلى كل

‏0 عين. يحكم غلق الطبق ويحضن عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة ونصف.

‏(5) يغسل 4 مرات مع 300 ميكرولتر مثبت أس هيدروجيني للغسل مع جهاز غسل طبق أوتوماتي. بعد الغسل الأخير؛ يقلب الطبق ويُسد بمنديل ورقي نظيف.

‏)6( يضاف 100 ميكرولتر من المقياس؛ العينة 5 ‎QC‏ كل عين في ثلاث نسخ وتحضن الأطباق عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة.

‏15 (7) يغسل 4 مرات مع 300 ميكرولتر مثبت أس هيدروجيني للغسل مع جهاز غسل طبق أوتوماتي. بعد الغسل الأخير؛ يقلب الطبق ويُسد بمنديل ورقي نظيف.

‏)8( يضاف 100 ميكرولتر من جسم مضاد للكشف عن ‎HRP‏ (100/1؛ يضاف 110 ميكرولتر من جسم مضاد إلى 11 ‎hile‏ مادة تخفيف تقارن)؛ إلى كل عين. يحكم غلق الطبق ويحضن ‎Baal‏ ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة.

‏20 (9) يغسل 4 مرات مع 300 ميكرولتر مثبت أس هيدروجيني للغسل مع جهاز غسل طبق أوتوماتي. بعد الغسل الأخير؛ يقلب الطبق ويُسد بمنديل ورقي نظيف.

— 6 5 — )10( يضاف 70 ميكرولتر من طبقة تحتية ‎Amplex Rd‏ (محضرة حديثا) إلى كل )11( يوضع الطبق في الظلام عند درجة حرارة الغرفة ويحضن لمدة 30-15 دقيقة. (12) يقرأ الطبق عند كثافة بصرية 485 نانومتر/ 595 نانومتر. (13) تتلاءم مقاييس مخطط له منحنى من ‎dan)‏ حدود؛ يحسب التركيز من المقارنات وكل عينة من المقياس في كل طبق ‎ELISA‏ ‏فعالية ‎V2‏ مُزال ‎sialylation‏ فى فأر عرضة للتخثر تجرى دراسة قطع ذيل حاد لتحديد فعالية 017/2 في فأر مكون التخثر. تخدر ‎oly‏ عرضة للتخثر مع 150101806 وتوضع الذيول في 70.9 محلول ملحي دافيء عند درجة حرارة 0 38-37 "مثوية في أنابيب بلاستيكية سعتها 15 ملليلتر لمدة 10 دقائق. بعد إعطاء 5 مجم/ كجم مُنشط ‎plasminogen‏ نسيج ‎(tPA)‏ داخل الوريد؛ يقطع الذيل عند 50 مم من الطرف بواسطة مشرط ويوضع مرة أخرى في أنبوب بلاستيك سعته 15 ملليلتر مدفاً مسبقا منفصل محتوي على ملليلتر محلول ملحي. يجرع ‎F7‏ و2/ مُزال ‎sialylation‏ داخل الوريد مباشرة بعد الإصابة بقطع الذيل. يترك الفأر لينزف بحرية خلال 45 دقيقة. تتحدد كمية فقد الدم بالمقياس ‎SE‏ عن 5 طريق وزن الأنابيب قبل وبعد تجميع الدم. النتائج تمييز بروتينات مُزال ‎sialylation‏ أو مُزال ‎glycosylation‏ فى المعمل تحلل السلسلة الثقيلة 01/2 بواسطة ‎.LC-TOF MS‏ يوضح التحليل أن ‎N-Glycans‏ ‏على السلسلة الثقيلة لا يحتوي على ‎sialic acid‏ بعد ‎dallas‏ 51810856. يتم تعقيد هذا التحليل 0 على السلسلة الخفيفة عن طريق وجود مجال السيطرة 8ا6. للحصول على صورة شاملة عن محتوى ‎sialic acid‏ من الجزيء المعالج» يجرى تعليم استشعاعي 8010 ‎Sialic‏ توضح هذه الطريقة ‎ally)‏ أكثر من 799.9 من ‎sialic acid‏ على ‎V2‏ أثناء عملية إزالة 5181/8100. يوضح شكل 7 تحليل ‎V2‏ مُزال ‎sialylation‏ من أجل محتوى ‎sialic acid‏ يستخدم ‎LC-TOF (das‏

وتعليم استشعاعي ‎Sialic Acid‏ يجرى تحليل محتوى ‎Sialic acid‏ على ‎dV1‏ أيضا مع نتائج مماثلة (بيانات غير موضحة). يختبر نشاط جزيئات مُزالة ‎sialylation‏ عن طريق كلا من ‎Xa Lapis‏ معتمد على الليبيد الفوسفوري واختبار ‎TGA‏ معتمد على الليبيد الفوسفوري. توضح اختبارات ‎PL-TGAy PL-Xa 5‏ أن نشاط البروتينات بعد إزالة ‎sialylation‏ لا يقل. (انظر شكل 9 وشكل 0). يوضح شكل 9 اختبار تنشيط ‎PL-FXa‏ على بروتينات مُزالة 718400ل58. يختبر ‎V1‏ ‏و1/ا مُزال ‎(dV2 »01/1( sialylation‏ من أجل النشاط باستخدام اختبار التنشيط ‎FXa‏ ‏الفوسفوري- الليبيد. يكون لكل من البروتينات مُزالة ‎sialylation‏ نشاط أعلى قليلا في هذا الاختبار مقارنة مع جزيئات أصلية غير مُعدّلة منها. يوضح شكل 10 اختبار ‎PL-TGA‏ على 0 البروتينات مُزالة ‎.sialylation‏ عن طريق ‎(PL-TGA‏ يُظهر 01/2 و ‎dV]‏ نشاط زائد قليلا عن الجزيئات الأصلية غير المُعدّلة منها. تتساوى النتائج مع الشكل 7. يوضح الاختبار 01-1768 بشكل مناسب ‎ab)‏ قابلة للقياس في ‎dV2 Lalas‏ 01/1 عن الجزيئات الأصلية غير المُعدّلة منها. توضح الجزيئات ‎V2 wiFVila‏ و1/ لها 00 منخفضة (شكل 11) وتختير كمستخلصات إظهار خام من أجل كل من الإظهار 5 والنشاط. يوضح شكل 11 إظهار أشكال مختلفة ‎FVII‏ ذات ‎glycosylation‏ منخفضة. تحلل عينات الوسط بعد 4 أيام من التثقيب الكهربي من أجل إظهار ‎FVII‏ يوضح تحليل بقعة ‎Western‏ باستخدام جسم مضاد مجال سيطرة ضد ‎Gla‏ إظهار الأشكال المختلفة. لا يوضح أن ‎ally)‏ المواقع ‎N-Glycan‏ تؤثر على النشاط عندما تتعادل من أجل مستويات الإظهار. يوضح شكل 12 تحديد "النشاط الخاص ‎"(specific activity) 0‏ للأشكال المختلفة ‎FVII‏ ذات ‎glycosylation‏ قليلة باستخدام مواد طافية ناقلة لحامل الجين من العائل. يختبر نشاط المواد الطافية الخام للإظهار من اثنين من انتقالات حامل الجين من العائل العابرة للأشكال المختلفة ذات ‎glycosylation‏ منخفضة عن طريق اختبار التنشيط ‎Xa‏ عند التعادل من أجل الإظهار حسب القياس بواسطة ‎ELISA‏ لا يلاحظ انخفاض في النشاط كنتيجة لإزالة 7080ا9-ل. كما هو متوقع في هذا الاختبار» يكون للبروتينات 5 1ل و7" نشاطات مماثلة بينما يكون للجزيئات 2/ نشاط ‎(Ji‏ كنتيجة لاستقلالية ‎TF‏ يوضح

هذا ‎Lila)‏ عن طريق اختبار النشاط ‎PL-TGA‏ المجرى على ‎glycosylation Lis V2‏ فقط مع ‎N322) 2N-Glycans‏ و01145) يشار ‎ad)‏ على أنه ‎pMB121‏ يوضح شكل 13 اختبار ‎PL-TGA‏ على شكل مختلف 01/8121 ذو ‎glycosylation‏ منخفضة منقى. عن ‎Gb‏ ‏اختبار 1©68-ا؛ يوضح 01/181212 نشاط ‎(pak‏ عن ‎FT‏ مماثل إلى ‎V2‏ غير مُعدّل. تختبر تصفية هذه الجزيئات في المعمل في نموذج تصفية خلية كبدية. يوضح 01/2 تصفية كبيرة في هذا النموذج عن ‎V2‏ غير المُعدّل (شكل 14)؛ بينما نرى زيادة طفيفة أو عدم زيادة في التصفية من أجل الأشكال المختلفة ذات ‎glycosylation‏ منخفضة (شكل 15). ‎PK; HemA PK‏ جرذ توضح الدراسات الدوائية الحركية في جرذان ‎Sprague Dawley‏ أن البروتينات المُزالة ‎sialylation 0‏ وذات ‎glycosylation‏ منخفضة توضح جوهريا أسرع من الأجزاء المقابلة غير المُعدّلة الخاصة بها حسب القياس عن طريق ‎(FVII ELISA‏ يوضح شكل 16 النتائج الدوائية الحركية بجرذ. تكون أعمار نتصف ‎V2‏ و 1/1 ذات إزالة ‎sialylation‏ أقصر بدرجة كبيرة من الجزيئات الأصلية غير المُعدّلة الخاصة بهم في جرذان ‎Sprague Dawley‏ حسب القياس عن طريق 5 58لا 11/ا. يكون هذا حقيقي من أجل ‎V2‏ مزال ‎V1 sialylation‏ مزال ‎«sialylation‏ ‎V2) (pMB121 4‏ ذو ‎glycosylation‏ منخفضة). يكون 11/2 من أجل كل من الجزبئات المُزالة 0 أقل من دقيقة واحدة بينما يكون 11/2 للبروتينات الأصلية الخاصة به تقريبا ساعتين ونصف. تصفية الجزيء ‎V2‏ ذو ‎glycosylation‏ منخفضة 01/8121 مكافئة إلى ‎F7‏ مع ‎t1/2‏ ‏بقيمة 1.6 ساعة. تكون دراسة ‎PK‏ في فثران ‎HemA‏ لها نتيجة ممائلة مع 01/2 و7 ‎Led‏ ‏0 أعمار نصف تقريبا 3 دقائق و2.6 ساعة؛ على التوالي (شكل 17()). يتم التأكد من عمر النصف القصير عن طريق اختبار تجلط 517-571 (شكل 17(ب)). يوضح شكل 17 نتائج ‎.HemA PK‏ يكون ‎jee‏ التصف لأجل ‎V2‏ مُزال ‎silylation‏ أقصر جوهريا من الجزيء الأصلي غير المُعدّل الخاص به في فثران ‎HemA‏ حسب القياس عن طريق (أ) ‎FVII ELISA‏ و(ب) الاختبار ‎STF-PT 5‏

نماذج فعالية ‎HemA‏ ‏يحتبر 01/2 في فثران ‎HemA‏ من أجل الفعالية. باستخدام نموذج قطع الذيل ‎(HemA‏ ‏يوضح أن 017/2 فعّال عند جرعة من 1 مجم/ كجم ‎dal)‏ داخل الوريد). عن طريق المقارنة؛ في هذا النموذج» تكون الجرعة ‎Aa‏ من أجل ‎FT‏ هي 2.5 مجم/ كجم (بلعة؛ داخل الوريد). توضح هذه النتائج أن 07/2 أكثر فعالية من 77 (الشكل 18()). يستخدم أيضا هذا النموذج ليبين أن فعالية 01/2 توضح أسرع من ‎FT‏ (الشكل 18(ب)). يوضح شكل 18 نتائج فعالية ‎V2‏ مُزال ‎sialylation‏ في فتئران ‎HemA‏ توضح الدراسات مع 01/2 أن هذا الجزيء (أ) أكثر فعالية و(ب) له تصفية فعالة أسرع من ‎FT‏ في نموذج قطع الذيل ‎HemA‏ ‏باستخدام النموذج 17/1 الأكثر حساسية؛ توضح أيضا تصفية 01/2 الأسرع فعالية من 0 7 وبتم التأكد من الجرعة الفعالة. يوضح شكل 19 دراسة فعالية 01/2 في نموذج 11/1 ‎.HemA‏ إن دراسات ‎TVT‏ باستخدام نموذج فعّال ‎(TVT)‏ مع حساسية ‎Jel‏ تثبت أن 07/2 له تصفية ‎Ald‏ أسرع من 7. قياسات ‎Thrombin‏ مضاد ‎(TAT) Thrombin‏ كعلامة على تكوين الجلطات المجراة بعد 30 و60 دقيقة من الإعطاء في فتئران ‎HemA‏ توضح مستويات أقل جوهريا من أجل 01/2. يوضح شكل 20 قياسات ‎TAT‏ في فثران 1600/8 فإن 017/2 المعطى عند 5 جرعة ‎dad‏ منه )1 مجم/ كجم) يولد ‎Thrombin‏ مضاد ‎(TAT) Thrombin‏ أقل من الجرعة الفغالة من 77 (2.5 مجم/ كجم). تقترح هذه البيانات؛ المأخوذة مع بيانات الفعالية؛ أن 017/2 له مؤشر ‎ade‏ أكثر ملاءمة من ‎FT‏ ‏الفعالية في فتران معرض للتخثر يختبر 01/2 في فئران معرضة للتخثر معالج مع ‎tPA‏ من أجل الفعالية. باستخدام نموذج 0 قطع الذيل» يوضح أن ‎dV2‏ فعّال عند جرعات من صفر-0.3 مجم/ كجم (بلعة؛ داخل الوريد). عن طريق المقارنة؛ في هذا النموذج» تكون الجرعة الفعّالة من أجل ‎FT‏ هي 5 مجم/ كجم ‎dal)‏ ‎Jal‏ الوريد). توضح هذه النتائج أن 07/2 أكثر فعالية من 77 (الشكل 21). يوضح شكل 21 نتائج دراسة فعالية ‎V2‏ مُزال 5817/181007 في فثران معرضة للتخثر معالج مع ‎APA‏ ‏تصفية وفعالية عامل ‎VII‏ من نوع بري مُزال ‎(dWT Vlla) sialylation‏

ينتج عامل ‎VII‏ من نوع ‎(gy‏ مُزال ‎(AWT Vila) sialylation‏ حسب الوصف ‎hel‏ ‏باستخدام ‎NovoSeven®‏ ناتج من ‎Novo Nordisk‏ كمادة بادئة للعامل ‎VII‏ وتجرى إزالة 0 لعديد الببتيد الباديء باستخدام إنزيم ‎sialidase‏ قابل ‎(lsd‏ حسب الوصف أعلاه. وجد أن ‎AWT Vila‏ له نقاء > 799؛ توكسين داخلي منخفض؛ و8610 ‎sialic‏ لا يمكن الكشف عنه. ‎Lila)‏ يوضح تحليل مقياس طيف ‎AS‏ إزالة انتقائية لأجل ‎sialic acid‏ يتحلل نشاط هذه المادة 1/118 ‎dWT‏ وتقارن مع العامل ‎VIE‏ من النوع البري باستخدام اختبار ‎alge‏ للون ‎Biophen FVII‏ واختبار ‎«Jak PT‏ حسب الوصف أعلاه. يوضح كل من هذه التحليلات أن 1/118 01//1 له نشاط متماثل تقريبا مع عديد الببتيد للعامل ‎VIE‏ من النوع البري. تحلل أيضا تصفية ‎Vila‏ 01//1 وعامل ‎VII‏ من النوع البري )1 مجم/ كجم) وتقارن 0 باستخدام نموذج فأري مصروع عامل نسيج ‎(TFKI)‏ آدمي. كما هو مبين في الشكل 22؛ يكون عمر نصف ‎AWT Vila‏ أقصر جوهريا من العامل ‎VIE‏ من النوع البري وتكون التصفية (ملليلتر/ ساعة/ كجم) أسرع بأكثر من 40 مرة. يتم التحقق من فعالية ‎Vila‏ 1//ا0 مقارنة مع العامل ‎VII‏ من النوع البري باستخدام فئران ‎TFKI‏ وطريقة ‎add‏ الذيل الموصوفة أعلاه. باختصار؛ يحقن 5 مجم/ كجم من ‎tPA‏ داخل الوريد 5 في ‎chal‏ ثم يقطع 50 مم من الذيل من الطرف. بعدئذ يحقن داخل الوريد العامل ‎VIE‏ من النوع ‎(NovoSeven®) (al‏ أو ‎WT Vila‏ مع جرعات تتراوح من 6-1 مجم/ كجم. بعدئذ يجمع الدم من الذيل لمدة 45 ‎dada‏ مع تمزق جلطات غير ثابتة كل ست دقائق خلال فترة التجميع. كما هو مبين في شكل ¢23 وجد على نحو مثير للدهشة أن ‎AWT Vila‏ أكثر فعالية من العامل ‎VIE‏ ‏من النوع البري. بصفة خاصة ‎«SST‏ يؤدي 3 مجم/ كجم من ‎Vila‏ 01//1 إلى خفض فقد الدم مقارنة مع جرعة 6 مجم/ كجم من عامل ‎VIE‏ من النوع البري. بتوفير نتائج من هذا التحليل؛ يتحدد أن 2 مجم/ كجم ‎AWT Vila‏ هو جرعة مكافئة حيوبا إلى 6 مجم/ كجم من العامل ‎VIE‏ من النوع البري. يتم التحقق أيضا من قدرة ‎Vila‏ 1//ا0 والعامل ‎VII‏ من النوع البري ‎(NovoSeven®)‏ ‏على تسبب تخثر جهازي بواسطة طريقة ‎Thrombin‏ ضد ‎(TAT) Thrombin‏ الموصوفة أعلاه.

