JP2024500921A - 開環チオスクシンイミド基、オリゴペプチドフラグメント及びキラル部分を含む新規異性化合物 - Google Patents

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Abstract

本開示は、薬物化学の分野に関し、特に、開環チオスクシンイミド基及びキラル部分を含む異性体化合物を分離する方法に関する。【選択図】図４８

Description

本開示は、薬物化学の分野に関し、特に、抗癌活性を有する開環チオスクシンイミド基、オリゴペプチドフラグメント及びキラル部分を有する異性体化合物に関する。本発明は、異性化合物を分離する方法にも関する。
哺乳動物における腫瘍再発の増加と化学療法薬の重篤な副作用により、現在使用されている多くの抗癌薬の臨床効果が低下している。したがって、副作用を最小限に抑える代替又は相乗的な抗癌薬を開発する必要性が常に存在する。効果的な抗癌剤を開発するための重要な戦略の１つは、薬物の「組み合わせ」から得た抗癌剤の研究であり、現在、標的薬物の新規な組み合わせを評価するために何百もの試験が実施されている。このような標的薬剤は、抗体－薬物－コンジュゲートを含む。
抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の概念は新しいものではなく、モノクローナル抗体に基づく強力な抗腫瘍薬として、抗体（標的部分及び／又は治療部分とする）と従来の細胞毒性薬（強い細胞毒性を有する）の利点を組み合わせている。
理想的なＡＤＣリンカーは、小分子薬物がリガンドに確実に連結されるように、細胞外で十分に安定していなければならないことと、細胞に入った後、切断可能なリンカーは、適切な条件下で切断され、活性な小分子薬物を放出することと、切断不能なリンカーの場合、活性成分が通常、小分子、リンカー及びリガンドが酵素加水分解によって生じるアミノ酸残基からなることと、の要件を満たす必要がある。したがって、ＡＤＣの開発では、リンカーの設計と関連するカップリング戦略は非常に重要であり、これらはＡＤＣの安定化に重要な役割を果たすだけでなく、コンジュゲートの生物学的活性、凝集状態、インビボバイオアベイラビリティ、分布及び代謝にも直接影響する。
現在主流のカップリング技術は、主に抗体中のリジン又はシステイン残基に基づく化学的カップリング戦略である。リンカーと反応可能な抗体中のアミノ酸の数と位置の多様性により、ＡＤＣ中の細胞毒素の数と位置は可変であり、このように得られたＡＤＣは異質である。このような異質性はＡＤＣの品質、安定性、有効性、代謝及び毒性に影響を与えることがあり、例えば、２０１３年に発売されたＡＤＣ Ｋａｄｃｙｌａの医薬品説明書には、抗体あたりの細胞毒素の数は０～８であり、平均ｎは約３．５であることが明記されている。ＡＤＣにおける異質性の問題は、新世代のＡＤＣの開発における主要な課題である。
バイオコンジュゲートの欠陥の１つは、正常な組織に毒性をもたらし、標的での有効なバイオコンジュゲートの数を減らし、有効性を低下させるオフターゲット放出である。市販又は臨床試験中の抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の半分以上は、チオスクシンイミド構造（チオスクシンイミド連結）を使用して小分子薬物を標的抗体又はタンパク質にコンジュゲートさせるものである。しかしながら、チオスクシンイミド連結は安定ではなく、生体では、逆マイケル付加又は他のチオール基との交換が起こり、ＡＤＣからの細胞毒素の脱落を直接引き起こし、オフターゲット毒性を引き起こす可能性がある。
スクシンイミドの開環は、逆マイケル付加又は逆マイケル付加メカニズムによるチオール基交換の潜在部位を除去することで、バイオコンジュゲートの安定性を高めることができる。
チオスクシンイミド構造は、チオール基とマレイミド構造の反応によって形成される。位置選択性が低く又は不完全な状況では、開環反応により一対の位置異性体が生じる。また、チオール基とスクシンイミドの共有結合によりキラル中心が生じる。ジアステレオマー及びエナンチオマーの存在は、開環反応の後処理に大きな課題をもたらす。したがって、異性体に関するさらなる研究が必要であり、新しい精製方法が緊急に必要とされる。
本開示は、下記式（ＸＩ）～（ＸＩＶ）のいずれかの構造を有する化合物に関する。
Figure 2024500921000002
 式中、
ペイロード、Ｌ１、Ｌ２及びＭは以下で定義する。
本開示は、式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）又は（ＸＩＶ）の化合物及び抗体又はその抗原結合フラグメントを用いて調製される、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）をさらに提供する。
特定の一実施形態において、式（ＸＩ）～（ＸＩＶ）の化合物はそれぞれ式（ｉ）～（ｉｖ）の構造を有し、
Figure 2024500921000003
 式中、ｘは－ＯＨ又は－ＮＨ２である。
式（ｉｉｉ）の化合物又は式（ｉｖ）の化合物と治療性抗体とをコンジュゲートすることによって得られたＡＤＣの混合物は、「α－ＡＤＣ」と表される。
開環チオスクシンイミド基、オリゴペプチドフラグメント、及びキラル部分を含むα－ＡＤＣが調製され、それらの生物学的活性はインビトロ及びインビボアッセイによって証明されている。予期せぬ抗癌結果は次の通りである。
α－ＡＤＣはＨＥＲ２陽性細胞の増殖に対して有意な阻害効果があり、効果はＤＭ１の数十倍である。
α－ＡＤＣは２４時間以内に腫瘍に濃縮され、インサイチュでの安定性を維持することができる。
要するに、現在の研究条件下では、１０、３０及び４５ｍｇ／ｋｇのα－ＡＤＣによる反復静脈内注入（３週間に１回、合計３回）はカニクイザルには耐えられ、１回の投与量は最大４５ｍｇ／ｋｇとなることができる。非重度毒性の最高用量（ＨＮＳＴＤ）は４５ｍｇ／ｋｇと決定され、これに対して、Ｋａｄｃｙｌａは１０ｍｇ／ｋｇの毒性用量を示している。
最適化された分子構造は代謝を改善した。Ｋａｄｃｙｌａに比べて、α－ＡＤＣは低用量で同様の効果を示した。
本開示は、混合物１から１つ又は複数の標的化合物を分離する方法をさらに提供し、前記混合物１は４つの化合物を含み、前記４つの化合物の各々は部分１、部分２及び部分３を含む。
部分１は、式（Ｉ）～（ＩＶ）から選択される開環チオスクシンイミド構造を有する。
Figure 2024500921000004
 ただし、
部分１中のチオール基とアミド基は２つの連結部位を構成し、部分２はその一方を介して部分１に連結され、部分３はその他方を介して部分１に連結され、
部分２は１つ又は複数のキラル中心を含み、
前記４つの化合物中の部分１は異なり、
部分３は前記分子中の残りの部分であり、
部分３の分子量は１９００以下であり、
前記１つ又は複数の標的化合物は混合物１に含まれる４つの化合物から選択さる。
前記方法は、
（１）混合物１を用意するステップと、
（２）混合物１をクロマトグラフィーにかけて標的化合物を得るステップと、を含み、
ただし、
ａ．前記標的化合物の各々は個別の生成物として得られ、又は
ｂ．２つの標的化合物は混合物として得られ、該混合物は混合物２と定義される。
一実施形態において、前記方法は、下記ステップ（３）と（４）をさらに含む。
（３）ステップ（２）で収集された混合物３を含む溶出物を回収し、ここで混合物３は、ステップ（２）で分離された標的化合物とは異なる１つ又は複数の追加の標的化合物を含む。
（４）ステップ（３）で回収された溶出物をクロマトグラフィーにかけて前記追加の標的化合物を分離する。
チオール基の位置に応じて、式（Ｉ）及び（ＩＩ）をβと呼び、式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の立体配置をαと呼ぶ。
本開示は、混合物１中の１つ又は複数の化合物を分析するための方法をさらに提供し、混合物１は４つの化合物を含み、前記混合物中の４つの化合物の各々は部分１、部分２及び部分３を含む。
本開示は、混合物２中の１つ又は複数の化合物を分析するための方法をさらに提供し、前記混合物は２つの化合物を含み、前記混合物中の２つの化合物の各々は部分１、部分２及び部分３を含む。
Ｄａｉｓｏｐａｋ Ｃ４ ＳＰ－１２０－８－Ｃ４－Ｐを使用したβ１、β２及びα異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８ １００－１０Ｃ１８を使用したβ１、β２及びα異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 Ａｃｃｈｒｏｍ Ｃ１８ Ｃ１８－ＭＥ １０ｕｍ １００Åを使用したβ１、β２及びα異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 Ｄａｉｓｏｐａｋ Ｃ１８ １００－１０－ＯＤＳ－Ｐを使用したβ１、β２及びα異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ａは０．１％のＴＦＡ水溶液で、溶出剤ＢはＭｅＯＨである、β１、β２及びα異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ａは０．１％のＨ３ＰＯ４水溶液で、溶出剤ＢはＭｅＯＨである、β１、β２及びα異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ａは０．２％のＴＦＡ水溶液で、溶出剤ＢはＭｅＯＨである、β１、β２及びα異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ａは０．１％のＣＨ２Ｏ２水溶液で、溶出剤ＢはＭｅＯＨである、β１、β２及びα異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ａは０．２％のＣＨ２Ｏ２で、溶出剤ＢはＭｅＯＨである、β１、β２及びα異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ａは０．５％のＡＡ水溶液で、溶出剤ＢはＭｅＯＨである、β１、β２及びα異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ａは０．１％のＣＨ３ＣＯＯＨ水溶液で、溶出剤ＢはＭｅＯＨである、β１、β２及びα異性体の分離のＨＰＬＣ図である。［００３４］ 溶出剤Ａは０．３％のＣＨ３ＣＯＯＨ水溶液で、溶出剤ＢはＭｅＯＨである、β１、β２及びα異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ａは０．３％のＣＨ３ＣＯＯＨ＋０．０５％のＬ－ＴＡ水溶液で、溶出剤ＢはＭｅＯＨである、β１、β２及びα異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ａは１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ＰＨ＝２．０で、溶出剤ＢはＭｅＯＨである、β１、β２及びα異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ａは１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ＰＨ＝４．０で、溶出剤ＢはＭｅＯＨである、β１、β２及びα異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ａは１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ＰＨ＝６．０で、溶出剤ＢはＭｅＯＨである、β１、β２及びα異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ａは１０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４ ＰＨ＝４．０で、溶出剤ＢはＭｅＯＨである、β１、β２及びα異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ａは１０ｍＭ ＴＥＡＰ ＰＨ＝４．０で、溶出剤ＢはＭｅＯＨである、β１、β２及びα異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ａは１０ｍＭ ＮａＣｌＯ４ ＰＨ＝２．０で、溶出剤ＢはＭｅＯＨである、β１、β２及びα異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ａは０．３％のＣＨ３ＣＯＯＨ水溶液で、溶出剤ＢはＭｅＯＨで、勾配は３０分で４６％～６６％Ｂである、β１、β２及びα異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ａは０．３％のＣＨ３ＣＯＯＨ水溶液で、溶出剤ＢはＭｅＯＨで、勾配は８０分で４６％～５６％Ｂである、β１、β２及びα異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ １１０Å ５ｕｍ ２５０＊４．６ｍｍを使用した、β１、β２及びα異性体の分析のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ｃは０．１％のＴＦＡ水溶液で、溶出剤Ｄは０．１％のＴＦＡを含むＣＡＮである、Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００－１０Ｃ１８，２１．２＊２５０ｍｍ （１００Å，１０μｍ）を使用したα１とα２異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ｃは０．１％のＴＦＡ水溶液で、溶出剤ＤはＡＣＮである、α１とα２異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ｃは０．１％のＡｃＯＨ水溶液で、溶出剤ＤはＡＣＮである、α１とα２異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ｃは０．３％のＡｃＯＨ水溶液で、溶出剤ＤはＡＣＮである、α１とα２異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ｃは０．１％のＣＨ２Ｏ２水溶液で、溶出剤ＤはＡＣＮである、α１とα２異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ｃは０．３％のＣＨ２Ｏ２水溶液で、溶出剤ＤはＡＣＮである、α１とα２異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ｃは０．５％のＡＡ水溶液で、溶出剤ＤはＡＣＮである、α１とα２異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ｃは０．１％のＨ３ＰＯ４水溶液で、溶出剤ＤはＡＣＮである、α１とα２異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ｃは０．２％のＨ３ＰＯ４水溶液で、溶出剤ＤはＡＣＮである、α１とα２異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ｃは１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ＰＨ＝２．０で、溶出剤ＤはＡＣＮである、α１とα２異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ｃは１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ＰＨ＝４．０で、溶出剤ＤはＡＣＮである、α１とα２異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ｃは１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ＰＨ＝６．０で、溶出剤ＤはＡＣＮである、α１とα２異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ｃは１０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４ ＰＨ＝２．０で、溶出剤ＤはＡＣＮである、α１とα２異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ｃは１０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４ ＰＨ＝４．０で、溶出剤ＤはＡＣＮである、α１とα２異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ｃは１０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４ ＰＨ＝６．０で、溶出剤ＤはＡＣＮである、α１とα２異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ｃは１０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４ ＰＨ＝８．０で、溶出剤ＤはＡＣＮである、α１とα２異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ｃは３０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ＰＨ＝２．０で、溶出剤ＤはＡＣＮである、α１とα２異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ｃは３０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ＰＨ＝６．０で、溶出剤ＤはＡＣＮである、α１とα２異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ｃは３０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ＰＨ＝４．０で、溶出剤ＤはＡＣＮである、α１とα２異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ｃは１０ｍＭ ＴＥＡＰ ＰＨ＝６．０で、溶出剤ＤはＡＣＮである、α１とα２異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ｃは１０ｍＭ ＴＥＡＰ ＰＨ＝２．０で、溶出剤ＤはＡＣＮである、α１とα２異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 溶出剤Ｃは１０ｍＭ ＴＥＡＰ ＰＨ＝４．０で、溶出剤ＤはＡＣＮである、α１とα２異性体の分離のＨＰＬＣ図である。 Ｗａｔｅｒｓ Ｘ－ｓｅｌｅｃｔ，ＣＳＨ Ｐｈｅｎｙｌ－Ｈｅｘｙｌ ３．５ｕｍ １５０＊４．６ｍｍを使用した、α１とα２異性体の分析のためのＨＰＬＣ図である。 癌細胞の増殖に対する異性体の効果を示す。 癌細胞の増殖に対するα－ＡＤＣの効果を示す。 α－ＡＤＣの生体内分布特性（８９Ｚｒ－α－ＡＤＣを単回静脈内注入した後のＰＥＴ／ＣＴスキャン結果）を示す。 α－ＡＤＣのインビボ抗腫瘍効果を示し、ｘ軸は単回投与後の時間を表し、ｙ軸は腫瘍サイズを表す。 α－ＡＤＣの薬物動力学特性を示し、ｘ軸は単回静脈内注入後の時間を表し、ｙ軸は血清濃度を表す。 α－ＡＤＣのトキシコキネティックデータのまとめを示し、ｘ軸は初回投与後の時間を表し、０時間目、５０４時間目及び１００８時間目は、静脈内注入の反復投与の時点を表し、１００８時間目から２０１６時間目は、６週間の回復期間を表す。ｙ軸は血清濃度を表す。
図１～４５では、ｘ軸は時間（分）を表す。図１～２１及び４５では、ｙ軸はＵＶ吸光度（ｍＡＵ）を表し、図２２～４４では、ｙ軸はＵＶ吸光度（ＡＵ）を表す。
一般的な定義
以下に別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される技術とは、当分野で一般的に理解されている技術を指し、当業者に明らかな変形及び同等の置換を含む。以下の用語は、当業者には容易に理解されると考えられるが、本開示をよりよく説明するために以下の定義を説明する。本明細書に商品名が記載されている場合、それに対応する商品又はその有効成分を指すことを意図する。本明細書に引用した全ての特許、公開特許出願及び出版物は全て参照によって本明細書に組み込まれる。
特定の量、濃度、又はその他の値もしくはパラメーターが範囲、好ましい範囲、又は好ましい上限値、又は好ましい下限値として示されていることは、任意の上限値又は好ましい値と任意の下限値又は好ましい値とを組み合わせた全ての範囲が、明記されているかどうかに関わらず、具体的に開示されていることと同等であると理解すべきである。別段の説明がない限り、本明細書で列挙される数値の範囲は、範囲の端点及び範囲内の全ての整数及び分数（小数）を含むことを意図する。例えば、「約０．０１％～約１％」という表現は、０．０１％から１％の任意の値を意味し、例えば０．０１％、０．０５％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．５５％、０．６％、０．６５％、０．７％、０．７５％、０．８％、０．８５％、０．９％、０．９５％及び１％である。例えば「４０％～５０％から５０％～７０％」等の他の類似表現も同様に理解すべきである。
本明細書に別段の説明がない限り、「１つ（１種）の」及び「この（このような）」のような単数形は、複数形を含む。表現「１つ（１種）又は複数（複数種）の」又は「少なくとも１つ（複数）の」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９（種）又はそれ以上（の種）を表すことができる。
数値変数と組み合わせて使用する場合、用語「約」及び「およそ」は、一般に、変数の値及び変数の全ての値が、実験誤差の範囲内（例えば、平均値の９５％信頼区間内）又は指定値±１０％以内、又はより広い範囲内であることを意味する。
用語「混合物」は、１つ以上の化合物を含む混合物を表し、１つ又は複数の化合物は標的化合物であり得る。用語「標的化合物」とは、分離又は精製すべき化合物を指す。分離プロセスを定義する場合、標的化合物は分離操作の前に決定される。標的化合物を含む生成物は、任意の所望の形態、例えば、純粋な異性体化合物を含む生成物又は複数の所定標的化合物を含む混合物であり得ることを理解すべきである。
用語「化学量論比」とは、様々な物質を一定の重量で配合した比率を指す。
用語「任意の」又は「任意に」とは、その後に説明される事象が発生する可能性があるが、必ずしも発生するわけではないことを意味し、該表現は、前記事象又は状況が発生する場合又は発生しない場合を含む。
表現「含む」又は類似の表現「備える」、「含有」及び「有する」等はオープンエンドなものであり、追加の列挙されていない要素、ステップ又は成分を排除しない。表現「…からなる」は、明確に示していない要素、ステップ又は成分をいずれも除外する。表現「実質的に…からなる」は、範囲を、指定の要素、ステップ又は成分、及び保護を請求する主題の基本特徴及び新しい特徴に実質的な影響を及ぼさない任意に存在する元素、ステップ又は成分に限定することを意味する。表現「含む」は表現「実質的に…からなる」と「…からなる」を包含すると理解すべきである。
本開示の化合物中の化学結合は本明細書において、
