JP2010022253A - アシアロ糖鎖化合物の作製方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 効率的なアシアロ糖鎖化合物の作製方法を提供する。
【解決手段】ガングリオシドのシアル酸残基を除去する目的で行われるシアリダーゼによる酵素反応液中に、シクロデキストリンを添加することにより様々な構造を持ったガングリオシドのアシアロ化効率を高める。
【選択図】 なし
【解決手段】ガングリオシドのシアル酸残基を除去する目的で行われるシアリダーゼによる酵素反応液中に、シクロデキストリンを添加することにより様々な構造を持ったガングリオシドのアシアロ化効率を高める。
【選択図】 なし
Description
本発明は、医薬・医療・研究用素材などに利用されるアシアロ糖鎖化合物の生産方法に関する。
糖鎖は構造が複雑であり、同じ生体分子であるDNAやタンパク質よりも産業上の利用の為の開発が遅れている。しかし、近年、糖鎖の研究が急速に進展し、産業上の利用への模索も進められてきている。特に、細胞分化、ガン化、免疫反応等への糖鎖の関わりについて新しい事実が明らかにされつつある。例えば、細胞表層における糖鎖は、タンパク質や脂質と相互作用することによって、生体内における細胞分化、ガン化、免疫反応等の重要なプロセスに関与している。また、糖鎖は、細胞表層における細胞認識、接着、細胞間のシグナル伝達において重要な役割を担っていることも明らかになってきている。
酸性スフィンゴ糖脂質(ガングリオシド)は、ラクトシルセラミドを基本骨格として、これにシアル酸を含有する糖鎖が結合した一群の糖脂質である。ガングリオシドは脊椎動物の脳神経系に豊富に存在し、現在までに数多くの構造が同定されてきた。現在40種類以上が発見されており、それぞれシアル酸(N-置換又はO-置換ノイラミン酸)の数と位置が異なっている。
酸性スフィンゴ糖脂質(ガングリオシド)は、ラクトシルセラミドを基本骨格として、これにシアル酸を含有する糖鎖が結合した一群の糖脂質である。ガングリオシドは脊椎動物の脳神経系に豊富に存在し、現在までに数多くの構造が同定されてきた。現在40種類以上が発見されており、それぞれシアル酸(N-置換又はO-置換ノイラミン酸)の数と位置が異なっている。
ガングリオシドは、細胞の表面に存在し細胞間の認識など種々の生理活性を有していることが古くから知られているが、最近、シアル酸がはずれたアシアロ糖脂質の生理作用も分かってきている。例えば、NK細胞は、細胞膜表面に、糖脂質のアシアロGM1を有しており、NK細胞は、細胞膜表面のCD161により、標的細胞の細胞膜に存在する特定の糖鎖構造(アシアロGM2など)と結合する。また、肝細胞の細胞膜には、血中の老朽化した糖タンパク質を細胞内に取り込んで処理するためのアシアロ糖タンパク質レセプターが存在している。このアシアロ糖タンパク質レセプターは、老朽化した糖タンパク質の糖鎖先端のシアル酸が欠失することによって露出されたガラクトースを特異的に認識するメカニズムを持っており、肝細胞の接着を効率よくすることから、細胞培養あるいは細胞分離技術への応用に期待がかかる。
シアル酸は通常、酸に不安定なα結合によって複合糖質に結合している。糖鎖の末端にシアル酸が結合している場合、50mM塩酸中で、80℃にて1時間程度加熱することにより簡単に遊離することが知られている。しかし、糖脂質GM1に見られる−GalNAcβ1−4(Neu5Acα2−3)Gal−という構造で結合したシアル酸は、N−アセチルガラクトサミンとの立体障害のため加水分解を受けにくい。また、Clostridium perfringensやVibrio cholerae由来のシアリダーゼ(ノイラミニダーゼ)を用いた場合、通常の酵素量ではシアル酸は遊離しない。また、Arthrobacter ureafaciens由来のノイラミニダーゼ(ナカライテスク)においても、完全に脱シアリル化するには、多量の酵素を要したり、或いはコール酸ナトリウムを加える方法もあるが界面活性剤であり分離が困難であるといった問題がある(非特許文献1)
Iwamori, M., Kaido, T., Iwamori, Y., Ohta, Y., Tsukamoto, K. and Kozaki, S. 2005, J. Biochem., 138, 327-334.
