KR20080027291A - 피이지화된 지-씨에스에프 폴리펩타이드 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하이드록실 기에 부착된 PEG 모이어티를 제거하기에 적절한 시간 동안 폴리펩타이드를 8.0 이상의 상승된 pH에 있게 하고 pH를 약 8.0 이하로 감소시키는 것을 포함하는, 라이신 잔기의 엡실론 아미노 기 또는 N-말단 아미노 기에 부착된 적어도 하나의 PEG 모이어티 및 하이드록실 기에 부착된 적어도 하나의 PEG 모이어티를 갖는 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드의 안정성 및 일정성을 증가시키기 위한 방법; 및 그 방법에 따라 제조된 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드 및 조성물 그리고 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드 및 조성물을 사용하여 환자에게서 호중구의 수준을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다..
G-CSF 폴리펩타이드, PEG화, PEG 모이어티

Description

피이지화된 지-씨에스에프 폴리펩타이드 및 그 제조방법{PEGYLATED G-CSF POLYPEPTIDES AND METHODS OF PRODUCING SAME}
본 발명은 안정성 및 일정성을 증가시키기 위하여 PEG화된(PEGylated) G-CSF 단백질로부터 불안정한 PEG 모이어티(moieties)를 제거하기 위한 방법 및 결과적인 PEG화된 G-CSF 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 PEG화된 단백질을 포함하는 약제학적 조성물 및 이 약제학적 조성물의 투여에 의한 치료방법에 관한 것이다.
단백질 또는 폴리펩타이드에 대한 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티의 공유결합("PEG화")은 예를 들면, 순환 반감기를 개선시키고 및/또는 잠재적인 에피토프(epitopes)를 차단시켜 원하지 않는 면역항원성(immunogenic) 응답의 잠재성을 감소시키기 위하여 그러한 단백질 또는 폴리펩타이드, 특히 약제학적 단백질의 특성을 개선시키기 위한 잘 알려진 기술이다. 활성화된 PEG에 기초한 많은 기술들이 단백질의 하나 이상의 기에 대한 PEG 모이어티의 부착을 제공하는데 이용가능하다. 예를 들면, mPEG-석신이미딜 프로피오네이트(mPEG-SPA, Nektar Therapeutics로부터 입수가능함)은 일반적으로 아미드 결합을 통해 N-말단 및 라이신 잔기의 엡실론-아미노 기에 대한 부착을 위해 선택적인 것으로 간주된다. 그러나, 실제적으로는 mPEG-SPA가 항상 이들 기에 독점적으로 부착하지는 않지만, 에스테르 결합을 통해 세린, 티로신 또는 트레오닌 잔기의 하이드록실 기에도 부착할 수 있다. 그 결과, 이러한 기술을 이용하여 제조된 PEG화 단백질은 충분한 정도의 일정성을 갖지 못할 수 있으며 의도한 것 이외의 다수의 다른 PEG 이성질체를 함유할 수 있다. 이것은 그러한 단백질의 특성화를 보다 복잡하게 한다는 사실을 포함하는 다양한 이유로 인하여 바람직하지 않다. 또한, 의도한 것들 이외의 기에 결합된 PEG 모이어티는 상대적으로 불안정할 수 있다. 예를 들면, mPEG-SPA와 같은 아민-특이적 PEG의 경우에 에스테르 결합을 통해 하이드록실 기에 결합된 PEG 모이어티는 N-말단 또는 라이신 잔기에 아미드 결합을 통해 결합된 모이어티들과 비교할 때 상대적으로 불안정한 경향이 있다. 제형 및 저장 조건에 따라, 이것은 이들 불안정한 PEG 기의 원하지 않는 손실을 가져오고 따라서 시간이 지남에 따라 PEG화된 단백질의 특성 변화를 잠재적으로 가져올 수 있다. 또한, 하나 이상의 PEG 모이어티가 환자에게 투여 후 몸 속에서 단백질로부터 떨어질 수 있는 위험이 있는, PEG화된 단백질 약제에 대한 잠재적인 조절성(regulatory) 또는 안정성 문제가 있을 수 있다.
본 발명은 그러한 불안정한 PEG 기가 쉽게 제거됨으로써 보다 일정하고 보다 안정한 PEG화 단백질 생성물을 가져올 수 있는 방법을 제공함으로써 그러한 문제들을 해결한다.
발명의 요약
본 발명은 일반적으로 하이드록실 기에 부착된 PEG 모이어티를 제거하기에 적절한 시간 동안 폴리펩타이드의 pH를 변화시키고, 그 후 문제의 폴리펩타이드를 장기간 저장하기에 적합한 pH로 조절하는 것을 포함하는, 라이신 잔기 또는 N-말단 에 부착된 적어도 하나의 PEG 모이어티 및 하이드록실 기에 부착된 적어도 하나의 PEG 모이어티를 갖는 PEG화 폴리펩타이드의 안정성 및 일정성을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다.
특정 양태로서, 본 발명은 하이드록실 기에 부착된 PEG 모이어티를 제거하기에 적절한 시간 동안 폴리펩타이드를 8.0 이상의 상승된 pH에 있게 하고 pH를 약 8.0 이하로 감소시키는 것을 포함하는, 라이신 잔기의 엡실론 아미노 기 또는 N-말단 아미노 기에 부착된 적어도 하나의 PEG 모이어티 및 하이드록실 기에 부착된 적어도 하나의 PEG 모이어티를 갖는 PEG화 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 폴리펩타이드의 안정성 및 일정성을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드 중간체를 제조하기 위하여 아미노-특이적 활성 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 G-CSF 폴리펩타이드를 PEG화 반응시키고, 하이드록실 기에 부착된 PEG 모이어티를 제거하기에 적절한 시간 동안 PEG화 폴리펩타이드 중간체를 적어도 9.0의 상승된 pH에 있게 하여 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드를 제조하는 것을 포함하는 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드 변종의 위치 PEG 이성질체의 균질한 혼합물을 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 여기에서 이 혼합물의 위치 PEG 모이어티 중 적어도 약 80%는 각각 라이신의 엡실론 아미노 기에 결합된 두 개의 PEG 모이어티 및 N-말단 아미노 기에 결합된 하나의 PEG 모이어티로 이루어진 PEG 모이어티를 갖는 두 개의 위치 PEG 이성질체로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 양태는 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드의 위치 PEG 이성질체의 혼합물을 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 여기에서 폴리펩타이드는 야생형 인간 G-CSF(SEQ ID NO:1)과 관련하여 치환 K16R, K34R, K40R, T105K 및 S159K를 포함하며, 폴리펩타이드의 위치 PEG 이성질체 중 적어도 약 80%는 세 개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 라이신/N-말단 위치 PEG 이성질체이다.
본 발명의 또 다른 양태는 a) 숙주세포에서 재조합 G-CSF 폴리펩타이드를 발현시키고; b) 재조합 G-CSF 폴리펩타이드를 분리하며; c) 분리된 재조합 G-CSF 폴리펩타이드를 아민-특이적 활성 PEG와 반응시켜 재조합 G-CSF 폴리펩타이드의 다수의 위치 PEG 이성질체를 제거하고; d) 다수의 위치 PEG 이성질체를 8.5-10.5의 pH에서 반응시켜 재조합 G-CSF 폴리펩타이드의 다수의 부분적으로 탈PEG화된(dePEGylated) 라이신/N-말단 위치 PEG 이성질체를 제조하는 것을 포함하는, 야생형 인간 G-CSF와 관련하여 치환 K16R, K34R, K40R, T105K 및 S159K를 포함하는 재조합 G-CSF 폴리펩타이드의 라이신/N-말단 위치 PEG 이성질체의 혼합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 여기에 기술된 방법을 사용하여 제조된 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드 뿐만 아니라 위치 PEG 이성질체 분포에 의해 특성화되는 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드 및 그러한 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 그리고 본 발명의 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드 또는 조성물을 투여함으로써 불충분한 중성구 수준으로 고통받는 환자에게서 중성구의 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 양태 및 바람직한 구현예는 하기의 설명 및 첨부된 청구범 위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 여기에 기술된 바와 같이 PEG화 되고, 부분적으로 탈-PEG화 되어 정제된 G-CSF 변종의 SDS-PAGE 분석의 스캔을 도시한 것이다.
도 2는 여기에 기술된 바와 같이 PEG화 되고 부분적으로 탈-PEG화된 G-CSF 의 SDS-PAGE 분석의 스캔을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명에 따라 제조된, 부분적으로 탈-PEG화된 생성물 풀(pool)의 양이온 교환 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 탈-PEG화를 하지않은, 정제되어 PEG화된 G-CSF 변종의 양이온 교환 크로마토그램을 도시한 것이다.
정의
본 발명 설명 및 청구범위와 관련하여 하기의 정의가 적용된다: 용어 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 어떤 특정 길이의 아미노산 서열에 제한되지 않은 아미노 산의 폴리머를 칭하는 것으로 여기에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이들 용어들은 전장(full-length) 단백질 뿐만 아니라 어떤 주어진 단백질 또는 폴리펩타이드의 예를 들면 단편 또는 잘린 형태, 변종, 도메인, 등을 포함하는 것을 의미한다.
"G-CSF" 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1에 도시된 바와 같은 인간 과립구 콜로니 자극 인자(hG-CSF)의 서열을 갖거나 G-CSF 활성을 나타내는 hG-CSF의 변종을 갖는 폴리펩타이드이다. "G-CSF 활성"은 G-CSF 수용체에 결합할 수 있는 능력일 수 있지만(Fukunaga 등, J. Bio . Chem ., 265:14008, 1990), 바람직하게는 뮤린(murine) 세포주 NFS-60 (ATCC Number: CRL-1838)를 사용하여 시험관 내 활성 검정에서 측정된. G-CSF 세포 증식 활성이다. NFS-60 세포주를 사용하는, G-CSF 활성을 위한 적절한 시험관 내 검정은 Hammerling 등의 J. Pharm . Biomed . Anal . 13(l):9-20, 1995에 기술되어 있다. G-CSF 활성을 "나타내는" 폴리펩타이드는 측정가능한 기능, 예를 들면 시험관 내 검정에서 측정가능한 증식 활성을 나타낼 때 그러한 활성을 갖는 것으로 간주된다.
"변종"은 모 폴리펩타이드와 하나 이상의 아미노산 잔기에서 다른 폴리펩타이드인데, 모 폴리펩타이드는 일반적으로 천연의 야생형 아미노산 서열을 갖는 것이고, 전형적으로는 천연의 포유류 폴리펩타이드, 보다 전형적으로는 천연의 인간 폴리펩타이드를 갖는 것이다. 따라서, 변종은 천연 폴리펩타이드와 비교할 때 하나 이상의 치환, 삽입 또는 절제를 함유한다. 이들로는 예를 들면 하나 이상의 아미노 산 잔기에 의한 N- 및/또는 C-말단의 절단(truncation), 또는 N- 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 여분의 잔기의 부가, 예를 들면 N-말단에서 메티오닌 잔기의 부가를 포함할 수 있다. 변종은 대부분 12, 10, 8 또는 6 아미노산 잔기 이하에서와 같이 모 폴리펩타이드와 15 이하의 아미노산 잔기에서 다르다.
"아민-특이적 활성화 PEG"는 N-말단 아미노 기 또는 아민 결합을 거쳐 라이신 잔기의 ε-아미노 기에 우선적으로 부착하는 어떤 활성화된 PEG 유도체이다. 아민-특이적 활성화 PEG 유도체의 예로는 하기를 포함한다:
mPEG-석신이미딜 프로피오네이트(mPEG-SPA):
Figure 112007095015247-PCT00001
mPEG-석신이미딜 부타노에이트(mPEG-SBA):
Figure 112007095015247-PCT00002
mPEG-석신이미딜 α-메틸부타노에이트(mPEG-SMB):
Figure 112007095015247-PCT00003
mPEG-SPA, mPEG-SBA 및 mPEG-SMB는 Nektar Therapeutics로부터 입수가능하다: Nektar Advanced PEGylation Catalogs 2004 및 2005-2006, "폴리에틸렌 글리콜 및 진전된 PEG화를 위한 유도체(Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation)" 참조. 다른 아민-특이적 활성화 PEG 유도체로는 SunBio Corporation으로부터 입수가능한 PEG-SS(석신이미딜 석시네이트), PEG-SG (석신이미딜 글루타레이트), PEG-NPC(p-니트로페닐 카보네이트) 및 PEG-이소시아네이트; 및 NOF Corporation 으로부터 입수가능한 PEG-SCM을 포함한다.
"불안정한" PEG 모이어티는 본 발명에서 폴리펩타이드의 하이드록실 기, 특히 에스테르 결합을 통해 세린, 티로신 또는 트레오닌 잔기의 하이드록실 기에 부착된 PEG 모이어티를 말한다. 상기에서 설명한 바와 같이, 하이드록실 기를 통한 그러한 PEG 모이어티의 부착은 불안정한 경향이 있어서, 예를 들면 그러한 모이어티들을 함유하는 폴리펩타이드가 수성 용액의 형태로 저장될 때 이 PEG 모이어티들이 에스테르 결합의 가수분해를 통해 시간이 지남에 따라 폴리펩타이드로부터 떨어지도록 한다.
여기에 사용된 바와 같이, "안정성"은 PEG 모이어티들이 시간이 지남에 따라, 예를 들면 수성용액에서 저장 중에 폴리펩타이드에 대하여 결합된 상태로 남아있는지, 또는 그들이 예를 들면 에스테르 결합 가수분해의 결과로서 떨어지는 경향이 있는지에 관계없이 폴리펩타이드에 결합된 PEG 모이어티의 부착의 안정성을 의미한다.
