KR20220024531A - 안트라사이클린 유도체 - Google Patents

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KR20220024531A
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seq
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그레이엄 코튼
제니퍼 톰
폴 트럼퍼
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알막 디스커버리 리미티드
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Abstract

본 출원은 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 안트라사이클린 유도체 및 표적-결합 분자와 함께 융합체를 형성하는데 있어서의 이의 용도에 관한 것이다. 표적-결합 분자 및 안트라사이클린 유도체의 접합체가 또한 제공된다. 또한 접합체의 의학적 용도 및 이를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

Description

안트라사이클린 유도체
발명의 분야
본 발명은 안트라사이클린 유도체 및 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는, 표적-결합 분자(target-binding molecule)와 함께 접합체(conjugate)를 형성하는데 있어서의 이의 용도에 관한 것이다. 표적-결합 분자와 안트라사이클린 유도체의 접합체가 또한 제공된다.
도입
항체와 같은 특이적인 결합 단백질에 대한 소 분자량 독소의 접합체는 체내에서 독성 페이로드(payload)를 표적에 대해 지시하는 강력한 도구이다. 예에는 암 세포에 대해 독성 페이로드를 표적화시키기 위한 이러한 접합체의 사용이 있으며 이러한 접합체는 암의 치료시 큰 가능성을 나타낸다.
암 치료요법(therapy)에 대해 효과적이고 안전한 접합체를 개발하기 위해서는, 수개의 양태가 처리될 필요가 있다. 첫째로, 결합 단백질 또는 항체는 정상 또는 건강한 조직 세포에 의해서는 거의 또는 이상적으로 발현되지 않아야 하는, 주어진 종양 특이적인 항원(tumour specific antigen)(TSA)에 대해 특이적일 필요가 있다.
둘째로, 약물과 결합 단백질 사이의 공유결합, 또는 연결은 순환시 안정하여서, 혈류 속에 독성 페이로드의 목적하지 않은 방출을 방지하지만, 암 세포에 대한 결합 및/또는 암 세포 내로의 내재화(internalization) 시 약물을 효과적으로 방출하여야만 한다. 셋째로, 독성 페이로드는 매우 충분한 독성, 또는 잠재능(potency)을 가져서, 심지어 잠재적으로 제한된 양의 TSA가 암 세포에서 발현됨으로써 단지 제한된 양의 ADC가 내재화되는 경우, 또는 독성 페이로드의 방출이 암 세포에 대한 결합 시 매우 충분한 효능으로 영향을 주지 않는 경우, 또는 암 세포 내로의 내재화 시에도, 암 세포의 파괴에 영향을 미쳐야 한다.
안트라사이클린 유도체 PNU-159682는 네모루비신의 대사산물로 기술되었고(Quintieri et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11, 1608-1617) 하나의 난소(A2780) 및 하나의 유방암(MCF7) 세포주(WO2012/073217 A1)를 사용하여 피코- 내지 펨토몰 범위에서 시험관내(in vitro) 세포 사멸에 대해 극도로 높은 효능을 나타내는 것으로 보고되었다. PNU-159682의 유도체는 또한 제WO2016/102679호에 기술되었다.
항체에 대한 PNU-159682 유도체의 접합은 제WO2009/099741호, 제WO2016/127081호 및 제WO2016/102679호, Yu et al, Clin. Cancer Res 2015, 21, 3298 및 Stefan et al, Mol. Cancer. Ther., 2017, 16,879에 기술되어 있다.
발명의 요약
본 발명은 약물 접합체에서 사용하기에 적합한 안트라사이클린(PNU) 유도체를 제공한다. 구체적으로, PNU159682의 유도체가 제공되며, 이는 C14 탄소 및 부착된 하이드록실 기능성(functionality)을 결여하고 있으며, 여기서 에틸렌디아민(EDA) 그룹은 PNU159682의 C13 카보닐과 말레이미드 그룹 사이에 링커 영역(linker region)의 부분을 형성한다. 링커가 val-cit-PAB를 포함하는 경우, 말레이미드 그룹은 접합(conjugation) 반응에 적합한 임의의 반응성 그룹으로 대체될 수 있다. 이러한 페이로드는 다른 분자에서 유리 티올 그룹(free thiol group)과 반응할 수 있다. 유리 티올이 단백질 상에 존재하는 경우, 단백질-약물 접합체(protein-drug conjugate)(PDC)가 형성될 수 있다.
따라서, 제1 양태에서, 화학식 (I)의 안트라사이클린(PNU) 유도체가 제공된다:
Figure pct00001
상기 화학식 (I)에서
[X]는 치환되거나 비치환된 알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 아릴 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴 그룹, 하나 이상의 헤테로원자, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 조합으로부터 선택된 임의의 스페이서(spacer)이고;
[L1] 및 [L2]는 발린(Val), 시트룰린(Cit), 알라닌(Ala), 아스파라긴(Asn), 펩타이드, -(CH2)n-, -(CH2CH2O)n-, p-아미노벤질옥시카보닐(PAB), Val-Cit-PAB, Val-Ala-PAB, Ala-Ala-Asn-PAB, 글리신을 제외한 임의의 아미노산, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 링커이다.
화학식 (I)의 안트라사이클린(PNU) 유도체는 [L1], [L2] 또는 [L1] 및 [L2]를 포함할 수 있다.
바람직하게는, [L1] 및/또는 [L2]가 펩타이드인 경우, 상기 펩타이드는 글리신을 함유하지 않는다.
임의의 스페이서 및/또는 임의의 링커가 부재하는 경우 결합은 이의 위치에 남아있음이 당해 분야의 기술자에게는 명확할 것이다.
바람직하게는, [X]는 폴리에틸렌 글리콜,
Figure pct00002
Figure pct00003
및
Figure pct00004
를 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 여기서
Figure pct00005
는 분자의 나머지에 대한 부착점을 나타내고 여기서 [R]은 치환되거나 비치환된 알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 아릴 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴 그룹, 하나 이상의 헤테로원자, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 임의의 스페이서이다.
가장 바람직하게는, [X]는 폴리에틸렌 글리콜이다. 폴리에틸렌 글리콜은 PEG4일 수 있다.
바람직하게는, [L2]는 p-아미노벤질옥시카보닐(PAB) 또는 알라닌이다.
바람직하게는, PNU 유도체는 다음으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00006
Figure pct00007
제2의 양태에서, 화학식 (IV)의 안트라사이클린(PNU) 유도체가 제공된다:
Figure pct00008
상기 화학식 (IV)에서,
[X]는 치환되거나 비치환된 알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 아릴 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴 그룹, 하나 이상의 헤테로원자, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 임의의 스페이서이고;
여기서 [Z]는 반응성 그룹이다. 반응성 그룹은 접합 반응, 특히 표적 결합 분자에 대한 접합 반응에서 사용하기에 적합한 임의의 반응성 그룹일 수 있다.
따라서, [Z]는 생물접합 반응에서 사용하기 위한 작용 그룹을 포함하는 모이어티(moiety)일 수 있다. 생물접합 반응에 사용하기 위한 작용 그룹은 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다:
· 티오에테르 및 셀로노에테르 반응을 통해 단백질에서 티올 그룹 또는 셀레놀 그룹과의 반응을 위한 말레이미드 또는 알킬 할라이드;
· 말레이미드, 알킬 할라이드 또는 단백질 시스테인 잔기의 티올 그룹을 포함하는 티올 작용화된 분자와의 반응을 위한 설프하이드릴 그룹;
· 티올 그룹과의 반응하여 티올 디설파이드 교환을 통한 디설파이드 연결을 형성하기 위한 피리딜 디티올(Npys 티올) 또는 TNB 티올(5-티올-2-니트로벤조산)과 같은 활성화된 디설파이드;
· 아미드 결합 형성 반응을 통한 단백질과 생물분자(biomolecule) 상의 카복실 그룹에 대한 부착용 아미노 그룹;
· 응력(strain) 촉진된 알킨-아지드 환부가(cycloaddition) 구리 유리된 화학을 통한 아지도 작용화된 생물분자와의 반응을 위한 알킨 그룹, 특히 환 구속된 알킨, 예를 들면, 디벤조사이클로옥틴(DBCO) 또는 비사이클로[6.1.0]노닌(BCN). 아지도 작용성은 예를 들면, 비천연 아미노산 파라-아지도메틸-L-페닐알라닌의 혼입을 통해 단백질 내로 또는 효소 매개된 당가공(glycoengineering)을 사용하여 단백질 글리칸 내로 도입되어 아지도-함유 당 유사체를 부착시킬 수 있다;
· 응력 촉진된 알킨-아지도 환부가 구리 유리된 화학을 통한 알킬 작용화된 표적-결합 분자와의 반응을 위한 아지도 그룹;
· 옥심 형성 연결을 통해 생물분자 상에서 알데하이드 및 케톤 그룹과의 반응을 위한 아민옥시 그룹. 케톤은 앰버 정지 코돈 기술(amber stop codon technology), 예를 들면, 비-천연 아미노산, 파라-아세틸 페닐알라닌의 혼입의 사용을 통해 단백질 내로 도입시킬 수 있다. 알데하이드는 환원 당의 존재를 통해 생물분자에서 발견될 수 있으며 N-말단 세린 잔기의 과옥소산염 산화 또는 탄수화물의 시스-글리콜 그룹의 과옥소산염 산화를 통해 단백질 내로 도입될 수 있다. 알데하이드 그룹은 또한 포르밀글리신 생성 효소에 의해, 특정 서열 내에, 단백질 시스테인의 포르밀 글리신으로의 전환을 통해 단백질 내로 혼입될 수 있다. 또한, 포르밀글리신 함유 단백질은 하이드라지노-픽테트-스펜글러(Hydrazino-Pictet-Spengler)(HIPS) 연결을 통해 페이로드에 접합되었다:
· 옥심 또는 하이드라진 결합 형성 연결 반응을 통한 아민옥시 또는 하이드라지드 작용화된 생물분자와의 반응을 위한 알데하이드 또는 케톤 그룹. 단백질 아민옥시 및 하이드라지드 작용화된 단백질은 인테린-융합 단백질의 절단을 통해 생성될 수 있다.
따라서 [Z]는 말레이미드, 알킬 할라이드, 설프하이드릴 그룹, 활성화된 디설파이드(예를 들면, 피리딜 디티올(Npys 티올) 또는 TNB 티올(5-티올-2-니트로벤조산)), 아미노 그룹, 알킨 그룹(예를 들면, 환 구속된 알킨, 예를 들면, 비벤조사이클로옥틴(DBCO) 또는 비사이클로[6.1.0]노닌(BCN)), 아지도 그룹, 아민옥시 그룹, 알데하이드 그룹 및 케톤 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
[Z]는 또한 효소 매개된 생물접합 반응을 위한 모이어티일 수 있다. 효소 매개된 접합 반응에서 사용하기 위한 모이어티는 소르타제-효소 매개된 항체 접합에서 사용하기 위한 폴리Gly[(Gly)n] 또는 Lys-Lys-Gln-Gly 및 Lys-Pro-Glu-Thr-Gly와 같은 서열과 함께 함유된 글루타민 γ-카복시아미드 그룹에 대한 세균 트랜스글루타미나제 매개된 접합에 적절한 1급 아민을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
따라서, [Z]는 폴리Gly 및 1급 아민으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 제2 양태에 따른 PNU 유도체는 본 발명의 제1 양태의 PNU 유도체에 상응할 수 있고 여기서 L1은 Val-Cit-PAB이고, L2는 부재하며 여기서 말레이미드 그룹은 상기 정의된 바와 같은 다른 반응성 그룹으로 대체될 수 있다.
바람직하게는, [X]는 폴리에틸렌 글리콜,
Figure pct00009
Figure pct00010
및
Figure pct00011
를 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 여기서
Figure pct00012
는 분자의 나머지에 대한 부착 점을 나타내고 여기서 [R]은 치환되거나 비치환된 알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 아릴 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴 그룹, 하나 이상의 헤테로원자, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 임의의 스페이서이다.
가장 바람직하게는, [X]는 폴리에틸렌 글리콜이다. 폴리에틸렌 글리콜은 PEG4일 수 있다.
제1 양태의 PNU 유도체는 다양한 모이어티에 접합될 수 있다. 특히, 제1 양태의 PNU 유도체는 본원에서 표적-결합 분자로 지칭된, 표적에 결합하는 분자에 접합될 수 있다. 제2 양태의 PNU 유도체는 본원에서 표적-결합 분자로 지칭된, 표적에 결합하는 분자에 접합될 수 있다. 표적-결합 분자의 예는 생물분자, 펩타이드, 소 분자, 단백질, 및 핵산(예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 압타머(aptamer))을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 경우에, 표적-결합 분자는 다량체성(예를 들면, 삼량체 및 보다 높은 차수의 다량체 또는 다중-소단위(subunit) 단백질)일 수 있다.
따라서, 추가의 양태에서, 제1 양태에 따른 PNU 및 결합 분자를 포함하는 표적-결합 분자-약물 접합체가 제공된다. 대안적으로, 당해 양태에서, 제2 양태에 따른 PNU 및 결합 분자를 포함하는 표적-결합 분자-약물 접합체가 제공된다. 당해 양태에서 사용하기에 적합한 결합 분자는 생물분자, 펩타이드, 소 분자, 단백질, 핵산(압타머를 포함하나 이에 한정되지 않음)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 당해 양태에 따라서, 표적-결합 분자 및 안트라사이클린(PNU) 유도체를 포함하는 표적-결합 분자-약물 접합체가 제공되며, 여기서 표적-결합 분자-약물 접합체는 화학식 (II)의 구조를 갖는다:
Figure pct00013
여기서, [X]는 치환되거나 비치환된 알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 아릴 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴 그룹, 하나 이상의 헤테로원자, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 임의의 스페이서이고;
[L1] 및 [L2]는 발린(Val), 시트룰린(Cit), 알라닌(Ala), 아스파라긴(Asn), 펩타이드, -(CH2)n-, -(CH2CH2O)n-, p-아미노벤질옥시카보닐(PAB), Val-Cit-PAB, Val-Ala-PAB, Ala-Ala-Asn-PAB, 글리신을 제외한 임의의 아미노산, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 링커이고;
Y는 표적 결합 분자이다.
화학식 (II)의 표적-결합 분자-약물 접합체는 [L1], [L2] 또는 [L1] 및 [L2]를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 표적-결합 분자-약물 접합체에서 [L1] 및/또는 [L2]는 펩타이드이고, 상기 펩타이드는 글리신을 함유하지 않는다.
임의의 스페이서 및/또는 임의의 링커가 부재하는 경우 결합이 이의 위치내에 남아있음은 당해 분야의 기술자에게 명확할 것이다.
