MX2008002395A - Factor vii y factor viia glicopegilados. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona conjugados entre peptidos de Factor VII o Factor VIIa y porciones de PEG. Los conjugados se enlazan mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto que esta interpuesto entre y unido covalentemente al peptido y el grupo modificador. Los conjugados se forman tanto de peptidos glicosilados como no glicosilados por la accion de una glicosiltransferasa. La glicosiltransferasa liga una porcion de azucar modificado en ya sea un residuo de aminoacido glicosilo en el peptido. Tambien se proporcionan formulaciones farmaceuticas que incluyen los conjugados. Los metodos para preparar los conjugados tambien estan dentro del alcance de la invencion.

Description

FACTOR VII Y FACTOR VIIA GLICOPEGILADOS Antecedentes de la invención Ahora se ha descubierto que la modificación controlada del Factor VII o Factor Vlla con una o más porciones de poli (etilenglicol) da un nuevo conjugado de péptido de Factor VII o Factor Vlla con propiedades farmacocinéticas que se mejoran con relación al Factor VII o Factor Vlla nativo (no pegilado) correspondiente. Adicionalmente, se han descubierto y desarrollado métodos efectivos en el costo para la producción confiable y reproducible de los conjugados de péptido de Factor VII o Factor Vlla. En una modalidad de ejemplo, las moléculas de Factor VII o Factor Vlla "glicopegiladas" de la invención se producen por la formación mediada por enzimas de un conjugado entre un péptido de Factor VII o Factor Vlla glicosilado o no glicosilado y una porción de sacarilo enzimáticamente transferible que incluye dentro de su estructura un grupo modificador, tal como un grupo modificador polimérico tal como poli (etilenglicol) . La porción de PEG se une a la porción de sacarilo directamente (es decir, a través de un grupo individual formado por la reacción de dos grupos reactivos) o a través de una porción ligadora, por ejemplo, alquilo sustituido o insustituido, Ref: 190445 heteroalquilo sustituido o insustituido, etc. De esta manera, en un aspecto, la presente invención proporciona un conjugado entre una porción de PEG, por ejemplo, PEG y un péptido que tiene una actividad in vivo similar o de otro modo análogo al Factor VII o Factor Vlla reconocido en la técnica. En el conjugado de la invención, la porción de PEG se une covalentemente al péptido mediante un grupo intacto de enlace de glicosilo. Los grupos de enlace de glicosilo intactos de ejemplo incluyen porciones de ácido siálico que se derivatizan con PEG. El grupo modificador polimérico se puede unir en cualquier posición de una porción de glicosilo del Factor VII o Factor Vlla. Además, el grupo modificador polimérico se puede unir a un residuo de glicosilo en cualquier posición en la secuencia de aminoácidos de un péptido de Factor VII o Factor Vlla tipo silvestre o mutante. En una modalidad de ejemplo, la invención proporciona un péptido de Factor VII o Factor Vlla que se conjuga a través de un grupo de enlace de glicosilo a un grupo modificador polimérico. Los conjugados de péptido de Factor VII o Factor Vlla de ejemplo incluyen un grupo de enlace de glicosilo que tiene una fórmula seleccionada de: En las Fórmulas I y II, R2 es H, CH2OR7, COOR7, COO" u OR7, en las cuales R7 representa H, alquilo sustituido o insustituido o heteroalquilo sustituido o insustituido. Los símbolos R3, R4, R5, R6 y R6' representan independientemente H, alquilo sustituido o insustituido, OR8, NHC(0)R9. El índice d es 0 ó 1. R8 y R9 se seleccionan independientemente de H, alquilo sustituido o insustituido, heteroalquilo sustituido o insustituido o ácido siálico. Al menos uno de R3, R4, R5, R6 o R6' incluye el grupo modificador polimérico, por ejemplo, PEG. En una modalidad de ejemplo, R6 y R6' , junto con el carbono al cual se unen son componentes de la cadena lateral de una porción de sialilo. En una modalidad de ejemplo adicional, esta cadena lateral se funcionaliza con el grupo modificador polimérico. En una modalidad de ejemplo, el grupo modificador polimérico se une al grupo de enlace de glicosilo, en general a través de un heteroátomo en el núcleo de glicosilo (por ejemplo, N, O), a través de un ligador, L, como se muestra a continuación: (R1)w—L R1 es el grupo modificador polimérico y L se selecciona de un enlace y un grupo de enlace. El índice w representa un número entero seleccionado de 1-6, de manera preferente 1-3 y de manera más preferente 1-2. Los grupos de enlace de ejemplo incluyen alquilo sustituido o insustituido, porciones de heteroalquilo sustituido o insustituido y ácido siálico. Un componente de ejemplo del ligador es una porción de acilo. Otro grupo de enlace de ejemplo es un residuo de aminoácidos (por ejemplo, cisteína, serina, lisina y oligopéptidos cortos, por ejemplo, Lys-Lys, Lys-Lys-Lys, Cys-Lys, Ser-Lys, etc.). Cuando L es un enlace, se forma por reacción de un grupo funcional reactivo en un precursor de R1 y un grupo funcional reactivo de la reactividad complementaria en un precursor del grupo de enlace de glicosilo. Cuando L es un grupo de enlace de orden no cero, L puede estar en el lugar en la porción de glicosilo antes de la reacción con el precursor de R1. De manera alternativa, los precursores de R1 y L se pueden incorporar en un cásete preformado que se une de manera subsiguiente a la porción de glicosilo. Como se expone en la presente, la selección y preparación de precursores con grupos funcionales reactivos apropiados está dentro de la capacidad de aquéllos expertos en la técnica. Además, el acoplamiento de los precursores prosigue por la química que es bien entendida en la técnica.

En una modalidad de ejemplo, L es un grupo de enlace que se forma de un aminoácido, o péptido pequeño (por ejemplo, 1-4 residuos de aminoácidos) que proporciona un azúcar modificada en la cual, la porción modificadora polimérica se une a través de un ligador de alquilo sustituido. Los ligadores de ejemplo incluyen glicina, lisina, serina y cisteína. Los análogos de aminoácidos, como se define en la presente también son de uso como componentes ligadores. El aminoácido se puede modificar con un componente adicional de un ligador, por ejemplo, alquilo, heteroalquilo, unido covalentemente a través de un enlace de acilo, por ejemplo, una amida o uretano formado a través de una porción de amina del residuo de aminoácido. En una modalidad de ejemplo, el grupo de enlace de glicosilo tiene una estructura de acuerdo a la Fórmula I y R5 incluye el grupo modificador polimérico. En otra modalidad de ejemplo, R5 incluye tanto la porción modificadora polimérica y un ligador, L, que une la porción modificadora polimérica al grupo de glicosilo. L puede ser una estructura lineal o ramificada. De manera similar, el grupo modificador polimérico puede estar ramificado o ser lineal . El grupo modificador polimérico comprende dos o más unidades de repetición que pueden ser solubles en agua o esencialmente insolubles en agua. Los polímeros solubles en agua de ejemplo de uso en los compuestos de la invención incluyen PEG, por ejemplo, m-PEG, PPG, por ejemplo, m-PPG, ácido polisiálico, poliglutamato, poliaspartato, polilisina, polietilenimina, polímeros biodegradables (por ejemplo, poliláctido, poliglicérido) , y PEG funcionalizado, por ejemplo, PEG terminal-funcionalizado . El núcleo de glicosilo de los grupos de enlace de glicosilo de uso en los conjugados de péptido de Factor VII o Factor Vlla se selecciona tanto de furanosas como piranosas naturales y no naturales. Los sacáridos no naturales incluyen opcionalmente una porción de hidroxilo y/o amina alquilada o acilada, por ejemplo, éteres, esteres y sustituyentes de amida en el anillo. Otros sacáridos no naturales incluyen un H, sustituyentes de hidroxilo, éster, éster o amida en una posición en el anillo en la cual este sustituyente no está presente en el sacárido natural. De manera alternativa, el carbohidrato está ausente, un sustituyente que se encontraría en el carbohidrato del cual se deriva su nombre, por ejemplo, azúcar desoxi. Aún además, los azúcares no naturales de ejemplo incluyen carbohidratos tanto oxidados (por ejemplo, ácidos -ónicos y -urónicos) y residuos (alcoholes de azúcar) . La porción de azúcar puede ser un mono-, oligo- o poli-sacárido. Los azúcares naturales de ejemplo de uso como componentes de grupos de enlace de glicosilo en la presente invención incluyen glucosa, glucosamina, galactosa, galactosamina, mucosa, mañosa, manosamina, xilanosa, ribosa, N-acetil-glucosa, N-acetil-glucosamina, N-acetil-galactosa, N-acetil-galactosamina, y ácido siálico. Breve descripción de la invención En una modalidad, la presente invención proporciona un conjugado de péptido de Factor VII o Factor Vlla que comprende la porción: en donde D es un miembro seleccionado de -OH y R1-L-HN-; G es un miembro seleccionado de H y R1-L- y -C(O) (Ci- e ) alquilo, R1 es una porción que comprende un residuo de poli (etilenglicol) de cadena recta o ramificada; y L es un ligador, por ejemplo, un alquilo unido ("de orden cero"), sustituido o insustituido y heteroalquilo sustituido o insustituido. En modalidades de ejemplo, cuando D es OH, G es Rx-L-, y cuando G es -C(O) (d-C6) alquilo, D es R1-L-NH-. En otro aspecto, la invención proporciona un conjugado de péptido de Factor VII o Factor Vlla que comprende un péptido que puede ser Factor VII o Factor Vlla. El conjugado también comprende un grupo de enlace de glicosilo, en donde el grupo de enlace de glicosilo se une a un residuo de aminoácido del péptido, y en donde el grupo de enlace de glicosilo comprende un grupo de enlace de sialilo que tiene una fórmula que es un miembro seleccionado de: en donde R16-X2 X5-C "\ R17-X4 son grupos modificadores . R2 es un miembro seleccionado de R2 es H , CH2OR7 , COOR7 , COO" u OR7 . R7 es un miembro seleccionado de H, alquilo sustituido o insustituido y heteroalquilo sustituido o insustituido . R3 y R4 son miembros independientemente seleccionados de H, alquilo sustituido o insustituido, OR8, y NHC(0)R' R y R- se seleccionan independientemente de H, alquilo sustituido o insustituido, heteroalquilo sustituido o insustituido y sialilo. L8 es un ligador seleccionado de un enlace, alquilo sustituido o insustituido y heteroarilo sustituido o insustituido. X5, R16 y R17 se seleccionan independientemente de grupo no reactivo y brazos poliméricos (por ejemplo, PEG) . X2 y X4 se seleccionan independientemente de fragmentos de enlace que unen porciones poliméricas R16 y R17 a C. El índice j es un número entero seleccionado de 1 a 15. En otra modalidad de ejemplo, el grupo modificador polimérico tiene una estructura de acuerdo a la siguiente fórmula : en la cual los índices m y n son números enteros seleccionados independientemente de 0 a 5000. A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10 y A11 son miembros independientemente seleccionados de H, alquilo sustituido o insustituido, heteroalquilo sustituido o insustituido, cicloalquilo sustituido o insustituido, heterocicloalquilo sustituido o insustituido, arilo sustituido o insustituido, heteroarilo sustituido o insustituido, -NA12A13, -OA12 y - SiA12A13. A12 y A13 son miembros independientemente seleccionados de alquilo sustituido o insustituido, o heteroarilo sustituido o insustituido, cicloalquilo sustituido o insustituido, heterocicloalquilo sustituido o insustituido, arilo sustituido o insustituido, y heteroarilo sustituido o insustituido. En una modalidad de ejemplo, el grupo modificador polimérico tiene una estructura de acuerdo a las siguientes fórmulas : En otra modalidad de ejemplo, de acuerdo a la fórmula anterior, el grupo modificador polimérico tiene una estructura de acuerdo a la siguiente formula: En una modalidad de ejemplo, A1 y A2 son cada uno miembros seleccionados de -OH y -OCH3. Los grupos modificadores poliméricos de ejemplo de acuerdo a esta modalidad incluyen: La invención proporciona un conjugado de péptido de Factor VII o Vlla que comprende un péptido que es un miembro seleccionado del Factor VII y Factor Vlla. El conjugado también comprende un grupo de enlace de glicosilo, en donde el grupo de enlace de glicosilo se une a un residuo de aminoácido del péptido, y en donde el grupo de enlace de glicosilo comprende un glicosilo de enlace de sialilo que tiene la fórmula: en donde es un grupo modificador. El índice s es un número entero seleccionado de 1 a 20. El índice f es un número entero seleccionado de 1 a 2500. Q es un miembro seleccionado de H y Ci-Cßalquilo sustituido o insustituido. En una modalidad de ejemplo, la invención proporciona un azúcar modificado que tiene la siguiente fórmula : La presente invención proporciona métodos para formar conjugados de péptidos de Factor VII, por ejemplo, Factor VII y Factor Vlla. Los métodos incluyen poner en contacto un péptido de Factor Vil/Factor Vlla con un donante de azúcar modificado que tiene un grupo modificador unido covalentemente a un azúcar. La porción de azúcar modificado se transfiere desde el donante a un residuo de aminoácido o glicosilo del péptido de Factor Vil/Factor Vlla por la acción de una enzima. Las enzimas representativas incluyen, pero no se limitan a, glicosiltransferasas, por ejemplo, sialiltransferasas . El método incluye poner en contacto el péptido de Factor Vil/Factor Vlla con: a) un donante de azúcar modificado; y b) una enzima capaz de transferir una porción de azúcar modificado desde el donante de azúcar modificado en un residuo de aminoácido o glicosilo del péptido, bajo condiciones apropiadas para transferir una porción de azúcar modificado desde el donante a un residuo de aminoácido o glicosilo del péptido, sintetizando de este modo el conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla. En una modalidad preferida, antes del paso a) , el péptido se pone en contacto con una sialidasa, removiendo de este modo al menos una porción del ácido siálico en el péptido . En otra modalidad preferida, el péptido de Factor Vil/Factor Vlla se pone en contacto con una sialidasa, una glicosiltransferasa y un donante de azúcar modificado. En esta modalidad, el péptido está en contacto con la sialidasa, glicosiltransferasa y donante de azúcar modificado esencialmente de forma simultánea, no importa el orden de adición de los varios componentes. La reacción se llevó a cabo bajo condiciones apropiadas para que la sialidasa remueva un residuo de ácido siálico del péptido; y la glicosiltransferasa transfiera una porción de azúcar modificado desde el donante de azúcar modificado a un residuo de aminoácido o glicosilo del péptido. En otra modalidad preferida, la desialilación y conjugación se realizan en el mismo recipiente, y el péptido desialilado de manera preferente no se purifica antes del paso de conjugación. En otra modalidad de ejemplo, el método comprende además un paso de "coronación" que comprende la sialilación del conjugado de péptido. Este paso se realiza en el mismo recipiente de reacción que contiene la sialidasa, siaililtransferasa y donante de azúcar modificado sin purificación anterior. En otra modalidad preferida, la desialilación del péptido de Factor Vil/Factor Vlla se realiza, y se purifica el asialo-péptido. El asialo-péptido purificado entonces se somete a condiciones de reacción de conjugación. En otra modalidad de ejemplo, el método comprende además un paso de "coronación" que comprende la sialilacion del conjugado de péptido. Este paso se realiza en el mismo recipiente de reacción que contiene la sialidasa, sialiltransferasa y donante de azúcar modificado sin purificación anterior. En otra modalidad de ejemplo, el paso de coronación, la sialilacion del conjugado de péptido, se realiza en el mismo recipiente de reacción que contiene la sialidasa, sialiltransferasa y donante de azúcar modificado sin purificación anterior. En una modalidad de ejemplo, la puesta en contacto es durante un tiempo de menos de 20 horas, de manera preferente menos de 16 horas, de manera más preferente menos de 12 horas, de manera aún más preferente menos de 8 horas, y de manera aún más preferente menos de 4 horas. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una mezcla de reacción de conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla. La mezcla de reacción comprende: a) una sialidasa; b) una enzima que es un miembro seleccionado de glicosiltransferasa, exoglicosidasa y endoglicosidasa; c) un azúcar modificado; y d) un péptido de Factor Vil/Factor Vlla. En otra modalidad de ejemplo, la relación de la sialidasa al péptido. de Factor Vil/Factor Vlla se selecciona de 0.1 U/L: 2 mg/mL a 10 U/L: 1 mg/mL, de manera preferente 0.5 U/L: 2 mg/mL, más preferentemente 1.0 U/L: 2 mg/mL, aún más preferentemente 10 U/L: 2 mg/mL, aún más preferentemente 0.1 U/L: 1 mg/mL, más preferentemente 0.5 U/L: 1 mg/mL, aún más preferentemente 1.0 U/L: 1 mg/mL, y aún más preferentemente 10 U/L: 1 mg/mL. En una modalidad de ejemplo, al menos 10 %, 20 %, %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % u 80 % del conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla incluye a lo mucho dos porciones de PEG. Las porciones de PEG se pueden adicionar en un proceso de una marmita, o se pueden adicionar después de que se purifica el asialo-Factor Vil/Factor Vlla.

En otra modalidad de ejemplo, al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % u 80 % del conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla incluye a lo mucho una porción de PEG. La porción de PEG se puede adicionar en un proceso de una marmita, o se puede adicionar después de que se purifica el asialo-Factor Vil/Factor Vlla. En una modalidad adicional de ejemplo, el método comprende además "coronar", o adicionar ácido siálico al conjugado de péptido. En otra modalidad de ejemplo, se adiciona sialidasa, seguida por un retraso de 30 minutos, 1 hora, 1.5 horas, o 2 horas, seguido por la adición de la glicosiltransferasa, exoglicosidasa, o endoglicosidasa. En otra modalidad de ejemplo, se adiciona sialidasa, seguida por un retraso de 30 minutos, 1 hora, 1.5 horas, o 2 horas, seguido por la adición de glicosiltransferasa, exoglicosidasa, o endoglicosidasa.

Serán evidentes, para aquéllos expertos en la técnica a partir de la descripción detallada que sigue, otros objetos y ventajas de la invención. En otra modalidad de ejemplo, el método incluye: (a) poner en contacto un péptido de Factor Vil/Factor Vlla que comprende un grupo glicosilo seleccionado de: ¿ GalNAc con un azúcar modificado que tiene la fórmula: y una transferasa apropiada que transfiere el grupo de enlace de glicosilo en un miembro seleccionado de GalNAc, Gal y el Sia del grupo glicosilo, bajo condiciones apropiadas para esta transferencia. Un azúcar modificado de ejemplo es CMP-ácido siálico modificado, a través de una porción ligadora, con un polímero, por ejemplo, una porción de poli (etilenglicol) de cadena recta o ramificada. El péptido se puede adquirir de esencialmente cualquier fuente, sin embargo, en una modalidad, antes de que se modifique como se analiza anteriormente, el péptido de Factor Vil/Factor Vlla se expresa en un hospedador adecuado. Las células de mamífero (por ejemplo, BHK, CHO), bacteria (por ejemplo, E. coli) y de insecto (por ejemplo, Sf-9) son sistemas de expresión de ejemplo que proporcionan Factor Vil o Factor Vlla de uso en las composiciones y métodos expuestos en la presente. En modalidades de ejemplo, se puede administrar un conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla a pacientes para el tratamiento de una lesión de tejido tal como isquemia, trauma, inflamación, o contacto con sustancias tóxicas. En otras modalidades de ejemplo, se puede administrar un conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla a pacientes para el tratamiento de un paciente que tenga Hemofilia A, un paciente con Hemofilia B, un paciente que tenga Hemofilia A, en donde el paciente tiene también anticuerpos al factor VIII, un paciente que tiene Hemofilia B, en donde el paciente también tiene anticuerpos al factor IX, y un paciente que tiene cirrosis hepática. En otra modalidad de ejemplo, se puede administrar un conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla a pacientes para el tratamiento contra sangrado en emergencias, cirugía electiva, cirugía cardiaca, cirugía espinal, trasplante de hígado, hepatectomías parciales, reconstrucción de fractura pelvicacetabular, y trasplante alogeneico de células madre. En otra modalidad de ejemplo, se puede administrar un conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla a pacientes para el tratamiento contra hemorragia intracerebral aguda, lesión cerebral traumática, sangrados variceales y sangrado gastrointestinal superior. En otro aspecto, la invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende un conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla y un portador farmacéuticamente aceptable. En el conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla, esencialmente cada uno de los residuos de aminoácido al cual se une el grupo de enlace de glicosilo o grupo modificador tiene la misma estructura. Por ejemplo, si un péptido incluye un residuo de glicosilo Thr-enlazado, al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 %, 99.2 %, 99.4 %, 99.6 %, o de manera más preferente 99.8 % de los péptidos en la población tendrá el mismo grupo de enlace de glicosilo unido covalentemente al mismo residuo de Thr. Otros objetos y ventajas de la invención serán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción detallada que sigue.

Breve Descripción de las Figuras La Figuras 1A-1B ilustra nucleótidos de ácido siálico modificado de ejemplo útiles en la práctica de la invención. Figura 1A. Estructura de nucleótidos de azúcar de CMP-ácido siálico-PEG ramificados de ejemplo (por ejemplo, de 30 KDa, 40 KDa) . Figura IB. Estructura de Factor Vlla lineal-SA-PEG-10 KDa. La Figura 2 es un esquema sintético para producir un precursor de grupo de enlace de PEG-glicosilo de ejemplo (azúcar modificado) de uso en la preparación de los conjugados de la invención. Las Figuras 3A-3N son tablas que proporcionan sialiltransferasas de ejemplo de uso en la formación de glicoconjugados de la invención, por ejemplo, a péptidos glicoPEGilados con un ácido siálico modificado. Las Figuras 4A a 4E, exponeN esquemas de ejemplo para remodeiar estructuras de glicano en Factor VII y Factor Vlla. La Figura 4A es un diagrama que representa los péptidos de Factor VII y Factor Vlla que indican los residuos que se unen a glicanos contemplados para remodelado. La Figura 4B es un diagrama que representa los péptidos A (línea continua) y B (línea punteada) de Factor VII y Factor Vlla que indican los residuos que se unen a los glicanos contemplados para remodelado, y las fórmulas para los glicanos. Las Figuras 4C a 4E son diagramas de los pasos de remodelación contemplados del glicano del péptido en la Figura 4B con base en el tipo de células en la cual se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada, deseada . Las Figuras 5A-5B, son secuencias de nucleótidos de ejemplo y secuencias de aminoácidos correspondiente de Factor Vlla (SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente) . La Figura 6 es una imagen de un gel de enfoque isoeléctrico (pH 3-7) de asialo-Factor Vlla. Senda 1 es Factor Vlla; Sendas 2-5 son asialo-Factor Vlla. La Figura 7 es una gráfica de los espectros MALDI del Factor Vlla. La Figura 8 es una gráfica de los espectros MALDI de Factor VIIa-SA-PEG-1 KDa. La Figura 9 es una gráfica que representa los espectros MALDI de Factor VIIa-SA-PEG-10 KDa. La Figura 10 es una imagen de un gel de SDS-PAGE del Factor Vlla PEGilado. La Senda 1 es asialo-Factor Vlla. La Senda 2 es el producto de la reacción de asialo-Factor Vlla y CMP-SA-PEG-1 KDa con ST3Gal3 después de 48 horas. La Senda 3 es el producto de la reacción de asialo-Factor Vlla y CMP-SA-PEG-1 KDa con ST3Gal3 después de 48 horas. La Senda 4 es el producto de la reacción de asialo-Factor Vlla y CMP-SA-PEG-10 KDa con ST3Gal3 a 96 horas. Las Figuras 11A-11B muestran desialilación simultánea, con menos sialidasa, y PEGilación. Estas figuras resaltan que la coronación en la presencia de sialidasa es eficiente. La Figura HA muestra el curso de reacción cuando la sialidasa está a un nivel de 0.5 U/L. La Senda 1 corresponde al Factor Vlla nativo en tanto que la Senda 2 es asialo-Factor Vlla. De la Senda 3 a la Senda 7, hay una cantidad creciente de producto PEGilado conforme progresa el tiempo. En la Senda 3, el producto principal está monoPEGilado (ver punto en 64), en tanto que las alícuotas valoradas en momentos posteriores muestran la formación y cantidades crecientes de productos di- (ver punto justo por debajo de 97), tri-(ver punto justo por debajo de 97), y superior-PEGilados . Las Sendas 8 y 9 muestran los resultados de la "coronación", o adición de ácido siálico, a la reacción. Cuando se corona la reacción, el grado de reacción se detiene, como se puede ver de la distribución de productos PEGilados similares encontrados en las Sendas 5, 8 y 9. La Figura 11B muestra el curso de la reacción cuando la sialidasa está a un nivel de 0.1 U/L. Figuras 12A y 12B. La Figura 12A muestra la situación cuando la sialidasa y la glicosiltransferasa se adicionan al mismo tiempo. La Figura 12B muestra la situación cuando se adiciona primero sialidasa, seguido por glicosiltransferasa después de un retraso de 30 minutos. Las Figuras 13A-13CC es una tabla de los péptidos a los cuales se pueden unir uno o más grupos de enlace de glicosilo a fin de proporcionar los conjugados de péptido de la invención. Las Figuras 14A y 14B presentan cromatogramas que muestran los resultados de experimentos de HPLC. La Figura 14A muestra cromatogramas marcados de Factor VIIa-SA-PEG-10 KDa (superior) y control de Factor Vlla nativo (fondo) analizados por el método de cadena ligera. La separación de LC (cadena ligera), 1x10 KDa-PEG-LC, 2x10 KDa-PEG-LC, y 3x10 KDa-PEG-LC de otros productos se muestra. La Figura 14B muestra cromatogramas marcados de Factor VII-SA-PEG-10 KDa (superior) y control de Factor Vlla nativo (fondo) analizados por el método de cadena pesada. La separación de HC ( cadena pesada) , 1x10 KDa-PEG-HC , 2x10 KDa-PEG-HC , y 3x10 KDa-PEG-HC de otros productos se muestra . Las Figuras 15A y 15B presentan cromatogramas que muestran los resultados de experimentos de HPLC . La Figura 15A presenta cromatogramas marcados de control de Factor Vlla masivo reducido (parte superior ) y Factor Vlla reducido-SA-PEG-40 KDa ( fondo ) analizados por el método de cadena ligera . La separación de LC ( cadena ligera) , 1x40 KDa-PEG-LC , 2x40 KDa-PEG-LC , y 3x40 KDa-PEG-LC de los otros productos se muestra . La Figura 15B presenta cromatogramas marcados de control de Factor Vlla nativo reducido (parte superior ) y Factor VIIa-SA-PEG-40 KDa ( fondo ) analizados por el método de cadena pesada . Se muestra la separación de HC ( cadena pesada ) , 1x40 KDa-PEG-HC , 2x40 KDa-PEG-HC , y 3x40 KDa-PEG-HC de otros productos . La figura 16 ilustra la estructura general de los conj ugados de la invención .

Descripción Detallada de la Invención Abreviaciones PEG, poli (etilenglicol) ; PPG, poli (propilenglicol) ; Ara, arabinosilo; Fru, fructosilo; Fue, fucosilo; Gal, galactosilo; GalNAc, N-acetilgalactosaminilo; Glc, glucosilo; GlcNAc, N-acetilglucosaminilo; Man, manosilo; ManAc, acetato de manosaminilo; Xyl, xilosilo; NeuAc, sialilo o N-acetilneuraminilo; Sia, sialilo o N-acetilneuraminilo; y derivados y análogos de los mismos.