تعالج الفئران مع جرعات مكافئة حيويا من ‎Vila‏ 01//1 )2 مجم/ كجم) والعامل ‎VII‏ من النوع البري )6 مجم/ كجم) وبعدئذ يقاس تشكيل معقدات ‎TAT‏ عن طريق ‎WSLELISA‏ هو مبين في ‎Jal‏ 24؛ يولد العامل ‎VII‏ من النوع البري ‎NovoSeven®‏ مستوى ‎TAT‏ أعلى جوهريا من ‎.dWT Vila‏ تتحدد حقيقة أن ‎Vila‏ 01//1 يولد فقط مستويات ‎TAT‏ بخط القاعدة؛ تقترح هذه التجرية أن هذه الجرعة من ‎Vila‏ 01//1 لا تنتج تخثر جهازي ملاحظ؛ على الرغم من حقيقة أن عديد الببتيد فعّال مثل العامل ‎VII‏ من النوع البري. إضافيا» يتم التحقق أيضا من قدرة ‎Vila‏ 01//1 والعامل ‎VIE‏ من النوع البري ‎(NovoSeven®)‏ على تسبب تشكيل جلطة في نموذج جلطة 6013. تعالج ‎Gl‏ مع جرعات مكافئة حيويا من ‎dWT Vila‏ )2 مجم/ كجم) والعامل ‎VII‏ من النوع البري )6 مجم/ كجم) قبل 0 15 دقيقة من بداية دراسة الجلطة. بعدئذ يبدأ التجلط عن طريق إعطاء 73.25 من محلول 53 ) ويعدئذ يقاس تشكيل الخثرة عن طريق ‎Doppler‏ لمدة 30 دقيقة. تخطط بيانات تدفق الدم الناتج على رسم بياني لتدفق الدم مقابل الزمن ويعدئذ تحسب النسبة المثوية للمساحة تحت منحنى عينة المقارنة لتحديد الخفض في تدفق الدم الذي يسببه تشكيل الجلطة من أجل كل من مجموعات معالجة العامل ‎VI‏ كما هو موضح في الشكل 25؛ يولد العامل ‎VII‏ من النوع البري ‎NovoSeven® 5‏ تدفق دم منخفض جوهريا (متوسط تقريبا 740)؛ بينما يوضح ‎dWT Vila‏ تقريبا عدم انخفاض في تدفق الدم (متوسط > 790). توضح هذه التجرية أن الجرعة المحددة من 828 01//1 تنتج تشكيل جلطة منخفض بدرجة كبيرة مقارنة مع العامل ‎VIE‏ من النوع البري. يتم التحقق أيضا من نشاط وفعالية 1/118 1//ا0 مقارنة مع العامل ‎VIE‏ من النوع البري عن طريق فحص انجذابات الارتباط الواضحة لهذه الببتيدات من أجل عامل النسيج القابل للذويان ‎(STF) 0‏ باستخدام طبقة تحتية مولدة للفلور ثلاثية الببتيد 51-178 ‎(HTH)‏ كما هو مبين في الشكل 26؛ يوضح هذا التحليل أن ‎dWT 1/118 (dF7)‏ والعامل ‎VI (FT)‏ من النوع البري لهما انجذابات ارتباط واضحة مكافئة من أجل ‎(STF‏ مع ذلك؛ كما هو مبين في الشكل 27؛ في نموذج تجريبي ‎(andl‏ قدرة هذه الببتيدات على تنشيط العامل ‎X‏ عن طريق معايرة تركيز العامل ‎AX‏ ‏وجود معقدات ‎STF‏ العامل ‎VII‏ )0.5 نانوجزيئي جرامي عامل ‎Vila] VII‏ 01//1 أو نوع بري]؛ 125 نانوجزيئي جرامي ‎(STF‏ حركيات ‎Michaelis Menten‏ من أجل 1/118 ‎WT‏ والعامل

8 من النوع البري توضح أن ‎dWT 1/118 (dF7)‏ يمكنه تنشيط العامل ل بفعالية أكثر (تقريبا ضعفين) من العامل ‎VIE (FT)‏ من النوع البري. تقترح هذه البيانات أن ‎dWT Vila‏ قادر على تحويل العامل ل إلى العامل ‎Xa‏ بكل موقع نشط من العامل |١/ا‏ أكثر من القسم الخاص به من النوع البري. المناقشة هناك ‎dala‏ طبية لم تتحقق لتطوير عقار علاجي فعّال من أجل معالجة نزيف حاد لكن مع تكوين جلطة منخفض. من المحتمل أن ينتج عن عديد ببتيد من عامل ‎VIE‏ فعّال له عمر نصف قصير جزيء له نافذة علاجية أكبر من أجل الاستخدام في حالات نزيف حادة. يكون ‎V2‏ و1/ هما شكلين مختلفين للعامل ‎Vila‏ (الأشكال 3-1). تحتوي هذه الأشكال 0 المختلفة على طفرات مع مجالات السيطرة ‎Gla‏ الخاصة بها التي تزيد من الانجذابية الخاصة بها من أجل الصفائح الدموية المُنشطة و؛ في حالة 2/؛ تؤدي إلى استقلالية عامل النسيج. يكون أيضا لكل من الأشكال المختلفة موقعين ‎N=Glycosylation‏ إضافيين؛ ينتج عنهما عمر نصف ممتد مقارنة مع العامل ‎Vila‏ من النوع ‎(gl)‏ سمة مميزة من أجل معالجة الناعور. مع ذلك يكون استخدامها كمعالجات لنزيف حاد مفيد من انخفاضات عمر النصف. هذا التعديل يقلل من خطورة 5 التأثيرات البعيدة عن الهدف وء نتيجة لذلك؛ يزداد المؤشر العلاجي الخاص بها. نوضح هنا أن إزالة ‎sialic acids‏ الموجودة على سلاسل ‎V2 carbohydrate‏ و ‎V1‏ تؤدي إلى تصفية أسرع جوهريا للجزيئات في نموذج تصفية خلية كبدية في المعمل. لا يكون من الواضح أن الأشكال المختلفة ذات ‎glycosylation‏ منخفضة أسرع في هذا النموذج في المعمل؛ الذي يقترح أن آلية التصفية بين جزيئات مُزالة ‎sialylation‏ وذات ‎glycosylation‏ منخفضة مختلفة. تجرى دراسات 0 في الجسم ‎all‏ توضح على جرذان ‎Sprague Dawley‏ توضح أن الجزيئات مُزالة ‎sialylation‏ ‎(dV] 5 dV2)‏ بالإضافة على الشكل المختلف 01/8121 ذو ‎glycosylation‏ منخفضة لها عمر نصف منخفض جوهريا. على نحو مفيد؛ يكون لكل من ‎V2‏ و ‎V1‏ مُزالين ‎sialylation‏ ‏معدلات تصفية زائدة مقارنة مع المعدل المقرر من أجل 71/118 مُزال ‎sialylation‏ من النوع البري:

— 6 3 —

‎(Appa et al, Thrombosis and Haemostasis 104.2/2010),‏ وهي ميزة ترجع إلى اثنين من ‎N—glycans‏ إضافيين. أحد النظريات الممكنة لهذا النشاط بدون تحديد على ما هو محدد ‎(ba‏ هو أن هذه ‎N-Glycans‏ الزائدة» عند إزالة ‎csialylation‏ تصبح مركبات ترابطية إضافية من أجل ‎ASGPR‏ أو مستقبل مماثل وتسبب تصفية أسرع بصورة غير

‏5 مباشرة. يبقى نشاط هذه الجزيئات أو يزداد مقارنة مع الجزيئات الأصلية الخاصة بها كما هو مقاس عن طريق اختبارات النشاط في المعمل. يتم التحقق أيضا من التصفية الأسرع لأجل 01/2 في الجسم الحي في دراسة فأر ‎PK HemA‏ ويوضح أنه فعال في دراسات تقليم ذيل ‎HemA‏ ‏وآ/اا. ‏إضافياء تنتج إزالة ‎sialylation‏ للعامل ‎VII‏ من النوع البري عديد ببتيد من العامل ‎VIE‏ ‏0 الذي يتضح بسرعة أكثر من النوع البري؛ بينما تتوافر ‎Wiad‏ نتيجة مدهشة للفعالية الزائدة كما هو مبين في نماذج تجريبية متنوعة. إزالة ‎N—glycans‏ أو تعديل تركيبة ‎monosaccharide‏ من ‎N—glycans‏ من العامل 8 أو الأشكال المختلفة للعامل ‎Vila‏ تؤدي إلى جزبئات تصفية أسرع. تحافظ هذه الجزيئات على النشاط وتكون فغّالة في الجسم الحي. تطوير هذه الجزيئات لعامل ‎Vila‏ سريعة التصفية يكون مفيد من أجل ‎dallas‏ أعراض النزيف الحادة؛ بالإضافة إلى أنه من المحتمل أن تكون ترياق ‎(antidote)‏ ‏لمضادات التخثر المتنوعة فى السوق. قوائم التسلسل <110>باير هيلثكير ال ال سي ماكسين بوسن >120< قصير التأثير ‎VIE‏ عديد ببتيدات لعامل ‎PCT‏ 810115011 >130<

<150> 61/754,674 <151> 2012-12-24 <150> 61/787,026 <151> 2013-03-15 <160> 18 5

<170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 1218 <212> DNA

<213> Homo sapiens 10 <400> 1 gccaacgcgt tcctggagga getgeggecg ggctecectgg agagggagtg caaggaggag 60 cagtgctcct tcgaggaggc ccgggagatc ttcaaggacg cggagaggac gaagctgttc

120 15 tggatttctt acagtgatgg ggaccagtgt gcctcaagtc catgccagaa tgggggctcc 180 tgcaaggacc agctccagtc ctatatctgc ttctgectce ctgecttcga gggccggaac 240

— 6 5 — tgtgagacgc acaaggatga ccagctgatc tgtgtgaacg agaacggcgg ctgtgagcag 300 tactgcagtg accacacggg caccaagcgc tcctgtcggt gccacgaggg gtactctctg 360 ctggcagacg gggtgtcctg cacacccaca gttgaatatc catgtggaaa aatacctatt 5 420 ctagaaaaaa gaaatgccag caaaccccaa ggccgaattg tggggggcaa ggtgtgccce 480 aaaggggagt gtccatggca ggtcctgttg ttggtgaatg gagctcagtt gtgtggggag 540 10 accctgatca acaccatctg ggtggtctcc gcggceccact gtttcgacaa aatcaagaac 600 tggaggaacc tgatcgcggt gctgggcgag cacgacctca gcgagcacga cggggatgag 660 cagagccggc gggtggcgca ggtcatcatc cccagcacgt acgtcccggg caccaccaac 15 720 cacgacatcg cgctgctccg cctgcaccag 6091090166 tcactgacca tgtggtgecc 780 ctetgectge ccgaacggac gttctctgag aggacgcetgg ccttegtgeg cttetcattg 840 gtcagcggct ggggcecagcet getggaccgt ggcgecacgg cectggagct catggtectc 0 900

— 6 6 — aacgtgcccc ggctgatgac ccaggactgce ctgcagcagt cacggaaggt gggagactcc 960 ccaaatatca cggagtacat gttctgtgcc ggctactcgg atggcagcaa ggactcctge 1020 aagggggaca gtggaggccc acatgccacc cactaccggg gcacgtggta cctgacggge 5 1080 atcgtcagct ggggccaggg ctgcgcaacc gtgggccact ttggggtgta caccagggtc 1140 tcccagtaca tcgagtggct gcaaaagctc atgcgctcag agccacgccc aggagtcctc 1200 10 ctgcgagccc catttcce 1218 <210> 2 <211> 1219 <212> DNA <213> Artificial Sequence 15 <220> <223> Variant human FVII nucleotide sequence <400> 2 gccaacgcgt tcctggagga gctgcggcag ggctccectgg agagggagtg caaggaggag 60 20

— 6 7 — cagtgctcct tcgaggaggc ccgggagatc ttcgaagacg cggagaggac gaagctgttc 120 tggatttctt acagtgatgg ggaccagtgt gcctcaagtc catgccagaa tgggggctcce 180 tgcaaggacc agctccagtc ctatatctgce ttctgectce ctgecttcga gggeccggaac 5 240 tgtgagacgc acaaggatga ccagctgatc tgtgtgaacg agaacggcgg ctgtgagcag 300 tactgcagtg accacaacgg caccaagcgc tcctgtcggt gccacgaggg gtactctctg 360 10 ctggcagacg gggtgtcctg cacacccaca gttgaatatc catgtggaaa aatacctatt 420 ctagaaaaaa gaaatgccag caaaccccaa ggccgaattg tggggggcaa ggtgtgccce 480 aaaggggagt gtccatggca ggtcctgttg ttggtgaatg gagctcagtt gtgtgggggg 5 540 accctgatca acaccatctg ggtggtctcc gcggceccact gtttcgacaa aatcaagaac 600 tggaggaacc tgatcgcggt gctgggcgag cacgacctca gcgagcacga cggggatgag 660 20 cagagccggc gggtggcegea ggtcatcatc cccagcacgt acgtcccggg caccaccaac 720

— 6 8 — cacgacatcg cgctgctccg cctgcaccag cccgtgaacc tcactgacca tgtggtgccc 780 ctetgectge ccgaacggac gttctctgag aggacgcetgg ccttegtgeg cttetcattg 840 gtcagcggct ggggccagcet gectggaccgt ggcgecacgg ccctggagcet catggtecte 900 5 aacgtgcccc ggctgatgac ccaggactgce ctgcagcagt cacggaaggt gggagactcc 960 ccaaatatca cggagtacat gttctgtgcc ggctactcgg atggcagcaa ggactcctge 1020 aagggggaca gtggaggccc acatgccacc cactaccggg gcacgtggta cctgacggge 10 1080 atcgtcagct ggggccaggg ctgcgcaacc gtgggccact ttggggtgta caccagggtc 1140 tcccagtaca tcgagtggct gcaaaagctc atgcgctcag agccacgccc aggagtccte 1200 15 ctgcgagccc catttcect 1219 <210> 3 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence 20 <220>

— 6 9 — <223> Variant human FVII nucleotide sequence <400> 3 gccaacgcgt tcctggagga gcetgecggcag ggctccetgg agagggagtg caaggaggag 60 cagtgctcct tcgaggaggc ccgggagatce ttcgaagacg aagaggaaac gaagctgttc 5 120 tggatttctt acagtgatgg ggaccagtgt gcctcaagtc catgccagaa tgggggctcce 180 tgcaaggacc agctccagtc ctatatctgc ttctgectce ctgecttcga gggccggaac 240 10 tgtgagacgc acaaggatga ccagctgatc tgtgtgaacg agaacggcgg ctgtgagcag 300 tactgcagtg accacaacgg caccaagcgc tcctgtcggt gccacgaggg gtactctctg 360 ctggcagacg gggtgtcctg cacacccaca gttgaatatc catgtggaaa aatacctatt 5 420 ctagaaaaaa gaaatgccag caaaccccaa ggccgaattg tggggggcaa ggtgtgccce 480 aaaggggagt gtccatggca ggtcctgttg ttggtgaatg gagctcagtt gtgtggggag 540 0 accctgatca acaccatctg ggtggtctcc gcggceccact gtttcgacaa aatcaagaac 600

— 7 0 — tggaggaacc tgatcgcggt gctgggcgag cacgacctca gcgagcacga cggggatgag 660 cagagccggc gggtggcegea ggtcatcatc cccagcacgt acgtcccggg caccaccaac 720 cacgacatcg cgctgctccg cctgcaccag cccgtgaacc tcactgacca tgtggtgcece 5

780 ctetgectge ccgaacggac gttctctgag aggacgcetgg ccttegtgeg cttetcattg 840 gtcagcggct ggggccagcet getggaccgt ggcgecacgg ccctggagcet catggtecte 900 aacgtgcccc ggctgatgac ccaggactge ctgcagcagt cacggaaggt gggagactcc 0 960 ccaaatatca cggagtacat gttctgtgcc ggctactcgg atggcagcaa ggactcctge 1020 aagggggaca gtggaggccc acatgccacc cactaccggg gcacgtggta cctgacgggce

1080 15 atcgtcagct ggggccaggg ctgcgcaacc gtgggccact ttggggtgta caccagggtc 1140 tcccagtaca tcgagtggct gcaaaagctc atgcgctcag agccacgccc aggagtccte 1200 ctgcgagccc catttcce 1218 0 <210> 4

— 7 1 — <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid sequence 5 <400> 4 gccaacgcgt tcctggagga getgeggecg ggctecectgg agagggagtg caaggaggag 60 cagtgctcct tcgaggaggc ccgggagatc ttcaaggacg cggagaggac gaagctgttc 120 10 tggatttctt acagtgatgg ggaccagtgt gcctcaagtc catgccagaa tgggggctcc 180 tgcaaggacc agctccagtc ctatatctgc ttctgectce ctgecttcga gggccggaac 240 tgtgagacgc acaaggatga ccagctgatc tgtgtgaacg agaacggcgg ctgtgagcag 5 300 tactgcagtg accacacggg caccaagcgc tcctgtcggt gccacgaggg gtactctctg 360 ctggcagacg gggtgtcctg cacacccaca gttgaatatc catgtggaaa aatacctatt 420 20

— 7 2 — ctagaaaaaa gaaatgccag caaaccccaa ggccgaattg tggggggcaa ggtgtgccce 480 aaaggggagt gtccatggca ggtcctgttg ttggtgaatg gagctcagtt gtgtgggggg 540 accctgatca acaccatctg ggtggtctcc gcggeccact gtttcgacaa aatcaagaac 5 600 tggaggaacc tgatcgcggt gctgggcgag cacgacctca gcgagcacga cggggatgag 660 cagagccggc gggtggcegea ggtcatcatc cccagcacgt acgtcccggg caccaccaac 720 0 cacgacatcg cgctgctccg cctgcaccag 6091090166 tcactgacca tgtggtgecc 780 ctctgectge ccgaacggac gttetctgag aggacgcetgg cettecgtgeg cttcteattg 840 gtcagcggct ggggccagcet gectggaccgt ggcgecacgg ccctggagcet catggtecte 900 15 aacgtgcccc ggctgatgac ccaggactgce ctgcagcagt cacggaaggt gggagactcc 960 ccaaatatca cggagtacat gttctgtgcc ggctactcgg atggcagcaa ggactcctge 1020 aagggggaca gtggaggccc acatgccacc cactaccggg gcacgtggta cctgacggge 0 1080

— 7 3 — atcgtcagct ggggccaggg ctgcgcaacc gtgggccact ttggggtgta caccagggtc 1140 tcccagtaca tcgagtggct gcaaaagctc atgcgctcag agccacgccc aggagtcctc 1200 ctgcgagccc catttcce 1218 5 <210> 5 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 10 <223> Plasmid sequence <400> 5 gccaacgcgt tcctggagga gcetgeggecg ggctcectgg agagggagtg caaggaggag 60 cagtgctcct tcgaggagge ccgggagatce ttcaaggacg cggagaggac gaagcetgttc 5 120 tggatttctt acagtgatgg ggaccagtgt gcctcaagtc catgccagaa tgggggctcce 180 tgcaaggacc agctccagtc ctatatctgc ttctgectce ctgecttcga gggccggaac 240 0

— 7 4 — tgtgagacgc acaaggatga ccagctgatc tgtgtgaacg agaacggcgg ctgtgagcag 300 tactgcagtg accacacggg caccaagcgc tcctgtcggt gccacgaggg gtactctctg 360 ctggcagacg gggtgtcctg cacacccaca gttgaatatc catgtggaaa aatacctatt 5

420 ctagaaaaaa gacaggccag caaaccccaa ggccgaattg tggggggcaa ggtgtgccce 480 aaaggggagt gtccatggca ggtcctgttg ttggtgaatg gagctcagtt gtgtgggggg

540 10 accctgatca acaccatctg ggtggtctcc gcggceccact gtttcgacaa aatcaagaac 600 tggaggaacc tgatcgcggt gctgggcgag cacgacctca gcgagcacga cggggatgag 660 cagagccggc gggtggcgca ggtcatcatc cccagcacgt acgtcccggg caccaccaac 15 720 cacgacatcg cgctgctccg cctgcaccag 609100166 tcactgacca tgtggtgecce 780 ctetgectge ccgaacggac gttctctgag aggacgcetgg ccttegtgeg cttetcattg 840 gtcagcggct ggggcecagcet getggaccgt ggcgecacgg cectggagct catggtectc 0 900

