MXPA06011867A

MXPA06011867A - Nuevos conjugados de g-csf.

Info

Publication number: MXPA06011867A
Application number: MXPA06011867A
Authority: MX
Inventors: Francesco Maria Veronese; Manuela Berna
Original assignee: Nektar Therapeutics
Priority date: 2004-04-15
Filing date: 2005-04-06
Publication date: 2007-01-16
Also published as: JP2007533665A; WO2005099769A3; EP1737496A2; EP1586334A1; WO2005099769A2; IL178538A0; CA2562890A1; KR20060135887A; CN1960766A; US20070166278A1; AU2005232475A1

Abstract

La presente solicitud se refiere a nuevos conjugados de PEG-G-CSF, en los cuales una molecula de PEG esta enlazada al residuo de cisteina en la posicion 17 de la secuencia primaria de G-CSF nativa o al residuo de cisteina de la posicion correspondiente de un analogo de G-CSF. La presente solicitud tambien describe un proceso para la manufactura de tales conjugados, tal proceso comprende las siguientes etapas: (i) someter la proteina de G-CSF a condiciones que inducen la desnaturalizacion reversible de la proteina, (ii) conjugacion de la proteina desnaturalizada obtenida en la etapa 1 con un PEG reactivo tiol bajo condiciones desnaturalizantes, (iii) someter los conjugados obtenidos en la etapa ii a condiciones que promueven la renaturalizacion del conjugado proporcionado el conjugado G-CSF-PEG biologicamente activo.

