JP2021530217A - Ｒｏｒ−１特異的キメラ抗原受容体およびその使用 - Google Patents

Ｒｏｒ−１特異的キメラ抗原受容体およびその使用 Download PDF

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Abstract

本明細書では、がん療法のためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、より詳細には、抗ＲＯＲ−１モノクローナル抗体からのｓｃＦｖを含有するＣＡＲが提供される。このようなＣＡＲを含有する免疫エフェクター細胞、および増殖性障害を治療する方法が提供される。

Description

相互参照
本出願は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、２０１８年７月１０日に出願された米国特許仮出願第６２／６９６，０７５号明細書の利益を主張する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて、電子的に提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１９年７月８日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、５０４７１＿７１６＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、３６０，０８２バイトのサイズである。
キメラポリペプチドなどの組換えポリペプチドは、研究、診断、製造および治療用途に有用である。ＣＡＲなどの抗原結合ポリペプチドを発現する改変エフェクター細胞は、感染症、自己免疫障害およびがんなどの疾患および障害の治療に有用である。
参照による組込み
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、参照により具体的かつ個別に組み込まれることが指し示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書では、ある特定の実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、単離された核酸、ベクター、免疫エフェクター細胞、方法および系が開示される。
本明細書では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離された核酸が提供され、ＣＡＲは、（ａ）ＲＯＲ−１抗原結合ドメイン；（ｂ）スペーサー；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはその両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、（ａ）配列番号３〜１４に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するポリペプチド；または（ｂ）配列番号７５〜８２に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するポリペプチド、のうちの少なくとも１つを含む。場合によっては、ＲＯＲ−１抗原結合ドメインは、配列番号１５〜７４に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。他の場合には、ＲＯＲ−１抗原結合ドメインは、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、および７３に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の例では、ＲＯＲ−１抗原結合ドメインは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、および７４に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号８３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドである。他の実施形態では、スペーサーは、配列番号８４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドである。場合によって、スペーサーは、配列番号８５のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドである。一部の例では、スペーサーは、配列番号８６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドである。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号８７〜８８に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドである。
場合によって、共刺激シグナル伝達ドメインは４−１ＢＢを含む。他の実施形態では、４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号８９のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。他の場合には、共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ２８を含む。一部の例では、ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインドメインは、配列番号９０のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、配列番号９３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。他の実施形態では、単離された核酸は、配列番号９４〜１０８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドをさらに含む。
一部の例では、単離された核酸は、細胞タグをさらに含む。一部の実施形態では、細胞タグは、切断型上皮増殖因子受容体である。場合によって、切断型上皮増殖因子受容体はＨＥＲ１ｔであり、配列番号１０９のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。他の実施形態では、切断型上皮増殖因子受容体はＨＥＲ１ｔ−１であり、配列番号１１０のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、細胞タグは、配列番号１１１のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。他の場合には、細胞タグは、配列番号１１２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の例では、単離された核酸は、異種遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチドをコードするさらなるポリヌクレオチドをさらに含み、遺伝子スイッチポリペプチドが、（ａ）第１の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたＤＮＡ結合ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド；および（ｂ）第２の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、第１の遺伝子スイッチポリペプチドおよび第２の遺伝子スイッチポリペプチドが、リンカーにより接続されている。
本明細書では、骨格と、（１）細胞タグ；（２）サイトカイン；ならびに（３）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、（ａ）ＲＯＲ−１抗原結合ドメイン；（ｂ）スペーサー；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはその両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸配列とを含むベクターが提供される。
一部の実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである。場合によっては、細胞タグは、切断型上皮増殖因子受容体である。一部の実施形態では、切断型上皮増殖因子受容体は、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ−１またはその機能的変異体である。一部の例では、切断型上皮増殖因子受容体は、配列番号１０９または配列番号１１０のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。他の例では、細胞タグは、配列番号１１１のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の例では、細胞タグは、配列番号１１２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。
場合によって、サイトカインはＩＬ−１５である。一部の実施形態では、ＩＬ−１５は膜結合型ＩＬ−１５である。一部の実施形態で、膜結合型ＩＬ−１５は、配列番号１１３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。他の場合には、ベクターは、自己切断型トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス（Ｔ２Ａ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、骨格は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンＤＮＡプラスミドである。一部の例では、ベクターは、プロモーターをさらに含む。一部の実施形態では、プロモーターは、ｈＥＦ１ａ１である。他の実施形態では、ＣＡＲは、（ａ）配列番号３〜１４に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するポリペプチド；または（ｂ）配列番号７５〜８２に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するポリペプチド、のうちの少なくとも１つを含む。
一部の実施形態では、ＲＯＲ−１抗原結合ドメインは、配列番号１５〜７４に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の例では、ＲＯＲ−１抗原結合ドメインは、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、および７３に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。他の例では、ＲＯＲ−１抗原結合ドメインは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、および７４に示されるアミノ酸配列との、少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。場合によって、スペーサーは、配列番号８３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドである。他の場合には、スペーサーは、配列番号８４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドである。
場合によって、スペーサーは、配列番号８５のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドである。他の場合には、スペーサーは、配列番号８６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドである。一部の実施態様では、膜貫通ドメインは、配列番号８７〜８８に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドである。
一部の例では、共刺激シグナル伝達ドメインは４−１ＢＢを含む。一部の実施形態では、４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインドメインは、配列番号８９のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。他の実施形態では、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、配列番号９３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。場合によって、ベクターは、配列番号９４〜１０８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドをさらに含む。
場合によって、ベクターはプラスミドを含む。一部の実施形態では、各ベクターは、発現プラスミドを含む。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。一部の例では、ベクターは、異種遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むさらなるベクターをさらに含み、遺伝子スイッチポリペプチドが、（ａ）第１の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたＤＮＡ結合ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド；および（ｂ）第２の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたトランス活性化を含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、第１の遺伝子スイッチポリペプチドおよび第２の遺伝子スイッチポリペプチドが、リンカーにより接続されている。
本明細書では、単離された核酸を含む免疫エフェクター細胞が提供される。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞はベクターを含む。
本明細書では、さらに、（１）細胞タグ；（２）サイトカイン；および（３）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、（ａ）ＲＯＲ−１抗原結合ドメイン；（ｂ）スペーサー；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはその両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞が提供される。
一部の実施形態では、サイトカインはＩＬ−１５である。一部の実施形態では、ＩＬ−１５は膜結合型ＩＬ−１５である。場合によって、膜結合型ＩＬ−１５は、配列番号１１３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。他の場合には、細胞タグは切断型上皮増殖因子受容体である。一部の実施形態では、切断型上皮増殖因子受容体は、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ−１またはその機能的変異体である。場合によって、切断型上皮増殖因子受容体は、配列番号１０９または配列番号１１０のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の例では、細胞タグは、配列番号１１１のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。他の実施形態では、細胞タグは、配列番号１１２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号８３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドである。他の実施形態では、スペーサーは、配列番号８４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドである。場合によって、スペーサーは、配列番号８５のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドである。他の場合には、スペーサーは、配列番号８６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドである。
一部の例では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、または調節性Ｔ細胞である。他の例では、ＣＡＲは、配列番号３〜１４または７５〜８２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む。場合によって、ＣＡＲは、配列番号１５〜７４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの少なくとも１つを含む。他の場合には、免疫エフェクター細胞は、異種遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチドをさらに含み、遺伝子スイッチポリペプチドが、（ａ）第１の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたＤＮＡ結合ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド；および（ｂ）第２の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、第１の遺伝子スイッチポリペプチドおよび第２の遺伝子スイッチポリペプチドが、リンカーにより接続されている。
本明細書では、ＣＡＲを発現するために遺伝子改変された有効量の細胞をヒト対象に投与することを含む、それを必要とするヒト対象における、標的細胞集団または組織に対するＴ細胞媒介性免疫応答を刺激する方法が提供され、ＣＡＲが（ａ）ＲＯＲ−１抗原結合ドメイン（ｂ）スペーサー；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはその両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン；および（ｆ）切断型上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔ）を含む。
一部の実施形態では、ヒトは、肺がん、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、副腎がん、黒色腫、子宮がん、精巣がん、または膀胱がんのうちの少なくとも１つと診断されている。場合によって、ヒトは、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）と診断されている。
本明細書では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離された核酸が提供され、ＣＡＲが、（ａ）配列番号３〜１４、７５〜８２または１５〜７４に示されるようなアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを有するＲＯＲ−１抗原結合ドメイン；（ｂ）配列番号８３〜８６のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを有するスペーサー；（ｃ）配列番号９０のアミノ酸配列を有するＣＤ２８を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；（ｄ）配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＨＥＲ１ｔおよび配列番号１１０のアミノ酸配列を有するＨＥＲ１ｔ−１のうちの少なくとも１つを含むＨＥＲ１タグ；ならびに（ｅ）配列番号９３のアミノ酸配列を有するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。
本明細書では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離された核酸が提供され、ＣＡＲが、（ａ）配列番号３〜１４、８５〜８２または１５〜７４に示されるようなアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを有するＲＯＲ−１抗原結合ドメイン；（ｂ）配列番号８３〜８６のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを有するスペーサー；（ｃ）配列番号８９のアミノ酸配列を有する４−１ＢＢを含む共刺激シグナル伝達ドメイン；（ｄ）配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＨＥＲ１ｔおよび配列番号１１０のアミノ酸配列を有するＨＥＲ１ｔ−１のうちの少なくとも１つを含むＨＥＲ１タグ；ならびに（ｅ）配列番号９３のアミノ酸配列を有するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。
一部の例では、ベクターは、いずれか１または複数の単離されたポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。他の例では、ベクターは複数のベクトルである。一部の実施形態では、ベクターは、異種遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むさらなるベクターをさらに含み、遺伝子スイッチポリペプチドが、（ａ）第１の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたＤＮＡ結合ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド；および（ｂ）第２の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、第１の遺伝子スイッチポリペプチドおよび第２の遺伝子スイッチポリペプチドが、リンカーにより接続されている。
本明細書では、免疫エフェクター細胞においてＣＡＲを発現するためのシステムが提供され、システムは、単離された核酸をコードする１または複数のベクターを含む。一部の例では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。一部の実施形態では、システムは、少なくとも１つのさらなる遺伝子をコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、さらなる遺伝子は、サイトカインを含む。場合によって、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１のうちの少なくとも１つ、およびＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαの融合体を含む。他の実施形態では、サイトカインは、分泌形態にある。一部の実施形態では、サイトカインは、膜結合形態にある。一部の実施形態では、システムは、少なくとも１つのベクターを含む。他の場合には、少なくとも１つのベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。一部の実施形態では、システムは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼをさらに含む。一部の例では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼは、ＳＢ１１、ＳＢ１００ＸまたはＳＢ１１０である。他の実施形態では、システムは、異種遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むさらなるベクターをさらに含み、遺伝子スイッチポリペプチドが、（ａ）第１の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたＤＮＡ結合ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド；および（ｂ）第２の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、第１の遺伝子スイッチポリペプチドおよび第２の遺伝子スイッチポリペプチドが、リンカーにより接続されている。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、哺乳動物細胞である。
本明細書では、免疫エフェクター細胞においてＣＡＲを発現するためのシステムが提供され、システムは、（１）骨格と、（ａ）細胞タグ；（ｂ）サイトカイン；および（ｃ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とをコードする核酸配列であって、ＣＡＲが、（ｉ）ＲＯＲ−１抗原結合ドメイン；（ｉｉ）スペーサー；（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；（ｉｖ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはその両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；および（ｖ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲとを含む第１のベクター；ならびに（２）異種遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターをさらに含み、遺伝子スイッチポリペプチドが、（ａ）第１の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたＤＮＡ結合ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド；および（ｂ）第２の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、第１の遺伝子スイッチポリペプチドおよび第２の遺伝子スイッチポリペプチドが、リンカーにより接続されている。
本明細書では、免疫エフェクター細胞をシステムと接触させることを含む、免疫エフェクター細胞においてＣＡＲを発現する方法が提供される。
本明細書では、操作Ｔ細胞の増殖および／または生存を刺激する方法が提供され、（ａ）Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を含む細胞の試料を対象から得；（ｂ）請求項１〜２２および７９〜８０のいずれか一項に提供される単離された核酸をコードする１または複数のベクター、およびトランスポザーゼをコードするベクターを細胞にトランスフェクトして、操作ＲＯＲ−１ ＣＡＲ発現Ｔ細胞の集団を用意し；ならびに（ｃ）任意選択で、ＲＯＲ−１ ＣＡＲ−Ｔ細胞の集団をｅｘ ｖｉｖｏで２日間またはそれ未満培養することを含む。
一部の実施形態では、ベクターは、サイトカインおよび細胞タグをさらにコードする。場合によっては、サイトカインは、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒαを含む融合タンパク質である。他の実施形態では、本方法は、異種遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むさらなるベクターをさらに含み、遺伝子スイッチポリペプチドが、（ａ）第１の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたＤＮＡ結合ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド；および（ｂ）第２の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、第１の遺伝子スイッチポリペプチドおよび第２の遺伝子スイッチポリペプチドが、リンカーにより接続されている。
