JP2017522893A

JP2017522893A - Ｒｏｒ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体

Info

Publication number: JP2017522893A
Application number: JP2017505166A
Authority: JP
Inventors: シファー−マニウイ，セシール
Original assignee: Cellectis SA
Current assignee: Cellectis SA
Priority date: 2014-07-31
Filing date: 2015-07-29
Publication date: 2017-08-17
Also published as: US20170226183A1; US10544201B2; CA2956482A1; EP3194432A1; WO2016016343A1; EP3194432B1

Abstract

本発明は、多重鎖ＣＡＲと称される、抗原ＲＯＲ１に特異的な新世代のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。このようなＣＡＲは、免疫細胞の特異性および反応性を、腫瘍抗原ＲＯＲ１を発現する悪性細胞に再指向させることを目的としている。これらのＣＡＲを構成するアルファ、ベータおよびガンマポリペプチドは、最適なシグナル伝達を付与する天然受容体により近いフレキシブルなアーキテクチャを形成する膜近傍位置においてアセンブルするように設計される。本発明は、特に免疫療法に使用するための、前記多重鎖ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ベクター、および表面においてそれらを発現する単離された細胞を包含する。本発明は、癌、特に慢性リンパ球性白血病または固形腫瘍を処置するための効率的な養子免疫療法戦略への道を開く。

Description

発明の分野
本発明は、抗原ＲＯＲ１に特異的な新世代のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（多重鎖ＣＡＲ）に関する。このようなＣＡＲは、免疫細胞の特異性および反応性を、腫瘍抗原ＲＯＲ１を発現する悪性細胞に再指向させるためのものである。これらのＣＡＲを構成するアルファ、ベータおよびガンマポリペプチドは、最適なシグナル伝達を付与する天然受容体により近いフレキシブルなアーキテクチャを形成する膜近傍位置においてアセンブルするように設計される。本発明は、特に免疫療法に使用するための、前記多重鎖ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ベクター、および表面においてそれらを発現する単離された細胞を包含する。本発明は、癌、特に慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）または乳房、結腸、肺および腎臓の腫瘍などの固形腫瘍を処置するための効率的な養子免疫療法戦略への道を開く。

発明の背景
エクスビボで生成された自己の抗原特異的Ｔ細胞の移入を含む養子免疫療法は、ウイルス感染および癌を処置するための有望な戦略である。養子免疫療法のために使用されるＴ細胞は、抗原特異的Ｔ細胞の増大または遺伝子操作を通したＴ細胞の再指向のいずれかによって生成され得る（Ｐａｒｋ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．（２０１１）ＴｒｅａｔｉｎｇＣａｎｃｅｒｗｉｔｈＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＣｅｌｌｓ．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（１１）：５５０−５５７）。ウイルス抗原特異的Ｔ細胞の移入は、移植に関連するウイルス感染および稀なウイルス関連悪性疾患の処置のために使用されている、よく確立された手法である。同様に、腫瘍特異的Ｔ細胞の単離および移入は、黒色腫の処置において成功が示されている。

Ｔ細胞における新規特異性は、トランスジェニックＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の遺伝子移入を通して、成功裡に生成された（Ｊｅｎａ，Ｄｏｔｔｉｅｔａｌ．（２０１０）ＲｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇＴ−ｃｅｌｌｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｂｙｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇａｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｌｏｏｄ．１１６（７）：１０３５−１０４４）。ＣＡＲは、１つ以上のシグナリングドメインに結合して一本鎖融合分子を形成するターゲティング部分からなる合成受容体である。しかし、このアプローチは、抗原ＣＤ１９を担持する悪性Ｂ細胞をターゲッティングすることによって、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する患者に関してのみ効率的であることがいまのところ証明されている（Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔａｌ．（２０１１）ＣｈｉｍｅｒｉｃＡｎｔｉｇｅｎＲｅｃｅｐｔｏｒ−ＭｏｄｉｆｉｅｄＴＣｅｌｌｓｉｎＣｈｒｏｎｉｃＬｙｍｐｈｏｉｄＬｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：７２５−７３３）。慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）は、実践の血液学者により管理された最も一般的に診断される白血病の１つである。自然史が長く、有効な療法がごくわずかであり、完全な応答をもたらすことが稀であることから、ＣＬＬを有する患者は長年にわたって同様にみなされてきた。近年、Ｖ_Ｈの突然変異状態の生物学的重要性ならびにそれに付随するＺＡＰ−７０の過剰発現、ｐ５３機能の崩壊および染色体異常に関するいくつかの重要な観察が、早期疾患進行および低生存の高いリスクにある患者を特定する能力をもたらした。これらの研究と同時に、ヌクレオシド類似体、モノクローナル抗体、リツキシマブおよびアレムツズマブを含むいくつかの処置が導入されている。臨床検査におけるこれらの療法の組み合わせは、症候性ＣＬＬに対する初期療法として用いた場合、高い完全かつ全体にわたる奏効率をもたらした。したがって、ＣＬＬおよび処置の初期リスク層別化の複雑さは、著しく増加して来た。さらに、これらの初期療法が作用しなかった場合、フルダラビン難治性疾患を有するＣＬＬ患者へのアプローチは非常に困難な課題であり得る（ＢｙｒｄＪ．Ｃｅｔａｌ，２０１４）。

慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）に対する免疫療法の候補抗原の１つは、チロシン−タンパク質キナーゼ膜貫通受容体ＲＯＲ１（ＮＴＲＫＲ１；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬとも呼ばれる）登録番号：Ｑ０１９７３）である。ＲＯＲ１（受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ−ｌｉｋｅｏｒｐｈａｎｒｅｃｅｐｔｏｒ）１）は、細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）様、ＫｒｉｎｇｌｅおよびＦｒｉｚｚｌｅｄ様システインリッチドメインを含む１２０−ｋＤａの糖タンパク質である（図１）。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、中枢神経系において神経突起の成長を調節する、受容体型チロシンキナーゼである。受容体型チロシンキナーゼはＩ型膜タンパク質であり、細胞表面受容体のＲＯＲサブファミリーに属する（Ｒｅｄｄｙｅｔａｌ，１９９７）。正常な白血球中ではなく、ＣＬＬを有する患者におけるＲｏｒ１タンパク質発現は、ＣＬＬの病理生物学におけるその役割のさらなる研究に値し、Ｒｏｒ１指向標的療法の開発の基礎を提供することができる（Ｄａｎｅｓｈｍａｎｅｓｈｅｔａｌ；２００８）。ＲＯＲ１は様々なＢ細胞悪性疾患ならびに乳房、結腸、肺および腎臓の腫瘍を含むいくつかの固形腫瘍のサブセットにおいて発現される。ＲＯＲ１は、発癌シグナリングにおいて上皮性腫瘍における腫瘍細胞の生存を促進するように機能する。重要なことは、ＲＯＲ１は、脂肪組織および膵臓組織を除いて重要器官においては発現せず、正常細胞の死滅による潜在毒性を低減させる（Ｈｕｄｅｃｅｋｅｔａｌ，２０１３）。ＲＯＲ１は、胚形成の間に発現されるが、未熟Ｂ細胞前駆体のサブセットは別として正常な成体組織には存在せず、脂肪細胞では低レベルの発現である（Ｈｕｄｅｃｅｋｅｔａｌ．，２０１０；Ｍａｔｓｕｄａｅｔａｌ．，２００１）。ＲＯＲ１は、初めに転写プロファイリングによりＢ細胞性慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）において発現されることが示され（Ｋｌｅｉｎｅｔａｌ．，２００１；Ｒｏｓｅｎｗａｌｄｅｔａｌ．，２００１）、その後マントル細胞リンパ種（ＭＣＬ）、ｔ（１；１９）染色体転座を有する急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）ならびに肺、乳房、結腸、膵臓、腎臓および卵巣の癌のサブセットを含む多くの癌の表面において同定された（Ｂａｓｋａｒｅｔａｌ．，２００８；Ｂｉｃｏｃｃａｅｔａｌ．，２０１２；Ｄａｎｅｓｈｍａｎｅｓｈｅｔａｌ．，２００８；Ｄａｖｅｅｔａｌ．，２０１２；Ｆｕｋｕｄａｅｔａｌ．，２００８；Ｙａｍａｇｕｃｈｉｅｔａｌ．，２０１２；Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，２０１２ａ，２０１２ｂ）。肺腺癌およびｔ（１；１９）ＡＬＬの両方において、ＲＯＲ１は発癌シグナリングに協力し、ｓｉＲＮＡによるＲＯＲ１のノックダウンは腫瘍細胞生存の維持におけるこの分子の重要な役割を明らかにした（Ｂｉｃｏｃｃａｅｔａｌ．，２０１２；Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙｅｔａｌ．，２０１０；Ｇｅｎｔｉｌｅｅｔａｌ．，２０１１；Ｙａｍａｇｕｃｈｉｅｔａｌ．，２０１２）。したがって、ＲＯＲ１の喪失は、腫瘍により容易に許容できるものではなく、ＲＯＲ１は広範囲にて適用可能なＣＡＲ指向Ｔ細胞療法の魅力的な候補となり得る。したがって、ＲＯＲ１は特にＣＡＲ発現Ｔ細胞を使用する、ＣＬＬまたは固形腫瘍を処置のための適切な標的抗原を表す。

Ｄｒ．ＳｔａｎｌｅｙＲｉｄｄｅｌｌおよびＤｒ．ＬａｕｒｅｎｃｅＣｏｏｐｅｒの実験室は、それぞれ４Ａ５ｓｃＦｖおよび２Ａ２ｓｃＦｖを含む抗ＲＯＲ１ｓｃＣＡＲを以前に操作し、検証している（Ｃｏｏｐｅｒｅｔａｌ２０１０；Ｈｕｄｅｃｅｋｅｔａｌ．，２０１３）。特に、Ｈｕｄｅｃｅｋらは、多様な長さのＩｇＧ４ヒンジおよびＣＤ２８膜貫通ドメインを含む抗ＲＯＲ１ｓｃＣＡＲを開示している。

これらのパラメータは重要な役割を果たし、細かい調整が必要なので、ＣＡＲアーキテクチャを設計し、適切な成分を使用することによるＣＡＲの機能性改善の必要性が依然として存在する。

悪性細胞または感染細胞をターゲティングし得る治療グレードの人工免疫細胞を開発する状況において、本発明者らは、天然のものに近い改善されたＣＡＲアーキテクチャであって、任意の細胞外単一特異的または多重特異的リガンド結合ドメインを使用して作用する可能性が高い改善されたＣＡＲアーキテクチャを研究した。国際公開第２０１４０３９５２３号では、本発明の別個のポリペプチドサブユニットを含む新世代のＣＡＲ（多重鎖ＣＡＲと称される）が記載されている。このアーキテクチャによれば、シグナリングドメインおよび共刺激ドメインは、異なるポリペプチド鎖上に配置される（図２）。このような多重鎖ＣＡＲは、ＦｃεＲＩアルファ鎖の高親和性ＩｇＥ結合ドメインを細胞外リガンド結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）で置換することによって、ＦｃεＲＩから生成され得る一方で、ＦｃεＲＩベータおよび／またはガンマ鎖のＮ末端および／またはＣ末端尾部は、それぞれシグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインに融合される。細胞外リガンド結合ドメインは、Ｔ細胞の特異性を細胞標的に再指向させる役割を有し、シグナル伝達ドメインは、免疫細胞応答を活性化する。ＦｃεＲＩ由来のアルファ、ベータおよびガンマポリペプチド由来の異なるポリペプチドが、膜近傍位置にある膜貫通ポリペプチドであるという事実は、ＣＡＲに対するよりフレキシブルなアーキテクチャを提供して、免疫細胞のバックグラウンド活性化を減少させる。しかし、この可動性は、１つの結合配列から別の結合配列により多くの可変性を与え、したがって、どの結合ドメインおよび最適アーキテクチャが適切な特異性をＲＯＲ１に提供するかを予測することが困難になる。

