CN115991868A - 硒代聚合物、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种硒代聚合物、其制备方法及应用。其中，该硒代聚合物由含有N‑羧酸酐的硒代氨基酸通过开环聚合获得；优选的，硒代聚合物由含有N‑羧酸酐的硒代氨基酸与含有N‑羧酸酐的氨基酸通过开环聚合获得。应用本发明提供的生物相容性硒代聚合物，将其与含有游离半胱氨酸的多肽或蛋白进行位点特异性结合，可以完全保留多肽或蛋白的生物抑制活性，同时增强其抗氧化能力，当多肽或蛋白用作药物时，延长了血清半衰期，提供了持久的保护活性。

Description

硒代聚合物、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种硒代聚合物、其制备方法及应用。

背景技术

人α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的成员，也是人体血浆中最丰富的内源性丝氨酸蛋白酶抑制剂之一。它主要由肝细胞分泌到循环系统中，阻止蛋白酶尤其是中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)在炎症条件下对组织的损伤(Travis,J.,et al,Am JMed 1988,84(6A),37-42；Carrell,R.W.,et al,N Engl J Med 2002,346(1),45-53；Kolarich,D.,et al,Proteomics 2006,6(11),3369-80；Hunt,J.M.et al.Curr Mol Med2012,12(7),827-835)。A1AT表面突出的活性中心环(RCL，位置357-366)与蛋白酶上的活性丝氨酸反应后，RCL断裂，构象改变，进而形成无活性的共价丝氨酸蛋白酶抑制剂复合物(Huntington,J.A.,et al.Nature2000,407(6806),923-926)。

A1AT缺乏症(A1ATD)是一种常见的遗传性疾病，影响全球约340万人(de Serres,F.J.,Chest 2002,122(5),1818-1829；Kelly E,Respir Med 2010,104(6),763-772)。目前，针对A1ATD的唯一治疗方法是每周一次静脉注射(60mg/Kg体重)人血浆来源的天然A1AT(nA1AT)以增加其在血液与肺中的浓度(Silverman,E.K,et al,N Engl J Med 2009,360(26),2749-2957；Hubbard,R.C.et al,Am J Med 1988,84(6A),52-62)。然而，该治疗方案中的nA1AT价格昂贵且其供应不足以满足临床需求(Wewers,M.D.et al,COPD 2013,10Suppl 1,64-67)。nA1AT的另一个缺点是由于其不稳定、蛋白水解和氧化失活等导致的体内半衰期短。据报道，中度A1ATD的吸烟者其患COPD(慢性阻塞性肺病)的风险大大增加(Stoller,J.K.et al,Am J Respir Crit Care Med 2012,185(3),246-259)；当暴露于烟草烟雾时，A1AT的RCL处的Met358残基易于被氧化成甲硫氨酸亚砜，导致蛋白失活；此外，在支气管扩张和风湿病患者中也可以检测到氧化型A1AT(Sepper,R.et al,J Clin Immunol1995,15(1),27-34；Chidwick,K.et al,Ann Rheum Dis 1991,50(12),915-916)。因此，保护A1AT不被氧化可显著提供其治疗效果。诸如聚乙二醇化或包括Fc、HSA、PAS、XTEN或CDR环的融合方法虽然可以延长蛋白药物在体内的循环时间，但它们均不能有效地保护蛋白质免受氧化失活(Zhang,Y.et al,Angew Chem Int Ed Engl 2013,52(32),8295-8298；Ko,J.H.et al,Chem Soc Rev 2018,47(24),8998-9014；Schellenberger,V.et al,NatBiotechnol 2009,27(12),1186-1190；Schlapschy,M.et al,Protein Eng Des Sel 2013,26(8),489-501；Kontos,S.et al,Chem Soc Rev 2012,41(7),2686-95；Chen,C.et al,Progress in Polymer Science 2020,105,101241；Ekladious,I.et al,Nature ReviewsDrug Discovery2019,18(4),273-294)。

硒是一种与人类健康和多种疾病高度相关的必需微量元素。与硫相比，硒具有更大的原子半径，并且在亲核取代、氧化还原反应和自由基反应等许多化学反应中具有更高的活性。硒所具有的这些独特的化学反应及其在生物学中的重要作用，使得硒代聚合物已被开发用于药物递送、自适应材料和酶模拟物等研究(Xia,J.H.et al,Macromolecules2018,51(19),7435-7455；Xu,H.et al,Acc Chem Res 2013,46(7),1647-1658)。然而截止目前，尚没有硒代聚合物用于保护蛋白免受氧化损伤的报道。

发明内容

本发明旨在提供一种硒代聚合物、其制备方法及应用，采用硒代聚合物保护蛋白免受氧化损伤。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种硒代聚合物。该硒代聚合物由含有N-羧酸酐的硒代氨基酸通过开环聚合获得；优选的，硒代聚合物由含有N-羧酸酐的硒代氨基酸与含有N-羧酸酐的氨基酸通过开环聚合获得。

