CN107949565A - 聚乙二醇化粒细胞集落刺激因子(gcsf) - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的PEGx‑GCSF缀合物，其中x为每个GCSF的PEG数量，并且在4‑8的范围内。本发明也涉及单个PEGx‑GCSF缀合物的PEG[x]‑GCSF群，其中[x]为该群每个GCSF的PEG平均数量并且为4或者更大。本发明的组合物具有意想不到的治疗效力，同时避免或实质上降低不良副作用的可能性。

Description

聚乙二醇化粒细胞集落刺激因子(GCSF)
相关申请
本发明要求2015年6月11日递交的临时专利申请美国序列号62/174373和2015年6月24日递交的美国序列号62/184042的优先权，两者的全部内容通过参照结合到本文中。
发明领域
本发明涉及具有意想不到的治疗效力，同时避免或实质上降低不良副作用的可能性的新的PEG-GCSF缀合物。
背景
近年来，非抗原性水溶性聚合物比如聚乙二醇(“PEG”)已被用于共价修饰具有治疗和诊断重要性的多肽。PEG为一种无毒性、非免疫原性、高度水溶性且易于自体内清除的聚合物。PEG具有许多应用，并且通常用于食品、化妆品、饮料和处方药。考虑到其高度的生物相容性，医药级PEG被FDA批准在美国使用，并且广泛用作生物药物载体。聚乙二醇化可修饰生物药物的某些特性而不改变其功能，从而增强治疗效果。
中性粒细胞是哺乳动物体内最丰富的白细胞类型，并且构成先天免疫系统的基本部分。其产生是经粒细胞集落刺激因子(GCSF)接合(engagement)至位于CD34+骨髓前体细胞表面的同源受体进行调控。受体接合导致受体链寡聚化、重排和通过细胞内激酶介导的信号转导，导致促进分化和细胞分裂的基因表达模式，从而增加中性粒细胞计数。GCSF受体信号传导的重要性在细胞因子:受体信号传导通路中具有先天性遗传错误的个体举例说明。总体而言，有限的信号传导将会导致维持适当水平中性粒细胞的能力降低。经GCSF受体的信号传导对中性粒细胞的产生和维持是重要的，并且GCSF信号传导中具有先天性遗传错误的个体具有减少的中性粒细胞计数，并因此易患严重和复发性微生物感染。
类似地，许多癌症疗法由于其抗增殖活性而呈现对中性粒细胞水平的有力抑制。许多类型化疗药物的最严重潜在副作用之一是白细胞计数低，包括中性粒细胞水平降低(中性粒细胞减少症)。中性粒细胞减少症可使一些患者处于严重感染的风险，并因此可能迫使化疗治疗周期停止。事实上，与白细胞计数低相关的并发症是化疗剂量减小或延迟的最常见原因(参见Link, 等人 (2001) Cancer 92:1354-1367; Lyman, 等人 (2003)J.Clin. Oncol. 21:4524-4531; 和Lyman, 等人 (2002) Am. J. Med. 112:406-411，其各自的全部内容通过参照结合到本文中)。这种剂量依赖性现象极大地限制了许多肿瘤药物的治疗剂量。
用于临床用途的重组GCSF (非格司亭(filgrastim))的开发已经导致显著改善出生时患有严重慢性中性粒细胞减少症(SCN)的个体以及经历具有有力的抗中性粒细胞活性的癌症疗法的那些个体两者。GCSF为一种易于通过肾脏系统清除的小蛋白质。GCSF的小鼠版本在1983年自外植组织纯化，并且于1985年自无意中以高浓度表达GCSF的培养物中生长的癌细胞系纯化了人等同物(参见例如Welte, 等人 (1985) PNAS USA 82:1526-30, 其通过参照以其全部结合到本文中)。人GCSF被发现为一种约19 kD的糖蛋白，其依碳水化合物组分而定呈变化的酸性。后来发现碳水化合物组分对生物活性为任选的。人重组GCSF的克隆和表征发生于1984至1986年之间，并导致其在大肠杆菌细胞中表达和最终在患有化疗诱导的中性粒细胞减少症的患者中测试该化合物的人临床试验。1991年，美国FDA批准了在大肠杆菌中制备的重组人GCSF用于该用途(名为非格司亭，商品名为Neupogen®)，并于1993年在欧洲批准了一种相关的中国仓鼠卵巢细胞表达形式(名为来诺拉提(lenograstim))。发现核心蛋白包括174个氨基酸，但是已知存在有多种变体(参见例如Ngata, 等人 (1986)Nature 319:415-18; Souza, 等人 (1986) Science 232:61-5; 美国专利第4999291号，其各自通过参照结合到本文中)。
被转让给Amgen, Inc.且要求追溯到1985年8月23日递交的美国专利申请07/768959的优先权的美国专利第4810643、4999291、5582823和5580755号，提供某些人多能GCSF分子及其生产方法，其各自通过参照以其全部结合到本文中。这些分子形成被批准的Neupogen产品的基础。在这些情况下没有讨论分子的潜在聚乙二醇化。
因为非格司亭易于在体内降解，Neupogen在癌症治疗引起的发热性中性粒细胞减少症发病期间需要每日给予。然而，聚乙二醇化代表增加GCSF蛋白的流体动力学半径、降低血清清除率和促进体内药物半衰期的合理方法。采用在GCSF的N-末端用醛活化的20 kDa线性PEG进行的位点特异性聚乙二醇化(参见PCT公布第WO 96/11953号以及美国专利第5824784和7090835号)，开发了PEG-非格司亭，并于2002年获得美国FDA批准，商品名为NEULASTA® (NEULASTA® [药品说明书]. Thousand Oaks, CA, Amgen, Inc., 02/2010修订; NEULASTA ® [药品说明书]. Thousand Oaks, CA, Amgen, Inc., 4/2016 修订的v1, 两种修订版本通过参照结合到本文中)。这种GCSF的单聚乙二醇化版本(PEG部分共价连接于蛋白的氨基末端)增加GCSF蛋白的分子量，大大降低肾脏清除率。PEG基团在氨基末端的位置对GCSF蛋白-GCSF受体相互作用没有特别的破坏性，因为参与受体相互作用的结合区域中的蛋白质残基不直接受到氨基末端20 kDa PEG的聚乙二醇化或空间阻碍。
还提出了用于提供稳定化的GCSF分子的几种备选策略。将PEG连接于半胱氨酸残基已在靶向方面提供了某些改进。巯基反应性PEG (包括PEG-马来酰亚胺)已在其游离半胱氨酸残基处连接于GCSF。Veronese, 等人 (2007) Bioconjugate Chem. 18:1824-1830描述了GCSF在Cys18的聚乙二醇化，其显示增加聚集，尽管聚集体没有共价聚集。类似地，Hao,等人 (2006) Biodrugs 20:357-363描述了PEG-马来酰亚胺与Cys18的缀合，其显示增加分子的半衰期。
位点特异性诱变为已经用于制备用于位点特异性聚合物连接的多肽的另一种方法。例如，美国专利第6646110号描述了呈现GCSF活性并具有插入的包含连接基团(用于PEG或寡糖部分)的氨基酸残基的多肽缀合物。这些可包括赖氨酸、谷氨酸、半胱氨酸或天冬氨酸。
WO 2011/041376反映了由本申请的发明人之一进行位点特异性聚乙二醇化的又一种方法。WO 2011/041376的内容通过参照以其全部结合。在该较早的工作中，甲氧基-PEG乙醛与GCSF在含有DMSO的反应缓冲液中反应，得到单聚乙二醇化的GCSF缀合物群，其中缀合位于N-末端附近的赖氨酸基团处，和其中至少30%的组合物不是N-末端聚乙二醇化的。在一个备选实施方案中，组合物包含至少80%单聚乙二醇化的GCSF缀合物，其中至少30%的组合物不是N-末端聚乙二醇化的。
作为位点特异性聚乙二醇化的备选方案，使用N-羟基-琥珀酰亚胺酯的随机聚乙二醇化经酰胺键形成稳定的蛋白-PEG缀合物。这些酯试剂对于与赖氨酸残基的氨基和N-末端的反应是相对特异性的，但与其他蛋白质亲核试剂像组氨酸、丝氨酸和酪氨酸残基也有较低程度的反应。反应条件像温度、pH、PEG试剂的量和时间限定产物的异质性(即可形成单-、二-、三-和更高级的聚乙二醇化缀合物)。由于与蛋白质上的不同亲核基团反应，多聚乙二醇化(和甚至单聚乙二醇化)缀合物产生位置异构体，后者在其生物学和生物医学性质方面可有实质性不同。聚乙二醇化的高度可变性以及以可重现的方式制造的能力限制了SC-PEG在临床药物开发中的应用。然而，有实例(例如Oncaspar、Adagen)证实这种缀合物在某些情况下可具有临床相关性。
已经报道之前尝试通过在赖氨酸残基和N-末端氨基酸上暴露的胺基连接来使用胺反应性PEG形成PEG-GCSF，成功有限。据观察，这种方法对于GCSF并不是最佳的，因为该蛋白含有4个赖氨酸残基和1个N末端氨基酸，赖氨酸残基位于受体结合区域。因此，用胺反应性PEG试剂修饰GCSF使蛋白质的体外生物活性降低至1/3-1/50，这取决于连接的PEG分子的数目和大小。当GCSF用大PEG (例如20 kDa PEG)修饰时，体外生物活性的损失最大，这对于延长蛋白质的半衰期是最有用的。胺-聚乙二醇化GCSF为异质的，作为至少4种同种型和多种分子量种类的复杂混合物存在，其全部可具有不同的比活性。
这种方法的一个具体实例在20世纪90年代早期的两篇期刊文章中由KirinBrewery Company 的一组药物研究人员描述：Tanaka 等人 (1991) Cancer Research 51:3710-3714和Satake-Ishikawa 等人 (1992) Cell Structure and Function 17:157-160。这些研究人员制备了缀合物的混合物，其中每个GCSF蛋白的分子明显地被1、2或3个PEG修饰，平均为两个。这些研究人员采用的活化的PEG试剂为SS-PEG (4.5 kDa或10 kDa)。尽管蛋白质与PEG之间所生成的酰胺键是稳定的，但接头含有水解不稳定的酯基。只要化合物处于水性介质中就会发生这种水解，因此，只要其在溶液中PEG数目就不断地减少。酯键的水解留下可环化成琥珀酰亚胺基的琥珀酸酯基团。这样的非天然残基可潜在地导致抗体反应，包括免疫原性。
与已知的GCSF版本(包括聚乙二醇化版本)相关的副作用包括剂量相关的肾小球肾炎以及骨痛的不良和严重不良事件。这已经导致许多癌症患者经历痛苦的治疗期，或者在某些情况下由于肾脏损害和/或骨痛的严重不良反应而减少或停止所有治疗。非格司亭或PEG-非格司亭的副作用与剂量水平有关。因此，更新的GCSF版本(优选地具有改善的PK特征的PEGx-GCSF)保证提供临床有益的中性粒细胞增加，副作用减少。因此，一种与目前的治疗类似，但是可以较低剂量产生中性粒细胞增加的药用制剂，将是改善与中性粒细胞减少症有关的病症的合乎需要的方法。
