TW201920254A

TW201920254A - 短－作用因子ｖｉｉ多肽類

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Publication number: TW201920254A
Application number: TW108101456A
Authority: TW
Inventors: 瑪克辛波桑; 泰瑞赫密士頓
Original assignee: 美商拜耳保健有限責任公司
Priority date: 2012-12-24
Filing date: 2013-12-24
Publication date: 2019-06-01
Also published as: TW202026309A; NZ749488A; DK2938351T3; US20230295596A1; EP2938351B8; SG10201710593UA; BR112015015182A2; KR102047235B1; CA3185756A1; ES2746116T3; TW201431876A; EP2938351A4; PE20151206A1; ES2936485T3; PL3572090T3; JP6363677B2; US20140363419A1; BR112015015182B1; US20160376578A1; MX2015007712A

Abstract

本發明揭示短-作用因子VII多肽。對於治療急性出血以及類似病症來說，半衰期縮短是所欲的。因子VII及其變異體的唾液酸化及/或醣化修飾產生可用於治療急性出血病況的肽。

Description

短-作用因子VII多肽類

本文提供人類凝血因子VII變異體以及編碼該等變異體的多核苷酸、含有並表現該等變異體的載體與宿主細胞、獲得該等變異體的方法、使用該等變異體的方法、該等變異體之組成物，以及與其相關之其他發明特徵。

相關申請案的交叉引用

本申請案請求於2012年12月24日申請之美國申請案連續號61/745,674以及於2013年3月15日申請之美國申請案連續號61/787,026的優先權，該等申請案以其整體併入本文做為參考資料。

凝血是由各種血液組分(或因子)複雜交互作用所構成的一個最終產生血纖維蛋白(fribrin)血塊的過程。一般來說，參與被稱為凝血”級聯”的血液組分為酶不活化蛋白質(酶原(proenzyme)或酵素原(zymogen))，其透過活化因子(本身為經活化凝血因子)的作用而被轉變成蛋白分解酵素。經歷這樣一個轉變的凝血因子通常稱為”活化因子”且藉由將字母”a”加到凝血因子名稱來命名(例如因子VIIa)。

止血過程的開始是由組織因子與因子VIIa之間形成的複合體所媒介，組織因子在對血管壁造成損傷後暴露於循環血液，而因子VIIa以對應於約1%總因子VII蛋白質質量的數量存在於循環中。這個複合體錨定至帶有組織因子的細胞並且在細胞表面上將因子IX以及因子X轉變成其活化形式因子IXa以及因子Xa。因子Xa在帶有組織因子的細胞上將凝血酶原轉變成凝血酶。而凝血酶又活化因子VIII、因子V、因子XI以及因子XIII。此外，在止血過程的這個最初步驟中形成之有限數量凝血酶也活化血小板。在凝血酶對血小板作用之後，血小板改變外形並且將帶電荷的磷脂暴露在其表面上。這個經活化的血小板表面形成更多因子X活化以及完全凝血酶生成的模板。在經活化血小板表面上的更多因子X活化是經由形成在經活化血小板表面上的因子IXa以及因子VIIIa複合體而發生，且因子Xa接而將仍然在表面上的凝血酶原轉變成凝血酶。凝血酶接著將血纖維蛋白原轉變成血纖維蛋白，其為不可溶且其會穩定初步血小板栓堵。這個過程侷限在組織因子暴露位置之處，從而將全身性活化凝血系統的風險降至最低。近年來，因子VII與組織因子已被發現是凝血作用的主要引發者。

因子VIIa是由其前驅體因子VII所產生，因子VII是在肝臟中被合成並且被分泌到血液中，其在血液中以單鏈醣蛋白的形式循環(分子量為約50,000Da)。如此處所用的野生型因子VII具有圖1與圖2中所揭示的胺基酸序列以及核苷酸序列。術語”因子VII”表示含括呈其未切割形式(酵素原形式)與彼等經蛋白分解或以其他方式加工而產生其個別生物活性形式的因子VII多肽，生物活化形式可被稱為因子VIIa。野生型因子VII通常在殘基152與153之間被切割而產生因子VIIa。

因子VII在活體外被因子Xa、因子XIIa、因子IXa或凝血酶轉變成雙鏈形式的因子VIIa。與數種涉入止血過程的其他血漿蛋白質相似，因子VII的活性取決於維生素K，維生素K對於在鄰近蛋白質胺基端處成簇的多個麩胺酸殘基的γ羧基化是必要的。這些γ羧基化麩胺酸對於金屬離子引起的因子VII與磷脂交互作用來說是必要的。於組織因子，磷脂與鈣離子存在下，雙鏈因子VIIa藉由限制性蛋白分解快速地活化因子X或因子IX。因子VIIa對於蛋白分解切割具有易感性，產生一些不具凝血活性的分解產物。

具有衍生自野生型因子VII之胺基酸序列而有一或多個胺基酸置換、刪除及/或插入的因子VII變異體已被公開。舉例而言，Dickinson等人(Proc.Natl.Acad.Sci USA(1996)93,14379-14384)是有關其中Lys157、Val158、Glu296、Met298、Asp334、Ser336或Lys227已個別被Ala取代的因子VII變異體。Iwanaga等人(Thromb.Haemost.(supplement August 1999),466,abstract 1474)是有關於其中殘基316-320被刪除或殘基311-322被胰蛋白酶的對應殘基所取代的因子VIIa變異體。Bolt等人的美國專利申請公開案2008/0058255 A1是有關於在N145或N322處，或在N145與N322兩者處具有醣化-瓦解置換的因子VII變異體。Toso等人報導一系列以天然突變為基礎的因子VII結構-功能研究。突變的重組因子VII蛋白包括T324M、E385K，以及兩個突變因子VII蛋白在因子VII重鏈(N322Q)或因子VII輕鏈(N145Q)處缺乏醣化核心序列。Toso et al.,“Lack of Heavy Chain Glycosylation in Patient with Factor VII Deficiency Not Responsible for Mutant FVIIa Activity,”Blood,vol.96,no.11,part 2(16 Nov.2000),p.79b(42^nd Annual Meeting of the American Society of Hematology)。

大多數天然肽與蛋白質含有沿著一級肽或蛋白質鏈長度經由特定鍵連至選定數量之胺基酸而附接至肽或蛋白質的醣類部分。因此，許多天然肽以及蛋白質分別被稱為”醣肽”或”醣蛋白”。任一給定肽或蛋白質上的醣化型態變異性可能影響到那個肽或蛋白質的功能。舉例而言，肽或蛋白質上的N-連結聚醣結構可能會影響肽或蛋白質的各種特質，包括肽或蛋白質在細胞或生物體內的蛋白酶易感受性、細胞內運輸、分泌、組織靶定、生物半衰期，以及抗原性。這些特質中的一或多者改變可能會影響肽或蛋白質在其天然環境中的效力，而且也可能影響肽或蛋白質在肽或蛋白質為此目的而被生成的環境中作為治療劑的效力。

附接至肽或蛋白質的醣類結構已知為”聚醣”分子。存在於肽或蛋白質上的特定聚醣結構影響肽或蛋白質的溶解度與聚集特徵、一級肽或蛋白質鏈的折疊，以及因此其功能或酶活性、肽或蛋白質對蛋白分解攻擊的抗性，以及使得肽或蛋白質的不活化形式轉變成活化形式的蛋白分解控制。例如，存在於聚醣分子上的末端唾液酸殘基影響肽或蛋白質在哺乳動物循環系統中的半衰期長度。聚醣不含末端唾液酸殘基的肽與蛋白質通常更快速地被肝臟從循環移除。

在天然醣肽與醣蛋白中所發現的聚醣結構通常被分成兩類，N-連結以及O-連結聚醣。野生型因子VIIa含有兩個N-連結醣化位點以及兩個O-連結醣化位點。N-連結醣化在真核細胞中是最為常見的共價修飾。N-連結醣化發生在Asn-X-Ser/Thr的一致序列處，其中聚醣附接至天冬醯胺酸的胺基且X表示脯胺酸以外的任一種胺基酸。N-連結聚醣是以共同的核心五醣Man₃(GlcNAc)₂為基礎，其可進一步藉由添加單糖(諸如N-半乳糖乙醯胺、半乳糖、神經胺糖酸、N-乙醯基葡萄糖胺、果糖、甘露糖和海藻糖)而被修飾。包括不同單糖(包括末端唾液酸)的Man₃(GlcNAc)₂核心可以經由N-乙醯基葡萄糖胺附接至Asn-X-Ser/Thr一致序列中的Asn處。這個化學複合體共轉譯修飾充作數種目的用且在許多方面(包括適當折疊、功能基定向，與廓清率)影響蛋白質的生物學。

在技藝中已提出各種方法來對肽或蛋白質的醣化型態進行客製化，包括那些描述於DeFrees et al.的美國專利第8,008,252號中者。

在個體體內刺激或增進凝血級聯通常是所欲的。因子VIIa已被用來控制由凝血因子缺乏症(例如A型血友病及B型血友病或凝血因子XI或VII的缺乏症)。由Novo Nordisk以商標名稱NovoSeven^®製造並販售的重組因子VIIa被核准用來治療使用針對因子VIII或因子IX的抑制劑之A型血友病或B型血友病患者，以及帶有後天血友病的患者的出血事件；防止在外科手術干擾或侵入性程序時在使用針對因子VIII或因子IX的抑制劑之A型血友病或B型血友病患者與在帶有後天血友病的患者中防止出血；在帶有先天因子VII缺乏症的患者中治療出血事件以及在帶有先天因子VII缺乏症的患者中於外科手術干擾或侵入性程序時防止出血。Hedner的美國專利第5,180,583號揭示使用因子VIIa來控制在不是因為凝血因子缺乏症或凝血因子抑制劑引起的情況下的過度出血。Hedner揭示治療例如由血小板功能缺陷、血小板減少症或馮威里氏病所引起的出血病症，以及供彼等用途使用的組成物。

對於治療不是由先天或已生成凝血因子缺乏症或凝血因子抑制劑引起之病症的出血有需要。數個臨床試驗已經證實重組因子VIIa控制出血的效力。但是，因為使用這個分子而致非所欲血栓性栓塞事件增加令人擔心。出血是許多病症的一個主要問題，諸如關於外科手術、外科手術之後的併發症、幹細胞與器官移植、腦出血、主動脈瘤，與創傷，或過量的特定抗凝血劑。

一個目標是使用短-作用因子VII多肽治療出血病症與事件。本項課題的一個目標是提供短-作用因子VII多肽(野生型或變異體)的組成物，其特徵在於諸如半衰期縮短的一或多種藥動學特點。一個目標是提供這樣一種因子VII分子，其降低在目標位點與治療時間框架以外的栓塞事件可能性。一個目標是提供因子VII多肽(野生型或變異體)，其因為改變醣化型態而增高廓清。

本文說明一種變異體因子VII多肽的組成物，其中該變異體因子VII多肽包含相對於胺基酸序列SEQ ID NO：16具有至少兩個序列變化的胺基酸序列，其中該至少兩個序列變化為(1)麩醯胺酸殘基置換在位置10中的脯胺酸殘基，以及(2)麩胺酸殘基置換在位置32中的離胺酸殘基；且其中於組成物中接合的唾液酸莫耳對N-連結聚醣莫耳的比率少於0.05、少於0,1、少於1.0、少於2.0、少於3.0、少於4.0、少於5.0或少於6.0。本文亦說明一種變異體因子VII多肽的組成物，其中變異體因子VII多肽包含相對於胺基酸序列SEQ ID NO：16具有至少兩個序列變化的胺基酸序列，其中該至少兩個序列變化為(1)麩醯胺酸殘基置換在位置10中的脯胺酸殘基，以及(2)麩胺酸殘基置換在位置32中的離胺酸殘基；且其中於每莫耳N-連結聚醣之接合唾液酸莫耳的比率落在選自下列組成之群的範圍中：(1)自0至5；(2)自0至4；(3)自0至3；(4)自0至2；(5)自0至1以及(6)自0至0.5。

本文亦說明一種經單離變異體因子VII多肽，其包含相對於胺基酸序列SEQ ID NO：16具有至少兩個序列變化的胺基酸序列，其中該至少兩個序列變化為(1)麩醯胺酸殘基置換在位置10中的脯胺酸殘基，以及(2)麩胺酸殘基置換在位置32中的離胺酸殘基，且其中接合的唾液酸莫耳對N-連結聚醣莫耳的比率少於0.05、少於0.1、少於1.0、少於2.0、少於3.0、少於4.0、少於5.0或少於6.0。本文亦說明一種因子VII多肽的組成物，其中因子VII多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：16(野生型因子VII)，且於組成物中接合的唾液酸莫耳對N-連結聚醣莫耳的比率落在選自下列組成之群的範圍中：(1)自1至5；(2)自1至4；(3)自1至3；(4)自1至2；(5)自0.5至1；或者接合的唾液酸偵測不到。

