JP2004508338A - ポリマー修飾合成タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
(技術分野)
本発明は生物学的活性を有する合成ペプチド類、ポリペプチド類及びタンパク質を、ポリマー類、特にグリコミメチックポリマー類で修飾し、それらの生物学的活性または薬物動態特性を改良する方法及び組成物に関する。本発明はさらに、このようなポリマー修飾ペプチド類、ポリペプチド類及びタンパク質類の製法及び使用も提供する。
【0002】
(関連出願の相互参照)
本出願は米国特許出願第60/231330号(2000年9月8日出願)及び第60/236377号(2000年9月29日出願)の一部継続出願である。これらは両方とも参照によりそのまま本明細書に組み込まれる。
【0003】
(背景技術)
過去30年にわたり、タンパク質を疾患治療のための治療薬として使用する可能性について医学的関心がますます高まってきた(例えば“治療タンパク質1999”、Datamonitor plc、ロンドン、1999、を参照されたい)。大部分のタンパク質治療は天然発生性動物−またはヒト型のタンパク質に基づいており(インスリン、成長ホルモン、エリスロポエチン、インターロイキン−2、等)、組換えDNAで処理された細菌または真核細胞で産生される。残念なことに、大腸菌(E,coli)等の細菌細胞で作られた組換えタンパク質には、タンパク質の天然産生型には普通に見られる翻訳後修飾が欠けることが多い。この修飾欠如は患者に導入する際の薬物学的特性に重大なマイナスの影響を与え得る。
【0004】
グリコシル化は、複雑な糖鎖とタンパク質との酵素的結合を含む真核生物における一般的翻訳後修飾の一例である。細菌の発現系において作られた組換えタンパク質にはタンパク質をグリコシル化する能力がないため、グリコシル化型または“糖タンパク質”が必要な場合はこれらに代わって植物、酵母、昆虫または哺乳動物細胞等の真核生物発現系が使われてきた。組換え糖タンパク質の産生における重要な問題は、生成した産物が一般には、異なる種々の“グリコ型”の複雑な混合物からなり、それは非常に多様な生理学的または薬物学的特性を有することである。
【0005】
それにもかかわらず、組換えDNA法は、多くのポリペプチド類及びタンパク質の主要な商業的生産法となった;それは、それらが細菌やその他のホスト細胞内で多量に生産できるからである。組換えタンパク質の産生法は、ホスト細胞を所望外来タンパク質をコードするDNAでトランスフェクトまたはトランスフォームし、それら細胞を組換えタンパク質の発現に好ましい条件下で増殖させる諸段階を含む。大腸菌及び酵母はホストとして好ましい、なぜならばそれらは組換えタンパク質を高濃度に産生するように作製できるからである(米国特許第5,756,672号)。
【0006】
組換えDNAでコードされるタンパク質の一般的細菌性発現に関して多数の米国特許が発行された(例えば米国特許第4,565,785号;第4,673,641号;第4,738,921号;第4,795,706号;第4,710,473号等を参照されたい)。残念なことに、組換えDNA法の使用はもれなく成功したわけではない。若干の条件のもとでは、細菌ホストから大量に発現する二、三の異種タンパク質が細胞内に緻密な凝集物となって沈殿した;それは位相差顕微鏡下で見える細胞膜内の明るいスポットとして確認された。これらの沈殿タンパク質の凝集物は“屈折体(refractile bodies)”と呼ばれ、全細胞タンパク質のかなりの部分を構成することがある(ブレムス(Brems)ら、Biochemistry(1985)24巻:7662ページ)。
【0007】
これら屈折体からのタンパク質の回収は多くの問題をあらわした;例えば細胞内に含まれる上記タンパク質を、これを担っている細胞物質やタンパク質からいかにして分離するか、及びこの封入タンパク質を生物学的活性型のままいかにして回収するか等の問題である。屈折体に関する一般的調査研究論文については下記を参照されたい。マーストン(Marston)、同上;ミツラキ(Mitraki)及びキング(King)、Bio/technology、7巻、690ページ(1989);マーストン及びハートレー(Hartley)、Methods in Enzymol.182巻:264−276ページ(1990);ウェツェル(Wetzel)著“生体内におけるタンパク質凝集:細菌封入体及び哺乳動物アミロイド(Protein Aggregation In Vivo:Bacterial Inclusion Bodies and Mammalian Amyloid)”、タンパク質医薬品の安定性:In vivo分解経路及びタンパク質安定化戦略、アハーン(Ahern)及びマンニング(Manning)(編集)(プレナム・プレス、1991);及びウェツエル“In vitro及びin vivoにおける凝集抑制によるタンパク質の折りたたみ及び安定性の向上”、タンパク質工学−−実際的アプローチ、リース(Rees,A.R.)ら(編集)(IRLプレス、オックスフォード大学出版、オックスフォード、1991)。
【0008】
タンパク質類は研究試薬として化学的全合成によっても生成される(ウィルキン(Wilkin)ら、Curr.Opin.Biotech.(1999)9巻:412−426ページ)。このプロセスには、個々のアミノ酸の段階的カップリングによるタンパク質の化学的合成、またはペプチドまたはポリペプチドセグメントを個別に合成し、その後このようなセグメントの化学的結合等により前記セグメントを連結し、完全長生成物を作成するという収束的戦略がある(例えばドーソン(Dawson)ら、Annu.Rev.Biochem.(2000)69巻、923−960ページを参照)。若干の場合には化学的合成を利用して、単純な低分子糖で修飾した小さい糖タンパク質が作られている。(シン(Shin)ら、J.Am.Chem.Soc.(1999)121巻、11684−11689ページ)。また或る場合には、検出可能の標識等を含むタンパク質が化学的に作られた(ボリン(Bolin)ら、FEBS Letters(1999)451巻、125−131ページ)。残念なことに、このような標識タンパク質には、組換えによって作られるそれらの対応物にまさる治療的利点がほとんどまたは全くない。だが、標的タンパク質のファーマコホア(pharmacophore)領域に小分子タイプの変化を適用して有効性(potency)を改善することに焦点を合わせた化学的合成によって、治療的ポテンシャルを示す幾つかのタンパク質が合成された(米国特許第6,168,784号)。有効性は治療薬の製造上重要な観点であるが、その他の要因はタンパク質治療薬ではいまだに問題である。
【0009】
治療的に有用なタンパク質薬剤を開発する努力は、推定的薬剤候補をin vivo投与した際の不都合な生物活性、生体適合性及び生体内動態(クリアリング時間等)によって長い間妨げられてきた。タンパク質、特にポリペプチドの治療薬としての使用を大きく制限した主要な要因は、これらの化合物が循環系にしばしば免疫原性反応を引き起こすという事実であった(米国特許第4,179,337号(デイヴィス(Davis)ら)参照)。この作用は次の二つの二次的結果の一つまたは両方を有する。第一は誘発された抗体によるポリペプチドの破壊であり、第二は(より深刻なことに)アレルギー反応の誘発である。例えばインスリンの抗体仲介性破壊は、インスリンがヒト循環系にかなり短時間しか滞在しない原因であると考えられている。酵素の場合、ポリペプチドの破壊及びそれに続くその生理学的活性の消滅という問題があるだけでなく、最も好ましくないアレルギー反応の誘発もおこる。逆に、凝固因子、成長因子および因子サイトカイン等のタンパク質は、それらのin vivo投与の際に不都合に長い生物学的半減期を示す可能性がある。
【0010】
治療薬として使用するタンパク質を改良する一つのアプローチは、上記タンパク質を水溶性ポリマーで誘導体化すること等である。このような組合わせは、投与したタンパク質類のin vivo循環寿命、水溶性または抗原性を改善する手段として提案されている(米国特許第4,179,337号(デイヴィスら)参照)。多くの異なる水溶性ポリマー及び結合の化学成分がこのゴールを目指して使用されている:例えばポリエチレングリコール、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー類、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸 コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダムコポリマー)等。ポリエチレングリコール(“PEG”)は、治療的有用なタンパク質を得る試みにおいて用いられるこのような化学的成分の一つである(ザリプスキー(Zalipsky,S.)Bioconjugate Chemistry(1995)、6巻:150−165ページ;メヴァー(Mehvar,R.)J.Pharm.Pharmaceut.Sci.(2000)3巻(1号):125−136ページ)。その主鎖(CH2CH2O)nはフレキシブルで、両親媒性であり、プロテアーゼの作用を受けず、非免疫原性である。PEGの結合は、タンパク質類をタンパク質分解から守ることも判明した(ブロムホフ(Blomhoff、H.K.)ら、Biochim Biophys Acta(1983)757巻:202−208ページ)。それはタンパク質類のその他の物理化学的特性も改善し得る。
【0011】
例えば重症複合型免疫不全症(SCID)の治療のためにpegademase bovin(アダゲン(登録商標))(PEGポリマーが付加したアデノシン デアミナーゼの組成物)が開発された;PEG部分が付加したスーパーオキシドジスムターゼが頭部損傷治療のための臨床試験に用いられた;肝炎治療のために、付加PEG部分を有するアルファ−インターフェロンの試験が行われた。Pegylated(PEG化)IL−6が報告されている(EP 0 442 724、及び米国特許第5,264,209号を参照されたい)。EP 0 154 316は、リンホカインとポリエチレングリコール−アルデヒドとの反応を報告している。欧州特許出願EP 0 401 384は、ポリエチレングリコール分子を付加した顆粒球コロニー刺激因子(“G−CSF”)を作るための材料及び方法を記載している。修飾G−CSF及びその同族体はEP 0 473 268にも報告されており、ポリエチレングリコール等の水溶性粒子ポリマーに共有結合した種々のG−CSF及び誘導体の使用について述べている。米国特許第5,880,255号はPEGで修飾した多くのタンパク質を要約して書いている。
【0012】
PEGのようなポリマー部分及び関連ポリマーをタンパク質上の反応性基に付加するための種々の方法が使用された(米国特許第4,179,337号(デイビスら)、及び米国特許第4,002,531号(ロイヤー(Royer))。アブチョウスキー(Abuchowski)ら、“薬としての酵素(Enzymes as Drugs)”(J.S.Holcerberg and J.Roberts編集、367−383ページ、1981)及びザリプスキー(Zalipsky,S)Bioconjugate Chemistry(1995)6巻:150−165ページを参照されたい。タンパク質を修飾するためのPEGの使用は、ヘング(Cheng,T.−L.)ら(Bioconjugate Chem.1999)10巻:520−528ページ;ベルチェバ(Belcheva,N.)ら、Bioconjugate Chem.(1999)10巻:932−937ページ;ベッチンガーら、Bioconjugate Chem.(1998)9巻:842−846ページ;フアング(Huang,S.−Y.)ら、Bioconjugate Chem.(1998)9巻:612−617ページ;Xu,B.ら、Langmuir(1997)13巻:2447−2456ページ;シュワルツ(Schwarz,J.B.)ら、J.Am.Chem.Soc.(1999)121巻:2662−2673ページ;ロイター(Reuter,J.D.)ら、Bioconjugate Chem.(1999)10巻:271−278ページ;チャン(Chan,T.−H)ら、J.Org.Chem.(1997)62巻:3500−3504ページでも論議されている。タンパク質の典型的付着部位は、リジン残基上またはN−末端にあるような第一アミノ基、システイン側鎖にあるようなチオール基、及びグルタメート−またはアスパルテート残基上またはC−末端にあるようなカルボキシル基である。最も一般的な付着部位の幾つかを挙げると、糖タンパク質の糖残基、システインまたは標的タンパク質のN−末端及びリジンである。
【0013】
ポリマーをタンパク質に結合するための多くの異なるアプローチが報告されているとはいえ、結合プロセスには複雑な要因がないわけではない。結合反応によって起きる生物学的活性の損失を少なくするするように注意しなければならない。例えば付着部位数を最小にするために折りたたみまたは再折りたたみタンパク質が一般に用いられる。もしも多すぎる活性化ポリマーが標的タンパク質またはポリペプチドに付着するならば、生物学的活性は著しく減少するかまたは消失する。同様に、タンパク質にポリマーを結合するために好ましくないリンカーを使用したり、または不十分な量のポリマーが標的に付着するならば、生成した結合物の治療効果は制限され、その生物活性の喪失を代償するためには循環寿命の十分な増加を示さないかも知れない。修飾するポリマーによるタンパク質活性部位のブロックによる問題も起きるかも知れない。この問題は避け難い、なぜならばポリマーとタンパク質とは溶液ベースの反応で結合するのが一般的だからである。活性部位を燐酸ピリドキサール等の材料であらかじめ遮蔽することが示唆されるが、その結果は一貫しない(米国特許第4,179,337号(デイヴィスら)参照)。これらの問題は、生物活性と関係ない付着部位をほとんどもたない低分子タンパク質及びペプチドでは特に深刻である。
【0014】
例えば、一般的方法は水溶性ポリマーを標的タンパク質の第一アミン(N−末端アミノ基、及びリジンのイプシロンアミノ基等)に付着することである。チオール反応性−ポリマー結合物もシステインのチオール側鎖にポリマーを付着させるために用いられる。これらのアプローチは両方とも重大な問題をもたらす。なぜならば大部分のタンパク質は、タンパク質の活性、折りたたみ、再折りたたみ及び安定性の決定に重要な役割を演ずるこのような反応性基の多数のコピーをポリペプチド主鎖の種々の領域全体に含むからである。こうして広く使用されるとはいえ、このようなアプローチは多かれ少なかれ不完全なまたは望ましくないタンパク質活性低下、及び分離及び特徴づけが難しい複雑な混合物の生成という欠点を有する(デルガダ(Delgada)ら、Pharmaceutical Sciences(1997)3巻:59−66ページ)。
【0015】
ランダム付着を減らす試みにおいて、天然リジンを除去し、それと同時に所望のポリマー付着部位にリジンを付加したタンパク質が作製された(米国特許第4,904,584号)。例えばG−CSF及びIL−2はこのやり方で改質された。ランダム付着を回避するその他の試みは、天然システインを除去すると同時に所望のポリマー付着部位にシステインを付加したタンパク質か、または(もしあれば)天然システインを除去せずにシステインを付加したタンパク質を作製することであった(EP 0 668 353)。例えば、G−CSF、IL−3及びEPOはこのやり方で作られた。このようなシステインまたはリジンのバリアントは理論的に部位特異的ポリマー付着を可能にするが、それでもまだ、全ての選択部位がコントロールされたやり方で改質されるという保証はない。
【0016】
同一または類似の反応性官能基を担う側鎖を有する多数のアミノ酸を含むタンパク質を、部位特異的に改質できない場合、最近の研究ではタンパク質のアミノまたはカルボキシ末端の改質に焦点が置かれた。アミノまたはカルボキシ末端の改変は、若干の化学的結合法がこれらの部位を特異的に改変し得ることに依存する(WO90/02136及びWO90/02135)。例えば、この方法を使用してPEG鎖をG−CSF及びケモカインIL−8のN−末端残基に結合した(ガートナー(Gaertner)ら、Bioconjug.Chem.(1996)7巻(1号):38−44ページ;WO96/41813)。しかし、N−末端またはC−末端の改変は一般的にタンパク質の活性を低下させる(例えば米国特許第5,985,265号はG−CSFのN−末端及びリジン側鎖へのPEGの結合を論じている)。水溶性ポリマーによるタンパク質修飾の欠点にもかかわらず、PEG化及びその他の水溶性ポリマーのタンパク質への結合は追求され続けている。例えばα−IFのヒスチジンへのPEGの結合が米国特許第5,951,974号及び第6,042,822号に記載されている。アルファ−インターフェロンのリジンへのPEGの結合が米国特許第5,595,732号に記載されている。エリスロポエチン(EPO)の糖鎖及びリジンのような内部アミノ酸(欧州特許0 605 963及びWO00/32772)、及びN−末端(米国特許第6,077,939号及びWO00/32772)へのPEG結合も記載されている。
【0017】
もう一つの問題は、上に述べたポリマーの全てが非常に不均質であり、それがポリマー修飾タンパク質の混合物の分析による特徴づけ及び精製を難しくすることである(デルガダら、Pharmaceutical Sciences(1997)3巻:59−66ページ)。例えばPEGまたはPEGを基礎とする鎖の合成に使用する技術は、それが3400のようなかなり低い相対的分子量のものでも、コントロールが不十分な重合段階を含み、それは平均値の周囲にひろがる長さの鎖を有する製品に導く;すなわちそれらは(CH2CH2O)nのポリマー製品を含む、ここでnは離散した数値ではなく平均値の周りの或る範囲の数値を有する。誘導体化タンパク質のこの不均質性は容易には確認できない、まして分離することはできない或る範囲の諸特性と関係していることが多い。ポリペプチド付加物の使用は原理的には解決の可能性を提供すると考えられるとはいえ、ポリペプチドはタンパク質分解的切断を受けやすく、誘導体化タンパク質を免疫原性にするため、ポリペプチドの使用は好ましくない。
【0018】
だが残念なことに、現在治療的使用に用いられる全てのタンパク質は組換えDNA法によって誘導されるという事実によって、適切なポリマーを同定し、使用するという問題はさらに悪化する。組換えDNA技術の使用では、性能を高める部分と組換え産生されたタンパク質との間に形成し得る結合のタイプ及び特異性に厳しい制限がある。これは、先ず第一に、結合に適した官能基の数が非常に限定されており、第二に、修飾されるタンパク質には一般的に反応性官能基の数種のコピーがあり、これによって修飾の特異性が阻害されるからである。例えば、スーパーオキシドジスムターゼとPEGとの非選択的結合の場合、修飾された酵素の幾つかのフラクションが完全に不活性であることが判明した(マックゴフ(P.MacGoff)ら、Chem.Pharm.Bull.(1988)36巻:3079−3091ページ)。また、そのような部分の、異なる数がランダムに結合する場合、治療的タンパク質の薬物動態は正確には予想できず、投与量に関して大きな問題が生ずる。結合がコントロールされなければ、(a)有効性の減少、(b)誘導体の広範囲の混合物を分離するための、時間のかかる精製スキームの必要性、そして(c)修飾部分の結合が不安定である可能性が、生まれる。当業者には公知のトレシルクロリド−ベースの結合等、数種の結合は免疫原性であることも知られている。
【0019】
こうして、生物学的に産生されたタンパク質の循環寿命を改善し、タンパク質分解および免疫原性を減らし、その他の特性を改善するために、PEGのような水溶性ポリマーを結合することはできるが、コントロールされたやり方で、ユーザーが決めた正確さでそれらを結合することは難しく、不均質な結果が得られる。また、ポリマーをユーザーが決めた正確な部位に結合させる成功度は限定的であるため、タンパク質に一般的に使用できる好ましい結合部位についてはほとんど知られていない。その上、結合は統計学的性質のものであり、PEG及びそのような目的に現在使われるその他の水溶性ポリマーはヘテロ分散性であるため、PEG−タンパク質結合物の精製および分析による特徴づけは難しい。このため、再現性のある結合のコントロールの欠如とポリマーの不均質性とがからみあった問題が、ポリマー修飾タンパク質の治療薬としての日常的承認を著しく阻害してきた(1970年代初期に紹介されたにもかかわらず今日までに治療的使用が承認されたのはほんの数種に過ぎない)。
【0020】
よって、組換えDNA法とは別個のもので、ポリマー修飾が可能なポリマーを形成するために利用できる、生物活性タンパク質の生成法が必要である。種々の長さの鎖の混合物でなく、決まった構造のポリマー付加物を有する誘導体化タンパク質を形成するために利用できる好ましいポリマーも必要である。天然タンパク質の好ましい諸特性を模するように仕立てることができる構造のポリマー付加物を有する誘導体化タンパク質の形成に使用できるポリマーも必要である。さらに、多くのタンパク質に一般的に適用できるタンパク質誘導体化法も必要である。本発明はこれらの、及びその他の必要性を満足する。
【0021】
(発明の開示)
本発明は、ポリマー修飾合成生物活性タンパク質、それらを含む医薬組成物およびそれらの製法及び使用法に関するものである。本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質は全体または一部分が、化学的合成によって形成され、したがって生物学的に産生されたタンパク質とは著しく異なる。
【0022】
詳細には、本発明は約25キロダルトン(“kDa”)より大きいモノマー分子量を有するポリマー修飾合成生物活性タンパク質を提供する。本発明はさらに、一つ以上のイレギュラーアミノ酸残基を有するポリマー修飾合成生物活性タンパク質を提供する。本発明は特に、天然哺乳動物タンパク質(例えばヒト、サル、ウシ、ネズミ、ブタ、ヒツジ、またはウマ、トリ、またはサカナのタンパク質)のようなリボソーム特異的タンパク質と関連する生物活性を模する生物活性を有するポリマー修飾合成生物活性タンパク質を提供する。より詳細に述べれば、本発明は、タンパク質受容体、そのフラグメント、タンパク質受容体リガンドまたはそのフラグメント、及びサイトカインからなる群から選択されるリボソーム特異的タンパク質と関連する生物活性を模する生物活性を有するポリマー修飾合成生物活性タンパク質を提供する。
【0023】
好ましい実施の態様において、本発明は下記の式を有する分子的に均質なポリマー修飾合成生物活性タンパク質に向けられる:
“タンパク質”−Un−s1−B−s2−“ポリマー”−s3−J*
【0024】
上記式中、“タンパク質”はリボソーム特異的タンパク質のポリペプチド鎖を含み、上記ポリペプチド鎖は、一つ以上の化学的結合部位によって共有結合した重なり合わない(non−overlapping)ペプチドセグメントを一つ以上含み、Uは、一つ以上の重なり合わない(non−overlapping)ペプチドセグメントの一つ以上のアミノ酸の側鎖nの相互に反応する特異的官能基に共有結合した特異的官能基の残基であり、nは1ないし6の整数であり、Bは、同じでも異なっていてもよく、存在しても存在しなくてもよい3本以上のアームを有する分岐コアであり、“ポリマー”は実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり、それはBが存在する場合同じでも異なっていてもよい、そしてJ*は、陰−、陽−及び中性電荷からなる群から選択される、生理的条件下において正味の電荷を有するペンダント群の残基であり、s1、s2及びs3は、同じでも異なっていてもよく、そして個々にあってもなくともよいスペーサーまたはリンカーである。本発明の好ましい分子的に均質なポリマー修飾合成生物活性タンパク質は、25kDaより大きいモノマー分子量を有する単分散系のものである。
【0025】
もう一つの実施態様において、本発明はリボソーム特異的糖タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖を有するポリマー修飾合成生物活性タンパク質に向けられる、その際上記ポリペプチド鎖はそれに結合した一つ以上の水溶性ポリマーを有する。より好ましい実施態様において、水溶性ポリマーの一つ以上がリボソーム特異的糖タンパク質のグリコシル化部位に対応する上記ポリペプチド鎖の一つ以上の部位に共有結合する。好ましい水溶性ポリマーは、グリコミメティック水溶性ポリマーであるポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシド及びそれらの誘導体である。最も好ましいのは、サイトカイン糖タンパク質のポリペプチド鎖を含んでなるポリマー修飾合成タンパク質である。
【0026】
本発明はさらに、このような本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質を含んでなる医薬組成物に関係する。本発明はさらに、ヒトの病気または疾患を治療する方法であって、このような本発明の医薬組成物を1種類以上含む医薬組成物の有効量を、このような治療を必要とする人に投与することを含んでなる治療法を提供する。
【0027】
本発明は、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質の製法にも向けられる。本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質の好ましい製法は、上記ポリマー修飾合成タンパク質のポリペプチド鎖の重なり合わない(non−overlapping)アミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に結合することを含み、その際結合に使用される上記ペプチドセグメントの一つ以上が水溶性ポリマーを有し、その水溶性ポリマーは、ペプチドセグメント中の、ユーザーによって決まり、且つあらかじめ選択された部位に結合する。上記ポリマー修飾ポリペプチド鎖はその後折りたたまれ、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質が生成する。
【0028】
本発明の合成生物活性タンパク質のもう一つの好ましい製法は、本発明の合成生物活性タンパク質のポリペプチド鎖の重なり合わない(non−overlapping)アミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に結合し、その(ペプチドセグメントの)一つ以上の化学的結合部位のアミノ酸の側鎖に一つ以上の水溶性ポリマーを結合すること含む。上記ポリマー修飾ポリペプチド鎖をその後折りたたみ、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質を生成する。
【0029】
本発明は、(1)合成生物活性タンパク質のポリペプチド鎖の重なり合わない(non−overlapping)アミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に結合し、上記合成生物活性タンパク質に対応する完全長ポリペプチド鎖を形成し、その際少なくとも一つのペプチドセグメントが第一の化学選択的官能基を有するイレギュラーアミノ酸を含み、(2)上記ポリペプチド鎖を折りたたみ、(3)第一の化学選択的基と特異的に、かつ相互に反応する第二の化学選択的基を含む水溶性ポリマーをそこに結合させる諸段階を含んでなる、ポリマー修飾合成生物活性タンパク質の製法にも向けられる。
【0030】
本発明のもう一つの実施態様は、式U−s1−B−s2−“ポリマー”−s3−J*であらわされる分子的に均質なグリコミメティック水溶性ポリマーに向けられる。上記式中、Uは特異的官能基の残基であり、Bは3本以上のアーム(同じでも異なっていてもよく、存在しても存在しなくてもよい)を有する分岐コアであり、“ポリマー”は、式−[C(O)−X−C(O)−NH−Y−NH]n−または−[NH−Y−NH−C(O)−X−C(O)]n−であらわされる約5,000ダルトンより大きい分子量を有するポリアミドであり、上記式中X及びYは同じでも異なっていてもよく、分岐鎖でも直鎖でもよい二価のラジカルであり、nは2から50までの整数であり、X及びYのどちらかまたは両方が、直鎖または分岐鎖である実質的に非抗原性、水溶性の反復単位を含み、J*は陰−、陽−及び中性電荷からなる群から選択される生理的条件のもとで正味の電荷を有する実質的に非抗原性のペンダント基の残基であり、s1、s2及びs3は同じでも異なっていてもよく、個々に存在しても存在しなくともよいスペーサーまたはリンカー部分である。
【0031】
本発明はさらに次の式であらわされる分子的に均質な水溶性ポリマーに関係する:
U−s1−B−s2−“ポリマー”−s3−J*
上記式中、Uは特異的官能基の残基であり、Bは3本以上のアーム(同じでも異なっていてもよく、存在しても存在しなくてもよい)を有する分岐コアであり、“ポリマー”は、式−[C(O)−X−C(O)−NH−Y−NH]n−または−[NH−Y−NH−C(O)−X−C(O)]n−であらわされる約5,000ダルトンより大きい分子量を有するポリアミドであり、上記式中、X及びYは、同じでも異なっていてもよく、分岐鎖でも直鎖でもよい二価のラジカルであり、nは2から50までの整数であり、X及びYのどちらかまたは両方が、直鎖または分岐鎖である実質的に非抗原性、水溶性の反復単位を含み、J*は陰−、陽−及び中性電荷からなる群から選択される生理的条件のもとで正味の電荷を有する実質的に非抗原性のペンダント基の残基であり、s1、s2及びs3は同じでも異なっていてもよく、個々に存在しても存在しなくともよいスペーサーまたはリンカー部分である;存在するならば、それらが1ないし18個の炭素を含むのが好ましい。
【0032】
本発明は特に、Uがアクリレート、アルデヒド、ケトン、アミノオキシ、アミン、カルボン酸、エステル、チオエステル、ハロゲン、チオール、シアノアセテート、ジパルミトイル ホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイル ホスファチジルエタノールアミン、エポキシド、ヒドラジド、アジド、イソシアネート、マレイミド、メタクリレート、ニトロフェニル カルボネート、オルトピリジル ジスルフィド、シラン、スルフヒドリル、ビニルスルホン類、スクシンイミジル グルタレート、スクシミジル スクシネート、琥珀酸、トレシレート及び活性化可能な官能基からなる群から選択される官能基の残基であるような、分子的に均質な水溶性ポリアミドに関係する。
【0033】
本発明はさらに、Uがカルボネート、エステル、ウレタン、オルトエステル、アミド、アミン、オキシム、イミド、尿素、チオ尿素、チオウレタン、チオエステル、エーテル、チアゾリジン、ヒドラゾン、及びオキサゾリジンからなる群から選択される結合を形成できる官能基の残基であるような分子的に均質な水溶性ポリマー、特にUが保護されているこのようなポリマーに関係する。
【0034】
本発明はさらに、ポリマーが約10,000Daより大きい、より好ましくは約15,000Daより大きい分子量を有するこのような分子的に均質な水溶性ポリマーにも関係する。
【0035】
本発明はさらに、Bが4本以上のアームを含んでなり、および/またはBが一つ以上のアミド結合によってs2または“ポリマー”に結合している分岐コアを含み、および/またはBがアミド結合によってポリマーに結合している分岐コアを含んでなるこのような分子的に均質な水溶性ポリマーに関する。
【0036】
本発明はさらに、反復単位が式−(CH2−CH2−O)−または−(CH2−CH2−O)−のエチレンオキシドを含み;および/またはX、Y、またはXとYが:−((CH2)n1−(CH2−CH2−O)n2−(CH2)n1−)−または−((CH2)n1−(O−CH2−CH2)n2−(CH2)n1−)から選択され、式中、n1は1ないし6の整数であり、n2は2ないし50の整数であり;および/またはXまたはYの1つがフェニル、C1−C10アルキレン部分、C1−C10アルキル基、ヘテロ原子含有フェニル、ヘテロ原子含有C1−C10アルキレン部分、ヘテロ原子含有C1−C10アルキル基、及びこれらの組合わせからなる群から選択される、上記分子的に均質な水溶性ポリマー類に関係する。
【0037】
本発明は特に、Xが−(CH2−CH2)−、または−X’−NH−または−NH−X’−である上記分子的に均質な水溶性ポリマーに関係する。
【0038】
本発明は特に、Yが−(CH2−(CH2−CH2−O)3−CH2−CH2−CH2)n−または−(CH2−CH2−CH2−(O−CH2−CH2)3−CH2)n−であり、ここでnは6ないし36;または−Y’−NH−または−NH−Y’−であり、特に、X’及びY’の少なくとも一つが式(−CH2−CH2−O−)nまたは(O−CH2−CH2−)nであり、ここでnは2ないし50である上記分子的に均質な水溶性ポリマー類に関する。
【0039】
本発明は特に、J*が保護されており、または(i)生理的条件のもとで正味の中性電荷を有する非イオン化基、または(ii)生理的条件のもとで正味の陽電荷を含むイオン化基、または(iii)生理的条件のもとで正味の陰電荷を含むイオン化基、を含んでなる、前記分子的に均質な水溶性ポリマー類に関する。
【0040】
本発明は水溶性ポリマーが単分散系である前記分子的に均質な水溶性ポリマー類に関する。
【0041】
(発明を実施するための最良の形態)
本発明はポリマー修飾合成生物活性タンパク質、その製法及び使用に関するものである。本発明はグリコミメティック水溶性ポリアミドポリマーにも関係する。
【0042】
I.本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質
ポリマー修飾タンパク質はこれまでに記述されているとはいえ、本発明において可能なポリマー修飾の性質及び方法はこれまでの試みとは明らかに異なる。例えば、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質はまるごと化学的に合成される。その上、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質は一つ以上の特定の、ユーザーにより選択され、且つユーザーが決める部位が水溶性ポリマーで修飾される。
【0043】
さらに、本発明のタンパク質の合成的製造により、このような修飾が、標本中のあらゆる分子の各ユーザー選択−及びユーザー決定部位に存在することを確認することができる。合成のこのような均一性及びコントロールによって、本発明は、先行技術の方法の使用では許される無秩序な修飾とははっきり区別される。重要なことに、本発明は、いかなる重要でない(non−critical)残基も誘導体化されてポリマー付加物を含むことができるという合成タンパク質を設計することができる。その上、このようなユーザー選択−及びユーザー決定部位の各々に関して、このような付加物をポリペプチド−またはタンパク質主鎖に結合する正確な結合(アミド、チオエステル、チオエーテル、オキシム等)をユーザーが決定できる。加えて、特定部位に存在することが望ましい特定のポリマー付加物を変えたり、コントロールして、存在するあらゆるタンパク質またはポリペプチドが正確に同じ誘導体化部位に、正確に同じ誘導体化付加物を含む最終試料が得られるようにすることができる。こうして、本発明はポリマー修飾ポリペプチド及びタンパク質の均質生成物の形成を可能にする。
【0044】
水溶性ポリマーを結合できる結合部位の位置及び数を変えるための手段を提供できる上に、本発明は結合したポリマーの性質を変えることもできる。特定のユーザー選択及びユーザー決定部位に挿入できるポリマー付加物は決められたいかなる長さでもよい。同様に、本発明の方法により、異なる部位に異なる長さのポリマーを使うことも可能である。例えば、一実施形態において、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質は水溶性ポリマー付加物による単修飾または多修飾のいずれでもよい。一種類以上のポリマー付加物が特定のポリペプチドまたはタンパク質に挿入される場合、使われるポリマーは、“単一種(mono−speciated)”、“多種(poly−speciated)”、“均一種(uniformly speciated)”、または“広範囲種(diversely speciated)”でよい。ここに使用する用語“単一種(mono−speciated)”は、一種類のポリマーによって修飾されるポリペプチドまたはタンパク質を意味する。対照的に、用語“多種(poly−speciated)”は一種類より多い種類のポリマーによって修飾されたポリペプチドまたはタンパク質を言う。このような多種(poly−speciated)ポリペプチドまたはタンパク質は、もしもポリペプチドまたはタンパク質の全修飾部位において同じ一種類のポリマーが存在するならば、“均一種(uniformly speciated)”であると言われる。対照的に、多種(poly−speciated)ポリペプチドまたはタンパク質は、もしも上記ポリペプチドまたはタンパク質の改変部位が種々の種類のポリマーで修飾されているならば“多様種(diversely−speciated)”であると言われる。
【0045】
その上、ユーザーが選択し、ユーザーが決定した各部位のポリマー付加物の直鎖性または枝分かれの程度を変えることができる。このためポリマー付加物は直鎖でも、枝分かれしていても、または均一に枝分かれしていてもよい。用語“均一に枝分かれ”とは、特定部位のポリマーの全ての枝が同じ構造及び長さを有することを意味する。我々が認めるように、本発明では、個々の枝の長さも、そのような分岐点に存在するポリマーの構造も両方とも独立的に変えることができる。
【0046】
要するに、本発明は、ポリペプチドまたはタンパク質主鎖の、ポリマーで修飾された、ユーザー選択、ユーザー決定部位の(1)位置及び(2)頻度を決定し、並びにそのような各部位に存在する枝分かれの(3)長さ、(4)種類、及び(5)程度をコントロールすることができる。さらに、ポリマーによる多数の修飾を有するポリペプチド及びタンパク質に関して、本発明は各部位の、上に述べた5変数の各々を独立的に決めることができる。その上、枝分かれポリマーで修飾したポリペプチド及びタンパク質に関しては、本発明は各分岐点に対して上記5変数の各々を独立的に決めることができる。これにより、存在する20種類の遺伝子的にコードされるアミノ酸側鎖のいずれかまたは全ての多数のコピーを、望ましくないポリマー結合によって妨害されずに含む精密なポリマー修飾合成生物活性タンパク質の均一組成物の合成が可能である。
【0047】
こうして本発明は、ポリマー修飾合成生物活性タンパク質、特にサイトカイン、成長因子等のための受容体を標的とするそれらの設計、合成及び使用にかなりの柔軟性を与える。例えば、本発明の合成生物活性タンパク質のアミノ酸配列は、基礎となる遺伝子的にコードされたタンパク質のアミノ酸配列(本発明の合成生物活性タンパク質のアミノ酸配列はこれに基づいている)に比較して一つ以上の欠失、挿入または置換を含むことができる。アミノ酸配列は一つ以上のイレギュラーアミノ酸、例えば擬似アミノ酸および/または不自然な側鎖を担うその他のアミノ酸等、例えば水溶性ポリマー付加物を結合するための特異な化学選択的官能基を担うように改変されたアミノ酸等で置換することができる。こうして、水溶性ポリマーはイレギュラーアミノ酸または遺伝子的にコードされたアミノ酸を介して結合できる。上記水溶性ポリマーは直鎖でも枝分かれしていてもよい、そしてカルボン酸、脂肪族、アミドまたはアミンのような化学的成分を含む末端基を有することができる。その上、上記水溶性ポリマーは単分散系でよい、すなわちそれは精密に決められた構造及び組成の単一の分子種を含むように作ることができる。例えば、上記水溶性ポリマーは、こうして修飾される標的タンパク質の半減期、免疫原性、有効性、保存安定性、投与量、デリバリー性等を細かく調節する特徴を含むように設計できる。
【0048】
好ましい実施の形態において、本発明は分子的に均質なポリマー修飾合成生物活性タンパク質に向けられる。これらのタンパク質は次の式であらわされる:
“タンパク質”−Un−s1−B−s2−“ポリマー”−s3−J*
【0049】
この式において、“タンパク質”はリボソーム特異的タンパク質のポリペプチド鎖を含む。上記ポリペプチド鎖は一つ以上の化学的結合部位によって共有結合した重なり合わない(non−overlapping)ペプチド セグメントを一つ以上含む。
【0050】
“リボソーム特異的タンパク質”とは細胞内でリボソームによって産生するタンパク質を意味する。好ましい実施形態において、ポリマー修飾ポリペプチド鎖は、天然哺乳動物タンパク質(例えばヒト、サル、ウシ、ネズミ、ブタ、ヒツジ、またはウマ、トリ、またはサカナのタンパク質)のようなリボソーム特異的タンパク質と関連した生物活性を模する生物活性を有する。タンパク質受容体またはそのフラグメント、タンパク質受容体リガンドまたはそのフラグメント、及びサイトカインからなる群から選択されるリボソーム特異的タンパク質と関連する生物活性を模する生物活性がより好ましい。リボソーム特異的タンパク質の生物活性ポリペプチド鎖には新規のものも、種々の遺伝子またはタンパク質のデータベースから得られるものも含まれる。このようなデータベースの例には、非制限的にジーンバンク(GeneBank)(ベンソン(Benson)ら、Nucleic Acids Res.(1998)26巻(1号):1−7ページ;USA National Center for Biotechnology Information、National Library of Medicine、National Institute of Health、ベセスダ、MD、USA)、TIGRデータベース(The Institute for Genomic Research、ロックヴィル、MD、USA)、タンパク質データバンク(ブルックヘヴン・ナショナル・ラボラトリー、USA)、及びExPASy及びスイスタンパク質データベース(Swiss Institute of Bioinformatics、ジュネーブ、スイス)がある。最も好ましいリボソーム特異的タンパク質はサイトカインである:そのポリペプチド鎖及びそれらの特異的アミノ酸配列はよく知られている(例えば“サイトカイン・ハンドブック(The Cytokine Handbook)”、第3版、トーマス(A.Thomas)編集、Associated Press、1998;“サイトカイン(Cytokines)”、A.Mire−Sluis&R.Therpe編集、アカデミックプレス、1998;及び“サイトカイン・リファレンス(Cytokine Reference)”1巻、リガンド類、サイトカイン及びその他のホスト防御メディエータ概論、オッペンハイム(J.J.Oppenheim)及びフェルドマン(M.Feldmann)編集、アカデミックプレス、2001、を参照されたい)。
【0051】
“化学的ライゲーション部位”とは、化学的ライゲーション(chemical ligation)によって両者の間に非可逆的共有結合を形成するまたは形成できる第一のペプチドまたはポリペプチドのN−末端アミノ酸及び第二のペプチドまたはポリペプチドのC−末端アミノ酸を意味する。ここに使用する“化学的ライゲーション”とは、2つの化学的成分の共有結合を含む化学選択的反応を言い、上記2つの化学的成分の各々は他者と特異的に非可逆的共有結合を形成できる相互に反応する官能基を担う。化学的ライゲーション(chemical ligation)には(1)特異的に反応するC−末端基を担う第一ペプチドまたはポリペプチドと(2)特異的に反応するN−末端基を担う第二のペプチドまたはポリペプチドとの共有結合がある;ここでC−末端及びN−末端の反応性基はそれらの間に非可逆的共有結合を形成する。特に、化学的ライゲーションは、保護されていないペプチドセグメントのライゲーションに適用できるいかなる化学選択反応化学をも含む。
【0052】
Uは一つ以上の重なり合わない(non−overlapping)ペプチドセグメントの、一つ以上のアミノ酸の側鎖nの、相互に反応性の特異的官能基に共有結合した特異的官能基の残基である。ここでnは1ないし6の整数である。より好ましくは、側鎖nは1ないし4の整数である。ここに使用する用語“アミノ酸”は20の遺伝子的にコードされるアミノ酸、天然に見いだされる稀なまたは異常なアミノ酸、及び天然以外で発生するアミノ酸、例えばイレギュラーアミノ酸等を含むものとする;ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の範囲内でアミノ酸残基を指す場合もある。U及び側鎖nの好ましい実施形態は、特異的相互反応性基から形成される共有結合である;その際このような結合はオキシム、アミド、アミン、ウレタン、エーテル、チオエーテル、エステル、ヒドラジド、オキサゾリジン、チアゾリジン、チオエーテル、エーテル及びエステルから選択される。最も好ましいU及びn結合は、Uが、アミド、オキシム、チオエステル、ヒドラゾン、チアゾリジン、オキサゾリジンからなる群から選択される化学的ライゲーションによって形成される結合を介して側鎖nに共有結合しているものである。
【0053】
Bは、同じでも異なっていてもよく、存在しても存在しなくてもよい3本以上のアームを有する分岐コアである。Bが存在し、3本以上のアームを含むことが最も好ましい。特に、Bのアームの1本がUに結合し(任意にスペーサーまたはリンカーs1を介して)、Bの第二のアームが“ポリマー”に結合する(任意にスペーサーまたはリンカーs2を介して)ことが好ましい。好ましいポリマー修飾合成生物活性タンパク質は、部分Bの枝分かれしたアームの少なくとも1本が、オキシム、アミド、ウレタン、チオエーテル、エステル、ヒドラジド、オキサゾリジン、及びチアゾリジンからなる群から選択される結合の残基を含むものである。本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質の好ましい枝分かれ基Bは、アミノ、カルボン酸塩及び混合アミノーカルボン酸塩からなる群から選択される分岐コアを含んでなる。好ましいアミノ分岐コアはリジンを含み、好ましいカルボン酸塩分岐コアはグルタミンまたはアスパラギン酸を含み、好ましい混合アミノ−カルボン酸塩分岐コアはガンマーグルタミン酸、またはその誘導体を含む。
【0054】
“ポリマー”成分は実質的に非抗原性の水溶性ポリマーで、Bが存在する場合は同一であるかまたは異なっていてもよい。“水溶性ポリマー”とは、水に溶解し、約1,000ダルトンより大きい原子分子量を有する実質的に非抗原性のポリマーである。上記“ポリマー”は好ましくは10,000Daより大きく、より好ましくは約20,000ないし500,000Da、最も好ましくは約40,000ないし300,000Daの有効的流体力学的分子量を有する。“有効的流体力学的分子量”とは、水ベースのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって測定されたポリマー鎖の有効的水溶媒和サイズを意味する。水溶性ポリマーがエチレンオキシド反復単位等のポリアルキレンオキシド反復単位を有するポリマー鎖を含む場合、各鎖は約200ないし約80,000Daの原子分子量、好ましくは約1,500ないし約42,000Daの原子分子量を有するのが好ましく、2,000ないし約20,000Daが最も好ましい。特に説明しない限り、分子量は原子分子量を指すものとする。
【0055】
“ポリマー”成分は広範囲の分子量、及びポリマーサブユニットを有することができる。これらのサブユニットには生物学的ポリマー、合成ポリマー、またはそれらの組み合わせがある。このような水溶性ポリマーの例には:デキストラン及びデキストラン誘導体、例えばデキストラン硫酸等、P−アミノ架橋デキストリン、及びカルボキシメチルデキストリン、セルロース及びセルロース誘導体、例えばメチルセルロース及びカルボキシメチルセルロース等、澱粉及びデキストリン類、及びデキストリン、澱粉の誘導体及び加水分解物、ポリアルキレングリコール及びこれらの誘導体類、例えばポリエチレングリコール、メチルオキシポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール ホモポリマー、ポリプロピレングリコール ホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー等(ここで前記ホモポリマー及びコポリマーは置換されていないか、または一端がアルキル基、ヘパリン及びヘパリン断片で置換されている)、ポリビニルアルコール及びポリビニルエチルエーテル類、ポリビニルピロリドン、アスパルタミド、及びデキストラン及びデキストラン誘導体、デキストリン及びデキストリン誘導体で置換されたポリオキシエチル化ポリオール類がある。上に詳細に記載された水溶性ポリマーの種々の誘導体も考慮されるのは当然である。
【0056】
上に記載したような水溶性ポリマーはよく知られており、特にポリアルキレンオキシド−ベース−ポリマー、例えばポリエチレングリコール(PEG)は公知である(下記を参照されたい:“ポリ(エチレングリコール)の化学:生物工学的及び生医学的用途”ハリス(J.M.Harris)編集、プレナムプレス、ニューヨーク、NY(1992);及び“ポリ(エチレングリコール)の化学及び生物学的用途”ハリス及びザリプスキー編集、ACS(1997);及び国際特許出願:WO90/13540、WO92/00748、WO92/16555、WO94/04193、WO94/14758、WO94/17039、WO94/18247、WO94/28937、WO95/11924、WO96/00080、WO96/23794、WO98/07713、WO98/41562、WO98/48837、WO99/30727、WO99/32134、WO99/33483、WO99/53951、WO01/26692、WO95/13312、WO96/21469、WO97/03106、WO99/45964、及び米国特許第4,179,337号、第5,075,046号;第5,089,261号;第5,100,992号;第5,134,192号;第5,166,309号;第5,171,264号;第5,213,891号;第5,219,564号;第5,275,838号;第5,281,698号;第5,298,643号;第5,312,808号;第5,321,095号、第5,324,844号;第5,349,001号;第5,352,756号;第5,405,877号;第5,455,027号;第5,446,090号;第5,470,829号;第5,478,805号;第5,567,422号;第5,605,976号;第5,612,460号;第5,614,549号;第5,618,528号;第5,672,662号;第5,637,749号;第5,643,575号;第5,650,388号;第5,681,567号;第5,686,110号;第5,730,990号;第5,739,208号;第5,756,593号;第5,808,096号;第5,824,778号;第5,824,784号;第5,840,900号;第5,874,500号;第5,880,131号;第5,900,461号;第5,902,588号;第5,919,442号;第5,919,455号;第5,932,462号;第5,965,119号;第5,965,566号;第5,985,263号;第5,990,237号;第6,011,042号;第6,013,283号;第6,077,939号;第6,113,906号;第6,127,355号;第6,177,087号;第6,180,095号;第6,194,580号;第6,214,966号)。
【0057】
