JP2020055828A - 新規安定型抗体薬物複合体の作製およびその応用 - Google Patents

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Abstract

【課題】低分子薬物の脱離をさせないために、細胞外に十分な安定性を持ち、細胞内に取り込まれた後に断裂型リンカーが適切な条件で断裂し、活性のある低分子薬物を放出する一方で非断裂型リンカーの場合には、活性成分が低分子、リンカーおよび酵素分解によるアミノ酸残基から構成される抗体薬物複合体リンカーを提供する。【解決手段】結合機能を有する新規リンカー（ｌｉｎｋｅｒ、別名：カップリング剤）、リンカー—ペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）中間物の作製方法および開環反応およびリンカー—ペイロード中間物を部位特異的な方式でタンパク質、ペプチドのＣ末端に安定に連接する方法、その複合産物の作製方法、複合産物と薬物と形成された複合体を開示する。【選択図】なし

Description

本発明は生物製薬および生物技術分野に属し、結合機能かつ開環安定構造を有する新規リンカー（linker、別名：カップリング剤）の作製に関する。なお、低分子化合物、核酸、核酸類似物、トレーサーなどとタンパク質、ペプチドのC末端に結合部位特異的に連接す
る方法にも関する。本発明において開発したリンカーおよび連接方法は腫瘍標的治療ADC
薬物、診断薬および特定細胞高指向性薬物の作製に応用可能である。本発明における技術で作製したADC薬物は安定的な開環構造、特定的な薬物負荷および再現性のある薬物動態
データを持ち、従来のADC薬物に存在する安定性問題および異質性問題が解決された。本
発明において、新規抗ヒトErbB2／Her2抗体-マイタンシン誘導体複合体、新規抗ヒトErbB2／Her2抗体-アウリスタチン誘導体複合体の作製およびErbB2／Her2陽性腫瘍標的治療に関する。
抗体薬物複合体（Antibody-Drug Conjugates、ADC）はモノクローナル抗体薬を基に、抗
体の指向性および伝統細胞毒素を重ねた新世代抗腫瘍薬である。2011年にADC薬物Adcetris（brentuximab vedotin）がホジキンリンパ腫治療薬として、2013年にKadcyla（ado-trastuzumab emtansine）が進行性転移性乳がん治療薬として、米国のFDAにより承認された
。2015年4月まで、全世界において約50種類のADC候補薬のＩ、IIまたはIIIステージ臨床
開発が進められている。
ADC薬物の作用メカニズムは下記のように、抗体または抗体類リガンドが細胞表面に発現
する抗原を認識・結合し、低分子薬物とともに細胞内に取り込まれる。更に、抗体が酵素により分解されるか、リンカーが断裂することにより、低分子薬物が適切な活性型に転換され、細胞内に遊離し、ターゲット細胞の死を誘導する。ADC薬物に用いる低分子細胞毒
素の活性が現在臨床に応用されている化学療法治療薬より10−1000倍まで高い。
ADC薬物は抗体（antibody）、リンカー（linker）および細胞毒素（toxin）の三つの部分により構成される。その中で、抗体部分が薬物の作用する細胞種類とターゲット部位を確定する。細胞毒素部分が細胞死の誘導、細胞アポトーシスの誘導または細胞生長抑制作用をもつ化合物である。リンカー部分が抗体と細胞毒素を連接させるために最も重要な部分となり、細胞標的薬物の送達に関わっている。
ADC薬物に用いるリンカーに断裂型と非断裂型の二種類が分けられる。理想的なリンカー
は下記の条件を満たさなければならない。低分子薬物の脱離をさせないために、細胞外に十分な安定性を持つ。また、細胞内に取り込まれた後、断裂型リンカーが適切な条件で断裂し、活性のある低分子薬物を放出する一方、非断裂型リンカーの場合には、活性成分が低分子、リンカーおよび酵素分解によるアミノ酸残基から構成される。
リンカーが抗体と低分子細胞毒素の連接に役立つ。細胞毒素が標的部位に届く前に脱離すれば、正常組織に副作用が引き起こされるとともに、ADC薬物の効果も低下する。よって
、ADC薬物の開発段階では、リンカーとカップリングストラテジーの設計がADC薬物の安定性に極めて重要となり、複合体の生物活性、凝集状態、生物学的利用能、体内分布および代謝に影響を及ぼす。現在市販または臨床開発段階の多くのADC薬物に、リンカーの構造
とカップリングストラテジーが主にSeattle GeneticsとImmunogen社から提供されている
。この二つの会社におけるストラテジーが僅かな異なりがあるにもかかわらず、両社ともチオール（thiol）とマレイミド（maleimide）との反応によって形成されたチオスクシンイミド構造（thiosuccinimide linkage）を利用し、低分子薬物と抗体との連接を行った
（図１）。このカップリング法に反応性が高く、かつ定量可能および温和な反応条件をもつため、広く応用されている（Hermanson GT, Bioconjugate Techniques. 2nd edition, 2008）。しかし、チオスクシンイミド構造の安定性が低く、体内においてほかのチオールと可逆的に置換でき、マレイミド除去反応（maleimide elimination reaction）が起こる。体内にあるシステイン（cysteine）、グルタチオン（glutathione）およびアルブミン
（albumin）の構造に大量なチオールが存在する。これらのチオールがチオスクシンイミ
ド構造にあるスクシンイミドリング（succinimide ring）を認識し、ADC薬物にあるチオ
ールと置換する。この反応の発生は、ADC薬物に抗体と細胞毒素の分解の原因となる（Alley SC etal., Bioconjug. Chem. 2008; Shen BQ etal., Nat. Biotechnol. 30, 184-189,2012; Chudasama VL, etal., Clin. Pharmacol. Ther. 92, 520-527, 2012）。
スクシンイミドに関する化学研究から、チオスクシンイミド構造の加水分解による開環（ring-open hydrolysis）現象が発見された。開環したチオスクシンイミド構造が体内にあるチオールと置換できなくなり（図１、開環反応模式図）、ADC薬物の体内での安定性を
向上させる。従来の化学開環方法にアルカリ性条件処理およびモリブデン酸塩処置などがあるが、（Kalia J, et al, 2007）、これらの反応条件は激しく、タンパク質（抗体）を不可逆的に失活させるため、直接にADC薬物にあるスクシンイミドリングの開環反応に応
用できない。
この問題を解決するため、多くの研究者が多種の解決方法を試してみた。例えば、Genentech社が抗体表面構造から化学特性の適切な部位を細胞毒素結合サイトとしてスクリーニ
ングすることで、チオスクシンイミドの開環加水分解反応を加速した（Shen BQ etal., Nat. Biotechnol. 30, 184-189,2012）。Seattle Genetics社がdiaminopropionic acid（DPR）を介して、リンカー構造のマレイミド（maleimide）の隣接部位に塩基性のアミノ基
を導入することで、チオスクシンイミド構造の加水分解を加速した（Lyon RP etal., Nat
Biotechnol. 2014 Oct;32(10):1059-62; US2013/0309256 A1）。Pfizer社が温和な弱ア
ルカリ性ホウ酸塩緩衝液を用いることで、チオスクシンイミド構造の加水分解を加速した（Tumey LN, et al.，Bioconjugate Chem. 2014, (25):1871-1880）。以上のストラテジ
ーを用い、チオスクシンイミド構造の加水分解を促進することにより、ADC薬物の安定性
を向上させるが、問題点がある。加水分解が抗体と細胞毒素を連接してから行われるため、ADC薬物の作製に複雑な開環操作が導入され、抗体失活のリスクを増大する可能性が考
えられる一方、チオスクシンイミド構造の加水分解は精確に制御できなくなり、品質管理標準の制定が困難となる。
以上のストラテジーでは、抗体にあるシステイン（cysteine）を連接部位として利用して開発された方法である。抗体にあるリシン（lysine）を連接部位として利用し、かつ細胞毒素にチオールが含まれる場合には（例えば、市販薬Kadcylaでは、Immunogen社から提供したDM1分子およびSMCCリンカーを用いた）、細胞毒素が体内に大量なシステイン（cysteine）、グルタチオン（glutathione）およびアルブミン（albumin）にあるチオールと置
換されやすい。現時点ではリンカー構造にあるチオスクシンイミドの開環加水分解反応を促進する方法はなく、細胞毒素の脱落が制御できないため、複合体の使用に危険性がある。
現在主流のカップリング技術は化学方法に基づき、抗体にあるリシンまたはシステインを利用するのが殆どである。抗体のアミノ酸組成にリンカーと化学反応を起こすアミノ酸の数と部位が多いため、実際にADC薬物に抗体と連接した細胞毒素化合物の数と部位が判断
できなくなる。これによるADC薬物が異質性を示し、ADC薬物の質、安定性、有効性、代謝および毒性に影響を及ぼすことになる。例えば、2013年に販売承認済みのADC薬物Kadcylaの説明書に、各抗体分子に連接された細胞毒素化合物の数が0−8であり、平均値ｎは約3.5であることが記載されている。ADC薬物の異質性問題を解決することは、新世代ADC薬物
開発に直面する目標と挑戦となる。
ErbB2 / Her2抗原はヒトが含まれる哺乳類動物に発現する表皮生長因子膜貫通受容体ファミリーの一つであり、約20％の乳がんおよび16％の胃がん細胞表面に高発現していることが報告されている（Slamon et al, 1987, Science, Vol235:177-182）。ヒト化モノクロ
ーナル抗体Trastuzumab（商品名Herceptin）がヒトErbB2 / Her2抗原と特異的に結合性が示され（Kd=5nM）、腫瘍細胞の増殖を抑制することが解明された（Hudziak et al, 1989
，Mol. Cell Biol., Vol9:1165-1172; Lewis et al,1993，Cancer Immuno. Immunother.,
Vol37:255-263; Baselga et al, 1998, Cancer Res., Vol58:2825-2831）。なお、化学
療法より、Herceptin治療がErbB2 / Her2陽性腫瘍患者に顕著な効果を示し、商業的な成
功を取得した。しかし、Herceptinの応用に伴い、一部の患者にHerceptin治療に対する耐性が表れてきた。
本発明は新規機能性リンカー（linker、別名：カップリング剤）、リンカー―ペイロード（payload）中間物の作製方法および開環反応に関する。本発明はリンカー―ペイロード
中間物を部位特異的な方式でタンパク質、ペプチドのC末端に安定に連接する方法および
その複合産物の作製に関する。本発明は複合産物と薬物と形成された複合体に関する。本発明は作製した複合産物または薬物複合体が疾患の予防と治療にかかわる応用に関する。本発明は式（I）、式（II）、式（III）または式（IV）に示す化合物または薬学的に許容されるその塩を提供する。
その中で、PCAはリガーゼが特異的に認識する基質にある配列である。いわゆるリガーゼ
とは二種類の分子を新たな化学結合を介して連接する酵素を指す。ある実施方式では、リガーゼはペプチド転移酵素を指し、天然Sortase酵素および改変型ペプチド転移酵素のみ
が含まれるに限らない。ある実施方式では、Sortase酵素にはSortase AとSortase Bが
含まれる。ある実施方式では、PCAはリガーゼの特異認識配列である。ある実施方式では
、PCAはグリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを少なくとも1個から直列接続して構成される。ある実施方式では、PCAはグリシン及びアラニンの一つまたは多
数からなるユニットを1−100まで直列接続して構成される。好ましくはPCAはグリシン及
びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−50まで直列接続して構成される。特
に好ましくはPCAはグリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−20まで直列接続して構成される。特に好ましくはPCAはグリシン及びアラニンの一つまたは多数
からなるユニットを5個直列接続して構成される。特に好ましくはPCAはグリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを3個直列接続して構成される。
LA1とLA2は連接ドメインであり、aとpは独立に0または１であり、即ち、LA1またはLA2の
有無がaとp値次第となる。LA1はPCAとCCA’との連接部位であり、LA2は‐S-グループとY
との連接部位である。CCA’は化学カップリンクドメインである。
は単結合または二重結合を指す。ある実施方式では、
は単結合を指す。
Yはペイロードであり、核酸配列、短ペプチド配列、ポリペプチド、タンパク質、低分子
化合物、生物物質などから選ばれる。ある実施方式では、Yは核酸配列、核酸類似物、マ
ーカー、ラベルまたは薬物である。ある実施方式では、Yは放射性マーカー、蛍光マーカ
ー、親和性精製マーカー、トレーサーまたは低分子化合物である。ある実施方式では、Y
は細胞毒素である。ある実施方式では、Yはメイタンシンまたはその誘導体、オーリスタ
チン（Auristatins）またはその誘導体、エポチロンまたはその類似物、パクリタキセル
またはその誘導体、ビンブラスチン類化合物である。ある実施方式では、Yはメイタンシ
ンまたはその誘導体である。
ｚは1−1000までの任意の整数である。好ましくは、ｚは1−100、1−50、1−40、1−30、1−20、1−10、1−5までの任意の整数である。
ある実施方式では、本発明が下記に示す化合物を提供する。














