KR20200104329A - Ror1-특이적 항원 결합 분자 - Google Patents

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cancer
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에스텔 그레이스 맥클린
폴 리차드 트럼퍼
제니퍼 톰
티모시 해리슨
그레이엄 존 코튼
캐롤라인 바렐
앤드류 포터
마리나 코바레바
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Abstract

본 발명은 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1(ROR1) 특이적 항원 결합 분자 및 관련된 융합 단백질 및 접합체에 관한 것이다. 추가의 양상에서, 본 발명은 접합된 면역글로불린-유사 상어 가변 신규 항원 수용체(variable novel antigen receptors, VNAR)에 관한 것이다.

Description

ROR1-특이적 항원 결합 분자
본 발명은 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1(ROR1) 특이적 항원 결합 분자 및 관련 융합 단백질 및 접합체에 관한 것이다. 추가의 양상에서, 본 발명은 접합된 면역글로불린-유사 상어 가변 신규 항원 수용체(VNAR)에 관한 것이다.
수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1)은 937개의 아미노산 글리코실화된 유형 I 단일 통로 막관통(transmembrane) 단백질이다. 세포외 영역은 N 말단 면역글로불린 도메인 (Ig) 이후, 시스테인 다존재 피즐 (fizzle) 도메인 (fz)이 이어지며, 이는 막 근위 크링글 (kringle) 도메인 (kr)에 연결된 3개의 별개의 도메인으로 구성된다. 단백질의 세포내 영역은 유사 키나제 도메인 이후, 프롤린-다존재 영역에 의해 분리된 2개의 Ser/Thr 다존재 도메인을 포함하고, 이와 동일한 전체 도메인 구조는 밀접하게 관련된 패밀리 구성원 ROR2에서 유지되며, 이는 높은 서열 동일성(sequence identity)을 공유한다. (문헌[Rebagay G et al, Frontiers Oncology, 2012, 2, Borcherding N et al Protein Cell, 2014, 5, 496-502]).
ROR1은 배아 발달 동안 발현되며, 이는 발달의 후기 단계에서 신경능 세포 및 괴사 및 지간 영역에서 현저하게 발현된다. 그러나, 그 발현은 출생 후 빠르게 침묵화되고, 정상적인 성인 조직에는 거의 존재하지 않는다 (문헌[Fukada PNAS, 2012, Baskar et al Clin. Cancer Res., 2008, 14, 396, Broome HE et al, Leuk. Res., 2011)., 35, 1390; Balakrishnan A et al., Clin. Cancer. Res. 2017, 23, 3061-3071]).
ROR1 발현은 폐암, 유방암, 췌장암, 난소암, 결장암, 두경부암 및 전립선암, 흑색종 및 신장 세포 암종 (문헌[Zhang S et al Am J. Pathol., 2012, 181, 1903-1910]), 유방암 (문헌[Zhang S et al PLoS One 2012, 7, e31127; Oxford Biotherapeutics patent application WO2011054007]) 및 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 및 급성 림프아구 백혈병 AML (문헌[Fukuda T et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2008, 105, 3047-3052; Baskar S et al, Clin Cancer Res., 2008, 14, 396-404; Daneshmanesh AH et al, Int J Cancer. 2008, 123, 1190-1195; Dave H et al, PLOS ONE, 2012, 7, e52655])을 포함한 광범위한 고형 종양 및 혈액 악성 종양에 걸쳐 mRNA 및 단백질 수준 둘 모두에서 관찰되었다.
또한, 증가된 ROR1 발현은 유방암 (문헌[Chien HP et al, Virchows Arch., 2016, 468, 589-595; Zhang]), 난소암 (문헌[Zhang H et al, Sci Rep., 2014, 4:5811. doi: 10.1038/srep05811]), 결장직장암 (문헌[Zhou JK et al, Oncotarget, 2017, 8, 32864-32872]), 폐 선암종 (문헌[Zheng YZ et al, Sci Rep., 2016, 6, 36447]) 및 CLL (문헌[Cui B et al, Blood, 2016, 128, 2931-2940])을 포함하는 다수의 암 적응증에 대한 불량한 임상 결과와 상관관계가 있는 것으로 보고되어 있다.
ROR1의 발현 패턴 및 불량한 임상적 예후와 일치하게, 종양 발생 및 질병 진행에서 ROR1의 기능적 역할은 다수의 상이한 암 적응증에 대해 입증되었다. ROR1은 유방암 모델에서 상피-중간엽 전달 및 전이를 촉진하고 (문헌[Cui B et al Cancer Res, 2013, 73, 3649-3660]), 난소암 모델에서 회전 타원체 형성 및 종양 생착을 촉진한다 (문헌[Zhang S et al, Proc Natl Acad Sci), 2014, 11, 17266-17271]). ROR1은 폐 선암종에서 NKX2-1/TTF-1 계통 생존 인자 종양 유전자의 전사체 표적이며, EGFR 신호전달을 유지하고, 프로아폽토시스 (pro-apoptosis) 신호전달을 억제한다 (문헌[Yamaguchi T et al, Cancer Cell, 2012, 21, 348-361; Ida L et al, Cancer Science, 2016, 107, 155-161]). ROR1은 또한 EGFR 티로신 키나제 억제제에 대한 내성을 부여하는 카베올레 (caveolae) 구조 및 우회 신호전달 메커니즘을 유지하기 위한 스캐폴드로서 작용하는 것으로 나타났다 (문헌[Yamaguchi T et al, Nat Commun., 2016, 7, 10060]). ROR1-HER3 복합체를 통한 신호전달은 Hippo-YAP 경로를 조절하고, 유방암 골 전이를 촉진하고 (문헌[Li C et al, Nature Cell Biol., 19, 1206-119]), 이러한 단백질은 Met-유도 종양 발생을 촉진할 수 있다 (문헌[Gentile A et al, Cancer Res., 2011, 71, 3132-3140]). CLL에서, ROR1은 ROR2와 이종 올리고머화되어, Wnt5a에 반응하여 신호전달을 변환하고, 증식 및 이동을 향상시키는 것으로 보고되었다 (문헌[Yu J et al, J. Clin. Invest., 2016, 2, 585-598]).
암 병리에서 ROR1의 기능적 역할 및 정상적인 성인 조직에서의 발현의 일반적 부재를 고려하면, 이러한 태아종양 단백질은 암 요법을 위한 매력적인 표적이다. ROR1에 대한 항체는 문헌 WO2021097313 (4A5 kipps), WO2014031174 (UC961), WO2016187220 (Five Prime) WO2010124188 (2A2), WO2012075158 (R11,R12), WO2011054007(Oxford Bio), WO2011079902 (Bioinvent) WO2017127664, WO2017127664 (NBE Therapeutics, SCRIPPS), WO2016094847 (Emergent), WO2017127499)에 기재되어 있으며, 인간화된 쥣과동물(murine) 항-ROR1 항체, UC961은 재발성 또는 불응성 만성 림프구성 백혈병에 대한 임상 시험에 들어갔다. ROR1을 표적화하는 키메라 항원 수용체 T 세포가 또한 보고되었고 (문헌[Hudecek M et al, Clin. Cancer Res., 2013, 19, 3153-64]), UC961 및 CAR-T 세포 표적화 ROR1에 의한 전임상 영장류 연구에서는 명백한 독성이 나타나지 않았으며, 이는 성인 조직에서 이러한 단백질의 일반적인 발현의 부재와 일치한다 (문헌[Choi M et al, Clinical Lymphoma, myeloma & leukemia, 2015, S167; Berger C et al, Cancer Immunol. Res., 2015, 3, 206]).
단일 도메인 결합 분자는 별개의 종으로부터의 단백질 어레이로부터 유래될 수 있다. 면역글로불린 동위원소 신규 항원 수용체 (IgNAR)는 원래 수염 상어 (깅글리모스토마 시라툼 (Ginglymostoma cirratum)) 및 다른 상어 및 가오리 종의 혈청에서 발견된 동종이량체 중쇄 복합체이다. IgNAR은 경쇄를 포함하지 않으며, 통상적인 면역글로불린 구조와 상이하다. 각 분자는 단일 가변 도메인 (VNAR) 및 5개의 불변 도메인 (CNAR)으로 구성된다. 문헌에서의 명명법에 따르면 IgNAR은 면역글로불린 동위원소 신규 항원 수용체 또는 면역글로불린 동위원소 새로운 항원 수용체로서 지칭되며, 상기 용어는 동의어이다.
I, II 및 III으로 공지된 상어 IgNAR의 3개의 소정의 주요 유형이 있다 (문헌[Kovalena et al, Exp Opin Biol Ther 2014 14 (10) 1527-1539]). 이는 강한 선택 압력 하에 있으므로, 거의 대체되지 않는 비정규 시스테인 잔기의 위치를 기반으로 하여 분류되었다.
3개 유형 모두는 위치 35 및 107에서 기존의 면역글로불린 정규 시스테인을 가지며, 이는 위치 36에서 비변이체 트립토판과 함께 표준 면역글로불린 접힘을 안정화시킨다. 이와 같은 CDR2는 규정되어 있지 않지만, TCR HV2 및 HV4와 더욱 밀접한 것으로 비교되는 서열 변이 영역이 각각 프레임워크(framework) 2 및 3에 규정되어 있다. 유형 I은 프레임워크 2 및 프레임워크 4에 생식계열 인코딩된 시스테인 잔기 및 CDR3 내에 짝수의 추가 시스테인을 갖는다. 리소자임에 대해 단리되고 그와의 복합체 내의 유형 I IgNAR의 결정 구조 연구에 의해 이들 시스테인 잔기의 관여를 결정할 수 있었다. 프레임워크 2 및 4 시스테인은 둘 모두 CDR3의 시스테인과 이황화 가교를 형성하여, CDR3 루프가 HV2 영역 하류에 밀접하게 유지되는 밀접하게 밀집된 구조를 형성한다. 현재까지 유형 I IgNAR은 수염 상어에서만 확인되었으며 - 동일한 목의 구성원을 포함하여 다른 판새류 모두는 단지 유형 II 또는 이 유형의 변이체를 갖는다.
유형 II IgNAR은 CDR1 및 CDR3에 시스테인 잔기를 갖는 것으로 규정되며, 이는 이들 두 영역을 근접하게 유지하는 분자내 이황화 결합을 형성하여 포켓 (pocket) 또는 그루브 (groove)를 결합시킬 수 있는 돌출 CDR3을 생성한다. 유형 I 서열은 통상적으로 유형 II보다 더 긴 CDR3을 가지며, 각각 평균 21 및 15개의 잔기를 갖는다. 이는 유형 I CDR3 내의 2개 이상의 시스테인 잔기가 그의 프레임워크 2 및 4 대응체와 결합하는 강한 선택 압력 때문인 것으로 여겨진다. 체세포 돌연변이의 축적에 대한 연구는 유형 II의 CDR1에 유형 I보다 더 많은 수의 돌연변이가 있으며, 유형 I의 HV2 영역은 유형 II보다 더 큰 서열 변이를 나타냄을 보여준다. 이 증거는 항원 결합 부위 내에서 이들 영역의 소정의 위치와 적절하게 관련된다. 유형 III으로 공지된 제3 IgNAR 유형은 신생아에서 확인되었다. IgNAR 패밀리의 이 구성원은 V 유전자와 D1 및 D2 영역 (CDR3 형성)의 생식계열 융합으로 인해 CDR3 내에 다양성이 결여되어 있다. 거의 모든 공지된 클론은 15개의 잔기의 CDR3 길이를 가지며, 서열 다양성이 거의 없거나 전혀 없다.
유형 (IIb 또는 IV)로 지칭되는 또 다른 구조적 유형의 VNAR은 (프레임워크 1 및 프레임워크 3b 영역에서) 단지 2개의 정규 시스테인 잔기를 갖는다. 지금까지 이 유형은 주로 돔발상어에서 발견되었으며 (문헌[Liu, J.L., et al. Mol. Immunol. 2007. 44(7): p. 1775-1783; Kovalenko O.V., et al. J Biol Chem. 2013. 288(24): p. 17408-19), 또한 워베공 상어 (wobbegong shark)로부터 유래된 반합성 V-NAR 라이브러리로부터 단리되었다 (문헌[Streltsov, V.A. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(34): p. 12444-12449]).
본 발명은 일반적으로 특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다. 제1 양상에서, 화학식 (I)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1) 특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4 (I)
여기서,
FW1은 프레임워크 영역이고,
CDR1은 CDR 서열이고,
FW2는 프레임워크 영역이고,
HV2는 초가변 서열이고,
FW3a는 프레임워크 영역이고,
HV4는 초가변 서열이고,
FW3b는 프레임워크 영역이고,
CDR3은 CDR 서열이고,
FW4는 프레임워크 영역이다.
프레임워크 영역 FW1은 바람직하게는 20 내지 28개의 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 22 내지 26개의 아미노산 길이, 여전히 더욱 바람직하게는 23 내지 25개의 아미노산 길이이다. 특정의 바람직한 실시형태에서, FW1은 26개의 아미노산 길이이다. 다른 바람직한 실시형태에서, FW1은 25개의 아미노산 길이이다. 여전히 다른 바람직한 실시형태에서, FW1은 24개의 아미노산 길이이다.
CDR 영역 CDR1은 바람직하게는 7 내지 11개의 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 8 내지 10개의 아미노산 길이이다. 특정의 바람직한 실시형태에서, CDR1은 9개의 아미노산 길이이다. 다른 바람직한 실시형태에서, CDR1은 8개의 아미노산 길이이다.
프레임워크 영역 FW2는 바람직하게는 6 내지 14개의 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 8 내지 12개의 아미노산 길이이다. 특정의 바람직한 실시형태에서, FW2는 12개의 아미노산 길이이다. 다른 바람직한 실시형태에서, FW2는 10개의 아미노산 길이이다. 다른 바람직한 실시형태에서, FW2는 9개의 아미노산 길이이다. 다른 바람직한 실시형태에서, FW2는 8개의 아미노산 길이이다.
초가변 서열 HV2는 바람직하게는 4 내지 11개의 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 5 내지 10개의 아미노산 길이이다. 특정의 바람직한 실시형태에서, HV2는 10개의 아미노산 길이이다. 특정의 바람직한 실시형태에서, HV2는 9개의 아미노산 길이이다. 다른 바람직한 실시형태에서, HV2는 6개의 아미노산 길이이다.
프레임워크 영역 FW3a는 바람직하게는 6 내지 10개의 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 7 내지 9개의 아미노산 길이이다. 특정의 바람직한 실시형태에서, FW3a는 8개의 아미노산 길이이다. 특정의 바람직한 실시형태에서, FW3a는 7개의 아미노산 길이이다.
초가변 서열 HV4는 바람직하게는 3 내지 7개의 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 4 내지 6개의 아미노산 길이이다. 특정의 바람직한 실시형태에서, HV4는 5개의 아미노산 길이이다. 다른 바람직한 실시형태에서, HV4는 4개의 아미노산 길이이다.
프레임워크 영역 FW3b는 바람직하게는 17 내지 24개의 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 18 내지 23개의 아미노산 길이, 여전히 더욱 바람직하게는 19 내지 22개의 아미노산 길이이다. 특정의 바람직한 실시형태에서, FW3b는 21개의 아미노산 길이이다. 다른 바람직한 실시형태에서, FW3b는 20개의 아미노산 길이이다.
CDR 영역 CDR3은 바람직하게는 8 내지 21개의 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 9 내지 20개의 아미노산 길이, 여전히 더욱 바람직하게는 10 내지 19개의 아미노산 길이이다. 특정의 바람직한 실시형태에서, CDR3은 17개의 아미노산 길이이다. 다른 바람직한 실시형태에서, CDR3은 14개의 아미노산 길이이다. 여전히 다른 바람직한 실시형태에서, CDR3은 12개의 아미노산 길이이다. 여전히 다른 바람직한 실시형태에서, CDR3은 10개의 아미노산 길이이다.
프레임워크 영역 FW4는 바람직하게는 7 내지 14개의 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 8 내지 13개의 아미노산 길이, 여전히 더욱 바람직하게는 9 내지 12개의 아미노산 길이이다. 특정의 바람직한 실시형태에서, FW4는 12개의 아미노산 길이이다. 다른 바람직한 실시형태에서, FW4는 11개의 아미노산 길이이다. 여전히 다른 바람직한 실시형태에서, FW4는 10개의 아미노산 길이이다. 여전히 다른 바람직한 실시형태에서, FW4는 9개의 아미노산 길이이다.
바람직하게는, ROR1-특이적 항원 결합 분자는 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 2 (ROR2)에 결합하지 않는다. 더욱 바람직하게는, ROR1-특이적 항원 결합 분자는 인간 ROR1 및 쥣과동물 ROR1 (mROR1) 둘 모두에 결합한다. 여전히 더욱 바람직하게는, ROR1-특이적 항원 결합 분자는 탈글리코실화된 ROR1에 결합한다.
본 발명의 특정 ROR1-특이적 항원 결합 분자는
YMESLHMQGEIENQI (서열번호 34)
CQPWNSQYPHTHTFTALRFP (서열번호 35)
RSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQ (서열번호 36)
QCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEYE (서열번호 37)
로부터 선택되는 선형 펩타이드 서열에 결합하지 않는다.
ROR1-특이적 항원 결합 분자 또는 그에 대해 적어도 45%의 서열 동일성을 갖는 기능성 변이체의 바람직한 실시형태에서:
FW1은 20 내지 28개 아미노산의 프레임워크 영역이고,
CDR1은 DTSYGLYS (서열번호 1), GAKYGLAA (서열번호 2), GAKYGLFA (서열번호 3), GANYGLAA (서열번호 4), 또는 GANYGLAS (서열번호 5)로부터 선택되는 CDR 서열이고,
FW2는 6 내지 14개 아미노산의 프레임워크 영역이고,
HV2는 TTDWERMSIG (서열번호 6), SSNQERISIS (서열번호 7), 또는 SSNKEQISIS (서열번호 8)로부터 선택되는 초가변 서열이고,
FW3a는 6 내지 10개 아미노산의 프레임워크 영역이고,
HV4는 NKRAK (서열번호 9), NKRTM (서열번호 10), NKGAK (서열번호 11), 또는 NKGTK (서열번호 12)로부터 선택되는 초가변 영역이고,
FW3b는 17 내지 24개 아미노산의 프레임워크 영역이고,
CDR3은 QSGMAISTGSGHGYNWY (서열번호 13), QSGMAIDIGSGHGYNWY (서열번호 14), YPWAMWGQWY (서열번호 15), VFMPQHWHPAAHWY (서열번호 16), REARHPWLRQWY (서열번호 17), 또는 YPWGAGAPWLVQWY (서열번호 18)로부터 선택되는 CDR 서열이고,
FW4는 7 내지 14개 아미노산의 프레임워크 영역이다.
ROR1-특이적 항원 결합 분자 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 갖는 그의 기능성 변이체의 다른 바람직한 실시형태에서, FW1은 ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLT (서열번호 19), AKVDQTPRTATKETGESLTINCVLT (서열번호 20), TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVT (서열번호 21), TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLT (서열번호 22), ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVT (서열번호 23), 또는 TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLT (서열번호 24)로부터 선택되고, FW2는 TSWFRKNPG (서열번호 25), 또는 TYWYRKNPG (서열번호 26)로부터 선택되고, FW3a는 GRYVESV (서열번호 27), 또는 GRYSESV (서열번호 28)로부터 선택되고, FW3b는 SFSLRIKDLTVADSATYYCKA (서열번호 29), SFTLTISSLQPEDSATYYCRA (서열번호 30), 또는 SFTLTISSLQPEDFATYYCKA (서열번호 31)로부터 선택되고, FW4는 DGAGTVLTVN (서열번호 32), 또는 DGAGTKVEIK (서열번호 33)로부터 선택된다.
상기 열거된 프레임워크 영역, 상보성 결정 영역 및 초가변 영역의 모든 가능한 조합 및 순열이 본 명세서에서 명시적으로 고려된다.
본 발명의 분자와 관련하여 언급된 서열 동일성은 개별 CDR, HV 또는 FW의 수준에서 판단될 수 있거나, 전체 분자의 길이에 걸쳐 판단될 수 있다. 기재된 CDR, HV 및 FW 서열은 또한 이것이 서열의 N 또는 C 말단에서 아미노산의 첨가 또는 결실에 의한 것이든, 또는 서열에 의한 아미노산의 삽입 또는 결실에 의한 것이든 더 길거나 더 짧을 수 있다.
ROR1-특이적 항원 결합 분자 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 갖는 그의 기능성 변이체의 바람직한 실시형태에서, FW1은 ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLT (서열번호 19); CDR1은 DTSYGLYS (서열번호 1)이고; FW2는 TSWFRKNPG (서열번호 25)이고; HV2는 TTDWERMSIG (서열번호 6)이고; FW3a는 GRYVESV (서열번호 27)이고; HV4는 NKRAK (서열번호 9)이고; FW3b는 SFSLRIKDLTVADSATYYCKA (서열번호 29)이고; CDR3은 QSGMAISTGSGHGYNWY (서열번호 13)이고; FW4는 DGAGTVLTVN (서열번호 32)이다.
ROR1-특이적 항원 결합 분자 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 갖는 그의 기능성 변이체의 또 다른 바람직한 실시형태에서, FW1은 AKVDQTPRTATKETGESLTINCVLT (서열번호 20)이고; CDR1은 DTSYGLYS (서열번호 1)이고; FW2는 TSWFRKNPG (서열번호 25)이고; HV2는 TTDWERMSIG (서열번호 6)이고; FW3a는 GRYVESV (서열번호 27)이고; HV4는 NKRAK (서열번호 9)이고; FW3b는 SFSLRIKDLTVADSATYYCKA (서열번호 29)이고; CDR3은 QSGMAIDIGSGHGYNWY (서열번호 14)이고; FW4는 DGAGTVLTVN (서열번호 32)이다.
ROR1-특이적 항원 결합 분자 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 갖는 그의 기능성 변이체의 또 다른 바람직한 실시형태에서, FW1은 TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVT (서열번호 21)이고; CDR1은 GAKYGLAA (서열번호 2)이고; FW2는 TYWYRKNPG (서열번호 26)이고; HV2는 SSNQERISIS (서열번호 7)이고; FW3a는 GRYVESV (서열번호 27)이고; HV4는 NKRTM (서열번호 10)이고; FW3b는 SFSLRIKDLTVADSATYYCKA (서열번호 29)이고; CDR3은 YPWAMWGQWY (서열번호 15)이고; FW4는 DGAGTVLTVN (서열번호 32)이다.
ROR1-특이적 항원 결합 분자 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 갖는 그의 기능성 변이체의 또 다른 바람직한 실시형태에서, FW1은 TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVT (서열번호 21)이고; CDR1은 GAKYGLFA (서열번호 3)이고; FW2는 TYWYRKNPG (서열번호 26)이고; HV2는 SSNQERISIS (서열번호 7)이고; FW3a는 GRYVESV (서열번호 27)이고; HV4는 NKRTM (서열번호 10)이고; FW3b는 SFSLRIKDLTVADSATYYCKA (서열번호 29)이고; CDR3은 VFMPQHWHPAAHWY (서열번호 16)이고; FW4는 DGAGTVLTVN (서열번호 32)이다.
ROR1-특이적 항원 결합 분자 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 갖는 그의 기능성 변이체의 또 다른 바람직한 실시형태에서, FW1은 TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLT (서열번호 22)이고; CDR1은 DTSYGLYS (서열번호 1)이고; FW2는 TSWFRKNPG (서열번호 25)이고; HV2는 TTDWERMSIG (서열번호 6)이고; FW3a는 GRYVESV (서열번호 27)이고; HV4는 NKGAK (서열번호 11)이고; FW3b는 SFSLRIKDLTVADSATYYCKA (서열번호 29)이고; CDR3은 REARHPWLRQWY (서열번호 17)이고; FW4는 DGAGTVLTVN (서열번호 32)이다.
ROR1-특이적 항원 결합 분자 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 갖는 그의 기능성 변이체의 또 다른 바람직한 실시형태에서, FW1은 ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVT (서열번호 23)이고; CDR1은 GANYGLAA (서열번호 4)이고; FW2는 TYWYRKNPG (서열번호 26)이고; HV2는 SSNQERISIS (서열번호 7)이고; FW3a는 GRYVESV (서열번호 27)이고; HV4는 NKRTM (서열번호 10)이고; FW3b는 SFSLRIKDLTVADSATYYCKA (서열번호 29)이고; CDR3은 YPWGAGAPWLVQWY (서열번호 18)이고; FW4는 DGAGTVLTVN (서열번호 32)이다.
ROR1-특이적 항원 결합 분자 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 갖는 그의 기능성 변이체의 또 다른 바람직한 실시형태에서, FW1은 TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLT (서열번호 24)이고; CDR1은 GANYGLAS (서열번호 5)이고; FW2는 TYWYRKNPG (서열번호 26)이고; HV2는 SSNKEQISIS (서열번호 8)이고; FW3a는 GRYSESV (서열번호 28)이고; HV4는 NKGTK (서열번호 12)이고; FW3b는 SFTLTISSLQPEDSATYYCRA (서열번호 30)이고; CDR3은 YPWGAGAPWLVQWY (서열번호 18)이고; FW4는 DGAGTKVEIK (서열번호 33)이다.
ROR1-특이적 항원 결합 분자 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 갖는 그의 기능성 변이체의 또 다른 바람직한 실시형태에서, FW1은 TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLT (서열번호 24)이고; CDR1은 GANYGLAS (서열번호 5)이고; FW2는 TYWYRKNPG (서열번호 26)이고; HV2는 SSNQERISIS (서열번호 7)이고; FW3a는 GRYSESV (서열번호 28)이고; HV4는 NKRTM (서열번호 10)이고; FW3b는 SFTLTISSLQPEDSATYYCRA (서열번호 30)이고; CDR3은 YPWGAGAPWLVQWY (서열번호 18)이고; FW4는 DGAGTKVEIK (서열번호 33)이다.
ROR1-특이적 항원 결합 분자 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 갖는 그의 기능성 변이체의 또 다른 바람직한 실시형태에서, FW1은 TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLT (서열번호 24)이고; CDR1은 DTSYGLYS (서열번호 1)이고; FW2는 TSWFRKNPG (서열번호 25)이고; HV2는 TTDWERMSIG (서열번호 6)이고; FW3a는 GRYVESV (서열번호 27)이고; HV4는 NKGAK (서열번호 11)이고; FW3b는 SFTLTISSLQPEDFATYYCKA (서열번호 31)이고; CDR3은 REARHPWLRQWY (서열번호 17)이고; FW4는 DGAGTKVEIK (서열번호 33)이다.
ROR1-특이적 항원 결합 분자 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 갖는 그의 기능성 변이체의 또 다른 바람직한 실시형태에서, FW1은 TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLT (서열번호 24)이고; CDR1은 DTSYGLYS (서열번호 1)이고; FW2는 TYWYRKNPG (서열번호 26)이고; HV2는 SSNKEQISIS (서열번호 8)이고; FW3a는 GRYSESV (서열번호 28)이고; HV4는 NKGTK (서열번호 12)이고; FW3b는 SFTLTISSLQPEDSATYYCRA (서열번호 30)이고; CDR3은 REARHPWLRQWY (서열번호 17)이고; FW4는 DGAGTKVEIK (서열번호 33)이다.
ROR1-특이적 항원 결합 분자 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 갖는 그의 기능성 변이체의 또 다른 바람직한 실시형태에서, FW1은 TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLT (서열번호 24)이고; CDR1은 DTSYGLYS (서열번호 1)이고; FW2는 TYWYRKNPG (서열번호 26)이고; HV2는 TTDWERMSIG (서열번호 6)이고; FW3a는 GRYSESV (서열번호 28)이고; HV4는 NKGAK (서열번호 11)이고; FW3b는 SFTLTISSLQPEDSATYYCRA (서열번호 30)이고; CDR3은 REARHPWLRQWY (서열번호 17)이고; FW4는 DGAGTKVEIK (서열번호 33)이다.
추가의 바람직한 실시형태에서, ROR1-특이적 항원 결합 분자 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 갖는 그의 기능성 변이체는
ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKRAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTVLTVN (서열번호 39);
AKVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKRAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAIDIGSGHGYNWYDGAGTVLTVN (서열번호 40);
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVTGAKYGLAATYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKAYPWAMWGQWYDGAGTVLTVN (서열번호 41);
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVTGAKYGLFATYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKAVFMPQHWHPAAHWYDGAGTVLTVN (서열번호 42);
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTVLTVN (서열번호 43);
ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVTGANYGLAATYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTVLTVN (서열번호 44);
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTGANYGLASTYWYRKNPGSSNKEQISISGRYSESVNKGTKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKVEIK (서열번호 45);
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTGANYGLASTYWYRKNPGSSNQERISISGRYSESVNKRTMSFTLTISSLQPEDSATYYCRAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKVEIK (서열번호 46);
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTKVEIK (서열번호 47);
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTYWYRKNPGSSNKEQISISGRYSESVNKGTKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAREARHPWLRQWYDGAGTKVEIK (서열번호 48);
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTYWYRKNPGTTDWERMSIGGRYSESVNKGAKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAREARHPWLRQWYDGAGTKVEIK (서열번호 49)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 ROR1-특이적 항원 결합 분자는 인간화될 수 있다. 본 발명의 ROR1-특이적 항원 결합 분자는 탈면역화(de-immunize)될 수 있다. 본 발명의 인간화된 서열의 예는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:
B1 G1 TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTGANYGLASTYWYRKNPGSSNKEQISISGRYSESVNKGTKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKVEIK (서열번호 45);
B1 G2 TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTGANYGLASTYWYRKNPGSSNQERISISGRYSESVNKRTMSFTLTISSLQPEDSATYYCRAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKVEIK (서열번호 46);
P3A1 V1 TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTKVEIK (서열번호 47);
P3A1 G1 TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTYWYRKNPGSSNKEQISISGRYSESVNKGTKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAREARHPWLRQWYDGAGTKVEIK (서열번호 48);
P3A1 G2 TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTYWYRKNPGTTDWERMSIGGRYSESVNKGAKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAREARHPWLRQWYDGAGTKVEIK (서열번호 49);
D3 인간화된 ADV1
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYSESVNKGAKSFTLTISSLQPEDSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (서열번호 50);
D3 인간화된 ADV2
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYSESVNKGAKSFTLTISSLQPEDSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (서열번호 51);
D3 인간화된 ADV3
ASVNQSPSSASASVGDRLTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYSESVNKGAKSFTLTISSLQPEDSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKLEVK (서열번호 52);
B1 인간화된 V5
ASVDQSPSSLSASVGDRVTITCVVTGANYGLAATYWYRKNPGSSNQERISISGRYSESVNKRTMSFTLTISSLQPEDSATYYCKAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKVEIK (서열번호 53);
B1 인간화된 V7
ASVDQSPSSASASVGDRLTITCVVTGANYGLAATYWYRKNPGSSNQERISISGRYSESVNKRTMSFTLTISSLQPEDSATYYCKAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKLEVK (서열번호 54);
D3 인간화된 EL V1
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKRAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (서열번호 55);
D3 인간화된 EL V2
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKRAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (서열번호 56);
D3 인간화된 EL V3
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRFSGSGSKRAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (서열번호 57);
D3 인간화된 EL V4
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWYQQKPGTTDWERMSIGGRYVESVNKRAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (서열번호 58); 및
D3 인간화된 EL V5
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWYQQKPGTTDWERMSIGGRFSGSGSKRAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (서열번호 59).
