KR20070001890A - 글리코페질화 과립구 콜로니 자극인자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 과립구 콜로니 자극인자와 PEG 부위 사이의 컨쥬게이트를 제공한다. 이 컨쥬게이트는 펩타이드와 변형성 그룹 사이에 삽입되고, 이들에 공유적으로 부착된 온전한 글리코실 연결그룹을 통해서 연결된다. 이 컨쥬게이트는 글리코실트랜스퍼라제의 작용에 의해서 글리코실화 및 비글리코실화된 펩타이드 둘 다로부터 형성된다. 글리코실트랜스퍼라제는 펩타이드 상의 아미노산 또는 글리코실 잔기 상에 변형된 당 부위를 연결시킨다. 또한, 본 발명은 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 제제를 제공한다. 컨쥬게이트를 제조하는 방법도 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다.
과립구 콜로니 자극인자, 컨쥬게이트, 글리코실 연결그룹, 글리코실트랜스퍼라제, 변형된 당.

Description

글리코페질화 과립구 콜로니 자극인자{GLYCOPEGYLATED GRANULOCYTE COLONY STIMULATING FACTOR}
(관련 출원에 대한 교차-참고)
본 출원은 모든 목적으로 본 발명에 그대로 참고로 포함된 2003년 12월 3일자 미국 가특허출원 제 60/526,796 호; 2004년 3월 23일자 미국 가특허출원 제 60/555,813 호; 2004년 5월 11일자 미국 가특허출원 제 60/570,282 호; 2004년 1월 26일자 미국 가특허출원 제 60/539,387 호; 2004년 7월 29일자 미국 가특허출원 제 60/592,744 호; 2004년 9월 29일자 미국 가특허출원 제 60/614,518호; 및 2004년 10월 29일자 미국 가특허출원 제 60/623,387 호 (이들은 각각 모든 목적으로 본 발명에 참고로 포함된다)를 우선권으로 주장한다.
본 발명은 글리코 페질화 과립구 콜로니 자극인자에 관한 것이다.
본 발명은 과립구 콜로니 자극인자와 PEG 부위 사이의 컨쥬게이트를 제공한다. 이 컨쥬게이트는 펩타이드와 변형성 그룹 사이에 삽입되고, 이들에 공유적으로 부착된 온전한 글리코실 연결그룹을 통해서 연결된다. 이 컨쥬게이트는 글리코실트랜스퍼라제의 작용에 의해서 글리코실화 및 비글리코실화된 펩타이드 둘 다로부터 형성된다. 글리코실트랜스퍼라제는 펩타이드 상의 아미노산 또는 글리코실 잔기 상에 변형된 당 부위를 연결시킨다. 또한, 본 발명은 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 제제를 제공한다. 컨쥬게이트를 제조하는 방법도 또한 본 발명의 범주내에 포함된다.
과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF)는 호중구 과립구 조상세포 및 성숙 호중구의 생존, 증식, 분화 및 기능을 자극하는 당단백질이다. 임상적 용도에서는 재조합 인간 G-CSF의 두가지 형태가 호중구 과립구형성의 강력한 자극제이며, 몇가지 호중구감소성 상태의 감염성 합병증을 예방하는데 효능을 나타내었다. 이들은 골수억제성 치료로부터 호중구 회복을 촉진시킬 수 있다.
G-CSF는 발열성 호중구감소증의 발생빈도, 골수 이식에 의해서 지지되는 고용량 화학요법의 이환율 (morbidity), 및 중증 만성 호중구감소증을 갖는 환자에게서 감염의 발생빈도 및 지속기간을 감소시킴으로써 암 화학요법의 이환율을 감소시킨다. 또한, G-CSF는 최근에, 심근경색이 발현한 후에 투여하면 치료효과를 갖는 것으로 밝혀졌다.
G-CSF의 인간 형태는 1986년에 일본과 미국으로부터의 그룹들에 의해서 클로닝되었다 (참조예: Nagata et al., Nature 319: 415-418, 1986). 천연 인간 당단백질은 두가지 형태로 존재하는데, 하나는 175 아미노산이고, 다른 하나는 178 아미노산이다. 더 풍부하고 더 활성인 175 아미노산 형태가 재조합 DNA 기술에 의한 약제학적 생성물의 개발에 이용되어 왔다.
이. 콜라이 (E. cloi) 발현시스템에서 합성된 재조합 인간 G-CSF는 필그라스팀 (filgrastim)이라 불린다. 팔그라스팀의 구조는 천연 당단백질과는 약간 상이 하다. 재조합 인간 G-CSF의 다른 형태는 레노그라스팀 (lenograstim)이라 불리며, 챠이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 합성된다.
hG-CSF는 2개의 G-CSF 분자와 2개의 수용체의 2:2 컴플렉스 형성에 의해서 G-CSF 수용체를 다이머화하는 모노머성 단백질이다 (Horan et al., Biochemistry, 35(15): 4886-96 (1996)). 이하의 hG-CSF 잔기가 수용체 결합 계면의 일부분으로서 X-선 결정학 연구에 의해서 확인되었다: G4, P5, A6, S7, S8, L9, P10, Q11, S12, L15, K16, E19, Q20, L108, D109, D112, T115, T116, Q119, E122, E123, 및 L124 (참조예: Aritomi et al., (1999) Nature 401: 713).
rhG-CSF의 상업적으로 이용가능한 형태는 단기간 약리학적 효과를 가지며, 호중구감소성 상태의 지속기간 중에는 종종 하루에 한번 이상 투여되어야 한다. 더 긴 순환 반감기를 갖는 분자는 호중구감소증을 완화시키고, 결과적인 감염을 예방하기 위해서 필요한 투여 횟수가 감소할 것이다. 현재 이용가능한 rG-CSF 생성물의 또 다른 문제는 용량-의존적인 뼈의 통증의 발생이다. 뼈의 통증은 rG-CSG에 의한 치료의 중요한 부작용으로 환자가 겪는 것이기 때문에, 고유적으로 이러한 효과를 갖지 않거나, 뼈의 통증을 야기하지 않는 충분히 소량으로 효과적인 생성물을 이용함으로써 뼈의 통증을 야기하지 않는 rG-CSF 생성물을 제공하는 것이 바람직할 것이다. 따라서, 개선된 재조합 G-CSF 분자의 필요성이 명백하다.
hG-CSF의 단백질-조작된 변이체가 보고되었다 (미국 특허 제 5,581,476, U.S. 5,214,132, U.S. 5,362,853, U.S. 4,904,584 및 문헌 Riedhaar-Olson et al., Biochemistry 35: 9034-9041, 1996). 천연 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 하나 의 추가의 카보하이드레이트 체인을 도입시키기 위해서 hG-CSF 및 그 밖의 폴리펩타이드를 변형시키는 것이 또한 보고되었다 (미국 특허 제 5,218,092 호). 또한, PEG 그룹의 부착을 포함하는 천연 hG-CSF의 폴리머 변형이 보고되고 연구되었다 (참조예: Satake-Ishikawa et al., (1992) Cell Structure and Function 17: 157; Bowen et al. (1999) Experimental Hematology 27: 425; 미국 특허 제 5,824,778, U.S. 5,824,784, WO 96/11953, WO 95/21629 및 WO 94/20069).
당단백질 치료제의 약력학적 특성을 개선시키기 위한 시도로 펩타이드 골격에 합성 폴리머를 부착시키는 것이 본 기술분야에서 알려져 있다. 펩타이드에 컨쥬게이트된 폴리머의 예는 폴리(에틸렌 글리콜)("PEG")이다. 펩타이드 치료제를 유도체화시키기 위한 PEG의 사용은 펩타이드의 면역원성을 감소시키는 것으로 나타났다. 예를 들어, 미국 특허 제 4,179,337 호 (Davis et al.)에는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜에 커플링된 효소 및 펩타이드 호르몬과 같은 비-면역원성 폴리펩타이드가 기술되어 있다. 감소된 면역원성 이외에도, 순환계에서의 청소시간 (clearance time)은 문제의 폴리펩타이드의 PEG-컨쥬게이트의 증가된 크기로 인하여 연장된다.
펩타이드에 대한 PEG 및 그의 유도체의 부착의 주모드는 펩타이드 아미노산 잔기를 통한 비-특이적 결합이다 (참조예: 미국 특허 제 4,088,538 호, 미국 특허 제 4,496,689 호, 미국 특허 제 4,414,147 호, 미국 특허 제 4,055,635 호, 및 PCT WO 87/00056). 펩타이드에 PEG를 부착시키는 또 다른 모드는 글리코펩타이드 상의 글리코실 잔기의 비-특이적 산화반응을 통한 것이다 (참조예: WO 94/05332).
이들 비-특이적 방법에서, 폴리(에틸렌글리콜)은 펩타이드 골격 상의 반응성 잔기에 무작위적이며 비-특이적인 방식으로 첨가된다. 물론, PEG 분자의 무작위적 첨가는 최종생성물의 균일성의 결여, 및 펩타이드의 생물학적 또는 효소적 활성의 감소 가능성을 포함한 그의 결점들을 갖는다. 따라서, 치료학적 펩타이드의 생산을 위해서는 특이적으로 표지되고 쉽게 특정화할 수 있으며, 필수적으로 균일한 생성물의 형성을 유도하는 유도체화 전략이 탁월하다. 이러한 방법이 개발되었다.
특이적으로 표지된 균질의 펩타이드 치료제는 효소의 작용에 의해서 시험관내에서 생산될 수 있다. 펩타이드에 합성 폴리머 또는 그 밖의 다른 라벨을 부착시키는 전형적인 비-특이적 방법과는 달리, 효소-기본 합성은 위치선택성 및 입체선택성의 이점을 갖는다. 표지된 펩타이드의 합성에 사용하기 위한 효소의 두가지 주부류는 글리코실트랜스퍼라제 (예를 들어, 시알릴트랜스퍼라제, 올리고사카릴트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사밀트랜스퍼라제), 및 글리코시다제이다. 이들 효소는 추후에 치료학적 부위를 포함하도록 변형될 수 있는 당의 특이적 부착을 위해서 사용될 수 있다. 대체방식으로, 글리코실트랜스퍼라제 및 변형된 글리코시다제를 사용하여 펩타이드 골격에 변형된 당을 직접 전이시킬 수도 있다 (참조예: 미국 특허 제 6,399,336 호 및 미국 특허출원공개 제 20030040037, 20040132640, 20040137557, 20040126838 및 20040142856 호, 이들은 각각 본 발명에 참고로 포함된다). 화학적 및 효소적 합성요소 둘 다를 결합시키는 방법도 또한 공지되어 있다(참조예: Yamamoto et al. Carbohydr. Res. 305: 415-422 (1998) 및 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허출원공개 제 20040137557 호).
개선된 치료학적 G-CSF에 대한 필요성에 답하여 본 발명은 동일하거나 매우 유사한 글리코페질화되지 않은 G-CSF 펩타이드에 비해서 개선된 약력학적 파라메터 및 특성을 가지며, 치료학적으로 활성인 글리코페질화된 G-CSF를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 개선된 G-CSF를 비용 효율적이며 산업적인 규모로 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 이르러, 하나 또는 그 이상의 폴리(에틸렌 글리콜) 부위를 갖는 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF)의 조절된 변형은 상응하는 천연 (비-페질화된) G-CSF에 비해서 개선된 약력학적 특성을 갖는 신규의 G-CSF 유도체를 제공하는 것으로 발견되었다 (도 3). 또한, 글리코페질화된 G-CSF의 약리학적 활성은 상업적으로 이용할 수 있는 모노-페질화된 필그라스팀과 대략 동일하다 (도 4).
예시적 구체예에서, 본 발명의 "글리코페질화된" G-CSF 분자는 글리코실화되거나 비-글리코실화된 G-CSF 펩타이드와, 그의 구조내에 폴리(에틸렌 글리콜) 부위를 포함하는 효소적으로 전이가능한 사카릴 부위 사이의 컨쥬게이트의 효소 매개된 형성에 의해서 생산된다. PEG 부위는 직접적으로 (즉, 두가지 반응성 그룹의 반응에 의해서 형성된 단일 그룹을 통해서), 또는 링커 (linker) 부위, 예를 들어, 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬 등을 통해서 사카릴 부위에 부착된다. 전이가능한 PEG-사카릴 구조의 예는 도 5에 기술되어 있다.
따라서, 한가지 관점에서, 본 발명은 PEG 부위, 예를 들어, PEG와 본 기술분야에서 인지된 G-CSF와 비슷하거나, 다른 식으로 유사한 생체내 활성을 갖는 펩타이드 사이의 컨쥬게이트를 제공한다. 본 발명의 컨쥬게이트에서, PEG 부위는 온전한 글리코실 연결그룹을 통해서 펩타이드에 공유적으로 부착된다. 온전한 글리코실 연결그룹의 예로는 PEG에 의해서 유도체화된 시알산 부위가 포함된다.
하나의 예시적 관점에서, 본 발명은 하기 화학식의 부위를 포함하는 G-CSF 펩타이드를 제공한다:
Figure 112006039150479-PCT00001
상기 화학식에서, D는 -OH 또는 R1-L-HN-이다. 심볼 G는 R1-L- 또는 -C(O)(C1-C6)알킬을 나타낸다. R1은 직쇄 또는 측쇄 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 포함하는 부위이며; L은 결합, 치환되거나 비치환된 알킬 및 치환되거나 비치환된 헤테로알킬로부터 선택된 구성원인 링커이다. 일반적으로, D가 OH이면 G는 R1-L-이고, G가 -C(O)(C1-C6)알킬이면 D는 R1-L-NH-이다. 본 발명에 기술된변형된 시알산 구조에서 COOH는 또한 COO- 및/또는 그의 염을 나타낸다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기의 부위를 포함하는 PEG-일화된 G-CSF를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 (a) 기질 G-CSF 펩타이드를 전이에 적절한 조건 하에서, PEG-시알산 공여체 (donor), 및 PEG-시알산을 G-CSF의 아미노산 또는 글리코실 잔기 상에 전이시키는 효소와 접촉시키는 단계를 포함한다. PEG-시알산 공여체 부위의 예는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112006039150479-PCT00002
한가지 구체예에서, 숙주는 포유동물 세포이다. 그 밖의 다른 구체예에서, 숙주 세포는 곤충 세포, 식물 세포, 박테리아 또는 진균이다.
본 발명의 화합물의 약력학적 특성은 펩타이드의 글리코실화 부위(들)의 구조, 수 또는 위치를 변화시킴으로써 쉽게 변화된다. 따라서, 본 출원의 범위 내에서는 야생형으로 존재하지 않는 G-CSF 펩타이드에 O- 또는 N-연결된 글리코실화 부위를 삽입하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 부가한다. 이들 돌연변이체 및 그들의 글리코실화된 최종 생성물 및 중간체에 대한 항체도 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 온전한 글리코실 연결그룹을 통해서 공유적으로 결합되어 있는 PEG 부위(들)의 집단, 예를 들어, PEG를 갖는 G-CSF 컨쥬게이트를 제공한다. 본 발명의 컨쥬게이트에서, 집단의 각각의 구성원은 본질적으로 글리코실 연결그룹을 통해서 펩타이드의 글리코실 잔기에 결합되고, 각각의 글리코실 잔기는 동일한 구조를 갖는다.
예시적 구체예에서, 본 발명은 온전한 글리코실 연결그룹을 통해서 공유적으로 결합되어 있는 PEG 부위(들)의 집단, 예를 들어, PEG를 갖는 G-CSF 컨쥬게이트를 제공한다. 본 발명의 컨쥬게이트에서, 집단의 각각의 구성원은 본질적으로 펩타이드의 아미노산 잔기에 결합되고, 폴리머가 결합되어 있는 각각의 아미노산 잔기는 동일한 구조를 갖는다. 예를 들어, 하나의 펩타이드가 Thr 연결된 글리코실 잔기를 포함한다면, 집단 중의 펩타이드의 적어도 약 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%, 99.2%, 99.4%, 99.6% 또는 더욱 바람직하게는 99.8%는 동일한 Thr 잔기에 공유적으로 결합된 동일한 글리코살 잔기를 가질 수 있다. 상기 언급한 내용은 O-글리코실화 및 N-글리코실화 부위 둘 다에 대해 동등하게 적용된다.
또한 약제학적 조성물이 제공된다. 이 조성물은 약제학적으로 허용되는 캐리어, 및 비-천연적으로 존재하는 PEG 부위와 글리코실화되거나 비-글리코실화된 G-CSF 펩타이드 사이의 공유적 컨쥬게이트를 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 이하의 상세한 설명으로부터 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 명백할 것이다.
도 1은 Thr 133 (메티오닌이 존재하면 Thr 134)에서 잠재적인 글리코실화 부위의 존재 및 위치를 나타내는 G-CSF의 구조이다.
도 2는 G-CSF 펩타이드 상의 카보하이드레이트 잔기가, PEG에 의해서 유도체화된 사카릴 부위를 부가하기 전에 Thr 133 (메티오닌이 존재하면 Thr 134)에서 글리코실 잔기에 GalNac 부위를 효소적으로 부가함으로써 리모델링죈 본 발명의 예시적인 구체예를 나타내는 도식이다.
도 3은 비글리코실화된 G-CSF, 뉴라스타 (Neulasta™) 및 효소적으로 글리코페질화된 G-CSF의 생체내 체류수명을 비교한 플롯이다.
도 4는 도 3에 나타낸 종의 활성을 비교한 플롯이다.
도 5는 본 발명의 컨쥬게이트를 제조하는데 유용한 예시적인 PEG-글리코릴 연결그룹 전구체 (변형된 당)를 제조하는 합성 반응식이다.
도 6은 예시적인 G-CSF 아미노산 서열을 나타낸 것이다. SEQ ID NO:1은 175 아미노산 변이체이며, 여기에서는 첫번째 아미노산이 메티오닌이고, Thr134에 트레오닌 잔기가 존재한다. SEQ ID NO:2는 선도 (leading) 메티오닌이 결실하고, 따라서 서열이 T로 시작하여 133 위치에 트레오닌 잔기가 존재하는 것을 제외하고는 175 아미노산 변이체와 동일한 서열을 갖는 174 아미노산 변이체이다.
도 7은 본 발명을 실시하는데 유용한 변형된 당 뉴클레오타이드의 몇가지 예를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명을 실시하는데 유용한 변형된 당 뉴클레오타이드의 몇가지 추가예를 나타낸 것이다.
도 9는 다양한 배지에서 성장하고 IPTG에 의해서 유도된 박테리아 내에서의 재조합 GCSF의 생산을 설명한 것이다.
도 10은 SP-세파로즈 크로마토그라피한 후에 재중첩된 (refolded) GCSF의 웨스턴 블럿 분석을 제공한다.
도 11은 본 발명에 기술된 변형된 시알산 종류 및 비변형된 시알산을 수용체 (acceptor) 상에 전이시키기 위해서 유용한 시알릴 트랜스퍼라제의 표이다.
약어
PEG, 폴리(에틸렌글리콜); PPG, 폴리(프로필렌글리콜); Ara, 아라비노실; Fru, 프럭토실; Fuc, 퓨코실; Gal, 갈락토실; GalNAc, N-아세틸갈락토사미닐; Glc, 글루코실; GlcNAc, N-아세틸글루코사미닐; Man, 만노실; ManAc, 만노사미닐 아세테이트; Xyl, 크실로실; 및 NeuAc, 시알릴 (N-아세틸뉴라미닐); M6P, 만노즈-6-포스페이트; Sia, 시알산, N-아세틸뉴라미닐, 및 그의 유도체 및 동족체.
정의
다른 식으로 정의되지 않는 한은, 본 발명에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 일반적으로 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적인 기술을 갖는 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 발명에서 사용된 명명법, 및 세포배양, 분자유전학, 유기화학 및 핵산 화학 및 하이브리드화의 실험실적 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 핵산 및 펩타이드 합성을 위해서는 표준기술이 사용된다. 기술 및 방법은 일반적으로 본 기술분야 및 본 명세서 전체에 걸친 다양한 일반적 문헌 [일반적인 참조: Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 이것은 본 발명에 참고로 포함된다]에서의 통상적인 방법에 따라서 수행된다. 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술된 분석화학 및 유기합성의 실험실적 방법은 본 기술분야에서 잘 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 표준기술 또는 그의 변형법이 화학적 합성 및 화학적 분석을 위해서 사용된다.
본 발명에 기술된 모든 올리고사카라이드는 비-환원성 사카라이드에 대한 명칭 또는 약어 (즉, Gal)에 이어서 글리코사이드 결합 (α 또는 β), 환 결합 (1 또는 2), 결합에 포함된 환원성 사카라이드의 환 위치 (2, 3, 4, 6 또는 8), 및 그후에 환원성 사카라이드의 명칭 또는 약어 (즉, GlcNAc)를 사용하여 기술된다. 각각의 사카라이드는 바람직하게는 피라노즈이다. 표준 당생물학 (glycobiology) 명명법의 검토를 위해서는 문헌 [Essentials of Glycobiology Varki et al. eds. CSHL Press (1999)]을 참고로 한다.
올리고사카라이드는 환원성 말단에서의 사카라이드가 실제로 환원성 당이든지 아니든지 환원성 말단 및 비-환원성 말단을 갖는 것으로 생각된다. 채택된 명명법에 따라, 올리고사카라이드는 여기에서 왼쪽에 비-환원성 말단 및 오른쪽에 환원성 말단을 갖는 것으로 표현된다.
용어 "시알산"은 9-탄소 카복실화된 당의 패밀리 (family)의 모든 구성원을 의미한다. 시알산 패밀리의 가장 통상적인 구성원은 N-아세틸-뉴라민산 (2-케토-5-아세트아미도-3,5-디데옥시-D-글리세로-D-갈락토노뉴로피라노즈-1-온산 (종종 Neu5Ac, NeuAc, 또는 NANA로 약칭함))이다. 이 패밀리의 두번째 구성원은 N-글리콜릴-뉴라민산 (Neu5Gc 또는 NeuGc)이며, 여기에서 NeuAc의 N-아세틸 그룹은 하이드록실화된다. 세번째 시알산 패밀리 구성원은 2-케토-3-데옥시-노뉴로손산 (KDN) (Nadano et al. (1986) J. Biol . Chem . 261: 11550-11557; Kanamori et al., J. Biol. Chem . 265: 21811-21819 (1990))이다. 또한, 9-O-락틸-Neu5Ac 또는 9-O-아 세틸-Neu5Ac 등의 9-O-C1-C6 아실-Neu5Ac, 9-데옥시-9-플루오로-Neu5Ac 및 9-아지도-9-데옥시-Neu5Ac와 같은 9-치환된 시알산도 포함된다. 시알산 패밀리에 대한 검토는 예를 들어, 문헌 [Varki, Glycobiology 2: 25-40 (1992); Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992))]을 참고로 한다. 시알릴화 방법에서 시알산 화합물의 합성 및 사용은 1992년 10월 1일에 공개된 국제출원 WO 92/16640에 기술되어 있다.
용어 "과립구 콜로니 자극인자" 또는 "과립구 콜로니 자극인자 펩타이드", 또는 "G-CSF" 또는 "G-CSF 펩타이드"는 천연 GCSF의 활성이거나 그를 모사한 활성을 갖는 G-CSF의 야생형 또는 돌연변이된 펩타이드, 재조합체 또는 천연 또는 어떤 단편을 의미한다. 용어는 또한, 일반적으로 비-펩타이드 G-CSF 유사체를 포함한다. 예시적 구체예에서, G-CSF 펩타이드는 SEQ ID NO:1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. 그 밖의 다른 예시적 구체예에서, G-CSF 펩타이드는 SEQ ID NOs:3-11로부터 선택된 서열을 갖는다.
용어 "과립구 콜로니 자극인자 활성"은 수용체 결합 및 활성화, 수용체 결합의 억제, 또는 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 작용에 의해서 정상적으로 영향을 받는 모든 생화학적 또는 생리학적 반응을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 모든 활성을 의미한다. 과립구 콜로니 자극인자 활성은 상기 정의한 바와 같은 모든 과립구 콜로니 자극인자 펩타이드의 작용으로부터 일어날 수 있다.
"펩타이드"는 모노머가 아미노산이고, 아미드 결합을 통해서 함께 결합되며, 다른 식으로는 폴리펩타이드라고 불리는 폴리머를 의미한다. 추가로, 비천연 아미노산, 예를 들어, β-알라닌, 페닐글리신 및 호모아르기닌도 포함된다. 유전자-코드화되지 않은 아미노산도 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 또한, 반응성 그룹, 글리코실화 부위, 폴리머, 치료학적 부위, 생체분자 등을 포함하도록 변형된 아미노산도 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용된 모든 아미노산은 d- 또는 l-이성체일 수 있다. l-이성체가 일반적으로 바람직하다. 또한, 그 밖의 다른 펩타이드유사체 (peptidomimetics)도 또한 본 발명에서 유용하다. 본 발명에서 사용되는 것으로서, "펩타이드"는 글리코실화 및 비글리코실화 펩타이드 둘 다를 의미한다. 또한, 펩타이드를 발현하는 시스템에 의해서 불완전하게 글리코실화된 펩타이드도 포함된다. 일반적인 검토는 문헌 [Spatola, A. F., in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983)]을 참고로 한다.
용어 "펩타이드 컨쥬게이트"는 펩타이드가 본 발명에 기술된 바와 같은 변형된 당과 컨쥬게이트된 본 발명의 종을 의미한다.
용어 "아미노산"은 천연적으로 존재하는 아미노산 및 합성 아미노산 뿐만 아니라 천연적으로 존재하는 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 동족체 및 아미노산 유사체를 의미한다. 천연적으로 존재하는 아미노산은 유전자 코드에 의해서 코드화된 것뿐만 아니라, 후에 변형된 아미노산, 예를 들어, 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 아미노산 동족체는 천연적으로 존재하는 아미노산과 동일한 기본적 화학구조, 즉 수소에 결합된 α 탄소, 카복 실 그룹, 아미노 그룹 및 R 그룹을 갖는 화합물, 예를 들어, 호모세린, 노르로이신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 의미한다. 이러한 동족체는 변형된 R 그룹 (예를 들어, 노르로이신) 또는 변형된 펩타이드 골격구조를 갖지만, 천연적으로 존재하는 아미노산과 동일한 기본적 화학구조는 유지한다. 아미노산 유사체는 아미노산의 일반적 화학구조와는 상이한 구조를 갖지만, 천연적으로 존재하는 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 화학적 화합물을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 것으로, "아미노산"은 이것이 링커로 있든지 또는 펩타이드 서열의 성분으로 있든지, 아미노산의 D- 및 L-이성체 둘 다, 및 이들 두가지 이성체의 혼합물을 의미한다.
본 발명에서 사용된 것으로, 용어 "변형된 당"은 본 발명의 방법에서 펩타이드의 아미노산 또는 글리코실 잔기 상에 효소적으로 부가된 천연적으로- 및 비-천연적으로-존재하는 카보하이드레이트를 의미한다. 변형된 당은 당 뉴클레오타이드 (모노-, 디- 및 트리-포스페이트), 활성화 당 (예를 들어, 글리코실 할라이드, 글리코실 메실레이트) 및 활성화되지도 않고 뉴클레오타이드도 아닌 당을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 다수의 효소 기질로부터 선택된다. "변형된 당"은 "변형성 그룹 (modifying group)"에 의해서 공유적으로 작용화된다. 유용한 변형성 그룹에는 PEG 부위, 치료학적 부위, 진단적 부위, 생체분자 등이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 변형성 그룹은 바람직하게는 천연적으로 존재하지 않거나, 비변형된 카보하이드레이트이다. 변형성 그룹에 의한 작용화의 위치는 이것이 "변형된 당"이 펩타이드에 효소적으로 부가되는 것을 방해하지 않도록 선택된 다.
용어 "수용성"은 물 중에서 약간의 검출가능한 정도의 용해도를 갖는 부위를 의미한다. 수용성을 검출하고/하거나 정량화하기 위한 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. PEG 부위의 예로는 펩타이드, 사카라이드, 폴리(에테르), 폴리(아민), 폴리(카복실산) 등이 포함된다. 펩타이드는 단일 아미노산으로 조성된 혼합 서열, 예를 들어, 폴리(라이신)을 가질 수 있다. 유사하게, 사카라이드는 단일 사카라이드 서브유니트, 예를 들어, 덱스트란, 아밀로즈, 키토산 및 폴리(시알산)으로 조성된 것이거나 혼합 서열로 될 수 있다. 폴리(에테르)의 예는 폴리(에틸렌 글리콜)이다. 폴리(에틸렌 이민)은 폴리아민의 예이며, 폴리(아크릴)산은 대표적인 폴리(카복실산)이다.
본 발명에서 사용된 것으로 용어 "글리코실 연결그룹"은 약제 (예를 들어, PEG 부위, 치료학적 부위, 생체분자)가 공유적으로 부착된 글리코실 잔기를 의미한다. 본 발명의 방법에서, "글리코실 연결그룹"은 글리코실화되거나 비글리코실화된 펩타이드에 공유적으로 부착하게 됨으로써 약제를 펩타이드 상의 아미노산 및/또는 글리코실 잔기에 연결시킨다. "글리코실 연결그룹"은 일반적으로, 펩타이드의 아미노산 및/또는 글리코실 잔기에 "변형된 당"을 효소적 부착시킴으로써 "변형된 당"으로부터 유도된다. "온전한 글리코실 연결그룹"은 컨쥬게이트를 연결시키는 개별적인 사카라이드 모노머가 예를 들어, 나트륨 퍼요오데이트에 의해서 분해, 예를 들어, 산화되지 않은 글리코실 부위로부터 유도된 연결그룹을 의미한다. 본 발명의 "온전한 글리코실 연결그룹"은 글리코실 유니트(들)를 부가하거나, 모 사카 라이드 구조로부터 하나 또는 그 이상의 글리코실 유니트를 제거함으로써 천연적으로 존재하는 올리고사카라이드로부터 유도될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "표적화 부위 (targeting moiety)"는 신체의 특정 조직 또는 부분에 선택적으로 국재화하는 종을 의미한다. 국재화 (localization)는 분자 결정인자 (molecular determinants)의 특이적 인식, 표적화제 또는 컨쥬게이트의 분자 크기, 이온성 상호작용, 소수성 상호작용 등에 의해서 매개된다. 약제를 특정의 조직 또는 부분에 표적화시키는 그 밖의 다른 메카니즘은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지되어 있다. 표적화 부위의 예로는 항체, 항체 단편, 트랜스페린, HS-당단백질, 응고인자, 혈청 단백질, β-당단백질, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO 등이 포함된다.
본 발명에서 사용되는 것으로 "약제학적으로 허용되는 캐리어"에는 컨쥬게이트와 배합하였을 때, 컨쥬게이트의 활성은 유지하며, 피검자의 면역 시스템과 비-반응성인 모든 물질이 포함된다. 예로는 포스페이트 완충된 식염용액, 물, 오일/물 에멀젼과 같은 에멀젼, 및 다양한 타입의 습윤제와 같은 표준 약제학적 캐리어 중의 어떤 것이라도 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 그 밖의 다른 캐리어로는 또한 멸균 용액, 코팅정을 포함하는 정제, 및 캅셀제가 포함될 수 있다. 일반적으로, 이러한 캐리어는 전분, 밀크 (milk), 당, 특정한 타입의 점토, 젤라틴, 스테아르산 또는 그의 염류, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트, 탈크, 식물성 지방 또는 오일, 고무, 글리콜 또는 그 밖의 다른 공지된 부형제와 같은 부형제를 포함한다. 이러한 캐리어에는 또한, 향료 및 색소 첨가제, 또는 그 밖의 다른 성분들 이 포함될 수 있다. 이러한 캐리어를 포함하는 조성물은 잘 알려진 통상적인 방법에 의해서 제제화된다.
