JP5659312B1 - 改変された第ｖｉｉ因子ポリペプチドおよびその使用 - Google Patents

Abstract

改変第ＶＩＩ因子ポリペプチドおよびその使用が提供される。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、第ＶＩＩａ因子および第ＶＩＩ因子の他の形態を含む。改変ＦＶＩＩポリペプチドの中で、変化した活性、典型的には、増加した凝血促進活性を含む、変化した凝血促進活性を有するものが提供される。したがって、そのような改変ポリペプチドは、治療薬である。【選択図】なし

Description

関連出願
優先権の利益は、２００８年４月１１日に出願された、「ＦＡＣＴＯＲ ＶＩＩ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＴＨＡＴ ＡＲＥ ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ」と題する、Ｅｄｗｉｎ ＭａｄｉｓｏｎおよびＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｔｈａｎｏｓに対する米国仮特許出願第６１／１２４，０２１号に対して主張される。

本出願は、２００９年４月１０日に出願された、「ＦＡＣＴＯＲ ＶＩＩ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＴＨＡＴ ＡＲＥ ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ」と題する、Ｅｄｗｉｎ ＭａｄｉｓｏｎおよびＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｔｈａｎｏｓに対する、対応する米国特許出願第１２／３８４，９１５号に関連し、これもまた、米国仮特許出願第６１／１２４，０２１号に対する優先権を主張する。

許可される場合、上記に言及される出願の主題は、その全体が参照によって組み込まれる。

許可される場合、２００８年４月１１日に出願された、「ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＦＡＣＴＯＲ ＶＩＩ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ」と題する、Ｅｄｗｉｎ Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｔｈａｎｏｓ、Ｓａｎｄｒａ Ｗａｕｇｈ Ｒｕｇｇｌｅｓ、およびＳｈａｕｎ Ｃｏｕｇｈｌｉｎに対する米国特許出願第１２／０８２，６６２号および２００８年４月１１日に出願された、「ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＦＡＣＴＯＲ ＶＩＩ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ」と題する、Ｅｄｗｉｎ Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｔｈａｎｏｓ、Ｓａｎｄｒａ Ｗａｕｇｈ Ｒｕｇｇｌｅｓ、およびＳｈａｕｎ Ｃｏｕｇｈｌｉｎに対する、対応する国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０４７９５号の主題もまた、その全体が参照によって組み込まれる。

コンパクトディスクで提供される配列表の参照による組み込み
配列表のコンパクトディスク（ＣＤ−Ｒ）の電子バージョンは、４つのコピー（コピー１、コピー２、コピー３、およびＣＲＦと標識）で本明細書と共に提出され、これらの内容は、それらの全体が参照によって組み込まれる。２００９年４月１０日に作成された前述のコンパクトディスクのそれぞれのコンピューター読み取り可能なファイルは、同一であり、サイズが１２００キロバイトであり、４９１９ＳＥＱ．ＰＣ１．ＴＸＴと題する。

発明の分野
改変治療タンパク質が提供される。特に、第ＶＩＩａ因子および第ＶＩＩ因子の他の形態を含む改変第ＶＩＩ因子ポリペプチドならびにその使用が提供される。

止血は、出血の休止に至る、複雑な生理学的プロセスである。血小板、血漿タンパク質、ならびに血管および内皮細胞は、それぞれ、組織傷害に直ちに続く事象において重要な役割を果たし、正常な状況下で、血餅の急速な形成をもたらすこのプロセスの３つの構成成分である。この中心となるのは、凝固カスケードという一連のタンパク質分解事象であり、ある種の血漿タンパク質（または凝固因子）が、他の先に活性化された凝固因子によって「カスケード」において連続的に活性化され、トロンビンの急速な生成に至る。次いで、このカスケードにおいて産生された大量のトロンビンは、フィブリノーゲンを、血餅形成に必要とされるフィブリンペプチドに切断するように機能する。

凝固因子は、不活性一本鎖チモーゲンとして循環しており、１つまたは複数の位置での切断によって活性化されて、タンパク質の二本鎖活性化形態を生成する。ビタミンＫ依存性血漿タンパク質である第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は、チモーゲンとして血液中で最初に循環している。ＦＶＩＩチモーゲンは、単一の部位、Ａｒｇ^１５２−Ｉｌｅ^１５３でのタンパク質分解による切断によって活性化され、単一のジスルフィド結合によって連結された二本鎖プロテアーゼをもたらす（ＦＶＩＩａ）。ＦＶＩＩａは、その補因子、組織因子（ＴＦ）に結合して、ＦＶＩＩａが、第Ｘ因子（ＦＸ）をＦＸａに効率的に活性化し、それによって、フィブリン形成および止血をもたらす一連の事象を開始することができる複合体を形成する。

正常な止血は、ほとんどの場合において達成されるが、このプロセスが欠損すると、血餅形成にかかる時間が長引く出血障害に至り得る。そのような障害は、先天性または後天性のものとなり得る。たとえば、血友病ＡおよびＢは、それぞれ、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）および第ＩＸ因子（ＦＩＸ）における欠乏症によって特徴づけられる遺伝病である。代償療法は、血友病ＡおよびＢのための伝統的な処置であり、ヒト血漿から調製されたまたは組換えタンパク質としてのいずれかのＦＶＩＩＩまたはＦＩＸの静脈内投与を伴う。しかしながら、多くの場合において、患者は、注入されたタンパク質に対して抗体（阻害因子としても知られている）を産生し、これは、処置の効能を低下させるまたは無効にする。組換えＦＶＩＩａ（Ｎｏｖｏｓｅｖｅｎ（登録商標）（凝固因子ＶＩＩａ（組換え体）））は、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに対する阻害因子を有する、血友病ＡまたはＢの患者の処置について承認されており、また、出血エピソードを停止させ、または外傷および／もしくは手術と関連する出血を予防するためにも使用される。組換えＦＶＩＩａはまた、先天性のＦＶＩＩ欠乏症を有する患者の処置についても承認されており、非血友病患者における、他の先天性または後天性の出血障害、外傷、および手術と関連する出血の処置などのような適応外の使用においてますます利用されている。

血餅形成を促進するための組換えＦＶＩＩａのその使用は、治療剤としての、その高まりつつある重要性を際立たせるものである。ＦＶＩＩａ療法は、重要な、未だ対処されていない医学的必要性を残している。たとえば、臨床試験データに基づくと、６時間またはそれ以上の時間にわたる、平均３回のＦＶＩＩａ投与が、血友病患者における急性出血エピソードを管理するのに必要とされる。ＦＶＩＩａのより効果的な変異体が、これらの必要量を低下させるために必要である。そのため、本明細書における目的の中でも、改善された治療特性を有するように設計された改変ＦＶＩＩポリペプチドを提供することを目的とする。

概要
改変第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドが、本明細書において提供される。特に、凝血促進性活性を示す改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供される。ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、一次配列において改変されており、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、およびアミノ酸交換を含むことができる。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）および組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）などのような阻害因子に対する増加した抵抗性を有するもの、Ｚｎ^２＋の阻害効果に対する増加した抵抗性を有するもの、ＴＦの存在下および／または非存在下において増加した触媒活性を有するもの、増加した半減期などのような改善された薬物動態学的特性を有するもの、血小板表面に対する増加した結合性および／または親和性を有するもの、血清アルブミンに対する増加した結合性および／または親和性を有するもの、ならびに血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３に対する増加した結合性および／または親和性を有するものを示すＦＶＩＩポリペプチドを含む。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、本明細書において提供される改変の任意の組み合わせを含有することができ、ポリペプチドの１つまたは複数の活性または特性は、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して変化している。典型的には、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、凝血促進性活性を保持する。改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードする／発現する核酸分子、ベクター、および細胞もまた、本明細書において提供される。医薬組成物、製品、キット、および処置の方法もまた、本明細書において提供される。ＦＶＩＩポリペプチドは、対立遺伝子および種変異体およびポリペプチドならびに他の活性および／または特性に影響を及ぼす改変を有する他の変異体を含む。本明細書において提供される改変を含む、ＦＶＩＩポリペプチドの活性断片もまた含まれる。例示的なＦＶＩＩポリペプチドは、配列番号３において記載されるアミノ酸の配列を含むものおよびそれと６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するその変異体である。

配列番号３において記載されるアミノ酸の配列を有するＦＶＩＩポリペプチドにおける位置Ｑ２８６にまたはＦＶＩＩポリペプチドにおける対応する残基において、ＦＶＩＩポリペプチドにおける改変を含有する改変第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドが、本明細書において提供される。改変は、アミノ酸交換、アミノ酸挿入（１つもしくは複数）、または欠失（１つもしくは複数）またはその組み合わせとすることができる。改変が、アミノ酸交換である場合、交換は、塩基性アミノ酸（たとえばＡｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、およびＨｉｓ（Ｈ））またはＡｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ａｓｐ（Ｄ）、およびＣｙｓ（Ｃ）の中から選択されるアミノ酸によるものとすることができる。例示的なそのようなアミノ酸交換は、Ｑ２８６Ｒ、Ｑ２８６Ｋ、Ｑ２８６Ｈ、Ｑ２８６Ｙ、Ｑ２８６Ｇ、Ｑ２８６Ｆ、Ｑ２８６Ｍ、Ｑ２８６Ｉ、Ｑ２８６Ｌ、Ｑ２８６Ｖ、Ｑ２８６Ｐ、Ｑ２８６Ｅ、Ｑ２８６Ｗ、Ｑ２８６Ｄ、およびＱ２８６Ｃを含む。そのような改変は、配列番号１〜３のいずれかにおいて記載される配列を含有する非改変ＦＶＩＩポリペプチドまたはその対立遺伝子変異体もしくは種変異体または配列番号１〜３のいずれかのＦＶＩＩと少なくとも６０％の配列同一性を有する変異体または配列番号１〜３のいずれかにおいて記載されるアミノ酸の配列を含むＦＶＩＩポリペプチドの活性断片またはその対立遺伝子変異体もしくは種変異体または配列番号１〜３のいずれかのＦＶＩＩと少なくとも６０％の配列同一性を有する変異体においてなすことができる。たとえば、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＶＩＩポリペプチドにおける位置Ｑ２８６に対応する位置に交換を含有する活性断片とすることができる。

いくつかの例において、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、配列番号３において記載されるアミノ酸の配列を有するＦＶＩＩポリペプチドにおける位置２８６に対応する位置にまたはＦＶＩＩポリペプチドにおける対応する残基においてアミノ酸交換を含有し、改変は、位置２８６に改変を有していないＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加した血液凝固活性を示す改変ＦＶＩＩポリペプチドをもたらす、塩基性アミノ酸による位置２８６での交換である。塩基性アミノ酸は、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、およびＨｉｓ（Ｈ）の中から選択することができる。たとえば、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、位置２８６での、Ｇｌｎ（Ｑ）のＡｒｇ（Ｒ）との交換を含有することができる。

いくつかの例において、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、位置２８６に単一の改変のみを有する。他の例において、改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、ＦＶＩＩポリペプチドにおける他の位置に１つまたは複数のさらなる改変をも含有する。さらなる改変は、アミノ酸交換、アミノ酸挿入、またはアミノ酸欠失とすることができる。たとえば、さらなる改変は、A51、S52、P54、S60、Q66、Y68、K109、S119、A122、G124、T130、E132、V158、K161、A175、D196、K197、K199、R202、H216、S222、G237、T239、H257、Q286、L287、R290 A292、A294、E296、M298、L305、S314、G318、P321、K337、K341、Q366、H373、F374、E394、P395およびR396の中から選択される位置に対応する位置でのアミノ酸交換とすることができる。例示的なそのような改変は、D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、R290M、R290V、K341E、K341R、K341Q、K341N、K341M、K341D、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA、K197I198insS、T239S、T239N、T239Q、T239V、T239L、T239H、T239I、L287T、M298Q、P321K、P321E、P321Y、P321S、Q366D、Q366E、Q366N、Q366T、Q366S、Q366V、Q366I、Q366L、Q366M、H373D、H373E、H373S、H373L、H373I、H373F、H373A、K161S、K161A、K161V、H216S、H216A、H216K、H216R、S222A、S222K、S222V、S222N、S222E、S222D、H257A、H257S、Gla Swap FIX、{Gla Swap FIX/E40L}、{Gla Swap FIX/K43I}、{Gla Swap FIX/Q44S}、{Gla Swap FIX/M19K}、{Gla Swap FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}、Gla Swap FX、Gla Swap Prot C、Gla Swap Prot S、Gla Swap トロンビン、S52A、S60A、E394N、P395A、R396S、R202S、A292N、A294S、G318N、A175S、K109N、A122N、G124S、A51N、T130N、E132S、S52N、P54S、S119N、L121S、T128N、P129A、Q66N、Y68S、S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、S103S111delinsIEDICLPRWGCLWE、H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE、T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE、S103S111delinsDICLPRWGCLWED、H115S126delinsDICLPRWGCLWED、T128P134delinsDICLPRWGCLWED、P406insIEDICLPRWGCLW、P406insGGGSIEDICLPRWGCLW、P406insDICLPRWGCLWED、P406insGGGSDICLPRWGCLWED、S103S111delinsSFGRGDIRNV、H115S126delinsSFGRGDIRNV、T127P134delinsSFGRGDIRNV、P406insCSFGRGDIRNVC、P406insGGGSCSFGRGDIRNVC、V158T、V158D、L287T、E296V、M298KおよびM298Qを含む。

本明細書において提供される例示的な改変ＦＶＩＩポリペプチドは、改変Q286R/M298Q、Q286R/Gla Swap FIX、Q286R/H257A、Q286R/S222A、Q286R/S222A/H257A、Q286R/S222A/Gla Swap FIX、Q286R/H257A/Gla Swap FIX、Q286R/S222A/H257A/Gla Swap FIX、Q286R/M298Q/K341Q、Q286R/M298Q/K199E、Q286R/M298Q/Gla Swap FIX、Q286R/Q366V、Q286R/A292N/A294S/Q366V、A175S/Q286R/Q366V、S222A/Q286R/Q366V、H257S/Q286R、H257S/Q286R/Q366V、S222A/H257A/Q286R/Q366V、Q286R/H373A、S222A/H257A/Q286R/M158Q、Q286R/K341D、Q286R/Q366D、Q286R/Q366N、Q286R/M298Q/Q366D、Q286R/M298Q/Q366N、Q286R/H373F、Q286R/M298Q/H373F、{Gla Swap FIX/E40L}/Q286R/M298Q、{Gla Swap FIX/K43I}/Q286R/M298Q、{Gla Swap FIX/Q44S}/Q286R/M298Q、{Gla Swap FIX/M19K}/Q286R/M298Q、{Gla Swap FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}/Q286R/M298Q、T128N/P129A/Q286R、T128N/P129A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/Q286R/H373F、V158D/Q286R/E296V/M298Q、Gla Swap FIX/T128N/P129A/S222A/Q286R、Gla Swap FIX/T128N/P129A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373F、S52A/S60A/Q286R、Gla Swap FIX/S52A/S60A/S222A/Q286R、S52A/S60A/Q286R/M298Q、Gla Swap FIX/S52A/S60A/Q286R/M298Q、S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/M298Q、S52A/S60A/Q286R/H373F/、S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F、T239V/Q286R、Gla Swap FIX/S222A/T239V/Q286R、T239V/Q286R/M298Q、S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q、Gla Swap FIX/T239V/Q286R/M298Q、T239V/Q286R/H373F、T239V/Q286R/M298Q/H373F、T239I/Q286R、Gla Swap FIX/S222A/T239I/Q286R、T239I/Q286R/M298Q、S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q、Gla Swap FIX/T239I/Q286R/M298Q、T239I/Q286R/H373F、T239I/Q286R/M298Q/H373F、Gla Swap FIX/S222A/Q286R/H373F、Gla Swap FIX/S222A/Q286R/M298Q、Gla Swap FIX/S222A/Q286R/M298Q/H373F、V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F、H257A/Q286R/M298Q、H257S/Q286R/M298Q、Gla Swap FIX/S222A/H257S/Q286R/、S222A/H257S/Q286R/M298Q、H257S/Q286R/M298Q/H373F、S222A/Q286R/M298Q/H373F、S222A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/A175S/Q286R、A122N/G124S/A175S/Q286R、Gla Swap FIX/T128N/P129A/A175S/S222A/Q286R、Gla Swap FIX/A122N/G124S/A175S/S222A/Q286R、T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q、A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q、T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q、A122N/G124S/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q/H373F、A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q/H373F、{Gla Swap FIX/K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N、{Gla Swap FIX/K43I}/Q286R/M298Q/Q366N、{Gla Swap FIX/K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N、V158D/Q286R/E296V/M298Q、T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373F、T239V/Q286R/M298Q/Q366N、T239I/Q286R/M298Q/Q366N、T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q、T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q/H373F、T128N/P129A/T239I/Q286R/M298QまたはT128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q/H373Fを含有するものである。

ＦＶＩＩポリペプチド、その対立遺伝子変異体もしくは種変異体、またはその活性断片において２つ以上の改変を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供される。そのようなポリペプチドにおける改変の少なくとも１つは、配列番号３において記載されるアミノ酸の配列を有するＦＶＩＩポリペプチドにおける位置Ｑ２８６に対応する位置におけるものであり、またはＦＶＩＩポリペプチドにおける対応する残基におけるものであり、ただし、位置Ｑ２８６での改変は、単独でまたは任意の他の改変と組み合わせて、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、新しいグリコシル化部位の導入をもたらさないことを条件とする。そのような改変は、アミノ酸交換、アミノ酸挿入、またはアミノ酸欠失とすることができる。たとえば、位置Ｑ２８６での改変は、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ａｓｐ（Ｄ）、およびＣｙｓ（Ｃ）の中から選択されるアミノ酸による交換とすることができる。いくつかの例において、改変は、Ｑ２８６Ｒである。１つまたは複数の他の改変は、D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、R290M、R290V、K341E、K341R、K341Q、K341N、K341M、K341D、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA、K197I198insS、T239S、T239N、T239Q、T239V、T239L、T239H、T239I、L287T、P321K、P321E、P321Y、P321S、Q366D、Q366E、Q366N、Q366T、Q366S、Q366V、Q366I、Q366L、Q366M、H373D、H373E、H373S、H373F、H373A、K161S、K161A、K161V、H216S、H216A、H216K、H216R、S222A、S222K、S222V、S222N、S222E、S222D、H257A、H257S、Gla Swap FIX、{Gla Swap FIX/E40L}、{Gla Swap FIX/K43I}、{Gla Swap FIX/Q44S}、{Gla Swap FIX/M19K}、{Gla Swap FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}、Gla Swap FX、Gla Swap Prot C、Gla Swap Prot S、Gla Swap トロンビン、S52A、S60A、E394N、P395A、R396S、R202S、A292N、A294S、G318N、A175S、K109N、A122N、G124S、A51N、T130N、E132S、S52N、P54S、S119N、L121S、T128N、P129A、Q66N、Y68S、S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、S103S111delinsIEDICLPRWGCLWE、H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE、T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE、S103S111delinsDICLPRWGCLWED、H115S126delinsDICLPRWGCLWED、T128P134delinsDICLPRWGCLWED、P406insIEDICLPRWGCLW、P406insGGGSIEDICLPRWGCLW、P406insDICLPRWGCLWED、P406insGGGSDICLPRWGCLWED、S103S111delinsSFGRGDIRNV、H115S126delinsSFGRGDIRNV、T127P134delinsSFGRGDIRNV、P406insCSFGRGDIRNVC、P406insGGGSCSFGRGDIRNVC、V158T、V158D、L287T、E296V、M298KおよびM298Qの中から選択することができる。

いくつかの例において、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、配列番号３において記載されるアミノ酸の配列を有するＦＶＩＩポリペプチドにおけるＰ５４、Ｑ６６、Ｌ１２１、Ａ１２２、Ｐ１２９、もしくはＥ１３２に対応する位置にまたはＦＶＩＩポリペプチドにおける対応する残基において改変を含有する。例示的な改変は、Ｐ５４Ｓ、Ｑ６６Ｎ、Ｌ１２１Ｓ、Ａ１２２Ｎ、Ｐ１２９Ａ、およびＥ１３２Ｓを含む。いくつかの例において、Ｐ５４、Ｑ６６、Ｌ１２１、Ａ１２２、Ｐ１２９、またはＥ１３２に対応する位置に改変を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、ＦＶＩＩポリペプチドにおける他の位置にアミノ酸交換、アミノ酸挿入、またはアミノ酸欠失を含む１つまたは複数のさらなる改変をも含有する。そのような改変は、Ｐ５４Ｓ、Ｓ５２Ｎ、Ｙ５８Ｓ、Ｓ１１９Ｎ、Ｇ１２４Ｓ、Ｔ１２８Ｎ、Ｔ１３０Ｎ、Ｖ１５８Ｄ、Ａ１７５Ｓ、Ｓ２２２Ａ、Ｇ２４１Ｓ、Ｅ２９６Ｖ、Ｍ２９８Ｑ、Ｅ３９４Ｎ、Ｐ３９５Ａ、Ｒ３９６Ｓ、Ｇ３１８Ｎ、およびＱ３６６Ｖを含む。したがって、本明細書において提供されるＦＶＩＩポリペプチドにおける例示的な組み合わせの改変は、S119N/L121S、T128N/P129A、A122N/G124S、A122N/G124S/A175S、A122N/G124S/E394N/P395A/R396S、A122N/G124S/E394N/P395A/R396S/G318N、A122N/G124S/E394N/P395A/R396S、S52N/P54S/A122N/G124S/E394N/P395A/R396S、S52N/P54S、S119N/L121S/A175S、T128N/P129A/A175S、T130N/E132S、Q66N/Y68S、T128N/P129A/V158D/E296V/M298Q、T128N/P129A/S222A、T128N/P129A/A175S/Q366V、A122N/G124S/A175S/Q366V、T128N/P129A/A175S/S222A、A122N/G124S/A175S/S222A、T128N/P129A/M298QおよびT128N/P129A/M298Q/H373Fである。

配列番号３において記載されるアミノ酸の配列を有するＦＶＩＩポリペプチドにおいて、またはＦＶＩＩポリペプチドにおける対応する残基において、T239S、T239Q、T239V、T239L、T239H、T239I、P321K、P321E、P321Y、P321S、Q366D、Q366N、Q366V、Q366I、Q366L、Q366M、H373D、H373E、H373S、H373F、H373A、K161S、K161V、H216S、H216K、H216R、S222A、S222K、S222V、S222D、S222N、S222EまたはH257Sに対応する改変を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドもまた、本明細書において提供される。さらに、そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、アミノ酸位置A51、S52、P54、S60、Q66、Y68、K109、S119、A122、G124、T130、E132、V158、K161、A175、D196、K197、K199、R202、H216、S222、G237、T239、H257、Q286、L287、R290 A292、A294、E296、M298、L305、S314、G318、P321、K337、K341、Q366、H373、F374、E394、P395およびR396などのような他の位置に１つまたは複数のさらなる改変を含有することができる。これらの位置での例示的な改変は、Q286N、Q286E、Q286D、Q286S、Q286T、Q286R、Q286K、Q286A、Q286V、Q286M、Q286L、Q286Y、D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、R290M、R290V、K341E、K341R、K341Q、K341N、K341M、K341D、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA、K197I198insS、T239S、T239N、T239Q、T239V、T239L、T239H、T239I、L287T、P321K、P321E、P321Y、P321S、Q366D、Q366E、Q366N、Q366T、Q366S、Q366V、Q366I、Q366L、Q366M、H373D、H373E、H373S、H373F、H373A、K161S、K161A、K161V、H216S、H216A、H216K、H216R、S222A、S222K、S222V、S222N、S222E、S222D、H257A、H257S、Gla swap FIX、Gla swap FX、Gla Swap Prot C、Gla Swap Prot S、Gla swap トロンビン、Gla Swap FIX、{Gla Swap FIX/E40L}、{Gla Swap FIX/K43I}、{Gla Swap FIX/Q44S}、{Gla Swap FIX/M19K}、{Gla Swap FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}、S52A、S60A、E394N、P395A、R396S、R202S、A292N、A294S、G318N、A175S、K109N、A122N、G124S、A51N、T130N、E132S、S52N、P54S、S119N、L121S、T128N、P129A、Q66N、Y68S、S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、S103S111delinsIEDICLPRWGCLWE、H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE、T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE、S103S111delinsDICLPRWGCLWED、H115S126delinsDICLPRWGCLWED、T128P134delinsDICLPRWGCLWED、P406insIEDICLPRWGCLW、P406insGGGSIEDICLPRWGCLW、P406insDICLPRWGCLWED、P406insGGGSDICLPRWGCLWED、S103S111delinsSFGRGDIRNV、H115S126delinsSFGRGDIRNV、T127P134delinsSFGRGDIRNV、P406insCSFGRGDIRNVC、P406insGGGSCSFGRGDIRNVC、V158T、V158D、L287T、M298KおよびM298Qを含む。結果として生じる組み合わせの改変は、Q366D/H373E、Q366V/H373V、Q366V/H373L、Q366V/H373I、S222K/H257A、H216A/S222A、S222S/Gla Swap FIX、S222A/H257A/Gla Swap FIX、S222A/M298Q、S222A/H257A/M298Q、S222A/A292N/A294S/Q366V、A175S/S222A/Q366V、S222A/Q366V、H257S/Q366V、S222A/H373A、M298Q/H373F、S52A/S60A/S222A、S222A/T239V、V158D/T239V/E296V/M298Q、S222A/T239I、V158D/E296V/M298Q/H373F、Gla Swap FIX/Q366V、M298Q/Q366N/H373F、T239V/M298Q/H373FおよびT239I/M298Q/H373Fを含むことができる。

ＦＶＩＩポリペプチド、その対立遺伝子変異体および種変異体、またはその活性断片において２つ以上の改変を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供され、２つ以上のアミノ酸改変は、Ｈ２１６Ａ、Ｈ２５７Ａ、Ｅ３９４Ｎ、Ｐ３９５Ａ、Ｒ３９６Ｓ、Ｋ１０９Ｎ、Ａ２９２Ｎ、Ａ１７５Ｓ、Ｈ２５７Ａ、およびＧｌａ Ｓｗａｐ ＦＩＸに対応するアミノ酸改変の中から選択される。たとえば、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、Ｈ２１６Ａ／Ｈ２５７Ａ、Ｅ３９４Ｎ／Ｐ３９５Ａ／Ｒ３９６Ｓ、およびＫ１０９Ｎ／Ａ１７５Ｓの中から選択される改変を有するものを含む。さらに、Ｍ２９８ＱまたはＡ２９４Ｓに対応する改変もまた含むことができる。したがって、Ｈ２１６Ａ／Ｈ２５７Ａ、Ｅ３９４Ｎ／Ｐ３９５Ａ／Ｒ３９６Ｓ、およびＫ１０９Ｎ／Ａ１７５Ｓの中から選択される改変を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドもまた本明細書において提供される。いくつかの例において、改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、Ｍ２９８ＱまたはＡ２９４Ｓに対応する改変をも含有する。これは、たとえば、改変Ｈ２５７Ａ／Ｍ２９８ＱまたはＫ１０９Ｎ／Ａ２９２Ｎ／Ａ２９４Ｓを含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドをもたらすことができる。Ｓ５２Ａ／Ｓ６０Ａ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８ＱまたはＶ１５８Ｄ／Ｔ２３９Ｉ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８に対応する改変を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドもまた提供される。

いくつかの例において、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、配列番号１０３〜１０９のいずれかにおいて記載されるアミノ酸の配列または血清アルブミン結合を行うのに十分なその部分などのような血清アルブミン結合配列を含有する。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、血清アルブミン結合性に対して増加した親和性または結合性を示すことができる。たとえば、血清アルブミン結合配列を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の血清アルブミン結合に対する増加した親和性または結合性を示すことができる。血清アルブミン結合配列によって、非改変ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸残基の連続(contiguous)配列を交換することができる。血清アルブミン結合配列を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、S103S111delinsIEDICLPRWGCLWE、H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE、T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE、S103S111delinsDICLPRWGCLWED、H115S126delinsDICLPRWGCLWED、T128P134delinsDICLPRWGCLWED、P406insIEDICLPRWGCLW、P406insGGGSIEDICLPRWGCLW、P406insDICLPRWGCLWEDおよびP406insGGGSDICLPRWGCLWEDの中から選択される改変を含有することができる。

血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合配列を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供される。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３に対する増加した親和性または結合性を示すことができる。たとえば、血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合配列を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合に対する増加した親和性または結合性を示すことができる。血清アルブミン結合配列の例は、配列番号１１０〜１１２のいずれかにおいて記載されるアミノ酸のそれらの配列または血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合を行うのに十分なその部分を含み、これによって、非改変ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸残基の連続(contiguous)配列を交換することができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、Ｓ１０３Ｓ１１１ｄｅｌｉｎｓＳＦＧＲＧＤＩＲＮＶ、Ｈ１１５Ｓ１２６ｄｅｌｉｎｓＳＦＧＲＧＤＩＲＮＶ、Ｔ１２７Ｐ１３４ｄｅｌｉｎｓＳＦＧＲＧＤＩＲＮＶ、Ｐ４０６ｉｎｓＣＳＦＧＲＧＤＩＲＮＶＣ、およびＰ４０６ｉｎｓＧＧＧＳＣＳＦＧＲＧＤＩＲＮＶＣの中から選択される改変を含有する。

血清アルブミン結合配列または血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合配列を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、位置Ｇ２３７Ｖに対応する位置でのアミノ酸交換などのような、ＦＶＩＩポリペプチドにおける他の位置に、１つまたは複数のさらなる改変をも含有することができる。したがって、S103S111delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V、S103S111delinsDICLPRWGCLWED/G237V、H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF/G237V、H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V、H115S126delinsDICLPRWGCLWED/G237V、T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF/G237V、T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V、S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF/G237VおよびT128P134delinsDICLPRWGCLWED/G237Vの中から選択される改変を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドもまた、本明細書において提供される。

いくつかの例において、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上の改変を含有する。さらなる例において、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、異種Ｇｌａドメインまたはリン脂質結合を行うのに十分なその部分を含有する。そのようなポリペプチドは、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上のリン脂質に対する増加した親和性または結合性などのような、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、リン脂質に対する増加した親和性または結合性を示すことができる。異種Ｇｌａドメインは、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、プロトロンビン、プロテインＣ、プロテインＳ、オステオカルシン、マトリックスＧｌａタンパク質、増殖停止特異的タンパク質６（Ｇａｓ６）、およびプロテインＺにおけるＧｌａドメインの中から選択することができ、いくつかの例において、配列番号８３〜９１、９３、および９４のいずれかにおいて記載されるアミノ酸の配列またはリン脂質結合を行うのに十分なその部分を有することができる。天然ＦＶＩＩ Ｇｌａドメインのすべての部分または連続(contiguous)部分は、配列番号３において記載されるアミノ酸の配列を有するＦＶＩＩポリペプチドにおいてまたはＦＶＩＩポリペプチドにおける対応する残基においてアミノ酸１〜４５を含むことができ、除去し、かつ異種Ｇｌａドメインまたはリン脂質結合を行うのに十分なその部分と交換することができる。

本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、アンチトロンビンＩＩＩに対する増加した抵抗性を示すことができる。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上のアンチトロンビンＩＩＩに対する抵抗性を示すことができる。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の増加などのような、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加した触媒活性または血液凝固活性を示すこともできる。さらに、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、ＴＦＰＩに対する増加した抵抗性を示すことができる。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上、ＴＦＰＩに対して抵抗性となり得る。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、Ｚｎ^２＋の阻害効果に対する増加した抵抗性を示すことができる。たとえば、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上、Ｚｎ^２＋の阻害効果に対して抵抗性となり得る。

いくつかの例において、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、１つまたは複数のグリコシル化部位を導入および／または排除する、１つまたは複数の改変を含有する。たとえば、１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のグリコシル化部位を導入または排除することができる。導入または排除することができるグリコシル化部位は、Ｎ−グリコシル化部位およびＯ−グリコシル化部位を含む。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、アンチトロンビンＩＩＩに対する抵抗性を増加させる、リン脂質に対する結合性および／もしくは親和性を増加させる、組織因子に対する親和性を増加させる、内因活性を増加させる、ＴＦ依存性活性を増加させる、血液凝固活性を増加させる、ポリペプチドのコンホメーションを変化させてチモーゲン性（ｚｙｍｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を変化させる、高度に活性なコンホメーションに有利なように高度に活性なＦＶＩＩａコンホメーションおよびそれほど活性でないＦＶＩＩａコンホメーションの間の平衡をシフトすることによって触媒活性もしくは血液凝固活性を増加させる、プロテアーゼに対する抵抗性を増加させる、グリコシル化を減少させる、グリコシル化を増加させる、免疫原性を低下させる、安定性を増加させる、ならびに／または化学基連結を容易にする、１つまたは複数のさらなるアミノ酸改変を含有することができる。いくつかの例において、変化したチモーゲン性は、よりチモーゲン様の形状またはそれほどチモーゲン様でない形状を付与する。

いくつかの例において、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、S279C/V302C、L280C/N301C、V281C/V302C、S282C/V299C、位置４でのチロシンの挿入、F4S、F4T、P10Q、P10E、P10D、P10N、Q21N、R28F、R28E、I30C、I30D、I30E、K32D、K32Q、K32E、K32G、K32H、K32T、K32C、K32A、K32S、D33C、D33F、D33E、D33K、A34C、A34E、A34D、A34I、A34L、A34M、A34V、A34F、A34W、A34Y、R36D、R36E、T37C、T37D、T37E、K38C、K38E、K38T、K38D、K38L、K38G、K38A、K38S、K38N、K38H、L39E、L39Q、L39H、W41N、W41C、W41E、W41D、I42R、I42N、I42S、I42A、I42Q、I42N、I42S、I42A、I42Q、I42K、S43Q、S43N、Y44K、Y44C、Y44D、Y44E、S45C、S45D、S45E、D46C、A51N、S53N、G58N、G59S、G59T、K62E、K62R、K62D、K62N、K62Q、K62T、L65Q、L65S、L65N、F71D、F71Y、F71E、F71Q、F71N、P74S、P74A、A75E、A75D、E77A、E82Q、E82N、E82S、E82T T83K、N95S、N95T、G97S、G97T、Y101N、D104N、T106N、K109N、E116D、G117N、G124N、S126N、T128N、L141C、L141D、L141E、E142D、E142C、K143C、K143D、K143E、R144E、R144C、R144D、N145Y、N145G、N145F、N145M、N145S、N145I、N145L、N145T、N145V、N145P、N145K、N145H、N145Q、N145E、N145R、N145W、N145D、N145C、K157V、K157L、K157I、K157M、K157F、K157W、K157P、K157G、K157S、K157T、K157C、K157Y、K157N、K157E、K157R、K157H、K157D、K157Q、V158L、V158I、V158M、V158F、V158W、V158P、V158G、V158S、V158T、V158C、V158Y、V158N、V158E、V158R、V158K、V158H、V158D、V158Q、A175S、A175T、G179N、I186S、I186T、V188N、R202S、R202T、I205S、I205T、D212N、E220N、I230N、P231N、P236N、G237N、Q250C、V253N、E265N、T267N、E270N、A274M、A274L、A274K、A274R、A274D、A274V、A274I、A274F、A274W、A274P、A274G、A274T、A274C、A274Y、A274N、A274E、A274H、A274S、A274Q、F275H、R277N、F278S、F278A。F278N、F278Q、F278G、L280N、L288K、L288C、L288D、D289C、D289K、L288E、R290C、R290G、R290A、R290S、R290T、R290K、R290D、R290E、G291E、G291D、G291C、G291N、G291K、A292C、A292K、A292D、A292E、T293K、E296V、E296L、E296I、E296M、E296F、E296W、E296P、E296G、E296S、E296T、E296C、E296Y、E296N、E296K、E296R、E296H、E296D、E296Q、M298Q、M298V、M298L、M298I、M298F、M298W、M298P、M298G、M298S、M298T、M298C、M298Y、M298N、M298K、M298R、M298H、M298E、M298D、P303S、P303T、R304Y、R304F、R304L、R304M、R304G、R304T、R304A、R304S、R304N、L305V、L305Y、L305I、L305F、L305A、L305M、L305W、L305P、L305G、L305S、L305T、L305C、L305N、L305E、L305K、L305R、L305H、L305D、L305Q、M306D、M306N、D309S、D309T、Q312N、Q313K、Q313D、Q313E、S314A、S314V、S314I、S314M、S314F、S314W、S314P、S314G、S314L、S314T、S314C、S314Y、S314N、S314E、S314K、S314R、S314H、S314D、S314Q、R315K、R315G、R315A、R315S、R315T、R315Q、R315C、R315D、R315E、K316D、K316C、K316E、V317C、V317K、V317D、V317E、G318N、N322Y、N322G、N322F、N322M、N322S、N322I、N322L、N322T、N322V、N322P、N322K、N322H、N322Q、N322E、N322R、N322W、N322C、G331N、Y332S、Y332A、Y332N、Y332Q、Y332G、D334G、D334E、D334A、D334V、D334I、D334M、D334F、D334W、D334P、D334L、D334T、D334C、D334Y、D334N、D334K、D334R、D334H、D334S、D334Q、S336G、S336E、S336A、S336V、S336I、S336M、S336F、S336W、S336P、S336L、S336T、S336C、S336Y、S336N、S336K、S336R、S336H、S336D、S336Q、K337L、K337V、K337I、K337M、K337F、K337W、K337P、K337G、K337S、K337T、K337C、K337Y、K337N、K337E、K337R、K337H、K337D、K337Q、K341E、K341Q、K341G、K341T、K341A、K341S、G342N、H348N、R353N、Y357N、I361N、F374P、F374A、F374V、F374I、F374L、F374M、F374W、F374G、F374S、F374T、F374C、F374Y、F374N、F374E、F374K、F374R、F374H、F374D、F374Q、V376N、R379N、L390C、L390K、L390D、L390E、M391D、M391C、M391K、M391N、M391E、R392C、R392D、R392E、S393D、S393C、S393K、S393E、E394K、P395K、E394C、P395D、P395C、P395E、R396K、R396C、R396D、R396E、P397D、P397K、P397C、P397E、G398K、G398C、G398D、G398E、V399C、V399D、V399K、V399E、L400K、L401K、L401C、L401D、L401E、R402D、R402C、R402K、R402E、A403K、A403C、A403D、A403E、P404E、P404D、P404C、P404K、F405K、P406C、K32N/A34S、K32N/A34T、F31N/D33S、F31N/D33T、I30N/K32S、I30N/K32T、A34N/R36S、A34N/R36T、K38N/F40S、K38N/F40T、T37N/L39S、T37N/L39T、R36N/K38S、R36N/K38T、L39N/W41S、L39N/W41T、F40N/I42S、F40N/I42T、I42N/Y44S、I42N/Y44T、Y44N/D46S、Y44N/D46T、D46N/D48S、D46N/D48T、G47N/Q49S、G47N/Q49T、K143N/N145S、K143N/N145T、E142N/R144S、E142N/R144T、L141N/K143S、L141N/K143T、I140N/E142S、I140N/E142T、R144N/A146S、R144N/A146T、A146N/K148S、A146N/K148T、S147N/P149S/、S147N/P149T、R290N/A292S、R290N/A292T、D289N/G291S、D289N/G291T、L288N/R290S、L288N/R290T、L287N/D289S、L287N/D289T、A292N/A294S、A292N/A294T、T293N/L295S、T293N/L295T、R315N/V317S、R315N/V317T、S314N/K316S、S314N/K316T、Q313N/R315S、Q313N/R315T、K316N/G318S、K316N/G318T、V317N/D319S、V317N/D319T、K341N/D343S、K341N/D343T、S339N/K341S、S339N/K341T、D343N/G345S、D343N/G345T、R392N/E394S、R392N/E394T、L390N/R392S、L390N/R392T、K389N/M391S、K389N/M391T、S393N/P395S、S393N/P395T、E394N/R396S、E394N/R396T、P395N/P397S、P395N/P397T、R396N/G398S、R396N/G398T、P397N/V399S、P397N/V399T、G398N/L400S、G398N/L400T、V399N/L401S、V399N/L401T、L400N/R402S、L400N/R402T、L401N/A403S、L401N/A403T、R402N/P404S、R402N/P404T、A403N/F405S、A403N/F405T、P404N/P406SおよびP404N/P406Tの中から選択される、１つまたは複数のさらなるアミノ酸改変を含有する。いくつかの例において、改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、トリプシン、トロンビン、もしくはＦＸに由来する対応するアミノ酸との、位置３００〜３２２、３０５〜３２２、３００〜３１２、もしくは３０５〜３１２の置換またはトリプシンに由来する対応するアミノ酸との、位置３１０〜３２９、３１１〜３２２、もしくは２３３〜３２９の置換をも含有する。

本明細書において提供される例示的な改変ＦＶＩＩポリペプチドは、配列番号１１３〜２７３のいずれかにおいて記載されるアミノ酸の配列を有するものである。いくつかの例において、改変は、配列番号３において記載されるポリペプチドの対立遺伝子変異体または種変異体である非改変ＦＶＩＩポリペプチドにおいてなされる。対立遺伝子変異体または種変異体または他の変異体は、アミノ酸改変（１つまたは複数）を除いて、配列番号３において記載されるポリペプチドに対して、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有することができる。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ヒトポリペプチド、非ヒトポリペプチド、および／または成熟ポリペプチドとすることができる。いくつかの例においては、一次配列のみが改変される。他の例においては、化学修飾または翻訳後修飾も含まれる。たとえば、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、グリコシル化する、カルボキシル化する、ヒドロキシル化する、硫酸化する、リン酸化する、アルブミン化する（ａｌｂｕｍｉｎａｔｅ）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分にコンジュゲートさせることができる。

本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、一本鎖ポリペプチド、二本鎖ポリペプチド、および／または活性ポリペプチドもしくは活性化ポリペプチドとすることができる。活性化は、自己活性化によるタンパク質分解による切断、第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）による切断、第Ｘ因子（ＦＸａ）による切断、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）による切断、またはトロンビンによる切断によって達成することができる。

本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドの１つまたは複数の活性を保持することができる。たとえば、ポリペプチドが、非改変ＦＶＩＩポリペプチドの少なくとも１つのＦＶＩＩ活性を保持する限り、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または６０のアミノ酸位置に改変を含有することができる。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドの、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の活性を保持することができる。いくつかの例において、１つまたは複数の活性は、組織因子（ＴＦ）結合性、第Ｘ因子（ＦＸ）活性化、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）活性化、リン脂質結合性、および凝固活性の中から選択される。さらに、保持される活性は、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加または減少させることができる。いくつかの例において、凝固活性は、非改変ＦＶＩＩポリペプチドの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の凝固活性などのように、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して増加する。活性は、インビトロにおいて、エクスビボにおいて、またはインビボにおいて測定することができる。

本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含有する核酸分子が、本明細書において提供される。原核生物ベクター、ウイルス性ベクター、または哺乳動物ベクターなどのような真核生物ベクターを含む、そのような核酸分子を含有するベクターもまた提供される。ウイルス性ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、およびサイトメガロウイルスの中から選択することができる。哺乳動物細胞などのような真核細胞を含む、これらのベクターを含有する細胞が、本明細書において提供される。例示的な哺乳動物細胞は、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ−２１）または２９３細胞またはＣＨＯ細胞である。いくつかの例において、細胞は、改変ＦＶＩＩポリペプチドを発現する。したがって、これらの細胞によって産生される改変ＦＶＩＩポリペプチドもまた、本明細書において提供される。

薬学的に許容可能な媒体中に、治療有効濃度または治療有効量の、本明細書において提供される任意の改変ＦＶＩＩポリペプチド、核酸分子、ベクター、または細胞を含有する医薬組成物が、本明細書において提供される。いくつかの例において、医薬組成物は、経口投与、経鼻投与、経肺投与、頬側投与、経皮投与、皮下投与、十二指腸内投与、経腸投与、非経口投与、静脈内投与、または筋肉内投与などのような局所的投与、全身投与、または局所投与用に製剤される。医薬組成物はまた、徐放性投与および／または単回投与用に製剤することができる。

本明細書において提供される医薬組成物を投与することによって対象を処置する方法であって、対象は、活性ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）の投与などによって、ＦＶＩＩまたは凝血促進薬の投与によって処置される疾患または状態を有する方法が本明細書において提供される。いくつかの例において、医薬組成物を用いる処置は、疾患または状態と関連する症状を回復させ、または軽減する。さらなる例において、本明細書において提供される方法はまた、ＦＶＩＩまたは凝血促進薬の投与によって処置される疾患または状態と関連する症状における変化について対象をモニターすることをも含む。本明細書において提供される方法を使用して処置されることとなる疾患または状態は、血液凝固障害、血液障害、出血性障害、血友病（血友病Ａまたは血友病Ｂまたは血友病Ｃ、先天性血友病または後天性血友病など）、第ＶＩＩ因子欠乏症、および手術（心臓手術、血管形成術、肺手術、腹部手術、脊髄手術、脳手術、血管手術、口腔手術、もしくは器官移植手術など）または外傷による出血合併症を含む出血障害の中から選択することができる。いくつかの例において、出血は、急性関節血症、慢性血友病性関節症、血腫、血尿、中枢神経系出血、消化管出血、または脳出血として現れる。さらなる例において、出血は、抜歯によるものである。移植手術は、骨髄、心臓、肺、膵臓、および肝臓の移植の中から選択することができる。

いくつかの例において、本明細書において提供される方法は、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子に対する自己抗体を有する対象を処置するために使用することができる。本明細書において提供される方法はまた、１つまたは複数のさらなる、血漿精製凝固因子もしくは組換え凝固因子などのような凝固因子、ビタミンＫ、ビタミンＫ誘導体、およびプロテインＣ阻害因子などのような凝血促進薬、血漿、血小板、赤血球、ならびにコルチコステロイドまたは処置を施すことをも含むことができる。

包装材、および包装材に入っている、本明細書において提供される医薬組成物を含有する製品が本明細書において提供される。いくつかの例において、医薬組成物における改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＶＩＩ媒介性疾患または障害の処置に有効であり、包装材は、改変ＦＶＩＩポリペプチドが、ＦＶＩＩ媒介性疾患または障害の処置に使用されることを示す標識を含む。本明細書において記載される医薬組成物、組成物の投与のためのデバイス、および所望により、投与についての説明書を含むキットもまた、本明細書において提供される。

図１は凝固カスケードを示す。図は、ＦＸａの非依存性の産生のための凝固の内在性経路および外因性経路ならびに血餅の形成に向けてトロンビンおよびフィブリンを生成するための共通経路への経路の集合を示す。これらの経路は、相互に連絡する。図は、チモーゲンが、１つまたは複数のペプチド結合の切断によって活性化プロテアーゼに変換される活性化カスケードに関与する分子の順番を示す。次いで、活性化プロテアーゼは、カスケードにおける次のチモーゲン分子のための活性化プロテアーゼとして働き、最終的に血餅形成をもたらす。 図２は凝固の細胞ベースのモデルを示す（たとえば、Hoffman et al. (2001) Thromb Haemost 85:958-965を参照されたい）。図は、凝固事象を３つのフェーズに分類して示し、凝固の開始は、ＴＦを有する細胞上のＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体によるＦＸのＦＸａへの活性化によって達成され、ＦＸａ／ＦＶａによる活性化の後に少量のトロンビンの生成をもたらす。増幅は、トロンビンが、血小板に結合し、活性化し、十分な量の適切な凝固因子の活性化を開始して、ＦＶＩＩＩａ／ＦＩＸａ複合体およびＦＶａ／ＦＸａ複合体を形成する場合に起こる。凝固の伝播は、傷害の部位の多くの活性化血小板の表面で生じ、フィブリノーゲンから十分なフィブリンを生成するのに十分に多い、トロンビン生成の著しい増加をもたらし、傷害の部位に血餅を構築する。 図３は、ＦＶＩＩａがトロンビン形成を開始することができるメカニズムを示す。図は、ＦＶＩＩａトロンビン生成のＴＦ依存性経路を示し、これは、ＴＦを有する細胞の表面で作用し、ＦＸのＦＸａへの活性化前にＴＦとのＦＶＩＩａの複合体形成を伴う。図はまた、ＦＶＩＩａトロンビン生成のＴＦ非依存性の経路を示し、この間に、ＦＶＩＩａは、活性化血小板上のリン脂質に結合し、ＦＸをＦＸａに活性化し、これは、順番に、ＦＶａと複合体を形成して、プロトロンビンを切断してトロンビンにする。

概要
Ａ． 定義
Ｂ． 止血概説
１． 血小板の粘着および凝集
２． 凝固カスケード
ａ． 開始
ｂ． 増幅
ｃ． 伝播
３． 凝固の調節
Ｃ． 第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）
１． ＦＶＩＩの構造および構成
２． 翻訳後改変
３． ＦＶＩＩプロセシング
４． ＦＶＩＩ活性化
５． ＦＶＩＩ機能
ａ． 組織因子依存性ＦＶＩＩａ活性
ｂ． 組織因子非依存性ＦＶＩＩａ活性
６． 生物製剤としてのＦＶＩＩ
Ｄ． 改変ＦＶＩＩポリペプチド
１． 増加した触媒活性
ａ． 触媒活性を増加させるための例示的な改変
ｉ． 位置２８６での塩基性アミノ酸置換
ｉｉ． 位置２８６での他の突然変異
２． ＡＴ−ＩＩＩに対する増加した抵抗性
ＡＴ−ＩＩＩに対する増加した抵抗性を達成するための例示的な改変
３． Ｚｎ^２＋による阻害に対する増加した抵抗性
Ｚｎ^２＋による阻害に対する抵抗性を増加させるための例示的な改変
４． 変化したグリコシル化
グリコシル化を変化させるための例示的な改変
５． 血清アルブミンおよび／または血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３に対する増加した結合性
ａ． 血清アルブミン結合配列を有する例示的なＦＶＩＩポリペプチド
ｂ． 血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合配列を有する例示的なＦＶＩＩポリペプチド
６． 異種Ｇｌａドメインの導入による改変
７． 組み合わせおよびさらなる改変
ａ． ＴＦＰＩに対する抵抗性を増加させる改変
ｂ． 内因活性を増加させる改変
ｃ． プロテアーゼに対する抵抗性を増加させる改変
ｄ． リン脂質に対する親和性を増加させる改変
ｅ． グリコシル化を変化させる改変
ｆ． 化学基連結を容易にするための改変
ｇ． 例示的な組み合わせ突然変異
Ｅ． ＦＶＩＩポリペプチドの産生
１． ベクターおよび細胞
２． 発現系
ａ． 原核生物発現
ｂ． 酵母
ｃ． 昆虫および昆虫細胞
ｄ． 哺乳動物細胞
ｅ． 植物
２． 精製
３． 融合タンパク質
４． ポリペプチド改変
５． ヌクレオチド配列
Ｆ． 改変ＦＶＩＩポリペプチド活性の評価
１． インビトロアッセイ
ａ． 翻訳後改変
ｂ． タンパク質分解活性
ｃ． 凝固活性
ｄ． 他のタンパク質による結合および／または阻害
ｅ． リン脂質結合性
２． 非ヒト動物モデル
３． 臨床アッセイ
Ｇ． 製剤および投与
１． 製剤
ａ． 投薬量
ｂ． 剤形
２． 改変ＦＶＩＩポリペプチドの投与
３． 改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードする核酸の投与（遺伝子治療）
Ｈ． 治療上の使用
１． 先天性の出血障害
ａ． 血友病
ｂ． ＦＶＩＩ欠乏症
ｃ． 他
２． 後天性の出血障害
ａ． 化学療法による後天性の血小板減少症
ｂ． 他の凝固障害
ｃ． 移植による後天性の出血
ｄ． 抗凝固療法誘発性の出血
ｅ． 後天性血友病
３． 外傷および手術による出血
Ｉ． 併用療法
Ｊ． 製品およびキット
Ｋ． 実施例

Ａ． 定義
他に特に定義されていない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、（１つまたは複数の）本発明が属する当技術分野の熟練者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書における全開示を通して言及されるすべての特許、特許出願、公開出願、および刊行物、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、データベース、ウェブサイト、ならびに他の出版物は、他に特に述べられていない限り、それらの全体が参照によって組み込まれる。本明細書における用語について、複数の定義がある場合、本部における定義が優先される。ＵＲＬまたは他のそのような識別子もしくはアドレスが言及される場合、そのような識別子は、変わり得るものであり、インターネット上の特定の情報は、絶えず入れ替わり得るが、等価な情報を、インターネットを検索することによって見つけることができることを理解されたい。インターネットへの参照は、そのような情報の有用性および公的な普及を証明する。

本明細書において使用されるように、凝固経路または凝固カスケードは、不溶性フィブリン血餅の形成に至る、一連の活性化事象を指す。凝固カスケードまたは凝固経路において、セリンプロテアーゼの不活性タンパク質（チモーゲンとも呼ばれる）は、１つまたは複数のペプチド結合の切断によって活性プロテアーゼに変換され、次いで、これは、カスケードにおける次のチモーゲン分子のための活性化プロテアーゼとして働く。カスケードの最終タンパク質分解工程において、フィブリノーゲンは、タンパク質分解によって、トロンビンによってフィブリンに切断され、次いで、これは、傷害の部位で架橋して、血餅を形成する。

本明細書において使用されるように、「止血」は、器官または身体部分における出血または血流の停止を指す。止血という用語は、血管傷害の後の失血を予防するための血液凝血から続く、組織修復の後の凝血の溶解の全プロセスを包含することができる。

本明細書において使用されるように、「凝血」または「凝固」は、不溶性フィブリン血餅の形成を指すまたは血液の凝固因子が、凝固カスケードにおいて相互作用し、不溶性フィブリン血餅の形成を最終的にもたらすプロセスを指す。

本明細書において使用されるように、「プロテアーゼ」は、共有結合性のペプチド結合の加水分解を触媒する酵素である。これらの名称は、チモーゲン形態ならびにその活性化一本鎖形態、活性化二本鎖形態、および活性化多重鎖形態を含む。明確にするために、プロテアーゼに対する言及は、すべての形態を指す。プロテアーゼは、たとえば、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼをそれらの活性部位の触媒活性および標的基質のペプチド結合を切断するメカニズムに依存して含む。

本明細書において使用されるように、セリンプロテアーゼまたはセリンエンドペプチダーゼは、ペプチダーゼのクラスを指し、これらは、酵素の活性部位におけるセリン残基の存在によって特徴づけられる。セリンプロテアーゼは、原核生物および真核生物における消化酵素として機能するだけではなく、血液凝血および炎症を含む身体における広範囲の機能に関与する。セリンプロテアーゼによる切断のメカニズムは、セリンによる、標的ペプチド結合の求核攻撃に基づく。システイン、トレオニン、もしくはアスパラギン酸と結合した水分子、または金属もまた、この役割を果たすことができる。セリン、ヒスチジン、およびアスパラギン酸の一列に並んだ側鎖は、ほとんどのセリンプロテアーゼに共通の触媒３残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄ）を形成する。セリンプロテアーゼの活性部位は、ポリペプチド基質が結合するくぼみとして形づくられる。

本明細書において使用されるように、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ、Ｆ７；第７因子、凝固第ＶＩＩ因子、血清第ＶＩＩ因子、血清プロトロンビン転換促進因子、ＳＰＣＡ、プロコンベルチン、およびエプタコグアルファとも呼ばれる）は、凝固カスケードの一部であるセリンプロテアーゼを指す。ＦＶＩＩは、Ｇｌａドメイン、２つのＥＧＦドメイン（ＥＧＦ−１およびＥＧＦ−２）、ならびにたとえばキモトリプシンとなど、セリンプロテアーゼのペプチダーゼＳ１ファミリーのすべてのメンバーの中で高度に保存されているセリンプロテアーゼドメイン（またはペプチダーゼＳ１ドメイン）を含む。シグナルペプチドおよびプロペプチドを有する例示的な前駆体ＦＶＩＩの配列は、配列番号１において記載される。例示的な成熟ＦＶＩＩポリペプチドは、配列番号３において記載される。ＦＶＩＩは、一本鎖チモーゲン、チモーゲン様二本鎖ポリペプチド、および完全に活性化された二本鎖形態として生じる。完全な活性化は、チモーゲン様の形態からのコンホメーションの変化に際して生じるが、補因子組織因子への結合に際して生じる。また、組織因子の非存在下においてコンホメーション変化をもたらす突然変異を導入することもできる。したがって、ＦＶＩＩに対する言及は、その一本鎖形態ならびにチモーゲン様二本鎖形態および完全に活性化された二本鎖形態を含む二本鎖形態を含む。

ＦＶＩＩポリペプチドに対する言及はまた、一本鎖形態または二本鎖形態、活性を有するその切断形態をした前駆体ポリペプチドおよび成熟ＦＶＩＩポリペプチドをも含み、配列番号１において記載される前駆体ポリペプチドに対して、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドまたはその成熟形態を含む、対立遺伝子変異体および種変異体、スプライス変異体によってコードされる変異体、ならびに他の変異体をも含む。配列番号１１３および２７３のポリペプチドならびにその変異体などのような改変ＦＶＩＩポリペプチドが含まれる。ＦＶＩＩのＴＦ結合性、第Ｘ因子結合性、リン脂質結合性、および／または血液凝固活性などのような、ＦＶＩＩの少なくとも１つの活性を保持するものもまた含まれる。活性を保持することによって、活性は、保持される活性のレベルが、検出可能な効果を得るのに十分である限り、野生型ＦＶＩＩと比較して、低下させるまたは増加させるなど、変化させることができる。ＦＶＩＩポリペプチドは、組織特異的アイソフォームおよびその対立遺伝子変異体、核酸の翻訳によって調製される合成分子、組換え法を通しての、より短いポリペプチドのライゲーションを含む合成などのような化学合成によって生成されるタンパク質、ヒトおよび非ヒトの組織および細胞から単離されるタンパク質、キメラＦＶＩＩポリペプチド、ならびにその改変形態を含むが、これらに限定されない。ＦＶＩＩポリペプチドはまた、十分な長さであり、または完全長成熟ポリペプチドの少なくとも１つの活性（必要に応じて、活性化に際して）を保持するのに適切な領域を含む、ＦＶＩＩの断片または部分をも含む。ＦＶＩＩポリペプチドはまた、化学改変または翻訳後改変を含有するものおよび化学改変または翻訳後改変を含有しないものをも含む。そのような改変は、ペグ化、アルブミン化、グリコシル化、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、および当技術分野において知られている他のポリペプチド改変を含むが、これらに限定されない。

例示的なＦＶＩＩポリペプチドは、ヒトを含む哺乳動物起源のものである。ヒト起源のＦＶＩＩの例示的なアミノ酸配列は、配列番号１、２、および３において記載される。そのようなヒトＦＶＩＩポリペプチドの例示的な変異体は、配列番号１８〜７４において記載される前駆体ポリペプチドのいずれかを含む。ＦＶＩＩポリペプチドはまた、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、トリ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、魚、カエル、および他の霊長動物の第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含むが、これらに限定されない非ヒト起源のいずれかを含む。非ヒト起源の例示的なＦＶＩＩポリペプチドは、たとえば、雌ウシ（ボース タウルス（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、配列番号４）、マウス（ムス ムスクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、配列番号５）、ピグミーチンパンジー（パン パニスクス（Ｐａｎ ｐａｎｉｓｃｕｓ）、配列番号６）、チンパンジー（パン トログロディテス（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）、配列番号７）、ウサギ（オリクトラガス クニクラス（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）、配列番号８）、ラット（ラッタス ノルベジクス（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、配列番号９）、アカゲザル（マカク ムラッタ（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）、配列番号１０）、ブタ（サス スクロファ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）、配列番号１１）、イヌ（カニス ファミリアリス、配列番号１２）、ゼブラフィッシュ（ブラキダニオ レリオ（Ｂｒａｃｈｙｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）、配列番号１３）、日本フグ（フグ ルブリペス（Ｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ）、配列番号１４）、ニワトリ（ガルス ガルス（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）、配列番号１５）、オランウータン（ポンゴ ピュグマエウス（Ｐｏｎｇｏ ｐｙｇｍａｅｕｓ）、配列番号１６）、およびゴリラ（ゴリラ ゴリラ、配列番号１７）を含む。

当業者は、成熟第ＶＩＩ因子ポリペプチド（配列番号３）の参照位置が、シグナルペプチド配列およびプロペプチド配列を含有するアイソフォームａ第ＶＩＩ因子ポリペプチドである、配列番号１において記載されるアイソフォームａ前駆体ＦＶＩＩポリペプチドと比較した場合、６０アミノ酸残基分異なることを認識する。したがって、配列番号３の第１のアミノ酸残基は、配列番号１の６１番目の（第６１の）アミノ酸残基「に対応する」。当業者はまた、成熟第ＶＩＩ因子ポリペプチド（配列番号３）の参照位置が、シグナルペプチド配列およびプロペプチド配列を含有するアイソフォームｂ第ＶＩＩ因子ポリペプチドである、配列番号２において記載される前駆体ＦＶＩＩポリペプチドと比較した場合、３８アミノ酸残基分異なることをも認識する。したがって、配列番号３の第１のアミノ酸残基は、配列番号２の３９番目の（第３９の）アミノ酸残基「に対応する」。

本明細書において使用されるように、対応する残基は、アライメントされた場所に生じる残基を指す。関連ポリペプチドまたは変異ポリペプチドは、当業者らに知られている任意の方法によってアライメントされる。そのような方法は、典型的には、マッチを最大限にし、マニュアルアライメントを使用する、ならびに入手可能な多数のアライメントプログラム（たとえばＢＬＡＳＴＰ）および当業者らに知られている他のものを使用することなどによる方法を含む。ポリペプチドの配列をアライメントすることによって、当業者は、指標として、保存アミノ酸残基および同一アミノ酸残基を使用して、対応する残基を同定することができる。たとえば、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの配列をアライメントすることによって、当業者は、指標として、保存アミノ酸残基および同一アミノ酸残基を使用して、対応する残基を同定することができる。たとえば、配列番号３（成熟第ＶＩＩ因子）のアミノ酸位置１（Ａ１）におけるアラニンは、配列番号１のアミノ酸位置６１（Ａ６１）におけるアラニンおよび配列番号２のアミノ酸位置３９（Ａ３９）におけるアラニンに対応する。他の場合において、対応する領域を、同定することができる。たとえば、Ｇｌａドメインは、配列番号３のアミノ酸位置Ａ１からＦ４５に、配列番号１のアミノ酸位置Ａ６１からＳ１０５、および配列番号２のアミノ酸位置Ａ３９からＳ８３に対応する。当業者はまた、ヒト配列および非ヒト配列の間ならびにそれらの中の対応するアミノ酸残基を見つけるために、指標として保存アミノ酸残基を利用することができる。たとえば、配列番号３（ヒト）のアミノ酸残基Ｓ４３およびＥ１６３は、配列番号４（ウシ）のＳ８３およびＥ２０３に対応する。対応する位置はまた、たとえばタンパク質構造のコンピューター模擬アラインメントを使用することによる構造のアラインメントに基づくものとすることができる。他の場合において、対応する領域を同定することができる。

本明細書において使用されるように、「プロ領域」、「プロペプチド」、または「プロ配列」は、切断されて、成熟タンパク質を産生する領域またはセグメントを指す。これは、触媒機構を遮蔽し、したがって、触媒中間体の形成を予防することによって（つまり基質結合部位を立体的に閉鎖することによって）、タンパク質分解活性を抑制するように機能するセグメントを含むことができる。プロ領域は、成熟した生物学的活性ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸の配列であり、わずか少数のアミノ酸でもあり得、または多重ドメイン構造でもあり得る。

本明細書において使用されるように、「成熟第ＶＩＩ因子」は、シグナル配列およびプロペプチド配列を欠くＦＶＩＩポリペプチドを指す。典型的には、シグナル配列は、小胞体（ＥＲ）−ゴルジ経路を介しての分泌のためのタンパク質を標的にし、翻訳の間のＥＲへの挿入の後に切断される。プロペプチド配列は、典型的には、タンパク質の翻訳後改変において機能し、細胞からのタンパク質の分泌前に切断される。したがって、成熟ＦＶＩＩポリペプチドは、典型的には、分泌タンパク質である。一例において、成熟ヒトＦＶＩＩポリペプチドは、配列番号３において記載される。配列番号３において記載されるアミノ酸配列は、配列番号３が、配列番号１および２のアミノ酸残基１〜２０に対応するシグナル配列を欠き、また、配列番号１のアミノ酸残基２１〜６０および配列番号２のアミノ酸残基２１〜３８に対応するプロペプチド配列をも欠くという点で、配列番号１および２において記載される前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列と異なる。成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対する言及は、一本鎖チモーゲン形態および二本鎖形態を包含する。

本明細書において使用されるように、ＦＶＩＩに関しての「野生型」および「天然」は、自然界においてヒトおよび他の動物を含む生物において存在する対立遺伝子変異体を含む、天然ＦＶＩＩ遺伝子または天然に存在するＦＶＩＩ遺伝子によってコードされるＦＶＩＩポリペプチドを指す。種に無関係の野生型第ＶＩＩ因子に対する言及は、野生型第ＶＩＩ因子の任意の種を包含するように意図される。コード前駆体ポリペプチド、その断片、ならびにシグナルペプチドを欠く成熟形態およびその任意の翻訳前または翻訳後処理形態または修飾形態などのようなその処理形態が、野生型ＦＶＩＩポリペプチドの中に含まれる。グリコシル化、カルボキシル化、およびヒドロキシル化による修飾を含むが、これらに限定されない、翻訳後修飾されるものもまた、天然ＦＶＩＩポリペプチドの中に含まれる。天然ＦＶＩＩポリペプチドはまた、一本鎖形態および二本鎖形態をも含む。たとえば、ヒトは、天然ＦＶＩＩを発現する。例示的な野生型ヒトＦＶＩＩのアミノ酸配列は、配列番号１、２、３において記載され、対立遺伝子変異体は、配列番号４４〜１００において記載され、その成熟形態。雌ウシ（ボース タウルス、配列番号４）、マウス（ムス ムスクルス、配列番号５）、ピグミーチンパンジー（パン パニスクス、配列番号６）、チンパンジー（パン トログロディテス、配列番号７）、ウサギ（オリクトラガス クニクラス、配列番号８）、ラット（ラッタス ノルベジクス、配列番号９）、アカゲザル（マカク ムラッタ、配列番号１０）、ブタ（サス スクロファ、配列番号１１）、イヌ（カニス ファミリアリス、配列番号１２）、ゼブラフィッシュ（ブラキダニオ レリオ、配列番号１３）、日本フグ（フグ ルブリペス、配列番号１４）、ニワトリ（ガルス ガルス、配列番号１５）、オランウータン（ポンゴ ピュグマエウス、配列番号１６）、およびゴリラ（ゴリラ ゴリラ、配列番号１７）を含むが、これらに限定されない他の動物は、天然ＦＶＩＩを産生する。

本明細書において使用されるように、種変異体は、マウスおよびヒトなどのような異なる哺乳動物種を含む様々な種の中のポリペプチドにおける変異体を指す。

本明細書において使用されるように、対立遺伝子変異体は、同じ種のメンバーの中のタンパク質における変異を指す。

本明細書において使用されるように、スプライス変異体は、複数の種類のｍＲＮＡをもたらす、ゲノムＤＮＡの転写一次産物の示差的プロセシング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）によって産生される変異体を指す。

本明細書において使用されるように、チモーゲンは、活性化切断などのような成熟切断を含むタンパク質分解による切断ならびに／または他のタンパク質（１つもしくは複数）および／または補因子（１つもしくは複数）との複合体形成によって活性化されるプロテアーゼを指す。チモーゲンは、タンパク質分解酵素の不活性前駆体である。そのような前駆体は、必ずしも大きいというわけではないが、活性形態よりも一般に大きい。セリンプロテアーゼに関して、チモーゲンは、触媒切断および自己触媒切断を含む特異的な切断によってまたは活性酵素を生成する活性化補因子の結合によって活性酵素に変換される。たとえば、一般に、チモーゲンは、一本鎖形態をしている。チモーゲンは、一般に、不活性であり、１つまたは複数のタンパク質分解部位での触媒切断または自己触媒切断によって成熟活性ポリペプチドに変換されて、二本鎖などのような多重鎖ポリペプチドを生成することができる。したがって、チモーゲンは、活性化因子の作用によってタンパク質分解酵素に変換される酵素的に不活性なタンパク質である。切断は、自己活性化によって達成することができる。多くの凝固タンパク質は、チモーゲンであり、それらは不活性であるが、血管損傷の後の凝固系の開始に際して切断され、活性化されるようになる。ＦＶＩＩに関して、ＦＶＩＩポリペプチドは、たとえば、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）、活性化第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）、トロンビンなどのようなプロテアーゼによって切断されるまでまたは自己活性化によって切断されるまで、チモーゲンとして血漿中に存在して、チモーゲン様の二本鎖形態を産生し、次いで、これは、完全な活性に向けて、さらなるコンホメーション変化を必要とする。

本明細書において使用されるように、「チモーゲン様」タンパク質またはポリペプチドは、タンパク質分解による切断によって活性化されているが、たとえば低い活性もしくは無活性またはタンパク質のチモーゲン形態のコンホメーションに類似するコンホメーションなどのような、チモーゲンと関連する特性をなお示すタンパク質を指す。たとえば、組織因子に結合しない場合、ＦＶＩＩの二本鎖活性化形態は、チモーゲン様タンパク質であり、それは、非切断ＦＶＩＩチモーゲンに類似するコンホメーションを保持し、したがって、非常に低い活性を示す。組織因子への結合に際して、ＦＶＩＩの二本鎖活性化形態は、コンホメーションの変化を起こし、凝固因子としてのその完全な活性を獲得する。

本明細書において使用されるように、活性化配列は、活性プロテアーゼを形成するために、活性化切断または成熟切断に必要とされる部位である、チモーゲンにおけるアミノ酸の配列を指す。活性化配列の切断は、自己触媒によってまたは活性化パートナーによって触媒することができる。

本明細書において使用されるように、活性化切断は、一種の成熟切断であり、これは、完全な酵素活性の発達に必要とされるコンホメーション変化を誘発する。これは、たとえば、切断により、キモトリプシンにおけるＡｓｐ１９４などのような、プロテアーゼの保存領域と相互作用して、活性に必要とされるコンホメーション変化を誘発する新しいＮ−末端を生成するセリンプロテアーゼについての古典活性化経路である。活性化は、プロテアーゼの多重鎖形態の産生をもたらし得る。いくつかの場合において、プロテアーゼの一本鎖形態は、タンパク質分解活性を示すことができる。

本明細書において使用されるように、「活性化第ＶＩＩ因子」または「ＦＶＩＩａ」は、ＦＶＩＩポリペプチドの任意の二本鎖形態を指す。二本鎖形態は典型的にタンパク質分解による切断に起因するが、合成によって産生することができる。活性化第ＶＩＩ因子は、したがって、低い血液凝固活性を有するチモーゲン様の二本鎖形態、組織因子への結合に際して生じる、完全に活性化された形態（約１０００倍高い活性）、および完全に活性化された二本鎖形態で存在するまたは完全に活性化された形態へのコンホメーション変化を起こす突然変異形態を含む。たとえば、ＦＶＩＩポリペプチドの一本鎖形態（たとえば配列番号３を参照されたい）は、成熟ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸残基Ｒ１５２およびＩ１５３の間でタンパク質分解によって切断される。切断産物、ＦＶＩＩ重鎖およびＦＶＩＩ軽鎖は、ジスルフィド結合によって共に保持されるが（配列番号３のＦＶＩＩにおけるアミノ酸残基Ｃ１３５およびＣ２６２の間で）、二本鎖活性化ＦＶＩＩ酵素を形成する。タンパク質分解による切断は、たとえば、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）、活性化第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）、トロンビン、または自己活性化によって実行することができる。

本明細書において使用されるように、ＦＶＩＩポリペプチドの「特性」は、３次元構造、ｐＩ、半減期、コンホメーション、および他のそのような物理的特徴などのような物理的特性または構造的特性を指す。