当業者により制御可能とは限らないパラメータに応じて、同じｓｃＦｖを担持する一本鎖および多重鎖ＣＡＲアーキテクチャが同じ方法を実行し得ないことに留意されたい。この所見は、使用される発現型（例えば、それぞれｍＲＮＡまたはレンチウイルス送達を使用することによる一過性または安定性）にも当てはまり得る。

考えられる別の態様は、人工Ｔ細胞の患者への注入に関連する潜在的有害作用、特に、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）である。したがって、正しいＣＡＲアーキテクチャおよびこのような有害事象の発生を低減可能なそれらの特異的成分を設計する必要性がある。

国際公開第２０１４０３９５２３号

Ｐａｒｋ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．（２０１１）ＴｒｅａｔｉｎｇＣａｎｃｅｒｗｉｔｈＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＣｅｌｌｓ．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（１１）：５５０−５５７Ｊｅｎａ，Ｄｏｔｔｉｅｔａｌ．（２０１０）ＲｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇＴ−ｃｅｌｌｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｂｙｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇａｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｌｏｏｄ．１１６（７）：１０３５−１０４４Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔａｌ．（２０１１）ＣｈｉｍｅｒｉｃＡｎｔｉｇｅｎＲｅｃｅｐｔｏｒ−ＭｏｄｉｆｉｅｄＴＣｅｌｌｓｉｎＣｈｒｏｎｉｃＬｙｍｐｈｏｉｄＬｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：７２５−７３３

本発明は、表面タンパク質としてＲＯＲ１を担持する悪性細胞をターゲティングするのに特に適切な、ｓｃＦｖ細胞外ドメインを担持する最適に設計された多重鎖ＣＡＲを提供する。十分に確立された成分を含む多重鎖ＣＡＲの特定のアーキテクチャにより、人工免疫細胞がＲＯＲ１抗原を担持する腫瘍細胞に対して細胞傷害性となることを可能にし得ることが、本発明において示されている。それらのｍｃＣＡＲのうちの２つ、ｃｓｍ１３およびｃｓｍ１４が、免疫細胞がその本質的な機能を維持しながら、特異的溶解に関して高性能であると思われる。

この達成は、ＣＬＬおよび固形腫瘍、特に乳房、結腸、肺および腎臓の腫瘍に見出されるような、ＲＯＲ１陽性と診断された悪性細胞を処置するための新しい免疫療法への道を開く。

発明の概要
本発明者らは、ＲＯＲ１特異的抗体に由来する、様々なｓｃＦＶを含むＲＯＲ１特異的多重鎖ＣＡＲを作製した。

インビトロの（例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８コーティングビーズおよび組換えＩＬ２を用いた）非特異的活性化の後で、ドナー由来のＴ細胞を、これらのＣＡＲを発現するポリヌクレオチドを用いて、ウイルス形質導入を使用して形質転換させた。特定の場合では、Ｔ細胞をさらに操作して、より具体的には、ＴＣＲ（αβ−Ｔ細胞受容体）の成分を崩壊させ、移植片対宿主の反応を防止することによって、非同種反応性Ｔ細胞を作製することができる。得られた人工Ｔ細胞は、ＲＯＲ１陽性細胞に対するインビトロの反応性を様々な程度で示し、本発明のＣＡＲが、抗原依存性活性化、Ｔ細胞の増殖に寄与し、さらにＲＯＲ１を発現する細胞に対する細胞傷害性になり得、これらが免疫療法に有用になり得ることを示している。

本発明のＣＡＲをコードするポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列を、本明細書において詳細に説明する。それぞれモノクローナル抗体Ｄ１０および２Ａ２に由来するｓｃＦｖを有する２つの抗体ＲＯＲ１多重鎖ＣＡＲ（ｍｃＣＡＲ）−ｃｓｍ１３およびｃｓｍ１４−は、細胞表面における高度な発現を著しく示し、２週間にわたって残存可能であった。また、ｃｓｍ１３およびｃｓｍ１４は、それらの本質的な機能を保持しながら、ＲＯＲ１発現細胞に対するそれらの細胞障害作用を示した。

本発明の人工免疫細胞は、血液癌の病態の処置または固形腫瘍の処置に特に有用である。

エクトドメイン部分およびエンドドメイン部分を含むＲＯＲ１タンパク質の構造。１型受容体型チロシンキナーゼは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−２／４との共受容体を進化的に保存しており、免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン、システインリッチドメイン（ＣＲＤ）およびＫｒｉｎｇｌｅドメインを含む。細胞内部分は、チロシンキナーゼ（ＴＫ）ドメイン、Ｓｅｒ／Ｔｈｒリッチドメイン（Ｓ／ＴＲＤ１および２）に挟まれたプロリンリッチドメイン（ＰＲＤ）を含む。本発明の多重鎖ＣＡＲアーキテクチャが由来するＦｃεＲＩの概略図。ＦｃεＲＩは３つの膜貫通鎖α、βおよびγで構成される。本発明のＲＯＲ１多重鎖ＣＡＲをコードするポリシストロン性構築物の一般構造。本発明の実施例に記載の構築物は、ｐＳＥＷなどのポリシストロン性レンチウイルスベクターに基づく。本発明のＲＯＲ１特異的多重鎖ＣＡＲの異なるアーキテクチャ。左から右へ：（ＣＤ３ゼータのＩＴＡＭに融合された）ポリペプチドガンマ、（ＳｃＦｖに融合された）ポリペプチドアルファ、（ＡおよびＢの４１ＢＢならびにＣおよびＤのＣＤ２８に由来する共刺激ドメインに融合された）ポリペプチドベータ。ＡおよびＢ：ポリペプチドベータは、４１ＢＢ由来の共刺激ドメインに融合されており、ＶＬおよびＶＨ断片は逆の順序である。形質導入Ｔ細胞における多重鎖ＣＡＲ、ｍｃ１３およびｍｃ１４の細胞表面発現を示すＦＡＣＳ分析。データは、３つの独立した実験の平均＋／−ＳＤとして表される。ＲＯＲ１陽性細胞株（Ｊｅｋｏ−１）もしくはＲＯＲ１陰性細胞株（ＳｕｐＴ１）の存在下、または細胞株の不在下（培地）もしくはＰＭＡ／イオノマイシン中（Ｔ細胞活性化のための陽性対照）において、多重鎖ＣＡＲ、ｍｃ１３およびｍｃ１４に実施された脱顆粒アッセイ。対照は、非形質導入Ｔ細胞（ＬＶ非含有）に対して実施された。データは、３つの独立した実験の平均＋／−ＳＤとして表される。）ＲＯＲ１陽性細胞株（Ｊｅｋｏ−１）の存在下において、多重鎖ＣＡＲ、ｍｃ１３およびｍｃ１４に対して実施された細胞傷害性アッセイ。対照は、非形質導入Ｔ細胞（ＬＶ非含有）に対して実施された。データは、３つの独立した実験の平均＋／−ＳＤとして表される。ＲＯＲ１陽性細胞株（Ｊｅｋｏ−１）の存在下において、多重鎖ＣＡＲ、ｍｃ１３およびｍｃ１４に対して実施されたＩＮＦγ分泌アッセイ。対照は、非形質導入Ｔ細胞（ＬＶ非含有）に対して実施された。データは、３つの独立した実験の平均＋／−ＳＤとして表される。同種性を付与し、したがって宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶反応および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を最小化する、抗ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞中のＴＣＲ遺伝子の不活性化の概略図。

下記の表１〜６は、本発明の多重鎖ＣＡＲをアセンブルするために使用される成分およびその配列ならびにそのアーキテクチャ（アセンブリ）を示す。表７は、ＲＯＲ１多重鎖ＣＡＲのポリペプチド配列を示す。

発明の詳細な説明
本明細書において特に定義されない限り、使用される技術用語および科学用語はすべて、遺伝子治療、生化学、遺伝学および分子生物学の領域の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。

適切な方法および材料が本明細書に記載されるが、本明細書に記載されるものに類似しているかまたは等価であるすべての方法および材料が、本発明の実施または試行において使用され得る。本明細書において言及された刊行物、特許出願、特許および他の参考文献はすべて、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先されるであろう。さらに、材料、方法および実施例は、他に特記されない限り、例示的なものに過ぎず、限定するためのものではない。

本発明の実施は、他に示されない限り、当技術分野の技術の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術を利用するであろう。このような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＦｒｅｄｅｒｉｃｋＭ．ＡＵＳＵＢＥＬ，２０００，ＷｉｌｅｙａｎｄｓｏｎＩｎｃ，ＬｉｂｒａｒｙｏｆＣｏｎｇｒｅｓｓ，ＵＳＡ）；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＴｈｉｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ，２００１，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）；ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔｅｄ．，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓｅｔａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｒｒｉｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓｅｄｓ．１９８４）；ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＡｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓｅｄｓ．１９８４）；ＣｕｌｔｕｒｅＯｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＣｅｌｌｓＡｎｄＥｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬＰｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅＴｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅｓｅｒｉｅｓ，ＭｅｔｈｏｄｓＩｎＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ｊ．ＡｂｅｌｓｏｎａｎｄＭ．Ｓｉｍｏｎ，ｅｄｓ．−ｉｎ−ｃｈｉｅｆ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ），ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ａｎｄ１５５（Ｗｕｅｔａｌ．ｅｄｓ．）ａｎｄＶｏｌ．１８５，“ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”（Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｄ．）；ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓＦｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒａｎｄＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓｅｄｓ．，１９８７，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓＩｎＣｅｌｌＡｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒａｎｄＷａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；ＨａｎｄｂｏｏｋＯｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＶｏｌｕｍｅｓＩ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒａｎｄＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；およびＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏ，（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照のこと。

多重鎖キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明は、免疫療法において使用される免疫細胞に特に適合された多重鎖キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。

一般に、本発明の多重鎖ＣＡＲは、少なくとも：
−少なくとも１つの細胞外リガンド結合ドメインを含む１つの膜貫通ポリペプチド；および
−少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む１つの膜貫通ポリペプチド
を、前記ポリペプチドが共にアセンブルして多重鎖キメラ抗原受容体を形成するように含む。

本明細書で使用される場合、「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、リガンドと結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。

