JP2019508375A - ポリアミノ酸、タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
Ptnは、タンパク質を示し、ETは、PtnのN末端に連結される場合、
R1は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
R2は、それぞれ独立に水素又はC1−C10アルキル基、C2−C10アルケニル基、C2−C10アルキニル基を示し、
nは、1〜300から選ばれる整数である。)
Ptn、ET、R1及びR2は、本明細書で定義した通りであり、
nは、1〜200から選ばれる整数であり、且つ
mは、1〜30から選ばれる整数である。)
Ptnは、N末端におけるシステイン残基とC末端におけるLPXaT配列とを有するタンパク質を示し、その中で、Xaは1種又は複数種のアミノ酸を示し、
PAA(Gly)mは、下記一般式4で表される構造を有し、
R1は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
R2は、それぞれ独立に水素又はC1−C10アルキル基、C2−C10アルケニル基、C2−C10アルキニル基を示し、
nは、10〜300から選ばれる整数であり、且つ
mは、1〜30から選ばれる整数である。)
Xは、硫黄又はセレンを示し、
R1は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
R2は、それぞれ独立に水素又はC1−C10アルキル基、C2−C10アルケニル基、C2−C10アルキニル基を示し、
R5は、置換又は非置換のC1−C30アルキル基、置換又は非置換のC2−C30アルケニル基、置換又は非置換のC2−C30アルキニル基、置換又は非置換のC3−C30シクロアルキル基、置換又は非置換のC3−C30シクロアルケニル基、置換又は非置換のC1−C30ヘテロアルキル基、置換又は非置換のC2−C30ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のC2−C30ヘテロアルキニル基、置換又は非置換のC1−C30ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のC2−C30ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のC6−C30アリール基、或いは置換又は非置換のC5−C30ヘテロアリール基を示し、且つ
nは、1〜200から選ばれる整数である。)
X、R1、R2及びR5は、本明細書で定義した通りであり、
nは、10〜200から選ばれる整数であり、
mは、1〜30から選ばれる整数である。)
本発明の一実施形態によれば、(1)開始剤を用いてN−カルボキシ無水物とグリシンのN−カルボキシ無水物との重合を開始させ、C末端にフェニルチオエステル構造を有し、N末端にポリグリシン(PGly)のブロック構造を有するブロックポリアミノ酸を得るステップと、(2)得られたブロックポリアミノ酸と、N末端にシステイン残基を有し、C末端にLPXaTG配列(Xaはいずれかのアミノ酸である)を有するタンパク質とを混合して、ネイティブ化学ライゲーション反応及びソルターゼ媒介性反応を連続的に発生させて、タンパク質の環化を達成するステップとを含む、部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲートの製造方法を提供する。
以下、特に断らない限り、本明細書に記載のすべての用語(技術用語と科学用語を含む)は、本発明の所属分野の当業者が通常理解する意味と同様である。明示的に定義されていない限り、用語、例えば一般的な辞書に定義された用語は、関連技術の文脈における意味と一致した意味を有し、且つ理想化された意味や過度に正式的な意味で解釈されない。
本発明の一実施形態では、一般式1で表される構造を有するタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートを提供する。
Ptnは、タンパク質を示し、
ETは、PtnのN末端に連結される場合、
R1は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
R2は、それぞれ独立に水素又はC1−C10アルキル基、C2−C10アルケニル基、C2−C10アルキニル基を示し、
nは、1〜300から選ばれる整数である。)
本発明の一実施形態によれば、本発明に使用し得るホルモンは、視床下部ホルモン、下垂体ホルモン、消化管ホルモン、インシュリン、カルシトニンが挙げられるが、それらに制限されない。
Ptn、ET、R1及びR2は前記一般式1の定義と同様であり、
nは、1〜200から選ばれる整数であり、且つ
mは、1〜30から選ばれる整数である。)
本発明の一実施形態によれば、下記一般式3で表される構造を有するタンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲートを提供する。
Ptnは、N末端におけるシステイン残基とC末端におけるLPXaT配列とを有するタンパク質を示し、その中で、Xaは1種又は複数種のアミノ酸を示し、
PAA(Gly)mは、次の一般式4で表される構造を有し、
R1は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
R2は、それぞれ独立に水素又はC1−C10アルキル基、C2−C10アルケニル基、C2−C10アルキニル基を示し、
nは、10〜300から選ばれる整数であり、且つ
mは、1〜30から選ばれる整数である。)
本発明の一実施形態によれば、下記一般式5で表される構造を有するタンパク質(環化)ライゲーション用のポリアミノ酸を提供する。
Xは、硫黄又はセレンを示し、
R1は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
R2は、それぞれ独立に水素又はC1−C10アルキル基、C2−C10アルケニル基、C2−C10アルキニル基を示し、
R5は、置換又は非置換のC1−C30アルキル基、置換又は非置換のC2−C30アルケニル基、置換又は非置換のC2−C30アルキニル基、置換又は非置換のC3−C30シクロアルキル基、置換又は非置換のC3−C30シクロアルケニル基、置換又は非置換のC1−C30ヘテロアルキル基、置換又は非置換のC2−C30ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のC2−C30ヘテロアルキニル基、置換又は非置換のC1−C30ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のC2−C30ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のC6−C30アリール基、或いは置換又は非置換のC5−C30ヘテロアリール基を示し、且つ
nは、1〜200から選ばれる整数である。)
X、R1、R2及びR5は前記一般式5の定義と同様であり、
nは、10〜200から選ばれる整数であり、
mは、1〜30から選ばれる整数である。)
本発明の一実施形態によれば、(1)開始剤を用いてN−カルボキシ無水物の重合を開始させて、炭素構造を有するポリアミノ酸を得るステップと、(2)得られたポリアミノ酸と1,2−メルカプトエチルアミン構造含有タンパク質とを混合して、ネイティブ化学ライゲーション反応を発生させ、部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートを得るステップとを含む本発明の前記部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートの製造方法を提供する。
X、R1、R5及びnは前記一般式5の定義と同様であり、
Yは、水素又はトリアルキルシリル基を示し、その中で、トリアルキルシリル基におけるアルキル基は、好ましくはC1−C10アルキル基、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等である。)
本発明の別の実施形態によれば、ステップ(1)は、以下のように、開始剤(R5XY)を用いてN−カルボキシ無水物の重合を開始させて、炭素構造を有するポリアミノ酸(PAA−XR5)を得ることを含む。
X、R1、R2、R5及びnは前記一般式5の定義と同様であり、