本明細書において使用されるように、ＦＶＩＩポリペプチドの「活性」は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドによって示される任意の活性を指す。そのような活性は、インビトロおよび／またはインビボにおいて試験することができ、凝固活性もしくは血液凝固活性、凝血促進活性、第Ｘ因子（ＦＸ）活性化もしくは第ＩＸ因子（ＦＩＸ）活性化を達成するなどのようなタンパク質分解活性もしくは触媒活性；抗原性（抗ＦＶＩＩ抗体に結合する能力もしくはそれへの結合についてあるポリペプチドと競合する能力）；組織因子、第Ｘ因子、もしくは第ＩＸ因子に結合する能力；および／またはリン脂質に結合するための能力を含むが、これらに限定されない。活性は、たとえば、インビトロにおいてまたはインビボにおいて凝固を測定することによって、承認されるアッセイを使用して、インビトロにおいてまたはインビボにおいて評価することができる。そのようなアッセイの結果は、ポリペプチドが、インビボにおけるポリペプチドの活性に相互に関連し得る活性を示すことを示し、インビボ活性は、生物学的活性とも呼ぶことができる。ＦＶＩＩの改変形態の機能性または活性を決定するためのアッセイは、当業者らに知られている。ＦＶＩＩポリペプチドの活性を評価するための例示的なアッセイは、血液凝固活性を評価するためのプロトロンボプラスチン時間（ＰＴ）アッセイもしくは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイまたは触媒活性もしくはタンパク質分解活性を評価するための、下記の実施例において記載されるものなどのような、合成基質を使用する発色アッセイを含む。

本明細書において使用されるように、「少なくとも１つの活性を示す」または「少なくとも１つの活性を保持する」は、同じ条件下で同じ形態の非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較した、改変ＦＶＩＩポリペプチドによって示される活性を指す。たとえば、二本鎖形態の改変ＦＶＩＩポリペプチドは、同じ実験条件下で、二本鎖形態の非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較され、２つのポリペプチドの間の唯一の差異は、研究下の改変である。他の例において、一本鎖形態の改変ＦＶＩＩポリペプチドは、同じ実験条件下で、一本鎖形態の非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較され、２つのポリペプチドの間の唯一の差異は、研究下の改変である。典型的には、同じ形態の非改変ＦＶＩＩポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持するまたは示す改変ＦＶＩＩポリペプチドは、インビボにおいて投与された場合、改変ＦＶＩＩポリペプチドが、凝血促進治療薬として治療的に有効となるのに十分な量の活性を保持する。一般に、凝血促進薬として治療的効能を保持するための改変ＦＶＩＩポリペプチドについて、保持される活性の量は、凝血促進薬として治療的効能を示す同じ形態の非改変ＦＶＩＩポリペプチドの活性の０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、もしくはそれ以上またはその前後である。必要であれば、凝血促進薬としての治療的効能を維持するために必要とされる活性の量は、経験的に決定することができる。典型的には、活性の０．５％〜２０％、０．５％〜１０％、０．５％〜５％の保持は、インビボにおいて凝血促進薬としての治療的効能を保持するのに十分である。

改変ＦＶＩＩポリペプチドによって示されるまたは保持される活性は、凝固活性もしくは血液凝固活性、凝血促進活性；第Ｘ因子（ＦＸ）活性化もしくは第ＩＸ因子（ＦＩＸ）活性化を達成するなどのようなタンパク質分解活性もしくは触媒活性；抗原性（抗ＦＶＩＩ抗体に結合する能力もしくはそれへの結合についてあるポリペプチドと競合する能力）；組織因子、第Ｘ因子、もしくは第ＩＸ因子に結合する能力；および／またはリン脂質に結合するための能力を含むが、これらに限定されない、任意の活性とすることができることが理解されたい。いくつかの場合において、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加した活性を保持し得る。いくつかの場合において、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、減少した活性を保持することができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドの活性は、問題の改変を含有していないポリペプチドと比較して１％の活性、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の活性を含むが、これらに限定されない、非改変ポリペプチドの活性の任意のレベルの百分率とすることができ、両方のポリペプチドは、同じ形態をしている。たとえば、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、同じ形態をした非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加したまたは減少した活性を示すことができる。たとえば、それは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドの少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％の活性を保持することができる。他の実施形態において、活性における変化は、非改変ＦＶＩＩよりも、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、またはそれ以上大きい。保持されることとなる特定のレベルは、ポリペプチドの意図される使用についての関数であり、経験的に決定することができる。活性は、たとえば、本明細書においてまたは下記の実施例において記載されるものなどのようなインビトロアッセイまたはインビボアッセイを使用して、測定することができる。

本明細書において使用されるように、「凝固活性」または「血液凝固活性」または「凝血促進活性」は、ポリペプチドが凝固を達成する能力を指す。血液凝固活性を評価するためのアッセイは、当業者らに知られており、プロトロンボプラスチン時間（ＰＴ）アッセイまたは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイを含む。

本明細書において使用されるように、ＦＶＩＩに関しての「触媒活性」または「タンパク質分解活性」は、ＦＶＩＩタンパク質が、基質のタンパク質分解による切断を触媒する能力を指し、区別なく使用される。そのような活性を評価するためのアッセイは、当技術分野において知られている。たとえば、ＦＶＩＩのタンパク質分解活性は、Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａ（ＣＨ_３ＳＯ_２−Ｄ−ＣＨＡ−Ｂｕｔ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）などのような発色基質を使用して測定することができ、基質の切断は、吸光度によってモニターされ、基質加水分解の速度は、線形回帰によって決定される。

本明細書において使用されるように、ＦＶＩＩに関しての「内因活性」は、組織因子の非存在における、ＦＶＩＩタンパク質の触媒活性、タンパク質分解活性、および／または血液凝固活性を指す。

本明細書において使用されるように、ドメイン（典型的には、３またはそれ以上、一般に、５または７またはそれ以上のアミノ酸の配列）は、構造的におよび／または機能的に分子の他の部分と異なり、同定可能である、タンパク質またはコード核酸などのような分子の部分を指す。たとえば、ドメインは、１つもしくは複数の構造モチーフから構成される、タンパク質内で独立して折り畳まれた構造を形成することができるおよび／またはタンパク質分解活性などのような機能的活性により認識されるポリペプチド鎖のそれらの部分を含む。タンパク質は、１つまたは複数の異なるドメインを有することができる。たとえば、ドメインは、プロテアーゼドメインまたはｇｌａドメインを規定するモチーフに対する相同性などのような、関連するファミリーメンバーに対する、その中の配列の相同性によって、同定し、規定し、または区別することができる。他の例において、ドメインは、タンパク質分解活性などその機能によって、またはＤＮＡ結合、リガンド結合、および二量体化など、生体分子と相互作用する能力によって区別することができる。ドメインは、ドメインが、独立してまたは他の分子に融合して、たとえばタンパク質分解活性またはリガンド結合などのような活性を実行することができるように、独立して、生物学的機能または生物学的活性を示すことができる。ドメインは、アミノ酸の線状配列またはアミノ酸の非線状配列とすることができる。多くのポリペプチドは、複数のドメインを含有する。そのようなドメインは、知られており、当業者らによって同定することができる。本明細書における例証のために、規定は、提供されるが、名称によって特定のドメインを認識することは、当技術分野における技術の範囲内に十分にあることが理解されたい。必要に応じて、適切なソフトウェアを、ドメインを同定するために利用することができる。

本明細書において使用されるように、プロテアーゼドメインは、プロテアーゼの触媒活性部分である。プロテアーゼのプロテアーゼドメインに対する言及は、これらのタンパク質のいずれかの一本鎖形態、二本鎖形態、および多重鎖形態を含む。タンパク質のプロテアーゼドメインは、たとえば触媒中心などのような、そのタンパク質分解活性に必要とされる、そのタンパク質の必須の特性をすべて含有する。ＦＶＩＩに関して、プロテアーゼドメインは、触媒３残基を含めて、キモトリプシン／トリプシンファミリープロテアーゼドメインと、相同性および構造的特徴を共有する。たとえば、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドにおいて、プロテアーゼドメインは、アミノ酸位置１５３〜３９２に対応する。

本明細書において使用されるように、ガンマ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメインは、タンパク質、たとえば、Ｇｌａを形成するためのビタミンＫ依存性カルボキシル化による、グルタミン酸残基、一般に、すべてではないが、ほとんどのグルタミン酸残基の翻訳後改変を含有するビタミンＫ依存性タンパク質の部分を指す。Ｇｌａドメインは、カルシウムイオンの高親和性結合および負電荷リン脂質に対する結合を担う。典型的には、Ｇｌａドメインは、ビタミンＫ依存性タンパク質の成熟形態のＮ−末端で始まり、保存芳香族残基で終わる。成熟ＦＶＩＩポリペプチドにおいて、Ｇｌａドメインは、配列番号３において記載される例示的なポリペプチドのアミノ酸位置１〜４５に対応する。Ｇｌａドメインは、十分に知られており、それらの場所は、特定のポリペプチドにおいて同定することができる。様々なビタミンＫ依存性タンパク質のＧｌａドメインは、Ｎ−末端の疎水性残基の、細胞膜上の負電荷リン脂質との相互作用を媒介する疎水性パッチへのクラスタリングを含む、配列、構造的相同性、および機能的相同性を共有する。例示的な他のＧｌａ含有ポリペプチドは、ＦＩＸ、ＦＸ、プロトロンビン、プロテインＣ、プロテインＳ、オステオカルシン、マトリックスＧｌａタンパク質、増殖停止特異的タンパク質６（Ｇａｓ６）、およびプロテインＺを含むが、これらに限定されない。これらおよび他の例示的なタンパク質のＧｌａドメインは、配列番号８３〜９４のいずれかにおいて記載される。

本明細書において使用されるように、Ｇｌａドメインに関しての「天然」または「内因性」は、Ｇｌａドメインを有するポリペプチドのすべてまたは一部と関連する天然に存在するＧｌａドメインを指す。本明細書における目的上、天然Ｇｌａドメインは、ＦＶＩＩポリペプチドに関してのものである。たとえば、配列番号９２において記載されるＦＶＩＩの天然Ｇｌａドメインは、配列番号３において記載されるアミノ酸の配列のアミノ酸１〜４５に対応する。

本明細書において使用されるように、異種Ｇｌａドメインは、ＦＶＩＩ Ｇｌａドメインでない、同じまたは異なる種に由来するポリペプチドに由来するＧｌａドメインを指す。例示的な異種Ｇｌａドメインは、ＦＩＸ、ＦＸ、プロトロンビン、プロテインＣ、プロテインＳ、オステオカルシン、マトリックスＧｌａタンパク質、増殖停止特異的タンパク質６（Ｇａｓ６）、およびプロテインＺを含むが、これらに限定されないＧｌａ含有ポリペプチドに由来するＧｌａドメインである。これらおよび他の例示的なタンパク質のＧｌａドメインは、配列番号８３〜９１、９３、および９４のいずれかにおいて記載される。

本明細書において使用されるように、Ｇｌａドメインの連続(contiguous)部分は、少なくとも２つ以上の近接アミノ酸、典型的には、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、３０、４０、またはそれ以上の、すべてのアミノ酸までの、Ｇｌａドメインを構成するアミノ酸を指す。

本明細書において使用されるように、「リン脂質結合を達成するのに十分な、Ｇｌａドメインの部分」は、少なくとも１つのアミノ酸、典型的には、２、３、４、５、６、８、１０、１５、またはそれ以上の、ドメインのアミノ酸を含むが、そのような部分を含有するポリペプチドが、リン脂質結合を示す限り、ドメインを構成するアミノ酸のすべてよりも少ないアミノ酸を含む。

本明細書において使用されるように、Ｇｌａドメインに関しての「交換する」または「Ｇｌａドメインｓｗａｐ」は、タンパク質の内因性Ｇｌａドメインが、他のタンパク質のＧｌａドメインと、組換え法、合成法、または他の方法を使用して交換されるプロセスを指す。「Ｇｌａドメインｓｗａｐ」との関連において、「Ｇｌａドメイン」は、リン脂質結合活性を保持するのに十分な、Ｇｌａドメインおよび近接領域に由来するアミノ酸の任意の選択物である。典型的には、Ｇｌａドメインｓｗａｐは、内因性タンパク質の４０〜５０のアミノ酸の、他のタンパク質の４０〜５０のアミノ酸との交換を伴うであろうが、より少ないまたはより多くのアミノ酸を伴うことができる。

本明細書において使用されるように、上皮成長因子（ＥＧＦ）ドメイン（ＥＧＦ−１またはＥＧＦ−２）は、上皮成長因子（ＥＧＦ）配列の特異的な３０〜４０のアミノ酸部分に対して配列相同性を共有する、タンパク質の部分を指す。ＥＧＦドメインは、ジスルフィド結合に関与することが示された（ＥＧＦにおいて）、６つのシステイン残基を含む。ＥＧＦドメインの主な構造は、Ｃ−末端の短い二本鎖シートまでのループが後続する二本鎖ベータシートである。ＦＶＩＩは、２つのＥＧＦドメイン：ＥＧＦ−１およびＥＧＦ−２を含有する。これらのドメインは、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドの、アミノ酸位置４６〜８２および８７〜１２８にそれぞれ対応する。

本明細書において使用されるように、「非改変ポリペプチド」または「非改変ＦＶＩＩ」およびその文法的な変化形は、本明細書において提供される改変のために選択される出発ポリペプチドを指す。出発ポリペプチドは、ポリペプチドの天然に存在する野生型形態とすることができる。さらに、出発ポリペプチドは、それが天然野生型アイソフォームと異なるように変化させるまたは変異させることができるが、それにもかかわらず、本明細書において産生され、引き続いて改変されるポリペプチドと比較して、出発非改変ポリペプチドと本明細書において呼ばれる。したがって、非改変参照タンパク質と比較して、特定の活性または特性における望ましい増加または減少を有するように改変された、当技術分野において知られている既存のタンパク質を選択し、出発非改変ポリペプチドとして使用することができる。たとえば、アミノ酸残基またはグリコシル化を変化させるための残基における変化などのように、１つまたは複数の単一のアミノ酸変化によってその天然形態から改変され、望ましい特性における増加または減少のいずれかを有するタンパク質は、同じまたは異なる特性のさらなる改変のための、本明細書において非改変と呼ばれる、標的タンパク質とすることができる。当技術分野において知られている例示的な改変ＦＶＩＩポリペプチドは、たとえば、米国特許第５５８０５６０号、第６０１７８８２号、第６６９３０７５号、第６７６２２８６号、および第６８０６０６３号、米国特許出願公開第２００３０１００５０６号および第２００４０２２０１０６号、ならびに国際特許出願公開ＷＯ１９８８０１０２９５、ＷＯ２００１８３７２５、ＷＯ２００３０９３４６５、ＷＯ２００３３８１６２、ＷＯ２００４０８３３６１、ＷＯ２００４１０８７６３、ＷＯ２００４０２９０９０、ＷＯ２００４０２９０９１、ＷＯ２００４１１１２４２、およびＷＯ２００５１２３９１６において記載される任意のＦＶＩＩポリペプチドを含む。

本明細書において使用されるように、「改変第ＶＩＩ因子ポリペプチド」および「改変第ＶＩＩ因子」は、非改変第ＶＩＩ因子ポリペプチドと比較して、１つまたは複数のアミノ酸の差異を有するＦＶＩＩポリペプチドを指す。１つまたは複数のアミノ酸の差異は、１つもしくは複数のアミノ酸交換（置換）、アミノ酸挿入、もしくはアミノ酸欠失などのようなアミノ酸突然変異でもあり得、または全ドメインの挿入もしくは欠失およびその任意の組み合わせでもあり得る。典型的には、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、一次配列における１つまたは複数の改変を有する。たとえば、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、またはそれ以上のアミノ酸の差異を有することができる。結果として生じるポリペプチドが、たとえば触媒活性、タンパク質分解活性、ＴＦに結合する能力、または活性化血小板に結合する能力などのような、天然ＦＶＩＩポリペプチドと関連する、少なくとも１つのＦＶＩＩ活性を示す限り、任意の改変が企図される。

本明細書において使用されるように、「凝固の阻害因子」は、凝固または血餅形成を阻害するまたは予防するように作用するタンパク質または分子を指す。凝固の阻害または予防は、インビボにおいてまたはインビトロにおいて観察することができ、プロトロンボプラスチン時間（ＰＴ）アッセイまたは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイを含むが、これらに限定されない、当技術分野において知られている任意の方法を使用してアッセイすることができる。

本明細書において使用されるように、組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ、ＴＦＰＩ−１とも呼ばれる）は、ＦＶＩＩａの活性が阻害される、４つ一組のＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＴＦＰＩ／ＦＸａ阻害性複合体の形成に関与するＫｕｎｉｔｚ型阻害因子である。ＴＦＰＩは、選択的スプライシングの後に、２つの異なる前駆体形態、ＴＦＰＩα（配列番号７５）およびＴＦＰＩβ（配列番号７７）前駆体として発現され、これらは、分泌の間に切断されて、２７６アミノ酸（配列番号７６）および２２３アミノ酸（配列番号７８）の成熟タンパク質をそれぞれ生成する。ＴＦＰＩは、３つのＫｕｎｉｔｚドメインを含有し、これらのうちのＫｕｎｉｔｚ−１ドメインは、ＦＶＩＩａの結合および阻害を担う。

本明細書において使用されるように、ＴＦＰＩ−２（胎盤タンパク質５（ＰＰ５）およびマトリックス結合セリンプロテアーゼ阻害因子（ＭＳＰＩ）としても知られている）は、ＴＦＰＩの相同体を指す。２１３アミノ酸成熟ＴＦＰＩ−２タンパク質（配列番号７９）は、ＴＦＰＩ−１ Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン１、２、および３と、それぞれ、４３％、３５％、および５３％の一次配列同一性を示す３つのＫｕｎｉｔｚ型ドメインを含有する。ＴＦＰＩ−２は、細胞外マトリックスの消化およびリモデリングの調節において役割を果たし、凝固経路における重要な因子であると考えられない。

本明細書において使用されるように、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）は、セリンプロテアーゼ阻害因子（セルピン）である。ＡＴ−ＩＩＩは、分泌の間に切断されて、４３２アミノ酸の成熟アンチトロンビン（配列番号９６）を放出する、４６４アミノ酸残基（配列番号９５）を含有する前駆体タンパク質として合成される。

本明細書において使用されるように、補因子は、他の特異的なタンパク質または分子に結合して、活性複合体を形成するタンパク質または分子を指す。いくつかの例において、補因子への結合は、最適なタンパク質分解活性に必要とされる。たとえば、組織因子（ＴＦ）は、ＦＶＩＩａの補因子である。ＴＦへのＦＶＩＩａの結合は、その基質、ＦＸおよびＦＩＸに対するＦＶＩＩａの増加したタンパク質分解活性をもたらす、コンホメーションの変化を誘発する。

本明細書において使用されるように、組織因子（ＴＦ）は、ＦＶＩＩａに対する補因子として機能する、２６３アミノ酸の膜貫通糖タンパク質（配列番号９７）を指す。それは、平滑筋細胞および線維芽細胞によって恒常的に発現され、これらの細胞が、組織傷害の後に血流に接触した場合に、ＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａに結合することよって、凝固を開始するのを助ける。

本明細書において使用されるように、活性化血小板は、最終的に凝固を促進する、形態、表現型、および機能における様々な変化を起こす、コラーゲン、トロンボキサンＡ２、ＡＤＰ、およびトロンビンなどのような分子の結合によって誘発された血小板を指す。たとえば、活性化血小板は、指状の突起部（ｐｒｏｊｅｃｔｉｎｇ ｆｉｎｇｅｒ）を有する、より無定形な形態に形状が変化する。活性化血小板はまた、ホスファチジルセリンおよび細胞膜の内側の葉状部において通常存在する他の負電荷リン脂質が、外側の血漿の方を向く表面に移動する、細胞膜の「ｆｌｉｐ」をも起こす。活性化血小板のこれらの膜は、凝固カスケードの多くの反応が達成される表面を提供する。活性化血小板はまた、ｖＷＦ、Ｆｖ、トロンビン、ＡＤＰ、およびトロンボキサンＡ２のような凝血促進因子を含有する小胞をも分泌し、互いに粘着して、フィブリンによって安定化されて、血餅になる血小板血栓を形成する。

本明細書において使用されるように、活性化血小板に対する増加した結合性および／または親和性ならびにその任意の文法的な変化形は、参照ポリペプチドまたは参照タンパク質と比較した、活性化血小板の表面に結合する、ポリペプチドまたはタンパク質、たとえばＦＶＩＩポリペプチドの増強した能力を指す。たとえば、改変ＦＶＩＩポリペプチドが活性化血小板に結合する能力は、非改変ＦＶＩＩポリペプチドが活性化血小板に結合する能力よりも大きくなり得る。活性化血小板に対するポリペプチドの結合性および／または親和性は、非改変ポリペプチドの結合性および／または親和性と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上、増加させることができる。活性化血小板に対するポリペプチドの結合性および／または親和性を決定するためのアッセイは、当技術分野において知られている。活性化血小板へのＦＶＩＩポリペプチドの結合は、ＦＶＩＩポリペプチドのＧｌａドメインにおけるアミノ酸および活性化血小板上のホスファチジルセリンなどのような負電荷リン脂質の相互作用を通して媒介される。そのため、ＦＶＩＩポリペプチドなどのようなポリペプチドの活性化血小板への結合をアッセイするための方法は、ホスファチジルセリンなどのようなリン脂質を含有する膜および小胞を使用する。たとえば、ポリペプチドが活性化血小板に結合する能力は、光散乱技術によって測定することができる、ポリペプチドがリン脂質小胞に結合する能力によって、反映される。

本明細書において使用されるように、リン脂質に対する増加した結合性および／または親和性ならびにその任意の文法的な変化形は、参照ポリペプチドまたは参照タンパク質と比較した、ポリペプチドまたはタンパク質がリン脂質に結合する、増強した能力を指す。リン脂質は、任意のリン脂質を含むことができるが、特に、ホスファチジルセリンを含むことができる。リン脂質に対するポリペプチドの結合性および／または親和性は、非改変ポリペプチドの結合性および／または親和性と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上、増加させることができる。リン脂質に対するポリペプチドの親和性および／または結合性を決定するためのアッセイは、当技術分野において知られている。たとえば、リン脂質小胞へのＦＶＩＩポリペプチドの結合は、入射光に対する９０°での相対的な光散乱によって決定することができる。リン脂質小胞単独でのおよびＦＶＩＩを有するリン脂質小胞での光散乱の強度は、解離定数を決定するために測定される。ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー機器でなどの表面プラズマ共鳴もまた、リン脂質膜に対するＦＶＩＩポリペプチドの親和性を測定するために使用することができる。

本明細書において使用されるように、阻害因子に対する増加した抵抗性または「ＡＴ−ＩＩＩに対する増加した抵抗性」または「ＴＦＰＩに対する増加した抵抗性」は、非改変ＦＶＩＩポリペプチドなどのような参照ポリペプチドと比較した、ＡＴ−ＩＩＩまたはＴＦＰＩなどのような阻害因子の阻害効果に対する、ポリペプチドの減少した感度の任意の量を指す。ＡＴ−ＩＩＩなどのような阻害因子に対する増加した抵抗性は、阻害因子への改変ＦＶＩＩポリペプチドの結合を評価することによってアッセイすることができる。ＡＴ−ＩＩＩなどのような阻害因子に対する増加した抵抗性はまた、ＡＴ−ＩＩＩの存在下において、ＦＶＩＩポリペプチドの内因活性または血液凝固活性を測定することによってアッセイすることもできる。阻害因子へのポリペプチドの結合を決定するためのアッセイは、当技術分野において知られている。たとえばＡＴ−ＩＩＩなどのような、共有結合性の阻害因子について、阻害に対する二次速度定数を測定することができる。たとえばＴＦＰＩなどのような、非共有阻害因子について、ｋ_ｉを測定することができる。さらに、ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー機器でなどの表面プラズマ共鳴もまた、ＡＴ−ＩＩＩまたは他の阻害因子に対するＦＶＩＩポリペプチドの結合を測定するために使用することができる。しかしながら、ＡＴ−ＩＩＩなどのような共有結合性の阻害因子については、ｏｎ速度のみを、ＢＩＡｃｏｒｅを使用して測定することができる。ＦＶＩＩ血液凝固活性または内因活性に対するたとえばＡＴ−ＩＩＩの阻害効果をまた決定するためのアッセイもまた、当技術分野において知られている。たとえば、改変ＦＶＩＩポリペプチドが、ＡＴ−ＩＩＩの存在下または非存在下においてその基質ＦＸを切断する能力を、測定することができ、ＡＴ−ＩＩＩが反応を阻害する程度を決定することができる。これは、ＡＴ−ＩＩＩの存在下または非存在下において、非改変ＦＶＩＩポリペプチドがその基質ＦＸを切断する能力と比較することができる。阻害因子に対する増加した抵抗性を示す改変ポリペプチドは、非改変ポリペプチドと比較した、たとえば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の阻害因子の効果に対する抵抗性の増加を示す。

本明細書において使用されるように、「Ｚｎ^２＋による阻害に対する増加した抵抗性」、「Ｚｎ^２＋の阻害効果に対する増加した抵抗性」、または「Ｚｎ^２＋に対する増加した抵抗性」は、非改変ＦＶＩＩポリペプチドなどのような参照ポリペプチドと比較した、Ｚｎ^２＋の阻害効果に対する、ポリペプチドの減少した感度の任意の量を指す。Ｚｎ^２＋に対する増加した抵抗性は、実施例１１において記載されるように、たとえば、Ｚｎ^２＋の存在下において、ＦＶＩＩポリペプチドの内因活性または血液凝固活性を測定することによって、アッセイすることができる。Ｚｎ^２＋の阻害効果に対する増加した抵抗性は、Ｚｎ^２＋に対する減少した結合性の結果となり得る。Ｚｎ^２＋に対する減少した結合性は、ＦＶＩＩａの分子当たりの結合したＺｎ^２＋の量を測定することによってまたはＦＶＩＩａに対するＺｎ^２＋の結合の親和性を測定することによってまたは亜鉛によるＦＶＩＩａ活性の阻害についてのＩＣ_５０を測定することによってアッセイすることができる。Ｚｎ^２＋の阻害効果に対して増加した抵抗性を示す改変ポリペプチドは、非改変ポリペプチドと比較した、たとえば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上のＺｎ^２＋の効果に対する抵抗性の増加を示す。

本明細書において使用されるように、血清アルブミン結合配列は、血清アルブミンへの結合を達成することができるアミノ酸残基の配列を指す。したがって、ＦＶＩＩポリペプチドの中に挿入された場合、血清アルブミン結合配列は、ＦＶＩＩポリペプチドの血清アルブミンに対する親和性またはそれへの結合を増強することができる。そのため、血清アルブミン結合配列を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドの能力は、血清アルブミンに対する増加した結合性および／または親和性を示すことができる。血清アルブミンに対する増加した結合性および／または親和性を示す改変ポリペプチドは、非改変ポリペプチドの結合性および／または親和性と比較して、たとえば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の増加を示す。典型的には、血清アルブミン結合配列は、少なくとも１０またはそれ以上のアミノ酸、典型的には、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、またはそれ以上のアミノ酸を含有する。例示的な血清アルブミン結合配列は、配列番号１０３〜１０９において記載されるものである。

本明細書において使用されるように、血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合配列は、血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３への結合を達成することができるアミノ酸残基の配列を指す。したがって、ＦＶＩＩポリペプチドの中に挿入された場合、血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合配列は、ＦＶＩＩポリペプチドが、血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３、そのため、活性化血小板を含む血小板に結合する能力を増強することができる。そのため、血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合配列を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドの能力は、血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３および／または血小板に対する増加した結合性および／または親和性を示すことができる。血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３に対する増加した結合性および／または親和性を示す改変ポリペプチドは、非改変ポリペプチドの結合性および／または親和性と比較して、たとえば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の増加を示す。典型的には、血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合配列は、少なくとも５つ以上のアミノ酸、典型的には、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、またはそれ以上のアミノ酸を含有する。例示的な血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合配列は、配列番号１１０〜１１２において記載されるものである。

本明細書において使用されるように、グリコシル化部位は、炭水化物部分を付加することができる、ポリペプチドにおけるアミノ位置を指す。典型的には、グリコシル化タンパク質は、炭水化物部分の付加のために、アスパラギンまたはセリンなどのような１つまたは複数のアミノ酸残基を含有する。

本明細書において使用されるように、天然グリコシル化部位は、炭水化物部分が野生型ポリペプチドにおいて付加されるアミノ位置を指す。ＦＶＩＩにおいて４つの天然グリコシル化部位がある；配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドにおけるアミノ酸位置に対応する、Ｎ１４５およびＮ３２２での２つのＮ−グリコシル化部位ならびにＳ５２およびＳ６０での２つのＯ−グリコシル化部位。

本明細書において使用されるように、非天然グリコシル化部位は、野生型ポリペプチドにおいて存在しない、改変ポリペプチドにおいて炭水化物部分が付加されるアミノ位置を指す。非天然グリコシル化部位は、アミノ酸交換によってＦＶＩＩポリペプチドの中に導入することができる。Ｏ−グリコシル化部位は、たとえば、天然残基のセリンまたはトレオニンとのアミノ酸交換によって、生成することができる。Ｎ−グリコシル化部位は、たとえば、モチーフＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｃｙｓを構築することによって、生成することができ、ここで、Ｘａａは、プロリンではない。アミノ酸改変によるこのコンセンサス配列の生成は、たとえば、天然アミノ酸残基のアスパラギンとの単一のアミノ酸交換、天然アミノ酸残基のセリン、トレオニン、もしくはシステインとの単一のアミノ酸交換、または天然残基のアスパラギンとの第１のアミノ酸交換および天然残基のセリン、トレオニン、もしくはシステインとの第２のアミノ酸交換を含む二重アミノ酸交換を含むことができる。

本明細書において使用されるように、「生物学的活性」は、化合物、組成物、または他の混合物のインビボ投与に際して結果として生じる、化合物のインビボ活性または生理学的応答を指す。したがって、生物学的活性は、そのような化合物、組成物、および混合物の治療上の効果および医薬活性を包含する。生物学的活性は、そのような活性を試験するまたは使用するために設計されるインビトロ系において観察することができる。したがって、本明細書における目的上、ＦＶＩＩポリペプチドの生物学的活性は、血液凝固活性を包含する。

本明細書において使用されるように、用語「評価する」およびその文法的な変化形は、ポリペプチドの活性についての絶対値を得るという意味でおよびまた活性のレベルを示す指数、比、百分率、視覚的または他の値を得るという意味でも、定量的決定および定質的決定を含むように意図される。評価は、直接的または間接的なものであってもよい。たとえば、ポリペプチドによる基質の切断の検出は、産物の直接的な測定によるものでもよく、または切断された基質の結果として生じる活性を決定することによって間接的に測定することもできる。

本明細書において使用されるように、「キモトリプシンナンバリング」は、配列番号８０の成熟キモトリプシンポリペプチドのアミノ酸ナンバリングを指す。たとえば第ＶＩＩ因子のプロテアーゼドメインなどのような他のプロテアーゼのプロテアーゼドメインのアラインメントは、キモトリプシンを用いてなすことができる。そのような場合、キモトリプシンのアミノ酸に対応する、第ＶＩＩ因子のアミノ酸は、キモトリプシンアミノ酸のナンバリングが与えられる。対応する位置は、マニュアルアライメントを使用してまたは入手可能な多数のアライメントプログラムを使用することによって（たとえばＢＬＡＳＴＰ）、当業者によるそのようなアライメントによって決定することができる。対応する位置はまた、たとえばタンパク質構造のコンピューター模擬アライメントを使用することによる構造のアライメントに基づくものとすることができる。ポリペプチドのアミノ酸が開示される配列におけるアミノ酸に対応するという記載は、ＧＡＰアルゴリズムなどのような標準的なアライメントアルゴリズムを使用して、同一性または相同性を最大にするための、開示される配列とのポリペプチドのアライメント（保存アミノ酸がアライメントする）に際して同定されるアミノ酸を指す。配列番号３において記載されるＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸位置１〜４０６の対応するキモトリプシンナンバーは、表１において提供される。配列番号３において記載される配列と比較したアミノ酸位置は、標準のフォント、それらの位置のアミノ酸残基は、太字、および対応するキモトリプシンナンバーは、イタリック体とする。たとえば、成熟キモトリプシン（配列番号８０）との成熟第ＶＩＩ因子（配列番号３）のアライメントに際して、第ＶＩＩ因子におけるアミノ酸位置１５３のイソロイシン（Ｉ）は、キモトリプシンナンバリングＩ１６が与えられる。続くアミノ酸は、それに応じてナンバリングされる。一例において、成熟第ＶＩＩ因子（配列番号３）のアミノ酸位置２１０のグルタミン酸（Ｅ）は、キモトリプシンナンバリングに基づいてアミノ酸位置Ｅ７０に対応する。残基が、プロテアーゼにおいて存在するが、キモトリプシンにおいて存在しない場合、アミノ酸残基は文字表記が与えられる。たとえば、キモトリプシンナンバリングに基づいたアミノ酸６０を有するループの一部であるが、キモトリプシンと比較して第ＶＩＩ因子配列の中に挿入された、キモトリプシンにおける残基は、たとえば、Ｋ６０ａ、Ｉ６０ｂ、Ｋ６０ｃ、またはＮ６０ｄと呼ばれる。これらの残基は、成熟第ＶＩＩ因子配列（配列番号３）と比較したナンバリングによって、Ｋ１９７、Ｉ１９８、Ｋ１９９、およびＮ２００にそれぞれ対応する。

本明細書において使用されるように、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびにペプチド核酸（ＰＮＡ）およびその混合物を含むその類似体を含む。核酸は、一本鎖または二本鎖とすることができる。蛍光または放射標識などの、検出可能な標識などを用いて所望により標識されるプローブまたはプライマーを指す場合、一本鎖分子が、企図される。そのような分子は、典型的には、それらの標的が、統計的にユニークとなるような長さであるか、またはライブラリーのプロービングもしくはプライミングのために低コピー数（典型的に５未満、一般に３未満）のものとする。一般に、プローブまたはプライマーは、対象とする遺伝子と相補的なまたは同一の配列の少なくとも１４、１６、または３０の隣接ヌクレオチドを含有する。プローブおよびプライマーは、１０、２０、３０、５０、１００、またはそれ以上の核酸長とすることができる。

本明細書において使用されるように、ペプチドは、２〜４０のアミノ酸長であるポリペプチドを指す。

本明細書において使用されるように、本明細書において提供されるアミノ酸の様々な配列において生じるアミノ酸は、それらの知られている３文字または１文字の略語に従って同定される（表２）。様々な核酸断片において生じるヌクレオチドは、当技術分野においてルーチン的に使用される標準的な単一の文字の名称を用いて命名される。

本明細書において使用されるように、「アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物である。ポリペプチドは、２つ以上のアミノ酸を含有する。本明細書における目的上、アミノ酸は、２０の天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸、およびアミノ酸類似体（つまりα−炭素が側鎖を有するアミノ酸）を含む。

J.Biol.Chem.,243:3552~3559(1969)および適合する米国特許法施行規則§§１．８２１〜１．８２２に記載される標準的なポリペプチド命名法に合わせて、アミノ酸残基のための略語を表２に示す。

本明細書における式によって表されるすべてのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端への従来の方向に、左から右への配向を有することに留意されたい。さらに、語句「アミノ酸残基」は、対応の表（表２）において列挙されるアミノ酸ならびに米国特許法施行規則§§１．８２１〜１．８２２において言及され、参照によって本明細書において組み込まれるものなどのような改変アミノ酸および異常アミノ酸を含むように、広く定義される。さらに、アミノ酸残基配列の始まりまたは終わりのダッシュは、１つまたは複数のアミノ酸残基のさらなる配列に対する、ＮＨ_２などのようなアミノ末端基に対する、またはＣＯＯＨなどのようなカルボキシル末端基に対するペプチド結合を示すことに留意されたい。

本明細書において使用されるように、「疎水性アミノ酸」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ疎水性コンセンサススケールを使用して疎水性であることが決定されたアミノ酸のいずれか１つを含む。例示的なものは、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、トリプトファン、メチオニン、アラニン、グリシン、システイン、およびチロシンなどのような天然に存在する疎水性アミノ酸である（Eisenberg et al., (1982) Faraday Symp. Chem. Soc. 17:109-120）。天然に存在しない疎水性アミノ酸もまた含まれる。

本明細書において使用されるように、「酸性アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸の中でも、アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基を含む。天然に存在しない酸性アミノ酸もまた含まれる。

本明細書において使用されるように、「天然に存在するアミノ酸」は、ポリペプチドにおいて生じる２０種のＬ−アミノ酸を指す。

本明細書において使用されるように、「非天然アミノ酸」は、表２において列挙される天然に存在するアミノ酸の１つではない、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物を指す。したがって、天然に存在しないアミノ酸は、たとえば、２０種の天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸の類似体を含み、アミノ酸のＤ−立体異性体を含むが、これらに限定されない。例示的な非天然アミノ酸は、当業者らに知られており、改変第ＶＩＩ因子ポリペプチドに含むことができる。

本明細書において使用されるように、ＤＮＡ構築物は、自然界において見い出されない様式で組み合わせられ、並べられたＤＮＡのセグメントを含有する一本鎖もしくは二本鎖、線状、または環状のＤＮＡ分子である。ＤＮＡ構築物は、ヒトの操作の結果として存在し、操作された分子のクローンおよび他のコピーを含む。

本明細書において使用されるように、ＤＮＡセグメントは、特定の性状を有する、より大きなＤＮＡ分子の部分である。たとえば、特定のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、プラスミドまたはプラスミド断片などのような、より長いＤＮＡ分子の部分であり、５’から３’方向に読み取られる場合、特定のポリペプチドのアミノ酸の配列をコードする。

本明細書において使用されるように、ポリヌクレオチドという用語は、５’端から３’端に読み取られるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドベースの一本鎖ポリマーまたは二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡおよびＤＮＡを含み、天然源から単離し、インビトロにおいて合成し、または天然分子および合成分子の組み合わせから調製することができる。ポリヌクレオチド分子の長さは、ヌクレオチド（「ｎｔ」と省略）または塩基対（「ｂｐ」と省略）により本明細書において示される。ヌクレオチドという用語は、状況が可能にする場合、一本鎖分子および二本鎖分子に使用される。この用語が、二本鎖分子に適用される場合、用語は、全長を表すために使用され、塩基対という用語と等価であることが理解されるであろう。二本鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖はわずかに長さが異なることがあり得、そしてその端がずれることがあり得、したがって、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドが対になることができるとは限らないことが当業者らによって認識されるであろう。そのような対でない端は、一般に、２０ヌクレオチド長を超えないであろう。

本明細書において使用されるように、「一次配列」は、ポリペプチドにおけるアミノ酸残基の配列を指す。

本明細書において使用されるように、２つのタンパク質または核酸の間の「類似性」は、タンパク質のアミノ酸の配列または核酸のヌクレオチド配列の間の関連性を指す。類似性は、残基の配列およびそこに含有される残基の同一性ならびに／または相同性の程度に基づくものとすることができる。タンパク質または核酸の間の類似性の程度を評価するための方法は、当業者らに知られている。たとえば、配列類似性を評価するためのある方法において、２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、配列の間で最大のレベルの同一性が得られるようにアライメントされる。「同一性」は、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列が一様である程度を指す。アミノ酸配列のアライメントおよびある程度のヌクレオチド配列のアラインメントはまた、アミノ酸（またはヌクレオチド）における保存的な差異および／または頻繁な置換を考慮することができる。保存的な差異は、含まれる残基の物理化学的特性を保存する差異である。アラインメントは、全体的（配列の全体の長さにわたりすべての残基を含む、比較される配列のアラインメント）または局所的（最も類似する１つまたは複数の領域のみを含む配列の部分のアラインメント）なものとすることができる。

本明細書において使用されるように、用語「相同性」および「同一性」は、区別なく使用されるが、タンパク質についての相同性は、保存的アミノ酸変化を含むことができる。一般に、対応する位置を同定するために、アミノ酸の配列は、最も高度な程度のマッチが得られるように、アライメントされる（たとえばComputational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；およびSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991；Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073を参照されたい）。

本明細書において使用されるように、「配列同一性」は、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの間の比較における、同一のアミノ酸（またはヌクレオチド塩基）の数を指す。相同性ポリペプチドは、ある一定の数の同一アミノ酸残基または相同性アミノ酸残基を指す。相同性は、同一残基と同様に、保存的なアミノ酸置換を含む。配列同一性は、それぞれのサプライヤーによって確立されるデフォルトギャップペナルティーを用いて使用される標準的なアライメントアルゴリズムプログラムによって決定することができる。相同性核酸分子は、ある一定の数の同一ヌクレオチドまたは相同性ヌクレオチドを指す。相同性は、同一残基と同様に、コードアミノ酸を変化させない置換（つまり「サイレント置換」）を含む。実質的に相同性の核酸分子は、典型的には、中程度のストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーで、核酸の全長に沿ってまたは対象とする完全長核酸分子の少なくとも約７０％、８０％、もしくは９０％に沿ってハイブリダイズする。ハイブリダイズする核酸分子におけるコドンの代わりに縮重コドンを含有する核酸分子もまた、企図される。（タンパク質の相同性の決定のために、保存的アミノ酸は、同一のアミノ酸と同様にアライメントすることができ、この場合、同一性の百分率および相同性百分率は、変わる）。任意の２つの核酸分子が、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％「同一の」ヌクレオチド配列を有する（または任意の２つのポリペプチドが、アミノ酸配列を有する）かどうかは、「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどのような知られているコンピューターアルゴリズムを使用して、たとえば、Pearson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)におけるデフォルトパラメーターを使用して、決定することができる（他のプログラムは、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I): 387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Atschul, S.F., et al., J. Molec. Biol. 215:403 (1990)；Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego (1994)、およびCarillo et al. SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988)を含む）。たとえば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎデータベースのＢＬＡＳＴ機能は、同一性を決定するために使用することができる。他の市販で入手可能なまたは公的に入手可能なプログラムは、ＤＮＡＳｔａｒ「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＵＷＧ）「Ｇａｐ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ））を含む。タンパク質および／または核酸分子の相同性または同一性のパーセントは、たとえば、ＧＡＰコンピュータープログラムを使用して配列情報を比較することによって決定することができる（（たとえば、Smith and Waterman（Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)によって改訂されたNeedleman et al. J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)）。手短に言えば、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうちの短い方の記号の総数で割った、類似する、アライメントされた記号（つまりヌクレオチドまたはアミノ酸）の数として、類似性を規定する。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメーターは、（１）単項比較マトリックス（同一の場合には１および同一でない場合には０という値を含有する）ならびにSchwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)によって記載されるGribskov et al. Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986)の加重比較マトリックス；（２）それぞれのギャップに対する３．０のペナルティーおよびそれぞれのギャップにおけるそれぞれの記号に対するさらなる０．１０のペナルティー；ならびに（３）エンドギャップに対するペナルティーなし、を含むことができる。

そのため、本明細書において使用されるように、用語「同一性」は、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの間の比較を表す。１つの非限定的な例において、「〜に少なくとも９０％同一の」は、参照ポリペプチドと比較した、９０〜１００％の同一性パーセントを指す。９０％またはそれ以上のレベルでの同一性は、例証目的と仮定して、１００のアミノ酸の試験および参照ポリヌクレオチド長が比較され、試験ポリペプチドにおけるアミノ酸の多くとも１０％（つまり１００のうち１０）が参照ポリペプチドのアミノ酸と異なるという事実を示す。類似する比較は、試験ポリヌクレオチドおよび参照ポリヌクレオチドの間でなすことができる。そのような差異は、アミノ酸配列の全長にわたって無作為に分布した点突然変異として表すことができ、またはそれらは、最大に許容できる、たとえば１０／１００のアミノ酸の差異（約９０％の同一性）まで、様々な長さの１つまたは複数の場所にクラスター形成し得る。差異は、核酸またはアミノ酸の置換、挿入、または欠失として規定される。約８５〜９０％以上の相同性または同一性のレベルでは、結果は、プログラムおよびギャップパラメーターセットに非依存性であるはずであり、そのような高度なレベルの同一性は、ソフトウェアに頼ることなく容易に評価することができることが多い。

本明細書において使用されるように、用語「実質的に同一の」または「類似する」は、当業者らによって理解されるように、状況により変わるが、当業者らは、そのようなものを評価することができることもまた理解されたい。

本明細書において使用されるように、配列のアライメントは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列における対応する位置をアライメントするための相同性（類似性および／または同一性）の使用を指す。典型的には、５０％またはそれ以上の同一性によって関係する２つ以上の配列が、アライメントされる。配列のアライメントセットは、対応する位置でアライメントされる２つ以上の配列を指し、ゲノムＤＮＡ配列とアライメントされる、ＥＳＴおよび他のｃＤＮＡなどのような、ＲＮＡに由来するアライメント配列を含むことができる。

本明細書において使用されるように、「特異的にハイブリダイズする」は、標的核酸分子への核酸分子（たとえばオリゴヌクレオチド）の相補的塩基対合によるアニーリングを指す。当業者らは、特定の分子の長さおよび組成などのような、特異的ハイブリダイゼーションに影響を及ぼすインビトロパラメーターおよびインビボパラメーターに精通している。インビトロハイブリダイゼーションに特に関連するパラメーターは、アニーリング温度および洗浄温度、緩衝液組成、ならびに塩濃度をさらに含む。非特異的結合核酸分子を除去するための例示的な洗浄条件は、高ストリンジェンシーでは０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、中ストリンジェンシーでは０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃である。等価なストリンジェンシー条件は、当技術分野において知られている。当業者は、特定の適用に適切な標的核酸分子への核酸分子の特異的なハイブリダイゼーションを達成するために、これらのパラメーターを容易に調整することができる。

本明細書において使用されるように、単離もしくは精製ポリペプチドもしくはタンパク質またはその生物学的活性部分は、タンパク質が由来する組織の細胞に由来する細胞性物質または他の混入タンパク質が実質的にないまたは化学的に合成される場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質が実質的にない。調製物は、そのような純度またはさらなる精製が、物質のタンパク質分解活性および生物学的活性などのような物理的特性および化学的特性を検出可能に変化させないように十分に純粋であることを評価するために当業者らによって使用される薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動、および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのような標準的な分析方法によって決定されるように、それらが、容易に検出可能な不純物がないと思われる場合、実質的に不純物がないと決定することができる。実質的に化学的に純粋な化合物を産生するための化合物の精製のための方法は、当業者らに知られている。しかしながら、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物となり得る。そのような場合、さらなる精製は、化合物の比活性を増加させ得る。

細胞性物質が実質的にないという用語は、タンパク質が単離され、または組換えで産生される細胞の細胞性構成成分からタンパク質が分離される、タンパク質の調製物を含む。一実施形態において、細胞性物質が実質的にないという用語は、約３０％未満（乾燥重量による）の非プロテアーゼタンパク質（本明細書において混入タンパク質とも呼ばれる）、一般に、約２０％未満の非プロテアーゼタンパク質、または１０％の非プロテアーゼタンパク質または、または約５％未満の非プロテアーゼタンパク質を有するプロテアーゼタンパク質の調製物を含む。プロテアーゼタンパク質またはその活性部分が、組換えで産生される場合、それもまた、実質的に培地がない、すなわち、培地は、プロテアーゼタンパク質調製物の容量の２０％、１０％、または５％未満、その前後、またはそれと等しい。

本明細書において使用されるように、化学的前駆体または他の化学物質が実質的にないという用語は、タンパク質が、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されるプロテアーゼタンパク質の調製物を含む。この用語は、約３０％（乾燥重量による）、２０％、１０％、５％、またはそれ以下、未満の化学的前駆体または非プロテアーゼ化学物質もしくは構成成分を有するプロテアーゼタンパク質の調製物を含む。

本明細書において使用されるように、組換えＤＮＡ法を使用することによる組換え法による産生は、クローニングされたＤＮＡによりコードされるタンパク質を発現させるための、分子生物学のよく知られている方法の使用を指す。

本明細書において使用されるように、ベクター（またはプラスミド）は、その発現または複製のいずれかのために細胞の中に異種核酸を導入するために使用される別個の要素を指す。ベクターは、典型的にエピソームのままであるが、ゲノムの染色体の中への遺伝子またはその部分の組み込みを達成するように設計することができる。細菌人工染色体、酵母人工染色体、および哺乳動物人工染色体などのような人工染色体であるベクターもまた企図される。そのような媒体の選択および使用は、当業者らによく知られている。

本明細書において使用されるように、発現は、核酸がｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。核酸が、ゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、適切な真核生物宿主細胞または真核生物宿主生物が選択される場合、ｍＲＮＡのスプライシングなどのようなプロセシングを含むことができる。

本明細書において使用されるように、発現ベクターは、そのようなＤＮＡ断片の発現を達成することができる、プロモーター領域などのような調節配列と作動可能に連結されるＤＮＡを発現することができるベクターを含む。そのようなさらなるセグメントは、プロモーター配列およびターミネーター配列を含むことができ、所望により、１つまたは複数の複製開始点、１つまたは複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含むことができる。発現ベクターは、プラスミドまたはウイルスＤＮＡに一般に由来し、または両方の要素を含有し得る。したがって、発現ベクターは、適切な宿主細胞の中への導入に際してクローニングＤＮＡの発現をもたらす、プラスミド、ファージ、組換えウイルス、または他のベクターなどのような組換えＤＮＡ構築物または組換えＲＮＡ構築物を指す。適切な発現ベクターは、当業者らによく知られており、真核細胞および／または原核細胞において複製可能なベクターならびにエピソームのままのベクターまたは宿主細胞ゲノム中に組み込むベクターを含む。

本明細書において使用されるように、ベクターはまた、「ウイルスベクター」または「ウイルス性ベクター」を含む。ウイルス性ベクターは、細胞の中に外因性遺伝子を移入する（媒体またはシャトルとして）ように外因性遺伝子に作動可能に連結される、操作されたウイルスである。

本明細書において使用されるように、アデノウイルスは、ヒトにおいて結膜炎および上気道感染症を引き起こすＤＮＡ含有ウイルスのグループのいずれかを指す。

本明細書において使用されるように、裸のＤＮＡは、ワクチンおよび遺伝子治療に使用することができるヒストンなしのＤＮＡを指す。裸のＤＮＡは、形質転換またはトランスフェクションと呼ばれる遺伝子移入プロセスの間に細胞から細胞に移される遺伝物質である。形質転換またはトランスフェクションにおいて、レシピエント細胞によって取り込まれる精製ＤＮＡまたは裸のＤＮＡは、レシピエント細胞に、新しい特徴または表現型を与えるであろう。

本明細書において使用されるように、作動可能にまたは作動的に連結されたは、ＤＮＡセグメントを指す場合、セグメントが、意図される目的に一致して機能するように、たとえば、転写がプロモーターにおいて開始し、コードセグメントを通ってターミネーターに進むように配置されることを意味する。

本明細書において使用されるように、タンパク質の活性または遺伝子もしくは核酸の発現を調整する作用物質(agent)は、タンパク質の活性を減少させるもしくは増加させるまたはその他の形で変化させ、またはいくつかの様式において、細胞における核酸の発現をアップレギュレートしもしくはダウンレギュレートしまたはその他の形で変化させる。

本明細書において使用されるように、「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、異なるポリペプチドに作動可能に連結されたポリペプチドを指す。本明細書において提供されるキメラタンパク質または融合タンパク質は、１つもしくは複数のＦＶＩＩポリペプチドもしくはその部分および任意の１つもしくは複数の転写／翻訳制御シグナルについての１つもしくは複数の他のポリペプチド、シグナル配列、局在化のためのタグ、精製のためのタグ、免疫グロブリンＧのドメインの一部、ならびに／または標的作用物質を含むことができる。キメラＦＶＩＩポリペプチドはまた、他のポリペプチドと交換されるポリペプチドのそれらの内因性ドメインまたは内因性領域を有するものをも含む。これらのキメラタンパク質または融合タンパク質は、融合タンパク質として組換え手段によって産生されるもの、たとえばスルフヒドリル基へのカップリングを通した化学的カップリングなどのように、化学的手段によって産生されるもの、任意の他の方法によって産生されるものを含み、少なくとも１つのポリペプチド（つまりＦＶＩＩ）またはその部分は、他のポリペプチドに、リンカー（１つまたは複数）を介して、直接的または間接的に連結される。

本明細書において使用されるように、作動可能に連結されたは、融合タンパク質を指す場合、インフレームで互いに融合されるプロテアーゼポリペプチドおよび非プロテアーゼポリペプチドを指す。非プロテアーゼポリペプチドは、プロテアーゼポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に融合することができる。

本明細書において使用されるように、標的作用物質(targeting agent)は、細胞表面受容体などのような細胞表面分子への特異的な結合を提供する、タンパク質またはその有効な部分などのような任意の部分であり、受容体は、いくつかの場合において、結合したコンジュゲートまたはその部分を内部移行することができる。標的作用物質はまた、たとえば、コンジュゲートのアフィニティー単離または精製、表面へのコンジュゲートの付加、またはコンジュゲートもしくはコンジュゲートを含有する複合体の検出を促進するもしくは容易にする作用物質とすることもできる。

本明細書において使用されるように、分子の誘導体または類似体は、分子から誘導される部分または分子の改変バーションを指す。

本明細書において使用されるように、「疾患または障害」は、感染症、後天性状態、遺伝的状態を含むが、これらに限定されない原因または状態に起因し、同定可能な症状によって特徴づけられる、生物における病的状態を指す。本明細書において対象とする疾患および障害は、凝固タンパク質によって媒介されるものおよび凝固タンパク質が病因または病状において役割を果たすものを含む、凝固を伴うものを含む。疾患および障害はまた、血友病におけるような、タンパク質の欠如によって引き起こされるものを含み、本明細書において特に対象とするのは、凝固タンパク質における欠損の欠乏症により凝固が生じないそれらの障害である。

本明細書において使用されるように、「凝血促進薬」は、血液凝固を促進する任意の物質を指す。

本明細書において使用されるように、「抗凝固薬」は、血液凝固を阻害する任意の物質を指す。

本明細書において使用されるように、「血友病」は、血液凝血因子における欠乏症によって引き起こされる出血障害を指す。血友病は、たとえば、凝血因子の欠如、低下した発現、または低下した機能の結果となり得る。最も一般的な型の血友病は、血友病Ａであり、これは、第ＶＩＩＩ因子における欠乏症に起因する。第２の一般的な型の血友病は、血友病Ｂであり、これは、第ＩＸ因子における欠乏症に起因する。ＦＸＩ欠乏症と呼ばれる血友病Ｃは、より軽度な、それほど一般的でない形態の血友病である。

本明細書において使用されるように、「先天性血友病」は、遺伝する血友病の型を指す。先天性血友病は、凝血因子遺伝子の突然変異、欠失、挿入、または他の改変に起因し、凝血因子の産生は、欠如しているか、低下しているか、または機能しない。たとえば、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子などのような凝血因子遺伝子における遺伝性の突然変異は、先天性血友病、血友病ＡおよびＢをそれぞれもたらす。

本明細書において使用されるように、「後天性血友病」は、ＦＶＩＩＩを不活性化する自己抗体の産生に由来する、成人期において発症する血友病の型を指す。

本明細書において使用されるように、「出血障害」は、対象が、出血を制御する能力が減少している状態を指す。出血障害は、遺伝性または後天性であり得、また、たとえば、凝固経路における欠損もしくは欠乏症、血小板活性における欠損もしくは欠乏症、または血管の欠損に起因し得る。

本明細書において使用されるように、「後天性出血障害」は、肝臓疾患、ビタミンＫ欠乏症、またはクマジン（ワルファリン）もしくは他の抗凝固薬による療法などのような状態によって引き起こされる凝血欠乏症に起因する出血障害を指す。

本明細書において使用されるように、疾患または状態を有する対象を「処置する」は、本明細書において提供されるポリペプチド、組成物、または他の産物が、対象に投与されることを意味する。

本明細書において使用されるように、治療剤、治療レジメン、放射線防護剤、または化学治療は、ワクチンを含む従来の薬剤および薬剤療法を意味し、これらは、当業者らに知られている。放射線治療剤は、当技術分野においてよく知られている。

本明細書において使用されるように、処置は、状態、障害、または疾患の症状が回復するまたは有益に変わる任意の様式を意味する。したがって、処置は、予防法、療法、および／または治療法を包含する。処置はまた、本明細書における組成物の任意の、医薬としての使用をも包含する。処置はまた、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩおよび組成物の任意の、医薬としての使用をも包含する。

本明細書において使用されるように、医薬組成物または他の治療薬の投与などのような処置による特定の疾患または障害の症状の回復は、永久的なものまたは一時的なもの、永続的なものまたは一過性のものにかかわらず、組成物または治療薬の投与に起因し得るまたは関連し得る症状の任意の緩和を指す。

本明細書において使用されるように、予防または予防法は、疾患または状態を発症する危険性を低下させる方法を指す。予防法は、疾患もしくは状態を発症する危険性の低下および／または症状の悪化もしくは疾患の進行の予防または症状の悪化もしくは疾患の進行の危険性における低下を含む。

本明細書において使用されるように、特定の疾患を処置するための化合物または組成物の有効量は、疾患と関連する症状を回復させるまたはいくつかの様式では低下させるのに十分な量である。そのような量は、単回投与として投与することもでき、またはレジメンに従って投与することもでき、それによって有効となる。その量は、疾患を治癒することができるが、典型的には、疾患の症状を回復させるために投与される。典型的には、反復投与が、症状の所望の回復を達成するために必要とされる。

本明細書において使用されるように、「治療有効量」または「治療有効用量」は、治療上の効果をもたらすのに少なくとも十分な化合物を含有する作用物質、化合物、物質、または組成物を指す。有効量は、疾患または障害の症状を予防する、治癒する、回復させる、阻止する、または部分的に阻止するために必要な治療剤の含量である。

本明細書において使用されるように、処置されることとなる「患者」または「対象」は、ヒトまたは哺乳動物を含む非ヒト動物を含む。哺乳動物は、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、およびサルなどのような霊長動物；イヌ、ウマ、ネコ、ブタ、ヤギ、雌ウシなどのような家畜化された動物；ならびにマウス、ラット、ハムスター、およびアレチネズミなどのようなげっ歯動物を含む。

本明細書において使用されるように、組み合わせは、２つのアイテムの間のまたはそれ以上のアイテムの間の任意の関連を指す。関連は、空間的なものとすることもでき、または共通の目的のための２つもしくはそれ以上のアイテムの使用を指すこともできる。

本明細書において使用されるように、組成物は、２つ以上の産物または化合物（たとえば作用物質、修飾因子、調節因子など）の任意の混合物を指す。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性配合物もしくは非水性配合物、またはそれらの任意の組み合わせとすることができる。

本明細書において使用されるように、「製品」は、作製され、販売される産物である。本出願の全体にわたって使用されるように、この用語は、包装製品に含有される改変プロテアーゼポリペプチドおよび核酸を包含するように意図される。

本明細書において使用されるように、液は、流動することができる任意の組成物を指す。したがって、液は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリーム、および他のそのような組成物の形態をしている組成物を包含する。

本明細書において使用されるように、「キット」は、包装された組み合わせを指し、所望により、組み合わせの要素を使用する方法を実施するための試薬ならびに他の産物および／または成分を含む。たとえば、本明細書において提供される改変プロテアーゼポリペプチドまたは核酸分子ならびに投与、診断、および生物学的活性または生物学的特性の評価を含むが、これらに限定されない目的のための他のアイテムを含有するキットが提供される。キットは、所望により、使用のための説明書を含む。

本明細書において使用されるように、抗体は、軽鎖および重鎖の可変領域から構成される、Ｆａｂ断片などのような抗体断片を含む。

本明細書において使用されるように、受容体は、特定のリガンドに対する親和性を有する分子を指す。受容体は、天然に存在する分子または合成分子とすることができる。受容体はまた、当技術分野において抗リガンドと呼ぶこともできる。

本明細書において使用されるように、動物は、これらに限定されないが、ヒト、ゴリラ、およびサルを含む霊長動物；マウスおよびラットなどのようなげっ歯動物；ニワトリなどのような家禽；ヤギ、雌ウシ、シカ、ヒツジなどのような反芻動物；ブタなどのようなヒツジに近い動物、ならびに他の動物などのような任意の動物を含む。非ヒト動物は、企図される動物としてヒトを除外する。本明細書において提供されるプロテアーゼは、任意の源、動物、植物、原核生物、菌類に由来するものである。

本明細書において使用されるように、遺伝子治療は、そのような治療が求められる障害または状態を有する哺乳動物、特にヒトの標的細胞であるある種の細胞の中へのＤＮＡなどのような異種核酸の移入を伴う。ＤＮＡなどの核酸は、直接的またはベクターもしくは他のデリバリー媒体においてなど、ＤＮＡなどの異種核酸が発現し、それによって、コードされる治療産物が産生される様式で、選択される標的細胞の中に導入される。その代わりに、ＤＮＡなどのような異種核酸は、いくつかの様式において、治療産物をコードするＤＮＡの発現を媒介することができ、またはそれは、いくつかの様式において、直接的または間接的に治療産物の発現を媒介するペプチドまたはＲＮＡなどのような産物をコードすることができる。遺伝的療法はまた、欠損遺伝子を交換するまたは核酸が導入される哺乳動物もしくは細胞によって産生される遺伝子産物を補充する遺伝子産物をコードする核酸を送達するために使用することもできる。導入された核酸は、哺乳動物宿主において通常産生されないまたは治療有効量でもしくは治療的に有用な時に産生されない、プロテアーゼまたは改変プロテアーゼなどのような治療化合物をコードすることができる。治療産物をコードする、ＤＮＡなどのような異種核酸は、産物またはその発現を増強するまたはその他の形で変化させるために、罹患した宿主の細胞の中への導入の前に改変することができる。遺伝的療法はまた、遺伝子発現の阻害因子またはリプレッサーまたは他の修飾因子のデリバリーを伴い得る。

本明細書において使用されるように、異種核酸は、核酸が発現する細胞によってインビボにおいて通常産生されないまたは細胞によって産生されるが、異なる座位にあるもしくは異なって発現するまたは転写、翻訳、もしくは他の調節可能な生化学的プロセスに影響を及ぼすことによって、ＤＮＡなどのような内因性核酸の発現を変化させる媒介物を媒介するもしくはコードする核酸である。異種核酸は、一般に、核酸が導入される細胞にとって内因性ではないが、他の細胞から得られたまたは合成的に調製されたものである。異種核酸は、内因性のものとすることができるが、異なる座位から発現するまたはその発現が変化した核酸である。一般に、必ずではないが、そのような核酸は、細胞によってまたは核酸が発現する細胞と同じ方法で通常産生されないＲＮＡおよびタンパク質をコードする。ＤＮＡなどのような異種核酸はまた、ＤＮＡなどのような外来性核酸と呼ぶこともできる。したがって、異種核酸または外来性核酸は、ＤＮＡなどのような核酸分子対応物がゲノムにおいて見つけられるように、全く同じ配向または位置に存在しない核酸分子を含む。それはまた、他の生物または種に由来する核酸分子を指すこともできる（つまり外因性）。

核酸が発現される細胞に対して異種または外来性であるとして当業者は認識するまたは考えるであろう、ＤＮＡなどのような任意の核酸は、本明細書において異種核酸によって包含され、異種核酸は、内因的にも発現する、外因的に追加される核酸を含む。異種核酸の例は、薬剤抵抗性を付与するタンパク質などのような追跡可能なマーカータンパク質をコードする核酸、抗癌剤、酵素、およびホルモンなどのような治療的に有効な物質をコードする核酸、ならびに抗体などのような他の種類のタンパク質をコードする、ＤＮＡなどのような核酸を含むが、これらに限定されない。異種核酸によってコードされる抗体は、異種核酸が導入された細胞の表面上に分泌され得るまたは発現され得る。

本明細書において使用されるように、遺伝子治療のための治療的に有効な産物は、異種核酸、典型的にＤＮＡによってコードされ、宿主の中への核酸の導入に際して発現され、遺伝性疾患もしくは後天性疾患の症状、徴候を回復させる、もしくは排除する、または疾患を治癒する産物である。ＲＮＡｉおよびアンチセンスなどのような生物学的活性核酸分子もまた含まれる。

本明細書において使用されるように、ポリペプチドが、アミノ酸の記載される配列から「本質的に成る」という説明は、完全長ポリペプチドの記載される部分またはその断片のみが存在することを意味する。ポリペプチドは、他の源からのさらなるアミノ酸を所望により含むことができ、一般にそれらを含み、または他のポリペプチドの中に挿入することができる。

本明細書において使用されるように、単数形「１つの（ａ）」「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に特に明らかに規定しない限り、複数の指示物を含む。したがって、たとえば、「細胞外ドメイン」を含む化合物への言及は、１つまたは複数の細胞外ドメインを有する化合物を含む。

本明細書において使用されるように、範囲および量は、「約」特定の値または範囲として表現することができる。約はまた、まさにその量を含む。したがって、「約５塩基」は、「約５塩基」およびまた「５塩基」をも意味する。

本明細書において使用されるように、「所望による」または「所望により」は、引き続いて記載される事象または状況が、生じるまたは生じないこと、および説明が、前記の事象または状況が生じる場合およびそれが生じない場合を含むことを意味する。たとえば、所望により置換される基は、基が置換されないまたは置換されることを意味する。

本明細書において使用されるように、任意の保護基、アミノ酸、および他の化合物についての略語は、他に示されない限り、それらの共通の使用法、認識される略語、またはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature（(1972) Biochem. 11:1726を参照されたい）に従うものとする。

Ｂ． 止血概説
改変第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドが、本明細書において提供される。そのようなＦＶＩＩポリペプチドは、増加した血液凝固活性を有するように設計される。したがって、これらのポリペプチドは、たとえば、止血および他の関係する生物学的プロセスを調整するための治療薬として、様々な使用および適用を有する。本明細書において提供される改変およびそのような改変ＦＶＩＩ分子の使用を十分に理解するために、止血系および血液凝固カスケードについての理解は、有利となる。以下の議論は、第ＶＩＩ因子およびその改変の議論に対する前置きとなるそのような背景を提供する。

止血は、血管系に対する傷害に起因する出血を止める生理学的メカニズムである。正常な止血は、細胞性構成成分および可溶性血漿タンパク質に依存し、凝血の形成に最終的に至る一連のシグナリング事象を伴う。傷害が血管に対して生じ、内皮細胞が損害を与えられた後に、凝固は、素速く開始される。凝固の一次フェーズにおいて、血小板は、活性化されて、傷害の部位で止血性の血栓を形成する。二次止血が続き、血漿凝固因子が伴い、これは、タンパク質分解カスケードにおいて作用し、血小板血栓を強化するフィブリン鎖の形成をもたらす。

血管傷害に際して、傷害を与えられた直後のエリアへの血流は、血管の収縮によって制限され、内皮下の結合組織上に新しく露出した線維状コラーゲンに血小板が粘着することを可能にする。この粘着は、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）に依存性であり、これは、傷害の３秒以内に内皮に結合し、それによって、血小板の粘着および凝集を容易にする。凝集した血小板の活性化は、ＡＤＰ、ＡＴＰ、トロンボキサン、およびセロトニンを含む様々な因子の分泌をもたらす。粘着分子、フィブリノーゲン、ｖＷＦ、トロンボスポンジン、およびフィブロネクチンもまた、放出される。そのような分泌は、血小板のさらなる粘着および凝集、増加した血小板活性化および血管収縮、ならびに血液凝固酵素複合体のアセンブリーのためのプラットフォームとして働く、血小板表面上の陰イオン性リン脂質の露出を促進する。血小板は、形状を変化させ、仮足形成に至り、これは、他の血小板への凝集をさらに容易にし、緩い血小板血栓をもたらす。

ペプチダーゼの凝血カスケード（凝固カスケード）は、同時に開始される。凝固カスケードは、タンパク質分解による切断を伴う一連の活性化事象を含む。そのようなカスケードにおいて、セリンプロテアーゼの不活性タンパク質（チモーゲンとも呼ばれる）は、１つまたは複数のペプチド結合の切断によって活性プロテアーゼに変換され、次いで、これは、カスケードにおける次のチモーゲン分子のための活性化プロテアーゼとして働き、フィブリンの架橋によって血餅形成を最終的にもたらす。たとえば、カスケードは、トロンビンなどのような活性化分子（プロトロンビンの切断に由来する）を生成し、これは、血小板をさらに活性化し、また、フィブリノーゲンの切断に由来するフィブリンを生成する。次いで、フィブリンは、血餅を安定化するために血小板血栓のまわりに架橋ポリマーを形成する。傷害の修復に際して、フィブリンは、線溶系によって消化され、この主要な構成成分は、プラスミノーゲンおよび組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）である。これらのタンパク質の両方は、重合フィブリンの中に組み込まれ、それらは、相互作用して、プラスミンを生成し、これは、順番に、フィブリンに作用して、あらかじめ形成された血餅を溶解する。血餅形成の間に、凝固因子阻害因子はまた、傷害部位を除く血餅形成を予防するために血液中を循環する。

傷害から血餅形成およびそれに続く線溶までの系の相互作用は、下記に記載される。

１． 血小板の粘着および凝集
血液の凝血は、正常な条件下で能動的に回避される。血管内皮は、血管拡張を支持し、血小板の粘着および活性化を阻害し、凝固を抑制し、フィブリン切断を増強し、かつ抗炎症性の特徴をしている。血管内皮細胞は、亜酸化窒素（ＮＯ）およびプロスタサイクリンなどのような分子を分泌し、これは、血小板の凝集を阻害し、血管を拡張する。これらの分子の放出は、可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）およびｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼＩ（ｃＧＫＩ）を活性化し、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）レベルを増加させ、これは、血管壁における平滑筋の弛緩を引き起こす。さらに、内皮細胞は、ＣＤ３９などのような細胞表面ＡＤＰアーゼを発現し、これは、血小板から放出されたＡＤＰをアデニンヌクレオチド血小板阻害因子に変換することによって、血小板の活性化および凝集を制御する。内皮はまた、線溶カスケードにおける酵素の調節において重要な役割を果たす。内皮細胞は、プラスミノーゲン（アネキシンＩＩ）およびウロキナーゼの受容体の発現ならびに組織型プラスミノーゲン活性化因子およびウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子の分泌を通してプラスミンの生成を直接的に促進し、これらのすべては、血餅クリアランスを促進する。血栓形成促進性の調節の最終層において、内皮細胞は、ヘパラン硫酸を産生することによって、凝固カスケードを阻害する際に能動的な役割を果たし、これは、トロンビンおよび他の凝固因子のアンチトロンビンＩＩＩ阻害の反応速度を増加させる。

しかしながら、急性血管外傷下で、血管収縮性のメカニズムが、優勢であり、内皮は、自然に、血栓形成促進性、凝固促進性（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｔｏｒｙ）、および炎症促進性になる。これは、内皮拡張剤：アデノシン、ＮＯ、およびプロスタサイクリンの低下；ならびにそれらの収縮を誘発するための、血管平滑筋細胞に対する、ＡＤＰ、セロトニン、およびトロンボキサンの直接的な作用によって達成される（Becker, Heindl et al.. 2000）。止血性の血栓の形成に至る内皮の機能における変化に対する主なトリガーは、血液および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成成分の間の内皮細胞壁の損失である（Ruggeri (2002) Nat Med 8:1227-1234）。循環する血小板は、内皮の病変のエリアを同定し、識別し、露出した内皮下層に接着する。様々な血栓形成性の基質および局所的に生成されたアゴニストまたは放出されたアゴニストとのそれらの相互作用は、血小板活性化をもたらす。このプロセスは、２つのステージ、１）粘着：表面への初期の連結、および２）凝集：血小板−血小板接着を有するとして記載されている（Savage et al. (2001) Curr Opin Hematol 8:270-276）。

血小板粘着は、循環する血小板が、細胞表面上のコラーゲン結合タンパク質との相互作用を通しておよびこれもまた内皮上に存在するｖＷＦとの相互作用を通して、露出したコラーゲンに結合する場合、開始される。ｖＷＦタンパク質は、内皮によって２つの方向に；基底面に（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌｌｙ）および血流の中に分泌される可変サイズの多量体構造である。ｖＷＦはまた、第ＶＩＩＩ因子に結合し、これは、第ＶＩＩＩ因子の安定化および血行路におけるその生存において重要である。