본 발명에서 사용되는 것으로, "투여"는 피검자에 대한 경구 투여, 좌제로서의 투여, 국소적 접촉, 정맥내, 복강내, 근육내, 병소내, 비내 또는 피하 투여, 또는 서방성 장치, 예를 들어 미니-삼투성 펌프 (mini-osmotic pump)의 이식을 의미한다. 투여는 비경구 및 경점막 (예를 들어, 구강, 비내, 질내, 직장 또는 경피적으로)을 포함하는 어떠한 경로에 의해서나 된다. 비경구 투여에는 예를 들어, 정맥내, 근육내, 세동맥내 (intra-arteriole), 피내, 피하, 복강내, 심실내 및 두개내가 포함된다. 더구나, 주사가 종양을 치료, 예를 들어, 세포소멸을 유도하기 위한 것인 경우에, 투여는 종양에 및/또는 종양을 둘러싼 조직 내로 직접 이루어질 수 있다. 그 밖의 다른 송달 모드에는 리포좀성 제제, 정맥내 주입, 경피적 패치 등의 사용이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 용어 "개선시키는" 또는 "개선시킨다"는 증상의 완화, 소실 또는 감소와 같은 객관적 또는 주관적 파라메터를 포함하여 병리학 또는 상태를 치료하는데 성공한 모든 징후, 또는 환자의 신체적 또는 정신적 웰빙 (well-being)의 개선을 의미한다. 증상의 개선은 신체검사 및/또는 정신의학적 평가의 결과를 포함한 객관적 또는 주관적 파라메터를 기본으로 할 수 있다.
용어 "요법"은 질병 걸릴 소인이 있을 수 있지만, 아직 그 질병의 증상을 경험하거나 나타내지 않는 동물에서 질병 또는 상태가 나타나는 것을 방지하고 (예방적 치료), 질병을 억제하고 (그의 발생을 느리게 하거나 정지시킴), 질병의 증상 또는 부작용의 경감을 제공하고 (완화적 치료), 및 질병을 경감시키는 (질병의 퇴행을 야기함) 것을 포함하는 질병 또는 상태의 "치료하는 것" 또는 "치료"를 의미한다.
용어 "유효량" 또는 "~에 효과적인 양" 또는 "치료학적 유효량" 또는 문법적으로 동등한 모든 용어는 질병을 치료하기 위해서 동물에게 투여되는 경우에 그 질병에 대한 치료를 달성하기에 충분한 양을 의미한다.
용어 "분리된"은 물질을 생산하는데 사용된 성분들을 실질적으로 또는 본질적으로 함유하지 않는 물질을 의미한다. 본 발명의 펩타이드 컨쥬게이트의 경우에, 용어 "분리된"은 통상적으로 펩타이드 컨쥬게이트를 제조하기 위해서 사용된 혼합물 내의 물질을 동반하는 성분들을 실질적으로 또는 본질적으로 함유하지 않는 물질을 의미한다. "분리된" 및 "순수한"은 상호교환적으로 사용된다. 일반적으로, 본 발명의 분리된 펩타이드 컨쥬게이트는 범위로 바람직하게 표현된 순도의 레벨을 갖는다. 펩타이드 컨쥬게이트에 대한 순도의 범위의 하한선은 약 60%, 약 70% 또는 약 80%이고, 순도의 범위의 상한선은 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 90% 이상이다.
펩타이드 컨쥬게이트가 약 90% 이상 순수한 경우에, 그들의 순도는 또한 바람직하게는 범위로 표현된다. 순도의 범위의 하한선은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 96% 또는 약 98%이다. 순도의 범위의 상한선은 약 92%, 약 94%, 약 96%, 약 98% 또는 약 100% 순도이다.
순도는 본 기술분야에서 인지된 어떤 분석방법 (예를 들어, 은 염색된 젤 상 의 밴드 강도, 폴리아크릴아미드 젤 전기영동, HPLC, 또는 유사한 수단)에 의해서라도 결정된다.
본 발명에서 사용된 것으로 "필수적으로 집단의 각각의 구성원"은 펩타이드에 부가된 변형된 당의 선택된 백분율이 펩타이드 상의 다수의 동일한 수용체 부위에 부가되는 본 발명의 펩타이드 컨쥬게이트의 집단의 특징을 설명한 것이다. "필수적으로 집단의 각각의 구성원"은 변형된 당에 컨쥬게이트된 펩타이드 상의 부위의 "균일성"을 말하는 것이며, 이것은 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95% 균일한 본 발명의 컨쥬게이트를 의미한다.
"균일성"은 변형된 당이 컨쥬게이트된 수용체 부위의 집단을 가로지른 구조적 일관성을 의미한다. 따라서, 각각의 변형된 당 부위가 그 밖의 모든 변형된 당이 컨쥬게이트된 수용체 부위와 동일한 구조를 갖는 수용체 부위에 컨쥬게이트된 본 발명의 펩타이드 컨쥬게이트에서 펩타이드 컨쥬게이트는 약 100% 균질인 것으로 언급된다. 균일성은 일반적으로 범위로 표현된다. 펩타이드 컨쥬게이트에 대한 균일성의 범위의 하한선은 약 60%, 약 70% 또는 약 80%이며, 순도의 범위의 상한선은 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 90% 이상이다.
펩타이드 컨쥬게이트가 약 90% 또는 그 이상 균질인 경우에, 이들의 균일성도 또한 바람직하게는 범위로 표현된다. 균일성의 범위의 하한선은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 96% 또는 약 98%이다. 순도의 범위의 상한선은 약 92%, 약 94%, 약 96%, 약 98% 또는 약 100% 균일성이다. 펩타이드 컨쥬게이트의 순도는 일반적으로 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 하나 또는 그 이상의 방법, 예를 들어, 액체 크로마토그라피-질량분석 (LC-MS), 플라이트 스펙트로메트리 (flight spectrometry)의 매트릭스 보조 레이저 탈착 질량시간 (MALDITOF), 모세관 전기영동 등에 의해서 결정된다.
글리코펩타이드 종을 언급할 때의 "실질적으로 균일한 글리코폼 (glycoform)" 또는 "실질적으로 균일한 글리코실화 패턴"은 중요한 글리코실트랜스퍼라제 (예를 들어, 퓨코실트랜스퍼라제)에 의해서 글리코실화되는 수용체 부위의 백분율을 의미하는 것이다. 예를 들어, α1,2 퓨코실트랜스퍼라제의 경우에, 실질적으로 모든 (이하에서 정의하는 바와 같음) Galβ1,4-GlcNAc-R 및 그의 시알릴화 동족체가 본 발명의 펩타이드 컨쥬게이트에서 퓨코실화된다면 실질적으로 균일한 퓨코실화 패턴이 존재한다. 출발물질이 글리코실화된 수용체 부위 (예를 들어, 퓨코실화된 Galβ1,4-GlcNAc-R 부위)를 함유할 수 있음은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 이해될 수 있을 것이다. 따라서, 계산된 글리코실화 퍼센트는 본 발명의 방법에 의해서 글리코실화된 수용체 부위 및 출발물질에서 이미 글리코실화된 수용체 부위를 포함할 것이다.
"실질적으로 균일한"의 상기 정의에서 용어 "실질적으로"는 일반적으로 특정한 글리코실트랜스퍼라제에 대한 수용체 부위의 적어도 약 40%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 약 95%가 글리코실화되는 것을 의미한다.
치환체 그룹이 왼쪽에서부터 오른쪽으로 쓰여진 그들의 통상적인 화학식에 의해서 구체화되는 경우에, 이들은 오른쪽에서부터 왼쪽으로 써서 표시될 수 있는 화학적으로 동일한 치환체도 동등하게 포함하는데, 예를 들어, -CH2O-는 -OCH2-를 또한 설명하고자 하는 것이다.
그 자체로 또는 또 다른 치환체의 일부분으로서의 용어 "알킬"은 다른 식으로 언급되지 않는 한은 완전히 포화되거나, 단일- 또는 다불포화될 수 있으며 2가 및 다가 래디칼을 포함할 수 있는, 지정된 탄소원자의 수를 갖는 (즉, C1-C10은 1 내지 10개의 탄소를 의미한다) 직쇄 또는 측쇄 또는 사이클릭 하이드로카본 래디칼 또는 이들의 조합을 의미한다. 포화된 하이드로카본 래디칼의 예로는 메틸, 에틸,
n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, 2급-부틸, 사이클로헥실, (사이클로헥실)메틸, 사이클로프로필메틸, 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등의 동족체 및 이성체와 같은 그룹들이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 불포화된 알킬 그룹은 하나 또는 그 이상의 이중결합 또는 삼중결합을 갖는 것이다. 불포화된 알킬 그룹의 예로는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 고급 동족체 및 이성체가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 용어 "알킬"은 달리 지적되지 않는 한은, 또한 "헤테로알킬"과 같은 이하에 더 상세히 정의되는 알킬의 유도체를 포함하는 것을 의미한다. 하이드로카본 그룹으로 제한되는 알킬 그룹은 "호모알킬"이라고 칭한다.
그 자체로 또는 또 다른 치환체의 일부분으로서의 용어 "알킬렌"은 -CH2CH2CH2CH2-로 예시되는 (단, 이것으로 제한되지는 않는다) 알칸으로부터 유도된 2가 래디칼을 의미하며, 추가로 "헤테로알킬렌"으로 이하에 기술된 그룹들을 포함한다. 일반적으로, 알킬 (또는 알킬렌) 그룹은 1 내지 24개의 탄소원자를 가질 수 있으며, 10개 또는 그보다 더 작은 수의 탄소원자를 갖는 이들 그룹이 본 발명에서 바람직하다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 일반적으로 8개 또는 그보다 더 작은 수의 탄소원자를 갖는 더 짧은 체인의 알킬 또는 알킬렌 그룹이다.
용어 "알콕시", "알킬아미노" 및 "알킬티오" (또는 티오알콕시)는 그들의 통상적인 개념으로 사용되며, 각각 산소원자, 아미노 그룹, 또는 황원자를 통해서 분자의 나머지 부분에 부착된 알킬 그룹을 의미한다.
그 자체로 또는 또 다른 용어와 조합한 용어 "헤테로알킬"은 다른 식으로 언급되지 않는 한은 지정된 수의 탄소원자, 및 O, N, Si 및 S로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자로 구성된 안정한 직쇄 또는 측쇄, 또는 사이클릭 하이드로카본 래디칼, 또는 이들의 조합을 의미하며, 여기에서 질소 및 황원자는 임의로 산화될 수 있으며, 질소 헤테로원자는 임의로 4급화될 수 있다. 헤테로원자(들) O, N 및 S 및 Si는 헤테로알킬 그룹의 내부 위치 어디에라도, 또는 알킬 그룹이 분자의 나머지 부분에 부착된 위치에 배치될 수 있다. 그의 예는 -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, 및 -CH=CH-N(CH3)-CH3를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, -CH2-NH-OCH3 및 -CH2-O- Si(CH3)3와 같이 2개 이하의 헤테로원자가 연속적으로 존재할 수도 있다. 유사하게, 그 자체로 또는 또 다른 치환체의 일부분으로서의 용어 "헤테로알킬렌"은 -CH2-CH2-S-CH2-CH2- 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-로 예시되는 바와 같이 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 헤테로알킬로부터 유도된 2가 래디칼을 의미한다. 헤테로알킬렌 그룹의 경우에, 헤테로원자는 또한 체인 말단 중의 어느 하나 또는 둘 다를 점유할 수도 있다 (예를 들어, 알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노 등). 또한, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 연결그룹의 경우에, 연결그룹의 배향은 연결그룹의 화학식이 쓰여진 방향에 의해서 암시되지는 않는다. 예를 들어, 화학식 -C(O)2R'-는 -C(O)2R' 및 -R'C(O)2- 둘 다를 나타낸다.
그들 자체로 또는 다른 용어와 조합한 용어 "사이클로알킬" 및 "헤테로사이클로알킬"은 다른 식으로 언급되지 않는 한은 각각 "알킬" 및 "헤테로알킬"의 사이클릭 변형체를 나타낸다. 추가로, 헤테로사이클로알킬의 경우에 헤테로원자는 헤테로사이클이 분자의 나머지 부분에 부착된 위치를 점유할 수 있다. 사이클로알킬의 예로는 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 1-사이클로헥세닐, 3-사이클로헥세닐, 사이클로헵틸 등이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 헤테로사이클로알킬의 예로는 1-(1,2,5,6-테트라하이드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라하이드로푸란-2-일, 테트라하이드로푸란-3-일, 테트라하이드티엔-2-일, 테트라하이드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
그들 자체로 또는 또 다른 치환체의 일부분으로서의 용어 "할로" 또는 "할로겐"은 다른 식으로 언급되지 않는 한은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 원자를 의미한다. 추가로, "할로알킬"과 같은 용어는 모노할로알킬 및 폴리할로알킬을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 용어 "할로(C1-C4)알킬"은 트리플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 4-클로로부틸, 3-브로모프로필 등을 포함하는 것을 의미하나, 이들로 제한되지는 않는다.
다른 식으로 언급되지 않는 한은, 용어 "아릴"은 함께 융합되거나, 공유적으로 연결된 단일 환 또는 다중 환 (바람직하게는 1 내지 3개의 환)일 수 있는 다중불포화된 방향족 치환체를 의미한다. 용어 "헤테로아릴"은 N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 아릴 그룹 (또는 환)을 의미하며, 여기에서 질소 및 황원자는 임의로 산화되며, 질소원자(들)는 임의로 4급화된다. 헤테로아릴 그룹은 헤테로원자를 통해서 분자의 나머지 부분에 부착될 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴 그룹의 비-제한적 예로는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 퓨리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀리닐, 5-이소퀴놀리닐, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴, 테트라졸릴, 벤조[b]푸라닐, 벤조[b]티에 닐, 2,3-디하이드로벤조[1,4]디옥신6-일, 벤조[1,3]디옥솔-5-일 및 6-퀴놀릴이 포함된다. 상기 제시된 아릴 및 헤테로아릴 환 시스템의 각각에 대한 치환체는 이하에 기술된 허용될 수 있는 치환체의 그룹으로부터 선택된다.
요약하여, 다른 용어와 조합하여 사용되는 경우의 용어 "아릴" (예를 들어, 아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬)은 상기 정의된 바와 같은 아릴 및 헤테로아릴 환 둘 다를 포함한다. 따라서, 용어 "아릴알킬"은 아릴 그룹이 탄소원자 (예를 들어, 메틸렌 그룹)가 예를 들어, 산소원자 (예를 들어, 페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등)에 의해서 치환된 알킬 그룹을 포함한 알킬 그룹에 부착된 래디칼 (예를 들어, 벤질, 펜에틸, 피리딜메틸 등)을 포함하는 것을 의미한다.
상기 용어 (예를 들어, "알킬", "헤테로알킬", "아릴" 및 "헤테로아릴")의 각각은 지시된 래디칼의 치환 및 비치환된 형태 둘 다를 포함하는 것을 의미한다. 각각의 래디칼 타입에 대한 바람직한 치환체는 이하에 제시되어 있다.
알킬 및 헤테로알킬 래디칼 (종종 알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 헤테로사이클로알케닐로 칭하는 그룹을 포함)에 대한 치환체는 일반적으로 "알킬 그룹 치환체"라고 불리며, 이들은 0 내지 (2m'+1) 범위의 수 (여기에서 m'는 이러한 래디칼의 탄소원자의 총수이다)의 -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'C(O)NR"R'", -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2로 부터 선택된 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 다양한 그룹 중의 하나 또는 그 이상일 수 있다. R', R", R'" 및 R"" 각각은 바람직하게는 독립적으로 수소, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬, 치환되거나 비치환된 아릴, 예를 들어, 1-3개의 할로겐으로 치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 그룹, 또는 아릴알킬 그룹을 의미한다. 본 발명의 화합물이 하나 보다 많은 R 그룹을 포함하는 경우에, 예를 들어, 각각의 R 그룹은 R', R", R'" 및 R"" 그룹의 하나 이상이 존재하는 경우의 이들 그룹 각각과 같이 독립적으로 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소원자에 부착되는 경우에, 이들은 질소원자와 결합하여 5-, 6- 또는 7-원 환을 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R"는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하는 것을 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 의미한다. 치환체에 대한 상기의 검토사항으로부터 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 용어 "알킬"이 할로알킬 (예를 들어, -CF3 및 -CH2CF3) 및 아실 (예를 들어, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등)과 같이 수소 그룹 이외의 그룹에 결합된 탄소원자를 포함하는 그룹들을 포함하는 것을 의미한다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
알킬 래디칼에 대해서 기술된 치환체와 유사하게, 아릴 및 헤테로아릴 그룹에 대한 치환체는 일반적으로 "아릴 그룹 치환체"라 불린다. 치환체는 예를 들어, 0 내지 방향족 환 시스템 상의 개방 원자가 (open valences)의 총수까지의 범위의 수의 할로겐, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R'", -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2, -R' -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시, 및 플루오로(C1-C4)알킬로부터 선택되며, 여기에서 R', R", R'" 및 R""는 바람직하게는 수소, 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬, 치환되거나 비치환된 아릴 및 치환되거나 비치환된 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된다. 본 발명의 화합물이 하나 보다 많은 R 그룹을 포함하는 경우에, 예를 들어, 각각의 R 그룹은 R', R", R'" 및 R"" 그룹의 하나 이상이 존재하는 경우의 이들 그룹 각각과 같이 독립적으로 선택된다. 이하의 반응식에서, 심볼 X는 상술한 바와 같은 "R"을 나타낸다.
아릴 또는 헤테로아릴 환의 인접한 원자 상의 두개의 치환체는 임의로 화학식 -T-C(O)-(CRR')q-U-의 치환체에 의해서 대체될 수 있으며, 여기에서 T 및 U는 독립적으로 -NR-, -O-, -CRR'- 또는 단일결합이며, q는 0 내지 3의 정수이다. 대신으로, 아릴 또는 헤테로아릴 환의 인접한 원자 상의 두개의 치환체는 임의로 화학식 -A-(CH2)r-B-의 치환체에 의해서 대체될 수 있으며, 여기에서 A 및 B는 독립적으로 -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'- 또는 단일결합이며, r은 1 내지 4의 정수이다. 이렇게 형성된 새로운 환의 단일결합 중의 하나는 임의 로 이중결합에 의해서 대체될 수 있다. 대신으로, 아릴 또는 헤테로아릴 환의 인접한 원자 상의 두개의 치환체는 임의로 화학식 -(CRR')s-X-(CR"R'")d-의 치환체에 의해서 대체될 수 있으며, 여기에서 s 및 d는 독립적으로 0 내지 3의 정수이고, X는 -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, 또는 -S(O)2NR'-이다. 치환체 R, R', R" 및 R'"는 바람직하게는 수소 또는 치환되거나 비치환된 (C1-C6)알킬로부터 독립적으로 선택된다.
본 발명에서 사용된 것으로, 용어 "헤테로원자"는 산소 (O), 질소 (N), 황 (S) 및 실리콘 (Si)을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명은 G-CSF 상의 글리칸 구조를 변형시키는 방법을 포함한다. G-CSF는 활성화된 T-세포, 대식세포, 내피세포 및 기질성 섬유아세포에 의해서 생성되는 사이토킨으로서 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. G-CSF는 일차적으로 골수에 작용하여 염증성 백혈구의 생산을 증가시키고, 나아가서 엔도크린 호르몬으로 작용하여 염증성 기능 중에 소비된 호중구의 보충을 개시시킨다. G-CSF는 또한, 화학요법 이후의 골수 치환에서 임상적 적용성을 갖는다.
본 발명은 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF)의 컨쥬게이트을 제공한다. 본 발명은 과립구 콜로니 자극활성을 갖는 글리코실화 및 비글리코실화된 펩타이드의 컨쥬게이트를 제공한다. 이 컨쥬게이트는 치료학적 부위, 진단적 부위, 표적화 부위 등과 같은 다양한 종류와의 추가의 컨쥬게이션에 의해서 더 변형될 수 있다.
본 발명은 또한, G-CSF를 리모델링하고/하거나 변형시키는 방법을 포함한다. G-CSF는 다수의 질병의 치료에 유용한 도구이지만, 상기 언급한 바와 같이 그의 임상적 효능은 그의 비교적 열등한 약력학에 의해서 저해된다.
예시적 구체예에서, 본 발명의 G-CSF 펩타이드는 특정한 형태의 방사선요법, 화학요법 및 골수 이식을 받고 있는 암 환자에게서 감염을 예방할 목적으로, 말초혈액 조상세포 이식 시에 수집을 위하여 조상세포를 가동화시키기 위해서, 만성 또는 상대적 백혈구감소증의 치료를 위해서, 그리고 급성 골수성 백혈병이 있는 환자의 치료를 도와주기 위해서 환자에게 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드 컨쥬게이트 또는 조성물은 AIDS 또는 그 밖의 다른 면역결핍성 질병 및 박테리아 감염의 치료를 위해서 사용될 수도 있다.
G-CSF는 클로닝 및 서열 분석되어 있다. 예시적 구체예에서, G-CSF는 SEQ ID NO:1에 따르는 아미노산 서열을 갖는다. 숙련된 전문가는 본 발명이 상기 언급한 바와 같은 G-CSF의 변이체로서 본 발명에 나타낸 서열로 제한되지는 않음을 쉽게 이해할 것이다.
따라서, 본 발명은 본 기술분야에서 잘 알려진 바와 같이 G-CSF 변이체를 더 포함한다. 어떤 식으로든 본 발명에 대한 제한을 의미하는 것은 아니지만, 예로서 G-CSF 변이체가 미국 특허 제 6,166,183 호에 기술되어 있는데, 여기에는 라이신 잔기의 천연 보체를 포함하며, 추가로 하나 또는 두개의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 연결된 G-CSF가 기술되어 있다. 또한, 미국 특허 제 6,004,548, 5,580,755, 5,582,823, 및 5,676,941 호는 17, 36, 42, 64 및 74 위치에서 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기가 알라닌, 또는 대신으로 세린에 의해서 치환된 G-CSF 변이체를 기술하고 있다. 미국 특허 제 5,416,195 호에는 17 위치의 시스테인, 27 위치의 아스파르트산 및 65 및 66 위치의 세린이 각각 세린, 세린, 프롤린 및 프롤린으로 치환된 G-CSF 분자가 기술되어 있다. 그 밖의 다른 변이체가 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제 5,399,345 호에 기술되어 있다. 추가의 변이체는 또한, SEQ ID Nos:3-11로부터 선택된 아미노산을 갖는다.
본 발명의 변형된 G-CSF 분자의 발현 및 활성은 본 기술분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제 4,810,643 호에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 분석시험된다. 예로서, 활성은 방사성-표지된 티미딘 흡수시험을 사용하여 측정될 수 있다. 간략하게, 건강한 공여체로부터 수득한 인간 골수를 피콜-하이파크 (Ficoll-Hypaque; 1.077 g/㎖, Pharmacia, Piscataway, NJ)에 의한 밀도 컷 (density cut)에 적용하고, 저밀도 세포를 10% 태자 소혈청, 글루타민 및 항생제를 함유하는 이스코브 매질 (Iscove's medium) (GIBCO, La Jolla, CA)에 현탁시킨다. 약 2×104 인간 골수세포를 약 2일 동안, 공기 중의 5% CO2 하에 약 37℃에서 96-웰 편평 바닥 플레이트에서 대조매질 또는 본 발명의 G-CSF와 함께 배양한다. 그후, 배양액을 약 4시간 동안, 0.5 μCi/웰의 3H-티미딘 (New England Nuclear, Boston, Mass.)으로 펄스 처리하고, 예를 들어, 문헌 (Ventua, et al., 1983, Blood 61:781)에 기술된 바와 같이 흡수를 측정한다. 대조화합물로 처리한 골수세포와 비교한 것으로, 인간 골수세포 내로의 3H-티미딘의 혼입의 증가는 활성 및 생존가능 한 G-CSF 화합물의 지표이다.
상기 거론한 바와 같이, 본 발명의 컨쥬게이트는 변형된 당을 글리코실화 또는 비글리코실화된 G-CSF 펩타이드에 효소적으로 부착시킴으로써 형성된다. G-CSF 펩타이드와 당 위의 변형성 그룹 사이에 삽입되는 경우의 변형된 당은 여기에서 "온전한 글리코실 연결그룹"으로 불릴 수 있는 것이 된다. 글리코실트랜스퍼라제와 같은 효소의 정교한 선택성을 이용하여, 본 발명의 방법은 하나 또는 그 이상의 특이적 위치에 목적하는 그룹을 갖는 펩타이드를 제공한다. 따라서, 본 발명에 따라 변형된 당은 G-CSF 펩타이드 체인 상의 선택된 위치에 직접적으로 부착되거나, 또는 대신으로 변형된 당은 글리코펩타이드의 카보하이드레이트 부위 상에 부가된다. 변형된 당이 글리코펩타이드 및 직접적으로 G-CSF 펩타이드의 아미노산 잔기 둘 다에 결합된 펩타이드도 본 발명의 범주 내에 포함된다.
공지의 화학적 및 효소적 펩타이드 생성전략과는 달리, 본 발명의 방법은 실질적으로 균일한 유도체화 패턴을 갖는 글리코펩타이드와 펩타이드를 조립할 수 있도록 만들며; 본 발명에서 사용된 효소는 일반적으로 특정한 아미노산 잔기 또는 G-CSF의 아미노산 잔기들의 배합물에 대하여 선택적이다. 이 방법은 또한, 변형된 펩타이드 및 글리코펩타이드의 대규모 생산에 실용적이다. 따라서, 본 발명의 방법은 미리 선택된 균일한 유도체화 패턴을 갖는 글리코펩타이드의 대규모 제조를 위한 실용적인 수단을 제공한다. 이 방법은 특히 세포배양에서 세포 (예를 들어, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 진균 세포, 효소 세포, 또는 원핵세포) 또는 유전자 도입 식물 또는 동물를 생산하는 중에 불완전하게 글리코실화된 글리코 펩타이드를 포함하는 (이것으로 제한되지는 않는다) 치료학적 펩타이드를 변형시키는데 매우 적합하다.
본 발명은 또한, 예를 들어, 감소된 청소율, 또는 면역 또는 망상내피계 (RES)에 의한 흡수의 감소된 비율로 인하여 증가된 치료학적 반감기를 갖는 글리코실화 및 비글리코실화된 G-CSF 펩타이드의 컨쥬게이트를 제공한다. 또한, 본 발명의 방법은 펩타이드 상의 항원성 결정인자를 차폐시킴으로써 펩타이드에 대한 숙주 면역반응을 감소 또는 제거하는 수단을 제공한다. 표적화제의 선택적 부착을 또한 사용하여 특정의 표적화제에 대하여 특이적인 특정의 조 조직 또는 세포표면 수용체에 대해서 펩타이드를 표적화시킬 수도 있다.
컨쥬게이트
첫번째 관점에서, 본 발명은 선택된 변형성 그룹과 G-CSF 펩타이드 사이의 컨쥬게이트를 제공한다.
G-CSF 펩타이드와 선택된 부위 사이의 연결은 펩타이드와 선택된 부위 사이에 삽입된 온전한 글리코실 연결그룹을 포함한다. 본 발명에서 거론된 바와 같이, 선택된 부위는 필수적으로, 사카라이드 유니트에 부착되어 G-CSF 펩타이드 상에 변형된 당을 부가시키는 적절한 트랜스퍼라제 효소에 의해서 인식되는 "변형된 당"을 생성시킬 수 있는 모든 종이다. G-CSF 펩타이드와 선택된 부위 사이에 삽입된 경우의 변형된 당의 사카라이드 성분은 "온전한 글리코실 연결그룹"이 된다. 글리코실 연결그룹은 선택된 부위에 의해서 변형시킨 후에, 적절한 트랜스퍼라제를 위한 기질인 모든 모노- 또는 올리고-사카라이드로부터 형성된다.
본 발명의 컨쥬게이트는 전형적으로 하기 화학식의 일반적 구조에 상응한다:
Figure 112006039150479-PCT00003
상기 식에서 심볼 a, b, c, d 및 s는 0이 아닌 양의 정수를 나타내고; t는 0 또는 양의 정수이다. "약제"는 일반적으로 수용성 부위, 예를 들어, PEG 부위이다. 링커는 이하의 연결그룹의 광범한 어레이 (array) 중의 어떤 것이라도 될 수 있다. 대신으로, 링커는 단일결합 또는 "0차 링커 (zero order linker)"일 수도 있다.
예시적 구체예에서, 선택된 변형성 그룹은 수용성 폴리머, 예를 들어, m-PEG이다. 수용성 폴리머는 G-CSF 펩타이드의 아미노산 잔기 또는 글리코실 잔기에 공유적으로 부착된 글리코실 연결그룹을 통해서 G-CSF 펩타이드에 공유적으로 부착된다. 본 발명은 또한, 아미노산 잔기 및 글리코실 잔기가 글리코실 연결그룹에 의해서 변형된 컨쥬게이트를 제공한다.
수용성 폴리머의 예는 폴리(에틸렌 글리콜), 예를 들어, 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)이다. 본 발명에서 사용된 폴리(에틸렌 글리콜)은 어떤 특정한 형태 또는 분자량 범위로도 제한되지 않는다. 분지되지 않은 폴리(에틸렌 글리콜) 분자의 경우에 분자량은 바람직하게는 500과 100,000 사이이다. 2,000-60,000 달톤의 분자량이 바람직하게 사용되며, 약 5,000 내지 약 30,000 달톤의 분자량이 더욱 바람직하다.
또 다른 구체예에서, 폴리(에틸렌 글리콜)은 부착된 하나 이상의 PEG 부위를 갖는 분지된 PEG이다. 분지된 PEGs의 예는 미국 특허 제 5,932,462 호; 미국 특허 제 5,342,940 호; 미국 특허 제 5,643,575 호; 미국 특허 제 5,919,455 호; 미국 특허 제 6,113,906 호; 미국 특허 제 5,183,660 호; WO 02/09766; 문헌 [Kodera Y., Bioconjugate Chemistry 5: 283-288 (1994); 및 Yamasaki et al., Agric. Biol. Chem., 52: 2125-2127, 1998]에 기술되어 있다. 그 밖의 다른 유용한 분지된 PEG 구조는 본 명세서에 기술된다.
예시적 구체예에서, 분지된 PEG의 각각의 폴리(에틸렌 글리콜)의 분자량은 약 2,000, 5,000, 10,000, 15,000, 20,000, 40,000 또는 60,000 달톤이거나, 또는 그 이상이다.
본 발명의 펩타이드는 적어도 하나의 N- 또는 O-연결된 글리코실화 부위를 포함한다. 효소적으로 부가된 글리코실 연결그룹을 통해서 형성된 컨쥬게이트를 제공하는 것 이외에도, 본 발명은 그들의 치환패턴이 매우 균일한 컨쥬게이트를 제공한다. 본 발명의 방법을 사용하여, 본 발명의 컨쥬게이트의 집단에 걸쳐 필수적으로 모든 변형된 당 부위가 구조적으로 동일한 아미노산 또는 글리코실 잔기의 다수의 카피에 부착된 펩타이드 컨쥬게이트를 형성시킬 수 있다. 따라서, 두번째 관점에서 본 발명은 온전한 글리코실 연결그룹을 통해서 G-CSF 펩타이드에 공유적으로 결합된 수용성 폴리머 부위의 집단을 갖는 펩타이드 컨쥬게이트를 제공한다. 본 발명의 바람직한 컨쥬게이트에서, 필수적으로 집단의 각각의 구성원은 글리코실 연결그룹을 통해서 G-CSF 펩타이드의 글리코실 잔기에 결합되며,글리코실 연결그룹 이 부착된 G-CSF 펩타이드의 각각의 글리코실 잔기는 동일한 구조를 갖는다.
또한, 글리코실 연결그룹을 통해서 공유적으로 부착되어 있는 수용성 폴리머 부위의 집단을 갖는 펩타이드 컨쥬게이트가 제공된다. 바람직한 구체예에서, 필수적으로 수용성 폴리머 부위의 집단의 모든 구성원은 글리코실 연결그룹을 통해서 G-CSF 펩타이드의 아미노산 잔기에 결합되며, 여기에 부착된 글리코실 연결그룹을 갖는 각각의 아미노산 잔기는 동일한 구조를 갖는다.