长期GCSF治疗的另一种潜在后果是增加发生恶性肿瘤的机会。患有严重慢性中性粒细胞减少症(SCN)需要终生GCSF治疗的患者，骨髓增生异常综合征的风险增加，这与他们已用GCSF治疗的时间成正比。也已知GCSF可能会加剧髓性癌症。因此，Neupogen不推荐用于患有例如骨髓增生异常综合征、慢性髓细胞性白血病和继发性急性髓细胞样白血病(AML)的患者。因此，提供具有对正常细胞更具选择性的增殖活性，并因此与目前现有的治疗相比避免或减少癌细胞增殖的GCSF疗法也将是有利的。
发明概述
本发明的实施方案涉及PEGx-GCSF，其中x代表每个GCSF的PEG数目且为4-8范围内的整数。
在PEGx-GCSF的实施方案中，PEG部分具有约3-约15 kDa，或者优选地约5-约6 kDa的平均分子量。
在本发明PEGx-GCSF的某些实施方案中，PEG通过源自GCSF的胺连接于GCSF。在备选的实施方案中，PEGx-GCSF包含不可水解的键，例如氨基甲酸酯键。
在本发明PEGx-GCSF的另外实施方案中，GCSF为一种具有选自以下的氨基酸序列的蛋白质：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4及其功能衍生物和同系物。在进一步的实施方案中，GCSF氨基酸序列为SEQ ID NO: 1，并且每个PEG连接于选自以下的GCSF位置：N-末端、17位的赖氨酸残基、35位的赖氨酸残基、41位的赖氨酸残基、44位的组氨酸残基、53位的组氨酸残基、80位的组氨酸残基、157位的组氨酸残基和171位的组氨酸残基。
本发明的实施方案还涉及PEG[x]-GCSF，一种包含PEGx-GCSF群的组合物，其中[x]为该群 x的平均值，并且其中[x]大于或等于约4、其中[x]为约4-约8、其中[x]为约4-约6或者其中[x]为约5-约6。
在某些实施方案中，PEG[x]-GCSF特征为以下中的一种或多种：PEG[x]-GCSF包含少于10% PEGx-GCSF，其中x为1-3；PEG[x]-GCSF包含至少约15% PEGx-GCSF，其中x为4；PEG[x]-GCSF包含至少约30% PEGx-GCSF，其中x为5；PEG[x]-GCSF包含至少约10% PEGx-GCSF，其中x为6；和PEG[x]-GCSF包含少于15% PEGx-GCSF，其中x为7。
在另外的实施方案中，PEG[x]-GCSF包含至少约15% PEGx-GCSF，其中x在6-7的范围内；或者包含至少约35% PEGx-GCSF，其中x在5-7的范围内。
另外的实施方案涉及一种包含药用活性量的PEGx-GCSF或PEG[x]-GCSF和无蛋白载体的药用制剂。
本发明的另外实施方案涉及一种用于制备本发明PEGx-GCSF (其中x为4-8)或PEG[x]-GCSF (其中x为4或者更大)的方法，所述方法包括以下步骤：(a) 获得具有至少约5.0mg/ml浓度的GCSF溶液；(b) 合并GCSF溶液与PEG，其中PEG的摩尔量为GCSF摩尔量的约65-约75倍；(c) 使GCSF与PEG反应足够的时间，以产生PEGx-GCSF；(d) 以足以与残余PEG反应的量加入羟胺；和(e) 分离PEG[x]-GCSF与未反应的PEG、N-羟基琥珀酰亚胺和羟胺。通过本领域已知用于分离纯化的蛋白缀合物的方法，包括根据分子量的分离方法，自该群进一步分离单个的PEGx-GCSF。
当现有的、市售可得到的GCSF和/或PEG-GCSF治疗可能由于骨痛的发生或癌细胞增殖的风险而显示治疗不当时，本发明的组合物在治疗各种医学病症方面提供意想不到的效用。这种医学病症包括严重先天性/慢性中性粒细胞减少症、自身免疫性/特发性中性粒细胞减少症以及与癌症治疗相关的中性粒细胞减少症。
本发明的另外优点对本领域的技术人员自以下详述(其中仅有本发明的某些实施方案得以显示和描述)是易于显而易见的。如所认识到的，本发明能够具有其他和不同的实施方案，并且其几个细节能够在多个方面进行常规修饰，全部不背离本发明。本发明可在没有这些具体细节中的一些或全部的情况下实施。因此，该描述本质上被认为是说明性的，而不是限制性的。
附图简述
本公开的实例性实施方案可通过部分地参照本公开和附图理解，附图在以下简要描述。
图1代表主要的、完全加工的人粒细胞集落刺激因子(“GCSF”)的氨基酸序列(SEQID NO: 1)。相应的DNA序列作为SEQ ID NO: 2提供。
图2描述用于本文描述的本发明某些实施方案的GCSF蛋白的测序数据。图2分别描述SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4。
图3提供用于制备本发明PEGx-GCSF和PEG[x]-GCSF的方法的流程图。
图4为得自本发明PEG[x]-GCSF样品分析的代表性生物分析仪电泳图。
图5为本发明PEG[x]-GCSF样品的SDS-PAGE分析结果的代表。
图6为说明本发明PEG[x]-GCSF (ANF-Rho)与市售PEG-GCSF (NEULASTA®,NLSTA)相比的生物测定结果的效力图。M-NFS-60细胞在存活力染色前用指示的GCSF化合物处理48小时。将数据相对于未处理对照归一化，并拟合到三参数逻辑曲线拟合模型。数据代表一式两份孔的平均值和标准误差。
图7为CD66和CD14细胞荧光强度的双变量图的象限门控(quadrant gating)，显示本发明PEG[x]-GCSF (AND-Rho)与NEULASTA®相比在体外对人CD34(+)细胞的作用。在对CD66和CD14表面染色之前，细胞用50 ng/ml的本发明PEG[x]-GCSF (AND-Rho)或NEULASTA®处理14天。抗原表达通过流式细胞术定量。在E4门出现的细胞事件表明粒细胞群。
图8为各种市售PEG-GCSF (NEULASTA®)和本发明PEG[x]-GCSF样品在中性粒细胞减少症大鼠中的单剂量药代动力学图表。通过在第-1天注射环磷酰胺(CPA)使大鼠中性粒细胞减少。在第1天以指示的剂量皮下给予4种不同浓度的本发明PEG[x]-GCSF (AND-Rho)和NEULASTA®。在指示的天数自大鼠获得血液样品，并通过ELISA测定GCSF血浆浓度。数据为每组8只大鼠的平均值和标准误差。图8A为线性图，和图8B为GCSF浓度的对数图。
图9为显示市售PEG-GCSF (NEULASTA®)和本发明PEG[x]-GCSF样品(批次1-3)在中性粒细胞减少症大鼠中的血浆暴露效果的图表。图9A显示3种不同浓度(100、50和25微克/千克，即μg/kg)的3个单个批次的本发明PEG[x]-GCSF和单一浓度的NEULASTA® (100 μg/kg)的曲线下面积(AUC)。星号表示在指示剂量下的本发明PEG[x]-GCSF AUC与以100微克/千克(μg/kg)给予的NEULASTA®相比的显著性差异。图9B显示PEG-GCSF血浆暴露与剂量的线性关系。合并本发明PEG[x]-GCSF的批次1、批次2和批次3的AUC值并进行线性回归分析。合并的平均值和95%置信区间显示在每个数据集之上。虚线和阴影区域表明100 μg/kgNEULASTA®治疗组的平均AUC和95%置信区间的上限和下限。星号表示通过ANOVA和Dunnet多重比较检验事后分析，与NEULASTA®治疗组相比的显著性差异(p<0.05)。
图10为显示每天用本发明PEG[x]-GCSF批次1、NEULASTA®或制剂缓冲液(FB)治疗的中性粒细胞减少症大鼠的中性粒细胞计数的代表性变化的图表。通过在第-1天注射环磷酰胺(CPA)使大鼠中性粒细胞减少。在第1天和之后，大鼠接受每天注射PEG[x]-GCSF (100μg/kg)、NEULASTA® (100 μg/kg)或溶媒溶液(FB)。在指示的天数自大鼠获得血液样品以测定中性粒细胞绝对计数(ANC)。数据为每组8只大鼠的平均值和标准误差。阴影区域表示与初始中性粒细胞释放相关的ANC值，其不包括在曲线下面积计算中。
图11图解说明来自给予PEG[x]-GCSF和NEULASTA®的中性粒细胞减少症大鼠的中性粒细胞绝对计数(ANC)。图11A显示使用图10中显示的第二次上升ANC峰值，作为给予后小时数的函数标绘的ANC值，以确定AUC。合并每个剂量下的每个PEG[x]-GCSF批次的值，并自分析中排除96小时之前的数据(代表预先形成的中性粒细胞的释放)。数据集之上和之下的星号分别代表通过PEGx-GCSF的合并剂量的ANOVA，与制剂缓冲液和NEULASTA®治疗组相比的显著性差异(p<0.05)。图11B显示25 μg/kg (方形)、50 μg/kg (倒三角形)和100 μg/kg(圆形)的PEG[x]-GCSF的3个单独批次的3种浓度的分组数据。阴影区域代表100 μg/kgNEULASTA®的值和95%CI (置信区间)。r2值为0.64的所有批次的ANC-AUC与血浆AUC之间的相关性分析表示在药物水平与ANC药效学之间的显著相关性。
详述
定义
关于氨基酸序列的“实质上同源”，本文定义为与另一种氨基酸序列具有至少70%，一般地至少约80%，和更一般地至少约90%同一性的序列，如按照Pearson 和 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 (1988)的FASTA搜索方法测定的那样。
本文使用的术语“N-末端”、“氨基-末端”或类似术语，当用于蛋白质与另一分子共价键合的情况下时，指的是经蛋白质的氨基末端α氨基共价键合。
本文使用的术语“野生型”或“天然的”指的是一般如同其被发现在体内天然发挥作用的其操作或功能形式的蛋白质或多肽。这些术语也指未经人为修饰或改变的形式的蛋白质。这些术语可因此涉及重组蛋白质。因此，这些术语可指相对于最初得到蛋白质的核酸和/或氨基酸序列的动物所产生的，具有改变的糖基化模式(包括缺乏糖基化)的蛋白质。
本文使用的术语“ANF-Rho”指的是用于实施例的本发明PEG[x]-GCSF的示例性样品。参见例如实施例3和表2。
NEULASTA®为PEGfilgrastim的商标名称，是重组人粒细胞集落刺激因子(GCSF)类似物非格司亭的聚乙二醇化形式。该药物通过将20 kDa聚乙二醇(PEG)分子偶联至非格司亭蛋白的N-末端来制备。
GCSF