Definiciones A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen en general el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la cual corresponde la invención. En general, la nomenclatura usada en la presente y los procedimientos de laboratorio en cultivo celular, genética molecular, química orgánica y química de ácido nucleico e hibridación son aquéllos bien conocidos y empleados comúnmente en la técnica. Se usan técnicas normales para síntesis de péptidos y ácido nucleico. Las técnicas y procedimientos se realizan en general de acuerdo a métodos convencionales en la técnica y varias referencias generales (ver, en general, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., que se incorpora en la presente como referencia) , que se proporcionan a todo lo largo de este documento. La nomenclatura usada en la presente y los procedimientos de laboratorio en química analítica, y la síntesis orgánica descrita más adelante son aquéllos bien conocidos y empleados comúnmente en la técnica. Se usan técnicas normales, o modificaciones de las mismas, para síntesis químicas y análisis químicos. Todos los oligosacáridos descritos en la presente se describen con el nombre o abreviación para el sacárido no reductor (es decir, Gal) , seguido por la configuración del enlace glicosídico (a o ß) , el enlace de anillo (1 ó 2), la posición de anillo del sacárido reductor comprendido en el enlace (2, 3, 4, 6 u 8), y luego el nombre o abreviación del sacárido reductor (es decir, GlcNAc) . Cada sacárido es preferentemente una piranosa. Para una revisión de la nomenclatura de glicobiología estándar, ver, Essen tials of Glycobiology Varki et al . eds. CSHL Press (1999). Se consideran oligosacáridos que tienen un extremo reductor y un extremo no reductor, si o no el sacárido en el extremo reductor es en realidad un azúcar reductor. De acuerdo con la nomenclatura aceptada, se representan oligosacáridos en la presente con el extremo no reductor a la izquierda y el extremo reductor a la derecha. El término "ácido siálico" o "sialilo" se refiere a cualquier miembro de una familia de azúcares carboxilados de nueve carbonos. El miembro más común de la familia de ácido siálico es ácido N-acetil-neuramínico (ácido 2-ceto-5-acetamido-3, 5-didesoxi-D-glicero-D-galactononulopiranos-l-ónico (abreviada frecuentemente como Neu5Ac, NeuAc, o NANA) . Un segundo miembro de la familia es ácido N-glicolil-neuramínico (Neu5Gc o NeuGc) , en el cual el grupo N-acetilo de NeuAc está hidroxilado. Un tercer miembro de la familia de ácido siálico es ácido 2-ceto-3-desoxi-nonulosónico (KDN) (Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al., J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990)). También se incluyen ácidos siálicos 9-sustituidos tal como 9-0-C?-C6acil-Neu5Ac tal como 9-0-lactil-Neu5Ac o 9-O-acetil-Neu5Ac, 9-desoxi-9-fluoro-Neu5Ac y 9-azido-9-desoxi-Neu5Ac. Para revisión de la familia de ácidos siálicos, ver, por ejemplo, Varki, Glycobiology 2:25-40 (1992); Sialic Acids : Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992)). La síntesis y uso de compuestos de ácido siálico en un procedimiento de sialilación se describe en la solicitud internacional WO 92/16640, publicada el 1 de octubre de 1992. "Péptido" se refiere a un polímero en el cual los monómeros son aminoácidos y se unen conjuntamente a través de enlaces de amida, referido alternativamente como un polipéptido. Adicionalmente, también se incluyen los aminoácidos no naturales, por ejemplo, ß-alanina, fenilglicina y homoarginina. Los aminoácidos que no se codifican genéticamente también se pueden usar en la presente invención. Además, también se pueden usar en la invención aminoácidos que se han modificado para incluir grupos reactivos, sitios de glicosilación, polímeros, porciones terapéuticas, biomoléculas y similares. Todos los aminoácidos usados en la presente invención pueden ser ya sea el isómero D o L. El isómero L se prefiere en general. Además, también son útiles otros peptidomiméticos en la presente invención. Como se usa en la presente, "péptido" se refiere tanto a péptidos glicosilados como no glicosilados . También se incluyen péptidos que están glicosilados de forma incompleta por un sistema que expresa el péptido. Para una revisión general, ver Spatola, A. F., en CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES AND PROTEINS, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983). En las Figuras 13A-13CC se proporciona un listado de algunos de los péptidos de la invención. El término "conjugado de péptido", se refiere a especies de la invención en los cuales se conjuga un péptido con un azúcar modificado como se expone en la presente. El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos que se presentan de forma natural y sintéticos, así como análogos de aminoácidos e imitadores de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos que se presentan de forma natural. Los aminoácidos que se presentan de forma natural son aquéllos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato y O-fosfoserina . Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica como un aminoácido que se presenta de forma natural, es decir, un carbono a que se une a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina-metil-sulfonio. Estos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o estructuras modificadas de péptido, pero retienen la misma estructura química básica como un aminoácido que se presenta de forma natural. Los imitadores de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de una manera similar a un aminoácido que se presenta de forma natural. Como se usa en la presente, el término "azúcar modificado" o "residuo de azúcar modificado", se refiere a un carbohidrato que se presenta de forma natural o no natural que se adiciona enzimáticamente sobre un aminoácido o un residuo de glicosilo de un péptido en un proceso de la invención. El azúcar modificado se selecciona de sustratos de enzima que incluyen, pero no se limitan a, nucleótidos de azúcar (mono-, di- y tri-fosfatos) , azúcares activados (por ejemplo, haluros de glicosilo, mesilatos de glicosilo) y azúcares que son ya sea activados o no nucleótidos. El "azúcar modificado" se funcionaliza de forma covalente con un "grupo modificador". Los grupos modificadores útiles incluyen, pero no se limitan a, porciones de PEG, porciones terapéuticas, porciones de diagnóstico, biomoléculas y similares. El grupo modificador de manera preferente no es un carbohidrato que se presenta de forma natural o un carbohidrato no modificado. El sitio de funcionalización con el grupo modificador se selecciona tal que no impida que el "azúcar modificado" se adicione enzimáticamente a un péptido . El término "soluble en agua" se refiere a porciones que tienen algún grado detectable de solubilidad en agua. Los métodos para detectar y/o cuantificar solubilidad en agua son bien conocidos en la técnica. Los polímeros solubles en agua de ejemplo incluyen péptidos, sacáridos, poli (éteres) , poli (aminas) , poli (ácidos carboxílicos) y similares. Los péptidos pueden tener secuencias mezcladas de que se componen de un aminoácido individual, por ejemplo, poli (lisina) . Un polisacárido de ejemplo es poli (ácido siálico). Un poli (éter) de ejemplo es poli (etilenglicol) . La poli (etilen-imina) es una poliamina de ejemplo, y poli (ácido acrílico) es un poli (ácido carboxílico) representativo. La estructura polimérica del polímero soluble en agua puede ser poli (etilenglicol) (es decir, PEG). Sin embargo, se debe entender que también son adecuados otros polímeros relacionados para el uso en la práctica de esta invención y que el uso del término PEG o poli (etilenglicol) se propone que sea incluyente y no excluyente a este respecto. El término PEG incluye poli (etilenglicol) en cualquiera de sus formas, incluyendo alcoxi-PEG, PEG difuncional, PEG de múltiples brazos, PEG de horquilla, PEG ramificado, PEG colgante (es decir, PEG o polímeros relacionados que tienen uno o más grupos funcionales colgantes a la estructura del polímero) , o PEG con enlaces degradables en el mismo. La estructura polimérica puede ser lineal o ramificada. Las estructuras poliméricas ramificadas se conocen en general en la técnica. Típicamente, un polímero ramificado tiene una porción de núcleo de ramificación central y una pluralidad de cadenas lineales de polímero enlazadas al núcleo de ramificación central. PEG se usa comúnmente en formas ramificadas que se pueden preparar por la adición de óxido de etileno a varios polioles, tal como glicerol, pentaeritritol y sorbitol . La porción de ramificación central también se puede derivar de varios aminoácidos, tal como lisina. El poli (etilenglicol) ramificado se puede representar en la forma general como R(-PEG-OH)m en la cual R representa la porción de núcleo, tal como glicerol o pentaeritritol, y m representa el número de brazos. Las moléculas de PEG de múltiples brazos, tal como aquéllas descritas en la patente de los Estados Unidos Número 5,932,462, que se incorpora como referencia en la presente en su totalidad, también se puede usar como la estructura polimérica. También son adecuados para la invención muchos otros polímeros. Las estructuras poliméricas que son no peptídicas y solubles en agua, dentro de aproximadamente 2 a aproximadamente 300 sitios para unión, son particularmente útiles en la invención. Los ejemplos de polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a, otros poli (alquilenglicoles) , tal como poli (propilenglicol) ("PPG") , copolímeros de etilenglicol y propilenglicol y similares, poli (poliol oxietilado) , poli (alcohol olefínico) , poli (vinilpirrolidona) , poli (hidroxipropilmetacrilamida) , poli (ácido a-hidroxi) , poli (alcohol vinílico) , polifosfazeno, polioxazolina, poli (N-acriloilmorfolina) , tal como se describe en la patente de los Estados Unidos Número 5,629,384, que se incorpora como referencia en la presente en su totalidad, y copolímeros, terpolímeros y mezclas de los mismos. Aunque el peso molecular de cada cadena de la estructura de polímero puede variar, típicamente está en el intervalo de aproximadamente 100 Da a aproximadamente 100,000 Da, frecuentemente de aproximadamente 6,000 Da a aproximadamente 80,000 Da. El "área bajo la curva" o "AUC", como se usa en la presente en el contexto de administrar un fármaco de péptido a un paciente, se define como el área total bajo la curva que describe la concentración del fármaco en circulación sistémica en el paciente como una función del tiempo desde cero a infinito. El término "vida media" o "tl/2", como se usa en la presente en el contexto de administrar un fármaco de péptido a un paciente, se define como el tiempo requerido para que la concentración en plasma de un fármaco en un paciente se reduzca a la mitad. Puede haber más de una vida media asociada con el fármaco de péptido dependiendo de múltiples mecanismos de depuración, redistribución y otros mecanismos bien conocidos en la técnica. Usualmente, se definen vidas media alfa y beta tal que la fase alfa se asocie con la redistribución y la fase beta se asocie con la depuración. Sin embargo, con fármacos de proteína que están confinados, para la mayor parte, a la corriente sanguínea, puede haber al menos dos vidas medias de depuración. Para algunos péptidos glicosilados, la rápida depuración de la fase beta se puede mediar mediante receptores o macrófagos, o células endoteliales que reconocen galactosa terminal, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina, mañosa, o fucosa. La depuración más lenta de la fase beta puede presentarse mediante filtración glomerular renal para moléculas con un radio efectivo <2 nm (aproximadamente 68 kD) y/o captación específica o no específica y metabolismo en tejidos. La glicoPEGilación puede coronar azúcares terminales (por ejemplo, galactosa o N-acetilgalactosamina) y de este modo bloquear la rápida depuración de fase alfa mediante receptores que reconocen estos azúcares. También puede conferir un mayor radio efectivo y de este modo disminuir el volumen de distribución y captación en tejido, prolongando de este modo la fase beta tardía. De esta manera, el impacto preciso de la glicoPEGilación en las vidas medias de fase alfa y fase beta puede variar dependiendo del tamaño, estado de glicosilación, y otros parámetros, como es bien conocido en la técnica. Se encuentra explicación adicional de "vida media" en Pharmaceutical Biotechnology (1997, DFA Crommelin y RD Sindelar, eds., Harwood Publishers, Amsterdam, pp 101-120) . El término "glicoconjugación", como se usa en la presente, se refiere a la conjugación enzimáticamente mediada de una especie de azúcar modificado a un residuo de aminoácido o glicosilo de un polipéptido, por ejemplo, un péptido de G-CSF de la presente invención. Un subgénero de "glicoconjugación" es "glico-PEGilación", en la cual el grupo modificador del azúcar modificado es poli (etilenglicol) , y derivado de alquilo (por ejemplo, m-PEG) o derivado reactivo (por ejemplo, H2N-PEG, HOOC-PEG) del mismo. Los términos "gran escala" y "escala industrial" se usan de forma indistinta y se refieren a un ciclo de reacción que produce al menos aproximadamente 250 mg, de manera preferente al menos aproximadamente 500 mg, y de manera más preferente al menos aproximadamente 1 gramo de glicoconjugado al término de un ciclo individual de reacción. El término "grupo de enlace de glicosilo", como se usa en la presente, se refiere a un residuo de glicosilo al cual se une de forma covalente un grupo modificador (por ejemplo, porción de PEG, porción terapéutica, biomolécula) ; el grupo de enlace de glicosilo une el grupo modificador al resto del conjugado. En los métodos de la invención, el "grupo de enlace de glicosilo" llega a estar unido covalentemente a un péptido glicosilado o no glicosilado, enlazando de este modo el agente a un residuo de aminoácido y/o glicosilo en el péptido. Un "grupo de enlace de glicosilo" se deriva en general de un azúcar modificado" por la unión enzimática del "azúcar modificado" a un residuo de aminoácido y/o glicosilo del péptido. El grupo de enlace de glicosilo puede ser una estructura derivada de sacárido que se degrada durante la formación del cásete de grupo modificador-azúcar modificado (por ejemplo, oxidación —> formación de base de Schiff —> reducción) , o puede estar intacto el grupo de enlace de glicosilo. Un "grupo de enlace de glicosilo intacto" se refiere a un grupo de enlace que se deriva de una porción de glicosilo en la cual el monómero de sacárido que enlaza el grupo modificador y al resto del conjugado no se degrada, por ejemplo, oxida, por ejemplo, por metaperiodato de sodio. Los "grupos de enlace de glicosilo intacto" de la invención se pueden derivar de un oligosacárido que se presenta de forma natural por la adición de unidades de glicosilo o remoción de una o más unidades de glicosilo de una estructura de sacárido de origen. El término "grupo modificador no glicosídico", como se usa en la presente, se refiere a grupos modificadores que no incluyen un azúcar que se presenta de forma natural enlazado directamente al grupo de enlace de glicosilo . El término "porción de dirección", como se usa en la presente, se refiere a especies que se localizarán de forma selectiva en un tejido o región particular del cuerpo. La localización se media por reconocimiento específico de determinantes moleculares, tamaño molecular del agente o conjugado de dirección, interacciones iónicas, interacciones hidrófobas y similares. Otros mecanismos para dirigir un agente a un tejido o región particular se conocen por aquéllos expertos en la técnica. Las porciones de dirección de ejemplo incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, transíerrina, HS-glicoproteína, factores de coagulación, proteínas de suero, ß-glicoproteína, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO y similares. Como se usa en la presente, "porción terapéutica" significa cualquier agente útil para terapia que incluye, pero no se limita a, antibióticos, agentes antiinflamatorios, fármacos anti-tumor, citotoxinas, y agentes radioactivos. La "porción terapéutica" incluye profármacos de agentes bioactivos, construcciones en las cuales se une más de una porción terapéutica a un portador, por ejemplo, agentes multivalentes . La porción terapéutica también incluye proteínas y construcciones que incluyen proteínas. Las proteínas de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, Factor de Estimulación de Colonias de Granulocitos (GCSF) , Factor de Estimulación de Colonias de Macrófagos de Granulocitos (GMCSF) , Interferón (por ejemplo, Interferón-a, -ß, -?) , Interleucina (por ejemplo, Interleucina II), proteínas de suero (por ejemplo, Factores VII, Vlla, VIII, IX, y X) , Gonadotropina Coriónica Humana (HCG) , Hormona Estimuladora de Folículo (FSH) y Hormona Lutenizante (LH) y proteínas de fusión de anticuerpo (por ejemplo, Receptor de Factor de Necrosis Tumoral ( (TNFR) /dominio de fusión de proteína Fe) ) . Como se usa en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier material, que cuando se combina con el conjugado retiene la actividad de los conjugados y no es reactivo con los sistemas inmunitarios del sujeto. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los portadores farmacéuticos estándar tal como una solución salina amortiguada con fosfato, agua, emulsiones tal como emulsión de aceite/agua, y varios tipos de agentes humectantes. Otros portadores también pueden incluir soluciones estériles, tabletas incluyendo tabletas revestidas y cápsulas. Típicamente, estos portadores contienen excipientes tal como almidón, leche, azúcar, ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico o sales del mismo, estearato de magnesio o calcio, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, glicoles, u otros excipientes conocidos. Estos portadores también pueden incluir aditivos de sabor y color u otros ingredientes. Las composiciones que comprenden estos portadores se formulan por métodos convencionales bien conocidos. Como se usa en la presente "administración", significa administración oral, administración como un supositorio, contacto tópico, administración intravenoso, intraperitoneal, intramuscular, intralesional, intranasal o subcutánea, o la implantación de un dispositivo de liberación lenta, por ejemplo, una mini-bomba osmótica, al sujeto. La administración es por cualquier ruta que incluye parenteral y transmucosal (por ejemplo, oral, nasal, vaginal, rectal o transdérmica) . La administración parenteral incluye, por ejemplo, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intraventricular e intracraneal. Además, cuando la inyección va a tratar un tumor, por ejemplo, inducir apoptosis, la administración puede ser directamente al tumor y/o en los tejidos que circundan el tumor. Otros modos de distribución incluyen, pero no se limitan a, el uso de formulaciones liposomales, infusión intravenosa, parches transdérmicos, etc. El término "mejora" o "mejorar" se refiere a cualquier indicio de éxito contra el tratamiento de una patología o afección, incluyendo cualquier parámetro objetivo o subjetivo tal como abatimiento, remisión o disminución de síntomas o una mejora en el bienestar físico o mental del paciente. La mejora de los síntomas se puede basar en parámetros objetivos o subjetivos; incluyendo los resultados de un examen físico y/o una evaluación psiquiátrica. El término "terapia" se refiere a "que trata" o "tratamiento" contra una enfermedad o condición que incluye prevención de la enfermedad o condición de que se presente en un animal que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que aún no experimenta o exhibe síntomas de la enfermedad (tratamiento profiláctico) , que inhibe la enfermedad (disminuye o detiene su desarrollo) , que proporciona alivio de los síntomas o efectos secundarios de la enfermedad (incluyendo tratamiento paliativo) , y aliviando la enfermedad (provocando regresión de la enfermedad) . El término "cantidad efectiva" o "una cantidad efectiva a", o una "cantidad terapéuticamente efectiva" o cualquier término gramaticalmente equivalente significa la cantidad que, cuando se administra a un animal para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar el tratamiento contra esa enfermedad. El término "aislado" se refiere a un material que está sustancial o esencialmente libre de componentes, que se usan para producir el material. Para conjugados de péptido de la invención, el término "aislado" se refiere a un material que está sustancial o esencialmente libre de los componentes que normalmente acompañan al material en la mezcla usada para preparar el conjugado de péptido. Se usan de manera indistinta "aislado" y "puro". Típicamente, los conjugados de péptido aislado de la invención tienen un nivel de pureza expresado de manera preferente como un intervalo. El extremo inferior del intervalo de pureza para los conjugados de péptido es aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, o aproximadamente 80 % y el extremo superior del intervalo de pureza es aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 % o más de aproximadamente 90 %. Cuando los conjugados de péptido son más de aproximadamente 90 % puros, sus purezas también se expresan de manera preferente como un intervalo. El extremo inferior del intervalo de pureza es aproximadamente 90 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 96 % o aproximadamente 98 %. El extremo superior del intervalo de pureza es aproximadamente 92 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 100 % de pureza. La pureza se determina por cualquier método reconocido en la técnica de análisis (por ejemplo, intensidad de banda en un gel teñido con plata, electrofóresis en gel de poliacrilamida, HPLC, o un medio similar) . "Esencialmente cada miembro de la población", como se usa en la presente, describe una característica de una población de conjugados de péptido de la invención en la cual un porcentaje seleccionado de los azúcares modificados adicionados a un péptido se adicionan a múltiples sitios aceptores idénticos en el péptido. "Esencialmente cada miembro de la población" habla de la "homogeneidad" de los sitios en el péptido conjugado a un azúcar modificado y se refiere a conjugados de la invención, que son al menos aproximadamente 80 %, de manera preferente al menos aproximadamente 90 % y de manera más preferente al menos aproximadamente 95 % homogéneos. "Homogeneidad", se refiere a la consistencia estructural a través de una población de porciones aceptoras a las cuales se conjugan los azúcares modificados. De esta manera, en un conjugado de péptido de la invención en el cual se conjuga cada porción de azúcar modificado a un sitio aceptor que tiene la misma estructura como el sitio aceptor al cual se conjuga cada azúcar modificado diferente, el conjugado de péptido se dice que es aproximadamente 100 % homogéneo. La homogeneidad se expresa típicamente como un intervalo. El extremo inferior del intervalo de homogeneidad de los conjugados de péptido es aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 % o aproximadamente 80 % y el extremo superior del intervalo de pureza es aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 % o más de aproximadamente 90 %. Cuando los conjugados de péptido son más de o igual a aproximadamente 90 % homogéneos, también se expresa de manera preferente como un intervalo su homogeneidad. El extremo inferior del intervalo de homogeneidad es aproximadamente 90 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 96 %, o aproximadamente 98 %. El extremo superior del intervalo de pureza es aproximadamente 92 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 100 % de homogeneidad. La pureza de los conjugados de péptido se determina típicamente por uno o más métodos conocidos por aquéllos expertos en la técnica, por ejemplo, cromatografía liquida-espectrometría de masa (LC-MS) , espectrometría de tiempo de vuelo, de masa por desorción de láser asistido con matriz (MALDITOF) , electrofóresis capilar, y similares. "Glicoforma sustancialmente uniforme" o un "patrón de glicosilación sustancialmente uniforme", cuando se refiere a una especie de glicopéptido, se refiere al porcentaje de porciones aceptoras que están glicosiladas por la glicosiltransferasa de interés (por ejemplo, fucosiltransferasa) . Por ejemplo, en el caso de una al,2-fucosiltransferasa, existe un patrón de fucosilación sustancialmente uniforme si sustancialmente todos (como se define más adelante) del Galßl, 4-GlcNAc-R y análogos sialilados del mismo se fucosilan en un conjugado de péptido de la invención. En las estructuras fucosiladas expuestas en la presente, el enlace de Fuc-GlcNAc en general es al,6 o al,3 con al,6 preferido en general. Se entenderá por un experto en la técnica, que el material de inicio puede contener porciones aceptoras de glicosilados (por ejemplo, porciones Galßl, 4-GlcNAc-R fucosiladas). De esta manera, el por ciento calculado de glicosilación incluirá porciones aceptoras que están glicosiladas por los métodos de la invención, así como aquellas porciones aceptoras ya glicosiladas en el material de inicio. El término "sustancialmente" en las definiciones anteriores de "sustancialmente uniforme" significa en general al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, o de manera más preferente al menos aproximadamente 90 %, y de manera aún más preferente al menos aproximadamente 95 % de las porciones aceptoras para una glicosiltransferasa particular se glicosilan. Donde se especifican grupos sustituyentes por sus fórmulas químicas convencionales, escritas de izquierda a derecha, abarcan igualmente los sustituyentes químicamente idénticos, que resultan de la escritura de la estructura de derecha a izquierda, por ejemplo, -CH20- se propone también que cite -OCH2-. El término "alquilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente significa, a menos que se señale de otro modo, un radical de hidrocarburo cíclico o de cadena recta o ramificada, o una combinación de los mismos, que puede estar completamente saturado, mono- o poli-insaturado y puede incluir radicales di- y multi-valentes, que tiene el número de átomos de carbono designado (es decir, Ci-Cio significa de uno a diez átomos de carbono) . Los ejemplos de radicales de hidrocarburo saturados incluyen, pero no se limitan a, grupos tal como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciclohexilo, (ciclohexil)metilo, ciclopropilmetilo, homólogos e isómeros de, por ejemplo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo y similares. Un grupo alquilo insaturado es uno que tiene uno o más dobles enlaces o triples enlaces. Los ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen, pero no se limitan a, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2-(butadienilo) , 2, -pentadienilo, 3- ( 1, 4-pentadienilo) , etinilo, 1- y 3-propinilo, 3-butinilo, y homólogos e isómeros superiores. El término "alquilo, a menos que se señale de otro modo, también se propone que incluya aquellos derivados de alquilo definidos en más detalle más adelante, tal como "heteroalquilo". Los grupos alquilo que se limitan a grupos de hidrocarburo se llaman"homoalquilo" . El término "alquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de un alcano, como se ejemplifica, pero no limitado, por -CH2CH2CH2CH2-, e incluye además aquéllos grupos descritos más adelante como "heteroalquileno" . Típicamente, un grupo alquilo (o alquileno) tendrá de 1 a 24 átomos de carbono, con aquellos grupos que tienen 10 ó menos átomos de carbono que se prefieren en la presente invención. Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un grupo alquilo o alquileno de cadena más corta, que tiene en general de ocho o menos átomos de carbono. Los términos "alcoxi", "alquilamino" y "alquiltio" (o tioalcoxi) se usan en su sentido convencional, y se refieren a aquellos grupos alquilo unidos al resto de la molécula mediante un átomo de oxígeno, un grupo amino, o un átomo de azufre, respectivamente. El término "heteroalquilo", por sí mismo o en combinación con otro término, significa, a menos que se señale de otro modo, un radical de hidrocarburo cíclico de cadena recta o ramificada, o combinaciones de los mismos, que consiste del número señalado de átomos de carbono y al menos un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste de O, N, Si y S, y en donde los átomos de nitrógeno y azufre pueden estar oxidados opcionalmente y los heteroátomos de nitrógeno pueden estar cuaternizados de forma opcional. Los heteroátomos O, N y S y Si se pueden colocar en cualquier posición interior del grupo de heteroalquilo o en la posición en la cual el grupo alquilo se une al resto de la molécula. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, CH2-CH2-0-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N (CH3) -CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2,-S(0)-CH3, -CH2-CH2-S (O) 2-CH3, -CH=CH-0-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, y -CH=CH-N (CH3) -CH3. Hasta dos heteroátomos pueden estar consecutivos, tal como por ejemplo, -CH2-NH-OCH3 y -CH2-0-Si (CH3) 3. De manera similar, el término "heteroalquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de heteroalquilo, como se ejemplifica, pero no limitado por, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2- . Para grupos de heteroalquileno, los heteroátomos también pueden ocupar cualquiera o ambos de los términos de la cadena (por ejemplo, alquilenoxi, alquilenodioxi, alquilenoamino, alquilenodiamino, y similares) . Aún además, para grupos de enlace de alquileno y heteroalquileno, no se implica orientación del grupo de enlace por la dirección en la cual se escribe la fórmula del grupo de enlace. Por ejemplo, la fórmula -C(0)2R'- representa tanto -C(0)2R'- como -R'C(0)2-. Los términos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo" , por si mismos o en combinación con otros términos, representan, a menos que se señale de otro modo, versiones cíclicas de "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente. De forma adicional, para heterocicloalquilo, un heteroátomo puede ocupar la posición en la cual se une el heterociclo al resto de la molécula. Los ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopentilo, ciclohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, cicloheptilo y similares. Los ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, pero no se limitan a 1- (1,2, 5,6-tetrahidropiridilo) , 1-piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo, tetrahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1-piperazinilo, 2-piperazinilo, y similares . Los términos "halo" o "halógeno" , por sí mismos o como parte de otro sustituyente, significan, a menos que se señale de otro modo, un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo. Adicionalmente, los términos tal como "haloalquilo", se propone que incluyan monohaloalquilo y polihaloalquilo. Por ejemplo, el término "halo (d-C alquilo" se propone que incluye, pero no se limita a, trifluorometilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 4-clorobutilo, 3-bromopropilo, y similares . El término "arilo" significa, a menos que se señale de otro modo, un sustituyente aromático, polisaturado que puede ser un anillo individual o múltiples anillos (de manera preferente de 1 a 3 anillos) , que se fusionan conjuntamente o se enlazan de forma covalente. El término "heteroarilo" se refiere a grupos arilo (o anillos) que contienen de uno a cuatro heteroátomos seleccionados de N, O, S, en donde los átomos de nitrógeno y azufre se oxidan de forma opcional, y los átomos de nitrógeno están opcionalmente cuaternizados . Un grupo heteroarilo se puede unir al resto de la molécula a través de un heteroátomo. Los ejemplos no limitantes de grupos arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, 1-pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-bencimidazolilo, 5-indolilo, 1-isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo, tetrazolilo, benzo [b] furanilo, benzo [b] tienilo, 2, 3-dihidrobenzo [1, 4] dioxin-6-ilo, benzo [1, 3] dioxol-5-ilo y 6-quinolilo. Los sustituyentes de cada uno de los sistemas de anillo de arilo y heteroarilo señalados anteriormente se seleccionan del grupo de sustituyentes aceptables descritos más adelante. Por brevedad, el término "arilo" cuando se usa en combinación con otros términos (por ejemplo, ariloxi, ariltioxi, arilalquilo) incluye anillos tanto de arilo como de heteroarilo como se define anteriormente. De esta manera, el término "arilalquilo" se propone que incluya aquellos radicales en los cuales un grupo arilo se une a un grupo alquilo (por ejemplo, bencilo, fenetilo, piridilmetilo y similares) que incluye aquellos grupos alquilo en los cuales se ha reemplazado un átomo de carbono (por ejemplo, un grupo metileno) por ejemplo por un átomo de oxígeno (por ejemplo, fenoximetilo, 2-piridiloximetilo, 3- (1-naftiloxi) propilo, y similares) . Cada uno de los términos anteriores (por ejemplo, "alquilo", "heteroalquilo", "arilo" y "heteroarilo") se propone que incluya formas tanto sustituidas como insustituidas del radical indicado. Los sustituyentes preferidos para cada tipo de radical se proporcionan más adelante. Los sustituyentes para los radicales alquilo y heteroalquilo (incluyendo aquellos grupos referidos frecuentemente como alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo, y heterocicloalquenilo) se refieren de forma genérica como "sustituyentes de grupo alquilo" y pueden ser uno o más de una variedad de grupos seleccionados, pero no limitados a: -OR' , =0, =NR' , =N-0R' , -NR'R", -SR' , -halógeno, -SiR' R' ' R' ' ' , -0C(0)R', -C(0)R', -C02R' , -CONR'R'', -0C(0)NR'R' ' , -NR''C(0)R', -NR' -C(0)NR' 'R' ' ' , -NR' 'C(0)2R' , -NR-C (NR' R' ' R' ' ' ) =NR' ' ' ' , -NR-C(NR'R")= R" ' , -S(0)R', -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -NRS02R' , -CN y -N02 en un número que varía desde 0 a (2m'+l), donde m' es el número total de átomos de carbono en este radical. R' , R' ' , R' ' ' y R' ' ' ' se refieren cada uno de manera preferentemente independiente a hidrógeno, heteroalquilo sustituido e insustituido, arilo sustituido e insustituido, por ejemplo, arilo sustituido con 1-3 halógenos, grupos alquilo, alcoxi o tioalcoxi sustituido e insustituido, o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como son cada grupo R', R'', R' ' ' , y R' ' ' ' cuando está presente más uno de estos grupos. Cuando R' y R' ' se unen al mismo átomo de nitrógeno, se pueden combinar con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5-, 6- ó 7- miembros. Por ejemplo, NR'R'' se propone que incluya, pero no se limita a, 1-pirrolidinilo y 4-morfolinilo. Del análisis anterior de sustituyentes, un experto en la técnica entenderá que el término "alquilo" se propone que incluya grupos que incluyen átomos de carbono unidos a grupos diferentes de grupos de hidrógeno, tal como haloalquilo (por ejemplo, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (por ejemplo, -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C (O) CH2OCH3, y similares) . Similar a los sustituyentes descritos para el radical alquilo, los sustituyentes para los grupos arilo y heteroarilo se refieren de forma genérica como "sustituyentes de grupos arilo" . Los sustituyentes se seleccionan de, por ejemplo: halógeno, -OR' , =0, =NR' , =N-OR' , -NR'R'', -SR' , -halógeno, -SiR'R"R'", -0C(0)R', -C(0)R', -C02R' , -CONR'R'', -OC (O) R' R' ' , -NR''C(0)R', -NR' -C(0) R"R"', -NR' 'C(0)2R' , - R-C (NR'R" R" ' ) =NR" " , -NR-C(NR'R' ' )=NR' ' ' , -S(0)R', -S(0)2R', -S (O) 2NR' R' ' , -NRS02R' , -CN y -N02, -R' , -N3, -CH(Ph)2, fluoro (C^C alcoxi, y fluoro (d-C alquilo, en un número que varía desde cero al número total de valencias abiertas en el sistema de anillo aromático; y donde R' , R' ' , R' ' ' y R' ' ' ' se seleccionan de manera preferentemente independiente de hidrógeno, alquilo sustituido o insustituido, heteroalquilo sustituido o insustituido, arilo sustituido o insustituido y heteroarilo sustituido o insustituido. Cuando un grupo de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como son cada uno de los grupos R' , R' ' , R' ' ' y R' ' ' ' cuando está presente más de uno de estos grupos . En los esquemas de reacción que siguen, el símbolo X representa "R" como se describe anteriormente . Dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del anillo de arilo o heteroarilo se pueden reemplazar opcionalmente con un sustituyente de la fórmula formula -T-C(O) - (CRR' )U-U- , en donde T y U son independientemente -NR- , -O-, -CRR'- o un enlace individual, y u es un número entero de 0 a 3. De manera alternativa, se pueden reemplazar opcionalmente dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del anillo de arilo o heteroarilo con un sustituyentes del a fórmula -A- (CH2) r-B- , en donde A y B son independientemente -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(0)2-, -S(0)2NR'- o un enlace individual, y r es un número entero de 1 a 4. Uno de los enlaces individuales del nuevo anillo formado de este modo se puede reemplazar opcionalmente con un doble enlace. De manera alternativa, se pueden reemplazar opcionalmente dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del anillo de arilo o heteroarilo con un sustituyentes de la fórmula -(CRR' ) Z-X- (CR' 'R' ' ' )d- , donde z y d son independientemente números enteros de 0 a 3 , y X es -O-, -NR'-, -S-, -S(0)-, -S(0)2-, o -S(0)2NR'-. Los sustituyentes R, R' , R' ' , y R' ' ' se seleccionan de manera preferentemente independiente de hidrógeno o (d-C alquilo sustituido o insustituido. Como se usa en la presente, el término "heteroátomo" se propone que incluya oxígeno (O) , nitrógeno (N) , azufre (S) , y silicio (Si) . Como se usa en la presente, el péptido de Factor VII se refiere tanto a péptidos de Factor VII como de Factor Vlla. Los términos se refieren en general a variantes y mutantes de estos péptidos, incluyendo mutantes de proteína de adición, supresión, sustitución y fusión. Donde se usan tanto el Factor VII como el Factor Vlla, el uso se propone que sea ilustrativo de dos especies del género "péptido de Factor VII" La invención se propone que incluya sales de los compuestos de la invención que se preparan con ácidos o bases relativamente no tóxicos, dependiendo de los sustituyentes particulares encontrados en los compuestos descritos en la presente. Cuado los compuestos de la presente invención contienen funcionalidades relativamente acidas, las sales de adición de base se pueden obtener al poner en contacto la forma neutral de estos compuestos con una cantidad suficiente de la base deseada, ya sea puro o en un solvente inerte adecuado. Los ejemplos de sales de adición de base incluyen sales de sodio, potasio, litio, calcio, amonio, aminoorgánico o magnesio, o una sal similar. Cuando los compuestos de la presente invención contienen funcionalidades relativamente básicas, se pueden obtener sales de adición de ácido al poner en contacto la forma neutral de estos compuestos con una cantidad suficiente del ácido deseado, ya sea puro o en un solvente inerte adecuado. Los ejemplos de sales de adición incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos tal como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, nítrico, carbónico, monohidrogenocarbónico, fosfórico, monohidrogenofosfórico, dihidrogenofosfórico, sulfúrico, monohidrogenosulfúrico, yodhídrico, o fosforoso y similares, así como las sales derivadas de ácidos orgánicos relativamente no tóxicos tal como ácido acético, propiónico, isobutírico, maleico, malónico, benzoico, succínico, subérico, fumárico, láctico, mandélico, ftálico, bencenosulfónico, p-tolilsulfónico, cítrico, tartárico, metanosulfónico, y similares. También se incluyen sales de aminoácidos tal como arginato y similares, y sales de ácidos orgánicos tal como ácidos glucurónico o galactunónico y similares (ver, por ejemplo, "Pharmaceutical Salts" , Journal of Pharmaceutical Science 66: 1-19 (1977)). Ciertos compuestos específicos de la presente invención contienen funcionalidades tanto básicas como acidas que permiten que los compuestos se conviertan en ya sea sales de adición de base o ácido. Las formas neutrales de los compuestos se regeneran de manera preferente al poner en contacto la sal como una base o ácido y al aislar los compuestos de origen de la manera convencional. La forma de origen del compuesto difiere de las varias formas de sal en ciertas propiedades físicas, tal como solubilidad en solventes polares. "Contraión de sal" como se usa en la presente, se refiere a iones positivamente cargados que se asocian con un compuesto de la invención cuando una de sus porciones se carga de forma negativa (por ejemplo, COO-). Los ejemplos de contraiones de sal incluyen H+, H30+, amonio, potasio, calcio, litio, magnesio y sodio. Como se usa en la presente, el término "CMP-SA- PEG" es una molécula de monofosfato de histidina que se conjuga a un ácido siálico que comprende una porción de polietilenglicol . Si no se especifica la longitud de la cadena de polietilenglicol, entonces es posible cualquier longitud de cadena de PEG (por ejemplo, lKDa, 2KDa, 5KDa, lOKDa, 20KDa, 30KDa, 40KDa) . Un CMP-SA-PEG de ejemplo es el compuesto 5 en el Esquema 1 de Reacción.

I . Introducción La presente invención abarca un método para el remodelado y modificación del Factor VII. La ruta de coagulación sanguínea es una reacción compleja que comprende muchos eventos . Un evento intermedio en esta ruta es el Factor VII, una pro-enzima que participa en la ruta extrínseca de la coagulación sanguínea al convertir (en su activación al Factor Vlla) el Factor X a Xa en la presencia de factor de tejido e iones de calcio. El Factor Xa a su vez entonces convierte pro-trombina a trombina en la presencia de Factor Va, iones de calcio y fosfolípido. La activación del Factor X a Factor Xa es un evento compartido tanto por las rutas intrínsecas como extrínsecas de coagulación sanguínea, y por lo tanto, se puede usar el Factor Vlla para el tratamiento de pacientes con deficiencias o inhibidores de Factor VIII. También hay evidencia para sugerir que el Factor Vlla puede participar en la ruta intrínseca así como para incrementar por lo tanto la prominencia e importancia del papel del Factor VlI/VIIa en coagulación sanguínea. El Factor VII es una glicoproteína de cadena individual que circula en la sangre como un zimógeno inactivo. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de ejemplo de Factor Vlla se proporcionan en las Figuras 5A-5B. La activación del Factor VII a Vlla se puede catalizar por varias proteasas de plasma diferentes, tal como Factor Xlla. La activación del Factor VII se presenta cuando se escinde la estructura del péptido de Factor VII en asparagina 152. El producto activado, Factor Vlla es una glicoproteína que comprende una cadena pesada y una cadena ligera mantenidas conjuntamente por al menos un enlace de disulfuro. Además, las moléculas de Factor VII modificadas que no se pueden convertir al Factor Vlla se han descrito, y son útiles como remedios anti-coagulación, tal como en el caso de coágulos sanguíneos, trombosis y similares. Dada la importancia del Factor VII en la ruta de coagulación sanguínea, y su uso como un tratamiento tanto para niveles incrementados como disminuidos de coagulación, se deduce que una molécula que tenga una vida media biológica más prolongada, potencia incrementada, y en general, un perfil terapéutico más similar al factor VII tipo silvestre como se sintetiza y segrega en el humano saludable será benéfico y útil como un tratamiento para trastornos de coagulación sanguínea. En tanto que el Factor VII es un compuesto importante y útil para aplicaciones terapéuticas, los presentes métodos para la producción de Factor VII de células recombinantes dará por resultado un producto con una vida media biológica más bien corta y un patrón de glicosilación no óptimo que puede conducir de forma potencial a la inmunogenicidad, pérdida de función, una necesidad incrementada de dosis más grandes y más frecuentes a fin de lograr el mismo efecto, y similares. Para mejorar la efectividad del Factor Vil/Factor Vlla recombinante usado para propósitos terapéuticos, la presente invención proporciona conjugados de péptidos glicosilados y no glicosilados de Factor Vil/Factor Vlla con un grupo modificador. Los grupos modificadores se pueden seleccionar de grupos modificadores poliméricos tal como por ejemplo, PEG (m-PEG) , PPG (m-PPG) , etc., porciones terapéuticas, porciones de diagnóstico, porciones de dirección y similares. En la modificación de los péptidos de Factor Vil/Factor Vlla, por ejemplo, con un grupo modificador polimérico soluble en agua puede mejorar la estabilidad y tiempo de retención del Factor Vil/Factor Vlla recombinante en la circulación de un paciente, y/o reducir la antigenicidad de Factor Vil/Factor Vlla recombinante. Los conjugados de péptido de la invención se pueden formar por la unión enzimática de un azúcar modificado al péptido glicosilado o no glicosilado. Un sitio de glicosilación y/o un grupo glicosilo modificado proporciona un sitio para conjugar un azúcar modificado que tiene un grupo modificador al péptido, por ejemplo, por glicoconjugación.

Los métodos de la invención también hacen posible montar conjugados de péptido y conjugados de glicopéptido que tienen un patrón de derivatización sustancialmente homogéneo. Las enzimas usadas en la invención en general son selectivas para un residuo de aminoácido particular, combinación de residuos de aminoácido, residuos particulares de glicosilo, o combinación de residuos de glicosilo del péptido. Los métodos también son prácticos para la producción a gran escala de conjugados de péptido. De esta manera, los métodos de la invención proporcionan un medio práctico para la preparación a gran escala de conjugados de péptido que tienen patrones pre-seleccionados uniformes de derivatización. Los métodos son particularmente bien adecuados para la modificación de péptidos terapéuticos, incluyendo pero no limitado a, glicopéptidos que están incompletamente glicosilados durante la producción en células de cultivo celular (por ejemplo, células de mamífero, células de insecto, células vegetales, células fúngales, células de levadura o células procarióticas) o plantas o animales transgénicos . Los conjugados de péptido de Factor Vil/Factor Vlla se pueden producir como formulaciones farmacéuticas que comprenden un conjugado de péptido así como un portador farmacéuticamente aceptable. Los conjugados de péptido de Factor Vil/Factor Vlla se pueden administrar a un paciente seleccionado del grupo que consiste de un paciente hemofílico que tiene un episodio de sangrado, un paciente que tiene Hemofilia A, un paciente con Hemofilia B, un paciente que tiene Hemofilia A, en donde el paciente también tiene anticuerpos al Factor VIII, un paciente que tiene Hemofilia B, en donde el paciente también tiene anticuerpos a Factor IX, un paciente que tiene cirrosis hepática, un paciente cirrótico que tiene un transplante hepático ortópico, un paciente cirrótico que tiene sangrado gastrointestinal superior, un paciente que tiene un transplante de médula ósea, un paciente que tiene una resección hepática, un paciente que tiene una hepatectomía parcial, un paciente que sufre reconstrucción de fractura pélvica acetabular, un paciente que sangra de una hemorragia intracerebral aguda, un paciente que se somete a transplante halogeneico de células madre, un paciente que sangra de lesión cerebral traumática, un paciente que sangra en una emergencia, un paciente que tiene sangrado de trauma, un paciente que sufre sangrado varicial, un paciente que sangra de cirugía electiva, un paciente que sangra de cirugía cardiaca, un paciente que sangra de cirugía espinal, una resección hepática, una resección hepática, una resección hepática, una resección hepática. En una modalidad de ejemplo, el paciente es un paciente humano. La presente invención también proporciona conjugados de péptidos glicosilados y no glicosilados con vida media terapéutica incrementada debido a, por ejemplo, velocidad reducida de depuración, o velocidad reducida de captación por el sistema inmunitario o reticuloendotelial (RES) . Además, los métodos de la invención proporcionan un medio para enmascarar determinantes antigénicos en péptidos, reduciendo o eliminando de este modo una respuesta inmunitaria del hospedador contra el péptido. La unión selectiva de agentes de dirección también se puede usar para dirigir un péptido a un tejido particular o receptor de superficie celular que sea específico para el agente de dirección particular. La determinación de las condiciones óptimas para la preparación de los conjugados de Factor Vil/Factor Vlla con polímeros solubles en agua, por ejemplo, comprende la optimización de numerosos parámetros, que son dependientes de la identidad del péptido y del polímero soluble en agua. Por ejemplo, cuando el polímero es poli (etilenglicol) , por ejemplo, poli (etilenglicol) ramificado, se establece de manera preferente un equilibrio entre la cantidad de polímero utilizada en la reacción y viscosidad de la mezcla de reacción atribuible a la presencia del polímero; si el polímero está demasiado altamente concentrado, la mezcla de reacción llega a ser viscosa, disminuyendo la velocidad de transferencia másica y la reacción.

Adicionalmente, aunque es intuitivamente evidente adicionar un exceso de enzima, los presentes inventores han reconocido que, cuando la enzima está presente en demasiado exceso, la enzima en exceso llega a ser un contaminante cuya remoción requiere pasos adicionales de purificación y material e incrementa innecesariamente los costos del producto final. Además, se desea en general producir un péptido con un nivel controlado de modificación. En algunos casos, es deseable adicionar un azúcar modificado de forma preferencial. En otros casos, es deseable adicionar dos azúcares modificados de forma preferencial. De esta manera, las condiciones de reacción se controlan de manera preferente para influir en el grado de conjugación de los grupos modificadores al péptido. La presente invención proporciona condiciones bajo las cuales se aumenta al máximo el rendimiento de un péptido de Factor Vil/Factor Vlla, que tiene el nivel deseado de conjugación. Las condiciones en las modalidades de ejemplo de las invenciones también reconocen el gasto de los varios reactivos y los materiales y tiempo necesarios para purificar el producto: las condiciones de reacción expuestas en la presente se optimizan para proporcionar excelentes rendimientos del producto deseado, en tanto que se reduce al mínimo al desperdicio de reactivos costosos.