본 발명의 ROR1-특이적 항원 결합 분자는 또한 검출 가능한 표지, 염료, 독소, 약물, 전구약물, 방사성핵종 또는 생물학적 활성 분자에 접합될 수 있다.
바람직하게는, ROR1-특이적 항원 결합 분자는 대략 0.01 내지 50 nM, 바람직하게는 0.1 내지 30 nM, 훨씬 더욱 바람직하게는 0.1 내지 10 nM의 친화도 상수를 갖는 ROR1 단백질과 선택적으로 상호작용한다.
추가로, ROR1-이중특이적 항원 결합 분자는 바람직하게는 ROR1-발현 종양 세포의 사멸을 매개할 수 있거나, 암 세포 증식을 억제할 수 있다.
ROR1-특이적 항원 결합 분자는 또한 ROR1과의 결합시에 세포 내 이입(endocytosis)될 수 있다. 다른 실시형태에서, ROR1-특이적 항원 결합 분자는 ROR1과 결합시 세포 내 이입되지 않을 수 있다.
본 발명의 제2 양상에서, 제1 양상의 특이적 항원 결합 분자를 포함하는 재조합 융합 단백질이 제공된다. 바람직하게는, 제2 양상의 재조합 융합 단백질에서, 특이적 항원 결합 분자는 하나 이상의 생물학적 활성 단백질에 융합된다. 특이적 항원 결합 분자는 하나 이상의 링커 도메인을 통해 하나 이상의 생물학적 활성 단백질에 융합될 수 있다. 바람직한 링커는 다음에 제한되는 것은 아니나 [G4S]x를 포함하며, x는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 특히 바람직한 링커는 [G4S]3 (서열번호 60) 및 [G4S]5 (서열번호 61)이다. 다른 바람직한 링커는 서열 PGVQPSP (서열번호 62), PGVQPSPGGGGS (서열번호 63) 및 PGVQPAPGGGGS (서열번호 64)를 포함한다. 글리코실화 패턴이 상이한 다른 발현 시스템, 예컨대 CHO 및 곤충 및 발현된 단백질을 글리코실화하지 않는 시스템 (예를 들어, E. 콜라이)에서 재조합 융합 단백질이 발현되는 경우, 이들 링커는 특히 유용할 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 단백질은 임의의 순서로, 즉 N 말단, C 말단 또는 말단 이외 (예를 들어, 더 긴 아미노산 서열의 중간)에서 ROR1-특이적 항원 결합 분자로 작제될 수 있음이 이해될 것이다.
바람직한 생물학적 활성 단백질 다음에 제한되는 것은 아니나 면역글로불린, 면역글로불린 Fc 영역, 면역글로불린 Fab 영역, 단일 사슬 Fv (scFv), 디아바디 (diabody), 트리아바디, 테트라바디, 이중특이적 T 세포 관여인자 (bispecific T-cell engager, BiTE), 인테인, VNAR 도메인, 단일 도메인 항체 (sdAb), VH 도메인, 또는 스캐폴드 단백질 (아피바디, 센티린, 다르핀 등)을 포함한다. 특히 바람직한 생물학적 활성 단백질은 면역글로불린 Fc 영역이다. 다른 바람직한 융합 단백질은 VNAR-VNAR 및 VNAR-VNAR-VNAR을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질의 임의의 부분은 접합이 가능하도록 조작될 수 있다. 바람직한 예에서, 면역글로불린 Fc 영역이 사용되는 경우, 접합 부위로 시스테인 잔기가 포함되도록 조작될 수 있다. 바람직한 도입 시스테인 잔기는 다음에 제한되는 것은 아니나 S252C 및 S473C (카밧 넘버링 (Kabat numbering))를 포함하며, 이는 EU 넘버링에서 각각 S239C 및 S442C에 해당한다.
제2 양상에 따르면, 다수의 VNAR 도메인을 포함하는 재조합 융합이 제공된다. 따라서, 본 발명의 재조합 융합은 VNAR의 이량체, 삼량체 또는 고차 다량체일 수 있다. 이러한 재조합 융합에서, 각각의 VNAR의 특이성은 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명의 재조합 융합은 다음에 제한되는 것은 아니나, 각각의 VNAR 도메인이 상이한 항원 또는 단일 항원 상의 상이한 에피토프 (이중-파라토프 결합제)에 결합하는 이중특이적 또는 삼중 특이적 분자를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "이중-파라토프"는 소정의 항원 상의 다수의 에피토프에 결합하는 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 소정의 항원 상의 3개 이상의 에피토프에 결합하는 분자가 또한 본 명세서에서 고려되고, 용어 "이중-파라토프"가 사용되는 경우, 삼중-파라토프 또는 다중-파라토프 분자에 대한 가능성이 또한 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
또한 제2 양상에 따르면, 제1 양상의 ROR1-특이적 항원 결합 분자 및 인간화된 VNAR 도메인을 포함하는 재조합 융합이 제공된다. 인간화된 VNAR 도메인은 soloMER로 지칭될 수 있으며, 다음에 제한되는 것은 아니나, 인간 혈청 알부민에 고 친화도로 결합하는 인간화된 VNAR인 VNAR BA11을 포함한다 (문헌[Kovalenko et al., J.Biol. Chem., 2013 JBC]).
이중-파라토프 및 다가 융합 단백질의 예는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다:
Figure pct00001
Figure pct00002
여기서:
B1은
ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVTGANYGLAATYWYRKNPGSSNQERISISGRWESVNKRTMSFSL RIKDLTVADSATYYCKAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTVLTVN (서열번호 44)이고,
2V는
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFS LRIKDLTVADSATYYCKAQSLAISTRSYWYDGAGTVLTVN (서열번호 65)이고.
P3A1은
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFS LRIKDLTVADSATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTVLTVN (서열번호 43)이고,
D3은
ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKRAKSFS LRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTVLTVN (서열번호 39)이고,
BA11은
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYPLYSTYWYRKNPGSSNKEQISISGRYSESVNKGTKSFTL TISSLQPEDSATYYCRAMSTNIWTGDGAGTKVEIK (서열번호 66)이고,
E9는
AKVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKRAKSFS LRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAIDIGSGHGYNWYDGAGTVLTVN (서열번호 40)이고,
B1G2는
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTGANYGLASTYWYRKNPGSSNQERISISGRYSESVNKRTMSFTL TISSLQPEDSATYYCRAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKVEIK (서열번호 46)이고,
B1G1은
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTGANYGLASTYWYRKNPGSSNKEQISISGRYSESVNKGTKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKVEIK (서열번호 45)이고,
링커가 정의되지 않은 경우, (-)는 -(G4S)5-의 링커에 상응하고,
-(L2)-는 -(G4S)3-의 링커에 상응하고,
-(L3)-는 -(G4S)7-의 링커에 상응하고,
-(L4)-는 링커 우베-G4S에 상응하고, 이는 또한 PGVQPSPGGGGS (서열번호 63)이고,
-(L5)-는 링커 우베-G4S-GM에 상응하고, 이는 또한 PGVQPAPGGGGS (서열번호 64)이고,
Cys-는 C-말단 태그를 함유하는 Cys, 예를 들어, QACGAHHHHHGAGAFEFEKKLISEEDL (서열번호 67)에 상응한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 특이적 결합 분자 또는 재조합 융합은 정제를 보조하기 위해 N 또는 C 말단 태그를 갖는 것으로 발현될 수 있다. 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, His6 및/또는 Myc를 포함한다. 또한, N 또는 C 말단 태그는 추가의 시스테인 잔기를 포함하여 접합 지점으로서 기능하도록 추가로 조작될 수 있다. 따라서, 본 발명의 모든 양상에서 특이적 결합 분자 또는 재조합 융합에 대한 언급은 또한 다양한 N 또는 C 말단 태그를 갖는 이러한 분자를 포함하는 것으로 의도되며, 또한 이러한 태그는 접합을 위한 추가 시스테인을 포함할 수 있다.
추가의 재조합 융합체가 아래에 나열된다. 링커와 VNAR 또는 융합 파트너의 모든 조합이 아래에 나열되어 있지는 않다는 것이 이해될 것이다. 그러나, 이러한 모든 조합은 본 발명에 의해 명백히 포함된다.
Figure pct00003
Figure pct00004
여기서 VNAR 도메인 사이의 링커는 제한적이지 않지만 우선적으로 (G4S)5, (G4S)3, (G4S)7, PGVQPSPGGGGS (서열번호 63)(우베-G4S), PGVQPAPGGGGS (서열번호 64)(우베-G4S GM)이고, 상이한 링커의 상이한 조합이 동일한 작제물 내에서 조합될 수 있다.
이에 의해, 추가의 C-말단 (또는 N-말단) 태그 서열이 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. C-말단 태그는 정제를 용이하게 하기 위한 폴리-히스티딘 서열(예: His6)을 함유하고 검출을 가능하게 하는 c-Myc 서열(예: EQKLISEEDL (서열번호 68))을 함유하고/하거나 티올 반응성 페이로드 및 프로브 및 이들의 조합을 사용하여 표지화 및 생체 접합을 가능하게 하는 시스테인 잔기를 함유하는 태그를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 C-말단 태그는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:
QASGAHHHHHGAEFEQKLISEEDL (서열번호 69)
QACGAHHHHHGAGAFEFEKKLISEEDL (서열번호 67)
QACKAHHHHHGAGAFEFEKKLISEEDL (서열번호 70)
AAAHHHHHGAGAFEFEKKLISEEDL (서열번호 71)
ACAHHHHHGAGAFEFEKKLISEEDL (서열번호 72)
QASGAHHHHHH (서열번호 73)
QACGAHHHHHH (서열번호 74)
QACKAHHHHHH (서열번호 75)
AAAHHHHHH (서열번호 76)
ACAHHHHHH (서열번호 77)
QASGA (서열번호 78)
QACGA (서열번호 79)
QACKA (서열번호 80)
ACA (서열번호 81)
SAPSA (서열번호 82)
여기서:
· B1은
ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVTGANYGLAATYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSL RIKDLTVADSATYYCKAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTVLTVN (서열번호 44)이고,
· 2V는
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFS LRIKDLTVADSATYYCKAQSLAISTRSYWYDGAGTVLTVN (서열번호 65)이고,
· P3A1은
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFS LRIKDLTVADSATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTVLTVN (서열번호 43)이고,
· D3은
ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKRAKSFS LRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTVLTVN (서열번호 39)이고,
· BA11은
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYPLYSTYWYRKNPGSSNKEQISISGRYSESVNKGTKSFTL TISSLQPEDSATYYCRAMSTNIWTGDGAGTKVEIK (서열번호 66)이고,
· E9는
AKVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKRAKSFS LRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAIDIGSGHGYNWYDGAGTVLTVN (서열번호 40)이다.
상기 언급된 바와 같이, VNAR 및 링커의 모든 조합은 본원에 명백히 포함된다. VNAR의 인간화 유도체도 본원에 포함된다. 또한, 제2 양상에 따라서, 제1 양상의 ROR1-특이적 항원 결합 분자 및 재조합 독소를 포함하는 재조합 융합체가 제공된다. 재조합 독소의 예는 슈도모나스 (Pseudomonas) 외독소 PE38 및 디프테리아 (diphtheria) 독소를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 제2 양상에 따라서, 제1 양상의 ROR1-특이적 항원 결합 분자 및 재조합 CD3 결합 단백질을 포함하는 재조합 융합체가 제공된다. 재조합 ROR1 및 CD3 결합제의 예는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다:
B1 CD3
ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVTGANYGLAATYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSL
RIKDLTVADSATYYCKAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTVLTVNGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKM
SCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLT
SEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEK
VTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAAT
YYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKSHHHHHH (서열번호 83)
B1 CD3 [G4S]3
ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVTGANYGLAATYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSL
RIKDLTVADSATYYCKAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTVLTVNGGGGSGGGGSGGGGSDIKLQQSGA
ELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKS
SSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQ
SPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSL
TISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKSHHHHHH (서열번호 84)
P3A1 CD3
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFS
LRIKDLTVADSATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTVLTVNGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMS
CKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTS
EDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEKV
TMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATY
YCQQWSSNPLTFGAGTKLELKSHHHHHH (서열번호 85)
P3A1 CD3 [G4S]3
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFS
LRIKDLTVADSATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTVLTVNGGGGSGGGGSGGGGSDIKLQQSGAE
LARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSS
STAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQS
PAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTI
SSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKSHHHHHH (서열번호 86)
P3A1 P3A1 CD3
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFS
LRIKDLTVADSATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTVLTVNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG
STRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSF
SLRIKDLTVADSATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTVLTVNGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKM
SCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLT
SEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEK
VTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAAT
YYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKSHHHHHH (서열번호 87)
P3A1 P3A1 CD3 [G4S]3
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFS
LRIKDLTVADSATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTVLTVNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG
STRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSF
SLRIKDLTVADSATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTVLTVNGGGGSGGGGSGGGGSDIKLQQSGA
ELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKS
SSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQ
SPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSL
TISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKSHHHHHH (서열번호 88)
P3A1-[PGVQPSPGGGGS]-B1-[G4S]-CD3
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFS
LRIKDLTVADSATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTVLTVNPGVQPSPGGGGSASVNQTPRTATKET
GESLTINCVVTGANYGLAATYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYY
CKAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTVLTVNGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYT
MHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARY
YDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVS
YMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLT
FGAGTKLELKSHHHHHH (서열번호 89)
P3A1-[PGVQPSPGGGGS]-B1-[G4S]3-CD3
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFS
LRIKDLTVADSATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTVLTVNPGVQPSPGGGGSASVNQTPRTATKET
GESLTINCVVTGANYGLAATYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYY
CKAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTVLTVNGGGGSGGGGSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMS
CKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTS
EDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEKV
TMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATY
YCQQWSSNPLTFGAGTKLELKSHHHHHH (서열번호 90)
P3A1-[PGVQPAPGGGGS]-D3-[G4S]-CD3
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFS
LRIKDLTVADSATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTVLTVNPGVQPAPGGGGSASVNQTPRTATKET
GESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWRMSIGGRYVESVNKRAKSFSLRIKDLTVADSATYY
CKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTVLTVNGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFT
RYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYC
ARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASS
SVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSN
PLTFGAGTKLELKSHHHHHH (서열번호 91)
P3A1-[PGVQPAPGGGGS]-D3-[G4S]3-CD3
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFS
LRIKDLTVADSATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTVLTVNPGVQPAPGGGGSASVNQTPRTATKET
GESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWRMSIGGRYVESVNKRAKSFSLRIKDLTVADSATYY
CKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTVLTVNGGGGSGGGGSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVK
MSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSS
LTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPG
EKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDA
ATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKSHHHHHH (서열번호 92)
P3A1-[G4S]5-D3-[G4S]-CD3
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFS
LRIKDLTVADSATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTVLTVNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG
SASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKRAKSF
SLRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTVLTVNGGGGSDIKLQQSGAELARPGA
SVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQ
LSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSAS
PGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAE
DAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKSHHHHHH (서열번호 93)
P3A1-[G4S]5-D3-[G4S]3-CD3
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFS
LRIKDLTVADSATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTVLTVNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG
SASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKRAKSF
SLRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTVLTVNGGGGSGGGGSGGGGSDIKLQ
QSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLT
TDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDI
QLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGT
SYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKSHHHHHH (서열번호 94)
본 발명의 제3 양상에서, 적어도 하나의 막관통 영역 및 적어도 하나의 세포내 도메인에 융합되거나 접합된, 본 발명의 제1 양상에 의해 규정된 바와 같은 적어도 하나의 ROR1-특이적 항원 결합 분자를 포함하는 ROR1-특이적 키메라 항원 수용체 (CAR)가 제공된다.
본 발명은 또한 제3 양상에 따른 키메라 항원 수용체를 포함하는 세포를 제공하며, 이 세포는 바람직하게는 조작된(engineered) T 세포이다.
본 발명의 제4 양상에서, 본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양상에 따른 특이적 항원 결합 분자, 재조합 융합 단백질 또는 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 제공된다.
제4 양상에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다.
제1, 제2 또는 제3 양상의 특이적 항원 결합 분자, 재조합 융합 단백질 또는 키메라 항원 수용체의 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 숙주 세포가 특이적 항원 결합 분자, 재조합 융합 단백질 또는 키메라 항원 수용체를 생성하는 조건 하에서, 상기 기재된 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양 또는 유지하는 단계를 포함하고, 선택적으로, 특이적 항원 결합 분자, 재조합 융합 단백질 또는 키메라 항원 수용체를 단리하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 제5 양상에서, 제1, 제2 또는 제3 양상의 특이적 항원 결합 분자, 융합 단백질 또는 키메라 항원 수용체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 다양한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 다음에 제한되는 것은 아니나, 정맥내, 근육내, 경구, 복강내 또는 국소 투여를 포함하여 당 업계에 공지된 임의의 적합한 방법으로 투여하기 위한 것일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 액체, 겔, 분말, 정제, 캡슐 또는 발포체의 형태로 제조될 수 있다.
제1, 제2 또는 제3 양상의 특이적 항원 결합 분자, 재조합 융합 단백질 또는 키메라 항원 수용체는 요법에 사용하기 위한 것일 수 있다. 더욱 특히, 제1, 제2 또는 제3 양상의 특이적 항원 결합 분자, 재조합 융합 단백질 또는 키메라 항원 수용체는 암의 치료에 사용하기 위한 것일 수 있다. 바람직하게는, 암은 ROR1-양성 암 유형이다. 더욱 바람직하게는, 암은 혈액암, 예컨대 림프종 및 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 맨틀 세포 림프종 (MCL), B 세포 급성 림프아구 백혈병 (B-ALL), 변연부 림프종 (marginal zone lymphoma, MZL), 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin lymphoma) (NHL), 급성 골수성 백혈병 (AML) 및 신경아세포종, 신장암, 폐암, 결장암, 난소암, 췌장암, 유방암, 피부암, 자궁암, 전립선암, 갑상선암, 두경부암, 방광암, 위암 또는 간암을 포함하는 고형 종양을 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 명세서에는 또한 필요한 환자에서 질병의 치료를 위한 의약의 제조에서 제1, 제2 또는 제3 양상의 특이적 항원 결합 분자, 재조합 융합 단백질 또는 키메라 항원 수용체의 용도가 제공된다.
또한, 본 발명에 따르면, 치료가 필요한 환자에서의 질병의 치료 방법으로서, 제1, 제2 또는 제3 양상의 특이적 항원 결합 분자, 재조합 융합 단백질 또는 키메라 항원 수용체 또는 제5 양상의 약제학적 조성물의 치료적으로 유효한 투여량을 상기 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
바람직하게는, 암은 ROR1-양성 암 유형이다. 더욱 바람직하게는, 암은 혈액암, 예컨대 림프종 및 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 맨틀 세포 림프종 (MCL), B 세포 급성 림프아구 백혈병 (B-ALL), 변연부 림프종 (MZL), 비호지킨 림프종 (NHL), 급성 골수성 백혈병 (AML) 및 신경아세포종, 신장암, 폐암, 결장암, 난소암, 췌장암, 유방암, 피부암, 자궁암, 전립선암, 갑상선암, 두경부암, 방광암, 위암 또는 간암을 포함하는 고형 종양을 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 명세서에서는 샘플에서 표적 분석물의 존재에 대한 분석 방법으로서, 제1 양상의 검출 가능하게 표지된 특이적 항원 결합 분자, 또는 제2 양상의 재조합 융합 단백질을 샘플에 첨가하는 단계 및 상기 분자와 표적 분석물의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또한, 본 명세서에서는 대상체에서 질병 부위를 영상화하는 방법으로서, 제1 양상의 검출 가능하게 표지된 특이적 항원 결합 분자 또는 제2 양상의 검출 가능하게 표지된 재조합 융합 단백질을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또한 본 명세서에서는 대상체에서 질병 또는 의학적 병태(medical condition)를 진단하는 방법으로서, 제1 양상의 특이적 항원 결합 분자 또는 제2 양상의 재조합 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또한 본 명세서에서는 ROR1에 결합하기 위해 제1 양상의 ROR1-특이적 항원 결합 분자와 경쟁하는 항체, 항체 단편 또는 항원-결합 분자가 고려된다. 항원 결합 단백질 (예를 들어, 중화 항원 결합 단백질 또는 중화 항체)과 관련하여 사용되는 경우, 용어 "경쟁하다"는 시험되는 항원 결합 단백질 (예를 들어, 항체 또는 이의 기능적 단편)이 본 명세서에 규정된 항원 결합 분자 (예를 들어, 제1 양상의 특이적 항원 결합 분자)와 공통 항원 (예를 들어, 제1 양상의 특이적 항원 결합 분자의 경우 ROR1)의 특이적 결합을 방지하거나 억제하는 분석에 의해 결정되는 바와 같은 항원 결합 단백질 사이의 경쟁을 의미한다.
암이 발병하거나 암에 대한 소인(pre-disposition)이 있는 대상체를 진단하거나, 대상체의 병태의 예후를 제공하기 위한 키트가 본 명세서에 기재되고, 상기 키트는 시험 대상체로부터의 샘플에 존재하는 항원의 농도를 검출하기 위한 검출 수단을 포함하고, 검출 수단은 제1 양상의 ROR1-특이적 항원 결합 분자, 제2 양상의 재조합 융합 단백질, 제3 양상의 키메라 항원 수용체 또는 제4 양상의 핵산 서열을 포함하고, 이는 각각 선택적으로 유도체화되며, 샘플 중 항원의 존재는 대상체에 암이 발병하였음을 나타낸다. 바람직하게는 항원은 ROR1 단백질, 더욱 바람직하게는 이의 세포외 도메인을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 키트는 샘플 중 ROR1-양성 세포의 존재 또는 부재를 확인하거나, 샘플 중 그 농도를 결정하기 위해 사용된다. 키트는 또한 분석이 비교되는 양성 대조군 및/또는 음성 대조군 및/또는 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 암이 발병하거나 암에 대한 소인이 있는 대상체를 진단하거나, 대상체의 병태의 예후를 제공하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체로부터 획득된 샘플에 존재하는 항원의 농도를 검출하는 단계를 포함하고, 검출은 제1 양상의 ROR1-특이적 항원 결합 분자, 제2 양상의 재조합 융합 단백질, 제3 양상의 키메라 항원 수용체 또는 제4 양상의 핵산 서열을 사용하여 수행되고, 이는 각각 선택적으로 유도체화되며, 샘플 중 항원의 존재는 대상체에 암이 발병하였음을 나타낸다.
본 명세서에서는 시험관내 또는 환자에서 ROR1을 발현하는 세포를 사멸하거나, 그 성장을 억제하는 방법이 또한 고려되며, 상기 방법은 (i) 제1 양상의 ROR1-특이적 항원 결합 분자, 제2 양상의 재조합 융합 단백질, 제3 양상의 핵산 서열, 또는 제4 양상에 따른 CAR 또는 세포, 또는 (ii) 제5 양상의 약제학적 조성물의 약제학적 유효량 또는 용량(dose)을 세포에 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, ROR1을 발현하는 세포는 암 세포이다. 더욱 바람직하게는, ROR1은 인간 ROR1이다.
본 발명의 제6 양상에서, 화학식 (II)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
X-FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4-Y (II)
여기서,
FW1은 프레임워크 영역이고,
CDR1은 CDR 서열이고,
FW2는 프레임워크 영역이고,
HV2는 초가변 서열이고,
FW3a는 프레임워크 영역이고,
HV4는 초가변 서열이고,
FW3b는 프레임워크 영역이고,
CDR3은 CDR 서열이고,
FW4는 프레임워크 영역이고,
X 및 Y는 선택적 아미노산 서열이고,
상기 특이적 항원 결합 분자는 제2 모이어티에 접합된다.
특정의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 이러한 양상에 따른 특이적 항원 결합 분자는 추가로 제3, 제4 또는 제5 모이어티에 접합될 수 있다. 추가 모이어티의 접합이 또한 고려된다. 일부 경우에, 제3, 제4 또는 제5 모이어티는 제2 모이어티에 접합될 수 있다. 따라서, 본 발명의 이러한 양상에 따른 모이어티 중 임의의 것은 이에 접합된 추가 모이어티를 가질 수 있음을 이해할 것이다. 하기에 제시된 바와 같은 제2 모이어티의 바람직한 특징의 기재는 제3, 제4, 제5 또는 더 고차의 모이어티에 준용된다.
바람직하게는 X 또는 Y는 개별적으로 부재하거나, 면역글로불린, 면역글로불린 Fc 영역, 면역글로불린 Fab 영역, 단일 사슬 Fv (scFv), 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이중특이적 T 세포 관여인자 (BiTE), 인테인, VNAR 도메인, 단일 도메인 항체 (sdAb), VH 도메인, 스캐폴드 단백질 (아피바디, 센티린, 다르핀 등), 또는 다음에 제한되는 것은 아니나, 슈도모나스 외독소 PE38, 디프테리아 독소를 포함하는 독소를 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 접합은 특이적 항원 결합 분자의 아미노산 서열의 시스테인 잔기를 통해 이루어진다. 시스테인 잔기는 선택적 서열 X 또는 Y (존재하는 경우)를 포함하여, 서열의 임의의 부분에 존재할 수 있다.
접합은 특이적 항원 결합 분자의 아미노산 서열의 N 말단 또는 C 말단에 혼입된 티올, 아미노옥시 또는 히드라지닐 모이어티를 통해 이루어질 수 있다.
바람직하게는, 제2 모이어티는 검출 가능한 표지, 염료, 독소, 약물, 전구약물, 방사성핵종 또는 생물학적 활성 분자를 포함하는 군으로부터 선택된다.
더욱 바람직하게는, 제2 모이어티는 다음을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 독소이다:
· 메이탄시노이드 (maytansinoid),
· 아우리스타틴 (auristatin),
· 안트라사이클린 (anthracyclin), 바람직하게는 PNU-유래 안트라사이클린
· 칼리케아미신 (calicheamicin),
· 아마니틴 (amanitin) 유도체, 바람직하게는 α-아마니틴 유도체
· 튜블리신 (tubulysin)
· 듀오카마이신 (duocarmycin)
· 방사성 동위원소, 예컨대, 알파-방출 방사성핵종, 예컨대 227 Th 및 225 Ac
· 독성 페이로드 (toxic payload)를 포함하는 리포솜,
· 단백질 독소
· 탁산 (taxane)
· 피롤벤조디아제핀 및/또는
· 인돌리노벤조디아제핀 유사이량체 (indolinobenzodiazepine pseudodimer) 및/또는
· 스플라이세오좀 (spliceosome) 억제제
· CDK11 억제제
· 피리디노벤조디아제핀.
다른 바람직한 실시형태에서 이 양상에 따르면, 제2 모이어티는 면역글로불린, 면역글로불린 Fc 영역, 면역글로불린 Fab 영역, 단일 사슬 Fv (scFv), 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이중특이적 T 세포 관여인자 (BiTE), 인테인, VNAR 도메인, 단일 도메인 항체 (sdAb), VH 도메인, 스캐폴드 단백질 (아피바디, 센티린, 다르핀 등), 또는 다음에 제한되는 것은 아니나, 슈도모나스 외독소 PE38, 디프테리아 독소를 포함하는 독소를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
특히 바람직한 실시형태에서, 제2 모이어티는 VNAR 도메인이며, 이는 이 양상에 따른 특이적 항원 결합 분자와 동일하거나 상이할 수 있다. 따라서, 화학적 접합에 의해 연결된 VNAR 도메인의 이량체, 삼량체 또는 고차 다량체가 본 명세서에서 명시적으로 고려된다. 이러한 실시형태에서, 각각의 개별 VNAR 도메인은 다른 VNAR 도메인과 동일한 항원 특이성을 갖거나, 그들은 상이할 수 있다.
이러한 양상에 따르면, 특이적 항원 결합 분자는, 예를 들어, 추가의 생물학적 활성 분자(반감기 연장용 분자, 예를 들어, BA11을 포함하지만, 이에 제한되지 않음)에 융합된 후, 세포독성 페이로드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 제2 모이어티에 추가로 접합된 제1 내지 제5 양상과 관련하여 기재된 바와 같은 이중파라토프 특이적 항원 결합 분자를 포함할 수 있다.
이 양상에 따르면, 특이적 항원 결합 분자는 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1) 특이적 항원 결합 분자일 수 있다. 이는 본 발명의 제1 양상의 ROR1-특이적 항원 결합 분자일 수 있다. 따라서, 제1, 제2 및 제3 양상과 관련하여 전술한 임의의 바람직한 특징은 제6 양상에 준용된다.
제6 양상의 특이적 항원 결합 분자는 요법에 사용하기 위한 것일 수 있다. 더욱 특히, 제6 양상의 특이적 항원 결합 분자는 암의 치료에 사용하기 위한 것일 수 있다. 바람직하게는, 암은 ROR1-양성 암 유형이다. 더욱 바람직하게는, 암은 혈액암, 예컨대 림프종 및 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 맨틀 세포 림프종 (MCL), B 세포 급성 림프아구 백혈병 (B-ALL), 변연부 림프종 (MZL), 비호지킨 림프종 (NHL), 급성 골수성 백혈병 (AML) 및 신경아세포종, 신장암, 폐암, 결장암, 난소암, 췌장암, 유방암, 피부암, 자궁암, 전립선암, 갑상선암, 두경부암, 방광암, 위암 또는 간암을 포함하는 고형 종양을 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 명세서에서는 필요한 환자에서 질병의 치료를 위한 의약의 제조에서 제6 양상의 특이적 항원 결합 분자의 용도가 제공된다.
제6 양상의 특이적 항원 결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다. 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 다양한 담체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 치료가 필요한 환자에서 질병을 치료하는 방법으로서, 제6 양상의 특이적 항원 결합 분자 또는 제6 양상의 특이적 항원 결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적으로 유효한 투여량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
바람직하게는, 암은 ROR1-양성 암 유형이다. 더욱 바람직하게는, 암은 혈액암, 예컨대 림프종 및 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 맨틀 세포 림프종 (MCL), B 세포 급성 림프아구 백혈병 (B-ALL), 변연부 림프종 (MZL), 비호지킨 림프종 (NHL), 급성 골수성 백혈병 (AML) 및 신경아세포종, 신장암, 폐암, 결장암, 난소암, 췌장암, 유방암, 피부암, 자궁암, 전립선암, 갑상선암, 두경부암, 방광암, 위암 또는 간암을 포함하는 고형 종양을 포함하는 군으로부터 선택된다.
또한 본 명세서에서는 샘플에서 표적 분석물의 존재에 대한 분석 방법으로서, 제6 양상의 검출 가능하게 표지된 특이적 항원 결합 분자를 샘플에 첨가하는 단계 및 상기 분자와 표적 분석물의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또한, 본 명세서에서는 대상체에서 질병 부위를 영상화하는 방법으로서, 제6 양상의 검출 가능하게 표지된 특이적 항원 결합 분자를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또한, 본 명세서에서는 대상체에서 질병 또는 의학적 병태를 진단하는 방법으로서, 제6 양상의 특이적 항원 결합 분자를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명의 상기 언급된 양상들 중 임의의 것과 관련하여 기재된 임의의 특징은 본 발명의 다른 양상들과 함께 준용하여 조합될 수 있다.