より好ましい“ポリマー”成分は、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシド、またはそれらの誘導体を含む。さらにより好ましい“ポリマー”成分は、式−[C(O)−X−C(O)−NH−Y−NH]n−または−[NH−Y−NH−C(O)−X−C(O)]n−であらわされる約1,000Daより大きい分子量を有するポリアミドである。上記式中、X及びYは同じでも異なっていてもよく、枝分かれしていても直鎖でもよい二価のラジカルであり、nは2ないし100、より好ましくは2ないし50の整数であり、X及びYの片方または両方が直鎖かまたは枝分かれした、生体適合性、実質的に非抗原性の水溶性反復単位を含む。最も好ましい水溶性反復単位は式−(CH2−CH2−O)−または−(CH2−CH2−O)−であらわされるエチレンオキシドを含む。このような水溶性反復単位のより好ましい数は2ないし500、2ないし400、2ないし300、2ないし200、2ないし100であり、最も好ましいのは2ないし50である。より好ましい実施形態の例では、X及びYの片方または両方が−((CH2)n1−(CH2−CH2−O)n2−(CH2)n1−)−または−((CH2)n1−(O−CH2−CH2)n2−(CH2)n1−)から選択され、式中n1は1ないし6、1ないし5、1ないし4であり、最も好ましくは1ないし3であり、n2は2ないし50、2ないし25、2ないし15、2ないし10、2ないし8であり、最も好ましくは2ないし5である。非常に好ましい実施形態の例は、Xが(CH2−CH2)−であり、Yが−(CH2−(CH2−CH2−O)3−CH2−CH2−CH2)−または−(CH2−CH2−CH2−(O−CH2−CH2)3−CH2)−であるものである。
【0058】
“ポリマー”成分または一つ以上のスペーサーまたはリンカー(存在すれば)は、生体内安定性または生分解性であるポリマー鎖またはポリマー単位を含むことができる。例えば反復結合を有する“ポリマー”は、生理的条件下で結合の不安定さに応じて種々の安定度を有する。このような結合を有するポリマーは、低分子量同族体の公知の加水分解速度に基づき、生理的条件下におけるそれらそれぞれの加水分解速度によって、例えば安定性の小さいポリカルボネートからより安定なポリカルボネート類にまで分類できる:(−O−C(O)−O−)>ポリエステル類(−C(O)−O−)>ポリウレタン類(−NH−C(O)−O−)>ポリオルトエステル(−O−C((OR)(R’))−O−)>ポリアミド類(−C(O)−NH−)。同様に、水溶性ポリマーを標的分子に付加させる結合系は生体内安定でも生分解性でもよく、例えばより不安定なカルボネートからより安定なカルボネートまでのいずれでもよい:(−O−C(O)−O−)>エステル(−C(O)−O−)>ウレタン(−NH−C(O)−O−)>オルトエステル(−O−C((OR)(R’))−O−)>アミド(−C(O)−NH−)。これらの結合は例として提供されるもので、本発明の水溶性ポリマーのポリマー鎖または結合系に使用できる結合のタイプを制限するものではない。
【0059】
成分J*は陰−、陽−及び中性電荷からなる群から選択される正味の電荷を生理的条件下で有するペンダント基の残基である。これはアルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アミド、アミン、カルボニル基等を含む;これらは置換されていても置換されていなくともよい、そしてそれらの塩でもよい。中性の基はアルキルまたはアルコキシ基が好ましく、非制限的に、1ないし18個の炭素を含む部分を含むことができ、直鎖でも枝分かれしていてもよい。帯電基として与えられる場合、J*はイオン化官能基を含む。官能基の例には、非制限的に、カルボン酸、エステル、アミド、ニトリル、チオール、及びヒドロキシルがある。このようなJ*基はアミノ酸、核酸、脂肪酸、炭水化物の一成分、及びそれらの誘導体でもよく、キチン、キトサン、ヘパリン、硫酸ヘパラン、コンドロイチン、硫酸コンドロイチン、デルマタンおよび硫酸デルマタン、シクロデキストリン、デキストラン、ヒアルロン酸、燐脂質、シアル酸等のような部分でもよい。J*はカルボキシル、アミノ、チオール、ヒドロキシル、ホスホリル、グアニジニウム、イミダゾール及びそれらの塩から選択されるイオン化可能部分を含むのが好ましい。最も好ましいのは、J*がイオン化可能カルボン酸塩部分を含み、生理的条件下で正味の陰電荷を有する場合である。
【0060】
成分s1、s2及びs3は、同じでも異なっていてもよく、個々に存在してもしなくともよいスペーサーまたはリンカー部分である。好ましいスペーサーまたはリンカーは、水溶性ポリマーに用いられる一つ以上の反復単位、ジアミノおよび/またはジアシド単位、天然または非天然アミノ酸またはそれらの誘導体、並びに、アルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、アルコキシ等を含み、好ましくは18個までの炭素原子または追加的ポリマー鎖も含む脂肪族部分を含む直鎖または枝分かれ部分等である。スペーサーまたはリンカーがポリマー鎖を含むのが最も好ましい。
【0061】
或いは、上記の式“タンパク質”−Un−s1−B−s2−“ポリマー”−s3−J*は“タンパク質−Un−B−“ポリマー”−J*”と表すことができる;上記式中、基s1、s2及びs3は存在してもしなくてもよい。より好ましい“ポリマー”成分は、水溶性ポリマーU−s1−B−s2−“ポリマー”−s3−J*が全体として段階的合成によって生成される場合である。これは、これらのポリマーが精密な分子量及び決められた構造をもつことを意味する。これに対して、普通のポリマー重合(すなわち重合プロセス)は鎖の長さが異なる混合物を生成し、そのため分子量及びサイズの、分離不可能でないにしても分離困難な分布があらわれる。分子の純度をコントロールできれば、水溶性ポリマーを結合して含み、単分散系である合成タンパク質を形成するのに好都合である。これは、不均一化合物から生成する変動し得る特性を排除でき、最も好ましい特徴を有する化合物だけが合成され、比較的容易に分離されるという点で非常に有益である。
【0062】
或いは、上の式“タンパク質”−Un−s1−B−s2−“ポリマー”−s3−J*は、基s1、s2及びs3が存在してもしなくともよい場合は“タンパク質−Un−B−ポリマー−J*”とあらわすことができる。
【0063】
式“タンパク質”−Un−s1−B−s2−“ポリマー”−s3−J*のより好ましい化合物は、リボソーム特異的タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖を有する、そして上記ポリペプチド鎖が一つ以上のイレギュラーアミノ酸を有するのがより好ましい。ここに使用する用語“イレギュラーアミノ酸”とは、非遺伝子的にコードされる側鎖、非遺伝子的にコードされる主鎖、非遺伝子的にコードされる置換NαまたはαC(O)部分、またはこれらの組み合わせを有するアミノ酸を言う、すなわちリボソームで産生される20の遺伝子的にコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を言う。好ましいイレギュラーアミノ酸の例には、遺伝子的にコードされる官能基以外の特異な官能基を担う側鎖を有するアミノ酸並びに擬似アミノ酸及び種々のアミノ酸誘導体がある。これに関して、本発明は合成生物活性タンパク質の設計および/または構成において広い選択性及びフレキシビリティを可能にする。本発明に使用できるリボソーム非依存性アミノ酸の例には、非制限的に:D−アミノ酸、β−アミノ酸、擬似グルタメート、γ−アミノブチレート、オルニチン、ホモシステイン、N−置換アミノ酸(シモン(R.Simon)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89巻:9367−71ページ;WO91/19735(バートレットら)、米国特許第5,646,285号(Baindur))、α−アミノメチレンオキシ酢酸(アミノ酸−Glyジペプチド イソステア)、及びα−アミノオキシ酸及び、非遺伝子的、非コード化側鎖官能基等を有するその他のアミノ酸誘導体等がある。チオアミド、ビニロギーな(vinylogous)アミド、ヒドラジノ、メチレンオキシ、チオメチレン、ホスホンアミド類、オキシアミド、ヒドロキシエチレン、還元アミド及び置換、還元アミド イソステア類及びβ−スルホンアミド(類)を含むペプチド同族体が使用できる。“擬似アミノ酸”は、遺伝子的にコードされたアミノ酸と同じ主鎖構造及び側鎖基を有するが、側鎖原子類の原子組成が異なるアミノ酸を意味する。
【0064】
好ましい実施の形態において、ポリペプチド鎖のイレギュラーアミノ酸に付加した水溶性ポリマーを有する合成生物活性タンパク質が提供される。水溶性ポリマーをそこに結合させるために最も好ましいイレギュラーアミノ酸は、遺伝子的にコードされた官能基の存在のもとで、それらと反応することなく利用できる化学選択的結合作用を行うものである。
【0065】
もう一つの実施形態において、本発明はリボソーム特異的糖タンパク質のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド鎖を含む合成生物活性タンパク質に向けられる;この際上記ポリペプチド鎖はそこに付加した一つ以上の水溶性ポリマーを有し、それは25kDaより大きいモノマー分子量を有するのが好ましい。これはリボソーム特異的糖タンパク質と関連する生物活性とそっくりな生物活性を有する合成生物活性タンパク質を含む。ここに使用する“糖タンパク質”は、糖残基を介して上記タンパク質のアミノ酸側鎖に共有結合した炭水化物鎖を含むタンパク質を言う。これはグリコシル化タンパク質と呼ばれることもある。糖タンパク質の炭水化物は単糖、二糖(類)、オリゴ糖(類)、多糖(類)またはそれらの誘導体(例えばスルホ−またはホスホ置換)の形でもよい。タンパク質に付加した炭水化物を一つより多く有する糖タンパク質もあり、N−結合及びO−結合グリコシル化を含む糖タンパク質が典型例である。天然または非天然糖タンパク質のグリコシル化生物活性ドメインもある。グリコシル化部位の一つ以上を除去するように突然変異した糖タンパク質、または上記タンパク質をグリコシル化しない細胞(例えば大腸菌)において発現される糖タンパク質がこの定義に包含されることは当然である、なぜならばポリマー修飾のための残基の部位が位置的に同じだからである。
【0066】
本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質の好ましいポリペプチド鎖はリボソーム特異的哺乳動物糖タンパク質、例えばヒト糖タンパク質のアミノ酸配列を含む。より好ましいポリペプチド鎖は、サイトカインであるリボソーム特異的糖タンパク質のアミノ酸配列を含む:その多くのポリペプチド鎖及びそれらの特異的アミノ酸配列及び関連生物学的特性はよく知られている(例えば“サイトカインハンドブック”第3版、トーマス編集、Associated Press、1998;“サイトカイン”、A.Mire−Sluis&R.Thorpe編集、アカデミックプレス、1998;及び“サイトカイン・リファレンス”1巻、リガンド、サイトカイン及びその他のホスト防御メディエータ概論、オッペンハイム(J.J.Oppenheim)及びフェルドマン(M.Feldmann)編集、アカデミックプレス、2001、を参照されたい)。好ましい一実施形態において、リボソーム特異的糖タンパク質は一つ以上のグリコシル化部位を含み、水溶性ポリマーは、合成生物活性タンパク質のポリペプチド鎖に、リボソーム特異的糖タンパク質の一つ以上のグリコシル化部位に対応する一つ以上の部位に結合する。より好ましい実施形態において、水溶性ポリマーはポリペプチド鎖に、専らこのようなグリコシル化部位の一つ以上に対応する一つ以上の部位に結合する。本発明のこの面には、リボソーム特異的糖タンパク質が組換え的に産生された糖タンパク質であるという合成生物活性タンパク質も含まれる。上記組換え的に産生される糖タンパク質は天然糖タンパク質でも非天然糖タンパク質でもよく、後者はさらに一つ以上の非天然グリコシル化部位を含むことができる。“グリコシル化部位”とは、オリゴ糖(炭水化物)鎖と、上記タンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸残基の側鎖との酵素的結合をコードするタンパク質のアミノ酸配列を意味する;典型例はN−結合及びO−結合グリコシル化部位である。このようなグリコシル化部位の一つ以上が除去されるように突然変異した糖タンパク質が“グリコシル化部位”の定義に含まれることは当然である、なぜならばポリマー修飾のための残基の部位が位置的に同じだからである。“天然に発生するグリコシル化部位”とは、天然に見いだされる糖タンパク質のグリコシル化部位を意味する。“非天然的に発生するグリコシル化部位”とはタンパク質に工学的に設計されたグリコシル化部位を意味する。例えば、組換えヒトEPO及びGCSFはこのやり方で設計された(米国特許第5,856,298号及び第5,218,092号を参照されたい)。
【0067】
本発明のこの好ましい実施形態は、一部分は次の知見に基づく:糖タンパク質のポリペプチド鎖を有する合成タンパク質においてその一つ以上のグリコシル化部位が本明細書に記載されるポリマー類等の水溶性ポリマーで修飾される際には、上記水溶性ポリマーを使用して、対応する天然発生性糖タンパク質、付加的グリコシル化部位を含むように工学的に設計された糖タンパク質、またはグリコシル化されるように工学的に設計された非−糖タンパク質のその位置に通常見いだされる炭水化物鎖に起因する生物学的作用の一つ以上を利用することができる。そのような生物学的作用には、耐プロテアーゼ性、免疫原性、受容体特異性、特異的活性、効力及び薬物動態の調節がある。しかし、炭水化物鎖の存在を排除し、その代わりに本発明の好ましい水溶性ポリマーを導入することによって、酵素的分解及びクリアランス(糖鎖のペンダントシアル酸が除去された時等)、不安定性、制限された循環半減期や分布、不十分な取扱い特性等が回避されるという重要な利益が得られる。重要なことに、本発明のこのようなポリマー修飾合成生物活性タンパク質が、修飾されない対応タンパク質に比較して生物学的活性の喪失を実質的には起こさずに生物活性の増強を含めるこのような有益な生物学的特性を保持することが判明した;上記合成タンパク質のモノマー分子量が25kDaより大きい場合でさえ、生物活性は増加した。
【0068】
このため、もう一つの好ましい実施形態において本発明は、リボソーム特異的糖タンパク質のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド鎖を含む合成生物活性タンパク質において、上記ポリペプチド鎖がそれに結合した一つ以上の水溶性ポリマーを有し、25kDaより大きいモノマー分子量を有し、上記合成生物活性タンパク質が、前記水溶性ポリマーを含まないポリペプチド鎖を有する対応する合成生物活性タンパク質に同等かまたはより良い生物活性を含む、上記合成生物活性タンパク質に向けられる。上記生物活性はin vivo、in vitroまたはその両方である。好ましい実施形態において、上記生物活性はin vitroにおいてである。もう一つの好ましい実施形態において、本発明は、リボソーム特異的糖タンパク質のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド鎖を含む合成生物活性タンパク質に向けられ、その際上記ポリペプチド鎖はこれに付加した一つ以上の水溶性ポリマーを有し、25kDaより大きいモノマー分子量を有する、そして上記合成生物活性タンパク質はリボソーム特異的糖タンパク質に同等かまたはより良い生物活性を含んでなる。ここでも、上記生物活性はin vitro、in vivoまたはその両方でよい。好ましい実施形態においては上記生物活性はin vivoである。最も好ましくは、このようなポリマー修飾合成生物活性タンパク質はこれに付加した整数の水溶性ポリマーを含む。
【0069】
タンパク質の非天然発生性グリコシル化部位を標的とする利点は、天然に見いだされるタンパク質が、天然糖タンパク質であろうとなかろうと組換えDNA法(部位特異的突然変異または直接進化)によって、一つ以上の部位または領域−−例えば免疫原性またはプロテアーゼ感受性の原因となり得る保護されていない異常領域または表面露出領域等−−にグリコシル化部位を含むように改変できることである。例えば、非天然発生グリコシル化部位は標的ポリペプチド配列の潜在的免疫原性またはプロテアーゼ感受性部位に設計され、産生のための組換え系(例えばCHO細胞及び酵母細胞発現系等)でスクリーニングされ、該当する所望生物活性のアッセイが行われる。それからグリコシル化しやすいことが判明した新しい部位を利用して、一つ以上の位置に排他的に結合した水溶性ポリマーを有する本発明の合成生物活性タンパク質を設計、合成する。
【0070】
もう一つの実施形態において、本発明は、タンパク質のライゲーション部位に擬似アミノ酸を含み、任意に上記水溶性ポリマーを結合して含む合成生物活性タンパク質に向けられる。これらの化合物は、システイン等の化学選択的反応性官能基を含むN−末端アミノ酸を有する第一のペプチドまたはポリペプチドをα−カルボキシチオエステル等の化学的ライゲーションに適するC−末端官能基を有する第二のペプチドまたはポリペプチドに結合することによって、ライゲーション部位に未保護側鎖官能基を有するライゲーション産物を形成し、上記ライゲーション部位の未保護側鎖官能基を擬似アミノ酸に化学的に変換する(例えばシステイン チオール側鎖のカルボキシメチル化を行い、擬似グルタメートアミノ酸を形成する等)という方法で作られる。天然型化学的ライゲーション部位におけるシステインの変換によって形成される擬似アミノ酸はここでは“擬似天然型化学的ライゲーション”と呼ばれる。これは以後詳細に説明される。
【0071】
また、上記タンパク質のライゲーション部位のアミノ酸の側鎖に付加した水溶性ポリマーを含む合成生物活性タンパク質も提供される。これらの化合物は、システインのように化学選択的反応性官能基を含むN−末端アミノ酸を有する第一のペプチドまたはポリペプチドをα−カルボキシチオエステルのようなライゲーションに適するC−末端官能基を有する第二のペプチドまたはポリペプチドに結合することによって未保護側鎖官能基を有するライゲーション生成物を形成し、ライゲーション部位の上記未保護側鎖官能基に水溶性ポリマーを付加するという方法で合成される。
【0072】
本発明の擬似アミノ酸化学的ライゲーション及び化学的ライゲーション部位ポリマー修飾法を使用すると、先行技術に比べて幾つかの利点が得られる;例えばこの方法以外では適切なライゲーション部位を持もてないような合成生物活性タンパク質の確実な合成、部位特異的ポリマー修飾が日常的及び費用効果的に実施できる上記部位(及び結合化学)の拡大、並びに実質的分子量を有する合成生物活性タンパク質の合成等。これらは、高処理量を連続的に扱い、水溶性ポリマー結合のための個々のまたは複数の部位の走査等、所望の生特性を微調整するのに特に適する。
【0073】
上記のように、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質の生物学的特性は、ポリマー付加の部位及び結合化学を正確に調節すると共に上記水溶性ポリマーの分子量、ポリマー組成、構造(例えば直鎖 対 枝分かれ、またはそれらの混合物)、及びペンダント基(例えば帯電 対 非帯電、またはそれらの混合物)を正確に調節することによって、改良できる。特に、タンパク質の分子量を高めて半減期や枝分かれ等を改善するのに加えて、そこに付加する水溶性ポリマーは、その合成タンパク質に、上記合成生物活性タンパク質のアミノ酸配列の基礎となる対応する生物学的に産生されたタンパク質の電荷にほぼ等しい正確な電荷(等電点測定による)を提供することができる。これは、対応するリボソーム特異的タンパク質の天然電荷とそっくり似せるという利点を有する。こうして本発明の好ましい実施形態は、上記の特徴、並びにそのために使用される水溶性ポリマー、特に、あらかじめ選択した位置に付加することができる構造的に確立されたポリマー付加物を組合わせて有する合成生物活性タンパク質に向けられる。
【0074】
やはり上記のように、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質は約25kDaより大きい実質的総分子量を有することができる。本発明の目的では、分子量のこのような測定は変性SDSポリアクリルアミド電気泳動法によって行われる。用語“モノマー分子量”とは、タンパク質またはポリペプチドの複数のコピーをもつ合成タンパク質とは区別されるモノマー合成タンパク質の分子量を指すものとする。用語“モノマー ポリペプチド分子量”はモノマーポリペプチドの分子量を指し、付加したポリマーおよび/またはタンパク質またはポリペプチドの複数のコピーをもつ合成タンパク質とは区別される。
【0075】
ここに使用するように、(タンパク質の)アミノ酸残基の若干、最も好ましくは全てを重合するために非組換え技術を使用した場合、タンパク質は“合成物”であると言われる。用語“非組換え技術”とは、有機化学及びその他の合成重合アプローチを含む技術と、in vivoまたはin vitroにおけるRNAのタンパク質への翻訳を含む技術とを区別するためのものである。合成タンパク質は完全合成タンパク質及び半合成タンパク質を含む。完全合成タンパク質は、全てのライゲーション成分が人の手で化学合成によって産生される、すなわちリボソームなしの合成によって産生される。半合成タンパク質は、ライゲーション成分の少なくとも一部分が生物学的合成、すなわち細胞中でリボソームにより、または無細胞−翻訳系で作られ、その他の部分が化学的合成で作られる。
【0076】
ここに使用される、合成タンパク質が“生物活性である”と言われるのは、上記タンパク質が認識可能の生物活性を有し、その生物活性が上記合成タンパク質の構造またはアミノ酸配列に依存して変化し、そのような構造または配列の変化が上記タンパク質の生物活性を高め、変化させ、または低下させる場合である。このような“生物活性”は、非制限的に、上記タンパク質が触媒的、シグナル化または誘導反応を仲介する能力を含む。ここに使用されるタンパク質は、それ自体は消費されず、永久的には改質されることなく、基質を産物に変換することによって“触媒反応を仲介する”と言われる。もしも或るタンパク質の存在が、生体またはその組織または細胞の遺伝子発現、細胞分化、または細胞増殖を開始、継続、増加、変更または減弱させるならば、そのタンパク質は“シグナル化または誘導性反応を仲介する”と言われる。このようなシグナル化または誘導性反応の例としては、サイトカイン発現の誘導またはサイトカイン発現に対する応答、赤血球産生の誘導、炎症および/または炎症プロセスの誘導または鎮静、血管形成または血管化の開始、アポトーシスの誘導、細胞サイクルへの影響等がある。
【0077】
よって、本明細書において使用する“ポリマー修飾合成生物活性タンパク質”は、一つ以上の水溶性ポリマーを付加して有する合成生物活性タンパク質を言う。本発明の合成生物活性タンパク質の生物活性は、そのタンパク質が受容体、リガンドまたは抗体に特異的に結合する能力も含む。ここに使用する用語“特異的”結合は、構造に基づく結合相互作用、例えばホルモンとその受容体、または抗体と抗原エピトープ等であって、電荷、溶解度、疎水性等に基づく“非特異的”結合とは区別されるものとする。
【0078】
本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質は、哺乳動物(ヒト、サル、ウシ、ネズミ、ブタ、ヒツジ、ウマ等)、鳥類、または魚類タンパク質と関連する生物活性を模する生物活性をもつように設計される。ここに使用されるように、もしも第一タンパク質が、第二タンパク質の生物活性に対して改変された、または増加または減少した生物活性を有するならば、第一タンパク質は第二タンパク質を模すると言われる。もしも生物活性の存在がタンパク質のアミノ酸配列に直接または間接に依存するならば、生物活性はそのタンパク質と“関係がある(associated)”と言われる。また別の実施形態において、本発明の生物活性タンパク質は、対応する天然生物活性対応物に比較することなく、全体または部分的に設計(engineered)してもよい。
【0079】
本発明の好ましい合成生物活性タンパク質には、受容体以外のポリマー修飾タンパク質、及びポリマー修飾−可溶性受容体ドメインがある。例えば、ポリマー修飾−可溶性受容体ドメインを含む合成生物活性タンパク質が特に好ましい。ポリマー修飾のために好ましい可溶性受容体ドメインの例はPCT/US00/06297に記載されており、副腎皮質刺激ホルモン受容体及びその生物活性フラグメント、アンギオテンシン受容体、心房性ナトリウム利尿受容体、ブラジキニン受容体、成長ホルモン受容体、走化性受容体、ダイノルフィン受容体、エンドルフィン受容体、β−リポトロピンのための受容体及びその生物活性フラグメント、エンケファリン受容体、酵素阻害剤受容体、フィブロネクチンの受容体及びその生物活性フラグメント、胃腸−及び成長ホルモン放出ペプチド受容体、黄体ホルモン放出ペプチド受容体、メラノサイト刺激ホルモン、ニューロテンシン受容体、オピオイド受容体、オキシトシン受容体、バソプレッシン受容体、バソトシン受容体、副甲状腺ホルモン受容体及びそのフラグメント、タンパク質キナーゼ受容体、ソマトスタチン受容体、サブスタンスP受容体の可溶性ドメインがある。
【0080】
ポリマー修飾合成サイトカイン類は本発明の特に好ましい実施形態である。特に、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質には、合成ケモカイン等の合成サイトカイン類がある。これらは細胞−細胞相互の作用や連絡に対する、そして生物学的設定におけるその他の細胞の挙動に対する特異的効果を仲介する。ここに使用される用語“サイトカイン”はインターロイキン(“IL”)(例えばIL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−14等)、リンホカイン類及び、赤血球産生刺激タンパク質(例:エリスロポエチン(EPO)、トロンボポイエチン(TPO))、腫瘍壊死因子(TNF)、インターフェロン、等、トランスフォーミング増殖因子、神経増殖因子、脳由来増殖因子、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、肝細胞増殖因子、T−細胞増殖因子(TGF、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、等)、コロニー刺激因子(G−CSF、GM−CSF、M−CSF等)、上皮成長因子(EGF、LIF、KGF、OSM、PDGF、IGF−I、等)、線維芽細胞成長因子(αFGF、βFGF等)、等の増殖因子、およびホルモン類、特に成長ホルモン等のシグナルペプチドホルモン類、及びケモカイン類を含むものとする。ここに使用する用語“ケモカイン”は、6Ckine、9E3、ATAC、ABCD−1、ACT−2、ALP、AMAC−1、AMCF−1、AMCF−2、AIF、ANAP、Angie、ベータ−R1、ベータ−トロンボグロブリン、BCA−1、BLC、blr−1リガンド、BRAK、C10、CCF18、Ck−ベータ−6、Ck−ベータ−8、Ck−ベータ−8−1、Ck−ベータ−10、Ck−ベータ−11、cCAF、CEF−4、CINC、C7、CKA−3、CRG−2、CRG−10、CTAP−3、DC−CK1、ELC、エオタキシン、エオタキシン−2、Exodus−1、Exodus−2、ECIP−1、ENA−78、EDNAP、ENAP、FIC、FDNCF、FINAP、フラクタルキン(Fractalkine)、G26、GDCF、GOS−19−1、GOS−19−2、GOS−19−3、GCF、GCP−2、GCP−2−like、GRO1、GRO2、GRO3、GRO−アルファ、GRO−ベータ、GRO−ガンマ、H400、HC−11、HC−14、HC−21、HCC−1、HCC−2、HCC−3、HCC−4、H174、ヘパリン中和タンパク質、Humig、I−309、ILINCK、I−TAC、Ifi10、IL8、IP−9、IP−10、IRH、JE、KC、リンホタクチン、L2G25B、LAG−1、LARC、LCC−1、LD78−アルファ、LD78−ベータ、LD78−ガンマ、LDCF、LEC、Lkn−1、LMC、LAI、LCF、LA−PF4、LDGF、LDNAP、LIF、LIX、LUCT、ラングカイン(Lungkine)、LYNAP、マンチェスターインヒビタ、MARC、MCAF、MCP−1、MCP−2、MCP−3、MCP−4、MCP−5、MDC、MIP−1−アルファ、MIP−1−ベータ、MIP−1−デルタ、MIP−1−ガンマ、MIP−3、MIP−3−アルファ、MIP−3−ベータ、MIP−4、MIP−5、モノタクチン−1、MPIF−1、MPIF−2、MRP−1、MRP−2、M119、MDNAP、MDNCF、巨核球刺激因子、MGSA、Mig、MIP−2、mob−1、MOC、MONAP、NC28、NCC−1、NCC−2、NCC−3、NCC−4 N51、NAF、NAP−1、NAP−2、NAP−3、NAP−4、NAP S、NCF、NCP、ニューロタクチン、オンコスタチンA、P16、P500、PARC、pAT464、pAT744、PBP、PBP−like、PBSF、PF4、PF4−like、PF4−ALT、PF4V1、PLF、PPBP、RANTES、SCM−1−アルファ、SCI、SCY A26、SLC、SMC−CF、ST38、STCP−1、SDF−1−アルファ、SDF−1−ベータ、TARC、TCA−3、TCA−4、TDCF、TECK、TSG−8、TY−5、TCF、TLSF−アルファ、TLSF−ベータ、TPAR−1、及びTSG−1等の走化性サイトカイン類を指すものとする。
【0081】
このようなサイトカイン類、及びそれらのケモカインサブファミリー及びそれらそれぞれのポリペプチド鎖、それらの変種及び関連生物活性はよく知られており、多数のソースから一般に提供される(“サイトカイン・ハンドブック(The Cytokine Handbook)”、第3版、トーマス(A.Thomas)編集、Associated Press、1998;“サイトカイン(Cytokines)”、A.Mire−Sluis&R.Therpe編集、アカデミックプレス、1998;及び“サイトカイン・リファレンス(Cytokine Reference)”1巻、リガンド類、サイトカイン及びその他のホスト防御メディエータ概論、オッペンハイム(J.J.Oppenheim)及びフェルドマン(M.Feldmann)編集、アカデミックプレス、2001、等を参照されたい)。
【0082】
II.本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質の製法
本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質の製法は、次の段階を含むと考察される:設計、ペプチド合成、ペプチドライゲーション、完全長ライゲーション産物を折りたたんでタンパク質を生成、上記タンパク質の生物活性の評価。我々は、ポリマー修飾が一つ以上のペプチド合成、ライゲーション、または、折りたたまれた生成物に関する諸段階で行われ得ることを見いだした。しかし、折りたたみの前にポリマーをペプチドに、またはライゲーション生成物に結合することが好ましい。このやり方で産生され、所望の生物活性を示すタンパク質が選択され、本発明の合成生物活性タンパク質を代表する。
【0083】
特に好ましい実施形態において、本発明の標的合成生物活性ポリマー修飾タンパク質のポリペプチド鎖の重なり合わないアミノ酸配列を含む化学的に結合しているペプチドセグメントを含む本発明の合成生物活性タンパク質の製法が提供される;その際ライゲーションのために使われるペプチドセグメントの一つ以上がユーザーが決定したあらかじめ選択した部位に結合する水溶性ポリマーを有する。ポリマー修飾ポリペプチド鎖はその後折りたたまれ、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質を生成する。
【0084】
本発明の合成生物活性タンパク質のもう一つの好ましい製法は、本発明の合成生物活性ポリマー修飾タンパク質のポリペプチド鎖の重なり合わないアミノ酸配列を含んでなるペプチドセグメントを化学的に結合し、一つ以上の水溶性ポリマーを、アミノ酸の側鎖の一つ以上の化学的ライゲーション部位に結合させることを含んでなる。ポリマー修飾ポリペプチド鎖はその後折りたたまれ、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質が生成する。
【0085】
本発明はポリマー修飾合成生物活性タンパク質の製法に関係し、その製法は(1)合成生物活性タンパク質のポリペプチド鎖の重なり合わないアミノ酸配列を含むペプチド鎖を化学的に結合し、上記合成生物活性タンパク質に相当する完全長ポリペプチド鎖を形成し、その際少なくとも1本のペプチドセグメントは第一の化学選択性官能基を有するイレギュラーアミノ酸を含み、(2)上記ポリペプチド鎖を折りたたみ、(3)上記第一の化学選択性基と特異的に且つ相互に反応する第二の化学選択性基を含む水溶性ポリマーをそこに結合する諸段階を含む。
【0086】
特に、本発明において実施され、実施例で例示されるこれらの種々のプロセスは図によって説明できる。例えば図1A−1Eは、ライゲーションの前か後、またはこれらの組み合わせで、水溶性ポリマー(本明細書で定義されるように、U−B−ポリマー−J*)を部分的にまたは全く保護されていないペプチドセグメント
【化1】
に付加することを含むライゲーションの図式を示す。図1A−1Dにおいて、Yaaは第一のペプチドセグメント上のC−末端アミノ酸をあらわす。上記第一のペプチドセグメントは、Yaaと化学選択的に化学結合できる特異的かつ相互に反応性のN−末端アミノ酸Xaa(例えばアミノ末端システイン)を担う第二のペプチドセグメントに化学的ライゲーションするための特異的化学選択性部分(例えばアルファ−カルボキシル チオエステルを担うアミノ酸)を担う。YaaとXaaとの間の化学選択性反応によりそれらの間に共有結合が形成される(例えばアミド結合)。こうしてYaaとXaaとは化学選択的ライゲーション対合を形成する。Un−は図に示すように、アミノ酸の側鎖上のユーザーが決めた正確な位置に挿入された第二の特異的化学選択的部分を示し、水溶性ポリマーU−B−ポリマー−J*の基U−と相互に反応性である。例えば、Unがケトン基を担うように改変された側鎖である場合、水溶性ポリマーU−ポリマー−J*のU−は、上記ケトンと反応するための化学選択的基、例えばそれらの間にオキシム結合を形成できるアミノオキシ基である。Un−の下付き文字“n”はアミノ酸と化学選択的基Uを担うように設計されたそれらの側鎖との数をあらわす、例えば、2カ所の特異的及びユーザー決定部位がポリマー修飾される場合はn=2であり、それはU2またはUn=2とあらわすことができる。全ての場合に、nは設計によって正確にコントロールされる正の整数である。こうしてUn及びUは、Xaa及びYaaの化学選択的基と適合し、且つ反応しない第二の化学選択性ライゲーション対合をあらわす。図1A及び1Bは起こり得る2種類の反応を示す。最初に描かれた反応において、Un官能価を担うポリペプチド鎖は、第二のポリペプチドに連結し、それからU−B−“ポリマー”J*部分と反応し、ポリマー修飾ポリペプチドを得る。次に描かれた反応では、Un官能価を担うポリペプチド鎖はU−B−“ポリマー”−J*部分と反応し、ポリマー修飾ポリペプチドを生成し、その後第二のポリペプチドに結合してより大きいポリマー修飾ポリペプチドを得る。これらの図の違いは、図1AではXaa残基を担うポリペプチドがポリマー修飾を受けることになり、図1BではYaa残基を担うポリペプチドがポリマー修飾を受けることになることである。図1Cは本発明が、複数のポリペプチド鎖を、それらのライゲーション前か後かどちらかに修飾し、より大きいポリペプチドを形成できることを説明している。図1Dにおいて、PG及びPG’は保護基をあらわす、その際PG’は直交(orthogonal)保護基である、すなわちPG及びPG’は異なる条件のもとで除去可能であり、異なる水溶性ポリマーが同じ化学作用によってUn基に付加している場合、またはUn基がポリマーによる修飾を所望されない側鎖官能基である場合(例えば、水溶性ポリマーのU基が専ら第一アミンまたは側鎖チオールと反応するように設計されている場合に反応性−NH2または−SHを担う側鎖)に有用である。図1Dは、保護基を用いることによって、本発明の方法によって結合するポリペプチドの所望側鎖を保護できることを示す。
【0087】
図1Eは、図1A−1Dによるライゲーション及びポリマー修飾において用いられるペプチド鎖に多様の基が存在する(または存在しない)ことを示す。
【0088】
図2A−2Cは本発明の合成生物活性タンパク質の製法の追加的方法を描く。特に、図2A−2Bはアミノ末端基Xaaのライゲーション部位の側鎖(例えばシステインの側鎖チオール)に水溶性ポリマーU−B−ポリマー−J*を付加することを含むライゲーションの図式である。図2Cは図2A−2Bによるライゲーション及びポリマー修飾に用いられるペプチドセグメントに存在する(存在しないかも知れない)基の多様性を説明する。
【0089】
図3A−3Bは3本以上の重なり合わないペプチドセグメントの化学的ライゲーションを含む多セグメント結合を実施するためのプロセスの追加的図式である。すなわち少なくとも1本のセグメントが最終的完全長ライゲーション生成物に相当する中心セグメントである。このやり方で製造されたペプチドを用いて例えば図1A−1E、図2A−2C、及び図4A−4Cに示されるような別のライゲーション反応に関係するペプチドセグメントを合成できる。概して多セグメントライゲーションでは、中心セグメント(類)が保護されたXaa基または保護されたYaa基を有し、使用するライゲーション化学作用による環化または鎖状化を回避するようになっている。逐次または連続ライゲーションでは、中心セグメントのXaa基は保護され(例えばCys(Acm))、一方Yaa基は保護されない(例えばYaa−COSR、ここでCOSRはアルファ−カルボキシル チオエステル)。ここでYaaは保護されていないXaa基を担う第二のペプチドと自由に反応し、その際上記第二のペプチドには遊離Yaa基はない。ライゲーション後、上記保護基を除去してXaa基が再生され、次のライゲーション反応に使われる。このプロセスを必要に応じて続け、それによって長いポリペプチド鎖が生成する。4本以上のセグメントからなる最終的ライゲーション産物を生成するための集中的(convergent)化学的結合には、Yaa基の保護が特に有用である。例えば、4本のセグメント結合から生成される(すなわちライゲーション反応は3回行われる)タンパク質を標的とするためには、そのタンパク質の一端に相当する2本のセグメントと、そのタンパク質の他端に相当する2本のセグメントとを次々に対置して平行して結合し、最終的結合反応で前記2端を結合する。このような集中的化学的結合スキームは直交(orthogonal)ライゲーション化学を利用することができる。ここで再び、このようなペプチドセグメントに存在し、または存在しないかも知れない基の多様性が図1E、2Cおよび4Cに示される。
【0090】
図4A−4Cは、生成した側鎖チオールの天然型(native)化学的ライゲーション及び化学的改変が本発明の原理によっていかに達成されるかを説明する。特に、図4A−4Bは、ライゲーション部位(1または複数)に生成したシステイン側鎖チオールの天然型化学的ライゲーション及び化学的改変を利用して、チオアルキル化や、チオエーテル結合を含む化学的に改変された側鎖(ψによって示される)の形成によって“疑似アミノ酸”(ψXaaと示される)を形成することを説明する。図示されていないもう一つの実施形態において、側鎖チオールは脱硫反応でアラニンに変換できる(リアング(Liang)ら、J.Am.Chem.Soc.(2001)123巻(4号)、526−533ページ)。両反応で重要な面は、変換または改変が所望でない他の側鎖チオール類が全て、適切な保護基(PG)で保護され、または多セグメントライゲーションの際には直交保護基(PG’)で保護される、その際カルボキシ末端Yaa基を担うセグメントは保護されたアミノ末端Xaa基、すなわちPG−Xaa−ペプチドを含む;これは図4Bに例として提供されている。図4Cは、図1A−1E、図2A−2C、及び図3A−3Bと同様に図4A−4Bによるライゲーション及びポリマー修飾に用いられるペプチドセグメントに存在する、または存在しないかも知れない基の多様性を示す。
【0091】
本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質を設計する際に、標的タンパク質の最初のポリペプチド主鎖のアミノ酸配列は一般的には遺伝子および/またはタンパク質データベースなどのデータベースを含む種々のソースから得るか、または例えば関心とする新規のタンパク質標的のプロテオミック同定によって新たに得る。上に記載したように、このようなデータベースの例には非制限的に、ジーンバンク(ベンソンら、Nucleic Acids Res.(1998)26巻(1号):1−7ページ;米国生物工学情報センター、国内医学ライブラリー、国家保健機構、ベセスダ、MD、USA)TIGRデータベース(ゲノム研究機関、ロックヴィル、MD、USA)、タンパク質データバンク(ブルックヘヴン・ナショナル・ラボラトリー、USA)、及びExPASy及びスイス−プロテイン データベース(スイス生物情報機関、ジュネーブ、スイス)がある。公開された特許データベースもこの目的に使用できる。設計のために使用されるポリペプチド主鎖は標的配列の一部(例えばドメイン)または全部(例えばポリペプチド鎖の完成形)をあらわすことができる。
【0092】
最初のポリペプチド主鎖配列で、与えられた標的合成タンパク質またはその一連の類似体の所望完全長ポリマー修飾ポリペプチド構造が設計される。これは、ポリペプチド主鎖の設計、水溶性ポリマー(類)の構造、及び関心とする与えられた合成タンパク質構成物のためのライゲーション及び水溶性ポリマー付加の戦略を含む。特に、設計の基礎となるポリペプチドアミノ酸配列について、一つ以上のグリコシル化部位の存在、一つ以上の免疫原性部位、または一つ以上のプロテアーゼ感受性部位(すなわちヘリックス構造またはベータ−シート二次構造が実質的にない領域;一般的にはループ及びターン領域)の存在を調べる。その他の部位、例えば凝集部位及びグリコサミノグリカン(GAG)結合部位なども調べることができる。この後者は全てのケモカインに共通である。さらに、多くのタンパク質の三次元構造が知られており、設計を助けるために使用することができる。
【0093】
グリコシル化部位にはN−結合及びO−結合グリコシル化部位があり、これは一般的にはループ及びターンに見いだされる不規則領域にあらわれるのが普通である。免疫原性部位はタンパク質の表面上にあるターンの親水性部位を含む。関心とするプロテアーゼ感受性部位は、プロテアーゼによって認識され、タンパク質の表面、一般的には不規則領域、にあるアミノ酸配列を含む。多くのタンパク質の凝集及びGAG部位、及びそれらを確認するための方法は、特にケモカインではよく知られている(“サイトカイン・ハンドブック(The Cytokine Handbook)”、第3版、トーマス編集、Associated Press、1998;“サイトカイン(Cytokines)”、A.Mire−Sluis&R.Therpe編集、アカデミックプレス、1998;及び“サイトカイン・リファレンス(Cytokine Reference)”1巻、リガンド類、サイトカイン及びその他のホスト防御メディエータ概論、オッペンハイム及びフェルドマン編集、アカデミックプレス、2001、等を参照されたい)
【0094】
例として、或るタンパク質標的の免疫原性またはプロテアーゼ安定性を次のようにして減らしたり除去することができる:すなわち一つ以上のポリマーを免疫原性エピトープまたはプロテアーゼ認識配列に部位特異的に結合し、本発明のプロテアーゼ抵抗性または非免疫原性の水溶性ポリマー修飾生物活性タンパク質を生成する。ポリマー結合に適するその他の部位としては、与えられたタンパク質標的のためのアミノおよび/またはカルボキシ末端がある。
【0095】
グリコシル化部位(天然の部位も、それらを含むように改変された部位も含めて)は、水溶性ポリマーが結合するのに特に適した部位である。これは、本発明の次のような知見に基づく;すなわち合成生物活性タンパク質において、このような部位(グリコシル化部位)の一つ以上を専ら水溶性ポリマーで修飾し、その位置の天然発生性糖タンパク質の1つ以上の炭水化物鎖の有益な生物学的効果にとって代わり、且つ上記効果とそっくりな効果を有する合成生物活性タンパク質を生成することができる。
【0096】
このような水溶性ポリマーの付加部位はモデリングおよび/または生物学的または化学的分析アプローチによって決定することができる。モデリングは、生物情報的アプローチ、例えば相同性モデリング ソフトウェア アルゴリズムまたは、標的タンパク質の所与の核酸またはアミノ酸配列の全体までを比較するプログラム、関心とするポリペプチドの二次元構造情報、及び関心とするタンパク質の三次元構造情報、またはこれらの組み合わせを含む。かなり多数のソフトウェアプログラム及びデータベースが知られており、この目的に使用できる。(ジーンバンク(ベンソンら、Nucleic Acids Res.(1998)26巻(1号):1−7ページ;米国生物工学情報センター、国内医学ライブラリー、国家保健機構、ベセスダ、MD、USA)TIGRデータベース(ゲノム研究機関、ロックヴィル、MD、USA)タンパク質データバンク(ブルックヘヴン・ナショナル・ラボラトリー、USA)、及びExPASy及びスイス−プロテイン データベース(スイス生物情報機関、ジュネーブ、スイス)等を参照されたい)。これらの方法を統合するソフトウェアプログラムの例は“MAXVECTOR”(オックスフォード・モレキュラー・グループ)であり、これは二次構造(チョウ−ファスマン及びロブソンーガルニエル法);親水性(ホップ−ウッズ、カイト−ドゥーリトル、ゴルドマン−エンゲルマン−ステイツ(GES)、及びホン−ヘイジュン法);疎水性(ハウチャー(Fauchere)−プリスカ、ジャニン、マナヴァラン、スィートアイゼンバーグ法);抗原性(ホップ−ウッズ、パーカー、プロトゥルージョン−インデックス(ソーントン)、ウェリング法);表面確率(カルプラス&シュルツ法);フレキシビリティ(ジャニン及びエミニ法);両親媒性(アイゼンバーグ法);PROSITE基礎−サブシーケンス データベース及びユーザー決定サブシーケンス;及びプロテアーゼ部位及びタンパク質分解性消化予測を含む。
【0097】
例えば、或るタンパク質標的の一カ所以上のグリコシル化部位の存在を走査する際に、固有のアミノ酸配列の一部または全てについてN−結合グリコシル化部位(普通はループまたはターンのAsn−Xaa−ThrまたはAsn−Xaa−Ser配列に起こる)及びO−結合部位(普通はループまたはターンのSer−Xaa−Xaa−ProまたはThr−Xaa−Xaa−Pro配列に起こる)を調査研究するのが一般的である。種々のアルゴリズム及びモデリングプログラムがこの目的に適する(例えばExPASy及びスイス−プロテイン データベース(スイス生物情報機関、ジュネーブ、スイス);グプタ(Gupta)ら、糖生物学(Glycobiology)(1999)9巻(10号):1009−1022ページ;“DICTYOGLYC”、ハンセンら、生化学ジャーナル(1995)308巻:801−813ページ;“O−GLYCBASE”ハンセンら、Nucleic Acids Research(1997)25巻:278−282ページ;“NETOGLYX”ハンセンら、糖結合物雑誌(Glycoconjugate J.)(1998)15巻:115−130ページを参照されたい)。
【0098】
タンパク質の免疫原性部位を予測するために下記のアプローチを使用できる。二次構造予測を上記タンパク質配列で行う。チョウ−ファスマン パラメータがこの目的のために特に有用である(チョウら、最新酵素学(Advanced Enzymology)(1978)47巻:45−148ページ;マクリン(Maclin)ら、“知識基礎神経網目構造に関する精細アルゴリズム:タンパク質折りたたみに関するチョウ−ファスマン−アルゴリズムの改良”、論文91−2ページ、ウィスコンシン大学コンピューター科学部、マジソン、1991;及びキアン(Qian)ら、J.Mol.Biol.(1988)202巻:865−884ページ;“PEPEPLOT”プログラム、Genetics Computer Group社)。不規則領域及び特にターンが確認される。上記タンパク質配列の疎水性も、一般的には標準法(例えばファウチャー−プリスクまたはホップ−ウッズ疎水性推定法またはBull−Breese)にしたがって6残基のランニング平均値を用いて走査された。より親水性の領域は、特にターンにあるものを注意して確認する。これと関連して、N−結合部位及びO−結合部位を含むグリコシル化部位が確認される。上記タンパク質の最も親水性の部位は、もしそれがターンにあり、予想ではグリコシル化されていないならば、免疫原性の可能性が高く、したがってポリマー修飾部位として役立つ。同じ基礎的ルールがより親水性の小さい領域に上首尾に適用でき、ポリマー修飾の二次的部位であることが確認される。
【0099】
本発明の合成生物活性タンパク質の作製においてポリマーを結合する特異的部位を確認するために生物学的及び化学的分析を使ってもよい。例えば、本発明の合成生物活性タンパク質の設計及び合成の基礎として使用される分離された糖タンパク質を酵素消化にかけ、例えばHPLCペプチドマッピング及び質量分析等によって分析し、O−及びN−結合グリコシル化部位を実験的に確認することができる。免疫原性部位、またはプロテアーゼ感受性部位を確認するために、そのような領域を含むタンパク質分子の表面上のより高度に不規則な“ループ”領域を、多数の生物学または化学的方法で確認できる。例えば、本発明の合成生物活性タンパク質のデザイン及び合成の基礎として用いられる分離されたタンパク質を、種々のプロテアーゼによる制限されたタンパク質分解性消化にかけ、その後生成したペプチドフラグメントの質量分析を行い、標準的プロトコルにしたがってプロテアーゼの作用を最も受けやすい部位の地図を作成することができる(コリガン(Coligan JE)、ドュン(Dunn BM)、プロー(Ploegh HL)、スパイヘル(Speicher DW)、ウィングフィールド(Wingfield PT)編集、タンパク質構造の近代的実験計画(Current Protocols in Protein Structure)II巻、ニューヨーク:ジョンウィリー&ソンズ、1997;チャイト(Chait,BT)、構造(Structure)(1994)2巻:465−467ページ;クリワキら、J.Chromatogr A(1997)777巻:23−30ページ;ヒレンカンプ(Hillenkamp)ら、Anal Chem.(1991)63巻:A1193−1201ページ;フェン(Fenn)ら、Mass Spectr Rev(1990)9巻:37−70ページ;及びシウザク(Siuzdak G.)生体工学のための質量分析、サンジエゴ、アカデミック・プレス、1996、等を参照されたい)。このような目的のために多くのプロテアーゼが一般的に使用されている(Konigsberg WH、Method Enzymol(1995)262巻:331−346ページ;キャリー(Carrey,EA):クレイトン(Creighton)編集。“タンパク質構造、実際的アプローチ”ニューヨーク:IRLプレス(1989)117−144ページ;及びコリガン、ドュン、プロー、スパイヘル、ウィングフィールド編集、タンパク質構造の近代的実験計画、II巻、ニューヨーク:ジョンウィリー&ソンズ、1997)。折りたたまれたタンパク質のポリペプチド鎖の表面ループ領域は通常、タンパク質分解性消化の受けやすさの増加と関連している。限定的“ランダム”化学的改変後、消化し、質量分析によりペプチドマッピングを行うという類似のアプローチを用いて未知三次元構造のタンパク質の露出表面領域を確認することもできる。
【0100】
免疫原性部位、プロテアーゼ感受性部位またはその他のポリマー修飾に適した部位を確認するために、アラニン走査を行って、水溶性ポリマー結合部位として適するポリペプチド主鎖の特異的残基を確認することもできる。これは生物学的活性のために必要な不変残基を確認するために特に有用であり、水溶性ポリマーの結合部位が標的分子の免疫原性またはプロテアーゼ感受性部位に位置する際に特に役立つ。アラニン走査は、上記のようなその他のタンパク質分析ツールと組み合わせて用いたときに特に有用である。その他のアプローチは、各分子のポリペプチド鎖における異なる部位に、修飾する水溶性ポリマー部分を有する関心とする合成タンパク質のライブラリーを系統的に作成することである。ライブラリーのポリマー修飾ポリペプチド鎖を折りたたんだ後、官能基の選択/アッセイを行い、例えば折りたたまれた分子を折りたたまれない分子から、または受容体結合分子を非結合分子から分離することができる。その後、ポリマー修飾部位の位置を上記官能性分子で決定できる。このようなアプローチは、ポリマー修飾の非妨害部位の確認を容易にする“タンパク質シグナチャー分析”法の原理を利用することができる。(Muirら、化学&生物学(1996)3巻:817−825ページ)。