II . Las Composiciones de los Conjugados de Material/Péptido En un primer aspecto, la presente invención proporciona un conjugado entre un azúcar modificado y un péptido de Factor Vil/Factor Vlla. La presente invención también proporciona un conjugado entre un grupo modificador y un péptido de Factor Vil/Factor Vlla. Un conjugado de péptido puede tener una de varias formas. En una modalidad de ejemplo, un conjugado de péptido puede comprender un péptido de Factor Vil/Factor Vlla y un grupo modificador enlazado a un aminoácido del péptido a través de un grupo de enlace de glicosilo. En otra modalidad de ejemplo, un conjugado de péptido puede comprender un péptido de Factor Vil/Factor Vlla y un grupo modificador enlazado a un residuo de glicosilo del péptido a través de un grupo de enlace de glicosilo. En otra modalidad de ejemplo, el conjugado de péptido puede comprender un péptido de Factor Vil/Factor Vlla y un grupo de enlace de glicosilo que- se une tanto a un carbohidrato de glicopéptido y directamente a un residuo de aminoácido de la estructura de péptido. En aún otra modalidad de ejemplo, un conjugado de péptido puede comprender un péptido de Factor Vil/Factor Vlla y un grupo modificador enlazado directamente a un residuo de aminoácido del péptido. En esta modalidad, el conjugado de péptido puede no comprender un grupo glicosilo. En cualquiera de estas modalidades, el péptido de Factor Vil/Factor Vlla puede estar no glicosilado. Los conjugados de la invención corresponderán típicamente a la estructura general ilustrada en la figura 16, en la cual los símbolos a, b, c, d y s representan un número entero positivo no cero; y t es ya sea 0 o un número entero positivo. El "agente", o grupo modificador, puede ser un agente terapéutico, un agente bioactivo, una marca detectable, un grupo modificador polimérico tal como un polímero soluble en agua (por ejemplo, PEG, m-PEG, PPG, y m-PPG) o similares. El "agente", o grupo modificador, puede ser un péptido, por ejemplo, enzima, anticuerpo, antígeno, etc. El ligador puede ser cualquiera de un arreglo amplio de grupos ligadores, in fra . De manera alternativa, el ligador puede ser un enlace individual o un "ligador de orden cero" .

II.A. Péptido El Factor VII es un polipéptido de cadena individual que es de aproximadamente 406 aminoácidos de longitud y tiene un peso molecular de aproximadamente 50 KDa. La conversión de Factor VII a Factor Vlla se presenta cuando la estructura del péptido de Factor VII se escinde en asparagina 152. Los péptidos de Factor VII y/o Factor Vlla contienen dos sitios N-glicano: uno está localizado en asparagina 145 y el otro está localizado en asparagina 322. El sitio de N-glicano en asparagina 145 se localiza en la cadena ligera de FVIIa, en tanto que el sitio de N-glicano en asparagina 322 está localizado en la cadena pesada de FVIIa. Los péptidos de Factor VII y/o Factor Vlla contienen dos sitios de O-glicano. Se han clonado y secuenciado el Factor VII o Factor Vlla. En una modalidad de ejemplo, el péptido de Factor VII tiene la secuencia presentada en SEQ ID NO:l. La presente invención no se debe considerar de ninguna manera como limitada a las secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico de Factor VII, expuestas en la presente. El uso de los péptidos de Factor Vil/Factor Vlla de otras secuencias que están mutadas para incrementar o disminuir una propiedad o modificar una característica estructural del péptido está dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, los péptidos mutantes de Factor Vil/Factor Vlla de uso en la invención incluyen aquellos que se proporcionan con sitios adicionales de O-glicosilación o sitios en otras posiciones. Además, los péptidos mutantes que incluyen uno o más sitios de N-glicosilación son de uso en la invención. Las variantes de Factor VII se describen en, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Números 4,784,950 y 5,580,560, en las cuales se reemplaza lisina-38, lisina-32, arginina-290, arginina-341, isoleucina-42 , tirosina-278 , y tirosina-332 por una variedad de aminoácidos. Además, Patentes de los Estados Unidos Números. 5,861,374, 6,039,944, 5,833,982, 5,788,965, 6,183,743, 5,997,864, y 5,817,788 describen variantes de Factor VII que no se escinden para formar Factor VII. Los expertos en la técnica reconocerán que la ruta de coagulación sanguínea y el papel del Factor VII en la misma es bien conocido, y por lo tanto se incluyen muchas variantes, tanto las que se presentan de forma natural como las manejadas, como se describe anteriormente, en la presente invención. En una modalidad de ejemplo, un péptido que tiene actividad de Factor Vil/Factor Vlla tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 95 % homologa a las secuencias de aminoácidos expuestas en la presente. De manera preferente, la secuencia de aminoácidos es al menos aproximadamente 96 %, 97 %, 98 % o 99 % homologa a las secuencias de aminoácidos expuestas en la presente. En una modalidad de ejemplo, el residuo de aminoácido al cual se une el grupo de enlace de glicosilo es un miembro seleccionado de serina, treonina o asparagina. En otra modalidad de ejemplo, el péptido tiene una secuencia de SEQ ID NO:2. En otra modalidad de ejemplo, el residuo de aminoácido es un miembro seleccionado de Asn 145, Asn 322 y combinaciones de los mismos. En otra modalidad de ejemplo, el péptido es un péptido de Factor Vil/Factor Vlla bioactivo . En aún otra modalidad de ejemplo, la porción de azúcar modificado y/o PEG en el conjugado de péptido de Factor Vlla se localiza en la cadena ligera. En aún otra modalidad de ejemplo, la porción de azúcar modificado y/o PEG en el conjugado de péptido de Factor Vlla está predominantemente en la cadena pesada. En aún otra modalidad de ejemplo, en una población de congujados de péptido de Factor Vlla, las cadenas ligeras contienen de manera predominante una porción de azúcar modificado y/o PEG. En aún otra modalidad de ejemplo, En una población de conjugados de péptido de Factor Vlla, las cadenas pesadas contienen predominantemente un azúcar modificado y/o porción de PEG. En otra modalidad de ejemplo, la relación de la funcionalización de cadena ligera: cadena pesada en la población es aproximadamente 33:66. En otra modalidad de ejemplo, la relación de la funcionalización de cadena ligera: cadena pesada en la población es aproximadamente 35:65: En otra modalidad de ejemplo, la relación de funcionalización de cadena ligera: cadena pesada en la población es aproximadamente 40:60. En otra modalidad de ejemplo, la relación de funcionalización de cadena ligera: cadena pesada en la población es aproximadamente 45:55. En otra modalidad de ejemplo, la relación es aproximadamente 50:50. En otra modalidad de ejemplo, la relación es aproximadamente 55:45. En otra modalidad de ejemplo, la relación es aproximadamente 60:40. En otra modalidad de ejemplo, la relación es aproximadamente 65:35. En otra modalidad de ejemplo, la relación es aproximadamente 66:33. En otra modalidad de ejemplo, la relación es aproximadamente 70:30. En otra modalidad de ejemplo, la relación es aproximadamente 75:25. En otra modalidad de ejemplo, la relación es aproximadamente 80:20. En otra modalidad de ejemplo, la relación es aproximadamente 85:15. En otra modalidad de ejemplo, la relación es aproximadamente 90:10. En otra modalidad de ejemplo, la relación de funcionalización de cadena ligera: cadena pesada en la población es mayor de aproximadamente 90:10. Los métodos para la expresión y para determinar la actividad de Factor Vil/Factor Vlla son bien conocidos en la técnica, y se describen por ejemplo en la Patente de los Estados Unidos Número 4,784,950. De forma breve, La expresión de Factor VII, o variantes del mismo, se puede lograr en una variedad de sistemas tanto procarióticos como eucarióticos, incluyendo células de E. coli , células CHO, células BHK, células de insecto usando un sistema de expresión de baculovirus, todos los cuales son bien conocidos en la técnica. Los ensayos para la actividad de un conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla preparado de acuerdo a los métodos de la presente invención se puede lograr usando métodos bien conocidos en la técnica. Como un ejemplo no limitante, Quick et al. (Hemorragic Disease and Thrombosis, 2nd ed. , Leat Febiger, Philadelphia, 1966) , describe un ensayo de coagulación de una etapa útil para determinar la actividad biológica de una molécula de Factor VII preparada de acuerdo a los métodos de la presente invención. Los péptidos usados en la invención no se limitan a Factor Vil/Factor Vlla cuando el grupo modificador es: En estos casos, el péptido en el conjugado de péptido es un miembro seleccionado de los péptidos en las Figuras 13A-13CC. En estos casos, el péptido en el conjugado de péptido es un miembro seleccionado de Factor VII, Factor Vlla, Factor VIII, Factor IX, Factor X, Factor XI, un péptido que es un miembro seleccionado de eritropoyetina, factor de estimulación de colonia de granulocitos (G-CSF) , Factor de Estimulación de Colonia de Macrofagos de Granulocitos (GM-CSF) interferón-alfa, interferón-beta, interferón-gamma, ax-antitripsina (ATT, o inhibidor de a-1-proteasa, glucocerebrosidasa, Activador de Plasminógeno Tipo Tejido (TPA) , Interleucina-2 (IL-2) , urocinasa, DNasa humana, insulina, proteína superficial de Hepatitis B (HbsAg) , hormona de crecimiento humana, proteína de fusión de Receptor de TNF-región Fe de IgG (EnbrelMR) , Anticuerpo monoclonal anti-HAR2 (HerceptinMR) , anticuerpo monoclonal a Proteína F de Virus Sincitial Respiratorio (Synagis"1*) , anticuerpo monoclonal a TNF-a (RemicadeMR) , anticuerpo monoclonal a glicoproteína Ilb/IIIa (Reopro"11) , anticuerpo monoclonal a CD20 (RituxanMR) , anti-trombina III (AT III) , Gonadotropina Coriónica humana (hCG) , alfa-galactosidasa (FabrazymeMR) , alfa-iduronidasa (Aldurazyme") , hormona de simulación de folículo, beta-glucosidasa, anticuerpo monoclonal anti-TNF-alfa (MLB 5075) , péptido-1 tipo glicagón (GLP-1) , beta-glucosidasa (MLB 5064) , alfa-galactosidasa A (MLB 5082) y factor de crecimiento de fibroblastos. En una modalidad de ejemplo, el grupo modificador polimérico tiene una estructura de acuerdo a la siguiente fórmula: Los péptidos usados en la invención también no se limitan al Factor VII o Factor Vlla cuando el grupo modificador es: En una modalidad de ejemplo, A1 y A2 son cada uno miembros seleccionados de -OH y -OCH3. Los grupos modificadores poliméricos de ejemplo de acuerdo a esta modalidad incluyen: En una modalidad de ejemplo, en la cual el grupo modificador es un polímero soluble en agua ramificado, tal como aquellos mostrados anteriormente, se prefiere en general que la concentración de sialidasa de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 2.5 U/L de mezcla de reacción. De manera más preferente, la cantidad de sialidasa es aproximadamente 2 U/L. En otra modalidad de ejemplo, se ponen en contacto aproximadamente 5 a aproximadamente 9 gramos de sustrato de péptido con las cantidades de sialidasa expuestas anteriormente . El azúcar modificado está presente en la mezcla de reacción en una cantidad de aproximadamente 1 gramo a aproximadamente 6 gramos, de manera preferente de aproximadamente 3 gramos a aproximadamente 4 gramos . En general, se prefiere mantener la concentración de un azúcar modificado que tiene una porción modificadora de polímero soluble en agua ramificada, por ejemplo, la porción mostrada anteriormente, en menos de aproximadamente 0.5 mM. En una modalidad preferida, el grupo modificador es un poli (etilenglicol) ramificado que tiene un peso molecular de aproximadamente 20 KDA a aproximadamente 60 KDa, de manera más preferente, de aproximadamente 30 KDa a aproximadamente 50 kDa, y de manera aún más preferente de aproximadamente 40 KDa. Un grupo modificador de ejemplo que tiene un peso molecular de aproximadamente 40 KDa es uno que es de aproximadamente 35 KDa a aproximadamente 45 KDa.

Con respecto a la concentración de glicosiltransferasa, en una modalidad actualmente preferida, usando el grupo modificador expuesto anteriormente, la relación de glicosiltransferasa a péptido es aproximadamente 40 µg/mL de transferasa a aproximadamente 200 µM de péptido.

II. B. Azúcar Modificado En una modalidad de ejemplo, los péptidos de la invención se hacen reaccionar con un azúcar modificado, formando de este modo un conjugado de péptido. Un azúcar modificado comprende una "porción donantea de azúcar" así como una "porción de transferencia de azúcar" . La porción donantea de azúcar es cualquier porción del azúcar modificado que se unirá al péptido, ya sea a través de una porción de glicosilo o una porción de aminoácido, como un conjugado de la invención. La porción donantea de azúcar incluye aquellos átomos que se alteran de forma química durante su conversión desde el azúcar modificado al grupo de enlace de glicosilo del conjugado de péptido. La porción de transferencia de azúcar es cualquier porción del azúcar modificado que no se unirá al péptido como un conjugado de la invención. Por ejemplo, un azúcar modificado de la invención es el nucleótido de azúcar PEGilado, CMP de PEG-ácido siálico. Para el CMP de PEG-ácido siálico, la porción donantea de azúcar, o la porción donantea de PEG-sialilo, comprende PEG-ácido siálico, en tanto que la porción de transferencia de azúcar, o porción de transferencia de silailo, comprende CMP. En azúcares modificados de uso en la invención, la porción de sacarilo es de manera preferente un sacárido, un desoxi-sacárido, un amino-sacárido, o un N-acil-sacárido. El término "sacárido" y sus equivalentes, "sacarilo", "azúcar" y "glicosilo" se refieren a monómeros, dímeros, oligómeros y polímeros. La porción de azúcar también se funcionaliza con un grupo modificador. El grupo modificador se conjuga a la porción de sacarilo, típicamente a través de la conjugación con una amina, sulfhidrilo o hidroxilo, por ejemplo, hidroxilo primario, porción en el azúcar. En una modalidad de ejemplo, el grupo modificador se une a través de una porción de amina en el azúcar, por ejemplo, a través de una amida, un uretano o una urea que se forma a través de la reacción de la amina con un derivado reactivo del grupo modificador. Se puede utilizar cualquier porción de sacarilo como la porción donantea de azúcar del azúcar modificado. La porción de sacarilo puede ser un azúcar conocido, tal como mañosa, galactosa o glucosa, o una especie que tenga la estereoquímica de un azúcar conocido. Las fórmulas generales de estos azúcares modificados son: Otras porciones de sacarilo que son útiles en la formación de las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a mucosa y ácido siálico, así como amino-azúcares tal como glucosalina, galactosamina, manosamina, el análogo de 5 -amina de ácido siálico y similares. La porción de sacarilo puede ser una estructura encontrada en la naturaleza o se puede modificar para proporcionar un sitio para conjugar el grupo modificador. Por ejemplo, en una modalidad, el grupo modificador proporciona un derivado de ácido siálico en el cual la porción de 9-hidroxi se reemplaza con una amina. La amina se derivatiza fácilmente con un análogo activado de un grupo modificador seleccionado. Los ejemplos de azúcares modificados de uso en la invención se describen en la Solicitud de Patente PCT Número PCT/US05/002522, que se incorpora en la presente como referencia. En una modalidad adicional de ejemplo, la invención utiliza azúcares modificados en los cuales la posición de 6 -hidroxilo se convierte a la porción de amina correspondiente, que tiene un cásete de ligador-grupo modificador tal como aquellos expuestos anteriormente. Los grupos glicosilo de ejemplo que se pueden usar como el núcleo de estos azúcares modificados incluyen Gal, GalNAc, Glc, GlcNAc, Fue, Xyl, Man, y similares. Un azúcar modificado representativo de acuerdo a esta modalidad tiene la fórmula: en la cual R1X-R14 son miembros independientemente seleccionados de H, OH, C(0)CH3, NH y NH C(0)CH3, R10 es un enlace a otro residuo de glicosilo ( -O-glicosilo) o a un aminoácido del péptido de Factor VII/Factor Vlla (-NH- (Factor Vil/Factor Vlla)). R14 es OR1, NHR1 o NH-L-R1. R1 y NH-L-R1 son como se describen anteriormente.

II. C. Grupos de Enlace de Glicosilo En una modalidad de ejemplo, la invención proporciona un conjugado de péptido formado entre un azúcar modificado de la invención y un péptido de Factor VIH/Factor Vlla. En otra modalidad de ejemplo, cuando el grupo modificador en el azúcar modificado es el péptido en el conjugado de péptido es un miembro seleccionado de los péptidos en las Figuras 13A-13CC. En aún otra modalidad de ejemplo, el péptido en el conjugado de péptido es un miembro seleccionado de Factor VII, Factor Vlla, Factor VIII, Factor IX, Factor X, Factor XI, eritropoyetina, factor de estimulación de colonia de granulocitos (G-CSF) , Factor de Estimulación de Colonias de Macrófagos de Granulocitos (GM-CSF) , interferón-alfa, interferón-beta, ínterferón-gamma, o^-antitripsina (ATT, o inhibidor de a-1-proteasa, glucocerebrosidasa, Activador de Plasminógeno Tipo Tejido (TPA) , Interleucina-2- (IL-2) , urocinasa, DNAasa humana, insulina, proteína de superficie de Hepatitis B (HbsAg) , hormona de crecimiento humana, proteína de fusión de TNF-Región Fe de IgG (EnbrelMR) , anticuerpo monoclonal anti-HER2 (Herceptin™) , anticuerpo monoclonal a Proteína F de Virus Sincitial Respiratorio (SynagisMR) , anticuerpo monoclonal a TNF-a (RemicadeMR) . anticuerpo monoclonal a glicoproteína Ilb/IIIa (Reopro™) , anticuerpo monoclonal a CD20 (Rituxan™) , anti-trombina III (AT III) , Gonadotropina Coriónica humana (hCG) , alfa-galactosidasa (Fabrazyme"11) , alfa-iduronidasa (AldurazymeMR) , hormona estimuladora de folículo, beta-glucosidasa, anticuerpo monoclonal anti-TNF-alfa (MLB 5075) , péptido-1 tipo glucagón (GLP-1) , beta-glucosidasa (MLB 5064) , alfa-galactosidasa A (MLB 5082) y factor de crecimiento de fibroblasto. En esta modalidad, la porción donantea de azúcar tal como la porción de sacarilo y el grupo modificador) del azúcar modificado llega a ser un "grupo de enlace de glicosilo" . El "grupo de enlace de glicosilo" puede referirse de manera alternativa a la porción de glicosilo que se interpone entre el péptido y el grupo modificador. En una modalidad de ejemplo, el grupo modificador polimérico tiene una estructura de acuerdo a las siguientes fórmulas : En una modalidad de ejemplo, el grupo modificador en el azúcar modificado es: En una modalidad de ejemplo, A1 y A2 son cada uno miembros seleccionados de -OH y -OCH3. Los grupos modificadores poliméricos de ejemplo de acuerdo a esta modalidad incluyen: Debido a la versatilidad de los métodos disponibles para adicionar y/o modificar residuos de glicosilo en un péptido, los grupos de enlace de glicosilo pueden tener sustancialmente cualquier estructura. En el análisis que sigue, la invención se ilustra por referencia al uso de derivados seleccionados de furanosa y piranosa. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que el enfoque del análisis es por claridad de ilustración y que las estructuras y composiciones expuestas son en general aplicables a través del género de grupos de enlace de glicosilo y azúcares modificados. El grupo de enlace de glicosilo puede comprender virtualmente cualquier mono- u oligo-sacárido. Los grupos de enlace de glicosilo se pueden unir a un aminoácido y ya sea a través de la cadena lateral o a través de la estructura de péptido. De manera alternativa, los grupos de enlace de glicosilo se pueden unir al péptido a través de una porción de sacarilo. Esta porción de sacarilo puede ser una porción de una estructura de glicano O-enlazado o N-enlazado en el péptido. En una modalidad de ejemplo, la invención proporciona un conjugado de péptido que comprende un grupo de enlace de glicosilo intacto que tiene una fórmula que se selecciona de: En la Fórmula I R2 es H, CH2OR7, COOR7 ú OR7, en las cuales R7 representa H, alquilo sustituido o insustituido o heteroalquilo sustituido o insustituido. Cuando COOR7 es un ácido carboxílico o carboxilato, ambas formas se representan por la designación de la estructura individual COO" o COOH. En las Fórmulas I y II, los símbolos R3, R4, R5, R6 y R6' representan independientemente H, alquilo sustituido o insustituido, OR8, NHC(0)R9. El índice d es 0 ó 1. R8 y R9 se seleccionan independientemente de H, alquilo sustituido o insustituido, heteroalquilo sustituido o insustituido, ácido siálico o ácido polisiálico. Al menos uno de R3, R4, R5, R6 ó R6' incluye un grupo modificador. Este grupo modificador puede ser una porción modificadora polimérica, por ejemplo, PEG, enlazada a través de un enlace o un grupo de enlace. En una modalidad de ejemplo, R6 y R6' , junto con el carbono al cual están unidos son componentes de la cadena lateral de piruvilo del ácido siálico. En una modalidad de ejemplo adicional, la cadena lateral de piruvilo se funcionaliza con el grupo modificador polimérico. En otra modalidad de ejemplo, Rs y R6' , junto con el carbón al cual están unidos son componentes de la cadena lateral de ácido siálico y el grupo modificador polimérico es un componente de R5. En una modalidad de ejemplo, la invención utiliza un grupo de enlace de glicosilo que tiene la fórmula: en la cual J es una porción de glicosilo, L es un enlace o un ligador y R1 es un grupo modificador, por ejemplo, un grupo modificador polimérico. Los enlaces de ejemplo son aquellos que se forman entre una porción de NH2 en la porción de glicosilo y un grupo de reactividad complementaria en el grupo modificador. Por ejemplo, cuando R1 incluye una porción de ácido carboxílico, esta porción se puede activar y acoplar con la porción de NH2 en el residuo de glicosilo que da un enlace que tiene la estructura NHCÍOjR1. J es de manera preferente una porción de glicosilo que esta "intacto", que no se ha degradado por la exposición a condiciones que escinden la estructura de piranosa o furanosa, por ejemplo, condiciones oxidativas, por ejemplo peryodato de sodio. Los ligadores de ejemplo incluyen porciones de alquilo y heteroalquilo. Los ligadores incluyen grupos de enlace, por ejemplo grupos de enlace en base a acilo, por ejemplo, -C(0)NH-, -OC(0)NH-, y similares. Los grupos de enlace son enlaces formados entre componentes de las especies de la invención, por ejemplo, entre la porción de glicosilo y el ligador (L) , o entre el ligador y el grupo modificador (R1) . Otros grupos de enlace de ejemplo son éteres, tioéteres y aminas. Por ejemplo, en una modalidad, el ligador es un residuo de aminoácido, tal como un residuo de glicina. La porción de ácido carboxílico de la glicina se convierte a la amida correspondiente por reacción con una amina en el residuo de glicosilo, y la amina de la glicina se convierte a la amida o uretano correspondiente por reacción con un ácido carboxílico activado o carbonato del grupo modificador.

Una especie de ejemplo de NH-L-R1 tiene la fórmula: -NH{C(0) (CH2)aNH}s{C(0) (CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNH}tR1, en la cual los índices s y t son independientemente 0 ó 1. Los índices a, b y d son independientemente números enteros de 0 a 20, y c es un número entero de 1 a 2500. Otros ligadores similares se basan en especies en las cuales se reemplaza una porción de -NH por otro grupo, por ejemplo, -S, -O ó -CH2. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que se pueden reemplazar una o más de las porciones marcadas que corresponden a los índices s y t con una porción de alquilo o heteroalquilo sustituida o insustituida. De manera más particular, la invención utiliza compuestos en los cuales NH-L-R1 es: NHC(O) (CH2)aNHC(0) (CH2) b (OCH2CH2) cO (CH2) dNHR\ NHC(O) (CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR\ NHC (O) O (CH2) b (OCH2CH2) cO (CH2) dNHRx , NH (CH2) aNHR1 , y NHR1. En estas fórmulas, los índices a, b y d se seleccionan independientemente de los números enteros de 0 a 20, de manera preferente de 1 a 5. El índice c es un número entero de 1 a aproximadamente 2500. En una modalidad de ejemplo, c se selecciona tal que la porción de PEG es aproximadamente de 1 kD, 5 kD, 10, kD, 15 kD, 20 kD, 25 kD, 30 kD, 35 kD, 40 kD o 45 kD. Para los propósitos de conveniencia, los grupos de enlace de glicosilo en el resto de esta sección se basarán en una porción de sialilo. Sin embargo, un experto en la técnica reconocerá que se puede usar otra porción de glicosilo, tal como mannosilo, galactosilo, glucosilo o fucosilo, en lugar de la porción de sialilo. En una modalidad de ejemplo, el grupo de enlace de glicosilo es un grupo de enlace de glicosilo intacto, en el cual la porción de glicosilo o las porciones que forman el grupo de enlace no se degradan por procesos químicos (por ejemplo, metaperyodato de sodio) o enzimáticos (por ejemplo, oxidasa) . Los conjugados seleccionados de la invención incluyen un grupo modificador que se une a la porción de amina de un amino-sacárido, por ejemplo, mannosamina, glucosamina, galactosamina, ácido siálico, etc. Los casetes de grupo modificador-grupo de enlace de glicosilo intacto de ejemplo de acuerdo a este motivo se basan en una estructura de ácido siálico, tal como aquellos que tienen las fórmulas: En las fórmulas anteriores, R1 y L son como se describen anteriormente. Se proporcionan más adelante los detalles adicionales a cerca de la estructura de los grupos R1 de ejemplo.

En aún una modalidad adicional de ejemplo, el conjugado se forma entre un péptido y un azúcar modificado en el cual el grupo modificador se une a través de un ligador en la posición del carbono 6 del azúcar modificado. De esta manera, los grupos de enlace de glicosilo ilustrativos de acuerdo a esta modalidad tienen la fórmula: en la cual los radicales son como se analizan anteriormente. Los grupos de enlace de glicosilo incluyen, sin limitación, glucosa, glucosamina, N-acetil-glucosamina, galactosa, galactosamina, N-acetil-galactosamina, mannosa, mannosamina, N-acetil-mannosamina y similares. En una modalidad, la presente invención proporciona un conjugado de péptido que comprende el siguiente grupo de enlace de glicosilo: en donde D es un miembro seleccionado de -OH y R1-L-HN-; G es un miembro seleccionado de H y R^ - y -C(O) Q. -Q.J) alquilo; R1 es una porción que comprende un residuo de poli (etilenglicol) de cadena recta o ramificada; y L es un ligador, por ejemplo, un enlace ("de orden cero"), alquilo sustituido o insustituido y heteroalquilo insustituido o sustituido. En modalidades de ejemplo, cuando D es OH, G es R^L-, y cuando G es -C(O) (C^C alquilo, D es R^L-NH- . En una modalidad, la presente invención proporciona un conjugado de péptido que comprende el siguiente grupo de enlace de glicosilo: D es un miembro seleccionado de -OH y R^L-HN-; G es un miembro seleccionado de R^L- y -C (O) (Cx-C6) alquilo-R1; R1 es una porción que comprende un miembro seleccionado de un residuo de poli (etilenglicol) de cadena recta y un residuo de poli (etilenglicol) ramificado; y M es un miembro seleccionado de H, un contraión de sal, y una carga negativa individual; L es un ligador que es un miembro seleccionado de un enlace, alquilo sustituido o insustituido y heteroalquilo sustituido o insustituido; en una modalidad de ejemplo, cuando D es OH, G es R1-L- . En otra modalidad de ejemplo, cuando G es -C(O) (C^C alquilo, D es R^L-NH- .

En cualquiera de los compuestos de la invención, un grupo COOH puede ser de manera alternativa COOM, en donde M es un miembro seleccionado de H, una carga negativa, y un contraión de sal . La invención proporciona un conjugado de péptido que incluye un grupo de enlace de glicosilo que tiene la fórmula: En otras modalidades, el grupo de enlace de glicosilo tiene la fórmula: en la cual el índice t es 0 ó 1. En aún otra modalidad adicional de ejemplo, el grupo de enlace de glicosilo tiene la fórmula: en la cual el índice t es 0 ó 1. En aún otra modalidad, el grupo de enlace de glicosilo tiene la fórmula: en la cual el índice p representa un número entero de 1 a ; y a es ya sea 0 ó 1. En otra modalidad de ejemplo, el conjugado de péptido comprende una porción de glicosilo seleccionada de las fórmulas : En la cual el índice a y el ligador La son como se analizan anteriormente. El índice p es un número entero de 1 a 10. Los índices t y a se seleccionan independientemente de 0 ó 1. Cada uno de estos grupos se puede incluir como componentes de las estructuras de sacárido mono-, bi-, tri-, y tetra-antenarias expuestas anteriormente. AA es un residuo de aminoácido del péptido. En una modalidad de ejemplo, la porción PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 20 KDa. En otra modalidad de ejemplo, la porción de PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 5 KDa. En otra modalidad de ejemplo, la porción de PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 10 KDa. En otra modalidad de ejemplo, la porción de PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 40 KDa. En una modalidad de ejemplo, el grupo de enlace de glicosilo es una porción de SA-PEG-10 KDa ramificada en base a un residuo de cisteína, y uno o dos de estos grupos de enlace de glicosilo se unen covalentemente al péptido. En otra modalidad de ejemplo, el grupo de enlace de glicosilo es una porción de SA-PEG-10 KDa ramificada basada en un residuo de lisina, y uno o dos de estos grupos de enlace de glicosilo se unen covalentemente al péptido. En una modalidad de ejemplo, el grupo de enlace de glicosilo es una porción de SA-PEG-10 KDa ramificada basada en un residuo de cisteína, y uno o dos de estos grupos de enlace de glicosilo se unen covalentemente al péptido. En una modalidad de ejemplo, el grupo de enlace de glicosilo es una porción de SA-PEG-10 KDa ramificada basada en un residuo de lisina, y uno o dos de estos grupos de enlace de glicosilo se unen covalentemente al péptido. En una modalidad de ejemplo, el grupo de enlace de glicosilo es una porción de SA-PEG-5KDa ramificada basada en un residuo de cisteína, y uno, dos o tres de estos grupos de enlace de glicosilo se unen covalentemente al péptido. En una modalidad de ejemplo, el grupo de enlace de glicosilo es una porción de SA-PEG-5KDa ramificada basada en un residuo de lisina, y uno, dos o tres de estos grupos de enlace de glicosilo se unen covalentemente al péptido. En una modalidad de ejemplo, el grupo de enlace de glicosilo es una porción de SA-PEG-40KDa ramificada basada en un residuo de cisteína, y uno o dos de estos grupos de enlace de glicosilo se unen covalentemente al péptido. En una modalidad de ejemplo, el grupo de enlace de glicosilo es una porción de SA-PEG-40KDa ramificada basada en un residuo de lisina, y uno o dos de estos grupos de enlace de glicosilo se unen covalentemente al péptido. En una modalidad de ejemplo, un conjugado de péptido glicoPEGilado de la invención seleccionado de las fórmulas expuestas a continuación: v? P (Fuc)t Man I I AA — GIcNAc — GIcNAc — Man rk I r M ian (GIcNAc— Gal)p— R15 ?jy' (Fuc)t Man (GIcNAc— Gal)p— R15' l I AA — GIcNAc — GIcNAc — Man v> Man (GIcNAc— Gal)p— R15' (GIcNAc— Gal)p— R 15' Man (GIcNAc— Gal)p— R 15' »??/ i (Fuc)t I i AA — GIcNAc — GIcNAc — Man »?? Man (GIcNAc— Gal)p— R 15' Man (GIcNAc— Gal)D— R 15' »?? i G> (F??c)t I i AA — GIcNAc — GIcNAc — Man *?? Man (GIcNAc— Gal)p— R15 (GIcNAc— Gal)p— R15' GIcNAc— Gal)p— R 15' Man (GIcNAc— Gal)p— R15' «??G (Fue), I AA — GIcNAc — GIcNAc — Man «?? Man (GIcNAc— Gal)p— R15' (GIcNAc— Gal)p— R15 En las fórmulas anteriores, el índice t es un número entero de 0 a 1 y el índice p es un número entero de 1 a 10. El símbolo R15' representa H, OH (por ejemplo, Gal-OH) , una porción de sialilo, un grupo de enlace de sialilo (es decir, un grupo de enlace de sialilo-grupo modificador polimérico (Sia-L-R1) , o una porción de sialilo a la cual se une una porción de sialilo modificada con polímero (por ejemplo, Sia-Sia-L-R1) ( "Sia-Sia" ) ) . Las porciones de sacarilo modificadas con polímero de ejemplo tienen una estructura de acuerdo a las Fórmulas I y II. Un conjugado de péptido de ejemplo de la invención incluirá al menos un glicano que tiene un R15' que incluye una estructura de acuerdo a las Fórmulas I ó II. El oxígeno, con la valencia abierta, de las Fórmulas I y II se une de manera preferente a través de un enlace glicosídico a un carbono de una porción de Gal ó GalNAc. En una modalidad de ejemplo adicional, el oxígeno se une al carbono en la posición 3 de un residuo de galactosa. En una modalidad de ejemplo, el ácido siálico modificado se enlaza a2,3-a el residuo de galactosa. En otra modalidad de ejemplo, el ácido siálico se enlaza a2,6-a el residuo de galactosa. En una modalidad de ejemplo, el grupo de enlace de sialilo es una porción de sialilo a la cual se une una porción de sialilo modificada con polímero (por ejemplo, Sia-Sia-L-R1) ( "Sia-Siap" ) . Aquí, el grupo de enlace de glicosilo se enlaza a una porción de galactosilo a través de una porción de sialilo: Una especie de ejemplo de acuerdo a este motivo se prepara al conjugar Si-L-R1 a un ácido siálico terminal de un glicano usando una enzima que forma enlaces Sia-Sia, por ejemplo, CST-II, ST8Sia-II, ST8Sia-III y ST8Sia-IV.

En otra modalidad de ejemplo, los glicanos en los conjugados de péptido tienen una fórmula que se selecciona del grupo: «?f (Fue), Man GIcNAc — Gal R15' A IA — G iIcNAc — GIcNAc — M ian i ^ I r M ian GIcNAc — Gal R15 y combinaciones de los mismos. En cada una de las fórmulas anteriores, R15' es como se analiza anteriormente. Además, un conjugado de péptido de ejemplo de la invención incluirá al menos un glicano con una porción R15 que tiene una estructura de acuerdo a las Fórmulas I ó II. En otra modalidad de ejemplo, el grupo de enlace de glicosilo comprende al menos un grupo de enlace de glicosilo que tiene la fórmula: (GIcNAc Gal)p R15 ; y | (GIcNAc Gal)p Sia R15 en donde R15 es un grupo de enlace de sialilo; y el índice p es un número entero seleccionado de 1 a 10.

En una modalidad de ejemplo, la porción de enlace de glicosilo tiene la fórmula: en la cual b es un número entero de 0 a 1. El índice s representa el número entero de 1 a 10; y el índice f representa un número entero de 1 a 2500. En una modalidad de ejemplo, el grupo modificador polimérico es PEG. En otra modalidad de ejemplo, la porción de PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 20 KDa. En otra modalidad de ejemplo, la porción de PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 5 KDa. En otra modalidad de ejemplo, la porción de PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 10 KDa. En otra modalidad de ejemplo, la porción de PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 40 KDa. En otra modalidad de ejemplo, el grupo de enlace de glicosilo se une a Asnl45, Asn322, Ser52, Ser60 o combinaciones de los mismos. En una modalidad de ejemplo, el grupo de enlace de glicosilo es una porción de SA-PEG-10 KDa lineal, y uno o dos de estos grupos de enlace de glicosilo se unen covalentemente al péptido. En otra modalidad de ejemplo, el grupo de enlace de glicosilo es una porción de SA-PEG-20 KDa lineal, y uno o dos de estos grupos de enlace de glicosilo se unen covalentemente al péptido. En una modalidad de ejemplo, el grupo de enlace de glicosilo es una porción de SA-PEG-5 KDa lineal, y uno, dos o tres de estos grupos de enlace de glicosilo se unen covalentemente al péptido. En una modalidad de ejemplo, el grupo de enlace de glicosilo es una porción de SA-PEG-40 KDa lineal, y uno o dos de estos grupos de enlace de glicosilo se unen covalentemente al péptido. En otra modalidad de ejemplo, el grupo de enlace de glicosilo es un grupo de enlace de sialilo que tiene la fórmula: En otra modalidad de ejemplo, Q es un miembro seleccionado de H y CH3. En otra modalidad de ejemplo, en donde el grupo de enlace de glicosilo tiene la fórmula: ? (GIcNAc Gal)p R15 ; y f (GIcNAc Gal)p Sia R15 en donde R15 es el grupo de enlace de sialilo; y el índice p es un número entero seleccionado de 1 a 10. En una modalidad de ejemplo, el grupo de enlace de glicosilo comprende la fórmula: en donde el índice b es un número entero seleccionado de 0 y 1. En una modalidad de ejemplo, el índice s es 1; y el índice f es un número entero seleccionado de aproximadamente 200 a aproximadamente 300. En otra modalidad de ejemplo, el grupo de enlace de glicosilo es un miembro seleccionado de SA-PEG-10-KDA y SA-PEG-20 KDa, y en donde el número de enlace de grupos de enlace de glicosilo que se unen covalentemente al péptido del Factor Vil/Factor Vlla es un número entero seleccionado de 1 a 2. En otra modalidad de ejemplo, el grupo de enlace de glicosilo es el miembro seleccionado de SA-PEG-5 KDa y SA-PEG-40 KDa, y en donde el número de grupos de enlace de glicosilo que se unen covalentemente al péptido del Factor Vil/Factor Vlla es un número entero seleccionado de 1 a 3.