여기에 사용된 용어, 단백질의 "위치 PEG 이성질체"는 PEG기가 단백질의 다른 아미노산 위치에 위치된, 단백질의 다른 PEG화 형태를 의미한다. 용어, 단백질의 "라이신/N-말단 PEG 이성질체"는 PEG 기가 단백질의; 아미노-말단 및/또는 단백질에 있는 라이신 잔기의 엡실론 아미노 기에 부착되는 것을 의미한다. 예를 들면, 용어, G-CSF에 적용되는 "3개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 라이신/N-말단 위치 PEG 이성질체"는 3개의 PEG 기가 라이신 잔기의 엡실론 아미노 기 및/또는 단백질의 N-말단에 부착되는 G-CSF 위치 PEG 이성질체의 혼합물을 의미한다. 일반적으로 "3개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 라이신/N-말단 위치 PEG 이성질체"는 라이신 잔기에 부착된 두 개의 PEG 모이어티 및 N-말단에 부착된 하나의 PEG 모이어티를 갖는다. 위치 PEG 이성질체의 분석은 하기 실시예에서 기술되는 바와 같이 양이온 교환 HPLC를 사용하여 수행될 수 있다.
폴리펩타이드의 "라이신/N-말단 위치 PEG 이성질체의 실질적으로 정제된 혼합물"은 비-라이신/N-말단 위치 PEG 이성질체와 같은 불순물을 제거하기 위하여 크로마토그래피되거나 다른 정제과정을 거친 라이신/N-말단 위치 PEG 이성질체의 혼합물을 일컫는다. "라이신/N-말단 위치 PEG 이성질체의 실질적으로 정제된 혼합물"은 예를 들면, 부분적인 탈-PEG화 단계 및 여기에 기술된 바와 같은 후속 정제가 없을 때 존재하는, 하이드록실 기에 부착된 대부분의 불안정한 PEG 모이어티가 없으며 일반적으로 하이드록실 기에 부착된 불안정한 PEG 모이어티를 약 20% 이하, 보다 일반적으로는 약 15% 이하 함유하는 폴리펩타이드를 함유한다. 바람직하게는, 하이드록실 기에 부착된 불안정한 PEG 모이어티를 약 10% 이하, 예를 들면 약 5% 이하 함유하는 폴리펩타이드이다.
용어, "폴리펩타이드 변종의 위치 PEG 이성질체의 균질한 혼합물"은 여러 위치 PEG 이성질체의 폴리펩타이드 모이어티가 동일한 것을 의미한다. 이것은 혼합물의 여러 위치 PEG 이성질체가 모두 단일 폴리펩타이드 변종 서열에 기초한다는 것을 의미한다. 예를 들면, PEG화 G-CSF 폴리펩타이드 변종의 위치 PEG 이성질체의 균질한 혼합물은 혼합물의 여러 위치 PEG 이성질체가 단일 G-CSF 폴리펩타이드 변종에 기초한다는 것을 의미한다.
여기에 사용된 "일정성"은 여러 위치 이성질체의 수, 즉 여러 개의 다른 위치에 부착된 PEG 모이어티를 함유하는 여러 폴리펩타이드 이성질체의 면에서 PEG화 폴리펩타이드의 균질성 뿐만 아니라 이들 위치 이성질체들의 상대적인 분포를 일컫는다. 인간 또는 동물에서 치료용으로 의도되는 약제학적 폴리펩타이드에 있어서는 일반적으로 다른 위치 PEG 이성질체의 수가 최소화되는 것이 바람직하다.
"부분적인 탈-PEG화"는 본 발명의 방법이 하이드록실 기에 부착된 불안정한 PEG 모이어티를 제거하도록 제공되는 반면에 라이신 잔기의 아미노 기 또는 N-말단에 보다 안정하게 부착되는 PEG 모이어티가 본래의 상태로 남아있다는 사실을 일컫는다. 하기에서 설명되는 바와 같이, 탈-PEG화 공정의 진전은 특정의 상승된 pH 값 및 상승된 pH에서의 시간에 좌우된다. 따라서, 어떤 특정의 경우에 선택된 조건에 따라 폴리펩타이드의 작은 부분이 탈-PEG화 단계의 말미에서 하이드록실 기에 부착된 PEG 모이어티를 갖는 것이 가능하다. 그러나, 여기에 제공된 정보 및 단백질 분석의 분야에서의 일반적인 지식에 기초하여 본 기술에서 통상의 지식을 가진 자는 실질적으로 모든 불안정한 PEG 모이어티가 제거되고 어떤 남아있는 불안정한 PEG 모이어티가 최종 제품의 바람직한 특성을 위하여 중요하지 않게 되도록 이 공정을 적용할수 있을 것이다. 여기에 있는 "탈-PEG화"는 "부분적인 탈-PEG화"로 이해되어야 한다.
상세한 설명
상기한 바와 같이, 본 발명의 특정한 하나의 양태는 하이드록실 기에 부착된 PEG 모이어티를 제거하기에 적절한 시간 동안 폴리펩타이드를 8.0 이상의 상승된 pH에 있게 하고, 약 8.0 이하로 pH를 감소시키는 것을 포함하는, 라이신 잔기의 아미노 기 또는 N-말단 아미노 기에 부착된 적어도 하나의 PEG 모이어티 및 하이드록실 기에 부착된 적어도 하나의 PEG 모이어티를 갖는 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드의 안정성 및 일정성을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 비록 이 방법은 어떤 포유류 G-CSF 폴리펩타이드에도 적절하지만, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는, 임의적으로 N-말단에 부가된 메티오닌 잔기를 갖는 인간 G-CSF 폴리펩타이드 또는 이들의 변종이 바람직하다. G-CSF 변종의 경우에는 천연의 야생형 G-CSF 폴리펩타이드, 일반적으로는 인간 G-CSF (SEQ ID NO:1)와 비교할 때 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 N- 및/또는 C-말단의 하나 이상의 치환, 예를 들면 6, 8, 10 또는 12 치환과 같은 1-15 치환, 삽입, 절제 및/또는 절단을 가질 수 있다. 바람직한 G-CSF 변종으로는 WO 01/51510 및 WO 03/006501에 기술된 것들을 포함한다.
예를 들면, WO 03/006501에 기술된 바와 같이 hG-CSF는 위치 16, 23, 34 및 40에 네 개의 라이신 잔기를 함유하고, 라이신 잔기 또는 N-말단에 우선적으로 결합하는 활성화된 PEG를 사용하여 G-CSF를 PEG화할 때는 예를 들면, 절제 그러나 바람직하게는 치환에 의해 적어도 하나의 라이신 잔기, 예를 들면 두 개, 세 개 또는 모든 라이신 잔기들을 제거하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 방법에 사용된 G-CSF 폴리펩타이드는 K16, K23, K34 및 K40으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기 중 적어도 하나가 절제 또는 다른 아미노산 잔기로 치환된 변종일 수 있다. 일반적으로, 라이신 잔기의 제거는 치환, 일반적으로 R 또는 Q 잔기로의 치환, 바람직하게는 R 잔기로의 치환에 의한 것이다. 따라서, G-CSF 폴리펩타이드는 K16R/Q, K23R/Q, K34R/Q, K40R/Q(여기에서, 예를 들면 "K16R/Q"는 위치 16에 있는 라이신이 아르기닌 또는 글루타민 잔기로 치환되는 것을 의미한다)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나, 두 개, 세 개 또는 네 개의 치환을 가질 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩타이드가 치환 K16R+K34R+K40R을 포함하지만, 위치 23에 있는 라이신이 변하지 않은 상태로 남는 것이다.
PEG화를 원하지 않는 라이신 잔기의 제거와 함께 WO 03/006501은 PEG화를 위한 부위를 생성하기 위한 라이신 잔기의 부가도 기술하고 있다. 이들은 삽입에 의하여 부가될 수 있지만 바람직하게는 치환에 의해 부가된다. PEG화를 위한 부위를 도입하기 위해 바람직한 아미노산 치환의 예로는 Q70K, Q90K, T105K, Q120K, T133K, S159K 및 H170K 중 하나 이상, 즉 이들 치환 중 둘, 셋, 넷 및 다섯 개를 포함하는데 바람직한 치환은 T105K+S159K 이다. 바람직한 구현예에서, G-CSF 폴리펩타이드로는 치환 K16R, K34R, K40R, T105K 및 S159K를 포함한다. 특정 구현예에서, G-CSF 폴리펩타이드는 hG-CSF와 관련하여 이들 다섯 개의 치환만을 갖는다.
G- CSF 폴리펩타이드의 제조
본 발명에 따라 PEG화되는 G-CSF 폴리펩타이드는 본 기술 분야에서 공지된 적절한 방법, 예를 들면 여기에 참고로 도입된 WO 03/006501에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 그러한 방법으로는 폴리펩타이드를 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 구축하고 적절한 형질전환 또는 형질 감염 숙주에서 서열을 발현시키는 것을 포함한다. 그러나, 본 발명의 폴리펩타이드는 덜 효율적이지만 화학적 합성 또는 화학적 합성의 조합 또는 화학적 합성과 재조합 DNA 기술의 조합에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 또는 콘쥬게이트의 폴리펩타이드 부분을 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO:1에 도시된 아미노산 서열을 갖는 hG-CSF와 같은 모 G-CSF를 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 분리 또는 합성하고, 해당 아미노산 잔기(들)의 도입(즉, 삽입 또는 치환) 또는 절제(즉, 제거 또는 치환)를 이루기 위하여 뉴클레오타이드 서열을 변화시키므로서 구축될 수 있다.
뉴클레오타이드 서열은 통상의 방법에 따른 지정부위 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)에 의해 편리하게 변성될 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 서열은 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드가 소정의 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 기초하여 설계되는 올리고뉴클레오타이드 합성기를 사용하여, 그리고 바람직하게는 재조합 폴리펩타이드가 제조되는 숙주세포에 유리한 코돈들을 선택함으로써 화학적 합성에 의해 제조된다. 예를 들면, 소정의 폴리펩타이드 부분에 대하여 코딩하는 몇몇 작은 올리고뉴클레오타이드가 PCR, 리게이션(ligation) 또는 리게이션 쇄 반응(LCR)에 의해 합성 및 조합될 수 있다(Barany, PNAS 88:189-193, 1991). 개별적인 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 보충 조합을 위한 5' 및 3' 오버행(overhangs)을 함유한다. 조합(합성, 지정부위 돌연변이유발 또는 다른 방법에 의해) 되었을 때, 폴리펩타이드를 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 재조합 벡터에 삽입되어 소정의 형질전환 숙주세포에서 G-CSF의 발현을 위해 필요한 대조 서열에 동작가능하게 결합된다.
본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자들은 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 적절한 벡터, 발현 대조 서열 및 숙주들을 선택할 수 있다. 재조합 벡터는 독립적으로 복제하는 벡터, 즉, 염색체 외 실재(extrachromosomal entity)로서 존재하며 그 복제가 염색체 복제와는 독립적인 벡터, 예를 들면 플라즈미드일 수 있다. 선택적으로, 벡터는 숙주세포로 도입되었을 때 숙주세포 게놈에 통합되어, 통합된 염색체(들)과 함께 복제되는 것이다.
벡터는 본 발명의 폴리펩타이드를 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 뉴클레오타이드 서열의 전사를 위해 요구되는 추가의 세그먼트에 동작가능하게 결합되는 발현벡터인 것이 바람직하다. 벡터는 일반적으로 플라즈미드 또는 바이러스성 DNA로부터 유도된다. 여기에 기술된 숙주세포에서 발현을 위한 다수의 적절한 발현 벡터는 상업적으로 입수가능 하거나 문헌에 기술되어 있다. G-CSF를 발현시키기 위해 적절한 벡터에 대한 상세한 정보는 WO 03/006501에서 발견될 수 있다.
용어 "대조 서열은 여기에서 본 발명의 폴리펩타이드의 발현을 위해 필요하거나 유리한 모든 성분들을 포함하는 것으로 정의된다. 각 대조 서열들은 천연이거나 폴리펩타이드를 엔코딩하는 핵산 서열에 외래일 수 있다. 그러한 대조 서열은 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로펩타이드 서열, 프로모터, 강화제 또는 업스트림 활성화 서열, 신호 펩타이드 서열, 합성 인트론(intron) 및전사 종료제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 최소한 대조서열은 프로모터를 포함한다. 광범위한 발현 대조서열, 예를 들면 WO 03/006501에 기술된 대조서열이 본 발명에 사용될 수 있다.
지정부위 돌연변이 유발, 합성, PCR 또는 다른 방법에 의해 제조되는지에 상관없이 G-CSF 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 엔코딩하는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 임의적으로 신호 펩타이드를 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열도 포함할 수 있다. 신호 펩타이드는 발현되는 세포로부터 폴리펩타이드가 분비될 때 존재한다. 그러한 신호 펩타이드는 존재할 경우 폴리펩타이드의 발현을 위해 선택된 세포에 의해 인식되는 것이어야 한다. 신호 펩타이드는 폴리펩타이드에 동종(예를 들면, 일반적으로 hG-CSF와 관련된) 또는 이종(즉, hG-CSF 이외에 다른 원으로부터 발생하는)이거나 숙주세포에 동종 또는 이종일 수 있는데, 즉, 일반적으로 숙주세포로부터 발현된 신호 펩타이드 또는 일반적으로 숙주세포로부터 발현되지 않은 것일 수 있다. 따라서, 신호 펩타이드는 예를 들면, E. coli와 같이 박테리아로부터 유도된 원핵(prokaryotic) 또는 예를 들면, 포유류 또는 곤충 또는 효모 세포로부터 유도된 진핵(eukaryotic)일 수 있다. 적절한 신호 펩타이드에 대한 추가적인 정보를 위해서는 WO 03/006501을 참조할 수 있다.