【0101】
設計と関連して、ポリペプチド主鎖を合成するために使用するペプチドまたはポリペプチドセグメントを構成する。これは種々のポリペプチド主鎖セグメントを組立てるために選択されるライゲーションの化学、与えられた標的タンパク質のために選択されるポリマー結合化学、及び特定のポリマー結合部位に基づいて選択される適切なライゲーション部位の選択を含む。天然型化学的ライゲーションを行う際には、システインライゲーション部位は、標的ポリペプチド主鎖アミノ酸配列を走査して適切な天然発生システイン残基を探すというやり方で決定できる。この明細書に記載される“拡張天然型化学的ライゲーション”を用いる際には、標的ポリペプチド主鎖アミノ酸配列を走査して、Xaa−Glyのような強力な結合を可能とする適切な天然発生性ライゲーション部位連結を探し出すことによって、ライゲーション部位を選択できる。拡張天然型化学的ライゲーションはシステイン残基におけるライゲーションには限らないから、かなり多数の残基がライゲーション部位連結部として役立つ。若干の例では、天然型及び拡張天然型化学的結合の組合わせが設計の一部分となり得る。
【0102】
好ましい実施形態において、天然型化学的結合を用いて完全長ポリペプチド鎖の一部または全てを形成する。合成生物活性タンパク質の基礎となる天然発生性タンパク質に存在するシステインは化学的結合部位として使用できる。しかし、好ましいライゲーション連結部に適切なシステインがない場合は、その場所の非システイン−アミノ酸をシステインで置換し、その部位で天然型化学的結合が行われるようにすることができる。所望ならば、新たに導入したシステインを、ここに記載するようにその部位のオリジナルアミノ酸に対応する擬似アミノ酸に変換できる。或いは、上記システインがポリマー修飾のための部位に挿入されたとき、修飾が望まれない標的ポリペプチド中の他の全てのシステインが保護されている限り、上記システインの側鎖チオールは、チオール反応性水溶性ポリマー構成物の結合のために利用できる。
【0103】
また別の好ましい実施形態において、ここに記載される拡張天然型化学的結合を利用して、完全長ポリペプチドの一部または全てを生成することができる。この方法では、N−末端Nα−置換された2または3炭素鎖アルキルまたはアリールチオールアミノ酸を使用できる。このような残基(ライゲーションのために使用したペプチドまたはポリペプチドのN−末端に存在する)を好都合に使用して、ここに記載の拡張天然型化学的ライゲーション法により、そのポリペプチドをC−末端α−カルボキシチオエステル部分を有するポリペプチドに結合することができる。
【0104】
一般的にはペプチドは、標準自動ペプチド合成器を用いる段階的標準的Bocおよび/またはFmoc固相ペプチド合成法で、または標準的プロトコルにしたがって手作業で合成され、または商業的売り手に注文し、そこから購入することができる。(“合成ペプチド、ユーザーのためのガイド”グラント(G.A.Grant)編 W.H.フリーマン&カンパニー、ニューヨーク、NY,1992;“ペプチド合成の原理、第2版”、M.ボダンスキー&A.ボダンスキー編集、スプリンガー出版、1993;及び“保護基”、コシエンスキー(P.J.Kocienszky)編集、ジョージ・シーム出版、シュトゥットガルト、ドイツ、1994;“Fmoc固相ペプチド合成、実際的アプローチ”チャン(W.C.Chan)及びホワイト(P.D.White)、オックスフォード大学出版、2000)。チオエステル依存性ライゲーション、例えば天然型化学的ライゲーション等、に利用されるペプチドに関して言えば、それらは標準的プロトコルによって作ることもできる。(ドーソンら、Science(1994)266巻:776−779ページ;カン(Canne)ら、Tetrahedron Lett.(1995)36巻:1217−1220ページ;ケントら、WO96/34878;ケントら、WO98/28434;インゲニト(Ingenito)ら、JACS(1999)49巻:11369−11374ページ;ハッケングら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96巻:10068−10073ページ;アミアト(Amiato)ら、同上、等を参照されたい)。
【0105】
水溶性ポリマー類のライゲーション及び部位特異的結合のためには、化学的直交戦略がペプチド合成に利用され(図1−4及び実施例参照)、不都合な結合を起こす副反応を回避する。例えば、ライゲーションデザイン及びポリマー結合法によって、種々の直交合成法が実施できる。特に、結合すべき水溶性ポリマーの性質、そして特に、それをポリペプチドに連結する官能基が、例えば本発明の好ましいグリコミメティックポリマーに関して以下に述べるように考慮される。
【0106】
詳細に述べれば、上記水溶性ポリマーは、ライゲーションのために使われる標的ペプチド、完全長物質、または折りたたまれたポリペプチドにある特異的官能基と選択的に反応する特異的官能基Uを含むように作られる。化学合成を用いる際には上記ペプチドはユーザーが決めた正確な部位に相互に反応する化学選択的基を含むように作られる。本発明のこの観点は、ペプチド合成(保護基戦略)及び化学的ライゲーション(部分的保護基または非保護基戦略)の原理を具体化する。保護基戦略では、水溶性ポリマー上の所望官能基を除く全ての潜在的反応性官能基、及び標的分子上に存在する相互に反応する官能基を適切な保護基でブロックする。多くの保護基が知られており、この目的に適する(例えば“有機合成における保護基”第3版、グリーン(T.W.Green)及びウッツ(P.G.M.Wuts)編集、ジョンウイリー&ソンズ社、1999;NovaBiochem カタログ2000;“合成ペプチド、ユーザーガイド”グラント編集、フリーマン&カンパニー、ニューヨーク、NY、1992;“組合わせ&固相有機化学の最新化学工学ハンドブック”ベネット、クリステンセン、ハマカー、ピーターソン、ローズ及びサネイ編集、最新化学工学(Advanced Chemtech)1998;“ペプチド合成の原理、第2版”ボダンスキー編集、スプリンガー出版、1993;“ペプチド合成の実際、第2版”ボダンスキー及びボダンスキー編集、スプリンガー出版、1994;及び“保護基”コシエンスキー編集、ジョージ・シーム出版、シュトゥッツガルト、ドイツ、1994を参照されたい)。
【0107】
こうして水溶性ポリマーは上記のもののような広範囲の官能基を担うように作ることができる。部分保護または非保護基戦略では、ポリマー上の官能基及び標的ペプチドまたはポリペプチド上に存在する相互に反応する官能基は化学選択的反応対合を利用する;その際その他の官能基がこの反応系に存在するが、反応はしない。これにはアミン捕獲戦略(例えばヘミアミン形成、イミン形成、及びマイケル付加によるライゲーション)、チオール捕獲戦略(例えばメルカプチド形成、ジスルフィド交換によるライゲーション)、天然型化学的ライゲーション戦略(例えば、システインまたはチオールを巻き込むチオエステル交換によるライゲーションには側鎖アミノ酸誘導体が含まれる)、及び直交ライゲーションカップリング戦略(例えばチアゾリジン形成、チオエステル交換、チオエステル形成、ジスルフィド交換、及びアミド形成によるライゲーション)にしたがう基が含まれる(例えばコルタート(Coltart,D.M.)Tetrahedron(2000)56巻:3449−3491ページ)。
【0108】
この実施形態のために好ましい化学選択的U基は、次のような水相容性ライゲーション化学に用いられる特異的官能基の残基を含む:天然型化学的ライゲーション(ドーソンら、Science(1994)266巻:776−779ページ;ケント、ら、WO98/34878)、拡張一般的化学的ライゲーション(ケントら、WO98/28434)、オキシム形成化学的ライゲーション(ローズら、J.Am.Chem.Soc.(1994)116:30−33ページ)、チオエステル形成ライゲーション(シュネルツァら、Science(1992)256巻:221−225ページ)、チオエーテル形成ライゲーション(エングルブレセン(Englebretsen)ら、Tet.Letts.(1995)36巻(48号):8871−8874ページ)、ヒドラゾン形成ライゲーション(ガートナー(Gaertner)ら、Bioconj.Chem.(1994)5巻(4号):333−338ページ)及びチアゾリジン形成ライゲーション及びオキサゾリジン形成ライゲーション(ツァング(Zhang)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)95巻(16号):9184−9189ページ;タム(Tam)ら、WO95/00846)、またはその他の方法(ヤン(Yan,L.Z.)及びドーソン(Dawson,P.E.)“脱硫を伴う天然型化学的ライゲーションによる、システイン残基を含まぬペプチド及びタンパク質の合成”、J.Am.Chem.Soc.2001、123巻、526−533ページ(参考として本明細書に組みこまれる);ギーゼルナン(Gieselnan)ら、Org.Lett.2001、3巻(9号):1331−1334ページ;サキソン(Saxon,E.)ら、アミノ結合の化学選択的合成のための“トレースレス”シュタウディンガーライゲーション、Org.Lett.2000、2巻、2141−2143ページ)。
【0109】
上記の種々の結合化学において、水溶性ポリマーと、標的ペプチドまたはポリペプチドとの間に形成される結合は、カルボネート、エステル、ウレタン、オルトエステル、アミド、アミン、オキシム、イミド、尿素、チオ尿素、チオエーテル、チオウレタン、チオエステル、エーテル、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキサゾリジン等から選択される結合の残基を含むことができる。
【0110】
例えば図1−4に示したようなペプチドライゲーション段階は固相または液相ライゲーション戦略を用いることができる。図8は、水溶性ポリマーをライゲーションに使用できるペプチドセグメントに正確に結合して、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質を産生するもう一つの経路である。第一段階は固相ペプチド合成(“SPPS”)(例えばFmocまたはBocSPPS)を用い、その際ポリマー結合の標的となるアミノ酸側鎖は直交保護基で保護される(例えばFmocSPPSを使用する場合はポリマー結合部位を保護するためにBoc基を用い、或いはBocSPPSを使用する場合は、直交保護基としてFmocを使用することができる)。ペプチド合成後、直交保護基は選択的に除去され、残りのペプチドは保護されたままになる。この結果、次の段階である固相ポリマー合成のための単一の結合部位が与えられる。ひとたび直交保護基が除去されると、そのポリマー鎖は中間体として結合する。より好ましくは、上記ポリマー鎖は図6A−6Dに示されるプロセスを使ってポリマー合成の連続ラウンドによって形成される。単一のポリマー結合部位が示されているが、一つより多い結合部位が与えられることもある。
【0111】
上記のように、化学的ライゲーションは第一化学的成分と第二化学的成分との間の選択的共有結合の形成を含む。第一及び第二成分に存在する唯一の相互反応性の官能基を利用してライゲーション反応を化学選択的にすることができる。例えば、ペプチドまたはポリペプチドの化学的ライゲーションは相溶性があり、唯一の相互反応性のC−末端及びN−末端アミノ酸残基を担うペプチドまたはポリペプチドセグメントの化学選択的反応を含む。この目的のために数種の異なる化学が用いられている:その例としては天然型化学的ライゲーション(ドーソンら、Science(1994)266巻:776−779ページ;ケントらWO96/34878;ケントら、WO98/28434)、オキシム形成化学的ライゲーション(ローズら、J.Am.Chem.Soc.(1994)116巻:30−34ページ)、チオエステル形成ライゲーション(シュネルツァーら、Science(1992)256巻:221−225ページ)、チオエーテル形成ライゲーション(エングルブレセンら、Tet.Letts.(1995)36巻(48号):8871−8874ページ)、ヒドラゾン形成ライゲーション(ガートナーら、Bioconj.Chem.(1994)5巻(4号):333−338ページ)及びチアゾリジン形成ライゲーション及びオキサゾリジン形成ライゲーション(ツァングら、Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)95巻(16号):9184−9189ページ;タム(Tam)ら、WO95/00846;米国特許第5,589,356号);ギーゼルマンら、セレノシステイン依存性天然型化学的ライゲーション(Org.Lett.(2001)3巻(9号):1331−1334ページ);及びシュタウジンガー アミド形成化学的ライゲーション(サキソン(Saxon)ら、Org.Lett.(2000)2巻:2141−2143ページ)がある。こうして、このような目的に沿う非保護ペプチドセグメントのライゲーションにはあらゆる化学選択的反応化学が適用できることが理解される。
【0112】
与えられたライゲーション化学のための反応条件は、ライゲーションのために使用されるペプチドまたはポリペプチドセグメント類の所望の相互作用を維持するように選択される。例えばpH及び温度、ライゲーション標識の水溶性、第一セグメント 対 第二セグメントの比、水分含有量、及び反応混合物の組成を変化させてライゲーションを最適にすることができる。ライゲーションセグメントを種々の程度に可溶性にするための試薬類を添加または排除して、所望ライゲーション反応の特異性及び速度をコントロールすることができる、すなわちペプチドまたはポリペプチドセグメントの溶解性を操作することによって反応基の露出または提示をコントロールすることができる。反応条件は、所望化学選択的反応産物を一つ以上の内部および/または外部対照と比較して分析試験することによって容易に決定できる。
【0113】
ライゲーションがN−末端システイン残基を有するポリペプチドの連結を含む場合、天然型化学的ライゲーションの方法を使用するのが好ましい(ドーソンら、Science(1994)266巻:776−779ページ;ケントら、WO96/34878;ケントら、WO98/28434)。この方法はライゲーション部位に天然型アミド結合を形成する確実な方法であることが証明された。天然型化学的ライゲーションは、C−末端α−カルボキシチオエステル部分を有する第一ペプチドまたはポリペプチドセグメントと、N−末端システイン残基を有する第二のペプチドまたはポリペプチドとの間の化学選択的反応を含む。チオール交換反応は最初のチオエステル結合中間体を与える。これは自発的に再配列して、そのライゲーション部位に天然型アミド結合を与え、一方システイン側鎖チオールを再生する。多くの場合、天然タンパク質の配列は、N−末端システイン残基を有するポリペプチドフラグメントが合成され、天然型化学的ライゲーション反応に用いられるように、適切に配置されたシステイン残基を含んでなる。その他の場合にはペプチド合成は、この目的のためにシステイン残基をポリペプチドに導入するように行われる。こうしてその標準形において、天然型化学的ライゲーションは標的ポリペプチド配列中のシステイン残基におけるチオエステル仲介性化学選択的反応を含む;ペプチド結合がライゲーション部位に形成され、Cysの側鎖は天然型に再生される。
【0114】
別法として、本発明のタンパク質は“擬似天然型化学的ライゲーション”または“拡張天然型化学的ライゲーション”の使用によって合成できる。擬似天然型化学的ライゲーションはタンパク質合成に用いられるペプチド中のあらかじめ選択した位置に非天然発生性擬似アミノ酸残基を使用することを含む(例えば図4を参照)。このような擬似アミノ酸の構造は、システインの構造と、合成しようとするタンパク質のこのようにあらかじめ選択された位置に天然に見いだされるアミノ酸の構造の両方を模するものである。このため、擬似天然型化学的ライゲーションは、天然型化学的ライゲーションのライゲーション部位に生成するシステイン側鎖のチオアルキル化に向けられる。好ましい観点は、システインライゲーション部位のチオアルキル化であり、その際少なくとも一つのペプチドが、適切な保護基で保護されたチオール側鎖を有する天然のシステインを含む。
【0115】
本発明の好ましい実施形態において、システイン基のチオール部分は所望の側鎖に改変される、例えばリボソーム特異的アミノ酸、そのようなアミノ酸の類似体、または非リボソーム特異的アミノ酸の側鎖に改変される。ここに使用する用語、リボソーム特異的アミノ酸(ribosonally specified amino acid)は、タンパク質の翻訳プロセスにおいてリボソームによって認識され、リボソームで産生されるタンパク質に組み込まれ得るアミノ酸である。システイン側鎖チオール部分の化学的改変について記述した文献はかなり多く発表されている(“タンパク質科学における最新プロトコル(Current Protocols in Protein Science)”John E.Coliganら編集、ジョンウィリー&ソンズ、NY(2000)、等を参照されたい)。カイザー(Kaiser,E.T.)は、システイン残基の側鎖を、天然発生性アミノ酸側鎖の化学特性を模するように変換することを記述している(カイザーら“酵素活性部位の化学的突然変異”Science、1984年11月2日;226巻(4674):505−11ページ)。さらに、システイン側鎖を利用して標識をペプチドまたはタンパク質に導入することが記載されている。システイン側鎖の改変は、“タンパク質の結合及び架橋の化学(Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking)”、ウォング(S.S.Wong)(1991、CRCプレス);タンパク質の化学的改変(Chemical Modification of Proteins)、Gary E.Meansら(1971、Holden−Day);タンパク質の化学的改変:すぐれた方法及び分析操作(Chemical Modification of Proteins:Selected method and analytical procedures)、グレイザー(Glazer,A.N.)ら(1975、エルスヴィール);タンパク質改変のための化学的試薬(Chemical Reagents for Protein Modification)、RL Lundblad(1991、CRCプレス)で研究されている。タム(Tam)ら(Biopolymers(1998)、46巻:319−327ページ)はnon−cys 天然型化学的ライゲーションのためにホモシステイン(−CH2−CH2−SH)を使用し、その後メチルp−ニトロベンゼンスルホネート(メチル化剤)を使ってチオアルキル化することによってホモシステイン側鎖を天然メチオニン側鎖(−CH2−CH2−S−CH3)に変換することを開示している。本発明も、ホモシステイン類を擬似アミノ酸に、すなわちメチオニン以外のアミノ酸に、変換するために使用できる。しかし、ここに記載されるシステインの変換と同様に、本発明によると、変換したくないシステインを少なくとも一つは含むペプチドでは、ジスルフィド対に含まれる天然システインの破壊を避けるために保護基を使う必要がある。適切な保護基を以下に記載する。
【0116】
擬似天然型化学的ライゲーションの方法は或る種のリボソーム特異的アミノ酸の側鎖(例えばグリシン、アラニン、バリン及びプロリンの側鎖等)を模倣しやすくはしないが、アラニンの側鎖は脱硫反応によって形成することができる(リアング及びドーソン、“脱硫を伴う天然型化学的ライゲーションによる、システイン残基を含まぬペプチド及びタンパク質の合成”、J.Am.Chem.Soc.2001、123巻、526−533ページ;これは参考としてここに組み込まれる)、この方法を使って多くのリボソーム特異的アミノ酸またはコードされていないアミノ酸を模する側鎖を形成することができる。本発明の擬似天然型化学的ライゲーション法により産生されるアミノ酸はチオエーテル結合を含み、ベーター分岐をもたない(すなわちそれら全てはベータ位置にメチル基を含む、すなわちaa−CH2−S−)。このため、ベータ幾何学制約及びそれに付随する制約を受けずに、ペンダント側鎖構造を有するベータ−分岐アミノ酸、イソロイシン及びトレオニン、の擬似アミノ酸変形物(versions)を作ることができる。
【0117】
本発明の方法を用いて、リボソーム特異的アミノ酸と同じ長さ、またはそのような長さより長いかより短い長さのアミノ酸側鎖を形成できることは重要である。側鎖長さをこのように変化させて、三次元コンホメーションを安定化(または不安定化)させ、タンパク質安定性を高めることができる(または上記タンパク質がコンホメーションを変え、それによって天然発生タンパク質が受け取るものとは異なる範囲の物質、インヒビター、受容体、リガンド等を受け取る能力を高めることができる)。例えば、Cys−CH2−SH + Br−CH2−COOHはCys−CH2−S−CH2−COOHを与える(このような“擬似グルタミン酸”は1個の付加的側鎖原子、すなわち−S−基を有する;或いは、もしアスパラギン酸の代わりに使用するならば、それは2個の付加的側鎖原子、すなわち−CH2−S−基を有する)。その他の側鎖は同数の原子を側鎖に有するが、チオエーテル結合(−S−)を含むことが異なる。例えばCys−CH2−SH + Br−CH2−CH2−NH−PGの後にPGを除去するとCys−CH2−S−CH2−CH2−NH2が得られる。生成した構造は側鎖に付加的原子をもたないが、1個の−CH2−基が−S−で置換されている。メチオニンはここではもう一つの例である、Cys−CH2−SH + I−CH2−CH3はCys−CH2−S−CH2−CH3を与える(Met−CH2−CH2−S−CH3の天然メチオニシン構造に対し);こうしてチオエーテルが再配置される。アルギニンでも:Cys−CH2−SH + Br−CH2−NH−CH((−NH2)(=NH2 +))はCys−CH2−S−CH2−NH−CH((−NH2)(=NH2 +))を与える。特に擬似リシンを構成する際には、反応性アミノ基を保護して不都合な副反応を避けるのが好ましい。チオアルキル化反応を行った後に、上記保護基を除去することができる。
【0118】
概して、天然に発生するタンパク質をできるだけそっくり模することが所望である場合、上記タンパク質のそのような位置に通常存在するリボソーム特異的アミノ酸の側鎖の長さと同じ長さの側鎖を有する擬似アミノ酸分子を使うことが最も好ましい;上記リボソーム特異的アミノ酸の側鎖の長さより1原子長い側鎖長さの擬似アミノ酸酸分子を使うことはあまり好ましくなく、上記リボソーム特異的アミノ酸の側鎖より2原子長い側鎖長さをもつ擬似アミノ酸分子を使うことはさらに好ましくない。その上、遺伝子的変化が機能を破壊しそうもない位置または関連タンパク質類にその位置のアミノ酸類が保存されている、というような位置にあるシステイン ライゲーション部位を選択するのが好ましい。このような部位はアラニン走査、相同体モデリング、及びその他の方法によって確認できる。
【0119】
擬似天然型化学的ライゲーションにおいて、天然型化学的ライゲーションと同様に、アミノ末端システイン残基を含むペプチドをカルボキシ末端チオエステルを有するペプチドに結合する。その後システインのチオール側鎖を式Raa−Xであらわされる化合物と反応させる;式中、Xは有効な離脱基であり、Raaはリボソーム特異的アミノ酸または合成アミノ酸の側鎖の末端部分を模する構造をもった基である。
【0120】
重要なのは、擬似天然型化学的ライゲーションの諸反応がシステイン側鎖の天然L−立体配置か、またはD−立体配置かどちらかで行われることである。D−立体配置の使用はそのライゲーション部位にプロテアーゼ抵抗性を与える、そのためタンパク質分解に対する安定性の増加が望まれる場合は好ましい。しかしD−システインを使用するとその部位の主鎖構造は変化する。プロテアーゼ抵抗性に加えて、このような変化は生物活性を変えるために好ましい。しかし、生物活性に与える影響を最小にするためには、D−システインを高フレキシビリティ部位、例えば生成した折りたたまれた分子の表面の、上記分子の無秩序末端に位置する不規則なループのような無秩序領域等に配置することが好ましい。擬似天然型化学的ライゲーションの諸反応を用いて大きい帯電した側鎖(例えばLys、Arg、AspまたはGluの側鎖)を合成分子の表面に配置することが好ましい。
【0121】
適切な有効な離脱基、X、の例としてはハロゲン、特にヨウ素および臭素がある。Raa基の例としてはPO4、COOH、COO、CONH2、グアニジニウム、アミン、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、イミダゾール、アルキル化イミダゾール、インドール、またはアルキル化インドール基がある。
【0122】
使用すべきRaaの選択は、特定の位置に存在することが望まれるアミノ酸側鎖に依存する。例えば、下記のアミノ酸配列を有する所望ポリペプチドまたはタンパク質:
aaNH2−Q−aax−aay−W−aaCOOH
(上記式中、Q及びWは任意の存在または不在の各々付加的アミノ酸残基を示し、aax及びaayは内部隣接残基(それぞれ側鎖x及びyを有する)を示し、aaNH2及びaaCOOHはポリペプチドまたはタンパク質のアミノ(N−)末端残基及びカルボキシ(C−)末端残基をそれぞれ示す)
は次の2つのペプチドフラグメントを調製することによって合成できる:
aaNH2−Q−COSR及びCys−W−aaCOOH
上記式中、Cysはaayをシステインで置換したことをあらわし、Rはチオエステル基と適合するあらゆる基、非制限的にアリール、ベンジル、及びアルキル基等である。Rの例には、3−カルボキシ−4−ニトロフェニル チオエステル類、ベンジルエステル類、及びメルカプトプロピオン酸ロイシンエステル等がある(ドーソンら、Science(1994)266巻:776−779ページ;カン(Canne)ら、Tetrahedron Lett.(1995)36巻:1217−1220ページ;ケントら、WO96/34878;ケントら、WO98/28434;インゲニト(Ingenito)ら、JACS(1999)121巻(49号):11369−11374ページ;ハッケング(Hackeng)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96巻:10068−10073ページ)。その他の例には、ジチオトレイトール、またはアルキルまたはアリールチオエステル類がある;これらはよく知られているインテイン(intein)−仲介性生物学的方法によって合成できる(チョング(Chong)ら、Gene(1997)192巻:277−281ページ);チョングら、Nucleic Acids Res.(1998)26巻:5109−5115ページ;エバンス(Evans)ら、Protein Science(1998)7巻:2256−2264ページ;及びコットン(Cotton)ら、Chemistry&Biology(1999)6巻(9号):247−256ページを参照されたい);その後それらのフラグメントを一緒に連結して、
aaNH2−Q−aax−Cys−W−aaCOOH
を形成する。
【0123】
連結したフラグメントをその後Ry−Xと反応させる、この式中、Ryはy側鎖の構造を模する側鎖基である。上記反応は、システインのチオール基を“擬似−y”側鎖に変換するのに十分な条件下で行われる。例えば、もしもRaaがCH2−COOHまたは(CH2)2−COOHであるように選択されるならば、上記反応はアスパラギン酸(“擬似−Asp”)またはグルタミン酸(“擬似−Glu”)の構造及び機能を模するアミノ酸残基の形成に導く。上記の説明に照らして、2つより多いペプチドフラグメントを使用してより複雑な合成を行えることは理解される。
【0124】
このアプローチの重要な特徴は、反応するセグメントにおいて改変が望まれないシステイン残基は例えばCys(Acm)のように保護された側鎖となり、ライゲーション部位(1カ所または複数)のもの以外のCys残基の化学的改変が回避されること、または反応するセグメントにおけるその他の全てのCysは、ライゲーション後の化学的改変によって同一の“擬似アミノ酸”を同時に形成するようになることである。
【0125】
ここに使用する記号ψはベンジル基をあらわす;IMはイミダゾール基をあらわし、INはインドール基を示し;PGは保護基を示す。本発明による擬似アミノ酸残基を含むペプチドの合成に使用できるRaa側鎖基をまとめる(この場合Xはハロゲン(I、Br、Cl、F;I及びBrが最も好ましく、ψ付加のためにはFが好ましい)):
【0126】
塩基性アミノ酸:
Lys(余分の原子は含まない)
−CH2−SH + X−CH2−CH2−NH−PG、その後保護基の除去により、−CH2−S−CH2−CH2−NH2
を得る。
Arg(余分の原子は含まない)
−CH2−SH + X−CH2−NH−C((NH2)(=NH2 +))は、
−CH2−S−CH2−NH−C((NH2)(=NH2 +))を与える。
His(余分の原子2個)
−CH2−SH + X−CH2−IMは
−CH2−S−CH2−IMを与える。
酸性アミノ酸:
Asp(余分の原子2個)
−CH2−SH + X−CH2−COOHは、
−CH2−S−CH2−COOHを与える。
Glu(余分の原子1個)
−CH2SH + X−CH2−COOHは、
−CH2−S−CH2−COOHを与える。
【0127】
非帯電−極性アミノ酸:
Tyr(余分の原子0または1個)
−CH2−SH + F−ψ−pOHは−CH2−S−ψ−pOH(余分原子0、同じ幾何学的構造)を与える
−CH2−SH + Br/I−CH2−ψ−pOHはCH2−S−CH2−ψ−pOH(余分原子1個)を与える。
Glu(余分原子1個)
−CH2−SH + X−CH2−C(O)(NH2)は、
−CH2−S−CH2−C(O)(NH2)を与える。
Asn(余分原子2個)
−CH2−SH + X−CH2−C(O)(NH2)は、
−CH2−S−CH2−C(O)(NH2)を与える。
Ser(余分原子2または3個)
−CH2−SH + X−CH2OHは、
−CH2−S−CH2OH(余分原子2個)を与える。
−CH2−SH + X−CH2−CH2OHは、
−CH2−S−CH2−CH2OH(余分原子3個)を与える。
Thr(余分原子2または3個、ベータ−分岐はない)
−CH2−SH + X−CH((CH3)(O−PG))、その後PGを除去すると、−CH2−S−CH((CH3)(OH))(余分原子2個)が生成する。
−CH2−SH + X−CH2−CH((CH3)(O−PG))、その後PGを除去すると、−CH2−S−CH2−CH((CH3)(OH))(余分原子3個)が生成する。
【0128】
無極性アミノ酸
Leu(余分原子1または2個)
−CH2−SH + X−CH((CH3)(CH3))は、−CH2−S−CH((CH3)(CH3))(余分原子1個)を与え、
−CH2−SH + X−CH2−CH((CH3)(CH3))は、−CH2−S−CH2−CH((CH3)(CH3))(余分原子1個)を与える。
Ile(余分原子2または3個、ベータ−分岐はない)
−CH2−SH + X−CH(CH3)−CH2−CH3は、−CH2−S−CH(CH3)−CH2−CH3(余分原子2個)を与える。
−CH2−SH + X−CH2−CH(CH3)−CH2−CH3は、−CH2−S−CH2−CH(CH3)−CH2−CH3(余分原子3個)を与える。
Phe(余分原子1または2個)
−CH2−SH + F−ψは、−CH2−S−ψ(余分原子1個)を与える。
−CH2−SH + Br/I−CH2−ψは、−CH2−S−CH2−ψ(余分原子2個)を与える。
Met(余分原子0)
−CH2−SH + I−CH2−CH3は、−CH2−S−CH2−CH3を与える。
Trp(余分原子1個)
−CH2−SH + F−INは、−CH2−S−INを与える。
【0129】
しかし、ライゲーションのために使用するポリペプチドの与えられたN−末端にシステインまたはホモシステイン残基が導入するようにタンパク質配列を改変することが不都合であるか、または好ましくない場合、またはライゲーション部位に擬似アミノ酸を使用する場合には、N−末端がN−置換−、より好ましくはNα置換−2または3炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールを含むように改変されたポリペプチドを使用して天然型化学的ライゲーションの方法を広げ、それによって天然型化学的ライゲーションの原理をシステイン残基のないポリペプチドに適用することができる(米国特許出願第60/231,339号を参照。これは参照により本明細書に組み込まれる)。
【0130】
“拡張天然型化学的ライゲーション”の方法は、カルボキシルチオエステル、より好ましくはα−カルボキシルチオエステルを含む第一成分を酸安定性N−置換、及び好ましくはNα−置換、2または3炭素鎖アミノアルキルまたはαアリール チオールを含む第二成分と結合することを含む。第一成分のカルボキシチオエステルと第二成分のN−置換2または3炭素鎖アルキルまたはアリールチオールとの間の化学選択的反応がチオエステル結合中間体を経て進み、最初のライゲーション産物になる。より詳細に述べれば、COSRチオエステル成分とアミノアルキルチオール成分との間に起こるチオール交換は、チオエステル結合中間体ライゲーション産物を生成し、それは自発的再配列後に、アミノアルキルチオール成分が式Iを有するかまたは式IIを有するかによって、それぞれ5員環または6員環を経てアミド結合第一ライゲーション産物を生成する:
J1−C(O)−N(C1(R1)−C2−SH)−J2 I
J1−C(O)−N(C1(R1)−C2(R2)−C3(R3)−SH−J2 II
上記式中、J1は任意に保護されたアミノ酸側鎖を一つ以上有するペプチドまたはポリペプチド、またはそのようなペプチドまたはポリペプチドの部分、ポリマー、色素、適切に官能化した表面、リンカーまたは検出可能マーカー、またはその他の、化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションに適合する化学的成分である。R1、R2及びR3は独立的にHまたはC1に結合する電子供与基である;この際、R1、R2及びR3の少なくとも一つが、C1に結合する電子供与基を含むことが条件である。J2は任意に保護されたアミノ酸側鎖を一つ以上有するペプチドまたはポリペプチド、またはそのようなペプチドまたはポリペプチドの部分、ポリマー、色素、適切に官能化された表面、リンカーまたは検出可能のマーカー;またはその他の、化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションに適合する化学的成分である。
【0131】
ライゲーション部位のN−置換−2または3炭素鎖アルキルまたはアリールチオール[HS−C2−C1(R1)−]または[HS−(C3(R3)−C2(R2)−C1(R1)−]はペプチド適合性条件下で、生成物にダメージを与えることなく容易に除去され、ライゲーション部位に天然アミド結合を有する式IIIの最終的ライゲーション産物を生成する:
J1−C(O)−HN−J2 III
上記式中、J1、J2、R1、R2及びR3は上に定義せるものである。
【0132】
R1、R2、及びR3基は、ペプチド適合性切断条件下でN−C1結合の切断を容易にするように選択される。例えば、特にC1に結合していれば、電子供与基を使用してC1に共鳴安定化カチオンを形成することができる。それは切断を容易にする。上記化学的ライゲーション反応は好ましくは賦形剤としてチオール触媒を含み、水性または混合有機−水性条件下、ほぼ中性のpH条件で行われる。第一および第二成分の化学的ライゲーションは5または6員環を経て進み、その環は自発的再配列を受けてN−置換アミド結合ライゲーション産物を与える。第一および第二成分がペプチドまたはポリペプチドである場合、N−置換アミド結合ライゲーション産物は式IVまたはVを有する:
J1−C(O)−Nα(C1(R1)−C2−HS)−CH(Z2)−C(O)−J2 IV
J1−C(O)−Nα(C1(R1)−C2(R2)−C3(R3)−HS)−CH(Z2)−C(O)−J2 V
上記式中、J1、J2及びR1、R2、R3及びZ2は上に定義せるものである。
【0133】
N−置換アミド結合ライゲーション産物の結合せる電子供与基R1、R2またはR3は、N−C1結合の切断を容易にし、N−置換アミド結合ライゲーション産物からの2または3炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの除去を容易にする。Nのアルキルまたはアリールチオ鎖をペプチド適合性切断条件下で除去すると、ライゲーション部位に天然アミド結合を有するライゲーション産物を生成する。第一および第二成分がペプチドまたはポリペプチドである場合、ライゲーション産物は次の式を有する:
J1−C(O)−NαH−CH(Z2)−C(O)−J2 X
【0134】
式Iの典型的R1置換基を表Iに示す。
表I
【表1】
【0135】
式IIの典型的R1、R2及びR3置換基を表IIに示す。
表II
【表2】
【0136】
N−置換2炭素鎖化合物の場合のように、ライゲーション後にNα−C1結合を確実に切断するためのC1炭素との電子結合を維持するためには、ベンジル及びピコリル電子供与置換基R1’、R3’及びR5’をオルトまたはパラ位に置くことが必要である。しかし、R2及びR3がC2及びC3と共にベンジル基を形成する場合、R1’及びR3’の少なくとも一つが強力な電子供与基を含み、その際R1’またはR3’は、メトキシ(−OCH3)、チオール(−SH)、ヒドロキシル(−OH)、及びチオメチル(−SCH3)から選択される。R2及びR3が水素であるN−置換3炭素鎖チオールでは、R1はベンジルまたはピコリル基を含み、そこではR1’、R3’及びR5’は強力または中程度の電子供与基、またはその組合わせのいずれかを含む。N−置換2炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの場合、強力な電子供与基が3炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの感度を高めて、ライゲーション後に切り離される。このようにして特定の電子供与基またはその組合わせを選択できる。
【0137】
N−置換2炭素鎖化合物と同様に、本発明のN−置換3炭素鎖化合物は、関心とする構成物における置換のために使用される際、R1’及びR5’の位置におけるR1の置換基としてチオールを含む。ここでも、電子供与チオール基はC1に結合し、これらの位置におけるその導入によって上記化合物は6員環形成ライゲーションのための2つのルートをもつことができる。それはα−カルボキシチオエステルと反応するために使用できるチオール類の局所的濃度を高め、ライゲーションを改善し得る構造的制約に関する別の立体配座(コンホメーション)を提供する。
【0138】
本発明のN−末端N−置換2または3炭素鎖アルキルまたはアリールチオールアミノ酸の合成は、本明細書の例えばスキームI及びスキームIIに記載されるように、当業者に公知の標準的有機化学技術によって行うことができる。例えば“最新有機化学、反応、作用機序及び構造(Advanced Organic Chemistry,Reagent,Mechanisms,and Structure)”第4版、マーチ(J.March)(編集)、ジョンウィリー&ソンズ、ニューヨーク、NY、1992;“包括的有機変換、官能基生成の指針(Comprehensive Organic Transformation,A Guide to Functional Group Preparations)”、ラロック(R.Larock)(編集)、VCH出版、ニューヨーク、NY、1989、を参照されたい。それらは溶液中で、またはポリマー支持合成によって、またはこれらの組合わせによって合成される。好ましいアプローチはNα保護−Nアルキル化S−保護アミノアルキル−またはアリール−チオールアミノ酸前駆体を使用する。合成のために使用される試薬類はかなり多くの商業的ソースから得ることができる。出発原料成分及び種々の中間体、例えば個々のアミノ酸誘導体等、がその後の使用のために保存されたり、キットで提供されることもよく理解されている。
【0139】
本発明のN−末端Nα−置換2または3炭素鎖アルキルまたはアリールチオアミノ酸を形成する際には保護基を使用する方法が使われる。種々の合成法に一般的に用いられる好ましい保護基(PG)は固相ペプチド合成(“SPPS”)に適合するものである。若干の例では異なる条件で除去できる直交保護基を利用することも必要である。多くのそのような保護基が知られており、この目的に適する(例えば“有機合成における保護基”、第3版、グリーン(T.W.Green)及びウッツ(P.G.M.Wuts)編集、ジョンウィリー&ソンズ社、1999;ノバビオケム(NovaBiochem)カタログ2000;“合成ペプチド、ユーザーの指針(Synthetic Peptides,A User’s Guide)”、グラント編集、フリーマン&カンパニー、ニューヨーク、NY、1992;“組合わせ&固相有機化学の最新化学工学ハンドブック”ベネット(W.D.Bennet)、クリステンセン(J.W.Christensen)、ハマカ(L.K.Hamaker)、ピーターソン(M.L.Peterson)、ローズ(M.R.Rhodes)、サニー(H.H.Saneii)編集、最新化学工学(Advanced Chemtech)1998;“ペプチド合成の原理(Principles of Peptide Synthesis)”第2版、M.ボダンスキー編集、スプリンガー出版、1993;“ペプチド合成の実際”第2版、ボダンスキー&ボダンスキー編集、スプリンガー出版、1994;“保護基(Protecting Groups)”、コシェンスキー(P.J.Kocienski)編集、ジョージ・シーム出版、シュッッツガルト、ドイツ、1994)。例としてはベンジルオキシカルボニル(Z)、Boc、Bpos、Trt、Nps、FmocCl−Z、Br−Z;NSC;MSC;Dde等がある。硫黄部分では、適切な保護基の例として、非制限的にベンジル、4−メチルベンジル、4−メトキシベンジル、トリチル、ACM、TACAM、キサンチル、ジスルフィド誘導体、ピコリル、及びフェナンシルがある。
【0140】
より詳細に述べれば、Nα−置換2または3炭素鎖アルキルまたはアリールチオール類はスキームI(Nα−置換前駆体の固相製法)、スキームII(Nα−置換前駆体の液相製法)にしたがって合成できる。スキームIでは、Nα−置換2または3炭素鎖アルキルまたはアリールチオール類は固相で、ポリマー置換有機合成標準法を使って直接組立てることができ、一方、スキームIIのNα−保護、N−アルキル化、S−保護、アミノアルキルまたはアリールチオアミノ酸前駆体は標準カップリングプロトコルを用いて樹脂に結合させる。ラセミまたはジアステレオマー製品が生成する場合、拡張天然型化学的ライゲーションに使用するためにはこれらを標準法によって分離しなければならない。
【0141】
スキームI
ECL補助誘導体化分子の固相合成
【化2】
【0142】
スキームII
【化3】
【0143】
α−カルボキシチオエステルは、実施例を含む本明細書に記載のものなど、当業者に公知の標準法にしたがって、化学的または生物学的方法によって合成できる。化学的合成では、α−カルボキシチオエステル ペプチド類は溶液中で、またはチオエステル生成樹脂から合成できる;これらの方法はよく知られている(例えばドーソンら、Science(1994)266巻:776−779ページ;カンら、Tetrahedron Lett.(1995)36巻:1217−1220;ケントら、WO96/34878;ケントら、WO98/28434;インゲニトら、JACS(1999)49巻:11369−11374ページ;ハッケングら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96巻:10068−10073ページ;アミアトら、同上、等を参照されたい)。例えば化学的に合成されたチオエステル ペプチドを、対応するペプチドα−チオ酸から作ることができ、上記ペプチドα−チオ酸はこれはこれでチオエステル樹脂上で、または溶液中で合成できる。ただし樹脂法がより好ましい。ペプチド−α−チオ酸は対応する3−カルボキシ−4−ニトロフェニル チオエステル、対応するベンジルエステル、または種々のアルキルチオエステルのいずれかに変換できる。これらのチオエステルの全てはライゲーション反応のための満足すべき離脱基となり、3−カルボキシ−4−ニトロフェニル チオエステルは対応するベンジルチオエステルより若干速い反応速度を示し、ベンジルチオエステルはこれはこれでアルキルチオエステルより反応性である。もう一つの例として、トリチル結合メルカプトプロピオン酸ロイシン チオエステル生成樹脂を利用してC−末端チオエステルを構成することができる(ハッケングら、同上)。C−末端チオエステルは、3−カルボキシプロパンスルホンアミド安全捕捉(safety−catch)リンカーを使用し、ジアゾメタンまたはヨードアセトニトリルで活性化後、適切なチオールで置換することによっても合成できる(インゲニトら、同上;ベルトッジら)。
【0144】
C−末端α−カルボキシチオエステル ペプチドはインテイン依存性生物学的方法等の生物学的プロセスを用いて合成することもできる(チョング(Chong)ら、Gene(1997)192巻:277−281ページ;チョングら、Nucleic Acids Res.(1998)26巻:5109−5115ページ;エバンスら、Protein Science(1998)7巻:2256−2264ページ;コットン(Cotton)ら、Chemistry&Biology(1999)6巻(9号):247−256ページを参照されたい)。例えば、インテイン発現系(アフィニティ−タグのような標識のあるもの、またはないもの)を利用して、“インテイン”タンパク質スプライシング要素の誘導性自己分解活性を活用し、C−末端ジチオスレイトール(DTT)エステルペプチドまたはポリペプチドを生成する。特に、インテインはDTT、b−メルカプトエタノールまたはシステイン等のチオールの存在下で特異的自己分解を受け、その結果C−末端チオエステルを担うペプチドセグメントが生成する。チョングら(1997)同上;チョングら(1998)同上;エバンスら、同上;及びコットンら、同上、等を参照されたい。しかし、組換え的に生成されたセグメントを使用する際には、最終的構成物の化学的に合成される部分はポリマー修飾を含むのが普通である。
【0145】
本発明のN−置換2または3炭素鎖アルキルまたはアリールチオール成分と第一のカルボキシチオエステル成分とのライゲーションは、ライゲーション部位にN−置換アミド結合を有するライゲーション産物を生成する。上記反応のライゲーション条件は、上記チオエステルと、N−置換2または3炭素鎖アルキルまたはアリールチオ部分との選択的反応性を保持するように選択される。好ましい実施形態において、ライゲーション反応はpH6−8を有する緩衝液中で行われる。pH範囲6.5−7.5がより好ましい。緩衝溶液は水性、有機性またはそれらの混合物でよい。ライゲーション反応は1種類以上の触媒および/または1種類以上の還元剤、脂質、界面活性剤、その他の変性剤または可溶化試薬等も含むことができる。好ましい触媒の例はチオール及びホスフィン含有部分、例えばチオフェノール、ベンジルメルカプタン、TCEP及びアルキルホスフィン等である。変性剤および/または可溶化剤の例にはグアニジニウム、水または有機溶媒(TFE、HFIP、DMF、NMP等)中の尿素、水と、またはグアニジニウムおよび尿素水溶液と混合したアセトニトリル等がある。ライゲーション反応速度を調節するために温度を利用することもできる。それは普通は5℃ないし55℃であり、より好ましい温度は15℃ないし40℃である。一例として、ライゲーション反応は6Mのグアニジニウム中2%チオフェノールを含むpH6.8ないし7.8の反応系でうまく進む。
【0146】
N−置換2炭素鎖アルキルまたはアリールチオール類では、ライゲーションは、COSRチオエステル成分とアミノアルキルチオール成分との間に起きるチオール交換から始まる。この交換はチオエステル結合中間体ライゲーション産物を生成する、それは5員環中間体を経て再配列した後、ライゲーション部位に除去可能のN−置換2炭素鎖アルキルまたはアリールチオール[HS−C2−C1(R1)−]を有する式J1−HN−CH(Z1)−C(O)−Nα(C1(R1)−C2−SH)CH(Z2)−J2の第一ライゲーション産物を生成する;ここで置換基は上に定義せるものである。ライゲーション部位のN−置換2炭素鎖アルキルまたはアリールチオール[HS−C2−C1(R1)−]はペプチド適合条件下で容易に除去され、ライゲーション部位に天然アミド結合を有する式J1−HN−CH(Z1)−CO−NH−CH(Z2)−CO−J2の最終的ライゲーション産物が生成する。
【0147】
N−置換3炭素鎖アリールまたはアルキルチオールでは、COSRチオエステル成分とアミノアルキルチオール成分との間のチオール交換はチオエステル結合中間体ライゲーション産物を生成し、それは6員環中間体を経て自発的に再配列した後、ライゲーション部位に除去可能のN−置換3炭素鎖アルキルまたはアリールチオール[HS−C3(R3)−C2(R2)−C1(R1)−]を有する式J1−HN−CH(Z1)−C(O)Nα(C1−C2(R2)−C3(R3)−SH)−CH(Z2)−J2の第一ライゲーション産物を生成する。ライゲーション部位のN−置換3炭素鎖アリールチオール[HS−C3(R3)C2(R2)−C1(R1)−]はペプチド適合性条件下で容易に除去され、ライゲーション部位に天然アミド結合を有する式J1−HN−CH(Z1)−CO−NH−CH(Z2)−CO−J2の最終的ライゲーション産物を生成する。
【0148】
N−置換アルキルまたはアリールチオール基の除去は、N−C1結合の切断を容易にするために好ましくは酸性条件において行われ、ライゲーション部位に安定化された未置換のアミド結合を与える。“ペプチド−適合切断条件”とは、ペプチドと適合すし、アルキルまたはアリールチオール部分のライゲーション産物からの切断に適した物理的−化学的条件を意味する。ペプチド適合切断条件は概して、使用するα−置換化合物によって決まり、日常的及び公知のアプローチによって容易に推定される(例えば“有機合成における保護基”第3版、グリーン及びウッツ編集、ジョンウィリー&ソンズ社、1999;ノバビオケム・カタログ2000;“合成ペプチド、ユーザーの指針”、グラント編集、フリーマン&カンパニー、ニューヨーク、NY、1992;“組合わせ&固相有機化学の最新化学工学ハンドブック”、ベネット、クリステンセン、ハマカ、ピーターソン、ローズ、サニー編集、“最新化学工学”1998;“ペプチド合成の原理”第2版、ボダンスキー(M.Bodanszky)編集、スプリンガー出版、1993;“ペプチド合成の実際(The Practice of Peptide Synthesis)”第2版、ボダンスキー&ボダンスキー編集、スプリンガー出版、1994;“保護基”、コシェンスキー編集、ジョージ シーム出版、シュトゥッツガルト、ドイツ、1994、を参照されたい)。
【0149】
例えば、R1、R2またはR3置換基がメトキシ、ヒドロキシル、チオール、またはチオメチル、メチル等を含む場合、除去のためのより普遍的方法には、ペプチド合成化学に典型的な酸性切断条件がある。これには、還元試薬および/または掃去剤系を含む、または含まない強酸性条件または水性酸性条件下におけるN−C1結合の切断がある(例えば、無水フッ化水素(HF)、トリフルオロ酢酸(TFA)、またはトリメチルスルホニルフルオロ酢酸(TMSFA)等の酸類)。より特異的酸性切断系を選択してNα−C1結合を最適に切断して或る与えられた構成物のためにアリールまたはアルキルチオール部分を切り離すことができる。このような条件は公知であり、ペプチドの一体性の維持と矛盾しない。特にトリプトファンがペプチドまたはポリペプチド配列に存在する際には、チオール掃去剤が含まれ、上記トリプトファンの側鎖と、遊離したアリールまたはアルキルチオール部分との反応を回避する。チオール掃去剤の例には、エタンジオール、システイン、ベータ−メルカプトエタノール及びチオクレゾールが含まれる。