本文亦說明一種經單離變異體因子VII多肽，其是選自下列組成之群：(1)包含相對於序列SEQ ID NO：16具有序列變化的因子VII胺基酸序列的多肽，其中該等序列變化由下列組成：(1)麩醯胺酸殘基置換在位置10中的脯胺酸殘基、(2)麩胺酸殘基置換在位置32中的離胺酸殘基，以及(3)使得在位置145處的N-連結醣化瓦解的序列變化；(2)包含相對於序列SEQ ID NO：16具有序列變化的因子VII胺基酸序列的多肽，其中該等序列變化由下列組成：(1)麩醯胺酸殘基置換在位置10中的脯胺酸殘基、(2)麩胺酸殘基置換在位置32中的離胺酸殘基，以及(3)使得在位置322處的N-連結醣化瓦解的序列變化；(3)包含相對於胺基酸序列SEQ ID NO：16具有序列變化的因子VII胺基酸序列的多肽，其中該等序列變化由下列組成：(1)麩醯胺酸殘基置換在位置10中的脯胺酸殘基、(2)麩胺酸殘基置換在位置32中的離胺酸殘基，以及(3)使得在位置145與322處的N-連結醣化瓦解的序列變化；(4)包含相對於胺基酸序列SEQ ID NO：16具有序列變化的因子VII胺基酸序列的多肽，其中該等序列變化由下列組成：(1)麩醯胺酸殘基置換在位置10中的脯胺酸殘基，以及(2)麩胺酸殘基置換在位置32中的離胺酸殘基，其中位置145與322為天冬醯胺酸且附接N-連結醣化；(5)包含相對於胺基酸序列SEQ ID NO：16具有序列變化的因子VII胺基酸序列的多肽，其中該等序列變化由下列組成：(1)麩醯胺酸殘基置換在位置10中的脯胺酸殘基、(2)麩胺酸殘基置換在位置32 中的離胺酸殘基、(3)麩胺酸殘基置換在位置34中的丙胺酸殘基、(4)麩胺酸殘基置換在位置36中的精胺酸殘基，以及(5)使得在位置145處的N-連結醣化瓦解的序列變化；(6)包含相對於胺基酸序列SEQ ID NO：16具有序列變化的因子VII胺基酸序列的多肽，其中該等序列變化由下列組成：(1)麩醯胺酸殘基置換在位置10中的脯胺酸殘基、(2)麩胺酸殘基置換在位置32中的離胺酸殘基、(3)麩胺酸殘基置換在位置34中的丙胺酸殘基、(4)麩胺酸殘基置換在位置36中的精胺酸殘基，以及(5)使得在位置322處的N-連結醣化瓦解的序列變化；(7)包含相對於胺基酸序列SEQ ID NO：16具有序列變化的因子VII胺基酸序列的多肽，其中該等序列變化由下列組成：(1)麩醯胺酸殘基置換在位置10中的脯胺酸殘基、(2)麩胺酸殘基置換在位置32中的離胺酸殘基、(3)麩胺酸殘基置換在位置34中的丙胺酸殘基、(4)麩胺酸殘基置換在位置36中的精胺酸殘基，以及(5)使得在位置145與322處的N-連結醣化瓦解的序列變化；以及(8)包含相對於胺基酸序列SEQ ID NO：16具有序列變化的因子VII胺基酸序列的多肽，其中該等序列變化由下列組成：(1)麩醯胺酸殘基置換在位置10中的脯胺酸殘基、(2)麩胺酸殘基置換在位置32中的離胺酸殘基、(3)麩胺酸殘基置換在位置34中的丙胺酸殘基，以及(4)麩胺酸殘基置換在位置36中的精胺酸殘基，其中位置145與322為天冬醯胺酸且附接N-連結醣化。

本文亦說明因子VII多肽，其具有與因子VII多肽接合降低的唾液酸。在某些實例中，因子VII多肽為醣化型態發生改變的變異體多肽。在其他實例中，因子VII多肽為野生型因子VII多肽，其唾液酸接合降低。在某些具體例中，唾液酸接合降低可以藉由以唾液酸酶酵素處理該多肽而達致。在其他具體例中，唾液酸接合降低可以藉由在細胞株中生產本身為部分或完全缺乏唾液酸化的肽的重組因子VII多肽而達致。在更多具體例中，唾液酸接合降低可以藉由在細胞株中共表現重組因子VII多肽與重組或外源性唾液酸酶酵素而達致。

亦說明一種治療帶有形成血塊為所欲之疾病或病症之哺乳動物的方法，其包含向有需要的哺乳動物投與有效量的因子VII多肽，該因子VII多肽的唾液酸接合降低。在某些具體例中，接合的唾液酸莫耳對N-接合聚醣莫耳的比率少於0.05。在其他具體例中，該因子VII多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：16。在更多具體例中，該因子VII多肽包含野生型因子VII。在其他具體例中，要被治療的疾病或病症是選自下列組成之群：出血、胃腸出血、未受控出血、經歷移植或切除術或外科手術之哺乳動物的出血、靜脈瘤出血、血小板減少症、血友病、腦內出血、主動脈瘤，以及抗凝血劑的過量投藥。

下面詳細揭示更多變異體、組成物、方法與相關產物與程序。

圖1A-1H顯示本申請案中所用三種因子VII分子的核苷酸序列。”VI”為人類因子VII變異體，其相對於野生型人類胺基酸序列SEQ ID NO：16具有四個胺基酸突變(P10Q、K32E、T106N與V253N)。”V2”為人類因子VII變異體，其相對於野生型人類胺基酸序列SEQ ID NO：16具有六個胺基酸突變(P10Q、K32E、A34E、R36E、T106N與V253N)。圖1亦顯示實例中所用各種構築體的核苷酸序列。

圖2顯示本申請案中所用三種因子VII分子的胺基酸序列。如本文所用的野生型人類因子VII具有胺基酸序列SEQ ID NO：16。V1具有胺基酸序列SEQ ID NO：17。V2具有胺基酸序列SEQ ID NO：18。在V1與V2中，相對於SEQ ID NO：16野生型因子VII的改變以粗體表示。

圖3為說明本申請案的實例中所用三種因子VII分子的簡圖。顯示聚醣附接在N-醣化位點處。關於聚醣的說明，實心盒表示N-乙醯基葡萄糖胺、較暗的橢圓形代表甘露糖、空心橢圓形代表半乳糖、深色菱形代表唾液酸(也顯示為N-乙醯基神經胺糖酸)以及封閉三角形代表海藻糖。聚醣結構為使用一種聚醣變異體的可行說明且不表示實際測得的聚醣。

圖4為說明N-連結聚醣的概圖，顯示附接在Asn-X-Ser/Thr一致序列中的Asn處。顯示具有包括末端唾液酸之各種單糖的Man₃(GlcNAc)₂核心。

圖5為說明兩種用於本揭示內容中的方法以降低因子VII變異體之半衰期的概圖，以參照V2作為例示。

圖6為低醣化因子VII分子的表格。

圖7顯示在依據實驗條件去唾液酸化之後，鑑定V2重鏈上殘餘之唾液酸的LC-MS方法的結果。

圖8顯示去唾液酸化V2的唾液酸含量分析。

圖9顯示磷脂FX活化分析的結果。

圖10顯示對於去唾液酸化蛋白質的PL-TGA分析結果。

圖11顯示低醣化因子VII變異體的表現情形。

圖12為顯示使用轉染上清液之低醣化FVII變異體”比活性”測定結果的表格。

圖13顯示經純化低醣化變異體pMB121的PL-TGA分析結果。

圖14顯示相較於野生型因子VII，去唾液酸化V2的活體外肝細胞廓清。

圖15顯示使用因子VII變異體的活體外肝細胞廓清結果。低醣化變異體在這個模型中未表現出廓清增加。這個結果暗示，這些分子相對於去唾液酸化V2所採用者有不同的廓清機制。

圖16顯示在大鼠中的藥動學研究結果。如藉由因子VIIELISA所測量，去唾液酸化V2與V1在SD大鼠中的半衰期比它們未經修飾的母分子明顯還短。

圖17顯示HemA小鼠中的藥動學研究結果。

圖18顯示HemA小鼠中的去唾液酸化V2效力研究。

圖19顯示在TVT HemA模型中的去唾液酸化V2效力研究。

圖20顯示相較於因子VII，在帶有去唾液酸化V2的HemA小鼠體內凝血酶-抗凝血酶(”TAT”)生成的結果。

圖21顯示在凝血勝任小鼠體內的去唾液酸化V2效力研究。

圖22顯示相較於帶有正常唾液酸接合的野生型因子VII，去唾液酸化野生型因子VII(dWT VIIa)的活體外肝細胞廓清。

圖23顯示相較於野生型因子VII，dWT VIIa在人類組織因子敲入(TFKI)小鼠中的割尾研究結果。去唾液酸化因子VII被發現比野生型因子VII明顯更為有效。

圖24顯示凝血酶抗凝血酶(TAT)複合體在投與dWT VIIa或野生型因子VII之後的ELISA分析結果。

圖25顯示在FeCl₃血栓模型中血栓形成的分析結果。相較於野生型因子VII，給定劑量的dWT VIIa大大降低血栓形成。

圖26顯示dWT VIIa與野生型因子VII對可溶性組織因子的表觀結合親和力，如藉由螢光受質所測量。

圖27顯示因子X因為可溶性組織因子與dWT VIIa或野生型因子VII的複合體而轉變成因子Xa。

本文說明用於調節重組因子VII多肽(野生型或變異體)的藥動學以在治療急性出血時限制血栓併發症的方法。亦說明帶有唾液酸接合降低的因子VII多肽。進一步說明增加從血液廓清並縮短效力持續時間的重組因子VII的變異體。此等變異體因為醣化型態改變而在活體內比重組野生型因子VII具有更短的半衰期。也說明生產與使用此等短-作用因子VII多肽的方法。

為了解釋因子VII與醣化，提供圖3與圖4。圖3概略顯示因子VII分子的三個實例與其結構域。因子VII是由Gla、EGF以及催化域所組成的蛋白質，且含有2個N-連結聚醣(N145與N322)。V1是帶有四個突變(P10Q、K32E、T106N、V253N)的因子VII變異體。V2是帶有六個突變(P10Q、K32E、A343、R36E、T106N、V253N)的因子VII變異體。V1以及V2對經活化血小板的親和力均有增加且含有兩個額外的N-醣化位點，相較於野生型因子VII有較長的半衰期。單獨在V2中發現的兩個突變(A34E、R36E)，咸信是其組織因子獨立性的原因。

圖4概略顯示N-連結聚醣的一個實例，顯示附接在Asn-X-Ser/Thr一致序列中的Asn處。顯示具有包括末端唾液酸之各種單糖的Man₃(GlcNAc)₂核心。

本文提供製備帶有所要短半衰期之因子VII多肽的方法。提供兩種一般性方法來製造短-作用因子VII多肽，該等方法可分開或組合使用。如圖5中概略顯示使用因子VII變異體的一個實例，經醣化因子VII變異體可藉由去唾液酸化或去醣化被加工處理而改變變異體的醣化型態，並從而改變(且較佳縮短)其半衰期。這個方法也可以用來使野生型因子VII多肽去唾液酸化。

去唾液酸化可以透過技藝中熟知的任一種方法而發生。適當方法的實例包括藉由與任何已知能去唾液酸化的酵素接觸而以酵素的方式去唾液酸化，該酵素包括，但不限於包括神經胺酸酶-瓊脂糖珠粒(Sigma N5254)的唾液酸酶，以及來自產氣莢膜芽胞梭菌(鑑定為GI：40479)以及在FEBS Lett.238(1),31-34(1988)中的神經胺酸酶。該去唾液酸化可以藉由使經部分純化的重組因子VII多肽與唾液酸酶在活體外於適當條件下接觸，或藉由在表現重組因子VII多肽的宿主細胞中共表現唾液酸酶而達致。活體外接觸可以是僅僅發生部分去唾液酸化的持續時間。舉例而言，若可由具有接合唾液酸對在因子VII多肽的組合物中N-連結聚醣莫耳的比率為0.5至1莫耳的分子獲得所要半衰期，則與唾液酸酶接觸持續一段到建議發生完全去唾液酸化之前的有限時間期間。部分去唾液酸化也可以藉由使用經修飾的唾液酸酶，透過令因子VII多肽與唾液酸酶在減緩或妨礙唾液酸酶完全作用的條件下接觸，或透過其他對於彼等習於技藝者來說為明顯的方法來生產僅部分去唾液酸化多肽而獲得。部分去唾液酸化可以藉由比較接合唾液酸對聚醣在已完全去唾液酸化的參考製品中的比率來測量。

去唾液酸化也可以透過在缺少或缺乏一或多種唾液酸添加所需的細胞組分的細胞株中表現因子VII多肽(野生型或變異體)而達致。某些細胞株已經過修飾或可被修飾而降低或移除唾液酸化。舉例而言，帶有中國倉鼠卵巢(”CHO”)源的Lec2細胞生產帶有比野生型細胞少約10倍唾液酸的醣蛋白。咸信聚醣的去唾液酸化會產生被肝臟受體活躍地清除的分子且因而縮短半衰期，該肝臟受體包括無唾液酸醣蛋白受體(ASGPR)。

第二個方法是使因子VII變異體去醣化且從而獲得一個半衰期縮短的分子。降低醣化會增強因子VII透過腎臟廓清(50-60Kd截斷，在Caliceti P and Veronese FM,“Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates,”Adv Drug Deliv Rev.2003；55(10)：1261-77,Weinstein T et al.,“Distribution of glycosaminoglycans in rat renal tubular epithelium,”J Am Soc Nephrol.1997；8(4)：586-95,Choi HS et al.,“Renal clearance of quantum dots,”Nat Biotechnol.2007；25(10)：1165-70中回顧)、表面電荷與等電點(pI)變化(其與醣蛋白循環增加有關，參見Byrne B.et al.,“Sialic acids：carbohydrate moieties that influence the biological and physical properties of biopharmaceutical proteins and living cells,”Drug Discovery Today 2007；12(7-8)：319)，以及透過較不受到醣蛋白媒介之保護而免於一些血漿蛋白酶(Ton G.,et al.,2005,Nie Y et al.,2006中的回顧)而被廓清。

如本文所用的去醣化包括，但不限於因子VII多肽的遺傳修飾，使得胺基酸序列相較於參考因子VII多肽有所改變，該改變移除N-連結醣化位點。舉例而言，因子VII變異體可以在N-連結聚醣一致序列(亦即Asn-X-Ser/Thr，其中X表示脯胺酸以外的任一種胺基酸)所需的一或多個胺基酸殘基處利用醣化-瓦解變化而生成。如此處所用因子VII胺基酸序列的”醣化-瓦解變化”意指相對於野生型因子VII的變化，其造成一或多個胺基酸殘基置換、添加或刪除，且造成一或多個N-連結醣化位點喪失。例如，N-連結醣化位點可以藉由以任一種胺基酸(天然或非天然)取代同時存在於野生型因子VII中的N145及/或N322而被移除。醣化位點應被鑑定為當被改變而瓦解醣化時對活性具有最小影響。在另一個實例中，去醣化可以藉由在缺少醣化機制的細胞株中表現因子VII多肽(野生型或變異體)而發生。舉例而言，在細菌細胞中生產的因子VII預期為完全非醣化，因為細菌細胞缺少醣化的細胞機制。在另一個具體例中，在缺少末端醣化酵素或具有這個酵素但所具有的一或多種活性低於在野生型細胞株所發現者的細胞株中生產因子VII多肽。參見，例如Appa R.et al.,201、Narita M et al.,1998、Seested et al.,2010。在另一個具體例中，在帶有缺乏涉及將聚醣合成或附接至因子VII的酵素或缺乏涉入合成CMP-唾液酸運輸蛋白的酵素的細胞株中生產因子VII多肽。在另一個具體例中，以去醣化酶或化學品處理因子VII多肽以去醣化。