Figure 2024500921000005
 で表すことができる。実線で描かれた不斉原子への結合は、該原子上の全ての可能な立体異性体（例えば、特定のエナンチオマー、ラセミ混合物等）が考慮されていることを示すことを意図する。波線で描かれた不斉原子への結合は、該結合が
Figure 2024500921000006
 であることを示すことを意図する。ソリッドウェッジ又は破線ウェッジで表される不斉原子への結合は、示されている立体異性体の存在を示すことを意図する。ラセミ混合物に存在する場合、ソリッドウェッジ又は破線ウェッジは、絶対立体化学ではなく相対立体化学を定義するために用いられる。別段の説明がない限り、本開示の化合物は、立体異性体（シス及びトランス異性体、光学異性体（例えば、Ｒ及びＳ鏡像異性体）、ジアステレオマー、幾何異性体、回転異性体、配座異性体、アトロプ異性体及びそれらの混合物を含む）の形態で存在し得る。本開示の化合物は、上記異性体形態の１つ又は複数を示すことができ、それらの混合物（例えば、ラセミ混合物及び／又はジアステレオマー対）からなることができる。
用語「ヒドロカルビル基」とは、炭化水素から誘導される一価の基を指す。ヒドロカルビル基の例としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基及びアリール基を含むが、これらに限定されない。
用語「アルキル基」とは、炭素原子と水素原子からなる直鎖又は分枝の飽和脂肪族炭化水素基を意味し、該飽和脂肪族炭化水素基は単結合によって分子の残りの部分に連結されている。アルキルは、１～２０個の炭素原子を含み得、即ちＣ１－Ｃ２０アルキルであり得、例えば、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ３アルキル基、Ｃ１－Ｃ２アルキル基、Ｃ３アルキル基、Ｃ４アルキル基、Ｃ３－Ｃ６アルキル基である。アルキルの非限定的な例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、イソペンチル基、２－メチルブチル基、１－メチルブチル基、１－エチルプロピル基、１，２－ジメチルプロピル基、ネオペンチル基、１，１－ジメチルプロピル基、４－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、２－メチルペンチル基、１－メチルペンチル基、２－エチルブチル基、１－エチルブチル基、３，３－ジメチルブチル基、２，２－ジメチルブチル基、１，１－ジメチルブチル基、２，３－ジメチルブチル基、１，３－ジメチルブチル基、又は１，２－ジメチルブチル基、又はそれらの異性体を含むが、これらに限定されない。
用語「基の原子価状態」とは、基の一価、二価又は三価の性質を指す。二価基とは、対応する一価基から、自由価電子を有する炭素原子から１つの水素原子を除去することによって得られた基を指し、三価基とは、対応する二価基から、自由価電子を有する炭素原子から１つの水素原子を除去することによって得られた基を指す。例えば、「アルキレン基」とは、直鎖又は分枝の飽和二価ヒドロカルビル基を指す。アルキレン基の例としては、メチレン基（－ＣＨ２－）、エチレン基（－Ｃ２Ｈ４－）、プロピレン基（－Ｃ３Ｈ６－）、ブチレン基（－Ｃ４Ｈ８－）、ペンチレン基（－Ｃ５Ｈ１０－）、ヘキシレン基（－Ｃ６Ｈ１２－）、１－メチルエチレン基（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－）、２－メチルエチレン基（－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－）、メチルプロピレン基、エチルプロピレン基を含むが、これらに限定されない。シクロアルキレン基の例としては、例えば、シクロプロピレン基、シクロブチレン基、シクロペンチレン基、シクロヘキシレン基、シクロヘプチレン基及びシクロオクチレン基等の二価の単環式アルキル基、及び、縮合環、スピロ環又は架橋環を含む二価の多環式アルキル基を含むが、これらに限定されない。アリーレン基の例としては、フェニレン基を含むが、これに限定されない。ヘテロシクリレン基の例としては、ピロリジニレン基、イミダゾリジニレン基、ピラゾリジニレン基、ピペリジニレン基、ピペラジニレン基及びモルホリニル基を含むが、これらに限定されない。ヘテロアリーレン基の例としては、ピロリレン基、フラニレン基、チエニレン基、イミダゾリレン基、オキサゾリレン基、オキサジアゾリレン基、オキサトリアゾレン基、イソオキサゾリレン基、チアゾリレン基、チアジアゾリレン基、イソチアゾリレン基、ピラゾリレン基、トリアゾリレン基及びテトラゾリレン基を含むが、これらに限定されない。
用語「開環チオスクシンイミド基」とは、チオスクシンイミド基中のスクシンイミド環の開環から得た生成物を表す。チオスクシンイミド基の開環反応は、チオスクシンイミド基中の２つのアミド結合のうちのいずれか１つの切断によって起こり得、２種の異性体が生成される。特に、開環チオスクシンイミド基は、
Figure 2024500921000007
 である。
用語「位置選択性」とは、特定の分子の複数の部位で起こり得る化学反応において、試薬が別の原子よりも、ある原子を優先して反応させ、別の位置異性体よりも、反応がある位置異性体を優先して生成することをいう。「位置特異的」とは、特定の分子上の２つ又はそれ以上の可能な部位について、化学反応又は試薬がそのうちの１つの部位のみを対象とする選択性を指す。
用語「ジアステレオマー」とは、分子が２つ又はそれ以上のキラル中心を有し、分子間が非鏡像関係にある立体異性体を指す。
小分子化合物とは、薬物に一般的に使用される有機分子に相当するサイズの分子を指す。該用語は、生体高分子（例えばタンパク質、核酸等）包含しないが、例えばジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド等の低分子量ペプチド又はその誘導体を含む。通常、小分子化合物の分子量は、例えば約１００～約２０００Ｄａ、約２００～約１０００Ｄａ、約２００～約９００Ｄａ、約２００～約８００Ｄａ、約２００～約７００Ｄａ、約２００～約６００Ｄａ、約２００～約５００Ｄａであり得る。本明細書で使用される場合、小分子化合物は薬物とも呼ばれる。
［００９１］本明細書で使用されるように、用語「抗体（Ａｂ）」は、少なくとも１つの抗原結合部位を介して抗原に特異的に結合する免疫グロブリン（Ｉｇ）分子又はその誘導体を意味する。「従来」又は「完全長」の抗体は、一般に、２つの重鎖（ＨＣ）と２つの軽鎖（ＬＣ）の４つのポリペプチドからなる。本明細書で使用されるように、「抗体」の定義は、従来の抗体、非ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ダイアボディ又はナノ抗体（即ち単一ドメイン抗体、ＶＨＨドメイン）を含むが、これらに限定されない。任意の免疫グロブリンタイプのメンバー（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、任意のクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）もしくはサブクラス（例えばＩｇＧ２及びＩｇＧ２ｂ）、又はそれらの任意の誘導体も考慮される。
本明細書で使用されるように、抗体の「抗体フラグメント」とは、完全長抗体よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体の任意の部分を指し、例えば、可変構造ドメインの少なくとも一部（例えば、１つ又は複数のＣＤＲ）を含み且つ完全長抗体と同じ同起源抗原に特異的に結合する抗原結合フラグメントや、抗体の重鎖定常領域を含み且つ細胞表面のＦｃ受容体に結合するＦｃフラグメントである。抗体フラグメントは、化学的又は酵素的処理や、化学合成又は組換えＤＮＡ技術などの様々な方法によって取得することができる。抗体フラグメントの例としては、Ｆｖ（フラグメント可変領域）、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖフラグメント）、ｄｓＦｖ（ジスルフィド結合によって安定化させた可変フラグメント）、ｓｃｄｓＦｖ（単鎖ジスルフィド結合によって安定化させた可変フラグメント）、ダイアボディ、Ｆｄ（困難フラグメント）、Ｆａｂ（抗原結合フラグメント）、ｓｃＦａｂ（単鎖Ｆａｂ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ（結晶化可能領域フラグメント）及びそれらの任意の誘導体を含むが、これらに限定されない。
ＨＥＲ２とは、上皮成長因子（ＥＧＦＲ）受容体チロシンキナーゼファミリーに属するヒト上皮成長因子受容体２を指す。本出願において、用語ＥｒｂＢ２とＨＥＲ２は同じ意味を有し、交換的に使用できる。
本明細書で使用されるように、用語「天然アミノ酸」は、タンパク質の構成アミノ酸であるアミノ酸を指し、一般的な２０のアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）と、あまり一般的ではないセレノシステイン及びピロリジンを含む。本明細書で使用されるように、用語「非天然アミノ酸」は、タンパク質の構成アミノ酸ではないアミノ酸を指す。具体的には、該用語は、上記で定義した天然アミノ酸でないアミノ酸を指す。
本明細書でアミノ酸配列を指定する場合、別段の説明がない限り、標準的な一文字アミノ酸コードが使用される。したがって、例えば、ＬＰＸＴＧは配列－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｘ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－を表し、ここでＸは任意の天然又は非天然の単一アミノ酸残基であり、ＬＰＥＴＧはＬｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－を表し、ＬＰＥＴＧＧは－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－を表し、ＧＧＧは－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－を表す。
本明細書で使用されるように、用語「ペプチド模倣体」とは、特定のペプチドのコンフォメーション及び所望の特徴を模倣する化合物を指す。
本明細書で使用されるように、「受容体」は、細胞内又は表面に存在し、特定の物質に結合して細胞内で特定の効果を引き起こす構造を指す。受容体は、本明細書に記載のＴ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、及び、シグナル分子、細胞成長因子とサイトカインの受容体を含み得る。
本明細書で記載されるように、化学物質（例えばイオン、分子、基又は原子団）間の相互作用は非共有相互作用を指し、水素結合、π－πスタッキング、イオン相互作用、イオン誘起双極子力及びイオン双極子力を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるように、用語「イオン化」とは、酸性基中の１つ又は複数の酸性水素を解離して１つ又は複数の負電荷を持つ基を形成し、又は１つ又は複数のプロトンを塩基性基に結合させて１つ又は複数の正電荷を持つ基を形成することを指す。例えば、「イオン化可能な」カルボキシル基は、負電荷を持つ基（－ＣＯＯ－）を形成することができ、「イオン化可能な」アミノ基は、正電荷を持つ基（－ＮＨ３ ＋）を形成することができる。１つ又は複数のイオン化可能な酸性基及び１つ又は複数のイオン化可能な塩基性基を同時に有する分子は、両性イオンを形成することができる。
用語「逆相クロマトグラフィー」（ＲＰＣ）は、疎水性固定相と極性移動相を使用する任意のクロマトグラフィー方法を含み、前記疎水性固定相は、疎水性又は極性の低い分子に対してより強い親和性を有する。
「逆相液体クロマトグラフィー」（ＲＰＬＣ）は、バイオ医薬品の研究及び製造で広く使用されている技術である。ＲＰＬＣに一般的に使用される固定相はＲＰ改質シリカゲルであり、例えば、シリカゲルに例えばアルキル鎖及び／又はシクロアルキル基又はアリール基（例えばフェニル基、ペンタフルオロフェニル基、シクロヘキシル基）等のヒドロカルビル基がグラフトされたものである。「単官能性」アルキルシリカゲル固定相とは、１分子のシランとシリカゲル担体上の１つのシラノール基との反応から得られた固定相を指す。「二座」結合アルキルシリカゲル固定相とは、２つの反応基を含む１分子の二座シランとシリカゲル担体上の２つのシラノール基との反応から得られたアルキルシリカゲル固定相を指す。１つの二座シランに２つの官能基（例えば、メチル基、ｎ－ブチル基、ｎ－オクチル基又はｎ－オクタデシル等のアルキル基）を持つ二座固定相は、二官能性固定相とも呼ばれる。アルキル結合シリカゲル等のアルキルシリカゲル固定相の例としては、Ｃ１８、Ｃ８、Ｃ４又はＣ１アルキル基、特にＣ１８アルキル基に結合するシリカゲルを含むが、これらに限定されない。アルキル結合シリカゲル中のアルキル基は直鎖でも分岐でもよい。一実施形態において、アルキル結合シリカゲル中のアルキル基は、直鎖のＣ１８アルキル基（ｎ－オクタデシル基）である。一実施形態において、アルキル結合シリカゲル中のＣ１８アルキル基は分岐しており、且つＣ１－Ｃ６アルキル基（好ましくはイソプロピル基、イソブチル基）及びそれらの任意の組合せから選択される１つ又は複数の側鎖アルキル基を含む。一部のアルキルシリカゲル固定相は、例えばカルバメート基（例えばＳｙｍｍｅｔｒｙ ＳｈｉｅｌｄＴＭ ＲＰ Ｃ１８）、アミド基（例えばＺｏｒｂａｘ Ｂｏｎｕｓ－ＲＰ Ｃ１８）等の埋め込み官能基を含む。混合モードの改質シリカゲルもＲＰＬＣに使用され、例えば、ヒドロカルビル基で部分的にエンドキャップされ、残留（エンドキャップされていない）シリカシラノールを一定の割合で含むシリカゲル、及び、ヒドロカルビル基で部分的にエンドキャップされ、改質極性基を一定の割合で含む例えばＮＨ２－修飾のシリカゲル等である。ＲＰ－改質シリカゲルは、適切な装置で堅牢なクロマトグラフィー分離を実現できることを考えると、任意の適切な形状の粒子であり得る。例えば、アルキル結合シリカゲルは、一般に球状粒子であり得る。場合によっては、ＲＰ改質シリカゲルは表面が多孔質であるか、又は完全に多孔質（表面及び内部）である。別の実施形態において、ＲＰ改質シリカゲルは、制御された表面多孔率を有し、孔径は１０Å～１μｍ、好ましくは２０～６００Å、より好ましくは４０－３００Åであり、例えば６０Å、７０Å、８０Å、９０Å、１００Å、１１０Å、１２０Å、１３０Å、１４０Å、１５０Å、１６０Å、１７０Å、１８０Å、１９０Å、２００Å、３００Åである。さらなる実施形態において、ＲＰ改質シリカゲルは、制御された表面多孔率を有し、ＲＰ－改質シリカゲルの孔径は上記の通りである。
ＲＰＬＣの移動相は、有機溶媒と水の混合溶媒であってもよい。いくつかの文献では、有機溶媒は「有機改質剤」とも呼ばれる。ＲＰＬＣ用の水性二成分移動相の例としては、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、ｉ－ＰｒＯＨ／Ｈ２Ｏ又はＴＨＦ／Ｈ２Ｏを含むが、これらに限定されない。ＲＰＬＣ用の水性三成分移動相の例としては、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏを含むが、これらに限定されない。
ＲＰＬＣのメカニズムは、一般に、移動相の極性を変化させることによって制御される固定相と溶質の相互作用と、溶質－溶媒及び溶媒－溶媒分散相互作用との方面に関連しています。液体クロマトグラフィーにおける溶質保持理論は、１９６０年代から発展してきた。分子相互作用に基づく保持モデル、例えば、溶質－溶媒相互作用（Ｓｃｏｔｔ－Ｋｕｃｅｒａ相互作用モデル）、溶質－溶媒相互作用及び吸着中の溶質及び／又は溶媒の局在化（線形溶媒強度（ＬＳＳ）モデルとも呼ばれるＳｎｙｄｅｒ－Ｓｏｃｚｅｗｉｎｓｋｉモデル）を確立するための努力がなされていた。しかしながら、クロマトグラフィー保持に影響を与える多くの要因とパラメーターの変動性を考慮すると、一般的に、ＬＣ保持メカニズムの詳細はまだ不明である。「高圧クロマトグラフィー」の発展過程で、小粒子のカラムフィラーと高いカラム圧を使用することによって、クロマトグラフィーの精度とロバスト性の両方が向上し、例えばソルバトクロミック分析（線形溶媒化－エネルギー関係に基づく方法，ＬＳＥＲ）等、いくつかの新しい保持モデリング方法が報告されている。ペプチドのＲＰＬＣメカニズムはペプチドのサイズに関連し、オリゴペプチドのメカニズムは他の小分子に類似する。ペプチド保持を予測するためのいくつかの半経験的モデルが提案され、アミノ酸残基と固定相の相互作用の相互作用強度を表すために、いくつかの計算された「係数」が使用される。これらの係数は、疎水、親水、イオン及びその他の相互作用を区別しない。しかしこのような発展があっても、実際の実験環境で満足のいく予測モデルはまだない。未知の小分子又は大分子の大量同定のためのクロマトグラフィー挙動の予測に成功した例は報告されていない。
「疎水性」とは、水が非極性分子を排除する傾向から生じる水性環境における非極性基又は分子の会合であり、溶質が水性環境よりも非水性を好む相対的傾向の尺度として理解され、又は２つ（又はそれ以上）の溶質分子が水溶液中で凝集する傾向の尺度とされる。「親油性」は、親油性環境に対する分子又は部分の親和力を表し、通常、液－液（例えば、１－オクタノール／水中での分配係数）システム又は固－液（例えば、ＴＬＣ又はＲＰ ＨＰＬＣでの保持）システムである二相システムにおける分布挙動によって測定される。用語「親油性」と「疎水性」は、特定の化学物質を説明するために本明細書で使用される場合、該化学物質の同一特徴を表し、したがって交換的に使用できる。
組成成分の保持因子（ｋ）は、式ｋ＝（ｔＲ－ｔＭ）／ｔＭ＝（ＶＲ－ＶＭ）／ＶＭを使用してクロマトグラムから決定することができ、式中ｔＲとＶＲはそれぞれ組成成分の保持時間及び保持体積であり、ｔＭは、例えば空気又は保持されない溶媒ピーク又は保持されないマーカー等、保持されない組成成分の保持時間であり、ＶＭは、保持されない組成成分の溶出に必要な移動相体積である。保持因子の対数形式ｌｏｇ ｋは、親油性の指数として使用され。しかしながら、親油性を定量化するために、ｌｏｇ ｋは、ｌｏｇ Ｐと同等に重要なパラメーターではない。いくつかの場合において、ｌｏｇ ｋは振盪フラスコ分配データ（ｌｏｇ Ｐ）との良好な相関関係を示すが、低速平衡システムとクロマトグラフィー分配システムとの間に明らかな差が示される。
クロマトグラフィー分解能（Ｒ）は、式Ｒ＝２（ｔＲ２－ｔＲ１）／（Ｗ１＋Ｗ２）を使用して計算され、式中、ｔＲ２及びｔＲ１は、２種の組成成分の保持時間であり、Ｗ２及びＷ１は、ピークの比較的直線的な側をベースラインに外挿することによって得られるピークベースの対応する幅である。
本明細書で使用される場合、表現「十分なクロマトグラフィー分離」及び類似の表現は、クロマトグラフィーの分解能（Ｒ）＞０．８、好ましくは＞０．９、例えば、＞１．０、＞１．１、＞１．２、＞１．３、＞１．４、＞１．５、＞１．６、＞１．７、＞１．８、＞１．９又は＞２．０であることを指す。特定の一実施形態において、Ｒ＞１．０である。別の特定の実施形態において、Ｒ＞１．５である。当業者は、異なる要求及び状況に応じて、クロマトグラフィー結果の期待値を設定及び調整することができる。いくつかの場合において、精製が完全（１００％純度）である必要がないことを理解すべきであり、分離前に定められた所定純度（例えば、＞９９％、＞９８％、＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％又は＞６０％）は十分と見なすことができる。
イオン化できる溶質のＲＰＬＣでは、溶質の保持時間は、非イオン化形で最も長く、イオン化形で最も短い。移動相のｐＨを変更すると（例えば溶出系列で）、イオン化できる溶質の保持時間は、常にイオン化と非イオン化形の保持時間の間にある。
ＲＰＬＣにおける溶出勾配は、一般的に有機溶媒含有量の増加又は時間の経過とともにｐＨ値が変化する勾配を指す。ピーク圧縮現象は、勾配分離の特徴である。勾配分離の過程で、ピーク前部（カラム出口に近い）と後部（カラム入口に近い）にある溶質の動きは異なる。ピーク後部の溶質が前部よりも速く移動する場合、ピーク幅の圧縮が見られる。したがって、有機溶媒の含有量／移動相のｐＨ値を調整することによって、保持時間だけでなくピーク幅も調整することができる。しかしながら、ｐＨ勾配分離におけるピーク圧縮現象によるピーク幅の変化は正確に予測することができないことに注意する必要がある。
移動相のｐＨ勾配は、例えば溶質の属性、酸性／塩基性物質の含有量、温度、及び移動相が部分的に水性である時の有機溶媒の割合等を含むパラメーターの結果である。
本開示に記載した具体的なｐＫａ値又はｐＫａ値の範囲は、水溶液中で測定された値を指す。本開示で開示されていないｐＫａ値については、ＩＵＰＡＣによって公開されたものを参照することができ、例えばＩｏｎｉｓａｔｉｏｎ Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｓｅｒｊｅａｎｔ，Ｅ．Ｐ．，Ｄｅｍｐｓｅｙ Ｂ．，ＩＵＰＡＣ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄａｔａ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ． ２３，１９７９． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐ． ９８９を参照することができる。特定のｐＨ値又はｐＨ値範囲とは、言及されている液体又は溶液が部分的にのみ水性である時の見かけのｐＨ値を指す。
産業界では、例えば常圧クロマトグラフィー、中圧クロマトグラフィー及び高圧クロマトグラフィー等、異なる圧力範囲でのクロマトグラフィー方法が開発されている。用語「過圧クロマトグラフィー」とは、周囲圧力よりも大きい圧力を適用するクロマトグラフィー方法を指す。「高圧クロマトグラフィー」とは、移動相と液体又は適切に溶解した固体サンプルを高圧でカラムを通過させるクロマトグラフィー方法を指し、ここで「高圧」は、移動相を所望の流量で固定相の粒子を通過させるのに十分であり、前記粒子は、通常、常圧クロマトグラフィー又は中圧クロマトグラフィーで適用される粒子よりも粒径が小さい。一実施形態において、本開示のＲＰＬＣ方法で使用される固定相は、ＲＰ改質シリカゲルであり、粒径は１～３００μｍ、好ましくは１～２００μｍ、より好ましくは１～１００μｍ、さらに好ましくは１～８０μｍ、より好ましくは３～６０μｍであり、例えば、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１１μｍ、１２μｍ、１３μｍ、１４μｍ、１５μｍ、２０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍである。
逆相イオン対（ＲＰＩＰ）クロマトグラフィー法（ＲＰＩＰｃ）（イオン対逆相クロマトグラフィー法（ＩＰＲＰ）とも呼ばれる）とは、移動相に少量のイオン対を添加することで（例えば、イオン対試薬を添加することで）、強極性化合物の保持が増加するクロマトグラフィー方法を指す。得られたイオン対の保持はｐＨ、対イオン濃度及び移動相の極性によって制御される。いくつかの場合において、強極性化合物は荷電分子であり、一般的な逆相クロマトグラフィーで保持されない。ＲＰＬＣのメカニズムは、イオン対の可能な影響を排除するものではない。ＲＰＬＣ移動相中の酸性又は塩基性物質の存在は、溶質とイオン対を形成することによって、例えばイオン化形の溶質とイオン対を形成することによって、環境のｐＨ値に関して溶質のクロマトグラフィー挙動に影響を与える可能性がある。