通常，可用于本发明实践的GCSF蛋白可为自哺乳动物生物体分离的任何形式、通过基因组或cDNA克隆或通过DNA合成获得的外源性DNA序列的原核或真核宿主表达产物，或者备选地化学合成程序或通过内源性基因激活的产物。因此，蛋白质可为得自组织、哺乳动物/微生物细胞培养物、植物细胞培养物、转基因动物、酵母、真菌和/或转基因植物的天然或重组来源。合适的原核宿主包括各种细菌比如大肠杆菌；合适的真核宿主包括酵母比如酿酒酵母(S. cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、哺乳动物细胞比如中国仓鼠卵巢细胞或猴细胞；转基因动物比如小鼠、兔、山羊、绵羊、昆虫；或植物细胞培养物和转基因植物比如小立碗藓(Physcomitrellapatens)(苔藓)。依所采用的宿主而定，蛋白表达产物可用哺乳动物、植物或其他真核生物碳水化合物糖基化，或者其可为非糖基化的。
本文使用的术语“GCSF”或粒细胞集落刺激因子包括具有SEQ ID NO: 1 (图1)所示的氨基酸序列或与其实质上同源的氨基酸序列的蛋白质，其生物学特性涉及刺激白细胞产生。本文使用的术语GCSF包括像例如通过定点诱变或意外地通过突变有意修饰的蛋白质，使得它们相对于天然GCSF具有氨基酸残基的添加、缺失或取代。这些术语包括天然和重组产生的人GCSF两者。GCSF指的是自任何常规来源比如组织、蛋白质合成、用天然或重组细胞进行细胞培养获得的天然存在的或重组蛋白质两者，一般地是人的。
可用于本发明实践的GCSF表达产物也可在1位包含起始甲硫氨酸氨基酸残基。本发明考虑使用任何和所有这种形式的GCSF，尽管重组GCSF (尤其是大肠杆菌衍生的)为典型的。据报道某些GCSF类似物具有生物学功能，并且这些类似物也可按照本发明进行缀合。这些GCSF类似物可包括与SEQ ID NO: 1的GCSF氨基酸序列相比具有氨基酸添加、缺失和/或取代的那些类似物。在某些实施方案中，序列与SEQ ID NO: 1相比包含氨基酸插入，比如在SEQ ID NO: 1的36、37和38位的VSE插入。在某些实施方案中，序列如SEQ ID NO: 3或SEQID NO:4所示。
本文使用的术语“GCSF”包括具有以上描述的GCSF活性的蛋白质，包括天然人糖蛋白GCSF、GCSF突变体、糖基化GCSF、非糖基化GCSF和/或GCSF的以其他方式修饰的结构和/或功能变体。在进一步的实施方案中，GCSF具有SEQ ID NO: 1中确定的氨基酸序列，其对应于细菌中产生的重组GCSF，具有174个氨基酸和额外的N-末端甲硫氨酰残基。也包括生物活性GCSF的氨基酸序列，其与SEQ ID NO: 1不同之处在于它们在1位不含甲硫氨酰残基。
PEG
术语“PEG”通常指的是含有或不含接头或活化部分的聚亚烷基二醇化合物或其衍生物。本文使用的术语PEG包括(但不限于)聚乙二醇均聚物、乙二醇与丙二醇的共聚物及其衍生物和等价物，其中所述均聚物和共聚物为未取代的或者取代的，例如在一个末端用烷基取代。用于本发明的PEG聚合物可为线性、分支、梳形或星形的，具有广泛范围分子量。用于本发明实施方案的PEG的平均分子量可在5-约100 kDa的范围内。
许多PEG衍生物和用于制备它们以及使其与蛋白质缀合的方法为本领域已知的，并且适合用于本发明。用于本发明的一种特别优选的PEG是聚合物的一个末端以相对惰性基团比如低级C1-6烷氧基终止的PEG。优选地，PEG为单甲氧基-PEG (通常称为mPEG)，其为PEG的线性形式，其中聚合物的一个末端是甲氧基(--OCH3)。
甚至更优选地，用于本发明的PEG为“活化的mPEG”，其中线性PEG的一个末端用甲氧基终止，和另一个末端用适合于偶联至GCSF上的优选位点的接头终止，以促进用期望的活化mPEG的聚乙二醇化。
优选的接头包括胺反应性接头，即会与伯胺形成化学键的合成化学基团。这些接头包括异硫氰酸酯类、异氰酸酯类、酰基叠氮化物类、NHS酯类、磺酰氯类、醛类、乙二醛类、环氧化物类、环氧乙烷类、碳酸酯类、芳基卤化物类、亚氨酸酯类、碳二亚胺类、酸酐类和氟苯基酯类。这些胺反应性接头中的大多数通过酰化或烷基化与胺缀合。
示例性的键为水解稳定的，并且是水溶性的。代表性的合适的接头可包括酰胺、氨基甲酸酯(也称为氨基甲酸酯)、胺、硫醚(也称为硫化物)或脲(也称为碳酰胺)基团的任何组合。
在一个特定实施方案中，甲氧基化的PEG (“mPEG”)可通过本领域熟知的方法活化用于随后共价连接于氨基，即mPEG可被修饰以含有不同的反应性部分，其适合于随后经含有可用的氨基残基的氨基酸残基例如赖氨酰残基连接于蛋白质。这样的活化PEG包括mPEG-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(“SS-PEG”)、mPEG-琥珀酰亚胺基碳酸酯(“SC-PEG”)、mPEG-亚氨酸酯(mPEGimidate)和mPEG-氰尿酰氯。在一个优选的实施方案中，接头被选择提供对水解稳定的PEG-GCSF键。
在某些实施方案中，用于本发明的PEG的平均分子量在约2-约50 kDa、约3-约25kDa、约4-约10 kDa或由本文提供的两个端点定义的任何子范围的范围内，包括在这些范围内存在的任何单个数字整数(整数)或非整数(分数)，比如4.5、5、5.6和6 kDa。
在一个特定实施方案中，用于本发明各实施方案的PEG具有约5-6 kDa SC-PEG，更具体地讲为约5.6 kDa SC-PEG的平均分子量。由GCSF伯氨基与SC-PEG反应生成的PEGx-GCSF包含对水解稳定的氨基甲酸酯键，不同于以上讨论的Tanaka 等人和Satake-Ishikawa等人的多聚乙二醇化缀合物中水解不稳定的键。
PEGx-GCSF
本发明的一个实施方案涉及“PEGx-GCSF”，其如本文定义的那样为包含共价连接于其上的x数目的PEG部分的GCSF缀合物，其中x为4-7的整数。PEGx-GCSF的具体实施方案包括其中x为4、5、6、7和8。
在某些实施方案中，每个PEG通过源自GCSF的胺部分(例如N末端或者任何赖氨酸或组氨酸残基)连接于GCSF。在这些特定的实施方案中，共价连接通过用氨基反应性接头活化的PEG与GCSF胺部分之间的反应形成。在特定的实施方案中，在与胺反应时，氨基反应性接头与GCSF形成不可水解的键。在进一步的实施方案中，PEGx-GCSF包含不可水解的键，例如氨基甲酸酯键。
PEGx-GCSF的实施方案包括其中GCSF为具有选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4及任何这些序列的功能衍生物和同系物的氨基酸序列的蛋白质。在特定的实施方案中，氨基酸序列为SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 1的功能衍生物或SEQ ID NO: 1的同系物，其中GCSF具有17位的赖氨酸残基、35位的赖氨酸残基、41位的赖氨酸残基和任选地44位的组氨酸残基、53位的组氨酸残基、80位的组氨酸残基、157位的组氨酸残基和171位的组氨酸残基。在PEGx-GCSF的相关实施方案中，每个PEG在选自以下的位置连接于GCSF：N-末端、17位的赖氨酸残基、35位的赖氨酸残基、41位的赖氨酸残基和任选地在44位的组氨酸残基、53位的组氨酸残基、80位的组氨酸残基、157位的组氨酸残基和171位的组氨酸残基。
具体的实施方案涉及PEGx-GCSF，其中GCSF为具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的蛋白质，和其中每个PEG连接于源自GCSF的胺，比如N-末端、赖氨酸或组氨酸残基。例如，其中PEG连接于选自以下的GCSF位置的实施方案：N-末端、17位的赖氨酸残基、35位的赖氨酸残基和41位的赖氨酸残基。在进一步的实施方案中，PEG连接于选自以下的GCSF位置：44位的组氨酸残基、53位的组氨酸残基、80位的组氨酸残基、157位的组氨酸残基和171位的组氨酸残基。
在PEGx-GCSF的某些实施方案中，PEG的平均分子量在约2-约50 kDa、约3-约25kDa、约4-约10 kDa或由本文提供的两个端点定义的任何子范围的范围内，包括在这些范围内存在的任何单个数字整数(整数)或非整数(分数)，比如4.5、5、5.6和6 kDa。PEGx-GCSF的特定实施方案包括其中PEG具有约5-约6 kDa，优选地为5.6 kDa的平均分子量的那些PEGx-GCSF。
PEG[x]-GCSF
本发明的实施方案涉及“PEG[x]-GCSF”，其如本文定义的那样为包含(包括各种比例的以上描述的任何单个PEGx-GCSF)群的组合物，其中[x]为该群的x平均值，和其中[x]为大于或等于约4，例如约4-约8、约4-约6或约5-约6的正数(包括分数值)。PEG[x]-GCSF包括包含“异质群”的实施方案，其中PEGx-GCSF缀合物具有不同的x值，其中PEG在GCSF分子上的不同位点连接，和/或其中PEG具有不同的分子量。
PEG[x]-GCSF的实施方案包括任何一种本文描述的各种单个PEGx-GCSF的群，包括PEGx-GCSF，其中PEG的平均分子量在约2-约50 kDa、约3-约25 kDa、约4-约10 kDa的范围内。PEGx-GCSF的特定实施方案包括其中PEG具有约5-约6 kDa，优选地为5.6 kDa的平均分子量的那些PEGx-GCSF。
PEG[x]-GCSF的某些实施方案特征为以下中的一种或多种：包含少于10%、少于8%或少于5% PEGx-GCSF，其中x为1-3；包含至少约15%、至少约18%、至少约20%、至少约25%或至少约30% PEGx-GCSF，其中x为4；包含至少约30%、至少约35%或至少约40% PEGx-GCSF，其中x为5；包含至少约10%、至少约12%或至少约15% PEGx-GCSF，其中x为6；包含至少约3%、至少约5%和/或至少约15% PEGx-GCSF，其中x为7；包含至少约15%、至少约20%、至少约25%或至少约35% PEGx-GCSF，其中x在6-7的范围内；和包含至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约75%或至少约80% PEGx-GCSF，其中x在5-7的范围内。PEG[x]-GCSF的另外实施方案可包括包含少于约15%、少于约12%或少于约10% PEGx-GCSF的那些，其中x为7。