进一步地，含有N-羧酸酐的硒代氨基酸为硒代蛋氨酸NCA；含有N-羧酸酐的氨基酸为肌氨酸NCA；优选的，硒代聚合物的末端具有马来酰亚胺残基；优选的，含有N-羧酸酐的硒代氨基酸还具有侧链，所述侧链选自由低聚乙二醇、低聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇、聚乙二醇单甲醚、N-甲基乙胺、N,N-二甲基乙胺、N,N-二乙基乙胺、乙基三甲基铵盐、丙基三甲基铵盐、乙酸和丙酸组成的组中一种或多种。

进一步地，硒代聚合物为P(SeMet)₃-CO-(Sar)₁₀₅或P(EG₄-SeHC)₃₀-b-(Sar)₁₅。

根据本发明的另一个方面，提供了一种上述任一种硒代聚合物在保护蛋白免受氧化损伤中的应用；优选的，蛋白含有游离的硫醇基；更优选的，蛋白含有半胱氨酸残基。

进一步地，蛋白为酶或抗体；优选的，酶为易被氧化的蛋白酶或抗体；更优选的，蛋白酶为α-1-抗胰蛋白酶。

进一步地，硒代聚合物与蛋白偶联；优选的，硒代聚合物通过末端的马来酰亚胺残基与蛋白的游离的硫醇基偶联。

根据本发明的再一个方面，提供了一种抗氧化损伤的蛋白。该蛋白偶联有上述任一种硒代聚合物。

进一步地，硒代聚合物通过末端的马来酰亚胺残基与蛋白的游离的硫醇基偶联；优选的，蛋白为酶；更优选的，蛋白为易被氧化的蛋白酶或抗体；更优选的，蛋白酶为α-1-抗胰蛋白酶。

根据本发明的另一个方面，提供了上述任一种蛋白在制备药物中的应用。

进一步地，当蛋白为α-1-抗胰蛋白酶时，药物为丝氨酸蛋白酶抑制剂；优选的，硒代聚合物为P(SeMet)₃-CO-(Sar)₁₀₅或P(EG₄-SeHC)₃₀-b-(Sar)₁₅，抗氧化损伤的蛋白在制备对肺损伤的保护作用的药物中的应用。

根据本发明的再一个方面，提供了一种硒代聚合物的制备方法。该制备方法包括将含有N-羧酸酐的硒代氨基酸进行开环聚合，获得硒代聚合物；优选的，将含有N-羧酸酐的硒代氨基酸与含有羧酸酐的氨基酸进行开环聚合获得硒代聚合物；优选的，含有N-羧酸酐的硒代氨基酸为硒代蛋氨酸NCA；含有羧酸酐的氨基酸为肌氨酸NCA；更优选的，制备方法还包括在硒代聚合物末端加马来酰亚胺残基的步骤。

进一步地，包括以下步骤：将肌氨酸NCA、硒代蛋氨酸NCA和苄胺分别溶于无水DMF，反应获得P(Sar-ran-SeMet)；将P(Sar-ran-SeMet)溶解在ddH₂O中，加入含有NHS-C₃-Mal和TEA的DMSO反应制备得到P(Sar-ran-SeMet)-Mal。

进一步地，包括以下步骤：将EG4-SeHC NCA溶解在无水DMF中，加入苄胺，室温下搅拌反应后得到第一反应液；将肌氨酸NCA加入到所述第一反应液中反应生成P(EG4-SeHC-co-Sar)；将P(EG4-SeHC-co-Sar)溶解于无水DMF中，加入含有NHS-C₃-Mal和TEA的DMSO反应制备得到P(EG4-SeHC-co-Sar)-Mal。

根据本发明的一个方面，提供了一种上述抗氧化损伤的蛋白的制备方法。该制备方法包括将硒代聚合物与蛋白偶联；优选的，将硒代聚合物通过末端的马来酰亚胺残基与蛋白的游离的硫醇基进行偶联；更优选的，制备方法包括以下步骤：将含有等摩尔量马来酰亚胺的上述硒代聚合物与蛋白在缓冲液中混合，4℃条件下偶联。

进一步地，缓冲液包括200mM NaCl、0.1mM TCEP和20mM磷酸钠缓冲液，缓冲液pH7.0；优选的，硒代聚合物与待偶联蛋白的摩尔比为4:1～6:1。

应用本发明提供的生物相容性硒代聚合物，将其与含有游离半胱氨酸的多肽或蛋白进行位点特异性结合，可以完全保留多肽或蛋白的生物抑制活性，同时增强其抗氧化能力，当多肽或蛋白用作药物时，延长了血清半衰期，提供了持久的保护活性。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了实施例1中A1AT的SDS-PAGE胶图；