도 1: VNAR 도메인을 디스플레이하는 항-ROR1 파지 단일클론: ELISA에서 인간 또는 마우스 재조합 ROR1-Fc와 결합. B1, P3A1 및 E7-특이적 ROR1 결합제, H2 - 비-특이적 파지.
도 2: 인간 ROR1 (B1 및 E7) 및 마우스 ROR1 (P3A1 및 CPF7)을 사용하여 합성 VNAR 라이브러리를 스크리닝함으로써 획득되는 ROR1 결합 서열. C 말단 His6Myc 태그 (His6 Myc 서열, 기울림체)의 존재 및 부재 하의 서열이 제시됨.
도 3: 인간 ROR1을 사용하여 면역화된 VNAR 라이브러리의 생성: 쥣과동물 또는 인간 ROR1에 대한 3마리의 곱상어 면역화 전 및 후 혈장 결합의 분석.
도 4: 면역화된 VNAR 라이브러리로부터의 항-ROR1 파지 단일클론: ELISA에서 인간 또는 마우스 재조합 ROR1-Fc와 결합. 파지 상에 디스플레이된 E9 및 D3 -특이적 ROR1 결합제, H1 - 비-특이적 VNAR 결합제.
도 5: 마우스 ROR1을 사용하여 면역화된 VNAR 라이브러리를 스크리닝함으로써 획득된 ROR1 결합 서열 E9 및 D3. C 말단 His6Myc 태그 (His6 Myc 서열, 기울림체)의 존재 또는 부재 하의 서열이 제시됨.
도 6: 실온에서 pH 6.0의 50mM NaCl 20mM NaP 완충액 중 무태그 VNAR, VNAR 6xHis 및 VNAR- His6-Myc의 원자외선 CD 스펙트럼.
도 7: 도 7: VNAR 변형 A: 단량체 VNAR, B: 동종이량체, C: C 말단 분자간 이황화 결합을 통해 접합된 동종이량체, D: 이종이량체, E: VNAR IgG Fc 융합, F: IgG Fc - VNAR 융합, G: VNAR- (IgG Fc) - VNAR 융합.
도 8: hROR1에 대한 B1 C 말단 연결된 동종이량체의 결합. ELISA에 의해 인간 ROR1에 결합하는 B1, B1 C 말단 티올 (B1 SH) 및 B1 C 말단 이황화 이량체 (B1 S-S B1).
도 9: 유세포 분석에 의해 VNAR (His6Myc tag) 분자의 A549 (ROR1hi) 폐암 세포에 대한 세포 표면 결합. B1 및 E7 단량체 및 P3A1-P3A1 이량체는 시험된 모든 농도에서 A549 세포에 강하게 결합한다. CPF7 및 P3A1 단량체는 A549 세포에 50 μg/ml로 결합한다. PE-항 Myc 태그 Ab (CST)를 사용하여 VNAR 결합을 검출하고, BD Biosciences FACSCalibur 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다.
도 10: VNAR IgG Fc 융합 단백질에 사용된 링커 마우스 IgG 및 링커 인간 IgG 서열. 부위 특이적 표지를 가능하게 하기 위해, 조작된 hIgG1 Fc 융합 단백질에 hIgG1 Fc 서열, 예를 들어 위치 S252C 또는 S473C (카밧 넘버링)에서 조작된 시스테인 치환을 혼입시켰다.
도 11: 인테인 절단 시약 및 해당 VNAR C 말단 유도체.
도 12: ELISA에 의한 인간, 마우스 및 랫트 ROR1 및 인간 ROR2에 대한 VNAR 결합. 모든 VNAR은 ROR1에 대해 종 교차 반응성인 것으로 나타났다. VNAR 클론은 인간 ROR2와 교차 반응하지 않았다.
도 13: 유세포 분석에 의해 A549 (ROR1hi) vs A427 (ROR1low) 폐암 세포주에 대한 VNAR 세포 표면 결합.
도 14: 4℃ 또는 37℃에서 2시간 동안 MDA-MB-231 유방암 세포에 대한 VNAR의 세포 표면 결합. 37℃에서 세포 표면 신호의 손실은 ROR1 내재화를 나타낸다. PE-항 Myc 태그 Ab (CST)를 사용하여 VNAR 결합을 검출하고, BD Biosciences FACS Calibur (B1) 또는 ThermoFisher Attune NxT 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다.
도 15: A549 (ROR1hi) vs A427 (ROR1low) 폐암 세포주에 대한 VNAR-hFc 분자 세포 표면 결합을 도시한 막대 차트. PE-항-인간 항체 (Jackson ImmunoResearch Labs/Stratech) 및 ThermoFisher Attune NxT 유세포 분석기를 사용하여 VNAR hFc 결합을 검출하였다.
도 16: VNAR-Fc 융합의 내재화. 4℃ 또는 37℃에서 2시간 동안 VNAR-Fc의 MDA-MB-231 유방암 세포에 대한 세포 표면 결합. 37℃에서 세포 표면 신호의 손실은 ROR1 내재화를 나타낸다.
도 17: VNAR은 글리코실화와 무관하게 인간 ROR1에 결합한다. A, hROR1 (레인 2) 및 탈글리코실화된 hROR1 (레인 3), Mwt 마커 (레인 1)의 SDS PAGE 분석. B, ROR1 결합 VNAR B1, P3A1-P3A1 및 D3-D3은 ELISA에 의해 탈글리코실화된 hROR1에 동일하게 잘 결합한다. C, B1 mFc는 ELISA에 의해 글리코실화 및 탈글리코실화 hROR1에 동일하게 잘 결합한다. 접히지 않은 hROR1 (28 mM DTT, 0.5% Sarkosyl에 의한 환원)에 대한 결합은 유의하게 감소하였으며, 이는 입체형태 에피토프 (들)에 대한 B1 VNAR 결합과 일치한다.
도 18a: B1은 SEC에 의해 ROR1 Ig 도메인과 복합체를 형성한다. A, B1 his의 존재 및 부재 하 (주황색 및 청색 트레이스)의 인간 ROR1 Ig 도메인의 중복된 SEC 분석 (Superdex 200 Increase 10/300, GE Healthcare). B, 피크 분획의 SDS PAGE 분석.
도 18b: ROR1 Ig 도메인(IgHis)의 비글리코실화된 버전에 대한 ROR1-특이적 VNAR B1 결합의 SEC 분석. 실행 조건: 20mM Hepes, 150mM NaCl, pH7.5. 화살표는 질량 분석법 분석용으로 선택된 피크를 나타낸다.
도 18c: ROR1 Ig 도메인(IgHis) 및 ROR1-특이적 VNAR B1의 비글리코실화된 버전이 SEC에 의해 분석될 때(도 18b) 형성된 추가 피크의 질량 분석법 분석. IgHis 예상된 MW: 12,218.6 Da; IgHis 관찰된 MW: 12,217.9 Da. B1 예상된 MW: 12,506.8 Da; B1 관찰된 MW: 12,506.0 Da. 이들 데이터는 B1과 비글리코실화 IgHis 사이의 복합체가 형성되었음을 입증한다.
도 18d. SEC/SDS-PAGE 분석에 의해 평가된 ROR1 도메인에 대한 VNAR 도메인 D3 및 P3A1의 결합
도 19a: hROR1 +/- 사전 포획 B1 His6Myc VNAR에 대한 VNAR의 결합을 도시하는 SPR 센소그램. 2V 단량체 또는 이량체는 이들 조건 중 어느 하나에서도 결합하지 않았다.
도 19b: hROR1 +/- 사전 포획 P3A1 His6Myc 이량체 VNAR에 대한 i) ROR1 2A2 mAb, ii) UC961 기반 mAb, iii) P3A1, iv) B1, v) D3 및 vi) E9의 결합을 묘사하는 대표적인 SPR 센소그램. P3A1 자기 경쟁(iii) 이외에 hROR1에 대한 결합 경쟁은 관찰되지 않았다
도 20: B1 및 P3A1은 ELISA에 의해 선택된 선형 ROR1 펩타이드에 결합하지 않는다. 인간 ROR1에 대한 결합은 양성 대조군으로서 포함된다.
도 21a 및 21b: B1, P3A1, D3 및 D3-D3은 ELISA에 의해 선택된 선형 ROR1 펩타이드에 결합하지 않는다. 인간 ROR1에 대한 결합은 양성 대조군으로서 포함된다.
도 22: 경쟁 ELISA 실험.
도 23: 경쟁 ELISA 실험.
도 24: B1, P3A1, D3 단량체 및 D3-D3 이량체의 상이한 ROR1 도메인에 대한 결합.
도 25: 벤즈알데하이드 형광에 대한 BA11 아미녹시 접합의 개략도
도 26: 말레이미드 형광에 대한 BA11 티올 접합의 개략도
도 27: 말레이미드 형광에 대한 BA11 C 말단 시스테인 유도체 접합의 개략도
도 28a 및 28b: 접합에 사용되는 표지 및 페이로드의 예
도 29: B1 MMAE 접합체의 분석. A, B1 his myc 유도체 및 접합체의 SDS PAGE 분석 - 레인 1, B1 아미녹시; 2, B1 옥심 MMAE; 3, B1 옥심 vc MMAE; 4, B1 SH vc MMAE. B-F, B1 his myc 유도체 및 접합체의 전기분무 질량 스펙트럼 - B, B1 SH (예상 질량; 14908.9 Da, 관찰 질량 14908.4 Da); C, B1 SH vc MMAE (예상 질량 16225.5 Da, 관찰 질량 16225.5 Da); D, B1 아미녹시 (예상 질량 14937.4 Da, 관찰 질량 14936.5 Da); E, B1 옥심 MMAE (예상 질량 16015.4 Da, 관찰 질량 16016.7 Da); F, B1 옥심 vc MMAE (예상 질량 16334.4 Da, 관찰 질량 16334.2 Da).
도 30: A549 (ROR1hi) vs A427 (ROR1low) 폐암 세포주에서 B1-, P3A1- 및 2V-hFc 분자 대 MMAE-접합된 버전의 세포 표면 결합. PE-항-인간 항체 (Jackson ImmunoResearch Labs/Stratech) 및 ThermoFisher Attune NxT 유세포 분석기를 사용하여 VNAR hFc 결합을 검출하였다.
도 31a 및 31b: VNAR hFc 접합체의 분석. A&B, VNAR hFc (S252C) 단백질 및 접합체의 SDS PAGE 분석 (각각 4 내지 12% 및 12% Bis Tris 겔). 레인 1, 비처리 단백질, 2, 재접힘된 단백질 및 3, MMAE 접합체 (DTT로 +/- 환원). C & D, MMAE 접합 전 및 후에 각각 탈글리코실화된 환원 VNAR hFc (S252C) 융합 단백질의 질량 분석의 예. 예상 질량: 비접합 38,997.8 Da 및 MMAE 접합체 (DAR 2) 40,310.0 Da. E&F VNAR hFc (S473C) 단백질 접합체의 SDS PAGE 분석. 레인 3, MMAE 접합체 및 4, AF488 접합체 (DTT에 의한 +/- 환원). G&H 탈글리코실화된 환원 B1- 및 P3A1 hFc (S473C) MMAE 접합체 각각의 질량 분석. 예상 질량: B1 접합체 40,170.5 Da 및 P3A1 접합체 40,308.5 Da (2의 DAR) [*는 공급원 단편화로 인한 MS 가공물에 해당]. I&J 탈글리코실화된 환원 B1- 및 P3A1 hFc (S473C) AF488 접합체 각각의 질량 분석. 예상 질량: B1 접합체 39,552.4 Da 및 P3A1 접합체 39,690.4 Da (2의 DAR).
도 32a 및 32b: VNAR hFc PBD 이량체, 아마니틴 및 PNU 접합체의 개략도.
도 33: 상이한 인간 암 세포주의 패널에서 B1 mFc MMAE 또는 2V mFc-MMAE 분자로 처리 후 (72시간)의 세포 생존율. 세포 역가 Glo 시약 (Promega)을 사용하여 ATP를 정량화하였으며, 이는 배양에서 대사 활성 세포의 수와 상관관계가 있다. IC50 값을 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.
도 34: 2개의 상이한 인간 암 세포주 (DU145 및 Jeko-1)에서 VNAR hFc PBD 접합체로 처리 후 (96시간)의 세포 생존율. 세포 역가 Glo 시약 (Promega)을 사용하여 ATP를 정량화하였으며, 이는 배양에서 대사 활성 세포의 수와 상관관계가 있다. IC50 값을 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 결정하였다. VNAR hIgG1 Fc (S252C) 융합을 MA PEG4 va PBD와 반응시킴으로써 VNAR hFc 접합체를 생성하였다 (도 32a 및 32b 참조).
도 35: 2개의 상이한 인간 암 세포주 (PA-1 및 Kasumi-2)에서 VNAR hFc PBD, SG3199 PBD 및 PNU (PEG4 vc PAB DMAE PNU159682) 접합체로 처리 후 (96시간)의 세포 생존율. 세포 역가 Glo 시약 (Promega)을 사용하여 ATP를 정량화하였으며, 이는 배양에서 대사 활성 세포의 수와 상관관계가 있다. IC50 값을 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 결정하였다. 이에 의해 VNAR hIgG1 Fc(S252C) 융합을 MA PEG4 va PBD, MA PEG8 va PAB SG3199, MA PEG4 vc PAB DMAE PNU 159682와 반응시킴으로써, VNAR hFg 접합체를 생성하였다 (도 32a 및 32b 참조).
도 35b: PA-1 세포 및 Kasumi-2 세포를 증가된 양의 비접합된 B1 hFc 또는 2VhFc의 존재 또는 부재하에 IC80 농도의 B1 hFc-SG3199, B1hFc-PNU 또는 2VhFc 비결합 대조군으로 처리하였다. 세포 생존율은 세포 역가 Glo 검정(Promega)을 사용하여 평가하였다. 단백질-약물 접합 분자로 처리한 후 세포 생존율에 대한 효과는 2VhFc 단백질이 아닌 증가하는 양의 경쟁하는 비접합된 B1hFc로 파기되었다.
도 36: B1-[(G4S)5]-D3 Alexa Fluor 488 접합체의 QC 데이터. 상단. Alexa Fluor 488 VNAR 접합체의 SDS-PAGE 분석. 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 또는 UV를 사용하는 시각화. SDS-PAGE는 환원성(+ 0.1M DTT) 또는 비환원성(-0.1M DTT) 조건하에 수행되었다. 하단. Alexa Fluor 488 VNAR 접합체의 분리된 질량 스펙트럼. 관찰된 질량(26286.8 Da)은 선택적으로 표지된 접합체에 대해 예상되는 이론적 질량(29285.1 Da)과 일치한다.
도 37: P3A1-[(G4S)5]-BA11-[(G4S)5]-D3 Alexa Fluor 488 접합체의 QC 데이터. 상단. Alexa Fluor 488 VNAR 접합체의 SDS-PAGE 분석. 쿠마시 브릴리언트 블루 또는 UV를 사용하는 시각화. SDS-PAGE는 환원성 (+ 0.1M DTT) 또는 비환원성 (-0.1M DTT) 조건하에 수행되었다. 하단. Alexa Fluor 488 VNAR 접합체의 분리된 질량 스펙트럼. 관찰된 질량(42273.81 Da)은 선택적으로 표지된 접합체에 대해 예상되는 이론적 질량(42,279.1)과 일치한다.
도 38: BA11-[PGVQPSPGGGGS]-B1 Alexa Fluor 488 접합체의 QC 데이터. 상단. Alexa Fluor 488 VNAR 접합체의 SDS-PAGE 분석. 쿠마시 브릴리언트 블루 또는 UV를 사용하는 시각화. SDS-PAGE는 환원성(+ 0.1M DTT) 또는 비환원성(-0.1M DTT) 조건하에 수행되었다. 하단. Alexa Fluor 488 VNAR 접합체의 분리된 질량 스펙트럼. 관찰된 질량(27821.12 Da)은 선택적으로 표지된 접합체에 대해 예상되는 이론적 질량(27,819.99 Da)과 일치한다.
언급된 서열 외에, 하기 서열이 명시적으로 개시되어 있다. 이들 서열 중 일부는 본 명세서에 기재된 본 발명의 분자의 예에 관한 것이다.
Figure pct00005

Figure pct00006

Figure pct00007

Figure pct00008
본 발명은 일반적으로 특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1)에 특이적인 면역글로불린-유사 상어 가변 신규 항원 수용체 (VNAR) 및 결합된 융합 단백질, 키메라 항원 수용체, 접합체, 및 핵산뿐만 아니라, 수행 방법을 제공한다. ROR1-특이적 VNAR 도메인은 본 명세서에서 ROR1-특이적 항원 결합 분자로서 기재된다.
신규 또는 새로운 항원 수용체 (IgNAR)는 연골 어류의 혈청에서 발견되는 대략 160 kDa 동종이량체 단백질이다 (문헌[Greenberg A. S., et al., Nature, 1995. 374(6518): p. 168-173, Dooley, H., et al, Mol. Immunol, 2003. 40(1): p. 25-33; Mueller, M.R., et al., mAbs, 2012. 4(6): p. 673-685)]). 각 분자는 단일 N 말단 가변 도메인 (VNAR) 및 5개의 불변 도메인 (CNAR)으로 구성된다. IgNAR 도메인은 면역글로불린-수퍼패밀리의 구성원이다. VNAR은 면역글로불린 및 T 세포 수용체 가변 도메인 및 세포 부착 분자와 구조적 및 일부 서열 유사성을 갖는 밀접하게 접힌 도메인이고, 통상적 면역글로불린 및 T 세포 수용체의 N 가변 말단 도메인과 유사하여 VNAR로 지칭된다. VNAR은 면역글로불린에 대해 제한된 서열 상동성을 공유하며, 예를 들어 VNAR과 인간 경쇄 서열 사이에 25 내지 30% 유사성이 존재한다 (문헌[Dooley, H. and Flajnik, MF, Eur. J. Immunol., 2005. 35 (3): p. 936-945]).
문헌[Kovaleva M. et al Expert Opin. Biol. Ther. 2014. 14(10): p. 1527-1539 and Zielonka S. et al mAbs 2015. 7(1): p. 15-25]은 VNAR의 구조적 특성 및 생성에 대한 요약을 제공하며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로 포함된다.
VNAR은 통상적인 면역글로불린 항체 전구체로부터 발생된 것으로 보이지 않는다. VNAR의 고유한 구조적 특징은 통상적인 면역글로불린 가변 도메인에 존재하는 CDR2 루프와 동일한 서열의 절단 및 일반적으로, IgNAR 구조에 존재하지 않는 경쇄 도메인과의 결합을 가능하게 하는 소수성 VH/VL 계면 잔기의 부재이다. 더욱이, 통상적인 면역글로불린과는 달리, 일부 VNAR 하위유형은 CDR 1 및 3에 N 말단에 의해 인접한 프레임워크 1 및 3 영역의 시스테인 사이의 정규 면역글로불린 수퍼패밀리 가교 이외에 이황화 가교를 형성하는 것으로 관찰되는 CDR 영역에 과외의 시스테인 잔기를 포함한다.
현재까지, I, II 및 III으로 공지된 3개의 소정의 유형의 상어 IgNAR이 존재한다. 이는 강한 선택 압력 하에 있으므로 거의 대체되지 않는 비정규 시스테인 잔기의 위치를 기반으로 하여 분류되었다.
3개의 유형 모두 위치 35 및 107 (문헌[Kabat, E.A. et al. Sequences of proteins of immunological interest. 5th ed. 1991, Bethesda: US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH]에 따라 넘버링됨)에서 통상적인 면역글로불린 정규 시스테인을 가지며, 이는 위치 36에서 비변이 트립토판과 함께 표준 면역글로불린 접힘을 안정화시킨다. 이와 같은 CDR2는 규정되어 있지 않지만, TCR HV2 및 HV4와 더욱 밀접한 것으로 비교되는 서열 변이 영역이 각각 프레임워크 2 및 3에 규정되어 있다. 유형 I은 프레임워크 2 및 프레임워크 4에 생식계열 인코딩된 시스테인 잔기 및 CDR3 내에 짝수의 추가 시스테인을 갖는다. 리소자임에 대해 단리되고 그와의 복합체 내의 유형 I IgNAR의 결정 구조 연구에 의해 이들 시스테인 잔기의 관여를 결정할 수 있었다. 프레임워크 2 및 4 시스테인은 둘 모두 CDR3의 시스테인과 이황화 가교를 형성하여, CDR3 루프가 HV2 영역 하류에 밀접하게 유지되는 밀접하게 밀집된 구조를 형성한다. 현재까지 유형 I IgNAR은 수염 상어에서만 확인되었으며 - 동일한 목의 구성원을 포함하여 다른 판새류 모두는 단지 유형 II 또는 이 유형의 변이체를 갖는다.
유형 II IgNAR은 CDR1 및 CDR3에 시스테인 잔기를 갖는 것으로 규정되며, 이는 이들 두 영역을 근접하게 유지하는 분자내 이황화 결합을 형성하여 포켓 또는 그루브를 결합시킬 수 있는 돌출 CDR3 (도 2)을 생성한다. 유형 I 서열은 통상적으로 유형 II보다 더 긴 CDR3을 가지며, 각각 평균 21 및 15개의 잔기를 갖는다. 이는 유형 I CDR3 내의 2개 이상의 시스테인 잔기가 그의 프레임워크 2 및 4 대응체와 결합하는 강한 선택 압력 때문인 것으로 여겨진다. 체세포 돌연변이의 축적에 대한 연구는 유형 II의 CDR1에 유형 I보다 더 많은 수의 돌연변이가 있으며, 유형 I의 HV2 영역은 유형 II보다 더 큰 서열 변이를 나타냄을 보여준다. 이 증거는 항원 결합 부위 내에서 이들 영역의 소정의 위치와 적절하게 관련된다.
유형 III으로 공지된 제3 IgNAR 유형은 신생아에서 확인되었다. IgNAR 패밀리의 이 구성원은 V 유전자와 D1 및 D2 영역 (CDR3를 형성함)의 생식계열 융합으로 인해 CDR3 내에 다양성이 결여되어 있다. 거의 모든 공지된 클론은 15개의 잔기의 CDR3 길이를 가지며, 서열 다양성이 거의 없거나 전혀 없다.
유형 (IIb 또는 IV)로 지칭되는 또 다른 구조적 유형의 VNAR은 (프레임워크 1 및 프레임워크 3b 영역에서) 단지 2개의 정규 시스테인 잔기를 갖는다. 지금까지 이 유형은 주로 돔발상어에서 발견되었으며 (문헌[Liu, J.L., et al. Mol. Immunol. 2007. 44(7): p. 1775-1783; Kovalenko O.V., et al. J Biol Chem. 2013. 288(24): p. 17408-19), 또한 워베공 상어로부터 유래된 반합성 V-NAR 라이브러리로부터 단리되었다 (문헌[Streltsov, V.A. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(34): p. 12444-12449]).
그러나 VNAR 서열로부터 형성된 합성 라이브러리로부터 단리된 특이적 VNAR은 다른 단백질에 대해 고 친화도로 결합할 수 있으며 (문헌[Shao C.Y. et al. Mol Immunol. 2007. 44(4): p. 656-65; WO2014/173959]), IgNAR은 연골 어류가 항원 및 항원에 결합하여 획득된 반응성 IgNAR로 면역화될 수 있기 때문에 적응 면역 시스템의 일부인 것으로 나타났다 (문헌[Dooley, H., et al, Mol. Immunol, 2003. 40 (1): p. 25-33; WO2003/014161]). IgNAR은 면역글로불린 및 T 세포 수용체와 유사한 D 및 J 서열과 V 유사 서열의 조합 결합 메커니즘을 갖는 것으로 나타났다 (문헌[Zielonka S. et al mAbs 2015. 7 (1): p. 15-25]에 요약됨).
VNAR 결합 표면은 다른 천연 면역글로불린의 가변 도메인과 달리, FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4의 순서로 개재 프레임워크 서열에 의해 연결된 CDR1, HV2, HV4 및 CDR3의 4개의 다양성 영역으로부터 유래한다 (또한 문헌[Stanfield, R. L., et al, Science, 2004. 305(5691): p. 1770-1773; Streltsov, V.A., et al, Protein Sci., 2005. 14(11): p. 2901-2909; Stanfield, R. L., et al., J Mol. Biol., 2007. 367(2): p. 358-372] 참조). 천연 경쇄 대응체의 부재 및 CDR2의 부재의 조합에 의해, VNAR은 척추동물계에서 가장 작은 천연 발생 결합 도메인으로 제조된다.
IgNAR은 낙타과에서 발견되는 중쇄 전용 면역글로불린 (HCAb)과 동일한 부수적인 특징을 공유한다 (낙타, 단봉 낙타 및 라마, 문헌[Hamers-Casterman, C. et al. Nature, 1993. 363, 446-448; Wesolowski, J., et al., Med Microbiol Immunol, 2009. 198(3): p. 157-74]). IgNAR과 달리, HCAb는 면역글로불린 패밀리로부터 명확하게 유래되며 표준 면역글로블린과 유의한 서열 상동성을 공유한다. 중요하게는, VNAR의 주요 차이점 중 하나는 상기 분자가 발생 중 임의의 시점에서 통상적인 면역글로불린 또는 HCAb와 달리 대응 경쇄를 갖지 않았다는 점이다. 문헌[Flajnik M.F. et al PLoS Biol 2011. 9(8): e1001120 and Zielonka S. et al mAbs 2015. 7(1): p. 15-25]은 낙타과로부터의 면역글로불린-유래 VHH 단일 결합 도메인 및 VNAR의 유사성 및 차이점, 및 가능하고 뚜렷한 발생 기원에 대해 언급하였다.
ROR1에 대한 항체가 문헌에 보고되어 있지만, 인간, 마우스와 랫트 ROR1의 세포외 도메인과 사이 및, 인간 ROR1과 ROR2 패밀리 구성원 사이의 높은 서열 동일성은 고친화도 hROR1-특이적 결합제의 생성이 간단하지 않음을 의미한다. 또한, 큰 크기의 항체는 고형 종양에 침투하는 능력을 손상시키고, 입체 인자로 인해 표적 단백질 영역에 접근할 수 없게 하며, 이는 올리고머화 또는 수용체 클러스터링이 관찰되는 세포 표면 단백질에 대해 특히 심각할 수 있다.
결과적으로, 당 업계에는 항체에 대해 상이한 기능적 또는 물리적 특징 또는 특성을 갖는 개선된 항-ROR1 결합 단백질 제제 및 ROR1 발현과 관련된 악성 종양을 위한 치료제 및 진단제의 개발이 요구되고 있다. 본 발명은 본 명세서에 기재된 ROR1-특이적 항원 결합 분자 형태의 이러한 제제를 제공한다.
본 명세서에 기재된 ROR1-특이적 항원 결합 분자는 인간 및 쥣과동물 ROR1 둘 모두에 결합하는 것으로 나타났다. 또한, 본 발명의 ROR1-특이적 항원 결합 분자는 탈글리코실화된 형태의 ROR1에 결합하고, 종래 기술에 기재된 항-ROR1 항체와 관련된 다수의 선형 펩타이드에는 결합하지 않는다. 따라서, 본 명세서에 기재된 ROR1-특이적 항원 결합 분자는 ROR1 서열 중 신규한 에피토프에 결합하는 것으로 생각된다.
암 세포주에 대한 본 발명의 ROR1-특이적 항원 결합 분자의 결합 및 내재화가 입증되었다. 이는 암, 특히 ROR1을 발현하는 암의 치료에서의 이러한 분자의 사용 가능성을 확인시켜 준다.
수종의 유형의 융합 단백질을 포함하여 다양한 형태의 ROR1-특이적 항원 결합 분자가 기재되어 있다. 동종 및 이종이량체 둘 모두뿐만 아니라, 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질이 기재되어 있다. 단백질의 Fc 도메인으로의 융합은 단백질 용해도 및 안정성을 개선하고, 혈장 반감기를 현저하게 증가시키고, 전반적인 치료 효과를 개선시킬 수 있다.
본 발명자들은 또한 다양한 모이어티 및 페이로드에 접합된 VNAR 분자를 최초로 생성하였다. 따라서 본 발명은 화학적으로 접합된 VNAR을 제공한다. 더욱 특히, 수종의 접합 형태의 ROR1-특이적 항원 분자가 제공된다.
정의
본 발명의 항원 특이적 결합 분자는 VNAR 분자의 합성 라이브러리 또는 연골 어류의 면역화로부터 유래된 라이브러리로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 용어 VNAR, IgNAR 및 NAR은 또한 상호 혼용될 수 있다.
아미노산은 본 명세서에서 단일 문자 코드 또는 3 문자 코드 또는 둘 모두로서 표시된다.
용어 "친화도 정제"는 분자가 화학적 또는 결합 대상에 대해 특이적으로 유도되거나 결합하여, 조합물 또는 복합체를 형성하여, 분자가 대상 모이어티에 결합되거나 부착되어 유지된 상태로, 불순물로부터 분리될 수 있도록 한 것을 기반으로 한 분자의 정제를 의미한다.
용어 "상보성 결정 영역" 또는 CDR (즉, CDR1 및 CDR3)은 그 존재가 통상적으로 항원 결합에 관여하는 VNAR 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각각의 VNAR은 통상적으로 CDR1 및 CDR3으로 확인되는 2개의 CDR 영역을 갖는다. 또한, 각각의 VNAR 도메인은 "초가변 루프" (HV)로부터의 아미노산을 포함하며, 이는 또한 항원 결합에 관여할 수 있다. 일부 경우에, 상보성 결정 영역은 CDR 영역 및 초가변 루프 둘 모두로부터의 아미노산을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 항원 결합은 단일 CDR 또는 HV로부터의 잔기만을 포함할 수 있다. VNAR 분자에 대해 일반적으로 인정되는 명명법에 따르면, CDR2 영역은 존재하지 않는다.
"프레임워크 영역" (FW)은 CDR 잔기 이외의 VNAR 잔기이다. 각 VNAR에는 일반적으로 FW1, FW2, FW3a, FW3b 및 FW4로 확인되는 5개의 프레임워크 영역이 있다.
VNAR에서 FW, CDR 및 HV 영역 사이의 경계는 일정한 것으로 의도되지 않으며, 따라서 이들 영역의 길이 및 조성에는 일부 변화가 예상된다. 이는 특히 이들 영역을 분석하는데 수행된 작업을 참조하여 당업자에 의해 이해될 것이다. (문헌[Anderson et al., PLoS ONE (2016) 11 (8); Lui et al., Mol Immun (2014) 59, 194-199; Zielonka et al., Mar Biotechnol (2015). 17, (4) 386-392; Fennell et al., J Mol Biol (2010) 400. 155-170; Kovalenko et al., J Biol Chem (2013) 288. 17408-17419; Dooley et al., (2006) PNAS 103 (6). 1846-1851]). 본 발명의 분자는 본 명세서에서 FW, CDR 및 HV 영역과 관련하여 규정되지만, 이러한 엄격한 규정으로 제한되지는 않는다. 따라서, VNAR 도메인의 구조로서 당업계의 이해에 따른 변형이 본 명세서에서 명백히 고려된다.
"코돈 세트"는 적절한 변이체 아미노산을 인코딩하는데 사용되는 상이한 뉴클레오타이드 3중체 서열의 세트를 지칭한다. 일 세트의 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어 코돈 세트에 의해 제공되는 뉴클레오타이드 3중체의 모든 가능한 조합을 나타내고, 적절한 아미노산 그룹을 인코딩할 수 있는 서열을 포함하는 고체상 합성에 의해 합성될 수 있다. 코돈 명칭의 표준 형태는 당 업계에 공지되어 있고 본 명세서에 기재된 IUB 코드의 형태이다.