用語「クロマトグラフィープロセス」は抽象的な用語であり、一般にクロマトグラフィー法を使用する分離プロセスを指す。分離プロセスは、分離のための操作と、任意に、クロマトグラフィー媒体の洗浄、平衡化又は再生のための操作とを含むことができる。
溶出剤の「分離範囲」は分離に使用される溶出剤を指し、溶出剤の「平衡化範囲」は、平衡化に使用される溶出剤を指す。分離範囲は、時間の経過とともに変化する溶出剤の組成を表すことができ、前記変化は、例えば標的製品の溶出完了等の重要な出来事等の時間帯の終了によって終了できることを理解すべきである。
本開示の方法
分離方法
第１態様では、本開示は、混合物１から１つ又は複数の標的化合物を分離する方法を提供し、前記混合物１は４つの化合物を含み、前記４つの化合物の各々は部分１、部分２及び部分３を含む。
部分１は、式（Ｉ）～（ＩＶ）から選択される開環チオスクシンイミド構造を有する。
Figure 2024500921000008
 ただし、
部分１中のチオール基とアミド基は２つの連結部位を構成し、部分２はその一方を介して部分１に連結され、部分３はその他方を介して部分１に連結され、
部分２は１つ又は複数のキラル中心を含み、
前記４つの化合物中の部分１は異なり、
部分３は前記分子中の残りの部分であり、
部分３の分子量は１９００以下であり、
前記１つ又は複数の標的化合物は混合物１に含まれる４つの化合物から選択される。
前記方法は、
（１）混合物１を用意するステップと、
（２）混合物１をクロマトグラフィーにかけて標的化合物を得るステップと、を含み、
ただし、
ａ．前記標的化合物の各々は個別の生成物として得られ、又は
ｂ．２つの標的化合物は混合物として得られ、該混合物は混合物２と定義される。
チオール基の位置に応じて、式（Ｉ）及び（ＩＩ）をβと呼び、式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の立体配置をαと呼ぶ。
一実施形態において、前記方法は、下記ステップ（３）と（４）をさらに含む。
（３）ステップ（２）で収集された混合物３を含む溶出物を回収し、ここで混合物３は、ステップ（２）で分離された標的化合物とは異なる１つ又は複数の追加の標的化合物を含む。
（４）ステップ（３）で回収された溶出物をクロマトグラフィーにかけて前記追加の標的化合物を分離する。
一実施形態において、ステップ（１）は任意である。別の実施形態において、混合物１は、当分野で知られている合成方法によって用意される。
一実施形態において、１つ又は複数の標的化合物の各々は、主に、例えば純粋又は実質的に純粋な異性体形態であり、例えば他の異性体形態を実質的に含まず、例えば９０％超、例えば９５％超、例えば９８％超、例えば少なくとも９９％の純度を有する。
１．分離ステップ
一実施形態において、各標的化合物中の部分１は異なる。
一実施形態において、ステップ（２）及びステップ（４）において、４つの標的化合物が得られ、その２つの標的化合物はステップ（２）において個別の生成物として得られ、他の２つの標的化合物はステップ（４）において個別の生成物として得られる。
好ましい実施形態において、ステップ（２）において個別の生成物として得られた２つの標的化合物中の部分１はそれぞれ式（Ｉ）又は式（ＩＩ）を有し、ステップ（４）において個別の生成物として得られた２つの標的化合物中の部分１はそれぞれ式（ＩＩＩ）又は式（ＩＶ）を有する。
別の好ましい実施形態において、ステップ（２）において、混合物１に含まれる３つの標的化合物は個別の生成物として得られ、残りの１つはステップ（４）において得られる。
さらなる好ましい実施形態において、ステップ（２）において４つの標的化合物が得られ、その２つの標的化合物は個別の生成物として得られ、残りの２つの標的化合物は混合物２として得られる。より好ましい実施形態において、ステップ（２）において個別の生成物として得られた２つの標的化合物中の部分１はそれぞれ式（Ｉ）又は式（ＩＩ）を有し、混合物２として得られた２つの標的化合物中の部分１はそれぞれ式（ＩＩＩ）又は式（ＩＶ）を有する。
２．固定相
一実施形態において、ステップ（２）とステップ（４）におけるクロマトグラフィーは逆相クロマトグラフィーである。別の実施形態において、ステップ（２）とステップ（４）の逆相クロマトグラフィーで使用される固定相はそれぞれ独立して、アルキル結合シリカゲルから選択される。
本開示で使用されるアルキル結合シリカゲルは、特に限定されない。許容可能なクロマトグラフィー結果を得ることができれば、任意のアルキルシリカゲル固定相を使用することができる。好ましい一実施形態において、ステップ（２）とステップ（４）の逆相クロマトグラフィーで使用される固定相はＣ１８結合シリカゲル（即ち、Ｃ１８アルキル結合シリカゲル）である。好ましい一実施形態において、Ｃ１８結合シリカゲル中のアルキル基は、直鎖Ｃ１８アルキル（ｎ－オクタデシル基）である。一実施形態において、Ｃ１８結合シリカゲルは、一般的に球状粒子である。別の実施形態において、Ｃ１８結合シリカゲルは、制御可能な表面多孔率を有し、孔径は２０～６００Å、好ましくは４０～３００Å、より好ましくは４０～２００Åであり、例えば６０Å、１００Å、１１０Å、１２０Å、１５０Å、２００Å、３００Åである。
３．移動相
一実施形態において、ステップ（２）における移動相は次の通りである。
溶出剤の組成として、
溶出剤Ａは、酸性剤１を任意に含有する水であり、
溶出剤Ｂは、酸性剤２を任意に含有する有機溶媒１であり、
ただしその条件として、酸性剤１及び酸性剤２のうちの少なくとも１つが存在し、
分離範囲について、Ｂは約０％～３０％から約３０％～１００％の勾配であり、残りはＡであり、
前記酸性剤１と酸性剤２は独立して無機酸又は有機酸である。
一実施形態において、有機溶媒１はメタノール及びＡＣＮから選択される。好ましい一実施形態において、有機溶媒１はメタノールである。
一実施形態において、ステップ（２）における移動相の分離範囲について、Ｂは約４０％～５０％から約５０％～７０％の勾配であり、残りはＡである。
一実施形態において、酸性剤１及び酸性剤２のうちの少なくとも１つが存在する。好ましい一実施形態において、酸性剤１と酸性剤２は両方とも存在する。
一実施形態において、酸性剤１と酸性剤２（存在する場合）の量は、溶出剤Ｃ及び溶出剤Ｄの勾配が酸性剤１及び酸性剤２の勾配を伴うような量である。
一実施形態において、酸性剤１は、Ｒｃ（ＣＯＯＨ）ｄの構造を有し、ここでｄは１又は２であり、Ｒｃは、Ｃ１－１５ヒドロカルビル基又はヒドロカルビレン基であり、Ｒｙから選択される少なくとも１つの置換基によって任意に置換され、Ｒｙは、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＯＣＨ２ＣＨ３、－ＳＨ、－ＳＣＨ３から選択され、好ましくは－ＯＨである。好ましい一実施形態において、Ｒｃ中のＣ１－１５ヒドロカルビル基は、Ｃ１－１５アルキル基、アルキレン基、Ｃ１－１５アルケニル基、又はＣ１－１５アルケニレン基であり、Ｒｙから選択される１つ、２つ、３つ又は４つの置換基によって任意に置換される。別の好ましい実施形態において、ｄは１であり、Ｒｃ中のＣ１－１５ヒドロカルビル基は、Ｃ１－１０アルキル基、好ましくはＣ１－４アルキル基である。好ましい一実施形態において、Ｒｃ中のＣ１－１５ヒドロカルビル基はＣ１－２アルキル基である。特定の一実施形態において、Ｒｃ中のＣ１－１５ヒドロカルビル基はメチル基である。好ましい一実施形態において、ｄは２であり、Ｒｃ中のＣ１－１５ヒドロカルビル基は、Ｃ２－４アルキレン基、特にエチレン基であり、１つの又は２つの－ＯＨ基によって任意に置換される。
一実施形態において、酸性剤１は有機酸から選択される。一実施形態において、酸性剤１のｐＫａ値は、０．１～６．５、例えば、０．４～６．５、０．６～６．５、１．０～６．５、２．０～６．５、又は２．０～５．５である。好ましい一実施形態において、酸性剤１は有機酸から選択され、酸性剤１のｐＫａ値は、４．０～５．５、例えば、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、又は約５．５であり、特に約４．７又は約４．８、例えば、約４．７１、約４．７２、約４．７３、約４．７４、約４．７５、約４．７６、約４．７７、約４．７８、又は約４．７９である。別の好ましい実施形態において、酸性剤１は有機酸から選択され、酸性剤１のｐＫａ値は２．３～３．８、例えば、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、又は約３．８であり、特に約３．０又は約３．１、例えば、約３．０１、約３．０２、約３．０３、約３．０４、約３．０５、約３．０６、約３．０７、約３．０８、又は約３．０９である。
別の実施形態において、酸性剤１はＡｃＯＨ及びＬ－酒石酸（Ｌ－ＴＡ）から選択される。好ましい一実施形態において、酸性剤１はＡｃＯＨであり。一実施形態において、酸性剤１の量は、溶出剤Ａの全体積に基づいて約０．０１％～約１％である。好ましい一実施形態において、酸性剤１の量は、溶出剤Ａの全体積に基づいて約０．０５％～約０．５％、好ましくは約０．１％～約０．５％、より好ましくは約０．１％～約０．３％であり、特に０．３％である。
一実施形態において、酸性剤２は存在しない。別の実施形態において、酸性剤２の種類は酸性剤１と同様である。
一実施形態において、酸性剤２の量は、溶出剤Ｂの全体積に基づいて約０．０１％～約１％である。別の実施形態において、酸性剤２の量は、溶出剤Ｂの全体積に基づいて約０．０５％～約０．５％、好ましくは約０．１％～約０．５％、より好ましくは約０．１％～約０．３％であり、特に０．３％である。
一実施形態において、標的化合物を溶出する時、酸性剤１と酸性剤２の総量は、溶出剤Ａと溶出剤Ｂの全体積に基づいて約１％以下、好ましくは約０．８％以下、より好ましくは約０．６％以下であり、例えば、約０．４％以下、特に約０．２８５％以下である。
一実施形態において、溶出組成物中で酸性剤１と酸性剤２（存在する場合）の総含有量は、約０．００５～０．０６Ｍである。
代替的な一実施形態において、酸性剤１と酸性剤２の含有量は、目標とするｐＨプロファイル（ｐｒｏｆｉｌｅ）、例えば、目標とするアイソクラティックｐＨ値又は目標とするｐＨ勾配を得るために、動的に設定及び／又は調整される。
一実施形態において、移動相のｐＨは、約１．０～約４．０である。別の実施形態において、移動相のｐＨは、約１．０～約３．５である。一実施形態において、移動相のｐＨは、約２．０～約３．５である。別の実施形態において、移動相のｐＨは、約２．４～約３．２である。
一実施形態において、ステップ（４）における移動相は次の通りである。
溶出剤の組成として、
溶出剤Ｃは、酸性剤３を任意に含有する水であり、
溶出剤Ｄは、酸性剤４を任意に含有する有機溶媒２であり、
分離範囲について、Ｄは約０％～３０％から約３０％～１００％の勾配であり、残りはＣであり、
前記酸性剤３と酸性剤４は独立して無機酸又は有機酸である。
一実施形態において、有機溶媒２は、メタノール及びＡＣＮから選択される。好ましい一実施形態において、有機溶媒２はＡＣＮである。
一実施形態において、酸性剤３及び酸性剤４のうちの少なくとも１つが存在する。好ましい一実施形態において、酸性剤３と酸性剤４は両方とも存在する。
一実施形態において、ステップ（４）における移動相の分離範囲について、Ｄは約１０％～３０％から約３０％～９５％の勾配であり、残りはＣである。
一実施形態において、酸性剤３と酸性剤４（存在する場合）の量は、溶出剤Ｃ及び溶出剤Ｄの勾配が酸性剤３及び酸性剤４の勾配を伴うような量である。
酸性剤３と酸性剤４の物質は、十分なクロマトグラフィー分離を実現できれば、特に限定されない。
一実施形態において、酸性剤２は有機酸から選択される。別の実施形態において、酸性剤２のｐＫａ値は、０．１～６．５、例えば、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、又は約６．５である。
一実施形態において、酸性剤３と酸性剤４は独立して、ＴＦＡ、リン酸緩衝液、酢酸アンモニウム（ＡＡ）、ＡｃＯＨ、Ｈ３ＰＯ４、ＴＥＡＰ及びＬ－酒石酸（Ｌ－ＴＡ）から選択される。好ましい一実施形態において、酸性剤３は、ＴＦＡ、リン酸緩衝液、ＡＡ及びＴＥＡＰから選択される。より好ましい実施形態において、酸性剤３は、ＴＦＡ、リン酸緩衝液及びＴＥＡＰから選択され、特にＴＦＡである。
一実施形態において、酸性剤４は存在しない。別の実施形態において、酸性剤４の種類は酸性剤３と同様である。
一実施形態において、酸性剤３の量は、溶出剤Ｃの全体積に基づいて約０．０１％～約１％である。別の実施形態において、酸性剤３の量は、溶出剤Ｃの全体積に基づいて約０．０５％～約０．５％、好ましくは約０．０５％～約０．３％、特に０．１％である。
一実施形態において、酸性剤４の量は、溶出剤Ｄの全体積に基づいて約０．０１％～約１％である。別の実施形態において、酸性剤４の量は、溶出剤Ｄの全体積に基づいて約０．０５％～約０．５％、好ましくは約０．０５％～約０．３％であり、特に０．１％である。
一実施形態において、ステップ（４）における移動相の分離範囲について、Ｄは約１０％～３０％から約３０％～９５％の勾配であり、残りはＣである。
一実施形態において、溶出組成物中で酸性剤３と酸性剤４（存在する場合）の総含有量は、約０．０１～０．２５Ｍである。
代替的な一実施形態において、酸性剤３と酸性剤４の含有量は、目標とするｐＨプロファイル、例えば、目標とするアイソクラティックｐＨ値又は目標とするｐＨ勾配を得るために、動的に設定及び／又は調整される。
一実施形態において、移動相のｐＨは、約１．０～約６．０である。具体的な一実施形態において、移動相のｐＨは、約２．０～約５．０、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、又は約５．０である。
一実施形態において、アイソクラティックｐＨ値が適用され、前記アイソクラティックｐＨ値は、約２．０～約６．０の範囲内にある。別の実施形態において、移動相のアイソクラティックｐＨ値は、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約５．０、又は約６．０である。
前記方法は、ステップ（２）の前に、任意の平衡化ステップをさらに含み、移動相は上記で定義した通りであり、移動相の平衡化範囲は、約１００％～９５％Ａと約０％～５％Ｂであり、例えば約９５％Ａと約５％Ｂである。別の代替的な実施形態において、前記方法は、ステップ（４）の前に、任意の平衡化ステップをさらに含み、移動相は上記で定義した通りであり、移動相の平衡化範囲は、約１００％～９５％Ｃと約０％～５％Ｄであり、例えば約９５％Ｃと約５％Ｄである。
４．溶質（標的化合物）
一実施形態において、部分２のｌｏｇ Ｐ（オクタノール－水分配係数）値は、約１～約５、好ましくは約１．５～約４．５、約２～約４．５、又は約２．５～約４．５であり、例えば、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、又は約４．５である。
一実施形態において、部分２は下記式（Ｖ）を有し、
Figure 2024500921000009
 式中、Ｑは、少なくとも１つのキラル中心を含む基であり、
Ｌ１は存在しないか、又はＣ１－１０アルキレン基、Ｃ３－１０シクロアルキレン基、Ｃ６－１０アリーレン基、４～１０員ヘテロシクリレン基、５～１０員ヘテロアリーレン基、－ＮＨ－、－（ＣＯ）－、－ＮＨ（ＣＯ）－、及び－（ＣＯ）ＮＨ－から選択される１つ又は複数の二価基である。
一実施形態において、ＱはＣ５－５０ヒドロカルビル基であり、
前記ヒドロカルビル基中の１つ又は複数の「ＣＨ２」構造は、安定した構造が形成されることを条件として、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＳ（＝Ｏ）２－、又は－Ｓ（＝Ｏ）２ＮＨ－によって任意に置き換えられ、
前記ヒドロカルビル基中の１つ又は複数の「ＣＨ」構造は、安定した構造が形成されることを条件として、Ｎ又はＰによって任意に置き換えられ、
Ｑ中の１つ又は複数の炭素原子、硫黄原子、窒素原子又はリン原子は独立して、オキソ（＝Ｏ）によって任意に置換され、
Ｑは、Ｒｑから選択される少なくとも１つの置換基によって任意に置換され、Ｒｑはそれぞれ独立して、Ｒａ１、－ＯＲａ１、－ＳＲａ１、－ＮＲａ１Ｒｂ１、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａ１、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ１Ｒｂ１、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒａ１、－Ｓ（＝Ｏ）２ＯＲａ１、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｒａ１、－Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲａ１Ｒｂ１、－Ｓ（＝Ｏ）Ｒａ１、－Ｃ（＝Ｓ）ＯＲａ１、－Ｃ（＝Ｓ）ＮＲａ１Ｒｂ１、－Ｃ（＝Ｓ）Ｒａ１、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲａ１）ＯＲｂ１、－Ｃ（＝ＮＲａ１）ＮＲｂ１Ｒｃ１から選択され、
Ｒａ１、Ｒｂ１及びＲｃ１はそれぞれ独立して、水素及びＣ１－６アルキル基から選択される。
一実施形態において、Ｑ中のシクロアルキル基構造はそれぞれ独立して、前記シクロアルキル基構造と同じ基原子価状態及び同じ環原子数を有する複素環構造によって任意に置き換えられる。
一実施形態において、Ｑ中のアリール基構造はそれぞれ独立して、前記アリール基構造と同じ基原子価状態及び同じ環原子数を有するヘテロアリール基構造によって任意に置き換えられる。
一実施形態において、Ｒｑはそれぞれ独立して、ハロゲン、－Ｃ１－３アルキル、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ１－３アルキル、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－３アルキル、及び－Ｓ（＝Ｏ）２－Ｃ１－３アルキルから選択される。非常に具体的な一実施形態において、Ｒｑは、ハロゲン、－ＣＨ３、－ＯＨ及び－ＯＣＨ３から選択される。
一実施形態において、Ｌ１は存在しない。
一実施形態において、部分２は下記式（Ｖ－１）の構造を有し、
Figure 2024500921000010
 式中、ペイロードは、水素、及び少なくとも１つのキラル中心を含む小分子化合物から選択され、
Ｌ１は上記で定義した通りである。
一実施形態において、小分子は、酵素阻害剤、酵素活性化剤、受容体調節剤（例えば、アゴニスト又は拮抗剤）、毒素（例えば細胞毒素）、グリカン、ＰＥＧ部分、放射性核種（例えば、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、６７Ｇａ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１９１ｍＯｓ、１９５ｍＰｔ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１１９Ｓｂ、１５３Ｓｍ、９９ｍＴｃ、２２７Ｔｈ及び９０Ｙ）、核酸及び類似体（例えば、干渉ＲＮＡ）、トレーサー分子（例えば、蛍光体及び蛍光分子）、低分子量ペプチド（例えば、分子量２０００Ｄａ以下、１０００Ｄａ以下、９００Ｄａ以下、８００Ｄａ以下、７００Ｄａ以下、６００Ｄａ以下、又は５００Ｄａ以下のタンパク質タグ、生物活性ペプチド、タンパク質毒素及び酵素）、低分子量ペプチド模倣体、低分子量抗体（例えばナノ抗体）及び抗体フラグメントから選択される。
一実施形態において、部分２は、イオン化可能な酸性基又はイオン化可能な塩基性基を含まない。別の実施形態において、部分２は、一定数のイオン化可能な酸性基とイオン化可能な塩基性基を含み、本明細書で使用されるクロマトグラフィー条件下で、部分２の総電荷は約ゼロである。イオン化可能な酸性基は、カルボキシル基、スルフィン酸基、スルホン酸基、ホスフィン酸基及びホスホン酸基等を含むが、これらに限定されず、特にカルボキシル基である。イオン化可能な塩基性基は、アミノ基、アミン等を含むが、これらに限定されず、特にアミノ基である。代替的な一実施形態において、ペイロードは、イオン化可能なカルボキシル基又はイオン化可能なアミノ基を含まない。別の代替的な実施形態において、ペイロードは、同数のイオン化可能なカルボキシル基とイオン化可能なアミノ基を含む。
一実施形態において、部分２は、下記式（Ｖ－１－１）の構造を有し、
Figure 2024500921000011
 式中、毒素は、１つ又は複数のキラル中心を含む細胞毒素部分であり、Ｌ１は上記で定義した通りである。
一実施形態において、Ｌ１は存在しないか、又はＣ１－１０アルキレン基から選択され、ここでアルキル基中の１つ又は複数の（－ＣＨ２－）構造は、オキソ（＝Ｏ）によって任意に置換される。