박테리아(비록 특히 바람직하지는 않지만), 균류(효모 포함), 식물, 곤충, 포유동물 또는 다른 적절한 동물 세포 또는 세포주 뿐만 아니라 형질전환 동물 또는 식물을 포함하는 어떤 적절한 숙주도 G-CSF 폴리펩타이드를 제조하는데 사용될 수 있다. 포유동물 세포가 바람직하다. 박테리아 숙주 세포의 예로는 Bacillus의 스트레인, 예를 들면, B. brevis 또는 B. subtilis, Pseudomonas 또는Streptomyces와 같은 그램-양성 박테리아 또는 E. coli의 스트레인과 같은 그램-음성 박테리아를 포함한다. 적절한 섬유상 균류 숙주 세포의 예로는 Aspergillus의 스트레인, 예를 들면, A. oryzae , A. niger, 또는 A. nidulans, Fusarium 또는 Trichoderma를 포함한다. 적절한 효모 숙주세포의 예로는 Saccharomyces의 스트레인, 예를 들면 S. cerevisiae , Schizosaccharomyces , Klyveromyces, P. pastoris 또는 P. methanolica와 같은 Pichia, H. Polymorpha 또는 Yarrowia와 같은 Hansenula를 포함한다. 적절한 곤충 숙주세포의 예로는 Spodoptera frugiperda(Sf 9 또는 Sf21) 또는 Trichoplusioa ni 세포 (High Five)와 같은 Lepidoptora 세포주를 포함한다(US 5,077,214). 적절한 포유동물 숙주 세포의 예로는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주, (예를 들면, CHO-Kl; ATCC CCL-61), 사바나 원숭이 세포주(COS) (예를 들면, COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)); 마우스 세포 (예를 들면, NS/O), 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포주 (예를 들면, ATCC CRL- 1632 또는 ATCC CCL-10) 및 인간 세포(예를 들면, HEK 293 (ATCC CRL-1573))를 포함한다. 추가적인 적절한 세포주는 본 기술분야에서 공지되어 있으며 메릴랜드, 록빌의 American Type Culture Collection과 같은 공공의 기탁기관으로부터 입수가능하다.
본 발명의 제조방법에서, 세포는 본 기술분야에서 알려진 방법을 사용하여 폴리펩타이드의 제조를 위해 적절한 영양배지에서 배양된다.
예를 들면, 세포는 실험실 또는 폴리펩타이드가 발현 및/또는 분리되도록 하는 적절한 배지 및 조건하에서 수행된 공업용 발효기에서 진동 플라스크 배양, 소규모 또는 대규모 발효(연속, 배치, 유가(fed-batch) 또는 고상 발효를 포함하여)에 의해 배양될 수 있다. 배양은 본 기술분야에서 공지된 과정을 사용하여 탄소 및 질소 원 및 무기염을 포함하는 적절한 영양 배지에서 이루어진다. 적절한 배지는 상업적 공급자로부터 입수가능하거나 공개된 조성(예를 들면, American Type Culture Collection의 카탈로그에 있는)에 따라 제조될 수 있다. 폴리펩타이드가 영양배지에 분비되면 폴리펩타이드는 배지로부터 직접 회수될 수 있다. 폴리펩타이드가 분비되지 않으면 세포융해체로부터 회수될 수 있다.
결과적인 폴리펩타이드는 본 기술분야에서 공지된 방법에 의해 회수될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드는 제한되지는 않지만, 원심분리, 여과, 추출, 스프레이 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 통상적인 방법에 의해 영양 배지로부터 회수될 수 있다.
폴리펩타이드는 제한되지는 않지만, 크로마토그래피(예를 들면, 이온교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱 및 크기별 배제), 전기영동 과정(예를 들면, 제조용 등전 집중), 시차 용해도(예를 들면, 암모늄 설페이트 침전), SDS- PAGE 또는 추출(예를 들면, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989 참조)을 포함하는, 본 기술분야에서 공지된 다양한 과정에 의해 회수될 수 있다. G-CSF 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 정제하기 위한 특정 방법은 D. Metcalf 및 N. A. Nicola에 의한 The hemopoietic colony- stimulating factors, p. 50-51, Cambridge University Press (1995), C. S. Bae, 등에 의한 Appl. Microbiol. Biotechnol, 52:338-344 (1999) 및 US 4,810,643에 기술되어 있다.
PEG 화( PEGylation )
정제된 G-CSF 폴리펩타이드는 이후 본 기술 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 PEG화 될 수 있다. 예를 들면, G-CSF 폴리펩타이드는 아민-특이적 활성화 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 PEG화 될 수 있다.
아민-특이적 활성화 PEG는 상기한 것들 중 어떤 것, 예를 들면, mPEG-석신이미딜 프로피오네이트(mPEG-SPA), mPEG-석신이미딜 부타노에이트(mPEG-SBA) 또는 mPEG-석신이미딜 α-메틸부타노에이트(mPEG-SMB)일 수 있다. PEG 모이어티의 분자량은 예를 들면, 폴리펩타이드에 부착될 PEG 모이어티의 수에 기초하여 선택될 수 있는데 약 1 kDa-약 12 kDa, 예를 들면 약 2 kDa-약 10 kDa, 바람직하게는 약 4 kDa-약 6 kDa, 보다 바람직하게는 약 5 kDa인 약 1-20 kDa의 범위이다. 예를 들면, 활성화된 PEG는 약 5 kDa의 분자량을 갖는 mPEG-SPA일 수 있다. PEG화는 예를 들면, 약 7.5-9.0, 예를 들면 약 8.0-8.5의 pH에서 수행될 수 있다. 여기에서 약 PEG 모이어티라는 용어가 사용될 때 "약"은 대략적인 평균 분자량을 나타내고 일반적으로 주어진 폴리머 제조에서 특정 분자량 분포가 있다는 사실을 반영한다. PEG화 방법에 대한 추가적인 일반적인 정보는 Nektar Advanced PEGylation Catalogs 2004 및 2005-2006 뿐만 아니라 거기에 인용된 참고자료들을 참조할 수 있다. G-CSF 폴리펩타이드를 위한 PEG화 방법의 보다 상세한 설명은 WO 03/006501에도 제공되어 있다.
부분적인 탈- PEG 화
탈-PEG화 단계를 위한 상승된 pH의 선택은 탈-PEG화 단계가 발생하는 온도, 탈-PEG화 단계의 기간 및 PEG화가 수행되는 pH를 포함하는, PEG화를 위해 사용된 조건과 같은 요인에 기초한다. 일반적으로, 탈-PEG화 중에 보다 높은 pH가 사용되면 보다 빠른 탈-PEG화가 발생한다. 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 pH, 시간 및 온도와 같은 탈-PEG화 조건이 어떤 주어진 상황에서 바람직한 결과를 얻기 위하여 서로 조절될 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들면, 8-9 사이의 상대적으로 낮은 상승된 pH를 사용하는 것이 가능하지만, 9-10 같은 9-11 사이의 더 높은 pH를 사용하면 보다 빠른 탈-PEG화를 가져온다. 일반적으로, 상승된 pH는 약8.5-11.0, 바람직하게는 약 8.5-10.5, 보다 바람직하게는 약 9.0-10.0의 범위이다. 상승된 pH는 예를 들면 약 9.2-9.8의 범위, 예를 들면 약 9.5이다.
일반적으로, 탈-PEG화 단계는 PEG화의 바로 직후에 발생하는데 이는 이것이 일반적으로 가장 효율적이고 보다 짧은 공정 시간 및 보다 높은 수율을 가져오기 때문이다. 이 기본적인 형태에서, 본 발명은 PEG화 벌크 중간체의 부분적인 탈-PEG화에 이은 예를 들면 하기한 크로마토그래피 정제를 사용하는 통상적인 분리로 특징된다. 그러나, 어떤 이유이든지 원할 경우 PEG화 과정에 이어서 탈-PEG화 전에 중간 정제단계가 이어질 수 있다. 중간 정제단계는 예를 들면, 하기한 바와 같은 크로마토그래피 정제에 이은 한외여과(ultrafiltration) 및/또는 정용여과(diafiltration)를 포함할 수 있다. 그러한 중간 정제 과정으로부터 얻어진 중간 생성물은 원할 경우 탈-PEG화 및 어떤 후속 정제 단계 전에 저장될 수 있다. 이 경우에 중간 PEG화 생성물은 예를 들면 본 기술 분야에서 공지된 방법을 사용하여 동결 및 동결건조로 저장될 수 있다.
탈-PEG화는 문제의 폴리펩타이드를 위해 적절한 어떤 온도, 예를 들면 약 5℃-약 40℃, 바람직하게는 약 10℃-35℃에서 수행될 수 있다. 탈-PEG화는 종종 약 15℃-25℃, 예를 들면 약 20℃-22℃의 상온에서 수행될 수 있다.
상기에서 설명한 바와 같이 , 소정의 결과를 얻기 위한, 상승된 pH에서 탈-PEG화 단계의 시간은 pH 및 온도와 같은 다른 요인에 좌우되지만, 일반적으로는 약 2-100 시간, 바람직하게는 약 4-72시간, 보다 바람직하게는 약 8-48시간의 범위이다. 일반적으로 가능한한 짧은 시간에서 탈-PEG화 단계를 수행하는 것이 바람직하기 때문에 폴리펩타이드는 약 24시간 이하, 바람직하게는 약 12-30시간, 보다 바람직하게는 18-24시간 동안 상승된 pH에 있게 된다. 상기한 바와 같이, 상승된 pH에서 상대적으로 짧은 탈-PEG화 시간은 일반적으로 상대적으로 높은 pH, 예를 들면 약 9-10에 의해 수반된다.
상승된 pH에서 탈-PEG화에 이어서 pH는 약 8.0 이하로 감소되는데, 폴리펩타이드를 위해 의도된 저장 조건에 따라 특정 pH가 선택된다. G-CSF에 있어서, 장기간 저장을 위해 적절한 pH는 약 2.0-5.0, 바람직하게는 약 2.5-4.5, 보다 바람직하게는 약 4.0이다. 어떤 경우에는 예를 들면, 사용될 특정 제형에 따라 약 5.0-8.0, 바람직하게는 약 6.0-7.5, 보다 바람직하게는 약 7.0-7.5와 같이 약간 더 높은 pH가 선택될 수 있다. G-CSF의 다양한 약제학적 제형은 예를 들면 US 5,104,651, US 5,919,757, US 6,497,869 및 US 6,776,983에 기술되어 있다.
본 발명의 맥락에서 pH의 조정을 위해 어떤 적절한 산 또는 염기, 예를 들면 유기 또는 무기산 및 염기가 사용될 수 있다. 마찬가지로, 어떤 적절한 완충제가 소정의 수준으로 pH를 유지하기 위해 사용될 수 있다. 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 예를 들면, 문제의 폴리펩타이드 및 소정의 pH에 따라 어떤 주어진 상황에서 사용하기에 적절한 산, 염기 및 완충제를 잘 알 것이다.
pH의 감소에 이어서, 폴리펩타이드는 일반적으로 소정 수의 부착된 PEG 기를 갖는 폴리펩타이드를 분리하기 위하여 적어도 하나의 크로마토그래피 정제 단계, 예를 들면 이온 교환 크로마토그래피 또는 겔 여과 크로마토그래피를 하게 된다. 크로마토그래피 정제는 본 기술 분야에서 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 탈-PEG화에 이은 감소된 pH가 약 7.0 이하일 경우 양이온 교환 크로마토그래피가 사용될 수 있다. 선택적으로 또는 추가적으로, 상승된 pH 값에서 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 pH의 감소 전에 크로마토그래피가 수행될 수 있다. 추가적인 정제뿐만 아니라 생성물의 어떤 소정의 분석은 본 기술분야에서 공지된 표준 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 크로마토그래피 정제단계에 이은 추가적인 정제가 예를 들면, 한외여과 또는 정용여과를 사용하여 수행될 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 또 다른 양태는 G-CSF 폴리펩타이드를 아민-특이적인 활성화 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 PEG화 하고, 후속하여 하이드록시 기에 부착된 PEG 모이어티를 제거하기에 적절한 시간 동안 적어도 약 9.0의 상승된 pH를 PEG화 폴리펩타이드에 가하는 것을 포함하는, PEG화된 G-CSF 폴리펩타이드를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 이 방법은 라이신 잔기의 엡실론 아미노 기 또는 N-말단 아미노 기에 부착된 적어도 하나의 PEG 모이어티를 가지며 실질적으로 하이드록실 기에 부착된 PEG 모이어티가 없는 PEG화된 G-CSF 폴리펩타이드를 가져온다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 이 양태는 약 7.0-9.0의 pH에서 PEG화를 사용하여 수행되고, 그 후 pH는 불안정한 PEG 모이어티를 제거하기 위하여 증가된다. 또 다른 구현예에서, PEG화는 9.0 이상의 보다 높은 pH, 바람직하게는 9-11의 범위, 보다 바람직하게는 약 9.2-10.0, 가장 바람직하게는 약 9.5에서 수행될 수 있다. 이 경우에, PEG화 및 탈-PEG화는 하이드록실 기에 대한 PEG 모이어티의 바람직하지 않은 결합을 피하면서 N-말단 및 라이신 잔기에서 소정의 PEG화를 가져오기에 충분한 시간동안 단일 pH 값에서 단일 단계로서 수행될 수 있다.
아민-특이적 활성화 PEG는 상기한 것들 중 어떤 것일 수 있는데, 예를 들면, mPEG-석신이미딜 프로피오네이트(mPEG-SPA), mPEG-석신이미딜 부타노에이트(mPEG-SBA) 또는 mPEG-석신이미딜 α-메틸부타노에이트(mPEG-SMB)일 수 있다. PEG 모이어티의 분자량도 상기한 바와 같을 수 있는데 예를 들면, 약 1-20 kDa, 예를 들면, 약 1-12 kDa, 바람직하게는 약 2-10 kDa, 보다 바람직하게는 약 4-6 kDa, 가장 바람직하게는 약 5 kDa의 범위이다. 예를 들면, 활성화된 PEG는 약 5 kDa의 분자량을 갖는 mPEG-SPA일 수 있다. PEG화는 예를 들면 약 7.5-9.0, 예를 들면 약 8.0-8.5의 pH에서 수행될 수 있다. PEG화 중에 사용된 pH에 따라서, 선택된 상승 pH도 일반적으로 상기한 범위와 유사할 수 있는데 예를 들면, 약 9.2 - 11.0, 바람직하게는 9.2 - 10.0의 범위일 수 있다. 마찬가지로, 상승된 pH에서의 시간도 상기한 바와 같이 선택될 수 있고, 이러한 것은 후속 정제, 등에도 적용된다.