코돈 세트는 일반적으로 예를 들어, NNK, NNS, XYZ, DVK 등의 이탤릭체 대문자 3개로 표시된다. "비-무작위 코돈 세트"는 따라서 본 명세서에 기재된 아미노산 선택 기준을 부분적으로, 바람직하게는 완전히 충족시키는 선택된 아미노산을 인코딩하는 코돈 세트를 지칭한다. 특정 위치에서 선택된 뉴클레오타이드 "퇴행성"을 갖는 올리고뉴클레오타이드의 합성은 당 업계에, 예를 들어 TRIM 접근법 (문헌[Knappek et al.; J. Mol. Biol. (1999), 296, 57-86); Garrard & Henner, Gene (1993), 128, 103])에 잘 공지되어 있다. 특정 코돈 세트를 갖는 이러한 올리고뉴클레오타이드 세트는 상업적 핵산 합성기 (예를 들어, Applied Biosystems, Foster City, CA 제공)를 사용하여 합성될 수 있거나, 시판되는 것 (예를 들어, Life Technologies, Rockville, MD)을 입수할 수 있다. 특정 코돈 세트를 갖는 합성된 올리고뉴클레오타이드 세트는 통상적으로 상이한 서열을 갖는 복수의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 것이며, 그 차이는 전체 서열 내 코돈 세트에 의해 확립된다. 본 발명에 따라 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 VNAR 핵산 주형에 혼성화할 수 있는 서열을 가지며, 또한 편리한 경우 제한 효소 부위를 포함할 수 있다.
"세포", "세포주" 및 "세포 배양"은 상호 혼용되며 (문맥상 달리 지시하지 않는 한) 이러한 명칭은 세포 또는 세포주의 모든 자손을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"와 같은 용어는 1차 대상 세포 및 전달 횟수에 관계없이 이로부터 유래된 배양물을 포함한다. 의도된 것이거나 의도되지 않은 돌연변이로 인해 모든 자손이 DNA 내용물에서 정확하게 동일하지 않을 수도 있다는 것이 또한 이해된다. 최초 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다.
발현을 지칭하는 경우, "제어 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 원핵 생물에 적합한 제어 서열은 예를 들어 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열, 리보솜 결합 부위 등을 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서와 같은 제어 서열을 사용한다.
용어 "외피 단백질"은 단백질의 적어도 일부가 바이러스 입자의 표면에 존재하는 단백질을 의미한다. 기능적 관점에서, 외피 단백질은 숙주 세포에서 바이러스 조립 과정 동안 바이러스 입자와 결합하고 다른 숙주 세포를 감염시킬 때까지 조립된 바이러스와 결합된 상태로 유지되는 임의의 단백질이다.
특정 분석에서 화학 물질에 대한 "검출 한계"는 해당 분석에 대한 배경 수준 이상으로 검출될 수 있는 해당 물질의 최소 농도이다. 예를 들어, 파지 ELISA에서, 특정 항원 결합 단편을 디스플레이하는 특정 파지에 대한 "검출 한계"는 특정 파지가 항원 결합 단편을 디스플레이하지 않는 대조군 파지에 의해 생성된 것보다 높은 ELISA 신호를 생성하는 파지 농도이다.
"융합 단백질" 및 "융합 폴리펩타이드"는 서로 공유결합된 2개의 부분을 갖는 폴리펩타이드를 지칭하며, 각각의 부분은 상이한 특성을 갖는 폴리펩타이드이다. 이 특성은 시험관내 또는 생체내 활성과 같은 생물학적 특성일 수 있다. 이 특성은 또한 표적 항원에의 결합, 반응의 촉매 작용 등과 같은 단순한 화학적 또는 물리적 특성일 수 있다. 이 두 부분은 단일 펩타이드 결합에 의해 직접 또는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드 링커를 통해 연결될 수 있다. 일반적으로, 이 두 부분과 링커는 서로 판독 프레임 내에 존재할 것이다. 바람직하게는, 폴리펩타이드의 두 부분은 이종 또는 상이한 폴리펩타이드로부터 획득된다.
본 명세서에서 용어 "융합 단백질"은 일반적으로 수소 결합 또는 염 가교를 포함하는 화학적 수단 또는 단백질 합성을 통한 펩타이드 결합 또는 둘 모두에 의해 함께 연결된 하나 이상의 단백질을 의미한다. 통상적으로, 융합 단백질은 DNA 재조합 기술에 의해 제조될 것이며, 본 명세서에서 재조합 융합 단백질로 지칭될 수 있다.
"이종 DNA"는 숙주 세포로 도입되는 임의의 DNA이다. DNA는 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 및 이들의 융합 또는 조합을 포함하여 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있다. DNA는 숙주 또는 수용체 세포와 동일한 세포 또는 세포 유형으로부터의 DNA 또는 상이한 세포 유형, 예를 들어 동종이계 또는 이종 공급원으로부터의 DNA를 포함할 수 있다. DNA는 선택적으로 마커 또는 선택 유전자, 예를 들어 항생제 내성 유전자, 내열성 유전자 등을 포함할 수 있다.
"매우 다양한 위치"는 공지의 및/또는 천연 발생 항체 또는 항원 결합 단편의 아미노산 서열과 비교하는 경우, 그 위치에 표시되는 다수의 상이한 아미노산을 갖는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역에 위치한 아미노산의 위치를 지칭한다. 매우 다양한 위치가 일반적으로 CDR 또는 HV 영역에 존재한다.
"동일성"은 서열을 비교함으로써 결정된 바와 같이 둘 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 관계를 기재한다. 동일성은 또한 경우에 따라 이러한 서열의 가닥 사이의 매칭에 의해 결정되는 바와 같이 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 서열 관련성 (상동성)의 정도를 의미한다. 2개의 폴리펩타이드 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 동일성을 측정하는 다수의 방법이 존재하지만, 동일성을 결정하기 위해 일반적으로 사용되는 방법은 컴퓨터 프로그램에서 코드화된다. 두 서열 사이의 동일성을 결정하기 위한 적절한 컴퓨터 프로그램은 다음에 제한되는 것은 아니나, GCG 프로그램 패키지 (문헌[Devereux, et al., Nucleic acids Research, 12, 387 (1984), BLASTP, BLASTN, and FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol. (1990) 215, 403])를 포함한다.
바람직하게는, 단백질의 아미노산 서열은 HGMP (Human Genome Mapping Project)에 의해 제공된 BLAST 컴퓨터 프로그램 (문헌[Atschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215, 403-410])의 디폴트 매개변수를 사용하여 아미노산 수준에서 본 명세서에 개시된 아미노산 서열에 대해 적어도 45% 동일성을 갖는다.
더욱 바람직하게는, 단백질 서열은 핵산 또는 아미노산 수준에서 본 명세서에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 대해 적어도 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 및 여전히 더욱 바람직하게는 95% (여전히 더욱 바람직하게는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 가질 수 있다.
단백질은 또한 HGMP에 의해 제공된 BLAST 컴퓨터 프로그램의 디폴트 매개변수를 사용하여 본 명세서에 개시된 서열과 적어도 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
"라이브러리"는 복수의 VNAR 또는 VNAR 단편 서열 (예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드), 또는 이들 서열을 인코딩하는 핵산을 지칭하며, 서열은 본 발명의 방법에 따라 이들 서열로 도입된 변이체 아미노산의 조합에서 상이하다.
"결찰"은 2개의 핵산 단편 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정이다. 두 단편의 결찰을 위해서는 단편의 말단이 서로 적용 가능해야 한다. 일부 경우에는, 엔도뉴클레아제 분해 후 말단이 직접적으로 적용 가능하게 될 수 있다. 그러나, 우선, 엔도뉴클레아제 분해 후 일반적으로 생성되는 점착 말단을 평활 말단으로 전환시켜 이를 결찰에 적용가능 하게 하는 것이 필요할 수 있다. 평활 말단이 되도록 하기 위해, 4개의 데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트의 존재하에 DNA 중합효소 I 또는 T4 DNA 중합효소의 Klenow 단편의 약 10 단위와 함께 적합한 완충액에서 15℃에서 적어도 15분 동안 DNA를 처리한다. 이어서 DNA를 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전 또는 실리카 정제에 의해 정제한다. 함께 결찰될 DNA 단편을 대략 등몰량으로 용액에 적용한다. 용액은 또한 ATP, 리가제 완충액, 및 리가제, 예컨대 T4 DNA 리가제를 0.5 μg의 DNA당 약 10 단위로 포함할 것이다. DNA를 벡터에 결찰시키는 경우, 벡터를 먼저 적절한 제한 엔도뉴클레아제 (들)로의 분해에 의해 선형화시킨다. 이어서 선형화된 단편을 박테리아 알칼리성 포스파타제 또는 송아지 장 포스파타제로 처리하여, 결찰 단계 동안 자가 결찰을 방지한다.
"돌연변이"는 야생형 서열과 같은 기준 뉴클레오타이드 서열과 대비한 뉴클레오타이드 (들)의 결실, 삽입 또는 치환이다.
"천연" 또는 "천연 발생" VNAR은 비합성 공급원, 예를 들어 엘라스모브란키 (Elasmobranchii) 아강의 동물의 혈청 또는 생체외에서 획득된 조직 공급원으로부터 확인된 VNAR을 지칭한다. 이들 VNAR은 천연 또는 다른 방식으로 유도된 임의의 유형의 면역 반응에서 생성된 VNAR을 포함할 수 있다. 천연 VNAR은 아미노산 서열, 및 이들 항체를 작제하거나 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 천연 VNAR은 "합성 VNAR"과 상이하며, 합성 VNAR은 예를 들어, 상이한 아미노산이 공급원 항체 서열과 상이한 항체 서열을 제공하는 상이한 아미노산을 갖는 특정 위치에서 아미노산 또는 하나 초과의 아미노산의 대체, 결실 또는 첨가에 의해 공급원 또는 주형 서열로부터 변화된 VNAR 서열을 지칭한다.
용어 "핵산 작제물"은 일반적으로 클로닝에 의해 획득되거나 화학적 합성에 의해 생성된 mRNA와 같은 DNA, cDNA 또는 RNA일 수 있는 임의의 길이의 핵산을 지칭한다. DNA는 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 단일 가닥 DNA는 코딩 센스 가닥일 수 있거나, 비코딩 또는 안티센스 가닥일 수 있다. 치료 용도를 위해, 핵산 작제물은 바람직하게는 치료될 대상체에서 발현될 수 있는 형태이다.
핵산을 지칭하는 경우, "작동 가능하게 연결된"은 핵산이 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 배치됨을 의미한다. 예를 들어, 전서열 (presequence) 또는 분비 리더 (secretory leader)의 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 관여하는 전단백질 (preprotein)로서 발현되는 경우, 폴리펩타이드의 DNA에 작동 가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되고; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하기 위해 위치되는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. 일반적으로, "작동 가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 인접하며, 분비 리더의 경우 일정하지 않으며, 판독 프레임 내에 있음을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접할 필요는 없다. 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의해 연결을 수행한다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커는 통상적인 실시예에 따라 사용된다.
용어 "단백질"은 일반적으로 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 복수의 아미노산 잔기를 의미한다. 이는 상호 혼용되고, 펩타이드, 올리고펩타이드, 올리고머 또는 폴리펩타이드와 동일함을 의미하며, 당단백질 및 그의 유도체를 포함한다. 용어 "단백질"은 또한 단백질의 단편, 유사체, 변이체 및 유도체를 포함하는 것으로 의도되며, 단편, 유사체, 변이체 또는 유도체는 기준 단백질과 필수적으로 동일한 생물학적 활성 또는 기능을 보유한다. 단백질 유사체 및 유도체의 예는 펩타이드 핵산 및 다르핀 (Designed Ankyrin Repeat Proteins)을 포함한다.
단백질의 단편, 유사체, 변이체 또는 유도체는 유래된 원래의 단백질 서열의 길이에 따라 적어도 25 바람직하게는 30 또는 40, 또는 최대 50 또는 100, 또는 60 내지 120개의 아미노산 길이일 수 있다. 일부 경우 90 내지 120, 100 내지 110개의 아미노산의 길이가 편리할 수 있다.
단백질의 단편, 유도체, 변이체 또는 유사체는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존되거나 비보존된 아미노산 잔기 (바람직하게는, 보존된 아미노산 잔기)로 치환되고, 이러한 치환된 아미노산 잔기가 유전자 코드에 의해 인코딩된 것이거나 인코딩되지 않을 수 있는 것, 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 것, 또는 (iii) 폴리펩타이드의 정제에 사용되는 리더 또는 보조 서열과 같은 성숙한 폴리펩타이드에 추가 아미노산이 융합된 것일 수 있다. 이러한 단편, 유도체, 변이체 및 유사체는 본 명세서의 교시로부터 당업자의 범위 내에 있는 것으로 고려된다.
"올리고뉴클레오타이드"는 공지된 방법 (예를 들어, 고체상 기술을 사용한 포스포트리에스테르, 포스파이트 또는 포스포르아미다이트 화학)에 의해 화학적으로 합성되는 짧은 길이의 단일 또는 이중 가닥 폴리데옥시뉴클레오타이드이다. 추가 방법은 유전자의 전체 핵산 서열이 공지되어 있거나, 코딩 가닥에 상보적인 핵산 서열이 이용 가능한 경우에 사용되는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 포함한다. 대안적으로, 표적 아미노산 서열이 공지된 경우, 각각의 아미노산 잔기에 대해 공지된 적절한 코딩 잔기를 사용하여 가능한 핵산 서열을 추론할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 폴리아크릴아미드 겔 또는 분자 크기 분석 컬럼 또는 침전에 의해 정제될 수 있다. DNA가 비-핵산 불순물 (극성, 비극성, 이온성 등일 수 있음)에서 분리되는 경우, DNA는 "정제"된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "공급원" 또는 "주형" VNAR은 항원 결합 서열이 본 명세서에 기재된 기준에 따른 다양화가 수행되는 주형 서열로서 기능하는 VNAR 또는 VNAR 항원 결합 단편을 지칭한다. 항원 결합 서열은 일반적으로 VNAR 내에 바람직하게는 프레임워크 영역을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함한다.
"전사 조절 요소"는 다음 성분들 중 하나 이상을 포함할 것이다: 인핸서 요소, 프로모터, 오퍼레이터 서열, 억제 유전자 및 전사 종결 서열.
"형질전환"은 세포가 DNA를 흡수하여 "형질전환체"가 되는 과정을 의미한다. DNA 흡수는 영구적이거나 일시적일 수 있다. "형질전환체"는 DNA와 관련된 표현형 (예를 들어, DNA에 의해 인코딩된 단백질에 의해 부여되는 항생제 내성)의 발현에 의해 나타나는 바와 같이 DNA를 흡수하여 유지하는 세포이다.
융합 단백질 (폴리펩타이드) 또는 이종성 폴리펩타이드 (파지에 이종성임)와 같은 출발 또는 기준 폴리펩타이드 (예를 들어, 공급원 VNAR 또는 그의 CDR)의 "변이체" 또는 "돌연변이체"는 (1) 출발 또는 기준 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖고, (2) 천연 또는 인위적 돌연변이 유발을 통해 출발 또는 기준 폴리펩타이드로부터 유래된 폴리펩타이드이다. 이러한 변이체는 예를 들어 대상 폴리펩타이드의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 예를 들어, (공급원 VNAR 또는 항원 결합 단편 내의 해당 위치에 존재하는 아미노산에 대하여) 변이체 아미노산을 갖는 서열을 인코딩하는 비무작위 코돈 세트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 생성된 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 공급원 VNAR 또는 항원 결합 단편에 대한 변이체 폴리펩타이드이다. 따라서, 변이체 CDR은 출발 또는 기준 폴리펩타이드 서열 (예를 들어, 공급원 VNAR 또는 항원 결합 단편의 서열)에 대해 변이체 서열을 포함하는 CDR을 지칭한다. 이와 관련하여, 변이체 아미노산은 출발 또는 기준 폴리펩타이드 서열 (예를 들어, 공급원 VNAR 또는 항원 결합 단편의 서열) 내의 해당 위치의 아미노산과 상이한 아미노산을 지칭한다. 최종 작제물이 적절한 기능적 특성을 갖는 경우, 최종 변이체 또는 돌연변이체 작제물을 달성하기 위해, 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다. 아미노산 변화는 또한 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것과 같이 폴리펩타이드의 번역 후 과정을 변이시킬 수 있다.
"야생형" 또는 "기준" 서열 또는 "야생형" 또는 "기준" 단백질/폴리펩타이드, 예컨대 외피 단백질 또는 공급원 VNAR의 CDR의 서열은 변이체 폴리펩타이드가 돌연변이의 도입을 통해 유도된 기준 서열일 수 있다. 일반적으로, 소정의 단백질에 대한 "야생형" 서열은 자연계에서 가장 일반적인 서열이다. 유사하게, "야생형" 유전자 서열은 자연계에서 가장 일반적으로 존재하는 유전자에 대한 서열이다. 돌연변이는 자연적 과정 또는 인간 유도 수단을 통해 "야생형" 유전자 (및 이에 따라 인코딩되는 단백질)에 도입될 수 있다. 이러한 과정의 생성물은 원래 "야생형" 단백질 또는 유전자의 "변이체" 또는 "돌연변이체" 형태이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "키메라 항원 수용체 (CAR)"는 예를 들어 인위적 T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체 또는 키메라 면역 수용체를 지칭할 수 있고, 특정 면역 효과기 세포에 인위적 특이성을 이식하는 조작된 수용체를 포함할 수 있다. CAR을 사용하여, 단일클론 항체 또는 VNAR과 같은 항원-특이적 결합 단백질의 특이성을 T 세포에 부여함으로써, 예를 들어, 입양 세포 요법에 사용하기 위해 다수의 특이적 T 세포를 생성할 수 있다. CAR은 예를 들어 종양 관련 항원에 대한 세포의 특이성을 유도할 수 있다. CAR은 세포내 활성화 도메인, 막관통 도메인, 및 종양 관련 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 특정 양상에서, CAR은 CD3-제타 막관통 및 엔도도메인에 융합된 단일클론 항체로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편 (scFv)의 융합을 포함한다. 다른 특정 양상에서, CAR은 본 명세서에 기재된 VNAR 도메인과 CD3-제타 막관통 및 엔도도메인의 융합을 포함한다. 다른 CAR 설계의 특이성은 수용체의 리간드 (예를 들어, 펩타이드) 또는 패턴 인식 수용체, 예컨대 덱틴 (Dectin)으로부터 유래될 수 있다. 특정 실시형태에서, B-계통 분자 CD 19에 특이적인 CAR을 사용하여 T 세포의 특이성을 재유도함으로써 악성 B 세포를 표적화할 수 있다. 특정 경우에, 항원-인식 도메인의 간격은 활성화-유도된 세포 사멸을 감소시키기 위해 변형될 수 있다. 특정 경우에, CAR은 CD3-제타, FcR, CD27, CD28, CD 137, DAP 10, 및/또는 OX40과 같은 추가적인 공동-자극 신호전달을 위한 도메인을 포함한다. 일부 경우에, 공동 자극 분자, 영상화를 위한 리포터 유전자 (예를 들어, 양전자 방출 단층 촬영), 전구약물의 첨가시 T 세포를 조건적으로 절제하는 유전자 산물, 원점 복귀 수용체(homing receptor), 케모카인, 케모카인 수용체, 사이토카인 및 사이토카인 수용체를 포함하여, 분자는 CAR과 함께 공동 발현될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "접합"은 둘 이상의 화학적 모이어티를 화학적으로 연결시키는 임의의 방법을 지칭할 수 있다. 통상적으로, 접합은 공유 결합을 통해 이루어질 것이다. 본 발명과 관련하여, 적어도 하나의 화학적 모이어티는 폴리펩타이드일 것이고, 일부 경우에 접합은 둘 이상의 폴리펩타이드를 포함할 것이고, 이들 중 하나 이상은 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 폴리펩타이드를 접합하기 위한 다수의 시스템이 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 접합은 N-하이드록시-숙신이미드를 사용하여 폴리펩타이드 분자에 존재하는 리신 잔기 또는 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르를 사용하여 폴리펩타이드 분자에 존재하는 시스테인 잔기를 통해 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 접합은 다음에 제한되는 것은 아니나, 에스테르, 카보네이트 에스테르, 카바메이트, 술페이트, 포스페이트, 아실옥시알킬 에테르, 아세탈 및 케탈, 히드라존, 옥심 및 디술파이드 연결을 포함하는 생리적으로 절단 가능한 연결을 포함하는 단기 작용 분해성 연결을 통해 이루어진다. 일부 실시형태에서, 접합된 폴리펩타이드 또는 단백질로부터 접합된 모이어티의 방출을 가능하게 하기 위해, 환원 조건 또는 산성 pH 하에서 절단 가능한 것으로, 세포내 또는 세포외 효소, 예를 들어 카텝신 패밀리 구성원에 의해 절단 가능한 링커가 포함된다.
특히 바람직한 접합 방법은 인테인-기반 기술의 사용이다 (US2006247417). 간단히 말하면, 대상 단백질은 조작된 인테인 도메인의 N 말단 융합으로서 발현된다 (문헌[Muir 2006 Nature 442, 517-518]). 단백질-인테인 결합에서 후속 N-S 아실 변화에 의해, 비스-아미녹시 제제 또는 아미노-티올로 화학적으로 절단되어 각각 적절한 단백질 C 말단 아미녹시 또는 티올 유도체를 제공할 수 있는 티오에스테르 연결된 중간체가 생성된다 (도 11). 이들 C 말단 아미녹시 및 티올 유도체는 화학 선택적 방식으로 각각 알데하이드/케톤 및 말레이미드 기능성 모이어티와 반응하여 부위-특이적 C 말단 변형 단백질을 제공할 수 있다 (도 25 내지 도 27).
다른 바람직한 접합 방법에서, VNAR의 C 말단 영역 또는 그 근처에 추가적인 시스테인을 갖는 VNAR이 직접 발현되거나, 말레이미드 기능성 모이어티와 같은 티올 반응성 페이로드와의 접합을 가능하게 하는 짧은 C 말단 태그 서열 내에 혼입된다.
본 명세서에 지칭된 바와 같은 접합은 또한 다수의 유용한 특성을 부여할 수 있는 링커 모이어티의 사용을 포함하는 것으로 의도된다. 링커 모이어티는 다음에 제한되는 것은 아니나, 폴리-글리신, gly-ser, val-cit 또는 val-ala와 같은 펩타이드 서열을 포함한다. 특정 경우에, 링커 모이어티는 특정 조건 하에서, 예를 들어 효소, 친핵성/염기성 시약, 환원제, 광 조사, 친전자성/산성 시약, 유기 금속 및 금속 시약 또는 산화제의 사용을 통해 절단 가능하도록 선택될 수 있거나, 링커는 특히, 이러한 조건 하에서 절단에 저항하도록 선택될 수 있다.
폴리펩타이드는 많은 목표를 달성하기 위해 다양한 기능성 모이어티에 접합될 수 있다. 기능성 모이어티의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 면역원성 및 항원성을 감소시키거나 용해도를 향상시키기 위해 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체를 포함한다. 추가의 비제한적 예는 폴리펩타이드를 치료제 또는 세포독성제에 접합시키는 것을 포함한다.
용어 "검출 가능한 표지"는 본 명세서에서 분광, 광화학, 생화학, 면역화학, 전기, 광학, 화학 또는 다른 수단에 의해 대상물을 시각화하거나 그외에는 검출할 수 있음을 명시하기 위해 사용된다. 검출 가능한 표지는 측정될 수 있고, 그 강도가 결합된 대상물의 양에 비례하는 신호를 생성하도록 선택될 수 있다. 단백질 및 펩타이드를 표지 및/또는 검출하기 위한 다양한 시스템이 당 업계에 공지되어 있다. 표지는 직접 검출 가능한 것일 수 있거나 (즉, 검출 가능하게 하기 위해, 임의의 추가 반응 또는 조작이 필요하지 않으며, 예를 들어, 형광단은 직접 검출 가능함), 간접적으로 검출 가능한 것일 수 있다 (즉, 이는 검출 가능한 다른 대상물과의 반응 또는 결합을 통해 검출 가능하며, 예를 들어, 합텐 (hapten)은 형광단과 같은 리포터를 포함하는 적절한 항체와의 반응 후 면역염색에 의해 검출 가능할 수 있음). 적합한 검출 가능한 제제는 다음에 제한되는 것은 아니나, 방사성 핵종, 형광단, 화학발광제, 미립자, 효소, 비색 표지, 자기 표지, 합텐, 분자 비콘 (beacon) 및 앱타머 (aptamer) 비콘을 포함한다.
시험관내 또는 환자에서 ROR1을 발현하는 세포의 사멸 또는 억제 방법이 본 명세서에서 고려되며, 일반적으로, 세포와 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "사멸"은 세포 사멸을 야기하는 것을 의미한다. 이는 괴사 또는 다른 세포 손상 또는 아폽토시스의 유도와 같은 다수의 메커니즘에 의해 달성될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 경우, "성장 억제" 또는 "증식 억제"라는 어구는 세포 발생의 방지, 더욱 구체적으로 세포 분열의 방지를 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 추가로 이해될 것이다.
실시예
실시예 1 - 특이적 항-ROR1 VNAR 서열의 생성
합성 라이브러리로부터의 특이적 VNAR 서열
특정 ROR1 결합제에 대한 VNAR 합성 도메인 라이브러리 (WO2014173959)를 스크리닝하기 위해 2개의 선택 방식을 적용하였다. 첫 번째 방식은 인간 ROR1 항원 및 두 번째로 사용된 마우스 ROR1 항원을 사용하였다. 항원 제시 및 선택 과정을 지원하기 위해, 두 재조합 ROR1 단백질 모두를 제조업체의 지시 (Thermo Scientific Sulfo-NHS-LC-Biotin protocol, Cat N 21327)에 따라 비오티닐화하였다. 스트렙타비딘-코팅된 비드에 고정된 이들 비오티닐화된 ROR1 항원을 사용하여 3회의 선택 후 VNAR 도메인을 단리하였다. 선택 후 및 개별 클론의 스크리닝 후, VNAR 도메인을 디스플레이하는 단일클론 파지의 70% (인간 ROR1 단백질에 대해 선택됨)가 인간 및 마우스 ROR1에 특이적인 것으로 나타났지만, 밀접하게 관련된 ROR2 단백질에는 특이적이지 않았다 (이 선택으로부터의 주요 클론 B1 - 40% 및 E7 - 30%로 언급됨) (도 1). 유사하게, 마우스 ROR1로 선택된 단일클론 파지의 45%는 인간 및 마우스 ROR1에 특이적이지만 ROR2에는 특이적이지 않았다 (이 선택의 주요 클론은 P3A1로 언급됨, 도 1). 마우스 ROR1 스크리닝으로부터 획득된 또 다른 특정 클론은 CPF7이며, 이는 200개의 스크리닝된 클론 중 단일 서열로서 존재하였다.
인간 ROR1에 의한 스크리닝으로부터 획득된 서열은 B1 및 E7이고, 마우스 ROR1에 의한 스크리닝으로부터 획득된 서열은 P3A1 및 CPF7이다 (도 2).
면역화된 라이브러리로부터의 특정 VNAR 서열
라이브러리 작제
3마리의 곱상어를 재조합 인간 ROR1 단백질의 세포외 도메인으로 면역화시키고, 문헌[M
Figure pct00009
ller M.R. et al. Generation and Isolation of Target-Specific Single-Domain Antibodies from Shark Immune Repertoires, Humana Press 2012]에 기재된 바와 같이 면역화 후 혈청의 분석을 통해 표적-특이적 IgNAR 면역 반응을 모니터링하였다. 면역화 전 및 면역화 후 혈청 샘플을 동물로부터 채취하여 ELISA에서 항원 결합에 대해 시험하였다. 인간 ROR1에 특이적인 IgNAR 역가 증가가 모든 동물에서 16주 후에 관찰되었다 (도 3). 마우스 ROR1에 대한 면역 후 혈청의 특이성이 또한 종 교차 반응성 ROR1 특이적 IgNAR 결합제의 면역화된 동물에서의 존재를 나타내는 것으로 관찰되었다 (도 3).
문헌[M
Figure pct00010
ller M.R. et al. Generation and Isolation of Target-Specific Single-Domain Antibodies from Shark Immune Repertoires, Humana Press 2012]에 기재된 바와 같이 VNAR 레퍼토리 (IgNAR의 결합 부위)를 특이적 PCR 프라이머를 사용하여 돔발상어 혈액으로부터 증폭시키고, 파지 디스플레이 백터에 클로닝하였으며, 이는 박테리오파지 M13 유전자의 인-프레임 외피 단백질 pIII을 포함하였다. 라이브러리 크기를 계산하였으며, 이는 표 1에 제시되어 있다.
Figure pct00011
항원 특이적 VNAR 서열에 대한 면역화된 라이브러리의 스크리닝.
재조합 마우스 ROR1 단백질을 면역화된 라이브러리 (ELSI 5-7)를 스크리닝하기 위해 사용하였다. 합성 라이브러리를 스크리닝하는데 사용된 것과 유사한 프로토콜에 따라, 스트렙타비딘-코팅된 비드에 고정된 비오티닐화 ROR1 항원을 사용하여 3회의 선택 후 VNAR 도메인을 단리하였다. 선택 과정 후, VNAR 도메인을 디스플레이하는 단일클론 파지의 45% (3개의 라이브러리로부터의 조합된 결과)는 인간 및 마우스 ROR1에 특이적이었다. ROR1 특이적 VNAR의 1/3은 서열 D3 (도 4 및 도 5)을 가졌으며, 나머지 2/3는 서열 E9 (도 4 및 도 5)를 갖는 것으로 나타났다.
마우스 ROR1로 스크리닝하여 획득된 서열은 E9 및 D3이다. (도 5).
모든 주요 항-ROR1 VNAR 단백질을 TG1 E. 콜라이 또는 HEK293 포유류 세포에서 발현시키고, IMAC를 각각 주변 세포질 분획 또는 세포 상청액으로부터 정제하였다.
방법
혈청 ELISA에서의 IgNAR 역가
ELISA를 다음 프로토콜을 사용하여 수행하였다:
1. 100 μl/웰의 1 mg/ml의 인간 ROR1-Fc 또는 마우스 ROR1-Fc 또는 PBS로 ELISA 플레이트를 코팅한다. 밤새 4℃에서 인큐베이션한다.
2. 플레이트를 PBST로 3회 세척한다.
3. 200 μl/웰 2% (w/v) M-PBS를 첨가하여 플레이트를 차단하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
4. 플레이트를 PBST로 3회 세척한다.
5. PBS 중 돔발상어 혈청을 최소한 1:10에서 1:1000까지 연속 희석하고, 100 μl/웰을 첨가한다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
6. 플레이트를 PBST로 3회 세척한다.
7. PBST에서 하이브리도마 조직 배양 상청액으로 희석된 100 μl/웰 1차 항체 (마우스 단일클론 항-IgNAR 항체, GA8)를 첨가한다.
8. 플레이트를 PBST로 3회 세척한다.