好ましい一実施形態において、細胞毒素は、タキサン類、メイタンシノイド類、アウリスタチン類、エポチロン類（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅｓ）、コンブレタスタチンＡ－４ホスフェート（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ Ａ－４ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、コンブレタスタチンＡ－４（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ Ａ－４）及びその誘導体、インドール－スルホンアミド類、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）等のビンブラスチン類、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ビンフルニン（ｖｉｎｆｌｕｎｉｎｅ）、ビングリシネート（ｖｉｎｇｌｙｃｉｎａｔｅ）、無水ビンブラスチン（ａｎｈｙ－ｄｒｏｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ドラスタチン１０（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ １０）及びその類似体、ハリコンドリンＢ、エリブリン（ｅｒｉｂｕｌｉｎ）、インドール－３－オキサミド類、ポドフィロトキシン類、７－ジエチルアミノ－３－（２’－ベンゾオキサゾリル）－クマリン（ＤＢＣ）、ディスコデルモリド（ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｏｌｉｄｅ）、ラウリマライド（ｌａｕｌｉｍａｌｉｄｅ）からなる群から選択される。別の実施形態において、細胞毒素は、例えば、カンプトテシン類及びその誘導体、ミトキサントロン、ミトグアゾン等のＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤からなる群から選択される。好ましい一実施形態において、細胞毒素は、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェナメット、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード等の窒素マスタード類からなる群から選択される。さらなる好ましい実施形態において、細胞毒素は、例えば、カルムスチン、フルベンズロン（ｆｌｕｂｅｎｚｕｒｏｎ）、ホルモテロール、ロムスチン、ニムスチン、ラムスチン等のニトロソウレア類からなる群から選択される。一実施形態において、細胞毒素は、アジリジン類からなる群から選択される。好ましい一実施形態において、細胞毒素は、ベンゾドーパ、カルボコン、メトレデパ、及びウレデパからなる群から選択される。一実施形態において、細胞毒素は、抗腫瘍抗生物質からなる群から選択される。好ましい一実施形態において、細胞毒素は、エンジイン抗生物質類からなる群から選択される。より好ましい一実施形態において、細胞毒素は、ダイネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、エスペラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）、ネオカルチノスタチン、及びアクラシノマイシンからなる群から選択される。別の好ましい実施形態において、細胞毒素は、アクチノマイシン、アントラマイシン、ブレオマイシン類、アクチノマイシンＣ、カラビシン、カルミノマイシン、カージノフィリン、カルミノマイシン、アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、デトルビシン、アドリアマイシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン素、ペプロマイシン、ピューロマイシン、鉄アドリアマイシン、ロドルビシン、ルフォクロモマイシン、ストレプトゾシン、ジノスタチン、ゾルビシンからなる群から選択される。さらなる好ましい実施形態において、細胞毒素は、トリコテセン類からなる群から選択される。より好ましい一実施形態において、細胞毒素は、Ｔ－２毒素、（ベルカリン）ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ Ａ、バシロクポリンＡ、及びアンギジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ）からなる群から選択される。一実施形態において、細胞毒素は、抗腫瘍アミノ酸誘導体からなる群から選択される。好ましい一実施形態において、細胞毒素は、ウベニメックス、アザセリン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシンからなる群から選択される。別の実施形態において、細胞毒素は、葉酸類似体からなる群から選択される。好ましい一実施形態において、細胞毒素は、ジメチル葉酸、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート、及びエダトレキサートからなる群から選択される。一実施形態において、細胞毒素は、プリン類似体からなる群から選択される。好ましい一実施形態において、細胞毒素は、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、及びチオグアニンからなる群から選択される。さらなる実施形態において、細胞毒素は、ピリミジン類似体からなる群から選択される。好ましい一実施形態において、細胞毒素は、アンシタビン、ゲムシタビン、エノシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、及びフロクスウリジンからなる群から選択される。一実施形態において、細胞毒素は、アンドロゲン類から選択される。好ましい一実施形態において、細胞毒素は、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、及びテストラクトンからなる群から選択される。別の実施形態において、細胞毒素は、抗副腎薬からなる群から選択される。好ましい一実施形態において、細胞毒素は、アミノグルテチミド、ミトタン、及びトリロスタンからなる群から選択される。一実施形態において、細胞毒素は、抗アンドロゲン類からなる群から選択される。好ましい一実施形態において、細胞毒素は、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、酢酸リュープロレリン、及びゴセレリンからなる群から選択される。さらなる実施形態において、細胞毒素は、プロテインキナーゼ阻害剤及びプロテアソーム阻害剤からなる群から選択される。特別な一実施形態において、細胞毒素は、ビンブラスチン類、コルヒチン類、タキサン類、アウリスタチン類、及びメイタンシノイド類からなる群から選択される。
特別な一実施形態において、細胞毒素は、例えばＤＭ１等のメイタンシノイドである。なお、チオール基部分を含む細胞毒素を使用する時、チオール基部分は、マレイミド部分と反応してチオスクシンイミド、例えばメイタンシノイド、例えばＤＭ１を形成することができ、細胞毒素は、チオスクシンイミドを介して直接連結できることを注意すべきである。この場合、いくつかの実施形態において、ペイロードとチオール基部分が共同で細胞毒素を構成するため、この場合、ペイロードは、チオール基部分を除いた細胞毒素分子の残りの部分を表すことが理解可能である。
一実施形態において、混合物１中の４つの化合物の各部分３は同じであり、部分３の分子量は１９００ Ｄａ以下である。
一実施形態において、部分３の分子量は、１８００Ｄａ以下、１７００Ｄａ以下であり、好ましくは１６００Ｄａ以下、１５００Ｄａ以下、１４００Ｄａ以下、１３００Ｄａ以下、１２００Ｄａ以下、１１００Ｄａ以下、１０００Ｄａ、９００Ｄ以下ａ、８００Ｄａ以下、７００Ｄａ以下、６００Ｄａ以下、５００Ｄａ以下、４００Ｄａ以下、３００Ｄａ以下、又は２００Ｄａ以下である。特定の一実施形態において、部分３の分子量は、約１００～約２０００Ｄａであり、好ましくは約１００～約１５００Ｄａ、約１００～約１０００Ｄａ、約２００～約１０００Ｄａ、又は約２００～約６００Ｄａである。
特定の一実施形態において、部分３は下記式（ＶＩ）の構造を有し、
Figure 2024500921000012
 式中、Ｌ２は結合であるか、又はＣ１－１０アルキレン基、Ｃ３－１０シクロアルキレン基、Ｃ６－１０アリーレン基、４～１０員ヘテロシクリレン基、５～１０員ヘテロアリーレン基、－ＮＨ－、－（ＣＯ）－、－ＮＨ（ＣＯ）－、及び－（ＣＯ）ＮＨ－から選択される１つ又は複数の二価基であり、
Ｍは、（１）１～２０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列１と、（２）「－（Ｃ２Ｈ４－Ｏ）ｉ－」構造を含み、ｉが１～１００の整数である、任意に存在するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分と、（３）切断可能な配列１、スペーサーＳｐ１及びそれらの組合せから選択される二価の任意に存在する基Ｙと、を含み、
前記切断可能な配列は、酵素によって切断可能なアミノ酸配列２を含み、前記切断可能な配列は１～１０個のアミノ酸を含み、
Ｓｐ１は、１～２０個のアミノ酸を含むスペーサー配列、ＰＡＢ及びそれらの組合せから選択される。
一実施形態において、アミノ酸配列１は、リガーゼ認識モチーフを含み、即ちリガーゼ供与体基質認識モチーフ又はリガーゼ受容体基質認識モチーフを含む。一実施形態において、リガーゼは、トランスペプチダーゼである。好ましい一実施形態において、リガーゼは、ソルターゼである。一実施形態において、ソルターゼは、ソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）、ソルターゼＢ（ＳｒｔＢ）、ソルターゼＣ（ＳｒｔＣ）、ソルターゼＤ（ＳｒｔＤ）、ソルターゼＥ（ＳｒｔＥ）、ソルターゼＦ（ＳｒｔＦ）及びそれらの組合せから選択される。一実施形態において、リガーゼはＳｒｔＡである。別の具体的な実施形態において、リガーゼ認識モチーフはＬＰＸＴＧから選択され、ここでＸは、天然又は非天然の任意の単一アミノ酸であり得る。特定の一実施形態において、リガーゼ認識モチーフはＬＰＥＴＧである。さらなる具体的な実施形態において、リガーゼ認識モチーフはＧｎであり、ここでＧはグリシン（Ｇｌｙ）で、ｎは３～１０の整数である。
一実施形態において、ｉは１～１０である。
一実施形態において、Ｙは結合であるか、又は切断可能な配列、スペーサーＳｐ１及びそれらの組合せから選択される。特定の一実施形態において、Ｙは結合である。一実施形態において、アミノ酸配列２は、酵素基質として認識することができ、酵素によって切断することができる。特定の一実施形態において、アミノ酸配列２は、細胞のリソソーム中で酵素によって切断することができる。別の具体的な実施形態において、アミノ酸配列２は、プロテアーゼ、特にカテプシンによって切断することができる。さらなる具体的な実施形態において、アミノ酸配列２は、グルタミナーゼによって切断することができる。一実施形態において、アミノ酸配列２は、カテプシン制限部位、グルタミナーゼ制限部位及びそれらの組合せから選択される。一実施形態において、切断可能な配列は、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ、Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ及びそれらの組合せから選択される。
一実施形態において、Ｙは結合であるか、又はスペーサーＳｐ１から選択される。別の実施形態において、Ｓｐ１は、１～１０、好ましくは１～６、より好ましくは１～４個のアミノ酸を含むスペーサー配列である。特定の一実施形態において、Ｓｐ１はＬｅｕである。別の具体的な実施形態において、Ｓｐ１はＧｌｎである。一実施形態において、Ｓｐ１はＰＡＢである。さらなる実施形態において、ＹはＰｈｅ－Ｌｙｓ－ＰＡＢ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ及びＶａｌ－Ｌｙｓ－ＰＡＢから選択される。
一実施形態において、Ｙに含まれるアミノ酸は天然又は非天然であり得る。特定の一実施形態において、Ｙは結合であるか、又はアミノ酸配列３である。アミノ酸配列３は、それぞれ独立して同一又は異なる１～３０個の天然又は非天然アミノ酸を含む。アミノ酸配列３は、１～１０個のアミノ酸を含む切断可能な配列１、１～２０個のアミノ酸を含むスペーサーＳｐ１及びそれらの組合せから選択される。
一実施形態において、Ｍは、リジン、オリゴマーグリシン、オリゴマーアラニン、重合度３～１０のオリゴマーグリシン／アラニン混合物及びそれらの組合せから選択される。
一実施形態において、部分３のｐＫａは７以上１２以下である。好ましい実施形態において、部分３のｐＫａは、約８～約１２、好ましくは約９～約１１であり、例えば約９．０、約９．１、約９．２、約９．３、約９．４、約９．５、約９．６、約９．７、約９．８、約９．９、約１０．０、約１０．１、約１０．２、約１０．３、約１０．４、約１０．５、約１０．６、約１０．７、約１０．８、約１０．９、約１１．０であり、特に約１０．０である。
特定の一実施形態において、ＭはＬ（Ｇ）ｎであり、ここでＧはグリシン（Ｇｌｙ）であり、ｎは３～１０の整数であり、特に３である。別の特定の実施形態において、ＭはＧｎである。一実施形態において、ＭのＣ末端はＬ２に連結され、Ｍはイオン化可能なアミノ基を有する。特定の一実施形態において、Ｍは、イオン化できる基を１つだけ有し、イオン化可能なアミノ基である。イオン化可能なアミノ基は、基－ＮＨ３ ＋にイオン化できる。アミノ基のイオン化形－ＮＨ３ ＋は、任意に溶媒分子又は化学物質と相互作用することができ、前記化学物質は、負電荷（＋）又は部分負電荷（δ＋）を有する。
代替的な一実施形態において、ＭはＬＰＸＴＧＪであり、ここで、Ｘは天然又は非天然の任意の単一アミノ酸であり得、Ｊは存在しないか、又は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントであり、任意にタグを有する。一実施形態において、Ｊは存在しない。別の実施形態において、Ｊは１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントであり、その中の各アミノ酸は独立して、任意の天然又は非天然アミノ酸である。別の実施形態において、ＪはＧｍであり、ここでｍは１～１０の整数である。さらなる具体的な実施形態において、ＭはＬＰＥＴＧである。別の具体的な実施形態において、ＭはＬＰＥＴＧＧである。一実施形態において、ＭのＮ末端はＬ２に連結され、Ｍは遊離のＣ末端カルボキシル基を有する。特定の一実施形態において、Ｍはイオン化できる基を１つだけ有し、イオン化可能なカルボキシル基である。イオン化可能なカルボキシル基は、基－ＣＯＯ－にイオン化できる。カルボキシル基のイオン化形－ＣＯＯ－は、任意に溶媒分子又は化学物質と相互作用することができ、前記化学物質は正電荷又は部分正電荷（δ＋）を有する。
一実施形態において、式（ＶＩ）の構造は、下記式（ＶＩ－１）の構造を有し、
Figure 2024500921000013
 式中、ｎは３～１０の整数であり、ｘは、水素、ＯＨ、ＮＨ２、１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメント、及び１～１０個のヌクレオチドを含むヌクレオチドフラグメントから選択される。
一実施形態において、ｎは３である。好ましい一実施形態において、ｘは、ＯＨ、ＮＨ２、１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントから選択される。より好ましい実施形態において、ｘは、ＯＨ、ＮＨ２及びＧｌｙから選択される。特定の一実施形態において、ｘはＮＨ２である。
一実施形態において、Ｌ１とＬ２はそれぞれ独立して、結合及びＣ１－１０アルキル基から選択され、アルキル基中の１つ又は複数の（－ＣＨ２－）構造は、オキソ（＝Ｏ）によって任意に置換される。
一実施形態において、部分２中のＬ１は、
Figure 2024500921000014
 から選択され、部分３中のＬ２は結合である。
別の実施形態において、部分２中のＬ１は結合であり、部分３中のＬ２は
Figure 2024500921000015
 から選択される。
一実施形態において、混合物１に含まれる４つの化合物はそれぞれ独立して、下記式（１）及び（１’）から選択される構造を有し、
Figure 2024500921000016
 式中、ペイロードは式（Ｖ－１）で定義された通りであり、Ｍは式（ＶＩ）で定義された通りである。
一実施形態において、混合物１に含まれる４つの化合物はそれぞれ独立して、下記式（２）及び（２’）から選択される構造を有し、
Figure 2024500921000017
 式中、ペイロードは式（Ｖ－１）で定義された通りであり、Ｙは式（ＶＩ）で定義された通りであり、ｎとｘは式（ＶＩ－１）で定義された通りである。
特定の一実施形態において、式（１）の化合物及び式（１’）の化合物は、下記式（３）中のチオスクシンイミド基の開環反応の生成物であり、
Figure 2024500921000018
 式中、ペイロードは式（Ｖ－１）で定義された通りであり、Ｍは式（ＶＩ）で定義された通りである。
特定の一実施形態において、式（２）の化合物及び式（２’）の化合物は、下記式（４）中のチオスクシンイミド基の開環反応の生成物であり、
Figure 2024500921000019
 式中、ペイロードは式（Ｖ－１）で定義された通りであり、ｎとｘは式（ＶＩ－１）で定義された通りである。
チオスクシンイミド基の開環反応は、当分野で知られている任意の方法で行うことができ、例えば、開環反応の方法はＷＯ２０１５１６５４１３Ａ１で見つけることができる。
特定の一実施形態において、Ｍはイオン化可能なアミノ基を有し、酸性剤１はＡｃＯＨであり、酸性剤１の量は、溶出剤Ａの全体積に基づいて約０．０１％～約１％、好ましくは約０．０５％～約０．５％、より好ましくは約０．１％～約０．５％、より好ましくは約０．１％～約０．３％であり、特に０．３％であり、酸性剤２は存在しない。
別の具体的な実施形態において、Ｍはイオン化可能なアミノ基を有し、酸性剤３はＴＦＡであり、酸性剤３の量は、溶出剤Ｃの全体積に基づいて約０．０１％～約１％、好ましくは約０．０５％～約０．５％、より好ましくは約０．０５％～約０．３％であり、特に０．１％であり、酸性剤４は存在しないか、又は溶出剤Ｄの全体積に基づいて約０．０１％～約１％、好ましくは約０．０５％～約０．５％、より好ましくは約０．０５％～約０．３％、特に０．１％の量で存在する。
一実施形態において、混合物１は、部分１の開環チオスクシンイミド構造をもたらすチオスクシンイミド基の開環反応で得られた反応混合物である。
代替的な一実施形態において、Ｍは１つ又は複数の第一級アミノ基を含み、酸性剤１～４はそれぞれ、Ｍに含まれる１つ又は複数の第一級アミノ基とイオン対を形成することができる。別の代替的な実施形態において、酸性剤１～４は独立して、ＡｃＯＨ、Ｌ－ＴＡ及びＴＦＡから選択される。特に具体的な一実施形態において、酸性剤１は、ＡｃＯＨ又はＬ－ＴＡ、好ましくはＡｃＯＨである。別の特に具体的な実施形態において、酸性剤３はＴＦＡである。
代替的な一実施形態において、部分１はさらにＲ１によって置換され、部分１は下記式（ＶＩＩ）～（Ｘ）から選択される構造を有し、
Figure 2024500921000020
 式中、Ｒ１は水素及びＣ１－１０アルキル基から選択され、各Ｒ１のキラル立体配置は式（ＶＩＩ）～（Ｘ）において同じである。
一実施形態において、ステップ（２）におけるクロマトグラフィーは、逆相ＨＰＬＣで行われる。代替的な一実施形態において、ステップ（４）におけるクロマトグラフィーは、常圧クロマトグラフィー、中圧クロマトグラフィー及び高圧クロマトグラフィーから選択される方法で行われる。別の実施形態において、ステップ（４）における逆相クロマトグラフィーは、逆相ＨＰＬＣで行われる。
特定の一実施形態において、混合物１に含まれる４つの化合物はそれぞれ式（ｉ）～（ｉｖ）の構造を有し、
Figure 2024500921000021
 式中、ｘは－ＯＨ又は－ＮＨ２である。具体的な一実施形態において、ｘは－ＮＨ２であり、式（ｉ）～（ｉｖ）の化合物は式（ｉ－１）～（ｉｖ－１）の構造を有する。
Figure 2024500921000022
特定の一実施形態において、化合物（ｉ）及び（ｉｉ）はステップ（２）において個別の生成物として得られ、化合物（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）はステップ（４）において個別の生成物として得られる。
別の具体的な実施形態において、ステップ（２）において、化合物（ｉ）及び（ｉｉ）は個別の生成物として得られ、化合物（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）は混合物２として得られる。
一実施形態において、混合物１は次の化合物中のチオスクシンイミド基の開環反応で得られた反応混合物であり、
Figure 2024500921000023
 式中、ｘは－ＯＨ又は－ＮＨ２である。
特定の一実施形態において、ステップ（２）の逆相クロマトグラフィー分離範囲について、
Ｂは約４３％～約５３％の勾配であり、残りはＡであり、時間は１０～１００分、好ましくは３０～５０分である。
特定の一実施形態において、ステップ（２）の逆相クロマトグラフィー分離範囲について、
Ｂは約４３％～約４８％の勾配であり、残りはＡであり、時間は１０～１００分、好ましくは４８分である。
特定の一実施形態において、ステップ（２）の逆相クロマトグラフィーのカラム温度は、約１０～約４０℃、好ましくは約２０～約３０℃である。別の具体的な実施形態において、逆相カラムクロマトグラフィーのローディング量は、２０ｇ／Ｋｇ以下、１９ｇ／Ｋｇ以下、１８ｇ／Ｋｇ以下、１７ｇ／Ｋｇ以下、１６ｇ／Ｋｇ、１５ｇ／Ｋｇ以下、１４ｇ／Ｋｇ以下、１３ｇ／Ｋｇ以下、１２ｇ／Ｋｇ以下、１１ｇ／Ｋｇ以下、１０ｇ／Ｋｇ以下、９ｇ／Ｋｇ以下、８ｇ／Ｋｇ以下、７ｇ／Ｋｇ以下、６ｇ／Ｋｇ以下である。好ましい一実施形態において、逆相カラムクロマトグラフィーのローディング量は１４ｇ／Ｋｇ以下である。非常に特別な一実施形態において、逆相カラムクロマトグラフィーのローディング量は、約０．１ｇ／Ｋｇ～１４ｇ／Ｋｇ、好ましくは０．１ｇ／Ｋｇ～１４ｇ／Ｋｇであり、移動相の流量は一定であり、且つ約１００±５０ｍＬ／ｍｉｎ～約５００±５０ｍＬ／ｍｉｎの範囲にあり、特に約３００±５０ｍＬ／ｍｉｎである。
別の具体的な実施形態において、ステップ（４）の逆相クロマトグラフィーの分離範囲について、
Ｄは約２２％～約４２％の勾配であり、残りはＣであり、時間は２０～１００分である。
別の具体的な実施形態において、ステップ（４）の逆相クロマトグラフィーの分離範囲について、
Ｄは約２２％～約２８％の勾配であり、残りはＣである、時間は４４分である。
特定の一実施形態において、ステップ（２）の逆相クロマトグラフィーのカラム温度は、約１０～４０℃、好ましくは約２０～約３０℃である。別の具体的な実施形態において、逆相カラムクロマトグラフィーのローディング量は、２０ｇ／Ｋｇ以下、１９ｇ／Ｋｇ以下、１８ｇ／Ｋｇ以下、１７ｇ／Ｋｇ以下、１６ｇ／Ｋｇ以下、１５ｇ／Ｋｇ以下、１４ｇ／Ｋｇ以下、１３ｇ／Ｋｇ以下、１２ｇ／Ｋｇ以下、１１ｇ／Ｋｇ以下、１０ｇ／Ｋｇ以下、９ｇ／Ｋｇ以下、８ｇ／Ｋｇ以下、７ｇ／Ｋｇ以下、６ｇ／Ｋｇ以下である。好ましい一実施形態において、逆相カラムクロマトグラフィーのローディング量は１４ｇ／Ｋｇ以下である。非常に特別な一実施形態において、逆相カラムクロマトグラフィーのローディング量は、約０．１ｇ／Ｋｇ～１４ｇ／Ｋｇ、好ましくは０．１ｇ／Ｋｇ～１４ｇ／Ｋｇであり、移動相の流量は一定であり、且つ約１００±５０ｍＬ／ｍｉｎ～約５００±５０ｍＬ／ｍｉｎの範囲にあり、特に約３００±５０ｍＬ／ｍｉｎである。
分析方法
発明者は、本開示の第１態様で提供される分離方法が、混合物１又は混合物２に含まれる４つの化合物の分析に効果的に適用できることを予想外に発見した。例えば、分離プロセスの有効性は、実質的に同じクロマトグラフィー条件下で、十分な精度を有する分析スケールで決定することができる。
したがって、第２態様では、本開示は、混合物１中の１つ又は複数の化合物を分析するための方法を提供し、前記混合物１は４つの化合物を含み、混合物中の４つの化合物の各々は部分１、部分２及び部分３を含む。
前記方法は、ステップ（２）を分析スケールで適用することを含み、ここで部分１、部分２、部分３及びステップ（２）は上記で定義した通りである。
一実施形態において、前記方法は、ステップ（４）を分析スケールで適用することをさらに含み、ここでステップ（４）は上記で定義した通りである。
第３態様では、本開示は、混合物２中の１つ又は複数の化合物を分析するための方法を提供し、前記混合物２は２つの化合物を含み、混合物中の２つの化合物の各々は部分１、部分２及び部分３を含む。
前記方法は、ステップ（４）を分析スケールで適用することを含み、ここで部分１、部分２、部分３及びステップ（４）は上記で定義した通りである。