可以在表現、純化期間或純化之後藉由唾液酸酶、去醣化酶或化學品處理而從因子VII多肽降低或移除聚醣。

在一個具體例中，以對活性影響最小的方式選擇性地移除在因子VII變異體V1(N322、N145)或因子VII變異體V2(N322、N145、N106、N253)中的至少一個N-連結醣化位點。N-聚醣位點可以藉由瓦解N-聚醣一致序列而在DNA層次上被塗銷。這可以藉由移除N(天冬醯胺酸)密碼子並且置換為Q(麩醯胺酸)密碼子而完成。圖6是顯示低醣化變異體實例的表格。醣化變異體可以依據野生型因子VII(在此稱為”F7”)、V1與V2骨架而做出。在V1與V2中經工程化的N-聚醣位點(N106、N253)被復原成其野生型序列(T106、V253)。變異體pMB113、pMB117與pMB121分別為含有兩個內源性N-醣化位點(N145、N322)的野生型因子VII、V1與V2構築體。圖6中的所有其他變異體的一或兩個內源性N-聚醣位點已藉由將引入N至Q突變(N145Q、N322Q)而被移除。這個去醣化方法會有最快的廓清。

在本揭示內容的一個態樣中，去醣化以及去唾液酸化被合併以產生具有所要半衰期縮短的因子VII多肽。例如，因子VII分子可以是經遺傳修飾以在野生型因子VII中存在的兩個N-連結醣化位點以外處納入其他N-連結醣化位點。這個變異體接著可以使用本文所述方法中的一者被去唾液酸化。所得分子則在各個N-連結聚醣位點保留聚醣結構而沒有末端唾液酸。在本文報導的實驗中。申請人報導具有消除時間比具有較少N-連結醣化位點之類似去唾液酸化因子VII變異體更快的變異體。類似地，僅具有兩個在野生型因子VII中發現的N-連結醣化位點的因子VII多肽可以在這些位點中的一者處被去醣化然後經去唾液酸化。依據本文報導的實驗證據，具有一個N-連結聚醣且缺少唾液酸的所得因子VII變異體具有與相似因子VII多肽不同的藥動學，該相似因子VII多肽未缺少第二個N-連結醣化位點。

定義與具體例

除非另有說明，否則本文中使用的全部技術與科學術語具有本揭示內容所屬技藝中具有通常技術者一般所理解的相同意思。一般來說，本文所用命名以及在細胞培養、分子遺傳學、有機化學與核酸化學及雜交的實驗室程序為熟知且通常在該技藝中被採用。核酸與多肽合成是使用標準技術。本文所用命名與下述分析化學及有機合成的實驗室程序為熟知且通常在該技藝中被採用。標準技術，或其修改技術被用於化學合成以及化學分析。用於遺傳工程的程序為熟知的且可以在例如Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.中找到。

術語”唾液酸”或”唾液基”意指九碳羧基化糖家族的任一個成員。唾液酸家族中最為常見的成員為N-乙烯基-神經胺糖酸(2-酮基-5-乙醯胺基-3,5-二去氧基-D-甘油-D-半乳糖九碳糖基吡喃-1-酸(通常被簡稱為Neu5Ac、NeuAc或NANA))。

術語”多肽”與”蛋白質”在本文中交替使用且意指單體為胺基酸並且透過醯胺鍵接合的聚合物。另外，非天然胺基酸，例如β-丙胺酸、苯基甘胺酸以及高精胺酸亦包括在內。不是基因編碼的胺基酸也與本文揭示的技術一起使用。此外，也可以使用已經過修飾而納入反應基團、醣化位點、聚合物、治療部分、生物分子以及類似物的胺基酸。本文所用的全部胺基酸可為D或L異構體。通常L-異構體較佳。如本文所用，”多肽”與”蛋白質”分別意指經醣化與未經醣化的多肽與蛋白質。

術語”胺基酸”意指天然與合成胺基酸，以及胺基酸類似物和胺基酸擬似物，其以與天然胺基酸類似的方式作用。天然胺基酸為彼等由遺傳密碼子所編碼者，以及彼等稍後經改變修飾的胺基酸，例如羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸與O-磷絲胺酸。”胺基酸類似物”意指具有與天然胺基酸相同基礎化學結構的化合物，亦即結合至氫的α碳、羧基、胺基與R基團，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲基甲硫胺酸鋶。此等類似物具有經修飾的R基團(例如正白胺酸)或經修飾的肽骨架，但仍保有與天然胺基酸相同的基本化學結構。”胺基酸擬似物”意指具有的結構不同於胺基酸的一般化學結構，但以與天然胺基酸類似的方式作用的化學化合物。

如本文所用術語”半衰期”或”t1/2”在對患者投與多肽或蛋白質藥物時，被定義為在患者體內降低藥物血漿濃度達一半所需要的時間。

半衰期可以在測試動物中被測定，例如藉由投與劑量約25-250微克/kg製品；在投與之後於預定時間取得血漿樣品；以及使用一或多種凝血分析(或任一種生物分析)、免疫分析或相同分析測定樣品中的因子VII多肽含量。數據可以以圖式的方式表現並決定生物可利用性為在曲線下的面積。在某些實例中，大鼠或鼠模型被用於半衰期測量。因子VII多肽或其組成物的相對生物可利用性意指短-作用因子VII多肽的曲線下面積對野生型因子VII或另一種適當相對物多肽或蛋白質的曲線下面積的比率。任一種具有因子VII凝血活性的因子VII變異體可用於本文所述目的與方法中。如本文所用的因子VII變異體為多肽。術語”變異體因子VII多肽”以及”因子VII變異體”在本文中交替使用。在一個具體例中，因子VII變異體具有衍生自野生型因子VII(SEQ ID NO：16)的胺基酸序列，相差在一或多個胺基酸置換、刪除及/或插入。在命名胺基酸置換時，第一個字母表示存在於某個位置處的野生型人類因子VII的胺基酸。次一個數字表示人類野生型因子FVII的位置。第二個字母表示取代野生型中的胺基酸的胺基酸。例如，”P10Q”表示麩醯胺酸(Q)置換在胺基酸位置10處的脯胺酸(P)。

在某些實例中，因子VII變異體包含一或多個選自下列組成之群的胺基酸置換：P10Q、K32E、R36E、A34E、T106N以及V253N。在其他實例中，因子VII變異體包含這些置換中的至少2個、3個、4個、5個或6個。在更多實例中，因子VII變異體包含相對於胺基酸序列SEQ ID NO：16(野生型人類因子VII)具有至少兩個序列變化的胺基酸序列，其中該等至少兩個序列變化為(1)麩醯胺酸殘基置換在位置10中的脯胺酸殘基，以及(2)麩胺酸殘基置換在位置32中的離胺酸殘基。在另一個實例中，因子VII變異體包含相對於胺基酸序列SEQ ID NO：16具有至少三個序列變化的胺基酸序列，其中該等至少三個序列變化為(1)麩醯胺酸殘基置換在位置10中的脯胺酸殘基、(2)麩胺酸殘基置換在位置32中的離胺酸殘基，以及(3)麩胺酸殘基置換在位置36中的精胺酸殘基。在又一個具體例中，因子VII變異體包含相對於胺基酸序列SEQ ID NO：16具有至少四個序列變化的胺基酸序列，其中該等至少四個序列變化為(1)麩醯胺酸殘基置換在位置10中的脯胺酸殘基、(2)麩胺酸殘基置換在位置32中的離胺酸殘基、(3)麩胺酸殘基置換在位置36中的精胺酸殘基，以及(4)麩胺酸殘基置換在位置34中的丙胺酸殘基。在一個特定實例中，因子VII變異體包含相對於胺基酸序列SEQ ID NO：16具有至少六個序列變化的胺基酸序列，其中該等至少六個或六個序列變化為(1)麩醯胺酸殘基置換在位置10中的脯胺酸殘基、(2)麩胺酸殘基置換在位置32中的離胺酸殘基、(3)麩胺酸殘基置換在位置36中的精胺酸殘基、(4)麩胺酸殘基置換在位置34中的丙胺酸殘基、(5)天冬醯胺酸殘基置換在位置106中的蘇胺酸殘基，以及(6)天冬醯胺酸殘基置換在位置253中的纈胺酸。在另一個特定具體例中，因子VII變異體只包含這六個變化。關於這些變異體的更多詳細說明可在Maxygen的WO 200158935以及Pedersen et al.的美國專利第7,371,543號中找到，兩者均以其整體併入本文做為參考資料。

本文所述的因子VII變異體可以使用任何功能性VII多肽作為起始多肽來進行設計。在某些具體例中，因子VII多肽為人類因子VII多肽。在更多具體例中，因子VII多肽為SEQ ID NO：16的人類因子VII多肽，或其經修飾形式或對偶基因變異體。可供使用的起始多肽也包括經修飾或變異體因子VII多肽，其含有與野生型人類因子VII(SEQ ID NO：16)的序列至少約99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%或66%同一性且亦具有因子VII活性的胺基酸序列。此外，在某些實例中，本揭示內容的變異體因子VII多肽包括與SEQ ID NO：16的序列具有至少約99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%或66%同一性並具有因子VII功能，且亦相對於SEQ ID NO：16含有一或多個本文所述胺基酸變化的任一種多肽。在另一個具體例中，因子VII多肽包括與SEQ ID NO：16有超過99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%或66%同源性並具有因子VII活性，且亦含有一或多個本文援引之一或多種胺基酸變化的胺基酸序列。

如本文所用因子VII變異體也包括野生型因子VII的醣化變異體。例如，部分去唾液酸化野生型因子VII變異體及其組成物可供使用，因為其具有比野生型因子VII還短的半衰期。也可以供本文中使用的是經部分或完全去唾液酸化野生型因子VII的醫藥調配物以及此等多肽與調配物在治療受益於具有因子VII活性之短-作用多肽的本文援引疾病中的用途。經部分或完全去唾液酸化可以藉由如本文所述因子VII多肽組成物中之接合的唾液酸莫耳對N-連結聚醣莫耳的比率而被測量。

編碼本文因子VII變異體的核苷酸序列也可供使用。在一個具體例中，因子VII多肽是由具有與整個野生型因子VII的全長核苷酸序列(SEQ ID NO：1)至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%或66%同一性且編碼功能性因子VII多肽的核苷酸序列所編碼。在某些實例中，該核苷酸序列也編碼相對於SEQ ID NO：16含有一或多個本文所述胺基酸變化的多肽。在另一個具體例中，因子VII多肽是由與野生型因子VII的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)具有超過99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%或66%同源性且編碼功能性因子VII多肽的核苷酸序列所編碼。在某些實例中，該核苷酸序列也編碼相對於SEQ ID NO：16含有一或多個本文所述胺基酸變化的多肽。

同一性百分率數值是對整個胺基酸或核酸序列區來進行計算。對於習於技藝者來說，一系列基於不同演算法的程式可用來比對不同序列。在至少一個具體例中，兩個胺基酸序列之間的同一性百分率是使用尼德曼與溫許演算法(Needleman 1970,J.Mol.Biol.(48)：444-453)來決定，該演算法已被併入EMBOSS軟體包的針程式(needle program)(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice,P.,Longden,I.,and Bleasby,A,Trends in Genetics 16(6),276-277,2000)，針對較不相關的蛋白質使用BLOSUM 45或PAM250計分陣列，或針對較為相關的蛋白質使用BLOSUM 62或PAM160計分陣列，而空位開放罰分為16、14、12、10、8、6或4，且空位擴展罰分為0.5、1、2、3、4、5或6。關於EMBOSS包的局部安裝以及連結至網路服務的指引可以在emboss.sourceforge.net找到。用於使用針程式來比對兩個胺基酸序列的參數的非限制性實例為預設參數，包括EBLOSUM62計分矩陣、空位開放罰分為10，以及空位擴展罰分為0.5。在又另一個具體例中，兩個核苷酸序列之間的同一性百分率是使用在EMBOSS軟體包中的針程式(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice,P.,Longden,I.,and Bleasby,A,Trends in Genetics 16(6),276-277,2000)，使用EDNAFULL計分矩陣以空位開放罰分為16、14、12、10、8、6或4以及空位擴展罰分為0.5、1、2、3、4、5或6來決定。用於使用針程式比對兩個胺基酸之參數的非限制性實例為預設參數，包括EDNAFULL計分矩陣、空位開放罰分為10，以及空位擴展罰分為0.5。核酸與蛋白質序列可進一步用作為”查詢序列”以相對於公開資料庫來進行檢索，例如以鑑定其他家族成員或相關序列。此等檢索可以使用Altschul等人的BLAST系列程式(第2.2版)來進行(Altschul 1990,J.Mol.Biol.215：403-10)。使用本揭示內容的核酸序列作為查詢序列的BLAST可以使用BLASTn、BLASTX或tBLASTx程式，利用預設參數來進行，以獲得與由本揭示內容之核酸序列編碼的序列同源的核苷酸序列(BLASTn、tBLASTx)或胺基酸序列(BLASTx)。使用由本揭示內容之核酸序列編碼的蛋白質序列作為查詢序列的BLAST可以BLASTp或tBLASTn程式，利用預設參數來進行，以獲得與由本揭示內容的序列同源的胺基酸序列(BLASTp)或核酸序列(tBLASTn)。為了獲得空位比對以供比對之用，可以如Altschul et al.,1997,Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述採用使用預設參數的空位BLAST。

本揭示內容的多核苷酸基本上由前述核苷酸序列組成或包含前述核苷酸序列。因此，它們也可含有其他核苷酸序列。在某些具體例中，該多核苷酸除了開放閱讀框架以外，可在編碼基因區的3’及/或5’端處進一步包含未轉譯序列，例如編碼區的5’端上游序列的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500或更多個核苷酸及/或編碼基因區的3’端下游序列的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500或更多個核苷酸。此外，該核苷酸可編碼融合蛋白質，其中該融合蛋白質的一個夥伴是由上文引用的核苷酸序列編碼的多肽。此等融合蛋白質可包含所謂”標籤”，其充當可偵測標記或作為輔助測量以供純化之用。用於不同目的之標籤為技藝中已知的且包含FLAG-標籤、6-組胺酸-標籤、MYC-標籤以及類似物。在一個具體例中，該多核苷酸進一步包含可操作地連結至該核苷酸序列的表現控制序列。