9. PBS에 희석된 적합한 2차 항-마우스 IgG HRP 접합체 100 μl/웰을 첨가한다. 1시간 동안 인큐베이션한다.
10. PBST로 플레이트를 2회 세척한 다음 PBS로 2회 세척한다.
11. 플레이트에 100 μl/웰의 TMB 기질을 첨가하고, 신호의 출현/포화 개시까지 인큐베이션한다. 0.18 M H2SO4의 100 μl/웰을 첨가하여 발색을 중지시킨다.
12. 마이크로타이터 플레이트 판독기로 450 nm에서 판독한다.
라이브러리 스크리닝
1. 선택을 위한 라이브러리 파지를 회수하기 위해, 라이브러리 글리세롤 스톡으로부터의 배양물을 37℃ 및 250 rpm에서 2xTY, 2% 글루코스, 100 μg/ml 암피실린에서 0.5의 OD600으로 성장시켰다.
2. 세포를 109 M13K07 헬퍼 파지 (NEB)로 초 감염 (super-infection)시킨 후, 25℃ 및 250rpm에서 2xTY, 100 μg/ml 암피실린, 50 μg/ml 카나마이신에서 밤새 인큐베이션하였다.
3. 파지를 박테리아 배양물로부터 2회 PEG-침전 (20% PEG/2.5 M NaCl)시키고, 생성된 파지 펠렛을 1 ml PBS에 재현탁시켰다.
4. 2% (w/v) MPBS로 사전 차단된 200 μl의 Dynabeads M-280 스트렙타비딘 (Invitrogen # 11205D)을 400nM 비오티닐화 마우스 ROR1로 코팅하고, 실온에서 20 rpm으로 1시간 동안 교반하였다.
5. 라이브러리 파지를 실온에서 1시간 동안 교반시키면서 Dynabead와 함께 인큐베이션함으로써 선택 해제한 후, 항원-코팅된 비드에 첨가하였다.
6. 비드를 PBST로 5 내지 10회 및 PBS로 5 내지 10회 세척하고, 400 μl 100 mM TEA에서 8분 동안 교반시켜 용리시키고, pH 7.5의 200 μl 1M Tris-HCl의 첨가에 의해 중화시켰다.
7. E. 콜라이 TG1 세포 (10 ml)를 37℃에서 30분 동안 300 μl의 용리된 파지로 감염시키고, 2% (w/v) 글루코스 및 100 μg/ml 암피실린 포함하는 TYE 한천 플레이트 상에서 37℃에서 밤새 성장시켰다.
8. 3회의 추가 선택을 수행하고, 인간 또는 마우스 ROR1에 대한 단일클론 파지 및 주변 세포질 추출물 ELISA에 의한 항원-특이적 결합에 대해 결과물을 스크리닝하였다. 파지 결합제를 HRP-접합된 항-M13 항체 (GE Healthcare, 27942101)를 사용하여 검출하고, 주변 세포질 단백질을 HRP-접합된 항-c-Myc 항체를 사용하여 검출하였다 (문헌[Roche, 118 141 50 001]).
E. 콜라이에서 VNAR 발현
1. 포스페이트 염, 1% 글루코스, 100 μg/ml 암피실린이 포함된 TB 배지에서 밤새 배양물을 1:50으로 희석시키고, 하루 종일 격렬한 진탕 (250 rpm)으로 37℃에서 인큐베이션한다.
2. 20℃에서 20분 동안 3,000 x g에서 원심분리하여 세포를 펠렛화한다.
3. 포스페이트 염, 100 μg/ml 암피실린 (글루코스 무함유)이 포함된 동일한 부피의 TB 배지에서 세포를 재현탁시켰다.
4. IPTG를 1 mM IPTG의 최종 농도로 첨가하고, 250 rpm에서 진탕하면서 16℃에서 밤새 (16시간) 인큐베이션한다.
5. 6,000 x g에서 30분 동안 원심분리하여 세포를 수집한다 (펠렛은 이 시점에서 -20℃에서 동결할 수 있음).
6. 펠렛을 10% 배양 부피의 빙냉 TES에 재현탁시키고, 15분 동안 얼음 위에서 부드럽게 진탕시킨다.
7. 동일한 부피의 빙냉된 5 mM MgSO4 (2.5 mM 최종 농도의 MgSO4)를 첨가하고, 계속하여 15분 동안 얼음 위에서 부드럽게 진탕시킨다.
8. 4℃에서 30분 동안 15,000 xg에서 원심분리하여 현탁액을 펠렛화하고, 방출된 주변 세포질 단백질을 포함하는 상청액을 깨끗한 팔콘에 조심스럽게 따라내었다.
9. IMAC 인큐베이션 전에 10x PBS pH 7.4 [최종 농도의 1xPBS]를 사전 제조 추출물에 첨가한다.
HEK293에서의 VNAR 발현
10 ml 배양을 위한 물 중 10 μg DNA (멸균 여과).
50 ml 생물반응기 튜브에서 10 ml의 세포 (약 106/ml)를 사용한다 (새로운 배지에서 세포를 급격하게 성장시킴).
DNA에 OptiMEM 배지를 총 부피 500 μl로 첨가한다.
별도의 500 μl OptiMEM 배지에 25 μl의 PEI (물로 제조된 1 mg/ml 스톡)를 첨가한다.
DNA 및 PEI를 실온에서 최대 15분 동안 인큐베이션한다.
배지 중의 각각 500 μl의 PEI를 배지 중의 500 μl의 DNA에 혼합한다.
20 내지 30분 동안 실온에서 인큐베이션하여, 복합체 형성을 촉진하였다.
1 ml의 혼합물을 세포에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 진탕 140 rpm에서 인큐베이션한다.
다음날 250 μl의 20% (w/v) 트립톤을 10 ml의 세포에 첨가하여, 트립톤 0.5%의 최종 농도를 획득하여 세포에 공급한다.
세포를 3 내지 5일 동안 발현되도록 방치한다.
세포를 스핀(spin)시키고, 분비된 단백질에 대한 상청액을 평가하여 생성성을 결정한다.
IMAC 인큐베이션 전에 10x PBS pH 7.4 [최종 농도의 1xPBS]를 사전 제조 추출물에 첨가한다.
이 프로토콜은 단백질 생성에 필요한 바에 따라 확대 또는 축소될 수 있다.
단백질 발현 (규모 확장)
ROR1 결합 VNAR 단백질은 수개의 상이한 발현 시스템에서 다수의 상이한 형태로 적절하게 발현되었다. 단백질 정제, 처리 및 단백질 분석을 지원하기 위해 His 및 His6Myc를 포함하는 표준 C 말단 태그를 첨가한 경우, 표적 ROR1에 대한 ROR1 VNAR의 결합에 영향을 미치지 않았다 (표 2).
인간 ROR1 및 ROR2에 대한 상이한 C 말단 태그를 갖는 VNAR의 결합에 대한 SPR 데이터
VNAR C-말단 태그 hROR1 hROR2
Ka (M-1s-1) Kd (s-1) KD (nM)
B1 6xHis 2.33E+06 1.91E-04 0.11 결합하지 않음
6xHis myc 7.47E+05 6.09E-04 0.83 결합하지 않음
P3A1 6xHis 2.92E+06 2.06E-02 7.8 결합하지 않음
6xHis myc 9.8E+05 2.5E-02 25.6 결합하지 않음
P3A1 이량체 태그 없음 1.67E+06 5.98E-04 0.36 결합하지 않음
6xHis myc 2.08E+06 6.37E-04 0.35 결합하지 않음
또한, VNAR C 말단 태그는 원형 이색성 (도 6-VNAR의 CD 스펙트럼) (Glasgow University, UK)에 의해 측정되는 바와 같이, VNAR 구조에 영향을 미치지 않는다.
또한 표지 및 약물에의 부위 특이적 접합을 가능하게 하기 위해, N 말단 융합으로서, 마우스 및 인간 IgG Fc 서열에 유전자 융합된 VNAR을 발현시켰다. 사용된 발현 시스템은 E. 콜라이 (주변 세포질 및 세포질 발현), HEK 293 및 CHO (Evitria Fc 융합 단백질)를 포함한다.
실시예 2 - VNAR 재구성
동종이량체
ROR1 결합 VNAR은 표준 GlySer 기반 링커를 사용하여 유전자 융합에 의해 동종이량체로 성공적으로 재형성시켰다 (도 7b). 이종이량체는 SPR 및 ELISA에 의해 재조합 hROR1에 대한 친화도가 증가하고, 유세포 분석법에 의해 ROR1 양성 암 세포주에서 세포 표면 ROR1에 대한 결합이 증가한 것으로 나타났다 (도 9). 유세포 분석 실험은 실시예 4에 보다 상세하게 기재되어 있다.
또한, 화학적 접합을 통해 ROR1 결합 VNAR 동종이량체를 성공적으로 생성시켰다. VNAR을 인테인 융합 단백질로서 발현시키고, 시스테아민으로 절단하여, C 말단 티올 유도체를 생성한 다음, C 말단 분자간 이황화 형성을 통해 동종이량체로 자가-결합시켰다 (도 7c). 이 이황화 결합 동종이량체는 ELISA에 의해 재조합 hROR1에 대한 결합 친화도가 증가된 것으로 나타났다 (도 8). 인테인 융합 단백질의 생성은 실시예 8에서 보다 상세하게 논의된다.
이종이량체
ROR1 결합 VNAR 이종이량체를 표준 GlySer 링커 또는 대안적으로 PGVQPSPGGGGS (서열번호 63) 또는 PGVQPAPGGGGS (서열번호 64) 링커와의 유전자 융합에 의해 생성시켰으며(도 7d), 재조합 ROR1 및 ROR1 양성 세포에 대한 높은 친화도 특이적 결합을 나타내었다. 또한 화학적 접합에 의해 이종이량체 VNAR 단백질을 생성시킬 수 있다.
결합 특성화 실험 결과를 표 3 및 표 4(실시예 3 참조) 및 표 18, 19, 20(실시예 10 참조)에 표로 나타내었다.
VNAR Fc 융합 단백질
Fc 도메인에 단백질을 융합시키면, 단백질 용해도 및 안정성이 개선되고, 혈장 반감기가 현저하게 증가하며, 전반적인 치료 효과가 향상될 수 있다. ROR1 결합 VNAR을 표준 GlySer 링커를 통해 마우스 IgG2a Fc (mFc)의 N 말단 및 인간 IgG1 (hFc)의 N 및 C 말단 둘 모두에 유전자 융합시켰다 (도 7e, 도 7f, 도 7g). Fc 서열의 예
마우스 IgG2a Fc (mFc)
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK (서열번호 95)
인간 IgG1 Fc (hFc)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 96)
VNAR Fc 융합 단백질을 CHO K1 세포에서 분비된 단백질로서 발현시키고, MabSelect™ SuRe™ (Evitria, Switzerland)를 사용하여 배지로부터 정제하였다. 정제된 단백질을 SEC (AdvanceBio, Agilent), SDS PAGE 및 질량 분석법으로 분석하여 서열 및 단백질 완전성을 확인하였다. 생성된 VNAR Fc 융합 단백질은 SPR (표 6), ROR1 양성 세포에 의해 높은 친화도로 재조합 인간 ROR1에 결합하고 (도 15), ROR1 양성 세포로 내재화되는 것으로 나타났다. 또한 부위 특이적 표지를 가능하게 하기 위해, 예를 들어 위치 S252C 또는 S473C (카밧 넘버링)에서 hIgG1 Fc 서열에 조작된 시스테인 치환이 혼입된 조작된 hIgG1 Fc 융합 단백질에 ROR1 결합 VNAR을 유전자 융합시켰다(도 10).
VNAR 인테인 융합 단백질의 통상적인 발현 방법
인테인 융합로서의 발현을 위해, VNAR을 인코딩하는 DNA를 E. 콜라이 발현 (GeneArt, Thermo)에 대해 최적화하고, pTXB1 벡터 (NEB) 및 그의 유도체의 NdeI/SapI 부위에 클로닝하였다. 이에 의해, 조작된 인테인 도메인에 융합된 대상 VNAR 단백질을 인코딩하는 유전자를 생성시킨 후, 키틴 컬럼 상 정제를 가능하게 하기 위해, 키틴 결합 도메인 (CBD)에 융합시켰다. pTXB1 벡터 유도체는 융합 단백질로서 대안적인 인테인을 인코딩한다.
형질전환된 E. 콜라이 세포를 OD600 = 약 0.6이될 때까지 1 L 진탕기 플라스크에서 성장시키고, 4℃에서 2시간 동안 냉 충격시킨 후, 18℃에서 밤새 0.5 mM IPTG로 단백질 발현을 유도하였다. 용해 완충액 (50 mM 인산나트륨 pH 7.4, 0.5 M NaCl, 15% 글리세롤, 0.5 mM EDTA, 0.1% Sarkosyl, 1 mM AEBSF)에서 초음파 처리하여 세포를 용해시키고, 원심분리하여 세포 잔해물을 제거하였다. VNAR 인테인 융합 단백질을 키틴 비드 (NEB, S6651)에 고정시킴으로써 정화된 세포 용해물로부터 정제하였다. 비드를 용해 완충액으로 광범위하게 세척한 후, 절단 완충액 (50 mM 인산나트륨 pH 6.9, 200 mM NaCl)으로 세척하고, VNAR을 400 mM 디옥시아민, 또는 O,O'-1,3-프로판디일비스히드록실아민, 또는 100 mM 시스테인 또는 시스테아민 중에서 밤새 화학적 절단에 의해 비드로부터 방출시켜, VNAR의 해당 C 말단 아미녹옥시, C 말단 시스테인 또는 C 말단 티올 유도체를 생성시켰다 (도 11).
이어서 절단된 VNAR 상청액을 SEC (Superdex75 26/60 GE Healthcare) 및/또는 IMAC (HisTrap HP, GE Healthcare)에 의해 추가로 정제하였다. 아미노산 서열로부터 예측된 이론적 소광 계수를 사용하여 280 nm에서의 흡광도로부터 농도를 결정하였다. 모든 단백질을 환원 및 비 환원 SDS PAGE 분석 및 질량 분석법에 의해 특성화하였다. 적절한 이황화 결합의 형성을 질량 분석법에 의해 확인하였다.
실시예 3 - 항-ROR1 VNAR 특성화 -
SPR 및 ELISA에 의한 ROR1 및 ROR2에 대한 결합
ROR1 VNAR 결합제의 종 교차-반응성
가용성 VNAR 단백질 클론 (B1, P3A1 및 D3)을 양성 대조군 항체 2A2 및 항 ROR2 특이적 항체 대조군과 함께 인간, 마우스 및 랫트 ROR1과 종 교차 반응성에 대해 분석하였다. 2A2는 항-인간 ROR1 특이적 마우스 단일클론 항체 (BioLegend Cat # 2357802)이고, 항 ROR2 항체는 R&D Systems (Cat # MAB2064)의 시판 단일클론 마우스 항체이다.
VNAR B1은 마우스 및 인간 ROR1 둘 모두에 대해 매우 강한 결합제인 것으로 관찰되었다. 모든 VNAR은 인간, 마우스 및 랫트 기원으로부터 유래된 ROR1에 대해 종 교차 반응성이다 (표 3 및 표 4). VNAR 클론은 인간 ROR2와 교차 반응하지 않았다 (표 3).
인간 ROR1, 인간 ROR2, 마우스 ROR1 또는 랫트 ROR1에 대한 결합 동역학의 결정
결합 동역학을 Pioneer 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기기 (SensiQ/Pall ForteBio)를 사용하여 측정하였다. 아민 연결을 사용하여 ROR1-hFc 또는 ROR2-hFc 융합 단백질 (세포외 도메인)을 아세트산 나트륨 pH5 완충액에서 COOH2 칩에 고정시켰다. VNAR 및 VNAR-Fc 분자를 다양한 농도로 시험하고, QDat 소프트웨어 (SensiQ/Pall ForteBio)를 사용하여 Ka (M-1s-1), Kd (s-1) 및 KD (nM) 값을 결정하였다. ROR1 2A2 mAb (Biolegend) 및 ROR2 mAb (R&D Systems)는 ROR1 및 ROR2에 대한 양성/음성 결합에 대한 대조군으로서 포함되었다. 2V는 나이브 VNAR 라이브러리로부터 유래된 대조군 VNAR 서열이므로, 이 단백질 부류를 나타내지만 공지된 표적은 없다.
인간 ROR1 (hROR1) 및 인간 ROR2 (hROR2)에 대한 VNAR 분자의 결합에 대한 SPR 데이터. C 말단 His6 또는 His6Myc 태그 VNAR을 발현시켰다.
VNAR hROR1 hROR2
발현 시스템 Ka (M -1 s -1 ) Kd (s -1 ) KD (nM)
B1 E. 콜라이 6.29E+05 7.93E-04 1.6 결합하지 않음
B1 HEK293 5.36E+05 2.26E-03 0.63 결합하지 않음
P3A1 E. 콜라이 2.47E+06 4.42E-02 19.1 결합하지 않음
CPF7 E. 콜라이 2.33E+06 2.96E-02 13.6 결합하지 않음
E7 E. 콜라이 1.11E+06 1.18E-02 11.1 결합하지 않음
D3 E. 콜라이 2.09E-05 3.24E-02 159.1 결합하지 않음
D3 HEK293 1.39E+06 7.52E-02 54.5 결합하지 않음
E9 HEK293 4.23E+05 4.45E-02 136.6 결합하지 않음
P3A1-[G4S]5-P3A1 HEK293 4.9E+06 1.12E-03 0.30 결합하지 않음
D3-[G4S]5-D3 E. 콜라이 2.95E+06 3.38E-03 2.33 결합하지 않음
P3A1-[G4S]5-B1 E. 콜라이 3.13E+06 2.08E-03 1.0 결합하지 않음
P3A1-[G4S]3-B1 E. 콜라이 1.09E+06 2.84E-03 2.7 결합하지 않음
P3A1-[G4S]7-B1 E. 콜라이 1.49E+06 6.44E-03 4.3 결합하지 않음
2V E. 콜라이 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음
2V-[G4S]5-2V E. 콜라이 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음
마우스 ROR1 (mROR1) 및 랫트 ROR1 (rROR1)에 대한 결합에 대한 SPR 데이터
VNAR 발현 시스템 mROR1 rROR1
Ka (M-1s-1) Kd (s-1) KD (nM) Ka (s-1) Kd (M-1s-1) KD (nM)
B1 E. 콜라이 4.32E+05 2.09E-03 5.2 1.2E+05 1.11E-02 94.5
B1 HEK 293 7.2E+05 1.51E-03 2.18 1.16E+05 6.51E-03 56.5
P3A1 E. 콜라이 2.95E+06 4.08E-02 14.3 2.86E+06 4.5E-02 17.7
CPF7 E. 콜라이 2.26E+06 3.2E-02 19.1 7.72E+05 3.66E-02 68.6
E7 E. 콜라이 1.41E+06 2.0E-03 1.4 ND ND ND
P3A1-[G4S]5-P3A1 HEK 293 4.17E+06 1.45E-03 0.396 3.18E+06 1.73E-03 0.57
2V E. 콜라이 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음
2V-[G4S]5-2V E. 콜라이 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음
VNAR 단백질을 개발하였으며, 이는 단량체 및 다량체 형태 (동종 및 이종 이량체 형태 둘 모두)로 인간 ROR1 ECD에 높은 친화도로 결합하고, 밀접하게 관련된 패밀리 구성원 인간 ROR2에 결합하지 않으며, 높은 친화도로 ROR1의 마우스 및 랫트 오쏘로그에 교차 반응한다. 이량체로서 P3A1 및 D3 단백질을 재형성함으로써, 인간 ROR1에 대한 결합 친화도가 유의하게 증가하였으며, 해리 속도 상수의 유의한 감소가 관찰되었다.
hROR1에 대해 화학적으로 접합된 B1 동종이량체의 결합을 또한 ELISA에 의해 평가하였다. 이 분자를 생성하기 위해, 시스테아민에 의한 해당 B1-인테인 융합 단백질 전구체의 화학적 절단을 통해 고유한 C 말단 티올 작용기를 갖는 B1 유도체를 생성시켰다. 분자간 이황화 결합 형성을 사용하여 두 단백질의 C 말단을 공유 결합에 의해 연결함으로써, 천연 발생은 아니지만, 규정된 토폴로지의 동종이량체를 생성하였다 (B1-S-S-B1, 도 7c). hROR1에 대한 B1-S-S-B1의 결합을 ELISA에 의해 B1 단량체와 비교하였다.
간단히 말하면, ELISA 방법은 다음과 같다. 웰을 100 ng 항원으로 코팅하고 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하여 도포하였다. 플레이트를 PBST (PBS + 0.05% Tween 20 (v/v))로 웰당 400 ul로 3회 세척한 다음, 37℃에서 1시간 동안 PBST에서 4% 탈지 분유 (w/v)로 차단하였다. 플레이트를 이전과 같이 세척하고 PBS 단독으로 추가 세척하였다. 결합 단백질을 4% 우유 PBST에 희석시키고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 3회, PBS로 3회 세척하고, 실온에서 1시간 동안 4% 우유 PBST 중 적절한 2차 검출 항체를 사용하여 결합을 검출하였다. 사용되는 2차 항체는 다음과 같다.
항-c-Myc, HRP (Invitrogen #R951-25)
토끼 항-인간 IgG H&L, HRP (Abcam #ab6759)
토끼 항-마우스 IgG H&L, HRP (Abcam #ab97046)
마우스 항-폴리His, HRP (Sigma #A7058)
플레이트를 PBST로 3회 세척하였다. 100 μl TMB 기질 (Thermo# 34029)을 첨가하고 반응을 실온에서 10분 동안 진행시켰다. 반응을 종결시키기 위해 100 μl의 2 M H2SO4를 첨가하였다. 플레이트를 간단하게 원심분리하고, CLARIOstar 플레이트 판독기 (BMG Labtech)에서 450 nm 흡광도를 판독하였다.
B1 단량체 및 C 말단 티올 유도체는 인간 ROR1에 강하게 결합하지만, 화학적으로 연결된 B1-S-S-B1 이량체에 대한 인간 ROR1 결합의 증가가 관찰되었다 (도 8).
실시예 4 - 항-ROR1 VNAR 특성화 - 유세포 분석에 의한 세포 결합 및 내재화
세포 표면 결합
37%에서 약 10분 동안 또는 세포가 쉽게 분리될 때까지 0.1% EDTA/PBS 용액과 함께 인큐베이션함으로써 조직 배양 플라스크로부터 부착성 인간 암 세포를 분리시켰다. 세포를 15 ml 튜브에서 5 ml 빙냉 PBS/2% FCS에 재현탁시키고 4℃에서 5분 동안 1500rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 세포 펠렛을 1 내지 2 ml의 PBS/2% FCS에 재현탁시켰다. Z1 Coulter Particle Counter (Beckman Coulter)를 사용하여 세포 계수를 수행하였고, 시험 샘플당 5 x 10^5개의 세포를 분취하였다. 세포를 얼음상에서 1시간 동안 100 μl의 VNAR (His6Myc 태그), VNAR-Fc 분자 또는 ROR1 mAb 및 IgG 대조군과 함께 인큐베이션하였다. 5 ml의 빙냉 PBS/2% FCS를 첨가하여 과량의 VNAR, VNAR-Fc 또는 mAb를 제거한 후, 4℃에서 5분 동안 1500 rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 1 ml의 빙냉 PBS/2% FCS에 세포 펠렛을 재현탁시킴으로써 두 번째 세척을 수행하고, 추가로 4 ml의 빙냉 PBS/2% FCS를 첨가하였다. 샘플을 다시 4℃에서 5분 동안 1500 rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 티슈 페이퍼 상에 튜브를 블롯팅함으로써 과량의 액체를 제거하였다. 적절한 2차 항체를 사용하여 결합된 VNAR (His6Myc), VNAR-hFc, VNAR-mFc 또는 ROR1 mAb (PE-항-Myc 태그 항체 (CST), PE-항-인간 항체 (JIR labs/Stratech) 및 PE-항-마우스 항체 (JIR/Stratech)를 검출하였다. 세포를 얼음상에서 30분 동안 선택된 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 전술한 바와 같이 세포를 세척하여 과량의 항체를 제거하였다. 세포 펠렛을 0.5 ml의 빙냉 PBS/2% FCS에 재현탁시키고, 암소에서 얼음 상에 방치한 후, FACS Calibur (BD Biosciences) 또는 Attune NxT (ThermoFisher) 유세포 분석기로 분석하였다.
암 세포주의 패널에 대한 VNAR의 결합
도 9는 ROR1hi A549 폐 선암종 세포에 결합하는 항 ROR1 VNAR의 결합에 대한 유세포 분석 히스토그램의 개략도를 보여준다.
도 13은 고정된 농도의 단백질에서 유세포 분석에 의한 ROR1hi A549 폐 선암종 세포 및 ROR1low 폐암 세포주 A427에 대한 상이한 VNAR의 결합을 보여준다.
표 5는 다양한 ROR1hi 및 ROR1low 암 세포주에 대한 VNAR 단백질의 결합에 대한 유세포 분석 데이터의 요약을 보여준다.
유세포 분석에 의해 확인된 인간 암 세포주에서 VNAR 세포 표면 결합의 상대적 순위. '+'의 개수는 결합 강도에 해당한다. ‘-’는 결합하지 않음을 나타낸다. '/'는 이 세포주에서 결정되지 않았다.
중앙값 (YL1-PE) 또는 기하 평균 (FL2-PE) 기준
분자 A549
(ROR1hi)		 A427
(ROR1low)		 MDA-MB-231 (ROR1hi) T47D
(ROR1low)		 HT-29
(ROR1hi)		 Colo205
(ROR1low)
B1 +++++ + +++ ++ +++ +
E7 ++++ + +++ ++ +++ +
P3A1 + - + +/- + -
CPF7 ++ - + +/- + -
P3A1-[G4S]5 -P3A1 이량체 +++ - ++ / / /
CPF7-[G4S]5-CPF7 이량체 +++ ++ / / / /
P3A1- [G4S]5-B1 ++++ - +++ / / /
D3 + - / / / /
D3-[G4S]5-D3 이량체 ++++ - ++ / / /
2V - - - - - -
2V-[G4S]5-2V 이량체 - - - - - -
ROR1 발현 암 세포주에 대한 VNAR의 강력한 결합이 ROR1low 암 세포주와 비교하여 관찰되었으며, 시험된 대부분의 ROR1 결합 VNAR에 대해 염색은 거의 관찰되지 않았거나 전혀 관찰되지 않았다.
P3A1-P3A1에 대한 세포-표면 염색은 B1 또는 D3-D3 단백질만큼 강하지 않았고, 이는 이들 결합제의 에피토프에서의 차이 및 세포와 관련하여, ROR1의 세포외 도메인의 일부 영역은 다른 것보다 결합에 더 쉽게 접근할 수 있음을 반영할 수 있다.
37℃ 대 4℃에서 인큐베이션한 후 세포 표면 염색.
간단히, 5 x 10∧5 MDA-MB-231 세포를 얼음 상에서 1시간 동안 VNAR, VNAR-Fc, ROR1 2A2 mAb 또는 IgG1 대조군과 함께 인큐베이션했다. 5ml의 빙냉 PBS/2% FCS를 첨가하여 세포를 2회 세척한 후, 4℃에서 5분 동안 1500rpm에서 원심분리하였다. 최종 원심분리 단계 후, 과량의 상청액을 제거하고 튜브를 티슈 페이퍼 상에 블롯팅하였다. 각 세포 펠릿을 200㎕의 PBS/2% FCS에 재현탁시키고, 얼음 또는 37℃에서 2시간 동안 두었다. PE-접합된 항-Myc 태그 항체(CST), PE-접합된 항-인간 항체(JIR/Stratech) 또는 PE-접합된 항-마우스 항체(JIR/Stratech)를 사용하여 결합된 VNAR (His6Myc 태깅됨), VNAR-hFc, VNAR-mFc 또는 ROR1 2A2 mAb를 검출하였다. 얼음에서 인큐베이션된 샘플에 대한 37℃에서의 신호 손실은 ROR1 내재화를 나타낸다.
37℃ 대 4℃에서 인큐베이션한 후 세포 표면 결합의 감소가 동일하거나 상이한 VNAR 결합 모듈을 포함하는 단량체 및 다량체 둘 다로서의 항ROR1 VNAR 작제물에서 관찰되었으며(도 14), 이는 결합 및 ROR1에 의한 단백질의 내재화와 일치한다.
실시예 5 - 항-ROR1 VNAR-Fc 융합 단백질의 특성화 -
SPR 및 세포 표면 결합 및 내재화에 의한 ROR1 및 ROR2에의 결합
ROR1 결합 VNAR을 표준 GlySer 링커를 통해 마우스 IgG2a Fc의 N 말단 (mFc) 및 인간 IgG1 (hFc)의 N 말단 및 C 말단에 융합된 것으로 나타났다. 인간 IgG1 Fc의 융합을 또한 생성하였으며, Fc 영역의 Ser252 (카밧 넘버링)를 Cys로 대체시켰다 (도 10).
SPR에 의한 ROR1 및 ROR2에 결합
상기 요약된 절차를 사용하여, 인간, 마우스 및 랫트 ROR1 및 인간 ROR2에 대한 VNAR-Fc 융합의 결합을 SPR에 의해 결정하였다.
인간 ROR1 및 인간 ROR2에 VNAR-Fc 융합의 결합에 대한 SPR 데이터
분자 hROR1 hROR2
Ka (M -1 s -1 ) Kd (s -1 ) KD (nM)
B1 mFc 4.19E+05 3.356E-04 0.8 결합하지 않음
2V mFc 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음
B1 hFc 3.08E+06 9.53E-05 0.032 결합하지 않음
P3A1 hFc 1.07E+07 5.64E-04 0.084 결합하지 않음
D3 hFc 1.21E+06 2.88E-03 2.6 결합하지 않음
E9 hFc 7.07E+05 3.64E-03 5.3 결합하지 않음
D3-D3 hFc 4.96E+06 9.88E-04 0.25 결합하지 않음
hFc - P3A1 2.38E+06 7.76E-04 0.35 결합하지 않음
hFc - D3 1.10E+06 2.35E-03 2.37 결합하지 않음
hFc - D3-D3 2.35E+06 1.01E-03 0.49 결합하지 않음
2V hFc 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음
2V-2V hFc 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음
표 6에 나타낸 바와 같이, 항 ROR1 VNAR-Fc 단백질은 인간 ROR1에 대해 고 친화도로 결합하고, 인간 ROR2에는 결합하지 않는 것으로 관찰되었다. 마우스 및 랫트 ROR1 ECD에 대한 강력한 결합이 또한 관찰되었다. VNAR-Fc 융합으로서, 해당 VNAR 단량체에 대하여 ROR1 결합에 대한 KD 겉보기 값의 유의한 감소가 관찰된다. 이는 SPR 실험에서 ROR1-칩 표면에 2가 방식으로 결합하는 이들 VNAR-Fc 융합과 일치한다. N 말단 및 C 말단 VNAR Fc 융합 둘 모두는 인간 ROR1에 대해 높은 친화도로 결합하지만 인간 ROR2에 결합하지는 않는다.
암 세포주에 대한 VNAR의 결합
암 세포주의 패널의 표면에 대한 VNAR-Fc 융합의 결합을 이전에 요약된 방법을 사용하여 유세포 분석에 의해 측정하였다. 도 15는 일정한 농도의 단백질에서 유세포 분석에 의해 ROR1hi A549 폐 선암종 세포 및 ROR1low 폐암 세포주 A427에 대한 상이한 VNAR-Fc 융합의 결합을 보여준다.