여기에 기술된 방법은 제한된 시간 동안 변화된 pH의 단일의 여분 단계만이 요구되므로 단순하고 빠르며, 주어진 제조공정에 사용되는 PEG 또는 정제과정을 변화시킬 필요가 없는 사실을 포함하여, 일정하고 안정한 PEG화 단백질의 제조에서 목표로하는 제조공정을 위한 다수의 이점을 제공한다. 이러한 이유로 인하여, 불안정한 PEG 기를 제거하기에 충분한 시간동안 변화된 pH의 동일한 일반적인 과정은 어떤 PEG화 단백질의 제조에도 사용될 수 있다. 일반적으로, 하이드록실 기에 부착된 불안정한 PEG 모이어티를 제거하기 위해서는 염기성 또는 산성 pH가 사용될 수 있으며, 불안정한 PEG 모이어티의 탈착은 pH가 보다 산성(산성 pH) 또는 보다 염기성(염기성 pH)일 때 보다 빠르게 발생한다. 불안정한 PEG 탈착을 얻기 위한 조건의 선택은 예를 들면, PEG 모이어티의 부착 부위의 미소환경을 포함하는, 특정 단백질의 구조적 특징에 기초한다.
PEG 화 G- CSF 폴리펩타이드
상기한 바와 같이, 본 발명의 방법은 여러 위치 PEG 이성질체의 수의 면에서 PEG화 폴리펩타이드의 증가된 균질성을 가져오는 이점이 있다. 부착 기의 수 및 사용되는 특정 PEG화 케미스트리에 따라서, 본 발명 방법은 저장중에 가능한 것보다 더 일정하고 더 안정한 PEG화 G- CSF의 분리를 허용한다. 예를 들면, 야생형 인간 G- CSF와 관련하여 치환 K16R, K34R, K40R, T105K 및 S159K를 갖는 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드에 있어서, 폴리펩타이드의 위치 PEG 이성질체의 적어도 약 90-95%가 3개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 생성물을 얻을 수 있다는 것이 발견되었다.
본 발명의 또 다른 구현예는 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드 변종의 위치 PEG 이성질체의 균질한 혼합물을 포함하는 조성물에 관한 것으로서 여기에서, 혼합물의 위치 PEG 이성질체의 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%, 예를 들면 적어도 약 95%가 라이신 잔기의 엡실론 아미노 기에 결합된 두 개의 PEG 모이어티 및 N-말단 아미노 기에 결합된 하나의 PEG 모이어티로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 구현예는 야생형 인간 G-CSF와 관련하여 치환 K16R, K34R, K40R, T105K 및 S159K를 포함하는 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드에 관한 것으로서 여기에서, 폴리펩타이드의 위치 PEG 이성질체의 적어도 약 80%가 3개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는다. 일반적으로, 3개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 위치 PEG 이성질체의 비율은 80% 이상, 바람직하게는 적어도 약 85% 또는 적어도 약 90%이고, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94% 또는 적어도 약 95%와 같이 더 높을 수도 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 야생형 인간 G-CSF와 관련하여 치환 K16R, K34R, K40R, T105K 및 S159K 만을 함유하는 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드에 관한 것으로서 여기에서, 폴리펩타이드의 위치 PEG 이성질체의 적어도 약 80%는 3개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는다. 일반적으로, 3개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 위치 PEG 이성질체의 비율은 80% 이상, 바람직하게는 적어도 약 85% 또는 적어도 약 90%이고, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94% 또는 적어도 약 95%와 같이 더 높을 수도 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 야생형 인간 G-CSF와 관련하여 치환 Kl6R, K34R, K40R, T105K 및 S159K를 포함하는 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드의 혼합물을 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 여기에서 혼합물에 있는 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드의 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%가 각각 세 개의 PEG 기를 함유하는 두 개의 위치 PEG G-CSF 이성질체로 이루어지고, 이성질체 중 하나는 N-말단, Lys23 및 Lysl59P에서 부착된 PEG 기를 가지며, 다른 이성질체는 N-말단, LyslO5 및 Lysl59에서 부착된 PEG 기를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 야생형 인간 G-CSF와 관련하여 치환 Kl6R, K34R, K40R, T105K 및 S159K를 함유하는 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드의 혼합물을 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 여기에서 혼합물에 있는 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드의 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%가 각각 세 개의 PEG 기를 함유하는 두 개의 위치 PEG G-CSF 이성질체로 이루어지고, 이성질체 중 하나는 N-말단, Lys23 및 Lysl59에서 부착된 PEG 기를 가지며, 다른 이성질체는 N-말단, LyslO5 및 Lysl59에서 부착된 PEG 기를 갖는다.
본 발명에 따라 제조된 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드는 그들의 PEG화 정도에 대하여 고도의 저장 안정성을 갖는다. 하기 실시예에서 도시된 바와 같이, 그러한 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드의 수성 제형은 크게 변하지 않는 PEG화 패턴과 함께 연장된 기간동안 저장될 수 있다. 이것은 특히 조성물이 5℃의 온도에서 저장되는 경우였지만, 놀랍게도 조성물이 25℃ 또는 35℃의 높은 온도에서 저장될 때 조차도 상대적으로 안정한 것으로 발견되었다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 야생형 인간 G-CSF와 관련하여 치환 Kl6R, K34R, K40R, T105K 및 S159K를 포함하는 저장 안정성의 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 폴리펩타이드의 위치 PEG 이성질체의 적어도 약 80%는 5℃의 온도에서 3달 동안 수성 참고 조성물에서 저장 후에 3개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는다. 일반적으로, 5℃의 온도에서 3달 동안 저장 후에 3개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 위치 PEG 이성질체의 비율은 적어도 약 85% 또는 적어도 약 90%와 같이, 80% 이상이다. 어떤 경우에, 이러한 비율은 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94% 또는 적어도 약 95%와 같이 더 높을 수도 있다. 본 발명에 따라서 제조된 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드의 안정성을 측정하기 위한 목적으로서, 안정성은 실시예 4에 기술된 바와 같이 예를 들면, 기준 조성으로서 거기에 기술된 제형 A, B, C 또는 D 중 하나, 특히 제형 D를 사용하여 테스트할 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 하나의 구현예는 약제학적으로 수용가능한 캐리어 및 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에 관한 것으로서 여기에서, 폴리펩타이드는 야생형 인간 G-CSF와 관련하여 치환 Kl6R, K34R, K40R, T105K 및 S159K(SEQ ID NO:1)를 포함하고, 폴리펩타이드의 위치 PEG 이성질체의 적어도 약 80%는 3개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는다. 일반적으로, 3개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 위치 PEG 이성질체의 비율은 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%이고, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94% 또는 적어도 약 95%와 같이 더 높을 수도 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 약제학적으로 수용가능한 캐리어 및 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것으로서 여기에서, 폴리펩타이드는 야생형 인간 G-CSF(SEQ ID NO:1)와 관련하여 치환 K16R, K34R, K40R, T105K 및 S159K 만을 함유하고, 폴리펩타이드의 위치 PEG 이성질체의 적어도 약 80%는 3개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는다. 일반적으로, 3개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 위치 PEG 이성질체의 비율은 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%이고, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94% 또는 적어도 약 95%와 같이 더 높을 수도 있다.
본 발명의 구현예는 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드 변종의 위치 PEG 이성질체의 균질한 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것으로서 여기에서, 혼합물의 위치 PEG 이성질체의 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%, 예를 들면 적어도 약 95%가 라이신 잔기의 엡실론 아미노 기에 결합된 두 개의 PEG 모이어티 및 N-말단 아미노 기에 결합된 하나의 PEG 모이어티로 이루어진다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 약제학적으로 수용가능한 캐리어 및 야생형 인간 G-CSF와 관련하여 치환 Kl6R, K34R, K40R, T105K 및 S159K를 포함하는 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드의 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것으로서, 여기에서 혼합물에 있는 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드의 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%가 각각 세 개의 PEG 기를 함유하는 두 개의 위치 PEG G-CSF로 이루어지고, 이성질체 중 하나는 N-말단, Lys23 및 Lysl59에서 부착된 PEG 기를 가지며, 다른 이성질체는 N-말단, LyslO5 및 Lysl59에서 부착된 PEG 기를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 약제학적으로 수용가능한 캐리어 및 야생형 인간 G-CSF와 관련하여 오직 치환 Kl6R, K34R, K40R, T105K 및 S159K를 함유하는 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드의 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것으로서, 여기에서 혼합물에 있는 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드의 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%가 각각 세 개의 PEG 기를 함유하는 두 개의 위치 PEG G-CSF로 이루어지고, 이성질체 중 하나는 N-말단, Lys23 및 Lysl59에서 부착된 PEG 기를 가지며, 다른 이성질체는 N-말단, LyslO5 및 Lysl59에서 부착된 PEG 기를 갖는다.
본 발명의 G-CSF 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 일반적으로 수성 제형으로서 다양한 형태로, 예를 들면 동결건조 형태 또는 바람직하게는 안정한 액체 제형으로 제형화될 수 있다. 그러한 조성물은 일반적으로 완충제, 보존제, 아이소토닉화제(isotonicifiers), 안정제, 비-이온성 계면활성제 또는 세정제 및 벌크제 또는 충전제, 킬레이트화제, 산화방지제 및 공동용매와 같은 추가적인 미량 보조제로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함한다. G-CSF에 대한 적절한 제형의 하나의 예로는 0.6 ml 당 0.35 mg 아세테이트, 30.0 mg 솔비톨, 0.02 mg 폴리소르베이트 20 및 0.02 mg 소듐을 함유하는 4.0의 pH로 수용액에 공급되는 Neulasta®(페그필그래스팀(pegfilgrastim))에 대해 사용된 것이다.
약제학적 조성물의 예는 경구 투여용으로 설계된 용액이다. 많은 경우에서 약제학적 용액 제형은 즉시 사용을 위해 적절한 액체형태로 제공되지만, 그러한 경구용 제형은 동결 또는 동결건조된 형태로도 제공될 수 있다. 전자의 경우에 조성물은 사용 전에 해동시켜야만 된다. 동결건조된 제제는 일반적으로 액체형태보다 안정하다는 것이 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해서 인정되므로, 후자의 형태는 보다 다양한 저장조건 하에서 조성물에 함유된 활성 화합물의 안정성을 강화하는데 사용된다. 그러한 동결건조된 제제는 주사용 증류수 또는 무균 생리 식염수 용액과 같은 하나 이상의 적절한 약제학적으로 수용가능한 희석제를 첨가하여 사용 전에 재구성된다. 그러나, 본 발명의 조성물은 수성용액의 형태가 바람직하다.
비 경구용의 경우에는, 본 기술에서 일반적으로 사용되는 하나 이상의 약제학적으로 수용가능한 캐리어, 부형제 또는 안정제(이들 모두를 부형제라 할 수 있다), 예를 들면 완충제, 안정제, 보존제, 아이소토닉화제, 비-이온성 세정제, 산화방지제 및/또는 다른 첨가제와 원하는 정도의 순도를 갖는 폴리펩타이드를 적절하게 혼합함으로써 수성 용액 또는 동결건조 제형으로 저장을 위해 제조될 수 있다.
완충제는 pH를 소정의 범위로 유지하는 것을 돕는다. 이들은 일반적으로 약 2 mM -약 50 mM 범위의 농도로 존재한다. 적절한 완충제로는 시트레이트 완충제(예를 들면, 모노소듐 시트레이트-디소듐 시트레이트 혼합물, 시트릭 산-트리소듐 시트레이트 혼합물, 시트릭 산-모노소듐 시트레이트 혼합물, 등), 석시네이트 완충제(예를 들면, 석신 산-모노소듐 석시네이트 혼합물, 석신산-소듐 하이드록사이드 혼합물, 석신산-디소듐 석시네이트 혼합물, 등), 타르트레이트 완충제(예를 들면, 타르타르산-소듐 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-포타슘 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-소듐 하이드록사이드 혼합물, 등), 푸마레이트 완충제(예를 들면, 푸마르산-모노소듐 푸마레이트 혼합물, 푸마르산-디소듐 푸마레이트 혼합물, 모노소듐 푸마레이트-디소듐 푸마레이트 혼합물, 등), 글루코네이트 완충제(예를 들면, 글루콘산-소듐 글리코네이트 혼합물, 글루콘산-소듐 하이드록사이드 혼합물, 글루콘산-포타슘 글루코네이트 혼합물, 등), 옥살레이트 완충액(예를 들면, 옥살산-소듐 옥살레이트 혼합물, 옥살산-소듐 하이드록사이드 혼합물, 옥살산-포타슘 옥살레이트 혼합물, 등), 락테이트 완충제(예를 들면, 락트산-소듐 락테이트 혼합물, 락트산-소듐 하이드록사이드 혼합물, 락트산-포타슘 락테이트 혼합물, 등) 및 아세테이트 완충제(예를 들면, 아세트산-소듐 아세테이트 혼합물, 아세트산-소듐 하이드록사이드 혼합물, 등)과 같은 유기 및 무기산 및 이들의 염을 포함할 수 있다. 추가적인 가능성은 포스페이트 완충제, 히스티딘 완충제 및 Tris와 같은 트리메틸아민 염이다.
보존제는 미생물 성장을 지연시키기 위하여 첨가되는데, 존재할 경우 일반적으로 약 0.2%-l% (w/v)의 양으로 첨가된다. 적절한 보존제로는 페놀, 벤질 알콜, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤즈알코늄 할라이드(예를 들면, 벤즈알코늄 클로라이드, 브로마이드 또는 아이오다이드), 헥사메토늄 클로라이드, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 사이클로헥사놀 및 3-펜타놀을 포함한다.
아이소토닉화제는 액체 조성물의 아이소토닉성을 보장하기 위하여 첨가되는데 글리세린, 에리스리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨과 같은 폴리하이드릭 당 알콜, 바람직하게는 트리하이드릭 또는 더 높은 당 알콜을 포함한다. 폴리하이드릭 알콜은 다른 성분들의 상대적인 양을 고려하여 0.1wt% - 25wt%, 바람직하게는 1-5wt%의 양으로 존재할 수 있다.