图2示出了实施例1中A1AT分子排阻层析图；

图3示出了实施例1中用NE抑制剂筛选试剂盒检测A1AT及氧化后的A1AT对NE的抑制作用；

图4示出了实施例1中硒代聚合物SeP1和SeP2的结构图；

图5示出了实施例1中p(EG4-SeHC)被NCS氧化前后¹HNMR检测结果；

图6示出了实施例1中10nM A1AT或10nM A1AT与不同当量硒代聚合物的混合物被100当量的NCS氧化后对NE活性的抑制；

图7示出了实施例1中A1AT、A1AT-SeP1、A1AT-SeP2 SDS-PAGE胶图；

图8示出了实施例1中A1AT-SeP1和A1AT-SeP2的SEC分析结果；

图9a-图9e示出了实施例1中硒代聚合物的抗氧化效果，其中图9a示出了实施例1中A1AT、A1AT-SeP1和A1AT-SeP2对NE的抑制活性；图9b示出了实施例1中A1AT、A1AT-SeP1、A1AT-SeP2与100当量NCS氧化室温孵育30分钟后对NE的抑制活性；图9c示出了实施例1中A1AT、A1AT-SeP1、A1AT-SeP2与200当量NCS室温孵育30分钟后对NE的抑制活性；图9d示出了实施例1中A1AT、A1AT-SeP1、A1AT-SeP2与200当量NCS室温孵育60分钟后对NE的抑制活性；图9e示出了实施例1中A1AT、A1AT-SeP2与200当量或40当量NCS室温孵育不同时间抑制NE的相对活性；

图10示出了实施例1中10nM A1AT、A1AT与等当量SeP1或SeP2的混合物、A1AT-SeP1、A1AT-SeP2被200当量NCS氧化后对NE的抑制活性，其中*表示P≤0.05；***表示P≤0.001；

图11示出了实施例1中灌注不同剂量猪胰弹性蛋白酶(PPE)的小鼠支气管肺泡灌洗液中髓过氧化物酶(MPO)的活性，其中*表示P≤0.05；

图12a和图12b示出了实施例1中A1AT、A1AT-SeP2对PPE诱导的小鼠肺损伤的保护作用；图12a示出了实施例1中A1AT、A1AT-SeP2预处理24小时后气管内吸入PPE，PPE处理24小时后小鼠BALF中MPO的活性；图12b示出了实施例1中A1AT、A1AT-SeP2预处理72小时后气管内吸入PPE，PPE处理24小时后小鼠BALF中MPO的活性，其中*表示P≤0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001；

图13示出了实施例1中A1AT、A1AT-SeP2尾静脉注射小鼠后，在小鼠体内的PK曲线；

图14示出了实施例1中p(EG4-SeHC)腹腔注射(第1天、第8天，第15天，第22天)小鼠后，不同时间小鼠体重变化。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

名词解释：

NCA是N-Carboxyanhydride的缩写，即N-羧基酸酐。

SeP：在本发明中是指Se代多肽。

人类alpha-1-抗胰蛋白酶(A1AT)是一种天然丝氨酸蛋白酶抑制剂，可保护组织免受过度蛋白酶活性的破坏，被用作治疗A1AT缺陷患者的增强疗法。然而，A1AT对氧化失活很敏感，并且循环半衰期很短。目前的方法都不能有效地保护治疗性蛋白质免受体内氧化损伤。针对此，本发明提供了一种新型的生物相容性硒代聚合物，并将其与含有游离半胱氨酸的多肽或蛋白例如A1AT进行位点特异性结合。与硒代聚合物结合的A1AT完全保留了其对中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)的抑制活性，同时增强了其抗氧化能力，延长了血清半衰期，并在急性肺损伤小鼠模型中提供了持久的保护活性。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种硒代聚合物。该硒代聚合物由含有N-羧酸酐(NCA)的硒代氨基酸通过开环聚合(ROP)获得，优选的，该硒代聚合物由含有N-羧酸酐(NCA)的硒代氨基酸与含有N-羧酸酐(NCA)的氨基酸通过开环聚合(ROP)获得。

在本发明一种典型的实施方式中，含有N-羧酸酐的硒代氨基酸为硒代蛋氨酸NCA；含有羧酸酐的氨基酸为肌氨酸NCA。为了更方便的与蛋白进行偶联，优选的，硒代聚合物的末端具有马来酰亚胺残基。为了共聚物中的硒含量并提高其水溶性，含有N-羧酸酐的硒代氨基酸还具有侧链，侧链选自由低聚乙二醇、低聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇、聚乙二醇单甲醚、N-甲基乙胺、N,N-二甲基乙胺、N,N-二乙基乙胺、乙基三甲基铵盐、丙基三甲基铵盐、乙酸和丙酸组成的组中一种或多种。

更优选的，硒代聚合物为P(SeMet)₃-CO-(Sar)₁₀₅或P(EG₄-SeHC)₃₀-b-(Sar)₁₅。本发明的实施例验证了与该硒代聚合物偶联的A1AT完全保留了其对中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)的抑制活性，同时增强了其抗氧化能力，延长了血清半衰期，并在急性肺损伤小鼠模型中提供了持久的保护活性。这些结果表明，将A1AT与设计的含硒聚合物偶联是改善其药理特性的可行策略。这种方法有可应用于各种氧化敏感的生物治疗药物。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种上述硒代聚合物在保护蛋白免受氧化损伤中的应用。在本发明一实施方式中，蛋白含有游离的硫醇基，例如，蛋白含有半胱氨酸残基。典型的，蛋白为酶或抗体；优选的，所述酶含有易被氧化的基团(例如半胱氨酸残疾)；优选的，酶为α-1-抗胰蛋白酶。本发明提供的生物相容性硒代聚合物与含有游离半胱氨酸的多肽或蛋白进行位点特异性结合，可以完全保留多肽或蛋白的生物抑制活性，同时增强其抗氧化能力，当多肽或蛋白用作药物时，延长了血清半衰期，提供了持久的保护活性。