一部の例では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＧＡＬ４（ＧＡＬ４ ＤＢＤ）、ＬｅｘＡ ＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、細菌ＬａｃＺ ＤＢＤ、および酵母ＤＢＤのうちの少なくとも１つを含む。他の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、トランス活性化ドメインは、ＶＰ１６トランス活性化ドメインおよびＢ４２酸性活性化因子トランス活性化ドメインのうちの少なくとも１つを含む。他の場合には、トランス活性化ドメインは、配列番号１３１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の核受容体リガンド結合ドメインおよび第２の核受容体リガンド結合ドメインのうちの少なくとも１つは、エクジソン受容体（ＥｃＲ）、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核内受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用性タンパク質１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用性タンパク質１４、およびファメソール受容体のうちの少なくとも１つを含む。
場合によって、第１の核受容体リガンド結合ドメインおよび第２の核受容体リガンド結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１３５〜１３６に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む。一部の例では、第１の遺伝子スイッチポリペプチドは、ＥｃＲ核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたＧＡＬ４ ＤＢＤを含み、第２の遺伝子スイッチポリペプチドは、レチノイド受容体Ｘ（ＲＸＲ）核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたＶＰ１６トランス活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ＥｃＲ核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたＧａｌ４ ＤＢＤは、配列番号１３７〜１３８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、レチノイド受容体Ｘ（ＲＸＲ）核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたＶＰ１６トランス活性化ドメインは、配列番号１３３に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、リンカーは、切断型リンカー、リボソームスキッピングリンカー配列、またはＩＲＥＳリンカーである。一部の例では、リンカーは、ＩＲＥＳリンカーであり、前記ＩＲＥＳリンカーは、配列番号１４６〜１４７のいずれか１つに示される配列を有する。他の実施形態では、リンカーは、切断型リンカーまたはリボソームスキッピングリンカー配列である。他の場合には、切断型リンカーまたはリボソームスキッピングリンカー配列は、２Ａリンカー、ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｆ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカー、ＧＳＧ−２Ａリンカー、ＧＳＧリンカー（配列番号１２９）、ＳＧＳＧリンカー（配列番号１３０）、フューリンリンクリンカー変異体およびそれらの誘導体のうちの１または複数を含む。一部の実施形態では、切断型リンカーまたはリボソームスキッピングリンカー配列は、配列番号１１６〜１２６のいずれか１つに示される配列を有する。一部の実施形態では、１または複数のベクターおよびさらなるベクターのうちの少なくとも１つは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである。場合によって、非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。一部の実施形態では、本方法は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼをさらに含む。一部の実施態様において、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼは、ＳＢ１１、ＳＢ１００ＸまたはＳＢ１１０である。
本明細書では、操作Ｔ細胞を培養する方法が提供され、（ａ）Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を含む細胞試料を対象から得；（ｂ）請求項１〜２２および７９〜８０のいずれか一項に提供される単離された核酸をコードする１または複数のベクター、およびトランスポザーゼをコードするベクターを細胞にトランスフェクトして、操作ＲＯＲ１ ＣＡＲ発現Ｔ細胞の集団を用意し；ならびに（ｃ）操作ＲＯＲ１ ＣＡＲ発現Ｔ細胞の増殖を選択的に増強する培地中で、ｅｘ ｖｉｖｏで操作ＲＯＲ１ ＣＡＲ発現Ｔ細胞の集団を培養し、操作ＲＯＲ１ ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、２１日以内で培養することを含む。
一部の例で、操作ＲＯＲ１ ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、１４日以内で培養される。場合によって、１または複数のベクターは、サイトカインおよび細胞タグをさらにコードする。一部の実施形態では、本方法は、異種遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むさらなるベクターをさらに含み、遺伝子スイッチポリペプチドが、（ａ）第１の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたＤＮＡ結合ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド；および（ｂ）第２の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、第１の遺伝子スイッチポリペプチドおよび第２の遺伝子スイッチポリペプチドが、リンカーにより接続されている。他の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＧＡＬ４（ＧＡＬ４ ＤＢＤ）、ＬｅｘＡ ＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、細菌ＬａｃＺ ＤＢＤ、および酵母ＤＢＤのうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、トランス活性化ドメインは、ＶＰ１６トランス活性化ドメインおよびＢ４２酸性活性化因子トランス活性化ドメインのうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、トランス活性化ドメインは、配列番号１３１に示されるアミノ酸配列を含む。場合によって、第１の核受容体リガンド結合ドメインおよび第２の核受容体リガンド結合ドメインのうちの少なくとも１つは、エクジソン受容体（ＥｃＲ）、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核内受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用性タンパク質１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用性タンパク質１４、およびファメソール受容体のうちの少なくとも１つを含む。他の場合には、第１の核受容体リガンド結合ドメインおよび第２の核受容体リガンド結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１３５〜１３６に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む。一部の実施形態では、第１の遺伝子スイッチポリペプチドは、ＥｃＲ核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたＧＡＬ４ ＤＢＤを含み、第２の遺伝子スイッチポリペプチドは、レチノイド受容体Ｘ（ＲＸＲ）核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたＶＰ１６トランス活性化ドメインを含む。一部の例では、ＥｃＲ核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたＧａｌ４ ＤＢＤは、配列番号１３７〜１３８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、レチノイド受容体Ｘ（ＲＸＲ）核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたＶＰ１６トランス活性化ドメインは、配列番号１３３に示されるアミノ酸配列を含む。
場合によって、リンカーは、切断型リンカー、リボソームスキッピングリンカー配列、またはＩＲＥＳリンカーである。他の実施形態では、リンカーは、ＩＲＥＳリンカーであり、前記ＩＲＥＳリンカーは、配列番号１４６〜１４７のいずれか１つに示される配列を有する。一部の実施形態では、リンカーは、切断型リンカーまたはリボソームスキッピングリンカー配列である。一部の例では、切断型リンカーまたはリボソームスキッピングリンカー配列は、２Ａリンカー、ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｆ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカー、ＧＳＧ−２Ａリンカー、ＧＳＧリンカー（配列番号１２９）、ＳＧＳＧリンカー（配列番号１３０）、フューリンリンクリンカー変異体およびそれらの誘導体のうちの１または複数を含む。他の例では、切断型リンカーまたはリボソームスキッピングリンカー配列は、配列番号１１６〜１２６のいずれか１つに示される配列を有する。一部の実施形態では、１または複数のベクター、ベクター、およびさらなるベクターのうちの少なくとも１つは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。他の実施形態では、本方法は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼをさらに含む。場合によって、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼは、ＳＢ１１、ＳＢ１００ＸまたはＳＢ１１０である。一部の実施形態では、（ｃ）において操作ＲＯＲ１ ＣＡＲ発現Ｔ細胞を培養することは、操作ＲＯＲ１ ＣＡＲ発現Ｔ細胞の拡大増殖を刺激する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の存在下で、操作ＲＯＲ１ ＣＡＲ発現Ｔ細胞を培養することを含む。他の場合には、ａＡＰＣは、操作Ｋ５６２細胞である。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、（ｉ）操作ＣＡＲ細胞上に発現されるＲＯＲ１抗原；（ｉｉ）ＣＤ６４；（ｉｉ）ＣＤ８６；（ｉｉｉ）ＣＤ１３７Ｌ；および／または（ｖ）ａＡＰＣの表面上に発現される膜結合型ＩＬ−１５を含む。
本明細書では、それを必要とする対象においてがんを治療する方法が提供され、有効量の操作Ｔ細胞の１または複数の用量を対象に投与することを含み、操作Ｔ細胞が、ＲＯＲ−１ ＣＡＲおよび膜結合型ＩＬ−１５を含む。
一部の実施形態では、有効量の操作Ｔ細胞の第１の用量は、腹膜腔内に投与される。他の実施形態では、有効量の操作Ｔ細胞の第２の用量は、静脈内に投与される。一部の実施形態では、がんは、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。場合によって、がんは、肺がん、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、副腎がん、黒色腫、子宮がん、精巣がん、または膀胱がんである。一部の例では、ＲＯＲ−１ ＣＡＲは、配列番号３〜１４、７５〜８２、または１５〜７４に示される配列のうちのいずれか１つによってコードされる。一部の実施態様では、膜結合型ＩＬ−１５は、配列番号２６０によってコードされる。一部の実施形態では、操作Ｔ細胞の有効量は、少なくとも１０２細胞／ｋｇである。他の実施形態では、操作Ｔ細胞の有効量は、少なくとも１０４細胞／ｋｇである。場合によって、操作Ｔ細胞の有効量は、少なくとも１０５細胞／ｋｇである。
本開示の特徴は、特に、付属の特許請求の範囲において明示されている。本開示の特徴および利点についてのよりよい理解は、本開示の原理が用いられる、例示的な実施形態を明示する、以下の詳細な記載および付属の図面を参照することにより得られるであろう。
図１Ａ〜１Ｅは、異なる構成のＲＯＲ１ ＣＡＲおよびサイトカインの例示的な遺伝子発現カセットを示す図である。ある特定の場合には、ＲＯＲ１ ＣＡＲおよび／またはサイトカインは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、条件付けアブレーションのために、細胞またはキルタグとともに共発現されうる。ＲＯＲ１ ＣＡＲおよびｍｂＩＬ−１５の構成的発現のための例示的な遺伝子発現カセットまたはそれらの組合せは、ｃ＋ｅまたはｄ＋ｅを含みうる。 図２Ａ〜２Ｅは、遺伝子スイッチ構成要素を有する、異なる構成におけるＲＯＲ１ ＣＡＲおよびサイトカインの例示的な遺伝子発現カセットを示す図である。誘導性発現のための例示的な遺伝子発現カセットまたはその組合せは、ａ＋ｅ、ｂ＋ｅ、ｃ＋ｅ、またはｄ＋ｅを含みうる。 例示的なＲＯＲ１ ＣＡＲデザインを示す図である。標準的なＣＡＲデザインに基づくＲＯＲ１ ＣＡＲは、遺伝子導入後にＲＯＲ１ ＣＡＲの発現を示さなかった。実施例１に記載されるような多様な最適化戦略を採用して、表面発現する機能性ＲＯＲ１ ＣＡＲを開発した。 異なる長さのスペーサーを有するＲＯＲ１ ＣＡＲの例示を示す図である。 従来のＣＤ８αストークを利用したＲＯＲ１ ＣＡＲ（マウスｓｃＦｖ）構築物において試験されたシグナルペプチドの組合せを示し、異なるシグナルペプチドを有するＲＯＲ１ ＣＡＲ（マウスｓｃＦｖ）の発現を示す図である。トランス遺伝子の発現をヌクレオフェクション後１日目に測定した。細胞を生ＣＤ３＋細胞としてゲートをかけた。短いＣＤ８α（従来の）ストークは、使用されるシグナルペプチド（ヒトまたはマウス）にかかわらず、表面発現を可能にしない。 シグナルペプチドならびに異なるスペーサーおよびスペーサー長の異なる組合せを有するＲＯＲ１ ＣＡＲ（マウスｓｃＦｖ）の発現を示す図である。強い表面発現を有する３つの異なるより長いスペーサー長を利用するＲＯＲ１ ＣＡＲを同定した。 異なるシグナルペプチドを含むＣＤ８α３Ｘストークを有するＲＯＲ１ ＣＡＲ（マウスｓｃＦｖ）の発現を示す図である。３Ｘ ＣＤ８αストークを有するマウスｓｃＦｖに基づくＲＯＲ１ ＣＡＲの発現は、ある特定の（ｍＩｇＧＶＨ、β２Ｍおよびアズロシジン）シグナルペプチドについて改善された。 査定されたＶＨ／ＶＬ鎖のストーク、細胞内ドメインおよび配向の多様な組合せを有する異なるＲＯＲ １ ＣＡＲ（マウスｓｃＦｖ）、ならびにＶＨ／ＶＬ鎖のストーク、細胞内ドメインおよび配向の多様な組合せを有するＲＯＲ １ ＣＡＲ（マウスｓｃＦｖ）の発現を示す図である。観察されるように、ＶＬ−ＶＨからＶＨ−ＶＬへの反転配向は、表面発現形態ｈＧＭＣＳＦＲおよびｈＩＧＨＶ３−２３シグナルペプチドを可能にする。 図９Ａおよび図９Ｂは、ＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイおよびＩＦＮ−α発現アッセイで測定した、多様な腫瘍細胞系におけるＲＯＲ１（マウスｓｃＦｖ）−ＣＤ８−３ｘストーク．ＣＤ２８ｚ ＣＡＲ−Ｔ細胞の特異性を示す図である。 図１０Ａは、ＣＡＲ−Ｔ処置後７日目におけるｉｎ ｖｉｖｏ生物発光（ＩＶＩＳ）イメージングによって測定されたＪｅＫｏ−１腫瘍量の定量分析を示す図である。ＮＳＧマウス（群当たりＮ＝５〜７匹のマウス）は、０日目にＪｅＫｏ腫瘍細胞系をｉｐ注射により投与された。腫瘍保有マウスは、腫瘍細胞投与の７日後に、単回ｉｐ注射により異なるｈＲＯＲ１ ＣＡＲ−Ｔ細胞処理で処理され、腫瘍量は、処理の経過を通じてＩＶＩＳを介して定量化された。データは平均ＳＥＭである。図１０Ｂは、治療前の腫瘍量を示す図である。 ３６日目にｉｎ ｖｉｖｏ生物発光（ＩＶＩＳ）イメージング（上述される）により測定されたＪｅＫｏ−１腫瘍量の定量分析を示す図である。 多様なｈＲＯＲ１ ＣＡＲ−Ｔ細胞で処理された、腫瘍を保有するＮＳＧマウスの末梢血中のヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の定量化を示す図である。血液中のＣＤ３＋Ｔ細胞拡大を１５、２２、２９、３６、４３および５０日目に測定した。 図１３Ａおよび図１３Ｂは、ＲＯＲ１＋腫瘍細胞系が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで構成的またはＲＴＳ−ｍｂＩＬ−１５を共発現するｈＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によって同等に殺滅されたことを裏付ける図である。 ｈＲＯＲ１ ＣＡＲ ＲＴＳ−ｍｂＩＬ−１５−Ｔ細胞＋ベレジメクスの投与が、用量依存的にＪｅＫｏ−１異種移植マウスモデルにおいて抗腫瘍効果を促進することを裏付ける図である。
発明の詳細な説明
以下の記載および例は、本発明の実施形態について、詳細に例示する。本発明は、本明細書で記載される特定の実施形態に限定されず、そのようなものとして、変動しうることを理解されたい。当業者は、本発明には、多数の変動および改変がなされ、これらは、その範囲内に包含されることを認識するであろう。
全ての用語は、それらが、当業者により理解される通りに理解されることを意図する。そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。
本明細書で使用される節の小見出しは、構成上の目的だけのものであり、記載される主題を限定するものと見なすべきではない。
本発明の多様な特色は、単一の実施形態の文脈で記載しうるが、特色はまた、個別に提示される場合もあり、任意の適切な組合せで提示される場合もある。逆に、本明細書では、明確さのために、本発明を、個別の実施形態の文脈で記載しうるが、本発明はまた、単一の実施形態でも、実施することができる。
以下の定義は、当技術分野における定義を補完し、本出願へと方向付けられ、いかなる関連または非関連の案件、例えば、共同所有される、いかなる特許または出願にも帰属しない。本明細書で記載される方法および材料と、同様または同等である、任意の方法および材料を、本開示の試験の実施において使用しうるが、本明細書では、好ましい材料および方法について記載する。したがって、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態について記載することだけを目的とするものであり、限定的であることを意図するものではない。
本出願では、そうでないことが別段に言明されない限りにおいて、単数形の使用は、複数形を含む。本明細書で使用される通り、そうでないことが文脈により明確に指示されない限りにおいて、単数形の「ある（a）」、「ある（an）」、および「その」は、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。本出願では、そうでないことが言明されない限りにおいて、「または」の使用は、「および／または」を意味する。さらに、「〜を含むこと」という用語のほか、「〜を含む（include）」、「〜を含む（includes）」、および「含まれた」など、他の形態の使用は、限定的ではない。
本明細書における、「一部の実施形態」、「ある実施形態」、「一実施形態」、または「他の実施形態」への言及は、実施形態との関連で記載される、特定の特色、構造、または特徴が、本発明の、少なくとも一部の実施形態には含まれるが、全ての実施形態には、必ずしも含まれないことを意味する。
本明細書および特許請求の範囲で使用される「〜を含むこと（comprising）」（「〜を含む（comprise）」および「〜を含む（comprises）」など、「〜を含むこと（comprising）」の任意の形態）、「〜を有すること」（「〜を有する（have）」および「〜を有する（has）」など、「〜を有すること」の任意の形態）、「〜を含むこと（including）」（「〜を含む（include）」および「〜を含む（includes）」など、「〜を含むこと（including）」の任意の形態）、または「〜を含有すること」（「〜を含有する（contain）」および「〜を含有する（contains）」など、「〜を含有すること」の任意の形態）という語は、包含的またはオープンエンドであり、さらなる、列挙されていない要素または方法ステップを除外しない。本明細書で論じられる任意の実施形態は、本発明の任意の方法または組成物に関して実施することが可能であり、この逆も成り立つことが想定される。さらに、本発明の組成物を使用して、本発明の方法を達成することができる。
本明細書で使用される、基準数値との関係における「約」という用語およびその文法的同等物は、数値自体およびこの数値から±１０％の値の範囲を含むことができる。例えば、「約１０」の量は、１０および９〜１１の任意の量を含む。例えば、基準数値との関係における「約」という用語はまた、値±この値から１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の範囲も含みうる。
「単離された」とは、その天然環境から核酸を摘出することを意味する。「精製された」とは、所与の核酸が、天然から摘出されたもの（ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡを含む）であれ、または合成されたもの（ｃＤＮＡを含む）であれ、および／または検査室条件下で増幅されたものであれ、純度が増大しており、この場合、「純度」とは、相対的用語であり、「絶対純度」ではないことを意味する。一方、核酸およびタンパク質は、希釈剤またはアジュバントと共に製剤化される場合があるが、実際的な目的では、単離されているものとしうることを理解されたい。例えば、核酸は、細胞への導入のために使用する場合、許容可能な担体または希釈剤と混合することが典型的である。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は、分子の一次構造だけを指す。したがって、この用語は、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、三重鎖ＤＮＡのほか、二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡも含む。この用語はまた、例えば、ポリヌクレオチドのメチル化および／またはキャッピングによる修飾形態、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形態も含みうる。用語はまた、天然のものではないヌクレオチドまたは合成ヌクレオチドのほか、ヌクレオチド類似体を含む分子を含むことも意図する。
「ポリペプチド」とは、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語と互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。「成熟タンパク質」とは、全長タンパク質であり、任意選択で、グリコシル化または所与の細胞環境内のタンパク質に典型的な他の改変を含むタンパク質である。
核酸および／または核酸配列は、天然または人工で、共通の先祖核酸または先祖核酸配列に由来する場合、「相同」である。タンパク質および／またはタンパク質配列は、それらのコードＤＮＡが、天然または人工で、共通の先祖核酸または先祖核酸配列に由来する場合、相同である。相同な分子は、相同体と称する場合がある。例えば、本明細書で記載される、任意の天然タンパク質は、任意の利用可能な突然変異誘発法により修飾することができる。発現させると、この突然変異核酸は、元の核酸によりコードされるタンパク質と相同なポリペプチドをコードする。相同性は一般に、２つまたはこれを超える核酸またはタンパク質（またはこれらの配列）の間の配列同一性から推定される。相同性を確立するのに有用な配列の間の同一性の、正確な百分率は、問題の核酸およびタンパク質と共に変動するが、少なくとも２５％の配列同一性を使用して、相同性を確立する。高レベルの配列同一性、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％、またはこれを超える配列同一性もまた、相同性を確立するのに使用することができる。
ポリペプチドの、２つの核酸配列またはアミノ酸配列の文脈において、「同一」または「配列同一性」という用語は、指定された比較域にわたり、最大の照応関係についてアライメントされた場合に同じである、２つの配列内の残基を指す。実施形態の１つのクラスでは、本明細書のポリペプチドは、例えば、デフォルトパラメーターを使用する、ＢＬＡＳＴＰ（もしくはＣＬＵＳＴＡＬ、または他の任意の利用可能なアライメントソフトウェア）により測定される通り、基準ポリペプチドまたはこの断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９８％の９９％、または１００％同一である。同様に、核酸はまた、出発核酸に照らして記載することもでき、例えば、それらは、例えば、デフォルトパラメーターを使用する、ＢＬＡＳＴＮ（もしくはＣＬＵＳＴＡＬ、または他の任意の利用可能なアライメントソフトウェア）により測定される通り、基準核酸またはこの断片と５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９８％、９９％、または１００％同一でありうる。１つの分子が、大型の分子に対して、ある特定の百分率の配列同一性を有するという場合、これは、２つの分子が最適にアライメントされれば、小型の分子内の、百分率の残基は、２つの分子が最適にアライメントされた順序に従い、大型の分子内にマッチ残基を見出すことを意味する。
「トランスポゾン」または「転移性エレメント」（ＴＥ）とは、ゲノム内のその位置を変化させ、場合によって、突然変異を創出または保存し、細胞のゲノムサイズを変更する、ベクターＤＮＡ配列である。転移は、ＴＥの重複を結果としてもたらすことが多い。クラスＩのＴＥは、２段階でコピーされる：まず、クラスＩのＴＥは、ＤＮＡからＲＮＡへと転写され、次いで、産生されたＲＮＡは、ＤＮＡへと逆転写される。次いで、この、コピーされたＤＮＡは、ゲノム内の新たな位置へと挿入される。逆転写ステップは、ＴＥ自身によりコードされうる、逆転写酵素により触媒される。レトロトランスポゾンの特徴は、ＨＩＶなどのレトロウイルスと同様である。クラスＩＩのＴＥによるカットアンドペースト転移機構は、ＲＮＡ中間体を伴わない。転移は、いくつかのトランスポザーゼ酵素により触媒される。あるトランスポザーゼは、ＤＮＡ内の任意の標的部位に非特異的に結合するのに対し、他のトランスポザーゼは、特異的ＤＮＡ配列標的に結合する。トランスポザーゼは、標的部位において、互い違いの（staggered）切断をもたらす結果として、５’側または３’側における、一本鎖のＤＮＡ突出（粘着（sticky）末端）をもたらす。このステップは、ＤＮＡトランスポゾンを切り出し、次いで、ＤＮＡトランスポゾンは、新たな標的部位へとライゲーションされるが、この過程は、ギャップを埋めるＤＮＡポリメラーゼの活性と、糖リン酸骨格をつなぎ合わせるＤＮＡリガーゼの活性とを伴う。これは、標的部位の重複を結果としてもたらす。ＤＮＡトランスポゾンの挿入部位は、標的ＤＮＡ内が互い違いに切断され、ＤＮＡポリメラーゼにより埋められることにより創出されうる短い直接的なリピート、ならびにそれらに続く、トランスポザーゼによるＴＥの切出しに重要な一連の逆位リピートにより同定されうる。細胞周期のＳ期において、ドナー部位は既に複製されているが、標的部位はまだ複製されていない場合に転移が生じるとカットアンドペーストＴＥは重複される。転移は、クラスＩ ＴＥおよびクラスＩＩ ＴＥのいずれにおいても、「自律型」または「非自律型」として分類することができる。自律型ＴＥが、それ自身で移動しうるのに対し、非自律型ＴＥは、移動するのに、別のＴＥの存在を必要とする。これは、非自律型ＴＥが、トランスポザーゼ（クラスＩＩの場合）または逆転写酵素（クラスＩの場合）を欠くためであることが多い。
「トランスポザーゼ」とは、トランスポゾンの末端に結合し、カットアンドペースト機構または複製性転移機構による、トランスポゾンの、ゲノムの別の部分への移動を触媒する酵素を指す。一部の実施形態では、トランスポザーゼの触媒活性を用いて、遺伝子を、ベクターからゲノムへと移動させることができる。