안정제는 벌크제에서 치료제를 용해하거나 변성 또는 용기 벽에 대한 점착을 방지하는데 도움을 주는 첨가제까지 작용하는 범위의 넓은 카테고리의 부형제를 일컫는다. 일반적인 안정제는 폴리하이드릭 당 알콜(상기 열거한); 이노시톨과 같은 사이클리톨을 포함하여, 아르기닌, 라이신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오미딘(Omithine), L-류신, 2-페닐알라닌, 글루타민 산, 트레오닌, 등과 같은 아미노산, 락토즈, 트레할로즈, 스타키오스, 만니톨, 솔비톨, 자일리톨, 리비톨, 마이오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤, 등과 같은 유기 당 또는 당 알콜; 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 폴리머; 우레아, 글루타치온, 치옥트산, 소듐 티오글리콜레이트, 티오글레세롤, α-모노티오글리세롤 및 소듐 티오설페이트와 같은 황 함유 환원제; 저분자량 폴리펩타이드(즉, <10 잔기); 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로블린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 자일로스, 만노오즈, 프럭토오즈 및 글루코오스와 같은 모노사카라이드; 락토오즈, 말토오즈, 및 슈크로오즈와 같은 디사카라이드; 라피노오즈와 같은 트리사카라이드 및 덱스트란과 같은 폴리사카라이드일 수 있다. 안정제는 예를 들면, 활성 단백질 중량에 따라 0.1 - 10,000 중량부의 범위로 존재할 수 있다.
비-이온성 계면활성제 또는 세정제("습윤제"로도 알려진)는 치료제를 용해하는 것을 도울 뿐만 아니라 제형이 폴리펩타이드의 변성을 야기하지 않고 전단 표면 스트레스에 노출되게 하는, 교반-유도 응집에 대하여 치료 펩타이드를 보호하기 위하여 존재할 수 있다. 적절한 비-이온성 계면활성제로는 폴리소르베이트(20, 80, 등), 폴리옥사머(184, 188, 등), Pluronic® 폴리올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르(Tween®-20, Tween®-80, 등)를 포함한다.
첨가될 수 있는 추가적인 기타 부형제로는 벌크제 또는 충전제(예를 들면, 전분), 킬레이트화제(예를 들면, EDTA), 산화방지제(예를 들면, 아스코르빈 산, 메티오닌, 비타민 E) 및 공동 용매를 포함한다.
활성성분들은 예를 들면, 코아세르베이션 기술(coascervation techniques) 또는 계면중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면 하이드록시메틸셀루로오즈, 젤라틴 또는 폴리-(메틸메타크릴레이트)마이크로캡슐, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포좀, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼에 포집될 수 있다.
생체 내 투여를 위해 사용될 비경구용 제형은 무균이어야 한다. 이것은 본 기술에서 잘 알려진 방법, 예를 들면, 무균 여과막을 통한 여과로 쉽게 수행된다.
치료방법
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드를 사용하는 치료방법 및 약물을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 백혈구 감소증(감소된 수준의 백혈 세포) 및 호중구 감소증(감소된 수준의 호중구)은 다양한 형태의 감염에 대하여 증가된 감수성(susceptibility)을 가져오는 장애이다. 호중구 감소증은 예를 들면 HIV에 감염된 환자에게는 만성이고 또는 화학요법 또는 방사선 요법을 받는 암 환자에게는 급성일 수 있다. 예를 들면, 화학요법의 결과로서 심한 호중구 감소증을 갖는 환자에게 있어서는 상대적으로 적은 감염조차도 심각할 수 있으며, 호중구 감소증은 종종 화학요법 프로토콜의 중단이 요구된다. 본 발명의 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드는 특정형태의 화학요법, 방사선 요법 및 골수 이식을 받는 암 환자에서의 감염 예방 또는 치료, 말초 혈액 모세포 이식에서 수집을 위한 모세포의 이동, 심한 만성 또는 관련 백혈구 감소증의 치료, 급성 골수성 백혈병을 갖는 환자의 치료, AIDS 또는 다른 면역결핍 질병의 치료 및 항균 요법, 특히 계통성 또는 침습성 칸디다증의 치료에 특히 적합하다. 본 발명의 목적을 위한 "환자"로는 본 발명의 치료방법이 기본적으로 인간 환자를 목표로 하고 있지만 인간 및 다른 포유동물 모두를 포함한다.
따라서, 본 발명의 이러한 양태는 효과적인 양의 상기한 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 상기한 약제학적 조성물을 불충분한 호중구 수준에 있거나 그로부터 고통받는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기한 환자에게서 호중구의 수준을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 양태의 한 구현예에서, 불충분한 호중구 수준의 위험에 있거나 그로부터 고통받는 환자는 특히 화학요법 또는 방사선 요법, 특히 화학요법으로 치료받는 암 환자이다.
본 발명의 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드는 유방암, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 결장 직장 암, 자궁암, 난소암, 비 호지킨 림프종 (NHL) 및 호지킨 질환을 포함하는 다양한 여러 형태의 암으로 고통받는 환자에게서 호중구의 생성을 자극하기에 유용하도록 시도된다. 마찬가지로, 본 발명의 폴리펩타이드는 하기를 포함하는 다양한 여러 형태의 화학치료제를 투여받는 환자에게 투여하도록 시도된다:
· 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide), 클로람부실(Chlorambucil), 이포스파미드(Ifosfamide), 메클로레타민(Mechlorethamine) 또는 멜팔란(Melphalan)과 같은 알킬화제, 예를 들면 머스타드 가스 유도체; 헥사메틸멜라민(Hexamethylmelamine) 또는 티오테파(Thiotepa)와 같은 에틸렌 이미네스; 부설판(Busulfan)과 같은 알킬설포네이트; 알트레타민(Altretamine), 다카르바진(Dacarbazine), 프로카르바진(Procarbazine) 또는 테모졸로미드(Temozolomide)와 같은 하이드라진 및 트리아진; 카르머스틴(Carmustine), 로머스틴(Lomustine) 또는 스트렙토조신(Streptozocin)과 같은 니트로수레아(nitrosureas); 및 시스플라틴(Cisplatin), 카르보플라틴(Carboplatin) 또는 옥살리플라틴(Oxaliplatin) 과 같은 무기 금속 복합제제;
· 식물 알칼로이드, 예를 들면, 탁산(예를 들면, 도세탁셀(Docetaxel) 또는 파클리탁셀(Paclitaxel)), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloids) (예를 들면, 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine) 또는 빈오렐빈(Vinorelbine), 캄토테칸 동족체(camptothecan analogs) (예를 들면, 이리노테칸(Irinotecan) 또는 토포테칸(Topotecan)) 및 포도필 로톡신(podophyllotoxins)(예를 들면, 에토포시드(Etoposide) 또는 테니소피드(Tenisopide);
· 항종양 항생물질, 예를 들면, 다우노루비신(Daunorubicin), 독소루비신(Doxorubicin), 에피루비신(Epirubicin), 이다루비신(Idarubicin) 또는 미톡산트론(Mitoxantrone)과 같은 안트라사이클린; 닥티노마이신(Dactinomycin) 또는 플리카마이신(Plicamycin)과 같은 크로모마이신; 및 블레오마이신(Bleomycin) 또는 미토마이신(Mitomycin)과 같은 다른 항종양 항생물질;
· 항 대사물질, 예를 들면 메토트레세이트(Methotrexate)와 같은 엽산 길항제; 카페시타빈(Capecitabine), 사이타라빈(Cytarabine), 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil) (5-FU), 폭스우리딘(Foxuridine) 또는 게미타빈(Gemcitabine)과 같은 피리미딘 길항제; 6-메르캅토유린(6-Mercaptopurine) 또는 6-티오구아닌(6-Thioguanine)과 같은 퓨린 길항제; 클라드리빈(Cladribine), 플루다라빈(Fludarabine), 넬라라빈(Nelarabine) 또는 펜토스타틴(Pentostatin)과 같은 아데노신 디아미나제 억제제; 및 하이드록시우레아와 같은 리보뉴클레오타이드 리덕타제 억제제;
· 토포이소머라제 억제제, 예를 들면, 아이오노테칸(Ironotecan) 또는 토포테칸(Topotecan)와 같은 토포이소머라제 I 억제제; 및 암사크린(Amsacrine), 에토포시드(Etoposide), 에토포시드 포스페이트 또는 테니포시드(Teniposide)와 같은 토포이소머라제 II 억제제.
본 발명의 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드는 환자에게 "효과적인" 또는 "치료적으로 효과적인" 용량, 즉 투여되는 조건과 관련하여 소정의 효과를 생성하기에 충분한 용량, 특히 주어진 조건하에서 호중구의 소정 자극을 가져오기에 충분한 용량으로 투여된다. 정확한 용량은 개별적인 환자 및 치료될 장애와 같은 요인들에 좌우되는데 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진자, 일반적으로 의사에 의해 결정될 수 있다. PEG화 G-CSF 폴리펩타이드의 복용량은 성인 환자에 대하여 6mg인 페그필그라스팀 (Neulasta®)에 대하여 현재 권유되는 복용량과 거의 같은 정도이다. 본 발명 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드의 적절한 용량은 약 1-15mg, 바람직하게는 약 2-15mg, 보다 바람직하게는 약 3-12mg의 범위인 것으로 예상된다. 따라서, 적절한 용량은 예를 들면, 약 3mg, 약 6mg 또는 약 9mg 일 수 있다. 각각의 경우에서, 복용량은 환자가 성인인지 또는 적어도 45kg의 체중을 갖는지에 대하여 환자당 표준용량으로 나타낸다. 선택적으로, 복용량은 본 발명의 G-CSF 폴리펩타이드의 적절한 용량이 약 10-200μg/kg, 바람직하게는, 약 25-150μg/kg, 보다 바람직하게는 약 30-120μg/kg의 범위에 있도록 환자의 체중에 따라 결정될 수 있다. 따라서, 적절한 용량은 예를 들면, 약 30μg/kg, 약 60 μg/kg, 약 90 μg/kg 또는 약 120 μg/kg일 수 있다.
본 발명은 이하에서 비 제한적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명된다.
실시예 1
부분적으로 탈- PEG화된 G- CSF 변종의 제조 및 분석
샘플 제조 및 탈- PEG 화
야생형 인간 G-CSF (SEQ ID NO: 1)와 비교할 때 치환 K16R, K34R, K40R, T105K 및 S159K를 갖는 G-CSF 변종을 실질적으로 WO 03/006501에 기술된 바와 같이 CHO-Kl 세포로부터 제조했다. mPEG-SPA 5000 (Nektar Therapeutics)를 사용하여 G-CSF 변종(900 mg G-CSF)의 4.5mg/mL의 200mL를 PEG화 시켰다. 200mL의 G-CSF 용액에 10분에 걸쳐 mPEG-SPA 5000의 13.2% (w/w)용액 100mL를 첨가하고, 충분한 혼합을 이루기 위하여 부드럽게 교반했다. 샘플을 부드럽게 교반하면서 21±3℃, pH 8.5에서 44분 동안 배양했다. 샘플 혼합물을 후속하여 800 mM 붕산, pH 10.0의 스 톡 용액을 사용하여 pH 9.5로 조정했다. 이후 이 샘플을 교반하지 않으면서 24시간 동안 21±3℃에서 배양했다. 이 샘플을 100 mmol/kg 시트르 산, 20 mmol/kg NaOH, pH 2.5로 약 2.5배 희석하여 최종 3.5의 pH로 희석했다.
부분적으로 탈- PEG화된 G- CSF 의 분리
3.5로 pH를 감소시킨 후, 샘플을 20 mmol/kg 시트르산, 15 mmol/kg NaOH, pH 3.4로 평형화시킨 약 225mL의 SP-Sepharose HP (Amersham, GE Healthcare)로 팩킹된 VL44 (Millipore) 컬럼에 즉시 로딩했다. 물질의 로딩 후, 유리 mPEG-산과 같은 비 결합 물질을 제거하기 위하여 컬럼을 세척했다. 컬럼으로부터 PEG화 G-CSF를 용출시키기 위하여 25-100% 용출 완충액(20 mmol/kg 시트르 산, 20 mmol/kg NaOH, 200 mmol/kg NaCl, pH 3.5)의 선형 구배를 사용했다. 이 구배를 25CV(컬럼 용량)에 대하여 전개했다. 컬럼 단계를 21±3℃에서 수행하고 사용된 모든 완충액을 같은 온도로 조정했다.컬럼 로딩은 4.1 mg 단백질/ml 수지였고 유속은 8CV/시간 이었다.
40 mL의 샘플크기를 갖는 프랙션을 수집하고 SDS-PAGE로 분석했다. SDS-PAGE 분석에 기초하여 기본적으로 G-CSF 분자당 3 개의 부착된 PEG 기를 갖는 분리된 G-CSF를 함유하는, 약 6.5CV에 상응하는 1440mL의 생성물 풀을 만들었다. 생성물 풀의 용량은 용출 구배의 경사를 증가시킴으로써 감소될 수 있는 것으로 예상된다.
생성물 풀을 약 200mL로 정용여과하고 후속하여 10 mM 소듐 아세테이트, 43 mg/mL, pH 4.0로 정용여과 한 후 30 kDA의 분자량 컷오프(MWCO)를 갖는 두 개의 50 cm2 Millipore Pellicon XL 멤브레인이 장착된 Millipore LabScale TFF-시스템을 사 용하여 4.9 mg/mL로 농축시켰다.