— 7 5 — aacgtgcccc ggctgatgac ccaggactgce ctgcagcagt cacggaaggt gggagactcc 960 ccaaatatca cggagtacat gttctgtgcc ggctactcgg atggcagcaa ggactcctge 1020 aagggggaca gtggaggccc acatgccacc cactaccggg gcacgtggta cctgacggge 5 1080 atcgtcagct ggggccaggg ctgcgcaacc gtgggccact ttggggtgta caccagggtc 1140 tcccagtaca tcgagtggct gcaaaagctc atgcgctcag agccacgccc aggagtccte 1200 10 ctgcgagccc catttcce 1218 <210> 6 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence 15 <220> <223> Plasmid sequence <400> 6 gccaacgcgt tcctggagga getgeggecg ggctecectgg agagggagtg caaggaggag 60 20

— 7 6 — cagtgctcct tcgaggaggc ccgggagatc ttcaaggacg cggagaggac gaagctgttc 120 tggatttctt acagtgatgg ggaccagtgt gcctcaagtc catgccagaa tgggggctcce 180 tgcaaggacc agctccagtc ctatatctgce ttctgectce ctgecttcga gggecggaac 5 240 tgtgagacgc acaaggatga ccagctgatc tgtgtgaacg agaacggcgg ctgtgagcag 300 tactgcagtg accacacggg caccaagcgc tcctgtcggt gccacgaggg gtactctctg 360 10 ctggcagacg gggtgtcctg cacacccaca gttgaatatc catgtggaaa aatacctatt 420 ctagaaaaaa gaaatgccag caaaccccaa ggccgaattg tggggggcaa ggtgtgccce 480 aaaggggagt gtccatggca ggtcctgttg ttggtgaatg gagctcagtt gtgtgggggg 5 540 accctgatca acaccatctg ggtggtctcc gcggceccact gtttcgacaa aatcaagaac 600 tggaggaacc tgatcgcggt gctgggcgag cacgacctca gcgagcacga cggggatgag 660 20 cagagccggc gggtggcegea ggtcatcatc cccagcacgt acgtcccggg caccaccaac 720

— 7 7 — cacgacatcg cgctgctccg cctgcaccag 609100166 tcactgacca tgtggtgecce 780 ctctgectge ccgaacggac gttetctgag aggacgcetgg cettecgtgeg cttcteattg 840 gtcagcggct ggggccagcet gectggaccgt ggcgecacgg ccctggagcet catggtecte 900 5 aacgtgcccc ggctgatgac ccaggactgce ctgcagcagt cacggaaggt gggagactcc 960 ccacagatca cggagtacat gttctgtgcc ggctactcgg atggcagcaa ggactcctge 1020 aagggggaca gtggaggccc acatgccacc cactaccggg gcacgtggta cctgacggge 10 1080 atcgtcagct ggggccaggg ctgcgcaacc gtgggccact ttggggtgta caccagggtc 1140 tcccagtaca tcgagtggct gcaaaagctc atgcgctcag agccacgccc aggagtccte 1200 15 ctgcgagccc catttcce 1218 <210> 7 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence 20 <220>

— 7 8 — <223> Plasmid sequence <400> 7 gccaacgcgt tcctggagga getgeggecg ggctecectgg agagggagtg caaggaggag 60 cagtgctcct tcgaggaggc ccgggagatce ttcaaggacg cggagaggac gaagcetgttc 5 120 tggatttctt acagtgatgg ggaccagtgt gcctcaagtc catgccagaa tgggggctcce 180 tgcaaggacc agctccagtc ctatatctgc ttctgectce ctgecttcga gggccggaac 240 10 tgtgagacgc acaaggatga ccagctgatc tgtgtgaacg agaacggcgg ctgtgagcag 300 tactgcagtg accacacggg caccaagcgc tcctgtcggt gccacgaggg gtactctctg 360 ctggcagacg gggtgtcctg cacacccaca gttgaatatc catgtggaaa aatacctatt 5 420 ctagaaaaaa gacaggccag caaaccccaa ggccgaattg tggggggcaa ggtgtgcccc 480 aaaggggagt gtccatggca ggtcctgttg ttggtgaatg gagctcagtt gtgtggggag 540 0 accctgatca acaccatctg ggtggtctcc gcggceccact gtttcgacaa aatcaagaac 600

— 7 9 — tggaggaacc tgatcgcggt gctgggcgag cacgacctca gcgagcacga cggggatgag 660 cagagccggc gggtggcegea ggtcatcatc cccagcacgt acgtcccggg caccaccaac 720 cacgacatcg cgctgctccg cctgcaccag ccegtggtee tcactgacca tgtggtgece 5

780 ctctgectge ccgaacggac gttetctgag aggacgcetgg cettecgtgeg cttcteattg 840 gtcagcggct ggggccagcet gectggaccgt ggcgecacgg ccctggagcet catggtecte 900 aacgtgcccc ggctgatgac ccaggactge ctgcagcagt cacggaaggt gggagactcc 0 960 ccacagatca cggagtacat gttctgtgcc ggctactcgg atggcagcaa ggactcctge 1020 aagggggaca gtggaggccc acatgccacc cactaccggg gcacgtggta cctgacgggce

1080 15 atcgtcagct ggggccaggg ctgcgcaacc gtgggccact ttggggtgta caccagggtc 1140 tcccagtaca tcgagtggct gcaaaagctc atgcgctcag agccacgccc aggagtcctc 1200 ctgcgagccc catttcce 1218 0 <210> 8

— 8 0 — <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid sequence 5 <400> 8 gccaacgcgt tcctggagga gcetgecggcag ggctcecctgg agagggagtg caaggaggag 60 cagtgctcct tcgaggaggc ccgggagatc ttcgaagacg cggagaggac gaagctgttc 120 10 tggatttctt acagtgatgg ggaccagtgt gcctcaagtc catgccagaa tgggggctcce 180 tgcaaggacc agctccagtc ctatatctgc ttctgectce ctgecttcga gggccggaac 240 tgtgagacgc acaaggatga ccagctgatc tgtgtgaacg agaacggcgg ctgtgagcag 5 300 tactgcagtg accacacggg caccaagcgc tcctgtcggt gccacgaggg gtactctctg 360 ctggcagacg gggtgtcctg cacacccaca gttgaatatc catgtggaaa aatacctatt 420 20

— 8 1 — ctagaaaaaa gaaatgccag caaaccccaa ggccgaattg tggggggcaa ggtgtgcccc 480 aaaggggagt gtccatggca ggtcctgttg ttggtgaatg gagctcagtt gtgtgggggg 540 accctgatca acaccatctg ggtggtctcc gcggeccact gtttcgacaa aatcaagaac 5 600 tggaggaacc tgatcgcggt gctgggcgag cacgacctca gcgagcacga cggggatgag 660 cagagccggc gggtggcegea ggtcatcatc cccagcacgt acgtcccggg caccaccaac 720 0 cacgacatcg cgctgctccg cctgcaccag 609100166 tcactgacca tgtggtgecce 780 ctctgectge ccgaacggac gttetctgag aggacgcetgg cettegtgeg cttetcattg 840 gtcagcggct ggggccagcet gectggaccgt ggcgecacgg ccctggagcet catggtecte 900 15 aacgtgcccc ggctgatgac ccaggactgce ctgcagcagt cacggaaggt gggagactcc 960 ccaaatatca cggagtacat gttctgtgcc ggctactcgg atggcagcaa ggactcctge 1020 aagggggaca gtggaggccc acatgccacc cactaccggg gcacgtggta cctgacggge 0 1080

— 8 2 — atcgtcagct ggggccaggg ctgcgcaacc gtgggccact ttggggtgta caccagggtc 1140 tcccagtaca tcgagtggct gcaaaagctc atgcgctcag agccacgccc aggagtccte 1200 ctgcgagccc catttcce 1218 5 <210> 9 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 10 <223> Plasmid sequence <400> 9 gccaacgcgt tcctggagga gcetgecggcag ggctccetgg agagggagtg caaggaggag 60 cagtgctcct tcgaggagge ccgggagatce ttcgaagacg cggagaggac gaagcetgttc 5 120 tggatttctt acagtgatgg ggaccagtgt gcctcaagtc catgccagaa tgggggctcce 180 tgcaaggacc agctccagtc ctatatctgc ttctgectce ctgecttcga gggccggaac 240 0

— 8 3 — tgtgagacgc acaaggatga ccagctgatc tgtgtgaacg agaacggcgg ctgtgagcag 300 tactgcagtg accacacggg caccaagcgc tcctgtcggt gccacgaggg gtactctctg 360 ctggcagacg gggtgtcctg cacacccaca gttgaatatc catgtggaaa aatacctatt 5

420 ctagaaaaaa gacaggccag caaaccccaa ggccgaattg tggggggcaa ggtgtgcccc 480 aaaggggagt gtccatggca ggtcctgttg ttggtgaatg gagctcagtt gtgtgggggg

540 10 accctgatca acaccatctg ggtggtctcc gcggceccact gtttcgacaa aatcaagaac 600 tggaggaacc tgatcgcggt gctgggcgag cacgacctca gcgagcacga cggggatgag 660 cagagccggc gggtggcgca ggtcatcatc cccagcacgt acgtcccggg caccaccaac 5 720 cacgacatcg cgctgctccg cctgcaccag 609100166 tcactgacca tgtggtgecce 780 ctetgectge ccgaacggac gttctctgag aggacgcetgg ccttegtgeg cttetcattg 840 gtcagcggct ggggcecagcet getggaccgt ggcgecacgg cectggagct catggtectc 0 900

— 8 4 — aacgtgcccc ggctgatgac ccaggactgce ctgcagcagt cacggaaggt gggagactcc 960 ccaaatatca cggagtacat gttctgtgcc ggctactcgg atggcagcaa ggactcctge 1020 aagggggaca gtggaggccc acatgccacc cactaccggg gcacgtggta cctgacggge 5 1080 atcgtcagct ggggccaggg ctgcgcaacc gtgggccact ttggggtgta caccagggtc 1140 tcccagtaca tcgagtggct gcaaaagctc atgcgctcag agccacgccc aggagtccte 1200 10 ctgcgagccc catttcce 1218 <210> 10 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence 15 <220> <223> Plasmid sequence <400> 10 gccaacgcgt tcctggagga gcetgecggcag ggctccetgg agagggagtg caaggaggag 60 20

— 8 5 — cagtgctcct tcgaggaggc ccgggagatc ttcgaagacg cggagaggac gaagctgttc 120 tggatttctt acagtgatgg ggaccagtgt gcctcaagtc catgccagaa tgggggctcce 180 tgcaaggacc agctccagtc ctatatctgce ttctgectce ctgecttcga gggecggaac 5 240 tgtgagacgc acaaggatga ccagctgatc tgtgtgaacg agaacggcgg ctgtgagcag 300 tactgcagtg accacacggg caccaagcgc tcctgtcggt gccacgaggg gtactctctg 360 10 ctggcagacg gggtgtcctg cacacccaca gttgaatatc catgtggaaa aatacctatt 420 ctagaaaaaa gaaatgccag caaaccccaa ggccgaattg tggggggcaa ggtgtgccce 480 aaaggggagt gtccatggca ggtcctgttg ttggtgaatg gagctcagtt gtgtgggggg 5 540 accctgatca acaccatctg ggtggtctcc gcggceccact gtttcgacaa aatcaagaac 600 tggaggaacc tgatcgcggt gctgggcgag cacgacctca gcgagcacga cggggatgag 660 20 cagagccggc gggtggcegea ggtcatcatc cccagcacgt acgtcccggg caccaccaac 720

— 8 6 — cacgacatcg cgctgctccg cctgcaccag 6091090166 tcactgacca tgtggtgecc 780 ctetgectge ccgaacggac gttctctgag aggacgcetgg ccttegtgeg cttetcattg 840 gtcagcggct ggggccagcet gectggaccgt ggcgecacgg ccctggagcet catggtecte 900 5 aacgtgcccc ggctgatgac ccaggactgce ctgcagcagt cacggaaggt gggagactcc 960 ccacagatca cggagtacat gttctgtgcc ggctactcgg atggcagcaa ggactcctge 1020 aagggggaca gtggaggccc acatgccacc cactaccggg gcacgtggta cctgacggge 0 1080 atcgtcagct ggggccaggg ctgcgcaacc gtgggccact ttggggtgta caccagggtc 1140 tcccagtaca tcgagtggct gcaaaagctc atgcgctcag agccacgccc aggagtcctc 1200 15 ctgcgagccc catttcce 1218 <210> 11 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence 20 <220>

— 8 7 — <223> Plasmid sequence <400> 11 gccaacgcgt tcctggagga gcetgecggcag ggctcecctgg agagggagtg caaggaggag 60 cagtgctcct tcgaggaggc ccgggagatce ttcgaagacg cggagaggac gaagcetgttc 5 120 tggatttctt acagtgatgg ggaccagtgt gcctcaagtc catgccagaa tgggggctcce 180 tgcaaggacc agctccagtc ctatatctgc ttctgectce ctgecttcga gggccggaac 240 10 tgtgagacgc acaaggatga ccagctgatc tgtgtgaacg agaacggcgg ctgtgagcag 300 tactgcagtg accacacggg caccaagcgc tcctgtcggt gccacgaggg gtactctctg 360 ctggcagacg gggtgtcctg cacacccaca gttgaatatc catgtggaaa aatacctatt 5 420 ctagaaaaaa gacaggccag caaaccccaa ggccgaattg tggggggcaa ggtgtgccce 480 aaaggggagt gtccatggca ggtcctgttg ttggtgaatg gagctcagtt gtgtggggag 540 0 accctgatca acaccatctg ggtggtctcc gcggceccact gtttcgacaa aatcaagaac 600

— 8 8 — tggaggaacc tgatcgcggt gctgggcgag cacgacctca gcgagcacga cggggatgag 660 cagagccggc gggtggcegea ggtcatcatc cccagcacgt acgtcccggg caccaccaac 720 cacgacatcg cgctgctccg cctgcaccag ccegtggtee tcactgacca tgtggtgecece 5

780 ctctgectge ccgaacggac gttetctgag aggacgcetgg cettegtgeg cttetcattg 840 gtcagcggct ggggccagcet gectggaccgt ggcgecacgg ccctggagcet catggtecte 900 aacgtgcccc ggctgatgac ccaggactge ctgcagcagt cacggaaggt gggagactcc 0 960 ccacagatca cggagtacat gttctgtgcc ggctactcgg atggcagcaa ggactcctge 1020 aagggggaca gtggaggccc acatgccacc cactaccggg gcacgtggta cctgacgggce

1080 15 atcgtcagct ggggccaggg ctgcgcaacc gtgggccact ttggggtgta caccagggtc 1140 tcccagtaca tcgagtggct gcaaaagctc atgcgctcag agccacgccc aggagtccte 1200 ctgcgagccc catttcce 1218 0 <210> 12

— 8 9 — <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid sequence 5 <400> 12 gccaacgcgt tcctggagga gcetgecggcag ggctccetgg agagggagtg caaggaggag 60 cagtgctcct tcgaggaggc ccgggagatc ttcgaagacg aagaggaaac gaagctgttc 120 10 tggatttctt acagtgatgg ggaccagtgt gcctcaagtc catgccagaa tgggggctcce 180 tgcaaggacc agctccagtc ctatatctgc ttctgectce ctgecttcga gggccggaac 240 tgtgagacgc acaaggatga ccagctgatc tgtgtgaacg agaacggcgg ctgtgagcag 5 300 tactgcagtg accacacggg caccaagcgc tcctgtcggt gccacgaggg gtactctctg 360 ctggcagacg gggtgtcctg cacacccaca gttgaatatc catgtggaaa aatacctatt 420 20

— 9 0 — ctagaaaaaa gaaatgccag caaaccccaa ggccgaattg tggggggcaa ggtgtgccce 480 aaaggggagt gtccatggca ggtcctgttg ttggtgaatg gagctcagtt gtgtgggggg 540 accctgatca acaccatctg ggtggtctcc gcggeccact gtttcgacaa aatcaagaac 5 600 tggaggaacc tgatcgcggt gctgggcgag cacgacctca gcgagcacga cggggatgag 660 cagagccggc gggtggcegea ggtcatcatc cccagcacgt acgtcccggg caccaccaac 720 0 cacgacatcg cgctgctccg cctgcaccag 609100166 tcactgacca tgtggtgecce 780 ctctgectge ccgaacggac gttetctgag aggacgcetgg cettecgtgeg cttcteattg 840 gtcagcggct ggggccagcet gectggaccgt ggcgecacgg ccctggagcet catggtecte 900 15 aacgtgcccc ggctgatgac ccaggactgce ctgcagcagt cacggaaggt gggagactcc 960 ccaaatatca cggagtacat gttctgtgcc ggctactcgg atggcagcaa ggactcctge 1020 aagggggaca gtggaggccc acatgccacc cactaccggg gcacgtggta cctgacggge 0 1080

— 9 1 — atcgtcagct ggggccaggg ctgcgcaacc gtgggccact ttggggtgta caccagggtc 1140 tcccagtaca tcgagtggct gcaaaagctc atgcgctcag agccacgccc aggagtccte 1200 ctgcgagccc catttcce 1218 5 <210> 13 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 10 <223> Plasmid sequence <400> 13 gccaacgcgt tcctggagga gcetgecggcag ggctccetgg agagggagtg caaggaggag 60 cagtgctcct tcgaggaggc ccgggagatce ttcgaagacg aagaggaaac gaagctgttc 5 120 tggatttctt acagtgatgg ggaccagtgt gcctcaagtc catgccagaa tgggggctcce 180 tgcaaggacc agctccagtc ctatatctgc ttctgectce ctgecttcga gggccggaac 240 0

— 9 2 — tgtgagacgc acaaggatga ccagctgatc tgtgtgaacg agaacggcgg ctgtgagcag 300 tactgcagtg accacacggg caccaagcgc tcctgtcggt gccacgaggg gtactctctg 360 ctggcagacg gggtgtcctg cacacccaca gttgaatatc catgtggaaa aatacctatt 5

420 ctagaaaaaa gacaggccag caaaccccaa ggccgaattg tggggggcaa ggtgtgcccc 480 aaaggggagt gtccatggca ggtcctgttg ttggtgaatg gagctcagtt gtgtgggggg

540 10 accctgatca acaccatctg ggtggtctcc gcggceccact gtttcgacaa aatcaagaac 600 tggaggaacc tgatcgcggt gctgggcgag cacgacctca gcgagcacga cggggatgag 660 cagagccggc gggtggcgca ggtcatcatc cccagcacgt acgtcccggg caccaccaac 15 720 cacgacatcg cgctgctccg cctgcaccag 6091090166 tcactgacca tgtggtgecc 780 ctetgectge ccgaacggac gttctctgag aggacgcetgg ccttegtgeg cttetcattg 840 gtcagcggct ggggcecagcet getggaccgt ggcgecacgg cectggagct catggtectc 0 900

— 9 3 — aacgtgcccc ggctgatgac ccaggactgce ctgcagcagt cacggaaggt gggagactcc 960 ccaaatatca cggagtacat gttctgtgcc ggctactcgg atggcagcaa ggactcctge 1020 aagggggaca gtggaggccc acatgccacc cactaccggg gcacgtggta cctgacggge 5 1080 atcgtcagct ggggccaggg ctgcgcaacc gtgggccact ttggggtgta caccagggtc 1140 tcccagtaca tcgagtggct gcaaaagctc atgcgctcag agccacgccc aggagtcctc 1200 10 ctgcgagccc catttcce 1218 <210> 14 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence 15 <220> <223> Plasmid sequence <400> 14 gccaacgcgt tcctggagga gcetgecggcag ggctcecctgg agagggagtg caaggaggag 60 20