표 7은 다양한 ROR1hi 암 세포주와 VNAR-Fc 단백질에 대한 결합 데이터를 요약한 것이다.
ROR1hi 인간 암 세포주에서 VNAR hFc 분자 세포 표면 결합의 상대 순위. '+'의 개수는 결합 강도를 나타낸다. ‘-’는 결합하지 않음을 나타낸다. '/'는 결정되지 않았음을 나타낸다. PE-항-인간 항체 (Jackson Immune Research/Stratech) 및 ThermoFisher Attune NxT 유세포 분석기를 사용하여 hFc 분자를 검출하였다.
중앙값 (YL1-PE) 기준
분자 A549 MDA-MB-231 PC-9 NCI-H1975
B1 hFc ++++ +++++ +++++ +++++
P3A1 hFc ++ +++ ++ ++
D3 hFc + ++ / /
E9 hFc + / / /
D3-D3 hFc ++ ++++ / /
2V hFc - - - -
2V-2V hFc + / / /
ROR1 발현 암 세포주에 대한 VNAR의 강력한 결합이 ROR1low 암 세포주와 비교하여 관찰되며, 시험된 대부분의 ROR1 결합 VNAR에 대해 염색이 거의 검출되지 않았거나 전혀 검출되지 않았다.
평균 세포-표면 염색의 차이는 단백질이 세포 표면에서 발현된 경우, ROR1의 상이한 영역이 다른 것보다 더 접근 가능할 수 있음을 나타낼 수 있다. 암 세포에서 ROR1의 접근성이 낮은 영역을 표적화하기 위해, 입체적으로 제한될 대형 항체와 달리 VNAR과 같은 소형 단백질 결합제를 사용하는 것이 유리할 것이다.
37℃ 대 4℃에서 인큐베이션한 후 세포 표면 염색.
37℃ 또는 4℃에서 인큐베이션한 후 MDA-MB-231 세포에 대한 VNAR-Fc 융합의 결합을 전술한 방법을 사용하여 유세포 분석에 의해 결정하였다. 시험된 B1-hFc, P3A1-hFc, D3-hFc 및 D3D3-hFc 단백질의 경우, 37℃ 대 4℃에서 인큐베이션한 후 세포 표면 염색 손실이 있었으며 (도 16), 이는 이들 VNAR-hFc 융합 단백질의 결합 및 내재화와 일치하였다.
37℃ 대 4℃에서 인큐베이션한 후 면역형광에 의한 내재화.
인간 IgG1 Fc 및 마우스 IgG2a Fc 융합 단백질의 세포 위치를 이들 도메인을 표적화하는 형광 표지 2차 항체를 사용하여 면역형광에 의해 검출할 수 있다. 면역형광 방법을 사용하여 암 세포에서 ROR1에 의한 VNAR-Fc의 내재화를 검출하였다.
흑색 투명 바닥 96-웰 플레이트 (Greiner)를 100 μg/ml 콜라겐 I (Sigma)로 코팅하여 세포 부착을 지원하였다. 세포를 완전 성장 배지 (Gibco)에서 코팅된 96웰 플레이트에 시딩하고, 5% CO2, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 제거하고, 다음날 무 혈청 배지 (Gibco)로 교체하고, 밤새 방치하였다. 다음날 아침, 배지를 제거하고 세포를 다양한 농도의 VNAR-Fc, ROR1 2A2 mAb 또는 IgG1 음성 대조군(모두 BioLegend)으로 처리하였다. 플레이트를 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 처리를 제거하고 웰당 100 μl의 PBS/2% FCS로 교체하였다. 하나의 플레이트를 얼음 상에 2시간 동안 유지하고, 다른 플레이트를 37℃, 5% CO2에 배치하였다. 이렇게 2시간 인큐베이션한 후, PBS/2% FCS 용액을 제거하고 세포를 빙냉 PBS 중 4% 파라포름알데하이드로 얼음 상에서 20분 동안 고정시켰다. PFA 용액을 제거하고 실온에서 15분 동안 PBS/2% FCS로 구성된 0.05% Saponin (Sigma)으로 교체하였다. 이 단계는 세포막을 투과시킨다. VNAR-hFc 융합 단백질을 검출하기 위해 AF 488-항-인간 Ab (1:250; ThermoFisher)를 사용하고 VNAR-mFc 융합 분자 및 ROR1 2A2 mAb를 검출하기 위해 AF488-항-마우스 Ab (1:500; CST)를 사용하여 2차 항체 염색을 수행하였다. 모든 2차 항체 작업 스톡을 0.05% Saponin/PBS/2% FCS로 제조하였다. 플레이트를 암소에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 2차 AF488-접합된 항체를 제거하고 세포를 0.05% Saponin/PBS/2% FCS를 사용하여 3회 세척하였다. Lamp-1 항체 (1:200; CST) 또는 EEA1 항체 (1:50; Santa Cruz)를 첨가하여 리소좀 및 초기 엔도솜 구획을 각각 검출하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 암소에서 인큐베이션하였다. 이어서, Lamp-1 및 EEA1 항체를 제거하고 세포를 0.05% Saponin/PBS/2% FCS로 3회 세척하였다. 이어서 AF647-항 토끼 항체 (1:1000; CST)를 첨가하여 Lamp1 및 EEA1 항체 결합을 검출하였다. 실온에서 2시간 동안 암소에서 추가 인큐베이션한 후, AF647 2차 항체를 제거하고 0.05% Saponin/PBS/2% FCS로 세포를 3회 세척하였다. 세포핵을 암소에서 실온에서 20분 동안 0.05% Saponin/PBS/2% FCS에서 10 μM Hoechst 시약 (Sigma)을 사용하여 염색하였다. 마지막으로 이 용액을 제거하고 PBS로 교체하였다. 플레이트를 암소에서 4℃에 저장한 후, GE Healthcare InCell 2000 기기를 사용하여 영상화하였다.
B1 hFc 및 B1 mFc의 내재화가 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후 MDA-MB-231 유방암 세포에서 관찰되었다. VNAR-Fc-ROR1 복합체는 내재화 후 Lamp-1 및 EEA1 염색과 중복되는 것으로 나타났으며, 이는 초기 엔도솜 및 리소좀 구획을 통한 ROR1 세포 수송을 나타낸다. 샘플을 얼음 상에서 2시간 동안 인큐베이션한 경우, ROR1-VNAR-Fc 염색은 주로 세포 표면에서 유지되었다. 2V Fc 단백질 (비-결합 음성 대조군 VNAR)과의 인큐베이션 후 세포 표면 결합 또는 내재화는 관찰되지 않았다. B1-hFc 및 B1-mFc는 ROR1low 폐암 세포주 A427에 의해 내재화되지 않았다.
실시예 6 - 인간화 및 추가 조작
2개의 주요 ROR1 결합 VNAR의 다수의 인간화 서열 유도체를 2개의 상이한 전략을 사용하여 생성하였다.
인간 생식 계열 Vκ1 서열, DPK-9를 기반으로 하여, 인간화된 서열을 설계하였다. 예를 들어, P3A1 V1에서 VNAR의 프레임워크 영역 1, 3 및 4를 돌연변이시키고, DPK-9의 프레임워크 영역과 정렬시켰다.
제2 전략은 ROR1 결합 VNAR의 결합 루프를 이전에 인간화된 VNAR 프레임워크에 이식하는 단계를 포함하였다 (문헌[Kovalenko et al JBC 2013 288 (24) 17408-17419]; WO2013/167883). 제1 작제물 (G1)의 경우, CDR1 및 CDR3 루프만이 이식되었다. 제2 작제물 (G2)은 CDR 및 HV 루프 둘 모두 이식되었다.
인간화된 D3 서열은 접근법의 조합을 사용하여 설계되었다.
인간화된/이식된 VNAR 서열의 예:
B1 G1 TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTGANYGLASTYWYRKNPGSSNKEQISISGRYSESVNKGTKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKVEIK (서열번호 45)
B1 G2 TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTGANYGLASTYWYRKNPGSSNQERISISGRYSESVNKRTMSFTLTISSLQPEDSATYYCRAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKVEIK (서열번호 46)
P3A1 V1 TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTKVEIK (서열번호 47)
P3A1 G1 TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTYWYRKNPGSSNKEQISISGRYSESVNKGTKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAREARHPWLRQWYDGAGTKVEIK (서열번호 48)
P3A1 G2 TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTYWYRKNPGTTDWERMSIGGRYSESVNKGAKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAREARHPWLRQWYDGAGTKVEIK (서열번호 49)
D3 인간화된 ADV1
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYSESVNKGAKSFTLTISSLQPEDSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (서열번호 50)
D3 인간화된 ADV2
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYSESVNKGAKSFTLTISSLQPEDSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (서열번호 51)
D3 인간화된 ADV3
ASVNQSPSSASASVGDRLTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYSESVNKGAKSFTLTISSLQPEDSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKLEVK (서열번호 52)
B1 인간화된 V5
ASVDQSPSSLSASVGDRVTITCVVTGANYGLAATYWYRKNPGSSNQERISISGRYSESVNKRTMSFTLTISSLQPEDSATYYCKAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKVEIK (서열번호 53)
B1 인간화된 V7
ASVDQSPSSASASVGDRLTITCVVTGANYGLAATYWYRKNPGSSNQERISISGRYSESVNKRTMSFTLTISSLQPEDSATYYCKAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKLEVK (서열번호 54)
인간화된 작제물을 인코딩하는 DNA를 E. 콜라이에서의 발현에 대해 코돈 최적화하고 GeneArt (Thermo)에 의해 합성하였다. VNAR 도메인을 연결하는 [G4S]5 링커를 갖는 이량체로 P3A1 서열을 설계하였다. 모든 인간화된 서열을 하기 C 말단 His6myc 태그를 사용하여 생성하였다:
QASGAHHHHHHGAEFEQKLISEEDLG (서열번호 97)
"VNAR 인테인 융합 단백질의 통상적인 발현 방법" 섹션에서 전술한 바와 같이 이들 단백질을 인코딩하는 DNA를 인테인 발현 벡터 내로 서브 클로닝하고, 이. 콜라이로 발현시키고, 정제하였다.
추가 인간화 버전의 D3을 다음과 같이 생성하였다:
D3 인간화된 EL V1
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKRAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (서열번호 55)
D3 인간화된 EL V2
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKRAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (서열번호 56)
D3 인간화된 EL V3
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRFSGSGSKRAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (서열번호 57)
D3 인간화된 EL V4
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWYQQKPGTTDWERMSIGGRYVESVNKRAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (서열번호 58)
D3 인간화된 EL V5
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWYQQKPGTTDWERMSIGGRFSGSGSKRAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (서열번호 59)
인간화된 ROR1 결합 VNAR 변이체는 SPR에 의해 인간 ROR1에 대한 높은 친화도 결합 및 개선된 열 안정성을 나타내었다. 칩 표면에 고정된 인간 ROR1 ECD - Fc를 사용하여 전술한 바와 같이 SPR을 수행하였다. 열 안정성 분석은 Protein Thermal Shift™ 염료 키트가 장착된 Applied Biosystems StepOne 실시간 PCR 시스템 (Thermo)을 사용하였다. 단백질이 20 μL의 최종 농도 20 μM이 되도록 분석 혼합물을 설정하였다. 2.5 μL의 8x Thermal Shift™ 염료와 함께 5 μL의 Thermal Shift™ 완충액을 첨가하였다. StepOne 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행하고 Protein Thermal Shift™ 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. 모든 데이터는 1차 유도체 분석에서 획득된 것이다.
인간화된 VNAR 변이체에 대한 열 안정성 및 hROR1 결합 데이터
작제물 Tm (℃) hROR1 결합 (SPR)
Ka (M-1s-1) Kd (s-1) KD (nM)
B1 54.2 7.45E+05 6.09E-04 0.83
B1G1 58.0 2.20E+05 1.62E-02 82.8
B1G2 59.9 1.85E+05 7.90E-03 45.9
B1V5 46.05 5.20E+04 3.85E-05 0.74
B1V7 43.91 7.74E+04 5.54E-05 0.77
P3A1 이량체 60.7 3.78E+05 1.17E-03 0.30
P3A1 V1 이량체 48.5 4.78E+05 8.46E-04 0.18
P3A1 G1 이량체 57.1 4.30E+05 1.47E-03 0.43
P3A1 G2 이량체 54.0 1.88E+05 1.19E-03 0.77
B1G1-hFc ND 2.4E+05 2.66E-03 11.8
B1G2-hFc ND 6.26E+05 1.41E-03 2.55
D3 ADV1 이량체 54.66 6.36E+05 5.67E-03 8.92
D3 ADV2 이량체 56.18 6.09E+05 1.60E-02 26.2
D3 WT 64.4 1.21E+06 9.43E-05 15.5
D3 AD V2 56.98 4.58E+04 2.36E-03 51.6
D3 EL V1 53.25 1.50E+06 1.58E-04 16.1
D3 EL V2 56.50 1.85E+06 1.63E-04 18.9
D3 EL V4 54.1 1.38E+06 5.45E-04 58.5
인간화된 VNAR 프레임워크 상에 B1의 HV 및/또는 CDR 루프를 이식하고 인간 DPK-9 서열로부터의 영역으로 P3A1 서열을 치환하여, 실질적으로 조작된 단백질을 획득하였으며, 이는 안정하였고, 나노몰 및 피코몰 친화도로 각각 hROR1 결합을 유지한다. 유사한 접근법은 야생형(WT) VNAR과 유사한 결합 특성을 유지하는 D3의 인간화된 변이체를 산출하였다.
실시예 7 - 에피토프 맵핑
탈글리코실화된 인간 ROR1에 단백질의 결합
ELISA를 사용하여 글리코실화 탈글리코실화 인간 ROR1 단백질에 대한 VNAR 결합을 비교하였다. 탈글리코실화 인간 ROR1을 생성하기 위해, 2 μg ROR1 단백질당 0.2 mg/ml 단백질을 1U PNGaseF (Roche)와 함께 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 대조군, 글리코실화된 인간 ROR1을 PNGaseF를 첨가하지 않고 병행 제조하였다. SDS PAGE 분석은 ROR1 탈글리코실화와 일치하는 PNGaseF 처리에 대한 변화를 보여주었다 (도 17a).
"항 ROR1 VNAR 특성화" 섹션에서 전술한 바와 같이 이들 ROR1 단백질을 사용하여 ELISA 플레이트를 코팅하고, ELISA를 수행하였다. ELISA (도 17b & 도 17c)에 의하면, VNAR (B1, P3A1-P3A1, D3-D3, B1 mFc)은 글리코실화 및 탈글리코실화 ROR1 단백질 둘 모두에 동일하게 잘 결합하였으며, 이는 ROR1 결합이 ROR1 글리코실화와 무관함을 나타낸다.
접히지 않은 hROR1 (28 mM DTT, 0.5% 사르코실로 환원됨)에 대한 B1의 결합은 유의하게 감소하였으며, 이는 입체형태 에피토프 (들)에 대한 B1 VNAR 결합과 일치한다 (도 17c).
SEC에 의한 ROR1 Ig 도메인에 대한 B1의 결합
B1 VNAR은 SEC에 의해 ROR1 Ig 도메인과 복합체를 형성한다 (도 18a). 1:1 VNAR:ROR1 도메인 또는 ROR1 도메인 쌍을 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, PBS에서 Superdex 200 증가 10/300 컬럼 (GE Healthcare)에서 구동시키고, SDS-PAGE에 의해 분획을 분석하였다. 이러한 조건 하에서, B1은 ROR1 Ig 도메인과 복합체를 형성하였다.
비글리코실화 ROR1 Ig 도메인에 대한 VNAR B1의 결합
VNAR B1 대 ROR1의 결합에 글리코실화의 관여를 평가하기 위해, ROR1 Ig 도메인을 이. 콜라이에서의 발현을 통해 생성하여 단백질의 비글리코실화된 형태를 생성하였다.
이어서, 이 비글리코실화 ROR1 Ig 도메인을 과량의 VNAR B1 (비율 1:2)과 함께 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하고, 분석적 크기 배제 컬럼(S75 증가 10/300 GL 분석적 SEC 컬럼)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 평가했다. 크로마토그래피는 20mM Hepes, 150mM NaCl, pH 7.5에서 수행되었다.
SEC 분석은, ROR1 Ig 또는 B1 단독보다 고분자량 종에 상응하는 용적에서 용출되는 새로운 피크가 형성된다는 것을 보여된다(도 18b). 이 초기 용출 피크의 MS 분석은 그것이 ROR1 Ig와 B1 사이의 복합체에 상응한다는 것을 보여준다(도 18c).
추가의 도메인 맵핑
개별 VNAR이 결합하는 특정 ROR1 도메인을 결정하기 위해, 인간 ROR1 세포외 도메인(ECD)의 서브-도메인 및 도메인 쌍을 Fc 융합 단백질로서 발현시켰다. 이어서, 복합체 형성은 분석적 SEC를 사용하여 평가했다.
구체적으로, 다음 ROR1 도메인 융합체가 생성되었다:
· Ig-Fc
· Ig-Fz-Fc
· Fz-Kr-Fc
· Fz-Fc
· Kr-Fc
SEC 분석/SDS-PAGE의 결과는 (D3) 및 (P3A1)에 대해 도 18d에 제시된다. 이러한 데이터는 D3은 ROR1 Ig 도메인에 결합하는 반면, P3A1은 Fz 단독 또는 Fz-Kr 계면에 결합한다는 것을 입증한다.
에피토프 비닝 (binning) 실험
결합 경쟁 연구를 SPR을 사용하여 완료하였다. 인간 ROR1 (hROR1)을 아민 연결에 의해 COOH2 칩의 유입 채널 1 및 3 (FC1 및 FC3)에 고정시켰다. FC2를 기준 채널로 사용하였다. 그 후, 선택한 VNAR 예를 들어, B1, P3A1 이량체; 또는 ROR1 2A2 mAb (BioLegend)를 FC1 상의 hROR1에 포획하였다. 이어서, 시험 분석물을 i) 이전에 포획된 VNAR 또는 ROR1 2A2 mAb의 존재 하의 hROR1에의 결합, 또는 ii) 결합된 VNAR 또는 mAb의 부재 하의 hROR1에의 결합에 대해 평가하였다. hROR1 칩 표면을 글리신 pH2를 사용하여 각각의 시험 분석물에 따라 재생시켰다. 다음 분석물을 시험하기 전에 VNAR 또는 ROR1 2A2 mAb를 FC1 등에서 hROR1에 다시 포획시켰다. QDat 소프트웨어를 사용하여 결합 동역학을 결정하였다. 비경쟁 분자의 경우, 결합 동역학 및 센소그램 프로파일은 hROR1 +/- 포획된 결합제와 유사/영향을 받지 않았다. 경쟁 분자의 경우 센소그램 프로파일 및 결합 동역학이 유의하게 변경되었다.
도 19는 B1과의 사전 인큐베이션의 존재 또는 부재 하에 인간 ROR1에의 VNAR의 결합에 대한 센소그램 및 결합 동역학의 개략도를 보여준다. 결과에 따르면 B1 및 P3A1 VNAR이 서로 경쟁하지 않으며, hROR1에 결합하기 위해 ROR1 mAb 2A2와 경쟁하지 않는 것으로 나타났다. B1 VNAR이 칩 표면 상의 hROR1에 포획되는 경우, B1의 추가 결합이 유의하게 방해되었지만, P3A1 단량체, P3A1 이량체 또는 ROR1 2A2 mAb의 hROR1에 대한 결합 프로파일은 사전 포획된 B1의 존재 및 부재에서 동일하였다 (도 19). 포획된 B1 VNAR의 존재 또는 부재 하에 이들 분자의 hROR1에의 결합에 대해 유도된 동역학 매개변수는 이들이 B1과 경쟁하지 않음을 확인시켜 준다 (B1을 제외하고, 예상되는 바와 같이 그 자체와 경쟁함).
hROR1 +/- 사전 포획 B1 VNAR에 대한 VNAR 또는 ROR1 2A2 mAb의 SPR 분석에 의해 유도된 결합 동역학 데이터. 데이터는 B1 결합이 P3A1 또는 2A2와 경쟁하지 않음을 나타낸다. C 말단 His6Myc 태그를 갖는 VNAR을 발현시켰다.
hROR1 결합 ROR1에 사전 포획된 B1
분자 Ka (M -1 s -1 ) Kd (s -1 ) KD (nM) Ka (M -1 s -1 ) Kd (s -1 ) KD (nM)
B1 1.04E+06 4.40E-04 0.424nM 결합 부재/저조한 결합
P3A1-P3A1 1.63E+06 6.28E-04 0.385nM 1.52E+06 5.36E-04 0.352nM
P3A1 2.58E+06 4.11E-02 15.9nM 1.94E+06 3.20E-02 16.45nM
ROR1 2A2 mAb (Biolegend) 9.79E+05 2.11E-04 0.21nM 8.35E+05 8.47E-05 0.101nM
P3A1 유도체의 사전-포획의 유무에 따르는 hROR1에 대한 V3AR, 2A2 mAb 또는 UC-961 기반 mAb의 결합을 유사하게 평가하였다. 결과는 (도 19b 및 표 9b)에 요약되어 있고, 이는 P3A1이 UC-961에 기초하여 B1, D3 또는 E9 또는 mAb 2A2 또는 mAb와 경쟁함을 나타냈다(Kipps/Oncternal에 의해, 중쇄: 서열번호 98; 경쇄: 서열번호 99). 표 9c는 VNAR 간의 결합 연구의 경쟁에 대한 SPR의 결과를 추가로 요약한다.
[표 9b]
hROR1 +/- 이전 포획된 P3A1His6Myc 이량체 VNAR에 대한 VNAR 서열, UC961 기반 mAb 또는 ROR1 2A2 mAb의 SPR 분석에 의해 유도된 결합 동역학 데이터. 데이터는 P3A1 자체 경쟁 이외에 다른 ROR1 결합제 및 P3A1 사이에서 hROR1에 대한 결합 경쟁이 관찰되지 않았음을 입증한다.
Figure pct00012
[표 9c]
분자 대 hROR1 사이의 결합의 경쟁을 결정하기 위해 SPR을 사용하여 수득된 요약 또는 결과. P3A1은 임의의 다른 서열과 경쟁하지 않았다. B1, D3 및 E9는 결합 경쟁을 나타내고, 이들 서열이 hROR1의 중첩성 에피토프에 결합한다는 것을 시사한다.
Figure pct00013
항 ROR1 펩타이드를 사용한 항 ROR1 VNAR의 에피토프 맵핑
ELISA 분석을 사용하여 주요 항-ROR1 VNAR 도메인, B1, P3A1 및 D3이 ROR1상의 동일하거나 중복되는 에피토프 (본 명세서에서 4개의 ECD 펩타이드로 규정됨)에 결합되었는지를 결정하였다. ELISA 플레이트에 고정된 펩타이드와의 직접 결합의 초기 분석 (PBS 및 DMSO 중)에 의하면, 어떠한 VNAR도 임의의 펩타이드에 결합하지 않았지만, 동일한 ELISA의 일부로서 포함된 고정된 ECD hROR1-Fc 단백질 대조군에는 결합하지 않은 것으로 나타났다 (도 20 및 도 21a 및 21b). 이를 더 조사하기 위해, 경쟁 분석을 설계하여, VNAR을 용액 중 4개의 시험 펩타이드 (또는 인간 ROR1 ECD-Fc)의 농도를 증가시키면서 인큐베이션하고, 그 후, ELISA 플레이트 상에 고정된 ROR1-Fc에 대한 잔여 결합의 평가를 관찰하였다. 양성 대조군으로 사용된 VNAR 및 인간 ROR1 ECD-Fc 사이의 경쟁이 명백하였다. 그러나, 펩타이드의 존재 하에서 감소 신호가 명백하지 않았으며, 이는 이들 특이적 ECD 펩타이드에 대한 VNAR의 결합이 이루어지지 않았음을 분명히 나타낸다 (도 22 및 도 23).
또한, B1, P3A1 및 D3 VNAR은 hROR1의 전체 ECD의 범위의 임의의 중첩 선형 15머 펩타이드에 결합하지 않는다. 이들은 또한 통상적으로 단백질을 변성시키는 조건인 환원 조건 하에서 SDS 포함 완충액에서 사전 초음파 처리된 hROR1에 결합하지 않는다 (Pepscan 데이터는 제시되지 않음). 이를 종합하면, B1, P3A1 및 D3 VNAR이 인간 ROR1 ECD 단백질 상의 별개의 입체형태 에피토프(들)에 결합한다는 것을 나타낸다.
ECD 펩타이드에 대한 VNAR의 직접 결합
하기 펩타이드를 합성하고 PBS pH 7.4에 용해시켰다:
펩타이드 1 -- YMESLHMQGEIENQI (서열번호 34)
펩타이드 2 -- RSTIYGSRLRINLDTTDTGYFQ (서열번호 38)
펩타이드 3 -- CQPWNSQYPHTHTFTALRFP (서열번호 35)
펩타이드 4 - QCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEYE (서열번호 37)
펩타이드 5 - RSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQ (서열번호 36)
ELSS1로부터 단리된 클론 B1 및 P3A1을 단량체로 평가하고, 면역화된 라이브러리로부터의 D3을 단량체 및 동종이량체로서 평가하였다.
B1 및 P3A1 둘 모두는 ROR1에 결합하였으며, 5개의 펩타이드 중 어느 것에도 명백하게 결합하지 않은 것으로 나타났다. HSA는 비특이적 대조군으로 포함되었다 (도 20).
그러나, 펩타이드 2가 PBS에 불용성이므로, 25% DMSO에 용해된 펩타이드로 직접 결합 ELISA를 반복하였다. 단백질 이량체 융합으로서의 D3 및 D3-D3이 이들 데이터세트에 포함되었고, 펩타이드에 대한 결합이 다시 관찰되지 않았다 (도 21a 및 21b).
방법
직접 펩타이드 결합 ELISA
1. PBS 중 10 또는 50 nM huROR1-Fc 또는 PBS 또는 25% DMSO 중 10 μM의 펩타이드로 96웰 플레이트를 코팅하였다. 4℃에서 밤새 배양하였다.
2. PBS로 2회 세척하였다.
3. 200 μl/웰의 4% MPBS로 실온에서 1시간 동안 차단하였다.
4. PBS로 2회 세척하였다.
5. 전체 플레이트에 1 μg/ml (67nM)의 B1 또는 P3A1; 10 μg/ml (670 nM)의 D3 및 D3-D3 및 1:3 연속 희석액을 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
6. PBST로 3회 세척하였다.
7. 100 μl의 항-his-HRP SIGMA (PBST 중 1:1000)와 함께 실온에서 1시간 동안 플레이트를 인큐베이션하였다.
8. PBST로 2회 및 PBS로 2회 세척하였다.
9. 100 μl/웰의 TMB 기질을 첨가하였다. 1 M H2SO4로 반응을 중지시켰다.
VNAR 및 ROR1 펩타이드의 경쟁 분석
PBS에서 재구성된 4개의 펩타이드 모두를 사용한 방법에 기재된 바와 같이 경쟁 분석을 수행하였다. 이러한 분석에서, 통상적인 결합 ELISA 형태에서 고정된 4개의 펩타이드 중 어느 것에도 VNAR B1 또는 P3A1이 결합하지 않는 것으로 관찰되었다 (도 22). 따라서, 이들 펩타이드가 B1 또는 P3A1에 의해 인식되는 ROR1 상의 에피토프를 나타낸다는 증거는 없었다.
(PBS에 불용성인 펩타이드 2로 인해) 도 21a 및 21b에 사용된 조건에 따라, 25% DMSO에 용해된 펩타이드로 모든 경쟁 분석을 반복하였다. 분석을 위해 D3 및 D3-D3 이량체가 또한 이들 데이터 세트에 포함되었다. 이들 결과에 의해 VNAR 도메인 B1, P3A1 및 D3이 시험된 4개의 펩타이드에 의해 나타난 바와 상이한 에피토프 (또는 에피토프들)를 인식한다는 것을 확인하였다.
방법
경쟁 ELISA
1. P3A1의 경우 50 nM의 huROR1-Fc; B1의 경우 10 nM의 huROR1-Fc, PBS 중 D3 및 D3-D3 이량체로 96웰을 코팅하였다. 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
2. PBS로 2회 세척하였다.
3. 200 μl/웰 4% MPBS로 실온에서 1시간 동안 차단하였다.
4. PBS로 2회 세척하였다.
5. 실온에서 30분 동안 사전 인큐베이션하였다.
· B1= 15 nM
1 μM의 시작 농도에서 펩타이드 (PBS 또는 25% DMSO) (그 후, 플레이트 전체에 1:3 연속 희석)
또는 100 nM의 시작 농도에서 huROR1-Fc (그 후, 플레이트 전체에 1:3 연속 희석)를 추가한다.
· P3A1 = 670 nM
50 μM의 시작 농도에서 펩타이드 (PBS 또는 25% DMSO) (그 후, 플레이트 전체에 1:3 연속 희석)
또는 시작 농도 1 μM에서 huROR1-Fc (그 후, 플레이트 전체에 1:3 연속 희석)를 추가한다.
· D3 = 67 nM
500 nM의 시작 농도에서 펩타이드 또는 huROR1-Fc (PBS 또는 25% DMSO) (그 후, 플레이트 전체에 1:3 연속 희석)를 추가한다.
· D3-D3 = 0.67 nM
500 nM의 시작 농도에서 펩타이드 또는 huROR1-Fc (PBS 또는 25% DMSO) (그 후, 플레이트 전체에 1:3 연속 희석)를 추가한다.
6. 100 μl/웰의 사전 인큐베이션 샘플을 첨가한다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
7. PBST로 3회 세척한다.
8. 100 μl/웰의 항-His-HRP (PBST 중 1:1000)로 플레이트를 인큐베이션하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
9. PBST로 2회 및 PBS로 2회 세척하였다.
10. 100 μl/웰의 TMB 기질을 첨가하였다. 50 μl/웰 1 M H2SO4로 반응을 중지시켰다.
재조합 ROR1 도메인을 사용한 항-ROR1 VNAR의 에피토프 맵핑
ROR1 ECD는 3개의 별도의 단백질 도메인: Ig-유사, 프리즐(Frizzle) 및 크링글(Kringle)로 구성된다. 이들 VNAR 각각에 의해 인식된 에피토프가 전체 ROR1 단백질의 특정 서브 도메인 내에 있는지를 결정하기 위해, 다음 ELISA 분석을 수행하였다.
VNAR의 ROR1 도메인에의 직접 결합
항-ROR1 VNAR B1, P3A1 및 D3을 직접 결합 ELISA에 의해 인간 ROR1의 3개의 세포외 도메인 (Ig-유사, 프리즐 및 크링글)에 대한 결합에 대해 평가하였다. B1 및 P3A1을 단량체로 평가하고, D3을 단량체 및 동종이량체 (D3-D3)로 평가하였다. 2A2 항-ROR1 항체를 또한 양성 대조군으로서 분석에 포함시켰다.
B1 및 2A2는 Ig-유사 도메인을 인식했지만, Ig-유사 도메인에 대한 이러한 결합은 전체 세포외 huROR1의 그의 결합과 비교하여 훨씬 약했다. P3A1은 프리즐 도메인을 인식했지만, 다시 완전한 ROR1 단백질에 비해 결합이 약하였다 (도 24 및 표 10). D3 및 D3-D3 동종이량체는 전장 ROR1 ECD에 결합하지만, 개별 ROR1 ECD 하위 도메인에 대한 결합은 관찰되지 않았다 (도 24 및 표 10).