일 구현예에서, 안트라사이클린(PNU) 유도체는 [L1] 및/또는 [L2]를 포함하고 [X]는 선택적이다. 따라서, [L1] 및/또는 [L2]는 발린(Val), 시트룰린(Cit), 알라닌(Ala), 아스파라긴(Asn), 펩타이드, -(CH2)n-, -(CH2CH2O)n-, p-아미노벤질옥시카보닐(PAB), Val-Cit-PAB, Val-Ala-PAB, Ala-Ala-Asn-PAB, 글리신을 제외한 임의의 아미노산, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 링커일 수 있다. 화학식 (I)의 안트라사이클린(PNU) 유도체는 [L1], [L2] 또는 [L1] 및 [L2]를 포함할 수 있다. 화학식 (I)의 안트라사이클린(PNU) 유도체는 [L1] 및/또는 [L2]를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 화학식 (I)의 안트라사이클린(PNU) 유도체가 제공된다:
Figure pct00014
여기서 [X]는 치환되거나 비치환된 알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 아릴 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴 그룹, 하나 이상의 헤테로원자, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 임의의 스페이서이고;
[L1] 및/또는 [L2]는 발린(Val), 시트룰린(Cit), 알라닌(Ala), 아스파라긴(Asn), 펩타이드, -(CH2)n-, -(CH2CH2O)n-, p-아미노벤질옥시카보닐 (PAB), Val-Cit-PAB, Val-Ala-PAB, Ala-Ala-Asn-PAB, 글리신을 제외한 임의의 아미노산, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 링커이고;
여기서 화학식 (I)의 안트라사이클린(PNU) 유도체는 [L1], [L2] 또는 [L1] 및 [L2]를 포함한다.
바람직하게는, [X]는 폴리에틸렌 글리콜,
Figure pct00015
Figure pct00016
및
Figure pct00017
를 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 여기서
Figure pct00018
는 분자의 나머지에 대한 부착점을 나타내고 여기서 [R]은 치환되거나 비치환된 알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 아릴 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴 그룹, 하나 이상의 헤테로원자, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 임의의 스페이서이다.
가장 바람직하게는, [X]는 폴리에틸렌 글리콜이다. 폴리에틸렌 글리콜은 PEG4일 수 있다.
바람직하게는, [L2]는 p-아미노벤질옥시카보닐 (PAB) 또는 알라닌이다.
바람직하게는, PNU 유도체는 다음으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00019
Figure pct00020
당해 양태에 따라서 표적-결합 분자 및 안트라사이클린(PNU) 유도체를 포함하는 표적-결합 분자-약물 접합체가 제공되고, 여기서 표적-결합 분자-약물 접합체는 화학식 (V)의 구조를 갖고:
Figure pct00021
여기서 [X]는 치환되거나 비치환된 알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 아릴 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴 그룹, 하나 이상의 헤테로원자, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 임의의 스페이서이고;
[Z]는 안트라사이클린(PNU) 유도체 및 표적-결합 분자를 접합시키는데 사용된 반응성 그룹으로부터 유도된 링커이고;
Y는 표적 결합 분자이다.
[Z]는 전형적으로 안트라사이클린(PNU) 유도체 및 표적-결합 분자를 접합시키는데 사용된 반응성 그룹으로부터 유도된 모이어티이다. [Z]는 말레이미드, 알킬 할라이드, 설프하이드릴 그룹, 활성화된 디설파이드, 아미노 그룹, 알킨 그룹, 아지도 그룹, 아민옥시 그룹, 알데하이드 그룹 및 케톤 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 반응성 그룹으로부터 유도된 모이어티일 수 있다.
따라서, [Z]는 디설파이드 결합, 아미드 결합, 옥심 결합, 하이드라존 결합, 티오에테르 결합, 1, 2, 3 트리아졸 및 폴리Gly로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, [X]는 폴리에틸렌 글리콜,
Figure pct00022
Figure pct00023
및
Figure pct00024
를 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 여기서
Figure pct00025
는 분자의 나머지에 대한 부착 점을 나타내고 여기서 [R]은 치환되거나 비치환된 알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 아릴 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴 그룹, 하나 이상의 헤테로원자, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 임의의 스페이서이다.
가장 바람직하게는, [X]는 폴리에틸렌 글리콜이다. 폴리에틸렌 글리콜은 PEG4일 수 있다.
바람직하게는, 표적-결합 분자는 단백질 또는 핵산이다. 표적-결합 분자(이는 특이적인 항원 결합 단백질로 지칭될 수 있다)의 예는 면역글로불린 또는 항체, 면역글로불린 Fc 영역, 면역글로불린 Fab 영역, Fab', Fv, Fv-Fc, 단일 쇄 Fv(scFv), scFv-Fc, (scFv)2, 디아보디(diabody), 트리아보디(triabody), 테트라보디(tetrabody), 이특이적인 t-세포 인게이저(bispecific t-cell engager)(BiTE), 인테론, VNAR 도메인, 단일 도메인 항체(sdAb), VH 도메인, 스캐폴드 단백질(아피보디(affibody), 센트린(centyrin), 다르핀(darpin) 등)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 표적-결합 핵산의 예는 압타머를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
바람직하게는, 표적-결합 분자-약물 접합체는 단백질이고 안트라사이클린(PNU) 유도체는 단백질의 아미노산 서열 내 티올-함유 아미노산 잔기에 접합되거나 또는 여기서 PNU 유도체가 단백질의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 화학적 변형에 의해 혼입된 티올 그룹을 통해 접합된다. 티올 그룹은 또한 다른 표적-결합 분자, 예를 들면, 핵산에 도입될 수 있다.
표적-결합 단백질(또한 특이적인 항원 결합 단백질로 명명됨)은 면역글로불린 또는 항체, 면역글로불린 FC 영역, 면역글로불린 Fab 영역, Fab', Fv, Fv-Fc, 단일 쇄 Fv(scFv), scFv-Fc, (scFv)2, 디아보디, 트리아보디, 테트라보디, 이특이적인 t-세포 인게이저(BiTE), 인테인, VNAR 도메인, 단일 도메인 항체(sdAb), VH 도메인, 또는 스캐폴드 단백질(scaffold protein)(아피보디(affibody), 센티린(centyrin), 다르핀(darpin) 등)을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 표적-결합 분자는 화학식 (III)으로 나타낸 아미노산 서열을 포함할 수 있는 특이적인 항원 결합 단백질을 포함할 수 있다:
Figure pct00026
상기 화학식 (III)에서
FW1은 골격 영역(framework region)이고,
CDR1은 CDR 서열이고,
FW2는 골격 영역이고,
HV2는 고가변성 서열(hypervariable sequence)이고,
FW3a는 골격 영역이고,
HV4는 고가변성 서열이고,
FW3b는 골격 영역이고,
CDR3은 CDR 서열이고,
FW4는 골격 영역이다.
바람직하게는, 특이적인 항원 결합 단백질은 수용체 타이로신 키나제-유사 오르판 수용체 1(ROR1)에 결합한다. 바람직하게는, ROR1-특이적인 항원 결합 분자는 수용체 타이로신 키나제-유사 오르판 수용체 2(ROR2)에 결합하지 않는다. 바람직하게는 ROR1-특이적인 항원 결합 분자는 사람 ROR1 및 쥐(murine) ROR1(mROR1) 둘 다에 결합한다. 바람직하게는 ROR1-특이적인 항원 결합 분자는 데글리코실화된(deglycosylated) ROR1에 결합한다. 이러한 분자는 동시-계류중인 국제 특허원 제PCT/EP2018/086823호에 기술되어 있으며, 이의 내용은 본원에 참고로 포함된다.
보다 바람직하게는, ROR1-특이적인 항원 결합 분자는 다음으로부터 선택된 선형 펩타이드에 결합하지 않는다:
Figure pct00027
Figure pct00028
.
표적-결합 분자-약물 접합체의 당해 구현예에서, 특이적인 항원 결합 단백질은 다음의 것 또는 이에 대해 적어도 45%의 서열 동일성(sequence identity)을 지닌 이의 기능성 변이체(functional variant)를 포함할 수 있다:
FW1은 20 내지 28개 아미노산으로부터의 골격 영역이고
CDR1은 DTSYGLYS(서열 번호: 1), GAKYGLAA(서열 번호: 2), GAKYGLFA(서열 번호: 3), GANYGLAA(서열 번호: 4), 또는 GANYGLAS(서열 번호: 5)로부터 선택된 CDR 서열이고:
FW2는 6 내지 14개 아미노산으로부터의 골격 영역이고,
HV2는 TTDWERMSIG(서열 번호: 6), SSNQERISIS(서열 번호: 7), 또는 SSNKEQISIS(서열 번호: 8)로부터 선택된 고가변성 서열이고,
FW3a는 6 내지 10개 아미노산으로부터의 골격 영역이고,
HV4는 NKRAK(서열 번호: 9), NKRTM(서열 번호: 10), NKGAK(서열 번호: 11), 또는 NKGTK(서열 번호: 12)로부터 선택된 고가변성 서열이고,
FW3b는 17 내지 24개 아미노산으로부터의 골격 영역이고,
CDR3는 QSGMAISTGSGHGYNWY(서열 번호: 13), QSGMAIDIGSGHGYNWY(서열 번호: 14), YPWAMWGQWY(서열 번호: 15), VFMPQHWHPAAHWY(서열 번호: 16), REARHPWLRQWY(서열 번호: 17), 또는 YPWGAGAPWLVQWY(서열 번호: 18)로부터 선택된 CDR 서열이고,
FW4는 7 내지 14개 아미노산으로부터의 골격 영역이다.
보다 바람직하게는 FW1은: ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLT(서열 번호: 19), AKVDQTPRTATKETGESLTINCVLT(서열 번호: 20), TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVT(서열 번호: 21), TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLT(서열 번호: 22), ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVT(서열 번호: 23), TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLT(서열 번호: 24) 또는 ASVTQSPRSASKETGESLTITCRVT(서열 번호: 56) 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 지닌 이의 기능성 변이체로부터 선택되고, FW2는: TSWFRKNPG(서열 번호: 25), 또는 TYWYRKNPG(서열 번호: 26) 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 지닌 이의 기능성 변이체로부터 선택되고; FW3a는: GRYVESV(서열 번호: 27), 또는 GRYSESV(서열 번호: 28) 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 지닌 이의 기능성 변이체로부터 선택되고, FW3b는: SFSLRIKDLTVADSATYYCKA(서열 번호: 29), SFTLTISSLQPEDSATYYCRA(서열 번호: 30), SFTLTISSLQPEDFATYYCKA(서열 번호: 31) 또는 SFSLRISSLTVEDSATYYCKA(서열 번호: 57) 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 지닌 이의 기능성 변이체로부터 선택되고, FW4는: DGAGTVLTVN(서열 번호: 32), DGAGTKVEIK(서열 번호: 33) 또는 DGQGTKLEVK(서열 번호: 58); 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 지닌 이의 기능성 변이체로부터 선택된다.
보다 바람직하게는, ROR1-특이적인 항원 결합 분자는 다음으로부터 선택된 아미노산 서열; 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 지닌 이의 기능성 변이체를 포함한다:
Figure pct00029
Figure pct00030
ROR1-특이적인 항원 결합 분자는 사람화될 수 있다. ROR1-특이적인 항원 결합 분자는 탈-면역화(de-immunizing)될 수 있다.
ROR1-특이적인 항원 결합 분자는 또한 융합 단백질의 일부일 수 있다. 바람직한 융합 단백질은 면역글로불린 Fc 영역에 융합된 ROR1-특이적인 항원 결합 분자이다. 바람직하게는 면역글로불린 Fc 영역은 사람 면역글로불린 Fc 영역이다. 일부 경우에, ROR1-특이적인 항원 결합 분자는 이량체, 삼량체 또는 보다 높은 차수의 다량체일 수 있다. 이러한 다량체는 또한 다른 분자, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 면역글로불린 Fc와의 융합 단백질일 수 있다. 융합 단백질의 개개 도메인은 임의의 링커에 의해 연결될 수 있다. 융합 단백질의 개개 도메인은 임의의 링커에 의해 연결될 수 있다. 링커는 (G4S)5, PGVQPSPGGGGS(WbG4S로 지칭됨)(서열 번호: 50), 및 PGVQPAPGGGGS(WbG4SGM으로 지칭됨)(서열 번호: 51)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또한 치료요법에서 사용하기 위한, 상기 양태에 따른 표적-결합 분자-약물 접합체가 본원에 제공된다.
또한 암의 치료에 사용하기 위한, 상기 양태에 따른 표적-결합 분자-약물 접합체가 본원에 제공된다.
또한 이를 필요로 하는 환자에게 질환의 치료를 위한 의약의 제조시 상기 양태에 따른 표적-결합 분자-약물 접합체의 용도가 본원에 제공된다.
또한 이를 필요로 하는 환자에게 치료학적 유효량의 상기 양태에 따른 표적-결합 분자-약물 접합체를 투여함을 포함하는 질환의 치료 방법이 본원에 제공된다. 질환은 암일 수 있다.
바람직하게는, 암은 ROR1-양성 암(positive cancer) 유형이다. 더욱 바람직하게는, 암은 혈액 암, 예를 들면, 림프종(lymphoma) 및 백혈병(leukemias), 만성 림프구 백혈병(chronic lymphocytic leukaemia)(CLL), 외투 세포 림프종(mantle cell lymphoma)(MCL), B-세포 급성 림프모구 백혈병(B-cell acute lymphoblastic leukaemia)(B-ALL), 변연부 포림프종(marginal zone lymphoma)(MZL), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma)(NHL), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia)(AML) 및 고형 종양(solid tumour), 예를 들면, 신경모세포종(neuroblastoma), 신장 암(renal cancer), 폐 암(lung cancer), 결장 암(colon cancer), 난소 암(ovarian cancer), 췌장 암(pancreatic cancer), 유방 암(breast cancer), 피부 암(skin cancer), 자궁 암(uterine cancer), 전립선 암(prostate cancer), 갑상선 암(thyroid cancer), 두경부 암(Head and Neck cancer), 방광 암(bladder cancer), 위 암(stomach cancer) 또는 간 암을 포함하는 그룹으로부터 선택된다. 암은 중피종(mesothelioma) 또는 삼중 음성 유방 암(triple negative breast cancer)(TNBC)일 수 있다. 중피종은 흉막 중피종(pleural mesothelioma)일 수 있다
상기 양태의 구현예에서, 표적-결합 분자는 항체이다. 상기 양태의 다른 구현예에서, 표적 결합 분자는 HER-2에 결합한다. 바람직하게는, 표적-결합 분자는 HER-2에 결합하는 항체이다. 보다 바람직하게는, 항체는 트라스투주맙 또는 이의 유도체이다.
또한 임의의 상기 양태에 따른 표적-결합 분자-약물 접합체, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 성분을 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다.
도면의 설명
도 1- Val-Cit(vc) PAB PNU 접합체로부터 방출된 페이로드(Payload)의 예.