본 발명은 또한, G-CSF 펩타이드가 온전한 글리코실 연결그룹을 통해서 치료학적 부위, 진단적 부위, 표적화 부위, 톡신 부위 등에 컨쥬게이트된, 상술한 것과 유사한 컨쥬게이트를 제공한다. 상기 언급된 각각의 부위는 소분자, 천연 폴리머 (예를 들어, 폴리펩타이드) 또는 합성 폴리머일 수 있다.
본질적으로 어떤 서열이라도 갖는 모든 과립구 콜로니 자극인자 펩타이드 또는 약제가 본 발명의 컨쥬게이트의 펩타이드 성분으로서 유용하다. 과립구 콜로니 자극인자는 클로닝되고 서열분석되어 있다. 예시적 구체예에서, G-CSF 펩타이드는 SEQ ID NO:1로 표시되는 서열을 갖는다:
Figure 112006039150479-PCT00004
또 다른 예시적 구체예에서, G-CSF 펩타이드는 SEQ ID NO:2로 표시되는 서열을 갖는다:
Figure 112006039150479-PCT00005
또 다른 예시적 구체예에서, G-CSF 펩타이드는 이하의 SEQ ID Nos:3-11로 표시되는 서열을 갖는다:
Figure 112006039150479-PCT00006
Figure 112006039150479-PCT00007
Figure 112006039150479-PCT00008
본 발명은 어떤 식으로든 본 명세서에 기술된 서열로 제한되지 않는다.
예시적 구체예에서, 본 발명의 G-CSF 펩타이드는 PEG 부위를 포함하는 글리코실 잔기에 의해서 글리코실화된 적어도 하나의 O-연결된 글리코실화 부위를 포함한다. PEG는 온전한 글리코실 연결그룹을 통해서 G-CSF 펩타이드에 공유적으로 부착된다. 글리코실 연결그룹은 G-CSF 펩타이드의 아미노산 잔기 또는 글리코실 잔기에 공유적으로 부착된다. 대용으로, 글리코실 연결그룹은 글리코펩타이드의 하나 또는 그 이상의 글리코실 유니트에 부착된다. 본 발명은 또한, 글리코실 연결그룹이 아미노산 잔기 및 글리코실 잔기 둘 다에 부착된 컨쥬게이트를 제공한다.
PEG 부위는 직접적으로, 또는 비-글리코실 링커, 예를 들어, 치환되거나 비 치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬을 통해서 온전한 글리코실 링커에 부착된다.
예시적 구체예에서, G-CSF 펩타이드는 하기 화학식 I의 구조를 갖는 부위를 포함한다:
Figure 112006039150479-PCT00009
상기 화학식에서, D는 -OH 및 R1-L-HN-로부터 선택된 구성원이며; G는 R1-L- 및 -C(O)(C1-C6)알킬로부터 선택된 구성원이고; R1은 직쇄 또는 측쇄 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 포함하는 선택된 부위로부터 선택된 구성원을 포함하는 부위이며; L은 결합, 치환되거나 비치환된 알킬 및 치환되거나 비치환된 헤테로알킬로부터 선택된 구성원인 링커이며, 따라서 D가 OH인 경우에, G는 R1-L-이며, G가 -C(O)(C1-C6)알킬인 경우에, D는 R1-L-NH-이다. 본 명세서에 기술된 변형된 시알산 구조에서, COOH는 또한 COO- 및/또는 그의 염을 나타낸다.
한가지 구체예에서, R1-L은 하기 화학식의 구조를 갖는다:
Figure 112006039150479-PCT00010
상기 식에서, a는 0 내지 20의 정수이다.
예시적인 구체예에서, R1은 하기 화학식들로부터 선택된 구성원의 구조를 갖는다:
Figure 112006039150479-PCT00011
여기에서, e 및 f는 1 내지 2500으로부터 독립적으로 선택되는 정수이며; q는 1 내지 20의 정수이다. 그 밖의 다른 구체예에서, R1은 이하의 화학식로부터 선택된 구성원인 구조를 갖는다:
Figure 112006039150479-PCT00012
여기에서 e, f 및 f'는 독립적으로 1 내지 2500으로부터 선택되는 정수이며; q 및 q'는 독립적으로 1 내지 20으로부터 선택되는 정수이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 R1이 하기 화학식으로부터 선택되는 구성원인 구조를 갖는 인자 IX 펩타이드 컨쥬게이트를 제공한다:
Figure 112006039150479-PCT00013
여기에서 e, f 및 f'는 독립적으로 1 내지 2500으로부터 선택되는 정수이며; q, q' 및 q"는 독립적으로 1 내지 20으로부터 선택되는 정수이다.
또 다른 구체예에서, R1은 하기 화학식으로부터 선택되는 구성원인 구조를 갖는다:
Figure 112006039150479-PCT00014
여기에서 e 및 f는 독립적으로 1 내지 2500으로부터 선택되는 정수이다.
또 다른 예시적 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식을 갖는 부위를 포함하는 펩타이드를 제공한다:
Figure 112006039150479-PCT00015
Gal은 아미노산에, 또는 아미노산에 직접 또는 간접적으로 (예를 들어, 글리 코실 잔기를 통해서) 부착된 글리코실 잔기에 부착될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 부위는 하기 화학식의 구조를 갖는다:
Figure 112006039150479-PCT00016
GalNac는 아미노산에, 또는 아미노산에 직접 또는 간접적으로 (예를 들어, 글리코실 잔기를 통해서) 부착된 글리코실 잔기에 부착될 수 있다.
추가의 또 다른 예시적 구체예에서, 펩타이드는 하기 화학식에 따르는 부위를 포함한다:
Figure 112006039150479-PCT00017
여기에서 AA는 상기 펩타이드의 아미노산 잔기이며, 상기 구조의 각각에서 D 및 G는 본 발명에 기술된 바와 같다.
하나 또는 그 이상의 상기 종이 컨쥬게이트될 수 있는 G-CSF 펩타이드의 아미노산 잔기의 예로는 세린 및 트레오닌, 예를 들어, SEQ. ID. NO:1의 트레오닌 133이 포함된다.
또 다른 예시적 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식의 구조를 갖는 글리코실 잔기를 포함하는 G-CSF 컨쥬게이트를 제공한다:
Figure 112006039150479-PCT00018
여기에서 a, b, c, d, i, r, s, t 및 u는 독립적으로 0 및 1로부터 선택되는 정수이다. 지수 q는 1이다. 지수 e, f, g 및 h는 독립적으로 0 내지 6의 정수로부터 선택된다. 지수 j, k, l 및 m은 독립적으로 0 및 100의 정수로부터 선택된다. 지수 v, w, x 및 y는 독립적으로 0 및 1로부터 선택되며, v, w, x 및 y 중의 적어도 하나는 1이다. 심볼 AA는 G-CSF 펩타이드의 아미노산 잔기를 나타낸다.
심볼 Sia-(R)은 하기 화학식의 구조를 갖는 그룹을 나타낸다:
Figure 112006039150479-PCT00019
여기에서 D는 -OH 및 R1-L-HN-으로부터 선택된다. 심볼 G는 R1-L- 또는 -C(O)(C1-C6)알킬을 나타낸다. R1은 직쇄 또는 측쇄 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 포함하는 부위를 나타낸다. L은 결합, 치환되거나 비치환된 알킬 및 치환되거나 비치환된 헤테로알킬로부터 선택되는 구성원인 링커이다. 일반적으로, D가 OH인 경우에 G는 R1-L-이며, G가 -C(O)(C1-C6)알킬인 경우에 D는 R1-L-NH-이다.
또 다른 예시적 구체예에서, 본 발명의 컨쥬게이트 내의 PEG-변형된 시알산 부위는 하기 화학식의 구조를 갖는다:
Figure 112006039150479-PCT00020
여기에서 지수 "s"는 0 내지 20의 정수를 나타내고, n은 1 내지 2500의 정수이다. 바람직한 구체예에서, s는 1이고, m-PEG 부위는 약 20 kD의 분자량을 갖는다.
또 다른 추가의 예시적 구체예에서, PEG-변형된 시알산은 하기 화학식의 구조를 갖는다:
Figure 112006039150479-PCT00021
여기에서 L은 시알산 부위와 PEG 부위를 결합시키는 치환되거나 비치환된 알킬 또는 치환되거나 비치환된 헤테로알킬 링커 부위이다.
바람직한 구체예에서는, 적어도 2개, 더욱 바람직하게는 3개, 더욱 바람직하게는 4개의 상기 언급된 아스파라진 잔기가 상기 나타낸 N-연결된 글리칸 체인에 의해서 작용화된다.
본 발명의 컨쥬게이트는 일가 또는 다가 (예를 들어, 안테나리 구조)인 온전 한 글리코실 연결그룹을 포함한다. 따라서, 본 발명의 컨쥬게이트는 선택된 부위가 일가 글리코실 연결그룹 및 다가 연결그룹을 통해서 펩타이드에 부착된 두가지 종류 모두를 포함한다. 또한, 본 발명에는 하나 이상의 선택된 부위가 다가 연결그룹을 통해서 펩타이드에 부착된 컨쥬게이트가 포함된다.
변형된 당
본 발명은 변형된 당, 변형된 당 뉴클레오타이드 및 변형된 당의 컨쥬게이트를 제공한다. 본 발명의 변형된 당 화합물에서, 당 부위는 바람직하게는 사카라이드, 데옥시-사카라이드, 아미노-사카라이드, 또는 N-아실 사카라이드이다. 용어 "사카라이드" 및 그의 동등용어 "사카릴", "당" 및 "글리코실"은 모노머, 다이머, 올리고머 및 폴리머를 의미한다. 당 부위는 또한, 변형성 그룹에 의해서 작용화된다. 변형성 그룹은 일반적으로, 당 상에서 아민, 설프하이드릴 또는 하이드록실, 예를 들어, 일급 하이드록실, 부위와의 컨쥬게이션을 통해서 당 부위에 컨쥬게이트된다. 예시적 구체예에서, 변형성 그룹은 당 상의 아민 부위를 통해서, 예를 들어, 변형성 그룹의 반응성 유도체와 아민의 반응을 통해서 형성된 아미드, 우레탄 또는 우레아를 통해서 부착된다.
어떤 당이라도 본 발명의 컨쥬게이트의 당 코어로서 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물을 형성하는데 유용한 당 코어의 예로는 글루코즈, 갈락토즈, 만노즈, 퓨코즈 및 시알산이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 그 밖의 유용한 당에는 글루코사민, 갈락토사민, 만노사민, 시알산의 5-아민 동족체 등과 같은 아미노 당이 포함된다. 당 코어는 천연에서 존재하는 구조일 수 있거나, 변형성 그룹을 컨 쥬게이트하기 위한 부위를 제공하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 한가지 구체예에서 본 발명은 9-하이드록시 부위가 아민에 의해서 대체된 시알산 유도체를 포함하는 펩타이드 컨쥬게이트를 제공한다. 아민은 선택된 변형성 그룹의 활성화된 동족체에 의해서 용이하게 유도체화 된다.
이하의 설명에서, 본 발명은 시알산의 선택된 유도체의 사용에 관하여 예시된다. 설명의 초점이 설명을 명확히 하기 위한 것이며, 기술된 구조 및 조성물은 사카라이드 그룹, 변형된 사카라이드 그룹, 활성화된 변형된 사카라이드 그룹, 및 변형된 사카라이드 그룹의 컨쥬게이트의 속에 걸쳐서 일반적으로 적용할 수 있다는 것은 본 기술분야에서 숙련된 전문가가 인지할 것이다.
예시적 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식의 구조를 갖는 변형된 당 아민을 포함하는 펩타이드 컨쥬게이트를 제공한다:
Figure 112006039150479-PCT00022
여기에서 G는 글리코실 부위이고, L은 결합 또는 링커이며, R1은 변형성 그룹이다. 결합의 예는 글리코실 부위 상의 NH2와 변형성 그룹 상의 상보적 반응성의 그룹 사이에서 형성된 것이다. 따라서, 결합의 예로는 NHR1, OR1, SR1 등이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, R1이 카복실산 부위를 포함하는 경우에, 이 부위는 활성화되고 글리코실 잔기 상의 NH2 부위과 커플링되어 화학식 NHC(O)R1의 구조를 갖는 결합을 제공할 수 있다. 유사하게, OH 및 SH 그룹은 각각 상응하는 에테르 또는 티오에테르 유도체로 전환될 수 있다.
링커의 예로는 알킬 및 헤테로알킬 부위가 포함된다. 링커에는 연결그룹, 예를 들어, 아실-기본 연결그룹, 예를 들어, -C(O)NH-, -OC(O)NH- 등이 포함된다. 연결그룹은 본 발명의 성분 종들의 성분 사이에서, 예를 들어, 글리코실 부위와 링커 (L) 사이에서, 또는 링커와 변형성 그룹 (R1) 사이에서 형성된 결합이다. 그 밖의 다른 연결그룹은 에테르, 티오에테르 및 아민이다. 예를 들어, 한가지 구체예에서 링커는 글리신 잔기와 같은 아미노산 잔기이다. 글리신의 카복실산 부위는 글리코실 잔기 상의 아민과의 작용에 의해서 상응하는 아미드로 전환되며, 글리신의 아민은 변형성 그룹의 활성화된 카복실산 또는 카보네이트와의 반응에 의해서 상응하는 아미드 또는 우레탄으로 전환된다.
또 다른 링커의 예는 PEG 부위, 또는 아미노산 잔기에 의해서 작용화된 PEG 부위이다. PEG는 하나의 PEG 말단에서 아미노산 잔기를 통해서 글리코실 그룹에 결합되고, 다른 PEG 말단을 통해서 R1에 결합된다. 대신으로, 아미노산 잔기는 R1에 결합되고, 아미노산에 결합되지 않은 PEG 말단은 글리코실 그룹에 결합된다.
NH-L-R1에 대한 종의 예는 다음의 화학식을 갖는다:
-NH{C(O)(CH2)aNH}s{C(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNH}tR1
여기에서, 지수 s 및 t는 독립적으로 0 또는 1이다. 지수 a, b 및 d는 독립적으로 0 내지 20의 정수이며, c는 1 내지 2500의 정수이다. 그 밖의 유사한 링커는 -NH 부위가 또 다른 그룹, 예를 들어, -S, -O 또는 -CH2에 의해서 대체된 종을 기본으로 한다.
더욱 특히, 본 발명은 NH-L-R1이 다음과 같은 화합물을 포함하는 펩타이드 컨쥬게이트를 제공한다: NHC(O)(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1, NHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNH-R1, NHC(O)O(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1, NH(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNH-R1, NHC(O)(CH2)aNHR1, NH(CH2)aNHR1, 및 NHR1. 이들 화학식에서, 지수 a, b 및 d는 독립적으로 0 내지 20, 바람직하게는 1 내지 5의 정수로부터 선택된다. 지수 c는 1 내지 2500의 정수이다.
실례가 되는 구체예에서 G는 시알산이며, 본 발명의 선택된 화합물은 다음의 화학식을 갖는다:
Figure 112006039150479-PCT00023
본 기술분야에서 숙련된 전문가가 인식할 수 있는 바와 같이, 예시적 화합물 내의 시알산 부위는 글루코사민, 갈락토사민, 만노사민, 이들의 N-아세틸 유도체 등을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 그 밖의 다른 어떤 아미노-사카라이드에 의해서도 대체될 수 있다.
또 다른 예증적 구체예에서, 당의 일급 하이드록실 부위는 변형성 그룹에 의해서 작용화된다. 예를 들어, 시알산의 9-하이드록실은 상응하는 아민으로 전환되고, 작용화되어 본 발명에 따르는 화합물을 제공할 수 있다. 이 구체예에 따르는 화학식은 다음을 포함한다:
Figure 112006039150479-PCT00024
추가의 예시적 구체예에서, 본 발명은 6-하이드록실 위치가 상기 제시된 바와 같은 링커-변형성 그룹 카세트를 갖는 상응하는 아미노 부위로 전환된 변형된 당을 포함하는 펩타이드 컨쥬게이트를 제공한다. 이들 변형된 당의 코어로서 사용될 수 있는 사카릴 그룹의 예로는 Gal, GalNAc, Glc, GlcNAc, Fuc, Xyl, Man 등이 포함된다. 이 구체예에 따르는 대표적인 변형된 당은 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112006039150479-PCT00025
여기에서 R3-R5 및 R7은 H, OH, C(O)CH3, NH, 및 NH C(O)CH3로부터 독립적으로 선택되는 구성원이다. R6는 상술한 바와 같은 OR1, NHR1 또는 NH-L-R1이다.
본 발명의 선택된 컨쥬게이트는 만노즈, 갈락토즈 또는 글루코즈, 또는 만노즈, 갈락토즈 또는 글루코즈의 입체화학을 갖는 종류를 기본으로 한다. 이들 컨쥬게이트의 일반적 화학식은 다음과 같다:
Figure 112006039150479-PCT00026
또 다른 예시적 구체예에서, 본 발명은 상응하는 뉴클레오타이드 당으로 활성화된, 상기 제시된 바와 같은 화합물을 제공한다. 그들의 변형된 형태로 본 발명에서 사용되는 당 뉴클레오타이드의 예로는 뉴클레오타이드 모노-, 디- 또는 트리포스페이트 또는 이들의 동족체가 포함된다. 바람직한 구체예에서, 변형된 당 뉴클레오타이드는 UDP-글리코사이드, CMP-글리코사이드 또는 GDP-글리코사이드로부터 선택된다. 더 더욱 바람직하게는, 변형된 당 뉴클레오타이드의 당 뉴클레오타이드 부분은 UDP-갈락토즈, UDP-갈락토사민, UDP-글루코즈, UDP-글루코사민, GDP-만노즈, GDP-퓨코즈, CMP-시알산 또는 CMP-NeuAc로부터 선택된다. 예시적 구체예에서, 뉴클레오타이드 포스페이트는 C-1에 부착된다.
따라서, 글리코실 부위가 시알산인 예시적 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식을 갖는 화합물을 사용하여 형성된 펩타이드 컨쥬게이트를 제공한다:
Figure 112006039150479-PCT00027
여기에서 L-R1은 상기에서 제시된 바와 같으며, L1-R1은 변형성 그룹에 결합된 링커를 나타낸다. L의 경우에서와 같이, L1에 따르는 링커 종류의 예로는 결합, 알킬 또는 헤테로알킬 부위가 포함된다. 이들 구체예에 따르는 변형된 당 뉴클레오타이드 화합물의 예는 도 1 및 도 2에 제시되어 있다.
또 다른 예시적 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 변형된 당과 기질, 예, 펩타이드, 리피드, 아글리콘 등의 사이에서, 더욱 바람직하게는 변형된 당과 글리코펩타이드 또는 글리코리피드의 글리코실 잔기 사이에서 형성된 컨쥬게이트를 제공한다. 이러한 구체예에서, 변형된 당의 당 부위는 기질과 변형성 그룹 사이에 삽입된 글리코실 연결그룹이 된다. 글리코실 연결그룹의 예는 연결그룹을 형성하는 글리코실 부위 또는 부위들이 화학적 (예를 들어, 나트륨 퍼요오데이트) 또는 효소적 과정 (예를 들어, 옥시다제)에 의해서 분해되지 않은 온전한 글리코실 연결그룹이다. 본 발명의 선택된 컨쥬게이트는 아미노사카라이드, 예를 들어, 만노사민, 글루코사민, 갈락토사민, 시알산 등의 아민 부위에 부착된 변형성 그룹을 포함한다. 이러한 모티브에 따르는 변형성 그룹-온전한 글리코실 연결그룹 카세트의 예는 하기 화학식을 갖는 것과 같은 시알산 구조를 기본으로 한다:
Figure 112006039150479-PCT00028
상기의 화학식에서 R1, L1 및 L2는 상술한 바와 같다.
또 다른 추가의 예시적 구체예에서, 컨쥬게이트는 기질과 변형성 그룹이 사카릴 부위의 6-탄소 위치에서 링커를 통해서 부착된 사카릴 부위의 1-위치 사이에서 형성된다. 따라서, 이 구체예에 따르는 예시적 컨쥬게이트는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112006039150479-PCT00029
여기에서 래디칼들은 상기에 기술된 바와 같다. 숙련된 전문가는 상술한 변형된 사카릴 부위도 또한 2, 3, 4, 또는 5 탄소원자에서 기질에 컨쥬게이트될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
이러한 구체예에서 유용한 예시적 화합물에는 하기 화학식을 갖는 화합물이 포함된다:
Figure 112006039150479-PCT00030
여기에서, R 그룹 및 지수들은 상술한 바와 같다.
본 발명은 또한, 6-탄소 위치에서 L-R1으로 변형된 당 뉴클레오타이드를 제공한다. 이러한 구체예에 따르는 종류의 예는 다음을 포함한다:
Figure 112006039150479-PCT00031
여기에서 R 그룹 및 L은 상술한 바와 같은 부위들을 나타낸다. 지수 "y"는 0, 1 또는 2이다.
본 발명의 추가의 예시적 뉴클레오타이드 당은 GDP 만노즈의 입체화학을 갖는 종류를 기본으로 한다. 이 구체예에 따르는 종류의 예는 하기 화학식의 구조를 갖는다:
Figure 112006039150479-PCT00032
또 다른 예시적 구체예에서, 본 발명은 UDP 갈락토즈의 입체화학을 기본으로 하는 컨쥬게이트를 제공한다. 이 구체예에 따르는 예시적 화합물은 하기 화학식의 구조를 갖는다:
Figure 112006039150479-PCT00033
또 다른 예시적 구체예에서, 뉴클레오타이드 당은 글루코즈의 입체화학을 기본으로 한다. 이러한 구체예에 따르는 종류의 예는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112006039150479-PCT00034
Figure 112006039150479-PCT00035
변형성 그룹 R1은 수용성 폴리머, 수-불용성 폴리머, 치료학적 약제, 진단적 약제 등을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 다수의 종류 중의 어느 것이라도 된다. 예시된 변형성 그룹의 성질은 이하에서 더 상세히 설명된다.
변형성 그룹
수용성 폴리머
다수의 수용성 폴리머가 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지되어 있으며, 본 발명을 실시하는데 유용하다. 용어 수용성 폴리머는 사카라이드 (예를 들어, 덱스트란, 아밀로즈, 히알우론산, 폴리(시알산), 헤파란, 헤파린 등); 폴리(아미노산), 예를 들어, 폴리(아스파르트산) 및 폴리(글루탐산); 핵산; 합성 폴리머 (예를 들어, 폴리(아크릴산), 폴리(에테르), 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜); 펩타이드, 단백질 등과 같은 종류를 포함한다. 본 발명은 어떠한 수용성 폴리머를 사용하여도 수행될 수 있으며, 유일한 제한조건은 폴리머가 반드시 컨쥬게이트의 나머지 부분이 부착될 수 있는 포인트 (point)를 포함하여야 한다는 점이다.
폴리머를 활성화시키는 방법은 또한, WO 94/17039, 미국 특허 제 5,324,844 호, WO 94/18247, WO 94/04193, 미국 특허 제 5,219,564 호, 미국 특허 제 5,122,614 호, WO 90/13540, 미국 특허 제 5,281,698 호, 및 또한 WO 93/15189, 및 활성화된 폴리머와 펩타이드 사이의 컨쥬게이션에 대해서는 예를 들어, 응고인자 VIII (WO 94/15625), 헤모글로빈 (WO 94/09027), 산소 운반분자 (미국 특허 제 4,412,989 호), 리보뉴클레아제 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 (Veronese at al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-45 (1985))에서 찾아 볼 수 있다.
바람직한 수용성 폴리머는 폴리머 샘플 내의 폴리머 분자의 상당한 비율이 대략 동일한 분자 중량의 것이며, 이러한 폴리머는 "호모디스퍼스 (homodisperse)"이다.
본 발명은 추가로, 폴리(에틸렌 글리콜) 컨쥬게이트에 관하여 더 설명된다. PEG의 작용화 및 컨쥬게이션에 대한 몇 가지 검토사항 및 연구논문을 이용할 수 있다 [참조예: Harris, Macronol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995); 및 Bhadra, et al., Pharmazie, 57:5-29 (2002)]. 반응성 PEG 분자를 제조하고, 이 반응성 분자를 사용하여 컨쥬게이트를 형성시키는 경로는 본 기술분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,672,662 호는 선형 또는 분지된 폴리(알킬렌 옥사이드), 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀성 알콜) 및 폴리 (아크릴로모르폴린)으로부터 선택된 폴리머 산의 활성 에스테르의 수용성 및 분리가능한 컨쥬게이트를 기술하고 있다.
미국 특허 제 6,376,604 호에는 폴리머의 말단 하이드록실을 유기용매 중에서 디(1-벤조트리아조일)카보네이트와 반응시킴으로써 수용성 및 비-펩타이드성 폴리머의 수용성 1-벤조트리아졸릴카보네이트 에스테르를 제조하는 방법이 기술되어 있다. 이 활성 에스테르를 사용하여 단백질 또는 펩타이드와 같은 생물학적 활성약제와의 컨쥬게이트를 형성시킨다.
WO 99/45964에는 안정한 결합을 통해서 폴리머 골격에 연결된 적어도 하나의 말단을 갖는 폴리머 골격을 포함하는 활성화된 수용성 폴리머와 생물학적 활성약제를 포함하는 컨쥬게이트가 기술되어 있으며, 여기에서 적어도 하나의 말단은 분지성 부위 (branching moiety)에 연결된 근위 반응성 그룹을 갖는 분지성 부위를 포함하며, 여기에서 생물학적 활성약제는 적어도 하나의 근위 반응성 그룹에 연결된다. 그 밖의 다른 분지된 폴리(에틸렌 글리콜)은 WO 96/21469에 기술되어 있으며, 미국 특허 제 5,932,462 호는 반응성 작용그룹을 포함하는 분지된 말단을 포함하는 분지된 PEG 분자에 의해서 형성된 컨쥬게이트를 기술하였다. 유리 반응성 그룹은 폴리(에틸렌 글리콜)과 생물학적 활성 종류 사이에서 컨쥬게이트를 형성하는, 단백질 또는 펩타이드와 같은 생물학적 활성 종류와 반응할 수 있다. 미국 특허 제 5,446,090 호에는 이작용성 PEG 링커, 및 PEG 링커 말단 각각에 펩타이드를 갖는 컨쥬게이트를 형성시키는데 있어서의 그의 용도가 기술되어 있다.
분해가능한 PEG 결합을 포함하는 컨쥬게이트는 WO 99/34833; 및 WO 99/14259 뿐만 아니라 미국 특허 제 6,348,558 호에 기술되어 있다. 이러한 분해가능한 결합은 본 발명에서 적용이 가능하다.
상술한 폴리머 활성화의 본 기술분야에서 인지되고 있는 방법은 본 발명에 기술된 분지된 폴리머의 형성 시에, 및 다른 종류, 예를 들어, 당, 당 뉴클레오타이드 등에 대한 이들 분지된 폴리머의 컨쥬게이션을 위한 본 발명과 관련하여 유용하다.
본 발명에서 유용한 폴리(에틸렌 글리콜) 분자의 예로는 하기 화학식을 갖는 것이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다:
Figure 112006039150479-PCT00036
여기에서 R8은 H, OH, NH2, 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로사이클로알킬, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬, 예를 들어, 아세탈, OHC-, H2N-(CH2)q-, HS-(CH2)q, 또는 -(CH2)qC(Y)Z1이다. 지수 "e"는 1 내지 2500의 정수를 나타낸다. 지수 b, d, 및 q는 독립적으로 0 내지 20의 정수를 나타낸다. 심볼 Z 및 Z1은 독립적으로 OH, NH2, 이탈그룹, 예를 들어, 이미다졸, p-니트로페닐, HOBT, 테트라졸, 할라이드, S-R9, 활성화된 에스테르의 알콜 부분; -(CH2)pC(Y1)V 또는 -(CH2)pU(CH2)sC(Y1)v를 나타낸다. 심볼 Y는 H(2), =O, =S, =N-R10을 나타낸다. 심볼 X, Y, Y1, A1, 및 U는 독립적으로 부위 O, S, N-R11를 나타낸다. 심볼 V는 OH, NH2, 할로겐, S-R12, 활성화된 에스테르의 알콜 성분, 활성화된 아미드의 아민 성분, 당-뉴클레오타이드 및 단백질을 나타낸다. 지수 p, q, s 및 v는 0 내지 20의 정수로부터 독립적으로 선택된 구성원이다. 심볼 R9, R10, R11 및 R12는 독립적으로 H, 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬, 치환되거나 비치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로사이클로알킬, 및 치환되거나 비치환된 헤테로아릴을 나타낸다.
그 밖의 다른 예시적 구체예에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 하기 화합물들로부터 선택된다:
Figure 112006039150479-PCT00037
본 발명의 컨쥬게이트를 형성하는데 유용한 폴리(에틸렌 글리콜)은 선형이거나 분지된다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 분지된 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 하기 화학식으로 나타낸 화합물을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다:
Figure 112006039150479-PCT00038
여기에서, R8 및 R8'는 상기 R8에 대해서 정의된 그룹으로부터 독립적으로 선택된 구성원이다. A1 및 A2는 상기 A1에 대해서 정의된 그룹으로부터 독립적으로 선택된 구성원이다. 지수 e, f, o, 및 q는 상술한 바와 같다. Z 및 Y는 상술한 바와 같다. X1 및 X1'는 S, SC(O)NH, HNC(O)S, SC(O)O, O, NH, NHC(O), (O)CNH 및 NHC(O)O, OC(O)NH로부터 독립적으로 선택된 구성원이다.
또 다른 예시적 구체예에서, 분지된 PEG는 시스테인, 세린 또는 디-라이신 코어를 기본으로 한다. 따라서, 분지된 PEGs의 추가로 예로는 다음 화합물이 포함된다:
Figure 112006039150479-PCT00039
또 다른 구체예에서, 분지된 PEG 부위는 트리-라이신 펩타이드를 기본으로 한다. 트리-라이신은 모노-, 디-, 트리- 또는 테트라-페질화될 수 있다. 이러한 구체예에 따르는 종류의 예는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112006039150479-PCT00040
여기에서 e, f 및 f'는 독립적으로 1 내지 2500으로부터 선택되는 정수이며; q, q' 및 q"는 독립적으로 1 내지 20으로부터 선택된 정수이다.
본 발명의 예시적인 구체예에서, PEG는 m-PEG (5 kD, 10 kD 또는 20kD)이다. 분지된 PEG 종류의 예는 세린- 또는 시스테인-(m-PEG)2이며, 여기에서 m-PEG는 20 kD m-PEG이다.
숙련된 전문가에게 명백한 것으로서, 본 발명에서 유용한 분지된 폴리머는 상술한 주제에 대한 변이체를 포함한다. 예를 들어, 상기에 나타낸 디-라이신-PEG 컨쥬게이트는 3개의 폴리머성 서브유니트를 포함할 수 있으며, 세번째는 상기 구조에서 비변형된 것으로 나타낸 α-아민에 결합된다. 유사하게, 3개 또는 4개의 폴리머성 유니트로 작용화된 트리-라이신의 사용은 본 발명의 범주 내에 포함된다.
본 발명에서 따르는 특이적 구체예에는 다음 화학식의 화합물들이 포함된다:
Figure 112006039150479-PCT00041
Figure 112006039150479-PCT00042
및 이들 종류의 카보네이트 및 활성 에스테르, 예를 들어,
Figure 112006039150479-PCT00043
본 발명에 기술된 화합물을 제조하는데 유용한 선형 PEGs를 활성화시키는데 적절한 그 밖의 다른 활성화 또는 이탈 그룹에는 다음 화학식의 종류들이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다:
Figure 112006039150479-PCT00044
이들 및 그 밖의 다른 종류에 의해서 활성화된 PEG 분자 및 활성화된 PEGs를 제조하는 방법은 WO 04/083259에 기술되어 있다.