— 9 4 — cagtgctcct tcgaggaggc ccgggagatc ttcgaagacg aagaggaaac gaagctgttc 120 tggatttctt acagtgatgg ggaccagtgt gcctcaagtc catgccagaa tgggggctcce 180 tgcaaggacc agctccagtc ctatatctgce ttctgectce ctgecttcga gggecggaac 5 240 tgtgagacgc acaaggatga ccagctgatc tgtgtgaacg agaacggcgg ctgtgagcag 300 tactgcagtg accacacggg caccaagcgc tcctgtcggt gccacgaggg gtactctctg 360 10 ctggcagacg gggtgtcctg cacacccaca gttgaatatc catgtggaaa aatacctatt 420 ctagaaaaaa gaaatgccag caaaccccaa ggccgaattg tggggggcaa ggtgtgcccc 480 aaaggggagt gtccatggca ggtcctgttg ttggtgaatg gagctcagtt gtgtgggggg 5 540 accctgatca acaccatctg ggtggtctcc gcggceccact gtttcgacaa aatcaagaac 600 tggaggaacc tgatcgcggt gctgggcgag cacgacctca gcgagcacga cggggatgag 660 20 cagagccggc gggtggcegea ggtcatcatc cccagcacgt acgtcccggg caccaccaac 720

— 9 5 — cacgacatcg cgctgctccg cctgcaccag 609100166 tcactgacca tgtggtgecce 780 ctetgectge ccgaacggac gttctctgag aggacgcetgg ccttegtgeg cttetcattg 840 gtcagcggct ggggccagcet gectggaccgt ggcgecacgg ccctggagcet catggtecte 900 5 aacgtgcccc ggctgatgac ccaggactgce ctgcagcagt cacggaaggt gggagactcc 960 ccacagatca cggagtacat gttctgtgcc ggctactcgg atggcagcaa ggactcctge 1020 aagggggaca gtggaggccc acatgccacc cactaccggg gcacgtggta cctgacggge 0 1080 atcgtcagct ggggccaggg ctgcgcaacc gtgggccact ttggggtgta caccagggtc 1140 tcccagtaca tcgagtggct gcaaaagctc atgcgctcag agccacgccc aggagtccte 1200 15 ctgcgagccc catttcce 1218 <210> 15 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence 20 <220>

— 9 6 — <223> Plasmid sequence <400> 15 gccaacgcgt tcctggagga gcetgecggcag ggctccetgg agagggagtg caaggaggag 60 cagtgctcct tcgaggagge ccgggagatce ticgaagacg aagaggaaac gaagctgttc 5 120 tggatttctt acagtgatgg ggaccagtgt gcctcaagtc catgccagaa tgggggctcce 180 tgcaaggacc agctccagtc ctatatctgc ttctgectce ctgecttcga gggccggaac 240 10 tgtgagacgc acaaggatga ccagctgatc tgtgtgaacg agaacggcgg ctgtgagcag 300 tactgcagtg accacacggg caccaagcgc tcctgtcggt gccacgaggg gtactctctg 360 ctggcagacg gggtgtcctg cacacccaca gttgaatatc catgtggaaa aatacctatt 5 420 ctagaaaaaa gacaggccag caaaccccaa ggccgaattg tggggggcaa ggtgtgcccc 480 aaaggggagt gtccatggca ggtcctgttg ttggtgaatg gagctcagtt gtgtgggagg 540 0 accctgatca acaccatctg ggtggtctcc gcggceccact gtttcgacaa aatcaagaac 600

— 9 7 — tggaggaacc tgatcgcggt gctgggcgag cacgacctca gcgagcacga cggggatgag 660 cagagccggc gggtggcegea ggtcatcatc cccagcacgt acgtcccggg caccaccaac 720 cacgacatcg cgctgctccg cctgcaccag ccegtggtee tcactgacca tgtggtgecece 5

780 ctctgectge ccgaacggac gttetctgag aggacgcetgg cettecgtgeg cttcteattg 840 gtcagcggct ggggccagcet gectggaccgt ggcgecacgg ccctggagcet catggtecte 900 aacgtgcccc ggctgatgac ccaggactge ctgcagcagt cacggaaggt gggagactcc 0 960 ccacagatca cggagtacat gttctgtgcc ggctactcgg atggcagcaa ggactcctge 1020 aagggggaca gtggaggccc acatgccacc cactaccggg gcacgtggta cctgacgggce

1080 15 atcgtcagct ggggccaggg ctgcgcaacc gtgggccact ttggggtgta caccagggtc 1140 tcccagtaca tcgagtggct gcaaaagctc atgcgctcag agccacgccc aggagtccte 1200 ctgcgagccc catttcce 1218 0 <210> 16

<211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 5 1 5 10 15

Cys Lys Glu Glu GIn Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lle Phe Lys

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lle Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 10

Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys GIn Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp GIn 60

Leu GIn Ser Tyr lle Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp GIn Leu lle Cys Val Asn Glu Asn Gly 15 85 90 95

Gly Cys Glu GIn Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr

115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lle Pro lle Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg lle Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160 5

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala GIn 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lle Asn Thr lle Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Lys lle Lys Asn Trp Arg Asn Leu lle Ala Val Leu 10 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu GIn Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lle lle Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240 5

His Asp lle Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly GIn Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu GIn GIn Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 5 305 310 315 320

Pro Asn lle Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350 10

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lle Val Ser Trp Gly 60 Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lle 370 375 380

Glu Trp Leu GIn Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 15 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405 <210> 17

<211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant human FVII peptide sequence 5 <220> <221> misc _feature <222> (407)..(407) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 17 10

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Gln Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15

Cys Lys Glu Glu GIn Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lle Phe Glu

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lle Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 15

Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys GIn Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp 0 60

Leu GIn Ser Tyr lle Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp GIn Leu lle Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu GIn Tyr Cys Ser Asp His Asn Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110 5

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lle Pro lle Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lle Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 10 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala GIn 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lle Asn Thr lle Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190 15

His Cys Phe Asp Lys lle Lys Asn Trp Arg Asn Leu lle Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu GIn Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lle lle Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lle Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Asn Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 5 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly GIn Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300 10

Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu GIn ‏ماي‎ Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lle Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 15 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lle Val Ser Trp Gly 60 Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lle

370 375 380

Glu Trp Leu 60 Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro Xaa 405 5 <210> 18 <211> 406 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 10 <223> Variant human FVII peptide sequence <400> 18

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Gln Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15

Cys Lys Glu Glu GIn Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lle Phe Glu 15

Asp Glu Glu Glu Thr Lys Leu Phe Trp lle Ser Tyr Ser Asp Gly Asp

Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys GIn Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp GIn

Leu GIn Ser Tyr lle Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp GIn Leu lle Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95 5

Gly Cys Glu GIn Tyr Cys Ser Asp His Asn Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lle Pro lle Leu Glu Lys Arg 10 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lle Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp GIn Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala 0 165 170 175 15

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lle Asn Thr lle Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Lys lle Lys Asn Trp Arg Asn Leu lle Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu GIn Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lle lle Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lle Ala Leu Leu Arg Leu His GIn Pro Val Asn Leu Thr Asp 5 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly GIn Leu Leu 275 280 285 10

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu GIn ‏ماي‎ Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lle Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 15 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lle Val Ser Trp Gly 60 Gly Cys

355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lle 370 375 380

Glu Trp Leu 60 Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400 5

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

Claims (3)

عناصر الحماية

1. متعدد ببتيد ‎polypeptide‏ من عامل متغاير ‎Vil variant Factor‏ معزول يتم إنتاجه في خلية مضيفة تديية ‎host cell‏ 10181717181127 يتميّرٌ بسياق حمض أميني ‎amino acid sequence‏ يتضمن تعديل واحد على الأقل بالسياق في سياق الحمض الأميني برقم التعريف:16؛ حيث يكون التعديل الواحد على الأقل بالسياق هو 2531/؛ حيث يمتلك متعدد الببتيد للعامل المتغاير ‎VIE‏ نسبة من مولات ‎sialic acid‏ المقترن إلى مولات ‎glycan‏ المرتبط ب لا تتراوح بين 0 و 5.0.

2. متعدد الببتيد ‎polypeptide‏ من العامل المتغاير ‎VII variant Factor‏ المعزول وفقاً لعنصر الحماية 1؛ حيث يتميز بأنه يمتلك فعالية لتعزيز تخثر الدم ‎blood clotting‏ تعادل 750 على الأقل من الفعالية الخاصة بعامل ‎VII‏ بري النمط المقاسة في نفس الظروف.

3. متعدد الببتيد ‎polypeptide‏ من العامل المتغاير ‎VII variant Factor‏ المعزول وفقاً لعنصر الحماية 1 حيث يشتمل متعدد الببتيد من العامل المتغاير ‎VIE‏ على تعديلين اثنين أو أكثر بالسياق يتمثل أحدهما ب ‎V253N‏ وئختار الآخر من المجموعة المكونة من ‎(R36E (K32E (P10Q‏ 34م و ‎.T106N‏ ‏15 ‏4 متعدد الببتيد ‎polypeptide‏ من العامل المتغاير ‎VII variant Factor‏ المعزول وفقاً لعنصر الحماية 1؛ حيث يشتمل متعدد الببتيد من العامل المتغاير ‎VIE‏ على ثلاثة تعديلات أو أكثر بالسياق يتمثل أحدها ب ‎V253N‏ وتُختار الآخران من المجموعة المكونة من 0106 ‎(R36E (K32E‏ 34م و ‎.T106N‏

5. متعدد الببتيد ‎polypeptide‏ من العامل المتغاير ‎VII variant Factor‏ المعزول وفقاً لعنصر الحماية 1؛ حيث يشتمل متعدد الببتيد من العامل المتغاير ‎VIE‏ على أريعة تعديلات أو أكثر بالسياق يتمثل ‎baal‏ ب ‎V253N‏ وتُختار الأخرى من المجموعة المكونة من ‎(R36E (K32E (P10Q‏ ‎TIOON (A34E 5‏ و ‎V253N‏

‏6. متعدد الببتيد ‎polypeptide‏ من العامل المتغاير ‎VII variant Factor‏ المعزول وفقاً لعنصر الحماية 1؛ حيث يشتمل متعدد الببتيد من العامل المتغاير ‎VIE‏ على تعديلات السياق المتمثتلة فى ‎T106N (A34E (R36E (K32E 00‏ و لا253/. 10 7. متعدد الببتيد ‎polypeptide‏ من العامل المتغاير ‎VII variant Factor‏ المعزول وفقاً لعنصر الحماية 1؛ حيث يشتمل متعدد الببتيد من العامل المتغاير ‎VIE‏ على تعديلات السياق المتمثتلة فى ‎T106N (K32E 064‏ و لا253/.

8. متعدد الببتيد ‎polypeptide‏ من العامل المتغاير ‎VII variant Factor‏ المعزول وفقاً لأي من عناصر الحماية من 1 - 7( حيث تكون نسبة مولات ‎sialic acid‏ المقترن إلى مولات ‎glycan‏ ‏المرتبط ب ‎N‏ أقل من 0.1.

9. طريقة لتحضير متعدد الببتيد ‎polypeptide‏ من العامل المتغاير ‎VII variant Factor‏ المعزول وفقاً لعنصر الحماية 1 حيث تشمل الطريقة المذكورة ما يلى:

(1) إنتاج متعدد ببتيد من العامل ‎VIE‏ يشتمل على سياق حمض أميني ‎amino acid sequence‏ يتضمن تعديل واحد على الأقل بالسياق في سياق الحمض الأميني برقم التعريف:16؛ حيث يكون التعديل الواحد على الأقل بالسياق هو ‎V253N‏ في خط خلية ‎dud‏ مأشوب ‎recombinant‏ ‎mammalian cell line‏ يفتقر للقدرة على إضافة مجموعة السياليل إلى الببتيدات بحيث يُنتج متعدد ببتيد من العامل ‎VIE‏ خالي من السياليل يمتلك نسبة من مولات ‎sialic acid‏ المقترن إلى مولات ‏07 المرتبط ب ‎N‏ تتراوح بين 0 و 5.0؛ و ‎Jie )2(‏ متعدد الببتيد من العامل المتغاير ‎VIE‏ الناتج بهذه الطريقة.

‏0. طريقة لتحضير متعدد الببتيد ‎polypeptide‏ من العامل المتغاير ‎VII variant Factor‏ ‏0 المعزول وفقاً لعنصر الحماية 1 حيث تشمل الطريقة المذكورة ما يلي: ‏(أ) الحصول على خط خلية ثديية مأشوب ‎recombinant mammalian cell line‏ يعبر بشكل إسهامي عن (أ) متعدد ببتيد من عامل ‎VIE‏ مأشوب يشتمل على سياق حمض أميني يتضمن تعديل واحد على الأقل بالسياق في سياق الحمض الأميني برقم التعريف:16؛ حيث يكون التعديل الواحد على الأقل بالسياق هو ‎V253N‏ و (ب) إنزيم ‎sialidase‏ مأشوب؛ ‏5 (ب) زراعة خط الخلية الثديية المأشوب المذكور للسماح بالتعبير عن كل من متعدد الببتيد للعامل ‎VII‏ المأشوب وإنزيم 518110856 المأشوب؛ حيث يزيل إنزيم ‎sialidase‏ المأشوب المذكور مقادير كافية من شقات ‎sialic acid‏ المرتبط تساهمياً لإنتاج متعدد ببتيد من العامل ‎VIE‏ منزوع السياليل يمتلك نسبة من مولات ‎sialic acid‏ المقترن إلى مولات ‎glycan‏ المرتبط ب لا تتراوح بين 0 و 5.0؛ و ‏0 (ج) عزل متعدد الببتيد من العامل المتغاير ‎VIE‏ الناتج بهذه الطريقة.

1. متعدد الببتيد ‎polypeptide‏ من العامل المتغاير ‎VII variant Factor‏ المعزول وفقاً لأي من عناصر الحماية من 1 - 8 لاستخدامه في علاج مرض أو اضطراب يكون فيه تشكيل الخثرة الدموية مرغوباً؛ حيث يتم اختيار المرض أو الاضطراب من المجموعة المكونة من النزيف ‎chemorrhage 5‏ نزيف الجهاز الهضمى ‎(gastrointestinal bleeding‏ نزيف لا ‎(Ka‏ السيطرة عليه ‎cuncontrolled bleeding‏ نزيف في ثديي يخضع لعملية زراعة ‎transplantation‏ أو استتصال ‎resection‏ أو ‎surgery daha‏ نزيف دوالى المنشاً ‎(variceal bleeding‏ قلة الصفيحات ‎thrombocytopenia‏ الهيموفيليا ‎chemophilia‏ نزيف داخل الجمجمة ‎hemorrhage‏ 00808018 تمدد الأوعية الدموية الأبهري ‎caortic aneurysm‏ وفرط إعطاء 0 مضادات التخثر.

2. ركيب صيدلى يشتمل على متعدد الببتيد ‎polypeptide‏ من العامل المتغاير ‎variant Factor‏ ‎VII‏ المعزول وفقاً لأي من عناصر الحماية من 1 - 8 وسواغ مقبول صيدلياً.

)أ(ل١ ‏شكل‎ ‏من توع بري‎ VIE ‏عامل‎ ‎0 ‏خمصممذت افوا جف فت 001004 004004001000001 110 خم‎ ‏نأف مغفاة تلفاف وا وى وفناة الت تن تاذ‎ 6 TOTGGATTTOTTACAGTGATGOOGACCAGTOTGUCTCAAGTUCATGUCAGAATGLAGRCT CUTGCAAGOACCAGCTUCACTUCTATATC TACT TCTGCOTCCOTECOTTCAAGRUOCAGA ACTETGAGACGCACAAGURATCACCAQCTOATCTGIGTGAACUAGAACGULGGCTUGTGAG CAGTACTGCAGTGACTACACGOGUACCAAGCOUIICTETCGRTOCCACGAGGOGTACTCY CTGCTOOCAGACGURGTOTOCTECACATCCACAGTTRAATATCCATOTGUAAKAATALCT ATTCTAGAALARAGAAATOCCAGCAAALCCCCAAGUUCEAATTOTQOUGGECAAGOTATG CCCCAAAGQGRAGTUTCUATROCAGUTCOTGTIOTTIGOTGAATOGAGCTCAGTTGTIGTGA GOGOACCCTRATCAACACCATOTGOGTGOTCTCCOCOGUCCACTUTTIUGACAAAATCAA GAACTGRAGHAACCTOATCGUGGTOCTGOUCHAGUACSACCTCAGOGAGUACGALGHGH ATGAGCAGAGCLOGCOGOTOCUGCAGGTCATCATCOUCAGCATGTACGTCCCGOGCALT ACCAACCACGACATOBOGCTECTCCGUCTECACCAGCCUGTCOTCOTCACTGACCATATO GROCCCOTCTRCOTORCCOAAQGLRATUTTCTUTGAGAGUACGUTHGUUTTCETGOGOTTIC 0 ‏فاالتاتات ا‎ 000010000046 00100100 0001000000000 04015 GTCCTCAACETORCCCGUUTBATGACLCAGRACTGCCTGCAGCAGTCACGGAAGGTEGG AGACTCCCCAAATATCACGGAGTACATUTTCTUTGCOGGCTACTUGGATGGCAGLAAGHA CTCCTGCAAGGGOGATAGTGGAGUUCCACATOCCACCCALCTATCCOGUGCATCGTGGTALC TGACGOGCATCGTCAGCTGOGOCCATGQGOTGUGCAALCOTAGOCCALTTTIGOGATG TAL ACCAGGGTCTCCCAGTACATCUAGTHOCTGCAAAAGCTUATGOOUTCAGAGUCACGCCT AGGAGTCCTCCTBCOAGRCCOATTTOCC ‏(تعريف الترثيب رقم‎ 71 GLCAACGOGTTCCTOGAGGAGETGUGGCAGGGUTCCC TUG AGAGGGAGTOCAAGTAGIIA GCAQTOLTCUTTCGAGCAGCUCCGOGAGATUTTCGAAGACGCOGAGAGGACGAAGCTGT TOTGGATTTCTTACAGTGATGOOCACCAGTGTGUCTCAAGTOUATOUCAGAATGGGEGCT COTGUAAGGACTAGCTLCAGTUCTATATCTACTTCTGCOTCCOTOUATTCG AGG 0008 ACTOTCAGACUCACAAGUATGACCAGUTCATUTGTU TAA ACGADAALGGCGACTATOAG CAGTACTGCAGTOACCACAACGGUALCAAGCGCTCCTATCAGTOCCACGAGRRGTALTCY CTCUTGGCAGACGOGOTOTOCTOUACACCCACAGTTGAATATCCATOTUGRAAAAATALCT ATTCTAGAAAAAAGAAATOUCAGUAAACCUCAAGQUCEAAT TG TAO HGGOCAALQTOTG CCOCAAATGCUGAGTGTCCATOOLALGTCOTCTTOTTGUTRAATGOAGCTCAGT TGTGTOG GOGUACCCTGATCAACACCATCIGOGTGOTOTCCELGUCUCACTUTTTCGACAAAATCAA GAACTOUAGUGAACCTOATLGUGETGCTCGHCOAGSCACGACCTCAGCGAGCACGACQGUG ATCAGCAGARCCOGUGRG TOUCH CAGGTCATCATICCCAGCACTTACGTCCUGBGCACT ACCAACCACBACATCOCOUTOCTCRCUCTOCACCAGUCOGTOAACCTCACTOACCATATG GTOCCCOTCTGCUTCLCCGAACCGGALOTTICTCTOAGAGQACGUTGGCCTTCATARGUTTC TCATTGHTCAGLOOUTGHGGUCAGCTGUIGHACCHTOROGCCALGOCCCTGUAGETCATG GTOCTCAACOTOOCCCOGUTCATOACCCAGGACTOCUTGCAGCAUGTCACCGRAABT TAG AGACTCCCCAAATATCACQUAGTACATOTTCTOTOUCGOLTALTCGGATGO LAGOA AGRA CTCCTGCAAUGUOGACAGTOGAGGCOCACATOUCACCCACTALCGUGGLACGTUGTACC TGACGGGCATCGTCAGCTEOGOCCAGGUCTGCHCAALCUTGUGCCALTTTOLGOTLTAC ACCATGCUTUICCCACTACATCHAGTGOCTOCAAAAGCTCATOCOCTCAGAGLCACGLCC AGCAGTCCTCCTGUGAGCCCCATTTCCCT