Description

OHYO No. 500636/88) ha permitido la producción de G-CSF humano por medio de técnicas de recombinación genética. El G-CSF expresado por E. coli difiere del material natural en su falta de glicosilación y el residuo metionil N-terminal incidente en la expresión bacteriana (Lu et al., 1989, Disulfide and secondary structure of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor, Arch. Biochem. Biophys 268, 81-92) . El uso clínico del G-CSF (revisado in Nemunaitis J., 1997, A comparative review of colonystimulating factor, Drugs 54, 709-729; Welte . et al., 1996, Filgrastim irmetHuG-CSF) : The first 10 years, Blood 88, 1907-1929), comenzó en 1986 con los primeros ensayos clínicos en pacientes de cáncer tratados con quimioterapia (Bronchud M. H. et al, 1987, Phase I/II study of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in patients receiving intensive quimioterapia for small cell lung cáncer, Br. J. Cáncer 56, 809-813) y es ampliamente usado en la actualidad para el tratamiento de la neutropenia. La neutropenia ocurre en una amplia variedad de escenarios de enfermedades, incluyendo defectos congénitos, supresión de la médula ósea posterior a manipulación farmacológica, e infección. Esta condición también ocurre en pacientes con cáncer sometidos a quimioterapia citotóxica. La neutropenia puede, a su vez, llevar a infecciones bacterianas y secundarias que, frecuentemente, requieren hospitalización. El G-CSF puede disminuir el período de neutropenia o evitarlo totalmente. En 1991, la Dirección de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU. aprobó el Neopogen (Filgrastin, rh-met-huG-CSF) para uso por aquellos pacientes que sufrían de neutropenia durante o después de quimioterapia. EL tratamiento con G-CSF puede permitir una programación superior de intensidad-dosis que puede permitir mejores efectos antitumorales (Morstyn D. and Dexter T. M. , 1994, Neupogen (r-metHuG-CSF) in Clinical Practice, Marcel Dekker, New York) . El mismo fue aprobado posteriormente para uso en todo el mundo en transplante de médula ósea y más recientemente para tratamiento de neutropenia severa crónica congénita. El Neopogen posee una aplicación potencial en movilizar células progenitoras hematopoyéticas periféricas para transplante (Hermán et al., 1996, Characterisation, formulation, and stability of Neupogen (Filgrastim) , a recombinant human granulocyte-colony stimulating factor., Pharm Biotechnol. 9, 303-28). Más de 80 fármacos polipéptidos son comercializados en los Estados Unidos, y 350 más están siendo sometidos a ensayos clínicos . Cerca de un tercio de los candidatos a fármacos en ensayos clínicos son polipéptidos, pero esos fármacos tienen normalmente una semivida corta in vivo. Muchos factores se hayan involucrados en la remoción de los péptidos de la circulación, como degradación propeolítica, filtración renal y reacciones inmunogénicas y antigénicas. Adicionalmente, la mayoría de los fármacos polipéptidos debe ser administrada mediante inyección, ya sea subcutánea o intravenosa, y la solubilidad normal baja puede también ser un problema. Para superar estas limitaciones, algunos métodos han sido propuestos, tal como alterar las secuencias de péptidos y aminoácidos para reducir la degradación por enzimas y efectos antigénicos colaterales, o unirlos a inmunoglobulinas o albúmina para mejorar la semivida, e incorporarlos a vehículos de administración tales como liposomas. Para lo que atañe al G-CSF, muchas solicitudes de patente fueron presentadas explotando tales métodos y artículos fueron también publicados. Entre aquellos que reportan variación en la secuencia primaria podemos citar: U.S. Pat. No. 5,214,132 reporta una variante genética de G-CSF humano que difiere del rhGCSF nativo en la posición 1, 3, 4, 5 y 17, donde, en lugar de los aminoácidos nativos del G-CSF, el mutante tiene en su lugar Ala, Thr, Tyr, Arg y Ser respectivamente (ver también, Ruga, et al., 1989, Mutagenesis of human granulocyte colony stimulating factor, Biochem. Biophys. Res. Cornmun. 159, 103-111) . M. Okabe, et al. (In vitro and in vivo hematopoietic effect of mutant human granulocyte colonystimulating factor, 1990, Blood 75(9) May 1, 1788-1793) reportó un derivado de rhG-CSF, en el cual aminoácidos fueron sustituidos en cinco posiciones en la región N-terminal del rhG-CSF, que mostró actividad específica superior al G-CSF intacto en células progenitoras de médula ósea de ratones y/o humana en dos ensayos. U.S. Pat. No. 5,218,092 revela una variante genética de G-CSF humano que difiere del rhGCSF nativo en la posición 1, 3, 4, 5, 17,145 y 147 donde, en lugar de los aminoácidos nativos del G-CSF, el mutein tiene en su lugar Ala, Thr, Tyr, Arg, Ser, Asn y Ser respectivamente. WO Ol/04329-A reporta un mutein rhG-CSF que difiere del rhG-CSF nativo en la posición 1, 2, 3 o 17. WO 02/20766-A y 02/20767-A revelan composiciones de análogos de G-CSF substituidos por histidina. WO 02/077034-A reporta G-CSF modificado con inmunogenicidad reducida, obtenido por remoción de uno o más epitopos de células T, ó mediante la reducción de del número de haplotipos MHC. Un métodos alternativo para disminuir la tasa de depuración, mejorando la estabilidad o aboliendo la antigenicidad de proteínas, es la PEGilación, en el cual las proteínas son modificadas químicamente usando cadenas poli (etileno) glicol. Cuando poli (etileno) glicol (PEG) está apropiadamente enlazado a un polipéptido, modifica muchas de sus características, al tiempo que las principales funciones biológicas, tales como la actividad enzimática o reconocimiento de receptor, pueden ser mantenidas. La conjugación de PEG enmascara la superficie de las proteínas y aumenta el tamaño molecular del polipéptido, reduciendo por consiguiente su ultrafiltración renal, evitando la aproximación de anticuerpos o células procesadoras de antígenos y reduciendo la degradación por enzimas proteolíticas . Finalmente, PEG comunica a las moléculas sus propiedades físico-químicas, modificando también, por lo tanto, la biodistribución y solubilidad de los fármacos péptidos y no péptidos. Para una revisión de métodos y resultados generales de PEGilación ver, entre otros reportes, las siguientes publicaciones y patentes: Davis et al., U. S. Pat. No. 4,179,337, Polipéptido No Inmunogénico, 1977, que puede ser considerado lo básico; Delgado C. et al., 1992, Los usos y propiedades de la proteínas enlazadas por PEG, Crit. Rew. Ther. Drug Car. Sys, 9 (3, 4), 249-304; Zalipsky S., 1995, Ad. Drug Del. Rev. : Química de conjugados de polietileno glicol con moléculas biológicamente activas 16, 157-182, donde se describe una colección de métodos y reportes prominentes; F. M. Veronese, 2002, PEGilación de Péptidos y Proteínas: una revisión de problemas y soluciones, Biomaterials, 1-13; F. M. Veronese y J. . Harris edrs., Ad. Drug Del. Rev. , Asunto temático sobre "PEGilación de Péptidos y Proteínas I", 2002, 54, 453-606, donde es reportada una colección adicional de artículos; Harris J. M. y Veronese F. M. edrs., Ad. Drug Del. Rev. , Asunto temático sobre "PEGilación de Péptidos y Proteínas II - evaluación clínica ", 2003. 55: 1259-1350). WO 995377 revela un método para preparación de beta conjugado de PEG-INF que envuelve una conexión concatenada de pequeñas mitades de PEG seguidas por la conexión de derivados de PEG más largos, y permite modificar sitios de interferón estéricamente aglomerados . Otras publicaciones que discuten métodos para la PEGilación de proteínas son: F. M. Veronese, 2001, PEGilación de Péptidos y Proteínas. Una revisión de problemas y soluciones, Biomaterials, Vol 22(5), 4-05-417. R.S. Goodson et al., 1990, PEGilación dirigida a sitio de interleukina-2 recombinante en su sitio de glicosilación, Biotecnology, Nature publishing, Vol 8 (4) , 343-346. Libros han sido también publicados sobre esta técnica, entre otros: Poly (ethylene) glycol Chemistry and Biological Application, J. Milton Harris and Samuel Zalipsky edrs, 1997, ACS Symposium series 680; Poly (ethylene) glycol Chemistry and Biological and Biomedical Applications, J. M. Harris edr., 1992, Plenum Press ; Por ahora, los beneficios generales disfrutados por las proteínas pegiladas, tales como semi idas prolongadas o inmunogenicidad reducida in vivo, son bien conocidos. Una serie de estudios han sido desarrollados para PEGylar anticuerpos y fragmentos de anticuerpos también para reducir la inmunogenicidad cuando administrados xenogénicamente . Varios otros estudios han mostrado biodistribución alterada de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos siguiendo PEGilación, llevando a mayor acumulación en tumores sin niveles altos en tejidos normales conforme reportado por A.P. Chapman en A.D.D.R., 2002, PEGylated antibodies and antibody fragments for improved therapy: a review 54, 531-545) . Schering-Plough desarrolló un nuevo fármaco atacando un 12 kDa mono-metoxi polietileno glicol a Interferón alfa- 2b (Intron A) que reúne los requisitos de una proteína de interferón alpha de larga duración al tempo que ofrece beneficios clínicos significativos (Y. Wang, S. Youngster, M. Grace et al., 2002, Structural and biological characterization of pegylated recombinant interferon alpha-2b and its implications , A.D.D.R. 54, 547-570) . En la literatura también está descrito PEG enlazados con interferon o de alto peso molecular, particularmente Peginterferón alfa-2a (40 kDa) , interferón alfa 2a conjugado a una mitad de polxetileno glicol ramificada 40 kDa, que muestra absorción sostenida y una depuración renal reducida, resultando en un esquema de dosificación de una vez semanal en lugar de dos veces por semana (K. R. Reddy, M. W. Modi, S. Pedder, 2002, Use of peginterferon alpha-2a (40 kDa) (Pegasys) for the treatment of hepatitis C, A.D.D.R. 54, 571586) . U. S. Pat. No. 4,766,106 revela el aumento de la solubilización de proteínas para composiciones farmacéuticas usando proteína selectivamente conjugada a polímero acuoso, seleccionado a partir de polietileno glicol o polioles polioxietilados . En U. S. Pat. Nos. 5,093,531 y 5,214,131 Sano et al., inventores, reportan un derivado de polietileno glicol capaz de modificar los grupos guanidina en péptido. U. S. Pat. No. 5,122,614 revela una nueva forma de PEG (polietileno glicol-N-succinirnida carbonato) que reacciona fácilmente con grupos amino de proteína en buffers acuosos. Harris et al. en U. S. Pat. No. 5,252,714 reporta la preparación y uso de polietileno glicol propionaldehido para conjugación a grupos amino. La Solicitudes de Patente Europea 0,236,987 y 0,539,167 revelan el uso de nuevos derivados de iraidato de PEG y otros polímeros solubles en agua para modificación de proteínas, péptidos y compuestos orgánicos con grupos amino libres . Varios artículos y patentes tratan más específicamente el G-CSF y su PEGilación, entre ellos Kinstler et al. en U.S. No. 5,985,265 revela un nuevo método para proteína modificadora de N-terminalmente . Usando alquilación reductora, se determinó que el producto final (proteína con una unión amina al polímero soluble en agua) era mucho más estable que el polímero-proteína idéntico conjugado que tenía una unión amida. En un artículo investigativo O. Kinstler et . al describe un método localmente dirigido de unir el rhGCSF a polietileno glicol (2002, Mono-N-terminal poly (ethylene) glycol protein conjugates, A.D.D.R. 54, 477- 485) . Esta selectividad es alcanzada conduciendo la alquilación reductora de proteínas con PEG-propionaldehido con pH 5. Como en los ejemplos de trabajo que usan rhG-CSF y rhMGDP es demostrada la aplicación de estos métodos para mejorar las características de administración y valor terapéutico de estas proteínas. WO 9903887 revela derivados de G-CSF obtenidos por mutagénesis dirigida localmente, donde un residuo de cisteína ha sido introducido en la secuencia de proteínas de origen natural. Estos derivados son opcionalmente PEGilados . WO 90/06952 revela un G-CSF químicamente modificado usando cadenas PEG unidas a través de grupos amino o carboxilo libres. Este G-CSF PEG-modificado posee semivida prolongada en el cuerpo, puede acelerar la recuperación de una neutropenia y posee, esencialmente, la misma actividad biológica. WO 00/44785 reporta conjugados de rhG-CSF unidos a 1-5 cadenas PEG, que muestran propiedades mejoradas, incluyendo superior estabilidad, mayor solubilidad y tiempos mejorados de semivida de circulación y de residencia en plasma. WO 90/06952 revela una variante genética de G-CSF humano, preparado de acuerdo a un método revelado en la Solicitud de Patente Japonesa Revelada KOHYO No. 500636/88, químicamente modificada usando PEG, que tiene esencialmente la misma actividad biológica, una semivida superior en el cuerpo. Adicionalmente, se observa que este conjugado G- CSF-PEG puede acelerar la recuperación de una neutropenia.

