KR101237884B1 - 글리코 peg화 과립구 콜로니 자극인자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 과립구 콜로니 자극인자(Granulocyte Colony Stimulating Factor)와 PEG 부분(moieties) 사이에서의 콘쥬게이트(conjugates)를 제공한다.
이들의 콘쥬게이트는 펩티드와 수식기(modifying group) 사이에서 개재되어 공유 결합되는 완전한 글리코실 결합기를 통하여 결합된다.
이들의 콘쥬게이트는 글리코실트랜스퍼라아제(glycosylltransferase)의 작용에 의해 글리코실화 펩티드와 비글리코실화 펩티드의 양쪽 모두에서 형성된다.
이들의 글리코실트랜스퍼라아제는 펩티드 상에서의 아미노산 잔기 또는 글리코실 잔기에 수식된 당 부분(modified sugar moiety)을 결합한다.
또, 본 발명은 상기 콘쥬게이트를 함유하는 의약제제를 제공한다. 그 콘쥬게이트를 제조하는 방법도 본 발명의 범위 내에 포함한다.
과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 콘쥬게이트(conjugates), 글리코실 결합기, 글리코실트랜스퍼라아제(glycosyltransferase), 리폴딩(refolding), G-CSF 단백질, 리폴딩된 G-CSF 단백질, 동시부가(simultaneous addition), 글리코PEG화(glycoPEGylation), 수식된 당(modified sugar).

Description

글리코 PEG화 과립구 콜로니 자극인자{GLYCOPEGYLATED GRANULOCYTE COLONY STIMULATING FACTOR}
(관련 출원에 대한 상호-참조)
본 출원은 2003년 12월 3일자 출원한 미국 가특허출원 제 60/526,796 호; 2004년 3월 23일자 출원한 미국 가특허출원 제 60/555,813 호; 2004년 5월 11일자 출원한 미국 가특허출원 제 60/570,282 호; 2004년 1월 26일자 출원한 미국 가특허출원 제 60/539,387 호; 2004년 7월 29일자 출원한 미국 가특허출원 제 60/592,744 호; 2004년 9월 29일자 출원한 미국 가특허출원 제 60/614,518호; 및 2004년 10월 29일자 출원한 미국 가특허출원 제 60/623,387 호에 대한 우선권으로 주장한다. 모든 목적을 위해 이들의 각 특허문헌 전체를 참조하여 본 명세서에서 인용하여 편집한다.
본 발명은 글리코 PEG화 과립구 콜로니 자극인자에 관한 것이다.
본 발명은 과립구 콜로니 자극인자와 PEG 부분 사이의 콘쥬게이트를 제공한다. 이 콘쥬게이트는 펩티드와 수식된 기 사이에 삽입되고, 이들에 공유 결합된 완전한 글리코실 결합기를 통해서 결합된다. 이 콘쥬게이트는 글리코실트랜스퍼라아제의 작용에 의해서 글리코실화 및 비글리코실화된 펩티드 둘 다로부터 형성된다. 글리코실트랜스퍼라아제는 펩티드 상의 아미노산 또는 글리코실 잔기 상에 수식된 당 부분을 결합시킨다. 또한, 본 발명은 콘쥬게이트를 포함하는 의약제제를 제공한다. 콘쥬게이트를 제조하는 방법도 또한 본 발명의 범주내에 포함된다.
과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF)는 호중구 과립구 전구세포 및 성숙 호중구의 생존, 증식, 분화 및 기능을 자극하는 당단백질이다. 임상적으로 사용되는 재조합 인간 G-CSF의 두가지 형태가 호중구 과립구형성의 강력한 자극제이며, 몇가지 호중구감소성 상태의 감염성 합병증을 예방하는데 있어 유효하다는 것이 실증되었다. 이들은 골수억제성 치료에서 호중구 회복을 촉진하는데 사용할 수 있다.
G-CSF는 발열성 호중구감소증의 발병율, 골수 이식에 의해서 지지되는 고용량 화학요법의 이환율 (morbidity), 및 중증 만성 호중구감소증을 갖는 환자에서 감염증의 발병율 및 지속기간을 감소시킴으로써 암 화학요법의 이환율을 감소시킨다. 또한, G-CSF는 최근에, 심근경색의 발증 후에 투여하면 치료효과를 갖는 것으로 밝혀졌다.
G-CSF의 인간 형태는 1986년에 일본과 미국으로부터의 그룹(groups)에 의해서 클로닝되었다 (참조예: Nagata et al., Nature 319: 415-418, 1986). 천연 인간 당단백질은 두가지 형태로 존재하며, 하나는 175 아미노산이고, 다른 하나는 178 아미노산이다. 더 풍부하고 더 활성인 175 아미노산 형태가 재조합 DNA 기술에 의한 의약품의 개발에 이용되었다.
대장군(E. coli) 발현계에서 합성된 재조합 인간 G-CSF는 필그라스팀 (filgrastim)이라 불린다. 팔그라스팀의 구조는 천연 당단백질과는 약간 상이하다. 재조합 인간 G-CSF의 다른 형태는 레노그라스팀 (lenograstim)이라 불리며, 챠이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary)(CHO) 세포에서 합성된다.
hG-CSF는 2개의 G-CSF 분자와 2개의 수용체의 2:2 복합체(complex) 형성에 의해서 G-CSF 수용체를 이합체화(dimerization)하는 모노머성 단백질이다(monomeric protein) [Horan et al., Biochemistry, 35(15): 4886-96 (1996)]. 아래의 hG-CSF 잔기는 수용체 결합 계면의 일부분으로서 X-선 결정 연구에 의해서 확인되었다: G4, P5, A6, S7, S8, L9, P10, Q11, S12, L15, K16, E19, Q20, L108, D109, D112, T115, T116, Q119, E122, E123, 및 L124 [참조예: Aritomi et al., (1999) Nature 401: 713].
rhG-CSF의 상업적으로 이용가능한 형태는 단기간의 약리 효과를 가지며, 백혈구 감소성 상태의 지속기간에 대해서는 종종 하루에 한번 이상 투여되어야 한다. 순환 반감기가 더 긴 분자는 백혈구 감소증을 경감하는데, 필요한 투여 횟수를 감소시켜 결과적으로 일어난 감염증을 예방한다. 현재 이용가능한 rG-CSF 제품의 또 다른 문제는 용량-의존적인 뼈 통증의 발생에 있다. 뼈의 통증은 rG-CSG를 사용한 치료 결과 현저한 부작용으로서 환자가 겪고 있기 때문에, 실질적으로 이러한 효과를 나타내지 않거나, 또는 뼈의 통증이 야기하지 않는 충분히 적은 소량으로 효과적인 제품에 의해 뼈의 통증을 야기하지 않는 rG-CSF 제품을 제공하는 것이 바람직하다. 따라서, 개선된 재조합 G-CSF 분자가 필요하다는 것은 명백하다.
hG-CSF의 단백질-조작 변이체가 다음 문헌에서 보고되었다 [미국 특허 제 5,581,476호; 미국 특허 제 5,214,132호; 미국 특허 제 5,362,853호; 미국 특허 제 4,904,584호 및 문헌(Riedhaar-Olson et al., Biochemistry 35: 9034-9041, 1996)]. 또, 천연 폴리펩티드와 비교하여 적어도 하나의 부가 망사슬을 도입시키기 위해 hG-CSF 및 다른 폴리펩티드의 수식(modification) 보고되었다 (미국 특허 제 5,218,092 호). 또한, PEG 기의 부가를 포함하여 천연 hG-CSF의 폴리머 수식이 보고되고 연구되었다 (참조예: Satake-Ishikawa et al., (1992) Cell Structure and Function 17: 157; Bowen et al. (1999) Experimental Hematology 27: 425; 미국 특허 제 5,824,778호; 미국 특허 제 5,824,784호; WO 96/11953; WO 95/21629 및 WO 94/20069).
당단백질 치료제의 약물동태학적 특성을 개선하기 위해 펩티드 골격에 합성 폴리머를 부가하는 것은 이 기술분야에서 공지되어 있다. 펩티드에 결합되어 있는 예시적인 폴리머는 폴리(에틸렌 글리콜)("PEG")이다. 펩티드 치료제를 유도체화하기 위해 PEG를 사용하면 펩티드의 면역원성이 감소된다는 것은 명백하게 나타내었다. 예를 들어, 미국 특허 제 4,179,337 호 (Davis et al.) 명세서에서는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜에 결합된 효소 및 펩티드 호르몬과 같은 비-면역원성 폴리펩티드가 개시되어 있다. 면역원성의 감소 이외에도, 문제의 폴리펩티드의 PEG-콘쥬게이트의 사이즈가 증대함으로써 순환에서의 클리어런시(clearance) 시간이 연장된다.
펩티드에 PEG 및 그의 유도체를 부가하는 주모드는 펩티드 아미노산 잔기를 통한 비-특이적 결합이다 (참조예: 미국 특허 제 4,088,538 호, 미국 특허 제 4,496,689 호, 미국 특허 제 4,414,147 호, 미국 특허 제 4,055,635 호, 및 PCT WO 87/00056). 펩티드에 PEG를 부가하는 또 다른 모드는 글리코펩티드 상의 글리코실 잔기의 비-특이적 산화반응을 통한 것이다 (참조예: WO 94/05332).
이들의 비-특이적 방법에서, 폴리(에틸렌글리콜)은 펩티드 골격 상의 반응성 잔기에 임의로, 또 비-특이적으로 부가된다. 물론, PEG 분자의 랜덤(random) 부가는 최종생성물의 균일성 결여, 및 그 펩티드의 생물활성 또는 효소 활성이 감소할 가능성을 포함하여 결점을 갖는다. 따라서, 치료용 펩티드의 생성을 위해서는 특이적으로 표지되고 쉽게 특징화할 수 있으며, 거의 균질한 생성물을 형성시키는 유도체화 전략이 우수하여, 이러한 방법이 개발되었다.
특이적으로 표지된 균질한 펩티드 치료제는 효소 작용을 통하여 시험관내에서 생성될 수 있다. 펩티드에 합성 폴리머 또는 다른 표지를 결합시키기 위한 일반적인 비-특이적 방법과는 달리, 효소를 기재로 한 합성은 위치선택성 및 입체선택성의 이점을 갖는다. 표지 펩티드의 합성에 사용하기 위한 효소의 두 가지의 주요한 부류에는 글리코실트랜스퍼라아제 (예를 들어, 시알릴트랜스퍼라아제, 올리고사카릴트랜스퍼라아제, N-아세틸글루코사밀트랜스퍼라아제) 및 글리코시다아제가 있다. 이들의 효소를 사용하여, 치료 효과를 가진 부분을 함유하도록 그 후에 수식할 수 있는 당을 특이적으로 부가할 수 있다. 또 다른 방식으로, 글리코실트랜스퍼라아제 및 변형된 글리코시다아제를 사용하여 펩티드 골격에 수식된 당을 직접 전이시킬 수 있다 (참조예: 미국 특허 제 6,399,336호 및 미국 특허출원공개 제 20030040037호, 제20040132640호, 제20040137557호, 제20040126838호 및 제20040142856호를 참고할 수 있고 이들의 각각 문헌을 본 발명 명세서에 인용하여 편집한다.). 화학 합성 구성요소 및 효소 합성 구성요소의 둘 다를 병용하는 방법도 공지되어 있다[참조예: Yamamoto et al. Carbohydr. Res. 305: 415-422 (1998) 및 본 명세서에 참고로 포함한 미국 특허출원공개 제 20040137557 호].
개선된 치료용 G-CSF의 필요성에 대응하여, 본 발명은 치료면에서 활성이며, 글리코(glyco) PEG화 되지 않는 동일 또는 유사성이 높은 G-CSF 펩티드에 비하여 개서된 약물 동태학적 파라미터와 여러 가지의 특성을 가진 글리코 PEG화 된 G-CSF를 제공한다. 또, 본 발명은 본 발명의 개선된 G-CSF 펩티드를 경제적인 면에서 코스트를 효율적으로, 또 공업적인 규모로 제조하는 방법을 제공한다.
하나 또는 그 이상의 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 사용한 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF)의 제어된 수식을 행하면 상응하는 천연 (비-PEG화된) G-CSF에 비하여 개선된 약물 동태학적인 여러 가지의 특성을 갖는 신규 G-CSF 유도체가 제공되는 것을 발견하였다 (도 3). 또한, 글리코PEG화된 G-CSF의 약리 활성은 상업적으로 이용할 수 있는 모노-PEG화된 필그라스팀(filgrastim)과 대략 동일하다 (도 4).
하나의 예시적 구체예에서, 본 발명의 "글리코PEG화된" G-CSF 분자는 글리코실화되거나 또는 비-글리코실화된 G-CSF 펩티드와, 그 구조내에 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함하는 효소에 의해 전이가능한 사카릴 부분과의 사이의 콘쥬게이트를, 효소를 매개하여 형성함으로써 생성된다. 그 PEG 부분은 직접(즉, 두 가지의 반응성 기의 반응에 의해서 형성된 하나의 기를 통해서), 또는 링커 (linker) 부분, 예를 들어, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬 등을 통해서 사카릴 부분에 결합된다. 하나의 예시적인 전이가능한 PEG-사카릴 구조는 도 5에 나타낸다.
따라서, 하나의 국면(aspect)에서, 본 발명은 PEG 부분, 예를 들어, PEG와 본 기술분야에서 당업자에 의해 인지된 G-CSF와 동일하거나 또는, 다른 방식으로 하여 유사한 생체내 활성을 가진 펩티드 사이의 콘쥬게이트(conjugate)를 제공한다. 본 발명의 콘쥬게이트에서, PEG 부분은 완전한 글리코실 결합기를 통해 펩티드에 공유 결합되어 있다. 예시적인 완전한 글리코실 결합기에는 PEG에 의해서 유도체화된 시알산 부분을 포함된다.
하나의 예시적 국면에서, 본 발명은 다음 식의 부분을 포함하는 하나의 G-CSF 펩티드를 제공한다:
Figure 112006039150479-pct00001
상기 식에서, D는 -OH 또는 R1-L-HN-이다. 기호 G는 R1-L- 또는 -C(O)(C1-C6)알킬을 나타낸다. R1은 직쇄상 또는 분지상 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 포함하는 부분이며; L은 결합, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬로부터 선택한 멤버(member)인 링커이다. 일반적으로, D가 OH일 때 G는 R1-L-이고, G가 -C(O)(C1-C6)알킬일 때 D는 R1-L-NH-이다. 본 발명 명세서에서 나타낸 수식된 시알산 구조에서 COOH는 또한 COO- 및/또는 그 염을 나타낸다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 상기의 부분을 포함하는 PEG-화된 G-CSF를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 (a) 기질 G-CSF 펩티드를 전이에 적합한 조건 하에서, PEG-시알산 공여체 (donor)와, PEG-시알산을 G-CSF의 아미노산 또는 글리코실 잔기 상에 전이시키는 효소에 접촉시키는 스텝을 포함한다. 하나의 예시적인 PEG-시알산 공여체 부분은 아래에 나타낸 식을 갖는다:
Figure 112006039150479-pct00002
한가지 구체예에서, 숙주는 포유동물 세포이다. 다른 구체예에서, 숙주 세포는 곤충 세포, 식물 세포, 박테리아 또는 진균이다.
본 발명의 화합물의 약물 동태학적인 여러 가지의 특성은 펩티드의 글리코실화 부위(들)의 구조, 수 또는 위치를 변경시킴으로써 쉽게 변화된다. 따라서, 야생형으로 존재하지 않는 G-CSF 펩티드에 O- 또는 N-결합 글리코실화 부위를 삽입하는 하나 또는 그 이상의 변이를 부가하는 것은 본 출원의 범위 내에 있다. 또, 이들의 변이체 및 이들의 글리코실화된 최종 생성물 및 중간체에 대한 항체도 본 발명의 범위 내에 있다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 완전한 글리코실 결합기를 통하여 공유 결합된 PEG 부분의 집단, 예를 들어, PEG를 갖는 G-CSF 콘쥬게이트(conjugate)를 제공한다. 본 발명의 콘쥬게이트에서, 그 집단의 거의 대부분 각각의 멤버(member)는 글리코실 결합기를 통하여 펩티드의 글리코실 잔기에 결합되고, 각각의 글리코실 잔기는 동일한 구조를 갖는다.
예시적 구체예에서, 본 발명은 완전한 글리코실 결합기를 통하여 공유 결합된 PEG 부분(들)의 집단, 예를 들어, PEG를 갖는 G-CSF 콘쥬게이트를 제공한다. 본 발명의 콘쥬게이트에서, 그 집단의 거의 대부분 각각의 멤버는 펩티드의 아미노산 잔기에 결합되고, 폴리머가 결합되어 있는 각각의 아미노산 잔기는 동일한 구조를 갖는다. 예를 들어, 하나의 펩티드가 Thr 결합된 글리코실 잔기를 포함할 경우, 그 집단 중 펩티드의 적어도 약 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%, 99.2%, 99.4%, 99.6% 또는 더 바람직하게는 99.8%는 동일한 Thr 잔기에 공유 결합된 동일한 글리코실 잔기를 가진다. 상기 언급한 설명 내용은 O-글리코실화 및 N-글리코실화 부위의 둘 모두에 대해 동일하게 적용된다.
또, 의약 조성물이 제공된다. 이 조성물에는 의약적으로 허용되는 캐리어와, 비-천연 PEG 부분과 글리코실화 또는 비-글리코실화 G-CSF 펩티드 사이의 공유결합성 콘쥬게이트를 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 아래의 상세한 설명으로부터 당업자에 의해 명백하게 이해할 수 있다.
도 1은 Thr 133 (메티오닌이 존재할 경우 Thr 134)에서 잠재적인 글리코실화의 존재 및 위치를 나타내는 G-CSF의 구조도이다.
도 2는 G-CSF 펩티드 상의 당 잔기가, PEG에 의해서 유도체화된 사카릴 부분을 부가하기 전에 Thr 133 (메티오닌이 존재할 경우 Thr 134)에서 글리코실 잔기에 GalNac 부분을 효소에 의해 부가함으로써 리모델링(remodeling)된 본 발명의 하나의 예시적인 구체예를 나타내는 스킴(scheme)이다.
도 3은 비글리코실화 G-CSF, 뉴라스타 (Neulasta™) 및 효소에 의해 글리코PEG화된 G-CSF의 생체내 잔존기간(residence lifetime)을 비교한 그래프이다.
도 4는 도 3에서 나타낸 화학종의 활성을 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 콘쥬게이트를 조제하는데 유용한 하나의 예시적인 PEG-글리코실 결합기 전구체 (수식된 당)를 제조하는 합성 스킴이다.
도 6은 예시적인 G-CSF 아미노산 서열을 나타낸 것이다. SEQ ID NO:1(서열번호 1)은 175 아미노산 변이체로, 여기에서 최초 아미노산이 메티오닌이고, Thr134의 위치에서 트레오닌 잔기가 존재한다. SEQ ID NO:2(서열번호 2)는 최초 메티오닌이 결실하고, 따라서 서열이 T로 시작하여 133 위치에서 트레오닌 잔기가 존재하는 것을 제외하고는 175 아미노산 변이체와 동일한 서열을 갖는 174 아미노산 변이체이다.
도 7은 본 발명을 실시하는데 유용한 몇가지 예시적인 수식된 당 뉴클레오티드를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명을 실시하는데 유용한 추가 예시적인 수식된 당 뉴클레오티드를 나타낸 도면이다.
도 9는 다양한 배지에서 증식하고 IPTG에 의해 유도된 박테리아 내에서의 재조합 GCSF의 생성을 나타낸 도면이다.
도 10은 SP-세파로오스 크로마토그라피 후에 리폴딩된 (refolded) GCSF의 웨스턴 블럿(Western blot) 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명 명세서에서 나타낸 수식된 시알산 화학종 및 미수식된 시알산을 수용체 (acceptor) 상에서 전이시키는데 유용한 시알릴 트랜스퍼라아제의 표이다.
약어
PEG, 폴리(에틸렌글리콜); PPG, 폴리(프로필렌글리콜); Ara, 아라비노실; Fru, 프룩토실; Fuc, 푸코실; Gal, 갈락토실; GalNAc, N-아세틸갈락토사미닐; Glc, 글루코실; GlcNAc, N-아세틸글루코사미닐; Man, 만노실; ManAc, 만노사미닐 아세테이트; Xyl, 크실로실; 및 NeuAc, 시알릴 (N-아세틸뉴라미닐); M6P, 만노오스-6-포스페이트; Sia, 시알산, N-아세틸뉴라미닐, 및 이들의 유도체 및 유사체.
정의
특별히 정의되지 않는 경우, 본 발명에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 일반적으로 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적인 기술을 갖는 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 발명의 명세서에서 사용된 명명법, 및 세포배양, 분자유전학, 유기화학 및 핵산 화학 및 하이브리드화의 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용된 것이다. 핵산 및 펩티드의 합성에서는 표준기술이 사용된다. 이들의 기술 및 방법 절차는 본 명세서의 전체를 통하여 제공되는 이 기술분야의 종래방법 및 다양한 일반적인 참고문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]에 의해 일반적으로 실시된다. 본 명세서에서 사용된 명명법 및 아래에서 설명하는 분석화학 및 유기합성의 실험 방법은 본 기술분야에서 주지되어 있고, 통상적으로 사용된다. 표준기술 또는 그의 변형법이 화학적 합성 및 화학적 분석에 사용된다.
본 발명 명세서에서 기술된 모든 올리고당은 비-환원당에 대한 명칭 또는 약어 (즉, Gal), 그 다음 글리코사이드 결합의 입체 배치 (α 또는 β), 환 결합 (1 또는 2), 그 결합에 관련된 환원당의 환 위치 (2, 3, 4, 6 또는 8), 및 그 다음 환원당의 명칭 또는 약어 (즉, GlcNAc)를 사용하여 기술한다. 각각의 당은 피라노오스인 것이 바람직하다. 표준 당생물학 (glycobiology) 명명법의 총체적 설명에 대해서는 참고 문헌 [Essentials of Glycobiology, Varki et al. eds. CSHL Press (1999)]을 참조할 수 있다.
올리고당은 환원 말단의 당이 실제로 환원당이든지 아니든지 불문하고 환원 말단 및 비-환원 말단을 갖는 것으로 본다. 채택된 명명법에 따라, 올리고당은 본 명세서에서 왼쪽에 비-환원 말단 및 오른쪽에 환원 말단을 갖는 것으로 나타낸다.
용어 "시알산"은 탄소 9개의 카르복실화 당 패밀리 (family)의 임의의 멤버(member)를 의미한다. 시알산 패밀리의 가장 통상적인 멤버는 N-아세틸-뉴라민산 (2-케토-5-아세트아미도-3,5-디데옥시-D-글리세로-D-갈락토노뉴로피라노스-1-온산 (종종 Neu5Ac, NeuAc, 또는 NANA로 약칭함))이다. 이 패밀리의 제 2 멤버는 NeuAc의 N-아세틸기가 하이드록실화 되어 있는 N-글리콜릴-뉴라민산(Neu5Gc 또는 NeuGc)이다. 제 3의 시알산 패밀리 멤버는 2-케토-3-데옥시-노뉴로손산 (KDN) [Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al., J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990)]이다. 또한, 9-O-락틸-Neu5Ac 또는 9-O-아세틸-Neu5Ac 등의 9-O-C1-C6 아실-Neu5Ac, 9-데옥시-9-플루오로-Neu5Ac 및 9-아지도-9-데옥시-Neu5Ac 등 9 위치 치환 시알산도 포함된다. 시알산 패밀리에 대한 총체적 설명에 대해서는 예를 들어, 참고문헌 [Varki, Glycobiology 2: 25-40 (1992); Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992))]을 참조할 수 있다. 시알릴화 방법에서 시알산 화합물의 합성 및 사용은 1992년 10월 1일에 공개된 국제출원 WO 92/16640 명세서에 개시되어 있다.
용어 "과립구 콜로니 자극인자" 또는 "과립구 콜로니 자극인자 펩티드", 또는 "G-CSF" 또는 "G-CSF 펩타이드"는 임의의 야생형 또는 변이형 펩티드, 재조합형, 천연형 또는 천연 GCSF의 활성과 동일하거나 또는 이것을 모방한 활성을 가진 G-CSF의 임의의 단편(fragment)을 의미한다. 또 그 용어는 일반적으로 비-펩티드성 G-CSF 모의체(mimetics)를 포함한다. 하나의 예시적 구체예에서, G-CSF 펩티드는 서열번호 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. 다른 예시적 구체예에서, G-CSF 펩티드는 서열번호 3-11로부터 선택한 하나의 서열을 가진다.
용어 "과립구 콜로니 자극인자 활성"은 수용체 결합 및 활성화, 수용체 결합의 억제, 또는 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 작용에 의해서 통상적으로 영향을 받는 임의의 생화학적 반응 또는 생리 반응을 포함하나 한정되지 않은 임의의 활성을 의미한다. 과립구 콜로니 자극인자 활성은 위에서 정의한 바와 같이 임의의 과립구 콜로니 자극인자 펩티드의 작용으로부터 일어날 수 있다.
"펩티드"는 모노머가 아미노산이고, 아미드 결합을 통해서 함께 결합되는 폴리머를 의미하여, 이와 달리 대신 폴리펩티드라 칭한다. 또, 비천연 아미노산, 예를 들어, β-알라닌, 페닐글리신 및 호모아르기닌도 포함된다. 또, 유전자로 코딩되지 않은 아미노산도 본 발명에서 사용될 수 있다. 또, 반응성 기, 글리코실화 부위, 폴리머, 치료 효과를 가진 부분, 생체분자 등을 포함하도록 수식된 아미노산도 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하는 아미노산은 모두 D형 이성질체 또는 L형 이성질체로 할 수 있다. L형 이성질체가 일반적으로 바람직하다. 또, 다른 펩티드 모의체 (peptidomimetics)도 본 발명에서 유용하다. 본 발명 명세서에서 사용되는 "펩티드"는 글리코실화 펩티드와 비글리코실화 펩티드 둘 다를 의미한다. 또한, 펩티드를 발현하는 계(system)에 의해서 불완전하게 글리코실화된 펩티드도 포함된다. 일반적인 총체적 설명은 문헌 [Spatola, A. F., in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983)]을 참조한다.
용어 "펩티드 콘쥬게이트"(peptide conjugate)는 펩티드가 본 발명에서 설명한 바와 같이 수식된 당에 결합되어 있는 본 발명의 화학종을 의미한다.
용어 "아미노산"은 천연 아미노산 및 합성 아미노산 뿐만 아니라 천연 아미노산과 동일하게 기능적 작용을 하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모의체(mimetics)를 의미한다. 천연 아미노산은 유전 코드에 의해서 코드화된 것뿐만 아니라, 후에 수식된 아미노산, 예를 들어, 하이드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이 있다. 아미노산 유사체는 천연 아미노산과 동일한 기본 화학구조, 즉 수소, 카르복실 기, 아미노 기 및 R 기에 결합되어 있는
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탄소를 갖는 화합물, 예를 들어, 호모세린, 노르루신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 의미한다. 이러한 유사체는 수식된 R 기 (예를 들어, 노르루신) 또는 수식된 펩티드 골격을 가지나, 천연 아미노산과 동일한 기본 화학구조를 유지한다. 아미노산 모의체(mimetics)는 아미노산의 일반적 화학구조와 상이한 구조를 가지나, 천연 아미노산과 동일하게 기능적 작용을 하는 화학 화합물을 의미한다. 본 발명 명세서에서 사용되는 "아미노산"은 이것이 링커로 있든지 또는 펩티드 서열의 성분으로 있든지, 그 아미노산의 D형 이성질체 및 L형 이성질체 둘 다, 및 이들 두가지 이성질체의 혼합물을 의미한다.
본 발명 명세서에서 사용되는 용어 "수식된 당"(modified sugar)은 본 발명의 방법에서 펩티드의 아미노산 또는 글리코실 잔기에 효소적으로 부가되는 천연 및 비-천연 당(carbohydrate)을 의미한다. 그 수식된 당은 당 뉴클레오티드 (모노-, 디- 및 트리-포스페이트), 활성화 당 (예를 들어, 글리코실 할라이드, 글리코실 메실레이트) 및 활성화되지도 않고 뉴클레오티드도 아닌 당을 포함하나 이들로 제한되지는 않는 다수의 효소 기질에서 선택된다. 그 "수식된 당"은 "수식기(modifying group)"로 공유 결합에 의해 기능적 작용을 한다. 유용한 수식기에는 PEG 부분, 치료 효과를 가진 부분, 진단용 부분, 생체분자 등이 포함되나, 이들로 한정되어 있는 것은 아니다. 그 수식기는 천연당, 즉 미수식당(unmodified carbohydrate)이 아닌 것이 바람직하다. 그 수식기에 의한 작용화의 위치(locus)는 "수식된 당"이 효소적으로 펩티드에 부가되는 것을 방해하지 않도록 선택된다.
용어 "수용성"은 수중에서 약간의 검출가능한 정도의 용해성을 나타낸 부분을 의미한다. 수용성을 검출 및/또는 정량화하는 방법은 이 기술분야에서 잘 알려져 있다. 예시적인 PEG 부분에는 펩티드, 당, 폴리(에테르), 폴리(아민), 폴리(카르복실산) 등이 포함된다. 펩티드는 단일 아미노산으로 구성된 혼합 서열, 예를 들어, 폴리(리신)을 가질 수 있다. 동일하게, 당도 혼합 서열로 이루어진 것으로도, 또는 단일 당 서브유니트(subunit)로 구성된 것, 예로서, 덱스트란, 아밀로오스, 키토산 및 폴리(시알산)으로 할 수도 있다. 하나의 예시적인 폴리(에테르)는 폴리(에틸렌 글리콜)이다. 폴리(에틸렌 이민)은 하나의 예시적인 폴리 아민이고, 폴리(아크릴)산은 하나의 대표적 폴리(카복실산)이다.
본 발명 명세서에서 사용되는 용어 "글리코실 결합기"는 작용물질(agent)(예를 들어, PEG 부분, 치료 효과를 가진 부분, 생체분자)이 공유 결합되어 있는 글리코실 잔기를 의미한다. 본 발명의 방법에서, 그 "글리코실 결합기"는 글리코실화되거나 비글리코실화된 펩티드에 공유 결하되어, 이것에 의해 작용물질을 펩티드 상에서의 아미노산 및/또는 글리코실 잔기에 결합시킨다. "글리코실 결합기"는 일반적으로, 펩티드의 아미노산 및/또는 글리코실 잔기에 "수식된 당"을 효소적 부가시킴으로써 "수식된 당"으로부터 유도된다. "완전한 글리코실 결합기"는 콘쥬게이트(conjugate)를 결합하는 개별적인 당 모노머가 분해되지 않는, 예를 들어 메타과요오드산 나트륨(sodium metaperiodate)에 의해 산화되지 않는 글리코실 부분으로부터 유도된 결합기를 의미한다. 본 발명의 "완전한 글리코실 결합기"는 하나 이상의 글리코실 단위를 부가하거나, 모(parent) 당 구조체로부터 하나 이상의 글리코실 유니트를 제거함으로써 천연 올리고당에서 유도할 수 있다.
본 발명 명세서에서 사용되는 용어 "표적성 부분 (targeting moiety)"은 신체의 특정 조직 또는 영역에 선택적으로 국재화하는 화학종을 의미한다. 그 국재화 (localization)는 분자 결정기(molecular determinants)의 특이적 인식, 표적성 작용물질 또는 표적성 콘쥬게이트의 분자 크기, 이온성 상호작용, 소수성 상호작용 등에 의해서 발생한다. 작용물질을 특정의 조직 또는 영역에 표적화시키는 다른 메카니즘은 이 기술분야에서 숙련된 당업자로부터 공지되어 있다. 예시적인 표적성 부분에는 항체, 항체 단편, 트랜스페린, HS-당단백질, 응고인자, 혈청 단백질, β-당단백질, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO 등이 포함된다.