PEG[x]-GCSF的实施方案包括任何本文描述的各种单个PEGx-GCSF群，其中[x](该群的x平均值)大于4。例如，PEG[x]-GCSF的实施方案包括PEGx-GCSF的组合物，其中PEG通过源自GCSF的胺(比如N末端、赖氨酸或组氨酸)连接于GCSF；其中PEGx-GCSF包含不可水解的键，例如氨基甲酸酯键；其中GCSF为具有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4及这些序列中任一种的功能衍生物和同系物的氨基酸序列的蛋白质；其中每个PEG在选自以下的位置连接于SEQ ID NO: 1的GCSF或其衍生物或同系物：N-末端、17位的赖氨酸残基、35位的赖氨酸残基、41位的赖氨酸残基、44位的组氨酸残基、53位的组氨酸残基、80位的组氨酸残基、157位的组氨酸残基和171位的组氨酸残基。
在一些实施方案中，PEG[x]-GCSF包含特征为以下中的一种或多种的PEGx-GCSF群：
约0%-约5%的PEGx-GCSF，其中x为3；
约22%-约32%的PEGx-GCSF，其中x为4；
约38%-约42%的PEGx-GCSF，其中x为5；
约18%-约28%的PEGx-GCSF，其中x为6；和
约0%-约9%的PEGx-GCSF，其中x为7。
PEG[x]-GCSF的另一个实施方案包含PEGx-GCSF群，其中PEG通过氨基甲酸酯键连接于GCSF，和任选地其中PEG具有约3-约15 kDa，更优选地为约5-约6 kDa的平均分子量分子量。在一个特定实施方案中，PEG[x]-GCSF由PEGx-GCSF群组成，其中PEG通过氨基甲酸酯键连接于GCSF，和任选地其中PEG具有约3-约15 kDa，更优选地为约5-约6 kDa的平均分子量分子量。
缀合方法
遵循以下过程以产生本发明的x (即每个GCSF的PEG数目)为4-8的PEGx-GCSF缀合物和[x] (即存在于PEGx-GCSF群中的每个GCSF的PEG平均数目)为4或者更大的PEG[x]-GCSF缀合物群。
如在图3中显示的那样，将GCSF蛋白浓缩至约5.0 mg/ml并使用10 kDa渗滤膜进行缓冲液交换。对配备有搅拌机构的反应容器装填蛋白质溶液。使设置为期望的叶片深度的双叶片叶轮系统淹没在容器中并开动。以蛋白质量的约65-约75倍的摩尔过量将SC-PEG粉末(5 kDa)经约15分钟的时间缓慢加入到反应容器中。监测pH并保持在约7.75，同时反应继续约另外45分钟。此后，将羟胺(HA)加入到反应容器中并混合约另外2小时，以猝灭残留的反应性PEG并自产物去除弱缔合的PEG。在整个反应过程中，反应容器的内容物保持在环境温度(即“室温”)下。使用50 kDa膜将反应混合物渗滤两次以去除残余(即未反应的) PEG、N-羟基琥珀酰亚胺和羟胺。将所获得的“原料药(drug substance)”浓缩至5.0-6.0 mg/ml之间。“药物产品(drug product)”然后通过以下步骤来配制：加入TWEEN 20® (聚乙二醇失水山梨醇单月桂酸酯，Sigma-Aldrich，St. Louis，MO)和山梨醇，并把体积调节至约2-约10 mg/ml，优选地为约5.0 mg/ml的最终药物产品浓度。将药物产品分配到无菌密封容器比如小瓶或注射器中。
药用制剂
在某些实施方案中，本发明涉及任选地在药学上可接受的载体中包含PEGx-GCSF缀合物(其中x为4-8)或如本文描述的单个缀合物的PEG[x]-GCSF群 (其中[x]为4或者更大)的药用制剂。在某些实施方案中，载体实质上不含蛋白。
可进一步使得本发明的制剂适合于通过本领域已知的方法与另外的药学上可接受的载体或溶媒混合或组合进行注射。用于配制本发明产品的药学上可接受的载体中包括盐水、人血清白蛋白、人血浆蛋白等。本发明还涉及包含以上描述的缀合物和药学上可接受的赋形剂和/或载体的药用组合物。这样的药学上可接受的载体可为水性或非水性溶液、混悬液和乳液。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油类比如橄榄油和注射用有机酯类比如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或混悬液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外溶媒包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖(Ringer's dextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油类。静脉人溶媒包括流体和营养补充剂、电解质补充剂比如基于林格氏葡萄糖的那些等。也可存在防腐剂和其他添加剂，比如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。
本发明的药用组合物包含与药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体一起的有效量的本发明PEGx-GCSF缀合物(其中x为4-8)或单个缀合物的PEG[x]-GCSF群 (其中[x]为4或者更大)。这样的组合物包含各种缓冲内容物比如Tris-HCl、醋酸盐、磷酸盐、pH和离子强度的稀释剂；添加剂比如洗涤剂和增溶剂比如TWEEN 80® (非离子油酸，≥58.0% (主要是亚油酸、棕榈酸和硬脂酸的平衡)平均摩尔分子量1310，可得自Sigma-Aldrich-也称为Polysorbate 80)、抗氧化剂比如抗坏血酸和焦亚硫酸钠、防腐剂比如苯甲醇和填充物质比如乳糖或甘露醇；将该材料掺入聚合物比如聚乳酸、聚乙醇酸等的颗粒制剂中或掺入脂质体中。这样的组合物可影响本发明PEGx-GCSF缀合物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除率。
按照本发明制备的PEGx-GCSF缀合物(其中x为4-8)或单个缀合物的PEG[x]-GCSF群(其中[x]为4或者更大)可通过本领域已知的方法用药学上可接受的载体或溶媒配制成适合于注射的药用组合物。参见例如W097/09996、W097/40850、W098/58660和W099/07401，其全部内容通过参照结合到本文中。本发明的化合物可例如以含有张度剂例如132 mM氯化钠的10 mM钠/钾磷酸盐缓冲液(pH 7)配制。任选地，药用组合物可含有防腐剂。
药用组合物通常包含按照本发明制备的PEGx-GCSF缀合物(其中x为4-8)或单个缀合物的PEG[x]-GCSF群(其中[x]为4或者更大)、在药学上可接受的缓冲液中适合于保持溶液pH在约4.0-约7.0的范围内(但最优选地在该范围的下限，即约4.0)的多电荷无机阴离子、和任选地一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂。
使用方法
在本发明的另一方面，提供一种用于在有需要的患者中增加白细胞计数的方法，所述方法包括给予所述患者本发明的药用制剂。在某些实施方案中，患者处于中性粒细胞减少症的风险或患有中性粒细胞减少症。在某些其他实施方案中，患者正在用降低他/她白细胞计数的药物治疗。在某些实施方案中，患者具有降低的内源性GCSF水平。在某些其他实施方案中，患者正在接受放射治疗。患者可能患有肺癌、淋巴瘤、乳腺癌、骨髓移植、睾丸癌、AIDS-相关的恶性肿瘤、骨髓增生异常疾病、急性白血病、先天性和周期性中性粒细胞减少症或再生障碍性贫血(参见Mortsyn, 等人 (1998) Filgrastim (r-metHuGCSF). InClinical Practice, 第2版, Marcel Dekker, Inc., New York, NY)。在某些实施方案中，将制剂给予有感染风险的患者。
以下是由于骨髓细胞或其前体的内在缺陷的原发性中性粒细胞减少症的实例，预期本发明的治疗方法对其是有用的：再生障碍性贫血、慢性特发性中性粒细胞减少症(包括良性中性粒细胞减少症)、周期性中性粒细胞减少症、骨髓增生异常、与丙种球蛋白异常血症相关的中性粒细胞减少症、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、严重先天性中性粒细胞减少症(科斯特曼综合征)和综合征相关的中性粒细胞减少症(例如软骨-毛发发育不全综合征、切-东综合征、先天性角化不良、IB型糖原贮积病、舒-戴二氏综合征、先天性骨髓粒细胞缺乏综合征(Myelokathexis syndrome)、先天性免疫缺陷综合征)。
以下是预期本发明的治疗方法是有用的继发性或获得性中性粒细胞减少症的示例性原因：酗酒、自身免疫性中性粒细胞减少症(包括AIDS的慢性继发性中性粒细胞减少症)、自身免疫性疾病(例如费尔蒂综合征/类风湿性关节炎、斯耶格伦氏综合征、系统性红斑狼疮)、骨髓置换或干细胞移植、癌症(例如由于白血病、骨髓瘤、淋巴瘤或转移性实体瘤(例如乳腺癌、前列腺癌)的骨髓浸润)、Tγ淋巴增生性疾病、细胞毒性化疗或放疗引起的发热性中性粒细胞减少症、药物诱发的中性粒细胞减少症、叶酸或维生素B12缺乏(巨幼细胞性贫血)、血液透析、脾功能亢进症、感染(例如细小病毒属(parvovirus)、肝炎病毒、疟疾、莱姆病、沙门氏菌属(salmonella)、脓毒症)、骨髓纤维化(即肉芽肿性感染)、戈谢病、中毒(例如砷)和原发性免疫缺陷病-例如X连锁常见变异型免疫缺陷病(CVID)、X-连锁无丙种球蛋白血症(XLA)、WHIM综合征、威斯科特-奥尔德里奇综合征和GATA2缺陷。
本发明的药用组合物尤其可用于治疗给予目前市售可得的GCSF产品显示治疗不当的某些骨髓癌(例如急性髓细胞样白血病、慢性粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病)。这是由于本发明PEGx-GCSF及其本发明PEG[x]-GCSF群在引起正常白细胞增殖的同时避免或减少癌细胞增殖的意想不到的选择性，如在以下实施例3中证实的。
此外，除了本发明提供的对癌症患者尤其有利的治疗之外，存在患有可导致严重慢性中性粒细胞减少症(SCN)的病症的患者，其需要终身GCSF治疗。这些患者处于骨髓增生异常综合征的风险增加的状态下，这与其对GCSF蛋白的累积暴露成正比。因此，避免或减少癌细胞增殖的本发明组合物也可为这些患者提供独特的益处。