好ましい実施形態では、前記細胞外リガンド結合ドメインは、ＲＯＲ１に特異的な標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽（Ｖ_Ｌ）および重（Ｖ_Ｈ）可変断片がフレキシブルリンカーによって連結されたものを含む一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）である。好ましい実施形態では、前記ｓｃＦｖは、好ましくは表５において配列番号：１２、１６、２０、２４、２８および３２として提供される抗ＲＯＲ１ｓｃＦＶである。ｓｃＦｖ以外のＲＯＲ１特異的結合ドメイン、例えば非限定的な例として、ラクダ科動物もしくはサメ類（ＶＮＡＲ）単一ドメイン抗体断片、または受容体リガンド、例えば血管内皮成長因子ポリペプチド、インテグリン結合ペプチド、ヘレグリンもしくはＩＬ−１３突然変異タンパク質、抗体結合ドメイン、抗体超可変ループもしくはＣＤＲもまた、リンパ球の所定のターゲティングに使用され得る。

表５に提供される他の実施例は、配列番号：３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８および７２の抗ＲＯＲ１ｓｃＦＶ配列である。

本発明は、より具体的には、
−細胞外ＲＯＲ１リガンド結合ドメインに融合された高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のアルファ鎖由来の膜貫通ポリペプチド；
−シグナル伝達ドメインに融合されたＦｃεＲＩのガンマ鎖由来の第２の膜貫通ポリペプチド、
−共刺激ドメインを含むＦｃεＲＩのベータ鎖由来の第３の膜貫通ポリペプチド
を含み、
ＦｃεＲＩの前記アルファ鎖に融合された前記ＲＯＲ１リガンド結合ドメインが、ＲＯＲ１に対する特異性を付与する重鎖（Ｖ_Ｈ）および軽鎖（Ｖ_Ｌ）を含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり、
前記Ｖ_Ｈが、配列番号：２８（Ｄ１０）、配列番号：１２（２Ａ２）、配列番号：２０（４Ａ５）、配列番号：３６（Ｇ６）、配列番号：４４（Ｇ３）、配列番号：５２（Ｈ１０）、配列番号：６０（２Ａ４）および配列番号：６８（１Ｃ１１）から選択される１つと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、ならびに
前記Ｖ_Ｌが、配列番号：３２（Ｄ１０）、配列番号：１６（２Ａ２）、配列番号：２４（４Ａ５）、配列番号：４０（Ｇ６）、配列番号：４８（Ｇ３）、配列番号：５６（Ｈ１０）、配列番号：６４（２Ａ４）および配列番号：７２（１Ｃ１１）から選択される１つと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を示すポリペプチドを含む、
ＲＯＲ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃＣＡＲ）に関する。上記したＶＨおよびＶＬ鎖は対で機能する、すなわち、例えば、Ｆ１０抗体のＶＨ鎖は同じ抗体（Ｆ１０）のＶＬ鎖と組み合わせて（ｉｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｖｅｃ）使用されることは理解されるであろう。

より好ましい実施形態によれば、前記Ｖ_ＨおよびＶＬは、それぞれ配列番号：２８および配列番号：３２（Ｄ１０）と、またはそれぞれ配列番号：１２もしくは配列番号：１６（２Ａ２）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を示すポリペプチド配列を含む。

別の実施形態によれば、前記細胞外リガンド結合ドメインは、
−配列番号：２９（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号：３０（ＣＤＲ−Ｈ２）および配列番号：３１（ＣＤＲ−Ｈ３）のマウスモノクローナル抗体Ｄ１０由来のＣＤＲを含むＶＨ鎖、ならびに配列番号３３（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号：３４（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号：３５（ＣＤＲ−Ｌ３）のマウスモノクローナル抗体Ｄ１０由来のＣＤＲを含むＶＬ鎖、
または
−配列番号：１３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号：１４（ＣＤＲ−Ｈ２）および配列番号：１５（ＣＤＲ−Ｈ３）のマウスモノクローナル抗体２Ａ２由来のＣＤＲを含むＶＨ鎖、ならびに配列番号：１７（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号：１８（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号：１９（ＣＤＲ−Ｌ３）のマウスモノクローナル抗体２Ａ２由来のＣＤＲを含むＶＬ鎖、
を含む。

好ましい実施形態では、前記細胞外リガンド結合ドメインは、ＲＯＲ１に特異的な標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽鎖（Ｖ_Ｌ）および重鎖（Ｖ_Ｈ）可変断片がフレキシブルリンカーによって連結されたものを含む一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）である。

好ましい実施形態では、前記ｓｃＦｖは、表５に配列番号：１２〜７５として好ましく提供されたＣＤＲなどの、抗ＲＯＲ１ｓｃＦＶまたはそれらの一部である。表５に記載の全ｓｃＦｖのうち、ｓｃＦｖの好ましい対は、Ｄ１０（配列番号：２８および３２）および２Ａ２（配列番号：１２および１６）のＶＨ鎖およびＶＬ鎖ならびにそれらの個別のＣＤＲ（それぞれＤ１０のＶＨ鎖およびＶＬ鎖に対応する配列番号：２９〜３１および３３〜３５、それぞれ２Ａ２のＶＨ鎖およびＶＬ鎖に対応する配列番号：１３〜１５および１７〜１９）に対応する。

ｓｃＦｖ以外のＲＯＲ１に特異的な結合ドメインは、例えば非限定的な例として、ラクダ科動物もしくはサメ類（ＶＮＡＲ）単一ドメイン抗体断片、または受容体リガンド、例えば血管内皮成長因子ポリペプチド、インテグリン結合ペプチド、ヘレグリンもしくはＩＬ−１３突然変異タンパク質、抗体結合ドメイン、抗体超可変ループもしくはＣＤＲもまた、リンパ球の所定のターゲッティングに使用され得る。

好ましい実施形態では、前記第１の膜貫通ポリペプチドは、前記細胞外リガンド結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間にストーク領域をさらに含む。本明細書で使用される「ストーク領域」という用語は、一般に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。特に、ストーク領域は、細胞外リガンド結合ドメインにさらなる可動性および接近性を与えるために用いられる。ストーク領域は、３００個までのアミノ酸、好ましくは１０〜１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５〜５０個のアミノ酸を含み得る。ストーク領域は、天然分子のすべてもしくは一部、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、もしくはＣＤ２８の細胞外領域のすべてもしくは一部、または抗体定常領域のすべてもしくは一部に由来し得る。あるいは、ストーク領域は天然ストーク配列に対応する合成配列であり得るか、または完全に合成のストーク配列であり得る。好ましい実施形態では、前記ストーク領域は、ヒトＣＤ８アルファ鎖の一部である（例えばＮＰ＿００１１３９３４５．１）（配列番号：２）。

したがって、免疫細胞における多重鎖ＣＡＲの発現は、限定されないが、各腫瘍関連表面抗原を有する悪性細胞、またはウイルス特異的表面抗原を有するウイルス感染細胞、または系統特異的もしくは組織特異的表面抗原を有する標的細胞を含む所定の標的を選択的に排除する改変細胞をもたらす。

標的抗原のダウンレギュレーションまたは突然変異は、一般に、癌細胞において観察され、抗原喪失エスケープ変異体を作成する。したがって、腫瘍エスケープをオフセットし、免疫細胞をより標的特異的にするために、多重鎖ＣＡＲは、いくつかの細胞外リガンド結合ドメインを含み得、標的中の異なる要素に同時に結合し、それにより、免疫細胞の活性化および機能を増強する。一実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、同じ膜貫通ポリペプチド上にタンデムに配置され得、場合により、リンカーによって分離され得る。別の実施形態では、前記異なる細胞外リガンド結合ドメインは、多重鎖ＣＡＲを構成する異なる膜貫通ポリペプチド上に配置され得る。別の実施形態では、本発明は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖ＣＡＲの集団に関する。特に、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、免疫細胞を提供すること、および前記細胞の表面において、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖ＣＡＲの集団を発現させることを含む方法に関する。別の特定の実施形態では、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、免疫細胞を提供すること、および各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖ＣＡＲの集団を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入することを含む方法に関する。特定の実施形態では、免疫細胞操作方法は、細胞の表面において、シグナル伝達ドメインに融合されたＦｃεＲＩベータおよび／またはガンマ鎖の少なくとも一部と、異なる細胞外リガンド結合ドメインに融合されたＦｃεＲＩアルファ鎖の複数の部分とを発現させることを含む。より具体的な実施形態では、前記方法は、シグナル伝達ドメインに融合されたＦｃεＲＩベータおよび／またはガンマ鎖の一部と、異なる細胞外リガンド結合ドメインに融合された複数のＦｃεＲＩアルファ鎖とをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入することを含む。多重鎖ＣＡＲの集団は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の多重鎖ＣＡＲを意味する。本発明の異なる細胞外リガンド結合ドメインは、好ましくは、標的中の異なる要素に同時に結合し、それにより、免疫細胞の活性化および機能を増強し得る。

好ましい実施形態によれば、ＲＯＲ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドは、表７において配列番号：７８（抗ＲＯＲ１ｍｃＣＡＲＤ１０）、配列番号：７６（抗ＲＯＲ１ｍｃＣＡＲ２Ａ２）、配列番号：７７（抗ＲＯＲ１ｍｃＣＡＲ４Ａ５）、配列番号：７９（抗ＲＯＲ１ｍｃＣＡＲＧ６）、配列番号：８０（抗ＲＯＲ１ｍｃＣＡＲＧ３）、配列番号：８１（抗ＲＯＲ１ｍｃＣＡＲＨ１０）、配列番号：８２（抗ＲＯＲ１ｍｃＣＡＲ２Ａ４）および配列番号：８３（抗ＲＯＲ１ｍｃＣＡＲ１Ｃ１１）と称される全長アミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を示すポリペプチド配列を含む。

より好ましい実施形態によれば、ＲＯＲ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドは、表７において配列番号：７８（抗ＲＯＲ１ｍｃＣＡＲＤ１０）、配列番号：７６（抗ＲＯＲ１ｍｃＣＡＲ２Ａ２）と称される全長アミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を示すポリペプチド配列を含む。

本発明はまた、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖ＣＡＲの集団を含む単離された免疫細胞に関する。

本発明の多重鎖ＣＡＲのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、免疫細胞の活性化および免疫応答をもたらす、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合の後の細胞内シグナリングを担う。換言すれば、シグナル伝達ドメインは、多重鎖ＣＡＲが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化を担う。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、専門の機能を果たすよう細胞に指令するタンパク質の部分を指す。

多重鎖ＣＡＲにおいて使用するためのシグナル伝達ドメインの好ましい例は、抗原受容体会合後にシグナル伝達を開始するために協調的に作用するＦｃ受容体またはＴ細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびに同一の機能的能力を有するこれらの配列の誘導体または変異体および合成配列であり得る。シグナル伝達ドメインは、細胞質シグナリング配列の２つの別個のクラス（抗原依存性の一次活性化を開始するもの、および二次的または共刺激的なシグナルを提供するために抗原非依存的に作用するもの）を含む。一次細胞質シグナリング配列は、ＩＴＡＭの免疫受容活性化チロシンモチーフとして公知であるシグナリングモチーフを含み得る。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスチロシンキナーゼのための結合部位として役立つ、多様な受容体の細胞質内テールに見出される十分に定義されたシグナリングモチーフである。本発明において使用されるＩＴＡＭの例としては、非限定的な例として、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＦｃＲイプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられ得る。好ましい実施形態では、多重鎖ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン、またはＦｃεＲＩベータもしくはガンマ鎖の細胞質内ドメインを含み得る。

特定の実施形態では、本発明の多重鎖ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル分子を含む。共刺激分子は、効率的な免疫応答のために必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。