本明細書で開示または想定される核酸配列およびベクターは、細胞へと、「トランスフェクション」、「形質転換」、「ヌクレオフェクション」または「形質導入」により導入することができる。本明細書で使用される「トランスフェクション」、「形質転換」、または「形質導入」とは、物理的方法または化学的方法を使用することによる、１または複数の外因性ポリヌクレオチドの、宿主細胞への導入を指す。当技術分野では、多くのトランスフェクション法が公知であり、例えば、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿法（例えば、Murray E. J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)を参照されたい）；ＤＥＡＥ−デキストラン法；電気穿孔法；カチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション法；タングステン粒子促進型遺伝子銃法（Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)）;リン酸ストロンチウム共沈殿法（Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)）；およびヌクレオフェクション（Trompeter et al., J. Immunol. Methods 274:245-256 (2003)）を含む。ファージベクターまたはウイルスベクターは、それらの多くが市販されている、適切なパッケージング細胞内で、感染性粒子を増殖させた後で、宿主細胞へと導入することができる。
「プロモーター」とは、コード配列の転写を誘発する、ポリヌクレオチドの領域を指す。プロモーターは、ＤＮＡの、同じ鎖上の、遺伝子の転写開始部位の近傍であり、かつ、上流に（センス鎖の５’側領域に向かって）位置する。あるプロモーターが、細胞内の全ての状況において活性であるので、構成的であるのに対し、他のプロモーター、例えば、誘導性プロモーターは、特異的刺激に応答して調節され、活性となる。
「プロモーター活性」という用語は、その活性が測定されているプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現の程度を指す。プロモーター活性は、例えば、ノーザンブロット解析により、産生されるＲＮＡ転写物の量を決定することにより、直接的に測定することができ、プロモーターに連結されたレポーター核酸配列など、連結された核酸配列によりコードされる産物の量を決定することにより、間接的に測定することができる。
本明細書で使用される「誘導性プロモーター」とは、転写調節因子、例えば、生物因子または非生物因子の存在または非存在により、活性へと誘導されるプロモーターを指す。誘導性プロモーターは、それらに作動可能に連結した遺伝子の発現が、生物または特に、組織の発生の、ある特定の段階において、オンまたはオフにされうるため、有用である。誘導性プロモーターの例は、アルコール調節性プロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、発症機序調節性プロモーター、温度調節性プロモーター、および光調節性プロモーターである。一実施形態では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチの一部である。
本明細書で使用される「エンハンサー」という用語は、例えば、それが作動可能に連結された核酸配列の転写を増大させるＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、核酸配列のコード領域から、何キロベースも離れて位置することが可能であり、調節因子の結合、ＤＮＡのメチル化パターン、またはＤＮＡ構造の変化を媒介しうる。当技術分野では、様々な異なる供給源に由来する、多数のエンハンサーが周知であり、クローニングされたポリヌクレオチドとして、またはクローニングされたポリヌクレオチド内で利用可能である（例えば、ＡＴＣＣなどの寄託先のほか、他の商業的供給源または個人的供給源から）。プロモーター（一般に使用されるＣＭＶプロモーターなど）を含む、多数のポリヌクレオチドはまた、エンハンサー配列も含む。エンハンサーは、コード配列の上流に位置する場合もあり、この中に位置する場合もあり、この下流に位置する場合もある。「Ｉｇエンハンサー」という用語は、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座内にマップされるエンハンサー領域に由来するエンハンサーエレメント（このようなエンハンサーは、例えば、重鎖（ミュー）５’側エンハンサー、軽鎖（カッパ）５’側エンハンサー、カッパイントロンエンハンサーおよびミューイントロンエンハンサー、ならびに３’側エンハンサーを含む）を指す（一般に、Paul W. E. (ed), Fundamental Immunology, 3rd Edition, Raven Press, New York (1993), pages 353-363、および米国特許第５，８８５，８２７号明細書を参照されたい）。
本明細書で使用される「コード配列」とは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのセグメントを指す。領域または配列には、５’末端の近傍では、開始コドンが結合し、３’末端の近傍では、終止コドンが結合する。コード配列はまた、オープンリーディングフレームと称することもできる。
本明細書で使用される「作動可能に連結された」とは、ＤＮＡセグメントの、別のＤＮＡセグメントへの、物理的な連結および／または機能的な連結であって、セグメントが、それらの意図される方式で機能することを可能とするような連結を指す。遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列は、それが、例えば、プロモーター、エンハンサー、および／またはサイレンサーなどの調節配列に、ＤＮＡ配列の転写のモジュレーションを、直接的または間接的に可能とする方式で連結されている場合に、調節配列に作動可能に連結されている。例えば、ＤＮＡ配列は、それが、プロモーターの転写開始部位に対して、下流において、転写開始部位に対して、適正なリーディングフレーム内で、プロモーターへとライゲーションされており、ＤＮＡ配列を通して、転写の伸長が進行することを可能とする場合に、プロモーターに作動可能に連結されている。エンハンサーまたはサイレンサーは、それが、それぞれ、ＤＮＡ配列の転写を増加または減少させるように、ＤＮＡ配列へとライゲーションされている場合に、遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。エンハンサーおよびサイレンサーは、ＤＮＡ配列のコード領域の上流に位置する場合もあり、この下流に位置する場合もあり、この中に埋め込まれている場合もある。シグナル配列が、ポリペプチドの分泌に参与するプレタンパク質として発現する場合、シグナル配列のＤＮＡは、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている。ＤＮＡ配列の、調節配列への連結は、典型的に、適切な制限部位におけるライゲーションにより、または当業者に公知の制限エンドヌクレアーゼを使用して、配列内に挿入された、アダプターまたはリンカーを介して達せられる。
「転写調節因子」という用語は、ある特定の環境条件下で、プロモーター駆動性ＤＮＡ配列の転写を防止もしくは阻害するように作用する生化学的エレメント（例えば、リプレッサータンパク質または核阻害性タンパク質）、または、ある特定の環境条件下で、プロモーター駆動性ＤＮＡ配列の転写を可能とするか、もしくは刺激するように作用する生化学的エレメント（例えば、インデューサーまたはエンハンサー）を指す。
「誘導」という用語は、転写調節因子によりもたらされる、核酸配列の転写、プロモーターの活性、および／またはプロモーターの発現の、何らかの転写基礎レベルと比べた上昇を指す。
「標的」遺伝子または「異種」遺伝子または「目的の遺伝子（ＧＯＩ）」とは、遺伝子導入により宿主細胞へと導入される遺伝子を指す。
本明細書で使用される「リコンビナーゼ」とは、規定された部位の間の部位特異的組換えを容易としうる酵素群であって、部位が、単一のＤＮＡ分子上で物理的に隔てられているか、または部位が、別個のＤＮＡ分子上に存在する、酵素群を指す。規定された組換え部位のＤＮＡ配列は、必ずしも同一ではない。組換えの開始は、タンパク質−ＤＮＡ間相互作用に依存し、酵素群内には、ファージの組込みおよび切出し（例えば、λインテグラーゼ、ΦＣ３１）、環状プラスミドの切断（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）（例えば、Ｔｎ３、ガンマデルタ、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ）、代替的遺伝子の発現のためのＤＮＡの反転（例えば、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｐｉｎ）、発生時における遺伝子（例えば、アナベナ属（Anabaena）による窒素固定遺伝子）のアセンブリ、および転移（例えば、ＩＳ６０７トランスポゾン）を触媒する、多数のタンパク質が存在する。大半の部位特異的リコンビナーゼは、進化的類縁性および機構的類縁性に基づき、２つのファミリーのうちの１つに収まる。これらは、λインテグラーゼファミリーまたはチロシンリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、ＸｅｒＤ）、およびレゾルバーゼ／インテグラーゼファミリー、またはセリンリコンビナーゼファミリー（例えば、ΦＣ３１、ＴＰ９０１−１、Ｔｎ３、ガンマデルタ）である。
「組換え接合部位」とは、本明細書で記載されるリコンビナーゼ酵素により認識される、特異的ポリヌクレオチド配列である。典型的に、１つの部位が、標的核酸（例えば、真核生物または原核生物の染色体またはエピソーム）内に存在し、別の部位が、標的組換え部位において統合される核酸上に存在する、２つの異なる部位（「相補的部位」と称する）が関与する。本明細書では、それぞれ、細菌標的およびファージドナーに由来する、接合（または組換え）部位を指す、「ａｔｔＢ」および「ａｔｔＰ」という用語が使用されるが、特定の酵素のための組換え部位は、異なる名称を有しうる。組換え部位は、典型的に、コア領域またはスペーサー領域により隔てられた、左側アームおよび右側アームを含む。したがって、ａｔｔＢ組換え部位は、ＢＯＢ’［配列中、ＢおよびＢ’は、それぞれ、左側アームおよび右側アームであり、Ｏは、コア領域である］からなる。同様に、ａｔｔＰとは、ＰＯＰ’［配列中、ＰおよびＰ’は、アームであり、Ｏは、ここでもまた、コア領域である］である。ａｔｔＢ部位と、ａｔｔＰ部位との組換え時、および標的における、同時の核酸の組込み時に、組み込まれるＤＮＡを挟む組換え部位を、「ａｔｔＬ」および「ａｔｔＲ」と称する。したがって、上記の用語法を使用する、ａｔｔＬ部位およびａｔｔＲ部位は、それぞれ、ＢＯＰ’およびＰＯＢ’からなる。本明細書における一部の表示では、「Ｏ」を省き、ａｔｔＢおよびａｔｔＰを、例えば、それぞれ、ＢＢ’およびＰＰ’と呼ぶ。
「発現ベクター」または「ベクター」とは、細胞内のポリヌクレオチドの複製の自律的単位として挙動する（すなわち、それ自身の制御下における複製が可能である）か、または宿主細胞の染色体への挿入により複製が可能となる、任意の遺伝子エレメント、例えば、プラスミド、染色体、ウイルス、トランスポゾンであって、接合させたセグメントの複製および／または発現をもたらすように、それへと、別のポリヌクレオチドセグメントを接合させた遺伝子エレメントである。適切なベクターは、プラスミド、トランスポゾン、バクテリオファージ、およびコスミドを含むがこれらに限定されない。ベクターは、所望の宿主細胞中へのベクターのライゲーションまたは挿入を実施し、接合させたセグメントの発現を実施するのに必要なポリヌクレオチド配列を含有しうる。このような配列は、宿主生物に応じて異なり、転写を実施するプロモーター配列、転写を増加させるエンハンサー配列、リボソーム結合性部位の配列、および転写翻訳終結配列を含む。代替的に、発現ベクターは、ベクターの、宿主細胞のＤＮＡ配列へのライゲーションまたは組込みを伴わずに、その中でコードされる核酸配列の産物を、直接発現させることが可能でありうる。
ベクターはまた、「選択用マーカー遺伝子」も含みうる。本明細書で使用される「選択用マーカー遺伝子」という用語は、核酸配列を発現する細胞を、対応する選択用薬剤の存在下で、これと順方向または逆方向に、特異的に選択することを可能とする核酸配列を指す。当技術分野では、適切な選択用マーカー遺伝子が公知であり、例えば、国際特許出願公開第１９９２／０８７９６号パンフレットおよび同第１９９４／２８１４３号パンフレット、Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567 (1980)、O’Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527 (1981)、Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072 (1981)、Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1 (1981)、Santerre et al., Gene, 30: 147 (1984)、Kent et al., Science, 237: 901-903 (1987)、Wigler et al., Cell, 11: 223 (1977)、Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026 (1962)、Lowy et al., Cell, 22: 817 (1980)、ならびに米国特許第５，１２２，４６４号明細書および同第５，７７０，３５９号明細書において記載されている。
一部の実施形態では、ベクターは、宿主細胞内で複製することが可能であり、適切な選択的圧の存在下で、宿主細胞内のＤＮＡの染色体外セグメントとして存続する、「エピソーム発現ベクター」または「エピソーム」である（例えば、Conese et al., Gene Therapy, 11:1735-1742 (2004)を参照されたい）。代表的な、市販のエピソーム発現ベクターは、エプスタイン−バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）複製起点（ｏｒｉＰ）を用いるエピソームプラスミドを含むがこれらに限定されない。ベクターである、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ７、ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐｃＤＮＡ３．１およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐＢＫ−ＣＭＶは、ＥＢＮＡ１およびｏｒｉＰの代わりに、Ｔ抗原およびＳＶ４０の複製起点を使用する、エピソームベクターの非限定的な例を表す。
「がん細胞」とは、前述したように、多段階腫瘍進行の初期、中間または進行期を経る細胞を指す（Pitot et al., Fundamentals of Oncology, 15-28 (1978)）。これには、「前新生物性」細胞（すなわち、「過形成性」細胞および異形成性細胞）、および異形成性細胞の新生物進行の進行段階における新生物性細胞を含む、新生物進行の初期、中期および進行期の細胞が含まれる。
「転移性」がん細胞とは、原発がん部位（すなわち、がん細胞が最初に正常、過形成または異形成細胞から形成された部位）から原発部位以外の部位に転座するがん細胞を指し、転座したがん細胞が滞留して増殖する。
「がん」とは、転移性である場合もそうでない場合もある複数のがん細胞を指し、例えば、卵巣がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、子宮頸がん、膵臓がん、結腸がん、胃がん、食道がん、口がん、舌がん、歯肉がん、皮膚がん（例えば、黒色腫、基底細胞がん、カポジ肉腫など）、筋肉がん、心臓がん、肝臓がん、気管支がん、軟骨がん、骨がん、精巣がん、腎臓がん、子宮内膜がん、子宮がん、膀胱がん、骨髄がん、リンパ腫がん、脾臓がん、胸腺がん、甲状腺がん、脳がん、ニューロンがん、中皮腫、胆嚢がん、眼がん（例えば、角膜がん、ブドウ膜がん、脈絡膜がん、黄斑がん、硝子体液がんなど）、関節がん（滑膜がんなど）、神経膠芽細胞腫、リンパ腫、白血病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）が挙げられる。
ＲＯＲ−１
ＲＯＲ１は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリー内の膜貫通タンパク質である。ＲＯＲ１遺伝子は、短い３９３アミノ酸（ａａ）の細胞内タンパク質（アイソフォーム２）および長い９３７ａａの１型膜貫通タンパク質（アイソフォーム１）の２つの明確に定義されたアイソフォームをコードする。長い細胞表面アイソフォームは、一次ヒトＢ−慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）およびマントル細胞リンパ腫、Ｂ−急性リンパ性白血病のサブセット、および転移性表現型に関連するものを含む多くの腫瘍上に発現される。
ＲＯＲ１は、主に胚発生中に発現するが、その発現は胎児発生中に減弱する。しかしながら、ＲＯＲ１は、リンパ腫、ＣＬＬ、およびＢ−ＡＬＬなどに限定されないいくつかのＢ細胞悪性腫瘍によって、ならびに副腎、膀胱、乳房、結腸、肺、膵臓、前立腺、卵巣、皮膚、精巣、子宮、および神経芽細胞腫などに限定されない多くの固形腫瘍悪性腫瘍によって異常に発現する。
キメラ抗原受容体
本明細書に記載される複数の実施形態では、ＣＡＲは、標的認識のための細胞外抗体由来の単鎖可変ドメイン（ｓｃＦｖ）を含み得、ｓｃＦｖは、可撓性リンカーによって、膜貫通ドメイン、および／または、例えば、Ｔ細胞活性化のためのＣＤ３ζを含む細胞内シグナル伝達ドメインに接続されうる。通常、Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｖｏで活性化された場合、それらは、サイトカイン（すなわち、ＩＬ−２およびＩＬ−２１）の産生を誘導するＣＤ２８からの二次共刺激シグナルを伴う一次抗原誘導ＴＣＲシグナルを受け取り、次に、オートクリン／パラクリン様式でシグナル伝達ループにフィードバックされる。このようにして、ＣＡＲは、シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ２８細胞質シグナル伝達ドメイン、または他の共刺激分子シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを含むことができる。キメラＣＤ２８共刺激は、抗アポトーシス分子の上方制御およびＩＬ−２の産生、ならびに末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来のＴ細胞の拡大増殖によってＴ細胞の持続性を改善する。
一実施形態では、ＣＡＲは、ＲＯＲ−１の多様なエピトープに特異的なモノクローナル抗体、例えば、膜貫通ドメインおよびＣＤ３−ゼータエンドドメインへと融合させた、モノクローナル抗体に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合体である。このような分子は、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答してゼータシグナルの伝達をもたらす。
ある実施形態では、ＣＡＲは、エクトドメイン（細胞外）、膜貫通ドメインおよびエンドドメイン（細胞内）を有することができる。ＣＡＲエクトドメインの一実施形態では、シグナルペプチドは、新生タンパク質を小胞体内に方向付ける。これは、例えば、受容体がグリコシル化され、細胞膜にアンカリングされる場合である。真核生物のシグナルペプチド配列は、機能的であると想定される。一般に、最もアミノ末端成分に天然に接合したシグナルペプチドが使用される（例えば、配向軽鎖−リンカー−重鎖を有するｓｃＦｖにおいて、軽鎖の天然シグナルが使用される）。複数の実施形態では、シグナルペプチドは、ＧＭ−ＣＳＦＲａ（配列番号９４）またはＩｇＫ（配列番号９５）である。使用することができる他のシグナルペプチドは、ＣＤ８アルファ（配列番号９７）およびＣＤ２８からのシグナルペプチドを含む。一実施形態では、シグナルペプチドは、マウスＩｇ ＶＨ領域３（配列番号１０１）、アズロシジン（配列番号１０３）、ＩＧＨＶ３−２３（配列番号１０６）、ＩＧＫＶ１−Ｄ３３（ＨｕＬ１）（配列番号１０７）またはＩＧＫＶ１−Ｄ３３（Ｌ１４Ｆ）（ＨｕＨ７）（配列番号１０８）である。
抗原認識ドメインは、ｓｃＦｖでありうる。しかしながら、選択肢がありうる。天然のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファおよびベータ単鎖からの抗原認識ドメインが想定され、これは、それらが単純なエクトドメイン（例えば、ＣＤ４エクトドメイン）、ならびに、連結された、例えば、サイトカイン（サイトカイン受容体を有する細胞の認識をもたらす）などの他の認識成分を有するためである。所与の標的に結合するもの、例えば、高い親和性を有するウイルス関連抗原は、抗原認識領域として使用することができる。
一般に、ＣＡＲは、二量体化された形態で存在し、細胞外ｓｃＦｖ（ＶＬに連結されたＶＨ）領域、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達モチーフを連結する融合タンパク質として発現される。第１世代ＣＡＲのエンドドメインは、ＣＤ３−ζシグナル伝達のみを介してＴ細胞活性化を誘導する。第２世代ＣＡＲは、ＣＤ３−ζおよびＣＤ２８、または４−１ＢＢもしくはＯＸ４０などの他のエンドドメインを介して活性化シグナル伝達を提供する。第３世代ＣＡＲは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、またはＯＸ４０などの３つのシグナル伝達モチーフのＣＤ３−ζ含有組合せを介してＴ細胞を活性化する。
複数の実施形態では、本発明は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。複数の実施形態では、細胞外ドメインは、そうでなければ、抗原結合部分またはｓｃＦｖと称する標的特異的結合エレメントおよびスペーサーを含む。複数の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメイン、または、そうでなければ、細胞質シグナル伝達ドメインは、共刺激性シグナル伝達領域およびゼータ鎖部分を含む。
共刺激シグナル伝達ドメイン領域は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要である抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。
複数の実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間には、ストークドメインまたはストーク領域が組込まれる。本明細書で使用される場合、「ストークドメイン」または「ストーク領域」という用語は、一般に、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖中のｓｃＦｖまたは細胞質ドメインのいずれかに連結するように機能する任意のオリゴヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。ストークドメインは、Ｆｃヒンジなどの可撓性ヒンジと、任意選択で、Ｆｃの１つまたは２つの定常ドメインとを含むことができる。いくつかの例では、ストーク領域は、ＩｇＧ１からのヒンジ領域を含む。代替的な場合に、ストーク領域は、免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域と、任意選択で、ＣＤ３の部分とを含む。場合によって、ストーク領域は、国際公開第２０１６／０７３７５５号パンフレットに記載されているＣＤ８αヒンジ領域（配列番号８３）、ＩｇＧ４−Ｆｃ１２アミノ酸ヒンジ領域（ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号２８５））またはＩｇＧ４ヒンジ領域を含む。
他の実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間に、スペーサーが組み込まれる。スペーサーは、図３および４に示されるように、ストーク領域およびストーク伸長領域を含みうる。一部の実施形態では、スペーサーは、キメラポリペプチドの異なるドメイン間の距離を延長し、その結果、さもなければスペーサーを欠く同一のポリペプチドと比較して、ポリペプチドの発現または機能的活性が改善される。いくつかの例では、スペーサーは、膜貫通領域をキメラポリペプチドの細胞外領域または細胞質領域のいずれかに連結するように機能する任意のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、スペーサーは、抗原またはリガンド結合領域が、抗原またはリガンド受容体認識を容易とするように、異なる方向に整列することを可能とするのに十分な程度に可撓性である。
一部の実施形態では、ストーク領域は、長さが約２０〜約３００アミノ酸であり、少なくとも１つの二量体化部位を含むことができ、ストーク伸長領域は、アミノ酸の数によって測定した場合、ストーク領域の長さの約１〜約１０倍を含むことができる。
場合によって、ストーク領域は、長さが約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０またはそれを超えるアミノ酸でありうる。他の場合には、ストーク領域は、長さが約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５または３００アミノ酸でありうる。
一実施形態では、スペーサーは、単一のストーク領域を含むことができる。別の実施形態では、スペーサーは、ストーク領域（「Ｓ」として示される）、および本明細書では「Ｓ’ｎ」として示されるストーク伸長領域を含むことができる。例えば、スペーサーは、１つのストーク領域およびＳ’ｎを含むことができ、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０でありうる。さらなる実施形態では、ストーク領域は、リンカーを介してストーク伸長領域Ｓ’ｎに連結されうる。一実施形態では、ＣＡＲは、ＲＯＲ１ ＣＡＲである場合、ｎは０ではない。
場合によって、ストーク伸長領域は、アミノ酸の数によって測定した場合、ストーク領域の長さの約１〜約１０倍を含むことができる。例えば、ストーク伸長領域は、アミノ酸の数によって測定した場合、ストーク領域の長さの約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍を含むことができる。場合によって、ストーク伸長領域は、アミノ酸の数によって測定した場合、ストーク領域の長さの１０倍よりも大きいものを含むことができる。一部の例では、ストーク伸長領域は、アミノ酸の数で測定した場合、ストーク領域の長さの最大２倍を含むことができるが、ストーク領域より少ない二量化部位を含むことができる。
対象抗原結合ポリペプチドのストーク伸長領域は、ストーク領域と比較して、少なくとも１つ少ない二量体化部位を含有することができる。例えば、ストーク領域が２つの二量体化部位を含む場合、ストーク伸長領域は、１つまたはゼロの二量体化部位を含むことができる。別の例として、ストーク領域が１つの二量体化部位を含む場合、ストーク伸長領域は、ゼロの二量体化部位を含むことができる。一部の例では、ストーク伸長領域は、二量体化部位を欠いている。一部の例では、ストーク伸長領域は、アミノ酸の数によって測定した場合、ストーク領域の長さの最大２倍を含むことができるが、二量体化部位を含まない。一部の例では、ストーク伸長領域は、アミノ酸の数によって測定した場合、ストーク領域の長さの最大３倍を含むことができるが、二量体化部位を含まない。一部の例では、ストーク伸長領域は、アミノ酸の数によって測定した場合、ストーク領域の長さの最大４倍を含むことができるが、ゼロの二量体化部位を含む。場合によって、１または複数の二量体化部位は、膜近位でありうる。他の場合には、１または複数の二量体化部位は、膜遠位でありうる。
ストーク伸長領域の各々は、一部の例では、長さが約２０〜約６０アミノ酸でありうる。他の例では、ストーク伸長領域は、長さが約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５より大きなアミノ酸、またはその範囲内もしくは範囲外の任意の整数でありうる。場合によって、各ストーク伸長領域は、ストーク領域に対する、少なくとも約６０％の同一性を有する配列を有する。一部の例では、各ストーク伸長領域は、ストーク領域に対する、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより大きい同一性を有する配列を有する。