【0150】
その他の特殊な切断条件としては、ピコリル基が置換基である場合の、光−または還元性切断条件がある。一例として、R1、またはR2及びR3置換基がピコリル部分を含む場合、標準プロトコルにしたがって光分解(例えば紫外線)、亜鉛/酢酸または電気分解還元を使用して切断することができる。N−置換2炭素鎖チオールのR1がR1にチオメタンを含む場合、水銀またはHF切断を利用することができる。第一または第二ライゲーション成分がその他の保護基を含む場合、上記切断系は固体支持体からの同時切断に、および/または脱保護試薬として利用される。
【0151】
本発明の一実施形態においては、Nα−置換2または3炭素鎖アルキルまたはアリールチオールをペプチド合成段階に使用して(特に自動ペプチド合成及び直交−及びコンバージェント−ライゲーション戦略において)、合成生物活性タンパク質を生成するための拡張化学的ライゲーションの基質として使用できるN−末端で誘導体化されたポリペプチドを適切に得ることができる。このような化合物は、完全に保護され、一部分保護され、または全く保護されていない、酸安定性の、式(PG1)S−C2−C1(R1)−Nα(PG2)−CH(Z2)−C(O)−J2または(PG1)S−C3(R3)−C2(R2)−C1(R1)Nα(PG2)−CH(Z2)−C(O)−J2であらわされるNα−置換2または3炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールを含む。これらは以下の表III及び表IVに示される。特に、R1、R2及びR3の一つ以上がC1に結合した電子供与基を構成し、それは、Nα−置換アミノアルキルまたはアリールチオールがNα−置換アミドアルキルまたはアリールチオールに変換した後、ペプチド適合性切断条件のもとでNα−C1結合を切断しやすくする共鳴安定化カチオンをC1に形成することができる。PG1及びPG2は個々に、または組合わせで存在するか、または存在しない保護基であり、同じでも異なっていてもよい;ここでZ2は化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションと適合するいかなる化学的成分でもよく、J2は化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションと適合するいかなる化学的成分でもよい。PG1(またはX1)はアミンを保護する基である。PG2(またはX2)はチオールを保護する基である。多くのそのような保護基が知られており、この目的に適する(例えば“有機合成における保護基”第3版、グリーン及びウッツ編集、ジョンウィリー&ソンズ社、1999;ノバビオケム・カタログ2000;“合成ペプチド、ユーザーの指針”、グラント編集、フリーマン&カンパニー、ニューヨーク、NY、1992;“組合わせ&固相有機化学の最新化学工学ハンドブック(Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial&Solid Phase Organic Chemistry)”ベネット、クリステンセン、ハマカ、ピーターソン、ローズ、サニー編集、“最新化学工学”1998;“ペプチド合成の原理”第2版、ボダンスキー(M.Bodansky)編集、スプリンガー出版、1993;“ペプチド合成の実際”第2版、ボダンスキー&ボダンスキー編集、スプリンガー出版、1994;“保護基”、コシェンスキー編集、ジョージ シーム出版、シュトゥッツガルト、ドイツ、1994、を参照されたい)。
【0152】
表III
【表3】
【0153】
PG1及びX1の好ましい保護基の例としては、非制限的に、[Boc(t−ブチルカルバメート)、Troc(2,2,2−トリクロロエチルカルバメート)、Fmoc(9−フルオレニルメチルカルバメート)、Br−ZまたはC1−Z(Br−またはC1−ベンジルカルバメート)、Dde(4,4−ジメチル−2,6−ジオキソシクロオキシ−イリデン)、MsZ(4−メチルスルフィニルベンジルカルバメート)、Msc(2−メチルスルホエチルカルバメート)、Nsc(4−ニトロフェニルエチルスルホニルエチルオキシ−カルボニル)]が含まれる。好ましい保護基PG1及びX1は“有機合成における保護基(Protective Groups in Organic Synthesis)”、グリーン及びウッツ、第三版、ウィリー−インターサイエンス(1999)から選択されるものであり、最も好ましいのはFmoc及びNscである。PG2の好ましい保護基の例には、非制限的に[Acm(アセタミドメチル)、MeoBzlまたはMob(p−メトキシベンジル)、Meb(p−メチルベンジル)、Trt(トリチル)、Xan(キサンテニル)、tButhio(s−t−ブチル)、Mmt(p−メトキシトリチル)、2または4ピコリル(2または4ピリジル)、Fm(9−フルオレニルメチル)、tbut(t−ブチル)、Tacam(トリメチルアセタミドメチル)]がある。好ましい保護基PG2及びX2は“有機合成における保護基”、グリーン及びウッツ、第三版、ウィリー−インターサイエンス(1999)から選択されるものであり、最も好ましいのはAcm、Mob、Meb、ピコリルである。
【0154】
表IV
【表4】
【0155】
本発明のNα−置換2または3鎖アルキルまたはアリールチオール類の保護形は上記スキームI及びIIのように作られる。
【0156】
本発明の化合物はハロゲン仲介性アミノアルキル化、還元アミノ化などの種々の手段のいずれかによって、また、固相アミノ酸合成法に適合するNα−保護、N−アルキル化、S−保護、アミノアルキル−またはアリール−チオール アミノ酸前駆体の形成によって合成される。所望の場合、生成したラセミ体またはジアステレオマーの分離を標準法で行い、満足できるキラル純度を有する化合物を与えることができる。
【0157】
III.本発明の好ましい水溶性ポリマー及びその製法
ここに使用する用語“分子的不均質性(Molecular heterogeneity)”はタンパク質製造における各タンパク質に付加するポリマー分子の数に変動があることを意味する。用語“分子的多様性”は(a)ポリマーによって修飾されるタンパク質の部位(1カ所または複数箇所)のバリエーション、(b)タンパク質調製物における同じタンパク質の異なる位置またはタンパク質調製物の異なるタンパク質の同じ位置のポリマー付加物の長さのバリエーション、または(c)タンパク質調製物における同じタンパク質の異なる部位または異なるタンパク質の同じ部位のポリマー付加物の枝分かれの程度および/または性質のバリエーションを示すものとする。ここに使用する用語“分子的に均質”とは、タンパク質分子の全てが同一位置に(同じ)アミノ酸配列及び同じポリマー修飾を含むタンパク質の調製物を言う。2個以上の“分子的均質”なタンパク質調製物の混合物は本明細書では“分子的に定義された(molecularly defined)”調製物と言う。
【0158】
本発明のこの面によると、上で確認されたポリマー不均質性や多様性や不適切性の問題の解決は、ポリペプチド(正確な長さ、便利な合成)及び“pPEG”の両方の利点を組合わせた有する新しい生体適合性ポリマー群、すなわちフレキシブル、両親媒性、非免疫原性で、プロテアーゼの作用を受けにくいポリマーの製造を含む(ローズ(Rose,K.)ら、米国特許出願第09/379,297号、参考としてここに組込まれる)。この生体適合性ポリマーの新しい群は下記の式を有する:
−[CO−X−CO−NH−Y−NH]n−
nは整数、好ましくは1−100、より好ましくは2−100であり、式中、X及びYはアミド結合によって結合した正確な構造の生体適合性反復要素である。好ましくは、X及びYは、反応性官能基のない二価有機ラジカルであるか、または存在せず、同じであっても異なっていてもよく、各反復単位(n)で独立的に変化し得る。n=2であるとき、XまたはYの少なくとも一つが置換、未置換、枝分かれ及び直鎖脂肪族及び芳香族基からなる群から選択される。より好ましくは、XまたはYの一つがフェニル、C1−C10アルキレン部分、C1−C10アルキル基、ヘテロ原子含有フェニル、ヘテロ原子含有C1−C10アルキレン部分、ヘテロ原子含有C1−C10アルキル基、及びこれらの組合わせからなる群から選択される。
【0159】
特に好ましいpPEG部分は下記の式を有する:
−{CO−(CH2)2−CO−NH−(CH2)3−(OCH2CH2)3−CH2NH}n−
上記式中、nは好ましくは1−100の間に、より好ましくは2−100の間で変動する;または
−{CO−(CH2)2−CO−NH−(CH2)6−NH−CO−(CH2)2−CO−NH−(CH2)3−(OCH2CH2)3−CH2−NH−}n−
上記式中、nは好ましくは1−50の間に、より好ましくは2−50の間に変動する。
【0160】
このようなpPEG部分は種々の方法のいずれによっても合成できる。しかしこのような部分は重合法よりも諸単位の固相段階的鎖組立法を用いて製造するのが好ましい。このような組立法を利用すれば、或る調製物の上記部分に、それらの長さ、それらのX及びY置換基の性質、以上の分岐点の位置(もしあれば)、及び枝分かれ鎖の長さ、X及びY置換基、及び以上の位置に関して一定の均質構造をもたせることができる。
【0161】
このような部分は次のように段階的に合成するのが好ましい:
(a)式Z−Q−支持体の化合物のアミノまたはヒドロキシル基を、式HOOC−X−COOHを有する二酸の誘導体のモル過剰でアシル化する。上記式中、ZはH2N−またはHO−である;Qはリンカーまたは標的分子である;支持体は固相、基質または表面である;
(b)段階(a)の生成物の遊離カルボキシル基を活性化する;
(c)段階(b)の生成物を、式NH2−Y−NH2を有するジアミンのモル過剰でアミノリシスにかける;
(d)HOOC−X−COOH及びNH2−Y−NH2を用いて任意に段階(a)−(c)を繰り返す;上記式中、X及びYは二価の有機ラジカルまたは存在せず、同じでも異なっていてもよく、上記任意に反復する単位の各々で独立的に変化することができ、それまでのアシル化及びアミノリシス段階のいずれかに使用されたX及びY置換基と同じでも異なっていてもよい。
【0162】
好ましい実施形態において、上記反復単位の6量体(6−mer)、12量体、18量体及び32量体が使用される。所望の際には上記反復単位を、例えばリジンのアミノ基と組み合わせて、分岐pPEG構造を形成することができる。pPEGを本発明の合成タンパク質に、チオエーテル、オキシム、及びアミド結合形成等、種々の化学的方法によって結合することができる。
一実施形態において、単位の固相段階的鎖組立は次の諸段階を含んでなる:
段階1:保護−または未保護の二酸を樹脂上のアミノに結合し、結合部位にアミド結合を生成する(ここでPGは使用する二酸によって存在するかまたは存在しない保護基である):
PG−OOC−X−COOH + NH2−Y−NH−樹脂
段階2:樹脂上の保護基(PG)(もしあれば)を除去する
HOOC−X−CO−NH−Y−NH−樹脂
段階3:保護または未保護ジアミノを樹脂上のカルボキシにカップリングし、結合部位にアミド結合を生成する(この際PGは使用したジアミノに依って、存在するかまたは存在しない)
PG−NH−Y−NH + HOOC−X−CO−NH−Y−NH−樹脂
段階4:樹脂上の保護基(PG)(もしあれば)を除去する
−NH−Y−NH−OC−X−CO−NH−Y−NH−樹脂
段階5:段階1−4を“n”回繰り返して“n”単位を付加し、その後樹脂から切断する
−[CO−X−CO−NH−Y−NH]−[CO−X−CO−NH−Y−NH]−[CO−X−CO−NH−Y−NH]−[CO−X−CO−NH−Y−NH]−
【0163】
前に述べたように、直鎖及び枝分かれpPEG構成物は本発明の合成生物活性分子に結合する好ましい水溶性ポリマーである。使用するpPEGは生理的条件下で帯電した、または中性のペンダント基を担い、使用するpPEG構造によって、結合化学、長さ、枝分かれ及び溶解度に変化が起こり得る。上に述べたように、本発明の好ましいpPEGは反復単位−CO−X−CO−NH−Y−NH−を有する水溶性ポリアミドを含み、この式中、X及びYの一つまたは両方が水溶性反復単位を含み、最も好ましくは“PEG”ベースの反復単位を含む。オリゴマー類は、アミノ樹脂、NH2−樹脂、及び対称性ジアミン、NH2−Y−NH2、の場合について下に示すように、簡単な二段階固相法を用いて原理的には操作できる:
カルボニルジイミダゾールで活性化→im−CO−NH−樹脂
ジアミンNH2−Y−NH2でアミノリシス→NH2−Y−NH−CO−NH−樹脂
(ここではこれらの二段階をn回繰り返し、反復単位−NH−Y−NH−CO−のオリゴマーを与える);しかしこのアプローチはあまり好ましくない。それは、上記2段階の収量が、大過剰の試薬で長時間反応させた場合でさえ、室温では定量的にはいかないからである。よって、以下にアミノ樹脂、NH2樹脂、の場合について示すように、三段階固相法を使用してポリアミドを生成することが好ましい。試薬HO2C−X−CO2H及びNH2−Y−NH2は、異性体生成物を避けるために左右対称でなければならない。
二酸HO2C−X−CO2H→HO−CO−X−CO−NH−樹脂
カルボニルジイミダゾールで活性化→im−CO−OCO−X−CO−NH−樹脂
ジアミンNH2−Y−NH2でアミノリシス→NH2−Y−NH−CO−X−CO−NH−樹脂
これらの三段階法を逐次n回繰り返し、反復単位−NH−Y−NH−CO−X−CO−を有するポリアミドを生成する。上記ポリマーは正確な数のモノマー単位を含み、X及びYは各段階で独立的に変化し得る、そして末端基は随意に選択できる。例えばアシル化段階に無水琥珀酸(“Succ”)を使用し、アミノリシス段階に4,7,10−トリオキサ−1,13−トリデカンジアミン(“EDA”または“TTD”とも言われる)を使用することによって、Xが−CH2CH2−で、Yが−NH−CH2CH2CH2−(OCH2CH2)3−CH2−NH−、反復単位が−NH−CH2CH2CH2−(OCH2CH2)3−CH2−NH−COCH2CH2CO−である“PEG”ベースのポリアミドが生成する。上記の方法が保護基をもたない二価の試薬を含むという事実にもかかわらず、標準的市販のペプチド合成樹脂を使用する際に、以下に記載される枝分かれ構成物を形成するための枝分かれLysコアの場合を除いて、架橋は問題とならない(ローズら(米国特許出願第09/379,297号);及びローズら、J.Am.Chem.Soc.(1999)121巻:7034ページ)。
【0164】
例えば、枝分かれpPEG構成物は、ローズら(米国特許出願第09/379,297号)及びローズ及びヴィザヴォナ(Vizzavona,J)(J.Am.Chem.Soc.(1999)121巻:7034ページ)に記載されたのと同様なやり方で形成できる。こうして枝分かれpPEG構成物はリジン枝分かれコアのような枝分かれコアをもつように作ることができる。このコアはオキシム リンカーによって、−(COCH2CH2CO−NH−CH2CH2CH2−(OCH2CH2)3−CH2−NH)n−のような好ましい水溶性ポリアミドに結合する。例えば、オキシム結合は上記ポリアミドの他端のLys側鎖上のアミノオキシアセチル基と、リジン・コア、例えばテトラマー・コア(O=CHCO)4Lys2Lys−上のグリオキシリル基との間に容易に形成できる。こうして各リジン枝分かれ点から離れたオキシム リンカーが構造−Lys(COCH2ON=CHCO−)アミド−として形成される。また別の構成法は、好ましくはモノ保護ジアミンの使用及びポリアミドのカップリング後の脱保護によって、オキシム結合を上記ポリアミドとそのポリアミドの遊離ペンダント基との間に置き、下記によって示される四価の枝分かれ構成物を生成することができる:
[O=CHCO−(NH−CH2CH2CH2−[OCH2CH2]3−CH2−NH−COCH2CH2CO−)n]4Lys2Lys−
【0165】
オキシムの化学は二量体および四量体の枝分かれ構成物の合成に利用できるだけでなく、八量体枝分かれ構成物を組立てるためにも適する(ローズ、J.Am.Chem.Soc.(1994)116巻:30ページ;ローズら、Bioconj.Chem.(1996)7巻:552ページ)。このようなpPEGポリアミドを使用する際にその他の化学作用をこのような目的に使用することはもちろん可能である(図15等を参照されたい)。さらに、ポリアミド生成を、BocまたはFmoc化学作用を含むペプチド合成のための合成スキームに組み込んでもよい。しかしこのようなスキームを研究する際には、上記アミノリシス段階でFmoc基を除去し、Boc化学を利用する場合はインドールのホルミル保護を除去することを心に留めておかなければならない。
【0166】
よって、このようなpPEGは、適した結合(例えばアミド、チオエーテル、オキシム等)によって直鎖水溶性ポリアミド(−(Succ−TTD)n等)に結合する種々の枝分かれコア(例えばリジン枝分かれコア等)をもつように作ることができる;この場合各直鎖水溶性ポリアミドの遊離端を各々所望のペンダント基(例えばカルボン酸塩、アミノ、アミド等)で冠して所望電荷を与える。さらに、本発明の直鎖及び枝分かれpPEGsは、相互に反応する特異的官能基を一つ以上担持する合成タンパク質に結合するための特異的官能基を含むように作ることができ、上記pPEGsのペンダント基は非抗原性であることが好ましい(図15等を参照されたい)。
【0167】
特に好ましい実施の形態において、本発明は下記の式であらわされる分子的に均質なグリコミメティック水溶性ポリマーに向けられる:
U−s1−B−s2−“ポリマー”−s3−J*
上記式中、Uは特異的官能基の残基であり、Bは、同じでも異なっていてもよく、存在しても存在しなくてもよい3本以上のアームを有する枝分かれコアである。“ポリマー”は式−[C(O)−X−C(O)−NH−Y−NH]n−または−[NH−Y−NH−C(O)−X−C(O)]nであらわされ、約5,000Daより大きい分子量を有するポリアミドであり、ここでX及びYは同じでも異なっていてもよく枝分かれでも直鎖でもよい二価ラジカルであり、nは2ないし50の整数であり、ここでX及びYのどちらかまたは両方が、直鎖でも枝分かれでもよい実質的に非抗原性の水溶性反復単位を含み、J*は、陰−、陽−及び中性電荷からなる群から選択される生理的条件のもとで正味の電荷を有する実質的に非抗原性のペンダント基の残基であり、s1、s2及びs3は同じでも異なっていてもよく、個々に存在しても存在しなくてもよいスペーサーまたはリンカー基である。このようなポリマー類には、米国特許出願第60/236,377号に記載されるもの等がある。上記特許出願は参考としてそのまま本明細書に組み込まれる。式U−s1−B−s2−“ポリマー”−s3−J*は、式U−B−“ポリマー”−J*によってあらわすこともできる。ここではスペーサーまたはリンカー基s1、s2、s3はあってもなくともよい。
【0168】
本発明の好ましいグリコミメティックポリマーの形成法は図5−7に説明される。図5A−5Bは、本発明の水溶性ポリマーU−B−“ポリマー”−J*の枝分かれコア(B)及び特異的化学選択的官能基(U)を生成するための固相法を描いているものである。上記プロセスは示されるような固相法が好ましいとはいえ、溶液中で行ってもよい。特に、図5Aは反応基
【化4】
をもった直交的に保護されたU−B前駆体部分を示し、このような構成物の基礎的幾何学構造は結合
【化5】
で連結した点によって描かれる;この基礎的幾何学構造は使用した化学的結合または基のタイプを制限するものではなく、本発明のU−B部分を形成するのに適した構造及び化学的合成点を形成するための幾何学の相対的点を単に説明するためのものである。直交的に保護されているU−B前駆体は、U−B前駆体に共有結合できる活性化後の適切な切断可能リンカー及び同時反応基
【化6】
を含むポリマー支持体/樹脂に結合される:
【化7】
【0169】
この系はポリマー支持有機化学の原理を応用する。カップリング後、上記枝分かれコアを図のように合成し(第一の枝分かれ点だけが示され、その他の枝分かれ点は存在してもしなくともよい)、実質的に非抗原性、水溶性、直鎖ポリマー等、所望の“ポリマー”成分がその後に付加するために適切な枝分かれコアを形成する。合成の始めに直交保護U−B前駆体の一部分として作るか、または枝分かれコアBの合成中または合成後に作ることができるU基も示される。“ポリマー”成分の付加は樹脂上で、すなわち分離する前に、実施できるが、U−B部分をポリマー支持体/樹脂から分離し、精製できるU−Bコアを作製し、その後“ポリマー”成分を付加するのが好ましい経路である。
【0170】
図示されるように、コア基Bのペンダント枝分かれ点は官能基(Func)を含むように組み立てられる。上記官能基は同じでも異なっていてもよく、可逆的に保護されていても(PG、PG’またはPG’’)保護されていなくてもよい。各場合に、上記“ポリマー”成分の付加の最終的段階はペンダント枝分かれ点における官能基(Func)の生成、及び基Uの生成を含む(図7参照)。図5Bは、保護されたU−B前駆体を、リンカーを担持するポリマー支持体と組合わせて使う別法を示す。リンカーが分裂すると所望の保護されたまたは未保護のU基が生成する。図5Bは、あらかじめ組み立てた枝分かれコアBをポリマー支持体に結合させ、U基−生成樹脂を使用してU−B部分を作り、その後“ポリマー”成分を付加することも描いている。
【0171】
図6A−6Dは、本発明の好ましい、実質的に非抗原性の水溶性ポリアミド、“ポリマー”−J*成分、を形成し、その後U−Bコアに結合させる固相法を描いている。好ましい方法である固相法が説明されているけれども、液相法を応用して同じ最終結果を得ることができる。図6A及び6Bでは、固相有機化学の原理を用いて二酸及びジアミノ単位をカップリングさせる。式−[NH−Y−NHCO−X−CO]−のポリアミド構造を有する最終的分離生成物中の基X及びYの追加的多様性のために、任意に、保護されたアミノ−X’−酸及び/またはアミノ−Y’−酸 単位を挿入することができる。図6AはN−からC−末端方向への合成を描き、図6BはC−からN−末端方向への合成を描く。図6C及び6Dにおいて、保護されたアミノ−X’−酸及び/またはアミノ−Y’−酸 単位を固相有機化学の原理を用いてカップリングする。図6CはN−からC−末端方向への合成を描き、一方図6DはC−からN−末端方向への合成を描く。図6A−6Dからわかるように、最終的ポリアミド生成物の性質は正確にコントロールされ、それは合成のために行うサイクル数に依存する。その上、ペンダント基J*は、実質的にユーザーが決めた仕様によって作ることができる。単分散系反復単位X、Y、X’及びY’を使用する場合、最終的ポリアミド生成物の正確な分子構造を正確にコントロールすることができる。
【0172】
U−B成分を“ポリマー”−J*成分にカップリングし、式U−B−“ポリマー”−J*を有する本発明の好ましい合成ポリマー構成物を生成する好ましいプロセスが図7に描かれる。図示されるように、種々の保護基が提供され、所与の構成物の最終的使用目的によって自由に選択できる。固相アプローチ及び液相アプローチを含む所望U−B−“ポリマー”−J*構成物を製造する異なる経路も図示される。
【0173】
上記のように、好ましい水溶性反復単位はポリアルキレン オキシド、ポリアミド アルキレンオキシド、またはそれらの誘導体を含む。最も好ましい水溶性反復単位は式−(CH2−CH2−O)−または−(CH2−CH2−O)−を有するエチレンオキシドを含む。このような水溶性反復単位の数は著しく変動し得るが、このような単位の好ましい数は2ないし500、2ないし400、2ないし300、2ないし200、2ないし100、2ないし50であり、より好ましい数は2ないし32、最も好ましいのは3ないし8である。より好ましい実施形態の例は、X及びYの一つまたは両方が:−((CH2)n1−(CH2−CH2−O)n2−(CH2)n1−)−または−(CH2)n1−(O−CH2−CH2)n2−(CH2)n1−)−から選択され、上記式中、n1は1ないし6、1ないし5、1ないし4、最も好ましくは1ないし3であり、n2は2ないし50、2ないし25、2ないし15、2ないし10、2ないし8であり、最も好ましくは2ないし5である。非常に好ましい実施形態の例は、Xが−(CH2−CH2)−で、Yが−(CH2−(CH2−CH2−O)3−CH2−CH2−CH2)−または−(CH2−CH2−CH2−(O−CH2−CH2)3−CH2)−であるものである。さらにより好ましいのは、各nが整数である単分散系組成物である。非常に好ましい実施形態において、Xは−(CH2−CH2)−であり、Yが−(CH2−(CH2−CH2−O)3−CH2−CH2−CH2)n−、または−(CH2−CH2−CH2−(O−CH2−CH2)3−CH2)n−であり、nが12ないし36である。
【0174】
特に“ポリマー”は、水溶性ポリマーがエチレンオキシド反復単位のようなポリアルキレンオキシド反復単位を有するポリマー鎖を含む際には、各鎖が約1500ないし約42,000Daの分子量を有するのが好ましく、約2,000ないし約20,000Daの分子量を有するのが最も好ましい。
【0175】
好ましいU基は化学的ライゲーションのできる部分を含む。好ましいポリマー類は枝分かれしており、基Bが3本以上のアームを含む。好ましい成分J*は、生理的条件下でイオン化可能である基を含み、最も好ましいのは、負に帯電しているものである。U及びJのどちらかまたは両方が、構成物の一体性を破壊することなく除去できる保護基を含むことができる。
【0176】
好ましいスペーサーまたはリンカーは、水溶性ポリマーに使われる1個以上の反復単位を含む直鎖または枝分かれ部分、ジアミノおよび/または二酸単位、天然または非天然アミノ酸またはそれらの誘導体、並びにアルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、アルコキシ等の脂肪族部分を含む。これらは18個までの炭素原子、またはさらに他のポリマー鎖を含むのが好ましい。
【0177】
上記のように、成分Uは標的分子、例えばペプチドまたはポリペプチド、または関心とするその他の表面に結合し得る、または結合する官能基の残基である。Uが標的分子に結合するための官能基の残基である場合、Uは求核性基または求電子基を含み、上記標的分子は相互に反応する求電子基または求核性基をそれぞれ含む。
【0178】
多くのそのような相互反応性官能基は公知であり、ペプチド及びポリペプチド、または誘導側鎖官能基に共通の側鎖官能基と結合できる(ザリプスキーら、Bioconjugate Chemistry、(1995)、6巻:150−165ページ;“Bioconjugate Chemistryの展望”メアーズ(C.F.Meares)編集、ACS、1993;“タンパク質結合及び架橋の化学”、ウォング編集、CRC出版社(1993))。官能基の例には、アミノ基と反応できる基、例えば(a)p−ニトロフェニルまたはスクシンイミジルのようなカルボネート;(b)カルボニルイミダゾール;(c)アズラクトン;(d)環状イミドチオン類;及び(e)イソシアネート類またはイソチオシアネート類等がある。カルボン酸基及び反応性カルボニル基と反応できる官能基の例には(a)第一アミン;または(b)ヒドラジン及びヒドラジド官能基、例えばアシルヒドラジド、カルバゼート、セミカルバメート、チオカルバゼート、アミノオキシ等がある。メルカプトまたはスルフヒドリル基と反応できる官能基には、フェニルグリオキサール類、マレイミド類及びハロゲンがある。(カルボキシル)酸のような、ヒドロキシル基と反応できる官能基の例、または求電子中心と反応できるその他の求核基の例には、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、チオール、活性メチレン等がある。
【0179】
例えば、上記ポリマーは標的分子に結合するための官能基として成分Uを担うように製造できる、その際上記官能基はアクリレート、アルデヒド、ケトン、アミノオキシ、アミン、カルボン酸、エステル、チオエステル、ハロゲン、チオール、シアノアセテート、ジパルミトイル ホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイル ホスファチジルエタノールアミン、エポキシド、ヒドラジド、アジド、イソシアネート、マレイミド、メタクリレート、ニトロフェニル カルボネート、オルトピリジル ジスルフィド、シラン、スルフヒドリル、ビニルスルホン類、スクシンイミジル グルタレート、スクシンイミジル スクシネート、琥珀酸、トレシレート等である。Uは活性化型でも提供される、例えばアミンのような求核基と反応できる活性エステル型に変換され得るカルボン酸等である。
【0180】
好ましい実施形態において、Uは標的分子上の特異的官能基と選択的に反応し得る特異的官能基の残基である。本発明のこの面は、上のII章で論じたようにペプチド合成(保護基戦略)及び化学的ライゲーション(部分保護基または無保護基戦略)の原理を具体化する。例えばUは上に記載されたような広範囲の官能基の残基をあらわす。好ましいU基はアミン捕捉戦略(例えばヘミアミナル形成(hemiaminal formation)による、イミン形成による、そしてマイケル付加によるライゲーション)、チオール捕捉戦略(例えばメルカプチド形成による、スルフィド交換によるライゲーション)、天然型化学的ライゲーション戦略(例えば、システインまたはチオールに関係するチオエステル交換によるライゲーションは側鎖アミノ酸誘導体を含む)、及び直交ライゲーション カップリング戦略(例えばチアゾリジン形成、チオエステル交換、チオエステル形成、ジスルフィド交換及びアミド形成によるライゲーション)を受けやすい(コルタート(Coltart,DM)、Tetrahedron(2000)56巻:3449−3491ページ、等を参照されたい)。特に好ましいUは、上のII章に記載したような水性適合性化学的ライゲーション化学に使用される特異的官能基の残基を含む。よって、Uはカルボネート、エステル、ウレタン、オルトエステル、アミド、アミン、オキシム、イミド、尿素、チオ尿素、チオエーテル、チオウレタン、チオエステル、エーテル、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキサゾリジン等からなる群から選択される結合を形成できる官能基である。好ましい結合はオキシム及びアミド結合である。
【0181】
上記のように、Bは3本以上のアームを有する枝分かれコア部分であり、存在しても存在しなくてもよい。Bが存在する場合、1本のアームはUに連結し、またはUに結合したスペーサーまたはリンカーに連結する。そして他の各アームは“ポリマー”、または“ポリマー”に結合したスペーサーまたはリンカーに連結する。枝分かれコアBの例には、非制限的に、アミノ、アミド、カルボキシル及びこれらの組み合わせがある。これらに、リジン等のオリゴアミド類、またはアルカンジアミンとアクリル酸から作られるオリゴマー類(“ポリアミドアミン類”)があり、後者は枝分かれコアに正味の正電荷をもたらす(例えばゼング(Zeng)ら、J.Pept.Sci.(1996)2巻:66−72ページ;ローズら、Bioconjugate Chem.(1996)7巻(5号):552−556ページ;ノボビオケム カタログ及びペプチド合成ハンドブック、ファウフェルフィンゲン、2001;ウェルズら、Biopolymers(1998)47巻:381−396ページ;マハジャン(Mahajan)ら、(1999)40巻:4909−4912ページ;ジュドソン(Judson)ら、(1998)39巻:1299−1302ページ;スワリ(Swali)ら(1997)62巻:4902−4903ページ;米国特許第5,932,462号、第5,919,455号、第5,643,575号;第5,681,567号を参照されたい)。次に記すような多くのその他の異なる枝分かれコアが使用でき、それらはこの目的に適する;置換ジアミン、置換二酸、グリセリン等のアルキル酸、及び3個以上の官能基または活性化可能基を有するその他の部分、例えば多価アルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリールおよびアルコキシ部分等、及びオリゴ糖(例えばニーレンガルテン(Nierengarten)ら、Tetrahedron Lett.(1999)40巻:5681−5684ページ;マシュース(Matthews)ら、Prog.Polym.Sci.(1998)1−56;サナー(Suner)ら、巨大分子(2000)33巻:253ページ;フィッシャー(Fischer)ら、Angew.Chem.Int.Ed.(1999)38巻:884ページ;サンダー(Sunder)ら、Adv.Mater.(2000)12巻:235ページ;マルダース(Mulders)ら、Tetrahedron Lett.(1997)38巻:631−634ページ;マルダースら、Tetrahedron Lett.(1997)38巻:30−3088ページ;及びターンブル(Turnbull)ら、Chembiochem(2000)1巻(1号):70−74ページ)。“ポリマー”成分に結合する最も好ましい枝分かれコアは、アミド結合によって連結する。
【0182】
好ましい枝分かれコアはアミノ、カルボキシルまたは混合アミノおよびカルボキシル官能基から発出する。好ましい枝分かれコアの例は、それぞれリジンアミノコア、アスパラギン−またはグルタミン酸枝分かれコア、ガンマ−グルタミン酸枝分かれコアである。さらに、好ましい枝分かれポリマー構成物は、枝分かれがオリゴアミドまたはポリアミドアミンコアのような単一枝分かれコアから発するものである。しかし枝分かれ構成物のその他の群も使用できる;例えば枝分かれが、ポリマー主鎖に沿って分布する複数の枝分かれコアの列から発出している虫状(worm−like)構造等である(シュリュッタ(Schluter)ら、Chem.Int.Ed.(2000)39巻:864ページ)。ポリマー主鎖及び反復単位の化学組成および/または嵩高性によって、生成するworm−like構造は水溶性になるように、または液晶構造を誘起しやすいように設計できる(クアリ(Quali)ら、Maclomolecules(2000)33巻:6185ページ);これはデリバリー投与、安定性及び作用持続時間のために好都合である。本発明のその他の枝分かれポリマー構成物では、上記worm−like構成物がUを含むペンダント官能基を含むように作られる。
【0183】
“ポリマー”成分、または一つ以上のスペーサーまたはリンカーは、例えば前にI章で述べたように、生体安定性または生体内分解性であるポリマー鎖、または間を満たすリンカーまたは結合等を含む。やはりI章に記載したように、成分J*は生理的条件のもとで、負−、正−及び中性電荷からなる群から選択される正味の電荷を有するペンダント基の残基である。最も好ましいのは、J*がイオン化可能カルボン酸塩部分を含み、生理的条件下で正味の負電荷を有する場合である。成分s1、s2、及びs3は、I章で述べたもののように、同じでも異なっていてもよく、個々に存在しても存在しなくてもよいスペーサーまたはリンカー部分である。最も好ましいのは、上記スペーサーまたはリンカーがポリマー鎖を含み、その際上記スペーサーまたはリンカーが式−[CO−X−CO−NH−Y−NH]n−の反復単位を一つ以上含んでなる場合である。
【0184】
IV.本発明の好ましいポリマー修飾合成生物活性タンパク質
上記のように、ポリマー修飾合成サイトカイン及び走化性サイトカインは本発明の特に好ましい例である。より好ましいサイトカインは糖タンパク質である。多くのこの種のサイトカインは糖タンパク質であり、例えば多くのインターロイキン、インターフェロン、成長ホルモン、ケモカイン等がある。例えば、EPO、TPO、GCSF、GM−CSF、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−9、IL−10、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、IFα−II、IF−γ、LIL、IF−ベータ、神経成長因子、及びRANTES及び多くのその他のケモカインは糖タンパク質であり、これら及びその他の、この種のタンパク質のグリコシル化部位は知られている。
【0185】
EPOは、赤血球産生刺激活性を有するポリマー修飾合成生物活性タンパク質の設計に役立つように用いられるアミノ酸配列を含むタンパク質の特に好ましい例である。コロニー刺激因子及びRANTESも、本発明の範囲内の合成生物活性タンパク質の設計に役立つように使用できるアミノ酸配列を含むタンパク質の特に好ましい例である。
【0186】
EPOは、定常状態の条件下における赤血球産生の調節及び出血後の赤血球量の回復の促進に役割を果たす主要因子である(ジェルクマン(Jelkmann,W.)(1992)Physiol.Reviews 72巻:449ページ;クランツ(Krantz,S.B.)(1991)Blood 77巻:419ページ;ポーター(Porter,D.L.)及びゴールドバーク(M.A.Goldberg)(1993)Exp.Hematol.21巻:399ページ;ニッセンソン(Nissenson,A.R.)(1994)Blood Purif.12巻:6ページ)。ヒトEPOの循環型は約30,000の分子量を有する165アミノ酸(aa)の糖タンパク質である(ソーヤー(Sawyer,S.T.)ら(1994)Hematol.Oncol.Clinics NA 8巻:895ページ;ヤコブス(Jacobs,K.J.)ら、Nature(1985)313巻:806ページ;リン(Lin,F−K.)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82巻:7580ページ)。EPOのcDNAは166アミノ酸残基を有する分子を予測するとはいえ、カルボキシ末端アルギニンは翻訳後改変において除去される。N−結合−グリコシル化の可能性のある部位が3カ所あり、全部が満たされている。一つのO−結合−炭化水素部分も存在する。グリコシル化作用は複雑である。非グリコシル化大腸菌−由来EPOはin vitroで十分な生物学的活性を示すとはいえ、十分なin vivo活性のためにはグリコシル化が明らかに必要である。例えば、大腸菌で産生され、脱グリコシル化された天然由来のEPOは動物研究では非常に低い活性を示す(クランツ(Krantz,S.B.)(1991)Blood 77巻:419ページ;ササキ,H.ら(1987)J.Biol.Chem.262巻:12059ページ;ロウィー(Lowy,P.H.)ら(1960)Nature 185巻:102ページ;ウォジュコウスキー(Wojchowski,D.M.)ら、Biochem.Biophys.Acta.910巻:224ページ;ドーダル(Dodal,M.S.)ら(1985)Endocrinology 116巻:2293ページ)。
【0187】
上記により、種々のグリコシル化パターンは種々の効果を示す。例えば脱シアル化(desialyated)EPOはin vitroでは高まった活性と、in vivoでは低下した活性との両方示す。この効果は、ガラクトースが露出し、肝細胞によって認識され、結合し、除去される結果である(スピバク(Spivak,J.L.)及びホーガンス(B.B.Hogans)(1989)Blood 73v:90;ゴールドワッサー(Goldwasser,E.)ら、(1974)J.Biol.Chem.249巻:4202ページ)。完全にシアル化された(sialated)EPOの枝分かれパターンも生物学的活性に差を生ずる。主として四本触覚型の枝分かれEPOは“標準的”EPOに匹敵する活性を示し、一方、主として二本触覚型の枝分かれEPOはin vitroでは正常活性の3倍以上、in vivoでは正常活性のたった15%の活性を示す(タケウチ,M.ら、(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86巻、7819ページ)。研究の結果、N−結合糖のみがEPO機能化において重要であり、O−結合糖は重要でないことが判明した(ヒグチ,M.ら(1992)J.Biol.Chem.267巻:770319ページ)。
【0188】
特に好ましい実施形態において、本発明の合成生物活性タンパク質にはポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を含む。ここに使用する用語、赤血球産生刺激タンパク質は、赤血球の産生を仲介するタンパク質である。或るタンパク質の赤血球産生刺激性生物活性は種々の方法のいずれか、例えばin vivo投与後の赤血球産生によって、上記タンパク質のEPO依存性細胞系増殖を仲介する能力の分析試験等によって測定できる。
【0189】
好ましい赤血球産生刺激タンパク質は哺乳動物、最も好ましくはヒトのEPO、及びその類似体である。(例えば米国特許第5,856,298号、第5,955,422号;第8,888,772号;第5,858,347号;第5,614,184号;第5,457,089号;及び第6,077,939号;及びWO 00/32772号を参照されたい)。エリスロポエチンは主として腎臓の尿細管及び傍尿細管内皮および間質細胞によって合成、分泌される。慢性腎臓病は腎臓のEPO産生細胞を破壊させる。その結果としてのEPO不足は、貧血を起こすことが多い。そこでEPOの主な臨床的用途は、通常輸血も受けている重症腎不全の患者(ヘマトクリット値0.3未満)の治療、並びに化学療法後の貧血患者の治療である。一般的に、EPOはハムスター卵細胞において組換え合成され臨床的に使用される。EPOはその成熟型では165アミノ酸残基の、相対的に耐熱性及びpH安定性の酸性(pI=4.5)タンパク質である。EPOの分子量の約40パーセントはそのグリコシル化によるものである。グリコシル化はEPOのin vivo薬物動態挙動を決定する重要な因子である。非グリコシル化EPOは極めて短い生物学的半減期を有する。それでもそれはその受容体に結合し、in vitroでも比較的高い特異な活性を有する。しかし最近の研究は、EPOのPEGylation(PEG化)はその寿命を著しく高める一方で、細胞ベースのアッセイ系ではEPO活性を有意に低下させることを示した。
【0190】
本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質(“SEP”)はヒト尿EPOのポリマー修飾合成類似体であるのが好ましい。好ましい実施形態において、それらはチオエーテル、オキシム、アミドまたはその他の結合によって、一つ以上のペプチド残基に結合した一つ以上のポリマー部分(最も好ましくはpPEG部分)を含む。非常に好ましい実施形態において、このような結合はヒト尿EPOの、天然にグリコシル化された一つ以上の位置に存在する(すなわち位置24、38、83及び126)。最も好ましくは、SEP分子はこのような2つ以上の位置にpPEG部分を有する。別の実施形態において、その他のタンパク質残基はポリマー部分によって修飾される。本発明の合成生物活性タンパク質の修飾位置としては、上記タンパク質の不規則ループ、領域またはドメインにある残基、または潜在的プロテア−ゼ開裂部位にあるまたはその近くにある残基が含まれる。例えば、ポリマー修飾はEPOの9、69および/または125の一つ以上の位置で行われる。本発明のSEP分子の総分子量は約25から約150kDaまでに変化し得る、より好ましくは約30ないし約80kDaの間に変化し得る。上記分子量は所与の類似体の修飾のために用いられるポリマー(例えばpPEG等)の数及び構造を増やしたり減らしたりすることによってコントロールできる。より大きい構成物のpPEG依存性流体力学的MWは約100kDaより大きい。ヒトEPO受容体を発現する細胞におけるin vitroアッセイは、本発明のSEPが組換え的に産生されるグリコシル化ヒトEPOのED50に匹敵するED50を有することを示す。
【0191】
オキシム結合pPEG類似体は好ましくはアミノオキシ、ケトンまたはアルデヒド官能化pPEGを、SEPタンパク質の、側鎖アミノオキシ、ケトンまたはアルデヒド官能基を担う非天然的にコードされるアミノ酸に結合することによって構成される。例えば、SEP−0及び1の位置89及び117は擬似グルタメートを含む(式CHα−CH2−S−COOHの側鎖を担う非天然的にコードされるアミノ酸(グルタミン側鎖−CHα−CH2−CH2−COOHに比較))。チオエーテル結合を利用するSEP類似体は、チオールを担う側鎖を有するシステインまたは非天然アミノ酸によって提供されるチオール官能価を含むように構成するのが好ましい。図10は好ましい合成赤血球産生刺激タンパク質の一つの型の基礎構造を描く。
【0192】
別の実施形態において、本発明のSEP分子は、EPOの天然アミノ酸カルボキシ末端が配置し直された“循環的置換(circularly permuted)”EPO類似体を含むことができる。このような再配置がアミノおよびカルボキシ末端を構造的制約が低い位置、例えば不規則(disordered)ループ等に動かすことが最も好ましい。位置125及び126の周囲の不規則ループは(天然EPO残基のナンバリング系に対して)このような再配置の一例である。このようなSEPがジスルフィド−フリー(無ジスルフィド)であり、あらかじめ選択された残基がポリマー部分を含むように化学的に改変されるのが最も好ましい。
【0193】
或いは、SEP分子はアミノ及びカルボキシ末端を天然に発生するグリコシル化部位に移動させ、またはグリコシル化されやすいその他の部位、例えば位置126及び125に移動させることができる。かかるSEP分子は(カルボキシアミド化等の)変化を排除または改変するためのアミノ及びカルボキシ末端の改変も含むことができる。このような循環的置換分子の好ましい一例において、新しいN−及びC−末端は位置126および125にそれぞれ作られる。位置7、29、33及び161の天然ジスルフィド形成システイン類は、非天然的にコードされるアミノ酸、L−α−N−酪酸(Aba)(これはジスルフィド−ブリッジを形成できない)によって置換されるのが好ましい。残基R166、E37およびV82をアラニンで置換し、生産を改善するのが好ましい。また、天然EPOナンバー・スキーム(これは以下で“0”のナンバーがつけられる)に対して追加的システインを位置1と166との間に挿入するのが好ましい。生成した分子は4個のシステインを含む(位置126、0、38及び83に(N−からC−末端方向に読んで))、これらは(1)結合部位及び(2)チオエーテル形成pPEG結合部位として利用される。任意に、システインをA125の代わりに入れて、付加的pPEG結合部位を与えてもよい。
【0194】
本発明のこのようなSEP分子の総分子量は約25から約150kDaまでに、より好ましくは約30から約80kDaまでに変化し得る。上記分子量は所与の類似体の修飾のために用いられるポリマー(例えばpPEG等)の数及び構造を増やしたり減らしたりすることによってコントロールできる。より大きい構成物のpPEG依存性流体力学的MWは100kDaより大きい。任意のpPEG結合部位は位置125、9及び24に置かれる(N−からC−末端方向に読んで)。その他のSEP類似体のデザインは不規則ループ領域に代ってN−及びC−末端をもち、および/または新しいN−および/またはC−末端から残基を切り捨てる。好ましい循環的置換分子の基礎構造は図11に示される。
【0195】
例として、下記のやり方で、ヒトEPOの天然配列を循環的に置換することによって或る配列を設計した:天然N−末端Ala1及びC−末端Arg166とを追加的Cys残基によって結合し、167アミノ酸のポリペプチドを与える;天然配列の残基125−126のところで鎖を分断することによって新しいN−及びC−末端を作り出す;全ての天然Cys残基をL−□アミノ−n−酪酸残基で置換した;そして下記の置換を行った:Glu37Ala;Asn38Cys;Val82Ala;Asn83Cys;Ser126Cys;Arg166Ala(全残基のナンバーはヒトEPOの天然配列に基づく)。同時に、これらの設計要素は示されるSEP−5のアミノ酸配列を形成する。SEP−5−L28タンパク質はCys残基126、0、24、38及び83(ヒトEPO配列に基づくナンバリング)がマイケル付加反応によって、マレイミド改変、直鎖性(TTD−Succ)6カルボン酸塩ポリマー構成物でポリマー修飾される。これらの変化は、SEP−5−L28タンパク質の合成及び取扱いを改善するために設計された。設計された配列は4ペプチドセグメントから作られ、各セグメントは末端Cys残基を有する。化学的ライゲーション部位はCys0、Cys38、Cys83であった。C−末端ペプチドが□−カルボン酸塩であるペプチドを合成した;その他の3ペプチドは□−チオエステルであり、このためN−末端Cys残基はAcmで保護された側鎖であった。Cys24は保護されない側鎖であった。上記セグメントはC−末端の2セグメントから始まり、逐次天然型化学的ライゲーションによって連結された。ライゲーション後、ライゲーション部位の遊離Cys側鎖をマイケル付加反応によってマレイミド改変、直鎖の(TTD−Succ)6カルボン酸塩 ポリマー構成物と反応させ、その後Cys側鎖のAcm保護基を除去し、次のセグメントのライゲーション及びポリマー修飾が同様に行われた。Acm基の除去後、次の(第四の)セグメントのライゲーションが行われ、最後のAcm基が除去され、ポリマー修飾が同様に行われ、上に記載したような図38に示される循環的に置換されたSEP構成物が生成した。
【0196】
また別の実施形態において、本発明の合成生物活性タンパク質は哺乳動物、最も好ましくはヒトのG−CSFである。G−CSFは好中性顆粒球の速やかな増殖及び血流への放出を誘起し、それによって感染症の克服に治療効果をもたらす。ヒトG−CSFタンパク質は長さが174アミノ酸である(特許:EP0459630(キャンブル(Camble R.)ら)。そしてその配列の変異体(variants)が分離されている(例えば米国特許第6,004,548号;第4,810,643号;第5,218,092号;第5,214,132号;第5,416,195号;及び第5,580,755号を参照されたい)。上記タンパク質は4個のシステイン残基を有し、スレオニン位置133にO−グリコシル化部位を有する。
【0197】
このような合成GCSF分子の一実施形態において、上記分子のアミノ酸配列を天然GCSFの配列に対して変化させ、位置1、2または3の一つ以上に天然、またはより好ましくは非天然にコードされた疎水性残基を含むようにすることができる。任意に、そのような分子をさらに改変し、GCSFの位置5および/または位置173および/または174に追加的天然またはより好ましくは非天然にコードされた疎水性残基を含むようにする。
【0198】
その他の好ましい実施形態において、合成GCSF分子は位置63、64および/または133の一つ以上および/または位置1及び174の一つ以上がポリマー(好ましくはpPEG)で修飾されている。pPEGポリマーは直鎖、枝分かれ、帯電、非帯電、または混合のいずれでもよい;そして修飾のために使用するpPEGの数及び構造に応じて、約5ないし約80kDaの分子量、より好ましくは約40ないし約70kDaのpPEG総分子量を有する。流体力学的半径(radius)はin vivoではより大きいMW効果を示す(例えば10kDaの枝分かれpPEGは約55kDaの有効MWを示す)。推定pPEG依存性流体力学的MWは100kDaより大きい。
【0199】
オキシム結合を使用する類似体では、pPEGは側鎖アミノオキシ、ケトンまたはアルデヒド官能基を担う、非天然的にコードされる残基に付加するのが好ましい。チオエーテル結合を使用する類似体では、pPEGはシステインまたはチオールを担う側鎖を有する非天然アミノ酸に付加するのが好ましい。アミド結合を使用する類似体では、pPEGは反応性側鎖アミンを担う天然または非天然アミノ酸に付加する。
【0200】
合成生物活性G−CSFタンパク質の基礎構造が図12に示される。図において、“J”は疎水性側鎖を有する非天然的にコードされる残基を示す。
【0201】
このようなポリマー修飾合成生物活性GCSFタンパク質類の生物活性は一般的手段、例えば因子依存性ヒトまたはマウス細胞株(NFS60細胞株等)の増殖を仲介するそれらの能力を分析測定(アッセイ)することによって、または20日以上の半減期/放出をターゲティングするデリバリーシステムを利用した場合または利用しない場合のin vivo好中球刺激、半減期、及び免疫原性を測定することによって分析試験できる。