Yは、水素又はトリアルキルシリル基を示し、その中で、トリアルキルシリル基におけるアルキル基は、好ましくはC1−C10アルキル基、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等である。)
本発明の一実施形態によれば、ステップ(1)で得られた、炭素構造を有するポリアミノ酸について、得られたポリアミノ酸と調整剤とを混合して反応させて、後修飾されたポリアミノ酸を得ることを含む後修飾を行うことができる。本発明の別の実施形態によれば、前記調整剤はメルカプトエチルアミン塩酸塩又はメルカプトプロピオン酸である。本発明の別の実施形態によれば、前記後修飾過程は、紫外線ランプの照射下で例えば1時間、3時間、5時間、10時間等の所定時間反応させることができ、当業者は具体的に反応プロセスに応じて決定できる。本発明の他の実施形態によれば、後修飾は、例えば、ジメチルホルムアミド(DMF)、テトラヒドロフラン(THF)、ジクロロメタン(DCM)等の非プロトン性溶媒を含む溶液中で行われ、且つ、前記溶液は、さらに反応を促進するために、例えばベンゾインジメチルエーテル(DMPA)等の光増感剤を含んでもよい。
標準分子クローニング法によってタンパク質のN末端にシステイン−グリシン(N末端はシステイン残基であり、グリシン残基が結合手段として用いられるため、N末端の柔軟性を高める)を挿入でき、或いは、TAGとスクシニルアミノアシルtRNA合成酵素/tRNAの方法(文献Nguyen, D. P.; Elliott, T.; Holt, M.; Muir, T. W.; Chin, J. W., Genetically encoded 1,2−aminothiols facilitate rapid and site−specific protein labeling via a bio−orthogonal cyanobenzothiazole condensation. JAmChemSoc2011,133 (30), 11418−21.)により、その側鎖に1,2−メルカプトエチルアミン構造を有する非天然アミノ酸を挿入して、後続の部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸のライゲーション反応を行う。
本発明の一実施形態によれば、(1)開始剤を用いてN−カルボキシ無水物とグリシンのN−カルボキシ無水物との重合を開始させ、C末端にフェニルチオエステル構造を有し、N末端にポリグリシンブロック構造を有するブロックポリアミノ酸を得るステップと、(2)得られたブロックポリアミノ酸と、N末端にシステインを有し、C末端にLPXaTG配列を有するタンパク質とを混合して、ネイティブ化学ライゲーション反応及びソルターゼ反応を連続的に発生させて、タンパク質の環化を達成するステップとを含む本発明の前記部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲートの製造方法を提供する。
Yは、水素又はトリアルキルシリル基を示し、その中で、トリアルキルシリル基におけるアルキル基は、好ましくはC1−C10アルキル基、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等である。)
上記方法と類似する方法により、平均重合度7のポリL−グルタミン酸(エチレングリコール)3エステルを合成し、L−グルタミン酸(エチレングリコール)3エステル−N−カルボキシ無水物の投入量を13mgに変更して、反応後、酢酸無水物(1.33mg、2.0当量)を加えてキャッピングし、上記方法のように後処理を行い、MALDI−TOFマススペクトルの特徴付けを図3に示す。
上記ポリアミノ酸(P3、80mg、0.0133mmol、1.0当量)をジクロロメタン(1.5mL)に溶解して、トリエチルアミン(300μL、2.1mmol)及びブロモトリメチルシラン(360μL、2.7mmol)を順次加えた。反応液を60℃に加熱して8時間撹拌し、ロータリーエバポレーターにおいて溶媒を回転乾燥させた後、生成物を脱イオン水(4mL)に溶解して、EDTA(10mg)を加え、水酸化ナトリウム水溶液(1M)でpHを中性になるまで調整し、塩化ナトリウム水溶液で透析した(1000Da MWCO、3回)。溶液を凍結乾燥させて、淡黄色固体P4 60mg(収率83%)を得た。
上記実施例で製造されたポリマーの特徴付けパラメータは、下表1に示されており、且つ示された実測値はすべて少なくとも3回測定して得られた数値の平均値であった。具体的に、すべてのポリマーの分子量及び分子量分布係数(PDI)はゲル排除クロマトグラフィー(GPC)と9角度レーザー光散乱装置との組み合わせにより測定されるものであり、使用される移動相は0.1M臭化リチウムを添加した無水N,N−ジメチルホルムアミドである。
実施例2で製造されたポリアミノ酸P2(n=7,m=3)(3.8mg、1.72μmol、2.0当量)と、N末端にシステインを有するポリペプチド(Cys−PEP、1.8mg、0.86μmol、1.0当量、配列CGDAKGLPETGHHHHHHK)とを超純水に溶解して、水酸化ナトリウム水溶液(1.0M)でpHを7.0に調整し、室温で12時間反応させた。NiNTAアフィニティー精製後、脱塩カラムPD10で処理した後、凍結乾燥させて、白色粉末である、ネイティブ化学ライゲーション生成物2.6mg(収率74%)を得た。ネイティブ化学ライゲーション生成物を塩化ナトリウム(150mM)及び塩化カルシウム(10mM)を含有するTris−HClバッファー(50mM、5.0mL、pH〜7.4)に溶解し、ソルターゼ(sortase)A(150μL×227μM、0.05当量)を加え、室温で0.5時間反応させた後、環状ポリペプチド−ポリアミノ酸コンジュゲートの粗製品をNiNTAにより精製した(20mMのTris−HCl、500mMの塩化ナトリウム、20mMのイミダゾールを含有したpH〜8.0のバッファーBで溶離した)。溶離された画分を収集して脱塩カラムPD10で処理した。凍結乾燥させて、白色粉末である環状(ポリペプチド−ポリアミノ酸P2(n=7,m=3))コンジュゲート精製品1.6mg(収率82%)を得た。図4に示されるように、生成物は、MALDI−TOFにより特徴付けられたところ、分子量が理論値と一致した。
N末端にENLYFQ、C末端にLPETGHHHHHHがコーディングされたプラスミドpET−TEV−Cys−eGFPを、化学的形質転換方法で大腸菌(E.coli)BL21に導入した。100μg/mLカナマイシンを添加したLB培地10mLにおいて菌種を10〜12時間活性化し、次に100μg/mLカナマイシンを添加したLB培地1Lに1:100で接種して、250rpm、37℃の条件においてOD600=0.8になるまで振とうさせ、最終濃度1mMのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを加えて細菌発現を誘導し、培養条件を250rpm、30℃に変更した。5時間後、6500rpm、4℃で40分間遠心処理して菌体を収集した。バッファーA(20mM tris−HCl、500mM NaCl、pH 8.0)20mLで細菌を懸濁させ、氷浴条件において超音波(130W、20kHz、50%パワー、5秒超音波処理、10秒停止、超音波処理時間10分間)で分解した。分解液について6500rpm、40分間、及び12000g、40分間の2つのステップにより4℃で順次遠心処理して、上澄み液を収集し、0.22μmろ過膜でろ過して、NiNTA親和性カラムにより精製し、ここで、平衡化バッファーは50mM Tris、500mM NaCl、pH8.0、溶離液は300mMのイミダゾールを添加した上記平衡化液であった。最後に目的タンパク質(配列は、配列表SEQ ID No:1に示される)48mgを得て、UPLC−MSにより確認したところ(図5を参照)、計算値は31324であり、得られた値は31333である。分子量誤差(9ダルトン)が誤差許可範囲(10ダルトン)にあるため、得られたタンパク質は目的タンパク質としてのTEV−強化緑色蛍光タンパク質−LPETGH6であることが確認された。
ステップ1: 1,2−メルカプトエチルアミン非天然アミノ酸の合成
化合物2(264mg、0.80mmol、1.0当量)をN,N−ジメチルホルムアミド(20mL)に溶解して、Boc−Lys−OH(246mg、0.80mmol、1.0当量)とトリエチルアミン(0.2mL)を加え、室温で3時間撹拌した後、溶媒を回転乾燥させ、ジクロロメタン:メタノール=10:1(体積比)を溶離剤としたカラムクロマトグラフィーにより分離した。無色油状液体化合物3(221mg、収率60%)を得た。