その中で、ｎは1−100までの任意の整数である。例えば、ｎは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15または20である。ｍは0または1−1000までの任意の整数である。例えば、ｍは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90または100である。
一方、本発明は一種類または多種類の前記化合物が含まれる組成物を提供し、下記に示す方法で作製する。
A) Y溶液と
溶液とを混合し、インキュベートした後、複合物質
溶液を得る。
または、Y溶液と
溶液とを混合し、インキュベートした後、複合物質
溶液を得る。この条件下、Yに-S-(LA2)pグループが付加される。
または、Y溶液と
溶液とを混合し、インキュベートした後、複合物質
溶液を得る。
または、Y溶液と
溶液とを混合し、インキュベートした後、複合物質
溶液を得る。この条件下、Yに
基が付加される。
B) ステップA)で作製した複合産物
溶液または
溶液に、開環反応を促進するトリスベース溶液を加える。
ある実施方式では、前記ステップによって得られた産物をさらにHPLCで精製する。ある実施方式では、前記ステップによって得られた産物をさらに半調製用HPLCまたは調製用HPLCで精製する。ある実施方式では、前記ステップによって得られた複合産物に式（I）、式
（II）、式（III）または式（IV）が含まれる総量は50％モル比を超える。例えば、60％
モル比、70％モル比、80％モル比、85％モル比、90％モル比、95％モル比、99％モル比またはそれ以上を超える。
なお、本発明は式（V）、式（VI）、式（VII）または式（VIII）に示す化合物または薬学的に許容されるその塩を提供する。
その中で、Aはタンパク質、ペプチド、シグナル伝達因子、細胞増殖因子、免疫グロブリ
ンまたは抗体である。ある実施方式では、いわゆる抗体は組み換え型モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体断片または抗体類似物（Fab、ScFv、minibody、diabody、nanobodyなど）を指す。ある実施方式では、Aは抗ErbB2／Her2抗体。ある実施方式では、式（V）、式（VI）、式（VII）または式（VIII）に示す化合物はHer2受容体発現細胞膜外ドメインを特異的に結合することで、ErbB2／Her2受容体陽性腫瘍細胞の増殖を抑制す
る。
LA1、LA2、LA3はそれぞれ独立的な連接ドメインである。LA1はPCAとCCA’との連接部位であり、LA2は‐S-グループとYとの連接部位であり、LA3はAとFとの連接部位である。LA3はグリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−100まで直列接続して構成される。好ましくはLA3はグリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−50まで直列接続して構成される。特に好ましくはLA3はグリシン及びアラニンの一つまた
は多数からなるユニットを1−20まで直列接続して構成される。特に好ましくはLA3はグリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを5個直列接続して構成される。a、bとpは独立に0または１であり、即ち、LA1、LA2 またはLA3の有無がa、bとp値次第となる。
PCAとFはリガーゼが認識する特異的な認識配列である。いわゆるリガーゼの作用では、PCAはFと特異的に結合する。いわゆるリガーゼに天然Sortase酵素および改変型ペプチド転
移酵素のみが含まれるに限らない。ある実施方式では、Sortase酵素にはSortase AとSortase Bが含まれる。ある実施方式では、Fはリガーゼのドナー基質に特異的な認識配列であり、PCAはリガーゼの受容体基質に特異的な認識配列である。ある実施方式では、Fはリガーゼの受容体基質に特異的な認識配列であり、PCAはリガーゼのドナー基質に特異的な
認識配列である。ある実施方式では、PCAはグリシン及びアラニンの一つまたは多数から
なるユニットを少なくとも1個から直列接続して構成される。ある実施方式では、PCAはグリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−100まで直列接続して構成される。好ましくはPCAはグリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−50まで直列接続して構成される。特に好ましくはPCAはグリシン及びアラニンの一つまたは
多数からなるユニットを1−20まで直列接続して構成される。特に好ましくはPCAはグリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを5個直列接続して構成される。ある
実施方式では、FはLA3を介して、または直接に共有結合により、Aの重鎖または軽鎖のC末端に精確的に連接する。ある実施方式では、FはX1X2X3TX4X5である。その中で、X1はロイシンまたはアスパラギンであり、X2はプロリンまたはアラニンであり、、X3は天然または非天然アミノ酸のうちのいずれか１つであり、Tはスレオニンであり、X4はグリシン、セ
リン、スパラギンまたは存在しない、X5は天然または非天然アミノ酸のうちのいずれか１つまたは存在しない。ある実施方式では、FはLPX3T或いはLPX3TGGである。その中で、Lはロイシンであり、Pはプロリンであり、、X 3は天然または非天然アミノ酸のうちのいずれか１つであり、Tはトレオニンであり、Gはグリシンである。
CCA’は化学カップリンクドメインである。
は単結合または二重結合を指す。ある実施方式では、
は単結合を指す。
Yはペイロードであり、水素、核酸配列、短ペプチド配列、ポリペプチド、タンパク質、
化合物、生物物質などから選ばれる。ある実施方式では、Yは核酸配列、核酸類似物、マ
ーカー、ラベルまたは薬物である。ある実施方式では、Yは放射性マーカー、蛍光マーカ
ー、親和性精製マーカー、トレーサーまたは低分子化合物である。ある実施方式では、Y
は細胞毒素である。ある実施方式では、Yはメイタンシンまたはその誘導体、オーリスタ
チン（Auristatins）またはその誘導体、エポチロンまたはその類似物、パクリタキセル
またはその誘導体、ビンブラスチン類化合物である。ある実施方式では、Yはメイタンシ
ンまたはその誘導体である。
ｚは1−1000までの任意の整数である。好ましくは、ｚは1−100、1−50、1−40、1−30、1−20、1−10、1−5までの任意の整数である。ｄは1−20までの任意の整数である。例え
ば、ｄは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20である。
ある実施方式では、本発明が下記に示す化合物を提供する。





