KR20180017104A - Peg화된 과립세포 콜로니 자극 인자(gcsf) - Google Patents

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KR20180017104A
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에이브라함 아부초스키
로널드 쥐. 주빈
피터 제이. 부온템포
프리데리크 카조
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앰비오 파마슈티컬스, 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 x가 GCSF당 PEG의 양이고 4 내지 8 범위인 신규 PEGx-GCSF 접합체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 [x]가 집단의 GCSF당 PEG의 평균 양이고 4 이상인 개별 PEGx-GCSF 접합체의 PEG[x]-GCSF 집단에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 부작용의 가능성을 피하거나 실질적으로 저하시키면서 예상치못한 치료 효능을 나타낸다.

Description

PEG화된 과립세포 콜로니 자극 인자(GCSF)
본 발명은 2015년 6월 11일에 출원한 미국 가특허출원 미국 일련번호 62/174,373, 및 2015년 6월 24일에 출원한 미국 일련번호 62/184,042를 우선권으로 주장하며, 이 가출원들의 전 내용들은 본원에 참고 인용된다.
본 발명은 부작용의 가능성을 피하거나 실질적으로 저하시키면서 예상치 못한 치료 효능이 있는 신규 PEG-GCSF 접합체에 관한 것이다.
최근, 폴리에틸렌 글리콜("PEG")과 같은 비-항원성 수용성 중합체는 치료 및 진단 중요성이 있는 폴리펩타이드를 공유 변형하는데 사용되고 있다. PEG는 비독성이고 비면역원성이며 고수용성이고 신체로부터 쉽게 제거되는 중합체이다. PEG는 많은 용도가 있고 흔히 식품, 화장품, 음료 및 처방약에 흔히 사용된다. 약제 등급의 PEG는 미국에서 FDA의 사용 승인을 받았고, 고도의 생체적합성이 있다면 바이오약제 운반체로써 널리 사용된다. PEG화는 바이오약제의 기능을 변경함이 없이 바이오약제의 특정 특성을 변형시켜 치료 효과를 향상시킬 수 있다.
호중구 과립세포는 포유동물에 존재하는 백혈구 세포 중에서 가장 풍부한 종류로, 선천적 면역계의 필수 부분을 구성한다. 이의 생산은 CD34+ 골수성 전구체 세포의 표면에 위치한 동족 수용체와 과립세포 콜로니 자극인자(GCSF)의 체결을 통해 조절된다. 수용체 체결은 수용체 사슬 올리고머화, 재배열 및 세포내 키나제를 통해 매개된 시그널 도입을 초래하고, 결과적으로 분화 및 세포 분열을 촉진하는 유전자 발현 패턴을 산출하여 호중구 수를 증가시킨다. GCSF 수용체 시그널링의 중요성은 시토킨:수용체 시그널링 경로에 선천적 유전자 오류가 있는 개체에서 예시된다. 종합하면, 제한된 시그널링은 호중구의 적당한 수준을 유지하는 능력을 저하시킬 것이다. GCSF 수용체를 통한 시그널링은 호중구의 생산 및 유지에 중요하고, GCSF 시그널링에 선천적 유전자 오류를 가진 개체는 저하된 호중구 수를 갖고 있어서 심각한 재발성 미생물 감염에 걸리기 쉽다.
이와 유사하게, 많은 암 치료법은 이의 항증식 활성으로 인해 호중구 수준을 강력하게 억제하는 것으로 나타난다. 많은 종류의 화학요법 약물의 가장 심각한 잠재적 부작용 중 하나는 저하된 호중구 수준을 포함하는 낮은 백혈구 세포수이다(호중구감소증). 호중구감소증은 몇몇 환자들을 심각한 감염의 위험에 처하게 할 수 있고, 이로써 화학요법 치료 사이클을 중단할 수 밖에 없게 한다. 실제로, 낮은 백혈구 세포수와 관련된 합병증은 화학요법의 용량 저하 또는 지연을 유발하는 가장 흔한 원인이다(Link, et al.(2001) Cancer 92: 1354-1367; Lyman, et al.(2003) J.Clin.Oncol. 21: 4524-4531; and Lyman, et al.(2002) Am. J. Med. 112:406-411, 각 전문이 본원에 참고 인용됨). 이러한 용량 의존적 현상은 많은 종양학 약물의 치료 투여량을 급격하게 제한했다.
임상용 재조합 GCSF(필그라스팀)의 개발은 강력한 항-호중구 활성이 있는 암 치료를 받는 개체뿐만 아니라 중증 만성 호중구감소증(SCN)을 갖고 태어난 개체를 극적으로 호전시켰다. GCSF는 신장 시스템을 통해 쉽게 제거되는 작은 단백질이다. GCSF의 마우스 버전은 1983년에 이식된 조직으로부터 정제되었고, 인간 등가물은 1985년에 우연히 GCSF를 고농도로 발현하는 배양물에서 증식된 암세포주로부터 정제되었다(예컨대, Welte, et al.(1985) PNAS USA 82: 1526-30, 전문이 본원에 참고 인용됨). 인간 GCSF는 탄수화물 성분에 따라 가변적으로 산성인 약 19kD의 당단백질인 것으로 밝혀졌다. 이후에는 탄수화물 성분이 생물학적 활성에 선택적이라는 것도 밝혀졌다. 인간 재조합 GCSF의 클로닝 및 특성화는 1984년과 1986년 사이에 수행되었고, 이.콜리(E.coli) 세포에서 발현되었고, 궁극적으로 화학요법 유도성 호중구감소증을 앓고 있는 환자에서 이 화합물의 인간 임상 실험이 시험되었다. 1991년에는 이.콜리에서 제조된 재조합 인간 GCSF가 상기 용도로 미국 FDA의 승인을 받았고(Filgrastim, 상표명 Neupogen®), 1993년에는 관련된 중국 햄스터 난소 세포에서 발현된 형태가 유럽에서 승인되었다(레노그라스팀이라는 명칭으로). 코어 단백질은 174개의 아미노산을 포함하는 것으로 밝혀져 있지만, 다수의 변형체가 존재하는 것으로 알려져 있다(예컨대, Ngata, et al.(1986) Nature 319:415-18; Souza, et al.(1986) Science 232: 61-5; 미국 특허 4,999,291, 각각 참고 인용됨).
미국 특허 4,810,643, 4,999,291, 5,582,823 및 5,580,755(암젠, 인크.에게 양도되고 1985년 8월 23일에 출원된 미국 특허출원 07/768,959에 대한 우선권을 주장한다)는 특정 인간 만능 GCSF 분자 및 이의 생산 방법을 제공하며, 각 문헌은 본원에 전문이 참고 인용된다. 이러한 분자들이 승인된 제품인 Neupogen의 기반을 구성한다. 이러한 케이스들에서 분자의 잠재적 PEG화에 대한 논의는 전혀 없다.
필그라스팀은 생체내에서 쉽게 분해되기 때문에, Neupogen은 암 치료에 의해 유발되는 발열성 호중구감소증의 발생 동안 매일 투여해야만 한다. 하지만, PEG화는 GCSF 단백질의 유체역학적 반경을 증가시키고 혈청 제거율을 감소시키며 생체내 약물 반감기를 향상시키기에 그럴듯한 시도를 나타낸다. 알데하이드-활성화된 20kDa 선형 PEG로 GCSF의 N-말단을 부위 특이적 PEG화하여(PCT 공개번호 WO 96/11953 및 미국 특허 5,824,784 및 7,090,835 참조), PEG-필그라스팀이 개발되었고, 2002년 상표명 NEULASTA®로 미국 FDA의 승인을 받았다(NEULASTA®[패키지 인서트]. Thousand Oaks, CA, Amgen, Inc. 개정 02/2010; NEULASTA® [패키지 인서트]. Thousand Oaks, CA, Amgen, Inc., 개정 4/2016 v1, 둘 다 본원에 참고인용됨). 이러한 GCSF의 단일 PEG화된 버전은 PEG 모이어티가 단백질의 아미노 말단에 공유 부착된 것으로, GCSF 단백질의 분자량을 증가시켜 신장 제거율을 상당히 감소시킨다. 아미노 말단에 있는 PEG 기의 위치는 GCSF 단백질 - GCSF 수용체 상호작용에 특별히 파괴적인 것은 아닌데, 그 이유는 수용체 상호작용에 관여하는 결합 영역의 단백질 잔기들이 직접 PEG화되거나 또는 아미노 말단 20kDa PEG에 의해 입체적으로 방해되는 것은 아니기 때문이다.
또한, 안정화된 GCSF 분자를 제공하기 위한 몇몇 대안적 전략들이 제안되었다. 시스테인 잔기에 PEG의 결합은 표적화에 있어서 특정한 향상을 제공했다. 티올 반응성 PEG(예컨대, PEG-말레이미드)는 이의 자유 시스테인 잔기에서 GCSF에 결합되어 있다. 문헌(Veronese, et al.(2007) Bioconjugate Chem. 18: 1824-1830)은 Cys 18에서의 GCSF의 PEG화에 대해 기술하고 있고, 이것은 응집체가 공유응집된 것은 아니지만 응집을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 이와 유사하게, 문헌[Hao, et al.(2006) Biodrugs 20:357-363]은 분자의 반감기를 증가시키는 것으로 밝혀진, Cys18에 대한 PEG-말레이미드의 접합을 기술하고 있다.
부위 특이적 돌연변이유발은 부위 특이적 중합체 부착을 위해 폴리펩타이드를 제조하는데 사용되고 있는 또 다른 시도이다. 예를 들어, 미국 특허 6,646,110은 GCSF 활성을 나타내고 PEG 또는 올리고사카라이드 모이어티의 삽입을 위한 부착 기를 함유하는 아미노산 잔기를 가진 폴리펩타이드 접합체를 기술한다. 이들은 리신, 글루탐산, 시스테인 또는 아스파르트산을 포함할 수 있다.
WO 2011/041376은 이 출원의 발명자들 중 한 명에 의한 부위 특이적 PEG화에 대한 또 다른 시도를 보여준다. WO 2011/041376의 내용들은 전문이 참고 인용된다. 이러한 이전 작업에서, 메톡시-PEG 아세트알데하이드는 DMSO 함유 반응 완충액에서 GCSF와 반응하여 단일PEG화된 GCSF 접합체의 집단을 생산했고, 이때 접합은 N-말단 부근의 리신 기에서 이루어지며, 이때 조성물의 적어도 30%는 N-말단 PEG화되지 않은 것이다. 대안적 양태에 따르면, 이 조성물은 적어도 80% 단일PEG화된 GCSF 접합체를 함유했고, 이 조성물의 적어도 30%는 N-말단 PEG화 되지 않은 것이다.
부위 특이적 PEG화의 대안으로써, N-하이드록시-석신이미드 에스테르를 이용한 랜덤 PEG화는 아미드 결합을 통해 안정한 단백질-PEG 접합체를 형성한다. 이러한 에스테르 시약은 리신 잔기의 아미노 기 및 N-말단과의 반응에 비교적 특이적이지만, 다른 단백질 친핵체, 예컨대 히스티딘, 세린 및 티로신 잔기와도 더 적은 정도로 반응한다. 온도, pH, PEG 시약의 양 및 시간과 같은 반응 조건은 산물의 불균일성을 결정한다(즉, 단일PEG화, 이중PEG화, 삼중PEG화 및 그 이상 PEG화된 접합체가 형성될 수 있다). 단백질에 존재하는 다른 친핵성 기와의 반응으로 인해, 다중PEG화된(그리고 특히 단일PEG화된) 접합체는 생물학적 성질 및 생물의약적 성질이 실질적으로 다를 수 있는 위치 이성질체를 생산한다. 고도의 PEG화 가변성 뿐만 아니라 재현성있는 방식의 제조 능력은 임상 약물 개발에서 SC-PEG의 사용을 제한했다. 하지만, 이러한 접합체들이 몇몇 상황에서 임상적 관련이 있을 수 있음을 입증하는 예가 있다(예, Oncaspar, Adagen).
이전 시도들은 아민 반응성 PEG를 이용하여 리신 잔기 및 N-말단 아미노산에 노출된 아민 기에 부착시켜 PEG-GCSF를 형성시키는 것으로, 제한적인 성공을 나타내는 것으로 보고되었다. 이러한 시도는 GCSF가 N-말단 아미노산 및 4개의 리신 잔기를 함유하고 상기 리신 잔기가 수용체 결합 영역에 위치하기 때문에, 이 GCSF에는 적합하지 않은 것으로 관찰되었다. 따라서, 아민-반응성 PEG 시약에 의한 GCSF의 변형은 부착된 PEG 분자의 수 및 크기에 따라 단백질의 시험관내 생물학적 활성을 3배 내지 50배 감소시킨다. 시험관내 생물활성은 GCSF가 단백질의 반감기를 연장시키는데 가장 유용한 큰 PEG, 예컨대 20kD PEG로 변형될 때 가장 큰 상실을 나타낸다. 아민-PEG화된 GCSF는 불균일성이고, 모두 다른 특이적 활성을 가질 수 있는 적어도 4개의 이소폼(isoform) 및 다수의 분자량 종의 복잡한 혼합물로 나타난다.
이 시도의 특별한 예는 1990년대 초에 2개의 전문지에 기린 브루어리 컴패니에 근무하는 약제 연구팀에 의해 기술되었다[Tanaka et al.(1991) Cancer Research 51:3710-3714 및 Satake-Ishikawa et al.(1992) Cell Structure and Function 17: 157-160]. 이 연구자들은 GCSF 단백질의 각 분자가 분명히 1개, 2개 또는 3개의 PEG에 의해 변형되고 평균 2개에 의해 변형된 접합체 혼합물을 제조했다. 이 연구자들에 의해 이용된 활성화된 PEG 시약은 SS-PEG(4.5kDa 또는 10kDa)였다. 단백질과 PEG 사이에 결과적으로 수득되는 아미드 결합은 안정하지만, 링커(linker)가 가수분해적으로 불안정한 에스테르 기를 함유한다. 이러한 가수분해는 화합물이 수성 매질에 존재하는 한 일어날 것이고, 따라서 용액에 존재하는 한 PEG 수는 계속 감소한다. 에스테르 결합의 가수분해는 석신이미딜 기로 고리화할 수 있는 석시네이트 기를 남긴다. 이러한 비-천연 잔기는 면역원성을 비롯한 항체 반응을 초래할 가능성이 있을 수 있다.