化合物3(221mg、0.48mmol、1.0当量)を塩化水素のジオキサン溶液(10mL)に溶解して、室温で一晩撹拌した後、製品を析出させて、吸引ろ過して、製品である化合物4(1,2−メルカプトエチルアミン非天然アミノ酸)を得て、pH調整後、後続の実験に用いた。
ステップ2: 強化緑色蛍光タンパク質の発現
タンパク質遺伝子配列の特定部位をTAGに突然変異したプラスミド(元のタンパク質配列について配列表SEQ ID No:2(C末端にHis6タグがある)に示されるように、第149位のアスパラギン酸のNに対応したコドンがTAGに突然変異して、特定部位突然変異した遺伝子配列を得る)と、スクシニルアミノアシルtRNA合成酵素/tRNAを有するプラスミドとを、化学的形質転換方法で大腸菌(E.coli)BL21に同時に導入した。菌種を100μg/mLアンピシリンと34μg/mLクロラムフェニコールを添加したLB培地10mLにおいて10〜12時間活性化させ、次に100μg/mLアンピシリンと34μg/mLクロラムフェニコールを添加したLB培地1Lに接種して、250rpm、37℃の条件下で2時間培養後、最終濃度2mMの非天然アミノ酸4を加え、OD600=0.8になるまで振とうさせ、最終濃度1mMのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを加えて細菌発現を誘導し、培養条件を250rpm、30℃に変更した。12時間後、6500rpm、4℃で40分間遠心処理して菌体を収集した。20mLのバッファーA(20mM tris−HCl、500mM NaCl、pH8.0)で細菌を懸濁させ、氷浴条件下、超音波で分解した。分解液について6500rpm、40分間、及び12000g、40分間の2つのステップにより4℃で順次遠心処理して、上澄み液を収集し、0.22μmのろ過膜でろ過し、実施例16と同様にNiNTA精製を行った。
透析バッグ(MWCO 3000)に、タンパク質溶液(12mg/mL)1mL、タバコエッチウイルスプロテアーゼ(0.2mg/mL)5μL及び10XバッファーB(500mMのリン酸ナトリウム、5mM EDTA及び10mM DTT)10μLを加えた。透析バッグをバッファーB(50mMのリン酸ナトリウム、0.5mM EDTA及び1mM DTT)1Lに入れて室温で透析して酵素消化を行った。3時間酵素消化した後、タンパク質Cys−eGFP−LPETGH6(アミノ酸配列は配列表SEQ ID No:1からN末端の「MENLYFQ」を除去した配列である)を得て、UPLC−MSにより確認したところ(図6を参照)、計算値は30398であり、得られた値は30404である。分子量誤差(6ダルトン)が誤差許可範囲(10ダルトン)にあるため、得られた酵素消化後のタンパク質は目的タンパク質Cys−緑色蛍光タンパク質−LPETGH6であることが確認された。
1当量のCys−強化緑色蛍光タンパク質−LPETGH6及び2当量のポリアミノ酸P1(n=7)を、50mM Tris−HCl、2mMのトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンの溶液(pH〜6.5)においてネイティブ化学ライゲーション反応を発生させ、10時間反応した後、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)により精製して、部位特異的タンパク質高分子ハイブリッド材料を得、且つ、その分子量変化は変性タンパク質ゲル電気泳動(SDS−PAGE gel)により特徴付けられ、その純度は非変性タンパク質ゲル電気泳動(Native SDS−PAGE gel)により特徴付けられた。図7に示されるように、SDS−PAGE gelにおいて、ポリアミノ酸−強化緑色蛍光タンパク質コンジュゲートのバンドが原料タンパク質に対して分子量の大きい位置へシフトしていることから、ポリアミノ酸のグラフトに成功したことが分かり、変性及び非変性ゲル電気泳動におけるポリアミノ酸−強化緑色蛍光タンパク質コンジュゲートは、均一な単一バンド(二量体は、同じモノマータンパク質から天然状態で物理的な相互作用により形成された)であることから、生成物の純度は比較的高く示され、収率は50%〜65%であった。
1当量のENLYFQC−強化緑色蛍光タンパク質−LPETGH6(1mg/mL、300μL)、5当量のポリエチレングリコール−ポリグリシン(10Mm、53μL)及び0.1当量のソルターゼ(4.9mg/mL、52μL)を150mMのNaClと10mMのCaCl2を含有する50mM Tris−HCl pH7.4バッファー200μLに加えた。室温で30分間反応させ、NiNTAアフィニティー精製を行って、生成物ENLYFQC−強化緑色蛍光タンパク質−ポリエチレングリコール−ポリグリシンコンジュゲートを分離した。平衡化バッファーは、50mM Tris、500mM NaCl、pH8.0であり、ローディングサンプルしてから流出バッファーを収集し始め、次に50mM Tris、500mM NaCl、20mM イミダゾール、pH8.0で溶離して、生成物を溶解した溶離液を得て、さらに50mM Tris、500mM NaCl、300mM イミダゾール、pH8.0のバッファーで樹脂を洗浄して、未反応のタンパク質原料を溶離した。ENLYFQC−強化緑色蛍光タンパク質−ポリエチレングリコール−ポリグリシンコンジュゲートについて、その分子量は変性タンパク質ゲル電気泳動(SDS−PAGE gel)により特徴付けられ、その純度は非変性タンパク質ゲル電気泳動(Native SDS−PAGE gel)により特徴付けられた。図8に示されるように、SDS−PAGE gelにおいて、ENLYFQC−強化緑色蛍光タンパク質−ポリグリシン−ポリエチレングリコールコンジュゲートのバンドが原料タンパク質に対して分子量の大きい位置へシフトし、このことから、ポリアミノ酸のグラフトに成功したことが分かり、変性及び非変性ゲル電気泳動におけるポリアミノ酸−強化緑色蛍光タンパク質コンジュゲートが均一な単一バンドであることから、生成物の純度は比較的高く示され、収率は56%であった。
2つのステップで、順次実施例19及び20に記載の反応及び精製方法によって、ポリアミノ酸P1(n=7)−強化緑色蛍光タンパク質−ポリグリシン−ポリエチレングリコールのノード状コンジュゲートを製造した。中間生成物であるポリアミノ酸P1(n=7)−強化緑色蛍光タンパク質とノード状コンジュゲートとのいずれについても変性及び非変性タンパク質ゲル電気泳動により特徴付けを行った(図9を参照)。生成物の分子量が徐々にタンパク質の分子量の高い位置へシフトすることから、高分子の前後のグラフトのいずれも成功したことが示され、且つ単一バンドから、生成物の純度は比較的高く示される。2つのステップの収率は、それぞれ65%及び50%であった。
1当量の強化緑色蛍光タンパク質−LPETGH6(6.5mg)、10当量のポリアミノ酸P2(n=7,m=3)(6.6mg)及び0.1当量のソルターゼ(0.5mg)を、150mMの塩化ナトリウム及び10mMの塩化カルシウムを含有するTris−HClバッファー(50mM、pH7.5)1mLに加え、室温で30分間反応させた。実施例21の精製方法と同様に精製して、強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸P2(n=7,m=3)コンジュゲートを、収率55%で得た。その後、強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸P2(n=7,m=3)コンジュゲートとCys−インターフェロンαについて実施例21と同様にネイティブ化学ライゲーションを行って、強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸P2(n=7,m=3)−インターフェロンαのダンベル状コンジュゲートを、収率50%で得た。中間生成物とダンベル状コンジュゲートとのいずれについても、変性及び非変性タンパク質ゲル電気泳動によって分子量及び純度の特徴付けを行った(図10を参照)。コンジュゲートの分子量が徐々に高分子量の大きい位置へシフトし、且つ強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸−インターフェロンαのダンベル状コンジュゲートの分子量がタンパク質分子スケールで43kDa〜55kDaの間に分布し、予測された強化緑色蛍光タンパク質(〜31kDa)及びインターフェロンα(〜21kDa)のヘテロダブルタンパク質の全分子量範囲(〜52kDa)にあるため、得られたものは強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸−インターフェロンαのヘテロダブルタンパク質のダンベル状コンジュゲートであることが確認できた。単一バンドから、生成物の純度が比較的高いと確認された。