본 기술분야에서 숙련된 전문가는, 분지된 폴리머의 하나 또는 그 이상의 m-PEG 팔이 상이한 말단, 예를 들어, OH, COOH, NH2, C2-C10-알킬 등을 갖는 PEG 부위에 의해서 대체될 수 있음은 인식할 수 있을 것이다. 또한, 상기의 구조는 α-탄소원자와 측쇄의 작용그룹 사이에 알킬 링커를 삽입함으로써 (또는 탄소원자를 제거함으로써) 용이하게 변형된다. 따라서, "호모" 유도체 및 더 고급의 동족체 및 또한 저급의 동족체는 본 발명에서 유용한 분지된 PEGs에 대한 코어의 범주에 포함된다.
본 발명에 기술된 분지된 PEG 종류는 이하의 반응식으로 나타낸 것과 같은 방법에 의해서 용이하게 제조된다:
Figure 112006039150479-PCT00045
여기에서 Xa는 O 또는 S이고, r은 1 내지 5의 정수이다. 지수 e 및 f는 독립적으로 1 내지 2500으로부터 선택되는 정수이다.
이렇게 상기 반응식에 따라, 천연 또는 비천연 아미노산을 활성화된 m-PEG 유도체와 접촉시켜, 토실레이트의 경우에는 측쇄 헤테로원자 Xa를 알킬화함으로써 1을 형성시킨다. 모노-작용화된 m-PEG 아미노산을 반응성 m-PEG 유도체와의 N-아실화 조건에 적용시킴으로써 분지된 m-PEG 2를 조립한다. 숙련된 전문가에게 인식되는 바와 같이, 토실레이트 이탈그룹은 어떤 적합한 이탈그룹, 예를 들어, 할로겐, 메실레이트, 트리플레이트 등에 의해서 대체될 수 있다. 유사하게, 아민을 아실레이트화 시키는데 이용된 반응성 카보네이트는 활성 에스테르, 예를 들어, N-하이드록시석신이미드 등으로 대체될 수 있거나, 산은 동일 반응계 내에서 디사이클로헥실카보디이미드, 카보닐디이미다졸 등과 같은 탈수제를 사용하여 활성화시킬 수 있다.
예시적 구체예에서, 변형성 그룹은 PEG 부위이지만, 어떤 변형성 그룹이라도, 예를 들어, 수용성 폴리머, 수-불용성 폴리머, 치료학적 부위 등이 적절한 결합을 통해서 글리코실 부위에 통합될 수 있다. 변형된 당은 효소적 수단, 화학적 수단 또는 그의 조합에 의해서 형성됨으로써 변형된 당을 생성시킨다. 예시적 구체예에서, 당은 변형성 부위의 부착을 허용하는 어떤 위치에서라도 활성 아민에 의해서 치환되지만, 당은 여전히 변형된 당을 G-CSF 펩타이드에 커플링시킬 수 있는 효소에 대한 기질로서 작용하도록 허용된다. 예시적 구체예에서, 갈락토사민이 변형된 당인 경우에 아민 부위는 6-위치에서 탄소원자에 부착된다.
수용성 폴리머 변형된 종류
당 부위가 수용성 폴리머에 의해서 변형된 수용성 폴리머 변형된 뉴클레오타이드 당 종류가 본 발명에서 유용하다. 예시적인 변형된 당 뉴클레오타이드는 당에 존재하는 아민 부위를 통해서 변형된 당 그룹을 갖는다. 변형된 당 뉴클레오타이드, 예를 들어, 당 뉴클레오타이드의 사카릴-아민 유도체도 또한 본 발명의 방법에서 유용하다. 예를 들어, 사카릴 아민 (변형성 그룹이 부재함)은 펩타이드 (또는 그 밖의 다른 종류)에 효소적으로 컨쥬게이트 시키고, 이어서 유리 사카릴 아민 부위는 목적하는 변형성 그룹에 컨쥬게이트 시킬 수 있다. 대신으로, 변형된 당 뉴클레오타이드는 변형된 당을 기질, 예를 들어, 펩타이드, 글리코펩타이드, 리피드, 아글리콘, 글리코리피드 등의 사카릴 수용체에 전이시키는 효소에 대한 기질로서 작용할 수 있다.
사카라이드 코어가 갈락토즈 또는 글루코즈인 한가지 구체예에서, R5는 NHC(O)Y이다.
예시적 구체예에서, 변형된 당은 6-아미노-N-아세틸-글리코실 부위를 기본으 로 한다. N-아세틸갈락토사민에 대하여 이하에 나타낸 바와 같이, 6-아미노-당 부위는 표준방법에 의해서 용이하게 제조된다.
Figure 112006039150479-PCT00046
상기 반응식에서, 지수 n은 1 내지 2500, 바람직하게는 10 내지 1500, 더욱 바람직하게는 10 내지 1200의 정수를 나타낸다. 심볼 "A"는 활성화 그룹, 예를 들어, 할로, 활성화된 에스테르 (예를 들어, N-하이드록시석신이미드 에스테르)의 성분, 카보네이트 (예를 들어, p-니트로페닐 카보네이트)의 성분 등을 나타낸다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 그 밖의 다른 PEG-아미드 뉴클레오타이드 당이 이 방법 및 유사한 방법에 의해서 용이하게 제조된다는 것을 인식할 수 있을 것이다.
또 다른 예시적 구체예에서, 아미드 부위는 우레탄 또는 우레아와 같은 그룹에 의해서 대체된다.
또 다른 추가의 구체예에서, R1은 분지된 PEG, 예를 들어, 상술한 종류 중의 하나이다. 이러한 구체예에 따르는 화합물의 예로는 다음의 화합물들이 포함된다:
Figure 112006039150479-PCT00047
여기에서, X4는 결합 또는 O이다.
또한, 상기에서 거론한 바와 같이, 본 발명은 직쇄 또는 측쇄인 수용성 폴리머에 의해서 변형된 뉴클레오타이드 당을 사용하여 형성된 펩타이드 컨쥬게이트를 제공한다. 예를 들어, 이하에 나타낸 화학식을 갖는 화합물들은 본 발명의 범주 내에 포함된다:
Figure 112006039150479-PCT00048
여기에서 X4는 O 또는 결합이다.
유사하게, 본 발명은 6-위치의 탄소가 변형된 이들 변형된 당 종류의 뉴클레오타이드 당을 사용하여 형성된 펩타이드 컨쥬게이트를 제공한다:
Figure 112006039150479-PCT00049
여기에서 X4는 결합 또는 O이다.
또한, 본 발명의 조성물을 포함하는 펩타이드 및 글리코펩타이드, 리피드 및 글리코리피드의 컨쥬게이트가 제공된다. 예를 들어, 본 발명은 하기 화학식을 갖는 컨쥬게이트를 제공한다:
Figure 112006039150479-PCT00050
수-불용성 폴리머
또 다른 구체예에서, 상기 거론한 바와 유사하게 변형된 당은 수용성 폴리머 보다는 수-불용성 폴리머를 포함한다. 본 발명의 컨쥬게이트는 또한, 하나 또는 그 이상의 수-불용성 폴리머를 포함할 수도 있다. 본 발명의 이러한 구체예는 조절된 방식으로 치료학적 펩타이드를 송달하는 비히클로서의 컨쥬게이트의 사용에 의해서 설명된다. 폴리머성 약물 송달 시스템은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다 [참조예: Dunn et al., Eds. Polymeric Drugs And Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991]. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 실질적으로 공지된 어떤 약물 송달 시스템이라도 본 발명의 컨쥬게이트에 적용할 수 있음을 인식할 수 있을 것이다.
대표적인 수-불용성 폴리머에는 폴리포스파진, 폴리(비닐 알콜), 폴리아미드, 폴리카보네이트, 폴리알킬렌, 폴리아크릴아미드, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬 렌 옥사이드, 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 에스테르, 폴리비닐 할라이드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리글리콜라이드, 폴리실옥산, 폴리우레탄, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸 메타크릴레이트), 폴리(부틸 메타크릴레이트), 폴리(이소부틸 메타크릴레이트), 폴리(헥실 메타크릴레이트), 폴리(이소데실 메타크릴레이트), 폴리(라우릴 메타크릴레이트), 폴리(페닐 메타크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트) 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리 (에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(비닐 아세테이트), 폴리비닐 클로라이드, 폴리스티렌, 폴리비닐 피롤리돈, 플루로닉스 및 폴리비닐페놀 및 이들의 코폴리머가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 컨쥬게이트에서 유용한 합성적으로 변형된 천연 폴리머에는 알킬 셀룰로즈, 하이드록시알킬 셀룰로즈, 셀룰로즈 에테르, 셀룰로즈 에스테르 및 니트로셀룰로즈가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 합성적으로 변형된 천연 폴리머의 광범한 클래스 중의 특히 바람직한 구성원에는 메틸 셀룰로즈, 에틸 셀룰로즈, 하이드록시프로필 셀룰로즈, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로즈, 하이드록시부틸 메틸 셀룰로즈, 셀룰로즈 아세테이트, 셀룰로즈 프로피오네이트, 셀룰로즈 아세테이트 부티레이트, 셀룰로즈 아세테이트 프탈레이트, 카복시메틸 셀룰로즈, 셀룰로즈 트리아세테이트, 셀룰로즈 설페이트 나트륨 염, 및 아크릴산 및 메타크릴산 에스테르와 알진산의 폴리머가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명에 거론된 이들 및 그 밖의 다른 폴리머는 시그마 케미칼 컴패니 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.), 폴리사이언시즈 (Polysciences, Warrenton, PA.), 앨드리히 (Aldrich, Milwaukee, WI.), 플루카 (Fluka, Ronkonkoma, NY), 및 바이오래드 (BioRad, Richmond, CA)와 같은 상업적 공급원으로부터 용이하게 수득될 수 있거나, 그 외에도 표준기술을 사용하여 이들 공급자들로부터 수득된 모노머로부터 합성될 수도 있다.
본 발명의 컨쥬게이트에서 유용한 대표적인 생물분해성 폴리머에는 폴리락티드, 폴리글리콜라이드 및 이들의 코폴리머, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(부티르산), 폴리(발레르산), 폴리(락티드-코-카프로락톤), 폴리(락티드-코-글리콜라이드), 폴리안하이드라이드, 폴리오르토에스테르, 이들의 블렌드 및 코폴리머가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 특히 유용한 것은 콜라젠, 플루로닉스 등을 포함하는 것과 같은 젤을 형성하는 조성물이다.
본 발명에서 유용한 폴리머에는 그들의 구조의 적어도 일부분 내에 생체재흡수성 (bioresorbable) 분자를 갖는 수-불용성 물질을 포함하는 "하이브리드 (hybrid)" 폴리머가 포함된다. 이러한 폴리머의 예는 폴리머 체인당, 생체재흡수성 부분, 친수성 부분 및 다수의 교차결합성 작용그룹을 갖는 수-불용성 코폴리머를 포함하는 것이다.
본 발명의 목적에 따라, "수-불용성 물질"은 물 또는 물-함유 환경에서 실질적으로 불용성인 물질을 포함한다. 따라서, 코폴리머의 특정한 부분 또는 절편이 친수성일 수 있거나 수용성일 수 있다고 하더라도 전체로서의 폴리머 분자는 물 중에서 어떤 상당한 척도까지 용해하지 않는다.
본 발명의 목적에 따라서, 용어 "생체재흡수성 분자"는 신체에 의해서 정상적인 분비경로를 통해서 대사되거나 분해되고 재흡수되고/되거나 제거될 수 있는 부분을 포함한다. 이러한 대사산물 또는 분해산물은 바람직하게는 신체에 대하여 실질적으로 비독성이다.
생체재흡수성 부분은 코폴리머 조성물이 전체로서 수용성이 되지 않는 한은 소수성이거나 친수성일 수 있다. 따라서, 생체재흡수성 부분은 전체로서의 폴리머가 수-불용성을 유지한다는 조건을 기준으로 하여 선택된다. 따라서, 상대적 특성, 즉 생체재흡수성 부분 및 친수성 부분에 의해서 함유된 작용그룹의 종류, 및 이들의 상대적 비율은 유용한 생체재흡수성 조성물이 수-불용성을 유지하는 것이 보장되도록 선택된다.
재흡수성 폴리머의 예로는 예를 들어, 폴리(α-하이드록시-카복실산)/폴리(옥시알킬렌)의 합성적으로 생성된 재흡수성 블럭 코폴리머가 포함된다 (참조: Cohn et al., U.S. Patent No. 4,826,945). 이들 코폴리머는 교차결합되지 않으며, 수용성이어서 신체가 분해된 블럭 코폴리머 조성물을 배설할 수 있다 [참조: Younes et al., J Biomed. Mater. Res. 21: 1301-1316 (1987); 및 Cohn et al., J Biomed. Mater. Res. 22: 993-1009 (1988)].
현재 바람직한 생체재흡수성 폴리머에는 폴리(에스테르), 폴리(하이드록시 산), 폴리(락톤), 폴리(아미드), 폴리(에스테르-아미드), 폴리(아미노산), 폴리(안하이드라이드), 폴리(오르토에스테르), 폴리(카보네이트), 폴리(포스파진), 폴리(포스포에스테르), 폴리(티오에스테르), 폴리사카라이드 및 이들의 혼합물로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 성분을 포함한다. 더욱 더 바람직하게는, 생체재흡수성 폴리머에는 폴리(하이드록시) 산 성분이 포함된다. 폴리(하이드록시) 산 중에서는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리카프로산, 폴리부티르산, 폴리발레르산 및 이들의 코폴리머 및 혼합물이 바람직하다.
생체내에서 흡수되는 ("생체재흡수되는") 단편을 형성하는 것 이외에도, 본 발명의 방법에서 사용하는데 바람직한 폴리머 코팅은 또한, 배설가능하고/하거나 대사가능한 단편을 형성할 수도 있다.
더 고급 코폴리머도 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 1984년 3월 20일에 허여된 미국 특허 제 4,438,253 호 (Casey et al.)에는 폴리(글리콜산)과 하이드록실-종결된 폴리(알킬렌 글리콜)의 트랜스에스테르화로부터 생성된 트리-블럭 (tri-block) 코폴리머가 기술되어 있다. 이러한 조성물은 재흡수가능한 모노필라멘트 봉합재로서의 용도에 대해 기술되어 있다. 이러한 조성물의 유연성은 코폴리머 구조 내로 테트라-p-톨릴 오르토카보네이트와 같은 방향족 오르토카보네이트를 통합시킴으로써 조절된다.
락트산 및/또는 글리콜산을 기본으로 하는 그 밖의 다른 폴리머가 이용될 수도 있다. 예를 들어, 1993년 4월 13일에 허여된 미국 특허 제 5,202,413 호 (Spinu)에는 올리고머성 디올 또는 디아민 잔기 상에서의 락티드 및/또는 글리콜라이드의 개환 중합반응에 이어서 디이소시아네이트, 디아실클로라이드 또는 디클로로실란과 같은 이작용성 화합물에 의해 체인 연장시킴으로써 생성된 폴리락티드 및/또는 폴리글리콜라이드의 연속적으로 질서화된 블럭을 갖는 생물분해성 멀티-블럭 코폴리머가 기술되어 있다.
본 발명에서 유용한 코팅의 생체재흡수성 부분은 가수분해적으로 및/또는 효소적으로 분해가 가능하도록 디자인될 수 있다. 본 발명의 목적에 따라, "가수분해적으로 분해가 가능한"은 물 또는 물-함유 환경 중에서의 가수분해에 대한 코폴리머, 특히 생체재흡수가능한 부분의 감수성을 나타내는 것이다. 유사하게, 본 발명에서 사용된 "효소적으로 분해가 가능한"은 내인성 또는 외인성 효소에 의한 분해에 대한 코폴리머, 특히 생체재흡수성 부분의 감수성을 나타낸다.
체내에 배치되었을 때, 친수성 부분은 배설가능하고/하거나 대사가능한 단편으로 처리될 수 있다. 따라서, 친수성 부분에는 예를 들어, 폴리에테르, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리올, 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알콜), 폴리(알킬 옥사졸린), 폴리사카라이드, 카보하이드레이트, 펩타이드, 단백질 및 이들의 코폴리머 및 혼합물이 포함될 수 있다. 또한, 친수성 부분은 또한 예를 들어, 폴리(알킬렌) 옥사이드일 수도 있다. 이러한 폴리(알킬렌) 옥사이드는 예를 들어, 폴리(에틸렌) 옥사이드, 폴리(프로필렌) 옥사이드 및 이들의 혼합물 및 코폴리머를 포함할 수 있다.
하이드로젤의 성분인 폴리머도 또한 본 발명에서 유용하다. 하이드로젤은 비교적 대량의 물을 흡수할 수 있는 폴리머성 물질이다. 하이드로젤 형성 화합물의 예로는 폴리아크릴산, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 젤라틴, 카라게난 및 그 밖의 다른 폴리사카라이드, 하이드록시에틸렌메타크릴산 (HEMA), 및 이들의 유도체 등이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 안 정하며, 생물분해성이고 생체재흡수성인 하이드로젤이 생성될 수 있다. 더구나, 하이드로젤 조성물은 하나 또는 그 이상의 이들 특성을 나타내는 서브유니트를 포함할 수 있다.
그의 인테그리티 (integrity)가 교차결합을 통해서 조절될 수 있는 생체-적합성 하이드로젤 조성물은 공지되어 있으며, 현재 본 발명의 방법에서 사용하기에 바람직하다. 예를 들어, 후벨 (Hubbell) 등의 미국 특허 제 5,410,016 호 (1995년 4월 25일에 특허됨) 및 5,529,914 호 (1996년 6월 25일에 특허됨)에는 두개의 가수분해적으로 불안정한 연장부 (extensions) 사이에 샌드위치된 수용성 중앙 블럭 절편을 갖는 교차결합된 블럭 코폴리머인 수용성 시스템이 기술되어 있다. 이러한 코폴리머는 또한, 광중합 가능한 아크릴레이트 작용기로 말단-캡핑된다. 교차결합된 경우에, 이들 시스템은 하이드로젤이 된다. 이러한 코폴리머의 수용성 중앙 블럭은 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함할 수 있으며; 그 반면에 가수분해적으로 불안정한 연장부는 폴리글리콜산 또는 폴리락트산과 같은 폴리(α-하이드록시산)일 수 있다 [참조: Sawhney et al., Macromolecules 26: 581-587 (1993)].
또 다른 바람직한 구체예에서, 젤은 열가역적 (thermoreversible) 젤이다. 현재 플루로닉스, 콜라젠, 젤라틴, 히알로유론산, 폴리사카라이드, 폴리우레탄 하이드로젤, 폴리우레탄-우레아 하이드로젤 및 이들의 배합물과 같은 성분을 포함하는 열가역적 젤이 바람직하다.
또 다른 예시적 구체예에서, 본 발명의 컨쥬게이트는 리포좀의 성분을 포함한다. 리포좀은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 방법에 따라, 예를 들 어, 엡스타인 (Eppstein) 등의 미국 특허 제 4,522,811 호 (1985년 6월 11일에 허여됨)에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 예를 들어, 리포좀 제제는 적절한 리피드(들) (예를 들어, 스테아로일 포스파티딜 에탄올아민, 스테아로일 포스파티딜 콜린, 아라카도일 포스파티딜 콜린, 및 콜레스테롤)을 무기용매에 용해시킨 다음에, 이것을 증발시켜 용기의 표면상에 건조된 리피드의 얇은 필름을 남게 함으로써 제조될 수 있다. 활성화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 수용액은 그 후에 용기 내에 도입시킨다. 그 후, 용기를 손으로 소용돌이를 일으켜 용기의 측면으로부터 리피드 물질을 떨어지게 하고, 리피드 응집체를 분산시킴으로써 리포좀성 현탁액을 형성시킨다.
상술한 미립자 및 그 미립자를 제조하는 방법은 예로서 제시된 것이며, 이들은 본 발명에서 유용한 미립자의 범위를 정의하고자 하는 것은 아니다. 다양한 방법들에 의해서 제작된 미립자의 어레이가 본 발명에서 유용하다는 것은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 자명할 것이다.
직쇄 및 분지된 수용성 폴리머 둘 다와 관련하여 상기에서 거론된 구조적 형식은 일반적으로 수-불용성 폴리머에 대해서도 마찬가지로 적용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 시스테인, 세린, 디라이신 및 트리라이신 분지성 코어는 두개의 수-불용성 폴리머 부위에 의해서 작용화될 수 있다. 이들 종류를 생산하기 위해서 사용된 방법은 일반적으로 수용성 폴리머를 생산하기 위해서 사용된 것과 매우 유사하다.
치료학적 글리코펩타이드의 생체내 반감기는 또한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 와 같은 PEG 부위에 의해서 증진될 수도 있다. 예를 들어, PEG에 의한 단백질의 화학적 변형 (페질화)은 그들의 분자 크기를 증가시키고, 그들의 표면- 및 작용그룹-접근성 (accessibility)을 감소시키는데, 이들은 각각 단백질에 부착된 PEG의 크기에 따라 좌우된다. 이것은 혈장 반감기 및 단백분해-안정성의 개선, 및 면역원성 및 간 흡수의 감소를 제공한다 (Chaffee et al., J. Clin . Invest. 89: 1643-1651 (1992); Pyatak et al., Res. Commun . Chem . Pathol Pharmacol. 29: 113-127 (1980)). 인터류킨-2의 페질화는 생체내에서 그의 항종양 효력을 증가시키는 것으로 보고되었으며 (Katre et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA. 84: 1487-1491 (1987)), 모노클로날 항체 A7으로부터 유도된 F(ab')2의 페질화는 그의 종양 국재화를 개선시켰다 (Kitamura et al. Biochem . Biophys . Res. Commun . 28: 1387-1394 (1990)). 따라서, 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 PEG 부위에 의해서 유도체화된 펩타이드의 생체내 반감기는 비-유도체화된 펩타이드의 생체내 반감기에 타당하게 증가된다.
펩타이드 생체내 반감기의 증가는 그의 양에 있어서의 증가 퍼센트의 범위로 가장 잘 표현된다. 증가 퍼센트의 범위 하한은 약 40%, 약 60%, 약 80%, 약 100%, 약 150% 또는 약 200%이다. 이 범위 상한은 약 60%, 약 80%, 약 100%, 약 150% 또는 약 250% 이상이다.
예시적 구체예에서, 본 발명은 페질화된 FSH를 제공한다 (도 1, 도 2 및 도 5).
방법
상기 거론된 컨쥬게이트 이외에도, 본 발명은 이들 및 그 밖의 다른 컨쥬게이트를 제조하는 방법을 제공한다. 따라서, 추가의 관점에서, 본 발명은 선택된 부위와 G-CSF 펩타이드 사이에 공유적 컨쥬게이트를 형성시키는 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 컨쥬게이트를 신체의 특정한 조직 또는 부위에 대해 표적화시키는 방법을 제공한다.
예시적 구체예에서, 컨쥬게이트는 PEG 부위 (또는 PEG 부위를 포함하는 효소적으로 전이가능한 글리코실 부위)와 글리코실화 또는 비-글리코실화 펩타이드 사이에서 형성된다. PEG는 G-CSF 펩타이드와 PEG 부위 사이에 삽입되고, 이들 둘 다에 공유적으로 연결된 온전한 글리코실 연결그룹을 통해서 G-CSF 펩타이드에, 또는 PEG-비-글리코실 링커 (예를 들어, 치환되거나 비치화된 알킬, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬) 작제물에 컨쥬게이트된다. 이 방법은 G-CSF 펩타이드를 변형된 당 및 글리코실트랜스퍼라제 (이것에 대하여는 변형된 당이 기질이다)를 함유하는 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이 반응은 변형된 당과 G-CSF 펩타이드 사이에서 공유결합을 형성시키기에 충분한 조건 하에서 수행된다. 변형된 당의 당 부위는 바람직하게는 뉴클레오타이드 당, 활성화된 당, 및 뉴클레오타이드도 아니고 활성화되지도 않은 당으로부터 선택된다.
수용체 펩타이드 (글리코실화되거나 비-글리코실화됨)는 일반적으로 새로이 합성되거나, 원핵세포 (예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli)와 같은 박테리아 세포) 또는 포유동물, 효모, 곤충, 진균 또는 식물 세포와 같은 진핵세포에서 재조합적으 로 발현된다. G-CSF 펩타이드는 전체-길이 단백질 또는 단편일 수 있다. 또한, G-CSF 펩타이드는 야생형 또는 돌연변이된 펩타이드일 수 있다. 예시적 구체예에서, G-CSF 펩타이드는 펩타이드 서열에 하나 또는 그 이상의 N- 또는 O-연결된 글리코실화 부위를 부가한 돌연변이를 포함한다.
예시적 구체예에서, 인자 IX는 다음의 방식으로 수용성 폴리머에 의해서 O-글리코실화되고 작용화된다. 펩타이드는 이용가능한 아미노산 글리코실화 부위를 갖도록 생산되거나, 글리코실화된 경우에는 글리코실 부위를 제거하여 아미노산을 노출시킨다. 예를 들어, 세린 또는 트레오닌을 α-1 N-아세틸 아미노 갈락토실화시키고 (GalNAc), NAc-갈락토실화된 펩타이드를 ST6GalNAcT1을 사용하여 시알산-변형성 그룹 카세트로 시알릴화시킨다. 대신으로, NAc-갈락토실화된 펩타이드는 코어-1-GalT-1을 사용하여 갈락토실화되며, 생성물은 ST3GalT1을 사용하여 시알산-변형성 그룹 카세트로 시알릴화시킨다. 이 방법에 따른 컨쥬게이트의 예는 다음의 결합을 갖는다: Thr-α-1-GalNAc-β-1,3-Gal-α2,3-Sia* (여기에서, Sia*는 시알산-변형성 그룹 카세트이다).
상술한 것과 같은 본 발명의 방법에서는, 다수의 효소 및 사카릴 공여체를 사용하여 개별적인 글리코실화 단계를 별도로 수행할 수 있거나, "단일 포트 (single pot)" 반응으로 배합할 수도 있다. 예를 들어, 상술한 3개의 효소반응에서는 GalNAc 트랜스퍼라제, GalT 및 SiaT 및 이들의 공여체를 단일 용기 내에서 배합시킬 수 있다. 대신으로, GalNAc 반응을 단독으로 수행할 수 있으며, GalT 및 SiaT 둘 다와 적절한 사카릴 공여체를 단일 단계로 첨가할 수 있다. 반응을 수행 하는 또 다른 모드는 각각의 효소 및 적절한 공여체를 순차적으로 첨가하고 반응을 "단일 포트" 모티브로 수행하는 것을 포함한다. 상술한 방법 각각의 조합이 본 발명의 방법을 제조하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트, 특히 글리코페질화된 N-연결 글리칸에서, Sia-변형성 그룹 카세트는 α-2,6 또는 α-2,3 결합으로 Gal에 연결될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한, 재조합적으로 생산된 불완전하게 글리코실화된 펩타이드의 변형을 제공한다. 본 발명의 방법에서 변형된 당을 사용하여, G-CSF 펩타이드는 동시에 추가로 글리코실화되고, 예를 들어, PEG 부위, 치료학적 약제 등에 의해서 유도체화될 수 있다. 변형된 당의 당 부위는 완전히 글리코실화된 펩타이드 내의 수용체에 적절하게 컨쥬게이트될 수 있는 잔기, 또는 바람직한 특성을 갖는 또 다른 당 부위일 수 있다.
본 발명의 방법에 의해서 변형된 G-CSF 펩타이드는 합성 또는 야생형 펩타이드일 수 있거나, 이들은 부위-지시된 돌연변이유발 (site-directed mutagenesis)과 같은 본 기술분야에서 공지된 방법에 의해서 생성된 돌연변이된 펩타이드일 수 있다. 펩타이드의 글리코실화는 일반적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-결합의 예는 아스파라진 잔기의 측쇄에 대한 변형된 당의 부착이다. 트리펩타이드 서열 아스파라진-X-세린 및 아스파라진-X-트레오닌 (여기에서, X는 프롤린을 제외한 어떤 아미노산이라도 된다)은 아스파라진 측쇄에 대한 카보하이드레이트 부위의 효소적 부착을 위한 인식서열이다. 따라서, 폴리펩타이드 내에 이들 트리펩타이드 서열 중의 어느 하나가 존재하는 것은 잠재적인 글리코실화 부위를 발생시킨다. O-연결 된 글리코실화는 하이드록시아미노산, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌의 하이드록시 측쇄에 대한 한가지 당 (예를 들어, N-아세틸갈락토사민, 갈락토즈, 만노즈, GlcNAc, 글루코즈, 퓨코즈 또는 자일로즈)의 부착을 의미하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신이 사용될 수도 있다.
예를 들어, 한가지 구체예에서 G-CSF는 포유동물 시스템에서 발현되며, 말단 시알산 잔기가 제거되도록 시알리다제 처리하고, 이어서 ST3Gal3 및 PEG-시알산의 공여체로 처리함으로써 변형시킨다.
또 다른 예시적 구체예에서는, 포유동물 세포에서 발현된 G-CSF를 우선 시알리다제로 처리하여 말단 시알산 잔기를 제거한 다음에, ST3Gal3 및 PEG-시알산의 공여체를 사용하여 페질화시키고, 그 후에 ST3Gal3 및 시알산 공여체를 사용하여 시알릴화시킨다.
포유동물 시스템에서 발현된 G-CSF는 또한, 시알리다제 및 갈락토시다제로 처리하여 그의 시알산 및 갈락토즈 잔기를 제거한 다음에, 갈락토즈 공여체 및 갈락토실트랜스퍼라제를 사용하여 갈락토실화시키고, 그 후에ST3Gal3 및 PEG-시알산의 공여체를 사용하여 페질화시킬 수도 있다.
또 다른 예시적 구체예에서는, G-CSF를 시알리다제로 우선 처리하지 않고, 시알산 전이반응을 사용하여 변형성 그룹-시알산 카세트, 및 ST3Gal13과 같은 효소에 의해서 글리코페질화시킨다.
추가의 예시적 구체예에서, G-CSF는 곤충세포에서 발현되고, 다음의 방법으로 변형된다: N-아세틸글루코사미드를 우선 적절한 N-아세틸글루코사민 공여체, 및 GnT-I, II, IV 및 V 중의 하나 또는 그 이상을 사용하여 G-CSF에 부가한 다음에, G-CSF를 PEG-갈락토즈의 공여체 및 갈락토실트랜스퍼라제를 사용하여 페질화시킨다.
효모에서 생산된 G-CSF도 또한 글리코페질화될 수 있다. 예를 들어, G-CSF를 우선 엔도글리카나제로 처리하여 글리코실 그룹을 제거하고, 갈락토즈 공여체 및 갈락토실트랜스퍼라제를 사용하여 갈락토실화시킨 다음에, ST3Gal3 및 PEG-시알산의 공여체로 페질화시킨다.
펩타이드 또는 그 밖의 다른 구조에 대한 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열이 하나 또는 그 이상의 글리코실화 부위를 함유하도록 변형시킴으로써 편리하게 수행된다. 부가는 또한, (O-연결된 글리코실화 부위를 위해서) G-CSF 펩타이드의 서열 내에 -OH 그룹을 나타내는 하나 또는 그 이상의 종류, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌 잔기를 통합시킴으로써 이루어질 수 있다. 부가는 돌연변이에 의해서, 또는 G-CSF 펩타이드의 완전한 화학적 합성에 의해서 이루어질 수 있다. G-CSF 펩타이드 아미노산 서열은 바람직하게는, DNA 레벨에서의 변화를 통해, 특히 바람직한 아미노산으로 해독되는 코돈이 생성되도록 전선택된 염기에서 펩타이드를 코드화한 DNA를 돌연변이시킴으로써 변화된다. DNA 돌연변이(들)는 바람직하게는 본 기술분야에서 공지된 방법을 사용하여 이루어진다.