공지된 버전의 GCSF, 예컨대 PEG화된 버전과 관련된 부작용은 용량 관련된 사구체신염, 골통증의 부작용 및 중증 부작용을 포함한다. 이는 통증이 있는 치료 기간을 겪고 있는 많은 암 환자들 또는 몇몇 증례들에서 신장 손상 및/또는 골통증의 중증 부작용으로 인한 모든 치료의 중단 또는 감소를 초래했다. 이러한 필그라스팀 또는 PEG-필그라스팀에 의한 부작용은 투여량 수준과 관련이 있다. 따라서, 새로운 GCSF 버전(바람직하게는, 향상된 PK 프로필을 가진 PEGx-GCSF)은 저하된 부작용과 함께 호중구의 임상적으로 유익한 증가를 제공하도록 보장한다. 따라서, 현행 치료와 유사하게 호중구 증가를 초래할 수 있지만 투여량이 더 낮은 약물 제형은 호중구감소증과 관련된 증상을 호전시키는데 바람직한 시도일 것이다.
장기간 GCSF 치료의 또 다른 잠재적 결과는 악성으로 발달하는 기회의 증가이다. 장기적인 GCSF 치료를 필요로 하는 중증 만성 호중구감소증(SCN) 환자는 GCSF 치료를 받은 시간에 정비례하는 골수형성이상 증후군의 증가된 위험을 갖고 있다. 또한, GCSF는 골수성 암을 악화시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, Neupogen은 골수형성이상 증후군, 만성 골수성 백혈병 및 2차 급성 골수성 백혈병(AML) 등을 가진 환자들에게는 권장되지 않는다. 따라서, 정상 세포에 더 선택적인 증식 활성을 갖고 있어서 기존 현행 치료들에 비해 암 세포의 증식을 감소시키거나 암 세포 증식을 피하는 GCSF 치료법을 제공하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명의 양태들은 x가 GCSF당 PEG의 수를 나타내고 4 내지 8 범위의 정수인 PEGx-GCSF에 관한 것이다.
PEGx-GCSF의 양태들에서, PEG 모이어티는 평균분자량이 약 3 내지 약 15kDa, 또는 바람직하게는 약 5 내지 약 6kDa이다.
본 발명의 PEGx-GCSF의 특정 양태들에서, PEG는 GCSF에서 기원하는 아민을 통해 GCSF에 부착된다. 대안적 양태들에서, PEGx-GCSF는 비-가수분해성 결합, 예컨대 우레탄 결합을 함유한다.
본 발명의 PEGx-GCSF의 다른 양태들에서, GCSF는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4 및 이의 기능성 유도체 및 동족체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 가진 단백질이다. 추가 양태들에서, GCSF 아미노산 서열은 서열번호 1이고 각 PEG는 N-말단, 위치 17의 리신 잔기, 위치 35의 리신 잔기, 위치 41의 리신 잔기, 위치 44의 히스티딘 잔기, 위치 53의 히스티딘 잔기, 위치 80의 히스티딘 잔기, 위치 157의 히스티딘 잔기 및 위치 171의 히스티딘 잔기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 GCSF 위치에 부착된다.
또한, 본 발명의 양태들은 PEG[x]-GCSF, 즉 PEGx-GCSF 집단을 함유하는 조성물(여기서, [x]는 이 집단의 x의 평균 값이고, [x]는 약 4보다 크거나 같고; [x]는 약 4 내지 약 8이고; [x]는 약 4 내지 약 6이고; 또는 [x]는 약 5 내지 약 6이다)에 관한 것이다.
특정 양태들에서, PEG[x]-GCSF는 다음 중 하나 이상을 특징으로 한다: PEG[x]-GCSF는 x가 1 내지 3인 PEGx-GCSF를 10% 미만으로 함유하고; PEG[x]-GCSF는 x가 4인 PEGx-GCSF를 약 15% 이상 함유하며; PEG[x]-GCSF는 x가 5인 PEGx-GCSF를 약 30% 이상 함유하고; PEG[x]-GCSF는 x가 6인 PEGx-GCSF를 약 10% 이상 함유하고; PEG[x]-GCSF는 x가 7인 PEGx-GCSF를 15% 미만으로 함유한다.
다른 양태들에서, PEG[x]-GCSF는 x가 6 내지 7 범위인 PEGx-GCSF를 약 15% 이상 함유하고; 또는 x가 5 내지 7 범위인 PEGx-GCSF를 약 35% 이상 함유한다.
추가 양태들은 PEGx-GCSF 또는 PEG[x]-GCSF의 약학적 활성 양 및 비-단백질 운반체를 함유하는 약학적 제형에 관한 것이다.
본 발명의 추가 양태들은 x가 4 내지 8인 본 발명의 PEGx-GCSF 또는 [x]가 4 이상인 PEG[x]-GCSF를 제조하는 방법으로써, (a) 농도가 약 5.0mg/ml 이상인 GCSF 용액을 수득하는 단계; (b) 이 GCSF 용액을 PEG와 배합하되, PEG의 몰량이 GCSF 몰량의 약 65 내지 약 75배인 단계; (c) GCSF와 PEG가 PEGx-GCSF를 생산하기에 충분한 시간 동안 반응시키는 단계; (d) 잔류 PEG와 반응하기에 충분한 양의 하이드록실아민을 첨가하는 단계; 및 (e) 미반응 PEG, N-하이드록시석신이미드 및 하이드록실아민으로부터 PEG[x]-GCSF를 분리하는 단계를 함유하는 방법에 관한 것이다. 각각의 PEGx-GCSF는 추가로 정제된 단백질 접합체를 분리하는 당업계에 공지된 방법, 예컨대 분자량에 따라 분리하는 방법 등에 의해 집단으로부터 분리된다.
본 발명의 조성물은 기존에 시중에서 입수할 수 있는 GCSF 및/또는 PEG-GCSF 치료가 골통증이 발생 또는 암세포 증식의 위험으로 인해 금기시될 수 있는 다양한 의학 상태의 치료에 예상치못한 유용성을 제공한다. 이러한 의학 상태로는 중증 선천적/만성 호중구감소증, 자가면역/특발성 호중구감소증, 뿐만 아니라 암 치료와 관련된 호중구감소증을 포함한다.
본 발명의 추가 장점은 이하 본 발명의 특정 양태들만이 제시되고 설명된 상세한 설명으로부터 당업자라면 쉽게 이해할 것이다. 자명하듯이, 본 발명은 다른 여러 양태들을 실현할 수 있고 이의 여러 세부사항들은 다양한 관점들에서 통상적인 변형이 모두 본 발명에서 벗어남이 없이 이루어질 수 있다. 본 발명은 이러한 몇몇 또는 모든 특정 세부사항들 없이도 실행될 수 있다. 따라서, 상세한 설명은 당연히 예시적인 것으로 간주되어야 하고, 제한적인 것이 아니다.
본 발명의 예시적 양태들은 이하에 간단하게 설명되는 첨부 도면들 및 본 명세서를 부분적으로 참고함으로써 이해할 수 있다.
도 1은 주로 완전 프로세싱된 인간 과립세포 콜로니 자극 인자("GCSF")(서열번호 1)의 아미노산 서열을 나타낸다. 대응하는 DNA 서열은 서열번호 2에 제공된다.
도 2는 본원에 기술된 본 발명의 특정 양태들에 사용된 GCSF 단백질의 서열 분석 데이터이다. 도 2는 각각 서열번호 3 및 서열번호 4를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 PEGx-GCSF 및 PEG[x]-GCSF를 제조하는 공정의 흐름도를 제공한다.
도 4는 본 발명의 PEG[x]-GCSF 샘플의 분석으로부터 수득되는 대표적인 생물분석기 전기영동도(electropherogram)이다.
도 5는 본 발명의 PEG[x]-GCSF 샘플의 대표적인 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 6은 상업적인 PEG-GCSF(NEULASTA®, NLSTA)에 비해 본 발명의 PEG[x]-GCSF(ANF-Rho)의 생물분석으로부터 수득되는 결과를 예시한 효능 그래프이다. M-NFS-60 세포는 생육성 염색 전에 48시간 동안 제시된 GCSF 화합물로 처리되었다. 데이터는 미처리 대조군에 대해 표준화되어 3가지 파라미터 로지스틱(logistic) 곡선-부합(fit) 모델에 부합화시킨다. 데이터는 이중 웰의 평균 및 표준오차를 나타낸다.
도 7은 시험관내 인간 CD34(+) 세포에 미치는 본 발명의 PEG[x]-GCSF(ANF-Rho) vs. NEULASTA®의 효과를 나타내는, CD66 세포 및 CD14 세포의 형광 강도를 이변량 플롯으로 나타낸 사분면 게이팅이다. 세포는 CD66 및 CD14로 표면 염색하기 전에 14일 동안 본 발명의 PEG[x]-GCSF(ANF-Rho) 또는 NEULASTA® 50ng/ml로 처리했다. 항원 발현은 유동세포계수법으로 정량화했다. E4 게이트에서 나타나는 세포 수는 과립세포 집단을 나타낸다.
도 8a 및 8b는 호중구감소증 래트에서 다양한 시판 PEG-GCSF(NEULASTA®) 및 본 발명의 PEG[x]-GCSF 샘플의 단일용량 약동학을 도시한 그래프이다. 래트는 -1일째 사이클로포스파미드(CPA)를 주사하여 호중구감소성으로 만들었다. 1일째 4가지 다른 농도의 본 발명의 PEG[x]-GCSF(ANF-Rho) 및 NEULASTA®를 1일째 표시된 투여량으로 피하 투여했다. 혈액 샘플은 표시된 날짜에 래트로부터 수집했고, GCSF 혈장 농도는 ELISA로 측정했다. 데이터는 그룹 당 8 마리 래트의 평균 및 표준오차이다. 도 8a는 선형 플롯이고, 도 8b는 GCSF 농도의 log 플롯이다.
도 9a 및 9b는 호중구감소증 래트에서 시판 PEG-GCSF(NEULASTA®) 및 본 발명의 PEG[x]-GCSF 샘플(lot 1 내지 3)의 혈장 노출 효과를 보여주는 그래프이다. 도 9a는 단일 농도의 NEULASTA®(100㎍/kg) 및 3가지 다른 농도(100, 50 및 25㎍/kg)에서의 본 발명의 PEG[x]-GCSF의 3개의 개별 로트(lot)들에 대한 곡선아래면적(AUC)을 도시한 것이다. 별표는 100㎍/kg로 투여된 NEULASTA® 대비, 표시된 투여량에서 본 발명의 PEG[x]-GCSF AUC의 유의적인 차이를 나타낸다. 도 9b는 PEG-GCSF 혈장 노출 및 투여량의 직선성을 나타낸다. 본 발명의 PEG[x]-GCSF의 로트 1, 로트 2 및 로트 3의 AUC 값을 합해서 선형회귀분석으로 처리했다. 합한 평균 및 95% 신뢰도 구간은 각 데이터 세트 위에 표시했다. 점선 및 음영처리된 영역은 100㎍/kg NEULASTA® 처리군의 평균 AUC 및 상위 및 하위 95% 신뢰도 구간을 나타낸다. 별표는 NEULASTA® 처리군 대비 ANOVA 및 던넷(Dunnet)의 다중비교 시험 사후(post-hoc) 분석에 의한 유의적인 차이(p<0.05)를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 PEG[x]-GCSF 로트 1, NEULASTA® 또는 제형 완충액(FB)으로 매일 처리된 호중구감소증 래트의 호중구 세포수의 대표적인 변화를 나타내는 그래프이다. 래트는 -1일째 사이클로포스파미드(CPA)를 주입하여 호중구감소성으로 만들었다. 1일째와 그 이후 래트는 매일 PEG[x]-GCSF(100㎍/kg), NEULASTA®(100㎍/kg) 또는 매개제 용액(FB)을 주사 투여받았다. 혈액 샘플은 절대호중구수(ANC)를 측정하도록 표시된 날짜에 래트로부터 수득했다. 데이터는 그룹당 8마리 래트의 평균 및 표준오차이다. 음영처리된 영역은 초기 호중구 방출과 관련된 ANC 값을 나타내고, 이는 곡선아래면적 계산에는 포함되지 않았다.
도 11a 및 11b는 PEG[x]-GCSF 및 NEULASTA® 용량투여된 호중구감소증 래트의 절대호중구수(ANC)를 예시한다. 도 11a는 도 10에 도시된 2차 상승 ANC 피크를 사용하여, AUC를 측정하기 위한 투여후 시간의 함수로써 플로팅된 ANC 값을 나타낸다. 각 용량마다 각 PEG[x]-GCSF 로트의 값을 합산했고, 96시간 전의 데이터(사전형성된 호중구의 방출을 나타냄)는 분석에서 배제했다. 데이터 세트 위와 아래의 별표는 제형 완충액 및 NEULASTA® 처리군과 각각 비교한 PEGx-GCSF 합산 투여량의 ANOVA 시 유의적인 차이(p<0.05)를 나타낸다. 도 11b는 25㎍/kg(사각형), 50㎍/kg(역삼각형) 및 100㎍/kg(원형)인 3가지 각각의 PEG[x]-GCSF의 로트들에서 3가지 농도마다 그룹화된 데이터를 도시한 것이다. 음영처리된 영역은 100㎍/kg NEULAST®에 대한 값들과 95% CI(신뢰 구간)를 나타낸다. r2 값이 0.64인 모든 로트들의 ANC-AUC와 혈장 AUC 간에 상관성 분석은 약물 수준과 ANC 약동학 간에 유의적인 상관성을 나타낸다.
정의
아미노산 서열과 관련하여 "실질적으로 상동성"은 문헌[Pearson and Lipman, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 85, 2444-2448(1988)]에 따르는 FASTA 조사 방법으로 측정했을 때, 다른 아미노산 서열과 적어도 70%, 전형적으로 적어도 약 80%, 더욱 전형적으로 적어도 약 90% 동일성을 가진 서열로써 본원에 정의된다.
본원에 사용된, 단백질과 다른 분자의 공유 결합의 상황에서 사용된 "N-말단", "아미노 말단"이란 용어 또는 이의 유사 용어들은 단백질의 아미노 말단 α-아미노 기를 통한 공유 결합을 의미한다.
본원에 사용된, "야생형" 또는 "천연"이란 용어는 보통 체내에서 자연적으로 기능하는 것으로 발견되는, 작동성 또는 기능성 형태의 단백질 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 또한, 이 용어들은 인공적으로 변형되거나 변경되지 않은 형태의 단백질을 의미한다. 따라서, 이 용어들은 재조합 단백질과 관련이 있을 수 있다. 따라서, 이 용어들은 단백질의 핵산 및/또는 아미노산 서열이 본래 유래되는 동물에서 생산된 것에 비해 글리코실화의 결여를 비롯하여 변경된 글리코실화 패턴을 가진 단백질을 의미할 수 있다.
