JP2000513924A

JP2000513924A - 新規ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニスト

Info

Publication number: JP2000513924A
Application number: JP09514462A
Authority: JP
Inventors: スタテン，ニコラス，アール．; ペッグ，ライル，イー．; マックファーター，チャールズ，エイ．; フェン，イイクイン; マッキャーン，ジョン，ピー．; サマーズ，ニーナ，エル．; ジリ，ジュディス，ジー．
Original assignee: ジー．ディー．サールアンドカンパニー
Priority date: 1995-10-05
Filing date: 1996-10-04
Publication date: 2000-10-24
Also published as: AU7390196A; CA2234059A1; AU722759B2; EP0870027A1; WO1997012978A1

Abstract

(57)【要約】ｃ−ｍｐｌリガンド受容体アゴニストタンパク質、ｃ−ｍｐｌリガンド受容体アゴニストタンパク質をコードするＤＮＡ、ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストタンパク質の製造方法、およびｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストタンパク質の使用方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】新規ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニスト本出願は、３５ＵＳＣ §１１９（ｅ）に従って、１９９５年１０月５日出願の米国仮出願第６０／００４，３８４号の優先権を主張する。発明の分野本発明は、造血系の分化と拡張に対する活性を有するヒトｃ−ｍｐｌ受容体アゴニスト（トロンボポエチン）に関する。発明の背景巨核球（ＭＫ）成熟と血小板産生は、赤血球（エリスロポエチン）と顆粒球（Ｇ−ＣＳＦ）拡張と成熟を誘導するサイトカインと同様の方法で、系統特異的液性増殖因子により制御されると、長い間考えられている。血小板は、血管傷害に応答して出血を防止するのに関与する。従って血小板産生は、造血系制御の重要な成分である。化学療法または骨髄移植を受けている患者は、通常血小板レベルが重度に低下（血小板減少症）しており、これが生死に関わる出血を引き起こすことがある。いくつかの既知の増殖因子やサイトカインは、巨核球や血小板産生を刺激することがわかっているが、ほとんどはインビトロおよびインビボで多面発現性である（ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＳＣＦ）。血小板減少症のイヌやヒトからの血漿、血清および尿は、すべての既知のサイトカインとは異なる特異的な巨核球減少性および血小板減少活性を有する増殖因子を含有することがわかっている。これらの因子は、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＭＫ−ＣＳＦ、巨核球増殖成長因子（ＭＧＤＦ）、メガカリオポエチン（magakaryopoietin）、およびトロンボポエチンと呼ばれているが、その分子構造は最近まで同定されていなかった。トロンビン生成性（thrombopoietic）サイトカインであるｃ−ｍｐｌリガンドの同定は、骨髄増殖性白血病ウイルス（ＭＰＬＶ、ウェンディング（Wending）ら、Virology 149:242-246，1986）の同定で始まった。このウイルスで感染したマウスは、多系統骨髄増殖を引き起こした。それ以後の研究（ソウイリ（Souyri ）ら、Cell 63:1137-1147，1990）は、レトロウイルスは、ウイルスのエンベロープ遺伝子に融合した時、造血増殖因子受容体ファミリーの細胞質ドメインに似た膜固定タンパク質を生成する癌遺伝子（ｖ−ｍｐｌ）をコードすることを証明した。ｖ−ｍｐｌは、同族遺伝子についてヒトおよびマウスのＲＮＡライブラリーとプローブ結合させるのに使用された。両方の種でクローンが同定され、ｃ−ｍｐｌと命名された（ビゴン（Vigon）ら、PNAS USA 89:5640-5644，1992；ビゴン（Vigon）ら、Oncogene 8:2607-2615，1993）。ｃ−ｍｐｌは、ｍＩＬ−５ｒｃ、ＩＬ３ｒｃ,ＩＬ４ｒｃ,ｍＥＰＯｒｃおよびｍＧＣＳＦｒｃと相同の領域を有するサイトカイン受容体スーパーファミリーのメンバーである。ｃ−ｍｐｌの細胞内ドメインとｈＩＬ４ｒｃの細胞外ドメインのキメラが、増殖因子依存性細胞株（ＢａＦ３）にトランスフェクションされた。いったんトランスフェクションされると、細胞はｈＩＬ４に応答して増殖し、ｃ−ｍｐｌ細胞質ドメインが、増殖性シグナルを導入するのに充分であることを示している（スコダ（Skoda）ら、EMBO J．12(7):2645-2653，1993）。ｃ−ｍｐｌについてのメッセージは、多分化能性細胞株であるＴＦ−１、Ｍｏ −７Ｅ、ＵＴ−７およびＫＵ８１２、および赤血球／巨核球細胞株であるＨＥＬ、ＤＡＭＩおよびＫ１５３を含む、逆転写酵素ポリメラーゼチェイン反応（ＲＴＰＣＲ）を使用して、多くの造血細胞株中で発見された。また転写体は、骨髄、胎児肝、巨核球、血小板およびＣＤ３４＋濃縮細胞中で同定された（メチア（ Methia）ら、Blood 82(5):1395-1401，1993）。推定受容体が同定されたため、いくつかのチームは、ｃ−ｍｐｌの天然に存在するリガンドの探索を始めた。１９９４年６月に同時にいくつかの論文で、ｃ− ｍｐｌに結合し巨核球形成性を有するリガンドについて報告された（ド・サウバージ（de Sauvage）ら、Nature 369:533-539，1994；ロック（Lok）ら、Nature 369:565-568，1994；ウェンドリング（Wendling）ら、Nature 369:571-574，199 4、およびバートレイ（Bartley）ら、Cell 77:1117-1124，1994）。ｃ−ｍｐｌリガンドまたはトロンボポエチンと呼ぶリガンドは、予測分子量が３５，０００ kDaのペプチドである。このタンパク質は、エリスロポエチンと相同性を有するアミノ末端ドメイン（１５３アミノ酸）と、セリン、スレオニン、およびプロリンが豊富ないくつかのグリコシル化部位も有するカルボキシ末端の２つのドメイン構造を有する。いずれも生物活性を有する２５kDaと３１kDa型の２つの短いペプチドを生成する、２つの可能なアルギニン切断部位がある。ヒト、マウス、ブタ、イヌ、ラットおよびウサギのｃ−ｍｐｌリガンドの間には種間の高い相同性があり、試験したすべての種についてほとんどの型は活性がある。ｃ−ｍｐｌリガンドは、ＣＤ３４＋細胞から巨核球性を有する細胞への分化を刺激することが証明されている。ｃ−ｍｐｌリガンドの存在下でＣＤ３４＋細胞は、核内有糸分裂を受け（カウシャンスキー（Kaushansky）ら、Nature 369:568 -571，1994）、巨核球系統特異的細胞の表面抗原ＣＤ４１ａを発現し、巨核球に特徴的な形態を有した。ｃ−ｍｐｌリガンドをインビボで投与すると、正常なマウスにおいて循環血小板が増加した（ロック（Lok）ら、Nature 369:565-568，1 994）。遺伝子ターゲティングにより作成されたｃ−ｍｐｌ欠損マウスは、循環血小板と巨核球の８５％の低下を示したが、他の造血系統の量は正常であった（ガーネイ（Gurney）ら、Science 265:1445-1447，1994）。これらの動物では絶対血小板減少症は観察されず、ＭＫ系統の拡張に他のサイトカインが何らかの活性を有することを示している。今日までの研究は、ｃ−ｍｐｌリガンドは、巨核球の成熟と血小板産生について特異的活性を有するサイトカインであることを示している。ＩＬ−３、ＩＬ− ６、ＩＬ−１１およびｃ−ｋｉｔリガンドを含む他のサイトカインは、巨核球拡張と分化に対する活性を有することが証明されている。最近の研究は、これらのサイトカイン（ＩＬ−３を除いて）は、ｃ−ｍｐｌリガンドの産生を刺激することにより作用し、それ自身は巨核球刺激活性はないことを証明した（カウシャンスキー（Kaushansky）ら、PNAS USA 92:3234-3236、1995）巨核球の増殖と成熟および血小板の産生を刺激するｃ−ｍｐｌリガンドの能力は、疾患または放射線照射および／または化学療法のような治療により血小板の数が減少しているケースで、循環血小板を正常な量に戻すのに治療的有用性を有するかも知れないことを示す。ＥＰ６７５，２０１Ａｌ号は、ｃ−ｍｐｌリガンド（巨核球増殖および成長因子またはＭＧＤＦ）、ｃ−ｍｐｌリガンドのアレレ変種、およびポリエチレングリコールのような水溶性ポリマーに結合したｃ−ｍｐｌリガンドに関する。ＷＯ９５／２１９２０号は、マウスおよびヒトｃ−ｍｐｌリガンド、およびそのポリペプチド断片を提供する。このタンパク質は、血小板産生を刺激するためのインビボおよびエクスビボ（生体外）治療法に有用である。ＷＯ９５／２７７３２号は、環状に置換されているＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびシュードモナス（Pseudomonas）外毒素との融合体を開示している。すでに公表されている要旨（イートン（Eaton）ら、Blood 84(19)Suppl．abst ract 948，1994）では、ヒト、イヌおよびマウスで同定されたｃ−ｍｐｌリガンドの別のスプライス型のｃＤＮＡが報告されている。コードされているタンパク質は、アミノ酸１１２〜１１５の位置に４つのアミノ欠失を有する。この分子は、バイオアッセイで活性を示さなかったが、この変異体のｍＲＮＡは、これら３つの種に豊富に存在することが見いだされ、これがｃ−ｍｐｌリガンドの天然に存在する別の型である可能性を示している。タンパク質配列の並べ替え進化において、ＤＮＡ配列の並べ替えはタンパク質構造と機能の多様性を生み出す重要な役割を果たしている。特に基礎的な突然変異速度は遅いため（ドリトル（Doolittle）、Protein Science 1:191-200，1992）、遺伝子の複製とエキソンの組み替えは、急速に多様性を与え、従って競合的優位性を有する生物を提供する。組換えＤＮＡ法の開発により、タンパク質の折り畳み、構造および機能に及ぼす配列位置の移動の影響を研究することが可能になった。新しい配列を作成するのに使用されるアプローチは、そのアミノ酸配列の線状の再構成により、関連するタンパク質の天然に存在する対の再構成に類似している（カニンガム（Cunnin gham）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．76:3218-3222，1979；ティーサーとアーフル（Teather & Erfle）、J．Bacteriol．172:3837-3841，1990；シミング（Schimming）ら、Eur．J．Biochem．204:13-19，1992；ヤミウチとミナミカワ（Yamiuchi and Minamikawa）、FEBS Lett．260:127-130，1991、マグレゴー（M acGregor）ら、FEBS Lett．378:263-266，1996）。このタイプの並べ替えのタンパク質へのインビトロの最初の応用は、ゴールデンバーグとクレイトン（Golden berg and Creighton）により記載された（J．Mol．Biol．165:407-413，1983）。元々の配列の内部の部位（切断点）で新しいＮ−末端が選択され、この新しい配列は、切断点から元々のＣ−末端またはその近くのアミノ酸に達するまで、元々のアミノ酸と同じ順序を有する。この点で、直接または配列の追加部分（リンカー）を介して、新しい配列は、元々のＮ−末端またはその近くのアミノ酸に結合され、この新しい配列は、元々の配列の切断点部位のＮ−末端であったアミノ酸またはその近くの点に達するまで元々の配列と同じ配列で続き、この残基は鎖の新しいＣ−末端を生成する。このアプローチは、５８〜４６２アミノ酸の範囲のサイズのタンパク質に応用されている（ゴールデンバーグとクレイトン（Goldenberg and Creighton）、J ．Mol．Biol．165:407-413，1983；リーとコフィノ（Li & Coffino）、Mol．Cel l．Biol．13:2377-2383，1993）。調べたタンパク質は、広範囲の構造クラスであり、α−らせん（インターロイキン−４；クレイトマン（Kreitman）ら、Cyto kine 7:311-318，1995）、β−シート（インターロイキン−１；ホーリック（Ho rlick）ら、Protein Eng．5:427-431，1992）、またはこの２つの混合物（酵母ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ；ルガー（Luger）ら、Science 243 :206-210，1989）を主に含有するものがある。これらの配列の再構成研究で、広範囲のタンパク質の機能が見いだされている。酵素Ｔ４リゾチームザング（Zhang）ら、Biochemistry 32:12311-12318（1993）ザング（Zhang）ら、Nature Struct．Biol．1:434-438（1995）ジヒドロ葉酸レダクターゼブフワルダー（Buchwa1der）ら、Biochemistry 31:1621-1630（1994）プロタソバ（Protasova）ら、Prot．Eng．7:1373-1377（1995）リボヌクレアーゼＴ１ムリンズ（Mullins）ら、J．Am．Chem．Soc．116:5529-5533（1994）ガレット（Garrett）ら、Protein Science 5:204-211（1996）バシルスβ−グルカンセハーン（Hahn）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．91:10417-10421（1994）アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼヤングとシャクマン（Yang & Schachman）、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A． 90:11980-11984（1993）ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼルガー（Luger）ら、Science 243:206-210，（1989）ルガー（Luger）ら、Prot．Eng．3:249-258（1990）ペプシン／ペプシノーゲンリン（Lin）ら、Protein Science 4:159-166（1995）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼビグネス（Vignais）ら、Protein Science 4:994-1000（1995）オルニチンデカルボキシラーゼリーとコフィノ（Li & Coffino）、Mol．Cell．Biol．13:2377-2383（1993）酵母ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼリトコ−ボンソビシ（Ritco-Vonsovici）ら、Biochemistry 34:16543-16551（ 1995）酵素インヒビター塩基性膵トリプシンインヒビターゴールデンバーグとクレイトン（Goldenberg and Creighton）、J．Mol．Biol ．165:407-413（1983）サイトカインインターロイキン−１β ホーリック（Horlick）ら、Protein Eng．5:427-431（1992）インターロイキン−４クレイトマン（Kreitman）ら、Cytokine 7:311-318（1995）チロシンキナーゼ認識ドメイン α−スペクトリンＳＨ３ドメインヴィグエラ（Viguera）ら、J．Mol．Biol．247:670-681（1995）トランスメンブランタンパク質ｏｍｐＡケーブニックとクレーマー（Koebnik & Kramer）、J．Mol．Biol．250:617-6 26（1995）キメラタンパク質インターロイキン−４−シュードモナス（Pseudomonas）外毒素融合分子クレイトマン（Kreitman）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．