在某些具體例中，編碼因子VII多肽的核酸序列被插入適當載體中。可供不同目的使用的數種載體為技藝中已知且習於技藝者將能夠輕易地針對他們所要的用途來選擇適當載體。在某些實例中，載體可以是選殖載體或表現載體。在其他實例中，載體可以是質體、病毒載體、黏質體，或人工染色體。在某些實例中，編碼因子VII多肽的核酸可以是鄰接適當啟動子及/或受適當啟動子所控制。數種可用於不同目的之啟動子為技藝中已知且習於技藝者將能夠輕易地針對它們所要的用途來選擇適當啟動子。在某些實例中，啟動子可以是組成性啟動子、誘導性啟動子，或組織特異性啟動子。

在某些具體例中，在細胞、組織或生物體中以重組方式生產因子VII多肽。在某些具體例中，此等重組生產是藉由以編碼變異體多肽的核酸分子或含有此一核酸的載體轉形或轉染宿主細胞而達致。轉形與轉染的數種方法為技藝中已知且習於技藝者將能夠輕易地針對它們所要的用途來選擇適當方法。

此重組生產也可以藉由使用任一種適當宿主細胞、組織或生物體而達致。適當細胞、組織，以及生物體為技藝中已知且習於技藝者將能夠輕易地針對它們所要的用途來選擇適當宿主。在一些具體例中，宿主細胞為哺乳動物。適當哺乳動物細胞株的實例為COS-1(ATCC CRL 1650)、幼倉鼠腎(BHK)、HEK293(ATCC CRL 1573；Graham et al.,J.Gen.Virol.36：59-72,1977)、HEK293T(ATCC CRL 11268；DSM ACC 2494)以及HEK293F(Invitrogen R79007)細胞株。可用BHK細胞株為tk³¹ ts13 BHK細胞株(Waechter and Baserga,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：1106-1110,1982，併入本文做為參考資料)，下文稱為BHK 570細胞。BHK 570細胞株已以ATCC寄存編號CRL 10314被寄存於美國典型培養物保存中心(12301 Parklawn Dr.,Rockville,Md.20852)。tk^- ts13 BHK細胞株也可以寄存編號CRL 1632得自於ATCC。此外，一些其他細胞株可用於本揭示內容中，包括大鼠Hep I(大鼠肝細胞瘤；ATCC CRL 1600)、大鼠Hep II(大鼠肝細胞瘤；ATCC CRL 1548)、TCMK(ATCC CCL 139)、人肺(ATCC HB 8065)、NCTC 1469(ATCC CCL 9.1)、CHO(ATCC CCL 61)、CHO K1(ATCC CCI61)、DUKX細胞(Urlaub and Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220,1980)以及CHO-DG44細胞(Urlaub et al.Cell 33：405-412,1983).。

因子VII多肽的組成物可供使用，其中因子VII多肽如本文定義，且在組成物中每莫耳N-連結聚醣的接合唾液酸莫耳的比率少於0.05、少於0.1、少於1.0、少於2.0、少於3.0、少於4.0、少於5.0或少於6.0，或在組成物中每莫耳N-連結聚醣的接合唾液酸莫耳的比率落在選自下列組成之群的範圍：(1)自0至8；(2)自0至7；(3)自0至6；(4)自0至5；(5)自0至4；(6)自0至3；(7)自0至2；(8)自0至1以及(9)自0至0.5，或自1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、2至3、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至8、4至7、4至6、4至5，以及0.1至1的比率。該比率是結合至醣蛋白之唾液酸莫耳相對於醣蛋白上之聚醣數量的度量單位。聚醣數量意指附接至醣蛋白中的N-連結聚醣的糖部分數量，其中一個N-連結醣化位點可給予僅一個如本文定義之聚醣以供此比率之用。使用唾液酸螢光標定套組來測定比率，諸如由Takara Bio Inc.所販售者(cat #4400)。該唾液酸螢光標定套組包括從結合的醣蛋白釋出唾液酸的步驟，諸如藉由部分酸水解或藉由使用唾液酸酶，諸如產脲節桿菌唾液酸酶。接著以螢光團(諸如1,2-二胺基-4,5-亞甲基氧基苯，”DMB”)標定游離唾液酸。經標定唾液酸接著可使用HPLC來進行量化測量並相對於校正曲線來比較峰高度。因此，測得比率為每莫耳從組成物之所有因子VII多肽釋出的聚醣的唾液酸莫耳的比率。

在一系列具體例中，因子VII多肽的組成物或經單離多肽本身如在人類或哺乳動物血漿(例如鼠或大鼠血漿)中測得，具有少於2小時、少於1.5小時、少於1小時、少於.75小時、少於.5小時、少於.25小時、少於0.1小時或短到無法被合理測量到的半衰期。

如本文所用，因子VII活性是一種可以藉由使用因子VII缺陷血漿與血栓形成素測量製品促進凝血的能力而被量化之生物活性，如技藝中熟知的。在某些實例中，如在相同條件下所測量，具有因子VII活性的因子VII多肽顯示野生型因子VII活性的至少25%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%，或至少90%。

因子VII多肽的醫藥調配物與其包含因子VII多肽以及醫藥上可接受賦形劑或載劑的組成物可供使用。在某些實例中，醫藥組成物用於非經腸投與，諸如藉由靜脈內、皮下或肌肉內投與，且給藥可以是作為單一團注給藥、間歇給藥或連續靜脈內輸注。也可以使用局部調配物。一個具體例包含醫藥調配物，該醫藥調配物包含如本文所述的經單離因子VII多肽，或包含如本文所述因子VII多肽的組成物，呈在使用之時被還原的凍乾製品形式。或者，醫藥調配物可以是不需要還原的穩定液體即用調配物。醫藥調配物可以是凍乾粉末，呈1、2、5或8mg因子VII多肽的單次使用小瓶。在以指定體積的液體(諸如含有組胺酸的無菌水)還原之後，最終溶液可含有任何適當數量之會產生治療效用的因子VII多肽，諸如，但不限於1mg/mL(1000微克/mL)、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、1-2mg/mL、1-3mg/mL、1-5mg/mL、1-10mg/mL、0.5-1mg/mL或0.5-2mg/mL因子VII多肽。投與給患者的適當劑量可由習於技藝者基於(例如)患者體重、待治療出血病症或事件的類型，以及所用特定因子VII多肽的活性來輕易決定。在某些實例中，給藥可以是在70-110微克/kg、70-90微克/kg，或80-100微克/kg的範圍內且可以是90微克/kg。以水性載劑還原凍乾粉末，水性載劑為諸如水、經緩衝之水、0.4%鹽水、0.3%甘油等。製備非經腸投與組成物的實際方法對於習於技藝者來說為熟知或明顯的，且進一步詳細描述於例如Remington's Pharmaceutical Sciences,18th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1990)中。局部施用，諸如在創傷病例中所建議者，可以藉由噴霧、灌注、導管、支架、血管移植片或支架、軟膏或其他技藝中熟知的製品來實施。在某些實例中，局部投遞可以是藉由固體或半固體基質，諸如外科手術海綿或膠原蛋白基質，其經含有因子VII變異體的組成物處理、浸漬其中、塗覆或浸泡其中。製備此等基質的方法為技藝中熟知(參見，例如Thrombosis/Hemostasis 12：445,2006)且習於技藝者將能夠輕易選擇適當劑量與將組成物施用到給定基質上的方法。

在一個具體例中，本揭示內容是有關於包含因子VII多肽的套組。在某些具體例中，該套組含有即用液體的小瓶，該即用液體中含有於適當醫藥組成物中的因子VII多肽。在其他實例中，該套組含有包含凍乾因子VII多肽，或包含多肽之凍乾調配物，以及還原用稀釋劑的小瓶。在其他實例中，該套組含有因子VII多肽以及諸如海綿的基質或其他醫學基質的局部調配物，例如軟膏、噴霧劑，或液體，該局部調配物可在投與給患者之前施用至諸如海綿的基質或其他醫學基質上。

本文所述因子VII多肽的組成物亦可供使用。因子VII與其天然分解產物存在於混合物中。因此，因子VII多肽的組成物包括具有如本文引用之完整胺基酸序列之一者的多肽，以及具有部分本文所述彼等胺基酸序列的分解產物。此外，因為因子VII為醣蛋白，因子VII的組成物預期可能含有因子VII多肽的異源性混合物，其中組成物中的各個醣蛋白不具有與他者完全相同的醣化。提到因子VII多肽或經單離因子VII多肽的組成物表示含括此等多肽的混合物，其中個別多肽具有不同醣化，且因此術語”組成物”或”經單離因子VII多肽”含括多肽的異源性醣化型態。

本文所述因子VII多肽以及組成物可用於治療凝血病症，以及彼等受益於凝血的病症，且特別是關於使用具有半衰期比野生型VII還短的藥物的凝血。因此，本文的因子VII多肽與組成物可用於穿刺傷；鈍器傷：常規外科手術中的出血；心臟外科手術中的出血；脊髓外科手術中的出血；整形外科手術、神經外科手術；腫瘤學外科手術；產後外科手術；月經過多；幹細胞移植中的出血；肝臟移植中的出血；胃腸出血；硬化中的活動性靜脈瘤出血；硬化中的非靜脈瘤出血；瀰漫性肺泡出血；主動脈瘤；腦內出血；腦創傷；腦挫傷；殺鼠靈的反轉；肝素的反轉；抗凝血劑的反轉；抗栓塞劑的反轉；因子VII缺乏症；燒傷；預防使用抑制劑的血友病患者；非硬化及硬化患者的局部肝切除；後天血友病；特發性血小板減少紫斑；葛氏病；對於血小板傳輸為難治性的葛氏病與巨血小板症候群。

本文亦揭示用以測量凝血因子(諸如因子VII)之半衰期的可用分析。有測量凝血因子半衰期的方法，包含培育大鼠肝細胞活細胞與凝血因子、在時間點1移除樣品、將上清液與樣品中的細胞分離並量化樣品之上清液中的凝血因子的活性或數量，其中凝血因子的活性或數量是使用雙抗體夾心式ELISA分析來測定。該方法可在不同時間點重複數次，以產生凝血因子之活性或數量對時間的圖式。

實例獲得去唾液酸化因子VII多肽的方法

採用許多方法來生成去唾液酸化因子VII多肽(野生型與變異體)，包括以酵素的方式使多肽去唾液酸化、在缺乏唾液酸化的細胞株中生產因子VII多肽，以及在重組細胞中共表現因子VII與唾液酸酶。

唾液酸缺乏細胞株的生成

在哺乳動物細胞中合成內源性唾液酸，其涉及到一個由32種酵素組成的複雜路徑(Wickramasinghe and Medrano 2011)。唾液酸的生物合成始於細胞質中，將UDP-N-乙醯基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)轉換成 Neu5Ac，這涉及數種酵素，諸如UDP-N-乙醯基葡萄糖胺-2-表異構酶/N乙醯基甘露糖胺激酶(GNE)、唾液酸9-磷酸合成酶(NANS)，以及唾液酸9-磷酸磷酸酶(NANP)。細胞質中的Neu5Ac透過核孔被運入細胞核中並且藉由被稱為CMP-Sia合成酶(CMAS)的酵素轉變成CMP-Neu5Ac。經合成CMP-Neu5Ac再次經由核孔被運回細胞質中，於高基氏體中進一步修飾與接合。Neu5Ac在細胞質中轉變成Neu5Gc是藉由酵素CMP-NeuAc-羥化酶(CMAH)而被催化。接著，CMP-Neu5Ac與CMP-Neu5Gc經由疏水性第3型膜運輸蛋白被運入高基氏體，該第3型膜運輸蛋白為CMP-唾液酸運輸蛋白(SLC35A1)，位於中間高基氏體反側。CMP-唾液酸運輸蛋白是細胞唾液酸化路徑的一個關鍵要素(Hirschberg,et al.1998)。這個基因的同型合子突變在小鼠中會致使分娩後致死性(MGI 4.32,Homologene)。在人類中，SLC35A1的突變與唾液基接合物的減少或完全喪失有關。在SLC35A1中的一些插入與刪除突變與人類中醣化的先天病症相關，使得神經系統發育有缺陷、凝血和免疫缺陷(Martinez-Duncker,et al.,2005)。在CMP-Neu5Ac/CMP-Neu5Gc被運入高基氏體之後，它們透過有20個成員的唾液基轉移酶(ST)家族中的酵素接合醣、醣蛋白以及醣脂質。

CMP-唾液酸運輸蛋白(SLC35A1)在高基氏體中是支持唾液酸接合的主要分子，而這個運輸蛋白的突變會合成出缺少適當唾液酸化的蛋白質。為了生產去唾液酸化因子VII，生成帶有CMP-唾液酸運輸蛋白基因剔除的因子VII生產細胞株。或者，可以藉由在細胞株中表現因子VII變異體而達致去唾液酸化，該細胞株生產在治療分子上唾液酸化程度非常低或無唾液酸化的蛋白質製劑。這個技術可用來生產在患者體內具有短T1/2的治療性蛋白質。

具有中國倉鼠卵巢(CHO)源的Lec2細胞被鑑別具有生產比個別野生型細胞在醣蛋白與醣脂質方面少約10倍唾液酸的特徵(Stanley and Siminovitch,1977,Stanley,1980 and 1983)。一個較晚的研究顯示，Lec2突變體在一個活體外分析中無法將CMP-唾液酸轉位跨過高基氏囊泡的膜，但其他核苷酸衍生物的轉位在突變細胞中與正常不相上下(Deutscher,et al.,1984)。藉由使用表現選殖，來自Leu2細胞之編碼CMP-唾液酸運輸蛋白的基因被報導(Eckhardt et al.,1998)。更多研究指出，刪除CMP-唾液酸運輸蛋白基因中的核苷酸575-751是Lec2表現型的主因(Eckhardt,et al.,1998)。在CMP-唾液酸運輸蛋白基因中的其他突變，諸如在IE3、6B2、8G8與9D3細胞的情況下，也會造成Lec2表現型(Eckhardt,et al.,1998)。