一実施形態において、分析プロセスのクロマトグラフィー条件のロバスト性は任意に研究される。一実施形態において、分析プロセスのクロマトグラフィー条件は、システム適用性測定の結果に基づいて調整される。各分析プロセスは独立して、１つ又は複数の調製プロセスのプロセス制御方法として用いることができる。一実施形態において、調製プロセスと分析プロセスはクロマトグラフィー条件が同じである。別の実施形態において、調製プロセスで使用されるクロマトグラフィー条件と分析プロセスで使用されるクロマトグラフィー条件は、固定相の粒径及び／又は孔径だけが異なる。一実施形態において、調製プロセスと分析プロセスは両方とも勾配溶出を使用する。別の実施形態において、調製プロセスは勾配溶出を使用し、分析プロセスはアイソクラティック溶出を使用する。
特定の一実施形態において、分析プロセスのローディング体積は１ｍｌ以下である。別の特定の実施形態において、分析プロセスのローディング体積は１～３００μＬ、例えば５～１００μＬである。非常に具体的な一実施形態において、移動相の流量は１ｍＬ／ｍｉｎ以下であり、例えば、流量は０．５～１ｍＬ／ｍｉｎであり得、特に０．７ｍＬ／ｍｉｎ、０．８ｍＬ／ｍｉｎ、０．９ｍＬ／ｍｉｎ、又は１．０ｍＬ／ｍｉｎである。
本開示の異性化合物
ペイロード－リンカー中間体
第４態様では、本開示は、下記式（ＸＩ）～（ＸＩＶ）のいずれか１つの構造を有する化合物を提供し、
Figure 2024500921000024
 式中、
ペイロード、Ｌ１、Ｌ２及びＭは上記で定義した通りである。
一実施形態において、Ｌ１は存在せず、Ｌ２は
Figure 2024500921000025
 であり、Ｍは
Figure 2024500921000026
 であり、式（ＸＩ）～（ＸＩＶ）はそれぞれ、下記式（ＸＩ－１）～（ＸＩＶ－１）の構造を有し、
Figure 2024500921000027
 式中、
ペイロード、Ｙ、ｎ及びｘは上記で定義した通りである。
チオール基の位置に応じて、式（ＸＩ）及び（ＸＩＩ）をβと呼び、式（ＸＩＩＩ）及び（ＸＩＶ）の立体配置をαと呼ぶ。
一実施形態において、Ｙは結合であり、ｎは３であり、式（ＸＩ－１）～（ＸＩＶ－１）はそれぞれ、下記式（ＸＩ－１－１）～（ＸＩＶ－１－１）の構造を有する。
Figure 2024500921000028
特定の一実施形態において、ペイロードは、１つ又は複数のキラル中心を含む細胞毒素部分であり、好ましくはメイタンシノイド、より好ましくはＤＭ１である。一実施形態において、ペイロードはＤＭ１であり、式（ＸＩ－１－１）～（ＸＩＶ－１－１）は異性化合物（ｉ）～（ｉｖ）の構造を表し、その定義は上記の通りである。
第５態様では、本開示は、２つの化合物を含む混合物を提供し、その中の各化合物は式（ＸＩ）～（ＸＩＶ）のいずれか１つの構造を有し、ただし、前記２つの化合物は異なる構造を有することを条件とする。一実施形態において、前記混合物は２つの化合物を含み、それぞれ式（ＸＩ）と式（ＸＩＩ）の構造を有する。別の実施形態において、前記混合物は２つの化合物を含み、それぞれ式（ＸＩＩＩ）と式（ＸＩＶ）の構造を有する。一実施形態において、前記混合物は２つの化合物を含み、それぞれ式（ＸＩ－１）と式（ＸＩＩ－１）の構造を有する。別の実施形態において、前記混合物は２つの化合物を含み、それぞれ式（ＸＩＩＩ－１）と式（ＸＩＶ－１）の構造を有する。一実施形態において、前記混合物は２つの化合物を含み、それぞれ式（ＸＩ－１－１）と式（ＸＩＩ－１－１）の構造を有する。別の実施形態において、前記混合物は２つの化合物を含み、それぞれ式（ＸＩＩＩ－１－１）と式（ＸＩＶ－１－１）の構造を有する。特定の一実施形態において、前記混合物は２つの化合物を含み、それぞれ式（ｉ）と式（ｉｉ）の構造を有する。別の実施形態において、前記混合物は２つの化合物を含み、それぞれ式（ｉｉｉ）と式（ｉｖ）の構造を有する。
以下において、化合物（ｉｉｉ）と（ｉｖ）の混合物をα中間体又はα異性体と呼ぶ。
いくつかの実施形態において、本開示で提供される化合物は、下記＜１＞～＜１０＞として記載することができる。
＜１＞ 式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）又は（ＸＩＶ）の化合物であって、
Figure 2024500921000029
 式中、
ペイロードは、１つ又は複数のキラル中心を含む細胞毒素部分であり、
Ｌ１は存在しないか、又はＣ１－１０アルキレン基、Ｃ３－１０シクロアルキレン基、Ｃ６－１０アリーレン基、４～１０員ヘテロシクリレン基、５～１０員ヘテロアリーレン基、－ＮＨ－、－（ＣＯ）－、－ＮＨ（ＣＯ）－、及び－（ＣＯ）ＮＨ－から選択される１つ又は複数の二価基であり、
Ｌ２は結合であるか、又はＣ１－１０アルキレン基、Ｃ３－１０シクロアルキレン基、Ｃ６－１０アリーレン基、４～１０員ヘテロシクリレン基、５～１０員ヘテロアリーレン基、－ＮＨ－、－（ＣＯ）－、－ＮＨ（ＣＯ）－、及び－（ＣＯ）ＮＨ－から選択される１つ又は複数の二価基であり、
Ｍはリガーゼ認識モチーフを含み、
前記化合物は、主に、例えば純粋又は実質的に純粋な異性体形態であり、例えば他の異性体形態を実質的に含まず、例えば９０％超、例えば９５％超、例えば９８％超、例えば少なくとも９９％の純度を有する、前記化合物。
＜２＞ 式（ＸＩＩＩ）又は（ＸＩＶ）の化合物である、＜１＞に記載の化合物。
＜３＞ 前記リガーゼ認識モチーフは、（ａ）例えばＬＰＥＴＧ等のＸが任意のアミノ酸残基であるＬＰＸＴＧと、（ｂ）Ｇがグリシン（Ｇｌｙ）で、ｎが３～１０の整数であるＧｎと、から選択される、＜１＞又は＜２＞に記載の化合物。
＜４＞ ＭがＨ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－ＮＨ２であり、Ｍがリジン上のε－アミノ基を介してＬ２に連結される、＜３＞に記載の化合物。
＜５＞ Ｌ１は存在せず、Ｌ２は
Figure 2024500921000030
 から選択される、＜１＞～＜４＞のいずれか１項に記載の化合物。
＜６＞ Ｌ１は存在せず、Ｌ２は
Figure 2024500921000031
 であり、Ｍは
Figure 2024500921000032
 であり、
式中、
Ｙは結合であるか又は１～２０個のアミノ酸のスペーサー配列であり、
ｎは３～１０の整数、例えば３であり、
ｘは、水素、－ＯＨ、－ＮＨ２、１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメント、及び１～１０個のヌクレオチドを含むヌクレオチドフラグメントから選択され、例えば－ＯＨ、－ＮＨ２、及び１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントから選択され、例えば－ＯＨ、－ＮＨ２及びＧｌｙから選択され、例えば－ＮＨ２である、＜１＞～＜４＞のいずれか１項に記載の化合物。
＜７＞ 前記細胞毒素は、マレイミド部分と反応できるチオール基部分を含む、＜１＞～＜６＞のいずれか１項に記載の化合物。
＜８＞ 前記細胞毒素はメイタンシノイドであり、
例えばＤＭ１
Figure 2024500921000033
 である、＜１＞～＜７＞のいずれか１項に記載の化合物。
＜９＞ 式（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）の化合物から選択され、
Figure 2024500921000034
 式中、ｘは－ＯＨ又は－ＮＨ２である、＜１＞～＜８＞のいずれか１項に記載の化合物。
＜１０＞ 式（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）の化合物である、＜９＞に記載の化合物。
１つの態様では、本開示は、式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）又は（ＸＩＶ）の化合物を調製する方法を提供し、次の＜１７＞～＜１８＞の通りである。
＜１７＞ 式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）又は（ＸＩＶ）の化合物を調製する方法であって、
（ｉ）式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）及び（ＸＩＶ）の化合物の混合物を合成するステップと、
（ｉｉ）前記混合物をクロマトグラフィーにかけて標的化合物を得るステップであって、
前記標的化合物の各々は個別の生成物として得られ、又は２つの標的化合物は第２混合物として得られる前記ステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で収集された第３混合物を含む溶出物を任意に回収し、前記第３混合物は、ステップ（２）で分離された標的化合物とは異なる１つ又は複数の追加の標的化合物を含み、そして回収された溶出物をクロマトグラフィーにかけて前記追加の標的化合物を分離するステップと、を含む、前記方法。
＜１８＞ 前記クロマトグラフィーは逆相クロマトグラフィーである、＜１７＞に記載の方法。
抗体薬物コンジュゲート
式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）又は（ＸＩＶ）の化合物は、リガーゼ認識モチーフを含む生体分子とコンジュゲートして、バイオコンジュゲートを形成することができ、ここで前記生体分子に含まれるリガーゼ認識モチーフは、式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）又は（ＸＩＶ）の化合物の構造Ｍ中のアミノ酸配列１に含まれるリガーゼ認識モチーフに対応する。
一実施形態において、式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）又は（ＸＩＶ）の化合物はリガーゼ受容体基質認識モチーフＧＧＧを含み、生体分子はリガーゼ供与体基質認識モチーフＬＰＸＴＧを含む。
第６態様では、本開示は、式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）又は（ＸＩＶ）の化合物及び抗体又はその抗原結合フラグメントを用いて調製される抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。ＡＤＣの調製は、当分野で知られている任意の方法で行うことができ、例えば構造Ｍに含まれるリガーゼ認識モチーフを抗体又はその抗原結合フラグメントに含まれるリガーゼ認識モチーフにカップリングすることによって行うことができる。得られたＡＤＣは、式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）又は（ＸＩＶ）のような化合物中の異性の開環チオスクシンイミド基をさらに含み、得られたＡＤＣは、下記式（ＸＶＩＩ－１）～（ＸＸ－１）のいずれか１つの構造を有し、
Figure 2024500921000035
 式中、
Ａは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ又はリガーゼ受容体基質認識モチーフを有するように任意に修飾された抗体又はその抗原結合フラグメントであり、
Ｌ３は存在しないか、又は、（１）１～２０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列４と、（２）「－（Ｃ２Ｈ４－Ｏ）ｊ－」構造を含み、ｊが１～１００の整数である任意に存在するＰＥＧフラグメントと、（３）切断可能な配列２、２～１００個のアミノ酸を含むスペーサーＳｐ２及びそれらの組合せから選択される二価の任意に存在する基Ｕと、を含み、
切断可能な配列２は、酵素によって切断可能なアミノ酸配列５を含み、切断可能な配列２は１～１０個のアミノ酸を含み、
ペイロード、Ｙ、ｎ及びｘは上記で定義した通りである。
一実施形態において、ｊは１～１０の整数である。
一実施形態において、Ｓｐ２は、２～２０個のアミノ酸を含むスペーサー配列である。特定の一実施形態において、Ｓｐ２は、ＧＡ、ＧＧＧＳ及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳから選択されるスペーサー配列であり、特にＧＡである。
一実施形態において、リガーゼ基質認識モチーフの導入位置は限定されず、例えば、その導入位置は、抗体重鎖又は軽鎖のＣ末端又はＮ末端であり得るが、これらに限定されない。
前記抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖は、野生型（ＬＣ）と、リガーゼ認識モチーフＬＰＸＴＧの直接導入により修飾されたＣ－末端修飾軽鎖（ＬＣＣＴ）と、短いペプチドスペーサー及びリガーゼ供与体基質認識モチーフＬＰＸＴＧの導入により修飾されたＣ－末端修飾軽鎖（ＬＣＣＴＬ）と、の３つのタイプを含む。抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖は、野生型（ＨＣ）と、リガーゼ認識モチーフＬＰＸＴＧの直接導入により修飾されたＣ－端修飾重鎖（ＨＣＣＴ）と、短いペプチドスペーサー及びリガーゼ供与体基質認識モチーフＬＰＸＴＧの導入により修飾されたＣ－末端修飾重鎖（ＨＣＣＴＬ）と、の３つのタイプを含む。Ｘは、任意の天然又は非天然の単一アミノ酸であり得る。式（ＩＶ）の化合物中のｚは１又は２である時、上記重鎖と軽鎖の組み合わせは、８種の好ましい抗体分子を形成することができる。ソルターゼ媒介の連結により、Ｃ末端ソーティング（ｓｏｒｔｉｎｇ）配列ＬＰＸＴＧとＮ末端ＧＧＧとの間に新しいアミド結合が形成され、ここでコンジュゲーション反応は、最初にスレオニンとグリシン残基との間のペプチド結合を切断し、次にＬＰＸＴをＧＧＧに連結することによって行われる。
好ましい一実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖は、野生型（ＬＣ）と、リガーゼ認識モチーフＧＧＧの直接導入により修飾されたＮ－末端修飾軽鎖（ＬＣＮＴ）と、短いペプチドスペーサー及びリガーゼ受容体基質認識モチーフＧＧＧの導入により修飾されたＮ－末端修飾軽鎖（ＬＣＮＴＬ）と、の３つのタイプを含む。抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖は、野生型（ＨＣ）と、リガーゼ認識モチーフＧＧＧの直接導入により修飾されたＮ－末端修飾重鎖（ＨＣＮＴ）と、短いペプチドスペーサー及びリガーゼ受容体基質認識モチーフＧＧＧの導入により修飾されたＮ－末端修飾重鎖（ＨＣＮＴＬ）と、の３つのタイプを含む。
一実施形態において、Ｙは結合であり、ｎは３であり、式（ＸＶＩＩ－１）～（ＸＸ－１）はそれぞれ、下記式（ＸＶＩＩ－１－１）～（ＸＸ－１－１）の構造を有し、
Figure 2024500921000036
 式中、
ペイロード、Ａ、ｘ及びｚは上記で定義した通りである。
一実施形態において、ペイロードはＤＭ１であり、ｚは２であり、式（ＸＩ－１）～（ＸＩＶ－１）はそれぞれ、下記式（ＸＩ－１－１）～（ＸＩＶ－１－１）の構造を有する。
特定の一実施形態において、ペイロードは、１つ又は複数のキラル中心を含む細胞毒素部分である。細胞毒素は、好ましくはメイタンシノイド、より好ましくはＤＭ１である。一実施形態において、ペイロードはＤＭ１であり、Ｌ３は存在せず、式（ＸＶＩＩ－１－１）～（ＸＸ－１－１）はそれぞれ、下記化合物（ｖ）～（ｖｉｉｉ）の構造を有し、
Figure 2024500921000037
Figure 2024500921000038
 式中、
Ａとｘは上記で定義した通りである。具体的な一実施形態において、ｘは－ＮＨ２である。
一実施形態において、Ａは、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）であり、リガーゼ供与体基質認識モチーフ及びリガーゼ受容体基質認識モチーフの１つを有するように任意に修飾される。好ましい一実施形態において、Ａは、短いペプチドスペーサー及びリガーゼ供与体基質認識モチーフＬＰＸＴＧＪの導入により修飾されたＣ－末端修飾軽鎖（ＬＣＣＴＬ）を有するトラスツズマブであり、ここでＪは上記で定義した通りである。一実施形態において、短いペプチドスペーサーはＧＡである。別の実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖は、野生型重鎖（ＨＣ）である。
第７態様では、本開示は、２つの化合物を含む混合物を提供し、その中の各化合物は、式（ＸＶＩＩ－１）～（ＸＸ－１）のいずれか１つの構造を有し、ただし、２つの化合物は異なる構造を有することを条件とする。一実施形態において、前記混合物は２つの化合物を含み、それぞれ式（ＸＶＩＩ－１）と式（ＸＶＩＩＩ－１）の構造を有する。別の実施形態において、前記混合物は２つの化合物を含み、それぞれ式（ＸＩＸ－１）と式（ＸＸ－１）の構造を有する。一実施形態において、前記混合物は２つの化合物を含み、それぞれ式（ＸＶＩＩ－１－１）と式（ＸＶＩＩＩ－１－１）の構造を有する。別の実施形態において、前記混合物は２つの化合物を含み、それぞれ式（ＸＩＸ－１－１）と式（ＸＸ－１－１）の構造を有する。特定の一実施形態において、前記混合物は２つの化合物を含み、それぞれ式（ｖ）と式（ｖｉ）の構造を有する。別の実施形態において、前記混合物は２つの化合物を含み、それぞれ式（ｖｉｉ）と式（ｖｉｉｉ）の構造を有する。以下において、化合物（ｖｉｉ）と（ｖｉｉｉ）の混合物をαＡＤＣと呼ぶ。
いくつかの実施形態において、本開示で提供される抗体薬物コンジュゲートは、下記＜１１＞～＜１６＞として記載することができる。
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の開環チオスクシンイミド構造を含む抗体薬物コンジュゲートであって、
Figure 2024500921000039
 前記化合物は、主に、例えば純粋又は実質的に純粋な異性体形態であり、例えば他の異性体形態を実質的に含まず、例えば９０％超、例えば９５％超、例えば９８％超、例えば少なくとも９９％の純度を有する、抗体薬物コンジュゲート。
＜１２＞ ＜１＞～＜１１＞のいずれか１項の化合物と抗体とをリガーゼの存在下で反応させることにより形成される、＜１１＞に記載の抗体薬物コンジュゲート。
＜１３＞ それぞれ式（ＸＶＩＩ－１－１）～（ＸＸ－１－１）を有し、
Figure 2024500921000040
 式中、
ペイロードとｘは上記で定義した通りであり、例えば１つ又は複数のキラル中心を含む細胞毒素部分、例えばチオール基部分を除いたメイタンシノイド分子の残りの部分、例えばチオール基部分を除いたＤＭ１の残りの部分であり、
Ａは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ又はリガーゼ受容体基質認識モチーフを有するように任意に修飾された抗体又はその抗原結合フラグメントであり、
例えば、Ａは、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）に結合する抗体であり、例えばトラスツズマブであり、前記トラスツズマブは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ又はリ ガーゼ受容体基質認識モチーフを有するように修飾され、
ｚは１又は２の整数である、＜１１＞又は＜１２＞に記載の抗体薬物コンジュゲート。
＜１４＞ Ａは、例えば－ＧＡ－等の短いペプチドスペーサー及びリガーゼ供与体基質認識モチーフＬＰＸＴＧＪの導入により修飾されたＣ－末端修飾軽鎖（ＬＣＣＴＬ）を有するトラスツズマブであり、ＬＰＸＴＧＪ中のＪは存在しないか、又は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントである、＜１３＞に記載の抗体薬物コンジュゲート。
＜１５＞ ペイロードはＤＭ１であり、Ｌ３は存在せず、
式（ＸＶＩＩ－１－１）～（ＸＸ－１－１）はそれぞれ構造（ｖ）～（ｖｉｉｉ）を有し、
Figure 2024500921000041
Figure 2024500921000042
 式中、ｘは－ＯＨ又は－ＮＨ２である、＜１３＞又は＜１４＞に記載の抗体薬物コンジュゲート。
＜１６＞ ＜１５＞に示す構造（ｖｉｉ）を有する、＜１４＞に記載の抗体薬物コンジュゲート。
化合物混合物及び抗体薬物コンジュゲート混合物
いくつかの実施形態において、本開示のα異性体は混合物の形態で提供され、したがって、第８態様では、本開示は、本開示のα異性体を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、下記＜４５＞～＜５２＞として記載することができる。
＜４５＞ 式（ＸＩＩＩ）の化合物と式（ＸＩＶ）の化合物の混合物、例えばラセミ混合物を含む組成物であって、
Figure 2024500921000043
 式中、
ペイロードは、１つ又は複数のキラル中心を含む細胞毒素部分であり、
Ｌ１は存在しないか、又はＣ１－１０アルキレン基、Ｃ３－１０シクロアルキレン基、Ｃ６－１０アリーレン基、４～１０員ヘテロシクリレン基、５～１０員ヘテロアリーレン基、－ＮＨ－、－（ＣＯ）－、－ＮＨ（ＣＯ）－、及び－（ＣＯ）ＮＨ－から選択される１つ又は複数の二価基であり、
Ｌ２は結合であるか、又はＣ１－１０アルキレン基、Ｃ３－１０シクロアルキレン基、Ｃ６－１０アリーレン基、４～１０員ヘテロシクリレン基、５～１０員ヘテロアリーレン基、－ＮＨ－、－（ＣＯ）－、－ＮＨ（ＣＯ）－、及び－（ＣＯ）ＮＨ－から選択される１つ又は複数の二価基であり、
Ｍはリガーゼ認識モチーフを含み、
前記組成物は、式ＸＩの化合物又は式ＸＩＩの化合物を実質的に含まない（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％含まない）、前記組成物。
Figure 2024500921000044
＜４６＞ 前記リガーゼ認識モチーフは、（ａ）例えばＬＰＥＴＧ等のＸが任意のアミノ酸残基であるＬＰＸＴＧと、（ｂ）Ｇがグリシン（Ｇｌｙ）で、ｎが３～１０の整数であるＧｎと、から選択される、＜４５＞に記載の組成物。
＜４７＞ ＭがＨ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－ＮＨ２であり、Ｍがリジン上のε－アミノ基を介してＬ２に連結される、＜４５＞又は＜４６＞に記載の組成物。
＜４８＞Ｌ１は存在せず、Ｌ２は
Figure 2024500921000045
 から選択される、＜４５＞～＜４７＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜４９＞ Ｌ１は存在せず、Ｌ２は
Figure 2024500921000046
 であり、Ｍは
Figure 2024500921000047
 であり、
式中、
Ｙは結合であるか又は１～２０個のアミノ酸のスペーサー配列であり、
ｎは３～１０の整数、例えば３であり、
ｘは、水素、－ＯＨ、－ＮＨ２、１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメント、及び１～１０個のヌクレオチドを含むヌクレオチドフラグメントから選択され、例えば－ＯＨ、－ＮＨ２、及び１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントから選択され、例えば－ＯＨ、－ＮＨ２及びＧｌｙから選択され、例えば－ＮＨ２である、＜４５＞～＜４８＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜５０＞ 前記細胞毒素は、マレイミド部分と反応できるチオール基部分を含む、＜４５＞～＜４９＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜５１＞ 前記細胞毒素はメイタンシノイドであり、例えばＤＭ１
