CN1960766A - 新的g－csf轭合物 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及新的PEG－G－CSF轭合物，在其中PEG分子连接天然G－CSF基本序列17位半胱氨酸残基或G－CSF类似物相应位置的半胱氨酸残基。本申请还描述生产这种轭合物的方法，这种方法包括以下步骤：(i)使G－CSF蛋白质经受诱导蛋白质可逆变性的条件，(ii)在步骤i得到的变性的蛋白质与巯基－活性PEG在变性的条件下轭合，(iii)使在步骤ii得到的轭合物经受促进轭合物复性的条件，产生生物活性的G－CSF－PEG轭合物。

Description

新的G-CSF轭合物
发明领域
本发明涉及粒细胞集落刺激因子(G-CSF)位点特异性的化学修饰。
背景技术
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，是体内粒细胞生成的主要调节因子，目前代表刺激粒细胞系增殖、分化和细胞存活的药物活性蛋白质。人类G-CSF是糖蛋白，大约20kDa大小，由骨髓中的巨噬细胞和基质细胞产生(Fibbe等人，1989 Interleukin 1 and poly(rI).poly(rC)induceproduction of granulocyte CSF，macrophage CSF，and granulocyte-macrophage CSF by human endothelial cells，Exp Hematol.，Mar 17(3)，229-34)，其首先由命名为5637的人类膀胱癌细胞系的条件培养液纯化(Welte等人，1985，Purification and biochemical characterizationof human pluripotent hematopoietic colony-stimulating factor，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，1526-1530)。编码人类G-CSF的DNA序列的确定(开放状态的日本专利申请KOHYO No.500636/88)使通过重组基因技术生产人类G-CSF成为可能。大肠杆菌(E.coli)表达的G-CSF不同于天然产物，因为它缺少糖基化并且随着细菌表达伴有N-末端的蛋氨酰(Lu等人，1989，Disulfide and secondary structure ofrecombinant human granulocyte colony-stimulating factor，Arch.Biochem.Biophys 268，81-92)。
G-CSF的临床应用(综述于Nemunaitis J.，1997，A comparativereview of colony-stimulating factor，Drugs 54，709-729；Welte K.等人，1996，Filgrastim(r-metHuG-CSF)：Thefirst 10 years，Blood88，1907-1929中)开始于1986年，在用化疗治疗的肿瘤病人中进行首次临床试验(Bronchud M.H.等人，1987，Phase I/II study ofrecombinant human granulocyte colony-stimulating factor inpatients receiving intensive chemotherapy for small cell lungcancer，Br.J.Cancer 56，809-813)，并且现在广泛用于治疗中性粒细胞减少症。中性粒细胞减少症发生在多种疾病背景中，包括先天缺陷、药物处理后的骨髓抑制、和感染。这种疾患在经历细胞毒化疗的癌症病人中也发生。中性粒细胞减少症能反过来引起通常需要住院的细菌感染和二次感染。G-CSF能缩短中性粒细胞减少症的时期或一起预防之。在1991年，美国食品与药物管理局批准了Neopogen(Filgrastin，rh-met-huG-CSF)用于化疗之中或之后遭受中性粒细胞减少症的那些病人。用G-CSF治疗能允许更高剂量强度的方案，其可能允许更好的抗肿瘤效果(Morstyn D.和Dexter T.M.，1994，Neupogen(r-metHuG-CSF)in Clinical Practice，Marcel Dekker，New York)。后来世界范围批准在骨髓移植中的应用并且更近期对严重的慢性先天性中性粒细胞减少症的治疗。Neopogen在用于移植的外周血祖细胞的动员中有潜在应用(Herman等人，1996，Characterisation，formulation，and stabilityof Neupogen(Filgrastim)，a recombinant human granulocyte-colonystimulating factor.，Pharm Biotechnol.9，303-28)。
美国市场有80多种多肽药，并且另外350种正在进行临床试验。大约1/3在临床试验中的候选药品是多肽，但这些药品通常体内半衰期短。多种因素影响从循环系统除去肽，如蛋白裂解降解作用、肾脏过滤作用、以及免疫原性反应和抗原性反应。另外，多数多肽药品必须通过注射递送，或者皮下地或者静脉地，并且通常低溶解性也可能是问题。
为克服这些不足，提议了一些方法，例如改变肽的氨基酸序列以降低被酶的降解和抗原性副作用，或者将它们与免疫球蛋白或白蛋白融合以改善半衰期，并且将它们掺入例如脂质体的递送载体。对于考虑G-CSF的，提交了开发这种方法的许多专利申请并且文章也发表了。我们引用在那些报道中基本序列中的变化：
美国专利No.5,214,132报道了人类G-CSF一种遗传变异体，其在1、3、4、5和17位与天然rhG-CSF不同，其中替代了天然的G-CSF氨基酸，突变蛋白相应替代为Ala、Thr、Tyr、Arg和Ser(参见Kuga等人1989，Mutagenesis of human granulocyte colony stimulating factor，Biochem.Biophys.Res.Commun.159，103-111)。