WO 03/006501-A revela un rhG-CSF que difiere del rhG- CSF nativo en por lo menos un residuo de aminoácido de la secuencia de aminoácido, y con por lo menos una mitad de no-polipéptido enlazada. WO 89/06546 revela una variante genética de CSF-1 conjugado a polietileno glicol u homopollmeros de polipropileno glicol, que retienen la actividad biológica y aumentan la semivida de circulación en mamíferos . WO 90/06952 reporta un nuevo G-CSF químicamente modificado unido a polietileno glicol ya sea a través de grupos amino de residuos de aminoácido o a través de grupos carboxilo. Más PEG-G-CSF conjugados con diferentes estructuras y propiedades son revelados en la Pat. Europea No. 0,335,423. Otros G-CSF polímero-modificados han sido revelados en WO 02/20033 y en WO 02/20034. G-CSF PEGilado ha sido también usado para investigar diferentes tasas de administración de la proteína, particularmente la administración pulmonar. Esto es reportado en R. W. Niven et al., 1994, Pulmonary absorption of polyethylene glicolated recombinant human granulocyte- colony stimulating factor (PEG rhG-CSF) , J". Controlled Reléase 32, 177-189. Finalmente, las propiedades biológicas del PEG-G-CSF son descritas por Satake-Ishikawa, et al., 1992, Chemical modification of recombinant human granulocyte colony- stimulating factor by polyethylene glycol increases its biological activity in vivo, Cell Struct Funct. 17, 157- 160. Los G-CSF conjugados mencionados anteriormente han sido obtenidos mediante conjugación vía aminogrupos de proteínas. Ningún derivado ha sido preparado, hasta ahora, por funcionalización del grupo -SH, probablemente debido a que este grupo está insertado en la estructura terciaria de la proteína y es muy difícil de acceder. La presente invención ha resuelto este problema e indica un método simple que proporciona G-CSF-PEG conjugados como un producto simple con alta pureza y biológicamente activo.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención revela una manera de resolver los problemas relacionados con la preparación de formulación G-CSF apropiada para uso terapéutico. Bien conocida de los avezados en la técnica en la aplicación de proteínas para terapia, y de G-CSF entre ellas, es la limitación de la corta servida en el cuerpo, debido a la alta tasa de depuración, la degradación proteolítica y adicionalmente las reacciones inmunogénicas . El objeto de la presente invención es un nuevo PEG-G- CSF conjugado activo, en el cual una cadena de poli (etileno) glicol (es decir, PEG) está enlazado de manera covalente a través de residuo aminoácido Cys 17 de proteína nativa. La molécula G-CSF que puede ser usada para los propósitos de la invención puede ser la molécula nativa, así como el reco binante con el residuo metionílico N-terminal methionyl residue (Filgrastim) .