II. D. Grupos Modificadores Los conjugados de péptido de la invención comprenden un grupo modificador. Este grupo se puede unir covalentemente a un péptido de Factor Vil/Factor Vlla a través de un aminoácido o un grupo de enlace de glicosilo. En otra modalidad de ejemplo, cuando el grupo modificador es el péptido en el conjugado de péptido es un miembro seleccionado de los péptidos en las Figuras 13A-13CC. En otra modalidad de ejemplo, el péptido en el conjugado de péptido es un miembro seleccionado de Factor VII, Factor Vlla, Factor VIII, Factor IX, Factor X, Factor XI, eritropoyetina, factor de estimulación de colonia de granulocito (G-CSF) , Factor de Estimulación de Colonias de Macrófagos de Granulocitos (GM-CSF) , interferón-alfa, interferón-beta, interferón-gamma, a^-antitripsina (ATT, o inhibidor de a-1-proteasa, glucocerebrosidasa, Activador de Plasminógeno Tipo Tejido (TPA) , Interleucina-2- (IL-2) , urocinasa, DNAasa humana, insulina, proteína de superficie de Hepatitis B (HbsAg) , hormona de crecimiento humana, proteína de fusión de TNF-Región Fe de IgG (Enbrel"*) , anticuerpo monoclonal anti-HER2 (Herceptin"11) , anticuerpo monoclonal a Proteína F de Virus Sincitial Respiratorio (Synagis") , anticuerpo monoclonal a TNF-a (Remicade1*) . anticuerpo monoclonal a glicoproteína Ilb/lIIa (ReoproMR) , anticuerpo monoclonal a CD20 (Rituxan"") , anti-trombina III (AT III) , Gonadotropina Coriónica humana (hCG) , alfa-galactosidasa (Fabrazyme") , alfa-iduronidasa (Aldurazyme"*) , hormona estimuladora de folículo, beta-glucosidasa, anticuerpo monoclonal anti-TNF-alfa (MLB 5075) , péptido-1 tipo glucagón (GLP-1) , beta-glucosidasa (MLB 5064) , alfa-galactosidasa A (MLB 5082) y factor de crecimiento de fibroblasto. Los "grupos modificadores" pueden abarcar una variedad de estructuras que incluyen porciones de dirección, porciones terapéuticas, biomoléculas . Adicionalmente, los "grupos modificadores" incluyen grupos modificadores poliméricos, que son polímeros que pueden alterar una propiedad del péptido tal como su biodisponibilidad o su vida media en el cuerpo. En una modalidad de ejemplo, el grupo modificador polimérico tiene una estructura de acuerdo a las siguientes fórmulas : En otra modalidad de ejemplo de acuerdo a las fórmulas anteriores, el grupo modificador polimérico tiene una estructura de acuerdo a la siguiente fórmula: En una modalidad de ejemplo, A1 y A2 son cada uno miembros seleccionados de -OH y -OCH3. Los grupos modificadores poliméricos de ejemplo de acuerdo a esta modalidad incluyen: Para los propósitos de conveniencia, los grupos modificadores en el resto de esta sección se basarán en su mayor parte en grupos modificadores poliméricos tal como polímeros solubles en agua e insolubles en agua. Sin embargo, un experto en la técnica reconocerá que se pueden usar, otros grupos modificadores, tal como porciones de dirección, porciones terapéuticas y biomoléculas, en lugar de los grupos modificadores poliméricos.

II. D. i. Ligadores de los Grupos Modificadores Los ligadores del grupo modificador sirven para unir el grupo modificador (es decir, grupos modificadores poliméricos, porciones de dirección, porciones terapéuticas y biomoléculas) al péptido. En una modalidad de ejemplo, el grupo modificador polimérico se une a un grupo de enlace de glicosilo, en general a través de un heteroátomo, por ejemplo, nitrógeno, en el núcleo a través de un ligador, L, como se muestra a continuación: R1 es la porción polimérica y L se selecciona de un enlace y un grupo de enlace . El índice w representa un número entero seleccionado de 1-6, de manera preferente 1-3 y de manera más preferente 1-2. Los grupos de enlace de ejemplo incluyen alquilo sustituido o insustituido, porciones de heteroalquilo sustituido o insustituido y ácido siálico. Un componente de ejemplo de un ligador es una porción de acilo. Un compuesto de ejemplo de acuerdo a la invención tiene una estructura de acuerdo a las Fórmulas I ó II anteriores, en las cuales al menos uno de R2, R3, R4, R5, R6 ó R6' tiene la fórmula: N NHH L—R1 En otro ejemplo de acuerdo a esta modalidad, al menos uno de R2, R3, R4, R5, R6 ó R6' tiene la fórmula: É>_NHC(0)(CH2)s—NHC(O) R1 en la cual s es un número entero de 0 a 20 y R1 es una porción modificadora polimérica lineal. En una modalidad de ejemplo, la construcción del grupo modificador polimérico-ligador es una estructura ramificada que incluye dos o más cadenas poliméricas unidas a la porción central. En esta modalidad, la construcción tiene la fórmula: en la cual R1 y L son como se analizan anteriormente y w' es un número entero de 2 a 6 , de manera preferente de 2 a 4 y de manera más preferente de 2 a 3. Cuando L es un enlace se forma entre un grupo funcional reactivo en un precursor de R1 y un grupo funcional reactivo de reactividad complementaria en el núcleo de sacarilo. Cuando L es un ligador de orden no cero, un precursor de L puede estar en lugar en la porción de glicosilo antes de la reacción con el precursor de R1. De manera alternativa, los precursores de R1 y L se pueden incorporar en un cásete preformado que se une de manera subsiguiente a la porción de glicosilo. Como se expone en la presente, la selección y preparación de precursores con grupos funcionales reactivos apropiados está dentro de la capacidad de aquellos expertos en la técnica. Además, el acoplamiento de los precursores prosigue por la química que es bien conocida en la técnica. En una modalidad de ejemplo, L es un grupo de enlace que se forma de un aminoácido, o péptido pequeño (por ejemplo, 1-4 residuos de aminoácido) que proporciona un azúcar modificado en el cual se une el grupo modificador polimérico a través de un ligador de alquilo sustituido. Los ligadores de ejemplo incluyen glicina, lisina, serina y cisteína. La porción de PEG se puede unir a la porción de amina del ligador a través de un enlace de amida o uretano. El PEG se enlaza a los átomos de azufre u oxígeno de cisteína y serina a través de enlaces de tioéter o éter, respectivamente . En una modalidad de ejemplo, Rs incluye el grupo modificador polimérico. En otra modalidad de ejemplo, R5 incluye tanto el grupo modificador polimérico como un ligador, L, que une el grupo modificador al resto de la molécula. Como se analiza anteriormente, L puede ser una estructura lineal o ramificada. De manera similar, el grupo modificador polimérico puede ser ramificado o lineal.

II. D. ii. Polímeros Solubles en Agua Se conocen muchos polímeros solubles en agua por aquellos expertos en la técnica y son útiles en la práctica de la presente invención. El término polímero soluble en agua abarca especies tal como sacáridos (por ejemplo, dextrano, amilosa, ácido hialurónico, poli (ácido siálico), heparanos, heparinas, etc.); poli (aminoácidos) , por ejemplo, poli (ácido aspártico) y poli (ácido glutámico); ácidos nucleicos; polímeros sintéticos (por ejemplo, poli (ácido acrílico) , poli (éteres) , por ejemplo, poli (etilenglicol) ; péptidos, proteínas y similares. La presente invención se puede practicar con cualquier polímero soluble en agua con la única limitación que el polímero deba incluir un punto en el cual se puede unir en el resto del conjugado. Los métodos para la activación de polímeros también se pueden encontrar en WO 94/17039, Patente de los Estados Unidos No. 5,324,844, WO 94/18247, WO 94/04193, Patente de los Estados Unidos No. 5,219,564, Patente de los Estados Unidos No. 5,122,614, WO 90/13540, Patente de los Estados Unidos No. 5,281,698, y más WO 93/15189, y para conjugación entre polímeros activados y péptidos, por ejemplo, Factor VIII de Coagulación (WO 94/15625) , hemoglobina (WO 94/09'27), molécula portadora de oxígeno (Patente de los Estados Unidos No. 4,412,989) ribonucleasa y superóxido-dismutasa ( Veronese at al . , ?pp. Biochem. Biotech. 11: 141-45 (1985)). Los polímeros solubles en agua de ejemplo son aquellos en los cuales una proporción sustancial de las moléculas de polímero en una muestra del polímero son de aproximadamente el mismo peso molecular; estos polímeros son "homodispersos" . La presente invención se ilustra además por referencia a un conjugado de poli (etilenglicol) . Están disponibles varias revisiones y monografías con respecto a la funcionalización y conjugación de PEG. Ver, por ejemplo, Harris, Mac roño 1 . Chem. Phys . C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol . 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Cri tical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995); y Bhadra, et al., Pharmazie, 57:5-29 (2002). Las rutas para preparar moléculas de PEG reactivas y formar conjugados usando las moléculas reactivas se conocen en la técnica. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,672,662 describe un conjugado aislable y soluble en agua de un éster activo de un ácido polimérico seleccionado de poli (alquilenóxidos) ramificados o lineales poli (polioles oxietilados) , poli (alcoholes olefínicos) y poli (acrilomorfolina) . La Patente de los Estados Unidos No. 6,376,604 expone un método para preparar un éster de 1-benzotriazolilcarbonato soluble en agua de un polímero soluble en agua y no peptídico al hacer reaccionar un hidroxilo terminal del polímero con di(l-benzotriazolil) carbonato en un solvente orgánico. El éster activo se usa para formar conjugados con un agente biológicamente activo tal como una proteína o péptido. La WO 99/45964 describe un conjugado que comprende un agente biológicamente activo y un polímero soluble en agua activado que comprende una estructura de polímero que tiene al menos un término enlazado a la estructura de polímero a través de un enlace estable, en donde al menos un término comprende una porción de ramificación que tiene grupos reactivos próximos enlazados a la porción de ramificación, en la cual el agente biológicamente activo se enlaza a al menos uno de los grupos reactivos próximos. Otros poli (etilenglicoles) ramificados se describen en la WO 96/21469, la Patente de los Estados Unidos No. 5,932,462 describe un conjugado formado con una molécula de PEG ramificada que incluye un término ramificado que incluye grupos funcionales reactivos . Los grupos reactivos libres están disponibles para reaccionar con una especie biológicamente activa, tal como una proteína o péptido, formando conjugados entre el poli (etilenglicol) y la especie biológicametne activa. La Patente de los Estados Unidos No. 5,446,090 describe un ligador de PEG bifuncional y su uso en la formación de conjugados que tienen un péptido en cada uno de los términos del ligador de PEG. Los conjugados que incluyen enlaces de PEG degradables se describen en la WO 99/34833; y la WO 99/14259, así como en la Patente de los Estados Unidos No. 6,348,558. Estos enlaces degradables son aplicables en la presente invención. Los métodos, reconocidos en la técnica, para la activación de polímero expuesta anteriormente son de uso en el contexto de la presente invención en la formación de los polímeros ramificados expuestos en la presente y también para la conjugación de estos polímeros ramificados a otras especies, por ejemplo, azúcares, nucleótidos de azúcar y similares . Un polímero soluble en agua de ejemplo es poli (etilenglicol) , por ejemplo, metoxi-poli (etilenglicol) . El poli (etilenglicol) usado en la presente invención no se restringe a ninguna forma particular o intervalo de peso molecular. Para moléculas de poli (etilenglicol) no ramificadas, el peso molecular esta de manera preferente entre 500 y 100,00. Un peso molecular de 2000-60,000 se usa de manear preferente y de manera preferente de aproximadamente5, 000 a aproximadamente 40,000.

II. D. iii. Polímeros Ramificados Solubles en Agua En otra modalidad, el poli (etilenglicol) es un PEG ramificado que tiene más de una porción de PEG unida. Los ejemplos de PEG ramificados se describen en Patente de los Estados Unidos No. 5,932,462; Patente de los Estados Unidos No. 5,342,940; Patente de los Estados Unidos No. 5,643,575; Patente de los Estados Unidos No. 5,919,455; Patente de los Estados Unidos No. 6,113,906; Patente de los Estados Unidos No. 5,183,660; WO 02/09766; Kodera Y., Bioconjugate Chemistry 5: 283-288 (1994); y Yamasaki et al., Agrie. Biol . Chem. , 52: 2125-2127, 1998. En una modalidad preferida, el peso molecular de cada poli (etilenglicol) del PEG ramificado es menor que o igual a 40,000 daltons . Las porciones modificadores poliméricas representativas incluyen estructuras que se basan en aminoácidos que contienen cadena lateral, por ejemplo, serina, cisteína, lisina, y péptidos pequeños, por ejemplo, lys-lys. Las estructuras de ejemplo incluyen: AkjAA- Aquellos expertos apreciarán que la amina libre en las estructuras de di-lisina, también se pueden pegilar a través de un enlace de amina o uretano con una porción de PEG. En aún otra modalidad, la porción modificadora polimérica es una porción de PEG ramificada que se basa en un péptido de tri-lisina. La tri-lisina puede estar mono-, di-, tri- o tetra-PEGilada. Las especies de ejemplo de acuerdo a esta modalidad tienen las fórmulas: en las cuales los índices e, f y f son independientemente números enteros seleccionados de 1 a 2500; y los índices q, q' y q' ' son independientemente números enteros seleccionados de 1 a 20. Como será evidente para aquellos expertos en la técnica, los polímeros ramificados de uso en la invención incluyen variaciones en los temas expuestos anteriormente. Por ejemplo, el conjugado de di-lisina-PEG mostrado anteriormente puede incluir tres subunidades poliméricas, la tercera unida al a-amina mostrada como no modificada en la estructura anterior. De manera similar, el uso de una tri-lisina funcionalizada con tres o cuatro subunidades poliméricas marcadas con la porción modificadora polimérica de una manera deseable esta dentro del alcance de la invención.

Como se analiza en la presente, el PEG de uso en los conjugados de la invención puede ser lineal o ramificado. Un precursor de ejemplo de uso para formar los conjugados de péptido que contienen PEG ramificado de acuerdo a esta modalidad de la invención tiene la fórmula: Otro precursor de ejemplo de uso para formar los conjugados de péptido que contienen PEG ramificado de acuerdo a esta modalidad de la invención tiene la Fórmula: Las especies de polímeros ramificados de acuerdo a esta fórmula son esencialmente polímeros solubles en agua, puros. X3' es una porción que incluye un grupo funcional ionizable (por ejemplo, OH, COOH, H2P04, HS03, HP03, y sales de los mismos, etc.), u otro grupo funcional reactivo, por ejemplo, infra . C es carbono. X5, R16 y R17 se seleccionan independientemente de grupos no reactivos (por ejemplo, H, alquilo insustituido, heteroalquilo insustituido) y brazos poliméricos (por ejemplo, PEG) . X2 y X4 son fragmentos de enlace que son de manera preferente esencialmente no reactivos bajo condiciones fisiológicas, que pueden ser los mismos o diferentes. Un ligador de ejemplo incluye ni porciones aromáticas ni porciones de éster. De manera alternativa, estos enlaces pueden incluir una o más porciones que se diseñan para degradarse bajo condiciones fisiológicamente pertinentes, por ejemplo esteres, disulfuros, etc. X2 y X4 unen brazos poliméricos R16 y R17 a C. Cuando X3' se hace reaccionar con un grupo funcional reactivo de reactividad complementaria en el ligador, azúcar o cásete de ligador-azúcar, X3' se convierte a un componente del fragmento de enlace X3. Los fragmentos de enlace de ejemplo para X2, X3 y X4 se seleccionan independientemente e incluyen S, SC(0)NH, HNC(0)S, SC(0)0, O, NH, NHC(O), (O)CNH y NHC(0)0, y OC(0)NH, CH2S, CH20 , CH2CH20, CH2CH2S, (CH2)o0, (CH2)0S ó (CH2)0Y'-PEG en donde, Y' es S, NH, NHC(O), C(0)NH, NHC(0)0, OC(0)NH, ú O y o es un número entero de 1 a 50. En una modalidad de ejemplo, los fragmentos de enlace X2 y X4 son diferentes fragmentos de enlace . En una modalidad de ejemplo, el precursor (Fórmula III) , o un derivado activado del mismo, se hace reaccionar con, y de este modo se une a un azúcar, un azúcar activado o un nucleótido de azúcar a través de una reacción entre X3' y un grupo de reactividad complementaria en la porción de azúcar, por ejemplo, una amina. De manera alternativa X3' reacciona con un grupo funcional reactivo en un precursor al ligador, L. Uno o más de R2, R3, R4, R5, R6 ó R6' de las Fórmulas I y II pueden incluir la porción modificadora polimérica ramificada, o esta porción unida a través de L. En una modalidad de ejemplo, el grupo modificador polimérico tiene una estructura de acuerdo a las siguientes fórmulas : En otra modalidad de ejemplo, de acuerdo a la fórmula anterior, el polímero ramificado tiene una estructura de acuerdo a la siguiente fórmula: En una modalidad de ejemplo, A1 y A2 se seleccionan cada uno de -OH y -OCH3. Los grupos modificadores poliméricos de ejemplo de acuerdo a esta modalidad incluyen: es un brazo ligador, L. En esta modalidad, un ligador de ejemplo se deriva de un aminoácido natural o no natural, análogo de aminoácido o imitador de aminoácido, o un péptido pequeño formado de una o más de estas especies. Por ejemplo, ciertos polímeros ramificados encontrados en los compuestos de la invención tienen la fórmula: Xa es un fragmento de enlace que se forma por la reacción de un grupo funcional reactivo, por ejemplo, X3', en un precursor de la porción modificadora polimérica reactiva y un grupo funcional reactivo en la porción de azúcar, o un precursor a un ligador. Por ejemplo, cuando X3' es un ácido carboxílico, se puede activar y unir directamente a un grupo amina colgante de un amino-sacárido (por ejemplo, Sia, GalNH2, GlcNH2, ManNH2, etc.), que forma un Xa que es una amida. Los grupos funcionales reactivos de ejemplo adicionales y precursores activados se describen más adelante en la presente. El índice c representa un número entero de 1 a 10. Los otros símbolos tienen la misma identidad como aquellos analizados anteriormente. En otra modalidad de ejemplo, Xa es una porción de enlace formada con otro ligador: 5 Xa L1 Xb en la cual Xb es un segundo fragmento de enlace y se selecciona independientemente de aquellos grupos expuestos para Xa, y, similar a L, L1 es un enlace, alquilo sustituido o insustituido o heteroalquilo sustituido o insustituido. Las especies de ejemplo para Xa y Xb incluyen S, SC(0)NH, HNC(0)S, SC(0)0, O, NH, NHC (O), C(0)NH y NHC (O) O, y OC(0)NH. En otra modalidad de ejemplo, X4 es un enlace de péptido a R17, que es un aminoácido, di-péptido (por ejemplo, Lys-Lys) o tri-péptido (por ejemplo, Lys-Lys-Lys) en el cual las porciones de alfa-amina y/o heteroátomos de cadena lateral se modifican con una porción modificadora polimérica. En una modalidad de ejemplo adicional, los conjugados de péptido de la invención incluyen una porción, por ejemplo, una porción de R15 que tiene la fórmula que se selecciona de: en las cuales la identidad de los radicales representados por los varios símbolos es la misma como aquella analizada anteriormente en la presente. La es un enlace o un ligador como se analiza anteriormente para L y L1, por ejemplo, alquilo sustituido o insustituido o porción de heteroalquilo sustituido o insustituido. En una modalidad de ejemplo, La es una porción de la cadena lateral de ácido siálico que se funcionaliza con la porción modificadora polimérica como se muestra. Las porciones de La de ejemplo incluyen cadenas de alquilo sustituido o insustituido que incluyen uno o más OH ó NH2. En aún otra modalidad de ejemplo, la invención proporciona conjugados de péptido que tienen una porción, VI VII La identidad de los radicales representados por los varios símbolos es la misma como aquella analizada anteriormente en la presente. Como lo apreciarán aquellos expertos en la técnica, el brazo ligador en las Fórmulas VI y VII es igualmente aplicable a otros azúcares modificados expuestos en la presente. En la modalidad de ejemplo, las especies de las fórmulas VI y VII son las porciones de R15 unidas a las estructuras de glicano expuestas en la presente. En aún otra modalidad de ejemplo, el conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla incluye una porción de R15 con una fórmula que es un miembro seleccionado de: en las cuales las identidades de los radicales son como se analizan anteriormente. Una especie de ejemplo para La es - (CH2)]C(0)NH(CH2)hC(0)NH-, en la cual los índices h y j se seleccionan independientemente de números enteros 0 a 10. Una especie de ejemplo adicional es -C(0)NH-. Los índices m y n son números enteros independientemente seleccionados de 0 a 5000. A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10 y A11 son miembros independientemente seleccionados de H, alquilo sustituido o insustituido, heteroalquilo sustituido o insustituido, cicloalquilo sustituido o insustituido, heterocicloalquilo sustituido o insustituido, arilo sustituido o insustituido, heteroarilo sustituido o insustituido, y -NA12A13, -OA12 y -SiA12A13. A12 y A13 son miembros independientemente seleccionados de alquilo sustituido o insustituido, heteroalquilo sustituido o insustituido, cicloalquilo sustituido o insustituido, heterocicloalquilo sustituido o insustituido, arilo sustituido o insustituido, y heteroarilo sustituido o insustituido. Las modalidades de la invención expuestas anteriormente se ejemplifican adicionalmente por referencia a la especie en la cual el polímero es un polímero soluble en agua, particularmente poli (etilglicol) ("PEG"), por ejemplo, metoxi-poli (etilenglicol) aquellos expertos apreciarán que el enfoque en las secciones que sigue es para claridad de ilustración y los varios motivos expuestos usando PEG como un polímero de ejemplo son igualmente aplicables a especies en las cuales se utiliza un polímero diferente de PEG. El PEG de cualquier pero molecular, por ejemplo 1 KDa, 2 KDa, 5 KDa, 10 KDa, 15 KDa, 20 KDa, 25 KDa, 30 KDa, 35 KDa, 40 KDa y 45 KDa es de uso en la presente invención. En una modalidad de ejemplo, la porción R15 tiene una fórmula que es un miembro seleccionado del grupo: En cada una de las estructuras anteriores, el fragmento ligador -NH(CH2)a- puede estar presente o ausente. En otras modalidades de ejemplo, el conjugado de péptido incluye una porción R15 seleccionada del grupo: En cada una de las fórmulas anteriores, los índices e y f se seleccionan independientemente de los números enteros de 1 a 2500. En modalidades adicionales de ejemplo, e y f se seleccionan para proporcionar una porción de PEG que es aproximadamente 1 KDa, 2 KDa, 5 KDa, 10 KDa, 15 KDa, 20 KDa, 25 KDa, 30 KDa, 35 KDa, 40 KDa y 45 KDa. El símbolo Q representa alquilo sustituido o insustituido (por ejemplo, C1-C6 alquilo, por ejemplo, metilo) , heteroalquilo sustituido o insustituido o H. Otros polímeros ramificados tienen estructuras en base a péptidos de di-lisina (Lys-Lys) , por ejemplo: y péptidos de tri-lisina (Lys-Lys-Lys) , por ejemplo: En cada una de las Figuras anteriores, los índices e, f, f y f ' ' representan números enteros seleccionados independientemente de 1 a 2500. Los índices q, q' y q' ' representan números enteros independientemente seleccionados de 1 a 20. En otra modalidad de ejemplo, el grupo modificador : tiene una fórmula que es un miembro seleccionado de : en donde Q es un miembro seleccionado de H y alquilo sustituido o insustituido. Los índices e y f son números enteros independientemente seleccionados de 1 a 2500, y el índice q es un número entero seleccionado de 0 a 20. En otra modalidad de ejemplo, el grupo modificador: R16-X2 I La X5-C "" \ R17-X4 tiene una fórmula que es un miembro seleccionado de: en donde Q es un miembro seleccionado de H y alquilo sustituido o insustituido. Los índices e, f y f son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 2500, y q y q' son números enteros independientemente seleccionados de 1 a 20. En otra modalidad de ejemplo, el polímero ramificado tiene una estructura de acuerdo a la siguiente fórmula : en la cual los índices m y n son números enteros independientemente seleccionados de 0 a 5000. A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10 y A11 son miembros independientemente seleccionados de H, alquilo sustituido o insustituido, heteroalquilo sustituido o insustituido, cicloalquilo sustituido o insustituido, heterocicloalquilo sustituido o insustituido, arilo sustituido o insustituido, heteroarilo sustituido o insustituido, -NA12A13, -OA12 y -SiA12A13. A12 y A13 son miembros independientemente seleccionados de alquilo sustituido o insustituido, heteroalquilo sustituido o insustituido, cicloalquilo sustituido o insustituido, heterocicloalquilo sustituido o insustituido, arilo sustituido o insustituido, y heteroarilo sustituido o insustituido. La fórmula lia es un subconjunto de la Fórmula III. Las estructuras descritas por la Fórmula Illa también se abarcan por la Fórmula III. En una modalidad de ejemplo, el grupo modificador polimérico tiene una estructura de acuerdo a las siguientes fórmulas : En otra modalidad de ejemplo de acuerdo a la fórmula anterior, el polímero ramificado tiene una estructura de acuerdo a la siguiente fórmula: en una modalidad de ejemplo, A1 y A2 son miembros independientemente seleccionados de -OH y -OCH3. Los grupos modificadores poliméricos de ejemplo de acuerdo a esta modalidad incluyen: En una modalidad ilustrativa, el azúcar modificado es ácido siálico y los compuestos seleccionados de azúcar modificado de uso en la invención tienen las fórmulas: Los índices a, b y d son números enteros de 0 a 20. El índice c es un número entero de 1 a 2500. Las estructuras expuestas anteriormente pueden ser componentes de R15. En otra modalidad ilustrativa, una porción de hidroxilo primaria del azúcar esta funcionalizada con el grupo modificador. Por ejemplo, el 9-hidroxilo de ácido siálico se puede convertir a la amina correspondiente y funcionalizar para proporcionar un compuesto de acuerdo a la invención. Las fórmulas de acuerdo a esta modalidad incluyen: Las estructuras expuestas anteriormente pueden ser componentes de R15. Aunque la presente invención se ejemplifica en las secciones precedentes por referencia a PEG, como lo apreciarán aquellos expertos en la técnica, un arreglo de porciones modificadoras poliméricas es de uso en los compuestos y métodos expuestos en la presente. En modalidades seleccionadas, R1 ó L-R1 es un PEG ramificado, por ejemplo, una de las especies expuestas anteriormente. En una modalidad de ejemplo, la estructura de PEG ramificada se basa en un péptido de cisteína. Los azúcares modificados ilustrativos de acuerdo a esta modalidad incluyen: en las cuales X4 es un enlace ú O. En cada una de las estructuras anteriores, el ligador de alquilamina -(CH2)aNH-puede estar presente o ausente. Las estructuras expuestas anteriormente pueden ser componentes de R15/R15' . Como se analiza en la presente, los ácidos siálicos modificados con polímero de uso en la invención también pueden ser estructuras lineales. De esta manera, la invención proporciona conjugados que incluyen una porción de ácido siálico derivada de una estructura tal como: en la cual los índices q y e son como se analizan anteriormente. Los azúcares modificados de ejemplo se modifican con polímeros solubles en agua o insolubles en agua. Los ejemplos de polímero útil se ejemplifican más adelante. En otra modalidad de ejemplo, el péptido se deriva de células de insecto, se remodela al adicionar GlcNAc y Gal al núcleo de mannosa y se glicopegila usando un ácido siálico que tiene una porción de PEG lineal, dando un péptido de Factor Vil/Factor Vlla que comprende al menos una porción que tiene la fórmula: en la cual el índice t es un número entero de 0 a 1; el índice s representa un número entero de 1 a 10; y el índice f representa un número entero de 1 a 2500. En una modalidad, la presente invención proporciona un conjugado de péptido que comprende el siguiente grupo de enlace de glicosilo: D es un miembro seleccionado de -OH y R^L-HN-; G es un miembro seleccionado de Rx-L- y -C(O) alquilo-R1; R1 es una porción que comprende un miembro seleccionado de un residuo de poli (etilenglicol) de cadena recta y residuo de poli (etilenglicol) ramificado; y M es un miembro seleccionado de H, un contra-ion de sal y una carga negativa individual, M es un ligador que es un miembro seleccionado de un enlace, alquilo sustituido o insustituido y heteroalquilo sustituido o insustituido. El una modalidad de ejemplo, cuando D es OH, es R^L- . En otra modalidad de ejemplo, cuando G es -C(0) alquilo, D es R1-L-NH- . En una modalidad de ejemplo, L-R1 tiene la fórmula: en donde a es un número entero seleccionado de 0 a 20. En una modalidad de ejemplo, R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: CH3 CH3; en donde e, f, m y n son números enteros independientemente seleccionados de 1 a 2500; y q es un número entero seleccionado de 0 a 20. En una modalidad de ejemplo, R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: en donde e, f y f son números enteros independientemente seleccionados de 1 a 2500; y q y q' son números enteros independientemente seleccionados de 1 a 20. En otra modalidad de ejemplo, R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: en donde e, f y f son número enteros independientemente seleccionados de 1 a 2500; y q y q' son números enteros independientemente seleccionados de 1 a 20. En otra modalidad de ejemplo, R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: l—C(0)CH2CH2(OCH2CH2)eOCH3 3 <—C(0)OCH2CH2(OCH2CH2)fOCH3 en donde e y f son números enteros independientemente seleccionados de 1 a 2500. En otra modalidad de ejemplo, el ligador de glicosilo tiene la fórmula: En otra modalidad de ejemplo, el conjugado de péptido comprende al menos uno del ligador de glicosilo de acuerdo a una fórmula seleccionada de: en donde AA es un residuo de aminoácido del conjugado de péptido y t es un número entero seleccionado de 0 y 1. En otra modalidad de ejemplo, el conjugado de péptido comprende al menos uno del ligador de glicosilo en donde cada uno del ligador de glicosilo tiene una estructura que es un miembro independientemente seleccionado de las siguientes fórmulas: en donde AA es un residuo de aminoácido del conjugado de péptido y t es un número entero seleccionado de 0 a 1. En otra modalidad de ej emplo, el conjugado de péptido comprende al menos uno de ligador de glicosilo de acuerdo a una fórmula seleccionada de : en donde AA es un residuo de aminoácido del conjugado de péptido y t es un número entero seleccionado de 0 y 1. En una modalidad de ejemplo, un miembro seleccionado de 0 y 2 de las porciones de sialilo que no comprenden G esta ausente. En una modalidad de ejemplo, un miembro seleccionado de 1 y 2 de las porciones de sialilo que no comprende G esta ausente. En otra modalidad de ejemplo, el conjugado de péptido comprende al menos uno del ligador de glicosilo de acuerdo a una fórmula seleccionada de: en donde AA es un residuo de aminoácido del conjugado de péptido y t es un número entero seleccionado de 0 y 1. En una modalidad de ejemplo, esta ausente un miembro seleccionado de 0 y 2 de las porciones de sialilo que no comprenden G. En una modalidad de ejemplo, esta ausente un miembro seleccionado de 1 y 2 de las porciones de sialilo que no comprende G. En otra modalidad de ejemplo, el conjugado de péptido comprende al menos uno del ligador de glicosilo de acuerdo a una fórmula seleccionada de: en donde AA es un residuo de aminoácido del conjugado de péptido y t es un número entero seleccionado de 0 y 1. En una modalidad de ejemplo, esta ausente un miembro seleccionado de 0 y 2 de las porciones de sialilo que no comprenden G. En una modalidad de ejemplo, esta ausente un miembro seleccionado de 1 y 2 de las porciones de sialilo que no comprende G. En otra modalidad de ejemplo, el péptido del Factor Vil/Factor Vlla tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ: ID. NO: 1. En otra modalidad de ejemplo, el ligador de glicosilo se une al péptido del Factor Vil/Factor Vlla a través de un residuo de aminoácido seleccionado del serina y treonina. En otra modalidad de ejemplo, el residuo de asparagina es un miembro seleccionad de N152, N322 y combinaciones de los mismos. En otra modalidad de ejemplo, el péptido de Factor Vlla es un péptido del Factor Vlla bioactivo. En otra modalidad de ejemplo, el ligador de glicosilo se une al péptido del Factor Vil/Factor Vlla a través de un residuo de aminoácido que es un residuo de asparagina . En otra modalidad de ejemplo, la invención proporciona un péptido del Factor Vil/Factor Vlla que se produce en un hospedador adecuado. La invención también proporciona métodos para expresar este péptido. En otra modalidad de ejemplo, el hospedador es un sistema de expresión de mamífero. En otra modalidad de ejemplo, la invención proporciona un método para tratar una condición en un sujeto en necesidad del mismo, la condición esta caracterizada por potencia comprometida de coagulación en un sujeto, el método que comprende el paso de administrar al sujeto una cantidad del conjugado de péptido del Factor Vil/Factor Vlla de la invención, efectiva para mejorar la condición en el sujeto. En otra modalidad de ejemplo, el método comprende administrar al mamífero una cantidad del conjugado de péptido del Factor Vil/Factor Vlla producido de acuerdo a los métodos descritos en la presente. En otro aspecto, la invención proporciona un método para elaborar un conjugado de péptido del Factor Vil/Factor Vlla que comprende un ligador de glicosilo que comprende un residuo de sialilo modificado que tiene la fórmula : en donde R2 es H, CH2OR7, COOR7 ó OR7. R7 representa H, alquilo sustituido o insustituido o hetoalquilo sustituido o insustituido. R3 y R4 son miembros independientemente seleccionados de H, alquilo sustituido o insustituido, OR8, NHC(0)R9. R8 y R9 se seleccionan independientemente de H, alquilo sustituido o insustituido, heteroalquilo sustituido o insustituido o ácido siálico. R1S y R17 son brazos poliméricas independientemente seleccionados. X2 y X4 son fragmentos de enlace independientemente seleccionados que unen porciones poliméricas R16 y R17 a C. X5 es un grupo no reactivo y La es un grupo ligador. El método comprende (a) poner en contacto un péptido de Factor Vil/Factor Vlla que comprende la porción de glicosilo: Gal- con una porción donantea de PEG-ácido siálico que tiene la fórmula : y una enzima que transf iere PEG-ácido siálico en el Gal de la porción de glicosilo, bajo condiciones apropiadas para esta transferencia. En otra modalidad de ejemplo, la porción: tiene un fórmula que es un miembro seleccionado de : 3 . 3 en donde e, f, m y n son números enteros independientemente seleccionados de 1 a 2500; y q es un número entero seleccionado de 0 a 20. En otra modalidad de ej emplo, la porción : tiene una fórmula que es un miembro seleccionado de: en donde e, f y f son números enteros independientemente seleccionados de 1 a 2500; y q y q' son números enteros independientemente seleccionados de 1 a 20. En otra modalidad de ejemplo, el ligador de glicosilo comprende la fórmula: En otra modalidad de ejemplo, el conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla comprende al menos un ligador de glicosilo que tiene la fórmula: ,?j (Fue), Man — GleNAc — Gal- -R 15 I I I AA — GleNAc GleNAc — Man I I V/WP Man GleNAc — Gal- >15 J\?G (Fue)* Man- -GleNAc — Gal- -R 15 I I I AA — GleNAc — GleNAc — Man *?A/ Man- GleNAc — Gal- >15 Man (GleNAc—Gal)p-R15 ^W I (Fuc)t I i AA—GIcNAc- GleNAc—Man (GleNAc—Gal)p-R15 J\? Man (GleNAc—Gal)p-R15 (GIcNAc—Gal)p-R 15 Man (GleNAc —— CGaaWl)p—-pR15 v?? (Fuc)t AA—GleNAc—GleNAc—Man (GlcNAc-Gal)p-R 15 «J /VT Man (GleNAc—Gal)p-R15 (GleNAc—Gal)p-R15 en donde AA es un residuo de aminoácido del péptido; t es un número entero seleccionado de 0 y 1; y R15 es la porción de sialilo modificada. En otra modalidad de ejemplo, el péptido de Factor VII/Factor Vlla tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad de ejemplo, el ligador de glicosilo se une al péptido de Factor Vil/Factor Vlla a través de un residuo de aminoácido que es un residuo de asparagina . En otra modalidad de ejemplo, el residuo de asparagina es un miembro seleccionado de N152, N322 y combinaciones de los mismos.

En otra modalidad de ejemplo, el péptido de Factor Vlla es un péptido de Factor Vlla bioactivo. En otra modalidad de ejemplo, el método comprende, antes del paso (a) : (b) expresar el péptido de Factor Vil/Factor Vlla en un hospedador adecuado. En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar una condición en un sujeto en necesidad del mismo, la condición está caracterizada por potencia comprometida de coagulación en el sujeto, el método que comprende el paso de administrar al sujeto una cantidad del conjugado de péptido del Factor Vil/Factor Vlla producido de acuerdo a los métodos descritos en la presente, efectiva para mejorar la condición en el sujeto. En otra modalidad de ejemplo, el método comprende administrar al mamífero una cantidad del conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla producido de acuerdo con los métodos descritos en la presente . En otro aspecto, la invención proporciona un método para sintetizar un conjugado de péptido de Factor VII o Factor Vlla, el método que comprende combinar a) sialidasa; b) enzima que es un miembro seleccionado de glicosiltransferasa, exoglicosidasa y endoglicosidasa; c) residuo de sialilo modificado/azúcar modificado; d) péptido de Factor VIIa/Factor Vlla sintetizando de esta manera el conjugado de péptido de Factor VII o Factor Vlla. En una modalidad de ejemplo, la combinación es durante un tiempo menor de 10 horas. En otra modalidad de ejemplo, la invención comprende además un paso de coronación.