M.Okabe等人(In vitro and in vivo hematopoietic effect ofmutant human granulocyte colony-stimulating factor，1990，Blood75(9)May 1，1788-1793)报道rhG-CSF的一种衍生物，其中rhG-CSF的N-末端区的5个位点的氨基酸被替代，其在两个分析中的小鼠和/或人的骨髓祖细胞中与完整的G-CSF相比显示更高的特异活性。
美国专利No.5,218,092公布人类G-CSF一种遗传变异体，其在1、3、4、5、17、145和147位与天然rhG-CSF不同，其中替代了天然的G-CSF氨基酸，突变蛋白相应替代为Ala、Thr、Tyr、Arg、Ser、Asn和Ser。
WO 01/04329-A报道了一种rhG-CSF突变蛋白，其在1、2、3或17位与天然rhG-CSF不同。
WO 02/20766-A和02/20767-A公布了被组氨酸取代的G-CSF类似物的构成。
WO 02/077034-A报道了有降低的免疫原性的修饰的G-CSF，通过移去一个或多个T-细胞表位或通过降低MHC同种异型的数量获得。
用于降低蛋白清除率、增进蛋白稳定性或消除蛋白抗原性的替代方法是PEG化，其中蛋白质通过使用聚(乙二醇)链被化学修饰。当聚(乙二醇)(PEG)被合适地连接到多肽，它修饰其许多特征，同时例如酶活性或受体识别的许多生物功能可能被保留。PEG的轭合遮盖了蛋白质表面并且增加了多肽分子的大小，因此降低肾脏的超滤作用、阻止与抗体或抗原递呈细胞的接触并且减少被蛋白裂解酶的降解。最终，PEG将其物理化学的性质传递给分子，并且因此也修饰肽和非肽药物的生物分布和溶解性。对于PEG化的一般方法和结果的回顾参见以下的出版物和专利，当然还有其它：
Davis等，美国专利No.4,179,337，Non immunogenic polypeptide，1977，其能被认为是基础；
Delgado C.等，1992，The uses and properties of PEG-linkedproteins，Crit.Rew.Ther.Drug Car.Sys，9(3，4)，249-304；
Zalipsky S.，1995，Ad.Drug Del.Rev.：Chemistry ofpolyethylene glycol conjugates with biologically active molecules16，157-182，其中描述了一批方法和突出的报道；
F.M.Veronese，2002，Peptide and Protein PEGylation：a reviewof problems and solutions，Biomaterials，1-13；F.M.Veronese和J.M.Harris edrs.，Ad.Drug Del.Rev.，Theme issue on″Peptideand Protein Pegylation I″，2002，54，453-606，其中报道了更多批的文章；
Harris J.M.和Veronese F.M.edrs.，Ad.Drug Del.Rev.，Themeissue on″Peptide and Protein pegylation II-clinical evaluation″，2003.55：1259-1350)。
WO 995377公布了一种方法，用于制备PEG-INF β轭合物，其包括分步连接小PEG组成部份，随后连接大PEG衍生物，并且允许修饰空间拥塞的干扰素位点。
其它讨论蛋白质PEG化方法的出版物为：
F.M.Veronese，2001，Peptide and protein PEGylation.A reviewof problems and solutions，Biomaterials，Vol 22(5)，405-417。
R.S.Goodson等，1990，Sitedirected PEGylation of recombinantinterleukin-2 at its glycosilation site，Biotecnology，Naturepublishing，Vol 8(4)，343-346。
关于这类技术也出版了书籍，当然还有其它：
Poly(ethylene glycol)Chemistry and Biological Application，J.Milton Harris and Samuel Zalipsky edrs，1997，ACS Symposiumseries 680；
Poly(ethylene glycol)chemistry，Biotechnical and BiomedicalApplications，J.M.Harris edr.，1992，Plenum Press；
到目前，通过PEG化蛋白质得到的好处是公认的，例如在体内延长半衰期或降低免疫原性。已经进行了一些关于PEG化抗体以及抗体片段的研究，以在异种给药时降低免疫原性。
一些其它的研究已经显示PEG化后的抗体或抗体片段生物分布的改变，其引起在肿瘤中更高的富集而在正常组织中没有较高的水平，如由A.P.Chapman报道在A.D.D.R.，2002，PEGylated antibodies andantibody fragments for improved therapy：a review 54，531-545)中。
Schering-Plough已经开发了通过连接12kDa单甲氧基聚乙二醇到干扰素α-2b(内含子A)的新药，其满足了长效干扰素α蛋白质的需要同时提供显著的临床意义(Y.Wang，S.Youngster，M.Grace等人，2002，Structural and biological characterization of pegylatedrecombinant interferon alpha-2b and its implications，A.D.D.R.54，547-570)。