膜貫通ドメインは、天然供給源に由来する場合もあり、組換え供給源に由来する場合もある。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合性タンパク質または膜貫通タンパク質に由来しうる。適切な膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体の、アルファ鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖の膜貫通領域を含む場合もあり、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ζ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８アルファ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４に由来する膜貫通領域を含む場合もある。代替的に、膜貫通ドメインは、合成の場合もあり、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含みうる。一部の実施形態では、合成膜貫通ドメインの、一方または両方の末端では、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが見出される。任意選択で、一部の実施形態では、長さが２〜１０アミノ酸の間の短いオリゴヌクレオチドまたはポリペプチドリンカーは、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成することができる。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン−セリンリンカーである。一部の実施態様では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む。一部の実施態様では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む。
細胞内ドメインは、１または複数の共刺激ドメインを含むことができる。例示的な共刺激ドメインには、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３−ゼータ、またはそれらの断片もしくは組合せを含むが、これらに限定されない。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される共刺激ドメインのうちの１もしくは複数、または２つもしくはこれを超えるものを含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される共刺激ドメインのうちの１もしくは複数、または２つもしくはこれを超えるものを含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるＣＡＲは、ＣＤ８、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、またはそれらの断片もしくは組合せから選択される１または複数の、あるいは２またはこれを超える共刺激ドメインを含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるＣＡＲは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはそれらの断片もしくは組合せから選択される１もしくは複数の、または２もしくはこれを超える共刺激ドメインを含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される共刺激ドメインのうちの１もしくは複数、または２つもしくはこれを超えるものを含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ２８および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこれらのそれぞれの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ２８およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらのそれぞれの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ８およびＣＤ２８、またはこれらのそれぞれの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ２８、またはこの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインである４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ８、またはこの断片を含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるＣＡＲは、少なくとも１つの共刺激ドメインＤＡＰ１０またはその断片を含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるＣＡＲは、少なくとも１つの共刺激ドメインＤＡＰ１２またはその断片を含む。
本開示のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞質ドメインとしても知られ、ＣＡＲが配置された免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特化機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性の場合もあり、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性の場合もある。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特化機能を実施するように、細胞を方向付ける、タンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメインの全体が用いられうるが、多くの場合、鎖全体を使用することは必要でない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分を使用し、エフェクター機能シグナルを伝達する限りにおいて、このような切断部分を、無傷鎖の代わりに使用することができる。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語とは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの、任意の切断部分を含むことが意図される。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、Ｔ細胞活性化のためのシグナル伝達ドメインをさらに含む。場合によって、Ｔ細胞活性化のためのシグナル伝達ドメインは、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、またはＣＤ６６ｄに由来するドメインを含む。場合によって、Ｔ細胞活性化のためのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来するドメインを含む。
複数の実施形態では、本明細書では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離された核酸が提供され、ＣＡＲは、（ａ）ＲＯＲ−１抗原結合ドメイン；（ｂ）ストークドメイン；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはその両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン；および任意選択で、（ｆ）切断型上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ１）を含む。
本発明の範囲には、本明細書に記載されるＣＡＲの機能的部分をコードする核酸配列が含まれる。機能的部分は、例えば、標的細胞を認識する能力を保持するＣＡＲの部分、あるいは親ＣＡＲと同様の程度、これと同程度、またはこれより高い程度に、疾患を検出、治療、または予防する能力を保持するＣＡＲの部分を包含する。親ＣＡＲをコードする核酸配列に関して、ＣＡＲの機能的部分をコードする核酸配列は、親ＣＡＲのうちの、例えば、約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％、またはこれを超える親ＣＡＲを含むタンパク質をコードしうる。
複数の実施形態では、ＣＡＲは、その部分のアミノ末端またはカルボキシ末端、または両方の末端にさらなるアミノ酸を含有し、これらのさらなるアミノ酸は、親ＣＡＲのアミノ酸配列中には見出されない。望ましくは、さらなるアミノ酸は、機能部分の生物学的機能、例えば、標的細胞を認識すること、がんを検出すること、がんを治療または予防することなどを妨げない。より望ましくは、さらなるアミノ酸は、親ＣＡＲの生物学的活性と比較して、ＣＡＲの生物学的活性を増強する。
本明細書で使用される「機能的変異体」という用語は、基準ポリペプチドと実質的または著明な配列同一性または配列類似性を有するポリペプチドまたはタンパク質を指し、それがその変異体である、基準ポリペプチドの生物学的活性を保持する。機能的変異体は、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ（親ＣＡＲ）の変異体であって、標的細胞を、親ＣＡＲと同様の程度、これと同程度、またはこれより高い程度に認識する能力を保持する変異体を包含する。親ＣＡＲをコードする核酸配列に照らして、ＣＡＲの機能的変異体をコードする核酸配列は、親ＣＡＲをコードする核酸配列と、例えば、約１０％同一、約２５％同一、約３０％同一、約５０％同一、約６５％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、または約９９％同一でありうる。
本明細書に記載されるＣＡＲは、グリコシル化された、アミド化された、カルボキシル化された、リン酸化された、エステル化された、Ｎ−アシル化された、例えば、ジスルフィド架橋を介して環化された、または酸付加塩に変換された、および／または任意選択で、二量化されたもしくは重合された、またはコンジュゲートされたもの（機能的部分およびその機能的変異体を含む）を含む。
抗原結合部分
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、そうでなければ、抗原結合部分と称する標的特異的結合エレメントを含む。複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、細胞上の抗原に特異的に結合する所望の抗原結合部分を操作することによって、目的の抗原を標的とするように操作される。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲの抗原結合部分は、ＲＯＲ−１に特異的である（ＲＯＲ−１ ＣＡＲ）。ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲは、細胞表面に発現された場合、Ｔ細胞の特異性をヒトＲＯＲ−１にリダイレクトする。複数の実施形態では、抗原結合ドメインは、可撓性リンカー、例えば、グリシン−セリンリンカーまたはホイットローリンカーによって連結される、標的抗原特異的モノクローナル抗ＲＯＲ−１抗体の可変ドメイン軽鎖（ＶＬ）および可変ドメイン重鎖（ＶＨ）を含む単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。複数の実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト化されているｍＲＯＲ−１である。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ｈＲＯＲ１（ＶＨ−ＶＬ）＿１４、ｈＲＯＲ１（ＶＬ−ＶＨ）＿０５、ｈＲＯＲ１（ＶＨ−ＶＬ）＿１４−３、ｈＲＯＲ１（ＶＨ−ＶＬ）＿１４−４、ｈＲＯＲ１（ＶＨ＿５−ＶＬ＿１４）、ｈＲＯＲ１（ＶＨ＿５−ＶＬ＿１６）、ｈＲＯＲ１（ＶＨ＿１８−ＶＬ＿０４）、またはｈＲＯＲ１（ＶＨ＿１８−ＶＬ＿１４）。一部の実施形態では、抗原結合部分は、例えば、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨに方向付けして連結されたＶＨおよびＶＬを含むことができる。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、および７４に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、および７３に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、抗原結合部分ＶＬ（配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、および７４）ならびにＶＨ（配列番号１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、および７３）を、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー（配列番号１２７、１２９、もしくは１３０）またはリンカーの機能的変異体とともに含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号３〜１４および７５〜８２に示されるようなアミノ酸配列のうちのいずれか１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド（ＶＨ、ＶＬおよびリンカー）を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号１５のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿０４）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号１６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿０４）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号１７のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿０５）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号１８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿０５）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号１９のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿０６）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号２０のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿０６）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号２１のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿０７）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号２２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿０７）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号２３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿０８）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号２４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿０８）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号２５のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿０９）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号２６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿０９）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号２７のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１０）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号２８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１０）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号２９のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１１）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号３０のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１１）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号３１のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１２）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号３２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１２）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号３３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１３）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号３４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１３）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号３５のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１４）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号３６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１４）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号３７のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１４−１）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号３８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１４−１）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号３９のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１４−２）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号４０のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１４−２）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号４１のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１４−３）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号４２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１４−３）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号４３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１４−４）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号４４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１４−４）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号４５のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１４−５）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号４６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１４−５）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号４７のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１５）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号４８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１５）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号４９のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１６）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号５０のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１６）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号５１のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１７）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号５２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１７）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号５３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１８）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号５４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１８）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号５５のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１９）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号５６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１９）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号５７のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿２０）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号５８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿２０）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号５９のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿２１）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号６０のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿２１）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号６１のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿２２）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号６２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿２２）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号６３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿２３）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号６４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿２３）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号６５のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿２４）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号６６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿２４）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号６７のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿２５）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号６８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿２５）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号６９のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿２６）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号７０のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿２６）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号７１のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿２７）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号７２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿２７）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号７３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿２８）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号７４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチドを含む抗原結合部分（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿２８）を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿５）、および配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿５）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号３５のアミノ酸配列を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１４）、および配列番号３６のアミノ酸配列を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１４）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号４１のアミノ酸配列を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１４−３）および配列番号４２のアミノ酸配列を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１４−３）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号４３のアミノ酸配列を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１４−４）および配列番号４４のアミノ酸配列を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１４−４）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿５）、および配列番号３６のアミノ酸配列を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１４）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号５３のアミノ酸配列を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１８）、および配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿０４）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号５３のアミノ酸配列を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１８）、および配列番号３６のアミノ酸配列を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１４）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、抗原結合部分は、配列番号９４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＧＭ−ＣＳＦＲａシグナルペプチドを有する。