91:6889-6893 （1994）これらの研究の結果は、大きく異なっている。多くの場合は、実質的に低い活性、溶解度または熱力学的安定性が観察された（大腸菌（E．coli）ジヒドロ葉酸レダクターゼ、アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼ、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、ｏｍｐＡ、酵母ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ）。他の場合には、配列が並べ替えられたタンパク質は、天然のものとほとんど同じ多くの性質を有するようであった（塩基性膵トリプシンインヒビター、Ｔ４リゾチーム、リボヌクレアーゼＴ１、バシルスβ−グルカナーゼ、インターロイキン−１β、α−スペクトリンＳＨ３ドメイン、ペプシノーゲン、インターロイキン−４）。例外的な場合には、天然の配列のある性質が予想外に改良されているものが観察された。例えば、並べ替えられたα−スペクトリンＳＨ３ドメイン配列の溶解度および再折り畳み速度、および並べ替えたインターロイキン−４−シュードモナス（Pseudomonas）外毒素融合分子の受容体親和性と抗癌活性（クレイトマン（Kreitman）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．91:688 9-6893(1994)；クレイトマン（Kreitman）ら、Cancer Res．55:3357-3363，1995 ）。これらのタイプの研究の主要な動機は、タンパク質の折り畳みおよび安定性の狭い範囲や広い範囲の相互作用の役割を研究することであった。このタイプの並べ替えは、元々の配列中の広い範囲の相互作用のサブセットを新しい配列の狭い範囲の相互作用に変換、およびその逆の変換をする。これらの配列の並べ替えの多くが、少なくともある活性を有するコンフォメーションを達成することができるという事実は、タンパク質の折り畳みが複数の折り畳み経路で起きることの説得力のある証拠である（ビグエラ（Viguera）ら、J．Mol．Biol．247:670-681， 1995）。α−スペクトリンのＳＨ３ドメインの場合は、β−ヘアピンの曲がり角に対応する位置で新しい末端を選択することにより、安定性が少し低いがそれでも折り畳みができるタンパク質が得られた。ここで引用した研究で使用される内部切断点の位置は、タンパク質の表面のみに見いだされ、末端または中間部に向かって明らかに偏ることなく線状の配列内に分布している（元々のＮ−末端から切断点への相対的距離の変動は、配列の全長の約１０〜８０％である）。これらの研究で元々のＮ−末端とＣ−末端をつなぐリンカーは、０〜９残基の範囲である。ある場合には（ヤングとシャクマン（ Yang & Schachman）、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．90:11980-11984，1993）、配列の一部が元々のＣ−末端セグメントから欠失し、端を切り取つたＣ−末端から元々のＮ−末端に接続されている。ＧｌｙやＳｅｒのような柔軟性のある親水性残基が、しばしばリンカーに使用される。ビグエラ（Viguera）ら（J．Mol ．Biol．247:670-681，1995）は、元々のＮ−末端とＣ−末端の３−残基リンカーまたは４−残基リンカーへの結合を比較した。３−残基リンカーは熱力学的に少し不安定であった。プロタソバ（Protasova）ら（Protein Eng．7:1373-1377 ，1994）は、大腸菌（E．coli）ジヒドロ葉酸レダクターゼの元々のＮ−末端をつなぐのに３−または５−リンカーを使用した。３−リンカーのみが高収率でタンパク質を産生した。リンカーの長さと組成のより体系的な研究は報告されていない。発明の要約本発明は、以下の式の新規ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストに関する：１．以下の式のｃ−ｍｐｌ受容体アゴニスト：（式中、１１２位のＸａａは、欠失しているか、またはＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり、１１３位のＸａａは、欠失しているか、またはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり、１１４位のＸａａは、欠失しているか、またはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり、１１５位のＸａａは、欠失しているか、またはＧｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、またはＡｓｎであり、１〜１７９アミノ酸はＣ−末端から欠失させることができ、Ｎ−末端は、直接、またはＮ−末端をＣ−末端に結合させることができ、アミノ酸：で新しいＣ−末端およびＮ−末端を有することができるリンカーを介して、Ｃ− 末端に結合され、そしてｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストはさらに、すぐ前に（メチオニン^-1）、（アラニン^-1）、または（メチオニン^-2、アラニン^-1）があってもよい）。２．以下の式のｃ−ｍｐｌ受容体アゴニスト：（式中、１１２位のＸａａは、欠失しているか、またはＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり、１１３位のＸａａは、欠失しているか、またはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり、１１４位のＸａａは、欠失しているか、またはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり、１１５位のＸａａは、欠失しているか、またはＧｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、またはＡｓｎであり、Ｎ−末端は、直接、またはＮ−末端をＣ−末端に結合させることができ、アミノ酸：で新しいＣ−末端およびＮ−末端を有することができるリンカーを介して、Ｃ− 末端に結合され、そしてｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストはさらに、すぐ前に（メチオニン^-1）、（アラニン^-1）、または（メチオニン^-2、アラニン^-1）があってもよい）。上記配列番号２のアミノ酸配列中で新しいＣ−末端およびＮ−末端を作成することができるより好適な切断点は、８０−８１、８１−８２、８２−８３、８３ −８４、８４−８５、８５−８６、８６−８７、１０８−１０９、１０９−１１０、１１０−１１１、１１１−１１２、１１２−１１３、１１３−１１４、１１４−１１５、１１５−１１６、１１６−１１７、１１７−１１８、１１８−１１９、１１９−１２０、１２０−１２１、１２１−１２２、１２２−１２３、１２３−１２４、１２４−１２５、１２５−１２６、および１２６−１２７である。上記配列番号２のアミノ酸配列中で新しいＣ−末端およびＮ−末端を作成することができる最も好適な切断点は、８１−８２、１０８−１０９、１１５−１１６、１１９−１２０、１２２−１２３、および１２５−１２６である。これらのヒトｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストは、アミノ酸置換、欠失および／または挿入を含有してもよく、Ｎ−末端およびＣ−末端の片方または両方にアミノ酸欠失を有してもよい。本発明の修飾されたヒトｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストは、以下の式で表される：Ｘ¹−（Ｌ）ａ−Ｘ² （式中、ａは０または１であり、Ｘ¹は、残基ｎ＋１からＪまでの配列に対応するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ²は、残基１からｎまでの配列に対応するアミノ酸配列を含むペプチドであり、ｎは、１からＪ−１までの範囲の整数であり、そしてＬはリンカーである）。上記式において、ヒトｃ−ｍｐｌリガンドの構成アミノ酸残基は、アミノ末端からＣ−末端に１からＪまで順に番号が付けられている。このタンパク質の中の一対の隣接アミノ酸は、それぞれｎとｎ＋１で番号が付けられ、ｎは１からＪ− １までの整数である。残基ｎ＋１は、新しいｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストの新しいＮ−末端になり、残基ｎは、新しいｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストの新しいＣ− 末端になる。本発明の好適な実施態様において、Ｎ−末端をＣ−末端に結合させるリンカー（Ｌ）は、以下よりなる群から選択されるポリペプチドである：ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号７３）、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号７４）、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号７５）、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号７６）、ＧｌｕＰｈｅＧｌｙＡｓｎＭｅｔＡｌａ（配列番号７７）、ＧｌｕＰｈｅＧｌｙＧＬｙＡｓｎＭｅｔＡｌａ（配列番号７８）、ＧｌｕＰｈｅＧＬｙＧｌｙＡｓｎＧｌｙＧｌｙＡｓｎＭｅｔＡｌａ（配列番号７９）、およびＧｌｙＧｌｙＳｅｒＡｓｐＭｅｔＡｌａＧｌｙ（配列番号８０）。本発明はまた、サイトカイン、リンホカイン、インターロイキン、造血増殖因子（本明細書ではまとめて、「コロニー刺激因子」と呼ぶ）（これらの各々は、異なるかつ特異的な細胞を介して作用して、相補的生物活性を開始する）を含む、１つまたはそれ以上のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）と同時に投与される、組換えヒトｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストを包含する。これらの同時に投与される分子は、ペプチドの両方の通常の活性を有することを特徴するか、またはヒトｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストまたは第２のコロニー刺激因子単独の存在の機能の単なる合計より大きな生物学的または生理学的活性を有することをさらなる特徴とする。同時投与はまた、予想外にヒトｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストまたは第２のコロニー刺激因子またはヒトｃ−ｍｐｌリガンド変種の存在により予測される活性またはこれとは異なる活性に対する増強作用も提供する。同時投与はまた、未変性のヒトｃ−ｍｐｌリガンドまたは未変性のサイトカインに伴う好ましくない生物活性の低下を含む、改良された活性プロフィールも有する。インビボでの本発明の同時投与の使用以外に、インビトロの使用には患者に注入する前に、骨髄、血球活性化と増殖を刺激することが企図される。図面の簡単な説明図１は、タンパク質の並べ替えを略図で示す。未変性のタンパク質のＮ−末端（Ｎ）とＣ−末端（Ｃ）は、リンカーを介して結合しているかまたは直接結合している。タンパク質は切断点で開いており、新しいＮ−末端（新しいＮ）と新しいＣ−末端（新しいＣ）ができており、新しい線状のアミノ酸配列を有するタンパク質が生成している。並べ替えられた分子は、新たに（de novo）合成されても、または元々のＮ−末端とＣ−末端の結合し切断点でタンパク質が開くという工程を受けなくてもよい。図２は、未変性のタンパク質の元々のＮ−末端とＣ−末端がリンカーで結合して、このタンパク質の異なるＮ−末端とＣ−末端が作成された、新しいタンパク質の作成を示す方法Ｉの略図を示す。この例では、配列の並べ替えにより、元々のタンパク質のアミノ酸９７で作成された新しいＮ−末端、リンカー領域を介してアミノ酸１１（アミノ酸１〜１０は削除される）に結合した元々のＣ−末端（アミノ酸１７４）、および元々の配列のアミノ酸９６で作成された新しいＣ−末端とを、有するタンパク質をコードする新しい遺伝子が得られる。図３は、未変性のタンパク質の元々のＮ−末端とＣ−末端がリンカー無しで結合して、このタンパク質の異なるＮ−末端とＣ−末端が作成された、新しいタンパク質の作成を示す方法IIの略図を示す。この例では、配列の並べ替えにより、元々のタンパク質のアミノ酸９７で作成された新しいＮ−末端、元々のＮ−末端に結合した元々のＣ−末端（アミノ酸１７４）、および元々の配列のアミノ酸９６で作成された新しいＣ−末端とを、有するタンパク質をコードする新しい遺伝子が得られる。図４は、未変性のタンパク質の元々のＮ−末端とＣ−末端がリンカーで結合して、このタンパク質の異なるＮ−末端とＣ−末端が作成された、新しいタンパク質の作成を示す方法IIIの略図を示す。この例では、配列の並べ替えにより、元々のタンパク質のアミノ酸９７で作成された新しいＮ−末端、リンカー領域を介してアミノ酸１に結合した元々のＣ−末端（アミノ酸１７４）、および元々の配列のアミノ酸９６で作成された新しいＣ−末端とを、有するタンパク質をコードする新しい遺伝子が得られる。発明の詳細な説明本発明の受容体アゴニストは、造血系の巨核球のレベルの低下を特徴とする疾患の治療に有用となり得る。ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストは、血小板減少症の治療または予防に有用となり得る。現在、血小板減少症の唯一の治療法は血小板輸血であるが、これは高価であり、感染（ＨＩＶ、ＨＢＶ）および自己免疫化の大きなリスクを有する。ｃ− ｍｐｌ受容体アゴニストは、血小板輸血の必要性を軽減または低下し得る。重症の血小板減少症は、ファンコーニ貧血、ウイスコット‐アルドリッチ症候群、またはメイ‐ヘグリン症候群のような遺伝的障害を原因として起きる。後天性血小板減少症は、免疫性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、溶血性貧血、または胎児母胎不適合性のような、自己または非自己の抗体を原因として起きる。さらに、脾腫、播種性血管内凝固、血栓性血小板減少性紫斑病、感染または人工心臓弁により、血小板減少症が起きることもある。重症の血小板減少症はまた、化学療法および／または放射線照射治療法、または癌により起きることもある。血小板減少症はまた、癌、リンパ腫、白血病または線維症による骨髄浸潤により起きることもある。本発明のｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストは、末梢血に造血始原細胞および幹細胞を動員するのに有用であり得る。末梢血由来始原細胞は、患者を自己骨髄移植の環境に再構成することが有用であることが証明されている。Ｇ−ＣＳＦやＧＭ−ＣＳＦを含む造血増殖因子は、末梢血中の循環始原細胞や幹細胞の数を増やすことが証明されている。このため、幹細胞の採取が容易になり、血漿交換が必要な回数が減少することによりコストが急激に低下した。ｃ− ｍｐｌ受容体アゴニストは、幹細胞の動員に有用であり、末梢幹細胞移植の効果をさらに増強するかも知れない。多くの薬物が、骨髄抑制または造血系欠乏を引き起こす。このような薬物の例としては、ＡＺＴ、ＤＤＩ、アルキル化剤および化学療法に使用される抗代謝物剤、抗生物質（例えば、クロラムフェニコール、ペニシリン、ガンシクロビル、ダウノマイシン、およびサルファ剤）、フェノチアゾン類、精神安定剤（例えば、メプロバメート）、麻酔剤（例えば、アミノピリンやジピロン）、抗けいれん剤（例えば、フェニトイン、カルバマゼピン）、抗甲状腺剤（例えば、プロピルチオウラシルやメチマゾール）、および利尿剤がある。ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストは、これらの薬物で治療されている患者で発生する骨髄抑制または造血系欠乏の防止または治療に有用であるかも知れない。造血系欠乏はまた、ウイルス、微生物または寄生体感染の結果として、および腎疾患または腎不全の治療（例えば、透析）の結果として起きる可能性がある。