血小板粘着およびそれに続く活性化は、ｖＷＦが、ＧＰＩｂ（血小板糖タンパク質受容体複合体ＧＰＩｂ−ＩＸ−Ｖの一部）にそのＡ１ドメインを介して結合する場合、達成される。ｖＷＦおよびＧＰＩｂの間の相互作用は、ずり応力における増加が、ＧＰＩｂに対するｖＷＦの親和性の対応する増加をもたらすように、剪断力によって調節される。白血球上のＶＬＡ−２としても知られているインテグリンα１β２は、血小板上の主要なコラーゲン受容体であり、この受容体を通した結合は、血小板活性化に寄与する細胞内シグナルを生成する。α１β２を通した結合は、低親和性コラーゲン受容体、ＧＰ ＶＩの結合を容易にする。これは、免疫グロブリンスーパーファミリーの一部であり、血小板活性化のための最も強力な細胞内シグナルを生成する受容体である。血小板活性化は、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）の放出をもたらし、これは、トロンボキサンＡ２に変換される。

血小板活性化はまた、血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３としても知られている血小板糖タンパク質ＩＩｂ〜ＩＩＩａ（ＧＰ ＩＩｂ〜ＩＩＩａ）受容体の表面の発現をもたらす。ＧＰ ＩＩｂ−ＩＩＩａ受容体は、これらの受容体を通して血小板に連結するフィブリノーゲン分子により互いの血小板の粘着（つまり凝集）を可能にする。これは、傷害の部位での血小板血栓の形成をもたらして、さらなる失血を予防するのを助けるが、損害を与えられた血管組織は、凝固カスケードおよび血小板血栓のまわりでの安定化フィブリン網の形成を開始する因子を放出する。

２． 凝固カスケード
凝固経路は、それぞれの酵素が、チモーゲンまたは不活性形態として血漿中に存在する、タンパク質分解経路である。チモーゲンの切断は、前駆体分子から活性形態を放出するために調節される。糖タンパク質ＦＶＩＩＩおよびＦＶなどのような活性化プロテアーゼの補因子もまた、カスケード反応において活性化され、血餅形成において役割を果たす。経路は、活性化プロセスを制御する、一連のポジティブフィードバックループおよびネガティブフィードバックループとして機能し、最終目標は、トロンビンを産生することであり、次いで、これは、可溶性フィブリノーゲンをフィブリンに変換して、血餅を形成することができる。凝固における因子は、典型的には、ローマ数字の番号が与えられ、小文字「ａ」は、活性化形態を示すために追加される。下記の表３は、凝固カスケードにおけるそれらの一般名およびそれらの役割を含む、因子の例示的なリストを記載する。一般に、これらのタンパク質は、１つまたは複数の、凝固の内在性経路、外因性経路、共通経路を通して、血液凝固に関与する（図１を参照されたい）。下記に議論されるように、これらの経路は、相互に連絡し、血液凝固は、凝固の主要な開始因子である第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）と共に、活性化の細胞ベースのモデルを通して生じると考えられる。

トロンビンの生成は、歴史的に、３つの経路、活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）の生成のための代替経路を提供する内在性経路（経路のすべての構成成分が、血漿に対して内在性であることを示唆する）および外因性経路（経路の１つまたは複数の構成成分が、血漿に対して外因性であることを示唆する）ならびにトロンビン形成をもたらす最終共通経路に分けられてきた（図１）。これらの経路は、凝固を達成するために、相互に連絡した、相互依存性のプロセスに共に関与する。これらの経路を記載する凝固の細胞ベースのモデルが、作られた（図２）（Hoffman et al. (2001) Thromb Haemost 85:958-965）。このモデルにおいて、「外因性」経路および「内在性」経路は、それぞれ、異なる細胞表面、組織因子（ＴＦ）を有する細胞および血小板上で達成される。凝固のプロセスは、異なるフェーズ、開始、増幅、および伝播に分類され、この間に、外因性経路および内在性経路は、様々なステージで機能して、血餅形成のための、十分な量のフィブリノーゲンをフィブリンに変換するために必要とされるトロンビンの大量の著しい増加をもたらす。

ａ． 開始
ＦＶＩＩは、凝固カスケードの開始を担う凝固因子であると考えられ、この開始は、ＴＦとのその相互作用に依存性である。ＴＦは、平滑筋細胞、線維芽細胞、単球、リンパ球、顆粒球、血小板、および内皮細胞などのような様々な細胞によって発現される膜貫通糖タンパク質である。骨髄性細胞および内皮細胞は、それらが、炎症促進性サイトカインなどによって刺激される場合のみ、ＴＦを発現する。しかしながら、平滑筋細胞および線維芽細胞は、ＴＦを恒常的に発現する。したがって、一度、これらの細胞が、組織傷害の後の血流に接すると、凝固カスケードは、血漿中の第ＶＩＩ因子またはＦＶＩＩａとのＴＦの結合によって速やかに開始される。

下記に議論されるように、血液中の大多数のＦＶＩＩは、チモーゲン形態をしており、少量、約１％は、ＦＶＩＩａとして存在する。しかしながら、ＴＦ結合の非存在下において、ＦＶＩＩａさえ、チモーゲン様の特徴を有し、それがＴＦと複合体を形成するまで、有意な活性を示さない。したがって、血漿ＦＶＩＩは、完全な活性のために、タンパク質分解による切断による活性化およびＴＦとの相互作用を通したさらなるコンホメーションの変化を必要とする。第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩＩａ因子、およびトロンビンを含む一連のプロテアーゼは、インビトロにおいて、ＴＦの存在下において加速されるプロセスであるＦＶＩＩの切断ができることが示された。ＦＶＩＩａもまた、それ自体、ＴＦの存在下において、ＦＶＩＩを活性化することができ、これは、自己活性化と呼ばれるプロセスである。血液中の少量のＦＶＩＩａは、おそらく、ＦＸａおよび／またはＦＩＸａによる活性化によるものである（Wildgoose et al. (1992) Blood 80:25-28およびButenas et al. (1996) Biochemistry 35:1904-1910）。ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体は、したがって、ＦＶＩＩａのＴＦへの直接的な結合によってまたはＦＶＩＩのＴＦへの結合および次いで、ＦＸａ、ＦＩＸａ、ＦＸＩＩａ、もしくはＦＶＩＩａそれ自体などのような血漿プロテアーゼによるＦＶＩＩのＦＶＩＩａへの続く活性化によって形成することができる。ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体は、ＴＦを有する細胞に固定されたままであり、それは、少量のＦＸをＦＸａに活性化し、これは、凝固の「外因性経路」として知られている。

ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体はまた、少量のＦＩＸをＦＩＸａに切断する。ＦＸａは、その補因子ＦＶａと結合して、これもまた、ＴＦを有する細胞上で、プロトロンビンをトロンビンに次いで変換することができる複合体を形成する。しかしながら、産生された少量のトロンビンは、完全な凝血に必要とされるフィブリン形成を支持するのに不十分である。さらに、あらゆる活性ＦＸａおよび活性ＦＩＸａは、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）および他のセルピンによって血行路において阻害され、これについては、下記により詳細に議論する。これは、通常、血行路において血餅形成を予防するであろう。しかしながら、傷害の存在下において、血管系への損害は、血小板凝集およびトロンビン形成のこの部位での活性化をもたらし、それによって、凝固シグナルの増幅を可能にする。

ｂ． 増幅
増幅は、トロンビンが血小板に結合し、活性化する場合、起こる。活性化血小板は、それらのアルファ顆粒からＦＶを放出し、これは、トロンビンによって活性化されて、ＦＶａになる。トロンビンはまた、血小板膜上でＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体からＦＶＩＩＩを放出し、活性化し、ＦＸＩを切断して、ＦＸＩａにする。これらの反応は、それらの表面上で、ＦＶａ、ＦＶＩＩＩａ、およびＦＩＸａを有する活性化血小板を生成し、これは、伝播ステージの間のトロンビン生成の大量の著しい増加のためのステージを準備するものである。

ｃ． 伝播
凝固の伝播は、傷害の部位の多くの血小板の表面で生じる。上記に記載されるように、活性化血小板は、それらの表面上に、ＦＸＩａ、ＦＶＩＩＩａ、およびＦＶａを有する。外因性経路が達成されるのは、ここにおいてである。ＦＸＩａは、ＦＩＸを活性化して、ＦＩＸａにし、これは、次いで、ＦＶＩＩＩａと結合することができる。このプロセスは、ＴＦを有する細胞上のＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体によるＦＩＸの切断によって生成される少量のＦＩＸａに加えて、順番に有意な量のＦＸを活性化して、ＦＸａにすることができる、多くのＦＸＩａ／ＦＶＩＩＩａ複合体を生成する。ＦＸａ分子は、ＦＶａに結合して、プロトロンビンを活性化してトロンビンにするプロトロンビナーゼ複合体を生成する。トロンビンは、より多くの血小板を活性化するためにポジティブフィードバックループにおいて作用し、増幅フェーズについて記載されるプロセスを再度開始する。

直後に、フィブリノーゲンから十分な量のフィブリンを生成して、止血性のフィブリン血餅を形成するのに十分に多い、著しく増加したトロンビンを生成するための、適切な複合体を有する、十分な数の活性化血小板がある。フィブリノーゲンは、トロンビンによって切断された場合、フィブリノペプチドＡおよびフィブリノペプチドＢを放出する、血漿において可溶性の二量体である。次いで、フィブリノペプチドＢは、トロンビンによって切断され、この第２のタンパク質分解による切断によって自発的に形成されたフィブリン単量体は、不溶性ゲルを形成する。重合したフィブリンは、非共有結合性の力および静電力によって共に保持され、トロンビンによるＦＸＩＩＩの切断によって産生されるトランスアミド化（ｔｒａｎｓａｍｉｄａｔｉｎｇ）酵素因子ＸＩＩＩａ（ＦＸＩＩＩａ）によって安定化される。トロンビンはまた、ＴＡＦＩをも活性化し、これは、血餅表面でプラスミン生成を低下させることによって線溶を阻害する。さらに、トロンビンは、それ自体、さらなる安定化のために血餅の構造の中に組み込まれる。これらの不溶性フィブリン凝集体（血餅）は、凝集した血小板（血栓）と共に、損害を与えられた血管をブロックし、さらなる出血を予防する。

３． 凝固の調節
凝固の間、カスケードは、さらなる血餅形成を阻害するために、恒常的な刺激プロセスによって調節される。そのような調節メカニズムにはいくつかの理由がある。第一に、調節は、フィブリン血餅形成による組織の虚血を制限するために必要とされる。第二に、調節は、組織傷害の部位にのみ血餅形成を局在化することによって、広範囲の血栓症を予防する。

調節は、いくつかの阻害分子の陽イオンによって達成される。たとえば、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）および組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）は、凝固カスケードにおける因子を阻害するために恒常的に働く。ＡＴ−ＩＩＩは、トロンビン、ＦＩＸａ、およびＦＸａを阻害するのに対して、ＴＦＰＩは、ＦＸａおよびＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体を阻害する。血小板活性化を介して刺激されるさらなる因子、プロテインＣは、ＦＶａおよびＦＶＩＩＩａのタンパク質分解による切断および不活性化によって凝固を調節する。プロテインＳは、プロテインＣの活性を増強する。さらに、凝固阻害に寄与する他の因子は、必須の膜タンパク質、トロンボモジュリンであり、これは、血管内皮細胞によって産生され、トロンビンのために受容体として働く。トロンビンのトロンボモジュリンへの結合は、トロンビン凝血促進活性を阻害し、またプロテインＣ活性化にも寄与する。

線溶、フィブリン血餅の崩壊もまた、凝固を調節するためのメカニズムを提供する。血餅における架橋フィブリン多量体は、セリンプロテアーゼであるプラスミンによって可溶性ポリペプチドに分解される。プラスミンは、その不活性前駆体プラスミノーゲンから生成することができ、２つの方法において：フィブリン血餅の表面の組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）との相互作用によって、および細胞表面のウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）との相互作用によってフィブリン血餅の部位に動員される。第１のメカニズムは、血管内の血餅の溶解を担う主要なメカニズムであると思われる。第２のものは、血餅融解を媒介することができるが、組織リモデリング、細胞移動、および炎症において主要な役割を果たすことができる。

血餅融解もまた、２つの方法において調節される。第一に、効率的なプラスミン活性化および線溶は、血餅表面でまたは細胞膜上で形成される複合体においてのみ生じるが、血液中に遊離しているタンパク質は、非効率的な触媒であり、速やかに不活性化される。第二に、プラスミノーゲン活性化因子およびプラスミンは、プラスミノーゲン活性化因子に作用するプラスミノーゲン活性化因子阻害因子１型（ＰＡＩ−１）およびＰＡＩ−２ならびにプラスミンを不活性化するα２−抗プラスミンおよびα２−マクログロブリンなどのような分子によって不活性化される。正常な状況下で、凝固と線溶の間の適時のバランスは、血管傷害の後の、血餅の効率的な形成および除去をもたらすが、望まれない血栓症エピソードまたは出血エピソードを同時に予防する。

例示的な凝固因子、補因子、および調節タンパク質の概説およびそれらの活性は、下記の表４において記載される。

Ｃ． 第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）
第ＶＩＩ因子は、肝臓において一本鎖チモーゲンとして、哺乳動物を含む動物において合成され、血流の中に分泌されるビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼ糖タンパク質である。上記に記載されるように、ＦＶＩＩは、トロンビン生成およびフィブリン沈着に至るタンパク質分解事象のカスケードの開始の担う凝固プロテアーゼである。その活性の下流の効果がまた内在性経路にも非常に影響を与えるが、それは、外因性経路の一部である。血餅形成におけるこの必須の役割は、臨床的な抗凝固薬および止血療法の標的としてのＦＶＩＩにおける著しい関心を引いた。たとえば、組換え活性化ＦＶＩＩ（ｒＦＶＩＩａ）は、血友病の対象および他の出血状態を有する対象における使用のための止血剤として開発されてきた。活性化に際して増加した凝固活性を有するように設計されるならびに第ＶＩＩ因子療法に適用可能な疾患および状態を処置するために改善された治療薬として働くことができる改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供される。

１． ＦＶＩＩの構造および構成
ヒトＦＶＩＩ遺伝子（Ｆ７）は、１３ｑ３４の染色体１３上に位置し、１２．８ｋｂ長であり、９つのエキソンを有する。ＦＶＩＩ遺伝子は、プロトロンビン、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、およびプロテインＣなどのような他のビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子と著しい構成上の類似性を共有する。ＦＶＩＩについてのｍＲＮＡは、選択的スプライシングを受けて、２つの転写物：変異１（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００１３１、配列番号８１において記載される）および変異２（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１９６１６、配列番号８２において記載される）を産生する。転写物変異体２は、肝臓においてより豊富な形態であり、エキソン１ｂを含まず、したがって、転写物変異体１によってコードされる４６６アミノ酸前駆体ポリペプチド（ＦＶＩＩアイソフォームａ前駆体；配列番号１）と比較して、４４４アミノ酸の、より短い前駆体ポリペプチドをコードする（ＦＶＩＩアイソフォームｂ前駆体；配列番号２）。ＦＶＩＩアイソフォームｂ前駆体ポリペプチドにおいて存在しないアミノ酸は、ＦＶＩＩアイソフォームａ前駆体のアミノ酸位置２２〜４３に対応する。これらのアミノ酸は、プロペプチド配列の一部であり、切断ＦＶＩＩアイソフォームｂプロペプチドをもたらす。前駆体ポリペプチドは、以下のセグメントおよびドメインから構成される：疎水性シグナルペプチド（配列番号１および２のアミノ酸１〜２０）、プロペプチド（配列番号１のアミノ酸２１〜６０および配列番号２のアミノ酸２１〜３８）、Ｇｌａドメイン（配列番号２のアミノ酸３９〜８３および配列番号１のアミノ酸６１〜１０５）、Ｂ型上皮成長因子ドメイン（ＥＧＦ様１、配列番号２のアミノ酸８４〜１２０および配列番号１のアミノ酸１０６〜１４２）、Ａ型上皮成長因子ドメイン（ＥＧＦ様２、配列番号２のアミノ酸１２５〜１６６；および配列番号１のアミノ酸１４７〜１８８）、ならびにセリンプロテアーゼドメイン（配列番号２のアミノ酸１９１〜４３０および配列番号１のアミノ酸２１３〜４５２）。

４０６アミノ酸のＦＶＩＩポリペプチドの成熟形態（配列番号３）は、シグナルペプチド配列およびプロペプチド配列を欠き、それが生じたアイソフォーム前駆体にかかわらず長さおよび配列が同一である。ＦＶＩＩポリペプチドの成熟形態において、上記に言及されるドメインについての対応するアミノ酸位置は、以下のとおりである：Ｇｌａドメイン（配列番号３のアミノ酸１〜４５）、ＥＧＦ様１（配列番号３のアミノ酸４６〜８２）、ＥＧＦ様２（配列番号３のアミノ酸８７〜１２８）、およびセリンプロテアーゼドメイン（配列番号３のアミノ酸１５３〜３９２）。

ＦＶＩＩのＧｌａドメインは、カルシウムイオンの存在下において、ホスファチジルセリンを含むリン脂質膜と相互作用する膜結合モチーフである。Ｇｌａドメインはまた、ＦＶＩＩａ補因子、組織因子（ＴＦ）への結合に際しても役割を果たす。ＴＦと複合体を形成すると、ＦＶＩＩａのＧｌａドメインは、７つのＣａ^２＋イオンで荷電され、細胞表面上のリン脂質との相互作用のために、細胞膜の方向に３つの疎水性側鎖を突き出し、ＴＦのＣ−末端ドメインと著しく接触する。Ｇｌａドメインは、プロトロンビン、凝固第ＶＩＩ因子、凝固第ＩＸ因子、および凝固第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、およびプロテインＺなどのようなビタミンＫ依存性タンパク質の中で保存されている。これらのタンパク質は、これらのタンパク質のＮ−末端Ｇｌａドメインにおいてクラスター形成されるアミノ酸であるγ−カルボキシグルタミン酸の翻訳後合成のためにビタミンＫを必要とする。ドメイン中に存在するグルタミン酸残基はすべて、カルボキシル化が可能な部位であり、そのため、それらの多くは、カルボキシル化によって修飾される。

Ｇｌａドメインに加えて、成熟ＦＶＩＩタンパク質はまた、２つのＥＧＦ様ドメインをも含有する。第一に、ＥＧＦ様ドメイン（ＥＧＦ様１またはＥＧＦ１）は、カルシウム結合ＥＧＦドメインであり、６つの保存コアシステインが、３つのジスルフィド架橋を形成する。ＦＶＩＩのＥＧＦ１ドメインは、たった１つのＣａ^２＋イオンに結合するのみであるが、Ｇｌａドメインで観察されるものよりも有意に高度な親和性で結合する（Banner et al. (1996) Nature 380:41-46）。この結合したＣａ^２＋イオンは、ＦＶＩＩのＥＧＦ１ドメインおよびＴＦの間で強い相互作用を促進する（Osterlund et al. (2000) Eur J Biochem 267:6204-6211）。第２のＥＧＦ様ドメイン（ＥＧＦ様２またはＥＧＦ２）は、カルシウム結合ドメインではないが、これもまた、３つのジスルフィド架橋を形成する。ＦＶＩＩにおける他のドメインのように、ＥＧＦ２ドメインは、ＴＦと相互作用する。それはまた、プロテアーゼドメインと共にジスルフィド結合され、それは、これと共に、大きな接触界面を共有する。

最終的に、ＦＶＩＩのセリンプロテアーゼドメインは、ＦＶＩＩａのタンパク質分解活性の担うドメインである。その触媒ドメインにおけるＦＶＩＩのアミノ酸の配列は、トリプシンおよびキモトリプシンなどのような他のセリンプロテアーゼと高度な配列同一性および三次構造類似性を示す（Jin et al.(2001) J Mol Biol, 307: 1503-1517）。たとえば、これらのセリンプロテアーゼは、キモトリプシンナンバリングに基づいて、共通の触媒３残基Ｈ５７、Ｄ１０２、Ｓ１９５を共有する。しかしながら、他のセリンプロテアーゼと異なり、ＦＶＩＩａの切断は、チモーゲンの完全に活性な酵素への変換を完了するのには十分ではない。その代わりとして、下記に議論されるように、ＦＶＩＩａは、細胞表面受容体ＴＦに結合することによって、その触媒機能がアロステリックに活性化され、これは、ＦＶＩＩａプロテアーゼドメインにおけるコンホメーションの変化を誘発し、それを、チモーゲン様の不活性状態から触媒活性酵素に変換する。ＦＶＩＩａの補因子結合部位および活性部位の間のヘリックスループ領域（つまり、キモトリプシンナンバリングに基づいて残基１６３から１７０ｉに対応するアミノ酸残基位置３０５〜３２１）は、ＦＶＩＩａのアロステリーおよびチモーゲン性にとって重要である（Persson et al. (2004) Biochem J., 379: 497-503）。この領域は、ループが後続する短いαヘリックス（アミノ酸残基位置３０７〜３１２）から構成される。ヘリックスのＮ−末端部分は、プロテアーゼドメインおよびＴＦの間の界面の一部を形成し、タンパク質分解機能およびＴＦへの最適な結合にとって重要な多くの残基を含有する。ＦＶＩＩａのみおよびＴＦと複合体を形成したＦＶＩＩａの結晶構造の比較は、ＦＶＩＩａが、ＴＦに結合した場合、αヘリックスが、著しいコンホメーションの変化を受けることを示す。ＦＶＩＩａのみのαヘリックスは、歪み、縮まり、かつ異なって方向づけられているように思われる。これは、近接したループ構造に影響を及ぼし、それらを活性部位から移動させて、離れさせる。対照的に、ＴＦと複合体を形成する場合のＦＶＩＩａのαヘリックスは、安定化され、近隣のループは、活性部位近くに位置する。この安定化は、ＦＶＩＩのアミノ酸位置３０６（キモトリプシンナンバリングによるアミノ酸残基Ｍｅｔ^１６４）でメチオニンを少なくとも含むメカニズムを通して達成される（Pike et al. (1999) PNAS 8925-8930）。

２． 翻訳後修飾
ＦＶＩＩ前駆体ポリペプチド（第ＶＩＩ因子遺伝子のいずれかアイソフォーム）は、疎水性シグナルペプチドによって細胞性分泌経路に向けられ、これは、小胞体（ＥＲ）の中に挿入して、膜を横切って移行を開始する。タンパク質が、ＥＲ膜を通して移行する間に、２０アミノ酸シグナルペプチドは、ＥＲ内腔内でシグナルペプチターゼによって切断され、その後に、ポリペプチドは、Ｎ−グリコシル化およびＯ−グリコシル化、Ｎ−末端グルタミン酸の、γ−カルボキシグルタミン酸へのビタミンＫ依存性カルボキシル化、ならびにアスパラギン酸の、β−ヒドロキシアスパラギン酸へのヒドロキシル化を含む翻訳後修飾をさらに受ける。

プロペプチドは、ＦＶＩＩプロペプチドにおける１０残基の両親媒性α−ヘリックスを認識するビタミンＫ依存性カルボキシラーゼのための結合部位を提供する。結合の後に、カルボキシラーゼは、ＦＶＩＩポリペプチドのＧｌａドメイン内の１０グルタミン酸残基をγ−カルボキシル化し、配列番号２において記載されるＦＶＩＩ前駆体アミノ酸配列と比較して、位置Ｅ６６、Ｅ６７、Ｅ７４、Ｅ７６、Ｅ７９、Ｅ８０、Ｅ８５、Ｅ８６、Ｅ８９、およびＥ９５でγ−カルボキシグルタミル残基を産生する。これらの位置は、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドの位置Ｅ６、Ｅ７、Ｅ１４、Ｅ１９、Ｅ２０、Ｅ２５、Ｅ２６、Ｅ２９、およびＥ３５に対応する。最適な活性のために、ＦＶＩＩ分子は、カルシウムを必要とし、これは、ポリペプチドに結合し、ＴＦおよび脂質とのＦＶＩＩａの結合に必要なコンホメーションの変化を容易にする。γ−カルボキシル化Ｇｌａドメインは、７つのＣａ^２＋イオンに可変の親和性で結合し、これは、Ｇｌａドメインが、ＴＦのＣ−末端ドメインとおよびまた血小板膜上のホスファチジルセリンまたは他の負電荷リン脂質とも相互作用することを可能にするコンホメーションの変化を誘発する。

Ｎ結合型グリコシル化は、成熟タンパク質（配列番号３）のアミノ酸残基１４５および３２２に対応する位置の、ＦＶＩＩポリペプチドにおける２つのアスパラギン残基へのＧｌｃ_３Ｍａｎ_９（ＧｌｃＮＡｃ）の移入によって実行される。Ｏ結合型グリコシル化は、成熟ポリペプチドのアミノ酸残基５２および６０で生じ、β−ヒドロキシアスパラギン酸に対するヒドロキシル化は、位置６３のアスパラギン酸残基で生じる。これらのＯ−グリコシル化セリン残基およびβ−ヒドロキシル化アスパラギン酸残基は、ＦＶＩＩのＥＧＦ−１ドメインにある。これらの修飾は、その成熟形態へのポリペプチドの最終プロセシングの前に、ＥＲおよびゴルジ複合体において達成される。

３． ＦＶＩＩプロセシング
改変プロＦＶＩＩポリペプチドは、ゴルジ内腔を通して、プロペプチドが、細胞からのタンパク質の分泌直前にプロペプチダーゼによって切断されるトランスゴルジコンパートメントに運搬される。ＰＡＣＥ／フューリン（ＰＡＣＥは、対になった塩基性アミノ酸切断酵素（Ｐａｉｒｅｄ ｂａｓｉｃ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｃｌｅａｖｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ）の頭字語である）は、配列モチーフＡｒｇ−［任意の残基］−（ＬｙｓまたはＡｒｇ）−Ａｒｇのカルボキシ末端側で多くのタンパク質を切断する、ゴルジ膜に局在化しているエンドペプチダーゼである。このプロペプチダーゼは、プロ第ＩＸ因子およびプロｖＷＦポリペプチドなどのようなビタミンＫ依存性糖タンパク質を切断し（Himmelspach et al. (2000) Thromb Research 97; 51-67）、成熟タンパク質からプロペプチドを放出する。組換え第ＶＩＩ因子前駆体の中への適切なＰＡＣＥ／フューリン認識部位の包含は、組換えポリペプチドの正確なプロセシングおよび分泌を容易にする（Margaritas et al. (2004) Clin Invest 113(7): 1025-1031）。ＰＡＣＥ／フューリンまたは他のスブチリシン様プロペプチダーゼ酵素は、おそらく、プロＦＶＩＩの、ＦＶＩＩへのタンパク質分解プロセシングを担う。それは、配列番号１において記載される配列のアミノ酸位置３５〜３８および配列番号２において記載される配列の位置５７〜６０の−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−コンセンサスモチーフを認識し、結合し、プロペプチドを切断し、分泌のために成熟タンパク質を放出することができる。

４． ＦＶＩＩ活性化
血液中のＦＶＩＩの大部分は、少量が、二本鎖活性化形態をしているが、活性化されていない一本鎖チモーゲンの形態をしている。ＦＶＩＩの活性化は、Ａｒｇ^１５２−Ｉｌｅ^１５３結合のタンパク質分解による切断に際して生じ（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドと比較した位置）、２５４アミノ酸重鎖（約３０ｋＤａ）に対して、ジスルフィドブリッジによって連結される１５２アミノ酸軽鎖（約２０ｋＤａ）を含有する二本鎖ポリペプチドを生じる。ＦＶＩＩａの軽鎖は、ＧｌａドメインおよびＥＧＦ様ドメインを含有するが、重鎖は、分子の触媒部分またはセリンプロテアーゼ部分を含有する。一本鎖ＦＶＩＩの、二本鎖ＦＶＩＩａへの変換は、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩＩａ、トロンビンによる切断によってまたは内因性ＦＶＩＩａによる自己触媒様式において媒介される（Butenas et al. (1996) Biochem 35:1904-1910；Nakagaki et al. (1991) Biochem 30:10819-10824）。血行路において生じる微量のＦＶＩＩａは、おそらく、ＦＸａおよびＦＩＸａの作用から生じる。

上記に議論されるように、そのチモーゲン形態からＦＶＩＩａへのＦＶＩＩの切断は、完全な活性に十分ではない。ＦＶＩＩａは、完全な活性のためにＴＦとの結合を必要とする（Higashi et al. (1996) J Biol Chem 271:26569-26574）。この必要性のために、ＦＶＩＩａのみでは、チモーゲンの折り畳みおよび形状を示し、比較的低い活性を示すチモーゲン様の特徴に属するものとみなされる。ＴＦとのその結合の非存在におけるＦＶＩＩａのこのチモーゲン様の特徴は、ＦＶＩＩａを、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）および他のセルピンに対して比較的抵抗性にし、これらは、一般に、チモーゲン形態ではなく、主にセリンプロテアーゼの活性形態に対して作用する。さらに、ＴＦ／ＦＶＩＩａ活性の主要な阻害因子であるＴＦＰＩもまた、ＦＶＩＩａの「不活性」な、複合体を形成していない形態に対して効率的に結合しない。

ＴＦとの複合体形成に際して、ＦＶＩＩａは、分子の完全な活性を可能にするコンホメーションの変化を受ける。ＦＶＩＩドメインはすべて、ＴＦとの相互作用に関与するが、生じるコンホメーションの変化は、ＦＶＩＩａのプロテアーゼドメインに局在化している。たとえば、ＦＶＩＩａおよびＴＦのアロステリック相互作用に際して生じるコンホメーションの変化は、広域高分子基質結合エキソサイトの生成を含む。この広域結合部位は、第Ｘ因子のＦＶＩＩ媒介性タンパク質分解活性化を非常に増強する。

ＦＶＩＩａの活性は、ＦＶＩＩａの相互作用が細胞表面に発現されたＴＦとのものである場合、さらに増加する（つまり１０００倍）。これは、ホスファチジルセリンなどのような負電荷リン脂質を含有するリン脂質膜が、Ｇｌａドメインを介して結合するＦＩＸおよびＦＸなどのような他のビタミンＫ依存性凝固因子の相互作用の部位であるからである。したがって、これらのビタミンＫ依存性タンパク質の局所的濃度は、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体とのそれらの相互作用を促進する細胞表面で高度である。

５． ＦＶＩＩ機能
ＦＶＩＩａは、ＴＦによるアロステリック活性化の後に、増加した活性を示すが、ＦＶＩＩａが単独で凝固を開始することができるメカニズムが存在するという証拠がある。したがって、ＦＶＩＩは、ＴＦ依存性の様式およびＴＦ非依存性の様式において機能することができる。この後者の経路は、その有意性が、それが、出血障害およびその処置との関連において考えられる場合、増加するかもしれないが、正常な止血においてはるかに小さな役割を果たし得る。

ａ． 組織因子依存性ＦＶＩＩａ活性
循環ＦＶＩＩは、上記に記載されるように、細胞表面ＴＦに結合し、ＦＩＸａ、ＦＸａ、トロンビンによってまたは内因性ＦＶＩＩａによる自己触媒様式において活性化される。代わりに、非常に少量の循環ＦＶＩＩａは、ＴＦに直接的に結合することができる。次いで、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体は、血漿ＦＸのごく一部分に結合し、ＦＶＩＩａ触媒ドメインは、ＦＸを切断して、ＦＸａを産生する。トロンビンは、したがって、ＦＸａがＦＶａと複合体を形成し、プロトロンビンを活性化して、トロンビンにする場合、ＴＦを有する細胞の表面上で外因性経路を介して形成される（図３）。ＦＩＸもまた、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体によって活性化され、活性化血小板の表面上で作動する内在性経路への連結を提供する。上記に記載される凝固カスケードにおけるポジティブフィードバック系は、フィブリノーゲンを切断して、フィブリンにし、血餅を形成する大量のトロンビンが産生される手段を提供する。

ｂ． 組織因子非依存性ＦＶＩＩａ活性
ＦＸのＦＸａへの活性化のためのＴＦ依存性メカニズムに加えて、ＦＶＩＩａがまた、ＴＦの非存在下においてＦＸを活性化することもできるという証拠がある。活性化血小板は、外側の血漿に向く表面に、ホスファチジルセリンおよび他の負電荷リン脂質を移行する。（Hemker et al. (1983) Blood Cells 9:303-317）。ＴＦへのＦＶＩＩａの結合親和性の１０００分の１未満である比較的低い親和性とはいえ、これらは、ＦＶＩＩａが結合することができる代替「受容体」を提供する（Monroe et al. (1997) Br J Haematol 99:542-7）。この相互作用は、Ｇｌａドメインにおける残基を通して媒介される（Harvey et al. (2003) 278:8363-8369）。次いで、ＦＶＩＩａは、活性化血小板表面上で、ＦＸをＦＸａに変換し、ＦＩＸをＦＩＸａに変換することができる（Hoffman et al. (1998) Blood Coagul Fibrinolysis 9:S61-S65）。ＦＸａは、血小板表面と結合したままであり、ここで、それは、ＦＶａに結合することができ、プロトロンビンから十分なトロンビンを生成するが、新しく形成されたＦＩＸａがＦＶＩＩＩａと組み合わさって、より多くのＦＸのＦＸａへの活性化を触媒する（図３）。ＴＦの非存在下における止血は、次いで、上記に記載されるように、ポジティブフィードバックおよび伝播メカニズムによって達成される。しかしながら、ＦＶＩＩＩａは、活性化血小板上で凝固プロセスに寄与することができるが、その存在は、ＴＦ非依存性のメカニズムにおけるトロンビン生成に必要とされないことは注目すべきである（図３）。したがって、血友病患者においてなどのようにＦＶＩＩＩの非存在下において、ＦＶＩＩａが、この二次的メカニズムを通してトロンビン生成を開始および／または増幅させることができ、また血餅形成を達成することができるという証拠がある。

６． 生物製剤としてのＦＶＩＩ
ＦＶＩＩは、血液凝固を開始するように機能する。組換えＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）；ｒＦＶＩＩａ）は、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子に対する阻害因子を有する血友病Ａまたは血友病Ｂを有する患者および先天性第ＶＩＩ因子欠乏症を有する患者における手術または侵襲性手技における出血エピソードの処置または出血の予防について承認されている。Ｎｏｖｏｓｅｖｅｎ（登録商標）は、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞を使用して、哺乳動物発現系において産生される第ＶＩＩａ因子の遺伝子的に操作された調製物である。この作用物質は、その構造および機能において、血漿由来第ＶＩＩａ因子にほとんど同一である（Ratko et al. (2004), P & T, 29: 712-720）。

組換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）の投与は、血友病に罹患している患者において血液凝血を促進することが示され、ＦＶＩＩａの用量を用いる処置は、ヒト対象において安全であり、かつ十分に許容的であることが分かった。典型的には、ｒＦＶＩＩａの使用は、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子に対して阻害因子（つまり同種抗体）を作った患者におけるものとした。凝固薬としてのｒＦＶＩＩａの使用は、他の出血障害、たとえばグランツマン血小板無力症；肝臓移植、前立腺手術、および大量出血の外傷を含むが、これらに限定されない、外傷または手術の結果などのような広範囲の出血と関連する他の事象；新生児凝固障害、重症の肝疾患；骨髄移植、血小板減少症、および血小板機能障害；経口抗凝固の緊急の逆転；第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、および第ＸＩ因子の先天性欠乏症；ならびにフォンウィルブランド因子に対する阻害因子を有するフォンウィルブランド病の処置まで拡張された。

高用量のｒＦＶＩＩが、治療効果を達成するために必要とされる。ｒＦＶＩＩ投与に必要とされる用量および投薬計画は、臨床的指標に依存して変わる。たとえば、同種抗体を有する血友病Ａまたは血友病Ｂを有する患者における出血エピソードに対するｒＦＶＩＩの典型的な投薬量は、９０μｇ／ｋｇであり、静脈内（ＩＶ）注射によって投与される。ｒＦＶＩＩが２時間の半減期を有するので、反復投薬が必要とされる。止血が達成されるまで、さらなる投薬は、２時間ごとに与えられ得る。用量範囲は、状態の重症度に依存して変更することができる。たとえば、３５〜１２０μｇ／ｋｇに及ぶ用量は、効果的であった。また、用量および投薬計画は、他の指標に応じて変わり得る。たとえば、手術を受ける血友病Ａまたは血友病Ｂの患者は、手術直前に９０μｇ／ｋｇの初回用量を投与することができ、反復投薬は、手術の間におよび手術の後に２時間ごとに与えられる。手術および出血エピソードの重症度に依存して、ボーラスＩＶ注入は、治癒が達成されるまで、２〜６時間ごとに継続することができる。先天性ＦＶＩＩ欠損患者において、ｒＦＶＩＩは、止血が達成されるまで、４〜６時間ごとに、１５〜３０μｇ／ｋｇで、手術または他の侵襲性手技における出血を予防するために典型的に投与される。

止血を開始するためのｒＦＶＩＩａの作用のメカニズムは、高用量の必要量について説明する。血友病患者は、凝固の正常な開始フェーズを有し、ここで、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体は、ＦＸを活性化してＦＸａにし、ＴＦを有する細胞の部位でのトロンビン産生に至る。その後、しかしながら、血友病患者がＦＶＩＩＩ（血友病Ａ）またはＦＩＸ（血友病Ｂ）を欠くので、凝固プロセスは、抑圧され、そのため、活性化血小板の表面上でＦＶＩＩＩａ／ＦＩＸａ複合体を形成することができず、これは、先に記載されるように、通常、増幅および伝播のフェーズにおいて、大量のＦＸを活性化してＦＸａにするために働く。ＴＦＰＩおよびＡＴ−ＩＩＩなどのような阻害因子の存在により、ＴＦ／ＦＶＩＩａによる切断の後にＴＦを有する細胞上で産生されるＦＸａは、細胞表面の間に容易に拡散することができない。その結果として、活性化血小板の表面上の大規模トロンビン生成は、生じず、血餅は、形成されない。

高用量のｒＦＶＩＩａの止血効果は、ＴＦ依存性の生成および／または活性化血小板上でのｒＦＶＩＩａによるＦＸａのＴＦ非依存性の生成を使用して達成することができるという証拠がある（図３）。ＴＦ依存性のトロンビン生成は、内因性ＦＶＩＩａおよびｒＦＶＩＩａを用いるＴＦ分子の飽和と共に非常に素速く最大限にすることができる。いくつかの場合において、高用量ｒＦＶＩＩａは、活性化血小板に結合し、ＦＸをＦＸａに変換することができる。表面結合ＦＸａは、止血に十分なトロンビンを生成するためにＦＶａを活性化する。ｒＦＶＩＩが、低親和性で血小板表面に結合するので、より高用量のｒＦＶＩＩが、トロンビン生成のために必要とされ得る。活性化血小板上のＦＸａの活性化は、ｒＦＶＩＩａ媒介性の止血が傷害の部位に局在化されることを保証する。

ｒＦＶＩＩの低下した投薬量を達成するための手段は、薬剤としてその有用性および効率を改善することができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供される。これらの中で、ＴＦの存在下および／または非存在下において、ＡＴ−ＩＩＩに対して増加した抵抗性および増加した触媒活性を示す改変ＦＶＩＩポリペプチドがある。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、ＴＦＰＩに対する増加した抵抗性、Ｚｎ^２＋の阻害効果に対する増加した抵抗性、増加した血清半減期などのような改善した薬物動態学的特性、活性化血小板に対する増加した結合性および／もしくは親和性、血清アルブミンに対する増加した結合性および／もしくは親和性ならびに／または血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３に対する増加した結合性および／もしくは親和性を示すこともできる。これらの改変ＦＶＩＩポリペプチドは、増加した血液凝固活性を示すことができる。本明細書において提供されるＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＸａが産生され、トロンビンが生成されるように、ＴＦ依存性および／またはＴＦ非依存性のメカニズムにおいて止血を開始するための処置において使用することができる。

Ｄ． 改変ＦＶＩＩポリペプチド
改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供される。ＦＶＩＩポリペプチドは、そのように改変されていないＦＶＩＩポリペプチドと比較して、１つまたは複数の活性または特性における変化を示す。改変の結果として変化させることができる活性または特性は、凝固もしくは血液凝固活性；凝血促進活性；第Ｘ因子（ＦＸ）活性化もしくは第ＩＸ因子（ＦＩＸ）活性化を達成するなどのようなタンパク質分解活性もしくは触媒活性；抗原性（抗ＦＶＩＩ抗体に結合する能力もしくはそれへの結合についてあるポリペプチドと競合する能力）；組織因子、第Ｘ因子、もしくは第ＩＸ因子に結合する能力；リン脂質に結合するための能力；半減期；３次元構造；ｐＩ；および／またはコンホメーションを含むが、これらに限定されない。典型的には、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、凝血促進活性を示す。それらの一本鎖チモーゲン形態からの活性化に際して増加した血液凝固活性を示す改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供される。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、血友病または傷害などのような、出血障害または出血事象の処置において使用することができ、ＦＶＩＩポリペプチドは、血液凝固を促進するために機能することができる。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドの中で、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）および組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）などのような阻害因子に対する増加した抵抗性を有するもの、Ｚｎ^２＋の阻害効果に対する増加した抵抗性を有するもの、ＴＦの存在下および／または非存在下において増加した触媒活性を有するもの、増加した半減期などのような改善された薬物動態学的特性を有するもの、血小板表面に対する増加した結合性および／または親和性を有するもの、血清アルブミンに対する増加した結合性および／または親和性を有するもの、ならびに血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３に対する増加した結合性および／または親和性を有するものを示すＦＶＩＩポリペプチドが含まれる。特に、そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＶＩＩＩａおよびＦＩＸａについての必要性を同時に回避しながら、血液凝固活性を提供するために疾患または状態において使用することができる。一例において、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＶＩＩＩａおよびＦＩＸａに対する自己抗体を有する血友病患者において使用することができる。したがって、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、止血のための、血清における活性ＦＶＩＩの十分な濃度を維持するために必要とされる、投与されるＦＶＩＩの量における減少を含む利点を提供する。これは、たとえば、同等の生物学的効果、より高度な快適さ、および対象による受け入れを達成するのに必要であるより低い用量および／または投薬頻度ならびに副次的影響の減弱に至り得る。

ＦＶＩＩポリペプチドにおける改変は、対立遺伝子変異体および種変異体、スプライス変異体、当技術分野において知られている変異体、ハイブリッドＦＶＩＩ分子またはキメラＦＶＩＩ分子を含む、ＦＶＩＩポリペプチドの任意の形態に対してなすことができる。たとえば、本明細書において提供される改変は、配列番号１もしくは２において記載される前駆体ＦＶＩＩポリペプチド、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチド、または配列番号１〜３において記載されるＦＶＩＩポリペプチドのいずれかに対して、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する任意の種変異体、対立遺伝子変異体、もしくは改変変異体およびその活性断片においてなすことができる。ＦＶＩＩの対立遺伝子変異体は、配列番号１８〜７４のいずれかにおいて記載されるアミノ酸の配列を有する前駆体ポリペプチドのいずれかを含むが、これらに限定されない。本明細書における改変のための例示的な種変異体は、雌ウシ、マウス、ピグミーチンパンジー、チンパンジー、ウサギ、ラット、アカゲザル、ブタ、イヌ、ゼブラフィッシュ、フグ、ニワトリ、オランウータン、およびゴリラのＦＶＩＩポリペプチドに由来するＦＶＩＩポリペプチドを含む、ヒトポリペプチドおよび非ヒトポリペプチドを含むが、これらに限定されず、これらの配列は、それぞれ、配列番号４〜１７において記載される。ＦＶＩＩポリペプチドにおける改変はまた、ポリペプチドの一次配列における改変および一次配列におけるものではない改変を含む、当技術分野において記載されるものなどのような他の改変を含有するＦＶＩＩポリペプチドに対してもなすことができる。

ＦＶＩＩポリペプチドの改変はまた、異なるＦＶＩＩポリペプチドのハイブリッドであるポリペプチドおよびまた知られているポリペプチドの配列に基づいて、組換えで調製されたまたは当技術分野において知られている他の方法によって合成されたもしくは構築された合成ＦＶＩＩポリペプチドの改変をも含む。たとえば、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）または第Ｘ因子（ＦＸ）などのような他の凝固因子ファミリーメンバーとのＦＶＩＩのアライメントに基づいて、ファミリーメンバーの間の相同性ドメインは、容易に同定される。ＦＶＩＩポリペプチドのキメラ変異体は、構築することができ、１つもしくは複数のアミノ酸または全ドメインは、対応するファミリーメンバーのアミノ酸配列を使用して、ＦＶＩＩアミノ酸配列において交換される。さらに、キメラＦＶＩＩポリペプチドは、１つもしくは複数のアミノ酸または全ドメインが、異なる種のアミノ酸配列を使用して、ヒトＦＶＩＩアミノ酸配列において交換されるものを含む（たとえば、Williamson et al. (2005) J Thromb Haemost 3:1250-6を参照されたい）。そのようなキメラタンパク質は、出発非改変ＦＶＩＩポリペプチドとして本明細書において使用することができる。

出発非改変参照ポリペプチドの本明細書において提供される改変は、アミノ酸の交換もしくは置換、アミノ酸の追加もしくは欠失、またはその任意の組み合わせを含む。たとえば、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、またはそれ以上の改変位置を有するものを含む。出発参照ＦＶＩＩポリペプチドと比較して２つ以上の改変を有する改変ＦＶＩＩポリペプチドもまた、本明細書において提供される。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、またはそれ以上の改変位置を有するものを含む。本明細書において提供されるあらゆる改変は、結果として生じる改変ＦＶＩＩポリペプチドが、その二本鎖形態をしている場合に、増加した凝固活性を示す限り、当業者に知られている任意の他の改変と組み合わせることができる。典型的には、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、増加した血液凝固活性を示す。改変の結果として変化させることができる活性または特性は、凝固もしくは血液凝固活性；凝血促進活性；第Ｘ因子（ＦＸ）活性化もしくは第ＩＸ因子（ＦＩＸ）活性化を達成するなどのようなタンパク質分解活性もしくは触媒活性；抗原性（抗ＦＶＩＩ抗体に結合する能力もしくはそれへの結合についてあるポリペプチドと競合する能力）；組織因子、組織因子抑制因子（ＴＦＰＩ）、アンチトロンビンＩＩＩ、第Ｘ因子、もしくは第ＩＸ因子に結合する能力；リン脂質、血清アルブミン、もしくは血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３に結合する能力；血清半減期；３次元構造；ｐＩ；および／またはコンホメーションを含むが、これらに限定されない。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドの中で、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）に対する増加した抵抗性、ＴＦの存在下および／もしくは非存在下において増加した触媒活性、組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）に対する増加した抵抗性、Ｚｎ^２＋の阻害効果に対する増加した抵抗性、増加した血清半減期などのような改善した薬物動態学的特性、増加した内因活性、変化したグリコシル化、血清アルブミンに対する増加した親和性および／もしくは結合性、血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３に対する増加した親和性および／もしくは結合、ならびに／または活性化血小板に対する増加した親和性および／もしくは結合を有するものが含まれる。

いくつかの例において、改変は、ＦＶＩＩポリペプチドの２つ以上の特性または活性に影響を及ぼすことができる。たとえば、改変は、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、改変ＦＶＩＩポリペプチドの増加したＡＴ−ＩＩＩ抵抗性および増加した触媒活性もたらすことができる。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、改変の効果の範囲を同定するために、それぞれの特性および活性についてアッセイすることができる。そのようなアッセイは、当技術分野において知られており、下記に記載される。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、細胞性機構によってさらに改変され、たとえば、グリコシル化ポリペプチド、γ−カルボキシル化ポリペプチド、およびβ−ヒドロキシル化ポリペプチドを含む、ＦＶＩＩポリペプチドをも含む。

ＦＶＩＩポリペプチドに対する本明細書において提供される改変は、ＡＴ−ＩＩＩ抵抗性を増加させるために、ＴＦＰＩ抵抗性を増加させるために、Ｚｎ^２＋の阻害効果に対する抵抗性を増加させるために、血清半減期を増加させるなどのように、薬物動態学的特性を改善するために、ＴＦの存在下および／もしくは非存在下において触媒活性を増加させるために、活性化血小板に対する結合性を増加させるために、グリコシル化を変化させるために、血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３に対する親和性および／もしくは結合性を増加させるために、血清アルブミンに対する親和性および／もしくは結合性を増加させるために、ならびに／または活性化血小板に対する親和性および／もしくは結合性を増加させるためになされる。たとえば、ＦＶＩＩポリペプチドは、血小板に対する触媒活性および結合性の一方または両方を増加させる改変（１つまたは複数）を含むことができる。他の例において、本明細書において提供されるあらゆる改変は、結果として生じる改変ＦＶＩＩポリペプチドが、その二本鎖形態をしている場合に、増加した凝固活性を示す限り、当業者に知られている任意の他の改変と組み合わせることができる。典型的には、そのような増加した凝固活性は、ＡＴ−ＩＩＩに対する増加した抵抗性、増加した触媒活性、Ｚｎ^２＋の阻害効果に対する増加した抵抗性、増加した血清半減期などのような改善した薬物動態学的特性、ＴＦＰＩに対する増加した抵抗性、変化したグリコシル化、リン脂質に対する増加した結合性および／もしくは親和性、血清アルブミンに対する増加した結合性および／もしくは親和性ならびに／または血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３に対する増加した結合性および／もしくは親和性によるものである。いくつかの例において、比活性または特性を変化させるためにＦＶＩＩポリペプチドの中に導入される改変はまた、またはその代わりとして、他の活性または特性に影響を及ぼすことができる。したがって、本明細書において提供される改変は、それらが影響を及ぼすように設計された特性または活性および１つまたは複数の他の特性または活性に影響を及ぼすことができる。たとえば、触媒活性を増加させるためにＦＶＩＩポリペプチドになされた改変はまた、ＡＴ−ＩＩＩ抵抗性をも増加させることができる。いくつかの例において、単一のアミノ酸置換などのような単一の改変は、ＦＶＩＩポリペプチドの２、３、４、またはそれ以上の特性または活性を変化させる。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、改変の効果の範囲を同定するために、それぞれの特性および活性についてアッセイすることができる。そのようなアッセイは、当技術分野において知られており、以下に記載される。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、細胞性機構によってさらに改変され、たとえば、グリコシル化ポリペプチド、γ−カルボキシル化ポリペプチド、およびβ−ヒドロキシル化ポリペプチドを含む、ＦＶＩＩポリペプチドをも含む。

本明細書において提供される改変は、当業者にとってルーチン的なものなどのような標準的な組換えＤＮＡ技術によってなすことができる。標的タンパク質における任意の１つまたは複数のアミノ酸の突然変異を達成するための、当技術分野において知られている任意の方法を利用することができる。方法は、コード核酸分子の標準的な部位特異的突然変異誘発（たとえばＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なＱｕｉｋＣｈａｎｇｅなどのようなキットなどのようなキットを使用して）または固相ポリペプチド合成法によるものを含む。さらに、本明細書において提供される改変キメラタンパク質（つまりＧｌａドメインｓｗａｐ）は、ルーチン的な組換えＤＮＡ技術によって生成することができる。たとえば、キメラポリペプチドは、望ましいキメラポリペプチド構成成分のルーチン的なサブクローニングのために、制限酵素およびクローニング方法論を使用して生成することができる。

炭水化物部分の追加、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の追加、Ｆｃドメインの追加などを含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの一次配列にあるまたはない他の改変は、改変ＦＶＩＩポリペプチドまたはそのコンジュゲートにおいて含むことができる。たとえば、そのようなさらなる改変は、タンパク質の安定性または半減期を増加させるためになすことができる。

結果として生じる改変ＦＶＩＩポリペプチドは、一本鎖チモーゲンポリペプチドであるものまたは二本鎖チモーゲン様のポリペプチドであるものを含む。たとえば、一本鎖ポリペプチドである、本明細書において提供される任意の改変ポリペプチドは、自己活性化するまたは他の凝固因子によって活性化して、二本鎖形態（つまりＦＶＩＩａ）である改変ＦＶＩＩを生成することができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドの活性は、その二本鎖形態において典型的に示される。

本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、増加したＡＴ−ＩＩＩ抵抗性、ＴＦの存在下および／もしくは非存在下において増加した触媒活性、Ｚｎ^２＋の阻害効果に対する増加した抵抗性、増加したＴＦＰＩ抵抗性、増加した血清半減期などのような改善した薬物動態学的特性、変化したグリコシル化、リン脂質に対する増加した結合性および／もしくは親和性、血清アルブミンに対する増加した結合性および／もしくは親和性ならびに／または血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３に対する増加した結合性および／もしくは親和性を示すことができる。典型的には、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドのそのような特性および／または活性は、限定はしないが、ＴＦに対する結合性ならびに／またはＦＸの結合性および活性化などのような、他のＦＶＩＩ活性または特性を保持しながら、なされる。したがって、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＶＩＩポリペプチドの野生型形態または出発形態と比較して、ＴＦ結合性および／またはＦＸ結合性および活性化を保持する。典型的には、そのような活性は、野生型タンパク質または出発タンパク質と比較して、実質的に不変である（１％、５％、または１０％未満変化する）。他の例において、改変ＦＶＩＩポリペプチドの活性は、野生型ポリペプチドまたは出発ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加するまたは減少する。活性は、インビトロにおいてまたはインビボにおいて評価することができ、たとえば成熟野生型天然ＦＶＩＩポリペプチド（配列番号３）、野生型前駆体ＦＶＩＩポリペプチド（配列番号１もしくは２）、または出発物質として使用される当業者に知られている任意の他のＦＶＩＩポリペプチドなどのような非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較することができる。

したがって、本明細書において提供される改変により、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、増加した血液凝固活性、血液凝固活性の増加した継続期間、および／または、増強した治療指数を示すことができる。これは、ＴＦ依存性および／またはＴＦ非依存性の様式において観察することができる。典型的には、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドの増加した血液凝固活性、血液凝固活性の増加した継続期間、および／または増強した治療指数は、インビトロにおいて、適切なアッセイにおいてエクスビボにおいて、またはヒト対象もしくは非ヒト対象などのような対象への投与に際してなどのように、インビボにおいて観察することができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドの増加した活性は、出発ポリペプチドまたは非改変ＦＶＩＩａポリペプチドの活性と比較して、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上増加させることができる。

１． 増加した触媒活性
ＦＶＩＩは、切断反応の間に求核剤として作用する、その活性中心におけるセリン残基（標準的なキモトリプシン（キモトリプシノーゲン）ナンバリングにおける位置１９５）を含有する。セリンプロテアーゼの触媒３残基はまた、２つのさらなる残基をも含む：Ｈ５７およびＤ１０２（キモトリプシンナンバリング）。ヒトＦＶＩＩａの触媒３残基は、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドのＨ１９３、Ｄ２４２、およびＳ３４４に対応する。これらの重要な３つのアミノ酸は、それぞれ、プロテアーゼの触媒活性における本質的な役割を果たす。セリンプロテアーゼは、四面体の遷移状態およびアシル酵素中間体の形成を介してペプチド結合を加水分解する。反応経路は、Ｈ５７およびＳ１９５を含有する、プロテアーゼの表面上の溝（つまり活性部位のくぼみ）の中への基質の非共有結合から始まり、「ミカエリス−メンテン複合体」を形成する。反応経路に沿った生産的な進行は、酵素の活性部位セリン（つまりセリン１９５）のＯ−ガンマによる、基質のＰ１カルボニル残基の、続く求核攻撃を必要とし、速やかにアシル酵素中間体に変換する四面体の遷移状態を形成する。残基グリシン１９３およびセリン１９５（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドのＧ３４２およびＳ３４４に対応）を含み、オキシアニオンホールとして知られている活性部位のくぼみ内の構造は、遷移状態を安定化することによって効率的な触媒を促進する。とりわけ、これらの２つの残基の主鎖アミド水素は、四面体の遷移状態において生成されるオキシアニオン（つまりＰ１残基のカルボニル酸素）と安定化水素結合を形成する。この安定化に加えて、オキシアニオンホール内の基質の結合は、結合切断をもたらす、生産的なアシル化および脱アシル化反応のための、切断しやすい結合を適切に位置づける。ＦＶＩＩ活性におけるオキシアニオンホールの重要性は、アミノ酸位置３４２（キモトリプシンナンバリングによる１９３に対応する）での突然変異が、ＦＶＩＩ欠乏症をもたらし得るという観察によって強調される（たとえばBernardi et al., (1994) Br. J. Haematol. 86:610-618およびBernardi et al., (1996) Human Mut. 8:108-115を参照されたい）。

ａ． 触媒活性を増加させるための例示的な改変
増加した血液凝固活性を示す改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供される。そのようなＦＶＩＩポリペプチドは、オキシアニオンホールのコンホメーションに影響を及ぼすことができる、１つまたは複数の残基のアミノ酸置換によって生成することができる。特定の位置（たとえばキモトリプシンナンバリングによる位置１４３または成熟ＦＶＩＩナンバリングによる２８６）での異なるアミノ酸残基の導入は、オキシアニオンホールが、触媒の間により有効となるように、改変ＦＶＩＩポリペプチドのコンホメーションを変化させることができる。これは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加した触媒活性を有する改変ＦＶＩＩポリペプチドをもたらすことができる。オキシアニオンホールに影響を及ぼす突然変異による触媒活性における変化は、増加した血液凝固活性として示すことができる。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドの触媒活性および血液凝固活性における増加は、組織因子の存在下および／または非存在下において観察することができる（つまりＴＦ依存性および／またはＴＦ非依存性のものとすることができる）。したがって、凝血促進治療薬としての対象への投与の後などのように、適切なインビトロ、インビボ、またはエクスビボアッセイにおいて評価した場合、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加した血液凝固活性を示すことができる。

オキシアニオンホールのコンホメーションは、オキシアニオンホールの形成に関与するまたはそれに近接した１つまたは複数のアミノ酸残基の改変によって、より有効なコンホメーションを誘発するために変化させることができる。本明細書において提供されるように、例示的なそのようなアミノ酸残基は、Ｑ２８６（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応するナンバリング）であり、これは、キモトリプシンナンバリングによるＱ１４３に対応する。Ｑ２８６は、たとえばアミノ酸置換、アミノ酸欠失、またはアミノ酸挿入によって改変することができる。改変が、アミノ酸置換によって達成される場合、位置２８６のグルタミン残基は、任意の他のアミノ酸残基と交換することができる。

Ｑ２８６は、ＦＶＩＩポリペプチドの活性部位および活性部位のくぼみの領域を形成する残基に近接しており、その残基に接している。そのため、この位置での改変が、低下した触媒活性をもたらすはずであると述べられてきた（たとえば米国特許第６８０６０６３号を参照されたい）。これは、先の研究（たとえば国際特許出願公開ＷＯ２００７０３１５５９を参照されたい）において実証されており、ここで、グルタミン残基は、アラニン（Ｑ２８６Ａ）と交換された。結果として生じる改変ＦＶＩＩａポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比較して、第Ｘ因子を活性化するための、低下した能力を示す。他の研究において、同じ突然変異は、第Ｘ因子（Dickinson et al., (1996) Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 93:14379-14384）または合成基質（国際特許出願公開ＷＯ２００７０３１５５９）に対する、ＦＶＩＩａ突然変異体の触媒活性に対する影響が本質的になかった。

しかしながら、本明細書において実証されるように（実施例４および下記を参照されたい）、特にアルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）などのような塩基性残基を用いる、位置２８６（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応するナンバリング；キモトリプシンナンバリングによる位置１４３に対応する）でのＦＶＩＩポリペプチドの改変は、増加した触媒活性および血液凝固活性を有する改変ＦＶＩＩポリペプチドをもたらす。

したがって、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸位置２８６（キモトリプシンナンバリングによるアミノ酸位置１４３）に対応するアミノ酸位置での、塩基性アミノ酸とのアミノ酸交換などのような改変を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供される。アミノ酸位置２８６での本明細書において提供される改変は、配列番号１もしくは２において記載される前駆体ＦＶＩＩポリペプチド、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチド、または配列番号１〜３において記載されるＦＶＩＩポリペプチドのいずれかに対して、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する任意の種変異体、対立遺伝子変異体、もしくは改変変異体およびその活性断片を含む、任意のＦＶＩＩポリペプチドにおいてなすことができる。

成熟ＦＶＩＩナンバリングによるアミノ酸位置２８６（キモトリプシンナンバリングによるアミノ酸１４３に対応する）でのＦＶＩＩポリペプチドの改変は、基質のより有効な触媒を容易にするコンホメーションに対して、オキシアニオンホールのコンホメーションを変化させることができる。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドの増加した触媒活性は、組織因子の存在下および／または非存在下において示すことができ、以下の実施例４および７において記載されるものなどのようなインビトロアッセイを使用して評価することができる。増加した触媒活性を示すことに加えて、成熟ＦＶＩＩナンバリングによってアミノ酸位置２８６で改変されるＦＶＩＩポリペプチドはまた、ＡＴ−ＩＩＩに対する増加した抵抗性を示すことができる。これは、たとえば、特定される条件（たとえば患者への注射の後）下でのＡＴ−ＩＩＩに対する改変ＦＶＩＩポリペプチドの低下した結合またはＡＴＩＩＩによる不活性化の低下した速度（つまり阻害に対する低下した二次速度定数）によるものとすることができ、これは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較した、ＡＴ−ＩＩＩの存在下における増加した血液凝固活性として示すことができる。ＡＴ−ＩＩＩに対する増加した抵抗性は、実施例５において記載されるものなどのようなインビトロアッセイを使用して評価することができる。

成熟ＦＶＩＩナンバリングによるアミノ酸残基Ｑ２８６（キモトリプシンナンバリングによるＱ１４３に対応する）は、アミノ酸欠失または任意の他のアミノ酸との交換もしくは置換によって改変することができる。代わりに、アミノ酸は、アミノ酸残基Ｑ２８６の近傍において、コンホメーションを変化させるために直前または直後に挿入することができる。さらに、Ｑ２８６の改変を含有するＦＶＩＩポリペプチドはまた、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、アミノ酸置換、もしくはアミノ酸交換、炭水化物部分の追加などのような、ポリペプチドの一次配列におけるものではない改変、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の追加、Ｆｃドメインの追加など、またはその任意の組み合わせを含む、１つまたは複数の他の改変をも含有することができる。したがって、成熟ＦＶＩＩナンバリングによるアミノ酸位置２８６での改変を含有するＦＶＩＩポリペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、またはそれ以上の改変位置を含有することができる。そのようなポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持する。典型的には、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、増加した血液凝固活性を示す。

活性におけるこれらの変化は、増加した血液凝固活性、血液凝固活性の増加した継続期間、治療的利益の増加した作用発現、血液凝固活性の増加した作用発現、および／または増強した治療指数として示すことができる。したがって、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加した凝固活性を示す、成熟ＦＶＩＩナンバリングによるアミノ酸位置２８６での改変を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供される。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、血友病、手術、外傷、および傷害などのような、出血障害または事象の処置において使用することができ、ＦＶＩＩポリペプチドは、血液凝固を促進するために機能することができる。増加した血液凝固活性のために、成熟ＦＶＩＩナンバリングによるアミノ酸位置２８６での改変を含有する、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）ＦＶＩＩなどのように、止血のための、血清における活性ＦＶＩＩの十分な濃度を維持するために必要とされる、投与されるＦＶＩＩの量における減少を含む、野生型ＦＶＩＩポリペプチドを用いる処置に対する利点を提供する。これは、たとえば、同等の生物学的効果を達成するのに必要な、低下した用量および／もしくは投薬頻度、治療的利益のより速い作用発現、作用のより長い継続期間、より高度な快適さおよび対象による受け入れ、ならびに／または望まれない副次的影響の減弱に至り得る。

ｉ． 位置２８６での塩基性アミノ酸置換
位置２８６（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応するナンバリング；キモトリプシンナンバリングによる位置１４３に対応する）でのグルタミンが、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、またはリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）のいずれか１つなどのような塩基性アミノ酸残基と交換される改変ＦＶＩＩポリペプチドが提供される。特に、アルギニン（つまりＱ２８６Ｒ、キモトリプシンナンバリングによるＱ１４３Ｒに対応する）と位置２８６のグルタミンが交換される改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供される。モデリング研究は、アルギニンとのグルタミンの置換が、野生型ＦＶＩＩまたは非改変ＦＶＩＩにおけるＦＶＩＩａオキシアニオンホールの不活性コンホメーションを安定化する、２つの重要な相互作用の損失をもたらすことを示す。野生型ポリペプチドまたは非改変ＦＶＩＩポリペプチドにおいて不安定化する相互作用は、Ｑ２８６（キモトリプシンナンバリングによるＱ１４３に対応する）の側鎖およびＧ３４２（キモトリプシンナンバリングによるＧ１９３に対応する）の主鎖アミドの間の相互作用ならびにＫ３４１（キモトリプシンナンバリングによるＫ１に対応する）の主鎖カルボニルおよびＳ１９５（キモトリプシンナンバリングによるＳ３４４に対応する）の主鎖アミドの間の相互作用を含む。しかしながら、位置２８６のアルギニンと野生型グルタミンを置換することによって、これらの相互作用が失われるだけでなく、２つの重要な新しい相互作用が生成されもする。これらは、改変ＦＶＩＩａポリペプチドの活性コンホメーションを安定化する、改変アミノ酸Ｒ２８６（キモトリプシンナンバリングによるＲ１４３）の塩基性側鎖および天然Ｄ２８９（キモトリプシンナンバリングによるＤ１４６）の酸性側鎖の間の塩ブリッジの生成ならびに改変アミノ酸Ｒ２８６の主鎖アミドおよびＫ３４１の主鎖カルボニルの相互作用を含む。さらに、改変アミノ酸Ｒ２８６およびＤ２８９の間の新しい塩ブリッジは、活性部位くぼみの一部を形成する「自己分解ループ」のコンホメーションおよび／または可動性を変化させることが予想される。自己分解ループは、凝固プロテアーゼの高分子基質および阻害因子特異性を決定することに関与する。したがって、このループの変化したコンホメーションおよび／または可動性は、たとえば、基質（たとえば第Ｘ因子および／または第ＩＸ因子）に対する増加した触媒活性ならびに阻害因子（たとえばＴＦＰＩおよび／またはＡＴ−ＩＩＩ）に対する増加した抵抗性をもたらすことができる。したがって、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、またはリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）などのような塩基性アミノ酸を用いる位置２８６のグルタミンの改変は、野生型ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加した触媒活性および血液凝固活性をもたらすことができる。したがって、成熟ＦＶＩＩナンバリングによるＱ２８６Ｒ、Ｑ２８６Ｋ、またはＱ２８６Ｈ突然変異（それぞれ、キモトリプシンナンバリングによるＱ１４３Ｒ、Ｑ１４３Ｋ、またはＱ１４３Ｈに対応する）を含有するＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供される。例示的なかかるポリペプチドは、それぞれ、配列番号１１８、１１９、および１２９において記載されるアミノ酸の配列を用いるものである。

グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）の塩基性アミノ酸残基、特に、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸位置２８６に対応するアミノ酸位置のアルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）とのアミノ酸交換は、配列番号１もしくは２において記載される配列を有する前駆体ＦＶＩＩポリペプチド、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチド、または配列番号１〜３において記載されるＦＶＩＩポリペプチドのいずれかに対して、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する、当技術分野において記載されるものなどのような任意の種変異体、対立遺伝子変異体、および改変変異体ならびにその活性断片を含む、任意のＦＶＩＩポリペプチドにおいてなすことができる。たとえば、Ｑ２８６Ｒ突然変異は、本明細書において別記されるもののいずれかを含む、当技術分野において記載される任意の改変ＦＶＩＩポリペプチドの中に組み込むことができる。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、突然変異（１つまたは複数）Ｍ２９８Ｑ（配列番号１５８）たとえばPersson et al., (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98:13583-13588を参照されたい）、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ（配列番号３４３）、Ｖ１５８Ｅ（配列番号３４４）、Ｅ２９６Ｒ／Ｍ２９８Ｋ（配列番号３４５）、Ｋ３３７Ａ（配列番号３４６）、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ（配列番号９８；ＮＮ１７３１；たとえばPersson et al., (2007) Art. Thromb. Vasc. Biol. 27(3): 683-689を参照されたい）、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ（配列番号３４７；たとえばLisman et al., (2003) J. Thromb. Haem. 1:2175-2178を参照されたい）、Ｖ２５３Ｎ（配列番号３４８；たとえばＵＳ７４２７５９２を参照されたい）、Ｔ１０６Ｎ（配列番号３４９；たとえばＵＳ７４２７５９２を参照されたい）、Ｔ１０６Ｎ／Ｖ２５３Ｎ（配列番号３５０；たとえばＵＳ７４２７５９２を参照されたい）、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ（配列番号３５１；たとえばＵＳ７４４２５２４を参照されたい）、Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ（配列番号３５２；たとえばＵＳ７４４２５２４を参照されたい）、またはＫ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ／Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ（配列番号３５３；たとえばＵＳ７４４２５２４を参照されたい）を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドを含むが、これらに限定されない。Ｑ２８６Ｒ突然変異はまた、キメラＦＶＩＩポリペプチドもしくはＦＶＩＩ融合ポリペプチドまたは糖ＰＥＧ化などによって他の形で改変されるＦＶＩＩポリペプチドの中に組み込むことができる（たとえばＷＯ２００７０２２５１２、Ghosh et al., (2007) transcript of presentation at the Am. Society. Hematol. Meeting, December 10, 2007を参照されたい）。一例において、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸位置２８６に対応するアミノ酸位置のグルタミンのアルギニンとのアミノ酸交換は、配列番号１１８において記載されるアミノ酸の配列を有するＦＶＩＩポリペプチドをもたらす。

成熟ＦＶＩＩナンバリングによるアミノ酸置換Ｑ２８６Ｒ（キモトリプシンナンバリングによるＱ１４３Ｒに対応する）を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供され、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、増加した血液凝固活性を示す。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、またはそれ以上の改変位置を含有することができ、改変位置の１つは、アミノ酸位置２８６である。したがって、２つ以上の改変を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供され、１つの改変は、アミノ酸置換Ｑ２８６Ｒ（成熟ＦＶＩＩナンバリングによる）であり、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加した血液凝固活性を示す。Ｑ２８６Ｒ突然変異は、本明細書において記載されるまたは当技術分野において知られている任意の他の突然変異と組み合わせることができる。典型的には、結果として生じる改変ポリペプチドは、増加した血液凝固活性を示す。当業者は、当技術分野においてよく知られているまたは本明細書において記載されるインビトロアッセイおよびインビボアッセイを使用して、Ｑ２８６Ｒ改変を含有するＦＶＩＩポリペプチドの血液凝固活性を決定することができる。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、Ｑ２８６Ｒ突然変異を含有し、たとえば、アンチトロンビンＩＩＩに対する抵抗性を増加させる、ＦＸの活性化を増加させる、ＦＩＸの活性化を増加させる、リン脂質に対する結合性および／もしくは親和性を増加させる、組織因子に対する親和性を増加させる、内因活性を増加させる、ＴＦ依存性活性を増加させる、ポリペプチドのコンホメーションを変化させて、チモーゲン性を変化させる、高度に活性なコンホメーションに有利なように、高度に活性なＦＶＩＩａコンホメーションおよびそれほど活性でないＦＶＩＩａコンホメーションの間の平衡をシフトすることなどによって、触媒活性もしくは血液凝固活性を増加させる、プロテアーゼに対する抵抗性を増加させる、グリコシル化を減少させる、グリコシル化を増加させる、免疫原性を低下させる、安定性を増加させる、ならびに／または化学基連結を容易にする、１つまたは複数の突然変異を含有するものも含む。

