CN104109199B - 一种聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子的制备方法及其产品 - Google Patents

一种聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子的制备方法及其产品 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子的制备方法，通过采用独特的工艺条件，无需进行突变等处理，来达到单修饰的效果，工艺简单，成本低，且得到的聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子活性损失小，纯度高等，本发明还涉及由该方法制得的产品。

Description

一种聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子的制备方法及 其产品
技术领域
本发明涉及蛋白质的聚乙二醇修饰领域，特别是指一种聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子的制备方法，本发明还涉及由该方法制得的聚乙二醇修饰的人粒细胞集落刺激因子。
背景技术
粒细胞集落刺激因子（G-CSF）是刺激骨髓细胞集落形成的集落刺激因子之一，能够特异性的刺激和调节粒细胞系统的增殖、分化、存活和活化，主要用于各种原因引起的中性粒细胞减少症，天然人粒细胞集落刺激因子（hG-CSF）含有174个氨基酸，分子量约为19KDa，其中含有5个半胱氨酸（Cys），Cys36与Cys42，Cys74与Cys64之间形成两对二硫键，Cys17为不配对半胱氨酸，而重组表达的人粒细胞集落刺激因子由于增加了一个起始密码子，因此为175个氨基酸，相应的，未配对的半胱氨酸成为Cys18。由于G-CSF在代谢过程中易由肾小球滤过，在通过肾小管时又被其中的蛋白酶部分降解并从尿中排出，临床表现为半衰期短，易被酶水解和肾脏清除，因此，临床应用时需要对患者进行多次注射以维持一定的疗效，这样会给患者带来很大的不便于痛苦，而且重复注射也会引起一些不良反应。
蛋白质或者多肽的聚乙二醇（PEG）修饰即PEG化，是将活化的PEG通过化学方法以共价键偶联到蛋白质或多肽分子上，自1977年Davis首次采用PEG修饰BSA（牛血清白蛋白）以来，PEG修饰技术迅速发展，并广泛应用于多种蛋白质和多肽的化学修饰。PEG修饰能赋予蛋白质和多肽多种优良性能，具体表现为循环半衰期延长、免疫原性降低或消失、毒副作用减少以及物理、化学、生物稳定性增强等，在很大程度上扩宽了蛋白质和多肽的应用范围，其机理可能为：蛋白质PEG修饰后，相对分子质量（Mr）增大，当修饰后的蛋白质Mr达到或超出肾小球滤过阀值时，蛋白质随血液循环进入肾脏后就可以逃避肾小球的滤过作用；由于PEG的屏蔽效应，使得修饰后的蛋白质或多肽不易受到各种蛋白酶的攻击，降解速率明显降低，稳定性提高；PEG在溶液中呈无规则卷曲，作为一种屏障，能掩盖蛋白质表面的抗原决定簇，使蛋白质不能与各种细胞表面受体结合，不被机体的免疫系统识别，降低了蛋白质的免疫原性；PEG与蛋白质偶联后能将其优良的理化性质赋予蛋白质，如能改善蛋白质的生物分布和溶解性能。
但是传统的PEG修饰多为随机修饰，存在修饰剂呈现多种聚合度、选择性不够高、修饰后蛋白质分子Mr分布宽、活性降低、稳定性有时不够理想等问题，对于hG-CSF的修饰，不同的PEG修饰剂能够与hG-CSF上N-端的氨基、赖氨酸上的氨基，半胱氨酸上的巯基进行反应，因此得到的为多种修饰产物的混合物，且每种产物的产量多少、活性高低均不同，这对于应用带来很多不便，因此，我们需要对传统的修饰进行处理，已达到定点单修饰的效果，传统的定点单修饰的方法主要从三个方面入手：蛋白质方面，如蛋白质的定点突变、蛋白质可逆性位点定向保护、非天然氨基酸的引入等；PEG的活化形式，如修饰氨基的PEG-醛和修饰巯基的PEG-乙烯基砜等；反应条件的控制，如PH值、金属离子或酶的催化等。发明专利（专利申请号为00130974.9）公开了N-端化学修饰的蛋白质组合物及方法，所采用的PEG-醛定点修饰蛋白质N端，但得到的产物仍然含多修饰产物的混合物。中国发明专利（专利申请号为200810062516.3）公开了一种聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体的制备方法，所采用的就是将重组人粒细胞集落刺激因子的第18位半胱氨酸突变为丝氨酸，从而将突变后的重组人粒细胞集落刺激因子突变体与带有氨基反应基团的PEG反应，再分离纯化，得到聚乙二醇单修饰重组人粒细胞集落刺激因子突变体，由于此方法需要对蛋白质进行突变，而突变之后对蛋白质的影响未知，所以，采用这种方法，一方面操作复杂，另一方面，容易对蛋白质的性质、活性等产生影响，因此，适用范围有限。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种具有高生物活性的聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子。