ｃ−ｍｐｌリガンドはこのような造血系欠乏の治療に有用である可能性がある。本発明の別の面として、ヒトｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストの新規ファミリーを産生する新規方法が提供される。本発明の方法では、新規ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストポリペプチドの発現をコードするＤＮＡ配列を含有するベクターで形質転換した、適切な細胞または細胞株を培養する。適切な細胞または細胞株には、大腸菌（E．coli）の種々の株、酵母、哺乳動物細胞、または昆虫細胞があり、本発明の方法において宿主細胞として利用できる。本発明の別の面は、これらの新規ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストの発現法で使用されるプラスミドＤＮＡベクターを提供する。これらのベクターは、本発明の新規ポリペプチドをコードする上記の新規ＤＮＡ配列を含有する。ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストを発現することができる微生物を形質転換することができる適切なベクターには、使用される宿主細胞に応じて選択される、転写および翻訳制御配列に結合したｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストをコードするヌクレオチド配列からなる発現ベクターを含む。上記の修飾配列を取り込んだベクターは本発明に含まれ、ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストポリペプチドの産生に有用である。この方法で使用されるベクターはまた、本発明の配列をコードするＤＮＡと協調して作用し、選択された宿主細胞中でその複製および発現を指令することができる、選択された制御配列を含有する。本発明の他の面は、上記症状を治療するための方法および治療用組成物である。このような組成物は、薬剤学的に許容される担体と混合された、治療上有効量の１つまたはそれ以上の本発明のｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストを含む。この組成物は、非経口的に、静脈内にまたは皮下に投与することができる。投与される時、本発明で使用される治療用組成物は、好ましくは発熱物質のない、非経口的に受容される水溶液の形である。このような、ｐＨ、等張性、安定性などが関係する非経口的に受容されるタンパク質溶液の調製は、当該分野の範囲である。本発明のｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストは、末梢血中の多分化能始原細胞の動員に有用であり得る。末梢血由来の始原細胞は、自己骨髄移植の環境に患者を再構成するのに有用であることが証明されている。Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦを含む造血増殖因子は、末梢血中の循環始原細胞および幹細胞の数を増やすことが証明されている。このため、末梢血幹細胞の採取が容易になり、血漿交換が必要な回数が減少することによりコストが大幅に低下した。ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストは、幹細胞の動員に有用であり、末梢幹細胞移植の効果をさらに増強し得る。本発明のｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストはまた、多分化能造血細胞のエクスビボ拡張に有用であるかも知れない。ｈＩＬ−３のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）は、単独で投与されるか、他のコロニー刺激因子と同時投与されるか、しばしばこのような高用量化学療法の結果である好中球減少症や血小板減少症を治療するための高用量化学療法後の骨髄移植と組合せて、投与される。しかし、重症の好中球減少症や血小板減少症は、完全には排除できないこともある。単球（マクロファージ）、顆粒球（好中球を含む）および巨核球からなる骨髄系統は、生死に関わる感染症や出血を防止するのに決定的に重要である。好中球減少症や血小板減少症はまた、疾患、遺伝的障害、薬物、毒物、放射線照射、および多くの治療処置（例えば、通常の癌治療）の結果でもある。骨髄移植は、この患者集団の治療に使用されている。しかし、骨髄を使用して易感染性宿主の造血系を再構成することにはいくつかの問題がある：１）骨髄または他のものの幹細胞の数は限られている、２）移植片対宿主反応病、３）移植片拒絶、および４）腫瘍細胞の混入の可能性。幹細胞は、骨髄、脾臓および末梢血中の有核細胞のほんの一部を構成する。より多くの数の幹細胞が造血系の回復を増強するような用量応答が存在することは明らかである。従って、幹細胞のインビトロでの拡張は、造血系の回復と患者の生存を増強するはずである。移植用の骨髄を提供するのに、同種のドナーからの骨髄が使用されている。しかし、移植片対宿主反応病および移植片拒絶が、ＨＬＡの一致した兄弟姉妹のドナーの受容者でさえ骨髄移植を制限している。同種骨髄移植の代替法は、自己骨髄移植である。自己骨髄移植では、骨髄切除治療法（例えば、高用量化学療法）の前に患者自身の骨髄の一部を採取し、後に患者自身に戻す。自己移植は、移植片対宿主反応病や移植片拒絶のリスクが無い。しかし、自己骨髄移植には、骨髄中の幹細胞の数が限定されていること、および腫瘍細胞が混入している可能性があることなどの問題がある。幹細胞の数が限定されている問題は、幹細胞をエクスビボで拡張させることにより克服できる。さらに、幹細胞はＣＤ３４＋のような特異的表面抗原の存在により選択して特異的に単離して、骨髄移植体の腫瘍細胞の混入量を減少させることができる。以下の特許は、幹細胞、ＣＤ３４＋細胞の分離、造血因子を用いるこれらの細胞の培養、造血系疾患を有する患者の治療のためのこれらの細胞の使用、および細胞拡張と遺伝子治療のための造血因子の使用について、さらに詳細に説明する。５，０６１，６２０号は、特定の細胞から幹細胞を分離することにより提供されるヒト造血幹細胞からなる組成物に関する。５，１９９，９４２号は、（１）患者から造血始原細胞を得て、（２）ＩＬ− ３、ｆｌｋ３リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＧＭ− ＣＳＦ／ＩＬ−３融合タンパク質、およびこれらの組合せよりなる群から選択される増殖因子で、細胞をエクスビボ拡張し、（３）患者に細胞調製物を投与することからなる、自己造血細胞移植のための方法を記載する。５，２４０，８５６号は、細胞分離工程を自動的に制御する装置を含む、細胞分離器に関する。ＷＯ９１／１６１１６号は、細胞の混合物から標的細胞を選択的に単離および分離するための装置と方法を記載する。ＷＯ９１／１８９７２号は、中空糸バイオリアクターを使用して骨髄細胞の懸濁物をインキュベートすることによる、骨髄のインビトロ培養法を記載する。ＷＯ９２／１８６１５号は、移植で使用するためのサイトカインの特異的混合物を含有する培地中で、骨髄細胞を維持し拡張する方法に関する。ＷＯ９３／０８２６８号は、（ａ）ＣＤ３４＋幹細胞を他の細胞から分離し、（ｂ）分離した細胞を選択的培地中でインキュベートして、幹細胞を選択的に拡張する工程からなる、幹細胞を選択的に拡張させる方法に関する。ＷＯ９３／１８１３６号は、末梢血由来の哺乳動物細胞のインビトロでの支持のための方法を記載する。ＷＯ９３／１８６４８号は、遺伝性または後天性の好中球減少症を治療するための、骨髄芽球および前骨髄球の高含量のヒト好中球始原細胞からなる組成物に関する。ＷＯ９４／０８０３９号は、ｃ−ｋｉｔタンパク質を発現する細胞の選択によるヒト造血幹細胞の濃縮法を記載する。ＷＯ９４／１１４９３号は、向流水簸法を用いて単離される、ｃｄ３４＋でありサイズの小さい幹細胞集団を記載する。ＷＯ９４／２７６９８号は、異種細胞混合物から有核異種細胞集団を選択的に分離するための、免疫親和性分離と連続流遠心分離を組合せた方法に関する。ＷＯ９４／２５８４８号は、標的細胞の採取と操作のための細胞分離装置を記載する。ＩＬ−１ａ、ＩＬ−３、ＩＬ−６またはＧＭ−ＣＳＦを含有する培養物中のヒト骨髄からの造血始原細胞の高度濃縮ＣＤ３４＋始原細胞の長期培養が、ブラント（Brandt）ら、J．Clin．Invest．86:932-941，1990、で考察されている。本発明の１つの面は幹細胞の選択的エクスビボ拡張法を提供する。「幹細胞」という用語は、多分化能造血細胞、ならびに骨髄、脾臓または末梢血から単離できる初期始原細胞および前駆細胞を意味する。「拡張」という用語は細胞の分化と増殖を意味する。本発明は、（ａ）幹細胞を他の細胞から分離し、（ｂ）分離した幹細胞を、ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストと随時コロニー刺激因子を含有する選択的培地で培養し、および（ｃ）幹細胞を採取する工程からなる、幹細胞の選択的エクスビボ拡張法を提供する。好中球、赤血球、血小板などになるように運命付けられている幹細胞ならびに始原細胞は、これらの細胞表面上のＣＤ３４のような特定の始原細胞マーカー抗原の有無および／または形態的特徴により、他の細胞から区別される。高度に濃縮されたヒト幹細胞画分の表現型はＣＤ３４＋、Ｔｈｙ−１＋およびｌｉｎ−として報告されているが、本発明はこの幹細胞集団の拡張に限定されないことに注意されたい。ＣＤ３４＋が濃縮されたヒト幹細胞画分は、ＣＤ３４＋のような表面抗原に対する抗体を使用して、親和性カラムまたはビーズ、磁性ビーズ、またはフローサイトメトリーなどの多くの報告された方法により分離できる。さらに向流水簸法のような物理的分離法が造血始原細胞の濃縮に使用できる。ＣＤ３４＋始原細胞は不均一であり、異なる系統関連細胞表面結合分子の同時発現の有無により特徴付けられるいくつかの亜集団に分類される。最も未成熟な始原細胞は、既知の系統関連マーカー（例えば、ＨＬＡ− ＤＲ、またはＣＤ３８）を発現しないが、ＣＤ９０（ｔｈｙ−１）を発現することがある。ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ７１、ＨＬＡ−ＤＲ、またはｃ −ｋｉｔのような他の表面抗原も、造血始原細胞を選択的に単離するのに使用できる。分離された細胞は、培養フラスコ、無菌バッグまたは中空糸中の選択培地中でインキュベートされる。細胞を選択的に拡張するために種々のコロニー刺激因子が利用できる。骨髄のエクスビボ拡張のために利用されている代表的な因子には、ｃ−ｋｉｔリガンド、ＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ｆｌｔ−３リガンドまたはこれらの組合せがある。幹細胞の増殖は、インキュベート後に標準的方法（例えば、血球計算計、ＣＦＵ、ＬＴＣＩＣ）またはフローサイトメトリーにより、幹細胞および他の細胞の数を計測することにより、追跡することができる。ｃ−ｋｉｔリガンド（ブラント（Brandt）ら、Blood 83:1507-1514，1994；マケンナ（McKenna）ら、Blood 86:3413-3420，1995）；ＩＬ−３（ブラント（Bra ndt）ら、Blood 83:1507-1514，1994；サト（Sato）ら、Blood 82:3600-3609，1 993）、Ｇ−ＣＳＦ（サト（Sato）ら、Blood 82:3600-3609，1993）、ＧＭ−ＣＳＦ（サト（Sato）ら、Blood 82:3600-3609，1993）、ＩＬ−１（ムエンチ（Mu ench）ら、Blood 81:3463-3473，1993）、ＩＬ−６（サト（Sato）ら、Blood 82 :3600-3609，1993）、ＩＬ−１１（レモリ（Lemoli）ら、Exp．Hem．21:1668-16 72，1993；サト（Sato）ら、Blood 82:3600-3609，1993）、ｆｌｔ−３リガンド（マケンナ（McKenna）ら、Blood 86:3413-3420，1995）、および／またはこれらの組合せ（ブラント（Brandt）ら、Blood 83:1507-1514，1994；ヘイロック（ Haylock）ら、Blood 80:1405-1412，1992；コラー（Koller）ら、Biotechnology 11:358-363，1993；（レモリ（Lemoli）ら、Exp．Hem．21:1668-1672，1993）、マケンナ（McKenna）ら、Blood 86:3413-3420，1995；ムエンチ（Muench）ら、Blood 81:3463-3473，1993；パッチェン（Patchen）ら、Biotherapy 7:13-26 ，1994；サト（Sato）ら、Blood 82:3600-3609，1993；スミス（Smith）ら、Exp ．Hem．21:870-877，1993；スティーン（Steen）ら、Stem Cells 12：214-224， 1994；ツジノ（Tsujino）ら、Exp．Hem．21:1379-1386，1993）を含む、種々のコロニー刺激因子を使用して、多くの選択法と拡張法を利用する、幹細胞のエクスビボ拡張のいくつかの方法が報告されている。各コロニー刺激因子の中で、ｈＩＬ−３は、末梢血ＣＤ３＋細胞を拡張するのに最も強力なものの１つであることが証明されている（サト（Sato）ら、Blood 82:3600-3609，1993；コバヤシ（ Kobayashi）ら、Blood 73:1836-1841，1989）。しかし、単一の因子で、複数の因子の組合せのように有効なものは証明されていない。本発明は、より有効なｃ −ｍｐｌ受容体アゴニストを利用するエクスビボ拡張法を提供する。本発明の他の面は、本発明のｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストを補足したＨＳ−５（ＷＯ９６／０２６６２号、レクレインとトロック−ストロブ（Roecklein and Torok-Strob）、Blood 85:997-1105，1995）のような間質性細胞株への暴露により調整される培地を有する、培養容器中に細胞を接種することを含む、造血前駆細胞を維持および／または拡張する方法を提供する。増殖因子の他の目的とする臨床応用は、遺伝子治療法のための造血始原細胞と幹細胞のインビトロでの活性化である。造血始原細胞の寿命の長さと体全体へのその娘細胞の分布のため、造血始原細胞は、エクスビボ遺伝子トランスフェクションの良好な候補である。目的の遺伝子を造血始原細胞または幹細胞のゲノム内に取り込むために、細胞分裂およびＤＮＡ複製を刺激することが必要である。造血幹細胞のサイクルの頻度は非常に低く、これは、遺伝子導入を促進し、従って遺伝子治療法の臨床的期待を増大させるのに、増殖因子が有用であり得ることを意味する。遺伝子治療の応用の可能性（総説クリスタル（Crystal）、Science 2 70:404-410，1995）には、１）多くの先天性代謝障害および免疫不全症（ケイとウー（Kay and Woo）、Trends Genet．10:253-257，1994）、２）神経障害（フリードマン（Friedmann）、Trends Genet．10:210-214，1994）、３）癌（カルバーとブラエセ（Culver and Blaese）、Trends Genet．10:174-178，1994）、および４）感染症（ギルボアとスミス（Gilboa and Smith）、Trends Genet．10 ：139-144，1994）がある。遺伝物質を宿主細胞に導入するための、当業者に公知の種々の方法がある。初代細胞に治療用遺伝子を移すために、ウイルス性および非ウイルス性の多くのベクターが開発されている。ウイルス性のベクターには、１）複製欠損組換えレトロウイルス（ボリス−ローリーとテミン（Boris-Lawrie and Temin）、Curr．Op in．Genet．Dev．3:102-109，1993；ボリス−ローリーとテミン（Boris-Lawrie and Temin）、Annal．New York Acad．Sci．716:59-71，1994；ミラー（Miller ）、Current Top．Microbiol．Immunol．158: 1-24，1992）、および複製欠損組換えアデノウイルス（バークナー（Berkner）、BioTechniques 6:616-629，1988 ；バークナー（Berkner）、Current Top．