アミノ酸置換Ｑ２８６Ｒを含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドの増加した血液凝固活性は、触媒活性における増加の結果とすることができる。増加した触媒活性は、組織因子（ＴＦ）の存在下および／または非存在下において観察することができる。したがって、増加した触媒活性は、ＴＦ依存性および／またはＴＦ非依存性のものとすることができる。Ｑ２８６Ｒ突然変異を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドの触媒活性は、実施例４および７において記載されるアッセイなどのようなインビトロアッセイを使用して評価することができる。そのようなアッセイは、組織因子の存在下または非存在下において、第Ｘ因子などのような基質に対する改変ＦＶＩＩポリペプチドの触媒活性を決定することができる。Ｑ２８６Ｒ突然変異を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、非改変ポリペプチドまたは野生型ＦＶＩＩポリペプチドの触媒活性と比較して、組織因子の存在下および／または非存在下において、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の増加した触媒活性を示すことができる。たとえば、実施例４において実証されるように、ただ１つの改変としてＱ２８６Ｒ突然変異（キモトリプシンナンバリングによるＱ１４３Ｒ）を含有するＦＶＩＩａポリペプチドは、野生型ＦＶＩＩによって示される触媒活性よりも約２〜４倍大きな、ＴＦの存在下または非存在下における、ＦＸに対する触媒活性を示すことができる。他の例において、Ｑ２８６ＲおよびＭ２９８Ｑの突然変異を含有するＦＶＩＩａポリペプチドは、野生型ＦＶＩＩによって示される触媒活性よりも約３〜４倍大きな、ＴＦの存在下における、ＦＸに対する触媒活性を示すことができ、野生型ＦＶＩＩによって示される触媒活性よりも約７〜２６倍大きな、ＴＦの非存在下における、ＦＸに対する触媒活性を示すことができる。

１つの改変が、アミノ酸置換Ｑ２８６Ｒ（成熟ＦＶＩＩナンバリングによる）であり、改変ＦＶＩＩポリペプチドが、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、組織因子の存在下および／または非存在下において、ＦＸに対して増加した触媒活性を示す、２つ以上の改変を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドの非限定的な例は、下記の表５および実施例４において記載される。改変ＦＶＩＩポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が記載される配列識別子（配列番号）が同定される。下記の部Ｄ．６においてよりさらに詳細に議論されるように、「Ｇｌａ ｓｗａｐ ＦＩＸ」改変は、アミノ酸残基Ａ１〜Ｙ４４（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する残基）を欠失させることによる、内因性ＦＶＩＩ Ｇｌａドメインの欠失および配列番号８３において記載されるＦＩＸ Ｇｌａドメインのアミノ酸残基Ｙ１〜Ｙ４５に対応する４５アミノ酸残基の挿入を含む。いくつかの例において、「Ｇｌａ ｓｗａｐ ＦＩＸ」改変ＦＶＩＩポリペプチドにおける異種ＦＩＸ Ｇｌａドメインは、配列番号８３において記載されるＦＩＸ ＧｌａドメインのＭ１９、Ｅ４０、Ｋ４３、および／またはＱ４４に対応するアミノ酸位置での１つまたは複数のアミノ酸置換を含有する。そのような置換は、中括弧（たとえば｛Ｇｌａ ｓｗａｐ ＦＩＸ／Ｑ４４Ｓ｝）によって表される。改変アミノ酸位置が対応するキモトリプシン番号を有していない（つまり、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応するアミノ酸位置１５３〜４０６内になく、上記の表１において記載されていない）場合、位置は、成熟ＦＶＩＩナンバリングを使用して、括弧中に表される。たとえば、Ｔ１５８Ｎは、対応するキモトリプシン番号を有しておらず、キモトリプシンナンバリングを指す場合、Ｔ［１５８］Ｎとして記載される。

成熟ＦＶＩＩナンバリングによるＱ２８６Ｒ突然変異を含有するＦＶＩＩポリペプチドはまた、ＡＴ−ＩＩＩに対する増加した抵抗性をも示すことができる。ＡＴ−ＩＩＩに対する増加した抵抗性は、ＡＴ−ＩＩＩによる阻害の減少した速度または動物もしくは患者への注射の後などのような特定される条件下でのＡＴ−ＩＩＩに対する減少した結合の結果とすることができる。ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性は、野生型ＦＶＩＩａポリペプチドおよび変異ＦＶＩＩａポリペプチドの阻害についての二次速度定数を測定することによって実証することができる。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイなどのような他のインビトロ方法もまた、使用することができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、ＡＴ−ＩＩＩの阻害効果に対する増加した抵抗性を示すことができ、これは、実施例５において記載されるものなどのようなインビトロアッセイにおいて評価することができる。Ｑ２８６Ｒ突然変異を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、非改変ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＶＩＩポリペプチドのＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性と比較して、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％ ５００％、またはそれ以上のＡＴ−ＩＩＩに対する増加した抵抗性を示すことができる。たとえば、下記の実施例５において実証されるように、Ｑ２８６Ｒ突然変異（キモトリプシンナンバリングによるＱ１４３Ｒ）を含有するＦＶＩＩａポリペプチドは、野生型ＦＶＩＩによって示される触媒活性よりも約２〜４倍またはそれ以上大きな、ＡＴ−ＩＩＩの存在下およびＴＦの非存在下における、ＦＸに対する触媒活性を示すことができる。したがって、改変Ｑ２８６Ｒ ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドの抵抗性の約２００％〜４００％の、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性における増加を示すことができる。

増加した触媒活性およびＡＴ−ＩＩＩに対する増加した抵抗性は、ＴＦの存在下および／または非存在下における増加した血液凝固活性として示すことができる。そのような活性は、ヒト対象または動物対象に対する投与などによって、インビトロにおいて、エクスビボにおいて、またはインビボにおいて評価することができる。Ｑ２８６Ｒ突然変異を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性は、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、非改変ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上、増加させることができる。たとえば、実施例６．Ｂ．２は、Ｑ２８６Ｒ突然変異（キモトリプシンナンバリングによるＱ１４３Ｒ）を含有するＦＶＩＩａポリペプチドは、野生型ＦＶＩＩポリペプチドによって示される凝固活性よりも大きな（約２倍）、マウス出血モデルにおける凝固活性を示す（たとえばＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）ＦＶＩＩ）ことを実証する。Ｑ２８６ＲおよびＭ２９８Ｑ突然変異（それぞれ、キモトリプシンナンバリングによるＱ１４３ＲおよびＭ１５６Ｑ）を含有するＦＶＩＩａポリペプチドは、さらに大きな凝固活性を示す。

ｉｉ． 位置２８６での他の突然変異
配列番号３において記載されるＦＶＩＩポリペプチドの位置２８６に対応するアミノ酸位置のグルタミンは、塩基性アミノ酸以外の（つまりアルギニン、ヒスチジン、またはリシン以外の）アミノ酸と交換することができる。そのような置換は、オキシアニオンホールのコンホメーションを変化させることができ、たとえば、野生型ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、改変ＦＶＩＩポリペプチドの触媒活性を増加させるコンホメーションをもたらす。変化したオキシアニオンホールコンホメーションを有する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、インビボアッセイ、エクスビボアッセイ、またはインビトロアッセイのいずれかを使用して測定された場合、非改変ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＶＩＩポリペプチドの触媒活性と比較して、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％ ５００％、またはそれ以上の増加した触媒活性を示すことができる。

表６は、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸位置に対応する、アルギニンを用いる交換以外のＱ２８６での例示的なアミノ酸交換の非限定的な例を提供する。述べられるように、そのようなＦＶＩＩポリペプチドは、オキシアニオンホールのコンホメーションをより有効なコンホメーションに変化させ、そのため、増加した血液凝固活性を有するように設計される。そのような突然変異に関して、第１のアミノ酸（１文字略語）は、交換されるアミノ酸に対応し、番号は、配列番号３に関する成熟ＦＶＩＩポリペプチド配列における位置に対応し、第２のアミノ酸（１文字略語）は、その位置の第１のアミノ酸と交換する、選択されるアミノ酸に対応する。突然変異のためのアミノ酸位置はまたキモトリプシンナンバリング体系によっても表される。下記の表６において、改変ＦＶＩＩポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が記載される配列識別子（配列番号）が同定される。

変化したオキシアニオンホールコンホメーションを有する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、インビボアッセイ、エクスビボアッセイ、またはインビトロアッセイのいずれかを使用して測定された場合、非改変ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＶＩＩポリペプチドの触媒活性と比較して、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％ ５００％、またはそれ以上の増加した触媒活性を示すことができる。いくつかの例において、変化したオキシアニオンホールコンホメーションを有する改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、インビボ、エクスビボ、またはインビトロのいずれかにおいて、非改変ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＶＩＩポリペプチドによって示される、内因性阻害因子による阻害の速度または内因性阻害因子に対する親和性と比較して、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上、ＴＦＰＩまたはＡＴ−ＩＩＩなどのような内因性プロテアーゼ阻害因子に対して増加した抵抗性（つまり、阻害因子による阻害の減少した速度または阻害因子に対する減少した親和性）をも示すことができる。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドのＡＴ−ＩＩＩ抵抗性などのような内因性阻害因子に対する増加した触媒活性および／または抵抗性はまた、増加した凝固活性、血液凝固活性の継続期間、血液凝固活性のより速い開始、および／または増強した治療指数としても示すことができる。たとえば、改変ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロのいずれかにおいて、非改変ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上、増加させることができる。

２． ＡＴ−ＩＩＩに対する増加した抵抗性
アンチトロンビンＩＩＩ（アンチトロンビンまたはＡＴ−ＩＩＩとしても知られている）は、重要な抗凝固セルピン（セリンプロテアーゼ阻害因子）である。ＡＴ−ＩＩＩは、４６４アミノ酸残基を含有する前駆体タンパク質として合成される（配列番号１２２）。分泌の過程において、３２残基シグナルペプチドは、切断されて、４３２アミノ酸成熟ヒトアンチトロンビン（配列番号１２３）を生成する。５８ｋＤａ ＡＴ−ＩＩＩ糖タンパク質は、血液中に循環し、セリンプロテアーゼ阻害因子（セルピン）として機能して、凝固系の多くのセリンプロテアーゼを阻害する。ＡＴ−ＩＩＩはまた、ＦＩＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、および程度はより少ないが、ＦＶＩＩａの活性をも阻害することが示されたが、ＡＴ−ＩＩＩの主要な標的は、トロンビンおよび第Ｘａ因子である。ＡＴ−ＩＩＩの作用は、診療において抗凝固薬として広く使用される、天然に存在するヘパラン硫酸または様々な組織由来ヘパリンなどのようなグリコサミノグリカンによって非常に増強される。ＡＴ−ＩＩＩは、反応性中心ループにおけるコンホメーションの変化を誘発する、ヘパリンにおける特有の五糖配列に対して高度に特異的な様式で結合する。そのようなコンホメーションにおいて、ＡＴ−ＩＩＩの反応性中心ループは、より効率的に、セリンプロテアーゼの反応部位と相互作用することができ、阻害を達成することができる。

ＡＴ−ＩＩＩは、おそらくＡＴ−ＩＩＩとの効率的な相互作用を予防する、ＦＶＩＩａのチモーゲン様のコンホメーションにより、ヘパリンの存在下においてでさえ、遊離血漿ＦＶＩＩａに対して通常阻害性ではない。しかしながら、一度、ＦＶＩＩａがＴＦと複合体を形成したら、ＡＴ−ＩＩＩの阻害効果は、増加する。ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体に対するＡＴ−ＩＩＩの結合により、ＴＦからＦＶＩＩａを放出することができ、ＡＴ−ＩＩＩとの不活性複合体にそれを維持する。ＦＶＩＩａのみと比較して、ＴＦ結合ＦＶＩＩａに対するＡＴ−ＩＩＩの増加した親和性は、おそらく、それがＴＦと複合体を形成した場合の、ＦＶＩＩａの活性部位の成熟を反映し、そのため、それが、ＡＴ−ＩＩＩに結合するのを可能にする（Rao et al. (1993) Blood 81:2600-2607）。したがって、ＦＶＩＩａに対するＡＴ−ＩＩＩの影響は、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性を媒介する突然変異がＦＶＩＩａポリペプチドに追加されていない限り、ＦＶＩＩａ分子自体の内因活性に比例する。ＦＶＩＩａが、そのチモーゲン様のコンホメーションを保持している間、ＡＴ−ＩＩＩは、影響をほとんど有していない。しかしながら、ＴＦへの結合によってまたは特異的なインビトロ改変などによって、ＦＶＩＩａがより活性な形態にコンホメーションを変化させる場合、ＡＴ−ＩＩＩ阻害は、有意に増加する。増加した内因活性を有するように改変されるＦＶＩＩａポリペプチドは、多くの場合、ＡＴ−ＩＩＩ阻害に対する感受性の増加を同時に示す。たとえば、Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ、Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ、およびＥ２９６Ｖの置換に対応するアミノ酸交換などによるＦＶＩＩａの活性化ポケットにおける１つまたは複数のアミノ酸の改変は（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩ配列と比較して）、ＡＴ−ＩＩＩに対するＦＶＩＩａポリペプチドの増加した感度をもたらし、それによって、９０％までＦＶＩＩａ活性を阻害する（Persson et al. (2001) PNAS 98:13583-13588）。他の例、ＦＶＩＩａのα−ヘリックスに含まれるアミノ酸の改変による、よりチモーゲン様のコンホメーションの誘発もまた、改変ＦＶＩＩａタンパク質の活性を増加させながら、ＡＴ−ＩＩＩに対するその感受性を増加させる（Persson et al. (2004) Biochem J 379:497-503）。

ＡＴ−ＩＩＩに対する増加した抵抗性を達成するための例示的な改変
ＡＴ−ＩＩＩに対するＦＶＩＩポリペプチドの抵抗性を増加させる改変は、ＦＶＩＩポリペプチドに対してなすことができる。一般に、そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＶＩＩポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持する。典型的には、そのような改変は、ＡＴ−ＩＩＩとのＦＶＩＩａの相互作用に関与する、ＦＶＩＩポリペプチドの任意の位置の１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。そのような改変は、たとえば、ＡＴ−ＩＩＩに対する改変ＦＶＩＩの低下した結合をもたらすことができる。そのため、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、凝固開始に関してのＡＴ−ＩＩＩの天然の阻害効果に対して抵抗性である。凝血促進治療薬としての対象への投与の後などのように、適切なインビトロアッセイまたはインビボアッセイにおいて評価した場合、改変ＡＴ−ＩＩＩ抵抗性ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加した血液凝固活性を示す。

本明細書において下記に記載されるように、当業者は、ＡＴ−ＩＩＩに対して増加した抵抗性を示す改変ＦＶＩＩポリペプチドを経験的にまたは合理的に設計することができる。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドがＡＴ−ＩＩＩに対して増加した抵抗性を示すかどうかを決定するための、当業者に知られているアッセイにおいて試験することができる。たとえば、そのような改変ＡＴ−ＩＩＩポリペプチドは、ＡＴ−ＩＩＩに対する結合について試験することができる。一般に、ＡＴ−ＩＩＩに対する増加した抵抗性を有する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＡＴ−ＩＩＩに対する減少した結合性および／または減少した親和性を示すであろう。典型的には、そのようなアッセイは、ＦＶＩＩの活性化形態（ＦＶＩＩａ）などのようなＦＶＩＩの二本鎖形態に対して実行される。さらに、ＡＴ−ＩＩＩの効果を決定するためのアッセイは、そのようなアッセイはまた、一方または両方の補因子の非存在下において実行することができるが、ヘパリンの存在下においておよび組織因子の存在下において一般に実行される。

ＡＴ−ＩＩＩに対する増加した抵抗性を示す改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供される。ＡＴＩＩＩによる阻害に対する抵抗性は、ＴＦの存在下および非存在下の両方において該当する。本明細書において提供されるＦＶＩＩポリペプチド変異体は、１つまたは複数のアミノ酸位置２３９、９３１、３６６、および３７３（それぞれ、キモトリプシンナンバリングによるアミノ酸位置９９、１７０ｉ、２１７、および２２４に対応する）で改変されている。これらのアミノ酸残基は、アミノ酸交換、アミノ酸欠失、またはアミノ酸置換などによる改変であってもよい。同定される残基は、任意の他のアミノ酸と交換または置換することができる。代わりに、アミノ酸挿入は、標的アミノ酸残基の近傍における標的アミノ酸残基またはタンパク質構造のコンホメーションを変化させるために使用することができる。

任意のアミノ酸残基はまた、同定される位置の内因性アミノ酸残基と置換することができる。典型的には、交換アミノ酸は、それが、ＦＶＩＩおよびＡＴ−ＩＩＩの間の相互作用に干渉するように選ばれる。いくつかの例において、位置２３９（キモトリプシンナンバリングによる位置９９に対応する）のトレオニン残基は、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、またはイソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）と交換される。他の例において、位置３２１（キモトリプシンナンバリングによる位置１７０ｉに対応する）のプロリンは、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、またはチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）と交換される。さらなる例において、位置３６６（キモトリプシンナンバリングによる位置２１７に対応する）のグルタミンは、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、またはバリン（Ｖａｌ、Ｖ）と交換される。他の例において、位置３７３（キモトリプシンナンバリングによる位置２２４に対応する）のヒスチジンは、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、セリン（セリン、Ｓ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、またはアラニン（Ａｌｎ、Ａ）と交換される。さらなる実施形態において、組み合わせ突然変異体は、生成することができる。そのような組み合わせ突然変異体の中に、残基Ｔ２３９、Ｐ３２１、Ｑ３６６、およびＨ３７３（それぞれ、キモトリプシンナンバリングによるＴ９９、Ｐ１７０ｉ、Ｑ２１７、およびＨ２２４に対応する）の２つ以上の突然変異を有するものが含まれる。たとえば、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、２、３、４、または５の同定される位置でのアミノ酸置換を有することができる。したがって、改変ポリペプチドは、ＡＴ−ＩＩＩの阻害効果に対する改変ＦＶＩＩポリペプチドの増加した抵抗性をもたらすことができる１、２、３、４、または５の突然変異を示すことができる。たとえば、ＦＶＩＩポリペプチドは、アミノ酸位置３６６およびアミノ酸位置３７３で改変することができる。いくつかの例において、位置は、たとえば位置３６６でのグルタミンのアスパラギン酸との交換および位置３７３でのヒスチジンのグルタミン酸との交換などのようなアミノ酸交換によって改変される。

表７は、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸位置に対応する、同定される残基での例示的なアミノ酸交換の非限定的な例を提供する。これらの中に、例示的な組み合わせ突然変異が含まれる。述べられるように、そのようなＦＶＩＩポリペプチドは、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性を増加させ、そのため、増加した血液凝固活性を有するように設計される。そのような突然変異に関して、第１のアミノ酸（１文字略語）は、交換されるアミノ酸に対応し、番号は、配列番号３に関する成熟ＦＶＩＩポリペプチド配列における位置に対応し、第２のアミノ酸（１文字略語）は、その位置の第１のアミノ酸と交換する、選択されるアミノ酸に対応する。突然変異のためのアミノ酸位置はまたキモトリプシンナンバリング体系によっても表される。下記の表７において、改変ＦＶＩＩポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が記載される配列識別子（配列番号）が同定される。

ＡＴ−ＩＩＩに対する増加した抵抗性を有する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、非改変ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＶＩＩポリペプチドの阻害の程度または阻害についての二次速度定数と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の、特定される条件下での阻害の程度におけるまたはＡＴ−ＩＩＩによる阻害についての二次速度定数における低下を示すことができる。したがって、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドによって示される抵抗性の、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上、ＡＴ−ＩＩＩに対して増加した抵抗性を示すことができる。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドによる、ＡＴ−ＩＩＩに対する増加した抵抗性はまた、ＡＴ−ＩＩＩの存在下における、増加した凝固活性、凝固活性の継続期間、および／または増強した治療指数としても示すことができる。ＡＴ−ＩＩＩ改変ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性は、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、非改変ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上、増加させることができる。

３． Ｚｎ^２＋による阻害に対する増加した抵抗性
ＦＶＩＩａのアミド分解活性は、カルシウムイオンおよび組織因子（ＴＦ）の結合によって誘発される、アロステリックな改変によって調節される。遊離ＦＶＩＩは、典型的には、不活性コンホメーションで存在する。Ｃａ^２＋およびＴＦに対する結合は、コンホメーションの変化を誘発し、アミド分解活性を増加させた（Pederson et al., (1990) J Biol. Chem. 265:16786-16793）。対照的に、ＦＶＩＩａに対する亜鉛イオンの結合は、活性に対して阻害効果を有することが示された。ＦＶＩＩａに対するＺｎ^２＋の結合は、減少したアミド分解活性およびＴＦに対する低下した親和性をもたらす。研究は、Ｃａ^２＋の存在下において、Ｚｎ^２＋の阻害効果が低下するように、Ｃａ^２＋およびＺｎ^２＋が、ＦＶＩＩａに対する結合について競合することを示す。さらに、ＴＦに結合したＦＶＩＩａは、亜鉛阻害に対して感受性である。

結合がＦＶＩＩａアミド分解活性に影響を及ぼさない、ＧｌａドメインにおけるＺｎ^２＋結合部位に加えて、２つのＺｎ^２＋結合部位が、ＦＶＩＩのプロテアーゼドメインに位置づけられた（Petersen et al., (2000) Protein Sci. 9:859-866、 Bajaj et al., (2006) J. Biol. Chem. 281:24873-24888）。プロテアーゼドメインにおけるこれらの結合部位の位置づけは、第１のＺｎ^２＋結合部位が、アミノ酸残基Ｈ２１６、Ｅ２２０、およびＳ２２２（キモトリプシンナンバリングによるＨ７６、Ｅ８０、およびＳ８２）の側鎖を含み、第２のＺｎ^２＋結合部位が、アミノ酸残基Ｈ２５７、Ｄ２１９、およびＫ１６１（キモトリプシンナンバリングによるＨ１１７、Ｄ７９、およびＫ２４）の側鎖を含むことを示す。

Ｚｎ^２＋は、そのため、ＦＶＩＩ阻害因子としてのホメオスタシスの調節における生理学的役割を有することができる。これらの阻害効果は、血小板活性化の後の、血餅の部位でのＺｎ^２＋濃度の増加の結果として生じることが推論された（Bajaj et al., (2006) J. Biol. Chem. 281:24873-24888）。血小板は、細胞質およびα−顆粒中に大量のＺｎ^２＋を貯蔵しており、これらは、血小板活性化に際して放出される。これは、Ｚｎ^２＋の局所的濃度を増加させることができ、これは、順番に、ＦＶＩＩａ活性およびＴＦに対するＦＶＩＩａ結合を阻害することができる。

Ｚｎ^２＋による阻害に対する抵抗性を増加させるための例示的な改変
Ｚｎ^２＋の阻害効果に対して増加した抵抗性を示す改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供される。これは、たとえば、Ｚｎ^２＋との相互作用および結合に関与する、ＦＶＩＩにおける１つまたは複数の残基の突然変異によって、達成され、そのような結合を低下させまたは予防し、それによって、触媒活性およびＴＦ結合に関して、Ｚｎ^２＋の阻害効果に抵抗性の改変ＦＶＩＩポリペプチドを作製することができる。凝血促進治療薬としての対象への投与の後などのように、適切なインビトロアッセイまたはインビボアッセイにおいて評価した場合、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加した血液凝固活性を示すことができる。

プロテアーゼドメインにおいてＺｎ^２＋結合に関与し得る残基における１つまたは複数の突然変異を有する改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供される。そのような残基は、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸位置と比較したナンバリングで、Ｋ１６１、Ｈ２１６、Ｄ２１９、Ｅ２２０、Ｓ２２２、およびＨ２５７を含むが、これらに限定されない（それぞれ、キモトリプシンナンバリングによるＫ２４、Ｈ７６、Ｄ７９、Ｅ８０、Ｓ８２、およびＨ１１７に対応する）。いくつかの例において、１つまたは複数のアミノ酸残基Ｈ２１６、Ｓ２２２、およびＨ２５７（それぞれ、キモトリプシンナンバリングによるＨ７６、Ｓ８２、およびＨ１１７に対応する）は、アミノ酸交換またはアミノ酸欠失などによって改変される。任意のアミノ酸残基は、同定される位置の内因性残基を交換するために使用することができる。たとえば、ヒスチジンが、セリン残基、アラニン残基、リシン残基、またはアルギニン残基とアミノ酸位置２１６で交換される改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供される。他の例において、アミノ酸位置２２２のセリンは、アラニン残基もしくはリシン残基と交換されるまたは位置２５７のヒスチジンは、アラニン残基もしくはセリン残基と交換される。さらなる実施形態において、位置１６１のリシンは、セリン残基、アラニン残基、またはバリン残基と交換される。改変はまた、Ｚｎ^２＋結合に関与するとして同定されるアミノ酸位置でのまたはその近くでのアミノ酸挿入を含む。そのような挿入は、Ｚｎ^２＋結合部位を破壊し、Ｚｎ^２＋に対する減少した結合性を有する改変ＦＶＩＩポリペプチドをもたらすことができる。

ＦＶＩＩポリペプチドにおける、複数の上記の同定される残基でアミノ酸交換がなされる組み合わせ突然変異体もまた生成することができる。そのような組み合わせ突然変異体の中に、残基Ｋ１６１、Ｈ２１６、Ｄ２１９、Ｅ２２０、Ｓ２２２、およびＨ２５７（それぞれ、キモトリプシンナンバリングによるＫ２４、Ｈ７６、Ｄ７９、Ｅ８０、Ｓ８２、およびＨ１１７に対応する）の２つ以上の突然変異を有するものが含まれる。たとえば、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、２、３、４、５、または６の同定される位置でのアミノ酸置換を有することができる。したがって、改変ポリペプチドは、改変ＦＶＩＩポリペプチドがＺｎ^２＋に結合する減少した能力をもたらすことができる１、２、３、４、５、または６の突然変異を示すことができる。たとえば、ＦＶＩＩポリペプチドは、位置２２２のセリンのリシンとのアミノ酸交換および位置２５７のヒスチジンのアラニン残基とのアミノ酸交換によって改変することができる。

Ｚｎ^２＋の阻害効果に対する増加した抵抗性を有する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、非改変ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＶＩＩポリペプチドの抵抗性と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の増加を示すことができる。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドによるＺｎ^２＋結合における低下、そのため、Ｚｎ^２＋の阻害効果に対する増加した抵抗性はまた、Ｚｎ^２＋の存在下において増加した凝固活性としても示すことができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性は、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、非改変ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上、増加させることができる。

表８は、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸位置に対応する、同定される残基での例示的なアミノ酸交換の非限定的な例を提供する。これらの中に、例示的な組み合わせ突然変異が含まれる。述べられるように、そのようなＦＶＩＩポリペプチドは、Ｚｎ^２＋に結合するための低下した能力、そのため、Ｚｎ^２＋の阻害効果に対する増加した抵抗性を示すように設計される。したがって、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、増加した血液凝固活性を有することができる。そのような突然変異に関して、第１のアミノ酸（１文字略語）は、交換されるアミノ酸に対応し、番号は、配列番号３に関する成熟ＦＶＩＩポリペプチド配列における位置に対応し、第２のアミノ酸（１文字略語）は、その位置の第１のアミノ酸と交換する、選択されるアミノ酸に対応する。突然変異のためのアミノ酸位置はまたキモトリプシンナンバリング体系によっても表される。下記の表８において、改変ＦＶＩＩポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が記載される配列識別子（配列番号）が同定される。

４． 変化したグリコシル化
タンパク質の特性および活性は、程度、レベル、および／またはグリコシル化の型を調整することによって変化させることができる。たとえば、グリコシル化は、安定性、溶解性を増加させることによっておよびタンパク質の免疫原性を低下させることによって、ポリペプチドの血清半減期を増加させることができる。グリコシル化は、タンパク質のタンパク質分解を低下させることによって、タンパク質の安定性を増加させることができ、熱分解、変性剤に対する曝露、酸素フリーラジカルによる損害、およびｐＨの変化からタンパク質を保護することができる。グリコシル化はまた、標的タンパク質が、細胞表面受容体を含む他のタンパク質に対する結合を含み得るクリアランスメカニズムを回避することを可能にすることができる。シアル酸を含有する炭水化物部分は、タンパク質の溶解性に影響を及ぼすことができる。シアル酸部分は高度に親水性であり、標的タンパク質の疎水性残基を遮蔽することができる。これは、標的タンパク質の凝集および沈殿を減少させる。減少した凝集はまた、標的タンパク質に対する免疫応答の予防を助ける。炭水化物は、さらに、免疫系から、免疫原性の配列を遮蔽することができる。炭水化物部分によって占められる空間の容量は、免疫系によって調査される、利用可能な表面積を減少させることができる。これらの特性は、標的タンパク質の免疫原性における低下に至る。

ポリペプチドが、グリコシル化が可能な真核細胞において産生される場合、それが、グリコシル化されるように、グリコシル化部位は、グリコシド結合を介しての単糖およびオリゴ糖のポリペプチドへの付加のための部位を提供する。２つの主な型のグリコシル化は、糖単位が、アスパラギン残基のアミド窒素を介して付加されるＮ結合型グリコシル化および糖単位が、セリン残基、トレオニン残基、ヒドロキシリシン残基、またはヒドロキシプロリン残基のヒドロキシル基を介して付加されるＯ結合型グリコシル化である。グリコシド連結のより少数の形態は、システインに対するＳ−連結およびトリプトファンに対するＣ−連結を含む。Ｎ結合型グリコシル化は、コンセンサス配列−Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｃｙｓにおけるアスパラギンにおいて生じ、ここで、Ｘａａは、プロリンではない。Ｏ−グリコシル化は、高度な割合のセリン残基、トレオニン残基、およびプロリン残基を有する配列において、より可能性が高いが、Ｏ−グリコシル化について知られているモチーフはない。しかしながら、潜在的なグリコシル化部位の存在は、その部位が、ＥＲにおける翻訳後プロセシングの間にグリコシル化されるであろうということを保証するものではない。さらに、グリコシル化のレベルは、所与の部位で変わり得、ある部位は、様々なグリカン構造を有し得る。ＦＶＩＩにおいて、４つの天然に存在するグリコシル化部位がある；配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドにおけるアミノ酸位置に対応する、Ｎ１４５およびＮ３２２での２つのＮ−グリコシル化部位ならびにＳ５２およびＳ６０での２つのＯ−グリコシル化部位。

グリコシル化を変化させるための例示的な改変
非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、レベルおよび／またはグリコシル化の型を変化させることによって改変されるＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供される。グリコシル化は、非改変ＦＶＩＩと比較して、増加させるまたは減少させることができる。いくつかの場合において、グリコシル化のレベルは、増加しており、高度にグリコシル化されたＦＶＩＩポリペプチドをもたらす。これは、たとえば、炭水化物部分が連結される非改変ＦＶＩＩポリペプチドにおいて見つけられない、少なくとも１つの非天然グリコシル化部位の組み入れによって達成することができる。高度にグリコシル化されたＦＶＩＩポリペプチドはまた、非改変ＦＶＩＩポリペプチドにおいて見つけられるが、グリコシル化されていない、少なくとも１つの天然グリコシル化部位への炭水化物部分の連結によって生成することができる。他の例において、改変ＦＶＩＩポリペプチドにおけるグリコシル化のレベルは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して減少している。これはアミノ酸交換または欠失などによって１つまたは複数の天然グリコシル化部位の排除によって達成することができる。配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応するアミノ酸位置５２、６０、１４５、および３２２の１つまたは複数のアミノ酸残基は欠失させることができ、または炭水化物部分に連結することができないアミノ酸残基と交換することができる。たとえば、位置５２および／または６０のセリン残基は、アラニン残基と交換し、それによって、一方または両方の天然Ｏ−グリコシル化部位を排除することができる。したがって、ＦＶＩＩポリペプチドにおけるグリコシル化部位は、導入する、変化させる、排除する、または再配置することができる。

ＦＶＩＩポリペプチドは、ポリペプチドのグリコシル化を変化させるために、１つまたは複数の位置で改変されてもよい。非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、変化したグリコシル化を有する、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、グリコシル化、Ｏ結合型グリコシル化、Ｎ結合型グリコシル化、および／またはその組み合わせを有することができない。いくつかの例において、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、それぞれ異なるグリコシル化部位に連結された、１、２、３、４、５、またはそれ以上の炭水化物部分を含む。グリコシル化部位は、天然グリコシル化部位および／または非天然グリコシル化部位とすることができる。いくつかの例において、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、複数の非天然グリコシル化部位でグリコシル化される。たとえば、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、１、２、３、４、５、またはそれ以上の非天然グリコシル化部位を導入するために改変することができる。

非天然グリコシル化部位は、アミノ酸交換によって導入することができる。Ｏ−グリコシル化部位は、たとえば、天然残基のセリンまたはトレオニンとのアミノ酸交換によって、生成することができる。Ｎ−グリコシル化部位は、モチーフＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｃｙｓを作ることによって、生成することができ、ここで、Ｘａａは、プロリンではない。アミノ酸改変によるこのコンセンサス配列の生成は、天然アミノ酸残基のアスパラギンとの交換、天然アミノ酸残基のセリン、トレオニン、もしくはシステインとの交換、または天然アミノ酸残基のアスパラギンとの交換、および天然残基のセリン、トレオニン、もしくはシステインとのアミノ酸交換を含むことができる。たとえば、位置１０９（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩのナンバリングに基づく）のリシンは、アスパラギンと交換し、ＥＧＦ１ドメインにおける新しいＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒモチーフおよびアミノ酸位置１０９での新しいＮ−グリコシル化部位を生成することができる。他の例において、位置２９２のアラニンは、アスパラギンと交換され、アラニン位置２９４は、セリンと交換されて、新しいＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒモチーフおよびアミノ酸位置２９２での新しいＮ−グリコシル化部位を生成する。さらなる例において、位置１７５のアラニンは、セリンと交換されて、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩのナンバリングに基づくアミノ酸位置１７３〜１７５での新しいＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒモチーフおよびアミノ酸位置１７３での新しいＮ−グリコシル化部位を生成する。非天然グリコシル化部位は、ＦＶＩＩポリペプチドにおける任意の領域において生成することができる。たとえば、１つまたは複数のグリコシル化部位は，ＥＧＦ１ドメインの中に導入することができ、これは、配列番号３における成熟ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸位置４６〜８２に対応する。他の例において、非天然グリコシル化部位は、ＦＶＩＩポリペプチドのプロテアーゼドメイン領域の中にまたはタンパク質折り畳みに際してプロテアーゼドメイン領域と結合することができる位置に導入される。

天然グリコシル化部位は、グリコシル化を予防するまたはグリコシル化を増強するもしくは減少させるために改変することができるが、ＦＶＩＩポリペプチドにおける他の位置は、非天然グリコシル化部位を導入するために改変することができる。いくつかの例において、ＦＶＩＩポリペプチドの炭水化物含有量を改変することができる。たとえば、ＦＶＩＩポリペプチドに追加される炭水化物部分の炭水化物連結の番号位置、結合強度、構造、および組成（つまり炭水化物のグリコシド連結または分岐の性質に基づく炭水化物の構造）は、変化させることができる。

変化したグリコシル化を有する、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＶＩＩの少なくとも１つの活性を保持する。典型的には、変化したグリコシル化を有する、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩと比較して、増加した血液凝固活性を示す。いくつかの例において、ＦＶＩＩポリペプチドのグリコシル化のレベルは、増加している。グリコシル化のレベルは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＶＩＩポリペプチドのグリコシル化のレベルと比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上、増加させることができる。他の例において、グリコシル化のレベルは、減少している。グリコシル化のレベルは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＶＩＩポリペプチドのグリコシル化のレベルと比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上、減少させることができる。改変ＦＶＩＩポリペプチド上に存在するグリコシル化の型における変化したグリコシル化レベルまたは変化は、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加した凝固活性として示すことができる。変化したグリコシル化を有する改変ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性は、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、非改変ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上、増加させることができる。

表９は、グリコシル化部位を追加するまたは排除することによってグリコシル化レベルを変化させるために改変ＦＶＩＩポリペプチドにおいて含まれる、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸位置に対応する、例示的なアミノ酸交換の非限定的な例を提供する。例示的なアミノ酸交換は、非天然グリコシル化部位を生成するまたは天然グリコシル化部位を排除することができる。いくつかの場合において、２つのアミノ酸交換が、新しいグリコシル化部位を生成するために必要とされる。ＦＶＩＩポリペプチドにおける複数の新しい非天然グリコシル化部位を生成する、例示的な組み合わせ突然変異もまた、表９において含まれる。上記に述べられるように、グリコシル化レベルにおける変化は、たとえば、半減期を増加させることができる。したがって、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、血液凝固活性を増加させることができる。そのような突然変異に関して、第１のアミノ酸（１文字略語）は、交換されるアミノ酸に対応し、番号は、配列番号３に関する成熟ＦＶＩＩポリペプチド配列における位置に対応し、第２のアミノ酸（１文字略語）は、その位置の第１のアミノ酸と交換する、選択されるアミノ酸に対応する。突然変異のためのアミノ酸位置はまた、必要に応じて、キモトリプシンナンバリング体系によっても表される。改変アミノ酸位置が対応するキモトリプシン番号を有していない（つまり、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応するアミノ酸位置１５３〜４０６内になく、上記の表１において記載されていない）場合、位置は、成熟ＦＶＩＩナンバリングを使用して、括弧中に表される。たとえば、Ａ５１Ｎは、対応するキモトリプシン番号を有しておらず、キモトリプシンナンバリングを指す場合、Ａ［５１］Ｎとして記載される。下記の表９において、改変ＦＶＩＩポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が記載される配列識別子（配列番号）が同定される。改変によって生成される任意の新しい非天然グリコシル化部位（１つまたは複数）もまた、表９において同定される。

５． 血清アルブミンおよび／または血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３に対する増加した結合性
組換え非改変ＦＶＩＩは、ヒトにおいて、わずか１．５〜３時間の血清半減期を有する。ＦＶＩＩポリペプチドの血清半減期を増加させることにより、治療効果に必要とされる投薬の量および頻度を低下させることができる。グリコシル化の増加、プロテアーゼ抵抗性の増加、ペグ化、ならびに血清アルブミンおよびＩｇＧのＦｃ部分などのような、より大きなタンパク質へのコンジュゲートまたは融合を含むが、これらに限定されない、いくつかの戦略は、血清半減期を増加させるために利用することができる。そのような改変は、たとえば、血清プロテアーゼによるＦＶＩＩポリペプチドの低下した分解、低下した腎クリアランス、低下した肝クリアランス、および免疫系による低下した中和またはクリアランスをもたらすことができる。ＦＶＩＩポリペプチドの血清半減期を増加させるために利用することができる他の戦略は、非改変ＦＶＩＩポリペプチドにおいて観察されない、新しいまたは改善されたタンパク質間相互作用を作るための、非改変ＦＶＩＩポリペプチドの中への結合配列の移植を含む。

非改変ＦＶＩＩポリペプチドの中に挿入される結合配列は、他のタンパク質との相互作用を容易にする、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、またはそれ以上のアミノ酸残基を含有することができる。結合配列は、天然タンパク質において天然に存在する結合配列に対応し得る、または天然タンパク質において天然に存在する結合配列との配列の相互関係をほとんどまたは全く有していない合成結合配列とすることができる。本明細書におけるＦＶＩＩポリペプチドを改変するために使用される結合配列は、とりわけ、他のタンパク質上の結合部位と相互作用し、非共有タンパク質間相互作用を作る。いくつかの例において、結合配列が特異的なタンパク質は、たとえば血清アルブミンなどのような血清タンパク質である。そのような配列は、当技術分野においてよく知られている（たとえばＵＳ２００３００６９３９５、ＵＳ２００４０００９５３４、およびＵＳ２００７０２０２０４５を参照されたい）。他の例において、結合配列によって認識されるタンパク質は、たとえば血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３などのような細胞表面受容体またはリガンドである（Smith et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:30486-30490）。改変ＦＶＩＩポリペプチドが血清タンパク質または細胞表面受容体に結合する親和性は、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ、１ｐＭ、またはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）によって典型的に特徴づけられる。結合配列を介しての血清タンパク質または細胞表面受容体への改変ＦＶＩＩポリペプチドの結合は、たとえば、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、改変ＦＶＩＩポリペプチドの腎クリアランスまたは肝クリアランスを低下させることができる。いくつかの例において、細胞表面受容体への改変ＦＶＩＩポリペプチドの結合はまた、望ましい細胞もしくは組織型または身体における領域に改変ＦＶＩＩポリペプチドを向け、それによって、たとえば凝血などのように、特定の部位にそのＦＶＩＩポリペプチドを「集結させる」ことができる。したがって、移植された結合配列を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加した半減期を示すことができる。

ａ． 血清アルブミン結合配列を有する例示的なＦＶＩＩポリペプチド
血清アルブミン結合配列を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供される。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、インビトロまたはインビボにおいて血清アルブミンに結合し、増加した半減期をもたらすことができる。したがって、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加した半減期を有する改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供される。凝血促進治療薬としての対象への投与の後などのように、適切なインビトロアッセイまたはインビボアッセイにおいて評価した場合、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加した血液凝固活性を示すことができる。

本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、血清アルブミン結合配列を含有することができる。血清アルブミン結合配列は、非改変ＦＶＩＩポリペプチド内に挿入することができ、またはＦＶＩＩポリペプチドのＣ−末端もしくはＮ−末端に連結することができる。たとえば、血清アルブミン結合配列は、ＦＶＩＩポリペプチドのＣ−末端のアミノ酸位置４０６のプロリン残基から伸長することができる（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する）。結合配列が、ＦＶＩＩポリペプチド内に挿入される場合、挿入は、結果として生じる改変ＦＶＩＩポリペプチドが、非改変ＦＶＩＩポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持するように位置するものとする。結合配列は、ＦＶＩＩポリペプチドにおける任意のアミノ酸残基を除去することなく、ＦＶＩＩポリペプチドの中に挿入することができるまたはＦＶＩＩポリペプチドにおける１つまたは複数のアミノ酸残基と交換することができる。いくつかの例において、血清アルブミン結合配列は、Ｓ１０３〜Ｓ１１１のアミノ酸残基と交換して（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する）、改変ＦＶＩＩポリペプチドを生成する。他の例において、血清アルブミン結合配列は、アミノ酸残基Ｈ１１５〜Ｓ１２６またはＴ１２８〜Ｐ１３４と交換される（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する）。例示的な血清アルブミン結合配列は、配列番号２０６〜２１２において記載される。

表１０は、血清アルブミン結合配列を挿入するためにＦＶＩＩポリペプチドになすことができる例示的な改変の非限定的な例を提供する。上記に述べられるように、血清アルブミン結合配列の包含は、ＦＶＩＩポリペプチドの半減期を増加させることができる。したがって、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、血液凝固活性を増加させることができる。表１０において列挙される改変に関して、血清アルブミン結合配列がＦＶＩＩポリペプチドにおいて挿入されるアミノ酸残基および結合配列の配列は、共に、表中に表される。たとえば、Ｓ１０３Ｓ１１１ｄｅｌｉｎｓＱＲＬＭＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＦは、非改変ＦＶＩＩポリペプチド完全長ナンバリングのアミノ酸残基Ｓ１０３〜Ｓ１１１（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチド配列に対応する残基）が、欠失しており、アミノ酸配列ＱＲＬＭＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＦ（配列番号２０６）を有する血清アルブミン結合配列と交換されたことを示す。Ｐ４０６などのようなただ１つのアミノ酸残基の記載は、血清アルブミン結合配列が、Ｐ４０６の後に挿入され、アミノ酸残基が、ＦＶＩＩポリペプチドから欠失されていないことを示す。突然変異のためのアミノ酸位置はまた、必要に応じて、キモトリプシンナンバリング体系によっても表される。改変アミノ酸位置が対応するキモトリプシン番号を有していない（つまり、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応するアミノ酸位置１５３〜４０６内になく、上記の表１において記載されていない）場合、位置は、成熟ＦＶＩＩナンバリングを使用して、括弧中に表される。たとえば、キモトリプシンナンバリングを指す場合、Ｓ１０３は、対応するキモトリプシン番号を有しておらず、Ｓ［１０３］として記載される。下記の表１０において、改変ＦＶＩＩポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が記載される配列識別子（配列番号）が同定される。

血清アルブミン結合配列を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、血清アルブミンに対する非改変ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＶＩＩポリペプチドの結合と比較して、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の血清アルブミンに対する増加した結合性を示すことができる。血清アルブミンに結合することができる改変ＦＶＩＩポリペプチドは、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、非改変ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＶＩＩポリペプチドの血清半減期と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の増加した血清半減期を示すことができる。増加した血清アルブミン結合性および／またはそのような改変ＦＶＩＩポリペプチドの増加した血清半減期はまた、増加した凝固活性、血液凝固活性の継続期間、および／または増強した治療指数としても示すことができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性は、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、非改変ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上、増加させることができる。

ｂ． 血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合配列を有する例示的なＦＶＩＩポリペプチド
血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合配列を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供される。血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３（糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａとも呼ばれる）は、最も豊富な血小板接着受容体である。それは、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フォンウィルブランド因子、およびトロンボスポンジンを含むが、これらに限定されないタンパク質に対する受容体として働くカルシウム依存性ヘテロ二量体である。「同族」タンパク質リガンドに対する結合は、α_ＩＩｂβ_３を活性化することができ、タンパク質の細胞間ドメインを介しての細胞質におけるシグナル伝達を誘発する。血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合配列を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、そのため、血小板に結合することができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、インビトロまたはインビボにおいて、血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３（活性化形態および／または非活性化形態）に結合し、増加した半減期をもたらすことができる。そのため、活性化α_ＩＩｂβ_３に選択的に結合するＦＶＩＩａ変異体は、活性化血小板に向けることができ、したがって、進展する凝血の部位に集結することができる。進展する凝血へのＦＶＩＩａの選択的ターゲティングは、効能および治療指数の両方を改善することによって、変異体の治療的有用性を改善することが予想されるであろう。したがって、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加した半減期を有する改変ＦＶＩＩポリペプチドおよび活性化血小板にさらに選択的に結合する変異体が、本明細書において提供される。凝血促進治療薬としての対象への投与の後などのように、適切なインビトロアッセイまたはインビボアッセイにおいて評価した場合、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加した血液凝固活性を示すことができる。

本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合配列を含有する。血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合配列は、非改変ＦＶＩＩポリペプチド内に挿入することができ、またはＦＶＩＩポリペプチドのＣ−末端もしくはＮ−末端に連結することができる。たとえば、α_ＩＩｂβ_３結合配列は、ＦＶＩＩポリペプチドのＣ−末端のアミノ酸位置４０６のプロリン残基から伸長することができる（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する）。結合配列が、ＦＶＩＩポリペプチド内に挿入される場合、挿入は、結果として生じる改変ＦＶＩＩポリペプチドが、非改変ＦＶＩＩポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持するように位置するものとする。結合配列は、ＦＶＩＩポリペプチドにおける任意のアミノ酸残基を除去することなく、ＦＶＩＩポリペプチドの中に挿入することができ、またはＦＶＩＩポリペプチドにおける１つまたは複数のアミノ酸残基と交換することができる。いくつかの例において、血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合配列は、Ｓ１０３〜Ｓ１１１のアミノ酸残基と交換して（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する）、改変ＦＶＩＩポリペプチドを生成する。他の例において、α_ＩＩｂβ_３結合配列は、アミノ酸残基Ｈ１１５〜Ｓ１２６またはＴ１２８〜Ｐ１３４と交換される（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する）。例示的な血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合配列は、配列番号２１３〜２１５において記載される。

表１１は、血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合配列を挿入するためにＦＶＩＩポリペプチドになすことができる例示的な改変の非限定的な例を提供する。上記に述べられるように、血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合配列の包含は、ＦＶＩＩポリペプチドの血清半減期を増加させることができる、および／または進展する凝血にタンパク質を向けることができる。したがって、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、血液凝固活性を増加させることができる。表１１において列挙される改変に関して、血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合配列がＦＶＩＩポリペプチドにおいて挿入されるアミノ酸残基および結合配列の配列は、共に、表中に表される。たとえば、Ｈ１１５Ｓ１２６ｄｅｌｉｎｓ ＳＦＧＲＧＤＩＲＮＶは、非改変ＦＶＩＩポリペプチド完全長ナンバリングのアミノ酸残基Ｈ１１５〜Ｓ１２６（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチド配列に対応する残基）が、欠失しており、アミノ酸配列ＳＦＧＲＧＤＩＲＮＶ（配列番号２１３）を有するα_ＩＩｂβ_３結合配列と交換されたことを示す。Ｐ４０６などのようなただ１つのアミノ酸残基の記載は、α_ＩＩｂβ_３結合配列が、Ｐ４０６の後に挿入され、アミノ酸残基が、ＦＶＩＩポリペプチドから欠失されていないことを示す。突然変異のためのアミノ酸位置はまた、必要に応じて、キモトリプシンナンバリング体系によっても表される。改変アミノ酸位置が対応するキモトリプシン番号を有していない（つまり、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応するアミノ酸位置１５３〜４０６内になく、上記の表１において記載されていない）場合、位置は、成熟ＦＶＩＩナンバリングを使用して、括弧中に表される。たとえば、キモトリプシンナンバリングを指す場合、Ｓ１０３は、対応するキモトリプシン番号を有しておらず、Ｓ［１０３］として記載される。下記の表１１において、改変ＦＶＩＩポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が記載される配列識別子（配列番号）が同定される。

血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合配列を含有する改変（修飾）ＦＶＩＩポリペプチドは、インビボにおいて、血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３に対する非改変（非修飾）ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＶＩＩポリペプチドの結合性と比較して、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３に対する増加した結合性を示すことができる。血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３介して血小板に結合することができる改変（修飾）ＦＶＩＩポリペプチドは、インビトロ、インビボ、またはエクスビボのいずれかにおいて、非改変（修飾）ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＶＩＩポリペプチドの半減期と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の、増加した半減期を示すことができる。そのような改変（修飾）ＦＶＩＩポリペプチドの増加した半減期はまた、増加した凝固活性、血液凝固活性の継続期間、および／または増強した治療指数としても示すことができる。たとえば、改変（修飾）ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性は、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、非改変（修飾）ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上、増加させることができる。

６． 異種Ｇｌａドメインの導入による改変（修飾）
ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、プロトロンビン、プロテインＣ、およびプロテインＳなどのようなビタミンＫ依存性血漿タンパク質のγ−カルボキシル化Ｇｌａドメインにおける残基ならびに膜表面上の負電荷リン脂質の相互作用は、止血にとって重要である。ビタミンＫ依存性血漿タンパク質のＧｌａドメインは、典型的に約４５アミノ酸を含有し、このうちの９〜１２のグルタミン酸残基は、ビタミンＫ依存性カルボキシル化によって翻訳後修飾されて、γ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）を形成する。Ｇｌａドメインを形成するアミノ酸は、タンパク質のシグナルペプチドおよびプロペプチドを形成するものの直後に位置し、そのため、前駆体ポリペプチドの成熟タンパク質へのプロセシングおよび切断の後にＮ−末端に位置する。たとえば、ＦＶＩＩにおいてＧｌａドメインを形成するアミノ酸は、配列番号１において記載される前駆体ポリペプチドの位置３９〜８３、配列番号２において記載される前駆体ポリペプチドの位置６１〜１０５、および配列番号３において記載される成熟ポリペプチドの位置１〜４５にある。これらのうち、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドの位置Ｅ６、Ｅ７、Ｅ１４、Ｅ１９、Ｅ２０、Ｅ２５、Ｅ２６、Ｅ２９、およびＥ３５の１０のグルタミン酸残基は、カルボキシル化によって修飾されて、γ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）残基を生成する。

活性化血小板に対するその比較的低い結合親和性により、ＦＶＩＩのＧｌａドメインは、改変ＦＶＩＩおよびリン脂質膜の間の相互作用を増強し、それによって凝固活性を増加させるための、改変の標的となる。改変は、この相互作用に関与する特異的なアミノ酸の置換によって達成することができる（たとえばShah et al. PNAS 95: 4429-4234、Harvey et al. (2003) J Biol Chem 278:8363-8369を参照されたい）。代わりに、改変は、他のビタミンＫ依存性タンパク質のＧｌａドメインとの全Ｇｌａドメインの置換、つまりＧｌａドメインｓｗａｐによって達成することができる。この種の改変は、プロテインＣのＧｌａドメインがＦＶＩＩのＧｌａドメインと交換された場合、結果として生じるものなどのようなキメラタンパク質をもたらす（Geng et al. (1997) Thromb Haemost 77:926-933）。

典型的には、そのような改変は、キメラ改変ＦＶＩＩポリペプチドを生成するための、異種ＧｌａドメインまたはＦＶＩＩポリペプチドの領域の中へのリン脂質結合を達成するのに十分なその部分の追加または置換などによる導入を含む。一般に、そのようなキメラＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＶＩＩの少なくとも１つの活性を保持する。活性化血小板に対するＧｌａ改変ＦＶＩＩポリペプチドの結合性および／または親和性は、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、非改変ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＶＩＩポリペプチドの結合性および／または親和性と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上、増加させることができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドによる活性化血小板に対する結合性および／または親和性はまた、増加した凝固活性としても示すことができる。Ｇｌａ改変ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性は、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、非改変ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性と比較して、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上、増加させることができる。

任意のポリペプチド内に含有されるＧｌａドメインまたは異種Ｇｌａドメインの３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上などのような、リン脂質結合を行うのに十分なその部分は、ＦＶＩＩポリペプチドの領域の導入または交換のための異種Ｇｌａドメインの供給源として使用することができる。典型的には、そのような異種Ｇｌａドメインは、リン脂質、たとえば、活性化血小板の表面上に存在するリン脂質に対して結合親和性を示す。一般に、異種Ｇｌａドメインのうちで選ばれるものは、ＦＶＩＩのＧｌａドメインの親和性と比較して、リン脂質に対するより高度な親和性を示すものである。ＦＶＩＩポリペプチドの改変のために異種ドメインとして使用される完全なＧｌａドメインまたは十分なその部分は、合理的にまたは経験的に決定することができる。例示的な他のＧｌａ含有ポリペプチドは、ＦＩＸ、ＦＸ、プロトロンビン、プロテインＣ、プロテインＳ、オステオカルシン、マトリックスＧｌａタンパク質、増殖停止特異的タンパク質６（Ｇａｓ６）、およびプロテインＺを含むが、これらに限定されない。これらの例示的なタンパク質のＧｌａドメインは、配列番号８３〜９１のいずれかにおいて記載される。たとえば、異種Ｇｌａドメインの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、またはそれ以上の隣接するアミノ酸または全Ｇｌａドメインは、ＦＶＩＩポリペプチドの中に導入することができる。さらに、ＦＶＩＩポリペプチドへのＧｌａドメインの導入はまた、さらなるアミノ酸が、導入されたＧｌａドメインのリン脂質結合能力を有意に弱めない限り、異種ポリペプチドのＧｌａドメインの一部ではない、さらなるアミノ酸を含むこともできる。

いくつかの例において、改変ＦＶＩＩポリペプチドが、ＦＶＩＩの少なくとも１つの活性を保持する限り、導入は、異種Ｇｌａドメインが、内因性Ｇｌａドメインの中にまたはＦＶＩＩポリペプチドの他の領域もしくはドメインの中に挿入されるように、ＦＶＩＩポリペプチドへのＧｌａドメインの追加によるものである。そのような実施例において、いくつかの場合において、天然Ｇｌａドメインを構成するアミノ酸配列が断続性であるが、ＦＶＩＩポリペプチドの天然Ｇｌａドメインは、ポリペプチドにおいて保持される。他の例において、異種Ｇｌａドメインまたは十分なその部分は、天然Ｇｌａドメインが断続性とならないように、挿入されて、天然ＧｌａドメインのＮ−末端またはＣ−末端上に近接する。さらなる例において、異種Ｇｌａドメインまたは十分なその部分は、ＦＶＩＩポリペプチドの他のドメインの中に挿入される。

改変ＦＶＩＩポリペプチドが、ＦＶＩＩの少なくとも１つの活性を保持する限り、ＦＶＩＩの内因性Ｇｌａドメインのすべての部分または連続(contiguous)部分が除去され、異種Ｇｌａドメインまたはリン脂質結合を達成するのに十分なその部分と交換される改変ＧｌａドメインＦＶＩＩポリペプチドもまた、本明細書において提供される。そのような改変はまた、Ｇｌａドメインｓｗａｐとも呼ばれる。例示的なＧｌａ ｓｗａｐ改変は、ＦＩＸ（配列番号８３）、ＦＸ（配列番号８４）、トロンビン（配列番号８５）、プロテインＣ（配列番号８６）、またはプロテインＳ（配列番号８７）のいずれか１つのＧｌａドメインのすべてまたは部分と内因性Ｇｌａドメインが交換されるものである。そのような改変は、それぞれ、「Ｇｌａ Ｓｗａｐ ＦＩＸ」、「Ｇｌａ Ｓｗａｐ ＦＸ」、「Ｇｌａ Ｓｗａｐトロンビン」、「Ｇｌａ Ｓｗａｐ Ｐｒｏｔ Ｃ」、および「Ｇｌａ Ｓｗａｐ Ｐｒｏｔ Ｓ」と呼ばれる。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、活性化血小板に対して増加した結合性を示し、増加した血液凝固活性をもたらすことができる。「Ｇｌａ ｓｗａｐ ＦＩＸ」改変は、アミノ酸残基Ａ１〜Ｙ４４（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する残基）を欠失させることによる、内因性ＦＶＩＩ Ｇｌａドメインの欠失および配列番号８３において記載されるＦＩＸ Ｇｌａドメインのアミノ酸残基Ｙ１〜Ｙ４５に対応する４５アミノ酸残基の挿入を含む。Ｇｌａ Ｓｗａｐ ＦＸ改変は、アミノ酸残基Ａ１〜Ｙ４４（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する残基）の欠失および配列番号８４において記載されるＦＸ ＧｌａドメインのＡ１〜Ｙ４４に対応する４４アミノ酸残基の挿入を含む。Ｇｌａ Ｓｗａｐトロンビン改変は、アミノ酸残基Ａ１〜Ｙ４４（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する残基）の欠失および配列番号８５において記載されるトロンビンＧｌａドメインのアミノ酸残基Ｙ１〜Ｙ４４に対応する４４アミノ酸残基の挿入を含む。Ｇｌａ ＳｗａｐプロテインＣ改変は、アミノ酸残基Ａ１〜Ｙ４４（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する残基）の欠失および配列番号８６において記載されるプロテインＣ Ｇｌａドメインのアミノ酸残基Ａ１〜Ｈ４４に対応する４４アミノ酸残基の挿入を含む。Ｇｌａ ＳｗａｐプロテインＳ改変は、アミノ酸残基Ａ１〜Ｙ４４（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する残基）の欠失および配列番号８７において記載されるプロテインＳ Ｇｌａドメインのアミノ酸残基Ｙ１〜Ｙ４４に対応する４４アミノ酸残基の挿入を含む。

いくつかの例において、アミノ酸置換もしくはアミノ酸交換、アミノ酸挿入、および／またはアミノ酸欠失を含むが、これらに限定されない改変は、ＦＶＩＩポリペプチドの中に導入されている異種Ｇｌａドメインに対してなされる。そのような改変は、たとえば、異種Ｇｌａドメインの野生型形態で観察される結合性と比較して増加したリン脂質結合性により、活性化血小板に対する増加した結合を行うことができる。たとえば、第ＩＸ因子Ｇｌａドメインまたはそのリン脂質結合性部分が、ＦＶＩＩポリペプチドの中に導入されて、改変ＦＶＩＩポリペプチドを生成する場合、第ＩＸ因子Ｇｌａドメインは、野生型第ＩＸ因子Ｇｌａドメインと比較して、増加したリン脂質結合性を付与するアミノ酸突然変異を含有することができる。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドにおいて含有される異種Ｇｌａドメインは、アミノ酸置換もしくはアミノ酸交換、アミノ酸挿入、および／またはアミノ酸欠失などのような、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の改変を含有することができる。

いくつかの例において、異種Ｇｌａドメインにおける改変（１つまたは複数）は、リン脂質結合性を増加させる。他の例において、異種Ｇｌａドメインは、異種Ｇｌａドメインの野生型形態と比較して、ＦＶＩＩ様の機能を異種Ｇｌａドメインに付与する１つまたは複数の突然変異を含有することができる。たとえば、上記に述べられるように、配列番号１１９において記載されるＦＶＩＩ ＧｌａドメインのＲ３６は、ＦＸとの相互作用に関与することができる。したがって、異種Ｇｌａドメインは、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドの位置３６のアルギニンを維持するために必要とされる任意のものまたは改変ＦＶＩＩａポリペプチドのＦＸ活性化特性を維持するために必要とされる任意の他の改変などのようなさらなる改変を含有することができる（Ruf et al. (1999) Biochem 38:1957-1966）。したがって、いくつかの例において、Ｒ３６に対応する突然変異は、異種Ｇｌａドメインにおいてなすことができる。対応する位置は、アミノ酸配列のアライメントなどによって当業者によって決定することができる。

Ｇｌａ ｓｗａｐ改変を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供され、異種Ｇｌａドメインまたはそのリン脂質結合性部分は、野生型異種Ｇｌａドメインと比較して、１つまたは複数の突然変異を含有し、いくつかまたはすべての内因性ＦＶＩＩ Ｇｌａドメインの交換によって、ＦＶＩＩポリペプチドの中に導入される。一例において、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、「Ｇｌａ ｓｗａｐ ＦＩＸ」改変を含有し、これは、上記に記載されるように、アミノ酸残基Ａ１〜Ｙ４４（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する残基）を欠失させることによる、内因性ＦＶＩＩ Ｇｌａドメインの欠失および配列番号８３において記載されるＦＩＸ Ｇｌａドメインのアミノ酸残基Ｙ１〜Ｙ４５に対応する４５アミノ酸残基の挿入を含む。Ｇｌａ ｓｗａｐ改変において使用されるＦＩＸ Ｇｌａドメインは、配列番号８３において記載されるＦＩＸ Ｇｌａドメインの野生型形態と比較して、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、またはアミノ酸挿入などのような１、２、３、４、５、またはそれ以上の突然変異などのような、１つまたは複数の突然変異を含有することができる。たとえば、「Ｇｌａ ｓｗａｐ ＦＩＸ」改変ＦＶＩＩポリペプチドにおける異種ＦＩＸ Ｇｌａドメインは、配列番号８３において記載されるＦＩＸ ＧｌａドメインのＭ１９、Ｅ４０、Ｋ４３、および／またはＱ４４に対応するアミノ酸位置に１つまたは複数のアミノ酸置換を含有することができる。

一例において、ＦＩＸ Ｇｌａドメインは、Ｍ１９Ｋアミノ酸置換を含有する。そのような改変は、｛Ｇｌａ Ｓｗａｐ ＦＩＸ／Ｍ１９Ｋ｝によって表され、つまり、配列番号８３において記載されるＦＩＸ Ｇｌａドメインのアミノ酸位置１９に対応するアミノ酸位置のメチオニンは、リシンと交換される。さらなる例において、改変ＦＶＩＩポリペプチドにおける改変異種ＦＩＸ Ｇｌａドメインは、｛ＦＩＸ Ｇｌａ Ｓｗａｐ／Ｅ４０Ｌ｝によって表される、Ｅ４０Ｌアミノ酸置換を含有し、それにより配列番号８３において記載されるＦＩＸ Ｇｌａドメインのアミノ酸位置４０に対応するアミノ酸位置のグルタミン酸は、ロイシンと交換される。Ｋ４３Ｉ置換（｛Ｇｌａ Ｓｗａｐ ＦＩＸ／Ｋ４３Ｉ｝によって表される）を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供され、配列番号８３において記載されるＦＩＸ Ｇｌａドメインのアミノ酸位置４３に対応するアミノ酸位置のリシンは、イソロイシンと交換される。他の例において、改変ＦＶＩＩポリペプチドにおける改変異種ＦＩＸ Ｇｌａドメインは、｛ＦＩＸ Ｇｌａ ｓｗａｐ／Ｑ４４Ｓ｝によって表される、Ｑ４４Ｓアミノ酸置換を含有し、それにより配列番号８３において記載されるＦＩＸ Ｇｌａドメインのアミノ酸位置４４に対応するアミノ酸位置のグルタミンは、セリンと交換される。一例において、異種ＦＩＸ Ｇｌａドメインは、Ｍ１９Ｋ／Ｅ４０Ｌ／Ｋ４３Ｉ／Ｑ４４Ｓアミノ酸置換を含有する。

改変異種Ｇｌａドメインなどのような異種Ｇｌａドメインを含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、活性化血小板に対する増加した結合性および／または親和性により、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）などのように、野生型ＦＶＩＩ分子と比較して、より低用量で、増加した血液凝固活性を示すことができる。Ｇｌａ改変ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロのいずれかにおいて、非改変ＦＶＩＩポリペプチドまたは野生型ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性と比較して、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上、増加させることができる。

７． 組み合わせおよびさらなる改変
上記に記載される、任意の１つまたは複数の改変は、上記に記載されるまたは当技術分野における他のところで記載される、任意の他の改変（１つまたは複数）と組み合わせることができる。したがって、ＡＴ−ＩＩＩに対する増加した抵抗性、増加した触媒活性、Ｚｎ^２＋による阻害に対する増加した抵抗性、変化したグリコシル化、増加した半減期などのような改善された薬物動態学的特性、血清アルブミンに対する増加した結合性および／もしくは親和性、リン脂質に対する増加した結合性および／もしくは親和性、または血小板インテグリン血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３に対する増加した結合性および／もしくは親和性を有するためのＦＶＩＩポリペプチドの改変に加えて、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、上記に述べられる複数の特性を示すものを含む。典型的には、そのようなさらなる改変は、それら自体が、改変ポリペプチドの増加した血液凝固活性および／またはポリペプチドの増加した安定性をもたらすものである。したがって、結果として生じる改変ＦＶＩＩポリペプチドは、増加した血液凝固活性を示す。さらなる改変は、たとえば、当技術分野において知られている任意のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、またはアミノ酸挿入、典型的には、ＦＶＩＩポリペプチドの血液凝固活性および／または安定性を増加させる任意のものを含むことができる。本明細書において提供される任意の改変ＦＶＩＩポリペプチドは、結果として生じる改変ＦＶＩＩポリペプチドが野生型ポリペプチドまたは非改変ポリペプチドのＦＶＩＩ活性を保持する限り、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のさらなるアミノ酸改変を含有することができる。

一例において、さらなる改変は、他の因子、分子、およびタンパク質とのその相互作用が変化するように、ＦＶＩＩポリペプチド配列に対してなすことができる。たとえば、組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）との相互作用に関与するアミノ酸残基は、ＴＦに対する改変ＦＶＩＩポリペプチドの親和性および／または結合性が減少するように、交換することができる。他の改変は、第Ｘ因子、第ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）、およびリン脂質との相互作用に関与するアミノ酸の改変を含むが、これらに限定されない。いくつかの例において、ＦＶＩＩポリペプチド配列に対してなされる改変は、たとえば血清アルブミン結合配列または糖タンパク質ＩＩｂ〜ＩＩＩａの結合配列などのような結合配列を構成するアミノ酸の挿入を含む。

ポリペプチドのコンホメーションまたは折り畳みを変化させるさらなる改変もまた、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドに対してなすことができる。これらは、たとえば、新しいジスルフィド結合が形成されるような、１つもしくは複数のアミノ酸のシステインとの交換またはα−ヘリックスコンホメーションを安定化する改変を含み、それによって、改変ＦＶＩＩポリペプチドに対して増加した活性を与える。

さらなる改変もまた、翻訳後修飾を達成するためにＦＶＩＩポリペプチドに対してなすことができる。たとえば、ポリペプチドは、結果として生じる改変ＦＶＩＩポリペプチドが、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加したグリコシル化を有するように、さらなるグリコシル化部位を含むように改変することができる。改変はまた、改変ＦＶＩＩポリペプチドの安定性を増加させるように作用するものなどのような化学的部分に引き続いて連結することができるアミノ酸残基を導入するためになすことができる。ＦＶＩＩポリペプチドの安定性はまた、潜在的なタンパク質分解部位を改変することによって変化させ、それによって、プロテアーゼに対する改変ＦＶＩＩポリペプチドの抵抗性を増加させることができる。

さらに、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、またはアミノ酸挿入は、改変ＦＶＩＩポリペプチドが、リン脂質膜に対する増加した結合性および／または親和性を示すように、内因性Ｇｌａドメインにおいてなすことができる。そのような改変は、単一のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、および／もしくはアミノ酸挿入を含むことができる、または複数のアミノ酸のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸挿入を含むことができる。たとえば、内因性Ｇｌａドメインのすべてまたは一部分は、異種Ｇｌａドメインのすべてまたは一部分と交換することができる。他の例において、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、内因性Ｇｌａドメインにおける欠失または通常γ−カルボキシル化される位置における置換を示すことができる（ＵＳ２００７００３７７４６）。

以下の部は、ＦＶＩＩポリペプチドの増加した安定性および／または血液凝固活性を達成するための、当技術分野において記載される例示的な改変の非限定的な例を記載する。上記に議論されるように、そのような改変は、また、本明細書において提供される任意の改変ＦＶＩＩポリペプチドにおいてさらに含むことができる。下記に言及されるアミノ酸位置は、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する。対応する突然変異は、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドの対立遺伝子変異体、種変異体、またはスプライス変異体などのような他のＦＶＩＩポリペプチドにおいてなすことができる。

ａ． ＴＦＰＩに対する抵抗性を増加させる改変
一例において、ＴＦＰＩに対する増加した抵抗性をもたらす、さらなる改変は、成熟ＦＶＩＩナンバリングによるアミノ酸位置２８６の改変を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドに対してなすことができる。たとえば、ＴＦＰＩに対するそのような抵抗性は、そのような結合を低下させまたは予防し、それによって、凝固開始に関して、ＴＦＰＩの天然に阻害性の効果に対して抵抗性の改変ＦＶＩＩポリペプチドを作製するために、ＴＦＰＩとの相互作用および結合に関与する、ＦＶＩＩにおける１つまたは複数の残基の突然変異によって達成することができる。たとえば、その改変は、ＦＶＩＩ／ＴＦＰＩ接触残基または相互作用表面に近接した残基であるアミノ酸残基でなすことができる。

ＴＦＰＩに対する抵抗性を増加させるために、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドにおいて含むことができるさらなる改変の例は、国際特許出願公開ＷＯ２００４／０８３３６１、Neuenschwander et al., (1995) Biochemistry 34:8701-8707、Chang et al., (1999) Biochemistry 38:10940-10948、およびIakhiaev et al., (2001) Thromb. Haemost. 85:458-463ならびに関連する米国特許出願第１２／０８２，６６２号において記載されるものを含むが、これらに限定されない。改変ＦＶＩＩポリペプチドのＴＦＰＩに対する増加した抵抗性をもたらすことができる、当技術分野において記載される例示的なアミノ酸改変の非限定的な例は、任意の１つまたは複数のQ176、D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、R290M、R290V、K341E、K341R、K341Q、K341N、K341M、K341D、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insAおよびK197I198insSを含む（たとえば、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＡＳは、アラニン（Ａ）およびセリン（Ｓ）が、位置２３７のグリシン（Ｇ２３７）および位置２３８のトレオニンの間に挿入されている改変を表す）。

ｂ． 内因活性を増加させる改変
一例において、第Ｘ因子に対する増加した触媒活性をもたらすさらなる改変は、本明細書において提供される改変第ＶＩＩ因子ポリペプチドに対してなすことができる。たとえば、改変は、結果として生じる改変ＦＶＩＩポリペプチドが、ＴＦに対する親和性を増加させ、それによってＦＸに対する増加した活性を示すように、その補因子、ＴＦとの相互作用に関与するアミノ酸に対してなすことができる。改変はまた、ＦＸに対する改変ＦＶＩＩポリペプチドの内因活性が、非改変ポリペプチドの活性と比較して増加するように、ＦＶＩＩポリペプチドの活性化ポケットに対してなすこともできる。増加した活性をもたらす他の改変戦略は、タンパク質の折り畳みおよびコンホメーションが、より活性な形態に変化するような、ＦＶＩＩポリペプチドの改変を含む。たとえば、アミノ酸置換は、プロテアーゼドメインのα−ヘリックスループ領域（配列番号３において記載される成熟配列の位置３０５〜３２１に対応する）が、プロテアーゼドメインの主要部に対してより密接に安定化され、折り畳まれて、改変ＦＶＩＩポリペプチドに対してよりチモーゲン様の形状を付与するように、なすことができる。より活性のポリペプチドはまた、ＦＶＩＩポリペプチドのβ鎖において含まれるアミノ酸の改変によって達成することができる。たとえば、改変ＦＶＩＩポリペプチドをより活性の形態に「固定する」ために機能することができる、新しいジスルフィド結合を形成することができる、新しいシステイン対を導入するアミノ酸置換は、なすことができる。