Iwamori, M., Kaido, T., Iwamori, Y., Ohta, Y., Tsukamoto, K. and Kozaki, S. 2005, J. Biochem., 138, 327-334.
糖脂質GM1に見られる−GalNAcβ1−4(Neu5Acα2−3)Gal−という構造で結合したシアル酸は、酸加水分解や通常の酵素反応では、N−アセチルガラクトサミンとの立体障害のため加水分解を受けにくい。
そこで、本発明の目的は、種々のカングリオシドから、効率良くアシアロ化する方法を 提供することにある。
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、シアリダーゼによる酵素反応液中に、γ−シクロデキストリンを添加することによりアシアロ糖鎖化合物を効率的に生産する方法を見出し、本発明を完成するに到った。
以上のように、本発明を適用することによって、これまで反応効率の低かったガングリオシドのアシアロ化を容易に行うことができ、様々のガングリオシドを作用させることにより、種々のアシアロ糖鎖化合物を提供できる。
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明は、シアル酸を有するガングリオシドのシアル酸残基を効率よくアシアロ化を行うことにより、アシアロ糖鎖化合物を得ることを特徴とする。ここで、シアル酸を遊離する効率を高め、アシアロ化を行うことは、糖脂質GM1に見られる−GalNAcβ1−4(Neu5Acα2−3)Gal−という構造で結合した、従来の方法では切断されにくいシアル酸を、効率よく切断することをいう。
反応基質となるシアル酸を有するガングリオシドとは、GM1、GM2、GM3、GD2、GD3、GT3、GT2、GT1、GQ1c、GQ1c、GP1c、GQ1b、GD1b、GD1a、GT1b、GT1a、GD1c、GD1bなどが挙げられる。ガングリオシド型の糖鎖化合物とは、その類似構造を持つ化合物を示す。例えば、スフィンゴ脂質にSphingolipid ceramide N-deacylaseを作用させて生じるリゾ体や、糖鎖プライマー法で得られるセラミド部分がアルキル基のものを指す。また、得られるアシアロ糖鎖化合物としては、GA1、GA3、GA2が挙げられる。アシアロ糖鎖型化合物とは、その類似構造を持つ化合物を示す。例えば、スフィンゴ脂質にSphingolipid ceramide N-deacylaseを作用させて生じるリゾ体や、糖鎖プライマー法で得られるセラミド部分がアルキル基のものを指す。
先ず、シアル酸を有するガングリオシドを溶解する場合、蒸留水を用いるのが好ましいが、水以外にもメタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド等の親水性の有機溶媒を0.1から99.9%含んでいても構わない。
用いる酵素としては、Clostridium perfringens、Vibrio cholerae、Arthrobacter ureafaciens等、由来は問わないが、特に、Arthrobacter ureafaciens由来のシアリダーゼが望ましい。
反応液のpHは、4.0から8.0の範囲で反応させることができるが、4.5から6.0の範囲が望ましい。
反応液中に加えるシクロデキストリンとしては特に限定はないが、反応効率からγ−シクロデキストリンが好ましい。
反応液中に加えるシクロデキストリンを終濃度としては、0.05mMから10mMの範囲が好ましく、更に好ましくは、1.25mMから10mMの範囲である。
反応は、20〜50℃にて、1〜48時間、インキュベートすることにより行える。
精製方法は、特に限定はされないが、有機溶媒、各種水溶液、および水などから選択される少なくとも2種以上の溶媒を混和した二相溶媒系の上層または下層の一方を固定相とし、他方を移動相に用いて試料を分離する、液液分配クロマトグラフィなどを用いておこなうことができる。液液分配クロマトグラフィには、さらに、遠心液液分配クロマトグラフィ(CPC)、高速向流クロマトグラフィ(HSCCC)などが含まれる。