實驗1

這個實驗被設計成決定CMP-唾液酸運輸蛋白基因中的突變是否會在諸如Lec2細胞中造成所表現重組蛋白質(例如因子VII)相比於由正常CHO細胞所表現之相同蛋白質缺乏唾液酸化。

(1)由Lec2細胞測試重組蛋白質(諸如因子VII)的表現。含有因子VII變異體基因的表現載體(例如pMB117與pMB121)在正常轉染條件下被轉染至Lec2細胞以及CHO細胞中。這些細胞之細胞培養物的因子VII表現位準是藉由因子VII活性分析來進行監控。將經轉染細胞的培養物放大規模並且收取培養物條件培養基供純化因子VII之用。

(2)相比於由正常CHO細胞表現之經純化因子VII，測試由Lce2細胞表現之經純化因子VII的唾液酸含量。遵循正常因子VII純化方法由這些條件培養基來進行因子VII的純化。針對經純化因子VII的唾液酸含量，分析來自Lec2細胞或正常CHO細胞的經純化因子VII。如本文所述分析生物活性以及藥動學(PK)參數。

實驗2

為了要生產製造細胞株以表現在經表現重組蛋白質上不帶有唾液酸的因子VII變異體，使用基因刪除法來靶定CMP-唾液酸運輸蛋白基因，以修飾表現因子VII的細胞株(例如CHO細胞株)。為了要完全抑制細胞內的唾液酸化，諸如上面引言中列出的UDP-N-乙醯基葡萄糖胺-2-表異構酶/N乙醯基甘露糖胺激酶(GNE)、唾液酸9-磷酸合成酶(NANS)、唾液酸9-磷酸磷酸酶(NANP)，以及CMP-Sia合成酶(CMAS)也可以視情況被刪除以增強CMP-Neu5Ac生物合成的抑制，而CMP-Neu5Ac生物合成提供CMP-唾液酸運輸蛋白的受質。

兩個基因刪除策略，Life Technologies的TALE核酸酶(TALENs)以及Sangamo BioSciences/Sigma-Aldrich的ZFP核酸酶(ZFNs)可用來進行CMP-唾液酸運輸蛋白基因的剔除，或在唾液酸合成路徑中多個基因的剔除。

評估帶有CMP-唾液酸運輸蛋白基因剔除的因子VII表現細胞株，以確認CMP-唾液酸運輸蛋白基因刪除。培養經確認的細胞株以生產因子VII。CMP-唾液酸運輸蛋白基因經刪除的細胞株的因子VII被純化並如本文所述進行評估，且與來自母體因子VII表現細胞株的因子VII針對分子上的唾液酸含量進行比對。

藉由共表現因子VII與細菌唾液酸酶生產去唾液酸化因子VII

為了要生成去唾液酸化形式的FVII，吾人共表現VII與衍生自產氣莢膜芽胞梭菌唾液酸酶(AU唾液酸酶)(N-乙醯基神經胺酸醣類水解酶，EC 3.2.1.18)的細菌唾液酸酶變異體。穩定表現FVII(例如帶有P10Q、 K32E、A34E與R36E突變的SEQ ID NO：16)的CHO細胞進一步使用pJ608表現載體被轉染以AU唾液酸酶。經表現蛋白質在N端具有生長激素訊號序列以促進蛋白質分泌。穩定選殖株被挑出，所生產的AU唾液酸酶是藉由顯色分析來偵測培養基中的唾液酸酶。吾人也證明該等細胞持續表現高位準的FVII蛋白質，其是藉由ELISA分析、SDS PAGE與西方墨點法利用EVII特異性抗體作為探針而被偵測。使用植物凝集素墨點分析，吾人無法利用經純化FVII在條件培養基中偵測到FVII蛋白質上的唾液酸。相對地，衍生自未被轉染唾液酸酶之細胞的類似位準的經純化FVII顯示強烈的植物凝集素結合訊號。總結來說，吾人的數據顯示，AU唾液酸酶在CHO細胞培養基中以足以有效對被細胞共表現之FVII進行去唾液酸化的位準表現。

使用可溶性唾液酸酶處理以酵素的方式製備去唾液酸化因子VII

在本實驗試驗中採用下列起始材料：因子VII：20mg野生型因子VIIa，濃度約1mg/ml

唾液酸酶：20ug，0.25mg/ml，50000U/ml，P0720L，購自於New England BioLabs

緩衝液A：25mM組胺酸，50mM NaCl，pH 6.4

緩衝液B：25mM組胺酸，1M NaCl，pH 6.4

FVIIa調配緩衝液：2.3mg/ml氯化鈉、1.5mg/ml去水氯化鈣、1.3mg/ml甘胺醯甘胺酸、0.1mg/ml聚山梨醇酯80、25mg/ml甘露醇、10mg/ml蔗糖、0.5mg/ml甲硫胺酸、1.6mg/ml組胺酸，pH 6.0

純化管柱：5ml HiTrap Q Sepharose HP管柱

使用這些材料，進行下列程序：

1.向20mgs的FVIIa(約1mg/ml)添加20ug唾液酸酶 (0.25mg/ml，1：1000質量比率)的唾液酸酶

2.在如下述以層析的方式純化去唾液酸化FVII之前於室溫下培養反應物過夜(約19hr)。

3.在5ml HiTrapQ Sepharose HP管柱上如下純化去唾液酸化FVIIa：

a)以5CV的緩衝液A(25mM組胺酸，50mM NaCl，pH 6.4)平衡Q-Sepharose管柱。

b)在施加至管柱之前，以200ml緩衝液A稀釋FVIIa及唾液酸酶反應物並將pH調整至6.4。

c)以2.5ml/min的流速使用AKTA Explorer系統來加載，同時監測A280。透過餾分收集流程。

d)在完成加載之後，以10CV的緩衝液A洗滌管柱。

e)於40分鐘內以20CV的0-50%緩衝液B(25mM組胺酸，1M NaCl，pH 6.4)沖提管柱。收集峰餾分(去唾液酸化NovoSeven)

f)在4℃下透析峰餾分對FVIIa調配緩衝液過夜

g)以等分式樣將樣品冷凍於-80℃下。

藉由FVIIa的SDS-PAGE、aSEC以及生物分析中的活性，產物顯示為高度純化。唾液酸含量的分析顯示沒有殘餘唾液酸，而重鏈的LC-MS分析顯示除了唾液酸移除以外，聚醣結構沒有明顯變化。

使用神經胺酸酶-瓊脂糖珠粒以酵素的方式製備去唾液酸化因子VII

如本文所用重組野生型因子VII為得自於Novo Nordisk的NovoSeven®，且在本文中被稱為”F7”。其他起始材料為上文所述的V1及V2。

在37℃水浴中快速解凍被冷凍的起始材料並集中。藉由離心將蛋白質濃縮2.5倍；藉由抽吸將濃縮物輕柔地混合以使得蛋白質-過濾器介面處的任何超濃縮(聚集)減至最低。

V2由其V2調配緩衝液(含有組胺酸、CaCl₂、海藻糖、甲硫胺酸以及微量Tween®-20，在pH 6.4-6.6下)經緩衝液交換至MES緩衝液(10mM MES，10mM CaCl₂，50mM NaCl，pH 6.0，經無菌過濾)中。這是藉由三種方法中的一者來達致。在第一個選項中，V2與NAP-10重力流管柱(GE,17-0854-01)進行緩衝液交換，該管柱以3份管柱體積的各個MES緩衝液預先洗滌3-5次。接著將V2加載至管柱上並以1.5倍加載體積的MES緩衝液沖提。在第二個選項中，V2藉由在MES緩衝液中過夜透析來進行緩衝液交換。透析匣預先浸潤於MES緩衝液中且V2是藉由注射器被加載至3.500MWCO slide-a-lyzer匣(Thermo Scientific,66130)中、在具有無菌過濾MES緩衝液的10L瓶中於4℃下過夜。在第三個選項中，V2透過Sephades G-25(Sigma,G-25-80)凝膠過濾管柱被緩衝液交換至MES緩衝液中，並且經MES緩衝液校正。

經緩衝液交換的V2以神經胺酸酶-瓊脂糖(Sigma N5254)去唾液酸化。以50%漿液混合物提供瓊脂糖珠粒產物，儲存於硫酸銨緩衝液中；珠粒在MES緩衝液中預先洗滌3-5次；珠粒/緩衝液混合物是藉由在4℃下以1000rcf離心3分鐘而被分離，且上清液被抽走並丟棄。向經洗滌的珠粒添加經緩衝液交換的V2並藉由在室溫下旋轉16至22小時來輕柔地混合。2.08ml堆疊珠粒/mg蛋白質用於去唾液酸化；就較大規模的製備來說，降低1：10至0.208ml珠粒/mg蛋白質。之後，經去唾液酸化V2是藉由離心而被回收並被抽走。藉由在1：1體積的新鮮MES緩衝液中旋轉歷時5分鐘來輕柔地洗滌珠粒，如前述離心洗滌混合物並集中帶有V2的上清液。最後藉由無菌過濾0.2微米注射器過濾器或藉由真空過濾0.45微米過濾器來移除珠粒。

使用EndoTrap HD樹脂(Hyglos)進行內毒素移除數回。在MES緩衝液中洗滌樹脂3-5次並丟棄洗滌緩衝液。在兩個批次中，將1-3mL的經洗滌樹脂與去唾液酸化V2在室溫下輕柔地混合過夜。藉由離心移除樹脂並濾過注射器或真空過濾器。

去唾液酸化V2透過在Ultracels中離心10分鐘循環濃縮4.75倍至2.1mg/mL；藉由抽吸來輕柔地混合濃縮物以降低在蛋白質-過濾器介面處的任何聚集。

去唾液酸化V2進一步由較高分子量成分(與聚集的內毒素)中使用HiLoad 26/60 Superdex 200尺寸排除管柱被分離出來。管柱與AKTA純化系統經0.1N NaOH+20% EtOH預先消毒。系統為pH中性、以水濕潤，並且以經還原且集中的V2調配緩衝液校正。數批濃縮物以手動的方式注入12mL樣品環中並以3mL/min的流速加載至尺寸排除管柱；回收洗脫物並以Frac-900分至聚苯乙烯管(17X100mm,Fisherbrand,14-956-6D)中。排除較早的高分子量峰且集中並使用Charles Rive EndoSafe PTS與NanoDrop ND-1000測試內毒素含量與濃度。V2緩衝液被用來沖提去唾液酸化V2。

進行五個批次的尺寸排除並且收集的洗脫物被集中至一個批次，在Ultracels中濃縮至1.0mg/mL。最終製品是透過0.2微米注射器過濾器來進行無菌過濾並測試內毒素與濃度。1mL等份試樣被抽吸至已標記的2mL管(Sarstedt,72.694.006)中、在乙醇/乾冰浴中快速冷凍，並且儲存在-80℃的經標記盒子中直到要使用。

特徵鑑定-蛋白質分析與活體外分析

最後製備材料以及未經處理的起始材料是藉由使用在MES運行緩衝液中的4-12% Bis-Tris NuPAGE(Novex NP0335BOX)的蛋白質凝膠分析並且藉由分析型尺寸排除(TSK3000管柱，運行緩衝液：200mM KH2PO4、150mM KCl，pH 6.8，流速：0.15ml/min，螢光偵測)來進行特徵鑑定。藉由LC-MS針對因子VII重鏈上的唾液酸含量以及使用上述Takara Bio Inc.套組進行總蛋白質的DMB-標定唾液酸量化來分析小測試樣品。藉由磷脂-依賴性因子X活化與凝血酶生成分析來測試活性。

唾液酸含量分析

針對未經處理的對照以及去唾液酸化因子VII，使用LC-MS方法來鑑別因子VII重鏈的N-聚醣上的唾液酸。以10mM DTT混合物在37℃下歷時30分鐘還原10μg蛋白質，然後在Agilent 1200 Capillary LC系統上分析：管柱：PLRP-S 8μm 4000A，0.3x150mm，75℃。緩衝系統：A：具有0.2%甲酸+0.01%TFA的水；B：具有0.2%甲酸+0.01%TFA的ACN。梯度：50μL/min，10%B在2min內，至90%B在25min內，90%B洗滌5min，10%B校正歷時5min。

Agilent 6520 Q-TOF系統：DualEsi來源，氣體溫度：350℃，乾燥氣體：7psi，噴霧器：10psi，掃瞄範圍：500-3000amu，1譜/s。參考離子：1221.990637以及2421.91399amu，50ppm窗，Min 1000計數。結果報導於圖7中。

使用DMB標定套組的唾液酸量化

唾液酸螢光標定套組(Takara Bio Inc.,Cat#4400)是用於唾液基醣接合物的量化與高度敏感性分析。這個以HPLC為主的唾液酸螢光標定技術使用1,2-二胺基-4,5-亞甲基氧基苯(DMB)，其為一種簡單且高度敏感的量化方法。在這個方法中，在被DMB標定之後，藉由逆相HPLC(GlycosepR, from Glyko,# 1-4727)來分析游離唾液酸。

結論

V2重鏈具有兩個N-醣化位點。N-聚醣是經海藻醣化，高度唾液酸化的二、三與四結構。在去唾液酸化樣品中沒有發現末端唾液酸，暗示樣品被完全去唾液酸化且在因子VII N-聚醣上>99.9%的唾液酸已被移除。

使用大鼠肝細胞的半衰期分析肝細胞的製備

冷凍保存的初代大鼠肝細胞是得自於CellzDirect(Invitrogen)。各個含有約5百萬個細胞的小管被解凍且細胞被添加至10ml解凍培養基中，接著在60g下離心3分鐘。將細胞再懸浮於培育培養基+0.25% BSA(約4ml)中並使用血球計數器來計數細胞。在以錐蟲藍染色以鑑別死細胞之後，計數活細胞。細胞存活率為80-82%。在計數之後立刻將細胞用於廓清分析中。

解凍培養基：Invitrogen CM3000解凍/放置補充包被添加至500ml Williams E培養基中。培育培養基：Invitrogen CM4000細胞維持補充包被添加至500ml Williams E培養基。