改変ＦＶＩＩポリペプチドの内因活性を増加させるための、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドにおいて含むことができるさらなる改変の例は、Persson et al. (2004) Biochem J. 379:497-503、Maun et al. (2005) Prot Sci 14:1171-1180、Persson et al. (2001) PNAS 98:13583-13588、Persson et al. (2002) Eur J Biochem 269:5950-5955、Soejima et al. (2001) J Biol Chem 276:17229-17235、Soejima et al. (2002) J Biol Chem 277:49027-49035、ＷＯ２００１８３７２５、ＷＯ２００２０２２７７６、ＷＯ２００２０３８１６２、ＷＯ２００３０２７１４７、ＷＯ２００３３８１６２、ＷＯ２００４０２９０９０、ＷＯ２００４０２９０９１、ＷＯ２００４１０８７６３、およびＷＯ２００４１１１２４２において記載されるものを含むが、これらに限定されない。改変ＦＶＩＩポリペプチドの増加した内因活性をもたらすことができる、当技術分野において記載される例示的なアミノ酸改変の非限定的な例は、任意の１つまたは複数のS279C/V302C、L280C/N301C、V281C/V302C、S282C/V299C、S314E、L39E、L39Q、L39H、I42R、S43Q、S53N、K62E、K62R、K62D、K62N、K62Q、K62T、L65Q、L65S、F71D、F71Y、F71E、F71Q、F71N、P74S、P74A、A75E、A75D、E77A、E82Q、E82N、T83K、E116D、K157V、K157L、K157I、K157M、K157F、K157W、K157P、K157G、K157S、K157T、K157C、K157Y、K157N、K157E、K157R、K157H、K157D、K157Q、V158L、V158I、V158M、V158F、V158W、V158P、V158G、V158S、V158T、V158C、V158Y、V158N、V158E、V158R、V158K、V158H、V158D、V158Q、A274M、A274L、A274K、A274R、A274D、A274V、A274I、A274F、A274W、A274P、A274G、A274T、A274C、A274Y、A274N、A274E、A274H、A274S、A274Q、F275H、E296V、E296L、E296I、E296M、E296F、E296W、E296P、E296G、E296S、E296T、E296C、E296Y、E296N、E296K、E296R、E296H、E296D、E296Q、M298Q、M298V、M298L、M298I、M298F、M298W、M298P、M298G、M298S、M298T、M298C、M298Y、M298N、M298K、M298R、M298H、M298E、M298D、R304Y、R304F、R304L、R304M、L305V、L305Y、L305I、L305F、L305A、L305M、L305W、L305P、L305G、L305S、L305T、L305C、L305N、L305E、L305K、L305R、L305H、L305D、L305Q、M306D、M306N、D309S、D309T、S314A、S314V、S314I、S314M、S314F、S314W、S314P、S314G、S314L、S314T、S314C、S314Y、S314N、S314E、S314K、S314R、S314H、S314D、S314Q、D334G、D334E、D334A、D334V、D334I、D334M、D334F、D334W、D334P、D334L、D334T、D334C、D334Y、D334N、D334K、D334R、D334H、D334S、D334Q、S336G、S336E、S336A、S336V、S336I、S336M、S336F、S336W、S336P、S336L、S336T、S336C、S336Y、S336N、S336K、S336R、S336H、S336D、S336Q、K337L、K337V、K337I、K337M、K337F、K337W、K337P、K337G、K337S、K337T、K337C、K337Y、K337N、K337E、K337R、K337H、K337D、K337Q、F374P、F374A、F374V、F374I、F374L、F374M、F374W、F374G、F374S、F374T、F374C、F374Y、F374N、F374E、F374K、F374R、F374H、F374D、F374Q、および位置３００〜３２２、３０５〜３２２、３００〜３１２、または３０５〜３１２の、トリプシン、トロンビン、またはＦＸに由来する対応するアミノ酸との置換、および位置３１０〜３２９、３１１〜３２２、または２３３〜３２９の、トリプシンに由来する対応するアミノ酸との置換を含む。

ｃ． プロテアーゼに対する抵抗性を増加させる改変
本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、プロテアーゼに対するポリペプチドの増加した抵抗性をもたらす、さらなる改変を含有することができる。たとえば、１つまたは複数の潜在的なタンパク質分解による切断部位を除去するアミノ酸置換は、なすことができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、したがって、プロテアーゼに対してより抵抗性になり、それによって、改変ポリペプチドの安定性および半減期を増加させることができる。

プロテアーゼに対する抵抗性を増加させるために、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドにおいて含むことができるさらなる改変の例は、米国特許第５５８０５６０号または国際特許出願公開ＷＯ１９８８０１０２９５およびＷＯ２００２０３８１６２において記載されるものを含むが、これらに限定されない。阻害因子および／またはプロテアーゼに対する、改変ＦＶＩＩポリペプチドの増加した抵抗性をもたらすことができる、当技術分野において記載される例示的な改変の非限定的な例は、任意の１つまたは複数のK32Q、K32E、K32G、K32H、K32T、K32A、K32S、K38T、K38D、K38L、K38G、K38A、K38S、K38N、K38H、I42N、I42S、I42A、I42Q、Y44N、Y44S、Y44A、Y44Q、F278S、F278A、F278N、F278Q、F278G、R290G、R290A、R290S、R290T、R290K、R304G、R304T、R304A、R304S、R304N、R315G、R315A、R315S、R315T、R315Q、Y332S、Y332A、Y332N、Y332Q、Y332G、K341E、K341Q、K341G、K341T、K341AおよびK341Sを含む。

ｄ． リン脂質に対する親和性を増加させる改変
本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、リン脂質に対する親和性を増加させるための１つまたは複数のさらなる改変を含有することができる。ＦＶＩＩの血液凝固活性は、活性化血小板の表面上に発現されるものなどのようなリン脂質に対するポリペプチドの結合性および／または親和性を増加させることによって増強することができる。これは、たとえば、内因性ＦＶＩＩ Ｇｌａドメインを改変することによって、達成することができる。改変は、ホスファチジルセリンおよび他の負電荷リン脂質に結合するための、増加した能力を有する改変ＦＶＩＩポリペプチドをもたらす、ＦＶＩＩポリペプチドのＧｌａドメインにおける１つまたは複数の位置のアミノ酸置換によって達成することができる。内因性ＦＶＩＩ Ｇｌａドメインを含有する、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドに対してなすことができる、リン脂質結合性および／または親和性を増加させるためのさらなる改変の例は、Harvey et al. (2003) J Biol Chem 278:8363-8369、ＵＳ２００３０１００５０６、ＵＳ２００４０２２０１０６、ＵＳ２００６０２４０５２６、ＵＳ６０１７８８２、ＵＳ６６９３０７５、ＵＳ６７６２２８６、ＷＯ２００３９３４６５、およびＷＯ２００４１１１２４２において記載されるものを含むが、これらに限定されない。例示的なそのような改変は、位置４での、チロシンの任意の１つもしくは複数の挿入または任意の１つまたは複数のＰ１０Ｑ、Ｐ１０Ｅ、Ｐ１０Ｄ、Ｐ１０Ｎ、Ｒ２８Ｆ、Ｒ２８Ｅ、Ｋ３２Ｅ、Ｋ３２Ｄ、Ｄ３３Ｆ、Ｄ３３Ｅ、Ｄ３３Ｋ Ａ３４Ｅ、Ａ３４Ｄ、Ａ３４Ｉ、Ａ３４Ｌ、Ａ３４Ｍ、Ａ３４Ｖ、Ａ３４Ｆ、Ａ３４Ｗ、Ａ３４Ｙ、Ｒ３６Ｄ、Ｒ３６Ｅ、Ｋ３８Ｅ、およびＫ３８Ｄの改変を含む。

ｅ． グリコシル化を変化させる改変
タンパク質のグリコシル化の程度、レベル、および／または型の改変は、免疫原性を低下させる、安定性を増加させる、投与の頻度を低下させる、および／または炎症などのような有害な副作用を低下させるための手段として当技術分野において記載されている。通常、これは、グリコシル化レベルを増加させることによって達成される。グリコシル化部位は、ポリペプチドが、グリコシル化が可能な真核細胞において産生される場合、それが、グリコシル化されるように、ポリペプチド上の炭水化物部分に対する付加のための部位を提供する。

ＦＶＩＩにおいて４つの天然グリコシル化部位がある；配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドにおけるアミノ酸位置に対応する、Ｎ１４５およびＮ３２２での２つのＮ−グリコシル化部位ならびにＳ５２およびＳ６０での２つのＯ−グリコシル化部位。一実施形態において、さらなる改変は、上記部位のグリコシル化が破壊されるように、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドに対してなすことができる。これは、増加した血液凝固活性を有する改変ＦＶＩＩポリペプチドをもたらすことができる（たとえばＷＯ２００５１２３９１６を参照されたい）。非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、改変ＦＶＩＩポリペプチドの減少したグリコシル化および増加した活性をもたらすことができる、当技術分野において記載される例示的な改変の非限定的な例は、S52A、S60A、N145Y、N145G、N145F、N145M、N145S、N145I、N145L、N145T、N145V、N145P、N145K、N145H、N145Q、N145E、N145R、N145W、N145D、N145C、N322Y、N322G、N322F、N322M、N322S、N322I、N322L、N322T、N322V、N322P、N322K、N322H、N322Q、N322E、N322R、N322WおよびN322Cを含むが、これらに限定されない。

他の実施形態において、さらなる改変は、さらなるグリコシル化部位が、導入され、したがって、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、改変ＦＶＩＩポリペプチドのグリコシル化のレベルを増加させるように、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸配列に対してなすことができる。グリコシル化部位は、Ｎ結合型グリコシル化部位またはＯ結合型グリコシル化部位とすることができる。１つまたは複数の新しいグリコシル化部位を導入する、ＦＶＩＩポリペプチドに対してなすことができる改変の例は、ＵＳ６８０６０６３およびＷＯ２００３９３４６５において記載されるものを含むが、これらに限定されない。非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、改変ＦＶＩＩポリペプチドの増加したグリコシル化をもたらすことができる、当技術分野において記載される例示的な改変の非限定的な例は、F4S、F4T、P10N、Q21N、W41N、S43N、A51N、G58N、L65N、G59S、G59T、E82S、E82T、N95S、N95T、G97S、G97T、Y101N、D104N、T106N、K109N、G117N、G124N、S126N、T128N、A175S、A175T、G179N、I186S、I186T、V188N、R202S、R202T、I205S、I205T、D212N、E220N、I230N、P231N、P236N、G237N、V253N、E265N、T267N、E270N、R277N、L280N、G291N、P303S、P303ST、L305N、Q312N、G318N、G331N、D334N、K337N、G342N、H348N、R353N、Y357N、I361N、V376N、R379N、M391N、K32N/A34S、K32N/A34T、F31N/D33S、F31N/D33T、I30N/K32S、I30N/K32T、A34N/R36S、A34N/R36T、K38N/F40S、K38N/F40T、T37N/L39S、T37N/L39T、R36N/K38S、R36N/K38T、L39N/W41S、L39N/W41T、F40N/I42S、F40N/I42T、I42N/Y44S、I42N/Y44T、Y44N/D46S、Y44N/D46T、D46N/D48S、D46N/D48T、G47N/Q49S、G47N/Q49T、S52N/P54S、Q66N/Y68S、S119N/L121S、A122N/G124S、T128N/P129A、T130N/E132S、K143N/N145S、K143N/N145T、E142N/R144S、E142N/R144T、L141N/K143S、L141N/K143T、I140N/E142S/、I140N/E142T、R144N/A146S、R144N/A146T、A146N/K148S、A146N/K148T、S147N/P149S/、S147N/P149T、R290N/A292S、R290N/A292T、A292N/A294S、D289N/G291S、D289N/G291T、L288N/R290S、L288N/R290T、L287N/D289S、L287N/D289T、A292N/A294S、A292N/A294T、T293N/L295S、T293N/L295T、R315N/V317S、R315N/V317T、S314N/K316S、S314N/K316T、Q313N/R315S、Q313N/R315T、K316N/G318S、K316N/G318T、V317N/D319S、V317N/D319T、K341N/D343S、K341N/D343T、S339N/K341S、S339N/K341T、D343N/G345S、D343N/G345T、R392N/E394S、R392N/E394T、L390N/R392S、L390N/R392T、K389N/M391S、K389N/M391T、S393N/P395S、S393N/P395T、E394N/R396S、E394N/R396T、E394N/P395A/R396S、P395N/P397S、P395N/P397T、R396N/G398S、R396N/G398T、P397N/V399S、P397N/V399T、G398N/L400S、G398N/L400T、V399N/L401S、V399N/L401T、L400N/R402S、L400N/R402T、L401N/A403S、L401N/A403T、R402N/P404S、R402N/P404T、A403N/F405S、A403N/F405T、P404N/P406SおよびP404N/P406Tを含むが、これらに限定されない。

ｆ． 化学基連結を容易にするための改変
本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドのさらなる改変はまた、化学基の続く連結を容易にするためになすこともできる。１つまたは複数のアミノ酸置換またはアミノ酸挿入は、化学基が、置換アミノ酸を介して改変ＦＶＩＩポリペプチドに連結することができるように、なすことができる、たとえば、システインは、改変ＦＶＩＩポリペプチドに対して導入することができ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分は、これに連結して、増加した安定性および血清半減期を付与することができる。他の付加残基は、リシン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸残基を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸残基は、潜在的な連結位置の数を低下させるために交換される。たとえば、リシンの数は、低下させることができる。化学基との続く連結を容易にすることができる、ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸配列に対してなすことができる改変の例は、ＵＳ２００３００９６３３８、ＵＳ２００６００１９３３６、ＵＳ６８０６０６３、ＷＯ２００１５８９３５、およびＷＯ２００２０７７２１８において記載されるものを含むが、これらに限定されない。化学基との続く連結を容易にすることができる、ＦＶＩＩポリペプチドの例示的な改変の非限定的な例は、Q250C、R396C、P406C、I42K、Y44K、L288K、D289K、R290K、G291K、A292K、T293K、Q313K、S314K、R315K、V317K、L390K、M391K、R392K、S393K、E394K、P395K、R396K、P397K、G398K、V399K、L400K、L401K、R402K、A403K、P404K、F405K、I30C、K32C、D33C、A34C、T37C、K38C、W41C、Y44C、S45C、D46C、L141C、E142C、K143C、R144C、L288C、D289C、R290C、G291C、A292C、S314C、R315C、K316C、V317C、L390C、M391C、R392C、S393C、E394C、P395C、R396C、P397C、G398C、V399C、L401C、R402C、A403C、P404C、I30D、K32D、A34D、T37D、K38D、W41D、Y44D、S45D、D46C、L141D、E142D、K143D、R144D、L288D、R290D、G291D、A292D、Q313D、S314D、R315D、K316D、V317D、L390D、M391D、R392D、S393D、P395D、R396D、P397D、G398D、V399D、L401D、R402D、A403D、P404D、130E、K32E、A34E、T37E、K38E、W41E、Y44E、S45E、D46C、L141E、E142E、K143E、R144E、L288E、R290E、G291E、A292E、Q313E、S314E、R315E、K316E、V317E、L390E、M391E、R392E、S393E、P395E、R396E、P397E、G398E、V399E、L401E、R402E、A403E、P404E、K18R、K32R、K38R、K62R、K85R、K109R、K137R、K143R、K148R、K157R、K161R、K197R、K199R、K316R、K337R、K341R、K389R、K18Q、K32Q、K38Q、K62Q、K85Q、K109Q、K137Q、K143Q、K148Q、K157Q、K161Q、K197Q、K199Q、K316Q、K337Q、K341Q、K389Q、K18N、K32N、K38N、K62N、K85N、K109N、K137N、K143N、K148N、K157N、K161N、K197N、K199N、K316N、K337N、K341N、K389N、K18H、K32H、K38H、K62H、K85H、K109H、K137H、K143H、K148H、K157H、K161H、K197H、K199H、K316H、K337H、K341HおよびK389Hを含むが、これらに限定されない。

ｇ． 例示的な組み合わせ突然変異
非改変ＦＶＩＩポリペプチドの１つまたは複数の特性または活性に影響を及ぼすように設計される２つ以上の改変を有する改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供される。いくつかの例において、２つ以上の改変は、ＦＶＩＩポリペプチドの２つ以上の特性または活性を変化させる。改変は、１つまたは複数の触媒活性、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性、ＴＦＰＩに対する抵抗性、Ｚｎ^２＋による阻害に対する抵抗性、内因活性、アミド分解活性、リン脂質結合性および／または親和性、グリコシル化、プロテアーゼに対する抵抗性、半減期、ならびにＦＸ、ＦＩＸ、血清アルブミン、および血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３などのような他の因子または分子との相互作用が変化するように、ＦＶＩＩポリペプチドに対してなすことができる。典型的には、２つ以上の改変は、結果として生じる改変ＦＶＩＩポリペプチドが、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加した血液凝固活性、血液凝固活性の増加した継続期間、および／または増強された治療指数を有するように組み合わせられる。その改変は、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、またはアミノ酸欠失を含むことができる。２つ以上の改変を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドの増加した血液凝固活性、血液凝固活性の増加した継続期間 および／または増強された治療指数は、出発ＦＶＩＩａポリペプチドまたは非改変ＦＶＩＩａポリペプチドの活性と比較して、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上増加させることができる。

２つ以上の活性または特性を変化させるために非改変ＦＶＩＩポリペプチドの中に導入される、２つ以上の改変を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供される。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、２、３、４、５、６、またはそれ以上の改変を含有することができる。さらに、それぞれの改変は、１つまたは複数のアミノ酸残基を含むことができる。たとえば、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、それぞれが単一のアミノ酸置換である２つの改変を含有することができる。他の例において、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、２つの改変を含有することができ、このうちの一方は、単一のアミノ酸置換であり、このうちの他方は、複数のアミノ酸残基の欠失および次いで複数のアミノ酸残基の挿入を含む。たとえば、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、Ｚｎ^２＋結合性を破壊するためのアミノ酸置換Ｓ２２２Ａ（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する残基）ならびにアミノ酸残基Ａ１〜Ｙ４４（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する残基）を欠失させることによる、内因性ＦＶＩＩ Ｇｌａドメインの欠失および配列番号８３において記載されるＦＩＸ Ｇｌａドメインのアミノ酸残基Ｙ１〜Ｙ４５に対応する４５アミノ酸残基の挿入を含むＧｌａ Ｓｗａｐ ＦＩＸ改変を含有することができる。

本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、もっぱら表５〜１３において記載されるものから選択される２つ以上の改変を有することができる。他の例において、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、２つ以上の改変を含有し、１つまたは複数の改変は、表５〜１３において記載されるものから選択され、１つまたは複数の改変は、たとえば当技術分野において記載される改変などのような、表５〜１３において記載されていないさらなる改変である。いくつかの例において、１つまたは複数のさらなる改変は、上記に、部Ｄ．６．ａ〜ｅにおいて記載されるものから選択することができる。たとえば、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＴＦＰＩに対する抵抗性を増加させることができる、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩのナンバリングに基づく、１つまたは複数のアミノ酸残基Ｄ１９６、Ｋ１９７、Ｋ１９９、Ｇ２３７、Ｔ２３９、Ｒ２９０、またはＫ３４１（それぞれ、キモトリプシンナンバリングに基づくＤ６０、Ｋ６０ａ、Ｋ６０ｃ、Ｇ９７、Ｔ９９、Ｒ１４７、およびＫ１９２に対応する）での改変、ならびにたとえばＶ１５８およびＭ２９８（それぞれ、キモトリプシンナンバリングに基づくＶ２１およびＭ１５６）などのような、内因活性に影響を及ぼす、１つまたは複数のアミノ酸残基での改変を含有することができる。たとえば、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、Ｋ１９７ＥおよびＧ２３７Ｖなどのような、ＴＦＰＩに対する抵抗性を増加させる２つのアミノ酸置換、ならびにＭ２９８Ｑなどのような、内因活性を増加させる１つのアミノ酸置換を含有し、増加した血液凝固活性を有するＦＶＩＩポリペプチドをもたらすことができる。

本明細書において提供される例示的な組み合わせの改変は、少なくともＱ２８６Ｒ突然変異（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応するナンバリング；キモトリプシンナンバリングによるＱ１４３Ｒに対応するナンバリング）を含むものである。Ｑ２８６Ｒ改変を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、またはそれ以上の改変を含有することができる。これらのさらなる改変は、たとえば、触媒活性、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性、ＴＦＰＩに対する抵抗性、Ｚｎ^２＋による阻害に対する抵抗性、内因活性、アミド分解活性、リン脂質結合性および／または親和性、グリコシル化、プロテアーゼに対する抵抗性、半減期、ならびにＦＸ、ＦＩＸ、血清アルブミン、および血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３などのような他の因子または分子との相互作用を変化させるために含むことができる。典型的には、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、２つ以上の改変を含有し、１つの改変は、アミノ酸置換Ｑ２８６Ｒであり、野生型ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加した血液凝固活性を示す。

いくつかの例において、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、２つ以上の改変を含有し、１つは、Ｑ２８６Ｒであり、野生型ポリペプチドと比較しておよび突然変異のいずれか１つを単独で含有するＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加した触媒活性および血液凝固活性を示す。たとえば、Ｑ２８６ＲおよびＭ２８９Ｑのアミノ酸置換の両方を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドが、本明細書において提供される（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応するナンバリングを有するＱ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ；キモトリプシンナンバリングによるＱ１４３Ｒ／Ｍ１５６Ｑに対応する）。Ｑ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ組み合わせＦＶＩＩ突然変異体は、野生型ＦＶＩＩ、Ｑ２８６Ｒ単一突然変異体、およびＭ２９８Ｑ単一突然変異体と比較して、その基質、第Ｘ因子に対して増加した触媒活性を示す（たとえば、下記の実施例４を参照されたい）。たとえば、ある研究において、Ｍ２９８Ｑ突然変異体は、野生型ポリペプチドよりも約１．８〜２倍大きな、ＴＦの存在下における、ＦＸに対する触媒活性を示し、Ｑ２８６Ｒ突然変異体の触媒活性は、野生型ＦＶＩＩポリペプチドよりも約２．１倍大きく、Ｑ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ突然変異体は、ＦＸに対する野生型ポリペプチドの触媒活性よりも約３．６〜４．４倍の、ＦＸに対する触媒活性を示した（下記の表１５を参照されたい）。

非限定的な例示的な組み合わせの改変は、表１２において提供される。これらの例示的な組み合わせの改変は、ＴＦＰＩに対する抵抗性、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性、内因活性、アミド分解活性、触媒活性、Ｚｎ^２＋結合性、リン脂質結合性および／または親和性、グリコシル化、プロテアーゼに対する抵抗性、半減期、ならびにＦＸおよびＦＩＸなどのような他の因子または分子との相互作用を含むが、これらに限定されない、ＦＶＩＩポリペプチドの２つ以上の活性または特性を変化させるために設計される、２つ以上の改変を含む。そのような組み合わせの改変を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、増加した血液凝固活性、血液凝固活性の増加した継続期間、および／または増強された治療指数を有することができる。下記の表１２において記載される改変は、上記、表５〜１１において記載されるのと同じ命名法およびナンバリング方式を使用する。たとえば、「Ｇｌａ Ｓｗａｐ ＦＩＸ」改変は、上記に記載されるように、アミノ酸残基Ａ１〜Ｙ４４（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する残基）を欠失させることによる、内因性ＦＶＩＩ Ｇｌａドメインの欠失および配列番号８３において記載されるＦＩＸ Ｇｌａドメインのアミノ酸残基Ｙ１〜Ｙ４５に対応する４５アミノ酸残基の挿入を含む。いくつかの例において、「Ｇｌａ Ｓｗａｐ ＦＩＸ」改変はまた、上記に議論されるように、野生型ＦＩＸ Ｇｌａドメインと比較して、ＦＩＸ Ｇｌａドメイン部分における１つまたは複数のアミノ酸置換をも含有する。たとえば、Ｇｌａ Ｓｗａｐ ＦＩＸ改変はまた、Ｍ１９Ｋアミノ酸置換（配列番号８３において記載されるＦＩＸ Ｇｌａドメインのアミノ酸位置に対応するナンバリング）を含むことができる。そのような改変は、｛Ｇｌａ Ｓｗａｐ ＦＩＸ／Ｍ１９Ｋ｝によって表され、つまり、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、配列番号８３において記載されるＦＩＸ Ｇｌａドメインの位置１９に対応する位置のメチオニンが、リシンと交換される異種ＦＩＸ Ｇｌａドメインを含有する。したがって、異種ＦＩＸ Ｇｌａドメイン部分に対してなされる改変は、成熟野生型ＦＩＸポリペプチドまたは配列番号８３において記載される野生型ＦＩＸ Ｇｌａドメインのアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置を使用して、参照される。ＦＶＩＩポリペプチドにおけるアミノ酸位置に対してなされる改変は、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置を使用して参照され、また、キモトリプシンナンバリング体系によっても表される。たとえば、Ｑ２８６Ｒ改変（配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応するナンバリング）およびＦＩＸ Ｇｌａドメインが、Ｍ１９Ｋアミノ酸置換（配列番号８３において記載されるＦＩＸ Ｇｌａドメインのアミノ酸位置に対応するナンバリング）を含有するＧｌａ ｓｗａｐ ＦＩＸ改変を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、｛Ｇｌａ Ｓｗａｐ ＦＩＸ／Ｍ１９Ｋ｝／Ｑ２８６Ｒによって表される。同様に、改変｛Ｇｌａ Ｓｗａｐ ＦＩＸ／Ｑ４４Ｓ｝／Ｑ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑは、ＦＶＩＩポリペプチドが、配列番号８３において記載されるＦＩＸ Ｇｌａドメインのアミノ酸位置４４に対応するアミノ酸位置のグルタミンが、セリンと交換されたＧｌａ Ｓｗａｐ ＦＩＸ改変を含有し、また、配列番号３において記載される成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応するナンバリングで、Ｑ２８６ＲおよびＭ２９８Ｑのアミノ酸置換をも含有することを表す。下記の表１２において、改変ＦＶＩＩポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が記載される配列識別子（配列番号）が同定される。

Ｅ． ＦＶＩＩポリペプチドの産生
改変ＦＶＩＩポリペプチドもしくはそのＦＶＩＩのドメインを含むＦＶＩＩポリペプチドまたは他のビタミンＫポリペプチドは、タンパク質精製および組換えタンパク質発現について当技術分野においてよく知られている方法によって得ることができる。所望の遺伝子をコードする核酸の同定のための、当業者に知られている任意の方法を使用することができる。当技術分野において入手可能な任意の方法は、細胞源または組織源からなどのように、たとえば肝臓からなどのように、ＦＶＩＩポリペプチドまたは他のビタミンＫポリペプチドをコードする完全長（つまり全コード領域を包含する）ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡクローンを得るために使用することができる。本明細書において記載される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、部位特異的突然変異誘発などによって、操作することができる。

ＦＶＩＩは、核酸分子のクローニングおよび単離について、当技術分野において知られている任意の入手可能な方法を使用してクローニングする、または単離することができる。そのような方法は、核酸のＰＣＲ増幅ならびに核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体ベースのスクリーニング、および活性ベースのスクリーニングを含む、ライブラリーのスクリーニングを含む。

たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を含む、核酸の増幅のための方法は、ＦＶＩＩポリペプチドをコードする核酸分子を単離するために使用することができる。核酸含有物質は、ＦＶＩＩコード核酸分子を単離することができる出発物質として使用することができる。たとえば、ＤＮＡ調製物およびｍＲＮＡ調製物、細胞抽出物、組織抽出物（たとえば、肝臓から）、体液サンプル（たとえば血液、血清、唾液）、健常および／または病気の対象に由来するサンプルは、増幅法において使用することができる。核酸ライブラリーもまた、出発物質の源として使用することができる。プライマーは、ＦＶＩＩコード分子を増幅するために設計することができる。たとえば、プライマーは、ＦＶＩＩが生成される発現配列に基づいて設計することができる。プライマーは、ＦＶＩＩアミノ酸配列の逆翻訳に基づいて設計することができる。増幅により生成される核酸分子は、配列を決定し、ＦＶＩＩポリペプチドをコードすることを確認することができる。

ベクター、たとえばタンパク質発現ベクターまたはコアタンパク質コードＤＮＡ配列の増幅のために設計されたベクターの中に合成遺伝子をクローニングする目的で制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するリンカー配列を含む、さらなるヌクレオチド配列を、ＦＶＩＩコード核酸分子に結合することができる。さらに、機能的ＤＮＡ要素を特定するさらなるヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩコード核酸分子に作動可能に連結することができる。そのような配列の例は、細胞内タンパク質発現を容易にするよう設計されたプロモーター配列およびタンパク質分泌を容易にするよう設計された分泌配列を含むが、これらに限定されない。タンパク質結合領域を特定する配列などのようなさらなるヌクレオチド配列もまた、ＦＶＩＩコード核酸分子に連結することができる。そのような領域は、特異的標的細胞の中へのＦＶＩＩの取り込みを容易にするまたは他の形で合成遺伝子の薬物動態を増強させる配列を含むが、これらに限定されない。

次いで、同定され、単離された核酸は、適切なクローニングベクターの中に挿入することができる。当技術分野において知られている多くのベクター宿主系を使用することができる。可能性として考えられるベクターは、プラスミドまたは改変ウイルスを含むが、これらに限定されず、しかしベクター系は、使用される宿主細胞と適合性でなければならない。そのようなベクターは、ラムダ誘導体などのようなバクテリオファージまたはｐＢＲ３２２プラスミド誘導体もしくはｐＵＣプラスミド誘導体などのようなプラスミドまたはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を含むが、これらに限定されない。クローニングベクターの中への挿入は、たとえば、相補的付着末端を有するクローニングベクターの中にＤＮＡ断片をライゲーションすることによって達成することができる。挿入は、ＴＯＰＯクローニングベクターを使用して達成することができる（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。ＤＮＡを断片化するために使用される相補的制限部位が、クローニングベクター中に存在しない場合、ＤＮＡ分子の端は、酵素的に改変することができる。代わりに、所望される任意の部位は、ＤＮＡ末端上にヌクレオチド配列（リンカー）をライゲーションすることによって産生することができる；これらのライゲーションされたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的化学合成オリゴヌクレオチドを含有することができる。代替方法では、切断されたベクターおよびＦＶＩＩタンパク質遺伝子は、ホモポリマーテーリングによって改変することができる。組換え分子は、たとえば形質転換、トランスフェクション、感染、電気穿孔、および超音波穿孔（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を介して宿主細胞の中に導入することができ、遺伝子配列の多くのコピーが、生成される。

特定の実施形態において、単離ＦＶＩＩタンパク質遺伝子、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ配列を組み込む組換えＤＮＡ分子を用いる宿主細胞の形質転換は、遺伝子の複数のコピーの生成を可能にする。したがって、遺伝子は、形質転換体を成長させ、形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離し、必要な場合には単離組換えＤＮＡから、挿入された遺伝子を回収することによって、多量に得ることができる。

１． ベクターおよび細胞
１つまたは複数のＦＶＩＩタンパク質の組換え発現のために、ＦＶＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列のすべてまたは一部分を含有する核酸は、適切な発現ベクター、つまり、挿入タンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクターに挿入することができる。例示的なそのようなベクターは、たとえばｐＣＭＶなどのような任意の哺乳動物発現ベクターである。必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルはまた、ＦＶＩＩ遺伝子についての天然プロモーターおよび／またはそれらのフランキング(flanking)領域によって供給することもできる。

ＦＶＩＩまたは改変ＦＶＩＩをコードする核酸を含有するベクターもまた、提供される。ベクターを含有する細胞もまた、提供される。細胞は、真核細胞および原核細胞を含み、ベクターは、その中での使用に適した任意のベクターである。

ベクターを含有する、内皮細胞を含む原核細胞および真核細胞が提供される。そのような細胞は、細菌細胞、酵母細胞、菌類細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞を含む。細胞は、コードＦＶＩＩタンパク質が細胞によって発現される条件下で上記細胞を成長させ、かつ発現ＦＶＩＩタンパク質を回収することによって、ＦＶＩＩポリペプチドまたはその改変ＦＶＩＩポリペプチドを産生するために使用される。本明細書における目的上、ＦＶＩＩは、培地の中に分泌させることができる。

一実施形態において、ＦＶＩＩ活性を有し、ＦＶＩＩポリペプチドのすべてもしくは一部分を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列またはその複数のコピーを含有するベクターが提供される。ベクターは、細胞におけるＦＶＩＩポリペプチドもしくは改変ＦＶＩＩポリペプチドの発現について選択することができる、またはＦＶＩＩタンパク質が、分泌タンパク質として発現されるように選択することができる。ＦＶＩＩが発現される場合、核酸は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−接合因子シグナル配列もしくはその部分などのような分泌シグナルまたは天然シグナル配列をコードする核酸に連結される。

様々な宿主−ベクター系は、タンパク質コード配列を発現するために使用することができる。これらは、ウイルス（たとえばワクシニアウイルス、アデノウイルス、および他のウイルス）を用いて感染させた哺乳動物細胞系；ウイルス（たとえばバキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母などのような微生物；またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡを用いて形質転換された細菌を含むが、これらに限定されない。ベクターの発現要素は、それらの強度および特異性において変わる。使用される宿主−ベクター系に依存して、多くの適した転写要素および翻訳要素のいずれか１つを使用することができる。

ベクターの中へのＤＮＡ断片の挿入について当業者らに知られている任意の方法が、適切な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列を含有するキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡ合成技術およびインビボ組換え体（遺伝的組換え）を含むことができる。ＦＶＩＩポリペプチドもしくは改変ＦＶＩＩポリペプチドまたはそのドメイン、誘導体、断片、もしくは相同体をコードする核酸配列の発現は、遺伝子またはその断片が、換えＤＮＡ分子（１つまたは複数）を用いて形質転換された宿主において発現するように、第２の核酸配列によって調節することができる。たとえば、タンパク質の発現は、当技術分野において知られている任意のプロモーター／エンハンサーによって制御することができる。特定の実施形態において、プロモーターは、ＦＶＩＩタンパク質についての遺伝子に対して天然のものではない。使用することができるプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター（Bernoist and Chambon, Nature 290:304-310 (1981)）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復配列において含有されるプロモーター（Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980)）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981)）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)）；β−ラクタマーゼプロモーター（Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543）またはｔａｃプロモーター（DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)）などのような原核生物発現ベクター；「Useful Proteins from Recombinant Bacteria」:Scientific American 242:79-94 (1980)）中もまた参照されたい；ノパリン合成酵素プロモーター（Herrar-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984)）またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター（Garder et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)）を含有する植物発現ベクターならびに光合成酵素リブロースビスリン酸カルボキシラーゼのプロモーター（Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984)）；Ｇａｌ４プロモーターなどのような酵母および他の菌類に由来するプロモーター要素、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、ならびに組織特異性を示し、形質転換動物において使用されてきた以下の動物転写制御領域：膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swift et al., Cell 38:639-646 (1984)；Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986)；MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)）；膵臓ベータ細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985)）、リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984)；Adams et al., Nature 318:533-538 (1985)；Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)）、精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞、および肥満細胞において活性なマウス乳癌ウイルス制御領域（Leder et al., Cell 45:485-495 (1986)）、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Pinckert et al., Genes and Devel. 1:268-276 (1987)）、肝臓において活性なアルファ−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985)；Hammer et al., Science 235:53-58 1987)）、肝臓中で活性なアルファ−１抗トリプシン遺伝子制御領域（Kelsey et al., Genes and Devel. 1:161-171 (1987)）、骨髄性細胞において活性なベータグロビン遺伝子制御領域（Mogram et al., Nature 315:338-340 (1985)；Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986)）、脳のオリゴデンドロサイト細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987)）、骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Shani, Nature 314:283-286 (1985)）および視床下部の性腺刺激細胞において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986)）を含むが、これらに限定されない。

特定の実施形態において、ＦＶＩＩポリペプチドもしくは改変ＦＶＩＩポリペプチドまたはそのドメイン、断片、誘導体、もしくは相同体をコードする核酸に作用可能に連結されるプロモーター、１つまたは複数の複製開始点、および所望により、１つまたは複数の選択マーカー（たとえば抗生物質抵抗性遺伝子）を含有するベクターが、使用される。ＦＶＩＩポリペプチドの発現のためのベクターおよび系は、よく知られているピキアベクター（たとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能）、特にコードタンパク質の分泌のために設計されるベクターを含む。哺乳動物細胞における発現のための例示的なプラスミドベクターは、たとえば、ｐＣＭＶを含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の形質転換のための例示的なプラスミドベクターは、たとえば、ｐＱＥ発現ベクターを含む（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡから入手可能；系について記載する、Ｑｉａｇｅｎによって出版される文献もまた参照されたい）。ｐＱＥベクターは、大腸菌における組換えタンパク質の、厳重に調節された、高度なレベルの発現を提供するためのファージＴ５プロモーター（大腸菌ＲＮＡポリメラーゼにより認識される）および二重のｌａｃオペレーター抑圧モジュール、効率的な翻訳のための合成リボソーム結合部位（ＲＢＳＩＩ）、６ｘＨｉｓタグコード配列、ｔ_０およびＴ１転写ターミネーター、ＣｏｌＥ１複製開始点、ならびにアンピシリン抵抗性を付与するためのベータ−ラクタマーゼ遺伝子を有する。ｐＱＥベクターは、組換えタンパク質のＮ−またはＣ−末端のいずれかに６ｘＨｉｓタグを置くことを可能にする。そのようなプラスミドは、３つのすべてのリーディングフレームのためのマルチクローニングサイトを提供し、Ｎ−末端６ｘＨｉｓタグ付きタンパク質の発現を提供するｐＱＥ３２、ｐＱＥ３０、およびｐＱＥ３１を含む。大腸菌細胞の形質転換のための他の例示的なプラスミドベクターは、たとえば、ｐＥＴ発現ベクターを含む（米国特許第４，９５２，４９６号を参照されたい；ＮＯＶＡＧＥＮ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能；系を記載する、Ｎｏｖａｇｅｎによって出版される、文献もまた参照されたい）。そのようなプラスミドは、Ｔ７ｌａｃプロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘発性大腸菌ｌａｃオペレーター、およびｌａｃリプレッサー遺伝子を含有するｐＥＴ１１ａ；Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター、および大腸菌ｏｍｐＴ分泌シグナルを含有するｐＥＴ１２ａ−ｃ；ならびにＨｉｓカラムを用いる精製において使用されるＨｉｓ−Ｔａｇ（商標）リーダー配列およびカラムでの精製の後での切断を可能にするトロンビン切断部位、Ｔ７−ｌａｃプロモーター領域、およびＴ７ターミネーターを含有するｐＥＴ１５ｂおよびｐＥＴ１９ｂ（ＮＯＶＡＧＥＮ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含む。

２． 発現系
ＦＶＩＩポリペプチド（改変および非改変）は、たとえば、宿主細胞、宿主動物の中への、ＦＶＩＩをコードする核酸分子の導入およびインビトロにおける、ＦＶＩＩをコードする核酸分子からの発現などのような、インビトロおよびインビボにおける方法を含む、タンパク質産生のための、当技術分野において知られている任意の方法によって産生することができる。ＦＶＩＩおよび改変ＦＶＩＩポリペプチドは、投与および処置に必要な、必要とされる量および形態のＦＶＩＩポリペプチドを産生するのに適した任意の生物において発現することができる。発現宿主は、大腸菌、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞株および形質転換動物を含む哺乳動物細胞などのような原核生物および真核生物を含む。発現宿主は、タンパク質産生レベルおよび発現したタンパク質上に存在する翻訳後修飾の種類において異なり得る。発現宿主の選定は、これらの因子ならびに調節および安全性の考慮、産生コスト、ならびに精製の必要性および方法などのような他の因子に基づいてなすことができる。

真核生物宿主における発現は、サッカロマイセス・セレビシエおよびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのような酵母、ショウジョウバエの細胞および鱗翅目の昆虫の細胞などのような昆虫細胞、タバコ、トウモロコシ、イネ、藻類、およびアオウキクサ属などのような植物および植物細胞における発現を含むことができる。発現のための真核細胞はまた、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞などのような哺乳動物細胞株をも含む。真核生物の発現宿主はまた、たとえば、血清、乳、および卵における産生を含む、トランスジェニック動物における産生を含む。野生型ＦＶＩＩポリペプチドの産生のためのトランスジェニック動物は、当技術分野において知られており（米国特許出願公開第２００２０１６６１３０号および第２００４０１３３９３０号）、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドの産生に適合し得る。

ＦＶＩＩの発現のための、多くの発現ベクターが、入手可能であり、当業者に知られている。発現ベクターの選定は、宿主発現系の選定により影響を及ぼされる。そのような選択は、十分に、当業者の技術のレベルの範囲内にある。一般に、発現ベクターは、転写プロモーターならびに所望によりエンハンサー、翻訳シグナル、ならびに転写終結シグナルおよび翻訳終結シグナルを含むことができる。安定した形質転換に使用される発現ベクターは、形質転換細胞の選択および維持を可能にする選択マーカーを典型的に有する。いくつかの場合において、複製開始点は、細胞におけるベクターのコピー数を増幅させるために使用することができる。

ＦＶＩＩまたは改変ＦＶＩＩポリペプチはまた、タンパク質融合物として利用するまたは発現することができる。たとえば、融合物は、ポリペプチに対してさらなる機能性を追加するために生成することができる。融合タンパク質の例は、シグナル配列、局在化のためなどのようなタグ、たとえばｈｉｓ_６タグもしくはｍｙｃタグまたは精製のためのタグ、たとえばＧＳＴ融合物、ならびにタンパク質分泌および／または膜結合を指示するための配列の融合物を含むが、これらに限定されない。

一実施形態において、ＦＶＩＩポリペプチドまたは改変ＦＶＩＩポリペプチドは、活性形態で発現することができ、それによって、活性化は、分泌の後に、ポリペプチドの自己活性化によって達成される。他の実施形態において、プロテアーゼは、不活性なチモーゲン形態で発現させることができる。

ＦＶＩＩポリペプチドの産生の方法は、ＦＶＩＩポリペプチドの生成を助けることができる１つまたは複数のさらなる異種ポリペプチドの同時発現を含むことができる。たとえば、そのようなポリペプチドは、ＦＶＩＩポリペプチドの翻訳後プロセシングに寄与することができる。例示的なポリペプチドは、プロペプチド配列などのようなＦＶＩＩ前駆体配列の切断を助けるペプチダーゼ、たとえばグリコシル化、ヒドロキシル化、カルボキシル化、またはリン酸化などによる、ＦＶＩＩポリペプチドの改変に関与する酵素を含むが、これらに限定されない。ＦＶＩＩと同時発現することができる例示的なペプチダーゼは、ＰＡＣＥ／フューリン（またはＰＡＣＥ−ＳＯＬ）であり、これは、ＦＶＩＩプロペプチド配列の切断を助ける。ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシル化を助ける例示的なタンパク質は、ワルファリン感受性酵素ビタミンＫ ２，３−エポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）であり、これは、ビタミンＫ依存性γ−カルボキシラーゼによる補因子としての利用のための還元ビタミンＫを産生する（Wajih et al., J. Biol. Chem. 280(36)31603-31607）。この酵素のサブユニット、ＶＫＯＲＣ１は、γカルボキシル化を増加させるために、改変ＦＶＩＩポリペプチドと同時発現させることができる。１つまたは複数のさらなるポリペプチドは、ＦＶＩＩポリペプチドと同じ発現ベクターまたは異なるベクターから発現させることができる。

ａ． 原核生物発現
原核生物、とりわけ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、大量のＦＶＩＩを産生するための系を提供する（たとえばPlatis et al. (2003) Protein Exp. Purif. 31(2): 222-30およびKhalilzadeh et al. (2004) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31(2): 63-69を参照されたい）。大腸菌の形質転換は、当業者らによく知られている単純で速い技術である。大腸菌についての発現ベクターは、高度なレベルのタンパク質発現を誘発するのにおよび宿主細胞に対していくらかの毒性を示すタンパク質を発現するのに有用である誘発性プロモーターを含有することができる。誘発性プロモーターの例は、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７ＲＮＡプロモーターおよびＳＰ６ＲＮＡプロモーター、ならびに温度調節性λＰ_Ｌプロモーターを含む。

ＦＶＩＩは、大腸菌の細胞質内環境において発現させることができる。細胞質は、還元環境であり、いくつかの分子については、これは、不溶性封入体の形成をもたらし得る。ジチオトレイトールおよびβ−メルカプトエタノールなどのような還元剤ならびに変性剤（たとえばグアニジン−ＨＣｌおよび尿素など）は、タンパク質を再可溶化するために使用することができる。代替アプローチは、酸化環境ならびにシャペロニン様イソメラーゼおよびジスルフィドイソメラーゼを提供し、可溶性タンパク質の産生に至る、細菌の細胞膜周辺腔におけるＦＶＩＩの発現である。典型的には、タンパク質を周辺質に向けるリーダー配列は、発現されることとなるタンパク質に融合される。次いで、リーダーは、周辺質の内部で、シグナルペプチターゼによって除去される。周辺質標的リーダー配列の例は、ペクチン酸リアーゼ遺伝子に由来するｐｅｌＢリーダーおよびアルカリホスファターゼ遺伝子に由来するリーダーを含む。いくつかの場合において、周辺質の発現は、培地の中への発現タンパク質の漏出を可能にする。タンパク質の分泌は、培養上清からの速やかで単純な精製を可能にする。分泌されないタンパク質は、周辺質から浸透圧溶解により得ることができる。細胞質内発現に類似して、いくつかの場合において、タンパク質は、不溶性になり得、変性剤および還元剤は、可溶化および再折り畳みを容易にするために使用することができる。誘発および成長の温度もまた、発現レベルおよび溶解性に影響を及ぼし得る。典型的には、２５℃および３７℃の間の温度が、使用される。突然変異もまた、発現タンパク質の溶解性を増加させるために使用することができる。典型的には、細菌は、アグリコシル化タンパク質を産生する。したがって、タンパク質が、機能するためにグリコシル化を必要とする場合、グリコシル化は、宿主細胞からの精製の後にインビトロにおいて追加することができる。

ｂ． 酵母
サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、およびピキア・パストリスなどのような酵母は、ＦＶＩＩのための有用な発現宿主である（たとえばSkoko et al. (2003) Biotechnol. Appl. Biochem. 38(Pt3):257-65を参照されたい）。酵母は、エピソーム複製ベクターを用いて、または相同組換えによる安定した染色体の組み込みによって形質転換することができる。典型的には、誘発性プロモーターは、遺伝子発現を調節するために使用される。そのようなプロモーターの例は、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７、およびＧＡＬ５ならびにＣＵＰ１などのようなメタロチオネインプロモーターを含む。発現ベクターは、形質転換ＤＮＡの選択および維持のために、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３、およびＵＲＡ３などのような選択マーカーを含むことが多い。酵母において発現されるタンパク質は、可溶性であることが多く、Ｂｉｐなどのようなシャペロニンおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの同時発現は、発現レベルおよび溶解性を改善することができる。さらに、酵母において発現されるタンパク質は、サッカロマイセス・セレビシエに由来する酵母接合型アルファ−因子分泌シグナルなどのような分泌シグナルペプチド融合物およびＡｇａ２ｐ接合接着受容体またはアークスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）グルコアミラーゼなどのような酵母細胞表面タンパク質との融合物を使用して、分泌のために指示され得る。プロテアーゼ切断部位（たとえばＫｅｘ−２プロテアーゼ）は、ポリペプチドが分泌経路を出る場合に、融合配列をポリペプチドから除去するよう操作することができる。酵母はまた、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフでのグリコシル化も可能である。

ｃ． 昆虫および昆虫細胞
特にバキュロウイルス発現系を使用する昆虫および昆虫細胞は、ＦＶＩＩまたはその改変形態などのようなポリペプチドを発現するのに有用である（たとえばMuneta et al. (2003) J. Vet. Med. Sci. 65(2):219-23を参照されたい）。血リンパにおける発現を含む昆虫細胞および昆虫幼虫は、高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物によって使用されるほとんどの翻訳後修飾が可能である。バキュロウイルスは、安全性を改善し、真核生物の発現の調節性の問題を低下させる制限的な宿主範囲を有する。典型的には、発現ベクターは、高レベルの発現のために、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターなどのようなプロモーターを使用する。一般的に使用されるバキュロウイルス系は、オートグラファカリフォルニア核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）およびカイコ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）などのようなバキュロウイルスならびにヨトウガに由来するＳｆ９、シューダレティア・ユニプンクタ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）（Ａ７Ｓ）、およびオオカバマダラ（ＤｐＮ１）などのような昆虫細胞系を含む。高度な発現のために、発現されることとなる分子のヌクレオチド配列は、ウイルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合される。哺乳動物分泌シグナルは、昆虫細胞において厳密に処理され、発現タンパク質を培地の中に分泌するために使用することができる。さらに、細胞株シューダレティア・ユニプンクタ（Ａ７Ｓ）およびオオカバマダラ（ＤｐＮ１）は、哺乳動物細胞系に類似するグリコシル化パターンを有するタンパク質を産生する。

昆虫細胞における代替発現系は、安定して形質転換された細胞の使用である。シュナイダー２（Ｓ２）およびＫｃ細胞（キイロショウジョウバエ）およびＣ７細胞（ヒトスジシマカ）などのような細胞株は、発現に使用することができる。ショウジョウバエメタロチオネインプロモーターは、カドミウムまたは銅を用いる重金属誘発の存在下で高度なレベルの発現を誘発するために使用することができる。発現ベクターは、ネオマイシンおよびハイグロマイシンなどのような選択マーカーの使用によって典型的に維持される。

ｄ． 哺乳動物細胞
哺乳動物発現系は、ＦＶＩＩポリペプチドを発現するために使用することができる。発現構築物は、アデノウイルスなどのようなウイルス感染によってまたはリポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランなどのような直接的ＤＮＡ移入によってならびに電気穿孔および微量注射などのような物理的手段によって、哺乳動物細胞に移入することができる。哺乳動物細胞のための発現ベクターは、ｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）、およびポリアデニル化要素を典型的に含む。そのようなベクターは、高度なレベルの発現のための転写プロモーター−エンハンサー、たとえばＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長末端反復配列を含むことが多い。これらのプロモーター−エンハンサーは、多くの細胞型において活性である。組織プロモーターおよび細胞型プロモーターならびにエンハンサー領域もまた、発現に使用することができる。例示的なプロモーター／エンハンサー領域は、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳癌ウイルス、アルブミン、アルファフェトプロテイン、アルファ１抗トリプシン、ベータグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２、および生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御などのような遺伝子に由来するものを含むが、これらに限定されない。選択マーカーは、発現構築物を有する細胞を選択し、維持するために使用することができる。選択マーカー遺伝子の例は、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、およびチミジンキナーゼを含むが、これらに限定されない。ＴＣＲ−ζおよびＦｃεＲＩ−γなどのような細胞表面シグナリング分子を有する融合物は、活性状態にあるタンパク質の、細胞表面上での発現を指示することができる。

多くの細胞株は、哺乳動物発現に利用可能であり、マウス、ラット、ヒト、サル、およびニワトリならびにハムスターの細胞を含む。例示的な細胞株は、ＢＨＫ（つまりＢＨＫ−２１細胞）、２９３−Ｆ、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０（非分泌）および他の骨髄腫細胞系、ハイブリドーマ細胞株およびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｓ、２９３Ｔ、２Ｂ８、およびＨＫＢの細胞を含むが、これらに限定されない。細胞株はまた、分泌タンパク質の細胞培養液からの精製を容易にする無血清培地に適合させて利用可能である。１つのそのような例は、無血清ＥＢＮＡ−１細胞株である（Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42）。血漿由来ＦＶＩＩと類似する構造および翻訳後修飾を示す組換えＦＶＩＩポリペプチドの発現は、当技術分野において知られている（たとえばJurlander et al. (2003) Semin Throm Hemostを参照されたい）。ビタミンＫ依存性タンパク質発現を最適化するための方法は、知られている。たとえば、培養液におけるビタミンＫの補足またはビタミンＫ依存性γ−カルボキシラーゼの同時発現（Wajih et al., J. Biol. Chem. 280(36)31603-31607）は、ＦＶＩＩポリペプチドなどのようなビタミンＫ依存性タンパク質の翻訳後修飾を助けることができる。

ｅ． 植物
形質転換植物細胞および形質転換植物は、ＦＶＩＩの発現に使用することができる。発現構築物は、微粒子銃などのような直接的ＤＮＡ移入およびプロトプラストの中へのＰＥＧ媒介性移入を使用してならびにアグロバクテリウム媒介性形質転換を用いて、植物に典型的に移入される。発現ベクターは、プロモーター配列およびエンハンサー配列、転写終結要素、ならびに翻訳制御要素を含むことができる。発現ベクターおよび形質転換技術は、シロイヌナズナおよびタバコなどのような双子葉植物宿主ならびにトウモロコシおよびイネなどのような単子葉植物宿主の間で通常分けられる。発現に使用される植物プロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボースビスリン酸カルボキシラーゼプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターおよびＵＢＱ３プロモーターを含む。ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼ、およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどのような選択マーカーは、形質転換細胞の選択および維持を容易にするために使用されることが多い。形質転換植物細胞は、細胞、凝集体（カルス組織）として培養において維持することができる、または完全な植物に再生成させることができる。植物は、哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するので、これは、これらの宿主においてＦＶＩＩを産生するための選定に影響を及ぼし得る。形質転換植物細胞はまた、タンパク質を産生するよう操作された藻類を含むこともできる（たとえばMayfield et al. (2003) PNAS 100:438-442を参照されたい）。植物は、哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するので、これは、これらの宿主においてＦＶＩＩを産生するための選定に影響を及ぼし得る。

２． 精製
宿主細胞に由来するＦＶＩＩポリペプチドの精製のための方法は、選定される宿主細胞および発現系に依存する。分泌分子については、タンパク質は、細胞を除去した後に培養液から一般に精製される。細胞内発現については、細胞を溶解させ、タンパク質を抽出物から精製することができる。形質転換植物および形質転換動物などのような形質転換生物が、発現に使用される場合、組織または器官は、溶解した細胞抽出物を作製するために出発物質として使用することができる。さらに、形質転換動物産生は、乳または卵におけるポリペプチドの産生を含むことができ、これは、収集することができ、必要であれば、さらに、タンパク質を抽出し、さらに、当技術分野における標準的な方法を使用して精製することができる。

ＦＶＩＩは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ分画クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析、キレートクロマトグラフィー、ならびにイオン交換クロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない、当技術分野において知られている標準的なタンパク質精製技術を使用して精製することができる。たとえば、ＦＶＩＩポリペプチドは、アニオン交換クロマトグラフィーによって精製することができる。ＦＶＩＩポリペプチドを精製するための例示的な方法は、機能的Ｇｌａドメインを有する任意のポリペプチドの結合を可能にするイオン交換カラムの使用、その後に続く、カルシウムの存在下における溶出によるものである（たとえば実施例２を参照されたい）。アフィニティー精製技術もまた、調製の効率および純度を改善するために使用することができる。たとえば、ＦＶＩＩに結合する抗体、受容体、および他の分子を、アフィニティー精製において使用することができる。他の例において、精製はまた、可溶性ＴＦ（ｓＴＦ）アフィニティーカラムを使用して増強することもできる（Maun et al. (2005) Prot Sci 14:1171-1180）。発現構築物はまた、ｍｙｃエピトープ、ＧＳＴ融合物、またはＨｉｓ_６などのようなアフィニティータグを追加するように操作し、タンパク質に対して、それぞれ、ｍｙｃ抗体、グルタチオン樹脂、およびＮｉ−樹脂を用いてアフィニティー精製することができる。純度は、ゲル電気泳動技術および染色技術ならびに分光光度計技術を含む、当技術分野において知られている任意の方法によって評価することができる。

ＦＶＩＩプロテアーゼは、発現させ、精製して、不活性形態（チモーゲン形態）とすることができる、または、代わりに、発現プロテアーゼは、自己触媒などによって、活性形態に精製することができる。たとえば、Ａｒｇ^１５２−Ｉｌｅ^１５３のタンパク質分解による切断を介して活性化されたＦＶＩＩポリペプチドは、インビトロにおいて調製することができる（つまりＦＶＩＩａ；二本鎖形態）。ＦＶＩＩポリペプチドは、最初に、哺乳動物細胞における産生、その後に続く精製を含むが、これらに限定されない、本明細書において記載される産生の方法のいずれかによって調製することができる。ＦＶＩＩポリペプチドの、活性プロテアーゼ形態、ＦＶＩＩａへの切断は、いくつかの手段によって達成することができる。たとえば、カルシウムの存在下における、リン脂質小胞とのインキュベーションの間の自己活性化は、４５分間で達成することができる（Nelsestuen et al. (2001) J Biol Chem 276:39825-31）。ＦＶＩＩポリペプチドはまた、リン脂質ありでまたはリン脂質なしで、カルシウムの存在下において、第Ｘａ因子、第ＸＩＩａ因子、またはＴＦとのインキュベーションによって完全な状態まで活性化することができる（たとえば実施例２およびBroze et al. (1980) J Biol Chem 255:1242-1247、Higashi et al. (1996) J Biol Chem 271:26569-26574、Harvey et al. J Biol Chem 278:8363-8369を参照されたい）。

３． 融合タンパク質
改変ＦＶＩＩポリペプチドおよび１つまたは複数の他のポリペプチドを含有する融合タンパク質もまた、提供される。適した経路による投与のために製剤されるそのような融合タンパク質を含有する医薬組成物が提供される。融合タンパク質は、任意の順番で、改変ＦＶＩＩポリペプチドならびに抗体またはその断片、成長因子、受容体、リガンド、および他のそのような作用物質などのような作用物質を連結することによって、ＦＶＩＩポリペプチドの精製を容易にする、ＦＶＩＩポリペプチドの薬力学的特性を、たとえば、標的細胞もしくは標的組織にポリペプチドを向けることによって変化させる、および／またはＦＶＩＩポリペプチドの発現もしくは分泌を増加させる目的で形成される。典型的には、任意のＦＶＩＩ融合タンパク質は、非融合ポリペプチドと比較した、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の血液凝固活性を含む、非融合ＦＶＩＩポリペプチドと比較した、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の血液凝固活性を保持する。

ＦＶＩＩポリペプチドの、他のポリペプチドとの連結は、直接的にまたはリンカーを介して間接的に達成することができる。一例において、連結は、ヘテロ二官能性剤を介するなどのように、化学的連結またはチオール連結または他のそのような連結によるものとすることができる。融合はまた、組換え手段によって達成することもできる。他のポリペプチドに対するＦＶＩＩポリペプチドの融合は、ＦＶＩＩポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に対するものとすることができる。本明細書中で提供されるＦＶＩＩポリペプチドを有する融合タンパク質において使用することができるポリペプチドの非限定的な例は、たとえば、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）ポリペプチド、免疫グロブリンＧに由来するＦｃドメイン、または異種シグナル配列を含む。融合タンパク質は、大腸菌マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）などのような、細胞によるタンパク質の取り込みを助ける、さらなる成分を含有することができる（国際ＰＣＴ出願ＷＯ０１／３２７１１を参照されたい）。

融合タンパク質は、標準的な組換え技術によって産生することができる。たとえば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片は、従来の技術に従って、インフレームで、たとえば、ライゲーションのための平滑端または付着端の末端、適切な末端を提供するための制限酵素による消化、適宜、粘着端の補充、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処置、および酵素によるライゲーションを利用することによって、共にライゲーションすることができる。他の実施形態において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって合成することができる。代わりに、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子断片の間の相補的オーバーハングを起こすアンカープライマーを使用して実行することができ、引き続いて、遺伝子断片をアニールし、再増幅させてキメラ遺伝子配列を生成することができる（たとえばAusubel et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992を参照されたい）。そのうえ、融合部分を既にコードしている多くの発現ベクターが、市販で入手可能である（たとえばＧＳＴポリペプチド）。ＦＶＩＩコード核酸は、融合部分がインフレームでプロテアーゼタンパク質に連結されるように、そのような発現ベクターの中にクローニングすることができる。

４． ポリペプチド改変（修飾(modification)）
改変ＦＶＩＩポリペプチドは、裸のポリペプチド鎖、または複合体として調製することができる。いくつかの適用のために、翻訳後修飾または他の化学的修飾を有していない「裸の」形態で改変ＦＶＩＩを調製することは望ましいものとなり得る。裸のポリペプチド鎖は、翻訳後にＦＶＩＩを修飾しない適した宿主において調製することができる。そのようなポリペプチドはまた、インビトロ系において、化学的ポリペプチド合成を使用して調製することができる。他の適用のために、ペグ化、アルブミン化、グリコシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、または他の知られている修飾を含む特定の修飾は、望ましいものとなり得る。改変（修飾）は、インビトロにおいてまたはたとえば、そのような改変（修飾）をもたらす、適した宿主において改変ＦＶＩＩを産生することによってなすことができる。

５． ヌクレオチド配列
ＦＶＩＩまたは改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードする核酸分子が、本明細書において提供される。核酸分子は、任意のコードＦＶＩＩポリペプチドの対立遺伝子変異体またはスプライス変異体を含む。本明細書において提供される例示的な核酸分子は、配列番号１１３〜２７３のいずれかにおいて記載されるポリペプチドをコードするいずれかのものなどのような、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードするいずれかのものである。一実施形態において、本明細書において提供される核酸分子は、少なくとも５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、または９９％の配列同一性を有する中もしくは高ストリンジェンシーの条件下で、本明細書において提供されるＦＶＩＩポリペプチドをコードする完全長の任意の核酸の少なくとも７０％に沿ってハイブリダイズする。他の実施形態において、核酸分子は、本明細書において提供されるＦＶＩＩポリペプチドのいずれかをコードする縮重コドン配列を有するものを含むことができる。

Ｆ． 改変ＦＶＩＩポリペプチド活性の評価
ＦＶＩＩポリペプチドの活性および特性は、インビトロにおいておよび／またはインビボにおいて評価することができる。そのような評価のためのアッセイは、当業者らに知られており、試験された活性および結果を、治療活性およびインビボ活性と相互に関連されることが知られている。一例において、ＦＶＩＩ変異体は、非改変ＦＶＩＩおよび／または野生型ＦＶＩＩと比較して、評価することができる。他の例において、改変ＦＶＩＩポリペプチドの活性は、ＡＴ−ＩＩＩに対するインビトロまたはインビボにおける曝露の後に評価することができ、ＡＴ−ＩＩＩに曝露されていない改変ＦＶＩＩポリペプチドの活性と比較することができる。そのようなアッセイは、ＴＦの存在下または非存在下において実行することができる。インビトロアッセイは、たとえば、凝固アッセイ、結合アッセイ、タンパク質アッセイ、および分子生物学アッセイを含む、細胞ベースのアッセイなどのような、当業者に知られている任意の検査アッセイを含む。インビボアッセイは、動物モデルにおけるＦＶＩＩアッセイおよびヒトに対する投与を含む。いくつかの場合において、ＦＶＩＩの活性は、アッセイ決定因子に対して、血液、血清、または他の体液を評価することによってインビボにおいて決定することができる。ＦＶＩＩ変異体もまた、治療効果などのような活性または特性を評価するためにインビボにおいて試験することができる。

典型的には、本明細書において記載されるアッセイは、ＦＶＩＩの二本鎖活性化形態（つまりＦＶＩＩａ）に関してのものである。一本鎖形態が、典型的には、ＦＶＩＩの血液凝固活性に必要とされるタンパク質分解活性または触媒活性を含有しないので、そのようなアッセイはまた、負の制御を提供するために、そのような一本鎖形態を用いて実行することができる。さらに、またそのようなアッセイは、ＴＦなどのような補因子の存在下において実行することができ、これは、いくつかの場合においてＦＶＩＩの活性を増大する。

１． インビトロアッセイ
例示的なインビトロアッセイは、ポリペプチド改変および活性を評価するためのアッセイを含む。改変は、当技術分野において知られている、γ−カルボキシル化および他の翻訳後修飾を評価するインビトロアッセイ、タンパク質アッセイ、ならびにコンホメーションアッセイを使用して評価することができる。活性についてのアッセイは、ＴＦ、第Ｘ因子、および第ＩＸ因子などのような他の凝固因子とのＦＶＩＩ相互作用の測定、ＦＶＩＩポリペプチドのタンパク質分解活性を決定するためのタンパク質分解アッセイ、ホスファチジルセリンおよび他のリン脂質に対するＦＶＩＩポリペプチドの結合性および／または親和性を決定するためのアッセイ、ならびに凝固に対するＦＶＩＩポリペプチドの効果を決定するための細胞ベースのアッセイを含むが、これらに限定されない。

改変ＦＶＩＩポリペプチドの濃度は、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；Ｂｒａｄｆｏｒｄ法、Ｌｏｗｒｙ法、ＢＣＡ法；ＵＶ吸光度、ならびにこれらに限定されないが、免疫学的方法、放射性の方法、蛍光性の方法、および関連する方法などのような他の定量化可能なタンパク質標識法を含むが、これらに限定されない、当技術分野においてよく知られている方法によって評価することができる。

ＦＶＩＩポリペプチドの切断またはＦＶＩＩプロテアーゼ活性によって産生される産物を含む、タンパク質分解反応の切断産物の評価は、発色基質切断、ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学的検査、免疫沈降、ＮＨ２−末端配列決定、およびタンパク質標識化を含むが、これらに限定されない方法を使用して実行することができる。

改変ＦＶＩＩポリペプチドの構造的特性もまた、評価することができる。たとえば、改変ＦＶＩＩポリペプチドのＸ線結晶解析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、および低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏ−ＥＭ）は、ＦＶＩＩポリペプチドの３次元構造および／またはＣａ^２＋結合性もしくは補因子結合性などのようなＦＶＩＩポリペプチドの他の特性を評価するために実行することができる。

さらに、ＦＶＩＩ分解の存在および程度は、硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および電気泳動にかけられたＦＶＩＩ含有サンプルのウェスタンブロッティングなどのような標準的な技術によって測定することができる。プロテアーゼに曝露されたＦＶＩＩポリペプチドはまた、改変（修飾）ＦＶＩＩポリペプチドの開裂部位の場所または変化を決定するためにＮ−末端配列決定にかけることもできる。

ａ． 翻訳後修飾
ＦＶＩＩポリペプチドはまた、翻訳後修飾の存在について評価することもできる。そのようなアッセイは、当技術分野において知られており、グリコシル化、ヒドロキシル化、およびカルボキシル化を測定するためのアッセイを含む。グリコシル化についての例示的なアッセイにおいて、炭水化物分析は、たとえば、ヒドラジン分解処置またはエンドグリコシダーゼ処置にさらされたＦＶＩＩポリペプチドのＳＤＳ ｐａｇｅ分析を用いて実行することができる。ヒドラジン分解は、無水ヒドラジンとのインキュベーションによって、糖タンパク質からＮ結合型グリカンおよびＯ結合型グリカンを放出するが、エンドグリコシダーゼによる放出は、ＰＮＧａｓｅ Ｆを伴い、これは、糖タンパク質から最もＮ−グリカンを放出する。ＦＶＩＩポリペプチドのヒドラジン分解処置またはエンドグリコシダーゼ処置は、蛍光体標識または発色団標識と用いてタグを付けることができる還元末端を生成する。標識ＦＶＩＩポリペプチドは、蛍光体支援炭水化物電気泳動（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＦＡＣＥ）によって分析することができる。グリカンに対する蛍光性タグはまた、ＨＰＬＣによる単糖分析、複雑なグリコシル化パターンのプロファイリングまたはフィンガープリンティングに使用することもできる。例示的なＨＰＬＣ方法は、親水性相互作用クロマトグラフィー、電子相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーを含む。例示的なグリカンプローブは、３−（アセチルアミノ）−６−アミノアクリジン（ＡＡ−Ａｃ）および２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）を含むが、これらに限定されない。炭水化物部分はまた、グリコシル化ＦＶＩＩポリペプチドを認識する特異的な抗体の使用を通して検出することができる。β−ヒドロキシル化を測定するための例示的なアッセイは、アルカリ性加水分解にさらされたＦＶＩＩポリペプチドの逆相ＨＰＬＣ分析を含む（Przysiecki et al. (1987) PNAS 84:7856-7860）。ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシル化およびγ−カルボキシル化は、当技術分野において記載されるように、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）分析を用いるマススペクトロメトリーを使用して評価することができる（たとえばHarvey et al. J Biol Chem 278:8363-8369、Maun et al. Prot Sci 14:1171-1180を参照されたい）。プロペプチド（プロＦＶＩＩ）を含有するＦＶＩＩポリペプチドの、翻訳後γ−カルボキシレート修飾を担うカルボキシラーゼとの相互作用は、評価することもできる。カルボキシラーゼの、フルオレセイン(flourescin)標識プロＦＶＩＩポリペプチドとのインキュベーションの後の解離定数（Ｋ_ｄ）は、異方性によって結合カルボキシラーゼの量を決定することによって測定することができる（Lin et al. (2004) J Biol Chem 279:6560-6566）。

ｂ． タンパク質分解活性
改変ＦＶＩＩポリペプチドは、タンパク質分解活性について試験することができる。ＦＶＩＩのタンパク質分解活性は、クロモザイムｔ−ＰＡ（ＭｅＳＯ_２−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）、Ｓ−２２８８（Ｈ−Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）、Ｓ−２２６６（Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）、Ｓ−２７６５（Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）、スペクトロザイムＦＸａおよびスペクトロザイムＦＶＩＩａ（ＣＨ_３ＳＯ_２−Ｄ−ＣＨＡ−Ｂｕｔ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）などのような発色基質を使用して測定することができる。ＦＶＩＩポリペプチドは、単独でまたはＴＦの存在下において、様々な濃度の発色基質とインキュベートされる。基質の切断は、容易に入手可能なソフトウェアを使用して、線形回帰によって決定される吸光度および基質加水分解の速度によってモニターすることができる。

ＦＸなどのような凝固因子基質の活性化もまた、ＦＶＩＩポリペプチドによって評価することができる。ＴＦとのプレインキュベーションありまたはなしのＦＶＩＩポリペプチドは、精製ＦＸ（商業的に入手可能）とインキュベートすることができる。ＦＶＩＩポリペプチドとのインキュベーションの結果として産生される活性ＦＸａの量は、Ｓ−２２２２またはＳｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ ＦＸａ（ＣＨ_３ＳＯ_２−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ．ＡｃＯＨ）などのような発色基質に対するＦＸａの活性として測定され、これは、吸光度変化を介してモニターされる（Harvey et al. J Biol Chem 278:8363-8369、下記の実施例４もまた参照されたい）。リン脂質の供給源もまた、ＦＶＩＩおよびＦＸのインキュベーションにおいて含むことができる（Nelsestuen et al. (2001) J Biol Chem 276:39825-31）。

ｃ． 凝固活性
ＦＶＩＩポリペプチドは、当技術分野においてよく知られているアッセイを使用することによって凝固活性について試験することができる。たとえば、アッセイのいくつかは、２ステージ凝血アッセイ（Liebman et al., (1985) PNAS 82:3879-3883）；プロトロンビン時間アッセイ（ＰＴ、これは、外因性経路におけるＦＶＩＩａのＴＦ依存性活性を測定することができる）；ＰＴ試験の改良であるアッセイ；活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ、これは、ＦＶＩＩａのＴＦ非依存性の活性を測定することができる）；活性化凝血時間（ＡＣＴ）；再石灰化活性化凝血時間；リー−ホワイト凝血時間；またはトロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）（Pusateri et al. (2005) Critical Care 9:S15-S24）を含むが、これらに限定されない。たとえば、改変ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性は、ＰＴベースのアッセイによって決定することができる。ＦＶＩＩは、ＦＶＩＩ欠損血漿において希釈され、Ｄａｄｅ ＢｅｈｒｉｎｇからのＩｎｎｏｖｉｎ（商標）として入手可能なものなどのようなプロトロンビン時間試薬（リン脂質およびカルシウムと組換えＴＦ）と混合される。血餅形成は、光学的に検出され、血餅までの時間は、決定され、ＦＶＩＩ欠損血漿のみに対して比較される。