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号５のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号７のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号９のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号１０のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号１１のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号１２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号１３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号１４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号７５のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号７６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号７７のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号７８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号７９のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号８０のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号８１のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、配列番号８２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。
スペーサー
複数の実施形態では、本開示のＲＯＲ−１ ＣＡＲは、抗原結合部分とＴ細胞膜との間の分離を提供する、１または複数のストーク領域と、任意選択で、１または複数のストーク伸長領域を含むスペーサーを含む。複数の実施形態では、スペーサーは、最適なエフェクター−標的膜間距離を確立する。複数の実施形態では、ストークドメインは、抗原結合ドメインがその標的に到達するための可撓性を提供する。一実施形態では、ストークドメインは、ＣＤ８アルファヒンジドメインである。一部の実施形態では、「スペーサー」、「ストーク領域」および「ストークドメイン」という用語は、本明細書において互換的に使用することができる。
複数の実施形態では、ＣＤ８アルファヒンジドメインは、配列番号８８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。
他の実施形態では、細胞外ドメインとＣＡＲの膜貫通ドメインとの間に、スペーサーが組み込まれる。本明細書に記載されるように、スペーサーは、図３および図４に示されるストーク領域およびストーク伸長領域を含むことができる。一実施形態では、スペーサーは、単一のストーク領域を含むことができる。別の実施形態では、スペーサーは、ストーク領域（「Ｓ」として示される）およびストーク伸長領域（本明細書では「Ｓ’ｎ」として示される）を含むことができる。例えば、スペーサーは、１つのストーク領域およびＳ’ｎを含むことができ、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０でありうる。一実施形態では、ＲＯＲ１ ＣＡＲのｓｃＦｖがｍＲＯＲ１（配列番号３〜１４）またはｈＲＯＲ１（配列番号７５〜８２）である場合、ｎは０ではない。
さらなる実施形態では、ストーク領域は、リンカーを介してストーク伸長領域Ｓ’ｎに連結されうる。本明細書に記載されるリンカーは、例えば、ＧＳＧリンカー（配列番号１２９）、ＳＧＳＧリンカー（配列番号１３０）、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号１２７）、（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号２９４）および／またはホイットローリンカー（配列番号１２８）を含むことができる。
一実施形態では、ストーク領域およびストーク伸長領域は、天然または合成の供給源のポリペプチドから誘導またはデザインすることができる。ストーク領域および／またはストーク伸長領域は、細胞表面タンパク質またはその誘導体もしくは変異体に由来するヒンジドメインを含むことができる。一部の実施形態では、ストーク領域および／またはストーク伸長領域は、ＣＤ２８またはＣＤ８アルファ（ＣＤ８α）に由来するヒンジドメインを含みうる。一部の実施形態では、ストーク領域およびストーク伸長領域の各々は、ＣＤ８アルファヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＣＴＬＡ−４ヒンジドメイン、ＬＮＧＦＲ細胞外ドメイン、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ、およびＣＨ２−ＣＨ３ドメインのうちの少なくとも１つから誘導することができる。ストークおよびストーク伸長領域は、ＣＤ８アルファヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＣＴＬＡ−４ヒンジドメイン、ＬＮＧＦＲ細胞外ドメイン、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジまたはＣＨ２−ＣＨ３ドメインの任意の組合せから別個に誘導することができる。一例として、ストーク領域は、ＣＤ８アルファヒンジドメインから誘導することができ、少なくとも１つのストーク伸長領域は、ＣＤ２８ヒンジドメインから誘導することができ、したがって、ハイブリッドスペーサーを作製することができる。別の例として、ストーク領域は、ＩｇＧ１ヒンジまたはＩｇＧ４ヒンジから誘導することができ、少なくとも１つのストーク伸長領域は、ＩｇＧのＣＨ２−ＣＨ３ドメインから誘導することができる。
ある特定の実施形態では、ストーク領域は、ホモまたはヘテロ二量体化キメラポリペプチドを形成するために、１または複数の二量体化部位を含むことができる。他の実施形態では、ストーク領域または１もしくは複数のストーク伸長領域は、二量体化部位を完全に消失する突然変異を含有することができる。一部の実施形態では、ストーク伸長領域は、ストーク領域と比較して、少なくとも１つ少ない二量体化部位を含むことができる。例えば、ストーク領域が２つの二量体化部位を含む場合、ストーク伸長領域は、１つまたはゼロの二量体化部位を含むことができる。別の例として、ストーク領域が１つの二量体化部位を含む場合、ストーク伸長領域は、ゼロの二量体化部位を含むことができる。一部の例では、ストーク伸長領域は、二量体化部位を欠く。
本明細書に開示される実施形態の一部の実施形態では、本抗原結合ポリペプチドのストーク領域は、ＣＤ８アルファヒンジドメインとの、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはそれより大きい同一性を有する配列を含む。ＣＤ８アルファヒンジドメインは、配列番号８３に示される配列との、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはそれより大きい同一性を有するポリペプチド配列を含むことができる。場合によって、ストーク伸長領域は、配列番号８３に示される配列との、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きい同一性を有するポリペプチド配列を含む。場合によって、ストーク伸長領域は、配列番号２３０に示される配列との、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きい同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の例では、ストーク領域およびストーク伸長領域は、配列番号２３０〜２３３に示される配列のうちのいずれか１つとの、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きい同一性を有するポリヌクレオチド配列を一緒に含むことができる。
膜貫通ドメイン
複数の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲストークドメインの細胞外ドメインへと融合させた膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、ＣＡＲ中のドメインの１つと自然に会合する膜貫通ドメインが使用される。複数の実施形態では、膜貫通ドメインは、膜を貫通する疎水性アルファヘリックスである。
膜貫通ドメインは、天然または合成の供給源のいずれかに由来しうる。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合性タンパク質または膜貫通タンパク質に由来しうる。本発明における特定の使用の膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８アルファ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４に由来しうる（すなわち、その少なくても膜貫通領域を含みうる）。代替的に、膜貫通ドメインは、合成の場合もあり、その場合、それは、主に、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含みうる。複数の実施形態では、合成の膜貫通ドメインの各末端では、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが見出される。任意選択で、複数の実施形態では、２〜１０アミノ酸の間の長さである、短いオリゴヌクレオチドリンカーまたはポリペプチドリンカーは、ＣＡＲの膜貫通ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成しうる。複数の実施形態では、リンカーは、グリシン−セリンリンカーである。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲにおける膜貫通ドメインは、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインである。複数の実施態様では、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインは、配列番号８７のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲにおける膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。複数の実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号８８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。
細胞質ドメイン（共刺激ドメインおよびシグナル伝達ドメイン）
本明細書に記載されるＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインとしてまた公知の細胞内ドメインは、ＣＡＲを入れた免疫細胞の正常エフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化の一因となる。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特化機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞傷害活性の場合もあり、サイトカインの分泌を含むヘルパー活性の場合もある。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特化機能を実施するように、細胞を方向付ける、タンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメインの全体が用いられうるが、多くの場合、鎖全体を使用することは必要でない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分を使用し、エフェクター機能シグナルを伝達する限りにおいて、このような切断部分を、無傷鎖の代わりに使用することができる。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語とは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの、任意の切断部分を含むことが意図される。
本明細書に記載されるＣＡＲにおいて使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例は、抗原受容体結合後にシグナル伝達を開始するために協調して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変異体、ならびに同じ機能能力を有する任意の合成配列を含むことができる。
ＴＣＲのみを介して産生されるシグナルは、一般に、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次または共刺激シグナルも必要とされる。したがって、Ｔ細胞の活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列、すなわちＴＣＲを介して抗原依存性の一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）と、二次または共刺激シグナルを提供するために抗原非依存的に作用するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）によって仲介されうる。
一次細胞質シグナル伝達配列は、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激的にまたは抑制的に調節する。刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）またはＩＴＡＭとして公知であるシグナル伝達モチーフを含有することができる。
本発明において特に使用されるＩＴＡＭ含有の一次細胞質シグナル伝達配列の例には、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが含まれる。複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ中の細胞質シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータに由来する細胞質シグナル伝達配列を含む。
複数の実施形態では、ＣＡＲの細胞質ドメインは、それ自体で、または本明細書に記載されるＣＡＲの文脈で有用な任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わせて、ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含むようにデザインすることができる。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激性シグナル伝達領域を含むことができる。共刺激シグナル伝達ドメイン領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。共刺激分子は、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子であり、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要である。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、およびＣＤ８３などと特異的に結合するリガンドなどが含まれる。複数の実施形態では、共刺激分子、例えば、ＣＤ２８および４−１ＢＢまたはＣＤ２８およびＯＸ４０を一緒に使用することができる。したがって、本発明は、主に共刺激シグナル伝達エレメントとして４−１ＢＢおよびＣＤ２８を用いて例示されるが、他の共刺激エレメントも、本発明の範囲内にある。
本明細書に記載されるＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムにまたは特定の順序で互いに連結することができる。任意選択で、２〜１０アミノ酸の長さの短いオリゴまたはポリペプチドリンカーは、連結を形成することができる。グリシン−セリンダブレットは、特に適したリンカーを提供する。
一実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメイン、および４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む。さらに別の実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメイン、およびＣＤ２８および４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲの細胞質ドメインは、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインを含み、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号８９のポリペプチド配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含み、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号９３の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。
一実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインを含むようにデザインされ、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、配列番号９０のポリペプチド配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９３％、９３％、９４％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含み、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号９３のポリペプチド配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９３％、９３％、９４％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。
一実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲの細胞質ドメインは、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１０（ＤＡＰ１０）のシグナル伝達ドメインを含むようにデザインされ、ＤＡＰ１０のシグナル伝達ドメインは、配列番号９１のポリペプチド配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。
一実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲの細胞質ドメインは、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１２（ＤＡＰ１２）のシグナル伝達ドメインを含むようにデザインされ、ＤＡＰ１０のシグナル伝達ドメインは、配列番号９２のポリペプチド配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。
一実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲの細胞質ドメインは、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインを含み、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号８９に記載されるアミノ酸配列を含み、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号９３に記載されるアミノ酸配列を含む。
さらなる遺伝子エレメント
細胞治療は、ヒト疾患の処置のために極めて有望であるが、細胞自体またはそれらのトランス遺伝子産物に由来する著明な毒性は、臨床的探索を妨げている。本明細書で記載される、複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞であって、哺乳動物対象、例えば、ヒトへと輸注された細胞は、それらの使用から毒性が生じる場合は、このような免疫エフェクター細胞の効果を調節するために、除去させることができる。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で記載される治療用ＲＯＲ−１特異的キメラ抗原受容体に加えて、第２の遺伝子もまた、本明細書で記載される、操作免疫エフェクター細胞へと導入される。一部の実施形態では、第２の遺伝子は「細胞タグ」である。一部の実施形態では、細胞タグは「キルスイッチ」である。一部の実施形態では、第２の遺伝子は、有効的に、ＲＯＲ−１ ＣＡＲまたはＲＯＲ−１ ＣＡＲ／ｍｂＩＬ−１５を含有する細胞の枯渇を可能とする「キルスイッチ」である。ある特定の実施形態では、「キルスイッチ」とは、ＨＥＲ１もしくはＣＤ２０の少なくとも抗体結合エピトープ、またはその機能的断片と、任意選択で、シグナルポリペプチド配列またはその断片とを含む、ＨＥＲ１ポリペプチドまたはＣＤ２０ポリペプチドを含むＨＥＲ１タグまたはＣＤ２０タグである。
ある特定の実施形態では、第２の遺伝子は、上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１）であるＨＥＲ１タグ、またはその断片もしくは変異体である。複数の実施形態では、第２の遺伝子は、切断型ヒト上皮増殖因子受容体１（例えば、ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ１）であるＨＥＲ１タグである。場合によって、第２の遺伝子は、切断型ヒト上皮増殖因子受容体１の変異体である。複数の実施形態では、ＨＥＲ１、ＨＥＲ１ｔおよびＨＥＲ１ｔ１のうちの少なくとも１つは、ＦＤＡが承認したセツキシマブ、またはＨＥＲ１、ＨＥＲ１ｔおよび／またはＨＥＲ１ｔ１を認識する任意の抗体を投与することによって、輸注されたＣＡＲ−Ｔ細胞の枯渇を可能にすることにより安全なメカニズムを提供する。複数の実施形態では、ＨＥＲ１ｔ遺伝子は、配列番号２５６の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。複数の実施形態では、ＨＥＲ１ｔ１遺伝子は、配列番号２５７の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。切断型ＨＥＲ１配列、例えば、ＨＥＲ１ｔおよびＨＥＲ１ｔ１は、セツキシマブの受容体への結合を無傷に保ちながら、ＥＧＦリガンド結合、ＥＧＦＲのホモおよびヘテロ二量体化、ならびにＥＧＦＲ媒介シグナル伝達の可能性を消失する（Ferguson, K., 2008. A structure-based view of Epidermal Growth Factor Receptor regulation. Annu Rev Biophys, Volume 37, pp. 353-373）。
一部の実施形態では、ＨＥＲ１ｔタグは、配列番号１０９の配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する。一部の実施形態では、ＨＥＲ１ｔ１タグは、配列番号１１０の配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する。