예시적 구체예에서, 글리코실화 부위는 폴리뉴클레오타이드를 셔플링 (shuffling)함으로써 부가된다. 후보 펩타이드를 코드화한 폴리뉴클레오타이드는 DNA 셔플링 프로토콜에 의해서 변조될 수 있다. DNA 셔플링은 관련된 유전자의 풀 (pool)을 무작위 단편화시키고, 이어서 폴리머라제 체인반응-유사 과정에 의한 단편의 재조립에 의해서 수행된 반복적인 재조합 및 돌연변이의 과정이다 [참조예: Stemmer, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91:10747-10751 (1994); Stemmer, Nature 370:389-391 (1994); 및 미국 특허 제 5,605,793, 5,837,458, 5,830,721 및 5,811,238 호].
본 발명은 또한, 펩타이드에 하나 또는 그 이상의 선택된 글리코실 잔기를 부가 (또는 제거)하는 수단을 이용하며, 그 후에 변형된 당은 펩타이드의 선택된 글리코실 잔기들 중의 적어도 하나에 컨쥬게이트된다. 이러한 구체예는 예를 들어, 변형된 당을 펩타이드 상에 존재하지 않거나, 원하는 양으로 존재하지 않는 선택된 글리코실 잔기에 컨쥬게이트시키는 것이 바람직한 경우에 유용하다. 따라서, 변형된 당을 펩타이드에 커플링시키기 전에, 선택된 글리코실 잔기를 효소적 또는 화학적 커플링에 의해서 G-CSF 펩타이드에 컨쥬게이트시킨다. 또 다른 구체예에서, 글리코펩타이드의 글리코실화 패턴은 글리코펩타이드로부터 카보하이드레이트 잔기를 제거함으로써 변형된 당을 컨쥬게이션하기 전에 변경된다 [참조예: WO 98/31826].
글리코펩타이드 상에 존재하는 모든 카보하이드레이트 부위의 부가 또는 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 수행된다. 화학적 탈글리코실화는 바람직하게는 화합물 트리플루오로메탄설폰산 또는 등가 화합물에 폴리펩타이드 변이체를 노출시킴으로써 이루어진다. 이러한 처리는 펩타이드는 온전하게 유지시킨 채로 연결성 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-갈락토사민) 이외의 대부분의 또는 모든 당의 분해 를 야기한다. 화학적 탈글리코실화 반응은 문헌 (Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys . 259: 52 (1987); 및 Edge et al., Anal. Biochem. 118: 131 (1981))에 기술되어 있다. 폴리펩타이드 변이체 상의 카보하이드레이트 부위의 효소적 분해는 문헌 (Thotakura et al., Meth . Enzymol. 138: 350 (1987))에 기술된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 사용함으로써 성취될 수 있다.
글리코실 부위의 화학적 부가반응은 본 기술분야에서 인지되고 있는 방법에 의해서 수행된다. 당 부위의 효소적 부가반응은 바람직하게는, 본 발명에서 사용된 변형된 당에 대해 천연 글리코실 유니트를 치환시킨 본 명세서에 기술된 방법의 변형법을 사용하여 이루어진다. 당 부위를 부가하는 그 밖의 다른 방법은 미국 특허 제 5,876,980, 6,030,815, 5,728,554 및 5,922,577 호에 기술되어 있다.
선택된 글리코실 잔기를 위한 부착점의 예로는 (a) N- 및 O-글리코실화를 위한 컨센서스 (consensus) 부위; (b) 글리코실트랜스퍼라제를 위한 수용체인 말단 글리코실 부위; (c) 아르기닌, 아스파라진 및 히스티딘; (d) 유리 카복실 그룹; (e) 시스테인에 존재하는 것과 같은 유리 설프하이드릴 그룹; (f) 세린, 트레오닌 또는 하이드로시프롤린에 존재하는 것과 같은 유리 하이드록실 그룹; (g) 페닐알라닌, 타이로신 또는 트리프토판에 존재하는 것과 같은 방향족 잔기; 또는 (h) 글루타민의 아미드 그룹이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명에서 유용한 방법의 예는 WO 87/05330 (1987년 9월 11일에 공개됨) 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기술되어 있다.
방법
상기 거론한 컨쥬게이트 이외에도, 본 발명은 이들 및 그 밖의 다른 컨쥬게이트를 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 컨쥬게이트를 질병을 발현할 위험이 있는 피검자 또는 질병에 걸린 피검자에게 투여함으로써 질병 상태를 예방, 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 선택된 부위와 G-CSF 펩타이드 사이에서 공유적 컨쥬게이트를 형성시키는 방법을 제공한다.
예시적 구체예에서, 컨쥬게이트는 수용성 폴리머, 치료학적 부위, 표적화 부위 또는 생체분자와 글리코실화 또는 비-글리코실화 G-CSF 펩타이드 사이에서 형성된다. 폴리머, 치료학적 부위 또는 생체분자는 펩타이드와 변형성 그룹 (예를 들어, 수용성 폴리머) 두개 사이에 삽입되고, 이들 둘에 공유적으로 연결된 글리코실 연결그룹을 통해서 G-CSF 펩타이드에 컨쥬게이트된다. 이 방법은 G-CSF 펩타이드를 변형된 당 및 변형된 당을 기질 (예를 들어, 펩타이드, 아글리콘, 글리코리피드)에 컨쥬게이트시키는 효소, 예를 들어, 글리코실트랜스퍼라제를 함유하는 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이 반응은 변형된 당과 G-CSF 펩타이드 사이에서 공유결합을 형성시키기에 적절한 조건 하에서 수행된다.
수용체 G-CSF 펩타이드는 일반적으로 새로이 합성되거나, 원핵세포 (예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli)와 같은 박테리아 세포) 또는 포유동물, 효모, 곤충, 진균 또는 식물 세포와 같은 진핵세포에서 재조합적으로 발현된다. G-CSF 펩타이드는 전체-길이 단백질 또는 단편일 수 있다. 또한, G-CSF 펩타이드는 야생형 또는 돌연변이된 펩타이드일 수 있다. 예시적 구체예에서, G-CSF 펩타이드는 펩타이드 서열에 하나 또는 그 이상의 N- 또는 O-연결된 글리코실화 부위를 부가한 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 방법은 또한, 재조합적으로 생산된 불완전하게 글리코실화된 G-CSF 펩타이드의 변형을 제공한다. 다수의 재조합적으로 생산된 당단백질은 불완전하게 글리코실화되어 바람직하지 않은 특성, 예를 들어, 면역원성, RES에 의한 인식을 가질 수 있는 카보하이드레이트 잔기를 노출시킨다. 본 발명의 방법에서 변형된 당을 사용하여, 펩타이드는 동시에 추가로 글리코실화되고, 예를 들어, 수용성 폴리머, 치료학적 약제 등에 의해서 유도체화될 수 있다. 변형된 당의 당 부위는 완전히 글리코실화된 펩타이드 내의 수용체에 적절하게 컨쥬게이트될 수 있는 잔기, 또는 바람직한 특성을 갖는 또 다른 당 부위일 수 있다.
본 발명에서 유용한 펩타이드를 변형시키는 방법의 예는 WO04/099231, WO 03/031464, 및 여기에서 언급된 문헌에 기술되어 있다.
예시적인 방법에서, 본 발명은 하기 화학식의 부위를 포함하는 PEG-일화된 G-CSF를 제조하는 방법을 제공한다:
Figure 112006039150479-PCT00051
상기 식에서 D는 -OH 또는 R1-L-HN-이다. 심볼 G는 R1-L- 또는 -C(O)(C1-C6)알킬을 나타낸다. R1은 직쇄 또는 측쇄 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 포함하는 부위 이다. 심볼 L은 결합, 치환되거나 비치환된 알킬 및 치환되거나 비치환된 헤테로알킬로부터 선택된 링커를 나타낸다. 일반적으로, D가 OH이면 G는 R1-L-이고, G가 -C(O)(C1-C6)알킬이면 D는 R1-L-NH-이다. 본 발명의 방법은 (a) 기질 G-CSF 펩타이드를 PEG-시알산 공여체, 및 PEG-시알산 부위를 공여체로부터 기질 G-CSF 펩타이드에 전이시킬 수 있는 효소와 접촉시키는 단계를 포함한다.
예시적 PEG-시알산 공여체는 하기 화학식을 갖는 것과 같은 뉴클레오타이드 당이며, 효소는 전이에 적절한 조건 하에서 PEG-시알산을 G-CSF 펩타이드의 아미노산 또는 글리코실 잔기 상에 전이시킨다:
Figure 112006039150479-PCT00052
한가지 구체예에서, 기질 G-CSF 펩타이드는 본 발명의 컨쥬게이트의 형성 전에 숙주세포 내에서 발현된다. 숙주세포의 예로는 포유동물 세포가 있다. 또 다른 구체예에서, 숙주세포는 곤충세포, 식물세포, 박테리아 또는 진균이다.
본 발명에 제시된 방법은 상기 항목에서 기술된 G-CSF 컨쥬게이트 각각에 대해 적용할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해서 변형된 G-CSF 펩타이드는 합성 또는 야생형 펩타이드일 수 있거나, 이들은 부위-지시된 돌연변이유발과 같은 본 기술분야에서 공지된 방법에 의해서 생성된 돌연변이된 펩타이드일 수 있다. 펩타이드의 글리코실화는 일반적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-결합의 예는 아스파라진 잔기의 측쇄에 대한 변형된 당의 부착이다. 트리펩타이드 서열 아스파라진-X-세린 및 아스파라진-X-트레오닌 (여기에서, X는 프롤린을 제외한 어떤 아미노산이라도 된다)은 아스파라진 측쇄에 대한 카보하이드레이트 부위의 효소적 부착을 위한 인식서열이다. 따라서, 폴리펩타이드 내에 이들 트리펩타이드 서열 중의 어느 하나가 존재하는 것은 잠재적인 글리코실화 부위를 발생시킨다. O-연결된 글리코실화는 하이드록시아미노산, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌의 하이드록시 측쇄에 대한 한가지 당 (예를 들어, N-아세틸갈락토사민, 갈락토즈, 만노즈, GlcNAc, 글루코즈, 퓨코즈 또는 자일로즈)의 부착을 의미하지만, 독특하거나 비-천연적인 아미노산, 예를 들어, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신이 사용될 수도 있다.
펩타이드 또는 그 밖의 다른 구조에 대한 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열이 하나 또는 그 이상의 글리코실화 부위를 함유하도록 변형시킴으로써 편리하게 수행된다. 부가는 또한, (O-연결된 글리코실화 부위를 위해서) 펩타이드의 서열 내에 -OH 그룹을 나타내는 하나 또는 그 이상의 종류, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌 잔기를 통합시킴으로써 이루어질 수 있다. 부가는 돌연변이에 의해서, 또는 펩타이드의 완전한 화학적 합성에 의해서 이루어질 수 있다. 펩타이드 아미노산 서열은 바람직하게는, DNA 레벨에서의 변화를 통해, 특히 바람직한 아미노산으로 해독되는 코돈이 생성되도록 전선택된 염기에서 펩타이드를 코드화한 DNA를 돌연변이시킴으로써 변화된다. DNA 돌연변이(들)는 바람직하게는 본 기술분야 에서 공지된 방법을 사용하여 이루어진다.
예시적 구체예에서, 글리코실화 부위는 폴리뉴클레오타이드를 셔플링함으로써 부가된다. 후보 펩타이드를 코드화한 폴리뉴클레오타이드는 DNA 셔플링 프로토콜에 의해서 변조될 수 있다. DNA 셔플링은 관련된 유전자의 풀을 무작위 단편화시키고, 이어서 폴리머라제 체인반응-유사 과정에 의한 단편의 재조립에 의해서 수행된 반복적인 재조합 및 돌연변이의 과정이다 [참조예: Stemmer, Proc . Natl . Acad. Sci . USA 91:10747-10751 (1994); Stemmer, Nature 370:389-391 (1994); 및 미국 특허 제 5,605,793, 5,837,458, 5,830,721 및 5,811,238 호].
글리코실화 부위를 부가하거나 제거하고, 글리코실 구조 또는 서브구조를 부가하거나 제거하는 방법의 예는 WO 04/099231, WO03/031464 및 관련된 미국 및 PCT 출원에 상세히 기술되어 있다.
본 발명은 또한, G-CSF 펩타이드에 하나 또는 그 이상의 선택된 글리코실 잔기를 부가 (또는 제거)하는 수단을 이용하며, 그 후에 변형된 당은 펩타이드의 선택된 글리코실 잔기들 중의 적어도 하나에 컨쥬게이트된다. 이러한 기술은 예를 들어, 변형된 당을 G-CSF 펩타이드 상에 존재하지 않거나, 원하는 양으로 존재하지 않는 선택된 글리코실 잔기에 컨쥬게이트시키는 것이 바람직한 경우에 유용하다. 따라서, 변형된 당을 펩타이드에 커플링시키기 전에, 선택된 글리코실 잔기를 효소적 또는 화학적 커플링에 의해서 G-CSF 펩타이드에 컨쥬게이트시킨다. 또 다른 구체예에서, 글리코펩타이드의 글리코실화 패턴은 글리코펩타이드로부터 카보하이드레이트 잔기를 제거함으로써 변형된 당을 컨쥬게이션하기 전에 변경된다 [참조예: WO 98/31826].
선택된 글리코실 잔기를 위한 부착점의 예로는 (a) N-연결된 글리코실화를 위한 컨센서스 부위, 및 O-연결된 글리코실화를 위한 부위; (b) 글리코실트랜스퍼라제를 위한 수용체인 말단 글리코실 부위; (c) 아르기닌, 아스파라진 및 히스티딘; (d) 유리 카복실 그룹; (e) 시스테인에 존재하는 것과 같은 유리 설프하이드릴 그룹; (f) 세린, 트레오닌 또는 하이드로시프롤린에 존재하는 것과 같은 유리 하이드록실 그룹; (g) 페닐알라닌, 타이로신 또는 트리프토판에 존재하는 것과 같은 방향족 잔기; 또는 (h) 글루타민의 아미드 그룹이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명에서 유용한 방법의 예는 WO 87/05330 (1987년 9월 11일에 공개됨) 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기술되어 있다.
PEG 변형된 당은 컨쥬게이션을 매개하는 적절한 효소를 사용하여 글리코실화되거나 비-글리코실화된 펩타이드에 컨쥬게이트된다. 바람직하게는, 변형된 공여체 당(들), 효소(들) 및 수용체 펩타이드(들)의 농도는 수용체의 변형이 원하는 정도로 수득될 때까지 글리코실화가 진행하도록 선택된다. 이하에 거론된 고려사항은 시알릴트랜스퍼라제와 관련하여 기술되어 있지만 그 밖의 다른 글리코실트랜스퍼라제 반응에 대해 일반적으로 적용이 가능하다.
바람직한 올리고사카라이드 구조를 합성하기 위해서 글리코실트랜스퍼라제를 사용하는 다수의 방법이 공지되어 있으며, 본 발명에 대해 일반적으로 적용이 가능하다. 방법의 예는 예를 들어, WO 96/32491, 문헌 [Ito et al., Pure Appl . Chem. 65: 753 (1993)], 미국 특허 제 5,352,670, 5,374,541, 5,545,553 호 및 통상적으로 소유된 미국 특허 제 6,399,336 및 6,440,703 호 (이들은 본 발명에 참고로 포함된다)에 기술되어 있다.
본 발명은 단일 글리코실트랜스퍼라제 또는 글리코실트랜스퍼라제의 배합물을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 시알릴트랜스퍼라제와 갈락토실트랜스퍼라제의 배합물을 사용할 수 있다. 하나 이상의 효소를 사용하는 이들 구체예에서는, 효소와 기질을 바람직하게는 초기 반응혼합물로 배합시키거나, 일단 일차 효소적 반응이 완료되거나 거의 완료된 후에 이차 효소적 반응을 위한 효소와 시약을 반응매질에 첨가한다. 두개의 효소적 반응을 단일 용기 내에서 순차적으로 수행함으로써 전반적인 수율이 중간체를 분리하는 방법에 비해서 개선된다. 더구나, 여분의 용매 및 부산물의 클린업 (cleanup) 및 폐기 (disposal)가 감소된다.
바람직한 구체예에서, 첫번째 및 두번째 효소 각각은 글리코실트랜스퍼라제이다. 또 다른 바람직한 구체예에서는 하나의 효소가 엔도글리코시다제이다. 추가의 바람직한 구체예에서는 두개 또는 그 이상의 효소를 사용하여 본 발명의 변형된 당단백질을 조립한다. 펩타이드에 대해 변형된 당을 첨가하기 전 또는 후의 어떤 시점에서라도 효소를 사용하여 G-CSF 펩타이드 상의 사카라이드 구조를 변경시킨다.
또 다른 구체예에서, 이 방법은 하나 또는 그 이상의 엑소- 또는 엔도글리코시다제를 사용한다. 글리코시다제는 일반적으로 글리코실 결합을 파괴하기 보다는 형성시키도록 조작된 돌연변이체이다. 돌연변이체 글리카나제는 일반적으로 활성 부위 산성 아미노산 잔기를 위한 아미노산 잔기의 치환을 포함한다. 예를 들어, 엔도글리카나제가 엔도-H인 경우에, 치환된 활성부위 잔기는 전형적으로 130 위치의 Asp, 132 위치의 Glu 또는 이들의 조합이 될 수 있다. 아미노산은 일반적으로 세린, 알라닌, 아스파라진 또는 글루타민으로 대체된다.
돌연변이체 효소는 통상적으로, 엔도글리카나제 가수분해 단계의 역반응과 유사한 합성단계에 의해서 반응을 촉진시킨다. 이들 구체예에서, 글리코실 공여체 분자 (예를 들어, 목적하는 올리고- 또는 모노-사카라이드 구조)는 이탈그룹을 함유하며, 반응은 단백질 상의 GlcNAc 잔기에 공여체 분자를 부가하여 수행된다. 예를 들어, 이탈그룹은 플루오라이드와 같은 할로겐일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이탈그룹은 Asn, 또는 Asn-펩타이드 부위이다. 추가의 또 다른 구체예에서는, 글리코실 공여체 분자 상의 GlcNAc 잔기가 변형된다. 예를 들어, GlcNAc 잔기는 1,2 옥사졸린 부위를 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 컨쥬게이트를 생성시키는데 사용된 각각의 효소는 촉매량으로 존재한다. 특정 효소의 촉매량은 효소의 기질의 농도, 및 온도, 시간 및 pH 값과 같은 반응조건에 따라서 변화한다. 전선택된 기질 농도 및 반응조건 하에서 소정의 효소에 대한 촉매량을 결정하는 방법은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있다.
상기의 방법이 수행되는 온도는 동결하기 직전의 온도로부터 대부분의 민감성 효소가 변성하는 온도까지의 범위일 수 있다. 바람직한 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 55℃, 더욱 바람직하게는 약 20℃ 내지 약 37℃이다. 또 다른 예시적 구체 예에서, 본 방법의 하나 또는 그 이상의 성분은 내열성 효소를 사용하여 상응된 온도에서 수행된다.
반응혼합물은 수용체에 대해서 글리코실화되기에 충분한 시간 동안 유지시킴으로써 목적하는 컨쥬게이트를 형성시킨다. 컨쥬게이트의 일부는 종종 몇시간 후에 검출될 수 있으며, 회수가능한 양은 통상적으로 24시간 또는 그 미만 이내에 수득된다. 반응속도가 선택된 시스템에 대해서 최적화된 다수의 가변적 인자 (예를 들어, 효소 농도, 공여체 농도, 수용체 농도, 온도, 용매 용적)에 따라서 좌우된다는 것은 본 기술분야에서 숙련된 전문가가 이해할 수 있다.
본 발명은 또한, 변형된 펩타이드의 산업적-규모 생산을 제공한다. 본 발명에서 사용된 것으로, 산업적 규모는 일반적으로 적어도 250 ㎎, 바람직하게는 적어도 500 ㎎, 더욱 바람직하게는 적어도 1 그람의 가공 정제된 컨쥬게이트를 생산한다.
이하의 설명에서, 본 발명은 글리코실화된 펩타이드에 대한 변형된 시알산 부위의 컨쥬게이션으로 예시되었다. 변형된 시알산의 예는 PEG로 표지된다. PEG-변형된 시알산과 글리코실화된 펩타이드에 대한 이하의 설명의 초점은 명확한 설명을 가기 위한 것이며, 본 발명을 이들 두가지 파트너의 컨쥬게이션으로 제한하는 것을 의미하고자 하는 것은 아니다. 이 설명이 일반적으로 시알산 이외의 변형된 글리코실 부위의 부가에도 적용할 수 있다는 것은 숙련된 전문가에게 이해되는 것이다. 더구나, 이 설명은 다른 PEG 부위, 치료학적 부위 및 생체분자를 포함한 PEG 이외의 다른 약제에 의한 글리코실 유니트의 변형에도 동등하게 적용될 수 있 다.
펩타이드 또는 글리코펩타이드 상에 PEG일화되거나 PPG일화된 카보하이드레이트를 선택적으로 도입시키기 위하여 효소적 방법이 사용될 수 있다. 이 방법은 PEG, PPG, 또는 차폐된 반응성 작용그룹을 함유하는 변형된 당을 이용하며, 적절한 글리코실트랜스퍼라제 또는 글리코신타제와 조합된다. 목적하는 카보하이드레이트 결합을 만들 수 있는 글리코실트랜스퍼라제를 선택하고, 공여체 기질로서 변형된 당을 이용함으로써 PEG 또는 PPG를 G-CSF 펩타이드 골격 상에, 글리코펩타이드의 기존의 당 잔기 상에, 또는 펩타이드에 부가된 당 잔기 상에 직접 도일시킬 수 있다.
시알릴트랜스퍼라제를 위한 수용체는 천연적으로 존재하는 구조로서, 또는 재조합적으로, 효소적으로 또는 화학적으로 배치된 것으로서 본 발명의 방법에 의해서 변형될 G-CSF 펩타이드 상에 존재한다. 적합한 수용체에는 예를 들어, Galβ1,4GlcNAc, Galβ1,4GalNAc, Galβ1,3GalNAc, 락토-N-테트라오즈, Galβ1,3GlcNAc, Galβ1,3Ara, Galβ1,6GlcNAc, Galβ1,4Glc (락토즈), 및 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지되어 있는 그 밖의 다른 수용체와 같은 갈락토실 수용체기 포함된다 [참조예: Paulson et al., J. Biol . Chem. 253: 5617-5624 (1978)].
한가지 구체예에서, 시알릴트랜스퍼라제에 대한 수용체는 글리코펩타이드의 생체내 합성시에 변형될 글리코펩타이드 상에 존재한다. 이러한 글리코펩타이드는 글리코펩타이드의 글리코실화 패턴을 미리 변형시키지 않고 특허청구된 방법을 사용하여 시알릴화될 수 있다. 대신으로, 본 발명의 방법을 사용하여 적합한 수용체 를 포함하지 않는 펩타이드를 시알릴화시킬 수 있으며; G-CSF 펩타이드는 우선 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 방법에 의해서 수용체를 포함하도록 변형시킨다. 예시적 구체예에서, GalNAc 잔기는 GalNAc 트랜스퍼라제의 작용에 의해서 부가된다.
예시적 구체예에서, 갈락토실 수용체는 갈락토즈 잔기를 G-CSF 펩타이드에 연결된 적절한 수용체, 예를 들어, GlcNAc에 부착시킴으로써 조립된다. 이 방법은 변형시키고자 하는 G-CSF 펩타이드를 적합한 양의 갈락토실트랜스퍼라제 (예를 들어, galβ1,3 또는 galβ1,4), 및 적합한 갈락토실 공여체 (예를 들어, UDP-갈락토즈)를 함유하는 반응혼합물과 함께 배양하는 단계를 포함한다. 반응은 실질적으로 완료할 할 때까지 진행하도록 허용되거나, 대신에 반응은 미리 선택된 양의 갈락토즈 잔기가 부가되면 종료된다. 선택된 사카라이드 수용체를 조립하는 그 밖의 다른 방법은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 명백할 것이다.
또 다른 구체예에서, 글리코펩타이드-연결된 올리고사카라이드는 우선 전체로 또는 부분적으로 "정돈되어 (trimmed)" 시알릴트랜스퍼라제를 위한 수용체, 또는 하나 또는 그 이상의 적절한 잔기를 첨가하여 적합한 수용체를 수득할 수 있는 부위를 노출시킨다. 글리코실트랜스퍼라제 및 엔도글리코시다제와 같은 효소 (참조예: 미국 특허 제 5,716,812 호)가 부착 및 정돈반응에 유용하다.
이하의 설명에서 본 발명의 방법은 PEG 부위가 부착되어 있는 변형된 당을 사용하는 것으로 예시되어 있다. 설명의 초점은 명확한 설명을 가기 위한 것이다. 이 설명이 변형된 부위가 치료학적 부위, 생체분자 등을 포함하는 이들 구체예에 동등하게 적용되는 것은 숙련된 전문가에게 명백할 것이다.
변형된 당을 부가하기 전에 카보하이드레이트 잔기가 "정돈되는" 본 발명의 예시적 구체예에서, 고급 만노즈는 일차 생성 바이안테나리 구조 (biantennary structure)로 역정돈된다. PEG 부위를 함유하는 변형된 당은 "역정돈 (trimming back)"에 의해서 노출된 하나 또는 그 이상의 당 잔기에 컨쥬게이트된다. 한가지 예로, PEG 부위는 PEG 부위에 컨쥬게이트된 GlcNAc 부위를 통해서 부가된다. 변형된 GlcNAc는 바이안테나리 구조의 말단 만노즈 잔기 하나 또는 둘 다에 부착된다. 대신으로, 비변형된 GlcNAc가 분지된 종류의 말단 하나 또는 둘 다에 부가될 수 있다.
또 다른 예시적 구체예에서, PEG 부위는 말단 만노즈 잔기 상에 부가된 GlcNAc 잔기에 컨쥬게이트된 갈락토즈 잔기를 갖는 변형된 당을 통해서 바이안테난리 구조의 말단 만노즈 잔기 중의 하나 또는 둘 다에 부가된다. 대신으로, 비변형된 Gal은 말단 GlcNAc 잔기 하나 또는 둘 다에 부가될 수 있다.
또 다른 추가의 예에서, PEG 부위는 변형된 시알산을 사용하여 Gal 잔기 상에 부가된다.
또 다른 예시적 구체예에서, 고급 만노즈 구조는 바이안테나리 구조가 분지되는 만노즈로 "역정돈"된다. 한가지 예로, PEG 부위는 폴리머에 의해서 변형된 GlcNAc를 통해서 부가된다. 대신으로, 비변형된 GlcNAc를 만노즈에 부가하고, 이어서 부착된 PEG 부위를 갖는 Gal이 부가된다. 또 다른 추가의 구체예에서는, 비변형된 GlcNAc 및 Gal 잔기를 만노즈에 순차적으로 부가하고, 이어서 PEG 부위로 변형된 시알산 부위를 부가한다.
추가의 예시적 구체예에서, 고급 만노즈는 GlcNAc로 "역정돈"되고, 여기에 첫번째 만노즈가 부착된다. GlcNAc는 PEG 부위를 함유하는 Gal 잔기에 컨쥬게이트된다. 대신으로, 비변형된 Gal을 GlcNAc에 부가하고, 이어서 수용성 당으로 변형된 시알산을 부가한다. 또 다른 추가의 구체예에서는, 말단 GlcNAc를 Gal과 컨쥬게이트시키고, GlcNAc는 이어서 PEG 부위를 함유하는 변형된 퓨코즈로 푸코실화시킨다.
고급 만노즈는 또한 펩타이드의 Asn에 부착된 첫번째 GlcNAc로 역정돈될 수도 있다. 한가지 예로서, GlcNAc-(Fuc)a 잔기의 GlcNAc는 수용성 폴리머를 함유하는 ha GlcNAc와 컨쥬게이트된다. 또 다른 예에서, GlcNAc-(Fuc)a 잔기의 GlcNAc는 수용성 폴리머를 보유하는 Gal에 의해서 변형된다. 추가의 또 다른 구체예에서, GlcNAc는 Gal에 의해서 변형된 다음에, 이어서 PEG 부위로 변형된 시알산의 Gal과 컨쥬게이트 된다.
그 밖의 다른 예시적 구체예는 통상적으로 소유된 미국 공개특허출원 제 20040132640; 20040063911; 20040137557 호; 미국 특허출원 제 10/369,979; 10/410,913; 10/360,770; 10/410,945 호 및 PCT/US02/32263 (이들 각각은 본 발명에 참고로 포함되어 있다)에 기술되어 있다.
상술한 예는 본 발명에 기술된 방법의 파워 (power)에 대한 설명을 제공한 것이다. 본 발명에 기술된 방법을 사용하여, 실질적으로 목적하는 구조의 카보하 이드레이트 잔기를 "역정돈" 및 형성시킬 수 있다. 변형된 당은 상술한 바와 같이 카보하이드레이트 부위의 말단에 부가될 수 있거나, 이것이 펩타이드 코어와 카보하이드레이트의 말단 사이의 중간체일 수 있다.
예시적 구체예에서, 기존의 시알산은 시알리다제를 사용하여 G-CSF 글리코펩타이드로부터 제거됨으로써 기본적인 갈락토실 잔기 모두 또는 대부분을 노출시킨다. 대신으로, 펩타이드 또는 글리코펩타이드는 갈락토즈 잔기, 또는 갈락토즈 유니트로 종결하는 올리고사카라이드 잔기로 표지된다. 갈락토즈 잔기를 노출시키거나 부가한 후에, 적절한 시알릴트랜스퍼라제를 사용하여 변형된 시알산을 부가한다. 이 방법은 반응식 1로 요약된다.
Figure 112006039150479-PCT00053
반응식 2에 요약된 또 다른 추가의 방법에서, 차폐된 반응성 작용기는 시알산 상에 존재한다. 차폐된 반응성 그룹은 바람직하게는 변형된 시알산을 G-CSF에 부착시키기 위해서 사용된 조건에 의해서 영향을 받지 않는다. 변형된 시알산을 G-CSF 펩타이드에 공유적으로 부착시킨 후에, 차폐를 제거하고 G-CSF 펩타이드는 PEG와 같은 약제와 컨쥬게이트된다. 약제는 약제와 변형된 당 잔기 상의 노출된 반응성 그룹과의 반응에 의해서 특이적 방식으로 펩타이드에 컨쥬게이트된다.
Figure 112006039150479-PCT00054
본 명세서에 기술된 모든 변형된 당은 글리코펩타이드의 올리고사카라이드 측쇄의 말단 당에 따라서 그의 적절한 글리코실트랜스퍼라제와 함께 사용될 수 있다 (표 1). 상기에서 설명한 바와 같이, 페질화된 구조의 도입에 필요한 글리코펩타이드의 말단 당은 발현 중에 자연적으로 도입될 수 있거나, 이것은 적절한 글리코시다제(들), 글리코실트랜스퍼라제(들) 또는 글리코시다제(들)와 글리코실트랜스퍼라제(들)의 혼합물을 사용하여 발현후 생성될 수 있다.
Figure 112006039150479-PCT00055
Figure 112006039150479-PCT00056
추가의 예시적 구체예에서, UDP-갈락토즈-PEG는 우유 β1,4-갈락토실트랜스퍼라제와 반응시킴으로써 변형된 갈락토즈를 적절한 말단 N-아세틸글루코사민 구조에 전이시킨다. 글리코펩타이드 상의 말단 GlcNAc 잔기는 포유동물, 곤충, 식물 또는 진균과 같은 발현 시스템에 존재할 수 있기 때문에, 발현 중에 생성될 수 있을 뿐만 아니라, 글리코펩타이드를 필요에 따라서 시알리다제 및/또는 글리코시다제 및/또는 글리코실트랜스퍼라제로 처리함으로써 생성될 수도 있다.
또 다른 예시적 구체예에서는, GNT1-5와 같은 GlcNAc 트랜스퍼라제를 이용하 여 PEG일화된-GlcN을 글리코펩타이드 상의 말단 만노즈 잔기에 전이시킨다. 또 다른 추가의 예시적 구체예에서는, N- 및/또는 O-연결된 글리칸 구조를 글리코펩타이드로부터 효소적으로 제거하여 아미노산 또는 말단 글리코실 잔기를 노출시키고, 이어서 이것을 변형된 당과 컨쥬게이트시킨다. 예를 들어, 엔도글리카나제를 사용하여 글리코펩타이드의 N-연결된 구조를 제거하여 글리코펩타이드 상의 GlcNAc-연결된-Asn으로서 말단 GlcNAc를 노출시킨다. UDP-Gal-PEG 및 적절한 갈락토실트랜스퍼라제를 사용하여 노출된 GlcNAc 상에 PEG-갈락토즈 작용기를 도입시킨다.