在文献中也描述了命名为Peginterferon α-2a(40kDa)的连接大分子量PEG的干扰素，干扰素α-2a与40kDa的支链聚乙二醇部分连接，其显示持续的吸收和减低肾脏清除作用，结果每周一次代替了每周两次的剂量方案(K.R.Reddy，M.W.Modi，S.Pedder，2002，Use ofpeginterferon alpha-2a(40kDa)(Pegasys)for the treatment ofhepatitis C，A.D.D.R.54，571-586)。
美国专利No.4,766,106公布了应用蛋白质选择性地连接水性聚合物(water polymer)的用于药物组合物的蛋白质增加的溶解性，所述水性聚合物选自聚乙二醇或聚氧乙二醇(polyoxyethylated polyols)。
在美国专利No.5,093,531和5,214,131中，发明人Sano等报道一种聚乙二醇衍生物能修饰肽中的胍基。
美国专利No.5,122,614公布了一种新形式的PEG(聚乙二醇-N-琥珀酰亚胺碳酸酯)，其在水性缓冲液中容易与蛋白质的氨基反应。
Harris等在美国专利No.5,252,714报道了用于轭合氨基的聚乙二醇丙醛的制备和使用。
欧洲专利申请0,236,987和0,539,167公布了使用新的PEG的亚胺酸酯(imidate)衍生物和其它水溶性聚合物修饰有自由氨基的蛋白质、肽和有机化合物。
几篇文章和专利是专门关于G-CSF及其PEG化的，在其中，Kinstler等在美国专利No.5,985,265中公布了用于蛋白质N-末端修饰的新方法。通过使用还原的烷基化反应，发现终产物(与水溶性聚合物氨基连接的蛋白质)与相同的有酰胺键的聚合物-蛋白质轭合物相比更加稳定。在研究文章中，Kinstler等报道了连接rhG-CSF和聚乙二醇的定点方法(2002，Mono-N-terminal poly(ethylene glycol)-protein conjugates，A.D.D.R.54，477-485)。这样的选择性是通过在pH 5引导蛋白质与PEG-丙醛的还原烷基化反应而获得的。作为使用rhG-CSF和rhMGDF的实施例子，显示了使用这个方法以促进这些蛋白质的递送特征和治疗意义。
WO 9903887公布了通过定点诱变获得的G-CSF的衍生物，其中在天然发生的蛋白质的序列中引入半胱氨酸残基。这些衍生物选择性地PEG化。
WO 90/06952公布了应用PEG链通过自由氨基或羧基对G-CSF进行化学修饰。这样的PEG修饰的G-CSF在体内有更长的半衰期，可能促进从中性粒细胞减少症的恢复并且它基本有相同的生物活性。
WO 00/44785报道rhG-CSF的轭合物有1-5个PEG链，其显示改进的性质，包括超稳定性、更强的溶解性、提高的循环半衰期和血浆滞留时间。
WO 90/06952公布了人类G-CSF的遗传变异体，根据开放状态的日本专利申请KOHYO No.500636/88中公布的方法制备，使用PEG化学修饰，其有基本相同的生物活性、在体内有更长的半衰期。而且观察到这样的G-CSF-PEG轭合物可能促进从中性粒细胞减少症的恢复。
WO 03/006501-A公布了氨基酸序列的至少一个氨基酸残基与天然rhG-CSF不同的rhG-CSF，并且与至少一个非多肽部分连接。
WO 89/06546公布了CSF-1的遗传变异体，其与聚乙二醇或聚丙二醇同聚物轭合，保持了生物活性并增加循环哺乳动物的半衰期。
WO 90/06952报道了新的化学修饰的G-CSF，其或者通过氨基酸残基的氨基基团或者通过羧基基团与聚乙二醇连接。
更多的具有不同结构和性质的PEG-G-CSF轭合物公布于欧洲专利No.0,335,423。
其它多聚物修饰的G-CSF已经公布于WO 02/20033和WO 02/20034中。
PEG 化的G-CSF也用于研究蛋白质的不同给药率，即肺部递送。这报道于R.W.Niven等人，1994，Pulmonary absorption of polyethyleneglycolated recombinant human granulocyte-colony stimulatingfactor(PEG rhG-CSF)，J Controlled Release 32，177-189中。
最后，PEG-G-CSF的生物性质被Satake-Ishikawa等人描述于1992，Chemical modification of recombinant human granulocytecolony-stimulating factor by polyethylene glycol increases itsbiological activity in vivo，Cell Struct Funct.17，157-160。
以上提及的G-CSF轭合物已经通过轭合蛋白质的氨基基团获得。到目前为止没有通过-SH基团的官能化制备衍生物，可能因为这样的基团嵌入蛋白质的三级结构的内部并且非常难接触到。本发明已经解决这样的问题并且提供简单的方法，其提供具有高纯度和生物活性的作为单一产物的G-CSF-PEG轭合物。
发明内容
本发明公布解决与用于治疗使用的合适G-CSF制剂的制备相关的问题的方法。本技术领域的专家非常清楚，关于G-CSF当然还有其它的蛋白质用于治疗的应用受限制于由于高清除率、蛋白裂解降解、和进一步的免疫原性反应的在体内短的半衰期。
本发明的目标是新的活性PEG-G-CSF轭合物，其中聚(乙二醇)(即PEG)的一条链通过天然蛋白质Cys 17氨基酸残基共价连接。能用于本发明目的的G-CSF分子可以是天然分子也可以是有N-末端蛋氨酰残基的重组分子(非格司亭)。G-CSF的类似物能替代使用。本文中的类似物指保留天然发生蛋白质的大部分主要结构并维持其生物活性的产物。优选地这些类似物能通过重组技术生产，用其它氨基酸替代人类序列的一个或多个氨基酸而产生。它们被通常称为突变蛋白。