実施例19のように、ネイティブ化学ライゲーションによりポリアミノ酸P2 (n=7,m=3)−強化緑色蛍光タンパク質−LPETGH6コンジュゲートを製造した。1当量のポリアミノ酸P2(n=7,m=3)−強化緑色蛍光タンパク質−LPETGH6コンジュゲート(0.42mg)及び0.1当量のソルターゼを、150mMの塩化ナトリウム及び10mMの塩化カルシウムを含有する50mM Tris−HCl、pH7.5のバッファーにおいて混合し、ポリアミノ酸P2(n=7,m=3)−強化緑色蛍光タンパク質−LPETGH6コンジュゲートの最終濃度を50mMに制御して、室温で30分間反応させ、反応終了後、実施例22のように、分離精製を行い、収率は約42%であった。
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置(MALDI−TOF)、変性タンパク質ゲル電気泳動及びウエスタンブロット分析(western blot)によって、環状(強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸P2(n=7,m=3))コンジュゲートが特徴付けられた。その結果、ポリアミノ酸P2(n=7,m=3)−強化緑色蛍光タンパク質−LPETGH6コンジュゲートのN末端は、環状(強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸P2(n=7,m=3))コンジュゲートよりもアミノ酸が7個多かった(すなわち、GHHHHHH)。したがって、MALDI−TOF分析によれば、ポリアミノ酸P2(n=7,m=3)−強化緑色蛍光タンパク質−LPETGH6コンジュゲートを環化した後の分子量は、全体的に環化前(理論的に1160Da、実際に〜1206Da)より低く、このことから、強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸P2(n=7,m=3)は環状コンジュゲートを形成することが示される。また、変性タンパク質ゲル電気泳動(SDS−PAGE gel)では、環状(強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸P2(n=7,m=3))は、分子量の減少及びトポロジー構造の変化により、バンド位置が低分子量の位置へシフトし、ウエスタンブロット分析から、ヒスチジンタグ(His−tag)が消えたことが分かる、このことによっても、環状(強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸P2(n=7,m=3))コンジュゲートを得ることは示され、具体的な分析結果は図11に示される。
Cys−強化緑色蛍光タンパク質、ポリアミノ酸P2(n=7,m=3)−強化緑色蛍光タンパク質及び環状(強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸P2(n=7,m=3))コンジュゲートの、50mM pH7.4のTris−HClバッファーにおける最終濃度を4.0mg/mL、カルボキシペプチダーゼの最終濃度を80μg/mL、当量比をeGFPの0.01当量に制御して、37℃でインキュベートした。設定時点に、サンプリング(5μL)してローディングバッファーとを混合して、95℃で10分間煮ることにより酵素消化反応を終止した。最後の時点でのサンプリングが終了した後、すべてのサンプルについて同時にゲル電気泳動にかけ、タンパク質ゲル電気泳動により特徴付けられた。クーマシーブリリアントブルー染色及び脱色が終了した後、typhoon FLA laser scannerでタンパク質を定量化させた。
図12に示されるように、図A、B、Cは、それぞれCys−強化緑色蛍光タンパク質、ポリアミノ酸P2(n=7,m=3)−強化緑色蛍光タンパク質及び環状(強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸P2(n=7,m=3))コンジュゲートがカルボキシペプチダーゼの作用下で経時的に分解する状況を示す。typhoon FLA laser scannerを用いて、染色後のバンドの強度に基づいてタンパク質を定量化させ、同一のカルボキシペプチダーゼの比率では、野生型強化緑色蛍光タンパク質は1時間内で殆どすべて分解し、ポリアミノ酸P2(n=7,m=3)−強化緑色蛍光タンパク質は、3時間後に完全なコンジュゲートが20%程度だけ残し、それに対して、環状(強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸P2(n=7,m=3)コンジュゲート)は、7時間から始めて一定の程度の分解が観察された。したがって、線状のトポロジー構造に比べて、環状(強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸P2(n=7,m=3))は、酵素耐性の面で大きな利点を示す。
N末端にMENLYFQCG、C末端にLPETGLEHHHHHHがコーディングされたプラスミドpET−TEV−Cys−IFNα−LPETGLEH6を化学的形質転換方法で大腸菌(E.coli)OrigamiB(DE3)に導入した。菌種を100μg/mLアンピシリンを添加したLB培地10mLにおいて10〜12時間活性化させ、次に、100μg/mLアンピシリンを添加したLB培地1Lに接種し、250rpm、37℃の条件においてOD600=0.8になるまで振とうさせ、最終濃度1.0mMのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを加えて細菌発現を誘導し、培養条件を200rpm、30℃に変更した。一晩培養後、6500rpm、4℃で30分間遠心処理して菌体を収集した。バッファーA(20mM Tris−HCl、500mM NaCl、pH 8.0)20mLで菌体を再懸濁させ、氷浴条件下、超音波で分解した。分解液について、6500rpm、40分間、及び12000g、40分間の2つのステップにより4℃で順次遠心処理して、上澄み液を収集して、0.22μmろ過膜でろ過し、NiNTA親和性コラムにより精製して、目的タンパク質98mgを得て、UPLC−MSにより確認したところ、計算した理論分子量は21918であるが、得られたのは21914である。分子量誤差(4ダルトン)が誤差許可範囲(10ダルトン)にあるため、得られたタンパク質は目的タンパク質TEV−Cys−IFNα−LPETGH6であることが確認された。
透析バッグ(MWCO 3000)にタンパク質溶液(12mg/mL)1mL、タバコエッチウイルスプロテアーゼ(0.2mg/mL)5μL及び10XバッファーB(500mMのリン酸ナトリウム、5mM EDTA及び10mM DTT)10μLを加えた。透析バッグをバッファーB(50mMのリン酸ナトリウム、0.5mM EDTA及び1mM DTT)1Lに入れて室温で透析して酵素消化を行った。3時間酵素消化した後、タンパク質Cys−eGFP−LPETGH6を得て、UPLC−MSにより確認したところ(図13を参照)、計算値は20991であるが、得られた値は20987である。分子量誤差(6ダルトン)が誤差許可範囲(10ダルトン)にあるため、得られた酵素消化後のタンパク質は目的タンパク質Cys−インターフェロンα−LPETGH6であることが確認された。