결과
생성물 풀을 10 mM Na-아세테이트, 43 mg/ml 만니톨, pH 4.0로 한외 여과 및 정용여과하고 물리-화학적 특성화를 시켰다. 도 1은 PEG화 되고, 부분적으로 탈-PEG화되어 상기한 바와 같이 정제된 G-CSF 변종의 SDS-PAGE 분석의 스캔을 도시한 것으로서, 도시된 7개의 레인은 다음과 같다:
1 분자량 마커
2 PEG화 후
3 pH 9.5, T=O h
4 pH 9.5, T=24 h
5 양이온 교환 컬럼 상에 적용시
6 양이온 교환으로부터의 흐름
7 정제된 생성물
레인 7에서 폴리펩타이드 분자당 3 mPEG-SPA 5000 기를 수반하는 G-CSF 변종에 상응하는 단일의 주 밴드가 관찰되었다. 또한, 레인 7에서는 4 mPEG-SPA 5000 기를 수반하는 G-CSF에 상응하는 부 밴드도 보였다. 원할 경우, 본 기술에서 일반적으로 알려진 방법에 의해 정제 과정의 최적화 또는 조정은 요구된 순도의 정도에 따라 수율의 약간 감소를 가져오지만 4 PEG 기에 상응하는 이러한 부 밴드를 감소시키거나 실질적으로 제거할 수 있게 한다.
이러한 과정의 수율은 전체 수율의 50%에 상응하는, 폴리펩타이드 분자당 기 본적으로 3 PEG 기를 수반하는 정제되고, 부분적으로 탈-PEG화된 G-CSF 450 mg이었다.
실시예 2
부분적으로 탈- PEG화된 G- CSF -변종의 제조 및 분석
샘플제조, 탈- PEG 화 및 정제
야생형 인간 G-CSF (SEQ ID NO: 1)와 비교할 때 치환 K16R, K34R, K40R, T105K 및 S159K를 갖는 G-CSF 변종을 CHO-Kl 세포로부터 제조하고 실질적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 mPEG-SPA 5000을 사용하여 PEG화 시켜 29mL의 3.5 mg/mL의 PEG화된 G-CSF 변종을 얻었다. 이것을 10 kDa MWCO 필터가 장착된 Vivaspin 필터 장치를 사용하여 150 mM 소듐 보레이트, pH 9.5로 정용여과 했다. 최종 샘플 농도는 4.7 mg/mL이었다. 이후 샘플을 21±3℃에서 42시간 동안 배양했다.
배양 후, 30 mM 시트르산, 10 mM NaOH, pH 2.9로 희석하여 양이온 교환 크로마토그래피용 샘플을 제조했다. 이후, 샘플을 28 mL의 SP-Sepharose HP 수지가 팩킹된 XK 16/20 컬럼 (Amersham Biosciences) 상에 적용했다. 컬럼을 샘플 로딩 전에 20 mM 시트르산, 15 mM NaCl, pH 3.5의 평형 완충액으로 평형화시켰다. 로딩 후에, 컬럼을 동일한 완충액으로 세척하고 다른 PEG화 종들을 분리하기 위하여 20 mM 시트르산, pH 3.5에 있는 15 mM - 200 mM NaCl의 선형 구배를 사용하여 용출시켰다.
프랙션을 튜브에 수집하고 SDS-PAGE 분석으로 분석했다. SDS-PAGE에 기초하여 기본적으로 3개의 부착된 PEG 모이어티를 함유하는 PEG화 G-CSF 변종 함유 생성 물 풀을 만들었다. 이 생성물 풀을 정용여과(diafiltrate) 하고 10 kDa의 MWCO를 갖는 Vivaspin 여과 장치로 완충액 교환했다. 샘플을 10 mM 소듐 석시네이트, 43 mg/mL, pH 4.0로 정용여과하고, 최종적으로 3.0 mg/mL로 농축시켰다.
위치적 이성질체의 분석
시알리다제와 조합된 양이온 교환 HPLC (CIEX-HPLC)를 사용하여 다수의 PEG화 종을 함유하는 생성물 풀에 있는 여러 위치 PEG 이성질체의 조성에 대한 전처리(pretreatment) 데이터를 얻었다. 여러 위치 이성질체의 존재로 인한 PEG화 후의 균질성 이외에, PEG화 G-CSF도 제로, 하나 또는 두 개의 부착된 시알산 기를 가질 수 있는 하나의 O-글리코실화 부위(Thrl33)를 함유하는 이종(heterogeneous)이다. 다른 수의 시알산 기의 결과로서 크로마토그램에서 피크의 수를 감소시키기 위하여, 분석 전에 시알리다제 효소 전처리 단계를 포함시켰다. 시알리다제 처리는 먼저 필요할 경우 50mM 소듐아세테이트 완충액을 사용하여 1 mg/ml으로 G-CSF 용액을 희석시키고, 그후, 단백질 μg 당 0.05 μl (0.25 mUnit)의 시알리다제를 첨가하고, 시알산을 제거하기 위하여 37℃에서 18시간 동안 배양함으로써 수행된다. 이후 샘플을 동일한 날에 분석하고 분석 날까지 4℃에서 유지시켰다. PolySULFOETHYL A™ 양이온 교환 HPLC 컬럼(PoIyLC Inc.)를 사용하여 214nm에서 UV 검출과 함께 HPLC를 수행했다. PolySULFOETHYL A™ CIEX 컬럼으로부터 수작업 수집 후에 SDS-PAGE 분석으로 여러 피크의 특성화를 수행했다.
결과 - PEG 손실
시간의 함수로서 PEG 손실의 정도를 예측하기 위하여 SDS-PAGE로 완충액-교 환 샘플을 분석했다. 결과(도 2 참조)는 실시예 1에 대하여 도 1에 도시된 것과 유사했으며, 단지 PEG화의 전체 정도에서 조금의 변화가 24 시간 또는 48시간 동안 배양된 샘플들(도 2, 레인 4 및 5) 사이에서 관찰되었다.
결과-생성물 풀에 있는 위치 이성질체의 평가
도 3은 SDS-PAGE 분석으로 판단했을 때 기본적으로 세 개의 PEG 5000 기를 함유하는, 상기한 바와 같이 얻어진 본 발명에 따른 부분적으로 탈-PEG화된 생성물 풀의 양이온 교환 크로마토그램을 도시한 것이다. 두 개의 주 피크는 각각 세 개의 PEG 5000 기를 수반하는 하나의 주 위치 이성질체를 나타낸다. 세 개의 부 피크는 네 개의 PEG 기를 수반하는 두 개의 위치 이성질체 및 두 개의 PEG 기를 수반하는 하나의 위치 이성질체를 나타낸다.
두 개의 주 피크를 수집하여 부착된 PEG 기의 위치를 측정하기 위해 천연(native) 펩타이드 맵 분석을 했다. 두 개의 주 위치 이성질체는 하기 아미노산 잔기 상에서 PEG화 된다는 것이 발견되었다:
이성질체 A: N-말단, Lys23 및 Lysl59
이성질체 B: N-말단, Lys105 및 Lysl59
이들 두 주 이성질체는 샘플에 존재하는 위치 이성질체의 95% 이상을 나타냈다.
실시예 3
비교 실시예
비교의 목적으로서, 도 4는 본 발명에 따른 탈-PEG화가 되지 않은, 정제된 PEG화 G-CSF 변종의 양이온 교환 크로마토그램을 도시한 것이다. 이 경우에 G-CSF 변종은 실시예 1 및 2에서 상기한 천연 인간 G-CSF와 비교했을 때 동일한 다섯 개의 치환, 즉 Kl6R, K34R, K40R, T105K 및 S159K를 가졌다. 이것은 제조되어 불안정한 PEG 모이어티의 제거를 위해 pH 9.5에서 배양하지 않은 것을 제외하고는 실질적으로 실시예 1에 기술된 mPEG-SPA 5000으로 PEG화 시켰다. 그 결과, PEG화 변종은 2-6의 부착된 PEG 모이어티를 갖는, 다수의 다른 PEG 이성질체의 혼합물을 포함했다. 이 위치 이성질체의 혼합물을 실질적으로 실시예 1에 기술된 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제했다. 기본적으로 4-5의 부착된 PEG 모이어티를 함유하는 프랙션을 분리하고, 실질적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 한외여과 및 정용여과 한 후 상기한 바와 같이 CIEX-HPLC 분석을 행하였다. 이 프랙션은 실시예 1 및 2에 기술된 3-PEG 프랙션에 상응하지만, 추가적인 (불안정한) PEG 기가 부분적으로 탈-PEG화 3-PEG 생성물과 관련하여 하나 또는 두 개의 위치에서 부착되는데, 즉, 이 경우에 정제된 생성물은 기본적으로 4-5 부착된 PEG 기를 함유한다.
그 조성이 도 3에 도시된, 본 발명에 따라 제조된 부분적으로 탈-PEG화된 생성물과 비교할 때, 도 4에 도시된 생성물은 확실히 훨씬 더 복잡하고 이종인 혼합물이다. 도 3에 도시된, 본 발명에 따라 제조된 생성물은 각각 3 PEG 모이어티를 갖는 두 개의 주 위치 이성질체의 95% 이상을 함유하는 반면에, 도 4에 도시된 생성물은 각각 4 또는 5의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 여섯 개의 주 위치 이성질체를 포함한다. 이들 여섯 개의 4-5 PEG 위치 이성질체는 Ser66 또는 Tyr165 (데이터가 도시되지 않음)중 하나 또는 둘 모두에서 불안정한 PEG 모이어티 뿐만 아니라 N-말단 및 위치 K23, K105 및 Kl59 중 1 또는 2에서 안정한 PEG 모이어티를 포함한다. 입체 장애(steric hindrance)로 인하여, 단일 G-CSF 폴리펩타이드 상의 이들 위치중 어느 것도 PEG 모이어티에 의해 점유될 수 없다. 따라서, 도 4에 도시된 생성물은 하기의 여섯 개의 주 PEG 이성질체의 이종 혼합물을 함유한다.:
N-말단, K23, S66, K159, Y165 (5-PEG)
N-말단, S66, K105, K159, Y165 (5-PEG)
N-말단, K23, S66, K159 (4-PEG)
N-말단, K23, S66, Y165 (4-PEG)
N-말단, S66, K105, K159 (4-PEG)
N-말단, S66, K105, Y165 (4-PEG)
실시예 4
안정성 데이터
부착된 PEG 모이어티의 안정성을 네 개의 다른 온도에서 저장된 다른 수성 제형으로 테스트했다. 폴리펩타이드는 실시예 1에 리스트된 다섯 개의 치환을 가지며, 역시 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조, PEG화 및 부분적인 탈-PEG화 후 정제된 G-CSF 변종이었다. 테스트된 제형은 하기와 같다:
단위 제 형
A B C D
G-CSF mg/mL 2 10 2 2
Na-아세테이트 mM 10 10 10 10
Tween®80 mg/mL - - 0.05 -
Tween®20 mg/mL - - - 0.05
만니톨 mg/mL 43 43 43 43
각 제형의 pH는 4.0 이었다. PEG화의 안정성을 연구하기 위하여 CIEX-HPLC를 사용하여 각 샘플에서 PEG 이성질체의 분포를 26일, 56일 및 89일 후에 측정했다. 그 결과를 하기 표에 도시하였다.
제 형 온 도 일 수 3 PEG 기타/특성화 않됨 2 PEG
A - 0 92.3 7.8 0
-80℃ 26 93.3 6.6 0
5℃ 93.5 6.4 0.1
25℃ 94.1 5.5 0.3
35℃ 94.3 4.7 0.8
-80℃ 56 95.4 4.7 0
5℃ 95.3 4.7 0
25℃ 95.3 3.8 0.9
35℃ 95.3 3.0 1.7
-80℃ 89 96.1 3.9 0
5℃ 95.9 4.1 0
25℃ 96.1 3.1 0.8
35℃ 95.5 2.7 1.8
B - 0 92.4 7.6 0
-80℃ 26 93.5 6.5 0.0
5℃ 93.4 6.5 0.1
25℃ 94.0 5.7 0.3
35℃ 94.2 5.0 0.8
-80℃ 56 95.1 4.9 0
5℃ 95.4 4.7 0
25℃ 95.2 4.3 0.6
35℃ 96.2 2.4 1.4
-80℃ 89 95.9 4.1 0
5℃ 95.9 4.1 0
25℃ 96.8 3.2 0
35℃ 95.5 2.6 1.9
C - 0 92.1 7.9 0
-80℃ 26 93.8 6.1 0
5℃ 94.1 5.8 0
25℃ 94.0 5.7 0.3
35℃ 94.6 4.5 0.8
-80℃ 56 95.1 4.9 0
5℃ 95.1 4.9 0
25℃ 94.1 4.8 1.1
35℃ 95.1 3.0 1.9
-80℃ 89 95.9 4.1 0
5℃ 95.9 4.1 0
25℃ 96.1 3.2 0.7
35℃ 95.5 2.7 1.8
D - 0 92.6 7.5 0
-80℃ 26 93.8 6.1 0.1
5℃ 93.6 6.3 0.1
25℃ 93.7 6.1 0.3
35℃ 94.4 4.9 0.8
-80℃ 56 95.3 4.7 0
5℃ 95.2 4.8 0
25℃ 95.2 4.0 0.8
35℃ 95.5 3.3 1.3
-80℃ 89 96.0 4.0 0
5℃ 96.0 4.0 0
25℃ 96.2 3.1 0.7
35℃ 95.7 2.5 1.8
상기 결과는 제형 및 저장 온도에 상관없이 3 PEG 이소폼의 비율이 26, 56 또는 89일에서 샘플링되었을 때 모든 온도에서 거의 95%에 가까우면서 PEG화가 매우 안정하다는 것을 나타낸다. 표로부터 쉽게 알 수 있는 차이는 주로 25℃ 또는 35℃에서 저장된 샘플에 있어서 기타/특성화되지 않은 형태에서 참고로 -80℃ 데이터를 사용했을 때 시간이 지남에 따라 약간 감소가 있으며 이들 샘플에서 2 PEG 이성질체의 상응하는 증가가 있는 것 뿐이다.