Microbiol．Immunol．158:39-66，199 2；ブローディとクリスタル（Brody and Crystal）、Annal．New York Acad．Sc i．716:90-103，1994）がある。非ウイルス性のベクターには、タンパク質／ＤＮＡ複合体（クリスチアーノ（Cristiano）ら、PNAS USA．90:2122-2126，19 93；クリエル（Curiel）ら、PNAS USA 88:8850-8854，1991；クリエル（Curiel ）ら、Annal．New York Acad．Sci．716:36-58，1994）、電気穿孔法および陽イオン性リポソームのようなリポソーム介在送達（ファーフッド（Farhood）ら、A nnal．New York Acad．Sci．716:23-35，1994）がある。本発明は、いかなる単一のコロニー刺激因子および／または物理的性質によっても見られない活性を含む、改良された生物活性を有するｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストを利用する方法を提供するという点で、新しい遺伝物質が導入されている造血細胞を拡張するための既存の方法の改良を提供する。上記症状を治療するための方法に関与する投与計画は、薬物の作用に影響する種々の要因（例えば、患者の症状、体重、性および食事、感染があればその重症度、投与時期、および他の臨床的因子）を考慮して、担当医師が決定するであろう。一般に１日の投与量は、体重１kg当たり非グリコシル化ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニスト０．２〜１５０μｇ/kgの範囲である。投与量は特定の受容体アゴニストの活性に対して調整され、１日に体重１kg当たり０．１μｇの少量から１mgの多量までの範囲を含むことが非現実的であるということはない。さらに、ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストの投与量が、体重１kg当たり０．２〜１５０μｇの範囲より多いかまたは少ないように調整される特定の状況もある。これらには、他のＣＳＦまたは増殖因子との同時投与、化学療法剤および／または放射線照射との同時投与、グリコシル化ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストの使用、およびこのセクションですでに記載した種々の患者に関する条件がある。前述のように、治療法および組成物はまた、他のヒト因子との同時投与を含んでもよい。本発明のポリペプチドとの同時投与または連続的同時投与のための他の適切なヘマトポエチン、ＣＳＦおよびインターロイキンの非限定的リストには、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＬＩＦ、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２リガンド、ヒト成長ホルモン、Ｂ細胞増殖因子、Ｂ細胞分化因子、好酸球分化因子および、スティール因子（steel factor）またはｃ−ｋｉｔとしても知られている幹細胞因子（ＳＣＦ）、（これらは、本明細書ではまとめて「コロニー刺激因子」と呼ぶ）、またはこれらの組合せがある。上記リスト以外に、ＷＯ９４／１２６３９号およびＷＯ９４／１２６３８号に記載のＩＬ−３変種は、本発明のポリペプチドと同時投与できる。本発明のｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストは、ＷＯ９５／２０９７６号およびＷＯ９５／２Ｏ９７７号に記載のような方法中の他の「コロニー刺激因子」とともに同時投与することができる。前述の投与量は、治療用組成物中のこのような追加の成分を補償するように調整されるであろう。治療した患者の進行は、血液学的プロフィール（例えば、血球百分率など）を定期的に評価することにより追跡することができる。リンカーの決定リンカーのアミノ酸配列の長さは、経験的にまたは構造情報を参考にして、または２つのアプローチの組合せにより選択することができる。構造情報が手に入らない場合は、０〜５０Åの範囲にわたるように長さを変化させ、配列が表面露出（親水性、ホップとウッズ（Hopp & Woods）、Mol．Immun ol．20:483-489，1983；カイトとドリトル（Kyte & Doolittle）、J．Mol．Biol ．157:105-132，1992；溶媒に露出される表面積、リーとリチャーズ（Lee & Ric hards）、J．Mol．Biol．55:379-400，1971）と、ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストのコンフォメーションを変化させることなく必要なコンフォメーションを取る能力（コンフォメーション的に柔軟性がある；カープラスとシュルツ（Karplus & Schulz）、Naturwissenschaften 72:212-213，1985）に一致するように選択される、デザインを使用して試験するために調製される。残基当たり２．０〜３．８ Åの翻訳の平均を仮定すると、これは、試験すべき長さは０〜３０残基であり、０〜１５残基が好ましい範囲であることを意味する。このような経験的シリーズの例は、ｎ回（ｎは、１、２、３、または４である）繰り返されるＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３）のようなカセット配列を使用してリンカーを作製することであろう。当業者は、リンカーとして作用する長さまたは組成が変化する多くのこのような配列があり、最初に考慮すべきことは、これらが過剰に長くなくまた短くもないこと（サンズウ（Sandhu）、Critical Rev．Biotech．1 2:437-462，1992）であり、もし長すぎるなら、エントロピー作用が３次元の折り畳みを不安定にする可能性があり折り畳みを速度論的に不可能にし、そして短すぎるなら、ねじれ力または立体的ひずみのため分子を不安定にする可能性があることは、理解されるであろう。タンパク質の構造解析の当業者は、鎖の末端の間の距離（ｃ−アルファ炭素間の距離として定義される）を使用することは、使用される配列の長さを定義するか、または少なくとも、リンカーの経験的選択で試験しなければならないいくつかのの可能性の数を限定するために使用できることは認識できるであろう。また、ポリペプチド鎖の末端の位置は、Ｘ線回折または核磁気共鳴分光分析データから得られるモデルでは、時に正しく定義されていないことがあり、また正しい場合はこれを考慮して、必要なリンカーの長さを正しく推定する必要があることも理解できるであろう。その位置が正しく定義されている残基から、鎖の末端に配列が近い２つの残基が選択され、そのｃ−アルファ炭素間の距離を使用して、その間のリンカーのおよその長さが計算される。次に計算された長さを指標として使用して、ある範囲の数の残基（残基当たり２〜３．８Åを使用して計算される）を有するリンカーが選択される。これらのリンカーは、元々の配列（必要に応じて短くなっていても長くなっていてもよい）から構成され、長くなっている場合は、前述のように柔軟で親水性を有するように追加の残基が選択されるか、または、配列は、一連のリンカーを使用して随時置換してもよく、その一例は前述のＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３）カセットアプローチであり、または、元々の配列と、適切な全体の長さを有する新しい配列の組合せが随時使用される。ｃ−ｍｐｌリガンドのアミノ末端およびカルボキシ末端の決定生物活性のある状態に折り畳まれるｃ−ｍｐｌリガンドの配列は、元々のポリペプチド鎖内から初め（アミノ末端）と終わり（カルボキシ末端）の位置を適切に選択して、一方リンカー配列を前述のように使用することにより、調製できる。アミノ末端およびカルボキシ末端は後述のガイドラインに従って、切断点領域と呼ばれる配列の共通の部分内から選択される。従って、新規のアミノ酸配列は、同じ切断点領域からアミノ末端およびカルボキシ末端を選択することにより作成される。多くの場合、新しい末端の選択は、カルボキシ末端の元々の位置がアミノ末端の直前にあるようなものであろう。しかし、この領域内の任意の場所で末端を選択したものは機能し、これらは有効に、新しい配列のアミノ末端またはカルボキシ末端への欠失または付加となることは、当業者は容易に理解できるであろう。タンパク質の一次アミノ酸配列がその生物的機能の発現に必要な３次元構造への折り畳みを支配するということは、分子生物学の中心的教義である。単一のタンパク質結晶のＸ線回折またはタンパク質溶液の核磁気共鳴分光学的分析を使用して、３次構造情報を得て解釈する方法は当業者に公知である。切断点の同定に関係する構造情報の例としてはタンパク質の２次構造の位置とタイプ（アルファおよび３〜１０らせん、平行および非平行のベータシート、鎖の逆転および回転、およびループ；カブシュとサンダー（Kabsch & Sander）、Biopolymers 22:25 77-2637，1983）、アミノ酸残基の溶媒への露出の程度、残基同士の相互作用の程度とタイプ（チョチア（Chothia）、Ann．Rev．Biochem．53:537-572，1984）、およびポリペプチド鎖に沿ったコンフォメーションの静的および動的分布（アルバーとマシューズ（Alber & Mathews）、Methods Enzymol．154:511-533，198 7）がある。残基の溶媒露出について追加の情報がある場合もある。１つの例はタンパク質の表面で必要な炭水化物の翻訳後の付着部位である。実験的構造情報が入手できない時または得ることが現実的でない時、一次アミノ酸配列を解析してタンパク質の３次構造および２次構造、溶媒の近づき易さ、および回転やループの存在を推定する方法がある。直接的構造法が現実的でない場合、表面露出を経験的に決定する生化学的方法もある。例えば表面露出を推定するために限定的タンパク質分解を行った後、鎖の切断の部位を同定する（ゲンチルとサルバトーレ（Gentile & Salvatore）、Eur．J．Biochem．218:603-621，1993）。すなわち、実験的に得られる構造情報または予測方法（例えば、スリニビサンとローズ（Srinivisan & Rose）、Proteins:Struct.，Funct．& Genetics，22:81-99，19 95）を使用して親のアミノ酸配列を調べて、これらが２次および３次構造の維持に必要であるかどうかにより領域を分類する。周期的２次構造（アルファおよび３〜１０らせん、平行および非平行のベータシート）に関与することがわかっている領域内の配列の存在は避けるべき領域である。同様に、保存されているかまたは溶媒露出の程度が低いことが観察されるか予測されるアミノ酸配列の領域は、いわゆるタンパク質の疎水性の核の一部である可能性があり、アミノ末端およびカルボキシ末端の選択のためには避けるべきである。これに対して表面回転またはループ内にあることが既知であるか予測される領域、特に生物活性に必要でないことが明らかな領域は、ポリペプチド鎖の端の位置には好適な部位である。上記基準に基づいて好適なアミノ酸配列の連続的部分は切断点と見なされる。本明細書に引用されるすべての文献、特許または出願は、参考のため本明細書に組み込まれる。材料と方法特に明記しない場合、すべての特殊化学薬品は、シグマ社（Sigma Co.）（セントルイス、ミズーリ州）から得た。制限エンドヌクレアーゼとＴ４ＤＮＡリガーゼは、ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs）（ビバリー、マサチューセッツ州）から得た。新しいＮ−末端／Ｃ−末端を有する遺伝子の作成方法方法Ｉ．リンカー領域を含有する新しいＮ−末端／Ｃ−末端を有する遺伝子の作成元々のＣ−末端とＮ−末端を分離するリンカー領域を含有する新しいＮ−末端／Ｃ−末端を有する遺伝子は、基本的にエル・エス・ムリンズ（L.S．Mullins）らの記載した方法（J．Am．Chem．Soc．116:5529-5533，1994）により作成できる。タンパク質の一次アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を並べ替えるのに、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）増幅の複数の工程が使用できる。その工程を図２に例示する。第１の工程で、第１のプライマーセット（「新しい開始点」と「リンカー開始点」）を使用して、遺伝子配列から新しいタンパク質の新しいＮ−末端部分と、その後に続く元々のタンパク質のＣ−末端とＮ−末端をつなぐリンカーを、コードする配列を含有するＤＮＡ断片（「断片開始点」）を、作成し増幅する。第２の工程で、第２のプライマーセット（「新しい停止点」と「リンカー停止点」）を使用して、遺伝子配列から、前記のものと同じリンカーとその後に続く新しいタンパク質のＣ−末端をコードする配列を含有するＤＮＡ断片（「断片停止点」）を、作成し増幅する。「新しい開始点」と「新しい停止点」プライマーは、発現プラスミド中への新しい遺伝子のクローニングを可能にする適切な制限部位を含むように設計する。典型的なＰＣＲ条件は、９５℃溶解を２分が１サイクル、９４℃変性を１分、５０℃アニーリングを１分、および７２℃伸長を１分が、２５サイクル、および７２℃伸長を７分が１サイクルである。パーキン・エルマー・ジーンアンプＰＣＲコア試薬（Perkin-Elmer GeneAmp PCR Core Reagents）キットが使用される。１００μｌの反応物は、１００pmolの各プライマーと１μｇの鋳型ＤＮＡ、および１×ＰＣＲ緩衝液、２００μＭｄＧＴＰ、２００μＭｄＡＴＰ、２００μＭｄＴＴＰ、２００μＭｄＣＴＰ、２．５単位のアンプリタク（AmpliTaq）ＤＮＡポリメラーゼと２mM ＭｇＣｌ₂を含有する。ＰＣＲ反応はモデル４８０ＤＮＡサーマルサイクラー（パーキン・エルマー社（Perk in-Elmer Corporation）、ノーウォーク（Norwalk）、コネチカット州）で行う。リンカー領域中に相補的配列とリンカーの両側に２つのアミノ酸のコード配列を有する「断片開始点」と「断片停止点」を、第３のＰＣＲ工程で結合させて新しいタンパク質をコードする完全長遺伝子を作成する。ＤＮＡ断片「断片開始点」と「断片停止点」を１％ＴＡＥゲルで分離し臭化エチジウムで染色し、キアエックス（Qiaex）ゲル抽出キット（キアゲン（Quiagen））で単離する。これらの断片を等モル量で組合せ、７０℃で１０分加熱しゆっくり冷却して「リンカー開始点」と「リンカー停止点」中の共通の配列を介してアニーリングさせる。第３のＰＣＲ工程で、アニーリングした断片にプライマー「新しい開始点」と「新しい停止点」を加えて完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成し増幅する。典型的なＰＣＲ条件は、９５℃溶解を２分が１サイクル、９４℃変性を１分、６０℃アニーリングを１分、および７２℃伸長を１分、が２５サイクル、および７２℃伸長を７分が１サイクルである。パーキン・エルマー・ジーンアンプＰＣＲコア試薬（Perkin-Elmer GeneAmp PCR Core Reagents）キットを使用する。１００μｌの反応物は、１００pmolの各プライマーと約０．５μｇのＤＮＡ、および１×ＰＣＲ緩衝液、２００μＭｄＧＴＰ、２００μＭｄＡＴＰ、２００μＭｄＴＴＰ、２００μＭｄＣＴＰ、２．５単位のアンプリタク（Amp1iTaq）ＤＮＡポリメラーゼと２mM ＭｇＣｌ₂を含有する。ＰＣＲ反応物はウィザードＰＣＲプレプス（Wizard PCR Preps）キット（プロメガ（Promega））を使用して精製する。方法II．リンカー領域の無い新しいＮ−末端／Ｃ−末端を有する遺伝子の作成ＰＣＲ増幅と平滑末端結合の２つの工程を使用して、元々のＮ−末端とＣ−末端を結合させるリンカー領域の無い新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子が作成できる。工程を図３に例示する。第１の工程で、第１のプライマーセット（「新しい開始点」と「Ｐ−ｂｌ開始点」）を使用して、元々の遺伝子配列から新しいタンパク質の新しいＮ−末端部分をコードする配列を含有するＤＮＡ断片（「断片開始点」）を作成し増幅する。