Figure 2024500921000048
 である、＜４５＞～＜５０＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜５２＞ 式（ｉ）の化合物又は式（ｉｉ）の化合物を実質的に含まない、式（ｉｉｉ）の化合物と式（ｉｖ）の化合物の混合物である、式（ｉｉｉ）の化合物と式（ｉｖ）の化合物の混合物。
Figure 2024500921000049
第９態様では、本開示は、本開示のα－ＡＤＣの混合物を含む、抗体薬物コンジュゲート組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示の抗体薬物コンジュゲート組成物は、下記＜５３＞～＜５７＞として記載することができる。
＜５３＞ 式（ＩＩＩ）の開環チオスクシンイミド構造を含む抗体薬物コンジュゲートと、式（ＩＶ）の開環チオスクシンイミド構造を含む抗体薬物コンジュゲートとの混合物、例えばラセミ混合物を含む抗体薬物コンジュゲート組成物であって、
Figure 2024500921000050
 前記組成物は、式（Ｉ）の化合物又は式（ＩＩ）の化合物を実質的に含まない（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％含まない）、前記抗体薬物コンジュゲート組成物。
Figure 2024500921000051
＜５４＞ ＜４５＞～＜５２＞のいずれか１項に記載の組成物と抗体とをリガーゼの存在下で反応させることにより形成される、＜５３＞に記載の抗体薬物コンジュゲート組成物。
＜５５＞ 式（ＸＩＸ－１－１）を有する化合物と式（ＸＸ－１－１）を有する化合物の混合物であり、
Figure 2024500921000052
 式中、
ペイロードは上記で定義した通りであり、例えば１つ又は複数のキラル中心を含む細胞毒素部分、例えばチオール基部分を除いたメイタンシノイド分子の残りの部分、例えばチオール基部分を除いたＤＭ１の残りの部分であり、
Ａは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ又はリガーゼ受容体基質認識モチーフを有するように任意に修飾された抗体又はその抗原結合フラグメントであり、例えば、Ａは、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）に結合する抗体であり、例えばトラスツズマブであり、前記トラスツズマブは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ又はリガーゼ受容体基質認識モチーフを有するように修飾され、
ｚは１又は２の整数である、＜５２＞、＜５３＞又は＜５４＞に記載の抗体薬物コンジュゲート組成物。
＜５６＞ Ａは、例えば－ＧＡ－等の短いペプチドスペーサー及びリガーゼ供与体基質認識モチーフＬＰＸＴＧＪの導入により修飾されたＣ－末端修飾軽鎖（ＬＣＣＴＬ）を有するトラスツズマブであり、ＬＰＸＴＧＪ中のＪは存在しないか、又は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントである、＜５５＞に記載の抗体薬物コンジュゲート組成物。
＜５７＞ ペイロードはＤＭ１であり、Ｌ３は存在せず、式（ＸＩＸ－１－１）～（ＸＸ－１－１）はそれぞれ構造（ｖｉｉ）と（ｖｉｉｉ）を有する、＜５５＞又は＜５６＞に記載の抗体薬物コンジュゲート組成物。
Figure 2024500921000053
第１０態様では、本開示で提供される治療方法は下記＜５８＞～＜６０＞として記載することができる。
＜５８＞ 癌の治療を必要とする患者の癌を治療する方法であって、＜５３＞～＜５７＞のいずれか１項に記載の抗体薬物コンジュゲート組成物の有効量を前記患者に投与することを含む、前記方法。
＜５９＞ 前記癌はＨＥＲ２－陽性癌、例えばＨＥＲ２－陽性乳癌である、＜５８＞に記載の方法。
＜６０＞ 前記抗体薬物コンジュゲート組成物は＜５７＞に記載のものである、＜５８＞又は＜５９＞に記載の方法。
薬物組成物、製剤及びキット
別の態様では、本開示は下記（ａ）及び（ｂ）を含む薬物組成物をさらに提供する。
（ａ） 式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）又は（ＸＩＶ）の化合物、又は本発明の抗体薬物コンジュゲート、又は式（ＸＩＩＩ）と（ＸＩＶ）の化合物の混合物を含む組成物、又は本開示の抗体薬物コンジュゲート組成物。
（ｂ） 薬学的に許容可能な担体。
治療と用途
別の態様では、本開示は、式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）又は（ＸＩＶ）の化合物、又は本発明の抗体薬物コンジュゲート、又は式（ＸＩＩＩ）と（ＸＩＶ）の化合物の混合物を含む組成物、又は本開示の抗体薬物コンジュゲート組成物、又は本開示の薬物組成物の、癌を治療するための薬物の調製における用途をさらに提供する。
別の態様では、本開示は、式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）又は（ＸＩＶ）の化合物、又は本発明の抗体薬物コンジュゲート、又は式（ＸＩＩＩ）と（ＸＩＶ）の化合物の混合物を含む組成物、又は本開示の抗体薬物コンジュゲート組成物、又は本開示の薬物組成物の有効量を必要とする対象に投与することを含む、癌を治療する方法をさらに提供する。
さらなる態様では、本発明は、癌を治療するために、式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）又は（ＸＩＶ）の化合物、又は本発明の抗体薬物コンジュゲート、又は式（ＸＩＩＩ）と（ＸＩＶ）の化合物の混合物を含む組成物、又は本発明の抗体薬物コンジュゲート組成物、又は本開示の薬物組成物を提供する。
一実施形態において、癌はＨＥＲ－２陽性癌である。
有益な効果
本開示の発明は、下記（１）～（５）の技術効果の少なくとも１つを実現する。
（１） 混合物１に含まれる４つの異性体化合物の完全な分離及び精製を実現し、純粋な異性体化合物を高い効率と収率で得ることができる。
なお、β１、β２及びα異性体の分離プロセス（例えば実施例１のプロセス）及び分析プロセス（例えば実施例２のプロセス）において、移動相に使用する酸性剤がＴＦＡや、ＮａＨ２ＰＯ４、ＣＨ２Ｏ２、Ｋ２ＨＰＯ４、ＡＡ、ＴＥＡＰ、ＮａＣｌＯ４又はその他の従来の試薬である時、β１、β２及びα異性体間の分離はほとんど観察されておらず、一方、酸性剤としてＣＨ３ＣＯＯＨ及びＬ－ＴＡを選択する時、β１、β２及びα異性体の分離及び精製に成功できることを注意すべきである。したがって、発明者は、特定の酸性剤であるＣＨ３ＣＯＯＨ又は類似のアルキルカルボン酸は、β１、β２及びα異性体間の分離度を効果的に高めることができるため、分離及び／又は精製方法に適用できることを予想外に発見した。
（２） 前記方法は操作しやすく、コストが低く、パイロット規模の生産において有効であることが証明されているため、工業化生産に有利である。
（３） 複雑なサンプルの分離有効性は、通常、複雑で高価なアフターカラム検出によって監視され、例えばＬＣＭＳ方法では、高価なクロマトグラフィーカラムを使用して正確に分析し、いくつかの場合において、サンプルを前処理して分離により得られた製品中の残りの不揮発性塩を除去する必要がある。
本開示の分析方法は、分離方法と類似のクロマトグラフィー条件を使用し、したがって、分離プロセスのクロマトグラフィー方法又は分析プロセスのクロマトグラフィー方法を設計する際に調整が少なく、複雑なサンプルのクロマトグラフィー処理が容易になる。また、本開示の分離方法では揮発性試薬が使用されるため、分離により得られた製品は不揮発性塩を含まず、脱塩の前処理なしで直接ＬＣＭＳ分析を行うことができる。これは、混合物１が開環反応の反応混合物である場合に特に有利である。必要があるときは、不純物又は副生成物を迅速に検出することができる。
（４） 前記方法は、例えば高分解能（クロマトグラフィーにおけるパラメーターＲ）と十分な精度等、高い有効性を示している。
（５） 分離された異性体は、細胞毒性に差を示すことがある。ヒト乳癌ＨＣＣ１９５４細胞増殖アッセイにおいて、異性体α２の活性はβ異性体（β１異性体とβ２異性体の混合物）の２倍である。
本開示のα－ＡＤＣは次の技術効果の少なくとも１つを実現する。
α－ＡＤＣは、有意な抗腫瘍効果を有し、腫瘍に濃縮されてインサイチュでの安定性を維持することができる。Ｋａｄｃｙｌａに比べて、α－ＡＤＣは低用量で同様の効果を示し、本開示のα－ＡＤＣの優れた効果が証明されている。
実施例
本開示の目的及び技術的解決手段をより明確に説明するために、以下において、本開示を具体的な実施例によりさらに説明する。これらの例は本発明の範囲を限定することを意図しないことを理解すべきである。以下の実施例で説明されていない具体的な実験方法は、いずれも従来の実験方法に従って行われる。
アブリヴィエーション
Figure 2024500921000054
器具、材料及び試薬
別段の説明がない限り、器具と試薬は市販されているものであってもよいし、又は当分野の従来の方法で調製してもよい。試薬は、さらに精製することなく直接使用することができる。
１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、１Ｈ－１Ｈ ＣＯＳＹ及びＨＭＢＣスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶ－６００、６００ＭＨｚで記録される。化学シフトは百万分の１（ｐｐｍ）で表される。カップリング定数はヘルツ（Ｈｚ）を単位とする。分裂パターンは見かけの多重度を説明するものであり、ｓ（一重線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｑ（四重線）、ｍ（多重線）及びｂｒ（広幅線）と指定される。
細胞生存率は、Ｂｉｏｔｅｋ Ｃｙｔａｔｉｏｎ３イメージングリーダーで読み取ったＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ(R) Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．＃Ｇ７５７３）を用いてテストされる。
メスのＢＡＬＢ／ｃヌードマウスのＨＣＣ１９５４ヒト乳癌異種移植モデル（ＨＣＣ１９５４モデル）及びＮＣＩ－Ｎ８７ヒト胃癌異種移植モデル（ＮＣＩ－Ｎ８７モデル）はＡＴＣＣから提供される。カニクイザルはＧｕａｎｇＺｈｏｕ ＸｉａｎｇＧｕａｎ，Ｌｔｄ．から提供される。
ＰＬＴ、ＡＰＴＴ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＧＬＯＢ及びＡ／Ｇは、血液分析装置（ＡＤＶＩＡ ２１２０ｉ Ｓｉｅｍｅｎｓ）及び補助試薬でテストされる。
ＫａｄｃｙｌａはＲｏｃｈｅから提供される。
β異性体とα異性体を含む混合物の調製
下記構造を有する化合物を調製し、ＷＯ２０１５１６５４１３Ａ１に記載の方法と同様の方法でチオスクシンイミド基の開環反応を行う。
Figure 2024500921000055
開環反応によって、４つの異性体（異性化合物（ｉ－１）、（ｉｉ－１）、（ｉｉｉ－１）及び（ｉｖ－１））が得られる。チオール基が、切断されていないアミド結合のα位又はβ位に位置するという違いによって、それぞれα異性体とβ異性体と命名される。４つの異性体の構造はそれぞれ次の通りである。
Figure 2024500921000056
反応で得られた反応混合物を、直接以下に記載の分離プロセスに供し、前記反応混合物は前記４つの異性体を含む。
実施例１ β１、β２及びα異性体の分離
１．１ 分離プロセス
β１、β２及びα異性体の分離に勾配溶出が使用される。溶出勾配は、ｐＨ勾配と有機溶媒勾配を含む。クロマトグラフィー条件は表１に示す通りである。
Figure 2024500921000057
図において、ピーク１（約ｔＲ ２７ｍｉｎ～約ｔＲ ３９ｍｉｎ範囲内の第１溶出ピーク）、ピーク２（約ｔＲ ２７ｍｉｎ～約ｔＲ ３９ｍｉｎ範囲内の第２溶出ピーク）及びピーク３（ｔＲ ４２ｍｉｎ～ｔＲ ５１ｍｉｎ範囲内のピーク）の３つの主要ピークが示される。溶出剤の各画分の純度は実施例２に記載の分析方法を用いてＨＰＬＣによって検出される。分析結果に基づいて画分を合わせ、その後凍結乾燥してＮＭＲアッセイを行う。１Ｄ及び２Ｄ ＮＭＲデータによると、ピーク１とピーク２は、それぞれ２つのβ異性体を含む。β異性体の構造は次の通りである。
Figure 2024500921000058
 式中、＊は不斉中心（２２－Ｃ）を表す。
ピーク１に含まれるβ異性体は、β１と表される。１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、１Ｈ－１Ｈ ＣＯＳＹ及びＨＭＢＣデータは表２に示す通りである。
Figure 2024500921000059
Figure 2024500921000060
ピーク２に含まれるβ異性体はβ２と表される。
１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、１Ｈ－１Ｈ ＣＯＳＹ及びＨＭＢＣデータは表３に示す通りである。
Figure 2024500921000061
Figure 2024500921000062
Figure 2024500921000063
Figure 2024500921000064
１Ｄ及び２Ｄ ＮＭＲデータによると、ピーク３はα異性体を含む。開環反応のメカニズムからピーク３の含有量を推測し、該ピークを、２つのα異性体の混合物、即ちα１とα２の混合物と表す。
他のクロマトグラフィー条件での分離をテストし、その結果を下記１．２～１．６に示す。
１．２ 固定相
異なるメーカーの充填カラムがテストされる。クロマトグラフィー条件は表４に示す通りである。
Figure 2024500921000065
ＨＰＬＣ図は、図１～図４に示す通りである。
溶出剤の各画分の純度は、実施例２に記載の分析方法を用いてＨＰＬＣによって検出される。図において、３つの主要ピークが示される。分析結果に基づいて画分を合わせ、その後凍結乾燥してＮＭＲアッセイを行う。分析結果と１Ｄ及び２Ｄ ＮＭＲデータによると、上記クロマトグラフィー条件下で、異性体の溶出順序は実施例１と同じである。図２～４において、２つのβ異性体はそれぞれ最初の２つのピークで溶出され、２つのα異性体の混合物は３番目のピークで溶出される。
因子が計算されて表５に示される。
Figure 2024500921000066
全ての種類のＲＰ－Ｃ１８固定相で、いずれも１より大きいＲが観察された。本開示の方法は、様々な市販の充填カラムに適用可能であるため、ロバスト性を有する。
１．３ 酸性剤１としての酸
溶出剤Ａ中の酸性剤１として、様々な酸がテストされた。クロマトグラフィー条件は表６に示す通りである。
Figure 2024500921000067
分離のＨＰＬＣ図は図５～１３に示す通りである。
図５、７、１１及び１２によると、任意に置換されるアルキルカルボン酸を使用した場合に、中程度の分離が観察され、そのうち、ＡｃＯＨ及びＬ－ＴＡは十分な分離度を示している。無機酸（例えばリン酸）も一定の分離度を示している。ギ酸は分離度が低い。移動相の分離能力は、有機酸の酸基の影響を受ける可能性がある。
溶出剤の各画分の純度は、実施例２に記載の分析方法を用いてＨＰＬＣによって検出される。分析結果に基づいて画分を合わせ、その後凍結乾燥してＮＭＲアッセイを行う。分析結果と１Ｄ及び２Ｄ ＮＭＲデータによると、上記クロマトグラフィー条件下で、異性体の溶出順序は実施例１と同じである。図１１～１３において、２つのβ異性体は（互いに部分的に融合する）最初の２つのピークで溶出され、２つのα異性体の混合物は３番目のピークで溶出される。
１．４ 緩衝塩を酸性剤１とする
溶出剤Ａ中の酸性剤１として、リン酸塩緩衝液がテストされた。
溶出剤Ａのテスト結果は表７に示す通りであり、溶出剤Ａ以外の他のクロマトグラフィー条件は表６と同じである。
Figure 2024500921000068
分離のＨＰＬＣ図は図１４～１９に示す通りである。
１．３と１．４の結果をまとめると、溶質クロマトグラフィー挙動に影響を与える要因はｐＨ値だけではないことが分かる。異性体の分離は、使用する酸性剤物質によって大きく影響される。出願人は、テストした酸性剤のうち、ＡｃＯＨ及びＬ－ＴＡは他の酸性剤に比べて分離度が有意に高まることを予想外に発見した。
１．５ 有機溶媒
実施例３との比較によって、２つのα異性体間の分離度を分析し、有機溶媒としてＭｅＯＨを使用した場合により高い分離度が得られたことから、有機溶媒の種類が重要な要因である可能性が示されている。
１．６ 勾配
上記１．１、１．３及び１．４では異なる勾配が使用され、上記１．２ではアイソクラティック溶出が使用されており、本開示の方法が一定範囲の溶出組成物に耐えられることが示される。これは前記方法に柔軟性をもたらし、パイロット規模の製造において特に有益であり得、溶出組成物のロバスト性制御に対する圧力の軽減に寄与する。
溶出剤Ａとして０．３％のＣＨ３ＣＯＯＨ水溶液を使用し、表８－１と８－２の溶出勾配を使用してさらなるテストを実施する。溶出剤Ａ及び溶出勾配以外のクロマトグラフィー条件は表６と同じである。
Figure 2024500921000069
分離のＨＰＬＣ図は図２０～２１に示す通りである。
溶出剤の各画分の純度は、実施例２に記載の分析方法を使用してＨＰＬＣによって検出される。分析結果に基づいて画分を合わせ、その後凍結乾燥してＮＭＲアッセイを行う。分析結果と１Ｄ及び２Ｄ ＮＭＲデータによると、上記クロマトグラフィー条件下で、異性体の溶出順序は実施例１と同じである。図２０～２１において、２つのβ異性体は（互いに部分的に融合する）最初の２つのピーク中で溶出され、２つのα異性体の混合物は３番目のピークで溶出される。
因子が計算されて表９に示される。
Figure 2024500921000070
８０ｍｉｎ以内の４６％～５６％のＢ勾配は、３０ｍｉｎ以内の４６％～６６％のＢ勾配よりも高い分離度が得られる。分離度が向上したことを考えると、勾配２のテーリング因子（向上）及び理論プレート数（低減）は依然として許容可能である。
溶出時間をさらに８０ｍｉｎ超に延長すると、システムの適用性テストでは不十分な結果が示されている。
実施例２ β１、β２及びα異性体分離のプロセス制御
実施例２では、実施例１に記載の方法を分析スケールで適用し、実施例１で使用された粒度（１０ｕｍ）よりも小さい粒度（５ｕｍ）を有する固定相を使用する。クロマトグラフィー条件は表１０に示す通りである。
Figure 2024500921000071
分離のＨＰＬＣ図は図２２に示す通りである。
計算によって、分離度は１．２８であり、理論プレート数は２００２０．６である。
実施例３ α１とα２異性体の分離
３．１ 分離方法
実施例１で得られたα異性体をさらに分離して異性体α１と異性体α２を得る。α異性体の構造は次の通りである。
Figure 2024500921000072
 式中、＊は不斉中心（２２－Ｃ）を表す。
勾配溶出を使用して、実施例１で得られたα異性体からα１とα２異性体を分離する。クロマトグラフィー条件は表１１に示す通りである。
Figure 2024500921000073
分離のＨＰＬＣ図は図２３に示す通りである。図において、ピーク１’（ｔＲ ４０．０７５ｍｉｎ）及びピーク２’（ｔＲ ４２．４９７ｍｉｎ）の２つの主要ピークが示されている。溶出剤の各画分の純度は、実施例４に記載の分析方法を使用してＨＰＬＣによって検出される。ピーク１に含まれるα異性体はα１と表される。１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、１Ｈ－１Ｈ ＣＯＳＹ及びＨＭＢＣデータは表１２に示す通りである。
Figure 2024500921000074
Figure 2024500921000075
Figure 2024500921000076
ピーク２に含まれるα異性体はα２と表される。１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、１Ｈ－１Ｈ ＣＯＳＹ及びＨＭＢＣデータは表１３に示す通りである。
Figure 2024500921000077
Figure 2024500921000078
Figure 2024500921000079
他のクロマトグラフィー条件での分離をテストし、その結果を下記３．２～３．６に示す。
３．２ 酸を酸性剤３とする
溶出剤Ｃ中の酸性剤３として、様々な酸がテストされた。クロマトグラフィー条件は表１４に示す通りである。
Figure 2024500921000080
分離のＨＰＬＣ図は図２４－３１に示す通りである。
３．３ 緩衝塩を酸性剤３とする
溶出剤Ａ中の酸性剤１として、リン酸塩緩衝液がテストされた。
溶出剤Ｃのテスト結果は表１５に示す通りであり、溶出剤Ｃ以外の他のクロマトグラフィー条件は表１４と同じである。
Figure 2024500921000081
分離のＨＰＬＣ図は図３２～４４に示す通りである。
３．４ 酸性剤３のまとめ
因子が計算されて表１６に示される。
Figure 2024500921000082
酸性剤３として、０．１％のＴＦＡ、１０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４（ＰＨ＝２．０）、１０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４（ＰＨ＝４．０）、１０ｍＭ ＴＥＡＰ（ＰＨ＝２．０）、又は１０ｍＭ ＴＥＡＰ ＰＨ＝４．０を使用した場合、１より大きい分離度が実現される。
実施例１の方法に比べて、図２３～４４及び表１６において、酸性剤の物質はそれほど有意な影響を示さず、β異性体とα異性体のクロマトグラフィー特性の違いが証明されている。
実施例４ α１とα２異性体の分離のプロセス制御
実施例４では、実施例３に記載の方法を分析スケールで適用し、実施例３で使用された粒径（１０ｕｍ）よりも小さい粒径（５ｕｍ）を有する固定相を使用する。クロマトグラフィー条件は表１７に示す通りである。
Figure 2024500921000083
分析のＨＰＬＣ図は図４５に示す通りである。
本開示の分析方法は、表１７～１９のいずれか１つに示されたパラメーターセットを使用して実施することができる。前記方法の柔軟性は、異なる条件での適用に寄与するとともに、例えばバイオコンジュゲートの調製等、標的製品の調製プロセスにおける異なる段階の検出要件を満たすこともできる。
実施例５ β異性体、α１異性体及びα２異性体の細胞毒性
実施例１で溶出したピークを収集し、ここで、（１） 第１ピーク及び第２ピークをサンプル（β異性体）として収集し、（２） 第３ピークをサンプル（α異性体）として収集し、実施例３に記載の方法で分離して、α１異性体とα２異性体を得る。
β異性体、α１異性体及びα２異性体の細胞毒性は腫瘍細胞増殖アッセイによってテストされる。
検出方法は次の通りである。
細胞融合度約８０％の良好な増殖条件にあるヒト乳癌ＨＣＣ１９５４細胞を０．２５％トリプシンで消化し、収集し、９６ウェルプレートに置いて一晩培養する。細胞接着後、テスト物質は、合計１０勾配で１０ｎＭから３倍に希釈される。インキュベーター中で３７℃で７２ｈ培養した後、細胞生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ(R)発光キットで検出する。細胞生存率の式は、生存率＝（ＲＬＵ（Ｘ）－ＲＬＵ（Ｐｕｒｏ））／（ＲＬＵ（対照）－ＲＬＵ（Ｐｕｒｏ））＊１００％である。Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアによって、データ処理、ＩＣ５０算出及び曲線フィッティングをＬｏｇｉｓｔｉｃモデル（４パラメーター）を用いて行う。結果は図４６及び表２０に示す通りである。