도 2- 본 발명의 PNU 유도체.
도 3- ROR1 양성 PA-1 세포주 대 비-결합 대조군(2VhFc-na-EDA-PNU)을 사멸시키는데 있어서 B1hFc-na-EDA-PNU 접합체의 효능.
도 4- ROR1 양성 PA-1 세포주 대 비-결합 대조군(2VhFc-va-EDA-PNU)을 사멸시키는데 있어서 B1hFc-va-EDA-PNU 접합체의 효능.
도 5- ROR1 녹 아웃(knock out)을 지닌 PA-1 세포 주 대 비-결합 대조군(2VhFc-va-EDA-PNU)을 사멸시키는데 있어서 B1hFc-na-EDA-PNU 접합체의 효능. ROR1 녹아웃을 지닌 PA-1 세포주 내 B1hFc-na-EDA-PNU 접합체는 세포 사멸을 나타내지 않는다.
도 6- ROR1 녹 아웃을 지닌 PA-1 세포 주 대 비-결합 대조군(2VhFc-va-EDA-PNU)을 사멸시키는데 있어서 B1hFc-va-EDA-PNU 접합체의 효능. ROR1 녹 아웃을 지닌 PA-1 세포주내 B1hFc-va-EDA-PNU 접합체는 세포 사멸을 나타내지 않는다.
도 7- 가스미(Kasumi)-2 세포주 대 비-결합 대조군(2VhFc-na-EDA-PNU)에서 B1hFc-na-EDA-PNU 접합체의 효능.
도 8- 가스미(Kasumi)-2 세포주 대 비-결합 대조군(2VhFc-va-EDA-PNU)을 사멸시키는데 있어서 B1hFc-va-EDA-PNU 접합체의 효능.
도 9- MHH-ES1 세포주 대 비-결합 대조군(2VhFc-na-EDA-PNU)을 사멸시키는데 있어서 B1hFc-na-EDA-PNU 접합체의 효능.
도 10- MHH-ES1 세포 주 대 비-결합 대조군(2VhFc-va-EDA-PNU)을 사멸시키는데 있어서 B1hFc-va-EDA-PNU 접합체의 효능.
도 11- ROR1 양성 PA-1 세포주 대 비-결합 대조군(2VhFc-vc-PAB-EDA-PNU)을 사멸시키는데 있어서 B1hFc-vc-PAB-EDA-PNU 접합체의 효능.
도 12- ROR1 녹 아웃을 지닌 PA-1 세포주 대 비-결합 대조군(2VhFc-va-EDA-PNU)에서 B1hFc-vc-PAB-EDA-PNU 접합체의 효능. ROR1 녹 아웃을 지닌 PA-1 세포주내 B1hFc-vc-PAB-EDA-PNU 접합체는 세포 사멸을 나타내지 않는다.
도 13- Her2 양성 세포주 SK-BR-3 및 Her2 음성 세포주 MDA-MB-468를 사용한 tras(S442C)-vc-PAB-EDA-PNU 접합체에 대한 세포 사멸 데이타.
도 14- Her2 양성 세포주 SK-BR-3 및 Her2 음성 세포주 MDA-MB-468와의 Tras(S442C)-va-EDA-PNU 접합체에 대한 세포 사멸 데이타.
도 15- ROR1 양성 PA-1 세포주 및 ROR1 녹 아웃을 지닌 PA-1 세포주를 사멸시키는데 있어서 P3A1hFc(S442C)-va-EDA-PNU 접합체의 효능.
도 16- 세포-표면 ROR1(A549 암 세포주)에 대한 다량체 VNAR 접합체의 결합. (A) BA11-B1-D3 대 BA11-B1-D3-PNU 접합체; (B) P3A1-BA11-D3 대 P3A1-BA11-D3-PNU 접합체; (C) P3A1-BA11-P3A1 대 P3A1-BA11-P3A1-PNU 접합체. ROR1에 대한 결합은 vc-PAB-EDA-PNU 또는 va-EDA-PNU 링커 페이로드와의 접합 후 유지된다.
도 17- 비히클-처리된 마우스(vehicle-treated mouse)에 대한 흉막 중피종(pleural mesothelioma)의 PDX 모델에서 평가된 B1-hFc-vc-PAB-EDA-PNU 및 B1-hFc-va-EDA-PNU의 생체내(in vivo) 효능. 절대 평균 종양 용적은 평균(n=5)의 +/- 표준오차를 플롯팅(plotting)하였다. 처리는 124 mm3의 평균 종양 용적에서 출발하였다. PDC 분자를 사용한 처리는 1, 4, 7, 10 및 18일째(화살표로 나타냄)에 정맥내 주사로 제공하였다; 모든 마우스를 처음 PDC 투여(dose) 20시간 전에 mIgG로 예비-프라이밍(pre-priming)하였다. 모든 마우스가 살아있고 그룹 내에 존재하는 마지막 날까지 비히클 데이타를 플롯팅하였다.
도 18- 비히클 처리된 마우스에 대한 TNBC의 PDX 모델에서 평가된 B1-hFc-vc-PAB-EDA-PNU 및 B1-hFc-va-EDA-PNU의 생체내 효능. 절대 평균 종양 용적은 평균(n=5)의 +/- 표준 오차를 플롯팅하였다. 치료는 180 mm3의 평균 종양 용적에서 출발하였다. PDC 분자를 사용한 치료는 2, 5, 8, 12, 15일째에 정맥내 주사로 제공하였다(화살표로 나타냄); 모든 마우스는 처음 PDC 투여 20시간 전에 mIgG로 예비-프라이밍하였다. 모든 마우스가 살아있고 그룹 내에 존재하는 마지막 날까지 비히클 데이타를 플롯팅하였다.
상세한 설명
암 치료요법에서 화학치료제로서 이의 입증된 임상 확인으로 인하여, 약물 접합체용 페리로드로서 사용하기 위한 DNA 삽입(intercalating) 독소의 매우 흥미로운 부류는 안트라사이클린이다. 안트라사이클린 유도체 PNU-159682는 네모루비신의 대사산물로서 기술되었으며(Quintieri et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11, 1608-1617) 1개의 난소(A2780) 및 1개의 유방암(MCF7) 세포주를 사용하여 피코- 내지 펨토몰 범위의 시험관 내(in vitro) 세포 사멸에 대해 매우 높은 효능을 나타내는 것으로 보고하였다(WO2012/073217 A1).
종양 세포의 표적화 전에 환자의 순환에서, PNU-159682와 같은 매우 강력한 안트라사이클린 독소의 의도하지 않은 방출이 오프 표적 효과(off target effect) 및 바람직하지 않은 부작용을 이끌 수 있으므로, 화학적으로 접합된 단백질 약물 접합체의 안정성은 중요한 고려사항이다. PNU 접합체로부터 방출된 분자의 일부 예는 도 1에 제공되어 있고, 이는 약물 링커를 함유하는 상이한 Val-Cit-PAB로부터 PNU159682 및 EDA-PNU159682 유도체의 방출을 나타내는, 도 1에 제공되어 있다.
따라서 고 안정성으로 표적화 단백질에 연결시킬 수 있는 강력한 독소가 원치않는 부작용을 피하거나, 적어도 감소시키기 위해 요구된다. 대안적으로, 링커 페이로드를 설계하여 세포외 절단이 약독화된 효능을 지닌 페이로드의 유도체를 방출하도록 한다. 그러나, 충분한 효능이 유지되어 효능을 달성하기 위한 보다 높은 용량을 투여할 필요성으로 인하여 부인되는 부작용에 있어서 임의의 감소를 피할 필요가 있다.
접합 용이성은 용이하게 제작가능한 생성물을 생산하는데 있어서 중요한 인자이다. 본 발명의 제1 양태의 페이로드는 말레이미드 그룹을 사용하며, 이는 간단한 및 표준 조건을 사용하여 접합 파트너 상에 임의의 이용가능한 티올 그룹과 반응할 수 있는, 말레이미드 그룹을 사용한다. 또한, 접합을 위한 말레이미드/티올 화학의 사용은 예를 들면, 단백질 서열 내 가공된 시스테인 잔기의 측쇄 상에 도입된 티올 그룹에 대한 부위-특이적인 접합을 허용한다. 본원에 기술된 일부 경우에, 시스테인은 단백질의 C- 또는 N-말단에서 가공된 시스테인(서열의 예는 QACKAHHHHHHGAEFEQKLISEEDL(서열 번호: 52) 또는 QACGAHHHHHHGAEFEQKLISEEDL(서열 번호: 53)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 함유하는 his myc tag의 도입을 통해 도입될 수 있다.
비-선택적인 표지화 방법을 사용하여, 예를 들면, 단백질 내에서 아미노 작용기와의 반응을 통해 생성된 항체/단백질 약물 접합체는 상이한 약물을 지닌 다수의 상이한 종을 함유하는 생성물을 항체 비까지 전달한다. 이는 생체내 효능 및 독성에 영향을 미치는 효능 및 PK 특성을 포함하는 접합체의 특성에 영향을 미친다. 따라서, 티올 반응성 페이로드는 단순한 공정에서 단백질내 천연적으로 존재하는 시스테인 잔기와 또는 분자 생물학/재조합 단백질 발현 또는 화학적 합성을 사용하여 또는 발현된, 합성 또는 천연의 단백질의 화학적 변형을 통해 단백질의 서열 내 임의의 지점에서 특이적인 부위내로 가공된 시스테인 잔기와 고 수율로 반응할 수 있기 때문에, 매우 중요하다.
본 발명은 단백질-약물 접합체(PDC)를 포함하나 이에 한정되지 않는, 약물 접합체내에서 사용하기에 적합한 안트라사이클린(PNU) 유도체를 제공한다. 구체적으로, PNU159682의 유도체가 제공되며, 이는 C14 탄소 및 부착된 하이드록실 작용기를 결여하고 있으며, 여기서 에틸렌디아미노(EDA) 그룹은 PNU159682의 C13 카보닐과 말레이미드 그룹 사이에 링커 영역의 부분을 형성한다. 말레이미드 그룹은 본 발명의 제1 양태의 안트라사이클린(PNU) 유도체에 존재하며 본 발명의 제2 양태의 안트라사이클린(PNU) 유도체에 존재할 수 있다. 이러한 페이로드는 다른 분자 상의 유리 티올 그룹과 반응할 수 있다. 유리 티올이 단백질 상에 존재하는 경우, 단백질-약물 접합체(PDC)가 형성될 수 있다.
놀랍게도, 에틸렌디아미노(EDA) 그룹으로 작용화되고 말레이미드 그룹을 통해 티올 그룹에 연결된 PNU159682의 유도체는 약간 적은 효능으로 비-EDA 페이로드 또는 유리된(liberated) 페이로드 유도체와 비교하여 보다 높은 안정성을 나타낸다. 보다 안정한 페이로드는 감소된 오프-표적 효과로 인하여 유리할 수 있고, 이는 궁극적으로 감소된 부작용 및 증가된 환자 순응도(compliance)를 이끌 수 있다.
본 발명은 또한 상기 개시내용에 따른 안트라사이클린 유도체 접합체 및 표적-결합 분자를 포함하는 표적-결합 분자-약물 접합체를 제공한다.
표적-결합 분자-약물 접합체의 다른 구현예에 따라서, 표적-결합 분자는 단백질이고, 안트라사이클린(PNU) 유도체는 단백질의 아미노산 서열 내로 도입된 티올 그룹에 임의로 하나 이상의 링커에 의해 접합된다. 도입된 티올은 단백질의 아미노 또는 카복시 말단에서, 또는 도메인의 아미노 또는 카복시 말단 또는 이의 소단위(subunit)로 도입될 수 있다. 다른 구현예에서, 접합은 단백질의 아미노 또는 카복시 말단에서 도입된 서열 내 티올 그룹에, 또는 도메인의 아미노 또는 카복시 말단 또는 이의 소단위에 대한 것이다.
표적-결합 분자는 연골 어류의 혈청에서 발견된 신규한 또는 새로운 항원 수용체(Novel or New antigen receptor)(IgNAR)로부터 유래된 VNAR 도메인일 수 있다(Greenberg A. S., et al., Nature, 1995. 374(6518): p. 168-173, Dooley, H., et al, Mol. Immunol, 2003. 40(1): p. 25-33;
Figure pct00031
M.R., et al., mAbs, 2012. 4(6): p. 673-685)).
따라서, 특이적인 항원 결합 단백질은 화학식 (III)으로 나타낸 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
Figure pct00032
상기 화학식 (III)에서,
FW1은 골격 영역이고,
CDR1은 CDR 서열이고,
FW2는 골격 영역이고,
HV2는 고가변성 서열이고,
FW3a는 골격 영역이고,
HV4는 고가변성 서열이고,
FW3b는 골격 영역이고,
CDR3은 CDR 서열이고,
FW4는 골격 영역이다.
골격 영역 FW1은 바람직하게는 길이가 20 내지 28개 아미노산, 보다 바람직하게는 길이가 22 내지 26개 아미노산, 여전히 보다 바람직하게는 길이가 23 내지 25개 아미노산이다. 특정의 바람직한 구현예에서, FW1은 길이가 26개 아미노산이다. 다른 바람직한 구현예에서, FW1은 길이가 25개 아미노산이다. 여전히 다른 바람직한 구현예에서, FW1은 길이가 24개 아미노산이다.
CDR 영역 CDR1은 길이가 바람직하게는 7 내지 11개 아미노산, 보다 바람직하게는 길이가 8 내지 10개 아미노산이다. 특정의 바람직한 구현예에서, CDR1은 길이가 9개 아미노산이다. 다른 바람직한 구현예에서, CDR1은 길이가 8개 아미노산이다.
골격 영역 FW2는 바람직하게는 길이가 6 내지 14개 아미노산, 보다 바람직하게는 길이가 8 내지 12개 아미노산이다. 특정의 바람직한 구현예에서, FW2는 길이가 12개 아미노산이다. 다른 바람직한 구현예에서, FW2는 길이가 10개 아미노산이다. 다른 바람직한 구현예에서, FW2는 길이가 9개 아미노산이다. 다른 바람직한 구현예에서, FW2는 길이가 8개 아미노산이다.
고가변성 서열 HV2는 바람직하게는 길이가 4 내지 11개 아미노산, 보다 바람직하게는 길이가 5 내지 10개 아미노산이다. 특정의 바람직한 구현예에서, HV2는 길이가 10개 아미노산이다. 특정의 바람직한 구현예에서, HV2는 길이가 9개 아미노산이다. 다른 바람직한 구현예에서, HV2는 길이가 6개 아미노산이다.
골격 영역 FW3a는 바람직하게는 길이가 6 내지 10개 아미노산, 보다 바람직하게는 길이가 7 내지 9개 아미노산이다. 특정의 바람직한 구현예에서, FW3a는 길이가 8개 아미노산이다. 특정의 바람직한 구현예에서, FW3a는 길이가 7개 아미노산이다.