さらなる実施形態では、本発明の治療用ＲＯＲ−１特異的キメラ抗原受容体に加えて、導入された第２の遺伝子は、ＣＤ２０タグである。場合によって、ＣＤ２０タグは、全長のＣＤ２０ポリペプチド、または切断型ＣＤ２０ポリペプチド（ＣＤ２０ｔ−１）である。場合によっては、ＣＤ２０タグ、例えば、ＣＤ２０またはＣＤ２０ｔ−１はまた、ＦＤＡが認可したリツキシマブ療法を投与することによって、輸注されたＣＡＲ−Ｔ細胞の枯渇を可能にすることにより安全なメカニズムを提供する。ある特定の実施形態では、ＣＤ２０タグは、配列番号１１１の配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ２０タグは、ＣＤ２０ｔ−１タグであり、配列番号１１２の配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する。一部の実施形態では、ＣＤ２０タグは、配列番号２５８の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むＣＤ２０遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、ＣＤ２０タグは、配列番号２５９の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むＣＤ２０ｔ−１遺伝子によってコードされる。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲを含むＣＡＲベクターは、配列番号２５８の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する核酸配列を含む全長ＣＤ２０タグをさらに含む。
複数の実施形態では、キルタグ、例えば、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ−１、ＣＤ２０またはＣＤ２０ｔ−１タグをコードする遺伝子は、自己切断ペプチド、例えば、トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス（Ｔ２Ａ）ペプチドを有するインフレームを介して、３’末端でＲＯＲ−１ ＣＡＲへと遺伝子融合されるが、これに限定されない。複数の実施形態では、Ｔ２Ａペプチドは、配列番号１１６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
複数の実施形態では、キルタグ遺伝子は、ＲＯＲ−１ ＣＡＲ遺伝子とインフレームでレンチウイルスプラスミド骨格にクローニングされる。他の実施形態では、キルタグを別個のレンチウイルスベクターにクローニングする。他の実施形態では、両方の遺伝子をＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンベクターにクローニングする。さらに他の実施形態では、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ−１、ＣＤ２０またはＣＤ２０ｔ−１などのキルタグは、別個のＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンベクターにクローニングされる。ある特定の実施形態では、キルタグは、シグナルペプチド、例えば、ＧＭ−ＣＳＦＲａシグナルペプチドを有し、ＧＭ−ＣＳＦＲａシグナルペプチドは、配列番号９４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号９５の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性の配列を有するＩｇＫである。
一実施形態では、シグナルペプチドは、マウスＩｇ ＶＨ領域３（配列番号１０１）、アズロシジン（配列番号１０３）、ＩＧＨＶ３−２３（配列番号１０６）、ＩＧＫＶ１−Ｄ３３（ＨｕＬ１）（配列番号１０７）またはＩＧＫＶ１−Ｄ３３（Ｌ１４Ｆ）（ＨｕＨ７）（配列番号１０８）である。
本明細書に記載されるＣＡＲおよびキルタグをコードする例示的な遺伝子発現カセットを図１および図２に示す。
例示的なＣＡＲオープンリーディングフレーム
本明細書に記載される方法および組成物によって包含される例示的なＣＡＲおよびヒトＲＯＲ−１受容体オープンリーディングフレームは、表１に示される：
Figure 2021530217
複数の実施形態では、本明細書では、ＣＡＲをコードする単離された核酸が提供され、ＣＡＲは、配列番号３〜１４または配列番号７５〜８２のアミノ酸との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。
複数の実施形態では、ＣＡＲ ｈＲＯＲ１（ＶＨ−ＶＬ）＿１４．ＣＤ８ａ（３ｘ）．ＣＤ２８ｚは、配列番号１７のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿５）、および配列番号１８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿５）を含む抗原結合部分を含む
複数の実施形態では、ＣＡＲ ｈＲＯＲ１（ＶＬ−ＶＨ）＿０５．ＣＤ８ａ（３ｘ）．ＣＤ２８ｚは、配列番号３５のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１４）、および配列番号３６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１４）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、ＣＡＲ ｈＲＯＲ１（ＶＨ−ＶＬ）＿１４−３．ＣＤ８ａ（３ｘ）．ＣＤ２８ｚは、配列番号４１のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１４−３）、および配列番号４２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１４−３）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、ＣＡＲ ｈＲＯＲ１（ＶＨ−ＶＬ）＿１４−４．ＣＤ８ａ（３ｘ）．ＣＤ２８ｚは、配列番号４３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１４−４）、および配列番号４４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１４−４）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、ＣＡＲ ｈＲＯＲ１（ＶＨ＿５−ＶＬ＿１４）．ＣＤ８ａ（３ｘ）．ＣＤ２８ｚは、配列番号１７のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿５）、および配列番号３６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１４）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、ＣＡＲ ｈＲＯＲ１（ＶＨ＿５−ＶＬ＿１６）．ＣＤ８ａ（３ｘ）．ＣＤ２８ｚは、配列番号１７のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿０５）、および配列番号５０のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１６）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、ＣＡＲ ｈＲＯＲ１（ＶＨ＿１８−ＶＬ＿０４）．ＣＤ８ａ（３ｘ）．ＣＤ２８ｚは、配列番号５３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１８）、および配列番号１６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿０４）を含む抗原結合部分を含む。
複数の実施形態では、ＣＡＲ ｈＲＯＲ１（ＶＨ＿１８−ＶＬ＿１４）．ＣＤ８ａ（３ｘ）．ＣＤ２８ｚは、配列番号５３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＨ＿１８）、および配列番号３６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチド（ｈＲＯＲ１ ＶＬ＿１４）を含む抗原結合部分を含む。
表１における実施形態の各々において、ＣＡＲのシグナルペプチドは、マウスＩｇ ＶＨ領域３（配列番号１０１）、アズロシジン（配列番号１０３）、ＩＧＨＶ３−２３（配列番号１０６）、ＩＧＫＶ１−Ｄ３３（ＨｕＬ１）（配列番号１０７）またはＩＧＫＶ１−Ｄ３３（Ｌ１４Ｆ）（ＨｕＨ７）（配列番号１０８）のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含むことができる。
表１における「ＣＤ８ａ」を伴う実施形態の各々において、ＣＡＲの膜貫通領域は、配列番号８７のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含むＣＤ８アルファ膜貫通ドメインを含み、スペーサーは、配列番号８３〜８６に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含むＣＤ８ａである。
表１における「ＣＤ２８ｍ」を伴う実施形態の各々において、ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号９０のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ２８を含む。
表１における「Ｔ２Ａ」を伴う実施形態の各々において、ＣＡＲ ＯＲＦは、単一ベクターからの複数の遺伝子産物の産生を可能にする自己切断型トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス（Ｔ２Ａ）ペプチドを含む。複数の実施形態では、Ｔ２Ａペプチドは、配列番号１１６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
表１における「ＨＥＲ１ｔ」を伴う実施形態では、ＣＡＲ ＯＲＦは、切断型ヒト上皮増殖因子受容体１（ＨＥＲ１ｔ）を含み、これは、ＦＤＡが承認したセツキシマブ療法を投与することによって、輸注されたＣＡＲ−Ｔ細胞の枯渇を可能にすることにより安全なメカニズムを提供する。本明細書に記載されるＨＥＲ１ｔ遺伝子は、配列番号１０９のアミノ酸配列の、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含むことができる。表１に別段の記載がない限り、ＨＥＲ１ｔタグは、ＧＭ−ＣＳＦＲａシグナルペプチド（「ＧＭ−ＣＳＦＲｓｐ」）（配列番号９４）を有する。一実施形態では、シグナルペプチドは、マウスＩｇ ＶＨ領域３（配列番号１０１）、アズロシジン（配列番号１０３）、ＩＧＨＶ３−２３（配列番号１０６）、ＩＧＫＶ１−Ｄ３３（ＨｕＬ１）（配列番号１０７）またはＩＧＫＶ１−Ｄ３３（Ｌ１４Ｆ）（ＨｕＨ７）（配列番号１０８）である。ある特定の実施形態では、ＨＥＲ１ｔは、別のタグ、例えば、ＨＥＲ１ｔ−１で置換されうる。本明細書に記載されるＨＥＲ１ｔ−１遺伝子は、配列番号１１０のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含むことができる。表１における「ＩｇＫｓｐ」を伴う実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号９５のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性のアミノ酸配列を有するＩｇＫである。
表１における「４−１ＢＢ」を伴う実施形態では、ＣＡＲ ＯＲＦは、配列番号８９のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する共刺激分子を含む。
表１における「ＦＬ ＣＤ２０」を伴う実施形態では、ＣＡＲ ＯＲＦは、配列番号１１１のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む全長ＣＤ２０タグを含む。ＣＤ２０は、ＦＤＡが承認したリツキシマブ療法を実施することによって、輸注されたＣＡＲ−Ｔ細胞の枯渇を可能にすることにより安全なメカニズムを提供する。他の実施形態では、ＦＬ ＣＤ２０は、配列番号１１２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含むＣＤ２０ｔ−１で置換することができる。
表１におけるある特定の実施形態では、ＣＡＲ ＯＲＦは、遺伝子転写のための誘導性プロモーターの制御下にありうる。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチリガンド誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなどの、低分子リガンド誘導性２ポリペプチドエクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。一部の実施形態では、ＣＡＲ ＯＲＦおよび遺伝子スイッチ構成要素は、図１Ａ−１Ｅおよび図２Ａ−２Ｅに示されるように構成することができる。
サイトカイン
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、サイトカインを含み、これに限定されないが、１または複数のさらなる治療剤とともに対象に投与される。場合によって、サイトカインは、少なくとも１つのケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、またはそれらの変異体もしくは組合せを含む。場合によって、サイトカインは、インターロイキンである。場合によって、インターロイキンは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ならびにそれらの機能的変異体および断片のうちの少なくとも１つである。一部の実施形態では、サイトカインは、膜結合型の場合もあり、または分泌型の場合もある。複数の実施形態では、サイトカインは、可溶性ＩＬ−１５、可溶性ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα複合体（例えば、ＡＬＴ−８０３）である。ある特定の場合には、インターロイキンは、膜結合型ＩＬ−１５（ｍｂＩＬ−１５）またはＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαの融合体を含むことができる。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、本明細書に記載される改変免疫エフェクター細胞と共発現されうる膜結合型キメラＩＬ−１５である。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、全長ＩＬ−１５Ｒα、またはこれらの機能的な断片もしくは変異体とインフレームで融合させた、全長ＩＬ−１５（例えば、天然ＩＬ−１５ポリペプチド）、またはこれらの断片もしくは変異体を含む。場合によって、ＩＬ−１５を、ＩＬ−１５Ｒαへと、リンカーを介して、間接的に連結する。場合によって、ｍｂＩＬ−１５は、Hurton et al., “Tethered IL-15 augments antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T cells,” PNAS 2016において記載されている通りである。場合によって、サイトカインは、ＣＡＲと同じ免疫エフェクター細胞において発現される
さらなる実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、膜結合型ＩＬ−１５（「ｍＩＬ−１５またはｍｂＩＬ−１５」）を発現する。本発明の態様では、ｍｂＩＬ−１５は、ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαとの間の融合タンパク質を含む。さらなる実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、配列番号１１３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の場合には、ＣＡＲおよびサイトカインは、別々のベクターで発現する。特定の場合には、ベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンでありうる。
一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、本明細書に記載されるように、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ−１ｔ−１、ＣＤ２０ｔ−１またはＣＤ２０などの細胞タグとともに発現される。ｍｂＩＬ−１５は、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ−１ｔ−１、ＣＤ２０ｔ−１またはＣＤ２０とインフレームで発現されうる。
一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、遺伝子転写のための誘導性プロモーターの制御下にありうる。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチリガンド誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなどの、低分子リガンド誘導性２ポリペプチドエクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。
別の態様では、インターロイキンは、ＩＬ−１２を含みうる。一部の実施形態では、ＩＬ−１２は、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）、プロテアーゼ感受性ＩＬ−１２、不安定化ＩＬ−１２、膜結合型ＩＬ−１２、挿入型ＩＬ−１２である。いくつかの例では、ＩＬ−１２変異体は、国際公開第２０１５／０９５２４９号パンフレット、国際公開第２０１６／０４８９０３号パンフレット、国際公開第２０１７／０６２９５３号パンフレットに記載されている通りであり、これらの全ては、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
一部の実施形態では、上述のサイトカインは、遺伝子転写のための誘導性プロモーターの制御下にありうる。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチリガンド誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなどの、低分子リガンド誘導性２ポリペプチドエクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。
遺伝子スイッチ
本明細書では、遺伝子スイッチポリペプチド、リガンド誘導性遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを組み込む方法および系が提示される。「遺伝子スイッチ（gene switch）」という用語は、プロモーターと関連する応答エレメントの組合せを指し、例えば、１または複数のリガンドの存在下で、応答エレメントおよびプロモーターを組み込んだ遺伝子の発現をモジュレートする、エクジソン受容体（ＥｃＲ）ベースの系を指す。緊密に調節された誘導性遺伝子発現系または遺伝子スイッチは、遺伝子治療、細胞内の、大スケールのタンパク質の作製、細胞ベースのハイスループットのスクリーニングアッセイ、機能的なゲノミクス、ならびにトランスジェニック植物およびトランスジェニック動物における形質の調節など、多様な適用に有用である。このような誘導性遺伝子発現系は、リガンド誘導性異種遺伝子発現系を含みうる。
ＥｃＲベースの遺伝子スイッチの初期形は、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）ＥｃＲ（ＤｍＥｃＲ）ポリペプチドおよびマウス（Mus musculus）ＲＸＲ（ＭｍＲＸＲ）ポリペプチドを使用し、これらの受容体が、ステロイドであるポナステロンＡの存在下で、哺乳動物細胞系およびトランスジェニックマウスにおいて、レポーター遺伝子をトランス活性化させることを示した（Christopherson et al., 1992；No et al., 1996）。その後、Suhr et al., 1998は、非ステロイド系のエクジソンアゴニストであるテブフェノジドが、外因性ヘテロ二量体パートナーの非存在下で、カイコ（Bombyx mori）ＥｃＲ（ＢｍＥｃＲ）を介して、哺乳動物細胞内のレポーター遺伝子の、高レベルのトランス活性化を誘導することを示した。
ＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９７／０５３３０号明細書（国際公開第９７／３８１１７号パンフレット）およびＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９９／０８３８１号明細書（国際公開第９９／５８１５５号パンフレット）は、外因性遺伝子の発現をモジュレートするための方法であって、外因性遺伝子およびエクジソン応答エレメントを含むＤＮＡ構築物が、それに対するリガンドの存在下で、かつ、任意選択で、サイレントパートナーとして作用することが可能な受容体の存在下で、エクジソン応答エレメントに結合して、遺伝子発現を誘導するエクジソン受容体を含む、第２のＤＮＡ構築物により活性化する方法について開示している。この例では、エクジソン受容体を、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）から単離した。典型的に、このような系は、最適の活性化をもたらすために、サイレントパートナー、好ましくはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の存在を必要とする。哺乳動物細胞内では、昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）は、哺乳動物レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）と、ヘテロ二量体化し、これにより、標的遺伝子または異種遺伝子の発現を、リガンド依存的に調節するのに使用することが可能である。ＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９８／１４２１５号明細書（国際公開第９９／０２６８３号パンフレット）は、カイコガであるカイコ（Bombyx mori）から単離されたエクジソン受容体が、外因性の二量体パートナーを必要とせずに、哺乳動物系内で機能的であることについて開示している。
米国特許第６，２６５，１７３号明細書は、受容体のステロイド／甲状腺スーパーファミリーの多様なメンバーを、遺伝子発現系における使用のための、ＵＳＰの、少なくとも二量体化ドメインを含むキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）ウルトラスピラクル受容体（ＵＳＰ）またはこの断片と組み合わせうることについて開示している。米国特許第５，８８０，３３３号明細書は、植物において使用された、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）のＥｃＲおよびウルトラスピラクル（ＵＳＰ）によるヘテロ二量体系であって、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合性ドメインが、２つの異なるハイブリッドタンパク質上に位置する、ヘテロ二量体系について開示している。これらの場合の各々では、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合性ドメイン（ＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９８／１４２１５号明細書における通りに、天然のＥｃＲとして、またはＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９７／０５３３０号明細書における通りに、修飾ＥｃＲとして）を、単一の分子へと組み込み、ＵＳＰまたはＲＸＲである、他のヘテロ二量体パートナーを、それらの天然状態において使用した。
ＰＣＴ国際特許出願／米国出願第０１／０９０５号明細書は、トランス活性化ドメインと、ＤＮＡ結合ドメインとを２つの異なるタンパク質上に置くことにより互いから隔てた、エクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系が、リガンドの非存在下で、バックグラウンド活性の大幅な低減を結果としてもたらし、リガンドの存在下で、バックグラウンドを上回る活性の著明な増大を結果としてもたらすことについて開示している。この２ハイブリッド系は、ＰＣＴ出願／米国出願第９７／０５３３０号明細書およびＰＣＴ出願／米国出願第９８／１４２１５号明細書の出願において開示されている、２つの系と比較して、著明に改善された誘導性遺伝子発現モジュレーション系である。２ハイブリッド系は、ＤＮＡ結合性ドメインが、遺伝子上のＤＮＡ結合性部位に結合すると、トランス活性化ドメインが、プロモーターを、より効果的に活性化させるように、相互作用タンパク質の対が、転写活性化ドメインを、ＤＮＡ結合性ドメインに対して、より好適な位置に置く能力を利用すると考えられる（例えば、米国特許第５，２８３，１７３号明細書を参照されたい）。２ハイブリッド遺伝子発現系は、核内受容体ポリペプチドへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインをコードする、第１の遺伝子発現カセット、および異なる核内受容体ポリペプチドへと融合させたトランス活性化ドメインをコードする、第２の遺伝子発現カセットである、２つの遺伝子発現カセットを含む。リガンドの存在下では、第１のポリペプチドの、第２のポリペプチドとの相互作用を促進するコンフォメーション変化が誘導され、これにより、ＤＮＡ結合性ドメインと、トランス活性化ドメインとの二量体化が結果としてもたらされると考えられる。ＤＮＡ結合性ドメインおよびトランス活性化ドメインは、２つの異なる分子上に存在するので、リガンドの非存在下では、バックグラウンド活性が、大幅に低減される。
２ハイブリッド系のある特定の修飾はまた、ステロイド性リガンド、例えば、ポナステロンＡ（「ＰｏｎＡ」）またはムリステロンＡ（「ＭｕｒＡ」）と比較した場合に、非ステロイド性リガンド、例えば、ジアシルヒドラジンに対する感受性の改善ももたらす。すなわち、ステロイドと比較した場合、非ステロイド性リガンドは、低リガンド濃度で、より大きな遺伝子転写活性をもたらした。さらに、２ハイブリッド系は、非修飾ＲＸＲを切り替えパートナーとして使用する場合に生じうる、ＲＸＲの過剰発現に起因する一部の副作用も回避する。好ましい２ハイブリッド系では、ＥｃＲまたはＲＸＲの、天然のＤＮＡ結合性ドメインおよびトランス活性化ドメインは除去され、結果として、これらのハイブリッド分子は、細胞内に存在する、他のステロイドホルモン受容体との相互作用の可能性を低下させ、これにより、副作用の低減を結果としてもたらす。
エクジソン受容体（ＥｃＲ）とは、核内受容体スーパーファミリーのメンバーであり、サブファミリー１、群Ｈ（本明細書では、「群Ｈ核内受容体」と称する）へと分類される。各群のメンバーは、Ｅ（リガンド結合）ドメイン内で、４０〜６０％のアミノ酸同一性を共有する（Laudet et al., A Unified Nomenclature System for the Nuclear Receptor Subfamily, 1999; Cell 97: 161-163）。エクジソン受容体に加えて、この核内受容体サブファミリー１、群Ｈの他のメンバーは、ユビキタス受容体（ＵＲ）、オーファン受容体１（ＯＲ−１）、ステロイドホルモン核内受容体１（ＮＥＲ−１）、ＲＸＲ相互作用性タンパク質１５（ＲＩＰ−１５）、肝臓ｘ受容体β（ＬＸＲβ）、ステロイドホルモン受容体様タンパク質（ＲＬＤ−１）、肝臓ｘ受容体（ＬＸＲ）、肝臓ｘ受容体α（ＬＸＲα）、ファルネソイドｘ受容体（ＦＸＲ）、受容体相互作用性タンパク質１４（ＲＩＰ−１４）、およびファルネソール受容体（ＨＲＲ−１）を含む。