液液分配クロマトグラフィに用いる二相溶媒系は、クロロホルム、酢酸エチル、ヘキサン、アセトニトリル、アルコール類、エーテル類、水、酸または酸性水溶液、およびアルカリ性水溶液からなる群より選択される少なくとも2種以上を混和して調製する。このうち、アルコール類として好ましいのは、メタノール、エタノール、ブタノールであるが、これに限定されない。酸性水溶液としては、酢酸水溶液が挙げられるが、これに限定されない。
糖脂質類似化合物を含有する試料から中性の化合物を分離する場合には、二相溶媒系が、クロロホルム、アルコール類、および水を混和してなるものであることが好ましい。
溶出した移動相はそのままあるいは溶出時間毎に分画し、固相抽出カートリッジ、逆相TLC、順相TLC、逆相HPLC、順相HPLC、GPC、アフィニティークロマトグラフィ、MS、LC−MS、TOF−MSなどの分析に供することにより、さらに詳細な分離、分析を行うことができる。
精製工程には、その他、Sep-Pak C-18カラムを使用した精製、強イオン交換カートリッジカラム、固体吸着剤として、スチレン系合成吸着体、メタクリル系合成吸着体、およびフェノール系合成吸着体からなる群より選択される少なくとも1種である吸着剤を使用する方法が含まれる。培養物中または培養上清中の糖鎖化合物を吸着させるスチレン系合成吸着剤としては、例えばスチレン−ジビニルベンゼン共重合体を樹脂母体とするものが挙げられる。スチレン系合成吸着体として、具体的には、三菱化学社製ダイヤイオン(登録商標、以下同じ)HP20、HP21、セパビーズ(登録商標、以下同じ)SP207、SP825、SP850、SP875、ロームアンドハース社製アンバーライト(登録商標、以下同じ)XAD4、XAD16、XAD1180、XAD2000、Bayer社製VPOC1062、VPOC1064等が挙げられる。また、メタクリル系合成吸着体として、三菱化学社製ダイヤイオン(登録商標、以下同じ)HP1MG、HP2MG等を用いることができる。
強イオン交換カートリッジカラムを使用する場合には、四級アンモニウム基などの官能基を有する充填剤など、当業者に公知のいずれの強イオン交換樹脂も使用することができる。中性のアシアロ糖鎖は非吸着画分に回収される。未反応のガングリオシドの溶出に用いる溶媒系は、クロロホルム、酢酸アンモニウム、アルコール類、エーテル類、および水からなる群より選択される少なくとも2種以上を混和して調製する。このうち、アルコール類として好ましいのは、メタノール、エタノール、ブタノールであるが、これに限定されない。酸性糖脂質の抽出には、クロロホルム、メタノール、酢酸アンモニウム水溶液の混和液が特に好ましい。
(実施例1)
10μgのガングリオシドミックス(GM1、GD1a 、GD1b 、GT1bが主成分の混合物)(フナコシ)及び、3μgのGM1をノイラミニダーゼ(ナカライテスク)200mUが含まれる50mM 酢酸緩衝液(pH5.5)200μl中で、様々な量(最終濃度が0mM、15mM、35mM、50mM)のγ-シクロデキストリンを添加したものについて、37℃で24時間反応させた。また、γ-シクロデキストリンをコール酸ナトリウムに換え、同様の実験を行った。反応後の産物は、Sep-Pak(C18)を用いて常法により精製し、HPTLCにより分析した。その結果を図1に示すように、ガングリオシドミックス、GM1のいずれにおいても、γ-シクロデキストリンを添加することにより、切れ残りであるGM1が殆どなくなった。また、コール酸ナトリウムでは、Sep-Pak(C18)による簡易精製では除くことができず、HPTLCにおいて目的物の分析が困難であった。
(実施例2)