II. D. iv. Polímeros Insolubles en Agua En otra modalidad, análoga a aquéllas analizadas anteriormente, los azúcares modificados incluyen un polímero insoluble en agua, en lugar de un polímero soluble en agua. Los conjugados de la invención también pueden incluir uno o más polímeros insolubles en agua. Esta modalidad de la invención se ilustra por el uso del conjugado como un vehículo con el cual distribuir un péptido terapéutico de una manera controlada. Los sistemas de distribución de fármaco polimérico se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Dunn et al . , Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991. Aquéllos expertos en la técnica apreciarán que es aplicable sustancialmente cualquier sistema de distribución del fármaco conocido a los conjugados de la presente invención. Los motivos expuestos anteriormente para R1, L-R1, R15, R15' y otros radicales son igualmente aplicables a polímeros insolubles en agua, que se incorporan en estructuras lineales y ramificadas sin limitación utilizando química fácilmente accesible para aquéllos expertos en la técnica. Los polímeros insolubles en agua representativos incluyen, pero no se limitan a, polifosfazinas, poli (alcoholes vinílicos), poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, poliacrilamidas, polialquilenglicoles, polialquilen-óxidos, polialquilen-tereftalatos, polivinil-éteres, polivinil-ésteres, polivinil-haluros, polivinilpirrolidona, poliglicólidos, polisiloxanos, poliuretanos, poli (metil-metacrilato) , poli (etil-metacrilato) , poli (butil-metacrilato) , poli (isobutil-metacrilato) , poli (hexil-metacrilato) , poli (isodecil-metacrilato) , poli (lauril-metacrilato) , poli(fenil-metacrilato) , poli (metil-acrilato) , poli (isopropil-acrilato) , poli (isobutil-acrilato) , poli (octadecil-acrilato) polietileno, polipropileno, poli (etilenglicol) , poli (óxido de etileno), poli (etilen-tereftalato) , poli (vinil-acetato) , cloruro de polivinilo, poliestireno, polivinil-pirrolidona, pluronics y polivinilfenoles y copolímeros de los mismos. Los polímeros naturales sintéticamente modificados de uso en los conjugados de la invención incluyen, pero no se limitan a, alquil-celulosas, hidroxialquil-celulosas, éteres de celulosa, esteres de celulosa, y nitrocelulosas . Los miembros particularmente preferidos de las clases amplias de polímeros naturales sintéticamente modificados incluyen, pero no se limitan a, metil-celulosa, etil-celulosa, hidroxipropil-celulosa, hidroxipropil-metil-celulosa, hidroxibutil-metil-celulosa, acetato de celulosa, propionato de celulosa, butirato de acetato de celulosa, ftalato de acetato de celulosa, carboximetil-celulosa, triacetato de celulosa, sal sódica de sulfato de celulosa, y polímeros de esteres acrílicos y metacrílicos y ácido algínico . Estos y otros polímeros analizados en la presente se pueden obtener fácilmente de fuentes comerciales tal como Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO. ) , Polysciences (Warrenton, PA. ) , Aldrich (Milwaukee, Wl . ) , Fluka (Ronkonkoma, NY) , y BioRad (Richmond, CA) , o también se sintetizan de monómeros obtenidos de estos proveedores usando técnicas normales. Los polímeros biodegradables representativos de uso en los conjugados de la invención incluyen, pero no se limitan a, poliláctidos, poliglicólidos y copolímeros de los mismos, poli (etilen-tereftalato) , poli (ácido butírico), poli (ácido valérico) , poli (láctido-co-caprolactona) , poli (láctido-co-glicólido) , polianhídridos, poliortoésteres, mezclas y copolímeros de los mismos. De uso particular son composiciones que forman geles, tal como aquéllas que incluyen colágeno, pluronics y similares. Los polímeros de uso en la invención incluyen polímeros "híbridos" que incluyen materiales insolubles en agua que tienen dentro de al menos una porción de su estructura, una molécula bio-resorbible. Un ejemplo de este polímero es uno que incluye un copolímero insoluble en agua, que tiene una región bio-resorbible, una región hidrófila y una pluralidad de grupos funcionales reticulables por cadena de polímero. Para propósitos de la presente invención, "materiales insolubles en agua" incluyen materiales que son sustancialmente insolubles en agua o ambientes que contienen agua. De esta manera, aunque ciertas regiones o segmentos de copolímero pueden ser hidrófilas o aún solubles en agua, la molécula de polímero, como una totalidad, no se disuelve en ninguna medida sustancial en agua. Para los propósitos de la presente invención, el término "molécula bio-resorbible" incluye una región que es capaz de ser metabolizada o descompuesta y resorbida y/o eliminada a través de las rutas excretorias normales por el cuerpo. Estos metabolitos o productos de descomposición son preferentemente no tóxicos de forma sustancial al cuerpo. La región bio-resorbible puede ser ya sea hidrófoba o hidrófila, en tanto que la composición de copolímero como una totalidad no se vuelva soluble en agua. De esta manera, la región bio-resorbible se selecciona en base a la preferencia que el polímero, como una totalidad, permanece insoluble en agua. Por consiguiente, las propiedades relativas, es decir, las clases de grupos funcionales contenidos por, y las proporciones relativas de la región bio-resorbible, y la región hidrófila se seleccionan para asegurar que las composiciones bio-resorbibles útiles permanecen insolubles en agua. Los polímeros resorbibles de ejemplo incluyen, por ejemplo, copolímeros de bloque resorbibles sintéticamente producidos de poli (ácido a-hidroxi-carboxílico) /poli (oxialquileno, (ver, Cohn, et al., patente de los Estados Unidos número 4,826,945). Estos copolímeros no están reticulados y son solubles en agua de modo que el cuerpo puede excretar las composiciones degradadas de los copolímeros de bloque. Ver, Younes et al . , J Biomed. Ma ter . Res . 21: 1301-1316 (1987); y Cohn et al . , J Biomed. Ma ter . Res . 22: 993-1009 (1988). Los polímeros bio-resorbibles actualmente preferidos incluyen uno o más componentes seleccionados de poli (esteres) , poli (hidroxi-ácidos) , poli (lactonas) , poli (amidas) , poli (éster-amidas) , poli (aminoácidos) , poli (anhídridos) , poli (ortoésteres) , poli (carbonatos) , poli (fosfazinas) , poli (fosfoésteres) , poli (tioésteres) , polisacáridos y mezclas de los mismos, De manera aún más preferente, el polímero bio-resorbible incluye un componente de poli (hidroxi) -ácido. De los poli (hidroxi) -ácidos, se prefieren ácido poliláctido, ácido poliglicólico, ácido policaproico, ácido polibutírico, ácido polivalérico y copolímeros y mezclas de los mismos. Además de formar fragmentos que se absorben in vivo ("bio-resorben") , los revestimientos poliméricos preferidos para el uso en los métodos de la invención también pueden formar un fragmento excretable y/o metabolizable . También se pueden usar copolímeros de orden superior en la presente invención. Por ejemplo, Casey et al., patente de los Estados Unidos número 4,438,253, que se emitió el 20 de marzo de 1984, describe copolímeros de tri-bloque producidos de la transesterificación de poli (ácido glicólico) y un poli (alquilenglicol) terminado en hidroxilo. Estas composiciones se describen para el uso como suturas monofilamento resorbibles. La flexibilidad de estas composiciones se controla por la incorporación de un ortocarbonato aromático, tal como ortocarbonato de tetra-p-tolilo en la estructura de copolímero. También se pueden utilizar otros polímeros basados en ácido láctico y/o glicólico. Por ejemplo, Spinu, patente de los Estados Unidos número 5,202,413, que se emitió el 13 de abril de 1993, describe copolímeros de multi-bloque biodegradables que tienen bloques secuencialmente ordenados de poliláctido y/o poliglicólido producido por polimerización de abertura de anillo de láctido y/o glicólido ya sea sobre un diol oligomérico o un residuo diamina seguido por extensión de cadena con un compuesto difuncional, tal como, un diisocianato, diacilcloruro o diclorosilano. Las regiones bio-resorbibles de los revestimientos útiles en la presente invención se pueden diseñar para ser hidrolítica y/o enzimáticamente escindibles. Para los propósitos de la presente invención, "hidrolíticamente escindible" se refiere a la susceptibilidad del copolímero, especialmente la región bio-resorbible, a hidrólisis en agua o un ambiente que contiene agua. De manera similar, "enzimáticamente escindible" como se usa en la presente se refiere a la susceptibilidad del copolímero, especialmente la región bio-resorbible, para escindirse por enzimas endógenos o exógenas. Cuando se coloca dentro del cuerpo, la región hidrófila se puede procesar en fragmentos excretables y/o metabolizables . De esta manera, la región hidrófila puede incluir, por ejemplo, poliéteres, polialquilen-óxidos, polioles, poli (vinil-pirrolidina) , poli (alcohol vinílico) , poli (alquil-oxazolinas) , polisacáridos, carbohidratos, péptidos, proteínas y copolímeros y mezclas de los mismos. Adicionalmente, la región hidrófila también puede ser, por ejemplo, un óxido de poli (alquileno) . Estos óxidos de poli (alquileno) pueden incluir, por ejemplo, poli (etileno) -óxido, poli (propileno) -óxido y mezclas y copolímeros de los mismos . Los polímeros que son componentes de hidrogeles también son útiles en la presente invención. Los hidrogeles son materiales poliméricos que son capaces de absorber cantidades relativamente grandes de agua. los ejemplos de compuestos formadores de hidrogel incluyen, pero no se limitan a, ácidos poliacrílicos, carboximetilcelulosa sódica, alcohol polivinílico, polivinil-pirrolidina, gelatina, goma de carragaén y otros polisacáridos, ácido hidroxietilenmetacrílico (HEMA) , así como derivados de los mismos, y similares. Se pueden producir hidrogeles que son estables, biodegradables y bio-resorbibles. Además, las composiciones de hidrogeles pueden incluir subunidades que exhiben una o más de estas propiedades. Las composiciones de hidrogel bio-compatibles cuya integridad se puede controlar a través de la reticulación se conocen y se prefieren actualmente para el uso en los métodos de la invención. Por ejemplo, Hubbell et al., patente de los Estados Unidos número 5,410,016, que se emitió el 25 de abril de 1995 y 5,529,914, que se emitió el 25 de junio de 1996, describe sistemas solubles en agua, que son copolímeros de bloque reticulados que tienen un segmento de bloque central soluble en agua intercalado entre dos extensiones hidrolíticamente lábiles. Estos copolímeros además se coronan en el extremo con funcionalidades de acrilato fotopolimerizables . Cuando se reticulan, estos sistemas llegan a ser hidrogeles. El bloque central soluble en agua de estos copolímeros pueden incluir poli (etilenglicol) ; en tanto que, las extensiones hidrolíticamente lábiles pueden ser un poli (ácido a-hidroxi), tal como ácido poliglicólico o ácido poliláctico. Ver, Sawhney et al., Macromolecules 26 : 581-587 (1993) . En otra modalidad preferida, el ge es un gel termo-reversible. Los geles termo-reversibles que incluyen componentes, tal como pluronics, colágeno, gelatina, ácido hialurónico, polisacáridos, hidrogel de poliuretano, hidrogel de poliuretano-urea y combinaciones de los mismos actualmente son preferidos. En aún otra modalidad de ejemplo, el conjugado de la invención incluye un componente de un liposoma. Se pueden preparar liposomas de acuerdo a métodos conocidos por aquéllos expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en Eppstein et al., patente de los Estados Unidos número 4,522,811. Por ejemplo, las formulaciones de liposoma se pueden preparar al disolver líquidos apropiados (tal como estearoil-fosfatidil-etanolamina, estearoil-fosfatidil-colina, aracadoil-fosfatidil-colina, y colesterol) en un solvente orgánico que entonces se evapora, dejando atrás una película delgada de lípido seco en la superficie del recipiente. Entonces se introduce en el recipiente una solución acuosa de compuesto activo o su sal farmacéuticamente aceptable. El recipiente entonces se agita a mano para liberar el material de lípido de los lados del recipiente y para dispersar los agregados de lípido, formando de este modo la suspensión liposomal. Las micropartículas citadas anteriormente y los métodos para preparar las micropartículas se ofrecen a manera de ejemplo y no se propone que definan el alcance de las micropartículas de uso en la presente invención. Se apreciará por aquéllos expertos en la técnica que es de uso en la presente invención un arreglo de micropartículas, fabricado por diferentes métodos. Los formatos estructurales analizados anteriormente en el contexto de los polímeros solubles en agua, tanto de cadena recta como ramificada, son en general aplicables con respecto también a los polímeros insolubles en agua. De esta manera, por ejemplo, los núcleos de ramificación de cisteína, serina, dilisina y trilisina se pueden funcionalizar con dos porciones de polímero insolubles en agua. Los métodos usados para producir estas especies en general están cercanamente análogos a aquéllos usados para producir los polímeros solubles en agua.

II. D. v. Métodos para Producir los Grupos Modificadores Poliméricos Los grupos modificadores poliméricos se pueden activar por reacción con una porción de glicosilo o sacarilo o una porción de aminoácido. Las estructuras de ejemplo de especies activadas (por ejemplo, carbonatos y esteres activos) incluyen: En la Figura anterior, q es un miembro seleccionado de 1-40. Otros grupos activadores, o de salida, apropiados para activar PEG lineales y ramificados de uso en la preparación de los compuestos expuestos en la presente incluyen, pero no se limitan a las especies: Moléculas de PEG que se activan con éstas y otras especies y métodos para elaborar los PEG activados como se expone en la WO 04/083259. Aquéllos expertos en la técnica apreciarán que uno o más de los brazos de m-PEG de los polímeros ramificados mostrados anteriormente se pueden reemplazar por una porción de PEG con un diferente término, por ejemplo, OH, COOH, NH2, C2-C?o-alquilo, etc. Además, las estructuras anteriores se modifican fácilmente al insertar ligadores de alquilo (o al remover átomos de carbono) entre el átomo de a-carbono y el grupo funcional de la cadena lateral de aminoácido. De esta manera, los "homo"-derivados y los análogos superiores, así como homólogos inferiores están dentro del alcance de núcleos para los PEG ramificados de uso en la presente invención .

Las especies de PEG ramificado expuestas en la presente se preparan fácilmente por métodos tal como aquéllos expuestos en el esquema de reacción a continuación: en el cual Xd es O, o S y r es un número entero de 1 a 5. Los índices e y f son números enteros independientemente seleccionados de 1 a 2500. En una modalidad de ejemplo, uno o ambos de estos índices se seleccionan tal que el polímero sea de aproximadamente 5 KDa, 10 KDa, 15 KDa, 20 KDa, 25 KDa, 30 KDa, 35 KDa, o 40 KDa de peso molecular. De esta manera, de acuerdo a este esquema de reacción se pone en contacto un aminoácido natural o no natural con un derivado de m-PEG activado, en este caso el tosilato, formando 1 al alquilar el heteroátomo Xd de cadena lateral. El aminoácido de m-PEG mono-funcionalizado se somete a condiciones de N-acilación con un derivado reactivo de m-PEG, montando de este modo el m-PEG 2 ramificado. Como lo que será un experto, el grupo saliente de tosilato se puede reemplazar con cualquier grupo saliente adecuado, por ejemplo, halógeno, mesilato, triflato, etc. De manera similar, el carbonato reactivo utilizado para acilar la amina se puede reemplazar con un éster activo, por ejemplo, N-hidroxisuccinimida, etc., o el ácido se puede activar in si tu usando un agente deshidratante tal como diciclohexilcarbodiimida, carbonildiimidazol, etc. En otras modalidades de ejemplo, la porción de urea se reemplaza por un grupo tal como una amida.

II. E. Composiciones de Materia Homodispersas de Conjugado de Péptido Además de proporcionar conjugados de péptido que se forman a través de un grupo de enlace de glicosilo química o enzimáticamente adicionado, la presente invención proporciona composiciones de materia que comprenden conjugados de péptido que son altamente homogéneos en sus patrones de sustitución. Usando los métodos de la invención, es posible formar conjugados de péptido en los cuales la proporción sustancial de los grupos de enlace de glicosilo y las porciones de glicosilo a través de una aprobación de conjugados de Factor Vil/Factor Vlla que unen a un aminoácido estructuralmente idéntico o residuo de glicosilo. De esta manera, en un segundo aspecto, la invención proporciona un conjugado de péptido que tiene una población de porciones de polímero solubles en agua, que unen covalentemente el péptido a través de un grupo de enlace de glicosilo, por ejemplo, un grupo de enlace de glicosilo intacto. En un conjugado de péptido de ejemplo de la invención, esencialmente cada miembro de la población de polímero soluble en agua se une mediante el grupo de enlace de glicosilo a un residuo de glicosilo del péptido, y cada residuo de glicosilo del péptido al cual se une el grupo de enlace de glicosilo tiene la misma estructura. La presente invención también proporciona conjugados análogos a aquéllos descritos anteriormente en los cuales el péptido se conjuga a un grupo modificador, por ejemplo, una porción terapéutica, porción de diagnóstico, porción de dirección, porción de toxina o similar mediante un grupo de enlace de glicosilo. Cada uno de los grupos modificadores citados anteriormente puede ser una molécula pequeña, polímero natural (por ejemplo, polipéptido) o polímero sintético. Cuando el grupo modificador se une a un ácido siálico, en general se prefiere que el grupo modificador sea sustancialmente no fluorescente. En una modalidad de ejemplo, los péptidos de la invención incluyen al menos un sitio de glicosilación 0-enlazado o N-enlazado, que se glicosile con una azúcar modificado que incluye un grupo modificador polimérico, por ejemplo, una porción de PEG. En una modalidad de ejemplo, el PEG se une covalentemente al péptido mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, o mediante un ligador de no glicosilo, por ejemplo, alquilo sustituido o insustituido, heteroalquilo sustituido o insustituido. El grupo de enlace de glicosilo se une covalentemente a ya sea un residuo de aminoácido o un residuo de glicosilo del péptido. De manera alternativa, el grupo de enlace de glicosilo se une a una o más unidades de glicosilo de un glicopéptido. La invención también proporciona conjugados en los cuales se une un grupo de enlace de glicosilo tanto un residuo de aminoácido como un residuo de glicosilo. Los glicanos en los péptidos de la invención corresponden en general a aquéllos encontrados en un péptido de Factor Vil/Factor Vlla que se produce por células de mamífero (BHK, CHO) o células de insecto (por ejemplo, Sf-9) , después del remodelado de acuerdo a los métodos expuestos en la presente. Por ejemplo, el péptido de Factor Vil/Factor Vlla derivado de insecto que se expresa con un núcleo de tri-manosilo se pone en contacto de forma subsiguiente con un donante de GleNAc y una GlcNAc-transferasa y un donante de Gal y una Gal-transferasa . El anexado de GleNAc y Gal al núcleo de tri-manosilo se logra ya sea en dos pasos o en un paso único. Se adiciona un ácido siálico modificado a al menos una ramificación de la porción de glicosilo como se analiza en la presente. Aquéllas porciones de Gal que no están funcionarizadas con el ácido siálico modificado se "corona" opcionalmente por reacción con un donante de ácido siálico en la presencia de una sialil-transferasa . En una modalidad de ejemplo, al menos 60 % de las porciones de Gal terminales en una población de péptidos se corona con ácido siálico, de manera preferente al menos 70 %, de manera más preferente al menos 80 %, de manera aún más preferente al menos 90 % y de manera aún más preferente al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % se coronan con ácido siálico .

II. F. Azúcares de Nucleótido En otro aspecto de la invención, la invención también proporciona nucleótidos de azúcar. Las especies de ejemplo de acuerdo a esta modalidad incluyen: en la cual el índice y es un número entero seleccionado de 0, 1 y 2. La base es una base de ácido nucleico, tal como adenina, timina, guanina, citidina y uridina. R2, R3 y R4 son como se describe anteriormente. En una modalidad de ejemplo, L-(R1)W es un miembro seleccionado de en las cuales, las variables son como se describe anteriormente . En una modalidad de ejemplo, L-(R1)W tiene una estructura de acuerdo a la siguiente fórmula: En una modalidad de ejemplo, A1 y A2 se seleccionan cada uno de -OH y -OCH3. Los grupos modificadores poliméricos de ejemplo de acuerdo a esta modalidad incluyen: En otra modalidad de ejemplo, los azúcares de nucleótido tienen una fórmula que es un miembro seleccionado de : Un azúcar de nucleótido de ejemplo de acuerdo a esta modalidad tiene la estructura: Un azúcar de nucleótido de ejemplo de acuerdo a esta modalidad tiene la estructura: En otra modalidad de ejemplo, el azúcar de nucleótido se basa en la siguiente fórmula en la cual, los grupos R y L, representan porciones como se analiza anteriormente. El índice "y" es 0, 1 ó 2. En una modalidad de ejemplo, L es un enlace entre NH y R1. La base es una base de ácido nucleico. En una modalidad de ejemplo, L-R1 es un miembro seleccionado de en la cual las variables son como se describe anteriormente. En una modalidad de ejemplo, L-R1 tiene una estructura de acuerdo a la siguiente fórmula: En una modalidad de ejemplo, A1 y A2 se seleccionan cada uno de -OH y -OCH3.

III. Los Métodos Además de los conjugados analizados anteriormente, la presente invención proporciona métodos para preparar estos y otros conjugados. Además, la invención proporciona métodos para prevenir, curar o mejorar un estado de enfermedad al administrar un conjugado de la invención a un sujeto en riesgo de desarrollar la enfermedad o un sujeto que tiene la enfermedad. En modalidades de ejemplo, el conjugado se forma entre una porción modificadora polimérica y un péptido glicosilado o no glicosilado. El polímero se conjuga al péptido mediante un grupo de enlace de glicosilo, que se interpone entre, y se une covalentemente tanto al péptido (o residuo de glicosilo) y el grupo modificador (por ejemplo, polímero soluble en agua) . El método incluye poner en contacto el péptido con una mezcla que contiene un azúcar modificado y una enzima, por ejemplo, una glicosiltransferasa que conjuga el azúcar modificado al sustrato. La reacción se lleva a cabo bajo condiciones apropiadas para formar un enlace covalente entre el azúcar modificado y el péptido. La porción de azúcar del azúcar modificado se selecciona de manera preferente de azúcares de nucleótidos. El método para sintetizar un conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla, que comprende combinar a) sialidasa; b) una enzima capaz de catalizar la transferencia de un grupo de enlace de glicosilo tal como una glicosiltransferasa, exoglicosidasa o endoglicosidasa; c) azúcar modificado; d) péptido de Factor Vil/Factor Vlla, sintetizando de este modo el conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla. La reacción se lleva a cabo bajo condiciones apropiadas para formar un enlace covalente entre el azúcar modificado y el péptido. La porción de azúcar del azúcar modificado se selecciona de manera preferente de azúcares de nucleótido. En una modalidad de ejemplo, el azúcar modificado, tal como aquéllos expuestos anteriormente, se activa como los azúcares de nucleótido correspondientes. Los nucleótidos de azúcar de ejemplo que se usan en la presente invención en su forma modificada incluyen mono-, di- o trifosfato de nucleótido o análogos de los mismos. En una modalidad preferida, el nucleótido de azúcar modificado se selecciona de un UDP-glicósido, CMP-glicósido, o un GDP-glicósido. De manera aún más preferente, la porción de nucleótido de azúcar del nucleótido de azúcar modificado se selecciona de UDP-galactosa, UDP-galactosamina, UDP-glucosa, UDP-glucosamina, GDP-manosa, GDP-fucosa, CMP-ácido siálico, o CMP-NeuAc. En una modalidad de ejemplo, el fosfato de nucleótido se une a C-1. La invención también proporciona el uso de nucleótidos de azúcar modificados con L-R1 en la posición de carbono 6. Las especies de ejemplo de acuerdo a esta modalidad incluyen: en la cual los grupos R, y L, representan porciones como se analiza anteriormente. El índice "y" es 0, 1 ó 2. En una modalidad de ejemplo, L es un enlace entre NH y R1. La base es una base de ácido nucleico. Los azúcares de nucleótido de ejemplo de uso en la invención en los cuales el carbono en la posición 6 se modifica incluyen especies que tienen la estereoquímica de GDP-manosa, por ejemplo: en las cuales X5 es un enlace u 0. El índice i representa 0 ó 1. El índice x representa un número entero de 1 a 20. Los índices e y f representan independientemente números enteros de 1 a 2500. Q, como se analiza anteriormente, es H o C?~C6alquilo sustituido o insustituido. Como lo apreciarán aquéllos expertos, el derivado de serina, en el cual S se reemplaza con O también cae dentro de este motivo general. En aún una modalidad adicional de ejemplo, la invención proporciona un conjugado en el cual el azúcar modificado se basa en la estereoquímica de UDP-galactosa. Un azúcar de nucleótido de ejemplo de uso en esta invención tiene la estructura : En otra modalidad de ejemplo, el azúcar de nucleótido se basa en la estereoquímica de glucosa. La especie de ejemplo de acuerdo a esta modalidad tiene las fórmulas : De esta manera, en una modalidad ilustrativa en la cual la porción de glicosilo es ácido siálico, el método de la invención utiliza compuestos que tiene la fórmula en las cuales L-R1 es como se analiza anteriormente, y L1-R1 representa un ligador unido al grupo modificador. Como con L, la especie ligadora de ejemplo de acuerdo a L1 incluye un enlace, porciones de alquilo o heteroalquilo. Además, como se analiza anteriormente, la presente invención proporciona el uso de azúcares de nucleótidos que se modifican con un polímero soluble en agua, que es ya sea de cadena recta o ramificada. Por ejemplo, los compuestos que tienen las fórmulas mostradas a continuación son de uso para preparar conjugados dentro del alcance de la presente invención : en la cual X es O, o un enlace. En general, la porción de azúcar o cásete de porción de azúcar-ligador y los grupos de PEG o cásete de PEG-ligador enlazan conjuntamente a través del uso de grupos reactivos, que se transforman típicamente por el proceso de enlace en un nuevo grupo funciona orgánico o especie no reactiva. Los grupos funcionales reactivos de azúcar, se localizan en cualquier posición en la porción de azúcar. Los grupos reactivos y clases de reacciones útiles en la práctica de la presente invención en general son aquéllos que son bien conocidos en la técnica de químico de bioconjugados . Las clases actualmente favorecidas de reacciones disponibles con porciones de azúcar reactivas son aquéllas, que prosiguen bajo condiciones relativamente moderadas. Estas incluyen, pero no se limitan a sustituciones nucleófilas (por ejemplo, reacciones de aminas y alcoholes con haluros de acilo, esteres activos), sustituciones electrófilas (por ejemplo, reacciones de enamina) y adiciones a múltiples enlaces carbono-carbono y carbono-heteroátomo (por ejemplo, reacción de Michael, adición de Diles-Alder) . Éstas y otras reacciones útiles se analizan por ejemplo en March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed. , John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; y Feeney et al . , Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982. Los grupos funcionales reactivos útiles colgantes de un núcleo de azúcar o grupo modificador incluyen, pero no se limitan a: (a) grupos carboxilo y varios derivados de los mismos que incluyen, pero no se limitan a, esteres de N-hidroxisuccinimida, esteres de N-hidroxibenztriazol, haluros de ácido, imidazoles de acilo, tioésteres, esteres de p-nitrofenilo, alquilo, alquenilo, alquinilo y esteres aromáticos; (b) grupos hidroxilo, que se pueden convertir a, por ejemplo, esteres, éteres, aldehidos, etc. (c) grupos haloalquilo, en donde el haluro se puede desplazar posteriormente con un grupo nucleófilo tal como por ejemplo, una amina, un anión de carboxilato, anión de tiol, carbanión, o un ion de alcóxido, dando por resultado de este modo la unión covalente de un nuevo grupo en el grupo funcional del átomo de halógeno; (d) grupos dienofilo, que son capaces de participar en reacciones de Diels-Alder tal como por ejemplo, grupos de maleimido; (e) grupos de aldehido o cetona, tal que la derivatización subsiguiente sea posible mediante la formación de derivados de carbonilo tal como por ejemplo, iminas, hidrazonas, semicarbazonas u oximas, o mediante mecanismos tal como adición de Grignard o adición de alquil-litio; (f) grupos de haluro de sulfonilo para reacción subsiguiente con aminas, por ejemplo, para formar sulfonamidas; (g) grupos tiol, que pueden ser, por ejemplo, convertidos a disulfuros o hechos reaccionar con haluros de acilo; (h) grupos de amina o sulfhidrilo, que pueden ser, por ejemplo, acilados, alquilados u oxidados; (i) alquenos, que pueden sufrir, por ejemplo, cicloadiciones, acilación, adición de Michael, etc; y (j) epóxidos, que pueden reaccionar con, por ejemplo, aminas y compuestos de hidroxilo. Los grupos funcionales reactivos se pueden elegir tal que no participen en, o interfieran con, las reacciones necesarias para montar el núcleo de azúcar reactivo o grupo modificador. De manera alternativa, un grupo funcional reactivo se puede proteger de participar en la reacción por la presencia de un grupo protector. Aquellos expertos en la técnica entenderán cómo proteger un grupo funcional particular tal que no interfiera con un conjunto elegido de condiciones de reacción. Para ejemplos de grupos protectores útiles, ver, por ejemplo, Greene et al., Protective Groups in Organic Síntesis, John Wiley & Sons, Nueva York, 1991. En el análisis que sigue, se exponen varios ejemplos específicos de azúcares modificados que son útiles en la práctica de la presente invención. En las modalidades de ejemplo, se utiliza un derivado de ácido siálico como el núcleo de azúcar al cual se une el grupo modificador. El enfoque del análisis en los derivados de ácido siálico es para claridad de ilustración únicamente y no se debe considerar para limitar el alcance de la invención. Aquéllos expertos en la técnica apreciarán que se puede activar una variedad de otras porciones de azúcar y derivatizar de una manera análoga a aquélla expuesta usando ácido siálico como un ejemplo. Por ejemplo, están disponibles numerosos métodos para modificar galactosa, glucosa, N-acetilgalactosamina y mucosa por nombrar unos pocos sustratos de azúcar, que se modifican fácilmente por métodos reconocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Elhalabi et al., Curr. Med. Chem. 6: 93 (1999); y Schafer et al., J. Org. Chem. 65: 24 (2000)). En una modalidad de ejemplo, el azúcar modificado se basa en la porción de 6-amino-N-acetil-glicosilo. En el esquema anterior, el índice n representa un número entero de 1 a 2500. En una modalidad de ejemplo, el índice x se selecciona tal que el polímero sea de aproximadamente 10 KDa, 15 KDa o 20 KDa de peso molecular. El símbolo "A" representa un grupo activador, por ejemplo, un halo, un componente de un éster activado (por ejemplo, un éster de N-hidroxisuccinimida) , un componente de un carbonato (por ejemplo, carbonato de p-nitrofenilo) y similares. Aquéllos expertos en la técnica apreciarán que se preparan fácilmente otros azúcares de nucleótido de PEG-amida por este método y métodos análogos. El péptido se sintetiza típicamente de novo, o se expresa de forma recombinante en una célula procariótica (por ejemplo, célula bacteriana, por ejemplo, E. coli ) o en una célula eucariótica tal como una célula de mamífero, levadura, insecto, fungoidea o vegetal. El péptido puede ser ya sea una proteína de longitud completa o un fragmento. Además, el péptido puede ser un péptido tipo silvestre o mutado. En una modalidad de ejemplo, el péptido incluye una mutación que adiciona uno o más sitios de glicosilación N- u O-enlazados a la secuencia peptídico. El método de la invención también proporciona modificación de péptidos incompletamente glicosilados que se producen de forma recombinante. Muchas glicoproteínas recombinantemente producidas están incompletamente glicosiladas, exponiendo residuos de carbohidrato que pueden tener propiedades indeseables, por ejemplo, inmunogenicidad, reconocimiento por el RES. Empleando un azúcar modificado en un método de la invención, el péptido se puede glicosilar de forma adicionalmente simultánea y derivatizar con, por ejemplo, un polímero soluble en agua, un agente terapéutico, o similar. La porción de azúcar del azúcar modificado puede ser el residuo que se conjugará de manera apropiada al aceptor en un péptido completamente glicosilado, u otra porción de azúcar con propiedades deseables. Aquéllos expertos en la técnica apreciarán que la invención se puede practicar usando sustancialmente cualquier péptido o glicopéptido de cualquier fuente. Los péptidos de ejemplo con los cuales se puede practicar la invención se exponen en la WO 03/031464, y las referencias citadas en la misma. Los péptidos modificados por los métodos de la invención pueden ser péptidos sintéticos o tipo silvestre o pueden ser péptidos mutados, producidos por los métodos conocidos en la técnica, tal como mutagénesis dirigida al sitio. La glicosilación de péptidos es típicamente ya sea N-enlazada u O-enlazada. Un N-enlace de ejemplo es la unión del azúcar modificado a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas, asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de una porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De esta manera, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio potencial de glicosilación. La glicosilación O-enlazada se refiere a la unión de un azúcar (por ejemplo, N-acetilgalactosamina, galactosa, mañosa, GleNAc, glucosa, mucosa o xilosa) a la cadena lateral de hidroxi de un hidroxiaminoácido, de manera preferente serina o treonina, aunque también se pueden usar aminoácidos no usuales o no naturales, por ejemplo, 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina . Además, además de los péptidos, los métodos de la presente invención se pueden practicar con otras estructuras biológicas (por ejemplo, glicolípidos, lípidos, esfingoides, ceramidas, células enteras, y similares, que contienen un sitio de glicosilación) . Además de los sitios de glicosilación a un péptido u otra estructura se logra de manera conveniente al alterar la secuencia de aminoácidos tal que contenga uno o más sitios de glicosilación. La adición también se puede hacer por la incorporación de una o más especies que presenta un grupo -OH, de manera preferente residuos de serina o treonina, dentro de la secuencia del péptido (para sitios de glicosilación O-enlazados) . La adición se puede hacer por mutación o por síntesis química completa del péptido. La secuencia de aminoácidos del péptido se altera de manera preferente a través de cambios al nivel del ADN, particularmente al mutar el ADN que codifica para le péptido en bases preseleccionadas tal que se generen codones que se traducirán los aminoácidos deseados. Las mutaciones de ADN se hacen de manera preferente usando métodos conocidos en la técnica . En una modalidad de ejemplo, el sitio de glicosilación se adiciona al trasponer polinucleótidos. Los polinucleótidos que codifican para un péptido candidato se pueden modular con protocolos de transposición de ADN. La transposición de ADN es un proceso de recombinación y mutación recursiva, realizado por fragmentación aleatoria de una combinación de genes relacionados, seguida por remontaje de los fragmentos por un proceso tipo reacción en cadena de la polimerasa. Ver, por ejemplo, Stemmer, Proc. Nati. Acad. Sci EUA 91:10747-10751 (1994); Stemmer, Nature 370:389-391 (1994); y patentes de los Estados Unidos números 5,605,793, 5,837,458, 5,830,721 y 5,811,238. Los péptidos de ejemplo con los cuales se puede practicar la presente invención, los métodos para adicionar o remover sitios de glicosilación, y la adición o remoción de estructuras o subestructuras de glicosilo se describen en detalle en la WO 03/031464 y solicitudes PCT y norteamericana relacionadas. La presente invención también toma ventaja de adicionar a (o remover de) un péptido uno o más residuos de glicosilo seleccionados, después de lo cual se conjuga un azúcar modificado a al menos uno de los residuos de glicosilo seleccionados del péptido. La presente modalidad es útil, por ejemplo, cuando se desea conjugar el azúcar modificado a un residuo de glicosilo seleccionado que ya sea no está presente en un péptido o no está presente en una cantidad deseada. De esta manera, antes de acoplar un azúcar modificado o un péptido, el residuo de glicosilo seleccionado se conjuga al péptido por acoplamiento enzimático o químico. En otra modalidad, el patrón de glicosilación de un glicopéptido se altera antes de la conjugación del azúcar modificado por la remoción de residuo de carbohidrato del glicopéptido. Ver, por ejemplo, WO 98/31826. La adición o remoción de cualquier porción de carbohidrato presente en el glicopéptido se logra ya sea de forma química o enzimática. Una desglicosilación química de ejemplo se ocasiona por la exposición de la variante de polipéptido al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento da por resultado la escisión de la mayoría o todos los azúcares excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina) , en tanto que deja intacto el péptido. La desglicosilación química se describe por Hakimuddin et al . , Arch . Biochem . Biophys . 259: 52 (1987) y por Edge et al . , Anal . Biochem . 118: 131 (1981). La escisión enzimática de las porciones de carbohidrato en las variantes de polipéptido se puede lograr por el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas como se describe por Thotakura et al . , Meth . Enzymol . 138: 350 (1987). En una modalidad de ejemplo, el péptido se desialila de una forma esencialmente completa con neuraminidasa antes de realizar la glicoconjugación o paso de remodelado en el péptido. Después de la glicoconjugación o remodelado, el péptido se re-sialila opcionalmente usando una sialiltransferasa . En una modalidad de ejemplo, la re-sialilación se presenta esencialmente en cada (por ejemplo, >80 %, de manera preferente mayor de 85 %, mayor de 90 %, de manera preferente mayor de 95 % y de manera más preferente mayor de 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) aceptor de sacarilo terminal en una población de aceptores de sialilo. En una modalidad preferida, el sacárido tiene un patrón de sialilación sustancialmente uniforme (es decir, patrón de glicosilación sustancialmente uniforme) . La adición química de porciones de glicosilo se lleva a cabo por cualquier método conocido en la técnica. La adición enzimática de porciones de azúcar se logra de manera preferente usando una modificación de los métodos expuestos en la presente, sustituyendo las unidades de glicosilo nativas por los azúcares modificados usados en la invención. Se describen otros métodos para adicionar porciones de azúcar en las patentes de los Estados Unidos números 5,876,980, 6,030,815, 5,728,554 y 5,922,577. Los puntos de unión de ejemplo para el residuo de glicosilo seleccionado incluyen, pero no se limitan a: (a) sitios de consenso para glicosilación N-enlazada, y sitios para glicosilación O-enlazada; (b) porciones de glicosilo terminales que son aceptores para una glicosiltransferasa; (c) arginina, asparagina e histidina; (d) grupos carboxilo libres; (e) grupos sulfhidrilo libres tal como aquéllos de cisteína; (f) grupos de hidroxilo libres tal como aquéllos de serina, treonina o hidroxiprolina; (g) residuos aromáticos tal como aquéllos de fenilalanina, tirosina, o triptofano; o (h) el grupo amida de glutamina. Los métodos de ejemplo de uso en la presente invención se describen en la WO 87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981) . En una modalidad, la invención proporciona un método para enlazar dos o más péptidos a través de un grupo de enlace. El grupo de enlace es de cualquier estructura útil y se puede seleccionar de estructuras de cadena recta y ramificada. De manera preferente, cada término del ligador, que se une a un péptido, incluye un azúcar modificado (es decir, un grupo de enlace de glicosilo intacto naciente) . En un método de ejemplo de la invención, se enlazan conjuntamente dos péptidos mediante una porción ligadora que incluye una polimérica (por ejemplo, ligador de PEG) . La construcción se ajusta a la estructura general expuesta en el dibujo anterior. Como se describe en la presente, la construcción de la invención incluye dos grupos de enlace de glicosilo intactos (es decir, s + t = 1) . El enfoque en un ligador de PEG que incluye dos grupos de glicosilo es para propósitos de claridad y no se debe interpretar como que limite la identidad de los brazos ligadores de uso en esta modalidad de la invención. De esta manera, una porción de PEG se funcionaliza en un primer término con una primera unidad de glicosilo y en un segundo término con una segunda unidad de glicosilo. La primera y segunda unidades de glicosilo son preferentemente sustratos para diferentes transíerasas, permitiendo la unión ortogonal del primero y segundo péptidos a la primera y segunda unidades de glicosilo, respectivamente. En la práctica, el ligador (glicosil) 1-PEG- (glicosil) 2 se pone en contacto con el primer péptido y una primera transferasa para la cual la primera unidad de glicosilo es un sustrato, formando de este modo (péptido) 1-(glicosil) 1-PEG- (glicosil) 2. La transferasa y/o péptido sin reaccionar entonces se remueve de forma opcional de la mezcla de reacción. El segundo péptido y una segunda transferasa para la cual la segunda unidad de glicosilo es un sustrato se adicionan al conjugado de (péptido) 1-(glicosil) 1-PEG- (glicosil) 2, formando (péptido) 1- (glicosil) 1-PEG- (glicosil) 2- (péptido) 2; al menos uno de los residuos de glicosilo está ya sea directa o indirectamente O-enlazado. Aquéllos expertos en la técnica apreciarán que el método resumido anteriormente también es aplicable para formar conjugados entre más de dos péptidos por ejemplo por el uso de un PEG ramificado, dendrímero, poli (aminoácido) , polisacárido o similar.