その中で、Abは配列番号1-8に示される配列であり、ｚは1−20までの任意の整数であり、ｎは1−100までの任意の整数であり、ｍは0または1−1000までの任意の整数であり、ｄは1−20までの任意の整数である。LA3はグリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−100まで直列接続して構成される。ｂは独立に0または１であり、即ち、LA3の有無がｂ値次第となる。
一方、本発明は前記化合物が含まれる組成物を提供し、下記に示す方法で作製する。
i) 式（I）、式（II）、式（III）或式（IV）に示す化合物を作製する。
ii) A-（LA3）b-Fを作製する。
iii) リガーゼを加え、ii)で得られたA-（LA3）b-Fを式（I）、式（II）、式（III）或式（IV）に示す化合物と連接する。
ある実施方式では、前記ステップによって得られた複合産物に式（V）、式（VI）、式（VII）または式（VIII）が含まれる総量は50％モル比を超える。例えば、60％モル比、70％モル比、80％モル比、85％モル比、90％モル比、95％モル比、99％モル比またはそれ以上を超える。
なお、本発明は前記化合物または複合産物を用い、動物における細胞の増殖を抑制する方法を提供する。ある実施方式では、動物は哺乳類動物を指す。ある実施方式では、動物はヒトを指す。
なお、本発明は前記化合物が疾病予防と治療に用いる薬物での用途を提供する。ある実施方式では、疾病は腫瘍および自己免疫疾病を指す。ある実施方式では、腫瘍細胞表面に前記化合物または複合産物が認識する抗原または受容体を発現する。ある実施方式では、腫瘍細胞表面に発現する抗原または受容体はErbB2/Her2である。ある実施方式では、腫瘍は乳がん、胃がん、卵巣がん、肺がん、結腸がん、直腸がん、結腸がん、食道がんを指す。
なお、本発明は薬物複合体を提供し、式（V）、式（VI）、式（VII）または式（VIII）に示す化合物または薬学的に許容されるその塩、またはそのベクターを含む。ある実施方式では、薬物複合体は冷凍乾燥粉注射剤または注射液である。
開環反応模式図。 リガーゼの触媒反応による連接技術模式図。 リンカー1の構造（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。 リンカー2の構造（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。 リンカー3の構造（nは1−100までの任意の整数であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。 リンカー4の構造（nは1−100までの任意の整数であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。 リンカー5の構造（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。 リンカー6の構造（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。 リンカー7の構造（nは1−100までの任意の整数であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。 リンカー8の構造（nは1−100までの任意の整数であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。 リンカー1-DM1中間物の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。 リンカー2-DM1中間物の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。 リンカー3-DM1中間物の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。 リンカー4-DM1中間物の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。 リンカー1-DM1中間物の開環構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。 リンカー2-DM1中間物の開環構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。 リンカー3-DM1中間物の開環構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。 リンカー4-DM1中間物の開環構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。 リンカー5-MMAE中間物の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。 リンカー6-MMAE中間物の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。 リンカー7-MMAE中間物の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。 リンカー8-MMAE中間物の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。 リンカー5-MMAE中間物の開環構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。 リンカー6-MMAE中間物の開環構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。 リンカー7-MMAE中間物の開環構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、AとBは異性体である）。 リンカー8-MMAE中間物の開環構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、AとBは異性体である）。 優先的に選んだADC1の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、dは1−20までの任意の整数であり、リガーゼの認識配列LPXTにおけるXはグルタミン酸（E）またはほかの天然/非天然アミノ酸である。Abは抗体であり、LA3は連接ドメインであり、グリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−100まで直列接続して構成される。ｂは独立に0または１であり、即ち、LA3の有無がｂ値次第となる。Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。 優先的に選んだADC2の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、dは1−20までの任意の整数であり、リガーゼの認識配列LPXTにおけるXはグルタミン酸（E）またはほかの天然/非天然アミノ酸である。Abは抗体であり、LA3は連接ドメインであり、グリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−100まで直列接続して構成される。ｂは独立に0または１であり、即ち、LA3の有無がｂ値次第となる。Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。 優先的に選んだADC3の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、dは1−20までの任意の整数であり、リガーゼの認識配列LPXTにおけるXはグルタミン酸（E）またはほかの天然/非天然アミノ酸である。mは0または1−1000までの任意の整数であり、Abは抗体であり、LA3は連接ドメインであり、グリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−100まで直列接続して構成される。ｂは独立に0または１であり、即ち、LA3の有無がｂ値次第となる。Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。 優先的に選んだADC4の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、dは1−20までの任意の整数であり、リガーゼの認識配列LPXTにおけるXはグルタミン酸（E）またはほかの天然/非天然アミノ酸である。mは0または1−1000までの任意の整数であり、Abは抗体であり、LA3は連接ドメインであり、グリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−100まで直列接続して構成される。ｂは独立に0または１であり、即ち、LA3の有無がｂ値次第となる。Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。 優先的に選んだADC5の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、dは1−20までの任意の整数であり、リガーゼの認識配列LPXTにおけるXはグルタミン酸（E）またはほかの天然/非天然アミノ酸である。Abは抗体であり、LA3は連接ドメインであり、グリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−100まで直列接続して構成される。ｂは独立に0または１であり、即ち、LA3の有無がｂ値次第となる。Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。 優先的に選んだADC6の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、dは1−20までの任意の整数であり、リガーゼの認識配列LPXTにおけるXはグルタミン酸（E）またはほかの天然/非天然アミノ酸である。Abは抗体であり、LA3は連接ドメインであり、グリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−100まで直列接続して構成される。ｂは独立に0または１であり、即ち、LA3の有無がｂ値次第となる。Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。 リンカー2-DM1中間物(n=3、閉環)におけるUPLC解析結果。 リンカー2-DM1中間物(n=3、閉環)における質量分析解析結果。 リンカー2-DM1中間物(n=3、閉環)開環反応のプロセス。A、B、C、DとEはそれぞれ開環反応が20分、40分、60分、2時間、4時間まで進行するUPLCの解析結果。 リンカー2-DM1中間物（n=3、開環）におけるUPLC解析結果。 リンカー2-DM1中間物(n=3、開環) における質量分析解析結果。 ADC薬物GQ1001におけるSDS-PAGE解析結果。 ADC薬物GQ1001 軽鎖におけるエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）解析結果。 A、軽鎖の質量分析図；B，ProMass 2.8 ソフトで計算した畳み込みを除いた軽鎖における相対分子量（25281）。 ADC薬物GQ1001におけるHIC-HPLC解析結果。 ADC薬物GQ1001におけるSEC-HPLC解析結果。 ADC薬物GQ1001はBT474細胞表面受容体ErbB2/Her2に対する結合親和性。 ADC薬物GQ1001はSK-BR-3細胞表面受容体ErbB2/Her2に対する結合親和性。 GQ1001、Kadcyla、Herceptin、DM1のMCF-7細胞増殖に対する影響。 GQ1001、Kadcyla、Herceptin、DM1のMDA-MB-468細胞増殖に対する影響。 GQ1001、Kadcyla、Herceptin、DM1のBT-474細胞増殖に対する影響。 GQ1001、Kadcyla、Herceptin、DM1のSK-BR-3細胞増殖に対する影響。 GQ1001、Kadcyla、Herceptin、DM1のHCC1954細胞増殖に対する影響。 GQ1001、Kadcyla、DM1のSK-OV-3細胞増殖に対する影響。 GQ1001、Kadcyla、Herceptin、DM1のNCI-N87細胞増殖に対する影響。 ラットにGQ1001またはKadcylaを単回尾静脈投与による薬物動態学分析。SDラットにGQ1001（10mg/kg）またはKadcyla（10mg/kg）を尾静脈により投与し、ELISAでラット血中総ADC薬物濃度を測定した。 ADC薬物GQ1001はHCC1954 移植ヌードマウスに対する腫瘍増殖抑制（n=10、Mean ± SEM.）。 ラットにGQ1001またはKadcylaを単回尾静脈により投与した後の体重変化。健康成年雌性ラットにGQ1001（6、60mg/kg）またはKadcyla（60mg/kg）を単回尾静脈により投与した。GQ1001投与群にラットの体重変化は溶媒投与群と比べ有意な差は示されなかった（P>0.05）。Kadcyla投与群にラットの体重は顕著に減少したことを発見した（P<0.05 vs Vehicle）。 ラットにGQ1001またはKadcylaを単回尾静脈により投与した後のALTとAST変化。健康成年雌性ラットにGQ1001（6、60mg/kg）またはKadcyla（60mg/kg）を単回尾静脈により投与した。GQ1001投与群にラット血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）濃度およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）濃度は溶媒投与群と比べ有意な差は示されなかった（P>0.05）。Kadcyla投与群にラット血中ALTおよびAST濃度は顕著に上昇したことを発見した（P<0.05 vs Vehicle）。 リンカー5-Mc-Val-Cit-Pab-MMAE薬物中間体（n=3）開環反応液におけるHPLC解析結果。 リンカー5-Mc-Val-Cit-Pab-MMAE薬物中間体（n=3）開環反応液におけるMALDI-TOF質量分析解析結果。
本発明は改良したカップリングシステムを提供し、ADC薬物においてリンカーの安定性と
異質性の問題を解決する。本発明に提供した解決案は核酸ターゲット薬物の作製および診断用トレーサーの作製に応用できる。本発明にはリンカーとその作製方法、リンカー―細胞毒素中間物（Linker−Payload intermediate）とその作製方法、開環安定構造リンカー―細胞毒素中間物とその作製方法が含まれる。本発明には遺伝子工学的手段で改良したHerceptinまたはほかの抗ヒトErbB2 ／Her2抗体（Ab）、リンカー（Linker）および修飾さ
れたメイタンシンまたはその誘導体、オーリスタチン（Auristatins）またはその誘導体MMAEをLDC技術プラットフォームでカップリングすることによって形成した新世代ADC薬物
およびその作製方法と応用が含まれる。
本発明は特定なリガーゼ触媒カップリング技術（Ligase dependent conjugation, LDC）
を用い、ADC薬物の作製を行う（図2に示す）。ここで、リガーゼはペプチド転移酵素を指し、天然Sortase酵素（A、B、C、D、L. PlantarumのSortase、詳細はUS20110321183A1に
参照）および改変型ペプチド転移酵素のみが含まれるに限らない。カップリング反応は生
物触媒反応によって実現される。その反応条件は温和のため、カップリング反応中に抗体に対する物理的および化学的な損傷が減少される。なお、作製プロセスは改良され、産業化のアップグレードが可能となり、ADC薬物の質量を管理できる。
LDC技術の核心的メリットは生物酵素による触媒を利用し、ワンステップでリンカー―細
胞毒素中間物を効率的に抗体の特定部位にカップリングさせ、ADC薬物の均質性を保証す
ることである。リンカー―細胞毒素中間物の作製中にスクシンイミドリングの開環反応をさせるため、抗体に対する影響を回避できる。この方法は二つのメリットを持つ。一つに、開環反応は低分子化合物の状態で行われるため、その加水分解の反応条件は抗体と細胞毒素とカップリングした後に加水分解をさせる条件より多様性があり、抗体が失活する可能性はなくなる。二つに、たとえリンカー―細胞毒素中間物におけるスクシンイミドリングの開環反応が不十分な場合があるとしても、HPLCなどの分離方法で開環された産物と開環されていない産物を分離でき、純度の高い開環産物を得ることができる。
本発明はチオスクシンイミド構造を持つADC薬物、核酸ターゲット薬物およびトレーサー
の作製に適用する。
1. リンカー（linker）
本発明は、一連の双官能リンカーを提供する。前記双官能リンカーは、タンパク質結合部位（Protein Conjugation Area，PCA），リンカー部位（Linker Area, LA）および化学結合部位(Chemical Conjugation Area, CCA)の三つの部分からなり、以下の式で表す。
PCA−(LA1)a−CCA
その中で、PCAはSortase A酵素の受容体基質であり、ポリグリシン（Gly）配列 Gn（通常、nは1−100）のみが含まれるに限らない。ここで、C−末端アミノ酸のα−カルボキシル基がLAに結合する。また、PCAはほかのSortase酵素または改良された酵素の受容体基質であってもよい。例えば、ポリアラニン（Ala）配列やポリグリシン/アラニンの共重合体配列などが挙げられる。
LA1はPCAとCCAを連接する部位であり、aは0または1である。即ち、LA1の有無がa値次第となる。LA1の構造は下記の式に示す。