"ANF-Rho"란 용어는 실시예들에 사용된 본 발명의 PEG[x]-GCSF의 예시적 샘플을 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 예컨대 실시예 3 및 표 2 참조.
NEULASTA®은 재조합 인간 과립세포 콜로니 자극 인자(GCSF) 유사체 필그라스팀의 PEG화된 형태인 PEG필그라스팀의 상표명이다. 이 약물은 필그라스팀 단백질의 N-말단에 20kDa 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자를 커플링시켜 제조한다.
GCSF
일반적으로, 본 발명의 실시에 유용한 GCSF 단백질은 포유동물 유기체로부터 분리된 임의의 형태인 것, 게놈 또는 cDNA 클로닝 또는 DNA 합성에 의해 수득되는 외인성 DNA 서열의 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 발현의 산물, 또는 대안적으로 화학적 합성 절차의 산물 또는 내인성 유전자 활성화에 의한 산물일 수 있다. 즉, 이 단백질은 조직, 포유동물/미생물 세포 배양물, 식물 세포 배양물, 돌연변이 동물, 효모, 진균 및/또는 돌연변이 식물에서 수득되는 천연 또는 재조합 근원의 단백질일 수 있다. 적당한 원핵생물 숙주로는 다양한 박테리아, 예컨대 이.콜리를 포함하고; 적당한 진핵생물 숙주로는 효모, 예컨대 S.세레비지에(cerevisiae) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 포유동물 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소 세포 또는 원숭이 세포, 돌연변이 동물, 예컨대 마우스, 토끼, 염소, 양, 곤충 또는 식물 세포 배양물 및 돌연변이 식물, 예컨대 Physcomitrellapatens(이끼)를 포함한다. 사용된 숙주에 따라, 단백질 발현 산물은 포유동물, 식물 또는 다른 진핵생물의 탄수화물에 의해 글리코실화되거나, 또는 비-글리코실화될 수 있다.
본원에 사용된, "GCSF" 또는 과립세포 콜로니 자극 인자란 용어는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열(도 1) 또는 이와 실질적으로 상동성인 아미노산 서열을 갖고, 이의 생물학적 성질이 백혈구 세포 생산의 자극과 관련이 있는 단백질을 포함한다. 본원에 사용된, GCSF란 용어는 예컨대 부위 특이적 돌연변이에 의해 의도적으로 변형된 상기 단백질, 또는 우연히 돌연변이를 통해 변형된 상기 단백질을 포함하며; 이에 따라 이 단백질들은 천연 GCSF 대비 아미노산 잔기의 첨가, 결실 또는 치환을 갖는다. 이 용어는 천연 및 재조합 생산된 인간 GCSF를 모두 포함한다. GCSF는 조직, 단백질 합성, 천연 또는 재조합 세포를 가진 세포 배양물과 같은 임의의 통상적인 근원으로부터 수득되는 것과 같은, 자연 발생 단백질 또는 재조합 단백질, 일반적으로 인간 단백질을 모두 의미한다.
또한, 본 발명의 수행에 유용한 GCSF 발현 산물은 위치 1에 최초의 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 본 발명은 임의의 이러한 모든 형태의 GCSF의 사용을 고려하지만, 재조합 GCSF, 특히 이.콜리 유래의 GCSF가 전형적이다. 특정 GCSF 유사체는 생물학적으로 기능성인 것으로 보고된 바 있고, 이들이 또한 본 발명에 따라 접합될 수도 있다. 이러한 GCSF 유사체는 서열번호 1에 따른 GCSF 아미노산 서열과 비교 시, 아미노산 첨가, 결실 및/또는 치환을 가진 것을 포함할 수 있다. 특정 양태들에서, 서열은 서열번호 1과 비교 시, 아미노산의 삽입, 예컨대 서열번호 1의 위치 36, 37 및 38에 VSE의 삽입을 포함한다. 특정 양태들에서, 서열은 서열번호 3 또는 서열번호 4에서와 같은 것이다.
본원에 사용된 "GCSF"란 용어는 전술한 GCSF의 활성을 가진 단백질, 예컨대 천연 인간 당단백질 GCSF, GCSF의 돌연변이체, 글리코실화된 GCSF, 비-글리코실화된 GCSF 및/또는 이와 다르게 변형된 GCSF의 구조적 및/또는 기능적 변형체를 포함한다. 추가 양태에 따르면, GCSF는 174개 아미노산과 추가 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는, 박테리아에서 생산되는 재조합 GCSF에 대응하는 서열번호 1에서 확인되는 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 위치 1에 메티오닐 잔기를 함유하지 않는다는 점에서 서열번호 1과 다른 생물학적 활성 GCSF의 아미노산 서열도 포함된다.
PEG
"PEG"란 용어는 일반적으로 링커 또는 활성화 모이어티가 있거나 없는 폴리알킬렌 글리콜 화합물 또는 이의 유도체를 의미한다. 본원에 사용된 PEG란 용어는 폴리에틸렌 글리콜 단독중합체, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체 및 이의 유도체 및 등가물을 포함하되, 이에 국한되지 않으며, 이 단독중합체 및 공중합체는 치환되지 않거나, 또는 예컨대 한쪽 말단이 알킬 기에 의해 치환된 것이다. 본 발명에 사용하기 위한 PEG 중합체는 광범위한 분자량을 가진 선형, 분지형, 빗(comb)형 또는 성상(star)형일 수 있다. 본 발명의 양태들에 사용되는 PEG의 평균분자량은 5 내지 약 100 kDa 범위일 수 있다.
PEG의 수많은 유도체들 및 이를 제조하고 이를 단백질에 접합시키는 방법들은 당업계에 공지되어 있고, 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명에 사용하기에 특히 바람직한 1가지 PEG는 이 중합체의 한쪽 말단이 비교적 불활성 기, 예컨대 저급 C1-6 알콕시 기로 끝나는 PEG이다. 바람직하게는, PEG는 중합체의 한쪽 말단이 메톡시(-OCH3) 기인 PEG의 선형 형태인 모노메톡시-PEG(일반적으로 mPEG라 지칭됨)이다.
더욱 특히 바람직하게는, 본 발명에 사용된 PEG는 선형 PEG의 한쪽 말단이 메톡시 기로 끝나고, 다른 쪽 말단은 GCSF 상의 바람직한 부위들에 커플링하기에 적당한 링커로 끝나서 원하는 활성화된 mPEG로 PEG화를 용이하게 하는, "활성화된 mPEG"이다.
바람직한 링커로는 아민 반응성 링커, 즉 1차 아민과 화학 결합을 형성하는 합성 화학적 기를 포함한다. 이 링커로는 이소티오시아네이트, 이소시아네이트, 아실 아자이드, NHS 에스테르, 설포닐 클로라이드, 알데하이드, 글리옥살, 에폭사이드, 옥시란, 카보네이트, 아릴 할라이드, 이미도에스테르, 카르보디이미드, 무수물 및 플루오로페닐 에스테르를 포함한다. 이러한 아민 반응성 링커는 대부분 아실화 또는 알킬화에 의해 아민에 접합한다.
예시적인 결합은 가수분해적으로 안정하고, 수용성이다. 대표적인 적당한 링커는 아미드, 우레탄(카바메이트로도 알려짐), 아민, 티오에테르(설파이드로도 알려짐), 또는 우레아(카바미드라고도 알려짐) 기의 임의의 조합을 함유할 수 있다.
특정 양태에 따르면, 메톡시화된 PEG("mPEG")는 이어서 아미노 기에 공유 부착하도록 당업계에 공지된 방법들에 의해 활성화될 수 있고, 즉 mPEG는 이용가능한 아미노 잔기, 예컨대 리신 잔기를 함유하는 아미노산 잔기를 통해 단백질에 후속적으로 부착하기에 적합한 다양한 반응성 모이어티를 함유하도록 변형될 수 있다. 이와 같이 활성화된 PEG는 mPEG-석신이미딜 석시네이트("SS-PEG"), mPEG-석신이미딜 카보네이트("SC-PEG"), mPEG이미데이트, 및 mPEG-시아누릭 클로라이드(cyanuric chloride)를 포함한다. 바람직한 양태에 따르면, 링커는 가수분해에 안정한 PEG-GCSF 결합을 제공하는 것으로 선택한다.
특정 양태들에서, 본 발명에 사용하기 위한 PEG의 평균분자량은 약 2 내지 약 50 kDa, 약 3 내지 약 25kDa, 약 4 내지 약 10kDa 범위이거나, 또는 여기에 제공된 두 말단값에 의해 한정된 임의의 하위범위, 예컨대 4.5, 5, 5.6 및 6kDa과 같이 상기 범위에 속하는 임의의 단일 정수(자연수) 또는 비정수(분수)도 포함한다.
특정 양태에 따르면, 본 발명의 다양한 양태에 사용되는 PEG는 평균분자량이 약 5 내지 6kDa SC-PEG, 더욱 특히 약 5.6kDa SC-PEG인 것이다. SC-PEG와 GCSF 1차 아미노 기의 반응으로부터 수득되는 PEGx-GCSF는, 상기 논의된 Tanaka et al. 및 Satake-Ishikawa et al.의 다중-PEG화된 접합체에 존재하는 가수분해적으로 불안정한 결합과 달리, 가수분해에 안정한 우레탄 결합을 함유한다.
PEGx - GCSF
본 발명의 한 양태는 "PEGx-GCSF"에 관한 것으로, 이는 본원에 정의된 바와 같이 PEG 모이어티의 x 수가 공유 부착되어 있는 GCSF 접합체이고, 여기서 x는 4 내지 7의 정수이다. PEGx-GCSF의 특정 양태는 x가 4, 5, 6, 7 및 8인 것을 포함한다.
특정 양태에서, 각 PEG는 GCSF 유래의 아민 모이어티, 예컨대 N 말단, 또는 임의의 리신 또는 히스티딘 잔기를 통해 GCSF에 부착된다. 이와 같은 특별한 양태에서, 공유 부착은 아미노-반응성 링커에 의해 활성화된 PEG와 GCSF 아민 모이어티 사이의 반응에 의해 형성된다. 특별한 양태들에 따르면, 아민과 반응 시, 아미노 반응성 링커는 GCSF에 비-가수분해성 결합을 형성한다. 추가 양태에 따르면, PEGx-GCSF는 비-가수분해성 결합, 예컨대 우레탄 결합을 함유한다.
PEGx-GCSF의 양태들은 GCSF가 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4, 및 이러한 임의의 서열들의 기능성 유도체 및 동족체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 가진 단백질인 것을 포함한다. 특별한 양태들에 따르면, 아미노산 서열은 서열번호 1, 서열번호 1의 기능성 유도체, 또는 서열번호 1의 동족체이고, 이때 GCSF는 위치 17에 리신 잔기, 위치 35에 리신 잔기, 위치 41에 리신 잔기, 및 경우에 따라 위치 44에 히스티딘 잔기, 위치 53에 히스티딘 잔기, 위치 80에 히스티딘 잔기, 위치 157에 히스티딘 잔기 및 위치 171에 히스티딘 잔기를 보유한다. PEGx-GCSF의 관련 양태들에서, 각 PEG는 N-말단, 위치 17의 리신 잔기, 위치 35의 리신 잔기, 위치 41의 리신 잔기, 경우에 따라 위치 44의 히스티딘 잔기, 위치 53의 히스티딘 잔기, 위치 80의 히스티딘 잔기, 위치 157의 히스티딘 잔기 및 위치 171의 히스티딘 잔기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 위치에서 GCSF에 부착된다.
특정 양태들은 PEGx-GCSF에 관한 것으로, 여기서 GCSF는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 단백질이고, 각 PEG는 GCSF 기원의 아민, 예컨대 N-말단, 리신 또는 히스티딘 잔기에 부착된다. 예를 들어, 이 양태들에서 PEG는 N-말단, 위치 17의 리신 잔기, 위치 35의 리신 잔기 및 위치 41의 리신 잔기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 GCSF 위치에 부착된다. 또 다른 양태에서, PEG는 위치 44의 히스티딘 잔기, 위치 53의 히스티딘 잔기, 위치 80의 히스티딘 잔기, 위치 157의 히스티딘 잔기 및 위치 171의 히스티딘 잔기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 GCSF 위치에 부착된다.
PEGx-GCSF의 특정 양태들에서, PEG의 평균분자량은 약 2 내지 약 50 kDa, 약 3 내지 약 25 kDa, 약 4 내지 약 10 kDa의 범위이거나, 또는 여기에 제공된 종점들 중 두 종점에 의해 정의되는 임의의 하위범위이고, 예컨대 이러한 범위들 내에서 발견되는 임의의 단일 수의 정수(자연수) 또는 비-정수(분수), 예컨대 4.5, 5, 5.6 및 6 kDa을 포함한다. PEGx-GCSF의 특별한 양태들은 PEG가 약 5 내지 약 6kDa, 바람직하게는 5.6kDa의 평균분자량을 가진 것을 포함한다.
PEG[x]- GCSF
본 발명의 한 양태는 본원에 정의된 바와 같이, 전술한 임의의 개별 PEGx-GCSF의 다양한 비율을 포함하는 집단을 함유하는 조성물이고, 여기서 [x]는 이 집단의 평균 x 값이고, [x]는 약 4보다 크거나 같은 양수(분수도 포함함)이고, 예컨대 약 4 내지 약 8; 약 4 내지 약 6; 또는 약 5 내지 약 6이다. PEG[x]-GCSF는 "불균일한 집단"을 함유하는 양태들을 포함하고, 여기서 PEGx-GCSF 접합체는 다른 x 값을 갖고, PEG는 GCSF 분자의 다른 부위에 부착되어 있으며, 및/또는 PEG는 다른 분자량인 것이다.
PEG[x]-GCSF의 양태들은 본원에 기술된 임의의 다양한 개체 PEGx-GCSF의 집단을 포함하며, 예컨대 PEG의 평균분자량이 약 2 내지 약 50kDa, 약 3 내지 약 25kDa, 약 4 내지 약 10kDa 범위인 PEGx-GCSF를 포함한다. PEGx-GCSF의 특정 양태들은 PEG가 평균분자량이 약 5 내지 약 6kDa, 바람직하게는 5.6kDa인 것을 포함한다.