本发明的另一个目的是提供一种制备高生物活性的聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子的方法。
本发明的另一个目的是提供一种聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子的纯化方法。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子的制备方法，包括以下步骤：
①在hG-CSF溶液中加入0.5-10mol/L的变性剂，在变性剂的存在下，hG-CSF中的巯基便暴露出来，易于与所述特异性巯基修饰剂发生反应；
②加入特异性巯基修饰剂，所述特异性巯基修饰剂为PEG-马来酰亚胺、PEG-邻-吡啶-二硫醚、PEG-乙烯基砜和PEG-碘乙酰胺中的一种，用量为hG-CSF摩尔量的1-50倍，所述特异性巯基修饰剂能够特异的同hG-CSF种未配对的Cys上的巯基进行结合；
③在无氧条件下，25-40℃反应1-24小时后，去除所述变性剂，从而使hG-CSF复性；
④将步骤③中的反应物上样，经离子交换层析及凝胶过滤层析得到单修饰的PEG-hG-CSF纯品。
优选的：
步骤①中，在hG-CSF中加入浓度为4mol/L的盐酸胍或者尿素作为变性剂；
步骤②中，加入hG-CSF摩尔量10倍的PEG-邻-吡啶-二硫醚作为所述特异性巯基修饰剂；
步骤③中，为在无氧条件下，室温反应4小时后，通过超滤将反应液置换至10-100mmol/L、PH4.0-5.0的醋酸缓冲液中；
步骤④中，将步骤③中的反应物上样，经10-100mmol/L、pH4.0-5.0的醋酸缓冲液平衡过的阳离子交换柱，上样后，用0-100%的含1mol/L氯化钠、浓度为10-100mmol/L、PH4.0-5.0的醋酸缓冲液线性洗脱，收集主峰为PEG-hG-CSF，经过凝胶过滤柱柱脱盐，并更换缓冲液为10-100mM醋酸缓冲液pH4.0-5.0，即得到单修饰PEG-hG-CSF。
根据上述方法制得的一种聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子，由人粒细胞集落刺激因子Cys17上的巯基结合聚乙二醇构成。
优选的，所述特异性巯基修饰剂为PEG-马来酰亚胺、PEG-邻-吡啶-二硫醚、PEG-乙烯基砜和PEG-碘乙酰胺中的任一种。
优选的，所述特异性巯基修饰剂的Mr为1KDa至60KDa，性状为直链状或分支状。
更优选的，所述特异性巯基修饰剂是Mr为10KDa的PEG-邻-吡啶-二硫醚。
对于重组的人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF），由于其于天然人粒细胞集落刺激因子（hG-CSF）的区别仅在于多了一个自由氨基酸，未配对的半胱氨酸由第17位排到第18位，因此，其也可以采用本发明提供的方法进行同hG-CSF的操作，并得到相应的单修饰的PEG-rhG-CSF（聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子），即由重组人粒细胞集落刺激因子Cys18上的巯基结合聚乙二醇构成。
本发明的有益效果为：本发明通过采用所述特异性巯基修饰剂以及特殊的反应条件控制、反应步骤设定等，得到的所述聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子（PEG-hG-CSF），具有活性高，操作简单，成本低的特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为采用本发明提供的方法制备的聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子的电泳图谱，其中，数字1表示蛋白maker，2为市售药品，3为采用本发明方法制得的单修饰PEG-rhG-CSF，4为反应液；
图2为本发明实施例中，根据单修饰PEG-rhG-CSF活性测定实验的方法测制得修饰PEG-rhG-CSF的曲线图；
图3为本发明实施例中，采用单修饰PEG-rhG-CSF活性测定实验的方法测未进行休书的rhG-CSF的曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明提供的方法，我们进行下述操作：
①在rhG-CSF中加入浓度为4mol/L的盐酸胍作为变性剂，本实施例中，该rhG-CSF由我公司自行纯化，在变性剂的存在下，rhG-CSF的巯基便暴露出来，易于与所述特异性巯基修饰剂发生反应；
②加入hG-CSF摩尔量10倍的PEG-邻-吡啶-二硫醚作为所述特异性巯基修饰剂；
③在无氧条件下，本实施中，采用的是氮气条件下，室温反应4小时后，通过超滤将反应液置换至10mmol/L、PH4.0的醋酸缓冲液中，使hG-CSF复性；