その中で、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9 またはR10は下記の残基の中に任意の一つでもよい。RはH、炭素数１−６の直線状アルキル基、炭素数３−６の分岐状もしくは環状のアルキル基、炭素数２−６の直線状、分岐状もしくは環状のアルケニル基またはアルキニル基、陰イオンまたは陽イオン荷電置換基のいずれかとなる。陰イオンにSO3-、X-SO3-、OPO32-、X-OPO32-、PO32-、X-PO32-またはCO2-などが含まれ、陽イオンに含窒素複素
環、N+R11R12R13、X-N+R11R12R13またはフェニル基が含まれる。その中で、R11、R12 ま
たはR13は下記の残基の中に任意の一つでもよい。RはH、炭素数１−６の直線状アルキル
基、炭素数３−６の分岐状もしくは環状のアルキル基のいずれかとなる。
α、βとγは0または1−4までの任意の整数である。
Bはフェニル基または置換フェニル基である。置換基は炭素数１−６の直線状アルキル基
、炭素数３−６の分岐状もしくは環状のアルキル基、陰イオンまたは陽イオン荷電置換基のいずれかとなる。陰イオンにSO3-、X-SO3-、OPO32-、X-OPO32-、PO32-、X-PO32-またはCO2-などが含まれ、陽イオンに含窒素複素環、N+R11R12R13またはX-N+R11R12R13が含まれる。Xは前述と同様であり、ｙは0または1であり、Pは式(OCH2CH2)zに任意のポリグリコールユニットであり、ｚは0または1−1000までの任意の整数である。
本発明に、LA2はLA1と同様な定義を有するか、天然アミノ酸または非天然アミノ酸がアミド結合により形成されたペプチドまたはペプチド類似物となるか、または上記に二種類の定義の組み合わせとなる。LA3にグリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニッ
トを1−100まで直列接続して構成される。
CCAは、CCA’と適切な官能基を有し、アミド結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、ペプチド結合、ヒドラゾン結合、エステル結合、エーテル結合又はウレタン結合により、低分子化合物、核酸分子、トレイサー分子などと共有結合する。好ましく、化学基は第一級アミンとの反応に適するN-スクシンイミジルエステル、N-スルホスクシンイミジルエステル、チオール基との反応に適するマレイミド基、チオール基と反応することによってジスルフィド結合の形成に適するピリジルジチオ基、チオール基との反応に適するハロアルキル基（alkylhalide）またはハロアセチル基（haloacetyl）、ヒ
ドロキシ基との反応に適するイソシアナート基（isocyanate)のみが含まれるに限らない
。
好ましく、本発明にリンカーのCCA1 にペプチド配列（α-アミノ基とカルボキシル基との縮合反応により形成されるアミド結合）が含まれ、その中に必数1−100までのリジン（Lysine）が含まれる。また、このペプチドにおいては、N-末端アミノ酸のα-アミノ基とLA
（または直接にPCA）とアミド結合を形成する。希望する結合数に応じて、リジンのε−
アミノ基は、適切な二官能性架橋剤（Heterobifunctional cross-linkers）を介して、直接にマレイミド基という官能基を導入することができる。一方、ε−アミノ基は、他のリジンのα−カルボキシル基とアミド結合を形成することによって、分岐鎖を形成し、さらに、分岐鎖リジンのαーアミノ基及びεーアミノ基は、適切な二官能性架橋剤を介して、直接にマレイミド基という官能基を導入することができる。このように繰り返すことで、主鎖リジンの数と分岐鎖リジンの分岐鎖構造を増加することにより、このCCA1分子に導入される官能基数は、1〜1000に至ることができる。好ましく、マレイミド基官能基を導入
する二官能性架橋剤は下記のもののみが含まれるに限らない。二官能性架橋剤としては、スクシンイミジル-4-[N-マレイミドメチル]-シクロヘキサン-1-カルボキシラート(N-Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate,SMCC)、SMCC の「長鎖」類似物であるN-(α-マレイミドアセトキシ)スクシンイミド(N-[alpha-maleimidoacetoxy]Succinimide ester, AMAS)、N-(4-マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド(N-gamma-Maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester，GMBS)、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(3-MaleiMidobenzoic acid N-hydroxysucciniMide ester,MBS)、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(6-maleimidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester,EMCS)、４−（４−マレイミドフェニル）酪酸 Ｎ−ス
クシンイミジル( N-SucciniMidyl 4-(4-MaleiMidophenyl)butyrate,SMPB)、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエー(Succinimidyl 6-[(beta-m
aleimidopropionamido)hexanoate, SMPH]、6-[[4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキシル]
カルボキサミド]ヘキサン酸 N-スクシンイミジル(Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxy-(6-amidocaproate), LC-SMCC)、11-マレイミドウンデカン酸 N-
スクシンイミジル(N-Succinimidyl 11-(maleimido)undecanoate, KMUS) 等のマレイミド
基を含む架橋剤、N-ヒドロキシスクシンイミジル-（ポリエチレングリコール）n -マレイミドを含む二官能性架橋剤（SM（PEG）n）などが挙げられる。ここで、nは、2、4、6、8
、12または24個のポリエチレングリコール（PEG）単位を示す。
上記のようなリンカーには、図3−6に示す分子例が好ましいが、この分子例のみに限らない。上記のリンカー1、2、3、4はマレイミド構造を有し、メルカプト基が含まれる、すべての化合物（下記のペイロードを参照）と速やかに結合でき、スルホスクシンイミジル構造を形成する。
本発明に好ましいCCA2にシステイン（Cysteine）配列（システインの数は1−100まで、α-アミノ基とカルボキシル基との縮合反応によりアミド結合が形成される）が含まれ、N-
末端システインのα-アミノ基がLA（又は直接にPCA1）とアミド結合が形成され、分岐鎖
にあるメルカプト基がマレイミド官能基を含む分子と結合する。
上記のようなリンカーには、図7−10に示す分子例が好ましいが、この分子例のみに限ら
ない。
本発明に係るリンカーは、Fmoc化学に基づき、標準のペプチド固相合成法により合成されるものである。具体的な方法は下記に示されている。
（１）樹脂の選択
リンカーのC末端アミノ酸残基はアミド基の配列合成にはRink amide-MBHA Resinを用い、C末端アミノ酸残基はカルボキシル基の配列合成にはワング樹脂(Wang resin)を用いる。
（２）樹脂の膨潤
反応用の樹脂の使用量は、合成の目標モル数に基づいて算出されるものである。この樹脂をDCMで浸漬済みのカラムに移し、DCMで二回洗浄した後に、DCM溶液に十分膨潤になるま
で３０分間浸漬する。
（３）Fmocの脱保護
20%ピペリジンが含まれるDMF溶液を用い、窒素ガスの保護で10分間反応させる。濾過により除去した後に、再び上記の溶液を加え、５分間反応させる。DCMで二回洗浄し、さらにDMFで三回洗浄した後に、ニンヒドリン法で検出された樹脂の色は、赤褐色あるいは濃い青色になるはずである。
（４）アミノ酸の結合
目標モル数2−4倍量の縮合反応をさせるアミノ酸をDMFに溶解する。適量の縮合剤DICあるいはHBTUを加え、5分間活性化させる。得られる溶液をカラムに移し、窒素ガスの保護で2時間反応させる。ニンヒドリン法で樹脂の色を検出し、無色に近づくまで上記の反応を繰り返す。その後、DCMで二回洗浄し、さらにDMFで三回洗浄をする。
（５）すべてのアミノ酸を連接したままでステップ（３）、（４）の操作を繰り返す。最後に連接されたアミノ酸にBoc保護を行う。
（６）分岐鎖SMCCまたはほかの二官能性分子との結合
Lys分岐鎖保護基の違いによって、脱保護の方法は異なる。例えば、触媒水素化処理法でZを脱離し、ヒドラジン水和物を用いivDdeを脱離する。その後、活性化されたSMCCまたは
ほかの二官能性分子を直接に結合させる。さらなる分岐鎖修飾はない場合には、反応を終了させる。
（７）樹脂の処理と切断
反応が終了した後に、窒素ガスで樹脂複合物を乾燥させ、10ml/g樹脂の量に基づいて、TFA/phenol/H20/EDT/TIS (85/5/5/3/2)の割合で切断液を加え、窒素ガスの保護で攪拌しな
がら0-5℃で２時間反応をさせる。濾過を行い、濾液に体積３０倍の氷冷したエチルエー
テルに入れ、冷蔵庫に２時間放置した。遠心分離によって沈澱物を回収し、凍結乾燥で粗ペプチドを得る。
（８）純化と質量分析
粗ペプチドを適切な割合のアセトニトリル水溶液に溶解し、逆相クロマトグラフィーで必要な純度まで精製した後、MSによりその分子量が理論値と一致か否かを確認する。
2．ペイロード（payload）
本発明におけるペイロード（payload）は低分子化合物、核酸、核酸類似物、トレーサー
（caged放射性核種および蛍光分子など）などが含まれ、低分子化合物には、好ましく細
胞毒素がよく使われている。
前記細胞毒素に、パクリタキセル及びその誘導体、マイタンシン及びその誘導体、オーリスタチン（Auristatins）及びその誘導体、エポチロン及びその誘導体、combretastatin A-4 phosphate、Combretastatin A-4及びその誘導体、インドール-スルフ類化合物、ビンブラスチン(Vinblastine)、ビンクリスチン(Vincristine)、ビンデシン(Vindesine)、ビ
ノレルビン(Vinorelbine)、 ビンフルニン(Vinflunine)、ビングリシナート(Vinglycinate)、 アンヒドロビンブラスチン(anhy-drovinblastine)のようなビンカアルカロイド、Dolastatins 10及びその類似物、ハリコンドリンB、eribulin、インドール-3-オキサリルアミド化合物、置換インドール-3-オキサリル、ポドフィロトキシン類化合物、7‐ジエチルアミノ‐3‐（2’‐ベンゾオキサゾリル）クマリン（DBC）、Discodermolide、Laulimalide、カンプトテシン及びその誘導体、ミトキサントロン、ミトキサントロングアニジンヒドラゾンのようなDNAトポイソメラーゼ阻害剤、クロラムブシル、クロルナファジン、胆