1当量の目的タンパク質Cys−IFNα−LPETGLEH6と、3当量のポリアミノ酸PhS−P(OEG3−Glu)100(L型、P1(n=100))とを、50mM Tris−HCl、2mM DTTの溶液(pH〜7.4)においてネイティブ化学ライゲーション反応を発生させ、10時間反応後、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)により精製して、部位特異的P(OEG3−L−Glu)100−IFNαコンジュゲートを得た。ポリアミノ酸P1(n=100)−インターフェロンαコンジュゲートについて、15%変性タンパク質ゲル電気泳動(SDS−PAGE gel)により、その分子量及び純度が特徴付けられた。図14に示されるように、SDS−PAGE gelにおいて、ポリアミノ酸P1(n=100)−インターフェロンαコンジュゲートバンドは、原料タンパク質に対して分子量の大きい位置へシフトし、このことから、ポリアミノ酸のグラフトに成功したことが分かり、且つコンジュゲートが均一な単一バンドであることから、生成物の純度は比較的高く示され、収率は70%であった。
或いは、上記と同様な方法及び条件を用いて、薬物タンパク質Cys−インターフェロンα−LPETGLEH6と、ポリアミノ酸PhS−P(OEG3−Glu)100(D,L−アミノ酸)及びポリアミノ酸P2(PhS−P(OEG3−Glu)n−Gly3(n=7又は20,m=3))のネイティブ化学ライゲーション反応を行い、得られたコンジュゲートは、FPLCで精製された後、15%の変性タンパク質ゲル電気泳動により特徴付けられた。図14に示されるように、ポリアミノ酸−インターフェロンαコンジュゲートのバンドは、原料タンパク質に対いていずれも分子量の大きい位置へシフトし、このことから、ポリアミノ酸のグラフトに成功したことが分かり、収率は70%〜80%であった。
実施例27における生成物ポリアミノ酸P1(n=100)−インターフェロンα−LPETGLEH6とポリアミノ酸P2(n=20,m=3)を用いて、ソルターゼの存在下、20mM Tris−HCl、150mM NaCl、10mM CaCl2のバッファーにおいてソルターゼ媒介性のペプチド転移反応を行い、反応系をNiNTAカラムにより分離精製して、N末端とC末端と共に部位特異的にポリアミノ酸がライゲーションされた生成物であるポリアミノ酸P1(n=100)−インターフェロンα−LPET−ポリアミノ酸P2(n=20,m=3)を得た。生成物は、15%の変性タンパク質ゲル電気泳動及びウエスタンブロット分析により特徴付けられた。ウエスタンブロット分析において、図14に示されるように、タグHis−tagの除去により、生成物の抗Hisタグシグナルが消えて、インターフェロンαのN末端とC末端と共にポリアミノ酸のグラフトに成功したことが分かった。
ポリアミノ酸P2(n=7又は20,m=3)−インターフェロンα−LPETGLEH6コンジュゲートを、ソルターゼの存在下、20mM Tris−HCl、150mM NaCl、10mM CaCl2のバッファーにおいて、環化反応させて、NiNTAカラムにより分離精製して、環状(ポリアミノ酸P2(n=7又は20,m=3)−インターフェロンα−LPETGLEH6)を得た。図15に示されるように、インターフェロンαとポリアミノ酸との環状トポロジー構造の形成は、SDS−PAGEゲルでのバンドが環化前のコンジュゲートより低分子量位置へシフトすると共に、対応したウエスタンブロット分析におけるAnti−Hisシグナルの消失により確認できる。
本実施例において、使用される目的タンパク質を組換えヒトインターフェロンαに変更し、染料Sypro Orangeを用いてタンパク質の融解温度(Tm値)を測定でき、この染料は昇温によるタンパク質構造変化につれて露出された疎水性領域と結合できるため、蛍光発光強度に大きな変化が示される。野生型IFNα及び各種のポリアミノ酸とのコンジュゲートのTm値については、200×SYPRO Orangeタンパク質染料(Thermo)5μLと(5μM)被検タンパク質45μLとを1×PBSバッファー中において混合し、反応系全体を50μLにして、96ウェル板に加え、3つの平行ウェルにサンプルを加えて、蛍光定量的PCR装置において検出し37℃から2.2℃/minで98℃に加熱して、得られた曲線に基づいて各タンパク質サンプルのTm値を計算した。
図16に各タンパク質サンプルのTm値が示されており、それから各種コンジュゲートの熱安定性が判断でき、Tm値が高いほど、熱安定性に優れる。ポリアミノ酸P1(n=100)−インターフェロンαコンジュゲートと環状(ポリアミノ酸P2(n=7又は20,m=3)−インターフェロンα)は非常に優れた熱安定性を示し、特に環状(ポリアミノ酸P2(n=7又は20,m=3)−インターフェロンα)の熱安定性は、従来の文献や特許に開示されたものに比べて最もよいである。
本実施例において、野生型組換えヒトインターフェロンαを対照にして、本発明のポリアミノ酸−インターフェロンαコンジュゲートのトリプシン耐性をテストした。37℃で、0.01当量のトリプシン処理サンプルを加えて、異なる時点にサンプリングして、残った完全なタンパク質の比率を検出し、結果を図17に示し、タンパク質のバンド強度に基づいて定量化させて、得られたデータを用いて曲線図(図17を参照)を作成し、曲線図B、Cから分かるように、コンジュゲートに使用されるポリアミノ酸の分子量の増大につれて、得られたコンジュゲートのトリプシン耐性は高まり、且つ、図Aに示されるように、分子量が近いコンジュゲートでは、トポロジー構造が環状のコンジュゲートは、トリプシン耐性が未環化のコンジュゲートよりも遥かに優れる。
本実施例において、使用されるポリアミノ酸P(OEG3−Glu)n(L型)は独立にαへリックスを主にする顕著な二次構造を有するため、IFNαとライゲーションすることによりIFNαの二次構造へ一定の影響を与える。0.35mg/mL PBSタンパク質溶液を調製して、円二色性スペクトルにより二次構造の変化を監視し、テストした結果、IFNα−ポリアミノ酸コンジュゲートはIFNαの二次構造を著しく強化させ、結果は図18に示される。
本実施例において、Daudi細胞に対する成長阻害及びそのA549細胞の抗脳心筋炎ウイルス(EMCV)活性の誘導の2つの点について、それぞれ各種ポリアミノ酸−インターフェロンαのインビトロ抗腫瘍活性及び抗ウィルス活性の維持を判断した。
IFNαに対して高感度のヒトBリンパ腫細胞系Daudiを実験細胞系とし、各種ポリアミノ酸−インターフェロンαのインビトロ抗腫瘍活性を検出した。具体的な実験ステップは以下の通りである。5000個の細胞/ウェルで96ウェル板に播種して、タンパク質及びポリアミノ酸とのコンジュゲートを適切な勾配になるまで希釈して、細胞を播種した96ウェル板に加え、72時間培養後、Celltiter Blue(R) Cell viability Assay(プロメガ)で細胞活性を検出して、Graphpad Prism処理関連データから各サンプルの半数抑制量IC50を得た。実験により確認されたとおり、異なるトポロジー構造のポリアミノ酸−IFNαコンジュゲートは、抗腫瘍活性に大きな差異があり、具体的なデータは表2に示される。表2中、二次構造を有するポリアミノ酸はインターフェロンαとライゲーションする場合は、その活性への影響が最も小さく、且つ臨床に実用されているインターフェロンα−ポリエチレングリコールコンジュゲートであるペグイントロン(PEG−INTRON)より優れ、環状コンジュゲートはそれに次いだ。以上から分かるように、インターフェロンα−ポリアミノ酸コンジュゲートの二次構造又はトポロジー構造を調整することにより、熱安定性及び酵素耐性を高めると共に、その活性を最大限に維持できる。
本実験では、ポリアミノ酸−インターフェロンαコンジュゲートで刺激されたA549細胞の抗脳心筋炎ウイルス(EMCV)活性を測定することによって、そのインビトロでの抗ウィルス活性が判断される。具体的な測定ステップは、以下の通りである。8000〜10000個の細胞/ウェルの密度で、A549細胞を黒色不透明の96ウェル板に播種して、24時間後、細胞が完全に付着すると、10%FBS、DMEM培地(10μg/mL、3倍希釈し、合計14個の濃度ポイント)に勾配希釈したポリアミノ酸−インターフェロンコンジュゲート(100μL/ウェル)を加えて、細胞と共に24時間共培養した後、タンパク質液体を吸い取り、所定濃度のEMCVウィルス液(2%FBS、DMEM培地に希釈し、ウィルスの添加量については、タンパク質未添加の細胞が48時間後にすべて病変する必要がある)を加え、タンパク質及びウィルスを添加していないウェルを細胞生存100%の対照とし、タンパク質を添加せずにウィルスだけを添加したウェルを細胞生存0%の対照とし、48時間後、Celltiter Glo(R) Luminescent Cell viability Assay(プロメガ)を用いて細胞活性を検出して、各種コンジュゲートの抗ウィルス活性を判断した。