Figure 2024500921000084
表２０に示すように、α１異性体の活性はβ異性体活性の±３０％以内であるため、それらの活性は同等であると見なされる。α２異性体の相対活性は２０５％（β異性体の生物学的活性は１００％と設定される）であり、即ちα２異性体の活性はβ異性体の約２倍である。
実施例６ α－ＡＤＣの調製
実施例１で得られたα異性体（α１とα２の混合物）を含む純粋な生成物を、治療性抗体とコンジュゲーション反応させる。コンジュゲーション反応の方法は、ＷＯ２０１５１６５４１３Ａ１に記載の方法と同様である。得られた生成物はＡＤＣの混合物であり、「α－ＡＤＣ」と表される。ＷＯ２０１５１６５４１３Ａ１に記載されたようにα異性体とＴ－ＬＣＣＴＬ－ＨＣ（Ｔはトラスツズマブを表す）をコンジュゲートすることによって調製されたα－ＡＤＣは、「α－ＡＤＣ組成物１」と表される。
実施例７ α－ＡＤＣを標的とするＨＥＲ２のＨＥＲ２選択的細胞毒性
目的：α－ＡＤＣの選択的細胞毒性を評価するために、ＨＥＲ２陽性細胞ＨＣＣ１９５４及びＨＥＲ２陰性細胞ＭＤＡ－ＭＢ－４６８を、それぞれα－ＡＤＣ組成物１、Ｋａｄｃｙｌａ及びＤＭ１を用いて処理する。
研究設計：
Figure 2024500921000085
研究設計は表２１及び表２２に示す通りである。細胞を、α－ＡＤＣ組成物１、Ｋａｄｃｙｌａ又はＤＭ１で７２ｈインキュベートした後、細胞生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ(R)発光キットで検出する。細胞生存率の式は、生存率＝（ＲＬＵ（Ｘ）－ＲＬＵ（Ｐｕｒｏ））／（ＲＬＵ（対照）－ＲＬＵ（Ｐｕｒｏ））＊１００％である。Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアによって、データ処理、ＩＣ５０算出及び曲線フィッティングをＬｏｇｉｓｔｉｃモデル（４パラメーター）を用いて行う。
結果：結果は図４７及び表２３に示す通りである。
Figure 2024500921000086
α－ＡＤＣは１００ｎＭまでＨＥＲ２陰性細胞に対して阻害効果を示さなかったが、ＨＥＲ２陽性細胞において有意な阻害効果を示した。Ｔ－ＤＭ１は高濃度でＨＥＲ２陰性細胞においてオフターゲット細胞毒性を示したが、α－ＡＤＣは示さなかった。このようなオフターゲット細胞毒性は、Ｔ－ＤＭ１におけるＭＣＣ－ＤＭ１の逆マイケル反応によるＤＭ１低減による可能性がある。α－ＡＤＣのＭＣＣ’リンカー（開環ＭＣＣ構造を含む）は、逆マイケル反応を減少させるように設計され、これにより、ＤＭ１が内在化する前に脱落することが回避されるか又は著しく減少される。このことから、正常細胞ではα－ＡＤＣはＴ－ＤＭ１よりも安全性が高いことが示されている。
実施例８ α－ＡＤＣの生体分布特性
目的：８９Ｚｒ－α－ＡＤＣ組成物１を単回静脈内注射した後の異なる時点で、陽電子放出コンピュータ断層撮影／コンピュータ断層撮影（ＰＥＴ／ＣＴ）スキャンによって、担癌マウスにおける８９Ｚｒ－α－ＡＤＣの生体分布特性を研究する。
研究設計：［８９Ｚｒ］同位体標識法を使用して、単回静脈内注射後、胸腺欠損マウスにおけるＢＴ－４７４ヒト乳癌異種移植片（ＢＴ－４７４異種移植片腫瘍モデルと呼ばれる）中のα－ＡＤＣ組成物１の分布を研究する。合格した８９Ｚｒ－α－ＡＤＣ組成物１を実験動物に投与する。８つのＢＴ－４７４異種移植腫瘍モデルに８９Ｚｒ－α－ＡＤＣ組成物１を投与する。投与後の１ｈ、２４ｈ、４８ｈ、９６ｈ、１６８ｈ及び３３６ｈでＰＥＴ／ＣＴスキャンを実施し、１０～３０ｍｉｎ静的スキャンする。
結果：結果は図４８に示す通りである。
ＢＴ－４７４異種移植片腫瘍モデルに８９Ｚｒ－α－ＡＤＣ組成物１を単回静脉内注射した後、総放射能は主に腫瘍内に分布し、次に血液が豊富な臓器（肝臓、心臓、腎臓、脾臓、肺）と膝に分布し、その他の組織及び臓器（骨、脳、筋肉）には少ない。放射能に基づいて計算すると、異なる組織における８９Ｚｒ－α－ＡＤＣ組成物１のＡＵＣ（０～３３６ｈ）順序は、腫瘍＞肝臓＞膝＞心臓＞腎臓＞脾臓＞肺＞骨＞筋肉＞脳である。これらの結果から、８９Ｚｒ－α－ＡＤＣ組成物１が血液脳関門を通過し難く、８９Ｚｒ－α－ＡＤＣ組成物１の腫瘍標的が明らかであることが示されている。
ＢＴ－４７４異種移植片腫瘍モデルに８９Ｚｒ－α－ＡＤＣ組成物１を単回静脈内注射した後、比率（腫瘍対筋肉及び腫瘍比対心臓）は徐々に増加し、両方とも投与後３３６時間で最高に達し、それぞれ３４．７８と１５．５４である。
実施例９ α－ＡＤＣのインビボ抗腫瘍効果
目的：この研究の目的は、ＩＶの単回投与後、メスのＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて、皮下ＨＣＣ１９５４ヒト乳癌異種移植片モデル（ＨＣＣ１９５４モデル）及びＮＣＩ－Ｎ８７ヒト胃癌異種移植片モデル（ＮＣＩ－Ｎ８７モデル）におけるα－ＡＤＣのインビボ抗腫瘍効果を評価することである。
研究設計：研究設計は表２４及び表２５に示す通りである。
Figure 2024500921000087
Figure 2024500921000088
治療効果は次のように計算される。Ｔ／Ｃ（％）＝（治療グループの平均ＲＴＶ）／（対照グループの平均ＲＴＶ）×１００％である。ＴＧＩ＝［１－（治療グループの投与終了時の平均腫瘍体積－該治療グループの投与開始時の平均腫瘍体積）／（対照グループ治療終了時の平均腫瘍体積－対照グループの治療開始時の平均腫瘍体積）］×１００％である。
結果：ＨＣＣ１９５４ヒト乳癌異種移植片モデルにおいて、α－ＡＤＣ組成物１（ＤＡＲ １．７９）の単独投与による治療有効性を評価し、陽性対照のＫａｄｃｙｌａ（ＤＡＲ～３．５）と比較する。治療開始後の異なる時点での異なるグループの腫瘍サイズの結果は図４９に示す通りである。ビヒクルグループに比べて、１．２５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇの試験品α－ＡＤＣ組成物１（Ｔ／Ｃはそれぞれ１８．８３％、９．１２％及び２．１２％であり、ＴＧＩはそれぞれ８６．６１％、９６．９７％及び１０４．４３％であり、ｐはそれぞれ０．００２、０．００１及び０．００１である）、及び２．５ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇのＫａｄｃｙｌａ（Ｔ／Ｃはそれぞれ６．４７％及び１．５７％であり、ＴＧＩはそれぞれ９９．７９％及び１０５．０２％であり、ｐはそれぞれ０．００１及び０．００１である）による治療は、有意な抗腫瘍活性を生じた。それらの平均腫瘍サイズは、同じ時間でそれぞれ４１８、２０２、４７、１４４及び３５ｍｍ３である。同じ用量レベルのα－ＡＤＣ組成物１とＫａｄｃｙｌａは、ＨＣＣ１９５４異種移植片モデルにおいて類似の抗腫瘍活性を生じ、ｐ値は、０．７９１（５ｍｇ／ｋｇ）と０．７０１（２．５ｍｇ／ｋｇ）である。
ＮＣＩ－Ｎ８７ヒト胃癌異種移植片モデルにおいて、α－ＡＤＣ組成物１の単独投与による治療有効性を評価する。腫瘍接種後の異なる時点での異なるグループの腫瘍サイズの結果は図４９に示す通りである。ビヒクルグループに比べて、５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇの試験品α－ＡＤＣ組成物１（Ｔ／Ｃはそれぞれ３４．１３％及び５．０７％であり、ＴＧＩはそれぞれ７６．６２％及び１１０．３８％であり、ｐはそれぞれ０．０１０、０．００１である）、及び５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇのＫａｄｃｙｌａ（Ｔ／Ｃはそれぞれ４１．６１％及び４．６６％であり、ＴＧＩはそれぞれ６７．９３％及び１１０．８７％であり、ｐはそれぞれ０．０２２、０．００１である）を用いた治療は、有意な抗腫瘍活性を生じた。それらの平均腫瘍サイズは、同じ時間でそれぞれ４７５、７１、５７９及び６５ｍｍ３である。治療後の３５日目に、１．６７ｍｇ／ｋｇのα－ＡＤＣ組成物１を投与した場合の腫瘍体積は１０２５ｍｍ３（Ｔ／Ｃ＝７３．７７％，ＴＧＩ＝３０．６７％，ｐ＝０．５０９）である。同じ用量レベルのα－ＡＤＣ組成物１とＫａｄｃｙｌａは類似の抗腫瘍活性を生じ、ｐ値はそれぞれ、０．７９１（５ｍｇ／ｋｇ）と１．０００（１５ｍｇ／ｋｇ）である。
実施例１０ α－ＡＤＣの薬物動力学特性
目的：この研究的目的は、カニクイザルにおけるα－ＡＤＣの単回投与後の薬物動力学特性を評価することである。
研究設計：０ｍｇ／ｋｇ（２０分／各投与／サル）のビヒクル（α－ＡＤＣ組成物１調製緩衝液）、又は１０、３０及び４５ｍｇ／ｋｇのα－ＡＤＣ組成物１を合計２４匹のカニクイザル（３匹／性別／グループ、合計４グループ）に単回静脈内注入する。動物は、６週間の観察期間後の４３日目に剖検される。動物の数及び用量レベルの詳細は表２６に示される。
Figure 2024500921000089
採血時点は、０ｈ、５ｍｉｎ、１ｈ、４ｈ、８ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、１６８ｈ、３３６ｈ、５０４ｈ、６７２ｈ、８４０ｈ及び１００８ｈを含む。
結果：まとめた薬物動力学データは図５０に示される。
ＩＶ注入後、α－ＡＤＣ組成物１とα－ＡＤＣ組成物１ＴＡｂの血清濃度は実質的に急速にピーク値に達し、ほぼ二相性で減少し、α－ＡＤＣ組成物１のグループでは、α－ＡＤＣ組成物１はＴＡｂよりも速く減少した。α－ＡＤＣ組成物１とＴＡｂの曝露量（平均Ｃｍａｘ、ＡＵＣ０－ｔ及びＡＵＣ０－∞）は、ほぼ用量比例的に増加する。α－ＡＤＣ組成物１の用量増加による平均ＭＲＴの延長はほとんど又はまったく観察されなかった。α－ＡＤＣ組成物１、α－ＡＤＣ組成物１ＴＡｂ、及びα－ＡＤＣ組成物１ｍＡｂについて、Ｃｍａｘ、ＡＵＣ０－ｔ又はＡＵＣ０－∞において明らかな性差は見られなかった。α－ＡＤＣ組成物１のＴ１／２は３．４～４．１日であり、α－ＡＤＣ組成物１のＴＡｂ Ｔ１／２は５．２～８．６日である。
投与後５ｍｉｎで、≧３０ｍｇ／ｋｇのα－ＡＤＣ組成物１のグループにおいて、ＬＬＯＱよりもわずかに高いＤＭ１が検出され、そして投与後１ｈで、４５ｍｇ／ｋｇのα－ＡＤＣ組成物１のグループでのみ、ＬＬＯＱよりもわずかに高いＤＭ１が検出された。ＤＭ１の平均Ｃｍａｘ及びＡＵＣ０－ｔは、用量が３０から４５ｍｇ／ｋｇに増加するにつれて増加する。
実施例１１ α－ＡＤＣの毒性及び潜在的な標的臓器
目的：本研究的目的は下記ｉ）とｉｉ）を含む。ｉ） ７週間の主段階で、カニクイザルにおいてα－ＡＤＣの反復静脈内注入（３週間に１回、合計３回）後の毒性及び潜在的な標的臓器を評価し、６週間の回復期間後に、観察された毒性又は潜在的な遅延毒性の可逆性を評価して、その後の毒性研究及び臨床試験の研究設計をサポートする。ｉｉ） カニクイザルにおけるα－ＡＤＣの毒物動態学を特徴付ける。
研究設計：４０匹のカニクイザル（５匹／性別／グループ、合計４グループ）を研究にランダムに割り当て、α－ＡＤＣ組成物１（１０、３０及び４５ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクル（０ｍｇ／ｋｇ）を３週間に１回投与し、７週間の投与段階で合計３回投与する。投与段階の終了時、３匹／性別／グループを剖検し、残りの２匹／性別／グループを６週間の回復期間後に剖検する。結果は表２７に示す通りである。
Figure 2024500921000090
結果：まとめたトキシコキネティックデータは図５１に示される。
ＩＶ注入後、α－ＡＤＣ組成物１（１０、３０又は４５ｍｇ／ｋｇ）、α－ＡＤＣ組成物１及びＴＡｂの血清濃度は、通常、それぞれピーク値に迅速に達し、ほぼ二相性で減少し、その後、時間の経過とともに減少し、α－ＡＤＣ組成物１は、１日目と４３日目の両方でもＴＡｂよりも速く減少した。α－ＡＤＣ組成物１の平均血清濃度はＴＡｂの血清濃度に近いが、それよりわずかに低い。α－ＡＤＣ組成物１とＴＡｂの曝露量（平均Ｃｍａｘ及びＡＵＣ０－ｔ）は、ほぼ用量比例的に増加する。α－ＡＤＣ組成物１とＴＡｂは曝露量に関して性差は見られなかった。１日目の曝露量（ＡＵＣ０－ｔ）に基づき、α－ＡＤＣ組成物１とＴＡｂの４３日目の平均蓄積率は両方とも全ての用量で約１．０であり、反復投与後に明らかな薬物蓄積がないことが示された。
１日目と４３日目には、３０及び４５ｍｇ／ｋｇのα－ＡＤＣ組成物１の治療グループでのみ、投与後の３つの時点（５ｍｉｎ、１ｈ及び４ｈ）で投与後の最高ＤＭ１が検出され、ＬＬＯＱよりもわずかに高い。ＤＭ１の平均Ｃｍａｘ及びＡＵＣ０－ｔは用量が３０から４５ｍｇ／ｋｇに増加することにつれて増加する。
非重度毒性の最高用量（ＨＮＳＴＤ）は４５ｍｇ／ｋｇと決定される。
注目すべき発見は次に示す通りである。
４５ｍｇ／ｋｇにおいて：ＰＬＴの減少（オス）、ＡＰＴＴの延長（オス）、ＡＳＴ及び／又はＡＬＴの増加は、各投与サイクルの投与後７日目に定期的に観察され、その後に回復する。ＧＬＯＢが減少する。投与段階でＡ／Ｇの減少が観察された。脾臓重量の増加（絶対及び相対）は両方の性別にも存在した。組織病理学的変化は、肝臓のＫｕｐｆｆｅｒ細胞の肥大、脾臓の赤色髄における細胞過多と単細胞壊死の増加、角膜（１匹のオス）と十二指腸ブルナー腺（Ｂｒｕｎｎｅｒ’ｓ ｇｌａｎｄ）における上皮細胞壊死、及び肝臓のＫｕｐｆｆｅｒ細胞、脾臓組織球、十二指腸ブルナー腺上皮（メス）、角膜上皮（１匹のオス）、食道扁平上皮（オス）の有糸分裂像の増加を含む。血管周囲の慢性炎症及び線維症は１匹のメスの投与部位に存在した。上記の全ての変化は回復期間終了時には観察されなかったが、１匹のオスでは両側の糸球体のメサンギウムマトリックスの増加が観察されたとともに、４３日目からＡＤＡが検出され、したがって、変化は免疫原性に関連すると考えられている。
要するに、現在の研究条件下では、１０、３０及び４５ｍｇ／ｋｇのα－ＡＤＣ組成物１による反復静脈内注入（３週間に１回、合計３回）はカニクイザルには耐えられ、１回の投与量は最大４５ｍｇ／ｋｇとなることができる。潜在的な標的臓器／組織は、肝臓、脾臓、上皮（十二指腸、食道及び角膜）及び投与部位である。
Ｋａｄｃｙｌａに比べて、α－ＡＤＣ組成物１は循環中のＤＭ１放出がはるかに少ないため、副作用が少なくなる可能性がある。詳細な比較は表２８に示す通りである。α－ＡＤＣ組成物１のＤＭ１ Ｃｍａｘは３０ｍｇ／ｋｇの用量でＴ－ＤＭ１の約１％であり、α－ＡＤＣ組成物１のＤＭ１ ＡＵＣ０－ｔは３０ｍｇ／ｋｇの用量でＴ－ＤＭ１の約０．００２％である。
Figure 2024500921000091
α－ＡＤＣとＫａｄｃｙｌａの代表的な病理学評価項目は表２９に示す通りである。
病理学的評価により、主要なＤＭ１関連毒性は肝毒性と末梢神経障害である。１０ｍｇ／ｋｇのＫａｄｃｙｌａに比べて、α－ＡＤＣ組成物１のＨＮＳＴＤ用量（４５ｍｇ／ｋｇ）は、組織病理学において有意に軽度の重症度を示している。同じ用量レベルのα－ＡＤＣ組成物１とＫａｄｃｙｌａは類似の抗腫瘍活性を生じ、α－ＡＤＣ組成物１のＨＮＳＴＤはＫａｄｃｙｌａの４．５倍であるため、α－ＡＤＣ組成物１の治療ウィンドウはＫａｄｃｙｌａよりもはるかに広いはずである。
Figure 2024500921000092
当業者であれば、本開示の精神及び範囲を逸脱することなく、本開示に対して様々な変更及び修飾を加えることができることを理解すべきである。本明細書に記載された実施形態は例として提供されるに過ぎず、限定として解釈されるべきではない。本発明の真の範囲及び精神は特許請求の範囲によって限定され、明細書及び実施例は例示的なものに過ぎない。

Claims (60)

  1. 式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）又は（ＸＩＶ）の化合物であって、
    Figure 2024500921000093
     式中、
    ペイロードは、１つ又は複数のキラル中心を含む細胞毒素部分であり、
    Ｌ１は存在しないか、又はＣ１－１０アルキレン基、Ｃ３－１０シクロアルキレン基、Ｃ６－１０アリーレン基、４～１０員ヘテロシクリレン基、５～１０員ヘテロアリーレン基、－ＮＨ－、－（ＣＯ）－、－ＮＨ（ＣＯ）－、及び－（ＣＯ）ＮＨ－からなる群より選択される１つ又は複数の二価基であり、
    Ｌ２は結合であるか、又はＣ１－１０アルキレン基、Ｃ３－１０シクロアルキレン基、Ｃ６－１０アリーレン基、４～１０員ヘテロシクリレン基、５～１０員ヘテロアリーレン基、－ＮＨ－、－（ＣＯ）－、－ＮＨ（ＣＯ）－、及び－（ＣＯ）ＮＨ－からなる群より選択される１つ又は複数の二価基であり、
    Ｍはリガーゼ認識モチーフを含み、
    前記化合物は、主に、例えば純粋又は実質的に純粋な異性体形態であり、例えば他の異性体形態を実質的に含まず、例えば９０％超、例えば９５％超、例えば９８％超、例えば少なくとも９９％の純度を有する、前記化合物。
  2. 式（ＸＩＩＩ）又は（ＸＩＶ）の化合物である、請求項１に記載の化合物。
  3. 前記リガーゼ認識モチーフは、
    （ａ）例えばＬＰＥＴＧ等のＸが任意のアミノ酸残基であるＬＰＸＴＧと、
    （ｂ）Ｇがグリシン（Ｇｌｙ）で、ｎが３～１０の整数であるＧｎと、から選択される、請求項１又は２に記載の化合物
  4. ＭがＨ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－ＮＨ２であり、Ｍがリジン上のε－アミノ基を介してＬ２に連結される、請求項３に記載の化合物。
  5. Ｌ１は存在せず、
    Ｌ２は
    Figure 2024500921000094
     から選択される、前記請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物。
  6. Ｌ１は存在せず、
    Ｌ２は
    Figure 2024500921000095
     であり、
    Ｍは
    Figure 2024500921000096
     であり、
    式中、
    Ｙは結合であるか又は１～２０個のアミノ酸のスペーサー配列であり、
    ｎは３～１０の整数、例えば３であり、
    ｘは、水素、－ＯＨ、－ＮＨ２、１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメント、及び１～１０個のヌクレオチドを含むヌクレオチドフラグメントからなる群より選択され、例えば－ＯＨ、－ＮＨ２、及び１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントから選択され、例えば－ＯＨ、－ＮＨ２及びＧｌｙからなる群より選択され、例えば－ＮＨ２である、請求項１、２、３又は４に記載の化合物。
  7. 前記細胞毒素は、マレイミド部分と反応できるチオール基部分を含む、前記請求項１～６のいずれか１項に記載の化合物。
  8. 前記細胞毒素はメイタンシノイドであり、
    例えばＤＭ１
    Figure 2024500921000097
     である、前記請求項１～７のいずれか１項に記載の化合物。
  9. 式（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）の化合物から選択される、前記請求項１～８のいずれか１項に記載の化合物。
    Figure 2024500921000098
  10. 式（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）の化合物である、請求項９に記載の化合物。
  11. 式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の開環チオスクシンイミド構造を含む抗体薬物コンジュゲートであって、
    Figure 2024500921000099
     前記化合物は、主に、例えば純粋又は実質的に純粋な異性体形態であり、例えば他の異性体形態を実質的に含まず、例えば９０％超、例えば９５％超、例えば９８％超、例えば少なくとも９９％の純度を有する、抗体薬物コンジュゲート。
  12. 請求項１から１１のいずれか１項の化合物と抗体とをリガーゼの存在下で反応させることにより形成される、請求項１１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  13. それぞれ式（ＸＶＩＩ－１－１）～（ＸＸ－１－１）を有し、
    Figure 2024500921000100
     式中、
    ペイロードは上記で定義した通りであり、例えば１つ又は複数のキラル中心を含む細胞毒素部分、例えばチオール基部分を除いたメイタンシノイド分子の残りの部分、例えばチオール基部分を除いたＤＭ１の残りの部分であり、
    Ａは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ又はリガーゼ受容体基質認識モチーフを有するように場合により修飾された抗体又はその抗原結合フラグメントであり、例えば、Ａは、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）に結合する抗体であり、例えばトラスツズマブであり、前記トラスツズマブは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ又はリガーゼ受容体基質認識モチーフを有するように修飾され、
    ｚは１又は２の整数である、請求項１１又は１２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  14. Ａは、例えば－ＧＡ－等の短いペプチドスペーサー及びリガーゼ供与体基質認識モチーフＬＰＸＴＧＪの導入により修飾されたＣ－末端修飾軽鎖（ＬＣＣＴＬ）を有するトラスツズマブであり、ＬＰＸＴＧＪ中のＪは存在しないか、又は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントである、請求項１３に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  15. ペイロードはＤＭ１であり、
    Ｌ３は存在せず、
    式（ＸＶＩＩ－１－１）～（ＸＸ－１－１）はそれぞれ構造（ｖ）～（ｖｉｉｉ）を有する、請求項１３又は１４に記載の抗体薬物コンジュゲート。
    Figure 2024500921000101
    Figure 2024500921000102
  16. 請求項１５に示す構造（ｖｉｉ）を有する、請求項１４に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  17. 請求項１から１０のいずれか１項に記載の化合物を調製する方法であって、
    （ｉ）式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）及び（ＸＩＶ）の化合物の混合物を合成するステップと、
    （ｉｉ）前記混合物をクロマトグラフィーにかけて標的化合物を得るステップであって、
    前記標的化合物の各々は個別の生成物として得られ、又は２つの標的化合物は第２混合物として得られる前記ステップと、