本发明进一步的目标是轭合PEG到生物活性蛋白质的新方法。专家已知多数PEG轭合物的应用与不稳定的分子有关，例如多肽或蛋白质，所以轭合反应必须要求温和的化学条件。蛋白质中适合多聚物轭合的最通常的反应基团是赖氨酸的ε氨基基团和N-末端氨基酸的α氨基基团。因为自由形式的N-末端的氨基或赖氨酸在目前任何给出的蛋白质或肽中几乎总是存在的，其中包括G-CSF，并且因为所述N-末端的氨基和赖氨酸容易反应，所以PEG被最经常地通过这些氨基基团与蛋白质轭合。实际上，WO 00/44785公布了G-CSF-PEG轭合物，其有连接在赖氨酸或NH2末端残基的PEG链。这种轭合对存在4赖氨酸(Lys 16，Lys 23，Lys 34，Lys 40)、一个α末端自由氨基基团的G-CSF是可能的并且它们全部可用于接触水溶液。在报道的实例中，由于PEG连接在不同的位点，共轭混合物提供为蛋白质种类的多种性，必须通过分离和鉴定以用于有利益的应用。为克服轭合物的多种性的问题，一些作者利用赖氨酸ε-氨基在pH 8以上是好的亲核体，因为它的pKa大约为9.5，而N-末端氨基酸的α氨基基团比赖氨酸碱性弱并且也在更低的pH反应的事实。反应的pH因此是关键以获得轭合物的选择性并随后得到简化的产物混合物。
在美国专利No.5,985,265中，这种性质被开发，并且使用在pH 5周围的反应优先地修饰N-末端氨基酸残基的化学方法被公布。在这个实例中，虽然反应是不完全的并且赖氨酸氨基基团也可能反应，尽管以相对非常低的程度，但是反应是优先地针对N-末端残基。获得的混合物因此必须被纯化以达到所要的产物的均一性。
在蛋白质中另一种重要的潜在活性残基是巯基，其对多种巯基活性PEG是非常活性的，所述巯基活性PEG例如单甲氧基-PEG-马来酰亚胺(m-PEG-马来酰亚胺)、m-PEG-邻-二硫化吡啶、m-PEG-乙烯砜，其根据文献中已知的方法反应[Veronese F(2001)Peptide and proteinPEGylation：a review of problems and solutions.Biomaterials 22，405-417；Roberts MJ等人(2002)Chemistry for peptide and proteinPEGylation.Adv.Drug Deliv.Rev.54，459-476]。
几篇文献描述了在半胱氨酸残基上特定的PEG化(Cantin AM等人，2002，Polyethylene glycol conjugation at Cys232 prolongs thehalf-life of alpha 1 proteinase inhibitor.Am J Respir Cell MolBiol.：27(6)：659-65；Leong SR等人，2001，Adapting pharmacokineticproperties of a humanized anti-interleukin-8 antibody fortherapeutic applications using site-specific PEGylation Cytokine.16(3)：106-19；Collen D等人，2000，Polyethyleneglycol-derivatized半胱氨酸-substitution variants ofrecombinant staphylokinase for single-bolus treatment of acutemyocardial infarction.Circulation 102(15)：1766-72；Goodson RJ等人，1990，Site-directed PEGylation of recombinant interleukin-2at its glycosylation site Biotechnology 8(4)：343-6；Paige等人Prolonged circulation of recombinant human granulocyte-colonystimulating factor by covalent linkage to albumin through aheterobifunctional polyethylene glycol，Pharmaceutical Research，Vol.12，No.12，1995)。
不幸地，在蛋白质中半胱氨酸残基很少以自由的形式存在，并且进一步它们通常在胱氨酸中以二硫化物存在，当半胱氨酸残基是自由时，它们经常包含在分子的活性区域。进一步它们经常处在难以接触的分子区域中。例如它们被包埋在狭窄的疏水缝隙中，并且只是部分暴露于溶剂。这样使这些残基被化学地遮蔽，其意味它们在天然条件下反应很慢或有很低的产量。
在rhG-CSF主要的序列中有5个Cys，它们中4个参与2个二硫键(Cys 36-Cys 42，Cys 64-Cys 74)，但幸运地一个Cys 17是自由的。Arakawa等人1993年报道Cys17在天然的构象下不被亲水剂、碘乙酸接触而羧甲基化，但当rhG-CSF变性时它变成完全活性的。在其它实验中，自由硫氢基(sulphydryl)已显示在非变性的条件下与疏水修饰剂二硫代双硝基苯甲酸(DTNB)反应很慢。从这些实验和从通过NMR估计的三维结构，假设自由半胱氨酸停留在分子的疏水环境内部并且因此不被通过亲水烷化剂的化学修饰接触，而更易被疏水剂接触。G-CSF的构象研究实际上显示17位的-SH在蛋白质的疏水口袋中，只是部分暴露于溶剂。另外，Wingfield等人(1988，Characterization of recombinant-derivedgranulocyte-colony stimulating factor(G-CSF)，Biochem J.Nov 15；256(1)，213-8)发现在17位Cys到Ser的取代没有引起可察觉到的蛋白质的物理或生物性质的改变。
发明人目前发现特定地在Cys17的巯基基团轭合用于生产G-CSF轭合物的方法。
所述方法包括以下步骤：
i)使G-CSF蛋白经受诱导蛋白质可逆变性的条件，