모든 결과는 표 10에 요약되어 있다.
　 B1 P3A1 D3 2A2
rhROR1-Fc +++ +++ +++ +++
Ig-유사 도메인 + - - +
프리즐 도메인 - + - -
크링글 도메인 - - - -
방법
ROR1 도메인에 대한 직접 결합 ELISA
1. PBS 중 1 μg/ml의 huROR1-Fc 또는 huROR1 도메인으로 96웰 플레이트를 코팅하였다. 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
2. PBS로 2회 세척하였다.
3. 200 μl/웰의 4% MPBS로 실온에서 1시간 동안 차단하였다.
4. PBS로 2회 세척하였다.
5. VNAR의 경우 시작 농도 10 μg/ml에서 D3, D3-D3 이량체 또는 2A2 mAb 및 mAb의 경우 1:150 희석액을 첨가하였다. 플레이트 전체에 3배 연속 희석을 제조하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
6. PBST로 3회 세척하였다.
7. 100 μl의 항-c-myc-HRP (PBST 중 1:1000)로 실온에서 1시간 동안 플레이트를 인큐베이션하였다.
8. PBST로 2회 및 PBS로 2회 세척하였다.
9. 100 μl/웰의 TMB 기질을 첨가하였다. 1 M H2SO4로 반응을 중지시켰다.
실시예 8 - VNAR 접합 화학
부위-특이적 VNAR 접합에 대한 개념 증명으로서 BA11의 표지
VNAR에 대한 표지 및 약물의 부위-특이적 접합을 위한 방법은 현재 존재하지 않으므로, 그러한 접합 방법을 확립할 필요가 있다. VNAR BA11은 인간 혈청 알부민에 높은 친화도로 결합하는 E06의 인간화 변이체이며 (문헌[Kovalenko et al, J.Biol. Chem., 2013 JBC]), 이는 반감기 연장 기술로서 적용된다. VNAR 도메인의 결합 활성을 손상시키지 않으면서 부위 특이적으로 접합된 VNAR이 양호한 수율로 생성될 수 있는지를 결정하기 위해 BA11을 모델 VNAR로서 사용하였다. VNAR의 C 말단은 CDR1 & 3 및 HV2 & 4 영역의 원위에 있으며, 이는 일반적으로 그의 표적에 결합하는데 사용되는 VNAR의 영역이다.
따라서, 인테인 기반 기술 (US2006247417)을 사용하여 상이한 화학을 통해 VNAR의 C 말단에 대한 페이로드의 부위 특이적 접합을 평가하였다. 요약하면, 대상 단백질은 조작된 인테인 도메인의 N 말단 융합으로서 발현된다 (문헌[Muir TW 2006 Nature 442, 517-518]). 단백질-인테인 결합에서 후속 N-S 아실 변화에 의해, 비스-아미녹시 제제 또는 아미노-티올로 화학적으로 절단되어 각각 적절한 단백질 C 말단 아미녹시 또는 티올 유도체를 제공할 수 있는 티오에스테르 연결된 중간체가 생성된다 (도 11). 이들 C 말단 아미녹시 및 티올 유도체는 화학 선택적 방식으로 각각 알데하이드/케톤 및 말레이미드 기능성 모이어티와 반응하여 부위-특이적 C 말단 변형 단백질을 제공할 수 있다 (도 25 내지 도 27). 이 방법을 사용하여 옥심 및 티오에테르 형성 화학을 통해 BA11 형광 접합체를 양호한 수율로 생성하였고, 이들 접합체는 인간 혈청 알부민 단백질에 대한 결합을 유지하였다.
초기에, 전술한 바와 같이, 키틴 비드에 고정된 BA11 인테인-CBD 융합 단백질을 E. 콜라이에서 세포질 발현으로부터 10 mg/L 이상의 통상적인 수율로 생성하였다. 이어서, 이 전구체 융합 단백질을 상이한 소분자 제제에 의해 수성 완충 조건 하에서 절단하여 그의 C 말단에서 고유한 화학적 반응성 작용기를 갖는 BA11을 생성하였다.
BA11-아미녹시의 생성 (도 11)
고정된 BA11 인테인-CBD 융합 단백질을 절단 완충액 pH6.9에서 400 mM 디옥시아민 (NH2-O-(CH2)2-O-NH2)에서 밤새 절단하여 약 75% 절단을 유발시켰다.
BA11 아미녹시를 포함하는 절단 상청액을 배수시키고, 20 mM 인산나트륨 pH6.9, 200 mM NaCl 중 Superdex75 26/60 (GE Healthcare) 상에서 정제하였다. 이는 2 mg/L 초과의 E. 콜라이의 수율로 가용성의 유도체화되고 접힌 단백질을 생성하였다. 모든 단백질을 환원 및 비 환원 SDS PAGE 분석 및 질량 분석에 의해 특성화하였다. 적절한 이황화 결합의 형성이 질량 분석에 의해 확인되었다.
BA11- 옥심-형광의 생성 (도 25)
정제된 BA11 아미녹시를 10% 아세토니트릴 및 10 mM 아닐린 촉매와 함께 실온에서 밤새 pH5.5 완충액 중 3 몰당량의 벤즈알데하이드-peg-형광과 혼합하였다. SDS PAGE 및 질량 분석은 98% 초과의 반응을 나타내었고, 상기와 같이 SEC에 의해 접합체를 정제하고, 환원 및 비 환원 SDS PAGE 분석 및 질량 분석에 의해 이를 확인하였다.
BA11 C 말단 티올 유도체의 생성 (도 11)
키틴 비드에 고정된 BA11 인테인-CBD 융합 단백질을 2 mM TCEP가 포함된 절단 완충액 중 100 mM 시스테아민 (Sigma)에서 밤새 절단하여 VNAR의 해당 C 말단 티올 유도체를 생성하였다. BA11 티올을 포함하는 절단 상청액을 배수하고, 도입된 C 말단 티올기에서 임의의 시스테아민 부가물을 환원시키기 위해 2 mM TCEP로 처리하고, 20 mM 인산나트륨 pH6.9, 200 mM NaCl 중 Superdex75 26/60 (GE Healthcare)에서 단백질을 정제하였다. BA11 SH에 대해 약 1.6 mg/L의 E. 콜라이 수율이 획득되었다. 모든 단백질을 환원 및 비 환원 SDS PAGE 분석 및 질량 분석에 의해 특성화하였다. 적절한 이황화 결합 및 유리 C 말단 티올의 형성을 질량 분석에 의해 확인하였다.
BA11-C 말단 티올-말레이미드-peg-형광의 생성 (도 26)
C 말단 티올 (BA11 SH)로 생성된 BA11을 0.3% DMF 최종, 실온 0.5 내지 1시간으로 pH6.9 완충액 중 4 몰당량 말레이미드-peg-형광과 혼합하였다. SDS PAGE 및 질량 분석은 98% 이상의 반응을 나타냈다. 상기와 같이 SEC에 의해 접합체를 정제하고, 환원 및 비환원 SDS PAGE 분석 및 질량 분석에 의해 확인하였다.
BA11 C 말단 시스테인 유도체의 생성 (도 11)
키틴 비드에 고정된 BA11 인테인-CBD 융합 단백질을 2 mM TCEP가 포함된 절단 완충액 중 100 mM 시스테인에서 밤새 절단하여 VNAR의 해당 C 말단 시스테인 유도체를 생성하였다. BA11 Cys을 포함하는 절단 상청액을 배수하고, 도입된 C 말단 티올기에서 임의의 시스테인 부가물을 환원시키기 위해 2 mM TCEP로 처리하고, 20 mM 인산나트륨 pH6.9, 200 mM NaCl 중 Superdex75 26/60 (GE Healthcare)에서 단백질을 정제하였다. BA11-cys에 대해 약 3 mg/L 초과의 E. 콜라이 수율이 획득되었다. 모든 단백질을 환원 및 비 환원 SDS PAGE 분석 및 질량 분석에 의해 특성화하였다. 적절한 이황화 결합 및 유리 C 말단 시스테인 티올의 형성을 질량 분석 방법에 의해 확인하였다.
BA11-C 말단 시스테인-말레이미드-peg-형광의 생성 (도 27)
C 말단 시스테인으로 생성된 BA11 (BA11 cys)을 0.3% DMF 최종, 실온 0.5 내지 1시간으로 pH6.9 완충액 중 4 몰당량 말레이미드-peg-형광과 혼합하였다. SDS PAGE 및 질량 분석은 BA11 cys에 대해 60 내지 80% 반응을 나타내었고, 더 낮은 반응은 유의한 BA11 cys 이량체 형성으로 인한 것이었다. 상기와 같이 SEC에 의해 접합체를 정제하고, 환원 및 비환원 SDS PAGE 분석 및 질량 분석에 의해 확인하였다.
혈청 알부민에 대한 BA11 및 해당 C 말단 유도체 및 접합체의 결합을 SPR에 의해 결정하였다.
인간, 마우스, 랫트 및 시아노몰거스 혈청 알부민에 대한 반감기 연장 VNAR (BA11) 또는 형광-접합된 BA11의 결합 동역학의 결정
결합 동역학을 SPR을 사용하여 결정하였다. 혈청 알부민 또는 음성 대조군 단백질을 다음과 같이 최적화된 완충 조건을 사용하여 아민 연결에 의해 COOH2 칩에 고정시켰다: -인간 혈청 알부민 (HSA) 및 마우스 혈청 알부민 (MSA)을 아세트산나트륨 pH5 완충액에서 고정시켰다. 랫트 혈청 알부민 (RSA) 및 시아노몰거스 혈청 알부민 (CSA)을 아세트산나트륨 pH 4.5 완충액에, 음성 대조군 암탉 난 리소자임 (HEL) 단백질을 아세트산나트륨 pH 5.5 완충액에 고정시켰다.
분석물 (BA11, BA11-형광 또는 2V 음성 대조군 결합제)을 다양한 농도로 시험하고, Ka (M-1s-1), Kd (s-1) 및 KD (nM) 값을 QDat 소프트웨어 (SensiQ/Pall ForteBio)를 사용하여 결정하였다. 각각의 분석물 시험 실험에 대해, 선택된 혈청 알부민 단백질에 대한 결합을 음성 대조군 단백질 (HEL)과 함께 분석하였다.
Figure pct00014
모든 BA11 유도체 및 접합체는 pH7.4 및 pH5.5 둘 모두에서 상이한 혈청 알부민 단백질에 높은 친화도 결합을 나타냈다. 따라서, 기재된 방법론은 단백질의 결합 활성을 유지하는 VNAR의 부위-특이적 변형 및 접합에 대한 강력한 고 수율 접근법을 제공한다.
ROR1 결합 VNAR-AF488 및 MMAE 접합체
C 말단 인테인 융합 단백질로서의 ROR1 결합 VNAR의 발현에 의해 고유한 C 말단 아미녹시 및 C 말단 티올기를 갖는 ROR1 결합 VNAR을 생성할 수 있다. 결과적으로 이는 각각 옥심 형성 접합 화학 및 말레이미드 화학을 통해 형광 표지 및 세포독성 페이로드에 대한 부위 특이적 C 말단 접합을 가능하게 한다. 사용된 표지 및 페이로드의 예는 도 28a 및 28b에 도시되어 있다.
키틴 비드에 고정된 ROR1 결합 VNAR 인테인 CBD 융합 단백질을 상기한 바와 같이 생성하였다
VNAR-ox-vcMMAE 및 VNAR-ox-MMAE의 생성
고정된 VNAR 인테인 융합 단백질을 절단 완충액 pH 6.9, 실온에서 밤새 400 mM O,O'-1,3-프로판디일비스하이드록실아민 (NH2-O-(CH2)3-O-NH2)으로 절단하였다. C 말단 아미녹시기 (VNAR 아미녹시)를 포함하는 생성된 VNAR을 IMAC 또는 SEC에 의해 정제하고, 10% 아세토니트릴 중 3 몰당량의 벤즈알데하이드 PEG2 vc PAB MMAE 또는 벤즈알데하이드 PEG4 MMAE와 10 mM 아닐린 촉매 최종에 의해 실온에서 밤새 반응시켰다. 접합체를 IMAC 또는 SEC에 의해 정제하고, 멸균 여과하고 적절한 물질의 형성 및 최종 순도를 환원 및 비 환원 SDS PAGE 분석 및 질량 분석에 의해 확인하였다 (도 29).
VNAR-S-mal-vcMMAE의 생성
고정된 VNAR 인테인 융합 단백질을 2 mM TCEP로 절단 완충액 pH 6.9에서 100 mM 시스테아민으로 실온에서 밤새 절단하였다. C 말단 티올 기를 포함하는 생성된 VNAR (VNAR SH)을 IMAC 또는 SEC에 의해 정제하고, 4 몰당량의 MC vc PAB MMAE 또는 malAF488과 반응시켰다. 접합체를 IMAC 또는 SEC에 의해 정제하고, 멸균 여과하고 적절한 물질의 형성 및 최종 순도를 환원 및 비 환원 SDS PAGE 분석 및 질량 분석에 의해 확인하였다 (도 29).
항 ROR1 VNAR-MMAE 접합체의 특성화 - SPR에 의한 ROR1 및 ROR2에의 결합 및 유세포 분석에 의한 세포 표면 결합
SPR에 의한 ROR1 및 ROR2에의 VNAR 접합체의 결합
인간 ROR1 ECD에 결합하는 VNAR-MMAE 접합체 및 VNAR-형광 접합체의 능력을 상기 기재된 절차를 사용하여 SPR에 의해 결정하였다.
표 12에 나타낸 바와 같이, C 말단 아미녹시 VNAR에 대한 벤즈알데하이드 페이로드의 옥심 결찰; C 말단 티올 VNAR에 대한 말레이미드 기능성 페이로드의 티오에테르 결찰 및 C 말단 시스테인 VNAR에 대한 말레이미드 기능성 페이로드의 티오에테르 결찰을 통해 제조한 VNAR 접합체는 모두 인간 ROR1에 대해 높은 친화도를 유지하지만 인간 ROR2에는 결합하지 않는다. 효소 절단 가능 링커 (Val-Cit) 또는 비절단 가능 링커를 사용하여 접합체를 제조하였으며, 인간 ROR1과 유사한 결합을 나타냈다.
인간 ROR1 및 ROR2에의 VNAR 및 해당 형광 및 MMAE 접합체의 결합에 대한 SPR 데이터. C 말단 His6Myc 태그를 갖는 VNAR을 발현시켰다.
hROR1 hROR2
VNAR Ka (M -1 s -1 ) Kd (s -1 ) KD (nM)
B1 4.75E+05 7.56E-04 1.65 결합하지 않음
B1 -S- mal-형광 4.7E+05 3.67E-04 0.81 결합하지 않음
2V 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음
2V -S-mal-vcMMAE 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음
2V-Ox-vcMMAE 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음
2V-Ox-MMAE 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음
P3A1-P3A1 1.86E+06 2.96E-03 1.61 결합하지 않음
P3A1-P3A1-S-mal-vcMMAE 4.96E+06 2.6E-03 0.59 결합하지 않음
P3A1-P3A1-Ox-vcMMAE 2.07E+06 2.77E-03 1.43 결합하지 않음
P3A1-P3A1-Ox-MMAE 4.20E+06 3.20E-03 0.78 결합하지 않음
2V-2V 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음
2V-2V-S-mal-vcMMAE 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음
2V-2V-Ox-vcMMAE 비 특이적 결합 비 특이적 결합 비 특이적 결합 결합하지 않음
2V-2V-Ox-MMAE 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음
암 세포주에 대한 VNAR 접합체의 결합
암 세포주에 대한 B1 및 P3A1 MMAE 접합체의 결합을 상기 기재된 방법을 사용하여 유세포 분석에 의해 결정하였다. B1 및 P3A1 접합체는 일정한 농도의 단백질에서 ROR1hi A549 폐 선암종 세포에 대한 결합을 유지하고, 유세포 분석에 의해 ROR1low 폐암 세포주 A427에 결합하지 않는다.
VNAR mFc 융합 단백질 접합체
B1 mIgG2a Fc 및 비 결합 2V mIgG2a Fc 융합 단백질을 항체 사슬 간 이황화물의 부분적 환원 및 표지화로부터 채택된 프로토콜을 통해 mal AF488 및 mc vc PAB MMAE로 표지하였다 (문헌[Methods in Molecular Biology vol 1045 chapter 9; Sun et al, Bioconj Chem 2005]). 요약하면, 1 mM EDTA가 첨가된 PBS +100 mM L-Arg 중 1 mg/ml의 VNAR mIgG2a Fc 단백질을 37℃에서 2시간 동안 2.75 몰당량의 새로운 TCEP로 부분적으로 환원시켰다. 유리 단백질 티올에 1.1 몰당량 말레이미드 표지를 첨가하고, 얼음 상에서 45분 동안 인큐베이션하고, L-시스테인을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 반응을 투석하여 비 반응 표지/약물을 제거하고, 멸균 여과하고, SDS PAGE로 분석하였다. 일반적 DAR은 B1-mFc-AF488의 경우 4.4, 2V-mFc-AF488의 경우 3.9이다.
VNAR hFc 융합 단백질 약물 접합체
ADC를 생성하는 또 다른 접근법은 항체의 경쇄 및 중쇄 상의 위치에서 시스테인 치환 또는 첨가를 조작하는 것이며, 이러한 시스테인은 부위 특이적 표지를 위한 반응성 티올기를 제공한다 (문헌[Junutula 2008 Nature Biotechnology 26, 925 - 932, Jeffrey 2013, Sutherland 2016]).
hIgG1 Fc 서열, S252C 또는 S473C (카밧 넘버링)에서 시스테인 치환을 포함하는 조작된 hIgG1 Fc 도메인에 항 ROR1 VNAR을 유전자 융합시켰다. 이로써 형광 표지 (AF488) 및 세포독성 약물의 말레이미드 유도체 (MC vc PAB MMAE, MC vc PAB NHC6 a-아마니틴, MA PEG4 va PBD, MA PEG8 va PAB SG3199, MA PEG4 vc PAB DMAE PNU 159682)에 의해 부위 특이적 표지가 가능하였다 (도 32a 및 32b).
VNAR-hFc - 약물 접합체의 생성
VNAR Fc S252C 또는 VNAR Fc S473을 표지하기 위한 부분적 환원, 재접힘 및 표지 방법은 문헌[Junutula et al, 2008 Nat Biotech, Jeffrey et al, 2013 Bioconj Chem]으로부터 채택하였다. 요약하면, 1 mg/ml VNAR hFc 용액을 1 mM EDTA와 함께 PBS + 100 mM L-아르기닌 pH7.4에서 제조하였다. 20 몰당량 TCEP를 첨가하고, 4℃에서 최소 48시간 동안 인큐베이션하였다. 30 몰당량 DHAA를 첨가하고, pH를 6.5로 조정하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 재접힘된 VNAR Fc S252C 또는 S473C를 PBS + 50mM L-아르기닌으로 완충액 교체하거나 광범위하게 투석하고, UV에 의해 정량화한 후, 표지/약물에 따라 실온에서 1시간 내지 밤새 4 몰당량의 말레이미드 표지/약물과 반응시켰다. 접합체를 SEC 또는 IEX에 의해 직접 투석/완충액 교체하거나 추가로 정제한 후, 투석/완충액 교체하였다.
이 접근법은 사용하여, B1, P3A1 및 2V Fc 융합 단백질의 MMAE 접합체를 생성하였고, 이에 의해 해당 hIgG1 Fc (S252C 또는 S473C) 유도체를 효소 절단 가능 (카텝신 B) 링커를 포함하는 말레이미드 기능성 MMAE 페이로드로 표지하였다.
최종 접합체의 SDS-PAGE 및 질량 분석에 의해 2의 약물 대 항체 비 (DAR)의 매우 순수한 균질한 VNAR-hFc-MMAE 접합체를 제공하기 위해 표지화가 정량적 방식으로 진행되었음을 결정하였다 (도 31a 및 31b은 VNAR-hFc(S252C)에의 접합을 나타낸다). 시스테인 조작된 VNAR-hFc 융합 단백질 (Levena Biopharma, San Diego)의 PBD 이량체, α-아마니틴 및 PNU 접합체를 생성하기 위해 유사한 절차를 사용하였다. 이에 의해 VNAR (B1, P3A1, 2V) hIgG1 Fc (S252C) 융합을 MC vc PAB NHC6 a-아마니틴, MA PEG4 va PBD, MA PEG8 va PAB SG3199, MA PEG4 vc PAB DMAE PNU 159682와 반응시켰다 (도 32a 및 32b).
hROR1 및 암 세포주에 대한 VNAR-hFc - MMAE 접합체의 결합
인간 ROR1 ECD에 결합하는 VNAR-hFc 접합체의 능력을 상기 기재된 절차를 사용하여 SPR에 의해 결정하였다.
인간 ROR1 및 인간 ROR2에 대한 VNAR 인간 Fc (hFc) 및 MMAE 접합된 버전의 결합에 대한 SPR 데이터
분자 세트 hROR1 hROR2
Ka (M -1 s -1 ) Kd (s -1 ) KD (nM)
B1 hFc
B1 hFc-MMAE		 3.08E+06
1.22E+06		 9.53E-05
1.29E-04		 0.032
0.105		 결합하지 않음
결합하지 않음
P3A1 hFcP3A1 hFc-MMAE 1.07E+07
2.68E+06		 5.64E-04
1.00E-03		 0.084
0.38		 결합하지 않음
결합하지 않음
2V hFc2V hFc -MMAE 결합하지 않음
결합하지 않음		 결합하지 않음
결합하지 않음		 결합하지 않음
결합하지 않음		 결합하지 않음
결합하지 않음
2V-2V hFc 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음
B1 및 P3A1 VNAR -hIgG Fc (S252C) - vcMMAE 접합체는 ROR1에 대한 높은 친화도 결합을 나타내었지만 인간 ROR2에는 결합하지 않는다. 2V는 비 결합 VNAR이고, 해당 2V-hFc 약물 접합체를 비 결합 대조군으로서 생성하였다.
ROR1hi A549 폐 선암종 세포주 및 ROR1low A427 폐암 세포주에 대한 B1 및 P3A1 hFc-vcMMAE 접합체의 결합을 상기 기재된 방법을 사용하여 유세포 분석에 의해 결정하였다.
도 30은 B1 및 P3A1 hFc-vcMMAE 접합체가 ROR1hi 암 세포에 강하게 결합하지만, ROR1low 암 세포에는 결합하지 않음을 보여준다. 2V-hFc-vcMMAE 접합체는 어느 세포주에도 결합하지 않는다.
항-ROR1 VNAR 약물 접합체로 처리된 암 세포에 대한 시험관내 세포 생존율 분석
세포를 백색 투명 바닥 96웰 플레이트 (Costar)에 시딩하고, 24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 다음날, x10 작업 스톡에서 각 시험 제제에 대해 연속 희석을 설정하였다. 용량 반응 X10 스톡은 10000, 5000, 1000, 500, 100, 50, 10, 5, 1, 0.5nM이었다. 다채널 피펫을 사용하여 10 μL의 X10 스톡 용액을 세포 플레이트에 첨가하였다 (웰당 90 μl). 이에 의해 웰에 1:10 희석 및 1000 nM (컬럼 1) 내지 0.05 nM (컬럼 10) 범위의 용량 반응이 생성되었다. 10 μl의 비히클 대조군 (PBS)을 대조군 웰 (컬럼 11 및 12)에 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. Promega Cell Titre Glo 시약을 제조업체의 지침에 따라 사용하여, 세포 생존율을 평가하였다. 요약하면, 분석 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하고, 실온으로 평형화한 후, 각각 100 μl의 분석 웰에 100 μl의 실온 Cell Titre Glo 시약을 첨가하였다. 플레이트를 600 rpm에서 2분 동안 플레이트 진탕기 상에 배치하였다. 플레이트를 실온에서 추가로 10분 동안 방치한 후, Clariostar 플레이트 판독기 (BMG)를 사용하여 발광 판독을 측정하였다. 처리되지 않은 (비히클 단독) 대조군 웰에 대한 평균을 계산하고 각각의 처리된 웰에 대한 대조군의 %를 결정함으로써 데이터를 분석하였다. 이어서, 대조군 데이터의 %를 GraphPad Prism 소프트웨어에서 비선형 회귀 피팅을 사용하여 유도된 IC50 값 및 Log [처리] 농도에 대해 그래프화하였다.
세포주
DU 145 전립선암 세포: EMEM, 10% hiFCS
JeKo-1 맨틀 세포 림프종 세포: RPMI 1640, 20% hiFCS
Kasumi-2 B 세포 전구체 백혈병 세포: RPMI 1640, 10% hiFCS
PA-1 난소암 세포: EMEM, 10% hiFCS
PA-1 ROR1 녹아웃 세포: EMEM, 10% hiFCS
A549 세포: DMEM, 10% hiFCS
MDA-MB-231 세포: DMEM, 10% hiFCS
도 33은 B1-mFc-vcMMAE 및 2V-mFc-vcMMAE 접합체에 의한 ROR1 양성 암 세포주 A549 (폐 선암종), MDA-MB-231 (유방암), DU145 (전립선암), Kasumi-2 (ALL 세포) 및 Jeko1 (MCL 세포)의 세포 사멸에 대한 해당 IC50 값에 의한 용량 반응 곡선을 보여준다. B1-mFc-vcMMAE 접합체는 ROR1 양성 암 세포의 강력한 세포-사멸을 나타내고, 각각의 세포주에 대해 해당 2V-mFc-vcMMAE 접합체에 대한 우수한 효능을 나타낸다.
세포주당 B1-mFc-MMAE 및 2V-mFc-MMAE에 의한 세포 사멸의 IC50 값.
세포주 IC50 (nM)
B1 mFc MMAE 2V mFc MMAE
A549 24.2 228
MDA-231 36.6 212
DU145 15 75
Kasumi-2 26 240
JeKo-1 8.1 66
도 34는 A) B1-hFc-PBD, D3-hFc-PBD 및 2V-hFc-PBD 접합체에 의한 ROR1 양성 DU145 전립선암 세포 및 B) B1-hFc-PBD, P3A1-hFc-PBD, D3-hFc-PBD 및 2V-hFc-PBD 접합체에 의한 ROR1 양성 Jeko1 MCL 세포의 세포 사멸에 대한 해당 IC50 값에 의한 용량 반응 곡선을 보여준다.
96시간째에 DU145 및 Jeko-1 암 세포주에서 VNAR hFc-PBD 분자에 대해 결정된 IC50 값 (nM).

세포주		 IC50 (nM)
B1 hFc-PBD
 P3A1 hFc-PBD
 D3 hFc-PBD
 2V hFc-PBD
DU145 4.6 / 29.2 226.2
JeKo-1 0.36 1.9 12.6 25.4
VNAR-PBD 접합체를 표적화하는 ROR1은 암 세포주 둘 모두의 강력한 사멸을 나타내고, 2V-hFc-PBD 접합체에 비해 증가된 효능을 나타내며, B1-hFc 접합체에 대한 IC50 값은 2V-hFc 접합체보다 적어도 49배 더 낮다.
도 35는 B1-hFc-PNU, 2V-hFc-PNU 접합체 (PEG4-vc PAB DMAE PNU 159682), P3A1-hFc-PBD, D3-hFc-PBD 및 2V-hFc-PBD 접합체 및 B1-hFc SG3199 PBD 및 2V-hFc SG3199 PBD 접합체에 의한 ROR1 양성 PA-1 난소암 세포 (A, C, E) 및 Kasumi-2 B 세포 전구체 백혈병 세포 (B, D, F)의 세포 사멸에 대한 해당 IC50 값에 의한 용량 반응 곡선을 보여준다.
VNAR-hFc 접합체에 의한 PA-1 및 Kasumi-2 암 세포의 세포 사멸에 대해 계산된 IC50 값 (nM). PA-1 ROR1 ko는 ROR1 발현이 녹아웃된 PA-1 암 세포주이다.
세포주 P3A1 hFc-va-PBD-SGD1882
IC50 (nM)		 D3 hFc-va-PBD-SGD1882
IC50 (nM)		 2V hFc-va-PBD-SGD1882
IC50 (nM)		 B1 hFc-va-PAB- SG3199
IC50 (nM)		 2V hFc-va-PAB- SG3199
IC50 (nM)		 B1 hFc-vc-PAB-DMAE-PNU159682
IC50 (nM)		 P3A1 hFc-vc-PAB-DMAE-PNU159682
IC50 (nM)		 2V-hFc-vc-PAB-DMAE-PNU159682
IC50 (nM)
PA-1 0.065 0.34 2.5 0.03 5.9 0.028 0.0027 3.13
PA-1 ROR1 ko ND ND ND 0.79 10.5 1.5 3.4 4.5
Kasumi-2 0.52 0.25 6.6 0.06 4.4 0.8 5.1 11
VNAR-접합체를 표적화하는 ROR1은 PA-1 및 Kasumi-2 암 세포주 둘 모두의 강력한 사멸을 나타내고, 해당 2V-hFc 접합체에 비해 증가된 효능을 나타내며, 다수의 ROR1 표적화 접합체에 대한 IC50 값은 해당 2V-hFc 접합체 대조군보다 100배 초과하여 더 낮다. 또한, B1hFc-SG3199 및 B1hFc-PNU의 세포 사멸 효과는 PA-1 및Kasumi-2 세포주에서 ROR-1 의존-경쟁 실험이다(도 35b). B1hFc는 용량 의존적 방식으로 B1hFc-SG3199 및 B1hFc-PNU에 의한 세포 사멸을 억제한다. 2VhFc는 이들 약물-접합 분자에 의한 세포 사멸을 억제하지 않았다(도 35b).
실시예 10 - ROR1 VNAR 이중특이성
ROR1 결합 VNAR에 대한 이중특이적 표적 조합은 예를 들어,
반감기 연장을 위한 HSA; ROR1 및 혈청 알부민의 이중특이적 관여;
RTK, 예를 들어 EGFR, Her3; 세포 표면에서 EGFR 및 ROR1 또는 HER3 및 ROR1 둘 모두를 표적화하는 이중특이성
을 포함한다.
본원에서 이미 논의되고 예시된 VNAR BA11은 HSA-결합 VNAR의 예이다. HSA-결합 VNAR(예: BA11)을 포함하는 이중-특이적 분자 및 다른 특이적 결합 분자가 논의된다.
2개의 상이한 길이의 G4S 링커를 통해 N-말단 ROR1 VNAR과 C-말단 항-CD3 scFv (클론 OKT3)를 조합하는 ROR1 x CD3 이중특이적 서열을 CHO 세포 (Evitria)에서 발현시키고, IMAC(HisTrap Excel, GE Healthcare)에 이어, SEC(Superdex 200 26/60, GE Healthcare)로 정제시켰다. 유사하게, N-말단 이중파라토프 ROR1 VNAR과 C-말단 항-CD3 scFv를 조합하는 이중파라토프 ROR1 x CD3 이중특이적 서열은 CHO(Evitria)에서도 발현되었다.