Alternativamente, análogos de G-CSF pueden ser usados. Análogo en este contexto define productos que conservan la mayor parte de la estructura primaria de las proteínas de existencia natural y mantienen su actividad biológica. Preferiblemente estos análogos pueden ser producidos por tecnología recombinante sustituyendo uno o más aminoácidos de la secuencia humana por otros . Los mismos son llamados normalmente de muteínas . Un objeto adicional de la invención es un nuevo proceso para conjugar PEG a proteínas biológicamente activas. Es conocido por los avezados que la mayoría de las aplicaciones de conjugación de PEG tiene que ver con moléculas inestables, como polipéptidos o proteínas, consecuentemente la reacción de acoplamiento debe requerir condición química moderada. Los grupos reactivos más comunes en proteínas apropiados para conjugación polimérica son los amino grupos épsilon de lisina y amino grupo alfa del aminoácido N-terminal. Como las aminas N-terminales o las lisinas en forma libre se encuentran casi siempre presentes en cualquier proteína o péptido dados, el G-CSF entre ellos, y como ellos reaccionan fácilmente, PEG ha sido más frecuentemente acoplado con proteínas a través de estos grupos amino. De hecho, la WO 00/44785 revela G-CSF- PEG conjugados, que tienen cadenas PEG unidas a lisina o a residuo Terminal de NH2. esta conjugación es posible para la presencia en G-CSF de 4 lisina (Lys 16, Lys 23, Lys 34, Lys 40) , un grupo amino libre alfa terminal y para accesibilidad al solvente acuoso de todos ellos . En el caso reportado la mezcla de conjugación está representada por una multiplicidad de especies de, con PEG unido a diferentes sitios, que deben ser aislados y caracterizados para un uso productivo. Para superar el problema de la multiplicidad de conjugados, algunos autores se aprovechan del hecho de que las lisina e-aminas son buenas nucleófilas por encima de pH 8 , ya que su pKa es de alrededor de 9.5, mientras los a-grupos amino de aminoácidos N-terminal son menos básicos que Lys y también reactivos a menor pH. El pH de reacción podría por tanto ser crítico para alcanzar selectividad en conjugación y consecuentemente podría ser obtenida mezcla simplificada de productos. En la U. S. Pat. No. 5,985,265 esta propiedad fue explotada y fue revelado el método químico de modificar preferentemente el residuo de aminoácidos N-terminales usando una reacción con pH de cerca de 5. En este caso la reacción era preferentemente dirigida al residuo IT- terminal, a pesar de que no fue completa y los grupos amino de licina pueden reaccionar también, a pesar de que en una extensión mucho menor. La mezcla obtenida debe, por tanto, ser purificada para alcanzar la homogeneidad requerida del producto . Otro residuo reactivo potencialmente importante en proteínas es el grupo tiol, que es muy reactivo para con algunos PEGs reactivos a tiol, tales como monometoxi-PEG-maleimida (m-PEG-maleimida) , m-PEG-o-piridildisulfuro, m-PEG-vinilsulfona que son reaccionados de acuerdo con métodos ya conocidos en la literatura [Veronese F (2001) Peptide and protein PEGylation: a review of problems and solutions. Bio aterials 22, 405-417; Roberts J et al. (2002) Chemistry for Peptide and protein PEGylation. Adv.Drug- Deliv.Rev. 54,459-476] . Varios artículos describen la PEGilación específica sobre residuo de cisteína (Cantin ?? et al, 2002, Polyethylene glycol conjugation at Cys232 prolongs the half-life of aip al proteinase inhibitor. Am J Respir Cell Mol Biol.: 27(6): 659-65; Leong SR et al, 2001, Adapting pharmacokinetic properties of a humanized anti-interleukin- 8 antibody for therapeutic applications using site-specific PEGilación Cytokine. 16(3): 106-19; Collen D et al., 2000, Polyethylene glicol-derivatized cysteine-substitution variants of recombinant staphylokinase for single-bolus treatment of acute myocardial infarction. Circulation 102(15): 1766-72; Goodson RJ et al, 1990, Site-directed PEGylation of recombinant interleukin-2 at its glicosilación site Biotechnology 8(4): 343-6; Paige et al. Prolonged circulation of recombinant human granulocyte-colony stimulating factor by covalent linkage to albumin through a heterobifunctional polyethylene glycol, Pharmaceutical Research, Vol. 12, No. 12, 1995) . Desgraciadamente, residuos de cisteína se encuentran raramente presentes en proteínas en forma libre y adicionalmente los mismos están comúnmente presentes como bisulfuro en cistina y, cuando libres, se encuentran frecuentemente involucrados en la región activa de la molécula. Adicionalmente, ellos se encuentran frecuentemente presentes en una región de la molécula que es de difícil acceso. Por ejemplo, pueden estar insertados en pequeñas grietas hidrófobas, y solo parcialmente expuestas al solvente. Esto hace que estos residuos sean químicamente inhibidos, lo que significa que pueden reaccionar muy lentamente o con rendimiento muy bajo en condiciones nativas . En la secuencia primaria de rhG-CSF existen cinco Cys, cuatro de los cuales se encuentran involucrados en dos enlaces bisulfuro (Cys 36-Cys 42, Cys 64-Cys 74) pero afortunadamente uno, Cys 17, está libre. Arakawa et al., 1993, reportan que Cys 17 no es accesible a carboximetilación por un agente hidrofílico, ácido iodo- acético, bajo conformación nativa, pero se torna totalmente reactivo cuando el rhG-CSF es desnaturalizado. En otros experimentos, el sulfidrilo libre ha mostrado reaccionar muy lentamente con un agente modificador hidrófobo, ácido ditiobis-nitrobenzóico (DTNB) bajo condiciones no-desnaturalizantes . A partir de estos experimentos y a partir de la estructura tridimensional conforme evaluado por NMR, es postulado que la cisteína libre reside dentro de un medio hidrófobo de la molécula y, como tal, es inaccesible a modificación química por agentes alquiladores lipofílicos, mientras que es más accesible a agentes hidrófobos. Estudios de conformación de G-CSF han, de hecho, demostrado que el -SH en la posición 17 se encuentra en una cavidad hidrófoba de la proteína, solo parcialmente expuesta al solvente. Además de eso, Wingfield et al. (1988, Characterization of recombinant-derived granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF), Biochem J. Nov 15; 256(1), 213- 8) determinó que una sustitución Cys a Ser en la posición 17 resultó en cambios no apreciables en las propiedades físicas o biológicas de la proteína. Los inventores han descubierto ahora un método para la fabricación de G-CSF conjugados específicamente conjugados en el grupo tiol del Cys 17. El método comprende los siguientes pasos: i) someter la proteína G-CSF a condiciones que induzcan la desnaturalización reversible de la proteína, ii) conjugación de la proteína desnaturalizada obtenida en el paso (i) con un PEG tiol reactivo, bajo condiciones de desnaturalización, iii) someter el conjugado obtenido en el paso (ii) a condición que promueva la renaturalización del conjugado y proporcione el conjugado deseado. Experimentos biológicos reportados por los inventores muestran que PEG-O-CSF conjugados preparados conforme el método descrito, mantienen la actividad biológica en ensayo de proliferación de células. La desnaturalización reversible del paso (i) es ejecutada en presencia de uno o más agentes desnaturalizadores como urea, cloruro de guanidina o isocianato, dimetil-urea, altas concentraciones de sal neutra y solventes (tales como, por ejemplo, acetonitrilo, alcoholes, ésteres orgánicos, dimetil sulfóxido) . Para desnaturalización química reversible es referido un proceso en el cual una proteína, bajo desnaturalización, pierde su estructura y función nativa, sin embargo al retirar el desnaturalizador, recupera tanto su estructura como sus propiedades funcionales. En presencia de tales agentes desnaturalizadotes, la proteína es desdoblada y el grupo tiol del Cys- 17 es expuesto y se torna accesible para funcionalización. EL proceso de desnaturalización puede ser monitoreado mediante espectros ÜV-CD lejanos. La cantidad de agente desnaturalizador puede ser seleccionada por una persona avezada dependiendo del agente desnaturalizador usado. El agente desnaturalizador puede ser urea, cloruro de guanidina, isotiocianato o dimetil-urea y tal agente desnaturalizador está preferiblemente a una concentración de más de 2 , preferiblemente más de 3 , e incluso más preferiblemente 2 a 4M. Por ejemplo para el caso de Cloruro de guanidina, una concentración de Cloruro de guanidina es preferiblemente mayor que 2 , y es preferiblemente mayor que 3 M, e incluso más preferiblemente 4 M a 6M. La proteína desdoblada obtenida en el paso (ii) es reaccionada manteniendo la condición de desnaturalizadores con un PEG activado que tiene una reactividad específica para el grupo tiol "PEG tiol reactivo". PEG tiol reactivos son conocidos por las personas avezadas; preferidos son: ortopiridil bisulfuro, vinilsulfona, N-maleimida, iodoacetamida. El PEG puede ser lineal o ramificado, y puede tener una MW de 800 a 80.000 Da y preferiblemente 5.000 a 40.000 Da. PEGs bi-funcionalizados como OPSS-PEG-OPSS ; VS-PEG-VS; VS-PEG-OPSS, MAL-PEG-MAL, MAL-PEG-OPSS, MAL-PEG-VS pueden también ser usados. La integridad de la reacción puede ser evaluada mediante métodos analíticos usuales, como HPLC o monitoreando la presencia de grupos tioles mediante pruebas colorimétricas .