고가변성 서열 HV4는 바람직하게는 길이가 3 내지 7개 아미노산, 보다 바람직하게는 길이가 4 내지 6개 아미노산이다. 특정의 바람직한 구현예에서, HV4는 길이가 5개 아미노산이다. 다른 바람직한 구현예에서, HV4는 길이가 4개 아미노산이다.
골격 영역 FW3b는 바람직하게는 길이가 17 내지 24개 아미노산, 보다 바람직하게는 길이가 18 내지 23개 아미노산, 여전히 보다 바람직하게는 길이가 19 내지 22개 아미노산이다. 특정의 바람직한 구현예에서, FW3b는 길이가 21개 아미노산이다. 다른 바람직한 구현예에서, FW3b는 길이가 20개 아미노산이다.
CDR 영역 CDR3은 바람직하게는 길이가 8 내지 21개 아미노산, 보다 바람직하게는 길이가 9 내지 20개 아미노산, 여전히 보다 바람직하게는 길이가 10 내지 19개 아미노산이다. 특정의 바람직한 구현예에서, CDR3은 길이가 17개 아미노산이다. 다른 바람직한 구현예에서, CDR3은 길이가 14개 아미노산이다. 여전히 다른 바람직한 구현예에서, CDR3은 길이가 12개 아미노산이다. 여전히 다른 바람직한 구현예에서, CDR3은 길이가 10개 아미노산이다.
골격 영역 FW4는 바람직하게는 길이가 7 내지 14개 아미노산, 보다 바람직하게는 길이가 8 내지 13개 아미노산, 여전히 보다 바람직하게는 길이가 9 내지 12개 아미노산이다. 특정의 바람직한 구현예에서, FW4는 길이가 12개 아미노산이다. 다른 바람직한 구현예에서, FW4는 길이가 11개 아미노산이다. 여전히 다른 바람직한 구현예에서, FW4는 길이가 10개 아미노산이다. 여전히 다른 바람직한 구현예에서, FW4는 길이가 9개 아미노산이다.
상기 나열된 골격 영역, 상보성 결정 영역 및 고가변성 영역의 모든 가능한 조합 및 순열(permutation)은 본원에서 명쾌하게 고려된다.
본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 VNAR 도메인은 B1, P3A1, D3, BA11, 및 E9를 포함하고, 이의 서열은 하기 나타나 있다. B1, P3A1, D3 및 E9는 ROR1에 결합한다(이의 내용이 본원에 참고로 포함된, 제WO 2019/122447호로서 발표된 동시-계류중인 국제 특허원 제PCT/EP2018/086823호에 나타낸 데이타). BA11은 사람 혈청 알부민에 고 친화성으로 결합하는 사람화된 VNAR이다(Kovalenko et al, J.Biol. Chem., 2013 JBC). 또한, 비-결합 VNAR 도메인 2V가 또한 하기 기술되어 있다:
Figure pct00033
본 발명에서 사용하기 위한 VNAR 도메인은 서열 번호: 40 내지 49 및 59에서 확인된 VNAR을 포함한다. 추가로 바람직한 VNAR은 서열 번호: 45 내지 49 및 59에서 확인된 사람화된 VNAR을 포함한다. 특히 바람직한 사람화된 VNAR은 다음 아미노산 서열을 갖는 B1V15이다:
Figure pct00034
본 발명의 분자와 관련하여 지칭된 서열 동일성은 개체의 CDR, HV 또는 FW의 수준에서 판단될 수 있거나, 이는 전체 분자의 길이에 걸쳐 판단될 수 있다. 기술된 CDR, HV 및 FW 서열은 또한 서열의 N-말단 또는 C-말단 끝에서 아미노산의 첨가 또는 결실 또는 서열에 의한 아미노산의 삽입 또는 결실에 의한 것에 상관없이, 보다 더 길거나 짧을 수 있다.
특이적인 결합 단백질의 임의의 부분을 가공하여 본 발명의 PDC내 접합을 가능하게 할 수 있다. 바람직한 예에서, 면역글로불린 Fc 영역이 사용되는 경우, 이는 가공되어 접합 부위로서 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 바람직한 도입된 시스테인 잔기는 S252C 및 S473C(카밧 넘버링(Kabat numbering))을 포함하나, 이에 한정되지 않고, 이는 EU 넘버링에서 각각 S239C 및 S442C에 상응한다.
표적-결합 분자-약물 접합체는 본원에 개시된 임의의 표적-결합 분자-약물 접합체일 수 있다. 예를 들면, 표적-결합 분자-약물 접합체는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00035
.
B1-hFc-vc-PAB-EDA-PNU 및 B1-hFc-va-EDA-PNU는 중피종 및 TNBC의 치료에 사용하기 위한 특수한 효능을 가진 것으로 본원에 밝혀져 있다.
바람직하게는, 표적-결합 분자-약물 접합체는 PEG4 스페이서를 포함한다. 예를 들면, 표적-결합 분자-약물 접합체는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00036
.
바람직하게는 hFc는 S239C(EU 넘버링)에서 도입된 시스테인 잔기를 포함한다. 따라서, 예를 들면, 표적-결합 분자-약물 접합체는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00037
.
표적-결합 분자-약물 접합체는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00038
.
표적-결합 분자-약물 접합체의 일 구현예에서, 표적-결합 분자는 항체이다. 표적-결합 분자-약물 접합체의 다른 구현예에서, 표적-결합 분자는 HER-2에 결합한다. 바람직하게는, 표적-결합 분자는 HER-2에 대해 특이적인 항체이다.
바람직하게는, 표적-결합 분자-약물 접합체는 PEG4 스페이서를 포함한다. 예를 들면, 표적-결합 분자-약물 접합체는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00039
.
표적-결합 분자-약물 접합체는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00040
.
본 발명의 임의의 상기 언급한 양태에 기술된 임의의 특징은 본 발명의 다른 양태를 지닌 무타티스 쿠탄디스(mutatis mutandis)와 조합될 수 있다.
정의
본원에 사용된 바와 같은, 알킬 그룹은 직쇄 또는 측쇄의, 1 내지 40개 탄소 원자를 함유하는 치환되거나 비치환된 그룹(바람직하게는 비치환된)일 수 있다. 알킬 그룹은 임의의 위치에서 임의로 치환될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "알케닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 가진 직쇄- 또는 측쇄 지방족 모이어티로부터 단일 수소 원자의 제거로 유도된 그룹을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "알키닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 직쇄- 또는 측쇄 지방족 모이어티로부터 단일 수소 원자의 제거로 유도된 그룹을 지칭한다.
용어 '알킬, '아릴', '헤테로아릴' 등은 또한 다가 종, 예를 들면, 알킬렌, 아릴렌, '헤테로아릴렌' 등을 포함한다. 알킬렌 그룹의 예는 에틸렌(-CH2-CH2-), 및 프로필렌(-CH2-CH2-CH2-)을 포함한다. 예시적인 아릴렌 그룹은 페닐렌(-C6H4-)이고, 예시적인 헤테로아릴렌 그룹은 피리디닐렌(-C5H3N-)이다.
방향족 환은 0, 1, 2개 이상, 바람직하게는 0, 1 또는 2개의 환 헤테로원자를 가질 수 있는 사이클릭 방향족 그룹이다. 방향족 환은 임의로 치환되고/되거나 하나 이상의 방향족 또는 비-방향족 환(바람직하게는 방향족)에 융합될 수 있고, 이는 0, 1, 2개 이상의 환 헤테로원자를 함유함으로써 폴리사이클릭 환 시스템을 형성할 수 있다.
방향족 환은 아릴 및 헤테로아릴 그룹 둘 다를 포함한다. 아릴 및 헤테로아릴 그룹는 단핵, 즉 단지 하나의 방향족 환(예를 들면, 페닐 또는 페닐렌과 같이), 또는 다핵, 즉, 융합될 수 있는 2개 이상의 방향족 환(예를 들면, 나프틸 또는 나프틸렌과 같이), 개별적으로 공유결합으로 연결될 수 있는 2개 이상의 방향족 환(예를 들면, 비페닐과 같이), 및/또는 융합된 및 개별적으로 연결된 방향족 환의 조합일 수 있다. 바람직하게는 아릴 또는 헤테로아릴 그룹은 실질적으로 전체 그룹에 걸쳐서 실질적으로 접합된 방향족 그룹이다. 아릴 그룹은 5 내지 40개의 환 원자, 5 내지 25개의 탄소 원자, 5 내지 20개의 탄소 원자, 또는 5 내지 12개의 탄소 원자를 함유할 수 있다. 헤테로아릴 그룹은 N, O, S 및 P로부터 선택된 하나 이상의 환 헤테로원자를 함유하는 5 내지 40원, 5 내지 25원, 5 내지 20원 또는 5 내지 12원의 환일 수 있다. 아릴 또는 헤테로아릴은 하나 이상의 방향족 또는 비-방향족 환(바람직하게는 방향족 환)에 융합되어 폴리사이클릭 환 시스템을 형성할 수 있다.
아릴 및 헤테로아릴은 바람직하게는 축합된 환을 포함할 수 있고 임의 치환된 25개 이하의 환 원자를 지닌 모노-, 비- 또는 트리사이클릭 방향족 또는 헤테로방향족 그룹을 나타낸다.
바람직한 아릴 그룹은 제한없이, 벤젠, 비페닐렌, 트리페닐렌, [1,1':3',1"]테르페닐-2'-일렌, 나프탈렌, 안트라센, 비나프틸렌, 페난트렌, 피렌, 디하이드로피렌, 크리센, 페릴렌, 테트라센, 펜타센, 벤조피렌, 플루오렌, 인덴, 인데노플루오렌, 스피로비플루오렌 등을 포함한다.
바람직한 헤테로아릴 그룹은 제한없이, 피롤, 피라졸, 실롤, 이미다졸, 1,2,3-트리아졸, 1,2,4-트리아졸, 테트라졸, 푸란, 티오펜, 셀레노펜, 옥사졸, 이속사졸, 1,2-티아졸, 1,3-티아졸, 1,2,3-옥사디아졸, 1,2,4-옥사디아졸, 1,2,5-옥사디아졸, 1,3,4-옥사디아졸, 1,2,3-티아디아졸, 1,2,4-티아디아졸, 1,2,5-티아디아졸, 1,3,4-티아디아졸과 같은 5-원 환, 피리딘, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 1,3,5-트리아진, 1,2,4-트리아진, 1,2,3-트리아진, 1,2,4,5-테트라진, 1,2,3,4-테트라진, 1,2,3,5-테트라진과 같은 6-원 환, 및 카바졸, 인돌, 이소인돌, 인돌리진, 인다졸, 벤즈이미다졸, 벤조트리아졸, 푸린, 나프티미다졸, 페난트리미다졸, 피리디미다졸, 피라진이미다졸, 퀴녹살린이미다졸, 벤족사졸, 나프톡사졸, 안트록사졸, 페난트록사졸, 이속사졸, 벤조티아졸, 벤조푸란, 이소벤조푸란, 디벤조푸란, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 프테리딘, 벤조-5,6-퀴놀린, 벤조-6,7-퀴놀린, 벤조-7,8-퀴놀린, 벤조이소퀴놀린, 아크리딘, 페노티아진, 페녹사진, 벤조피리다진, 벤조피리미딘, 퀴녹살린, 페나진, 나프티리딘, 아자카르바졸, 벤조카르볼린, 페난트리딘, 페난트롤린, 티에노[2,3b]티오펜, 티에노[3,2b]티오펜, 디티에노티오펜, 디티에노피리딘, 이소벤조티오펜, 디벤조티오펜, 벤조티아디아조티오펜, 2,5-디하이드로피롤로[3,4-c]피롤-1,4-디온(디케노피롤로피롤, DPP), 2-옥소-1H-인돌-3-일리덴, [3,3'-비피롤로[2,3-b]피리디닐리덴]-2,2'(1H,1'H)-디온(피리딘 이소인디고) 및 (3E)-3-(2-옥소-1H-인돌-3-일리덴)-1H-인돌-2-온(이소인디고)과 같은 융합된 시스템, 또는 이의 조합을 포함한다. 헤테로아릴 그룹은 알킬, 알콕시, 티오알킬, 플루오로, 플루오로알킬 또는 추가의 아릴 또는 헤테로아릴 치환체로 치환될 수 있다. 바람직하게는 헤테로아릴 그룹은 티오펜이다.
특히 바람직한 헤테로원자는 O, S, N, P 및 Si로부터 선택된다. 전형적으로, 수소는 본 발명의 분자에 포함된 헤테로원자의 원자가를 완성할 것인데, 예컨대, N의 경우 -NH- 또는 -NH2가 존재할 수 있고 여기서 1개 또는 2개의 다른 그룹이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "임의 치환된"은 임의 치환된 모이어티 속의 수소 원자 중 하나 이상이 적합한 치환체로 치환됨을 의미한다. 달리 나타내지 않는 한, "임의 치환된" 그룹은 그룹의 각각의 치환가능한 위치에서 적합한 치환체를 가질 수 있고, 임의의 주어진 구조 내에서 하나 이상의 위치는 규정된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있고, 치환체는 모든 위치에서 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명에 의해 고려된 치환체의 조합은 바람직하게는 안정한 화합물의 형성을 야기하는 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "안정한"은 화학적으로 실현가능하고 실온(즉, 16 내지 25℃)에서 충분히 길게 존재하여 화학 합성 동안 이의 검출, 단리 및/또는 사용을 허용하는 화합물을 지칭한다.
임의의 상기 그룹(예를 들면, 본원에서 "임의 치환된"으로 지칭된 것, 예를 들면, 알킬, 아릴 및 헤테로아릴 그룹)은 바람직하게는 실릴, 설포, 설포닐, 포르밀, 아미노, 이미노, 니트릴로, 머캅토, 시아노, 니트로, 할로겐, -NCO, -NCS, -OCN, -SCN, -C(=O)NR0R00, -C(=O)X0, -C(=O)R0, -NR0R00, C1-12알킬, C1-12알케닐, C1-12알키닐, C6-12아릴, C3-12사이클로알킬, 4 내지 12개의 환 원자를 갖는 헤테로사이클로알킬, 5 내지 12개의 환 원자를 갖는 헤테로아릴, C1-12 알콕시, 하이드록시, C1-12 알킬카보닐, C1-12 알콕시-카보닐, C1-12 알킬카보닐옥시 또는 C1-12 알콕시카보닐옥시로부터 선택된 하나 이상의 치환체를 임의로 포함할 수 있고 여기서 하나 이상의 H 원자는 F 또는 Cl 및/또는 이의 조합으로 임의 대체될 수 있고; 여기서 X0는 할로겐이고 R0 및 R00는, 독립적으로, H 또는 임의 치환된 C1-12알킬이다. 임의의 치환체는 동일한 그룹 내에서 모든 화학적으로 가능한 조합 및/또는 다수의 전술한 그룹(예를 들면 서로 직접 부착된 경우 아미노 및 설포닐은 설파모일 라디칼을 나타낸다)내 모든 화학적으로 가능한 조합을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 치환체는 아실이 아니다. 본원에 사용된 바와 같은 아실은 옥소산, 예를 들면, 카복실산으로부터 하나 이상의 하이드록실 그룹의 제거에 의해 유도된 모이어티인 아실 그룹을 지칭한다. 이는 이중-결합된 산소 원자 및 알킬 그룹을 함유한다.