ｄ． 他のタンパク質および分子による結合および／または阻害
阻害アッセイは、たとえばＡＴ−ＩＩＩおよびＴＦＰＩまたはＺｎ^２＋などのような分子などのようなＦＶＩＩ阻害因子に対する改変ＦＶＩＩポリペプチドの抵抗性を測定するために使用することができる。他の阻害因子についての阻害の評価もまた、試験することができ、他のセリンプロテアーゼ阻害因子およびＦＶＩＩ特異的抗体を含むが、これらに限定されない。阻害は、たとえばＡＴ−ＩＩＩ、ＴＦＰＩ、またはＺｎ^２＋の、ＴＦありおよび／またはなしでプレインキュベートされたＦＶＩＩポリペプチドとのインキュベーションによって評価することができる。次いで、ＦＶＩＩの活性は、上記に記載される、任意の１つまたは複数の活性アッセイまたは凝固アッセイを使用して測定することができ、ＡＴ−ＩＩＩ、ＴＦＰＩ、またはＺｎ^２＋による阻害は、阻害因子とインキュベートされたＦＶＩＩポリペプチドの活性を、阻害因子とインキュベートされなかったＦＶＩＩポリペプチドの活性と比較することによって、評価することができる。

ＦＶＩＩポリペプチドは、他の凝固因子および阻害因子に対する結合について試験することができる。たとえば、ＴＦなどのような補因子、ＦＸおよびＦＩＸなどのような基質、ならびにアンチトロンビンＩＩＩ、ＴＦＰＩ、およびヘパリンなどのような阻害因子とのＦＶＩＩの直接的なおよび間接的な相互作用は、免疫沈降、カラム精製、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、蛍光偏光（ＦＰ）、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、円二色性（ＣＤ）、タンパク質断片補足性アッセイ（ＰＣＡ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、光散乱、沈降平衡、小ゾーンゲル濾過クロマトグラフィー、ゲル遅延、ファーウェスタンブロッティング、蛍光偏光、ヒドロキシルラジカルタンパク質フットプリント、ファージディスプレー、および様々な２−ハイブリッド系を含むが、これらに限定されない、当技術分野において知られている任意の結合アッセイを使用して評価することができる。一例において、Ｚｎ^２＋結合は、平衡分析を使用して評価される（Petersen et al., (2000) Protein Science 9:859-866）。

ｅ． リン脂質親和性
ホスファチジルセリン（ＰＳ）および他のリン脂質に対する改変ＦＶＩＩポリペプチドの結合性および／または親和性は、当技術分野においてよく知られているアッセイを使用して決定することができる。高度に純粋なリン脂質（たとえば既知濃度のウシＰＳおよび卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）これは、Ｓｉｇｍａからなどのように入手可能である）は、有機溶媒において、小さな単層リン脂質小胞を調製するために使用することができる。これらのＰＳ／ＰＣ小胞へのＦＶＩＩポリペプチドの結合は、入射光に対する９０°での相対的な光散乱によって決定することができる。ＰＳ／ＰＣ単独でのおよびＰＳ／ＰＣ／ＦＶＩＩでの光散乱の強度は、解離定数を決定するために測定される（Harvey et al. J Biol Chem 278:8363-8369）。ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー機器でなどのような表面プラズマ共鳴は、リン脂質膜に対するＦＶＩＩポリペプチドの親和性を測定するために使用することもできる（Sun et al. Blood 101:2277-2284）。

２． 非ヒト動物モデル
非ヒト動物モデルは、改変ＦＶＩＩポリペプチドの活性、効能、および安全性を評価するために使用することができる。たとえば、非ヒト動物は、疾患または状態についてのモデルとして使用することができる。非ヒト動物は、疾患進行に対する効果をモニターするために、配列番号１１３〜２７３のいずれかにおいて記載される任意のＦＶＩＩ変異体などのようなＦＶＩＩ変異体の投与前に、疾患誘発物質および／または表現型誘発物質を注射することができる。遺伝モデルもまた、有用である。たとえば、血友病Ａを示す第ＶＩＩＩ因子ノックアウトマウスなどのような、１つまたは複数の遺伝子の過剰発現、過小発現、またはノックアウトによって疾患または状態を模倣するマウスなどのような動物は、産出することができる（Bi et al. (1995) Nat Gen 10:119-121）。そのような動物は、当技術分野においてよく知られているトランスジェニック動物産生技術または天然に存在する突然変異株もしくは誘発突然変異株を使用して産出することができる。ＦＶＩＩと関連する疾患の有用な非ヒト動物モデルの例は、出血障害、特に血友病または血栓症の疾患のモデルを含むが、これらに限定されない。傷害に対する非ヒト動物モデルはまた、ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性などのような活性を評価するために使用することもできる。これらの非ヒト動物モデルは、野生型ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、ＦＶＩＩ変異体の活性をモニターするために使用することができる。

動物モデルはまた、改変ＦＶＩＩポリペプチドの安定性、半減期、およびクリアランスをモニターするために使用することができる。そのようなアッセイは、改変ＦＶＩＩポリペプチドを比較するのに、ならびにさらなる非ヒト動物試験および人体試験のための用量および用量レジメンを計算するのに有用である。たとえば、たとえば、配列番号１１３〜２７３のいずれかにおいて記載されるいずれかを含む、本明細書において提供される任意のＦＶＩＩ変異体などのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、マウスの尾部静脈の中に注射することができる。次いで、血液サンプルは、注射の後の時点で採取され（数分、数時間、および数日後になどのように）、次いで、血清または血漿を含むが、これらに限定されない身体のサンプルにおける改変ＦＶＩＩポリペプチドのレベルは、たとえばＥＬＩＳＡまたはラジオイムノアッセイによって特定の時点でモニターすることができる。また、ＦＶＩＩポリペプチドの注射の後の様々な時点からの血液サンプルは、実施例９において記載されるなどのように、様々な方法を使用して凝固活性について試験される。薬物動態研究のこれらの種類は、ＦＶＩＩポリペプチドの半減期、クリアランス、および安定性に関する情報を提供することができ、これは、凝血促進薬としての投与に適した投薬を決定するのを支援することができる。

配列番号１１３〜２７３のいずれかにおいて記載されるいずれかなどのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、血友病についての動物モデルを使用して治療有効性について試験することができる。非限定的な一例において、マウスなどのような動物モデルは、使用することができる。血友病のマウスモデルは、当技術分野において入手可能であり、改変ＦＶＩＩポリペプチドを試験するために利用することができる。たとえば、抗ＦＶＩＩＩ抗体の注射によって産生される血友病Ａのマウスモデルは、ＦＶＩＩポリペプチドの血液凝固活性を評価するために使用することができる（たとえば実施例６およびTranholm et al. Blood (2003)102:3615-3620を参照されたい）。血友病Ｂのマウスモデルもまた、ＦＶＩＩポリペプチドを試験するために使用することができる（Margaritis et al. (2004) J Clin Invest 113:1025-1031）。出血障害の非マウスモデルもまた、存在する。ＦＶＩＩポリペプチド活性は、ワルファリン誘発性出血またはメラガトラン誘発性出血を有するラット（Diness et al. (1992) Thromb Res 67:233-241、Elg et al. (2001) Thromb Res 101:145-157）およびヘパリン誘発性出血を有するウサギ（Chan et al. (2003) J Thromb Haemost 1:760-765）において評価することができる。重症の出血を示す近交系血友病Ａ、血友病Ｂ、およびフォンウィルブランド病イヌもまた、ＦＶＩＩポリペプチドを用いる非ヒト動物研究において使用することができる（Brinkhous et al. (1989) PNAS 86:1382-1386）。ＦＶＩＩポリペプチドの活性はまた、出血のウサギモデルにおいて評価することもでき、血小板減少症は、ガンマ線照射および血小板抗体の使用の組み合わせによって誘発される（Tranholm et al. (2003) Thromb Res 109:217-223）。

全身性出血障害を有する動物に加えて、傷害モデルおよび外傷モデルもまた、血液凝固治療薬としてのＦＶＩＩポリペプチドの活性ならびにそれらの安全性および効能を評価するために使用することができる。そのようなモデルの非限定的な例は、ウサギ冠動脈狭窄症モデル（Fatorutto et al. (2004) Can J Anaesth 51:672-679）、ブタにおけるグレードＶ肝傷害モデル（Lynn et al. (2002) J Trauma 52:703-707）、ブタにおけるグレードＶ肝傷害モデル（Martinowitz et al. (2001) J Trauma 50:721-729）、およびブタ大動脈切開モデル（Sondeen et al. (2004) Shock 22:163-168）を含む。

３． 臨床アッセイ
多くのアッセイは、臨床的使用のためのＦＶＩＩの活性を評価するのに入手可能である。そのようなアッセイは、インビボにおける凝固、タンパク質安定性、および半減期の評価ならびに表現型アッセイを含むことができる。表現型アッセイおよびＦＶＩＩ処置の治療効果を評価するためのアッセイは、ＦＶＩＩの血液レベルの評価（たとえば、肥満度指数（ＢＭＩ）について修正するための、投与前のならびに第１の投与の後、最後の投与直後、および中間の時点を含む投与の後の時点の血清ＦＶＩＩの測定）、ＦＶＩＩを用いる処置の後の、上記に記載される方法を使用する、インビトロにおける血液凝固の評価（たとえばＰＴアッセイ）、ならびに非改変ＦＶＩＩおよび／もしくは野生型ＦＶＩＩまたは偽薬を用いて処置される対象と比較した、長い間にわたる症状の回復を含む、ＦＶＩＩ処置に対する表現型の応答を含む。ＦＶＩＩポリペプチドを用いて処置される患者は、失血、輸血必要量、およびヘモグロビンについてモニターすることができる。患者は、ルーチン的な投与または反復投与のためにある期間にわたりまたは出血、外傷、もしくは手術手技などのような急性事象に応じた投与の後に定期的にモニターすることができる。

Ｇ． 製剤および投与
出血障害の処置における使用のための組成物は、本明細書において提供される。そのような組成物は、治療有効量の本明細書において記載される第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する。有効濃度のＦＶＩＩポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその誘導体は、全身投与、局所投与、または局所的投与のための適した医薬担体または医薬媒体と混合される。化合物は、選択される障害の処置に有効な量で含まれる。組成物における活性化合物の濃度は、活性化合物の吸収、不活性化、排泄率、投薬スケジュール、および投与される量ならびに当業者に知られている他の因子に依存するであろう。

本明細書において提供される化合物の投与に適した医薬担体または医薬媒体は、当業者らに知られている任意のそのような担体を含み、投与の特定のモードに適したものとなる。治療有効量の本明細書において記載されるＦＶＩＩポリペプチドを含む医薬組成物は、投与の直前に、滅菌水などを用いて、再構成される凍結乾燥粉末として提供することもできる。

１． 製剤
改変ＦＶＩＩを含有する医薬組成物は、選択される量のポリペプチドを、１つまたは複数の生理学的に許容可能な担体または賦形剤と混合することによって、任意の従来の様式において製剤することができる。担体または賦形剤の選択は、投与する医者の技術の範囲内にあり、多くのパラメーターに依存し得る。これらは、たとえば、投与のモード（すなわち、全身、経口、経鼻、経肺、局所的、局所、または任意の他のモード）および処置される障害を含む。本明細書において提供される医薬組成物は、単回投与での（直接的）投与のためにまたは希釈もしくは他の改変のために製剤することができる。製剤における化合物の濃度は、意図される処置に有効な、投与の際の量のデリバリーに有効である。典型的には、組成物は、単回投与での投与のために製剤される。組成物を製剤するために、化合物またはその混合物の重量分率は、処置される状態が軽減するまたは回復するような有効濃度で、選択される媒体において溶解される、懸濁される、分散される、または他の形で混合される。

本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、二本鎖ＦＶＩＩａタンパク質として対象に対する投与のために製剤することができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、製剤前に、当技術分野において知られている任意の方法によって活性化することができる。たとえば、ＦＶＩＩは、イオン交換クロマトグラフィーによる精製の間に自己活性化を受け得る（Jurlander et al. (2001) Semin Thromb Hemost 27:373-384）。改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、ビーズ上に固定されたＦＸａとのインキュベーション（Kemball-Cook et al. (1998) J Biol Chem 273:8516-8521）または当技術分野において知られている任意の他の方法（下記の実施例２もまた参照されたい）によって活性化することもできる。これらのプロセスにおけるカルシウムの包含は、改変ＦＶＩＩａタンパク質の完全な活性化および正確な折り畳みを保証する。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、一本鎖タンパク質として投与のために製剤することもできる。一本鎖ＦＶＩＩポリペプチドは、切断を予防するような方法において精製することができる（たとえばＵＳ６６７７４４０を参照されたい）。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、一本鎖形態および二本鎖形態が、自己活性化を排除するまたは制御するために、培地の適切な選択によって、任意の比において医薬組成物において含有されるように、製剤することができる。

化合物は、微粒子化された形態もしくは他の適した形態で懸濁させることができるまたはより可溶性の活性産物を産生するために誘導体化することができる。結果として生じる混合物の形態は、投与の意図されるモードおよび選択される担体または媒体における化合物の溶解性を含む、多くの因子に依存する。結果として生じる混合物は、溶液、懸濁液、乳濁液、および他のそのような混合物であり、非水性または水性の混合物、クリーム、ゲル、軟膏剤、乳剤、水剤、エリキシル剤、ローション、懸濁剤、チンキ剤、ペースト、泡、エアロゾル、灌注剤、スプレー剤、坐剤、包帯、または全身投与、局所投与、もしくは局所的投与に適している任意の他の製剤として製剤することができる。筋肉内投与、非経口投与、または関節内投与などのような局所的内部投与については、ポリペプチドは、等張緩衝生理食塩水などのような水性ベースの培地において溶液懸濁剤として製剤することができるまたは内部投与のために意図される生体適合性支持体もしくは生体接着性のものと組み合わせられる。有効濃度は、標的とされる状態を回復させるのに十分であり、経験的に決定することができる。組成物を製剤するために、化合物の重量分率は、標的とされる状態が軽減するまたは回復するような有効濃度で、選択される媒体において溶解される、懸濁される、分散される、または他の形に混合される。

一般に、薬学的に許容可能な組成物は、規制当局に対する承認を考慮して調製され、他のものは、動物およびヒトにおける使用のための、一般に承認される薬局方に従って調製される。医薬組成物は、アイソフォームが共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体などのような担体を含むことができる。そのような医薬担体は、落花生油、ダイズ油、鉱油、およびゴマ油などのような、石油起源、動物起源、野菜起源、または合成起源のものを含む、水および油などのような、滅菌した液体とすることができる。医薬組成物が静脈内に投与される場合、水は、典型的な担体となる。食塩水ならびに水性デキストロース溶液および水性グリセロール溶液は、特に注射可能な溶液のための、液体担体として利用することもできる。組成物は、有効成分と共に、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、またはカルボキシメチルセルロースなどのような希釈剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、および滑石などのような滑沢剤；ならびにデンプン、アラビアゴムなどのような天然ゴム、ゼラチン、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリジン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドン、ならびに当業者らに知られている他のそのような結合剤などのような結合剤を含有することができる。適した医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、石粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールを含む。組成物はまた、望ましい場合、少数の量の湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤、たとえばアセテート、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレアート、および他のそのような作用物質を含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、および徐放性製剤の形態をとることができる。治療化合物およびラクトースまたはデンプンなどのような適した粉末ベースの粉末ミックスを含有する、たとえば、吸入器または注入器における使用のためのゼラチンのカプセル剤およびカートリッジは、製剤することができる。組成物は、伝統的な結合剤およびトリグリセリドなどのような担体と共に坐剤として製剤することができる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、および他のそのような作用物質などのような、標準的な担体を含むことができる。経口投与のための調製物もまた、ボーマン−バーク阻害因子、コンンジュゲートボーマン−バーク阻害因子、アプロチニン、およびカモスタットなどのようなプロテアーゼ阻害因子と共に適切に製剤することができる。適した医薬担体の例は、Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」において記載される。そのような組成物は、対象または患者への適切な投与のための形態を提供するために、適した量の担体と共に、一般に精製形態において、治療有効量の化合物を含有するであろう。

製剤は、投与のモードに適するはずである。たとえば、改変ＦＶＩＩは、注射による（たとえばボーラス注射または継続注入による）非経口投与のために製剤することができる。注射可能な組成物は、油性媒体または水性媒体において、懸濁剤、水剤、または乳剤としてそのような形態をとることができる。滅菌した注射可能な調製物はまた、たとえば１，４−ブタンジオールにおける水剤として、無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶剤における、滅菌した注射可能な水剤または懸濁剤とすることができる。滅菌した不揮発性油は、溶剤または懸濁媒として慣習的に利用される。この目的のために、合成モノグリセリドもしくは合成ジグリセリド、脂肪酸（オレイン酸を含む）、ゴマ油、やし油、落花生油、綿実油、および他の油のような天然に存在する植物油、またはオレイン酸エチルのような合成脂肪性媒体を含むが、これらに限定されない任意の無刺激の不揮発性油を、利用することができる。緩衝液、保存剤、酸化防止剤、および適した成分は、必要に応じて組み込むことができるまたは代わりに、製剤を含むことができる。

ポリペプチドは、組成物におけるただ１つの薬学的に活性な成分として製剤することができるまたは他の活性成分と組み合わせることができる。ポリペプチドは、抗体などのような標的作用物質へのコンンジュゲートなどによって、デリバリーのために標的にすることができる。組織標的リポソームを含むリポソーム懸濁剤もまた、薬学的に許容可能な担体として適し得る。これらは、当業者らに知られている方法に従って調製することができる。たとえば、リポソーム製剤は、米国特許第４，５２２，８１１号において記載されるように調製することができる。リポソームデリバリーはまた、徐放性製剤を含むこともでき、フィブロネクチンを用いて改変される、コラーゲンゲルおよびリポソームなどのような医薬マトリックスを含む（たとえばWeiner et al. (1985) J Pharm Sci. 74(9): 922-5を参照されたい）。本明細書において提供される組成物は、これらに限定されないが、不活性担体またはコロイド分散系などのような、デリバリーを容易にする１つまたは複数のアジュバントをさらに含有することができる。そのような不活性担体の代表的で非限定的な例は、水、イソプロピルアルコール、ガス状フルオロカーボン、エチルアルコール、ポリビニルピロリドン、プロピレングリコール、ゲル産生物質、ステアリルアルコール、ステアリン酸、鯨ろう、ソルビタンモノオレアート、メチルセルロース、およびその２つ以上の適した組み合わせから選択することができる。活性化合物は、処置される対象に対して望ましくない副作用の非存在下において、薬学的に許容可能な担体において、治療的に有用な効果を発揮するのに十分な量で含まれる。治療的に有効な濃度は、本明細書において提供されるアッセイなどのような知られているインビトロ系およびインビボ系において化合物を試験することによって経験的に決定することができる。

ａ． 投薬量
投与される治療剤の正確な量または用量は、特定のＦＶＩＩポリペプチド、投与の経路、ならびにその疾患の重症度ならびに対象の体重および全身状態などのような他の考慮に依存する。治療剤の局所的濃度が、いくつかの場合において、全身投与に際して安全性を伴って達成することができるものよりも、局所的投与の後に、高いものとなり得るが、治療剤の局所的投与は、典型的には、全身投与のあらゆるモードよりも低い用量を必要とするであろう。必要であれば、特定の投薬量および継続期間ならびに処置プロトコールは、経験的に決定するまたは推定することができる。たとえば、組換えＦＶＩＩポリペプチドおよび天然ＦＶＩＩポリペプチドの例示的な用量は、適切な投薬量を決定するための出発点として使用することができる。たとえば、ｒＦＶＩＩａに活性化された組換えＦＶＩＩ（ｒＦＶＩＩａ）ポリペプチド、Ｎｏｖｏｓｅｖｅｎ（登録商標）は、少なくとも２μｇ／ｍｌの有効な循環レベルを達成する、２〜５分間にわたるボーラス注入によって９０μｇ／ｋｇの投薬量で、出血エピソードを経験している血友病Ａまたは血友病Ｂを有する患者に投与されてきた。止血が達成されるまで、その用量は、２時間ごとに反復される。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、そのような組換えＦＶＩＩと比較して、低下した投薬量および／または頻度で有効となり得る。たとえば、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、８０μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、またはそれ以下の投薬量で投与することができる。いくつかの実施形態において、投薬量は、１００μｇ／ｋｇ、１１０μｇ／ｋｇ、１２０μｇ／ｋｇ、またはそれ以上などのような、より高いものとすることができる。処置の継続期間および注射の間の間隔は、出血の重症度および処置に対する患者の応答に応じて変わるであろう、また、適宜、調整することができる。非改変ＦＶＩＩと比較した、改変ＦＶＩＩの活性のレベルおよび半減期などのような因子は、投薬量の決定をなす場合、考慮に入れることができる。特定の投薬量およびレジメンは、経験的に決定することができる。

他の例において、ｒＦＶＩＩａに活性化された組換えＦＶＩＩ（ｒＦＶＩＩａ）ポリペプチド、Ｎｏｖｏｓｅｖｅｎ（登録商標）は、２〜５分間にわたるボーラス注入によって１５〜３０μｇ／ｋｇの投薬量で、出血エピソードを経験している、先天性ＦＶＩＩ欠乏症を有する患者に投与されてきた。止血が達成されるまで、その用量は、４〜６時間ごとに反復される。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、そのような組換えＦＶＩＩと比較して、低下した投薬量および／または頻度で有効となり得る。たとえば、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、２０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、またはそれ以下の投薬量で投与することができる。いくつかの例において、投薬量は、３５μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、４５μｇ／ｋｇ、またはそれ以上などのような、より高いものとすることができる。処置の継続期間および注射の間の間隔は、出血の重症度および処置に対する患者の応答に応じて変わるであろう、また、適宜、調整することができる。非改変ＦＶＩＩと比較した、改変ＦＶＩＩの活性のレベルおよび半減期などのような因子は、投薬量の決定をなすのに使用することができる。たとえば、非改変ＦＶＩＩポリペプチドよりも長い半減期を示す改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドよりも低い用量および／または低い頻度で投与することができる。同様に、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増加した血液凝固活性を示す改変ＦＶＩＩポリペプチドを使用する、治療効果に必要とされる投薬量は、頻度および量を低下させることができる。特定の投薬量およびレジメンは、経験的に当業者によって決定することができる。

ｂ． 剤形
医薬品の治療的に活性な化合物およびその誘導体は、典型的には、単位剤形または複数回の剤形で製剤され、投与される。製剤は、適した量の化合物または薬学的に許容可能なその誘導体を含有する、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒、滅菌した非経口水剤または非経口懸濁剤、経口水剤または懸濁剤、および油水乳剤を含むが、これらに限定されない剤形で、ヒトおよび動物に対する投与のために提供することができる。それぞれの単位用量は、必要とされる医薬担体、医薬媒体、または医薬希釈剤と関連して、望ましい治療効果をもたらすのに十分な所定の量の治療的に活性な化合物を含有する。単位用量形態の例は、アンプルおよびシリンジならびに個々に包装される錠剤またはカプセル剤を含む。いくつかの例において、単位用量は、投与前に再構成される凍結乾燥散剤として提供される。たとえば、ＦＶＩＩポリペプチドは、注射のための単一用量水剤を生成するために、適した水剤を用いて再構成される凍結乾燥散剤として提供することができる。いくつかの実施形態において、凍結乾燥散剤は、滅菌蒸留水を用いる再構成によって、緩衝液または食塩水におけるＦＶＩＩポリペプチドをもたらすように、ＦＶＩＩポリペプチドおよび塩などのような、さらなる構成成分を含有することができる。単位用量形態は、分割してまたはそれを複数にして投与することができる。複数用量形態は、分離した単位用量形態で投与されるように、単一の容器中に包装される複数の同一単位剤形である。複数用量形態の例は、バイアル、錠剤もしくはカプセル剤のボトル、またはパイントもしくはガロンのボトルを含む。したがって、複数用量形態は、包装において分離されない複数の単位用量である。

２． 改変ＦＶＩＩポリペプチドの投与
本明細書において提供されるＦＶＩＩポリペプチド（つまり活性化合物）は、体液または他の組織サンプルなどのような混合物をＦＶＩＩポリペプチドと接触させることによって、インビトロ、エクスビボ、またはインビボにおいて投与することができる。たとえば、エクスビボにおいて化合物を投与する場合、対象からの体液または組織サンプルは、たとえばバイパス機械におけるチューブまたはフィルターなどのようなチューブまたはフィルター上にコーティングされているＦＶＩＩポリペプチドと接触させることができる。インビボにおいて投与される場合、活性化合物は、液体形態、半液体形態、または固体形態において、任意の適切な経路によって、たとえば経口的に、経鼻的に、経肺で、非経口的に、静脈内に、皮内に、皮下に、関節内に、槽内に眼内に、脳室内に、鞘内に、筋肉内に、腹腔内に、気管内に、または局所におよびその任意の２つ以上の任意の組み合わせによって、投与することができ、投与のそれぞれの経路に適した様式において製剤される。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、１回または２回、３回、４回、もしくは治療効果を達成するために必要とされる任意の回数などのように、１回よりも多く投与することができる。複数回の投与は、任意の経路または経路の組み合わせを介して達成することができ、１時間ごと、２時間ごと、３時間ごと、４時間ごとに、またはそれ以上で投与することができる。

投与に最も適した経路は、処置されることとなる疾患状態、たとえば出血障害の場所に依存して変わるであろう。一般に、ＦＶＩＩポリペプチドは、約２〜５分間の投与（注入）時間と共に、静脈内ボーラス注射によって投与されるだろう。他の例において、ＦＶＩＩの望ましい血液レベルは、血漿レベルによって確かめられるように、活性剤の継続注入によって維持することができる。主治医は、毒性または骨髄、肝臓、もしくは腎臓の機能障害により、投薬量を下げるために、どのようにかついつ療法を終了させる、中断する、調整するかを知っているであろうということに留意されたい。反対に、主治医はまた、臨床応答が適当でない場合に、どのようにかついつ処置をより高度なレベルに調整するかをも知っているであろう（有毒な副作用を防止する）。他の例において、出血障害の場所は、ＦＶＩＩ製剤が代替経路を介して投与されることを示してもよい。たとえば、脳の中への（たとえば脳室内）投与を含む局所的投与は、患者がこの領域における出血を経験している場合、実行されてもよい。同様に、関節における出血の処置のために、関節への治療剤の注射による局所的投与（つまり関節内手段、静脈内手段、または皮下手段）は、利用することができる。他の例において、たとえば、クリーム、ゲル、もしくは軟膏剤として製剤された、皮膚への治療剤の局所投与または吸入によるまたは気管内の肺への投与は、出血がこれらのエリアに局在化している場合、適切であってもよい。

改変ＦＶＩＩポリペプチドが、デポー調製物として製剤される場合、長時間作用性製剤は、植え込み（たとえば皮下にもしくは筋肉内に）または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、たとえば、治療化合物は、適したポリマー物質もしくは疎水性物質（たとえば許容可能な油中の乳剤として）またはイオン交換樹脂と共にまたはわずかに可溶性の誘導体として、たとえばわずかに可溶性の塩として製剤することができる。

組成物は、所望の場合、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有することができる包装、キット、またはディスペンサーデバイスにおいて提供することができる。包装は、たとえば、ブリスターパック等の金属箔またはプラスチック箔を含有する。パックまたはディスペンサーデバイスは、投与のための説明書を添付することができる。活性剤を含有する組成物は、包装材、本明細書において提供される作用物質、および作用物質が提供される障害を示す標識を含有する製品として包装することができる。

３． 改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードする核酸の投与（遺伝子治療）
改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードする核酸分子および遺伝子治療に適したそれらをコードする発現ベクターの組成物もまた、提供される。タンパク質を送達するのではなく、全身的にまたは他の経路によってまたはリンパ球を含む細胞の除去、その中への核酸の導入、および宿主または適合性のあるレシピエントへの再導入など、エクスビボなどで、核酸をインビボにおいて投与することができる。

改変ＦＶＩＩポリペプチドは、核酸分子の発現によって細胞および組織に送達させることができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードする核酸分子として投与することができ、エクスビボ技術および直接的インビボ発現を含む。核酸は、当業者らに知られている任意の方法によって細胞および組織に送達することができる。単離核酸配列は、さらなる操作のためにベクターの中に組み込むことができる。本明細書において使用されるように、ベクター（またはプラスミド）は、その発現または複製のいずれかのために細胞の中に異種ＤＮＡを導入するために使用される別個の要素を指す。そのような媒体の選択および使用は、当業者の技術の範囲内に十分にある。

コード核酸分子の発現による改変ＦＶＩＩポリペプチドの投与のための方法は、組換えベクターの投与を含む。ベクターは、複製開始点の包含などにより、エピソームのままとなるように設計することができるまたは細胞における染色体の中に組み込むよう設計することができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、非ウイルス性ベクターを使用して、エクスビボ遺伝子発現療法において使用することができる。たとえば、細胞は、改変ＦＶＩＩポリペプチドコード核酸をゲノムの場所の中に組み込み、調節配列に作動可能に連結されるまたは結果として、それが、ゲノムの場所における調節配列に作動可能に連結されて配置されることなどによって、改変ＦＶＩＩポリペプチドを発現するように操作することができる。次いで、そのような細胞は、処置を必要とする患者などのような対象に局所的にまたは全身的に投与することができる。

たとえばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、および遺伝子治療のために設計される他のものを含むウイルス性ベクターを、利用することができる。ベクターは、エピソームのままとすることができるまたは処置される対象の染色体の中に組み込むことができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ウイルスによって発現させることができ、プロテアーゼポリペプチドは、処置を必要とする対象に投与される。遺伝子治療に適したウイルス性ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、および上記に述べられる他のものを含む。たとえば、アデノウイルス発現技術は、当技術分野においてよく知られており、アデノウイルス産生および投与方法もまた、よく知られている。アデノウイルス血清型は、たとえばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から利用可能である。アデノウイルスは、エクスビボにおいて使用することができる、たとえば、細胞は、処置を必要とする患者から単離され、改変ＦＶＩＩポリペプチド発現アデノウイルスベクターを用いて形質導入される。適した培養期間の後、形質導入された細胞は、対象に局所的および／または全身的に投与される。代わりに、改変ＦＶＩＩポリペプチド発現アデノウイルス粒子は、単離され、対象の疾患または状態を予防する、処置する、または回復させるために、治療的有効量のデリバリーのために、薬学的に許容可能な担体において製剤される。典型的には、アデノウイルス粒子は、対象体重１キログラム当たり１個の粒子から１０^１４個の粒子の範囲、一般に、対象体重１キログラム当たり１０^６個または１０^８個の粒子から１０^１２個の粒子の間の用量で送達される。いくつかの場面において、細胞膜タンパク質もしくは標的細胞に特異的な抗体または標的細胞上の受容体に対するリガンドなどのような、細胞を標的にする作用物質と共に核酸源を提供することが望ましい。ＦＶＩＩはまた、デリバリーのために、特定の細胞型の中に向けることもできる。たとえば、ＦＶＩＩポリペプチドをコードするアデノウイルスベクターは、肝細胞などのような非分裂細胞における安定した発現に使用することができる（Margaritis et al. (2004) J Clin Invest 113:1025-1031）。他の例において、ＦＶＩＩポリペプチドをコードするウイルス性ベクターまたは非ウイルス性ベクターは、続くデリバリーのために、単離細胞の中に形質導入することができる。ＦＶＩＩの発現およびデリバリーのためのさらなる細胞型は、線維芽細胞および内皮細胞を含むが、これらに限定されない。

核酸分子は、人工染色体および他の非ウイルス性ベクターの中に導入することができる。ＡＣＥＳなどのような人工染色体（Lindenbaum et al. (2004) Nucleic Acids Res. 32(21):e172を参照されたい）は、アイソフォームをコードし、発現するように操作することができる。手短に言えば、哺乳動物人工染色体（ＭＡＣ）は、細胞の中に大きなペイロードの遺伝子情報を自律複製非組み込み方式において導入するための手段を提供する。ＭＡＣの中で特有に、哺乳動物サテライトＤＮＡベースの人工染色体発現（ＡＣＥ）は、異なる種の細胞株において再現性よくデノボ生成され、宿主細胞の染色体から容易に精製することができる。次いで、精製された哺乳動物ＡＣＥは、様々なレシピエント細胞株に再導入することができ、ＡＣＥは、長期間、選択圧の非存在下においてＡＣＥ系を使用して安定して維持される。このアプローチを使用して、１つまたは２つの遺伝子標的を特異的に積むことがＬＭＴＫ（−）およびＣＨＯ細胞中で達成された。

改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードする核酸を導入する他の方法は、酵母における２工程遺伝子交換技術であり、酵母人工染色体（ＹＡＣ）においてクローニングされる完全アデノウイルスゲノム（Ａｄ２；Ketner et al. (1994) PNAS 91: 6186-6190）ならびにＹＡＣクローンにおける特異的な領域を標的とするためのアデノウイルス配列、対象とする遺伝子のための発現カセット、ならびにポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーを含有するプラスミドを用いて始まる。ＹＡＣは、より大きな遺伝子の組み込みを可能にするので、特に対象となる。このアプローチは、哺乳動物細胞または全動物に対する遺伝子移入のための、記載される改変ＦＶＩＩポリペプチドのいずれかをコードする核酸を運ぶ、アデノウイルスベースのベクターの構築に使用することができる。

核酸は、リポソームなどのような媒体にカプセル化するまたは細菌細胞、特に弱毒化された細菌などのような細胞の中に導入するまたはウイルス性ベクターの中に導入することができる。たとえば、リポソームが利用される場合、エンドサイトーシスに関連する細胞膜タンパク質に結合するタンパク質、たとえば、特定の細胞型に対して向性のカプシドタンパク質またはその断片、サイクリングにおいてインターナリゼーションを起こすタンパク質に対する抗体、および細胞内局在化を標的にし、細胞内半減期を増強させるタンパク質が、ターゲティングのためにおよび／または取り込みを容易にするために使用することができる。

エクスビボおよびインビボにおける方法については、改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードする核酸分子は、処置されることとなる適したドナーまたは対象からの細胞の中に導入される。療法の目的のために核酸を導入することができる細胞は、たとえば、処置されることとなる疾患または状態に適切な任意の所望の利用可能な細胞型を含み、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などのような血球；様々な幹細胞または前駆細胞、特にたとえば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓、およびそれらの他の源から得られる幹細胞などのような造血幹細胞または造血前駆細胞を含むが、これらに限定されない。

エクスビボ処置については、処置されることとなる対象と適合性のあるドナーに由来する細胞または処置されることとなる対象からの細胞は、除去され、核酸は、これらの単離細胞の中に導入され、改変細胞は、対象に投与される。処置は、たとえば患者の中に植え込まれる多孔質膜内にカプセル化されるものなどのように、直接的投与を含む（たとえば、米国特許第４，８９２，５３８号および第５，２８３，１８７号を参照されたい。これらのそれぞれは、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる）。インビトロにおける哺乳動物細胞の中への核酸の移入に適した技術は、リポソームならびにカチオン脂質（たとえばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、およびＤＣ−Ｃｈｏｌ）の使用、電気穿孔法、微量注射法、細胞融合法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、ならびにリン酸カルシウム沈降法を含む。ＤＮＡデリバリーの方法は、インビボにおいて改変ＦＶＩＩポリペプチドを発現させるために使用することができる。そのような方法は、電気穿孔、超音波、およびリン酸カルシウムデリバリーの使用などのように、局所的および全身的なデリバリーを含む、核酸のリポソームデリバリーおよび裸のＤＮＡのデリバリーを含む。他の技術は、微量注射、細胞融合、染色体媒介性遺伝子移入、ミクロセル媒介性遺伝子移入、およびスフェロプラスト融合を含む。

改変ＦＶＩＩポリペプチドのインビボ発現は、さらなる分子の発現に連結させることができる。たとえば、改変ＦＶＩＩポリペプチドの発現は、操作されたウイルスにおいてなどのように、細胞毒性産物の発現と連結することができるまたは細胞毒性ウイルスにおいて発現させることができる。そのようなウイルスは、治療的効果のために標的とされる特定の細胞型を標的にすることができる。発現改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ウイルスの細胞毒性を増強させるように使用することができる。

改変ＦＶＩＩポリペプチドのインビボ発現は、細胞特異的プロモーターまたは組織特異的プロモーターなどのような特異的な調節配列に、改変ＦＶＩＩポリペプチドコード核酸分子を作動可能に連結することを含むことができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、とりわけ標的細胞型および／または標的組織において感染するおよび／または複製するベクターから発現することができる。誘発性プロモーターは、改変ＦＶＩＩポリペプチド発現を選択的に調節するために使用することができる。例示的な調節可能な発現系は、ドキシサイクリン誘発性遺伝子発現系であり、これは、組換えＦＶＩＩ発現を調節するために使用されてきた（Srour et al.(2003) Thromb Haemost. 90(3): 398-405）。

核酸分子は、裸の核酸としてまたはベクター、人工染色体、リポソーム、および他の媒体において、全身投与、局所経路、局所的経路、および投与の他の経路によって対象に投与することができる。全身およびインビボにおけるものである場合、核酸分子または核酸分子を含有する媒体は、細胞を標的にすることができる。

投与はまた、細胞または組織を典型的に標的にするベクターまたは細胞の投与などによって、直接的なものとすることができる。たとえば、腫瘍細胞および増殖は、改変ＦＶＩＩポリペプチドのインビボ発現についての標的細胞となり得る。改変ＦＶＩＩポリペプチドのインビボ発現に使用される細胞はまた、患者にとって自己となる細胞をも含む。そのような細胞は、患者から取り出され、改変ＦＶＩＩポリペプチドの発現のための核酸を、導入し、次いで、注射または植え付けなどによって、患者に投与することができる。

Ｈ．治療上の使用
本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、組換えＦＶＩＩが利用される任意の状態の処置に使用することができる。典型的には、そのような処置は、増加した止血性の応答などのような増加した凝固が望ましいものを含む。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、単独でまたは他の作用物質と組み合わせて治療活性を有する。本明細書において提供される改変ポリペプチドは、治療活性を保持するが、改変特性、特にＡＴ−ＩＩＩに対する増加した抵抗性および増加した触媒活性を示すように設計される。本明細書において提供される改変ポリペプチドはまた、ＴＦＰＩに対する増加した抵抗性、Ｚｎ^２＋の阻害効果に対する増加した抵抗性、血清半減期などのような改善された薬物動態学的特性、活性化血小板に対する増加した結合性および／もしくは親和性、血清アルブミンに対する増加した結合性および／もしくは親和性ならびに／または血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３に対する増加した結合性および／もしくは親和性を示すこともできる。そのような改変特性は、たとえば、改変ＦＶＩＩポリペプチドの増加した血液凝固活性により、ポリペプチドの治療有効性を改善することができる。この部は、例示的な使用および投与方法を提供する。これらの記載される療法は、例示的なものであり、改変ＦＶＩＩポリペプチドの適用を限定しない。

本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、様々な治療薬およびＦＶＩＩが利用される診断法において使用することができる。そのような方法は、記載されるおよび以下に挙げられる生理学的状態および医学的状態の処置の方法を含むが、これらに限定されない。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、野生型ＦＶＩＩと比較して、同じ効果を達成するためのより低い用量を含む、インビボ活性および治療効果の改善ならびにより少ないおよび／またはより頻度が低い投与、減少した副作用、ならびに増加した治療効果などのような、投与および処置における他の改善を示すことができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドが、ＦＶＩＩチモーゲン（つまり一本鎖形態）として投与することができることは理解されるが、典型的には、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、たとえば、精製の間になどのように、自己活性化または他の凝固因子による活性化の後に、活性化二本鎖形態で投与される。

特に、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＶＩＩが処置に使用された治療方法における使用を意図する。そのような方法は、これらに限定されないが、血液凝固障害、血液障害、出血性障害、血友病Ａ、血友病Ｂなどのような血友病および第ＶＩＩ因子欠乏症、ならびに肝臓疾患によって引き起こされる後天性第ＶＩＩ因子欠乏症などのような後天性血液障害などのような疾患および障害の処置の方法を含むが、これらに限定されない。改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、これらに限定されないが、血小板減少症（たとえば化学療法計画などにより）、フォンウィルブランド病、遺伝性血小板障害（たとえば、チェディアック−東症候群およびヘルマンスキー−パドラック症候群などのような貯蔵プール病、トロンボキサンＡ２機能障害、グランツマン血小板無力症、ならびにベルナール−スーリエ症候群）、溶血性尿毒症症候群、ランデュ−オースラ−ウェバー症候群としても知られている先天性出血性末梢血管拡張症、アレルギー性紫斑病（ヘノッホ シェーンライン紫斑病）、ならびに播種性血管内凝固症候群などのような、さらなる出血疾患および出血障害の処置において使用することができる。

いくつかの実施形態において、ＦＶＩＩポリペプチドによって処置されることとなる出血は、脳、内耳領域、眼、肝臓、肺、腫瘍組織、胃腸管などのような器官において生じる。他の実施形態において、出血は、出血性胃炎および大量の子宮出血においてなどのように、びまん性である。たとえば血友病ＡおよびＢなどのような出血障害を有する患者は、手術または外傷の間に出血合併症の危険性にあることが多い。そのような出血は、出血性関節症（関節における出血）、慢性血友病性関節症、血腫（たとえば、筋肉、腹膜後、舌下、および咽頭後方）、血尿（腎管からの出血）、中枢神経系出血、消化管出血（たとえばＵＧＩ出血）、ならびに脳出血として示すことができ、これらはまた、改変ＦＶＩＩポリペプチドを用いて処置することもできる。さらに、手術（たとえば肝切除術）または抜歯と関連する任意の出血は、改変ＦＶＩＩポリペプチドを用いて処置することができる。一実施形態において、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、対象における、外傷（すなわち手術）による出血エピソードまたは血小板の低下した数もしくは活性を処置するために使用することができる。手術を受ける患者のための例示的な方法は、出血を予防するための処置およびこれらに限定されないが、心臓手術、血管形成術、肺手術、腹部手術、脊髄手術、脳手術、血管手術、口腔手術、または骨髄、心臓、肺、膵臓、もしくは肝臓の移植を含む器官移植手術などのような手術の前の、その間の、またはその後の処置を含む。

改変ＦＶＩＩポリペプチドを用いる疾患および状態の処置は、注射、経肺投与、経口投与、および経皮投与を含むが、こられに限定されない、本明細書において記載される適した製剤を使用する投与の任意の適した経路によって達成することができる。処置は、静脈内ボーラス投与によって典型的に達成される。

必要であれば、特定の投薬量および継続期間ならびに処置プロトコールは、経験的に決定するまたは推定することができる。たとえば、組換えＦＶＩＩポリペプチドおよび天然ＦＶＩＩポリペプチドの例示的な用量は、適切な投薬量を決定するための出発点として使用することができる。たとえば、ｒＦＶＩＩａに活性化された組換えＦＶＩＩ（ｒＦＶＩＩａ）ポリペプチド、Ｎｏｖｏｓｅｖｅｎ（登録商標）は、２．７時間の平均半減期と共に、少なくとも２μｇ／ｍｌの有効な循環レベルを達成する、２〜５分間にわたるボーラス注入によって９０μｇ／ｋｇの投薬量で、出血エピソードを経験している血友病Ａまたは血友病Ｂを有する患者に投与されてきた。止血が達成されるまで、その用量は、２時間ごとに反復される。たとえば、ＡＴ−ＩＩＩに対する増加した抵抗性、増加した触媒活性、Ｚｎ^２＋の阻害効果に対する増加した抵抗性、ＴＦＰＩに対する増加した抵抗性、増加した血清半減期などのような改善した薬物動態学的特性、活性化血小板に対する増加した結合性および／もしくは親和性、血清アルブミンに対する増加した結合性および／もしくは親和性ならびに／または血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３に対する増加した結合性および／もしくは親和性により、増加した血液凝固活性を有する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、そのような組換えＦＶＩＩと比較して、低下した投薬量および／または頻度で有効となり得る。野生型ＦＶＩＩポリペプチドまたは非改変ＦＶＩＩポリペプチドについての投薬量は、改変ＦＶＩＩポリペプチドについての投薬量の決定のための手引きとして使用することができる。非改変ＦＶＩＩと比較した、改変ＦＶＩＩの活性のレベルおよび半減期などのような因子は、そのような決定をなすのに使用することができる。特定の投薬量およびレジメンは、経験的に決定することができる。

投薬量レベルおよびレジメンは、知られている投薬量およびレジメンに基づいて決定することができ、必要ならば、改変ポリペプチドの特性の変化に基づいて推定することができるおよび／または様々な因子に基づいて経験的に決定することができる。そのような因子は、個人の体重、健康状態、年齢、利用される特異的な化合物の活性、性別、食餌、投与の時間、排泄の速度、薬剤の組み合わせ、疾患の重症度および過程、ならびに疾患に対する患者の素因および処置する医師の判断を含む。有効成分、ポリペプチドは、典型的には、薬学的に有効な担体と組み合わせられる。単一剤形または多剤形を産生するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、処置される宿主および投与の特定のモードに依存して変わり得る。

血液の凝血時間に対するＦＶＩＩポリペプチドの効果は、全血プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、活性化凝血時間（ＡＣＴ）、再石灰化活性化凝血時間、またはリー−ホワイト凝血時間を含むが、これらに限定されない、当技術分野において知られている凝血試験のいずれかを使用してモニターすることができる。

患者の状態の改善に際して、必要であれば、維持用量の化合物または組成物を投与することができ、および、投与量、剤形、もしくは投与の回数またはそれらの組み合わせを修正することができる。いくつかの場合において、対象は、疾患症状のあらゆる再発に際してまたはスケジューリングされた投薬量に基づいて、長期ベースでの断続的な処置を必要とし得る。他の場合において、さらなる投与は、出血、外傷、または手術手技などのような急性事象に応じて必要とされ得る。

以下は、ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａとして投与される）が治療剤として単独でまたは他の作用物質と組み合わせて使用されたいくつかの例示的な状態である。

１． 先天性の出血障害
ａ． 血友病
先天性の血友病は、血漿における凝固因子のレベルが減少しており、凝固カスケードの崩壊およびブロット凝血時間の増加に至る、劣性の血液障害である。血友病Ａは、血友病のすべての症例の約８５％を占めるが、Ｘ染色体上の第ＶＩＩＩ因子遺伝子における突然変異（１つまたは複数）に起因し、ＦＶＩＩＩタンパク質の欠乏症または機能障害に至る。血友病Ｂは、凝固因子、ＦＩＸの欠乏症または機能障害によって引き起こされ、一般に、Ｘ染色体上のＦＩＸ遺伝子における点突然変異または欠失に起因する。血友病Ａの世界的な発生率は、５０００人の男性個人当たり約１症例であり、血友病Ｂについて、２５０００人の男性当たり１症例である。血友病ＡおよびＢは、軽度、中程度、または重症にさらに分類される。通常機能する第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の５％〜２５％を有する血漿レベルは、軽度として分類され、１％〜５％は、中程度であり、１％未満は、重症である。血友病Ｃは、ＦＩＸ欠乏症と呼ばれることが多いが、比較的軽度で珍しい疾患であり、常染色体劣性様式において、１０００００人のうち約１人に影響を及ぼす。

血友病ＡおよびＢは、多くの方法において臨床的に明らかになる。小さな切り傷およびすり傷は、過度の出血をもたらさないであろうが、外傷および手術は、もたらすであろう。患者はまた、多数の関節および筋肉の出血ならびに軽い打撲傷を有するであろう。出血性関節症または関節への出血は、血友病における主要な合併症の１つであり、自発的にまたは外傷に応じて生じ得る。膝、肘、および足首などのようなちょうつがい関節は、最も頻繁に影響を及ぼされる。球関節が、それらを包囲する、より多くの筋系を有し、したがって、傷害からそれらをより保護するので、股関節部および肩は、それほど頻繁に影響を及ぼされない。出血は、重症の急性の痛みを引き起こし、移動を制限し、滑膜肥大を含む二次的合併症に至り得る。さらに、関節において再発する出血は、慢性滑膜炎を引き起こし得、これは、関節の損害を引き起こし、滑膜、軟骨、および硬骨を破壊し得る。頭蓋内出血および中枢神経系における出血などのような生命を脅かす出血もまた、血友病の対象に罹患する。頭蓋出血は、重症の血友病を有する患者の約１０％において生じ、３０％の死亡率をもたらす。対照的に、血友病Ｃは、より軽度である。自発的な出血は、めったに見られず、関節、軟組織、および筋肉への出血もまた、めったにない。出血は、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）の輸血、ＦＸＩ代償療法、または外部の創傷もしくは抜歯の処置などのような局所処置については、フィブリン接着剤を用いて一般に処置される。

血友病ＡまたはＢのための最も一般的な処置は、代償療法であり、患者に、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸが投与される。製剤は、血漿由来産物または組換え産物として商業的に入手可能であり、組換えタンパク質は、以前に処置されていない患者において最適な処置である。これらの療法は、非常に成功し得るが、患者が、新しく投与される第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子に対する阻害因子を作れば、合併症が生じる。阻害因子は、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸと反応する、ほとんどがＩｇＧ４サブクラスのＩｇＧ抗体であり、凝血促進機能に干渉する。阻害因子は、重症の血友病Ａを有する５人の患者のうちの約１人に影響を及ぼす。ほとんどの対象は、第ＶＩＩＩ因子の第１の注入の投与の直後にこれらの阻害因子を作り、対象は、高齢期にそれらを作るが、これは、幼児期に多い。阻害因子はまた、軽度または中程度の血友病Ａを有する１５人のうちの約１人にも影響を及ぼす。これらの阻害因子は、通常、成人期の間に生じ、投与される外因性ＦＶＩＩＩを破壊するだけでなく、内因性ＦＶＩＩＩをも破壊する。その結果として、軽度のおよび中程度の血友病患者は、重症になる。臨床的に、阻害因子を有する血友病Ａ患者は、彼らが、ＦＶＩＩＩに対して再曝露させられる場合に、彼らが経験する既往応答の強度に従って高応答者および低応答者に分類される。阻害因子は、血友病Ｂを有する１００人の患者のうちの約１人に影響を及ぼす。ほとんどの場合において、阻害因子は、治療第ＩＸ因子の第１の注入の後に生じ、アレルギー反応を伴い得る。

本明細書において示される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、血友病を有する患者、特に阻害因子を有する血友病患者を処置するために使用することができる。組換えＦＶＩＩａ産物（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに対する阻害因子を有する血友病Ａまたは血友病Ｂの患者における出血エピソードの処置についておよびＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに対する阻害因子を有する血友病Ａまたは血友病Ｂの患者における外科的介入または侵襲性手技における出血の予防について承認され、許可された。ｒＦＶＩＩａを用いる処置は、ＦＶＩＩＩａおよび／またはＦＩＸａの必要性を回避しながら、トロンビン生成を増強する。凝固は、ｒＦＶＩＩａのＴＦとの相互作用によって傷害の部位で開始され、最初のＦＸ活性化、トロンビン生成、および血小板の活性化をもたらす。ｒＦＶＩＩａによる完全な凝固は、ＴＦ依存性およびＴＦ非依存性のメカニズムによって達成することができ、生成されたトロンビンのいくつかは、ｒＦＶＩＩａのみによる、活性化血小板上のＦＸの直接的な活性化に起因し得、それ自体は、リン脂質膜との低い親和性相互作用を通して活性化血小板に結合する。

本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、出血エピソードの処置および外科的介入または侵襲性手技における出血の予防を含む、血友病のための療法において使用することができる。本明細書における改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＡＴ−ＩＩＩに対する増加した抵抗性、増加した触媒活性、Ｚｎ^２＋の阻害効果に対する増加した抵抗性、ＴＦＰＩに対する増加した抵抗性、血清半減期などのような改善された薬物動態学的特性、活性化血小板に対する増加した結合性および／もしくは親和性、血清アルブミンに対する増加した結合性および／もしくは親和性ならびに／または血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３に対する増加した結合性および／もしくは親和性を提供することができる。そのため、ＦＶＩＩポリペプチドは、ＴＦ依存性の様式（ＴＦＰＩに対する増加した抵抗性を通してなど）においてならびに／またはＴＦ非依存性の様式（活性化血小板に対する増加した結合性および／もしくは親和性を通してなど）において、より高度な血液凝固活性を示すことができる。したがって、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、血友病に対して、より活性な療法を提供するために使用することができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドを使用する治療的改善の例は、たとえば、より低い投薬量、より少ないおよび／またはより頻度が低い投与、減少した副作用、ならびに増加した治療効果を含むが、これらに限定されない。

改変ＦＶＩＩポリペプチドは、活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドとして典型的に投与される。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、たとえば、動物モデルを使用することによって、治療有効性について試験することができる。たとえば、抗体誘発性血友病マウスまたは血友病についての任意の他の知られている疾患モデルは、改変ＦＶＩＩポリペプチドを用いて処置することができる。疾患症状および表現型の進行は、改変ＦＶＩＩポリペプチドの効果を評価するためにモニターされる。改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、偽薬コントロールおよび／または非改変ＦＶＩＩを使用するコントロールと比較した、インビボにおける有効性を評価するために、臨床試験などにおいて、対象に投与することもできる。

ｂ． ＦＶＩＩ欠乏症
第ＶＩＩ因子欠乏症は、５０００００人のうちの約１人に影響を及ぼす常染色体劣性出血障害である。ＦＶＩＩ欠乏症は、臨床的に、軽度、中程度、または重症となり得、軽度から中程度の欠乏症は手術および外傷の後の増加した出血によって特徴づけられる。重症のＦＶＩＩ欠乏症（１％未満のＦＶＩＩ活性）を有する患者は、血友病に対する類似する症状を経験する。たとえば、ＦＶＩＩ欠損対象は、関節出血、自発的な鼻出血、消化管出血、尿路出血を起こしやすい。脳内の大量出血および筋肉出血もまた、報告されたが、女性は、重症の月経過多（大量の月経出血）を経験し得る。処置は、代償療法によって達成することができる。組換えＦＶＩＩａ産物（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、先天性のＦＶＩＩ欠乏症を有する患者における出血エピソードの処置についておよび先天性のＦＶＩＩ欠乏症を有する患者における外科的介入または侵襲性手技における出血の予防について承認され、許可された。したがって、本明細書における改変ＦＶＩＩポリペプチドは、同様に使用することができる。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＶＩＩ欠損患者における、出血エピソードの処置および外科的介入または侵襲性手技における出血の予防において使用することができる。たとえば、頭蓋内の出血を有する重症のＦＶＩＩ欠乏症を示す新生児の患者は、凝固を達成し、かつ止血を維持するために、静脈内ボーラスによって、改変ＦＶＩＩポリペプチドを投与することができる。一般に、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドとして投与される。

ｃ． 他
他の出血障害は、凝固を促進するために、本明細書において提供されるＦＶＩＩポリペプチドを用いて処置することができる。第Ｖ因子および第Ｘ因子の先天性の欠乏症もまた、血液凝固時間の増加の症状を示し、可能性として、治療用量のＦＶＩＩの投与を用いて処置することができる。たとえば、第Ｘ因子欠乏症を有する患者は、脾摘出術と関連する出血を制御するためにｒＦＶＩＩａを投与することができる（Boggio et al. (2001) Br J Haematol 112:1074-1075）。フォンウィルブランド病（ｖＷＤ）と関連する自発的なおよび手術関連性の出血エピソードはまた、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドを使用して処置することができる。ＶＷＤは、血液凝血タンパク質、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）の欠損または欠乏症によって引き起こされる出血障害であり、集団の１％〜２％において生じることが推定される。ｖＷＤを有する対象は、容易にあざがつき、再発性鼻出血を有し、抜歯、扁桃摘出術、または他の手術の後に出血し、女性患者は、増加した月経出血を有し得る。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ｖＷＤ患者における自発的なおよび手術関連性の出血を回復させるために使用することができる（von Depka et al. (2006) Blood Coagul Fibrin 17:311-316）。たとえばグランツマン血小板無力症およびヘルマンスキー−パドラック症候群などのような、他の血小板関連性の出血障害はまた、低下した内因性凝血活性とも関連する。血小板関連性の出血障害を有する患者における過剰な自発的なまたは手術関連性の出血もまた、治療用量の改変ＦＶＩＩポリペプチドによって制御することができる。たとえば、手術を受けている、グランツマン血小板無力症を有する患者は、重大な失血を予防するために、改変ＦＶＩＩポリペプチドを用いて、手術の前、その後、および／またはその間に処置することができる（van Buuren et al. (2002) Dig Dis Sci 47:2134-2136）。一般に、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドとして投与される。

２． 後天性の出血障害
ａ． 化学療法による後天性の血小板減少症
出血障害はまた、先天性ではなく、後天性のものともなり得る。たとえば、白血病および他の癌のためのなどのような化学療法による処置は、血小板減少症をもたらし得る。これは、おそらく、化学療法を受けている患者の骨髄における血小板産生の損失によるものであり、典型的には、薬物投与の６〜１０日後に生じる。後天性の血小板減少症の処置は、通常、血小板、赤血球、または血漿輸血によるものであり、これは、血小板欠乏症に起因し得る、あらゆる異常な自発性の出血を予防するのに働く。化学療法誘発性の血小板減少症または任意の他の後天性もしくは先天性の血小板減少症を有する患者における出血もまた、本明細書において提供される治療量の改変ＦＶＩＩポリペプチドの投与によって制御することができる。たとえば、胃腸管におけるなどのような、制御されていない出血を有する血小板減少症の患者は、大量出血を停止させるために、治療量のＦＶＩＩポリペプチドの静脈内ボーラス注射を施すことができる（Gerotziafas et al. (2002) Am J Hematol 69:219-222）。一般に、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドとして投与される。

ｂ． 他の凝固障害
他の後天性の凝固障害は、本明細書において示される改変ＦＶＩＩポリペプチドを使用して処置することができる。凝固障害は、劇症肝不全（ＦＨＦ；肝毒性薬剤、毒素、代謝性疾患、感染症、および虚血によって引き起こされるようなもの）、硬変を含む、他の肝臓疾患、ならびにウィルソン病、ビタミンＫ欠乏症（抗生物質処置または食餌によって引き起こされるようなもの）、溶血性尿毒症症候群、血栓症血小板減少症（ＴＴＣ）、および播種性血管内血液凝固症候群（ＤＩＣ）と関連する疾患を含むが、これらに限定されない状態に起因し得る。従来の処置は、一般に、血漿、赤血球（ＲＢＣ）、または血小板を用いる輸血によるが、失敗し得る。一実施形態において、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、出血を予防するために、侵襲性手技を受けている、ＦＨＦを有する患者に投与することができる。新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）を用いる従来の処置は、失敗することが多く、大量の血漿を必要とし得、容量過負荷および全身浮腫（皮下結合組織への浮腫液の全身性浸潤）をもたらす。たとえば肝生検または肝移植などのような侵襲性の手術の間、その前、および／またはその後の、静脈内ボーラスによる、治療量の改変ＦＶＩＩポリペプチドを用いる処置は、ＦＨＦ患者において、出血を予防し、止血を確立することができる。患者は、処置の効能を決定するために、血液のＰＴによってモニターすることができる（Shami et al. (2003) Liver Transpl 9:138-143）。他の実施形態において、ＦＶＩＩは、従来の輸血注入に応答しなかった、たとえば、肝機能障害およびＤＩＣと関連する重症の帝王切開後の腹腔内の出血などのような、凝固障害と関連する、重症の出血を有する患者に投与することができる（Moscardo et al. (2001) Br J Haematol 113:174-176）。さらに、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、新生児患者および小児患者における凝固障害を処置するために使用することができる。特定の実施形態において、新生児患者および小児患者は、ＲＢＣ注入および血小板注入などのような従来の処置に応答しない。たとえば、ＲＢＣ輸血および血小板輸血に応答しない、増加したＰＴと関連する重症の肺大量出血を有する新生児は、ＰＴを減少させ、かつ止血を確立するために、改変ＦＶＩＩポリペプチドを投与することができる（Olomu et al. (2002) J Perinatol 22:672-674）。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増強した凝固活性を示し、そのため、たとえばより低い用量で、より低い頻度で、およびより低い有害反応で投与することができる。一般に、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドとして投与される。

ｃ． 移植による後天性の出血
骨髄移植（ＢＭＴ）および幹細胞移植（ＳＣＴ）の後の重症の出血は、血小板の低下による、これらの手技と関連する、比較的一般的で、生命を脅かす合併症である。たとえば、びまん性肺胞出血（ＤＡＨ）は、ＢＭＴの肺合併症であり、推定される発生率は、移植集団において１〜２１％であり、死亡率は、６０〜１００％である。そのような出血エピソードの従来の処置は、コルチコステロイド処置ならびに血漿、血小板、および／またはＲＢＣを用いる輸血を含むが、これらは、大部分は失敗し、全体的な死亡率は、約５０％である（Hicks et al. (2002) Bone Marrow Transpl 30:975-978）。コルチコステロイド注入および／または血小板注入を用いる同時の処置を伴うまたは伴わない静脈内ボーラスによるＦＶＩＩの投与は、ＤＡＨを処置し、かつ止血を確立するために実行することができる（Hicks et al. (2002) Bone Marrow Transpl 30:975-978）。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増強した凝固活性を示し、そのため、たとえば、より低用量で、より少ない頻度で、より短い処置継続期間にわたり、および同じ生物学的活性および効能に対するより少ない有害反応で、投与されてもよい。一般に、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドとして投与される。

ｄ． 抗凝固療法誘発性の出血
血栓塞栓症などのような状態の処置のための抗凝固療法を受けている患者は、ワルファリン、ヘパリン、およびフォンダパリヌクスなどのような抗凝固薬の急性投与に際して出血エピソードを示し得るまたはそのような療法の長期的な使用法の結果として出血性障害を発症し得る。出血エピソードのための処置は、典型的には、ヘパリンを中和するための、ビタミンＫ、血漿、外因性ＦＩＸ、およびプロタミンなどのような凝血促進薬の投与を含む。外因性ＦＶＩＩの投与はまた、抗凝固薬の効果を中和し、ＰＴ、ａＰＴＴ、および／または凝固の他のマーカーを増加させ、止血を確立するために実行することもできる（Deveras et al. (2002) Ann Inten Med 137:884-888）。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、抗凝固処置により、後天性の出血障害を有する患者における出血エピソードを制御するための処置において使用することができる。一般に、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドとして投与される。

ｅ． 後天性血友病
第ＶＩＩＩ因子阻害因子は、他の場合であれば健康な個人において自発的に発症し、「後天性血友病」として知られている状態をもたらし得る。後天性血友病は、まれな状態であり、毎年の発生率は、１００万人の集団当たり０．２〜１．０である。自己抗体は、主としてＩｇＧ４抗体であり、これは、ＦＶＩＩＩに結合した場合、トロンビン切断、フォンウィルブランド因子相互作用、および／またはリン脂質結合に干渉することによって、ＦＶＩＩＩ活性を阻害する。これは、冒された患者の約８７％において生命を脅かす出血をもたらす。出血の一般的な部位は、関節および筋肉において主に出血する遺伝性の血友病を有する患者とは対照的に、皮膚、粘膜、筋肉、および腹膜後腔である。後天性血友病は、出血エピソードを制御するために、活性化プロトロンビン複合体濃縮物または活性化組換え体第ＶＩＩ因子（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（Ｒ）、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）を用いて処置することができる。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増強した凝固活性を示し、そのため、たとえば、より低用量で、より少ない頻度で、より短い処置継続期間にわたり、および同じ生物学的活性および効能に対するより少ない有害反応で、投与することができる。一般に、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドとして投与される。

３． 外傷および手術による出血
ＦＶＩＩポリペプチドは、正常な凝固系を有する対象において、手術時および外傷性の失血と関連する出血を処置するための療法として使用することができる。たとえば、ＦＶＩＩポリペプチドは、凝固を促進し、手術と関連する失血を低下させ、さらに、輸血の必要性を低下させるために、患者に投与することができる。一実施形態において、ＦＶＩＩポリペプチドは、恥骨後前立腺摘除術を受けている対象に投与することができる。恥骨後前立腺摘除術は、重大な失血およびそれに続く、輸血の必要性と関連することが多い。そのような手術または類似する手術を受けている対象は、手術の部位で凝固を増強することによって手術時の失血を低下させるために、早期手術フェーズにおいて治療量のＦＶＩＩの静脈内ボーラスを与えることができる。失血の低下は、これらの患者における輸血の必要性の排除をもたらす（Friederich et al. (2003) Lancet 361:201-205）。ＦＶＩＩポリペプチドは、急速な止血を達成し、かつ失血を予防するために、他の種類の手術を受けている、正常な凝固を有する患者に投与することができる。典型的に活性化形態（つまりＦＶＩＩａ）で投与されるＦＶＩＩを、手術時の出血を低下させるための療法に使用することができる手術手技の非限定的な例は、心臓弁手術（Al Douri et al. (2000) Blood Coag Fibrinol 11:S121-S127）、大動脈弁置換術（Kastrup et al. (2002) Ann Thorac Surg 74:910-912）、再発性血管周囲細胞腫の切除術（Gerlach et al. (2002) J Neurosurg 96:946-948）、癌手術（Sajdak et al. (2002) Eur J Gynaecol Oncol 23:325-326）、および十二指腸潰瘍に対する手術（Vlot et al. (2000) Am J Med 108:421-423）を含むが、これらに限定されない。ＦＶＩＩを用いる処置は、手術の部位での止血を促進し、失血を低下させまたは予防し、それによって、輸血の必要性を低下させるまたは消滅させることができる。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増強された凝固活性を示すように設計され、そのため、たとえばより低い用量で、より低い頻度で、およびより低い有害反応で投与されてもよい。一般に、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドとして投与される。

第ＶＩＩ因子ポリペプチドはまた、外傷を有する対象において、凝固を促進し、かつ失血を予防するために使用することができる。外傷は、外因性作用物質による生組織に対する傷害として定義され、米国において４番目の主要な死因となっている。外傷は、鈍的外傷（内部の圧迫、器官損害、および内出血をもたらす）または貫通外傷（身体を貫通し、組織、血管、および器官を破壊する作用物質の結果であり、外部の出血をもたらす）として分類される。外傷は、自動車事故（鈍的外傷および／または貫通外傷を引き起こす）、銃創（貫通外傷を引き起こす）、刺傷（貫通外傷を引き起こす）、機械による事故（鈍的外傷および／または貫通外傷を引き起こす）、ならびにかなりの高さからの落下（鈍的外傷および／または貫通外傷を引き起こす）を含むが、これらに限定されない、いくつかの事象によって引き起こされ得る。外傷の結果としての未制御の出血は、関連する死亡率のほとんどの原因である。びまん性凝固障害は、外傷患者と関連する、比較的一般的な合併症であり、対象の２５〜３６％もの数において生じる。凝固障害は、傷害の後の早期に発症し、凝固因子および血小板の薄弱化および消費、線溶、アシドーシス、ならびに低体温症などのような様々な因子に起因し得る。従来の管理は、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）血小板、ＲＢＣ、および／またはクリオプレシピテートを用いる輸血による代償療法、アシドーシスの治療、ならびに低体温症の処置を含む。これらの工程は、出血を停止させ、かつ死亡を予防するのに不十分であることが多い。治療量のＦＶＩＩの投与による処置は、外傷患者において、凝固を促進し、失血を低下させることができる。たとえば、外科的介入に加えて、大量の流血の症状を示す、銃撃傷害を有する患者は、凝固障害の出血を制御するための、ＦＶＩＩが投与される（Kenet et al. (1999) Lancet 354:1879）。ＦＶＩＩを用いる血液凝固療法は、鈍的外傷および貫通外傷を有する患者において、失血および出血を有効に低下させることができる（Rizoli et al. (2006) Crit Care 10:R178）。本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増強された凝固活性を示すように設計され、そのため、たとえばより低い用量で、より低い頻度で、およびより低い有害反応で投与されてもよい。一般に、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドとして投与される。

Ｉ． 併用療法
本明細書において記載される改変ＦＶＩＩポリペプチドのいずれも、他の生物学的製剤、小分子化合物、および手術を含むが、これらに限定されない他の治療剤または手技と組み合わせて、その前に、それと断続的に、またはそれに続いて、投与することができる。ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａおよびｒＦＶＩＩａを含む）が必要であるまたは使用されてきたならびに他の作用物質および処置が利用可能である、上記に例証されるものをすべて含む任意の疾患または状態について、ＦＶＩＩは、それと組み合わせて使用することができる。したがって、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、同様に使用することができる。処置されることとなる疾患または状態に依存して、例示的な組み合わせは、他の血漿精製凝固因子または組換え凝固因子、ビタミンＫ、ビタミンＫ誘導体、およびプロテインＣ阻害因子などのような凝血促進薬、血漿、血小板、赤血球、ならびにコルチコステロイドとの組み合わせを含むが、これらに限定されない。

Ｊ． 製品およびキット
改変ＦＶＩＩポリペプチドもしくは改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードする核酸またはその誘導体もしくは生物学的活性部分の医薬化合物は、包装材、止血性の疾患または障害の処置に有効な医薬組成物、および改変ＦＶＩＩポリペプチドまたは核酸分子が、止血性の疾患または障害の処置について使用されることになっていることを示す標識を含有する製品として包装することができる。

本明細書において提供される製品は、包装材を含有する。医薬製品の包装における使用のための包装材は、当業者らによく知られている。たとえば、米国特許第５，３２３，９０７号、第５，０５２，５５８号、および第５，０３３，３５２号を参照されたい、これらのそれぞれは、その全体が本明細書において組み込まれる。医薬包装材の例は、ブリスターパック、ボトル、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ、ボトル、ならびに選択される製剤ならびに投与および処置の意図されるモードに適した任意の包装材を含むが、これらに限定されない。任意の止血性の疾患または障害に対する様々な処置のように、本明細書において提供される化合物および組成物の多くの製剤が、企図される。

改変ＦＶＩＩポリペプチドおよび核酸分子はまた、キットとして提供することもできる。キットは、本明細書において記載される医薬組成物および投与のためのアイテムを含むことができる。たとえば、改変ＦＶＩＩは、シリンジ、吸入器、投薬カップ、ドロッパー、またはアプリケーターなどのような投与のためのデバイスと共に提供することができる。キットは、所望により、投薬量、投薬レジメン、および投与のモードのための説明書を含む、適用のための説明書を含むことができる。キットはまた、本明細書において記載される医薬組成物および診断のためのアイテムを含むことができる。たとえば、そのようなキットは、ＦＶＩＩの濃度、量、もしくは活性を測定するためのアイテムまたは対象のＦＶＩＩ調節システムを含むことができる。

以下の実施例は、例示的な目的のみのために含まれ、本発明の範囲を制限するように意図されない。

Ｋ． 実施例
実施例１
ＦＶＩＩのクローニングおよび発現
Ａ． ＦＶＩＩのクローニング
４６６アミノ酸ヒトＦＶＩＩアイソフォーム前駆体ポリペプチド（Ｐ０８７０９；配列番号１において記載される）をコードするヌクレオチドを、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含有する哺乳動物発現ベクター、ｐＣＭＶ Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；配列番号９９）の中にクローニングした。手短に言えば、ＣＢＯ−１２５（配列番号１００）オリゴヌクレオチドおよびＣＢＯ−１２６（配列番号１０１）オリゴヌクレオチドは、鋳型としてヒトＦＶＩＩ ｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＰＣＲによってＦＶＩＩ配列を増幅するために、順方向プライマーおよび逆方向プライマーとしてそれぞれ使用した。ＣＢＯ−１２５プライマーは、ＢａｍＨＩ制限部位（太字）、コザック配列（二重下線）、その後に続く、ＡＴＧ開始コドンを含む、ＦＶＩＩ ｃＤＮＡ配列の５’末端に対する相同性を有する１８ヌクレオチド（下線）を含有した。ＣＢＯ−１２６プライマーは、ＥｃｏＲＩ制限部位（太字）、終止コドン（二重下線）、およびＦＶＩＩ ｃＤＮＡ配列の３’末端に対する相同性を有する２１ヌクレオチド（下線）を含有した。
ＣＢＯ−１２５順方向プライマー

ＣＢＯ−１２６逆方向プライマー

標準的なＰＣＲ反応およびサーモサイクリング条件を、メーカーによって推奨されるように、ＫｏＤ ＨｉＦｉ ＰＣＲキット（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に、使用した。ＰＣＲ産物は、ＢａｍＨ Ｉ制限酵素およびＥｃｏＲ Ｉ制限酵素を用いて消化し、標準的な分子技術を使用して、ｐＣＭＶ ＳｃｒｉｐｔベクターのＢａｍＨ Ｉ制限部位およびＥｃｏＲ Ｉ制限部位の中にライゲーションした。次いで、ベクターを、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の中に形質転換した。選択したコロニーを、成長させ、細菌細胞は、ルーチン的な分子生物学技術を使用する、プラスミドの精製のために採取した。