ii)在变性的条件下，步骤i)中得到的变性蛋白质与巯基活性PEG的轭合，
iii)使步骤ii)中得到的轭合物经受促进轭合物复性和出产期望的轭合物的条件。
发明人报道的生物实验显示根据上述方法制备的PEG-G-CSF轭合物在细胞增殖测试中保持生物活性。
步骤(i)的可逆变性是在一种或多种变性剂存在下实施的，所述变性剂例如，尿素、盐酸胍(guanidine chloride)或异硫氰酸酯、二甲基-尿素、高中性盐浓度和溶剂(例如乙腈、醇、有机酯、二甲亚砜)。对于可逆化学变性，其指一种过程，在其中蛋白质在变性时失去其天然结构和功能，然而当除去变性剂时，或者结构或者功能性质恢复。在这样的变性剂存在下，蛋白质伸展并且17位Cys的巯基基团暴露并且变成功能化接触得到的。变性的过程能通过远UV-CD光谱监控。变性剂的量能根据使用的变性剂由技术人员选择。变性剂能是尿素、盐酸胍、异硫氰酸酯或二甲基-尿素，并且这样的变性剂优选地在大于2M的浓度，优选地大于3M，并且甚至更优选地2-4M。例如在盐酸胍的情况下，盐酸胍的浓度优选地大于2M，并且优选地大于3M，并且甚至更优选地4-6M。
在步骤ii)中得到的伸展蛋白质维持在变性的条件，与活性PEG反应，其对于巯基基团有特定的反应性“巯基反应性PEG”。
巯基反应性PEG对于本领域的技术人员是已知的；优选的是二硫邻位吡啶(orthopyridyl disulphide)、乙烯砜、N-马来酰亚胺、碘乙酰胺。
PEG能是直链或支链的，并且可以有800-80,000Da并且优选地5,000-40,000Da的分子量。
双官能化的PEG可以使用，例如OPSS-PEG-OPSS；VS-PEG-VS；VS-PEG-OPSS，MAL-PEG-MAL，MAL-PEG-OPSS，MAL-PEG-VS。
反应的完全性能通过例如HPLC的普通分析方法测定，或通过比色实验监视巯基的存在。
当步骤(ii)完成时，轭合物能被引导再折叠，由暴露它于根据标准方法的复性条件，例如公布于Mechanisms of protein folding，Pain RH(edt.)，IRL-Press，Oxford U.K.，1994中和Middelberg APJ.Preparative protein refolding.Trends Biotechnol.20，437-443，2002中(在此并入作为参考)，产生原始的α-螺旋结构。
典型的方法包括通过透析、超滤、色谱方法去除变性剂。用于步骤i、ii、iii的pH和温度能由技术人员选择并且可以根据使用的反应物、活化的多聚物的类型和其分子量而变化。
条件和试剂必须选定以避免不可逆的变性或半胱氨酸-S-S-键的断裂。
优选温和的pH，例如4-10，更优选地6-8，并且更优选地接近中性。
低温也是优选的，0-30℃，尽管对于高MW的PEG(多聚物)的轭合，如果高温被使用(例如40℃)，能获得高产量。
对技术人员，清楚的是，以上所述轭合的方法能用于制备包含″隐藏的″半胱氨酸基团的任何蛋白质的轭合物。
该方法的第一步优选地在5℃-50℃之间的温度下进行，优选地在20℃-40℃之间的温度下进行。
复性可以通过透析、超滤、色谱或稀释方法除去变性剂而获得。
如在此报道的，用生产单官能化的蛋白质的方法进行的，G-CSF与具有巯基反应性PEG的成功轭合，对已知的和大大开发PEG化的技术和生物优势开辟了道路。
提出的方法允许得到具有分子量很大增长的产物，并且更重要地，在分子的大的水动力学体积有很大增长。
如已知的，PEG的水动力学体积相应于大约3-4倍来自它重量的期望，并且因此具有5000、10000和20000Da的PEG的轭合物，如本专利在实施例中描述的，相应于大约40000、50000和60000Da的蛋白质的体积。有这样体积的产物已知克服了肾小球过滤的阈值，并且期望由此显著增加在血液中的滞留时间。
因此，本专利申请公布了一种药物组合物，其包括如上述描述制备的轭合物，用于口、注射、鼻、肺或栓剂或经皮肤的应用。
在此报道的巯基轭合步骤，其开发用于轭合可逆变性以暴露半胱氨酸残基的SH基团(在G-CSF情况中为序列中的17号残基)，与以往报道的技术相比更方便，并且其是基于氨基基团的修饰。实际上，在氨基基团的修饰中，如果通过降低pH到只是靶向α氨基酸残基来增加反应的特异性，通常也获得多重产物。在氨基基团的修饰中得到的产物，之后必须通过耗时的过程适当地分割和纯化并且损失产物。
在此提出的方法可能容易地放大并且仅需要几步以获得终产物：
i.在变性溶液中溶解，
ii.加入粉末形式的活性PEG，
iii.除去变性剂并且通过透析或柱层析使蛋白质重折叠。
可选地，变性剂(即盐酸胍、尿素或其它变性剂)可被加入蛋白质的水性溶液，伴随着在步骤ii中加入活化的PEG。变性剂能是尿素、盐酸胍、异硫氰酸酯或二甲基-尿素，并且这样的变性剂优选地在大于2M的浓度，优选地大于3M，并且甚至更优选地2-4M。例如在盐酸胍的情况下，盐酸胍的浓度优选地大于2M，并且优选地大于3M，并且甚至更优选地4-6M。
众所周知的是，在蛋白质PEG轭合中的通常问题在于在酶的情况下催化活性的丢失，或在例如细胞因子的配基修饰的情况中的识别的丢失。作为典型的例子，在轭合后α-干扰素的活性发生几倍的降低。
我们的G-CSF巯基修饰发现不是这样的情况。最可能地这种积极的行为是与通过我们技术获得的单点粘附有关，到达远离识别位点的蛋白质的三维排列中的SH位置。我们的轭合物的原始生物活性的维持用NFS-60细胞在细胞培养中检测。具有G-CSF受体的数量过表达和生长的细胞与细胞因子的浓度成比例。表示为EC50即刺激50％最大生长的浓度的G-CSF活性，与一种天然蛋白质很相似，如在实施例中和在图n10中举例说明的。
在本发明的另一方面，双官能活性PEG衍生物(OPSS-PEG-OPSS；VS-PEG-VS；VS-PEG-OPSS，MAL-PEG-MAL，MAL-PEG-OPSS，MAL-PEG-VS)可用于产生二聚G-CSF(即G-CSF-PEG-G-CSF)，在其中两个G-CSF单体在Cys17的巯基基团通过PEG连接在一起。这样获得的二聚体的体外活性与那些相应的G-CSF的PEG形式相当。这些二聚体的主要优势是由于它们增加的分子质量而减少的体内清除率(如果与相应的G-CSF的PEG形式相比)。