PEG[x]-GCSF의 특정 양태들은 다음 중 하나 이상을 특징으로 한다: x가 1 내지 3인 PEGx-GCSF 10% 미만, 8% 미만 또는 5% 미만을 함유하는 것; x가 4인 PEGx-GCSF를 약 15% 이상, 약 18% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 또는 약 30% 이상 함유하는 것; x가 5인 PEGx-GCSF를 약 30% 이상, 약 35% 이상, 또는 약 40% 이상 함유하는 것; x가 6인 PEGx-GCSF를 약 10% 이상, 약 12% 이상, 또는 약 15% 이상 함유하는 것; x가 7인 PEGx-GCSF를 약 3% 이상, 약 5% 이상, 및/또는 약 15% 미만으로 함유하는 것; x가 6 내지 7 범위인 PEGx-GCSF를 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 또는 약 35% 이상 함유하는 것; x가 5 내지 7 범위인 PEGx-GCSF를 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 75% 이상 또는 약 80% 이상 함유하는 것. PEG[x]-GCSF의 추가 양태들은 x가 7인 PEGx-GCSF를 약 15% 미만, 약 12% 미만, 또는 약 10% 미만으로 함유하는 것을 포함할 수 있다.
PEG[x]-GCSF의 양태들은 본원에 기술된 임의의 다양한 개별 PEGx-GCSF의 집단을 포함하는 것으로, 여기서 [x]는 이 집단에서 x의 평균 값이 4 초과인 것이다. 예를 들어, PEG[x]-GCSF의 양태들은 PEG가 GCSF 유래의 아민, 예컨대 N-말단, 리신, 또는 히스티딘을 통해 GCSF에 부착된 PEGx-GCSF의 조성물; PEGx-GCSF가 비-가수분해성 결합, 예컨대 우레탄 결합을 함유하는 것; GCSF가 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4 및 이러한 서열들 중 어느 하나의 기능성 유도체 및 동족체의 아미노산 서열을 가진 단백질인 것; 각 PEG가 서열번호 1 또는 이의 유도체 또는 동족체에 따르는 GCSF에 N-말단, 위치 17의 리신 잔기, 위치 35의 리신 잔기, 위치 41의 리신 잔기, 위치 44의 히스티딘 잔기, 위치 53의 히스티딘 잔기, 위치 80의 히스티딘 잔기, 위치 157의 히스티딘 잔기 및 위치 171의 히스티딘 잔기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 위치에서 부착된 것을 포함한다.
몇몇 양태들에 따르면, PEG[x]-GCSF는 다음 중 하나 이상을 특징으로 하는 PEGx-GCSF의 집단을 함유한다:
x가 3인 PEGx-GCSF 약 0% 내지 약 5%;
x가 4인 PEGx-GCSF 약 22% 내지 약 32%;
x가 5인 PEGx-GCSF 약 38% 내지 약 42%;
x가 6인 PEGx-GCSF 약 18% 내지 약 28%; 및
x가 7인 PEGx-GCSF 약 0% 내지 약 9%.
PEG[x]-GCSF의 다른 양태는 PEG가 우레탄 결합을 통해 GCSF에 부착되고, 경우에 따라 PEG가 평균분자량이 약 3 내지 약 15kDa, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 6kDa인 PEGx-GCSF의 집단을 함유한다. 특정 양태에 따르면, PEG[x]-GCSF는 PEG가 우레탄 결합을 통해 GCSF에 부착되고 경우에 따라 PEG가 평균분자량이 약 3 내지 약 15kDa, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 6kDa인 PEGx-GCSF의 집단으로 이루어진다.
접합 공정
x, 즉 GCSF당 PEG의 수가 4 내지 8인 PEGx-GCSF 접합체, 및 [x], 즉 PEGx-GCSF의 집단에 존재하는 GCSF당 PEG의 평균 수가 본 발명에 따라 4 이상인 PEG[x]-GCSF 접합체 집단을 생산하기 위해 다음과 같은 공정이 수행된다.
도 3에 도시된 바와 같이, GCSF 단백질은 약 5.0mg/ml로 농축되고, 10kDa 정용여과 막을 통해 완충액 교환으로 처리된다. 교반 기구가 장착된 반응 용기에 단백질 용액이 충전된다. 바람직한 블레이드 깊이로 설정된 이중 블레이드의 임펠러 시스템을 용기 내에 침지시키고 작동시킨다. SC-PEG 분말(5kDa)을 단백질 양의 약 65 내지 약 75배의 몰 과량으로 반응 용기에 약 15분의 기간 동안 천천히 첨가한다. 반응이 약 추가 45분간 지속되는 동안 pH는 모니터하여 약 7.75로 유지시킨다. 이후, 반응 용기에 하이드록시아민(HA)을 첨가하고 약 추가 2시간 동안 혼합하여 잔류 반응성 PEG를 반응정지시키고, 약하게 결합된 PEG는 산물로부터 제거한다. 이 반응 공정 전반에서 반응 용기의 내용물은 상온(즉, "실온")에서 유지된다. 이 반응 혼합물을 50kDa 막을 사용하여 2회 정용여과하여 잔류(즉, 미반응) PEG, N-하이드록시석신이미드 및 하이드록시아민을 제거한다. 수득되는 "약물 성분"은 5.0 내지 6.0mg/ml 사이로 농축시킨다. 그 다음, "약물 산물"은 부피를 최종 약물 산물 농도 약 2 내지 약 10mg/ml, 바람직하게는 약 5.0 mg/ml로 조정하는 소르비톨과 TWEEN 20®(폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)의 첨가를 통해 조제한다. 이 약물 산물은 바이엘 또는 주사기와 같은 멸균 용기 마개 내로 분배한다.
약제 제형
특정 양태들에 따르면, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같이 PEGx-GCSF 접합체(여기서, x는 4 내지 8이다) 또는 개별 접합체들의 PEG[x]-GCSF 집단(여기서, [x]는 4 이상이다)과 경우에 따라 약학적 허용성 운반체를 함유하는 약제 제형(formulation)에 관한 것이다. 특정 양태들에서, 운반체는 실질적으로 단백질이 없는 것이다.
본 발명의 제형은 추가로 당업계에 공지된 방법들에 의해 추가 약학적 허용성 운반체 또는 매개제와의 혼합물 또는 조합에 의해 주사에 적합해질 수 있다. 본 발명의 산물을 조제하기 위한 약학적 허용성 운반체 중에는 식염수, 인간 혈청 알부민, 인간 혈장 단백질 등이 있다. 또한, 본 발명은 전술한 바와 같은 접합체 및 약학적 허용성 부형제 및/또는 운반체를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 약학적 허용성 운반체는 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액 및 에멀젼(emulsion)일 수 있다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일 및 주사성 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올리에이트일 수 있다. 수성 운반체로는 물, 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액, 예컨대 식염수 및 완충 매질을 포함한다. 비경구 매개제로는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산염화된 링거액 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥내 매개제로는 유체 및 영양소 보충제, 전해질 보충제, 예컨대 링거 덱스트로스 기반의 보충제 등을 포함한다. 보존제 및 기타 첨가제도 존재할 수 있고, 그 예로는 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제, 불활성 기체 등이 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 PEGx-GCSF 접합체(이때, x는 4 내지 8이다), 또는 개별 접합체들의 PEG[x]-GCSF 집단(이때, [x]는 4 이상이다)의 유효량을 약학적 허용성 희석제, 보존제, 용해제, 유화제, 보조제 및/또는 운반체와 함께 함유한다. 이러한 조성물은 다양한 완충액 함유물의 희석액, 예컨대 트리스-HCl, 아세테이트, 포스페이트, pH 및 이온 강도; 세정제 및 용해제와 같은 첨가제, 예컨대 TWEEN 80®(평균분자량이 1310이고 시그마-알드리치에서 입수용이하며, Polysorbate 80으로도 불리는 비-이온성 올레산, ≥58.0%(나머지는 주로 리놀레산, 팔미트산 및 스테아르산)), 아스코르브산 및 소듐 메타비설파이트와 같은 산화방지제, 벤질 알코올과 같은 보존제, 및 락토스 또는 만니톨과 같은 팽화(bulking) 성분; 폴리락트산, 폴리글리콜산 등과 같은 중합체성 화합물의 미립자 제조물 또는 리포좀에 물질의 혼입을 포함한다. 이러한 조성물들은 본 발명에 따른 PEGx-GCSF 접합체의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 제거 속도에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명에 따라 제조된, x가 4 내지 8인 PEGx-GCSF 접합체, 또는 [x]가 4 이상인 개별 접합체의 PEG[x]-GCSF 집단은 당업계에 공지된 방법들에 의해 약학적 허용성 운반체 또는 매개제와 주사하기에 적합한 약학적 조성물로 조제될 수 있다. 예컨대, 전문이 참고 인용된 WO 97/09996, WO 97/40850, WO 98/58660 및 WO 99/07401 참조. 본 발명의 화합물들은 장성(tonicity) 제제, 예컨대 132mM 염화나트륨을 함유하는 pH 7의 10mM 소듐/포타슘 포스페이트 완충액 등에 조제될 수 있다. 경우에 따라, 약학적 조성물은 보존제를 함유할 수 있다.
약학적 조성물은 일반적으로 본 발명에 따라 제조된 x가 4 내지 8인 PEGx-GCSF 접합체 또는 [x]가 4 이상인 개별 접합체의 PEG[x]-GCSF 집단, 용액의 pH를 약 4.0 내지 약 7.0 범위(가장 바람직하게는 이 범위의 하한값, 즉 약 4.0)로 유지시키기에 적합한 약학적 허용성 완충액 중의 다중 하전성 무기 음이온, 및 경우에 따라 하나 이상의 약학적 허용성 운반체 및/또는 부형제를 함유한다.
사용 방법
본 발명의 다른 관점에 따르면, 본 발명의 약제 제형을 백혈구 세포 수의 증가를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 함유하여, 상기 환자의 백혈구 세포 수를 증가시키는 방법이 제공된다. 특정 양태들에 따르면, 환자는 호중구감소증의 위험이 있거나 호중구감소증을 앓고 있는 자이다. 다른 특정 양태들에 따르면, 환자는 백혈구 세포수를 감소시키는 제제로 치료받고 있는 자이다. 특정 양태들에 따르면, 환자는 GCSF의 내인성 수준이 감소된 자이다. 다른 특정 양태들에 따르면, 환자는 방사선 치료를 받고 있는 자이다. 환자는 폐암, 림프종, 유방암, 골수 이식, 정소암, AIDS 관련 악성종양, 골수형성이상 장애, 급성 백혈병, 선천적 및 주기적 호중구감소증 또는 재생불량성 빈혈을 앓고 있을 수 있다(Mortsyn, et al.(1998) Filgrastim(r-metHuGCSF). In Clinical Practice, 2nd Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, NY). 특정 양태들에서, 제형은 감염 위험에 있는 환자에게 투여된다.
다음은 골수 세포 또는 이의 전구체에 내인성 결함으로 인한 1차 호중구감소증의 예로써, 이들에 대해 본 발명의 치료 방법이 유용할 것으로 생각된다: 재생불량성 빈혈증; 만성 특발성 호중구감소중, 예컨대 양성 호중구감소증; 주기적 호중구감소증; 골수형성이상; 이상감마글로불린혈증과 관련된 호중구감소증; 발작성 야간 헤모글로빈뇨; 중증 선천적 호중구감소증(Kostmann syndrome); 및 증후군-관련 호중구감소증(예, 연골-털형성저하증, 세디아크-히가시 증후군, 선천성 각화부전증, IB형 글리코겐 축적병, 슈와크만-다이아몬드 증후군, 중성구감소증(Myelokathexis), 선천적 면역결핍증후군).
다음은 본 발명의 치료 방법이 유용할 것으로 예상되는 2차 또는 후천적 호중구감소증의 예시적인 원인들이다: 알코올중독증; 자가면역 호중구감소증, 예컨대 AIDS의 만성 2차 호중구감소증; 자가면역 질환(예를 들어, 펠티 증후군/류마티스성 관절염, 쇼그렌 증후군, 전신성 홍반성 루푸스); 골수 대체 또는 줄기 세포 이식; 암(예, 백혈병, 골수종, 림프종 또는 전이성 고형암(예 : 유방암, 전립선 암)에 의한 골수 침윤); Tγ 림프증식성 질환; 세포 독성 화학요법 또는 방사선 치료로 인한 열성 호중구감소증; 약물에 의한 호중구감소증; 엽산 또는 비타민 B12 결핍증(거대적아구성 빈혈); 혈액 투석; 비장기능항진증; 감염(예: 파르보바이러스, 간염 바이러스, 말라리아, 라임 병, 살모넬라, 패혈증); 골수섬유증(즉, 육아종성 감염); 고셔(Gausher) 병; 중독(예: 비소); 및 1차 면역결핍증, 예컨대 X 연관, 공통 가변 면역결핍증(CVID), X-연관 무감마글로불린혈증(XLA), WHIM 증후군, 비스코트-알드리치(Wiskott-Aldrich) 증후군 및 GATA2 결핍.
본 발명의 약학적 조성물은 특히 현재 시판되는 GCSF 제품의 투여가 금기시되는 특정 골수 암(예, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수원성 백혈병, 급성 전구골수세포 백혈병)의 치료에 유용할 수 있다. 이것은 정상 백혈구세포의 증식을 유발하면서 이하 실시예 3에서 입증되는 것처럼 암세포의 증식을 피하거나 감소시키는 데 있어서 본 발명의 PEGx-GCSF 및 이의 본 발명의 PEG[x]-GCSF 집단의 예상치못한 선택성때문이다.
게다가, 본 발명에서 제공되는 암 환자의 특히 유익한 치료외에도, 수명이 긴 GCSF 치료법을 필요로 하는 중증 만성 호중구감소증(SCN)을 초래할 수 있는 상태를 가진 환자가 있다. 이 환자는 GCSF 단백질에 대한 누적 노출에 정비례하는 골수형성이상 증후군의 증가된 위험에 있는 자이다. 따라서, 암세포의 증식을 피하거나 감소시키는 본 발명의 조성물은 이 환자들에게 특유의 이점을 제공할 수도 있다.
또한, 호중구감소증의 치료 외에, GCSF는 자가 이식 환자 및 동종이계 공여체에서 말초혈액 줄기세포 이동에 사용되었다. 이식 전에, 공여체 또는 환자는 선조 줄기 세포 수를 증가시키기 위해 GCSF로 처리되고, 이에 따라 줄기 세포의 수확량이 우수해져 이식 절차의 성공 가능성이 높아진다. 본 발명의 약학적 조성물은 이하 실시예 4에서 입증되는 것처럼 증진된 생체활성의 관점에서 이러한 목적에 특히 유용할 것으로 생각된다.