En una modalidad de ejemplo, el péptido que se modifica por un método de la invención es un glicopéptido que se produce en células de mamífero (por ejemplo, células de CHO) o en un animal transgénico y de esta manera, contiene cadenas de oligosacárido N- y/u O-enlazadas, que están incompletamente sialiladas. Las cadenas de oligosacárido del glicopéptido que carecen de un ácido siálico y que contienen un residuo de galactosa terminal se pueden PEGilar, PEGilar o modificar de otro modo con un ácido siálico modificado. En el Esquema 1 de reacción, el amino-glicósido 1, se trata con el éster activo de un derivado de aminoácido protegido (por ejemplo, glicina) , convirtiendo el residuo de azúcar-amina en el correspondiente aducto de aminoácido protegido-amida. El aducto se trata con una aldolasa para formar a-hidroxi-carboxilato 2. El compuesto 2 se convierte al correspondiente derivado de CMP por la acción de CMP-SA-sintetasa, seguido por hidrogenación catalítica del derivado de CMP para producir el compuesto 3. La amina introducida mediante la formación del aducto de glicina se utiliza como un sitio de unión de PEG al hacer reaccionar el compuesto 3 con un derivado de PEG o PPG activado (por ejemplo, PEG-C(0)NHS, PEG-OC (O) 0-p-nitrofenil) , produciendo las especies tal como 4 ó 5, respectivamente. squema 1 de reacción CMP-SA-5-NHCOCH2NH—C(0)0-PEG En una modalidad de ejemplo, se puede unir un azúcar modificado a un sitio de unión de O-glicano en un péptido de Factor Vil/Factor Vlla. Las glicosiltransferasas que se pueden usar para producir este conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla incluyen: para Ser56 (-Glc- (Xyl) n-Gal-SA-PEG - una galactosiltransferasa y sialiltransferasa; para Ser56 -Glc- (Xyl) n-Xyl-PEG- una xilosiltransferasa; y para Ser60-Fuc-GlcNAc- (Gal) n- (SA) m-PEG- una GleNAc transferasa .

III. A. Conjugación de Azúcares Modificados a Péptidos Los azúcares modificados con PEG se conjugan a un péptido glicosilado o no glicosilado usando una enzima apropiada para mediar la conjugación. De manera preferente, las concentraciones de los azúcares donantees modificados, enzimas y péptidos aceptores se seleccionan tal que la glicosilación prosigue hasta que se consuma el aceptor. Las consideraciones analizadas más adelante, en tanto que se exponen en el contexto de una sialiltransferasa, en general son aplicables a otras reacciones de glicosiltransferasa. En las Figuras 3A-3N se proporciona una lista de sialiltransferasas preferidas para el uso en la invención. Se conocen varios métodos para usar glicosiltransferasas para sintetizar estructuras deseadas de oligosacárido, y en general son aplicables a la presente invención. Los métodos de ejemplo se describen, por ejemplo, WO 96/32491, Ito et al., Puré Appl. Chem. 65: 753 (1993), Patentes de los Estados Unidos números. 5,352,670, 5,374,541, 5,545,553, patentes de los Estados Unidos comúnmente poseídas números 6,399,336, y 6,440,703, y solicitudes PCT publicadas comúnmente poseídas, WO 03/031464, WO 04/033651, WO 04/099231, que se incorporan en la presente como referencia. La presente invención se practica usando una glicosiltransferasa individual o una combinación de glicosiltransferasa. Por ejemplo, se puede usar una combinación de una sialiltransferasa y una galactosiltransferasa. En aquellas modalidades que usan más de una enzima, las enzimas y sustratos se combinan de manera preferente en una mezcla de reacción indicial, o las enzimas de reactivos para una segunda reacción enzimática se adicional al medio de reacción una vez que se termina la primera reacción enzimática o está cerca de terminarse. Al llevar a cabo dos reacciones enzimáticas en secuencia en un recipiente único, se mejoran los rendimientos totales con respecto a los procedimientos en los cuales se aisla una especie intermedia. Además, se reduce la limpieza y eliminación de solventes adicionales y sub-productos adicionales . En una modalidad preferida, cada una de la primera y segunda enzimas es una glicosiltransferasa. En otra modalidad preferida, una enzima es una endoglicosidasa. En una modalidad preferida adicional, se usan más de dos enzimas para montar la glicoproteína modificada de la invención. Las enzimas se usan para alterar una estructura de sacárido en el péptido en cualquier punto ya sea antes o después de la adición del azúcar modificado al péptido. En otra modalidad, el método hace uso de una o más exo- o endo-glicosidasas . La glicosidasa es típicamente un mutante, que se maneja para formar enlaces de glicosilo en lugar de romperlos . La glicanasa mutante incluye típicamente una sustitución de un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido, ácido de sitio activo. Por ejemplo, cuando la endoglicanasa es endo-H, los residuos de sitio activo sustituidos serán típicamente Asp en la posición 130, Glu en la posición 132 o una combinación de estos. Los aminoácidos se reemplazan en general con serina, alanina, asparagina o glutamina. La enzima mutante cataliza la reacción, usualmente por un paso de síntesis que es análogo a la reacción inversa del paso de hidrólisis de endoglicanasa. En estas modalidades, la molécula donantea de glicosilo (por ejemplo, una estructura deseada de oligo- o mono-sacárido) contiene un grupo saliente y la reacción prosigue con la adición de la molécula donantea a un residuo de GleNAc en la proteína. Por ejemplo, el grupo saliente puede ser un halógeno, tal como fluoruro. En otras modalidades, el grupo saliente es un Asn, o una porción de Asn-péptido. En modalidades adicionales, el residuo de GleNAc en la molécula donantea de glicosilo está modificado. Por ejemplo, el residuo de GleNAc puede comprender una porción de 1, 2-oxazolina. En una modalidad preferida, cada una de las enzimas utilizadas para producir un conjugado de la invención está presentes en una cantidad catalítica. La cantidad catalítica de una enzima particular varía de acuerdo a la concentración del sustrato de esta enzima así como las condiciones de reacción tal como temperatura, tiempo y valor de pH. Un medio para determinar la cantidad catalítica para una enzima determinada bajo concentración preseleccionada del sustrato y condiciones de reacción es bien conocida por aquéllos expertos en la técnica. La temperatura a la cual se lleva a cabo el proceso anterior puede variar desde justo por arriba de congelamiento a la temperatura en la cual se desnaturaliza la enzima más sensible. Los intervalos preferidos de temperatura son aproximadamente 0°C a aproximadamente 55°C, y de manera más preferente de aproximadamente 20°C a aproximadamente 37°C. En otra modalidad de ejemplo, se llevan a cabo uno o más componentes del presente método a una temperatura elevada usando una enzima termofílica. La mezcla de reacción se mantiene durante un periodo de tiempo suficiente para que el aceptor se glicosile, formando de este modo el conjugado deseado. Algo del conjugado frecuentemente se puede detectar después de unas pocas horas, con cantidades recuperables que se obtienen usualmente en el espacio de 24 horas o menos . Aquéllos expertos en la técnica entienden que la velocidad de reacción es dependiente del número de un número de factores variables (por ejemplo, concentración de enzima, concentración de donante, concentración de aceptor, temperatura, volumen de solvente) , que se optimizan para un sistema seleccionado. La presente invención también proporciona la producción a escala industrial de péptidos modificados. Como se usa en la presente, una escala industrial produce en general al menos un gramo de conjugado purificado, terminado. En el análisis que sigue, la invención se ejemplifica por la conjugación de porciones modificadas de ácido siálico a un péptido glicosilado. El ácido siálico modificado de ejemplo se marca con PEG. El enfoque del siguiente análisis en el uso de péptidos glicosilados y ácido siálico modificado con PEG es para claridad de ilustración y no se propone para implementar que la invención se limite a la conjugación de estos dos compañeros. Un experto en la técnica entiende que el análisis en general es aplicable a las adiciones de porciones modificadas de glicosilo diferentes de ácido siálico. Además, el análisis es igualmente aplicable a la modificación de una unidad de glicosilo con agentes diferentes de PEG que incluyen otras porciones de PEG, porciones terapéuticas y biomoléculas . Se puede usar un planteamiento enzimático para la introducción selectiva de carbohidratos PEGilados y PPGilados en un péptido o glicopéptido. El método utiliza azúcares modificados que contienen PEG, PPG, o un grupo funcional reactivo enmascarado, y se combina con la glicosiltransferasa o glicosintasa apropiada. Al seleccionar la glicosiltransferasa que hará el enlace deseado de carbohidrato utilizando el azúcar modificado como el sustrato donante, se puede introducir directamente PEG o PPG sobre la estructura del péptido, sobre residuos de azúcar existentes de un glicopéptido o sobre residuos de azúcar que se han adicionado a un péptido. En una modalidad de ejemplo, está presente un aceptor para una sialiltransferasa en el péptido que se va a modificar ya sea como una estructura que se presenta de forma natural o se coloca de forma recombinante, enzimática o química. Los aceptores adecuados, incluyen, por ejemplo, aceptores de galactosilo tal como Gal/31, 4GlcNAc, Gal31, 4GalNAc, Gal/31, 3GalNAc, lacto-N-tetraosa, Gal/31, 3GlcNAc, Gal/31, 3Ara, Gal/3l, 6GlcNAc, Gal/31, 4Glc (lactosa) , y otros aceptores conocidos por aquéllos expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Paulson et al., J. Biol. Chem. 253: 5617-5624 (1978)). Las sialiltransferasas de ejemplo se exponen en la presente. En una modalidad, un aceptor para la sialiltransferasa está presente en el glicopéptido que se va a modificar en la síntesis in vivo del glicopéptido. Estos glicopéptidos se pueden sialilar usando los métodos reivindicados sin modificación anterior del patrón de glicosilación del glicopéptido. De manera alternativa, los métodos de la invención se pueden usar para sialilar un péptido que no incluye un aceptor adecuado; se modifica primero el péptido para incluir un aceptor por métodos conocidos por aquéllos expertos en la técnica. En una modalidad de ejemplo, se adiciona un residuo de GalNAc por la acción de una GalNAc-transíerasa. En una modalidad de ejemplo, el aceptor de galactosilo se monta al unir un residuo de galactosa a un aceptor apropiado enlazado al péptido, por ejemplo, un GleNAc . El método incluye incubar el péptido que se va a modificar con una mezcla de reacción que contiene una cantidad adecuada de una galactosiltransferasa (por ejemplo, Gal/31,3 o Gal/31,4), y un donante de galactosilo adecuado (por ejemplo, UDP-galactosa) . Se permite que la reacción prosiga sustancialmente hasta el término, o de manera alternativa, la reacción se termina cuando se adiciona una cantidad preseleccionada del residuo de galactosa. Otros métodos para montar un aceptor de sacárido seleccionado serán evidentes para aquéllos expertos en la técnica. En aún otra modalidad, los oligosacáridos enlazados a glicopéptido se "recortan" primero, ya sea en totalidad o en parte, para exponer ya sea un aceptor para la sialiltransferasa o una porción a la cual se pueden adicionar uno o más de los residuos apropiados para obtener un aceptor adecuado. Las enzimas tal como glicosiltransferasas y endoglicosidasas (ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos número 5,716,812) son útiles para las reacciones de unión y recorte. En otra modalidad de este método, las porciones de ácido siálico del péptido se remueven de una manera esencialmente completa (por ejemplo, al menos 90, al menos 95 o al menos 99 %) , exponiendo un aceptor para un ácido siálico modificado. En el análisis que sigue, el método de la invención se ejemplifica por el uso de azúcares modificados que tienen una porción de PEG unida a estos. El enfoque del análisis es para claridad de ilustración. Aquéllos expertos en la técnica apreciarán que el análisis es igualmente pertinente a aquéllas modalidades en las cuales el azúcar modificado tiene una porción terapéutica, biomolécula o similar. En una modalidad de ejemplo de la invención en la cual se "recorta" un residuo de carbohidrato antes de la adición del azúcar modificado, el alto contenido de mañosa se recorta de nuevo a la estructura biantenaria de primera generación. Un azúcar modificado que tiene una porción de PEG se conjuga a uno o más residuos de azúcar expuestos por el "recorte". En un ejemplo, se adiciona una porción de PEG mediante una porción de GleNAc conjugada a la porción de PEG. El GleNAc modificado se une a uno o ambos de los residuos terminales de mañosa de la estructura biantenaria. De manera alternativa, se puede adicionar un GleNAc no modificado a uno o ambos de los términos de la especie ramificada.

En otra modalidad de ejemplo, se adiciona una porción de PEG a uno o ambos de los residuos terminales de mañosa de la estructura biantenaria mediante un azúcar modificado que tiene un residuo de galactosa, que se conjuga a un residuo de GleNAc adicionado en los residuos terminales de mañosa. De manera alternativa, se puede adicionar un Gal no modificado a uno o ambos residuos terminales de GleNAc. En aún un ejemplo adicional, se adiciona una porción de PEG en un residuo de Gal usando un ácido siálico modificado tal como aquéllos analizados anteriormente. En otra modalidad de ejemplo, una estructura de alto contenido de mañosa se "recorta de regreso" a la mañosa de la cual se ramifica la estructura biantenaria. En un ejemplo, se adiciona una porción de PEG mediante un GleNAc modificado con el polímero. De manera alternativa, se adiciona un GleNAc no modificado a la mañosa, seguido por Gal con una porción de PEG unida. En aún otra modalidad, los residuos de GleNAc y Gal no modificados se adicionan de manera subsiguiente a la mañosa, seguido por una porción de ácido siálico modificada con una porción de PEG. Una estructura de alto contenido de mañosa también se puede recortar de regreso al núcleo de tri-manosilo elemental . En una modalidad adicional de ejemplo, el alto contenido de mañosa se "recorta de regreso" al GleNAc al cual se adiciona la primera mañosa. El GleNAc se conjuga a un residuo de Gal que tiene una porción de PEG. De manera alternativa, se adiciona un Gal no modificado al GleNAc, seguido por la adición de un ácido siálico modificado con un azúcar soluble en agua. En aún un ejemplo adicional, el GleNAc terminal se conjuga con Gal y el GleNAc se fucosila subsiguientemente con una fucosa modificada que tiene una porción de PEG. El alto contenido de mañosa también se recorta de regreso al primer GleNAc unido al Asn del péptido. En un ejemplo, el GleNAc del residuo de GleNAc- (Fue) a se conjuga con el GleNAc que tiene un polímero soluble en agua. En otro ejemplo, el GleNAc del residuo de GleNAc- (Fue) a se modifica con Gal, que tiene un polímero soluble en agua. En una modalidad aún adicional, el GleNAc se modifica con Gal, seguido por conjugación al Gal de un ácido siálico modificado con una porción de PEG. Otras modalidades de ejemplo se exponen en las publicaciones de solicitudes de patente de los Estados Unidos, comúnmente poseídas: 20040132640; 20040063911; 20040137557; solicitudes de patente de los Estados Unidos números: 10/369,979; 10/410,913; 10/360,770; 10/410,945 y PCT/US02/32263 cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia Los ejemplos expuestos anteriormente proporcionan una ilustración del poder de los métodos expuestos en la presente. Usando los métodos descritos en la presente, es posible "recortar de regreso" y acumular un residuo de carbohidrato de sustancialmente cualquier estructura deseada. El azúcar modificado se puede adicionar a los términos de la porción de carbohidrato como se expone anteriormente, o puede ser intermedio entre el núcleo de péptido y el término del carbohidrato. En una modalidad de ejemplo, el ácido siálico existente se remueve de un glicopéptido usando una sialidasa, desenmascarando de este modo, todos o la mayoría de los residuos de galactosilo subyacentes. De manera alternativa, se marca un péptido o glicopéptido con residuos de galactosa, o un residuo de oligosacárido que termina en una unidad de galactosa. Después de la exposición de o la adición de los residuos de galactosa, se usa una sialiltransferasa apropiada para adicionar un ácido siálico modificado. En otra modalidad de ejemplo, se utiliza una enzima que transfiere ácido siálico sobre ácido siálico. El método se puede practicar sin tratar un glicano sialilado con una sialidasa para exponer residuos de glicano por debajo del ácido siálico. Un ácido siálico modificado con polímero de ejemplo es un ácido siálico modificado con poli (etilenglicol) . Otras enzimas de ejemplo que adicionan ácido siálico y porciones modificadas de ácido siálico sobre glicanos que incluyen un residuo de ácido siálico o intercambian un residuo existente de ácido siálico en un glicano para estas especies incluyen ST3Gal3, CST-II, ST8Sia-II, ST8Sia-III y ST8Sia-IV. En aún un planteamiento adicional, la funcionalidad reactiva enmascarada está presente en el ácido siálico. El grupo reactivo enmascarado está preferentemente sin afectar por las condiciones usadas para unir el ácido siálico modificado al péptido de Factor Vil/Factor Vlla. Después de la unión covalente del ácido siálico modificado al péptido, la máscara se remueve y el péptido se conjuga con un agente tal como PEG. El agente se conjuga al péptido de una manera específica por su reacción con el péptido reactivo no enmascarado en el residuo de azúcar modificado. Se puede usar cualquier azúcar modificado con su glicosiltransferasa apropiada, dependiendo de los azúcares terminales de las cadenas laterales de oligosacárido del glicopéptido. Como se analiza anteriormente, el azúcar terminal del glicopéptido requerido para la introducción de la estructura PEGilada se puede introducir de forma natural durante la expresión o se puede producir después de la expresión usando las glicosidasas apropiadas, glicosiltransferasas apropiadas o mezcla de glicosidasas y glicosiltransferasas.

En una modalidad adicional de ejemplo, se hace reaccionar UDP-galactosa-PEG con ßl, 4-galactosiltransferasa, transfiriendo de este modo la galactosa modificada a la estructura de N-acetilglucosamina terminal apropiada. Los residuos de GleNAc terminales en el glicopéptido se pueden producir durante la expresión, como puede presentarse en sistemas de expresión tal como de mamífero, insecto, planta o fungoideo, pero también se puede producir al tratar el glicopéptido con una sialidasa y/o glicosidasa y/o glicosiltransferasa, como se requiera. En. otra modalidad de ejemplo, una GlcNAc-transferasa, tal como GNT1-5, se utiliza para transferir GleNAc PEGilado a un residuo de mañosa terminal en un glicopéptido. En una modalidad adicional aún de ejemplo, las estructuras de glicano N- y/u O-enlazadas se remueven enzimáticamente de un glicopéptido para exponer un residuo de aminoácido o glicosilo terminal que subsiguientemente se conjuga con el azúcar modificado. Por ejemplo, se usa una endoglicanasa para remover las estructuras N-enlazadas de un glicopéptido para exponer una GleNAc terminal como un GlcNAc-enlazado-Asn en el glicopéptido. Se usa UDP-Gal-PEG y la galactosiltransferasa apropiada para introducir la funcionalidad de PEG-galactosa en el GleNAc expuesto. En una modalidad alternativa, el azúcar modificado se adiciona directamente a la estructura de péptido usando una glicosiltransferasa conocida para transferir residuos de azúcar a la estructura de péptido. Las glicosiltransferasa de ejemplo útiles en la práctica de la presente invención incluyen, pero no se limitan, a GalNAc-transferasas (GalNAc Tl-14), GlcNAc-transferasas, fucosiltransferasas, glucosiltransíerasas, xilosiltransíerasas, manosiltransferasas y similares. El uso de este planteamiento permite la adición directa de azúcares modificados sobre péptidos que carecen de cualquier carbohidrato, o de manera alternativa, sobre glicopéptidos existentes. En ambos casos, la adición del azúcar modificado se presenta en posiciones específicas en la estructura de péptido como se define por la especificidad del sustrato de la glicosiltransferasa y no de una manera aleatoria como se presenta durante la modificación de la estructura de péptido de una proteína usando métodos químicos. Se puede introducir un arreglo de agentes en proteínas o glicopéptidos que carece de la secuencia peptídico del sustrato de glicosiltransferasa al manejar la secuencia apropiada de aminoácidos en la cadena de polipéptido. En cada una de las modalidades de ejemplo expuestas anteriormente, se pueden utilizar uno o más pasos de modificación química o enzimática adicionales después de la conjugación del azúcar modificado al péptido. En una modalidad de ejemplo, se usa una enzima (por ejemplo, fucosiltransferasa) para anexar una unidad de glicosilo (por ejemplo, fucosa) en el azúcar terminal modificado unido al péptido. En otro ejemplo, se utiliza una reacción enzimática para "coronar" sitios a los cuales falló en conjugarse el azúcar modificado. De manera alternativa, se utiliza una reacción química para alterar la estructura del azúcar modificado conjugado. Por ejemplo, el azúcar modificado conjugado se hace reaccionar con agentes que estabilizan o desestabilizan su enlace con el componente de péptido al cual se adiciona el azúcar modificado. En otro ejemplo, un componente del azúcar modificado se desprotege después de su conjugación al péptido. Un experto en la técnica apreciará que hay un arreglo de procedimientos enzimáticos y químicos que es útil en los métodos de la invención en una etapa después de que el azúcar modificado se conjuga al péptido. La elaboración adicional del conjugado de azúcar-péptido modificado está dentro del alcance de la invención. Las enzimas y condiciones de reacción para preparar los conjugados de la presente invención se analizan en detalle en la solicitud de origen de la presente solicitud así como en solicitudes de patente PCT publicadas co-poseídas WO 03/031464, WO 04/033651, WO 04/099231. En una modalidad seleccionada, un péptido de Factor Vil/Factor Vlla, expresado en células de insecto, se remodela tal que los glicanos en el glicopéptido remodelado incluyen un residuo de glicosilo de GlcNAc-Gal. La adición de GleNAc y Gal puede presentarse como reacciones separadas o como una reacción individual en un recipiente individual. En este ejemplo, se usan GlcNAc-transferasa I y Gal-transferasa I. La porción de sialilo modificada se adiciona usando ST3Gal-III. En otra modalidad, la adición de GleNAc, Gal y Sia modificado también puede presentarse en un recipiente de reacción individual, usando las enzimas expuestas anteriormente. Cada uno de los pasos de remodelado enzimático y glicoPEGilación se llevan a cabo de forma individual . Cuando el péptido se expresa en células de mamífero, son de uso diferentes métodos. En una modalidad, el péptido se conjuga sin la necesidad de remodelar antes de la conjugación al poner en contacto el péptido con una sialiltransferasa que transfiere el ácido siálico modificado directamente sobre un ácido siálico en le péptido que forma Sia-Sia-L-R1, o intercambio de ácido siálico en el péptido para el ácido siálico modificado, formando Sia-Sia-L-R1. Una enzima de ejemplo de uso en este método es CST-II. Otras enzimas que adicionan ácido siálico a ácido siálico se conocen por aquéllos expertos en la técnica y los ejemplos de estas enzimas se exponen en las figuras anexas a la presente. En aún otro método para preparar los conjugados de la invención, el péptido expresado en un sistema de mamífero se desialila usando una sialidasa. El residuo de Gal expuesto se sialila con un ácido siálico modificado usando una sialiltransferasa específica para glicanos O-enlazados, proporcionando un péptido de Factor Vil/Factor Vlla con un glicano modificado O-enlazado. El péptido de Factor Vil/Factor Vlla modificado desialilado opcionalmente se re-sialila de forma parcial o completa al usar una sialiltransferasa tal como ST3GalIII. En otro aspecto, la invención portador un método para elaborar un conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla PEGilado de la invención. El método incluye: (a) poner en contacto un péptido de Factor Vil/Factor Vlla que comprende un grupo glicosilo seleccionado de: GalNAc con un donante de PEG-ácido siálico que tiene la fórmula que es un miembro seleccionado de y una enzima que transfiere PEG-ácido siálico desde el donante sobre un miembro seleccionado del GalNAc, Gal y el Sia del grupo glicosilo, bajo condiciones apropiadas para la transferencia. Un donante de ácido siálico modificado de ejemplo es CMP-ácido siálico modificado, a través de una porción ligadora, con un polímero, por ejemplo, porción de poli (etilenglicol) recta o ramificada. Como se analiza en la presente, el péptido se glicosila de forma opcional con GalNAc y/o Gal y/o Sia ("remodela") antes de la unión al azúcar modificado. Los pasos de remodelado pueden presentarse en secuencia en el mismo recipiente sin purificación del péptido glicosilado entre los pasos. De manera alternativa, después de uno o más pasos de remodelación, el péptido glicosilado se puede purificar antes de someterlo al siguiente paso de glicosilación o glicoPEGilación. En una modalidad de ejemplo, el método comprende además expresar el péptido en un hospedador. En una modalidad de ejemplo, el hospedador es una célula de mamífero o una célula de insecto. En otra modalidad de ejemplo, la célula de mamífero es un miembro seleccionado de una célula BHK y una célula CHO y la célula de insecto es una célula de Spodoptera frugiperda . Como se ilustra en los ejemplos y analiza adicionalmente más adelante, la colocación de una porción aceptora para un PEG-azúcar se logra en cualquier número deseado de pasos. Por ejemplo, en una modalidad, la adición de GalNAc al péptido se puede seguir por un segundo paso en el cual el PEG-azúcar se conjuga al GalNAc en el mismo recipiente de reacción. De manera alternativa, se pueden llevar a cabo estos dos pasos en un recipiente individual de una manera aproximadamente simultánea. En una modalidad de ejemplo, el donante de PEG-ácido siálico tiene la fórmula: En otra modalidad de ejemplo, el donante de PEG-ácido siálico tiene la fórmula: En una modalidad de ejemplo adicional, el péptido de Factor Vil/Factor Vlla se expresa en un sistema apropiado de expresión antes de que se glicopegile o remodele . Los sistemas de expresión de ejemplo incluyen Sf-9/baculovirus y células de ovario de hámster chino (CHO) . En una modalidad de ejemplo, la invención proporciona un método para elaborar un conjugado de péptido de Factor VII/Factor Vlla que comprende un ligador de glicosilo que comprende un residuo de sialilo modificado que tiene la fórmula: en donde D es un miembro seleccionado de-OH y R1-L-HN-; G es un miembro seleccionado de Rx-L- y -C(0) (C?-C6) alquilo-R1; R1 es una porción que comprende un miembro seleccionado de un residuo de poli (etilenglicol) de cadena recta y un residuo de poli (etilenglicol) ramificado; M es un miembro seleccionado de H, un metal y una carga negativa individual; L es un ligador que es un miembro seleccionado de un enlace, alquilo sustituido o insustituido y heteroalquilo sustituido o insustituido, tal que cuando D es OH, G es R1-L-, y cuando G es -C (O) (C?-C6) alquilo, D es RX-L-NH- El método que comprende: (a) poner en contacto un péptido de Factor Vil/Factor Vlla que comprende la porción de glicosilo : Gal ? Con una porción donantea de PEG-ácido siálico que tiene la fórmula : Y una enzima que transfiere el PEG-ácido siálico en el Gal de la porción de glicosilo, bajo condiciones apropiadas para la transferencia. En una modalidad de ejemplo, L-R1 tiene la fórmula : En donde a es un número entero seleccionado de 0 a 20 En otra modalidad de ejemplo, R tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: to NH ?,to°to°tof; -cOto-Q C H3 : en donde e, f, m y n son números enteros independientemente seleccionados de 1 a 2500; y q es un número entero seleccionado de 0 a 20. Las cantidades a gran escala o pequeña escala del conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla se pueden producir por los métodos descritos en la presente. En una modalidad de ejemplo, la cantidad de péptido de Factor VlI/VIIa es un miembro seleccionado de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 100 kg. En una modalidad de ejemplo, la cantidad de péptido de Factor VlI/VIIa es un miembro seleccionado de aproximadamente 0.1 kg a aproximadamente 1 kg. En una modalidad de ejemplo, la cantidad de péptido de Factor VlI/VIIa es un miembro seleccionado de aproximadamente 0.5 kg a aproximadamente 10 kg. En una modalidad de ejemplo, la cantidad de péptido de Factor Vll/Vlla es un miembro seleccionado de aproximadamente 0.5 kg a aproximadamente 3 kg. En una modalidad de ejemplo, la cantidad de péptido de Factor Vll/VIIa es un miembro seleccionado de aproximadamente 0.1 kg a aproximadamente 5 kg. En una modalidad de ejemplo, la cantidad de péptido de Factor VlI/VIIa es un miembro seleccionado de aproximadamente 0.08 kg a aproximadamente 0.2 kg. En una modalidad de ejemplo, la cantidad de péptido de Factor VlI/VIIa es un miembro seleccionado de aproximadamente 0.05 kg a aproximadamente 0.4 kg. En una modalidad de ejemplo, la cantidad de péptido de Factor VlI/VIIa es un miembro seleccionado de aproximadamente 0.1 kg a aproximadamente 0.7 kg. En una modalidad de ejemplo, la cantidad de péptido de Factor VlI/VIIa es un miembro seleccionado de aproximadamente 0.03 kg a aproximadamente 1.75 kg. En una modalidad de ejemplo, la cantidad de péptido de Factor VlI/VIIa es un miembro seleccionado de aproximadamente 25 kg a aproximadamente 65 kg. La concentración del péptido de Factor Vil/Factor Vlla utilizado en las reacciones descritas en la presente es un miembro seleccionado de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 10 mg de péptido de Factor Vil/Factor VIIa/mL de mezcla de reacción. En una modalidad de ejemplo, la concentración de péptido del Factor Vil/Factor Vlla es un miembro seleccionado de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 1 mg de péptido de Factor Vil/Factor VIIa/mL de mezcla de reacción. En una modalidad de ejemplo, la concentración de péptido del Factor Vil/Factor Vlla es un miembro seleccionado de aproximadamente 0.8 a aproximadamente 3 mg de péptido de Factor Vil/Factor VIIa/mL de mezcla de reacción. En una modalidad de ejemplo, la concentración de péptido del Factor Vil/Factor Vlla es un miembro seleccionado de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 mg de péptido de Factor Vil/Factor VIIa/mL de mezcla de reacción. En una modalidad de ejemplo, la concentración de péptido del Factor Vil/Factor Vlla es un miembro seleccionado de aproximadamente 4 a aproximadamente 9 mg de péptido de Factor Vil/Factor VIIa/mL de mezcla de reacción. En una modalidad de ejemplo, la concentración de péptido del Factor Vil/Factor Vlla es un miembro seleccionado de aproximadamente 1.2 a aproximadamente 7.8 mg de péptido de Factor Vil/Factor VIIa/mL de mezcla de reacción. En una modalidad de ejemplo, la concentración de péptido del Factor Vil/Factor Vlla es un miembro seleccionado de aproximadamente 6 a aproximadamente 9.5 mg de péptido de Factor Vil/Factor VIIa/mL de mezcla de reacción. La concentración de CMP-SA-PEG que se puede utilizar en las reacciones descritas en la presente es un miembro seleccionado de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1.0 mM. Los factores que pueden incrementar o disminuir la concentración incluyen el tamaño del PEG, tiempo de incubación, temperatura, componentes amortiguadores, así como el tipo, y concentración, de glicosiltransferasa usada. En una modalidad de ejemplo, la concentración de CMP-SA-PEG es un miembro seleccionado de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1.0 mM . En una modalidad de ejemplo, la concentración de CMP-SA-PEG es un miembro seleccionado de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.5 mM. En una modalidad de ejemplo, la concentración de CMP-SA-PEG es un miembro seleccionado de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.3 m . En una modalidad de ejemplo, la concentración de CMP-SA-PEG es un miembro seleccionado de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.7 mM. En una modalidad de ejemplo, la concentración de CMP-SA-PEG es un miembro seleccionado de aproximadamente 0.3 a aproximadamente 0.5 mM. En una modalidad de ejemplo, la concentración de CMP-SA-PEG es un miembro seleccionado de aproximadamente 0.4 a aproximadamente 1.0 mM. En una modalidad de ejemplo, la concentración de CMP-SA-PEG es un miembro seleccionado de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 0.7 mM. En una modalidad de ejemplo, la concentración de CMP-SA-PEG es un miembro seleccionado de aproximadamente 0.8 a aproximadamente 0.95 mM. En una modalidad de ejemplo, la concentración de CMP-SA-PEG es un miembro seleccionado de aproximadamente 0.55 a aproximadamente 1.0 mM. Los equivalentes molares de CMP-SA-PEG que se pueden utilizar en las reacciones descritas en la presente se basan en el número teórico de SA-PEG que se puede adicionar a la proteína de Factor Vil/Factor Vlla. El número teórico de SA-PEG se basa en el número teórico de sitios de sialación en la proteína de Factor Vil/Factor Vlla así como en el MW de la proteína de Factor Vil/Factor Vlla cuando se compara al MW y por lo tanto los moles de CMP-SA-PEG. Para Factor Vil/Factor Vlla, que es aproximadamente cuatro o cinco PEG en base a los N-glicanos que son principalmente bi- y tri-antenarios con solo dos sitios de glicano. En una modalidad de ejemplo, los equivalentes molares de CMP-SA-PEG es un número entero seleccionado de 1 a 20. En una modalidad de ejemplo, los equivalentes molares de CMP-SA-PEG es un número entero seleccionado de 1 a 20. En una modalidad de ejemplo, los equivalentes molares de CMP-SA-PEG es un número entero seleccionado de 2 a 6. En una modalidad de ejemplo, los equivalentes molares de CMP-SA-PEG es un número entero seleccionado de 3 a 17. En una modalidad de ejemplo, los equivalentes molares de CMP-SA-PEG es un número entero seleccionado de 4 a 11. En una modalidad de ejemplo, los equivalentes molares de CMP-SA-PEG es un número entero seleccionado de 5 a 20. En una modalidad de ejemplo, los equivalentes molares de CMP-SA-PEG es un número entero seleccionado de 1 a 10. En una modalidad de ejemplo, los equivalentes molares de CMP-SA-PEG es un número entero seleccionado de 12 a 20. En una modalidad de ejemplo, los equivalentes molares de CMP-SA-PEG es un número entero seleccionado de 14 a 17. En una modalidad de ejemplo, los equivalentes molares de CMP-SA-PEG es un número entero seleccionado de 7 a 15. En una modalidad de ejemplo, los equivalentes molares de CMP-SA-PEG es un número entero seleccionado de 8 a 16.