본 발명 명세서에서 사용되는 "제약상(의약상) 허용되는 캐리어"에는 콘쥬게이트와 배합하였을 때, 콘쥬게이트의 활성을 유지하여, 피검자의 면역계와 반응하지 않는 임의의 물질이 포함된다. 예로는 포스페이트 완충화 생리 식염수, 물, 오일/물 에멀션 등의 에멀션 및 다양한 타입의 습윤제 등 표준 약제용 캐리어 중 임의의 것이 포함되나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또 다른 캐리어로는 멸균 액제, 코팅정을 포함하는 정제 및 캅셀제가 포함될 수 있다. 일반적으로, 이와 같은 캐리어는 전분, 밀크 (milk), 당, 특정한 타입의 점토, 젤라틴, 스테아르산 또는 그 염류, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트, 탈크, 식물성 지방 또는 오일, 검, 글리콜 또는 다른 공지된 부형제 등의 부형제를 포함한다. 또, 이와 같은 캐리어에는 향료 첨가제 및 착색 첨가제, 또는 다른 성분들도 포함될 수 있다. 이와 같은 캐리어를 포함하는 조성물은 잘 알려진 종래의 방법에 의해서 조제된다.
본 발명 명세서에서 사용되는 "투여"는 피검자에 대한 경구 투여, 좌제로서의 투여, 국소적 접촉, 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 병소내 투여, 비내강 투여 또는 피하 투여, 또는 서방 장치(slow-release device), 예를 들어 미니-침투압 펌프 (mini-osmotic pump)의 매입을 의미한다. 투여는 비경구 투여 및 경점막 투여(예를 들어, 구강, 비강내, 질내, 직장 또는 경피)를 포함하는 어떠한 경로에 의한 것이라고 가능하다. 비경구 투여에는 예를 들어, 정맥내, 근육내, 세동맥내(intra-arteriole), 피내, 피하, 복강내, 심실내 및 두개내가 포함된다. 더구나, 주사로 종양을 치료할 경우, 예를 들어, 세포소멸(apoptosis)을 유도하도록 할 경우, 투여는 종양으로 직접 투여 및/또는 종양 주변의 조직 중으로 직접 투여로 할 수 있다. 다른 송달 모드에는 리포솜 제제, 정맥내 주입, 경피 패치 등의 사용이 포함되나, 이들로 한정되어 있는 것은 아니다. 용어 "개선하는 것"(ameliorating) 또는 "개선한다"는 증상의 완화, 소실 또는 감소 또는 환자의 육체적 건강 또는 정신적 건강(well-being)의 개선 등 임의의 객관적 또는 주관적 파라미터를 포함하여 병상 또는 병태의 치료 성공을 나타내는 임의의 징후를 의미한다. 증상의 개선은 신체검사 및/또는 정신감정의 결과를 포함하여 객관적 또는 주관적 파라메터를 기본으로 할 수 있다.
용어 "요법"(therapy)은 어느 질환에 걸리기가 쉬운 가능성이 있으나 그 질환의 증상을 아직 경험하거나 나타내지 않은 동물에 있어서 그 질환 또는 병태가 발생하는 것을 방지하며(예방치료), 그 질환을 억제하고(그 질환의 발생을 지연 또는 저지함), 그 질환의 증상 또는 부작용에서 경감(relief)을 제공하며(고식적 치료 포함), 그 질환을 경감하는 것(질환의 감퇴 발생)을 포함하여, 어느 질환 또는 병태를 "치료하는 것"(treating) 또는 이들의 "치료"(treatment)를 의미한다.
용어 "유효량"(effedive amount) 또는 "유효한 양" 또는 "치료 유효량" 또는 문법적으로 등가인 임의의 용어는 어느 질환을 치료하기 위해서 동물에 투여하는 경우 그 질환에 대한 치료를 실시하기에 충분한 양을 의미한다.
용어 "분리된"은 그 물질을 생성하는데 사용되는 성분들을 실질적으로 또는 본질적으로 함유하지 않는 물질을 의미한다. 본 발명의 펩티드 콘쥬게이트의 경우에, 그 용어 "분리된"은 통상적으로 펩티드 콘쥬게이트를 조제하기 위해서 사용된 혼합물 중에서 그 물질에 통상적으로 동반하는 성분들을 실질적으로 또는 본질적으로 함유하지 않는 물질을 의미한다. "분리된" 및 "순수한"은 서로 동의적으로 사용된다. 일반적으로, 본 발명의 분리된 펩티드 콘쥬게이트는 바람직하게 어느 범위로 나타낸 레벨의 순도를 갖는다. 그 펩티드 콘쥬게이트에 대한 순도의 범위의 하한(lower end)은 약 60%, 약 70% 또는 약 80%이고, 그 순도의 범위의 상한은 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 90% 이상이다.
그 펩티드 콘쥬게이트의 순도가 약 90% 이상인 경우에, 그들의 순도도 바람직하게는 어느 범위로 나타낸다. 그 순도의 범위의 하한은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 96% 또는 약 98%이다. 그 순도의 범위의 상한은 약 92%, 약 94%, 약 96%, 약 98% 또는 약 100%의 순도이다.
순도는 이 기술분야의 기술자에 의해 인지된 어떤 임의의 분석방법 (예를 들어, 은 염색 겔 상의 밴드 강도, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, HPLC, 또는 유사한 수단)에 의해 측정된다.
본 발명 명세서에서 사용되는 "집단의 필수적인 각각의 멤버"는 어느 펩티드에 부가되는 선택된 백분율의 수식된 당이 그 펩티드 상의 다수의 동일한 수용체 부위에 부가되는 본 발명의 펩티드 콘쥬게이트의 집단의 특징을 설명한 것이다. "집단의 필수적인 각각의 멤버"는 수식된 당에 결합된 펩티드 상의 부위의 "균질성"을 설명한 것이며, 이것은 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 더 바람직하게는 적어도 약 95% 균질한 본 발명의 콘쥬게이트를 의미한다.
"균질성"은 수식된 당이 결합된 수용체 부분의 집단 전체에 걸친 구조의 일관성을 의미한다. 따라서, 각각의 수식된 당 부분이, 다른 모든 수식된 당이 결합되어 있는 수용체 부위와 동일한 구조를 가진 수용체 부위에 결합되어 있는 본 발명의 펩티드 콘쥬게이트에서는 펩티드 콘쥬게이트가 약 100% 균질인 것으로 칭한다. 균질성은 일반적으로 어느 범위로 나타낸다. 그 펩티드 콘쥬게이트에 대한 균질성의 범위의 하한치는 약 60%, 약 70% 또는 약 80%이며, 순도의 범위의 상한치는 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 90% 이상이다.
그 펩티드 콘쥬게이트가 약 90% 또는 그 이상 균질인 경우에, 이들의 균질성도 바람직하게는 어느 범위로 나타낸다. 그 균질성의 범위의 하한치는 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 96% 또는 약 98%이다. 그 순도의 범위의 상한치는 약 92%, 약 94%, 약 96%, 약 98% 또는 약 100%의 균질성이다. 펩티드 콘쥬게이트의 순도는 일반적으로 이 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해 공지된 하나 또는 그 이상의 방법, 예를 들어, 액체 크로마토그라피-질량분석법(LC-MS), 매트릭스 보조 레이저 이탈 이온화 비행 시간형 질량 분석법(matrix assisted laser desorption mass time of flight spectrometry)(MALDITOF), 모세관 전기영동법 등에 의해서 측정된다.
글리코펩티드 종을 언급할 때 "실질적으로 균등한 글리코폼 (glycoform)" 또는 "실질적으로 균등한 글리코실화 패턴"은 그 대응하는 글리코실트랜스퍼라아제 (예를 들어, 푸코실트랜스퍼라아제)에 의해 글리코실화되는 수용체 부분의 백분율을 의미하는 것이다. 예를 들어, α1,2 푸코실트랜스퍼라아제의 경우, 실질적으로 모든 (아래에서 정의하는 바와 같음) Galβ1,4-GlcNAc-R 및 그 시알릴화 유사체가 본 발명의 펩티드 콘쥬게이트에서 푸코실화될 경우 실질적으로 균등한 푸코실화 패턴이 존재한다. 출발물질이 글리코실화된 수용체 부분(예를 들어, 푸코실화된 Galβ1,4-GlcNAc-R 부분)을 포함하는 경우가 있음은 이 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 이해할 수 있다. 따라서, 계산된 글리코실화 퍼센트는 본 발명의 방법에 의해서 글리코실화된 수용체 부분 및 출발물질에서 이미 글리코실화된 수용체 부분을 포함한 것으로 생각된다.
"실질적으로 균등한"의 상기 정의에서 용어 "실질적으로"는 일반적으로 특정한 글리코실트랜스퍼라아제에 대한 수용체 부분의 적어도 약 40%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 더 바람직하게는 적어도 약 90%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 약 95%가 글리코실화되는 것을 의미한다.
치환기가 종래의 화학식에 의해 지정되어 왼쪽에서부터 오른쪽으로 쓰여질 경우, 이들은 그 구조를 오른쪽에서부터 왼쪽으로 기재함으로써 얻어진 화학적으로 동일한 치환기도 동일하게 포함한다. 예를 들어, -CH2O-는 -OCH2-로도 나타낸 것으로 한다.
그 자체 또는 또 다른 치환기의 일부분으로서 용어 "알킬"은 특별한 설명이 없는 경우 직쇄상 또는 분지상 도는 환상 탄화수소 래디컬 또는 이들의 조합물을 의미하며, 이들은 완전 포화, 모노(mono) 불포화 도는 다(poly) 불포화할 수 있고, 2가 래디컬 또는 다가 래디컬을 포함할 수 있으며, 지정된 탄소원자수를 가진다(즉, C1-C10은 1 ~ 10개의 탄소를 의미한다). 포화 탄화수소 래디컬의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 사이클로헥실, (사이클로헥실)메틸, 사이클로프로필메틸, 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등의 동족체 및 이성질체 등의 기를 포함되나, 이들로 제한되어 있는 것은 아니다. 하나의 불포화 알킬기는 하나 또는 그 이상의 이중결합 또는 삼중결합을 가진 것이다. 불포화 알킬기의 예로는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐 및 더 고차적인 동족체 및 이성질체가 포함되나, 이들로 한정되어 있는 것은 아니다. 용어 "알킬"은 특별한 설명이 없는 경우, 또 "헤테로알킬" 등 아래에서 더 상세하게 정의되는 알킬의 유도체를 포함하는 것을 의미한다. 탄소 수소기도 한정되어 있는 알킬기를 "호모알킬"이라고 칭한다.
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그 자체 또는 또 다른 치환기의 일부분으로서의 용어 "알킬렌"은 -CH2CH2CH2CH2-로 예시되는 (단, 이것으로 제한되지는 않는다) 알칸으로부터 유도된 2가 래디컬을 의미하며, 또 "헤테로알킬렌"으로 아래에 기술된 바와 같은 기를 포함한다. 일반적으로, 알킬 (또는 알킬렌)기는 1 내지 24개의 탄소원자를 가지며, 10개 이하의 탄소원자를 가진 이들의 기가 본 발명에서 바람직하다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 일반적으로 8개 이하의 탄소원자를 가진 사슬이 더 짧은 알킬 또는 알킬렌기이다.
용어 "알콕시", "알킬아미노" 및 "알킬티오" (또는 티오알콕시)는 통상의 종래 의미로 사용되며, 각각 산소원자, 아미노기, 또는 황원자를 통해 분자의 나머지 부분에 결합되어 있는 알킬기를 의미한다.
그 자체 또는 또 다른 용어와 조합한 용어 "헤테로알킬"은 특별할 설명이 없는 경우 지정된 수의 탄소원자와 O, N, Si 및 S로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 헤테로원자로 이루어지며, 그 질소원자 및 황원자는 경우에 따라 선택적으로 산화시킬 수 있고, 그 질소 헤테로 원자는 경우에 따라 선택적으로 4급화 할 수 있는 안정한 직쇄상 또는 분지상 또는 환상 탄화수소 래디컬 또는 이들의 조합물을 의미한다. 헤테로원자(들) O, N 및 S 및 Si는 헤테로알킬기의 임의의 내부 위치 또는 알킬기가 분자의 나머지 부분에 결합되어 있는 위치에 존재할 수 있다. 예에는 -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2 -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3 및 -CH=CH-N(CH3)-CH3를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, -CH2-NH-OCH3 및 -CH2-O-Si(CH3)3 등 2개 이하의 헤테로원자가 연속하여 존재할 수 있다. 동일하게, 그 자체 또는 또 다른 치환기의 일부분으로서의 용어 "헤테로알킬렌"은 -CH2-CH2-S-CH2-CH2- 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-로 예시되는 바와 같이 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 헤테로알킬로부터 유도된 2가 래디컬을 의미한다. 헤테로알킬렌기의 경우에, 또 헤테로원자는 사슬의 말단 중의 어느 하나 또는 둘 다를 점유할 수 있다 (예를 들어, 알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노 등). 또, 알킬렌 결합기 및 헤테로알킬렌 결합기의 경우에, 그 결합기의 배향은 그 결합기의 식이 쓰여진 방향에 의해 나타낸 것은 아니다. 예를 들어, 식 -C(O)2R'-는 -C(O)2R'-와 -R'C(O)2-의 양쪽을 나타낸다.
그들 자체 또는 다른 용어와 조합한 용어 "사이클로알킬" 및 "헤테로사이클로알킬"은 특별한 설명이 없는 경우 각각 "알킬" 및 "헤테로알킬"의 환상형(cyclic versions)을 나타낸다. 또, 헤테로사이클로알킬의 경우 하나의 헤테로원자는 헤테로사이클이 분자의 나머지 부분에 결합되어 있는 위치를 점유할 수 있다. 사이클로알킬의 예로는 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 1-사이클로헥세닐, 3-사이클로헥세닐, 사이클로헵틸 등이 포함되나, 이들로 한정된 것은 아니다. 헤테로사이클로알킬의 예로는 1-(1,2,5,6-테트라하이드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라하이드로푸란-2-일, 테트라하이드로푸란-3-일, 테트라하이드티엔-2-일, 테트라하이드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등이 포함되나, 이들로 한정된 것은 아니다.
그들 자체 또는 또 다른 치환기의 일부분으로서의 용어 "할로" 또는 "할로겐"은 특별한 설명이 없는 경우, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 원자를 의미한다. 또, "할로알킬" 등의 용어는 모노할로알킬 및 폴리할로알킬을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 용어 "할로(C1-C4)알킬"은 트리플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 4-클로로부틸, 3-브로모프로필 등을 포함하는 것을 의미하나, 이들로 한정한 것은 아니다.
특별한 설명이 없는 경우, 용어 "아릴"(aryl)은 다불포화 방향족 치환기를 의미하며, 그 치환기는 하나의 단일링(single ring) 또는 서로 축합하거나, 또는 공유 결합된 다중링(multiple rings)(1 ~ 3개의 링이 바람직함)으로 할 수 있다. 용어 "헤테로아릴"(heteroaryl)은 N, O 및 S에서 선택된 1내지 4개의 헤테로 원자를 포함하며, 상기 질소 원자와 황원자는 경우에 따라 선택적으로 산화되며, 상기 질소 원자(들)는 경우에 따라 선택적으로 4급화 하는 아릴기(또는 링)를 의미한다. 하나의 헤테로아릴기는 하나의 헤테로 원자를 통해 분자의 나머지 부분에 결합시킬 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴기의 비-한정 예로는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이소옥사졸릴, 4-이소옥사졸릴, 5-이소옥사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 푸리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴, 테트라졸릴, 벤조[b]푸라닐, 벤조[b]티에닐, 2,3-디하이드로벤조[1,4]디옥신-6-일, 벤조[1,3]디옥솔-5-일 및 6-퀴놀릴이 포함된다. 상기 제시한 아릴 및 헤테로아릴 환계의 각각에 대한 치환기는 아래에 설명한 허용될 수 있는 치환기의 군으로부터 선택된다.
간결하게 하기 위하여, 다른 용어와 조합하여 사용되는 경우의 용어 "아릴" (예를 들어, 아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬)에는 위에서 정의된 바와 같은 아릴 및 헤테로아릴 환 둘 다를 포함한다. 따라서, 용어 "아릴알킬"은 아릴기가 탄소원자 (예를 들어, 메틸렌기)가 예를 들어, 산소원자 (예를 들어, 페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등)에 의해서 치환된 알킬기를 포함한 알킬기에 아릴가기 결합된 래디컬(예를 들어, 벤질, 펜에틸, 피리딜메틸 등)을 포함하는 것을 의미한다.
상기 용어 (예를 들어, "알킬", "헤테로알킬", "아릴" 및 "헤테로아릴")의 각각은 지시된 래디컬의 치환 및 비치환 형태 둘 다를 포함하는 것을 의미한다. 각각의 래디컬 타입에 대한 바람직한 치환기는 아래에서 제시한다.
그 알킬 및 헤테로알킬 래디컬 (종종 알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 사이클로알케닐 및 헤테로사이클로알케닐로 칭하는 기를 포함)에 대한 치환기는 일반적으로 "알킬기 치환기"라고 불리며, 이들은 0 내지 (2m'+1)의 범위의 수 (여기에서 m'는 이러한 래디컬의 탄소원자의 총수이다)의 -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'C(O)NR"R'", -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2로 부터 선택된 (단, 이들로 한정되지는 않는다) 다양한 기 중의 하나 또는 그 이상으로 할 수 있다. R', R", R'" 및 R""는 각각 바람직하게는 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 예를 들어, 1-3개의 할로겐으로 치환된 아릴, 치환 또는 비치환 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기, 또는 아릴알킬기를 의미한다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R 기를 포함하는 경우에, 예를 들어, 각각의 그 R 기가 R', R", R'" 및 R"" 기 중 하나 이상으로 존재하는 경우 이들 기 각각과 같이 독립적으로 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소원자에 결합되는 경우, 이들은 그 질소원자와 결합하여 5-, 6- 또는 7-멤버 환을 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R"는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하는 것(단, 이들로 제한되는 것은 아니다)을 의미한다. 치환기에 대한 상기 설명으로부터 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 용어 "알킬"이 할로알킬 (예를 들어, -CF3 및 -CH2CF3) 및 아실 (예를 들어, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등) 등 수소 기 이외의 기에 결합된 탄소원자를 포함하는 기들을 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해할 수 있다.
알킬기에 대하여 설명한 치환기와 동일하게, 아릴기 및 헤테로아릴기에 대한 치환기는 일반적으로 "아릴기 치환기"라 불린다. 이들의 치환기는 예를 들어, 0 에서 방향족 환계 상의 개방 원자가 (open valences)의 총수까지의 범위의 수로 할로겐, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R'", -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시 및 플루오로(C1-C4)알킬로부터 선택되며, 여기에서 R', R", R'" 및 R""가 바람직하게는 수소, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된다. 예를 들어, 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R기를 포함할 경우, 각각의 R', R", R'" 및 R"" 기가 이들의 기중 하나 이상으로 존재할 경우와 같이 그 R기의 각각은 독립하여 선택된다. 아래의 스킴(scheme)에서 기호 X는 위에서 설명한 바와 같이 "R"을 나타낸다.
아릴 환 또는 헤테로아릴 환의 인접 원자 상의 치환기 중 2개는 식 -T-C(O)-(CRR')q-U-의 치환기에 의해서 경우에 따라 선택적으로 치환시킬 수 있다. 이 식에서 T 및 U는 독립적으로 -NR-, -O-, -CRR'- 또는 단일결합이며, q는 0 내지 3의 정수이다. 또, 아릴 환 또는 헤테로아릴 환의 인접 원자 상의 치환기 중 2개는 식 -A-(CH2)r-B-의 치환기에 의해서 경우에 따라 선택적으로 치환시킬 수 있다. 이 식에서 A 및 B는 독립적으로 -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'- 또는 단일결합이며, r은 1 내지 4의 정수이다. 이와 같이 형성된 새로운 환의 단일결합 중의 하나는 하나의 이중결합에 의해서 선택적으로 경우에 따라 치환시킬 수 있다. 또, 아릴 환 또는 헤테로아릴 환의 인접 원자 상의 치환기 중 2개는 식 -(CRR')s-X-(CR"R'")d-의 치환기에 의해서 경우에 따라 선택적으로 치환시킬 수 있다. 이 식에서 s 및 d는 독립적으로 0 내지 3의 정수이고, X는 -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, 또는 -S(O)2NR'-이다. 치환기 R, R', R" 및 R'"가 바람직하게는 수소, 또는 치환 또는 비치환 (C1-C6)알킬에서 독립적으로 선택된다.
본 발명 명세서에서 사용된 용어 "헤테로원자"는 산소 (O), 질소 (N), 황 (S) 및 실리콘 (Si)을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명은 G-CSF 상의 글리칸 구조를 수식하기 위한 방법을 포함한다. G-CSF는 활성화 T-세포, 대식세포, 내피세포 및 기질성 섬유아세포에 의해서 생성되는 사이토카인으로서 이 기술분야에서 잘 알려져 있다. G-CSF는 주로 골수에 작용하여 염증성 백혈구의 생성을 증가시키고, 또 내분비 호르몬으로 작용하여 염증작용 중에 소비된 호중구의 보충을 개시시킨다. 또 G-CSF는 화학요법 이후의 골수 치환에 있어서도 임상적인 적용을 갖는다.
본 발명은 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF)의 콘쥬게이트을 제공한다. 본 발명은 과립구 콜로니 자극활성을 갖는 글리코실화 펩티드 및 비글리코실화 펩티드의 콘쥬게이트를 제공한다. 이들의 콘쥬게이트는 치료 효과를 가지는 부분, 진단용 부분, 표적성 부분 등 다양한 화학종과 더 결합함으로써 더 수식할 수 있다.
또, 본 발명은 G-CSF를 리모델링(remodeling) 및/또는 수식하기 위한 방법을 포함한다. G-CSF는 다수의 질환의 치료에 있어서 유용한 수단이나, 위에서 설명한 바와 같이 그 임상적 유효성은 그 약물 통태가 상대적으로 나쁘기 때문에 방해를 받는다.
예시적 구체예에서, 본 발명의 G-CSF 펩티드는 원인에 관계없이 중증(severe)의 만성 백혈구 감소증 또는 상대적 백혈구 감소증을 치료할 목적으로 말초혈 전구 세포이식(peripheral blood progenitor cell transplantation)에서 수집하기 위한 전구 세포를 가동하기 위해, 또 급성 골수성 백혈병 환자의 치료를 지원하기 위해, 방사선 요법, 화학요법 및 골수 이식 중 어느 타입을 받고 있는 암 환자에 있어서 감염증을 예방할 목적으로 환자에 투여할 수 있다. 또, 본 발명의 폴리펩티드 콘쥬게이트 또는 폴리펩티드 조성물은 AIDS 또는 다른 면역부전 질환 및 세균 감염증의 치료에 사용할 수 있다.
G-CSF는 클로닝되고 서열 결정되어 있다. 하나의 예시적 구체예에서, G-CSF는 서열번호 1에 의해 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명은 위에서 설명한 바와 같이 G-CSF의 변이체로서 본 명세서에서 나타낸 서열에 한정되어 있는 것이 아님을 당업자들은 용이하게 이해할 것이다.
따라서, 본 발명은 본 기술분야에서 잘 알려진 바와 같이 G-CSF 변이체를 더 포함한다. 어떤 식으로든 본 발명에 대한 제한을 의미하는 것은 아니나, 예로서 G-CSF 변이체가 미국 특허 제 6,166,183 호 명세서에 기술되어 있는바, 여기에서는 리신 잔기의 천연 보체(natural complement)를 포함하며, 하나 또는 두개의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 더 결합되어 있는 G-CSF가 기재되어 있다. 또, 미국 특허 제 6,004,548호, 제5,580,755호, 제5,582,823호,및 제5,676,941호의 명세서에서는 17, 36, 42, 64 및 74 위치에서 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기가 알라닌, 또는 그 대신으로 세린에 의해 치환되어 있는 G-CSF 변이체가 기재되어 있다. 미국 특허 제 5,416,195 호 명세서에는 17 위치의 시스테인, 27 위치의 아스파르트산 및 65 및 66 위치의 세린이 각각 세린, 세린, 프롤린 및 프롤린으로 치환되어 G-CSF 분자가 기재되어 있다. 다른 변이체는 본 기술분야에서 주지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제 5,399,345호 명세서에 기재되어 있다. 또 다른 변이체는 서열번호 3~11로부터 선택된 하나의 아미노산을 가진다.
본 발명의 수식된 G-CSF 분자의 발현 및 활성은 이 기술분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제 4,810,643호 명세서에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 분석시험할 수 있다. 예로서, 활성은 방사능-표지를 한 티미딘의 흡수 아세이를 사용하여 측정할 수 있다. 간단하게 말하면, 건강한 제공자로부터 얻은 인간 골수를, 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque; 1.077 g/ml)(미국 NJ,Piscataway 소재의 제조업자 Pharmacia 제품)를 사용한 밀도분리(density cut)에 처리하여 저밀도의 세포를 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum), 글루타민 및 항생물질을 함유하는 이스코브 배지(Iscove's medium)(GIBCO, La Jolla, CA)에 현탁시킨다. 약 2×104개의 사람 골수세포를, 약 37℃, 대기중의 CO2 농도 5%에서 약 2일간 96웰(well)의 평저 플레이트(flat bottom plates)에 넣은 대조 배지(control medium) 또는 본 발명의 G-CSF와 함께 배양한다. 그 다음, 배양물을 0.5 μCi/웰의 3H-티미딘 (New England 회사; 미국 Mass, Boston 소재)으로 약 4시간 동안 펄스 표지하고, 예로서 문헌(Ventua, et al.; 1983, Blood 61:781)에서 기술된 바와 같이 하여 얻어진 량(uptake)을 측정하였다. 대조화합물로 처리한 골수세포와 비교할 때 사람 골수세포 중 3H-티미딘의 혼입의 증가는 활성이며 생존가능한 G-CSF 화합물의 지표가 된다.
위 설명에서와 같이, 본 발명의 콘쥬게이트는 수식된 당을 글리코실화 또는 비글리코실화 G-CSF 펩티드에 효소적으로 결합을 함으로써 형성된다. 그 수식된 당은 G-CSF 펩티드와 그 당 상의 수식기 사이에 삽입되는 경우 예로서, "완전한 글리코실 결합기"로 본 명세서에서 불릴 수 있는 것으로 된다. 글리코실트랜스퍼라아제 등 효소의 정교한 선택성을 이용하여, 본 발명의 방법은 하나 또는 그 이상의 특이적 위치에 바람직한 하나의 기를 갖는 펩티드를 제공한다. 따라서, 본 발명에 의해 수식된 당은 G-CSF 펩티드 사슬 상의 선택된 위치에 직접 결합되거나, 또는 그 대신으로 수식된 당은 글리코펩티드의 당 부분 상에 부가된다. 수식된 당이 글리코펩타이드의 당에 그리고 직접 G-CSF 펩티드 골격의 아미노산 잔기에 모두 결합된 펩티드도 본 발명의 범위 내에 있다.
공지의 화학적 및 효소적 펩티드 합성전략과는 대조적으로, 본 발명의 방법은 실질적으로 균일한 유도체화 패턴을 갖는 글리코펩티드와 펩티드를 구축하는 것을 가능하게 한다. 즉, 본 발명에서 사용하는 효소는 일반적으로 G-CSF 펩티드의 특정한 어느 아미노산 잔기 또는 복수의 아미노산 잔기의 조합물에 대하여 선택적이다. 또 이 방법은 수식된 펩티드 및 글리코펩티드의 대규모의 다량 생산도 실용적이다. 따라서, 본 발명의 방법은 사전에 선택된 균일한 유도체화 패턴을 가진 글리코펩티드의 대량 제조를 위한 실용적인 수단을 제공한다. 이 방법은 세포배양용 세포(예를 들어, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 진균 세포, 효모 세포, 또는 원핵세포) 또는 형질 전환한(transgenic) 식물 또는 동물 중에서 생성할 때 불완전하게 글리코실화되는 글리코펩티드를 포함하여(이것으로 제한되지는 않는다) 치료 펩티드를 수식하는데 특히 적합하다.
또, 본 발명은 예를 들어, 클리어런스 속도(clearance rate)의 감소에 의해, 또는 면역 또는 망상내피계(reticuloendothelial system)(RES)에 의한 취득의 속도(rate of uptake)의 감소에 의해 치료 효과의 반감기를 연장한 글리코실화 G-CSF 펩티드 및 비글리코실화 G-CSF 펩티드의 콘쥬게이트를 제공한다. 또, 본 발명의 방법은 펩티드 상의 항원 결정기(antigenic determinats)를 마스킹(masking)하여, 이것에 의해 그 펩티드에 대한 숙주의 면역 응답을 감소 또는 소실시키는 수단을 제공한다. 또, 표적성 작용물질의 선택적 부가도 특정의 표적성 작용물질에 특이적인 하나의 특정의 조직 또는 세포표면 수용체에 펩티드를 유도하는데 사용할 수 있다.
콘쥬게이트(conjugates)
제 1 국면에서, 본 발명은 하나의 선택된 수식기(modifying group)와 G-CSF 펩티드와의 콘쥬게이트를 제공한다.
그 G-CSF 펩티드와 선택된 부분 사이의 결합은 그 펩티드와 그 선택된 부분 사이에 개재되어 있는 완전한 글리코실 결합기를 포함한다. 본 명세서에서 설명한 바와 같이, 그 선택된 부분은 당 단위에 결합을 할 수 있어, 그 결과 수식된 당을 G-CSF 펩티드에 부가시키는 적합한 트랜스퍼라아제 효소에 의해 인식되는 "수식된 당"(modified sugar)을 생성할 수 있는 본질적으로 임의의 화학종이다. 그 수식된 당의 당 부분은 그 G-CSF 펩티드와 선택된 부분 사이에 기재되어 있을 때 "완전한 글리코실 결합기"로 된다. 그 완전한 글리코실 결합기는 선택된 부분으로 수식시킨 후에 적합한 트랜스퍼라아제의 기질인 임의의 단당 또는 올리고당으로 형성된다.
본 발명의 콘쥬게이트는 통상적으로 아래의 식의 일반적인 구조에 대응하는 것으로 생각된다:
Figure 112010017920206-pct00081
위 식에서 기호 a, b, c, d 및 s는 0이 아닌 양의 정수를 나타내고; t는 0 또는 양의 정수이다. "작용물질"(agent)은 일반적으로 수용성 부분, 예를 들어, PEG 부분이다. 링커(linker)는 아래 기재의 여러 가지 결합기 중 임의의 것으로 할 수 있다. 또 그 대신, 링커는 단일결합 또는 "0차 링커 (zero order linker)"로 할 수 있다.
예시적 구체예에서, 그 선택된 수식기는 수용성 폴리머, 예를 들어, m-PEG이다. 그 수용성 폴리머는 G-CSF 펩티드의 아미노산 잔기 또는 글리코실 잔기에 공유 결합되어 있는 글리코실 결합기를 통해 G-CSF 펩티드에 공유 결합되어 있다. 또, 본 발명은 아미노산 잔기와 글리코실 잔기가 글리코실 결합기로 수식되어 있는 콘쥬게이트를 제공한다.
하나의 예시적인 수용성 폴리머는 폴리(에틸렌 글리콜), 예를 들어, 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)이다. 본 발명에서 사용된 폴리(에틸렌 글리콜)은 어느 특정의 형태 또는 분자량 범위로 제한되지 않는다. 비분지상 폴리(에틸렌 글리콜) 분자의 경우, 그 분자량이 바람직하게는 500 ~ 100,000이다. 분자량 2,000-60,000이 바람직하게 사용되며, 분자량 약 5,000 ~ 약 30,000이 더 바람직하게 사용된다.
또 다른 구체예에서, 폴리(에틸렌 글리콜)은 하나 이상의 PEG 부분이 결합되어 있는 분지상 PEG이다. 분지상 PEG의 예는 미국 특허 제 5,932,462 호; 미국 특허 제 5,342,940 호; 미국 특허 제 5,643,575 호; 미국 특허 제 5,919,455 호; 미국 특허 제 6,113,906 호; 미국 특허 제 5,183,660 호; WO 02/09766; 문헌 [Kodera Y., Bioconjugate Chemistry 5: 283-288 (1994)] 및 문헌[Yamasaki et al., Agric. Biol. Chem., 52: 2125-2127, 1998]에 기술되어 있다. 다른 유용한 분지상 PEG 구조가 본 명세서에 개시되어 있다.
예시적 구체예에서, 분지상 PEG의 각각의 폴리(에틸렌 글리콜)의 분자량은 약 2,000, 5,000, 10,000, 15,000, 20,000, 40,000 또는 60,000 달톤 또는 그 이상이다.