第２の工程で、第２のプライマーセット（「新しい停止点」と「Ｐ−ｂｌ停止点」）を使用して、遺伝子配列から新しいタンパク質の新しいＣ−末端部分をコードする配列を含有するＤＮＡ断片（「断片停止点」）を、作成し増幅する。「新しい開始点」と「新しい停止点」プライマーは、発現ベクターへの新しい遺伝子のクローニングを可能にする適切な制限部位を含むように設計される。典型的なＰＣＲ条件は、９５℃溶解を２分が１サイクル、９４℃変性を１分、５０℃アニーリングを４５秒、および７２℃伸長を４５秒が、２５サイクルである。ディープベント（Deep Vent）ポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs））を使用して、製造業者の勧める条件でオーバーハングの発生を低下させる。「Ｐ−ｂｌ開始点」と「Ｐ−ｂｌ停止点」プライマーは５’末端でリン酸化して、以後の「断片開始点」と「断片停止点」の互いの平滑末端結合を補助する。１００μｌの反応物は、１５０pmol の各プライマーと１μｇの鋳型ＤＮＡ、および１×ベント（Vent）緩衝液（ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs））、３００μＭｄＧＴＰ,３００μＭｄＡＴＰ、３００μＭｄＴＴＰ、３００μＭｄＣＴＰ、および１単位のディープベント(DeepVent)ポリメラーゼを含有する。ＰＣＲ反応はモデル４８０ＤＮＡサーマルサイクラー（パーキン・エルマー社（Perkin-Elmer Corporation）、ノーウォーク（Norwalk）、コネチカット州）で行った。ＰＣＲ反応物はウィザードＰＣＲプレプス（Wizard PCR Preps）キット（プロメガ（ Promega））を使用して精製する。プライマーは、発現ベクターへの新しい遺伝子のクローニングを可能にする適切な制限部位を含むように設計される。典型的には、「断片開始点」は、ＮｃｏＩ制限部位を作成するように設計され、「断片停止点」はＨｉｎｄIII制限部位を作成するように設計される。制限消化反応物は、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（Magic DNA Clean-up System kit）（プロメガ（Promega））を使用して精製される。断片開始点と断片停止点は、１％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し、キアエックス（Qiaex）ゲル抽出キット（キアゲン（Qui agen））を使用して単離する。これらの断片を、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIベクター断片の末端に組合せて、５０℃で１０分加熱してアニーリングし、ゆっくり冷却する。３つの断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannheim））を使用して結合させる。結果は、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子を含有するプラスミドである。結合反応物の一部を使用して、大腸菌（E．coli）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Life Technologies）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）を形質転換する。プラスミドＤＮＡを精製し、配列を下記のように確認する。方法III．縦列（tandem）複製法による新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子の作成新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子は、アール・エー・ホーリック（R.A．Horli ck）らの記載した方法（Protein Eng．5:427-431，1992）により作成できる。新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子のポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）増幅は、縦列に複製した鋳型ＤＮＡを使用して行われる。その工程を図４に例示する。縦列に複製した鋳型ＤＮＡは、クローニングにより作成され、遺伝子の２つのコピーの元々のＣ−末端とＮ−末端をつなぐリンカーをコードするＤＮＡ配列により分離される遺伝子の、２つの類似の（しかし、必ずしも同一ではない）コピーを含有する。特異的なプライマーセットは、縦列に複製した鋳型ＤＮＡから、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端を作成し増幅するのに使用される。これらのプライマーは、発現ベクターへの新しい遺伝子のクローニングを可能にする適切な制限部位を含むように設計される。典型的なＰＣＲ条件は、９５℃溶解を２分が１サイクル、９４℃変性を１分、５０℃アニーリングを１分、および７２℃伸長を１分が、２５サイクル、および７２℃伸長を７分が１サイクルである。パーキン・エルマー・ジーンアンプＰＣＲコア試薬（Perkin-Elmer GeneAmp PCR Cor e Reagents）キット（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）、ノーウォーク（No rwalk）、コネチカット州）が使用される。１００μｌの反応物は、１００pmol の各プライマーと１μｇの鋳型ＤＮＡ、および１×ＰＣＲ緩衝液、２００μＭｄＧＴＰ、２００μＭｄＡＴＰ、２００μＭｄＴＴＰ、２００μＭｄＣＴＰ、２．５単位のアンプリタク（AmpliTaq）ＤＮＡポリメラーゼと２mM ＭｇＣｌ₂を含有する。ＰＣＲ反応はモデル４８０ＤＮＡサーマルサイクラー（パーキン・エルマー社（Perkin-Elmer Corporation）、ノーウォーク（Norwalk）、コネチカット州）で行った。ＰＣＲ反応物はウィザードＰＣＲプレプス（Wizard P CR Preps）キット（プロメガ（Promega））を使用して精製する。ＰＣＲ鋳型の作成は以下に概説する工程を含む１．逆転写酵素／ポリメラーゼチェイン反応（ＲＴ／ＰＣＲ）によるアミノ酸コドン１１２〜１１５を含むかまたは含まないｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子の作成。ヒトの肝臓は、アミノ酸１１２〜１１５の欠失を含むかまたは含まないｃ−ｍｐｌリガンドｍＲＮＡを含有する。２．哺乳動物発現ベクターへのＰＣＲ産物のサブクローニング。３．ｉ）遺伝子Ｉ位置のためのｃ−ｍｐｌリガンドアミノ酸１〜１５３をコードする遺伝子；ii）２つの遺伝子の分離のためのユニークな合成リンカー；およびiii）遺伝子II位置のためのアミノ酸１１２〜１１５を含むかまたは含まないｃ−ｍｐｌリガンドアミノ酸１〜１５３をコードする遺伝子。工程１：逆転写酵素／ポリメラーゼチェイン反応２つの型のｃ−ｍｐｌリガンド（１つはアミノ酸１１２〜１１５の欠失を有し、１つは欠失が無い）は、ＲＴ／ＰＣＲ技術により単離することができる。合成プライマーは、最初の鎖の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）合成をプライムするためのｃ−ｍｐｌリガンドＤＮＡまたはｍＲＮＡ（ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号Ｌ３３４１０またはデサウバジ（de Sauvage）ら、Nature 369，1994，pp.5 33538）に基づくｃ−ｍｐｌリガンド配列）のいずれかにアニーリングするように設計される。追加のＰＣＲで使用されるかまたは大腸菌（E．coll）または哺乳動物発現プラスミドへの移動のための適切な制限酵素で消化できる２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡまたはＤＮＡ）を作成するために、得られるｃＤＮＡはｐＣＲ（サイキ（Saiki）、1985）の鋳型として使用される。逆転写（ＲＴ）反応のために、ヒト胎児肝（ロット＃３８１３０）および成人肝（ロット＃４６０１８）のＡ＋ＲＮＡが、クロンテク（Clontech）（パロアルト、カリホルニア州）から得られる。ＲＴ反応は、インビトロゲン（InVitrogen ）（サンジエゴ、カリホルニア州）から得られるｃＤＮＡサイクル（Cycle）（登録商標）キットを使用して行われる。１マイクログラム（μｇ）の各ＲＮＡ試料を一緒にし、ランダムプライマー、オリゴｄＴプライマーまたは特異的３’アンチセンスプライマーの存在下で、６５℃で１０分変性させる。変性後、試料を氷上で２分冷却し、１０，０００×ｇで１０秒間遠心分離する。ＲＮＡｓｅインヒビター、逆転写酵素緩衝液、デオキシヌクレオチド、ピロリン酸ナトリウムおよび逆転写酵素を、製造業者が記載したように加え、２０μｌの反応物を４２℃ で１時間インキュベートする。ＰＣＲのために、特異的５’センスプライマーと３’アンチセンスプライマーをＲＴ反応物に加えて、Ｔａｑポリメラーゼを使用して、ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannheim）（インディアナポリス、インディアナ州）またはパーキン・エルマー（Perkin-Elmer）（ノーウォーク（Norwalk）、コネチカット州）の試薬を製造業者の説明書に従ってＰＣＲを行う。ＰＣＲ反応物を以下の３０サイクルにかける：９４℃で１分、５８℃で１分、７２℃で９０秒。等量の充填色素（０．０１％ずつのブロモフェノールブルーとキシレンシアノールブルー）を、最終生成物１０μｌに加えて、１×ＴＢＥ／ＥｔＢｒ（トリス−ホウ酸− ＥＤＴＡ＋臭化エチジウム；サムブルーク（Sambrook）ら、モレキュラークローニング、実験室マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、１９８９）の存在下で１％シーケムＬＥアガロース（SeaKemR LE agarose）（ＦＭＣ、ロックランド、メイン州）ゲルで電気泳動する。分子量標準物質のための、ＨａｅIII制限酵素（ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs）、ビバリー、マサチューセッツ州）で消化した１μｇのｐｈｉＸ１７４ファージＤＮＡを、ゲルにのせる。生成物（約１０９０塩基対）を短波長紫外線源を使用して視覚化する。反応物を、プロメガ（Promega）（マジソン、ウィスコンシン州）のウィザードＰＣＲプレプス（Wizard PCR Preps）キット（プロメガ（Promega））を使用して精製する。簡単に説明すると、ＰＣＲ反応物を１００μｌの直接精製緩衝液に加えて、この混合物に１ミリリットル（ml）のＰＣＲプレプスＤＮＡ精製樹脂を加える。２４℃で１分間インキュベート後、ろ過カラムを通して真空ろ過して上清を除く。２mlの８０％イソプロパノールを使用して、真空ろ過により樹脂を洗浄する。次に、樹脂を含有するカラムを１０，０００×ｇで３０秒間遠心分離して残存イソプロパノールを除去する。ＰＣＲ産物を５０μｌの１０mMトリス−Ｃｌ、１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）で１０，０００×ｇで３０秒間遠心分離して、次に上清を新しい試験管に移す。工程２：哺乳動物発現ベクターへのＰＣＲ産物のサブクローニングｃ−ｍｐｌリガンドＰＣＲ産物を、哺乳動物発現ベクターへ結合させるために、適切な制限酵素で消化する。哺乳動物発現ベクターは、哺乳動物発現カセットを含有するｐＵＣ１８ベースのベクターであるｐＭＯＮ３３５９の誘導体である。カセットは、単純ヘルペスウイルスプロモーターＩＥ１１０（−８００〜＋１２０）、ＩＬ−３分泌シグナル配列、およびｐＵＣ１８ポリリンカーにサブクローニングされたＳＶ４０後期ポリアデニル化（ｐｏｌｙ−Ａ）シグナル（ヒッペンマイアー（Hippenmeyer）ら、Bio/Technology，1037-1041，1993）を含む。制限酵素消化は製造業者が記載したように３７℃で１時間行い、次に１％アガロース／１×ＴＢＥ／ＥｔＢｒゲルで電気泳動する。断片をまず長波長紫外線で可視化し、キアエックス（Qiaex）ゲル抽出キット（キアゲン（Quiagen））を使用してゲル精製する。ＤＮＡ断片を、アガロース可溶化、ＤＮＡ結合樹脂の添加、および樹脂を充分洗浄した後、水で溶出して精製する。精製したＤＮＡ生成物をモル過剰のＰＣＲ産物でベクター断片に組合せて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼについて製造業者の勧める条件に従って結合反応を行う。次にこの結合物で大腸菌（E．c oli）株を形質転換し、アンピシリン（１００μｇ/ml）を含むＬＢ−寒天に広げる。ｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子の存在についてコロニーをスクリーニングし、ＤＮＡを単離してＤＮＡ配列を定し、両方の型のｃ−ｍｐｌリガンド（１つはアミノ酸１１２〜１１５が欠失し、他の１つはこれらが存在する）を同定する。３．ダイマーＰＣＲ鋳型の集合５μｌの結合緩衝液（ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannheim）＃１２４３２９２）中の相補的合成オリゴヌクレオチドの各対２００pmolをアニーリングして、ｃ−ｍｐｌ（１〜１５３）リガンド遺伝子を結合するリンカーを作成する。両側にＥｃｏＲＩとＡｆｌIII部位を有する各リンカーを、アミノ酸１〜１５３（工程２）を有する１つの型のｃ−ｍｐｌリガンドからの３．７キロ塩基対のＥｃｏＲＩ／ＢｓｔXI断片と、そして上記工程２の２つのタイプのコロニーのいずれか（１つはアミノ酸１１２〜１１５の欠失があり、１つは欠失が無い）からの１キロ塩基対ＮｃｏＩ／ＢｓｔXI断片と一晩結合させる。得られるＤＮＡを使用して、大腸菌（E．coli）ＤＨ５α（登録商標）細胞を形質転換する。形質転換した細胞を、アンピシリン（１００μｇ/ml）を含有するＬＢ寒天平板上で選択する。いくつかのコロニーの単一のコロニーからプラスミドＤＮＡを得て、配列決定してリンカーを介してダイマーの正しい集合を証明する。得られるプラスミドＤＮＡ鋳型は、ホーリック（Horlick）法（Protein Eng．5:427-431，1 992）により、新規ｃ−ｍｐｌリガンド分子を作成するのに使用することができる。Ｂ．ホーリック（Horlick）法５’センスプライマーと３’アンチセンスプライマーをダイマー鋳型と一緒にしてＴａｑポリメラーゼを使用して、ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Man nheim）（インディアナポリス、インディアナ州）またはパーキン・エルマー（P erkin-Elmer）（ノーウォーク（Norwalk）、コネチカット州）の試薬を製造業者の記載に従ってＰＣＲを行う。ＰＣＲ反応物を以下の３０サイクルにかける：９４℃で１分、５８℃で１分、７２℃で９０秒。生成物（約４８０塩基対）を短波長紫外線源を使用して視覚化する。反応物を、プロメガ（Promega）（マジソン、ウィスコンシン州）のウィザードＰＣＲプレプス（Wizard PCR Preps）キットを使用して精製する。簡単に説明すると、ＰＣＲ反応物を１００μｌの直接精製緩衝液に加えて、この混合物に１ミリリットル（ml）のＰＣＲプレプスＤＮＡ精製樹脂を加える。２４℃で１分インキュベート後、ろ過カラムを通して真空ろ過して上清を除く。２mlの８０％イソプロパノールを使用して、真空ろ過により樹脂を洗浄する。次に、樹脂を含有するカラムを１０，０００×ｇで３０秒間遠心分離して残存イソプロパノールを除去する。ＰＣＲ産物を５０μｌの１０mMトリス−Ｃｌ、１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）、で１０，０００×ｇで３０秒間遠心分離し、次に上清を新しい試験管に移す。発現ベクターへの新規ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストのサブクローニングこの新規ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストＰＣＲ産物は、適切な制限酵素で消化して、哺乳動物または大腸菌（E．