    （ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で収集された第３混合物を含む溶出物を場合により回収し、前記第３混合物は、ステップ（２）で分離された標的化合物とは異なる１つ又は複数の追加の標的化合物を含み、そして回収された溶出物をクロマトグラフィーにかけて前記追加の標的化合物を分離するステップと、を含む、前記方法。
  18. 前記クロマトグラフィーは逆相クロマトグラフィーである、請求項１７に記載の方法。
  19. 癌の治療を必要とする患者の癌を治療する方法であって、請求項１１から１６のいずれか１項に記載の抗体薬物コンジュゲートの有効量を前記患者に投与することを含む、前記方法。
  20. 前記癌はＨＥＲ２－陽性乳癌であり、前記抗体薬物コンジュゲートは請求項１６に記載のものである、請求項１９に記載の方法。
  21. 混合物１から１つ又は複数の標的化合物を分離する方法であって、前記混合物１は４つの化合物を含み、前記４つの化合物の各々は部分１、部分２及び部分３を含み、
    部分１は、式（Ｉ）～（ＩＶ）から選択される開環チオスクシンイミド構造を有し、
    Figure 2024500921000103
     ここで、
    部分１中のチオール基とアミド基は２つの連結部位を構成し、部分２はその一方を介し て部分１に連結され、部分３はその他方を介して部分１に連結され、
    部分２は１つ又は複数のキラル中心を含み、
    前記４つの化合物中の部分１は異なり、
    部分３は前記分子中の残りの部分であり、
    部分３の分子量は１９００以下であり、
    前記１つ又は複数の標的化合物は混合物１に含まれる４つの化合物から選択され、
    前記方法は、
    （１）混合物１を用意するステップと、
    （２）混合物１をクロマトグラフィーにかけて標的化合物を得るステップと、を含み、
    ここで、
    ａ．前記標的化合物の各々は個別の生成物として得られ、又は
    ｂ．２つの標的化合物は混合物として得られ、該混合物は混合物２と定義される、前記方法。
  22. （３）ステップ（２）で収集された混合物３を含む溶出物を回収するステップであって、混合物３は、ステップ（２）で分離された標的化合物とは異なる１つ又は複数の追加の標的化合物を含む前記ステップと、
    （４）ステップ（３）で回収された溶出物をクロマトグラフィーにかけて前記追加の標的化合物を分離するステップと、をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
  23. ステップ（２）及びステップ（４）において、４つの標的化合物が得られ、その２つの標的化合物はステップ（２）において個別の生成物として得られ、他の２つの標的化合物はステップ（４）において個別の生成物として得られ、
    好ましくは、ステップ（２）において個別の生成物として得られた２つの標的化合物中の部分１はそれぞれ式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の構造を有し、ステップ（４）において個別の生成物として得られた２つの標的化合物中の部分１はそれぞれ式（ＩＩＩ）又は式（ＩＶ）の構造を有する、請求項２１又は２２に記載の方法。
  24. ステップ（２）において４つの標的化合物が得られ、その２つの標的化合物は個別の生成物として得られ、残りの２つの標的化合物は混合物２として得られ、
    好ましくは、ステップ（２）において個別の生成物として得られた２つの標的化合物中の部分１はそれぞれ式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の構造を有し、混合物２として得られた２つの標的化合物中の部分１はそれぞれ式（ＩＩＩ）又は式（ＩＶ）の構造を有する、請求項２１に記載の方法。
  25. ステップ（２）におけるクロマトグラフィーは逆相クロマトグラフィーであり、及び／又は
    ステップ（２）における逆相クロマトグラフィーで使用される固定相はアルキル結合シリカゲルの種から選択され、及び／又は
    ステップ（２）における移動相は溶出剤Ａ、溶出剤Ｂであり、
    溶出剤Ａは、酸性剤１を場合により含有する水であり、
    溶出剤Ｂは、酸性剤２を場合により含有する有機溶媒１であり、
    ただしその条件として、酸性剤１及び酸性剤２のうちの少なくとも１つが存在し、
    分離範囲について、Ｂは約０％～３０％から約３０％～１００％の勾配であり、残りはＡであることを条件とする、
    前記酸性剤１と酸性剤２は独立して無機酸又は有機酸である、請求項２１から２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 酸性剤１はＡｃＯＨ及びＬ－酒石酸（Ｌ－ＴＡ）から選択され、好ましくは、酸性剤１はＡｃＯＨであり、及び／又は
    酸性剤１の量は、溶出剤Ａの全体積に基づいて約０．０１％～約１％、好ましくは約０．０５％～約０．５％、より好ましくは約０．１％～約０．５％、最も好ましくは約０．１％～約０．３％であり、特に０．３％である、請求項２１から２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 酸性剤２は存在せず、又は
    酸性剤２の種類は酸性剤１と同様であり、
    及び／又は
    酸性剤２の量は、溶出剤Ｂの全体積に基づいて約０．０１％～約１％、好ましくは０．０５％～約０．５％、より好ましくは約０．１％～約０．５％、最も好ましくは約０．１％～約０．３％であり、特に０．３％であり、及び／又は
    溶出組成物中で酸性剤１と酸性剤２（存在する場合）の総量は約０．００５～０．０６Ｍである、請求項２６に記載の方法。
  28. 標的化合物を溶出する時、酸性剤１と酸性剤２の総量は、溶出剤Ａと溶出剤Ｂの全体積に基づいて約１％以下、好ましくは約０．８％以下、より好ましくは約０．６％以下であり、例えば、約０．４％以下、特に約０．２８５％以下である、請求項２６又は２７に記載の方法。
  29. ステップ（４）におけるクロマトグラフィーは逆相クロマトグラフィーであり、及び／又は
    逆相クロマトグラフィーの固定相はアルキル結合シリカゲルの種から選択され、及び／又は
    ステップ（４）における移動相は溶出剤Ｃ、溶出剤Ｄであり、
    溶出剤Ｃは、酸性剤３を場合により含有する水であり、
    溶出剤Ｄは、酸性剤４を場合により含有する有機溶媒２であり、
    分離範囲について、Ｄは約０％～３０％から約３０％～１００％の勾配であり、残りはＣであり、
    前記酸性剤３と酸性剤４は独立して無機酸又は有機酸である、請求項２１から２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 酸性剤３は、ＴＦＡ、リン酸塩緩衝液、酢酸アンモニウム（ＡＡ）、ＡｃＯＨ、Ｈ３ＰＯ４、ＴＥＡＰ及びＬ－酒石酸（Ｌ－ＴＡ）から選択され、好ましくはＴＦＡ、リン酸塩緩衝液、ＡＡ及びＴＥＡＰから選択され、より好ましくはＴＦＡ、リン酸塩緩衝液及びＴＥＡＰから選択され、特にＴＦＡであり、及び／又は
    酸性剤３の量は、溶出剤Ｃの全体積に基づいて約０．０１％～約１％、好ましくは約０．０５％～約０．５％、より好ましくは約０．０５％～約０．３％であり、特に０．１％である、請求項２１から２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 酸性剤４は存在せず、又は
    酸性剤４の種類は酸性剤３と同様であり、及び／又は
    酸性剤４の量は、溶出剤Ｄの全体積に基づいて約０．０１％～約１％であり、好ましくは約０．０５％～約０．５％、より好ましくは約０．０５％～約０．３％であり、特に０．１％であり、及び／又は
    溶出組成物中で酸性剤３と酸性剤４（存在する場合）の総量は約０．０１～０．２５Ｍである、請求項３０に記載の方法。
  32. クロマトグラフィープロセスの任意の時点で、酸性剤３と酸性剤４の総量は、溶出剤Ｃと溶出剤Ｄの全体積に基づいて約０．０１％～約１％、好ましくは約０．０５％～約０．５％、より好ましくは約０．０５％～約０．３％であり、特に０．１％である、請求項３０又は３１に記載の方法。
  33. 混合物１に含まれる４つの化合物中の各部分２は同じであり、
    部分２は下記式（Ｖ）の構造を有し、
    Figure 2024500921000104
     式中、Ｑは、少なくとも１つのキラル中心を含む基であり、
    Ｌ１は存在しないか、又はＣ１－１０アルキレン基、Ｃ３－１０シクロアルキレン基、Ｃ６－１０アリーレン基、４～１０員ヘテロシクリレン基、５～１０員ヘテロアリーレン基、－ＮＨ－、－（ＣＯ）－、－ＮＨ（ＣＯ）－、及び－（ＣＯ）ＮＨ－からなる群より選択される１つ又は複数の二価基であり、
    好ましくは、ＱはＣ５－５０ヒドロカルビル基であり、
    前記ヒドロカルビル基中の１つ又は複数の「ＣＨ２」構造は、安定した構造が形成されることを条件として、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＳ（＝Ｏ）２－、又は－Ｓ（＝Ｏ）２ＮＨ－によって場合により置き換えられ、
    前記ヒドロカルビル基中の１つ又は複数の「ＣＨ」構造は、安定した構造が形成されることを条件として、Ｎ又はＰによって場合により置き換えられ、
    Ｑ中の１つ又は複数の炭素原子、硫黄原子、窒素原子又はリン原子は独立して、オキソ（＝Ｏ）によって場合により置換され、
    Ｑは、Ｒｑから選択される少なくとも１つの置換基によって場合により置換され、Ｒｑはそれぞれ独立して、Ｒａ１、－ＯＲａ１、－ＳＲａ１、－ＮＲａ１Ｒｂ１、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａ１、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ１Ｒｂ１、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒａ１、－Ｓ（＝Ｏ）２ＯＲａ１、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｒａ１、－Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲａ１Ｒｂ１、－Ｓ（＝Ｏ）Ｒａ１、－Ｃ（＝Ｓ）ＯＲａ１、－Ｃ（＝Ｓ）ＮＲａ１Ｒｂ１、－Ｃ（＝Ｓ）Ｒａ１、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲａ１）ＯＲｂ１、－Ｃ（＝ＮＲａ１）ＮＲｂ１Ｒｃ１から選択され、
    Ｒａ１、Ｒｂ１及びＲｃ１はそれぞれ独立して、水素及びＣ１－６アルキル基から選択される、請求項２１から３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 部分２は下記式（Ｖ－１）の構造を有し、
    Figure 2024500921000105
     式中、ペイロードは、水素、及び少なくとも１つのキラル中心を含む小分子化合物からなる群より選択され、
    好ましくは、前記小分子化合物は、酵素阻害剤、酵素活性化剤、受容体調節剤、毒素、グリカン、ＰＥＧ部分、放射性核種、核酸及び類似体、トレーサー分子、低分子量ペプチド、低分子量ペプチド模倣体、低分子量抗体及び抗体フラグメントから選択される、請求項３２に記載の方法。
  35. 混合物１に含まれる４つの化合物中の各部分３は同じであり、及び／又は
    部分３は下記式（ＶＩ）の構造を有し、
    Figure 2024500921000106
     式中、Ｌ２は結合であるか、又はＣ１－１０アルキレン基、Ｃ３－１０シクロアルキレン基、Ｃ６－１０アリーレン基、４～１０員ヘテロシクリレン基、５～１０員ヘテロアリーレン基、－ＮＨ－、－（ＣＯ）－、－ＮＨ（ＣＯ）－、及び－（ＣＯ）ＮＨ－からなる群より選択される１つ又は複数の二価基であり、
    Ｍは、（１）１～２０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列１と、（２）「－（Ｃ２Ｈ４－Ｏ）ｉ－」構造を含み、ｉが１～１００の整数である、場合により存在するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分と、（３）切断可能な配列１、スペーサーＳｐ１及びそれらの組合せから選択される二価の場合により存在する基Ｙと、を含み、
    前記切断可能な配列は、酵素によって切断可能なアミノ酸配列２を含み、前記切断可能な配列は１～１０個のアミノ酸を含み、
    Ｓｐ１は、１～２０個のアミノ酸を含むスペーサー配列、ＰＡＢ及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
  36. Ｌ１は存在しないか、又は
    Figure 2024500921000107
     から選択され、及び／又は
    Ｌ２は、結合、
    Figure 2024500921000108
     から選択される、請求項３４から３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. Ｍは、１～２０個のアミノ酸を含むスペーサー配列、ＰＡＢ、リジン、オリゴマーグリシン、オリゴマーアラニン、重合度３～１０のオリゴマーグリシン／アラニン混合物及びそれらの組合せからなる群より選択され、
    好ましくは、
    ＭはＬ（Ｇ）ｎであり、ここでＬはロイシン（Ｌｅｕ）であり、又は、
    ＭはＥ（Ｇ）ｎであり、ここでＥはグルタミン酸（Ｇｌｕ）であり、又は、
    ＭはＧｎであり、
    Ｇはグリシン（Ｇｌｙ）であり、
    ｎは３～１０の整数であり、特に３である、請求項３５又は３６に記載の方法。
  38. Ｍはイオン化可能なアミノ基を有し、酸性剤１はＡｃＯＨであり、
    酸性剤１の量は、溶出剤Ａの全体積に基づいて約０．０１％～約１％、好ましくは約０．０５％～約０．５％、より好ましくは約０．１％～約０．５％、最も好ましくは約０．１％～約０．３％であり、特に０．３％であり、
    酸性剤２は存在しないか、又は酸性剤２は、前記移動相のｐＨ値の目標勾配が得られるような量で存在する、請求項３７に記載の方法。
  39. Ｍはイオン化可能なアミノ基を有し、酸性剤３はＴＦＡであり、
    酸性剤３の量は、溶出剤Ｃの全体積に基づいて約０．０１％～約１％、好ましくは約０．０５％～約０．５％、より好ましくは約０．０５％～約０．３％であり、特に０．１％であり、
    酸性剤４は存在しないか、又は酸性剤４は、溶出剤Ｄの全体積に基づいて約０．０１％～約１％、好ましくは約０．０５％～約０．５％、より好ましくは約０．０５％～約０．３％、特に０．１％の量で存在するか、又は酸性剤４は、前記移動相のｐＨ値の目標勾配が得られるような量で存在する、請求項３５から３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. ステップ（１）は、部分１の開環チオスクシンイミド構造をもたらすチオスクシンイミド基の開環反応を含み、
    好ましくは、混合物１は前記開環反応で得られた反応混合物である、請求項２１から３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 混合物１に含まれる４つの化合物は、それぞれ異性体化合物（ｉ）～（ｉｖ）である、請求項２１から４０のいずれか１項に記載の方法。
    Figure 2024500921000109
  42. 化合物（ｉ）及び（ｉｉ）はステップ（２）において個別の生成物として得られ、
    化合物（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）はステップ（４）において個別の生成物として得られる、請求項２１に記載の方法。
  43. ステップ（２）において、化合物（ｉ）及び（ｉｉ）は個別の生成物として得られ、化合物（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）は混合物２として得られる、請求項２１に記載の方法。
  44. 混合物１は、次の化合物中のチオスクシンイミド基の開環反応によって得られた反応混合物である、請求項２１に記載の方法。
    Figure 2024500921000110
  45. 式（ＸＩＩＩ）の化合物と式（ＸＩＶ）の化合物の混合物、例えばラセミ混合物を含む組成物であって、
    Figure 2024500921000111
     式中、
    ペイロードは、１つ又は複数のキラル中心を含む細胞毒素部分であり、
    Ｌ１は存在しないか、又はＣ１－１０アルキレン基、Ｃ３－１０シクロアルキレン基、Ｃ６－１０アリーレン基、４～１０員ヘテロシクリレン基、５～１０員ヘテロアリーレン基、－ＮＨ－、－（ＣＯ）－、－ＮＨ（ＣＯ）－、及び－（ＣＯ）ＮＨ－からなる群より選択される１つ又は複数の二価基であり、
    Ｌ２は結合であるか、又はＣ１－１０アルキレン基、Ｃ３－１０シクロアルキレン基、Ｃ６－１０アリーレン基、４～１０員ヘテロシクリレン基、５～１０員ヘテロアリーレン基、－ＮＨ－、－（ＣＯ）－、－ＮＨ（ＣＯ）－、及び－（ＣＯ）ＮＨ－からなる群より選択される１つ又は複数の二価基であり、
    Ｍはリガーゼ認識モチーフを含み、
    前記組成物は、式ＸＩの化合物又はなるＸＩＩの化合物を実質的に含まない（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％含まない）、前記組成物。
    Figure 2024500921000112
  46. 前記リガーゼ認識モチーフは、
    （ａ）例えばＬＰＥＴＧ等のＸが任意のアミノ酸残基であるＬＰＸＴＧと、
    （ｂ）Ｇがグリシン（Ｇｌｙ）で、ｎが３～１０の整数であるＧｎと、から選択される、請求項４５に記載の組成物。
  47. ＭがＨ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－ＮＨ２であり、Ｍがリジン上のε－アミノ基を介してＬ２に連結される、請求項４５又は４６に記載の組成物。
  48. Ｌ１は存在せず、
    Ｌ２は
    Figure 2024500921000113
     から選択される、請求項４５から４７のいずれか１項に記載の組成物。
  49. Ｌ１は存在せず、
    Ｌ２は
    Figure 2024500921000114
     であり、
    Ｍは
    Figure 2024500921000115
     であり、
    式中、
    Ｙは結合であるか又は１～２０個のアミノ酸のスペーサー配列であり、
    ｎは３～１０の整数、例えば３であり、
    ｘは、水素、－ＯＨ、－ＮＨ２、１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメント、及び１～１０個のヌクレオチドを含むヌクレオチドフラグメントからなる群より選択され、例えば－ＯＨ、－ＮＨ２、及び１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントからなる群より選択され、例えば－ＯＨ、－ＮＨ２及びＧｌｙからなる群より選択され、例えば－ＮＨ２である、請求項４５から４８のいずれか１項に記載の組成物。
  50. 前記細胞毒素は、マレイミド部分と反応できるチオール基部分を含む、請求項４５から４９のいずれか１項に記載の組成物。
  51. 前記細胞毒素はメイタンシノイドであり、
    例えばＤＭ１
    Figure 2024500921000116
     である、請求項４５から５０のいずれか１項に記載の組成物。
  52. 式（ｉ）の化合物及び式（ｉｉ）の化合物を実質的に含まない、式（ｉｉｉ）の化合物と式（ｉｖ）の化合物の混合物である、請求項４５から４７のいずれか１項に記載の組成物。
    Figure 2024500921000117
  53. 式（ＩＩＩ）の開環チオスクシンイミド構造を含む抗体薬物コンジュゲートと、式（ＩＶ）の開環チオスクシンイミド構造を含む抗体薬物コンジュゲートとの混合物、例えばラセミ混合物を含む抗体薬物コンジュゲート組成物であって、
    Figure 2024500921000118
     前記組成物は、式（Ｉ）の化合物又は式（ＩＩ）の化合物を実質的に含まない（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％含まない）、前記抗体薬物コンジュゲート組成物。
    Figure 2024500921000119
  54. 請求項４５から５２のいずれか１項に記載の組成物と抗体とをリガーゼの存在下で反応させることにより形成される、請求項５３に記載の抗体薬物コンジュゲート組成物。
  55. 式（ＸＩＸ－１－１）を有する化合物と式（ＸＸ－１－１）を有する化合物の混合物であり、
    Figure 2024500921000120
     式中、
    ペイロードは上記で定義した通りであり、例えば１つ又は複数のキラル中心を含む細胞毒素部分、例えばチオール基部分を除いたメイタンシノイド分子の残りの部分、例えばチオール基部分を除いたＤＭ１の残りの部分であり、
    Ａは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ又はリガーゼ受容体基質認識モチーフを有するように場合により修飾された抗体又はその抗原結合フラグメントであり、例えば、Ａは、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）に結合する抗体であり、例えばトラスツズマブであり、前記トラスツズマブは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ又はリガーゼ受容体基質認識モチーフを有するように修飾され、
    ｚは１又は２の整数である、請求項５２、５３又は５４に記載の抗体薬物コンジュゲート組成物。
  56. Ａは、例えば－ＧＡ－等の短いペプチドスペーサー及びリガーゼ供与体基質認識モチーフＬＰＸＴＧＪの導入により修飾されたＣ－末端修飾軽鎖（ＬＣＣＴＬ）を有するトラスツズマブであり、ＬＰＸＴＧＪ中のＪは存在しないか、又は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントである、請求項５５に記載の抗体薬物コンジュゲート組成物。
  57. ペイロードはＤＭ１であり、
    Ｌ３は存在せず、
    式（ＸＩＸ－１－１）～（ＸＸ－１－１）はそれぞれ構造（ｖｉｉ）と（ｖｉｉｉ）を有する、請求項５５又は５６に記載の抗体薬物コンジュゲート組成物。
    Figure 2024500921000121
  58. 癌の治療を必要とする患者の癌を治療する方法であって、請求項５３から５７のいずれか１項に記載の抗体薬物コンジュゲート組成物の有効量を前記患者に投与することを含む、前記方法。
  59. 前記癌はＨＥＲ２－陽性癌、例えばＨＥＲ２－陽性乳癌である、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記抗体薬物コンジュゲート組成物は請求項５７に記載のものである、請求項５８又は５９に記載の方法。
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