본 발명에 따라 제조된 x가 4 내지 8인 PEGx-GCSF 또는 [x]가 4 이상인 개별 접합체들의 PEG[x]-GCSF 집단은 또한 내독소 등에 의한 GCSF 수용체의 억제조절로 인한 중증 패혈증 및 패혈성 쇼크의 치료에도 유용성이 있다.
특정 양태들에서, 본 발명의 제형은 화학요법의 과정 동안 단일 용량으로 제공된다. 몇몇 양태들에서, 제형은 화학요법의 과정 동안 다회 용량으로 제공된다. 특정 양태들에서, 제형은 1일 1회, 1주 1회, 2주 1회 또는 1달 1회씩 투여된다. 제형은 화학요법 용량의 24시간 이내에 투여될 수 있다. 특정 양태들에서, 제형은 화학요법의 용량 전에 적어도 14일 전에 투여된다. 하지만, 이하에 더 상세히 설명되는 것처럼, 본 발명의 제형들은 시중에서 입수할 수 있는 NEULASTA® 제품의 경우보다 훨씬 더 큰 용량투여의 유연성을 제공한다. 본 발명의 제형은 화학요법동안 임의의 시간에 환자에게 투여될 수 있어 유리하다.
특정 양태들에서, 제형은 주사로써 투여된다. 몇몇 양태들에서, 제형은 피하, 근육내 및 복강내를 비롯한 다수의 투여 경로에 적합하다. 다른 양태들에서, 제형은 정맥내 투여에 적합하다. 또한, 이 제형은 경구용 형태로 제공될 수 있다. 환자는 적어도 약 1주 1회씩 용량을 투여받을 수 있다. 다른 양태들에 따르면, 환자는 2주마다 적어도 약 1회, 3주마다 적어도 약 1회, 또는 매달에 적어도 약 1회씩의 용량을 투여받는다.
치료적 유효량은 골수 세포가 백혈구 세포의 생산을 증가시키도록 하는 생체내 생물학적 활성에 필수적인, 본 발명에 따라 제조된 PEGx-GCSF 접합체(이때, x는 4 내지 8이다), 또는 개별 접합체들의 PEG[x]-GCSF 집단(이때, [x]는 4 이상이다)의 양이다. PEGx-GCSF 또는 PEG[x]-GCSF의 정확한 양은 치료받는 상태의 정확한 종류, 치료받는 환자의 상태뿐만 아니라 조성물 중의 다른 성분들과 같은 요인들에 종속적인 바람직함의 문제이다. PEGx-GCSF 또는 PEG[x]-GCSF를 함유하는 약제 제형은 낮은 또는 결손성 백혈구 세포 생산을 특징으로 하는 장애를 겪고 있는 인간 환자에게 다양한 수단으로 투여하기에 효과적인 강도로 조제될 수 있다. PEGx-GCSF 또는 PEG[x]-GCSF의 평균 치료적 유효량은 다양할 수 있고, 특히 전문의의 처방 및 권장을 기반으로 해야 한다. 예를 들어, 0.01 내지 10㎍/체중kg, 일반적으로 0.1 내지 3㎍/체중kg이 예컨대 화학요법 순환당 1회씩 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 45kg이 넘는 환자에게 유용한 고정된 용량 제형에, 예컨대 1 내지 10mg, 또는 2 내지 9mg, 또는 약 6mg과 같은 고정된 용량의 PEGx-GCSF 또는 PEG[x]-GCSF를 함유할 수 있다. 하지만, 이하 실시예 4에서 입증되듯이, 이러한 양들은 예컨대 NEULASTA®에 비해 본 발명의 조성물의 급증하는 생체내 활성을 감안하여 감소시킬 수 있다.
실시예
실시예 1: 본 발명의 PEG[x]- GCSF의 합성
x가 4 내지 8인 PEGx-GCSF 접합체 또는 [x]가 4 이상인 개별 접합체들의 PEG[x]-GCSF 집단은 상기 "접합 공정" 섹션에 제시된 일반적인 절차에 따라 4가지 주요 단계를 이용하여 이하에 상세히 제시되는 바와 같이 생산했다: (1) 정용여과 pH 7.75 - 10kDa, (2) PEG화 반응, (3) 정용여과 pH 4.0 - 30kDa/50kDa 및 여과, 및 (4) 멸균 보로실리케이트 스토퍼를 가진 유리 바이엘 또는 BD Hypak 주사기(Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey)에 최종 충전.
정용여과 pH 7.75 - 10kDa
GCSF 단백질은 20 부피의 PEG화 완충액과 10kDa 막을 이용하여 PEG화 완충액(100mM 인산염 완충액, pH 7.75)으로 완충액 교환했다. 완충액 교환 후, 용액은 UV 분광광도법으로 측정된 바와 같이 5mg/ml 용액으로 농축했다.
PEG화 반응 및 하이드록실아민의 첨가
인산염 완충액 중에 농축된 GCSF(5mg/ml)는 600ml 유리 비이커에 담아 다음과 같은 조건하에 PEG가 첨가되었을 때 천천히 교반했다: pH 7.75; 상온; 1시간 반응 시간. 65x 내지 75x 몰비(PEG:GCSF)의 SC-PEG 분말(5kDa)을 천천히 첨가했고, 첨가 동안 150rpm으로 일정하게 교반했고, 약 15분 후 종결시켰다. 반응 pH를 모니터했고, 필요한 경우 PEG 첨가 동안 10N NaOH를 첨가하여 7.75로 유지시켰다; 이어서 pH는 일정하게 유지되었다. 1시간 동안 교반한 후, 반응은 1.2M 하이드록실아민 염산염(HA)을 첨가하여 종결시켰다. 하이드록실아민의 첨가는 히스티딘에 불안정한 PEG 첨가를 제거하고 산물의 균일성 및 안정성을 향상시킨다. 이러한 반응들로부터 PEG화된 GCSF 단백질의 혼합물, 즉 GCSF 분자의 다양한 부위에 PEG가 부착된 PEG[x]-GCSF가 형성되었다.
정용여과 pH 4.0 - 30kDa 및 여과
반응 혼합물은 그 다음 20부피의 아세트산염 완충액(10mM 아세트산나트륨, pH 4.0)과 30/50KDa 정용여과 시스템을 사용하여 아세트산나트륨 pH 4 완충액으로 완충액 교환했다. PEG[x]-GCSF는 잔류물에서 수집되었고; N-하이드록시석신이미드(NHS), 하이드록실아민 및 5kDa 유리의 PEG는 투과물에서 제거되었다. 그 다음, 2차 동일한 정용여과를 수행하여 공정 관련된 불순물을 추가로 제거했다. 완충액 교환 후, 용액은 약 5.5mg/ml 용액으로 농축했다. 수득되는 PEG[x]-GCSF 용액은 0.2㎛ 필터를 통해 무균적으로 여과하고, 최종 정제된 PEG[x]-GCSF(또한, "약물 성분"이라고도 지칭됨)로써 아세트산나트륨 완충액에 2 내지 8℃ 하에 보관했다. 열거된 배취들로부터 수득한 산물의 수율은 분광광도계를 사용하여 OD280을 측정하여 추정했다.
BD/Hypak 유리 주사기에 충전/마무리
수득한 PEG[x]-GCSF의 농도는 5mg/ml로 추정된 부피로 제형 부형제를 첨가한 후 아세트산나트륨 완충액 pH 4를 사용하여 5mg/ml로 조정했다. 그 다음, 최종 "약물 산물"은 TWEEN 20®(폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) 및 소르비톨을 첨가하고, 부피를 약 2 내지 약 10mg/ml, 바람직하게는 약 5.0mg/ml의 최종 약물 산물 농도로 조정하고, 수동 충전 기구와 반복 피펫터를 사용하여 0.6ml/주사기씩 BD Hypak 유리 주사기에 충전하여 제형화했다. 또한, 최종 약물 산물은 2.0 내지 5.0mg/ml로 제형화했고, 스토퍼가 있는 멸균 유리 바이엘에 무균적으로 분배했다.
실시예 2: PEG[x]- GCSF의 특성화
본 실시예는 본원에 예시된 개별 PEGx-GCSF 및 PEG[x]-GCSF 집단의 본 발명의 양태들을 특성화하기 위해 수행한 분석 작업, 특히 GCSF 단백질에 부착된 PEG 분자의 수 x 및 위치에 관한 작업을 설명한다. 또한, 본 발명의 PEG[x]-GCSF의 속성을 문헌[Tanaka et al.(1991) Cancer Research 51: 3710-3714 및 Satake-Ishikawa et al.(1992) Cell Structure and Function 17: 157-160]에 기술된 다중-PEG화된 접합체들의 속성과 비교했다.
생물분석기 절차:
Agilent 2100 생물분석기는 크기를 기준으로 단백질을 빠르게 분리할 수 있는 마이크로칩-기반의 모세관 전기영동 시스템으로, 자동 염료-기반의 가시화 및 정량 능력을 제공한다. 4㎕의 PEG-GCSF 샘플, 즉 약물 성분(즉, 10mM 아세트산나트륨 pH 4에 조제된 본 발명의 PEG[x]-GCSF) 또는 약물 산물(즉, 소르비톨과 TWEEN® 20이 첨가된 약물 성분)을 1mg/ml로 희석하고, 디티오트레이톨(DTT)(Agilent 변성 용액의 새 바이엘에 첨가된 1M 용액 7㎕)과 함께 Agilent 변성 용액 2㎕와 배합하고, 95 내지 100℃로 5분 동안 가열했다. 변성된 샘플은 다시 물 84㎕를 첨가하여 희석한 다음, 칩 위에 부하했다. 이 PEG-GCSF 샘플과 동일하게, Agilent Protein 230 키트 래더(ladder) 및 사내에서 생산한 5K PEG 래더를 제조했다. 5K PEG 래더는 PEG화 정도가 1 내지 4 범위인 PEG-GCSF 접합체의 혼합물이고, 분석되는 PEG-GCSF 샘플의 조성을 평가하기 위한 참고용 및 시스템 성능의 점검용으로써 사용된다. 분석되는 각 샘플마다, 각각 분리된 단백질 종에 대한 피크 면적을 나타내는 전기영동도가 포착된다. PEG-GCSF의 경우에는 일반적으로 4 내지 5개의 피크가 3 내지 7개의 PEG를 함유하는 GCSF에 다양하게 대응하는 것으로 관찰된다. 각각의 PEG화된 종의 피크 면적의 가중 평균은 시험된 샘플의 평균 PEG 수를 생산할 것이다.
도 4에 제시된 생물분석기 겔 이미지에서, 가장 왼쪽 레인은 "Ladder"로 표시된 다음 레인에서 분석된 단백질들에 대한 분자량을 함유한다. 다음 컬럼의 "5K Ladder"는 다양한 양의 PEG1-GCSF, PEG2-GCSF 및 PEG3-GCSF 및 소량의 PEG4-GCSF로 구성된 PEG-GCSF 샘플을 함유한다. 다음 2개의 레인에는 PEG-GCSF lot PG-051412-2가 적용되고, 이어서 PEG-GCSF lot PG-042413이 먼저 "스페이서"로써, 그 다음 분석 목적을 위해 중복 적용된다. 레인 2 및 3 경계에 있는 숫자는 나타난 각 PEGx-GCSF 종들에서 GCSF에 결합된 PEG 수 x를 나타낸다. 모든 배취들에 사용된 PEG의 분자량은 5.6kDa이었다.
특히, GCSF 분자당 4개의 PEG를 가진 것으로 표지된 PEGx-GCSF 종(즉, x=4)은 참평균분자량이 약 41kDa이라는 사실에도 불구하고, 63kDa 단백질 마커의 이동을 기준으로 할 때, 63kDa보다 큰 겉보기 분자량으로 이동한다는 점을 유의해야 한다. 다나카 문헌에 기록된 데이터에 대해 이하에 논의되는 바와 같이, PEG화된 화합물의 분자량은 분자량 마커로써 구상 단백질을 사용할 때에는 과대평가된다. 이것은 분석이 여기에 기술되는 생물분석기에 의해 이루어지거나 또는 다나카의 문헌에 기술된 바와 같이 SDS-PAGE로 이루어지든지 간에 사실이다.
도 4의 밴드들은 정량가능하고, 각 PEGx-GCSF 종의 면적% 측정에 사용된다. 바로 아래 표 1은 본 발명의 PEG[x]-GCSF의 다수의 다른 배취들에서 수득된 결과의 범위를 정리한 것이다.
PEGx-GCSF 조성 퍼센트
x=3 0 내지 5%
x=4 22 내지 32%
x=5 38 내지 42%
x=6 18 내지 28%
x=7 0 내지 9%
SDS-PAGE:
SDS-PAGE는 다나카 문헌에 기술된 분석 방법이므로, 본 발명의 PEGx-GCSF 접합체(x가 4 내지 8) 또는 개별 접합체들의 PEG[x]-GCSF 집단([x]가 4 이상)에 대한 결과의 간단한 설명을 비교 목적으로 여기에 제시한다. PEG[x]-GCSF 샘플은 약 3㎍ 단백질을 함유하는 샘플 부피를 에펜도르프 튜브에 취하고 DTT와 함께 샘플 완충액으로 6X 희석하여 제조했다. 샘플들은 Nupage 4 내지 12% 비스-트리스 겔의 웰에 부하했다. 이 겔을 인비트로겐의 Xcell Surelock 전기영동 시스템을 사용하여 SDS-MOPS 이동 완충액에서 200V로 10분, 150V로 40분 동안 이동시켰다. 고정은 아세트산/메탄올로 수행하고, 그 다음 10% 아세트산, 10% MeOH 중의 0.01% 쿠마시로 염색했다.
SDS-PAGE 분석 결과는 도 5에 제시했다. 본 발명의 PEG[x]-GCSF 샘플의 결과는 레인 1 내지 5에 나타낸다. 레인 6은 공지된 PEG/GCSF 비율이 1 내지 4 범위인 PEG-GCSF로 구성된 "5K Ladder"의 결과를 함유한다. 레인 7은 단백질 표준 마커를 함유한다. 레인 5와 6 사이의 숫자는 존재하는 다양한 밴드들의 예상 PEG/GCSF 비율에 해당한다.