典型的，硒代聚合物与蛋白偶联；优选的，硒代聚合物通过末端的马来酰亚胺残基与蛋白的游离的硫醇基偶联。另外，硒代聚合物还可以通过末端的活化酯与蛋白上的氨基进行非定点偶联，从而达到保护蛋白的目的。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种抗氧化损伤的蛋白。其中，该蛋白偶联有本发明的上述硒代聚合物。

典型的，硒代聚合物通过末端的马来酰亚胺残基与蛋白的游离的硫醇基偶联；优选的，蛋白为酶；更优选的，酶为α-1-抗胰蛋白酶。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种上述抗氧化损伤的蛋白在制备药物中的应用。例如，当蛋白为α-1-抗胰蛋白酶时，药物为丝氨酸蛋白酶抑制剂。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种上述硒代聚合物的制备方法，包括将含有N-羧酸酐的硒代氨基酸进行开环聚合，获得硒代聚合物；优选的，将含有N-羧酸酐的硒代氨基酸与含有羧酸酐的氨基酸进行开环聚合获得硒代聚合物；典型的，含有N-羧酸酐的硒代氨基酸为硒代蛋氨酸NCA；含有羧酸酐的氨基酸为肌氨酸NCA；更优选的，制备方法还包括在硒代聚合物末端加马来酰亚胺残基的步骤。在本发明一种典型的实施方式中，上述硒代聚合物的制备方法包括以下步骤：将肌氨酸NCA、硒代蛋氨酸NCA和苄胺分别溶于无水DMF，反应获得P(Sar-ran-SeMet)；将P(Sar-ran-SeMet)溶解在ddH₂O中，加入含有NHS-C₃-Mal和TEA的DMSO反应制备得到P(Sar-ran-SeMet)-Mal。

在本发明一种典型的实施方式中，上述硒代聚合物的制备方法包括以下步骤：将EG4-SeHC NCA溶解在无水DMF中，加入苄胺，室温下搅拌反应后得到第一反应液；将肌氨酸NCA加入到第一反应液中反应生成P(EG4-SeHC-co-Sar)；将P(EG4-SeHC-co-Sar)溶解于无水DMF中，加入含有NHS-C₃-Mal和TEA的DMSO反应制备得到P(EG4-SeHC-co-Sar)-Mal。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种上述抗氧化损伤的蛋白的制备方法。该制备方法包括以下步骤：将含有等摩尔量马来酰亚胺的上述硒代聚合物与所述蛋白在缓冲液中混合，4℃条件下偶联。

优选的，缓冲液包括200mM NaCl、0.1mM TCEP和20mM磷酸钠缓冲液，缓冲液pH7.0；优选的，硒代聚合物与待偶联蛋白的摩尔比为4:1～6:1。

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

实施例1

实验材料和方法

1.动物

雌性C57BL小鼠和雄性昆明小鼠均购自维通利华(Charies River,Beijing,China)。

2.化学合成

2.1EG4-SeHC NCA和肌氨酸NCA的合成

EG4-SeHC NCA根据文献[Wu,G.Q.et al,Chem.Commun.2019,55(54),7860-7863]报道的步骤合成，肌氨酸NCA根据文献[Macromolecules 2011,44,6746–6758报道的步骤合成。

2.2硒代蛋氨酸NCA的合成

将硒代蛋氨酸(700mg，3.5mmol)与三光气(530mg，1.8mmol)置于50ml THF(四氢呋喃)溶液中，加入环氧丙烷(～2.5mL,～35mmol)，室温下搅拌混合2小时，反应生成硒代甲硫氨酸NCA。移除反应液，通过硅胶(使用前在90℃干燥至少4小时)色谱法纯化产物(移动相：乙酸乙酯/石油醚)。纯化回收后的硒代甲硫氨酸NCA为浅黄色油状物，在冰箱中逐渐固化(124毫克，产率：16％)。高分辨电喷雾质谱(HR-ESI-MS)检测的分子量为245.9633，与理论值245.9640一致。

2.3P(Sar-ran-SeMet)-Mal的合成

P(Sar-ran-SeMet)的制备：在手套箱中，将肌氨酸NCA(76mg,0.66mmol)和硒代蛋氨酸NCA(16mg,0.072mmol)溶解在1.0mL无水DMF中，往溶液中加入48μL 0.1苄胺(溶于DMF中)搅拌24小时。傅里叶变换红外光谱(FI-IR)检测NCA完全转化后，用50mL乙醚沉淀多肽并用PD-10脱盐。冻干后，回收的多肽P(Sar-ran-SeMet)为白色粉末(38mg，产率：64％)，SEC分析其为单峰(结果未显示)。