일부 구현예에서, 그룹은 비치환될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 제1 양태와 관련하여, 안트라사이클린(PNU) 유도체는 화학식 (I)일 수 있다:
Figure pct00041
화학식 (I)에서,
[X]는 비치환된 알킬 그룹, 비치환된 헤테로알킬 그룹, 비치환된 아릴 그룹, 비치환된 헤테로아릴 그룹, 하나 이상의 헤테로원자, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 임의의 스페이서이고;
[L1] 및 [L2]는 발린(Val), 시트룰린(Cit), 알라닌(Ala), 아스파라긴(Asn), 펩타이드, -(CH2)n-, -(CH2CH2O)n-, p-아미노벤질옥시카보닐 (PAB), Val-Cit-PAB, Val-Ala-PAB, Ala-Ala-Asn-PAB, 글리신을 제외한 임의의 아미노산, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 링커이다.
그룹이 비치환된 구현예에서, [X]는 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜 및
Figure pct00042
를 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 여기서
Figure pct00043
는 분자의 나머지에 대한 부착점을 나타내고 여기서 [R]은 비치환된 알킬 그룹, 비치환된 헤테로알킬 그룹, 비치환된 아릴 그룹, 비치환된 헤테로아릴 그룹, 하나 이상의 헤테로원자, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 임의의 스페이서이다.
일반적으로, 용어 PAB는 p-아미노벤질옥시카보닐을 의미하는 것으로 의도된다. 문헌에서 때때로, 용어 PB는 p-아미노벤질을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에서, PAB는 p-아미노벤질옥시카보닐을 나타내기 위해 의도된다.
용어 "단백질"은 일반적인 용어에서, 펩타이드 결합에 의해 함께 결합된 다수의 아미노산 잔기를 의미한다. 이는 상호교환적으로 사용되고 펩타이드, 올리고펩타이드, 올리고머 또는 폴리펩타이드를 의미하고, 이의 당단백질 및 유도체를 포함한다. 용어 "단백질"은 또한 단백질의 단편, 유사체, 변이체 및 유도체를 포함하는 것으로 의도되고 여기서 단편, 유사체, 변이체 또는 유도체는 필수직으로 참고 단백질과 동일한 생물학적 활성 또는 기능을 보유한다. 단백질 유사체 및 유도체의 예는 핵산, 및 DARPin(설계된 안키린 반복 단백질(Designed Ankyrin Repeat Protein))을 포함한다.
용어 "표적-결합 분자"는 주어진 표적에 결합하는 임의의 분자를 지칭한다. 이러한 맥락에서, "표적" 및 "항원"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 표적-결합 분자의 예는 천연 또는 재조합 단백질, 예를 들면, 면역글로불린 또는 항체, 면역글로불린 Fc 영역, 면역글로불린 Fab 영역, Fab, Fab', Fv, Fv-Fc, 단일 쇄 Fv(scFv), scFv-Fc, (scFv)2, 디아보디(diabody), 트리아보디(triabody), 테트라보디(tetrabody), 이특이적인 t-세포 인게이저(bispecific t-cell engager)(BiTE), 인테인(intein), 인테인 융합체(fusion), VNAR 도메인, 단일 도메인 항체(single domain antibody)(sdAb), VH 도메인, 스캐폴드 단백질(scaffold protein)(아피보디(affibody), 센티린(centyrin), 다르핀(darpin) 등) 및 표적에 결합하거나 표적에 천연적으로 결합하도록 개발된 압타머 또는 소 분자 또는 천연 생성물을 포함하는 핵산을 포함한다.
항원 특이적인 결합 단백질은 주어진 항원에 결합하는 임의의 단백질을 포함할 수 있다. 바람직한 예는 면역글로불린 또는 항체, 면역글로불린 Fc 영역, 면역글로불린 Fab 영역, Fab', Fv, Fv-Fc, 단일 쇄 Fv(scFv), scFv-Fc, (scFv)2, 디아보디, 트리아보디, 테트라보디, 이특이적인 t-세포 인게이저(BiTE), 인테인, 인테인 융합체, VNAR 도메인, 단일 도메인 항체(sdAb), VH 도메인, 또는 스캐폴드 단백질(아피보디, 센티린, 다르핀 등)을 포함한다. 특히 바람직한 예 VNAR 분자의 합성 라이브러리, 또는 연골 어류의 면역화로부터 유도된 합성 라이브러리로부터의 아미노산 서열을 포함하는 VNAR 도메인을 포함한다. 용어 VNAR, IgNAR 및 NAR은 또한 상호교환적으로 사용될 수 있다.
아미노산은 본원에서 단 문자 코드 또는 3문자 코드 또는 둘 다로서 나타낸다. 티올을 도입하기 위한 단백질 및 생물분자의 화학적 변형이 또한 확립되어 있다. 방법은 아민 그룹과 2-이미노티올란(트라우트 시약(Traut's reagent))의 반응, NHS-에스테르 함유 헤테로이작용성 제제, 예를 들면, N-석신이미딜 S-아세틸티올레이트(SATA) 또는 N-석신이미딜-4-(2-피리딜디티오)부타노에이트(SPDB)에 의한 아민 그룹의 변형에 이은, 하이드록실아민 및 환원제 각각을 사용한 처리 및 시스테아민을 사용한 가공된 인테인-융합 단백질의 절단으로 C-말단 티올 단백질 및 펩타이드의 생성을 포함한다.
용어 "친화성 정제"는 화학적 또는 결합 파트너에 대한 분자의 특이적인 유인 또는 결합으로 파트너 모이어티에 결합되거나 부착되면서 불순물로부터 분자가 분리되도록 하는 조합물 또는 복합체를 형성하는 것을 기반으로 한 분자의 정제를 의미한다.
용어 "상보성 결정 영역" 또는 CDR(즉, CDR1 및 CDR3)은 이의 존재가 전형적으로 항원 결합에 포함된 VNAR 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각각의 VNAR은 전형적으로 CDR1 및 CDR3으로 확인된 2개의 CDR 영역을 갖는다. 또한, 각각의 VNAR 도메인은 "초가변 루프"(HV)로부터의 아미노산을 포함하고, 이는 또한 항원 결합에 포함된다. 일부 예에서, 상보성 결정 영역은 CDR 영역 및 초가변 루프 둘 다로부터의 아미노산을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 항원 결합은 단일의 CDR 또는 HV로부터의 잔기를 단지 포함할 수 있다. VNAR 분자에 대한 일반적으로 허용된 명명법에 따라서, CDR2 영역은 존재하지 않는다.
"골격 영역"(FW)은 CDR 잔기 이외의 VNAR 잔기이다. 각각의 VNAR은 전형적으로 FW1, FW2, FW3a, FW3b 및 FW4로서 확인된 5개의 골격 영역을 갖는다.
VNAR 내 FW, CDR 및 HV 영역 사이의 경계부는 고정된 것으로 의도되지 않으므로 이러한 영역의 길이 및 조성에서 일부 변화가 예측되어야 한다. 이는 특히 이러한 영역을 분석하는데 있어 수행되어온 연구를 참고로, 당해 분야의 기술자에게 이해될 것이다. (Anderson et al., PLoS ONE (2016) 11 (8); Lui et al., Mol Immun (2014) 59, 194-199; Zielonka et al., Mar Biotechnol (2015). 17, (4) 386-392; Fennell et al., J Mol Biol (2010) 400. 155-170; Kovalenko et al., J Biol Chem (2013) 288. 17408-17419; Dooley et al., (2006) PNAS 103 (6). 1846-1851). 본 발명의 분자는, 본원의 FW, CDR 및 HV 영역을 참고로 정의되었지만, 이러한 제한된 정의에 한정되지 않는다. 따라서, VNAR 도메인의 구조로서 당해 분야에서의 이해와 함께 변화는 본원에서 명확하게 고려된다.
"코돈 세트(codon set)"는 목적한 변이체 아미노산을 암호화하는데 사용된 상이한 뉴클레오타이드 서열의 세트를 지칭한다. 코돈 세트에 의해 제공된 뉴클레오타이드 삼중선(triplet)의 모든 가능한 조합을 나타내고 아미노산의 목적한 그룹을 암호화할 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 세트는 예를 들면, 고체 상 합성, 예를 들면, 고체 상 합성에 의해 합성될 수 있다. 코돈 정의의 표준 형태는 IUB 코드의 것이며, 이는 당해 분야에 공지되어 있고 본원에 기술되어 있다.
코돈 세트는 전형적으로 이탤릭체의 3 대문자, 예컨대, NNK, NNS, XYZ, DVK 등으로 나타낸다. 따라서, "비-무작위 코돈 세트"는 부분적으로, 바람직하게는 완전히, 본원에 기술된 바와 같은 아미노산 선택을 위한 기준을 충족하는 선택 아미노산을 암호화하는 코돈 세트를 지칭한다. 특정 위치에서 선택된 뉴클레오타이드"축퇴성(degeneracy)"을 지닌 올리고뉴클레오타이드의 합성은 당해 분야, 예를 들면, TRIM 접근법(Knappek et al.; J. Mol. Biol. (1999), 296, 57-86); Garrard & Henner, Gene (1993), 128, 103)에 잘 공지되어 있다. 특정 코돈 세트를 갖는 올리고뉴클레오타이드의 이러한 세트는 시판되는 핵산 합성기(예를 들면, Applied Biosystems, 캘리포니아주 포스터 시티 소재)를 사용하여 합성할 수 있거나, 상업적으로(예를 들면, 메릴랜드 주 록 빌 소재의 Life Technologies로부터) 수득할 수 있다. 특수한 코돈 세트를 갖는 합성된 올리고뉴클레오타이드의 세트는 전형적으로 상이한 서열을 지닌 다수의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 이러한 차이는 전체 서열내 코돈 세트에 의해 확립된다. 본 발명에 따라 사용된 올리고뉴클레오타이드는 VNAR 핵산 주형에 대해 하이브리드화하도록 하는 서열을 가지며 또한 편리하게는 제한 효소 부위를 포함할 수 있다.
"세포", "세포주", 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고(문맥이 달리 나타내지 않는 한) 이러한 정의는 세포 또는 세포주의 후대세포 모두를 포함한다. 따라서, 예를 들면, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"와 같은 용어는 1차 대상체 세포 및 형질전환의 수와는 상관없이 이로부터 유래된 배양물을 포함한다. 고의의 또는 우연의 돌연변이체로 인하여, 모든 후대세포가 DNA 성분과 정밀하게 동일하지 않을 수 있다. 원래 형질전환된 세포에 대해 스크리닝한 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 후대세포가 포함된다.
특수한 검정에서 화학적 실체에 대한 "검출 한계"는 이러한 검정의 배경 수준을 초과하여 검출될 수 있는 이러한 실체의 최소 농도이다. 예를 들면, 파아지 ELISA에서, 특수한 항원 결합 단편을 나타내는 특수한 파아지에 대한 "검출 한계"는 특수한 파아지가 항원 결합 단편을 나타내지 않는 대조군 파아지에 의해 생산된 것 이상의 ELISA 신호를 생산하는 파아지 농도이다.
"융합 단백질" 및 "융합 폴리펩타이드"는 함께 공유결합으로 연결된 2개의 부위를 갖는 폴리펩타이드를 지칭하고, 여기서 각각의 부위는 상이한 특성을 갖는 폴리펩타이드이다. 특성은 생물학적 특성, 예를 들면, 시험관 내 또는 생체 내 활성일 수 있다. 특성은 또한 단순한 화학적 또는 물리적 특성, 예를 들면, 표적 항원에 대한 결합, 반응의 촉매 등일 수 있다. 2개의 부위는 단일 펩타이드 결합에 의해 또는 하나 이상의 아미노산 잔기를 함유하는 펩타이드 링커에 의해 직접 연결될 수 있다. 일반적으로, 2개의 부위 및 링커는 서로 판독 프레임(reading frame)으로 존재할 것이다. 바람직하게는, 폴리펩타이드의 2개의 부위는 이종 또는 상이한 폴리펩타이드로부터 수득된다.
본 내용에서 용어 "융합 단배질"은 일반적인 용어에서, 화학적 수단, 예를 들면, 수소 결합 또는 염 브릿지를 통해, 또는 단백질 합성을 통한 펩타이드 결합에 의해 또는 둘 다에 의해 함께 결합된 하나 이상의 단백질을 의미한다. 전형적으로 융합 단백질은 DNA 재조합 기술에 의해 제조될 수 있고 본원에서 재조합 융합 단백질로 지칭될 수 있다.
"동일성"은 서열을 비교함으로써 측정된 것으로서, 2개 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이스 서열 사이의 관계를 기술한다. 동일성은 또한 이러한 서열들의 스트링(string) 사이의 조화(match)에 의해 측정된 것으로서, 존재할 수 있는, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 서열 관련성(상동성)의 정도를 의미한다. 2개의 폴리펩타이드 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열 사이에 동일성을 측정하는 다수의 방법이 존재하지만, 동일성을 측정하기 위해 일반적으로 사용된 방법은 컴퓨터 프로그램에서 분류된다. 2개의 서열 사이의 동일성을 측정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램은 GCG 프로그램 패키지(Devereux, et al., Nucleic acids Research, 12, 387 (1984), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA(Atschul et al., J. Molec. Biol. (1990) 215, 403)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직하게는, 단백질의 아미노산 서열은 본원에 개시된 아미노산 서열에 대해, 아미노산 수준에서, HGMP(사람 게놈 맵핑 프로젝트(Human Genome Mapping Project))에 의해 제공된 BLAST 컴퓨터 프로그램(Atschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215, 403-410)의 디폴트 매개변수(default parameter)를 사용하여, 적어도 45% 동일성을 갖는다.
보다 바람직하게는, 단백질 서열은 본원에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열에 대해, 핵산 또는 아미노산 수준에서 적어도 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 및 여전히 보다 바람직하게는 95%(여전히 보다 바람직하게는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 가질 수 있다.
단백질은 또한 이에 대해 HGMP에 의해 제공된 BLAST 컴퓨터 프로그램의 디폴트 매개변수를 사용하여, 본원에 개시된 서열과 적어도 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
"돌연변이"는 야생형 서열과 같은, 참고 뉴클레오타이드 서열에 대해 뉴클레오타이드(들)의 결실, 삽입, 또는 치환이다.