【0202】
また別の実施形態では、本発明の合成生物活性タンパク質は哺乳動物、最も好ましくはヒトのケモカイン、RANTES、である。RANTESはM−tropicHIV種が主要受容体CCR5を介して流入するのを遮断し、喘息、移植拒絶及び創傷治癒に関係する炎症経路を抑制する(カリンコヴィッチ(Kalinlovich)ら、Immunol Lett.(1999)68巻:281−287ページ)。本発明の合成RANTES分子は、好ましくは、(1)RANTES1−68の位置1に見いだされるN−末端セリンがn−ノナノイル(“NNY”)基で置換され;(2)位置3のチロシンが疎水性側鎖を有する非天然にコードされるアミノ酸で置換される、というように化学的に改変されている点で、RANTESケモカインとは異なる。このような化合物は極めて強力で、組換え“Met−RANTES1−68”のmM範囲のED50に対して、pM範囲のED50を有する。
【0203】
強力なRANTES類似体は上記のものに次のような一つ以上の追加的変化をもたせるように作られた:位置2のプロリンを疎水性側鎖を有する非天然コード−アミノ酸で置換し、脂肪酸を上記分子のC−末端に結合する。RANTES残基12−20に相当するN−ループ領域を改変することによって受容体特異性が効力と共に改善された。その他の好ましい実施形態において、本発明の合成RANTES分子はポリマー部分(pPEG等)、またはノナノイル(“NNY”)またはY3XをそれらのN−またはC−末端に組み込んで、特にin vivo半減期を改善する。上記pPEG部分はオキシム結合によって、位置66、67、68に、または位置68のリンカーに導入された非天然的にコードされたアミノ酸に結合するのが好ましい。この際、凝集領域の原因となる領域である位置67がより好ましい。上記脂肪酸はオキシム結合によって(好ましくはリンカーによって)残基68に結合するのが好ましい;例えばアミノ−オキシ改変アミノ酸ジ−またはトリ−ペプチド リンカー等。その他の結合化学を代わりに使用してもよい。このような合成RANTES類似体の比較的大きい構成物の分子量は、pPEG結合の数及び構造に応じて約25kDaないし約45kDaの範囲であり、上記の比較的大きい構成物は60kDaを超えるpPEG依存性流体力学的MWを有する。好ましい合成RANTES類似体の構造は図13に示される。
【0204】
V.医薬品
本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質は病気及び疾患を治療する薬剤として使用することができる。治療を必要とする患者または人に投与する際、このような合成生物活性ポリペプチドおよび/またはタンパク質をドラッグ・デリバリー・システムを利用して投与するのが最も好ましい。このようなシステムの使用により、患者が満足でき、そして所望生物活性の有効性を高めるようなやり方で薬を患者に与えることができる。本発明の目的において好ましいドラッグ・デリバリー・システムは、ポリペプチドまたはタンパク質を経口、経鼻、または吸入経路で、または筋肉内、皮下、経皮、静脈内、腸壁内(intraurally)、または眼球内に投与することができるシステムを含む。
【0205】
このようなドラッグ・デリバリー・システムには部位特異的に放出できる組成物または腸粘膜の保護を高める組成物がある。適切な組成物としては:乾燥粉末組成物、ウィルス粒子封入による運搬、リポソーム封入、経皮パッチ、電気的手段を用いる運搬(エレクトロポレーション治療)及びポリマー/niazone 複合体がある。
【0206】
好ましい実施形態において、このようなドラッグ・デリバリー・デバイスは生物学的環境の変化に反応し、これらの変化に基づいて薬を運搬し、または運搬を中止する。薬及びその他の活性物質の放出をコントロールする一連の物質が使われている:ポリ(ウレタン)、ポリ(シロキサン)、ポリ(メチルメタクリレート)、親水性及び強度のためのポリ(ビニルアルコール)、ポリ(エチレン)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(n−ビニルピロリドン)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(アクリル酸)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレン−コ−ビニルアセテート)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(メタクリル酸)等。その他の好ましい実施形態において、ドラッグ・デリバリーを容易にするために生体内分解性ポリマーが使用される。そのようなポリマーとしては、ポリラクチド(PLA)、ポリグリコライド(PGA)、ポリ(ラクチド−コ−グリコライド)(PLGA)、ポリ無水物、ポリオルトエステル等がある。ドラッグ・デリバリー・デバイス、及びそれらの使用法は米国特許第6,072,041号;第6,041,253号;第6,018,678号;第6,017,318号;第6,002,961号;第5,879,712号;第5,849,331号;第5,792,451号;第5,783,212号;第5,766,633号;第5,759,566号;第5,690,954号;第5,681,811号;第5,654,000号;第5,641,511号;第5,438,040号;第4,810,499号;及び第4,659,558号に記載されている。
【0207】
よって、本発明のもう一つの面は、治療を必要とする哺乳動物に、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質を含む化合物類または薬物学的に容認されるそれらの塩の治療的有効量を投与することによって治療する医薬組成物及び方法に関係する。“薬物学的に容認される塩”とは、本発明のポリペプチドの生物学的有効性及び特性を保持し、生物学的にまたはそれ以外の面でも不都合でない塩を意味する。塩類は酸または塩基から誘導できる。酸付加塩は塩酸、臭化水素酸、硫酸(硫酸塩及び重硫酸塩を与える)、硝酸、燐酸等の無機酸、及び酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、蓚酸、リンゴ酸、マロン酸、琥珀酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、サリチル酸、p−トルエンスルホン酸等の有機酸から誘導される。塩基付加塩は無機塩基から誘導され、ナトリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム塩等を含む。有機塩基から誘導される塩には、第一、第二及び第三アミン、天然に発生する置換アミンや環状アミン等を含む置換アミン、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、2−ジメチルアミノエタノール、トロメタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、N−アルキルグルコサミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、N−エチルピペリジン等から形成されるものが含まれる。好ましい有機塩基はイソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、ピペリジン、トロメタミン及びコリンである。
【0208】
ここに使用する用語“治療”は本明細書では哺乳動物、特にヒトの病気の全ての治療を含み、(i)病気にかかる素因はあるが、まだその病気とは診断されていない人においてその病気の発生を阻止する;(ii)上記病気の阻止、すなわちその進行を止める;または(iii)上記病気の緩和、すなわち上記病気を後退させることを含む。
【0209】
本明細書に使用する“タンパク質拮抗物質または作用薬(アゴニスト)で予防されるかまたは軽快する哺乳動物の疾病状態”には、概してタンパク質インヒビターで有効に治療できることが当業者に一般的に認められている全ての疾病状態、及び本発明の特殊な化合物で治療することによって有効に阻止されまたは軽快することが判明した疾病状態を含むものとする。説明のためにこれらを非制限的に挙げれば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、ウィルス疾患、アテローム/アテローム性動脈硬化症、リウマチ性関節炎及び臓器移植拒絶等である。
【0210】
ここに使用する用語“治療的有効量”とは、治療を必要とする哺乳動物に投与した際に、例えば抗炎症剤、抗喘息薬、免疫抑制剤または抗自己免疫病薬として十分な治療(上に定義した)効果をあらわし、哺乳動物におけるウィルス感染を阻止するポリマー修飾合成生物活性タンパク質の量を言う。“治療的有効量”を構成する量はタンパク質誘導体、疾患または病気およびその重症度、及び治療すべき哺乳動物、その体重、年齢等によって変動するが、その時代における知識及びこの開示によって、熟練せる当業者は日常的に決定できる。ここに使用する用語“q.s.”は、定められた機能を得るために十分な量、例えば或る溶液を所望容量(例えば100mL)にするのに十分な量を加えることを意味する。
【0211】
本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質およびそれらの薬物学的に容認される塩類、すなわち活性成分が、治療的有効量、すなわち上記のように治療を必要とする哺乳動物に投与した際に治療効果をあらわすのに十分な量が投与される。ここに記載される合成生物活性タンパク質の投与は、同様な用途に役立つ薬剤類を投与する容認される方法のいずれによっても投与できる。ここに使用する用語“ポリマー修飾合成生物活性タンパク質”、“本発明のポリペプチドの薬物学的に容認される塩”及び“活性成分”は交換可能に用いられる。
【0212】
組成物中のポリマー修飾合成生物活性タンパク質の濃度は、熟練せる当業者によって使用される全範囲内に変動し得る。例えば総組成物を基にしてタンパク質拮抗物質または作用薬が約0.01質量パーセント(%w)ないし約99.99%wの濃度であり、約0.01%wないし99.99%wの賦形薬である。より一般的には、ポリマー修飾合成生物活性タンパク質は約0.5%wないし約80%wの濃度で存在する。
【0213】
上記ポリマー修飾合成生物活性タンパク質のヒト投与量レベルはなお最適化すべきだが、一般的に、投与する化合物量は阻止または緩和の標的となる人及び疾病状態、疾患の性質または重症度、投与法及びスケジュール、及び処方医の判断によって決まるのは当然である。このような使用の最適化は熟練せる当業者による最適化の範囲内でよい。
【0214】
投与はあらゆる容認される全身または局所的経路、例えば非経口、経口(特に乳児用組成物)、静脈内、鼻孔内、気管支吸入(すなわちエアロゾル組成物)、経皮的または局所的経路を介して、固体、半固体、または液体またはエアロゾル投与型、例えば錠剤、丸薬、カプセル、粉末、液体、溶液、乳濁液、注射用、懸濁液、坐剤、エアロゾル等の形で投与できる。本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質は除放性またはコントロール放出薬剤型、例えば蓄積型(depot)注射、浸透ポンプ、丸薬、経皮(エレクトロトランスポートも含む)パッチ等の形で上記ポリペプチドを所定の速度で持続的に投与し、好ましくは正確な容量を単回投与するための単位投与型で投与することもできる。上記組成物は一般的医薬用担体または賦形薬、及び本発明のタンパク質拮抗物質または作用薬を含み、加えてその他の医薬製剤、薬剤、担体、アジュバント等を含むことができる。担体は種々の油、例えば石油、動物油、植物油、または合成油、例えばピーナツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油、等から選択できる。水、生理食塩水、デキストロース水溶液、そしてグリコールは好ましい液体担体であり、特に注射用液には好ましい。適切な薬剤用担体には澱粉、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦、白墨、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール モノステアレート、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール、等がある。その他の適切な薬剤用担体及びそれらの組成物はマーチン(E.W.Martin)の“レミントンの薬剤科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)”に記載されている。
【0215】
所望ならば、投与すべき薬剤組成物は湿潤剤、または乳濁剤、pH緩衝剤等の無毒性補助物質も少量含むことができる;例えば酢酸ナトリウム、ソルビタン モノラウレート、トリエタノールアミン オレエート等である。
【0216】
活性成分がより多く必要な場合は、経口投与により従来の毎日投与方式を用いて本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質をデリバリーすることができ、それは所望の予防程度または苦痛の緩和程度によって調節できる。このような経口投与のためには、薬物学的に容認される無毒性組成物は、通常使用される賦形薬、例えば薬剤品位のマンニット、ラクトース、澱粉、ポビドン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン ナトリウム、タルク、セルロース、クロスカルメローズ ナトリウム、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウム等のいずれかを組み込むことによって形成される。このような組成物は溶液、懸濁液、分散性錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放性組成物等の形をとる。経口組成物は特に胃腸疾患の治療に適する。全身的目的のための経口バイオアベイラビリティは、例えばアセチル化アミノ酸を含む組成物等のように、全身循環への取り込みを改善する賦形薬を使用することによって調節できる。米国特許第5,935,601号及び米国特許第5,629,020号等を参照されたい。
【0217】
上記組成物類はカプセル、丸薬または錠剤の形をとることができ、したがって上記組成物は活性成分と共に、ラクトース、スクロース、燐酸二カルシウム等の希釈剤;クロスカルメローズ ナトリウム、澱粉またはそれらの誘導体等の崩壊剤;ステアリン酸マグネシウム等の滑剤;及び澱粉、ポリビニルピロリドン、アカシアゴム、ゼラチン、セルロース及びその誘導体等の結合剤を含む。
【0218】
薬剤として投与できる液体組成物は例えば本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質(約0.5ないし約20%)及び任意の補助薬剤を水、デキストロース水溶液、グリセロール、グリコール類、エタノール、保存剤等の担体に溶解、または分散し(またはその他の方法で)、溶液または懸濁液を生成するというやり方で調製できる。所望ならば、投与すべき薬剤組成物は湿潤剤、懸濁剤、または乳化剤、溶解剤、pH緩衝剤等の無毒性補助物質を少量含むことができる;例えば酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ポリオキシエチレン、ソルビタン モノラウレートまたはステアレート等である。このような薬剤型の実際的製法は熟練せる当業者には公知であるか、明らかである;例えばレミントンの薬剤科学、マック出版社、イーストン、ペンシルバニア、を参照されたい。投与すべき組成物または処方は、活性成分を、少なくとも治療すべき人の症状を阻止または緩和するのに有効な量含む。乳児に経口投与するためには液体組成物(例えばシロップまたは懸濁液)が好ましい。
【0219】
液体を含む固型与型では、例えばプロピレンカーボネーと、植物油またはトリグリセリド−溶液または懸濁液をゼラチンカプセルに封入するのが好ましい。液体投与型では、溶液、例えばポリオキシエチレングリコール溶液を水等の薬物学的に容認される液体担体の十分量で希釈し、投与のために計量しやすいようにする。
【0220】
或いは、液体または半固体経口組成物は活性成分を植物油、グリコール類、トリグリセリド類、プロピレングリコールエステル類(例えばプロピレンカーボネート)等に溶解または分散し、これらの溶液または懸濁液を硬−または軟ゼラチンカプセル皮膜に封入することによって製造できる。
【0221】
本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質を上記の病気の治療のために使用する際に、上記の活性成分の投与は非経口投与であることが好ましい。非経口投与は一般的に皮下、筋肉内または静脈内注射を特徴とし、皮内−または腹腔内注射、並びに胸骨内注射または注入法も含まれる。注射可能物質は一般的形の液体溶液または懸濁液として、または注射前に液体溶液または懸濁液とするのに適した固体形として、乳濁液としてまたは生体適合性ポリマー(例えばリポソーム、ポリエチレングリコール誘導体、ポリ(D,C)ラクチド等)ベースのミクロスフェアとして調製できる。適切な賦形薬は例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等である。それに加えて、もし所望ならば、投与すべき薬剤組成物は少量の無毒性補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、溶解促進剤、タンパク質担体等も含むことができる;例えば酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレン、ソルビタン モノラウレート、トリエタノールアミン オレエート、シクロデキストリン、血清アルブミン等である。
【0222】
本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質は、例えばこの化合物を適切な溶媒(水または生理食塩水)に溶解し、またはリポソーム組成物に挿入し、その他の容認される注入液に分散させることによって、非経口的に投与できる。本発明のポリペプチドの典型的1日量は1回の注入によって、または定期的間隔をおいた一連の注入によって投与できる。非経口投与では、特に適切な水溶性形の活性成分の水溶液がある;例えば水溶性塩の形、または、カルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび/またはデキストラン等の粘度増加物質や、所望ならば安定剤も含む水性注射用懸濁液がある。上記活性成分は、任意に賦形剤と一緒に、凍結乾燥物の形でもよく、これを非経口投与前に適切な溶媒の添加によって溶液にすることができる。
【0223】
非経口投与のためのより最近工夫されたアプローチは一定の投与量レベルが維持されるように、徐放性または持続的放出系を埋め込む方法である。例えば米国特許第3,710,795号、米国特許第5,714,166号及び米国特許第5,041,292号を参照されたい。これらは参考として本明細書に組み込まれる。
【0224】
このような非経口組成物に含まれる活性成分のパーセンテージは、その特異的性質、並びにポリペプチドの活性及び対象の要求に大きく依存する。しかし溶液中0.01%ないし10%の活性成分パーセントが用いられ、その組成物が固体である場合はパーセンテージはより高く、その後上記のパーセントに希釈される。上記組成物は、溶液中に活性成分を0.02−8%含むのが好ましい。
【0225】
本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質の別の投与法は静脈内ボーラス注射(大量注射)と連続注入の両方を使用するものである。
【0226】
エアロゾル投与は、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質を直接呼吸気道に運搬する有効な手段である。この方法の利点の幾つかを挙げると;1)それは酵素的分解作用、消化管からの貧弱な吸収、または肝臓の初回通過効果(first−pass effect)による治療薬の喪失を回避し;2)それらの分子サイズ、電荷または肺外部位への親和性により、それ以外の方法では呼吸気道のそれらの標的部位に達することができない活性成分を投与できる;3)それは肺胞を介して体内への速やかな吸収を可能にする;4)それはその他の器官系を活性成分に曝すことを避ける;これは上記被曝が好ましくない副作用をおこすかもしれない場合には重要なことである。これらの理由から、エアロゾル投与は喘息、肺の局所的感染症及び肺及び呼吸気道のその他の疾患または疾患状態の治療に特に有益である。
【0227】
3種類の薬剤吸入装置、ネブライザー吸入器、定量吸入器及び乾燥粉末吸入器がある。ネブライザー装置はタンパク質誘導体(液体形に処方されている)を霧として噴霧させる高速気流を生成する。定量吸入器は一般的には圧縮ガスと共に包蔵された組成物を含み、実施時には、測定量のポリペプチドを圧縮ガスによって放出し、したがって規定された量の薬剤を確実に投与する方法である。乾燥粉末吸入器は、この装置によって呼吸する際に患者の呼吸流に分散し得る流動性粉末の形のポリペプチドを投与する。流動性粉末を得るためには、上記タンパク質誘導体をラクトース等の賦形薬と一緒に処方する。測定量のタンパク質誘導体はカプセル形に保存され、各実施時に患者に分配される。上記の方法は全て、本発明の投与に用いられる。
【0228】
リポソームをベースにした薬剤組成物も本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質を使用するために適する。例えば米国特許第5,631,018号、第5,723,147号;第5,766,627号を参照されたい。リポソームの利点は、薬剤のリポソーム捕捉に起因する、組織分布及び薬物動態パラメーターの好都合な変化と関係があると考えられ、熟練せる当業者はこの利点を本発明のポリペプチドに応用できる。注射または経口投与のためのコントロールド放出性リポソーム液体薬剤組成物も使用できる。
【0229】
坐薬による全身投与の場合、伝統的結合剤及び担体には例えばポリエチレングリコールまたはトリグリセリド、例えばPEG1000(96%)およびPEG4000(4%)がある。このような坐薬は活性成分を約0.5w/w%ないし約10w/w%の範囲;より好ましくは約1w/w%ないし約2w/w%の範囲を含む混合物から形成される。
【0230】
本明細書において言及した全ての出版物及び特許公報は、それらを参照により本明細書に組み込む旨が具体的かつ個別に明記されていなくても、参照によって本明細書に組み込まれるものである。本発明の背景についての検討は、本発明の範囲を説明する目的で記載するものであって、言及した事物のいずれについても、本請求項に係わるいずれかの優先日現在、世界のいずれかの場所において、公表されていること、公知であること、或いは先行技術や一般的な通常の知見の一部であることを出願人が自認するものではない。ここに本発明を概ね説明したが、これは下記の実施例を参照してより容易に理解される;これらの実施例は説明のためのものであり、特に記載がない限り本発明を制限するものでない。
【0231】
(実施例)
(略語)
Acm=アセトアミドメチル チオール保護基(すなわち−CH2NHCOCH3)
AoA=アミノオキシアセチル
Arg(Tos)=L−アルギニン(側鎖NGトルエンスルホニル保護)
ART=網状赤血球の絶対数
Asp(cHex)=L−アスパラギン酸(側鎖シクロヘキシルエステル保護)
AUC=曲線下面積
Boc=第三ブトキシカルボニル
CD=円二色性
CDI=カルボニルジイミダゾール
CHO=チャイニーズハムスター卵巣
CL=クリアランス(mL/hr/kg)
Cmax=最大濃度
Cys(4MeBzl)=L−システイン(側鎖(4−メチル)ベンジル保護)
Cys(Acm)=L−システイン(側鎖アカトアミドメチル[すなわち−CH2NHCOCH3]−保護)
DCM=ジクロロメタン
DIC=ジイソプロピルカルボジイミド
DIEA=ジイソプロピルエチルアミン
DMF=ジメチルホルムアミド
DMSO=ジメチルスルホキシド
DPC=ドデシルホスホコリン
Dpr=L−1,2−ジアミノプロピオン酸
ED50=50%最大効果に達するために必要な有効量
EDA=(4,7,10)−トリオキサトリデカン−1,13−ジアミン
ELISA=酵素免疫測定法
EPO=エリスロポエチン
ES−MS=エレクトロスプレーイオン化質量分析法
FBS=ウシ胎児血清
Glu(cHex)=L−グルタミン酸(側鎖シクロヘキシルエステル保護)
GM−CSF=顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子
HATU=O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルアンモニウム ヘキサフルオロホスフェート
HCT=ヘマトクリット
HGB=ヘモグロビン
His(Dnp)=L−ヒスチジン(側鎖NImジニトロフェニル保護)
HOBT=N−ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC=高圧液体クロマトグラフィー
IMDM=イスコブの改良ダルベッコ培地
IPA=イソプロパノール
Lev=レブリン酸
Lys(CIZ)=L−リジン(側鎖2−クロロベンジルオキシカルボニル)保護
MBHA=4−メチルベンズヒドリルアミン
MRT=平均滞在時間
MTT=4−メチルトリチル
MTT=チアゾリルブルー
NHS=N−ヒドロキシスクシンイミド
−OCH2−Pam−樹脂=−O−CH2−Bz−CH2CONHCH2(コポリスチレン−ジビニルベンゼン)−樹脂
Pbo=4−(CH3S(O))ベンジル
PBS=燐酸緩衝生理食塩液
PCV=赤血球沈層
RBC=赤血球
RET=網状赤血球
rhEPO=組換えヒトEPO
RSA=ラット血清アルブミン
SDS=ドシル硫酸ナトリウム
SDS−PAGE=SDS−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動法
Ser(Bzl)=L−セリン(側鎖ベンジル保護)
アミノ酸の一字コード:A=アラニン;C=システイン;D=アスパラギン酸;E=グルタミン酸:F=フェニルアラニン;G=グリシン;H−ヒスチジン;I=イソロイシン;K=リジン;L=ロイシン;M=メチオニン;N=アスパラギン;P=プロリン;Q=グルタミン;R=アルギニン;S=セリン;T=スレオニン;V=バリン;W=トリプトファン;Y=チロシン
SPPS=段階的固相ペプチド合成
Succ=スクシニル[すなわち−COCH2CH2CO−]
TCEP=トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸
TFE=2,2,2,−トリフルオロエタノール
Thr(Bzyl)=L−スレオニン(側鎖ベンジル保護)
アミノ酸の三文字コード:Ala=アラニン;Arg=アルギニン;Asn=アスパラギン;Asp=アスパラギン酸;Chg=シクロヘキシルグリシン;Cys=システイン;Gln=グルタミン;Glu=グルタミン酸;Gly=グリシン;His=ヒスチジン;Ile=イソロイシン;Leu=ロイシン;Lys=リジン;Met=メチオニン;Phe=フェニルアラニン;Pro=プロリン;Ser=セリン;Thr=スレオニン;Thz=4−チオプロリン;Trp=トリプトファン;Tyr=チロシン;Val=バリン
Trp(フォルミル)=L=トリプトファン(側鎖NInホルミル保護)
TTD=(4,7,10)−トリオキサトリデカン−1,13ジアミン
Tyr(BrZ)=L−チロシン(側鎖2−ブロモベンジルオキシカルボニル−保護)
Vc=中心コンパートメントの分布容量
【0232】
(実施例1)
合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−0の合成
合成赤血球産生刺激タンパク質(SEP)を合成した。完全長合成タンパク質(“SEP−0(1−166)”と呼ばれる)の配列は:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA
EHCSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA
VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPWψP
LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAIS
PPDAASAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR
GKLKLYTGEA CRTGDR(配列番号:1)
上記配列中、ψは、スルフヒドリル基がカルボキシメチル化されたシステインからなる非天然アミノ酸残基を指す。SEP−0タンパク質は溶液中で4個のポリペプチドセグメントから合成される:
セグメントSEP−0:1(GRFN1711;配列番号:1の残基1−32からなる):
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH−チオエステル
セグメントSEP−0:2(GRFN1712、配列番号:1の残基33−88からなる)
CSLNEKITVP DTKVNFYAWK RMEVGQQAVE
VWQGLALLSE AVLRGQALLV KSSQPW−チオエステル(ここでCys33がAcmで保護されている)
セグメントSEP−0:3(GRFN1713、配列番号:1の残基89−116からなる):
CPLQLHVDKA VSGLRSLTTL LRALGAQK−チオエステル(ここでCys89がAcmで保護されている)
セグメントSEP−0:4(GRFN1714、配列番号:1の残基117−166からなる):
CAISPPDAAS AAPLRTITAD TFRKLFRVYS
NFLRGKLKLY TGEACRTGDR−カルボン酸塩(ここでC−末端システイン(Cys161)はピコリル(pico)保護基を担う)
【0233】
ペプチドSEP−0:1及びSEP−0:2及びSEP−0:3は、チオエステル生成樹脂上で、Boc(tert−ブトキシカルボニル)化学的処理のためのin situ(現場)中和プロトコル、及び確立されたSPPS、側鎖保護及びチオエステル樹脂戦略を使用する段階的固相ペプチド合成(SPPS)によって(ハッケン(Hackeng)ら、PNAS(1999)96巻:10068−10073ページ;及びシュノルツァ(Schnolzer)ら、Int.J.Pept.Prot.Res.(1992)40巻:180−193ページ)、ABI433A自動ペプチド合成器で、または手動鎖組立てによって合成するか、または商業的販売会社に注文し、そこから入手した。例えばBoc SPPS保護基の標準セット、すなわち:Arg(Tos);Asp(cHex);Cys(4MeBzl)&Cys(Acm);Glu(cHex);His(DNP);Lys(CIZ);Ser(Bzl);Thr(Bzl);Trp(ホルミル);Tyr(BrZ)を使用した;Met、Asn、Glnは側鎖が保護されていなかった。セグメントSEP−0:4は−OCH2−Pam−樹脂上で同様に合成した。これらのペプチドを脱保護し、同時に、標準的Boc化学的処理法によりHF/p−クレゾールを用いて樹脂支持体から分離した;しかしHF/p−クレゾール中に取り出されない保護基を含むペプチド類では、保護基は保持された。上記ペプチド類を分取C4逆相高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)によって精製した。純粋ペプチドを含むフラクションをES−MS(エレクトロスプレー イオン化質量分析法)を使用して同定し、集め、その後のライゲーションのために凍結乾燥した。
【0234】
段階1:ライゲーション#1 セグメントSEP−0:4及びセグメントSEP−0:3をTFEに15mM濃度で溶解した。6M塩化グアニジン及び1%チオフェノールを含む飽和燐酸緩衝液(pH7.9)を加え、ペプチドセグメント類の澄明溶液を生成した。ライゲーション後、ライゲーション混合物を、25%β−メルカプトエタノールを含む、2mlTFE(トリフルオロエタノール)、6ml6M塩化グアニジン、100mM燐酸塩の溶液に加え、20分間インキュベートした。この溶液を、氷酢酸中15mg/ml TCEP(トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンHCl)溶液で酸性にし、分取C4逆相HPLCカラム(直径1インチ)上に注入した。ペプチド類をその後分取勾配逆相HPLCによって精製した。所望の結合産物SEP−0:Acm+SEP−0:3+SEP−0:4を含むフラクションをES−MSによって同定し、集めた。
【0235】
段階2:Acm−除去#1 Acmを除去するために、集めたフラクションSEP−0:Acm+SEP−0:3+SEP−0:4を含むアセトニトリル水溶液を1×HPLC級水で希釈し、固体尿素を最終濃度2モルになるまで加えた。3%酢酸水溶液中30mg/ml Hg(acetate)2溶液を3倍モル過剰(総推定システイン濃度に対して)加え、その溶液を1時間撹拌する。上記溶液をβ−メルカプトエタノール中20%にし、半−分取逆相HPLCカラム上に注入し、段階的勾配で精製した。所望生成物SEP−0:3+SEP−0:4を含むフラクションをES−MSによって同定し、一晩凍結乾燥した。
【0236】
段階3:ライゲーション#2 等量のSEP−0:3+SEP−0:4及びSEP−0:2を生のTFEに15mM濃度で一緒に溶解した。6M塩化グアニジニウム及び1%チオフェノールを含む250mM燐酸緩衝液を加え、上記ペプチドセグメントの澄明溶液を生成した。1日ライゲーションを行った後、ライゲーション混合物を10mlTFE、10mlβ−メルカプトエタノール、10mlピペリジン及び20ml 6M塩化グアニジニウム、pH4、の溶液に加え、20分間インキュベートして残っている全ての保護基を除去した。上記溶液を20%酢酸水溶液中15mg/ml TCEPの溶液で酸性にし、分取逆相HPLCカラム上に置き、直線勾配で精製した。所望の結合生成物SEP−0:Acm+SEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4を含むフラクションをES−MSによって同定し、一晩凍結乾燥した。
【0237】
段階4:カルボキシメチル化 SEP−0:Acm+SEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4をTFE中に15mM濃度になるように溶解した。6M塩化グアニジニウムを含む200mM燐酸緩衝液(pH7.9)の2倍過剰(v/v)を加えると、ペプチドセグメントの澄明溶液が生成した。最小量のメタノールに溶解した25倍過剰のブロモ酢酸を加え、その溶液を2時間反応させた。上記溶液を20%酢酸水溶液中15mg/ml TCEPの溶液で酸性にし、分取逆相HPLCカラムに置き、段階的勾配で精製した。所望のカルボキシメチル化生成物SEP−0:Acm+SEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4+EtをES−MSによって同定し、集めた。
【0238】
段階5:ピコリル除去 亜鉛ダストを2M HCl中で30分間活性化した。ペプチドSEP−0:Acm+SEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4+Etを生のTFEに約10mg/ml濃度になるように溶解した。その溶液を35mg/mlL−メチオニン及び35mg/mlドデシルサルコシン(すなわちN−ドデカノイルサルコシン ナトリウム)を含む(調製時に加える)4×(v/v、TFEに対して)6M塩化グアニジニウム、100mMアセテート、pH4、で希釈した。溶液を活性化Zn粉末に加えた。反応を〜1時間間隔でモニターし、5時間後に完了した。完了後、上澄液を分離し、残るZn粉末を、35mg/mlL−メチオニン及び35mg/mlドデシルサルコシンを含み、20%TFEを含む6M塩化グアニジニウム、pH4、100mMアセテートで5分間、2度洗い、20%β−メルカプトエタノールを含む同じ溶液で1度洗った。合一した生成物を20%酢酸水溶液中15mg/mlTCEPの溶液で酸性にし、分取逆相HPLCカラム上に置き、段階的勾配で精製した。所望の修飾生成物SEP−0:Acm+SEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4+Et−PicoをES−MSによって同定し、集めた。
【0239】
段階6:Acm−除去#2 プールしたSEP−0:Acm+SEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4+Et−Picoの溶液を3×HPLC級水で希釈し、固体尿素を最終濃度2モルになるまで加えた。3%酢酸水溶液に3倍モル過剰(総推定システイン濃度に対して)の30mg/ml Hg(アセテート)2溶液を溶解した溶液を加え、その溶液を1時間撹拌した。上記溶液をβ−メルカプトエタノール20%にし、半−分取逆相HPLCカラム上に載せ、段階的勾配で精製した。所望生成物SEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4+Et+Picoを含むフラクションをES−MSによって同定し、2×(w/w、ペプチド重量に対して)DPC(ドデシルホスホコリン)を含む水2倍量(v/v)で希釈し、一晩凍結乾燥した。
【0240】
段階7:ライゲーション#3 等量のSEP−0:2+SEP−0:3+SEP−0:4+Et+Pico及びSEP−0:1を生のTCEPに15mM濃度で一緒に溶解し、6M塩化グアニジニウムを含む250mM燐酸緩衝液(pH7.5)を加える。その溶液に1%チオフェノールを加えた。1日ライゲーションを行った後、ライゲーション混合物を、10mlTFE、10mlβ−メルカプトエタノール、10mlピペリジン及び20ml6M塩化グアニジニウム、pH4、の溶液に加え、20分間インキュベートし、残っている保護基を除去した。溶液を20%酢酸水溶液中15mg/mlTCEPの溶液で酸性にし、分取逆相HPLCカラム上に置き、直線勾配で精製した。所望の結合生成物SEP−0(1−166):(配列番号1)を含むフラクションをエレクトロスプレー質量分析法によって同定し、2×(w/w、ペプチド重量に対して)ドデシルサルコシンを含む2倍量(v/v)の水で希釈し、凍結乾燥した。
【0241】
段階8 折りたたみ:完全長結合ペプチドSEP−0(1−166)を、6M塩化グアニジニウム及び20%TFE及び10倍モル過剰(タンパク質中のCys残基に対して)のシステインを含む200mMトリス緩衝液(pH8.7)に溶解した。この溶液を、3M塩化グアニジニウムを含む200mMトリス緩衝液(pH8.7)の溶液に対して室温で一晩透析した。上記溶液をその後1M塩化グアニジニウムを含む200mMトリス緩衝液(pH8.7)溶液に対して4℃で4時間再び透析し、最後に10mM燐酸緩衝液(pH7.0)に対して4℃で4時間透析すると最終的折りたたみ生成物が得られた。折りたたみはエレクトロスプレーES−MS及びCD(円二色性)分光法によって証明された。
【0242】
段階9 精製:折りたたまれたポリペプチドをセントリコン(centricon)コンセントレータバイアル中で5倍に濃縮し、10mM燐酸塩、pH7.0で平衡化したResource S カチオン交換カラム上に注いだ。折りたたまれたタンパク質を、500mM NaClまでの直線塩勾配で10分間溶出した。所望の折りたたまれた生成物SEP−0(1−166)を含むフラクションをSDS−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって同定し、凍結し、−80℃で保存した。折りたたまれたタンパク質生成物の分析的逆相HPLCクロマトグラム及びES−MSスペクトル並びにCDスペクトルは折りたたまれたタンパク質の存在を証明した。
【0243】
(実施例2)
合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−L30の合成
第二の合成赤血球産生刺激タンパク質(SEP−1−L30と呼ばれる)は、SEP−0の24及び126の位置にオキシム形成基を含むように合成された。これらの基を用いてSEP−1−L30を形成した;このタンパク質ではSEP−1−L30では直鎖(EDA−Succ−)18カルボン酸塩(EDA=(4,7,10)−トリオキサトリデカン−1,13−ジアミン、TTDとも呼ばれる;Succ=−CO−CH2CH2CO−)ポリマーがタンパク質の主鎖に結合している。完全長SEP−1−(1−166)の配列を次に示す:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA
EHCSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA
VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPWψP
LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAIS
PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR
GKLKLYTGEA CRTGDR(配列番号:2)
上記配列中、ψはスルフヒドリル基がカルボキシメチル化されているシステインからなる非天然アミノ酸残基を示し;KOXは、ε−アミノ基が、指定された水溶性ポリマーにオキシム結合を介して結合したオキシムリンカー基で化学的に改変されている非天然リジンを指す。SEP−1−L30の構造も図17に示される。
【0244】
以下に述べるSEP−1−L30の化学的合成を説明するスキームが図16に示される。つまり、図16A及び16Bにおいて、水溶性ポリマーGRFN32(GP32)がオキシム結合形成化学的ライゲーション反応によってペプチドSEP−1:1及びSEP−1:4に結合する。示されているように、ペプチドSEP−1:1は位置32に、その後の天然型化学的ライゲーションのためのヒスチジン アルファ−カルボキシル チオエステルからなるC−末端Yaa基を担い、位置24には非天然リジン残基(その側鎖は化学的に改変され、アミノオキシアシル部分を含んでなるUn=1基を有する)を担う。最終的完全長生成物の位置1に相当するN−末端アラニンが参照のため示される。ペプチドSEP−1:4は位置117にシステインを含む非保護N−末端Xaa基を有し、Un=1基は位置126(天然ヒトEPOのグリコシル化部位)にアミノオキシアシルで改変されたリジンを、位置161にピコリル基で保護された側鎖チオールを有するシステイン(ジスルフィド形成システイン)を含んでなる。Cys161は保護され、天然型化学的ライゲーション部位のために行われるその後のシステイン変換時のチオアルキル化は阻止される(図16D参照);また、ピコリル保護基を使用するのは、その除去が、最初の天然型化学的ライゲーション反応におけるAcm(アセタミドメチル)保護システインを除去するために必要な条件に直交的であるからである(図16C参照)。位置24及び位置126におけるGP32ポリマー構成物の部位特異的及び排他的付加は、オキシム形成化学的ライゲーションによって行われ、精密なポリマー修飾ペプチドSEP−1:1+GP32及びSEP−1:4+GP32を生成する。図16CはSEP−1:4+GP32の、ミドルペプチドセグメントSEP−1:3への天然型化学的ライゲーションと、SEP−1:3+SEP−1:4+GP32の生成を示す。その結合部位はLys116及びCys117である。示されるように、ペプチドSEP−1:3は位置89に、Acm保護システインを含むN−末端Xaa基を含み、位置116にはリジン アルファ−カルボキシル チオエステルを含むC−末端Yaa基を含む。天然型化学的ライゲーション後、Acm保護基は除去され、このライゲーション生成物は次のライゲーション反応のために使われる。図16DはSEP−1:3+SEP−1:4+GP32の、ミドルペプチドセグメントSEP−1:2への天然型化学的ライゲーション、及びSEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP32の生成を示す。その結合部位はTrp88及びCys89である。示されるように、ペプチドSEP−1:2は位置33にAcmシステインを含むN−末端Xaa基、及び位置89にトリプトファン アルファ−カルボキシル チオエステルを含むC−末端Yaa基を有する。天然型化学的ライゲーション後、ライゲーション生成物をブロモ酢酸にさらし、ライゲーション部位システイン89及び117の側鎖チオールをカルボキシメチル化し、それらを擬似グルタミン酸に変換する。カルボキシメチル化後、Acm及びピコリル保護基を除去し、この非保護、ポリマー修飾ライゲーション産物を次のライゲーション反応に使う。図16EはSEP−1−:3+SEP−1:4+GP32の、ペプチドセグメントSEP−11+GP32(完全長生成物のN−末端セグメントに相当する)への天然型化学的ライゲーション、及び完全長SEP−1−L30生成物SEP−1:1+GP32+SEP−1:2+SEP−1:3+SEP+1:4+GP32の生成を示す;その最後のライゲーション部位はHis32とCys33である。示されるように、完全長SEP−1−L30生成物はユーザーが決めた部位、すなわち天然ヒトEPOの位置24及び位置126に相当するグリコシル化部位だけに結合する2個の水溶性ポリマー(G32)を含む。上記合成の詳細を次に記載する。
【0245】
A.GRFN1776及びGRFN1711とGRFNP32とのオキシム化 オキシム形成を行い、アミノオキシアセチル基を担う水溶性ポリマーをケトンカルボニル基を担持するペプチドに結合した。これを実現するために下記のペプチドセグメントを合成した。:
セグメントSEP−1:4(GRFN1776;配列番号2の残基117−166からなる):
CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRKLFRVYS
NFLRGKLKLY TGEACRTGDR−カルボン酸塩(ここでLys126はε−アミノ基のレブリン酸残基で改変され、Cys117はAcmで保護されている)
セグメントSEP−1:1(GRFN1711、配列番号2の残基1−32からなる):
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA
EH−チオエステル(ここでLys24はレブリン酸残基で改変される)
【0246】
セグメントSEP−1:1(GRFN1711)は実施例1におけるようにチオエステル生成樹脂上で合成し、SEP−1:4(GRFN1776)は−OCH2−Pam−樹脂上で合成した。これら2つのペプチドセグメントのリジン24及び126では最初はε−アミノ基がFmoc基で保護されていた。鎖の組立ての完了後、Fmoc担持アミノ基は標準的Fmoc脱保護操作にしたがって脱保護され、各ペプチド樹脂それぞれへのレブリン酸の結合によって改変された。実施例1に記載したように上記ペプチドを脱保護し、同時に樹脂支持体から切り離した。これらペプチドを分取C4逆相HPLCによって精製した。純粋ペプチドを含むフラクションをES−MSを使用して同定し、集め、その後のライゲーションのために凍結乾燥した。GRFNP32[−(EDA−Succ)18カルボン酸塩]を標準的プロトコルにしたがってサスリン(Sasrin)カルボキシル生成樹脂上で組立てた(ローズ(Rose,K.)ら、米国特許出願第09/379,297号;ローズら、J.Am.Chem.Soc.(1999)121巻:7034ページ)。アミノオキシアセチル(AoA)部分を、活性化Boc−アミノオキシ酢酸の5倍過剰をカップリングすることによって、上記ポリマーのN−末端アミノ基に付加した。古典的Fmoc−化学操作を使用してポリマー鎖を樹脂支持体から切り離した。上記ポリマー鎖を分取C4逆相HPLCによって精製した。純粋ポリマーを含むフラクションをES−MSによって同定し、集め、その後のライゲーションのために凍結乾燥した。
【0247】
セグメントSEP−1:4及びGRFNP32を一緒に等モル比で、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液に溶解した。上記溶液を凍結乾燥した。乾燥した粉末を溶解し、分取勾配C4逆相HPLCによってポリマー修飾ペプチドを未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化生成物SEP−1:4+GP32を含むフラクションをES−MSによって同定し、集め、凍結乾燥した。
【0248】
セグメントSEP−1:1及びGRFNP32を一緒に等モル比で、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液に溶解した。上記溶液を凍結乾燥した。乾燥した粉末を溶解し、分取勾配C4逆相HPLCによってポリマー修飾ペプチドを未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化生成物SEP−1:1+GP32を含むフラクションをES−MSによって同定し、集め、凍結乾燥した。
【0249】
B.合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−L30の合成
SEP−1−L30を溶液中で4ポリペプチドセグメントから合成した:
セグメントSEP−1:1+GP32(GRFN1711+GRFNP32、配列番号:2の残基1−32に相当する):
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA
EH−チオエステル(ここでLys24ではε−アミノ基が、KOXとして示されるレブリン−アミノオキシアセチル(Lev−AoA)オキシム結合によってGRFNP32にカップリングしたレブリン オキシム リンカー基で改変されている)
セグメントSEP−1:2(GRFN1712、配列番号:2の残基33−88に相当する):
CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA
VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPW−チオエステル(ここでCys33はAcmで保護されている)
セグメントSEP−1:3(GRFN1713、配列番号:2の残基89−116に相当する):
CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK−チオエステル(ここではCys89がAcm保護されている)
セグメントSEP−1:4+GP32(GRFN1776+GRFNP32、配列番号:2の残基117−166に相当する):
CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK
LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR−カルボン酸塩(ここでLys126ではε−アミノ基が、KOXと示されるレブリン−アミノオキシアセチル(Lev−AoA)オキシム基によってGRFNP32にカップリングするレブリン オキシム リンカー基で改変されており、C−末端システインはピコリル(pico)保護基を担持する)
【0250】
付加的ペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、折りたたみ及び精製を実施例1の記載のように行って、完全長の、折りたたまれたSEP−1−L30を得た。上記折りたたまれたタンパク質生成物の分析的逆相HPLCクロマトグラム及びES−MSスペクトル並びにCDスペクトルは折りたたまれたタンパク質の存在を証明した。
【0251】
(実施例3)
合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−L26の合成