进一步地，除了治疗中性粒细胞减少症之外，GCSF已用于自体移植患者和同种异体供体的外周血干细胞动员。在移植之前，供体或患者用GCSF治疗以增加祖干细胞的数目，因此干细胞的收获更好，并因此移植过程成功的可能性更大。预期本发明的药用组合物由于其增强的生物活性而特别适用于此目的，如以下实施例4中证实的。
按照本发明制备的PEGx-GCSF缀合物(其中x为4-8)或单个缀合物的PEG[x]-GCSF群(其中[x]为4或者更大)也可在治疗由于GCSF受体被例如内毒素下调而造成的严重脓毒症和感染性休克方面具有效用。
在某些实施方案中，本发明的制剂在化疗过程期间以单一剂量提供。在一些实施方案中，制剂在化疗过程中作为多剂量提供。在某些实施方案中，制剂被给予每天一次、每周一次、每两周一次或每月一次。制剂可在一剂化疗的24小时内给予。在某些实施方案中，制剂在一剂化疗之前至少14天给予。然而，如以下更详细解释的，本发明的制剂提供比市售可得的NEULASTA®产品的情况下大得多的给药灵活性。本发明的制剂有利地可在化疗期间的任何时间给予患者。
在某些实施方案中，制剂作为注射剂给予。在一些实施方案中，制剂适合于多种给予途径，包括皮下、肌内和腹膜内。在其他的实施方案中，制剂适合于静脉内给予。制剂也可作为口服可用的形式提供。患者可接受每周至少约一次剂量。在其他的实施方案中，患者接受每两周至少约一次、每三周至少约一次或每月至少约一次剂量。
治疗有效量为引起骨髓细胞增加白细胞产生的体内生物活性所必要的按照本发明制备的PEGx-GCSF缀合物(其中x为4-8)或单个缀合物的PEG[x]-GCSF群 (其中[x]为4或者更大)的量。PEGx-GCSF或PEG[x]-GCSF的确切量为一个优选问题，受到所治疗病症的确切类型、所治疗患者的状况以及组合物中的其它成分等因素的影响。含有PEGx-GCSF或PEG[x]-GCSF的药用制剂可以通过各种手段给予经历特征为白细胞产生低或有缺陷的障碍的人患者有效的强度配制。PEGx-GCSF或PEG[x]-GCSF的平均治疗有效量可能会有所不同，并且具体地讲应基于有资格医师的建议和处方。例如，0.01-10 μg/kg体重，一般地为0.1-3 μg/kg体重可给予例如一个化疗周期一次。或者，本发明的药用组合物可在用于超过45 kg宿主的固定剂量制剂中含有固定剂量例如1-10 mg，或者2-9或约6 mg的PEGx-GCSF或PEG[x]-GCSF。然而，如在以下实施例4中证实的，考虑到与例如NEULASTA®相比本发明组合物的体内活性水平显著增加，这些量可以降低。
实施例
实施例1：本发明PEG[x]-GCSF的合成
按照在以上“缀合方法”部分中阐释的一般程序，采用以下4个主要步骤，产生了实例PEGx-GCSF缀合物(其中x为4-8)或单个缀合物的PEG[x]-GCSF群(其中[x]为4或者更大)：(1) 渗滤pH 7.75-10 kDa，(2) 聚乙二醇化反应，(3) 渗滤pH 4.0-30 kDa/50 kDa 和过滤，和(4) 将成品填充到无菌硼硅酸盐加塞玻璃小瓶或BD Hypak注射器中(BectonDickinson, Franklin Lakes, New Jersey)，如以下更详细介绍的。
渗滤pH 7.75-10 kDa
采用10 kDa膜，用20倍体积的聚乙二醇化缓冲液将GCSF蛋白缓冲液交换为聚乙二醇化缓冲液(pH 7.75的100 mM磷酸盐缓冲液)。在缓冲液交换后，如通过UV分光光度法测定的，将溶液浓缩至5 mg/ml溶液。
聚乙二醇化反应和加入羟胺
随着在以下条件下加入PEG，缓慢搅拌在600 mL玻璃烧杯中的磷酸盐缓冲液中的浓缩的GCSF (5 mg/ml)：pH 7.75、环境温度和反应时间1小时。以65x-75x的摩尔比率(PEG:GCSF)缓慢加入SC-PEG粉末(5 kDa)，并在整个加料过程中以150 rpm不断搅拌，其在约15分钟内完成。监测反应pH，并在必要时于添加PEG期间通过加入10 N NaOH维持在7.75，随后pH保持恒定。在搅拌1小时后，通过加入1.2 M盐酸羟胺(HA)终止反应。羟胺的加入清除组氨酸处不稳定的PEG添加，并提高产物的均匀性和稳定性。自具有在GCSF分子的不同位点连接的PEG的这些反应物即PEG[x]-GCSF，形成聚乙二醇化GCSF蛋白的混合物。
在pH 4.0-30 kDa渗滤和过滤
然后使用具有20倍体积的乙酸盐缓冲液(10 mM乙酸钠，pH 4.0)的30/50 KDa渗滤系统将反应混合物缓冲液交换为乙酸钠缓冲液(pH 4)。PEG[x]-GCSF被收集在滞留物中，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、羟胺和5 kDa游离PEG在渗透物中除去。然后实施第二次相同的渗滤以促进进一步去除工艺相关的杂质。在缓冲液交换后，将溶液浓缩成~5.5 mg/ml溶液。将生成的PEG[x]-GCSF溶液通过0.2 μm过滤器无菌过滤，并在2-8℃下储存在乙酸钠缓冲液中，作为最终纯化的PEG[x]-GCSF (也称为“原料药”)。通过使用分光光度计测量OD280来估测自所列批次获得的产物的产率。
将成品填充到BD/Hypak玻璃注射器中
在以5 mg/ml的估测体积加入制剂赋形剂后，使用乙酸钠缓冲液(pH 4)将所得到的PEG[x]-GCSF浓度调节至5 mg/ml。最终“药物产品”然后通过加入TWEEN 20® (聚乙二醇失水山梨醇单月桂酸酯，Sigma-Aldrich，St. Louis，MO)和山梨醇，把体积调节至约2-约10 mg/ml，优选地为约5.0 mg/ml的最终药物产品浓度，并使用手动填充工具和连续移液器(repeater pipettor)以0.6 ml/注射器填充到BD Hypak玻璃注射器中来进行配制。最终药物产品也配制成了2.0-5.0 mg/ml并无菌分配到带有瓶塞的无菌玻璃小瓶中。
实施例2：PEG[x]-GCSF的表征
该实施例描述为了表征本文举例说明的单个PEGx-GCSF和PEG[x]-GCSF群的本发明实施方案而实施的分析工作，特别是关于连接于GCSF蛋白的PEG分子的数目x和位置。另外，将本发明PEG[x]-GCSF的属性与在Tanaka 等人 (1991) Cancer Research 51:3710-3714和Satake-Ishikawa 等人 (1992) Cell Structure and Function 17:157-160中描述的多聚乙二醇化缀合物的那些属性进行比较。
生物分析仪程序：
Agilent 2100生物分析仪为一种基于微芯片的毛细管电泳系统，其可基于大小快速分离蛋白质，并提供自动化基于染料的可视化和量化功能。将4 μl的PEG-GCSF样品-原料药(即以10 mM乙酸钠(pH 4)配制的本发明PEG[x]-GCSF)或药物产品(即已加入山梨醇和TWEEN®-20的原料药)-稀释至1 mg/ml，并与2 μl含有二硫苏糖醇(DTT)的Agilent变性溶液合并(7 μl的1 M溶液加入到新的Agilent变性溶液小瓶中)，并加热至95-100℃保持5分钟。在加载到芯片上之前，变性的样品通过加入84 μl水进一步稀释。与PEG-GCSF样品相同地制备Agilent蛋白质230试剂盒梯带和内部生产的5K PEG梯带。5K PEG梯带是聚乙二醇化程度在1-4范围内的PEG-GCSF缀合物的混合物，并且用作系统性能的检查和作为评估被分析的PEG-GCSF样品组成的参考。对于分析的每个样品，捕获电泳图，其代表每种分离的蛋白质种类的峰面积。对于PEG-GCSF，一般地观察到4-5个峰，其各自对应于含有3-7个PEG的GCSF。每个聚乙二醇化种类的峰面积的加权平均数将产生测试样品的平均PEG数目。
在图4中显示的生物分析仪凝胶图像中，最左边的泳道含有在标记为“梯带”的下一个泳道分析的蛋白质的分子量。下一栏中的“5K梯带”含有包含不同数量的PEG1-GCSF、PEG2-GCSF和PEG3-GCSF的PEG-GCSF样品，其中含有少量的PEG4-GCSF。将PEG-GCSF批次PG-051412-2应用于接下来的两个泳道，紧接着为PEG-GCSF批次PG-042413，第一个作为“间隔泳道”，然后一式两份地施加用于分析目的。泳道2和3边界处的数字代表每个显示的PEGx-GCSF种类的与GCSF结合的PEG数目x。用于所有批次的PEG的分子量为5.6 kDa。
应该注意，基于63 kDa蛋白标记物的迁移，标记为每个GCSF分子具有4个PEG (即其中x=4)的PEGx-GCSF种类以大于63 kDa的表观分子量运行，尽管真实的平均分子量为约41 kDa。如以下对于Tanaka论文中报道的数据所讨论的，当使用球形蛋白作为分子量标记物时，聚乙二醇化化合物的分子量被高估。无论分析是通过在此描述的生物分析仪进行，还是通过在Tanaka论文中的描述SDS-PAGE都是如此。
图4中的条带是可定量的，并用于确定每个PEGx-GCSF种类的面积%。以下紧接着的表1包含对于许多不同批次的本发明PEG[x]-GCSF所得结果范围的总结：
表1
PEGx-GCSF 组成百分比
x = 3 0-5%
x = 4 22-32%
x = 5 38-42%
x = 6 18-28%
x = 7 0-9%
SDS-PAGE：
因为SDS-PAGE为Tanaka论文中描述的分析方法，在这里提供对本发明PEGx-GCSF缀合物(其中x为4-8)或单个缀合物的PEG[x]-GCSF群 (其中[x]为4或者更大)的结果的简要讨论用于比较目的。通过在Eppendorf管中取含有约3 μg蛋白质的样品体积并用含有DTT的样品缓冲液稀释6X来制备PEG[x]-GCSF样品。将样品加载到Nupage 4-12% Bis-tris凝胶的孔中。使用Invitrogen的Xcell Surelock电泳系统，使凝胶在SDS-MOPS运行缓冲液中以200V运行10分钟和150V运行40分钟。用乙酸/甲醇完成固定，然后用0.01%考马斯在10%乙酸、10%MeOH中染色。
SDS-PAGE分析的结果显示在图5中。本发明的PEG[x]-GCSF样品的结果显示在泳道1-5中。泳道6含有包含已知PEG/GCSF比率在1-4范围内的PEG-GCSF的“5K梯带”的结果。泳道7含有蛋白质标准标记物。泳道5和6之间的数字对应于存在的各条带的预期PEG/GCSF比率。
应该注意，标记为每个GCSF分子具有4个PEG的PEG4-GCSF种类以约55.4kDa的表观分子量运行，尽管真实的平均分子量为约41 kDa。如对Tanaka论文中报道的数据所讨论的，当使用球形蛋白作为分子量标记物时，聚乙二醇化化合物的分子量被高估。条带的量化可通过光密度测量来完成，类似于Tanaka所使用的程序。然而，由生物分析仪提供的快速自动化的量化特征优先用于SDS-PAGE所需的更费力和繁琐的量化程序，并且两种技术所获得的结果是相似的。