)ب(١ ‏شكل‎ ‎17 ‎GCCAACGCGTTCOTGGAGQAGCTGOAGCAGGECTCCCTOCAGAGGUAGTGLAAGGALGA ‏7ت ففف مف 004 تفي 3011 100010000000000 قفا‎ FTOTGUATTTUTTACAGTUATGUGGACCAGTUTGOUTCAASTCCATGCCAGAATGGRGGLT CCTOCAAGGACCAGCTCCAGTCCTATATCTOCTTCTGCCTCCCTROOTTUGAGGGOLGGA ACTOTGAGACCCACAAGUATGACCAGCTGATOTUTOTGAACGAGAACGGUGOUTATGAG CAGTACTOUAGTOACCACAACBOCACCAAGLQCTCOTATCEGTORCACGAGOGGGTALTCT CTGCTGACAGATGHGOTUTUCTGCACACUCACAGTTOAATATCCATOTGGAAAAATACCT ATTOTAGAAAAAAGAAATOCCAGCAMAACCCCAAGGCCOAATTIGTOGGUGOUCAAGOTOTG CUCCAAAQGUOATTOTCCATGOCAGCTUCTOTTATTQUTOAATOCAGCTCAGTIGTATGG GOGCACCCTOATCAACALCATCIGGOTGGTCINCECGACCCACTATTTCHACAAARATCAA GAACTORAGOAACCTOATOBCOGTGCTRGGUCAGCAQGACCTCAGUCAGCACGATGHRT ATGAGCAGAGCCGULEGGTOGLOCAGGTCATCATCCUCAGUACGTACGTCCCHRGLALC ACCAALCACGACATCOCOUTOUTCOGUCTOGCACCAGCUCHTAAACUTCACTOACCATOTG STCCCCOTCTOOOTOCCUGAACCGAACGTTCTCTCAGAGGACGCTGOCCTTCGTGCGOTTC TCATTGOTCAGCGUCTGGGOUCAGC TGC TGRACCETOGCOCCACGOCCCTEOAGUTCATO GTOCTCAACOTOOCCCOGCTCATGACCCAGGACTOOUTGUAGCAGTCACCEAAGUTGGE AGACTCCCCASATATCACQGAGTACATGTIUTGTCULGOUTACTCOGATCUCAGCA AGUA CTOCTGCAAGQGGGACAGTAGAGGUCRADATGOCACCCACTACCGGGGLALGTGOTACC TGACGUGCATOOTCAGCTOUGGUCAGOOCTOCOCAACCUTGGOCCACTTTIGGAGTETAC ACCAGGUTCTCCCAGTACATOGAGTGGCTEUAAAAGCTOATGCGUTCAGALCCACGCCT AGQAGTCCTCCTOCOAGCOCLATTTCRC { ١ ‏(تعريف الترتيب زقم:‎ |ّ ‏3ممم)‎ ‎000400011010004 0170000000001 001000 ‏خوذ وففا لقف‎ ‏تف لااستفقفة وو قف و04 0000ل‎ 000607 TCTQCGATITCTTACAGTOATGGOGACCAGTOTOCOTCAAGTCCATGCLAGAATGUGGUCT CCTOCAAGGACCACCTCCAGTCOTATATCTGOTICTGUCTCCCTOCCTTCOAGRECUGEA ACTOTGAGACGCACAAGBATOACCAGCTBATCTRTATOAACGAGAACGEOGGCTGTGAG CAGTACTGCAGTOACCACACGOGCACCAAGCGUTCOTOTCOOTOCCACGAGGROTALTCT CTOCTOOCAGACGOGETOTCCTOCACACCUACAGTTGAATATCLATU TIGA AAAATACCT ATTCTAGAAAAAAGAAATGCOAGCAAADCCOAAGOCCGAATTOTGRGGOOCAATGTOTG COOCAAAGGOGOAOTOTCCATGOCAGHTCCTOTTUTTGOTGAATGGAGCTCAGTTOTATICG GGUGACCCTGATCAACACCATCTEQUTOOTCTCUCROGCCCACTOTTTOCACA AAATOA A GAACTOGAGUAACCTRATCOCGOTOOTOGGUGAGCACGACCTCAGCGAGCATGACBGGT ATCGAGCAGAGCCGOCOGUTOOCACAGUTCATCATCCCCAGCACUTACHGTCLCGAGLALC ACCAACCACGACATCHCGCTOOTCCGOCTOLACCAGLCCCTOOTCCTCACTGACCATOTG GYGCCCUTCTGCCTOUCCGAACGUACOTTIOTCTGAGAGRACGCTGRUCTTICGTGOGCTTC TCATTGOTCAGLGOCTOGROCCAGOTECTRRACCOTGOCOCLALGLUCCTHRAGUTCATG GTOCTCAACHTGUCCCGGUTGATOACCLAGGATTGUCTGCAGCAGTUALGUA 0 ACACTCCUCAAATATCACOGAGTACATHITCTOTGCOOGCTACTCGUATGOCAGCAAGGA CTOCTOCAAGOGGRACAGTOGAGGCCCACATGCCACCCACTALCBAGUCACOTOATALL TCACGGOCATCETCAGCTEOGACCAGAGCTOOCUAACCOTOGOCCALTTIGOGGUTATAL ACCAGGGTCTCCCAGTACATCGANTOGUTAUAAAAGCTCATOCOUTCAGAGCTALGUCC AGGAGTCCTCOTOCBAGCOCCATITCOC{§ ‏(تعريف الترتيب رقم‎

(=) ‏شكل‎ ‎4 ‎GCCAACGOOTTCOTGH AGG AGUTGCGHCCOGUCTUOCTOUAG AGGGATGTOCA ‏غمومف م‎ GCAGTOCTCOTTCOAGGACGCCCBOGAGATOTTCAAGUACSCOGAGAGOACSAATCTAT TCTGGATT TCT TAC AG TOATOUGGACCACTGIGCOTCAAGTCCATGCCAGAATGOGTEGOT COTGOAAGOALCAGUTCCAGTCCTATATCTGOTTCTGCCTOCUTOCCTIOGAGGGOCHGA ACTGTGAGACGCACAAGGATGACCAGCTSATC TOTO ‏فوم موه مممفر فت اغغل‎ CAGTACTGUAGTOACCATACOGOCACCAAGUGCTCC TEICHGTGCOACCAGOUGTACTLT CTGUTCOUAGACGOGGTOTOCTGCACACUCACAGTTGAATATCCATUTOOAAAAATALST ATTCTAGAAAAAAGACAGOUCAGCAAACCCCAAGUOCGAATTOTOGGGOGCAACGTOTG CUCCAAAGCOOAGTOTCCATGOCACOTCOTOTTOTTOOTGAATGUAGCTCAGTIGTGTGG GOGGACCCTOATCAACACCATCTGOOTOOTCTOCGCGGOUCACTU TT TOGA AAAATCAA GAALTGUAGGAACCTGATCOCGO TCO TGGUCGAGCACOALCTCAGLGAGCACTGACGGUES ATGAGCAGAGCCOGUGGETAGUOTAGUTCATCATOCCCAGCATGTACGTCLCHBOCALT AUCAACCALGACATOGCHCTGOTCCHCOTECACCAGUOCGTOO TCO TCATTGACUATG TO GTOCCCOTOTGOCTOOCCOAACGTACOTTOTCTCAGAGGACGC TOGO TP PCG TRCHRCTTIC TCATTGGICAGUOGCTOUUGCCAGCTGCTUGACCHTEOLACCACOGCCCTUGATCTCATS GTCOTCAACOTOCOCCGGCTOATOALCCAGGACTGCCTOOAGCAGTCALGAAAGGTIGGG AGACTCOCCARATATCACOGAGTACATGTTCTOTOCCGUOTACTCOOATGUCAGUARGGA CTCOTOCAAGGOOHACAGTONAGGCCCACATGOCALCCACTACOGGGUCACHTGATALC TOACGOUCATOGTCAGUTOGBGOCAGGGCTGUOUAAUCHTACUCCACTTTSOGUTOTAC ACCACGOTOICCCAGTACATCGAGTUGO TGCAARAGL TCA TO LGU TCAGATCCATGOLS AGGAGTCCTCCTGUGAGCUCCATTICCO (2 ‏(تعريف الترتيب رق‎ ‏5خ‎ ‎GOCAACOOUTTCOTGG AGG AGCTGOBGOCHUGCTCLCTOGACGAGOUAGTOCAALGAGGA GOAGTGCTOCTTORAGGAGOCCCOGTAGATOTTCAAGCACGOOGAGAGUALGAAGCTGT TOTGOATTICTTACASTOATGOGHACCAGTOTGUOTCAAGTCCATOUCAGAATGGGGOUT COTOOAAGGARCAGCTCCAGTCOTATATC TCU TTUTGLCTUCCTGOCTTCGAGGRCCHGA ACTOTGACACGUATAAGCGATOACCAGCTUATCTGTGTGAACCAGAACTOCOGUTGTGAG CAGTACTGUAUTUALCACACOGGCACCAAGCOCTCOTGTCOGTEUCACGABUOGTACTCT STG TOO CACACG GOUT TOC TGCACACCTACAGTTCAATATOCATUTGGAAAAATALCT ATTCTAGAAAAAASAAATOCCAGCAAACCOCAASGUCGAATTOTOGGUGGCAASGTGTG COCCAAAGOOGAGTOTOCATOOCAGT TCO TO TTC TTA TO AATGOAGCTCAGTTATETON GUOGACCCTOATCAACACCATCTIGAOTOETCTOCGCHGUCCACTGTTTCGACAAAATCAA GAACTOGAGGAACCTGATCOCOOTEOTCOGCGAGCACGALCTOAGCOAGUADCACHGAS ATDACCAGAGCOOOCOGGTGOCCCAGETCATCATCCCCAGCACS TACUTOUCHGORALC ACCAACCACTACATCOCGCTGOTCCGUUTGCACCAGCCCOTERTCOTCACTOACCATOTG 100001010001000 00000177017010 040 04-00100001100100001 TCAT TOG TCAGCOGOTORGOUCASCTGUTGUACCGTEUCGCCALGGUCCTOBAGUTCATS GICOTCAACOTGCONCGOCTOATGACCCAGEACTOCOTGLAGUAG TUACGUAAGHITGOS ATACTOCCCACAGATCACGOAGTACATO TIC TETGOCOGCTACTCOOATOGCAGCAAGG ACTCUTGCAAGTOGGACACTOGAGUCUCACATGCCACCCACTACCOGEUCALGTOGTAL CTOACGOGCATCCTCAGCTGGGOCCAGGOCTGCGCAACOGTGOGOCATUTT TGOGETGTA CACCAGGATCTOCCAGTACATCOAGTOGOTGCAAAAGUTCATOCBCTCAGAGCOALGOCE AGGAGTOCTCCTOCOAGUCCCATITCCC (1 (a8 3 ‏(تعريف الثرتيب‎

‎Jas‏ (د) 465 404000401004004 000000000000001 00007100100040 0004 004040046001 تف فضا فو 00400000004 00004 ‎TCTGGATTTCTTACAGTCATSOGGACCAGTATOUCTCAAGTCUATGUCAGAATRGHGOGETY‏ ‎DCTGCAAQCGACCAGUTCCAGTCUTATATUTGUTTOTGLOTCCOTGCCTICGARQULCGGA‏ ‎ACTOTGAGACGCACAACGATOACCAGUTGATOTOTOTGAACGAGAACGLUGUCTETGAG‏ ‎CAGTACTGCAGTCACCACACGGGUACCAAGCGUTOCTG TCA TOOT ACGAGQGGTACTETY‏ ‎CTGUTQBCAGACGRGHTETCUTOCALALCUAC AGT TGAATATCCATOTGGAAA AATALCT‏ ‎ATTCTAGAAAAAAGACAGGCCAGCAAACCCCAAGGUCOAATTGTGGGGOGUAAGGTGTE‏ ‎COCCAAAGOGGAGTOTCCATOORAGOTCCTATTGTTGUTOANTCOAGCTCAGTTGTUTGE‏ ‎GGOGACCCTCATCAACACCATCTCGUTACTUTCCOCOGUCCACTOTTICGACAAAATCAA‏ ‎GAACTOCAGGAACTTOATURCGUTHCTBGOURAGCACBACCTCAGOGAGCACOACGGAG‏ ‎ATGAGCADAGCOGGCGGOTHGCOCAGUTCATTATCCCCAGCACOGTACGTCLCGGOCALCC‏ ‎ACCAACCACGACATCOCGOTGUTOCOOUTGUACCAGLCCGTGUTCCTUAUTGAUCATATSG‏ ‎GTOCCCCTCICCCTGCOCGAACGGACGTTUTCTOAGAGGACGUTGGCCTICETGCRATTC‏ ‎TCATTOOETCAGCGGCTHGOGCTAGCTRCTOGACCOTOACERCOACGOLCCTRGAGLTCATG‏ ‏4 م تأففق 0040 0004 010410710000001 04ت الوا ف ا اتات 04 مووي ينث عا وزغ قف ل م|ممفغنوقول لخر ولتت الا 0000101 01000411 فم 00100 و0 لعو تو اذغ وان فت رن ‎CACCAGGOTCTCOCAGTACATCGAGTGOUTGCAAAAGCTCATGUGUTCAGAGUCACGOTY‏ ‎iy pd)‏ الترتيب ‎AGGAGTCCTCCTGUGAGCTCCATTTOCC {VY ad‏ 87م تبغ عفدا تبنفاتن قفا اناا و فااا لا قا ان اا اناا 407 تو قت ل اغفوق 0 تذفك04 0000-0000 040170010017004 ات تخي ا عا ور راف 0 لخت مقي 01ل تتا 000000000008 لم1 تخ ا وخ تاذ فا ا تنفت 00101 تن ولد ذتنذ( افق 11 وا اخ اتامشتنئف ا ذراتلقفضاهشاتا اذنتم نا ولام 0000017 04 1ن توا و0 فاخن 00 0ت لفان خرن لخن وتخا وهل ‎CTECTGOCAGACGGGOTOTOCTOCACACCCACAGTTGAATATCCATGTUGAAAAATACCY‏ ‎ATTCTAGAAAAAAGAAATOCCAGCAAACCCCAAGGCCOAATTATGHROGGGUAAGOTGTG‏ ‎CCCCAAAGGGCAGTOTCCATGUCAGGTCCTUT TOT TOU TUAATGCAGCTCAGTTIGTATGH‏ ‎GUGGOACCCTOATCAACATCATCTUOGTOETCTUCOCUGCUCACTHTTICG ACA AAA TUAA‏ ‎GAACTOOACUAACCTGATCOCOETOUTCUUCOAGLACGACUTCAGCGAGCACGACGOGG‏ ‎ATGAGCAGAGCCGCRGOGTOUCOCAGGTCATCATOCCCAGLACGTAQETCCQGEGTACC‏ ‎ACCAACCACGACATOGCGUTGUTOCGUCTOCACCAGUCCGTGOTCOTCACTGACTATOTG‏ ‎GTGCOCCTCTIGCCTOCOCCGAACOCACGTITCTCTGAGAGGACGCTGOCCTTCAETCGUGLTTC‏ ‎TCATFOGTCAGCGGCTGGGGUCAGLTGCTAGACCETAGLGUCACGGUCCTGOAGUTCATG‏ ‎GTCCTCAACOTHRCCCOOGCTRATAACCCAGBACTOCCTOCAGCAGTCACCUAAGUGTCOS‏ ‎AGACTCCOCAAATATCACGRAGTACATOTTCTOTGUCGGCTACTUQUATOGUADTAAGCGA‏ ‎CYCCTGCAAQGHOCACATTOCAGGUCCAUATOOCACCCACTACCORUOLALG TOG TACL‏ ‎TCAQGUGOCATOOTCAGRTGGGGUCAGOOCTOCGCAACCOTOGGUCACTTIGOGOTGETAC‏ ‎ACCAGOOTCTCOCAGTACATCOAGTOOOTGCAAAAGCTCATCCOCTCATGAGCCAQOQLC‏ ‏(تعريف الترتيب رقم: ‎AGGAGTCCTCCTGOOAGUCCOATTTONE (A‏