P(Sar-ran-SeMet)末端加Mal尾：10.0mg P(Sar-ran-SeMet)溶解在500μL ddH₂O中，向溶液中加入500μL含有NHS-C3-Mal(3.8mg,0.014mmol)和TEA(1μL)的DMSO，室温下搅拌24小时。脱盐冻干后回收白色粉末状多肽(8.0mg，产率：80％)。¹H NMR分析多肽的组成和末端加Mal尾的效率(其中，引发剂：硒代蛋氨酸：肌氨酸＝1:3:105)。

2.4P(EG4-SeHC-co-Sar)-Mal的合成

制备P(EG4-SeHC-co-Sar)：在手套箱中，将100mg EG4-SeHC NCA溶解在2.0mL无水DMF中，加入62μL 0.1M苄胺(溶于DMF)，室温下搅拌24小时。傅里叶变换红外光谱(FT-IR)确认NCA转化后，取200μL溶于用于SEC分析。将肌氨酸NCA(12.8mg，0.112mmol)加入到上述混合溶液中再次搅拌24小时，在乙醚中沉淀共聚肽并通过PD-10脱盐。冻干后回收蓬松粉末(64mg，66％)。SEC分析其为单峰(结果未展示)，¹H NMR分析多肽的组成(引发剂：EG4-SeHC：肌氨酸＝1:30:15)。

P(EG4-SeHC-co-Sar)用NHS-C3-Mal加尾：将前述获得的10.0mg P(EG4-SeHC-co-Sar)溶解于100μL无水DMF中，往溶液中加入NHS-C3-Mal(1.0mg，0.0037mmol)和TEA(0.5μL)，室温下搅拌24小时。经PD-10脱盐、冻干后回收白色粉末状多肽(10.0mg，产率99％)。1HNMR确定P(EG4-SeHC-co-Sar)末端已成功加Mal(结果未展示)。

3.A1AT表达质粒的构建

A1AT基因(P01009(uniprot))由生工生物(上海)进行密码子优化并合成。为了提高蛋白质与Ni-NTA树脂的亲和力，在A1AT蛋白C端添加了柔性接头GGGS，并将其与10xHis标签融合。通过CloneExpress II一步克隆试剂盒(Vazyme Biotech，#C112)将基因片段克隆到pET28a载体的NcoI和HindIII位点，并通过DNA测序进一步确认克隆获得的序列。

4.A1AT蛋白的表达和纯化

将5mL过夜培养物接种至500ml添加了卡那霉素(100μg/mL)的TB培养基中，37℃，220rpm培养至OD600达到约0.6至0.8。将培养物冷却至室温，加入0.2mM IPTG在25℃下诱导20小时。离心收集细胞并重悬于含有200mM NaCl、20mM咪唑、2mM TCEP和20mM磷酸钠缓冲液的缓冲液(pH8.0)中。将细胞超声30秒，冰上静置1分钟，持续15分钟后，将裂解物于4℃，12000×g离心20分钟。将上清液加到Ni-NTA柱上进行亲和纯化后，用pH8.0且含20mM磷酸钠、2mM TCEP和200mM NaCl的咪唑溶液进行梯度洗脱(从40mM到300mM)，收集洗脱液进行SDS/PAGE分析。尺寸排阻柱(HiLoad 16/600Superdex 75prep Grade，用200mM NaCl、0.1mMTCEP(sigma)和20mM磷酸钠缓冲液pH 7.0平衡)用于进一步分离蛋白和进行缓冲液交换。BCA试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司，#PC0020)测定蛋白质浓度。

5.A1AT活性测定

A1AT对中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)的抑制通过NE抑制剂筛选试剂盒(BioVision)进行测定。将12.5μL稀释的样品(A1AT或A1AT偶联物的终浓度为10nM)、抑制剂对照、DPBS对照与25μL NE溶液混合，37℃孵育5分钟后，将含有底物的反应液加入含有上述混合液的孔(12.5μL/孔)中混合后立即测量其在激发光400nm(Ex400)和发射光505nm(Em505)处的荧光值；在37℃避光条件下孵育30min后，再次测量其在激发光400nm(Ex400)和发射光505nm(Em505)处的荧光值。分别计算T1时间Ex(400)/Em(505)的比值R1以及T2时间Ex(400)/Em(505)的比值R2。底物水解产生的荧光RFU为ΔRFU＝R2–R1。通过动力学读数选择线性范围内的R1和R2。将空白对照的ΔRFU设置为100％的相对活性值，并计算每个抑制剂的相对活性，如下所示：

6.A1AT被N-氯琥珀酰亚胺(NCS)氧化

将1μM A1AT与不同浓度的NCS(Innochem)于100mM Tris、pH 8.5的溶液中在室温下孵育不同的时间(Le,D.T.et al,Biochemistry 2008,47(25),6685-94)。

7.A1AT与聚合物偶联

将含有等当量马来酰亚胺的不同聚合物与A1AT(200mM NaCl、0.1mM TCEP和20mM磷酸钠缓冲液，pH7.0中的终浓度为0.5mg/mL)在4℃下孵育过夜，并通过SDS/PAGE进行分析。聚合物与A1AT的最佳摩尔比范围为4:1至6:1。通过SEC(HiLoad 16/600Superdex75制备级)从反应混合物中纯化偶联产物。