본 발명의 펩티드는 적어도 하나의 N-결합형 또는 O-결합형 글리코실 부위를 포함한다. 효소에 의해 부가되는 글리코실 결합기를 통해 형성되는 콘쥬게이트를 제공하는 것 이외에, 본 발명의 콘쥬게이트의 집단 전체에 걸쳐 수식된 당 부분의 거의 전부가 구조적으로 동일한 아미노산 잔기 또는 글리코실 잔기의 복수의 코피(copy)에 결합되어 있는 펩티드 콘쥬게이트를 형성할 수 있다. 따라서, 제 2의 국면(aspect)에서, 본 발명은 완전한 글리코실 결합기를 통해 G-CSF 펩티드에 공유 결합되어 있는 수용성 폴리머 부분의 집단을 가진 펩티드 콘쥬게이트를 제공한다. 본 발명의 하나의 바람직한 콘쥬게이트에서는 그 집단의 거의 전부의 각각의 멤버(member)는 글리코실 결합기를 통해 G-CSF 펩티드의 글리코실 잔기에 결합되어 있으며, 글리코실 결합기가 결합되어 있는 G-CSF 펩티드의 각각의 글리코실 잔기는 동일한 구조를 가진다.
또, 수용성 폴리머 부분의 집단이 글리코실 결합기를 통해 공유 결합되어 있는 펩티드 콘쥬게이트도 제공된다. 하나의 바람직한 구체예에서, 수용성 폴리머 부분의 집단의 거의 전부의 멤버는 글리코실 결합기를 통해 그 G-CSF 펩티드의 아미노산 잔기에 결합되며, 글리코실 결합기가 결합되어 있는 각각의 아미노산 잔기는 동일한 구조를 가진다.
또, 본 발명은 G-CSF 펩티드가 완전한 글리코실 결합기를 통해 치료 효과를 가지는 부분, 진단용 부분, 표적성 부분, 독성 부분 등에 결합되어 있는, 위에서 설명한 것과 유사한 콘쥬게이트를 제공한다. 위에서 설명한 각각의 부분은 소분자(small molecule), 천연 폴리머(예로서, 폴리펩티드) 또는 합성 폴리머로 할 수 있다.
임의의 서열을 가진 임의의 과립구 콜로니 자극인자 펩티드 또는 작용물질이 본 발명의 콘쥬게이트의 펩티드 성분으로서 유용하다. 과립구 콜로니 자극인자는 클로닝되어 서열결정 된다. 예시적 구체예에서, 그 G-CSF 펩티드는 다음의 서열번호 1로 나타낸 서열을 가진다:
Figure 112010017920206-pct00082
또 다른 예시적 구체예에서, 그 G-CSF 펩티드는 다음의 서열번호 2로 나타낸 서열을 가진다:
Figure 112010017920206-pct00083
또 다른 예시적 구체예에서, 그 G-CSF 펩티는 다음의 서열번호 3~11로 나타낸 서열을 가진다:
Figure 112010017920206-pct00084
Figure 112010017920206-pct00085
Figure 112010017920206-pct00086
본 발명이 본 명세서에서 나타낸 서열로 한정하는 것은 결코 아니다.
하나의 예시적인 구체예에서, 본 발명의 G-CSF 펩티드는 PEG 부분을 포함하는 글리코실 잔기에 의해서 글리코실화된 적어도 하나의 O-결합형 글리코실화 부위를 포함한다. 그 PEG는 완전한 글리코실 결합기를 통해 G-CSF 펩티드에 공유 결합되어 있다. 그 글리코실 결합기는 G-CSF 펩티드의 아미노산 잔기 또는 글리코실 잔기에 공유 결합된다. 그 대용으로, 글리코실 결합기는 글리코펩티드의 하나 또는 그 이상의 글리코실 단위에 결합된다. 또, 본 발명은 글리코실 결합기가 아미노산 잔기와 글리코실 잔기 둘 다에 결합되어 있는 콘쥬게이트를 제공한다.
그 PEG 부분은 직접 또는 비-글리코실 링커, 예를 들어, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬을 통해 완전한 글리코실 링커에 결합되어 있다.
하나의 바람직한 예시적 구체예에서, 그 G-CSF 펩티드는 다음 식 I의 구조를 가진 부분을 포함한다:
Figure 112010017920206-pct00087
상기 식에서, D는 -OH 및 R1-L-HN-에서 선택한 하나의 멤버(member)이며; G는 R1-L- 및 -C(O)(C1-C6)알킬에서 선택한 하나의 멤버이고; R1은 직쇄상 또는 분지상 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 포함하는 하나의 부분(moiety)에서 선택한 하나의 멤버를 포함하는 하나의 부분이며; L은 결합, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬에서 선택한 하나의 멤버인 링커(linker)이며, D가 OH인 경우, G는 R1-L-이며, G가 -C(O)(C1-C6)알킬인 경우, D는 R1-L-NH-이다. 본 명세서에 나타낸 수식된 시알산 구조에서, COOH는 COO- 및/또는 그 염을 나타낸다.
하나의 구체예에서, R1-L은 다음 식의 구조를 가진다:
Figure 112006039150479-pct00010
위 식에서, a는 0 ~ 20의 정수이다.
하나의 예시적인 구체예에서, R1은 다음 식에서 선택한 하나의 멤버인 구조를 가진다:
Figure 112010017920206-pct00088
위 식에서, e 및 f는 1 ~ 2500에서 각각 독립적으로 선택되는 정수이며; q는 1 ~ 20의 정수이다. 다른 구체예에서, R1은 다음 식에서 선택한 하나의 멤버인 구조를 가진다:
Figure 112010017920206-pct00089
위 식에서 e, f 및 f'는 1 ~ 2500에서 각각 독립적으로 선택되는 정수이며; q 및 q'는 1 ~ 20에서 독립적으로 선택되는 정수이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 R1이 다음 식에서 선택되는 하나의 멤버인 구조를 가진 인자 IX 펩티드 콘쥬게이트를 제공한다:
Figure 112010017920206-pct00090
위 식에서 e, f 및 f'는 1 ~ 2500에서 각각 독립적으로 선택되는 정수이며; q, q' 및 q"는 1 ~ 20에서 각각 독립적으로 선택되는 정수이다.
또 다른 구체예에서, R1은 다음 식에서 선택되는 하나의 멤버인 구조를 가진다:
Figure 112010017920206-pct00091
위 식에서, e 및 f는 1 ~ 2500에서 각각 독립적으로 선택되는 정수이다.
또 다른 예시적 구체예에서, 본 발명은 다음 식을 가진 부분을 포함하는 펩티드를 제공한다:
Figure 112006039150479-pct00015
위 식에서, Gal은 아미노산에 결합할 수 있거나, 또는 직접 또는 간접적으로(예로서, 글리코실 잔기를 통해서) 아미노산에 결합되어 있는 글리코실 잔기에 결합할 수도 있다.
다른 구체예에서, 그 부분은 아래에 나타낸 식을 가진다:
Figure 112006039150479-pct00016
위 식에서, GalNac는 아미노산에 결합할 수 있거나, 또는 직접 또는 간접적으로 (예를 들어, 글리코실 잔기를 통해서) 아미노산에 결합되어 있는 글리코실 잔기에 결합할 수도 있다.
추가의 또 다른 예시적 구체예에서, 그 펩티드는 아래에 나타낸 식에 의한 부분을 포함한다:
Figure 112006039150479-pct00017
위 식에서, AA는 상기 펩티드의 아미노산 잔기이며, 위 식의 구조체의 각각에서 D 및 G는 본 발명의 명세서에서 기술된 것과 같다.
상기 화학종 중 1종 또는 그 이상이 결합될 수 있는 G-CSF 펩티드의 예시적인 아미노산 잔기는 세린 및 트레오닌, 예를 들어, 서열번호 1의 트레오닌 133이 포함된다.
또 다른 예시적 구체예에서, 본 발명은 다음 식을 가진 글리코실 잔기를 포함하는 G-CSF 콘쥬게이트를 제공한다:
Figure 112006039150479-pct00018
위 식에서, a, b, c, d, i, r, s, t 및 u는 0 및 1에서 각각 독립하여 선택되는 정수이다. 지수 q는 1이다. 지수 e, f, g 및 h는 0 ~ 6의 정수에서 각각 독립하여 선택된다. 지수 j, k, l 및 m은 0 ~ 100의 정수에서 각각 독립하여 선택된다. 지수 v, w, x 및 y는 0 ~ 1에서 각각 독립하여 선택되며, v, w, x 및 y 중의 적어도 하나는 1이다. 기호 AA는 G-CSF 펩티드의 아미노산 잔기를 나타낸다.
기호 Sia-(R)은 다음 식을 가진 기를 나타낸다:
Figure 112006039150479-pct00019
위 식에서, D는 -OH 및 R1-L-HN-에서 선택된다. 기호 G는 R1-L- 또는 -C(O)(C1-C6)알킬을 나타낸다. R1은 직쇄상 또는 분지상 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 포함하는 부분을 나타낸다. L은 결합, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬에서 선택되는 멤버(member)인 링커(linker)이다. 일반적으로, D가 OH인 경우 G는 R1-L-이며, G가 -C(O)(C1-C6)알킬인 경우 D는 R1-L-NH-이다.
또 다른 예시적 구체예에서, 본 발명의 콘쥬게이트 중의 PEG-수식된 시알산 부분은 다음 식을 가진다:
Figure 112006039150479-pct00020
위 식에서, 지수 "s"는 0 ~ 20의 정수를 나타내고, n은 1 ~ 2500의 정수이다. 하나의 바람직한 구체예에서, s는 1이고, m-PEG 부분은 약 20 kD의 분자량을 가진다.
또 다른 추가의 예시적 구체예에서, PEG-수식된 시알산 부분은 다음 식을 가진다:
Figure 112006039150479-pct00021
위 식에서, L은 시알산 부분과 PEG 부분을 결합하는 치환 또는 비치환 알킬 또는 치환 또는 비치환 헤테로알킬 링커 부분이다.
하나의 바람직한 구체예에서는 적어도 2개, 바람직하게는 3개, 더 바람직하게는 4개의 상기 아스파라긴 잔기가 위에서 나타낸 N-결합형 글리칸 사슬에 의해서 기능적 작용을 한다.
본 발명의 콘쥬게이트는 일가 또는 다가 (예를 들어, 안테나 구조)인 완전한 글리코실 결합기를 포함한다. 따라서, 본 발명의 콘쥬게이트는 하나의 선택된 부분이 일가의 글리코실 결합기와 다가의 결합기를 통해 펩티드에 결합되어 있는 양쪽의 화학종을 포함한다. 또, 본 발명에서는 하나 이상의 선택된 부분이 다가의 결합기를 통해 펩티드에 결합되어 있는 콘쥬게이트인 것도 포함된다.
수식된 당(modified sugars)
본 발명은 수식된 당, 수식된 당 뉴클레오티드 및 그 수식된 당의 콘쥬게이트를 제공한다. 본 발명의 수식된 당 화합물에 있어서, 당 부분이 바람직하게는 당, 데옥시당, 아미노당, 또는 N-아실 당이다. 용어 "당" 및 그 동의 용어 "사카릴", "당" 및 "글리코실"은 모노머, 다이머(dimers), 올리고머 및 폴리머를 의미한다. 또 그 당 부분도, 수식기에 의해서 기능적 작용을 한다. 수식기는 일반적으로, 그 당 상에서의 아민, 술프하이드릴 또는 하이드록실, 예를 들어, 일급 하이드록실 부분과의 결합을 통해 그 당 부분에 결합되어 있다. 하나의 예시적인 구체예에서, 그 수식기는 당 상의 아민 부분을 통해, 예를 들어, 그 수식기의 반응성 유도체와 그 아민의 반응을 통해 형성된 아미드, 우레탄 또는 우레아를 통해 결합되어 있다.
임의의 어떤 당이라도 본 발명의 콘쥬게이트의 당 코어로서 이용할 수 있다. 본 발명의 조성물을 형성하는데 유용한 예시적인 당 코어에는 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 퓨코오스 및 시알산이 포함되나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 다른 유용한 당에는 글루코사민, 갈락토사민, 만노사민, 시알산의 5-아민 유사체 등 아미노 당이 포함된다. 그 당 코어는 천연으로 존재하는 구조체이거나, 또는 수식기를 결합하기 위한 부위를 제공하도록 수식할 수 있다. 예를 들어, 하나의 구체예에서 본 발명은 9-하이드록시 부분이 아민으로 치환된 시알산 유도체를 포함하는 펩티드 콘쥬게이트를 제공한다. 그 아민은 하나의 선택된 수식기의 활성화 유사체로 용이하게 유도체화 된다.
아래의 설명에서, 시알산의 선택된 유도체의 사용을 참조하여 본 발명을 예시한다. 설명의 초점은 설명을 명확히 하기 위한 것이며, 설명한 구조체 및 조성물은 일반적으로 당기, 수식된 당기, 활성화된 수식된 당기 및 수식된 당기의 콘쥬게이트의 종류 전체에 걸쳐 적용할 수 있다는 것은 이 기술분야의 당업자에 의해 이해할 수 있을 것이다.
하나의 예시적인 구체예에서, 본 발명은 다음 식을 가진 수식된 당 아민을 포함하는 하나의 펩티드 콘쥬게이트를 제공한다:
Figure 112006039150479-pct00022
위 식에서, G는 글리코실 부분이고, L은 결합 또는 링커(linker)이며, R1은 수식기이다. 예시적인 결합은 글리코실 부분 상의 NH2와 수식기 상에서 상보적으로 반응하는 기 사이에서 형성된 것이다. 따라서, 예시적인 결합에는 NHR1, OR1, SR1 등이 포함되나, 이들로 한정되어 있는 것은 아니다. 예를 들어, R1이 카르복실산 부분을 포함하는 경우, 이 부분은 활성화되고 글리코실 잔기 상의 NH2 부분과 결합되어 NHC(O)R1의 구조를 가진 결합을 형성할 수 있다. 동일하게, OH 및 SH 기는 각각 대응하는 에테르 또는 티오에테르 유도체로 전환시킬 수 있다.
예시적인 링커로는 알킬 및 헤테로알킬 부분이 포함된다. 그 링커에는 결합기, 예를 들어, 아실-기재 결합기, 예로서, -C(O)NH-, -OC(O)NH- 등이 포함된다. 그 결합기는 본 발명의 화학종의 성분 사이에서, 예를 들어, 글리코실 부분과 링커 (L) 사이에서, 또는 그 링커와 수식기(R1) 사이에서 형성된 결합이다. 다른 결합기는 에테르, 티오에테르 및 아민이다. 예를 들어, 하나의 구체예에서 그 링커는 글리신 잔기 등 아미노산 잔기이다. 그 글리신의 카르복실산 부분은 글리코실 잔기 상의 아민과의 반응에 의해서 그 대응하는 아미드로 전환되며, 그 글리신의 아민은 그 수식기의 활성화된 카르복실산 또는 카르보네이트와의 반응에 의해서 그 대응하는 아미드 또는 우레탄으로 전환된다.
또 다른 예시적인 링커에는 PEG 부분, 또는 아미노산 잔기로 기능적으로 작용화시킨 PEG 부분이다. 그 PEG는 한쪽의 PEG 말단에서 아미노산 잔기를 통해서 글리코실 기에 결합되고, 다른 한쪽의 PEG 말단을 통해 R1에 결합되어 있다. 또는 그 대신, 그 아미노산 잔기가 R1에 결합되고, 그 아미노산에 결합되지 않은 PEG 말단이 글리코실 기에 결합된다.
NH-L-R1에 대한 예시적인 화학종은 다음 식을 가진다:
-NH{C(O)(CH2)aNH}s{C(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNH}tR1
위 식에서, 지수 s 및 t는 각각 독립하여 0 또는 1이다. 지수 a, b 및 d는 각각 독립하여 0 ~ 20의 정수이며, c는 1 ~ 2500의 정수이다. 다른 유사한 링커는 예로서 -S, -O 및 -CH2로 -NH 부분이 치환되는 화학종을 기재로 한다.
본 발명은 더 구체적으로 말하면 NH-L-R1이 아래에 나타낸 화합물을 포함하는 펩티드 콘쥬게이트를 제공한다: NHC(O)(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1, NHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNH-R1, NHC(O)O(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1, NH(CH2)aNHC (O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNH-R1, NHC(O)(CH2)aNHR1, NH(CH2)aNHR1 및 NHR1. 위 식에서, 지수 a, b 및 d는 서로 독립하여 0 ~ 20, 바람직하게는 1 ~ 5의 정수에서 선택된다. 지수 c는 1 ~ 2500의 정수이다.
예시적인 구체예에서, G는 시알산이며, 본 발명의 선택된 화합물은 다음에 나타낸 식을 가진다:
Figure 112010017920206-pct00092
이 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해 이해할 수 있는 바와 같이, 위의 예시적 화합물 중 시알산 부분은 글루코사민, 갈락토사민, 만노사민, 이들의 N-아세틸 유도체 등을 포함하여(단, 이들로 제한되지는 않는다) 다른 임의의 아미노당으로 치환시킬 수 있다.
또 다른 예시적 구체예에서, 그 당의 제일급 하이드록실 부분은 그 수식기로 기능적으로 작용화된다. 예를 들어, 시알산의 9-하이드록실은 그 대응하는 아민으로 전환되고, 기능적으로 작용화되어 본 발명에 의한 화합물을 얻을 수 있다. 이 구체예에 의한 식은 아래에 나타낸 것을 포함한다:
Figure 112010017920206-pct00093
추가의 예시적인 구체예에서, 본 발명은 6-하이드록실 위치가 그 대응하는 아민부분으로 전환되는 수식된 당을 포함하며, 위에서 설명한 것 등 하나의 링커-수식기 카세트를 가진 펩티드 콘쥬게이트를 제공한다. 이들의 수식된 당의 코어로서 사용될 수 있는 예시적인 사카릴기에는 Gal, GalNAc, Glc, GlcNAc, Fuc, Xyl, Man 등이 포함된다. 이 구체예에 의한 대표적인 수식된 당은 다음에 나타낸 식을 가진다:
Figure 112006039150479-pct00025
위 식에서, R3-R5 및 R7은 H, OH, C(O)CH3, NH, 및 NH C(O)CH3에서 각각 독립적으로 선택되는 멤버이다. R6는 위에서 설명한 바와 같이 OR1, NHR1 또는 NH-L-R1이다.
본 발명의 선택된 콘쥬게이트는 만노오스, 갈락토오스 또는 글루코오스, 또는 만노오스, 갈락토오스 또는 글루코오스의 공간적 배치를 가진 화학종을 기재로 한다. 이들의 콘쥬게이트의 일반식은 다음과 같다:
Figure 112010017920206-pct00094
또 다른 예시적인 구체예에서, 본 발명은 그 대응하는 뉴클레오티드 당으로서 활성화되는 위 설명에서와 같은 화합물을 제공한다. 그들의 수식된 형태로 본 발명에서 사용되는 예시적인 당 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 모노-, 디- 또는 트리포스페이트 또는 이들의 유사체가 포함된다. 하나의 바람직한 구체예에서, 그 수식된 당 뉴클레오티드는 UDP-글리코사이드, CMP-글리코사이드 또는 GDP-글리코사이드에서 선택된다. 더 바람직하게는, 수식된 당 뉴클레오티드의 당 뉴클레오티드 부분은 UDP-갈락토오스, UDP-갈락토사민, UDP-글루코오스, UDP-글루코사민, GDP-만노오스, GDP-푸코오스, CMP-시알산 또는 CMP-NeuAc에서 선택된다. 하나의 예시적 구체예에서, 그 뉴클레오티드 포스페이트는 C-1에 결합되어 있다.
따라서, 글리코실 부분이 시알산인 예시적 구체예에서, 본 발명은 아래의 식을 가진 화합물을 사용하여 형성된 펩티드 콘쥬게이트를 제공한다:
Figure 112010017920206-pct00095
위 식에서, L-R1은 위 설명에서와 같으며, L1-R1은 수식기에 결합된 하나의 링커를 나타낸다. L의 경우에서와 같이, L1으로 나타낸 링커 종은 결합, 알킬 또는 헤테로알킬 부분이 포함된다. 이들의 구체예에 따르는 수식된 당 뉴클레오티드 화합물을 도 1 및 도 2에서 나타낸다.
또 다른 예시적 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 수식된 당과 기질, 예로서, 펩티드, 지질, 아글리콘 등의 사이에서, 더 구체적으로는 수식된 당과 글리코펩티드 또는 당지질의 글리코실 잔기 사이에서 형성된 하나의 콘쥬게이트를 제공한다. 이 구체예에서, 그 수식된 당의 당 부분은 기질과 수식기 사이에 개재된 글리코실 결합기로 된다. 하나의 예시적인 글리코실 결합기는 결합기를 형성하는 하나 또는 그 이상의 글리코실 부분이 화학물질(예를 들어, 소듐메타퍼요오데이트) 또는 효소적 프로세스(예를 들어, 옥시다아제)에 의해서 분해되지 않은 완전한 글리코실 결합기이다. 본 발명의 선택된 콘쥬게이트는 아미노당, 예를 들어, 만노사민, 글루코사민, 갈락토사민, 시알산 등의 아민 부분에 결합되어 있는 수식기를 포함한다. 이러한 모티프(motif)에 따르는 예시적인 수식기-완전한 글리코실 결합기 카세트는 아래의 식을 가진 구조등 시알산의 구조를 기재로 한다:
Figure 112010017920206-pct00096
위 식에서, R1, L1 및 L2는 상술한 바와 같다.
또 다른 추가의 예시적 구체예에서, 그 콘쥬게이트는 기질과, 수식기가 사카릴 부분의 6-탄소 위치에서 링커를 통해서 결합되어 있는 사카릴 부분의 1-위치와의 사이에서 형성된다. 따라서, 이 구체예에 따르는 예시적인 콘쥬게이트는 다음 식을 가진다:
Figure 112010017920206-pct00097
위 식에서, 래디컬들은 위에서 설명한 바와 같다. 숙련된 전문가는 위에서 설명한 수식된 사카릴 부분이 2, 3, 4, 또는 5 위치의 탄소원자에서 기질에 결합될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
이러한 구체예에서 예시적인 화합물에는 다음 식을 갖는 화합물이 포함된다:
Figure 112010017920206-pct00098
위 식에서, R 기 및 지수들은 위에서 설명한 바와 같다.
또, 본 발명은 6-탄소 위치에서 L-R1으로 수식된 당 뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 구체예에 따르는 예시적인 화학종에는 다음 것을 포함한다:
Figure 112010017920206-pct00099
위 식에서, R 기 및 L은 위의 설명에서와 같은 부분을 나타낸다. 지수 "y"는 0, 1 또는 2이다.
본 발명의 추가의 예시적인 뉴클레오티드 당은 GDP 만노오스의 공간적 배치를 가진 화학종을 기재로 한다. 이 구체예에 따르는 예시적인 화학종은 아래에 나타낸 구조를 가진다:
Figure 112010017920206-pct00100
또 다른 예시적인 구체예에서, 본 발명은 UDP 갈락토오스의 공간적 배치를 기준(base)으로 하는 콘쥬게이트를 제공한다. 이 구체예에 따르는 예시적인 화합물은 아래에 나타낸 구조를 가진다:
Figure 112010017920206-pct00101
또 다른 예시적인 구체예에서, 뉴클레오티드 당은 글루코오스의 공간적 배치를 기준으로 한다. 이러한 구체예에 따르는 예시적인 화학종은 아래에 나타낸 식을 가진다:
Figure 112010017920206-pct00102
Figure 112006039150479-pct00035
수식기 R1은 수용성 폴리머, 수-불용성 폴리머, 치료 작용물질(agents), 진단용 작용물질 등을 포함하나, 한정되지 않는 다수의 화학종 중 임의의 화학종이다. 예시적인 수식기의 성질을 아래에서 구체적으로 설명한다.
수식기(modifying groups)
수용성 폴리머
다수의 수용성 폴리머가 이 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해 공지되어 있으며, 본 발명을 실시하는데 유용하다. 용어 수용성 폴리머는 당(예를 들어, 덱스트란, 아밀로오스, 히알루론산, 폴리(시알산), 헤파란, 헤파린 등); 폴리(아미노산), 예를 들어, 폴리(아스파르트산) 및 폴리(글루탐산); 핵산; 합성 폴리머[예를 들어, 폴리(아크릴산), 폴리(에테르), 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜)]; 펩티드, 단백질 등의 화학종을 포함한다. 본 발명은 임의의 수용성 폴리머를 사용하여 실시할 수 있으며, 유일한 제한조건은 콘쥬게이트의 나머지 부분이 결합될 수 있는 개소(point)를 그 폴리머가 포함할 필요가 있다는 점에 있다.
또, 폴리머의 활성화 방법은 특허문헌 WO 94/17039, 미국 특허 제 5,324,844 호, WO 94/18247, WO 94/04193, 미국 특허 제 5,219,564 호, 미국 특허 제 5,122,614 호, WO 90/13540, 미국 특허 제 5,281,698 호 및 WO 93/15189에서 확인할 수 있고, 활성화 폴리머와 펩티드, 예를 들어, 응고인자 VIII (WO 94/15625), 헤모글로빈 (WO 94/09027), 산소 운반분자 (미국 특허 제 4,412,989 호), 리보뉴클레아제 및 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (Veronese at al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-45 (1985))를 결합시키는 방법도 각 문헌에서 확인할 수 있다.
바람직한 수용성 폴리머는 폴리머의 샘플 중 상당한 비율의 폴리머 분자가 대략 동일한 분자 중량을 가진 것이며, 이러한 폴리머는 "균일 분산성 (homodisperse)"이다.
본 발명은 폴리(에틸렌 글리콜) 콘쥬게이트를 참조하여 더 예시한다. PEG의 작용화 및 결합에 대한 몇 가지 총체적 설명 및 연구논문을 입수하여 이용할 수 있다 [참조예: Harris, Macronol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995); 및 Bhadra, et al., Pharmazie, 57:5-29 (2002)]. 반응성 PEG 분자를 조제하며, 이 반응성 분자를 사용하여 콘쥬게이트를 형성시키는 수단은 이 기술분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,672,662호에서는 직쇄상 또는 분지상 폴리(알킬렌 옥사이드), 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀성 알코올) 및 폴리(아크릴로모르폴린)에서 선택된 폴리머 산의 활성 에스테르의 수용성이며 분리가능한 콘쥬게이트가 개시되어 있다.
미국 특허 제 6,376,604 호에서는 폴리머의 말단 하이드록실을 유기용매 중에서 디(1-벤조트리아조일)카르보네이트와 반응시킴으로써 수용성이며 비펩티드성인 폴리머의 수용성 1-벤조트리아졸릴카르보네이트 에스테르를 제조하는 방법이 기술되어 있다. 이 활성 에스테르를 사용하여 단백질 또는 펩티드 등 생물학으로 활성인 작용물질과의 콘쥬게이트를 형성시킨다.
특허문헌 WO 99/45964 명세서에서는 생물학적으로 활성인 작용물질과, 최소 하나의 말단이 안정한 결합에 의해 폴리머 골격에 결합되어 있는 하나의 폴리머 골격을 포함하는 활성화된 수용성 폴리머를 포함하는 하나의 콘쥬게이트에 있어서, 최소 하나의 말단은 근접한 반응성기(proximal reactive group)가 분기부분(branching moiety)에 결합되어 있는 하나의 분지부분을 포함하고, 생물학적으로 활성인 작용물질이 근접한 반응성기 중 최소 하나에 결합되어 있는 상기 콘쥬게이트에 대하여 기재되어 있다. 다른 분지상 폴리(에틸렌 글리콜)은 특허문헌 WO 96/21469 명세서에 기재되어 있으며, 미국 특허 제 5,932,462호 명세서에서는 반응성 작용기를 포함하는 하나의 분지상 말단을 포함하는 분지상 PEG 분자에 의해 형형성되어 있는 콘쥬게이트에 대하여 기재되어 있다. 단백질 또는 펩티드 등 생물학적으로 활성인 화학종과 반응하여 폴리(에틸렌 글리콜)과 생물학적으로 활성인 화학종 사이에서의 콘쥬게이트를 형성하기 위하여 유리 반응성기가 이용될 수 있다. 미국 특허 제 5,446,090호 명세서에서는 이작용성 PEG 링커 및 그 PEG 링커 말단 각각에 하나의 펩티드를 갖는 콘쥬게이트를 형성할 때 그 사용에 대하여 기재되어 있다.
분해성 PEG 결합을 포함하는 콘쥬게이트는 특허문헌 WO 99/34833; 및 WO 99/14259와 미국 특허 제 6,348,558호 명세서에서 기재되어 있다. 이러한 분해성 결합은 본 발명에서 적용할 수 있다.
당업자에 의해 인식되어 있는 위에서 설명한 폴리머 활성화의 방법은 본 발명에 있어서, 본 명세서에 기술된 분지상 폴리머를 형성할 때, 또 다른 화학종 예를 들어, 당, 당 뉴클레오티드 등에 이들의 분지상 폴리머를 결합할 때에도 유용하다.
본 발명에서 유용한 예시적인 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 다음 식을 가진 것이 포함되나, 이들로 한정되어 있는 것은 아니다:
Figure 112006039150479-pct00036
위 식에서, R8은 H, OH, NH2, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 예를 들어, 아세탈, OHC-, H2N-(CH2)q-, HS-(CH2)q, 또는 -(CH2)qC(Y)Z1이다. 지수 "e"는 1 ~ 2500의 정수를 나타낸다. 지수 b, d, 및 q는 각각 독립하여 0 ~ 20의 정수를 나타낸다. 기호 Z 및 Z1은 각각 독립하여 OH, NH2, 이탈기, 예를 들어, 이미다졸, p-니트로페닐, HOBT, 테트라졸, 할라이드, S-R9, 활성화된 에스테르의 알코올 부분; -(CH2)pC(Y1)V 또는 -(CH2)pU(CH2)sC(Y1)v를 나타낸다. 기호 Y는 H(2), =O, =S, =N-R10을 나타낸다. 기호 X, Y, Y1, A1 및 U는 각각 독립하여 부분 O, S, N-R11를 나타낸다. 기호 V는 OH, NH2, 할로겐, S-R12, 활성화된 에스테르의 알코올 성분, 활성화된 아미드의 아민 성분, 당-뉴클레오티드 및 단백질을 나타낸다. 지수 p, q, s 및 v는 0 ~ 20의 정수에서 각각 독립하여 선택된 멤버이다. 기호 R9, R10, R11 및 R12는 각각 독립하여 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로아릴을 나타낸다.
다른 예시적인 구체예에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 아래에 나타낸 것에서 선택된다:
Figure 112006039150479-pct00037
본 발명의 콘쥬게이트를 형성하는데 유용한 폴리(에틸렌 글리콜)은 직쇄상 또는 분지상이다. 본 발명에서 사용하는데 적합한 분지상 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에는 다음 식으로 나타낸 화합물을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다:
Figure 112006039150479-pct00038
위 식에서, R8 및 R8'는 상기 R8에 대해서 정의한 기들(groups)에서 각각 독립하여 선택된 멤버이다. A1 및 A2는 상기 A1에 대해서 정의한 기들에서 독립하여 선택된 멤버이다. 지수 e, f, o 및 q는 위 설명에서와 같다. Z 및 Y는 위 설명에서와 같다. X1 및 X1'는 S, SC(O)NH, HNC(O)S, SC(O)O, O, NH, NHC(O), (O)CNH 및 NHC(O)O, OC(O)NH에서 각각 독립하여 선택된 멤버이다.
다른 예시적인 구체예에서, 그 분지상 PEG는 시스테인, 세린 또는 디-리신 코어를 기재(base)로 한다. 따라서, 추가로 예시적인 분지상 PEG에는 다음 화합물이 포함된다:
Figure 112010017920206-pct00103
또 다른 구체예에서, 그 분지상 PEG 부분은 트리-리신 펩티드를 기재로 한다. 그 트리-리신은 모노-, 디-, 트리- 또는 테트라-PEG화될 수 있다. 이러한 구체예에 따르는 예시적인 화학종은 다음 식을 가진다:
Figure 112010017920206-pct00104
위 식에서, e, f 및 f'는 각각 독립하여 1 ~ 2500에서 선택되는 정수이며; q, q' 및 q"는 각각 독립하여 1 ~ 20에서 선택된 정수이다.
본 발명의 예시적인 구체예에서, 그 PEG는 m-PEG (5 kD, 10 kD 또는 20kD)이다. 하나의 예시적인 분지상 PEG 종은 세린- 또는 시스테인-(m-PEG)2이며, 여기에서 m-PEG는 20 kD m-PEG이다.