GM1(3μg)、GD1a(6μg)、GD1b(6μg)、GT1b(6μg)を、それぞれ50mM 酢酸緩衝液(pH5.5)200μl中で、ノイラミニダーゼ(ナカライテスク)200mUのみを添加して37℃で24時間反応させたものと、ノイラミニダーゼ(ナカライテスク)200mUとγ-シクロデキストリン(最終濃度50mM)を添加して37℃で24時間反応させたものとの比較を行った。反応後の産物は、Sep-Pak(C18)を用いて常法により精製し、HPTLCにより分析した。その結果を図2に示すように、いずれのガングリオシドも、ノイラミニダーゼのみでは、−GalNAcβ1−4(Neu5Acα2−3)Gal−という構造で結合したシアル酸の切断効率は悪かった。
10μgのガングリオシドミックス(GM1、GD1a 、GD1b 、GT1bが主成分の混合物)(フナコシ)及び、3μgのGM1をノイラミニダーゼ(ナカライテスク)200mUが含まれる50mM 酢酸緩衝液(pH5.5)200μl中で、様々な量(最終濃度が0mM、15mM、35mM、50mM)のγ-シクロデキストリンを添加したものについて、37℃で24時間反応させた。また、γ-シクロデキストリンをコール酸ナトリウムに換え、同様の実験を行った。反応後の産物は、Sep-Pak(C18)を用いて常法により精製し、HPTLCにより分析した。その結果を図1に示すように、ガングリオシドミックス、GM1のいずれにおいても、γ-シクロデキストリンを添加することにより、切れ残りであるGM1が殆どなくなった。また、コール酸ナトリウムでは、Sep-Pak(C18)による簡易精製では除くことができず、HPTLCにおいて目的物の分析が困難であった。
(実施例2)
GM1(3μg)、GD1a(6μg)、GD1b(6μg)、GT1b(6μg)を、それぞれ50mM 酢酸緩衝液(pH5.5)200μl中で、ノイラミニダーゼ(ナカライテスク)200mUのみを添加して37℃で24時間反応させたものと、ノイラミニダーゼ(ナカライテスク)200mUとγ-シクロデキストリン(最終濃度50mM)を添加して37℃で24時間反応させたものとの比較を行った。反応後の産物は、Sep-Pak(C18)を用いて常法により精製し、HPTLCにより分析した。その結果を図2に示すように、いずれのガングリオシドも、ノイラミニダーゼのみでは、−GalNAcβ1−4(Neu5Acα2−3)Gal−という構造で結合したシアル酸の切断効率は悪かった。
一方、ノイラミニダーゼとγ-シクロデキストリンを添加した場合、GM、GD1a、GD1b、GT1bのいずれの場合も、シアル酸は完全に切断され、GA1が検出された。
(実施例3)
3μgのGM1を200mUのノイラミニダーゼ(ナカライテスク)が含まれる50mM 酢酸緩衝液(pH5.5)200μl中で、様々な量(最終濃度が0mM、0.01mM、0.05mM、0.25mM、1.25mM、5mM、10mM)のγ-シクロデキストリンを添加し、37℃で24時間反応させた。反応後の産物は、Sep-Pak(C18)を用いて常法により精製し、HPTLCにより分析した。その結果を図3に示すように、γ-シクロデキストリンの濃度が高くなるにつれてGM1がGA1に変化する割合が高くなり、γ-シクロデキストリンを最終濃度5mM以上添加すると、完全にGM1をアシアロ化できることがわかった。
(実施例4)
3μgのGM1をγ-シクロデキストリン(最終濃度5mM)が含まれる50mM 酢酸緩衝液(pH5.5)200μl中で、様々な量(0mU、2mU、10mU、25mU、50mU、100mU、200mU)のノイラミニダーゼ(ナカライテスク)を添加し、37℃で24時間反応させた。反応後の産物は、Sep-Pak(C18)を用いて常法により精製し、HPTLCにより分析した。その結果を図4に示すように、100mUのノイラミニダーゼの添加することにより、完全にGM1をアシアロ化できることがわかった。
(実施例5)