場合によって、誘導性プロモーター（「ＩＰ」）は、Ｉｎｔｒｅｘｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。場合によって、遺伝子スイッチは、それらの各々が、参照によりその全体において組み込まれる、ＰＣＴ／米国出願第２００１／００９０５０号明細書（国際公開第２００１／０７０８１６号パンフレット）；米国特許第７，０９１，０３８号明細書；同第７，７７６，５８７号明細書；同第７，８０７，４１７号明細書；同第８，２０２，７１８号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００１／０３０６０８号明細書（国際公開第２００２／０２９０７５号パンフレット）；米国特許第８，１０５，８２５号明細書；同第８，１６８，４２６号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５２３５号明細書（国際公開第２００２／０６６６１３号パンフレット）；米国特許出願公開第１０／４６８，２００号明細書（米国公開第２０１２０１６７２３９号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５７０６号明細書（国際公開第２００２／０６６６１４号パンフレット）；米国特許第７，５３１，３２６号明細書；同第８，２３６，５５６号明細書；同第８，５９８，４０９号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５０９０号明細書（国際公開第２００２／０６６６１２号パンフレット）；米国特許第８，７１５，９５９号明細書（米国公開第２００６０１００４１６号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５２３４号明細書（国際公開第２００３／０２７２６６号パンフレット）；米国特許第７，６０１，５０８号明細書；同第７，８２９，６７６号明細書；同第７，９１９，２６９号明細書；同第８，０３０，０６７号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５７０８号明細書（国際公開第２００２／０６６６１５号パンフレット）；米国特許出願公開第１０／４６８，１９２号明細書（米国公開第２０１１０２１２５２８号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５０２６号明細書（国際公開第２００３／０２７２８９号パンフレット）；米国特許第７，５６３，８７９号明細書；同第８，０２１，８７８号明細書；同第８，４９７，０９３号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００５／０１５０８９号明細書（国際公開第２００５／１０８６１７号パンフレット）；米国特許第７，９３５，５１０号明細書；同第８，０７６，４５４号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００８／０１１２７０号明細書（国際公開第２００９／０４５３７０号パンフレット）；米国特許出願公開第１２／２４１，０１８号明細書（米国公開第２００９０１３６４６５号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００８／０１１５６３号明細書（国際公開第２００９／０４８５６０号パンフレット）；米国特許出願公開第１２／２４７，７３８号明細書（米国公開第２００９０１２３４４１号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００９／００５５１０号明細書（国際公開第２０１０／０４２１８９号パンフレット）；米国特許出願公開第１３／１２３，１２９号明細書（米国公開第２０１１０２６８７６６号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２０１１／０２９６８２号明細書（国際公開第２０１１／１１９７７３号パンフレット）；米国特許出願公開第１３／６３６，４７３号明細書（米国公開第２０１３０１９５８００号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２０１２／０２７５１５号明細書（国際公開第２０１２／１２２０２５号パンフレット）；および米国特許第９，４０２，９１９号明細書において記載されている系のうちのいずれかの、エクジソンベースの受容体による構成要素から選択しうるが、これらに限定されない。
本明細書に開示される遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞におけるＣＡＲおよび／またはサイトカインの発現をモジュレートするためのシステムが提供される。さらに、遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供され、遺伝子スイッチポリペプチドは、（ａ）核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む第１の遺伝子スイッチポリペプチド；および（ｂ）核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、第１の遺伝子スイッチポリペプチドおよび第２の遺伝子スイッチポリペプチドは、リンカーによって接続されている。一部の実施形態では、リンカーは、２Ａ、ＧＳＧ−２Ａ、ＧＳＧリンカー（配列番号１２９）、ＳＧＳＧリンカー（配列番号１３０）、それらのフューリンリンク変異体および誘導体からなる群から選択される切断型またはリボソームスキッピングリンカー配列である。ある特定の実施形態では、２Ａリンカーは、ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｆ２Ａリンカー、またはＥ２Ａリンカーである。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、ＧＡＬ４（ＧＡＬ４ ＤＢＤ）、ＬｅｘＡ ＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、細菌ＬａｃＺ ＤＢＤ、および酵母ＤＢＤのうちの少なくとも１つを含む。場合によっては、トランス活性化ドメインは、ＶＰ１６トランス活性化ドメイン、およびＢ４２酸性活性化因子トランス活性化ドメインのうちの少なくとも１つを含む。他の場合には、核受容体リガンド結合ドメインは、エクジソン受容体（ＥｃＲ）、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用タンパク質−１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用タンパク質１４、およびファメソール受容体のうちの少なくとも１つを含む。一部の実施態様では、核受容体リガンド結合ドメインは、配列番号１３５および１３６のエクジソン受容体ポリペプチド配列に由来する。
さらに別の実施形態では、第１の遺伝子スイッチポリペプチドは、ＥｃＲ核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたＧＡＬ４ ＤＢＤを含み、第２の遺伝子スイッチポリペプチドは、レチノイド受容体Ｘ（ＲＸＲ）核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたＶＰ１６トランス活性化ドメインを含む。場合によって、第１の遺伝子スイッチポリペプチドおよび第２の遺伝子スイッチポリペプチドは、リンカーによって接続され、リンカーは、２Ａ、ＧＳＧ−２Ａ、ＧＳＧリンカー（配列番号１２９）、ＳＧＳＧリンカー（配列番号１３０）、フューリンリンク変異体およびそれらの誘導体からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされる２またはこれを超えるポリペプチドは、リンカーポリペプチドをコードする介在配列によって分離することができる。ある特定の場合には、リンカー、易切断性リンカーである。一部の実施形態では、目的のポリペプチドは、易切断性リンカーポリペプチドによって連結された融合タンパク質として発現される。ある特定の実施形態では、易切断性リンカーポリペプチドは、Ｆ／Ｔ２Ａ、Ｔ２Ａ、ｐ２Ａ、２Ａ、ＧＳＧ−ｐ２Ａ、ＧＳＧリンカー（配列番号１２９）、およびフューリンリンク変異体のうちのいずれか１または複数でありうる。ある特定の実施形態では、リンカーポリペプチドは、配列番号１１６〜１３０に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む。
場合によって、ウイルス２Ａ配列を用いることができる。２Ａエレメントは、５〜１００塩基対を有するＩＲＥＳより短くなりうる。場合によって、２Ａ配列は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または１００ヌクレオチドの長さを有しうる。２Ａを連結された遺伝子は、単一のオープンリーディングフレーム内で発現させることができ、「自己切断」は、２ＡポリペプチドＣ末端の、最後の２つのアミノ酸であるＧ−Ｐ間で、共翻訳的に生じることが可能であり、等量の共発現タンパク質をもたらす。
ウイルス２Ａ配列は、約２０アミノ酸でありうる。場合によって、ウイルス２Ａ配列は、コンセンサスモチーフＡｓｐ−Ｖａｌ／Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号２８６）を含有することができる。コンセンサスモチーフ配列は、共翻訳的に作用しうる。例えば、グリシン残基とプロリン残基との、正常なペプチド結合の形成を防止することができ、これは、リボソームスキッピングおよび新生ポリペプチドの切断を結果としてもたらしうる。この効果は、等モルレベルで、複数の遺伝子をもたらしうる。
２Ａペプチドは、単一のオープンリーディングフレーム内の、複数のタンパク質の、その後、リボソームスキッピング機構を介して、個別のポリペプチドへと切断されうる、ポリペプチドへの翻訳を可能としうる（Funston, Kallioinen et al. 2008）。一部の実施形態では、２Ａ配列は、Ｆ／Ｔ２Ａ、Ｔ２Ａ、ｐ２Ａ、２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、およびＢｍＣＰＶ２Ａ、ＢｍＩＦＶ２Ａ、ならびにこれらの任意の組合せを含みうる。
場合によって、ベクターは、ＩＲＥＳ配列および２Ａリンカー配列を含むことができる。他の場合では、２Ａペプチドと連結された複数の遺伝子の発現は、２Ａペプチドの前のスペーサー配列（ＧＳＧ（配列番号１２９））によって容易にされうる。場合によって、構築物は、スペーサー、リンカー、アダプター、プロモーター、またはそれらの組合せを組み合わせることができる。例えば、構築物は、異なる２Ａペプチドを有する、スペーサー（ＳＧＳ（配列番号１３０）またはＧＳＧ（配列番号１２９））およびフューリンリンカー（Ｒ−Ａ−Ｋ−Ｒ（配列番号１２５））切断部位を有することができる。スペーサーは、Ｉ−Ｃｅｕｉでありうる。場合によって、リンカーは、操作することができる。例えば、リンカーは、疎水性などの化学的特徴を含むようにデザインすることができる。場合によって、少なくとも２つのリンカー配列は、同じタンパク質をもたらしうる。他の場合には、複数のリンカーを、ベクター内で使用することができる。例えば、目的の遺伝子は、少なくとも２つのリンカーにより隔てることができる。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドによりコードされる、２つまたはこれを超えるポリペプチドは、リンカーポリペプチドをコードする介在配列により隔てることができる。ある特定の場合には、リンカーは、易切断性リンカーである。一部の実施形態では、目的のポリペプチドは、易切断性介在リンカーポリペプチドにより連結された、融合タンパク質として発現する。ある特定の実施形態では、易切断性リンカーポリペプチドは、配列番号１１９、１２０、１２１、１２５、および１２８に記載される、フューリンリンク、ｆｍｄｖ、ｐ２ａ、ＧＳＧ−ｐ２ａ、および／またはｆｐ２ａのうちのいずれか１つまたは２つでありうる。
一部の実施形態では、リンカーは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドにおいて利用されうる。リンカーは、可撓性リンカー、非可撓性リンカー、ｉｎ ｖｉｖｏ切断型リンカー、またはそれらの任意の組合せでありうる。場合によって、リンカーは、機能的ドメインを、互いに連結する（可撓性および非可撓性リンカーの場合のように）場合もあり、またはｉｎ ｖｉｖｏ切断型リンカーの場合のように、遊離の機能的ドメインをｉｎ ｖｉｖｏにおいて放出する場合もある。
リンカーは、生物学的活性を改善し、発現収量を増加させ、望ましい薬物動態プロファイルを達成することができる。リンカーはまた、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、またはチオエーテル（thioesther）も含みうる。
場合によって、本明細書で記載されるリンカー配列は、可撓性リンカーを含みうる。可撓性リンカーは、接合されるドメインが、ある程度の移動または相互作用を必要とする場合に適用することができる。可撓性リンカーは、小型、非極性（例えば、Ｇｌｙ）、または極性（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）のアミノ酸から構成されうる。可撓性リンカーは、Ｇｌｙ残基およびＳｅｒ残基の連なりから主になる配列（「ＧＳ」リンカー）を有しうる。可撓性リンカーの例は、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎの配列（配列番号２８７）を有しうる。コピー数である「ｎ」を調整することにより、この例示的ＧＳリンカーの長さを最適化して、機能的ドメインの適切な分離を達成することもでき、必要なドメイン間相互作用を維持することもできる。例えば、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは３である）は、配列番号１２７に示されるような（Ｇ４Ｓ）３リンカーである。ＧＳリンカーのほかに、他の可撓性リンカーも、組換え融合タンパク質に用いることができる。場合によって、可撓性リンカーはまた、ＧｌｙおよびＳｅｒなど、小型アミノ酸または極性アミノ酸に富む場合もあるが、可撓性を維持するように、ＴｈｒおよびＡｌａなど、さらなるアミノ酸を含有する場合もある。他の場合には、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの極性アミノ酸を使用して、可溶性を改善することができる。
本明細書に記載されるリンカー配列に含まれる可撓性リンカーは、良好な可撓性および可溶性をもたらすように、ＧｌｙおよびＳｅｒなどの小型または極性アミノ酸に富む場合がある。可撓性リンカーは、ある特定の移動または相互作用が融合タンパク質ドメインに所望される場合に適切な選択でありうる。加えて、可撓性リンカーは、非可撓性構造を有さない場合もあるが、機能的ドメイン間の距離を保持する、受動的リンカーとして用いられる場合もある。可撓性リンカーの長さを調整して、適正なフォールディングを可能とすることもでき、融合タンパク質の最適な生物学的活性を可能とすることもできる。
本明細書に記載されるリンカーは、場合によって、非可撓性リンカーをさらに含むことができる。非可撓性リンカーを利用して、ポリペプチドのドメイン間で一定の距離を維持することができる。非可撓性リンカーの例は、少数を挙げれば、アルファヘリックス形成リンカー、Ｐｒｏに富む配列、（ＸＰ）ｎ、Ｘ−Ｐｒｏ骨格、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２〜５）（配列番号２８８）でありうる。非可撓性リンカーは、場合によって、αヘリックス構造を取ることにより、または複数のＰｒｏ残基を含有することにより、比較的剛直な構造を呈しうる。
本明細書に記載されるリンカーは、場合によって、切断されうる。他の場合には、リンカーは、切断されない。切断されないリンカーは、ｉｎ ｖｉｖｏ過程またはｅｘ ｖｉｖｏ過程を通して１つの分子として作用するように、機能的ドメインを、共有結合的に、一体に接合しうる。リンカーはまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても切断されうる。切断型リンカーは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、遊離の機能的ドメインを放出させるように導入することができる。切断型リンカーは、少数を挙げれば、還元試薬、プロテアーゼの存在により切断することができる。例えば、ジスルフィド結合の還元を利用して、切断型リンカーを作製することができる。ジスルフィドリンカーの場合、グルタチオンなどの、チオールとのジスルフィド交換を介する切断イベントが、切断をもたらしうる。他の場合には、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、組換え融合タンパク質のリンカーの切断はまた、ｉｎ ｖｉｖｏの、病理学的状態（例えば、がんまたは炎症）下、特異的な細胞または組織において発現する場合もあり、ある特定の細胞区画内に拘束される場合もあるプロテアーゼによっても実施されうる。場合によって、切断型リンカーは、切断のターゲティングを可能としうる。例えば、多くのプロテアーゼの特異性は、拘束区画内のリンカーの緩徐な切断をもたらしうる。切断型リンカーはまた、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、またはチオエーテルも含みうる。例えば、ヒドラゾンは、血清中の安定性を付与しうる。他の場合には、ヒドラゾンは、酸性区画内の切断を可能としうる。酸性区画は、最大で７のｐＨを有しうる。リンカーはまた、チオエーテルも含みうる。チオエーテルは、非還元性でありうる。チオエーテルは、細胞内タンパク質分解のためにデザインすることができる。
ある特定の実施形態では、ｆｍｄｖリンカーポリペプチドは、配列番号１２６と少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一でありうる配列を含む。ある特定の実施形態では、ｆｍｄｖリンカーポリペプチドは、２またはこれを超える融合タンパク質を連結する単一のベクター中にコードされる１または複数のリンカーである。ある特定の場合には、ｆｍｄｖリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）核酸配列によってコードされうる。場合によって、ｆｍｄｖをコードするＯＲＦは、配列番号２７２の配列を含むか、またはそれからなる。ある特定の実施形態では、ｆｍｄｖをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２７２と少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
ある特定の場合には、リンカーポリペプチドは「ｐ２ａ」リンカーでありうる。ある特定の実施形態では、ｐ２ａポリペプチドは、配列番号１１９と少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一でありうる配列を含むことができる。ある特定の実施形態では、ｐ２ａリンカーポリペプチドは、２つまたはこれを超える融合タンパク質を連結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの１または複数でありうる。場合によって、ｐ２ａリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の核酸配列によりコードされうる。ある特定の場合には、ｐ２ａをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２６６と少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一でありうるか、またはほぼそうでありうる。
場合によって、リンカーポリペプチドは「ＧＳＧ−ｐ２ａ」リンカーでありうる。ある特定の実施形態では、ＧＳＧ−ｐ２ａリンカーポリペプチドは、配列番号１２０と少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一でありうる配列を含むことができる。ある特定の実施形態では、ＧＳＧ−ｐ２ａリンカーポリペプチドは、２つまたはこれを超える融合タンパク質を連結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの１または複数でありうる。場合によって、ＧＳＧ−ｐ２ａリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の核酸配列によりコードされうる。ＧＳＧ ｐ２ａをコードするＯＲＦは、配列番号２６７の配列を含むことができる。場合によって、ＧＳＧ−ｐ２ａをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２６７と少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一でありうるか、またはほぼそうでありうる。
リンカーポリペプチドは、本明細書に提供される「ｆｐ２ａ」リンカーでありうる。ある特定の実施形態では、ｆｐ２ａリンカーポリペプチドは、配列番号１２１と少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一でありうる配列を含むことができる。ある特定の場合には、ｆｐ２ａリンカーポリペプチドは、２つまたはこれを超える融合タンパク質を連結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの１または複数でありうる。場合によって、ｆｐ２ａリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の核酸配列によりコードされうる。ある特定の実施形態では、ｆｐ２ａリンカーをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２６８と、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるか、または少なくともほぼこれらの比率同一でありうる。
場合によって、リンカーは、操作することができる。例えば、リンカーは、疎水性などの化学的特徴を含むようにデザインすることができる。場合によって、少なくとも２つのリンカー配列は、同じタンパク質をもたらしうる。配列は、配列番号１１６から配列番号１３０までの配列と約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一でありうるか、またはほぼそうでありうる。他の場合には、複数のリンカーは、ベクターにおいて使用することができる。例えば、目的の遺伝子、および本明細書に記載される１または複数の遺伝子スイッチポリペプチド配列は、少なくとも２つのリンカーによって分離することができる。場合によって、遺伝子は、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大で１０個のリンカーによって分離することができる。
リンカーは、操作リンカーでありうる。リンカーをデザインする方法は、コンピューター計算によるものでありうる。場合によって、コンピューター計算による方法は、グラフ法を含みうる。コンピューター計算法を使用して、データベースから導出された三次元ペプチド構造のライブラリーから、適切なペプチドを検索することができる。例えば、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）を使用して、リンカーの選択されたアミノ酸の間の間隔の距離を測ることができる。
一部の実施形態では、フューリンポリペプチドおよび２Ａポリペプチドを含むポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドであり、フューリンポリペプチドおよび２Ａポリペプチドは、少なくとも３つの疎水性アミノ酸を含むポリペプチドリンカーによって接続されている。場合によって、少なくとも３つの疎水性アミノ酸は、グリシン（Ｇｌｙ）（Ｇ）、アラニン（Ａｌａ）（Ａ）、バリン（Ｖａｌ）（Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ）（Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）（Ｉ）、プロリン（Ｐｒｏ）（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）（Ｆ）、メチオニン（Ｍｅｔ）（Ｍ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）（Ｗ）からなるリストから選択される。場合によって、ポリペプチドリンカーはまた、１または複数のＧＳリンカー配列、例えば（ＧＳ）ｎ（配列番号２８９）、（ＳＧ）ｎ（配列番号２９０）、（ＧＳＧ）ｎ（配列番号２９１）および（ＳＧＳＧ）ｎ（配列番号２９２）を含み得、ｎは、ゼロから１５までの任意の数でありうる。
ポリペプチド構築物の発現の改善をうる方法であって、第１の機能的ポリペプチドおよび第２の機能的ポリペプチドを含む前記ポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドを用意するステップであって、前記第１の機能的ポリペプチドと、第２の機能的ポリペプチドとが、配列ＡＰＶＫＱ（配列番号２９３）との、少なくとも６０％の同一性を有する配列を含むリンカーポリペプチドにより接続されている、ステップと；宿主細胞内で、前記ポリヌクレオチドを発現させるステップであって、前記発現が、ポリペプチド構築物の発現の、配列ＡＰＶＫＱ（配列番号２９３）との、少なくとも６０％の同一性を有する配列を含むリンカーポリペプチドを有さない、対応するポリペプチド構築物と比較した改善を結果としてもたらすステップとを含む方法が提供される。
他の例では、リンカーは、ＩＲＥＳでありうる。本明細書で使用される「内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）」という用語は、内部リボソーム侵入部位を意味することを意図することができる。ＩＲＥＳ配列を含むベクターでは、第１の遺伝子は、それ自身の５’−ＵＴＲを有するキャップ依存性リボソームスキャニング機構によって翻訳されうるが、その後の遺伝子の翻訳は、キャップ非依存性様式でリボソームをＩＲＥＳに直接動員することによって達成されうる。ＩＲＥＳ配列は、真核生物のリボソームが５’キャップ末端に結合することなしに結合し、翻訳を開始することを可能にする。ＩＲＥＳ配列は、１つの転写産物から複数の遺伝子を発現させることができる（Mountford and Smith 1995）。
例示的なＩＲＥＳ配列は、配列番号１４６および１４７に見出されうる。ある特定の実施形態では、２ｘＲｂｍ３ ＩＲＥＳ ａをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４６と少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一でありうるか、またはほぼそうでありうる。ある特定の場合には、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳａをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４７と少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一でありうるか、またはほぼそうでありうる。
一部の実施形態では、第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の遺伝子発現カセットと、第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の遺伝子発現カセットと、リガンドとを含む、宿主細胞においてＣＡＲおよびサイトカインの発現をモジュレートするためのシステムであって、第１および第２のポリペプチドは、（ｉ）転写活性化ドメイン；（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン；および（ｉｉｉ）リガンド結合ドメイン；（ｉｖ）ＣＡＲ；（ｖｉ）サイトカイン、および／または（ｖｉｉ）細胞タグのうちの１または複数を含み、それにより、リガンドの存在下で宿主細胞を第１の遺伝子発現カセットおよび第２の遺伝子発現カセットと接触させると、ＣＡＲおよびサイトカインが宿主細胞内で発現される。場合によって、ＣＡＲは、ＲＯＲ−１ ＣＡＲであり、サイトカインは、ｍｂＩＬ−１５である。場合によって、ＲＯＲ−１ＣＡＲ、ｍｂＩＬ−１５は、１つの細胞タグと共発現される。場合によって、ＲＯＲ−１ ＣＡＲおよびｍｂＩＬ−１５は、各々、細胞タグと共発現される。他の場合には、ＲＯＲ−１ ＣＡＲは、細胞タグとともに発現され、ｍｂＩＬ−１５は、第２の細胞タグとともに発現される。遺伝子発現カセットの例示的な構成を図１および２に示す。他の場合には、ＣＡＲは、ＲＯＲ−１ＣＡＲであり、サイトカインは、ＩＬ−１２である。場合によって、ＲＯＲ−１ ＣＡＲ、ＩＬ−１２は、１つの細胞タグと共発現される。場合によって、ＲＯＲ−１ ＣＡＲおよびＩＬ−１２は、各々、細胞タグと共発現される。他の場合には、ＲＯＲ−１ ＣＡＲは、細胞タグとともに発現され、ＩＬ−１２は、第２の細胞タグとともに発現される。