coli）発現ベクターに結合させる。哺乳動物発現ベクター哺乳動物発現ベクターは、哺乳動物発現カセットを含有するｐＵＣ１８ベースのベクターであるｐＭＯＮ３３５９の誘導体である。カセットは、単純ヘルペスウイルスプロモーターＩＥ１１０（−８００〜＋１２０）、ＩＬ−３シグナルペプチド配列、およびｐＵＣ１８ポリリンカーにサブクローニングされたＳＶ４０後期ポリアデニル化（ｐｏｌｙ−Ａ）シグナル（ヒッペンマイアー（Hippenmeye r）ら、Bio/Technology，1037-1041，1993）を含む。制限酵素消化は、製造業者が記載したように３７℃で１時間行い、次に１％アガロース／１×ＴＢＥ／ＥｔＢｒゲルで電気泳動する。断片をまず長波長紫外線で可視化し、キアエックス（ Qiaex）ゲル抽出キット（キアゲン（Quiagen）、チャッツワース（Chatsworth）、カリホルニア州を使用してゲル精製する。ＤＮＡ断片を、アガロース可溶化、ＤＮＡ結合樹脂の添加、および樹脂を充分洗浄した後水で溶出して、樹脂から精製する。精製したＤＮＡ生成物をモル過剰のＰＣＲ産物でベクター断片に組合せて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼについて製造業者の勧める条件に従って結合反応を行う。大腸菌（E．coli）発現ベクター細胞質中で異種タンパク質の高レベルの産生を指令する大腸菌（E．coli）発現ベクターは、別に記載されているもの（オリンズ（Olins）ら、Methods Enzym .，185:115-119，1988およびラングワラ（Rangwala）ら、Gene，122:263-269，1 992）の誘導体である。この発現カセットは、ｒｅｃＡプロモーターとＴ７遺伝子１０リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）、ならびにＭ１３複製開始点、または転写ターミネーターとして作用するファージＰ２２遺伝子の縦列逆方向反復配列から構成される。これらのカセットは、ｐＢＲ３２７複製開始点を有するプラスミドの上にあり、スペクチノマイシン（spectinomycin）またはアンピシリン耐性のいずれかの遺伝子をコードする。大腸菌（E．coli）株の形質転換大腸菌（E．coli）株ＤＨ５α（登録商標）（ライフテクノロジーズ（Life Te chnologies）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）とＴＧ１（アマシャム社（Amersham Corp.）、アーリントンハイツ（Arlington Heights ）、イリノイ州）は結合反応のすべての形質転換に使用され、哺乳動物細胞をトランスフェクションするためのプラスミドＤＮＡの供給源である。大腸菌（E．c oli）ＭＯＮ１０５は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、ロックビル（Rockville）、メリーランド州）から得られ、大腸菌のそれぞれ細胞質または細胞周辺空腔中のｃ−ｍｐｌリガンドの交互の型を発現する宿主である。ＭＯＮ１０５ＡＴＣＣ＃５５２０４：Ｆ−、ラムダー、ＩＮ（ｒｒｎＤ、ｒｒＥ）１、ｒｐｏＤ＋、ｒｐｏＨ３５８ＤＨ５α（登録商標）：Ｆ−、ｐｈｉ８０ｄｌａｃＺｄｅｌｔａＭ１５、ｄｅｌｔａ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９、ｄｅｏＲ、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−、ｍｋ＋）、ｐｈｏＡ、ｓｕｐＥ４４ｌａｍｄａ−、ｔｈｉ−１、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１ＴＧ１：ｄｅｌｔａ（ｌａｃ−ｐｒｏ）、ｓｕｐＥ、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＤ５／Ｆ’（ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡ＋Ｂ＋、ｌａｃｌｑ、ｌａｃＺｄｅｌｔａＭ１５）ＤＨ５α（登録商標）サブクローニング効率細胞はコンピタントな細胞として購入し、製造業者のプロトコールを使用して形質転換が可能であるが、大腸菌（ E．coli）株ＴＧ１とＭＯＮ１０５はＣａＣｌ₂法を使用してＤＮＡを摂取できるようにコンピタントにする。典型的には、２０〜５０mlの細胞をＬＢ培地（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１５０ミリモルＮａＣｌ）で、バウシュとローム（Baush & Lomb）スペクトロニック（Spectronic）分光光度計（ローチェスター、ニューヨーク州で測定する時６００nm（ＯＤ６００）で約１．０光学密度単位まで増殖させる。細胞を遠心分離して集め、培養物の５分の１量のＣａＣｌ₂溶液（５０ミリモルＣａＣｌ₂、１０ミリモルトリス−Ｃｌ，ｐＨ７．４）に再懸濁し、４℃で３０分維持する。細胞を遠心分離して再度集め、培養物の１０分の１量のＣａＣｌ₂溶液に再懸濁する。結合したＤＮＡを、０．２mlのこれらの細胞に加えて、試料を４℃に１時間維持する。試料を２分間４２℃に移し、１．０mlのＬＢを加えてから、３７℃で１時間振盪する。これらの試料からの細胞を、アンピシリン耐性形質転換体について選択する時はアンピシリン（１００マイクログラム／ml、μｇ／ml）を含有するプレート（ＬＢ培地＋１．５％バクト寒天）に広げ、スペクチノマイシン耐性形質転換体について選択する時はスペクチノマイシン（７５μｇ/ml）を含有するプレートに広げる。プレートを３７℃で一晩インキュベートする。単一のコロニーを拾い上げ、適切な抗生物質を補足したＬＢで３７℃で６〜１６時間振盪して増殖させる。コロニーを取り上げ、適切な抗生物質（１００μｇ/mlアンピシリンまたは７５μｇ/mlスペクチノマイシン）を含有するＬＢに接種し、３７℃で振盪して増殖させる。培養物を採取する前に、１μｌの細胞をｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子の存在についてＰＣＲで解析する。ｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子および／またはベクターにアニーリングするプライマーの組合せを使用してＰＣＲを行う。ＰＣＲ完了後、充填色素を試料に加え、次に前述のように電気泳動を行う。予測されるサイズのＰＣＲ産物が観察される時は、ベクターに遺伝子が結合している。ＤＮＡ単離と性状解析プロメガ（Promega）ウィザードミニプレプ（Wizard^TMMiniprep Miniprep）キット（マジソン、ウィスコンシン州）、またはキアゲンキアウェルプラスミド(Q uiagen QIAwell Plasmid)単離キット（チャッツワース（Chatsworth）、カリホルニア州）を使用して、プラスミドＤＮＡを単離する。いずれのキットもプラスミドＤＮＡ単離について同じ一般的方法を用いる。簡単に説明すると、細胞を遠心分離（５０００×ｇ）してペレットにし、順にＮａＯＨと酸で処理してプラスミドＤＮＡが放出し、細胞破片を遠心分離（１００００×ｇ）して除去する。上清（プラスミドＤＮＡを含有）をＤＮＡ結合樹脂を含有するカラムにのせ、カラムを洗浄し、プラスミドＤＮＡをＴＥで溶出する。目的のプラスミドを有するコロニーについてスクリーニングした後、大腸菌（E．coli）細胞を適切な抗生物質を含有する１００mlのＬＢ中に接種し、振盪しながら空気インキュベーター中で３７℃で一晩増殖させる。プラスミドＤＮＡをキアゲンプラスミドミジキット（Quiagen Plasmid Midi kit）（チャッツワース（Chatsworth）、カリホルニア州）（これは、前述のキアゲンキアウェルプラスミド単離キット（Quiagen QIAwel l Plasmid isolation kit）をスケールアップしたものである）を使用して単離する。ＤＮＡ配列決定のためにこのＤＮＡを使用し、さらに制限酵素消化し、ＤＮＡ断片をさらにサブクローニングし、哺乳動物細胞または大腸菌（E．coli）細胞中にトランスフェクションする。精製した組換え２本鎖ＤＮＡを、アプライドバイオシステムズ社（Applied Bi osystems Inc.）（ＡＢＩ、フォスターシティ（Foster City）、カリホルニア州）のプリズム（登録商標）レディリアクションダイデオキシ（登録商標）ターミネーター配列決定システム（PRISM^TMReady Reaction DyeDeoxy^TMTerminator Seq uencing system）を使用して配列決定する。ＡＢＩシステムは、複数のラウンドの増幅の間の４つの蛍光標識ジデオキシヌクレオチドの取り込みに依存する。プラスミドＤＮＡと配列決定プライマーを反応混合物（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液およびヌクレオチドを含む）に加え、これを２５サイクルの増幅（９６℃で３０秒、５０℃で１５秒、６０℃で４分）を行う。増幅後、取り込まれなかったヌクレオチドを、プリンストンセパレーションズ社（Princeton Separati ons Inc.）（アデルフィア（Adelphia）、ニュージャージー州が記載したようにセントリセップ（Centri-Sep）スピンカラム（水で平衡化）を使用して除去する。簡単に説明すると、２分遠心分離（７００×ｇ）して過剰の水を除去したカラムに試料をのせ、精製した配列決定産物を４分遠心分離（７００×ｇ）して溶出する。次に試料をスピードバック（Speed Vac）（サバント（Savant）、ヒックスビル（Hicksville）、ニューヨーク州）で乾燥し、次に充填溶液を添加する。試料を、１×ＴＢＥ中に７Ｍ尿素を含有する４．７５％ポリアクリルアミド配列決定ゲルで７０ワットの一定電力で電気泳動する。ＡＢＩ装置は、電気泳動をしている間それぞれ別々に標識されたＰＣＲ産物を認識する検出器を使用する。新規ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストの産生哺乳動物細胞のトランスフェクション／調整培地の産生ＢＨＫ−２１細胞株は、ＡＴＣＣ（ロックビル（Rockville）、メリーランド州）から得られる。細胞を、２ミリモル（mM）のＬ−グルタミンと１０％胎児牛血清（ＦＢＳ）を補足したダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ／高グルコース）中で培養する。この調製物をＢＨＫ増殖培地と呼ぶ。選択培地は、４５３単位／mlヒグロマイシンＢ（カルビオケム（Calbiochem）、サンジエゴ、カリホルニア州）を補足したＢＨＫ増殖培地である。ＢＨＫ−２１細胞株は、すでにＨＳＶトランス活性化タンパク質ＶＰ１６で安定にトランスフェクションされており、これはプラスミドｐＭＯＮ３３５９（ヒッペンマイアー（Hippenmeyer）ら、B io/Technology，1037-1041，1993）上に存在するＩＥ１１０プロモーターをトランス活性化する。ＶＰ１６タンパク質は、ＩＥ１１０プロモーターの後ろに挿入された遺伝子の発現を指令する。トランス活性化タンパク質ＶＰ１６を発現するＢＨＫ−２１細胞は、ＢＨＫ−ＶＰ１６と呼ぶ。プラスミドｐＭＯＮ１１１８（ハイキン（Highkin）ら、Poultry Sci.，70:970-981，1991）は、ＳＶ４０プロモーターからヒグロマイシン耐性遺伝子を発現する。ＡＴＣＣから同様のプラスミド（ｐＳＶ２−ｈｐｈ）が入手できる。ＢＨＫ−ＶＰ１６細胞を、６０ミリメートル（mm）の組織培養プレートに３× １０⁵細胞／プレートでトランスフェクションの２４時間前に接種する。細胞を、目的の遺伝子を含有するプレート当たり１０μｇのプラスミドＤＮＡ、３μｇのヒグロマイシン耐性プラスミドであるｐＭＯＮ１１１８、および８０μgのギブコビーアールエル（Gibco-BRL）「リポフェクタミン（LIPOFECTANIME）」（登録商標）を含有する３mlの「オプチメム（OPTIMEM）」（登録商標）（ギブコビーアールエル（Gibco-BRL）（ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）で１６時間トランスフェクションする。次に培地を吸引し、３mlの増殖培地と交換する。トランスフェクションの４８時間後、各プレートの培地を集め活性を測定する（一過性の調整培地）。プレートからトリプシン−ＥＤＴＡにより細胞を取り出し、１：１０に希釈し、１０mlの選択培地を含有する１００mmの組織培養プレートに移す。選択培地中で約７日後、耐性の細胞は増殖して直径数ミリメートルのコロニーになる。ろ紙（コロニーとほぼ同じサイズに切断し、トリプシン／ＥＤＴＡに浸漬した）でプレートからコロニーを取り、１mlの選択培地を含有する２４ウェルプレートの各ウェルに移す。コロニーをコンフルエンスになるまで増殖させ、調整培地を再測定し、陽性クローンを増殖培地に拡張する。大腸菌（E．coli）からの組換えタンパク質の発現と精製目的のプラスミドを有する大腸菌（E．coli）株ＭＯＮ１０５を、カザミノ酸含有Ｍ９培地中で、ニューブランズウィックサイエンティフィック（New Brunsw ick Scientific）（エジソン、ニュージャージー州）の空気インキュベーターモデルＧ２５中で３７℃で振盪して増殖させる。ＯＤ６００が１．０になるまでＯＤ６００で増殖を追跡し、ここで０．１ＮＮａＯＨ中のナリジキシン酸（１０ mg/ml）を、最終濃度５０μｇ/mlになるように加える。次に、培養物を３７℃で３〜４時間振盪する。目的の遺伝子産物の産生を最大にするため、培養期間中、高度の通気を維持する。光学顕微鏡下で封入体（ＩＢ）の有無について細胞を調べる。培養物のアリコート１mlを取って、ペレットにした細胞を沸騰させ、これを還元緩衝液で処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（マニアティス（Maniatis）ら、モレキュラークローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning:A Labo ratory Manual）、１９８２）でタンパク質含量について解析する。遠心分離（５０００×ｇ）して細胞をペレットにした後、タンパク質精製の最初の段階は細胞の音波処理かまたは破砕である。音波処理のために、細胞を１０分の１量（培養物の量の）の音波処理緩衝液（１０mMトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１mM ＥＤＴＡ）に再懸濁する。これらの再懸濁した細胞を、ヒートシステムズ−ウルトラソニックス社（Heat Systems-Ultrasonics Inc.）（ファーミングデール（Far mingdale）、ニューヨーク州）から得られるソニケーター（Sonicator）細胞破砕機モデルＷ−３７５のマイクロチップを使用して、音波による破裂（burst）を数回繰り返す。音波処理の程度は光学顕微鏡でホモジネートを調べて追跡する。すべての細胞が破砕された後、ホモジネートをＪＡ−２０ロータとＪ２−２１遠心分離機（ベックマン（Beckman）、フラートン（Fullerton）、カリホルニア州）で４℃で１００００×ｇで２０分遠心分離して分画する。あるいは、マントン−ガウリンホモジナイザー（Manton-Gaulin homogenizer）（オランダ）で音波処理緩衝液で細胞を溶解して、次に前述のように遠心分離して細胞からＩＢを放出させる。組換えタンパク質が高度に濃縮されたＩＢペレットを、さらに１ラウンド音波処理し、前述のように遠心分離する。組換えタンパク質を種々の標準的方法で精製する。最も一般的な方法は、４〜６モル尿素またはグアニジン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９〜１２）によるＩＢの可溶化、および触媒量のシステイン、ベーターメルカプトエタノールまたはジチオスレイトールの存在下での２４〜７２時間の空気酸化／折り畳みである。Ｑ−セファロース（陰イオン）およびＳ−セファロース（陽イオン）のようなイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水性クロマトグラフィーまたは逆相高速液体クロマトグラフィーを使用して、大腸菌（E．c oli）混入物からタンパク質を精製する。低イオン強度緩衝液に対して透析してから、精製したタンパク質を凍結または凍結乾燥する。