비교로서, 하기 표는 상기한 것들과 유사한 제형이지만, 본 발명의 탈-PEG 단계없이 제조된, 즉 상기 실시예 3에 기술된 생성물에 상응하는 G-CSF 변종에 대하여 저장 20 및 83일 후에 측정된 유사한 데이터를 도시한 것이다. 이 경우에 제형은 pH 4.0을 가졌으며 실험의 초기에 기본적으로 (98-99%) 4-5 부착된 PEG 모이어티를 함유한, 5 mg/ml의 PEG화 G-CSF 변종, 45 mg/ml의 만니톨 및 15mM 소듐 아세테이트로 이루어졌다. 하기 표는 표시된 네 개의 온도에서 83일 후에 뿐만 아니라 이 온도들 중 두 개에서 20일 후에 측정된 PEG 이소폼의 분포를 도시한 것이다. 4-5 PEG 모이어티를 함유하는 G-CSF 폴리펩타이드의 비율은 25℃에서 저장했을 때 3 PEG 이소폼에서 상응하는 증가 및 4-5 PEG 이소폼의 실질적인 손실이 있으며 35℃에서 3 PEG 이소폼의 상응하는 증가 및 4-5 PEG 이소폼의 훨씬 더 큰 손실이 있지만 5℃에서 저장했을 때 83일 후에는 약간 감소한다는 것을 알 수 있다. 이것은 본 발명의 탈-PEG화 방법이 없을 경우 상기한 바와 같이 제조된 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드가 시간이 지남에 따라 그리고 온도에 따라, 수성 제형에 저장했을 때 폴 리펩타이드로부터 탈착되는 불안정한 PEG 기를 함유한다는 것을 설명한다.
온 도 일 수 4-5 PEG 3 PEG 기타/특성화되지 않음
- 98.6% 0 1.4%
-80℃ 20 98.1% 0.5% 1.4%
35℃ 96.0% 2.9% 1.1%
-80℃ 83 97.9% 0.6% 1.6%
5℃ 97.6% 1.0% 1.5%
25℃ 90.6% 8.4% 1.1%
35℃ 78.1% 21.5% 0.5%
상기한 발명은 명확성 및 이해의 목적으로 어느 정도 상세히 설명되었지만 본 명세서를 읽은, 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 형태 및 구체적인 것에 있어서의 다양한 변화가 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다는 것을 알 것이다. 여기에 기술된 실시예 및 구현예는 설명의 목적만을 위한 것이고 그들을 고려하여 다양한 변형 및 변화가 당업자에게 제시되는 것이며, 이 출원의 정신 및 권한 그리고 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다. 본 출원에 인용된 모든 공보, 특허, 특허출원 및/또는 다른 서류들은 각 개별적인 공보, 특허, 특허출원 및/또는 다른 서류가 모든 목적을 위하여 그 전체가 여기에 참고로 도입되도록 기술되는 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위하여 그 전체가 여기에 참고로 도입된다.
SEQUENCE LISTING <110> Maxygen Holdings Ltd. Germansen, Carsten Soni, Bobby Rasmussen, Grethe <120> PEGYLATED G-CSF POLYPEPTIDES AND METHODS OF PRODUCING SAME <130> 0282wo210 <140> PCT/DK2006/000292 <141> 2006-05-26 <150> US 60/686,726 <151> 2005-06-01 <160> 1 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 174 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys 1 5 10 15 Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln 20 25 30 Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val 35 40 45 Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys 50 55 60 Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser 65 70 75 80 Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser 85 90 95 Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp 100 105 110 Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro 115 120 125 Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe 130 135 140 Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe 145 150 155 160 Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 165 170

Claims (49)

  1. 하이드록실 기에 부착된 PEG 모이어티를 제거하기에 적절한 시간 동안 폴리펩타이드를 8.0 이상의 상승된 pH에 있게 하고 pH를 약 8.0 이하로 감소시키는 것을 포함하는, 라이신 잔기의 엡실론 아미노 기 또는 N-말단 아미노 기에 부착된 적어도 하나의 PEG 모이어티 및 하이드록실 기에 부착된 적어도 하나의 PEG 모이어티를 갖는 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드의 안정성 및 일정성을 증가시키기 위한 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상승된 pH가 약 8.5-10.5 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상승된 pH가 약 9.0-10.0 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상승된 pH가 약 9.2-9.8 범위, 예를 들면 약 9.5인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 상기 항들 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 약 2-100 시간 동안 상승된 pH에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 폴리펩타이드가 약 4-72 시간 동안 상승된 pH에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 폴리펩타이드가 약 8-48 시간 동안 상승된 pH에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 폴리펩타이드가 약 12-30 시간 동안 상승된 pH에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 상기 항들 중 어느 한 항에 있어서, 감소된 pH에 있는 폴리펩타이드에 대하여 적어도 한번의 크로마토그래피 정제 단계가 행해지는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 크로마토그래피 정제 단계가 이온 교환 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, pH는 약 7.0 이하로 감소되고, 크로마토그래피 정제 단계는 양이온 교환 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 9항에 있어서, 크로마토그래피 정제 단계가 겔 여과 크로마토그래피인 것 을 특징으로 하는 방법.
  13. 상기 항들 중 어느 한 항에 있어서, 감소된 pH가 약 2.0-5.0의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 감소된 pH가 약 2.5-4.5의 범위인 것을 특징으로 하는 방법
  15. PEG화 G-CSF 폴리펩타이드 중간체를 제조하기 위하여 아미노-특이적 활성 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 G-CSF 폴리펩타이드를 PEG화 반응시키고, 하이드록실 기에 부착된 PEG 모이어티를 제거하기에 적절한 시간 동안 PEG화 폴리펩타이드 중간체를 상승된 pH인 적어도 약 9.0 pH에 있게 하여 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드를 제조하는 것을 포함하는 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드 제조방법.
  16. 제 15항에 있어서, PEG화 반응이 약 7.0-9.0 범위의 pH에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 15항에 있어서, PEG화 반응이 9.0 이상의 pH에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, PEG화 반응 및 후속하는, 하이드록실 기에 부착된 PEG 모이어티의 제거가 단일 pH 값에서 단일 단계로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 15항에 있어서, 아민-특이적 활성화 PEG가 mPEG-석신이미딜 프로피오네이트(mPEG-SPA), mPEG-석신이미딜 부타노에이트(mPEG-SBA), 또는 mPEG-석신이미딜 α-메틸부타노에이트(mPEG-SMB)인 것을 특징으로하는 방법.
  20. 제 15항에 있어서, 아민-특이적 활성화 PEG가 약 5 kDa의 분자량을 갖는 mPEG-SPA인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 15항에 있어서, 상승된 pH가 약 9.2-11.0의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상승된 pH가 약 9.2-10.0의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 상기 항들 중 어느 한 항에 의해 제조된 PEG화 G-CSF 폴리펩타이드.
  24. 제 23항에 있어서, 폴리펩타이드가 야생형 인간 G-CSF와 관련하여 치환 K16R, K34R, K40R, T105K 및 S159K를 포함하는 G-CSF 변종인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. PEG화 G-CSF 폴리펩타이드의 위치 PEG 이성질체의 혼합물을 포함하는 조성물에 있어서, 폴리펩타이드는 야생형 인간 G-CSF와 관련하여 치환 K16R, K34R, K40R, T105K 및 S159K를 포함하며, 폴리펩타이드의 위치 PEG 이성질체 중 적어도 약 80%는 세 개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 라이신/N-말단 위치 PEG 이성질체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  26. 제 25항에 있어서, 폴리펩타이드의 위치 PEG 이성질체 중 적어도 약 85%가 세 개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 라이신/N-말단 위치 PEG 이성질체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제 25항에 있어서, 폴리펩타이드의 위치 PEG 이성질체 중 적어도 약 90%가 세 개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 라이신/N-말단 위치 PEG 이성질체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제 25항에 있어서, 세 개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 위치 PEG 이성질체 중 적어도 약 80%가 두 개의 위치 PEG 이성질체로 이루어지고, 이성질체 중 하나는 N-말단, Lys23 및 Lys159에서 부착된 PEG 모이어티를 가지며, 다른 이성질체는 N-말단, Lys1O5 및 Lys159에서 부착된 PEG 모이어티를 갖는 조성물.
  29. 제 26항에 있어서, 세 개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 위치 PEG 이성질체 중 적어도 약 85%가 두 개의 위치 PEG 이성질체로 이루어지고, 이성질체 중 하나는 N-말단, Lys23 및 Lys159에서 부착된 PEG 모이어티를 가지며, 다른 이성질체는 N-말단, Lys1O5 및 Lys159에서 부착된 PEG 모이어티를 갖는 조성물.
  30. 제 27항에 있어서, 세 개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 위치 PEG 이성질체 중 적어도 약 90%가 두 개의 위치 PEG 이성질체로 이루어지고, 이성질체 중 하나는 N-말단, Lys23 및 Lys159에서 부착된 PEG 모이어티를 가지며, 다른 이성질체는 N-말단, Lys1O5 및 Lys159에서 부착된 PEG 모이어티를 갖는 조성물.
  31. PEG화 G-CSF 폴리펩타이드의 위치 PEG 이성질체의 혼합물을 포함하는 조성물에 있어서, 폴리펩타이드가 야생형 인간 G-CSF와 관련하여 치환 K16R, K34R, K40R, T105K 및 S159K를 포함하고, 폴리펩타이드의 위치 PEG 이성질체 중 적어도 약 80%는 5℃의 온도에서 3달 동안 수성 기준 조성물에 저장 후에 세 개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 라이신/N-말단 위치 PEG 이성질체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  32. 약제학적으로 수용가능한 캐리어와 청구범위 제 23 또는 24항에 따른 PEG화 G-CSF 또는 청구범위 제 25-31항에 따른 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  33. 야생형 인간 G-CSF와 관련하여 치환 K16R, K34R, K40R, T105K 및 S159K를 포함하는 재조합 G-CSF 폴리펩타이드의 라이신/N-말단 위치 PEG 이성질체의 혼합물을 제조하는 방법에 있어서,
    a) 숙주세포에서 재조합 G-CSF 폴리펩타이드를 발현시키고;
    b) 재조합 G-CSF 폴리펩타이드를 분리하며;
    c) 분리된 재조합 G-CSF 폴리펩타이드를 아민-특이적 활성 PEG와 반응시켜 재조합 G-CSF 폴리펩타이드의 다수의 위치 PEG 이성질체를 제조하고; 및
    d) 다수의 위치 PEG 이성질체를 8.5-10.5의 pH에서 반응시켜 재조합 G-CSF 폴리펩타이드의 다수의 부분적으로 탈PEG화된 라이신/N-말단 위치 PEG 이성질체를 제조하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 아민-특이적 활성 PEG가 mPEG-석신이미딜 프로피오네이트(mPEG-SPA), mPEG-석신이미딜 부타노에이트(mPEG-SBA) 또는 mPEG-석신이미딜 α-메틸부타노에이트 (mPEG-SMB)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 33항 또는 제 34항에 있어서, 재조합 G-CSF 폴리펩타이드의 다수 라이신/N-말단 위치 PEG 이성질체에 대하여 하나 이상의 크로마토그래피 정제 단계를 행 하여 G-CSF 폴리펩타이드의 라이신/N-말단 위치 PEG 이성질체의 실질적으로 정제된 혼합물을 제조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 35항에 있어서, 적어도 하나의 약제학적으로 수용가능한 부형제와 재조합 G-CSF 폴리펩타이드의 라이신/N-말단 위치 PEG 이성질체의 실질적으로 정제된 혼합물의 효과적인 양을 조합하여 약제학적 조성물을 제조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 청구범위 제 33항의 방법에 의해 제조된 다수의 부분적으로 탈PEG화된 라이신/N-말단 위치 PEG 이성질체.
  38. 청구범위 제 35항의 방법에 의해 제조된 라이신/N-말단 위치 PEG 이성질체의 실질적으로 정제된 혼합물.
  39. 청구범위 제 36항의 방법에 의해 제조된 약제학적 조성물.
  40. 청구범위 제 23항 또는 24항에 따른 PEG화된 G-CSF 폴리펩타이드 또는 청구범위 제 25-32항 또는 제 36-39항에 따른 조성물의 효과적인 양을 불충분한 호중구 수준으로 또는 그 위험으로 고통받는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에게서 호중구의 수준을 증가시키기 위한 방법.
  41. 제 40항에 있어서, 불충분한 호중구 수준이 화학요법 또는 방사선 요법의 결과인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 불충분한 호중구 수준으로 또는 그 위험으로 고통받는 환자에게서 호중구의 수준을 증가시키기 위한 약물의 제조를 위한, 청구범위 제 23항 또는 24항에 따른 PEG화된 G-CSF 폴리펩타이드 또는 청구범위 제 25-32항 또는 제 36-39항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  43. 제 42항에 있어서, 불충분한 호중구 수준이 화학요법 또는 방사선 요법의 결과인 것을 특징으로 하는 용도.
  44. PEG화 G-CSF 폴리펩타이드 변종의 위치 PEG 이성질체의 균질한 혼합물을 포함하는 조성물에 있어서, 혼합물의 위치 PEG 이성질체의 적어도 약 80%가 각각 라이신의 엡실론 아미노 기에 결합된 두 개의 PEG 모이어티 및 N-말단 아미노 기에 결합된 하나의 PEG 모이어티로 이루어진 PEG 모이어티들을 갖는 두 개의 위치 PEG 이성질체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  45. 제 44항에 있어서, 균질한 혼합물의 위치 PEG 이성질체의 적어도 약 85%가 각각 라이신의 엡실론 아미노 기에 결합된 두 개의 PEG 모이어티 및 N-말단 아미노 기에 결합된 하나의 PEG 모이어티로 이루어진 PEG 모이어티들을 갖는 두 개의 위치 PEG 이성질체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  46. 제 44항에 있어서, 혼합물의 위치 PEG 이성질체의 적어도 약 90%가 각각 라이신의 엡실론 아미노기에 결합된 두 개의 PEG 모이어티 및 N-말단 아미노기에 결합된 하나의 PEG 모이어티로 이루어진 PEG 모이어티들을 갖는 두 개의 위치 PEG 이성질체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  47. 약제학적으로 수용가능한 캐리어 및 청구범위 제 44-46항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 조성물.
  48. 청구범위 제 44-46항에 따른 조성물의 효과적인 양을 불충분한 호중구 수준으로 또는 그 위험으로 고통받는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에게서 호중구의 수준을 증가시키기 위한 방법.