活體外肝細胞廓清分析

初代大鼠肝細胞，每ml一百萬個活細胞，在37℃下以1.2ml起始體積於離心管內與25ng/ml的各種因子VII變異體在CellzDirect培育培養基+0.25% BSA中一起培育同時顛倒地輕柔混合。在每個指定時間點，移除0.25ml的混合物並且立刻離心以使得細胞沉澱(1000rpm，在離心管中離心3分鐘)。移除0.18ml的澄清上清液，快速冷凍並在-80℃下儲存過夜。次日，使用ELISA分析來量化上清液中的因子VII，其中使用經純化的對應突變蛋白質作為標準品。因子VII變異體單獨在37℃下培育2小時的無細胞對照上清液被用來作為0時間點數值。以三重複的方式進行各個培育。基於Lu等人的方法(Lu ref.)使用等式CLint=0.693/活體外T_1/2，經培育體積以及細胞數目校正來計算固有廓清值。活體外半衰期(T_1/2)是使用程式WinNonLin(Pharsight Corporation,Sunnyvale,CA)來計算。使用雙抗體夾心式ELISA形式來分析肝細胞培育的上清液。將0.1ml/孔抗-因子VII單株抗體(1.0μg/ml，於PBS中)添加至Greiner Microlon 655061 96孔盤中。在4℃下培育過夜之後，在37℃下以每孔0.2ml的1%酪蛋白阻斷緩衝液(50mM TrisHCl、100mM NaCl、0.05% Tween 20 pH7.2)阻斷盤歷時1.5小時。以每孔0.3ml的PBS+0.05% Tween 20洗滌盤四次(使用BioTek ELx405盤洗滌器)，接著相關因子VII標準品及未知樣品被添加至盤。藉由添加0.18ml稀釋緩衝液(50mM TrisHCl、100mM NaCl、0.1%酪蛋白、0.05% Tween 20 pH7.2)將0.18ml的各個肝細胞上清液稀釋兩倍。以三重複的方式將0.10ml的各個經稀釋上清液添加至ELISA盤。由稀釋於稀釋緩衝液中的對應經純化因子VII變異體製作標準品。以稀釋緩衝液做出兩倍連續稀釋的標準品而得到範圍在50至0.8ng/ml最終濃度的稀釋度。在室溫(21℃)下培育因子VII標準品以及樣品(每孔0.1ml)2小時。如上述洗滌盤四次，接著添加1μg/ml(每孔0.1ml)於稀釋緩衝液(50mM TrisHCl、100mM NaCl、0.1%酪蛋白、0.05% Tween 20 pH7.2)中的經生物素化偵測抗體，然後在室溫下培育歷時1.5小時。如上述洗滌盤四次，且接而添加以1/1000稀釋於稀釋緩衝液中的卵白素-辣根過氧化酶(每孔0.1ml)，然後在室溫下培育歷時1小時。再次洗滌盤並添加 Ultra-TMB，每孔0.1ml。在室溫下培育10至15分鐘之後，添加每孔0.05ml的2M H₂SO₄來終止反應。在450nm下使用Molecular Devices Spectramax M2盤讀取儀來讀取吸光度。使用Softmax Pro 5.4(Molecular Devices)來進行數據分析。

冷凍保存大鼠肝細胞，解凍培養基以及培育培養基(CellzDirect)是來自Invitrogen/Life Technologies(Grand Island,NY)。1步驟Ultra-TMB(One Step)受質，目錄型號為34028，來自Thermo Scientific(Rockford,IL)。卵白素-辣根過氧化酶(SA-HRP)，目錄型號為DY998，是來自R&D Systems,Minneapolis,MN。磷酸鹽緩衝鹽水，pH 7.2，是來自Invitrogen(Carlsbad,CA)。SD大鼠血漿(5%檸檬酸鈉抗凝血劑)是來自Bioreclamation(Westbury,NY)。Greiner Microlon盤(目錄型號655061)是透過Fisher Scientific(Pittsburgh,PA)而獲得。

獲得去醣化變異體：分子變異體的方法

野生型因子VIIa具有兩個N-聚醣(N322與N145)，而V1及V2具有4個N-聚醣(N106、N145、N253、N322)。在V1與V2中發現的額外2個N-聚醣(N106、N253)原先被設計成增加半衰期。為此，藉由將它們回復成野生型因子VII(T106、V253)的內源性胺基酸序列而移除這些位點。接著在DNA層次藉由在這些位點將N→Q突變而移除其餘2個內源性N-聚醣位點(N145與N322)(圖6)。

野生型因子VII被選殖至pmCMV中以製得pMB113。合成在位置aa145或322處含有單一個N至Q突變以及雙重突變體(aa145與322)的插入物並使用XbaI與PmlI位點選殖至pMB113中，產生選殖株pMB114-116。編碼V1與V2之Gla域的插入物接而使用AscI與AfeI被選殖至pMB1143116中，產生構築體pMB117-120(以V1為主的變異體)以及pMB121-124(以V2為主的變異體)。所有構築體經定序確認(McLab)。經由電穿孔使用各個構築體在6孔形式中瞬時轉染哺乳動物細胞(CHO衍生的細胞株)。轉染後4天，收集上清液並藉由西方墨點分析表現，然後是hFVII ELISA(AssayPro)以及FVII活性分析。然後將變異體的一個子集單一細胞地選殖出來。稱為pMB121的V22-聚醣變異體被純化並活化供進一步分析。

從10L WAVE表現純化/活化FVIIa的方法方法摘要

使用需要數天的多步驟方法來純化並活化由經濾洗的濃縮條件培養基而來的FVII。首先將培養基解凍並離心以移除任何在冷凍/解凍期間形成的聚集物。採用經CaCl₂沖提之陰離子交換管柱(Q-Sepharose)的偽親和力捕捉步驟被用來進一步濃縮FVII蛋白質並且改變緩衝液。接著，羥基磷灰石管柱被用來進一步純化FVII蛋白質。在FVII於pH7.8-8.2的溶液中被活化24小時之前，較小的Q-Sepharose管柱繼而被用來進一步純化FVII。活化反應是藉由降低pH至4.0而被終止。FVIIa最後被透析至調配緩衝液(pH6.5)中並冷凍儲存。

最終經純化蛋白質是藉由SDS-PAGE、aSEC、ELISA、醣分析、內毒素與FVIIa活性分析來進行特徵鑑定。

EVII ELISA

Zymutest FVII酶連結免疫分析(Aniara,West Chester,Ohio)。該ELISA是兩個位點免疫分析，其中兔抗-FVII多株抗體結合至96孔微量盤的孔中。引入樣品，接著是偶和至馬辣根過氧化酶(HRP)的兔抗-FVII 多株抗體。分析是遵循製造商的指示進行。簡言之，樣品與校正品稀釋於96孔圓底聚苯乙烯稀釋盤的分析緩衝液中。50μL等份式樣的經稀釋樣品被轉移至提供的兔抗-FVII塗覆的盤並且在室溫下培育15分鐘。添加200μL HRP偶合的兔抗-FVII並在室溫下培育1小時。以300μL的給定洗滌緩衝液洗滌盤5次。以200μL/孔添加TMB並在室溫下培育大約5分鐘。藉由引入50μL的0.45M硫酸終止反應。在450nm下讀取吸光度。因子FVII位準是藉由比較樣品數值與使用4參數曲線擬合產生的V2校正曲線而推導出。

因子VII顯色分析

使用Biophen FVII顯色分析(Aniara,West Chester,Ohio)。顯色分析主要涉及由樣品的因子VII與由製造商提供之兔血栓形成素(組織因子)組成的酶複合體。過量添加的FX被活化成FXa，其又切割FXa特異性顯色受質(SXa-11)，產生pNA。被釋放的pNA數量與FXa活性呈直接比例。遵循製造商的指示進行分析。簡言之，在96孔圓底聚丙乙烯稀釋盤(Fisher Scientific)的Tris-BSA分析緩衝液中稀釋樣品及校正品。在使用之前，套組試劑、R1、R2與R3以及96孔平底聚苯乙烯分析盤(Costar)被溫熱至37℃。將30μL的樣品與校正品從稀釋盤轉移至分析盤，接著是30μL試劑R2，然後60μL試劑R1。混合分析盤並在37℃下於吉特巴(jitterbug)盤震盪器(Boekel Scientific)中培育7分鐘。添加60μL的R3並在37℃下使用SpectraMax Plus微量盤讀取儀(Molecular Devices)測量吸光度的變化速率(在405nm下每分鐘的OD變化)。因子VII位準是藉由比較樣品數值與使用4參數曲線擬合產生的V2校正曲線而推導出。

磷脂-依賴性凝血酶生成分析

相較於野生型FVIIa，Gla域的修飾(P10Q/K32E)在陰離子磷脂或經活化血小板存在下會因為額外的γ-羧基化而增加FX活化時的效力、凝血酶生成，以及全血凝血。PL-依賴性TGA被設計成在陰離子磷脂存在下測量rFVIIa活性，並使用凝血酶校正品與受質試劑F1uCa-套組(來自Thrombinoscope,BV)來實施。由20%磷脂醯絲胺酸(PS)、40%磷脂醯乙醇胺(PE)，以及40%磷脂醯膽鹼(PC)組成的磷脂(PL)囊泡是來自於Avanti Polar Lipids並藉由在100mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH 7.2)中音波處理10分鐘而被製備。

將二十μL的PL-囊泡(500μM)或凝血酶校正品分配於96孔盤中。不同濃度的rFVIIa被稀釋至人類HemA血漿中，以三重複的方式添加至PL混合物中，並且在37℃下校正歷時10分鐘。凝血酶生成反應是藉由添加FluCa溶液而開始且遵循Thrombinoscope^BV概示的經校正自動血栓圖(CAT)方法來連續監控歷時60分鐘。擷取數據並使用Thrombinoscope^BV(3.4.0)軟體來分析，該軟體針對α2-巨球蛋白活性使用凝血酶校正品來進行校正。分析參數”峰高度”表示生成的凝血酶的最大位準，”內源性凝血酶潛勢”(ETP)對應於生成的凝血酶總量。凝血酶生成參數是以四參數非線性曲線擬合方法使用Prism 4.0(GraphPad Inc)來進行分析。

磷脂依賴性FX活化分析

在磷脂囊泡存在而沒有組織因子的情況下，使用PL依賴性FX活化分析測量FVIIa活化FX的能力。因子VIIa或FVIIa變異體與FX在磷脂囊泡存在下一起培育。藉由添加S-2765(FXa的一種顯色受質)來測量FX的活化。簡言之，校正品與樣品稀釋於聚丙烯圓底盤的Tris-HCl緩衝液中。將30μL的4μg/mL FX(Haematologic Technologies Inc.)添加至96孔平底聚苯乙烯盤的所有孔中，然後以20：40：40的重量%比率添加由磷脂醯絲胺酸、磷脂醯膽鹼以及磷脂醯乙醇胺組成的30μL磷脂囊泡。30μL的稀釋樣品與校正品被轉移至FX/磷脂混合物。密封盤、輕柔地混合，且在37℃下培育歷時20-23小時。對所有孔添加40μL的5M S-2765溶液(DiaPharma)。密封盤並在37℃下培育歷時6小時。在405nm下於微量盤讀取儀中讀取吸光度。樣品的活性是藉由比較樣品的FX活性位準與F7校正品曲線而被決定。

大鼠PK研究-動物、研究程序(製品注射、血液與製品的取樣、ELISA、數據分析、動物犧牲)

蛋白質(F7、V2、V1、dV2與dV1)以0.1mg/kg被靜脈內投與給SD大鼠。在投與後1分鐘時開始收取血漿樣品並且藉由FVII ELISA分析。

HemA-PK研究

蛋白質(F7、dV1)以1.0mg/Kg被i.v.投與至HemA小鼠。在投與後5分鐘時收取血漿樣品並且藉由FVII ELISA以及sTF-PT分析來分析。

針對血漿樣品的FVII ELISA 材料

使用對抗FVIIa的單株抗體。一個單株抗體進一步被生物素化。使用經純化FVIIa變異體(野生型或去唾液酸化)作為分析校正品以及分析對照品。阻斷緩衝液為於30mM Tris pH 7.2、60mM NaCl、0.03% Tween-20中的1%(w/v)酪蛋白。分析稀釋緩衝液(ADB)為0.1%(w/v)酪蛋白、50mM Tris pH 7.2、0.1M NaCl、0.05% Tween-20。分析洗滌緩衝液為PBS+0.05% Tween-20。免疫分析盤為Greiner Microlon高結合盤(#655061)。卵白素-馬辣根過氧化酶(SA-HRP)是來自R&D Systems。HRP受質Ultra-TMB是來自 ThermoFisher Pierce。空白小鼠血漿是得自於商業上(Bioreclamation)或透過自家來源的CD1或HemA小鼠。所有其他材料(酪蛋白、Tris、NaCl、Tween-20、PBS、硫酸)是試劑級品質。

用於FVIIa夾心式免疫分析的方法

在4℃下以0.1ml/孔對抗FVIIa的抗體(1μg/ml於PBS中)塗覆96孔盤過夜。將盤抽引並在室溫下以0.2ml/孔的阻斷緩衝液進行阻斷歷時至少2小時同時旋轉(150rpm)。在阻斷之後，以0.3ml/孔洗滌緩衝液洗滌孔4次。FVIIa樣品或標準品以1：20稀釋至最終濃度為在ADB中的5%血漿並在室溫下培育0.1ml/孔歷時至少1.5小時同時旋轉。以三重複孔的方式測量所有標準品、對照品以及樣品。在如前述洗滌盤之後，添加對抗FVIIa的經生物素化抗體，42ng/ml於ADB中，0.1ml/孔，並且在室溫下培育盤至少1小時同時旋轉。洗滌盤，接著與卵白素-HRP(1：1000於ADB中)一起培育，在室溫下培育至少1小時同時旋轉。在最終盤洗滌之後，以0.1ml/孔的Ultra-TMB使孔顯色，以0.05ml/孔的2M硫酸終止反應。在OD-450nm下讀取終止的反應，並分析與校正數據。在100%血漿中，分析的量化下限通常為15-30ng/ml FVIIa。

以可溶性組織因子(sTF)為主的經修改PT分析以測量rFVIIa活性

進行凝血酶原時間(PT)分析來測量人類rFVIIa在HemA小鼠離體血漿樣品中的活性。

簡言之，50μL含有於PTT緩衝液(0.15M NaCl、0.05M Tris pH 7.5、0.1% BSA)中之10% HemA小鼠血漿以及50%人類FVII-缺乏血漿(George King Inc)的樣品與50μL的sTF-PT試劑混合並在37℃下培育歷時30秒。sTF-PT試劑是由1份體積的2μM重組人類可溶性TF(sTF_1-221)以及1份體積的8μM磷脂囊泡(PS²⁰：PC⁴⁰：PE⁴⁰)組成。藉由添加50μL的25mMCaCl₂開始凝血並在STA凝血分析儀(Diagnostica Stago Inc)上記錄凝血時間。標準品由rFVIIa(wt-rFVII或經修飾rFVIIa變異體)連續2倍從200稀釋至0.78ng/mL所組成。