대체용 구체예에서, 변형된 당은 펩타이드 골격에 당 잔기를 전이시키는 것으로 공지된 글리코실트랜스퍼라제를 사용하여 G-CSF 펩타이드 골격에 직접적으로 부가된다. 이러한 예시적 구체예는 반응식 3에 기술되어 있다. 본 발명을 실시하는데 유용한 글리코실트랜스퍼라제의 예로는 GalNAc 트랜스퍼라제 (GalNAc T1-14), GlcNAc 트랜스퍼라제, 퓨코실트랜스퍼라제, 글루코실트랜스퍼라제, 자일로실트랜스퍼라제, 만노실트랜스퍼라제 등이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 방법의 사용은 카보하이드레이트가 전혀 결핍되어 있는 펩타이드 상에, 또는 대신으로 기존의 글리코펩타이드 상에 변형된 당의 직접적인 부가를 가능하게 한다. 두 경우 모두에서, 변형된 당의 부가는 화학적 방법을 사용한 단백질의 펩타이드 골격의 변형 중에 일어나는 것과 같은 무작위적 방식이 아니라, 글리코실트랜스퍼라제의 기질 특이성에 의해서 정의되는 바와 같이 펩타이드 골격 상의 특정 위치에서 일어난다. 약제의 어레이는 적절한 아미노산 서열을 폴리펩타이드 체인으로 조작함으로써, 글리코실트랜스퍼라제 기질 펩타이드 서열이 결여된 단백질 또는 글리 코펩타이드에 도입될 수 있다.
Figure 112006039150479-PCT00057
상술한 예시적 구체예의 각각에서는, 펩타이드에 대한 변형된 당의 컨쥬게이션 이후에 하나 또는 그 이상의 추가의 화학적 또는 효소적 변형단계가 이용될 수 있다. 예시적 구체예에서, 효소 (예를 들어, 퓨코실트랜스퍼라제)를 사용하여 G-CSF 펩타이드에 부착된 말단 변형된 당 위에 글리코실 유니트 (예를 들어, 퓨코즈)를 붙인다. 또 다른 예에서는 효소적 반응을 이용하여 변형된 당이 컨쥬게이트하는데 실패한 부위를 "캡핑"한다. 대신으로, 화학적 반응을 이용하여 컨쥬게이트된 변형된 당의 구조를 변경시킨다. 예를 들어, 컨쥬게이트된 변형된 당을, 변형된 당이 부착된 펩타이드 성분과의 그의 결합을 안정화 또는 불안정화시키는 약제와 반응시킨다. 또 다른 예에서는, 펩타이드에 대한 그의 컨쥬게이션 후에 변형된 당의 성분을 탈보호시킨다. 숙련된 전문가는, 변형된 당이 G-CSF 펩타이드에 컨쥬게이트된 후의 단계에서 본 발명의 방법에 유용한 효소적 및 화학적 절차의 어레이가 있음을 인식할 것이다. 변형된 당-펩타이드 컨쥬게이트의 추가의 조작은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
효소
아실-연결된 컨쥬게이트를 형성하는 것과 관련하여 상기에 거론된 효소 이외 에도, 컨쥬게이트 및 출발기질 (예를 들어, 펩타이드, 리피드)의 글리코실화 패턴을 다른 효소를 이용하는 방법에 의해서 조작되거나, 역정돈되거나, 다른 식으로 변형될 수 있다. 당 공여체를 수용체에 전이시키는 효소를 사용하여 펩타이드 및 리피드를 리모델링하는 방법은 WO 03/031464 A2 (DeFrees, 2003년 4월 17일 공개 됨)에 더 상세히 거론되어 있다. 본 발명의 방법에서 유용한 선택된 효소의 간단한 요약은 이하에 언급하였다.
글리코실트랜스퍼라제
글리코실트랜스퍼라제는 단계적 방식으로 단백질, 글리코펩타이드, 리피드 또는 글리코리피드에 대한 또는 성장형 올리고사카라이드의 비-환원성 말단에 대한 활성화된 당 (공여체 NDP- 또는 NMP-당)의 부가를 촉진시킨다. N-연결된 글리코페타이드는 엔 블럭 전이 (en block transfer)에 이어서 코어의 정돈 시에 트랜스퍼라제 및 리피드-연결된 올리고사카라이드 공여체 Dol-PP-NAG2Glc3Man9를 통해서 합성된다. 이 경우에, "코어" 사카라이드의 성질은 후속 부착물과는 약간 상이하다. 매우 다수의 글리코실트랜스퍼라제가 본 기술분야에서 공지되어 있다.
본 발명에서 사용되는 글리코실트랜스퍼라제는 이것이 당 공여체로서 변형된 당을 이용할 수 있는 한은 어떤 것이라도 될 수 있다. 이러한 효소의 예로는 갈락토실트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제, N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제, 퓨코실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제, 만노실트랜스퍼라제, 자일로 실트랜스퍼라제, 글루쿠로노닐트랜스퍼라제 등과 같은 르로이어 경로 (Leloir pathway) 글리코실트랜스퍼라제가 포함된다.
글리코실트랜스퍼라제 반응을 포함하는 효소적 사카라이드 합성의 경우에는, 글리코실트랜스퍼라제가 어떤 공급원으로부터도 클로닝되거나 분리될 수 있다. 다수의 클로닝된 글리코실트랜스퍼라제가 그들의 폴리뉴클레오타이드 서열과 마찬가지로 공지되어 있다 [참조예: "The WWW Guide To Cloned Glycosyltransferases" (http://www.vei.co.uk/TGN/gt_guide.htm)]. 글리코실트랜스퍼라제 아미노산 서열, 및 아미노산 서열이 추론될 수 있는 글리코실트랜스퍼라제를 코드화한 뉴클레오타이드 서열은 또한 진뱅크 (GenBank), 스위스-프로트 (Swiss-Prot), EMBL 등을 포함하는 공공연하게 이용가능한 다양한 데이타베이스에서 발견된다.
본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 글리코실트랜스퍼라제에는 갈락토실트랜스퍼라제, 퓨코실트랜스퍼라제, 글루코실트랜스퍼라제, N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제, 글루쿠로닐트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제, 만노실트랜스퍼라제, 글루쿠론산 트랜스퍼라제, 갈락투론산 트랜스퍼라제, 및 올리고사카릴트랜스퍼라제가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 적합한 글리코실트랜스퍼라제에는 진핵세포로부터 뿐만 아니라 원핵세포로부터 수득된 것이 포함된다.
글리코실트랜스퍼라제를 코드화 한 DNA는 화학적 합성에 의해서, 적절한 세포 또는 세포라인 배양물로부터 mRNA의 역전사물을 스크리닝함으로써, 적절한 세포로부터의 지놈 라이브러리를 스크리닝함으로써, 또는 이들 절차를 조합함으로써 수 득될 수 있다. mRNA 또는 지놈 DNA의 스크리닝은 글리코실트랜스퍼라제 유전자 서열로부터 생성된 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 수행될 수 있다. 프로브는 공지된 절차에 따라서 통상적인 하이브리드화 시험방법에서 사용되는 형광성 그룹, 방사성 원자 또는 화학발광성 그룹과 같은 검출가능한 그룹으로 표지될 수 있다. 대용으로, 글리코실트랜스퍼라제 유전자 서열은 폴리머라제 체인 반응 (PCR) 절차를 사용하여 수득될 수 있으며, 여기에서 PCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 글리코실트랜스퍼라제 유전자 서열로부터 생성된다 [참조: 미국 특허 제 4,683,195 호 (Mullis et al.) 및 미국 특허 제 4,683,202 호 (Mullis)].
글리코실트랜스퍼라제는 글리코실트랜스퍼라제 효소를 코드화한 DNA를 함유하는 벡터에 의해서 형질전환된 숙주세포에서 합성될 수 있다. 벡터를 사용하여 글리코실트랜스퍼라제 효소를 코드화한 DNA를 증폭시키고/시키거나, 글리코실트랜스퍼라제 효소를 코드화한 DNA를 발현시킨다. 발현벡터는 글리코실트랜스퍼라제 효소를 코드화한 DNA 서열이 적합한 숙주 내에서 글리코실트랜스퍼라제 효소의 발현을 일으킬 수 있는 적합한 조절서열에 작동적으로 연결된 복제가능한 DNA 작제물이다. 이러한 조절서열의 필요성은 선택된 숙주 및 선택된 형질전환방법에 따라서 달라질 것이다. 일반적으로, 조절서열은 전사 프로모터, 전사를 조절하는 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코드화한 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 증폭벡터는 발현조절 영역을 필요로 하지 않는다. 필요한 것은 단지 통상적으로 복제의 기원에 의해서 부여되는 것으로 숙주 내에서 복제하는 능력, 및 형질전환체의 인식을 촉진시키는 선택 유전자이다.
예시적 구체예에서, 본 발명은 원핵성 효소를 이용한다. 이러한 글리코실트랜스퍼라제에는 다수의 그람 음성 박테리아에 의해서 생산된 리포올리고사카라이드 (LOS)의 합성에 연루되는 효소가 포함된다 [Preston et al., Critical Reviews in Microbiology 23(3): 139-180 (1996)]. 이러한 효소에는 β1,6 갈락토실트랜스퍼라제 및 β1,3 갈락토실트랜스퍼라제 [참조예: EMBL 기탁번호 제 M80599 및 M86935 호 (E. coli); EMBL 기탁번호 제 S56361 호 (S. typhimurium)], 글루코실트랜스퍼라제 (Swiss-Prot 기탁번호 제 P25740 호 (E. coli)), β1,2-글루코실트랜스퍼라제 (rfaJ)(Swiss-Prot 기탁번호 제 P27129 호 (E. coli) 및 Swiss-Prot 기탁번호 제 P19817 호 (S. typhimurium)), 및 β1,2-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 (rfaK)(EMBL 기탁번호 제 U00039 호 (E. coli))를 포함하는, 이. 콜라이 (E. coli) 및 살로넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium)과 같은 종의 rfa 오페론의 단백질이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 그에 대한 아미노산 서열이 공지되어 있는 그 밖의 다른 글리코실트랜스퍼라제에는 클렙시엘라 뉴모니에 (Klebsiella pneumoniae), 이. 콜라이 (E. coli), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica), 예르시니아 엔테로콜리티가 (Yersinia enterocolitica), 마이코박테리움 레프로섬 (Mycobacterium leprosum)과 같은 유기체에서 특정화된 rfaB, 및 슈모도나스 에루기노자 (Pseudomonas aeruginosa)의 rh1 오페론과 같은 오페론에 의해서 코드화된 것이 포함된다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 것은 또한, 점막성 병원체 나이세리아 고노 레아 (Neisseria gonnorhoeae) 및 나이세리아 메닌지티디스 (N. meningitidis)의 LOS에서 확인되는 락토-N-네오테트라오즈, D-갈락토실-β-1,4-N-아세틸-D-글루코사미닐-β-1,3-D-갈락토실-β-1,4-D-글루코즈 및 Pk 혈액 그룹 트리사카라이드 서열, D-갈락토실-α-1,4-D-갈락토실-β-1,4-D-글루코즈를 함유하는 구조를 생성시키는데 연루되는 글리코실트랜스퍼라제이다 (Scholten et al., J. Med . Microbiol. 41: 236-243 (1994)). 이들 구조물의 생합성에 연루된 글리코실트랜스퍼라제를 코드화한, 나이세리아 메닌지티디스 및 나이세리아 고노레아로부터의 유전자는 나이세리아 메닌지티디스 이뮤노타입 (immunotypes) L3 및 L1 (Jennings et al., Mol . Microbiol. 18: 729-740 (1995)) 및 나이세리아 고노레아 돌연변이체 F62 (Gotshlich, J. Exp . Med. 180: 2181-2190 (1994))로부터 확인되었다. 나이세리아 메닌지티디스에서, 3개의 유전자 lgtA, lgtB 및 lg E로 구성된 유전자좌는 락토-N-네오테트라오즈 체인에서 마지막 3개의 당의 부가에 필요한 글리코실트랜스퍼라제 효소를 코드화한다 (Wakarchuk et al., J. Biol . Chem. 271: 19166-73 (1996)). 최근에는, 그들의 제안된 글리코실트랜스퍼라제 기능에 대한 직접적인 첫번째 증거를 제공하는 lgtB 및 lgtA 유전자 생성물의 효소적 활성이 입증되었다 (Wakarchuk et al., J. Biol . Chem. 271(45): 28271-276 (1996)). 나이세리아 고노레아에서는, 두개의 추가의 유전자, 즉 락토-N-네오테트라오즈 구조의 말단 갈락토즈의 3 위치에 β-D-GalNAc를 부가하는 lgtD, 및 절단된 LOS의 락토즈 요소에 말단 α-D-Gal을 부가하는 lgtC가 존재하여 Pk 혈액 그룹 항원구조를 발생시킨다 (Gotshlich (1994), 상기 참조). 나이세리아 메닌지티디스에서, 별도의 이뮤노타입 L1은 또한 Pk 혈액 그룹 항원을 발현하며, lgtC 유전자를 운반하는 것으로 나타났다 (Jennings et al., (1995), 상기 참조). 나이세리아 글리코실트랜스퍼라제 및 관련된 유전자도 또한 USPN 5,545,553 (Gotschlich)에 기술되어 있다. 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori)로부터 α1,2-퓨코실트랜스퍼라제 및 α1,3-퓨코실트랜스퍼라제에 대한 유전자가 특정화되었다 (Martin et al., J. Biol . Chem. 272: 21349-21356 (1997)). 또한, 본 발명에서 유용한 것은 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni)의 글리코실트랜스퍼라제이다 (참조예: http://afmb.cnrs-mrs.fr/~pedro/CAZY/gtf_42.html).
퓨코실트랜스퍼라제
몇가지 구체예에서, 본 발명의 방법에서 사용된 글리코실트랜스퍼라제는 퓨코실트랜스퍼라제이다. 퓨코실트랜스퍼라제는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지되어 있다. 퓨코실트랜스퍼라제의 예로는 L-퓨코즈를 GDP-퓨코즈로부터 수용체 당의 하이드록시 부위에 전이시키는 효소가 포함된다. 비-뉴클레오타이드 당을 수용체에 전이시키는 퓨코실트랜스퍼라제도 또한 본 발명에서 유용하다.
몇가지 구체예에서, 수용체 당은 예를 들어, 올리고사카라이드 글리코사이드 내의 Galβ(1→3,4)GlcNAcβ- 그룹 중의 GlcNAc이다. 이러한 반응에 적합한 퓨코실트랜스퍼라제에는 인체 밀크로부터 최초로 특정화된 Galβ(1→3,4)GlcNAcβ1-α(1→3,4)퓨코실트랜스퍼라제 (FTIII E.C. No. 2.4.1.65) [참조: Palcic, et al., Carbohydrate Res. 190: 1-11 (1989); Prieels, et al., J. Biol. Chem. 256: 10456-10463 (1981); 및 Nunez, et al., Can. J. Chem. 59: 2086-2095 (1981)], 및 인체 혈청 중에 존재하는 Galβ(1→4)GlcNAcβ-α퓨코실트랜스퍼라제 (FTIV, FTV, FTVI)를 포함한다. FTVII (E.C. No. 2.4.1.65), 시알릴 α(2→3)Galβ((1→3)GlcNAcβ 퓨코실트랜스퍼라제도 또한 특정화되었다. Galβ(1→3,4)GlcNAcβ-α(1→3,4)퓨코실트랜스퍼라제도 또한 특정화되었다 [참조: Dumas, et al., Bioorg. Med . Letters 1: 425-428 (1991) 및 Kukowska-Latallo, et al., Genes and Development 4: 1288-1303 (1990)]. 그 밖의 다른 예시적 퓨코실트랜스퍼라제에는 예를 들어, α1,2 퓨코실트랜스퍼라제 (E.C. No. 2.4.1.69)가 포함된다. 효소적 퓨코실화는 문헌 [Mollicone, et al., Eur . J. Biochem . 191: 169-176 (1990)] 또는 미국 특허 제 5,374,655 호에 기술된 방법에 의해서 수행될 수 있다. 퓨코실트랜스퍼라제를 생산하기 위해서 사용되는 세포는 또한, GDP-퓨코즈를 합성하기 위한 효소적 시스템을 포함할 수 있다.
칼락토실트랜스퍼라제
구체예의 또 다른 그룹에서, 글리코실트랜스퍼라제는 갈락토실트랜스퍼라제이다. 갈락토실트랜스퍼라제의 예로는 α(1,3) 갈락토실트랜스퍼라제 [E.C. No. 2.4.1.151, 참조예: Dabkowski et al., Transplant Proc. 25:2921 (1993) 및 Yamamoto et al. Nature 345: 229-233 (1990), 소 (GenBank j04989, Joziasse et al., J. Biol. Chem. 264: 14290-14297 (1989)), 쥐 (GenBank m26925; Larsen et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86: 8227-8231 (1989)), 돼지 (GenBank L36152; Strahan et al., Immunogenetics 41: 101-105 (1995))]가 포함된다. 또 다른 적합한 α1,3 갈락토실트랜스퍼라제는 혈액 그룹 B 항원의 합성에 연루되는 것이다 [EC 2.4.1.37, Yamamoto et al., J. Biol. Chem. 265: 1146-1151 (1990) (인간)]. 추가의 또 다른 갈락토실트랜스퍼라제의 예는 코어 Gal-T1이다.
본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 것은 또한, 예를 들어, EC 2.4.1.90 (LacNAc 신테타제) 및 EC 2.4.1.22 (락토즈 신테타제) [소 (D'Agostaro et al., Eur. J. Biochem. 183: 211-217 (1989)), 인간 (Masri et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 157: 657-663 (1988)), 쥐 (Nakazawa et al., J. Biochem. 104: 165-168 (1988))] 및 E.C. 2.4.1.38 및 세라마이드 갈락토실트랜스퍼라제 (EC 2.4.1.45, Stahl et al., J. Neurosci. Res. 38: 234-242 (1994))를 포함하는 β(1,4) 갈락토실트랜스퍼라제이다. 그 밖의 적합한 갈락토실트랜스퍼라제에는 예를 들어, α1,2 갈락토실트랜스퍼라제 (예를 들어, 문헌 Schizosaccharomyces pombe, Chapell et al., Mol. Biol. Cell 5: 519-528 (1994)으로부터 유래함)가 포함된다.
시알릴트랜스퍼라제
시알릴트랜스퍼라제는 본 발명의 재조합 세포 및 반응혼합물에서 유용한 또 다른 타입의 글리코실트랜스퍼라제이다. 재조합 시알릴트랜스퍼라제를 생산하는 세포는 또한, 시알릴트랜스퍼라제를 위한 시알산 공여체인 CMP-시알산을 생산할 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 시알릴트랜스퍼라제의 예로는 ST3Gal III (예를 들어, 랫트 또는 인간 ST3Gal III), ST3Gal IV, ST3Gal I, ST3GalII, ST6Gal I, ST3Gal V, ST6Gal II, ST6GalNAc I, ST6GalNAc II, 및 ST6GalNAc III (본 발명에서 사용된 시알릴트랜스퍼라제 명명법은 문헌 [Tsuji et al., Glycobiology 6: v-xiv (1996)]에 기술되어 있다)가 포함된다. α(2,3)시알릴트랜스퍼라제 (EC 2.4.99.6)라고 불리는 예시적 α(2,3)시알릴트랜스퍼라제는 시알산을 Galβ1→3Glc 디사카라이드 또는 글리코사이드의 비-환원성 말단 Gal에 전이시킨다 [참조: Van den Eijnden et al., J. Biol. Chem. 256: 3159 (1981), Weinstein et al., J. Biol. Chem. 257: 13845 (1982) 및 Wen et al., J. Biol. Chem. 267: 21011 (1992)]. 또 다른 예의 α2,3-시알릴트랜스퍼라제 (EC 2.4.99.4)는 시알산을 디사카라이드 또는 글리코사이드의 비-환원성 말단 Gal에 전이시킨다 [참조: Rearick et al., J. Biol. Chem. 254: 4444 (1979) 및 Gillespie et al., J. Biol. Chem. 267: 21004 (1992)]. 추가의 효소의 예로는 Gal-β-1,4-GlcNAc α-2,6 시알릴트랜스퍼라제가 포함된다 [참조: Kurosawa et al. Eur. J. Biochem. 219: 375-381 (1994)].
바람직하게는, 글리코펩타이드의 카보하이드레이트의 글리코실화를 위해서 시알릴트랜스퍼라제는 시알산을 완전히 시알릴화된 카보하이드레이트 구조 상의 말단 시알산을 기본으로 하여 끝에서 두번째 있는 가장 공통적인 서열인 서열 Galβ1,4GlcNAc-에 전이시킬 수 있다 (참조: 표 2).
수용체 기질로서 Galβ1,4GlcNAc 서열을 사용하는 시알릴트랜스퍼라제
시알릴트랜스퍼라제 공급원 형성된 서열(들) 참고문헌
ST6Gal I 포유동물 NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNAc- 1
ST3Gal III 포유동물 NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAc- NeuAcα2,3Galβ1,3GlcNAc- 1
ST3Gal IV 포유동물 NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAc- NeuAcα2,3Galβ1,3GlcNAc- 1
ST6Gal II 포유동물 NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNAc-
ST6Gal II 발광세균 NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNAc- 2
ST3Gal V 나이세리아 메닌지티디스 나이세리아 고노레아 NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAc- 3
1) Goochee ey al., Bio/Technology 9: 1347-1355 (1991) 2) Yamamoto et al., J. Biochem. 120: 104-110 (1996) 3) Gilbert et al., J. Biol . Chem. 271: 28271-28276 (1996)
특허청구된 방법에서 유용한 시알릴트랜스퍼라제의 예는 또한 α(2,3)시알릴트랜스퍼라제 (EC 2.4.99.6)로도 불리는 ST3Gal III이다. 이 효소는 Galβ1,3GlcNAc 또는 Galβ1,4GlcNAc 글리코사이드의 Gal에 대한 시알산의 전이를 촉진시키며 [참조예: Wen et al., J. Biol . Chem. 267: 21011 (1992); Van den Eijnden et al., J. Biol . Chem . 256: 3159 (1991)], 글리코펩타이드에서 아스파라진-연결된 올리고사카라이드의 시알릴화를 책임질 수 있다. 시알산은 두개의 사카라이드 사이의 α-결합의 형성에 의해서 Gal에 연결된다. 사카라이드 사이의 결합 (linkage)은 NeuAc의 2-위치와 Gal의 3-위치 사이이다. 이러한 특정의 효소는 랫트 간 (Weinstein et al., J. Biol . Chem. 257: 13845 (1982)); 인간 cDNA (Sasaki et al. (1993) J. Biol . Chem. 268: 22782-22787; Kitagawa & Paulson (1994) J. Biol. Chem. 269: 1394-1401)로부터 분리될 수 있으며, 지놈성 (Kitagawa et al. (1996) J. Biol . Chem. 271: 931-938) DNA 서열은 공지되어 있어서 재조합 발현에 의해서 이 효소의 생성을 촉진시킨다. 바람직한 구체예에서, 특허청구된 시알릴화 방법은 랫트 ST3Gal III을 사용한다.
본 발명에서 유용한 그 밖의 다른 시알릴트랜스퍼라제의 예로는 CST-I 및 CST-II 및 α(2,3) 결합을 형성하는 것을 포함하여 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni)로부터 분리된 것이 포함된다 [참조예: WO99/49051].
표 2에 열거된 것이 아닌 시알릴트랜스퍼라제도 또한, 상업적으로 중요한 글리코펩타이드의 시알릴화를 위한 경제적이고 효율적인 대규모 방법에 유용하다. 이들 그 밖의 효소의 유용성을 확인하기 위한 간단한 시험으로서, 다양한 양의 각각의 효소 (1-100 mU/㎎ 단백질)를 아시알로-α1 AGP (1-10 ㎎/㎖)와 반응시켜 소의 ST6Gal I, ST3Gal III 또는 시알릴트랜스퍼라제 둘 다에 비해서 글리코펩타이드를 시알릴화시키는 해당 시알릴트랜스퍼라제의 능력을 비교한다. 대신으로, 그 밖의 다른 글리코펩타이드 또는 펩타이드 골격으로부터 효소적으로 유리된 글리코펩타이드 또는 N-연결된 올리고사카라이드가 이러한 평가를 위한 아시알로-α1 AGP 대신에 사용될 수 있다. ST6Gal I보다 더 효율적으로 글리코펩타이드의 N-연결된 올리고사카라이드를 시알릴화시키는 능력을 갖는 시알릴트랜스퍼라제가 펩타이드 시알릴화를 위한 실용적인 대규모 방법에서 유용하다.
이들 및 추가의 시알릴트랜스퍼라제는, 본 명세서에 기술된 변형된 시알산 종류 및 비변형된 시알산을 수용체에 전이시키기 위해서 유용한 시알릴 트랜스퍼라제의 표인 도 11에 제시되어 있다.
GalNAc 트랜스퍼라제
N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제는 본 발명을 실시하는데, 특히 펩타이드의 O-연결된 글리코실화 부위의 아미노산에 GalNAc 부위를 결합시키는데 유용하다. 적합한 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제에는 α(1,3) N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제, β(1,4) N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제 (Nagata et al., J. Biol. Chem. 267: 12082-12089 (1992) 및 Smith et al., J. Biol Chem. 269: 15162 (1994)) 및 폴리펩타이드 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제 (Homa et al., J. Biol. Chem. 268: 12609 (1993))가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
유전자 조작에 의해서 클로닝된 유전자로부터 효소 GalNAc TI - XX와 같은 단백질의 생산은 잘 공지되어 있다 [참조예: 미국 특허 제 4,761,371 호]. 한가지 방법은 충분한 샘플을 수집한 다음에, 효소의 아미노산 서열을 N-말단 서열분석에 의해서 결정한다. 그 후, 이러한 정보를 사용하여 곤충세포 라인 Sf9에서 발현시키면 완전히 활성인 효소의 합성을 제공하는 전장 (막 결합된) 트랜스퍼라제를 코드화한 cDNA 클론을 분리시킨다. 그 후, 효소의 수용체 특이성은 16개의 상이한 단백질에서 공지된 글리코실화 부위를 둘러싼 아미노산의 반정량적 분석에 이은 합성 펩타이드의 시험관내 글리코실화 시험을 사용하여 결정된다. 이 연구는 특정의 아미노산 잔기가 글리코실화된 펩타이드 절편에서 과도하게 나타나고, 글리코실화된 세린 및 트레오닌 잔기를 둘러싼 특정의 위치에서의 잔기는 다른 아미노산 잔기보다 수용체 효율에 더 현저한 영향을 미칠 수 있음을 입증하였다.
세포- 결합된 글리코실트랜스퍼라제
또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법에서 이용된 효소는 세포-결합된 글리코실트랜스퍼라제이다. 다수의 가용성 글리코실트랜스퍼라제가 공지되어 있지만 (참조: 예를 들어, 미국 특허 제 5,032,519 호), 글리코실트랜스퍼라제는 일반적으로 세포와 결합하였을 때에 막-결합된 형태로 존재한다. 여태까지 시험된 다수의 막-결합된 효소는 내인성 단백질인 것으로 간주되며, 즉 이들은 초음파처리에 의해서 막으로부터 유리되지 않으며, 가용화를 위해서 세정제를 필요로 한다. 표면 글리코실트랜스퍼라제는 척추동물 및 무척추동물 세포의 표면 상에서 확인되었으며, 또한 이들 표면 트랜스퍼라제는 생리학적 조건 하에서 촉매적 활성을 유지하는 것으로 인식되어 있다. 그러나, 세포 표면 글리코실트랜스퍼라제의 더 잘 인식된 기능은 세포간의 인식을 위한 것이다 (Roth, Molecular Approaches to Supracellular Phenomena, 1990).
세포에 의해서 발현된 글리코실트랜스퍼라제를 변경시키는 방법이 개발되었다. 예를 들어, 문헌 [Larsen et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86: 8227-8231 (1989)]에는 세포 표면 올리고사카라이드 구조 및 그들의 동족성 글리코실트랜스퍼라제의 발현을 결정하는 클로닝된 cDNA 서열을 분리하는 유전적 방법이 보고되었다. UDP-갈락토즈:.β.-D-갈락토실-1,4-N-아세틸-D-글루코사미니드 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제를 발현하는 것으로 알려진 쥐의 세포라인으로부터 분리된 mRNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리를 COS-1 세포 내로 형질감염시켰다. 그 후, 형질감염된 세포를 배양하고, α1-3 갈락토실트랜스퍼라제 활성에 대해서 시험하였다.
문헌 [Francisco et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89: 2713-2717 (1992)]에는 β-락타마제를 에스케리키아 콜라이의 외부 표면에 고정시키는 방법이 기술되어 있다. (i) 외부 막단백질의 시그날 서열, (ii) 외부 막단백질의 막-스패닝 (spanning) 절편, 및 (iii) 완전 성숙 β-락타마제 서열로 구성된 삼부분 융합물이 생성되어 활성표면 결합된 β-락타마제 분자를 제공한다. 그러나, 프란시스코(Francisco) 방법은 단지 원핵세포 시스템으로만 제한되며, 저자에 의해서 인지 되는 바와 같이, 적절한 기능화를 위한 완전한 삼부분 융합물을 필요로 한다.
설포트랜스퍼라제
본 발명은 또한, 예를 들어, 헤파린, 헤파란 설페이트, 카라게넨 및 관련된 화합물과 같은 설페이트화된 폴리사카라이드를 포함한 설페이트화 분자를 포함하는 펩타이드를 생성하는 방법을 제공한다. 적합한 설포트랜스퍼라제에는 예를 들어, 콘드로이틴-6-설포트랜스퍼라제 [문헌 (Fukuta et al., J. Biol . Chem. 270: 18575-18580 (1995))에 기술된 닭의 cDNA; 진뱅크 기탁번호 제 D49915 호], 글리코사미노글리칸 N-아세틸글루코사민 N-데아세틸라제/N-설포트랜스퍼라제 1 (Dixon et al., Genomics 26: 239-241 (1995); UL18918), 및 글리코사미노글리칸 N-아세틸글루코사민 N-데아세틸라제/N-설포트랜스퍼라제 2 [문헌 (Orellana et al., J. Biol . Chem. 269: 2270-2276 (1994) 및 Eriksson et al., J. Biol . Chem. 269: 10438-10443 (1994))에 기술된 쥐의 cDNA; 진뱅크 기탁번호 제 U2304로 기술된 인간의 cDNA]가 포함된다.
글리코시다제
본 발명은 또한, 야생형 및 돌연변이체 글리코시다제의 용도를 포함한다. 돌연변이체 β-갈락토시다제 효소는 갈락토실 수용체 분자에 대한 α-글리코실 플루오라이드의 커플링을 통해서 디사카라이드의 형성을 촉진시키는 것으로 입증되었다 (Withers, 미국 특허 제 6,284,494 호; 2001년 9월 4일에 허여됨). 본 발명에서 유용한 그 밖의 다른 글리코시다제에는 예를 들어, β-글루코시다제, β-갈락토시다제, β-만노시다제, β-아세틸 글루코사미니다제, β-N-아세틸 갈락토사미니다제, β-자일로시다제, β-퓨코시다제, 셀룰라제, 자일라나제, 갈락타나제, 만나제, 헤미셀룰라제, 아밀라제, 글루코아밀라제, α-글루코시다제, α-갈락토시다제, α-만노시다제, α-N-아세틸 글루코사미니다제, α-N-아세틸 갈락토사미니다제, α-자일로시다제, α-퓨코시다제 및 뉴라미니다제/시알리다제가 포함된다.