8.PK实验

雌性C57BL小鼠(6周龄，体重～20g)随机分为两组(6只小鼠/组)。通过尾静脉注射100μg A1AT或A1AT-SeP2。在不同时间点(0.5小时、1小时、2小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、120小时、168小时、240小时、336小时)尾静脉采集静脉血。使用SerpinA1Matched ELISA Antibody Pair Set,Human(#SEK10306,SinoBiological)通过ELISA检测每个样品中A1AT的浓度，并通过GraphPad Prism处理数据。

9.A1AT-SeP2对猪胰弹性蛋白酶(PPE)诱导的肺损伤的保护试验

将雌性C57BL小鼠(6周龄)(8只小鼠/组，共3组)麻醉后，通过移液管将50μL样品(PBS、130μM A1AT或130μM A1AT-SeP2)滴入气管并吸入肺部。24小时或72小时后，以同样的方式滴注50μL PPE(150U/kg)(上海源叶生物科技有限公司，#S31655)。24小时后处死小鼠，按文献报道⁴⁴收集支气管肺泡灌洗液(BALF)，1000g，4℃离心10分钟分离细胞，并使用蒸馏水通过低渗裂解机制裂解剩余的红细胞5秒。将细胞PBS洗涤后并重悬于含有300μL含有0.1％Triton-X(北京索莱宝生物科技有限公司，#T8200)的PBS中。取50μL样品与等体积的TMB(Novoprotein，#PA005)混合，37℃孵育5分钟后，加入50μL 2MH2SO4终止反应，并于450nm处测量吸光度以测髓过氧化物酶(MPO)的活性。

10.p(EG4-SeHC)安全性测试

将雄性昆明小鼠(6周龄)随机分为两组(n＝6)。在第1天、第8天、第15天、第22天，分别注射(i.p)1mg/kg p(EG4-SeHC)或10mL/kg PBS作为对照。每周测量3次体重。

11.数据处理

数据用平均值±SEM标示，并通过GraphPad Prism进行统计学处理。误差棒代表SD。*，P≤0.05；**，P≤0.01；***,P≤0.001

结果与分析：

将编码A1AT基因的表达质粒转化并在大肠杆菌BL21(DE3)中过表达。通过镍-次氮基三乙酸树脂(Ni-NTA)和尺寸排阻色谱(SEC)从裂解细胞的上清液中纯化A1AT蛋白。纯化后的A1AT产量约为16mg/L。通过SDS-PAGE、SEC分析其纯度。SDS-PAGE(图1)显示，纯化的A1AT条带大小在50kDa左右，并作为单峰从Superdex 75柱上洗脱，未见聚集(图2)。MS分析显示A1AT分子量为46144Da，与理论分子量46142Da一致。A1AT是中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)的天然抑制剂。晶体学研究表明，NE与A1AT的结合会切割其反应环，形成共价复合物(Huntington,J.A.et al,Nature 2000,407(6806),923-926)。位于A1AT活性环的蛋氨酸358易于氧化，导致蛋白质失活。据报道，N-氯琥珀酰亚胺(NCS)可选择性地将蛋白表面暴露的蛋氨酸残基氧化成蛋氨酸亚砜(Boudier,C.et al,Biochem J 1994,303(Pt 1),61-68)。因此，发明人将A1AT与100当量的NCS室温孵育30分钟后，NE抑制剂筛选试剂盒评估A1AT对NE的抑制活性。在该测定中，检测并量化了特定荧光底物被NE水解后产生的荧光。在抑制剂如A1AT存在的情况下，荧光底物的水解受到抑制，荧光信号降低。如图3所示，10nM A1AT可以完全抑制NE的活性。将A1AT与NCS孵育后，NE活性几乎不受影响，表明A1AT的抑制活性因氧化而丧失。作为对照，含有等量NCS的氧化缓冲液中NE活性几乎没有受到影响。

由氨基酸N-羧酸酐(NCA)开环聚合(ROP)制备的多肽或类多肽因其可生物降解性和生物相容性而广泛应用于生物医学工程。例如，聚肌氨酸(PSar)是一种无结构的类多肽，其具有优异的水溶性和无污染特性，作为PEG的出色替代品，已被用于蛋白质偶联(Hou,Y.et al,Bioconjugate Chem 2019,30(6),1604-1616；Hu,Y.et al,Bioconjugate.Chem.2018,29(7),2232-2238.)。发明人通过共聚制备了两种硒代聚合物(SeP1和SeP2，图4)。SeMet在肌氨酸NCA(SarNCA)和硒代甲硫氨酸NCA(SeMet NCA)的随机共聚制备SeP1的过程中引入。由于SeMet的疏水性，发明人发现当Sar/SeMet摩尔比大于10:1时形成的多肽才具有水溶性。为了增加共聚物中的硒含量并提高其水溶性，在SeP2中引入了水溶性硒多肽P(EG4-SeHC)(Wu,G.et al,Chem Commun(Camb)2019,55(54),7860-7863)，同时在P(EG4-SeHC)的N端引入了PSar以延长其在体内循环的时间。SeP1和SeP2的结构式如图4所示，其末端均有用于与半胱氨酸偶联的马来酰亚胺。为了证明硒代聚合物对NCS的反应性，将P(EG4-SeHC)与5当量的NCS和NaOD在水溶液中混合，¹H NMR原位监测发现P(EG4-SeHC)的α-、β-和γ-氢信号明显偏移(图5)，且与含硒多肽的化学位移相似，表明该多肽可以被NCS氧化。