당업자에 의해 명백한 바와 같이, 본 발명에서 유용한 그 분지상 폴리머에는 위에서 설명한 취지를 기초로 한 변형체를 포함한다. 예로서, 위에서 나타낸 디-리신-PEG 콘쥬게이트는 3개의 폴리머 서브 유니트(polymeric subunits)를 포함할 수 있으며, 제 3의 것은 상기 구조에서 미수식으로 나타낸
Figure 112010017920206-pct00105
-아민에 결합된다. 동일하게, 3개 또는 4개의 폴리머 서브 유니트로 작용화(기능화)된 트리-리신의 사용도 본 발명의 범위 내에 포함되어 있는 것이다.
본 발명에 따르는 특정의 구체예에는 다음 식을 가진 화합물과,
Figure 112010017920206-pct00106
Figure 112006039150479-pct00042
아래에 나타낸 식의 화합물 등 이들의 화학종의 카르보네이트 및 활성 에스테르를 포함한다.
Figure 112010017920206-pct00107
본 발명 명세서에서 설명한 화합물을 제조하는데 유용한 직쇄상 PEG를 활성화시키는데 적합한 다른 활성화기 또는 이탈기에는 아래에 나타낸 화학종이 포함되나, 이들로 한정되어 있는 것은 아니다:
Figure 112010017920206-pct00108
이들 및 그 밖의 다른 화학종에 의해서 활성화되는 PEG 분자 및 그 활성화된 PEG를 제조하는 방법은 특허문헌 WO 04/083259 명세서에서 기술되어 있다.
당업자는 그 분지상 폴리머의 하나 또는 그 이상의 m-PEG 암(arms)이 하나의 상이한 말단, 예를 들어, OH, COOH, NH2, C2-C10-알킬 등을 가진 PEG 부분에 의해 치환시킬 수 있는 것으로 이해할 것이다. 또, 상기의 구조체는 α-탄소원자와 측쇄의 작용기 사이에 알킬 링커를 삽입함으로써 (또는 탄소원자를 제거함으로써) 용이하게 수식된다. 따라서, "호모"(homo) 유도체 및 고급 동족체와 저급 동족체는 본 발명에서 유용한 분지상 PEG의 코어의 범위내에 포함된다.
본 명세서에서 설명하는 분지상 PEG 종은 아래의 스킴(scheme)으로 나타낸 것 등의 방법에 의해 용이하게 제조된다:
Figure 112006039150479-pct00045
위 식에서, Xa는 O 또는 S이고, r은 1 ~ 5의 정수이다. 지수 e 및 f는 각각 독립하여 1 ~ 2500에서 선택되는 정수이다.
즉, 상기 스킴에 따라, 천연 또는 비천연 아미노산을 활성화된 m-PEG 유도체, 이 경우, 토실레이트와 접촉시켜, 측쇄 헤테로원자 Xa를 알킬화함으로써 1을 형성시킨다. 모노-작용화된 m-PEG 아미노산을 반응성 m-PEG 유도체와 함께 N-아실화 조건하에 처리시킴으로써 분지상 m-PEG 2를 구축한다. 당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 그 토실레이트 이탈기는 임의의 적합한 이탈기, 예를 들어, 할로겐, 메실레이트, 트리플레이트 등으로 교환할 수 있다. 동일하게, 아민을 아실화하는데 이용하는 반응성 카르보네이트는 활성 에스테르, 예를 들어, N-하이드록시숙신이미드 등으로 교환할 수 있거나, 또는 그 산은 디사이클로헥실카르보디이미드, 카르보닐디이미다졸 등 탈수제를 사용하여 현장(in situ)에서 활성화시킬 수 있다.
하나의 예시적인 구체예에서, 그 수식기는 PEG 부분이나, 임의의 수식기, 예를 들어, 수용성 폴리머, 수-불용성 폴리머, 치료 효과가 있는 부분 등을 적절한 결합을 통해 글리코실 부분에 혼입시킬 수 있다. 수식된 당은 효소적 수단, 화학적 수단 또는 이들의 조합에 의해서 형성됨으로써 수식된 당을 생성한다. 하나의 예시적인 구체예에서, 이들의 당은 수식부분의 결합을 가능하게 하며, 또 수식된 당을 G-CSF 펩티드에 결합할 수 있는 효소의 기질로서 그 당이 기능적 작용을 하도록 하는 임의의 위치에서 활성 아민으로 치환된다. 하나의 예시적인 구체예에서 갈락토사민이 수식된 당일 때 그 아민부분은 6-위치 탄소 원자에 결합된다.
수용성 폴리머로 수식된 화학종(water-soluble polymer modified species)
당 부분이 수용성 폴리머로 수식되어 있는, 수용성 폴리머로 수식된 뉴클레오티드당 종은 본 발명에서 유용하다. 하나의 예시적인 수식된 당 뉴클레오티드는 그 당상의 아민부분을 통하여 수식되어 있는 당기를 가진다. 수식된 당 뉴클레오티드, 예를 들어 당 뉴클레오티드의 사카릴-아민 유도체도 본 발명의 방법에서 유용하다. 예로서, 사카릴 아민(수식기가 결합되어 있지 않음)은 펩티드(또는 다른 화학종)에 효소에 의해 결합시키고, 이어서 그 유리 사카릴 아민 부분을 바람직한 수식기에 결합시킬 수 있다. 또, 그 수식된 당 뉴클레오티드는 그 수식된 당을 기질, 예로서 펩티드, 글리코펩티드, 지질, 아글리콘, 당 지질 등에 있는 사카릴 수용체에 전이시키는 효소의 기질로서 기능적 작용을 할 수 있다.
당 코어가 갈락토오스 또는 글루코오스인 하나의 구체예에서, R5는 NHC(O)Y이다.
하나의 예시적인 구체예에서, 그 수식된 당은 6-아미노-N-아세틸-글리코실 부분을 기재로 한다. N-아세틸갈락토사민에 대하여 아래에 나타낸 바와 같이, 6-아미노-당 부분은 표준방법에 의해서 용이하게 제조된다.
Figure 112010017920206-pct00109
상기 스킴에서, 지수 n은 1 ~ 2500, 바람직하게는 10 ~ 1500, 더 바람직하게는 10 ~ 1200의 정수를 나타낸다. 기호 "A"는 활성화기, 예를 들어, 할로, 활성화 에스테르의 성분(예를 들어, N-하이드록시숙신이미드 에스테르), 카르보네이트의 성분(예를 들어, p-니트로페닐 카르보네이트) 등을 나타낸다. 당업자는 다른 PEG-아미드 뉴클레오티드 당이 이 방법 및 유사한 방법에 의해서 용이하게 제조되는 것으로 이해할 수 있을 것이다.
다른 예시적인 구체예에서, 그 아미드 부분은 우레탄 또는 우레아 등의 기로 치환된다.
또 다른 추가 구체예에서, R1은 분지상 PEG, 예를 들어, 위에서 설명한 화학종 중 하나이다. 이러한 구체예에 따르는 예시적인 화합물은 다음의 화합물들이 포함된다:
Figure 112006039150479-pct00047
위 식에서, X4는 결합 또는 O이다.
또, 위에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 직쇄상 또는 분지상 수용성 폴리머로 수식되어 있는 뉴클레오티드 당을 사용하여 형성되어 있는 펩티드 콘쥬게이트를 제공한다. 예를 들어, 아래에 나타낸 식을 가진 화합물은 본 발명의 범위 내에 포함된다:
Figure 112010017920206-pct00110
위 식에서, X4는 O 또는 결합이다.
동일하게, 본 발명은 6-위치의 탄소가 수식되어 있는 이들의 수식된 당 종의 뉴클레오티드 당을 사용하여 형성되는 펩티드 콘쥬게이트를 제공한다:
Figure 112006039150479-pct00049
위 식에서, X4는 결합 또는 O이다.
또, 본 발명의 조성물을 포함하는 펩티드 및 글리코펩티드, 지질 및 당지질의 콘쥬게이트가 제공된다. 예를 들어, 본 발명은 다음 식을 가진 콘쥬게이트를 제공한다:
Figure 112010017920206-pct00111
수-불용성 폴리머(water-insoluble polymer)
또 다른 구체예에서, 위에서 설명한 것과 유사하게 그 수식된 당은 수용성 폴리머가 아닌 수-불용성 폴리머를 포함한다. 또, 본 발명의 콘쥬게이트는 1종 또는 그 이상의 수-불용성 폴리머를 포함할 수도 있다. 본 발명의 이러한 구체예는 제어된 방식으로 하여 치료용 펩티드를 송달하는데 사용되는 비히클(vehicle)로서 콘쥬게이트를 사용함으로써 예시된다. 폴리머 약물의 송달 시스템은 본 기술분야에서 공지되어 있다 [참조예: Dunn et al., Eds. Polymeric Drugs And Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991]. 당업자는 실질적으로 공지된 어느 약물 송달 시스템이라도 본 발명의 콘쥬게이트에 적용할 수 있는 것으로 이해할 수 있을 것이다.
대표적인 수-불용성 폴리머에는 폴리포스파진, 폴리(비닐 알코올), 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 폴리알킬렌, 폴리아크릴아미드, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 에스테르, 폴리비닐 할라이드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리글리콜라이드, 폴리실록산, 폴리우레탄, 폴리(메틸 메타아크릴레이트), 폴리(에틸 메타아크릴레이트), 폴리(부틸 메타아크릴레이트), 폴리(이소부틸 메타아크릴레이트), 폴리(헥실 메타아크릴레이트), 폴리(이소데실 메타아크릴레이트), 폴리(라우릴 메타아크릴레이트), 폴리(페닐 메타아크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트), 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리 (에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(비닐 아세테이트), 폴리비닐 클로라이드, 폴리스티렌, 폴리비닐 피롤리돈, 플루로닉스 및 폴리비닐페놀 및 이들의 코폴리머가 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
본 발명의 콘쥬게이트에서 유용한 합성에 의해 수식된 천연 폴리머에는 알킬 셀룰로오스, 하이드록시알킬 셀룰로오스, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 에스테르 및 니트로셀룰로오스가 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다. 합성에 의해 수식된 천연 폴리머의 광범한 클래스(classes) 중 특히 바람직한 멤버에는 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스, 하이드록시부틸 메틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 프로피오네이트, 셀룰로오스 아세테이트 부티레이트, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 카르복시메틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 트리아세테이트, 셀룰로오스 술페이트 나트륨 염 및 아크릴산 에스테르, 메타아크릴산 에스테르 및 알긴산의 폴리머가 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
본 발명 명세서에서 설명한 이들 폴리머 및 다른 폴리머는 공급업자[시그마 케미컬 컴패니(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.), 폴리사이언시즈 (Polysciences, Warrenton, PA.), 앨드리히 (Aldrich, Milwaukee, WI.), 플루카 (Fluka, Ronkonkoma, NY), 및 바이오래드 (BioRad, Richmond, CA)]로부터 용이하게 얻을 수 있으며, 또는 표준기술을 사용하여 이들의 공급업자로부터 얻은 모노머로 합성할 수 있다.
본 발명의 콘쥬게이트에서 유용한 대표적인 생분해성 폴리머(biodegradable polymers)에는 폴리락티드, 폴리글리콜라이드 및 이들의 코폴리머, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(부티르산), 폴리(발레르산), 폴리(락티드-코-카프로락톤), 폴리(락티드-코-글리콜라이드), 폴리안하이드라이드, 폴리오르토에스테르, 이들의 블렌드(blends) 및 코폴리머가 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 콜라젠, 플루로닉(pluronics) 등을 포함하는 것 등 겔을 형성하는 조성물이 특히 유용하다.
본 발명에서 유용한 폴리머에는 그들의 구조의 적어도 일부분의 내부에 생체흡수성 (bioresorbable) 분자를 가진 수-불용성 물질을 포함하는 "하이브리드 (hybrid)" 폴리머가 포함된다. 이와 같은 폴리미의 예는 수-불용성 코폴리머를 포함한 것으로, 폴리머 사슬(polymer chain) 당, 생체 흡수성 영역, 친수성 영역 및 다수의 가교성 작용기를 가진다.
본 발명의 목적에서, "수-불용성 물질"은 물 또는 물-함유 환경에서 실질적으로 불용성인 물질을 포함한다. 따라서, 그 코폴리머의 일부 영역 또는 부분이 친수성 또는 수용성일 수 있으나, 그 폴리머 분자는 전체로서, 실질적인 양으로 볼 때 물에 용해하지 않는다.
본 발명의 목적에 있어서, 용어 "생체흡수성 분자"(bioresorbable molecule)는 대사 또는 분해되고 통상적인 배출 경로를 통하여 신체에 재흡수 및/또는 배제될 수 있는 영역을 포함한다. 이러한 대사산물 또는 분해산물은 신체에 대하여 실질적으로 비독성인 것이 바람직하다.
그 생체흡수성 영역은 코폴리머 조성물이 전체로서 수용성이 되지 않는 한 소수성 또는 친수성으로 할 수 있다. 따라서, 생체흡수성 영역은 폴리머가 전체로서 수-불용성으로 유지하는 우선 조건을 기준으로 하여 선택된다. 따라서, 여러 가지의 상대적 특성, 즉 포함된 작용기의 종류 및 생체흡수성 영역과 친수성 영역의 상대적 비율은 유용한 생체흡수성 조성물이 수-불용성을 유지하는 것을 확실하게 보장하도록 선택된다.
예시적인 흡수성 폴리머는 예로서, 폴리(α-하이드록시-카르복실산)/폴리(옥시알킬렌)의 합성에 의해 제조된 흡수성 블럭 코폴리머가 포함된다 (참조: Cohn et al., U.S. Patent No. 4,826,945). 이들의 코폴리머는 가교되지 않으며, 수용성이어서, 신체는 그 분해된 블럭 코폴리머 조성물을 배출할 수 있다 [참조: Younes et al., J Biomed. Mater. Res. 21: 1301-1316 (1987); 및 Cohn et al., J Biomed. Mater. Res. 22: 993-1009 (1988)].
현재, 바람직한 생체흡수성 폴리머에는 폴리(에스테르), 폴리(하이드록시 산), 폴리(락톤), 폴리(아미드), 폴리(에스테르-아미드), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(오르토에스테르), 폴리(카르보네이트), 폴리(포스파진), 폴리(포스포에스테르), 폴리(티오에스테르), 폴리사카라이드 및 이들의 혼합물로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 성분을 포함한다. 더 바람직하게는, 그 생체흡수성 폴리머에는 폴리(하이드록시) 산 성분이 포함된다. 폴리(하이드록시) 산 중에서는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리카프로산, 폴리부티르산, 폴리발레르산 및 이들의 코폴리머 및 혼합물이 바람직하다.
생체내에서 흡수되는 ("생체흡수되는") 단편을 형성하는 것 이외에도, 또 본 발명의 방법에서 사용하는데 바람직한 폴리머 코팅은 배출 및/또는 대사 가능한 단편을 형성할 수도 있다.
또, 고차 코폴리머도 본 발명에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 특허문헌[1984년 3월 20일에 허여된 미국 특허 제 4,438,253 호 (Casey et al.)]에서는 폴리(글리콜산)과 하이드록실-말단 폴리(알킬렌 글리콜)의 에스테르 교환 반응에서 생성된 트리-블럭 (tri-block) 코폴리머가 개시되어 있다. 이러한 조성물은 흡수성 모노필라멘트 봉합사로서 사용에 대하여 개시되어 있다. 이러한 조성물의 유연성은 그 코폴리머 구조 내로 테트라-p-톨릴 오르토카르보네이트 등 방향족 오르토카르보네이트를 편입(incorporation)시킴으로써 조절된다.
또, 락트산 및/또는 글리콜산을 기재로 하는 다른 폴리머가 이용될 수도 있다. 예를 들어, 특허문헌[1993년 4월 13일에 허여된 미국 특허 제 5,202,413 호 (Spinu)]에는 올리고머 디올 또는 디아민 잔기 상에서 락티드 및/또는 글리콜라이드를 개환 중합시킨 다음 이어서 디이소시아네이트, 디아실클로라이드 또는 디클로로실란 등 이작용성 화합물을 사용하여 사슬 연장을 함으로써 생성된 폴리락티드 및/또는 폴리글리콜라이드의 연속 배치된 블록을 가진 생분해성 멀티-블록 코폴리머에 대하여 개시되어 있다.
본 발명에서 유용한 코팅의 생체흡수성 영역은 가수분해 및/또는 효소에 의해 절단할 수 있도록 설계할 수 있다. 본 발명에서, "가수분해에 의해 절단할 수 있는"의 용어는 물 또는 물-함유 환경에서 가수분해에 대하여 코폴리머, 특히 그 생체흡수성 영역이 영향을 받기가 용이한 감수성을 의미한다. 동일하게, 본 명세에서 사용되는 "효소에 의해 절단할 수 있는"의 용어는 내인성 또는 외인성 효소에 의한 절단에 대하여 그 코폴리머, 특히 생체흡수성 영역이 영향을 받기가 용이한 감수성을 의미한다.
체내에 들어와 있을 때, 그 친수성 영역은 처리되어 배출 및/또는 대사 가능한 단편으로 될 수 있다. 따라서, 그 친수성 영역에는 예를 들어, 폴리에테르, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리올, 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리(알킬 옥사졸린), 다당, 당, 펩티드, 단백질 및 이들의 코폴리머 및 혼합물이 포함될 수 있다. 또, 그 친수성 영역은 예를 들어, 폴리(알킬렌) 옥사이드일 수도 있다. 이러한 폴리(알킬렌) 옥사이드는 예를 들어, 폴리(에틸렌) 옥사이드, 폴리(프로필렌) 옥사이드 및 이들의 혼합물 및 코폴리머를 포함할 수 있다.
또, 하이드로겔의 성분인 폴리머도 본 발명에서 유용하다. 하이드로겔은 비교적 대량의 물을 흡수할 수 있는 폴리머 물질이다. 하이드로겔 형성 화합물의 예로는 폴리아크릴산, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 젤라틴, 카라게난 및 그 밖의 다른 다당, 하이드록시에틸렌메타아크릴산 (HEMA), 및 이들의 유도체 등이 포함되나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 안정성이며, 생분해성이고 생체흡수성인 하이드로겔을 제조할 수 있다. 또, 하이드로겔 조성물은 이들의 특성 중 1종 이상을 나타내는 서브유니트(subunits)를 포함할 수도 있다.
가교에 의해 완전성(integrity)을 조절할 수 있는 생체-적합성 하이드로겔 조성물은 공지되어 있으며, 현재 본 발명의 방법에서 사용하는데 바람직하다. 예를 들어, 특허문헌[후벨 (Hubbell) 등의 미국 특허 제 5,410,016 호 (1995년 4월 25일에 특허됨) 및 5,529,914 호 (1996년 6월 25일에 특허됨)]에서는 수용성계에 대하여 개시되어 있으며, 이들의 계는 수용성의 중앙 블록부분이 가수분해에 대하여 불안정한 2개의 연장부분 사이에 샌드위치 되어 있는 가교블록 코폴리머이다. 또, 이러한 코폴리머는 광중합성 아크릴레이트 작용기로 더 엔드-캐핑(end-capping)되어 있다. 가교될 경우, 이들의 계는 하이드로겔로 된다. 이러한 코폴리머의 수용성의 중앙 블록은 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함할 수 있으며; 그 반면에 가수분해에 대하여 불안정한 연장부분은 폴리글리콜산 또는 폴리락트산 등 폴리(α-하이드록시산)일 수 있다 [참조: Sawhney et al., Macromolecules 26: 581-587 (1993)].
또 다른 바람직한 구체예에서, 그 겔은 열가역성(thermoreversible) 겔이다. 현재, 플루로닉스, 콜라젠, 젤라틴, 히알루론산, 다당, 폴리우레탄 하이드로겔, 폴리우레탄-우레아 하이드로겔 및 이들의 조합물 등의 성분을 포함하는 열가역성 겔이 바람직하다.
또 다른 예시적인 구체예에서, 본 발명의 콘쥬게이트는 리포솜의 성분을 포함한다. 리포솜은 이 기술분야에서 당업자로부터 공지된 방법에 따라, 예를 들어, 특허문헌[엡스타인 (Eppstein) 등의 미국 특허 제 4,522,811 호 (1985년 6월 11일에 허여됨)]에 기술된 바와 같이 하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리포솜 제제는 적절한 지질(들)(예를 들어, 스테아로일 포스파티딜 에탄올아민, 스테아로일 포스파티딜 콜린, 아라카도일 포스파티딜 콜린, 및 콜레스테롤)을 무기용매 중에 용해시킨 다음, 그 용매를 증발시켜 용기의 표면상에서 건조된 지질의 얇은 필름을 남게 함으로써 조제할 수 있다. 그 활성화합물 또는 의약적으로 허용할 수 있는 그 염의 수용액은 그 다음 용기 내에 도입시킨다. 그 다음, 용기를 수동으로 회전시켜 용기의 측면에서 지질 물질을 유리시켜, 지질 응집체를 분산시킴으로써 리포솜 현탁액을 형성시킨다.
위에서 설명한 미립자 및 그 미립자를 제조하는 방법이 예로서 제공되나, 이들은 본 발명에서 유용한 미립자의 범위를 한정하는 것은 아니다. 다양한 방법에 의해서 제조된 일련의 미립자가 본 발명에서 유용하다는 것은 당업자로부터 자명할 것이다.
그 수용성 폴리머에 대하여 위에서 설명한 구조 형태는 직쇄상 및 분지상의 양쪽 모두에 있어서 일반적으로 수-불용성 폴리머에 대해서도 동일하게 적용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 시스테인, 세린, 디리신 및 트리리신 분지 코어는 두개의 수-불용성 폴리머 부분에 의해서 기능적 작용을 할 수 있다. 이들의 화학종을 제조하는데 사용되는 방법은 일반적으로 수용성 폴리머를 제조하는데 사용되는 방법과 매우 유사하다.
또, 치료용 글리코펩티드의 생체내 반감기는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 등 PEG 부분에 의해서 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 단백질을 PEG로 화학적 수식(PEG화)을 하면 그들의 분자 크기가 커지고, 그들의 표면 및 작용기-접근 용이성 (accessibility)이 감소된다. 각각의 접근 용이성은 단백질에 결합되어 있는 PEG의 크기에 따라 좌우된다. 그 결과, 혈장 반감기 및 단백질분해-안정성이 개선되고, 면역원성 및 간으로의 흡수가 감소된다.(Chaffee et al., J. Clin. Invest. 89: 1643-1651 (1992); Pyatak et al., Res. Commun. Chem. Pathol Pharmacol. 29: 113-127 (1980)). 인터류킨-2를 PEG화 하면, 생체내에서 항종양력이 증가되는 것으로 보고되었으며 (Katre et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 1487-1491 (1987)), 모노클로날 항체 A7 유래의 F(ab')2를 PEG화 하면 종양 국재화가 개선되었다.(Kitamura et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28: 1387-1394 (1990)). 따라서, 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 PEG 부분으로 유도체화된 펩티드의 생체내 반감기는 비-유도체화 펩티드의 생체내 반감기에 비하여 연장된다.
펩티드의 생체내 반감기의 증가는 그 양의 증가율의 범위로서 가장 잘 표현된다. 증가율의 범위 하한은 약 40%, 약 60%, 약 80%, 약 100%, 약 150% 또는 약 200%이다. 이 범위의 상한은 약 60%, 약 80%, 약 100%, 약 150% 또는 약 250% 이상이다.
하나의 예시적인 구체예에서, 본 발명은 PEG화된 FSH를 제공한다 (도 1, 도 2 및 도 5).
방법(methods)
위에서 설명한 콘쥬게이트 이외에, 본 발명은 이들 및 다른 콘쥬게이트를 제조하는 방법을 제공한다. 따라서, 다른 국면에서, 본 발명은 선택된 부분과 G-CSF 펩티드 사이의 공유결합 콘쥬게이트를 형성시키는 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 콘쥬게이트를 신체의 특정 조직 또는 영역에 대해 표적화시키는 방법을 제공한다.
하나의 예시적인 구체예에서, 그 콘쥬게이트는 PEG 부분(또는 PEG 부분을 포함하는 효소적으로 전이가능한 글리코실 부분)과 글리코실화 펩티드 또는 비-글리코실화 펩티드 사이에서 형성된다. 그 PEG는 G-CSF 펩티드와 PEG 부분 사이에 개재되고, 이들의 쌍방에 공유 결합된 완전한 글리코실 결합기를 통해 G-CSF 펩티드에 결합되어 있으며, 또는 PEG-비-글리코실 링커 (예를 들어, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬) 구축체에 결합되어 있다. 이 방법은 수식된 당과, 그 수식된 당이 기질인 글리코실트랜스퍼라아제를 포함하는 혼합물에 G-CSF 펩티드를 접촉하는 것을 포함한다. 이 반응은 수식된 당과 G-CSF 펩티드 사이에서 공유결합을 형성시키는데 충분한 조건 하에서 실시한다. 수식된 당의 당 부분은 뉴클레오티드 당, 활성화 당 및 뉴클레오티드도 아니고 활성화되지도 않은 당으로부터 선택하는 것이 바람직하다.
수용체 펩티드 (글리코실화 또는 비-글리코실화)는 일반적으로 신규로 합성되거나, 또는 원핵세포 (예를 들어, 대장균(E. coli) 등 박테리아 세포)중에서 또는 포유동물, 효모, 곤충, 진균 또는 식물 세포 등의 진핵세포 중에서 재조합에 의해 발현된다. 그 G-CSF 펩티드는 완전-길이 단백질 또는 단편일 수 있다. 또, G-CSF 펩티드는 야생형 펩티드 또는 변이 펩티드일 수 있다. 예시적인 구체예에서, G-CSF 펩티는 펩티드 서열에 하나 또는 그 이상의 N- 또는 O-결합형 글리코실화 부위를 가하는 돌연변이를 포함한다.
하나의 예시적인 구체예에서, 인자 IX는 다음의 방법으로 O-글리코실화 되고 수용성 폴리머로 기능화된다. 그 펩티드는 이용가능한 아미노산 글리코실화 부위를 사용하여 제조되거나, 또는 글리코실화될 경우에는 그 글리코실 부분을 트리밍(trimming)시켜 그 아미노산을 노출시킨다. 예를 들어, 세린 또는 트레오닌을 α-1 N-아세틸 아미노 갈락토실화시키고 (GalNAc), NAc-갈락토실화 펩티드는 ST6GalNAcT1을 사용하여 시알산 수식기 카세트로 시알릴화시킨다. 또는, 그 NAc-갈락토실화 펩티드는 코어-1-GalT-1을 사용하여 갈락토실화 시키고, 그 생성물은 ST3GalT1을 사용하여 시알산-수식기 카세트로 시알릴화시킨다. 이 방법에 따른 하나의 예시적인 콘쥬게이트는 다음의 결합을 가진다: Thr-α-1-GalNAc-β-1,3-Gal-α2,3-Sia* (여기에서, Sia*는 시알산-수식기 카세트이다).
위에서 설명한 방법 등 다수의 효소 및 사카릴 공여체를 사용하는 본 발명의 방법에서, 각각의 개별적인 글리코실화 스텝은 개별적으로 각각 실시할 수 있거나, 또는 "단일포트"(single pot) 반응계에서 조합시킬 수도 있다. 예를 들어, 상술한 3종의 효소반응에서 GalNAc 트랜스퍼라아제, GalT 및 SiaT 및 이들의 공여체를 단일 용기 중에 혼합시킬 수 있다. 또, GalNAc 반응을 단독으로 실시하고, GalT 및 SiaT 둘 다와 적합한 사카릴 공여체를 단일 스텝으로 하여 첨가할 수도 있다. 그 반응을 실시하는 또 다른 모드에는 각각의 효소 및 적합한 공여체를 순차적으로 첨가하고, 그 반응을 "단일 포트" 형식으로 실시하는 것을 포함한다. 상술한 방법의 각각을 조합하면 본 발명의 화합물을 제조하는데 유용하다.
본 발명의 콘쥬게이트, 특히 글리코PEG화된 N-결합형 글리칸에서 Sia-수식기 카세트는 α-2,6 결합 또는 α-2,3 결합에서 Gal에 결합시킬 수 있다.
또, 본 발명의 방법은 재조합에 의해 생성된 불완전한 글리코실화 펩티드의 수식방법도 제공한다. 본 발명의 방법에서 수식된 당을 사용하여, G-CSF 펩티드를 더 글리코실화시킴과 동시에, 예를 들어, PEG 부분, 치료용 작용물질 등으로 유도체화할 수 있다. 그 수식된 당의 당 부분은 완전한 글리코실화 펩티드 수용체에 적절하게 결합될 수 있는 잔기, 또는 바람직한 특성을 가진 또 다른 당 부분으로 할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 수식된 G-CSF 펩티드는 합성 펩티드 또는 야생형 펩티드로 할 수 있거나, 또는 이들은 부위-특이적 변이유발 (site-directed mutagenesis) 등 이 기술분야에서 공지된 방법에 의해서 생성된 변이 펩티드로 할 수 있다. 펩티드의 글리코실화는 일반적으로 N-결합형 또는 O-결합형이다. 하나의 예시적인 N-결합은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 수식된 당이 결합한 것이다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기에서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다.)은 아스파라긴 측쇄에 당부분이 효소적으로 결합하는 인식서열이다. 따라서, 폴리펩티드 중에 이들의 트리펩티드 서열의 어느 하나가 존재함으로써 글리코실화 가능 부위를 생성시킨다. O-결합형 글리코실화는 하이드록시 아미노산의 하이드록시 측쇄에 하나의 당 (예를 들어, N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스, 만노오스, GlcNAc, 글루코오스, 푸코오스 또는 자일로오스)이 결합하는 것을 의미한다. 그 하이드록시 아미노산은 세린 또는 트레오닌이 바람직하나, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신도 사용할 수도 있다.
예로서, 하나의 구체예에서 G-CSF는 포유 동물계에서 발현시켜, 시알리다아제의 처리에 의해 말단의 시알산 잔기를 트리밍(trimming)하고, 그 다음 이어서ST3Gal3 및 PEG-시알산의 공여체를 사용하여 PEG화 함으로써 수식한다.
또 다른 예시적인 구체예에서, 포유동물 세포에서 발현된 G-CSF를 우선 처음으로 시알리다아제로 처리하여 말단의 시알산 잔기를 트리밍하고, 이어서 ST3Gal3 및 PEG-시알산의 공여체를 사용하여 PEG화 하며, 그 다음 ST3Gal3 및 시알산 공여체를 사용하여 시알릴화시킨다.
또, 포유동물계에서 발현된 G-CSF는 시알리다아제 및 갈락토시다아제로 처리하여 그 시알산 및 갈락토오스 잔기를 트르밍하며, 그 다음 갈락토오스 공여체 및 갈락토실트랜스퍼라아제를 사용하여 갈락토실화시키고, 그 다음 이어서 ST3Gal3 및 PEG-시알산의 공여체를 사용하여 PEG화할 수도 있다.
또 다른 예시적인 구체예에서, 그 G-CSF를 우선 일차적으로 시알리다아제로 처리하지 않고, 수식기-시알산 카세트 및 ST3Gal13 등 효소를 사용하는 시알산 전이반응에 의해 글리코PEG화 시킨다.
추가의 예시적인 구체예에서, G-CSF는 곤충세포에서 발현시켜, 다음의 처리순서로 수식한다: N-아세틸글루코사미드를 우선 적절한 N-아세틸글루코사민 공여체, 및 GnT-I, II, IV 및 V 중의 하나 또는 그 이상을 사용하여 G-CSF에 부가하고, 다음에, G-CSF를 PEG-갈락토오스의 공여체 및 갈락토실트랜스퍼라아제를 사용하여 PEG화 시킨다.
또, 효모에서 생성되는 G-CSF도 글리코PEG화할 수 있다. 예를 들어, G-CSF를 우선 엔도글리카나아제로 처리하여 글리코실기를 트리밍하고, 갈락토오스 공여체 및 갈락토실트랜스퍼라아제를 사용하여 갈락토실화하며, 그 다음에, ST3Gal3 및 PEG-시알산의 공여체로 PEG화 시킨다.
펩티드 또는 그 밖의 다른 구조체에 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열이 하나 또는 그 이상의 글리코실화 부위를 포함하도록 아미노산 서열을 변형시킴으로써 편리하게 실현된다. 그 부가는 또 -OH기를 제시하는 1종 이상의 화학종, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌 잔기를 그 G-CSF 펩티드의 서열 내부에 편입(incorporation)함으로써(O-결합형 글리코실화 부위의 경우) 실행할 수 있다. 그 부가는 변이에 의해, 또는 그 G-CSF 펩티드의 완전한 화학적인 합성에 의해 실행할 수 있다. 그 G-CSF 펩티드 아미노산 서열은 DNA 레벨에서의 변화를 통해, 특히 바람직한 아미노산으로 번역되는 코돈이 생성되도록, 미리 선택한 염기의 위치에서 그 펩티드를 코딩하는 DNA를 변이시킴으로써 바람직하게 변형된다. 그 DNA 변이는 이 기술분야에서 공지된 방법을 사용하여 실행하는 것이 바람직하다.