특히, GCSF 분자당 4개의 PEG를 가진 것으로 표시된 PEG4-GCSF 종은 참 평균분자량이 약 41kDa이라는 사실에도 불구하고, 약 55.4kDa의 겉보기 분자량으로 이동한다는 것을 유의해야 한다. 다나카 논문에 보고된 데이터에서 논한 바와 같이, PEG화된 화합물의 분자량은 분자량 마커로써 구상 단백질을 사용할 때 과대평가된다. 밴드들의 정량은 다나카 문헌에서 사용된 절차와 유사하게 농도계측으로 수행할 수 있다. 하지만, 생물분석기에 의해 제공되는 빠른 자동 정량 특성은 SDS-PAGE에 필요로 되는 더욱 힘들고 지루한 정량 절차보다 바람직하게 사용되며, 두 기술에 의해 수득되는 결과는 유사하다.
이러한 결과들을 다나카 및 사다케-이시카와 문헌의 정보와의 비교를 기반으로 할 때, PEG화의 정도는 본 발명의 PEGx-GCSF 접합체 및 PEG[x]-GCSF 접합체 혼합물에서의 PEG화 정도에 비해 전술한 조성물들에서 훨씬 낮다. 사다케-이시카와 문헌의 도 1에 제시된 농도계 스캔과의 비교 시, 1, 5, 10 및 50의 PEG/단백질 비율에서 GCSF와 SS-PEG의 사다케-이시카와의 반응이 단일-PEG, 단일-PEG + 이중-PEG, 단일-PEG + 이중-PEG + 삼중-PEG 및 이중/삼중/사중-PEG 혼합물로 이루어진 프로필을 산출하지만, 주로 단일PEG화 및 이중PEG화된 GCSF의 혼합물이라는 것을 보여준다.
다나카 문헌의 작업은 당업자라면 사타케-이시카와 문헌에 기술된 2,4-비스(O-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-6-클로로-s-트리아진(활성화된 PEG 10,000; PEG2라고도 불림)인 것으로 이해되는 "PEG2"로 변형된 GCSF를 이용한다. 이것의 화학구조는 본 발명의 공정에 바람직하게 사용되는 SC-PEG와는 실질적으로 다르다. 다나카 문헌은 PEG2(평균분자량 10,000)가 GCSF의 PEG화에 사용되었고, 최종 분자량이 30kDa, 40kDa 및 66kDa 중에 분포된 약 45kDa라고 기술한다. 이는 각각 1개, 2개 및 3개의 PEG에 의한 변형과 일치하고, 평균 2개이다.
즉, 다나카 문헌과 사타케-이시카와 문헌 중 어느 하나에 개시된 방법들에 의해 제조된 접합체들은 본 발명의 PEGx-GCSF 접합체(x가 4 내지 8) 또는 개별 접합체들의 PEG[x]-GCSF 집단([x]는 4, 5, 6, 7, 8, 또는 그 이상)에 존재하는 것보다 훨씬 낮은 PEG화 비율을 갖는 것을 특징으로 하는 접합체들의 혼합물을 생산한다.
PEGx - GCSF 접합체의 PEG화 부위
이하 논의에서 GCSF 분자 상의 부위에 대한 모든 수치적 언급들은 도 1, 즉 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열에 대응한다.
본 발명의 한 양태에 따라 [x]가 4 이상인 PEG[x]-GCSF의 접합체 혼합물의 샘플을 산성 잔기인 글루타메이트와 아스파테이트의 카르복시 측에 특이적인 엔도프로테이나제 Glu-C로 분해했다. N-말단과 리신-17을 함유하는 Glu-C 단편 1 내지 20, 및 리신-35 및 리신-41을 함유하는 Glu-C 단편 35-47은 Glu-C 펩타이드 지도의 비-PEG화된 영역에서는 발견되지 않았고, 이들의 PEG화된 것과 일치한다. 이에 반해, Glu-C 단편 21-34는 리신-24를 함유하는 것으로, 이 잔기에 PEG화는 나타나지 않았고, 이는 검출 수준 이하의 미량이거나 완전 부재를 암시한다. 이 데이터와 함께 평균 4 내지 6개의 PEG가 각 GCSF 분자 위에 존재함을 나타내는 PEG화 데이터의 정도는 GCSF의 위치 17, 35 및 41에 있는 리신 및 N-말단에서의 본 발명의 접합체의 방대한 PEG화와 일치한다. 이 데이터는 위치 17, 35 및 41에 있는 리신 및 N-말단이 매우 노출되어 있고, 결과적으로 SC-PEG와 같은 친전자성 시약과 반응성인 반면, 위치 24에 있는 리신은 단백질의 3차원 형태 내에 비교적 매립되어 있고, 결과적으로 SC-PEG와 매우 제한된 반응성을 나타낸다는 추정에 부합한다. 전술한 생물분석기 및 SDS-PAGE 실험의 증거는 7개만큼 많은 PEG가 본 발명에 따라 GCSF에 부착될 수 있고, GCSF에 부착된 PEG의 평균 수가 4보다 5에 더 가깝고, 나머지 3개의 PEG의 부착 위치는 히스티딘 잔기의 이미다졸 기 위인 것으로 생각되며, 이는 위치 44, 53, 80, 157 및 171에 존재하는 것이고, 우선적인 변형은 상대적 노출 정도 및 각 히스티딘 잔기의 국소적인 전자 상황에 의해 좌우된다.
실시예 3: 시험관내 연구 결과
본 실시예는 본 발명의 PEG[x]-GCSF의 세포 증식 활성 vs. NEULASTA®의 세포 증식 활성을 (i) 특정 암 세포 및 (ii) 정상 골수 선조 세포에 대해 비교한 것이다.
성장인자를 평가하기 위한 표준 생물학적 선별 시험은 GCSF 산물의 분석 및 약학적 로트의 방출에 대해 특별히 개발된 세포주의 사용을 포함한다. 쥐의 M-NSF-60 세포주가 개발되었고, 현재 GCSF 단백질의 약학적 방출 시험에 널리 사용되고 있다(Mire-Sluiset. Al., Pharm. PHarmacol. Commun. 5, 45-49; Shirafuji N1, Exp Hematol. 1989 Feb; 17(2): 116-9).
상기 실시예 1에 따라 제조된 PEG[x]-GCSF 샘플은 세계 보건기구(WHO STD)의 PEG-GCSF 국제 표준 및 Amgen의 시판 제형(NEULASTA®)과 나란히, ATCC에서 구입하여 재조합 GCSF(r-GCSF) 62ng/ml의 존재하에 최소 20회 계대배양을 위해 매주 2회 연속 계대배양한 M-NFS-60 세포를 이용하여 생물분석으로 분석했다. 세포 생육성은 배양물의 생육성이 95% 초과를 유지하도록 트립판 블루 염료 배제를 통해 모니터했다. 1일째, 세포를 계수하고, 세포 밀도를 성장 배지(10% FBS, 0.05mM BME, 1x 페니실린/스트렙토마이신, 및 62ng/ml 인간 r-GCSF가 보충된 RPMI 1640)에 5x105 세포/ml 로 조정했다. 24시간 후, 세포수를 트립판 블루 배제로 측정하고, 원심분리하여 세포를 수집하고, 분석 매질(10% 태내 소 혈청(FBS), 0.05mM BME, 1x 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640)에 5x105 세포/ml로 현탁시키고, 다시 24시간동안 37℃로 복귀시켰다. 3일째, 세포를 계수하고, 밀도를 분석을 위해 2x105 세포/ml로 조정하고, 세포 현탁액을 0.1ml/웰씩 96웰 평판에 분배했다. 분석 배지에 2x 분석 농도의 시험 물질을 연속 5배 희석한 희석물을 제조하고, 0.1ml 첨가했다. 샘플 첨가 후, 평판을 48시간 동안 37℃ 항온배양기로 복귀시켰다. 5일째, 각 웰에 Promega Cell Titer Aqueous One(Promega, Madison, WI) 0.04ml를 첨가하고, 37℃에서 항온배양했다. 항온배양 4시간 후, 490nm에서 광학밀도(OD)를 측정하고, 데이터를 마이크로소프트 엑셀(MSXL) 워크북 파일로 전송했다. 처리된 세포의 OD는 미처리 대조군 웰의 OD에 대해 정규화했고, 대조군의 퍼센트로 나타냈다. 3개의 파라미터 로지스틱 곡선 부합 모델에 데이터를 부합(fit)시켜 효능 추정치를 만들었다(도 6). 도 6의 부합도(goodness of fit)와 함께 EC50의 대표적인 값과 95% 신뢰구간을 바로 아래의 표 2에 제시했다. 표 2의 "상대 효능" 열은 본 발명의 PEG[x]-GCSF(이 표에서는 "ANF-Rho"라 표시됨)와 WHO PEG-GCSF 또는 NEULASTA® 간의 배수 차이를 나타낸다.
EC50 ng/ml 95% 신뢰 구간 r2 상대 효능
ANF-RHO 38.3 18-79 0.93 1
WHO PEG-GCSF 0.02 0.01-0.03 0.98 1915
Neulasta 0.15 0.11-0.19 0.99 255
도 6 및 표 2에 제시된 바와 같이, WHO STD PEG-GCSF 및 NEULASTA®는 각각 0.15 및 0.02ng의 서브나노그람(sub-nanogram) 효능 값을 나타냈다. 이에 반해, 본 발명의 PEG[x]-GCSF(도 6 및 표 2에 "ANF-Rho"라 표시됨)의 EC50 값은 약 38ng/ml의 EC50 값으로 255 내지 1955배 덜 효능적인 것으로 추정되었다. 3가지 PEG-GCSF 제조물은 모두 각각의 최대 처리 농도에서 동일하게 세포 증식을 유발할 수 있었다.
쥐의 암 세포주를 사용하여 수행한 전술한 연구와 비교하기 위해, 정상 인간 세포에 대해서도 본 발명의 PEG[x]-GCSF의 효과를 측정했다. 구체적으로, 조혈 줄기 세포를 NEULASTA® 또는 본 발명의 PEG[x]-GCSF로 처리하고, 성숙 호중구 내로 CD34(+) 줄기 세포의 분화 및 증식은 유동세포분석법으로 다음과 같은 절차에 따라 정량화했다.
동결보존된 골수 CD34+ 세포 및 CFC 키트를 Stem Cell Technologies(Vancouver, BC, Canada)에서 구입하고, 세포를 분석 시간까지 -135℃에 보관했다. 10% FBS가 보충된 이스코브(Iscove) 변형된 둘베코 배지(IMDM)(Life Technologies, Grand Island, New York)는 37℃로 가온시켰다. 세포는 바이엘을 37℃ 배쓰에 넣어 해동시켰고, 0.01ml 샘플에 대해 즉시 생육성을 측정했다. 세포를 300㎍ Dnase I(Life Technologies)을 함유하는 멸균 50ml 튜브로 옮겼다. 이 튜브를 부드럽게 회전시키고 최종 부피가 20ml일 때까지 가온 배지를 첨가하여 세포를 계속해서 천천히 가온시켰다. 현탁액은 저속 인버전(inversion)으로 혼합했다. 그 뒤, 튜브를 실온하에 15분 동안 날개회전자(swinging bucket rotor)에서 200g(840rpm, R&D lab, Beckman JS4.2)로 원심분리시켰다. 상청액은 조심스럽게 피펫으로 분리하고 소량의 배지를 남겼다. 그 다음, 세포 펠릿을 남은 배지에 현탁시킨 뒤, 20ml 배지를 첨가하고, 세포를 저속 인버전으로 혼합했다. 이 단계를 다시 한번 반복한 후, 세포 펠릿을 1ml 배지에 현탁시켜 세포 밀도를 1.5x105 세포/ml로 만들었다.
MethoCult 배지(Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canada)는 4℃에서 밤새 해동시키고, 분석 개시 바로 전에 25℃로 만들었다. 그 다음, NEULASTA® 및 본 발명의 PEG[x]-GCSF를 최종 분석 농도 50ng/ml로 첨가하고, 볼텍스로 저속 혼합했다. 내부에 뚜껑이 있는 2개의 35mm 배양 접시를 뚜껑이 있는 100ml 페트리 접시에 넣었다. 물을 함유하고 뚜껑이 없는 세번째 35mm 배양 접시는 적당한 습도 수준을 유지하기 위해 추가했다. 세포는 2% FBS가 보충된 IMDM으로 5x105 세포/ml의 최종 농도로 희석했다. 희석된 세포 0.3ml를 3ml MethoCult 튜브에 첨가하고 볼텍스로 저속 혼합했다. 혼합물을 적어도 5분 동안 정치시켜 기포가 상부로 올라오게 했다. 멸균 3ml 주사기에 멸균 16게이지 끝이 무딘 주사바늘을 부착했다. 이 주사기에서 공기를 빼낸 뒤, 바늘을 용액의 표면 아래에 넣고, 약 1ml를 주사기로 뽑았다. 플런저를 부드럽게 압력을 해제시켜 추출 배지를 완전히 빼내고 공기 공간이 보이지 않을 때까지 반복했다. 세포를 함유하는 MethoCult 혼합물은 주사기로 뽑아서 이 주사기가 접시에 접촉되지 않게 각 35mm 접시에 1.1ml 부피로 분배했다. 배지는 접시를 부드럽게 기울이고 회전시켜 배지가 접시의 벽에 모든 면에서 부착하게 하면서 배지가 뚜껑에는 닿지 않게 하여 각 35ml 접시의 표면을 따라 균일하게 분포시켰다. 배양 접시의 내용물을 100ml 접시에 놓고, 뚜껑이 없는 35mm 접시에 멸균수 약 3ml를 첨가하고 5% CO2, >95% 습도하에 37℃에서 14일 동안 항온배양했다. 각 웰에 2% FBS 배지가 보충된 IMDM 1ml를 첨가하고 상하 피펫팅으로 완전히 혼합하여 메틸셀룰로오스 매트릭스로부터 세포를 회수했다. 전체 혼합물을 15ml 튜브로 옮기고 11ml 배지를 첨가했다. 세포를 600xg로 10분 동안 펠릿화하고, 배지 상청액을 흡인시켰다. 세포 펠릿은 남은 배지에 현탁시키고, 세포 수를 트립판 블루 배제로 측정했다.
세포 펠릿은 저온 염색 완충액(BD Pharmingen, San Jose, CA) 320㎕로 300xg에서 5분 동안 원심분리하여 2회 세척했다. 세포는 각 펠릿에 Cytofix(BD Pharmingen) 50㎕를 첨가하여 고정시키고 저속 볼텍싱으로 재현탁시켰다. 세포는 4℃에서 20분 동안 항온배양한 뒤, 300xg에서 5분 동안 원심분리했다. 그 다음, 세포는 염색 완충액 1ml로 총 3회 세척했다. 세포는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 또는 피코에리스린(PE)이 직접 접합된 CD-14 및 항-CD66b 항체들로 염색했다. 염색 특이성은 직접 접합된 이소타입 대조 항체를 사용하여 확인했다. 그 다음, 유동세포분석 및 데이터 획득을 수행했다.