为了确定SePs是否可以保护A1AT免受氧化失活，将A1AT与100当量的NCS及不同当量SePs室温下孵育30分钟后，检测其对NE的抑制活性以评估未氧化的A1AT的含量。如图6所示，在没有SePs的情况下，A1AT在氧化条件下丧失了大部分活性。SeP1对A1AT没有明显的保护作用，而SeP2可以以剂量依赖的方式保护A1AT的活性，可能是因为与SeP1相比，其硒含量更高。当A1AT与8当量的SeP2混合时，A1AT保留了约50％的抑制活性。

SePs可保护与之混合的A1AT免遭NCS氧化，发明人推断如果在A1AT活性环Met358附近偶联SePs也许可以更有效地提供抗氧化保护。基于A1AT的晶体结构，带有游离硫醇基团的Cys232位于A1AT表面并靠近Met358。发明人将A1AT与4-6当量的SePs于4℃孵育过夜，并通过SEC纯化获得A1AT-SePs偶联物(A1AT-SeP1和A1AT-SeP2)。SDS-PAGE结构显示A1AT-SePs偶联物的条带从A1AT分子量所在的位置迁移至更高分子量所在的位置，且偶联物均为单体形式(图5、图6)。图7示出了A1AT、A1AT-SeP1、A1AT-SeP2 SDS-PAGE胶图；图8示出了A1AT-SeP1和A1AT-SeP2的SEC分析结果。

接下来，发明人检测A1AT-SeP1和A1AT-SeP2对NE的抑制活性。结果显示，与A1AT类似，10nM A1AT-SeP1或A1AT-SeP2能够完全抑制NE的活性(图9a)，表明Cys232处的聚合物偶联不会干扰A1AT的活性；。接下来，发明人将一系列不同浓度A1AT、A1AT-SeP1或A1AT-SeP2与100当量的NCS孵育，以量化和比较它们对NE的抑制活性，结果显示，A1AT对NE的抑制活性显著降低(IC50＝22.0±7.1nM)。相比之下，A1AT-SeP1(IC50＝7.7±1.0nM)和A1AT-SeP2(IC50＝5.7±1.0nM)对NE的抑制活性则大部分被保留(图9b)。当发明人将NCS增加到200当量时，A1AT-SeP2(IC50＝7.4±1.4nM)和A1AT-SeP1(IC50＝13.0±1.8nM)的活性都出现下降，并且A1AT-SeP2更能抵抗高浓度氧化剂的氧化能力(图9c)。此外，发明人在一个时间过程中研究了氧化诱导的失活。发明人首先将孵育时间从30分钟延长至1小时。正如预期的那样，在200当量NCS处理下，A1AT-SeP2仍保持其大部分活性(IC50＝12.5±2.5nM)，而A1AT和A1AT-SeP1的活性急剧下降(图9d)，这可能是SeP1硒含量相对较低导致；接着发明人将A1AT、A1AT-SeP2分别与200当量NCS孵育不同的时间，发现A1AT的活性随着孵育时间的延长丧失迅速(图9e)，而A1AT-SeP2在40分钟时仍保留其原始活性的50％以上。接下来，发明人将NCS的数量从200当量减少到40当量并延长孵育时间，发现A1AT-SeP2在10小时后保留了大约一半的原始活性。为了探索NCS氧化对A1AT和A1AT-SePs偶联物活性的影响，发明人将200当量的NCS与A1AT、A1AT与等当量的聚合物(如SeP1、SeP2)、A1AT-SePs偶联物分别孵育30分钟，并比较它们对NE的抑制活性。如发明人假设的那样，A1AT几乎丧失了对NE的抑制活性，而A1AT-SePs偶联物比A1AT与等量SePs的混合物显示出更强的抗氧化能力；与聚合物的抗氧化能力一致，在相同的氧化条件下，A1AT-SeP2保持比A1AT-SeP1更高的抑制活性(图10)。

基于上述结果，发明人选择A1AT-SeP2进行进一步的药效评估。肺是含氧量最高的器官，肺组织表面也因此成为高度氧化的环境。通过肺部输送的药物更容易被氧化，因此抗氧化能力为药物开发和制剂的重要参数。为此，发明人利用猪胰弹性蛋白酶(PPE)诱导的肺损伤小鼠模型来考察A1AT和A1AT-SeP2对肺损伤的保护作用，通过吸入式气管滴注不同剂量的PPE以优化诱导肺损伤的适当剂量，并选择嗜中性粒细胞的嗜天青颗粒中最丰富的促炎酶髓过氧化物酶(MPO)作为炎症的生物标志物(Julius,S,et al,Archives ofBiochemistry and Biophysics1962,96(3),465-467)。正如预期的那样，施用100μg PPE(150U/kg)诱发的小鼠炎症反应导致支气管肺泡灌洗液(BALF)中的MPO活性增加15倍(图11)。在施用PPE前24小时用A1AT和A1AT-SeP2处理的小鼠均显示出显著的保护作用(图12a)。然而，在施用PPE前72小时用A1AT或A1AT-SeP2处理时，A1AT已无法提供足够的保护，而A1AT-SeP2仍然有效抑制肺损伤引起的炎症(图12b)，这表明A1AT-SeP2的抗氧化能力可延长药物在肺部的停留时间。