本実施例において、SD雌ラットを動物生体実験の対象として、SDラットについて頸静脈挿管手術を行い、48時間回復後、150μg/kgの用量で静脈挿管を介して被検サンプルを注射し、薬物ごとの実験数を3匹にし、それぞれ1min、15min、30min、1h、3h、6h、9h、12h、24h、48h、72hの時点で採血した。氷上に30分間保存後、4000gを遠心処理して上澄み液を−80℃で保存した。
ELISA方法により血清中のIFNα含有量を測定し、各タンパク質サンプルの血液中の濃度変化曲線を図19に示し、血中濃度半減期(t1/2)を表2に示す。タンパク質ポリアミノ酸コンジュゲートは、WT−IFNα2bより遥かに高い血中濃度半減期を有し、且つL型ポリアミノ酸をライゲーションしたコンジュゲートの効果は高くて(t1/2=9.6h)臨床に実用されたペグイントロンとほぼ一致し(t1/2=9.8h)、D,L型ポリアミノ酸をライゲーションしたコンジュゲート(t1/2=7.8h)より高く、このことから、ポリアミノ酸の二次構造は、タンパク質ポリアミノ酸コンジュゲート固体の二次構造を調整することでその各種の生物学的特性や機能を調整できることが明らかになった。環状ポリアミノ酸−インターフェロンαコンジュゲートの血液循環時間(t1/2=7.5h)が環化前の血液循環時間(t1/2=6.5h)より長いことから、ポリアミノ酸−インターフェロンαコンジュゲートのトポロジー構造は、血液循環にも大きな影響を与えることが分かった。
本実施例において、ヒト卵巣癌細胞OVCAR−3を研究する腫瘍細胞系として、六週齢のBalb/c雌性ヌードマウスの体内で腫瘍モデルを作成した。細胞を107/200μLの密度で1640/マトリゲル(1:1混合)に懸濁させて、200μL/匹でヌードマウス右前胸に皮下注射して、三週間後、腫瘍の大きさが約30mm3になり、マウスをランダムに4群に分けて、1群を5匹とし、それぞれPBS、wt−IFNα、ポリアミノ酸P2(n=20,m=3)−IFNαコンジュゲート及び環状(ポリアミノ酸P2(n=20,m=3)−IFNα)コンジュゲートを注射し、用量は20μgインターフェロンα/匹で、注射体積は100μLで、投与頻度は1週間に1回であり、3日間おきに腫瘍の大きさ及びヌードマウス体重を測定した。
Cys−Her2 Fab(システインを軽鎖のN末端に挿入した)抗体を有するプラスミドを化学的形質転換によりTOP10大腸菌コンピテント細胞に導入して、LB培地10mLにおいて37℃、250rpmで一晩活性化させて、1:100の比率でTB培地1Lに接種し、37℃、250rpmの条件においてOD600=0.8程度になるまで振とうさせ、最終濃度0.2%のアラビノースを加えてタンパク質発現を誘導し、30℃、200rpmで16〜20時間発現させた。発現終了後、6500rpmで30分間遠心処理して、菌体を収集した。分解液(30mM Tris、1mMEDTA、pH8.0、20%蔗糖)150mLを加えて、室温で30分間軽く撹拌して、菌体を分解液に均一に分散させ、最終濃度0.2mg/mLのリゾチーム、2.5U/Lベンゾナーゼヌクレアーゼを加え、37℃、250rpmで30分間振とうさせ、分解液について、6500rpmと12000gで順次30分間遠心処理して、それぞれ上澄み液を保留した。上澄み液を0.22μmろ過膜でろ過して、proteinG樹脂により精製し、ローディングサンプル後、4〜5カラム体積の酢酸ナトリウムバッファー(pH4.5)で洗浄し、50mM、pH2.8グリシン溶液(5〜8カラム体積)で抗体を溶離して、Cys−Her2 Fab抗体を得た。ジチオスレイトールで還元した後、UPLC−MSによりタンパク質の分子量を確認した。理論値として、抗体重鎖の分子量は24305で、軽鎖の分子量は23674であった。装置で確認したところ、得られた抗体重鎖の分子量は24310で、軽鎖の分子量は23682であり、これらの分子量は理論計算値と一致した(誤差は許可範囲にある)。このため、得られた抗体はターゲット抗体であることが確認された。
Cys−Her2 Fab (5mg/mL、50μL、1.0当量)とポリアミノ酸P1(n=7)(30当量)とを混合して、室温で10〜12時間反応させた。混合物をFPLCにより精製して、ポリアミノ酸P1(n=7)−Her2 Fab抗体コンジュゲートを得、タンパク質ゲル電気泳動によりその純度及び分子量が特徴付けられた。ジチオスレイトールで還元すると、抗体の重鎖及び軽鎖が解かれて、図21に示されるように、分子量が約半減するバンドは得られた。精製して得られた生成物は、反応前の抗体に対していずれも高分子量の位置へシフトし且つ還元前のバンドが均一であるから、ポリアミノ酸のグラフトに成功し、且つ生成物の純度は比較的高いことが分かり、生成物の収率は26%であった。
Ptnは、タンパク質を示し、ETは、PtnのN末端に連結される場合、
R1は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
R2は、それぞれ独立に水素又はC1−C10アルキル基、C2−C10アルケニル基、C2−C10アルキニル基を示し、
nは、1〜300から選ばれる整数である。)
本発明の一実施形態では、一般式1で表される構造を有するタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートを提供する。
Ptnは、タンパク質を示し、
ETは、PtnのN末端に連結される場合、
R1は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
R2は、それぞれ独立に水素又はC1−C10アルキル基、C2−C10アルケニル基、C2−C10アルキニル基を示し、
nは、1〜300から選ばれる整数である。)
Claims (31)
- 次の一般式1:
Ptnは、タンパク質を示し、
ETは、PtnのN末端に連結される場合、
R1は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
R2は、それぞれ独立に水素又はC1−C10アルキル基、C2−C10アルケニル基、C2−C10アルキニル基を示し、
nは、1〜300から選ばれる整数である。)
で表される構造を有する、タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート。 - Ptnは、ポリペプチドホルモン、モノクローナル抗体、遺伝子組換え抗体、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、組換えワクチンを含むタンパク質であり、好ましくは、Ptnはインターフェロンα2bである、請求項1に記載のタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート。
- R1は、それぞれ天然アミノ酸の側鎖を示し、前記天然アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、及びヒスチジンから選ばれ、好ましくは、R1は、それぞれオリゴエチレングリコール、リン酸エステル、プロペニルオキシベンジルエステル、アリルトリエチレングリコールで修飾されたチロシン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン酸及び/又はグルタミン酸の側鎖を示す、請求項1又は2に記載のタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート。
- R2は、それぞれ水素又はC1−C10アルキル基を示す、請求項1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート。
- 次の一般式2:
Ptn、ET、R1及びR2は、請求項1〜4のいずれかに記載の定義と同様であり、
nは、1〜200から選ばれる整数であり、且つ
mは、1〜30から選ばれる整数である。)
で表される構造を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載のタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート。 - 次の一般式3:
Ptnは、N末端におけるシステイン残基とC末端におけるLPXaT配列とを有するタンパク質を示し、その中で、Xaは1種又は複数種のアミノ酸を示し、