도 7은 CD66 및 CD14의 형광 강도를 이변량 플롯들로 나타낸 사분면 게이팅(quadrant gating)이다. CD66(+), CD14(-) 세포는 과립세포를 나타내고(게이트 E4), 반면 CD66(-) 세포, CD14(+) 세포(게이트 E1)는 대식세포의 특징이다. 이 두 항원 모두에 대해 양성으로 염색된 세포는 게이터 E2에서 나타난다. NEULASTA® 처리(도 7의 왼쪽 패널)는 CD66에 대해 양성으로 염색된 세포를 11% 산출했고, 본 발명의 PEG-GCSF 접합체로의 처리(도 7의 오른쪽 패널)는 CD66에 대해 양성으로 염색된 세포를 51% 산출했다. 따라서, 본 발명의 접합체-처리된 샘플은 동일한 농도의 NEULASTA®로 처리된 샘플에 비해 과립세포의 분획이 4.6배 더 높았다.
이러한 결과들은 전술한 M-NFS-60 생물분석에서의 데이터(골수원성 백혈병 유래의 세포주를 이용하고, 본 발명의 PEG[x]-GCSF가 현재 판매되는 제품보다 훨씬 적은 효능을 나타냈다)와 대조적으로, 본 발명의 PEG[x]-GCSF가 정상 골수세포를 과립세포로 분화 및 증식을 유발하는데 있어서 NEULASTA®보다 약 1000배 더 큰 효능이 있다는 것을 입증한다. 암세포주 및 정상 세포에 대한 각각의 효능 데이터를 함께 종합해보면, 본 발명의 PEG[x]-GCSF 접합체는 특정 암 종류의 종양 성장을 악화시킴이 없이 정상 골수 세포의 증식을 유발하는데 있어서 필그라스팀 및 PEG-필그라스팀에 비해 더 큰 임상 치료 창을 가진 것으로 생각할 수 있다.
따라서, NEULASTA®과 비교했을 때, 본 발명의 PEG[x]-GCSF는 놀랍게도 골수 세포의 증식을 자극하는 바람직한 활성은 훨씬 크고, 반면 암세포의 증식을 유발하는 부적절한 활성은 훨씬 적다.
실시예 4: 동물 연구 결과
본 실시예는 래트에서의 생체내 약동학적 및 약력학적 연구 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 PEG[x]-GCSF가 NEULASTA®에 비해 호중구 생산을 자극하는 능력이 우수하다는 것을 입증한다.
상기 실시예 1에 따라 제조된 본 발명의 PEG[x]-GCSF 3개의 로트의 약동학 및 약력학은 래트에게 단일 피하(SC) 용량으로 투여한 후 NEULASTA®와 비교했다. NEULASTA®는 시중에서 구입했다. 또한, 적당한 투여량을 제조하기 위해 사용한 제형 완충액도 본 연구에서 음성 대조군으로 포함되었다.
10과 1/2주된 96마리 수컷 Sprague Dawley(SD) 래트에게 호중구감소증을 유도하기 위해 -1일째 암 화학치료제 사이클로포스파미드 90mg/kg을 복강내(IP) 주사로 투여했다. 각 시험 물질은 피하(SC) 주사로 1일째 투여했다. 각 용량은 사이클로포스파미드 및 시험 물질을 각각 투여하기 전에 -1일 및 1일째 측정한 체중을 기반으로 하여 계산했다. 모든 시험 물질 용액은 상온에 도달하게 하고 투여하기 전에 부드럽게 인버전 및 회전시켰다. 모든 제형은 투명 용액이었다. 사이클로포스파미드는 주사용 멸균수에 복원시킨 후 초음파처리하여 투명 용액을 만들었다. 본 발명의 PEG[x]-GCSF를 3개의 별개 로트로써 25, 50 및 100㎍/kg으로 투여했다. NEULASTA®은 100㎍/kg으로 투여했다. IP 및 SC 용량은 각각 복부 및 면도한 중간 견갑골 영역에 주사기로 투여했다.
혈액(약 0.8ml)은 주사기로 경정맥으로부터 수집하고 K2 EDTA 항응고제 사전용량을 함유하는 튜브로 용량투여후 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264 및 288시간째 전달했다. 혈액은 용량투여전 2마리 동물/그룹으로부터 수집하고, 용량투여후 수집물 전부에 대해서는 4 동물/그룹/시점으로부터 수집했다. 각 동물의 총 혈액 샘플 부피는 동물보호이용협회(IACUC)의 승인된 제한 범위내였다.
각 혈액 샘플은 나누고 약 400㎕의 혈액을 새로운 튜브로 옮겨 혈장을 원심분리했다. 혈액 샘플은 원심분리 전에 함습 얼음 위에서 유지시켰다. 원심분리는 수집 1시간 내에 시작했다. 혈장은 스크류탑 저온바이엘에 옮겨 약 -70℃에서 저장하기 전에 드라이아이스 위에 두었다. 절대호중구수(ANC)를 측정했다.
그 다음 인간 GCSF 혈장 수준은 구입한 ELISA 키트를 제조업자의 지시(Catalog No. DCS50, RnD Systems, Minneapolis, MN)에 따라 사용하여 측정했다. 본 발명의 PEG[x]-GCSF 배취들 및 NEULASTA®의 혈장 농도는 투여후 시간의 함수로써 도 8에 제시했다(본 발명의 PEG[x]-GCSF에 대응하는 데이터 세트는 "Lot 1", "Lot 2" 및 "Lot 3"으로 각각 표시했다).
통계 분석: ANC(103 세포/ml로 나타냄) 및 GCSF 혈장 수준(ng/ml로 나타냄)은 엑셀(Microsoft, Redmond WA)을 사용하여 분석했다. 데이터는 Prism Graphpad(GraphPad Software, La Jolla, CA)를 사용하여 투여후 시간의 함수로써의 ANC 또는 GCSF 농도로 기시화했다. GCSF 및 ACN에 대한 곡선아래 면적, 1단계 붕괴(one-phase decay), 및 선형회귀분석을 소프트웨어 지시에 따라 수행했다. 던넷(Dunnet)의 사후(post-hoc) 시험으로 분산분석(ANOVA)을 수행하여 처리군 간에 유의적인 차이(p<0.05)를 입증했다.
도 8a는 투여 후 24시간 이내에 PEG화된 GCSF 분자 둘 모두의 수준이 피크에 오른 후, 비교적 빠르게 떨어진다는 것을 보여준다. 하지만, 농도를 도 8b에서와 같이 log 스케일로 가시화하면, 본 발명의 접합체와 NEULASTA® 간의 차이는 뚜렷해진다. 100㎍/kg인 NEULASTA®의 농도는 72시간 후에 약 1000배 떨어진다. 이는 연구 과정 동안 느리고 다소 안정적인 혈장 농도의 감소를 나타내고 투여 5일 후 NEULASTA® 수준의 20 내지 100배까지 유지하는 본 발명의 접합체와 대조적이다.
처리군의 혈장 수준의 차이를 추가로 평가하기 위한 노력으로, "곡선아래면적" 분석(AUC)을 이용한 약동학을 사용하여 본 발명의 접합체 및 NEULASTA®의 혈장 노출을 정량화했다. 도 9a는 각 본 발명의 접합체 로트 및 투여량, 뿐만 아니라 NEULASTA®에 대한 AUC 값을 정리한 것이다. 100㎍/kg으로 투여된 본 발명의 접합체의 각 로트는 동일한 용량의 NEULASTA®에 비해 훨씬 높은 혈장 농도를 산출했다. 25 또는 50 ㎍/kg으로 투여된 동물 유래의 본 발명의 PEG[x]-GCSF 혈장 수준은 NEULASTA® 투여된 래트 유래의 혈장에 존재하는 GCSF 수준보다 훨씬 적었다(NEULASTA® 용량은 100㎍/kg이었기 때문에). 용량과 혈장 노출 간의 관계를 추가로 특성화하기 위해, 각 본 발명의 접합체 로트의 AUC 값을 용량에 따라 합산해서 선형 회귀 분석으로 처리했다(도 9b). 본 발명의 PEG[x]-GCSF 100㎍/kg 투여량에 대해 ml*시간당 합산된 7322ng의 AUC는 NEULASTA®에 대해 계산된 5543ng/ml*시간보다 훨씬 높았다. 50 및 25㎍/kg의 본 발명의 접합체의 투여량은 NEULASTA®보다 각각 3127 및 1280의 훨씬 낮은 AUC 값을 산출했다(이 역시 NEULASTA® 용량이 100㎍/kg이었기 때문에 예상치 못한 것은 아니다). 이 연구에서 투여량과 혈장 AUC 간에는 선형 관계가 존재했다(r2 = 0.91). 또한, 개별 100㎍/kg 본 발명의 접합체의 AUC 값을 NEULASTA®이 투여된 래트의 평균 및 95% 신뢰 구간과 비교할 때 24마리의 래트 중 22마리는 동일 용량에서 더 많은 혈장 노출을 달성했다.
도 10은 본 발명의 PEG[x]-GCSF, NEULASTA®(NLST) 또는 제형 완충액(FB)이 투여된 래트로부터의 시간의 함수로써 절대 호중구 수(ANC)를 도시한 대표 그래프이다. 2가지 사항이 고려되어야 한다: 첫째, 사이클로포스파미드 치료 후 선천적 증식 반응이 회복할 때, FB 투여된 래트로부터 호중구 수준의 점진적 상승; 및 둘째, PEG화된 시험 물질의 투여 후 바로 이어지는 ANC 수준의 급증. 이 두 번째 사항은 골수 및 다른 구획들에서 사전형성된 미성숙 호중구의 GCSF-매개의 방출에 기인하는 것이다(음영 영역); 즉, "줄기세포 저장소 이동". 따라서, 본 발명의 접합체 또는 NEULASTA®에 의해 매개되는 신규 증식을 정확하게 비교하기 위해, AUC 분석은 96시간 후의 ANC 수준만을 고려했고; 도 10의 음영 영역에 속하는 데이터는 ANC 분석에 포함되지 않았다. 약 125시간과 250시간 사이에 ANC 수의 비교는 등가 투여량 수준에서 NEULASTA®에 비해 본 발명의 PEG[x]-GCSF에 의한 ANC 수가 더 높다는 것을 보여주었다.
효능 차이를 더욱 잘 분석하기 위해, 신규 증식 기간 과정 동안의 절대 호중구 수의 AUC(AUC-ANC)는 3가지 다른 농도(25, 50 및 100㎍/kg)에서 본 발명의 PEG[x]-GCSF의 3가지 고유의 로트로 평가했다. 이러한 방식으로 호중구 생산의 수준 및 기간을 정량화할 수 있다. 도 11a는 본 발명의 접합체 및 NEULASTA® 처리된 호중구감소증 래트로부터 절대 호중구 수의 AUC를 정리한 것이다. 제형 완충액과 비교 시, NEULASTA® 및 본 발명의 PEG[x]-GCSF는 둘 다 각 투여량에서 호중구 증식을 유의적으로 증가시킬 수 있었다. 또한, 100㎍/kg으로 투여된 NEULASTA®과 비교 시, 50 및 25㎍/kg 수준의 본 발명의 PEG[x]-GCSF는 유사한 호중구 증식을 달성했고, 50㎍/kg 용량의 경우에는 호중구 증식을 약간 증가시켰다. 또한, NEULASTA®과 동일한 100㎍/kg 용량에서 본 발명의 PEG[x]-GCSF는 유의적으로 높은 호중구 수준을 달성했다. 또한, 동일한 데이터 세트를 사용하여 선형 회귀 플롯을 작도하여 NLST(도 11b의 음영 영역) 대비 본 발명의 PEG[x]-GCSF의 약력학적 성질을 추가로 예증했다.
약동학(도 9) 및 약력학(도 10) 데이터를 종합하면, 본 발명의 PEG[x]-GCSF는 NEULASTA®과 다른 프로필을 나타낸다. 본 발명의 PEG[x]-GCSF는 25 및 50㎍/kg의 투여량에서 100㎍/kg NEULASTA®에 비해 유의적으로 낮은 혈장 수준을 제공했다. 25 및 50㎍/kg의 혈장 GCSF AUC는 100㎍/kg NEULASTA®에 비해 4.3배 및 1.8배 낮았고, 피크 수준은 각각 7.2배 및 2.9배 낮았다. 하지만, 더 낮은 용량(25 및 50㎍/kg)의 본 발명의 접합체는 100㎍/kg의 NEULASTA®에 비해 생체내에서 동등한 호중구 생산을 초래했다. 동등한 용량의 본 발명의 접합체가 NEULASTA®보다 4배 넘는 과립세포를 생산할 수 있음을 보여준 실시예 3에 제시된 시험관내 CD34(+) 선조세포 결과와 조합해보면, 이 데이터는 PEG[x]-GCSF가 호중구 생산에 있어서 NEULASTA®보다 더 강력하고, 훨씬 긴 순환성 반감기를 갖고 있음을 암시한다. 이는 다음과 같은 본 발명의 제형의 장점을 암시한다:
● NEULASTA®과 같은 현재 시중에서 입수용이한 제형들과 달리, 본 발명의 PEG[x]-GCSF는 화학요법 중 임의의 시기에 투여될 수 있고, 필요하다면 현행 또는 증가된 투여량으로의 재투여가 고려될 수 있다. 본 발명의 PEG[x]-GCSF의 투여 후 ANC의 상승은 중증 호중구감소증의 위험이 가장 높은 중요한 시기인 화학요법 후 7일 기간 동안 NEULASTA®에 기인하는 상승보다 더 느리다. 이는 NEULASTA®이 줄기세포 풀(pool)의 대부분을 분명하게 이동시키기 때문이며(호중구를 급격히 생산하는 결과에 의해), 이에 따라 NEULASTA®의 용량투여 지침은 줄기 세포가 스스로 재생하도록 하기 위해 NEULASTA®를 다시 투여하기 전에 14일의 지연 시간을 필요로 한다. 이에 반해, 본 발명의 PEG[x]-GCSF는 줄기 세포 풀의 더 작은 일부만을 이동시키는 것으로 보인다(결과적으로 호중구를 더욱 점진적이고 더욱 장기적으로 생산한다). 이러한 이유로, 상기 입증된 바와 같이 ANC의 더욱 느리고 더욱 지속적인 증가를 기반으로 하여 본 발명의 제형의 경우에는 14일의 주의가 필요하지 않다. 더욱이, 특히 이러한 "반복 용량투여" 없이 본 발명의 제형의 작용은 ANC가 호중구감소증 수준(<2.0x 10e5/L)으로 떨어지지 않게 방지한다. 임상가들은 일반적으로 21일의 순환 기간 동안 화학요법에 대한 반응을 모니터한다. 즉, 본 발명의 PEG[x]-GCSF는 원하는 종양 성장의 감소가 관찰되지 않는다면 상기 21일 순환 동안 임의의 시기에 화학 용량-강화를 뒷받침하기 위해 사용될 수 있다.