하나의 예시적인 구체예에서, 글리코실화 부위는 폴리뉴클레오티드를 셔플링 (shuffling)함으로써 부가된다. 후보 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 DNA 셔플링 프로토콜를 사용하여 변조될 수 있다. DNA 셔플링은 관련된 유전자의 풀 (pool)을 무작위 단편화시키고, 이어서 폴리머라아제 연쇄반응 방법과 동일한 프로세스에 의한 단편의 재구축에 의해서 실시되는 재조합 및 변이의 반복 프로세스이다 [참조예: Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751 (1994); Stemmer, Nature 370:389-391 (1994); 및 미국 특허 제 5,605,793호, 제 5,837,458호, 제 5,830,721호 및 5,811,238 호].
또, 본 발명은 하나 이상의 선택되는 글리코실잔기를 펩티드에 부가하고(또는 이것에서 제거하고), 그 후에 그 펩티드의 선택되는 글리코실잔기 중 최소 하나에 수식된 당을 결합시키는 수단도 제공한다. 이 구체예는 예로서 펩티드상에 존재하지 않거나, 또는 바람직한 소정량이 존재하지 않은 선택된 글리코실잔기에 그 수식된 당을 결합하는 것이 바람직할 때 유용하다. 즉, 수식된 당을 펩티드에 결합시키기 전에 효소적 결합 또는 화학적 결합에 의해 그 선택된 글리코실잔기를 G-CSF 펩티드에 결합시킨다. 또 다른 구체예에서, 그 글리코펩티드에서 당 잔기를 제거함으로써 그 수식된 당을 결합시키기 전에 글리코펩티드의 글리코실화 패턴을 변경한다(참조 문헌 예: WO 98/31826).
그 글리코펩티드 상에 존재하는 임의의 당부분의 부가 또는 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 수행한다. 화학적 탈글리코실화가 바람직하게는 화합물 트리플루오로메탄술폰산 또는 등가 화합물에 폴리펩티드 변이체를 노출시킴으로써 이루어진다. 이러한 처리에 의해 결합되어 있는 당(N-아세틸글루코산민 또는 N-아세틸갈락토사민)이외 대두분의 당 또는 모든 당이 절단되나, 그 펩티드는 손상되지 않고 남아 있다. 화학적 탈글리코실화는 다음 참고 문헌[Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987); 및 Edge et al., Anal. Biochem. 118: 131 (1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드 변이체 상의 당 부분의 효소적 절단은 다음 참고 문헌[Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138: 350 (1987)]에 기재된 바와 같이 다양한 엔도-글리코시다아제 및 엑소-글리코시다아제를 사용함으로써 달성할 수 있다.
글리코실 부분의 화학적 부가는 당업자로부터 인식되어 있는 방법에 의해 실시된다. 당 부분의 효소적 부가는 본 명세서에서 설명한 방법의 변형 방법에 의해, 본 발명에서 사용되는 수식된 당 대신 천연 글리코실 단위를 사용하여 실시하는 것이 바람직하다. 당 부분을 부가하는 다른 방법은 특허문헌으로, 미국 특허 제 5,876,980호, 제 6,030,815호, 제 5,728,554호 및 제 5,922,577호 명세서에서 기재되어 있다.
선택된 글리코실 잔기의 예시적인 부가 위치는 (a) N- 및 O-글리코실화를 위한 컨센서스 (consensus) 부위; (b) 글리코실트랜스퍼라아제에 대한 수용체인 말단 글리코실 부분; (c) 아르기닌, 아스파라긴 및 히스티딘; (d) 유리 카르복실기; (e) 시스테인에서의 기 등 유리 술프하이드릴기; (f) 세린, 트레오닌 또는 하이드록시프롤린에서의 기 등 유리 하이드록실기; (g) 페닐알라닌, 티로신 또는 트리프토판에서의 기 등 방향족 잔기; 또는 (h) 글루타민에서의 아미드기가 포함되나, 이들로 한정되어 있는 것은 아니다. 본 발명에서 유용한 예시적인 방법은 특허문헌 WO 87/05330 (1987년 9월 11일에 공개됨) 및 참고문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.
방법(methods)
위에서 설명한 콘쥬게이트 이외에, 본 발명은 이들 콘쥬게이트 및 그 밖에 다른 콘쥬게이트를 제조하는 방법도 제공한다. 또, 본 발명은 어느 질병에 걸린 위험에 있는 피검자 또는 그 질병에 걸린 피검자에 본 발명의 콘쥬게이트를 투여함으로써 질병 상태를 예방, 치료 또는 개선하는 방법도 제공한다.
따라서, 본 발명은 선택된 부분과 G-CSF 펩티드의 사이에서 공유 결합성 콘쥬게이트를 형성시키는 방법을 제공한다.
예시적인 구체예에서, 그 콘쥬게이트는 수용성 폴리머, 치료 효과가 있는 부분, 표적성 부분 또는 생체분자와 글리코실화 G-CSF 펩티드 또는 비-글리코실화 G-CSF 펩티드 사이에서 형성된다. 폴리머, 치료 효과가 있는 부분 또는 생체분자는 펩티드와 수식기(예를 들어, 수용성 폴리머) 쌍방 사이에 개재하여, 이들 쌍방에 공유 결합되어 있는 글리코실 결합기를 통해 G-CSF 펩티드에 결합되어 있다. 이 방법은 G-CSF 펩티드를 수식된 당과, 효소, 예로서 수식된 당을 기질(예를 들어, 펩티드, 아글리콘, 당지질)에 결합시키는 글리코실트랜스퍼라아제를 함유하는 혼합물에 접촉시키는 것을 포함한다. 이 반응은 수식된 당과 G-CSF 펩티드 사이에서 공유 결합을 형성하는데 적합한 조건하에서 실시한다.
수용체 G-CSF 펩티드는 통상 신규로 합성되거나, 또는 원핵세포 (예를 들어, 대장균(E. coli) 등 박테리아 세포) 또는 포유동물, 효모, 곤충, 진균 또는 식물 세포 등 진핵세포 중에서 재조합에 의해 발현된다. G-CSF 펩티드는 전체-길이 단백질 또는 단편일 수 있다. 또한, G-CSF 펩티드는 야생형 펩티드 또는 변이 펩티드일 수 있다. 하나의 예시적인 구체예에서, G-CSF 펩티드는 펩티드 서열에 하나 또는 그 이상의 N-결합형 또는 O-결합형 글리코실화 부위를 부가한 돌연변이를 포함한다.
또, 본 발명의 방법은 재조합에 의해 생성된 불완전한 글리코실화 G-CSF 펩티드의 수식방법도 제공한다. 다수의 재조합에 의해 생성된 당단백질은 불완전하게 글리코실화 되어, 바람직하지 않은 특성, 예를 들어, 면역원성, RES에 의한 인식 등을 가질 수 있는 당 잔기를 노출시킨다. 본 발명의 방법에서 수식된 당을 사용하면, 펩티드를 더 글리코실화 하여, 동시에 예를 들어, 수용성 폴리머, 치료용 작용물질 등으로 유도체화할 수 있다. 그 수식된 당의 당 부분은 완전한 글리코실화 펩티드의 수용체에 적절하게 결합되는 잔기, 또는 바람직한 특성을 가진 또 다른 당 부분으로도 할 수 있다.
본 발명에서 유용한 펩티드를 수식하는 예시적인 방법은 특허문헌으로 WO04/099231, WO 03/031464, 및 본 명세서에서 설명한 참고문헌에 기재되어 있다.
하나의 예시적인 구체예에서, 본 발명은 다음 식의 부분을 포함하는 PEG화된 G-CSF를 제조하는 방법을 제공한다:
Figure 112006039150479-pct00051
위 식에서, D는 -OH 또는 R1-L-HN-이다. 기호 G는 R1-L- 또는 -C(O)(C1-C6)알킬을 나타낸다. R1은 직쇄상 또는 분지상 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 포함하는 부분이다. 기호 L은 결합, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬에서 선택한 링커를 나타낸다. 일반적으로, D가 OH이면, G는 R1-L-이고, G가 -C(O)(C1-C6)알킬이면 D는 R1-L-NH-이다. 본 발명의 방법은 (a) 기질 G-CSF 펩티드를 PEG-시알산 공여체와 그 공여체에 유래하는 PEG-시알산 부분을 기질 G-CSF 펩티드로 전이시킬 수 있는 효소에 접촉시키는 단계를 포함한다.
하나의 예시적인 PEG-시알산 공여체는 다음 식을 가진 것 등 뉴클레오티드 당이며,
Figure 112010017920206-pct00112
전이에 적합한 조건 하에서 PEG-시알산을 G-CSF 펩티드의 아미노산 잔기 또는 글리코실 잔기 상에서 전이시키는 효소이다.
하나의 구체예에서, 그 기질 G-CSF 펩티드는 본 발명의 콘쥬게이트를 형성시키기 전에 숙주세포에서 발현시킨다. 숙주세포의 예로는 포유동물 세포가 있다. 또 다른 구체예에서, 숙주세포는 곤충세포, 식물세포, 박테리아 또는 진균이다.
본 발명 명세서에서 제시되어 있는 방법은 상기 설명 섹션에서 기재된 각각의 G-CSF 콘쥬게이트에 적용할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해서 수식된 G-CSF 펩티드는 합성 펩티드 또는 야생형 펩티드로 할 수 있거나, 또는 이들은 부위 특이적 변이유발 등 이 기술분야에서 공지된 방법에 의해서 생성된 변이 펩티드로 할 수 있다. 펩티드의 글리코실화는 일반적으로 N-결합형 또는 O-결합형이다. N-결합형의 예에는 아스파라긴 잔기의 측쇄에 수식된 당의 결합이 있다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기에서, X는 프롤린을 제외한 임의의 어느 아미노산이다.)은 아스파라긴 측쇄에 당 부분이 효소적으로 결합하기 위한 인식서열이다. 따라서, 폴리펩티드내 중에 이들의 트리펩티드 서열 중의 어느 하나가 존재함으로써 글리코실화 가능성 부위가 생성된다. O-결합형 글리코실화는 하나의 당(예로서, N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스, 만노오스, GlcNAc, 글루코오스, 푸코오스 또는 크실로오스)이 하이드록시 아미노산의 하이드록시 측쇄에 결합하는 것을 의미한다. 하이드록시 아미노산은 특이한 아미노산 또는 비천연 아미노산, 예로서 5-하이드록시 프롤린 또는 5-하이드록시 리신이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌이다.
펩티드 또는 그 밖에 다른 구조체에 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열이 하나 또는 그 이상의 글리코실화 부위를 함유하도록 아미노산 서열을 변형시킴으로써 간단하게 실현된다. 또, 그 부가는 하나의 -OH기를 제시하는 1종 이상의 화학종, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌 잔기를 그 펩티드의 서열 내부에 편입(incorporation)함으로써 이루어질 수 있다(O-결합형 글리코실화 부위의 경우). 그 부가는 돌연변이에 의해, 또는 그 펩티드의 완전한 화학적 합성에 의해 이루어질 수 있다. 그 펩티드 아미노산 서열은 DNA 레벨에서의 변화를 통해, 특히 바람직한 소정의 아미노산으로 번역되는 코돈(codons)이 생성되도록, 미리 선택된 염기의 위치에서 그 펩티드를 코딩하는 DNA를 변이시킴으로써 변형되는 것이 바람직하다. 그 DNA 변이는 이 기술분야에서 공지된 방법을 사용하여 이루어지는 것이 바람직하다.
하나의 예시적인 구체예에서, 그 글리코실화 부위는 폴리뉴클레오티드를 셔플링함으로써 추가된다. 후보 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 DNA 셔플링 프로토콜을 사용하여 변조시킬 수 있다. DNA 셔플링은 관련된 유전자의 풀의 무작위 단편화와, 이어서 폴리머라아제 연쇄반응과 동일한 프로세스에 의한 단편의 재구축에 의해서 실시되는 재조합 및 변이를 반복하는 프로세스이다[참조 문헌 예: Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751 (1994); Stemmer, Nature 370:389-391 (1994); 및 미국 특허 제 5,605,793, 5,837,458, 5,830,721 및 5,811,238 호].
글리코실화 부위를 추가하거나 또는 제거하는 예시적인 방법과, 글리코실 구조 또는 서브구조(substructures)를 추가하거나 제거하는 예시적인 방법은 특허문헌으로 WO 04/099231, WO03/031464 및 관련된 미국 및 PCT 출원 명세서에서 상세하게 기재되어 있다.
또, 본 발명은 G-CSF 펩티드에 하나 또는 그 이상의 선택된 글리코실 잔기를 부가하고(또는 이것에서 제거하고), 그 다음 수식된 당을 그 펩티드의 선택된 글리코실 잔기들 중 적어도 하나에 결합시키는 수단도 이용한다. 이러한 기술은 예를 들어, 수식된 당을 G-CSF 펩티드 상에 존재하지 않거나, 원하는 소정의 양으로 존재하지 않은 선택된 글리코실 잔기에 결합시키는 것이 바람직한 경우에 유용하다. 즉, 수식된 당을 펩티드에 결합시키기 전에, 그 선택된 글리코실 잔기는 효소적 결합 또는 화학적 결합에 의해서 G-CSF 펩티드에 결합시킨다. 또 다른 구체예에서, 글리코펩티드의 글리코실화 패턴은 글리코펩티드에서 당 잔기를 제거함으로써 그 수식된 당을 결합시키기 전에 변경된다 [참조 특허문헌 예: WO 98/31826].
선택된 글리코실 잔기의 예시적인 결합 위치는 (a) N-결합형 글리코실화를 위한 콘센서스 부위 및 O-결합형 글리코실화를 위한 부위; (b) 글리코실트랜스퍼라아제에 대한 수용체인 말단 글리코실 부분; (c) 아르기닌, 아스파라긴 및 히스티딘; (d) 유리 카르복실기; (e) 시스테인에서의 존재하는 기 등 유리 술프하이드릴 기; (f) 세린, 트레오닌 또는 하이드록시프롤린에서의 존재하는 기 등 유리 하이드록실기; (g) 페닐알라닌, 티로신 또는 트리프토판에서의 존재하는 기 등 방향족 잔기; 또는 (h) 글루타민의 아미드기가 포함되나, 이들로 한정되어 있는 것은 아니다. 본 발명에서 유용한 예시적인 방법은 특허문헌 WO 87/05330 (1987년 9월 11일에 공개됨) 및 참고문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에서 기재되어 있다.
PEG 수식된 당은 그 결합을 매개하는 적절한 효소를 사용하여 글리코실화 펩티드 또는 비-글리코실화 펩티드에 결합된다. 1종 또는 그 이상의 수식된 당 공여체, 효소(들) 및 수용체 펩티드의 농도는 바람직한 정도의 수용체의 수식이 얻어질때까지 글리코실화가 진행하도록 선택하는 것이 바람직하다. 아래에서 설명한 고찰은 시알릴트랜스퍼라아제와 관련하여 설명하나, 그 밖에 다른 글리코실트랜스퍼라아제 반응에 일반적으로 적용할 수 있다.
글리코실트랜스퍼라아제를 사용하여 바람직한 올리고당 구조체를 합성하는 다수의 방법은 공지되어 있으며, 본 발명에 일반적으로 적용할 수 있다. 예시적인 방법은 예로서 참고로 본 명세서에서 편집하여 인용한 특허문헌 WO 96/32491; 참고 문헌[Ito et al., Pure Appl. Chem. 65: 753 (1993)]; 특허 문헌 미국 특허 제 5,352,670호, 제 5,374,541호, 제 5,545,553호 및 본원의 권리자가 공동 소유한 미국 특허 제 6,399,336호 및 제 6,440,703호의 명세서에서 기재되어 있다.
본 발명은 단일 글리코실트랜스퍼라아제 또는 다수의 글리코실트랜스퍼라아제의 조합물을 사용하여 실시된다. 예를 들어, 시알릴트랜스퍼라아제와 갈락토실트랜스퍼라아제의 조합물을 사용할 수 있다. 하나 이상의 효소를 사용하는 이들의 구체예에서는, 효소와 기질을 바람직하게는 초기 반응혼합물 중에 혼합시키며, 또는 제 2 효소 반응용 효소와 시약을, 최초 효소 반응이 완료 또는 거의 완료된 후에 그 반응 매체에 첨가한다. 2종의 효소 반응을 단일 용기 중에서 차례로 실시함으로써 중간 종을 분리하는 처리방법에 비해서 전수율(overall yield)이 개선된다. 또, 여분의 용매 및 부산물의 세정(cleanup) 및 폐기(disposal)가 감소된다.
하나의 바람직한 구체예에서, 첫번째 및 두번째 효소 각각은 글리코실트랜스퍼라아제이다. 또 다른 바람직한 구체예에서는 하나의 효소가 엔도글리코시다아제이다. 추가의 바람직한 하나의 구체예에서, 2종 또는 그 이상의 효소를 사용하여 본 발명의 수식된 당단백질을 구축한다. 이들의 효소는 그 수식된 당을 펩티드에 부가하기 전 후의 임의의 어느 시점에서 G-CSF 펩티드 상의 당 구조체를 변경하는데 사용된다.
또 다른 구체예에서, 이 방법은 하나 또는 그 이상의 엑소- 또는 엔도글리코시다아제를 이용한다. 그 글리코시다아제는 일반적으로 글리코실 결합을 절단하지 않고 형성시키도록 변형된 변이체이다. 변이체 글리카나아제는 일반적으로 활성부위의 산성 아미노산 잔기를 어느 아미노산 잔기로 치환시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 엔도글리카나아제가 엔도-H인 경우, 그 치환된 활성부위 잔기는 일반적으로 130 위치의 Asp, 132 위치의 Glu 또는 이들의 조합이다. 이들의 아미노산은 일반적으로 세린, 알라닌, 아스파라긴 또는 글루타민으로 치환된다.
그 변이체 효소는 통상적으로, 엔도글리카나아제 가수분해 스텝의 역반응과 유사한 합성 스텝에 의해서 그 반응을 촉진시킨다. 이들의 구체예에서, 그 글리코실 공여체 분자(예를 들어, 바람직한 소정의 올리고- 또는 모노-당 구조체)는 이탈기를 함유하며, 그 반응은 단백질 상의 GlcNAc 잔기에 그 공여체 분자의 부가와 함께 진행한다. 예를 들어, 그 이탈기는 플루오라이드 등 할로겐으로 할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 그 이탈기는 Asn, 또는 Asn-펩티드 부분이다. 또 다른 구체예에서, 글리코실 공여체 분자 상의 GlcNAc 잔기가 수식된다. 예를 들어, 그 GlcNAc 잔기는 1,2 옥사졸린 부분을 포함할 수 있다.
하나의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 콘쥬게이트를 생성하는데 이용되는 각각의 효소는 촉매량으로 존재한다. 하나의 특정 효소의 촉매량은 효소의 기질의 농도와 온도, 시간 및 pH 값 등 반응조건에 따라 변화한다. 미리 선택된 기질 농도 및 반응조건 하에서 소정의 효소에 대한 촉매량을 결정하는 수단은 당업자로부터 주지되어 있다.
상기의 방법이 실시되는 온도는 빙점을 바로 상회하는 온도로부터 가장 민감한 효소가 변성하는 온도까지의 범위로 할 수 있다. 바람직한 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 55℃, 더 바람직하게는 약 20℃ 내지 약 37℃이다. 또 다른 예시적인 구체예에서, 본 방법의 하나 또는 그 이상의 구성요소는 호열성 효소(thermophilic enzyme)를 사용하여 고온에서 실시된다.
그 반응혼합물은 수용체가 글리코실화 하는데 충분한 시간 동안 유지시킴으로써 바람직한 소정의 콘쥬게이트를 형성시킨다. 다수의 경우 콘쥬게이트의 일부는 수시간 후에 검출할 수 있으며, 회수가능한 양은 통상적으로 24시간 이내에 얻어진다. 반응속도가 선택된 계(system)에 대하여 최적화되는 다수의 변동요인 (예를 들어, 효소 농도, 공여체 농도, 수용체 농도, 온도, 용매 용적)에 따라 좌우되는 것으로 당업자는 이해할 수 있다.
또, 본 발명은 수식된 펩티드의 공업적-규모의 생산을 제공한다. 본 발명 명세서에서 사용된 공업적 규모는 일반적으로 적어도 1 그람의 완성되어 정제된 콘쥬게이트를 제조한다.
아래의 설명에서, 본 발명은 글리코실화 펩티드에 대한 수식된 시알산 부분의 결합(conjugation)에 의해 예시된다. 그 예시적인 수식된 시알산은 PEG로 표지된다. PEG-수식된 시알산과 글리코실화 펩티드의 사용에 대한 아래 고찰의 초점은 예시를 명확하게 하기 위한 것이며, 본 발명이 이들의 두 가지 파트너의 결합으로 한정하는 것을 의미하는 것은 아니다. 아래 설명이 일반적으로 시알산 이외의 수식된 글리코실 부분의 부가에도 적용할 수 있는 것으로 당업자는 이해한다. 또, 아래 설명은 다른 PEG 부분, 치료 효과가 있는 부분 및 생체분자를 포함하여, PEG 이외의 작용물질(agents)에 의한 글리코실 단위의 수식에도 동일하게 적용할 수 있다.
펩티드 또는 글리코펩티드 상에서 PEG화 또는 PPG화된 당을 선택적으로 도입시키기 위하여 하나의 효소적 방법을 사용할 수 있다. 이 방법은 PEG, PPG, 또는 차폐된 반응성 작용기를 함유하는 수식된 당을 이용하며, 적절한 글리코실트랜스퍼라아제 또는 글리코신타아제와 병용하여 조합한다. 바람직한 소정의 당 결합을 형성하는 글리코실트랜스퍼라아제를 선택하고, 그 공여체 기질로서 수식된 당을 이용함으로써, G-CSF 펩티드 골격, 글리코펩티드의 기존의 당 잔기, 또는 펩티드에 부가된 당 잔기 상에서 그 PEG 또는 PPG를 직접 도일시킬 수 있다.
그 시알릴트랜스퍼라아제의 수용체는 천연 구조체로서, 또는 재조합에 의해, 효소적으로 또는 화학적으로 배치된 것으로서, 본 발명의 방법에 의해 수식되도록 하는 G-CSF 펩티드 상에 존재한다. 적합한 수용체에는 예를 들어, Galβ1,4GlcNAc, Galβ1,4GalNAc, Galβ1,3GalNAc, 락토-N-테트라오스, Galβ1,3GlcNAc, Galβ1,3Ara, Galβ1,6GlcNAc, Galβ1,4Glc (락토오스) 등 갈락토실 수용체 및 당업자로부터 공지된 다른 수용체가 포함한다[참조문헌: Paulson et al., J. Biol. Chem. 253: 5617-5624 (1978)].
하나의 구체예에서, 그 시알릴트랜스퍼라제의 수용체는 글리코펩티드의 생체내 합성시에 수식되는 글리코펩티드 상에 존재한다. 이들의 글리코펩티드는 특허청구범위의 방법에 의해 글리코펩티드의 글리코실화 패턴을 미리 사전에 수식하지 않고 시알릴화 할 수 있다. 또, 본 발명의 방법을 사용하여 적합한 수용체를 포함하지 않는 펩티드를 시알릴화할 수 있으며, 이때 당업자로부터 공지된 방법에 의해 최초로 G-CSF 펩티드를 수식하여 수용체를 포함하도록 한다. 하나의 예시적인 구체예에서, GalNAc 트랜스퍼라아제의 작용에 의해 하나의 GalNAc 잔기를 부가한다.
하나의 예시적인 구체예에서, 그 갈락토실 수용체는 갈락토오스 잔기를 G-CSF 펩티드에 결합된 적절한 수용체, 예를 들어, GlcNAc에 결합시킴으로써 구축된다. 이 방법에는 수식시키고자 하는 G-CSF 펩티드를 적합한 양의 갈락토실트랜스퍼라아제 (예를 들어, galβ1,3 또는 galβ1,4), 및 적합한 갈락토실 공여체 (예를 들어, UDP-갈락토오스)를 함유하는 반응혼합물과 함께 배양하는 것을 포함한다. 그 반응은 실질적으로 거의 완료할 때까지 진행하도록 하거나, 또는 사전에 미리 선택된 양의 갈락토오스 잔기가 부가될 때 종료된다. 선택된 당 수용체를 구축하는 다른 방법은 당업자로부터 명백하다.
또 다른 구체예에서, 글리코펩티드가 결합된 올리고당의 전체 또는 일부분을 우선 최초로 "트리밍"(trimming)하여, 시알릴트랜스퍼라아제의 수용체 또는 하나 또는 그 이상의 적절한 잔기를 부가하여 적합한 수용체를 얻을 수 있는 부분을 노출시킨다. 글리코실트랜스퍼라아제 및 엔도글리코시다아제 등 효소(참조 특허문헌 예: 미국 특허 제 5,716,812 호)는 결합반응 또는 트리밍 반응에 유용하다.
아래의 설명에서, 본 발명의 방법은 PEG 부분이 결합되어 있는 수식된 당을 사용하여 예시한다. 그 설명의 초점은 예시를 명확하게 하기 위한 것이다. 아래의 설명은 수식된 당이 치료 효과가 있는 부분이나 생체 분자 등을 포함하는 이들의 구체예에 동일하게 해당된다는 것을 당업자로부터 이해할 수 있다.
수식된 당을 부가하기 전에 하나의 당 잔기가 "트리밍"(trimming)되는 하나의 예시적인 구체예에서, 고급 만노오스는 트리밍 되어 제 1 세대의 바이안테나 구조체로 된다. PEG 부분을 가진 수식된 당은 "트리밍"에 의해 노출된 하나 이상의 당 잔기에 결합된다. 하나의 예로, PEG 부분은 그 PEG 부분에 결합된 GlcNAc 부분을 통해 부가된다. 그 수식된 GlcNAc는 바이안테나 구조체의 말단 만노오스 잔기의 한쪽 또는 쌍방에 부가된다. 또, 미수식된 GlcNAc는 분지상의 화학종의 말단의 한쪽 또는 쌍방에 부가시킬 수 있다.
또 다른 예시적 구체예에서, 하나의 PEG 부분은 말단 만노오스 잔기 상에 부가된 GlcNAc 잔기에 결합된 갈락토오스 잔기를 가진 수식된 당을 통해 바이안테나 구조체의 말단 만노오스 잔기의 한쪽 또는 쌍방에 부가된다. 떠 미수식된 Gal은 말단 GlcNAc 잔기의 한쪽 또는 쌍방에 부가시킬 수 있다.
또 다른 추가 예에서, 하나의 PEG 부분은 수식된 시알산을 사용하여 Gal 잔기 상에 부가된다.
또 다른 예시적인 구체예에서, 고급 만노오스 구조체가 "트리밍"되어 만노오스를 생성하고, 이것에 의해 바이안테나 구조체가 분지된다. 하나의 예로, PEG 부분은 폴리머로 수식된 GlcNAc를 통해 부가된다. 또, 미수식된 GlcNAc는 만노오스에 부가하고, 이어서 PEG 부분이 결합된 Gal에 부가된다. 또 다른 추가 구체예에서,미수식된 GlcNAc 및 Gal 잔기는 만노오스에, 그 다음 이어서 PEG 부분으로 수식된 시알산 부분에 순차적으로 부가된다.
추가의 예시적 구체예에서, 고급 만노오스는 "트리밍"되어 최초의 만노오스가 결합된 GlcNAc를 생성한다. 그 GlcNAc는 PEG 부분을 가진 Gal 잔기에 결합되어 있다. 또, 미수식된 Gal을 GlcNAc에 부가하고, 다음에 이어서 수용성 당으로 수식된 시알산을 부가한다. 또 다른 추가의 구체예에서, 말단 GlcNAc를 Gal과 결합시키고, 그 다음 이어서, GlcNAc는 PEG 부분을 가진 수식된 푸코오스로 푸코실화한다.
또, 고급 만노오스는 트리밍 되어 펩티드의 Asn에 결합된 최초 GlcNAc를 얻을 수도 있다. 하나의 예에서, GlcNAc-(Fuc)a 잔기의 GlcNAc는 수용성 폴리머를 가진 GlcNAc에 결합된다. 또 다른 예에서, GlcNAc-(Fuc)a 잔기의 GlcNAc는 수용성 폴리머를 가진 Gal로 수식된다. 추가의 또 다른 구체예에서, GlcNAc는 Gal로 수식시키고, 그 다음 이어서 PEG 부분으로 수식된 시알산의 Gal에 결합시킨다.
다른 예시적 구체예는 각각 본 발명 명세서에서 참고로 인용하여 편집된 다음 특허문헌[본원 권리자가 소유한 미국 공개특허출원 제 20040132640; 제 20040063911; 20040137557호; 미국 특허출원 제 10/369,979호; 제 10/410,913호; 제 10/360,770호; 제 10/410,945호 및 PCT/US02/32263]에서 기술되어 있다.
위에서 설명한 예는 본 발명 명세서에서 기술한 방법의 범위의 예시를 제공한다. 본 발명 명세서에서 기술된 방법에 의해, 실질적으로 바람직한 소정의 구조의 당 잔기를 "트리밍"(trimming) 및 구축하는 것이 가능하다. 그 수식된 당은 위에서 설명한 바와 같이, 그 당 부분의 말단에 부가시킬 수 있고, 또는 펩티드 코어와 당 말단 사이의 개재물로 할 수 있다.
하나의 예시적인 구체예에서, 기존의 시알산은 시알리다아제에 의해 G-CSF 글리코펩티드에서 제거됨으로써 내재하는 갈락토실 잔기 모두 또는 대부분이 노출된다. 혹은, 펩티드 또는 글리코펩티드를, 갈락토오스 잔기, 또는 말단이 갈락토오스 단위인 올리고당 잔기로 표지한다. 갈락토오스 잔기의 노출 또는 부가에 이어, 적절한 시알릴트랜스퍼라아제를 사용하여 수식된 시알산을 부가한다. 이 방법을 스킴 1에 요약한다.
Figure 112010017920206-pct00113
스킴 2에서 요약된 또 다른 추가의 방법에서, 차폐된 반응성 작용기는 시알산 상에 존재한다. 그 차폐된 반응성기는 수식된 시알산을 G-CSF에 결합하는데 사용되는 조건에 의해 영향을 받지 않는 것이 바람직하다. 수식된 시알산을 G-CSF 펩티드에 공유 결합시킨 후에, 차폐 부분을 제거하고, G-CSF 펩티드를 PEG 등 작용물질과 결합시킨다. 수식된 당 잔기 상에서 차폐되지 않은 반응성기와 반응함으로써 그 작용물질(agent)은 특이적으로 그 펩티드에 결합된다.
Figure 112010017920206-pct00114
본 명세서에 임의의 수식된 당은 글리코펩티드의 올리고당 측쇄의 말단 당에 따라 적절한 글리코실트랜스퍼라아제와 함께 사용될 수 있다 (표 1). 상기에서 설명한 바와 같이, PEG화 구조의 도입에 필요한 글리코펩티드의 말단 당은 발현 중에 자연적으로 도입시킬 수 있고, 혹은 적절한 글리코시다아제(들), 글리코실트랜스퍼라아제(들) 또는 글리코시다아제(들)와 글리코실트랜스퍼라아제(들)의 혼합물을 사용하여 발현 후에 생성시킬 수 있다.
Figure 112010017920206-pct00115
Figure 112010017920206-pct00116
추가의 예시적인 구체예에서, UDP-갈락토오스-PEG는 우유의 β1,4-갈락토실트랜스퍼라아제와 반응시킴으로써 수식된 갈락토오스를 적절한 말단 N-아세틸글루코사민 구조체에 전이시킨다. 글리코펩티드 상의 말단 GlcNAc 잔기는 포유동물, 곤충, 식물 또는 진균 등의 발현계에서 일어날 수 있도록, 발현 중에 생성될 수 있을 뿐만 아니라, 필요에 따라서 시알리다아제 및/또는 글리코시다아제 및/또는 글리코실트랜스퍼라아제로 글리코펩티드를 처리함으로써 생성할 수도 있다.