PAA(Gly)mは、次の一般式4で表される構造を有し、
R1は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
R2は、それぞれ独立に水素又はC1−C10アルキル基、C2−C10アルケニル基、C2−C10アルキニル基を示し、
nは、10〜300から選ばれる整数であり、且つ
mは、1〜30から選ばれる整数である。)
で表される構造を有する、タンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲート。 - Ptnは、ポリペプチドホルモン、モノクローナル抗体、遺伝子組換え抗体、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、組換えワクチンを含むタンパク質であり、好ましくは、Ptnはインターフェロンα2bである、請求項6に記載のタンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲート。
- R1は、それぞれ天然アミノ酸の側鎖を示し、前記天然アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群より選ばれ、好ましくは、R1は、それぞれオリゴエチレングリコール、リン酸エステル、プロペニルオキシベンジルエステル、アリルトリエチレングリコールで修飾されたチロシン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン酸及び/又はグルタミン酸の側鎖を示す、請求項6又は7に記載のタンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲート。
- R2は、それぞれ水素又はC1−C10アルキル基を示す、請求項6〜8のいずれか1項に記載のタンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲート。
- 次の一般式5:
Xは、硫黄又はセレンを示し、
R1は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
R2は、それぞれ独立に水素又はC1−C10アルキル基、C2−C10アルケニル基、C2−C10アルキニル基を示し、
R5は、置換又は非置換のC1−C30アルキル基、置換又は非置換のC2−C30アルケニル基、置換又は非置換のC2−C30アルキニル基、置換又は非置換のC3−C30シクロアルキル基、置換又は非置換のC3−C30シクロアルケニル基、置換又は非置換のC1−C30ヘテロアルキル基、置換又は非置換のC2−C30ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のC2−C30ヘテロアルキニル基、置換又は非置換のC1−C30ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のC2−C30ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のC6−C30アリール基、或いは置換又は非置換のC5−C30ヘテロアリール基を示し、且つ
nは、1〜200から選ばれる整数である。)
で表される構造を有する、ポリアミノ酸化合物。 - R1は、それぞれ天然アミノ酸の側鎖を示し、前記天然アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群より選ばれ、好ましくは、R1は、それぞれオリゴエチレングリコール、リン酸エステル、プロペニルオキシベンジルエステル、アリルトリエチレングリコールで修飾されたチロシン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン酸及び/又はグルタミン酸の側鎖を示す、請求項10に記載のポリアミノ酸化合物。
- R2は、それぞれ水素又はC1−C10アルキル基を示す、請求項10又は11に記載のポリアミノ酸化合物。
- R5は、置換又は非置換のC1−C10アルキル基、置換又は非置換のC2−C10アルケニル基、置換又は非置換のC2−C10アルキニル基、置換又は非置換のC3−C10シクロアルキル基、置換又は非置換のC3−C10シクロアルケニル基、置換又は非置換のC1−C10ヘテロアルキル基、置換又は非置換のC2−C10ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のC1−C10ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のC2−C10ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のC6−C18アリール基、或いは置換又は非置換のC5−C18ヘテロアリール基を示し、その中で、R5を置換する置換基は、C1−3ハロアルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基、カルボニル基、カルボキシル基、スルホン酸基、カルボン酸塩、スルホン酸塩、エステル基、アミド及び/又はハロゲンその中で、R5を置換する置換基は、C1−3ハロアルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基、カルボニル基、カルボキシル基、スルホン酸基、カルボン酸塩、スルホン酸塩、エステル基、アミド及び/又はハロゲンからなる群より選ばれ、好ましくは、R5は、置換又は非置換のC1−C10アルキル基、置換又は非置換のC3−C10シクロアルキル基、置換又は非置換のC1−C10ヘテロアルキル基、置換又は非置換のC1−C10ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のC6−C18アリール基、或いは置換又は非置換のC5−C18ヘテロアリール基を示す、請求項10〜12のいずれか1項に記載のポリアミノ酸化合物。
- R5は、以下の構造から選ばれる、請求項10〜13のいずれか1項に記載のポリアミノ酸化合物。
- 次の一般式6:
X、R1、R2及びR5は、請求項10〜14のいずれかに記載の定義と同様であり、
nは、10〜200から選ばれる整数であり、
mは、1〜30から選ばれる整数である。)
で表される構造を有する、請求項10〜14のいずれか1項に記載のポリアミノ酸化合物。 - 請求項1〜5のいずれか1項に記載のタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート、請求項6〜9のいずれか1項に記載のタンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲート、請求項10〜15のいずれか1項に記載のポリアミノ酸化合物の、タンパク質の製造における使用。
- (1)開始剤を用いてN−カルボキシ無水物の重合を開始させて、炭素構造を有するポリアミノ酸を得るステップと、
(2)得られたポリアミノ酸と1,2−メルカプトエチルアミン構造含有タンパク質とを混合して、ネイティブ化学ライゲーション反応を発生させ、部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートを得るステップとを含む、
部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートの製造方法。 - 前記ステップ(1)では、以下のように、開始剤R5XYを用いてN−カルボキシ無水物の重合を開始させて、炭素構造を有するポリアミノ酸PAA−XR5を得る、請求項17に記載の方法。
Xは、硫黄又はセレンを示し、
Yは、水素又はトリアルキルシリル基を示し、その中で、トリアルキルシリル基中のアルキル基はC1−C10アルキル基であり、
R1は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
R5は、置換又は非置換のC1−C30アルキル基、置換又は非置換のC2−C30アルケニル基、置換又は非置換のC2−C30アルキニル基、置換又は非置換のC3−C30シクロアルキル基、置換又は非置換のC3−C30シクロアルケニル基、置換又は非置換のC1−C30ヘテロアルキル基、置換又は非置換のC2−C30ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のC2−C30ヘテロアルキニル基、置換又は非置換のC1−C30ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のC2−C30ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のC6−C30アリール基、或いは置換又は非置換のC5−C30ヘテロアリール基を示し、且つ