汁酸リン酸アミド、エストラムスチン、イホスファミド、窒素マスタード、塩酸酸化窒素マスタード、メルファラン、新窒素マスタード、フェナメット、フェニルアラニンマスタードコレステロール、ニムスチン、トロホスファミド、ウラムスチンのようなナイトロジェンマスタード類、カルムスチン、ストレプトゾトシン塩素尿素、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンのようなニトロソウレア類、アルケン抗生物質、ジネマイシン、エスペランスマイシン、ネオカルジノスタチン、アクラマイシン、チノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、チノマイシンC、カラビシン、イ
ダルビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、カルビシン、アントラマイシンD、
ダウノルビシン、ドキソルビシン、6-ジアゾ5-オキソ-L-ノルロイシン、アドリアマイシ
ン、エピルビシン、エソルビシン、イダマイシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、アイロンアドリアマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、tuberculocidin、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンのような抗生物質、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート、エダトレキサートのような葉酸類似物、フルダラビン、6‐メルカプトプリン、チアミ
プリン、チオグアニンのようなプリン類似物、アンシタビン、ゲムシタビン、エノシタビン、アザシチジン、6‐アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ツーデオキシウリジ
ン、ドキシフルリジン、フルオロウリジンのようなチアゾール類似物、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン類、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのようなアンチアドネラル類、T-2毒素、verracurin A、bacillosporin、アングイジンのようなTricothecene類、ベンゾデパ、カルボコン、メツレデパ、ウレデパのようなアジリジニウム類、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、エトポシドのようなプラチナ類似物、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、酢酸リュープロリド、ゴセレリンのようなアンチアンドロゲン類、タンパク質キナーゼ及びプロテアソーム阻害剤などが含まれる。
本発明に関わる細胞毒素には、メイタンシン及びその誘導体DM1、DM4、オーリスタチン（Auristatins）誘導体MMAE、MMAF、MMADなどが好ましい。
3．リンカー―細胞毒素中間物（Linker-toxin intermediate）及び開環反応
上記のような、CCA1が含まれるリンカーには、マレイミドリング構造が含まれ、メルカプト基が含まれる分子とスルホスクシンイミジルアミン構造を形成する。メルカプト基を含む分子に低分子化合物、短ペプチド、ポリペプチド、模倣ペプチド、タンパク質、核酸および核酸類似物などが挙げられる。上記カップリング中間物をスクシンイミドリングの開環条件に従って処理し、安定性の高い開環構造を有する中間物を形成する。その構造式は下記に示す。
PCA-(LA1)a-CCA1open−Y
その中で、CCA1open−Yの構造は下記に示す構造が含まれる。
スクシンイミドリングはメルカプト基と連接すると、スルホスクシンイミジルアミン異性体が形成されることが報告されている。開環されたスルホスクシンイミジルアミン構造も異性体が存在する（式（IX）及び式（X）に示す）が、活性に対する影響は及ぼさない。
本発明に用いるリンカー1、2、3または4分子の溶液を細胞毒素メイタンシン誘導体DM1と
混合し、スルホスクシンイミジルアミン構造が含まれるリンカー―DM1中間物を形成する
。構造式は図11−14に示す。本発明に用いるリンカー1、2、3または4は細胞毒素DM1と連
接された後、開環反応によって図15−18に示す分子が得られる。開環反応は下記に示す条件で処理するのみに限らない。0.1-0.5M Lys、0.1-0.5M Arg、0.1-0.5M Tris Base、0.1-0.5M炭酸水素ナトリウム、0.1-0.5M炭酸ナトリウム、0.1-0.5M ホウ酸ナトリウムで、室
温に2-12時間反応する。上記に示す条件に従って、開環効率は10％、20％、30％、50%、60％、70％、80％、90％またはほぼ100％に達する。実施例にリンカー―DM1中間物（ｎ＝3）の開環を例として、その作製の流れを説明する。
重要なことに、マレイミドリングの開環反応の効率に関わらず、半調製用／調製用HPLCまたはほかの分離手段で開環中間物の精製ができ、抗体との連接への応用を保証する（実施例に参照）。
上記のような、CCA2が含まれるリンカーには、メルカプト基が含まれ、マレイミドが含まれる分子とスルホスクシンイミジルアミン構造を形成する。マレイミドを含む分子に低分子化合物、短ペプチド、ポリペプチド、模倣ペプチド、タンパク質、核酸および核酸類似物などが挙げられる。上記カップリング中間物をスクシンイミドリングの開環条件に従って処理し、安定性の高い開環構造を有する中間物を形成する。その構造式は下記に示す。PCA-(LA1)a-CCA2open−Y
その中で、CCA2open−Yの構造は下記に示す構造が含まれる。
スクシンイミドリングはメルカプト基と連接すると、スルホスクシンイミジルアミン異性
体が形成されることが報告されている。開環されたスルホスクシンイミジルアミン構造も異性体が存在する（式（XI）及び式（XII）に示す）が、活性に対する影響は及ぼさない
。
本発明に用いるリンカー5、6、7または8をMC-VC-PAB-MMAEと連接し、スルホスクシンイミジルアミン構造が含まれるリンカー―MMAE中間物を形成する。構造式は図19−22に示す。本発明に用いる細胞毒素はMMAEのみに限らない。本発明に用いるリンカー5、6、7または8は細胞毒素MMAEと連接された後、開環反応によって図23−26に示す分子が得られる。開環反応は下記に示す条件で処理するのみに限らない。0.1-0.5M Lys、0.1-0.5M Arg、0.1-0.5M Tris Base、0.1-0.5M炭酸水素ナトリウム、0.1-0.5M炭酸ナトリウム、0.1-0.5M ホウ
酸ナトリウムで、室温で2-12時間反応する。上記に示す条件に従って、開環効率は10％、20％、30％、50%、60％、70％、80％、90％またはほぼ100％に達する。実施例13にリンカー―MMAE中間物（ｎ＝3）の開環を例として、その作製の流れを説明する。
重要なことに、マレイミドリングの開環反応の効率に関わらず、半調製用／調製用HPLCまたはほかの分離手段で開環中間物の精製ができ、抗体との連接への応用を保証する。
4．抗体（Ab）
本発明に関わる抗体は組み換え型モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体断片および抗体類似物（Fab、ScFv、minibody、diabody、nanobodyなど）を指す。
本発明に関わる抗体はエンジニアリング技術で改変された抗体であり、重鎖および／または軽鎖のC末端にリガーゼが認識する配列が修飾されている。リガーゼはペプチド転移酵
素を指し、天然Sortase酵素（A、B、C、D、L. plantarumのSortaseなど、特許US20110321183A1に参照）および改変型ペプチド転移酵素のみが含まれるに限らない。リガーゼの認
識サイトはStaphylococcus aureusに発現するSortase A酵素の認識する配列（LPXTG）に
由来する。Xは天然または非天然アミノ酸を指す。リガーゼの認識サイトは別のタイプのSortase酵素の認識配列（Staphylococcus aureusに発現するSortase BはNPQTN、Bacillus anthracisに発現するSortase BはNPKTG、Streptococcus pyogenesに発現するSortase AはLPXTG、Streptomyces coelicolorに発現するSortase subfamilyはLAXTG、Lactobacillus plantarumに発現するSortaseはLPQTSEQである）にも由来する。リガーゼ認識サイトはス
クリーニングによって得られた改良ペプチド転移酵素の認識サイトにもなる。
本発明に関わる抗体はエンジニアリング技術で更なる改変された抗ヒトErbB2／HER2抗体
であり、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体断片および抗体類似物（Fab、ScFv、minibody、diabody、nanobodyなど）から選択することである。抗ヒトErbB2／HER2抗体は細胞表面に発現するErbB2／HER2受容体の細胞外領域に特異的に結合し、in vitroおよびin vivo実験では、Her2受容体高発現する腫瘍細胞の増殖を抑制することが解明
されている。
本発明はHerceptin / Trastuzumabに基づいて改良された抗ヒトErbB2／HER2抗体を用いる。軽鎖（light chain，LC）には野生型（LC）、C末端にリガーゼ認識配列LPETGGが修飾された軽鎖（LCCT）およびC末端に連接配列Gly-Alaさらにリガーゼ認識配列LPETGGが修飾された軽鎖（LCCTL）の三種類が含まれる。重鎖（heavy chain，HC）には野生型（HC）、C
末端にリガーゼ認識配列LPETGGが修飾された重鎖（HCCT）およびC末端に連接配列Gly-Alaさらにリガーゼ認識配列LPETGGが修飾された重鎖（HCCTL）の三種類が含まれる。上記の
重鎖および軽鎖の組み合わせから3種類の抗体が合成でき、それぞれ種類の組み合わせか
ら8種類の抗体が合成できる。アミノ酸残基の配列はアミノ酸配列表に参照する。
5．ADC薬物の作製および品質管理
従来の化学方法で作製するADC薬物に連接部位の確定は難しく、産物のDAR（Drug Antibody Ratio）の分布範囲が広く、異質性があり、更なる純化は不可能などの欠点が存在する
。本発明に作製するADC薬物は部位特定連接との特徴を持つ。
1）作製方法
ステップ1：前記に記載した方法で式（I）、式（II）、式（III）および式（IV）に示す
リンカー―細胞毒素開環中間物を作製する。マレイミドリングの開環反応の効率に関わらず、半調製用／調製用HPLCまたはほかの分離手段で開環中間物の分離および精製をすることができる。
ステープ2：エンジニアリング技術で改変された、リガーゼ認識配列が含まれる組み換え
抗体をCHO細胞またはほかの哺乳類細胞培養システムを用いて発現させる。
ステープ3：組み換え抗体（または抗体類似物）とリンカー―細胞毒素開環中間物を連接
する。軽鎖および／または重鎖のC末端にリガーゼ特異認識配列を含む組み換え抗体とリ
ンカー―細胞毒素開環中間物をリガーゼ（またはリガーゼグループ）の触媒反応を介して連接する。
抗体とリンカー―細胞毒素開環中間物をリガーゼの触媒反応を介して連接し、数種類のADC薬物を得ることができる（図27−32に示し、実施例を参照）。
2）ADC薬物の構造分析
本発明におけるADC薬物が多種の方法で分析される。反応効率がSDS-PAGEにより分析され