具体实施方式
实施例1：通过直接PEG化将5kDa PEG轭合到rhG-CSF的制备
用5kDa甲氧-PEG-邻位吡啶-二硫化物修饰G-CSF
在2ml的缓冲液中(0.5M Tris，pH 7.2)，甲氧-PEG-邻位吡啶-二硫化物(1.81mg，0.360μmol)被加入到0.67mg，0.0356μmol的rhG-CSF，反应物对rhG-CSF的摩尔比例10/1。允许反应在室温进行几个小时，以达到PEG-G-CSF轭合物稳定地形成，如通过HPLC和SDS-PAGE证实的(参见以下)。
PEG-OPSS G-CSF轭合物的鉴定
1.DTNB比色分析(Ellman)
Ellman反应物，5，5′-二硫代双(2硝基苯甲酸)(DTNB)允许估算在蛋白质和其它生物系统中的自由巯基。分析的敏感性归于2-硝基-5-硫代苯甲酸阴离子的高分子吸收系数，其与来自硫醇阴离子与DTNB的反应的混合的二硫化物一起产生(Habeeb A.F.S.A.，1972，Reaction ofprotein sulphydryl group with Ellman′s reagent，Methods inEnzymology 25，457-464)。以这种方式可能确定在天然或轭合物蛋白质中硫氢基团的百分比，并且以此知道修饰的量。
2.SDS-PAGE
rhG-CSF衍生物的量通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳定量评价。具有低度交联的胶(60％丙烯酰胺，0.8％双丙烯酰胺)被使用以允许轭合物迁移。在不同时间分析反应混合物。
通过考马斯蓝染色观察到的蛋白质揭示少量新的高分子量蛋白质种类的存在，相应于5kDa PEG-OPSS链连接到rhG-CSF，并与起始材料未反应蛋白质的主要点(major spot)在一起。参见图1b。
3.RP-HPLC C4
反应混合物根据以下的洗脱条件用C4 Vydac柱通过反相HPLC分析。洗脱剂A，0.05％TFA于水中，和洗脱剂B，0.05％TFA在乙腈中。以下的线性梯度被使用：40％B使用4分钟，18分钟后升到70％B，2分钟后95％B，在95％B中放置6分钟并且然后放置在40％B 2分钟。流为0.8ml/min并且UV灯在226nm。反应的时间过程显示有限量的轭合物的形成而大部分蛋白质没有被修饰洗脱了。参见图1a。
用5kDa甲氧基-PEG-乙烯砜修饰G-CSF
在6ml缓冲液中(0.5M Tris，pH 7.2)，甲氧基-PEG-乙烯砜(5.29mg，1.058(mol)加入到2.18mg，0.116(mol的rh G-CSF，反应物对rhG-CSF的摩尔比例10/1。反应被允许在室温进行几个小时，以达到PEG-G-CSF轭合物稳定的形成，如通过HPLC和SDS-PAGE证实的(参考以下)。在图2a或b中反应混合物在不同时间的HPLC关系图和SDS-PAGE。图形显示G-CSF的轭合但只是发生在很有限的程度，虽然反应进行了几个小时。
实施例2：rhG-CSF的可逆变性
在0.1M、pH 7.27的磷酸缓冲液中的8M盐酸胍以不同的量加入rh-GCSF缓冲液以达到终浓度2，4 e 5摩尔。在室温孵育4小时后，混合物对水性酸溶液透析，以除去变性剂并且达到pH 3.5的G-CSF的稳定条件。
图3报道起始蛋白质和在变性-复性过程后的CD光谱。二级结构的恢复是从治疗前和后220-208nm椭圆率证明的。以下的实验显示G-CSF可经受变性并且复性到原来的结构。
实施例3：在变性条件下通过巯基反应物制备5kDa的PEG rhG-CSF
5kDa PEG-OPSS和PEG-VS与rhG-CSF的轭合
3a：pH 7.2的Tris 0.5M，6M尿素被加入G-CSF缓冲溶液以达到3M尿素的终浓度。mPEG-OPSS或mPEG-VS被以每摩尔蛋白质10摩尔反应物的摩尔比例加入这种溶液。反应被允许在室温进行6小时并且通过加入0.1 N HCl终止。
3b：G-CSF被加入pH 7.27，0.1M的磷酸缓冲液中的8M盐酸胍的溶液，以获得终变性浓度2、4、6M。变性的G-CSF被加入PEG-OPSS或PEG-VS溶液以达到每摩尔蛋白质10摩尔反应物的摩尔比例。在室温4小时后，反应被用0.1N的HCl终止。
实施例4：5kDa PEG轭合到rh-G-CSF的鉴定
1.RP-HPLC色谱
反应混合物通过反相HPLC分析，根据以下的洗脱条件使用C4 Vydac柱。洗脱剂A，0.05％TFA于水中，和洗脱剂B，0.05％TFA在乙腈中。以下的线性梯度被使用：40％B使用4分钟，18分钟后升到70％B，2分钟后95％B，在95％B中放置6分钟并且然后2分钟后放置在40％B。流为0.8ml/min并且UV灯在226nm。
图4A显示天然G-CSF的色谱。图4B显示使用尿素作为变性剂的轭合物(PEG-OPSS)的形成。图4C、D、E显示在不同反应条件下轭合物(OPSS)的形成，即在图4C中盐酸胍的量为2M，在4D中4M，和在4E中6M。如可能在图4C-E中看到的，轭合物的百分比随胍的浓度而增长。图5B、C、D显示相应地与图5C、D、E相同条件(胍的浓度)下轭合物(PEG-VS)的形成。
选择的最好条件为4M胍，因为它代表了在产量修饰和温和变性条件之间好的折衷。
反应的时间过程显示有限量轭合物的形成而大部分蛋白质没有修饰洗脱了。
2.天然G-CSF和使用HPLC色谱从反应混合物分离的G-CSF-PEG-OPSS(5kDa)轭合物的MALDI-TOF质谱。
图6A(天然G-CSF)报道在18.930Da峰，其对应天然G-CSF的分子量。图6B(PEG化G-CSF)报道在24.711Da的峰，其对应天然G-CSF结合单链PEG-OPSS(5kDa)的分子量。
图7(G-CSF的反应混合物)报道在24.583Da的峰，其对应天然G-CSF结合单链PEG-VS(5kDa)的分子量。