또 다른 예시적인 구체예에서는, GNT1-5 등 GlcNAc 트랜스퍼라아제를 이용하여 PEG화된 GlcN을 글리코펩티드 상의 말단 만노오스 잔기에 전이시킨다. 또 다른 추가의 예시적인 구체예에서는, N-결합형 및/또는 O-결합형 글리칸 구조체를 글리코펩티드에서 효소에 의해 제거시키며, 이이서 수식된 당에 결합되어 있는 아미노산 또는 말단 글리코실 잔기를 노출시킨다. 예를 들어, 엔도글리카나아제를 사용하여 글리코펩티드의 N-결합형 구조체를 제거하여 글리코펩티드 상의 GlcNAc-결합형-Asn으로서 말단 GlcNAc를 노출시킨다. UDP-Gal-PEG 및 적절한 갈락토실트랜스퍼라아제를 사용하여 노출된 GlcNAc 상에 PEG-갈락토오스 작용기를 도입한다.
하나의 대체 구체예에서, 그 수식된 당은 펩티드 골격에 당 잔기를 전이시키는 것이 공지된 글리코실트랜스퍼라아제에 의해 G-CSF 펩티드 골격에 직접 부가된다. 이러한 예시적인 구체예는 스킴 3에서 설명한다. 본 발명을 실시하는데 유용한 예시적인 글리코실트랜스퍼라아제는 GalNAc 트랜스퍼라아제 (GalNAc T1-14), GlcNAc 트랜스퍼라아제, 푸코실트랜스퍼라아제, 글루코실트랜스퍼라아제, 크실로실트랜스퍼라아제, 만노실트랜스퍼라아제 등이 포함되나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이러한 방법을 사용함으로써 임의의 당이 결여되어 있는 펩티드 상에, 또는 기존의 글리코펩티드 상에 수식된 당을 직접 부가할 수 한다. 두 경우 중 어느 경우에서도, 그 수식된 당의 부가는 글리코실트랜스퍼라아제의 기질 특이성(substrate specificity)에 의해 정하여지며, 그 펩티드 골격상의 특정 위치에서 일어나며, 화학적 방법에 의한 단백질의 펩티드 골격의 수식 중에 일어나는 것과 같이 랜덤방식(randon manner)으로는 일어나지 않는다. 폴리펩티드 사슬 중에 적절한 아미노산 서열을 인공적으로 생성함으로써 글리코실트랜스퍼라아제 기질의 펩티드 서열이 결여되어 있는 단백질 또는 글리코실펩티드에 일련의 작용물질을 도입할 수 있다.
Figure 112010017920206-pct00117
위에서 설명한 각각의 예시적 구체예에서는 수식된 당을 펩티드에 결합한 후에 하나 또는 그 이상의 화학적 또는 효소적 수식 스텝을 이용할 수 있다. 하나의 예시적인 구체예에서, 효소(예를 들어, 푸코실트랜스퍼라아제)를 사용하여 G-CSF 펩티드에 결합되어 있는 말단 수식된 당에 글리코실 단위(예를 들어, 푸코오스)를 부가한다. 또 다른 예에서, 효소 반응을 이용하여 수식된 당이 결합할 수 없는 부위를 "캡핑"(capping)한다. 혹은, 화학 반응을 이용하여 결합되어 있는 수식된 당의 구조를 변경시킨다. 예를 들어, 결합되어 있는 수식된 당을, 그 수식된 당이 결합되어 있는 펩티드 성분과의 결합을 안정화 또는 불안정화시키는 작용물질과 반응시킨다. 또 다른 예에서, 펩티드에 결합한 후에 수식된 당의 성분을 탈보호한다. 수식된 당이 G-CSF 펩티드에 결합된 후의 단계에서 본 발명의 방법에 유용한 일련의 효소적 및 화학적 절차가 있다는 것은 당업자가 이해할 것이다. 수식된 당과 펩티드의 콘쥬게이트의 추가 가공은 본 발명의 범위 내에 있다.
효소(enzymes)
아실 결합형 콘쥬게이트의 형성에 있어서, 위에서 설명한 효소 이외에 다른 효소를 이용하는 방법에 의해 그 콘쥬게이트의 글리코실화 패턴 및 출발기질(예로서, 펩티드, 지질)을 가공하며, 트리밍하고 또는 특별한 설명이 없는 경우 수식할 수 있다. 당 공여체를 수용체에 전이시키는 효소를 사용하여 펩티드 및 지질을 재구축하는 방법은 특허문헌[WO 03/031464 A2 (DeFrees); 2003년 4월 17일 공개]에 서 구체적으로 기재되어 있다. 본 발명의 방법에서 유용한 선택된 효소를 간단하게 요약하여 아래에서 설명한다.
글리코실트랜스퍼라아제(glycosyltransferases)
글리코실트랜스퍼라아제는 단백질, 글리코펩티드, 지질 또는 당지질 또는 신장 중에 있는 올리고당의 비환원 말단에, 활성화된 당(공여체 NDP- 또는 NMP-당)의 부가를 단계적으로 촉진시킨다. N-결합형 글리코펩티드는 트랜스퍼라아제 및 지질-결합형 올리고당 공여체 Dol-PP-NAG2Glc3Man9를 통해 일괄 전이(en block trandsfer)와 그 다음 이어서 그 코어(core)의 트리밍(trimming)에 의해 합성된다. 이 경우에, "코어" 당의 성질은 후속하는 부가물과는 약간 다르다. 대단히 많은 글리코실트랜스퍼라아제가 이 기술분야에서 공지되어 있다.
본 발명에서 사용되는 글리코실트랜스퍼라아제는 당 공여체로서 수식된 당을 이용할 수 있는 한 어느 것이라도 될 수 있다. 이러한 효소의 예로는 갈락토실트랜스퍼라아제, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제, N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라아제, 푸코실트랜스퍼라아제, 시알릴트랜스퍼라아제, 만노실트랜스퍼라아제, 크실로실트랜스퍼라아제, 글루쿠로노닐트랜스퍼라아제 등 르로와르 경로 (Leloir pathway)의 글리코실트랜스퍼라아제가 포함된다.
글리코실트랜스퍼라아제 반응을 포함하는 효소적 당 합성을 위해, 글리코실트랜스퍼라제아를 클로닝하거나, 또는 임의의 공급원에서 분리할 수 있다. 다수의 클로닝된 글리코실트랜스퍼라아제는 공지되어 있으며, 이들의 폴리뉴클레오티드 서열이 알려져 있다[참조예: "The WWW Guide To Cloned Glycosyltransferases", (http://www.vei.co.uk/TGN/gt_guide.htm)]. 글리코실트랜스퍼라아제 아미노산 서열 및 아미노산 서열을 이것에서 추측할 수 있는 글리코실트랜스퍼라아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 또한 젠뱅크 (GenBank), 스위스-프로트 (Swiss-Prot), EMBL 및 기타를 포함하여 공적으로 입수가능한 데이타베이스에서 확인할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 글리코실트랜스퍼라아제에는 갈락토실트랜스퍼라아제, 푸코실트랜스퍼라아제, 글루코실트랜스퍼라아제, N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라아제, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제, 글루쿠로닐트랜스퍼라아제, 시알릴트랜스퍼라아제, 만노실트랜스퍼라아제, 글루쿠론산 트랜스퍼라아제, 갈락투론산 트랜스퍼라아제 및 올리고사카릴트랜스퍼라아제가 포함되나, 이들로 한정되어 있는 것은 아니다. 적합한 글리코실트랜스퍼라아제에는 진핵 생물 및 원핵생물로부터 얻어진 것이 포함된다.
글리코실트랜스퍼라아제를 코딩하는 DNA는 화학적 합성에 의해서, 적절한 세포 또는 세포계통 배양물에 유래하는 mRNA의 역전사물(reverse trandscripts)을 스크리닝함으로써, 적절한 세포에 유래하는 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써, 또는 이들의 절차를 조합함으로써 얻을 수 있다. mRNA 또는 게놈 DNA의 스크리닝은 글리코실트랜스퍼라제 유전자 서열에서 생성된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 실시할 수 있다. 프로브(probes)는 공지된 절차에 따라 형광기, 방사성 원자 또는 화학 발광기 등 검출 가능한 기로 표지할 수 있고, 종래의 하이브리다이제이션 아세이(hybridization assays)에서 사용할 수 있다. 또, 대체방법으로 폴리머라아제 연쇄 반응법(PCR) 절차에 의해, 글리코실트랜스퍼라아제 유전자 서열에서 생성되는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 글리코실트랜스퍼라아제 유전자 서열을 얻을 수 있다[참조 특허문헌: 미국 특허 제 4,683,195호(Mullis et al.) 및 미국 특허 제 4,683,202호(Mullis)].
글리코실트랜스퍼라아제는 글리코실트랜스퍼라아제 효소를 코딩하는 DNA를 함유하는 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포 중에서 합성할 수 있다. 벡터를 사용하여 글리코실트랜스퍼라아제 효소를 코딩하는 DNA를 증폭시키며 및/또는 글리코실트랜스퍼라아제 효소를 코딩하는 DNA를 발현시킨다. 발현벡터는 글리코실트랜스퍼라아제 효소를 코딩하는 DNA 서열이 적합한 숙주 중에서 글리코실트랜스퍼라아제 효소의 발현을 일으킬 수 있는 적합한 조절서열에 작동할 수 있게 연결된 복제가능한 DNA 구축체이다. 이러한 조절서열의 필요성은 선택된 숙주 및 선택된 형질전환방법에 따라 달라진다고 생각된다. 일반적으로 조절서열은 전사 프로모터, 전사를 조절하는 임의의 선택 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 번역의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 증폭벡터는 발현조절 도메인(domain)을 필요로 하지 않는다. 필요로 한 것은 통상적으로 복제의 기점에 의해 부여된 숙주 중에서 복제하는 능력과, 형질전환체의 인식을 용이하게 하는 선택 유전자만이다.
하나의 예시적인 구체예에서, 본 발명은 원핵 생물의 효소를 이용한다. 이러한 글리코실트랜스퍼라아제에는 다수의 그람 음성 세균에 의해 생성된 리포올리고당(LOS)의 합성에 관여되는 효소가 포함된다 [Preston et al., Critical Reviews in Microbiology 23(3): 139-180 (1996)]. 이러한 효소에는 β1,6 갈락토실트랜스퍼라아제 및 β1,3 갈락토실트랜스퍼라아제 [참조예: EMBL 기탁번호 제 M80599 및 M86935 호(대장균); EMBL 기탁번호 제 S56361 호(S. typhimurium)], 글루코실트랜스퍼라아제 (Swiss-Prot 기탁번호 제 P25740 호(대장균), β1,2-글루코실트랜스퍼라아제 (rfaJ)(Swiss-Prot 기탁번호 제 P27129 호(대장균) 및 Swiss-Prot 기탁번호 제 P19817 호 (S. typhimurium)), 및 β1,2-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 (rfaK)(EMBL 기탁번호 제 U00039 호(대장균)를 포함하는, 대장균(E. coli) 및 살로넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium) 등 종의 rfa 오페론의 단백질이 포함되나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 그 아미노산 서열이 공지되어 있는 그 밖의 다른 글리코실트랜스퍼라아제에는 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 대장균(E. coli), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica), 예르시니아 엔테로콜리티가 (Yersinia enterocolitica), 마이코박테리움 레프로섬 (Mycobacterium leprosum) 등 생물에서 특정이 있는 rfaB, 및 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)의 rh1 오페론 등 오페론에 의해서 코딩되어 있는 것이 포함된다.
락토-N-네오테트라오스, D-갈락토실-β-1,4-N-아세틸-D-글루코사미닐-β-1,3-D-갈락토실-β-1,4-D-글루코오스, 및 점막 병원균 나이세리아 고노레애(Neisseria gonnorhoeae) 및 나이세리아 메닌기티디스(N. meningitidis)의 LOS 중에서 동정된 Pk 혈액형 3당 서열, D-갈락토실-α-1,4-D-갈락토실-β-1,4-D-글루코오스[Scholten et al., J. Med. Microbiol. 41: 236-243 (1994)]를 포함하는 구조체를 생성하는데 연관되는 글리코실트랜스퍼라아제도 본 발명에서 사용하는데 적합하다. 이들의 구조체의 생합성에 연관되어 있는 글리코실트랜스퍼라아제를 코딩하는 나이세리아 메닌기티디스 및 나이세리아 고노레애 유래의 유전자는 나이세리아 메닌기티디스 면역형 L3 및 L1[Jennings et al., Mol. Microbiol. 18: 729-740 (1995] 및 나이세리아 고노레애 변이체 F62[Gotshlich, J. Exp. Med. 180: 2181-2190 (1994)]에서 동정되어 있다. 나이세리아 메닌기티디스(수막염균)에서는 3종의 유전자 lgtA, lgtB 및 lgt E로 이루어진 부위가 락토-N-네오테트라오오스 사슬 중 당의 최종 3개를 부가하는데 필요한 글리코실트랜스퍼라아제 효소를 코딩한다[Wakarchuk et al., J. Biol. Chem. 271: 19166-73 (1996)]. 최근에는 lgtB 및 lgtA 유전자 생성물의 효소 활성이 실증되어, 제안된 이들의 글리코실트랜스퍼라아제 기능에 대하여 처음에 직접적인 증거가 제공되었다[Wakarchuk et al., J. Biol. Chem. 271(45): 28271-276 (1996)]. 나이세리아 고노레애(임균)에서는 2종의 추가 유전자, β-D-GalNAc를 락토-N-네오테트라오오스 구조체의 말단 갈락토오스 3위치에 부가하는 lgtD와, 절단된 LOS의 락토오스 성분에 말단
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-D-Gal를 부가함으로써, Pk 혈액형의 항원구조를 생성하는 lgtC가 있다[Gostshlich(1994), 상기 문헌 기재 참조]. 나이세리아 메닌기티디스(수막염균)에서는 또 하나의 분리된 면혁형 L1도 Pk 혈액형의 항원을 발현하며, 또 lgtC 유전자를 가지는 것을 나타낸다[Jennings et al., (1995) 상기 문헌 참조]. 나이세리아 글리코실트랜스퍼라아제 및 그 관련 유전자는 미국 특허 제 5,545,553호(Gotschlich) 명세서에서도 기재되어 있다. 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)에서 유래하는
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1,2-푸코실트랜스퍼라아제와
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1,3-푸코실트랜스퍼라아제의 유전자도 특징화되어 있다[Martin et al., J. Biol. Chem. 272: 21349-21356 (1997)]. 또, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)의 글리코실트랜스퍼라아제도 본 발명에서 유용하다(참조 예로서, http://afmb.cnrs-mrs.fr/~pedro/CAZY/gtf_42.html).
푸코실트랜스퍼라아제(Fucosyltransferases)
몇가지 구체예에서, 본 발명의 방법에서 사용된 글리코실트랜스퍼라제는 푸코실트랜스퍼라아제이다. 푸코실트랜스퍼라아제는 당업자로부터 공지되어 있다. 예시적인 푸코실트랜스퍼라아제에는 L-푸코오스를 GDP-푸코오스에서 수용체 당의 하이드록시 부위로 전이시키는 효소가 포함된다. 비-뉴클레오티드 당을 수용체로 전이시키는 푸코실트랜스퍼라아제도 본 발명에서 유용하다.
몇가지 구체예에서, 수용체 당은 예를 들어, 올리고당 글리코사이드 중 Galβ(1→3,4)GlcNAcβ- 기의 GlcNAc이다. 이 반응에 적합한 푸코실트랜스퍼라아제에는 사람의 우유에서 최초로 특징화된 Galβ(1→3,4)GlcNAcβ1-α(1→3,4)푸코실트랜스퍼라아제 (FTIII E.C. No. 2.4.1.65) [참조: Palcic, et al., Carbohydrate Res. 190: 1-11 (1989); Prieels, et al., J. Biol. Chem. 256: 10456-10463 (1981); 및 Nunez, et al., Can. J. Chem. 59: 2086-2095 (1981)], 및 사람 혈청 중에 존재하는 Galβ(1→4)GlcNAcβ-α푸코실트랜스퍼라아제 (FTIV, FTV, FTVI)를 포함한다. FTVII (E.C. No. 2.4.1.65), 즉 시알릴 α(2→3)Galβ((1→3)GlcNAcβ 푸코실트랜스퍼라아제도 특징화되었다. Galβ(1→3,4)GlcNAcβ-α(1→3,4)푸코실트랜스퍼라아제의 재조합 형도 특징화되었다 [참조: Dumas, et al., Bioorg. Med. Letters 1: 425-428 (1991) 및 Kukowska-Latallo, et al., Genes and Development 4: 1288-1303 (1990)]. 그 밖의 다른 예시적인 푸코실트랜스퍼라아제에는 예를 들어, α1,2 푸코실트랜스퍼라아제 (E.C. No. 2.4.1.69)가 포함된다. 효소적 푸코실화는 문헌 [Mollicone, et al., Eur. J. Biochem. 191: 169-176 (1990)] 또는 미국 특허 제 5,374,655 호에 기술된 방법에 의해서 실시할 수 있다. 푸코실트랜스퍼라제를 얻는데 사용되는 세포는 GDP-푸코오스를 합성하기 위한 효소계도 포함하는 것으로 생각한다.
칼락토실트랜스퍼라아제(Galactosyltransferases)
구체예의 또 다른 군(group)에서, 글리코실트랜스퍼라아제는 갈락토실트랜스퍼라아제이다. 예시적인 갈락토실트랜스퍼라아제에는 α(1,3) 갈락토실트랜스퍼라아제 [E.C. No. 2.4.1.151, 참조예: Dabkowski et al., Transplant Proc. 25:2921 (1993) 및 Yamamoto et al. Nature 345: 229-233 (1990), 소(bovine)유래 (GenBank j04989, Joziasse et al., J. Biol. Chem. 264: 14290-14297 (1989)), 마우스(murine)유래 (GenBank m26925; Larsen et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86: 8227-8231 (1989)), 돼지(porcine) 유래 (GenBank L36152; Strahan et al., Immunogenetics 41: 101-105 (1995))]가 포함된다. 또 다른 적합한 α1,3 갈락토실트랜스퍼라아제는 B혈액형 항원의 합성에 연관되어 있는 것이다 [EC 2.4.1.37, Yamamoto et al., J. Biol. Chem. 265: 1146-1151 (1990) (사람)]. 추가의 또 다른 예시적인 갈락토실트랜스퍼라아제는 코어 Gal-T1이다.
갈락토실트랜스퍼라아제도 본 발명의 방법에서 사용하는데 적합하며, 예를 들어, EC 2.4.1.90 (LacNAc 신테타아제) 및 EC 2.4.1.22 (락토오스 신테타아제) [소 유래 (D'Agostaro et al., Eur. J. Biochem. 183: 211-217 (1989)), 인간 유래 (Masri et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 157: 657-663 (1988)), 마우스 유래 (Nakazawa et al., J. Biochem. 104: 165-168 (1988))] 및 E.C. 2.4.1.38 및 세라미드 갈락토실트랜스퍼라아제[EC 2.4.1.45, Stahl et al., J. Neurosci. Res. 38: 234-242 (1994)]를 포함한다. 그 밖의 다른 적합한 갈락토실트랜스퍼라아제에는 예를 들어, α1,2 갈락토실트랜스퍼라아제[예를 들어, 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)유래의 것, Chapell et al., Mol. Biol. Cell 5: 519-528 (1994)으로부터 유래함]가 포함된다.
시알릴트랜스퍼라아제(Sialytransferases)
시알릴트랜스퍼라아제는 재조합 세포 및 본 발명의 반응혼합물에서 유용한 또 다른 타입의 글리코실트랜스퍼라아제이다. 또, 재조합형 시알릴트랜스퍼라아제를 생산하는 세포는 시알릴트랜스퍼라아제에 대한 시알산 공여체인 CMP-시알산을 생산할 수 있다. 본 발명에서 사용하는데 적합한 시알릴트랜스퍼라아제의 예로는 ST3Gal III (예를 들어, 랫트 또는 사람의 ST3Gal III), ST3Gal IV, ST3Gal I, ST3GalII, ST6Gal I, ST3Gal V, ST6Gal II, ST6GalNAc I, ST6GalNAc II, 및 ST6GalNAc III[본 발명의 명세서에서 사용하는 시알릴트랜스퍼라아제의 명명법은 문헌(Tsuji et al., Glycobiology 6: v-xiv (1996))에 기술되어 있다]가 포함된다. α(2,3)시알릴트랜스퍼라제 (EC 2.4.99.6)라고 불리는 예시적인 α(2,3)시알릴트랜스퍼라아제는 시알산을 2당 Galβ1→3Glc의 비환원 말단 Gal 또는 글리코사이드로 전이시킨다[참조: Van den Eijnden et al., J. Biol. Chem. 256: 3159 (1981), Weinstein et al., J. Biol. Chem. 257: 13845 (1982) 및 Wen et al., J. Biol. Chem. 267: 21011 (1992)]. 또 다른 예시적인 α2,3-시알릴트랜스퍼라아제 (EC 2.4.99.4)는 시알산을 2당의 비환원 말단 Gal 또는 글리코사이드로 전이시킨다[참조: Rearick et al., J. Biol. Chem. 254: 4444 (1979) 및 Gillespie et al., J. Biol. Chem. 267: 21004 (1992)]. 추가의 예시적인 효소로는 Gal-β-1,4-GlcNAc α-2,6 시알릴트랜스퍼라아제가 포함된다 [참조: Kurosawa et al. Eur. J. Biochem. 219: 375-381 (1994)].
바람직하게는, 글리코펩티드의 당을 글리코실화하는 경우, 시알릴트랜스퍼라아제는 완전히 시알릴화된 당 구조체 상에서 말단 시알산을 기초로 하는 가장 일반적인 말단에서 2번째 서열인 Galβ1,4GlcNAc 서열에 시일산을 전이시킬 수 있다(참조: 표 2).
수용체 기질로서 Galβ1,4GlcNAc 서열을 사용하는 시알릴트랜스퍼라아제
시알릴트랜스퍼라아제 공급원 형성된 서열 참고문헌
ST6Gal I 포유동물 NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNAc- 1
ST3Gal III 포유동물 NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAc-
NeuAcα2,3Galβ1,3GlcNAc-		 1
ST3Gal IV 포유동물 NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAc-
NeuAcα2,3Galβ1,3GlcNAc-		 1
ST6Gal II 포유동물 NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNAc-
ST6Gal II 발광세균 NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNAc- 2
ST3Gal V 나이세리아 메닌기티디스
나이세리아 고노레애		 NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAc- 3
1) Goochee ey al., Bio/Technology 9: 1347-1355 (1991)
2) Yamamoto et al., J. Biochem. 120: 104-110 (1996)
3) Gilbert et al., J. Biol. Chem. 271: 28271-28276 (1996)
특허 청구범위의 방법에서 유용한 시알릴트랜스퍼라아제의 예는 α(2,3)시알릴트랜스퍼라아제 (EC 2.4.99.6)로도 불리는 ST3Gal III이다. 이 효소는 Galβ1,3GlcNAc의 Gal 또는 Galβ1,4GlcNAc 글리코사이드로 시알산의 전이를 촉진하며[참조예: Wen et al., J. Biol. Chem. 267: 21011 (1992); Van den Eijnden et al., J. Biol. Chem. 256: 3159 (1991)], 글리코펩티드 중의 아스파라긴-결합 올리고당의 시알릴화를 담당한다. 시알산은 Gal에 결함하여, 2개의 당 사이에서
Figure 112010017920206-pct00121
결합이 형성된다. 이들의 당 사이의 결합(linkage)은 NeuAc의 2-위치와 Gal의 3-위치 사이에 있다. 이러한 특징의 효소는 랫트의 간에서 분리할 수 있다(Weinstein et al., J. Biol. Chem. 257: 13845 (1982)). 인간의 cDNA (Sasaki et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 22782-22787; Kitagawa & Paulson (1994) J. Biol. Chem. 269: 1394-1401) 및 게놈(Kitagawa et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 931-938) DNA 서열은 공지되어 있어, 재조합 발현에 의해 이 효소를 생성하는 것을 용이하게 한다. 바람직한 구체예에서, 특허 청구범위의 시알릴화 방법은 랫트 ST3Gal Ⅲ을 사용한다.
본 발명에서 유용한 그 밖의 다른 예시적인 시알릴트랜스퍼라아제에는 CST-I 및 CST-II 및 α(2,3) 결합을 형성하는 것을 포함하여 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni)로부터 분리된 것이 포함된다 [참조 특허문헌 예: WO99/49051].
표 2에서 열거된 것 이외에 시알릴트랜스퍼라아제도 상업적으로 중요한 글리코펩티드의 시알릴화를 위한 경제적이고 효율적인 대규모 프로세스에서 유용하다. 이들의 다른 효소의 유용성을 확인하기 위한 간단한 시험으로서, 다양한 양의 각각의 효소 (1-100 mU/㎎ 단백질)를 아시알로-α1 AGP (1-10 ㎎/㎖)와 반응시켜, 문제의 시알릴트랜스퍼라아제가 글리코펩티드에 시알릴화 하는 능력을 소(bovine)의ST6Gal I, ST3Gal Ⅲ 또는 양쪽의 시알릴트랜스퍼라아제에 대하여 비교한다. 또, 다른 글리코펩티드 또는 글리코펩티드, 또는 펩티드 골격에서 효소적으로 유리된 N-결합형 올리고당은 아시알로-α1 AGP 대신에 이 평가에 사용할 수 있다. ST6Gal I보다 더 효율적으로 글리코펩티드의 N-결합형 올리고당을 시알릴화시키는 능력을 가진 시알릴트랜스퍼라아제가 펩티드 시알릴화를 위한 실용적인 대규모 프로세스에 있어서 유용하다.
이들 및 추가의 시알릴트랜스퍼라아제는 도 11에서 나타낸다. 도 11은 본 명세서에 설명한 수식된 시알산종 및 미수식된 시알산을 수용체에 전이시키는데 유용한 시알릴 트랜스퍼라아제의 표이다.
GalNAc 트랜스퍼라아제(transferases)
N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라아제는 본 발명을 실시하는데 있어서, 특히 펩티드의 O-결합형 글리코실화 부위의 아미노산에 GalNAc 부분을 결합시키는데 유용하다. 적합한 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라아제에는 α(1,3) N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라아제, β(1,4) N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라아제[Nagata et al., J. Biol. Chem. 267: 12082-12089 (1992) 및 Smith et al., J. Biol Chem. 269: 15162 (1994)] 및 폴리펩티드 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라아제[Homa et al., J. Biol. Chem. 268: 12609 (1993)]가 포함되나, 이들로 한정되어 있는 것은 아니다.
유전자 공학에 의해, 클론화된 유전자에서 효소 GalNAc TI-XX 등 단백질을 생성하는 것은 주지되었다[참조 특허문헌 예: 미국 특허 제 4,761,371 호]. 하나의 방법은 충분한 샘플을 수집하고 그 다음, 효소의 아미노산 서열을 N-말단 서열결정에 의해 결정한다. 그 다음, 이 정보를 사용하여, 곤충세포 계통 Sf9에서 발현시키면 완전히 활성인 효소의 합성을 얻은 완전장(full-length)의 (막 결합형) 트랜스퍼라아제를 코딩하는 cDNA 클론을 분리한다. 그 다음, 효소의 수용체 특이성은 16종의 상이한 단백질에서 공지된 글리코실화 부위의 주위의 아미노산을 반정량적으로 분석하며, 이이서 합성 펩티드의 시험관내 글리코실화 조사를 함으로써 결정된다. 이 연구는 몇개의 아미노산 잔기가 글리코실화된 펩티드 부분에서 과잉으로 나타나고, 글리코실화된 세린 및 트레오닌 잔기의 주위의 특정의 위치에서의 잔기는 다른 아미노산 부분보다 수용체 효율에 대하여 더 현저한 영향을 미칠 수 있다는 것을 실증하였다.
세포-결합형 글리코실트랜스퍼라아제(Cell-bound glycosyltransferases)
또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법에서 사용된 효소는 세포-결합형 글리코실트랜스퍼라아제이다. 다수의 가용성 글리코실트랜스퍼라아제는 공지되어 있으나(참조 특허문헌: 예를 들어, 미국 특허 제 5,032,519 호), 글리코실트랜스퍼라아제는 일반적으로 세포와 결합하였을 때 막-결합형으로 존재한다. 지금까지 연구된 막-결합형 효소의 대부분은 내인성의 단백질인 것으로 간주되었다. 즉 이들은 초음파처리에 의해서 막으로부터 유리되지 않으며, 가용화 하기 위해서 계면활성제를 필요로 한다. 표면형 글리코실트랜스퍼라아제는 척추동물 세포(vertebrate cells) 및 무척추동물 세포의 표면상에서 확인되었으며, 또 이들의 표면형 트랜스퍼라아제는 생리적 조건 하에서 촉매 활성을 유지하는 것으로 인식되어 있다. 그러나, 세포 표면형 글리코실트랜스퍼라아제의 더 인식되어 있는 기능은 세포간 인식을 위한 것이다 (Roth, Molecular Approaches to Supracellular Phenomena, 1990).
세포에 의해서 발현된 글리코실트랜스퍼라아제를 변경시키는 방법이 개발되었다. 예를 들어, 참고 문헌 [Larsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8227-8231 (1989)]에는 세포 표면의 올리고당 구조체 및 그들의 동기원(cognate)의 글리코실트랜스퍼라아제의 발현을 결정하는 클론화 cDNA 서열을 분리하는 유전적 방법이 보고되었다. UDP-갈락토오스:.β.-D-갈락토실-1,4-N-아세틸-D-글루코사미니드 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라아제를 발현하는 것으로 알려진 마우스의 세포계통에서 분리된 mRNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리를 COS-1 세포 내로 트랜스펙팅(transfecting)(이입)시켰다. 그 다음, 이입된 세포를 배양하여, α1-3 갈락토실트랜스퍼라아제 활성에 대해서 시험하였다.
참고문헌 [Francisco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2713-2717 (1992)]에서는 β-락타마아제를 에쉬리케아 콜리(Escherichia coli)의 외표면에 고정시키는 방법이 개시되어 있다. (i) 외막단백질의 시그날 서열, (ii) 외막단백질의 막-관통(spanning) 부분, 및 (iii) 완전 성숙한 β-락타마아제의 서열로 이루어진 3종간 융합물(tripartite fusion)이 생성되어 활성표면 결합형 β-락타마아제 분자가 얻어진다. 그러나, 프란시스코(Francisco) 방법은 원핵세포계만 한정되어 있어, 저자가 인식하고 있는 바와 같이, 적절한 기능을 하기 위해서는 3종간의 완전한 융합을 필요로 한다.
술포트랜스퍼라아제(Sulfotransferases)
또, 본 발명은 예를 들어, 헤파린, 헤파란 술페이트, 카라게넨 및 관련된 화합물 등 술페이트화된 다당을 포함하여, 술페이트화 분자를 포함하는 펩티드를 생성하는 방법도 제공한다. 적합한 술포트랜스퍼라아제에는 예를 들어, 콘드로이틴-6-술포트랜스퍼라아제 [문헌 (Fukuta et al., J. Biol. Chem. 270: 18575-18580 (1995))에 기술된 닭의 cDNA; 젠뱅크(GenBank) 기탁번호 제 D49915 호], 글리코사미노글리칸 N-아세틸글루코사민 N-데아세틸라아제/N-술포트랜스퍼라아제 1 (Dixon et al., Genomics 26: 239-241 (1995); UL18918), 및 글리코사미노글리칸 N-아세틸글루코사민 N-데아세틸라아제/N-술포트랜스퍼라아제 2 [문헌 (Orellana et al., J. Biol. Chem. 269: 2270-2276 (1994) 및 Eriksson et al., J. Biol. Chem. 269: 10438-10443 (1994))에 기술된 마우스의 cDNA; 젠뱅크 기탁번호 제 U2304호에서 기술된 사람 cDNA]가 포함된다.
글리코시다아제(Glycosidases)
또, 본 발명은 야생형 글리코시다아제 및 변이형 글리코시다아제의 사용도 포함한다. 변이형 β-갈락토시다제 효소는 갈락토실 수용체 분자에 α-글리코실 플루오라이드를 결합함으로써 2당류의 형성을 촉진시키는 것으로 실증되었다 (Withers, 미국 특허 제 6,284,494 호; 2001년 9월 4일에 허여됨). 본 발명에서 유용한 다른 글리코시다아제에는 예를 들어, β-글루코시다아제, β-갈락토시다아제, β-만노시다아제, β-아세틸 글루코사미니다아제, β-N-아세틸 갈락토사미니다아제, β-크실로시다아제, β-푸코시다아제, 셀룰라아제, 크실라나아제, 갈락타나아제, 만나나아제, 헤미셀룰라아제, 아밀라아제, 글루코아밀라아제, α-글루코시다아제, α-갈락토시다아제, α-만노시다아제, α-N-아세틸 글루코사미니다아제, α-N-아세틸 갈락토오스-아미니다아제, α-크실로시다아제, α-푸코시다아제 및 뉴라미니다아제/시알리다아제가 포함된다.