第三の合成赤血球産生刺激タンパク質(SEP−1−L26と呼ばれる)を、SEP−0の位置24及び126にオキシム形成基を含むように合成した。これらの基を使ってSEP−1−L26を形成した;その際直鎖ポリマー(EDA−Succ)18カルボン酸塩及び(EDA−Succ)6−アミドがタンパク質主鎖の位置24及び126にそれぞれオキシム結合によって連結した。完全長SEP−1(1−166)の配列を次に示す:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA
EHCSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA
VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPWψP
LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAIS
PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR
GKLKLYTGEA CRTGDR(配列番号:2)
上記配列中、ψは、スルフヒドリル基がカルボキシメチル化されているシステインからなる非天然アミノ酸残基をあらわし、KOXは、ε−アミノ基が、“オキシム結合によって指定の水溶性ポリマーにカップリングしたオキシムリンカー基”で化学的に改変されている非天然リジンをあらわす。
SEP−1−L30とは異なり、SEP−1−L26構成物は位置126に結合した比較的小さい、電荷をもたない水溶性ポリマーを担うように設計された。位置24に付加するポリマーはSEP−1−L30と同じであった。完全長生成物の組立ては実施例2の記載と同様であった。SEP−1−L26の構造は図18に示される。
【0252】
A.GRFNP6によるGRFN1776のオキシム化、及びGRFNP32によるGRFN1711のオキシム化
オキシム形成を行い、アミノオキシアセチル基を担う水溶性ポリマーを、ケトンカルボニル基を担うペプチドに結合した。これを実現するために下記のペプチドセグメントを合成した:
セグメントSEP−1:4(GRFN1776;配列番号:2の残基117−166からなる):
CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRKLFRVYS
NFLRGKLKLY TGEACRTGDR−カルボン酸塩(ここでLys126は、ε−アミノ基がレブリン酸残基で改変され、Cys117はAcmで保護されている)
セグメントSEP−1:1(GRFN1711、配列番号:2の残基1−32からなる):
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA
EH−チオエステル(ここでLys24はレブリン酸残基で改変されている)
【0253】
実施例1と同様にセグメントSEP−1:1(GRFN1711)は、チオエステル生成樹脂上で、セグメントSEP−1:4(GRFN1776)は−OCH2−Pam樹脂上で合成された。これら2つのペプチドセグメントのリジン24及び126は先ず最初にε−アミノ基をFmocで保護された。鎖組立ての完了後、Fmocを担うアミノ基を、標準的Fmoc保護基除去法によって脱保護し、標準的カップリング プロトコルによって、各ペプチド樹脂にそれぞれレブリン酸を付加することによって改変した。それから上記ペプチドを脱保護し、同時に実施例1と同様のBoc化学操作によって樹脂支持体から切り離した。これらペプチドを別々に分取C4逆相HPLCによって精製した。各ペプチドについて、純粋ペプチドを含むフラクションをES−MSによって同定し、集め、その後のライゲーションのために凍結乾燥した。
【0254】
水溶性ポリマー(EDA−Succ)18カルボン酸塩(GRFNP32)をサスリン カルボキシ生成樹脂上で標準的プロトコルにしたがって組み立てた(ローズら、米国特許出願第09/379,297号;ローズら、J.Am.Chem.Soc.(1999)121巻:7034ページ)。水溶性ポリマー(EDA−Succ)6−アミド(GRFNP6)を下記の標準プロトコルにしたがってシーバー(Sieber)アミド−生成樹脂上で組み立てた(ローズら、米国特許出願第09/379,297号;ローズら、J.Am.Chem.Soc.(1999)121巻:7034ページ)。活性化Boc−アミノオキシ酢酸の5倍過剰をカップリングすることによって、アミノオキシアセチル(AoA)部分を各樹脂結合ポリマーのN−末端アミノ基に付加した。古典的Fmoc化学操作を使って、2つのポリマー鎖を別々にそれぞれの樹脂支持体から切り離した。各ポリマー鎖を分取逆相HPLCによって精製した。各ポリマーで、純粋ポリマーを含むフラクションをES−MSによって同定し、集め、その後のライゲーションのために凍結乾燥した。
【0255】
セグメントSEP−1:4及びGRFNP6を等モル比で一緒に、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液に溶解した。この溶液をその後凍結乾燥した。乾燥した粉末を溶解し、ポリマー修飾ペプチドを分取勾配C4逆相HPLCによって未修飾ペプチド及び未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化生成物SEP−1:4+GP6を含むフラクションをES−MSによって同定し、集め、凍結乾燥した。
セグメントSEP−1:1及びGRFNP32を等モル比で一緒に、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液に溶解した。この溶液をその後凍結乾燥した。乾燥した粉末を溶解し、ポリマー修飾ペプチドを分取勾配C4逆相HPLCによって未修飾ペプチド及び未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化生成物SEP−1:1+GP32を含むフラクションをES−MSによって同定し、集め、凍結乾燥した。
【0256】
B.合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−L26の合成
SEP−1−L26を溶液中で4ポリペプチドセグメントから合成した:
セグメントSEP−1:1+GP32(GRFN1711+GRFNP32、配列番号:2の残基1−32に相当する):
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA
EH−チオエステル(ここでLys24はε−アミノ基のところで、KOXとして示されるレブリン−アミノオキシアセチル(Lev−AoA)オキシム結合によってGRFNP32にカップリングしているレブリンオキシム リンカーで改変されている)
セグメントSEP−1:2(GRFN1712、配列番号:2の残基33−88に相当する):
CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA
VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPW−チオエステル(ここではCys33はAcmで保護されている)
セグメントSEP−1:3(GRFN1713、配列番号:2の残基89−116に相当する):
CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK−チオエステル(ここではCys89はAcmで保護されている)
セグメントSEP−1:4+GP6(GRFN1776+GRFNP6、配列番号:2の残基117−166に相当する):
CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK
LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR−カルボン酸塩(ここでLys126は、ε−アミノ基が、KOXとして示されるレブリン−アミノオキシアセチル(Lev−AoA)オキシム結合によってGRFNP6にカップリングしているレブリン オキシム リンカー基で改変され、C−末端システイン[すなわちCys161]はピコリル(pico)保護基を担う)
【0257】
その他のペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、折りたたみ及び精製が実施例1及び2に記載のように実施され、完全長の折りたたまれたSEP−1−L26を与える。折りたたまれたタンパク質生成物の分析的C4逆相HPLCクロマトグラム及びES−MSスペクトル並びにCDスペクトルは折りたたまれたタンパク質の存在を証明した。
【0258】
(実施例4)
合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−B50の合成
第四の合成赤血球産生刺激タンパク質(SEP−1−B50と呼ばれる)を合成した。完全長SEP−1−B50のアミノ酸配列はSEP−1−L30のそれと同じである:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA
EHCSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA
VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPWψP
LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAIS
PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR
GKLKLYTGEA CRTGDR(配列番号:2)
上記配列中、ψは、スルフヒドリル基がカルボキシメチル化されているシステインからなる非天然アミノ酸残基を示し;KOXは、ε−アミノ基が、指定された水溶性ポリマーにオキシム結合によってカップリングしているオキシム リンカー基で化学的に改変されている非天然リジンを示す。
【0259】
しかし、上記タンパク質をSEP−1−L30の直鎖(Succ−EDA)18ポリマーでなく、4個の直鎖(Succ−EDA)12を有する枝分かれポリマー構成物で誘導体化した。誘導体化はオキシム結合によって行われた。
【0260】
図19は以下に詳細に説明するように、オキシム形成ライゲーションによってSEP−1−B50に連結した枝分かれ水溶性ポリマーGRFNP29(GP29)の化学的合成を図示するスキームである。図19に示すように、直交的に保護されたリジンU−B前駆体を使用してU基としてアミノオキシアセチルを担持し、4個のペンダント チオール基を担う3×リジン枝分かれコアBを有するU−B成分GRFN17(GP17)を生成した。上記4個のペンダントチオール基はその後チオエーテル結合によってGP29と呼ばれる直鎖水溶性ポリアミドエチレンオキシド構成物(これは琥珀酸残基によって与えられるペンダントカルボン酸塩を担う)にカップリングする。SEP−1−B50の構造は図20に示される。
【0261】
A.複数のチオール基を担うテンプレートGRFNP17の合成
テンプレートGRFNP17をアミド生成(4−メチル)ベンズヒドリルアミン(MBHA)−樹脂上で0.4mmol規模で手で合成した。Fmoc−Lys(Boc)−OHを標準的カップリングプロトコルを使用してカップリングした(シュネルツァー(Schn lzer)Int.J Pept Protein Res.(1992)40巻、180−93ページ)。0.5M HBTU3.8ml中2.1mmolアミノ酸、10%DIEAを使用した;すなわち5倍過剰のアミノ酸を使用した。Fmoc保護基の除去後、標準的アミノ酸カップリングプロトコルを用いてFmoc−Lys(Fmoc)−OHをカップリングした(0.5M HBTU3.8ml中2.1mmolアミノ酸、10%DIEA;すなわち5倍過剰のアミノ酸)。第二のFmoc除去段階後、Fmoc−Lys(Fmoc)−OHを標準的アミノ酸カップリングプロトコルを用いてカップリングした(0.5M HBTU7.6ml中4.2mmolアミノ酸、10%DIEA;すなわち遊離アミンに対して5倍過剰のアミノ酸)。最後のFmoc脱保護段階後、DMF中の5倍過剰の(遊離アミンに対して)S−アセチルチオグリコール酸ペンタフルオロフェニルエステル(SAMA−oPfp)を30分間カップリングした。生のTFAで1分間づつ2回バッチ洗浄することによって、C−末端リシル残基の側鎖のBoc保護基を除去し、その後DMF中10%DIEAで洗うことによって上記樹脂を中和した。2mmolBoc−アミノオキシ酢酸と2mmolN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を3mlのDMFに溶解した。2mmolDIC(ジイソプロピルカルボジイミド)の添加後、上記酸を30−60分間活性化した。その溶液を、中和した上記樹脂に加え、1時間カップリングした。最後にS−結合アセチル基をDMF中20%ピペリジンで30分間除去した。遊離アルデヒドの掃去剤としてのシステインの存在下で、標準的Boc−化学的操作によりHF/p−クレゾールを使用してテンプレートを脱保護し、同時に樹脂支持体から切り離した(シュネルツァー、Int.J Pept Protein Res.(1992)40巻:180−93ページ)。50%B[すなわち0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液](アルデヒドを含まず)中の回収ポリアミドを凍結乾燥した。精製のために、テンプレート粗生成物を2ml50%Bに溶解し、100%A[すなわち0.1%TFA水溶液]100mlを加えてサンプルを希釈した(アルデヒドの添加が保証されているから、グアニジニウム塩化物またはグアニジニウム アセテートの添加は避ける)。3%B、T=40℃で平衡化したC4分取逆相HPLCカラム上にテンプレートを載せた。塩類をアイソクラチック溶出し、所望のテンプレート、GRFNP17を直線勾配で精製した。所望生成物を含むフラクションをES−MSによって同定し、集め、凍結乾燥した。
【0262】
B.枝分かれ水溶性ポリマーGRFNP29の合成
GRFNP29、15kDa分子量を有する枝分かれ(EDA−Succ)12ポリマー、を精製チオール含有テンプレートGRFNP17および直鎖ポリマーGRFNP31、Br−アセチル−(EDA−Succ)12カルボン酸塩のチオエーテル生成結合によって合成した;その際GRFNP31はサスリン カルボキシ生成樹脂上で標準的プロトコルにしたがって合成された(ローズら、米国特許出願第09/379,297号;ローズら、J.Am.Chem.Soc.(1999)121巻:7034ページ)。
【0263】
1.3モル過剰(総チオールを上回る)の精製GRFNP31、Br−アセチル化(EDA−Succ)12、及び精製チオール含有テンプレートGRFNP17を一緒に、0.1Mトリス−HCl/6Mグアニジニウム塩化物(pH8.7)に 〜10mM濃度で溶解した。溶解後、溶液を0.1M トリス−HCl、pH8.7緩衝液で3倍(v/v)に希釈した。上記ライゲーション混合物を室温で撹拌し、反応を逆相HPLC及びES−MSによってモニターした。追加的GRFNP31反応体を必要なバイアスで加え、所望の反応生成物が主要生成物になるようにした。仕上げのために3×(v/v、ライゲーション混合物に対して)0.1Mアセテート/6Mグアニジニウム塩化物(pH4)を加え、その溶液を分取逆相HPLCカラム上に注ぎ、直線勾配で精製した。純粋GRFNP29構成物を含むフラクションをES−MSを使って同定し、集め、凍結乾燥した。
【0264】
C.GRFN1776及びGRFN1711のGRFNP29によるオキシム化
セグメントSEP−1:4及びセグメントSEP−1:1を実施例2に記載のように合成した。セグメントSEP−1:4及びGRFNP29を等モル比で一緒に、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液に溶解した。その溶液を凍結乾燥した。乾燥した粉末を分取逆相HPLCカラム(1インチ直径)に載せた。ポリマー修飾ペプチドを分取勾配C4逆相HPLCによって未修飾ペプチド及び未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化生成物SEP−1:4+GP29を含むフラクションをES−MSによって同定し、集めた。
セグメントSEP−1:1及びGRFNP29を一緒に等モル比で、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液に溶解した。乾燥した粉末を0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液に溶解し、分取GPC(ゲル透過クロマトグラフィー)カラム(1インチ直径)上に載せた。ポリマー修飾ペプチドをアイソクラチック溶出によって未修飾ペプチド及び未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化生成物SEP−1:1+GP29を含むフラクションをES−MSによって同定し、集めた。
【0265】
D.合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−B50の合成
SEP−1−B50(配列番号:2)を溶液中で4ポリペプチドセグメントから合成した:
セグメントSEP−1:1+GP29(GRFN1711+GRFNP29、配列番号:2の残基1−32に相当する):
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA
EH−チオエステル(ここでLys24はε−アミノ基が、KOXとして示されるレブリン−アミノオキシアセチル(Lev−AoA)オキシム結合によってGRFNP29に結合したレブリン オキシム リンカー基で改変されている)
セグメントSEP−1:2(GRFN1712、配列番号:2の残基33−88に相当する):
CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA
VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPW−チオエステル(ここではCys33はAcmで保護されている)
セグメントSEP−1:3(GRFN1713、配列番号:2の残基89−116に相当する):
CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK−チオエステル(ここではCys89はAcmで保護されている)
セグメントSEP−1:4+GP29(GRFN1776+GRFNP29、配列番号:2の残基117−166に相当する);
CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK
LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR−カルボン酸塩(ここでLys126は、ε−アミノ基が、KOXとして示されるレブリン−アミノオキシアセチル(Lev−AoA)オキシム結合によってGRFNP29に結合したレブリン オキシム リンカー基で改変されており、C−末端システインはピコリル(pico)保護基を担う)
【0266】
その他のペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、折りたたみ、及び精製は、精製がリソース(Resource)Qカラム上で行われたこと以外は、実施例1及び実施例2に記載のように行われ、完全長、折りたたまれたSEP−1−B50(配列番号:2)を得た。折りたたまれたタンパク質生成物SEP−1−B50の分析的C4逆相HPLCクロマトグラム及びES−MS並びにCDスペクトルは折りたたまれたタンパク質の存在を証明した。
【0267】
(実施例5)
合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−3−L42の合成
第五の合成赤血球産生刺激タンパク質(SEP−3−L42と呼ぶ)を合成した。完全長SEP−3のアミノ酸配列は次の通りである:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA
EHCSLNECIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA
VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LACSSQPWEP
LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKEAIS
PPDAACAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR
GKLKLYTGEA CRTGDR(配列番号:3)
位置:24、38、83及び126のシステイン残基をマレイミド官能化(EDA−Succ)18(GRFNP32)ポリマー単位で修飾し(マイケル付加反応による)、SEP−3−L42を生成した。SEP−3−L42の構造は図22に示される。
【0268】
下に記載するSEP−3−L42の化学的合成を説明するスキームは図21に示す。つまり、図21Aおよび21BはSEP−3:1からSEP−3:4までの4個のSEP−3−L42ペプチドセグメントの天然型化学的ライゲーションを示す。そのライゲーションは、ヒトEPOの4個全ての天然グリコシレーション部位に相当するライゲーション部位にシステインを生成する。特に、図21Bは全て保護されたジスルフィド形成システインを有する完全長ポリペプチドを示し、4個の帯電直鎖水溶性ポリマー(GRFN32−マレイミド(GP32−マレイミド)と呼ばれる)がマイケル付加反応によってシステインライゲーション部位に部位特異的に結合できる。図21Bはジスルフィド形成システインの最終的脱保護段階と完全長、ポリマー修飾生成物の生成も示す。
【0269】
詳細に述べれば、SEP−3を溶液中で4ポリペプチドセグメントから合成した:
セグメントSEP−3:1(GRFN1747、配列番号の残基1−37に対応する):
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA
EHCSLNE−チオエステル(ここでCys7、Cys29、及びCys33はAcmで保護されている)
セグメントSEP−3:2(GRFN1774、配列番号3の残基38−82に対応する):
CIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALLSEAVLRGQAL LA−チオエステル(ここでCys38はAcm基で保護された側鎖である)
セグメントSEP−3:3(GRFN1749、配列番号:3の残基83−125に相当する):
CSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR
ALGAQKEAIS PPDAA−チオエステル(ここではCys83がAcm基で保護された側鎖である)
セグメント−3:4(GRFN1750、配列番号:3の残基126−166に相当する):
CAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR
GKLKLYTGEA CRTGDR−カルボン酸塩(ここではCys161はPbo[すなわち4−(CH3S(O)−)ベンジル−]で保護されている)
【0270】
ペプチド合成:ペプチドSEP−3:1及びSEP−3:2及びSEP−3:3を、チオエステル生成樹脂上で、Boc化学SPPSのためのin situ中和プロトコルによって、実施例1に記載したような確立された側鎖保護戦略を用いて(上記の特定のペプチドについて記したように保護基戦略に変化を加えて)、合成した。セグメントSEP−3:4は−OCH2−Pam樹脂上で同様に合成した。上記ペプチド類は実施例1に記載したように、脱保護し、同時に樹脂支持体から切り離した。上記の生成したペプチドを分取RP−HPLCによって精製した。純粋ペプチドを含むフラクションをES−MSを使用して同定し、集め、その後のライゲーションのために凍結乾燥した。
【0271】
段階1:ライゲーション#1。セグメントSEP−3:4及びセグメントSEP−3:3をTFEに15mM濃度で溶解した。6Mグアニジニウム塩化物及び1%チオフェノールを含む飽和燐酸緩衝液(pH7.5)を加えるとペプチドセグメントの澄明溶液が生成した。ライゲーション後、ライゲーション混合物(1容量とする)を2容量の{2mlTFE、6ml6Mグアニジニウム塩化物、100mM燐酸塩、25%β−メルカプロエタノールを含む}溶液に加え、20分間インキュベートした。溶液を氷酢酸中15mg/ml TCEP溶液で酸性にし、分取C4逆相HPLCカラム上に載せ、直線勾配で精製した所望の結合産物SEP−3:Acm+SEP−3:3+SEP−3:4を含むフラクションをES−MSによって同定し、集めた。
【0272】
段階2:Acm−除去#1 Acmを除去するために、プールしたSEP−3:Acm+SEP−3:3+SEP−3:4のフラクションを含むアセトニトリル水溶液を1×HPLC級−水で希釈し、固体尿素を最終濃度2モルになるまで加えた。3%酢酸水溶液中30mg/mlHg(アセテート)2溶液を3倍モル過剰(期待される総システイン濃度に対して)に加え、その溶液を1時間撹拌した。その後上記溶液をβ−メルカプトエタノール20%にし、半−分取C4逆相HPLCカラム上に注ぎ、段階的勾配で精製した。所望結合産物SEP−3:3+SEP−3:4を含むフラクションをES−MSによって同定し、一晩凍結乾燥した。
【0273】
段階3:ライゲーション#2 等量のSEP−3:3+SEP−3:4及びSEP−3:2を一緒に、15mM濃度で生のトリフルオロエタノールに溶解し、1%チオフェノールを加えると、上記ペプチドセグメントの澄明溶液が生成した。1日ライゲーションを行った後、ライゲーション混合物(1容量とする)を10mlTFE、10mlβ−メルカプロエタノール、10mlピペリジン及び20ml&Mグアニジニウム、pH4、の溶液2容量に加え、20分間インキュベートし、残っている保護基を全て除去した。上記溶液を20%酢酸水溶液中15mg/mlTCEP溶液で酸性にし、分取C4逆相HPLCカラム上に載せ、直線勾配で精製した。所望の結合産物SEP−3:Acm+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4を含むフラクションをES−MSによって同定し、一晩凍結乾燥した。
【0274】
段階4:Acm除去。Acmを除去するために、SEP−3:Acm+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4を含むアセトニトリル水溶液を1×HPLC級−水で希釈し、固体尿素を最終濃度2モルになるまで加えた。3%酢酸水溶液中30mg/mlHg(アセテート)2溶液を3倍モル過剰(期待される総システイン濃度に対して)に加え、その溶液を1時間撹拌した。上記溶液をβ−メルカプロエタノール20%にし、C4半分取逆相HPLCカラム上に載せ、段階的勾配で精製した。所望の結合産物SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4を含むフラクションをES−MSによって同定し、一晩凍結乾燥した。
【0275】
段階5:ライゲーション#3 等量のSEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4及びSEP−3:1を一緒に15mM濃度で生のTFEに溶解した。6Mグアニジニウム及び1%チオフェノールを含む燐酸緩衝液(pH7.5)を加えると上記ペプチドセグメントの澄明溶液が生成した。1日ライゲーションを行った後、ライゲーションミックス(1容量とする)を10mlTFE、10mlβ−メルカプロエタノール、10mlピペリジンおよび20ml6Mグアニジニウム、pH4、の溶液2容量に加え、20分間インキュベートして残っている保護基を除去した。上記溶液を20%酢酸水溶液中15mg/mlTCEPの溶液で酸性にし、分取C4逆相HPLCカラム上に載せ、直線勾配で精製した。所望結合産物SEP−3:1+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4を含むフラクションをES−MSによって同定し、一晩凍結乾燥した。
【0276】
段階6:ポリマーGRFNP32の付加。GRFNP32−マレイミドと呼ばれるマレイミド官能化直鎖(EDA−Succ)18ポリマーを次のように合成した:GRFNP32を、メーカーのプロトコルにしたがってBMPS(3−マレイミド プロピオン酸NHSエステル、ピアース(Pierce)、USA)で官能化し、マレイミド官能化(EDA−Succ)18ポリマー[すなわちマレイミド−(EDA−Succ)18]を形成した。SEP−3:1+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4を必要最小量のTFEに溶解した。3倍過剰のGRFNP32−マレイミドを6Mグアニジニウム塩化物、100mM燐酸塩、pH7.5、に溶解し、TFE溶液に加えた。マイケル付加反応の進行を分析的逆相HPLCによって辿った。反応が完了した後、この溶液を分取C4逆相HPLCカラム上に注ぎ、直線勾配で精製した。所望のポリマー修飾産物SEP−3:Acm+SEP−3:1+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4+pPEG[すなわちCys24、Cys38、Cys83及びCys126の側鎖チオールに結合したGRFNP32の4コピーを有する結合完全長166残基ポリペプチド鎖であり、このためSEP−3:Acm+SEP−3:1+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4+GP32とも呼ばれる]を含むフラクションをES−MSによって同定し、一晩凍結乾燥した。
【0277】
段階7:Pboの除去 Pboを還元するために、SEP−3:Acm+SEP−3:1+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4+GP32を、5%エタンジチオールを含む生のTFAに溶解した。Pbo基を、10%チオアニソール及び15%ブロモトリメチルシランの添加によって30分間切り離した。上記溶液を回転蒸発器で乾燥し、0.1%TFAを含むアセトニトリル水溶液に取った。生成した溶液を半−分取逆相HPLCカラム上に注ぎ、段階的勾配で精製した。所望Cys161−脱保護産物SEP−3:Acm+SEP−3:1+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4+GP32−Pboを含むフラクションをES−MSによって同定し、一晩凍結乾燥した。
【0278】
段階8:Acm除去。Cys7、Cys29、及びCys33の側鎖からの最終的Acm除去のために、プールしたSEP−3:Acm+SEP−3:1+SEP−3:2+SEP−3:3+SEP−3:4+GP32−Pboフラクションを含むアセトニトリル水溶液を1×HPLC級−水で希釈し、固体尿素を最終濃度2モルになるまで加えた。3%酢酸水溶液中30mg/mlHg(アセテート)2溶液を3倍モル過剰(期待される総システイン濃度に対して)に加え、その溶液を1時間撹拌した。上記溶液をβ−メルカプトエタノール20%にし、半−分取C4逆相HPLCカラムに載せ、段階的勾配で精製した。所望の結合ポリマー修飾産物SEP−3(1−166)をES−MSによって同定し、一晩凍結乾燥した。
【0279】
段階9:折りたたみ:完全長結合、ポリマー修飾ペプチドSEP−3(1−166)を、6Mグアニジニウム塩化物及び20%TFE及び10倍モル過剰(SEP−3のCys残基に対して)のシステインを含む200mMトリス緩衝液(pH8.7)に溶解した。この溶液を3Mグアニジニウム塩化物を含む200mMトリス緩衝液(pH8.7)の溶液に対して室温で一晩透析し、最後に10mM燐酸緩衝液(pH7.0)に対して4℃で4時間透析し、最終的折りたたみ生成物を得た。折りたたみはエレクトロスプレーES−MS及びCDスペクトロメトリーによって確認された。
【0280】
段階10 精製:折りたたまれたポリペプチドはセントリコン(centricon)コンセントレータ バイアル中で5倍に濃縮され、10mM燐酸塩(pH7.0)で平衡化したリソースS(Resource S)カチオン交換カラムに置かれる。折りたたまれたタンパク質は500mMNaClまでの直線塩勾配で10分間溶出された。所望の折りたたまれた産物SEP−3−L42を含むフラクションをSDS−PAGEによって同定し、凍結して−80℃で保存した。
【0281】
(実施例6)
合成赤血球産生刺激タンパク質の生物活性のアッセイ
折りたたまれた合成赤血球産生刺激タンパク質、SEP−0、SEP−1−L26、SEP−1−L30、SEP−1−B50、及びSEP−3−L42の生物活性をUT/7及び32D 103197細胞系を使用し、対照標準として市販の組換えエリスロポエチンを用いる因子依存性(factor−dependent)細胞系増殖アッセイによって測定した。UT−7は、インターロイキン−3、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、またはエリスロポエチン(EPO)の一つに絶対的に依存して増殖および生存するヒト巨核芽球性白血病細胞系である(ミウラ Y、ら、Acta Haematol(1998)99巻:180−184ページ);コマツ N、ら、Canc.Res.(1991)51巻:341−8ページ)。32D 103197はネズミ赤血球産生細胞系である(メトカーフ(Metcalf,D)Int.J Cell Cloning(1992)10巻:116−25ページ)。
【0282】
SEP構成物の保存溶液をイスコフ(Iscove)の改良ダルベッコ培地(IMDM)、10%FBS(ウシ胎児血清)、グルタミン及びペンストレプ(Penstrep)で作り、これらの保存溶液の2×希釈液をマルチウェル−プレートに加え、それに濃度5000細胞/50μlのヒトUT/7EPO細胞を加えた。プレートを5%CO2の存在のもとで37℃でインキュベートし、増殖を毎日モニターした。4日後、PBS(燐酸緩衝食塩液)中2.5mg/ml MTT(メチルチアゾール テトラゾリウム)20μlを加え、プレートを4時間インキュベートした。150μl IPAを加え、各ウェルの吸光度を562nmで読んだ。上記SEP化合物類のED50(最大効果の50%に達する有効量)値を測定し、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)−細胞で産生されたrhEPO(組換えヒトエリスロポエチン)のそれと比較した。これらの実験の結果は、合成赤血球産生刺激タンパク質の全てが生物活性をあらわすことを証明した。SEP−0、SEP−1−L26、SEP−1−L30、SEP−1−B50のED50結果を表VIに示す。
【0283】
表VI
【表5】
【0284】
ポリマー修飾SEP−1−L30において吸光度によってタンパク質濃度を計算するために吸光係数を使用してペプチド含有量を標準化した際、これらの実験から得られるその他の結果をSEP−0、SEP−1−L26、SEP−1−L30、SEP−1−B50、SEP−3−L42及びSEP−1−B51(SEP−1−B51化合物の合成は実施例7に説明される)について表VIIおよび図28に示した。まとめて言うと、これらのin vitroアッセイは、ポリマー構造及び結合部位が変わるとin vitro生物活性に異なる効果があらわれることを示している。その際これらの化合物は(1)ヒトEPO受容体活性について試験した際には以下の相対的順序の効力を有し(最大効力から最小効力へ):SEP−1−L26≒SEP−1−L30>SEP−1−B50≒SEP−1−B51>SEP−3−L42>SEP−0;そして(2)マウスEPO受容体活性について試験した際には以下の相対的順序の効力を有する(最大効力から最小効力へ):SEP−1−L26>SEP−1−L30>SEP−0>SEP−3−L42>SEP−1−B50≒SEP−1−B51。
【0285】
表VII
【表6】
【0286】
表VIIおよび図28の結果も、非ポリマー修飾構成物SEP−0に比較してポリマー修飾SEP構成物に対する受容体選択性(preference)に非ポリマー修飾構成物SEP−0に比較して有意差があることを示す。特に、SEP−1−L26は、対応するヒトEPOグリコシル化部位、位置24(この部位に結合したペンダント負電荷を有する5.5kDa直鎖ポリマー)及び位置126(この部位に結合したペンダント中性電荷を有する1.8kDa直鎖ポリマー)に結合した異なる直鎖ポリマーで修飾されている;この構成物はヒト及びマウス受容体両方に同様の活性を有する。SEP−1−L30は対応するヒトEPOグリコシル化部位である位置24及び126にペンダント負電荷を有する5.5kDa直鎖ポリマーで修飾されている;この構成物はマウス受容体と比較してヒト受容体に対して、約5倍より高い活性をもっていた。SEP−3−L42は対応するヒトEPOグリコシル化部位の位置24、38、83及び126にペンダント負電荷を有する5.5kDa直鎖ポリマーで修飾され、この構成物はマウス受容体に比べてヒト受容体に対しては約10倍の活性を有した。最大の差はSEP−1−B50およびSEP−1−B51に認められた。これらは対応するヒトEPOグリコシル化部位の位置24及び126に結合した、枝分かれし、負電荷を有する15kDaポリマーで修飾され、約5のpI(ヒトpIと同様)を有した;これら2構成物はマウス受容体に比べてヒト受容体に対して〜60倍の活性を有した。
【0287】
マウスEPOにはヒトEPO位置126に対応する位置にグリコシル化部位がないため(マウスEPOは、ヒトEPOに見られるO−グリコシル化セリンの代わりに非グリコシル化プロリンを有する)、異なる受容体活性は一部分はこの差によるものであり、こうしてマウス受容体が、対応する位置126にO−結合グリコシル化がないEPOを優先的に選択するためである。これはSEP−1−L26及びSEP−1−L30と、SEP−1−B50及びSEP−1−B52との比較と一致する。例えば、SEP−1−L26は位置126に1.8kDaの帯電していないポリマーを有し、一方SEP−1−L30は位置126に5.5kDaの負に帯電したポリマーを有する。ヒトEPO受容体に対しては等しい活性が認められたとはいえ、マウスEPO受容体に対しては4倍の差が見いだされた。最大の差は、対応するヒトEPOグリコシル化部位の位置126に結合した負に帯電した15kDaポリマーを有するSEP−1−B50及びSEP−1−B51構成物で認められた。SEP−3−L42構成物の場合のようにヒトEPOの4つの天然グリコシル化位置、すなわち24、38、83および126全てに対応する部位に5.5kDaの負に帯電したポリマーを付加すると、マウスに対する優先性はさらに減少したが、SEP−1−B50及びSEP−1−B51構成物ほどではなかった。これらの結果は、受容体特異性が生物学的に産生するグリコシル化タンパク質のグリコシル化部位に相当する部位の精密な修飾によって、そして上記ポリマーの大きさ、枝分かれの性質および電荷を調整することによって調節できることを証明するものである。
【0288】
(実施例7)
合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−B51の合成
A.SEP−1−1−B51の組成。第六の合成赤血球産生刺激タンパク質(SEP−1−B51と呼ばれる)を合成した。完全長SEP−1−51のアミノ酸配列はSEP−1−B50のそれと同じである:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA
EHCSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA
VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPWψP
LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAIS
PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR
GKLKLYTGEA CRTGDR(配列番号:2)
上記配列中、ψは、スルフヒドリル基がカルボキシメチル化されているシステインからなる非天然アミノ酸残基を示し;KOXは、ε−アミノ基が、指定された水溶性ポリマーにオキシム結合によってカップリングしているオキシム リンカー基で化学的に改変されている非天然リジンを示す。
しかしSEP−1−B50とは異なり、このタンパク質は、アミド結合によってリジン枝分かれコアに結合した4本の直鎖(Succ−TTD)12−Succ−アラニノ−OH[すなわち(Succ−TTD)12−Succ−Ala−OH、または(Succ−TTD)12Succ−Ala]ポリマーを有する枝分かれポリマー構成物で誘導体化された。上記直鎖ポリマーのアミド結合を介する枝分かれコアへのカップリングは安定性を改善するために設計された。4本の直鎖ポリマーもアラニン部分及びペンダント負電荷を担うように設計された;上記負電荷はシアリン酸を模し、アラニンは炭水化物鎖のペンダント糖部分に類似の疎水性を模する。枝分かれポリマー類は、上記枝分かれコアとタンパク質主鎖結合部位との間に水溶性スペーサを有し、枝分かれコア・テンプレートの合成及び取扱い特性を改善し、天然炭水化物鎖においてタンパク質主鎖への糖結合部位と上記炭水化物の第一の枝分かれ点との間に見いだされるスペーシングを模するように設計された。
図23は、以下に説明するように、オキシム形成ライゲーションによってSEP−1−B51に結合した枝分かれ水溶性ポリマーGRFNP41(GP41)の化学的合成を説明するスキームである。完全長生成物の組立ては実施例2に記載した通りであった。SEP−1−B51の構造は図24に示される。
【0289】
B.枝分かれテンプレート(GRFNP40)にカップリングする(Succ−TTD)12Succ−AlaOtBu(GRFNP39)の合成
直鎖ポリマー(Succ−TTD)12Succ−AlaOtBu(GRFNP39)を0.5mmoleスケールで、サスリン酸不安定カルボン酸生成樹脂上で合成した。0.5mmole(〜0.5グラム)サスリン酸不安定、カルボン酸生成ポリスチレン樹脂(ヒドロキシ置換1.02mmole/g)をDMF中で15分間膨潤させ、それから水気をきった。このヒドロキシル官能化樹脂に、500マイクロリットル(3.9mmole)DIEA(ジイソプロピルエチルアミン)を含む8mlのDMFに溶解した450mg(4.5mmole)琥珀酸無水物及び488mg(4mmole)4−(ジメチルアミノ)ピリジンを加え、渦状に撹拌しながら30分間反応させ、水気をきった。カップリングを繰り返し、過剰の反応体及び可溶性副生成物をDMF(〜50ml)で1分間渦流洗浄することによって除去し、それから水気をきった。HOOC−CH2CH2CO−O−樹脂(0.5mmole)をDMF中新鮮1.0M(8mmole)CDI(カルボニルジイミダゾール)溶液8mlの添加によって活性化し、40分間反応させ、それから水気をきった。過剰の反応体及び可溶性副生成物をDMF(〜50ml)で1分間渦流洗浄することによって除去し、水気をきった。DMF中0.5M(2mmole)HOBT溶液4mlに溶解した(4,7,10)−トリオキサトリデカン−1,13ジアミン(TTD)4ml(4グラム、18.2mmole)を加え、渦状に撹拌しながら30分間反応させ、それから水気をきった。過剰の反応体および可溶性副生成物をDMF(〜50m)で1分間渦流洗浄することによって除去し、その後水気をきった。500マイクロリットル(3.9mmole)DIEAを含む0.5M(4mmole)HOBT(N−ヒドロキシベンゾトリアゾール)溶液8mlに溶解した琥珀酸無水物(450mg、4.5mmole)を上記樹脂に加え、渦状撹拌しながら15分間反応させ、それから水気をきった。上記3段階(CDI活性化;TTDカップリング;琥珀酸無水物反応)を11回繰り返した[すなわち全部で12回]。過剰の反応体および可溶性副生成物をDMF(〜50ml)による1分間渦流洗浄によって除去し、水気をきった。HOOC−CH2CH2CO(TTD−スクシニル)12−O−樹脂(0.5mmole)をDMF中新鮮1.0M(8mmole)CDI溶液8mlで活性化し、40分間反応させ、水気をきった。過剰の反応体及び可溶性副生成物をDMF(〜50ml)による1分間渦流洗浄によって除去し、水気をきった。2.5mmole H−AlaOtBu.HClを、150マイクロリットル(111mg、0.825mmole)DIEAを含むDMF中0.5M(2.375mmole)HOBTに溶解し、渦状に撹拌しながらCDI活性化HOOC−CH2CH2CO(TTD−スクシニル)12−O−樹脂(0.5mmole)と1時間反応させ、それから水気をきった。過剰の反応体及び可溶性副生成物をDMF(〜50ml)による1分間渦流洗浄によって除去し、水気をきった。上記生成物tertBuOOC−CH(CH3)−HN−OCCH2CH2CO(TTD−スクシニル)12−O−樹脂をDCM(ジクロロメタン)でよく洗い、水気をきり、それから上記樹脂を一定重量になるまで真空下で乾燥した。生成樹脂の典型的重量は約2グラムであった。
【0290】
直鎖(Succ−TTD)12Succ−AlaOtBuポリマーを樹脂支持体から、DCM中4%TFAを使用する標準的Fmoc−化学操作によって切り離した。沈殿した粗生成物を0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥したポリマーを0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液の少量に溶解し、希釈して有機物濃度を1%未満に減らした。粗生成物をT=40℃、3%Bで平衡化したC4分取逆相カラム上に置いた。塩類をアイソクラチック溶出し、所望のテンプレートを20−35%緩衝液B(0.1%TFAを含むアセトニトリル)対0.1%TFA水溶液の直線勾配で60分間にわたって精製した。所望の(Succ−TTD)12−Succ−AlaOtBu物質(GRFNP39)を含むフラクションをES−MSによって同定し、凍結乾燥した。
【0291】
C.枝分かれのための複数のアミン基と、(後に)タンパク質(GRFNP40)に付加するための保護されたアミノオキシ基とを担持するテンプレートの合成
テンプレートGRFNP40を、手で、シーバー(Sieber)アミド生成樹脂上で0.4mmol規模で合成した。各カップリング、脱保護及び活性化段階の間にDMFによる1分間流れ洗浄段階が設けられた。2mmolNα−Fmoc−Nβ(Boc−アミノオキシアセチル)−L−ジアミノプロピオン酸を上記樹脂に1時間結合させた;その際DCM/DMF(ジメチルホルムアミド)中2mmolDIC及び2mmolNHSによる30分間のNHS−エステル予備活性化を行った。Fmoc保護基除去(2×3分間、DMF中20%v/vピペリジン)及び洗浄後、2.2mmolDIEAを含む0.5M HOBT(N−ヒドロキシベンゾトリアゾール)溶液8mlに溶解した4mmol琥珀酸無水物を上記樹脂に10分間結合させた。この段階後、カルボキシル基をDMF中新鮮0.5M(4mmole)CDI溶液8mlで活性化した。4ml(18.2mmole)TTDをDMF中0.5M HOBT溶液4mlに加え、30分間結合させた。
【0292】
Fmoc−Lys(Fmoc)−OH(2mmol)を、生成したアミノ−TTD−Succ−Dpr(BocAoA)−樹脂(ここでDpr=ジアミノプロピロン酸)に、DMF中2mmolDIC及び2mmolNHSによる30分間予備活性化及び1時間のカップリングを用いて結合した。このカップリングをもう一度繰り返した。Fmoc除去段階(2×3分間、DMF中20%v/vピペリジン)後に、4mmol Fmoc−Lys(Fmos)−OHを上記のようにカップリングした(再カップリングも含む)。最後のFmos保護段階(2×3分間、DMF中20%v/vピペリジン)後、テンプレートを樹脂支持体から、DCM中4%TFAを使用する標準的Fmos化学操作によって切り離した。沈殿した生成物を0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥した粗生成物を0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液の少量に溶解し、有機物濃度が1%未満に減るまで希釈した。上記テンプレートをT=40℃で3%緩衝液B(アセトニトリル中0.1%TFA)で平衡化したC4分取逆相HPLCカラム上に載せた。塩類およびその他の非アミド物質をアイソクラチックに溶出し、所望のテンプレートを5−12%緩衝液B(0.1%TFA含有アセトニトリル)対0.1%TFA水溶液の直線勾配で60分間精製した。所望のLys−Lys(Lys)−TTD−Succ−Dpr(BocAoA)アミド物質(GRFNP40)を含むフラクションがES−MSによって同定され、これを凍結乾燥した。
【0293】
D.アミド結合枝分かれポリマー(GRFNP41)の組立て及び脱保護
GRFNP41、16kDa分子量の枝分かれ(TTD−Succ)49−ポリマー、をGRFNP39[(Succ−TTD)12−Succ−AlaOtBu]と精製テンプレートGRFNP40とのカップリングによって合成した。20mg/ml濃度になるように60℃でDMSO(ジメチルスルフォキシド)に溶解した精製(Succ−TTD)12−Succ−AlaOtBu(GRFNP39)(1.0mmole)を、20倍(モル)過剰のDIEAの存在下で、DMSO中0.95moleHATU{O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート}で活性化した。DMSO中に3.9mg/ml濃度で溶解した精製テンプレートGRFNP40(0.24mole)を直ちに加えた。反応の進行をC4分析的逆相HPLC及びES−MSでモニターした。一般的には上記カップリングは数分以内に完了した。仕上げのために4容量(ライゲーション ミックスに対して)の0.1M酢酸ナトリウム/6Mグアニジニウム塩化物、pH4、を加え、溶液を分取(C4)逆相HPLCカラム上に置いた。塩類およびその他の非アミド含有物質をアイソクラチック溶出し、所望の枝分かれポリマー生成物を20−35%緩衝液B(0.1%TFAを含むアセトニトリル)対0.1%TFA水溶液の直線勾配で80分間精製した。所望物質を含むフラクションをES−MSによって同定し、凍結し、凍結乾燥した。
【0294】
生成した精製ポリマーを生のTFAに濃度1mg/mlで1時間溶解し、アミノオキシアセチル部分からBoc基を除去し、−Ala−OtBu部分からtert−ブチルエステル基を除去した。上記溶液を回転蒸発機で回転して乾燥させ、乾燥したポリマーを50%緩衝液B(0.1%TFAを含むアセトニトリル)に溶解した。アミノオキシ酢酸(a.k.a.“カルボキシメトキシルアミン”)を最終濃度0.5Mまで加え、付加物形成不純物を掃去した。20分後、溶液を3.3容量の緩衝液A(水中0.1%TFA)で希釈し、分取C4逆相HPLCカラムに置き、全てのアミノオキシ酢酸が除去されるまでポンプを使って10%緩衝液Bで吸い出した。それから上記ポリマーを15%ないし45%緩衝液B対0.1%TFA水溶液の段階的勾配で80分間精製した。所望の枝分かれポリマー物質(GRFNP41)を含む集めたフラクションを凍結し、凍結乾燥した。
【0295】
E.ペプチドセグメントGRFN1776及びGRFN1711と、枝分かれポリマーGRFNP41とのオキシム形成ライゲーション(オキシム化)
セグメントSEP−1:4(GRFN1776、配列番号:2の残基117−166からなる)及びセグメントSEP−1:1(GRFN1711、配列番号:2の残基1−32からなる)を前記の実施例1に記載のように標準in situ中和Boc化学SPPSを使って合成した。ペプチドGRFN1776はやはり前記のように標準的プロトコルにしたがって−OCH2−Pam−樹脂上で合成した。ペプチドGRFN1711は前記のように標準的プロトコルにしたがってチオエステル生成樹脂上で合成した。Lys126上にレブリンアシル部分を含むセグメントGRFN1776とAoA含有GRFNP41とを等モル比で、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液に一緒に溶解した。その溶液を凍結乾燥した。乾燥した粉末粗生成物を0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液に再溶解し、分取逆相(C4)HPLCカラム上に置いた。ポリマー修飾ペプチドを分取勾配逆相HPLCによって未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望オキシム結合(オキシム化)生成物SEP−1:4+GP41をES−MSによって同定し、集め、凍結乾燥した。