「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それにより、例えば、ペプチドが負荷されたＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化などを含むが、これらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子を指す。共刺激リガンドとしては、限定されないが、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ｉｇａｎｄ）（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびＢ７−Ｈ３に特異的に結合するリガンドが挙げられ得る。共刺激リガンドはまた、とりわけ、限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＴＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどの、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体を包含する。

「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、これに限定されないが、増殖などの、細胞による共刺激応答を媒介するＴ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子としては、限定されないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびトールリガンド受容体が挙げられる。共刺激分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。

別の特定の実施形態では、前記シグナル伝達ドメインは、ＴＮＦＲ関連因子２（ＴＲＡＦ２）結合モチーフ（共刺激ＴＮＦＲメンバーファミリーの細胞質内尾部）である。共刺激ＴＮＦＲファミリーメンバーの細胞質尾部は、主要な保存的モチーフ（Ｐ／Ｓ／Ａ）Ｘ（Ｑ／Ｅ）Ｅ）またはマイナーモチーフ（ＰＸＱＸＸＤ）（式中、Ｘは、任意のアミノ酸である）からなるＴＲＡＦ２結合モチーフを含有する。ＴＲＡＦタンパク質は、受容体の三量化に応じて、多くのＴＮＦＲの細胞内尾部に動員される。

好ましい実施形態では、本発明の多重鎖ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル分子４−１ＢＢ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５３１３３）の一部を含む。

適切な膜貫通ポリペプチドの顕著な特徴は、免疫細胞、特に、リンパ球細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面において発現され、所定の標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を指令するために一緒に相互作用する能力を含む。細胞外リガンド結合ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインを含む本発明の多重鎖ＣＡＲの異なる膜貫通ポリペプチドは、一緒に相互作用して、標的リガンドとの結合後のシグナル伝達に関与し、免疫応答を誘導する。膜貫通ドメインは、天然起源に由来し得るか、または合成起源に由来し得る。膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。非限定的な例として、膜貫通ポリペプチドは、α、β、γ、もしくはなどのＴ細胞受容体のサブユニット、ＣＤ３複合体を構成するポリペプチド、ＩＬ２受容体のｐ５５（α鎖）、ｐ７５（β鎖）、もしくはγ鎖、Ｆｃ受容体、特に、Ｆｃγ受容体ＩＩＩのサブユニット鎖またはＣＤタンパク質であり得る。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含み得る。

「由来する」という用語は、Ｆｃε受容体の配列の１つ以上のアミノ酸改変を含むＦｃε受容体のものと等価であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。このようなアミノ酸改変は、アミノ酸置換、欠失、付加またはそれらの改変の任意の組み合わせを含み得、Ｆｃ受容体のものと比べてＦｃ結合領域の生物学的活性を変化させ得る。一方、特定のＦｃ受容体由来のＦｃ結合領域は、Ｆｃ受容体のものと比べてＦｃ結合領域の生物学的活性を実質的に変化させない１つ以上のアミノ酸改変を含み得る。この種のアミノ酸改変は、典型的には、保存的アミノ酸置換を含むであろう。

特定の実施形態では、多重鎖ＣＡＲは、ＦｃεＲＩ鎖由来の膜貫通ポリペプチドを含む。より具体的な実施形態では、ＦｃεＲＩ鎖は、細胞外ドメインが細胞外リガンド結合ドメイン、好ましくはＲＯＲ１に対するｓｃＦＶで置換されたＦｃεＲＩα鎖である。

より具体的な実施形態では、前記多重鎖ＣＡＲは、ＦｃεＲＩアルファ鎖の一部およびＦｃεＲＩベータ鎖の一部またはそれらの変異体を、前記ＦｃεＲＩ鎖が一緒に自発的に二量体化して二量体キメラ抗原受容体を形成するように含み得る。別の実施形態では、多重鎖キメラ抗原は、ＦｃεＲＩアルファ鎖の一部およびＦｃεＲＩガンマ鎖の一部またはそれらの変異体を、前記ＦｃεＲＩ鎖が一緒に自発的に三量体化して三量体キメラ抗原受容体を形成するように含み、別の実施形態では、多重鎖キメラ抗原受容体は、ＦｃεＲＩアルファ鎖の一部およびＦｃεＲＩベータ鎖の一部およびＦｃεＲＩガンマ鎖の一部またはそれらの変異体を、前記ＦｃεＲＩ鎖が一緒に自発的に四量体化して四量体キメラ抗原受容体を形成するように含み得る。

非限定的な例として、多重鎖ＣＡＲの様々なバージョン（アーキテクチャ）が図４に示されている。より好ましい実施形態では、本発明の多重鎖ＣＡＲは、表６に示されているアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。好ましい実施形態では、多重鎖ＣＡＲは、このようなアミノ酸配列（ａｍｉｎｏａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するか、または多重鎖ポリペプチド構造のポリペプチド構成要素の１、２もしくは３をコードするポリヌクレオチド配列を有するポリペプチドを含む。

「同一性」は、２つの核酸分子またはポリペプチドの間の配列同一性を指す。同一性は、比較の目的のためにアライメントされ得る各配列の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列のある位置が同一の塩基によって占有される時、それらの分子はその位置において同一である。核酸またはアミノ酸配列の間の類似性または同一性の程度は、核酸配列が共有する位置における同一のまたは一致するヌクレオチドの数の関数である。ＧＣＧ配列分析パッケージ（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）の一部として入手可能であるＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴを含む、様々なアライメントアルゴリズムおよび／またはプログラムが、２つの配列の間の同一性を計算するために使用され得、例えば、デフォルト設定で使用され得る。例えば、本明細書に記載される特定のポリペプチドとの少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有しており、好ましくは、実質的に同一の機能を示すポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、企図される。他に示されない限り、類似性スコアは、ＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づくであろう。ＢＬＡＳＴＰが使用される時、パーセント類似性は、ＢＬＡＳＴＰ陽性スコアに基づき、パーセント配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰ「同一性」は、同一である高スコア配列対における全残基の数および画分を示す；ＢＬＡＳＴＰ「陽性」は、アライメントスコアが正の値を有しており、相互に類似している残基の数および画分を示す。本明細書に開示されるアミノ酸配列との同一性もしくは類似性のこれらの程度または同一性もしくは類似性の任意の中間の程度を有するアミノ酸配列が、本開示によって企図され包含される。類似のポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝暗号を使用して推定され、従来の手段によって、特に、遺伝暗号を使用して、そのアミノ酸配列を逆翻訳することによって入手され得る。

ポリヌクレオチド、ベクター：
本発明はまた、本発明の上記多重鎖ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ベクターに関する。本発明は、多重鎖ＣＡＲに含まれ得る本明細書に開示される膜貫通ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ分子を含む）を提供する。特に、本発明は、上記多重鎖ＣＡＲを構成する少なくとも１つの膜貫通ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。より具体的には、本発明は、上記多重鎖ＣＡＲを構成する膜貫通ポリペプチドをコードする２つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。

ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞への導入のためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのウイルスベクター、例えばバキュロウイルスベクター、または哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのプラスミドもしくはウイルスベクター、例えばレンチウイルス）中に存在し得る。

特定の実施形態では、異なる核酸配列は、リボソームスキップ配列をコードする核酸配列、例えば２Ａペプチドをコードする配列を含む１つのポリヌクレオチドまたはベクターに含められ得る。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された２Ａペプチドは、コドンによってコードされる２つのアミノ酸の間にペプチド結合が形成されない、あるコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす（Ｄｏｎｎｅｌｌｙｅｔａｌ．，Ｊ．ｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ８２：１０１３−１０２５（２００１）；Ｄｏｎｎｅｌｌｙｅｔａｌ．，Ｊ．ｏｆＧｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７８：１３−２１（１９９７）；Ｄｏｒｏｎｉｎａｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ａｎｄ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ２８（１３）：４２２７−４２３９（２００８）；Ａｔｋｉｎｓｅｔａｌ．，ＲＮＡ１３：８０３−８１０（２００７）を参照のこと）。「コドン」は、リボソームによって１つのアミノ酸残基へ翻訳されるｍＲＮＡ（またはＤＮＡ分子のセンス鎖）上の３ヌクレオチドを意味する。したがって、ポリペプチドが、インフレームにある２Ａオリゴペプチド配列によって隔てられている時、ｍＲＮＡ内の単一の連続するオープンリーディングフレームから、２つのポリペプチドが合成され得る。このようなリボソームスキップ機序は、当技術分野で周知であり、単一のメッセンジャーＲＮＡによってコードされる数種のタンパク質の発現のため、数種のベクターによって使用されることが公知である。非限定的な例として、本発明では、２Ａペプチドは、多重鎖ＣＡＲの異なるポリペプチドを細胞に発現させるために使用した。

ＦｃεＲなどの膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に指向させるために、（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても公知の）分泌シグナル配列が、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列の中に提供される。分泌シグナル配列は、ＦＣεＲのものであり得るか、または別の分泌タンパク質（例えば、ｔ−ＰＡ）に由来し得るか、またはデノボ合成され得る。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に機能的に連結される。すなわち、２つの配列は、正確なリーディングフレームにおいて結合され、新たに合成されたポリペプチドが宿主細胞の分泌経路に指向されるよう配置される。分泌シグナル配列は、一般に、目的のポリペプチドをコードする核酸配列の５’に配置されるが、特定の分泌シグナル配列は、目的の核酸配列の他の場所に配置され得る（例えば、Ｗｅｌｃｈｅｔａｌ．，米国特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄｅｔａｌ．，米国特許第５，１４３，８３０号を参照のこと）。好ましい実施形態では、シグナルペプチドは、ＦｃεＲＩアルファ鎖（ＮＰ＿００１９９２．１）の残基１〜２５を含む。

当業者は、遺伝暗号の縮重を考慮して、これらのポリヌクレオチド分子において相当の配列変動が可能であることを認識するであろう。好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のため、好ましくは、ヒト細胞における発現のため、コドン最適化される。コドン最適化は、目的の配列において、所定の種の高発現遺伝子において一般に稀であるコドンを、このような種の高発現遺伝子において一般に高頻度であるコドンへ交換することを指し、このようなコドンは、交換されるコドンとしてアミノ酸をコードする。

免疫細胞を操作する方法：
包含される特定の実施形態では、本発明は、免疫療法のための免疫細胞を調製する方法であって、前記多重鎖ＣＡＲを構成するポリペプチドを前記免疫細胞に導入すること、および前記細胞を増大させることを含む方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、細胞を提供すること、および前記細胞の表面において、少なくとも１つの上記多重鎖ＣＡＲを発現させることを含む方法に関する。特定の実施形態では、前記方法は、少なくとも１つの上記多重鎖ＣＡＲを構成するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドで細胞を形質転換すること、および前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させることを含む。

別の実施形態では、本発明は、免疫療法のための細胞を調製する方法であって、前記多重鎖ＣＡＲを構成する異なるポリペプチドを前記細胞に導入すること、および前記細胞を増大させることを含む方法に関する。好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、細胞において安定に発現されることを考慮して、レンチウイルスベクターに含められる。

送達方法
上記様々な方法は、場合によりＤＮＡ末端処理酵素または外因性核酸と共に、多重鎖ＣＡＲ、ｐＴアルファまたはその機能的変異体、低頻度切断エンドヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ＣＡＲを細胞に導入することを含む。