基于这些结果与Tanaka和Satake-Ishikawa论文中的信息的比较，与本发明的PEGx-GCSF缀合物和PEG[x]-GCSF缀合物混合物的聚乙二醇化程度相比，先前描述的组合物的聚乙二醇化程度明显更低。与Satake-Ishikawa论文的图1中的光密度扫描比较表明，SS-PEG与GCSF以PEG/蛋白质比率为1、5、10和50进行Satake-Ishikawa反应，导致概况由单PEG、单-PEG +二-PEG、单-PEG +二-PEG +三-PEG至二/三/四-PEG混合物组成，但主要是单-和二聚乙二醇化GCSF的混合物。
Tanaka论文中的工作采用以“PEG2”修饰的GCSF，本领域技术人员将其理解为2,4-双(O-甲氧基聚乙二醇)-6-氯-s-三嗪(活化的PEG10000，也称为PEG2)，如Satake-Ishikawa论文中描述的。这与优选地用于本发明方法的SC-PEG的化学大不相同。Tanaka论文指出PEG2 (平均分子量为10000)用于GCSF的聚乙二醇化，并且生成的分子量约为45 kDa，分布在30k Da、40 kDa和66 kDa之间。这与分别用1、2和3个PEG进行的修饰(平均为2)一致。
因此，通过Tanaka和Satake-Ishikawa两者论文中的任何一个公开的方法制备的缀合物产生缀合物的混合物，其特征为聚乙二醇化比率比在本发明PEGx-GCSF缀合物(其中x为4-8)或单个缀合物的PEG[x]-GCSF群(其中[x]为4、5、6、7或8或者更大)中存在的低得多。
PEGx-GCSF缀合物的聚乙二醇化位点
在以下讨论中对GCSF分子上位点的所有数字指涉对应于图1中显示的氨基酸序列，即SEQ ID NO: 1。
本发明一个实施方案的[x]为4或者更大的PEG[x]-GCSF的缀合物混合物样品用蛋白内切酶Glu-C消化，该酶对酸性残基谷氨酸和天冬氨酸的羧基侧为特异性的。在Glu-C肽图的非聚乙二醇化区域未发现含有N-末端和赖氨酸-17的Glu-C片段1-20和含有赖氨酸-35和赖氨酸-41的Glu-C片段35-47，这与其被聚乙二醇化相一致。相比之下，含有赖氨酸-24的Glu-C片段21-34在该残基处显示出没有聚乙二醇化，表明完全没有或低于检测水平的痕量。该数据连同表明在每个GCSF分子上平均存在4-6个PEG的聚乙二醇化程度数据一起，与本发明缀合物在GCSF的 N-末端及17、35和41位上的赖氨酸处的广泛聚乙二醇化一致。该数据符合预期，因为N-末端及17、35和41位的赖氨酸高度暴露，并且因此与亲电试剂比如SC-PEG反应，而24位的赖氨酸相对埋藏在蛋白质的三维构象中，并因此呈现出与SC-PEG的反应性高度受限。由于来自以上描述的生物分析仪和SDS-PAGE实验证据是多达7个PEG可连接于本发明的GCSF，并且连接于GCSF的PEG平均数目接近5，而非4，所以认为剩余的3个PEG的连接位置位于存在于44、53、80、157和171位的组氨酸残基的咪唑基团上，其中优先修饰受单个组氨酸残基的相对暴露程度和局部电子环境影响。
实施例3：体外研究结果
该实施例比较本发明PEG[x]-GCSF与NEULASTA®对于(i) 某些癌细胞和(ii) 正常骨髓祖细胞的细胞增殖活性。
用于评价生长因子的标准生物筛选测试包括使用专门为GCSF产品的分析和药品批次释放而开发的细胞系。开发了鼠M-NSF-60细胞系，并且目前广泛用于GCSF蛋白的药物释放测试(Mire-Sluiset. Al., Pharm. Pharmacol. Commun. 5, 45-49; Shirafuji N1,Exp Hematol. 1989年2月;17(2):116-9)。
使用自ATCC市售获得，并在62 ng/mL重组GCSF (r-GCSF)存在下每周两次连续传代最少20次的M-NFS-60细胞，按照以上实施例1制备的PEG[x]-GCSF样品与来自世界卫生组织的国际标准PEG-GCSF (WHO STD)和Amgen的市售制剂(NEULASTA®)，在平行生物测定中进行分析。通过台盼蓝染料排除法来监测细胞存活力，以确保培养物存活力保持>95%。在第1天，计数细胞并以生长培养基(补充有10% FBS、0.05 mM BME、1x青霉素/链霉素和62 ng/mL人r-GCSF的RPMI 1640)将细胞密度调节至5 x 105个细胞/mL。24小时后，通过台盼蓝排除法测定细胞数，通过离心收集细胞并以5 x 105个细胞/mL悬浮于测定培养基(补充有10%胎牛血清(FBS)、0.05 mM BME、1x青霉素/链霉素的RPMI 1640)中，并恢复到37℃持续24小时。在第3天，计数细胞并在测定中将密度调节至2 x 105个细胞/mL，并将0.1 mL/孔的细胞悬浮液分配至96孔板。在测定培养基中制备测试材料的2 x测定浓度的连续5倍稀释液，并加入0.1 ml。加入样品后，将板放回到37℃培养箱中保持48小时。在第5天，向每孔加入0.04mL的Promega Cell Titer Aqueous One (Promega，Madison，WI)并在37℃下温育。温育4小时后，测量490 nM下的光密度(OD)，并将数据输出到Microsoft Excel (MSXL)WorkbookFile (工作簿文件)。所处理细胞的OD归一化至未处理对照孔的OD，并表示为对照的百分数。通过将数据拟合到三参数逻辑曲线拟合模型(图6)来进行效力估测。代表性数值EC50、95%置信区间与来自图6的拟合优度一起，显示在以下紧接的表2中。表2中的“相对效力”栏代表本发明PEG[x]-GCSF (表中标记为“ANF-Rho”)与WHO PEG-GCSF或NEULASTA®之间的倍数差异。
表2
如在图6和表2中显示的，WHO STD PEG-GCSF和NEULASTA®分别显示0.15和0.02 ng的亚纳克效力值。相比之下，本发明PEG[x]-GCSF (在图6和表2中标记为“ANF-Rho”)的EC50值被估测为效力低至1/255-1/1955，EC50值为约38 ng/mL。PEG-GCSF的所有3种制剂均能在其各自的最大处理浓度下引起同等的细胞增殖。
为了与使用鼠癌细胞系实施的上述研究相比的目的，还测量了本发明PEG[x]-GCSF对正常人细胞的作用。具体地讲，用NEULASTA®或本发明PEG[x]-GCSF处理造血干细胞，并按照以下程序通过流式细胞术定量CD34 (+)干细胞向成熟中性粒细胞的分化和增殖。
冷冻保存的骨髓CD34+细胞和CFC试剂盒购自Stem Cell Technologies(Vancouver, BC, Canada)，并将细胞储存于-135℃下直到测定时。将补充有10% FBS的Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM) (Life Technologies, Grand Island, New York)温热至37℃。通过将小瓶置于37℃浴中解冻细胞，并立即对0.01 mL样品测定存活力。将细胞转移到含有300 μg Dnase I (Life Technologies)的无菌50 ml管中。通过轻轻旋转管并加入温热的培养基直至最终体积为20 ml，继续缓慢温热细胞。通过轻轻倒置混合悬浮液。然后将管以200 g在吊桶式转头(840 rpm, R&D lab, Beckman JS4.2)中，于室温下离心15分钟。用移液管小心除去上清液，留下少量培养基。然后将细胞沉淀悬浮于剩余的培养基中，然后加入20 mL培养基，并通过轻轻倒置混合细胞。然后将该步骤再次重复一次后，然后将细胞沉淀悬浮于1 mL培养基中以使细胞密度为1.5 x 105个细胞/ml。
将MethoCult培养基(Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canada)在4℃下解冻过夜，然后就在测定开始之前使其达到25℃。然后加入NEULASTA®和本发明PEG[x]-GCSF至最终测定浓度为50 ng/mL，并通过涡旋轻轻混合。将两个内部带有盖子的35 mm培养皿置于带有盖子的100 mm皮氏培养皿中。加入第三个没有盖子含有水的35 mm培养皿，以保持适当的湿度水平。将细胞用补充有2% FBS的IMDM稀释至终浓度为5 x 105个细胞/mL。将0.3 ml稀释的细胞加入到3 ml MethoCult管中，并通过涡旋轻轻混合。使混合物静置至少5分钟以使气泡上升到顶部。将无菌的16号钝头针连接到无菌的3 ml注射器上。使空气自注射器中排出，然后将针置于液面的下方，并将约1 ml吸入到注射器中。轻轻压下柱塞以完全排出培养基并重复，直到看不到空气空间。将含有细胞的MethoCult混合物吸入到注射器中，并以1.1 ml的体积分配到每个35 mm培养皿中，而不使注射器接触到培养皿。通过轻轻地倾斜和旋转培养皿使培养基附着于培养皿四周的壁上，同时确保没有培养基接触到盖子，使培养基均匀地分布在每个35 mm培养皿的整个表面上。将培养皿的内容物置于100 mm培养皿中，将约3 ml无菌水加入到未盖的35 mm培养皿中，并在37℃、5% CO2和> 95%湿度下温育14天。通过向每个孔中加入1 ml补充有2% FBS培养基的IMDM自甲基纤维素基质回收细胞，并用移液管上下移液以彻底混合。将整个混合物转移到15 mL管中，并加入11 ml培养基。将细胞以600 xg沉淀10分钟，并吸出培养基上清液。将细胞沉淀悬浮于剩余的培养基中，并通过台盼蓝排除法测定细胞数目。
通过以300 xg离心5分钟，将细胞沉淀以320 μl冷染色缓冲液(BD Pharmingen,San Jose, CA)洗涤两次。通过向每个沉淀加入50 μl Cytofix (BD Pharmingen)来固定细胞，并通过轻轻涡旋重新悬浮。细胞在4℃下温育20分钟，然后以300 xg离心5分钟。然后用1ml染色缓冲液洗涤细胞，总共3次。细胞用直接与异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)缀合的抗CD66b和CD-14抗体染色。通过使用直接缀合的同种型对照抗体来确保染色特异性。然后进行流式细胞术和数据采集。