【0296】
Lys24上にレブリンアシル部分を含むセグメントGRFN1711とAoA含有GRFNP41とを等モル比で0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液に一緒に溶解した。その溶液を凍結し、凍結乾燥した。乾燥粉末を0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液に溶解し、C4分取逆相HPLCカラム上に注いだ。このポリマー修飾ペプチドを分取勾配溶出C4逆相HPLCによって未修飾ペプチド及び未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム結合(オキシム化)生成物SEP−1:1+GP41を含むフラクションをES−MSによって同定し、集め、凍結乾燥した。
【0297】
F.合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−B51の合成
(配列番号:2)を有するSEP−1−B51を溶液中で4ポリペプチドセグメントから合成した:
セグメントSEP−1:1+GP41(GRFN1711+GRFNP41;配列番号:2の残基1−32に相当する):
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA
EH−チオエステル(ここでLys24はKOXによって示される、枝分かれポリマーGRFNP41にオキシム結合したレブリンアシル ペンダント部分を有する;His32はDnpで保護されている)
セグメントSEP−1:2(GRFN1712;配列番号:2の残基33−88に相当する):
CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA
VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPW−チオエステル(ここでCys33はAcmで保護され;3個のTrp残基がホルミルで保護されている)
セグメントSEP−1:3(GRFN1713、配列番号:2の残基89−116に相当する):
CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK−チオエステル(ここでCys89はAcmで保護され;His94はDnpで保護されている)
セグメントSEP−1:4+GP41(GRFN1776+GRFNP41、配列番号:2の残基117−166に相当する)
CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK
LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR−カルボン酸塩(ここでC−末端システイン(すなわちCys161)はピコリル(pico)保護基を有し、Lys126はKOXによって示される、枝分かれポリマーGRFNP41にオキシム結合したレブリンアシル ペンダント部分を有する)
【0298】
完全長、折りたたまれたSEP−1−B51(配列番号:2)を得るためのその他のペプチド類の合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、折りたたみ及び精製は下記の改良を伴う実施例1−4に記載の方法で行われた:
【0299】
段階1:ライゲーション#1 セグメントSEP−1:4+GP41をTFE(1容量)中に3mM濃度で溶解した。セグメントSEP−1:3を6Mグアニジウム塩化物を含む2容量の300mM Na燐酸緩衝液(pH7.9)に、2.25mM濃度で溶解した。上記2溶液を混合し、1mM SEP−1:4+GP41及び1.5mM SEP−1:3の最終セグメント濃度とし、1%チオフェノールを加え、pH6.8−7.2のペプチドセグメント溶液(“3容量”)を生成した。反応を室温で一晩進行させた。ライゲーション後、β−メルカプトエタノール(3容量)を上記ライゲーションミックスに加え、それから6Mグアニジウム塩化物を含む300mM Na燐酸pH7.9緩衝液、3容量を加え、TCEPを加え(重量で、ペプチドセグメントの総重量の0.25)、この溶液を20分間撹拌した。溶液を0.6容量の氷酢酸でpH4.0±0.1まで酸性にすると澄明溶液が得られる。これに30容量のpH4.0、100mM Naアセテート希釈緩衝液、6Mグアニジウム塩化物を加えた。生成した溶液をポンプで分取逆相(C4)HPLCカラムに注いだ。緩衝液を非ペプチド物質が全てカラムから溶出するまで5%Bで[したがって残りは95%緩衝液A(0.1%TFA水溶液)である]ポンプで吸引した。それからライゲーション生成物を25−45%緩衝液Bの勾配によって80分間にわたって精製した。所望の結合産物(Cys89(Acm)){SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}を含むフラクションをエレクトロスプレー質量分析によって同定し、集めた。
【0300】
段階2:Acm−除去#1 Acm除去のために、プールした(Cys89(Acm)){SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}のフラクションを含むアセトニトリル水溶液を1×HPLC級−水で希釈し、固体尿素を最終濃度2Mまで加えた。3倍モル過剰(総システイン濃度に対して)の3%酢酸水溶液中30mg/mlHg(アセテート)2溶液を加え、溶液を1時間撹拌した。上記溶液をその後β−メルカプトエタノール20%にし、半−分取逆相HPLCカラム上に載せ、全ての非ペプチド物質が溶出するまで25%緩衝液Bでポンプで吸引し、生成物を50%緩衝液Bの段階的勾配で精製した。所望の結合産物{SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}を含むフラクションをエレクトロスプレー質量分析によって同定し、集め、凍結乾燥した。
【0301】
段階3:ライゲーション#2 段階2から得られる{SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}生成物[すなわち1713−1776−GP41]をTFE(1容量)に3mM濃度で溶解した。セグメントSEP−1:2(セグメントGRFN1712)を6Mグアニジウム塩化物を含む300mM Na燐酸緩衝液(pH7.9)2容量に、濃度2.25mMになるように溶解した。2液を混合すると最終的に1mM{SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}及び1.5mM SEP−1:2のセグメント濃度が得られる。1%チオフェノールを加えると、pH6.8−7.2のペプチドセグメント溶液(“3容量”)が生成した。反応を室温で一晩進行させた。その後ライゲーションミックスを3容量(すなわち使用したTFEの容量に対して)の希釈緩衝液:6Mグアニジウム塩化物を含む100mM酢酸ナトリウムpH4.0で希釈し、それから3容量のTFE、3容量のβ−メルカプトエタノール、3容量のピペリジン及び6容量の6Mグアニジウム塩化物、100mM酢酸ナトリウムpH4.0からなる4℃に冷やした溶液に加え、室温で20分間撹拌して残る保護基を全て除去した。上記溶液を凍結氷酢酸1.8容量で酸性にすると澄明溶液が得られた。これにTCEP(重量でペプチドセグメントの総重量の0.25)を加え、溶液を20分間インキュベートした。それから30容量のpH4.0、100mM酢酸ナトリウム希釈緩衝液、6Mグアニジウム塩化物を加え、溶液を混合した。生成した溶液をポンプで分取逆相(C4)HPLCカラムに注入した。緩衝液を30%C(緩衝液C:60%イソプロパノール/30%アセトニトリル/10%水中、0.1%TFA)で、非ペプチド物質が全てカラムから溶出するまでポンプで吸引し、それからライゲーション産物を37−57%緩衝液Cの勾配によって80分間精製した。所望の結合産物(Cys33(Acm)){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}を含むフラクションをES−MSによって同定し、集め、凍結乾燥した。
【0302】
段階4:残基Cys89及びCys117のカルボキシメチル化
(Cys33(Acm)){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}[すなわち(Cys33(Acm))−1712−1713−1776−GP42]をTFEに1mM濃度で溶解した。6Mグアニジウム塩化物を含む300mM Na燐酸緩衝液(pH7.9)10容量を加えた。メタノールに75mg/ml濃度で溶解したブロモ酢酸の25倍過剰(スルフヒドリル基に関して)を加えた。溶液を室温で撹拌しながら2時間反応させた。反応混合物を11容量の100mM酢酸ナトリウム(pH4.0)、6Mグアニジウム塩化物で希釈し、分取逆相(C4)HPLCカラム上に注ぎ、全ての非ペプチド化合物が溶出するまで20%緩衝液Cで吸引し、それからライゲーション産物を55%緩衝液Cまでの段階的勾配で精製した。所望の修飾産物(Cys33(Acm);ψ89,117){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}をES−MSによって同定し、集め、凍結乾燥した。
【0303】
段階5:ピコリル除去 亜鉛くず(ペプチド1ミリグラムあたり71ミリグラム)を2M HCl中で5分間活性化し、その活性化をもう一度繰り返し、上記亜鉛を、(新たに加える)35mg/ml L−メチオニン及び35mg/mlドデカノイルサルコシン ナトリウムを含む6Mグアニジウム塩化物、50mMグリシンpH2.2、及び10%v/vTFEで10分間洗い、過剰の酸を除去した。洗浄をもう一度繰り返した。Cys161(ピコ)−含有ペプチド(Cys33(Acm);ψ89,117){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}を生のTFEに約30mg/ml濃度で溶解した。その溶液を、(新たに加える)35mg/ml L−メチオニン及び35mg/mlドデカノイルサルコシン ナトリウムを含む6Mグアニジウム塩化物、50mMグリシン、pH2.2、の4容量(TFEに対して)及び10%v/vTFEで希釈した。上記溶液を活性化亜鉛粉末に加え、室温で50分間撹拌した。反応を部分(等容量のβ−メルカプトエタノール及び数滴のTCEPで処理し、2容量の6Mグアニジウム塩化物、100mM酢酸ナトリウムpH4.0で希釈して分析する)の分析的C4逆相HPLCによって〜1時間間隔でモニターした。上記反応は2ないし5時間で完了した。分析HPLCピーク(すなわち91Da質量の喪失)のES−MS分析によって示されるように、ピコリル基の除去が完了した後、上澄液を濾過して除去し、残るZn粉末を35mg/ml L−メチオニン及び35mg/mlドデカノイルサルコシン及び20%TFEを含む6Mグアニジウム塩化物、pH4、100mMアセテートで3回洗った。ビオラドSM−2(BioRad SM−2)ビーズ(上記溶液の容量の約3分の1)を合一した上澄液に加え、洗い、室温で30分間撹拌し、それから濾過した。β−メルカプトエタノールを10%v/vまで加え、それから0.25×(ペプチドの合一量)のTCEPを加え、その溶液を室温で5分間撹拌した。溶液を等容量の100mM酢酸NapH4.0、6Mグアニジウム塩化物で1:1に希釈し、分取(C4)逆相HPLCカラム上に置き、所望産物を55%緩衝液Cまでの段階的勾配で精製した。所望のCys161−脱保護産物(Cys33(Acm);ψ89,117){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41−Pico}をエレクトロスプレー質量分析によって同定し、プールした。
【0304】
段階6:Acm除去#2 (Cys33(Acm);ψ89,117){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41−Pico}[すなわち(Cys33(Acm);ψ89,117)−1712−1713−1776−GP41]のプールした溶液をHPLC級−水で3×希釈し、固体尿素を最終濃度2Mになるように加えた。3%酢酸水溶液中30mg/mlHg(アセテート)2溶液の3倍モル比(総システイン濃度に対して)を加え、溶液を室温で1時間撹拌した。上記溶液をそれからβ−メルカプトエタノール中20%にし、半−分取(C4)逆相HPLCカラム上に置いた。緩衝液C(20%)を全ての非ペプチド材料が溶出するまでポンプで吸引し、所望産物を55%緩衝液Cの段階的勾配で精製した。所望産物(Cys33;ψ89,117){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41−Pico}を含むフラクションをES−MSによって同定し、2×(w/w、ペプチド質量に対して)DPC(ドデシルホスホコリン)を含む水で2倍(v/v)に希釈し、一晩凍結乾燥した。
【0305】
段階7:ライゲーション#3 (Cys33;ψ89,117){SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41−Pico}[すなわち(Cys33;ψ89,117)−1712−1713−1776−GP41]を生のTFE(1容量)に3mM濃度で溶解した。SEP−1:1[すなわち1711−GP41]を6Mグアニジウム塩化物を含む300mM燐酸ナトリウム緩衝液(pH7.9)2容量に溶解した。上記の溶液を合一し、1%v/vチオフェノールを加えた。ライゲーションミックスを室温で一晩撹拌した。上記溶液に3容量(上のTFE容量に対して)のβ−メルカプトエタノール、9容量のライゲーション緩衝液(6Mグアニジウム塩化物を含む300mM燐酸ナトリウムpH7.9)を加えた。上記溶液に0.25×(合一ペプチド重量)TCEPを加え、上記溶液を室温で20分間撹拌した。氷酢酸(0.6容量)を加えて上記溶液をpH4.0まで酸性にし、その後溶液を6Mグアニジウム塩化物を含む100mM酢酸ナトリウムpH4.0の30容量で希釈し、分取(C4)逆相HPLCカラム上に置いた。緩衝液C(25%)を、全ての非ペプチド物質が溶出するまでポンプで引いた。
それからライゲーション生成物を35−55%の緩衝液Cの直線勾配で80分間にわたって精製した。所望の結合産物SEP−1(1−166)(ψ89,117){SEP−1:1(+GP41)+SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}(配列番号:2)をエレクトロスプレー質量分析によって同定し、プールした。
【0306】
段階8 折りたたみ: 完全長結合ペプチド SEP−1(1−166)(ψ89,117){SEP−1:1(+GP41)+SEP−1:2+SEP−1:3+SEP−1:4+GP41}[すなわち1711(GP41)−1712−1713−1776−GP41]を含む合一フラクションに、固体グアニジウム塩化物、1Mトリス緩衝液(pH8.7)及び蒸留水を加え、1mlあたり0.1ミリグラムの結合ペプチドSEP−1(1−166)、6Mグアニジウム塩化物、100mMトリスの最終的溶液を調製した。この結合ペプチド(“タンパク質”)溶液を15ml透析カセットに入れ、4℃で、3Mグアニジウム塩化物、5マイクロモル システイン及び2マイクロモル システインを含む100mMトリス緩衝液(pH8.5)溶液に対して一晩透析した。上記タンパク質溶液をその後、1Mグアニジウム塩化物を含む100mMトリス緩衝液(pH8.5)溶液に対して4℃で8時間透析し、最後に10mMトリス緩衝液(pH7.0)に対して4℃で14時間透析すると、最終的折りたたみ生成物が得られる。透析カセットからの折りたたまれたタンパク質を含む溶液を合一した。折りたたみはES−MS、分析的RP−HPLC及びCDスペクトロメトリーによって確認された。
【0307】
段階9 精製:折りたたまれたタンパク質を含む溶液を10mMトリス、pH7.0、で平衡化したQ−セファロース イオン交換カラムに注入した。上記折りたたまれたタンパク質を125mM NaClまでの直線塩勾配を用いて溶出した。所望折りたたみ生成物SEP−1−B51を含むフラクションを非還元性SDS−PAGEによって同定し、集めた。合一したフラクションを限外濾過によって濃縮し、約2ミリグラム/ミリリットルの濃度にし、そのタンパク質溶液を2.6×100cmS−300ゲル濾過カラム上に注いだ。生成SEP−1−B51を10mMトリスpH7.0、137mM塩化ナトリウムで溶出した。高純度のSEP−1−B51を含むフラクションを非還元性SDS−PAGEによって同定し、集め、凍結し、−80℃で保存した。最終的精製折りたたみタンパク質SEP−1−B51を分析的(C4)逆相HPLC、ES−MSによって、非還元性SDS−PAGEによって、及びCDスペクトロメトリーによって特徴づけた。図27は、上記折りたたまれた精製SEP−1−B51の相対的分子量を示す代表的等電点電気泳動ゲル(IEF)及び非還元性SDS−PAGEゲルを示す。同じゲル上の分子量標準移動が比較のために示される。示されているように、非還元性SDS−PAGEによって測定されたSEP−1−B51の相対的分子量は約73kDaである。相対的pIは約5.0である。折りたたまれ、精製されたSEP−1−B51生成物の代表的RP−HPLCクロマトグラムも示される。これは、本発明の精密なポリマー修飾タンパク質の純粋性及び高い相対分子量を示す。
【0308】
(実施例8)
合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−B52の合成
A.SEP−1−B52の組成。第七の合成赤血球産生刺激タンパク質(SEP−1−B52と呼ぶ)を合成した。完全長SEP−1−B52のアミノ酸配列はSEP−1−B51のそれと同じである:
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA
EHCSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA
VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPWψP
LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAIS
PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR
GKLKLYTGEA CRTGDR(配列番号:2)
上記配列中、ψは、スルフヒドリル基がカルボキシメチル化されているシステインからなる非天然アミノ酸残基を示し;KOXは、ε−アミノ基が、指定された水溶性ポリマーにオキシム結合によってカップリングしているオキシム リンカー基で化学的に改変されている非天然リジンを示す。
【0309】
SEP−1−B52タンパク質は、残基24及び126がSEP−1−B51と同様に枝分かれ(Succ−TTD)12−Succ−Alaポリマー構成物で誘導体化された;だがこの類似体では上記ポリマーはピルビン酸とアミノオキシ酢酸との間のオキシム結合によって結合した。その上、リジン残基24及び126のε−アミノ基はレブリンアシル部分の代わりにアミノオキシアセチル官能基を担うように改変され、枝分かれ(Succ−TTD)12−Succ−Alaポリマー構成物はペンダント−ピルビンアシル部分を担うように作られた。これらの変化は合成及び取扱いを改良するために、そして上記オキシム結合の安定性をさらに高めるために設計された。
図25は、以下に述べるようにオキシム形成ライゲーションによってSEP−1−B52に結合した、枝分かれ水溶性ポリマーGRFNP43(GP43)の化学合成を説明するスキームである。完全長生成物の組立ては実施例2に記載された。SEP−1−B52の構造を図26に示す。
【0310】
B.枝分かれテンプレート(GRFNP42)にカップリングするための(Succ−TTD)12−Succ−AlaOtBu(GRFNP39)の合成
(Succ−TTD)12−Succ−AlaOtBu(GRFNP39)を0.5mmolスケールで合成した。0.5mmole(〜0.5グラム)サスリン酸不安定、カルボン酸生成ポリスチレン樹脂(ヒドロキシル置換1.02mmole/g)をDMF中で15分間膨潤させ、それから水気をきった。このヒドロキシル官能化樹脂に、500マイクロリットル(3.9mmole)DIEA(ジイソプロピルエチルアミン)を含む8mlのDMFに溶解した450mg(4.5mmole)琥珀酸無水物及び488mg(4mmole)4−(ジメチルアミノ)ピリジンを加え、渦状に撹拌しながら30分間反応させ、水気をきった。カップリングを繰り返し、過剰の反応体及び可溶性副生成物を1分間DMF(〜50ml)で渦流洗浄することによっ除去し、それから水気をきった。HOOC−CH2CH2CO−O−樹脂(0.5mmole)を、DMF中新鮮1.0M(8mmole)CDI溶液8mlの添加によって活性化し、40分間反応させ、それから水気をきった。過剰の反応体及び可溶性副生成物を、DMF(〜50ml)で1分間渦流洗浄することによって除去し、水気をきった。0.5M(2mmole)HOBT−DMF溶液4mlに溶解した4ml(4グラム、18.2mmole)のTTDを加え、渦状に撹拌しながら30分間反応させ、それから水気をきった。過剰の反応体および可溶性副生成物をDMF(〜50m)で1分間渦流洗浄することによって除去し、その後水気をきった。500マイクロリットル(3.9mmole)DIEAを含む0.5M(4mmole)HOBT(N−ヒドロキシベンゾトリアゾール)溶液8mlに溶解した琥珀酸無水物(450mg、4.5mmole)を上記樹脂に加え、渦状撹拌しながら15分間反応させ、それから水気をきった。上記3段階(CDI活性化;TTDカップリング;無水琥珀酸反応)を11回繰り返した[すなわち全部で12回]。過剰の反応体および可溶性副生成物はDMF(〜50ml)による1分間渦流洗浄によって除去し、水気をきった。HOOC−CH2CH2CO(TTD−スクシニル)12−O−樹脂(0.5mmole)をDMF中新鮮1.0M(8mmole)CDI溶液8mlで活性化し、40分間反応させ、水気をきった。過剰の反応体及び可溶性副生成物をDMF(〜50ml)による1分間渦流洗浄によって除去し、水気をきった。2.5mmole H−AlaOtBu.HClを、150マイクロリットル(111mg、0.825mmole)DIEAを含むDMF中0.5M(2.375mmole)HOBTの4.75mlに溶解し、渦状に撹拌しながらCDI活性化HOOC−CH2CH2CO(TTD−スクシニル)12−O−樹脂(0.5mmole)と1時間反応させ、それから水気をきった。過剰の反応体及び可溶性副生成物はDMF(〜50ml)による1分間渦流洗浄によって除去し、水気をきった。上記生成物tertBuOOC−CH(CH3)−HN−OC−CH2CH2CO(TTD−スクシニル)12−O−樹脂を、DCMでよく洗い、水気をきり、それから上記樹脂を一定重量になるまで真空下で乾燥した。生成樹脂の典型的重量は約2グラムであった。
【0311】
直鎖GRFNP39を樹脂支持体から、DCM中4%TFAを使用する標準的Fmoc−化学操作によって切り離した。沈殿した粗生成物を0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥したポリマーを0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液の少量に溶解し、希釈し、有機物の濃度を1%未満に減らした。粗生成物をT=40℃、3%Bで平衡化したC4分取逆相カラム上に置いた。塩類をアイソクラチック溶出し、所望のテンプレートを20−35%緩衝液B(0.1%TFAを含むアセトニトリル)対0.1%TFA水溶液の直線勾配で60分間にわたって精製した。所望の(Succ−TTD)12−Succ−AlaOtBu物質(GRFNP39)を含むフラクションをES−MSによって同定し、凍結し、凍結乾燥した。
【0312】
C.枝分かれのための複数のアミン基、及び(その後)タンパク質(GRFNP42)に結合するためのペンダント ピルビン アシル部分を担うテンプレートの合成。
テンプレートを手で、Boc−Leu−OCH2−Pam樹脂上で、0.4mmolスケールで合成した。各カップリング、脱保護および活性化段階の間にDMFによる1分間流れ洗浄段階を設けた。Boc基は生の(すなわち100%)TFAによる処理によって除去した。DMF洗浄後、2mmol Fmoc−(Rink−リンカー)−OHを、1ml DIEAを含む3.8mlDMF中1.8mmol HBTUで活性化した後、上記樹脂にカップリングした。Fmoc−保護基を除去した後(2×3分、DMF中20%ピペリジン)、2mmol Fmoc−Lys(MTT)−OH[MTT=4−メチルトリル]を、DMF中2mmol DIC及び2mmolNHSを用いて上記樹脂にカップリングした。Fmoc−保護基を除去した後(2×1分、DMF中0.5%DBU)、2.2mmolDIEAを含む0.5M HOBT溶液8ml中に溶解した4mmol無水琥珀酸を上記樹脂に10分間カップリングした。この段階後、樹脂に結合したカルボキシル基をDMF中0.5M CDI溶液8mlで活性化した。4ml TTDを4mlの0.5M HOBT溶液に加え、30分間カップリングした。
【0313】
2mmol Fmoc−Lys(Fmoc)−OHを、DMF中2mmol DIC及び2mmol NHSで活性化したNHS−エステルを用いて上記樹脂にカップリングした。Fmoc除去段階後(2×1分、DMF中0.5%DBU)、4mmol Boc−Lys(Boc)−NHSを3mlDMF中でカップリングした。
【0314】
MTT保護基をDCM中2%TFAによる複数回の洗浄によって除去した。上澄液がその黄色を失ったとき、脱保護は完了した。上記樹脂をDMF中10%DIEAで1分間中和した。2mmol ピルビン酸を、DMF中2mmol DIC及び2mmol NHSによるNHS−エステル活性化を使用して45分間樹脂にカップリングした。上記テンプレートを脱保護し、5%水を含む生のTFAを使用して上記樹脂支持体から切り離した。上記切断溶液を回転蒸発器中で蒸発乾固した。残渣を0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥したテンプレートを0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液の少量に溶解し、希釈して有機物の濃度を1%未満に減らした。上記ピルベート含有テンプレートをT=40℃で0%緩衝液B[すなわち100%緩衝液A=水中0.1%TFA]で平衡化したC4分取カラム上に注入した。塩類をアイソクラチック溶出し、所望のテンプレートを5−12%緩衝液B対0.1%TFA水溶液で60分間精製した。所望物質(GRFNP42)を含むフラクションをES−MSによって同定し、凍結し、凍結乾燥した。
【0315】
D.アミド結合枝分かれポリマー(GRFNP43)の組立て及び脱保護
GRFNP43(16kDa分子量を有する枝分かれ(TTD−Succ)49−ポリマー)を、GRFNP39と精製テンプレートGRFNP42とのカップリングによって合成した。DMSOに60℃で20mg/ml濃度になるように溶解した精製(Succ−TTD)12−Succ−AlaOtBu(GRFNP39)(1.0mmole)を、20倍(モル)過剰のDIEAの存在下で、10mg/ml濃度のDMSO中HATU(0.95モル)で活性化した。DMSOに濃度3.9mg/mlになるように溶解した精製テンプレート(0.24モル)GRFNP42を直ちに加えた。反応の進行を分析的C4逆相HPLC及びES−MSによってモニターした。一般的にはこのカップリングは数分以内に完了した。仕上げのために4容量(ライゲーション混合物に対して)の0.1Mアセテート/6Mグアニジニウム塩化物、pH4、を加え、上記溶液を分取(C4)逆相HPLCカラム上に注入した。塩類及びその他の非アミド含有物質をアイソクラチック溶出し、所望産物である枝分かれポリマーを20−35%緩衝液B(0.1%TFAを含むアセトニトリル)対0.1%TFA水溶液の直線勾配で80分間にわたって精製した。所望物質を含むフラクションをES−MSによって同定し、凍結し、凍結乾燥した。
【0316】
生成した精製枝分かれポリマー構成物GRFNP43を生のTFAに濃度1mg/mlに1時間溶解し、Ala−OtBu tertブチル エステル保護を取り除いた。上記溶液を回転蒸器中で蒸発乾固し、乾燥したポリマーを50%緩衝液B(0.1%TFAを含むアセトニトリル)に溶解した。このポリマーを分取逆相HPLC上で15%ないし45%緩衝液B対0.1%TFA水溶液の段階的勾配で80分間脱塩した。所望物質(GRFNP43)を含むプールしたフラクションを凍結し、凍結乾燥し、上記乾燥粉末をオキシム化形成ライゲーション段階に使用した。
【0317】
E.GRFN1776及びGRFN1711の、枝分かれポリマーGRFNP43によるオキシム形成ライゲーション(オキシム化)
セグメントSEP−1:4、及びセグメントSEP−1:1を実施例2、3、4、及び7に記載のように合成した、ただしレブリン酸の代わりに、アミノオキシアセチル(AoA)部分をそれぞれのペプチドセグメントのLys24及びLys126に、標準的カップリングプロトコルにしたがって付加した。こうして、ペプチド樹脂の組立て後、側鎖Fmoc基を各ペプチド樹脂から除去し、2mmol BOc−アミノオキシ酢酸を、DMF中2mmol DIC及び2mmol NHSによるNHS−エステル活性化を行って上記樹脂に加えた。上記2ペプチドを脱保護し、HFで樹脂から切り離し、C4逆相HPLCによって精製した。カルボニル化合物にさらされないように適切な注意をした。セグメントSEP−1:4及びGRFNP43を一緒に、等モル比で、0.1%TFA(トリフルオロ酢酸)を含む50%アセトニトリル水溶液に溶解した。上記溶液を凍結乾燥した。乾燥粉末を0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液に再溶解し、分取C4逆相HPLCカラムに注入した。上記ポリマー修飾ペプチドを未修飾ペプチド及び未反応ポリマーから分取勾配逆相HPLCによって分離した。所望オキシム化生成物SEP−1:4+GP43を含むフラクションをES−MSによって同定し、プールした。
【0318】
セグメントSEP−1:1及びGRFNP43を等モル比で一緒に、0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液に溶解した。上記溶液を凍結し、凍結乾燥した。乾燥した粉末を0.1%TFAを含む50%アセトニトリル水溶液に溶解し、分取勾配C4逆相HPLCカラムに注入した。上記ポリマー修飾ペプチドを未修飾ペプチド及び未反応ポリマーから分取逆相勾配溶出によって分離した。所望オキシム化生成物SEP−1:1+GP43を含むフラクションをES−MSによって同定し、プールした。
【0319】
F.合成赤血球産生刺激タンパク質SEP−1−B52の合成
SEP−1−B52(配列番号:2)を溶液中で4ポリペプチド セグメントから合成した:
セグメントSEP−1:1+GP43(GRFN1711+GRFNP43;配列番号:2の残基1−32に相当する):
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA
EH−チオエステル(ここでLys24は、KOXによって示される、枝分かれポリマーGRFNP43にオキシム結合したAoAペンダント部分を有する;His32はDnpで保護されている)
セグメントSEP−1:2(GRFN1712;配列番号:2の残基33−88に相当する):
CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA
VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPW−チオエステル(ここでCys33はAcmで保護されている;3個のTrp残基はホルミル保護されている)
セグメントSEP−1:3(GRFN1713、配列番号:2の残基89−116に相当する):
CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK−チオエステル(ここでCys89はAcmで保護されており、His94はDnpで保護されている)
セグメントSEP−1:4+GP43(GRFN1776+GRFNP43、配列番号:2の残基117−166に相当する):
CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK
LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR−カルボン酸塩(ここでC−末端システイン(すなわちCys161)はピコリル(pico)保護基を担い、Lysq126は、KOXによって示される、枝分かれポリマーGRFNP43にオキシム結合したAoAペンダント部分を有する)。
【0320】
付加的ペプチドの合成、ライゲーション反応体、カルボキシメチル化、保護基除去反応、折りたたみ及び精製は実施例1、2、3、4、及び7に記載のように行われ、完全長折りたたみSEP−1−B52(配列番号:2)を与える。これは分析的(C4)逆相HPLC、ES−MS、及び非還元性SDS−PAGEによって特徴づけられた。バイオアッセイはその他のSEP構成物について記載したように行われる。
【0321】
(実施例9)
SEP−3−L42の有効性試験
SEP−3−L42をクエン酸緩衝液(20mMクエン酸ナトリウム+100mM塩化ナトリウム) + 0.25%ラット血清アルブミン(RSA)中で再組成化し、正常雄ラット(5ラット/群)に1週間に3回(tiw)1、3、6日目に、0、1、5または10μg/kgの用量を静脈内投与した。血液サンプルを最後の注射後4日目(9日目)に採取し、血液学的パラメーターを分析した。これらの用量のSEP−3−L42の最後の注射後4日目の赤血球(RBC)、ヘモグロビン(HGB)、ヘマトクリット(HCT)、及び網状赤血球(RET)の数値には対照群のこれらと比較して統計的有意差はなかった。
【0322】
(実施例10)
SEP−3−L42の薬物動態試験
SEP−3−L42をクエン酸緩衝液(20mMクエン酸ナトリウム+100mM塩化ナトリウム)+0.25%RSA、pH6.9、中で再組成化し、正常雄ラットに単回量として5μg/kg用量レベルで静脈内投与した。投与後0、1、2、4、6、12、24、48、72、96、120、144、168時間目に血液サンプルを採取した。血漿SEP−3−L42濃度をメーカーのインストラクションにしたがって、抗−EPO ELISAキット(R&Dシステムズ、ヒトエリスロポエチン クァンチカインIVD免疫アッセイキット#DEP00)を使用して測定した。結果を図29に示す。
【0323】
図29に示すように、SEP−1−B50はSEP−3−L42に比較してわずかに遅いクリアランスを示した。その循環半減期にもかかわらず、SEP−3−L42は試験に使用した用量では赤血球産生の促進において統計的有意差を示すことができなかった。これに対して、SEP−1−B50は同量で赤血球産生を刺激した。これは、ポリマー構造を利用して、薬物動態的挙動及び効力を含むin vivo生物学的特性を微調整することができることを示すものである。
【0324】
(実施例11)
SEP−1−L30の有効性試験
SEP−1−L30をクエン酸緩衝液(20mMクエン酸ナトリウム+100mM塩化ナトリウム)+0.25%RSA中で再組成化し、正常雄ラット(5ラット/群)に1週間に3回(tiw)1、3、5日目に、0、1、5、25または50μg/kgの量を静脈内投与した。最後の注射後4及び8日(9及び13日目)に血液サンプルを採取し、血液学的パラメーターを分析した。
SEP−1−L30投与後いかなる間隔をおいても、RBC、HGB及びHCT数値には対照群のそれらと比較して統計的有意差はなかった。網状赤血球は最後の注射後4日(9日目)には25及び50μg/kgを投与したラットではより高かった(対照群のそれらと比較して統計的有意差あり)。9日目または13日目には、SEP−1−L30投与動物のいずれにも血液パラメーターのその他の差は認められなかった[データは示されず]。
【0325】
(実施例12)
SEP−1−L30の薬物動態試験
SEP−1−L30をクエン酸緩衝液(20mMクエン酸ナトリウム+100mM塩化ナトリウム)+0.25%RSA、pH6.9、中で再組成化し、正常雄ラットに単回量として5または25μg/kgの量を静脈内投与した。投与後0、1、2、4、6、12、24、48、72、96、120、144、及び168時間に血液サンプルを採取した。SEP−1−L30の血漿中濃度をメーカーのインストラクションにしたがって、ELISAキット(R&Dシステムズ、ヒトエリスロポエチン クァンチカインIVD免疫測定キット#DEP00)を使用して測定した。与えた投与量ではいずれの時点にもSEP−1−L30は検出されなかった。
【0326】
(実施例13)
SEP−1−B50の有効性試験
SEP−1B50を滅菌PBS(燐酸緩衝食塩液)+0.25%RSA中で再組成化し、正常雄ラット(5匹/群)に、1週間に3回(tiw)1、3、6日目に、0、1、5、25または125μg/kgの量を静脈内投与した。血液サンプルを最後の注射後4、9及び14日(10、15及び20日目)に採取し、血液学的パラメーターを分析した。そのデータを下の表VIIIに示す。最後の注射後4日(10日目)には、5、25及び125μg/kgのSEP−1−B50を投与した動物たちのRBC、HGB、HCT及びRETが用量依存的に増加するのが認められた(対照群のそれらと比較して統計的有意差あり)。これらの動物のRBC、HGB及びHCTは15日目には対照値より高いままで、125μg/kgを投与した動物では20日目(最後の注射後14日)にも対照値より有意に高かった。RET産生は10日目後には減少し、25及び125μg/kg動物では、15及び20日目には有意に低下した。
【0327】
表VIII
【表7】
【0328】
(実施例14)
SEP−1−B50の薬物動態試験
SEP−1−B50をクエン酸緩衝液(20mMクエン酸ナトリウム+100mM塩化ナトリウム)+0.25%RSA、pH6.9、中で再組成化し、正常雄ラットに単回量として5または25μg/kg量を静脈内投与した。投与後0、1、2、4、6、12、24、48、72、96、120、144、及び168時間に血液サンプルを採取した。SEP−1−B50の血漿中濃度をメーカーのインストラクションにしたがって、ELISAキット(R&Dシステムズ、ヒトエリスロポエチン クァンチカインIVD免疫測定キット#DEP00)を使用して測定した。排泄半減期は5及び25μg/kg量ではそれぞれ9.7及び9.9時間と測定された。観察されたMRT(平均滞留時間)は5及び25μg/kg量でそれぞれ13.9及び14.4時間であった。SEP−1−B50の典型的薬物動態プロフィールを図29に示す。
【0329】
(実施例15)
SEP−1−B51の有効性試験
SEP−1−B51を2実験で正常雄ラットに静脈投与した。
実験1:SEP−1−B51をクエン酸緩衝液(20mMクエン酸ナトリウム+100mM塩化ナトリウム)+0.25%RSA中で再組成化し、雄ラット(5匹/群)に、1週間に3回(tiw)、1、3、6日目に、0、1、5、または25μg/kgの量を静脈内投与した。最後の注射後14日(10、15及び20日目)に血液サンプルを採取し、血液学的パラメーターを分析した。そのデータを下の表IXに示す。25μg/kgSEP−1−B51投与動物ではSEP−1−B51の3番目そして最後の投与後4日に(10日目)、RBC、HGB、HCT、及び絶対的網状赤血球数(ART)の、20日目の対照値と比較した統計的有意な増加が認められた。網状赤血球産生は10日目の後には減少し、15日目には5及び25μg/kg投与動物で有意に低い数値が認められた。
【0330】
表IX
【表8】
【0331】
実験2:SEP−1−B51をクエン酸緩衝液(20mMクエン酸ナトリウム+100mM塩化ナトリウム)+0.25%ヒト血清アルブミン中で再組成化し、雄ラット(5匹/群)に1週3回、1、3及び5日目に、0、1、5、または25μg/kg量を静脈内に投与した。血液サンプルを最後の注射後2、4、及び6日(7、9及び11日目)に集め、血液学的パラメーターを分析した。その上、ヘマトクリット測定[血球容積として]のためだけの血液サンプルを残りの試験日(2、3、4、5、6、8、10、12及び13日目)に毎日集めた。データを下表Xに示す。HCT(PCVまたは計算)値は5及び25μg/kg投与動物では最初の注射後2日(3日目)から始まって有意に増加し、その増加は第三の、最後の注射後6日(11日目)まで続いた。RBC及びHGBも、5及び25μg/kg投与動物では、それらを測定した日(最後の投与後2、4、及び6日;7、9及び11日目)には有意に増加した。ARTは25μg/kg群においてのみ、最後の投与後2及び4日(7及び9日目)に有意に増加した。
【0332】
表X
【表9】
【0333】
追加的ラット群に単回静脈内投与で25μg/kgのSEP−1−B51を投与し、血液サンプルを注射後48時間目に集め、血液学的パラメーターを分析した。ヘマトクリットだけの測定(血球容積として)のための血液サンプルを注射後8、24、及び72時間及び7日(1、2、4及び8日目)に集めた。SEP−1−B51を静脈内投与したラットのHCT、HGB及びART値は3日目に(注射後2日)対照動物のそれらより高かった(統計的に有意)。HCTはこれらの動物において4日目にも有意に増加した。
【0334】
(実施例16)
赤血球増加症−及び低酸素症モデルにおけるSEP−1−B51の有効性試験 各10匹ずつの正常マウス群(ビヒクル対照、CHO−細胞で産生された組換えグリコシル化ヒトエリスロポエチン(“rhEPO”)の4用量レベル;及びSEP−1−B51、4用量レベル:100mU/ngと仮定して、0.32、1、5、25μg/kg/投与)を、1日18時間、模擬高所−室中で506.5mbに維持した空気に20日間さらした。クエン酸緩衝液プラス0.25%ヒト血清アルブミン中に処方されたrhEPOまたはSEP−1−B51を200μL容量にして、低酸素後の第4日目に静脈注射(IV)した。2日後各マウスに0.2μCiの59Feを腹腔内(i.p.)注射した。3日後にRBC−放射性鉄の取り込みを、心臓穿刺によって採取した血液500μLに存在する放射能の量を測定することによって推定した。
【0335】
SEP−1−B51及びrhEPOの72時間−RBC−59Fe取り込み(投与量の%)は明白な用量依存的応答を示し、投与量5μg/kgまでは投与量の増加につれて59Fe取り込みは増加し、5μg/kg以上では応答は平らになった(25μg/kg)。そこで3種類の最低投与量レベルを使用して直線回帰を計算した。SEP−1−B51及びrhEPOの直線回帰分析を図30に示す。SEP−1−B51およびrhEPOでは応答は実質的に同じであった。rhEPOに対するSEP−1−B51の効力比は1.0035(95%信頼限界は0.6947ないし1.4498)で、このアッセイにおいて測定されたSEP−1−B51の効力は100mU/ngであった(95%信頼限界69−145)。
【0336】
SEP−1−B51はrhEPOに近いin vivo活性を示し、このモデルのrhEPOに典型的な負のフィードバックメカニズムの誘導による比較的高投与量における応答プラトー等も含めて用量依存的に作用する。これは、SEP−1−B51の正確なユーザー決定グリコシル化部位に結合したポリマー構造がrhEPOの糖鎖が貢献するin vivo活性を模することを示している。
【0337】
(実施例17)
SEP−1−B51の薬物動態試験
正常雄ラット群に、クエン酸緩衝液+0.25%ヒト血清アルブミン中で処方したSEP−1−B51の単回量、5μg/kg、またはrhEPO(500U/kgに匹敵する)を静脈内に単回投与し、その投与後5、30、60分、2、4、8、及び24時間、及び2、3、4、5、6及び7日に採血した。血漿サンプル中のSEP−1−B51またはrhEPO濃度を、メーカーのインストラクションにしたがって、R&Dシステムズ抗−EPO ELISAキット(R&Dシステムズ、ヒトエリスロポエチン クァンチキンIVD免疫測定キット#DEP00)を用いてELISA法によって測定した。
【0338】
濃度の対数の最小二乗分析を行い、下の表XIに列挙する薬物動態的パラメーターを得た。5μg/kgの単回静脈注射を受けた雄ラットにおいて時間の経過につれて起きるSEP−1−B51の血漿濃度の変化は半減期10.5±0.5時間の片側指数的薬物動態的消失関数によって説明できる。SEP−1−B51の中心コンパートメントの分布容積(Vc)は32.5±2.0mL/kgであった。クリアランス(CL)は2.15mL/hr/kgで、平均滞留時間(MRT)は15.1±0.7時間であった。比較によると、5μg/kgの静脈内投与を受けた雄ラットの血漿中rhEPO濃度の変化は両側指数的薬物動態的消失関数によって最もよく説明でき、α半減期は1.24±0.22時間、β半減期は5.51±0.40時間であった。rhEPOのVcは57.0±3.2mL/kgであった。CLは16.0±0.5mL/hr/kgであり、SEP−1−B51のそれより約8倍大きかった。rhEPOの平均滞留時間(MRT)は5.73±0.17時間であり、SEP−1−B51のそれの約3分の1であった。
【0339】
表XI
【表10】
【0340】
SEP−1−B51及びrhEPOの血漿中クリアランスのグラフを図31に示す。これらのデータはSEP−1−B51の循環半減期がグリコシル化組換えヒトEPOを上回って有意に増加することを示し、この増加が分子の正確なユーザー決定部位に結合したポリマー構造によることを示す。
【0341】
(実施例18)
ポリマー修飾合成RANTESタンパク質の合成
本発明のポリマー修飾タンパク質をさらによく説明するために、RANTES 2−68の2種類のポリマー修飾誘導体(RANTES G1755−01;図32、及びRANTES G1755;図33)及びRANTES4−66の2種類のポリマー修飾誘導体(RANTES G1805;図34、及びRANTES G1806;図35)を合成した。これらのポリマー修飾タンパク質の構造は図32−35に示される。
【0342】
RANTES類似体G1755−01の製法
図32に示されるRANTES類似体、G1755−01、を次のように合成した。
【0343】
1.AOP−[RANTES(2−33)]−チオエステルの製法
アミノオキシペンタン−グリオキサリル−PYSSDTTPCC
FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GK−チオエステル
N−末端アミノオキシペンタン−グリオキサリル オキシム部分(AOP)を含む、N−末端ペプチドセグメントAOP−[RANTES(2−33)]−αチオエステル(チオエステルは−C(O)SRとも記される)を、チオエステル生成樹脂上でRANTES(2−33)配列を組立てることによって合成し(ハッケング(Hackeng)ら、PNAS(1999)96巻:10068−10073ページ)、それから標準的プロトコルにしたがって、アミノオキシペンタン−グリオキサリルオキシム部分[すなわちCH3(CH2)4−O−N=CHCOOH]と樹脂との直接カップリングによって上記N末端を改変した(ウィルケン(Wilken)ら、Chemistry&Biology(1999)6巻(1号):43−51ページ)。ペプチド−樹脂はフッ化水素で切り離し、逆相HPLCによって精製してα−カルボキシチオエステル ペプチド AOP−RANTES(2−33)−チオエステルを得た。分析質量=4179.6Da;計算質量=4178.6Da(平均同位体組成物)。
【0344】
2.[RANTES(34−68)]−Lys69(GP6)−Leu70の製法
CSNPAVVFVT RKNRQVCANP EKKWVREYIN
SLEMSK(GP6)L
上記配列において、GP6はLys69のNεに結合する:
【化8】
a.固相ペプチド合成及び{ペプチド−樹脂}水溶性ポリマーの合成
C−末端ペプチドセグメント[RANTES(34−68)]−Lys69(Fmos)−Leu70を、Boc−Leu−OCH2−Pam−樹脂上で、Boc化学SPPSのためのin situ中和/HBTU活性化プロトコルを用いる一般的SPPS(シュネルツァーら、Int.J.Pep.Protein Res.(1992)40巻:180−193ページ)によって合成した。
鎖の組立て完了後、Lys69のイプシロン窒素のFmoc基を、DMF中20%ピペリジン処理によって、保護されたペプチド樹脂から除去した。その後無水琥珀酸をDIEAを含むDMF中HOBT溶液中でLys69のイプシロン窒素にカップリングした。洗浄後、樹脂結合琥珀酸の遊離カルボキシル基をDMF中CDIの添加によって活性化した。もう一回洗浄サイクルを行った後、DMF中0.5M HOBT中50%TTDを加えた。洗浄後、樹脂結合ポリマーは次の無水琥珀酸カップリング/CDI活性化/TTDカップリングというサイクルの準備ができた。6サイクル後、琥珀酸無水物を、HOBT/DMFプラスDIEA溶液中の最後のTTDアミンにカップリングした。
ペプチド/直鎖水溶性ポリマー樹脂をフッ化水素で樹脂から切り離し、生成物を逆相分取HPLCによって精製すると、[RANTES(34−68)]−Lys69(GP6)−Leu70が得られる。分析質量=6253Da;計算質量=6252Da(平均同位体組成)。
【0345】
3.G1755−01の製法
アミノオキシペンタン−グリオキサリル−PYSSDTTPCC
FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GKCSNPAVVF
VTRKNRQVCA NPEKKWVREY INSLEMSK(GP6)L(配列番号:4)
上記のN−末端及びC−末端ペプチドセグメントを、ドーソン(Dawson)らが記載したように(Science 266巻:776−779ページ(1994))天然型化学的ライゲーションによって一緒に結合した。還元型の完全長ポリペプチド生成物を逆相HPLCを使用してアセトニトリル対0.1%トリフルオロ酢酸含有水の直線勾配で精製した。分析質量=10,060Da。
GP6が付加した完全長ポリペプチドを、システイン−システイン レドックス対を含む緩衝水溶液中で2ジスルフィド結合を同時に形成しながら折りたたみ、標準的プロトコルにしたがい逆相HPLCによって精製した(ウィルケンら、Chemistry&Biology(1999)6巻(1号)43−51ページ)。折りたたまれた生成物はHPLCでは均質であった。分析質量=10,056Da;計算質量=10,058Da(平均同位体組成)。
【0346】
(実施例19)
RANTES類似体G1755の製法
図33に描かれるG1755を次のようにして合成した。
1.n−ノナノイル−RANTES(2−33)の製法
n−ノナノイル−PYSSDTTPCC FAYARPLPR
AHIKEYFYTS GK−チオエステル
n−ノナノイル−RANTES(2−33)をチオエステル生成樹脂上で実施例18に記載したように合成し、その後n−ノナノン酸を樹脂に直接カップリングすることによってN−末端を改変した。ペプチド樹脂をフッ化水素で切り離し、逆相HPLCで精製すると、n−ノナノイル−RANTES(2−33)が得られた。分析質量=4177.0Da;計算質量=4177.6Da(平均同位体組成)
【0347】
2.RANTES(34−68)−Lys69(GP6)−Leu70の製法CSNPAVVFVT RKNRQVCANP EKKWVREYIN
SLEMSK(GP6)L
a.固相ペプチド合成及び{ペプチド−樹脂}水溶性ポリマー合成