非限定的な例として、前記多重鎖ＣＡＲは、１つまたは異なるプラスミド性ベクターによってコードされる導入遺伝子として導入され得る。異なる導入遺伝子は、リボソームスキップ配列をコードする核酸配列、例えば２Ａペプチドをコードする配列を含む１つのベクターに含められ得る。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された２Ａペプチドは、コドンによってコードされる２つのアミノ酸の間にペプチド結合が形成されない、あるコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす（Ｄｏｎｎｅｌｌｙｅｔａｌ．，Ｊ．ｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ８２：１０１３−１０２５（２００１）；Ｄｏｎｎｅｌｌｙｅｔａｌ．，Ｊ．ｏｆＧｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７８：１３−２１（１９９７）；Ｄｏｒｏｎｉｎａｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ａｎｄ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ２８（１３）：４２２７−４２３９（２００８）；Ａｔｋｉｎｓｅｔａｌ．，ＲＮＡ１３：８０３−８１０（２００７）を参照のこと）。「コドン」は、リボソームによって１つのアミノ酸残基へ翻訳されるｍＲＮＡ（またはＤＮＡ分子のセンス鎖）上の３ヌクレオチドを意味する。したがって、ポリペプチドが、インフレームにある２Ａオリゴペプチド配列によって隔てられている時、ｍＲＮＡ内の単一の連続するオープンリーディングフレームから、２つのポリペプチドが合成され得る。このようなリボソームスキップ機序は、当技術分野で周知であり、単一のメッセンジャーＲＮＡによってコードされる数種のタンパク質の発現のため、数種のベクターによって使用されることが公知である。非限定的な例として、本発明では、２Ａペプチドは、低頻度切断エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡ末端処理酵素または多重鎖ＣＡＲの異なるポリペプチドを細胞に発現させるために使用した。

前記プラスミドベクターはまた、前記ベクターを受容した細胞の同定および／または選択を提供する選択マーカーを含有し得る。

ポリペプチドは、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞への導入の結果として、細胞においてインサイチューで合成され得る。あるいは、前記ポリペプチドは、細胞外で生産され、次いで、細胞に導入され得る。ポリヌクレオチド構築物を動物細胞に導入する方法は、当技術分野で公知であり、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれる安定的形質転換法、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれない一過性形質転換法、およびウイルスによって媒介される方法を非限定的な例として含む。前記ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソームなどによって細胞に導入され得る。例えば、一過性形質転換法としては、例えば、微量注入、エレクトロポレーションまたは微粒子銃が挙げられる。前記ポリヌクレオチドは、細胞における発現を考慮して、ベクター、より具体的には、プラスミドまたはウイルスに含められ得る。

−エレクトロポレーション
本発明の特定の実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えばエレクトロポレーションによって細胞に直接導入されるｍＲＮＡであり得る。本発明者らは、Ｔ細胞におけるｍＲＮＡエレクトロポレーションの最適条件を決定した。

本発明者は、パルス電場を用いることで、材料を細胞に送達するために生細胞を一過的に透過処理するのを可能にするｃｙｔｏＰｕｌｓｅ技術を使用した。この技術は、ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓｐｒｏｐｅｒｔｙ）エレクトロポレーション波形の使用に基づいており、パルス持続時間、強度、ならびにパルス間の間隔の正確な制御を与える（米国特許第６，０１０，６１３号および国際公開第２００４０８３３７９号）。高いトランスフェクション効率と最低限の死のための最高条件に達するために、これらのパラメータはすべて変更することができる。基本的には、最初の高電場パルスによって孔が形成するのに対して、その後の低電場パルスによってポリヌクレオチドは細胞内に移動する。本発明の一態様では、本発明者は、Ｔ細胞におけるｍＲＮＡの＞９５％トランスフェクション効率の達成につながった工程、およびＴ細胞において様々な種類のタンパク質を一過的に発現させるためのエレクトロポレーションプロトコールの使用について説明する。特に、本発明は、Ｔ細胞を形質転換する方法であって、前記Ｔ細胞をＲＮＡと接触させること、ならびに
（ａ）電圧範囲が２２５０〜３０００Ｖ／センチメートルであり、パルス幅が０．１ｍｓであり、工程（ａ）の電気パルスと（ｂ）の電気パルスとの間のパルス間隔が０．２〜１０ｍｓである、１回の電気パルス、
（ｂ）電圧範囲が２２５０〜３０００Ｖであり、パルス幅が１００ｍｓであり、工程（ｂ）の電気パルスと工程（ｃ）の最初の電気パルスとの間のパルス間隔が１００ｍｓである、１回の電気パルス、；および
（ｃ）電圧が３２５Ｖであり、パルス幅が０．２ｍｓであり、４回それぞれの電気パルス間のパルス間隔が２ｍｓである、４回の電気パルス
からなる素早いパルスシーケンスをＴ細胞に適用することを含む方法に関する。

特定の実施形態では、Ｔ細胞を形質転換する方法は、前記Ｔ細胞をＲＮＡと接触させること、ならびに
（ａ）電圧が２２５０Ｖ、２３００Ｖ、２３５０Ｖ、２４００Ｖ、２４５０Ｖ、２５００Ｖ、２５５０Ｖ、２４００Ｖ、２４５０Ｖ、２５００Ｖ、２６００Ｖ、２７００Ｖ、２８００Ｖ、２９００Ｖ、または３０００Ｖ／センチメートルであり、パルス幅が０．１ｍｓであり、工程（ａ）の電気パルスと（ｂ）の電気パルスとの間のパルス間隔が０．２ｍｓ、０．５ｍｓ、１ｍｓ、２ｍｓ、３ｍｓ、４ｍｓ、５ｍｓ、６ｍｓ、７ｍｓ、８ｍｓ、９ｍｓ、または１０ｍｓである、１回の電気パルス、
（ｂ）電圧範囲が２２５０Ｖ、２２５０Ｖ、２３００Ｖ、２３５０Ｖ、２４００Ｖ、２４５０Ｖ、２５００Ｖ、２５５０Ｖ、２４００Ｖ、２４５０Ｖ、２５００Ｖ、２６００Ｖ、２７００Ｖ、２８００Ｖ、２９００Ｖ、または３０００Ｖであり、パルス幅が１００ｍｓであり、工程（ｂ）の電気パルスと工程（ｃ）の最初の電気パルスとの間のパルス間隔が１００ｍｓである、１回の電気パルス、および
（ｃ）電圧が３２５Ｖであり、パルス幅が０．２ｍｓであり、４回それぞれの電気パルス間のパルス間隔が２ｍｓである、４回の電気パルス
からなる素早いパルスシーケンスをＴ細胞に適用することを含む。

上記値域に含まれる任意の値が、本出願において開示される。エレクトロポレーション培地は、当技術分野で公知の任意の適切な培地であり得る。好ましくは、エレクトロポレーション培地は、０．０１〜１．０ミリシーメンスの範囲の伝導率を有する。

特定の実施形態では、非限定的な例として、前記ＲＮＡは、低頻度切断エンドヌクレアーゼ、低頻度切断エンドヌクレアーゼの１つのモノマー、例えば半ＴＡＬＥヌクレアーゼ、キメラ抗原受容体、多重鎖キメラ抗原受容体の少なくとも１つの成分、ｐＴアルファまたはその機能的変異体、外因性核酸、１つさらなる触媒ドメインをコードする。

人工Ｔ細胞
本発明はまた、前記細胞操作方法によって得られやすい単離された細胞または細胞株に関する。特に、前記単離された細胞は、少なくとも１つの上記多重鎖ＣＡＲを含む。別の実施形態では、前記単離された細胞は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖ＣＡＲの集団を含む。特に、前記単離された細胞は、少なくとも１つの多重鎖ＣＡＲを構成するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド配列を含む。

以前に記載されている方法のいずれか１つによって得られる単離された免疫細胞、好ましくはＴ細胞も、本発明の範囲内に包含される。前記免疫細胞は、自然免疫応答および／または適応免疫応答の開始および／または実行に機能的に関与する造血系起源の細胞を指す。本発明の前記免疫細胞は、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、より具体的には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。前記単離された細胞はまた、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞または炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、もしくはヘルパーＴリンパ球からなる群より選択されるＴ細胞であり得る。別の実施形態では、前記細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球からなる群に由来し得る。本発明の細胞の増大および遺伝子改変の前に、細胞の起源は、多様な非限定的な方法を通して被験体から入手され得る。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位に由来する組織、腹水、胸水、脾組織および腫瘍を含む、多数の非限定的な起源から得られ得る。本発明の特定の実施形態では、当業者に入手可能であり公知である多数のＴ細胞株が使用され得る。別の実施形態では、前記細胞は、健常ドナー、癌を有すると診断された患者、または感染を有すると診断された患者に由来し得る。別の実施形態では、前記細胞は、異なる表現型的特徴を提示する細胞の混合集団の一部である。以前に記載されている方法による形質転換Ｔ細胞から得られる細胞株も、本発明の範囲内に包含される。免疫抑制処置に対して耐性であり、以前の方法によって得られやすい改変細胞は、本発明の範囲内に包含される。

前述のように、このような細胞はまた、例えば、ＣＤ５２、ＧＲ、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＨＬＡ遺伝子、免疫チェックポイント遺伝子、例えばＰＤ１およびＣＴＬＡ−４からなる群より選択される１つもしくは複数の遺伝子を不活性化するように遺伝的に操作され得るか、またはｐＴアルファの導入遺伝子を発現し得る。

別の実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ遺伝子および／またはＴＣＲベータ遺伝子を不活性化することによって、本発明の細胞において非機能的になる。上記戦略は、より具体的にはＧｖＨＤを避けるために使用される。本発明の特定の態様は、個体由来の改変細胞を得るための方法であって、前記細胞が、主要組織適合複合体シグナル伝達経路と無関係に増殖し得る方法である。前記方法は、以下の工程：
（ａ）前記個体から細胞を回収する工程；
（ｂ）ＴＣＲアルファまたはＴＣＲベータ遺伝子を不活性化することによって、前記細胞をエクスビボで遺伝子改変する工程；
（ｃ）適切な条件下で、遺伝子改変Ｔ細胞をインビトロで培養して前記細胞を増幅する工程
を含む。

主要組織適合複合体シグナル伝達経路と無関係に増殖し得る改変細胞であって、この方法によって得られやすい改変細胞は、本発明の範囲内に包含される。前記改変細胞は、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶反応および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対して、処置を必要とする患者を処置するために、本発明の特定の態様において使用され得る；したがって、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶反応および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対して、処置を必要とする患者を処置する方法であって、不活性化ＴＣＲアルファおよび／またはＴＣＲベータ遺伝子を含む有効量の改変細胞を前記患者に投与することによって、前記患者を処置することを含む方法は、本発明の範囲内である（概略図については図９）。

例えば、Ｔ細胞受容体アルファ定常鎖領域（ＴＲＡＣ）遺伝子内の、１５ｂｐスペーサーで分けられた２つの１７ｂｐ長配列（半標的（ｈａｌｆｔａｒｇｅｔ）と呼ばれる）をターゲッティングするヘテロ二量体ＴＡＬＥヌクレアーゼを設計し、作製した。個々の半標的は、下記の表８に記載の半ＴＡＬＥヌクレアーゼの反復配列により認識される。