고정된 효소
본 발명은 또한, 고체 및/또는 가용성 지지체 상에 고정된 효소의 용도를 제공한다. 예시적 구체예에서는 본 발명의 방법에 따라 온전한 글리코실 링커를 통해서 PEG에 컨쥬게이트된 글리코실트랜스퍼라제가 제공된다. PEG-링커-효소 컨쥬게이트는 임의로 고체 지지체에 부착된다. 본 발명의 방법에서 고체 지지된 효소의 사용은 반응혼합물의 후처리 및 반응생성물의 정제를 간단하게 하며, 또한 효소의 용이한 회수를 가능하게 한다. 글리코실트랜스퍼라제 컨쥬게이트가 본 발명의 방법에서 이용된다. 효소와 지지체의 또 다른 배합물은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 명백할 것이다.
융합 단백질
또 다른 예시적 구체예에서, 본 발명의 방법은 목적하는 글리코펩타이드 컨쥬게이트의 합성에 연관된 하나 이상의 효소적 활성을 갖는 융합 단백질을 이용한다. 융합 폴리펩타이드는 예를 들어, 악세사리 효소의 촉매적 활성영역에 결합된 글리코실트랜스퍼라제의 촉매적 활성영역으로 구성될 수 있다. 악세사리 효소 촉매적 영역은 예를 들어, 글리코실트랜스퍼라제를 위한 공여체인 뉴클레오타이드 당의 형성 시의 단계를 촉진시킬 수 있거나, 글리코실트랜스퍼라제 사이클에 연루된 반응을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 클리코실트랜스퍼라제를 코드화한 폴리뉴클레오타이드는 프레임 내에서 (in-frame) 뉴클레오타이드 당 합성에 연루된 효소를 코드화한 폴리뉴클레오타이드에 결합될 수 있다. 그 후, 생성된 융합 단백질은 뉴클레오타이드 당의 합성뿐만 아니라 수용체 분자에 대한 당 부위의 전이를 촉진시킬 수 있다. 융합 단백질은 하나의 발현가능한 뉴클레오타이드 서열로 연결된 두개 또는 그 이상의 사이클 효소일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 융합 단백질은 두개 또는 그 이상의 글리코실트랜스퍼라제의 촉매적 활성영역을 포함한다 (참조예: 5,641,668). 본 발명의 변형된 글리코펩타이드는 다양한 적합한 융합 단백질을 이용하여 용이하게 디자인되고 제조될 수 있다 (참조예: 1999년 6월 24일에 WO 99/31224로 공개된 PCT 특허출원 PCT/CA98/01180).
변형된 당의 제조
일반적으로, 당 부위 또는 당 부위-링커 카세트 및 PEG 또는 PEG-링커 카세트 그룹은 일반적으로 연결방법에 의해서 새로운 유기 작용그룹 또는 비반응 종으로 형질전환된 반응성 그룹을 사용함으로써 함께 연결된다. 당 반응성 작용그룹(들)은 당 부위 상의 어떤 위치에라도 배치된다. 본 발명을 실시하는데 유용한 반응성 그룹 및 반응의 클래스는 일반적으로 바이오컨쥬게이트 화학의 기술분야에서 잘 알려져 있는 것이다. 반응성 당 부위에 의해서 이용가능한 반응의 현재 바람직한 클래스는 비교적 온화한 조건 하에서 진행하는 것이다. 이들에는 친핵성 치환반응 (예를 들어, 아민 및 알콜과 아실 할라이드, 활성 에스테르와의 반응), 친전자성 치환반응 (예를 들어, 엔아민 반응) 및 탄소-탄소 및 탄소-헤테로원자 다중결합에 대한 부가반응 (예를 들어, 마이클 (Michael) 반응, 디엘스-알더 (Diels-Alder) 부가반응)이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 이들 및 그 밖의 유용한 반응은 예를 들어, 문헌 (March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; 및 Feeney et al., Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982)에 기술되어 있다.
당 핵 또는 변형성 그룹으로부터 펜던트된 유용한 반응성 작용그룹에는 다음 (a) 내지 (j)의 그룹이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다:
(a) N-하이드록시석신이미드 에스테르, N-하이드록시벤즈트리아졸 에스테르, 산 할라이드, 아실 이미다졸, 티오에스테르, p-니트로페닐 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐 및 방향족 에스테르를 포함한 (이들로 제한되지는 않는다) 카복실 그룹 및 이들의 다양한 유도체;
(b) 예를 들어, 에스테르, 에테르, 알데히드 등으로 전환될 수 있는 하이드록실 그룹;
(c) 할로알킬 그룹 (여기에서, 할라이드는 후에 예를 들어, 아민, 카복실레이트 음이온, 티올 음이온, 카보 음이온 (carbanion) 또는 알콕사이드 이온과 같은 친핵성 그룹에 의해서 대체됨으로써 할로겐 원자의 작용그룹에서 새로운 그룹의 공유적 부착을 제공한다);
(d) 예를 들어, 말레이미도 그룹과 같이, 디엘스-알더 반응에 참여할 수 있는 친디엔성 그룹;
(e) 후속 유도체화 반응이 예를 들어, 이민, 하이드라존, 세미카바존 또는 옥심과 같은 카보닐 유도체의 형성을 통해서, 또는 그리나드 부가반응 또는 알킬리튬 부가반응과 같은 기전을 통해서 이루어질 수 있도록 하는 알데히드 또는 케톤 그룹;
(f) 예를 들어, 설폰아미드를 형성시키는, 아민과의 후속 반응을 위한 설포닐 할라이드 그룹;
(g) 예를 들어, 디설파이드로 전환될 수 있거나, 아실 할라이드와 반응할 수 있는 티올 그룹;
(h) 예를 들어, 아실화, 알킬화 또는 산화될 수 있는 아민 또는 설프히드릴 그룹;
(i) 예를 들어, 사이클로부가반응 (cycloaddition), 아실화반응, 마이클 부가반응 등을 수행할 수 있는 알켄; 및
(j) 예를 들어, 아민 및 하이드록실 화합물과 반응할 수 있는 에폭사이드.
반응성 작용그룹은 이들이 반응성 당 핵 또는 변형성 그룹을 조립하는데 필요한 반응에 참여하지 않거나 이 반응을 저해하지 않도록 선택될 수 있다. 대신으로, 반응성 작용그룹은 보호그룹이 존재함으로써 반응에 참여하는 것으로부터 보호될 수 있다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 반응조건의 선택된 세트를 저해하지 않도록 특정한 작용그룹을 어떻게 보호하는지 이해할 것이다. 유용한 보호그룹의 예에 대해서는 예를 들어, 문헌 (Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991)을 참고로 한다.
이하의 설명에는, 본 발명을 실시하는데 유용한 변형된 당의 다수의 구체적인 예가 기술되어 있다. 예시적 구체예에서는 시알산 유도체가 변형성 그룹이 부착된 당 핵으로 이용된다. 시알산 유도체에 대한 설명의 초점은 단지 설명을 명확히 하기 위한 것이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 이해되지는 않아야 한다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는, 그 밖의 다양한 당 부위가 예로서 시알산을 사용하여 기술된 방식과 유사한 방식으로 활성화되고 유도체화될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 본 기술분야에서 인지된 방법에 의해서 용이하게 변형되는 몇 개의 당 기질을 지칭하기 위해서 갈락토즈, 글루코즈, N-아세틸갈락토사민 및 퓨코즈를 변형시키는데 다수의 방법을 이용할 수 있다 [참조예: Elhalabi et al., Curr. Med. Chem. 6: 93 (1999); 및 Schafer et al., J. Org. Chem. 65: 24 (2000)].
예시적 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해서 변형된 펩타이드는 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)에서, 또는 유전자도입 동물에서 생산된 글리코펩타이드이며, 따라서 불완전하게 시알릴화된 N- 및/또는 O-연결된 올리고사카라이드 체인을 함유한다. 시알산이 결여되고 말단 갈락토즈 잔기를 함유하는 글리코펩타이드의 올리고사카라이드 체인은 PEG일화되거나, PPG일화되거나, 또는 변형된 시알산에 의해서 다른 식으로 변형될 수 있다.
반응식 4에서는, 아미노 글리코사이드 1을 보호된 아미노산 (예를 들어, 글리신) 유도체의 활성 에스테르로 처리하여 당 아민 잔기를 상응하는 보호된 아미노산 아미드 부가물로 전환시킨다. 부가물을 알돌라제로 처리하여 α-하이드록시 카복실레이트 2를 형성시킨다. 화합물 2를 CMP-SA 신테타제의 작용에 의해서 상응하는 CMP 유도체로 전환시키고, 이어서 CMP 유도체의 촉매적 수소화반응으로 화합물 3을 생성시킨다. 글리신 부가물의 형성을 통해서 도입된 아민은 화합물 3을 활성화된 PEG 또는 PPG 유도체 (예를 들어, PEG-C(O)NHS, PEG-OC(O)O-p-니트로페닐)와 반응시켜 각각 4 또는 5와 같은 종류를 생성시킴으로써 PEG 부착의 위치로서 이용된다.
Figure 112006039150479-PCT00058
표 3은 PEG 부위에 의해서 유도체화된 당 모노포스페이트의 대표적인 예를 기술한 것이다. 표 3의 화합물 중의 특정한 것은 반응식 4의 방법에 의해서 제조된다. 그 밖의 다른 유도체는 본 기술분야에서 인지된 방법에 의해서 제조된다 [참조예: Keppler et al., Glycobiology 11: 11R (2001); 및 Charter et al., Glycobiology 10: 1049 (2000)]. 그 밖의 다른 아민 반응성 PEG 및 PPG 동족체는 시판품으로 이용할 수 있거나, 이들은 본 기술분야에서 숙련된 전문가가 쉽게 이용할 수 있는 방법에 의해서 제조될 수 있다.
Figure 112006039150479-PCT00059
본 발명을 실시하는데 유용한 변형된 당 포스페이트는 상술한 위치뿐만 아니라 다른 위치에서도 치환될 수 있다. 현재 바람직한 시알산의 치환은 이하의 화학식으로 기술된다:
Figure 112006039150479-PCT00060
상기 식에서, X는 바람직하게는 -O-, -N(H)-, -S-, -CH2-, 및 -N(R)2 (여기에서, 각각의 R은 R1-R5로부터 독립적으로 선택된 구성원이다)로부터 선택된 연결그룹이다. 심볼 Y, Z, A 및 B는 각각 X의 본체에 대해서 상술한 그룹으로부터 선택되는 그룹을 나타낸다. X, Y, Z, A 및 B는 각각 독립적으로 선택되며, 따라서 이들은 동일하거나 상이할 수 있다. 심볼 R1, R2, R3, R4 및 R5는 H, PEG 부위, 치료학적 부위, 생체분자 또는 그 밖의 부위를 나타낸다. 대신으로, 이들 심볼은 PEG 부위, 치료학적 부위, 생체분자 또는 그 밖의 부위에 결합된 링커를 나타낸다.
본 발명에 기술된 컨쥬게이트에 부착된 부위의 예로는 PEG 유도체 (예를 들어, 아실-PEG, 아실-알킬-PEG, 알킬-아실-PEG 카바모일-PEG, 아릴-PEG), PPG 유도체 (예를 들어, 아실-PPG, 아실-알킬-PPG, 알킬-아실-PPG 카바모일-PPG, 아릴-PPG), 치료학적 부위, 진단적 부위, 만노즈-6-포스페이트, 헤파린, SLex, 만노즈, 만노즈-6-포스페이트, 시알릴 루이스 X, FGF, VFGF, 단백질, 콘드로이틴, 케라탄, 더마탄, 알부민, 인테그린, 안테나리 (antennary) 올리고사카라이드, 펩타이드 등이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 다양한 변형성 그룹을 사카라이드 부위에 컨쥬게이트시키는 방법은 본 기술분야에서 숙련된 전문가가 쉽게 이용할 수 있다 [Poly (Ethylene Glycol Chemistry : Biotechnical and Biomedical Applications, J. Milton Harris, Ed., Plenum Pub. Corp., 1992; Poly (Ethylene Glycol) Chemical and Biological Applications, J. Milton Harris, Ed., ACS Symposium Series No. 680, American Chemical Society, 1997; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; 및 Dunn et al., Eds. Polymeric Drugs And Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991].
링커 그룹 (교차결합성 그룹)
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 변형된 당의 제조방법에는 당 잔기에 대한 PEG 부위의 부착, 및 바람직하게는 글리코실트랜스퍼라제에 대한 기질인 안정한 부가물의 형성이 포함된다. 따라서, 종종 링커, 예를 들어, PEG 및 당 부위를 교차결합제와 반응시켜 PEG와 당을 컨쥬게이트시킴으로써 형성된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 변형성 그룹을 카보하이드레이트 부위에 부착시키기 위해서 사용될 수 있는 이작용성 화합물의 예로는 이작용성 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리아미드, 폴리에테르, 폴리에스테르 등이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 카보하이드레이트를 다른 분자에 연결시키는 일반적인 방법은 문헌에 공지되어 있다 [참조예: Lee et al., Biochemistry 28: 1856 (1989); Bhatia et　al., Anal. Biochem . 178: 408 (1989); Janda et al., J. Am. Chem . Soc . 112: 8886 (1990) 및 Bednarski et al., WO 92/18135]. 이하의 설명에서, 반응성 그룹은 발생 초기의 변형된 당의 당 부위 상에서 양성으로 처리된다. 설명의 초점은 설명을 명확하게 하기 위한 것이다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 이 설명이 변형성 그룹 상의 반응성 그룹에도 마찬가지로 해당한다는 것을 이해할 것이다.
다양한 시약을 사용하여 분자내 화학적 교차결합을 갖는 변형된 당의 성분을 변형시킨다 (교차결합성 시약 및 교차결합 방법의 검토를 위해서는 다음을 참조한다: Wold, F., Meth . Enzymol . 25: 623-651, 1972; Weetall, H. H., and Cooney, D. A., In: Enzymes as Drugs. (Holcenberg, and Roberts, eds.) pp. 395-442, Wiley, New York, 1981; Ji, T. H., Meth . Enzymol . 91: 580-609, 1983; Mattson et al., Mol . Biol . Rep. 17: 167-183, 1993, 이들은 모두 본 발명에 참고로 포함된다). 바람직한 교차결합성 시약은 다양한 제로-길이 (zero-length), 호모-이작용성, 및 헤테로-이작용성 교차결합성 시약으로부터 유도된다. 제로-길이 교차결합성 시약에는 외인성 물질의 도입이 없이 두개의 내인성 화학적 그룹의 직접적인 컨쥬게이션이 포함된다. 디설파이드 결합의 형성을 촉진시키는 시약이 이 카테고리에 속한다. 또 다른 예는 카보디이미드와 같은 아미드 결합을 형성시키기 위한 카복실과 일급 아미노 그룹의 축합반응을 유도하는 시약, 에틸클로로포르메이트, 우드워드 시약 (Woodward's reagent) K (2-에틸-5-페닐이속사졸륨-3'-설포네이트) 및 카보닐디이미다졸이다. 이들 화학적 시약 이외에도, 효소 트랜스글루타미나제 (글루타밀-펩타이드-γ-글루타밀트랜스퍼라제; EC 2.3.2.13)가 제로-길이 교차결합성 시약으로 사용될 수 있다. 이 효소는 통상적으로 기질로서 일급 아미노 그룹을 갖는 단백질-결합된 글루타미닐 잔기의 카복스아미드 그룹에서 아실 전이반응을 촉진시킨다. 바람직한 호모- 및 헤테로-이작용성 시약은 두개의 동일하거나, 두개의 상이한 부위를 각각 함유하며, 이들은 아미노, 설프하이드릴, 구아니디노, 인돌 또는 비특이성 그룹에 대해서 반응성일 수 있다.
G- CSF 컨쥬게이트의 정제
재중첩 불용성 G- CSF
박테리아에서 발현된 다수의 재조합 단백질은 박테리아 봉입체에서 불용성 응집체로서 발현된다. 봉입체는 박테리아의 세포질 및 세포형질 공간 둘 다에서 발견되는 단백질 침적물이다 (참조예: Clark, Cur. Op. Biotech. 12:202-207 (2001)). 재조합 G-CSF 단백질은 박테리아성 봉입체에서 발현되며, 본 명세서에는 이들 단백질을 재중첩하여 활성 G-CSF 단백질을 생산하는 방법이 제공되어 있다.
A. 활성 G-CSF를 재중첩시키기 위한 조건
활성 G-CSF 단백질을 박테리아 세포로부터 생산하기 위해서, G-CSF 단백질은 박테리아 봉입체에서 발현되며, 박테리아를 수확하여 붕괴시키고, 봉입체를 분리하여 세척한다. 한가지 구체예에서는 3회의 세척을 수행한다: 일가 염, 예를 들어, 나트륨 클로라이드, 음이온성 세정제, 예를 들어, 트리톤 (Triton) X-100, 이온성 세정제, 예를 들어, 나트륨 데옥시콜레이트 및 EDTA로 된 pH 6.0 내지 9.0 사이의 완충액 중에서 일차 세척; 세정제가 없는 완충액 중에서의 이차 세척; 및 H2O 중에서의 삼차 세척. 그 후, 봉입체 내의 단백질을 가용화시킨다. 가용화는 변성제, 구아니디늄 클로라이드 또는 우레아, 극단의 pH, 또는 세정제 또는 이들의 어떠한 조합을 사용하여서도 수행될 수 있다. 한가지 구체예에서는 5-6 M 구아니딘 HCl 또는 우레아를 사용하여 G-CSF를 가용화시킨다. 또 다른 구체예에서는 DTT가 첨가된다.
가용화시킨 후에, G-CSF 단백질 혼합물로부터 변성제를 제거한다. 변성제 제거는 재중첩성 완충액으로 희석 또는 완충제 교환방법을 포함하는 다양한 방법에 의해서 수행될 수 있다. 완충제 교환방법은 투석, 투석여과, 젤 여과 및 고체 지지체 상에서 단백질의 고정화를 포함한다 (참조예: Clark, Cur. Op. Biotech. 12:202-207 (2001)). 상기 방법 중의 어떤 것이라도 조합하여 변성제를 제거할 수 있다.
G-CSF 단백질에서 디설파이드 결합 형성은 산화환원 커플 (redox couple)을 포함하는 재중첩성 완충액을 첨가함으로써 촉진된다. 산화환원 커플은 환원 및 산화된 글루타치온 ((-JSF-I/GSSG), 시스테인/시스텐, 시스테아민/시스타민, DTT/GSSG, 및 DTE/GSSG를 포함한다 (참조예: Clark, Cur. Op. Biotech. 12:202-207 (2001)). 한가지 구체예에서, 산화환원 커플른 10:1의 비로 된 GSH/GSSG이다.
재중첩은 예를 들어, 6.0 내지 10.0 범위의 pH의 완충액 중에서 수행될 수 있다. 재중첩 완충액은 재중첩을 증진시키기 위한 그 밖의 다른 첨가제, 예를 들어, L-아르기닌 (0.4-1 M); PEG; 우레아 (1-2 M) 및 구아니디늄 클로라이드 (0.5-1.5 M)와 같은 저농도의 변성제; 및 세정제 (예를 들어, Chaps, SDS, CTAB, 라우릴 말토사이드, 트윈 80 및 트리톤 X-100)를 포함할 수 있다.
재중첩시킨 후에, GCSF 단백질을 투석하여 산화환원 커플 또는 그 밖의 다른 원치않는 완충제 성분을 제거할 수 있다. 한가지 구체예에서, 투석은 나트륨 아세테이트, 글리세롤 및 비이온성 세정제, 예를 들어, 트윈-80을 포함하는 완충제를 사용하여 수행한다. 투석한 후에, G-CSF 단백질을 더 정제하고/하거나 이온 교환 크로마토그라피에 의해서 농축시킬 수 있다. 한가지 구체예에서, SP-세파로즈 양이온 교환수지가 사용된다.
숙련된 전문가는, 재중첩된 단백질이 검출가능한 생물학적 활성을 갖는 경우에 단백질이 정확하게 재중첩된 것으로 인식할 것이다. G-CSF 단백질의 경우에, 생물학적 활성은 다양한 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 활성 G-CSF 단백질은 2004년 1월 8일자 미국 특허출원 제 60/535,284 호; 2004년 2월 12일자 60/54411 호; 및 2004년 2월 20일자 대리인 도켓 번호 (Attorney Docket Number) 019957-018820US (이들은 각각 본 발명에 모든 목적으로 참고로 포함된다)에 기술된 O-연결된 글리코실화를 위한 기질이다. G-CSF 단백질 활성은 또한, 랫트에서 세포 증식시험 또는 백혈구 (WBC) 시험을 사용하여 측정될 수 있다 (또한, 2004년 1월 8일자 미국 특허출원 제 60/535,284 호; 2004년 2월 12일자 60/54411 호; 및 2004년 2월 20일자 대리인 도켓 번호 019957-018820US에도 기술됨; 이들은 각각 본 발명에 모든 목적으로 참고로 포함된다). 증식시험 및 WBC 시험은 재중첩된 G-CSF 단백질의 O-연결된 글리코실화의 전 또는 후에 수행될 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트를 분리하기 위한 다른 방법
대신으로, 상기의 방법에 의해서 생산된 생성물은 정제가 없이 사용될 수 있다. 그러나, 생성물을 회수하는 것이 통상적으로 바람직하다. 박층 또는 후층 크로마토그라피, 칼럼 크로마토그라피, 이온 교환 크로마토그라피 또는 막여과와 같이 글리코실화된 사카라이드의 회수를 위한 잘 알려져 있는 표준방법이 사용될 수 있다. 이하의 설명 및 본 명세서에서 인용된 문헌에서와 같이 막여과, 더욱 바람직하게는 역삼투성 막, 또는 회수를 위한 하나 또는 그 이상의 칼럼 크로마토그라피 기술을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 막이 약 3000 내지 약 10,000의 분자량 컷오프를 갖는 막여과를 사용하여 글리코실 트랜스퍼라제와 같은 단백질을 제거할 수 있다. 그 후, 나노여과 또는 역삼투압을 사용하여 염을 제거하고/하거나, 생성물 사카라이드를 정제할 수 있다 (참조예: WO 98/15581). 나노여과막은 사용된 막에 따라서 일가 염을 통과시키지만 다가 염 및 약 100 내지 약 2,000 달톤보다 큰 비하전된 용질은 잔류시키는 역삼투작용 막의 일종이다. 따라서, 전형적인 적용시에 본 발명의 방법에 의해서 제조된 사카라이드는 막 내에 잔류하고, 오염성 염은 이것을 통과하게 될 것이다.
변형된 당단백질이 세포내적으로 생산된다면, 일단계로서 숙주세포이거나 용해된 단편인 미립상 파편은 원심분리 또는 한외여과에 의해서 제거되며; 임의로 단백질은 시판품으로 이용가능한 단백질 농축필터를 사용하여 농축시키고, 이어서 면역친화성 크로마토그라피, 이온교환 칼럼 분획화 (예를 들어, 디에틸아미노에틸 (DEAE), 또는 카복시메틸 또는 설포프로필 그룹을 함유하는 매트릭스 상에서), 블루-세파로즈 (Blue-Sepharose), CM 블루-세파로즈, 모노-Q, 모노-S, 렌틸 렉틴-세파로즈, WGA-세파로즈, Con A-세파로즈, 에테르 토요펄 (Toyopearl), 부틸 토요펄, 페닐 토요펄, 또는 단백질 A 세파로즈 상에서의 크로마토그라피, SDS-PAGE 크로마토그라피, 실리카 크로마토그라피, 크로마토포커싱 (chromatofocusing), 역상 HPLC (예를 들어, 매달린 지방족 그룹을 갖는 실리카겔), 예를 들어 세파덱스 분자체를 사용한 겔여과 또는 크기-배제 크로마토그라피, 폴리펩타이드를 특이적으로 결합시키는 칼럼 상에서의 크로마토그라피, 및 에탄올 또는 암모늄 설페이트 침전으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 단계에 의해서 다른 불순물로부터 폴리펩타이드 변이체를 분리시킬 수 있다.
배양물에서 생성된 변형된 글리코펩타이드는 통상적으로, 세포, 효소 등으로부터의 초기 추출에 이어서 하나 또는 그 이상의 농축, 염석, 수성 이온-교환, 또는 크기-배제 크로마토그라피 단계에 의해서 분리된다. 추가로, 변형된 당단백질은 친화성 크로마토그라피에 의해서 정제될 수 있다. 마지막으로, HPLC가 최종 정제단계를 위해서 사용될 수 있다.
프로테아제 억제제, 예를 들어, 메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)가 단백질분해를 억제하기 위하여 전술한 단계들 중의 어떤 것에라도 포함될 수 있으며, 항생제는 우연한 오염물의 성장을 방지하기 위해서 포함될 수 있다.
또 다른 구체예의 범위에서, 본 발명의 변형된 글리코펩타이드를 생산하는 시스템으로부터의 상등액은 우선 시판품으로 이용가능한 단백질 농축필터, 예를 들어, 아미콘 (Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 한외여과 유니트를 사용하여 농축된다. 농축단계에 이어서, 농축물은 적합한 정제 매트릭스에 적용될 수 있다. 예를 들어, 적합한 친화성 매트릭스는 펩타이드에 대한 리간드, 적합한 지지체에 결합된 렉틴 또는 항체 분자를 포함할 수 있다. 대신으로, 음이온-교환수지, 예를 들어, 펜던트 DEAE 그룹을 갖는 매트릭스 또는 기질이 사용될 수 있다. 적합한 매트릭스에는 아크릴아미드, 아가로즈, 덱스트란, 셀룰로즈, 또는 단백질 정제에 통상적으로 사용되는 그 밖의 타입이 포함된다. 대신으로, 양이온-교환 단계가 사용될 수도 있다. 적합한 양이온 교환기에는 설포프로필 또는 카복시메틸 그룹을 포함하는 다양한 불용성 매트릭스가 포함된다. 설포프로필 그룹이 특히 바람직하다.
마지막으로, 소수성 RP-HPLC 매체, 예를 들어, 펜던트 메틸 또는 그 밖의 다른 지방족 그룹을 갖는 실리카겔을 사용한 하나 또는 그 이상의 RP-HPLC 단계를 이용하여 폴리펩타이드 변이체 조성물을 더 정제할 수 있다. 또한, 전술한 정제단계의 일부 또는 전부는 다양한 조합으로 이용하여 균질한 변형된 당단백질을 제공할 수도 있다.
대규모 발효로부터 제공된 본 발명의 변형된 글리코펩타이드는 문헌 (Urdal et al., J. Chromatog. 296: 171 (1984))에 기술된 방법과 유사한 방법에 의해서 정제될 수 있다. 이 문헌은 정제용 HPLC 칼럼 상에서 재조합체 인간 IL-2의 정제를 위한 2개의 순차적인 RP-HPLC 단계를 기술하고 있다. 대신으로, 친화성 크로마토그라피와 같은 기술을 이용하여 변형된 당단백질을 정제할 수도 있다.
약제학적 조성물
또 다른 관점에서, 본 발명은 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 희석제 및 천연적으로 존재하지 않는 PEG 부위, 치료학적 부위 또는 생체분자와 글리코실화 또는 비-글리코실화된 펩타이드 사이의 공유적 컨쥬게이트를 포함한다. 폴리머, 치료학적 부위 또는 생체분자는 G-CSF 펩타이드 및 폴리머, 치료학적 부위 또는 생체분자 둘 다의 사이에 삽입되어 이들에 공유적으로 연결된 온전한 글리코실 연결그룹을 통해서 G-CSF 펩타이드에 컨쥬게이트된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 약물 송달 시스템에서 사용하기에 적합하다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985))에 기술되어 있다. 약물 송달을 위한 방법의 간단한 검토를 위해서는 문헌 (Langer, Science 249:1527-1533 (1990))을 참고로 한다.
약제학적 조성물은 예를 들어, 국소, 경구, 비내, 정맥내, 두개내, 복강내, 피하 또는 근육내 투여를 포함한 어떤 적절한 투여방식으로도 제제화될 수 있다. 피하 주사와 같은 비경구 투여를 위해서, 캐리어는 물, 식염수, 알콜, 지방, 왁스 또는 완충제를 포함한다. 경구 투여를 위해서는, 상기의 캐리어 또는 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 탈크, 셀룰로즈, 글루코즈, 슈크로즈, 및 마그네슘 카보네이트와 같은 고체 캐리어 중의 어떤 것이라도 사용될 수 있다. 생물분해성 미립구 (예를 들어, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)가 또한, 본 발명의 약제학적 조성물을 위한 캐리어로서 사용될 수도 있다. 적합한 생물분해성 미립구는 예를 들어, 미국 특허 제 4,897,268 및 5,075,109 호에 기술되어 있다.
통상적으로, 약제학적 조성물은 비경구적으로, 예를 들어, 정맥내로 투여된다. 따라서, 본 발명은 허용되는 캐리어, 바람직하게는 수성 캐리어, 예를 들어, 물, 완충된 물, 식염수, PBS 등에 용해되거나 현탁된 화합물을 포함하는 비경구 투여용 조성물을 제공한다. 조성물은 생리적 조건에 근접하도록 하는데 필요한 것으로서 약제학적으로 허용되는 보조성분, 예를 들어, pH 조정 및 완충제, 장성 조정제, 습윤제, 세정제 등을 함유할 수 있다.
이들 조성물은 통상적인 멸균기술에 의해서 멸균될 수 있거나, 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 그대로, 또는 동결건조하여 포장될 수 있으며, 동결건조된 제제는 투여하기 전에 멸균 수성 캐리어와 배합된다. 제제의 pH는 일반적으로 3 내지 11, 더욱 바람직하게는 5 내지 9, 가장 바람직하게는 7 및 8일 수 있다.
몇가지 구체예에서, 본 발명의 글리코펩타이드는 표준 소포 (vesicle)-형성 리피드로부터 형성된 리포좀 내에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Szoka et al., Ann. Rev. Biophys . Bioeng. 9: 467 (1980), 미국 특허 제 4,235,871, 4,501,728 및 4,837,028 호)에 기술된 바와 같은 다양한 방법이 리포좀을 제조하기 위해서 이용될 수 있다. 다양한 표적화제 (예를 들어, 본 발명의 시알릴 갈락토사이드)를 사용한 리포좀의 표적화는 본 기술분야에서 잘 알려져 있다 (참조예: 미국 특허 제 4,957,773 및 4,603,044 호).
표적화제를 리포좀에 커플링시키는 표준방법이 사용될 수 있다. 이들 방법은 일반적으로, 표적화제의 부착을 위해서 활성화될 수 있는 포스파티딜에탄올아민과 같은 리피드 성분, 또는 본 발명의 리피드-유도된 글리코펩타이드와 같은 유도체화된 친유성 화합물의 리포좀 내로의 혼입을 포함한다.
표적화 기전은 일반적으로, 표적부위를 표적, 예를 들어, 세포표면 수용체와의 상호작용에 이용할 수 있도록 하는 방식으로 리포좀의 표면 상에 표적화제를 배치시키는 것을 필요로 한다. 본 발명의 카보하이드레이트는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 방법 (예를 들어, 리포좀 상에 존재하는 하이드록실 그룹과 장쇄 알킬 할라이드 또는 지방산 각각과의 알킬화 또는 아실화 반응)을 사용하여 리포좀이 형성되기 전에 리피드 분자에 부착될 수 있다. 대신으로, 리포좀은 연결기 부분을 막을 형성하는 시기에 막에 우선 혼입시키는 방식으로 만들어질 수 있다. 연결기 부분은 막 내에 단단하게 포매되고 고정된 친유성 부분을 가져야 한다. 이것은 또한, 리포좀의 수성 표면 상에서 화학적으로 이용할 수 있는 반응성 부분을 반드시 가져야 한다. 반응성 부분은 이것이 추후에 첨가되는 표적화제 또는 카보하이드레이트와 안정한 화학적 결합을 형성하는데 화학적으로 적합할 수 있도록 선택된다. 몇몇 경우에, 표적화제는 연결기 분자에 직접 부착시킬 수도 있지만, 대부분의 경우에는 화학적 브릿지로 작용하여 막 내에 있는 연결기 분자를 소포 표면 밖으로 삼차원적으로 연장된 표적화제 또는 카보하이드레이트와 연결시키는 제 3의 분자를 사용하는 것이 더 적합하다.