III. B. Desialilación Simultánea y GlicoPEGilación de Factor Vil/Factor Vlla La presente invención proporciona un método "en marmita" para glicopegilar el Factor Vil/Factor Vlla. El método en marmita es distinto de otros procesos de ejemplo para hacer un conjugado de péptido del Factor Vil/Factor Vlla, que emplea una des-sialilación secuencial con sialidasa, purificación subsiguiente del asialo-Factor Vil/Factor Vlla en una columna de intercambio aniónico, entonces glicoPEGilación usando CPM-ácido siálico- PEG y una glicosiltransferasa (tal como ST3Gal3) , exoglicosidasa o una endoglicosidasa. El conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla entonces se purifica mediante intercambio aniónico seguido por cromatografía de exclusión de tamaño para producir el conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla purificado. El método en marmita es un método mejorado para elaborar un conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla. En este método, las reacciones de des-sialilación y glicoPEGilación se combinan en una reacción en marmita que evita el primer paso de cromatografía de intercambio aniónico usado en el proceso descrito anteriormente para purificar el péptido de asíalo Factor Vil/Factor Vlla. Esta reducción en los pasos de proceso produce varias ventajas. Primero, el número de paso de procesos requeridos para producir el conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla se reduce, y también reduce la complejidad de operación del proceso. Segundo, el tiempo de proceso para la producción de los conjugados de péptido se reduce a por ejemplo de 4 a 2 días. Esto reduce los requerimientos de materias primas y los costos de control de calidad asociados con los controles en proceso. Tercero, la invención utiliza menos sialidasa, por ejemplo, hasta 20 veces menos sialidasa, por ejemplo, se requieren 500 mU/L para producir el conjugado de péptido del Factor Vil/Factor Vlla con relación al proceso. Esta reducción en el uso de sialidasa reduce de manera significativa la cantidad de contaminantes, tal como sialidasa, en la mezcla de reacción. En una modalidad de ejemplo, se preparar un conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla por el siguiente método. En un primer paso, se combina un péptido de Factor Vil/Factor Vlla con una sialidasa, un azúcar modificado de la invención, y una enzima capaz de catalizar la transferencia del grupo de enlace de glicosilo desde el azúcar modificado al péptido, preparando de esta manera el conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla. Se puede usar cualquier sialidasa en este método. Las sialidasas de ejemplo de uso en la invención se pueden encontrar en la base de datos CAZY (ver http : / /afmb . cnrs-mrs . fr/CAZY/index.html y www.cazy.org/CAZY) . Las sialidasas de ejemplo se pueden comprar de cualquier número de fuentes (QA-Bio, Calbiochem, Marukin, Prozyme, etc.). En una modalidad de ejemplo, la sialidasa es un miembro seleccionado de sialidasas citoplásmicas, sialidadas lisosomales, exo-a-sialidasas, y endosialidasas . En otra modalidad de ejemplo, las sialidadas usadas se producen de bacterias tal como Clostridium perfringens o Streptococcus pneumoniae, o de un virus tal como un adenovirus. En una modalidad de ejemplo, la enzima capaz de catalizar la transferencia del grupo de enlace de glicosilo desde el azúcar modificado al péptido es un miembro seleccionado de una glicosiltransferasa, tal como sialiltransferasas y fucosiltransferasas, así como exoglicosidadas y endoglicosidasas . En una modalidad de ejemplo, la enzima es una glicosiltransferasa, que es ST3Gal3. En otra modalidad de ejemplo, la enzima usada se produce de bacterias tal como Escherichia Coli o un hongo tal como Aspergill us niger. En otra modalidad de ejemplo, la sialidasa se adiciona al péptido del Factor Vil/Factor Vlla antes de la glicosiltransferasa durante un tiempo especificado, dejando que la reacción de sialidasa prosiga antes del inicio de la reacción de glicoPEGilación con la adición del reactivo de PEG-ácido siálico y la glicosiltransferasa. Se analizan en la presente muchos de estos ejemplos. Finalmente, se puede utilizar en esta reacción cualquier azúcar modificado descrito en la presente. En otra modalidad de ejemplo, el método comprende además un paso de "coronación" . En este paso, se adiciona ácido siálico no PEGilado adicional a la mezcla de reacción. En una modalidad de ejemplo, este ácido siálico se adiciona al péptido o conjugado de péptido del Factor Vil/Factor Vlla, previniendo de esta manera la adición adicional de PEG-ácido siálico. En otra modalidad de ejemplo, este ácido siálico impide la función de la glicosiltransferasa de la mezcla de reacción, deteniendo de forma efectiva la adición de grupos de enlace de glicosilo a los péptidos o conjugados de péptido de Factor Vil/Factor Vlla. De manera más importante, el ácido siálico que se adiciona a la mezcla de reacción corona los glicanos no glicoPEGilados, proporcionando de este modo un conjugado de péptido del Factor Vil/Factor Vlla que tiene farmacocinética mejorada. Además, esta sialidasa se puede adicionar directamente a la mezcla de reacción de glicoPEGilación cuando se desea el grado de PEGilación a ciertas cantidades sin purificación anterior. En una modalidad de ejemplo, después del paso de coronación, menos de aproximadamente 50 % de los sitios de sialilación en el péptido o conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla no comprenden una porción de sialilo. En una modalidad de ejemplo, después del paso de coronación, menos de aproximadamente 40 % de los sitios de sialilación en el péptido o conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla no comprenden una porción de sialilo. En una modalidad de ejemplo, después del paso de coronación, menos de aproximadamente 30 % de los sitios de sialilación en el péptido o conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla no comprenden una porción de sialilo. En una modalidad de ejemplo, después del paso de coronación, menos de aproximadamente 20 % de los sitios de sialilación en el péptido o conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla no comprenden una porción de sialilo. En una modalidad de ejemplo, después del paso de coronación, menos de aproximadamente 10 % de los sitios de sialilación en el péptido o conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla no comprenden una porción de sialilo. En una modalidad de ejemplo, entre aproximadamente 20 % y aproximadamente 5 % de los sitios de sialilación en el péptido o conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla no comprenden una porción de sialilo. En una modalidad de ejemplo, entre aproximadamente 25 % y aproximadamentelO % de los sitios de sialilación en el péptido o conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla no comprenden una porción de sialilo. En una modalidad de ejemplo, después del paso de coronación, esencialmente todos los sitios de sialilación en el péptido o conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla comprenden una porción de sialilo.

III. C. Desialilación y Modificación Selectiva de Péptidos de Factor Vil/Factor Vlla En otra modalidad de ejemplo, la presente invención proporciona un método para desialilar un péptido de Factor Vil/Factor Vlla. El método proporciona de manera preferente un péptido de Factor Vil/Factor Vlla que es al menos aproximadamente 40 %, de manera preferente 45 %, de manera preferente cerca de 50 %, de manera preferente cerca de 55 %, de manera preferente aproximadamente 60 %, de manera preferente aproximadamente 65 %, de manear preferente cerca de 70 %, de manera preferente aproximadamente 75 %, de manera preferente aproximadamente 80 %, de manera preferente al menos 85 %, de manera más preferente al menos 90 %, de manera aún más preferente, al menos 92 %, de manera preferente al menos 94 %, de manera aún más preferente al menos 96 %, de manera aún más preferente al menos 98 %, y de manera aún más preferente 100 % disialilado. El método incluye poner en contacto el Factor Vil/Factor Vlla con una sialidasa, de manera preferente durante un periodo de tiempo. El periodo de tiempo preseleccionado es suficiente para desialilar el péptido de Factor Vil/Factor Vlla al grado deseado. En una modalidad preferida, el péptido de Factor Vil/Factor Vlla desialilado se separa de la sialidasa cuando se logra el grado deseado de desialilación. Una reacción de desialilación de ejemplo y ciclo de purificación se expone en la presente. Aquellos expertos en la técnica son capaces de determinar un periodo de tiempo preseleccionado apropiado durante el cual llevar a cabo la reacción de desialilación. En una modalidad de ejemplo, el periodo es menos de 24 horas, de manera preferente menos de 8 horas, de manera más preferente menos de 6 horas, de manera más preferente menos de 4 horas, de manera aún más preferente menos de 2 horas y de manera aún más preferente menos de 1 hora. En otra modalidad de ejemplo, en la preparación del Factor Vil/Factor Vlla al final de la reacción de desialilación, al menos 10 % de los miembros de la población de péptidos del Factor Vil/Factor Vlla tiene sólo un ácido siálico individual unido a este, de manera preferente al menos 20 %, de manera más preferente al menos 30 %, de manera aún más preferente al menos 40 %, de manera aún más preferente al menos 50 % y de manera más preferente al menos 60 %, y de manera aún más preferente esta completamente desialilado. En aún una modalidad adicional de ejemplo, en la preparación del Factor Vil/Factor Vlla al final de la reacción de desialilación, al menos 10 % de los miembros de la población de péptidos del Factor Vil/Factor Vlla se desialila completamente, de manera preferente al menos 20 %, de manera más preferente al menos 30 %, de manera aún más preferente al menos 40 %, de manera aún más preferente al menos 50 % y de manera aún más preferente al menos 60 %. En aún otra modalidad de ejemplo, en la preparación del Factor Vil/Factor Vlla al final de la reacción de desialilación, al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % ó 60 % de los miembros de la población de péptidos del Factor Vil/Factor Vlla tienen solo un ácido siálico individual, y al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % ó 60 % del péptido del Factor Vil/Factor Vlla esta completamente desialilado. En una modalidad preferid, en la preparación del Factor Vil/Factor Vlla al final de la reacción de desialilación, al menos 50 % de la población de péptidos de Factor Vil/Factor Vlla esta completamente desialilada y al menos 40 % de los miembros de la población de péptidos del Factor Vil/Factor Vlla tiene solo una porción de ácido siálico individual. Después de la desialilación, el péptido de Factor Vil/Factor Vlla se conjuga opcionalmente con un azúcar modificado. Un azúcar modificado de ejemplo incluye una porción de sacarilo unida a una porción de poli (etilenglicol) lineal o ramificada. La conjugación se cataliza por una enzima que transfiere el azúcar modificado desde un donante de azúcar modificado sobre un residuo de aminoácido o glicosilo del péptido de Factor Vil/Factor Vlla. Un donante de azúcar modificado de ejemplo es un CMP-ácido siálico que tiene una porción de poli (etilenglicol) lineal 'o ramificado. Una porción de poli (etilenglicol) de ejemplo tiene un peso molecular de al menos aproximadamente 2 KDA, de manera más preferente al menos aproximadamente 5 KDA, de manera más preferente al menos aproximadamente 10 KDA, de manera preferente al menos aproximadamente 20 KDA, de manera más preferente al menos aproximadamente 30 KDA, y de manera más preferente al menos aproximadamente 40 KDA. En una modalidad de ejemplo, la enzima utilizada para transferir la porción de azúcar modificado desde el donante de azúcar modificado es una glicosiltransferasa, por ejemplo, sialiltransferasa. Una sialiltransferasa de ejemplo de uso del os métodos de la invención es ST3Gal3. Un método de ejemplo de la invención da por resultado un péptido de Factor Vil/Factor Vlla modificado que tiene al menos uno, de manera preferente al menos dos, de manera preferente al menos tres grupos modificadores. En una modalidad, el péptido del Factor Vil/Factor Vlla producido tiene un grupo modificador único en la cadena ligera del péptido del Factor Vil/Factor Vlla. En otra modalidad, el método proporciona un péptido de Factor Vil/Factor Vlla modificado que tiene un grupo modificador único en la cadena pesada. En aún otra modalidad, el método proporciona un método del Factor Vil/Factor Vlla modificado con un grupo modificador único en la cadena ligera y un grupo modificador único en la cadena pesada. En otro aspecto, la invención proporciona un método para preparar un péptido de Factor Vil/Factor Vlla modificado. El método incluye poner en contacto el péptido del Factor Vil/Factor Vlla con un donante de azúcar modificado que tiene un grupo modificador y una enzima capaz de transferir una porción de azúcar modificado desde el donante de azúcar modificado sobre un residuo de aminoácido o glicosilo de péptido. En una modalidad de ejemplo, el método proporciona una población de péptidos de Factor Vil/Factor Vlla modificados en la cual al menos 40 %, de manera preferente al menos 50 %, de manera preferente al menos 60 %, de manera más preferente al menos 70 % y de manera aún más preferente al menos 80 % de la población de miembros están mono-conjugados en la cadena ligera del péptido de Factor Vil/Factor Vlla. En una modalidad de ejemplo, el método proporciona una población de péptidos de Factor Vil/Factor Vlla modificados en los cuales al menos 40 %, de manera preferente al menos 50 %, de manera preferente al menos 60 %, de manera más preferente al menos 70 % y de manera aún más preferente al menos 80 % de los miembros de la población están di-conjugados en la cadena ligera del péptido de Factor Vil/Factor Vlla. En una modalidad de ejemplo de este aspecto, el método proporciona una población de péptidos del Factor Vil/Factor Vlla modificados en los cuales no más de 50 %, de manera preferente no más de 30 %, de manera preferente no más de 20 %, de manera más preferente no más de 10 % de los miembros de la población están mono-conjugados en la cadena pesada del péptido de Factor Vil/Factor Vlla. En una modalidad de ejemplo de este aspecto, el método proporciona una población de péptidos del Factor Vil/Factor Vlla modificados en los cuales no más de 50 %, de manera preferente no más de 30 %, de manera preferente no más de 20 %, de manera preferente no más de 10 % de los miembros de la población están di-conjugados en la cadena pesada del péptido del Factor Vil/Factor Vlla. El péptido del Factor Vil/Factor Vlla se pude someter a la acción de una sialidasa antes del paso de puesta en contacto, o el péptido se puede usar sin desialilación anterior. Cuando el péptido se pone en contacto con una sialidasa se puede desialilar de forma esencialmente completa o solo se desialila parcialmente. En una modalidad de ejemplo, el péptido de Factor Vil/Factor Vlla se desialila al menos parcialmente antes del paso de puesta en contacto. El péptido del Factor Vil/Factor Vlla se puede desialilar de manera esencialmente completa (esencialmente asíalo) o solo se desialila parcialmente. En una modalidad preferida, el péptido del Factor Vil/Factor Vlla desialilado es una de las modalidades desialiladas descritas anteriormente en la presente .

III. D. Alicuotas Adicionales de Reactivos Adicionados en la Síntesis de Conjugados de Péptido de Factor Vil/Factor Vlla En una modalidad de ejemplo de la síntesis de los conjugados de péptido descritos en la presente, se adicionan una o más alícuotas adicionales de un componente/reactivo de reacción a la mezcla de reacción después de un periodo seleccionado de tiempo. En una modalidad de ejemplo, el conjugado de péptido es un conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla. En otra modalidad de ejemplo, el componente/reactivo de reacción adicionado es un nucleótido de azúcar modificado. La introducción de un nucleótido de azúcar modificado en la reacción incrementará la probabilidad de activar la reacción de glicoPEGilación al término. En una modalidad de ejemplo, el azúcar de nucleótido es un CMP-SA-PEG descrito en la presente. En una modalidad de ejemplo, el componente/reactivo de reacción adicionado es una sialidasa. En una modalidad de ejemplo, el componente/reactivo de reacción adicionado es una glicosiltransferasa. En una modalidad de ejemplo, el componente/reactivo de reacción adicionado es magnesio. En una modalidad de ejemplo, la alícuota adicional adicionada representa aproximadamente 10 %, o 20 %, o 30 %, o 40 %, o 50 %, o 60 %, o 70 %, o 80 % o 90 % de la cantidad original adicionada al inicio de la reacción. En una modalidad de ejemplo, el componente/reactivo de reacción se adiciona a la reacción aproximadamente 3 horas, o 6 horas, u 8 horas, o 10 horas, 12 horas, o 18 horas, o 30 horas, o 36 horas después de su inicio.

III. E. Producción Selectiva de Conjugados de Péptido de Factor Vil/Factor Vlla PEGilados de Cadena Ligera En una modalidad de ejemplo, la invención proporciona un método para incrementar la producción de conjugados de péptido de Factor Vlla que se modifican en la cadena ligera con respecto a la cadena pesada. Este método comprende la inactivación o secuestro de la cadena pesada, permitiendo de esta manera que la GlicoPEGilación se presente de forma preferencial en la cadena ligera. La actividad de serina-proteasa de la cadena pesada del Factor Vlla se puede aprovechar como la base para este secuestro. La adición de una matriz de benzamidina y/o la resina de pseudoafinidad para serina-proteasas a una mezcla de reacción de GlicoPEGilación da por resultado el secuestro de l cadena pesada, en tanto que prosigue la GlicoPEGilación en la cadena ligera. La cadena ligera entonces se puede purificar de la cadena pesada por técnicas normales conocidas. La cadena pesada se puede remover de la matriz por la adición de benzamidina o remover la resina al disminuir el pH de la solución. Las impurezas de benzamidina introducidas en este paso se pueden remover por diafiltración. III. E. Purificación de Conjugados de Péptido de Factor Vil/Factor Vlla Los productos producidos por los procesos anteriores se pueden usar sin purificación. Sin embargo, usualmente se prefiere recuperar el producto y uno o más de los compuestos intermedios, por ejemplo, azúcares de nucleótido, especies de PEG lineales o ramificadas, azúcares modificados y azúcares de nucleótido modificados. Se pueden usar técnicas normales bien conocidas para la recuperación de péptidos glicosilados tal como cromatografía de capa gruesa o delgada, cromatografía en columna, cromatografía en intercambio iónico, configuración de membrana. Se prefiere usar filtración de membrana, de manera más preferente utilizando una membrana osmótica inversa, o una o más técnicas cromatográficas en columna para la recuperación como se analiza más adelante en la presente y en la literatura citada en la presente. Por ejemplo, se puede usar filtración de membrana en donde las membranas tienen un corte de peso molecular de aproximadamente 3000 a aproximadamente 10,000, para remover las proteínas tal como glicosil-transferasa. En ciertos casos, las diferencias en el corte de peso molecular entre la impureza y el producto se utilizarán a fin de asegurar purificación de producto.

Por ejemplo, a fin de purificar el producto Factor VIIa-SA-PEG-40KDa del CMP-SA-PEG-4OKDa sin reaccionar, se debe elegir un filtro que permitirá, por ejemplo, que el Factor VIIa-SA-PEG-40KDa permanezca en el producto retenido en tanto que permitirá que el CMP-SA-PEG-4OKDa fluya en el producto filtrado. La nanofiltración u osmosis inversa entonces se puede usar para remover las sales y/o purificar los sacáridos de producto (ver, por ejemplo, WO 98/15581) . Las membranas de nanofiltro son una clase de membranas de osmosis inversa que pasa sales monovalentes pero retiene sales polivalentes y solutos no cargados mayores de aproximadamente 100 a aproximadamente 2,000 Daltones, dependiendo de la membrana usada. De esta manera, en una aplicación típica, se retendrán los sacáridos preparados por los métodos de la invención, en la membrana y las sales contaminantes pasarán. Si el péptido se produce de forma intracelular, como un primer paso, los desechos en partículas, ya sea células hospedadores o fragmentos lisados, se remueven. Después de la glicoPEGilación, el péptido PEGilado se purifica por métodos reconocidos en la técnica, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración; opcionalmente, la proteína se puede concentrar con un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, seguido por separación de la variante de polipéptido de las otras impurezas por uno o más pasos seleccionados de cromatografía de inmunoafinidad, fraccionamiento por columna de intercambio iónico (por ejemplo, en dietilaminoetilo (DEAE) o matrices que contienen grupos carboximetilo o sulfopropilo) , cromatografía en Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, lentil lectin-Sepharose, WGA-Sepharose, Con A-Sepharose, Ether Toyopearl, Butyl Toyopearl, Phenyl Toyopearl, o proteína A Sepharose, la cromatografía por SDS-PAGE, cromatografía en sílice, cromatoenfoque, HPLC de fase inversa (por ejemplo, gel de sílice con grupos alifáticos anexos) , filtración en gel usando, por ejemplo, tamiz molecular Sephadex o cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía en columnas que unen selectivamente el polipéptido, y precipitación por etanol o sulfato de amonio. Se puede usar purificación para separar una cadena del conjugado de péptido del Factor VII/Factor Vlla del otro, como se describe más adelante en esta sección. Los glicopéptidos modificados producidos en cultivo se aislan usualmente por extracción inicial de células, enzimas, etc., seguido por uno o más pasos de concentración, salación, intercambio iónico acuoso, o cromatografía de exclusión de tamaño. Adicionalmente, la glicoproteína modificada se puede purificar por cromatografía de afinidad. Finalmente, se puede emplear HPLC para pasos finales de purificación. Se puede incluir un inhibidor de proteasa en cualquiera de los pasos anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos o conservadores para impedir el crecimiento de contaminantes externos. Los inhibidores de proteasa usados en los pasos anteriores pueden ser inhibidores de bajo peso molecular, incluyendo antipaina, alfa-1-antitripsina, anti-trombina, leupeptina, amastatina, quimostatina, banzamidina, así como otros inhibidores de serina-proteasa (es decir, serpinas) . En general, se deben usar inhibidores de serina-proteasa en concentraciones que varían desde 0.5 - 100 µM, aunque se puede usar quimostatina en cultivo celular en concentraciones de hasta 200 µM. Otros inhibidores de serina-proteasa incluirán inhibidores específicos al tipo de quimiotripsina, al tipo de subtilisina, la alfa/beta-hidrolasa, o el grupo de peptidasa de señal de serina-proteasas . Además de las serinas, también se pueden usar otros tipos de inhibidores de proteasa, incluyendo inhibidores de sisteina-proteasa (1 - 10 µM) e inhibidores de proteasa aspártica (1 - 5 µM) así como inhibidores de proteasa no específicos tal como pepstatina (1 - 5 µM) . Los inhibidores de proteasa usados en esta invención también pueden incluir inhibidores de proteasa naturales, tal como de inhibidor de hirustasin aislado de sanguijuela. En algunas modalidades, los inhibidores de proteasa comprenderán péptidos o anticuerpos sintéticos que son capaces de unirse con especificidad al sitio catalítico de proteasa para estabilizar el Factor Vil/Factor Vlla sin interferir con una reacción de glicoPEGilación. Dentro de otra modalidad, se concentran primero sobrenadantes de sistemas que producen el glicopéptido modificado de la invención usando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de filtración Amicon o Millipore Pellicon. Después del paso de concentración, el concentrado se aplica a una matriz de purificación adecuada. Por ejemplo, una matriz de afinidad adecuada puede comprender un ligando para el péptido, una molécula de lectina o anticuerpo unida a un soporte adecuado. De manera alternativa, se puede emplear una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos DEAE colgantes. Las matrices adecuadas incluyen acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa, u otros tipos comúnmente empleados en purificación de proteínas. De manera alternativa, se puede emplear un paso de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupo sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren de forma particular los grupos sulfopropilo. Otros métodos de uso en la purificación incluyen cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) , cromatografía con hidroxiapatita, cromatografía con intaracción hidrófoba y cromatografía en Blue Sepharose. Estos y otros métodos útiles se ilustran en la Patente Provisional co-asignada de los Estados Unidos No. (Documento de Abogado No. 40853-01-5168-PI, presentada el 6 de Mayo de 2005) . Se pueden emplear, para purificar adicionalmente una composición de conjugado de polipéptido uno o más pasos de RP-HPLC que emplean medios de RP-HPLC (por sus siglas en Inglés) hidrófobos, por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos metilo colgantes u otros grupos alifáticos. Algunos o todos los pasos de purificación anteriores, en varias combinaciones, se pueden emplear para proporcionar una glicoproteína homogénea o esencialmente homogénea, modificada. El glicopéptido modificado de la invención que resulta de una fermentación a gran escala se puede purificar por métodos análogos a aquéllos descritos por Urdal et al., J. Chromatog. 296: 171 (1984). Esta referencia describe dos pasos secuenciales de RP-HPLC para purificación de IL-2 recombinante en una columna de HPLC preparativa. De manera alternativa, las técnicas tal como cromatografía de afinidad se pueden utilizar para purificar la glicoproteína modificada. En una modalidad de ejemplo, la purificación se logra por los métodos expuestos en la patente provisional de los Estados Unidos, co-asignada, comúnmente poseída, número 60/665,588, presentada el 24 de marzo de 2005. De acuerdo a la presente invención, los péptidos pegilados, por ejemplo, péptido o conjugado de péptido de Factor VII o Factor Vlla producido ya sea mediante desialilación secuencial o sialilación simultánea se pueden purificar o resolver al usar gradiente de cloruro de magnesio. En una modalidad de ejemplo, los conjugados de péptido de Factor Vil/Factor Vlla se pueden separar en una cadena ligera y una cadena pesada, y una cadena se puede purificar de la otra. En otra modalidad de ejemplo, se obtiene un producto en el cual al menos 80 % del conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla en el producto es la porción de cadena ligera del conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla. En otra modalidad de ejemplo, se obtiene un producto en el cual al menos 90 % del conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla en el producto es la porción de cadena ligera del conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla. En otra modalidad de ejemplo, se obtiene un producto en el cual al menos 95 % del conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla en el producto es la porción de cadena ligera del conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla. En otra modalidad de ejemplo, se obtiene un producto en el cual esencialmente todo el conjugado de péptido del Factor Vil/Factor Vlla en el producto es la porción de cadena ligera del conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla. Este producto es posible para cualquier compuesto de la invención. En otra modalidad de ejemplo, se obtiene un producto en el cual al menos 80 % del conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla en el producto es la porción de cadena ligera del conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla. En otra modalidad de ejemplo, se obtiene un producto en el cual al menos 90 % del conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla en el producto es la porción de cadena pesada del conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla. En otra modalidad de ejemplo, se obtiene un producto en el cual al menos 95 % del conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla en el producto es la porción de cadena pesada del conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla. En otra modalidad de ejemplo, se obtiene un producto en el cual esencialmente todo el conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla en el producto es la porción de cadena pesada del conjugado de péptido del Factor Vil/Factor Vlla. Este producto es posible para cualquier compuesto de la invención.

III. F. Propiedades de Conjugados de Factor Vil/Factor Vlla En una modalidad de ejemplo, los conjugados de péptido de Factor Vil/Factor Vlla de la invención poseen esencialmente las mismas propiedades bioquímicas (por ejemplo, coagulación) como un péptido de Factor Vil/Factor Vlla nativo. En una modalidad de ejemplo, los conjugados de péptido de Factor Vil/Factor Vlla de la invención poseen propiedades bioquímicas reducidas o mejoradas (por ejemplo, coagulación) con respecto a un péptido de Factor Vil/Factor Vlla nativo dependiendo del sitio de PEGilación, el tamaño del PEG adicionado y el número de PEG adicionado. Los conjugados de péptido de Factor Vil/Factor Vlla están comprendidos en el proceso de coagulación sanguínea. En una modalidad de ejemplo, los conjugados de péptido de Factor Vil/Factor Vlla retienen aproximadamente 20 %, o aproximadamente 25 %, o aproximadamente 30 %, o aproximadamente 35 %, O aproximadamente 40 %, O aproximadamente 45 %, o aproximadamente 50 %, O aproximadamente 55 %, o aproximadamente 60 %, O aproximadamente 65 o aproximadamente 70 O , o aproximadamente 75 %, o aproximadamente 80 %, o aproximadamente 85 a. o aproximadamente 90 %, o aproximadamente 95 % de la actividad de coagulación del Factor Vil/Factor Vlla nativo. Los conjugados de péptido de Factor Vil/Factor Vlla poseen actividad amidolítica. En una modalidad de ejemplo, los conjugados de péptido de Factor Vil/Factor Vlla retienen aproximadamente 20 %, o aproximadameite 2 5 %, o aproximadamente 30 %, o aproximadamente 35 %, O aproximadamente 40 , o aproximadamente 45 %, O aproximadamente 50 %, o aproximadamente 55 O , o aproximadamente 60 %, o aproximadamente 65 %, o aproximadamente 70 o, O o aproximadamente 75 %, o aproximadamente 80 %, o aproximadamente 85 *o , o aproximadamente 90 %, o aproximadamente 95 % de la actividad amidolítica de Factor Vil/Factor Vlla nativo. Los conjugados de péptido de Factor Vil/Factor Vlla son capaces de convertir Factor X a Factor Xa. En una modalidad de ejemplo, los conjugados de péptido de Factor Vil/Factor Vlla retienen aproximadamente 20 *o / O aproximadamente 25 % o aproximadamente 30 %, o aproximadamente 35 % o aproximadamente 40 %, o aproximadamente 45 % o aproximadamente 50 %, o aproximadamente 55 % o aproximadamente 60 %, o aproximadamente 65 % o aproximadamente 70 %, o aproximadamente 75 % o aproximadamente 80 %, o aproximadamente 85 % o aproximadamente 90 "O , o aproximadamente 95 % de la actividad de conversión de Factor X del Factor Vil/Factor Vlla nativo.

IV. Composiciones Farmacéuticas En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica. La composición farmacéutica incluye un diluyente farmacéuticamente aceptable y un conjugado covalente entre una porción de PEG que no se presenta de forma natural, porción terapéutica o biomolécula y un péptido glicosilado y no glicosilado. El polímero, porción terapéutica o biomolécula se conjuga al péptido mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto interpuesto entre y enlazado covalentemente tanto al péptido como al polímero, porción terapéutica o biomolécula. Las composiciones farmacéuticas de la invención son adecuadas para el uso en una variedad de sistemas de distribución de fármaco. Las formulaciones adecuadas para el uso en la presente invención se encuentran en Remington ' s Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelfia, PA, 17th ed. (1985) . Para una breve revisión de los métodos de la distribución de fármacos, ver, Langer, Science 249: 1527-1533 (1990) . En una modalidad de ejemplo, la formulación farmacéutica comprende un conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla y un diluyente farmacéuticamente aceptable que es un miembro seleccionado de cloruro de sodio, dihidrato de cloruro de calcio, glicilglicina, polisorbato 80, y manitol. En otra modalidad de ejemplo, el diluyente farmacéuticamente aceptable es - cloruro de sodio y glicilglicina. En otra modalidad de ejemplo, el diluyente farmacéuticamente aceptable es dihidrato de cloruro de calcio y polisorbato 80. En otra modalidad de ejemplo, el diluyente farmacéuticamente aceptable es manitol . Las composiciones farmacéuticas se pueden formular por cualquier manera apropiada de administración, incluyendo, por ejemplo, administración tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Para administración parenteral, tal como inyección subcutánea, el portador comprende de manera preferente agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera o un amortiguador. Para administración oral, se puede emplear cualquiera de los portadores anteriores o un portador sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio. También se pueden emplear microesferas biodegradables (por ejemplo, poliglicolato de polilactato) como portadores para las composiciones farmacéuticas de la invención. Se describen microesferas biodegradables adecuados por ejemplo en las patentes de los Estados Unidos números 4,897,268 y 5,075,109. Comúnmente, las composiciones farmacéuticas se administran de manera parenteral, por ejemplo, de forma intravenosa. De esta manera, la invención proporciona composiciones para administración parenteral que incluyen el compuesto disuelto o suspendido en un portador aceptable, de manera preferente un portador acuoso, por ejemplo, agua, agua amortiguada, solución salina, PBS y similares. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como se requiere para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tal como agentes amortiguadores y de ajuste de pH, agentes de ajuste de tonicidad, agentes humectantes, detergentes y similares. Estas composiciones se pueden esterilizar por técnicas convencionales de esterilización, o se pueden filtrar estériles. Las soluciones acuosas resultantes se pueden envasar para el uso como están, o liofilizar, la preparación liofilizada que se combina con un portador acuoso estéril antes de la administración. El pH de las preparaciones estará típicamente entre 3 y 11, de manera más preferente de 5 a 9 y de manera más preferente de 7 y 8. En algunas modalidades, los glicopéptidos de la invención se pueden incorporar en liposomas formados de lípidos formadores de vesículas estándar. Está disponible una variedad de métodos para preparar liposomas, como se describe en, por ejemplo, Szoka et al . , Ann . Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980), patentes de los Estados Unidos números 4,235,871, 4,501,728 y 4,837,028. La dirección de los liposomas usando una variedad de agentes de dirección (por ejemplo, sialil-galactósidos de la invención) es bien conocida en la técnica (ver, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos números 4,957,773 y 4,603,044). Se pueden usar métodos normales para acoplar agentes de dirección a liposomas. Estos métodos comprenden en general la incorporación en liposomas de componentes lípidos, tal como fosfatidiletanolamina, que se pueden activar para la unión de agentes de dirección, o compuestos lipófilos derivatizados, tal como glicopéptidos derivatizados con lípidos de la invención. Los mecanismos de dirección requieren en general que los agentes de dirección se coloquen en la superficie de liposoma de una manera tal que las porciones objetivo estén disponibles para interacción con el objetivo, por ejemplo, un receptor de superficie celular. Los carbohidratos de la invención se pueden unir a una molécula de lípido antes de que se forme el liposoma usando métodos bien conocidos por aquéllos expertos en la técnica (por ejemplo, alquilación o acilación de un grupo hidroxilo presente en el carbohidrato con un haluro de alquilo de cadena larga o un ácido graso, respectivamente) . De manera alternativa, el liposoma se puede moldear de una manera tal que se incorpore primero una porción conectadora en la membrana en el momento de formar la membrana. La porción conectadota debe tener una porción lipófila, que se incrusta firmemente y se ancla en la membrana. También debe tener una porción reactiva, que está químicamente disponible en la superficie acuosa del liposoma. La porción reactiva se selecciona de modo que será químicamente adecuada para formar un enlace químico estable con el agente de dirección o carbohidrato, que se adiciona posteriormente. En algunos casos, es posible unir el agente objetivo a la molécula conectadora directamente, pero en muchos casos es más adecuado usar una tercera molécula para actuar como un puente químico, que enlace de este modo la molécula conectadora que está en la membrana con el agente objetivo o carbohidrato que se extiende, tridimensionalmente, fuera de la superficie de la vesícula. Los compuestos preparados por los métodos de la invención también pueden encontrar uso como reactivo de diagnóstico. Por ejemplo, se pueden usar compuestos marcados para localizar áreas de inflamación o metástasis tumoral en un paciente sospechoso de tener una inflamación. Por este uso, los compuestos se pueden marcar con 125I, 14C, o tritio. El ingrediente activo usado en las composiciones farmacéuticas de la presente invención es conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla que tienen las propiedades biológicas de estimular la producción de coágulos sanguíneos. De manera preferente, el conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla se administra de manera parenteral (por ejemplo, IV, IM, SC o IP) . Se espera que las dosis efectivas varíen considerablemente dependiendo de la condición que se trate y de la ruta de administración pero se espera que esté en el intervalo de aproximadamente 0.1 (~7U) a 100 (~7000U) µg/kg de peso corporal del material activo. Las dosis preferibles para el tratamiento de condiciones anémicas son aproximadamente 50 a aproximadamente 300 unidades/kg tres veces por semana. Debido a que la presente invención proporciona una composición de materia que comprende un péptido de Factor Vil/Factor Vlla con un tiempo de residencia in vivo mejorado, las dosis señaladas se disminuyen opcionalmente cuando se administración una composición de la invención. Los métodos preparativos para especies de uso en la preparación de las composiciones de la invención se exponen en general en varias solicitudes de patente, por ejemplo, US 20040137557; WO 04/083258; y WO 04/033651. Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar los conjugados, y los métodos de la presente invención, pero no para limitar la invención reivindicada.

Ejemplos Ej emplo 1 Desialilación de Factor Vlla El Factor Vlla que se expresó en medio libre de suero, el Factor Vlla que se produjo en medio que contiene suero, más tres mutantes N145Q, N322Q, y el análogo DVQ de Factor Vlla (V158D/E296V/M298Q) . En la preparación para desialilación enzimática, se dializó el Factor Vlla en MES, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, MES 50 mM, pH 6 durante la noche a 4°C en una tubería de diálisis Snakeskin con un MWCO de 10 KDa. Se realizó la desialilación de Factor Vlla (1 mg/mL) con 10 U/L de sialidasa soluble de Arthrobacter ureafaciens (Calbiochem) a 32 °C durante 18 horas en el amortiguador intercambiado.

Ejemplo 2 Sialil-PEGilación de Factor Vlla Se realizó la sialil-PEGilación ("GlicoPEGilación") en asialo-Factor Vlla (1 mg/mL) con 100 U/L de ST3Gal-III y CMP-ácido siálico-PEG 200 µM (40 KDa, 20 KDa, 10 KDa, 5 KDa, y 2 KDa) a 32°C en el amortiguador de desialilación durante 2-6 horas. Después de que ha vencido el tiempo de reacción apropiado, la muestra pegilada se purificó inmediatamente para reducir al mínimo la glicoPEGilación . Para coronar el Factor Vil/Factor Vlla GlicoPEGilado con muestras coronadas con ácido siálico, se removió primero sialidasa del asialo-Factor Vlla por cromatografía de intercambio iónico como se indica más adelante. Se adicionó CMP-ácido siálico en exceso (5 mM) y se incubó a 32 °C durante 2 horas, coronando el Factor Vlla GlicoPEGilado con ácido siálico. Las formas sialil-PEGiladas del Factor Vlla se analizaron por SDS-PAGE no reductor (geles de tris-glicina y/o geles de NuPAGE) y un Equipo de Tinción de Azul Coloidal, como se describe por Invitrogen.