Una vez completado el paso (ii) , el conjugado puede ser dejado replegado exponiéndolo a condiciones de renaturalización conforme métodos estándar como, por ejemplo, revelado en Mechanisms of protein folding, Pain RH (edt.), IRL-Press, Oxford U.K., 1994 y en Middelberg APJ. Preparative protein refolding. Trends Biotechnol.20, 437-443, 2002 (incorporado a la presente como referencia), produciendo la estructura original en a-hélice Métodos típicos envuelven la remoción de los agentes desnaturalizadores mediante diálisis, ultrafiltración, métodos cromatográficos . El pH y la temperatura usada en los pasos i, ii, iii pueden ser seleccionados por la persona avezada y pueden depender mucho de los agentes reactivos usados, el tipo de polímero activado y de su peso molecular . Las condiciones y los reactivos tienen que ser seleccionados de manera que la desnaturalización irreversible o segmentación del enlace -S-S- de la cisteína de la proteína sean evitadas . Valores moderados de pH son preferibles por ejemplo 4 a 10, más preferibles 6 a 8 e incluso más preferiblemente cerca de la neutralidad. Bajas temperaturas también son preferibles, 0 a 30 °C, a pesar de que para conjugación de altos MW PEGs (polímeros) , rendimientos superiores pueden ser obtenidos si son usadas temperaturas superiores (por ejemplo 40°C) . Para la persona avezada también está claro que el método de conjugación descrito anteriormente puede ser usado para preparar conjugados de cualquier proteína comprendiendo un grupo cisteina "inhibido". El primer paso del método es preferiblemente ejecutado a una temperatura comprendida entre 5°C a 50°C , preferiblemente a una temperatura de entre 20°C a 40°C. La renaturalización puede ser obtenida retirando el agente desnaturalizador mediante diálisis, ultrafiltración, cromatografía ó dilución. La conjugación exitosa de G-CSF con PEGs tiol-reactivos, conforme aquí reportado, que fue desarrollada con un método que produce proteína mono-funcionalizada, despeja el camino hacia las bien conocidas y ampliamente explotadas ventajas tecnológicas y biológicas de la PEGilación. El método propuesto permite obtener productos con gran aumento en Mol. Peso, y, más importante, en gran volumen hidrodinámico de la molécula. Conforme conocido, el volumen hidrodinámico del PEG corresponde a cerca de 3 a 4 veces que lo esperado a partir de su peso y, por consiguiente, los conjugados con 5000, 10000 y 20000 Da PEG, conforme descrito en los ejemplos de esta patente, corresponden al volumen de una proteína de cerca de 40000, 50000 y 60000 Da PEG. Productos de estos volúmenes se sabe que superan el umbral de la filtración glomerular renal y, consecuentemente, puede ser esperado un aumento significativo del tiempo de retención en la sangre. La solicitud de patente, por consiguiente, revela una composición farmacéutica comprendiendo los conjugados preparados conforme descrito anteriormente para aplicaciones orales, inyectables, nasales, pulmonares ó supositorio ó transdérmica. El procedimiento de conjugación de tiol aquí reportado, que explota para conjugación la desnaturalización reversible para exponer el grupo SH de un residuo de cisteína (en el caso de G-CSF es el residuo número 17 en la secuencia) , es más conveniente que los reportados en la técnica anterior y que son basados en modificación del grupo amino. De hecho, en la modificación del grupo amino, múltiples productos son también comúnmente obtenidos si se aumenta la especificidad de la reacción disminuyendo el pH para alcanzar solamente el residuo de aminoácidos alfa. Los productos obtenidos en la modificación de amino deben, posteriormente, ser adecuadamente fraccionados y purificados por procedimientos que consumen tiempo y pérdida de producto. El método aquí propuesto puede ser fácilmente perfeccionado y pocos pasos son necesarios para obtener el producto final: i. disolución en solución desnaturalizadora, ii. adición del PEG activado en forma de polvo, iii. retirada del agente desnaturalizador y repliegue de la proteína mediante diálisis ó cromatografía de columna. Opcionalmente el agente desnaturalizador (es decir, guanidina HCI, urea u otros agentes desnaturalizadores) pueden ser añadidos a una solución acuosa de la proteína, concomitantemente a la adición del PEG activado durante el paso ii. El agente desnaturalizante puede ser urea, cloruro de guanidina, isotiocianato o dimetil-urea y tal agente desnaturalizador está preferiblemente a una concentración de más de 2M, preferiblemente más de 3M, e incluso más preferiblemente 2 a 4 . Por ejemplo para el caso de Cloruro de guanidina, una concentración de Cloruro de guanidina es preferiblemente mayor que 2 , y es preferiblemente mayor que 3 M, e incluso más preferiblemente 4 M a 6 . Es bien conocido que un problema común en la conjugación de proteína con PEG reside en la pérdida de actividad catalítica en el caso de enzimas, ó del reconocimiento en caso de una modificación de ligando tal como una citocina. Como un ejemplo típico se manifiesta la reducción varias veces en la actividad del alfa-interferón que tiene lugar después de la conjugación. No se determinó que fuese el caso de nuestra tilo- modificación del G-CSF. Más probablemente, este comportamiento positivo tiene que ver con la fijación en punto único alcanzada por nuestra tecnología, a la posición del SH en la disposición tridimensional de la proteina lejos del lugar de reconocimiento. El mantenimiento de la actividad biológica original de nuestro conjugado fue evaluado en cultura celular usando células NFS-60. Estas poseen un número sobre-expresado de receptores a G-CSF y el crecimiento de las células es proporcional a la concentración de citocina. La actividad de G-CSF, expresada como EC50, particularmente la concentración que estimula el 50% del máximo crecimiento, fue muy similar al de la proteina nativa conforme es ejemplificado en el ejemplo reportado y en la figura n. 10. En otro aspecto de esta invención, derivados de PEG bi-funcionalmente activados (OPSS-PEG-OPSS; VS-PEG-VS; VS- PEG-OPSS, MAL-PEG-MAL, MAL-PEG-OPSS, MAL-PEG-VS) pueden ser usados para generar G-CSF dimérico (es decir, G-CSF-PEG-G- CSF) en el cual dos monómeros G-CSF se encuentran unidos juntos en el grupo tiol del Cys 17 vía PEG. La actividad in vitro de estos dímeros obtenidos es comparable a la de la forma pegilada correspondiente de G-CSF. La principal ventaja de estos dímeros es la reducción de la tasa de eliminación in vivo (si comparada a la forma pegilada correspondiente de G-CSF) debido al aumento de su masa molecular.