去唾液酸化V2在A型血友病(HemA)小鼠中的效力急性割尾效力研究

為了測定失血量，以異氟烷麻醉小鼠並將尾巴置於15ml塑膠管的37-38℃溫熱0.9%鹽水中歷時10分鐘。從尾端起在4mm處藉由解剖刀割下尾巴並立刻放回分開的預溫熱15ml塑膠管(含有10ml鹽水)。容許小鼠在40分鐘內自行出血。在割尾損傷5分鐘之後或15與30分鐘之前靜脈內給與去唾液酸化V2以及F7。藉由測量管的重量在收集血液之前與之後按重量量化失血量。

尾靜脈橫斷效力(TVT)研究

在尾靜脈橫斷損傷之前1小時或之後5分鐘，藉由尾靜脈注射將去唾液酸化V2或F7給予HemA小鼠。使用適當麻醉。尾靜脈以#11解剖刀直刀片橫剖，並開始計時器。接著讓小鼠回到其有白報紙墊料(Versi-Dri^TM)的個別乾淨鼠籠，白報紙墊料是放在4X8英吋加熱墊的頂部上。接下來9個小時裡的每小時以及24小時時間點監控動物活力狀態。在監控表上註記任何顯示活力程度減少之徵象的小鼠，且立刻將任何顯示失血過量之徵象的小鼠安樂死。

HemA小鼠血漿中的凝血酶-抗凝血酶(TAT)分析試劑

(1)捕捉抗體：抗凝血酶多株抗體，來自Enzyme Research Labs,Cat#TAT-EIA-C；(2)偵測抗體：HRP-接合抗-AT-III多株抗體，來自Enzyme Research Labs，Cat#TAT-EIA-D，(3)分析稀釋液：來自Enzyme Research Labs，Cat#TAT-EIA-D，(4)HRP受質：Amplex Red，Invitrogen，cat#A12216，(5)α-凝血酶，來自Enzyme Research Labs，Cat#HT-1002a，儲存於-80℃下，(6)AT-III：來自Enzyme Research Labs，Cat# HAT，儲存於-80℃下，(7)BSA：來自Sigma，Cat# A-7030；(8)AT-III缺乏血漿：購自於Enzyme Research Labs，Cat：AT-DP，儲存於-80℃下。

緩衝液

(1)TAT標準緩衝液：20mM Tris-HCl，pH7.4，0.15M NaCl、1mM EDTA、0.05U/mL肝素；(2)塗覆緩衝液：1錠碳酸氫鹽+100ml dH20，儲存於4℃下；(3)阻斷緩衝液：2%BSA-PBS；(4)樣品稀釋緩衝液：添加0.1M HEPES，pH7.4，0.15M NaCl、1% BSA、0.05% Tween20、過濾與等分式樣，儲存於-20℃下；(5)受質緩衝液：添加50μL的5mg/mL Amplex Red、20μl的3% H2O2至PBS緩衝液中。混合，在添加至盤之前新鮮製備；(6)製備1μM TAT標準原液：添加100μL人類AT-III(1.36mg/ml)與5.93μL的人類凝血酶(3.28mg/mL)至419μL的TAT緩衝液中，混合，在37℃下培育10-20分鐘；(7)製備60nM TAT標準原液：添加50μL的1μM TAT複合物至783μL的AT-III缺乏血漿中，混合。等分式樣50μL/管，儲存於-80℃下。

分析程序

1.將抗-凝血酶pAb(捕捉抗體)稀釋於碳酸氫鹽緩衝液中(1： 100稀釋度：對一個96孔盤來說，將110μL抗體加至11mL碳酸氫鹽緩衝液中)。

2.將100μL經稀釋塗覆抗體添加至2HB Immulon96孔盤的各孔中。輕拍盤以確保液體完全覆蓋盤的底部。密封盤並在4℃下培育過夜。

3.以300μL洗滌緩衝液在自動盤洗滌器中洗滌4次。在最後一次洗滌之後，將盤倒轉並將它在乾淨紙巾上輕扣。

4.對各孔添加150μL阻斷緩衝液(2% BSA-PBS)。密封盤並在室溫下培育1.5小時。

5.以300μL洗滌緩衝液用自動盤洗滌器洗滌4次。在最後一次洗滌之後，將盤倒轉並將它在乾淨紙巾上輕扣。

6.以三重複的方式對各孔添加100μL標準品、樣品與QC並在室溫下培育盤歷時2小時在室溫下。

7.以300μL洗滌緩衝液用自動盤洗滌器洗滌4次。在最後一次洗滌之後，將盤倒轉並將它在乾淨紙巾上輕扣。

8.對各孔添加100μL HRP-偵測抗體(1/100，添加110μL抗體至11mL接合物稀釋劑)。密封盤並在室溫下培育歷時1小時。

9.以300μL洗滌緩衝液用自動盤洗滌器洗滌4次。在最後一次洗滌之後，將盤倒轉並將它在乾淨紙巾上輕扣。

10.對各孔添加70μL Amplex Rd受質(新鮮製備)。

11.在室溫下將盤置於暗處並培育歷時15-30分鐘。

12.在OD485nm/595nm下讀取盤。

13.以四參數曲線擬合來對標準品做圖；對照品與各樣品的濃度是由各ELISA盤的標準品算出。

去唾液酸化V2在凝血勝任小鼠中的效力

進行急性割尾研究來決定dv2在凝血勝任小鼠中的效力。以異氟烷麻醉凝血勝任小鼠並將尾巴置於15ml塑膠管的37-38℃溫熱0.9%鹽水中歷時10分鐘。在iv投與5mg/kg組織胞漿素原活化劑(tPA)之後，從尾端起在50mm處藉由解剖刀切下尾巴並立刻放回分開的預溫熱15ml塑膠管(含有10ml鹽水)。在割尾損傷之後立刻靜脈內給與去唾液酸化V2與F7。容許小鼠在45分鐘內自行出血。藉由測量管的重量在收集血液之前與之後按重量量化出血量。

結果去唾液酸化或去醣化蛋白質的活體外特徵鑑定

藉由LC-TOF MS分析dV2的重鏈。分析顯示，重鏈上的N-聚醣在唾液酸酶處理之後不含有唾液酸。因為Gla域的存在，輕鏈上的分析是複雜的。為了取得經處理分子的唾液酸含量的全面性狀態，進行唾液酸螢光標定。這個方法顯示，V2上超過99.9%的唾液酸在去唾液酸化過程期間被移除了。圖7顯示去唾液酸化V2的唾液酸含量分析。使用LC-TOF MS分析以及唾液酸螢光標定。對dV1進行唾液酸含量分析也有類似結果(數據未示出)。藉由磷脂-依賴性Xa活化以及磷脂-依賴性TGA分析測試去唾液酸化分子的活性。PL-Xa以及PL-TGA分析證實，蛋白質在去唾液酸化後的活性並未降低(參見圖9及圖10)。圖9顯示對去唾液酸化蛋白質的PL-FXa活化分析。使用磷-脂FXa活化分析測試去唾液酸化V1及V2(dV1、dV2)的活性。去唾液酸化蛋白質在這個分析中具有比其未經修飾的母分子略高的活性。圖10顯示對去唾液酸化蛋白質的PL-TGA分析。依據PL-TGA，dV2與dV1表現比它們未經修飾的母分子略為增加的活性。結果相對於F7進行常規化。

PL-Xa分析同樣顯示，dV2與dV1在活性方面勝過其未經修飾之母分子而有可測得的增加。表現低醣化wtFVIIa、V2以及V1分子(圖11)並作為粗表現萃取物測試表現與活性。圖11顯示低醣化FVII變異體的表現。電穿孔之後4天分析培養基樣品的FVII表現。使用抗-Gla域抗體的西方墨點分析顯示變異體表現。當對表現位準進行常規化時，移除N-聚醣位點似乎不會影響活性。圖12顯示使用轉染上清液測定低醣化FVII的”比活性”。低醣化變異體之兩種暫時轉染株的粗表現上清液的活性是藉由Xa活化分析來進行分析。當針對藉由ELISA測得之表現常規化時，注意到因為N-聚醣移除而沒有活性降低。在本分析中一如預期，V1與F7蛋白質具有類似活性，而V2分子因為其TF-依賴性而具有較低活性。藉由對經純化低醣化V2(僅有2個N-聚醣，N322及N145)(被稱為pMB121)進行PL-TGA活性分析而獲得進一步證實。圖13顯示對經純化低醣化變異體pMB121的PL-TGA分析。依據PL-TGA分析，pMB1212顯示活性增強勝過F7，類似於未經修飾的V2。在肝細胞廓清模型中測試這些分子的活體外廓清。dV2證實在這個模型中有明顯勝過未經修飾V2的廓清(圖14)，而就低醣化變異體來說只有很低或沒有廓清增加(圖15)。

大鼠PK及HemA PK

SD大鼠中的藥動學研究證實，如藉由FVII ELISA所測量，去唾液酸化與去醣化蛋白質比其未經修飾者明顯廓清地較快。圖16顯示大鼠藥動學結果。在SD大鼠中，如藉由FVII ELISA所測量，去唾液酸化V2及V1的半衰期明顯比其未經修飾的母分子更短。這對於去唾液酸化V2、去唾液酸化V1以及pMB121(低醣化V2)來說是準確的。去唾液酸化分子的t1/2均少於1分鐘，而其母蛋白質的t1/2為約2.5小時。低醣化V2分子pMB121的廓清等於F7的廓清，t1/2為1.6小時。HemA小鼠的PK研究具有與dV2以及F7相似的結果，dV2以及F7具有分別為約3分鐘以及2.6小時的半衰期(圖17(A))。半衰期短是藉由sTF-PTT凝血分析獲得證實(圖17(B))。圖17顯示HemA PK結果。在HemA小鼠中，如藉由A)FVII ELISA與B)sTF-PT分析所測量，去唾液酸化V2的半衰期明顯比其未經修飾母分子還短。

HemA效力模型

在HemA小鼠中測試dV2的效力。使用HemA割尾模型，dV2在1mg/kg(團注，iv)的劑量下顯示有效。依據比對，在這個模型中，F7的有效劑量為2.5mg/kg(團注，iv)。這些結果證實，dV2比F7更為有效(圖18(A))。這個模型也可以用來顯示dV2的效力明顯比F7還快(圖18(B))。圖18顯示在HemA小鼠中的去唾液酸化V2效力研究結果。使用dV2的研究顯示，這個分子在HemA割尾模型中A)比F7更為有效，以及B)效力廓清比F7更快。

使用更為靈敏的TVT模型，也證實dV2的效力廓清比F7更快。圖19顯示TVT HemA模型中的dV2效力研究。使用效力模型的TVT研究(TVT)具有較高的靈敏度，確認dV2比F7具有更快的效力廓清。凝血酶抗凝血酶(TAT)測量作為凝血活性的標記，在HemA小鼠中投與後30分鐘與60分鐘時顯示dV2位準明顯較低。圖20顯示TAT測量。在HemA小鼠中，以其有效劑量(1mg/kg)投與dV2產生比F7的有效劑量(2.5mg/kg)還少的凝血酶抗凝血酶(TAT)。這個數據，與效力數據一起暗示dV2具有比F7還要更好的治療指標。

凝血勝任小鼠的效力

在經tPA處理的凝血勝任細胞中測試dV2的效力。使用割尾模型，dV2顯示在0.3-1mg/kg(團注，iv)的劑量下有效。透過比較，在這個模型中，F7的有效劑量為5mg/kg(團注，iv)。這些結果證實，dV2比F7更為有效(圖21)。圖21顯示去唾液酸化V2在經tPA處理的凝血勝任小鼠中的效力研究結果。

去唾液酸化野生型因子VII(dWT VIIa)的廓清及效力

如上所述使用得自於Novo Nordisk的NovoSeven®作為起始因子VII材料並如上所述使用可溶性唾液酸酶酵素令該起始多肽去唾液酸化而生成去唾液酸化野生型因子VII(dWT VIIa)。dWT VIIa被發現具有>99%的純度、低內毒素以及沒有可被偵測到的唾液酸。此外，質譜分析顯示選擇性移除唾液酸。

如上所述使用Biophen FVII顯色分析以及經修改的PT分析來分析這個dWT VIIa材料的活性並與野生型因子VII相比較。這些分析中的每一者顯示，dWT VIIa具有與野生型因子VII多肽近乎相同的活性。

也使用人類組織因子敲入(TFKI)小鼠小鼠模型來分析並比較dWT VIIa與野生型因子VII(1mg/kg)的廓清。如圖22中所示，dWT VIIa的半衰期明顯短於野生型因子VII且廓清(ml/h/kg)快上40倍。

如上所述使用TFKI小鼠與割尾法研究dWT VIIa相比於野生型因子VII的效力。簡言之，將5mg/kg tPA靜脈內注射至小鼠中，接著從尾端開始50mm切下尾巴。野生型因子VII(NovoSeven®)或dWT VIIa接著以範圍1-6mg/kg的劑量被靜脈內注射。然後從尾巴收集血液歷時45分鐘，在整個收集期間每六分鐘破壞不穩定的血塊。如圖23中所示，出乎意料地發現dWT VIIa明顯比野生型因子VII更為有效。更具體而言，3mg/kg劑量的dWT VIIa相比於6mg/kg野生型因子VII降低出血。依據這個分析結果，2mg/kg 的dWT VIIa被認為與6mg/kg野生型因子VII為生物等效的。

亦如上述藉由凝血酶抗凝血酶(TAT)方法研究dWT VIIa與野生型因子VII(NovoSeven®)造成全身性凝血的能力。以生物等效劑量的dWT VIIa(2mg/kg)以及野生型因子VII(6mg/kg)來處理小鼠，且接著藉由ELISA測量TAT複合體的形成。如圖24中所示，野生型NovoSeven®因子VII產生比dWT VIIa位準明顯更高的TAT。依據dWT VIIa僅產生基線TAT位準的結果，這個實驗暗示這個劑量的dWT VIIa產生無法觀察到的全身性凝血，儘管這個多肽與野生型因子VII同樣有效。