CD3 BiTE-유사 접근법: ROR1 VNAR 이중특이성으로서 사용하기 위한 CD3 결합 서열의 예
항 CD3 scFv 클론 OKT3 (WO 2014028776 Zyngenia) 및 그의 배향 및 인간화 유도체
VH-[G4S]3-VL
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKS (서열번호 100)
인간화된 항 CD3 scFv UCHT1 (문헌[Arnett et al PNAS 2004 101(46) 16268-16273]) 및 그의 유도체
VL-[G4S]3-VH
MDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTTLTVFS (서열번호 101)
[표 17]
ROR1xCD3 작제물의 특성화
Figure pct00015
이중 파라토프 VNAR 분자
몇몇 이중 파라토프 VNAR 작제물을 설계하고 (G4S)5 링커를 사용하여 클로닝했다.
결합 동역학은 SPR (이전에 기재된 바와 같음) 또는 생물층 간섭법(K2 Octet instrument/Pall ForteBio)을 사용하여 결정하였다. BLI 실험을 위해, ROR1-hFc, ROR2-hFc 융합 단백질(세포외 도메인) 및 HSA를 나트륨 아세테이트 pH5 완충제에서 아민 커플링을 사용하여 AR2G 센서에 고정시켰다. VNAR 및 VNAR-Fc 분자를 다양한 농도로 시험하였고, Octet 데이터 분석 HT 소프트웨어(Pall ForteBio)를 사용하여 Ka(M-1s-1), Kd(s-1) 및 KD(nM) 값을 결정하였다. 2V는 순수한 VNAR 라이브러리로부터 유래된 대조군 VNAR 서열이고, 따라서 이 단백질 부류를 대표하지만 공지된 표적은 갖지 않는다.
hROR1 결합에 대한 결합 동역학은 또한 기준선, 회합 및 해리 조건에서 HSA (200 nM)의 포화 수준으로 수행되었다.
[표 18]
Figure pct00016
Figure pct00017
[표 19]
Figure pct00018
또한, -PGVQPSPGGGGS- 링커(또한, 우베-G4S로 칭명됨) 및 -PGVQPAPGGGGS- 링커(또한, 우베-G4S-GM-으로 칭명됨) 서열을 사용하여 다수의 이중 파라토프 VNAR 작제물을 생성하였다. 모두 QACKA HisMyc 태그(서열번호 80)를 사용하여 발현되었고, 전술한 바와 같이 특성화되고 평가되었다.
[표 20]
Figure pct00019
Figure pct00020
본원에 언급된 이중 파라토프 VNAR 작제물은 또한 말레이미드 알렉사488 형광단과 성공적으로 결합되어, 작제물이 다른 모이어티에의 접합에 적합하다는 것을 입증한다. 이 개념 작업의 증명은 이중 파라토프 분자의 다른 페이로드에의 접합이 가능할 것임을 보여준다.
Alexa Fluor 488 C5 말레이미드(Thermo Fisher Scientific, UK)를 사용한 VNAR의 선택적 표지는 IMAC 용출 완충액(일반적으로 50mM NaPi pH 6.9, 150mM NaCl, 50mM L-아르기닌, 250mM 이미다졸, 접합을 위해 혼입된 Cys.로부터 임의의 캡핑을 제거하기 위해 2mM TCEP를 첨가함)에서 VNAR의 Ni2 + IMAC 정제 후 수행되었다. 대략 4몰 당량의 Alexa Fluor 488 염료를 VNAR 용액(전형적인 단백질 농도는 2-30μM이었다)에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 완만하게 교반하면서 암실에서 배양했다. 용액에 미반응된 VNAR가 잔류하지 않음을 보장하기 위해 반응을 LC-MS(ESI)로 모니터링했다. 미반응 염료를 제거하기 위해, 반응 혼합물을 50mM NaPi pH 6.9, 150mM NaCl, 50mM L-아르기닌으로 50mM 이미다졸 농도로 희석하고, Ni2 + IMAC는 HisTrap Excel 컬럼(모두 GE Healthcare, U.K.)을 사용하여 AKTA Pure 시스템에서 수행하였다. 단백질은 50mM NaPi pH 6.9, 150mM NaCl, 50mM L-아르기닌, 250mM 이미다졸에서 용출시켰다. Alexa488 VNAR 접합체를 함유하는 용출 분획을 풀링하고, 필요할 때까지 4℃에서 저장하였다. 단백질은 SEC 또는 투석에 의해 PBS pH 7.4 또는 PBS pH 7.4, 50mM L-Arg로 완충제 교환하였다. 도 36 내지 38을 참조한다.
실시예 11 - ROR1 CAR-T 접근법
본 출원에 기재된 ROR1-특이적 항원 결합 분자를 기반으로 하여 키메라 항원 수용체 (CAR)를 생성할 수 있다. 또한, 이러한 CAR을 발현하는 조작된 T 세포를 또한 생성할 수 있으며, 이는 예를 들어 입양 세포 요법에 사용될 수 있다.
간단히 말하면, ROR1-특이적 CAR을 인코딩하는 핵산 작제물을 생성할 수 있다. ROR1-특이적 CAR은 세포내 활성화 도메인, 막관통 도메인, 및 본 명세서에 기재된 ROR1-특이적 항원 결합 분자를 포함하는 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 이어서, 핵산 작제물을 레트로바이러스 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터)와 같은 바이러스 벡터에 혼입할 수 있다.
T 세포를 치료가 필요한 환자로부터 단리될 수 있으며, 그 후, 예를 들어 CRISPR-CAS-9와 같은 접근법을 사용하여 레트로바이러스 형질감염 또는 유전자-편집에 의해 CAR을 인코딩하는 핵산 작제물을 발현하도록 변형시킬 수 있다.
이어서, 암의 치료와 같은 병태의 치료를 위해 조작된 T 세포를 환자에게 재 주입할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Almac Discovery Limited <120> ROR1-SPECIFIC ANTIGEN BINDING MOLECULES <130> IPA200739-GB <150> GB1721802.5 <151> 2017-12-22 <160> 270 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 Asp Thr Ser Tyr Gly Leu Tyr Ser 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 Gly Ala Lys Tyr Gly Leu Ala Ala 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 Gly Ala Lys Tyr Gly Leu Phe Ala 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 4 Gly Ala Asn Tyr Gly Leu Ala Ala 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 5 Gly Ala Asn Tyr Gly Leu Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 6 Thr Thr Asp Trp Glu Arg Met Ser Ile Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> 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Ser Asn Pro Leu Thr Phe 465 470 475 480 Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ser His His His His His His 485 490 495 <210> 270 <211> 506 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 270 Thr Arg Val Asp Gln Thr Pro Arg Thr Ala Thr Lys Glu Thr Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Thr Asp Thr Ser Tyr Gly Leu Tyr 20 25 30 Ser Thr Ser Trp Phe Arg Lys Asn Pro Gly Thr Thr Asp Trp Glu Arg 35 40 45 Met Ser Ile Gly Gly Arg Tyr Val Glu Ser Val Asn Lys Gly Ala Lys 50 55 60 Ser Phe Ser Leu Arg Ile Lys Asp Leu Thr Val Ala Asp Ser Ala Thr 65 70 75 80 Tyr Tyr Cys Lys Ala Arg Glu Ala Arg His Pro Trp Leu Arg Gln Trp 85 90 95 Tyr Asp Gly Ala Gly Thr Val Leu Thr Val Asn Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Ala Ser Val Asn Gln Thr Pro Arg Thr Ala Thr Lys 130 135 140 Glu Thr Gly Glu Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Thr Asp Thr Ser 145 150 155 160 Tyr Gly Leu Tyr Ser Thr Ser Trp Phe Arg Lys Asn Pro Gly Thr Thr 165 170 175 Asp Trp Glu Arg Met Ser Ile Gly Gly Arg Tyr Val Glu Ser Val Asn 180 185 190 Lys Arg Ala Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Lys Asp Leu Thr Val Ala 195 200 205 Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Ala Gln Ser Gly Met Ala Ile Ser 210 215 220 Thr Gly Ser Gly His Gly Tyr Asn Trp Tyr Asp Gly Ala Gly Thr Val 225 230 235 240 Leu Thr Val Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 245 250 255 Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg 260 265 270 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe 275 280 285 Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 290 295 300 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn 305 310 315 320 Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser 325 330 335 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 340 345 350 Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp 355 360 365 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 370 375 380 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser 385 390 395 400 Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys 405 410 415 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser 420 425 430 Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 435 440 445 Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser 450 455 460 Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 465 470 475 480 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 485 490 495 Glu Leu Lys Ser His His His His His His 500 505

Claims (66)

  1. 하기 화학식 (I)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1(ROR1) 특이적 항원 결합 분자 또는 이의 기능적 변이체:
    FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4 (I)
    여기서,
    FW1은 프레임워크 영역이고,
    CDR1은 CDR 서열이고,
    FW2는 프레임워크 영역이고,
    HV2는 초가변 서열이고,
    FW3a는 프레임워크 영역이고,
    HV4는 초가변 서열이고,
    FW3b는 프레임워크 영역이고,
    CDR3은 CDR 서열이고,
    FW4는 프레임워크 영역이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 ROR1-특이적 항원 결합 분자가 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 2(ROR2)에 결합하지 않는, ROR1-특이적 항원 결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 ROR1-특이적 항원 결합 분자가 인간 ROR1 및 쥣과동물 ROR1(murine ROR1, mROR1) 둘 다에 결합하는, ROR1-특이적 항원 결합 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROR1-특이적 항원 결합 분자가 탈글리코실화된 ROR1에 결합하는, ROR1-특이적 항원 결합 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROR1-특이적 항원 결합 분자가 하기로부터 선택된 선형 펩티드 서열에 결합하지 않는, ROR1-특이적 항원 결합 분자:
    YMESLHMQGEIENQI (서열번호 34)
    CQPWNSQYPHTHTFTALRFP (서열번호 35)
    RSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQ (서열번호 36)
    QCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEYE (서열번호 37).
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    FW1이 20 내지 28개 아미노산의 프레임워크 영역이고,
    CDR1이 DTSYGLYS (서열번호 1), GAKYGLAA (서열번호 2), GAKYGLFA (서열번호 3), GANYGLAA (서열번호 4) 또는 GANYGLAS (서열번호 5)로부터 선택된 CDR 서열이고,
    FW2가 6 내지 14개 아미노산의 프레임워크 영역이고,
    HV2가 TTDWERMSIG (서열번호 6), SSNQERISIS (서열번호 7) 또는 SSNKEQISIS (서열번호 8)로부터 선택된 초가변 서열이고,
    FW3a가 6 내지 10개 아미노산의 프레임워크 영역이고,
    HV4가 NKRAK (서열번호 9), NKRTM (서열번호 10), NKGAK (서열번호 11) 또는 NKGTK (서열번호 12)로부터 선택된 초가변 서열이고,
    FW3b가 17 내지 24개 아미노산의 프레임워크 영역이고,
    CDR3이 QSGMAISTGSGHGYNWY (서열번호 13), QSGMAIDIGSGHGYNWY (서열번호 14), YPWAMWGQWY (서열번호 15), VFMPQHWHPAAHWY (서열번호 16), REARHPWLRQWY (서열번호 17) 또는 YPWGAGAPWLVQWY (서열번호 18)로부터 선택된 CDR 서열이고,
    FW4가 7 내지 14개 아미노산의 프레임워크 영역인, ROR1-특이적 항원 결합 분자 또는 이와 적어도 45% 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 변이체.
  7. 제6항에 있어서, FW1이 ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLT (서열번호 19), AKVDQTPRTATKETGESLTINCVLT (서열번호 20), TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVT (서열번호 21), TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLT (서열번호 22), ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVT (서열번호 23), 또는 TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLT (서열번호 24)로부터 선택되고, FW2가 TSWFRKNPG (서열번호 25) 또는 TYWYRKNPG (서열번호 26)로부터 선택되고; FW3a이 GRYVESV (서열번호 27) 또는 GRYSESV (서열번호 28)로부터 선택되고, FW3b가 SFSLRIKDLTVADSATYYCKA (서열번호 29), SFTLTISSLQPEDSATYYCRA (서열번호 30) 또는 SFTLTISSLQPEDFATYYCKA (서열번호 31)로부터 선택되고, FW4가 DGAGTVLTVN (서열번호 32) 또는 DGAGTKVEIK (서열번호 33)로부터 선택되는, ROR1-특이적 항원 결합 분자 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 변이체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROR1-특이적 항원 결합 분자가
    ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKRAKSFS LRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTVLTVN (서열번호 39);
    AKVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKRAKSFS LRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAIDIGSGHGYNWYDGAGTVLTVN (서열번호 40);
    TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVTGAKYGLAATYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSL RIKDLTVADSATYYCKAYPWAMWGQWYDGAGTVLTVN (서열번호 41);
    TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVTGAKYGLFATYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSL RIKDLTVADSATYYCKAVFMPQHWHPAAHWYDGAGTVLTVN (서열번호 42);
    TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFS LRIKDLTVADSATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTVLTVN (서열번호 43);
    ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVTGANYGLAATYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSL RIKDLTVADSATYYCKAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTVLTVN (서열번호 44);
    TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTGANYGLASTYWYRKNPGSSNKEQISISGRYSESVNKGTKSFTL TISSLQPEDSATYYCRAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKVEIK (서열번호 45);
    TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTGANYGLASTYWYRKNPGSSNQERISISGRYSESVNKRTMSFTL TISSLQPEDSATYYCRAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKVEIK (서열번호 46);
    TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFT LTISSLQPEDFATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTKVEIK (서열번호 47);
    TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTYWYRKNPGSSNKEQISISGRYSESVNKGTKSFTL TISSLQPEDSATYYCRAREARHPWLRQWYDGAGTKVEIK (서열번호 48);
    TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTYWYRKNPGTTDWERMSIGGRYSESVNKGAKSFT LTISSLQPEDSATYYCRAREARHPWLRQWYDGAGTKVEIK (서열번호 49)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, ROR1-특이적 항원 결합 분자 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 변이체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROR1-특이적 항원 결합 분자가 인간화된, ROR1-특이적 항원 결합 분자.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROR1-특이적 항원 결합 분자가 탈면역화된, ROR1-특이적 항원 결합 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROR1-특이적 항원 결합 분자가 검출 가능한 표지, 염료, 독소, 약물, 전구 약물, 방사성 핵종 또는 생물학적 활성 분자에 접합되는, ROR1-특이적 항원 결합 분자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특이적 항원 결합 분자가 약 0.01 내지 50nM, 바람직하게는 0.1 내지 30nM, 더욱 더 바람직하게는 0.1 내지 10nM의 친화도 상수를 갖는 ROR1 단백질과 선택적으로 상호작용하는, ROR1-특이적 항원 결합 분자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특이적 항원 결합 분자가 ROR1-발현 종양 세포의 사멸을 매개할 수 있는, ROR1-특이적 항원 결합 분자.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특이적 항원 결합 분자가 암 세포 증식을 억제할 수 있는, ROR1-특이적 항원 결합 분자.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특이적 항원 결합 분자가 ROR1과 결합시 세포 내 이입(endocytosis)될 수 있는, ROR1 특이적 항원 결합 분자.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따르는 특이적 항원 결합 분자를 포함하는 재조합 융합 단백질.
  17. 제16항에 있어서, 상기 특이적 항원 결합 분자가 하나 이상의 생물학적 활성 단백질에 융합된, 재조합 융합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, 상기 특이적 항원 결합 분자가 하나 이상의 링커 도메인을 통해 하나 이상의 생물학적 활성 단백질에 융합된, 재조합 융합 단백질.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 적어도 하나의 생물학적 활성 단백질이 면역글로빈, 면역글로불린 Fc 영역, 면역글로빈 Fab 영역, 단일 쇄 Fv(scFv), 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이중특이적 t-세포 관여인자(bispecific T-cell engager, BiTE), 인테인, VNAR 도메인, 단일 도메인 항체(sdAb), VH 도메인 또는 스캐폴드 단백질인, 재조합 융합 단백질.
  20. 제19항에 있어서, 적어도 하나의 생물학적 활성 단백질이 면역글로불린 Fc 영역인, 재조합 융합 단백질.
  21. 적어도 하나의 막관통 영역 및 적어도 하나의 세포내 도메인에 융합 또는 접합된, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 ROR1-특이적 항원 결합 분자를 포함하는, ROR1-특이적 키메라 항원 수용체(CAR).
  22. 제21항에 따르는 키메라 항원 수용체를 포함하는 세포로서, 이 세포가 바람직하게는 조작된 T-세포인, 세포.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따르는 특이적 항원 결합 분자, 재조합 융합 단백질 또는 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열.
  24. 선택적으로 하나 이상의 조절 서열을 추가로 포함하는, 제23항에 청구된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  25. 제24항에 청구된 바와 같은 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  26. 특이적 항원 결합 분자, 재조합 융합 단백질 또는 키메라 항원 수용체를 제조하는 방법으로서,
    제23항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를, 상기 숙주 세포가 결합 분자를 생성하는 조건하에서 배양하거나 유지하는 단계를 포함하고, 선택적으로 상기 결합 분자를 단리시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  27. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 특이적 항원 결합 분자, 재조합 융합 단백질 또는 키메라 항원 수용체를 포함하는 약제학적 조성물.
  28. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한, 특이적 항원 결합 분자, 재조합 융합 단백질 또는 키메라 항원 수용체.
  29. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한, 특이적 항원 결합 분자, 재조합 융합 단백질 또는 키메라 항원 수용체.
  30. 제29항에 있어서, 상기 암이 ROR1-양성 암 유형인, 특이적 항원 결합 분자, 재조합 융합 단백질 또는 키메라 항원 수용체.
  31. 제29항에 있어서, 상기 암이 혈액암, 예를 들어, 림프종(lymphoma) 및 백혈병(leukemia), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukaemia; CLL), 맨틀 세포 림프종(mantle cell lymphoma; MCL), B 세포 급성 림프모구성 백혈병(B-cell acute lymphoblastic leukaemia; B-ALL), 변연부 림프종(marginal zone lymphoma; MZL), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma; NHL), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia; AML) 및 신경 모세포종(neuroblastoma), 신장암(renal cancer), 폐암(lung cancer), 결장암(colon cancer), 난소암(ovarian cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 유방암(breast cancer), 피부암(skin cancer), 자궁암(uterine cancer), 전립선암(prostate cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 두경부암(Head and Neck cancer), 방광암(bladder cancer), 위암(stomach cancer) 또는 간암(liver cancer)을 포함하는 고형 종양을 포함하는 군으로부터 선택되는, 특이적 항원 결합 분자, 재조합 융합 단백질 또는 키메라 항원 수용체.
  32. 질병의 치료가 필요한 환자에서 질병을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 특이적 항원 결합 분자, 재조합 융합 단백질 또는 키메라 항원 수용체의 용도.
  33. 치료를 필요로 하는 환자에서의 질병을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 특이적 항원 결합 분자, 재조합 융합 단백질 또는 키메라 항원 수용체 또는 제27항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 질병이 암인, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 암이 ROR1-양성 암 유형인, 방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 암이 혈액암, 예를 들어, 림프종 및 백혈병, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 맨틀 세포 림프종(MCL), B-세포 급성 림프모구성 백혈병(B-ALL), 변연부 림프종(MZL), 비호지킨 림프종(NHL), 급성 골수성 백혈병(AML) 및 신경아세포종, 신장암, 폐암, 결장암, 난소암, 췌장암, 유방암, 피부암, 자궁암, 전립선암, 갑상선암, 두경부암, 방광암, 위암 또는 간암을 포함하는 고형 종양을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
  37. 샘플 중 표적 분석물의 존재 여부를 분석하는 방법으로서, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 검출 가능하게 표지된 특이적 항원 결합 분자 또는 제16항 내지 제20항의 재조합 융합 단백질을 샘플에 첨가하는 단계 및 표적 분석물에 대한 상기 분자의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  38. 대상체에서 질병 부위를 영상화(imaging)하는 방법으로서, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 검출 가능하게 표지된 특이적 항원 결합 분자 또는 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항의 검출 가능하게 표지된 재조합 융합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  39. 대상체에서 질병 또는 의학적 병태를 진단하는 방법으로서, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 특이적 항원 결합 분자 또는 제16항 내지 제20항의 재조합 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  40. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 ROR1-특이적 항원 결합 분자와 ROR1에의 결합에 대해 경쟁하는 항체, 항체 단편 또는 항원-결합 분자.
  41. 암이 발병하거나 암에 대한 소인이 있는 대상체를 진단하거나 대상체의 병태의 예후를 제공하기 위한 키트로서, 상기 키트가 시험 대상체로부터의 샘플에 존재하는 항원의 농도를 검출하기 위한 검출 수단을 포함하고, 여기서 상기 검출 수단이 각각 선택적으로 유도체화된 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 ROR1-특이적 항원 결합 분자, 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 재조합 융합 단백질, 제21항에 정의된 바와 같은 CAR, 또는 제23항에 정의된 바와 같은 핵산을 포함하며, 상기 샘플에서 항원의 존재가 상기 대상체가 암을 앓고 있음을 시사하는, 키트.
  42. 제41항에 있어서, 상기 항원이 ROR1 단백질, 더욱 바람직하게는 이의 세포외 도메인을 포함하는, 키트.
  43. 제41항에 있어서, 상기 키트가 상기 샘플에서 ROR1-양성 세포의 존재 또는 부재를 동정하거나, 또는 상기 샘플에서 ROR1-양성 세포의 농도를 결정하기 위해 사용되는, 키트.
  44. 제41항에 있어서, 상기 키트가 분석(assay)이 비교되는 양성 대조군 및/또는 음성 대조군을 포함하는, 키트.
  45. 제41항에 있어서, 상기 키트가 검출될 수 있는 표지를 추가로 포함하는, 키트.
  46. 암이 발병하거나 암에 대한 소인이 있는 대상체를 진단하거나 대상체의 병태의 예후를 제공하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 대상체로부터 수득된 샘플에 존재하는 항원의 농도를 검출하는 단계를 포함하고, 상기 검출이 각각 선택적으로 유도체화되는 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 ROR1-특이적 항원 결합 분자, 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 재조합 융합 단백질, 제21항에 정의된 바와 같은 CAR, 또는 제23항에 정의된 바와 같은 핵산 서열을 사용하여 달성되고, 상기 샘플에서 항원의 존재가 상기 대상체가 암을 앓고 있음을 시사하는, 방법.
  47. 시험관내 또는 환자에서 ROR1을 발현하는 세포를 사멸시키거나 그 성장을 억제하는 방법으로서, 상기 방법이 (i) 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 ROR1-특이적 항원 결합 분자, 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 재조합 융합 단백질, 제23항에 정의된 바와 같은 핵산 또는 제21항 또는 제23항에 따르는 CAR 또는 세포의 약제학적 유효량 또는 용량, 또는 (ii) 제27항에 따르는 약제학적 조성물의 약제학적 유효량 또는 용량을 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 ROR1을 발현하는 세포가 암 세포인, 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 ROR1이 인간 ROR1인, 방법.
  50. 하기 화학식 (II)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 특이적 항원 결합 분자로서:
    X-FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4-Y (II)
    여기서,
    FW1은 프레임워크 영역이고,
    CDR1은 CDR 서열이고,
    FW2는 프레임워크 영역이고,
    HV2는 초가변 서열이고,
    FW3a는 프레임워크 영역이고,
    HV4는 초가변 서열이고,
    FW3b는 프레임워크 영역이고,
    CDR3은 CDR 서열이고,
    FW4는 프레임워크 영역이고,
    X 및 Y는 선택적 아미노산 서열이고,
    상기 특이적 항원 결합 분자가 제2 모이어티에 접합되는, 특이적 항원 결합 분자.
  51. 제50항에 있어서, X 또는 Y가 개별적으로 부재하거나, 면역글로불린, 면역글로불린 Fc 영역, 면역글로불린 Fab 영역, 단일 쇄 Fv(scFv), 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이중특이적 t-세포 관여인자(BiTE), 인테인, VNAR 도메인, 단일 도메인 항체(sdAb), VH 도메인 또는 스캐폴드 단백질을 포함하는 군으로부터 선택되는, 특이적 항원 결합 분자.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 상기 접합이 상기 특이적 항원 결합 분자의 아미노산 서열의 시스테인 잔기를 통해 이루어지는, 특이적 항원 결합 분자.
  53. 제50항 또는 제51항에 있어서, 상기 접합이 상기 특이적 항원 결합 분자의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 혼입된 티올, 아민옥시 또는 하이드라지닐 모이어티를 통해 이루어지는, 특이적 항원 결합 분자.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 모이어티가 면역글로불린, 면역글로불린 Fc 영역, 면역글로불린 Fab 영역, 단일 쇄 Fv(scFv), 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이중특이적 t-세포 관여인자(BiTE), 인테인, VNAR 도메인, 단일 도메인 항체(sdAb), VH 도메인 또는 스캐폴드 단백질을 포함하는 군으로부터 선택되는, 특이적 항원 결합 분자.
  55. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 모이어티가 검출 가능한 표지, 염료, 독소, 약물, 전구 약물, 방사성 핵종 또는 생물학적 활성 분자를 포함하는 군으로부터 선택되는, 특이적 항원 결합 분자.
  56. 제50항 내지 제53항 또는 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 모이어티가 하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 독소인, 특이적 항원 결합 분자:
    · 메이탄시노이드 (maytansinoid),
    · 아우리스타틴 (auristatin),
    · 안트라사이클린 (anthracyclin), 바람직하게는 PNU-유래 안트라사이클린
    · 아마니틴 (amanitin) 유도체, 바람직하게는 α-아마니틴 유도체
    · 칼리케아미신 (calicheamicin),
    · 튜블리신 (tubulysin)
    · 듀오카마이신 (duocarmycin)
    · 방사성 동위원소 - 예컨대 알파-방출 방사성핵종, 예컨대 227 Th 또는 225 Ac 표지
    · 독성 페이로드(payload)를 포함하는 리포솜,
    · 단백질 독소
    · 탁산 (taxane)
    · 피롤벤조디아제핀 및/또는
    · 인돌리노벤조디아제핀 유사이량체 (indolinobenzodiazepine pseudodimer) 및/또는
    · 스플라이세오좀 (spliceosome) 억제제
    · CDK11 억제제
    · 피리디노벤조디아제핀.
  57. 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특이적 항원 결합 분자가 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1(ROR1) 특이적 항원 결합 분자인, 특이적 항원 결합 분자.
  58. 제57항에 있어서, 상기 ROR1-특이적 항원 결합 분자가 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 2(ROR2)에 결합하지 않는, 특이적 항원 결합 분자.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 ROR1-특이적 항원 결합 분자가 인간 ROR1 및 쥣과동물 ROR1(mROR1) 둘 다에 결합하는, 특이적 항원 결합 분자.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROR1-특이적 항원 결합 분자가 탈글리코실화된 ROR1에 결합하는, 특이적 항원 결합 분자.
  61. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROR1-특이적 항원 결합 분자가 다음으로부터 선택된 선형 펩티드 서열에 결합하지 않는, 특이적 항원 결합 분자:
    YMESLHMQGEIENQI (서열번호 34)
    CQPWNSQYPHTHTFTALRFP (서열번호 35)
    RSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQ (서열번호 36)
    QCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEYE (서열번호 37).
  62. 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
    FW1이 20 내지 28개 아미노산의 프레임워크 영역이고,
    CDR1은 DTSYGLYS (서열번호 1), GAKYGLAA (서열번호 2), GAKYGLFA (서열번호 3), GANYGLAA (서열번호 4) 또는 GANYGLAS (서열번호 5)로부터 선택된 CDR 서열이고,
    FW2가 6 내지 14개 아미노산의 프레임워크 영역이고,
    HV2가 TTDWERMSIG (서열번호 6), SSNQERISIS (서열번호 7) 또는 SSNKEQISIS (서열번호 8)로부터 선택된 초가변 서열이고,
    FW3a가 6 내지 10개 아미노산의 프레임워크 영역이고,
    HV4가 NKRAK (서열번호 9), NKRTM (서열번호 10), NKGAK (서열번호 11) 또는 NKGTK (서열번호 12)로부터 선택된 초가변 서열이고,
    FW3b가 17 내지 24개 아미노산의 프레임워크 영역이고,
    CDR3이 QSGMAISTGSGHGYNWY (서열번호 13), QSGMAIDIGSGHGYNWY (서열번호 14), YPWAMWGQWY (서열번호 15), VFMPQHWHPAAHWY (서열번호 16), REARHPWLRQWY (서열번호 17) 또는 YPWGAGAPWLVQWY (서열번호 18)로부터 선택된 CDR 서열이고,
    FW4가 7 내지 14개 아미노산의 프레임워크 영역인, 특이적 항원 결합 분자 또는 이와 적어도 45%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 변이체.
  63. 제57항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, FW1이 ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLT (서열번호 19), AKVDQTPRTATKETGESLTINCVLT (서열번호 20), TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVT (서열번호 21), TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLT (서열번호 22), ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVT (서열번호 23), 또는 TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLT (서열번호 24)로부터 선택되고, FW2가 TSWFRKNPG (서열번호 25), 또는 TYWYRKNPG (서열번호 26)로부터 선택되고, FW3a가 GRYVESV (서열번호 27), 또는 GRYSESV (서열번호 28)로부터 선택되고, FW3b가 SFSLRIKDLTVADSATYYCKA (서열번호 29), SFTLTISSLQPEDSATYYCRA (서열번호 30), 또는 SFTLTISSLQPEDFATYYCKA (서열번호 31)로부터 선택되고, FW4가 DGAGTVLTVN (서열번호 32), 또는 DGAGTKVEIK (서열번호 33)로부터 선택되는, 특이적 항원 결합 분자 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 변이체.
  64. 제57항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROR1-특이적 항원 결합 분자가
    ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKRAKSFS LRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTVLTVN (서열번호 39);
    AKVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKRAKSFS LRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAIDIGSGHGYNWYDGAGTVLTVN (서열번호 40);
    TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVTGAKYGLAATYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSL RIKDLTVADSATYYCKAYPWAMWGQWYDGAGTVLTVN (서열번호 41);
    TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVTGAKYGLFATYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSL RIKDLTVADSATYYCKAVFMPQHWHPAAHWYDGAGTVLTVN (서열번호 42);
    TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFS LRIKDLTVADSATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTVLTVN (서열번호 43);
    ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVTGANYGLAATYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSL RIKDLTVADSATYYCKAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTVLTVN (서열번호 44);
    TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTGANYGLASTYWYRKNPGSSNKEQISISGRYSESVNKGTKSFTL TISSLQPEDSATYYCRAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKVEIK (서열번호 45);
    TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTGANYGLASTYWYRKNPGSSNQERISISGRYSESVNKRTMSFTL TISSLQPEDSATYYCRAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKVEIK (서열번호 46);
    TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFT LTISSLQPEDFATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTKVEIK (서열번호 47);
    TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTYWYRKNPGSSNKEQISISGRYSESVNKGTKSFTL TISSLQPEDSATYYCRAREARHPWLRQWYDGAGTKVEIK (서열번호 48);
    TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTYWYRKNPGTTDWERMSIGGRYSESVNKGAKSFT LTISSLQPEDSATYYCRAREARHPWLRQWYDGAGTKVEIK (서열번호 49)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 특이적 항원 결합 분자; 또는 적어도 45%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 변이체.
  65. 제57항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROR1-특이적 항원 결합 분자가 인간화되는, 특이적 항원 결합 분자.
  66. 제57항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROR1-특이적 항원 결합 분자가 탈면역화되는, 특이적 항원 결합 분자.
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