Ejemplo 1: Preparación de 5 kDa PEG Conjugado a rhG-CSF por PEGilación directa Modificación de G-CSF con 5 kDa metoxi-PEG-ortopiridil-disulfuro Metoxi-PEG-orto iridil-disulf ro (1.81 mg, 0.360 gmol) fue añadido a 0.67mg, 0.0356 gmol de rh G-CSF, en 2 mi de buffer (0.5 M Tris, pH 7.2), razón molar reactiva a rhG-CSF de 10/1. La reacción fue dejada que transcurriese a la temperatura ambiente por varias horas, para alcanzar formación constante de PEG-G-CSF conjugado conforme verificado por HPLC y SDS-PAGE (ver abajo) . Caracterización de PEG-OPSS G-CSF conjugados 1 DTNB ensayo colorimétrico (Ellman) Reactivo de Ellman, 5 , 5 ' -ditiobis (2 ácido nitrobenzoico) (DTNB) permite la estimación de tioles libres en proteínas . y otros sistemas biológicos . La sensibilidad del ensayo es debida al alto coeficiente de absorción molar del anión 2-nitro-5-tiobenzoato, que es producido junto con el bisulfuro mezclado a partir de la reacción de un anión tiolato con DTNB (Habeeb A. F. S. A., 1972, Reaction of proteín sulphydryl group with Ellma 's reagent, Methods in Enzymology 25, 457-464) . De esta manera es posible verificar el porcentual de grupos sulfidrilo en proteína nativa o conjugada, y de esta manera conocer la cantidad de modificación. 2. SDS-PAGE La cantidad de derivatización de rhG-CSF fue estimada cualitativamente por electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida. Un gel con un bajo grado de reticulación (60% acrilamida, 0.8% bisacrilamida) fue usado para permitir la migración conjugada. La mezcla de reacción mixture fue analizada en tiempos diferentes . Proteínas visualizadas por tinción azul de Coomassie revelaron la presencia de una pequeña cantidad de una nueva especie de proteína de alto peso molecular, correspondiente a una cadena 5 kDa PEG-OPSS unida al rhG-CSF conjuntamente con principal mancha de la proteína no-reaccionada del material inicial. Ver figura 1 b. 3. RP-HPLC C4. La mezcla de reacción fue analizada por HPLC de fase reversa usando una columna C4 Vydac conforme la siguiente condición de elución. Eluyente A, 0.05% TFA en agua, y B, 0.05%TFA en acetonitrilo . Fue usado el siguiente gradiente lineal: 40%B por 4 minutos, hasta 70%B en 18 minutos, 95%B en 2 minutos, estadía a 95%B por 6 minutos y más de 0%B en 2 minutos. El flujo fue 0.8 ml/min y lámpara UV a 226 nm. El curso del tiempo de la reacción mostrando la formación de cantidad limitada de conjugado mientras la mayor parte de la proteína es extraída no es modificado. Ver figura 1 a. Modificación de G-CSF con 5 kDa metoxi-PEG-vinilsulfona Metoxi-PEG-vinilsulfona (5.29 mg, 1.058 (mol) fue añadida a 2.18 mg, 0.116 (mol de rh G-CSF, en 6 mi de buffer (0.5 M Tris, pH 7.2), razón molar reactiva a rhG-CSF de 10/1. La reacción fue dejada que transcurriese a temperatura ambiente por varias horas, para alcanzar formación constante de PEG-GCSF conjugado conforme verificado por HPLC y SDS-PAGE (ver abajo) . En la figura 2 a ó b el perfil de HPLC y SDS-PAGE de la mezcla de reacción a diferentes tiempos . Las figuras demuestran que una conjugación de G-CSF tiene lugar , pero solo en una extensión muy limitada, a pesar de que la reacción fue dejada que procediese por varias horas. Ejemplo 2: Desnaturalización, reversible de rhG-CSF Guanidina HC1 8M en buffer de fosfato 0.1 M, pH 7.27 fue añadida en cantidad diferente a una solución buffer de rhGCSF para alcanzar una concentración final de 2, 4 e 5 Molar. Después de 4 horas de incubación a temperatura ambiente la mezcla fue dializada contra solución acuosa acida, para retirar el desnaturalizador y alcanzar la condición estable de G-CSF de pH 3.5. Figura 3 reporta el espectro CD de las proteínas iniciales y después del proceso de desnaturalización - renaturalización. La recuperación de la estructura secundaria es evidente a partir de la razón de excentricidad de 220-208 nm del tratamiento antes y después . El siguiente experimento demuestra que G-CSF puede estar sujeto a desnaturalización y renaturalizado a la estructura original . Ejemplo 3: Preparación de 5 kDa PEG rhG-CSF conjugado por tiol-reactivos en condiciones de desnaturalización Conjugación de 5 kDa PEG-OPSS y PEG-VS a rhG-CSF. 3a: A G-CSF, una solución buffer de Tris 0.5 M, 6 M Urea, pH 7.2 fue añadida para alcanzar una concentración final de 3 M urea. A esta solución fueron añadidos mPEG-OPSS ó mPEG-VS a una razón molar de 10 moles de reactivo por mol de proteína. Se dejó que la reacción transcurriese a la temperatura ambiente por 6 horas y fue detenida mediante adición de 0.1 N HCl . 3b: G-CSF fue añadido a una solución de 8 M Guanidina HCl en buffer de fosfato 0.1 M, pH 7.27, para tener una concentración final de desnaturalizador de 2, 4, 6M. El G- CSF desnaturalizado fue añadido a solución de PEG-OPSS ó PEG-VS para alcanzar razón molar de 10 moles de reactivos por mol de proteína. Después de 4 horas a temperatura ambiente la reacción fue detenida con HC10.1N. Ejemplo 4: Caracterización de 5 kDa PEG conjugado a rh-G- CSF 1. RP-HPLC cromatografía. La mezcla de reacción fue analizada por HPLC de fase reversa usando una columna C4 Vydac conforme la siguiente condición de elución. Eluyente A, 0.05% TFA en agua, y B, 0.05%TFA en acetonitrilo . Fue usado el siguiente gradiente lineal: 40%B por 4 minutos, hasta 70%B en 18 minutos, 95%B en 2 minutos, estadía a 95%B por 6 minutos y más de 40%B en 2 minutos. El flujo fue 0.8 ml/min y lámpara UV a 226 nm. Figura 4A muestra el cromatograma del G-CSF nativo. Figura 4B muestra la formación del conjugado (PEG-OPSS) usando urea como desnaturalizador . Figuras 4C, D, E muestran la formación del conjugado (OPSS) en diferente condición de reacción, particularmente en figura 4C la cantidad de guanidina HGI era 2 M, in 4D, 4M, y en 4E, 6M. Como es posible ver en la figura 4C-E el porcentual de conjugado es aumentado siguiendo la concentración de guanidina. Figuras 5B, C, D muestran la formación del conjugado (PEG-VS) respectivamente bajo las mismas condiciones (concentración de guanidina) de la figura 5C, D, E. La mejor condición escogida fue 4 de guanidina, porque representa un buen compromiso entre modificación de rendimiento y condición moderada de desnaturalización. El curso del tiempo de la reacción mostrando la formación de cantidad limitada de conjugado mientras la mayor parte de la proteína es extraída no es modificado. 2. MALDI-TOF espectroscopia de masa de G-CSF nativo y de G-CSF-PEG-OPSS (5kDa) conjugado fraccionado a partir de la mezcla de reacción usando cromatografía HPLC.