多肽的聚乙二醇化可降低肾脏清除率并增加其半衰期，并已用于产生长效生物治疗剂。为了评估SeP偶联是否可以产生类似的效果，通过尾静脉注射雌性C57BL小鼠进行单剂量药代动力学研究。如图13所示，与A1AT相比，A1AT-SeP2的半衰期显著延长，提示A1AT-SeP2在长效疗法中的潜力。与PEG类似，可通过控制聚合条件合理设计SeP2的单元数和分子量，以调节偶联蛋白的循环半衰期和抗氧化能力。

发明人还对SeP2进行了初步毒性评估。通过腹膜内注射每周向小鼠给药1mg/kg P(EG4-SeHC)(比药效研究中使用的剂量高2.7倍)，持续4周。没有观察到明显的毒性，聚合物给药组的所有小鼠都表现出与PBS对照组相似的体重，这表明SeP2的潜在生物安全性(图14)。

总之，发明人设计并产生了一类新型的含硒多肽，其强大的抗氧化能力在长效蛋白质疗法中具有极大的潜力。发明人优化了A1AT在大肠杆菌中的表达和纯化，并在A1ATCys232位点特异性偶联SePs。A1AT Cys232处偶联SePs对其抑制NE活性的影响可以忽略不计，但是却能够有效抑制与炎症性肺病(包括COPD、IPF、ARDS和哮喘)相关的氧化剂的活性。体内和小鼠模型上的实验均显示SeP-A1AT偶联物具有强大而持久的抗氧化活性。此外，SePs的偶联显著延长了A1AT的循环半衰期，这有助于其在长效疗法中的开发应用。此外，P(EG4-SeHC)在小鼠中显示出良好的安全性。总之，发明人的研究揭示了使用抗氧化聚合物作为药理成分来增强易氧化生物治疗剂的潜力。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种硒代聚合物，其特征在于，所述硒代聚合物由含有N-羧酸酐的硒代氨基酸通过开环聚合获得；

优选的，所述硒代聚合物由含有N-羧酸酐的硒代氨基酸与含有N-羧酸酐的氨基酸通过开环聚合获得。

2.根据权利要求1所述的硒代聚合物，其特征在于，所述含有N-羧酸酐的硒代氨基酸为硒代蛋氨酸NCA；所述含有N-羧酸酐的氨基酸为肌氨酸NCA；

优选的，所述硒代聚合物的末端具有马来酰亚胺残基；

优选的，所述含有N-羧酸酐的硒代氨基酸还具有侧链，所述侧链选自由低聚乙二醇、低聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇、聚乙二醇单甲醚、N-甲基乙胺、N,N-二甲基乙胺、N,N-二乙基乙胺、乙基三甲基铵盐、丙基三甲基铵盐、乙酸和丙酸组成的组中一种或多种。

3.根据权利要求2所述的硒代聚合物，其特征在于，所述硒代聚合物为P(SeMet)₃-CO-(Sar)₁₀₅或P(EG₄-SeHC)₃₀-b-(Sar)₁₅。

4.如权利要求1至3中任一项所述的硒代聚合物在保护蛋白免受氧化损伤中的应用；优选的，所述蛋白含有游离的硫醇基；更优选的，所述蛋白含有半胱氨酸残基。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述蛋白为酶或抗体；优选的，所述酶为易被氧化的蛋白酶或抗体；更优选的，所述蛋白酶为α-1-抗胰蛋白酶。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述硒代聚合物与所述蛋白偶联；优选的，所述硒代聚合物通过末端的马来酰亚胺残基与所述蛋白的游离的硫醇基偶联。

7.一种抗氧化损伤的蛋白，其特征在于，所述蛋白偶联有如权利要求1至3中任一项所述的硒代聚合物。

8.根据权利要求7所述的蛋白，其特征在于，所述硒代聚合物通过末端的马来酰亚胺残基与所述蛋白的游离的硫醇基偶联；优选的，所述蛋白为易被氧化的蛋白酶或抗体；更优选的，所述蛋白酶为α-1-抗胰蛋白酶。

9.如权利要求7或8所述的蛋白在制备药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，当所述蛋白为α-1-抗胰蛋白酶时，所述药物为丝氨酸蛋白酶抑制剂；

优选的，当所述硒代聚合物为P(SeMet)₃-CO-(Sar)₁₀₅或P(EG₄-SeHC)₃₀-b-(Sar)₁₅，所述抗氧化损伤的蛋白在制备对肺损伤的保护作用的药物中的应用。

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