● 본 발명의 PEG[x]-GCSF는 더 적은 투여량이지만 동일하거나 더욱 효과적인 본 발명의 PEG[x]-GCSF로 치료될 수 있고, 및/또는 NEULASTA®에 비해 덜 빈번한 용량투여로 치료될 수 있어 골 통증 감소 등을 초래한다는 점에서 환자의 삶의 질을 향상시킨다.
실시예 5: 임상 연구( 골통증 )
비-PEG화된 GCSF 및 PEG화된 GCSF의 다수의 실험들에서, 골통증은 가장 중요하고 해로운 부작용이다(Renwick et al., 2009). GCSF 치료 매개의 골통증을 예방하고 치료하기 위해 시도한 치료 시술에는 몇가지 종류가 있다. 아세트아미노펜, 비 스테로이드성 소염 약물, 항히스타민 및 아편유사제는 통증을 경감시키기 위한 시도들에 이용되었고 성공의 정도는 다양했다(Kirsher, 2007, Oagata 2005). 1가지 관찰성 회고적 연구는 PEG-필그라스팀의 용량이 6mg에서 4mg으로 감소되었을 때 25명의 환자에서 골통증이 전혀 관찰되지 않았음을 나타냈다(Paba et al 2008). 전술한 임상전 약동학 및 약력학 연구를 기반으로 할때, 본 발명의 PEG[x]-GCSF는 더 낮은 용량에서 NEULASTA®만큼 효능적이라는 잠재성이 있다. 이에 따라, 이러한 더 낮은 용량에서 본 발명의 접합체는 NEULASTA® 투여와 관련된 골통증을 유발하지 않을 것이다.
수행된 임상 연구는 5 내지 10 내지 20 내지 40 내지 80㎍/kg 체중을 기반으로 한 용량투여 섭생의 본 발명의 접합체의 상승 단일 피하 용량을 포함했다. 또한, NEULASTA®에 비해 인간에서 PEG[x]-GCSF의 안전성, 허용성, 약동학 및 약력학을 연구하기 위해, 이중맹 무작위 위약 대조 연구도 수행했다. 지원자에게 1차 안전성 종점이 있는 본 발명의 접합체의 증가 투여량을 피하 투여한다. 또한, 다른 파라미터들 중에서 골통증 점수를 본 발명의 접합체 및 NEULASTA® 양자의 기준값과 비교한다. 전반적인 통증을 측정하기 위해 특정 골통증 설문지와 함께 가시적 아날로그 척도(VAS)를 사용한다. VAS 및 골통증은 둘 다 통증 표시인자가 붙어있는 100mm 수평선과 이 선의 좌측(무 통증)으로부터의 거리를 측정하여 나타낸 통증을 사용하여 정량화한다. 본 발명의 접합체가 투여된 환자는 NEULASTA®이 투여된 환자보다 낮은 골통증을 보고한다.
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Claims (63)

  1. x가 4 내지 8의 정수인 PEGx-GCSF.
  2. 제1항에 있어서, x가 5인 PEGx-GCSF.
  3. 제1항에 있어서, x가 6인 PEGx-GCSF.
  4. 제1항에 있어서, x가 7인 PEGx-GCSF.
  5. 제1항에 있어서, PEG가 GCSF 유래의 아민을 통해 GCSF에 부착되어 있는, PEGx-GCSF.
  6. 제1항에 있어서, 비-가수분해성 결합을 함유하는, PEGx-GCSF.
  7. 제6항에 있어서, 비-가수분해성 결합이 우레탄 결합인, PEGx-GCSF.
  8. 제1항에 있어서, GCSF가 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4 및 이의 기능성 유도체 및 동족체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 가진 단백질인 PEGx-GCSF.
  9. 제8항에 있어서, 아미노산 서열이 서열번호 1, 서열번호 1의 기능성 유도체, 또는 서열번호 1의 동족체이고, GCSF가 위치 17에 리신 잔기, 위치 35에 리신 잔기, 위치 41에 리신 잔기, 위치 44에 히스티딘 잔기, 위치 53에 히스티딘 잔기, 위치 80에 히스티딘 잔기, 위치 157에 히스티딘 잔기 및 위치 171에 히스티딘 잔기를 보유하는, PEGx-GCSF.
  10. 제9항에 있어서, 각 PEG가 N-말단, 위치 17의 리신 잔기, 위치 35의 리신 잔기, 위치 41의 리신 잔기, 위치 44의 히스티딘 잔기, 위치 53의 히스티딘 잔기, 위치 80의 히스티딘 잔기, 위치 157의 히스티딘 잔기 및 위치 171의 히스티딘 잔기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 위치에서 GCSF에 부착되는, PEGx-GCSF.
  11. 제1항에 있어서, PEG가 평균분자량이 약 3 내지 약 15kDa인, PEGx-GCSF.
  12. 제11항에 있어서, PEG가 평균분자량이 약 5 내지 약 6kDa인, PEGx-GCSF.
  13. [x]가 x의 평균 값이고, [x]가 약 4 이상인, PEGx-GCSF의 집단을 함유하는, PEG[x]-GCSF.
  14. 제13항에 있어서, [x]가 약 4 내지 약 8인, PEG[x]-GCSF.
  15. 제13항에 있어서, [x]가 약 4 내지 약 6인, PEG[x]-GCSF.
  16. 제13항에 있어서, [x]가 약 5 내지 약 6인, PEG[x]-GCSF.
  17. 제13항에 있어서, x가 1 내지 3인 PEGx-GCSF를 10% 미만으로 함유하는, PEG[x]-GCSF.
  18. 제13항에 있어서, x가 4인 PEGx-GCSF를 약 15% 이상 함유하는, PEG[x]-GCSF.
  19. 제13항에 있어서, x가 5인 PEGx-GCSF를 약 30% 이상 함유하는, PEG[x]-GCSF.
  20. 제13항에 있어서, x가 6인 PEGx-GCSF를 약 10% 이상 함유하는, PEG[x]-GCSF.
  21. 제13항에 있어서, x가 7인 PEGx-GCSF를 15% 미만으로 함유하는, PEG[x]-GCSF.
  22. 제13항에 있어서, x가 6 내지 7 범위인 PEGx-GCSF를 약 15% 이상 함유하는, PEG[x]-GCSF.
  23. 제13항에 있어서, x가 5 내지 7인 PEGx-GCSF를 약 35% 이상 함유하는, PEG[x]-GCSF.
  24. 제13항에 있어서, PEG가 GCSF 유래의 아민을 통해 GCSF에 부착된, PEG[x]-GCSF.
  25. 제13항에 있어서, PEGx-GCSF가 비-가수분해성 결합을 함유하는, PEG[x]-GCSF.
  26. 제25항에 있어서, 비-가수분해성 결합이 우레탄 결합인, PEG[x]-GCSF.
  27. 제13항에 있어서, GCSF가 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4 및 이의 기능성 유도체 및 동족체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 서열을 가진 아미노산인 PEG[x]-GCSF.
  28. 제27항에 있어서, 아미노산이 서열번호 1, 서열번호 1의 기능성 유도체, 또는 서열번호 1의 동족체이고, GCSF가 위치 17에 리신 잔기, 위치 35에 리신 잔기, 위치 41에 리신 잔기, 위치 44에 히스티딘 잔기, 위치 53에 히스티딘 잔기, 위치 80에 히스티딘 잔기, 위치 157에 히스티딘 잔기 및 위치 171에 히스티딘 잔기를 보유하는, PEG[x]-GCSF.
  29. 제28항에 있어서, 각 PEG가 N-말단, 위치 17의 리신 잔기, 위치 35의 리신 잔기, 위치 41의 리신 잔기, 위치 44의 히스티딘 잔기, 위치 53의 히스티딘 잔기, 위치 80의 히스티딘 잔기, 위치 157의 히스티딘 잔기 및 위치 171의 히스티딘 잔기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 위치에서 GCSF에 부착된, PEG[x]-GCSF.
  30. 제13항에 있어서, PEG가 평균분자량이 약 3 내지 약 15kDa인, PEG[x]-GCSF.
  31. 제30항에 있어서, PEG가 평균분자량이 약 5 내지 약 6kDa인, PEG[x]-GCSF.
  32. 제13항에 있어서, 상기 집단이
    x가 3인 PEGx-GCSF 약 0% 내지 약 5%;
    x가 4인 PEGx-GCSF 약 22% 내지 약 32%;
    x가 5인 PEGx-GCSF 약 38% 내지 약 42%;
    x가 6인 PEGx-GCSF 약 18% 내지 약 28%; 및
    x가 7인 PEGx-GCSF 약 0% 내지 약 9%를 함유하는, PEG[x]-GCSF.
  33. 제13항에 있어서, PEG가 우레탄 결합을 통해 GCSF에 부착되고, PEG가 평균분자량이 약 3 내지 약 15kDa인, PEG[x]-GCSF.
  34. 제33항에 있어서, PEG가 평균분자량이 약 5 내지 약 6kDa인 PEG[x]-GCSF.
  35. 제13항에 기재된 PEG[x]-GCSF의 약학적 활성량 및 비-단백질 운반체를 함유하는 약제 제형.
  36. 제35항에 기재된 약제 제형의 치료적 유효량을 백혈구 세포수의 증가를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 상기 환자의 백혈구 세포수를 증가시키는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 환자가 호중구감소증의 위험에 있거나 호중구감소증을 앓고 있는 환자인 방법.
  38. 제36항에 있어서, 환자가 환자의 백혈구 세포수를 감소시키는 제제로 치료 중이거나, 또는 치료받고 있는 환자인, 방법.
  39. 제36항에 있어서, 환자가 GCSF의 내인성 수준이 저하된 환자인, 방법.
  40. 제36항에 있어서, 환자가 방사선 치료 중인 환자인, 방법.
  41. 제38항에 있어서, 환자가 암 치료 중인 환자인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 암이 골수성 암인 방법.
  43. 제37항에 있어서, 환자가 중증 만성 호중구감소증 또는 중증 선천성 호중구감소증 또는 중증 복합 호중구감소증을 앓고 있는 환자인, 방법.
  44. 제36항에 있어서, 환자가 자가유래 줄기세포 이식 전에 치료되는 방법.
  45. 제35항에 기재된 약제 제형의 치료적 유효량을, 중증 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 상기 환자의 중증 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 치료하는 방법.
  46. 제1항에 기재된 PEGx-GCSF를 제조하는 방법으로써,
    (a) 약 5.0mg/ml 농도의 GCSF 용액을 수득하는 단계;
    (b) PEG가 GCSF의 몰량보다 약 65 내지 약 75배의 몰량으로 존재하는 PEG와 GCSF 용액을 배합하는 단계;
    (c) GCSF와 PEG가 충분한 시간동안 반응하여 PEGx-GCSF를 생산하도록 하는 단계;
    (d) 잔여 PEG와 반응하기에 충분한 양으로 하이드록실아민을 첨가하는 단계;
    (e) 미반응 PEG, N-하이드록시석신이미드 및 하이드록실아민으로부터 PEG[x]-GCSF를 분리하는 단계; 및
    (f) PEGx-GCSF를 분리하는 단계를 함유하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 약 5.0mg/ml의 GCSF 용액은 GCSF 용액을 농축하는 단계에 의해 수득되는 것인, 방법.
  48. 제46항에 있어서, 추가로 (g) 분리된 PEGx-GCSF를 용액 중에 약 5.5 내지 6mg/ml로 농축시키는 단계를 포함하는 방법.
  49. 제47항에 있어서, 상기 농축 단계가 막 정용여과에 의해 달성되는 방법.
  50. 제48항에 있어서, 상기 농축 단계가 막 정용여과에 의해 달성되는 방법.
  51. 제46항에 있어서, pH가 단계 (a) 내지 (e) 동안 약 7.75로 유지되는 방법.
  52. 제46항에 있어서, 온도가 방법 전반에 걸쳐 실온으로 유지되는 방법.
  53. 제46항에 있어서, 단계 (b) 및 (c)가 약 1시간 동안 수행되는 방법.
  54. 제46항에 있어서, 단계 (d)가 약 2시간 동안 수행되는 방법.
  55. 제13항에 기재된 PEG[x]-GCSF를 제조하는 방법으로써,
    (a) 약 5.0mg/ml 농도의 GCSF 용액을 수득하는 단계;
    (b) PEG가 GCSF의 몰량보다 약 65 내지 약 75배의 몰량으로 존재하는 PEG와 GCSF 용액을 배합하는 단계;
    (c) GCSF와 PEG가 충분한 시간동안 반응하여 PEGx-GCSF를 생산하도록 하는 단계;
    (d) 잔여 PEG와 반응하기에 충분한 양으로 하이드록실아민을 첨가하는 단계; 및
    (e) 미반응 PEG, N-하이드록시석신이미드 및 하이드록실아민으로부터 PEGx-GCSF를 분리하는 단계를 함유하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 약 5.0mg/ml의 GCSF 용액은 GCSF 용액을 농축하는 단계에 의해 수득되는 것인, 방법.
  57. 제55항에 있어서, 추가로 (f) 분리된 PEGx-GCSF를 용액 중에 약 5.5 내지 6mg/ml로 농축시키는 단계를 포함하는 방법.
  58. 제56항에 있어서, 상기 농축 단계가 막 정용여과에 의해 달성되는 방법.
  59. 제57항에 있어서, 상기 농축 단계가 막 정용여과에 의해 달성되는 방법.
  60. 제55항에 있어서, pH가 단계 (a) 내지 (e) 동안 약 7.75로 유지되는 방법.
  61. 제55항에 있어서, 온도가 방법 전반에 걸쳐 실온으로 유지되는 방법.
  62. 제55항에 있어서, 단계 (b) 및 (c)가 약 1시간 동안 수행되는 방법.
  63. 제55항에 있어서, 단계 (d)가 약 2시간 동안 수행되는 방법.
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