Ｂ． ＦＶＩＩ変異体の生成
ＦＶＩＩ変異体は、新しく合成されたＤＮＡの中に特定の突然変異を組み込むプライマーとして働く、特異的に設計されたオリゴヌクレオチドと共に、メーカーの説明書に従って、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して生成した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ方法は、ＰｆｕＵｌｔｒａ ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼによる鋳型ＤＮＡの線形増幅を含む。望ましい突然変異を含む相補的プライマーは、鋳型としてクローニングＦＶＩＩ ｃＤＮＡ配列を含有する精製二本鎖スーパーコイルｐＣＭＶ Ｓｃｒｉｐｔベクターを使用して、サイクリングの間に伸長させた。プライマーの伸長は、新しく合成された鎖の中への所望の突然変異の組み込みをもたらし、付着ニック（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｎｉｃｋ）を有する突然変異プラスミドをもたらした。増幅の後に、核酸は、大腸菌由来ｐＣＭＶ Ｓｃｒｉｐｔベクターのｄａｍメチル化親鎖を消化するＤｐｎ Ｉを用いて処置した。これは、メチル化されていない、新しく合成された突然変異プラスミドの「選択」をもたらした。（１つまたは複数の）望ましい突然変異を含有するベクターＤＮＡを、ＸＬ１０−Ｇｏｌｄウルトラコンピテント大腸菌細胞の中に形質転換し、ここで、細菌リガーゼは、ニックを修復し、正常な複製が生じることを可能にした。

下記の表１３は、生成されたＦＶＩＩ変異体を記載する。いくつかの場合において、血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３に対する結合配列が、ＶＩＩポリペプチドの様々な領域において挿入されたＦＶＩＩ変異体が生成された。３つの異なるインテグリンα_ＩＩｂβ_３結合配列の１つが挿入された：ＳＦＧＲＧＤＩＲＮＶ（配列番号１１０）；ＣＳＦＧＲＧＤＩＲＮＶＣ（配列番号１１１）；またはＧＧＧＳＣＳＦＧＲＧＤＩＲＮＶＣ（配列番号１１２）。インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合配列は、成熟ＦＶＩＩナンバリングによるアミノ酸残基Ｐ４０６の後のＦＶＩＩポリペプチドのＣ末端に挿入されたまたは成熟ＦＶＩＩナンバリングによるＦＶＩＩアミノ酸残基Ｓ１０３〜Ｓ１１１、Ｈ１１５〜Ｓ１２６、もしくはＴ１２７〜Ｐ１３４の欠失および交換によって挿入された。血清アルブミン結合配列が挿入された他のＦＶＩＩ変異体もまた、生成された。これらのＦＶＩＩ変異体は、７つの異なる血清アルブミン結合配列：QRLMEDICLPRWGCLWEDDF(配列番号103)、IEDICLPRWGCLWE(配列番号104)、DICLPRWGCLWED(配列番号105)、IEDICLPRWGCLW(配列番号106)、GGGSIEDICLPRWGCLW(配列番号107)、DICLPRWGCLWED(配列番号108)、またはGGGSDICLPRWGCLWED(配列番号109)のうちの１つを含有した。血清アルブミン結合配列は、成熟ＦＶＩＩナンバリングによるアミノ酸残基Ｐ４０６の後のＦＶＩＩポリペプチドのＣ末端に挿入されたまたは成熟ＦＶＩＩナンバリングによるＦＶＩＩアミノ酸残基Ｓ１０３〜Ｓ１１１、Ｈ１１５〜Ｓ１２６、もしくはＴ１２８〜Ｐ１３４の欠失および交換によって挿入された。「Ｇｌａ Ｓｗａｐ ＦＩＸ」ＦＶＩＩ変異体（つまり内因性ＧｌａドメインがＦＩＸに由来するＧｌａドメインと交換されたＦＶＩＩポリペプチド）は、Ｎ末端に、配列番号８３のアミノ酸残基Ｙ１〜Ｙ４５を含有する。いくつかの例において、「Ｇｌａ Ｓｗａｐ ＦＩＸ」変異体は、ＦＩＸ Ｇｌａドメイン部分において１つまたは複数のアミノ酸置換を含有する。ＦＩＸ Ｇｌａドメイン部分にある突然変異は、大括弧で囲まれ、成熟野生型ＦＩＸポリペプチドまたは配列番号８３において記載される野生型ＦＩＸ Ｇｌａドメインのアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置を使用して、参照される。たとえば、｛Ｇｌａ Ｓｗａｐ ＦＩＸ／Ｍ１９Ｋ｝は、改変ＦＶＩＩポリペプチドが、配列番号８３において記載されるＦＩＸ Ｇｌａドメインの位置１９のメチオニンが、リシンと交換される異種ＦＩＸ Ｇｌａドメインを含有することを表す。下記の表１３において、血小板インテグリンα_ＩＩｂβ_３結合配列または血清アルブミン結合配列がＦＶＩＩポリペプチド中に挿入されるアミノ酸残基および結合配列のアミノ酸配列の両方を表す。たとえば、Ｈ１１５Ｓ１２６ｄｅｌｉｎｓＱＲＬＭＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＦは、アミノ酸残基Ｈ１１５〜Ｓ１２６が、欠失させられ、アミノ酸配列ＱＲＬＭＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＦ（配列番号１０３）を有する血清アルブミン結合配列と交換されたことを示す。

Ｃ． ＦＶＩＩポリペプチドの発現
ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットによる最初の発現分析のために、ＦＶＩＩポリペプチドを、ＢＨＫ−２１細胞において発現させた。下記に記載されるものなどのような生化学的アッセイのために、ＦＶＩＩポリペプチドを、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標） ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において発現させた。

野生型第ＶＩＩ因子ポリペプチド（配列番号３）および変異ＦＶＩＩポリペプチドを、ベビーハムスター腎臓細胞株ＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６３２）において最初に発現させた。ＢＨＫ−２１細胞は、３７℃および５％ＣＯ_２で、１００ｍｍ培養皿において、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を有するイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において培養した。約９０％のコンフルエンスまで成長させた後、細胞に、メーカーによって説明されるように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２４μｇのＦＶＩＩプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。培地は、トランスフェクションの６時間後に、１μｇ／ｍｌビタミンＫ１（Ｓｉｇｍａ）を含有する、血清を有していないＥＭＥＭと交換し、細胞を、さらに７２時間インキュベートした。細胞培養培地におけるＦＶＩＩの発現は、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットによってアッセイした。

生化学的アッセイを使用する続く分析のために、野生型第ＶＩＩ因子ポリペプチド（配列番号３）および変異ＦＶＩＩポリペプチドを、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標） ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において発現させた。細胞は、通気孔キャップを有するエルレンマイヤーフラスコにおいて、３７℃および８％ＣＯ_２で、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標） ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において培養した。細胞は、メーカーが提案するプロトコールを使用してトランスフェクトした。手短に言えば、１×１０^６細胞／ｍｌまで成長させた後、細胞を遠心分離し、培地を交換した。次いで、細胞に、２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２４０ｍｌの細胞ごとに、２４０μｇのＦＶＩＩプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。さらに、エタノール中ビタミンＫ_１（Ｓｉｇｍａ）の１ｍｇ／ｍｌストックの５０μｌを、２４０ｍｌの細胞ごとに添加した。細胞を５日間成長させ、次いで、培養上清を採取した。細胞培養培地におけるＦＶＩＩの発現を、ＥＬＩＳＡによってアッセイした。

いくつかの例において、野生型ＦＶＩＩポリペプチドおよび変異ＦＶＩＩポリペプチドを、ＣＨＯ−Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＣＨＯＸ）細胞（Ｅｘｃｅｌｌｇｅｎｅ）において発現させた。ＣＨＯ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＣＨＯＸ）細胞を、ＤＭ２０２完全培地（ＳＡＦＣ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）において維持し、産生種培養物（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）を接種するために使用した。種培養物を、５×１０^６生細胞／ｍｌまで成長させ、約６０ｍｌを、約０．６Ｌ ＤＭ２０２完全培地に接種するために使用して（接種密度は、０．４×１０^６ｖｃ／ｍｌである）、産生培養物を生成した。この産生培養物は、トランスフェクションの日に８〜１２×１０^６ｖｃ／ｍｌに達するように、４日間成長させた。トランスフェクション複合体は、第ＶＩＩ因子プラスミドＤＮＡ（６ｍｇ）および２３．１ｍｇのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して形成した。次いで、トランスフェクション複合体を、０．５Ｌの無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭトランスフェクション培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において希釈し、これを、０．６Ｌ産生培養物に添加した。トランスフェクションの５時間後、培養物は、８ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび４ｍｇ／ＬビタミンＫ１を補充した、約１Ｌ ＰｒｏＣＨＯ５培地（Ｌｏｎｚａ）を用いてさらに希釈した。２．２Ｌ振盪フラスコ培養物を、粗第ＶＩＩ因子を採取する前に、５〜７日間発現させた。次いで、培養上清は、ろ過によって採取し、ＦＶＩＩを精製した。

ＦＶＩＩ変異体（Ｑ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ）のうちの１つの発現は、安定した細胞株において実行した。この株は、ＣＨＯＸ細胞のトランスフェクションによってＥｘｃｅｌｌｇｅｎｅ（Ｍｏｎｔｈｅｙ、Ｖａｌａｉｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で生成された。手短に言えば、細胞は、メトトレキサートの存在下において成長させ、次いで、９６ウェルプレートにおいて１ウェル当たり１細胞での限界希釈によって平板培養した。最も高度なレベルの変異ＦＶＩＩを産生するクローンは、ＥＬＩＳＡによって決定した。あるクローン（クローン５２）は、第２の限界希釈および９６ウェルプレートにおける平板培養によって、さらにサブクローニングした。コロニーは、８ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭシステイン、１ｍｇ／ＬビタミンＫ１を補充したＤＭ２０４Ａ培地（ＳＡＦＣ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）において３７℃で成長させた。２４のクローンは、元々のクローン５２よりも高度なレベルのＱ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ発現を有することがＥＬＩＳＡ分析によって分かった。これらの２４のクローンを、成長のために６日間、６ウェルプレートにおいて、その後に続いて、４日間の４０ｍｌ振盪フラスコにおける成長によってさらに増やした。それぞれの成長工程は、上記のように補充したＤＭ２０４Ａ培地において３７℃で行った。成長の４日後に、クローンは、１×１０^７生細胞／ｍｌで凍結した。それぞれのクローンによって産生されたＱ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑのレベルは、ＥＬＩＳＡによって決定した。クローン５Ｆ７は、最も高度な産生者であり、典型的には、２５〜３５ｍｇ／Ｌ Ｑ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑを生成した。

１． ＥＬＩＳＡ
免疫アッセイは、サンプルにおいて、ヒトＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａの量を定量化するために使用した。ヒトＦＶＩＩに対するポリクローナル抗体は、溶液におけるプロテアーゼを捕捉し、検出するために使用した。免疫アッセイは、条件培地もしくは精製ストックのタンパク質濃度を決定するためにまたは他のサンプル、たとえばヒトもしくはマウスの血漿サンプルにおけるＦＶＩＩの濃度を決定するために使用することができる。ヒト血液におけるＦＶＩＩのベースライン濃度は、約５０ｎＭであり、酵素的に活性な形態（ＦＶＩＩａ）は、約１ｎＭである。

サンプルにおけるヒトＦＶＩＩタンパク質またはヒトＦＶＩＩａタンパク質の量を決定するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを実行した。９６ウェル平底Ｍａｘｉｓｏｒｐイムノプレート（Ｎｕｎｃ）を、５ｎｇ／μｌアビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の１００μｌ／ウェルを用いてコートした。プレートは、カバーし、室温（ＲＴ）で１時間、振盪しながらインキュベートし、その後に続いて、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を用いてＰＢＳにおいて４回洗浄した。プレートは、２００μｌ／ウェルでそれぞれのウェルに添加した、ＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ｗ／ｖ）とのインキュベーションによって、振盪しながら、ＲＴで最低１時間ブロックした。次いで、ブロックしたプレートは、使用まで４℃で保管した（２週間まで）。

使用の前に、プレートは、ＢＳＡを除去するためにＰＢＳＴ中で４回洗浄し、ビオチン化抗第ＶＩＩ因子抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の１ｎｇ／μｌ溶液の１００μｌ／ウェルを、それぞれのウェルに添加し、プレートを、振盪しながら４５分間、室温でインキュベートして、コートしたアビジンとの複合体形成を可能にした。過剰な非結合抗体は、ＰＢＳＴを用いてプレートを洗浄することによって（４回）、除去した。

５０ｎｇ／μｌ〜０．８ｎｇ／μｌの範囲の、ＦＶＩＩ標準物の系列２倍希釈溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ；ＰＢＳＴにおいて希釈）を、１００μｌ／ウェルでプレートに添加した。いかなるＦＶＩＩをも有していないＰＢＳＴを含有するウェルもまた、緩衝液のみのコントロールとして含めた。ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａの精製サンプルをアッセイするために（活性化の前および後、実施例３を参照されたい）、サンプルは、最初に、ＰＢＳＴにおいて１：２５に希釈し、次いで、２５倍、５０倍、１００倍、および２００倍希釈溶液を試験するために、系列２倍希釈溶液を作製した。希釈サンプルは、１００μｌ／ウェルで２つ組でウェルに添加した。ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａを含有する血漿サンプルをアッセイするために、血漿サンプルを、ＰＢＳＴにおいて１：１００および１：４００に希釈し、１００μｌ／ウェルで２つ組でウェルに添加した。ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａを有していない血漿サンプルもまた、バックグラウンドレベルを決定するために含めた。次いで、プレートを、振盪しながらＲＴで３０分間インキュベートして、サンプルにおける、あらゆるＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａが抗ＦＶＩＩ抗体と複合体を形成することを可能にした。

サンプルとのインキュベーションの後に、プレートは、ＰＢＳＴを用いて４回洗浄した。二次抗体、ウマ抗ヒトＦＶＩＩまたはマウスモノクローナル抗ヒトＦＶＩＩ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を、ＰＢＳＴにおいて１：５０００に希釈し、１００μｌの容量でそれぞれのウェルに添加した。プレートを、振盪しながら室温で３０分間インキュベートし、添加した抗体がプレート上のＦＶＩＩ複合体またはＦＶＩＩ複合体に結合することを可能にした。過剰な二次抗体を除去するために、プレートをＰＢＳＴを用いて洗浄した（４回）。結合した二次抗体を検出するために、ＰＢＳＴ中１：５０００希釈のヤギ抗ウマＨＲＰコンジュゲートの１００μｌまたはＰＢＳＴ中１：２０，０００希釈のヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲートの１００μｌを、それぞれのウェルに添加した。振盪しながらの室温での３０分間のインキュベーションの後に、プレートは、ＰＢＳＴを用いて４回洗浄し、ＴＭＢ基質および過酸化水素水（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の１：１混合物を含有する溶液の１００μｌ／ウェルを添加した。反応を停止させるための２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４の１００μｌ／ウェルの添加の前に、プレートは、室温で約１分間振盪した。４５０ｎｍでの光学密度は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ Ｍ５プレートリーダーを使用して測定し、プレートについてのバックグラウンド値（ＰＢＳＴのみで測定）は、それぞれのウェルからの測定値から引いた。標準曲線は、ＦＶＩＩ標準物の濃度対吸光度をプロットすることによって生成した。約０．２〜５０ｎｇ／ｍｌの標準曲線の範囲を、上記のＥＬＩＳＡ条件下で典型的に生成した。次いで、それぞれのサンプルの濃度は、標準曲線を使用し、希釈係数を掛けることによって決定し、平均および標準偏差を報告した。

２． ウエスタンブロット
細胞培養培地におけるＦＶＩＩの発現はまた、ウエスタンブロットによってもアッセイした。ＦＶＩＩトランスフェクト細胞（ＢＨＫ−２１細胞もしくはＣＨＯＸの細胞）に由来する細胞培養培地の無希釈サンプルまたはＰＢＳ中２つの系列２倍希釈溶液を含有する一定分量を、Ｃｏｎｃ．１（無希釈）、Ｃｏｎｃ．２（２倍希釈）、およびＣｏｎｃ．３（４倍希釈）と標識した。サンプルを、１０、２５、および５０ナノグラムのコントロール血漿精製ｒＦＶＩＩ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）の隣のＳＤＳ ｐａｇｅゲル上に装填した。ＢＨＫ−２１細胞またはＣＨＯＸ細胞によって産生されたＦＶＩＩタンパク質は、一次ポリクローナルウマ抗ＦＶＩＩ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ；メーカーの提案する濃度で使用）およびＨＲＰコンジュゲート抗ウマＩｇＧ二次抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの１ｍｇ／ｍｌの溶液の１：２０００希釈溶液）を使用して、ウエスタンブロットによって検出した。いくつかの例において、ＦＶＩＩは、一次ウサギ抗ヒト第ＶＩＩａ因子抗体（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＨＲＰコンジュゲート抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ウエスタンブロットによって検出した。発現レベルの比較は、コントロール血漿精製ｒＦＶＩＩを用いて行った。結果は、ＦＶＩＩの約２０ｎｇ〜５０ｎｇ以上の範囲の濃度が、細胞培養物の一定分量において存在したことを示す。

実施例２
ＦＶＩＩポリペプチドの精製および活性化
ＦＶＩＩポリペプチドは、機能的Ｇｌａドメインを有するＦＶＩＩポリペプチドが吸着するであろうＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗカラムまたはＣａｐｔｏＱカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、その後に続くカルシウム溶出工程を使用して精製した。典型的には、トランスフェクトしたものに由来する培養上清は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０および０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有する溶液を用いて２倍希釈し、次いで、５００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０を、１．５ｍＭの最終濃度まで希釈サンプルに添加した。サンプルは、最初に緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０）、次いで緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０）を用いてあらかじめ平衡化したＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗカラムまたはＣａｐｔｏＱカラムに装填する前にろ過した。装填した後に、２８０ｎｍでのフロースルーの吸光度がベースラインを達するまで、カラムは、緩衝液Ａを用いて洗浄した。緩衝液Ａは、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０、５ｍＭ ＣａＣｌ_２）と交換し、ポンプ洗浄は、その系列の緩衝液を完全に交換するために実行した。ポンプ洗浄の完了に際して、緩衝液Ｃを、８ｍｌ／分でカラムに適用して、ＦＶＩＩポリペプチドを溶出し、これを、画分で収集した。溶出の後に、カラムは、なお画分を収集しながら、ピンク色の色素（培養液に由来）がカラムから洗浄されるまで、緩衝液Ｂを用いて洗浄した。次いで、カラムは、再利用のためにそれを再平衡化するために緩衝液Ａを用いて洗浄した。

溶出した画分は、最初に緩衝液Ｂ、次いで緩衝液Ａを用いてあらかじめ平衡化したＭｏｎｏ ＱカラムまたはＱＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、さらに精製した。ＦＶＩＩを含有する、上記の緩衝液Ｃを用いて収集した画分は、プールし、ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を４０ｍＭの最終濃度まで添加する前に、緩衝液Ａを用いて２倍希釈した。少量の一定分量（たとえば１００μｌ）は、ＥＬＩＳＡなどによる分析のために、このポイントで所望により採取した。組み合わせたサンプルは、Ｍｏｎｏ Ｑ（またはＱＨｉＴｒａｐ）カラム上に装填し、次いで、緩衝液Ａを用いて洗浄した。結合したＦＶＩＩポリペプチドを溶出するために、０％〜３０％の勾配の緩衝液Ｂを、カラムに流し、画分を収集した。次いで、カラムは、再利用のために再平衡化するために、緩衝液Ｂ、その後に続いて、緩衝液Ａを用いて洗浄した。

いくつかの例において、第１のＣａｐｔｏ Ｑカラムの後に、プールした画分は、緩衝液Ｄ（２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．１ＭのＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０）にダイアフィルトレーションによって緩衝液を交換し、次いで、緩衝液Ｄを用いてあらかじめ平衡化したＳＰ−ＨＰカラム上に装填した。緩衝液Ｄを用いて洗浄した後に、０．１Ｍ ＮａＣｌ〜１．０Ｍの勾配のＮａＣｌをカラムに適用し、画分を収集した。次いで、ＦＶＩＩを含有する画分を、ｐＨ８．０に調整し、緩衝液Ｅ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０）において２倍に希釈し、緩衝液Ｅを用いてあらかじめ平衡化したＱ Ｈ−ＨＰカラムに適用した。次いで、このカラムは、緩衝液Ｅを用いて洗浄し、ＦＶＩＩは、緩衝液Ｅ中に０〜１Ｍの勾配のＮａＣｌによって溶出した。

精製したＦＶＩＩポリペプチドは、Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）からのビオチン化第Ｘａ因子を使用して、ＦＶＩＩａに活性化した。典型的には、Ｍｏｎｏ Ｑ精製からの７つの画分を、１５ｍｌコニカルチューブ中にプールし、３８８μｌの５００ｍＭ ＣａＣｌ_２、３８．９μｌの蒸留水中１０％ＢＳＡ、および３．２μｇのビオチン化第Ｘａ因子を添加した。３７℃での１４〜１６時間のインキュベーションの後に、２５０μｌの固定アビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）を、添加し、サンプルを、３０分間、４℃で混合した。次いで、結果として生じる溶液は、Ｅｃｏｎｏ−ｐａｋカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を通してろ過し、ろ液は、さらに３０分間、さらに２５０μｌの固定アビジンと混合した。溶液を再度ろ過し、ろ液は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ １０ｋＤａ遠心ろ過機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、約３００〜５００μｌに濃縮した。次いで、ＦＶＩＩａ濃度は、ＥＬＩＳＡによって分析し（実施例１．Ｃ．１において記載）、第ＶＩＩ因子活性化のレベルは、ウエスタンブロットによってモニターした。ウエスタンブロッティングは、本質的に実施例１．Ｃ．２において記載されるように実行したが、その代わりとして、一次抗体として、１時間、１：２０００のウサギ抗ヒト第ＶＩＩａ因子抗体（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）、その後に続いて、３０分間、１：５０００のＨＲＰヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。

実施例３
溶液中の、触媒的に能力のあるプロテアーゼの濃度の決定
ストック溶液中の、触媒的に能力のあるＦＶＩＩａの濃度は、第ＶＩＩａ因子および可溶性組織因子（ｓＴＦ）の複合体を、ＦＶＩＩａの不可逆的ペプチド阻害因子、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＦＦＲ−ＣＭＫ）を用いて滴定することによって決定した。阻害因子は、ＦＶＩＩａには結合するが、ＦＶＩＩには結合しない。高濃度のＦＶＩＩａ（５０ｎＭ）での長時間にわたるインキュベーションは、プロテアーゼの完全な滴定を保証する。ＦＦＲ−ＣＭＫとのインキュベーションの後のＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体の残存活性は、元々のストック溶液中の、触媒的に能力のあるＦＶＩＩａの濃度を決定するために測定した。

９６ウェルクリアハーフエリアアッセイプレート（Ｎｕｎｃ）は、１５０μｌ／ウェルの１×プレート緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）をそれぞれのウェルに添加し、最低１時間、３７℃でプレートをインキュベートすることによって前処置した。緩衝液は、ペーパータオル上で乾かし、いかなる残りの緩衝液をも除去するためにひっくり返してプレートを遠心分離することによって完全に除去し、プレートを、１時間、空気乾燥し、室温（ＲＴ）でカバーして保管した。

ＦＶＩＩａ／ｓＴＦ／ＦＦＲ−ＣＭＫ反応混合物を調製するために、ＦＶＩＩａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ；５０％グリセロール（ｖ／ｖ）において５μＭに希釈し、−２０℃で一定分量において低温で保管）またはＦＶＩＩａ変異体のストックを１×ダイレクトアッセイ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．０１％ＢＳＡ）において５００ｎＭに最初に希釈した。次いで、ＦＶＩＩａ／ｓＴＦ混合物は、９０μｌ蒸留水を、３６μｌ ５×ダイレクトアッセイ緩衝液、１８μｌ ５００ｎＭ ＦＶＩＩａ、および１８μｌ ５μｍ ｓＴＦ（組換えヒト第ＩＩＩ凝固因子／可溶性組織因子；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；使用したストック溶液は、５０％グリセロール中１９．６μＭとし、１×ダイレクトアッセイ緩衝液において５μＭに希釈し、４℃で２週間まで保管した）と混合することによって作製した。次いで、構成成分は、室温で５分間、複合体を形成させた。

ＤＭＳＯ中１０ｍＭ ＦＦＲ−ＣＭＫ（ＢａＣｈｅｍ）のストック溶液（−２０℃で保管）を、３．５μＭまで水において希釈した。ポリプロピレン不透明貯蔵プレート（Ｃｏｓｔａｒ）の１列を使用して、ＦＦＲ−ＣＭＫの水中系列２倍希釈溶液を、９６ウェル不透明プレートの１１ウェルにわたって作製し、水のみを含有する、列の最後のウェルをコントロールとした。これを、１０×ＦＦＲ−ＣＭＫ阻害因子系列溶液とする。前処置した９６ウェルクリアハーフエリアアッセイプレートの列のそれぞれのウェルの中に、１０．８μｌのＦＶＩＩａ／ｓＴＦ混合物を添加し、その後に続いて、１．２μｌの１０×ＦＦＲ−ＣＭＫ阻害因子系列を添加した。溶液を、十分に混合し、プレートは、ウェルにおける水滴を除去するために、５分間、＜３０００ｒｐｍで遠心分離した。プレートを、カバーし、３７℃で８時間インキュベートした。

ＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体の残存活性をアッセイするために、基質Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、＃２１７Ｌ；５ｍＬ蒸留水中５０μモル バイアルのストックを１０ｍＭに再構成し、４℃で保管）および５×ダイレクト緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＣａＣｌ_２、および０．０５％ＢＳＡ）の混合物は、３６０μｌ ５×ダイレクトアッセイ緩衝液を、１８０μｌの１０ｍＭ溶液のＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａおよび１０８０μｌの水と混合することによって、最初に調製した。アッセイプレートのそれぞれのウェルに、１０８μｌの調製した基質溶液を添加した。ウェルを混合し、プレートを、３７℃でインキュベートした。４０５ｎｍでの吸光度の増加を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖｉｃｅからのＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｍ５プレートリーダーで３７℃で、１時間、３０秒ごとに測定した。

ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して、吸光度の割合を測定し、非阻害プロテアーゼの割合によって測定した割合を割ることによって、阻害因子とインキュベートしたプロテアーゼの活性率を決定した。活性率は、ＦＦＲ−ＣＭＫの濃度に対してグラフで表し、非阻害活性の＞９０％または＜１０％であるポイントは切り捨てた。次いで、線を、残りのポイントを通して引き、ｘ切片を決定した。これは、溶液中の活性プロテアーゼの濃度を表す。複数回のアッセイからの値を、測定し、平均し、標準偏差を決定した。

実施例４
ＦＶＩＩａの、その基質、第Ｘ因子に対する触媒活性の決定
ＦＶＩＩａ変異体の、その基質、第Ｘ因子（ＦＸ）に対する触媒活性は、合成基質Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ ＦＸａ上で、ＦＶＩＩａによる活性化に際して生成されたＦＸａの活性をアッセイすることによって、蛍光発生アッセイにおいて間接的に評価した。

Ａ． 野生型ＦＶＩＩａの、その基質、第Ｘ因子に対するＴＦ依存性触媒活性
野生型ＦＶＩＩａのＴＦ依存性触媒活性は、精製組織因子（ＴＦ）の脂質付加形態が、ＦＶＩＩａの最適な活性を提供するために含まれる蛍光発生アッセイにおいて評価した。Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ ＦＸａ（ＣＨ_３ＳＯ_２−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ．ＡｃＯＨ）に対するＦＸａの酵素活性は、時間の関数として、生成された遊離蛍光体、ＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）の吸光度の増加を測定することによって決定した。

手短に言えば、野生型ＦＶＩＩａポリペプチドは、１×アッセイ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、および０．０１％ＢＳＡ）において０．５μＭに最初に希釈し、次いで、アッセイ緩衝液において０．１ｎＭにさらに希釈した。脂質付加完全長ＴＦ（Ｉｎｎｏｖｉｎ；Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）は、２０ｍｌ水において再構成して、３ｎＭ溶液を作製し、１×アッセイ緩衝液において０．２ｎＭに希釈した。４００μｌの０．１ｎＭ ＦＶＩＩａを、４００μｌ ０．２ｎＭ ＴＦと混合し、５分間、室温でインキュベートした。溶液は、２つの２倍希釈溶液によって、０．２ｎＭ ＴＦを含有する１×アッセイ緩衝液にさらに希釈し、それぞれ０．２ｎＭ ＴＦを含有する０．０５ｎＭ、０．０２５ｎＭ、または０．０１２５ｎＭ ＦＶＩＩａの合計３つのＦＶＩＩａ希釈溶液を得た（ＦＶＩＩａ／ＴＦ溶液）。

基質、第Ｘ因子（ＦＸ；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ；８０μｇ）を、１３５．６μｌ蒸留水において再構成して、１０μＭストックを生じさせ、−８０℃で一定分量で保管した。一定分量は、２回以上、凍結、解凍しなかった。ＦＸストックは、ダイレクトアッセイ緩衝液において８００ｎＭに希釈し、次いで、８００ｎＭ〜５０ｎＭの範囲のＦＸ溶液を得るために系列２倍希釈した。

Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒ Ｘａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ；１０μモル）を、蒸留水において５ｍＭに再構成し、４℃で保管した。９６ウェル黒色ハーフエリアアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に、５μｌ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒ Ｘａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）をそれぞれのウェルに添加した。次いで、２５μｌのＦＸ溶液を、それぞれのウェルに添加した。プレートのウェルの最後の列に、ＦＸを添加しなかったネガティブコントロールもまた、アッセイに含めた。それぞれのＴＦ／ＦＶＩＩａ希釈溶液が、それぞれのＦＸ希釈溶液に対してアッセイされるように、２つ組で、３つの濃度のＴＦ／ＦＶＩＩａ溶液を、プレートのそれぞれのカラムのウェルに２０μｌで添加し、カラムの１セットは、添加のＴＦ／ＦＶＩＩａを含有しなかった（つまりＦＸのみ）。プレートは、振盪によって混合した。蛍光発光は、３７℃で、１時間、３０秒ごとに読み取るために設定した分光蛍光光度計を用いて長い間にわたって測定し（Ｅｘ：３８０ｎｍ、ＥＭ：４５０ｎｍ、カットオフ：４３５ｎｍ）、時間は、時間の２乗の単位で報告した。アッセイの後に、同じプレートリーダーにおけるＡＭＣ蛍光発光の標準曲線を、蛍光発光単位から、アッセイにおいて放出されたｕＭ基質に変換するために、生成した。ＤＭＳＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中１ｍＭ ＡＭＣを、１×アッセイ緩衝液において０．０２ｍＭに希釈した。ＡＭＣの６つの２倍系列希釈溶液を、１×アッセイ緩衝液において２０ｎＭ〜０．６２５ｎＭの範囲で作製した。ＡＭＣの蛍光発光は、上記に記載されるのと同じアッセイ条件を使用して測定し、蛍光発光対ＡＭＣの濃度のグラフをプロットした。線の傾きを計算し、これは、続く計算における、ＲＦＵのμＭへの変換係数として提供された。

ＦＸのＦＶＩＩａ活性化についての反応速度定数は、基質濃度の逆数対基質切断の速度の逆数についての線形回帰分析を実行することによって計算した（秒^２の単位）、Ｖ_{ｍａｘ，ＦＶＩＩａ}は、ｙ切片の逆数として計算し、Ｋ_{ｍ，ＦＶＩＩａ}は、ｙ切片での傾きとして計算し、Ｖ_ｍａｘ／Ｋ_{ｍ，ＦＶＩＩａ}は、傾きの逆数として計算した。次いで、ｋ_ｃａｔ値は、式を使用して導き出した。
ｋ_ｃａｔ／Ｋ_{ｍ，ＦＶＩＩａ}＝Ｖ_ｍａｘ／Ｋ_{ｍ，ＦＶＩＩａ}×１／（０．５×ｋ_２×［μＭでＦＶＩＩａ］×（ＲＦＵ／μＭ変換係数））
ここで、ｋ_２＝（［Ｓ］×ｋ_{ｃａｔ，ＦＸａ}）／（Ｋ_{ｍ，ＦＸａ}＋［Ｓ］）、ｋ_{ｃａｔ，ＦＸａ}およびＫ_{ｍ，ＦＸａ}は、ｋ_{ｃａｔ，ＦＸａ}＝１１７秒^−１およびＫ_{ｍ，ＦＸａ}＝１６４μＭとしてＦＸａ標準物を使用して実験的に決定されるＳｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒＸａのＦＸａ切断についての定数である。

上記アッセイ条件を使用して、反応速度定数ｋ２は、８８．１秒^−１であることが決定された。

ＦＶＩＩａ変異体のそれぞれについてのＫ_ｍおよびｋ_ｃａｔは、その基質、ＦＸに対するそれぞれの触媒活性、ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ（Ｍ^−１秒^−１）を評価するために決定した（表１４）。野生型ＦＶＩＩａプロテアーゼを評価し、１．８×１０^７Ｍ^−１秒^−１の活性を示すことが分かった。Krishnaswamy, et al.（J. Biol. Chem. (1998) 273:8 4378-86）によって測定される、第Ｘ因子の第ＶＩＩａ因子活性化は、２．９×１０^７Ｍ^−１秒^−１である。

Ｂ． 基質、第Ｘ因子に対するＦＶＩＩａ変異体の触媒活性の分析
基質、第Ｘ因子（ＦＸ）に対するＦＶＩＩａ変異体の触媒活性を、合成基質Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ ＦＸａ上でのＦＶＩＩａによる活性化に際して生成されるＦＸａの活性をアッセイすることによって、２種類の発色アッセイにおいて間接的に評価した。２つのアッセイは、ＴＦ依存性およびＴＦ非依存性の活性の両方を評価するために、脂質付加組織因子の存在下または非存在下において実行した。ＦＶＩＩ変異体は、実施例１および２において上記に記載されるように、発現し、精製し、ＦＶＩＩａに活性化した。ほとんどのＦＶＩＩ変異体は、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標） ２９３−Ｆ細胞においてのみ発現したが、いくつかはまた、ＢＨＫ−２１細胞においても発現した。

脂質付加組織因子依存性間接的アッセイ
組織因子の存在下におけるＦＶＩＩａ変異体の触媒活性は、少し改変した、上記の実施例４のＡ部において記載されるアッセイを使用して、評価した。１つのそのような改変は、バックグラウンド活性を低下させるために、ＥＲＧ−ＣＭＫおよびＦＦＲ−ＣＭＫを用いて処置した第Ｘ因子基質プロテアーゼの使用であった（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）。２種類のデータ分析は、２つの別々のアッセイ；線形範囲分析アッセイおよび双曲線範囲分析アッセイを使用して実行した。線形範囲分析アッセイは、用量曲線の線形範囲における反応速度定数の正確な測定を保証するために、０および１５０ｎＭの間の一連の第Ｘ因子濃度を使用した。対照的に、双曲線範囲分析アッセイは、飽和（双曲線）用量曲線を用いる、反応速度定数の正確な測定を保証するために、０および１．４４μＭの間の一連の第Ｘ因子濃度を使用した。

線形範囲データ分析を用いる脂質付加組織因子間接的アッセイは、以下のように改変して、本質的に上記の実施例４のＡ部において記載されるように実行した。ＦＶＩＩａ変異体／ＴＦ溶液は、０．１ｎＭ ＦＶＩＩａ／０．４ｎＭ ＴＦ溶液として調製し、０．４ｎＭ ＴＦにおいて、１．５６２５ｐＭ ＦＶＩＩａ／０．４ｎＭ ＴＦを含有する溶液に２倍希釈する前に３０分間、インキュベートした。２５μＬのＦＶＩＩａ／ＴＦ溶液は、１．０ｍＭ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒ ＦＸａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）および３００ｎＭ、２００ｎＭ、１３３．３ｎＭ、８８．９ｎＭ、５９．３、３９．５ｎＭ、３６．３ｎＭ、または０ｎＭの第Ｘ因子のうちの１つ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）を含有する２５μＬの基質溶液と混合した。したがって、アッセイについての最終濃度は、５０μＬ／ウェル中０．８ｐＭ ＦＶＩＩａ、０．２ｎＭ ＴＦ、０．５ｍＭ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒ ＦＸａ、および１５０ｎＭ、１００ｎＭ、６６．７ｎＭ、４４．４ｎＭ、２９．６ｎＭ、１９．８ｎＭ、１３．２ｎＭ、または０ｎＭの第Ｘ因子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）であった。続く計算における、ＲＦＵのμＭへの変換係数として提供されるＡＭＣ標準曲線は、０μＭ〜１００μＭ ＡＭＣをカバーする用量範囲を含むように拡張した。

双曲線範囲データ分析を用いる脂質付加組織因子間接的アッセイは、以下のように改変して、本質的に上記の実施例４のＡ部において記載されるように実行した。ＦＶＩＩａ変異体／ＴＦ溶液は、０．１ｎＭ ＦＶＩＩａ／０．４ｎＭ ＴＦ溶液として調製し、０．４ｎＭ ＴＦにおいて、１．５６２５ｐＭ（または高度な活性を有することが予想されるプロテアーゼについては０．７８ｐＭ）ＦＶＩＩａ／０．４ｎＭ ＴＦに２倍希釈する前に、３０分間、インキュベートした。２５μＬのＦＶＩＩａ／ＴＦ溶液は、１．０ｍＭ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒ ＦＸａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）および１４４０ｎＭ、７２０ｎＭ、３６０ｎＭ、１８０ｎＭ、９０ｎＭ、４５ｎＭ、２２．５ｎＭ、または０ｎＭの第Ｘ因子のうちの１つ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）を含有する２５μＬの基質溶液と混合した。したがって、アッセイについての最終濃度は、５０μＬ／ウェル中０．８（または０．３９）ｐＭ ＦＶＩＩａ、０．２ｎＭ ＴＦ、０．５ｍＭ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒ ＦＸａ、および７ｎＭ、７２０ｎＭ、３６０ｎＭ、１８０ｎＭ、９０ｎＭ、４５ｎＭ、２２．５ｎＭ、１１．２５ｎＭ、または０ｎＭの第Ｘ因子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）であった。ｋ_ｃａｔおよびＫ_ｍのパラメーターは、式（Ｖ_ｍａｘ／（１＋（Ｋ_ｍ／ｘ）））のミカエリス メンテン双曲線式を使用して計算する。続く計算における、ＲＦＵのμＭへの変換係数として提供されるＡＭＣ標準曲線は、０μＭ〜１００μＭ ＡＭＣをカバーする用量範囲を含むように拡張した。

ＦＸのＦＶＩＩａ活性化またはＦＶＩＩａ変異体活性化についての反応速度定数を決定するために、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏアプリケーション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて収集した生データを、．ＸＭＬファイルとしてエクスポートした。さらなるデータの線形分析および非線形分析は、ＸＬｆｉｔ４、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌスプレッドシート環境内での自動カーブフィッティングおよび統計分析のためのソフトウェアパッケージを用いて実行した（ＩＤＢソフトウェア）。

線形範囲アッセイを使用して収集したデータについては、ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ（Ｍ^−１秒^−１）反応速度定数は、ＦＸ濃度対蛍光発生基質切断の速度（μＭ／秒^２）の線形回帰分析の傾きから直接的に計算し、ここで、ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ＝傾き／［ＦＶＩＩａ］×０．５×ｋ_２とする。補正係数ｋ_２は、実施例４のＡ部において記載される方法ならびに以前に、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンを用いて滴定した活性部位であった活性化ＦＸ（ＦＸａ）を用いて実験的に決定した、ｋ_ｃａｔ， _ＦＸａ＝５６秒^−１およびＫ_ｍ， _ＦＸａ＝１２６ｎＭのＳｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒ ＦＸａのＦＸａ切断についての反応速度定数を使用して、４５であることが決定された。０．９８未満のＲ^２値をもたらしたデータポイントを除くことにより、フィッティングルーチンにおいて使用されるデータセットの線形性を保証した。

双曲線範囲アッセイを使用して収集したデータの分析は、ＦＸ濃度対蛍光発生基質切断の速度（μＭ／秒^２）の非線形回帰分析から計算した。個々のｋ_ｃａｔおよびＫ_ｍのパラメーターは、式（Ｖ_ｍａｘ／（１＋（Ｋ_ｍ／ｘ）））のミカエリス メンテン双曲線式を使用して、フィットパラメーターとして計算し、ここで、ｋ_ｃａｔ＝Ｖ_ｍａｘ／［ＦＶＩＩａ］×０．５×ｋ_２とする。反応速度定数、ｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍは、個々のｋ_ｃａｔおよびＫ_ｍのフィットパラメーターから計算した。

組織因子非依存性間接的アッセイ
組織因子の存在下におけるＦＶＩＩａ変異体の触媒活性は、組織因子が、アッセイにおいて含まれていなかったという点を除いて、上記に記載されるものに類似する間接的アッセイにおいて評価した。したがって、ＴＦ非依存性の活性を評価するためのアッセイは、以下のように改変して、本質的に上記に記載されるように実行した。ＦＶＩＩａ変異体溶液は、５０ｎＭ（または高いＴＦ非依存性活性を有することが予想される変異体については５ｎＭ）に希釈した。２５μＬのそれぞれのＦＶＩＩａ溶液は、１．０ｍＭ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒ ＦＸａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）および１０５０ｎＭ、７００ｎＭ、４６６．７ｎＭ、３１１．１ｎＭ、２０７．４ｎＭ、１３８．３ｎＭ、９２．２ｎＭ、または０ｎＭの第Ｘ因子のうちの１つ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）を含有する２５μＬの基質溶液と混合した。したがって、アッセイについての最終濃度は、５０μＬ／ウェル中２５ｎＭ ＦＶＩＩａ（または高活性変異体については２．５ｎＭ）、０．５ｍＭ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒ ＦＸａ、および５２５ｎＭ、３５０ｎＭ、２３３．３ｎＭ、１５５．６ｎＭ、１０３．７ｎＭ、６９．１ｎＭ、４６．１ｎＭ、または０ｎＭの第Ｘ因子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）であった。データ分析は、改変せずに、上記、線形範囲アッセイについて記載されるように実行した。

表１４は、２９３−Ｆ細胞およびＢＨＫ−２１細胞から発現したＦＶＩＩａポリペプチドを使用して、ＴＦ依存性間接的アッセイにおいて測定されるＦＶＩＩａ変異体の触媒活性ならびに２９３−Ｆ細胞および／またはＢＨＫ−２１細胞から発現したＦＶＩＩａポリペプチドを使用して、ＴＦ非依存性間接的アッセイにおいて測定される触媒活性を提供する。結果は、触媒活性についての反応速度定数、ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ（Ｍ^−１秒^−１）として示し、野生型ＦＶＩＩａの活性の割合としても表現し、活性は、触媒活性、その基質（ＦＸ）に対するそれぞれのＦＶＩＩａ変異体のｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ（Ｍ^−１秒^−１）である。線形範囲データ分析または双曲線範囲データ分析の使用もまた、表において示す値に対して示す。すべてのＦＶＩＩａ変異体を、それぞれのアッセイにおいてアッセイしたとは限らなかった。いくつかのＦＶＩＩａ変異体は、野生型ＦＶＩＩａ分子と比較して、増加した触媒活性を示した。たとえば、Ｑ２８６Ｒ突然変異のみを含有するＦＶＩＩａポリペプチド（Ｑ２８６Ｒ−ＦＶＩＩａ）は、野生型ＦＶＩＩａの２倍および３倍の間の触媒活性を有し、Ｑ２８６ＲおよびＭ２９８Ｑの突然変異を含有するＦＶＩＩａポリペプチド（Ｑ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａ）は、野生型ＦＶＩＩａの３倍を超える触媒活性を有する。

実験のさらなるセットにおいて、ＢＨＫ−２１細胞において産生されるＦＶＩＩａポリペプチドの触媒活性を、少し改変した、上記に記載されるＴＦ非依存性およびＴＦ依存性間接的アッセイを使用して分析した。いくつかの変異体は、ＢＨＫ−２１細胞に加えて、ＣＨＯＸ細胞においてまたはもっぱらＣＨＯＸ細胞において産生された。変異体は、使用する細胞株にかかわらず同一条件下でアッセイした。ＴＦ依存性触媒アッセイ（線形分析を使用）については、ＦＶＩＩａポリペプチドは、最初に、実施例１２において記載されるように、ＦＶＩＩａ濃度を決定するために、４−メチルウンベリフェリルｐ’−グアニジノベンゾエート（ＭＵＧＢ）を用いて活性部位滴定した。線形範囲におけるデータポイントの数を最大限にするために、アッセイにおけるＦＸの最高濃度を、２５ｎＭ（つまり０〜１５０ｎＭの代わりに０〜２５ｎＭ）に設定した。アッセイにおいて使用したＦＸは、下記の実施例１５において記載されるように、活性化し（つまりＦＸａ）、フルオレスセイン−モノ−ｐ’−グアニジノベンゾエート（ＦＭＧＢ）を用いて滴定した。Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ ＦＸａ基質の切断についての反応速度定数は、この活性部位滴定ＦＸａについて決定し、１９０．２μＭのＫ_ｍおよび３４０ｓ^−１のｋ_ｃａｔであることが実証された。主要な差異はｋ_ｃａｔにおけるものであり、ほとんど、改善された活性部位決定によるものである。これらのパラメーターは、ＴＦの存在下におけるＦＶＩＩａポリペプチドの触媒活性を決定するために線形分析において使用される２４６．４の修正ｋ_２補正係数値を与える。

ＴＦ非依存性触媒アッセイについては、ＦＶＩＩａポリペプチドは、最初に、下記実施例１２において記載されるように、ＦＶＩＩａ濃度を決定するために、４−メチルウンベリフェリルｐ’−グアニジノベンゾエート（ＭＵＧＢ）を用いて活性部位滴定した。アッセイにおいて使用したＦＸは、実施例１５において記載されるように、活性化し（つまりＦＸａ）、フルオレスセイン−モノ−ｐ’−グアニジノベンゾエート（ＦＭＧＢ）を用いて滴定した。Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ ＦＸａ基質の切断についての反応速度定数は、この活性部位滴定ＦＸａについて決定し、１９０．２μＭのＫ_ｍおよび３４０ｓ^−１のｋ_ｃａｔであることが実証された。これらのパラメーターは、ＴＦの非存在下におけるＦＶＩＩａポリペプチドの触媒活性を決定するために分析において使用される２４６．４の修正ｋ_２補正係数値を与える。

表１５は、アッセイしたＦＶＩＩａ変異体ポリペプチドのそれぞれの触媒活性を記載する。結果は、触媒活性についての反応速度定数、ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ（Ｍ^−１秒^−１）として示し、野生型ＦＶＩＩａの活性の割合としても表現し、活性は、触媒活性、その基質、ＦＸに対するそれぞれのＦＶＩＩａ変異体のｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ（Ｍ^−１秒^−１）である。標準偏差（ＳＤ）、変動係数（百分率として；％ＣＶ）、および実行したアッセイの数（ｎ）もまた提供する。変異体のいくつかは、野生型ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、著しく増加した触媒活性を示す。たとえば、Ｇｌａ ｓｗａｐ ＦＩＸ／Ｑ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ変異体は、野生型ＦＶＩＩポリペプチドの６倍を超えるＴＦ依存性触媒活性を示した。ＦＶＩＩａ変異体の増加した触媒活性は、ＴＦ非依存性アッセイにおいて、より明白であった。たとえば、Ｇｌａ ｓｗａｐＦＩＸ／Ｑ３６６Ｖ変異体は、野生型ＦＶＩＩａの９倍を超える触媒活性を有し、Ｇｌａ ｓｗａｐ ＦＩＸ／Ｑ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ、｛Ｇｌａ ｓｗａｐ ＦＩＸ／Ｅ４０Ｌ｝／Ｑ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ、｛Ｇｌａ ｓｗａｐ ＦＩＸ／Ｋ４３Ｉ｝／Ｑ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ、および｛Ｇｌａ ｓｗａｐ ＦＩＸ／Ｑ４４Ｓ｝／Ｑ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ変異体は、野生型ＦＶＩＩａの７０〜８０倍を超える触媒活性を有し、Ｓ５２Ａ／Ｓ６０Ａ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ１２９８Ｑ変異体は、野生型ＦＶＩＩａの２２０倍を超える触媒活性を有した。

実施例５
ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンによる、ＦＶＩＩａ／ＴＦまたはＦＶＩＩａの阻害の決定
可溶性組織因子（ｓＴＦ）の存在下または非存在下における、つまり、ＴＦ依存性またはＴＦ非依存性の、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体およびＦＶＩＩａの間の相互作用の作用強度は、基質、メシル−ＦＰＲ−ＡＣＣに対するＦＶＩＩａ／ｓＴＦの触媒活性について、ＡＴ−ＩＩＩの様々な濃度の阻害のレベルを測定することによって評価した。Ｋ_０．５値は、試験したそれぞれのＦＶＩＩａ変異体について決定し、これは、室温（約２５°）での３０分間のアッセイにおいてＦＶＩＩａ変異体の５０％阻害（ＩＣ_５０）に必要とされる、ＡＴ−ＩＩＩのモル濃度に対応する。

２つの別々のアッセイを調製し、一方はｓＴＦを用い、一方はｓＴＦを用いなかった。ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンの２μＭ溶液（最終５μＭヘパリン）は、２６．４μＬの１５１．７μＭ ＡＴ−ＩＩＩ（血漿精製ヒトＡＴ−ＩＩＩ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）を、５０μＬの０．２ｍＭ ＬＭＷヘパリン（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）、４００μＬの５×アッセイ緩衝液（１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．０５％ＢＳＡ、０．５％ＰＥＧ ８０００、ｐＨ７．４）、および１．５２３ｍｌの試薬グレードの水と混合することによって調製した。この溶液は、ＴＦ依存性アッセイにおける最も高度な濃度として使用した。４μＭ ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンを含有する溶液（最終５μＭヘパリン）は、５２．８μＬの１５１．７μＭ ＡＴ−ＩＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）を、５０μＬの０．２ｍＭ ＬＭＷヘパリン（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）、４００μＬの５×アッセイ緩衝液、および１．４９７ｍｌの試薬グレードの水と混合することによって、ＴＦ非依存性のアッセイにおいて使用するために調製した。ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン溶液は、室温で、５〜１０分間、インキュベートし、次いで、５μＭヘパリンを含有する１ｍｌの最終容量を有する９６深型ウェルポリプロピレンプレートにおいて２倍希釈し、２０００、１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、および０ｎＭまたは４０００、２０００、１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、および０ｎＭの希釈溶液がもたらされた。ＦＶＩＩａ変異体および野生型ＦＶＩＩａは、１×アッセイ緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．０１％ＢＳＡ、０．１％ＰＥＧ ８０００、ｐＨ７．４）において２５０ｎＭに希釈した。ＴＦ依存性アッセイについては、５ｎＭ ＦＶＩＩａ／５０ｎＭ ｓＴＦ複合体は、２０μＬのＦＶＩＩａを、１０μＬの５μＭ ｓＴＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓヒト第ＩＩＩ凝固因子：＃２３３９−ＰＡ）、２００μＬ ５×アッセイ緩衝液、および７７０μＬの試薬グレードの水と混合し、室温で、１０〜１５分間、溶液をインキュベートすることによって、形成した。ＴＦ非依存性アッセイについては、１００μＬのＦＶＩＩａは、２００μＬ ５×アッセイ緩衝液および７００μＬの試薬グレードの水と混合し、ＦＶＩＩａの２５ｎＭ溶液を産生した。アッセイを始めるために、２５μＬのＦＶＩＩａ／ＴＦ溶液またはＦＶＩＩａのみの溶液は、９６ウェル黒色ハーフエリアアッセイプレート（Ｎｕｎｃ）のウェルにおいて、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンのそれぞれの希釈溶液の２５μＬと別々に混合した。ＴＦ依存性アッセイについての最終アッセイ条件は、２．５ｎＭ ＦＶＩＩａ／２５ｎＭ ｓＴＦおよび１０００ｎＭ〜０ｎＭの範囲のＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン濃度であった。ＴＦ非依存性のアッセイについては、ＦＶＩＩａ濃度は、１２．５ｎＭ ＦＶＩＩａであり、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン濃度は、２０００ｎＭ〜０ｎＭの範囲であった。プレートは、室温（約２５℃）で振盪しながら、３０分間、インキュベートした。

ＦＶＩＩａ基質（メシル−ＦＰＲ−ＡＣＣ）のストック溶液は、２０ｍＭにＤＭＳＯにおいて基質を溶解し、次いで、１×アッセイ緩衝液において０．５ｍＭの希釈標準溶液を調製することによって調製した。上記からのアッセイプレートのインキュベーションの後に、５０μｌのＦＶＩＩａ基質を、アッセイプレートのそれぞれのウェルに添加した。反応液を、混合し、ＦＶＩＩａの残存活性を、３０℃に設定した蛍光発光リーダーにおいて１５分間、基質切断の初速度に従って評価した。

ＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩａ変異体に対するＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンによる阻害の程度を決定するために、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏアプリケーション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて収集した生データを、．ＸＭＬファイルとしてエクスポートした。さらなる非線形データ分析は、ＸＬｆｉｔ４、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌスプレッドシート環境内での自動カーブフィッティングおよび統計分析のためのソフトウェアパッケージを用いて実行した（ＩＤＢＳソフトウェア）。スプレッドシートテンプレートは、ＡＴ−ＩＩＩ希釈溶液系列、ＦＶＩＩａに対するＡＴ−ＩＩＩの比、およびそれぞれの実験的ＡＴ−ＩＩＩ濃度でのそれぞれのＦＶＩＩａ反復実験についてのＶｉ／Ｖｏ比を計算するために使用した。残存ＦＶＩＩａ活性（Ｖｉ／Ｖｏとして表現）対ＡＴ−ＩＩＩ濃度の非線形回帰分析は、ＸＬｆｉｔ４および式（Ｃ＋（Ａｍｐ＊（１−（Ｘ／（Ｋ_０．５＋Ｘ）））））の双曲線阻害式を使用して、処理した。ここで、Ｃ＝オフセット（アッセイの過程の間に１００％に阻害を達しないデータセットの補外を可能にするために０に固定）、Ａｍｐ＝フィットの振幅（ｔｈｅ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｔ）、およびアッセイ条件下での最大の半分の阻害に必要とされるＡＴ−ＩＩＩの濃度に対応するＫ_０．５。いくつかのＦＶＩＩａ変異体については、ＡＴ−ＩＩＩは、ＡＴ−ＩＩＩの最も高度な試験濃度で、全プロテアーゼ活性の２０〜２５％未満を阻害し、アッセイについての検出の上限を表した。２０〜２５％未満の最大の阻害を有する変異体は、そのため、下限Ｋ_０．５値に割り当てられ（ＴＦ依存性については５μＭ、ＴＦ非依存性については１０μＭ）、ほとんどの場合において、報告された値よりも大きなＡＴ−ＩＩＩ抵抗性を有することが予想される。

表１６および１７は、それぞれＴＦの存在下および非存在下において、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標） ２９３−Ｆ細胞および／またはＢＨＫ−２１細胞において発現したＦＶＩＩａ変異体を使用して実行したアッセイの結果を提供する。結果は、共に、フィットＫ_０．５パラメーターとしておよびそれらのフィットＫ_０．５値の比（Ｋ_０．５変異体／Ｋ_０．５野生型）として表現される、野生型ＦＶＩＩａと比較した、それぞれの変異体についてのＡＴ−ＩＩＩ抵抗性の程度の説明として示される。いくつかのＦＶＩＩａ変異体は、野生型ＦＶＩＩａと比較して、ＡＴ−ＩＩＩに対する増加した抵抗性を示す。たとえば、Ｑ２８６Ｒ−ＦＶＩＩａ（つまりＱ２８６Ｒ突然変異を含有するＦＶＩＩａ）、Ｑ２８６Ｒ／Ｓ２２２Ａ−ＦＶＩＩａ、Ｑ２８６Ｒ／Ｓ２２２Ａ／Ｇｌａ Ｓｗａｐ ＦＩＸ−ＦＶＩＩａ、Ａ１７５Ｓ／Ｑ２８６Ｒ／Ｑ３６６Ｖ−ＦＶＩＩａ、Ｑ２８６Ｍ−ＦＶＩＩａ、Ｑ２８６Ｌ−ＦＶＩＩａ、およびＱ２８６Ｙ−ＦＶＩＩａは、野生型ＦＶＩＩａよりも４倍以上大きな、ＴＦの非存在下におけるＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性を示すグループの中にある。

さらなるセットの実験は、少し改変した、上記に記載されるものと同じアッセイを使用して、ＴＦの非存在下において、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンによるＦＶＩＩａ変異体の阻害を評価するために実行した。完全長の未分画のヘパリン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）は、阻害反応の速度を増加させるために、低分子ヘパリン（ＬＭＷヘパリン）の代わりに使用した（たとえばOlson et al. (2004) Thromb Haemost 92(5), 929-939を参照されたい）。アッセイのインキュベーション時間は、６０分まで増加し、残存活性を確かめるために使用したメシル−ＦＰＲ−ＡＣＣ基質の濃度は、０．５ｍＭの最終濃度まで増加させた。

表１８は、ＢＨＫ−２１細胞およびＣＨＯＸ細胞において発現したＦＶＩＩａ変異体を使用する、ＴＦの非存在下において実行したアッセイの結果を提供する。結果は、共に、フィットＫ_０．５パラメーターとしておよびそれらのフィットＫ_０．５値の比（Ｋ_０．５突然変異体／Ｋ_０．５野生型）として表現される、野生型ＦＶＩＩａと比較した、それぞれの変異体についてのＡＴ−ＩＩＩ抵抗性の程度の説明として示される。標準偏差（ＳＤ）およびアッセイの数（ｎ）もまた示す。

実施例６
ＦＶＩＩａポリペプチド凝血促進活性のインビボ評価
血友病Ａのマウスモデルは、ＦＶＩＩａポリペプチドの凝血促進活性を評価するために確立した。血友病Ａは、抗ＦＶＩＩＩ抗体の腹腔内投与、その後に続く、出血を開始するための、尾部の先端の手術による除去によって、ＣＤ−１マウスにおいて誘発した。ＦＶＩＩＩが欠損しているマウス（ＦＶＩＩＩ^−／−マウス）もまた使用したが、抗ＦＶＩＩＩ抗体を用いて処置しなかった。次いで、マウスは、ＦＶＩＩａポリペプチドを用いて処置し、２０分間に失われた血液の量は、ＦＶＩＩａポリペプチドの凝血促進活性を決定するために測定した。

Ａ． 野生型ＦＶＩＩａ凝血促進活性のインビボ評価
血友病Ａのマウスモデルは、ＦＶＩＩａポリペプチドの凝血促進活性を評価するために確立した。血友病Ａは、抗ＦＶＩＩＩ抗体の投与、その後に続く、出血を開始するための、尾部の先端の手術による除去によって、ＣＤ−１マウスにおいて誘発した。次いで、マウスは、ＦＶＩＩａポリペプチドを用いて処置し、出血を停止させるためにかかった時間およびこの時間の間に失われた血液の量は、ＦＶＩＩａポリペプチドの凝血促進活性を決定するために測定した。

オスＣＤ−１マウスに、１００ｍｇ／ｋｇのチオバルビタールナトリウムおよび１００ｍｇ／ｋｇのケタミンの両方の腹腔内投与によって麻酔をかけた。リドカインは、感度を弱めるために、腹部の頸部への皮下注射によって投与した。自由な呼吸ならびに抗第ＶＩＩＩ因子抗体、組換えヒト第ＶＩＩａ因子（ｒｈＦＶＩＩａ）、および／または改変ＦＶＩＩポリペプチドの投与を容易にするために、気管および頸動脈に、頸部における小さな皮膚切開を通して、カニューレを挿入した。

カニューレを挿入したマウスに、４０μＬ中３．７６ｍｇ ヒツジ抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ロットＩＧ１２９Ｒ４、６１２マウスＢＵ／ｍｌ）を投与した。この用量は、抗体（０．３７６、０．９４、１．８８、および３．７６ｍｇの抗ヒトＦＶＩＩＩを使用）を用いる初回用量応答実験を行い、失血および出血時間を評価することによって、決定した。２０分後に、マウスの尾部は、１０分間、３９℃リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含有する１５ｍｌのチューブ中に配置した。３０分で、尾部は、ＰＢＳ溶液から短い間、取り出し、尾部の先の５ｍｍを、出血を開始させるために切断した。出血が始まった時間を記録した。次いで、尾部は、３９℃ＰＢＳを含有するチューブに戻し、マウスが抗ＦＶＩＩＩ抗体に応答したことを保証するために、５分間（前出血）、出血させた。前出血の後に、マウスに、ＦＶＩＩａポリペプチドまたはＦＶＩＩａタンパク質が、調製され、送達される媒体を投与した。ＦＶＩＩａポリペプチドは、ＰＢＳまたは５２ｍＭ塩化ナトリウム、１０．２ｍＭ塩化カルシウム無水物、９．８４ｍＭグリシルグリシン、０．０１％ポリソルベート８０、および１６５ｍＭマンニトールから構成される緩衝液において希釈した。ＦＶＩＩａ調製物は、頸動脈のカニューレを介して、３ｍｌ／ｋｇに等しい容量で、１、３、または１０ｍｇ／ｋｇで投与し、尾部は、３９℃ＰＢＳを含有する新鮮なチューブ中に配置した。出血は、２０分間、モニターし、出血が停止した時間を記録した。総出血時間は、前出血の間の出血の継続期間およびＦＶＩＩａポリペプチドまたはＰＢＳもしくは緩衝液の投与の後の出血の継続期間の合計として計算した。

出血エピソードの間に失われた血液の量を決定するために、１５ｍｌチューブの含有量を、ヘモグロビン含有量についてアッセイした。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００は、滅菌水において１対４に希釈し、１００μＬを、溶血を引き起こすために１ｍｌのサンプルに添加した。次いで、サンプルの吸光度は、５４６ｎｍの波長で測定した。失われた血液の量を計算するために、吸光度は、ＰＢＳにおいて希釈し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００を用いて上記のように溶血させたマウス血液の知られている容量の、５４６ｎｍでの吸光度を測定することによって生成した標準曲線に対して読み取った。

実験は、上記記載されるように生成したｒｈＦＶＩＩａを、市販で入手可能な組換えヒトＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）と比較して行い、失血は、それぞれのタンパク質の３ｍｇ／ｋｇの用量の投与の後に評価した。媒体グループ（緩衝液、ｎ＝１５）における失血は、２０分間にわたり６７１．９±５７．８９μｌであった。これは、Ｃａｔａｌｙｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって産生されたｒｈＦＶＩＩａによって２６４．１±５６．５９μｌまで、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）によって２７３．７±５３．９３μｌまで低下した（ｎ＝１４）。この実験は、２つのタンパク質の間の同等性を実証した。

Ｂ． 誘発された血友病Ａを有するＣＤ−１マウスにおけるＦＶＩＩａ変異体の血液凝固活性の分析
最初の実験は、ＣＤ−１マウスにおいて血友病を誘発するために腹腔内経路によって与えられた場合に、抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体の必要とされる用量ならびに効果の時間および継続期間を決定するために実行した。抗ＦＶＩＩＩの第１のロット（ロット１；Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ロットＩＧ１２９Ｒ４）については、これは、最初に、上記に記載されるカニューレ挿入実験に使用した用量に基づくものとした。血友病の状態（２０分間のアッセイ期間にわたる、制御されていない出血）を引き起こすために決定した用量は、７．５４ｍｇ／マウス（８０μｌの９４．２５ｍｇ／ｍｌストック溶液）であった。このロットは、６１２マウスＢＵ／ｍｌの中和活性を有した。抗ヒトＦＶＩＩＩの第２のロット（ロット２；Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ロットＩＧ１５７７Ｒ２４７４、マウスＢＵ／ｍｌの中和活性）については、使用した用量は、１１．９８ｍｇ／マウス（１２０μｌの９９．８ｍｇ／ｍｌストック溶液）であり、尾部切断の６時間前に投与した。

血友病を誘発するために、オスＣＤ−１マウス（２５〜３５ｇ）に、実験前に、抗ＦＶＩＩＩのロット１またはロット２を腹腔内に投薬した。オスＣＤ−１マウスおよびＦＶＩＩＩ^−／−マウスに、ケタミン／キシラジンカクテル（生理食塩水中、それぞれ４５ｍｇ／ｍｌおよび３．６ｍｇ／ｍｌ）の腹腔内投与によって麻酔をかけ、体温の低下がなかったことを保証するために、加熱したプラットフォーム（３９℃）上に配置した。手技室は、８２°Ｆの温度に保った。尾部切断の１０分間前に、尾部は、１０ｍｌのあらかじめ暖めたＰＢＳ（１５ｍｌ遠心分離管；３９℃）中に浸した。８〜１０匹のマウスに、単一投与において、尾部静脈を介して、５２ｍＭ塩化ナトリウム、１０．２ｍＭ塩化カルシウム無水物、９．８４ｍＭグリシルグリシン、０．０１％ポリソルベート８０、および１６５ｍＭマンニトールから構成される緩衝液において希釈した組換えヒトＦＶＩＩａ（Ｎｏｖｏｓｅｖｅｎ（登録商標）、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）または改変ＦＶＩＩポリペプチドを注射した。媒体のみもまた、コントロールとしてのマウスのグループに注射した。注射が失敗した場合、動物を研究から除いた。ＦＶＩＩａポリペプチドまたは媒体を用いる注射は、尾部切断の５分間前に行った。尾部切断は、尾部の末端から５ｍｍでカミソリ刀を使用して行い、血液は、２０分間、ＰＢＳの中に収集した。収集期間の終わりに、失血の合計を評価した。収集チューブを混合し、それぞれのサンプルの１ｍｌの一定分量を採取し、ヘモグロビン含有量についてアッセイした。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００は、滅菌水において１対４に希釈し、１００μＬを、溶血を引き起こすために１ｍｌサンプルに添加した。次いで、サンプルの吸光度は、５４６ｎｍの波長で測定した。失われた血液の量を計算するために、吸光度は、ＰＢＳにおいて希釈し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００を用いて上記のように溶血させたマウス血液の知られている容量の、５４６ｎｍでの吸光度を測定することによって生成した標準曲線に対して読み取った。

１． 野生型ＦＶＩＩａ血液凝固活性を評価する用量応答研究
０．３、１、または３ｍｇ／ｋｇの野生型ＦＶＩＩａを評価した用量応答研究もまた、実行した。媒体を受けたマウスは、２０分間のアッセイにおいて、１００２．３±６０．７１μＬを失った。これは、３ｍｇ／ｋｇの野生型ＦＶＩＩａを投与したマウスにおいて４１５．５±９０．８５μＬまで有意に低下した（ｐ＜０．０５、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、その後に続いてＤｕｎｎ事後検定を使用）。１ｍｇ／ｋｇへの用量の低下は、６７９．５７±８３．９５μＬの失血をもたらし、より低用量０．３ｍｇ／ｋｇは、８５２．４２±９４．４６μＬの失血をもたらした。

２． ＦＶＩＩａ変異血液凝固活性の最初の分析
媒体のみの注射は、コントロールとして使用した。媒体のみを受けたマウスは、２０分間のアッセイにおいて９１５．２±１０５．６μＬを失い、これは、マウスに組換えヒトＦＶＩＩａを投与した場合、３５２±９９．８６μＬ（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ）まで低下した。失われた血液の量は、マウスにＱ２８６Ｒ−ＦＶＩＩａ（つまりＱ２８６Ｒ突然変異を含有するＦＶＩＩａ）を投与した場合、１６５．８±４８．４１μＬまで、Ｑ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａで１４１．３±４３．７７μＬまで、またはＶ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａで１２９．５±３６．６４μＬまでさらに低下した。Ｓ２２２Ａ−ＦＶＩＩａを投与したマウスもまた、野生型ＦＶＩＩａを投与したマウスと比較して、低下した失血（２２５．７±６２．７５μＬまで）を示した。Ｇｌａ Ｓｗａｐ ＦＩＸ−ＦＶＩＩａ、Ｑ３６６Ｖ−ＦＶＩＩａ、またはＡ１２２Ｎ／Ｇ１２４ＳＦＶＩＩａの投与は、組換えヒトＦＶＩＩａを与えたマウスにおいて観察されるものと、およそ同じ量の失血をもたらしたが（それぞれ３３４．６±５４．９５μＬ、３２１．７±１０２．６μＬ、および３２９．８±８３．９１μＬ）、Ｈ２５７Ａ−ＦＶＩＩａ、Ｓ２２２Ａ／Ｑ２８６Ｒ−ＦＶＩＩａ、またはＨ２５７Ａ−ＦＶＩＩａを投与したマウスは、わずかに多い失血を有するように思われた（それぞれ、３９０±１０７μＬ、４４７．３±１２７．７μＬ、および４４３．７±１３９．５μＬ）。

３． ＦＶＩＩａ変異体血液凝固活性を評価する用量応答
０．１、０．３、１、または３ｍｇ／ｋｇのＱ２８６−Ｒ−ＦＶＩＩａ、Ｓ２２２Ａ−ＦＶＩＩａ、Ｑ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａ、またはＶ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａをマウスに投与した用量応答研究。媒体のみを受けたマウスは、２０分間のアッセイにおいて９１５．２±１０５．６μＬの血液を失った。これは、Ｑ２８６Ｒ−ＦＶＩＩａ（１４１．３±４３．７７μＬ）、Ｓ２２２Ａ−ＦＶＩＩａ（２２５．７±６２．７５μＬ）、またはＱ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａ（１２９．５±３６．６４μＬ）のいずれかの３ｍｇ／ｋｇを投与したマウスにおいて有意に低下した（ｐ＜０．０５、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、その後に続いてＤｕｎｎ事後検定を使用）。１ｍｇ／ｋｇへの用量の低下は、Ｑ２８６Ｒ−ＦＶＩＩａを受けたマウスにおいて６４１±９６．４８μＬおよびＳ２２２Ａ−ＦＶＩＩａを受けたマウスにおいて４８７．９２±９２．０７μＬの失血をもたらした。より低い用量のこのＦＶＩＩａ変異体は、媒体コントロールを受けたマウスにおいて観察されたものとおよそ同じ失血をもたらした（それぞれ、Ｑ２８６Ｒ−ＦＶＩＩａおよびＳ２２２Ａ−ＦＶＩＩａについて８１７．７１±１０７．９４μＬおよび９００．３４±１１５．７７μＬ）。対照的に、１ｍｇ／ｋｇのＱ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａを受けたマウスは、媒体のみのコントロールマウスと比較して、失血を有意に低下させた（６９．３６±１５．５５μＬ）。０．３ｍｇ／ｋｇおよび０．１ｍｇ／ｋｇのより低い用量では、失血は、それぞれ、５３８．３±９４．０４μＬおよび６６４±１２１．６μＬであった。０．３、１、および３ｍｇ／ｋｇのＶ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａを受けるマウスは、それぞれ、７５４．４９±１２１．６μＬ、４８１．９５±１１４．２２μＬ、および１３３．２５±５０．０９μＬの失血を有した。