此外，亦在FeCl₃血栓模型中研究dWT VIIa與野生型因子VII(NovoSeven®)致使血栓形成能力。在開始血栓研究之前15分鐘，以生物等效劑量的dWT VIIA(2mg/kg)以及野生型因子VII(6mg/kg)處理小鼠。藉由投與3.25% FeCl₃溶液來引起血栓，然後藉由都卜勒測量血栓形成歷時30分鐘。所得血流數據在血流對時間圖上做圖，且接而針對因子VII處理組的每一者計算控制樣品的曲線下面積百分率來決定受血栓形成影響之血流減少。如圖25中所示，野生型NovoSeven®因子VII產生的血流明顯降低(平均約40%)，而dWT VIIa顯示在血流方面幾乎沒有降低(平均>90%)。這個實驗證實，相比於野生型因子VII，給定劑量的dWT VIIa使血栓形成大幅降低。

相較於野生型因子VII，使用SN-17c三肽螢光受質(HTI)藉由檢驗這些肽對於可溶性組織因子(sTF)之表觀結合親合力來進一步研究dWT VIIa的活性與效力。如圖26中所示，這個分析證實，dWT VIIa(dF7)以及野生型因子VII(F7)對sTF具有相同的表觀結合親和力。但是，如圖27中所示，在藉由滴定因子X濃度於sTF-因子VII複合體存在(0.5nM因子II[dWT VIIa或野生型]，125nM sTF)下檢驗這些肽對於活化因子V的能力的實驗模型中，dWT VIIa以及野生型因子VII的米歇爾曼頓動力學證實，dWT VIIa(dF7)可以比野生型因子VII(dF7)更為有效地活化因子X(約2倍)。這個數據暗示，dWT VIIa的每一因子VII活化位點能夠比其野生型對應物將更多的因子X轉變成因子Xa。

討論

對於發展出有效治療急性出血但不會降低凝血性的治療藥物有未能滿足的醫學需求。具有短半衰期的有效因子VII多肽將有效地產生一個對於使用於急性出血有較大治療窗的分子。

V2與V1是兩種因子VIIa變異體(圖1-3)。這些變異體含有對其Gla域來說會增加其與活化血小板之親和力的突變，且在V2的情況下，產生組織因子非依賴性。兩種變異體都具有兩個額外的N-醣化位點，造成半衰期相比於野生因子VIIa更為延長，對於治療血友病來說是有益的特質。但是，它們作為治療急性出血的用途會受益於半衰期降低。這個修飾將會降低脫靶效用的風險，並因此增加其治療指數。吾人在此已顯示，移除存在於V2及V1之醣鏈上的唾液酸在活體外肝細胞廓清模型中明顯使得分子廓清地更快。低醣化變異體在這個活體外模型中不會廓清地更快，暗示去唾液酸化與低醣化分子之間的廓清機制有所不同。在SD大鼠中進行的活體內研究證實，去唾液酸化分子(dV2及dV1)，還有低醣化變異體pMB121具有明顯降低的半衰期。令人感到興趣的是，相較於針對去唾液酸化野生型FVIIa所報導的速率(Appa et al,Thrombosis and Haemostasis 104.2/2010)，去唾液酸化V2及V1兩者均增加廓清率，這是一個可能因為其2個額外N-聚醣所致的特性。在不受本文所請求者限制的情況下，關於這個活性的一個可能學理是這些額外的N-聚醣可能在去唾液酸化變成ASGPR或類似受體的額外配體且媒介更快的廓清。相比於其母分子，這些分子如在活體外活性分析中測量般維持或增加活性。於HemA小鼠PK研究中進一步在活體內確認dV2的廓清更快且顯示在HemA割尾與TVT研究中有效。

此外，野生型因子VII的去唾液酸化會產生比野生型更加快速地廓清的因子VII多肽，同時如在許多研究模型中所示般提供效力增加的驚人結果。

移除因子VIIa或因子VIIa變異體的N-聚醣或修飾N-聚醣之單糖組成會產生廓清更快的分子。這些分子在活體內維持活性且有效。發展這些廓清快速的因子VIIa分子對於治療急性出血適應症來說將會是有利的，並且能在市場上做為各種抗凝血劑的解毒劑。

<110> 拜耳保健有限責任公司

<120> 短-作用因子VII多肽類

<130> BHC115011 PCT

<150> 61/754,674

<151> 2012-12-24

<150> 61/787,026

<151> 2013-03-15

<160> 18

<170> PatentIn第3.5版

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<212> DNA

<213> 智人

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 變異體人類FVII核苷酸序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 變異體人類FVII核苷酸序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 質體序列

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<213> 人工序列

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<223> 質體序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 質體序列

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<213> 人工序列

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<223> 質體序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 質體序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 質體序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 質體序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 質體序列

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<212> PRT

<213> 智人

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 變異體人類FVII肽序列

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<221> 混合特徵

<222> (407)..(407)

<223> Xaa可以是任何天然胺基酸

<400> 17

<210> 18

<211> 406

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 變異體人類FVII肽序列

<400> 18

Claims

一種經單離變異體因子VII多肽，其包含相對於胺基酸序列SEQ ID NO：16具有至少一個序列變化的胺基酸序列，其中該至少一個序列變化係選自P10Q、K32E、R36E、A34E、T106N及V253N所組成之群組，其中該多肽具有接合唾液酸莫耳對N-連結聚醣莫耳的比率介於0至5.0。
如申請專利範圍第1項之經單離變異體因子VII多肽，其中該變異體因子VII多肽包含二個或更多個選自P10Q、K32E、R36E、A34E、T106N及V253N所組成群組之序列變化。
如申請專利範圍第1項之經單離變異體因子VII多肽，其中該變異體因子VII多肽包含三個或更多個選自P10Q、K32E、R36E、A34E、T106N及V253N所組成群組之序列變化。
如申請專利範圍第1項之經單離變異體因子VII多肽，其中該變異體因子VII多肽包含四個或更多個選自P10Q、K32E、R36E、A34E、T106N及V253N所組成群組之序列變化。
如申請專利範圍第1項之經單離變異體因子VII多肽，其中該變異體因子VII多肽包含五個或更多個選自P10Q、K32E、R36E、A34E、T106N及V253N所組成群組之序列變化。
如申請專利範圍第1項之經單離變異體因子VII多肽，其中該變異體因子VII多肽包含P10Q、K32E、R36E、A34E、T106N及V253N之序列變化。
如申請專利範圍第1項之經單離變異體因子VII多肽，其中該變異體因子VII多肽包含P10Q、K32E、T106N及V253N之序列變化。
如申請專利範圍第1項之經單離變異體因子VII多肽，其中該胺基酸序列係由具有P10Q、K32E、R36E、A34E、T106N及V253N之序列變化的胺基酸序列SEQ ID NO：16所組成。
如申請專利範圍第1項之經單離變異體因子VII多肽，其中該胺基酸序列由具有P10Q、K32E、T106N及V253N之序列變化的胺基酸序列SEQ ID NO：16所組成。
如申請專利範圍第1至9項中任一項之經單離變異體因子VII多肽，其中該接合唾液酸莫耳對N-連結聚醣莫耳的比率係少於0.1。
一種製備如申請專利範圍第1項之經單離變異體因子VII多肽的方法，該方法包含：(1)獲得唾液酸化因子VII多肽，其包含相對於胺基酸序列SEQ ID NO：16具有至少一個序列變化的胺基酸序列，其中該至少一個序列變化係選自P10Q、K32E、R36E、A34E、T106N及V253N所組成之群組；(2)使該經唾液酸化因子VII多肽與唾液酸酶在足量共價附接之唾液酸殘基從經唾液酸化因子VII多肽被移除而生成去唾液酸化因子VII多肽的條件下接觸，該去唾液酸化因子VII多肽具有接合的唾液酸莫耳對N-連結聚醣莫耳的比率介於0至5.0；以及 (3)分離由此生成的該變異體因子VII多肽。
如申請專利範圍第11項之方法，其中該變異體因子VII多肽包含變異體序列，其包含四個或更多個選自P10Q、K32E、R36E、A34E、T106N及V253N所組成群組之序列變化。
一種製備如申請專利範圍第1項之經單離變異體因子VII多肽的方法，該方法包含：(1)在缺乏將肽唾液酸化能力之重組細胞株中生產因子VII多肽，該因子VII多肽包含相對於胺基酸序列SEQ ID NO：16具有至少一個序列變化的胺基酸序列，其中該至少一個序列變化係選自P10Q、K32E、R36E、A34E、T106N及V253N所組成之群組，使得其生產的去唾液酸化因子VII多肽具有接合的唾液酸莫耳對N-連結聚醣莫耳的比率介於0至5.0；以及(2)分離由此生成的該變異體因子VII多肽。
如申請專利範圍第13項之方法，其中該變異體因子VII多肽包含變異體序列，其包含四個或更多個選自P10Q、K32E、R36E、A34E、T106N及V253N所組成群組之序列變化。
一種製備如申請專利範圍第1項之經單離變異體因子VII多肽的方法，該方法包含(1)獲得一重組細胞株，其共表現(a)重組因子VII多肽，其包含相對於胺基酸序列SEQ ID NO：16具有至少一個序列變化的胺基酸序列，其中該至少一個序列變化係選自P10Q、K32E、R36E、A34E、T106N及V253N所組成之群組，與(b)重組唾液酸酶酵素；(2)培養該重組細胞株以容許該重組因子VII多肽與該重組唾液酸酶酵素表現，其中該重組唾液酸酶酵素移除適量之共價附接唾液酸殘基，以生產具有接合的唾液酸莫耳對N-連結聚醣莫耳的比率介於0至5.0之去唾液酸化因子VII多肽；以及(3)分離由此生成的該變異體因子VII多肽。
如申請專利範圍第15項之方法，其中該變異體因子VII多肽包含變異體序列，其包含四個或更多個選自P10Q、K32E、R36E、A34E、T106N及V253N所組成群組之序列變化。
一種經單離變異體因子VII多肽，其係選自下列組成之群組：(1)包含相對於序列SEQ ID NO：16具有序列變化的因子VII胺基酸序列的多肽，其中該等序列變化由下列組成：(1)麩醯胺酸殘基置換在位置10中的脯胺酸殘基、(2)麩胺酸殘基置換在位置32中的離胺酸殘基，以及(3)使得在位置145處的N-連結醣化瓦解的序列變化；(2)包含相對於序列SEQ ID NO：16具有序列變化的因子VII胺基酸序列的多肽，其中該等序列變化由下列組成：(1)麩醯胺酸殘基置換在位置10中的脯胺酸殘基、(2)麩胺酸殘基置換在位置32中的離胺酸殘基，以及(3)使得在位置322處的N-連結醣化瓦解的序列變化；(3)包含相對於胺基酸序列SEQ ID NO：16具有序列變化的因子VII胺基酸序列的多肽，其中該等序列變化由下列組成：(1)麩醯胺酸殘基置換在位置10中的脯胺酸殘基、(2)麩胺酸殘基置換在位置32中的離胺酸殘基，及(3)使得在位置145與322處的N-連結醣化瓦解的序列變化； (4)包含相對於胺基酸序列SEQ ID NO：16具有序列變化的因子VII胺基酸序列的多肽，其中該等序列變化由下列組成：(1)麩醯胺酸殘基置換在位置10中的脯胺酸殘基，以及(2)麩胺酸殘基置換在位置32中的離胺酸殘基，其中位置145與322為天冬醯胺酸且具有附接N-連結醣化；(5)包含相對於胺基酸序列SEQ ID NO：16具有序列變化的因子VII胺基酸序列的多肽，其中該等序列變化由下列組成：(1)麩醯胺酸殘基置換在位置10中的脯胺酸殘基、(2)麩胺酸殘基置換在位置32中的離胺酸殘基、(3)麩胺酸殘基置換在位置34中的丙胺酸殘基、(4)麩胺酸殘基置換在位置36中的精胺酸殘基，以及(5)使得在位置145處的N-連結醣化瓦解的序列變化；(6)包含相對於胺基酸序列SEQ ID NO：16具有序列變化的因子VII胺基酸序列的多肽，其中該等序列變化由下列組成：(1)麩醯胺酸殘基置換在位置10中的脯胺酸殘基、(2)麩胺酸殘基置換在位置32中的離胺酸殘基、(3)麩胺酸殘基置換在位置34中的丙胺酸殘基、(4)麩胺酸殘基置換在位置36中的精胺酸殘基，以及(5)使得在位置322處的N-連結醣化瓦解的序列變化；(7)包含相對於胺基酸序列SEQ ID NO：16具有序列變化的因子VII胺基酸序列的多肽，其中該等序列變化由下列組成：(1)麩醯胺酸殘基置換在位置10中的脯胺酸殘基、(2)麩胺酸殘基置換在位置32中的離胺酸殘基、(3)麩胺酸殘基置換在位置34中的丙胺酸殘基、(4)麩胺酸殘基置換在位置36中的精胺酸殘基，以及(5)使得在位置145與322處的N-連結醣化瓦解的序列變化；以及(8)包含相對於胺基酸序列SEQ ID NO：16具有序列變化的因子VII胺基酸序列的多肽，其中該等序列變化由下列組成：(1)麩醯胺酸殘基置換在位置10中的脯胺酸殘基、(2)麩胺酸殘基置換在位置32中的離胺酸殘基、(3)麩胺酸殘基置換在位置34中的丙胺酸殘基，以及(4)麩胺酸殘基置換在位置36中的精胺酸殘基，其中位置145與322為天冬醯胺酸且具有附接N-連結醣化。
一種如申請專利範圍第1至9項或第17項中任一項之經單離變異體因子VII多肽於製備治療其中形成血塊為所欲之疾病或病症的醫藥品的用途，其中該疾病或病症選自下列組成之群組：出血、胃腸出血、未受控出血、經歷移植或切除術或外科手術之哺乳動物的出血、靜脈瘤出血、血小板減少症、血友病、腦內出血、主動脈瘤，以及抗凝血劑的過量投藥。
一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至9項或第17項中任一項之經單離變異體因子VII多肽與醫藥上可接受賦形劑。