より好ましい実施形態では、前記方法は、
（ａ）好ましくは細胞培養物由来のまたは血液サンプル由来のＴ細胞を提供すること；
（ｂ）ＤＮＡ切断によって、好ましくは二本鎖切断によって、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）成分をコードする少なくとも１つの遺伝子を選択的に不活性化することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードする核酸で前記Ｔ細胞を形質転換すること；
（ｃ）前記低頻度切断エンドヌクレアーゼを前記Ｔ細胞に発現させること；
（ｄ）細胞表面上においてＴＣＲを発現しない形質転換Ｔ細胞を分類すること；
（ｅ）前記細胞を増大させること
を含む。

別の実施形態では、前記低頻度切断エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼであり得る。好ましい実施形態では、前記低頻度切断エンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼである。好ましい方法および関連ＴＡＬＥヌクレアーゼは、国際公開第２０１３１７６９１５号に記載されている。

抗ＲＯＲ１Ｔ細胞の化学療法耐性化
本発明の好ましい実施形態によれば、抗ＲＯＲ１多重鎖ＣＡＲを与えられたＴ細胞は、化学療法薬、特にプリンヌクレオチド類似体（ＰＮＡ）に耐性になるように操作され、養子免疫療法と化学療法とを組み合わせた癌の処置に適切になる。

プリンヌクレオチド類似体は、多数の癌の処置用化学療法組成物に組み込まれ、ＣＬＬの標準的ケアとして使用される。最も広範囲に使用されるＰＮＡは、単独または組み合わせで、クロファラビン、フルダラビンおよびシタラビンである。

ＰＮＡは、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）により、ＰＮＡの一、二および三リン酸塩に代謝される。その三リン酸型および特にクロファラビン（ｃｌｏｒｏｆａｒａｂｉｎｅ）三リン酸は、ＤＮＡ合成のためにＡＴＰと競合し、アポトーシス促進（ｐｒｏ−ａｐｏｔｐｔｏｔｉｃ）剤として作用し、トリヌクレオチド産生に関与するリボヌクレオチド還元酵素（ＲＮＲ）の強力な阻害剤である。

本発明者らは、前記細胞内のｄｃＫ遺伝子発現の不活性化に介在することによって、プリンヌクレオチド類似体、より具体的には、クロファラビン（ｃｌｏｒｏｆａｒａｂｉｎｅ）およびフルダラビンに耐性な抗ＲＯＲ１Ｔ細胞の作製に成功している。ｄｃｋ遺伝子に対する特異的ＴＡＬヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを使用する、好ましくは、ｍＲＮＡのエレクトロポレーションを使用することによるＴ細胞のトランスフェクションは、ＲＯＲ１を担持する細胞に対するＴ細胞傷害活性を維持しながら、これらの薬物に対する大きな耐性を誘導した。

したがって、本出願は、デオキシシチジンキナーゼの発現が抑制または不活性化された、白血病の処置のための抗ＲＯＲ１Ｔ細胞を提供する。

Ｔ細胞の活性化および増大
Ｔ細胞は、Ｔ細胞の遺伝子改変の前であっても後であっても、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；米国特許第６，５３４，０５５号；米国特許第６，９０５，６８０号；米国特許第６，６９２，９６４号；米国特許第５，８５８，３５８号；米国特許第６，８８７，４６６号；米国特許第６，９０５，６８１号；米国特許第７，１４４，５７５号；米国特許第７，０６７，３１８号；米国特許第７，１７２，８６９号；米国特許第７，２３２，５６６号；米国特許第７，１７５，８４３号；米国特許第５，８８３，２２３号；米国特許第６，９０５，８７４号；米国特許第６，７９７，５１４号；米国特許第６，８６７，０４１号；および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載されている方法を使用して、活性化させ遺伝的に増大させることができる。Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボで増大させることができる。

一般に、本発明のＴ細胞は、Ｔ細胞の表面上のＣＤ３ＴＣＲ複合体および共刺激分子を刺激してＴ細胞のための活性化シグナルを作出する薬剤との接触によって増大する。

例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などの分裂促進性レクチンなどの化学物質が、Ｔ細胞のための活性化シグナルを作出するために使用され得る。

非限定的な例として、Ｔ細胞集団は、例えば、表面に固定化された抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片もしくは抗ＣＤ２抗体と接触させることによって、またはカルシウムイオノフォアと共にプロテインキナーゼＣ活性化剤（例えば、ブリオスタチン）と接触させることによって、インビトロで刺激され得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のため、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するために適切な条件の下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させ得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあり得るか、または表面に結合され得る。当業者であれば容易に理解し得るように、粒子と細胞との比は、標的細胞に対する粒子サイズに依存し得る。本発明のさらなる実施形態では、Ｔ細胞などの細胞を薬剤コーティングビーズと結合させ、続いて、ビーズおよび細胞を分離し、次いで、細胞を培養する。代替的な実施形態では、培養前に、薬剤コーティングビーズおよび細胞を分離せず、一緒に培養する。Ｔ細胞培養のために適切な条件としては、血清（例えば、ウシ胎仔血清もしくはヒト胎児血清）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＮＦ−γ、１Ｌ−４、１Ｌ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、−１０、−２、１Ｌ−１５、ＴＧＦｐおよびＴＮＦ−、または当業者に公知の細胞の増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖および生存可能性のために必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ−ｖｉｖｏ５（Ｌｏｎｚａ））が挙げられる。細胞の増殖のための他の添加剤としては、限定されないが、界面活性剤、プラスマネート、ならびにＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｉ）などの還元剤が挙げられる。培地としては、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンが追加されているか、無血清であるか、または適切な量の血清（もしくは血漿）もしくはホルモンの定義されたセットおよび／もしくはＴ細胞の増殖および増大のために十分な量のサイトカインが補充されているＲＰＭＩ１６４０、Ａ１Ｍ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ１およびＸ−Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが挙げられ得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養にのみ含まれ、被験体へ注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％Ｃ０２）で維持される。様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。

別の特定の実施形態では、前記細胞は、組織または細胞との共培養によって増大させ得る。前記細胞はまた、前記細胞を被験体に投与した後、インビボで、例えば、被験体の血液中で増大させ得る。

治療用途
別の実施形態では、以前に記載されているような異なる方法によって得られる単離された細胞または前記単離された細胞に由来する細株は、医薬として使用され得る。別の実施形態では、前記医薬は、ＲＯＲ１陽性細胞に関連する病変と診断された患者における癌または感染症を処置するために使用され得る。別の実施形態では、本発明の前記単離された細胞または前記単離された細胞由来の細胞株は、癌、特にＣＬＬまたは乳房、結腸、肺もしくは腎臓の腫瘍などの固形腫瘍を処置するための医薬の製造において使用され得る。

別の態様では、本発明は、処置を必要とする患者を処置するための方法であって、以下の工程：
（ａ）以前に記載されている方法のいずれか１つによって入手可能な免疫細胞を提供すること；
（ｂ）前記形質転換免疫細胞を前記患者に投与すること
の少なくとも１つを含む方法に依拠する。

一実施形態では、本発明の前記Ｔ細胞は、頑強なインビボＴ細胞増大を受けることができ、より長時間にわたり、存続することができる。

前記処置は、寛解的、治癒的または予防的であり得る。それは、自己免疫療法の一部または同種免疫療法処置の一部のいずれかであり得る。自己は、患者を処置するために使用される細胞、細胞株または細胞の集団が、前記患者またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合性ドナーに起因することを意味する。同種は、患者を処置するために使用される細胞または細胞の集団が、前記患者ではなく、ドナーに起因することを意味する。

典型的にはドナーから得られたＴ細胞の非同種反応性細胞への形質転換を可能にする限り、本発明は、同種免疫療法に特に適切である。これは、標準的なプロトコールの下で行われ得、必要に応じて何回も再現され得る。得られた改変Ｔ細胞をプールし、１人または複数の患者に投与し得るので、「既製」治療製品として利用可能である。

開示される方法と共に使用され得る細胞は、先のセクションに記載されている。前記処置は、癌、ウイルス感染、自己免疫障害または移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）と診断された患者を処置するために使用され得る。処置され得る癌としては、血管新生していないかまたはまだ実質的に血管新生していない腫瘍、および血管新生した腫瘍が挙げられる。癌は、非固形腫瘍（例えば、血液学的腫瘍、例えば白血病およびリンパ腫など）を含み得るか、または固形腫瘍を含み得る。本発明の多重鎖ＣＡＲで処置すべき癌の種類としては、限定されないが、癌腫、芽細胞腫および肉腫ならびに特定の白血病またはリンパ性悪性疾患、良性および悪性の腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えば肉腫、癌腫および黒色腫が挙げられる。成人の腫瘍／癌および小児の腫瘍／癌も挙げられる。

開示される方法と共に使用され得る細胞は、先のセクションに記載されている。前記処置は、ＲＯＲ１発現細胞、特に、ＲＯＲ１発現細胞の過剰により特徴付けられる、前悪性または悪性の癌状態と診断された患者を処置するために使用され得る。このような状態は白血病または悪性リンパ増殖性障害などの血液の癌に見出される。

白血病は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群（ｍｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅ）、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病および骨髄異形成症候群であり得る。

リンパ増殖性障害はリンパ腫、特に慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫および濾胞性リンパ腫（小細胞および大細胞）であり得る。

好ましい一実施形態によれば、前記人工Ｔ細胞は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）または小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）の処置のために提供される。

別の好ましい実施形態によれば、ＣＬＬまたはＳＬＬの前記処置は、ＲＯＲ１−ＣＡＲ−Ｔ細胞の注入前にリンパ球を枯渇させた患者に投与される。前記リンパ球の枯渇は、普通化学療法によって、好ましくはフルダラビン（Ｆ）、シクロホスファミド（Ｃ）、ベンダムスチン（Ｂ）もしくはリツキシマブ（Ｒ）などの薬物またはこれらの組み合わせを使用することによって実施される。通常、ＦＣＲまたはＦＢＲの組み合わせが、ＣＡＲ−Ｔ投与前のリンパ球枯渇に使用され得る。

別の好ましい実施形態によれば、前記人工Ｔ細胞は、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ｔ（１；１９）染色体転座を有する急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の処置のために提供される。

また、乳房、結腸、肺および腎臓の腫瘍などの固形腫瘍は、本発明のＣＡＲにより処置することができる。また、本発明の人工Ｔ細胞は、膵臓または卵巣の癌の処置に使用することができる。

それは、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法および放射線療法の群から選択される１つ以上の抗癌療法と組み合わせた処置であり得る。

本発明の好ましい実施形態によれば、前記処置は、免疫抑制処置を受けている患者に施すことができる。実際、本発明は、好ましくは、このような免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活性化のため、少なくとも１つの免疫抑制剤に対して耐性にされた細胞または細胞の集団に依拠する。この態様では、免疫抑制処置は、患者における本発明のＴ細胞の選択および増大を支援するべきである。

本発明の細胞または細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口、輸液、植え込みまたは移植を含む、任意の便利な様式で実施され得る。本明細書に記載される組成物は、皮下に、皮内に、腫瘍内に、結節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内注射もしくはリンパ内注射によって、または腹腔内に、患者に投与され得る。一実施形態では、本発明の細胞組成物は、好ましくは、静脈内注射によって投与される。