、分子の構造がエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）により分析され、DAR分
布が疎水高速液体クロマトグラフィー（HIC-HPLC）により測定され、抗体凝集程度が分子サイズスクリーニング高速液体クロマトグラフィー（SEC-PAGE）により分析される。
6．ADC薬物の活性分析
1）ADC薬物の腫瘍細胞表面特定抗原との結合及び親和力の測定
本発明にADC薬物が腫瘍細胞表面特定抗原に結合する親和力の測定方法を提供し、腫瘍細
胞表面特定抗原または受容体に効率的に結合するADC薬物をスクリーニングする。例えば
、ADC候補薬物であるGQ1001を乳がん細胞と混合培養し（10−60min）、FACSでADC候補薬
物であるGQ1001と乳がん細胞表面受容体ErbB2/Her2との結合親和性を測定する。その結果、本発明に用いられるリンカーおよび連接法で作製したADC薬物であるGQ1001が細胞表面
受容体ErbB2/Her2に特異的に認識し、その親和力がHerceptinと同程度であることが分か
り、本発明に用いられるリンカーおよび連接法は抗体の活性に対する影響が少ないことが提示されている。
2）ADC薬物の腫瘍細胞増殖抑制作用
候補ADC薬物の腫瘍細胞（ErbB2/Her2高発現腫瘍細胞）に対する増殖抑制作用を確認する
ため、本発明は下記の方法で候補ADC薬物の細胞毒性または細胞増殖抑制活性を測定する
ことになる。ターゲット抗原または受容体発現哺乳類細胞（例えばErbB2/Her2高発現または低発現腫瘍細胞）に候補ADC薬物を加え、12−120hr培養してから、CellTiter Glo法で
細胞生存率を測定する（viability）。
実施例の一つとして、ヒト乳がん細胞（BT474、HCC1954、SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-468）、ヒト卵巣がん細胞（SK-OV-3）、ヒト胃がん細胞（NCI-N87）にADC薬物GQ1001を加え、12−120hr培養してから、CellTiter Glo法で細胞内のATP量を測定した。ATP量の変化によ
って、細胞生存率に換算した。その結果、GQ1001はErbB2/Her2高発現腫瘍細胞の増殖を特異的に抑制することがわかった。
3）ラット体内での代謝および安定性
ラットに候補ADC薬物を5-50 mg/kg尾静脈投与を行い、各時間点で採血し、ELISA法で血清中の候補ADC薬物濃度を測定する。実施例の一つとして、SDラットにADC薬物GQ1001またはKadcylaの尾静脈投与を行い、投与1時間から28日までの各時間点で採血し、ELISA法で血
清中のGQ1001またはKadcyla濃度を測定した。その結果、各時間点で、GQ1001またはKadcylaのラット体内における濃度に変化は認められなかった。
4）ADC薬物の体内薬効
本発明において、腫瘍細胞を移植するヌードマウスモデルを作製し、候補ADC薬物の抗腫
瘍作用を検討する。実施例の一つとして、ヒト乳がん細胞を移植するヌードマウスモデルを作製し、0.5-50 mg/kg のADC薬物GQ1001の尾静脈を通しての単回投与を行い、腫瘍のサイズを測定した。その結果、0.5-50 mg/kg のADC薬物GQ1001の単回投与では、ErbB2/Her2高発現腫瘍細胞の増殖が顕著に抑制された。
5）げっ歯類動物に対する毒性
本発明はラットを用い、候補ADC薬物の急性毒性を評価した。雌性Sprague-Dawleyラット
に高用量（60mg/kgまたはその以上）の候補ADC薬物を投与し、ラットの体重、症状、血液学、臨床生化学と組織病理学などの指標を通して、候補ADC薬物の毒性を評価した。その
結果、ADC薬物GQ1001のラットに対する毒性は同濃度（60mg/kg）のKadcylaより低いこと
を発見した。
用途
本発明は特殊なリンカーを提供する。これらのリンカーはタンパク質、特に抗体と低分子化合物、ペプチド、核酸、トレーサーなどとの連接に応用でき、研究、臨床診断および治療に用いられる複合体の作製に関わっている。
本発明が提供するリンカーは低分子化合物と抗体との精確的な連接に応用でき、均質性の高いADC薬物の作製を求める。本発明は上記リンカーを用い、細胞毒素、特にメイタンシ
ンおよびその誘導体と抗ヒトErbB2/Her2抗体と精確的に連接することによって作製されたADC薬物を提供する。
本発明におけるADC薬物は多種類の疾病または障害（例えば、腫瘍、自己免疫疾患）に対
する治療に応用する。ADC薬物が腫瘍細胞表面特定抗原または受容体に特異的に結合した
後、ADC薬物に複合されている細胞毒素が細胞に取り込み、細胞毒性を示す。
本発明に提供する抗ヒトErbB2/Her2抗体と細胞毒素と形成されたADC薬物GQ1001は腫瘍細
胞に発現するErbB2/Her2と特異的に結合し、ErbB2/Her2高発現腫瘍細胞に障害性を示し、各種のErbB2/Her2陽性腫瘍を治療することができる。腫瘍には乳がん、胃がん、肺がん、卵巣がんなどが含まれるのみに限らない。
［発明の効果］
1）本発明が提供するリンカーは各種タンパク質、特に抗体と低分子化合物、ペプチド、
核酸、蛍光トレーサー、インディケーターなどとの精確的な連接に応用できる。連接条件は温和であり、生物分子に対する活性に影響を及ぼさず、応用範囲が広い。
2）本発明が提供するリンカーにスクシンイミド開環構造を有し、閉環構造より、哺乳類
動物体内での安定性が高い。また、連接された細胞毒素は体内に存在するシステイン、グルタチオンまたはアルブミンとメルカプト基置換反応を起こしにくい。このリンカーを用いて作製するADC薬物は体内での安定性が高く、ADC薬物の低分子が脱離しやすい問題点が解決された。
3）本発明が提供するADC薬物は精確カップリング複合体であり、均質性が高い。伝統的な化学カップリング複合体と比べ、本発明が提供するADC薬物は品質管理と薬物安全性の面
で改善され、ADC薬物の異質性問題点が解決された。
実施例を挙げることによって、本発明を説明する。下記の実施例は本発明を説明する目的で挙げられ、本発明の範囲を制限するわけではない。
注釈がなければ、本発明で使用する専門用語は本領域研究者が理解する専門用語と同じ意味を指す。なお、記載された内容と類似または同等の方法および材料は本発明の方法に応用できる。本発明に用いる実施方法および材料について例示のみに用いられる。
実施例1：抗ヒトErbB2/Her2抗体T-LCCTL-HCの作製、精製およびアッセイ
1）抗体T-LCCTL-HCの作製
SEQ ID No.1 抗体T-LCCTL-HC配列が組み込まれたプラスミドをCHO細胞に導入し、T-LCCTL-HC発現量の高い細胞をスクリーニングした。Trastuzumabの培養方法に基づき、5−10Lスケールで培養を行い、上清を回収した。
2）抗体T-LCCTL-HCの精製
MabSelect親和性クロマトグラフィー法およびSepharoseS陽イオン交換クロマトグラフィ
ー法を用い、T-LCCTL-HCの精製を行った。Trastuzumabの緩衝液（5mM histidine-HCl、2%
Trehalose、0.009% Polysorbate 20、pH6.0）に溶解し、分注保存した。
3）T-LCCTL-HC抗体の品質管理
精製されたT-LCCTL-HC抗体の純度をSDS-PAGEによって確認した結果、98.5％になったことが観察された。SEC-HPLCによって、T-LCCTL-HC抗体が形成された高分子量ポリマーの量は0.4％未満であった。また、エンドトキシンの量は0.098EU/mg未満であった。
実施例2：リンカー2−DM1中間物（ｎ＝3、開環）の作製
1）リンカー2−DM1中間物（ｎ＝3、閉環）の作製および質量管理
等モル数のリンカー2（ｎ＝3）とDM1 を計り、溶解混合後、0−40℃で0.5−20hr反応させ、リンカー2−DM1中間物（ｎ＝3、閉環、構造は図12に示す）を得た。超高速液体クロマ
トグラフ−タンデム型質量分析法（UPLC-MS）を用い、リンカー2−DM1中間物（ｎ＝3、閉環）の純度と分子量を測定した。その結果は予想通りに、純度は100％に示し（同量の異
性体が含まれ、図33に示す）、分子量は1274である。
2）リンカー2−DM1中間物（ｎ＝3、閉環）の開環反応および精製
リンカー2−DM1中間物（ｎ＝3、閉環）溶液を適量のTris base溶液またはほかの開環反応を促進する溶液と混合し、0−40℃で0.5−20hr反応させ、リンカー2−DM1中間物（ｎ＝3
、開環、構造は図16に示す）を得た。開環反応が20分、40分、60分、2時間または4時間進んだ時点において、UPLCで測定した結果が図35A-Eに示す。反応の進行に伴い、リンカー2−DM1中間物（ｎ＝3、開環）の割合は増加し（10％から73％まで増加）、マレイミドリングの開環反応の効率に関わらず、半調製用／調製用HPLCでリンカー2−DM1中間物（ｎ＝3
、開環）の精製ができ、抗体との連接への応用を保証する。
3）リンカー2−DM1中間物（ｎ＝3、開環）の質量管理
適量のリンカー2−DM1中間物（ｎ＝3、開環）を計り、溶解し、超高速液体クロマトグラ
フ−タンデム型質量分析法（UPLC-MS）を用い、その純度と分子量を測定した。結果は図36と図37に示す。予想通り、HPLCで精製されたリンカー2−DM1中間物（ｎ＝3、開環）の純度は100％に達し、分子量は1291.8であり、ADC薬物GQ-1001の作製に理想的なリンカーを
提供した。
実施例3：ADC薬物GQ1001の作製
本発明はペプチド転移酵素を用い、リンカー2−DM1中間物（ｎ＝3、開環）を抗体T-LCCTL-HCと部位特定的に連接し、図28に示すようなADC薬物を得た。その中で、ｎは3であり、
ｄは2であり、リガーゼの認識配列LPXTにおけるXはグルタミン酸（E）である。
1）抗体T-LCCTL-HCの処理
限外ろ過、透析または脱塩カラム法によって抗体T-LCCTL-HCのバッファーを１×リガーゼ緩衝液に置換した。１×リガーゼ緩衝液に50mM Tris-HCl（pHは5-8）、150mM NaCl、CaCl2（ありまたはなし）が含まれる。
2）ADC薬物GQ1001の固相精製
本発明はSortase酵素を基づいた改変型ペプチド転移酵素を用い、抗体T-LCCTL-HCをリン
カー2−DM1中間物（ｎ＝3、開環）と連接し、ADC薬物GQ1001を作製した。
１×リガーゼ緩衝液中で抗体T-LCCTL-HCとリンカー2−DM1中間物（ｎ＝3、開環）を適量
のモル比（1：1〜1：100）で混合し、固相カップリングカラムに加えた。固相カップリングカラムに充填した基質は転移酵素を有し、抗体T-LCCTL-HCをリンカー2−DM1中間物（ｎ＝3、開環）と連接させる。4−40℃で0.5−20hr連接反応を行い、固相カップリングカラ
ムから産物を回収し、限外ろ過または透析法で反応できていない薬物中間物を分離した。精製されたADC薬物GQ1001を4℃または―80℃において、Kadcyla緩衝液（10 mM Sodium Succinate、pH5.0；100 mg/ml Trahelose; 0.1% (w/v) Polysorbate 20； Kadcyla製剤の調製を参照）に保存した。
実施例4：ADC薬物GQ1001のSDS-PAGE分析
連接反応が完成された後、SDS-PAGE法によってGQ1001の純度および連接効率を測定した。その結果は図38に示すように、連接反応には部位特定的に抗体T-LCCTL-HCの軽鎖に連接された。なお、細胞毒素が連接されていない抗体T-LCCTL-HCの軽鎖と比べ、細胞毒素DM1が