④将步骤③中的反应物上样，经10mmol/L、pH4.0的醋酸缓冲液平衡过的阳离子交换柱，阳离子交换柱的种类很多，如MacroCap SP，SP Sepharose Fast Flow，SP SepharoseHigh Performance等阳离子交换介质，本实施例中，我们采用的是SP Sepharose HighPerformance，上样后，用100%含1mol/L氯化钠、浓度为10mmol/L、PH4.0的醋酸缓冲液线性洗脱，收集主峰为PEG-rhG-CSF，经过凝胶过滤柱脱盐，凝胶过滤柱有多种，包括SephadexG10、G15、G25等，本实施例中，采用的是Sephadex G25柱，并更换缓冲液为10mM醋酸缓冲液pH4.0，得到单修饰PEG-rhG-CSF。
我们对得到的单修饰的PEG-rhG-CSF进行活性测定实验，如下：
1、实验目的：测定采用本发明得到的单修饰PEG-rhG-CSF的活性；
2、实验材料准备：
2.1RPMI1640培养液：每1L添加2.2g碳酸氢钠、5.9g HEPES，4℃保存。
2.2基础培养液：RPMI1640培养液+15%马血清(v/v)+0.03%谷氨酰胺+0.011%丙酮酸钠＋100U/ml双抗（青、链霉素），4℃保存。
2.3完全培养液：基础培养液＋PEG-rhG-CSF至终浓度20ng(3000IU/ml)。4℃保存。
2.4测活培养液：RPMI1640培养液+7.5%马血清(v/v)+0.03%谷氨酰胺+0.011%丙酮酸钠＋100U/ml双抗（青、链霉素），4℃保存。
2.5MTT：用PBS(0.01mol/L pH7.2)配成5mg/ml。
2.6裂解液：含1%浓盐酸，10%Triton X-100的异丙醇溶液，室温避光保存。
2.7PEG-rhG-CSF生物学活性国家标准品：使用rhG-CSF，购于中国生物制品检定所。
2.8NFS-60细胞培养物：应为偏酸性、略微混浊液体，上次传代后48～60小时用于PEG-rhG-CSF活性测定。
3、实验步骤
以下3.1～3.7项各步骤应于无菌条件下进行。
3.1准备：将实验所用溶液预温至37℃。
3.2制备细胞悬液：取足量NFS-60细胞培养物，离心收集NFS-60细胞，用RPMI1640培养液洗涤3次，然后重悬于测活培养液配成1.0×105～2.0×105个细胞/ml的细胞悬液，每孔50μl细胞悬液接种96孔培养板中，置37℃备用。
3.3标准品溶液：取标准品或企业生物学活性标准品，用测活培养液稀释至500IU/ml左右。
3.4样品溶液：将待检样品按标示量溶解后，用测活培养液稀释成500IU/ml左右。
3.5在96孔细胞培养板中，每孔加入100μl测活培养液，每孔加入50μl标准品溶液或样品溶液，然后以3倍稀释度做梯度稀释，标准品和待检样品同做7～8个稀释度，取50ul加入96孔细胞板中，每个梯度做2～3个复孔，同时做空白对照。37℃，5%CO2培养40～48小时。
3.6加入MTT溶液并培养：每孔加入20μlMTT溶液，37℃，5%CO2培养4～5小时。
3.7加入裂解液并测定结果：每孔加入200μl裂解液，混匀后在酶标仪上比色，测定波长570nm，参比波长630nm，记录测定结果。
3.8稀释倍数为横坐标，A570/630值为纵坐标，做四参数回归方程曲线图。
4.结果计算：
通过该方法测得的单修饰PEG-rhG-CSF体外活性为0.98×108U/mg，而相比修饰前的体外活性（1.4×108U/mg），活性仅下降了30%。
我们比对国内外同类型专利产品的活性，发明专利（专利申请号为200510042587.3）公开了一种聚乙二醇修饰蛋白质α-氨基的方法和发明专利（专利申请号为00130974.9）公开了N-端化学修饰的蛋白质组合物及方法的专利中发现，国内同类型产品的活性下降约50%，而国外同类型产品的活性下降约40%，因此，本发明专利产品的活性相比其他的产品，活性更高。
我们还对得到的单修饰PEG-rhG-CSF进行纯度的测定，采用的测定方法是琼脂糖凝胶电泳，并得到如图1所示的电泳图谱，采用本发明的的方法纯化样品纯度高，再通过进行拍照检测对比分析，我们测得本发明得到的单修饰PEG-rhG-CSF的纯度大于99.5%，高于国内外同类型的产品的纯度（>95%）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
①在rhG-CSF中加入浓度为4mol/L的盐酸胍作为变性剂；
②加入rhG-CSF摩尔量10倍的PEG-邻-吡啶-二硫醚作为特异性巯基修饰剂；
③采用的是氮气条件下，室温反应4小时后，通过超滤将反应液置换至10mmol/L、pH4.0的醋酸缓冲液中，使rhG-CSF复性；
④将步骤③中的反应物上样，经10mmol/L、pH4.0的醋酸缓冲液平衡过的阳离子交换柱，阳离子交换柱采用的是SP Sepharose High Performance，上样后，用100％含1mol/L氯化钠、浓度为10mmol/L、pH4.0的醋酸缓冲液线性洗脱，收集主峰为PEG-rhG-CSF，经过凝胶过滤柱脱盐，凝胶过滤柱采用的是SephadexG25柱，并更换缓冲液为10mM醋酸缓冲液pH4.0，得到单修饰PEG-rhG-CSF。
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