본 발명의 방법에 의해서 제조된 화합물은 또한, 진단적 시약으로서의 용도를 가질 수 있다. 예를 들어, 표지된 화합물을 사용하여 염증을 갖는 것으로 의심되는 환자에게서 염증 또는 종양 전이 영역의 위치를 정할 수 있다. 이러한 용도를 위해서, 화합물은 125I, 14C, 또는 삼중수소로 표지될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에서 사용된 활성성분은 예를 들어, 배란을 증가시키기 위하여 난포 자극 호르몬의 생물학적 특성을 갖는 글리코페질화된 G-CSF 및 그의 유도체이다. 바람직하게, 본 발명의 G-CSF 조성물은 비경구적으로 투여된다 (예를 들어, IV, IM, SC 또는 IP). 효과적인 투약량은 치료할 상태 및 투여의 경로에 따라서 상당히 변화하는 것으로 예상되지만, 체중 ㎏당, 활성물질 약 0.1 (~7 U) 내지 100 (~7000 U) ㎍의 범위일 것으로 예상된다. 빈혈성 상태의 치료에 바람직한 용량은 1주일에 3회, 약 50 내지 약 300 유니트/㎏이다. 본 발명은 증진된 생체내 체류시간을 갖는 G-CSF를 제공하기 때문에, 본 발명의 조성물이 투여되는 경우에 언급된 투약량은 임의로 저하된다.
이하의 실시예는 본 발명의 컨쥬게이트 및 방법을 설명하기 위하여 제시된 것이지만, 특허청구된 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
CHO 세포에서 생산된 G-CSF의 글리코페질화
a. 아시알로-과립구-콜로니 자극인자 (G-CSF)의 제조
CHO 세포에서 생산된 G-CSF를 50 mM 트리스, 50 mM 트리스-HCl pH 7.4, 0.15 M NaCl, 5 mM CaCl2에 2.5 ㎎/㎖로 용해시키고, 센트리콘 플러스 (Centricon Plus) 20 원심분리 필터에서 500 ㎕로 농축시켰다. 용액을 300 mU/㎖ 뉴라미니다제 II (비브리오 콜레라에 (Vibrio cholerae))와 함께 32℃에서 16시간 동안 배양하였다. 반응을 모니터하기 위하여 반응액의 소량의 분취액을 적절한 완충액으로 희석하고, IEF 젤을 수행하였다. 그 후, 반응혼합물을 전세척한 N-(p-아미노페닐)옥삼산-아가로즈 컨쥬게이트 (800 ㎕/㎖ 반응 용적)에 첨가하고, 세척된 비드를 4℃에서 24시간 동안 온화하게 회전시켰다. 혼합물을 10,000 rpm으로 원심분리하고, 상등액을 수거하였다. 비드를 트리스-EDTA 완충액으로 3회, 0.4 ㎖ 트리스-EDTA 완충액으로 1회 및 0.2 ㎖의 트리스-EDTA 완충액으로 1회 세척하고, 모든 상등액을 모았다. 상등액을 4℃에서, 50 mM 트리스-HCl pH 7.4, 1 M NaCl, 0.05% NaN3에 대해서 투석하고, 50 mM 트리스-HCl pH 7.4, 1 M NaCl, 0.05% NaN3에 대해서 2회 더 투석하였다. 그 후, 투석된 용액을 센트리콘 플러스 20 원심분리 필터를 사용하여 농축시키고, -20℃에서 저장하였다. IEF 젤에 대한 조건은 인비트로겐 (Invitrogen)에 의해서 제공된 방법 및 시약에 따라서 수행하였다. 천연 및 탈시알릴화된 G-CSF의 샘플을 물에 대하여 투석하고, MALDI-TOF-MS에 의해서 분석하였다.
b. G- CSF -(α2,3)- 시알릴 -PEG의 제조
탈시알릴화된 G-CSF를 50 mM 트리스-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05% NaN3, pH 7.2 중에 2.5 ㎎/㎖로 용해시켰다. 이 용액을 1 mM CMP-시알산-PEG 및 0.1 U/㎖의 ST3Gal1과 함께 32℃에서 2일 동안 배양하였다. 시알산-PEG의 혼입을 모니터하기 위해서, 반응액의 소량의 분취액에 CMP-SA-PEG-형광 리간드를 첨가하고, 펩타이드에 혼입된 라벨을 PBS 완충액 (pH 7.1)을 사용하여 토소 하스 (Toso Haas) G3000SW 분석용 칼럼 상에서 젤 여과에 의해 유리 라벨로부터 분리시켰다. 펩타이드에 대한 형광성 라벨 혼입은 인-라인 (in-line) 형광성 검출기를 사용하여 정량화하였다. 2일 후에, 반응혼합물을 PBS 완충액 (pH 7.1)을 사용하는 토소 하스 G3000SW 정제용 칼럼을 사용하고 UV 흡수를 기준으로 분획을 수거함으로써 정제하였다. 반응의 생성물을 인비트로겐에 의해서 제공된 방법 및 시약에 따라서 SDS-PAGE 및 IEF 분석을 사용하여 분석하였다. 천연 및 페질화된 G-CSF의 샘플을 물에 대해서 투석하고, MALDI-TOF MS에 의해서 분석하였다.
c. G- CSF -(α2,8)- 시알릴 -PEG의 제조
α2,3-시알릴화된 O-연결된 글리칸을 함유하는 CHO 세포 내에서 생산된 G-CSF를 50 mM 트리스-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05% NaN3, pH 7.2 중에 2.5 ㎎/㎖로 용해시켰다. 이 용액을 1 mM CMP-시알산-PEG 및 0.1 U/㎖의 CST-II와 함께 32℃에서 2일 동안 배양하였다. 시알산-PEG의 혼입을 모니터하기 위해서, 반응액의 소량의 분취액에 CMP-SA-PEG-형광 리간드를 첨가하고, 펩타이드에 혼입된 라벨을 PBS 완충액 (pH 7.1)을 사용하여 토소 하스 G3000SW 분석용 칼럼 상에서 젤 여과에 의해 유리 라벨로부터 분리시켰다. 펩타이드에 대한 형광성 라벨 혼입은 인-라인 형광성 검출기를 사용하여 정량화하였다. 2일 후에, 반응혼합물을 PBS 완충액 (pH 7.1)을 사용하는 토소 하스 G3000SW 정제용 칼럼을 사용하고 UV 흡수를 기준으로 분획을 수거함으로써 정제하였다. 반응의 생성물을 인비트로겐에 의해서 제공된 방법 및 시약에 따라서 SDS-PAGE 및 IEF 분석을 사용하여 분석하였다. 천연 및 페질화된 G-CSF의 샘플을 물에 대해서 투석하고, MALDI-TOF MS에 의해서 분석하였다.
d. G- CSF -(α2,6)- 시알릴 -PEG의 제조
단지 O-연결된 GalNAc 만을 함유하는 G-CSF를 50 mM 트리스-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05% NaN3, pH 7.2 중에 2.5 ㎎/㎖로 용해시켰다. 이 용액을 1 mM CMP-시알산-PEG 및 0.1 U/㎖의 ST6GalNacI 또는 II와 함께 32℃에서 2일 동안 배양하였다. 시알산-PEG의 혼입을 모니터하기 위해서, 반응액의 소량의 분취액에 CMP-SA-PEG-형광 리간드를 첨가하고, 펩타이드에 혼입된 라벨을 PBS 완충액 (pH 7.1)을 사용하여 토소 하스 G3000SW 분석용 칼럼 상에서 젤 여과에 의해 유리 라벨로부터 분리시켰다. 펩타이드에 대한 형광성 라벨 혼입은 인-라인 형광성 검출기를 사용하여 정량화하였다. 2일 후에, 반응혼합물을 PBS 완충액 (pH 7.1)을 사용하는 토소 하스 G3000SW 정제용 칼럼을 사용하고 UV 흡수를 기준으로 분획을 수거함으로써 정제하였다. 반응의 생성물을 인비트로겐에 의해서 제공된 방법 및 시약에 따라서 SDS- PAGE 및 IEF 분석을 사용하여 분석하였다. 천연 및 페질화된 G-CSF의 샘플을 물에 대해서 투석하고, MALDI-TOF MS에 의해서 분석하였다.
CHO 세포에서 생산된 G-CSF를 아트로박터 시알리다제 (Arthrobacter sialidase)로 처리한 다음에, 슈퍼덱스 75 상에서 크기 배제함으로써 정제하고, ST3Gal1 또는 ST3Gal2으로 처리한 다음에 CMP-SA-PAGE 20 Kda로 처리하였다. 생성된 분자를 이온 교환 및 젤 여과에 의해서 정제하고, SDS PAGE에 의한 분석으로 페질화 반응이 완료되었음을 확인하였다. 이것은 O-연결된 글리칸의 글리코페질화 반응의 첫번째 증거이다.
실시예 2
재조합 G-CSF 발현, 재중첩 및 정제
● 원심분리에 의해서 세포를 수거하고, 상등액은 버린다. 다양한 배지 상에서 증식시킨 결과는 도 9에 나타내었다.
● 세포 펠릿을 10 mM 트리스 pH 7.4, 75 mM NaCl, 5 mM EDTA에 세포 펠릿을 현탁시킨다 - 10 ㎖/g을 사용한다 (용해 완충액).
● 세포를 마이크로유동화 (microfluidize)시킨다 (프렌치 프레스 (French press)도 또한 작용시킨다).
● 4℃에서 5,000 RPM으로 30분 동안 원심분리시킨다 - 상등액은 버린다.
● 펠릿을 용해 완충액에 재현탁시키고, 상기한 바와 같이 원심분리시킨다.
● IB's를 25 mM 트리스 pH 8, 100 mM NaCl, 1% TX-100, 1% NaDOC, 5 mM EDTA에서 세척한다. 펠릿을 파이펫팅 (pipetting)하고, 소용돌이를 일으킴으로써 재현탁시킨다.
4℃에서 5,000 RPM으로 15분 동안 원심분리한다. 이 단계를 한번 더 반복한다 (총 2회 세척).
● 펠릿을 25 mM 트리스 pH 8, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA 중에서 2회 세척하여 세정제를 제거하고, 상기한 바와 같이 원심분리한다.
● 펠릿을 dH2O 중에서 재현탁하여 분취하고, 상기한 바와 같이 원심분리한다. 펠릿을 -20℃에서 동결시킨다.
● IB's를 파이펫터 (pipettor)를 사용하여 6 M 구아니딘 HCl, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, 100 mM 트리스 pH 8, 10 mM DTT 중에 20 ㎎/㎖로 재현탁시키고, 이어서 실온에서 2-4시간 동안 회전시킨다.
● 가용화된 IB's를 14,000 RPM으로 실온에서 1분 동안 원심분리시킨다. 상등액은 남겨둔다.
● 상등액을 재중첩 완충액 50 mM MES pH 6, 240 mM NaCl, 10 mM에 의해서 1:20으로 희석한다.
● KCl, 0.3 mM 라우릴 말토사이드, 0.055% PEG3350, 1 mM GSH, 0.1 M GSSG, 0.5 M 아르기닌과 함께 4℃에서 밤새 회전기 상에서 재중첩시킨다.
● 재중첩물을 투석을 위해서 피어스 스네이크스킨 (Pierce snakeskin) 7 kDa MWCO에 전이시킨다. 투석 완충액 20 mM NaOAc pH 4, 50 mM NaCl, 0.005% 트윈 -80, 0.1 mM EDTA. 4℃에서 적어도 200배 과량에 대하여 총 3회 투석한다.
● 투석한 후에, 물질을 0.45 μM 필터를 통해서 통과시킨다.
● SP-세파로즈 칼럼을 투석 완충액으로 평형화시키고, 샘플을 적용한다. 칼럼을 투석 완충액으로 세척하고, 1 M NaCl 까지의 염 구배를 함유하는 투석 완충액으로 용출시킨다. 단백질은 일반적으로 300-400 mM NaCl로 용출시킨다.
● 물질을 SDS-PAGE 상에서 검사한다 (참조예: 도 10).
실시예 3
2개의 포트에서 2 효소 방법
이하의 실시예는 2개의 순차적 단계에서 G-CSF-GalNSc-SA-PEG를 제조하는 방법을 설명한 것이며, 여기에서 각각의 중간체 생성물은 다음 단계에서 사용하기 전에 정제된다.
a. GalNAc-T2를 사용하여 G-CSF 및 UDP-GalNAc로부터 G-CSF-GalNAc (pH 6.2)의 제조
3.2 ㎖의 패키지화된 완충액 중의 G-CSF (960 ㎎)를 UF 필터 (MWCO 5K)를 사용하여 한외여과하여 농축시킨 다음에, 1 ㎖의 25 mM MES 완충액 (pH 6.2, 0.005% NaN3)로 재구성하였다. 그 후, UDP-GalNAc (6 ㎎, 9.24 mM), GalNAc-T2 (40 ㎕, 0.04 U) 및 100 mM MnCl2 (40 ㎕, 4 mM)를 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 배양하였다.
24시간 후에, MALDI는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 반응혼합물을 SEC (Superdex 75 및 Superdex 200) 및 PBS (포스페이트 완충된 식염수, pH 4.9 및 0.005% 트윈 80)를 함유하는 용출 완충액을 사용하는 HPLC 정제에 직접 적용하였다. G-CSF-GalNAc의 수집된 피크를 센트리콘 5 KDa MWCO 필터를 사용하여 약 150 ㎕로 농축시키고, 용적을 PBS (포스페이트 완충된 식염수, pH 4.9 및 0.005% 트윈 80)을 사용하여 1 ㎖로 조정하였다. 최종 단백질 농도 1 ㎎/㎖ (A280), 수율 100%. 샘플은 4℃에서 저장하였다.
b. 정제된 G-CSF-GalNAc, CMP-SA-PEG (20 KDa) 및 마우스 ST6GalNAc-T1 (pH 6.2)을 사용한 G-CSF-GalNAc-SA-PEG의 제조
1 ㎎의 단백질을 함유하는 G-CSF-GalNAc 용액을 25 mM MES 완충액 (pH 6.2, 0.005% NaN3)로 완충액 교환하고, CMP-SA-PEG (20 KDa) (5 ㎎, 0.25 μmol)을 첨가하였다. 용해시킨 후에, MnCl2 (100 mcL, 100mM 용액) 및 ST6GalNAc-I (100 mcL, 마우스 효소)를 첨가하고, 반응혼합물을 32℃에서 3일 동안 서서히 진동시켰다. 반응혼합물을 한외여과 (MWCO 5K)에 의해서 농축시키고, 25 mM NaOAc (pH 4.9)로 1회 완충액 교환한 다음에, 총용적 1 ㎖로 농축시켰다. 그 후, 생성물을 체류시간 13-18분으로 SP-세파로즈 (A: 25 mM NaOAc + 0.005% 트윈-80 pH 4.5; B: 25 mM NaOAc + 0.005% 트윈-80 pH 4.5 + 2 M NaCl) 및 체류시간 8.6분 (superdex 75, 유속 1 ㎖/분)으로 SEC (Superdex 75; PBS-pH 7.2, 0.005% 트윈 80)를 사용하여 정제 하였다. 목적하는 분획을 수집하여 0.5 ㎖로 농축시키고, 4℃에서 저장하였다.
실시예 4
효소의 동시 첨가에 의하여 G-CSF-GalNAc-SA-PEG를 제조하는 단일 포트 방법
이하의 실시예는 효소의 동시 첨가를 사용하여 1개의 포트에서 G-CSF-GalNSc-SA-PEG를 제조하는 방법을 설명한 것이다.
1. 마우스 ST6GalNAc-I (pH 6.0)을 사용한 단일 포트 방법
G-CSF (3.2 ㎖의 생성물 제제 완충액 중에 용해된 960 ㎍의 단백질)를 한외여과 (MWCO 5K)에 의해서 0.5 ㎖로 농축시키고, 25 mM MES 완충액 (pH 6.0, 0.005% NaN3)으로 약 1 ㎖의 총용적으로 또는 1 ㎎/㎖의 단백질 농도로 재구성하였다. 그 후, UDP-GalNAc (6 ㎎, 9.21 μmol), GalNAc-T2 (80 ㎕, 80 mU), CMP-SA-PEG (20 KDa) (6 ㎎, 0.3 μmol) 및 마우스 효소 ST6GalNAc-I (120 ㎕) 및 100 mM MnCl2 (50 ㎕)를 첨가하였다. 용액을 32℃에서 48시간 동안 진동시키고, SP-세파로즈 상에서 표준 크로마토그라피 방법을 사용하여 정제하였다. 총 0.5 ㎎의 단백질 (A280) 또는 약 50% 총수율을 수득하였다. 생성물 구조는 MALDI 및 SDS-PAGE 둘 다에 의해서 분석함으로써 확인되었다.
2. 닭 ST6GalNAc-I (pH 6.0)을 사용한 단일 포트 방법
14.4 ㎎의 G-CSF를 3 ㎖ 최종 용적으로 농축시키고, 25 mM MES 완충액 (pH
6.0, 0.005% NaN3, 0.004% 트윈 80)으로 완충액 교환하고, 용적을 13 ㎖로 조정하였다. 그 후, UDP-GalNAc (90 ㎎, 150 μmole), GalNAc-T2 (0.59 U), CMP-SA-PEG-20 KDa (90 ㎎), 닭 ST6GalNAc-I (0.44 U) 및 100 mM MnCl2 (600 mcL)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 60시간 동안 정치시켰다. 그 후, 반응혼합물을 UF (MWCO 5K) 및 원심분리를 사용하여 농축시켰다. 잔류물 (약 2 ㎖)을 25 mM NaOAc 완충액 (pH 4.5)에 용해시키고, 다시 5 ㎖의 최종 용적으로 농축시켰다. 이 샘플을 약 10-23분 동안 SP-세파로즈, SEC (Superdex 75, 17분, 유속 0.5 ㎖/분) 및 추가의 SEC (Superdex 200, 23분, 유속 0.5 ㎖/분)를 사용해서 정제하여 3.6 ㎎ (총수율 25%)의 G-CSF-GalNAc-SA-PEG-20 KDa (A280 및 BCA 방법)을 수득하였다.
실시예 5
효소의 순차적 첨가에 의하여 G-CSF-GalNAc-Gal-SA-PEG를 제조하는 단일 포트 방법
이하의 실시예는 효소의 순차적 첨가를 사용하여 1개의 포트에서 G-CSF-GalNSc-Gal-SA-PEG를 제조하는 방법을 설명한 것이다.
1. GalNAc-G-CSF를 출발물질로 함
a. GalNAc-T2를 사용하여 G-CSF 및 UDP-GalNAc로부터 G-CSF-GalNAc (pH 6.2)의 제조
3.2 ㎖의 패키지화된 완충액 중의 G-CSF (960 ㎍)를 UF 필터 (MWCO 5K)를 사용하여 한외여과함으로써 농축시킨 다음에, 1 ㎖의 25 mM MES 완충액 (pH 6.2, 0.005% NaN3)으로 재구성하였다. 그 후, UDP-GalNAc (6 ㎎, 9.24 mM), GalNAc-T2 (40 ㎕, 0.04 U) 및 100 mM MnCl2 (40 ㎕, 4 mM)를 첨가하고, 생성된 용액을 실온에 서 배양하였다.
b. G-CSF-GalNAc; UDP-갈락토즈, SA-PEG-20 K달톤 및 적절한 효소로부터 G-CSF-GalNAc-Gal-SA-PEG의 제조
UDP-갈락토즈 (4 ㎎, 6.5 μmoles), 코어-1-Gal-T (320 ㎕, 160 mU), CMP-SA-PEG-20 KDa (8 ㎎, 0.04 μmole), ST3Gal2 (80 ㎕, 0.07 mU) 및 100 mM MnCl2 (600 mcL)를 상기 단계 a로부터 수득된 1.5 ㎖의 25 mM MES 완충액 (pH 6.0) 중의 G-CSF-GalNAc (1.5 ㎎)의 조 반응혼합물에 직접 첨가하였다. 생성된 혼합물을 32℃에서 60시간 동안 배양하였다. 반응혼합물을 원심분리하고, 용액을 한외여과 (MWCO 5K)를 사용하여 0.2 ㎖로 농축시킨 다음에, 25 mM NaOAc (pH 4.5)에 의해서 1 ㎖의 최종 용적으로 재용해시켰다. 생성물을 SP-세파로즈 (체류시간 10-15분)를 사용하여 정제하고, 피크 분획을 스핀 필터 (spin filter; MWCO 5K)를 사용하여 농축시키고, 잔류물을 SEC (Superdex 75, 체류시간 10.2분)를 사용하여 더 정제하였다. 스핀 필터 (MWCO 5K)를 사용하여 농축시킨 후에, 단백질을 PBS, 2.5% 만니톨, 0.005% 폴리소르베이트, pH 6.5에 의한 제제 완충액을 사용하여 1 ㎖로 희석하고, ㎖당 850 ㎍ 단백질의 단백질 농도로 제제화하였다 (A280). 총수율은 55%였다.
실시예 6
효소의 동시 첨가에 의하여 G-CSF-GalNAc-Gal-SA-PEG를 제조하는 단일 포트 방법
a. G-CSF를 출발물질로 함
G-CSF (960 ㎍, 3.2 ㎖)를 한외여과 (MWCO 5K)에 의해서 농축시키고, 25 mM Mes 완충액 (pH 6.0, 0.005% NaN3)으로 재구성하였다. G-CSF 용액의 총용적은 약 1 ㎎/㎖였다. UDP-GalNAc (6 ㎎), GalNAc-T2 (80 ㎕, ~80 μU), UDP-Gal (6 ㎎), 코어 GalT (160 ㎕, 80 μU), CMP-SA-PEG (20 K) (6 ㎎) 및 2,3-(O)-시알릴트랜스퍼라제 (160 ㎕, 120 μU), 100 mM MnCl2 (40 ㎕)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 32℃에서 48시간 동안 배양하였다. 정제는 IEX 및 SEC를 사용하여 후술하는 바와 같이 수행되었다. 생성물을 함유하는 분획을 한외여과 (MWCO 5K)를 사용하여 농축시키고, 용적은 완충액을 사용하여 약 1 ㎖로 조정하였다. 단백질 농도는 A280에 의해서 0.392 ㎎/㎖인 것으로 측정되었으며, G-CSF로부터의 총수율 40%를 제공하였다.
본 발명에 기술된 예 및 구체예는 단지 설명을 목적으로 하는 것이며, 이것에 비추어 다양한 변형 또는 변경이 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 제안될 수 있고, 이들은 본 출원의 의의 및 범위, 및 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 포함되는 것으로 이해된다. 본 발명에서 인용된 모든 문헌, 특허 및 특허출원은 모든 목적에서 온전히 그대로 여기에 참고로 포함된다.

Claims (28)

  1. 하기 화학식의 부위를 포함하는 과립구 콜로니 자극인자 펩타이드.
    Figure 112006039150479-PCT00061
    상기 식에서,
    D는 -OH 및 R1-L-HN-로부터 선택된 구성원이며;
    G는 R1-L- 및 -C(O)(C1-C6)알킬로부터 선택된 구성원이고;
    R1은 직쇄 또는 측쇄 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 포함하는 부위로부터 선택된 구성원을 포함하는 부위이며;
    L은 결합, 치환되거나 비치환된 알킬 및 치환되거나 비치환된 헤테로알칼로부터 선택된 구성원인 링커이며,
    단 D가 OH인 경우에 G는 R1-L-이고, G가 -C(O)(C1-C6)알킬인 경우에 D는 R1-L-NH-이다.
  2. 제 1 항에 있어서, L-R1이 하기 화학식을 갖는 펩타이드.
    Figure 112006039150479-PCT00062
    상기 식에서,
    a는 0 내지 20의 정수이다.
  3. 제 1 항에 있어서, R1이 하기 화학식의 그룹들로부터 선택된 구성원인 구조를 갖는 펩타이드.
    Figure 112006039150479-PCT00063
    상기 식에서,
    e 및 f는 독립적으로 1 내지 2500으로부터 선택된 정수이고;
    q는 0 내지 20의 정수이다.
  4. 제 1 항에 있어서, R1이 하기 화학식의 그룹들로부터 선택된 구성원인 구조를 갖는 펩타이드.
    Figure 112006039150479-PCT00064
    상기 식에서,
    e, f 및 f'는 독립적으로 1 내지 2500으로부터 선택된 정수이며;
    q 및 q'는 독립적으로 1 내지 20으로부터 선택된 정수이다.
  5. 제 1 항에 있어서, R1이 하기 화학식의 그룹들로부터 선택된 구성원인 구조를 갖는 펩타이드.
    Figure 112006039150479-PCT00065
    상기 식에서,
    e, f 및 f'는 독립적으로 1 내지 2500으로부터 선택된 정수이고;
    q, q' 및 q"는 독립적으로 1 내지 20으로부터 선택된 정수이다.
  6. 제 1 항에 있어서, R1이 하기 화학식의 그룹들로부터 선택된 구성원인 구조를 갖는 펩타이드.
    Figure 112006039150479-PCT00066
    상기 식에서,
    e 및 f는 독립적으로 1 내지 2500으로부터 선택된 정수이다.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기의 부위가 하기 화학식을 갖는 G-CSF 펩타이드.
    Figure 112006039150479-PCT00067
  8. 제 1 항에 있어서, 상기의 부위가 하기 화학식을 갖는 G-CSF 펩타이드.
    Figure 112006039150479-PCT00068
  9. 제 1 항에 있어서, 상기의 부위가 하기 화학식을 갖는 G-CSF 펩타이드.
    Figure 112006039150479-PCT00069
    상기 식에서,
    AA는 상기 펩타이드의 아미노산 잔기이다.
  10. 제 9 항에 있어서, 아미노산 잔기가 세린 및 트레오닌으로부터 선택된 구성원인 G-CSF 펩타이드.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드가 SEQ. ID. NO:1의 아미노산 서열을 갖는 G-CSF 펩타이드.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 아미노산 잔기가 SEQ. ID. NO:1의 133 위치에서 트레오닌인 G-CSF 펩타이드.
  13. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:1 및 SEQ. ID. NO:2로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 부위가 하기 화학식을 갖는 G-CSF 펩타이드.
    Figure 112006039150479-PCT00070
    상기 식에서,
    a, b, c, d, i, r, s, t, 및 u는 독립적으로 0 및 1로부터 선택된 정수이며;
    q는 1이고;
    e, f, g, 및 h는 독립적으로 0 내지 6으로부터 선택된 구성원이며;
    j, k, l, 및 m은 독립적으로 0 및 100으로부터 선택된 구성원이고;
    v, w, x, 및 y는 독립적으로 0 및 1로부터 선택되며, v, w, x 및 y 중의 적 어도 하나는 1이고;
    AA는 G-CSF 펩타이드의 아미노산 잔기이며;
    Sia-(R)은 하기 화학식을 가지고:
    Figure 112006039150479-PCT00071
    여기에서
    D는 -OH 및 R1-L-HN-로부터 선택된 구성원이며;
    G는 R1-L- 및 -C(O)(C1-C6)알킬로부터 선택된 구성원이고;
    R1은 직쇄 또는 측쇄 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기로부터 선택된 구성원을 포함하는 부위이며;
    L은 결합, 치환되거나 비치환된 알킬 및 치환되거나 비치환된 헤테로알킬로부터 선택된 구성원인 링커이고,
    단 D가 OH인 경우에 G는 R1-L-이고, G가 -C(O)(C1-C6)알킬인 경우에 D는 R1-L-NH-이다.
  15. 제 14 항에 있어서, 아미노산 잔기가 아스파라진 잔기인 펩타이드.
  16. 제 1 항에 있어서, 생물활성 과립구 콜로니 자극인자 펩타이드인 펩타이드.
  17. (a) 기질 G-CSF 펩타이드를 전이에 적절한 조건 하에서, 하기 화학식을 갖는 PEG-시알산 공여체 부위.
    Figure 112006039150479-PCT00072
    및 G-CSF 펩타이드의 아미노산 또는 글리코실 잔기 상에 PEG 시알산을 전이시키는 효소와 접촉시키는 것을 포함하여, 하기 화학식의 부위를 포함하는 G-CSF 펩타이드 컨쥬게이트를 제조하는 방법:
    Figure 112006039150479-PCT00073
    상기 식에서,
    D는 -OH 및 R1-L-HN-로부터 선택된 구성원이며;
    G는 R1-L- 및 -C(O)(C1-C6)알킬로부터 선택된 구성원이고;
    R1은 직쇄 또는 측쇄 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기로부터 선택된 구성원을 포함 하는 부위이며;
    L은 결합, 치환되거나 비치환된 알킬 및 치환되거나 비치환된 헤테로알칼로부터 선택된 구성원인 링커이며,
    단 D가 OH인 경우에 G는 R1-L-이고, G가 -C(O)(C1-C6)알킬인 경우에 D는 R1-L-NH-이다.
  18. 제 17 항에 있어서, L-R1이 하기 화학식을 갖는 방법.
    Figure 112006039150479-PCT00074
    상기 식에서,
    a는 0 내지 20의 정수이다.
  19. 제 17 항에 있어서, R1이 하기 화학식의 그룹들로부터 선택된 구성원인 구조를 갖는 방법.
    Figure 112006039150479-PCT00075
    상기 식에서,
    e 및 f는 독립적으로 1 내지 2500으로부터 선택된 정수이고;
    q는 0 내지 20의 정수이다.
  20. 제 17 항에 있어서, R1이 하기 화학식의 그룹들로부터 선택된 구성원인 구조를 갖는 방법.
    Figure 112006039150479-PCT00076
    상기 식에서,
    e, f 및 f'는 독립적으로 1 내지 2500으로부터 선택된 정수이며;
    q 및 q'는 독립적으로 1 내지 20으로부터 선택된 정수이다.
  21. 제 17 항에 있어서, R1이 하기 화학식의 그룹들로부터 선택된 구성원인 구조를 갖는 방법.
    Figure 112006039150479-PCT00077
    상기 식에서,
    e, f 및 f'는 독립적으로 1 내지 2500으로부터 선택된 정수이고;
    q, q' 및 q"는 독립적으로 1 내지 20으로부터 선택된 정수이다.
  22. 제 17 항에 있어서, R1이 하기 화학식의 그룹들로부터 선택된 구성원인 구조를 갖는 방법.
    Figure 112006039150479-PCT00078
    상기 식에서,
    e 및 f는 독립적으로 1 내지 2500으로부터 선택된 정수이다.
  23. 제 17 항에 있어서, 단계 (a) 이전에 추가로 (b) 상기 기질 과립구 콜로니 자극인자 펩타이드를 적합한 숙주에서 발현시키는 단계를 포함하는 방법.
  24. 제 17 항에 있어서, 숙주가 곤충 세포 및 포유동물 세포로부터 선택되는 방법.
  25. 제 1 항에 따르는 펩타이드를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하여, 포유동물에게서 염증성 백혈구 생산을 자극하는 방법.
  26. 피검자에게서 감염을 개선시키는데 효과적인 양의 제 1 항에 따르는 펩타이드를 피검자에게 투여하는 단계를 포함하여, 필요한 피검자에게서 감염을 치료하는 방법.
  27. 제 1 항에 따르는 과립구 콜로니 자극인자 펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 캐리어를 포함하는 약제학적 제제.
  28. (a) G-CSF 단백질을 가용화시키고;
    (b) 가용성 G-CSF 단백질을 산화환원 커플을 포함하는 완충제와 접촉시켜 G-CSF 단백질을 재중첩 (여기에서, 재중첩 G-CSF 단백질은 생물학적으로 활성이다)시키는 단계를 포함하여, 불용성 재조합 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 단백질을 재중첩시키는 방법.
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