  49. 불충분한 호중구 수준으로 또는 그 위험으로 고통받는 환자에게서 호중구의 수준을 증가시키기 위한 약물의 제조를 위한, 청구범위 제 44-46항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2607844C (en) * 2005-06-01 2012-07-10 Maxygen Holdings Ltd. Pegylated g-csf polypeptides and methods of producing same
PT2197919E (pt) * 2007-08-27 2014-07-17 Ratiopharm Gmbh Formulação líquida de conjugado de g-csf
MX2011003014A (es) * 2008-09-19 2011-05-24 Maxygen Inc Uso de una variante del factor estimulador de colonias de granulocitos multi-pegilado en el tratamiento de neutropenia inducida por radiacion.
US7914828B2 (en) * 2008-10-17 2011-03-29 Levine Brian M Combination herbal product to benefit respiratory tract
WO2011041376A1 (en) * 2009-09-30 2011-04-07 Prolong Pharmaceuticals Modified granulocyte colony stimulating factor (g-csf)
EP2494050A4 (en) * 2009-10-30 2013-10-30 Merck Sharp & Dohme FACTOR FOR STIMULATING GRANULOCYTES AND MONOCYTES PRODUCED IN GLYCOMODIFIED PICHIA PASTORIS
TWI480288B (zh) * 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
WO2012064845A2 (en) * 2010-11-09 2012-05-18 Nektar Therapeutics G-csf polymer conjugates having a releasable linkage
US20140187488A1 (en) * 2011-05-17 2014-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Methods for maintaining pegylation of polypeptides
CN104109199B (zh) * 2013-04-16 2019-04-30 深圳未名新鹏生物医药有限公司 一种聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子的制备方法及其产品
US20160361426A1 (en) * 2015-06-11 2016-12-15 Prolong Pharmaceuticals, LLC Pegylated granulocyte colony stimulating factor (gcsf)
KR102020995B1 (ko) * 2017-10-30 2019-09-16 한국코러스 주식회사 콜로니자극인자와 폴리올이 접합된 접합물을 고수율로 제조하는 방법
US20210386680A1 (en) * 2018-12-06 2021-12-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Selectively cleavable therapeutic nanoparticles
CN114853872B (zh) * 2022-04-27 2023-11-17 山东新时代药业有限公司 一种聚乙二醇修饰rhG-CSF的制备方法

Family Cites Families (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US588025A (en) * 1897-08-10 Furnace-door-operating device
WO1985000817A1 (en) 1983-08-10 1985-02-28 Amgen Microbial expression of interleukin ii
JPS61227526A (ja) 1984-07-25 1986-10-09 Chugai Pharmaceut Co Ltd 新規なコロニー刺激因子
WO1986004605A1 (en) 1985-02-08 1986-08-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Human granulocyte colony stimulating factor
US6004548A (en) 1985-08-23 1999-12-21 Amgen, Inc. Analogs of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
US4810643A (en) 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
JPS63500636A (ja) 1985-08-23 1988-03-10 麒麟麦酒株式会社 多分化能性顆粒球コロニー刺激因子をコードするｄｎａ
JPS6263335A (ja) 1985-09-13 1987-03-20 Fuji Photo Film Co Ltd 化学反応情報の処理方法
ATE67517T1 (de) 1985-09-30 1991-10-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Menschlicher granulozyten-colony stimulierender faktor.
ES2039209T5 (es) 1986-01-22 1996-07-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Compuesto farmaceutico que promueve el restablecimiento de la capacidad hemopoyetica.
US4908773A (en) 1987-04-06 1990-03-13 Genex Corporation Computer designed stabilized proteins and method for producing same
DK203187A (da) 1986-04-22 1987-10-23 Immunex Corp Human g-csf proteinekspression
WO1988001297A1 (en) 1986-08-11 1988-02-25 Cetus Corporation Expression of g-csf and muteins thereof
US4704692A (en) 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US5362853A (en) 1986-12-23 1994-11-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US5681720A (en) 1986-12-23 1997-10-28 Kyowa Hakko Co., Ltd. DNA encoding human granulocyte colony stimulating factor plasmids and host cells comprising same, and methods of expressing the encoded polypeptide
US5214132A (en) 1986-12-23 1993-05-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
DK174044B1 (da) 1986-12-23 2002-05-06 Kyowa Hakko Kogyo Kk Polypeptid afledt fra human granulocytkolonistimulerende faktor, og fremgangsmåde til fremstilling deraf, DNA kodende for nævnte polypeptid, rekombinant plasmid indeholdende nævnte DNA, og mikroorganismer indeholdende nævnte rekombinante plasmid.......
US4853871A (en) 1987-04-06 1989-08-01 Genex Corporation Computer-based method for designing stablized proteins
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
GB2213821B (en) 1987-12-23 1992-01-02 British Bio Technology Synthetic human granulocyte colony stimulating factor gene
CA1340810C (en) 1988-03-31 1999-11-02 Motoo Yamasaki Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
JP2796388B2 (ja) 1988-05-13 1998-09-10 アムジエン・インコーポレーテツド Ｇ−ｃｓｆの精製方法
ATE111921T1 (de) 1988-06-03 1994-10-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Menschlicher kristallinischer granulocyt- koloniestimulierungsfaktor und dessen herstellung.
US5025388A (en) 1988-08-26 1991-06-18 Cramer Richard D Iii Comparative molecular field analysis (CoMFA)
US5218092A (en) 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
US5349052A (en) 1988-10-20 1994-09-20 Royal Free Hospital School Of Medicine Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US5104651A (en) 1988-12-16 1992-04-14 Amgen Inc. Stabilized hydrophobic protein formulations of g-csf
ATE135370T1 (de) * 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US6166183A (en) 1992-11-30 2000-12-26 Kirin-Amgen, Inc. Chemically-modified G-CSF
US20020177688A1 (en) * 1988-12-22 2002-11-28 Kirin-Amgen, Inc., Chemically-modified G-CSF
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5109119A (en) 1989-06-06 1992-04-28 Schering Corporation Crystalline r-h-gm-csf and method
IE66494B1 (en) 1989-09-26 1996-01-10 Immunex Corp Granulocyte-colony stimulating factor receptors
KR920701252A (ko) 1989-10-10 1992-08-11 스티븐 엠. 오드레 과립구 군체 자극인자 및 그를 이용하여 개 및 고양이과 동물의 전염병을 치료하거나 예방하는 방법
US5265030A (en) 1990-04-24 1993-11-23 Scripps Clinic And Research Foundation System and method for determining three-dimensional structures of proteins
GB9107846D0 (en) 1990-04-30 1991-05-29 Ici Plc Polypeptides
US5399345A (en) 1990-05-08 1995-03-21 Boehringer Mannheim, Gmbh Muteins of the granulocyte colony stimulating factor
DE4014750A1 (de) 1990-05-08 1991-11-14 Boehringer Mannheim Gmbh Muteine des granulozyten-stimulierenden faktors (g-csf)
JP3249147B2 (ja) 1990-06-01 2002-01-21 キリン−アムジエン・インコーポレーテツド 生理活性蛋白含有経口製剤
IE912365A1 (en) 1990-07-23 1992-01-29 Zeneca Ltd Continuous release pharmaceutical compositions
AU651152B2 (en) 1990-08-29 1994-07-14 Genetics Institute, Llc Multidomain hematopoiesis stimulators
US5124297A (en) 1990-12-07 1992-06-23 Amoco Corporation Olefin polymerization and copolymerization catalyst
DE4105480A1 (de) 1991-02-21 1992-08-27 Boehringer Mannheim Gmbh Verbesserte aktivierung von rekombinanten proteinen
US6565841B1 (en) 1991-03-15 2003-05-20 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
US5157736A (en) 1991-04-19 1992-10-20 International Business Machines Corporation Apparatus and method for optical recognition of chemical graphics
DE69231467T2 (de) 1991-05-10 2001-01-25 Genentech Inc Auswählen von agonisten und antagonisten von liganden
US5386507A (en) 1991-07-18 1995-01-31 Teig; Steven L. Computer graphics system for selectively modelling molecules and investigating the chemical and physical properties thereof
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
CA2116533A1 (en) 1991-08-30 1993-03-18 George J. Todaro Hybrid cytokines
JP2638359B2 (ja) 1991-11-26 1997-08-06 富士通株式会社 分子動力学法の拘束条件作成装置
EP0955365A3 (en) 1992-06-09 2000-12-20 Chiron Corporation Crystallization of M-CSF
ZA933926B (en) 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
US5772992A (en) 1992-11-24 1998-06-30 G.D. Searle & Co. Compositions for co-administration of interleukin-3 mutants and other cytokines and hematopoietic factors
WO1994012639A2 (en) 1992-11-24 1994-06-09 G. D. Searle & Co. Interleukin-3 (il-3) mutant polypeptides
US5738849A (en) 1992-11-24 1998-04-14 G. D. Searle & Co. Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them
US6153183A (en) 1992-11-24 2000-11-28 G. D. Searle & Company Co-administration of interleukin-3 mutant polypeptides with CSF's or cytokines for multi-lineage hematopoietic cell production
US6057133A (en) 1992-11-24 2000-05-02 G. D. Searle Multivariant human IL-3 fusion proteins and their recombinant production
US5424963A (en) 1992-11-25 1995-06-13 Photon Research Associates, Inc. Molecular dynamics simulation method and apparatus
US5581476A (en) 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
AU1916295A (en) 1994-02-08 1995-08-29 Amgen, Inc. Oral delivery of chemically modified proteins
JP4011106B2 (ja) 1994-02-23 2007-11-21 協和醗酵工業株式会社 血小板増殖促進剤
US5635599A (en) 1994-04-08 1997-06-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Fusion proteins comprising circularly permuted ligands
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
JPH11500308A (ja) 1995-02-03 1999-01-12 ジー．ディー．サール アンド カンパニー 新規ｃ−ＭＰＬリガンド
US6017523A (en) 1995-06-06 2000-01-25 G.D. Searle & Co. Therapeutic methods employing mutant human interleukin-3 (IL-3) polypeptides
CZ295518B6 (cs) 1995-10-05 2005-08-17 G. D. Searle & Co. Multifunkční agonisté hematopoetických receptorů
JP2000513924A (ja) 1995-10-05 2000-10-24 ジー．ディー．サール アンド カンパニー 新規ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニスト
US6066318A (en) 1995-10-05 2000-05-23 G.D. Searle & Co. Multi-functional hematopoietic fusion proteins between sequence rearranged C-MPL receptor agonists and other hematopoietic factors
US6100070A (en) 1995-10-05 2000-08-08 G. D. Searle & Co. G-CSF receptor agonists
AU717733B2 (en) 1995-10-05 2000-03-30 G.D. Searle & Co. Novel G-CSF receptor agonists
US6660257B1 (en) 1996-10-25 2003-12-09 Pharmacia Corporation Circular permuteins of flt3 ligand
KR100497423B1 (ko) 1996-10-25 2005-07-07 지.디. 썰 엘엘씨 다기능 키메라 조혈 수용체 아고니스트
US5969105A (en) 1996-10-25 1999-10-19 Feng; Yiqing Stem cell factor receptor agonists
BR9808514A (pt) 1997-04-11 2000-05-23 Searle & Co Proteìnas quiméricas do ligante flt3
KR100241257B1 (ko) 1997-05-22 2000-02-01 한승수 인체 과립구 콜로니 자극 인자 활성물질 및 그것의 제조방법
US6583267B2 (en) 1997-06-06 2003-06-24 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Chemically modified polypeptides
EP1012184B1 (en) 1997-07-14 2007-10-10 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US6451986B1 (en) 1998-06-22 2002-09-17 Immunex Corporation Site specific protein modification
AU6246599A (en) 1998-09-25 2000-04-17 G.D. Searle & Co. Method of producing permuteins by scanning permutagenesis
US6420339B1 (en) 1998-10-14 2002-07-16 Amgen Inc. Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility
US6627186B1 (en) 1999-01-06 2003-09-30 Xencor Nucleic acids and protein variants of hG-CSF with granulopoietic activity
ATE246202T1 (de) 1999-01-29 2003-08-15 Hoffmann La Roche Gcsf konjugate
JP2000319298A (ja) 1999-03-04 2000-11-21 Seibutsu Bunshi Kogaku Kenkyusho:Kk 蛋白質複合体の結晶、構造座標、及び構造座標の使用
KR100356140B1 (ko) 1999-07-08 2002-10-19 한미약품공업 주식회사 인간 과립구 콜로니 자극인자 변이체 및 이의 생산 방법
US6555660B2 (en) 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
ES2327606T3 (es) * 2000-01-10 2009-11-02 Maxygen Holdings Ltd Conjugados de g-csf.
US6831158B2 (en) 2000-01-10 2004-12-14 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
US6646110B2 (en) 2000-01-10 2003-11-11 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF polypeptides and conjugates
WO2002020751A2 (en) 2000-09-07 2002-03-14 Eli Lilly And Company Hyperglycosylated polypeptides
WO2002020767A2 (en) 2000-09-08 2002-03-14 Massachusetts Institute Of Technology G-csf analog compositions and methods
GB0022877D0 (en) 2000-09-18 2000-11-01 Isis Innovation Analogues
US20020142964A1 (en) 2000-11-02 2002-10-03 Nissen Torben Lauesgaard Single-chain polypeptides
EP1334127A1 (en) * 2000-11-02 2003-08-13 Maxygen Aps Single-chain multimeric polypeptides
KR100861810B1 (ko) * 2000-12-11 2008-10-07 코닌클리즈케 필립스 일렉트로닉스 엔.브이. 신호 처리 장치 및 신호 처리 결과 공급 방법
MXPA04000231A (es) 2001-07-11 2004-05-04 Maxygen Holdings Ltd Conjugados del factor de estimulacion de colonias de granulocitos.
CA2607844C (en) * 2005-06-01 2012-07-10 Maxygen Holdings Ltd. Pegylated g-csf polypeptides and methods of producing same

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