RANTES(34−68)−Lys69(Fmos)−Leu70を、Boc−Leu−OCH2−Pam−樹脂上の一般的固相ペプチド合成法によって、実施例18に記載のようにBoc化学固相ペプチド合成のためのin−situ中和/HBTU活性化プロトコルを使用して合成した。
鎖組立完了後、Lys69のイプシロン窒素上のFmoc基を保護されたペプチド樹脂から除去し、上記ペプチド樹脂上で実施例18に記載のようにGP6構成物を合成した。ペプチド/直鎖水溶性ポリマー樹脂をフッ化水素で切り離し、生成物を逆相分取HPLCで精製すると、RANTES(34−68)−Lys69(GP6)−Leu70が得られた。分析質量=6252.9Da;計算質量=6252.2Da(平均同位体組成)。
【0348】
3.G1755の製法
ノナノイル−PYSSDTTPCC FAYIARPLPR
AHIKEYFYTS GKCSNPAVVF VTRKNRQVCA
NPEKKWVREY INSLEMSK(GP6)L(配列番号:5)
a.天然型化学的ライゲーションによる完全長ポリペプチドの組立
N−末端及びC−末端ペプチドセグメントを上の実施例18に記載のように天然型化学的ライゲーションによって一緒に結合した。還元型の完全長ポリペプチドを、逆相HPLCを用い、アセトニトリル対0.1%トリフルオロ酢酸含有水の直鎖勾配で精製した。分析質量=10060.7Da;計算質量=10058.7Da(平均同位体組成)。
b.水溶性ポリマーで修飾したポリペプチドの折りたたみ及び精製
GP6が付加した完全長ポリペプチドを、システイン−システイン レドックス対を含む緩衝水溶液中で2ジスルフィドの同時形成のもとで折りたたみ、上の実施例18に記載のように逆相HPLCによって精製した。折りたたまれた生成物はHPLCでは均質であった。分析質量=10057.4Da;計算質量=10054.7Da(平均同位体組成)。
【0349】
(実施例20)
RANTES類似体G1805の製法
図34に描かれるG1805化合物を次のように合成した。
1.n−ノナノイル−RANTES(2−33)(Tyr3Chg)−チオエステルの製法
ノナノイル−PXSSDTTPCC FAYIARPLPR
AHIKEYFYTS GK−チオエステル
上記配列中、X=L−シクロヘキシルグリシン(Chg)。
n−ノナノイル−RANTES(2−33)(Tyr3Chg)を実施例18に記載のようにチオエステル生成樹脂上で合成し、それからn−ノナノン酸を上記樹脂に直接カップリングすることによってN−末端を改変した。上記ペプチド樹脂をフッ化水素で切り離し、逆相HPLCによって精製するとn−ノナノイル−RANTES(2−33)(Tyr3Chg)が得られた。分析質量=41512.0Da;計算質量=4152.6Da(平均同位体組成)。
【0350】
2.RANTES(34−68)(Met67Lys(Lev)−Lys69−Leu70)の製法
CSNPAVVFVT RKNRQVCANP EKKWVREYIN
SLEK(Lev)SKL
RANTES(34−68)(Met67Lys)−Lys69(Fmoc)−Leu70をBoc−Leu−OCH2−Pam−樹脂上で一般的SPPSによって、実施例18に記載のようにBoc化学SPPSのためのin situ中和/HBTU活性化プロトコルを使用して合成した。
鎖組立の完了後、Lys67のイプシロン窒素上のFmoc基を、DMF中20%ピペリジン処理によって、保護ペプチド樹脂から除去した。レブリン酸は1,3−ジ−イソプロピルカルボジ−イミドで対称性無水物として活性化され、Lys67のイプシロン窒素にカップリングした。ペプチド−樹脂をフッ化水素で切り離し、生成物を逆相分取HPLCによって精製すると、RANTES(34−68)(Met67Lys(Lev))−Lys69−Leu70が得られた。分析質量=4433.2Da;計算質量=4434.2Da(平均同位体組成)。
【0351】
3.G1805の製法
ノナノイル−PXSSDTTPCC FAYIARPLPR
AHIKEYFYTS GKCSNPAVVF VTRKNRQVCA
NPEKKWVREY INSLEK(Lev−GP29)SKL(配列番号:6)
上記配列中、X=L−シクロヘキシルグリシン(Chg)、GP29は、図34に描かれ、実施例4に記載のように合成された枝分かれオキシム結合水溶性ポリマー構成物である。
a.天然型化学ライゲーションによる完全長ポリペプチドの組立
N−末端及びC−末端ペプチドセグメントを実施例18に記載のように天然型化学的ライゲーションによって一緒に結合した。還元型完全長ポリペプチドを逆相HPLCを用い、アセトニトリル 対 0.1%トリフルオロ酢酸含有水の直線勾配で精製した。分析質量=8213.6Da;計算質量=8216.6Da(平均同位体組成)。
b.GP29の、結合完全長ポリペプチドへの付加
凍結乾燥した完全長ポリペプチドを、等モル量のアミノオキシアセチル(AoA)含有、枝分かれ水溶性ポリマー構成物GP29と共に溶解し、共に凍結乾燥した。乾燥粉末を溶解し、逆相HPLCによって精製すると、位置67リジンの改変された側鎖上のケト官能基にオキシム結合によって共有結合したGP29を有する完全長ポリペプチドが得られた。分析質量=23.836Da;計算質量=23.845Da(平均同位体組成)。別法として上記ポリペプチドの折りたたみ後にGP29が共有結合された;しかしこの方法では低収率であることが判明した。
c.オキシム結合GP29を含むポリペプチドの折りたたみおよび精製
GP29と結合した完全長ポリペプチドをシステイン−システイン レドックス対を含む緩衝水溶液中で2ジスルフィド結合を同時に生成しながら折りたたみ、実施例18に記載のように逆相HPLCによって精製した。折りたたまれた生成物はHPLCでは均質であった。分析質量=23,832Da;計算質量=23,840Da(平均同位体組成)。
【0352】
(実施例21)
RANTES類似体G1806の製法
図35に描かれるRANTES類似体、G1806、を次のように合成した。
1.n−ノナノイル−RANTES(2−33)(Tyr3Chg)−チオエステルの製法
ノナノイル−PXSSDTTPCC FAYIARPLPR
AHIKEYFYTS GK−チオエステル
上記配列中、X=シクロヘキシルグリシン(Chg)
ペプチドセグメント n−ノナノイル−RANTES(2−33)(Tyr3Chg)−チオエステル(チオエステルは−COSRとも記される、ここでRはアルキル基である)を実施例18に記載したようにチオエステル生成樹脂上で合成し、その後n−ノナン酸を樹脂に直接カップリングすることによってN−末端を改変した。上記ペプチド樹脂をフッ化水素で切断し、逆相HPLCで精製するとn−ノナノイル−RANTES(2−33)Tyr3Chgが得られた。分析質量=4152.0Da;計算質量=4152.6Da(平均同位体組成物)。
【0353】
2.RANTES(34−68)(Met67Lys(Lev))−Lys69(Palm)−Leu70の製法
CSNPAVVFVT RKNRQVCANP EKKWVREYIN
SLEK(Lev)SK(Palm)L
上記配列中、K(lev)は、野生型RANTESから変化したMet67LysのLys67のレブリン酸修飾イプシロン窒素である;K(Palm)はアミノ−オクタン部分を介して結合したパルミテート修飾−Lys69−イプシロン窒素で、次の構造を有する:
[ε窒素Lys69]−C(O)−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−NH−C(O)−(CH2)14−CH3
RANTES(34−68)(Met67Lys)−Lys69(Palm)−Leu70は、一般的SPPSによって、Boc−Leu−OCH2−Palm樹脂上で実施例18に記載のようにBoc化学固体相ペプチド合成のためのin situ中和/HBTU活性化プロトコルを用いて合成された。位置69でBoc−Lys(Fmos)−OHをカップリングした後、上記Fmos基をDMF中で20%ピペリジンで除去した。Fmos−8−アミノ−オクタン酸をHBTU/DIEAで活性化し、Lys69のイプシロン窒素にカップリングした。Fmos基の除去後、パルミチン酸を1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール(HATU)及び1,3−ジ−イソプロピルカルボジ−イミドで活性化し、樹脂に結合した。それから実施例18に記載のように、標準Boc化学SPPS法を使用して鎖組立を完了した。鎖組立の完了後、Lys67のイプシロン窒素上のFmos基をDMF中20%ピペリジン処理によって除去した。レブリン酸を1,3−ジ−イソプロピルカルボジ−イミドで対称性無水物として活性化し、Lys67のイプシロン窒素に連結した。ペプチド樹脂をフッ化水素で切り離し、生成物を逆相分取HPLCで精製すると、RANTES(34−68)(Met67Lys(Lev))−Lys69(パルミテート)−Leu70が得られた。分析質量=4813.7Da;計算質量=4813.8Da(平均同位体組成)。
【0354】
3.G1806の製法
ノナノイル−PXSSDTTPCC FAYIARPLPR
AHIKEYFYTS GKCSNPAVVF VTRKNRQVCA
NPEKKWVREY INSLEK(Lev−GP29)SK(Palm)L (配列番号:7)
上記配列中、X=L−シクロヘキシルグリシン(Chg)であり、パルミテート(“Palm”)脂肪酸結合はアミノ−オクタン部分を介して行われる:
[ε窒素Lys69]−C(O)−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−NH−C(O)−(CH2)14−CH3
a.脂肪酸修飾完全長ポリペプチドの天然型化学的ライゲーションによる組立
N−末端及びC−末端ペプチドセグメントを一緒に、実施例18に記載のように天然型化学的ライゲーションによって結合した。還元型の完全長ポリペプチドを、逆相HPLCを使用し、アセトニトリル 対 0.1%トリフルオロ酢酸含有水の直線勾配で精製した。分析質量=8598.2Da;計算質量=8596.3Da(平均同位体組成)
b.水溶性ポリマーGP29と、連結した脂肪酸修飾完全長ポリペプチドとの結合
凍結乾燥した完全長ポリペプチドを溶解し、等モル量のAoA含有ポリマーGP29と共に凍結乾燥した。乾燥した粉末を溶解し、逆相HPLCによって精製すると、位置67のリジンの改変された側鎖上のケト官能基にGP29がオキシム結合した完全長ポリペプチドが得られた。分析質量=24,217Da;計算質量=24,224Da(平均同位体組成)。或いは、上記ポリペプチドの折りたたみ後にGP29を共有結合することができる、しかしこの方法は低収率であることが判明した。
c.オキシム結合したGP29及び脂肪酸を含むポリペプチドの折りたたみ及び精製
GP29が付加した完全長ポリペプチドをシステイン−システイン レドックス対を含む緩衝水溶液中で2ジスルフィド結合を同時に生成しながら折りたたみ、実施例18に記載のように逆相HPLCによって精製した。折りたたまれた生成物はHPLCでは均質であった。分析質量=24,210Da;計算質量=24,220Da(平均同位体組成)。
図36には最終的折りたたみ、精製、合成Rantes類似体をあらわす分析データが示される。より詳細に述べれば、還元(R)及び非還元(N)条件下で野生型(Wt)RANTESの相対的分子量を合成ケモカイン類似体RANTES G1806に比較する典型的SDS−PAGEゲルが図36に示される。相対的分子量は各ゲルの左手側に記され、それらは同じゲル上の分子量標準試験(示されず)に対応する。折りたたまれ、精製されたG1806生成物の代表的RP−HPLCクロマトグラムも示される。これらは精密なポリマー修飾構成物が野性型天然RANTESに比較して純粋であり、相対的分子量が大きいことを説明する。
【0355】
(実施例22)
G1755−01、G1755、G1805及びG1806の細胞融合アッセイ 細胞融合アッセイを行い、種々のポリマー修飾RANTES類似体の抗−HIV活性を調べた。与えられた化合物パネルのCCR5−依存性細胞融合能力を、CD4及びCCR5を担い、リポーター系を含む細胞と融合するウィルス−エンベロープタンパク質を含むように改質された細胞を使用して測定した。CCR5−依存性ウィルス−エンベロープ仲介性細胞融合アッセイは、実質的にシモンズら(Science(1997)276巻:276−279ページ)が記載した方法で、細胞系HeLa−P5L及びHeLa−Env−ADAを用いて(両方ともアリゾン(M.Alizon)(パリ)の研究室から提供された)行われた。つまり、HeLa−P5L細胞を96ウェル プレートに培養した(104細胞/100μl/各ウェル)。24時間後、培地を除去し、104HeLa−Env−ADA細胞/ウェル+ケモカインを含む培地を加えた(200μl最終容量)。さらに24時間後、細胞をPBSで1回洗い、50μl PBS/0.5%NP−40中で室温で15分間溶解(lysed)した。溶解物(lysates)について、β−ガラクトシダーゼ活性を次のように分析試験した:50μl 2×CPRG基質(16mMクロロフェノール レッド−β−D−ガラクトピラノシド;120mM Na2HPO4、80mM NaH2PO4、20mM KCl、20mM MgSO4、及び10mM β−メルカプトエタノール)を加え、それから暗所で室温で1−2時間インキュベートした。575nmの吸光度をラブシステムズ(Labsystems)マイクロプレート リーダーで読み取った。これらの数値から、阻止パーセント[100×(OD(試験))−OD(陰性対照)]/OD(陽性対照)−OD(陰性対照)]を各阻止濃度で計算した。融合阻止パーセントを阻止濃度に対してプロットすると、各化合物のIC50が計算できた。
代表的結果を下の表XIIに示す。
【0356】
表XII
【表11】
【0357】
これらの結果は、直鎖または枝分かれ水溶性ポリマー構成物で部位特異的修飾を行った後も、抗融合活性がかなり保有されることを示す。この結果は、脂肪酸のような疎水性部分がC−末端に付加した際に種々のRANTES類似体に観察された活性増加を考えると、驚くべきである。これはRANTES類似体の疎水性が概して抗融合活性を高めるという仮説を支持するものである。これに対して、修飾に用いた水溶性ポリマー、特に枝分かれ水溶性ポリマーは非常に親水性で負に帯電していたが、活性の減少はごくわずかで、それはin vivo活性に求められる目標効力範囲内に十分入っていることが認められた。さらにより予想外だったことは、大きい、負に帯電した枝分かれ水溶性ポリマー構成物で修飾されたRANTES類似体の活性が、より小さい直鎖水溶性ポリマー構成物に比較して、相対的に保留されていたこと、及び小さい直鎖ポリマーで修飾された類似体と大きい枝分かれポリマーで修飾された類似体とが活性に対してほぼ同じ効果を有したことである。この後者の考察は、一部分は、水溶性ポリマーによる修飾が野生型RANTESのペンダントC−末端残基内部の凝集領域において設計通り行われる際の凝集特性、および/または水溶性ポリマーの局所的抗融合特性によると考えられる。
【0358】
追加的効力増強性変化が、AOP−RANTES及びNNY−RANTESに対して、水溶性ポリマーの結合に起因するわずかの活性損失を代償する。これらの変化は、N−末端への1個以上の疎水性アミノ酸誘導体の挿入、及びC−末端への疎水性脂肪酸部分の付加等がある。これらの結果は、単分散ポリアミド エチレンポリマー類(またはその他の水溶性ポリマー類)と関連した付加的変化がNNY−及びAOP−型改変ケモカイン分子(例えばN−末端にPro2Thz及びTyr3Chg両方の変化を受けた、および/またはC−末端に脂質部分が付加された、AOP−またはNNY−RANTES等)の全体的効力を改善し得ることを示唆する。
【0359】
(実施例23)
G1755、G1805、及びG1806の薬物動態試験
ポリマー−修飾RANTES類似体の薬物動態試験を次のように雄SDラットで行った。前記のように製造したRANTES類似体G1755、G1805、及びG1806(対照としてのAOP−RANTESと共に)を注射直前に、凍結乾燥タンパク質ストックから燐酸緩衝食塩水(pH7.0)中組成物として静脈注射(IV)用に処方した。個々の試験動物に等モル量のRANTES類似体が投与されるように処方した[400μg/kg(AOP−RANTES);510μg/kg(G1755);1210μg/kg(G1805);及び1225μg/kg(G1806)(μg類似体/kg動物)]。必要ならば最終濃度を調節して各動物で1ml/kgの総投与量にした(すなわち投与容量を一定に保った)。実験1日目に処方した各類似体をラットの尾から静脈内に投与し、各動物は単回量を受けた。
【0360】
実験期間を通じて、各サンプル採取時点に約0.25mlの血液を尾静脈/動脈から集め、標準的プロトコル及び国立衛生研究所(NIH)動物ケア指針及び推奨される試験法にしたがって抗凝固剤としてEDTAを使用して血漿または血清サンプルを調製した。最初のデータ収集に基づいて、各動物で3週間以内に0.25リットル サンプルを14回より多く採取することは避けるようにサンプル採取時を調節した(NIH動物ケア指針によって決められている)。最初のサンプル後、検出可能の血中濃度が持続するまでの間、1週間間隔で追加的サンプルを集めた。各時点における各RANTES類似体の血漿濃度をメーカーのインストラクションによって、クァンチカイン(商標)ELISA、ヒトRANTESイムノアッセイ(R&Dシステムズ カタログ#DRN00)を使用して測定した。動物の体重、食習慣、素質、外観等を含む全身的健康状態を実験期間中モニターした。明らかな副作用は認められなかった。典型的結果を図37に記す。
【0361】
これらの結果は、種々の前駆体RANTES類似体に水溶性ポリマーを付加することによって循環半減期が実質に増加することを示している;半減期の見かけ上の増加はG1805>G1806>G1755>AOP−RANTESである。AOP−RANTESに比べて、G1805では約40倍、G1806では20倍、G1755では10倍であった。まとめていうと、水溶性ポリマー修飾RANTES類似体において保持される高い効力と顕著に改善される循環半減期とのバランスから、in vivo環境におけるこれら化合物の治療的硬化の改善、並びに治療に必要な投与回数および一量の減少が期待される。
【0362】
本発明を本発明の特殊な実施形態と関連づけて説明したが、その他の改変も可能であることは当然であり、本出願は、概ね本発明の原理にしたがう本発明のいかなるバリエーション、使用または適応を網羅し、そのなかには、本発明が係わる技術の範囲内の公知のまたは従来の実地に使われる、またはこれまでに示した本質的特徴のために利用できる本開示からの逸脱も含まれるものとする。
【0363】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1A】
本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質の製法の略図である。
【図1B】
図1Aと同様な図である。
【図1C】
図1Aと同様な図である。
【図1D】
図1Aと同様な図である。
【図1E】
図1Aと同様な図である。
【図2A】
本発明の合成生物活性タンパク質の製法の略図である。
【図2B】
図2Aと同様な図である。
【図2C】
図2Aと同様な図である。
【図3A】
3本以上の重なり合わないペプチドセグメントの化学的ライゲーションを含む多セグメントライゲーションのプロセスの略図である;すなわち少なくとも1本のセグメントが最終的完全長ライゲーション生成物に対応する中間セグメントである。
【図3B】
図3Aと同様な図である。
【図4A】
生成した側鎖チオールの化学的ライゲーション及び化学的改変を示す図である。
【図4B】
図4Aと同様な図である。
【図4C】
図4Aと同様な図である。
【図5A】
本発明の水溶性ポリマーU−B−“ポリマー”−J*の分岐コア(B)及び特異的化学選択的官能基(U)を生成する固相プロセスを示す図である。
【図5B】
図5Aと同様な図である。
【図6A】
本発明の好ましい実質的に非抗原性、水溶性ポリアミド“ポリマー”−J*コンポーネントを生成し、その後U−Bコアに結合させる固相プロセスを示す図である。
【図6B】
図6Aと同様な図である。
【図6C】
図6Aと同様な図である。
【図6D】
図6Aと同様な図である。
【図7】
U−Bコンポーネントを“ポリマー”−J*コンポーネントにカップリングし、式U−B−ポリマー−J*であらわされる本発明の好ましい合成ポリマー構成物を生成するプロセスを示す図である。
【図8】
本発明の生物活性タンパク質のライゲーション及び産生のために使用できるペプチドセグメントに水溶性ポリマーを正確に結合するためのもう一つの経路を示す図である。
【図9】
本発明の合成生物活性タンパク質の全体的製法を示す図である。
【図10】
合成赤血球産生刺激タンパク質の好ましいタイプの一般的構造を示す図である。pPEG=“precision PEG”
【図11】
再配置されたアミノ及びカルボキシ末端を有する、環状に入れ替えたSEP同族体の一般的構造を示す図である。
【図12】
合成生物活性タンパク質の基礎構造を示す図である。図において、“J”は疎水性側鎖を有する非天然的にコードされた残基を意味する。
【図13】
好ましい合成RANTES類似体の構造を示す。図において、NNY=ノナノイル、X=疎水性側鎖を有する非天然的にコードされたアミノ酸。FA=脂肪酸。
【図14A】
好ましい水溶性ポリマー、及びその種々の直鎖及び枝分かれ構成物を示す図である。
【図14B】
図14Aと同様な図である。
【図14C】
図14Aと同様な図である。
【図14D】
図14Aと同様な図である。
【図15】
枝分かれ鎖pPEGポリマーの形成を図式的に描いた図である。
【図16A】
実施例2に記載したように作製されたヒトEPOの精密なポリマー修飾合成類似体である、SEP1−L30と呼ばれる合成サイトカインの合成を示す図である。
【図16B】
図16Aと同様な図である。
【図16C】
図16Aと同様な図である。
【図16D】
図16Aと同様な図である。
【図16E】
図16Aと同様な図である。
【図17】
実施例2に記載したように作製されたヒトEPOの精密なポリマー修飾合成類似体である、SEP1−L30と呼ばれる合成サイトカインを示す図である。
【図18】
実施例3に記載したように作製されたヒトEPOの精密なポリマー修飾合成類似体である、SEP1−L26と呼ばれる合成サイトカインを示す図である。
【図19A】
実施例4に記載したように作製されたヒトEPOの精密なポリマー修飾合成類似体である、SEP1−B50と呼ばれる合成サイトカインに結合する好ましい枝分かれ鎖水溶性ポリマーの形成を図式的に示す図である。
【図19B】
図19Aと同様な図である。
【図20】
実施例4に記載したように作製されたヒトEPOの精密なポリマー修飾合成類似体であるSEP1−B50と呼ばれる合成サイトカインを示す図である。
【図21A】
実施例5に記載したように作製されたヒトEPOの精密なポリマー修飾合成類似体であるSEP3−L42と呼ばれる合成サイトカインの合成を示す図である。
【図21B】
図21Aと同様な図である。
【図22】
実施例5に記載したように作製されたヒトEPOの精密なポリマー修飾合成類似体であるSEP3−L42と呼ばれる合成サイトカイン
を示す図である。
【図23A】
実施例7に記載したように作製されたヒトEPOの精密なポリマー修飾合成類似体である、SEP1−B51と呼ばれる合成サイトカインに結合させるための好ましい水溶性ポリマーの合成を示す図である。
【図23B】
図23Aと同様な図である。
【図24】
実施例7に記載したように作製されたヒトEPOの精密なポリマー修飾合成類似体である、SEP1−B51と呼ばれる合成サイトカインを示す図である。
【図25A】
実施例8に記載したように作製されたヒトEPOの精密なポリマー修飾合成類似体である、SEP1−B52と呼ばれる合成サイトカインに結合させるための好ましい水溶性ポリマーの合成を示す図である。
【図25B】
図25Aと同様な図である。
【図26】
実施例8に記載したように作製されたヒトEPOの精密なポリマー修飾合成類似体である、SEP1−B52と呼ばれる合成サイトカインを示す図である。
【図27】
実施例2−5及び7−8に記載したように作製されたヒトEPOの精密なポリマー−修飾合成類似体の代表的分析データを示す図である。示されるように、代表的等電点電気泳動ゲル(IEF)及び非還元性SDS−PAGEゲルは折りたたまれた精製SEP1−B51の相対的モノマー分子量を示す。
【図28】
SEP化合物の因子依存性細胞系、SEP0、SEP1−L26、SEP1−L30、SEP1−B50、SEP1−B51、及びSEP3−L42のin vitro活性を示す図である。
【図29】
SEP3−L42及びSEP1−B50の血漿中濃度、ナノグラム/ミリリットル(ng/ml)対 時間(hour)を比較する薬物動態曲線を示す図である。
【図30】
SEP1−B51と、低酸素症ラットモデルのCHO細胞で産生された組換えグリコシレート化ヒトエリスロポエチンとで、72時間赤血球(RBC)−59Fe取り込み(投与量の%として)によって測定したin vivo活性の線型回帰分析を示す図である。
【図31】
各化合物5μg/kgの単回静脈内注射後の時間(hour)に対するSEP1−B51及びrhEPOの血漿中濃度(ng/kg)を比較する、ラットにおけるクリアランスの典型的薬物動態曲線を示す図である。
【図32】
実施例18に記載したように作製したRANTESの精密なポリマー−修飾合成類似体である、RANTES G1755−01と呼ばれる合成ケモカインを示す図である。
【図33】
実施例19に記載したように作製されたRANTESの精密なポリマー−修飾合成類似体である、RANTES G1755と呼ばれる合成ケモカインを示す図である。
【図34】
実施例20に記載したように作製された、RANTESの精密なポリマー−修飾合成類似体であるRANTESG1805と呼ばれる合成ケモカインを示す図である。
【図35】
実施例21に記載したように作製された、RANTESの精密なポリマー−修飾合成類似体である、RANTESG1806と呼ばれる合成ケモカインを示す図である。
【図36】
実施例18−21において作製された合成ケモカイン類似体に関する典型的分析データを示す図である。示されるように、典型的SDS−PAGEゲルは還元性状態(R)及び非還元性状態(N)における野生型(Wt)RANTESと合成ケモカイン類似体RANTESG1806との相対的分子量を比較する。
【図37】
各動物に各化合物の等モル量/キログラム(kg)を単回静脈内投与した後の時間(分)に対する合成RANTES類似体G1755、G1806、及びG1805の血漿中濃度(ピコグラム/ミリリットル(pg/ml))を比較するラットのクリアランスの薬物動態曲線を示す図である。
【図38】
環状に入れ替えたポリマー修飾化合物を示す図である。
Claims (109)
- タンパク質−Un−B−“ポリマー”−J*の式を有する分離された合成生物活性タンパク質であって、上記式中、タンパク質はリボソーム特異的タンパク質のポリペプチド鎖を含んでなり、前記ポリペプチド鎖は一つ以上の化学的ライゲーション部位によって共有結合した一つ以上の重なり合わない(non−overlapping)ペプチドセグメントを含み、Uは一つ以上の前記重なり合わないペプチドセグメントの一つ以上のアミノ酸の側鎖nの相互に反応性の特異的官能基に共有結合する特異的官能基の残基であり、ここでnは1ないし6から選択される整数であり、Bは同じでも異なっていてもよく、存在しても存在しなくてもよい、3個以上のアームを有する分岐コアであり、ポリマーは実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり、J*は負−、中性−及び正電荷からなる群から選択される正味の電荷を生理的条件下で有するペンダント基である合成生物活性タンパク質。
- 前記合成生物活性タンパク質が25,000ダルトンより大きい分子量のモノマーを含んでなる請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記合成生物活性タンパク質は前記リボソーム特異的タンパク質と関連する生物活性を模する生物活性を有する請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記リボソーム特異的タンパク質が哺乳動物タンパク質である請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記哺乳動物タンパク質がサイトカインである請求項4に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記サイトカインがインターロイキン、赤血球産生刺激タンパク質、インターフェロン、リンホカイン、ケモカイン、増殖因子、コロニー刺激因子及びシグナル ペプチド ホルモンからなる群から選択される請求項4に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記哺乳動物タンパク質がヒトタンパク質である請求項4に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記リボソーム特異的タンパク質がリボソーム特異的グリコシル化部位を含む請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- Uが、リボソーム特異的グリコシル化部位に対応する前記ポリペプチド鎖の一部位で前記側鎖nに共有結合する請求項8に記載の合成生物活性タンパク質。
- Uが、前記リボソーム特異的グリコシル化部位に対応する一部位だけで前記側鎖nに共有結合する請求項9に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記リボソーム特異的タンパク質が組換えによって産生されたタンパク質である請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記組換えによって産生されたタンパク質が非天然タンパク質である請求項11に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記非天然タンパク質が一つ以上の非天然リボソーム特異的グリコシル化部位を有する請求項12に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記ポリペプチド鎖が一つ以上のイレギュラーアミノ酸を含む請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記イレギュラーアミノ酸が20個の遺伝子的にコードされるアミノ酸の一つより多い側鎖を有する請求項14に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記イレギュラーアミノ酸が擬似アミノ酸及び疎水性アミノ酸誘導体からなる群から選択される請求項15に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記化学的ライゲーション部位がアミド、オキシム、ヒドラゾン、チオエステル、チアゾリジン、オキサゾリジン及びチオエステルからなる群から選択される結合を含む請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記側鎖nが非天然側鎖である請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- Uが、化学的ライゲーションによって形成された結合によって前記側鎖nに共有結合する請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- 化学的ライゲーションによって形成された前記結合がアミド、オキシム、ヒドラゾン、チオエステル、チアゾリジン及びオキサゾリジンからなる群から選択される請求項19に記載の合成生物活性タンパク質。
- U、B、ポリマー及びJ*の一つ以上がスペーサーまたはリンカーによって分離され、式U−s1−B−s2−ポリマー−s3−J*を有し、その際s1、s2、s3が、同じでも異なっていてもよく、個々に存在しても存在しなくてもよいスペーサーまたはリンカー部分である請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- Uがオキシム、アミド、アミン、ウレタン、エーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、ヒドラジド、オキサゾリジン及びチアゾリジンから選択される結合の残基である請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- Bの一つのアームがUに結合し、Bの第二のアームがポリマーに結合する請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- Bが4本以上のアームを含んでなる請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記アームの少なくとも1本がオキシム、アミド、アミン、ウレタン、チオエーテル、エステル、チオエステル、ヒドラジド、オキサゾリジン、及びチアゾリジンからなる群から選択される結合の残基を含む請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- Bがアミノ、カルボン酸塩及び混合アミノ−カルボン酸塩から選択される分岐コアを含む請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記アミノ分岐コアがリジンを含み、前記カルボン酸塩分岐コアがグルタミン−またはアスパラギン酸を含み、前記混合アミノ−カルボン酸塩分岐コアがガンマ−グルタミン酸を含む請求項26に記載の合成生物活性タンパク質。
- “ポリマー”がポリアルキレンオキシド、ポリアミド アルキレン オキシド及びそれらの誘導体からなる群から選択される請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記側鎖nが前記ポリペプチド鎖の化学的ライゲーション部位にある請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- B−“ポリマー”−J*が1,500ないし80,000ダルトンの分子量を有する請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- 側鎖nが2以上であり、B−“ポリマー”−J*の一つ以上が異なる請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- B−“ポリマー”−J*が負−、中性−及び正電荷からなる群から選択される正味の電荷を生理的条件下で有する請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- B−“ポリマー”−J*が単分散(mono−disperse)である請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記合成生物活性タンパク質が単分散である請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- “ポリマー”が式−[C(O)−X−C(O)NH−Y−NH]n−または−[NH−Y−NH−C(O)−X−C(O)]n−のポリアミドであり、上記式中、X及びYは同じでも異なっていてもよく、枝分かれしていても直鎖でもよい二価ラジカルであり、nは2ないし100の整数であり、X及びYのいずれかまたは両方が直鎖または枝分かれした水溶性反復単位からなる請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記Xが式−NH−X’−または−X’−NH−であらわされる二価ラジカルであり、上記式中X’は直鎖または枝分かれした水溶性反復単位からなる請求項35に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記Yが式−CO−Y’−または−Y’−CO−であらわされる二価ラジカルであり、上記式中Y’は二価ラジカルである請求項35に記載の合成生物活性タンパク質。
- nが2から50までの整数である請求項35に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記水溶性反復単位が式−(CH2−CH2−O)−または−(O−CH2−CH2)−のエチレンオキシド反復単位を含んでなる請求項35に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記エチレンオキシド反復単位が式−(CH2−CH2−O)n−または−(O−CH2−CH2)n−を有し、上記式中nは2ないし50の不連続整数である請求項39に記載の合成生物活性タンパク質。
- Jが、負−及び正電荷からなる群から選択される正味電荷を生理的条件下で有するイオン化可能基である請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記イオン化可能基がカルボキシル、アミン及びヒドロキシルから選択される請求項41に記載の合成生物活性タンパク質。
- Jが、生理的条件下で正味の中性電荷を有するイオン化可能基である請求項1に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記水溶性ポリマーのない対応する合成生物活性タンパク質に比較して、哺乳動物において、より大きい循環半減期を有する請求項35に記載の合成生物活性タンパク質。
- リボソーム特異的糖タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖を含んでなる合成生物活性タンパク質であって、前記ポリペプチド鎖は一つ以上の水溶性ポリマーを結合して含み、25kDaより大きいモノマー分子量を有する合成生物活性タンパク質。
- 前記合成生物活性タンパク質が、前記リボソーム特異的糖タンパク質に関連した生物活性を模する生物活性を有する請求項45に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記リボソーム特異的糖タンパク質がサイトカインである請求項46に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記サイトカインが赤血球産生刺激タンパク質、ランテス(Rantes)、及び顆粒球コロニー刺激因子からなる群から選択される請求項47に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記リボソーム特異的糖タンパク質が一つ以上のグリコシル化部位を含む請求項45に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記水溶性ポリマーが前記ポリペプチド鎖の、前記一つ以上のグリコシル化部位に対応する一つ以上の部位に結合する請求項49に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記水溶性ポリペプチドが前記ポリペプチド鎖の、前記一つ以上のグリコシル化部位に対応する一つ以上の部位にだけ結合する請求項50に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記リボソーム特異的糖タンパク質が組換えによって産生された糖タンパク質である請求項45に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記組換えによって産生された糖タンパク質が非天然糖タンパク質である請求項52に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記非天然糖タンパク質が一つ以上のグリコシル化部位を有する請求項53に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記ポリペプチド鎖が一つ以上のイレギュラーアミノ酸を含む請求項45に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記水溶性ポリマーが1,500ないし80,000ダルトンの分子量を有する請求項45に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記水溶性ポリマーが負−、中性−及び正電荷からなる群から選択される正味の電荷を生理的条件下で含む請求項45に記載の合成生物活性タンパク質。
- “ポリマー”がポリアルキレンオキシド、ポリアミド アルキレンオキシド及びそれらの誘導体からなる群から選択される請求項45に記載の合成生物活性タンパク質。
- “ポリマー”が式−[C(O)−X−C(O)NH−Y−NH]n−または−[NH−Y−NH−C(O)−X−C(O)]n−のポリアミドであり、上記式中、X及びYは同じでも異なっていてもよく、枝分かれしていても直鎖でもよい二価ラジカルであり、nは2ないし100の整数であり、X及びYのいずれかまたは両方が直鎖または枝分かれした水溶性反復単位からなる請求項45に記載の合成生物活性タンパク質。
- nが2から50までの整数である請求項59に記載の合成生物活性タンパク質。
- 前記水溶性反復単位が式−(CH2−CH2−O)−または−(O−CH2−CH2)−のエチレンオキシド反復単位を含んでなる請求項59に記載の合成生物活性タンパク質。
- 請求項1から請求項61までのいずれか1項に記載の合成生物活性タンパク質、または薬物学的に容認されるそれらの塩類を含む医薬組成物。
- 緩衝剤、担体タンパク質、アミノ酸、界面活性剤、脂質、水溶性ポリマー及び保存料からなる群から選択される一つ以上の賦形剤を含む請求項62に記載の医薬組成物。
- 前記合成生物活性タンパク質以外にその他の生物活性物質を一種類以上含む請求項63に記載の医薬組成物。
- ヒトの疾患または症状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする人に、約25kDaより大きいモノマー分子量を有し、天然ヒトタンパク質受容体またはそのフラグメント、タンパク質受容体リガンドまたはそのフラグメント、またはサイトカインと関連する生物活性を模する生物活性を有するポリマー修飾合成生物活性タンパク質の分子的に均質な医薬組成物を一種類以上含む医薬組成物を有効量投与することを含んでなる治療法。
- 前記合成生物活性タンパク質がサイトカインの生物活性を有する請求項65に記載の治療法。
- 前記サイトカインがインターロイキン、赤血球産生刺激タンパク質、インターフェロン、リンホカイン、ケモカイン、増殖因子、コロニー刺激因子及びシグナルペプチド ホルモンからなる群から選択される請求項66に記載の治療法。
- 天然ヒトタンパク質受容体またはそのフラグメント、タンパク質受容体リガンドまたはそのフラグメント、またはサイトカインの生物活性またはその欠乏と関連するヒト疾患または症状を治療するために使用される請求項62に記載の医薬組成物。
- 前記ポリマー修飾合成生物活性タンパク質がサイトカインの生物活性を有する請求項68の医薬組成物。
- 前記サイトカインがインターロイキン、赤血球産生刺激タンパク質、インターフェロン、リンホカイン、ケモカイン、増殖因子、コロニー刺激因子、及びシグナルペプチド ホルモンからなる群から選択される請求項69に記載の医薬組成物。
- 合成生物活性ポリマー修飾タンパク質のポリマー修飾ポリペプチド鎖を生成する方法であって、前記方法は前記合成生物活性ポリマー−修飾タンパク質の重なり合わないアミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に連結することを含み、その際前記ペプチドセグメントの一つ以上がそれに結合した水溶性ポリマーを有し、それによって前記合成生物活性ポリマー修飾タンパク質のポリマー修飾ポリペプチド鎖が生成する方法。
- 前記ポリペプチド鎖がリボソーム特異的タンパク質のアミノ酸配列を含む請求項71に記載の方法。
- 前記リボソーム特異的タンパク質が哺乳動物タンパク質である請求項72に記載の方法。
- 前記哺乳動物タンパク質がサイトカインである請求項73に記載の方法。
- 前記サイトカインがインターロイキン、赤血球産生刺激タンパク質、インターフェロン、リンホカイン、ケモカイン、増殖因子、コロニー刺激因子、及びシグナルペプチド ホルモンからなる群から選択される請求項74に記載の方法。
- 合成生物活性ポリマー修飾タンパク質を生成するために前記ポリマー修飾ポリペプチド鎖を折りたたむことをさらに含む請求項71に記載の方法。
- 前記ペプチドセグメントの一つ以上が部分的に保護されている請求項71に記載の方法。
- 前記ペプチドセグメントの一つ以上が保護されていない請求項71に記載の方法。
- 前記ペプチドセグメントの一つ以上が一つ以上のイレギュラーアミノ酸を含む請求項71に記載の方法。
- 前記化学的ライゲーションが、天然型化学的ライゲーション、拡張天然型化学的ライゲーション及び擬似天然型化学的ライゲーションから選択される化学選択的ライゲーション化学作用を含む請求項71に記載の方法。
- 前記水溶性ポリマーが1,500ないし80,000ダルトンの分子量を含む請求項71に記載の方法。
- 合成生物活性ポリマー修飾タンパク質のポリマー修飾ポリペプチド鎖を生成する方法であって、前記方法は:
a.前記合成生物活性ポリマー修飾タンパク質の重なり合わないアミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に連結し、前記合成生物活性ポリマー修飾タンパク質のアミノ酸配列に対応する完全長ポリペプチド鎖を形成し、その際前記ペプチドセグメントの一つ以上は第一の特異的化学選択基を含み;
b.水溶性ポリマーを前記完全長ポリペプチド鎖に化学的に連結し、前記水溶性ポリマーは、前記第一の特異的化学選択基と相互にかつ特異的に反応する第二の化学選択基を含み、それによって前記合成生物活性ポリマー−修飾タンパク質のポリマー修飾ポリペプチド鎖が生成する
諸段階からなる方法。 - 合成生物活性ポリマー修飾タンパク質を産生するために前記ポリマー修飾ポリペプチド鎖を折りたたむことをさらに含む請求項82に記載の方法。
- 合成生物活性ポリマー修飾タンパク質の生成法であって、前記方法は、
a.前記合成生物活性ポリマー修飾タンパク質の重なり合わないアミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に連結し、前記合成生物活性ポリマー修飾タンパク質のアミノ酸配列に対応する完全長ポリペプチド鎖を形成し、その際前記ペプチドセグメントの一つ以上が、遺伝子的にコードされたアミノ酸の側鎖官能基とは反応しない第一の特異的化学選択基を含む非天然側鎖を含み;
b.前記完全長ポリペプチド鎖を折りたたんで、折りたたまれたポリペプチド鎖を形成し;
c.水溶性ポリマーを前記折りたたまれたポリペプチド鎖に化学的に連結し、前記水溶性ポリマーは、前記第一の特異的化学選択基と相互にかつ特異的に反応する第二の化学選択基を含み、それによって前記合成生物活性ポリマー修飾タンパク質のポリマー修飾ポリペプチド鎖が生成する
諸段階を含んでなる方法。 - 下記の式であらわされる分子的に均質な水溶性ポリマーにおいて:
U−s1−B−s2−“ポリマー”−s3−J*
上記式中Uは特異的官能基の残基であり、Bは同じでも異なっていてもよく、存在しても存在しなくてもよい、3本以上のアームを有する分岐コアであり、“ポリマー”は式−[C(O)−X−C(O)−NH−Y−NH]n−または−[NH−Y−NH−C(O)−X−C(O)]n−を有し、約5,000Daより大きい分子量を有するポリアミドであり、ここでX及びYは同じでも異なっていてもよく、枝分かれしていても直鎖でもよい二価ラジカルであり、nは2から50までの整数であり、X及びYのいずれかまたは両方が直鎖かまたは枝分かれしている実質的に非抗原性の水溶性反復単位を含み、J*は負−、正−及び中性電荷からなる群から選択される正味の電荷を生理的条件下で有する実質的に非抗原性のペンダント基の残基であり、s1、s2、及びs3は同じでも異なっていてもよく、個々に存在しても存在しなくてもよいスペーサーまたはリンカー部分である水溶性ポリマー。 - Uがアクリレート、アルデヒド、ケトン、アミノオキシ、アミン、カルボン酸、エステル、チオエステル、ハロゲン、チオール、シアノアセテート、ジパルミトイル ホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイル ホスファチジルエタノールアミン、エポキシド、ヒドラジド、アジド、イソシアネート、マレイミド、メタクリレート、ニトロフェニル カルボネート、オルトピリジル ジスルフィド、シラン、スルフヒドリル、ビニルスルホン類、スクシンイミジル グルタレート、スクシミジル スクシネート、琥珀酸、トレシレート及び活性化可能な官能基からなる群から選択される官能基の残基である請求項85に記載の水溶性ポリマー。
- Uが、カルボネート、エステル、ウレタン、オルトエステル、アミド、アミン、オキシム、イミド、尿素、チオ尿素、チオエーテル、チオウレタン、チオエステル、エーテル、チアゾリジン、ヒドラゾン、及びオキサゾリジンからなる群から選択される結合を形成し得る官能基の残基である請求項85に記載の水溶性ポリマー。
- Uが保護されている請求項85に記載の水溶性ポリマー。
- s1、s2及びs3の一つ以上が存在し、選択され、炭素原子1ないし18個を含む請求項85に記載の水溶性ポリマー。
- s1、s2及びs3の一つ以上が存在し、選択され、“ポリマー”を含む請求項85に記載の水溶性ポリマー。
- s1が“ポリマー”を含む請求項85に記載の水溶性ポリマー。
- Bが4本以上のアームを含む請求項85に記載の水溶性ポリマー。
- 前記分子量が約10,000Daより大きい請求項85に記載の水溶性ポリマー。
- 前記分子量が約15,000Daより大きい請求項93に記載の水溶性ポリマー。
- Bが一つ以上のアミド結合によってs2またはポリマーに結合した分岐コアを含んでなる請求項85に記載の水溶性ポリマー。
- Bがアミド結合によってポリマーに結合した分岐コアを含む請求項85に記載の水溶性ポリマー。
- 前記反復単位が式−(CH2−CH2−O)−または−(CH2−CH2−O)−のエチレンオキシドを含む請求項85に記載の水溶性ポリマー。
- X、Y、またはX及びYが、−((CH2)n1−(CH2−CH2−O)n2−(CH2)n1−)−または−((CH2)n1−(O−CH2−CH2)n2−(CH2)n1−)から選択され、上記式中、n1は1ないし6の整数であり、n2は2ないし50の整数である請求項85に記載の水溶性ポリマー。
- XまたはYの一つがフェニル、C1−C10アルキレン部分、C1−C10アルキル基、ヘテロ原子含有フェニル、ヘテロ原子含有C1−C10アルキレン部分、ヘテロ原子含有C1−C10アルキル基、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される請求項85に記載の水溶性ポリマー。
- Xが−(CH2−CH2)−である請求項96に記載の水溶性ポリマー。
- Yが−(CH2−(CH2−CH2−O)3−CH2−CH2−CH2)n−または−(CH2−CH2−CH2−(O−CH2−CH2)3−CH2)n−であり、ここでnは6ないし36である請求項100に記載の水溶性ポリマー。
- J*が保護されている請求項85に記載の水溶性ポリマー。
- J*が生理的条件下で正味の中性電荷を有する非イオン化性基を含む請求項85に記載の水溶性ポリマー。
- J*が生理的条件下で正味の正電荷を含むイオン化性基を含む請求項85に記載の水溶性ポリマー。
- J*が生理的条件下で正味の負電荷を含むイオン化性基を含む請求項85に記載の水溶性ポリマー。
- Xが−X’−NH−または−NH−X’−である請求項85に記載の水溶性ポリマー。
- Yが−Y’−NH−または−NH−Y’−である請求項85に記載の水溶性ポリマー。
- X’及びY’の少なくとも一つが式(−CH2−CH2−O−)nまたは(O−CH2−CH2−)nのポリエチレンオキシドを含み、上記式中nが2ないし50である請求項107に記載の水溶性ポリマー。
- 前記水溶性ポリマーが単分散である請求項85に記載の水溶性ポリマー。
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