アシアロ化によって得られたGA1を、HPTLCで分離した後、プレートよりスポットをかきとり、クロロホルム/メタノール(2:1)で溶出し回収した。さらに、イオントラップ型質量分析装置HCTplus(BRUKER DALTONICS社製)により、MSn解析を行い、構造を確認した結果を図5に示す。
(実施例3)
3μgのGM1を200mUのノイラミニダーゼ(ナカライテスク)が含まれる50mM 酢酸緩衝液(pH5.5)200μl中で、様々な量(最終濃度が0mM、0.01mM、0.05mM、0.25mM、1.25mM、5mM、10mM)のγ-シクロデキストリンを添加し、37℃で24時間反応させた。反応後の産物は、Sep-Pak(C18)を用いて常法により精製し、HPTLCにより分析した。その結果を図3に示すように、γ-シクロデキストリンの濃度が高くなるにつれてGM1がGA1に変化する割合が高くなり、γ-シクロデキストリンを最終濃度5mM以上添加すると、完全にGM1をアシアロ化できることがわかった。
(実施例4)
3μgのGM1をγ-シクロデキストリン(最終濃度5mM)が含まれる50mM 酢酸緩衝液(pH5.5)200μl中で、様々な量(0mU、2mU、10mU、25mU、50mU、100mU、200mU)のノイラミニダーゼ(ナカライテスク)を添加し、37℃で24時間反応させた。反応後の産物は、Sep-Pak(C18)を用いて常法により精製し、HPTLCにより分析した。その結果を図4に示すように、100mUのノイラミニダーゼの添加することにより、完全にGM1をアシアロ化できることがわかった。
(実施例5)
アシアロ化によって得られたGA1を、HPTLCで分離した後、プレートよりスポットをかきとり、クロロホルム/メタノール(2:1)で溶出し回収した。さらに、イオントラップ型質量分析装置HCTplus(BRUKER DALTONICS社製)により、MSn解析を行い、構造を確認した結果を図5に示す。
Claims (4)
- ガングリオシド型の糖鎖化合物にシアリダーゼを作用させる際、シクロデキストリンを添加してアシアロ糖鎖型化合物を作製する方法。
- ガングリオシド型の糖鎖化合物がガングリオシドである請求項1記載のアシアロ型糖鎖化合物を作製する方法。
- 請求項1または2に記載のアシアロ糖鎖型化合物を作製する方法であって、終濃度0.05mMから10mMのシクロデキストリンを添加する方法。
- 請求項3に記載するアシアロ糖鎖型化合物を作製する方法であって、シクロデキストリンを加えることにより、糖脂質GM1に見られる−GalNAcβ1−4(Neu5Acα2−3)Gal−という構造で結合したシアル酸を遊離する効率を高める方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008186079A JP2010022253A (ja) | 2008-07-17 | 2008-07-17 | アシアロ糖鎖化合物の作製方法 |
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JP2008186079A JP2010022253A (ja) | 2008-07-17 | 2008-07-17 | アシアロ糖鎖化合物の作製方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017071608A (ja) * | 2012-12-24 | 2017-04-13 | バイエル・ヘルスケア・エルエルシーBayer HealthCare LLC | 短時間作用性第vii因子ポリペプチド |
CN108254231A (zh) * | 2016-12-28 | 2018-07-06 | 株式会社岛津制作所 | 分析用试样的调制方法以及分析方法 |
-
2008
- 2008-07-17 JP JP2008186079A patent/JP2010022253A/ja active Pending
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