고정화 효소(Immobilized Enzymes)
또, 본 발명은 고체 및/또는 가용성 지지체 상에 고정화된 효소의 사용도 제공한다. 하나의 예시적인 구체예에서는 본 발명의 방법에 의한 완전한 글리코실 링커를 통해 PEG에 결합되어 있는 글리코실트랜스퍼라아제가 제공된다. 그 PEG-링커-효소 콘쥬게이트는 임의로 경우에 따라 고체 지지체에 결합된다. 본 발명의 방법에서 고체에 지지된 효소를 사용함으로써 반응혼합물의 후처리(정밀한 검사) 및 반응생성물의 정제를 간단하게 하며, 또한 효소를 용이하게 회수하는 것도 가능하게 한다. 글리코실트랜스퍼라아제 콘쥬게이트는 본 발명의 방법에서 이용된다. 효소와 지지체의 또 다른 배합물은 당업자로부터 명백하게 알 수 있다.
융합 단백질(Fusion proteins)
또 다른 예시적인 구체예에서, 본 발명의 방법은 바람직한 소정의 글리코펩티드 콘쥬게이트의 합성에 관련되어 있는 하나 이상의 효소 활성을 가진 융합 단백질을 이용한다. 융합 폴리펩티드는 예를 들어, 보조 효소의 촉매 활성 도메인에 결합되어 있는 글리코실트랜스퍼라아제의 촉매 활성 도메인으로 구성할 수 있다. 그 보조 효소 촉매 도메인은 예를 들어, 글리코실트랜스퍼라아제를 위한 공여체인 뉴클레오티드 당을 형성하는 단계를 촉진시킬 수 있거나, 또는 글코실트랜스퍼라아제 사이클에 관련되어 있는 반응을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 글리코실트랜스퍼라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 당 합성에 관련되어 있는 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 인 프레임(in-frame)에서 결합시킬 수 있다. 그 다음, 얻어진 융합 단백질은 뉴클레오티드 당의 합성만이 아니라, 수용체 분자에 당 부분의 전이도 촉진시킬 수 있다. 그 융합 단백질은 하나의 발현 가능한 뉴클레오티드 서열에 결합된 2종 이상의 사이클 효소로 될 수 있다. 다른 구체예에서, 그 융합 단백질은 2종 이상의 글리코실트랜스퍼라아제의 촉매 활성 도메인을 포함한다(참조 특허문헌 예: 미국 특허 제 5,641,668호). 본 발명의 수식된 글리코펩티드는 여러 가지의 적합한 융합 단백질을 이용함으로써 용이하게 설계하여 제조할 수 있다(참조 특허문헌 예: 1999년 6월 24일에 WO 99/31224호 공개된 PCT/CA98/01180).
수식된 당의 제조(Preparation of modified sugars)
일반적으로, 당 부분 또는 당 부분-링커 카세트 및 PEG 또는 PEG-링커 카세트 기는 반응성기를 사용함으로써 서로 결합되며, 이들은 통상적으로 결합 프로세스에 의해 하나의 새로운 유기 작용기 또는 비반응성 화학종으로 변환된다. 그 당 반응성 작용기는 당 부분 상의 임의의 어느 위치에 위치된다. 본 발명을 실시할 때 유용한 반응성기 및 반응의 종류는 일반적으로 바이오콘쥬게이트 화학의 기술분야에서 잘 알려져 있다. 반응성 당 부분을 사용하여 이용가능한 반응의 현시점에서 바람직한 종류는 비교적 온화한 조건 하에서 진행하는 반응이다. 이들 반응에는 친핵성 치환반응 (예를 들어, 아민 및 알코올과 아실 할라이드, 활성 에스테르와의 반응), 친전자성 치환반응 (예를 들어, 엔아민 반응) 및 탄소-탄소 및 탄소-헤테로원자 다중결합에서의 부가반응[예를 들어, 미하엘(Michael) 반응, 디일스-알더 (Diels-Alder) 부가반응]이 포함되나, 이들로 한정되어 있는 것은 아니다. 이들 및 그 밖의 다른 유용한 반응은 예를 들어, 참고문헌 (March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; 및 Feeney et al., Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982)에서 기술되어 있다.
당 핵 또는 수식기에서 결합된 유용한 반응성 작용기에는 다음 (a) 내지 (j)의 기가 포함되나, 이들로 한정되어 있는 것은 아니다:
(a) N-하이드록시숙신이미드 에스테르, N-하이드록시벤즈트리아졸 에스테르, 산 할라이드, 아실 이미다졸, 티오에스테르, p-니트로페닐 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐 및 방향족 에스테르를 포함하나, 이들에 한정되어 있는 것이 아닌 카르복실기 및 이들의 다양한 유도체;
(b) 예를 들어, 에스테르, 에테르, 알데히드 등으로 전환시킬 수 있는 하이드록실 기;
(c) 할라이드가 예를 들어, 아민, 카르복실레이트아니온, 티올아니온, 카르바니온(carbanion) 또는 알콕사이드 이온 등 친핵성기로 후치환시킴으로써 할로겐 원자의 작용기 위치에서 새로운기를 공유 결합할 수 있는 할로 알킬기;
(d) 예를 들어, 말레이미도기 등 디일스-알더 반응에 참가할 수 있는 친디엔체기(dienophile groups);
(e) 후속 유도체화 반응이 예를 들어, 이민, 하이드라존, 세미카르바존 또는 옥심 등 카르보닐 유도체의 형성을 통해, 또는 그리냐르 부가반응 또는 알킬리튬 부가반응 등의 기전을 통해 가능하도록 하는 알데히드 또는 케톤기;
(f) 예를 들어, 술폰아미드를 형성시키기 위하여, 아민과의 후속 반응을 하기 위한 술포닐 할라이드기;
(g) 예를 들어, 디술파이드로 전환시킬 수 있거나, 또는 아실 할라이드와 반응시킬 수 있는 티올기;
(h) 예를 들어, 아실화, 알킬화 또는 산화시킬 수 있는 아민 또는 술프히드릴기;
(i) 예를 들어, 사이클로부가(cycloaddition), 아실화, 미하엘(Michael) 부가 등을 실시할 수 있는 알켄; 및
(j) 예를 들어, 아민 및 하이드록실 화합물과 반응할 수 있는 에폭사이드.
반응성 작용기는 이들이 반응성 당 핵 또는 수식기를 구축하는데 필요한 반응에 참가 및 간섭하지 않도록 선택할 수 있다. 또, 반응성 작용기는 보호기의 존재에 의해 반응에 참가하지 않도록 보호할 수 있다. 당업자들은 선택된 일련의 반응조건에서 간섭하지 않도록 특정의 작용기를 보호하는 방법을 이해한다. 유용한 보호기의 예에 대해서는 예를 들어, 다음 문헌 (Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991)을 참조할 수 있다.
아래 설명에서는 본 발명을 실시하는데 유용한 수식된 당의 다수의 특성 예를 기술한다. 예시적인 구체예에서 하나의 시알산 유도체는 수식기가 결합되어 있는 당의 핵으로 이용된다. 시알산 유도체를 기초로 한 설명의 초점은 단지 예시를 명확하게 하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석할 필요는 없다. 예로서, 시알산을 사용하여 설명하는 방법과 유사한 방법으로, 여러 가지의 다른 당 부분을 활성화 및 유도체화 할 수 있는 것은 당업자로부터 이해할 수 있다. 예로서, 수종의 당 기질을 열거하면 갈락토오스, 글루코오스, N-아세틸갈락토사민 및 푸코오스 등을 수식하기 위해 여러 가지의 다수방법을 이용할 수 있어, 이들은 당업자로부터 인지되어 있는 방법에 의해 쉽게 수식된다. 예로서 다음 문헌을 참조할 수 있다[참조 문헌: Elhalabi et al., Curr. Med. Chem. 6: 93 (1999); 및 Schafer et al., J. Org. Chem. 65: 24 (2000)].
하나의 예시적인 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 수식된 G-CSF 펩티드는 포유동물의 세포(예로서, CHO 세포) 또는 트랜스제닉 동물(ransgenic animal)에서 생성된 글리코펩티드이며, 따라서 불완전하게 시알릴화된 N- 및/또는 O-결합형 올리고당 사슬을 포함한다. 시알산이 결여되고 말단 갈락토오스 잔기를 포함하는 글리코펩티드의 올리고당 사슬은 PEG화 하고, PPG화 하며, 또는 특별한 설명이 없는 경우 수식된 시알산으로 수식시킬 수 있다.
다음의 스킴(scheme) 4에서는, 아미노 글리코사이드 1을 보호된 아미노산 (예를 들어, 글리신) 유도체의 활성 에스테르로 처리하여, 당 아민 잔기를 대응하는 보호된 아미노산 아미드 부가물로 전환한다. 그 부가물을 알돌라아제로 처리하여 α-하이드록시 카르복실레이트 2를 형성시킨다. 화합물 2를 CMP-SA 신테타아제의 작용에 의해서 대응하는 CMP 유도체로 전환시키고, 그 다음 이어서 CMP 유도체의 접촉 수소화반응에 의해 화합물 3을 얻는다. 글리신 부가물의 형성을 통해 도입된 아민은 화합물 3을 활성화된 PEG 또는 PPG 유도체 (예를 들어, PEG-C(O)NHS, PEG-OC(O)O-p-니트로페닐)와 반응시킴으로써 PEG 결합 부위로서 이용되어, 각각 4 또는 5 등 화학종을 생성한다.
Figure 112010017920206-pct00122
다음의 표 3은 PEG 부분으로 유도체화된 당 모노포스페이트의 대표적인 예를 나타낸다. 표 3의 화합물 중의 수종 화합물은 스팀 4의 방법에 의해서 제조된다. 다른 유도체는 당업자로부터 인지된 방법에 의해 제조된다 [참조예: Keppler et al., Glycobiology 11: 11R (2001); 및 Charter et al., Glycobiology 10: 1049 (2000)]. 다른 아민 반응성의 PEG 및 PPG 유사체는 시판제품으로 이용할 수 있거나, 또는 당업자가 쉽게 이용할 수 있는 방법에 의해서 제조될 수 있다.
Figure 112006039150479-pct00059
본 발명을 실시하는데 유용한 수식된 당 포스페이트는 상술한 위치뿐만 아니라 다른 위치에서도 치환시킬 수 있다. 현재 바람직한 시알산의 치환체를 아래의 식으로 나타낸다:
Figure 112006039150479-pct00060
위 식에서, X는 -O-, -N(H)-, -S-, -CH2-, 및 -N(R)2 (여기에서, 각각의 R은 R1-R5로부터 독립하여 선택된 하나의 멤버이다)로부터 바람직하 선택된 결합기이다. 기호 Y, Z, A 및 B는 각각 X의 아이덴티티(identity)에 대해서 상술한 군에서 선택된 기를 나타낸다. X, Y, Z, A 및 B는 각각 독립하여 선택되며, 따라서 이들은 동일하거나 상이한 것으로 할 수 있다. 기호 R1, R2, R3, R4 및 R5는 H, PEG 부분, 치료 효과가 있는 부분, 생체분자 또는 기타 부분을 나타낸다. 또는, 이들의 기호는 PEG 부분, 치료 효과가 있는 부분, 생체분자 또는 기타 부분에 결합되어 있는 링커를 나타낸다.
본 발명 명세서에서 개시된 콘쥬게이트에 결합되어 있는 예시적인 부분에는PEG 유도체 (예를 들어, 아실-PEG, 아실-알킬-PEG, 알킬-아실-PEG 카르바모일-PEG, 아릴-PEG), PPG 유도체 (예를 들어, 아실-PPG, 아실-알킬-PPG, 알킬-아실-PPG 카르바모일-PPG, 아릴-PPG), 치료 효과가 있는 부분, 진단용 부분, 만노오스-6-포스페이트, 헤파린, SLex, 만노오스, 만노오스-6-포스페이트, 시알릴 루이스(Lewis) X, FGF, VFGF, 단백질, 콘드로이틴, 케라탄, 데르마탄, 알부민, 인테그린, 안테나리 (antennary) 올리고당, 펩티드 등이 포함되나, 이들로 한정하는 것은 아니다. 다양한 수식기를 당 부분에 결합시키는 방법은 당업자에 의해 쉽게 이용할 수 있다 [Poly(Ethylene Glycol Chemistry : Biotechnical and Biomedical Applications, J. Milton Harris, Ed., Plenum Pub. Corp., 1992; Poly(Ethylene Glycol) Chemical and Biological Applications, J. Milton Harris, Ed., ACS Symposium Series No. 680, American Chemical Society, 1997; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; 및 Dunn et al., Eds. Polymeric Drugs And Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991].
링커기(가교기)[Linker-Groups(cross-linking groups]
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 수식된 당의 제조에는 당 잔기에 PEG 부분을 부가하며, 바람직하게는 글리코실트랜스퍼라아제의 기질인 안정한 부가물을 형성하는 것을 포함된다. 따라서, 링커, 예를 들어, PEG와 당 부분을 결합하는 가교제와 PEG 및 당 부분의 반응에 의해 형성된 것을 사용하는 것이 대부분의 경우 바람직하다. 수식기를 당 부분에 결합하는데 사용될 수 있는 예시적인 2작용성 화합물에는 2작용성 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리아미드, 폴리에테르, 폴리에스테르 등이 포함되나, 이들로 한정되어 있는 것은 아니다. 당을 다른 분자에 결합시키는 일반적인 방법은 다음 문헌에서 공지되어 있다 [참조예: Lee et al., Biochemistry 28: 1856 (1989); Bhatia et　al., Anal. Biochem. 178: 408 (1989); Janda et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 8886 (1990) 및 Bednarski et al., WO 92/18135]. 아래의 설명에서, 반응성기는 신생(nascent)의 수식된 당의 당 부분 상에서 바람직하게 처리된다. 설명의 초점은 예시를 명확하게 하기 위한 것이다. 당업자는 이 설명이 수식기 상에서의 반응성기에도 동일하게 관련되어 있는 것으로 이해할 것이다.
다양한 시약은 분자내 화학적 가교로 수식된 당의 구성요소를 수식하는데 사용된다[가교 시약 및 가교 처리수순의 총설에 대해서는 다음 문헌을 참조한다: Wold, F., Meth. Enzymol. 25: 623-651, 1972; Weetall, H. H., and Cooney, D. A., In: Enzymes as Drugs. (Holcenberg, and Roberts, eds.) pp. 395-442, Wiley, New York, 1981; Ji, T. H., Meth. Enzymol. 91: 580-609, 1983; Mattson et al., Mol. Biol. Rep. 17: 167-183, 1993, 이들 문헌은 모두 본 발명 명세서에서 참고로 인용하여 편집한다]. 바람직한 가교 시약은 다양한 제로-길이 (zero-length), 호모-2용성, 및 헤테로-2작용성 가교 시약에서 유도된다. 제로-길이 가교시약에는 외인성 물질을 도입하지 않고 두개의 내인성 화학기를 직접 결합하는 것을 포함한다. 디술파이드 결합의 형성을 촉진시키는 작용물질이 이 카테고리(부류)에 속한다. 또 다른 예는 카르보디이미드, 에틸클로로포르메이트, 우드워드 시약(Woodward's reagent) K (2-에틸-5-페닐이소옥사졸륨-3'-술포네이트) 및 카르보닐이미다졸 등, 카르복실기와 제 1 급 아미노기의 축합을 유도하여 아미드 결합을 형성하는 시약이다. 이들의 화학 시약 이외, 효소 트랜스글루타미나아제(글루타밀-펩티드-γ-글루타밀트랜스퍼라아제; EC 2.3.2.13)가 제로-길이 가교 시약으로 사용할 수 있다. 이 효소는 통상적으로 기질로서 제 1 급 아미노기를 사용하여 단백질-결합 글루타미닐 잔기의 카르복스아미드 기에서의 아실 전이반응을 촉진한다. 바람직한 호모- 및 헤테로-2작용성 시약에는 아미노, 술프하이드릴, 구아니디노, 인돌 또는 비특이성 기에 반응성인 2개의 동일 부위 또는 2개의 상이한 부위를 각각 포함한다.
G-CSF 콘쥬게이트의 정제(Purification of G-CSF conjugates)
불용성 G-CSF의 리폴딩(refolding)
세균에서 발현된 다수의 재조합 단백질은 세균 봉입체 중에서 불용성의 응집체로서 발현된다. 봉입체는 세포의 세포질 및 세포 주변 공간의 양쪽에서 존재하는 단백질 침착물(protein deposits)이다[참조예: Clark, Cur. Op. Biotech. 12:202-207 (2001)]. 재조합 G-CSF 단백질은 세균의 봉입체에서 발현되며, 활성 G-CSF 단백질을 생성하기 위해 이들의 단백질을 리폴딩하는 방법이 본 명세서에서 제공된다.
A. 활성 G-CSF의 리폴딩 조건(Conditions for refolding)
활성 G-CSF 단백질을 세균 세포에서 생성하기 위해 G-CSF 단백질을 세균의 봉입체에서 발현시켜, 그 세균을 회수하여 파쇄하고, 그 봉입체를 분리하여 세척한다. 하나의 구체예에서는 세척을 3회 실시한다. 즉, pH 6.0 ~ 9.0의 완충액(1가의 염, 예로서 소듐클로라이드; 비이온성 계면활성제, 예로서 트리톤(Triton)X-100; 이온성 계면활성제, 예로서 소듐데옥시콜레이트; 및 EDTA)에서 1회 세척을 실시한다; 계면활성제가 없는 완충액 중에서 2회 세척을 실시한다; H20 중에서 3회 세척을 실시한다. 그 다음으로, 그 봉입체 내부의 단백질을 가용화 시킨다. 가용화는 변성제, 구아니디늄클로라이드 또는 우레아; 극단(extremes)의 pH, 또는 계면활성제 또는 이들의 임의 조합을 사용하여 실시할 수 있다. 하나의 구체예에서는 5 ~ 6M의 구아니딘 HCl 또는 우레아를 사용하여 G-CSF를 가용화 시킨다. 또 다른 구체예에서는 DTT를 첨가한다.
가용화한 후, G-CSF 단백질 혼합물에서 변성제를 제거한다. 변성제의 제거는 리폴딩 완충액(refolding buffer) 중에서 희석하는 방법 또는 버퍼 교환 방법을 포함하여 여러 가지의 방법에 의해 실시할 수 있다. 버퍼 교환 방법에는 투석, 다이어필트레이션(diafiltration), 예로서 여과 및 고체 지지체 상에서 단백질의 고정화가 포함한다[참조문헌 예: Clark, Cur. Op. Biotech. 12:202-207 (2001)]. 상기 방법 중 임의의 어느 것이라도 조합시켜 변성제를 제거할 수 있다.
G-CSF 단백질 중에서 디술파이드 결합 형성은 산화환원 커플 (redox couple)을 포함하는 리폴딩 완충액을 첨가함으로써 촉진된다. 산화환원 커플에는 환원 및 산화된 글루타티온 ((-JSF-I/GSSG), 시스테인/시스틴, 시스테아민/시스타민, DTT/GSSG, 및 DTE/GSSG를 포함한다[참조문헌 예: Clark, Cur. Op. Biotech. 12:202-207 (2001)]. 하나의 구체예에서, 산화환원 커플은 10:1의 비의 GSH/GSSG이다.
리폴딩(refolding)은 예를 들어, pH 6.0 ~ 10.0 범위의 완충액 중에서 실시할 수 있다. 리폴딩 완충액은 리폴딩을 촉진시키기 위한 다른 첨가제, 예를 들어, L-아르기닌 (0.4-1 M); PEG; 우레아 (1-2 M) 및 구아니디늄 클로라이드 (0.5-1.5 M)등 저농도의 변성제; 및 계면활성제(예를 들어, Chaps, SDS, CTAB, 라우릴 말토사이드, Tween 80 및 Triton X-100)를 포함할 수 있다.
리폴딩 후에, G-CSF 단백질을 투석하여 산화환원 커플 또는 다른 불필요한 완충액 성분을 제거할 수 있다. 하나의 구체예에서, 투석은 소듐 아세테이트, 글리세롤 및 비이온성 계면활성제, 예를 들어, Tween-80을 포함하는 완충액을 사용하여 실시한다. 투석한 후에, 그 G-CSF 단백질을 이온 교환 크로마토그라피에 의해서 더 정제 및/또는 농축시킬 수 있다. 하나의 구체예에서, SP-세파로오스 양이온 교환수지가 사용된다.
당업자는 리폴딩된 단백질의 생물 활성이 검출가능할 때, 단백질은 정확하게 리폴딩되는 것으로 인식될 것이다. G-CSF 단백질의 경우에, 생물 활성은 다양한 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 생물학적으로 활성인 G-CSF 단백질은 참고문헌[미국 특허출원 60/535,284(2004.1.18 출원); 미국 특허출원 60/54411 (2004.2.12 출원); 출원 대리인 도켓 번호(Docket Number) 019957-018820US(2004.2.20 출원)]에 기재되어 있는 O-결합형 글리코실화 기질이며, 이들 문헌의 각각은 본 명세서에서 참고로 인용하여 편집한다. 또, G-CSF 단백질 활성은 세포 증식 아세이 또는 백혈구(WBC) 아세이에 의해 측정할 수 있다[또, 특허문헌으로 미국 특허출원 60/535,284(2004.1.8 출원), 미국 특허출원 60/54411(2004.2.12 출원) 및 출원 대리인 도켓 번호 019957-018820US(2004.2.20 출원)에서 기재되어 있으며, 이들 문헌 각각을 본 명세서에서 참고로 인용하여 편집한다.]. 그 증식 아세이와 WBC 아세이는 리폴딩된 G-CSF 단백질을 O-결합형 글리코실화 전후에도 실시할 수 있다.
본 발명의 콘쥬게이트를 분리하기 위한 다른 방법
또 다른 방법으로 하여, 상기의 방법에 의해서 생성된 생성물을 정제 없이 사용할 수 있다. 그러나, 생성물을 회수하는 것이 통상적으로 바람직하다. 박층 또는 후층 크로마토그라피, 칼럼 크로마토그라피, 이온 교환 크로마토그라피 또는 막여과 등 글리코실화된 당을 회수하기 위한 잘 알려져 있는 표준 기술을 사용할 수 있다. 아래의 설명과 본 발명 명세서에서 인용한 문헌의 설명에서와 같이, 더 바람직하게는 역삼투막에 의한 막여과 또는 1종 이상의 칼럼 크로마토그라피법을 회수를 위해 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 분자량 컷 오프 값(molecular weight cutoff) 약 3000 ~ 약 10,000를 가진 막에 의한 막여과를 사용하여 글리코실트랜스퍼라아제 등의 단백질을 제거할 수 있다. 그 다음으로, 나노여과 또는 역삼투(reverse osmosis)를 사용하여 염류(salts)의 제거 및/또는 당 생성물의 정제를 할 수 있다(예로서, 특허문헌 WO 98/15581 참조). 나노여과막은 사용하는 막에 따라 1가 염을 통과시키거나, 다가의 염 및 약 100 ~ 약 2,000 달톤보다 큰 비하전된 용질(uncharged solutes)을 잔류시키는 어느 종류의 역삼투막이다. 따라서, 하나의 전형적인 적용예에서 본 발명의 방법에 의해 제조된 당은 그 막 내에 잔류되고, 혼입하여 있는 염은 통과하게 된다.
그 수식된 당단백질이 세포내에서 생성될 경우, 제 1 스텝으로서 입자상 파편(debris), 즉 숙주세포 또는 용해된 단편을 예로서 원심분리 도는 한외여과에 의해 제거한다. 임의로 경우에 따라 단백질은 시판제품의 단백질 농축 필터를 사용하여 농축시키고, 이이서 면역친화성(immunoaffinity) 크로마토그라피; 이온교환 칼럼에 의한 분획(예로서, 디에틸아미노에틸(DEAE) 또는 카르복시메틸 또는 술포프로필기를 함유하는 매트릭스 상에서); 블루-세파로오스(Blue-Sepharose), CM 블루-세파로오스, Mono-Q, Mono-S, 렌틸 렉틴(lentil lectin)-세파로오스, WGA-세파로오스, Con A-세파로오스, 에테르 토요펄(Ether Toyopearl), 부틸 토요펄(Butyl Toyopearl), 페닐 토요펄(Phenyl Toyopearl) 또는 단백질 A 세파로오스 상에서의 크로마토그라피; SDS-PAGE 크로마토그라피; 실리카 크로마토그라피; 크로마토포커싱(chromatofocusing); 역상(reverse phase) HPLC(예로서, 지방족 기를 부가한 실리카겔); 예로서 세파덱스(Sephadex) 분사체 또는 사이즈 배제 크로마토그라피를 사용하는 겔 여과; 폴리펩티드를 선택적으로 결합하는 칼럼 상에서 크로마토그라피; 및 에탄올 또는 암모늄 술페이트 침전에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 스텝에 의해 다른 불순물에서 그 폴리펩티드 변이체를 분리시킬 수 있다.
배양 상태에서 생성되는 수식된 글리코펩티드는 통상적으로, 세포, 효소 등에서 초기 추출하고, 이어서 1종 또는 그 이상의 농축, 염석, 수계 이온-교환, 또는 사이즈-배제 크로마토그라피의 스텝을 실시함으로써 분리된다. 또, 수식된 당단백질은 친화성 크로마토그라피에 의해서 정제할 수 있다. 마지막으로, 최종 정제 스텝을 위해 HPLC를 사용할 수 있다.
단백질 분해를 억제하기 위해 상기 스텝 중 어느 스텝에서도 프로테아제 억제제, 예로서 메틸술포닐플루오라이드(PMSF)를 포함시킬 수 있으며, 외인성 오염균의 증식을 방지하기 위해 항생물질을 포함시킬 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 수식된 글리코펩티드를 생성하는 계에서 얻은 상청액은 시판제품의 단백질 농축필터, 예를 들어, 아미콘 (Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 한외여과 유니트를 사용하여 최초로 농축한다. 농축 스텝 후에 이어서, 그 농축물을 적합한 정제 매트릭스에 가할 수 있다. 예를 들어, 적합한 친화성 매트릭스는 펩티드에 대한 리간드, 즉 적합한 지지체에 결합되어 있는 렉틴 또는 항체 분자를 포함할 수 있다. 또, 음이온-교환수지, 예를 들어, DEAE 기를 부가한 매트릭스 또는 기재를 사용할 수 있다. 적합한 매트릭스에는 아크릴아미드, 아가로오스, 덱스트란, 셀룰로오스, 또는 단백질 정제에 통상적으로 사용되는 다른 타입의 것이 포함된다. 또는, 양이온-교환 스텝을 사용할 수도 있다. 적합한 양이온 교환체에는 술포프로필 또는 카르복시메틸 기를 포함하는 다양한 불용성 매트릭스가 포함된다. 술포프로필 기가 특히 바람직하다.
마지막으로, 소수성 RP-HPLC 매체, 예를 들어, 메틸기 또는 그 밖의 다른 지방족 기가 부가된 실리카겔을 사용하는 1종 또는 그 이상의 RP-HPLC 스텝을 사용하여 폴리펩티드 변이체 조성물을 더 정제할 수 있다. 또한, 상기 정제 스텝 중 일부 또는 전부를 다양한 조합으로 사용하여 균질한 수식된 당단백질을 제공할 수도 있다.
대규모 발효에서 얻어진 본 발명의 수식된 글리코펩티드를 문헌 (Urdal et al., J. Chromatog. 296: 171 (1984))에서 개시된 방법과 유사한 방법에 의해서 정제할 수 있다. 이 문헌에서는 분취 HPLC 칼럼 상에서 재조합 인간 IL-2를 정제하기 위한 2회 연속한 RP-HPLC 스텝을 기술하고 있다. 또, 친화성 크로마토그라피 등의 기술을 이용하여 수식된 당단백질을 정제할 수도 있다.
약제 조성물(Pharmaceutical composition)
또 다른 관점에서, 본 발명은 약제 조성물을 제공한다. 그 약제 조성물은 약제학적으로 허용되는 희석제 및 비천연 PEG 부분, 치료 효과가 있는 부분 또는 생체분자와 글리코실화 펩티드 또는 비-글리코실화 펩티드 사이의 공유 결합 콘게이트를 포함한다. 폴리머, 즉 치료 효과가 있는 부분 또는 생체분자는 G-CSF 펩티드와 폴리머, 즉 치료 효과가 있는 부분 또는 생체분자 쌍방의 사이에 개재되어 이들에 공유 결합되어 있는 완전환 글리코실 결합기를 통해 G-CSF 펩티드에 결합되어 있다.
본 발명의 약제 조성물은 다양한 약물 송달 시스템에서 사용하는데 적합하다. 본 발명에서 사용하는데 적합한 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)]에 기재되어 있다. 약물 송달을 위한 방법의 간단한 총설(review)에 대해서는 문헌[Langer, Science 249:1527-1533 (1990)]을 참조한다.
그 약제 조성물은 예를 들어, 국소, 경구, 경비, 정맥내, 두개내, 복강내, 피하 또는 근육내 투여를 포함하여 임의의 적절한 투여방법으로 조제할 수 있다. 피하 주사 등의 비경구 투여의 경우, 캐리어는 물, 식염수, 알코올, 지방, 왁스 또는 완충액을 포함한다. 경구 투여의 경우, 상기 캐리어 중 임의의 어느 것 또는 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 탈컴(talcum), 셀룰로오스, 글루코오스, 슈크로오스, 및 마그네슘 카르보네이트 등의 고형 캐리어 를 사용할 수 있다. 생분해성 마이크로스페어(microsphere)(예를 들어, 폴리락테이트, 폴리글리콜레이트)도 본 발명의 약제 조성물의 캐리어로서 사용할 수 있다. 적합한 생분해성 마이크로스페어는 예를 들어, 미국 특허 제 4,897,268호 및 제 5,075,109호 명세서에 개시되어 있다.
통상적으로, 그 약제 조성물은 비경구적으로, 예를 들어, 정맥내에 투여된다. 따라서, 본 발명은 허용되는 캐리어, 바람직하게는 수성 캐리어, 예를 들어, 물, 완충수, 식염수, PBS 등에 용해되거나 현탁된 화합물을 포함하는 비경구 투여용 조성물을 제공한다. 그 조성물은 예를 들어, pH 조정제 및 완충제, 삼투압 조정제, 습윤제, 계면활성제 등 근사성 생리 조건에 필요한 제약상 허용할 수 있는 보조제를 함유할 수 있다.
이들의 조성물은 통상적인 종래 멸균기술에 의해서 멸균할 수 있고, 또는 멸균 여과할 수 있다. 그 얻어진 수용액제는 그대로 사용하기 위해 포장할 수도 있고, 동결건조할 수도 있다. 그 동결건조된 제제(조제물)는 투여하기 전에 무균의 수성 캐리어와 혼합한다. 그 조제물의 pH는 일반적으로 3 ~ 11, 더 바람직하게는 5 ~ 9, 가장 바람직하게는 7 ~ 8이다.
몇 가지의 구체예에서, 본 발명의 글리코펩티드는 표준 소포 (vesicle)-형성 지질에서 형성된 리포솜 중에 편입(incorporation)할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980), 미국 특허 제 4,235,871호, 제 4,501,728호 및 제 4,837,028호]에 기재된 바와 같이, 다양한 방법이 리포솜을 조제하는데 이용할 수 있다. 다양한 표적성 작용물질(예를 들어, 본 발명의 시알릴 갈락토사이드)을 사용한 리포솜의 표적화는 이 기술분야에서 주지되어 있다(참조예: 미국 특허 제 4,957,773호 및 제 4,603,044호).
표적성 작용물질을 리포솜에 결합시키는 표준방법을 사용할 수 있다. 이들의 방법은 일반적으로, 표적성 작용물질을 결합하기 위해 활성화시킬 수 있는 포스파티딜에탄올아민 등의 지질 성분, 또는 본 발명의 지질-유도체화 된 글리코펩티드등 유도체화된 친유성 화합물을 리포솜 중에 편입하는 것을 포함한다.