3.天然G-CSF和G-CSF-PEG轭合物的远紫外线圆二色光谱(Far-ultraviolet Circular Dichroism spectra)。
CD光谱在25℃、在蛋白质浓度大约0.1mg/ml、使用0.1cm通道长度石英管被记录在Jasco Model J-700分光旋光计上。
图8A报道天然G-CSF和G-CSF-PEG-OPSS轭合物的远-UV CD光谱。这些光谱典型地是具有最小椭圆率在208和222nm的α-螺旋多肽。天然和轭合物蛋白质之间α-螺旋百分数的不同应归于聚集问题，其能扭曲蛋白质浓度以及光谱的标准化。图8B报道G-CSF和G-CSF-PEG-VS轭合物的远-UV CD光谱。在这种情况，天然和轭合物蛋白质之间二级结构的变化更明显。
4.荧光发射的研究
天然G-CSF和G-CSF-PEG-OPSS轭合物以及G-CSF-PEG-VS轭合物的荧光光谱被在25℃记录在Perkin Elmer LS-50上，在295nm激发样品(1.3μM)并且在波长范围303-500nm中记录发射荧光。在加入阴性(NaI)和阳性(CsCl)猝灭剂后在相同的条件记录光谱。天然和轭合物的荧光光谱是在发射波长中只对于5nm蓝移(从350到345nm)的不同，对于在荧光团(fluorofore)曝光给溶剂中的变化的显示是太小了。荧光团(Trp 59，Trp 119)在周围有极性，并且所以可能在天然和共轭蛋白质的情况下都暴露于溶剂。图9A-B报道对天然G-CSF、G-CSF-PEG-OPSS和G-CSF-PEG-VS使用CsCl(A)和NaI(B)的猝灭实验。这些研究揭示在天然和轭合物蛋白质中Trp的溶剂可及性(solvent accessibility)小的变化，变化很可能由于Trp周围PEG链的存在。
实施例5：在变性条件下通过巯基反应物轭合10kDa PEG到rhG-CSF的制备
5a.1.5ml的rhG-CSF(1.46mg/ml)被加入1.5ml pH 7.2磷酸缓冲液中的6M盐酸胍溶液。在这样的溶液以每摩尔rhG-CSF对10摩尔多聚物的摩尔比例加入mPEG-OPSS或mPEG-VS(10kDa)。反应混合物允许在室温氩大气中进行20小时，并且反应用0.1M的HCl终止。
5b轭合物的鉴定通过RP-HPLC色谱(图11)和远-UV CD光谱(图13)实现。RP-HPLC使用C4 Phenomenex柱进行。
实施例6：在变性条件下通过巯基反应物(mPEG-OPSS和mPEG-VS)轭合20kDa PEG到rhG-CSF的制备
6a.1.5ml的rhG-CSF(1.46mg/ml)被加入1.5ml pH 7.2磷酸缓冲液中的6M盐酸胍溶液。在这样的溶液以每摩尔rhG-CSF对10摩尔多聚物的摩尔比例加入mPEG-OPSS或mPEG-VS(20kDa)。
反应混合物允许在40℃进行1小时，并且然后在室温另外进行4小时。反应用0.1M的HCl终止。
6b轭合物的鉴定通过RP-HPLC色谱(图12)和远-UV中的CD光谱(图13)实现。
实施例7：在变性条件下通过巯基反应物(mPEG-MAL)轭合20kDa PEG到rhG-CSF的制备
溶液A：制备加入到pH 7.2有0.5M Tris-HCl的3mg/ml rhG-CSF溶液缓冲液(溶液A)
溶液B：mPEG-马来酰亚胺溶于6M盐酸胍溶液，用Tris-HCl(0.5M)缓冲至pH 7.2，以获得30mg/ml(PEG-Mal)的终浓度。
6ml的溶液A和6ml的溶液B混合，并且所得的混合物被允许在室温下反应1小时(摩尔比例rhG-CSF/PEG-Mal＝1∶10)。PEG化的产量高于95％。
图14显示天然rhG-CSF(图14A)和室温1小时后的那些反应混合物(图14B)的RP-HPLC色谱。
实施例8：体外在NFS-60细胞中的细胞增殖活性
生物分析基于rhG-CSF对敏感细胞系增殖的刺激作用的评价，所述敏感细胞系源于具有G-CSF受体的小鼠原始粒细胞白血病：NFS-60细胞。蛋白质结合到细胞引起指数生长反应，并且发现细胞的终浓度与细胞培养液中存在的G-CSF的浓度成比例。应用剂量-反应比例，这允许G-CSF样品的生物潜能与标准或参考制备物对比的量化。为了测试，NFS-60细胞被维持于添加5％胎牛血清、4mM谷氨酰胺和rhG-CSF终浓度18.000IU/ml的培养液中悬浮培养。在每个实验前，细胞在冰冷的磷酸盐缓冲液(PBS)中洗3次，并且再悬浮于分析培养液中(2.5％胎牛血清，4mM谷氨酰胺)以除去生长培养液中包含的rhG-CSF。在我们的情况，G-CSF和PEG轭合物的溶液被在分析培养液中系列稀释，以重复(duplicate)的形式(每个50μl)转移到96孔板，并且与等体积的事先洗过的细胞悬浮物混合以到达1.0×105细胞/ml的终密度。然后，板在加入10μl的MTT溶液(100mg MTT加入20ml无菌温热的PBS)之前在37℃、CO2中孵育72小时。反应被允许在37°、CO2恒温箱中进行4小时。活细胞的微粒体脱氢酶将甲
Figure A20058001752400211
盐MTT((3[4，5二甲基噻唑(Dimethylthyazol)-2-基]-2，5联苯四氮唑溴(diphenyltetrasolium bromide)变成蓝色晶体。Tris晶体用0.01 N HCl中15％SDS的溶液100μl溶解。在570nm的吸收率直接与活细胞的数量成比例。
G-CSF和轭合物作为刺激因子的活性，从活性图线(图10)计算为EC50值，报道于以下的表中。
               体外NSF-60细胞中的活性
  样品   EC50(pmol/ml)   活性
  rhG-CSFrhG-CSF-PEG-OPSSrhG-cSF-PEG-VS   0.00960.01450.039   1x0.66x0.246x
EC50值(pmol/mL)是相对于最大细胞生长促进50％细胞生长的rh-G-CSF的量。所以EC50值越低rhG-CSF活性越高。考虑到方法的精确性，能认为rhG-CSF-PEG-OPSS的活性与天然rhG-CSF几乎一样。
附图说明