Ejemplo 3 Purificación de Factor Vlla PEGilado Las muestras GlicoPEGiladas del Factor Vlla se purificaron con un método de intercambio aniónico modificado. Las muestras se manejaron a 5°C. Inmediatamente antes de cargar la columna, se adicionó 1 g de Chelex 100 (BioRad) por 10 mL de solución de Factor Vlla a la muestra remodelada. Después de la agitación durante 10 minutos, la suspensión se filtró en una membrana de acetato de celulosa (0.2 µm) con un sistema de vacío. La resina de quelador retenido en el filtro se lavó una vez con 1-2 mL de agua por 10 mL de volumen. La conductividad del filtrado se ajustó a 10 mS/cm a 5°C, y se ajustó a pH 8.6, si es necesario. Se realizó el intercambio aniónico a 8-10°C. Se preparó una columna que contiene Q Sepharosa FF antes de cargar al lavar con NaOH 1M (10 volúmenes de columna) , agua (5 volúmenes de columna) , NaCl 2M, HOAC 50 mM, pH 3 (10 volúmenes de columna) , y equilibrando con NaCl 175 mM, glicilglicina 10 mM, pH 8.6 (10 volúmenes de columna) . Para cada reacción de PEGilación, se cargaron 15-20 mg de Factor Vlla en una columna XK 16 (Amersham Biosciences) con 10 mL de Q Sefarosa FF (no más de 2 mg de proteína por mL de resina) a una velocidad de flujo de 100 cm/h. Para el PEG lineal de 2 KDa, se cargaron 20 mg de Factor Vlla en una columna XK26 (Amersham Biosciences) con 40 mL de Q Sepharose FF (0.5 mg de proteína por mg de resina) a una velocidad de flujo de 100 cm/h. Después de la carga, la columna se lavó con NaCl 175 mM, glicilglicina 10 mM, pH 8.6, (10 volúmenes de columna) y NaCl 50 mM, glicilglicina 10 mM, pH 8.6 (2 volúmenes de columna) . Se realizó la elusión con un gradiente gradual de CaCl2 15 mM, al usar NaCl 50 mM, glicilglicina 10 mM, CaCl2 15 mM, pH 8.6 (5 volúmenes de columna) . La columna entonces se lavó con NaCl 1M, glicilglicina 10 mM, pH 8.6 (5 volúmenes de columna). El efluente se monitorizó por absorbancia a 280 nm. Se recolectaron las fracciones (5 mL) durante el flujo de paso y los dos lavados; se recolectaron fracciones 2.5 mL durante las elusiones con CaCl2 y sal 1M. Se analizaron las fracciones que contienen Factor Vlla por SDS-PAGE no reductora (geles de Tris-glicina y/o geles de NUPAGE) y un Equipo de Tinción de Azul Coloidal. Las fracciones apropiadas con Factor Vlla se mezclaron, y el pH se ajustó a 7.2 con HCl 4M. Se purificó el Factor VIIa-SA-PEG-10 KDa como se describe anteriormente, excepto por los siguientes cambios. Se adicionó EDTA (10 mM) a la solución de Factor Vlla PEGilado, el pH se ajustó a pH 6, y la conductividad se ajustó a 5 mS/cm a 5°C. Se cargaron aproximadamente 20 mg de Factor VIIa-SA-PEG-10 KDa en una columna XK16 (Amersham Biosciences) con 10 mL de resina Poros 50 Micron HQ (no más de 2 mg de proteína por mL, de resina) a una velocidad de flujo de 100 cm/h. Después de la carga, la columna se lavó con NaCl 175 mM, histidina 10 mM, pH 6 (10 volúmenes de columna) y NaCl 50 mM, histidina 10 mM, pH 6 (2 volúmenes de columna) . Se realizó la elusión con un gradiente gradual de CaCl2 20 mM en NaCl 50 mM, histidina 10 mM, pH 6 (5 volúmenes de columna) . La columna entonces se lavó con NaCl 1M, histidina 10 mM, pH 6 (5 volúmenes de columna) . El producto eluido del intercambio aniónico que contiene Factor VIIa-SA-PEG-10 KDa (25 mL) se concentró a 5- 7 mL al usar un dispositivo de filtro centrífugo Amicon Ultra- 15 10K, de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Millipore) . Después de la concentración, se realizó la cromatografía de exclusión de tamaño. La muestra (5-7 mL) se cargó en una columna que contiene Superdex 200 (HiLoad 16/60, prep. grado; Amersham Biosciences) puesta en equilibrio en NaCl 50 mM, glicilglicina 10 mM, CaCl2 15 mM, pH 7.2 para la mayoría de las variantes PEGiladas. Se separó Factor VIIa-SA-PEG-10 KDa del asialo-Factor Vlla no modificado a una velocidad de flujo de 1 mL/min, y la absorbancia se monitorizó a 280 nm. Las fracciones (1 mL) que contienen el Factor Vlla se recolectaron y analizaron por SDS-PAGE no reductora (geles de Tris-glicina y/o geles de NuPAGE) y un Equipo de Tinción Azul Coloidal. Las fracciones que contienen la isoforma PEGilada buscada y desprovistas de asialo-Factor Vlla no modificado se mezclaron y concentraron a 1 mg/mL usando un dispositivo de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 10K. Se determinó la concentración de proteína de las lecturas de absorbancia a 280 nm usando un coeficiente de extinción de 1.37 (mg/mL)"1 cm"1.

Ejemplo 4 Determinación de Isoformas PEGiladas por Análisis de HPLC de Fase Inversa Se analizó el factor Vlla PEGilado por HPLC en una columna de fase inversa (Zorbax 300SB-C3, tamaño de partícula 5 µm, 2.1 x 150 mm) . Los eluyentes fueron A) 0.1 TFA en agua y B) TFA al 0.09 % en acetonitrilo. La detección fue a 214 nm. El gradiente, velocidad de flujo, y temperatura de columna dependen de la longitud de PEG (PEG de 40 KDa, 20 KDa, y 10 KDa: 35-65 % de B en 30 min. 0.5 mL/min, 45°C, PEG 10 KDa: 35-60 % de B en 30 min, 0.5 mL/min, 45°C; 5 KDa: 40-50 % de B en 40 min, 0.5 mL/min, 45°C; 2 KDa: 38-43 % de B en 67 min, 0.6 mL/min, 55°C) . La identidad de cada pico se asignó en base a dos o más de cuatro diferentes piezas de evidencia: el tiempo de retención conocido de Factor Vlla nativo, la migración de SDS-PAGE, el pico aislado, el espectro de masa de MALDI-TOF del pico aislado, y el progreso ordenado del tiempo de retención de cada pico con número creciente de PEG unido.

Ejemplo 5 Determinación de Sitio de Unión de PEG por HPLC de Fase Inversa Las variantes de Factor Vlla y Factor Vlla PEGilado se redujeron al mezclar la muestra (10 µL a una concentración de 1 mg/mL) con amortiguador reductor (40 µL, NaCl 50 mM, glicilglicina 10 mM, EDTA 15 mM, urea 8M, DTT 20 mM, pH 8.6) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se adicionó agua (50 µL) y la muestra se enfrió a 4°C hasta que se inyectó en la HPLC (<12 horas) . La columna de HPLC, los eluyentes, y la detección fueron como se describe anteriormente para muestras no reducidas. La velocidad de flujo fue de 0.5 mL/min y el gradiente fue 30-55 % de B en 90 minutos, seguido por un ciclo de lavado breve hasta 90 % de B. La identidad de cada pico se asignó como se describe en el Ejemplo 4. Ejemplo 6 Ensayo de Coagulación de Factor Vlla Se probaron muestras y normas PEGiladas en duplicado, y se diluyeron en NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM. BSA al 0.1 % (peso/vol) , Tris 50 mM, pH 7.4. La norma y las muestras se valoraron sobre un intervalo de 0.1 a 10 ng/mL. Se mezclaron volúmenes iguales de normas y muestras diluidas con plasma deficiente en Factor Vlla (Diagnostica Stago) , y se almacenaron en hielo durante no más de 4 horas antes de que se valoraran. Se midieron los tiempos de coagulación con un coagulómetro STart4 (Diagnostica Stago) . El coagulómetro midió el tiempo transcurrido hasta que se formó un coágulo in vi tro, como se indica por la detención del movimiento suave hacia atrás y hacia delante de una bola magnética en una probeta de muestra. En cada probeta, se depositó una bola magnética, más 100 µL de muestra/plasma deficiente de Factor Vlla y 100 µL de una solución de cefalina cerebral de rata diluida (almacenada en hielo por no más de 4 horas) . Cada reactivo se adicionó con 5 segundos entre cada concavidad, y la mezcla final se incubó durante 300 segundos a 37°C. La solución de cefalina cerebral de rata diluida (RBC) se hizo de 2 mL de solución concentrada de RBC (solución concentrada de RBC de un frasco, de Haemachem, más 10 mL de NaCl 150 mM) y 4 mL de NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM, BSA al 0.1 % (peso/volumen), Tris 50 mM, pH 7.4. A 300 segundos, el ensayo se inició por la adición de 100 µL de una solución pre-calentada (37°C) de factor de tejido soluble (2 µg/mL; aminoácidos 1-209) en NaCl 100 mM. CaCl2 12.5 mM, BSA al 0.1 % (peso/vol) , Tris 50 mM, pH 7.4. Nuevamente, esta siguiente solución se adicionó con un intervalo de 5 segundos entre muestras . Los tiempos de coagulación de las muestras diluidas se usaron para generar una curva estándar (logaritmo de tiempo de concentración versus logaritmo de concentración de Factor Vlla) . La regresión lineal resultante de la curva se usó para determinar las actividades relativas de coagulación de variantes PEGiladas. Las variantes de Factor Vlla PEGilado se compararon contra una función concentrada en alícuotas de Factor Vlla.

Ejemplo 7 GlicoPEGilación de Factor Vlla Recombinante Producido en Células BHK Este ejemplo expone la PEGilación de Factor Vlla recombinante hecho en células BHK.

Preparación de asialo-Factor Vlla. Se produjo Factor Vlla recombinante en células BHK (células de riñon de hámster neonato) . Se disolvió Factor Vlla (14.2 mg) en 1 mg/mL en solución amortiguadora (pH 7.4, Tris 0.05 M, NaCl 0.15 M, CaCl2 0.001 M, NaN3 al 0.05 %) y se incubó con 300 mU/mL de conjugado de sialidasa ( Vibrio chol era) -agarosa durante 3 días a 32 °C. Para monitorizar la reacción, se diluyó una alícuota pequeña de la reacción con el amortiguador apropiado y un gel de IEF se realizó de acuerdo a los procedimientos de Invitrogen (Figuras 15A-15B) . La mezcla se centrifugó a 3,500 rpm y el sobrenadante se recolectó. La resina se lavó tres veces (3x2 mL) con la solución amortiguadora anterior (pH 7.4, Tris 0.05 M, NaCl 0.15 M, NaN3 al 0.05 %) y los lavados combinados se concentraron en un Centricon-Plus-20. La solución restante se intercambió con amortiguador con Tris 0.05 M (pH 7.4), NaCl 0.15 M, NaN3 al 0.05 % a un volumen final de 14.4 mL. Preparación de Factor VIIa-SA-PEG-1 KDa y Factor Vlla-SA-PEG-10 KDa. La desialilación de la solución de Factor Vlla se dividió en dos muestras iguales de 7.2 mL. A cada muestra se adicionó ya sea CMP-SA-PEG-1 KDa (7.4 mg) o CMP-SA-PEG-10 KDa (7.4 mg) . Se adicionó ST3Gal3 (1.58U) a ambos tubos y las mezclas de reacción se incubaron a 32 °C durante 96 horas. La reacción se monitorizó por gel de SDS-PAGE usando reactivos y condiciones descritas por Invitrogen. Cuando estuvo completa la reacción, la mezcla de reacción se purificó usando una columna preparativa Toso Haas TSK-Gel-3000 usando amortiguador de PBS (pH 7.1) y recolectando las fracciones basadas en absorción de UV. Las fracciones combinadas que contienen el producto se concentraron a 4°C en filtro centrífugo Centricon-Plus-20 (Millipore, Bedford, MA) y la solución concentrada se reformuló para producir 1.97 mg (ensayo de proteína de ácido bicinconínico, ensayo de BCA, Sigma-Aldrich, St. Louis MO) de Factor VIIa-SA-PEG. El producto de la reacción se analizó usando SDS-PAGE y análisis de IEF de acuerdo a los procedimientos y reactivos suministrados por Invitrogen. Las muestras se dializaron contra agua y analizaron por MALDI-TOF. La Figura 7 muestra los resultados de MALDI para Factor Vlla nativo. La Figura 8 contiene los resultados de MALDI para Factor VIIa-SA-PEG-lKDa. La figura 9 contiene los resultados de MALDI para Factor VIIa-SA-PEG-lOKDa. La Figura 10 representa el análisis de SDS-PAGE de todos los productos de reacción, donde es evidente una banda para Factor VIIa-SA-PEG-10 KDa.

Ejemplo 8 Factor VIIa-SA-PEG-10 KDa: Método en Marmita El Factor Vlla (5 mg diluido en el amortiguador de formulación de producto a una concentración final de 1 mg/mL) , CMP-SA-PEG-10 KDa (lOmM, 60 µL) y enzima ST3Gal3 de A. niger (33 U/L) e histidina 10 mM, NaCl 50 mM, CaCl2 20 mM se combinaron en un recipiente de reacción junto con ya sea 10 U/L, 1 U/L, 0.5 U/L o 0.1 U/L de sialidasa (CalBiochem) . Los ingredientes se mezclaron e incubaron a 32 °C. Se midió el progreso de la reacción al analizar las alícuotas en intervalos de 30 minutos durante las primeras cuatro horas. Entonces se removió una alícuota en el punto de tiempo de 20 horas y se sometió a SDS-PAGE. Se determinó el grado de PEGilación al remover 1 mL en el punto de tiempo de 1.5, 2.5 y 3.5 horas y se purificó la muestra en una columna Poros 50HQ. Para las condiciones de reacción que contienen 10 U/L de sialidasa, no se formó cantidad apreciable del producto de Factor VIIa-SA-PEG. Para las condiciones de reacción que contienen 1 U/L de sialidasa, aproximadamente 17.6 % del Factor Vlla en la mezcla de reacción estaba ya sea mono- o di-PEGilado después de 1.5 horas. Esto incrementó a 29 % después de 2.5 horas, y a 40.3 % después de 3.5 horas. Para las condiciones de reacción que contienen 0.5 U/L de sialidasa, aproximadamente 44.5 % del Factor Vlla en la mezcla de reacción estaba ya sea mono- o di-PEGilado después de 3 horas, y 0.8 % estaba tri-PEGilado o mayor. Después de 20 horas, 69.4 % estaba ya sea mono- o di-PEGilado, y 18.3 % estaba tri-PEGilado o más.

Para las condiciones de reacción que contienen 0.1 U/L de sialidasa, aproximadamente 29.6 % del Factor Vlla en la mezcla de reacción estaba ya sea mono- o di-PEGilada después de 3 horas. Después de 20 horas, 71.3 % estaba ya sea mono- o di-PEGilada, y 15.1 % fue tri-PEGilada o más. Se muestran los resultados en la Figura 11A-11B y Figura 12A-12B.

Ejemplo 9 Preparación de Cisteína-PEG-, (2) a. Síntesis de Compuesto 1 Se adicionó hidróxido de potasio (84.2 mg, 1.5 mmol, como un polvo) a una solución de L-cisteína (93.7 mg, 0.75 mmol) en metanol anhidro (20 L) bajo argón. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos, y luego se adicionó mPEG-O-tosilato de masa molecular 20 kilodalton (Ts; 1.0 g, 0.05 mmol) en varias porciones durante 2 horas. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 días, y se concentró por evaporación giratoria. El residuo se diluyó con agua (30 mL) , y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para destruir cualquier exceso de mPEG-O-tosilato de 20 kilodalton. La solución entonces se neutralizó con ácido acético, el pH se ajustó a pH 5.0 y se cargó en una columna de cromatografía de fase inversa (sílice C-18) . La columna se eluyó con un gradiente de metanol/agua (el producto eluye a aproximadamente 70 % de metanol) , la elusión del producto se monitorizó por dispersión de luz evaporativa, y las fracciones apropiadas se recolectaron y diluyeron con agua (500 mL) . Esta solución se cromatografió (intercambio iónico, XK 50 Q, BIG Beads, 300 mL, forma de hidróxido; gradiente de agua a agua/ácido acético-0.75 N) y el pH de las fracciones apropiadas se disminuyó a 6.0 con ácido acético. La solución entonces se capturó en una columna de fase inversa (sílice C-18) y se eluyó con un gradiente de metanol/agua como se describe anteriormente. Las fracciones del producto se mezclaron, se concentraron, se disolvieron en agua y se secaron por congelación para dar 453 mg (44 %) de un sólido blanco (1) . Los datos estructurales para el compuesto fueron como sigue: RMN XH (500 MHz; D20) d 2.83 (t, 2H, 0-C-CH2-S) , 3.05 (q, 1H, S-CHH-CHN), 3.18 (q, 1H, (q, 1H, S-CHH-CHN), 3.38 (s, 3H, CH30) , 3.7 (t, OCH2CH20) , 3.95 (q, 1H, CHN) . La pureza del producto se confirmó por SDS-PAGE. b. Síntesis de Cisteína-PEG2 (2) Se adicionó gota a gota trietilamina (-0.5 mL) a una solución del compuesto 1 (440 mg, 22 µmol) disuelto en CH2C12 anhidro (30 mL) hasta que fue básica la solución. Una solución de carbonato de mPEG-O-p-nitrofenilo de 20 kilodalton (660 mg, 33 µmol) y N-hidroxisuccinimida (3.6 mg, 30.8 µmol) en CH2C12 (20 mL) se adicionó en varias porciones durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. El solvente entonces se removió por evaporación giratoria, el residuo se disolvió en agua (100 mL) , y el pH se ajustó a 9.5 con NaOH 1.0 N. La solución básica se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y luego se neutralizó con ácido acético a pH 7.0. La solución entonces se cargó sobre una columna de cromatografía de fase inversa (sílice C-18) . La columna se eluyó con un gradiente de metanol/agua (el producto eluye a aproximadamente 70 % de metanol) , la elusión del producto se monitorizó por dispersión de luz evaporativa, y las fracciones apropiadas se recolectaron y diluyeron con agua (500 mL) . La solución se cromatografió (intercambio iónico, XK 50 Q, BIG Beads, 300 mL, forma de hidróxido, gradiente de agua a agua/ácido acético-0.75N) y el pH de las fracciones apropiadas disminuyó a 6.0 con ácido acético. Esta solución entonces se capturó en una columna de fase inversa (sílice C-18) y se eluyó con un gradiente de metanol/agua como se describe anteriormente. Las fracciones del producto se mezclaron, se concentraron, se redisolvieron en agua y se secaron por congelación para dar 575 mg (70 %) de un sólido blanco (2) . Los datos estructurales para el compuesto fueron como sigue: RMN H (500 MHz; D20) d 2.83 (t, 2H, 0-C-CH2-S) , 2.95 (t, 2H, 0-C-CH2-S) , 3.12 (q, 1H, S-CHH-CHN), 3.39 (s, 3H, CH30) , 3.7 (t, 0CH2CH20) . La pureza del producto se confirmó por SDS-PAGE.

Ejemplo 10 Factor VIIa-SA-PEG-40 KDa GlicoPEGilación de Factor Vlla (una marmita con coronación) . Se logró la GlicoPEGilación de Factor Vlla en una reacción en marmita donde se presenta simultáneamente desialación y PEGilación, seguido por coronación con ácido siálico. La reacción se realizó en un recipiente de vidrio con chaqueta controlado a 32 °C por un baño de agua de recirculación. Primero, el Factor Vlla filtrado a 0.2 µm concentrado se introdujo y el recipiente se calentó a 32 °C al mezclar con una barra de agitación durante 20 minutos. Se hizo un solución de sialidasa de polvo seco en histidina lOmM/NaCl 50mM/CaCl2 20mM, pH 6.0 a una concentración de 4,000 U/L. Una vez que el Factor Vlla alcanzó 32 °C, la sialidasa se adicionó al Factor Vlla, y la reacción se mezcló durante aproximadamente 50 minutos para asegurar una solución uniforme tiempo después del cual el mezclado se detuvo. La desialación se dejó proseguir durante 1.0 horas a 32 °C. Durante la reacción de desialación, se disolvió el CMP-SA-PEG-40 KDa en amortiguador de histidina 10 mM/NaCl 50 mM/CaCl2 20 mM, pH 6.0, y la concentración se determinó por absorbancia de UV a 271 nm. Después de que se disolvió el CMP-SA-PEG-40 KDa, se adicionó el CMP-SA-PEG-40 KDa a la reacción, así como el ST3Gal3 , y la reacción se mezcló durante aproximadamente 15 minutos con una barra de agitación para asegurar una solución uniforme. Se adicionó un volumen adicional de 85 mL de amortiguador para llevar la solución a 1.0 L. La reacción se dejó proseguir sin agitación durante 24 horas antes de que se adicionara CMP-SA a una concentración de 4.3 mM para extinguir la reacción y coronar los residuos de galactosa terminales restantes con ácido siálico. La extinción se dejó proseguir con mezclado durante 30 minutos a 32 °C. El volumen total de la reacción fue 1.0 L antes de la extinción. Se sumaron muestras en los puntos de tiempo (1 mL) a 0, 4.5, 7.5, y 24 horas, extinguido con CMP-SA, y se analizó por RP-HPLC y SDS-PAGE. Purificación de Factor VIIa-SA-PEG-40 KDa. Después de la coronación, la solución se diluyó con 2.0 L de histidina 10 mM, pH 6.0 que se ha almacenado durante la noche a 4 °C y la muestra se filtró a través de un filtro Millipak 60 de 0.2 µm. El volumen de carga resultante fue 3.1 L. Se realizó la cromatografía de AEX2 a 20-25°C (temperatura ambiente) en un sistema Akta Pilot. Después de la carga, un lavado con 10 volúmenes de columna con amortiguador de equilibrio se realizó, y el producto se eluyó de la columna usando un gradiente con 10 volúmenes de columna de MgCl2 que dio por resultado resolución de la especie de Factor Vlla PEGilado de Factor Vlla no PEGilado. La carga para esta columna se mantuvo intencionalmente baja, teniendo como objetivo <2 mg de Factor VIIa/mL de resina. Los geles de SDS-PAGE se corrieron además del análisis de RP-HPLC de las fracciones seleccionadas y mezclas de fracciones a fin de hacer la mezcla del producto volumétrico. Las fracciones mezcladas se ajustaron en pH a 6.0 con NaOH 1M y se almacenaron en un cuarto frío a 2-8 °C durante la noche . Concentración final/diafiltración, filtración aséptica y toma de alícuotas. Las fracciones mezcladas se filtraron a través de un filtro de 0.2 µm Millipak 20 y se almacenaron durante la noche a 2-8°C. Para realizar la concentración/diafiltracion, se usó una membrana de celulosa regenerada de 30 KDa de 0.1 m2 Millipore en un sistema equipado con una bomba peristáltica y tubería de silicón. El sistema se montó y se enjuagó con agua, luego se desinfectó con NaOH 0.1 M durante al menos 1 hora, y luego se almacenó en NaOH 0.1 M hasta el equilibrio con amortiguador de diafiltración de histidina 10 mM/CaCl2 5 mM/NaCl 100 mM, pH 6.0 inmediatamente antes del uso. El producto se concentró a aproximadamente 400 mL y luego se diafiltró a volumen constante con aproximadamente 5 diavolúmenes de amortiguador. El producto entonces se concentró a aproximadamente 300 mL y se recuperó después de una recirculación a baja presión durante 5 minutos, y las membranas se enjuagaron con 200 mL de amortiguador de diafiltración por una recirculación durante 5 minutos. El lavado se recuperó con el producto, y se hicieron recircular otros 50 mL de amortiguador durante otros 5 minutos para un lavado final. El volumen resultante fue de aproximadamente 510 mL, y que se filtró a través de un filtro al vacío de ÍL equipado con una membrana de PES de 0.2 µm (Millipore) . El volumen asépticamente filtrado entonces se tomó en alícuotas de 25 mL en tubos falcon estériles de 50 mL y se congeló a - 80°C. Análisis de la reacción de PEGilación or HPLC (E em lo 10) % dipegilado 0.1 0.9 1.9 5.1 5.1 % tripegilado 0.0 0.0 0.0 0.2 0.2 Después de 24 horas, la distribución de PEG-estado de producto volumétrico fue: 0.7 % no pegilado, 85.3 % mono-pegilado, 11.5 % di-pegilado y 0.3 % tri-pegilado. La cromatografía en columna es el paso principal en el proceso que genera la distribución del producto, en su mayor parte a través de la remoción de material no pegilado de especies mono- y di-pegiladas .

Ejemplo 11 Factor VIIa-SA-PEG-10 KDa El siguiente ejemplo describe un procedimiento para determinar el número de uniones de azúcar modificado a cadenas ligera y pesada de VIIa-SA-PEG-10 KDa por HPLC de fase inversa. Se sometió Factor VIIa-SA-PEG-10 KDa a condiciones reductoras a fin de separar la cadena pesada de la cadena ligera. Después de la separación, las cadenas pesada y ligera se sometieron a experimentos separados de HPLC de fase inversa. Los picos se asignaron en base a su posición relativa a los picos de Factor Vlla no modificados en los cromatogramas del control de Factor Vlla nativo. La siguiente tabla describe los parámetros de gradiente de solvente de HPLC para la cadena ligera. La temperatura en columna fue de 39°C.

Parámetros de gradiente de solvente de cadena ligera por HPLC Los cromatogramas de cadena ligera de Factor Vlla- SA-PEG-10 KDa de cadena ligera (superior) y Factor Vlla de cadena ligera nativo (fondo) se proporciona en la Figura i4A. La siguiente tabla describe los parámetros de gradiente de solvente de HPLC para la cadena pesada. La temperatura en columna fue de 52 °C.

Parámetros de gradiente de solvente de cadena pesada por HPLC Los cromatogramas de Factor VIIa-SA-PEG-10 KDa de cadena pesada (superior) y Factor Vlla de cadena pesada nativo (fondo) se proporciona en la Figura 14B.

Ejemplo 12 Factor VIIa-SA-PEG-40 KDa El siguiente ejemplo describe un procedimiento para determinar el número de uniones de azúcar modificado a las cadenas ligera y pesada de Factor VIIa-SA-PEG-40 KDa por HPLC de fase inversa. Se sometió el Factor VIIa-SA-PEG-40 KDa a condiciones reductoras a fin de separar la cadena pesada de la cadena ligera. Después de la separación, las cadenas pesada y ligera se sometieron a experimentos separados de HPLC de fase inversa. Se asignaron los picos en base a su posición relativa a los picos de azúcar no modificado en los cromatogramas del control de Factor Vlla nativo. La siguiente tabla describe los parámetros de gradiente de solvente de HPLC para la cadena ligera. La temperatura de la columna fue de 25°C.

Parámetros de gradiente de solvente de cadena ligera por HPLC Los cromatogramas de Factor VIIa-SA-PEG-40 KDa de cadena ligera (fondo) y Factor Vlla de cadena ligera nativo (superior) se proporcionan en la Figura 15A. La siguiente tabla describe los parámetros de gradiente de solvente de HPLC para la cadena pesada. La temperatura de la columna fue de 40°C. Parámetros de gradiente de solvente de cadena pesada por HPLC Los cromatogramas de Factor VIIa-SA-PEG-40 KDa de cadena pesada (fondo) y Factor Vlla de cadena pesada nativo (superior) se proporcionan en la Figura 15B. Se entiende que los ejemplos y modalidades descritos en la presente son para propósitos ilustrativos únicamente y que se sugerirán a la persona experta en la técnica varias modificaciones o cambios en vista de lo mismo y se van a incluir dentro del alcance y espíritu de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente se incorporan de este modo como referencia en su totalidad para todos los propósitos. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (37)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Método para elaborar un conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla que comprende un ligador de glicosilo que comprende un residuo de sialilo modificado que tiene la fórmula : en donde D es un miembro seleccionado de -OH y R1-L-HN-; G es un miembro seleccionado de R1-L- y -C(O) (C?~ C6) alquilo-R1; R1 es una porción que comprende un miembro seleccionado de un residuo de poli (etilenglicol) de cadena recta y un residuo de poli (etilenglicol) ramificado; y M es un miembro seleccionado de H, un metal y una carga negativa individual; L es un ligador, que es un miembro seleccionado de un enlace, alquilo sustituido o insustituido y heteroalquilo sustituido o insustituido, tal que cuando D es OH, G es R1-L-, y en donde G es -C (O) (C?-C6) alquilo, D es RX-L-NH-, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto un péptido de Factor Vil/Factor Vlla que comprende la porción de glicosilo: Gal con una porción donantea de PEG-ácido siálico que tiene la fórmula: y una enzima que transfiere el PEG-ácido siálico sobre el Gal de la porción de glicosilo, bajo condiciones apropiadas para la transferencia, formando de este modo el conjugado.
2. 2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque L-R1 tiene la fórmula: en donde : a es un número entero seleccionado de 0 a 20.
3. 3. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: en donde e, f, m y n son números enteros independientemente seleccionados de 1 a 2500; y q es un número entero seleccionado de 0 a 20.
4. 4. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: en donde e, f y f son números enteros independientemente seleccionado de 1 a 2500; y q y q' son números enteros independientemente seleccionados de 1 a 20.
5. 5. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: I— C(0)CH2CH2(OCH2CH2)eOCH3 ; -C(0)OCH2CH2(OCH2CH2)fOCH3 en donde e y f son números enteros independientemente seleccionados de 1 a 2500.
6. 6. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ligador de glicosilo tiene la fórmula:
7. 7. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el conjugado de péptido comprende al menos uno del ligador de glicosilo de acuerdo a una fórmula seleccionada de: en donde AA es un residuo de aminoácido del conjugado de péptido y t es un número entero seleccionado de 0 y 1.
8. 8. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el conjugado de péptido comprende al menos uno de ligador de glicosilo en donde cada uno de ligador de glicosilo tiene una estructura que es un miembro independientemente seleccionado de la siguiente fórmula: en donde AA es un residuo de aminoácido del conjugado de péptido y t es un número entero seleccionado de 0 y 1.
9. 9. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el conjugado de péptido comprende al menos uno del ligador de glicosilo de acuerdo a una fórmula seleccionada de: en donde AA es un residuo de aminoácido del conjugado de péptido y t es un número entero seleccionado de 0 y 1, y en donde está ausente un miembro seleccionado de 0 y 2 de las porciones de sialilo que no comprenden G.
10. 10. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el conjugado de péptido comprende al menos uno del ligador de glicosilo de acuerdo a una fórmula seleccionada de: en donde AA es un residuo de aminoácido del conjugado de péptido y t es un número entero seleccionado de 0 y 1, y en donde está ausente un miembro seleccionado de 0 y 2 de las porciones de sialilo que no comprenden G.
11. 11. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido de Factor Vil/Factor Vlla tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
12. 12. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ligador de glicosilo se une al péptido de Factor Vil/Factor Vlla a través de un residuo de aminoácidos seleccionado de serina y treonina.
13. 13. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ligador de glicosilo se une al péptido de Factor Vil/Factor Vlla a través de un residuo de aminoácido que es un residuo de asparagina.
14. 14. Método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el residuo de asparagina es un miembro seleccionado de N152, N322 y combinaciones de los mismos .
15. 15. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido de Factor Vlla es un péptido de Factor Vlla bioactivo.
16. 16. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende, antes del paso (a) : (b) expresar el péptido de Factor Vil/Factor Vlla en un hospedador adecuado.
17. 17. Método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el hospedador es un sistema de expresión de mamífero.
18. 18. Método para tratar una condición en un sujeto en necesidad del mismo, la condición está caracterizada por potencia comprometida de coagulación en el sujeto, caracterizado porque comprende el paso de administrar al sujeto una cantidad del conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla producido de CONFORMIDAD al método de la reivindicación 1, efectiva para mejorar la condición en el sujeto.
19. 19. Método para mejorar la potencia de coagulación en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad del conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla producido de CONFORMIDAD CON método de la reivindicación 1.
20. 20. Método para elaborar un conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla que comprende un ligador de glicosilo caracterizado porque comprende un residuo de sialilo modificado que tiene la fórmula: en donde R2 es H, CH2OR7 , COOR7 , u OR7 en donde 7 representa H, alquilo sustituido o insustituido o heteroalquilo sustituido o insustituido; R3 y R4 son miembros independientemente seleccionados de H, alquilo sustituido o insustituido, OR8, y NHC(0)R9 en donde R8 y R9 se seleccionan independientemente de H, alquilo sustituido o insustituido, heteroalquilo sustituido o insustituido o ácido sialilo; R16 y R17 son independientemente brazos poliméricos seleccionados; X2 y X4 son independientemente fragmentos de enlace seleccionados que unen porciones poliméricas R16 y R17 a C; X5 es un grupo no reactivo; y La es un grupo ligador, el método está caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto un péptido de Factor Vil/Factor Vlla que comprende la porción de glicosilo: Gal¬ eón una porción donantea de PEG-ácido siálico que tiene la fórmula : y una enzima que transfiere PEG-ácido siálico sobre el Gal de la porción de glicosilo, bajo condiciones apropiados para la transferencia, formando de este modo el conjugado.
21. 21. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la porción: tiene una fórmula que es un miembro seleccionado de: 3. en donde e, f, m y n son números enteros independientemente seleccionados de 1 a 2500; y q es un número entero seleccionado de 0 a 20.
22. 22. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la porción: tiene una fórmula que es un miembro seleccionado de: en donde e, f y f son números enteros independientemente seleccionado de 1 a 2500; y q y q' son números enteros independientemente seleccionados de 1 a 20.
23. 23. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el ligador de glicosilo comprende la fórmula:
24. 24. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla comprende al menos un ligador de glicosilo que tiene la fórmula: *?J (Fue), Man — GleNAc — Gal R15 A IA — G ileNAc — GleNAc — M ian v?? Man v W (Fue)» Man I l I AA — GleNAc — GleNAc — Man I I >15 WP Man- GleNAc — Gal- v W I (Fue), Man GleNAc — Gal- 15 I i i AA — GleNAc — GleNAc — Man J Man GleNAc — Gal R15 ;GlcNAc— Gal)p-R15 Man (GleNAc— Gal)p—R15 v??? (Fuc)t I AA — GleNAc — GleNAc — Man (GleNAc— Gal)p—R15 « \?/> Man- (GIcNAc— Gal)p-R 15 (GleNAc— Gal)p-R15 en donde AA es un residuo de aminoácido del péptido; t es un número entero seleccionado de 0 y 1; y R15 es la porción de sialilo modificada.
25. 25. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el péptido de Factor Vil/Factor Vlla tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
26. 26. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el ligador de glicosilo se une al péptido de Factor Vil/Factor Vlla a través de un residuo de aminoácidos que es un residuo de asparagina.
27. 27. Método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el residuo de asparagina es un miembro seleccionado de N152, N322 y combinaciones de los mismos .
28. 28. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el péptido de Factor Vlla es un péptido de Factor Vlla bioactivo.
29. 29. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque además comprende, antes del paso (a) : (b) expresar el péptido de Factor Vil/Factor Vlla en un hospedador adecuado.
30. 30. Método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el hospedador es un sistema de expresión de mamífero.
31. 31. Método para tratar una condición en un sujeto en necesidad del mismo, la condición está caracterizada por potencia comprometida de coagulación en el sujeto, caracterizado porque comprende el paso de administrar al sujeto una cantidad del conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla producido de acuerdo al método de la reivindicación 20, efectiva para mejorar la condición en el sujeto.
32. 32. Método para mejorar la potencia de coagulación en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad del conjugado de péptido de Factor Vil/Factor Vlla producido de conformidad con el método de la reivindicación 20.
33. 33. Método para sintetizar un conjugado de péptido de Factor VII o Factor Vlla, caracterizado porque comprende combinar a) una sialidasa; b) una enzima que es un miembro seleccionado de glicosiltransferasa, exoglicosidasa y endoglicosidasa; c) un azúcar modificado/residuo de sialilo modificado; y d) un péptido de Factor Vil/Factor Vlla, bajo condiciones apropiadas para sintetizar el conjugado, sintetizando de este modo el conjugado de péptido de Factor VII o Factor Vlla.
34. 34. Método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la combinación es durante un tiempo de menos de 10 horas.
35. 35. Método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque además comprende un paso de coronación.
36. 36. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende: (b) purificar el conjugado de péptido formado en (a) usando cromatografía de interacción hidrófoba.
37. 37. Método de conformidad con la reivindicación 0, caracterizado porque además comprende: (b) purificar el conjugado de péptido formado en (a) usando la cromatografía de interacción hidrófoba.