連接されたGQ1001の軽鎖に顕著な分子量遷移が見られた。連接産物に細胞毒素が連接されていない軽鎖が検出されておらず、連接効率は95％以上になり、連接産物の純度も予想に達した。
実施例5：ADC薬物GQ1001の高精度質量分析（ESI-MS）
高精度質量分析（ESI-MS）を行い、ADC薬物GQ1001の軽鎖を解析した結果、分子量が25281に示し、理論分子量の25284とほぼ一致の結果が得られ、各軽鎖に一つの細胞毒素分子が
連接されていることを確認した。高精度質量分析（ESI-MS）の結果を図39Aと39Bに示す。
実施例6：ADC薬物GQ1001のHIC-HPLC解析
Butyl-HICカラムを利用し、ADC薬物GQ1001のDAR分布を測定した。その結果は図40に示す
ように、細胞毒素が連接されていない抗体T-LCCTL-HCの割合は5％未満であり、連接産物DAR2がADC薬物GQ1001の主体として、1.8に達したことがわかった。
実施例7：ADC薬物GQ1001のSEC-HPLC解析
SECカラムを利用し、ADC薬物GQ1001の高分子量凝集程度を測定した。その結果は図41に示すように、ADC薬物GQ1001に高分子量凝集が検出されていないことから、カップリング反
応は抗体に影響を及ぼさないことがわかった。
実施例8：ADC薬物GQ1001の細胞表面受容体ErbB2/Her2に対する親和力
1）ヒト乳がん細胞BT-474またはSK-BR-3単細胞懸濁液を（0.5-5）×106/mlになるように
調整した。5×105 cells/testに6.25nMのHerceptin、T-LCCTL-HCまたはGQ1001を加え、4
℃で60分培養した。さらに1ml洗浄液（PBS+1% BSA）を加え、1000rpmで5分間遠心分離し
、上清を除去した。この洗浄操作を二回繰り返した。
2）Herceptin、T-LCCTL-HCまたはGQ1001を加えた細胞に100 μLのFITC-Goat anti-human IgG抗体希釈液を加え、4℃で30分遮光培養した。1ml洗浄液を加え、1000rpmで5分間遠心
分離し、上清を除去した。この洗浄操作を二回繰り返した後、500μLのPBSで懸濁した。300目ふるいを通して、氷上において放置し、BD C6で測定を行った。その結果は図42−43
に示すように、Herceptin、T-LCCTL-HCまたはGQ1001は乳がん細胞BT-474またはSK-BR-3表面に発現する受容体ErbB2/Her2に対する親和力に顕著な差は認められなかった。
実施例9：ADC薬物GQ1001のErbB2/Her2発現量の違う腫瘍細胞の増殖に対する影響
1）ErbB2/Her2低発現するヒト乳がん細胞をMCF-7、MDA-MB-468に、高発現するヒト乳がん細胞をBT-474、SK-BR-3、HCC1954に、ヒト卵巣がん細胞をSK-OV-3に、ヒト胃がん細胞をNCI-N87に使用された。各ウェルに100μLの細胞（1000−10000細胞数）を96ウェル細胞培
養プレートに播種し、37℃、5％CO2、95%空気、100%湿度の条件でO/N培養を行った。
2）O/Nで培養した細胞に各濃度（30、10、3.333、1.111、0.370、0.123、0.041、0.014、0.005 nM）のGQ1001、Kadcyla、Herceptin、DM1を加え、コントロールとして、50 μM の
Puromycinを加え、されに37℃で48−96hr培養を行った。
3）細胞培養プレートを室温になるまで放置した。各ウェルに100μM 的CellTiter Glo試
薬を加え、2分間振動培養を行い、10分間遮光反応を行った。最後にBioTech Gen5マイク
ロプレートリーダーで発光値（RLU）を測定した。
4）各薬物の腫瘍細胞に対する増殖抑制作用の結果は表１および図44−50に示す。DM1はErbB2/Her2高発現および低発現細胞に顕著な増殖抑制作用を示した一方、Herceptin、GQ1001はErbB2/Her2高発現細胞のみに顕著な増殖抑制作用を示した。また、Kadcylaは高濃度において、ErbB2/Her2低発現細胞の増殖に抑制作用を示した。
実施例10：ラット体内における薬物動態学
1）体重160−180gのSPF雌性SDラットを用い、各群に4匹でランダムにGQ1001群、Kadcyla
群、ブランク群に分けられた。
2）10 mg/kg のGQ1001（ロット：20141128、純度>98%）またはKadcyla（ロット N1003）
を尾静脈により投与を行った。ブランク群では、同体積のPBS（ｐH=7.4）を尾静脈により投与した。
3）投与1hr、1日、2日、3日、4日、6日、8日、13日、17日、21日、28日後、眼底採血により100−200μL採血を行った（抗凝固剤使用せず）。血液を氷上において1−2hr静置し、4000rpm、20min、4℃で遠心分離した。上清の血清画分を新しいEPチューブに分注し、−80℃で保存した。
4）ELISAで血清中のおけるGQ1001、Kadcyla量を測定した。
5）その結果、投与1日後、血中GQ1001およびKadcyla濃度は大幅に減少し、ADC薬物が体内で速やかに吸収されたことが考えられる。投与1hr後と比べ、それぞれ44.7％と42.5％ま
で減少し、両群には顕著な差は見られなかった。投与6日後、血中GQ1001およびKadcyla濃度は投与1hr後と比べ、それぞれ20.9％と20.5％まで減少した。投与13日後、血中GQ1001
およびKadcyla濃度は投与1hr後と比べ、それぞれ9.9％と12.2％まで減少した。投与21日
後、血中GQ1001およびKadcyla濃度は投与1hr後と比べ、それぞれ5.5％と7.7％まで減少し
た。投与28日後、血中GQ1001およびKadcyla濃度は投与1hr後と比べ、それぞれ3.5％と5.2％まで減少した。以上の結果から、GQ1001およびKadcylaは雌性ラットでの薬物動態に明
らかな差は認められなかった（図51）。
実施例11：ADC薬物GQ1001の体内における薬効評価
1）対数成長期における乳がん細胞HCC1954を使用し、マトリゲルバッファー（PBS:BD Matrigel=1:1）で細胞密度を2.5×107/mlまで調製した。6−8週齢のSPF雌性BALB/cヌードマ
ウスを使用し、右の肩甲骨に調製したHCC1954細胞懸濁液を0.2ml皮下投与した。
2）接種7日後、ノギスで腫瘍の直径を測定し、公式V＝0.5a × b2に従って腫瘍の体積を
計算した（aは腫瘍における最長直径、bは腫瘍における最短直径）。腫瘍サイズが130−140mm3までになるマウスを使用し、各群に10匹でランダムにブランク群、GQ1001 0.5mg/kg、5mg/kg群、Kadcyla 5 mg/kg群、Herceptin 5 mg/kg群に分けられた。投与方法に尾静脈投与を採用し、ブランク群では等量の溶媒を投与することになった。投与から31日までに週二回腫瘍サイズの測定を行い、31日後週一回腫瘍サイズの測定を行った。各時間点における腫瘍サイズを各群において比較した。また、T-CまたはT/C値を抗腫瘍活性の指標として、薬物の薬効を評価した。T-C値の計算では、Tは治療群において、腫瘍平均サイズが予定サイズ（500 mm3）に達するまでの平均日数であり、Cはブランク群において、腫瘍平均サイズが予定サイズ（500 mm3）に達するまでの平均日数である。T/C値（％）は腫瘍抑制効果を評価する指標として、その中で、Tはある時間点で治療群における腫瘍平均体積
であり、Cはある時間点でブランク群における腫瘍平均体積である。
3）GQ1001 5 mg/kgおよびKadcyla 5 mg/kg投与10日後、ブランク群と比べ、腫瘍体積が顕著に減少した。その中に、腫瘍が完全に消えた例も発見し、38日まで腫瘍の再生は見られなかった（表2、図52）。以上の結果から、5 mg/kgの GQ1001またはKadcylaがErbB2/Her2陽性乳がん細胞に対して、顕著な抑制作用を有することが示唆された。
実施例12：ADC薬物GQ1001単回投与における毒性研究
1）成年健康雌性SDラットを使用し、各群に6匹でランダムにブランク群（0 mg/kg）、GQ1001 6mg/kg、60mg/kg群、Kadcyla 60 mg/kg群に分けられた。単回尾静脈投与により、10ml/kgを1 ml/minの速度で投与した。投与期間では、ラットに臨床観察を行い、体重、摂食量を記録し、血液細胞計数、血液生化指標を測定した。試験が終わった後、ラットに安楽死を行い、解剖により可視病変を観察し、臓器を摘出し、重量を計り、臓器係数を計算した。
2）その結果、投与期間に、各濃度のGQ1001群では明らかな臨床症状は観察されていない
。Kadcyla 60 mg/kg群では、投与5日後（D5）鼻分泌物（2/6）、耳フラッシング（耳部
）と腫脹（6/6）、毛乱れ（6/6）、体重減少（1/6）、背曲げ（1/6）、耳と四肢青い（1/6）などの症状が観察された。耳腫脹の症状はD6に消失し、鼻分泌物の症状はD7に消失し
た。4/6のラットはD8に正常に回復し、残りの2/6のラットはD15の安楽死まで毛乱れ以外
の症状が回復した。ブランク群と比べ、各GQ1001投与群では、明確な症状は観察されていないのに対して、Kadcyla 60 mg/kg投与群では、投与後（D2-D12）体重減少が観察できた（図53）。
血液学と臨床生化指標の結果から、各GQ1001投与群では、明らかな毒性は観察されていないのに対して、Kadcyla 60 mg/kg投与群では、赤血球指標（RBC、HGB、HCT、Retic）の減少、白血球数の増加、ALT、AST、TBIL、GGT指標の上昇、特にALTおよびASTの上昇が観察
され、Kadcyla 60 mg/kg単回投与下、肝毒性に関わる可能性が示唆された（図54）。
解剖所見から、各GQ1001投与群では、明確な変化は観察されていないのに対して、Kadcyla 60 mg/kg投与群では、脾臓膨大（6/6）、肝臓周辺鈍い（4/6）、胸腺縮小（1/6）など
の症状が観察された。
以上の結果から、同濃度（60 mg/kg）条件下において、GQ1001の毒性はKdcylaより低いことが示唆された。
実施例13：リンカー5-Mc-Val-Cit-Pab-MMAE薬物中間物（n=3、開環）の作製
1）リンカー5-Mc-Val-Cit-Pab-MMAE薬物中間物（n=3、閉環）の作製および質量管理
等モル数のリンカー5（ｎ＝3）とMc-Val-Cit-Pab-MMAEを計り、溶解混合後、0−40℃で0.5−20hr反応させ、リンカー5-Mc-Val-Cit-Pab-MMAE中間物（ｎ＝3、閉環）を得た。構造は図19に示す。
2）リンカー5-Mc-Val-Cit-Pab-MMAE薬物中間物（n=3、閉環）の開環反応および質量管理
リンカー5-Mc-Val-Cit-Pab-MMAE薬物中間物（n=3、閉環）溶液は適量のTris base溶液ま
たはほかの開環反応を促進する溶液と混合し、0−40℃で0.5−20hr反応させ、開環構造になった薬物中間物を得た。構造は図23に示す。HPLCで薬物中間物（n=3、開環）の純度お
よび分子量を測定した。結果は図55に示すように、異性体がHPLCでは分離できなかった。開環反応液をMALDI-TOF質量分析器で解析した結果は図56に示すように、その分子量は1702または1718であり、Na、Kイオン化による原因と考え、理論分子量1681と一致し、開環産物ができたことが示唆された。マレイミドリングの開環反応の効率に関わらず、半調製用／調製用HPLCで開環薬物中間物の精製ができ、抗体との連接への応用を保証する。