图7显示CD66和CD14的荧光强度的双变量图的象限门控。CD66 (+)、CD14 (-)细胞表明粒细胞(E4门)，而CD66 (-)细胞、CD14 (+)细胞(E1门)为巨噬细胞的特征。对这两种抗原染色阳性的细胞出现在E2门。NEULASTA®处理(图7的左侧图)导致11%的细胞对CD66染色呈阳性，而用本发明PEG-GCSF缀合物处理(图7的右侧图)导致51%的细胞对CD66染色呈阳性。因此，与用相同浓度NEULASTA®处理的样品相比，本发明缀合物处理的样品中粒细胞的分数是4.6倍高。
这些结果表明，与以上讨论的M-NFS-60生物测定法(其使用源自髓细胞性白血病的细胞系，并且其中本发明PEG[x]-GCSF比目前可获得的产品效力弱得多)的数据相比，本发明PEG[x]-GCSF在引起正常骨髓细胞向粒细胞的分化和增殖方面，具有的效力高达NEULASTA®的约三个数量级。当将癌细胞系和正常细胞各自的效力数据放在一起时，预期本发明的PEG[x]-GCSF缀合物与非格司亭和PEG-非格司亭相比，在引起正常骨髓细胞增殖方面具有更大的临床治疗窗，而不会加剧某些癌症类型的肿瘤生长。
因此，当与NEULASTA®相比时，本发明的PEG[x]-GCSF出乎意料地具有多得多的期望的刺激骨髓细胞增殖的活性，同时不合需要的引起癌细胞增殖的活性小得多。
实施例4：动物研究结果
该实施例呈现大鼠体内药代动力学和药效学研究的结果，表明当与NEULASTA®相比时，本发明的PEG[x]-GCSF刺激中性粒细胞产生的优异能力。
将3批按照以上实施例1制备的本发明PEG[x]-GCSF的药代动力学和药效学与单次皮下(SC)给予大鼠后的NEULASTA®相比。NEULASTA®可市售得到。另外，在研究中包括用于制备适当剂量的制剂缓冲液作为阴性对照。
96只雄性10周半龄的Sprague Dawley (SD)大鼠在第-1天通过腹膜内(IP)注射给予90毫克/千克癌症化疗用环磷酰胺，以诱导中性粒细胞减少症。在第1天通过皮下(SC)注射给予相应的测试品。分别基于在给予环磷酰胺和测试品之前的第-1天和第1天的体重计算个体剂量。使所有的测试品溶液达到环境温度，并在给予之前轻轻倒置和旋转。所有制剂为澄清的溶液。将环磷酰胺以注射用无菌水重新构成，并超声处理以提供澄清的溶液。以25、50和100 μg/kg给予3个单独批次的本发明PEG[x]-GCSF。NEULASTA®以100 μg/ kg给予。IP和SC剂量分别用注射器和针在腹部和剃毛的肩胛中区给予。
通过注射器和针自颈静脉采集血液(约0.8 mL)，并在给药前和给药后12、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264和288小时转移到含有K2EDTA抗凝剂的管中。给药前自2只动物/组和对于所有的给药后采集自4只动物/组/时间点采集血液。每只动物的总血液样品量均在Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)批准的限度内。
每个血液样品被分开，将约400 μL的血液转移到一个新管中，并离心分离血浆。在离心之前将血液样品保持在湿冰上。在采集1小时内开始离心。将血浆转移到带螺旋盖的冷冻小瓶中并置于干冰上，之后储存于约-70℃下。测定中性粒细胞绝对计数(ANC)。
然后按照制造商的说明书，使用市售购买的ELISA试剂盒测定人GCSF血浆水平(目录号DCS50, RnD Systems, Minneapolis, MN)。本发明PEG[x]-GCSF批次和NEULASTA®的血浆浓度作为给予后时间的函数显示在图8中(对应于本发明PEG[x]-GCSF的数据集分别标记为“批次1”、“批次2”和“批次3”)。
统计分析：使用Excel (Microsoft，Redmond WA)整理ANC (表示为103个细胞/mL)和GCSF血浆水平(表示为ng/mL)。使用Prism Graphpad (Graphpad Software, La Jolla,CA)将数据显示为作为给予后时间的函数的ANC或GCSF浓度。按照软件说明书实施GCSF和ANC两者的曲线下面积、单相衰减和线性回归分析。使用Dunnett事后检验进行方差分析(ANOVA)以证明治疗组之间的显著性差异(p <0.05)。
图8A显示在给予后≤24小时聚乙二醇化GCSF分子峰值和然后相对快速地下降两者的水平。然而，当浓度在图8B中以对数标度显现时，本发明缀合物与NEULASTA®之间的差异变得明显。100 μg/ kg的NEULASTA®浓度在72小时后下降约3个数量级。这与本发明的缀合物形成对比，后者在研究过程期间显示出血浆浓度缓慢、稍微稳定的下降，并且在给予后5天后保持高达NEULASTA®水平的20-100倍。
为了进一步评估治疗组血浆水平的差异，使用“曲线下面积”分析(AUC)的药代动力学用于定量本发明的缀合物和NEULASTA®的血浆暴露。图9A总结了每个本发明缀合物批次的AUC值和剂量以及NEULASTA®。与等剂量的NEULASTA®相比，以100 μg/kg给药的每个批次本发明缀合物导致血浆浓度明显更高。以25或50 μg/kg给药的动物的本发明PEG[x]-GCSF血浆水平明显低于给予NEULASTA®的大鼠的血浆中GCSF水平(因为NEULASTA®剂量为100 μg/kg)。为了进一步表征剂量和血浆暴露之间的关系，根据剂量合并每个本发明缀合物批次的AUC值，并进行线性回归分析(图9B)。100 μg/kg剂量的本发明PEG[x]-GCSF的7322ng/ml*小时的合并AUC显著高于对于NEULASTA®计算的5543 ng/ml*小时。本发明缀合物剂量为50和25 μg/kg分别产生比NEULASTA®显著更低的AUC值3127和1280 (这也并不出乎意料，因为NEULASTA®的剂量为100 μg/kg)。在该项研究中，剂量与血浆AUC之间呈线性关系(r2=0.91)。此外，当个体100 μg/kg本发明缀合物AUC值与给予NEULASTA®的大鼠的平均值和95%置信区间进行比较时，24只大鼠中有22只在相同剂量下实现了更大的血浆暴露。
图10显示给予本发明PEG[x]-GCSF、NEULASTA® (NLST)或制剂缓冲液(FB)的大鼠的中性粒细胞绝对计数(ANC)作为时间函数的代表性图表。有两点必须考虑：首先，在环磷酰胺治疗后随着先天性增殖反应恢复，给予FB的大鼠中性粒细胞水平逐渐升高；和第二，在给予聚乙二醇化测试品之后立即ANC水平急剧增加。这第二点归因于GCSF介导的预先形成的未成熟中性粒细胞自骨髓和其他区室的释放(阴影区域)，即“干细胞库动员”。因此，为了准确比较由本发明缀合物或NEULASTA®介导的从头增殖，AUC分析仅考虑96小时后的ANC水平，落在图10的阴影区域内的数据没有包括在ANC分析中。比较~125和250小时之间的ANC计数显示，与相当剂量水平的NEULASTA®相比，用本发明PEG[x]-GCSF的ANC计数更高。
为了更好地分析效力差异，在3种单独的浓度(25、50和100 μg/kg)下，用3个独特批次的本发明PEG[x]-GCSF评估在从头增殖期间过程中中性粒细胞绝对计数的AUC (AUC-ANC)。这样，可定量中性粒细胞产生的水平和持续时间。图11A总结了本发明缀合物和NEULASTA®治疗的中性粒细胞减少症大鼠的中性粒细胞绝对计数的AUC。当与制剂缓冲液比较时，每种剂量的NEULASTA®和本发明PEG[x]-GCSF两者均能显著增加中性粒细胞增殖。此外，当与以100 μg/kg给药的NEULASTA®相比时，50和25 μg/kg水平的本发明PEG[x]-GCSF实现了类似的中性粒细胞增殖，并且在50 μg/kg剂量的情况下，中性粒细胞增殖略有增加。另外，在与NEULASTA®相同的100 μg/kg剂量下，本发明的PEG[x]-GCSF获得了显著更 高的中性粒细胞水平。还使用相同的数据集产生了线性回归图，以进一步图解说明本发明PEG[x]-GCSF与NLST (图11B的阴影区域)相比的药效学性质。
如果将药代动力学(图9)和药效学(图10)数据放在一起，则本发明PEG[x]-GCSF呈现不同于NEULASTA®的概况。与100 μg/kg NEULASTA®相比，本发明PEG[x]-GCSF的剂量为25和50 μg/kg提供显著降低的血浆水平。与100 μg/kg NEULASTA®相比，25和50 μg/kg的血浆GCSF AUC分别低至1/4.3和1/1.8，峰值水平分别低至1/7.2和1/2.9。然而，与100 μg/kg的NEULASTA®相比，较低剂量(25和50 μg/kg)的本发明缀合物导致在体内产生相当的中性粒细胞。结合实施例3中呈现的体外CD34 (+)祖细胞结果，其显示等剂量的本发明缀合物可产生是NEULASTA®4倍多的粒细胞，这些数据表明PEG[x]-GCSF在中性粒细胞产生方面比NEULASTA®更有效力，并具有显著更长的循环半衰期。这表明本发明制剂具有以下优点：
• 不像目前市售可得到的制剂比如NEULASTA®，本发明的PEG[x]-GCSF可以在化疗期间的任何时间给予，并且如果必要的话，可考虑以当前的或增加的剂量再次给予。在给予本发明PEG[x]-GCSF之后ANC的升高比在化疗后7天期间(在严重中性粒细胞减少症风险最高的关键时间)可归因于NEULASTA®的ANC升高慢。这是因为NEULASTA®明显动员干细胞池的大多数(结果快速产生中性粒细胞)，并因此NEULASTA®的给药说明书要求再次给予NEULASTA®之前延迟14天-以使得干细胞再生它们自己。相比之下，本发明的PEG[x]-GCSF似乎只动员干细胞池的较小部分(导致中性粒细胞的产生更渐进和更持久)。出于这个原因，基于以上证实的ANC的增加更缓慢和更持久，在本发明制剂的情况下14天的预防措施是不必要的。此外，即使没有这种“重复给药”，本发明制剂的作用也保持ANC不降至中性粒细胞减少症水平(<2.0 x 10e5/L)。临床医生一般地监测21天周期内对化疗的反应。因此，如果没有观察到期望的肿瘤生长减少，则本发明的PEG[x]-GCSF可用于在整个这种21天周期的任何时间来支持化疗剂量-增强。
• 本发明的PEG[x]-GCSF为患者提供了改善的生活质量，因为与NEULASTA®相比，他们可用较低但同等或更有效剂量的本发明PEG[x]-GCSF和/或用频率较低的给药来治疗，导致例如骨痛减轻。
实施例5：临床研究(骨痛)