"천연의" 또는 "천연적으로 존재하는" VNAR은 비-합성 공급원으로부터, 예를 들면, 생체 외(ex vivo) 수득된 조직 공급원으로부터, 또는 엘라스모브란치이(Elasmobranchii) 소부류의 동물의 혈청으로부터 확인된 VNAR을 지칭한다. 이러한 VNAR은 천연의 또는 달리 유도된, 임의의 유형의 면역 반응에서 생성된 VNAR을 포함할 수 있다. 천연의 VNAR은 아미노산 서열, 및 이러한 항체를 구성하거나 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 천연의 VNAR은 "합성 VNAR"보다 상이하고, 합성 VNAR은 예를 들면, 특정의 위치에서 하나의 아미노산, 또는 하나 이상의 아미노산의 상이한 아미노산으로의 대체, 결실, 또는 첨가에 의해 공급원 또는 주형 서열로부터 변화된 VNAR 서열을 지칭하고, 상이한 아미노산은 항체 서열 공급원으로부터 상이한 항체 서열을 제공한다.
단백질의 단편, 유사체, 변이체 또는 유도체는 이것이 유래된 원래의 단백질 서열의 길이에 따라, 적어도 25개, 바람직하게는 30 또는 40개, 또는 50 또는 100개 이하, 또는 60 내지 120개 아미노산 길이일 수 있다. 90 내지 120개, 100 내지 110개 아미노산의 길이는 일부 예에서 편리할 수 있다.
단백질의 단편, 유도체, 변이체 또는 유사체는 (i) 아미노산 잔기 중 하나 이상이 보존된 또는 비-보존된 아미노산 잔기(바람직하게는, 보존된 아미노산)으로 치환되고 이러한 치환된 아미노산이 유전 코드에 의해 암호화된 것이거나 암호화된 것이 아닐 수 있는 것, 또는 (ii) 아미노산 잔기 중 하나 이상이 치환체 그룹을 포함하는 것, 또는 (iii) 추가의 아미노산이 성숙한 폴리펩타이드, 예를 들면, 폴리펩타이드의 정제에 사용된 리더 또는 보조 서열에 융합된 것일 수 있다. 이러한 단편, 유도체, 변이체 및 유사체는 본원의 교시로부터 당해 분야의 기술자의 영역 내에 있는 것으로 고려된다.
"올리고뉴클레오타이드"는 공지된 방법(예를 들면, 고체-파아지 기술을 사용한, 포스포트리에스테르, 포스파이트, 또는 포스포르아미디트 화학)에 의해 화학적으로 합성된 짧은-길이, 단일-가닥 또는 이중-가닥 폴리데옥시뉴클레오타이드이다. 추가의 방법은 유전자의 전체 핵산 서열이 공지된 경우, 또는 암호화 가닥에 대해 상보성인 핵산의 서열이 이용가능한 경우에 사용된 폴리머라제 쇄 반응(PCR)을 포함한다. 대안적으로, 표적 아미노산 서열이 공지되어 있는 경우, 각각의 아미노산 잔기에 대해 공지된 및 바람직한 암호화 잔기를 사용하여 잠재적인 핵산 서열을 추론할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 폴리아크릴아미드 겔 또는 분자 사이징 컬럼(molecular sizing column) 상에서 또는 침전에 의해 정제할 수 있다. DNA가 비-핵산 불순물(이는 극성, 비-극성, 이온성 등일 수 있다)로부터 분리된 경우 "정제"된다.
출발 또는 참고 폴리펩타이드(예를 들면, VNAR 공급원 또는 이의 CDR)의 "변이체" 또는 "돌연변이체", 예를 들면, 융합 단백질(폴리펩타이드) 또는 이종 폴리펩타이드(파아지에 대해 이종)는 (1) 출발 또는 참고 폴리펩타이드의 아미노산 서열과는 상이한 아미노산 서열을 갖고 (2) 천연 또는 인공 돌연변이유발을 통해 출발 또는 참고 폴리펩타이드로부터 유래된 폴리펩타이드이다. 이러한 변이체는 예를 들면, 목적한 폴리펩타이드의 아미노산 서열 내 잔기로부터의 결실, 및/또는 잔기로의 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 예를 들면, 변이체 아미노산(VNAR 공급원 또는 이의 항원 결합 단편내 상응하는 위치에서 발견된 아미노산과 관련하여)을 지닌 서열을 암호화하는 미무작위 코돈을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 생성된 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 VNAR 공급원 또는 항원 결합 단편과 관련하여 변이체 폴리펩타이드일 수 있다. 따라서, 변이체 CDR은 출발 또는 참고 폴리펩타이드 서열(예를 들면, VNAR 공급원 또는 항원 결합 단편의 폴리펩타이드 서열)과 관련하여 변이체 서열을 포함하는 CDR을 지칭한다. 이러한 맥락에서 변이체 아미노산은 출발 또는 참고 폴리펩타이드 서열(예를 들면, VNAR 공급원 또는 항원 결합 단편의 폴리펩타이드 서열)내 상응하는 위치에서 아미노산과는 상이한 아미노산을 지칭한다. 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합은 최종 변이체 또는 돌연변이체 작제물에 도달하도록 제조될 수 있고, 단 최종 작제물은 목적한 기능적 특성을 소유한다. 아미노산 변화는 또한 폴리펩타이드의 해독 후 공정을 변경, 예를 들면, 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시킬 수 있다.
"야생형" 또는 "참고" 서열 또는 "야생형" 또는 "참고" 단백질/폴리펩타이드, 예를 들면, 코트 단백질(coat protein)의 서열, 또는 VNAR 공급원의 CDR은 이로부터 변이체 폴리펩타이드가 돌연변이의 도입을 통해 유래된 참고 서열일 수 있다. 일반적으로, 주어진 단백질에 대한 "야생형" 서열은 천연에서 가장 일반적인 서열이다. 유사하게, "야생형" 유전자 서열은 천연에서 가장 일반적으로 발견된 이러한 유전자에 대한 서열이다. 돌연변이는 천연의 공정을 통해 또는 사람 유도된 수단을 통해 "야생형" 유전자(및 따라서 이것이 암호화하는 단백질) 내로 도입될 수 있다. 이러한 공정의 생성물은 원래의 "야생형" 단백질 또는 유전자의 "변이체" 또는 "돌연변이체" 형태이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "접합"은 2개 이상의 화학적 모이어티를 화학적으로 연결시키는 임의의 방법을 지칭할 수 있다. 전형적으로, 접합은 공유 결합을 통할 것이다. 본 발명의 맥락에서, 화학적 모이어티 중 적어도 하나는 표적-결합 분자일 것이고 다른 또는 분자는 본 발명의 PNU 유도체일 것이다. 일부 경우에 접합은 본 발명의 PNU 유도체 외에 2개 이상의 표적-결합 분자를 포함할 것이고, 이러한 경우에 접합은 표적-결합 분자 중 하나에 접합된 PNU 유도체를 지닌 표적-결합 분자 사이에 직접 존재할 수 있다.
어구 "를 포함하는 그룹으로부터 선택된"은 이것이 본원에 존재하는 어디에서도, 어구 "로 이루어진 그룹으로부터 선택된"으로 치환될 수 있고, 이의 역도 가능하다.
본 발명은 다음의 실시예를 참고로 추가로 이해될 것이다.
실시예
실시예 1: PNU 유도체의 특성화
본 발명의 PNU 유도체는 표준 합성 방법에 따라 제조하였다. 질량 분광법을 사용하여 정확한 분자가 생산되었는지를 입증하였다(표 1).
[표 1]
Figure pct00044
Figure pct00045
EDA-PNU159682 유도체의 잠재능(도 1)을 다양한 세포주에서 시험하였다. 결과는 표 2에 요약한다.
[표 2]
Figure pct00046
실시예 2: VNAR-hFc PNU 접합체
다수의 VNAR-hFc-PNU 접합체를 제조하여 본 발명의 PNU 유도체를 시험하였다. 2개의 VNAR은 ROR1(B1 및 P3A1)에 대해 특이적이었다. 또한, 비-결합 VNAR(2V)을 대조군 분자로서 사용하였다.
VNAR은 hIgG1 Fc 서열 내 시스테인 치환, S239C(EU 넘버링)을 함유한 표준 [G4S]3를 통해 가공된 hIgG1 Fc 도메인에 유전적으로 융합되었다. VNAR Fc 융합 단백질은 CHO K1 세포 내에서 분비된 단백질로서 발현되었으며 배지로부터 MabSelect™ SuRe™(Evitria, 스위스)을 사용하여 정제하였다. 정제된 단백질을 SEC(AdvanceBio, Agilent), SDS PAGE 및 질량 분광법으로 분석하여 서열 및 단백질 온전성(integrity)을 확인하였다. 결합 역학은 Pioneer 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance)(SPR) 장치(SensiQ/Pall ForteBio), 또는 바이오층 간섭법(Biolayer Interferometry)(BLI) 옥텟 K2 시스템(ForteBio)을 사용하여 측정하였다. ROR1-hFc 또는 ROR2-hFc 융합 단백질(세포외 도메인)을 아세트산나트륨 pH5 완충제 속에서 COOH2 칩 또는 AR2G 센서에 아민 커플링을 사용하여 고정시켰다. VNAR 및 VNAR-Fc 분자를 다양한 농도에서 시험하고 Ka(M-1s-1), Kd(s-1) 및 KD(nM) 값을 QDat 소프트웨어(SensiQ/Pall ForteBio) 또는 바이오층 간섭법용 옥텟 데이타 분석 고 처리량 소프트웨어(Octet Data Analysis High Throughput software)(ForteBio)를 사용하여 측정하였다. ROR1 2A2 mAb(Biolegend) 및 ROR2 mAb(R&D Systems)를 ROR1 및 ROR2에 대한 양성/음성 결합에 대해 대조군으로서 포함시켰다. 2V는 나이브(
Figure pct00047
) VNAR 라이브러리로부터 유래된 대조군 VNAR 서열이므로, 당해 단백질 부류를 나타내며 공지된 표적을 가지지 않는다. 표 3 및 3b는 사람 ROR1 & 사람 ROR2에 대한 이러한 분자의 친화성에 대한 표면 플라스몬 공명 데이타를 요약한다.
[표 3]
Figure pct00048
동일한 공정을 P3A1 hFc(442)에 대해 반복하여, 비교가능한 결합 데이타를 생성하였다. 이러한 유도체의 경우, VNAR을 hIgG1 Fc 서열내 시스테인 치환, S442C(EU 넘버링)을 함유한 가공된 hIgG1 Fc 도메인에 유전적으로 융합되었다. 사람 ROR1 & 사람 ROR2에 대한 당해 분자의 친화성에 대한 표면 플라스몬 공명 데이타는 표 3b에 나타낸다.
[표 3b]
Figure pct00049
문헌[Junutula et al, 2008 Nat Biotech, Jeffrey et al, 2013 Bioconj Chem]으로부터 채택된 부분적 환원, 리폴딩(refolding) 및 표지화 방법(labelling method)을 사용하여, 이러한 단백질을 말레이미드 PNU 유도체로 부위 특이적으로 표지하였다(도 1 및 2). 요약하면, 1mg/ml의 VNAR hFc 용액을 1mM EDTA가 들어있는 PBS + 100mM L-아르기닌 pH 7.4 속에서 제조하였다. 20 몰 당량의 TCEP를 가하고 4℃에서 최소 48시간 동안 항온처리하였다. 30몰 당량의 DHAA를 첨가하고, pH를 6.5로 조절하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 재폴딩된 VNAR Fc S239C를 집중적으로 나타내거나 완충제를 PBS + 50mM L-아르기닌으로 교환하고 UV로 정량화한 후 4 또는 5 몰 당량의 말레이미드 PNU 용액과 실온에서 밤새 반응시켰다. 접합체를 SEC로 정제하고 분석 HIC, 분석 SEC, 및 LC-MS로 정제하였다. 표 4는 제조된 접합체를 요약한다.
[표 4]
Figure pct00050
동일한 공정을 P3A1 hFc(442)-va-EDA-PNU 접합체에 대해 반복하였다. 표 4b는 제조된 접합체를 요약한다.
Figure pct00051
항 ROR1 VNAR 약물 접합체로 처리한 암 세포에 대한 시험관내 세포 생존능 검정
세포를 백색의 깨끗한 바닥 96 웰 플레이트(Costar) 내로 씨딩(seeding)하고 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 항온처리하였다. 다음날, 희석 시리즈(dilution series)를 각각의 시험 제에 대해 x10 작업 스톡(working stock)에서 설정하였다. 용량 반응(dose response) X10 스톡은 다음과 같았다: 10000, 5000, 1000, 500, 100, 50, 10, 5, 1, 0.5nM 등. 10μL의 X10 스톡 용액을 세포 플레이트(웰(well) 당 90μl)에 다중채널 피펫(multichannel pipette)을 사용하여 가하였다. 이는 웰 내로 1:10 희석 및 대부분의 민감성 세포주에 대해, 필요한 경우, 1000nM(컬럼 1) 내지 0.05nM(컬럼 10) 범위의 용량 반응을 생성하거나 0.5fM로 지속하였다. 10μl의 비히클 대조군(vehicle control)(PBS)을 대조군 웰(컬럼 11 및 12)에 가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 72 내지 96 시간 동안 항온처리하였다. Promega Cell Titre Glo 시약을 제조업자의 설명서에 따라 사용하여 세포 생존능을 평가하였다. 요약하면, 검정 플레이트를 항온처리기로부터 제거하고 실온으로 평형화하도록 한 후 100μl의 실온 Cell Titre Glo 시약을 각각의 100μl의 검정 웰에 가하였다. 플레이트를 플레이트 진탕기 상에 2분 동안 600rpm에서 두었다. 플레이트를 실온에서 추가로 10분 동안 둔 후 Clariostar 플레이트-판독기(plate-reader)(BMG)를 사용하여 발광성 판독물(luminescence read-out)을 측정하였다. 데이타를 미처리(비히클 단독) 대조군 웰에 대한 평균을 계산하고 각각의 처리된 웰에 대한 대조군의 %를 측정함으로써 분석하였다. 이후에, 대조군 데이타의 %를 Log[처리] 농도에 대해 플롯팅하고 IC50 값을 GraphPad Prism 소프트웨어 내에서 비-선형 회귀 핏팅(non-linear regression fitting)을 사용하여 유도하였다.
다음의 세포주를 사용하였다:
가스미-2(Kasumi-2) - 사람 B 세포 백혈병 전구체;
PA-1 - 사람 난소 암 세포주;
PA-1 ROR1 ko - ROR1 녹-아웃(knock-out)을 지닌 사람 난소 암 세포주;
697 - 사람 B 세포 백혈병 전구체, 및
MHH-ES1 - 사람 유윙 육종(Ewing's sarcoma) 세포주.