さらに説明することなく前述の説明から、当業者は本発明を最大限に利用することができると考えられる。従って、以下の好適な具体例は、単に例示するためのものであり、決して本発明の開示の残りの部分を限定するものではない。変種を作成し、細菌、哺乳動物細胞または昆虫細胞で発現し、目的のタンパク質を精製し再度折り畳み、タンパク質の生物活性を測定するための方法に使用できる組換えＤＮＡ方法についてのさらなる詳細は、同時出願の米国特許出願ＷＯ９４／１２６３９号、ＷＯ９４／１２６３８号、ＷＯ９５／２０９７６号、ＷＯ９５／２１１９７号、ＷＯ９５／２０９７７号、ＷＯ９５／２１２５４号、および来国特許第０８／３８３，０３５号に見いだされる（これらは、参考のため本明細書に組み込まれる）。当業者に公知のさらなる詳細は、ティー・マニアティス（T．Maniatis）ら、モレキュラークローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning，A Laborat ory Manual）、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（１９８２）およびそこに記載の文献（参考のため本明細書に組み込まれる）、およびジェイ・サムブルーク（J．Sambrook）ら、モレキュラークローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning，A LaboratoryManual）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Lab oratory）（１９８９）およびそこに記載の文献（参考のため本明細書に組み込まれる）に見いだされる。本明細書で引用したすべての文献、特許または出願は、参考のためその全体が本明細書に組み込まれる。表１オリゴヌクレオチド表２遺伝子配列表３タンパク質配列以下の例は本発明をより詳細に例示するが、本発明は決してこれらの具体例に限定されるものではない。例１ダイマー鋳型の第１の遺伝子を含有する親プラスミドの作製ｃ−ｍｐｌリガンドのコード配列の後にユニークなＥｃｏＲＩ制限部位を有するプラスミドＤＮＡを作成するために、逆転写酵素／ポリメラーゼチェイン反応（ＲＴ／ＰＣＲ）により遺伝子を単離する。ｃ−ｍｐｌリガンドメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の供給源としてのヒト胎児（ロット＃３８１３０）と成人肝（ロット＃４６０１８）Ａ＋ＲＮＡは、クロンテク（Clontech）（パロアルトカリホルニア州）から得られる。第１の鎖のｃＤＮＡ反応は、インビトロゲン（In Vitrogen）（サンジエゴ、カリホルニア州）から得られるｃＤＮＡサイクル（登録商標）キットを使用して行われる。ＲＴ反応では、ランダムプライマーとオリゴｄＴプライマーを使用してヒトおよび胎児肝ｍＲＮＡの組合せからｃＤＮＡを作成する。アミノ酸１〜１５３をコードするｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子断片の増幅のために、ＲＴ産物はプライマーの組合せ（前進プライマー：ｃ−ｍｐｌＮｃｏＩ（配列番号４）および逆プライマー：Ｅｃｏｍｐｌ（配列番号５））を用いるＰＣＲの鋳型として作用する。ｃ−ｍｐｌＮｃｏＩ（配列番号４）プライマーは、ｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子（ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号Ｌ３３４１０またはデサウバジ（de Sauvage）ら、Nature 369:533-538，1994）からのｃ−ｍｐｌリガンド配列に基づく塩基＃２７９〜３１１）にアニーリングし、最初の成熟コドン（Ｓｅｒ¹）のすぐ５’にあるＮｃｏＩ制限酵素部位をコードする。ＮｃｏＩ制限酵素部位は、ｓｅｒ−１の前のメチオニンとアラニンコドンをコードし、Ａｌａコドンと最初の４つのｃ−ｍｐｌリガンドコドン（Ｓｅｒ¹、Ｐｒｏ²、Ａｌａ³、およびＰｒｏ⁴）のコドン縮重を含む。Ｅｃｏｍｐｌ（配列番号５）プライマーは、ｃ−ｍｐｌリガンドの塩基＃７２０〜７３７にアニーリングし、Ａｒｇ¹⁵³のすぐ後のｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子と同じフレームにあるＥｃｏＲＩ認識部位をコードする。ＥｃｏＲＩ部位は、Ａｒｇ¹⁵³の後にＧｌｕ¹ ⁵⁴ とＰｈｅ¹⁵⁵コドンを作成する。約４８０塩基対のＰＣＲ産物を精製し、ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで消化し、ｐＭＯＮ３９９３のＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩベクター断片（約４５５０塩基対）に結合する。ｐＭＯＮ３９９３はｐＭＯＮ３３５９の誘導体である。ｐＭＯＮ３３５９中の発現カセットは、単純ヘルペスウイルスプロモーターＩＥ１１０（−８００〜＋１２０）、ＩＬ−３シグナルペプチド配列、およびｐＵＣ１８ポリリンカーにサブクローニングされたＳＶ４０後期ポリアデニル化（ｐｏｌｙ−Ａ）シグナルを含む（ヒッペンマイアー（Hippenmeyer）ら、Bio/Tec hnology，1037-1041，1993）。ＩＥ１１０プロモーターとｐｏｌｙ−Ａシグナルの間のユニークなＢａｍＨＩ部位中に、ＢａｍＨＩ断片としてサブクローニングされたヒトＩＬ−３ペプチド配列は、その３’末端にＮｃｏＩ部位を含有し、後にユニークなＥｃｏＲＩ部位が続く。シグナルペプチドのＤＮＡ配列を以下に示す（制限酵素部位は上に示す）。ＮｃｏＩ部位内のＡＴＧ（メチオニン）コドンは、シグナルペプチドの開始ＡＴＧ（下線）と同じフレーム内にある；ＢａｍＨＩＮｃｏＩ CATGG（配列番号８１）ｃ−ｍｐｌリガンドアミノ酸１〜１５３をコードするｐＭＯＮ２６４５８は、このクローニングの結果である。例２ダイマー鋳型の第２の遺伝子を含有する親プラスミドの作製アミノ酸１（Ｓｅｒ）で開始し、アミノ酸１５３の後に停止コドンを有するｃ −ｍｐｌリガンド遺伝子断片の増幅のために、例１のＲＴ反応物は、プライマーの組合せ（ｃ−ｍｐｌＮｃｏＩ（配列番号４）（前進プライマー）およびｃ−ｍｐｌＨｉｎｄIII（配列番号６）（逆プライマー））を用いるＰＣＲの鋳型として作用する。ｃ−ｍｐｌＮｃｏＩ（配列番号４）プライマーは、例１に記載されている。ｃ−ｍｐｌリガンドの塩基＃７１６〜７３７にアニーリングするｃ−ｍｐｌＨｉｎｄIII（配列番号６）プライマーは、停止コドンと、最終コドンＡｒｇ¹⁵³のすぐ後のＨｉｎｄIII制限酵素部位を付加する。２つのタイプのＰＣＲ産物がＲＴｃＤＮＡ試料から作成され、１つはアミノ酸１１２〜１１５のコドンの欠失があり、１つはこれらのコドンの欠失が無い。ｃ −ｍｐｌリガンドＰＣＲ産物（約４８０塩基対）は、ｐＭＯＮ３３５９（例１を参照）の誘導体である哺乳動物発現ベクターｐＭＯＮ３９３４に移すために、ＮｃｏＩとＨｉｎｄIII制限酵素で消化される。ｐＭＯＮ３９３４はＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消化され（約３８００塩基対）、ＰＣＲ産物を受け入れる。ｃ−ｍｐｌリガンドのアミノ酸１〜１５３（配列番号４４）をコードする配列番号８２のＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ３２１３２は、このクローニングの結果であった。コドン１１２〜１１５の欠失（Δ１１２〜１１５）を有するｃ− ｍｐｌリガンドのアミノ酸１〜１５３をコードする配列番号８３のＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ３２１３３もこのクローニングの結果であった。例３第２の遺伝子中にΔ１１２〜１１５を含有するＰＣＲ５Ｌダイマー鋳型の作成ｐＭＯＮ２６４５８の３．７キロ塩基対のＢｓｔXI／ＥｃｏＲＩ断片を、ＥｃｏＲＩ／ＡｆｌIII ５Ｌ合成オリゴヌクレオチドリンカー５Ｌ−５’（配列番号９）と５Ｌ−３’（配列番号１０）とともに、ｐＭＯＮ３２１３３の１キロ塩基対のＮｃｏｌ／ＢｓｔXI断片（アミノ酸１１２〜１１５の欠失を含有する）に結合させることにより、ｃ−ｍｐｌリガンドの新規な型を作成するためのＰＣＲ鋳型を作製する。リンカーのＥｃｏＲＩ末端は、ｐＭＯＮ２６４５８のＥｃｏＲＩ末端に結合するであろう。リンカーのＡｆｌIII末端は、ｐＭＯＮ３２１３３のＮｃｏＩ部位に結合し、結合するといずれの部位も保持されないであろう。ｐＭＯＮ２６４５８とｐＭＯＮ３２１３３のＢｓｔXI部位も同様に結合するであろう。プラスミドｐＭＯＮ２８５４８は、クローニングの結果であり、アミノ酸１１２〜１１５の欠失を含有するアミノ酸１〜１５３ｃ−ｍｐｌリガンドにＧｌｕＰｈｅＧｌｙＧＬｙＡｓｎＭｅｔＡｌａ（配列番号７８）リンカーを介して融合したアミノ酸１〜１５３ｃ−ｍｐｌリガンド（配列番号４３）をコードする配列番号３８のＤＮＡ配列を含有する。例４ＰＣＲ４Ｌダイマー鋳型ｐＭＯＮ２８５００の作成ｐＭＯＮ２６４５８の３．７キロ塩基対のＢｓｔXI／ＥｃｏＲＩ断片を、ＥｃｏＲＩ／ＡｆｌIII ４Ｌ合成オリゴヌクレオチドリンカー４Ｌ−５’（配列番号７）と４Ｌ−３’（配列番号８）とともに、ｐＭＯＮ３２１３２の１キロ塩基対のＮｃｏＩ／ＢｓｔXI断片に結合させることにより、ｃ−ｍｐｌリガンドの新規な型を作成するためのＰＣＲ鋳型を作製する。リンカーのＥｃｏＲＩ末端は、ｐＭＯＮ２６４５８のＥｃｏＲＩ末端に結合するであろう。リンカーのＡｆｌII I末端は、ｐＭＯＮ３２１３２のＮｃｏｌ部位に結合し、結合するといずれの部位も保持されないであろう。ｐＭＯＮ２６４５８とｐＭＯＮ３２１３２のＢｓｔ XI部位も同様に結合するであろう。プラスミドｐＭＯＮ２８５００は、クローニングの結果であり、アミノ酸１〜１５３ｃ−ｍｐｌリガンドにＧｌｕＰｈｅＧｌｙＡｓｎＭｅｔＡｌａ（配列番号７７）リンカー（４Ｌ）を介して融合したアミノ酸１〜１５３ｃ−ｍｐｌリガンド（配列番号４６）をコードする配列番号３９のＤＮＡ配列を含有する。例５ＰＣＲ５Ｌダイマー鋳型ｐＭＯＮ２８５０１の作成ｐＭＯＮ２６４５８の３．７キロ塩基対のＢｓｔXI／ＥｃｏＲＩ断片を、ＥｃｏＲＩ／ＡｆｌIII ５Ｌ合成オリゴヌクレオチドリンカ−５Ｌ−５’（配列番号９）と５Ｌ−３’（配列番号１０）とともに、ｐＭＯＮ３２１３２の１キロ塩基対のＮｃｏＩ／ＢｓｔXI断片に結合させることにより、ｃ−ｍｐｌリガンドの新規な型を作成するためのＰＣＲ鋳型を作製する。リンカーのＥｃｏＲＩ末端は、ｐＭＯＮ２６４５８のＥｃｏＲＩ末端に結合するであろう。リンカーのＡｆｌ III末端は、ｐＭＯＮ３２１３２のＮｃｏｌ部位に結合し、結合するといずれの部位も保持されないであろう。ｐＭＯＮ２６４５８とｐＭＯＮ３２１３２のＢｓｔXI部位も同様に結合するであろう。プラスミドｐＭＯＮ２８５０１は、クローニングの結果であり、アミノ酸１〜１５３ｃ−ｍｐｌリガンドにＧｌｕＰｈｅＧｌｙＧｌｙＡｓｎＭｅｔＡｌａ（配列番号７８）リンカー（５Ｌ）を介して融合したアミノ酸１〜１５３ｃ−ｍｐｌリガンド（配列番号４７）をコードする配列番号４０のＤＮＡ配列を含有する。例６ＰＣＲ８Ｌダイマー鋳型ｐＭＯＮ３２１３６の作成ｐＭＯＮ２６４５８の３．７キロ塩基対のＢｓｔXI／ＥｃｏＲＩ断片を、ＥｃｏＲＩ／ＡｆｌIII ８Ｌ合成オリゴヌクレオチドリンカ−８Ｌ−５’（配列番号１１）と８Ｌ−３’（配列番号１２）とともに、ｐＭＯＮ３２１３２の１キロ塩基対のＮｃｏＩ／ＢｓｔXI断片に結合させることにより、ｃ−ｍｐｌリガンドの新規な型を作成するためのＰＣＲ鋳型を作製する。リンカーのＥｃｏＲＩ末端は、ｐＭＯＮ２６４５８のＥｃｏＲＩ末端に結合するであろう。リンカーのＡｆｌIII末端は、ｐＭＯＮ３２１３２のＮｃｏＩ部位に結合し、結合するといずれの部位も保持されないであろう。ｐＭＯＮ２６４５８とｐＭＯＮ３２１３２のＢｓｔXI部位も同様に結合するであろう。プラスミドｐＭＯＮ３２１３６は、クローニングの結果であり、アミノ酸１〜１５３ｃ−ｍｐｌリガンドにＧｌｕＰｈｅＧｌｙＧｌｙＡｓｎＧｌｙＢｌｙＡｓｎＭｅｔＡｌａ（配列番号７９）リンカー（８Ｌ）を介して融合したアミノ酸１〜１５３ｃ−ｍｐｌリガンド（配列番号４８）をコードする配列番号４１のＤＮＡ配列を含有する。例７〜１８新規ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストの作成Ａ．新規ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストのＰＣＲ作成ホーリック（Horlick）法を使用して、新規ｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子を作成する。ＰＣＲ反応は、ダイマー鋳型ｐＭＯＮ２８５０１と下記合成プライマーセット（番号は新しい分子の最初のアミノ酸を意味する）の１つを使用して行う。３１−５’（配列番号１３）と３１−３’（配列番号１４）、３５−５’（配列番号１５）と３５−３’（配列番号１６）、３９−５’（配列番号１７）と３９ −３’（配列番号１８）、４３−５’（配列番号１９）と４３−３’（配列番号２０）、４５−５’（配列番号２１）と４５−３’（配列番号２２）、４９−５ ’（配列番号２３）と４９−３’（配列番号２４）、８２−５’（配列番号２５）と８２−３’（配列番号２６）、１０９−５’（配列番号２７）と１０９−３ ’（配列番号２８）、１１６−５’（配列番号２９）と１１６−３’（配列番号３０）、１２０−５’（配列番号３１）と１２０−３’（配列番号３２）、１２３−５’（配列番号３３）と１２３−３’（配列番号３４）、１２６−５’（配列番号３５）と１２６−３’（配列番号３６）作成される生成物は約４８０塩基対であり、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（Magic DNA Clean-up System kit）（プロメガ（Promega））を使用して精製される。表４は、鋳型、ＰＣＲ反応に使用されるプライマー、および各例の切断点を示す。Ｂ．哺乳動物発現ベクターへの新規ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストのサブクローニング哺乳動物発現ベクターへの移動のために、ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストＰＣＲ産物をＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIまたはＡｆｌIIIとＨｉｎｄIII制限酵素で消化する（約４７０塩基対）。発現ベクターｐＭＯＮ３９３４は、ＮｃｏＩとＨｉｎｄ IIIで消化され（約３８００塩基対）、ＰＣＲ産物をＮｃｏＩ−ＨｉｎｄIIIまたはＡｆｌIII−ＨｉｎｄIII断片として受け取る。表４は、ＰＣＲ産物の制限消化と、得られる発現プラスミドｐＭＯＮの名前を示す。表４同様の方法で、ダイマー鋳型ｐＭＯＮ２８５００、ｐＭＯＮ３２１３６およびｐＭＯＮ２８５４８は、例７〜１８に記載のＰＣＲ反応に使用するすることができた。ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストの生物活性測定トランスフェクションされた細胞株：Ｂａｆ／３細胞株のような細胞株は、通常細胞株が有していないコロニー刺激因子受容体（例えば、ヒトＩＬ−３受容体またはヒトｃ−ｍｐｌ受容体）によりトランスフェクションすることができる。これらのトランスフェクションされた細胞株は、細胞株に受容体がトランスフェクションされたリガンドの活性を測定するのに使用することができる。このようなトランスフェクションされた１つのＢａｆ／３細胞株は、ｃ−ｍｐｌ応答性細胞株から作成したライブラリーからのｃ−ｍｐｌをコードするｃＤＮＡをクローニングし、プラスミドｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン（InVitrogen）、サンジエゴ、カリホルニア州）の複クローニング部位にクローン化することにより作成される。Ｂａｆ／３細胞は、電気穿孔法によりプラスミドでトランスフェクションされた。細胞を、ウェヒ（Wehi）調整培地中のマウスＩＬ−３の存在下でＧ４１８選択下で増殖させた。限界希釈によりクローンを作成した。本発明のｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストの一部のＢＨＫ発現レベルと生物活性を、表５に示す。