Figura 6 A (G-CSF nativo) reporta un pico en 18.930 Da, que corresponde al peso molecular del G-CSF nativo. Figura 6 B (G-CSF PEGilado) reporta un pico en 24.711 Da, que corresponde al peso molecular del G-CSF nativo unido a una cadena única de PEG-OPSS (5kDa) . Figura 7 B (mezcla de reacción de G-CSF) reporta un pico en 24.583 Da, que corresponde al peso molecular del G-CSF nativo unido a una cadena única de PEG-VS (5kDa) . 3. Espectros Ultravioletas Lejanos de Dicroísmo Circular de G-CSF nativo y G-CSF-PEG conjugados. Espectros CD fueron registrados en un espectropolarímetro Jasco Modelo J-700 a 25°C a una concentración de proteína de cerca de 0.1 mg/ml usando celda de cuarzo de longitud de camino de 0.1 cm. Figura 8A reporta espectros UV-lejano CD de G-CSF nativo y G-CSF-PEG-OPSS conjugado. Estos espectros son típicos de polipéptidos -helicoidales con mínimos de excentricidad en 208 y 222 nm. Una diferencia de porcentual a-helicoidal entre proteína nativa y conjugada debe ser debida a problemas de agregación que pueden distorsionar la concentración de proteína y de ese modo la normalización de los espectros. Figura 8B reporta espectros UV-le ano CD de G-CSF y G-CSF-PEG-VS conjugados. En este caso la variación de la estructura secundaria entre nativo y conjugado proteína es más evidente. 4. Estudios de emisión de fluorescencia . El espectro fluorescente del G-CSF nativo y G-CSF-PEG-OPSS y G-CSF-PEG-VS conjugados fue registrado a 25°C en un Perkin Elmer LS-50, excitando las muestras (1.3 µ?) a 295 nm y registrando la fluorescencia de emisión en el rango de longitud de onda de 303-500 nm. Espectros fueron registrados en la misma condición después de la adición de quenc ers negativo (Nal) y positivo (CsCI) . Los espectros de fluorescencia del nativo y conjugado difieren solamente para un desplazamiento azul de 5 nm (de 350 a 345 nm) en longitud de onda de emisión, muy pequeño para indicar un cambio en exposición de fluoróforos a solvente. Fluoróforos (Trp 59, Trp 119) tienen un entorno polar, y por eso están probablemente expuestos a solvente en la proteína tanto nativa como conjugada. Figuras 9 A-B reportan experimentos de quenching usando CsCI (A) y Nal (B) para G-CSF nativo, G-CSF-PEG-OPSS y G-CSF-PEG-VS. Estos estudios revelan una pequeña variación en accesibilidad del solvente de Trp en proteína nativa y conjugada, variación probablemente debida a la presencia de una cadena PEG alrededor del Trp. Ejemplo 5: Preparación de 10 kDa PEG conjugado a rhG-CSF por tiol-reactivo en condiciones de desnaturalización 5a. 1.5 mi of rhG-CSF (1.46 mg/ml) fue añadido a 1.5 mi de una solución 6 M Guanidina HCl en buffer de fosfato, pH 7.2. En esta solución fue añadido mPEG-OPSS ó mPEG-VS (10 kDa) en una razón molar de 10 moles de polímero por mol de rhG-CSF. Se dejó que la mezcla de reacción procediese a temperatura ambiente en atmósfera de argón por 20 horas y la reacción fue detenida con HCl 0.1M. 5b La caracterización de los conjugados fue realizada por cromatografía RP-HPLC (Figura 11) y espectros UV-lejano CD (Figura 13) . El RP-HPLC fue efectuado usando una columna C4 Phenomene . Ejemplo 6: Preparación de 20 kDa PEG conjugado a rhG-CSF por tiol-reactivo (mPEGOPSS y mPEG-VS)en condiciones de desnaturalización 6a. 1.5 mi of rhG-CSF (1.46 mg/ml) fue añadido a 1.5 mi de una solución 6 M Guanidina HCl en buffer de fosfato, pH 7.2. En esta solución fue añadido mPEG-OPSS ó mPEG-VS (20 kDa) en una razón molar de 10 moles de polímero por mol de rhG-CSF. Se dejó que la mezcla de reacción procediese a 0°C por 1 hora y que la temperatura ambiente por otras 4 horas . La reacción fue detenida con HCl 0.1M. 6b La caracterización de los conjugados fue realizada por cromatografía RP-HPLC (Figura 12) y espectros UV-lejano CD (Figura 13) .

Ejemplo 7: Preparación de 20 kDa PEG conjugado a rhG-CSF por tiol-reactivo (mPEGMAL) en condiciones de desnaturalización Solución As una solución de 3mg/ml rhG-CSF con buffer hasta pH7.2 con 0.5M Tris-HCI fue preparada (solución A) Solución B: mPEG-Maleimida fue disuelto en una solución a 6M guanidina HC1, con buffer hasta pH 7.2 con Tris-HCI (0.5M), para obtener una concentración final de 30mg/ml (PEG-Mal) . 6 mi de solución A y 6 mi de solución. B fueron mezclados y la mezcla resultante se dejó reaccionar a temperatura ambiente por 1 hora (razón molar rhG-CSF/PEG-Mat=l:10). El rendimiento de la PEGilación fue superior a 95%. Figura 14 muestra el cromatograma RP-HPLC del rhG-CSF nativo (fig. 14A) y los de la mezcla de reacción después de 1 hora a temperatura ambiente (fig. 14B) . Ejemplo 8: Actividad proliferativa celular In Vitro en células NFS-60. El ensayo biológico es basado en la evaluación de los efectos estimulantes del rhG-CSF en la proliferación de una línea de células sensibles desarrollada a partir de un " alcance de leucemia mieloblástica en ratones de receptores GCSF: células NFS-60. La proteína sujeta a las células conduce a una reacción exponencial proliferativa y fue determinado que la concentración celular final era proporcional a la concentración de G-CSF presente en la cultura celular. Esto permite cuantificar la potencia biológica de la muestra de G-CSF versus una preparación estándar ó de referencia, aplicando una razón dosis-reacción. Para la prueba, células NFS-60 son mantenidas como culturas en suspensión en RP I 1640 complementado con 5% de suero fetal bovino, 4 mM Glutamina y rhG-CSF hasta una concentración de 18.000 lü/ml de medio. Antes de cada experimento, las células eran lavadas tres veces en solución salina helada con buffer de fosfato (PBS) y suspendidas nuevamente en medio de ensayo (suero fetal bovino 2.5%, 4 M Glutamina) para retirar el rhGCSF contenido en el medio de crecimiento. En nuestro caso la solución de G-CSF y PEGs conjugados fue sometida a diluciones en serie en medio de ensayo, transferida en duplicados (50 µ? cada) a placas con noventa y seis cavidades y mezcladas con un volumen igual de suspensión celular pre-lavada hasta una densidad final de 1.0 x 105 células por mi. Las placas fueron entonces incubadas a 37°C en C02 por 72 horas antes de la adición de 10 µ de MTT solución (100 mg MTT en 20 mi de PBS tibio estéril) . Se dejó que la reacción procediese por 4 horas a 37°C en un horno con C02. Las enzimas microsomáticas deshidrogenadas de células vivas convierten las sales de formazan MTT ((3 [4 ,5 Dimetiltiazol-2 y 1] -2, 5difeniltetrasolium bromuro) en cristales azules. Estos cristales fueron disueltos usando 100 µ? de una solución de SOS 15% en 0.01 N HCI. La absorbancia a 570 nm es directamente proporcional al niámero de células vivas . Las actividades del G-CSF y los conjugados como factores estimulantes, calculados como valores EC50 a partir del ploteo de la actividad (Figura 10) , son reportados en la siguiente tabla.