在许多非聚乙二醇化和聚乙二醇化GCSF的试验中，骨痛是最显著且有害的不良事件(Renwick 等人, 2009)。已有几种类型的治疗干预试图预防和治疗GCSF治疗介导的骨痛。对乙酰氨基酚、非甾体抗炎药、抗组胺药和阿片类药物已被用于试图减轻疼痛，并取得了不同程度的成功(Kirsher, 2007, Oagata 2005)。一项观察性的回顾性研究显示，当PEG-非格司亭剂量从6 mg减少至4 mg时，在25位患者中未观察到骨痛(Paba 等人 2008)。基于前述的临床前药代动力学和药效学，本发明的PEG[x]-GCSF具有在较低剂量下与NEULASTA®一样有效的潜力。然后随之而来的是，在这种较低的剂量下，本发明的缀合物不会引起与NEULASTA®给予相关的骨痛。
实施了临床研究，其包括基于从5至10至20至40至80 μg/kg体重的递增的单次皮下剂量的本发明缀合物的给药方案。还进行了双盲、随机、安慰剂对照研究，以研究PEG[x]-GCSF与NEULASTA®相比在人体内的安全性、耐受性、药代动力学和药效学。志愿者皮下给予增加剂量的本发明缀合物，并具有主要安全性终点。另外，在其它参数中，骨痛评分与本发明缀合物和NEULASTA®两者的基线值进行比较。直观类比标度(VAS)与特定的骨痛问卷一起用于确定总体疼痛。VAS和骨痛两者均使用疼痛描述符锚定的100 mm水平线进行定量，并且通过测量距离该线的左手(无疼痛)侧的距离来指示疼痛。给予本发明缀合物的患者比给予NEULASTA®的患者报告的骨痛更少。

Claims (63)

1.一种PEGx-GCSF，其中x为4-8的整数。
2.权利要求1的PEGx-GCSF，其中x为5。
3.权利要求1的PEGx-GCSF，其中x为6。
4.权利要求1的PEGx-GCSF，其中x为7。
5.权利要求1的PEGx-GCSF，其中PEG通过源自GCSF的胺连接于GCSF。
6.权利要求1的PEGx-GCSF，其包含不可水解的键。
7.权利要求6的PEGx-GCSF，其中所述不可水解的键为氨基甲酸酯键。
8. 权利要求1的PEGx-GCSF，其中GCSF为具有选自以下的氨基酸序列的蛋白质：SEQ IDNO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4及其功能衍生物和同系物。
9. 权利要求8的PEGx-GCSF，其中所述氨基酸序列为SEQ ID: 1、SEQ ID: 1的功能衍生物或SEQ ID: 1的同系物，其中GCSF具有17位的赖氨酸残基、35位的赖氨酸残基、41位的赖氨酸残基、44位的组氨酸残基、53位的组氨酸残基、80位的组氨酸残基、157位的组氨酸残基和171位的组氨酸残基。
10.权利要求9的PEGx-GCSF，其中每个PEG在选自以下的位置连接于GCSF：N-末端、17位的赖氨酸残基、35位的赖氨酸残基、41位的赖氨酸残基、44位的组氨酸残基、53位的组氨酸残基、80位的组氨酸残基、157位的组氨酸残基和171位的组氨酸残基。
11. 权利要求1的PEGx-GCSF，其中PEG具有约3-约15 kDa的平均分子量。
12. 权利要求11的PEGx-GCSF，其中PEG具有约5-约6 kDa的平均分子量。
13.一种包含PEGx-GCSF群的PEG[x]-GCSF，其中[x]为x的平均值，和其中[x]大于或等于约4。
14.权利要求13的PEG[x]-GCSF，其中[x]为约4-约8。
15.权利要求13的PEG[x]-GCSF，其中[x]为约4-约6。
16.权利要求13的PEG[x]-GCSF，其中[x]为约5-约6。
17. 权利要求13的PEG[x]-GCSF，其包含少于10% PEGx-GCSF，其中x为1-3。
18. 权利要求13的PEG[x]-GCSF，其包含至少约15% PEGx-GCSF，其中x为4。
19. 权利要求13的PEG[x]-GCSF，其包含至少约30% PEGx-GCSF，其中x为5。
20. 权利要求13的PEG[x]-GCSF，其包含至少约10% PEGx-GCSF，其中x为6。
21. 权利要求13的PEG[x]-GCSF，其包含少于15% PEGx-GCSF，其中x为7。
22. 权利要求13的PEG[x]-GCSF，其包含至少约15% PEGx-GCSF，其中x在6-7的范围内。
23. 权利要求13的PEG[x]-GCSF，其包含至少约35% PEGx-GCSF，其中x在5-7的范围内。
24.权利要求13的PEG[x]-GCSF，其中PEG通过源自GCSF的胺连接于GCSF。
25.权利要求13的PEG[x]-GCSF，其中PEGx-GCSF包含不可水解的键。
26.权利要求25的PEG[x]-GCSF，其中所述不可水解的键为氨基甲酸酯键。
27. 权利要求13的PEG[x]-GCSF，其中GCSF为具有选自以下的序列的氨基酸：SEQ IDNO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4及其功能衍生物和同系物。
28. 权利要求27的PEG[x]-GCSF，其中所述氨基酸为SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 1的功能衍生物或SEQ ID NO: 1的同系物，其中GCSF具有17位的赖氨酸残基、35位的赖氨酸残基、41位的赖氨酸残基、44位的组氨酸残基、53位的组氨酸残基、80位的组氨酸残基、157位的组氨酸残基和171位的组氨酸残基。
29.权利要求28的PEG[x]-GCSF，其中每个PEG在选自以下的位置连接于GCSF：N-末端、17位的赖氨酸残基、35位的赖氨酸残基、41位的赖氨酸残基、44位的组氨酸残基、53位的组氨酸残基、80位的组氨酸残基、157位的组氨酸残基和171位的组氨酸残基。
30. 权利要求13的PEG[x]-GCSF，其中PEG具有约3-约15 kDa的平均分子量。
31. 权利要求30的PEG[x]-GCSF，其中PEG具有约5-约6 kDa的平均分子量。
32.权利要求13的PEG[x]-GCSF，所述群包含：
约0%-约5%的PEGx-GCSF，其中x为3；
约22%-约32%的PEGx-GCSF，其中x为4；
约38%-约42%的PEGx-GCSF，其中x为5；
约18%-约28%的PEGx-GCSF，其中x为6；和
约0%-约9%的PEGx-GCSF，其中x为7。
33. 权利要求13的PEG[x]-GCSF，其中PEG通过氨基甲酸酯键连接于GCSF，和其中PEG具有约3-约15 kDa的平均分子量分子量。
34. 权利要求33的PEG[x]-GCSF，其中PEG具有约5-约6 kDa的平均分子量。
35.一种药用制剂，其包含权利要求13的药用活性量的PEG[x]-GCSF和无蛋白载体。
36.一种在有需要的患者中增加白细胞计数的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的权利要求35的药用制剂。
37.权利要求36的方法，其中所述患者处于中性粒细胞减少症的风险或患有中性粒细胞减少症。
38.权利要求36的方法，其中所述患者已经或正在用降低患者白细胞计数的药物治疗。
39.权利要求36的方法，其中所述患者具有降低的内源性GCSF水平。
40.权利要求36的方法，其中所述患者正在接受放射治疗。
41.权利要求38的方法，其中所述患者正在被治疗癌症。
42.权利要求41的方法，其中所述癌症为骨髓癌。
43.权利要求37的方法，其中所述患者正患有严重慢性中性粒细胞减少症或严重先天性中性粒细胞减少症或严重联合中性粒细胞减少症。
44.权利要求36的方法，其中所述患者在自体干细胞移植前进行治疗。
45.一种在有需要的患者中治疗严重脓毒症或感染性休克的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的权利要求35的药用制剂。
46.一种用于制备权利要求1的PEGx-GCSF的方法，所述方法包括以下步骤：
(a) 获得具有约5.0 mg/ml浓度的GCSF溶液；
(b) 合并GCSF溶液与PEG，其中PEG以GCSF摩尔量的约65-约75倍的摩尔量存在；
(c) 使GCSF与PEG反应足够的时间，以产生PEGx-GCSF；
(d) 以足以与残余PEG反应的量加入羟胺；
(e) 分离PEG[x]-GCSF与未反应的PEG、N-羟基琥珀酰亚胺和羟胺；和
(f) 分离PEGx-GCSF。
47. 权利要求46的方法，其中约5.0 mg/ml的GCSF溶液通过浓缩GCSF溶液的步骤得到。
48. 权利要求46的方法，其进一步包括将分离的PEGx-GCSF在溶液中浓缩至约5.5-6mg/ml的步骤(g)。
49.权利要求47的方法，其中所述浓缩步骤通过膜渗滤实现。
50.权利要求48的方法，其中所述浓缩步骤通过膜渗滤实现。
51.权利要求46的方法，其中pH在步骤(a)-(e)期间保持在约7.75。
52.权利要求46的方法，其中在整个方法期间温度保持在室温下。
53.权利要求46的方法，其中步骤(b)和(c)实施约1小时。
54.权利要求46的方法，其中步骤(d)实施约2小时。
55.一种用于制备权利要求13的PEG[x]-GCSF的方法，所述方法包括以下步骤：
(a) 获得具有约5.0 mg/ml浓度的GCSF溶液；
(b) 合并GCSF溶液与PEG，其中PEG以GCSF摩尔量的约65-约75倍的摩尔量存在；
(c) 使GCSF与PEG反应足够的时间，以产生PEGx-GCSF；
(d) 以足以与残余PEG反应的量加入羟胺；和
(e) 分离PEGx-GCSF与未反应的PEG、N-羟基琥珀酰亚胺和羟胺。
56. 权利要求55的方法，其中约5.0 mg/ml的GCSF溶液通过浓缩GCSF溶液的步骤得到。
57. 权利要求55的方法，其进一步包括将分离的PEGx-GCSF在溶液中浓缩至约5.5-6mg/ml的步骤(f)。
58.权利要求56的方法，其中所述浓缩步骤通过膜渗滤实现。
59.权利要求57的方法，其中所述浓缩步骤通过膜渗滤实现。
60.权利要求55的方法，其中pH在步骤(a)-(e)期间保持在约7.75。
61.权利要求55的方法，其中在整个方法期间温度保持在室温下。
62.权利要求55的方法，其中步骤(b)和(c)实施约1小时。
63.权利要求55的方法，其中步骤(d)实施约2小时。
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