Claims (34)

  1. 式（I）、式（II）、式（III）または式（IV）で示される構造の化合物：

    または薬学的に許容されるその塩［式中、
    PCAはリガーゼが特異的に認識する基質にある配列であり；
    LA1、LA2は連接ドメインであり；
    a、pは独立に0または１であり、即ち、LA1またはLA2の有無がaとp値次第となり；
    CCA’ は化学カップリンクドメインであり；
    は単結合または二重結合を指し；
    Yはペイロードであり、核酸配列、短ペプチド配列、ポリペプチド、タンパク質、低分子
    化合物、生物物質などから選ばれ；
    ｚは1−1000までの任意の整数である］。
  2. リガーゼはSortase酵素であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
  3. PCAリガーゼが特異的に認識する基質にある配列であることを特徴とする、請求項１に
    記載の化合物。
  4. PCAが、グリシンまたはアラニンからの一つまたは多数のユニットを1−100まで直列接
    続して構成されることを特徴とする、請求項３に記載の化合物。
  5. Yは放射性マーカー、蛍光マーカー、親和性精製マーカー、トレーサー、抗腫瘍薬物ま
    たは細胞毒素分子であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
  6. Yはメイタンシンまたはその誘導体、パクリタキセルまたはその誘導体、オーリスタチ
    ンまたはその誘導体、エポチロンまたはその誘導体、ビンブラスチン類化合物であることを特徴とする、請求項５に記載の化合物。
  7. 下記に示す化合物から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の化合物：










    ［式中、ｎは1−100までの任意の整数であり、mは0または1−1000までの任意の整数であ
    る］。
  8. 下記に示す方法で作製することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物が含まれる組成物：

    A）Y溶液と
    溶液と混合し、インキュベートした後、複合物質
    溶液を得る；
    または、
    Y溶液と
    溶液と混合し、インキュベートした後、複合物質
    溶液を得る。この条件下、Yに-S-(LA2)pグループが付加される；
    または、

    Y溶液と
    溶液と混合し、インキュベートした後、複合物質
    溶液を得る；
    または、
    Y溶液と
    溶液と混合し、インキュベートした後、複合物質
    溶液を得るステップ（この条件下、Yに
    グループが付加される）；

    B）ステップA)で作製した複合産物
    溶液または
    溶液に、開環反応を促進するトリスベース溶液またはほかの開環反応促進溶液を加えるステップ。
  9. 得られた産物をさらにHPLCで精製することを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
  10. 式（I）、式（II）、式（III）または式（IV）で示される化合物の総量が50％モル比を超えることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
  11. 式（V）、式（VI）、式（VII）または式（VIII）で示される構造の化合物：


    または薬学的に許容されるその塩［式中、
    Aはタンパク質、ペプチド、シグナル伝達因子、細胞増殖因子、免疫グロブリンまたは抗
    体であり；
    LA1、LA2、LA3はそれぞれ独立的な連接ドメインであり、LA3はグリシンまたはアラニンからの一つまたは多数のユニットを1−100まで直列接続して構成され；
    a、bとpは独立に0または１であり、即ち、LA1、LA2 またはLA3の有無がa、bとp値次第と
    なり；
    PCAとFはリガーゼが認識する特異的な認識配列であり、前記リガーゼの作用により、PCA
    はFと特異的に結合し；
    CCA’ は化学カップリンクドメインであり；
    は単結合または二重結合を指し；
    Yはペイロードであり、水素、核酸配列、短ペプチド配列、ポリペプチド、タンパク質、
    化合物、生物物質などから選ばれ；
    ｚは1−20までの任意の整数であり；
    ｄは1−20までの任意の整数である］。
  12. Aは抗体であることを特徴とする、請求項１１に記載の化合物。
  13. FはLA3を介して、または直接に共有結合により、Aの重鎖または軽鎖のC末端に連接することを特徴とする、請求項１２に記載の化合物。
  14. リガーゼがSortase酵素または改変型ペプチド転移酵素を含むことを特徴とする、請求
    項１１に記載の化合物。
  15. Fはリガーゼの受容体基質に特異的な認識配列であり、PCAはリガーゼのドナー基質に特異的な認識配列であることを特徴とする、請求項１１に記載の化合物。
  16. FはX1X2X3TX4X5であることを特徴とする、請求項１５に記載の化合物［式中、X1はロイシンまたはアスパラギンであり、X2はプロリンまたはアラニンであり、X3は天然または非天然アミノ酸のうちのいずれか１つであり、Tはスレオニンであり、X4はグリシン、セリ
    ン、アスパラギンまたは存在せず、X5は天然または非天然アミノ酸のうちのいずれか１つまたは存在しない］。
  17. FはLPX3T或いはLPX3TGGであることを特徴とする、請求項１６に記載の化合物［式中、Lはロイシンであり、Pはプロリンであり、X3は天然または非天然アミノ酸のうちのいずれ
    か１つであり、Tはトレオニンであり、Gはグリシンである］。
  18. PCAはグリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−100まで直列接続
    して構成されることを特徴とする、請求項１１に記載の化合物。
  19. ｄは1−20までの任意の整数であることを特徴とする、請求項１１〜１８のいずれかに
    記載の化合物。
  20. Yは放射性マーカー、蛍光マーカー、親和性精製マーカー、トレーサー、抗腫瘍細胞薬
    物または細胞毒素分子であることを特徴とする、請求項１１に記載の化合物。
  21. Yはメイタンシンまたはその誘導体、パクリタキセルまたはその誘導体、オーリスタチ
    ンまたはその誘導体、エポチロンまたはその誘導体、ビンブラスチン類化合物であることを特徴とする、請求項２０に記載の化合物。
  22. 下記に示す化合物から選ばれることを特徴とする、請求項１１に記載の化合物：
























    ［式中、Abは配列番号1-8で示される配列であり、ｚは1−20までの任意の整数であり、ｎは1−100までの任意の整数であり、ｍは0または1−1000までの任意の整数であり、ｄは1−20までの任意の整数であり、LA3はグリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−100まで直列接続して構成され、ｂは独立に0または１であり、即ち、LA3の有無がｂ値次第となる］。
  23. 下記に示す方法で作製することを特徴とする、請求項１１〜２２のいずれかに記載の化合物が含まれる組成物：
    i) 式（I）、式（II）、式（III）或いは式（IV）に示す化合物を作製するステップ
    ；
    ii) A-（LA3）b-Fを作製するステップ；
    iii）リガーゼを加え、ii)で得られたA-（LA3）b-Fを式（I）、式（II）、式（III）或いは式（IV）に示す化合物と連接するステップ。
  24. 式（V）、式（VI）、式（VII）または式（VIII）で示される化合物の総量が80％モル比を超えることを特徴とする、請求項２３に記載の組成物。
  25. 請求項１１〜２２のいずれかに記載の化合物または請求項２３または２４に記載の組成物を用いることを特徴とする、動物における細胞増殖を抑制する方法。
  26. 動物は哺乳類動物であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
  27. 動物はヒトであることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
  28. 疾病予防と治療に用いる薬物を製造するための、請求項１１〜２２のいずれかに記載の化合物の使用。
  29. 疾病は腫瘍または自己免疫疾病であることを特徴とする、請求項２８に記載の使用。
  30. 腫瘍細胞表面が化合物または複合産物が認識する抗原または受容体を有することを特徴とする、請求項２９に記載の使用。
  31. 腫瘍細胞表面が有する抗原または受容体はErbB2/Her2であることを特徴とする、請求項
    ３０に記載の使用。
  32. 腫瘍は乳がん、胃がん、卵巣がん、肺がん、結腸がん、直腸がん、結腸がん、または食道がんであることを特徴とする、請求項３１に記載の使用。
  33. 請求項１１〜２２のいずれかに記載の式（V）、式（VI）、式（VII）または式（VIII）で示される構造の化合物または薬学的に許容されるその塩、及び薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
  34. 冷凍乾燥粉末注射剤または注射液であることを特徴とする、請求項３３に記載の医薬組成物。
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