)ه(١ ‏شكل‎ ‎8 ‎000440071001000 00100000400001 0100400000170 ‏ممصو مم‎ 006401001001100 0000000 034101700440000 000047 1101004117014 040170470000004 01010001 ‏خا مع تذعه وففئ‎ 0007 COTGUAAGUACCAGCTCCACTCCTATATCTGUTTOTGLCTOCUPGUCT TCG AG GGCOGHA ACTGTOAGACGCACAAGGATGACCAGCTGATCTOTGTGAACCAGAACGGUGGUTOTOAG CAGTACTGCAGTOACCACACGGOCACCAABCAUTCC TGTCGGTGCCACTAGGOGTATTCT CTOCTGGCAGACGGUGTATCOTOCACACCCACATGTTOAATATCCATOTCGAAAAATACUT ATTCTAGAAAAAAGACAGGUCAGCAAACCCCAAGUOCGAATTATABOGBGCAAGOTOTE CCCCAAAGOGGAGTGTCCATOGUAGUTCC TOT TOT TCO TUAATGBAGCTCAGT TG TGTGE GOGUACCCTGATCAACACCATUTGOUTHOTCTOCHCHGCCCACTRTTTCOACAAAATCAA GAACTGOAGGAACCTEA TCACGOTOOTAUGCOAGCACGACUTCAGCHAGCALGACEGUHG ATGAGCAGAGCCOGCGGUTUGCRCAGETCATCATOCCCAGCACGTACSTUCCOGGCACS ACCAACCACGACATCOCGCTROTCCOCCTGCACCATCCCOTGATCOTCACTGACCATGTG GTGUCCCTUTEOCTGUCCBAACGOACO TTC TCTHAGANGACGCTRGCCTTCGTGUROTIC TCATTGETCAGCGGCTEAGHCCAGCTEUTGOACCATEOCGCUACCGUCUTGHAGCTCATG GTCCTCAACGTGCOUCHECTHATAACCCAGGACTECCTOCAGCAGTCALGGAAGG TOBE AGACTCCCCAAATATCACGOAGTACATGTTCTOTOCCBGOTACTCGOA TOOT AGCAAGGA CTOCTOCAAGGUGGACAGTGGAGGUCCACATOUCACCCACTACOGBGGCACGTARATALC TGACGOUGCATOOTCABCTGOGGUCAGGUCTHCOUAACCETOOOCOACTTTGGOUTUTAC ACCAGUOTCTOCCAGTACATCOAGTGOUTECAAAAGCTCATGCGCTCAGAGCCATGOCT 004010010010004 0000047770005 ‏(تعريف الترتيب رقم‎ ‏89م‎ ‏ووممه لمعه مف وصفه 00001700017004 00117001004007-100004 تت لفقا‎ 004010101700400 000900 ‏0ف0ئه 0 ف004 17 تنفد‎ 000017 TCTGGATTTOTTACAGTOATGOGGACCAGTETGCCTCAAGTCCATGUCAGAATGGGGGCT COTGCAAGGACCAGUTCCAGTCUTATATCTIGC TTC TOCCTCOCTRCOTTCRAGGRCOGAA ACTGTGAGACCCACAAGOATGACCAGCTOATCTO TO THA ACGAGAACUUCOGCTE TAG CAGTACTOCAGTOACCACACGBGCACCAAGUGUTCCTOTOOGTGUOACBAGGGGTACTCT CTOCTOOUAGACCUAOTHTOCTGCACACCCACAGTTGAATATCCATUTUGAAAAATACCT ATTOTAGAAASAAGAAATOCCAGCAAAUCCCAABOCUGAATTATGROGBGCAAGUTHTG CCCCAAADGOCATTOTCCATGOCAGOTUCTU TIO TTGUTOAATGOAGCTCAGTTOTOTGE GGOOACCCTOATCAACACCATCTGGOTOUTOTCCOOGECOCACTUTITCGACAAAATUAA CAACTOGAGOAACCTOATCOCOGTGCTOBOCGAGUACGACCTCAGCBAGUALGALGGHA ATGAGCAGAGCCGUOUGGTUCCCCAGOTCATCATCOCCABCACSTACGTOCCGGGCACD ACCAACCACGACATCOOGCTOUTCCOUCTECACCAGUCOOTOGTCCTCACTGACCATGTS GIGOUCCTCTEUCTOCCCOAACGGALGTTCTOTGAGAGCGACGUTOGUCTTUGTGLACTIT TCATTGOTCAGLOUCTOOGUCCAGC THC TOGACCOTGRCBCCACGOUCCTOGAGCTUATS GTCCTCAACOTOOCCOGOC TOA TGACCCAGGACTGUCTECAGCAGTCACGUAAGG TOG AGACTCOCCCACAGATCACUUAGTACATOTTCTOTOCCAGBCTACTCOOATORCAGCAAGS ACTCCTOCAAGGUOGACAGTOUAGGUCCATATHCCACCUACTACCUGGOCACATAOTAC CTGACGGOCATOGTCAGCTGOGGCCAGGACTGURCAATCCOTGGUCUACTTTUGGGTGTA CACCACGGTCTCCOAGTACATCOAGTOOC TOCA ‏ممم ومنمم مف 001047000070 في‎ AGGAGTCCTCOTOCOAGUCCRATITCOC )٠١ (pf) ‏(تعريف الترثيب‎

)و(١ ‏شكل‎ ‏مت‎ |, 00044000017001 ‏40-010-00و0 0و0‎ 004000-00 000400001004004 004310010017004 004000000000701 004000000000400 007 110170041170714 ‏خا تع مت مضه 00004 أنفن تفل‎ 70070067 ‏فتاه لفق فلن خف فت‎ TOC TATATC TGC TTC TROCTCCCTOUCTILGAGGGUCGGA ACTGTGAGACGCACAAGGATOACCAGCTUATC TOTO TAAACBAGAACOGCGGCTRTGAL CAGTACTGCAGTEALCACACGOGUACCAAGUGCTCLTATCROTGUCACCAGGHGTACTCT CTOUTGUCAGACGAOOTETCOTGUACACCUACAGTTGAATATCCATOTGUAAAAATALCT ATTCTAGAASAAAGACAGGCCAGCAAACOCCAAGGLCUAATTGTOGGCUGCAAGLTGTG COCOAAAGGOGACTOTCCATGRCAGGTCCTUTIGTTGCTOAATCRACCTCAGTTATGTG0 GOOGACCCTOATCAACACCATCTOAO TGA TCTUCGCHALCRACTRTITCOACAAAATCAA ‏تافو تافو تفخت‎ 010000010010000 064000-0-000 ‏“ممم ووعم موي00 041074 فى توعفه 00000000010000 تخت تله‎ ACCAACCAQGACATCOOGCTGUTCCGUOTOCACCAGCCCUTOGTCCTCACTOACCATETE 010000101010060 00040101010 0040001000011001 00016 ‏تف‎ 1001 040000013000400 000010003004 00000-100 0013 07004 0017000000001704104 00040040100010 ‏خخ تف 1 قاف وف‎ 0 AGACTCCCCACAGATCACGGAGTACATGTITCTOTGCCGOCTACTCOGATOGCACLAAGT ACTCCTOCAAGUGGBACAGTGOAGOCCCACATACCACCCACTACCRGGUCACGTOGTAC CTCACGGGCATUGTCAGUTAGBECCABGUUTOUGCAALCGTGOGCCACTTTGGGUTATA CACCAQGUICTCCCAGTACATCGASTOGCTRCA AAA GCTCATOOGCTCAGAGCUALGCCT AGGAGTOCTOCTGCGAGCCOCATITCCO {VY ‏(تعريف الترتيب رقم‎ pMBI GCCAACGOOTRCCDIGAGHAGCTGCGOCAGGGUTCCUTGGAGAGUGAGTOCAAGG AGUA GCAGTOCTCCTTCEAGOAGOCCOOGGAGATOT TCO AABACBAABAGOAAALGAAGCTGT TCTGOATTTCTTACAUTOATGGOCACCAGTO TUCO TCAATTCCATGCOAGAATGOOBOCT COTGCAAGOATCAGCTCCAGTCCTATATC TOOT TCTOCOTCOCTOCOTTCHAGHOOTGHA ACTOTUAGACGCACAAGGATOACCAGCTGATCTETUTGAACGAGAACGOCOECTOTOAC CAGTACTGCAGTCACCACACGOCCACCAAGUGCTCCTETCOATGLCACCAGGUGTACTLY CTGUTOGCAGACGOGUTOTCCTOCACACOCACAGTTGAATATCOATOTOGAAAAATACTT ATTCTAGAAAAAAGAAATGCCAGCAAACCOCAAGGCOUAATTGTGOOGBOCAAGHTGTG COCCAAAGOUGAGTGTCCATOOCAGHTCOTOTTOTTGGTGAATGOAGCTCAGTTOTETAG GOOGACCCTGATCAACACCATCTOOGTGOTCTCCUCHOCCUACTUTTTOCACAAAATCAA GAACTOOAGUAACCTUATLGCOGTOUTGGHCBAGCALGACCTCAGCOAGUACTACGGHO ATCAGUAGAGCCGUCHOOTRGCGCAGGTCATCATCCCCACCACGTACGTCCCRGUCALT ACCAACCACCACATCOCGUTECTCOGCCTOCACCAGCCOGTOOTCCTCACTGACCATG TG 010000101000100 000001101710404 000001000110010 041001704 00000-10000000010010040010000000000000 GTOCTCAACGTGUCCCUGCTUATCAUCCAGOACTOUCTICAGCAGTCACOGAAGGTGON AGACTCCCCAAATATCACGOAGTACATATTCTGTOCOCACTACTCOGATOGCAGUAAGGA CTCCTOCAAGOUGHACAGTOGAGGCOCACATGUCACCCACTACUOBUGCACGTGG TALC TGACGUOCATCETCAGCTGOGGUCAGGECTECGCAACCATOGECCALTTTGGOUTGTAC ACCAGGOGTUTCCCAGTACATCCAGTGOUTACAA A AGUTCATHCOCTCAGAGCTATGUOC AGGAGTCCTOCTGOGAGOCCCATTTONE {VY ‏(تعريف الترتيب رقم؛‎

)ز(١ ‏شكل‎ ‏2م‎ ‎006400001100100 0100100000400001000100 44009040170 ‏مومفه وف‎ 004010010017004 004 000000004041011 0044 ‏ف فا تف موف‎ 17 TCTGOATTTCTTACAUTGATGUGGACCAGTGTGCCTCAAGTCCATCOCAGAATG 00007 6010 ‏معان متخو ف"‎ 7 001414101 0011010001000170-011700400000004 ‏ومو ومن وجممم عمف 10707 تمدو تف ده الدو فخ نت معننمتعتتاة‎ CAGTACTGUAUTUACCACAUGOGCACCAAGLGCTOCTGTCOGTGCCACBAGGGATACTCT CTGCTGGCAGACGOGGTGTCCTOCACACCCACAGTTGAATATCCATOTGAAAAAATACCT ATTCTAGAAASAAGACAGGCCAGUASACCUCAAGUCUGAATTGTOOOGOUCAAGHTOTE CCCCAAAGGUOAGTOTCCATORCAGATCCTOTTOTIGGTGAATGUAGUTCAGTTUTOTGH GOGOGACCCTGATCAACACCATCTOOGTOOTCTCCOCORUOCACTOTTTCGACAAAATUAA GAACTOUAGOAACCTOATCOCOOTGUTOGUCGAGUALGACCTCAGCGAGLATGALGONE ATGAGCAGAGLUGGUGOGTGGUGCAGGTCATCATCCCCAGCACGTACGTOCCUEGLACS ACCAADCACCACA TOGO TGCTCCGLOTOCANTAGCCCO TAG TCCTCACTRACCATITG GTOCCCOTCTOOCTRCOCGAACOOACGTTCTOTOAGAGOAUGUTGOUCT ICATGLACTTC TCATTGOTCAGCGGCTGOOGCCAGUTGCTGOACCOTOGCGCCACGOUCOTAUAGUTOATG GTCCTCAACGTOCCCCGOCTGATGACCCAGCACTICCTGCAGCAGTCALGUAAGETGGG AGACTCCCCABATATCACGGAGTACATGTTCTGTGCCOGCTACTCOBATAGCAGUAAGGA CTCCTGUAAGGGUGACAGTOGACGOCCACATGUCACCCACTACCHRGOUACGTAUTAC TEACGOUCATCOTCAGCTAGONCCAGGUCTECGCAACCATORACCACTTTAGUGTGTAC ACCAGGOTCTOCCAGTACATCOAGTOGUTACAAAAGUTCATACRCTCAGAGCCACGUCE AGGAGTUCTCCTGOGAGCCOCATTTOOC (VF ‏الترتيب رقم‎ iy sad) ‏مم‎ 3 000440000170010 0040010000 040000100010 040000401000004 GCAGTGOTOCTTOGABGAGGCOCGOUAGATOTTCGAAGACGAAGAGCGAAACGAABCTOT TCTGGATTICTTACAGTGATORGOACCAGTOTGOCTCAAGTOCATOUCAGAATGGUGALT COTOCAAGOACCAGCTCCAGTOCTATATCTGCT TCTGUCTOCCTOOCT 0040000004 ACTOTGAGACGCACAAGGATUACCAGCTOATCTETOTOAACGAGAACTGLGUCTUTOAG CAUTACTUCAGTOALCACACGGGCACCAACCGUTCOTATCGUTGOCACGAGGGGTACTCY CTGUTGGCAGACGGGOTOTCOTECACACCCACAGTTUAATATCOATATGOAAAAATACCT ATTCTAGAAAAAAGAAATGCCAGCAAACCOCAAGGCCGAATTHTHGOGOUAALGTATO COCCAAAGOGGAGTGTCCATGOCAGETCCTUTTATIGHTGAATOCAGCTCAGTTGTGTGG GOGGACCCTGATCAACACCATCTOOOTOGTCTCCGCEOCCCACTGTTTCUACAAAATCAA GAACTOGAGGAACCTGATCACGATOCTGOGCCAGCACGACCTCAGCUAGCALGACTHGS ATGAGUAGAGCCOGCOGETOOCOCAGETCATCATCCUCAGCACOTACGTCCCOGGUALE ACCAACCACOACATOUCGCTGUTCUGUCTHCACCAGCCORTGOTCOTCACTOACCATATG 010000010100010000044 00040011010104 0400 000100001170100 TCATTOOTCAGCGGCTOGGUCCAGCTGCTGOACCOTOCUECCATGBUCCTOGAGUTCATG GTCOTCAACGTGCOCCOGCTUATRACCCAGUACTACCTOUABCAGTOALGGA AGE TGS AGACTCCCCACAGATCACOGAGTACATOTTCTUTGOCGACTACTCGOATOGUAGCAAGG ACTOUTOCAAGGOGUACAGTGURAGHCCCACATUCCACCCACTACCOGUOCACTTUGTAL CTGACGGUCATUGTCAGCTGOOGCCARGOCTOCGCAACCGTGUCOCACTITGAOUTGTA CACCAGGOTCTCCCAGTACATCOAUTOGUTGCAAAAGETCATECECTCAGAGCLALGUCT AGGAGTCCTCCTOCOAGUCCOATTTOCC )1 £ ‏(تعريف الترثيب رقم:‎

)ح(١ ‏شكل‎ ‎854 ‏ممم معد ممم مم0 0100010 001000004000 04ف 0001710010 ففااقات‎ GCAGTOGOTCCTTCGAGGAGUCUCGOGAGATCTICGAAGACGAAGAGCAAACGAAGCTOT TOTGOA TT TCT TACAGTOATOGOGACCACTGTGCUTCAAGTCCATGCCAGAATOGGGOT COTGCAAGGACCAGOTCCAGTCCTATATCIGUTTOTGCCTCOUTGOCTTCGAGGGCCGGA ADTGTGAGACGCACAAGCATOACCAGUTOATCTOTGTOAACGAGAACGGCGGUTGTGAC CAGTACTGCAGTEACCACACGOGCACCAAGCGCTOCTO TCO TGUCACGAGGOGTACTCT CTOCTOOCACACGGOO TO TCC TOCACACCCACAGTTOAATATCCATHTOOAAAAATATCT ATTCTAGAAAAAAUACAGGUCAGCAAACCCCAAGUUCGAAT 101000000440 COCCAAAGGOOAGTOTCCATGGCAGGTCCTOTTOT TOO TRAATGUAGCTCAGTIGTGTGE GGUGACCCTOATCAACACCATCTOGG TRG TOICCOCOGOCCACTOTITCOACAAAATIAA GAACTOGAGGAACCTGATOGCGG TOU TOGGOGAGCACGALCTCAGCGAGCACGACGGGE ATGAGCAGAGCCGOOGROTOGCGCAGTTCATCATCOCCAGUACGTACOTCCCGRGCACE ACCAACCACGACATOGCGUTGOTOCGUCTHCACCAGUCCOTGUTCCTCATTOACCATETG 0100000101000100000 ‏تافل تلفتاغل غك تتموغ اند‎ 100001100100007 101001 ‏وم د-مممه مو 000ئ7ى4000001000004001001700400100-00-0‎ 51001 040100000007047 ‏مممممع سه ته معى ه العو والتجفة جفق'ة ع0‎ 090 AGACTCCCCACAGATCACGGAGTACATG TTCTG TOCOGGCTACTOOGATGOCAGCAAGE ACTCOTOUAAGOGGOATAGTOBAGOUCCACATOCCACCCACTACCOGGUCACGTOGTAC CTGACGOGCATCGTCAGCTGGGOUCAGGGUTGCGCAACCTTGGGOCACTITGOGGTGTA CACCAGOGTOTCCCAGTACATOOAGTOGCTGUAAAAGCTCATGCGC TCAGAGLLACGCCT AGGAGTCCTCCTGCGAGCCCOATITOOC (10 ‏(تعريف الترتيب رقم‎

‏شكل ؟‎ ‏من نوع بري‎ VI ‏ببتيد عامل‎ ANAFLERLRPGSLERECKEEQCSFERARBIFKDABRTK LF WISY SDODQUASSPOONGGS CROQLOSYICPCLPAFRGRNCETHRDDOLICVNENGGCRQY CS DH TO TR RSCRCHBG YSL LADGVSOTPTVEY PCGKIPILEKRNASKPQURIVOGK VOPR OECPWOVLLLYNGAQLUGH TLINTIWVVSAAHCFDKIK NWRNLIAVLORHDLSEHDODEQSRRVAQVIIPS TY VPGTTN HALLRLHQFVVLTDRVVPLOLPERTFSERTLAFVRFSLVSOWOQLLDRGATALELMVL NVPRLMTQDCLOQOSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDOSKDSCRODSGOPHATHYROTWYLTG IWSWOOGCATVGHFGVY TRVSQYIEWLOQKLMRSEPRPOVLLRAPFF ‏(تعريف الترتيب رقم‎ 1 ‏ى| أ‎ VI abs ANAPLERLROGSLERECKBEQCSFERARRIFEDABRTRLFWISYSDODOQUASSPOQRGGS CRDQLOSYICFCLPAFRGRNCETHEDDQLICVNRNGOCRQYCSDHNG TK RECRCHEGYSL LADGVSCTPIVEYPCOKIPILEKRNASKPQURIVGGK VCPROBCPWOVLLLVNGAQLLGG TLINTIWVVSAAHCRDRIKNWRNLIAVLOEHDLSEHDGDBQSRRVAGVIPS TY VRGTTN HOIALLRLHOQPVNL TORY VBLOLPER TFSERTLAFVRFSLVSOWOOLLDRGATALELMYL NVPRLMTQDCLOQSREVODSPNITEY MECAGY SDGSKDSCKGDSCOPHATHYRGTWYLTG IVSWOQGCATVGHFGVYTRVSQVIEWLOKLMRSEPRPGVILRAPFP (of 5 ‏(تعريف الترثيب‎ 0 V2 al ANAFLEBELRQGSLERECKEEQUSFEBARRIFEDEEE TE LEWIS YSDGDOQUASSPCONGGS CKDQLOSYICFCLPAFRGRNCETHEDDGLICVNENGOCRQYUSDHNG TKRSCRCHEGY SL LADGVSCTPTVEYPCOKIPILEKRNASKPQURIVGGK VOPR OBECPWQVLLLVNGAQLUGH TLINTIWVVSAAHCFDRIKNWRNLIAVLOEHDLS BHDODBQSRRVAQVITPS TY VPGTTN HINALLRLHQPYNLTDHVVPLOLPERTFSERTLAPVRFSLVSGWOULLORGATALELMYL NVPRLMTQDOLOQS REVO DAPNITEYMECAGY SDGSKDSCRGDSGGPHATHYROTWYLTG IVSWOQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLOKLMRSEFRPOVLLRAPER ‏(لعريف الترتيب رقم:‎ {YA

+ ‏شكل‎ ‎2 2 5 : ‏ل‎ 3 El SR yl 1 | Sw, _¥ «ER { 3 pode . 4 ‏وج‎ 4 borin 4 ‏اج‎ +38 _y sa es 4 RY) ْ 4 ‏“يت‎ 4 postu | A =) Lo) ‏ل‎ ‏اناي‎ y prey Re, _y elu, ge—— rem" ‏اس نمس‎ | = = ] a m ‏رحد‎ va. | JET | > 0 = Ll IGS = < a 17 ‏لبن |" لن‎ 5 2