トランスフェクションされたＢＨＫ細胞からの上清を、ｃ−ｍｐｌリガンドに対する抗体を使用してウェスタン解析によりｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストの発現について評価する。「＋＋＋＋」レベルで表した作製体を、Ｂａｆ −３／ｃ−ｍｐｌ細胞増殖測定法で測定した。表５ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストの発現と生物活性２．骨髄増殖測定法ａ．ＣＤ３＋細胞精製インフォームドコンセント後、正常な同種骨髄ドナーから１５〜２０mlの骨髄吸引物を得る。細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、ギブコビーアールエル（Gibco-BRL）で１：３に希釈し、３０mlを１５mlのヒストペーク（Histopaqu e）−１０７７（シグマ（Sigma））に重層し、３００ＲＣＦで３０分遠心分離する。単核細胞の界面層を集め、ＰＢＳで洗浄する。親和性カラムを製造業者（セルプロ社（CellPro，Inc.）、ボセル（Bothell）、ワシントン州）の説明書に従って使用して、単核細胞調製物からＣＤ３４＋細胞を濃縮する。濃縮後ＣＤ３４＋細胞の純度は、フルオレセインに結合した抗ＣＤ３４モノクローナル抗体とフィコエリスリン（phycoerythrin）に結合した抗ＣＤ３８（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、サンホセ（San Jose）、カリホルニア州）を使用してフローサイトメトリー解析により測定すると、平均７０％である。細胞をＸ−Ｖｉｖｏ１０培地（バイオーウィッタカー（Bio-Whittaker）、ウォーカーズビル（Walkersville）、メリーランド州）で４０，０００細胞／mlに再懸濁し、１mlを１２ウェル組織培養プレート（コスター（Coster））に広げる。ヒトＩＬ−３変種であるｐＭＯＮ１３２８８を、１０ng/mlまたは１００ng/ml で使用する。ｃ−ｍｐｌリガンドをコードするプラスミドでトランスフェクションしたＢＨＫ細胞からの調整培地を、１mlの培養物に加えた１００μｌの上清（約１０％希釈）を添加して試験した。細胞を、３７℃加湿インキュベーター中で５％ＣＯ２で３７℃で８〜１４日間インキュベートする。ｂ．細胞採取と解析培養期間の最後に、各条件について総細胞数が得られる。蛍光解析と倍数性測定のために、細胞を巨核球緩衝液（ＭＫ緩衝液、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１３．６mMクエン酸ナトリウム、１mMテオフィリン、２．２μＭＰＧＥ１、１１mMグルコース、３％ w/v ＢＳＡ）（トマー（Tomer）ら、Blood 70(6):1735-42(198 7)）で洗浄し、抗ＣＤ４１ａＦＩＴＣ抗体（１：２００、ＡＭＡＣ、ウェストブルーク（Westbrook）、メイン州を含有するＭＫ緩衝液５００μｌに再懸濁し、ＭＫ緩衝液で洗浄する。ＤＮＡ解析のために細胞を、０．５％ツイーン−２０（フィッシャー（Fisher）、フェアローン（Fair Lawn）、ニュージャージー州）を含有するＭＫ緩衝液中で氷上で２０分、次に０．５％ツイーン−２０と１％パラホルムアルデヒド（フィッシャーケミカル（Fisher Chemical））中で３０分固定し、次にヨウ化プロピジウム（カルビオケム（Calbiochem）、ラホヤ（La J olla）、カリホルニア州）（５０μｇ/ml）中で５５％ v/v ＭＫ緩衝液（２００mOsm）中のＲＮＡａｓｅ（４００単位/ml）とともに氷上で１〜２時間インキュベートして、細胞を透過性にする。細胞を、ファクスキャン（FACScan）またはバンタージ（Vantage）フローサイトメーター（ベクトンディッキンソン（Bec ton Dickinson）、サンホセ（San Jose）、カリホルニア州で解析する。赤い蛍光（ＰＩ）について線状とｌｏｇシグナルに沿って緑色の蛍光（ＣＤ４１ａ）を集めて、ＤＮＡ倍数性を測定する。すべての細胞を集めて、ＣＤ４１＋である細胞のパーセントを求める。リシス（LYSIS）ソフトウェア（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、サンホセ（San Jose）、カリホルニア州を使用してデータ解析を行う。ＣＤ４１抗原を発現する細胞のパーセントを、フローサイトメトリー解析から得る（パーセント）。ＣＤ４１＋細胞／mlの絶対数（Abs）を、（Abs）＝（細胞数）×（パーセント）／１００から計算する。３．巨核球フィブリン凝固測定法ＣＤ３４＋を濃縮した集団を前述のように単離する。細胞を、０．３％ＢＳＡ、０．４mg/mlアポートランスフェリン、６．６７μＭＦｅＣｌ２、２５μｇ/m l ＣａＣｌ２、２５μｇ/ml Ｌアスパラギン、５００μｇ/ml Ｅ−アミン− ｎ−カプロン酸およびペニシリン／ストレプトマイシンを補足したベースイスコベス（base Iscoves）ＩＭＤＭ培地から構成される培地中で、サイトカイン有り／無しで２５，０００細胞／mlで懸濁する。３５mmのプレートに広げる前に、トロンビン（０．２５単位/ml）を加えて凝固形成を開始させる。細胞を３７℃加湿インキュベーター中で５％ＣＯ２で３７℃で１３日間インキュベートする。培養期間の最後に、プレートをメタノール：アセトン（１：３）で固定し、空気乾燥し、染色するまで−２００Ｃで保存する。ＣＤ４１ａ、ＣＤ４２、およびＣＤ６１から構成される一次モノクローナル抗体のカクテルを使用して、ペルオキシダーゼ免疫細胞化学染色法を使用する（ザイメド（Zymed）、ヒストスタチン− ＳＰ’Histostatin-SP）、サンフランシスコ、カリホルニア州。染色後コロニーを数え、陰性、ＣＦＵ−ＭＫ（小さいコロニー、１〜２個の細胞増殖巣、および約２５未満の細胞）、ＢＦＵＭＫ（大きい、多細胞増殖巣、２５を超える細胞）、または混合コロニー（陽性と陰性の混合物）に分類する。本明細書の開示を読んだ後、当業者は本発明の精神と範囲を逸脱することなく、種々の他の例が明らかであろう。しかし、そのような他の例は、添付の請求の範囲の範囲内に含有されると考えられる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成９年１０月１６日（１９９７．１０．１６）【補正内容】 15．（補正後）患者の造血細胞の産生を刺激するための薬剤を調製するための、請求の範囲第１、２、３または４項のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。 16．（補正後）患者の造血細胞の産生を刺激するための薬剤を調製するための、請求の範囲第１３項に記載の組成物の使用。 17．（補正後）患者の造血細胞の産生を刺激するための薬剤を調製するための、請求の範囲第１４項に記載の組成物の使用。 18．（補正後）幹細胞の選択的エクスビボ拡張方法であって、（ａ）他の細胞から幹細胞を分離し、（ｂ）分離した幹細胞を、請求の範囲第１、２、３または４項に記載のポリペプチドを含む選択された培地で培養し、そして（ｃ）培養細胞を採取する、工程からなる上記方法。 19．（補正後）造血障害を有する患者の治療のための薬剤を調製するための請求の範囲第１、２、３または４項に記載のポリヌクレオチドの使用であって、（ａ）幹細胞を取り出し、（ｂ）他の細胞から幹細胞を分離し、（ｃ）分離した幹細胞を、請求の範囲第１、２、３または４項に記載のポリペプチドを含む選択された培地で培養し（ｄ）培養した細胞を採取し、そして（ｅ）培養した細胞を患者に移植する、工程からなる上記使用。 20．（補正後）ヒトの遺伝子の治療のための薬剤を調製するための請求の範囲第１、２、３または４項に記載の造血タンパク質の使用であって、（ａ）患者から幹細胞を取り出し、（ｂ）他の細胞から幹細胞を分離し、（ｃ）分離した幹細胞を、請求の範囲第１、２、３または４項に記載の造血タンパク質を含む選択された培地で培養し（ｄ）培養した細胞にＤＮＡを導入し、（ｅ）形質導入した細胞を採取し、そして（ｆ）形質導入した細胞を患者に移植する、工程からなる上記使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｐ 7/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 43/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/47 37/24 Ｃ１２Ｐ 21/02 37/36 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ペッグ，ライル，イー. アメリカ合衆国63017 ミズーリ州チェスターフィールド，オークバラドライブ 1164 (72)発明者マックファーター，チャールズ，エイ. アメリカ合衆国63011 ミズーリ州エリスビル，サンダーヘッドキャニヨンコート 16564 (72)発明者フェン，イイクインアメリカ合衆国63130 ミズーリ州セントルイス，ミッションコート 423 (72)発明者マッキャーン，ジョン，ピー. アメリカ合衆国63038 ミズーリ州セントルイス，バブラーメドウズドライブ 18612 (72)発明者サマーズ，ニーナ，エル. アメリカ合衆国63304−2423 ミズーリ州セントチャールズ，サドルメイカー 1203 (72)発明者ジリ，ジュディス，ジー. アメリカ合衆国63017 ミズーリ州チェスターフィールド，グラントリードライブ 15446

Claims

【特許請求の範囲】１．式：［式中、１１２位のＸａａは、欠失しているか、またはＬｅｕ、Ａｌａ,Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり、１１３位のＸａａは、欠失しているか、またはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり、１１４位のＸａａは、欠失しているか、またはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり、１１５位のＸａａは、欠失しているか、またはＧｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、またはＡｓｎであり、Ｎ−末端は、直接、またはＮ−末端をＣ−末端に結合させることができ、アミノ酸：で新しいＣ−末端およびＮ−末端を有することができるリンカーを介して、Ｃ− 末端に結合され、そして、さらにすぐ前に（メチオニン^-1）、（アラニン^-1）、または（メチオニン^-2、アラニン^-1）があってもよい］の修飾ｃ−ｍｐｌリガンドアミノ酸配列、からなるｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストポリペプチド。２．請求の範囲第１項に記載のｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストポリペプチドであって、リンカーは、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号７３）、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号７４）、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号７５）、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号７６）、ＧｌｕＰｈｅＧｌｙＡｓｎＭｅｔＡｌａ（配列番号７７）、ＧｌｕＰｈｅＧｌｙＧｌｙＡｓｎＭｅｔＡｌａ（配列番号７８）、ＧｌｕＰｈｅＧｌｙＧｌｙＡｓｎＧｌｙＧｌｙＡｓｎＭｅｔＡｌａ（配列番号７９）、およびＧｌｙＧｌｙＳｅｒＡｓｐＭｅｔＡｌａＧｌｙ（配列番号８０）よりなる群から選択される、上記ポリペプチド。３．請求の範囲第１項に記載のｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストポリペプチドであって、ポリペプチドは、よりなる群から選択される、上記ポリペプチド。４．請求の範囲第３項に記載のｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストポリペプチドであって、ポリペプチドは、よりなる群から選択される、上記ポリペプチド。５．請求の範囲第１項記載のｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストポリペプチドをコードする核酸分子。６．請求の範囲第２項記載のｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストポリペプチドをコードする核酸分子。７．請求の範囲第３項記載のｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストポリペプチドをコードする核酸分子。８．請求の範囲第４項記載のｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストポリペプチドをコードする核酸分子。９．請求の範囲第７項記載の核酸分子であって、よりなる群から選択される、上記分子。１０．請求の範囲第８項記載の核酸分子であって、よりなる群から選択される、上記分子。１１．ヒトｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストポリペプチドの製造方法であって、請求の範囲第５、６、７または８項に記載の核酸分子からなる複製可能なベクターで形質転換またはトランスフェクションした宿主細胞を、ヒトｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストポリペプチドの発現を可能にする方法で、適切な栄養条件下で増殖させ、そしてこのヒトｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストポリペプチドを回収することからなる、上記方法。１２．請求の範囲第１、２、３または４項に記載のポリペプチドと、薬剤学的に許容される担体と、からなる組成物。１３．請求の範囲第１、２、３または４項に記載のポリペプチド；コロニー刺激因子；および薬剤学的に許容される担体と、からなる組成物。１４．請求の範囲第１、２、３または４項に記載のポリペプチド；ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦＳｅｒ¹⁷、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ −１５、ＬＩＦ、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２リガンド、ヒト成長ホルモン、Ｂ細胞増殖因子、Ｂ細胞分化因子、好酸球分化因子、および幹細胞因子よりなる群から選択されるコロニー刺激因子；および、薬剤学的に許容される担体と、からなる組成物。１５．請求の範囲第１、２、３または４項に記載のポリペプチドを患者に投与する工程からなる、患者の造血細胞の産生を刺激する方法。１６．請求の範囲第１３項に記載の組成物を患者に投与する工程からなる、患者の造血細胞の産生を刺激する方法。１７．請求の範囲第１４項に記載の組成物を患者に投与する工程からなる、患者の造血細胞の産生を刺激する方法。１８．幹細胞の選択的エクスビボ拡張方法であって、（ａ）他の細胞から幹細胞を分離し、（ｂ）分離した幹細胞を、請求の範囲第１、２、３または４項に記載のポリペプチドを含む選択された培地で培養し、そして（ｃ）培養細胞を採取する、工程からなる上記方法。１９．造血障害を有する患者の治療方法であって、（ａ）幹細胞を取り出し、（ｂ）他の細胞から幹細胞を分離し、（ｃ）分離した幹細胞を、請求の範囲第１、２、３または４項に記載のポリペプチドを含む選択された培地で培養し（ｄ）培養した細胞を採取し、そして（ｅ）培養した細胞を患者に移植する、工程からなる上記方法。２０．ヒトの遺伝子治療法であって、（ａ）患者から幹細胞を取り出し、（ｂ）他の細胞から幹細胞を分離し、（ｃ）分離した幹細胞を、請求の範囲第１、２、３または４項に記載のポリペプチドを含む選択された培地で培養し（ｄ）培養した細胞にＤＮＡを導入し、（ｅ）形質導入した細胞を採取し、そして（ｆ）形質導入した細胞を患者に移植する、工程からなる上記方法。