[표 5]
Figure pct00052
[표 6]
Figure pct00053
표 5 및 6 및 도 3 내지 12 및 도 15는 본 발명의 페이로드를 사용한 ROR1 표적화 단백질 약물 접합체가 상응하는 비-결합 단백질 약물 접합체(2V hFc)와 비교하는 경우, 큰 윈도우(window)를 사용하여, ROR1 의존적 양식으로, ROR1 발현 암을 사멸하는데 있어 매우 강력하다.
[표 7]
Figure pct00054
표 7의 데이타는 본 발명의 PNU 접합체가 선행 기술의 PEG4-vc-PAB-DMAE-PNU159682보다 더 높은 IC50 값을 일관되게 가짐을 입증한다. 따라서, 본 발명의 링커-페이로드는 보다 안정한 접합체 및/또는 거의 강력하지 않은 부산물을 생성하며 이러한 단백질 약물 접합체는 정상 조직에 대해 거의 비독성일 수 있다.
실시예 3: 트라스투주맙 접합체
트라스투주맙 돌연변이체를 생산하였고 여기서 Fc 부위 내 단일 세린 잔기(442번 위치)는 시스테인 잔기로 변화된다. 이는 접합용 Fc 부위내에 중쇄의 442번 위치에서 유일한 티올을 지닌 트라스투주맙 분자를 생산한다. 이러한 돌연변이체는 트라스투주맙 S442C 또는 tras(S442C)로 지칭될 수 있다.
신규한 PNU 페이로드 중 2개를 가공된 시스테인을 통해 당해 분자에 상술한 바와 같은 방법을 사용하여 접합함으로써 양호한 전체 수율의 상응하는 접합체를 수득하였다. 하기 표 8은 이러한 접합체의 특성을 요약한다.
[표 8]
Figure pct00055
또한, HER2 양성 세포주를 사멸시키는데 있어서 tras(S442C)-PNU 접합체의 잠재능을 시험하였다. 도 13 및 14는 tras(S442C)-PNU 접합체 둘 다가 HER2 양성 세포주 SK-BR-3을 사멸시켰고 HER2 음성 세포주 MDA-MB-468에서 거의 효과가 없었음을 나타낸다.
실시예 4: VNAR-PNU 접합체
다량체성 및 비-파라토프성(bi-paratopic) VNAR 작제물을 부위 특이적인 표지화를 위해 가공된 시스테인을 함유하는 C-말단 his myc tag를 사용하여 생성시켰다. 단백질을 2mM TCEP로 처리하고 IMAC로 정제하였다.
ROR1-hFc 또는 ROR2-hFc 융합 단백질(세포외 도메인)에 대한 다량체성 VNAR 단백질의 결합에 대한 결합 역학을 앞서 기술한 바와 같이 Pioneer 표면 플라스몬 공명(SPR) 장치(SensiQ/Pall ForteBio) 또는 생물층 간섭(Biolayer Interferometry)(BLI) 옥텟 K2 시스템(ForteBio)을 사용하여 측정하였다.
[표 9]
Figure pct00056
접합을 4 당량의 PNU를 사용하여 실온에서 1시간 동안 수행하고 SEC로 정제하였다. 최종 접합체를 분석적 HIC, 분석적 SEC, 및 LC-MS로 분석하였다.
[표 10]
Figure pct00057
VNAR 도메인 사이의 링커는 (G4S)5[([G4S]5]로 나타냄; PGVQPSPGGGGS[(WbG4S)로 나타냄](서열 번호: 50); PGVQPAPGGGGS[(WbG4SGM)로 나타냄](서열 번호: 51)이다.
페이로드를 단백질의 C-말단 영역에 도입된 유일한 유리 티올에 가공된 시스테인을 함유하는 C-말단 his myc tag(QACKAHHHHHHGAEFEQKLISEEDL(서열 번호: 52) 또는 QACGAHHHHHHGAEFEQKLISEEDL(서열 번호: 53)의 서열)의 혼입을 통해 접합시켰다.
ROR1hi A549 폐 선암종(lung adenocarcinoma) 세포의 표면에 대한 다량체성 접합체의 결합을 유동 세포분석법으로 평가하였다. 부착성 사람 암 세포를 0.1% EDTA/PBS 용액과 37℃에서 대략 10분 동안 또는 세포가 용이하게 탈착될 때까지 항온처리함으로써 조직 배양 플라스크로부터 탈착시켰다. 세포를 15ml의 튜브 속에서 5ml의 빙-냉 PBS/2% FCS 속에 재-현탁시키고 1500rpm에서 5분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 1 내지 2ml의 PBS/2% FCS 속에 재-현탁시켰다. 세포 계수를 Z1 Coulter 입자 계수기(Particle Counter)(Beckman Coulter)를 사용하여 수행하고 5 x 10^5개의 세포를 96웰 플레이트 내로 시험 샘플에 대해 분취하였다. 세포를 100μl의 VNAR(태그된 His6Myc) 또는 상응하는 VNAR 접합체와 함께 나타낸 농도에서, 및 대조군과 1시간 동안 빙상에서 항온처리하였다. 샘플 플레이트를 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 0.25mL의 빙냉 PBS/2% FCS 속에 다중채널 피펫을 사용하여 재-현탁함으로써 수행하였다. 샘플을 다시 2000rpm에서 5분 동안 4℃에서 원심분리하였다.
상층액을 제거하고 2개의 추가 세척을 기술된 바와 같이 수행하였다. 최종 세척 및 원심분리 단계 후, 과량의 액체를 플레이트를 티슈 페이퍼(tissue paper) 상에 플롯팅하여 제거하였다. 100μl의 항-x6His tag Ab(Abcam)를 적절하게는 세포 펠렛당 가하여 VNAR(태그된 His6Myc) 또는 상응하는 VNAR 접합체에 결합시키고 빙상에서 30분 동안 항온처리하였다. 세척 단계를 앞서 기술한 바와 같이 수행하였다. PE-항-마우스 항체(JIR)를 사용하여 VNAR(태그된 His6Myc) 및 상응하는 VNAR 접합체를 적절한 샘플과 30분 동안 빙상에서 암실 속에서 항온처리함으로써 검출하였다. 세척 단계는 앞서 기술한 바와 같이 수행하였다. 세포 펠렛을 0.3ml의 빙-냉 PBS/2% FCS 속에 재-현탁시키고 Merck-Millipore Guava EasyCyte HT 유동 세포분석기 상에서 분석하기 전에 암실 속에서 빙상에 두었다.
도 16은 vc-PAB-EDA-PNU 또는 va-EDA-PNU와 접합된, VNAR 다량체가 암 세포의 표면에서 ROR1에 대한 결합을 유지함을 나타낸다.
실시예 5: 단백질-PNU 접합체의 카텝신 B 처리
VNAR-hFc-vc-PAB-EDA-PNU 접합체 및 다량체성 단백질의 상응하는 접합체의 카텝신 B 처리는 유리된 EDA-PNU159682 유도체를 정량적 방식으로 유리시켰다. 반면에, VNAR-hFc-va-EDA-PNU 접합체 및 다량체성 단백질의 상응하는 접합체는 카텝신 B 처리에 대해 완전하게 안정하였다.
[표 11]
Figure pct00058
vc-PAB-EDA-PNU 만이 이러한 시험관 내 검정에서 사용된 조건에 대해 예측된 바와 같이 CatB를 사용한 처리시 페이로드를 방출한다. 방출은 정량적이며 - 접합체는 2의 약물 대 항체 비를 가지므로, 방출된 페이로드의 농도 2배 대 접합체의 농도가 CatB 처리 후 예측된다. 이러한 예측은 vc-PAB-EDA-PNU 접합체에 대해 표 11에 나타낸 데이타와 일치한다.
실시예 6: 단백질-PNU 접합체의 혈장 안정성
상이한 P3A1-hFc-PNU 접합체를 37℃에서 마우스 혈장 속에서 4 μM의 단백질의 최종 농도에서 항온처리하였다. 샘플을 시간의 함수로서 LC-MS로 분석하고 방출된 PNU159682 및 EDA-PNU159682 유도체의 양을 교정 표준에 대한 참고에 의해 정량화하였다.
[표 12]
Figure pct00059
표 12에 나타낸 바와 같이, va-EDA-PNU159682 페이로드와의 접합체는 시간에 따라 방출된 PNU 유도체가 거의 없거나 없으면서 탁월한 마우스 혈장 안정성을 나타내었다. vc-PAB-DMAE-PNU 및 vc-PAB-EDA-PNU 접합체 둘 다의 경우 일부 유리된 페이로드의 유리를 시간의 함수로서 검출할 수 있었고, 217 nM의 PNU159682 및 114 nM의 EDA-PNU159682 유도체가 각각 120 h 후 검출되었다. 평행한 연구(parellel study)에서, 본 발명자는 유리된 PNU159682 및 EDA-PNU159682 유도체의 마우스 혈장 반감기가 각각 33h 및 116h 임을 계산하였음에 주목한다. vc-PAB-DMAE-PNU 접합체에 대해 방출된 유리된 PNU 페이로드의 절대량은 vc-PAB-EDA-PNU 접합체와 관련하여 과소평가됨을 나타낸다.
상이한 접합체를 37℃에서 168시간 동안 사람 혈장 속에서 4 μM 또는 2 μM의 단백질의 최종 농도에서 항온처리하였다. 샘플을 168h 이하의 시간의 함수로서 LC-MS로 분석하고 방출된 PNU159682 및 EDA-PNU159682 유도체의 양을 교정 표준에 대한 참고로 정량화하였다.
[표 13]
Figure pct00060
표 13에 나타낸 바와 같이, 접합체는 실험의 과정에 걸쳐 방출된 PNU 유도체의 검출가능한 양이 없으면서도 탁월한 사람 혈장 안정성을 나타내었다. 사람 혈장 속에서 EDA-PNU의 반감기는 172.25h이다(4개의 상이한 실험의 평균).
실시예 7: 융막 중피종(pleural mesothelioma)의 환자-유래된 이종이식체 모델에서 단백질-약물 접합체의 생체 내 효능
ROR1+ PXF-1118 환자-유래된 흉막 중피종 이종이식체 모델에서의 효능 연구는 Charles River Laboratories(프라이부르크 소재)에 의해 수행되었다.
누드 마우스(nude mouse)에서 일련의 계대배양(passage)의 이종이식체로부터 수득된 종양 단편을 암컷 NMRI nu/nu 마우스(Crl:NMRI-Foxn1 nu ) 내로 피하 이식하였다. 마우스를 종양 이식체가 충분한 수의 동물에서 50 내지 250 mm3, 바람직하게는 150 내지 200 mm3의 연구 용적 보충 기준에 도달할 때까지 모니터링하였다. 마우스를 처리 그룹으로 무작위처리함으로써 각각의 그룹에서 종양 용적 사이에 통계적인 차이가 없도록 하였다. 무작위처리는 실험 0일째에 설계하였다. 마우스를 비히클 또는 단백질-약물 접합체 B1-hFc-vc-PAB-EDA-PNU 또는 B1-hFc-va-EDA-PNU로 0.3 mg/kg에서 정맥내 주사에 의해 1, 4, 7, 10, 18일 째에 처리하였다. 모든 마우스에게 마우스 IgG로 단일 용량 프라이민을 제공하고 제1의 PDC 용량보다 20시간 전에 29 mg/kg에서 정맥내(i.v.) 투여하였다.
절대 종양 용적(ATV)을 무작위 처리 날 및 주당 3회 디지털 캘리퍼(digital caliper)로 2-차원 측정으로 측정하였다. 종양 용적을 다음 식에 따라 계산하였다:
종양 용적 = (L× W²) × 0.5
여기서 L은 종양의 최대 직경이고 W는 종양의 너비(수직 직경)(mm)이다.
동물을 주당 3회, 및 용량을 투여한 당일에 일정하게 칭량하였다. 마우스를 물리적 외관, 거동 및 부작용 임상 신호에 있어서의 변화 및 지역 및 우수한 수의학 실무 지침(local and best veterinary practice guidelines)에 부합하는 일반 복지(general welfare)에 대해 관찰하고 매일 문서화하였다.
도 17은 종양 성장 대 비히클 대조군에서 단백질-약물 접합체의 효과를 나타낸다. B1-hFc-vc-PAB-EDA-PNU 및 B1-hFc-va-EDA-PNU는 잘 견디어지며 이러한 흉막 중피종 PDX 모델에서 종양의 성장을 유의적으로 억제한다. ROR1+ve 흉막 중피종 환자-유래된 종양을 표적화하는 PDC 분자는 양호한 항-종양 효능을 나타낸다.
실시예 8: 삼중 음성 유방암(Triple Negative Breast Cancer)(TNBC)의 환자-기원한 이종이식체 모델에서 단백질-약물 접합체의 생체 내 효능
ROR1+ HBCx-28 환자-유래된 TNBC 이종이식체 모델에서 효능 연구는 XenTech(파리 소재)에 의해 수행되었다.
이계교배된 무흉선(Outbred athymic)(nu/nu) 암컷 마우스(HSD: Athymic Nude-Foxn1 nu )에게 이의 종양을 생체내 계대배양으로 피하 이식하였다. 마우스를 종양 이식체가 충분한 수의 동물에서 60 내지 200 mm3, 바람직하게는 75 내지 196 mm3의 연구 용적 보충 기준에 도달할 때까지 모니터링하였다. 마우스를 처리 그룹으로 무작위처리함으로써 각각의 그룹에서 종양 용적 사이에 통계적인 차이가 없도록 하였다. 무작위처리를 실험 0일로 지정하였다. 마우스를 비히클 또는 단백질-약물 접합체 B1-hFc-vc-PAB-EDA-PNU 또는 B1-hFc-va-EDA-PNU로 0.3 mg/kg에서 정맥내 주사에 의해 2, 5, 8, 12, 15일 째에 제1의 PDC 용량 20시간 전에 마우스 IgG로 예비-프리이밍한 모든 마우스를 사용하여 처리하였다. 종양 용적은 캘리퍼를 사용하여 D55까지 실험 기간 동안 주당 3회 수직 종양 직경을 측정함으로써 평가한 다음, 실험 종결(즉 103일)까지 주당 2회 측정 및 칭량하였다. 정대 종양 용적(ATV)을 수학식 TV (mm3) = [길이(mm) x 너비(mm)2] x 0.5를 사용하여 계산하였고, 여기서 길이 및 너비는 각각 수직으로 측정된 종양의 가장 긴 및 가장 짧은 수직 직경이다. 모든 동물을 종양 크기 측정으로서 동시에 칭량하였다. 마우스를 물리적 외관, 거동, 부작용 임상 신호 및 지역 및 우수한 수의학 실무 지침에 부합하는 일반 복지에 대해 매일 관찰하고 문서화하였다.