‏شكل ؛‎ > T RE 5 2 2 u ¥ 5 = i 535 IEEE 111 £ % 0 a a w= 3 Se ‏للا © تت‎ ١ 2 - ‏ا‎ k i 030000: . k AIAN ‏جنب‎ > 5 ERA 1 3 ‏ا‎ #7 ni i So oe of HEE ‏ا نح‎ 2 PN <2 RR RR QO CO El 1 . 4 ‏ام‎ Gi ‏م ك4 << »م‎ 3 c i 0 ‏ني‎ Eh ‏مساض‎

‏بج‎ Wad x : 5 8 : ] A 4 ‏ان‎ ‏ا ل‎ ‏ب‎ i 4 FE © a 2 ‏ذا‎ 3 ~ hoe vO j= { o x : ‏ب‎ 2 “ 8 | ES Cl 1 2 = ٍ ‏ا : مسلسسم‎ 4 : | ] Poe 1 3 : 1 ES : ٍ ‏د < 1 إ‎ ْ Ba 1 | © ‏ني‎ ¥ wa’ : ‏ميج‎ A . oi 3 2 «ER y : A ‏ا‎ : : : 8 ‏مم‎ 8 1 3 : ge ‏أ‎ 5 : 3 | | - bbe ‏ين‎ ١ x g 3 4 4 = 2 | 8 4 ] ‏ال ل" = | | إ نا‎ . : ‏صصح ل‎ FE 2 5 | ‏ا‎ ‎5 ‏لع‎ 3 31 3 5 : 5 ِ i 3 g

> ‏شكل‎ ‎1 : ‏إْ‎ 3 1 0 5 0 1 J § 3 : 1 0 § 1 8 § j $ 6 0 0. 1 ‏ملع إٍْ باجم‎ ‏ا اي أ‎ ١ ‏ل الله امات ا ابل لمان‎ ١ i [1 se { ‏ميخ‎ i i 2 i peal 3 fhe i i | quem ae pS | : 1 i § en 3 H $1] Ni H 1 1 3 i 3 § i 8 i : 3 3 i & i #1 th . : a rd 1 ‏وا ل‎ JE SA 1 hk 5 pot ved A an : ‏مسي‎ 3 = : ‏مجع جه ام 0 مط‎ 2 3 1 ol wa tal il 3 0-3 0 8 ‏لآ‎ FY ‏#ا‎ 8 Ud i Lg 1 ‏حا ال 1 بها‎ poi b] : : = wd ‏نح‎ od ![ ; 1 2 0 - ii Ee Be | By el ™ i $ § id 3 | ‏"م‎ 2 3 i. a N 1 § of 3 EE ‏نا ل اليا لبا م نا با‎ 0 EE DET ١ 7 7 1| 4 4 ١ 3 : CY ‏لا يم‎ - I ‏الم‎ | HS gle la lg 19 ‏ع با‎ lg 8# ‏ع ا‎ lg IE = ‏م‎ 0 id od 0 ‏لد‎ fe 0 | I = fm o a AY) oN ‏“.ا‎ fit) BN £3 & 7 1 = ‏ادا‎ 1 = ion = 81 : CO A PC CO ]- ‏ىا‎ a ‏ا‎ ‎TE JES 1 : N - Fo Foy FoF FAN ‏#ا 9ا جا ىا‎ i ‏ا يا .ا #ا #9ا ا‎ es I = jb |r ot ‏و‎ << jar Bo hoe = ps k en Fd = ‏4ك‎ I = oI oe 2 = = ot : 2 ‏ا 2-2 ا للها لها ا جا زا‎ =z 2 | | ٍ = 58 | ْ ¥ > ‏إٍْ‎ IN J hs k 5 4 ‏ص‎ ‎7 : ١ i I | : ‏اين‎ A ‏اا‎ : ERE OE BE ‏ها ها .ا .ها .ا‎ IA A ‏با‎ = § st fed Feed 4 i sd wi ed wd «i = j= © jm lm 8 © 0 © fo ‏©ا‎ im be = ‏للها 2 2 ب‎ EE ‏ب ب‎ = 8 = = = Ja 1a 8 jd ‏2ا‎ |d ja ‏ا‎ fa jd ja ia

VES N 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 - nis ‏يبيب‎ 8 : SAE TR AE A ‏أي‎ TR A 1 SH 1 7 ‏ل‎ + 1 ‏ا‎ 1 7 Rese ‏ل‎ AE TE SE SS SN + ‏«لا !: 4 ؛ 0 ل‎ 1 J ‏ا لأس أ اا‎ SH ‏ا الى الاك‎ 1 ‏ا‎ PR ‏يي . ال‎ 8 J 3 s H TTY i H H 8 N 1 ‏م 0 10 ؟‎ 9 3 ; SD SE SE SE 01 + Bg 1 ‏ام :0 0 لوخ‎ HR ion ‏؟‎ + Bae 1 ‏ب‎ FR 0 H ‏امنا"‎ EE $b 1 1 pot ‏لم‎ 1 > bl 2} 3 H 4 ¥ $ bh RN ‏*؟‎ 14 go =~ i : por} 3 JE SEE SHE SE SU + ‏؛‎ SUR SUE SN : 0 ‏سل ا‎ ~ HE PE {I : ‏4؛ :0 :0 :ل‎ : 5: SE I © N Se = i 3 H i ww NOE JE bot : ‏يا‎ N 26 ‏ال يح ااا اق‎ ! [| [EE | 8 ‏لل‎ + 8 ‏الدج ا‎ 3 : EAE 1 0: ‏ام 1 01 1 ؛‎ * 1 1 ‏ل م‎ ‏ات اا د ل د نه لد ا ل لمحي‎ I] \ AFI ‏كك‎ | “EERE EEE: ESN ‏ل‎ A 1 reed ‏ا 1 1 1 1 1 1 1 ل الح‎ 1 ‏خا‎ i ¥ § ‏يا ال سس با‎ FS SE SE + H : OB i ‏اس‎ EEC NE SE A NE oA \ > i i wi { qs wet hy 8 i i 3 3 3 1 N ~ 8 1 1 ) ‏؛ :0 + 1 !ل | | ؛ 1 | مل ل وى‎ 8 : 1 EN game i ; io H 3 1 | 1 1 1 1 1 4 : ‏يخ‎ + 0 4 ‏اا اتات ألا ل سيا ل ل ا اليف‎ OOS | 0: ‏إلا‎ ‎N - BHAT ‏الي‎ SAA ‏اما لمم‎ TS Gl 7 3 ‏م مب يمه سي ا لات‎ i ‏ال ب‎ Ng = \ [arts I ‏0000ل‎ J J Ei A Sa: IS HEE EEE | § ! 8 ‏ل‎ i : ‏اي‎ i i 0 1 [EE TE 10 ‏؟0‎ + LE : i ook SOX ped 8 roe Pog 1 TE SE SE + HER 1 ER JES hn EA ‏اي‎ 0 SS PRUNE J 1 0: SN SN SN ‏الها‎ + | [0 A Por : ‏:ل سال 1 #سييع ا‎ aes | 00 Sh

. + NM N Is 83 hs 8 3 3 ry ~ J i i i 8 ‏ا‎ BM ‏انود ل‎ + i } { i ; 1 ‏أي 1 3 ل‎ 3 1 ‏اسم‎ 4 id i WR EV IR: 4 H i ‏ة‎ 01 Yor lL ‏اا‎ ‎v a I a ; SHUTS URS ‏سد‎ SEE ‏ا‎ +; 9 BE FE SE A Ba TS Sa 4 413 HE LE EE ‏ب‎ 1 :! | Twi ‏ع‎ 8 IER ; SEE EE EEE < EE | | IEEE EE EY a px H i H od > tA coli if 040 1 ‏فج‎ > io 3 «ed § x 0 ‏؟-‎ 1 1000 N ‏ا اسلا‎ SE = Sooo 0 ‏ب‎ - 1 0: Ett ICT EE :[ ‏الى <لة‎ SF So mada a 1 ‏ا‎ ‎Moadig bol ENS Rl LD ‏اال‎ Ras! ‏ل‎

‎3. i : 0:1 +: & ‏ع‎ EEE ‏امياد‎ ETI EEE ‏اس‎ ‎oe ‏اح‎ § rb RAD EC SEP TR i ‏الله قلا ااا الا أ‎ : 1 SE : : 3 tre ol 1 > ~ 0 ‏أنه م‎ I SE JRL ES ‏د‎ NRE ‏د ا‎ Fa ‏الم‎ SEER ‏يا كذ ليرا الا 2 مسي اال :0 ؟ لس‎ ‏ل آنا انا اانا نل نا اا ا ا | لاسا | خالا‎ ol IEE SEE BE | SR EC ‏كسا‎ ON A 7 1 1 0| ‏ا‎ ‏م : ف لبي‎ : i HR Ea 8 LI ‏اذا‎ ‎= Hh i | boo = id id 1 SN ENC EE A : :! +] 1 v ond > 3 0 ‏جح 3 33 1 ل‎ 3 3 3 avy ¥ Jo gC BA BE ER Lo BY ow NUE A SE TNE I J + ‏اله‎ ‏ا امد الهحطل اتا د 01 بير‎ Sen HE « ‏ا م امسق سا‎ SOUR VU SOURS JU A - 433 NEN 5 BD SCR ‏ا‎ Hh VE ‏م‎ bo ETE HE ht ‏الا‎ Woe dd ‏لأسا بحر‎ i Poe 1 H 1 002 Re J ١ ١ 1 1 ‏ل سلا إل ]| نم‎ ‏ل ل اا 7 ا لواحي‎ SR SA A ‏ا لم‎ | SE i ‏أ‎ 5 8 : ‏طب“‎ H 23 1 ~ 4 a BE I oe : § HE Ff 1 | Se ‏د + ج»‎ 3 nd ‏يم بت‎ 3 Poe $ H § 1 SH 3 ot 3 1 H { * p 3 ond NES BEE TR NE ed SE 1 ‏:ا أل‎ EE ‏ا‎ SOE NT R ‏اس‎ a ‏ان‎ + i Veg 1 pi + ‏يحايس‎ FF ‏لي ؟‎ andor ‏م لمم‎ 8 ‏ان‎ BE ٍ ‏ال‎ i H 1 OE RE ‏ل‎ ‎=} ‏بر‎ 1 i Loan 1 { 1 ‏ا ا ال‎ SOE 3k 3 ‏جين ا‎ NE {SEY > J SUT 7 2:5 TE WN ‏تيت الاك السك ما ل‎ sg hk ge ne SEL ‏لاس‎ Ten spe Be £3 N > I~ ts + I AN fH ‏هنا‎ 0 ¥ 8 TRY 1 FEE ‏نض‎ 1 N FERIARLD 7 0 | SE ‏أ أ ا اغا الجا‎ = “3 H § : 8 3 0 11 $a My ‏حم | 0: ال‎ HI ‏يننا‎ Epp BH 2 i ‏ا لأ ا بق : أ نا )0 1 0 1 301 اله‎ k $ HE . : 3 7 3 sb ‏ل ا ا‎ IND Ema 1 ‏ا‎ 1 H 3 th FE NE RE Cal 8 RN H i H H 3 3 $ £1 ‏ل‎ H : ‏تدا‎ 1 wn 3 H ioe { ‏اللي + ل‎ 1 1 1 H H HY : : هعه٠هشذ‎ | : [1 + : ‏ع‎ ‎3 ‏م‎ 3 i i H 1 3H RRL EEE DES Se SU SOUT STN JOE SIN SURV SNE AVE SS ‏ا لا لاا‎ un a SE TIE ‏ا‎ SE EE H FEE WE Ds : ١ 10 1 Pe 1 4 ‏ل ل ل‎ NE SE NE SE S.C SS + ‏الله‎ 1 EE SA 1 ‏حي‎ 3 H ¥ ‏ل‎ 1 H N 3° I 8 : N {PS ‏ل ل‎ EE AEE © ‏ل‎ A = 01 00007 N LE TEN SE A 0:1 ‏؟:‎ 03 +10 3 Be! 0: ١ | 8 ١ 1 4 1 = 1 3 5 : 3 § i HE HE SE SE ‏؟‎ ١0 i Es ! § 1 i H i 3 VE aw H : 1 8 0 1 N H 3 {1 § 3 1 ‏ال‎ Hy i i 8° N ‏د‎ 1 } i } H i i He HEH HOE { LH 1 H i 1 ‏ل‎ * N + : 1 Ee ] 1 SCS | : : 1 ‏لات سس ساس ا ا ا‎ Js ‏ات دا‎ J ‏أ دا لاس عد‎ 1 H 3 1 8 i 3 ‏اف ا ا الي‎ : FE ‏؟‎ i EEE EE 1 ‏العا 1 : 1 اللا ا‎ | VEY 3 3 1 ¥ a 0 1: ‏ا‎ 1 3H 8, ; 8 : ‏إْ‎ i i i i 1 1 0: 1 ‏ا‎ 1 1 { i 2 ‏ا أ‎ ‏؛ُ‎ 3 4 8 i 1 i 1 N £0 ‏ل ل ل‎ by by ‏دل‎ bre boro 1 ‏ا 4ل ؛ 0 ل : ل ا : 40و41‎ 4 NE | ١ 1 8.0 ‏إلا يي‎ bd ‏تخالا ا‎ ‏اا اها ا‎ NOUR SUE DUO SU OL OO | = SUE UOC SUSE URN ORR SUN ‏لقتال لطا‎ 1 1 1 X : 3 0 3 HE. HE ‏اح و تح‎ H : i HER 1 EE | 0: 0 1 ‏ال 9لا‎ 1 1 1 1 | EE | BE » ‏لل‎ SE SS 0: 01 4 ‏ألم‎ I 01 1 04 84 ‏ا ا‎ ‏اي‎ ١ 010 t ii © 01 EE 1 1 7 + 1 1 . x - py 3 1 1 : ry i v 3 Ry 1 PI SUE CE ‏هل 4 010 1 ل ة:‎ | 1 1 1 ] 01 1 + 1 1 1 1 0 : } ‏أ 01 أ‎ ; \ الللسلشستسسسل ‎UD | UR UU‏ اتا ‎INR SONS‏ \ وح مت لح لحا لحت اه ل ل ا ا ‎a Bs a ei eS‏ ‎N‏ لون ددا افد اب ‎FT RE Pe ET‏ أبن ‎WOW‏ با لخطا لاا ير افا ‎ERY I‏ ‎FUER N‏ الخ ءاج + - - - = - ب م 0 1 : .+ بير يد ب ‎a‏ اللا الابما اغب سي > جم + - 2 ‎J a‏ ‎a + 1‏

ب شكل ‎A‏ ‏> : 1 83 1

‎g . Sd‏ ‎i 3%‏ 1 ' 1 : = 1 ‎FE . Ron H i i { 3‏ ‎OF 1 { § i‏ ; : - ‎Fy Sal ; 1 § i {‏ ‎ki a 3 >‏ 3 & ‎El 4 1 i | { bes‏ ‎i : i : 0 i i i TY‏ ‎i i i i pa‏ هوأ 1 * َي ‎wr‏ ‎i § 1 1 i poe‏ 1 * يي ‎EC‏ ‎Id | :‏ اا دخو 3 8# ا 3 1 ‎PE‏ 3 و 0 | ‎i i‏ ا ما ال ‎i‏ 5 ا ا ‎i ] Loe‏ ا يس ‎ha Rai I‏ ا ‎LL >‏ ؤي 1 ‎ES Wg‏ ‎ER‏ : بها لد +1 تم يع ‎ -‏ ‎H i SPE SI‏ لا ا | لبد . ‎g‏ م ‎Po‏ ‎H 3‏ ا ا ل : م ‎Hh‏ 1 ‎i 1 : «lo‏ 3 17 المج 2 7 #8 ‎E ES be Fo wd 18 ON i i 1 eed‏ ‎Ry i HI 8:1 1 lead‏ ع ب 2 ‎cof‏ ‎SE‏ اي ‎Boat ORD dl LE‏ 8 ا ا ا 178 لهند 17 ‎WP‏ دأ ذا ‎Je {LA eR i i 1‏ : لوو ‎fv in‏ ‎i‏ ٍْ د 7 الب ] 0 8 ‎wm Ike‏ ‎i i‏ المح ‎a Hl g » O31‏ م ‎a By 6% | A H‏ ‎Lo‏ أي | ‎Sina lex‏ اح ٍْ لالتحا ‎Peis‏ ‎ha + 2 i A] i 3‏ 5 ‎ee i 1‏ ,4 .م 0 ‎i i i 1‏ ال 8 ‎i 1‏ { ا * ‎Bg‏ الممسسسس اا ‎ol‏ ‎i 3‏ 23 : = ‎J i i 1 1‏ سوا ‎I'S‏ ب | ‎a‏ ‎ERE : SERENE 0 :‏ ‎IY : wo EE 3 1‏ حي ل لمق ‎RA‏ ‏: +« ا ل ‎A% wy oa = 0:1 bE I‏ م ‎ME ME EE ee ee)‏ ميض ات ال لم د د د د د ‎See br oe EEN‏ 3 ‎ES al |e EEE Re‏ > سل ‎Jr‏ ,£2 ييا ‎lS Ra‏ يج ‎os‏ 3 جنا ل ‎HEE‏ | ¥ سخ 8 ‎ao‏ 4 ا ‎i‏ ‏ا ل ‎fa 3 ¥ » oo Le‏ 3 ; لمحا ‎how 2 3 1 EN = A TN‏ ) 3 : ‎i i g‏ زر ا » 5 ‎E25 8 << T= I BE | :‏ ‎Yo Ex H i i :‏ م 1 اق ‎i i {‏ § = #510 ‎i i H 1‏ 3 ! حب ‎B‏ 5 ‎qi weed : 1 i‏ : امد م لمحت لدت مسد ‎a‏ لي ؟ 1 ‎San‏ ~~ 2 = ف ل سق ا «م ‏ مج يم ‎EE‏ الل ‎Ww‏ + 0 ‎Eg fn [= = . 1‏ ا د سسا “*) 219 ‎PN NU SR. ih‏ 1 # = 3 1 ‎3h SQ § x‏ 3 ; مب ‎ERE‏ ‎i = 8 *‏ م ا ا م1 ألا سل ا ‎je :‏ ‎PRE‏ لل ‎Pa aE‏ & ‎Le ~ :‏ < و له احج ‎XE‏ ‎bd WORE, a « ¥ OF a‏ سمي ‎Ny‏