細胞または細胞の集団の投与は、これらの範囲内の細胞数のすべての整数値を含む、体重１ｋｇ当たり１０^４〜１０^９個の細胞、好ましくは、体重１ｋｇ当たり１０^５〜１０^６個の細胞の投与からなり得る。細胞または細胞の集団は、単回投与されてもよいしまたは複数回投与されてもよい。別の実施形態では、前記有効量の細胞が、単回投与される。別の実施形態では、前記有効量の細胞が、ある期間にわたり複数回投与される。投与のタイミングは、管理する医師の判断にあり、患者の臨床状態に依存する。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーなどの任意の起源から入手され得る。個々の必要性は変動するが、特定の疾患または状態のための所定の細胞型の有効量の最適範囲の決定は、当技術分野の技術の範囲内にある。有効量は、治療的または予防的な利益を提供する量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康および体重、もしあれば、同時処置の種類、処置の頻度、ならびに望まれる効果の性質に依存するであろう。

別の実施形態では、前記有効量の細胞またはそれらの細胞を含む組成物は、非経口投与される。前記投与は、静脈内投与であり得る。前記投与は、腫瘍内への注射によって直接行われ得る。

本発明の特定の実施形態では、細胞は、限定されないが、抗ウイルス治療、シドホビルおよびインターロイキン２、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃとしても公知）などの薬剤による処置、またはＭＳ患者のためのナタリズマブ（ｎａｔａｌｉｚｉｉｍａｂ）処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ処置、またはＰＭＬ患者のための他の処置を含む多数の関連する処置モダリティと共に（例えば、前に、同時にまたは後に）患者に投与される。さらなる実施形態では、本発明のＴ細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体またはＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、もしくは他の抗体治療などの他の免疫除去剤、シトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、ならびに照射と組み合わせて使用され得る。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）、または増殖因子によって誘導されるシグナリングにとって重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Ｌｉｕｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ６６：８０７−８１５，１１；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎ．７３：３１６−３２１，１９９１；Ｂｉｅｒｅｒｅｔａｌ．，Ｃｉｔｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｍｍｎ．５：７６３−７７３，９３）。さらなる実施形態では、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビン、外部照射治療（ＸＲＴ）、シクロホスファミドなどの化学療法剤、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体のいずれかを使用したＴ細胞除去治療と共に（例えば、前に、同時にまたは後に）患者に投与される。別の実施形態では、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンなどのＢ細胞除去治療の後に投与される。例えば、一実施形態では、被験体は、高用量化学療法による標準的な処置を受けた後、末梢血幹細胞移植を受けることができる。特定の実施形態では、移植の後、被験体は、増大させた本発明の免疫細胞の注入を受ける。さらなる実施形態では、増大させた細胞は、手術の前または後に投与される。本明細書に記載される方法のいずれか１つによって得られる前記改変細胞は、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶反応および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対して、処置を必要とする患者を処置するために、本発明の特定の態様において使用され得る；したがって、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶反応および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対して、処置を必要とする患者を処置する方法であって、不活性化ＴＣＲアルファおよび／またはＴＣＲベータ遺伝子を含む有効量の改変細胞を前記患者に投与することによって、前記患者を処置することを含む方法は、本発明の範囲内である。

一般的方法
初代細胞
末梢血単核細胞を、密度勾配遠心分離法により、健康なボランティアドナー（ＥｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔＦｒａｎｃａｉｓｄｕＳａｎｇ）由来の軟膜から単離した。その後、Ｔリンパ球をＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞濃縮キット（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して精製し、ＤｙｎａｂｅａｄｓＨｕｍａｎＴ−ＡｃｔｉｖａｔｏｒＣＤ３／ＣＤ２８（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）および５％ヒトＡＢ血清（Ｓｅｒａｌａｂ）を添加したＸ−ｖｉｖｏ１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。

細胞株
Ｊｅｋｏ−１およびＳｕｐＴ１細胞株はアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。Ｊｅｋｏ−１細胞は、２０％の熱失活ＦＣＳ、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミンおよび１００単位／ｍｌのペニシリンならびに１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。ＳｕｐＴ１細胞は、１０％の熱失活ＦＣＳ、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミンおよび１００単位／ｍｌのペニシリンならびに１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。

ｍｃＣＡＲをコードするＤＮＡの合成
ｍｃＣＡＲをコードするＤＮＡをＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより合成した。

ポリシストロン性レンチウイルスベクターの構築
ｍｃＣＡＲをコードするＤＮＡを、ＳＦＦＶプロモーターとＷＰＲＥ配列との間にｐＳＥＷレンチウイルスベクター骨格においてクローン化した。

レンチウイルスベクターの作製
濃縮レンチウイルスベクターを、Ｖｅｃｔａｌｙｓ（Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）により作製した。

Ｔ細胞の形質導入
活性化の３日後、Ｔ細胞を、レトロネクチンコーティングプレートにおいてＭＯＩが５で形質導入した。

ｍｃＣＡＲの検出
Ｔ細胞表面におけるｍｃＣＡＲの検出を、ＲＯＲ１タンパク質の細胞外ドメインとマウスＩｇＧ１Ｆｃ断片とを一つに融合した組換えタンパク質（ＬａｋｅＰｈａｒｍａにより作製）を使用して実施した。このタンパク質とＣＡＲ分子との結合を、該タンパク質のマウスＦｃ部分をターゲッティングするＰＥ結合二次抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出し、フローサイトメトリーにより分析した。

脱顆粒アッセイ
５×１０^４のＴ細胞を、５×１０^４のＲＯＲ１陽性またはＲＯＲ１陰性の細胞と一緒に０．１ｍｌ／ウェルで９６ウェルプレートにおいて共培養した。ＡＰＣ標識抗ＣＤ１０７ａ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４９ｄ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）および１×モネンシン溶液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に加えて共培養のはじめに添加した。６時間のインキュベーション後、これらの細胞を固定可能な生存色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびｖｉｏｂｌｕｅ標識抗ＣＤ８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて染色し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して分析した。注：脱顆粒細胞傷害性Ｔ細胞はＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋細胞に対応する。

サイトカイン放出アッセイ
５×１０^４のＴ細胞を、５×１０^４のＲＯＲ１陽性またはＲＯＲ１陰性の細胞と一緒に０．１ｍｌ／ウェルで９６ウェルプレートにおいて共培養した。２４時間のインキュベーション後、培養上清を収集して、ｅに関するＩＮＦγ ＮＦγ ｓｅｄまたはＲＯＲ１陰性細胞に関して分析した（ａｎａｌｙｓｅｄｆｏｒＩＮＦγ ＮＦγ ｓｅｄｆｏｒｅｏｒＲＯＲ１−ｎｅｇａｔｉｖｅｃｅｌｌｓ）。

細胞傷害性アッセイ
ＲＯＲ１陽性およびＲＯＲ１陰性の細胞を、それぞれ、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＣＦＳＥおよびＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔを用いて標識した。１×１０^４のＲＯＲ１陽性細胞のバッチを、１×１０^４のＲＯＲ１の陰性細胞および１×１０^５のＴ細胞と一緒に０．１ｍｌ／ウェルで９６ウェルプレートにおいて共培養した。４時間のインキュベーション後、これらの細胞を回収し、固定可能な生存色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて染色し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して分析した。

特異的溶解のパーセンテージは下記の式を使用して計算した：

ＲＯＲ１特異的多重鎖ＣＡＲの実施例
Ａ．多重鎖ＣＡＲの設計
ＲＯＲ１抗原をターゲティングする１０の多重鎖ＣＡＲを、ＩｇＥに対する高親和性受容体（ＦｃεＲＩ）に基づいて設計した。肥満細胞および好塩基球上において発現されるＦｃεＲＩは、アレルギー反応をトリガーする。それは、単一のαサブユニット、単一のβサブユニットおよび２つのジスルフィド結合γサブユニットから構成される四量体複合体である。αサブユニットは、ＩｇＥ結合ドメインを含有する。βおよびγサブユニットは、シグナル伝達を媒介するＩＴＡＭを含有する。あらゆる多重鎖ＣＡＲにおいて、ＦｃＲα鎖の細胞外ドメインを削除し、それぞれ表５においてμと称される各ｓｃＦｖで置換し、ＦｃＲβ鎖および／またはＦｃＲγ鎖のＣＤ８αヒンジ（配列番号：２）およびＩＴＡＭを削除した。得られた構造は、表６に詳述されている構造を有していた。

ＲＯＲ１特異的多重鎖ＣＡＲのアーキテクチャ（ｃｓｍ１３およびｃｓｍ１４）
本発明において開発および試験した、ＲＯＲ１に特異的な２つのｍｃＣＡＲは図４Ａに表したＣＡＲアーキテクチャを有し、表１−３に示すα、βおよびγ鎖の成分を含む。これらの２つの受容体は、それらの抗原結合ドメインだけが互いに異なる。表５に示すように、ｃｓｍ１３ＣＡＲはＤ１０ｓｃＦｖを含むが、一方ｃｓｍ１４ＣＡＲは２Ａ２ｓｃＦｖを含む。ｃｓｍ１３およびｃｓｍ１４は両方とも、４１−ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータＩＴＡＭをシグナリングドメインとして含む。

ＲＯＲ１特異的ｍｃＣＡＲ、ｃｍｓ１３およびｃｍｓ１４をコードするレンチウイルスベクター中のポリシストロン性発現カセットは、図３のようであると見なされる。

ｃｍｓ１３およびｃｍｓ１４のポリペプチド配列は、表７に示す配列番号：７８および配列番号：７６に対応する。

Ｂ．Ｔ細胞における一過性発現
ポリシストロン性ｍＲＮＡのエレクトロポレーション後に、ヒトＴ細胞において、多重鎖ＣＡＲを発現させる。ｍＭＥＳＳＡＧＥｍＭＡＣＨＩＮＥキットおよび線状化プラスミド（テンプレートとして）を使用して生産したキャップ化およびポリアデニル化ポリシストロン性ｍＲＮＡをＴ細胞にエレクトロポレーションした。テンプレートとして使用したプラスミドは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターと、続いて、異なるＣＡＲ変異体をコードするポリシストロン性ＤＮＡ配列を含有していた。

以下のプロトコールにしたがって、ＣｙｔｏＬＶＴ−Ｓデバイス（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ）を使用して、ヒトＴ細胞へのポリシストロン性ｍＲＮＡのエレクトロポレーションを行った：抗ＣＤ３／ＣＤ２８コーティングビーズで数日間（３〜５）予備活性化した５×１０^６個のＴ細胞およびＩＬ２をＣｙｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ緩衝液Ｔに再懸濁し、４５μｇのｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの２４時間後に、多重鎖ＣＡＲをコードするポリシストロン性ｍＲＮＡを使用して操作したヒトＴ細胞を、固定可能な生存色素ｅＦｌｕｏｒ−７８０およびＰＥ結合特異的ヤギ抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）２断片で標識し、フローサイトメトリーによって分析した。