さらなる用量応答研究を、Ｑ２８６Ｒ−ＦＶＩＩａ、Ｑ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａ、およびＶ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａについて実行し、データを、上記のものと組み合わせた。Ｑ２８６Ｒ−ＦＶＩＩａの効果を評価する実験において、媒体を受けたグループは、８３３．６１±７３．９５μＬの血液を失った。これは、３ｍｇ／ｋｇのＱ２８６Ｒ−ＦＶＩＩａを用いて処置したマウスにおいて１９６．７１±４９．１８μＬまで有意に低下した。１ｍｇ／ｋｇへの用量の低下は、５７７．７８±６６．２９μＬの失血をもたらした。マウスに、０．１および０．３ｍｇ／ｋｇのＱ２８６−ＲＦＶＩＩａを投薬した場合、もたらされた失血は、媒体コントロール値（それぞれ、７３９．５８±１０４．２８μＬおよび８０６．６３±６５．１７μＬ）に類似した。Ｑ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａの効果を評価する実験において、媒体グループは、９０２．４２±８８．０４μＬの失血をもたらし、これは、１および３ｍｇ／ｋｇのＱ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａを用いる処置によって、１４５．１７±３８．８９μＬおよび１４０．７６±３３．３６μＬの失血まで有意に低下した。０．１および０．３ｍｇ／ｋｇへの用量の低下は、それぞれ、６６４．０３±１２１．６２μＬおよび５５１．９４±６７．６０μＬの失血値をもたらした。Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａを評価する実験において、媒体コントロールグループは、９６６．６４±５７．９７μＬの失血を実証し、これは、３ｍｇ／ｋｇのＶ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａを用いる処置によって、１２８．１９±２７．７３μＬまで有意に低下した。１ｍｇ／ｋｇへの用量の低下は、５６５．５０±６５．７８μＬの失血に至り、０．３および０．１ｍｇ／ｋｇへのさらなる用量の低下は、コントロールグループに類似した失血をもたらした（８１１．１６±７１．８７μＬおよび８９３．６２±１０６．７３μＬ）。統計分析は、Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ、その後に続くＤｕｎｎ事後検定によって行い、有意性は、ｐ＜０．０５の場合、許容された。

４． 用量３ｍｇ／ｋｇのＨ２１６Ａ−ＦＶＩＩａ、Ｈ３７３Ｆ−ＦＶＩＩａ、Ｑ３６６Ｄ−ＦＶＩＩａ、およびＱ３６６Ｎ−ＦＶＩＩａの血液凝固活性
実験の１セットにより、用量３ｍｇ／ｋｇのＨ２１６Ａ−ＦＶＩＩａ、Ｈ３７３Ｆ−ＦＶＩＩａ、Ｑ３６６Ｄ−ＦＶＩＩａ、およびＱ３６６Ｎ−ＦＶＩＩａを試験した。媒体のみの注射は、コントロールとして使用した。媒体を受けたマウスは、２０分間のアッセイにおいて９１５．２±１０５．６μＬを失った。マウスをＨ３７３Ｆ−ＦＶＩＩａを用いて処置した場合、これは、２１１．１±６７．７０μＬまでさらに低下した。失血は、Ｈ２１６Ａ−ＦＶＩＩａ、Ｑ３６６Ｄ−ＦＶＩＩａ、およびＱ３６６Ｎ−ＦＶＩＩａを用いる処置に際してそれほど影響を及ぼされず、それぞれ、５５８．６±６６．２２、５７７．１±１５１．４、および４７７．１±１１２．６μＬの値であった。

４． 用量３ｍｇ／ｋｇのＱ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ／Ｇｌａ ｓｗａｐ ＦＩＸ−ＦＶＩＩａ、Ｓ２２２Ａ／Ｈ２５７Ａ／Ｑ２８６Ｒ／Ｍ１５８Ｑ−ＦＶＩＩａ、Ｑ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３４１Ｄ−ＦＶＩＩａ、およびＱ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ／Ｈ３７３Ｆ−ＦＶＩＩａの血液凝固活性
用量３ｍｇ／ｋｇのＱ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ／Ｇｌａ ｓｗａｐ ＦＩＸ−ＦＶＩＩａ、Ｓ２２２Ａ／Ｈ２５７Ａ／Ｑ２８６Ｒ／Ｍ１５８Ｑ−ＦＶＩＩａ、Ｑ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３４１Ｄ−ＦＶＩＩａ、およびＱ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ／Ｈ３７３Ｆ−ＦＶＩＩａの血液凝固活性を、ＣＤ−１血友病マウスモデルにおいて評価した。媒体のみの注射は、コントロールとして使用した。媒体を受けたマウスは、２０分間のアッセイにおいて８０３±９２．１８μＬを失った。これは、Ｓ２２２Ａ／Ｈ２５７Ａ／Ｑ２８６Ｒ／Ｍ１５８Ｑ−ＦＶＩＩａを用いる処置によって１１８．６±６３．２７μＬまで低下した。３ｍｇ／ｋｇのＱ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ／Ｇｌａ ｓｗａｐ ＦＩＸ−ＦＶＩＩａを用いる処置は、媒体グループと比較して、８８８．８９±１０４．７６μＬから１７１．８３±６２．０６μＬに、失血を低下させた。Ｑ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３４１Ｄ−ＦＶＩＩａおよびＱ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ／Ｈ３７３Ｆ−ＦＶＩＩａを評価する実験において、媒体グループからの失血は、８１３．１±８２．６６μＬであった。これは、Ｑ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ／Ｈ３７３Ｆ−ＦＶＩＩａを用いる処置の後に、３９．４２±５．５３μＬの失血まで低下した。Ｑ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３４１Ｄ−ＦＶＩＩａは、アッセイにおいてそれほど有効でないように思われ、６３６．７±１２１．６μＬの失血をもたらした。

５． Ｓ２２２Ａ／Ｈ２５７Ａ／Ｑ２８６Ｒ／Ｍ１５８Ｑ−ＦＶＩＩａおよびＱ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ／Ｈ３７３Ｆ−ＦＶＩＩａの血液凝固活性を評価するための用量応答研究
０．３、０．５、１、および３ｍｇ／ｋｇのＳ２２２Ａ／Ｈ２５７Ａ／Ｑ２８６Ｒ／Ｍ１５８Ｑ−ＦＶＩＩａに対する用量応答を、評価した。媒体を受けたマウスは、２０分間のアッセイにおいて８３２．４８±７１．７０μＬを失った。これは、３ｍｇ／ｋｇのＳ２２２Ａ／Ｈ２５７Ａ／Ｑ２８６Ｒ／Ｍ１５８Ｑ−ＦＶＩＩａを投与したマウスにおいて１１８．６３±６３．２７μＬまで有意に低下した（ｐ＜０．０５、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、その後に続いてＤｕｎｎ事後検定を使用）。１および０．５ｍｇ／ｋｇへの用量の低下は、失血における有意な低下をもたらし（２０２．６９±７７．６０μＬおよび３６６．５２±１０６．２１μＬ）、より低用量の０．３ｍｇ／ｋｇは、媒体レベルと比較してより多くの失血をもたらした（７４２．０４±１１２μＬ）。０．１、０．３、１、および３ｍｇ／ｋｇのＱ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ／Ｈ３７３ＦＦ−ＶＩＩａに対する用量応答もまた、評価し、この実験において、媒体を受けたマウスは、８１３．１５±８２．６６μＬの失血を有した。これは、３ｍｇ／ｋｇのＱ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ／Ｈ３７３Ｆ−ＦＶＩＩａを用いて処置したマウスにおいて３９．４２±５．５２μＬまで有意に低下した（ｐ＜０．０５、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、その後に続いてＤｕｎｎ事後検定を使用）。１および０．３ｍｇ／ｋｇへの用量の低下は、２０８．１０±１０５．１２および５０８．９±１５５．８μＬの失血値にそれぞれ至った。試験した最も低用量の０．１ｍｇ／ｋｇは、媒体コントロールレベルに近似する失血をもたらした（７３３．５±１５２．８８μＬ）。

Ｃ． ＦＶＩＩＩ^−／−マウスにおけるＦＶＩＩａ血液凝固活性の分析
ＦＶＩＩＩが欠損したマウス（ＦＶＩＩＩ^−／−マウス）を使用する血友病Ａのマウスモデルはまた、マウスを抗ＦＶＩＩＩ抗体を用いて処置しなかった以外は、上記に記載されるのと同じプロトコールを使用して、ＦＶＩＩａポリペプチドの血液凝固活性を評価するためにも使用した。

１． 野生型ＦＶＩＩａ血液凝固活性を評価する用量応答研究
０．３、１、３、および６ｍｇ／ｋｇのＦＶＩＩＩ^−／−マウスにおけるＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）および野生型ｒｈＦＶＩＩａの血液凝固活性を評価するための用量応答研究を、実行した。ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）実験において、媒体グループにおける失血は、９１２．７９±３８．３２μＬであり、これは、６および３ｍｇ／ｋｇのＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）処置によって有意に低下した（３６１．７４±５５．２８μＬおよび５８６．９８±６０．５６μＬまで；ｐ＜０．０５、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、その後に続いてＤｕｎｎ事後検定を使用）。１ｍｇ／ｋｇへの用量の低下は、６７４．８４±４６．８８μＬの失血をもたらし、試験した最も低用量で、値は、８０１．０８±４１．３９μＬであった。野生型ｒｈＦＶＩＩａ実験において、媒体コントロールグループは、９０４．０８±１５．３８μＬの失血をもたらした。これは、６ｍｇ／ｋｇの野生型ｒｈＦＶＩＩａによって、４５１．０４±７４．１７μＬまで有意に低下した（ｐ＜０．０５、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、その後に続いてＤｕｎｎ事後検定を使用）。３ｍｇ／ｋｇへの用量の低下は、６９５．７５±６０．５０μＬの失血値をもたらしたが、１および０．３ｍｇ／ｋｇへの用量の低下は、媒体コントロールレベルの近くのおよびコントロールレベルの失血値をもたらした（それぞれ、８４６．０８±３４．１７μＬおよび９３６．４３±３１．３９μＬ）。

２． Ｑ１４３Ｒ−ＦＶＩＩａ、Ｓ２２２Ａ−ＦＶＩＩａ、Ｑ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａ、およびＶ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａ血液凝固活性を評価する用量応答
実験の第１のセットは、３ｍｇ／ｋｇの組換えヒトＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａ、Ｑ２８６Ｒ−ＦＶＩＩａ、およびＳ２２２Ａ−ＦＶＩＩａを試験した。媒体のみの注射は、コントロールとして使用した。媒体を受けるマウスは、２０分間のアッセイにおいて９４２．９±２７．３７μＬの失血を有した。ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａ、Ｑ１４３Ｒ−ＦＶＩＩａ、およびＳ２２２Ａ−ＦＶＩＩａを用いる処置は、失血を、それぞれ４６８±５５．９μＬ、３０２．３８±７３．１２μＬ、６９７．２６±９２．２２μＬ、および６７５．０７±３５．２９μＬまで低下させた。Ｑ１４３Ｒ−ＦＶＩＩａは、３ｍｇ／ｋｇでＦＶＩＩＩ^−／−マウスにおいて再度試験した場合、媒体コントロールグループ（９３５．５４±５１．９６μＬ）と比較して、７５４．８４±６０．９６μＬの失血の低下を実証した。５ｍｇ／ｋｇで評価した場合、Ｑ１４３Ｒ−ＦＶＩＩａは、媒体コントロールグループ（９６０．４２±２４．５μＬ）と比較して、４４５．８７±７９．６２μＬまでの失血におけるさらなる低下をもたらした。

実験の第２のセットは、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａおよびＱ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａを、０．３、１、および３ｍｇ／ｋｇで評価した用量応答研究とした。３ｍｇ／ｋｇのＶ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａを用いる処置は、媒体コントロールと比較して（９６０．４２±２４．５μＬ；ｐ＜０．０５、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、その後に続いてＤｕｎｎ事後検定を使用）、失血における有意な低下をもたらした（３７５．６２±７４．２２μＬ）。１および０．３ｍｇ／ｋｇへの用量の低下は、それぞれ８３４．７６±５４．３８μＬおよび８４１．６２±６８．９９μＬの、コントロールレベルの近くの失血値に至った。Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａの異なるロットを評価した第２の実験は、９１２．７９±３８．３２μＬの媒体コントロール失血値をもたらし、これは、３および１ｍｇ／ｋｇで有意に阻害された（２４７．２４±３５．１７μＬおよび６２８．３０±３７．３６μＬ；ｐ＜０．０５、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、その後に続いてＤｕｎｎ事後検定を使用）。より低用量のＶ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａを用いる処置は、コントロール値（８４１．８５±１９．３２μＬ）に近似する失血をもたらした。ＦＶＩＩＩ^−／−マウスにおけるＱ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａの効果を評価する実験において、媒体グループは、９４１．３９±３５．１８μＬの失血をもたらした。これは、３ｍｇ／ｋｇの用量で有意に阻害され、２５８．９２±５９．８２μＬの失血をもたらした。１および０．３ｍｇ／ｋｇのより低用量で、もたらされた失血のレベルは、それぞれ６１６．８２±７８．４３μＬおよび９２４．９±３８．０１μＬであった。

Ｄ． 誘発された血友病モデルの使用における、さらなるＦＶＩＩａ変異体の血液凝固活性の分析
いくつかのＦＶＩＩａ変異体の血液凝固活性は、上記の実施例６．Ｂにおいて記載されるＣＤ−１マウスを用いて誘発された血友病モデル（ＩＨＭ）を使用して評価した。プロトコールは、Ｔ１２８Ｎ／Ｐ１２９Ａ−ＦＶＩＩａ変異体およびＭ１５６Ｑ／Ｈ２２４Ｆ−ＦＶＩＩａ変異体の評価を除いて、上記に記載されるものと同じものとし、ヒト抗ＦＶＩＩＩの異なるロット（それぞれ第３および第４）を使用した。抗ヒトＦＶＩＩＩの第３のロット（ロット３；Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ロットＩＧ１６０３Ｒ１、４１８マウスＢＵ／ｍｌの中和活性）については、使用した用量は、１２．１７ｍｇ／マウス（１２０μｌの１０１．４ｍｇ／ｍｌストック溶液）とし、これは、尾部切断の１８時間前に投与した。抗ヒトＦＶＩＩＩの第４のロット（ロット４；Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ロットＩＧ１６３９Ｒ１、８７５マウスＢＵ／ｍｌの中和活性）については、使用した用量は、８．０４ｍｇ／マウス（８０μｌの１００．４５ｍｇ／ｍｌストック溶液）とした。失血は、上記に記載されるように測定し、阻害パーセント（所望の変異体についての平均値を使用し、媒体グループによって割って計算）およびＥＤ５０値（それぞれ媒体処置動物および正常コントロール動物を用いて観察された失血を用いて応答曲線の上部および下部を制限する非線形回帰分析を使用して決定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．を使用））として表１９において下記に示す。

Ｅ． 誘発された血友病モデルの使用における、さらなるＦＶＩＩａ変異体の血液凝固活性の分析
いくつかのＦＶＩＩａ変異体の血液凝固活性は、上記の実施例６．Ｂにおいて記載されるＣＤ−１マウスを用いて誘発された血友病モデル（ＩＨＭ）を使用して評価した。プロトコールは、これらの実験について、抗ＦＶＩＩＩのロット４〜６を使用した以外は、上記に記載されるものと同じものとした。これらのロットについての詳細は、以下のとおりであった：ロット４（上記に詳述）、第５のロット（ロット５；Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ロットＩＧ１５９３Ｒ２、２５５マウスＢＵ／ｍｌの中和活性）については、使用した用量は、１２．２５ｍｇ／マウス（１２０μｌの１０２．１ｍｇ／ｍｌストック溶液）とし、これは、尾部切断の６時間前に投与した。第６のロット（ロット６；Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ロットＩＧ１７０３Ｒ２、６８５マウスＢＵ／ｍｌの中和活性）については、使用した用量は、８．０２ｍｇ／マウス（８０μｌの１００．２ｍｇ／ｍｌストック溶液）とし、これは、実験前日の午後４時に投与した。失血は、上記に記載されるように測定し、阻害パーセント（所望の変異体についての平均値を使用し、媒体グループによって割って計算）それぞれの場合において、用量はすべて、下記の対応する阻害値と一緒に示す、およびＥＤ５０値（それぞれ媒体処置動物および正常コントロール動物を用いて観察された失血を用いて応答曲線の上部および下部を制限する非線形回帰分析を使用して決定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．を使用））として表２０において下記に示す。「ｎ／グループ」は、グループ当たりのマウスの総数を指すのに対して、ＥＤ５０の計算に関する「ｎ」は、変異体を用いて実行した実験の総数を指す。

実施例７
小分子基質に対するＦＶＩＩａのアミド分解活性のミカエリス メンテン反応速度定数の決定
ＦＶＩＩ変異体のアミド分解活性は、ペプチジル基質Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａ（ＣＨ_３ＳＯ_２−Ｄ−ＣＨＡ−Ｂｕｔ−Ａｒｇ−ｐＮＡ．ＡｃＯＨ）に対するＦＶＩＩａポリペプチドのミカエリス メンテン反応速度定数を測定することによって評価することができる。そのようなアッセイは、以下のとおり実行することができる。

脂質付加ヒト精製組織因子（Ｉｎｎｏｖｉｎ、Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ、ＶＷＲ Ｃａｔ＃６８１００−３９０）は、ＦＶＩＩａの最適な活性を提供するためにアッセイにおいて含まれる。ＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体は、パラニトロアニリン−発色団（ｐＮＡ）を放出する高度に特異的な発色基質としてのＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａを切断し、これは、４０５ｎｍでの吸収を測定することによってモニターすることができる。酵素活性は、時間の関数として生成される遊離ｐＮＡの４０５ｎｍでの吸光度をモニターすることによって決定される。

反応は、３つの異なる酵素濃度で実行する。反応液については、ＦＶＩＩａ変異体は、１．７ｍｌチューブ（ＩＳＣ Ｂｉｏｅｘｐｒｅｓｓからの低粘着マイクロチューブ）において、１×ダイレクトアッセイ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．０１％ＢＳＡ）において４０ｎＭに最初に希釈する。ＦＶＩＩａは、以下のとおり、１２ウェルポリプロピレンリザーバー（Ａｘｙｇｅｎ）において２ｎＭに希釈することによってＴＦ（Ｉｎｎｏｖｉｎ、Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）の存在下においてさらに希釈する：７２０μｌ ５×ダイレクト緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．０５％ＢＳＡ）、１８０μｌ ４０ｎＭ ＦＶＩＩａ、および２７００μｌ ２×ＴＦ（１０ｍｌ水において再構成された６ｎＭストック溶液）。希釈したプロテアーゼは、室温で５分間、インキュベートする。ＦＶＩＩａの２ｎＭストックは、２倍系列希釈溶液においてさらに希釈して、またＴＦの存在下において、プロテアーゼの１ｎＭおよび０．５ｎＭストックをそれぞれ生じさせる。系列希釈反応液は、以下のとおりである：最初に、３６０μｌ ５×ダイレクト緩衝液、９００μｌ ２×ＴＦ、および５４０μｌ水の中に希釈された上記からの１８００μｌの２ｎＭストックのＦＶＩＩａ／ＴＦ。この希釈したストックを、ダイレクト緩衝液において、１８００μｌ １×ＴＦの中に１：１に再度希釈する。

基質Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）の希釈溶液プレートを、作製する。Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａのストック溶液を、蒸留水中５０μモル バイアルの１０ｍＭへの再構成によって作製し、４℃で保管する。８０μｌ（１０ｍＭＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａ）および１０ｍＭＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａの６０μｌ＋２０μｌ水（７．５ｍＭＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａ）を、９６ウェルポリプロピレンアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ）の２つの近接したカラムにおけるウェルに添加する。２つのウェルを、それぞれのカラムの８つのウェルのそれぞれに沿って、系列２倍希釈し、第１のカラムのウェルに沿って１０ｍＭ〜７８μＭ基質および第２のカラムのウェルに沿って７．５ｍＭ〜５８．６μＭ基質の範囲の一連の１０×基質濃度を作製する。

それぞれのＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａ基質希釈溶液の５μｌを、９６ウェルクリアハーフエリアアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に添加する。３つのＦＶＩＩａ／ＴＦ希釈溶液のそれぞれの４５μｌを、基質系列希釈溶液の３グループのカラムに添加する。この工程の間に、アッセイのウェルの中に泡を入れないように注意する。泡が入った場合、泡は、それぞれのアッセイを始める前に、清潔な針を用いて刺すことによって除去することができる。次いで、プレートは、振盪することによって混合する。アッセイの開始の前に、アッセイウェルの光路長は、終点読み取り値を得、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）のＰａｔｈｃｈｅｃｋ機能を使用することによって、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｍ５プレートリーダー分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して測定する。４０５ｎｍでの吸光度の増加は、３７℃で１時間、３０秒ごとに測定する。

ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアは、４０５ｎｍ、９６００Ｍ^−１ｃｍ^−１で、光路長およびｐＮＡ脱離基の吸光係数を使用することによって、吸光度率（ミリ単位／秒）を、放出されたｐＮＡの濃度（μＭ／秒）に変換するために使用する。変換式は、以下のとおりである：率×（１／６０×１０００）×（１／９６００×光路長）×１０００００。プロテアーゼのそれぞれの濃度についての結果は、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフで表し、基質濃度をＸ軸上にし、決定したμＭ／秒の率をＹ軸上にする。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ４ソフトウェアを使用して、ＫｍおよびＹｍａｘを、以下のとおり、ミカエリス メンテン式にデータをフィットさせることによって決定する：
Ｙ＝（（ｋ_ｃａｔＫ_ｍ／１００００００）×Ｘ×［Ｅ］）／（１＋（Ｘ＋Ｋ_ｍ）
ここで、Ｘは、基質濃度（μＭ）であり、
Ｙは、酵素活性（μＭ／秒）であり、
ｋ_ｃａｔＫ_ｍは、特異性定数（Ｍ^−１ｓｅｃ^−１）であり、
Ｋ_ｍは、ミカエリス定数（μＭ）であり、
Ｅは、酵素濃度（μＭ）であり、
Ｅ＝１、Ｋｍ＝０．５でのＸ×Ｙｍａｘ、およびｋ_ｃａｔＫ_ｍ＝１０００の初期値を設定した。

実施例８
ＦＶＩＩａ変異体およびＴＦＰＩの間の相互作用の作用強度の評価
本明細書において提供されるものなどのようなＦＶＩＩａポリペプチドおよびＴＦＰＩの間の相互作用の作用強度は、１つまたは複数のアッセイを使用して評価することができる。一例において、ＴＦＰＩおよびＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体の間の相互作用の作用強度は、基質、Ｓｐｅｃｔｒａｚｙｍｅ ＶＩＩａに対するＦＶＩＩａ／ＴＦの触媒活性について、様々な濃度のＴＦＰＩの阻害のレベルを測定することによって評価する。他の例において、ハイスループット表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを、使用することができる。

Ａ． ＦＶＩＩａ／ＴＦのＴＦＰＩ阻害についてのＩＣ_５０の決定
ＴＦＰＩおよびＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体の間の相互作用の作用強度は、基質、Ｓｐｅｃｔｒａｚｙｍｅ ＶＩＩａに対するＦＶＩＩａ／ＴＦの触媒活性について、様々な濃度のＴＦＰＩの阻害のレベルを測定することによって評価した。５０％阻害に必要とされるＴＦＰＩの濃度（ＩＣ_５０）は、それぞれのＦＶＩＩ変異体およびＦＶＩＩａ標準物について計算した。

９６ウェルクリアハーフエリアアッセイプレート（Ｎｕｎｃ）は、１５０μｌ／ウェルの１×プレート緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）をそれぞれのウェルに添加し、最低１時間、３７℃でプレートをインキュベートすることによって前処置した。緩衝液は、プレートを振盪し、乾かし、残りの緩衝液を除去するためにひっくり返してプレートを遠心分離することによって完全に除去した。プレートを、１時間、空気乾燥し、室温（ＲＴ）で保管した。

１．７ｍｌマイクロチューブ（ＩＳＣ Ｂｉｏｅｘｐｒｅｓｓからの低粘着マイクロチューブ）において、ＦＶＩＩａ／ＴＦの混合物は、４５０μｌの全容量で、９μｌの２５０ｎＭ ＦＶＩＩａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、試験されることとなる野生型ＦＶＩＩａまたはそれぞれの変異体）を、３３７．５μｌの２×ＴＦ（Ｉｎｎｏｖｉｎ；Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ；２×ＴＦを生成するために１０ｍＬ蒸留水において再懸濁される凍結乾燥産物、これは、約７ｎＭの脂質付加ＴＦと等しい）、９０μｌ ５×アッセイ緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．０５％ＢＳＡ）、および１３．５μｌの水と混合することによって調製し、５ｎＭ ＦＶＩＩａおよび５．２ｎＭ ＴＦを含有する溶液をもたらした。混合物を、５分間、室温でインキュベートし、構成成分が複合体を形成するのを可能にした。前処置した９６ウェルクリアハーフエリアアッセイプレートにおける２カラムのそれぞれのウェルに、２５μｌのそれぞれのＦＶＩＩａ／ｓＴＦ混合物を、添加し、プレートは、蒸発を予防するためにカバーした。

ヒト組換えＴＦＰＩ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、３３μｌ ５０％グリセロール（ｖ／ｖ）において最初に溶解し、−２０℃での貯蔵のために１０μＭストックを作製した。ＴＦＰＩストックは、以下のとおり、ポリプロピレン貯蔵プレートにおいて、最終１×緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．０１％ＢＳＡ）において１．５μＭにさらに希釈した：試験するそれぞれのプロテアーゼについて、８７．５μｌの１．５μＭ溶液のＴＦＰＩは、１３．１μｌ １０μＭ ＴＦＰＩを、１７．５μｌ ５×アッセイ緩衝液および５６．９μｌ蒸留水と混合することによって作製した。ＴＦＰＩ溶液の系列３倍希釈溶液は、２７．５μｌ ＴＦＰＩを、５５μｌ １×アッセイ緩衝液の中に混合することによって、１×アッセイ緩衝液において作製し、７５０ｎＭ、２５０ｎＭ、８３．３ｎＭ、２７．８ｎＭ、９．２６ｎＭ、３．１ｎＭ、および１．０３ｎＭ ＴＦＰＩを含有する溶液を、生成した。系列の最終ウェルは、コントロールとして１×緩衝液のみを含有した。

ＴＦＰＩのそれぞれの希釈溶液の２５μｌは、ＦＶＩＩａ／ＴＦ混合物を含有する９６ウェルクリアハーフエリアアッセイプレートの２つのカラムの２つのウェル（つまり２つ組）に添加し、プロテアーゼ混合物は、それぞれのＴＦＰＩ希釈溶液を用いて２つ組でアッセイした。ＴＦＰＩを有していない１×アッセイ緩衝液の溶液もまた、ネガティブコントロールとしてＦＶＩＩａ／ＴＦ混合物を含有する２つのウェルに添加した。プレートを、短い間、撹拌し、次いで、１．５時間３７℃でのインキュベーションの前に５分間、３０００ｒｐｍで遠心分離した。

Ｓｐｅｃｔｒａｚｙｍｅ ＶＩＩａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）のストック溶液は、５ｍｌ蒸留水において５０μモルを１０ｍＭに再構成し、使用まで４℃で保管することによって、調製した。使用の直前に、溶液を、蒸留水において６００μＭに希釈した。上記からのアッセイプレートのインキュベーションの後に、１０μｌの希釈したＳｐｅｃｔｒａｚｙｍｅ ＶＩＩａを、アッセイプレートのそれぞれにウェルに添加した。反応液は、混合し、プレートは、３７℃でインキュベートした。４０５ｎｍでの吸光度の増加は、３７℃で１時間、３０秒ごとに測定し、吸光度率は、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して計算した。

ＴＦＰＩによる阻害の程度を決定するために、ＴＦＰＩを含有するプロテアーゼ反応液の吸光度率は、ＴＦＰＩを含有しない反応液（コントロールサンプル）の吸光度率によって最初に割り、活性率を得、それぞれのＴＦＰＩ濃度のｌｏｇ_１０を決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、ｌｏｇ_１０［ＴＦＰＩ］は、それぞれのプロテアーゼについての活性率に対してプロットし、用量応答曲線は、活性データの上部および下部がそれぞれ１および０に固定されると仮定したカーブフィットを用いて生成した。ソフトウェアは、それぞれのプロテアーゼについて、ｌｏｇ ＩＣ_５０（ｐＩＣ_５０）値および絶対ＩＣ_５０（ｎＭでのＴＦＰＩ阻害）の両方としてＴＦＰＩ阻害を決定するために使用し、その平均および標準偏差を決定した。

脂質付加ＴＦ（Ｉｎｎｏｖｉｎ；Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）と複合体のＦＶＩＩａ変異体のそれぞれのＴＦＰＩの阻害のレベルを、決定し、野生型ＦＶＩＩａと比較した、ＴＦＰＩ抵抗性の増加倍数として表現した（表２１）。

Ｂ． ＴＦＰＩに対する抵抗性についての、ＦＶＩＩａ変異体の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング
ヒト組換え可溶性ＴＦＰＩによる阻害に対する様々なＦＶＩＩａ変異体の相対的な抵抗性は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００機器を用いてハイスループット表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用して評価した。ＴＦＰＩによる阻害に対するＦＶＩＩａ変異体の相対的な抵抗性は、標準化インジェクション時間後に結合した野生型ＦＶＩＩａの量と比較した、Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５センサーチップ上に固定した可溶性ＴＦＰＩに結合したＦＶＩＩａ変異体の相対量およびプロテアーゼ濃度を測定することによって、評価した。

すべての実験について、可溶性ＴＦＰＩ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ−１００コントロールソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）内で利用可能なアミンカップリングプロトコールおよびアミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から提供される試薬を使用して、新しい４フローセルＢｉａｃｏｒｅ ＣＭ５シリーズＳセンサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定した。４つの利用可能なフローセルはすべて、２つの異なる密度のＴＦＰＩおよび参照セルにおいてブロック剤として果たすウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の固定化に利用した。ＢＳＡは、酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）において５μｇ／ｍｌに希釈し、それぞれ１０００および２０００の応答単位（ＲＵ）でフローセル１および３において固定した。ＴＦＰＩ固定化について、凍結乾燥可溶性ＴＦＰＩ（１０μｇ）は、１００μＬの１×カップリング緩衝液（３０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）において０．１ｍｇ／ｍＬの濃度に再懸濁した。合計２０μＬの０．１ｍｇ／ｍＬ ＴＦＰＩを、それぞれ１０００および２０００ＲＵでのフローセル２および４への固定化のために酢酸ナトリウムｐＨ４．０において１０μｇ／ｍｌに希釈する。カップリング緩衝液は、固定化工程の間のランニング緩衝液として使用した。

ＦＶＩＩａのそれぞれのサンプルは、６２０ｎＭ ｓＴＦ（ヒト第ＩＩＩ凝固因子；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する１×ランニング緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．１％ＰＥＧ ８０００、０．１％ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）において３２０ｎＭの最終濃度で調製した。一般に、それぞれのＦＶＩＩａ変異体は、３２０ｎＭの最終希釈の前に１×ランニング緩衝液の中に１０倍希釈した。ＦＶＩＩａ／ｓＴＦ複合体は、２つ組で、１２０μＬの最終容量で調製し、４８までの特有のＦＶＩＩａ変異体が、９６ウェル貯蔵プレートの中に装填され、単一の実行で２つ組のインジェクションで評価されることを可能にした。ＦＶＩＩａ／ｓＴＦ複合体は、第１のサンプルインジェクションの開始の前に、１０〜１５分間、ＲＴでインキュベートした。

標準化された結合分析法は、Ｂｉａｃｏｒｅコントロールソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）内で生成し、すべてのＦＶＩＩａ反復実験を、１８０秒間の結合時間の間、インジェクションし、その後に、１０μＬ／分の流速での解離の短い６０秒間を続けた。センサーチップの再生は、１０ｍＭグリシン、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．０を用いて、３０秒間、解離フェーズに続けて行い、次いで同じ１０μＬ／分の流速で１×ランニング緩衝液を用いて６０秒間を安定化期間とした。２つのアッセイ参照ポイントは、それぞれの実行およびそれに続くデータ分析について記録し、１つ目は、結合フェーズ（結合）の終了前の５秒および２つ目は、解離フェーズ（解離）の終了の前の５秒として報告した。完全アッセイを開始する前に、センサーチップは、１８０秒間、３２０ｎＭ野生型ＦＶＩＩａ／ｓＴＦの単一インジェクションで試験した。これは、それぞれ、フローセル２（１０００ＲＵ）および４（２００ＲＵ）への結合について約４００〜４５０ＲＵおよび７５０〜８５０ＲＵの応答をするはずである。

データ分析は、参照セルに対する結合が最小であることを確認することを含むアッセイバリデーションパラメーター、ベースラインドリフト、およびコントロールブランクインジェクション（ランニング緩衝液）の結合を検査するために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて最初に実行した。データテーブルは、結合報告ポイントおよび解離報告ポイントの両方で結合したＦＶＩＩａ変異体の量（ＲＵで）を示した、このアプリケーション内で生成した。データテーブルは、引き続いて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌスプレッドシート環境内でのさらなる分析のためにエクスポートした。生データポイント（ＲＵ結合）は、センサーチップに対するコントロール結合について補正し、次いで、結合したＦＶＩＩａ変異体の量（ＲＵ）に対する、結合した野生型ＦＶＩＩａの量（ＲＵ）の比を、それぞれのパラメーターについて得、結合（ｗｔ／変異体）および解離（ｗｔ／変異体）として報告した。表２２は、研究の結果を示す。ＴＦＰＩ阻害に対する抵抗性は、評価したパラメーターについての一方または両方の比の増加として反映される。たとえば、特定のＦＶＩＩａ変異体についての２０の結合（ｗｔ／変異体）値または解離（ｗｔ／変異体）値は、その変異体が、野生型ＦＶＩＩａよりもＴＦＰＩ阻害に対して２０倍抵抗性であることを示す。いくつかの変異体は、ＴＦＰＩ阻害に対する増加した抵抗性を示した。たとえば、Ｑ２８６Ｒ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３４１Ｄ−ＦＶＩＩａ、Ｑ２８６Ｒ／Ｋ３４１Ｄ−ＦＶＩＩａ、およびＭ２９８Ｑ／Ｋ３４１Ｄ−ＦＶＩＩａなどのようなＫ３４１Ｄ突然変異（成熟ＦＶＩＩナンバリング）を含有する変異体は、ＴＦＰＩに対する有意な抵抗性を示す比を有する（４０〜１５０倍よりも大きい）。いくつかの場合において、解離の率は、結合の率以上に影響を及ぼされた。

実施例９
ＦＶＩＩａポリペプチドの薬物動態学的分析
ＦＶＩＩａポリペプチドの薬物動態学的特性は、マウス血漿におけるヒト第ＶＩＩａ因子の量を測定することによって評価した。２つのアッセイは、血漿におけるＦＶＩＩａを定量化するために使用することができる。ＥＬＩＳＡは、マウス血漿における総ＦＶＩＩａタンパク質を定量化するために使用することができ、ＦＶＩＩａ依存性凝血アッセイ（ＦＶＩＩａ：Ｃ）は、血漿におけるＦＶＩＩａポリペプチドの血液凝固活性を定量化するために使用することができる。

Ａ． マウスへのＦＶＩＩａポリペプチドの投与
改変ＦＶＩＩａポリペプチドおよび非改変組換えヒトＦＶＩＩａ（ｒｈＦＶＩＩａ）タンパク質（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）を、薬物動態学的研究において評価した。それぞれの研究について、１８匹のオスＣＤ−１マウスに、静脈内ボーラス用量（０．１〜３．０ｍｇ／ｋｇ、研究に依存）のｒＦＶＩＩａを注射した。注射の５、１５、３０、６０、１２０、および２４０分後、それぞれの注射プロトコールからの３つのマウスは、ＣＯ_２による窒息を使用して安楽死させ、約１．０ｍＬの血液を、経皮的心性穿刺を介して１．０ｍＬシリンジの中に取り出した。それぞれのシリンジに、十分なクエン酸ナトリウムをあらかじめ装填し、１ｍＬの血液中３．２％の最終濃度を達成した。次いで、血液サンプルは、４℃で、８分間、９０００ｒｐｍで遠心分離した。血漿は、標識した個々の１．５ｍｌチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に取り出し、液体窒素において急凍結し、−８０℃で保管した。さらに、実験当たり１匹のマウスに、媒体のみ（偽）を注射し、このマウスからの血漿は、バックグラウンドＦＶＩＩａ活性の決定に使用した。

Ｂ． ＥＬＩＳＡアッセイ
市販で入手可能なキット、ＩＭＵＢＩＮＤ（登録商標）第ＶＩＩ因子ＥＬＩＳＡ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）は、ＥＬＩＳＡによって血清におけるＦＶＩＩタンパク質を検出するために使用した。このキットは、タンパク質を捕捉するために抗ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ抗体を用いてあらかじめコートしたプレートおよびストレプトアビジン標識ホースラディシュペルオキシダーゼを通した検出のためのビオチン化抗ＦＶＩＩ抗体を利用する。キットは、以下の例外を除いてメーカーの指示に従って使用した：第一に、標準曲線は、全濃度範囲にわたり線形範囲を保証するために狭め、０．８８ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度にわたる；第二に、抗体親和性における差異のために、キットで提供されたＦＶＩＩ標準物ではなく、精製ＦＶＩＩａ変異体を、それ自体、標準曲線に使用した。実験は、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、ＦＶＩＩａの潜在的な血漿阻害因子とのＦＶＩＩａの複合体が、遊離プロテアーゼの７５％のレベルで検出され、アッセイが、活性および不活性形態をした、血漿サンプルにおける総ＦＶＩＩａを検出することができることを保証することを示した。

手短に言えば、血漿サンプルは、室温で解凍し、サンプル緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００＋１．０％ＢＳＡ）において１０倍希釈し、次いで、４つの希釈溶液用に系列５．５倍希釈した。４つの希釈サンプルは、２０、１１０、６０５、および３３２７．５倍の最終サンプル希釈溶液用に、ＥＬＩＳＡプレート上で２倍希釈した。マウス血漿のこれらの４つの希釈溶液は、３３，０００ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの一連のプロテアーゼ濃度をカバーした。それぞれのサンプルは、２つの別々のアッセイプレート上で測定し、標準曲線の範囲内のそれらの測定値は、血漿サンプルにおける変異ＦＶＩＩａの濃度を計算するために使用した。

Ｃ． 凝血アッセイ
市販で入手可能なキット（ＳＴＡＣＬＯＴ ＦＶＩＩａ−ｒＴＦ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）は、凝血アッセイとして使用した。活性ＦＶＩＩａポリペプチドの血液凝固活性を決定するために、血漿サンプルは、ＦＶＩＩａ依存性凝血アッセイ（ＦＶＩＩａ：Ｃ）を使用してアッセイした。アッセイは、市販のキットにおいて提供される試薬および説明書を使用して実行し、凝血時間は、電気機械血餅検出機器（ＳＴＡｒｔ４、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）を使用して測定した。キットは、以下の例外を除いてメーカーの指示に従って使用した：第一に、キットで提供されたｒｈＦＶＩＩａ標準物ではなく、精製ＦＶＩＩａ変異体を、それ自体、標準曲線に使用した。第二に、以下の大量の市販の試薬を、ルーチン的な薬物動態学的スクリーニング研究に使用し、キット試薬に対する同等の結果を得た：可溶性組織因子（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ）および合成リン脂質ブレンド（Ａｖａｎｔｉ極性脂質、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）、ＴＢＳＡ緩衝液（１％ＢＳＡを有するＴｒｉｓ−ＮａＣｌ、ｐＨ７．５；ＤｉａＰｈａｒｍａ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、Ｏｈｉｏ）、ならびに２５μＭ塩化カルシウム溶液（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）。

凝血アッセイは、以下のとおり実行した。凍結血漿サンプルは、約４５分間、室温で解凍し、次いで、緩衝液において１：５０００に希釈した。５０μｌの希釈した血漿を、５０μＬ第ＶＩＩ因子欠損ヒト血漿および５０μＬの再脂質付加組織因子と組み合わせ、１８０秒間、プレインキュベートした。プレインキュベーションの後に、５０μＬの塩化カルシウム溶液（２５μＭ）を、凝血を開始するために添加した。凝血時間は、電気機械血餅検出を使用して決定した。それぞれの血漿サンプルを、２つ組でアッセイした。系は、アッセイしている、知られている量の特異的なＦＶＩＩａ変異体を含有する緩衝液の系列希釈溶液の凝血時間を使用して、標準曲線を構築することによって較正した。マウス血漿サンプルにおけるＦＶＩＩａ濃度は、ｌｏｇ ＦＶＩＩａ対Ｌｏｇ凝血時間標準曲線の線形部分から計算した。血漿サンプルが第ＶＩＩ因子欠損血漿において凝血を誘発する能力は、血漿における内因性野生型ＦＶＩＩａのバックグラウンドを偽処置マウスから引いた後のＦＶＩＩａ ｎｇ／マウス血漿ｍＬとして報告した。

それぞれのＦＶＩＩタンパク質の半減期は、直線に対する、活性の自然ｌｏｇの従来のフィットを行い、ＦＶＩＩａタンパク質の活性が半分に低下するのにかかる時間を測定することによって、ルーチン的に決定した。多重指数関数的減衰を有するＦＶＩＩタンパク質について、半減期は、ｌｏｇ血漿対時間プロファイルの終末部から決定した。さらなる薬物動態学的パラメーターは、以下のとおり計算した：血漿ＡＵＣ_{０−ｉｎｆ}／用量（［ＡＵＣ_{（０−ｔ）}＋Ｃｔ／（ｌｎ２／Ｔ_１／２）］として計算、ここで、ｔは、ＩＶ用量（ｍｇ／ｋｇ）によって割った、ＦＶＩＩａポリペプチドの測定可能な血漿濃度を有する最後の時点である）；半減期（血漿ＦＶＩＩａ濃度対時間プロファイルの最終フェーズの間のＦＶＩＩａポリペプチドの半減期；Ｔ_１／２は、血漿ＦＶＩＩａ濃度対時間曲線の対数線形プロットの最終フェーズの間の負の傾きによって割った−ｌｎ２として計算する）；ＭＲＴ_{０−ｌａｓｔ}（ＦＶＩＩａポリペプチドが身体において存在する平均時間；ＡＵＭＣ_{０−ｌａｓｔ}／ＡＵＣ_{０−ｌａｓｔ}として計算、ＡＵＭＣ_{０−ｌａｓｔ}は、第１のモーメント対時間曲線下の合計面積（ＦＶＩＩａ濃度・時間対時間曲線）であり、線形台形公式によって計算する）；Ｃｌ（全身クリアランス；用量／ＡＵＣ_{０−ｉｎｆ}として計算）；およびＶ_ｄ（終末消失ｅ定数（β）に基づく分布容積；［Ｃｌ／（ｌｎ２／Ｔ_１／２）］として計算）。

Ｄ． ＦＶＩＩａ変異体の薬物動態学的特性
上記に記載されるＦＶＩＩａ：Ｃプロトコールを使用して、野生型ＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩａ変異体の薬物動態学的特性は、血漿における凝血活性に基づいて評価した。結果を表２３に記載する。いくつかのＦＶＩＩａ変異体は、野生型ＦＶＩＩａと比較して、改善された薬物動態学的パラメーターを示した。

表２４は、以下の薬物動態学的パラメーターを使用する研究の結果を記載する：回収率％（インビボ）［理論的な最大ＦＶＩＩａ血漿濃度（投与したＦＶＩＩａ量および理論的な全血量に基づく）によって割った、投与後５分（第１の時点）でのＦＶＩＩａの測定血漿濃度×１００％］；回収率％（インビトロ）［理論的なＦＶＩＩａ血漿濃度（知られている血漿量の中に添加したＦＶＩＩａ量の量に基づく）によって割った、知られている量のＦＶＩＩａを添加した血漿における測定ＦＶＩＩａ濃度×１００％］；ＡＵＣ＊活性／用量（ＴＦ依存性）［ＴＦ依存性間接的活性を掛けた血漿ＡＵＣ／用量（上記の表１５を参照されたい）；ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標） ＦＶＩＩａ（ＴＦ依存性）に関する活性提示における改善（ＡＵＣ＊活性／用量（ＴＦ依存性）_{ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）ＦＶＩＩａ}／ＡＵＣ＊活性／用量（ＴＦ依存性）_{突然変異体ＦＶＩＩａ}によって計算）；ＡＵＣ＊活性／用量（ＴＦ非依存性）［ＴＦ非依存性間接的活性を掛けた血漿ＡＵＣ／用量（上記の表１５を参照されたい）；ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）ＦＶＩＩａに関する活性提示における改善（ＴＦ非依存性）［ＡＵＣ＊活性／用量（ＴＦ非依存性）_{ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）ＦＶＩＩａ}／ＡＵＣ＊活性／用量（ＴＦ非依存性）_{突然変異体ＦＶＩＩａ}によって計算］。

実施例１０
可溶性組織因子に対する第ＶＩＩａ因子結合性の決定
ＨＥＫ ２９３細胞またはＢＨＫ細胞から発現したＦＶＩＩａ変異体が可溶性組織因子（ｓＴＦ）に結合する能力は、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴を使用して評価した。ＦＶＩＩａ変異体は、Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５チップに結合する異なる２つのレベルのｓＴＦを使用して、２つの２つ組の実験において、３つのプロテアーゼ濃度での結合プロファイルの測定を通して評価する。

新しいシリーズＳ ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃａｔ＃ＢＲ１００６−６８）は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００機器を使用して、ウシ血清アルブミンおよび可溶性組織因子に結合した。結合は、アミン結合キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃａｔ＃ ＢＲ−１０００−５０）を用いてＢｉａｃｏｒｅ結合緩衝液（３０ｍＭ Ｎａ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）およびＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ソフトウェアにおけるプロトコールウィザードを使用して実行した。固定化のために、チップのすべての４つのセルを使用した。セル１および３は、酢酸緩衝液、ｐＨ４．０において希釈した５００応答単位（ＲＵ）ウシ血清アルブミン参照タンパク質と結合させ、セル２および４は、酢酸緩衝液、ｐＨ４．５において希釈した、５００および２５０ＲＵのｓＴＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と結合させた。

それぞれのＦＶＩＩａ変異体および野生型ＦＶＩＩａプロテアーゼは、３つの濃度で、２つ組で試験した。プロテアーゼは、９６ウェルアッセイプレートにおいて、１００Ｌ Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ緩衝液（２０ｍＭ Ｎａ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．１％ＰＥＧ ８０００、０．１％ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）において６０ｎＭ、３０ｎＭ、および１５ｎＭに希釈した。それぞれのサンプルは、１２０秒間の接触時間、その後に続く１０μＬ／分の流速での、１８０秒間の解離時間を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００機器においてアッセイした。緩衝液ブランクもまた、アッセイした。チップは、６０秒間、次いで３０秒間、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０を用いて再生成した。ｓＴＦに対する野生型ＦＶＩＩａの結合を測定するためのアッセイは、約８ｎＭのＫ_ｄを示す３セットの曲線をもたらすはずである。

Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェアを、データを分析するために使用した。とりわけ、データをＬａｎｇｍｕｉｒ等温式にフィットさせる反応速度／親和性１：１結合分析を、利用し、データは、２つの応答単位結合で、それぞれの変異体の２つの反復実験について個々にフィットさせた。４つのフィットＫ_ｄ値を、平均し、表２５に示す。Ｍ２９８Ｑ突然変異を含有するＦＶＩＩａ変異体は、より低いＫ_ｄの結果を示す傾向があり、したがってｓＴＦに、より密接に結合する。

実験のさらなるセットは、上記に記載されるが、ＦＶＩＩａ用量範囲を３０ｎＭ、１５ｎＭ、および７．５ｎＭに改変した同じアッセイならびにＳＰＲデータをフィットさせるために二状態のモデルを使用するデータ分析を使用して、可溶性ＴＦに対するＦＶＩＩａ変異体の結合を評価するために実行した。この二状態のモデル分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェアスーツにおいて提供され、下記に再現する。結果を、表２６に提供する。

実施例１１
Ｚｎ^２＋によるＦＶＩＩａ変異体の阻害
ＨＥＫ ２９３細胞またはＢＨＫ細胞から発現したＦＶＩＩａ変異体は、可溶性組織因子の存在下または非存在下の両方において、Ｚｎ^２＋による阻害に対する抵抗性についてアッセイした。手短に言えば、ＺｎＣｌ_２（Ａｌｄｒｉｃｈ）は、ｄＨ_２０において２０ｍＭに希釈し、次いで、１×アッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｎａ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、および０．０１％ＰＥＧ−８０００）において４ｍＭに希釈した。系列２倍希釈溶液は、９６ウェルプレートにわたって、３．９μＭまでの、亜鉛の１１の濃度を生成するために作製した。列の最後のウェルは、非阻害ＦＶＩＩａタンパク質分解活性を測定するために、亜鉛を有していない緩衝液を含有した。ＦＶＩＩａ変異体プロテアーゼおよび野生型プロテアーゼは、５００ｎＭに希釈し、次いで、再度、５０ｎＭまで１０倍希釈した。この５０ｎＭストック溶液は、可溶性組織因子（ｓＴＦ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）なしで実行するアッセイに使用した。可溶性組織因子を有するアッセイについては、プロテアーゼは、それぞれ１２．５ｎＭおよび１２５ｎＭの最終濃度まで、ｓＴＦを有する１×アッセイ緩衝液において再度希釈した。溶液は、室温で、少なくとも５分間、プレインキュベートした。

阻害反応を始めるために、２０μＬのＦＶＩＩａ／ｓＴＦ溶液またはＦＶＩＩａ溶液を、１０の濃度について、それぞれの列に、６０μＬの亜鉛系列と混合した。ＦＶＩＩａのみを用いる阻害反応について、混合物は、２ｍＭ ＺｎＣｌ_２を使用して始め、ＦＶＩＩａ／ｓＴＦについては、それらは、４ｍＭ ＺｎＣｌ_２を使用して始めた。プレートは、室温で、３０分間、インキュベートした。Ｚｎ^２＋阻害をアッセイするために、２０μＬ ＦＶＩＩａ基質（メシル−ｄＦＰＲ−ＡＣＣ、ＤＭＳＯにおいて２０ｍＭに溶解し、アッセイ緩衝液において希釈）を、９０μＭの最終濃度までウェルに添加した。ｓＴＦ濃度および亜鉛濃度は、基質溶液に適宜それらを添加することによってアッセイにおいて維持した。蛍光発光増加（Ｅｘ：３８０ｎｍ、Ｅｍ：４６０ｎｍ）は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）プレートリーダーで３０℃で６０分間、測定した。残存タンパク質分解活性は、非阻害プロテアーゼ率によって阻害率を割ることによって、亜鉛のすべての濃度で計算した。タンパク質分解活性の半分を阻害するのに必要なＺｎ^２＋濃度（Ｋ_０．５）は、亜鉛の濃度対残存活性をプロットし、ＸＬＦｉｔ４ソフトウェア（ＩＤＢ）を使用して双曲線式とフィットさせることによって、計算した。それぞれのプロテアーゼは、Ｋ_０．５についての平均値を得るために、２つの別々の回に、２度アッセイした。

結果を表２７に提供する。Ｈ２５７およびＨ２１６の突然変異は、抵抗性を約３倍増加させた。Ｍ２６８Ｑ突然変異もまた、亜鉛に対する抵抗性を３倍増加させた。すべての場合において、さらなる突然変異と組み合わせた場合、効果は、異なる程度まで保持された。最も抵抗性の変異体は、上記の突然変異の組み合わせであった：Ｈ２１６Ａ／Ｈ２５７Ａ−ＦＶＩＩａおよびＨ２５７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａ。

実施例１２
活性部位滴定剤４−メチルウンベリフェリルｐ’−グアニジノベンゾエート（ＭＵＧＢ）を使用する触媒活性プロテアーゼの濃度の決定
いくつかの場合において、ストック溶液における触媒活性ＦＶＩＩａの濃度は、４−メチルウンベリフェリルｐ’−グアニジノベンゾエート（ＭＵＧＢ）、トリプシン様セリンプロテアーゼに対する活性部位として開発された蛍光発生エステル基質を用いて複合体であるＦＶＩＩａおよび可溶性組織因子（ｓＴＦ）を滴定することによって、決定した。アッセイは、少し改変して、本質的にPayne et al.（Biochemistry (1996) 35:7100-7106）によって記載されるように、実行した。ＭＵＧＢは、容易に、ＦＶＩＩａと反応するが、ＦＶＩＩまたは不活性プロテアーゼとは反応せず、ＭＵＧＢの濃度が、飽和しており、脱アシル化が、とりわけ遅く、触媒の律速となる条件下で、有効に安定したアシル酵素中間体を形成する。これらの条件下で、ＦＶＩＩａプロテアーゼは、１回の触媒代謝回転を受けて、４−メチルウンベリフェロン蛍光体（４−ＭＵ）を放出する。蛍光発光の初期バーストを、４−ＭＵ蛍光発光の外部濃度標準曲線に較正する場合、活性部位の濃度を、計算することができる。

アッセイは、連続的な撹拌下で、それぞれ０．４ｃｍ×１ｃｍまたは１ｃｍ×１ｃｍ石英キュベットにおいて、１ｍＬまたは２ｍＬ反応液容量で実行した。それぞれの反応液は、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、および０．１％ＰＥＧ ８０００、ｐＨ７．６を含有するアッセイ緩衝液において、０．５μＭ ｓＴＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓヒト）を含有した。４−ＭＵ標準溶液は、ＤＭＳＯにおいて０．５Ｍのストック濃度で新たに調製し、濃度は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ９．０において１９，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１の吸光係数を使用して、３６０ｎｍで吸光度分光法によって確認した。ＭＵＧＢは、乾燥重量に基づいて、ＤＭＳＯにおいて０．０４Ｍのストック濃度で調製した。アッセイは、４μＬの４ｍＭ ＭＵＧＢ（２．０ｍＬ反応液に対して）または２ｍＭ ＭＵＧＢ（１．０ｍＬ反応液に対して）（それぞれの場合において、８μＭ最終濃度）を、１×アッセイ緩衝液中０．５μＭ ｓＴＦ（２０．２μＬまたは１０．１μＬの４９．４μＭ ｓＴＦ）の溶液に添加し、最初のＥＬＩＳＡ（実施例１Ｃ．１）またはＦＦＲ−ＣＭＫを用いる活性部位滴定（実施例３）に基づいて、約１００〜２００ｎＭの最終濃度までＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩａ変異体を添加する前に、最初に、約１５０〜２００秒間、ＭＵＧＢのバックグラウンド加水分解を測定することによって、開始した。反応のバーストフェーズにおける４−ＭＵ蛍光発光の放出を、さらに１０００〜１２００秒間、続けた。遊離４−ＭＵの標準曲線は、吸光度を較正した４−ＭＵの、２６０〜３００ｎＭの最終濃度までの、２０ｎＭ間隔の、０．５μＭ ｓＴＦを含有する１×アッセイ緩衝液の中への滴定によって調製した。

データ分析については、反応の記録を、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージの中にインポートし、バックグラウンド加水分解の寄与率を、典型的には、総蛍光発光バーストの５％未満であった、自発的なＭＵＧＢ加水分解の初期測定速度の補外によって、曲線から引いた。補正した曲線は、式△蛍光発光＝Ａｍｐ（１−ｅ^−ｋｔ）＋Ｂｔの、線形構成成分（脱アシル化の遅い速度の説明）を有する一重指数関数方程式にフィットさせ、ここで、Ａｍｐ＝上記に概説される飽和アッセイ条件下のバーストフェーズの振幅であり、ｋは、アシル酵素形成に対して観察される一次速度定数であり、Ｂは、ＭＵＧＢの完全な代謝回転と関連するバルク速度定数である。活性ＦＶＩＩａプロテアーゼの濃度は、４−ＭＵ標準曲線に対する振幅についてのフィットパラメーターの比較によって計算する。複数回のアッセイからの値を、測定し、平均し、標準偏差を決定した。

実施例１３
メシル−ｄＦＰＲ−ＡＣＣに対するＦＶＩＩａ変異ポリペプチドの比活性
ＦＶＩＩａ変異体の活性を評価するために、標準化されたアッセイ条件のセット下の、トリペプチドＡＣＣ基質（メシル−ｄＦＰＲ−ＡＣＣ）の切断に対するＦＶＩＩａポリペプチドの活性（活性／モル）を決定した。アッセイは、メシル−ｄＦＰＲ−ＡＣＣ基質への希釈前の、飽和量のｓＴＦとのＦＶＩＩａポリペプチドのプレインキュベーションを含んだ。次いで、初速度の基質切断に、ＡＣＣ蛍光発光の増加の評価を続けた。蛍光発光放出の初速度は、内部ＡＣＣ標準曲線に標準化し、データは、μｍｏｌ／秒／ＦＶＩＩａ μｍｏｌとして報告した。

反応液を調製するために、試験することとなるそれぞれのＦＶＩＩａサンプルは、１×アッセイ緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．１％ＢＳＡ、０．１％ＰＥＧ−８０００、ｐＨ７．５）において、２００ｎＭに、ポリプロピレン貯蔵プレートにおいて希釈した。必要である場合、ストックＦＶＩＩａの１：１０希釈溶液を、最小ピペット容量が５μＬとなるように、調製した。ストック可溶性組織因子（ｓＴＦ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の希釈溶液は、８〜３２のプロテアーゼ／プレートのスクリーニングを説明するのに必要な１×アッセイ緩衝液の適切な容量を用いて、１．０μＭの最終濃度に調製した。たとえば、８つのプロテアーゼをアッセイする場合、１．０ｍＬの１．０μＭ ｓＴＦが、プレート当たりに必要とされるのに対して、３２のプロテアーゼのアッセイについて、２．５ｍＬのｓＴＦが、プレート当たりに必要とされる。ＦＶＩＩａサンプルは、ポリプロピレン貯蔵プレートにおいて、２５μＬの２００ｎＭ ＦＶＩＩａ変異体を、２５μＬの１．０μＭ ｓＴＦと混合することによって、５０μＬアッセイ容量において、１００ｎＭ ＦＶＩＩａ／５００ｎＭ ｓＴＦの最終濃度でｓＴＦと複合体を形成した。次いで、ＦＶＩＩａ／ｓＴＦ複合体反応液は、平衡に達するように、１５分間、室温でインキュベートした。平衡期間の後に、１０μＬのそれぞれのＦＶＩＩａ／ｓＴＦ複合体反応液を、９６ウェルハーフエリア黒色アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ）の対応する列の中に分配した。ＦＶＩＩａ変異体およびコントロールは、三通りアッセイした。メシル−ｄＦＰＲ−ＡＣＣ基質を、基質へのＦＶＩＩａポリペプチドの１：１０希釈を説明するために、０．０９ｍＭの１．１×最終濃度に調製した。全９６ウェルハーフエリアプレートについて、０．１ｍＭメシル−ｄＦＰＲ−ＡＣＣ基質の２０ｍＬを、乾燥ＤＭＳＯ中に保管したストック基質の希釈によって、１×アッセイ緩衝液において調製した。

アッセイは、９６チップヘッド（ＭＢＰ ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｘ ＡＲＴ（登録商標）１３０μＬチップ）を装備したＢｉｏＭｅｋ（登録商標）ＦＸ自動ワークステーション（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で実行した。アッセイプレート（１０μＬのＦＶＩＩａ／ｓＴＦ反応液をあらかじめ分配）を、１．１×メシル−ｄＦＰＲ−ＡＣＣ溶液で満たした単一チャネルリザーバーを有するワークステーションのデッキ上に配置した。プレートリーダーの温度を３７℃に設定した。ＢｉｏＭｅｋ（登録商標）ＦＸワークステーションは、１．１×メシル−ｄＦＰＲ−ＡＣＣ基質で満たした単一チャネルリザーバーから９０μＬを、１０μＬのＦＶＩＩａ／ｓＴＦを含有する黒色アッセイプレートのそれぞれのウェルの中に移すことによって、アッセイを開始した。アッセイにおけるＦＶＩＩａ変異体、ｓＴＦ、およびメシル−ｄＦＰＲ−ＡＣＣの濃度の最終濃度は、それぞれ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、および０．０９ｍＭとした。次いで、ワークステーションは、１００μＬサンプルの７０μＬを２回混合した。黒色アッセイプレートは、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）の中に移し、初期反応速度は、３７℃で１０分間続いた。

アッセイの完了の後に、標準曲線の遊離ＡＣＣ（１００μＬ／ウェル）を含有するプレートは、同じＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉプレートリーダーで読み取り、ＲＦＵ／秒のμＭ／秒への正確な変換を提供するために使用した。標準プレートは、以下のとおり調製した。９６ウェル黒色エリアハーフアッセイプレートの上列のすべての「偶数の」ウェル（つまり１ウェルおき）において、１ｍＭ ＡＣＣサンプルは、最終容量２００μＬまで、１×アッセイ緩衝液において２５ｎＭに希釈した（１９５μＬ １×アッセイ緩衝液において５μＬ １ｍＭ ＡＣＣ）。１００μＬの１×アッセイ緩衝液を、「偶数の」カラムの残りのウェルのすべての中にピペットで移した。ＡＣＣ基質は、さらに６つのＡＣＣ濃度を生成するために、偶数カラムに沿って１：１に系列希釈した。最後の列は、１００μＬ １×アッセイ緩衝液のままとした（つまりＡＣＣを有していない）。蛍光発光は、終点読み取りバージョンのアッセイ条件を使用して測定し、蛍光発光対ＡＣＣの濃度のグラフをプロットした。これらのポイントを通る線の傾きにより、ＲＦＵからμＭへの変換係数が与えられた。

ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）は、プレート読み取りについてのデータおよび標準曲線を分析するために使用した。データを含有するファイルを、保存し、ＡＳＣＩＩテキストファイルとしてエクスポートし、これを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌプログラムの中にインポートし、処理し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌにおいて生成したテンプレートを使用して分析した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌテンプレートへのデータのインポートに際して、平均ＲＦＵ／μＭの変換は、ＡＣＣ標準曲線の傾きから計算し、ＲＦＵ／秒からμＭ／秒の活性測定値にプレートデータを変える変換係数を提供するために使用した。すべての三通りの値を、異常値について評価し、必要である場合、それを除いた。それぞれのＦＶＩＩａ変異体および野生型コントロールの比活性は、μｍｏｌ／秒／μｍｏｌの単位で表現し、以下の式によって計算した。
平均データ（ＲＦＵ／秒）＊変換係数（ＲＦＵ／μＭ）＝活性（μＭ／秒）比活性（μｍｏｌ／秒／μｍｏｌ）＝［（μＭ／秒）＊（１００μＬ）＊（１／１００００００）］／［（１０ｎＭ）＊（１００μＬ）＊（１／１００００００）＊（１／１０００）］

表２８は、野生型ＦＶＩＩａと比較した活性を含む、アッセイしたＦＶＩＩａ変異体の比活性を記載する。標準偏差（ＳＤ）および変動係数（百分率として；ＣＶ％）もまた含む。いくつかのＦＶＩＩａ変異体は、野生型ＦＶＩＩａポリペプチドと比較して、メシル−ｄＦＰＲ−ＡＣＣの切断に対して増加した比活性を示した。たとえば、Ｑ３６６Ｖ−ＦＶＩＩａは、野生型ＦＶＩＩａ変異体を用いて観察されたものよりも４倍大きな、メシル−ｄＦＰＲ−ＡＣＣの切断に対する比活性を示した。Ｈ３７３Ｆ突然変異を含有するＦＶＩＩａ変異体もまた、野生型ＦＶＩＩａポリペプチドと比較して、メシル−ｄＦＰＲ−ＡＣＣの切断に対する増加した比活性を示す傾向があった。

実施例１５
ＦＸの活性化および活性部位滴定剤フルオレスセイン−モノ−ｐ’−グアニジノベンゾエート（ＦＭＧＢ）を使用する触媒活性プロテアーゼの濃度の決定
チモーゲンのストック溶液において、触媒的に活性になることができる第Ｘ因子（ＦＸ）の濃度は、ラッセルクサリヘビ蛇毒（ＲＶＶ−ａｓｅ）を用いるＦＸサンプルの活性化、その後に続く、フルオレスセイン−モノ−ｐ’−グアニジノベンゾエート（ＦＭＧＢ）、トリプシン様セリンプロテアーゼに対する活性部位滴定剤として開発された蛍光発生エステル基質を用いる活性因子Ｘ（ＦＸａ）の滴定によって、決定した。活性化の後で、活性部位滴定アッセイは、少し改変して、本質的にBock et al.（Archives of Biochemistry and Biophysics (1989) 273:375-388）によって記載されるように実行した。ＦＭＧＢは、容易に、ＦＸａと反応するが、ＦＸまたは不活性プロテアーゼとは反応せず、ＦＭＧＢの濃度が、飽和しており、脱アシル化が、とりわけ遅く、触媒の律速となる条件下で、有効に安定したアシル酵素中間体を形成する。これらの条件下で、ＦＸａプロテアーゼは、１回の触媒代謝回転を受けて、フルオレスセイン蛍光体を放出する。蛍光発光の初期バーストを、フルオレスセイン蛍光発光の外部濃度標準曲線に較正する場合、活性部位の濃度を、計算することができる。

ＦＸａ活性化反応液は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．１％ＰＥＧ ８０００、ｐＨ８．１を含有する反応緩衝液における５０〜１００μＬの最終容量において、１０μＭ ＦＸの最終濃度（Ａ_２８０吸光度および１．１６の吸光係数に基づく）で、調製した。活性化は、活性化時間の４５〜６０分間（サンプルを１５分ごとに収集し、Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ ＦＸａ蛍光発生基質の切断の増加を試験することによって、完全な活性化を表すために以前に決定した）、３７℃で、５μｇ／ｍｌの最終濃度までのＲＶＶ−ａｓｅの添加によって（１００μＬ反応液当たり５μＬの９８μｇ／ｍｌ希釈溶液または５０μＬ反応液当たり２．５μＬ）、開始した。反応は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＰＥＧ ８０００、ｐＨ８．１を含有する消光緩衝液の１／１０容量を用いて止めた。

アッセイは、連続的な撹拌下で、０．４ｃｍ×１ｃｍの石英キュベットにおいて１ｍＬ反応容量を用いて実行した。反応液は、３０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１％ＰＥＧ ８０００、ｐＨ７．４を含有するアッセイ緩衝液において、１００〜４００ｎＭの新たに活性化されたＦＸａおよび５μＭ ＦＭＧＢを含有した。フルオレスセイン標準溶液は、ＤＭＦにおいて７０ｍＭのストック濃度で新たに調製し、濃度は、０．１Ｎ ＮａＯＨにおいて、８９，１２５Ｍ^−１ｃｍ^−１の吸光係数を使用して、４９６ｎｍで標準的な条件下で、吸光度分光法によって確認した。ＦＭＧＢは、乾燥重量に基づいて、ＤＭＦにおいて０．０１Ｍのストック濃度で調製し、濃度は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２において１９，４９８の吸光係数を使用して、４５２ｎｍで吸光度分光法によって確認した。アッセイは、１×アッセイ緩衝液に５μＬの１ｍＭ ＦＭＧＢ（５μＭ最終濃度）を添加し、ＲＶＶ−ａｓｅによる活性化前に吸光度によって決定した初期濃度に基づく約１００〜４００ｎＭの最終濃度までのＦＸａの添加の前に、最初に、約１５０〜２００秒間、ＦＭＧＢのバックグラウンド加水分解を測定することによって、開始した（上記を参照されたい）。反応のバーストフェーズにおけフルオレスセイ蛍光発光の放出を、さらに３６００秒間、続けた。遊離フルオレスセインの標準曲線は、吸光度を較正したフルオレスセイン標準物の、２６０〜３００ｎＭの最終濃度までの、２０ｎＭ間隔の、１×アッセイ緩衝液の中への滴定によって調製した。

データ分析については、反応の記録を、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージの中にインポートし、バックグラウンド加水分解の寄与率を、典型的には、総蛍光発光バーストの５％未満であった、自発的なＦＭＧＢ加水分解の初期測定速度の補外によって、曲線から引いた。補正した曲線は、式△蛍光発光＝Ａｍｐ（１−ｅ^−ｋｔ）＋Ｂｔの、線形構成成分（脱アシル化の遅い速度の説明）を有する一重指数関数方程式にフィットさせ、ここで、Ａｍｐ＝上記に概説される飽和アッセイ条件下のバーストフェーズの振幅であり、ｋは、アシル酵素形成に対して観察される一次反応定数であり、Ｂは、ＦＭＧＢの完全な代謝回転と関連するバルク速度定数である。活性ＦＸａプロテアーゼの濃度は、フルオレスセイン標準曲線に対する振幅についてのフィットパラメーターの比較によって計算する。複数回のアッセイからの値を、測定し、平均し、標準偏差を決定した。そのため、調製物における活性ＦＸａの量は、ＦＶＩＩａによって活性化され得る、ストック調製物におけるＦＸの濃度を直接的に表す。この活性部位滴定値は、実施例４において記載されるＴＦ依存性およびＴＦ非依存性アッセイなどのような間接的アッセイにおいて使用されることとなるＦＸの濃度を計算する場合、利用される。

改変は、当業者らに明白であるので、本発明が、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることが意図される。

Claims (22)

1. 配列番号３に示されるアミノ酸の配列を有するＦＶＩＩポリペプチドにおける、位置１２８、１２９、２８６および２９８に対応する位置でのアミノ酸交換を含む、改変第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドであって：
   位置１２８に対応する位置でのアミノ酸交換がＡｓｎ（Ｎ）であり、位置１２９に対応する位置でのアミノ酸交換がＡｌａ（Ａ）であり、位置２８６に対応する位置でのアミノ酸交換がＡｒｇ（Ｒ）であり、かつ位置２９８に対応する位置でのアミノ酸交換がＧｌｎ（Ｑ）であり；
   改変ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号１〜３のいずれかのポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有し；
   改変ＦＶＩＩポリペプチドにおける対応する位置が、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する改変ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸配列のアラインメントにより同定され；かつ
   改変ＦＶＩＩポリペプチドが、その活性化形態にある場合、凝血促進活性を示す、
   改変第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチド。
2. 配列番号１〜３のいずれかのポリペプチドにおいてアミノ酸交換Ｑ２８６Ｒ、Ｍ２９８Ｑ、Ｐ１２９ＡおよびＴ１２８Ｎを含む、請求項１に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
3. 配列番号３のポリペプチドにおいてアミノ酸交換Ｑ２８６Ｒ、Ｍ２９８Ｑ、Ｐ１２９ＡおよびＴ１２８Ｎを含む、請求項１に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
4. ＦＶＩＩａポリペプチドである、請求項１〜３のいずれかに記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
5. １２８Ｎ／１２９Ａ／２８６Ｒ／２９８Ｑに加えて最大４つの突然変異を含有する、請求項１〜４のいずれかに記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
6. 改変ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸残基の配列が配列番号２８０に示されるアミノ酸の配列からなる、請求項１に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
7. 二本鎖活性化第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドである、請求項１に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチドであって、位置１５２のアルギニンと位置１５３のイソロイシンの間で切断される、配列番号２８０に示されるアミノ酸の配列からなる、改変ＦＶＩＩポリペプチド。
8. 第一および第二の鎖がそれぞれ、互いにジスルフィド結合を介して連結されている、配列番号２８０のアミノ酸１〜１５２および１５３〜４０６からなる、請求項７に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
9. 翻訳後修飾を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
10. 翻訳後修飾がグリコシル化を含む、請求項９に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
11. 二本鎖活性化ＦＶＩＩａポリペプチドである、請求項１〜１０のいずれかに記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
12. 一本鎖ポリペプチドである、請求項１〜４、９および１０のいずれかに記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
13. 請求項１〜６のいずれかに記載の改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含む核酸分子。
14. 請求項１３に記載の核酸分子を含むベクター。
15. 請求項１４に記載のベクターを含む細胞。
16. 薬学的に許容可能な媒体中に、治療有効濃度または治療有効量の請求項１〜１２のいずれかに記載の改変ＦＶＩＩポリペプチドを含む、医薬組成物。
17. 単回投与用に製剤されている、請求項１６に記載の医薬組成物。
18. 経口投与、経鼻投与、経肺投与、頬側投与、経皮投与、皮下投与、十二指腸内投与、経腸投与、非経口投与、静脈内投与、または筋肉内投与用に製剤されている、請求項１７に記載の医薬組成物。
19. 凍結乾燥されている、請求項１６〜１８のいずれかに記載の医薬組成物。
20. 血液凝固障害、出血性障害、血友病、第ＶＩＩ因子欠乏症、出血障害、手術による出血、または外傷に起因する出血の中から選択される疾患または状態の治療における使用のための、請求項１〜１２のいずれかに記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
21. 治療される疾患または状態が血友病である、請求項２０に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
22. 疾患または状態が血友病であり、血友病が、血友病Ａまたは血友病Ｂまたは血友病Ｃである、請求項２１に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。

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