لكشلا‎ od ‏ببح‎ = o> x GF $2 5 3 ‏جم‎ ‎} SE O00 9 $8 > - Ant . . pu Jo EI RR ‏الم سكي يه ع‎ - ‏لو نفج ا مي ات هئ‎ (a Serena oie ‏سه‎ Ma po Se ‏لا ا يتا تيوه اف اد ليمي بن بط لماي جيك ا‎ : ; X f : ‏.ب‎ ‎3 i 1 : ‏د‎ + i FANE ARSON SARIS Si WEN AY 4 ‏ادي مم ا ب‎ REA SLAIN 7 ‏ابا لا اي ا‎ * + ‏وله ميهي ولمحعس‎ IE SA “SN ‏ال تام‎ a os SER ARUN: SCI s SITET FISHER ‏ل‎ SRE ers ‏اا تتا ايخ‎ ‏وك موا ميا‎ OE Ge REE SE ‏ب‎ ‏ايب‎ ng ‏االو‎ 3 Ne I ‏ليما‎ ‎% | ih ‏لا‎ 2 6 8: 3 1 ponte] 1 8 on, Ny, 5 * ‏م‎ ‏ل د ل‎ fo be ht ‏عع و ا‎ WEIN CEH Er FHA ie WE IE SRNR SANGIN EP + ‏تب‎ ١ ‏ا اوفقي ع الجا او دا سس‎ 9 foun enna 3 ea SE Rd ‏ا‎ AN EN SRE R ‏سيا ل لس 1 حب‎ Es EL, ae isi ~~ & a eB A ad an aE ASS BA A ‏قا را الايد ل‎ ETN ‏ا‎ ‏ل‎ : 0 HR | ~ 1 ta ‏مسد مسترت تس‎ ei ees LATIN ra = ِْ ٍ ‏ال‎ ‎* 1 + 2 1 8 1 : 0 1 ‏مال ل ملس يس سس اا اا كك‎ ‏ا‎ 3 IR SRE HY Ey J a a Ein a ‏ل‎ a SA AY iN ‏ا‎ a es QA ate ne cn] 32 tintin ; ‏ا‎ 4 RE, y ‏د انو اام جم بخ حي اا اديت احم امدق‎ [SEIS CISTI CLEP tt. x IESE 4 § § 3 8 I : ‏الم سمي ا‎ ٍ ْ t Ko 3 I _ igri 1 . : ‏امي‎ ‎9 Ni 1 ‏د‎ ‎i 8 ‘ i. ‏أقصى حجم (ملي وحدة دولية/دفيقة)‎

شكل ‎٠١‏ ‏مقارنات: النشاط في المعمل للأشكال المختلفة و1111 (اختبار ‎PL-TGA‏ في بلازما ‎hemA mye‏ شديد) ‎a‏ ‎oe hed 2‏ 1 ٍ ا م 4 ‎REN‏ ‏@ غير محانج 71 ‎AF‏ " 4 © معالج ‎gf fF Vi‏ = + غير ‎V2 ghee‏ لمر 28 © معالج ‎SF V1‏ : 3 ‎ETF‏ سر ل 0 2 ‎Toe i wr = VEVIE a‏ ‎CL gmat oe‏ ¥ نت جات لا 4 مغر ‎Yowors‏ تيرك ‎Ye Yar Yous‏ 3 ‎FV 98‏ تانوجرام/ ملليلتر كمية ‎thrombin‏ المتولدة عن طريق ‎١٠١‏ تانوجرام/ ملليلتزر من بروتيتات 1717116 متتوعة 00 أ|ا غيب مغالحة؟» ‎١‏ معالحة ا 00 ‎١‏ بون معالجة؟ ‎١‏ ملم 0 لا ا ‎pn‏ معالجة ‎PVD‏ مغالجة ‎Vi‏ يدون معالجة 173 معالجة 2 ذروة ‎Thiombin‏ .459 تالوجزيء جرامي | $9 نالوجزيء جرامي | ‎EA.‏ نانيجزيء جزامي | 00 نانوجزيء جرامي | ‎YA‏ نانوجزيء ‎Ln‏ ‏صضعف أكثر من ‎FEV‏ مخ | ‎AR ¥ vn‏ إٍْ را إٍْ 4

١ 4 > ‏الخ‎ . : B NN “= pram | : NN sTTand \ 1 ‏ل‎ 3 ‏و‎ N NE d N TEIN . ‏الاق‎ 0 SE SIT Nn 4 3 3 81 3 ‏ري‎ 8 28118 3 8 li . 1 ‏فلتت‎ -[ ْ' ® 8 0 ‏الا‎ 0 ‏ب‎ x HITEC 0-020 - ٍْ 8 88 8 0 ) 181 NN NN 1 440 34 ‏ميد سي‎ 1 Ld og > 3,

VY ‏شكل‎ ‎| ELISA ‏تنظ نسبة الصبغة/‎ ELISA | FVII ‏صبغة‎ ‎Cn) | (a, py _ an pMB114 Ry ‏فب‎ | YR pMB115 ‏ض‎ ge : ١ ‏6م | 08 ض‎ ‏ض‎ V4 AV LA | VYEAY pMB117 ١ | 1 | fax pMB120 vf ‏ض كاه‎ YAY, pMBI23 ‏لسن ا‎ ١ ‏د‎ | MBE

٠؟ ‏شكل‎ ‎3 ‎: : or wr 4 - 4 BN 7 - 4 3 ‏سي‎ 3 4 0 2 ‏ره ادي‎ J: hod 0 ‏ا‎ 9 Y - = | = 1, | ‏لا‎ ‎3 | EREE . | NE ‏ا‎ ‎0 || FE 85 5 8 / = = . ‏حب‎ 3 > T= 2 = . - 3 so o + > = # n - = uy . 2 fon For 2 ‏ا لد‎ = | = - R i - > ‏و‎ - oe MW WE WE ‏بايا اباي انهو اجن عير اليو اجا‎ ١ - = 4 ,' « |. 3 7 ‏يي 3 لا‎ 3 J 4 \ g - < ‏ل«‎ 3 ‏ان‎ ‎= J x ; 5: ً 4 ‏م‎ WON], ‏رض ع ضح جعي‎

Ye ‏شكل‎ ‎dV2 5 V2 ‏تصفية خلية كبدية من‎ Xo 5 ‏يت‎ . . 1 ft | a 0 AAA A AAA AAA A 3, ٠١ ‏سس سو ب سس‎ EE 1 ‏أ‎ be ARAN SAMAR ARRAN ARAN ARAN AR AA SARA AAA SAA A RAN AANA AR AAA A AANA AAR A ‏الالالال جاجد‎ Me MAA AAA AAA AAAS ‏أي‎ da 1 1 ‏أ‎ - V2 RYE I DE ‏أ 2 با‎ & 4 ‏ا‎ - ‏نان حر أو ملليلة‎ ١ ١ ‏امت‎ ‎NE ‏نانوجرام/ ملليلتر‎ 1. ]1.©© ‏سر‎ * S18 LO x ‏يان‎ 4 3 do 3 3 3 Ne + ‏الزمن (ساعات)‎

شكل ‎Vo‏ ‏7 في المادة الطافية ‎voz 7 7‏ اج ا اط أ ضابط ‎sms‏ 3 ‎pMBLEA ——————‏ ط لكا للا كنا ل ‎os‏ | 2 ودودددددودس .م | - بان تنه 8م £ ‎ewes SUA A |‏ أ 1 اا بهد ‎i phB120‏ ‎A |‏ ننه لست ا 38 ‎Cn ———— ١‏ سََّّّ 3م ادن ته" | 4 \ 1 ‎I MS. -‏ نقي ‎V2‏ ‏| له مزوّد بجيلة ‎V2‏

٠١ ‏شكل‎ ‏ميكروجرام/ كجم‎ ٠٠١ ‏إعطاء في الوريد لجرذ عند‎ ey ‏لا سه‎ ‏ب امسج را‎ 12 A 3 ‏ب سطع لماعت ذا‎ we (V1 RTI: ST Peg TTT gem 7 3 : tg ope PMIBIZIE bE ١ 3 3 ‏ها‎ Sthrtanes accsssns: sesseen “esmeeres ٠ ‏صل‎ ١ EE ‏ا 0 ه050 ء|‎ ‏ا الل اد‎ ‏كجم)‎ JL) Vis ‏ساعة/ كجم)‎ J lia) CL ‏(ساعة)‎ MRT ‏(ساعة)‎ 7 As ¥1 + ‏ب‎ ْ v2 = ER ‏اما‎ ‎YAY 51 1 4 ' 7 >< 1A v.94 1.4 ' pMBIZt CT The TTT ae ee ETE EE me meme EEE

VY ‏شكل‎ ‎Obl ‏قابل‎ TF PTT ‏(ب) اختبار تجلط‎ ELISA ‏اختباز‎ {) STF PTT ‏عن طريق‎ FVII ‏تحايل‎ Trenance 2 ‏ال‎ ‎Serna RU ‏اليه‎ a FV 3 H at 3 « + ‏و‎ < & N i \ TT ava 8 ٠٠. ‏وم‎ wee EVIE 8 3 3 ove : ATT on CETTE, : ‏ا ا‎ . {asta ‏الزمن‎ ‎3 Vad] ~ 3 Yan 3 ta 5 6 ٍ : 7 0 Ja § A VY 4 ‏ا ناتيت الباااالبابابابسااادررل##7الئاا7”“#اا07ا”ا»طا7”7ا©ؤل7إ|ظ<ج#ؤ‎ Lay ‏ا > "0 الزمن (ساعة)‎ CS Eh um NR NY NAN Eh see ‏ا‎

شكل ‎YA‏ ‏0 =( دراسة قطع ذيل | دراسة المسار الزمني لقطع الذيل ‎fe yen‏ . . ا إٍْ ب ‎-١‏ جرعة قبل قطع الذيل ‎ad‏ دقائق ٍ مضع ‎i‏ ل« زرو ل ,4 *- إعطاء ‎else af‏ من مواد الاختبار 1 ‎Sapa‏ كجم ‎LR dV‏ 4 0 ا ‎py: mir 1 /, X 7 he a. pe‏ #- قياس فقد الدم خلال ؛؟ دقيقة | مجم/ كجم ‎Tes J PVT‏ 3 ‎a PE | AR +‏ 1 ‎K Tan oo | .‏ & : ~~ 3 Vous 3

I. a N 1 1 | 4 ١ kd “ ‏مجموعة ب وو تت‎ 15 > 2am ‏كز ادبت‎ PE | . bon + ‏دا‎ ‏وعة 0 ب‎ ٍ ١ ‏حر إل حرم 200 ى‎ | 4 Aaa ‏سك‎ + - Sor ib ‏ورحيد‎ Mann Whitney Cog ١ ‏اسه‎ tea a Ys A ‏و‎ Ya Ta | <3 ‏راع‎ " & °

‎ed. * ٍ‏ ل ا الزمن اللامق للجرعة 338( سق عي 4 ‎A ead tw‏ ‎A, «‏ ل 1ح لحو ا ب ‎ER EY 7 PE‏ 1 1 1 4 112 11111

شكل ‎Ya‏ ‏عدد ‎T=‏ ‏ل ل ‎voy‏ 11 ب سسا ‎Ned‏ ‎Y= sam‏ 0 3 ‎I}‏ يي \ , ; = | :8 \ = مما 4 م 4 ‎JPL S JN‏ ل ا | ‎nr‏ ‎SPE a‏ و الحا ‎dh‏ ‏اختبار رتبة اللوغاريتم ‎Sy‏ ض مجو ا م جا ال عد + 0 ‎A vy Al! Xs vs‏ 4 صفر الزمن اللاحق لبتر وريد الذيل (ساعة) ذم ‎١‏ مجم/ كجم 8432| (التجريع بعد أ لإصابة بخمس دقانئق لمعالجة) سم 0,¥ مجم/ كجم ]1171 (التجريع قبل الإصابة بساعة واحدة) ديد أ مجم/ كجم 072 (التجريع قبل ! لإصابة بساعة واحدة)

شكل .؟ : ‎r Td‏ ‎Feed > RY‏ 0 م ا م ‎J‏ ا ةا 0 ‎ron‏ ‏و 3 أ 0 0 - ‎Le‏ - ‎nn EE a. <‏ الاي ‎Re N «3 > STR‏ ‎١ alr‏ ا + ا ‎on‏ حم 4 ل الم م = م 3 . ال ‎TT‏ ا تتا ا الاك ال الات الل وك | ‎he‏ 2 د و بيخ اير ل ‎NR > EE‏ & > 4 يبا لإ ‎SSE Ee‏ 3 = 2 3 ان + له ‎rE‏ ‎Ce ES hy‏ ل ب > ‎Sa‏ ‏2 2 0 سس 3 7 ‎Ey‏ - .- ‎Es 4‏ ا د ‎١‏ - ٍِ ا اا ‎EE‏ 0 لماعا»ء ‎RR‏ ~ 4 5 ‎a‏ = ‎IT 7‏ 5 ‎oo‏ ا د 58 5©_- ده = ااا ادن لتو ‎Bf‏ ‎A‏ عي ‎EY + wd‏ * سور سن حير حي 0 جص 12101130111 ‎ever‏ كرس

YY ‏شكل‎ ‎HPA) ‏بنسخ‎ Plasminogen ‏فتران لديها مكون التخثر معالجة مع مُنشط‎ dV2 5 17 ‏فعالية‎ ‏نموذج لنزيف تقليم ذيل‎ ‏*ج‎

‎. ig 3, Ave a 83 # A as IN * SEE ‏اه ثيه‎ , [ ‏سيت‎ " - « 3 3 feat ‏مات‎ * ¥ ¥¥ ‏ب * ب‎ * KET EE — © EN EY 1 ¥ vt vs NE 5 o Ty EN 0) En ¥ ‏؟ ب‎ + + a 0 ae Ty EE ‏ليمي‎ A & ¥ ¥ hy ve? * > > $3 Rex y _ 2 ‏سس"‎ 5 wr 7 = n 3 1 5 * + ‏ص‎ ‎& 7 vd Zz > Say SA Ch = ‏عي كم الجن كاي كر آي نم‎ \ oF ¥ a bog © AN A A Ce 7 : 7 "a S 5 ‏ب كم الخ‎ 7 ‏ا م‎ ّ ES IN) ‏ا‎ a .. : 7 ) 1 ‏ا‎ 1 tPA ‏فذران معالجة مع © مجم كجم‎

YY ‏شكل‎ ‎0 Ev ‏جو يج‎ ‏سه‎ Novo 7 ‏م‎ 05-7 ‏ا‎ Yous tg 3 J ١ : 3 1 ‏بت‎ ‎0 ٠و‎ ko . ‏ل‎ ‎a \ $ 4 A ‏الزمن (ساعة)‎ Vss CL ‏(ساعة)‎ MRT | ‏(ساعة)‎ Tin (5 ‏(ملليلتر/‎ | (pS ‏(ملليلتر/ ساعة/‎

Yy ‏شكل‎ ‏قطع ديل‎ a ‏دراسة‎ ‏داخل الوريد‎ tPA ‏مجم/ كجم‎ © -١ ‏ملليمتر من الطرف‎ ٠ ‏تقليم ذيل عند‎ -" ‏داخل الوريد‎ Nove? ‏أو‎ dWT ‏ولا‎ -١ ‏؟- تمزق الخثرات غير المناسبة كل 1 دقائق خلال فترة التجميع‎ ‏تجميع الدم خلال £0 دقيقة‎ <5 ob Ler OPY Kruskal-Wallis ‏اختبار مقارن متعدد‎ * ١فكحح'“يتلسعس77<سلب‎ ed ! Dunn's ‏مع‎ ‏امات يو‎ & b LER BE * " * ‏ل‎ "

*«. ١

: *.

3 . ‏كي«‎ * # & ; A : *. & A Are | ‏عي‎ * wg : * Tu Mow LPS ® ٍ 0 ‏ا‎ ; J : *# £25 - 4 LEY a» & *« *o & © of 3 ro oe 0 * Sx Seat = nena reves Sey ‏ا مام‎ SARE. SAR veers. © Los oy ‏8ج“ ب‎ Cu x * FS © ‏اب‎ ‎0 Yee M LR © Et 8 3

3 . o? on, = — , SOO... 20 = ‏مم ب‎ K Et ‏ينا عي‎ 4 ‏سلا 5 3 ا‎ 0 = hs 3 po Ea ve) wd te 143 1s 5 3 3 1 jg Lg Le Lo L249 F = = i Sn Ks na ‏سن‎ 0 © 13 13 ‏جا‎ 3 PA PENA fans © 4 ‏ب ملليلثر قطع‎

Yi ‏شكل‎ ‎TAT ‎3 a IP 0 , . (p25 ‏مجم/‎ 7( AWT Vila ‏-ه‎ ‎& ‏كجم)‎ Jane 1) NovoSeven ‏به‎ ‎4 ‎8 1 ‏و‎ 3 CIEE ' 3 1 ‏ا‎ treet ow JAT ‏مستوى‎

‎. oo BI Sr ‏جد ححا لعاف‎ damn ‏الداعت‎ 2 won one an ‏القاعدة‎ Jada 00 Scat A ‏ل‎ ‎a ¥ 3 i! A ‏الزمن (ساعة)‎ ‏أعلى خط القاعدة‎ AUC AWT Vila ‏؟ مجم/ كجم‎ YoY NovoSeven ‏مجم/ كجم‎ 1

Yeo ‏شكل‎ ‏وحيد الذيل‎ Mann-Whitney «+,» Yop LITT SUNY AUC ARE ‏معت ب اليا جا بيس‎ slo 3 Aa hd ‏يدون جلطات‎ ‏م‎ . << 1 HS + % " So § & oe " rE NES ee ‏ب الاك‎ ‏ا ا‎ = AUC ‏ءال‎ ‎Na RB . LL 1 ARIE La = hh =. N La I» rea NovoSeven ‏أ مجم/ كجم‎ dsNT ‏؟ مجم/ حجم‎

Yu ‏شكل‎ ‎Vila ‏طبقة تحتية مولدة للفلور‎ LP ‏زه‎ ‎- ‏سه‎ 7 ٠+5 | ~~ ‏7ل‎ 0 ‏اه ست سم ل‎ -- % , % x ‏لبي‎ AR DT A J FJ = 0 ‏ل‎ LE ¥ =f ١١١ 083 — Kd ¥ ¥ *® 3 3 ‏ا‎ I» ‏+ة,‎ 4 F7 * 3 £ ‏و47‎ 3 17 1 x «3 & ١ \ . 1 \ > . STF ‏نانوجزيني جرامي‎

شكل ‎١7‏ ‏ا § ‎Ri‏ - #* ا * : سه ‎nMXa‏ 177 نانية ail /dF7 nMXa ‏سه‎ [TT 4 | . . 1 LIN ‏ا‎ { “3 | w= J | & -_ ٍ Y HE TA 1 | . > ‏ل‎ ‎3 A keat Km vmax ‏ا‎ ‎= i | Vo * FY ¥ oy i M7

L SY ‏دن‎ YY 7

‎as‏ +8 قز نانوجزيني جرامي ‎EX‏

لاله الهيلة السعودية الملضية الفكرية ا ‎Sued Authority for intallentual Property‏ ‎RE‏ .¥ + \ ا 0 § 8 ‎Ss o‏ + < م ‎SNE‏ اج > عي كي الج ‎TE I UN BE Ca‏ ‎a‏ ةا ‎ww‏ جيثة > ‎Ld Ed H Ed - 2 Ld‏ وذلك بشرط تسديد المقابل المالي السنوي للبراءة وعدم بطلانها ‎of‏ سقوطها لمخالفتها ع لأي من أحكام نظام براءات الاختراع والتصميمات التخطيطية للدارات المتكاملة والأصناف ع النباتية والنماذج الصناعية أو لائحته التنفيذية. ‎Ad‏ ‏صادرة عن + ب ب ‎٠.‏ ب الهيئة السعودية للملكية الفكرية > > > فهذا ص ب ‎101١‏ .| لريا ‎1*١ v=‏ ؛ المملكة | لعربية | لسعودية ‎SAIP@SAIP.GOV.SA‏