图1a：使用C4 VIDAC柱的RP-HPLC色谱。天然G-CSF(A)；在生理条件中、在反应时间0.5、3.5、28h(B、C、D)的G-CSF和PEG-OPSS(5kDa)的反应混合物；1b：天然G-CSF(泳道1)和在生理条件中、在反应时间0.5、2.5、3.5、6、28、51h(泳道2-7)的G-CSF PEG-OPSS轭合物的SDS-PAGE分析。
图2a：使用C4 VIDAC柱的RP-HPLC色谱。天然G-CSF(A)；在反应28小时后生理条件中的G-CSF和PEG-VS(5kDa)的反应混合物(B)；2b：天然G-CSF(泳道1)和在生理条件中、在反应时间0.5、2.5、3.5、6、28、51h(泳道2-7)的G-CSF PEG-VS轭合物的SDS-PAGE分析。
图3：在标准条件中和在通过盐酸胍进行变性-复性后天然G-CSF的远UV-CD光谱。光谱在25℃、pH 3.5的酸性溶液中获得。
图4：使用C4 VIDAC柱的RP-HPLC色谱。天然G-CSF(A)；3M尿素存在下的G-CSF和PEG-OPSS(5kDa)的反应混合物(B)；2、4、6M盐酸胍存在下的G-CSF和PEG-OPSS(5kDa)的反应混合物(C、D、E)。
图5：使用C4 VIDAC柱的RP-HPLC色谱。天然G-CSF(A)；2、4、6M盐酸胍存在下的G-CSF和PEG-VS(5kDa)的反应混合物(B、C、D)。
图6：天然G-CSF(A)；通过RP-HPLC色谱从反应混合物获得的G-CSF-PEG-OPSS(5kDa)轭合物(B)的MALDI-TOF质谱。
图7：G-CSF和PEG-VS(5kDa)之间的反应混合物的MALDI-TOF质谱(A)。扩展光谱(Spectrum expanded)(B)。
图8：天然G-CSF以及轭合物A，G-CSF-PEG-OPSS(5kDa)、B，G-CSF-PEG-VS(5kDa)的远UV CD光谱。光谱在25℃、10mM乙酸、0.004％吐温、10mg/ml甘露醇、pH 4中取得。
图9：天然G-CSF、G-CSF-PEG-OPSS(5kDa)和G-CSF-PEG-VS(5kDa)轭合物的荧光发射光谱。光谱通过在CsCl(A)、NaI(B)存在下在295nm激发样品(1.3μM)取得。
图10：天然G-CSF、G-CSF-PEG-OPSS、G-CSF-PEG-VS轭合物在NFS-60细胞增殖中的刺激作用的评价。反映是通过MTT比色分析在540nm读取D.O.获得的。
图11：使用C4Phenomenex柱，G-CSF和PEG-OPSS(10kDa)的反应混合物的RP-HPLC色谱。
图12：使用C4 Phenomenex柱，G-CSF和PEG-OPSS(20kDa)的反应混合物的RP-HPLC色谱。
图13：天然G-CSF和PEG-OPSS轭合物(5kDa黑色、10kDa紫色、20kDa绿色)的远UV CD光谱。光谱在25℃、10mM乙酸、0.004％吐温、10mg/ml甘露醇、pH 4中取得。
图14：在3M盐酸胍中，天然rhG-CSF(A)以及G-CSF和PEG-Mal(20kDa)反应混合物(B)的RP-HPLC色谱。

Claims (16)

1.一种PEG与人类G-CSF或G-CSF类似物的轭合物，其特征在于所述人类G-CSF的17位或所述G-CSF类似物相应位置的半胱氨酸巯基与PEG分子轭合。
2.一种根据权利要求1所述的轭合物，其特征在于所述G-CSF是序列类似物，其通过基因工程经过替代加入或删除天然人类序列的一个或多个氨基酸残基但维持所述G-CSF活性的方式获得。
3.根据权利要求1或2所述的轭合物，其中所述PEG是直链或支链的并且是单官能或双官能的。
4.根据权利要求1至3所述的轭合物，其中所述PEG是双官能的并且包括1分子的多聚物和2分子的G-CSF或其类似物。
5.根据前述任一权利要求所述的轭合物，其中所述PEG有在800到80,000Da并且优选地5,000到40,000Da之间范围的MW。
6.一种药物组合物，其包括根据前述任一权利要求所述的轭合物。
7.根据前述任一权利要求所述的轭合物的用途，用于制备药物制剂，以治疗中性粒细胞减少症(慢性的、化疗诱导的、HIV诱导的、骨髓移植)。
8.一种用于制造具有空间位阻的半胱氨酸基团的多肽与多聚物的轭合物的方法，其包括以下步骤：
(i)使所述多肽经受诱导所述多肽可逆变性的条件，
(ii)在变性的条件下，步骤(i)中得到的变性多肽与巯基活性多聚物轭合，
(iii)使步骤(ii)中得到的轭合物经受促进所述轭合物复性和提供所期望的轭合物的条件。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述多肽是G-CSF或其类似物并且所述多聚物是PEG。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述可逆变性是通过暴露所述多肽于变性剂获得的，所述变性剂选自尿素、盐酸胍或异硫氰酸酯、二甲基-尿素，这样的变性剂优选浓度大于2M，优选大于3M，且甚至更优选为2至4M。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述变性剂是盐酸胍并且盐酸胍的浓度优选地大于2M，且优选地为3M，并且甚至更优选为4至6M。
12.根据权利要求9-11所述的方法，其中所述PEG具有选自OPSS、VS、N-马来酰亚胺或碘乙酰胺的巯基活性基团。
13.根据权利要求8-12所述的方法，其中所述复性是通过透析、超滤、色谱或稀释的方法除去所述变性剂而获得的。
14.根据前述任一权利要求所述的方法，其特征在于在pH 5至11的缓冲水溶液中进行。
15.根据权利要求14所述的方法，其中缓冲剂是TRIS或磷酸缓冲液并且所述pH大约为7。
16.根据权利要求8-15所述的方法，其特征在于所述步骤(ii)是在包括5℃至50℃之间的温度下进行的，优选地在20℃至40℃之间的温度下进行。
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