ポリシストロン性ｍＲＮＡを使用して操作した生Ｔ細胞は、それらの表面において多重鎖ＣＡＲを発現した。

Ｃ．Ｔ細胞におけるレンチウイルス（Ｌｅｎｖｉｒａｌ）の発現
ＲＯＲ１特異的ｍｃＣＡＲのインビトロのスクリーニング
ｃｓｍ１３およびｃｓｍ１４をコードするポリシストロン性遺伝子を、前記のようにレンチウイルスベクターを使用してヒトＴ細胞中にベクター化した。まず、ｃｓｍ１３およびｃｓｍ１４の細胞表面の発現プロファイルを、形質導入Ｔ細胞において経時的に評価した。この目的のために、ＲＯＲ１／Ｆｃ融合タンパク質を使用した。図５に示すように、ｃｓｍ１３およびｃｓｍ１４が形質導入の３日後に細胞表面に高度に発現され、２週間にわたって比較的高度な発現を保持したことが観察された。その後、ｃｓｍ１３およびｃｓｍ１４の抗原依存性Ｔ細胞活性化を仲介する能力を評価した。この課題に対処するために、ＲＯＲ１陽性細胞株（Ｊｅｋｏ−１）およびＲＯＲ１陰性細胞株（ＳｕｐＴ１）を使用して活性アッセイを実施した。図６、７および８にそれぞれ示された、脱顆粒アッセイ、細胞傷害性アッセイおよびＩＦＮγ分泌アッセイの結果により示されるように、ｃｓｍ１３およびｃｓｍ１４は、Ｊｅｋｏ−１の存在下ではＴ細胞を活性化できるが、ＳｕｐＴ１の存在下では活性化できないことが観察された。

Ｄ．多重鎖ＣＡＲを一過性発現するヒトＴ細胞は、標的細胞との共培養後に脱顆粒する
エレクトロポレーションの２４時間後に、多重鎖ＣＡＲをコードするポリシストロン性ｍＲＮＡを使用して操作したヒトＴ細胞を、標的（ダウディ）または対照（Ｋ５６２）細胞と共に６時間共培養した。次いで、フローサイトメトリーによってＣＤ８＋Ｔ細胞を分析して、その表面における脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現を検出した。この実験の目的は、ＲＯＲ１多重鎖ＣＡＲを発現するヒトＣＤ８＋Ｔ細胞が、対照細胞との共培養ではなくＲＯＲ１発現標的細胞との共培養において脱顆粒することの確認である。

Ｅ．多重鎖ＣＡＲを一過性発現するヒトＴ細胞は、標的細胞との共培養後にサイトカインを分泌する
エレクトロポレーションの２４時間後に、多重鎖ＣＡＲをコードするポリシストロン性ｍＲＮＡを使用して操作したヒトＴ細胞を、標的（ダウディ）または対照（Ｋ５６２）細胞と共に２４時間共培養した。次いで、上清を回収し、ＴＨ１／ＴＨ２サイトカインサイトメトリービーズアレイキットを使用して分析して、Ｔ細胞によって産生されたサイトカインを定量した。このアッセイの目的は、多重鎖ＣＡＲを発現するヒトＴ細胞は、対照細胞との共培養ではなくＲＯＲ１発現標的細胞との共培養においてＩＦＮγ、ＩＬ８およびＩＬ５を産生することを示すことである。

Ｆ．多重鎖ＣＡＲを一過性発現するヒトＴ細胞は、標的細胞を溶解する
エレクトロポレーションの２４時間後に、多重鎖ＣＡＲをコードするポリシストロン性ｍＲＮＡを使用して操作したヒトＴ細胞を、標的（ダウディ）または対照（Ｋ５６２）細胞と共に４時間共培養した。次いで、フローサイトメトリーによって標的細胞を分析して、その生存を分析した。このアッセイの目的は、ＲＯＲ１多重鎖ＣＡＲを発現する異なる細胞が、対照細胞ではなくＲＯＲ１発現標的細胞を溶解することを示すことである。

Claims

−細胞外ＲＯＲ１リガンド結合ドメインに融合された高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のアルファ鎖由来の膜貫通ポリペプチド；
−シグナル伝達ドメインに融合されたＦｃεＲＩのガンマ鎖由来の第２の膜貫通ポリペプチド、
−共刺激ドメインを含むＦｃεＲＩのベータ鎖由来の第３の膜貫通ポリペプチド
を含み、
ＦｃεＲＩの前記アルファ鎖に融合された前記ＲＯＲ１リガンド結合ドメインが、ＲＯＲ１に対する特異性を付与する重鎖（Ｖ_Ｈ）および軽鎖（Ｖ_Ｌ）を含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり、
前記Ｖ_Ｈが、配列番号：２８（Ｄ１０）、配列番号：１２（２Ａ２）、配列番号：２０（４Ａ５）、配列番号：３６（Ｇ６）、配列番号：４４（Ｇ３）、配列番号：５２（Ｈ１０）、配列番号：６０（２Ａ４）および配列番号：６８（１Ｃ１１）から選択される１つと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、ならびに
前記Ｖ_Ｌが、配列番号：３２（Ｄ１０）、配列番号：１６（２Ａ２）、配列番号：２４（４Ａ５）、配列番号：４０（Ｇ６）、配列番号：４８（Ｇ３）、配列番号：５６（Ｈ１０）、配列番号：６４（２Ａ４）および配列番号：７２（１Ｃ１１）から選択される１つと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を示すポリペプチドを含む、
ＲＯＲ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃＣＡＲ）。
前記Ｖ_ＨおよびＶＬが、それぞれ配列番号：２８および配列番号：３２（Ｄ１０）と、ならびにそれぞれ配列番号：１２もしくは配列番号：１６（２Ａ２）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を示すポリペプチド配列を含む、請求項１に記載のＲＯＲ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
前記細胞外リガンド結合ドメインが、
−配列番号：２９（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号：３０（ＣＤＲ−Ｈ２）および配列番号：３１（ＣＤＲ−Ｈ３）のマウスモノクローナル抗体Ｄ１０由来のＣＤＲを含むＶＨ鎖、ならびに配列番号３３（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号：３４（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号：３５（ＣＤＲ−Ｌ３）のマウスモノクローナル抗体Ｄ１０由来のＣＤＲを含むＶＬ鎖、
または
−配列番号：１３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号：１４（ＣＤＲ−Ｈ２）および配列番号：１５（ＣＤＲ−Ｈ３）のマウスモノクローナル抗体２Ａ２由来のＣＤＲを含むＶＨ鎖、ならびに配列番号：１７（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号：１８（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号：１９（ＣＤＲ−Ｌ３）のマウスモノクローナル抗体２Ａ２由来のＣＤＲを含むＶＬ鎖、
を含む、請求項１または請求項２に記載のＲＯＲ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
ＦｃεＲＩの前記アルファ鎖が、ＣＤ８α、ＩｇＧ１またはＦｃγＲＩＩＩαタンパク質由来のヒンジによって、前記細胞外リガンド結合ドメインに融合されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＲＯＲ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
前記ヒンジが、配列番号：２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を示すポリペプチド配列を含む、請求項５に記載のＲＯＲ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
ＦｃεＲＩのガンマ鎖に融合された前記シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲゼータ鎖、ＦＣεＲβ鎖、ＦｃεＲＩγ鎖に由来し、または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＲＯＲ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
前記シグナル伝達ドメインがＣＤ３ゼータに由来する、請求項６に記載のＲＯＲ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
前記シグナル伝達ドメインが、配列番号：９と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を示すポリペプチド配列を含む、請求項７に記載のＲＯＲ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
前記第２または第３のポリペプチドが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、およびそれらの任意の組み合わせから選択される共刺激分子の細胞質ドメイン由来の共刺激ドメインを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＲＯＲ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
前記共刺激ドメインが４−１ＢＢに由来し、配列番号：６と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を示すポリペプチド配列を含む、請求項９に記載のＲＯＲ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
配列番号：７８（抗ＲＯＲ１ｍｃＣＡＲＤ１０）、配列番号：７６（抗ＲＯＲ１ｍｃＣＡＲ２Ａ２）、配列番号：７７（抗ＲＯＲ１ｍｃＣＡＲ４Ａ５）、配列番号：７９（抗ＲＯＲ１ｍｃＣＡＲＧ６）、配列番号：８０（抗ＲＯＲ１ｍｃＣＡＲＧ３）、配列番号：８１（抗ＲＯＲ１ｍｃＣＡＲＨ１０）、配列番号：８２（抗ＲＯＲ１ｍｃＣＡＲ２Ａ４）および配列番号：８３（抗ＲＯＲ１ｍｃＣＡＲ１Ｃ１１）の全長アミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を示すポリペプチド配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＲＯＲ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチド。
配列番号：７８（抗ＲＯＲ１ｍｃＣＡＲＤ１０）および配列番号：７６（抗ＲＯＲ１ｍｃＣＡＲ２Ａ２）の全長アミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を示すポリペプチド配列を含む、請求項１１に記載のＲＯＲ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチド。
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＲＯＲ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードする核酸を含む、ポリヌクレオチド。
請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
免疫細胞を操作する方法であって、
（ａ）免疫細胞を提供すること、
（ｂ）前記細胞の表面において、少なくとも１つの請求項１〜１２のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体を発現させること
を含む、方法。
（ａ）免疫細胞を提供すること；
（ｂ）少なくとも１つの請求項１〜１２のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体を構成するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること；
（ｃ）前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させること
を含む、請求項１５に記載の免疫細胞操作方法。
（ａ）免疫細胞を提供すること；
（ｂ）前記細胞の表面において、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む請求項１〜１２のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体の集団を発現させること
を含む、請求項１５または１６のいずれか一項に記載の免疫細胞操作方法。
（ａ）免疫細胞を提供すること；
（ｂ）各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む請求項１〜１２のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体の集団を構成するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること；
（ｃ）前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させること
を含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の免疫細胞操作方法。
請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法から得られる、単離された免疫細胞。
少なくとも１つの請求項１〜１２のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体を含む、単離された免疫細胞。
医薬として使用するための、請求項１９または２０に記載の単離された免疫細胞。
ヒトの療法に使用するための、請求項２１に記載の単離された免疫細胞。
状態が、ＲＯＲ１発現細胞により特徴付けられる前悪性または悪性の癌状態である療法に使用するための、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の単離された免疫細胞。
状態が、ＲＯＲ１発現細胞の過剰により特徴付けられる状態である療法に使用するための、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の単離された免疫細胞。
状態が血液の癌状態である療法に使用するための、請求項２４に記載の単離された免疫細胞。
血液の癌状態が白血病である療法に使用するための、請求項２５に記載の単離された免疫細胞。
血液の癌状態が慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）または小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）である療法に使用するための、請求項２６に記載の単離された免疫細胞。
前記白血病が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病および骨髄異形成症候群からなる群から選択される療法に使用するための、請求項２６に記載の単離された免疫細胞。
前記白血病が、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ｔ（１；１９）染色体転座を有する急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である療法に使用するための、請求項２６に記載の単離された免疫細胞。
状態が固形腫瘍である療法に使用するための、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の単離された免疫細胞。
腫瘍が、乳房、結腸、肺および腎臓の腫瘍である。請求項３０に記載の単離された免疫細胞。
腫瘍が、腎臓、膵臓または卵巣の腫瘍である、請求項３０に記載の単離された免疫細胞。
ＮＫ細胞、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球またはヘルパーＴリンパ球に由来する、請求項２０〜３２のいずれか一項に記載の単離された細胞。
処置を必要とする患者を処置するための方法であって、
ａ）請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法によって得られる免疫細胞を提供すること；
ｂ）前記Ｔ細胞を前記患者に投与すること
を含む、方法。
前記免疫細胞がドナーから回収されるものである、請求項３４に記載の患者を処置するための方法。
前記免疫細胞が患者から回収されるものである、請求項３４に記載の患者を処置するための方法。