nは、1〜200から選ばれる整数である。) - 前記ステップ(1)では、以下のように、開始剤R5XYを用いてN−カルボキシ無水物の重合を開始させて、炭素構造を有するポリアミノ酸PAA−XR5を得る、請求項17に記載の方法。
Xは、硫黄又はセレンを示し、
Yは、水素又はトリアルキルシリル基を示し、その中で、トリアルキルシリル基中のアルキル基はC1−C10アルキル基であり、
R1は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
R2は、それぞれ独立に水素又はC1−C10アルキル基、C2−C10アルケニル基、C2−C10アルキニル基を示し、
R5は、置換又は非置換のC1−C30アルキル基、置換又は非置換のC2−C30アルケニル基、置換又は非置換のC2−C30アルキニル基、置換又は非置換のC3−C30シクロアルキル基、置換又は非置換のC3−C30シクロアルケニル基、置換又は非置換のC1−C30ヘテロアルキル基、置換又は非置換のC2−C30ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のC2−C30ヘテロアルキニル基、置換又は非置換のC1−C30ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のC2−C30ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のC6−C30アリール基、或いは置換又は非置換のC5−C30ヘテロアリール基を示し、且つ
nは、1〜200から選ばれる整数である。) - 前記R5XYは、トリメチルシリルベンゼンチオール又はトリメチルシリルベンゼンセレノールである、請求項18又は19に記載の方法。
- 前記ステップ(1)は非プロトン性溶媒中且つ室温で行われる、請求項18又は19に記載の方法。
- 前記ステップ(1)で得られたポリアミノ酸について後修飾を行い、前記後修飾は、前記得られたポリアミノ酸と、メルカプトエチルアミン塩酸塩又はメルカプトプロピオン酸である調整剤とを混合して紫外線ランプの照射下で反応させることを含む、請求項18又は19に記載の方法。
- 前記ステップ(2)では、以下のように、前記ステップ(1)で得られたポリアミノ酸と、1,2−メルカプトエチルアミン構造含有タンパク質とを混合して、室温でネイティブ化学ライゲーション反応を発生させ、部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートを得る、請求項18に記載の方法。
- 前記ステップ(2)では、以下のように、前記ステップ(1)で得られたポリアミノ酸と、1,2−メルカプトエチルアミン構造含有タンパク質とを混合して、室温でネイティブ化学ライゲーション反応を発生させ、部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートを得る、請求項19に記載の方法。
- (1)開始剤を用いてN−カルボキシ無水物とグリシンのN−カルボキシ無水物との重合を開始させ、C末端にフェニルチオエステル構造を有し、N末端にポリグリシンブロック構造を有するブロックポリアミノ酸を得るステップと、
(2)得られたブロックポリアミノ酸と、N末端にシステインを有し、C末端にLPXaTG配列(Xaはいずれかのアミノ酸である)を有するタンパク質とを混合して、ネイティブ化学ライゲーション反応及びソルターゼ反応を連続的に発生させて、タンパク質の環化を達成するステップとを含む、
部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲートの製造方法。 - 前記ステップ(1)では、以下のように、開始剤R5XYを用いてN−カルボキシ無水物とグリシンのN−カルボキシ無水物との重合を開始させ、C末端にフェニルチオエステル構造を有し、N末端にポリグリシンブロック構造を有するブロックポリアミノ酸を得る、請求項25に記載の方法。
Yは、水素又はトリアルキルシリル基をを示し、その中で、トリアルキルシリル基中のアルキル基はC1−C10アルキル基であり、
R1は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
R5は、置換又は非置換のC1−C30アルキル基、置換又は非置換のC2−C30アルケニル基、置換又は非置換のC2−C30アルキニル基、置換又は非置換のC3−C30シクロアルキル基、置換又は非置換のC3−C30シクロアルケニル基、置換又は非置換のC1−C30ヘテロアルキル基、置換又は非置換のC2−C30ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のC2−C30ヘテロアルキニル基、置換又は非置換のC1−C30ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のC2−C30ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のC6−C30アリール基、或いは置換又は非置換のC5−C30ヘテロアリール基を示し、
nは、10〜200から選ばれる整数であり、且つ
mは、1〜30から選ばれる整数である。) - 前記ステップ(1)では、以下のように、開始剤R5XYを用いてN−カルボキシ無水物と別の1種のN−カルボキシ無水物との重合を開始させ、C末端にフェニルチオエステル構造を有し、N末端にポリグリシンブロック構造を有するブロックポリアミノ酸を得る、請求項25に記載の方法。
Xは、硫黄又はセレンを示し、
Yは、水素又はトリアルキルシリル基をを示し、その中で、トリアルキルシリル基中のアルキル基はC1−C10アルキル基であり、
R1は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
R2は、それぞれ独立に水素又はC1−C10アルキル基、C2−C10アルケニル基、C2−C10アルキニル基を示し、
R5は、置換又は非置換のC1−C30アルキル基、置換又は非置換のC2−C30アルケニル基、置換又は非置換のC2−C30アルキニル基、置換又は非置換のC3−C30シクロアルキル基、置換又は非置換のC3−C30シクロアルケニル基、置換又は非置換のC1−C30ヘテロアルキル基、置換又は非置換のC2−C30ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のC2−C30ヘテロアルキニル基、置換又は非置換のC1−C30ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のC2−C30ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のC6−C30アリール基、或いは置換又は非置換のC5−C30ヘテロアリール基を示し、
nは、10〜200から選ばれる整数であり、且つ
mは、1〜30から選ばれる整数である。) - 前記R5XYは、トリメチルシリルベンゼンチオール又はトリメチルシリルベンゼンセレノールである、請求項26又は27に記載の方法。
- 前記ステップ(1)は非プロトン性溶媒中且つ室温で行われる、請求項26又は27に記載の方法。
- 前記ステップ(1)で得られたポリアミノ酸について後修飾を行い、前記後修飾は、前記得られたポリアミノ酸と、メルカプトエチルアミン塩酸塩又はメルカプトプロピオン酸である調整剤とを混合して紫外線ランプの照射下で反応させることを含む、請求項26又は27に記載の方法。
- 前記ステップ(2)では、以下のように、前記ステップ(1)で得られたブロックポリアミノ酸と、N末端にシステインを有し、C末端にLPXaTG配列を有するタンパク質とを混合して、前記ブロックポリアミノ酸と前記タンパク質のN末端におけるシステインとをライゲーション反応させ、次にソルターゼの存在下で環化を達成する、請求項26又は27に記載の方法。
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