도 18은 종양 성장 대 비히클 대조군에 대한 단백질-약물 접합체의 효과를 나타낸다. B1-hFc-vc-PAB-EDA-PNU 및 B1-hFc-va-EDA-PNU 둘 다는 잘 견디어지며 당해 ROR1+ TNBC PDX 모델에서 매우 통계적으로 유의적인 생체내 효능을 나타낸다. 또한, 연구 전체 기간(103일) 동안 지속된 종양 '치유'를 포함하는 완전하고 내구성있는 회귀가 제제 둘 다에 대해 관측되었다. ROR1+ve TNBC 환자-유래된 종양을 표적화하는 PDC 분자는 완전하고 내구성있는 종양 회귀로 풍부한 항-종양 효능('치유' 포함)을 나타낸다.
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Claims (44)

  1. 화학식 (I)의 안트라사이클린(PNU) 유도체:
    Figure pct00061

    상기 화학식 (I)에서,
    [X]는 치환되거나 비치환된 알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 아릴 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴 그룹, 하나 이상의 헤테로원자, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 조합으로부터 선택된 임의의 스페이서(spacer)이고;
    [L1] 및 [L2]는 발린(Val), 시트룰린(Cit), 알라닌(Ala), 아스파라긴(Asn), 펩타이드, -(CH2)n-, -(CH2CH2O)n-, p-아미노벤질옥시카보닐(PAB), Val-Cit-PAB, Val-Ala-PAB, Ala-Ala-Asn-PAB, 글리신을 제외한 임의의 아미노산, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 링커(linker)이다.
  2. 제1항에 있어서, 화학식 (I)의 안트라사이클린(PNU) 유도체가 [L1], [L2] 또는 [L1] 및 [L2]를 포함하는 안트라사이클린 유도체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, [X]가 폴리에틸렌 글리콜,
    Figure pct00062
    Figure pct00063
    및
    Figure pct00064
    를 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 여기서
    Figure pct00065
    는 분자의 나머지에 대한 부착점을 나타내고 여기서 [R]은 치환되거나 비치환된 알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 아릴 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴 그룹, 하나 이상의 헤테로원자, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 임의의 스페이서인 안트라사이클린 유도체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, [X]가 폴리에틸렌 글리콜인 안트라사이클린 유도체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, [L2]가 p-아미노벤질옥시카보닐(PAB) 또는 알라닌인 안트라사이클린 유도체.
  6. 제1항에 있어서, PNU 유도체가 다음으로부터 선택된 구조를 갖는 안트라사이클린 유도체:
    Figure pct00066

    Figure pct00067
    .
  7. 화학식 (IV)의 안트라사이클린(PNU) 유도체:
    Figure pct00068

    상기 화학식 (IV)에서,
    [X]는 치환되거나 비치환된 알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 아릴 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴 그룹, 하나 이상의 헤테로원자, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 임의의 스페이서이고;
    여기서 [Z]는 접합(conjugation) 반응에서 사용하기에 적합한 반응성 그룹이다.
  8. 제7항에 있어서, [Z]가 말레이미드, 알킬 할라이드, 설프하이드릴 그룹, 활성화된 디설파이드, 아미노 그룹, 알킨 그룹, 아지도 그룹, 아민옥시 그룹, 알데하이드 그룹 및 케톤 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 안트라사이클린 유도체.
  9. 제7항에 있어서, [Z]가 폴리Gly 및 1급 아민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 안트라사이클린 유도체.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, [X]가 폴리에틸렌 글리콜,
    Figure pct00069
    Figure pct00070
    및
    Figure pct00071
    를 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 여기서
    Figure pct00072
    는 분자의 나머지에 대한 부착 점을 나타내고 여기서 [R]은 치환되거나 비치환된 알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 아릴 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴 그룹, 하나 이상의 헤테로원자, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 임의의 스페이서인 안트라사이클린 유도체.
  11. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, [X]가 폴리에틸렌 글리콜인 안트라사이클린 유도체.
  12. 특이적인 항원 결합 단백질 및 안트라사이클린(PNU) 유도체를 포함하는, 표적-결합 분자-약물 접합체(target-binding molecule-drug conjugate)로서, 여기서 표적-결합 분자-약물 접합체가 화학식 (II)의 구조를 갖는, 표적-결합 분자-약물 접합체:
    Figure pct00073

    상기 화학식 (II)에서,
    [X]는 치환되거나 비치환된 알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 아릴 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴 그룹, 하나 이상의 헤테로원자, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 임의의 스페이서이고;
    [L1] 및 [L2]는 발린(Val), 시트룰린(Cit), 알라닌(Ala), 아스파라긴(Asn), 펩타이드, -(CH2)n-, -(CH2CH2O)n-, p-아미노벤질옥시카보닐(PAB), Val-Cit-PAB, Val-Ala-PAB, Ala-Ala-Asn-PAB, 글리신을 제외한 임의의 아미노산, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 링커이고;
    Y는 표적 결합 분자이다.
  13. 제12항에 있어서, 화학식 (II)의 표적-결합 분자-약물 접합체가 [L1], [L2] 또는 [L1] 및 [L2]를 포함하는, 표적-결합 분자-약물 접합체.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, [X]가 폴리에틸렌 글리콜,
    Figure pct00074
    Figure pct00075
    및
    Figure pct00076
    를 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 여기서
    Figure pct00077
    는 분자의 나머지에 대한 부착점을 나타내고 여기서 [R]은 치환되거나 비치환된 알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 아릴 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴 그룹, 하나 이상의 헤테로원자, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 임의의 스페이서인, 표적-결합 분자-약물 접합체.
  15. 제12항 또는 제13항에 있어서, [X]가 폴리에틸렌 글리콜인, 표적-결합 분자-약물 접합체.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, [L2]가 p-아미노벤질옥시카보닐 (PAB) 또는 알라닌인, 표적-결합 분자-약물 접합체.
  17. 제12항에 있어서, PNU 유도체가 다음으로부터 선택된 구조를 갖는, 표적-결합 분자-약물 접합체:
    Figure pct00078
    .
  18. 특이적인 항원 결합 단백질 및 안트라사이클린(PNU) 유도체를 포함하는 표적-결합 분자-약물 접합체로서, 여기서 표적-결합 분자-약물 접합체가 화학식 (V)의 구조를 갖는, 표적-결합 분자-약물 접합체:
    Figure pct00079

    상기 화학식 (V)에서,
    [X]는 치환되거나 비치환된 알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 아릴 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴 그룹, 하나 이상의 헤테로원자, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 임의의 스페이서이고;
    [Z]는 안트라사이클린(PNU) 유도체 및 표적-결합 분자를 접합시키는데 사용된 반응성 그룹으로부터 유도된 링커이고;
    Y는 표적 결합 분자이다.
  19. 제18항에 있어서, [Z]가 디설파이드 결합, 아미드 결합, 옥심 결합, 하이드라존 결합, 티오에테르 결합, 1, 2, 3 트리아졸 및 폴리Gly로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 안트라사이클린 유도체.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, [X]가 폴리에틸렌 글리콜,
    Figure pct00080
    Figure pct00081
    및
    Figure pct00082
    를 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 여기서
    Figure pct00083
    는 분자의 나머지에 대한 부착 점을 나타내고, 여기서 [R]은 치환되거나 비치환된 알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬 그룹, 치환되거나 비치환된 아릴 그룹, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴 그룹, 하나 이상의 헤테로원자, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 임의의 스페이서인, 표적-결합 분자-약물 접합체.
  21. 제18항 또는 제19항에 있어서, [X]가 폴리에틸렌 글리콜인, 표적-결합 분자-약물 접합체.
  22. 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 표적-결합 분자가 단백질이고 안트라사이클린(PNU) 유도체가 단백질의 아미노산 서열 내 티올-함유 아미노산 잔기에 접합되거나 또는 여기서 PNU 유도체가 단백질의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 화학적 변형에 의해 혼입된 티올 그룹을 통해 접합되는, 표적-결합 분자-약물 접합체.
  23. 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 표적-결합 단백질이 면역글로불린 또는 항체, 면역글로불린 FC 영역, 면역글로불린 Fab 영역, Fab', Fv, Fv-Fc, 단일 쇄 Fv(scFv), scFv-Fc, (scFv)2, 디아보디(diabody), 트리아보디(triabody), 테트라보디(tetrabody), 이특이적인 t-세포 인게이저(bispecific t-cell engager)(BiTE), 인테인(intein), VNAR 도메인, 단일 도메인 항체(sdAb), VH 도메인, 또는 스캐폴드 단백질(scaffold protein)을 포함하는 그룹으로부터 선택된 결합 단백질인, 표적-결합 분자-약물 접합체.
  24. 제12항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 표적-결합 분자가 수용체 타이로신 키나제-유사 오르판 수용체 1(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1)(ROR1)에 결합하는, 표적-결합 분자-약물 접합체.
  25. 제12항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 표적-결합 분자가 화학식 (III)으로 나타낸 아미노산 서열을 포함할 수 있는 특이적인 항원 결합 단백질인, 표적-결합 분자-약물 접합체:
    Figure pct00084

    상기 화학식 (III)에서
    FW1은 골격 영역(framework region)이고,
    CDR1은 CDR 서열이고,
    FW2는 골격 영역이고,
    HV2는 고가변성 서열(hypervariable sequence)이고,
    FW3a는 골격 영역이고,
    HV4는 고가변성 서열이고,
    FW3b는 골격 영역이고,
    CDR3은 CDR 서열이고,
    FW4는 골격 영역이다.
  26. 제25항에 있어서, 특이적인 항원 결합 단백질이 수용체 타이로신 키나제-유사 오르판 수용체 1(ROR1)에 결합하는, 표적-결합 분자-약물 접합체.
  27. 제26항에 있어서, ROR1-특이적인 항원 결합 단백질이 수용체 타이로신 키나제-유사 오르판 수용체 2(ROR2)에 결합하지 않는, 표적-결합 분자-약물 접합체.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, ROR1-특이적인 항원 결합 단백질이 사람 ROR1 및 쥐(murine) ROR1(mROR1) 둘 다에 결합하는, 표적-결합 분자-약물 접합체.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1-특이적인 항원 결합 분자가 데글리코실화된(deglycosylated) ROR1에 결합하는, 표적-결합 분자-약물 접합체.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1-특이적인 항원 결합 분자가 다음으로부터 선택된 선형 펩타이드에 결합하지 않는, 표적-결합 분자-약물 접합체:
    Figure pct00085

    Figure pct00086
    .
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    FW1이 20 내지 28개 아미노산의 골격 영역이고,
    CDR1이 DTSYGLYS(서열 번호: 1), GAKYGLAA(서열 번호: 2), GAKYGLFA(서열 번호: 3), GANYGLAA(서열 번호: 4), 또는 GANYGLAS(서열 번호: 5)로부터 선택된 CDR 서열이고,
    FW2가 6 내지 14개 아미노산의 골격 영역이고,
    HV2가 TTDWERMSIG(서열 번호: 6), SSNQERISIS(서열 번호: 7), 또는 SSNKEQISIS(서열 번호: 8)로부터 선택된 고가변성 서열이고,
    FW3a가 6 내지 10개 아미노산의 골격 영역이고,
    HV4가 NKRAK(서열 번호: 9), NKRTM(서열 번호: 10), NKGAK(서열 번호: 11), 또는 NKGTK(서열 번호: 12)로부터 선택된 고가변성 서열이고,
    FW3b가 17 내지 24개 아미노산의 골격 영역이고,
    CDR3이 QSGMAISTGSGHGYNWY(서열 번호: 13), QSGMAIDIGSGHGYNWY(서열 번호: 14), YPWAMWGQWY(서열 번호: 15), VFMPQHWHPAAHWY(서열 번호: 16), REARHPWLRQWY(서열 번호: 17), 또는 YPWGAGAPWLVQWY(서열 번호: 18)로부터 선택된 CDR 서열이고,
    FW4가 7 내지 14개 아미노산의 골격 영역인, 표적-결합 분자-약물 접합체 또는 이에 대해 적어도 45% 서열 동일성을 지닌 이의 기능성 변이체(functional variant).
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    FW1이 ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLT(서열 번호: 19), AKVDQTPRTATKETGESLTINCVLT(서열 번호: 20), TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVT(서열 번호: 21), TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLT(서열 번호: 22), ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVT(서열 번호: 23), TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLT(서열 번호: 24) 또는 ASVTQSPRSASKETGESLTITCRVT(서열 번호: 56)로부터 선택되고, FW2가 TSWFRKNPG(서열 번호: 25), 또는 TYWYRKNPG(서열 번호: 26)로부터 선택되고; FW3a가 GRYVESV(서열 번호: 27), 또는 GRYSESV(서열 번호: 28)로부터 선택되고, FW3b가 SFSLRIKDLTVADSATYYCKA(서열 번호: 29), SFTLTISSLQPEDSATYYCRA(서열 번호: 30), SFTLTISSLQPEDFATYYCKA(서열 번호: 31) 또는 SFSLRISSLTVEDSATYYCKA(서열 번호: 57)로부터 선택되고, FW4가 DGAGTVLTVN(서열 번호: 32), DGAGTKVEIK(서열 번호: 33) 또는 DGQGTKLEVK(서열 번호: 58)로부터 선택되는, 표적-결합 분자-약물 접합체; 또는 적어도 45%의 서열 동일성(sequence identity)을 지닌 이의 기능성 변이체.
  33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1-특이적인 항원 결합 분자가 다음으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 표적-결합 분자-약물 접합체; 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 지닌 이의 기능성 변이체:
    Figure pct00087

    Figure pct00088

    Figure pct00089
  34. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1-특이적인 항원 결합 단백질이 사람화되는, 표적-결합 분자-약물 접합체.
  35. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1-특이적인 항원 결합 분자가 탈-면역화(de-immunizing)되는, 표적-결합 분자-약물 접합체.
  36. 제24항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 치료요법(therapy)에서 사용하기 위한, 표적-결합 분자-약물 접합체.
  37. 제24항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한, 표적-결합 분자-약물 접합체.
  38. 이를 필요로 하는 환자에서 질환의 치료용 의약의 제조 시의, 제24항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 표적-결합 분자-약물 접합체의 용도.
  39. 치료가 필요한 환자에게 치료학적 유효량의 제24항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 표적-결합 분자-약물 접합체를 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 질환을 치료하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 질환이 암인, 방법.
  41. 제12항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 표적-결합 분자가 항체인, 표적-결합 분자-약물 접합체.
  42. 제41항에 있어서, 항체가 HER-2에 결합하는 항체인, 표적-결합 분자-약물 접합체.
  43. 제42항에 있어서, 항체가 트라스투주맙 또는 이의 유도체인, 표적-결합 분자-약물 접합체.
  44. 제24항 내지 제35항 또는 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 표적-결합 분자-약물 접합체, 및 적어도 하나의 다른 약제학적으로 허용되는 성분을 포함하는 약제학적 조성물.
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