Valores EC50 (pmol/mL) es la cantidad de rh-G-CSF que promueve el crecimiento celular de 50% contra el máximo crecimiento celular. Por consiguiente, cuanto menor es el valor EC50, mayor es la actividad rhG-CSF. Tomando en cuenta la exactitud del método, rhG-CSF-PEG-OPSS puede ser considerado casi tan activo como el rhG-CSF nativo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura la: RP-HPLC . cromatografía G-CSF nativo (A) mezcla de reacción de G-CSF y PEG-OPSS (5 kDa) en condición fisiológica a tiempo de reacción 0.5, 3.5, 28 h (B, C, D) usando Columna C4 VIDAC™; 8b: SDS-PAGE análisis de G-CSF nativo (pista 1) y G-CSF PEG-OPSS conjugados en condiciones fisiológicas a tiempos de reacción 0.5, 2.5, 3.5, 6, 28, 51 h (pista 2-7) . Figura 2a: RP-HPLC cromatogramas . G-CSF nativo (A) ; mezcla de reacción de G-CSF y PEG-VS (5 kDa) en condición fisiológica después de 28 de reacción (B) usando Columna C4 VIDAC™; Ib: SDSPAGE de análisis G-CSF nativo (pista 1) y G-CSF PEG-OPSS conjugados en condiciones fisiológicas a tiempos de reacción 0.5, 2.5, 3.5, 6, 28, 51 h (pista 2-7). Figura 3: Espectros UV-lejano CD de G-CSF nativo en condición estándar y después de proceso de desnaturalización-renaturalización por Guanidina HCl. Los espectros fueron obtenidos a 25 °C en solución ácida a pH 3.5. Figura 4: RP-HPLC cromatogramas usando columna C4 VIDAC™. G-CSF nativo (A) ; mezcla de reacción de G-CSF y PEG-OPSS (5kDa) en presencia de 3M Urea (B) ; mezcla de reacción de G-CSF y PEG-OPSS (5kDa) en presencia de 2, 4, 6M guanidina HCI (C, D, E) . Figura 5: RP-HPLC cromatogramas. G-CSF nativo (A); mezcla de reacción de G-CSF y PEG-VS (5 kDa) en presencia de 3,4,6M guanidina HCI (B, C, D) , usando columna C4 VIDAC™.

Figura 6: MALDI-TOF espectroscopia de masa de G-CSF nativo (A) ; G-CSF-PEG-OPSS (5kDa) conjugado obtenido de mezcla de reacción por cromatografía RP-HPLC (B) . Figura 7: MALDI-TOF espectroscopia de masa de la mezcla de reacción entre G-CSF y PEG-VS (5kDa) (A) . Espectro expandido (B) . Figura 8: Espectros XJV-lejano CD de G-CSF nativo y conjugado A4G-C8P-PBG-0PSS (5kDa) . B, G-CSF-PEG-VS (5 kDa) . Espectros fueron tomados a 25°C in 10 m ac. acético, 0.004% entre 10 mg/ml manitol, pH 4. Figura 9: Espectros de emisión de fluorescencia de G-CSF nativo, G-CSF-PEG-OPSS (5 kDa) y G-CSFPEG-VS (5 kDa) conjugados. Espectros fueron tomados excitando las muestras (1.3 µ?) a 295 nm, en presencia de CsCl (A) ,NaI (B) . Figura 10: Evaluación de los efectos estimulantes de G-CSF nativo, G-CSF-PEG-OPSS, G-CSF-PEG-VS conjugados en la proliferación de células NFS-60. Respuestas fueron obtenidas por lectura de ensayo colorimétrico MTT D.O. a 540nm. Figura 11: RP-HPLC cromatogramas de mezcla de reacción de G-CSF y PEG-OPSS (10 kDa) usando columna C4 PhenomeneX™. Figura 12: RP-HPLC cromatogramas de mezcla de reacción de G-CSF y PEG-OPSS (20 kDa) usando columna C4 PhenomeneX™. Figura 13: Espectros UV-lejano CD de G-CSF nativo y PEG- OPSS conjugados (5 kDa negro, 10 kDa violeta, 20 kDa verde) . Espectros fueron tomados a 25°C in 10 mM ac. acético, 0.004% entre 10 mg/ml manitol, pH 4. Figura 14: RP-HPLC cromatogramas de rhG-CSF nativo (A) y de la mezcla de reacción de G-CSF y PEG-Mal (20 kDa) (B) en 3 M Cloruro de guanidina.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la presente se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Un conjugado de PEG y G-CSF humano o un análogo de G-CSF, caracterizado en que la cisterna thiol en posición 17 del G-CSF humano o en la correspondiente posición del G-CSF análogo es conjugado a la molécula de PEG.
2. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado en que el G-CSF es una secuencia análoga obtenida por ingeniería genética por sustitución o adición o retirada de uno o más residuos de aminoácido de la secuencia humana natural, pero manteniendo la actividad del G-CSF.
3. El conjugado de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, donde el PEG es lineal o ramificado y es raonofuncional o bifuncional
4. El conjugado de las reivindicaciones 1 o 3, donde el PEG es bifuncional y comprende una molécula de polímero y 2 moléculas de G-CSF ó de su análogo. 5. Los conjugados de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el PEG tiene MW que va entre 800 a 80.000 Da y preferiblemente
5.000 a 40.000 Da.
6. Composición farmacéutica comprendiendo un conjugado de acuerdo con cualquiera de la reivindicaciones anteriores .
7. Uso de un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la fabricación de una formulación farmacéutica para el tratamiento de neutropenia (crónica, inducida por quimioterapia, inducida por HIV, trasplante de médula ósea) .
8. Un proceso para la fabricación de un conjugado de un polímero y un polipéptido con un grupo cisteína inhibido estéricamente comprendiendo los siguientes pasos: (i) someter el polipéptido a condiciones que induzcan la desnaturalización reversible del polipéptido, ii) conjugación del polipéptido desnaturalizado obtenido en el paso (i) con un polímero tiol-reactivo, bajo condiciones de desnaturalización, iii) someter el conjugado obtenido en el paso (ii) a condiciones que promuevan la renaturalización del conjugado y proporcione el conjugado deseado.
9. El proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en el cual el polipéptido es G-CSF o su análogo y el polímero es PEG.
10. El proceso de la reivindicación 8 en el cual la desnaturalización reversible es obtenida exponiendo el polipéptido a un agente desnaturalizador seleccionado entre urea, cloruro de guanidina ó isotiocianato, dimetilurea, tal agente desnaturalizador estando preferiblemente a una concentración de más de 2M, preferiblemente más de 3M, e incluso más preferiblemente 2 a 4M.
11. El proceso de la reivindicación 10 en el cual el agente desnaturalizador es Cloruro de guanidina y la concentración de Cloruro de guanidina es preferiblemente mayor que 2 M, y es pref riblemente 3 , e incluso más preferiblemente 4 a 6 M.
12. El proceso de las reivindicaciones 9-11, en el cual el PEG tiene un grupo tiol-reactivo seleccionado entre OPSS, VS, N-maleimida ó iodoacetamida.
13. El proceso de las reivindicaciones 8-12. donde la renaturalización es obtenida retirando el agente desnaturalizador mediante diálisis, ultrafiltración, cromatografía ó dilución.
14. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por ser realizado en una solución acuosa con buffer a pH de 5 a 11.
15. El proceso de la reivindicación 14, donde el agente buffer es TRIS ó buffer de fosfato y el pH es de cerca de 7.
16. Un proceso de acuerdo con las reivindicaciones 8- 15, caracterizado porque el paso (ii) es realizado a una temperatura comprendida entre 5°C a 50°C , preferiblemente a una temperatura entre 20°C a 40°C