표적화 기전(targeting mechanisms)은 일반적으로 표적성 부분이 표적, 예로서, 세포표면 수용체와의 상호작용에 이용할 수 있도록 하는 방식으로 하여 리포솜의 표면상에 표적성 작용물질을 위치시키는 것을 필요로 한다. 본 발명의 당은 리포솜이 형성되기 전에 당업자에 의해 공지된 방법(예로서, 각각의 사슬이 긴 알킬 할라이드 또는 지방산에 의한, 당상에 존재한 하이드록실기의 알킬화 또는 아실화)을 사용하여 지질 분자에 결합시킬 수 있다. 또, 막 형성시에 연결부분(connector portion)이 최초에 그 막중에 편입되도록 한 형태로 그 리포솜을 제조할 수 있다. 그 연결부분은 그 막중에서 견고하게 매입되고, 고정되어 있는 친유성 부분을 가질 필요가 있다. 또, 이것은 리포솜의 수성표면상에서 화학적으로 이용할 수 있는 반응성 부분도 가질 필요가 있다. 그 반응성 부분은 후에 첨가되는 표적성 작용물질 또는 당과 안정한 화학적 결합을 형성하는데 화학적으로 적합하게 할 수 있도록 선택된다. 몇몇의 경우, 표적성 작용물질을 연결분자에 직접 결합시킬 수도 있으나, 대부분의 경우 화학적 가교 역활을 나타내는 제 3의 분자를 사용함으로써 막중의 연결분자를 표적성 작용물질 또는 당과 결합시켜 이들을 소포 표면에서 3차원적으로 떨어지게 하여 신장시키는 것이 더 적합하다.
또, 본 발명의 방법에 의해 제조된 화합물은 진단 시약으로도 사용할 수 있다. 예를 들어, 표지된 화합물을 사용하여 염증을 가진 것으로 의심되는 환자의 염증 또는 종양 전이영역을 특정시킬 수 있다. 이러한 용도를 위해 화합물은 125I, 14C, 또는 트리튬으로 표지할 수 있다.
본 발명의 약제 조성물에서 사용되는 활성성분은 글리코PEG화 된 G-CSF 및 예를 들어 배란을 증대시키는 여포자극 호르몬(Follicle Stimulating Homone)의 생물학적인 모든 특성을 가진 그 유도체이다. 바람직하게는 본 발명의 G-CSF 조성물이 비경구직으로 투여된다(예로서, IV, IM, SC 또는 IP). 유효 투여량은 치료 대상 상태 및 투여경로에 따라 상당히 변동하는 것으로 예상되나, 약 0.1(~7U) ~ 100(~7000U) ㎍/㎏ 체중의 범위의 활성물질인 것으로 예상된다. 빈혈상태(anemic condition)의 치료에 바람직한 용량은 1주 3회, 약 50 ~ 약 300 단위/㎏이다. 본 발명은 생체내 잔존시간을 연장시킨 G-CSF를 제공하기 때문에 상기 기재된 투여량은 본 발명의 조성물을 투여할 때 경우에 따라 감소된다.
아래의 실시예는 본 발명의 콘쥬게이트 및 방법을 예상하기 위해 제공하나, 특허청구범위의 발명을 한정하는 것은 아니다.
실시예 1
CHO 세포에서 생산된 G-CSF의 글리코PEG화(GlycoPEGylation)
a. 아시알로-과립구-콜로니 자극인자 (G-CSF)의 조제
CHO 세포에서 생산된 G-CSF를 50 mM 트리스, 50 mM 트리스-HCl pH 7.4, 0.15 M NaCl, 5 mM CaCl2 중에 2.5 ㎎/mL로 용해시켜, 센트리콘 플러스 (Centricon Plus) 20 원심분리 필터에서 500 uL로 농축시켰다. 용액을 300 mU/mL의 뉴라미니다아제 II (비브리오 콜레라에 (Vibrio cholerae))와 함께 32℃에서 16시간 동안 배양하였다. 반응을 관찰하기 위하여 반응물을 소량 분취하여 적절한 완충액으로 희석하고, 겔 IEF를 실시하였다. 그 다음, 반응혼합물을 미리 세척한 N-(p-아미노페닐)옥삼산-아가로오스 콘쥬게이트에 가하고 (800 ㎕/㎖ 반응 용적), 세척된 비드를 4℃에서 24시간 동안 느리게 회전시켰다. 혼합물을 10,000 rpm으로 원심분리하여, 상청액을 수집하였다. 비드를 트리스-EDTA 완충액으로 3회, 0.4 mL의 트리스-EDTA 완충액으로 1회 및 0.2 ㎖의 트리스-EDTA 완충액으로 1회 세척하고, 모든 상청액을 모았다. 상청액을 4℃에서, 50 mM 트리스-HCl pH 7.4, 1 M NaCl, 0.05% NaN3에 대해서 투석하고, 그 다음 50 mM 트리스-HCl pH 7.4, 1 M NaCl, 0.05% NaN3에 대해서 2회 더 투석하였다. 그 다음, 투석된 용액을 센트리콘 플러스 20 원심분리 필터를 사용하여 농축시키고, -20℃에서 저장하였다. 겔 IEF에 대한 조건은 인비트로겐사(Invitrogen)에 의해서 제공된 처리수순 및 시약에 의해 실시하였다. 천연의 G-CSF 및 탈시알릴화된 G-CSF의 샘플을 물에 대하여 투석하고, MALDI-TOF-MS에 의해서 분석하였다.
b. G-CSF-(α2,3)-시알릴-PEG의 조제
탈시알릴화된 G-CSF를 50 mM 트리스-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05% NaN3, pH 7.2 중에 2.5 ㎎/mL로 용해시켰다. 이 용액을 1 mM CMP-시알산-PEG 및 0.1 U/mL의 ST3Gall과 함께 32℃에서 2일간 배양하였다. 시알산-PEG의 편입을 관차하기 위해, 반응물의 소량 분취물에 CMP-SA-PEG-형광 리간드를 가하였다. PBS 완충액(pH 7.1)을 사용하여 토소 하스(Toso Haas) G3000SW 분석 칼럼 상에서 겔 여과를 함으로써 펩티드에 편입된 표지를 유리 표지에서 분리하였다. 그 펩티드 중으로의 형광 표지의 편입은 인라인(in-line) 형광 검출기를 사용하여 정량하였다. 2일 후에, PBS 완충액(pH 7.1)을 사용하고 토소 하스 G3000SW 분리 칼럼을 사용하며 UV 흡수를 기준으로 하는 분획을 회수하여 그 반응 혼합물을 정제하였다. 인비트로겐사(Unvitrogen)에 의해 제공된 처리순서 및 시약에 따라 SDS-PAGE 및 IEF 분석을 사용하여 반응 생성물을 분석하였다. 천연 G-CSF 및 PEG화된 G-CSF의 샘플은 물에 대해 투석하고 MALDI-TOF MS에 의해서 분석하였다.
c. G-CSF-(α2,8)-시알릴-PEG의 조제
α2,3-시알릴화된 O-결합형 글리칸을 함유하는, CHO 세포 내에서 생산된 G-CSF를 50 mM 트리스-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05% NaN3, pH 7.2 중에서 2.5 ㎎/mL로 용해시켰다. 이 용액을 1 mM CMP-시알산-PEG 및 0.1 U/mL의 CST-II와 함께 32℃에서 2일 동안 배양하였다. 시알산-PEG의 편입을 관찰하기 위해, 반응물의 소량 분취물에 CMP-SA-PEG-형광 리간드를 가하였다. 펩티드에 편입된 표지를 PBS 완충액 (pH 7.1)을 사용하여 토소 하스 G3000SW 분석 칼럼 상에서 겔 여과를 함으로써 유리 표지에서 분리시켰다. 펩티드 중에서의 형광 표지 편입은 인-라인 형광 검출기를 사용하여 정량하였다. 2일 후에, PBS 완충액 (pH 7.1)을 사용하며 토소 하스 G3000SW 분리 칼럼을 사용하고 UV 흡수를 기준으로 한 분획을 회수하여 반응 혼합물을 정제하였다. 인비트로겐사(Invitrogen)에 의해서 제공된 처리순서 및 시약에 따라 SDS-PAGE 및 IEF 분석을 사용하여 반응 생성물을 분석하였다. 천연 G-CSF 및 PEG화된 G-CSF의 샘플을 물에 대해서 투석하고, MALDI-TOF MS에 의해서 분석하였다.
d. G-CSF-(α2,6)-시알릴-PEG의 조제
O-결합형 GalNAc 만을 함유하는 G-CSF를 50 mM 트리스-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05% NaN3, pH 7.2 중에서 2.5 ㎎/mL로 용해시켰다. 이 용액을 1 mM CMP-시알산-PEG 및 0.1 U/mL의 ST6GalNAcI 또는 II와 함께 32℃에서 2일 동안 배양하였다. 시알산-PEG의 편입을 관찰하기 위해, 반응물의 소량 분취물에 CMP-SA-PEG-형광 리간드를 가하였다. 펩티드에 편입된 표지를, PBS 완충액 (pH 7.1)을 사용하여 토소 하스 G3000SW 분석 칼럼 상에서 겔 여과함으로써 유리 표지에서 분리시켰다. 펩티드 중에서의 형광 표지 편입을 인-라인 형광 검출기를 사용하여 정량하였다. 2일 후에, PBS 완충액 (pH 7.1)을 사용하고 토소 하스 G3000SW 정제 칼럼을 사용하며 UV 흡수를 기준으로 한 분획을 회수하여 반응 혼합물을 정제하였다. 반응 생성물은 인비트로겐사에 의해서 제공된 처리순서 및 시약에 따라서 SDS-PAGE 및 IEF 분석을 사용하여 분석하였다. 천연 G-CSF 및 PEG화된 G-CSF의 샘플을 물에 대해서 투석하고, MALDI-TOF MS에 의해서 분석하였다.
CHO 세포에서 생산된 G-CSF를 아트로박터 시알리다아제(Arthrobacter sialidase)로 처리한 다음에, 슈퍼덱스 75 상에서 사이즈 배제에 의해 정제하고, ST3Gal1 또는 ST3Gal2로 처리한 다음에 CMP-SA-PAGE 20 Kda로 처리하였다. 그 결과 얻어진 분자를 이온 교환 및 겔 여과에 의해서 정제하고, SDS PAGE에 의한 분석으로 PEG화가 완료되었음을 실증하였다. 이것은 O-결합형 글리칸의 글리코PEG화 를 처음으로 실증한 것이다.
실시예 2
재조합 G-CSF의 발현, 리폴딩(refolding) 및 정제
● 원심분리에 의해서 세포를 회수하고, 상청액은 버린다. 다양한 배지 상에서 증식시킨 결과를 도 9에서 나타낸다.
● 10 mM 트리스 pH 7.4, 75 mM NaCl, 5 mM EDTA(10 ㎖/g로 사용, 용해 완충액) 중에서 세포 침전물을 재현탁한다.
● 세포를 미세한 유체로 한다(microfluidize)[프렌치 프레스 (French press)]도 동일하게 사용한다.
● 4℃에서 5,000 RPM으로 30분 동안 원심분리한다. - 상청액을 버린다.
● 침전물을 용해 완충액 중에서 재현탁시켜, 상기와 같이 원심분리한다.
● 25 mM 트리스 pH 8, 100 mM NaCl, 1% TX-100, 1% NaDOC, 5 mM EDTA 중에서 1B를 세척한다. 침전물을 파이펫팅 (pipetting) 및 보르텍싱(vortexing) 처리에 의해 재현탁시킨다.
4℃에서 5,000 RPM으로 15분 동안 원심분리한다. 이 스텝을 1회 더 반복한다(합계 2회 세척).
● 침전물을 25 mM 트리스 pH 8, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA 중에서 2회 세척하여 계면활성제를 제거하고, 상기한 바와 같이 원심분리한다.
● 침전물을 dH2O 중에서 재현탁하여 일정량으로 분취하고, 상기와 같이 원심분리한다. 침전물을 -20℃에서 동결시킨다.
● 파이펫터 (pipettor)를 사용하여, 6 M 구아니딘 HCl, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, 100 mM 트리스 pH 8, 10 mM DTT 중에서 20 ㎎/㎖로 1B를 재현탁시키고, 그 다음 이어서 실온에서 2-4시간 동안 회전시킨다.
● 가용화된 IB를 14,000 RPM으로 실온에서 1분 동안 원심분리한다. 상청액을 취한다.
● 리폴딩(refolding)용 완충액 50 mM MES pH 6, 240 mM NaCl, 10 mM을 사용하여 1:20의 비로 상청액을 희석한다.
● KCl, 0.3 mM 라우릴 말토사이드, 0.055% PEG3350, 1 mM GSH, 0.1 M GSSG, 0.5 M 아르기닌과 함께 4℃에서 하룻밤 회전기(rotator) 상에서 리폴딩 시킨다.
● 리폴딩 물을 투석용 피어스 스네이크 스킨(Pierce snakeskin)(7KDaMWCO)으로 옮긴다. 투석 완충액: 20 mM NaOAc pH 4, 50 mM NaCl, 0.005% Tween-80, 0.1 mM EDTA. 최소 200배를 초과하는 양에 대하여 4℃에서 합계 3회 투석한다.
● 투석한 후에, 물질을 0.45 μM 필터에 통과시킨다.
● SP-세파로오스 칼럼을 투석 완충액으로 평형화시키고, 샘플을 첨가한다. 칼럼을 투석 완충액으로 세척하고, 최대 1 M NaCl의 염 구배를 함유하는 투석 완충액으로 용출시킨다. 단백질은 일반적으로 300-400 mM NaCl로 용출시킨다.
● 물질을 SDS-PAGE 상에서 검사한다 (참조예: 도 10).
실시예 3
2개의 포트(Pot)에서 2종의 효소를 사용하는 방법
아래의 실시예는 각각의 중간 생성물이 다음 스텝에서 사용하기 전에 정제되는 2개의 연속하는 스텝에서 G-CSF GalNAc-SA-PEG의 조제를 예시한다.
a. GalNAc-T2에 의한 G-CSF 및 UDP-GalNAc에서의 G-CSF-GalNAc (pH 6.2)의 조제
용기에 넣은 완충액 3.2 mL 중의 G-CSF(960 mcg)를, UF 필터(MWCO 5K)를 사용한 한외여과에 의해 농축시키고, 그 다음 25 mM MES 완충액(pH 6.2, 0.005% NaN3) 1mL로 용해하였다. 그 다음, UDP-GalNAc (6 ㎎, 9.24 mM), GalNAc-T2 (40 uL, 0.04 U) 및 100 mM MnCl2 (40 uL, 4 mM)를 가하여, 그 결과 얻어진 용액을 실온에서 배양하였다.
24시간 후, MALDI는 그 반응이 완료되었음을 나타내었다. 그 반응혼합물을, SEC (Superdex 75 및 Superdex 200) 및 PBS (포스페이트 완충환 생리 식염수, pH 4.9 및 0.005% Tween 80)를 함유하는 용출 완충액을 사용하는 HPLC 정제에 직접 처리하였다. 회수한 피크의 G-CSF-GalNAc를 센트리콘 5 KDa MWCO 필터를 사용하여 약 150 uL로 농축시키고, PBS (포스페이트 완충화 생리 식염수, pH 4.9 및 0.005% Tween 80)를 사용하여 용적을 1 ㎖로 조정하였다. 최종 단백질 농도는 1 ㎎/mL (A280)이었고, 수율은 100%이었다. 샘플은 4℃에서 저장하였다.
b. 정제된 G-CSF-GalNAc, CMP-SA-PEG (20 KDa) 및 마우스 ST6GalNAc-T1 (pH 6.2)을 사용한 G-CSF-GalNAc-SA-PEG의 조제
1 ㎎의 단백질을 함유하는 G-CSF-GalNAc 용액을 25 mM MES 완충액 (pH 6.2, 0.005% NaN3) 중에 넣어 완충액 교환하며, CMP-SA-PEG (20 KDa) (5 ㎎, 0.25 μmol)을 첨가하였다. 용해시킨 후에, MnCl2 (100 mcL, 100mM 용액) 및 ST6GalNAc-I (100 mcL, 마우스 효소)를 첨가하고, 그 반응혼합물을 32℃에서 3일 동안 서서히 진동시켰다. 그 반응혼합물을 한외여과 (MWCO 5K)에 의해서 농축시키고, 25 mM NaOAc (pH 4.9)로 1회 완충액 교환시킨 다음에, 농축하여 총용적을 1 ㎖로 하였다. 그 다음, 체류시간 13-18분의 SP-세파로오스(A: 25 mM NaOAc + 0.005% Tween-80 pH 4.5; B: 25 mM NaOAc + 0.005% Tween-80 pH 4.5 + 2 M NaCl)와 체류시간 8.6분 (Superdex 75, 유속 1 ml/분)의 SEC (Superdex 75; PBS-pH 7.2, 0.005% Tween 80)를 사용하여 그 생성물을 정제하였다. 소정의 바람직한 분획을 회수하고, 농축하여 0.5 mL로 하며, 4℃에서 저장하였다.
실시예 4
효소의 동시 부가를 사용하여 G-CSF-GalNAc-SA-PEG를 제조하는 단일 포트의 방법
아래의 실시예는 효소의 동시 부가를 사용한 원 포트(one pot)에서의 G-CSF-GalNAc-SA-PEG의 조제를 예시한다.
1. 마우스 ST6GalNAc-I (pH 6.0)을 사용한 원 포트의 방법
G-CSF(3.2 mL의 생성물 조제 완충액 중에 용해한 960 ㎍의 단백질)를 한외여과 (MWCO 5K)에 의해서 0.5 mL로 농축시키고, 25 mM MES 완충액 (pH 6.0, 0.005% NaN3)으로 용해하여 전체 용적을 1mL로 하거나 또는 단백질 농도를 1 ㎎/mL로 하였다. 그 다음, UDP-GalNAc (6 ㎎, 9.21 μmol), GalNAc-T2 (80 uL, 80 mU), CMP-SA-PEG (20 KDa) (6 ㎎, 0.3 μmol) 및 마우스 효소 ST6GalNAc-I (120 uL) 및 100 mM MnCl2 (50 uL)를 가하였다. 그 용액을 32℃에서 48시간 동안 진동시키고, SP-세파로오스 상에서 표준 크로마토그라피 조건을 사용하여 정제하였다. 합계 0.5 ㎎의 단백질 (A280)이 얻어졌으며, 전 수율이 약 50%이었다. 그 생성물 구조는 MALDI 및 SDS-PAGE 쌍방을 사용한 분석에 의해 확인되었다.
2. 닭 ST6GalNAc-I (pH 6.0)을 사용한 원 포트의 방법
14.4 ㎎의 G-CSF를 농축하여 최종 용적을 3mL로 하고, 25 mM MES 완충액 (pH
6.0, 0.005% NaN3, 0.004% Tween 80)으로 완충액 교환을 하며, 그 용적을 13 mL로 조정하였다. 그 다음, UDP-GalNAc (90 ㎎, 150 μmole), GalNAc-T2 (0.59 U), CMP-SA-PEG-20 KDa (90 ㎎), 닭 ST6GalNAc-I (0.44 U) 및 100 mM MnCl2 (600 mcL)를 가하였다. 그 결과 얻어진 혼합물을 실온에서 60시간 방치하였다. 그 다음으로, 반응혼합물을 UF(MWCO 5K) 및 원심분리에 의해 농축하였다. 잔류물(약 2 mL)을 25 mM NaOAc 완충액(pH 4.5) 중에 용해시켜, 다시 농축하여 최종 용적을 5 mL로 하였다. 약 10 ~ 23분 동안의 SP-세파로오스, SEC(Superdex 75, 17분, 유속 0.5 ml/분) 및 추가의 SEC(Superdex 200, 23분, 유속 0.5 ml/분)를 사용하여 샘플을 정제시켜 3.6 ㎎(전수율 25%)의 G-CSF-GalNAc-SA-PEG-20 KDa(A280 및 BCA 방법)을 얻었다.
실시예 5
효소의 연속 부가를 사용하여 G-CSF-GalNAc-Gal-SA-PEG를 제조하는 원 포트(one pot) 방법
아래의 실시예는 효소의 연속 부가를 사용하여 원 포트에서 G-CSF-GalNAc-Gal-SA-PEG를 제조하는 방법을 예시한다.
1. GalNAc-G-CSF에서 출발
a. GalNAc-T2를 사용한, G-CSF 및 UDP-GalNAc에서 G-CSF-GalNAc (pH 6.2)의 조제
UF 필터(MWCO 5K)를 사용하는 한외여과에 의해, 용기에 넣은 완충액 3.2 mL중 G-CSF(960 mcg)를 농축하고, 그 다음으로 1mL의 25mM MES 완충액(pH 6.2, 0.005% NaN3)에 용해하였다. 그 다음, UDP-GalNAc (6 ㎎, 9.24 mM), GalNAc-T2 (40 uL, 0.04 U) 및 100 mM MnCl2 (40 uL, 4 mM)를 가하여, 그 결과 얻어진 용액을 실온에서 배양하였다.
b. G-CSF-GalNAc, UDP-갈락토오스, SA-PEG-20 K달톤 및 적절한 효소에서 G-CSF-GalNAc-Gal-SA-PEG의 조제
UDP-갈락토오스(4 ㎎, 6.5 μmoles), 코어-1-Gal-T (320 uL, 160 mU), CMP-SA-PEG-20 KDa (8 ㎎, 0.4 μmole), ST3Gal2 (80 uL, 0.07 mU) 및 100 mM MnCl2 (80 uL)를, 상기 스텝 a로부터 얻은 25 mM MES 완충액 (pH 6.0) 1.5ml 중 G-CSF-GalNAc의 거친 반응혼합물(1.5㎎)에 직접 가하였다. 그 결과 얻어진 혼합물을 32℃에서 60시간 동안 배양하였다. 그 반응혼합물을 원심분리하고, 용액을 한외여과 (MWCO 5K)에 의해 0.2 mL로 농축시킨 다음에, 25 mM NaOAc (pH 4.5)로 용해시켜 최종 용적을 1mL로 하였다. SP-세파로오스 (체류시간 10-15분)를 사용하여 생성물을 정제하고, 스핀 필터 (spin filter; MWCO 5K)를 사용하여 피크 분획(peak fraction)을 농축시키고, 또, SEC (Superdex 75, 체류시간 10.2분)를 사용하여 잔류물을 더 정제하였다. 스핀 필터 (MWCO 5K)를 사용하여 농축시킨 후에, PBS, 2.5% 만니톨, 0.005% 폴리소르베이트, pH 6.5의 조제 완충액에 의해 단백질을 1 mL로 희석하였고, 단백질 농도가 1 mL당 850 mcg의 단백질이 되도록 조제하였다(A280). 전수율은 55%이었다.
실시예 6
효소의 동시 부가를 사용하여 G-CSF-GalNAc-Gal-SA-PEG를 제조하는 원 포트(one pot)의 방법
a. G-CSF에서의 출발
한외여과(MWCO 5K)에 의해 G-CSF (960 mcg, 3.2 mL)를 농축시키고, 25 mM Mes 완충액 (pH 6.0, 0.005% NaN3)으로 용해하였다. G-CSF 용액의 전체 용적은 약 1 ㎎/ml이었다. UDP-GalNAc (6 ㎎), GalNAc-T2 (80 uL, ~80 μU), UDP-Gal (6 ㎎), 코어 GalT (160 uL, 80 μU), CMP-SA-PEG (20 K) (6 ㎎) 및 2,3-(O)-시알릴트랜스퍼라아제 (160 uL, 120 μU), 100 mM MnCl2 (40 uL)를 가하였다. 그 결과 얻어진 혼합물을 32℃에서 48시간 동안 배양하였다. 아래에서 설명한 바와 같이 IEX 및 SEC를 사용하여 정제를 실시하였다. 그 결과 얻어진 생성물을 함유하는 분획을 한외여과(MWCO 5K)에 의해 농축시키고, 그 용적은 완충액으로 약 1 mL로 조정하였다. 그 단백질 농도는 A280에 의해서 0.392 ㎎/ml로 측정되었으며, G-CSF에서의 전수율은 40%를 얻었다.
본 명세서에서 기술한 실시예 및 구체예는 예시한 것에 불과하며, 이것을 고려하여 다양한 변형 또는 변경은 당업자에 의해 암시하거나 시사될 수 있고, 이들은 본 출원의 취지 및 목적과 첨부된 특허청구범위 내에 포함되는 것으로 이해할 수 있다. 본 명세서에서 인용한 모든 참고문헌(간행물), 특허 및 특허출원은 모든 목적을 위해 참고로 본 명세서에 인용하여 편집한다.

Claims (28)

  1. 다음 화학식의 부분을 포함하는 생물활성 과립구 콜로니 자극인자 펩티드:
    Figure 112012069215561-pct00061
    상기 식에서,
    D는 -OH 또는 R1-L-HN-이며;
    G는 R1-L- 또는 -C(O)(C1-C6)알킬이고;
    R1은 직쇄상 또는 분지상 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 포함하는 부분이며;
    L은 결합, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬로부터 선택된 링커이고,
    단, D가 OH인 경우 G는 R1-L-이고, G가 -C(O)(C1-C6)알킬인 경우 D는 R1-L-NH-이며,
    여기에서 상기의 생물활성 과립구 콜로니 자극인자 펩티드 내의 상기의 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기는 a) N-결합된 글리코실화를 위한 컨센서스 부위 및 O-결합된 글리코실화를 위한 부위; (b) 글리코실트랜스퍼라아제에 대한 수용체인 말단 글리코실 부분; (c) 아스파라긴; 및 (d) 세린 및 트레오닌의 유리 하이드록실기로부터 선택된 부위에서 부착된다.
  2. 청구항 1에 있어서,
    L-R1이 다음 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 펩티드:
    Figure 112011073905459-pct00062
    상기 식에서,
    a는 0 내지 20의 정수이다.
  3. 청구항 1에 있어서,
    R1이 다음 화학식의 그룹으로부터 선택된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 펩티드.
    Figure 112011073905459-pct00123
    상기 식에서,
    e 및 f는 1 내지 2500에서 각각 독립적으로 선택한 정수이고;
    q는 0 내지 20의 정수이다.
  4. 청구항 1에 있어서,
    R1이 다음 화학식의 그룹으로부터 선택된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 펩티드:
    Figure 112011073905459-pct00124
    상기 식에서,
    e, f 및 f'는 1 내지 2500에서 각각 독립적으로 선택한 정수이며;
    q 및 q'는 1 내지 20에서 각각 독립적으로 선택한 정수이다.
  5. 제 1 항에 있어서,
    R1이 다음 화학식의 그룹으로부터 선택된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 펩티드:
    Figure 112011073905459-pct00125
    상기 식에서,
    e, f 및 f'는 1 내지 2500에서 각각 독립적으로 선택한 정수이고;
    q, q' 및 q"는 1 내지 20에서 각각 독립적으로 선택한 정수이다.
  6. 청구항 1에 있어서,
    R1이 다음 화학식의 그룹으로부터 선택된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 펩티드:
    Figure 112011073905459-pct00126
    상기 식에서,
    e 및 f는 1 내지 2500에서 각각 독립적으로 선택한 정수이다.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 부분이 다음 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 G-CSF 펩티드:
    Figure 112011073905459-pct00067
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 부분이 다음 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 G-CSF 펩티드:
    Figure 112011073905459-pct00068
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 부분이 다음 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 G-CSF 펩티드:
    Figure 112011073905459-pct00069
    상기 식에서,
    AA는 상기 펩티드의 아미노산 잔기이다.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 아미노산 잔기가 세린 또는 트레오닌인 것을 특징으로 하는 G-CSF 펩티드.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩티드가 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 G-CSF 펩티드.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 아미노산 잔기가 서열번호 1의 133 위치에서의 트레오닌인 것을 특징으로 하는 G-CSF 펩티드.
  13. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩티드가 서열번호 1 및 서열번호 2에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  14. 청구항 1에 있어서,
    상기 부분이 다음 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 G-CSF 펩티드:
    Figure 112011073905459-pct00070
    상기 식에서,
    a, b, c, d, i, r, s, t 및 u는 0 및 1에서 각각 독립적으로 선택한 정수이며;
    q는 1이고;
    e, f, g, 및 h는 0 내지 6의 정수에서 각각 독립적으로 선택되며;
    j, k, l, 및 m은 0 내지 100의 정수에서 각각 독립적으로 선택되고;
    v, w, x, 및 y는 0 및 1에서 각각 독립적으로 선택되며, v, w, x 및 y 중 적어도 하나는 1이고;
    AA는 상기 G-CSF 펩티드의 아미노산 잔기이며;
    Sia-(R)은 다음 화학식을 갖고,
    Figure 112011073905459-pct00071
    위 식에서
    D는 -OH 또는 R1-L-HN-이며;
    G는 R1-L- 또는 -C(O)(C1-C6)알킬이고;
    R1은 직쇄상 또는 분지상 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 포함하는 부분이며;
    L은 결합, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬로부터 선택된 링커이고,
    단, D가 OH인 경우 G는 R1-L-이고, G가 -C(O)(C1-C6)알킬인 경우 D는 R1-L-NH-이다.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 아미노산 잔기가 아스파라긴 잔기인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  16. (a) 전이에 적합한 조건 하에서 기질 G-CSF 펩티드를 다음의 화학식을 갖는 PEG-시알산 공여체 부분
    Figure 112012069215561-pct00128
    ,
    및 상기 G-CSF 펩티드의 아미노산 또는 글리코실 잔기 상에서 상기 PEG-시알산을 전이시키는 효소와 접촉시키는 단계를 포함하여, 다음 화학식의 부분을 포함하는 G-CSF 펩티드 콘쥬게이트를 제조하는 방법:
    Figure 112012069215561-pct00127
    (위 식에서,
    D는 -OH 또는 R1-L-HN-이며;
    G는 R1-L- 또는 -C(O)(C1-C6)알킬이고;
    R1은 직쇄상 또는 분지상 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 포함하는 부분이며;
    L은 결합, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬로부터 선택된 링커이고,
    단, D가 OH인 경우 G는 R1-L-이고, G가 -C(O)(C1-C6)알킬인 경우 D는 R1-L-NH-이며,
    여기에서 상기의 G-CSF 펩티드 내의 상기의 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기는 a) N-결합된 글리코실화를 위한 컨센서스 부위 및 O-결합된 글리코실화를 위한 부위; (b) 글리코실트랜스퍼라아제에 대한 수용체인 말단 글리코실 부분; (c) 아스파라긴; 및 (d) 세린 및 트레오닌의 유리 하이드록실기로부터 선택된 부위에서 부착된다.)
  17. 청구항 16에 있어서,
    L-R1이 다음 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112011073905459-pct00074
    상기 식에서,
    a는 0 내지 20의 정수이다.
  18. 청구항 16에 있어서,
    R1이 다음 화학식의 그룹으로부터 선택된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112011073905459-pct00129
    상기 식에서,
    e 및 f는 1 내지 2500에서 각각 독립적으로 선택한 정수이고;
    q는 0 내지 20의 정수이다.
  19. 청구항 16에 있어서,
    R1이 다음 화학식의 그룹으로부터 선택된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112011073905459-pct00130
    상기 식에서,
    e, f 및 f'는 1 내지 2500에서 각각 독립적으로 선택한 정수이며;
    q 및 q'는 1 내지 20에서 각각 독립적으로 선택한 정수이다.
  20. 청구항 16에 있어서,
    R1이 다음 화학식의 그룹에서 선택된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112011073905459-pct00131
    상기 식에서,
    e, f 및 f'는 1 내지 2500에서 각각 독립적으로 선택한 정수이고;
    q, q' 및 q"는 1 내지 20에서 각각 독립적으로 선택한 정수이다.
  21. 청구항 16에 있어서,
    R1이 다음 화학식의 그룹으로부터 선택된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112011073905459-pct00132
    상기 식에서,
    e 및 f는 1 내지 2500에서 각각 독립적으로 선택한 정수이다.
  22. 청구항 16에 있어서,
    상기 단계 (a) 이전에, (b) 적합한 숙주 내에서 상기 기질 과립구 콜로니 자극인자 펩티드를 발현시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 청구항 16에 있어서,
    상기 숙주가 곤충 세포 및 포유동물 세포로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 포유동물에게서 염증성 백혈구 생산을 자극하는 방법에서, 또는 필요한 대상체에서 감염을 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 청구항 1에 따르는 과립구 콜로니 자극인자 펩티드 및 약제학적으로 허용할 수 있는 캐리어를 포함하는 약제학적 제제.
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
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