一部の実施形態では、第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の遺伝子発現カセットと、第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の遺伝子発現カセットと、リガンドとを含む、宿主細胞においてＣＡＲおよびサイトカインの発現をモジュレートするためのシステムであって、第１のポリペプチドは、（ｉ）転写活性化ドメイン；（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン；および（ｉｉｉ）リガンド結合ドメインのうちの１または複数を含み、第２のポリペプチドは、（ｉ）ＣＡＲ；（ｉｉ）サイトカイン、および／または（ｉｉｉ）細胞タグのうちの１または複数を含み、それにより、リガンドの存在下で宿主細胞を第１の遺伝子発現カセットおよび第２の遺伝子発現カセットと接触させると、ＣＡＲおよび／またはサイトカインが宿主細胞内で発現される。場合によって、ＣＡＲは、ＲＯＲ−１ ＣＡＲであり、サイトカインは、ｍｂＩＬ−１５である。場合によって、ＲＯＲ−１ ＣＡＲおよびｍｂＩＬ−１５は、各々、細胞タグとともに発現される。他の場合には、ＲＯＲ−１ ＣＡＲは、第１の細胞タグとともに発現され、ｍｂＩＬ−１５は、第２の細胞タグとともに発現される。
宿主細胞におけるＲＯＲ−１ＣＡＲおよびサイトカインの発現をモジュレートするためのシステムの例示的な構成を図１Ａ〜１Ｅおよび図２Ａ〜２Ｅに示す。一部の実施形態では、遺伝子発現カセットは、ウイルスまたはウイルスベースの系を用いて、免疫エフェクター細胞に導入される。本明細書に記載される非ウイルスベースの送達系の例としては、ＳＢ１１トランスポゾン系、ＳＢ１００Ｘトランスポゾン系、ＳＢ１１０トランスポゾン系、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系が挙げられる。一実施形態では、遺伝子発現カセットは、１または複数のＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン中の免疫エフェクター細胞に導入される。
ＲＯＲ−１ ＣＡＲ、サイトカイン（ｍｂＩＬ−１５またはＩＬ−１２など）および細胞タグの構成的発現をコードする遺伝子発現カセットの例示的な実施形態を図１Ａ〜１Ｅに示す。図１Ａ〜１Ｂは、多様な構成のＲＯＲ−１ ＣＡＲ、ｍｂＩＬ−１５および細胞タグのための例示的な遺伝子発現カセットデザインを示す。この実施形態では、遺伝子発現カセットは、１つのＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン中の免疫エフェクター細胞に導入される。図１Ｃ〜１Ｄは、ＲＯＲ−１ ＣＡＲが１つの遺伝子発現カセットおよびｍｂＩＬ−１５中にあり得、細胞タグが第２の遺伝子発現カセット中にある遺伝子発現カセット構成を示す。この実施形態では、遺伝子発現カセットは、１または複数のＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン中の免疫エフェクター細胞に導入される。
ＲＯＲ−１ ＣＡＲ、誘導性サイトカイン（ｍｂＩＬ−１５など）および／または細胞タグの発現をコードする遺伝子発現カセットの例示的な実施形態を図２Ａ〜２Ｅに示す。図２Ａ〜２Ｄは、誘導性プロモーターの制御下の多様な構成のＲＯＲ−１ ＣＡＲ、ｍｂＩＬ−１５および細胞タグの例示的な遺伝子発現カセットデザインを示す。図２Ｅは、本明細書に記載される遺伝子スイッチポリペプチドをコードする遺伝子発現カセットの例示的な実施形態である。この実施形態では、遺伝子発現カセットは、１または複数のＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン中の免疫エフェクター細胞に導入される。
リガンド
一部の実施形態では、誘導性遺伝子スイッチの調節のために使用されるリガンドは、以下：Ｎ−［（１Ｒ）−１−（１，１−ジメチルエチル）ブチル］−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−３，５−ジメチルベンゾヒドラジド（ベレジメクスともまた称する）、（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，９Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）−１７−［（２Ｓ，３Ｒ）−３，６−ジヒドロキシ−６−メチルヘプタン−２−イル］−２，３，１４−トリヒドロキシ−１０，１３−ジメチル−２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７−デカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−６−オン；Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−［（３Ｒ）−２，２−ジメチル−３−ヘキサニル］−２−エチル−３−メトキシベンゾヒドラジド；５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；２−メトキシ−ニコチン酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ペンチル）−Ｎ’−（４−エチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（２，２−ジメチル−１−フェニル−プロピル）−Ｎ’−（４−エチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ペンチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；および３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ペンチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのうちのいずれかから選択しうるがこれらに限定されない。
場合によって、エクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子スイッチの、用量調節性制御のために使用されるリガンドは、エクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ、ムリステロンＡなどのｅｃｄｙステロイド、９−ｃｉｓ−レチノイン酸、レチノイン酸の合成類似体、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０１３，８３６号明細書；同第５，１１７，０５７号明細書；同第５，５３０，０２８号明細書；および同第５，３７８，７２６号明細書、ならびに米国出願公開第２００５／０２０９２８３号明細書および同第２００６／００２０１４６号明細書において開示されているＮ，Ｎ’−ジアシルヒドラジンなどのＮ，Ｎ’−ジアシルヒドラジン；米国出願公開第２００４／０１７１６５１号明細書において記載されているオキサゾリン；欧州出願第４６１，８０９号明細書において開示されているジベンゾイルアルキルシアノヒドラジンなどのジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン；米国特許第５，２２５，４４３号明細書において開示されているＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジンなどのＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジン；欧州出願第２３４，９９４号明細書において開示されているＮ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジンなどのＮ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジン；米国特許第４，９８５，４６１号明細書において記載されているＮ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジンなどのＮ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジン；米国出願公開第２００４／００４９０３７号明細書において記載されているアルニドケトンなどのアルニドケトン；３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド、８−Ｏ−アセチルハルパジド、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−スルフェート（sulfate）（ＥＣＨＳ）、７−ケトコレステロール−３−スルフェート（sulfate）、フラメゾール、胆汁酸、１，１−ビホスホネート（biphosphonate）エステル、若年性ホルモンＩＩＩなどを含む、他の類似の材料のうちのいずれかから選択しうるがこれらに限定されない。本開示において有用なジアシルヒドラジンリガンドの例は、ＲＧ−１１５８１９（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−メチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、ＲＧ−１１５９３２（（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、およびＲＧ−１１５８３０（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）を含む。例えば、それらのいずれもが参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１２／１５５，１１１号明細書およびＰＣＴ出願／米国出願第２００８／００６７５７号明細書を参照されたい。
非ウイルスベースの送達系
本発明で記載されるＣＡＲをコードする核酸はまた、脊椎動物の染色体にＤＮＡ配列を導入するための合成ＤＮＡトランスポゾン系を指す「Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾン系」などの非ウイルスベースの送達系を用いて免疫エフェクター細胞に導入することができる。例示的なＳＢトランスポゾン系は、例えば、米国特許第６，４８９，４５８号明細書および第８，２２７，４３２号明細書に記載される。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポザーゼおよびＳＢトランスポゾンを含む。本明細書で使用される場合、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンポリペプチド、ならびに活性を保持する誘導体、変異体および／または断片、ならびに活性を保持するＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンポリヌクレオチド、誘導体、変異体および／または断片を含みうる。ある特定の実施形態では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼは、ｍＲＮＡとして提供される。一部の態様では、ｍＲＮＡは、ＳＢ１０、ＳＢ１１、ＳＢ１００ｘまたはＳＢ１１０トランスポザーゼをコードする。一部の態様では、ｍＲＮＡは、キャップおよびポリＡテールを含む。
ＤＮＡトランスポゾンは、１つのＤＮＡ部位から、別のＤＮＡ部位へと、単純なカットアンドペースト方式で転座する。転移は、規定されたＤＮＡセグメントを、１つのＤＮＡ分子から切り出し、同じＤＮＡ分子内もしくはゲノム内、または異なるＤＮＡ分子内もしくはゲノム内の別の部位へと移動させる、正確な過程である。他のＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポザーゼと同様、ＳＢトランスポザーゼも、トランスポゾンを、レシピエントＤＮＡ配列内の、ＴＡジヌクレオチド塩基対へと挿入する。挿入部位は、同じＤＮＡ分子内の別の部位の場合もあり、別のＤＮＡ分子（または染色体）内の場合もある。ヒトゲノムを含む哺乳動物ゲノムには、約２億カ所のＴＡ部位が存在する。ＴＡ挿入部位は、トランスポゾン組込みの過程において、重複される。このＴＡ配列の重複は、転移の顕著な特徴であり、一部の実験では、機構を確認するのに使用される。トランスポザーゼは、トランスポゾン内にコードされるか、またはトランスポザーゼは、別の供給源から供給されるかのいずれかである。この場合、トランスポゾンは、非自律型エレメントとなる。非自律型トランスポゾンは、挿入の後、独立では切出しおよび再挿入を行いえないため、遺伝子ツールとして最も有用である。ＳＢトランスポゾンは、脊椎動物のゲノムへの遺伝子の導入および遺伝子治療のための非ウイルスベクターとして使用することが想定されている。略述すると、免疫エフェクター細胞を遺伝子改変するように、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）系（Hackett et al., Mol Ther 18:674-83, (2010)）を適合させた（Cooper et al., Blood 105:1622-31, (2005)）。一実施形態では、これは、２つのステップ：（ｉ）Ｔ細胞の特異性をリダイレクトするためのＳＢトランスポゾン［すなわち、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）］およびＳＢトランスポザーゼを発現するＤＮＡプラスミドのエレクトロトランスファー（Jin et al., Gene Ther 18:849-56, (2011)、Kebriaei et al., Hum Gene Ther 23:444-50, (2012)）、ならびに（ｉｉ）Ｋ５６２細胞株に由来するデザイナー人工抗原提示細胞（ＡａＰＣ）（ＡａＰＣ（Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ）としてもまた公知である）に接する形での、組込み配列を安定的に発現するＴ細胞の繁殖および拡大増殖を伴った。別の実施形態では、第２の工程（ｉｉ）は消失され、遺伝子改変Ｔ細胞は、凍結保存される、または患者に速やかに輸注される。
一実施形態では、ＳＢトランスポゾン系は、例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Hudecek et al, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 52:4, 355-380 (2017)、Singh et al, Cancer Res (8):68 (2008). April 15, 2008 およびMaiti et al, J Immunother. 36(2): 112-123 (2013)に記載される。
ある特定の実施形態では、ＲＯＲ−１ ＣＡＲおよびｍｂＩＬ−１５は、トランスポゾンＤＮＡプラスミドベクターにコードされ、ＳＢトランスポザーゼは、別個のベクターにコードされる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＲＯＲ−１ ＣＡＲは、トランスポゾンＤＮＡプラスミドベクターにコードされ、ｍｂ−ＩＬ１５は、第２のトランスポゾンＤＮＡプラスミドベクターにコードされ、ＳＢトランスポザーゼは、第３のＤＮＡプラスミドベクターにコードされる。一部の実施形態では、ＣＡＲは、キルタグ、例えば、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ１、ＣＤ２０またはＣＤ２０ｔ−１でコードされる。ある態様において、ｍｂＩＬ−１５は、キルタグ、例えば、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ１、ＣＤ２０またはＣＤ２０ｔ−１とともにコードされる。ＲＯＲ−１ ＣＡＲ、キルタグおよび／またはｍｂＩＬ１５の例示的な構成を図１に示す。
複数の実施形態では、ＲＯＲ−１ ＣＡＲは、ｍｂＩＬ−１５、およびトランスポゾンＤＮＡプラスミドベクター由来の細胞タグと共発現されうる。さらなる実施形態では、ＲＯＲ−１ ＣＡＲは、誘導性プロモーターの制御下にありうる。別の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、誘導性プロモーターの制御下にありうる。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチリガンド誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなどの低分子リガンド誘導性２ポリペプチドエクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。ある特定の実施形態では、ＲＯＲ−１ ＣＡＲ、ｍｂＩＬ−１５およびキルタグは、１、２またはこれを超えるトランスポゾン中に構成されうる。誘導性プロモーターの制御下でのＲＯＲ−１ ＣＡＲまたはｍｂＩＬ１５の例示的な構成を図２に示す。
複数の実施形態では、ＲＯＲ−１ ＣＡＲおよび他の遺伝子エレメントは、ＳＢ１１トランスポゾン系、ＳＢ１００Ｘトランスポゾン系、ＳＢ１１０トランスポゾン系、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，２２８，１８０号明細書、Wilson et al, “PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells,” Molecular Therapy 15:139-145 (2007)を参照されたい）、および／またはｐｉｇｇｙＢａｔトランスポゾン系（例えば、Mitra et al., “Functional characterization of piggyBat from the bat Myotis lucifugus unveils an active mammalian DNA transposon,” Proc. Natl. Acad. Sci USA 110:234-239 (2013)を参照されたい）を用いて、細胞に送達される。さらなるトランスポザーゼおよびトランスポゾン系は、米国特許第７，１４８，２０３号明細書；同第８，２２７，４３２号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０１１７０７２号明細書；Mates et al., Nat Genet, 41(6):753-61 (2009). doi: 10.1038/ng.343. Epub 2009 May 3, Gene Ther., 18(9):849-56 (2011). doi: 10.1038/gt.2011.40. Epub 2011 Mar 31 and in Ivics et al., Cell. 91(4):501-10, (1997)に提供され、その各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
他の実施形態では、ＲＯＲ−１ ＣＡＲ、およびサイトカイン、ｍｂＩＬ−１５および／またはＨＥＲ１ｔ／ＨＥＲ１ｔ１／ＣＤ２０／ＣＤ２０ｔ−１タグなどの他の遺伝子エレメントは、組換えおよび組込み用発現ベクターを介して免疫エフェクター細胞のＤＮＡに組み込むことができる。このようなベクターは、宿主細胞のＤＮＡにランダムに組み込むことができ、または発現ベクターと宿主細胞の染色体との間の特異的組換えを可能にする組換え部位を含むことができる。このような組込み用発現ベクターは、宿主細胞の染色体の内因性発現制御配列を利用して、所望のタンパク質の発現をもたらしうる。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド上の配列であって、組込み部位を挟む配列と相同な配列の存在により、組込みのターゲティングを促進する。例えば、本明細書に記載されるドナーポリヌクレオチドを使用する、組込みのターゲティングは、従来のトランスフェクション技法、例えば、相同組換えにより、遺伝子のノックアウトまたはノックインを創出するのに使用される技法に従い達成することができる。他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド上の配列であって、組込み部位を挟む配列と相同な配列の存在、および部位特異的リコンビナーゼの存在下で、細胞を、ドナーポリヌクレオチドと接触させることの両方により、組込みのターゲティングを促進する。部位特異的リコンビナーゼ、または、単に、リコンビナーゼとは、その適合性の組換え部位の間の、保存的な部位特異的組換えを触媒するポリペプチドを意味する。本明細書で使用される部位特異的リコンビナーゼは、天然ポリペプチドのほか、活性を保持する誘導体、変異体、および／または断片、ならびに天然ポリヌクレオチド、活性を保持するリコンビナーゼをコードする誘導体、変異体、および／または断片を含む。
リコンビナーゼは、標的細胞へと、ターゲティングベクターの導入の前に導入することもでき、これと共時的に導入することもでき、この後で導入することもできる。リコンビナーゼは、例えば、リポソーム、粒子のコーティング、またはマイクロインジェクションを使用して、細胞へと、タンパク質として直接導入することができる。代替的に、適切な発現ベクターを使用して、リコンビナーゼをコードするＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡである、ポリヌクレオチドを、細胞へと導入することもできる。上記で記載したターゲティングベクターの構成要素は、目的のリコンビナーゼをコードする配列を含有する発現カセットの構築において有用である。しかし、リコンビナーゼの発現は、他の方式で、例えば、リコンビナーゼの発現を、調節可能なプロモーター（すなわち、その発現を選択的に誘導または抑制しうるプロモーター）の制御下に置くことにより調節することもできる。
リコンビナーゼは、インテグラーゼファミリーまたはリゾルバーゼファミリーに由来しうる。リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーは、１００を超えるメンバーを有し、例えば、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、およびラムダインテグラーゼを含む。インテグラーゼファミリーはまた、チロシンファミリーまたはラムダインテグラーゼファミリーとも称し、ＤＮＡのホスホジエステル結合に対する求核攻撃のために、チロシンの触媒性ヒドロキシル基を使用する。典型的に、チロシンファミリーのメンバーはまず、ＤＮＡにニックを入れ、これにより、その後、二重鎖切断を形成する。チロシンファミリーインテグラーゼの例は、Ｃｒｅインテグラーゼ、ＦＬＰインテグラーゼ、ＳＳＶ１インテグラーゼ、およびラムダ（λ）インテグラーゼを含む。セリンリコンビナーゼファミリーとしてもまた公知の、リゾルバーゼファミリーでは、保存性セリン残基が、ＤＮＡ標的部位への共有結合性連結を形成する（Grindley, et al., (2006) Ann Rev Biochem 16:16）。
一実施形態では、リコンビナーゼは、ＳＰβｃ２リコンビナーゼ、ＳＦ３７０．１リコンビナーゼ、Ｂｘｂ１リコンビナーゼ、Ａ１１８リコンビナーゼ、およびΦＲｖ１リコンビナーゼからなる群から選択されるリコンビナーゼをコードする核酸配列を含む、単離ポリヌクレオチド配列である。セリンリコンビナーゼの例については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第９，０３４，６５２号明細書において詳細に記載されている。
本発明の実施において使用するためのリコンビナーゼは、組換え的に産生されうるか、または前述したように精製されうる。所望のリコンビナーゼ活性を有するポリペプチドは、当技術分野で公知の方法であって、タンパク質の硫酸アンモニウム沈殿の方法、サイズ分画、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンアガロースアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Thorpe & Smith, Proc. Nat. Acad. Sci. 95:5505-5510, 1998）を含むがこれらに限定されないタンパク質精製の方法により、所望の純度まで精製することができる。
一実施形態では、リコンビナーゼを、任意の適切な方法による組換えが所望される組換え接合部位を含有する真核細胞へと導入することができる。当技術分野では、例えば、マイクロインジェクションまたは他の方法により、機能的タンパク質を、細胞へと導入する方法が周知である。精製リコンビナーゼタンパク質の導入は、タンパク質の一過性の存在、およびその機能を確保するが、これは、好ましい実施形態であることが多い。代替的に、リコンビナーゼをコードする遺伝子は、細胞を形質転換するのに使用される発現ベクターであって、リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドを、真核細胞内のポリヌクレオチドの発現を媒介するプロモーターに作動可能に連結した、発現ベクター内に含まれうる。リコンビナーゼポリペプチドはまた、リコンビナーゼポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡによっても、真核細胞へと導入することができる。リコンビナーゼは、核酸断片の、改変されるゲノムへの挿入に必要であるような時間の間だけ存在することが一般に好ましい。したがって、大半の発現ベクターと関連する永続性の欠如は、有害ではないと予測される。リコンビナーゼ遺伝子を、目的の外因性ポリヌクレオチドの導入の前に導入することもでき、これと同時に導入することもでき、この後で導入することもできる。一実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子は、挿入されるポリヌクレオチドを保有するベクター内に存在し、リコンビナーゼ遺伝子はなお、ポリヌクレオチド内にも、組み入れることができる。
一実施形態では、部位特異的組換えのための方法は、第１の組換え部位および第２の組換え部位を用意する工程と、第１の組換え部位および第２の組換え部位を、原核細胞のリコンビナーゼポリペプチドと接触させる結果として、組換え部位の間の組換えをもたらす工程とを含み、リコンビナーゼポリペプチドは、第１の組換え部位と第２の組換え部位との間の組換えを媒介することが可能であり、第１の組換え部位は、ａｔｔＰまたはａｔｔＢであり、第２の組換え部位は、ａｔｔＢまたはａｔｔＰであり、第１の組換え接合部位が、ａｔｔＢである場合、第２の組換え接合部位は、ａｔｔＰであり、第１の組換え接合部位が、ａｔｔＰである場合、第２の組換え接合部位は、ａｔｔＢであるという条件で、リコンビナーゼは、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）のファージリコンビナーゼ、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）のファージリコンビナーゼ、枯草菌（Bacillus subtilis）のファージリコンビナーゼ、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のファージリコンビナーゼ、およびスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）のファージリコンビナーゼからなる群から選択される。
さらなる実施形態は、部位特異的リコンビナーゼの、ゲノムが改変される細胞への導入を提供する。一実施形態は、真核細胞内の部位特異的組換えを得るための方法であって、第１の組換え接合部位および第２の組換え接合部位を含む真核細胞を用意するステップと、第１の組換え接合部位および第２の組換え接合部位を、原核細胞のリコンビナーゼポリペプチドと接触させる結果として、組換え接合部位の間の組換えをもたらすステップとを含み、リコンビナーゼポリペプチドが、第１の組換え接合部位と、第２の組換え接合部位との組換えを媒介することが可能であり、第１の組換え接合部位が、ファージゲノムの組換え接合部位（ａｔｔＰ）、または細菌ゲノムの組換え接合部位（ａｔｔＢ）であり、第２の組換え接合部位が、ａｔｔＢまたはａｔｔＰであり、第１の組換え接合部位が、ａｔｔＢである場合、第２の組換え接合部位が、ａｔｔＰであり、第１の組換え接合部位が、ａｔｔＰである場合、第２の組換え接合部位が、ａｔｔＢであるという条件で、リコンビナーゼが、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）のファージリコンビナーゼ、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）のファージリコンビナーゼ、枯草菌（Bacillus subtilis）のファージリコンビナーゼ、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のファージリコンビナーゼ、およびスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）のファージリコンビナーゼからなる群から選択される、方法に関する。ある実施形態では、リコンビナーゼは、Ａ１１８リコンビナーゼ、ＳＦ３７０．１リコンビナーゼ、ＳＰβｃ２リコンビナーゼ、ΦＲｖ１リコンビナーゼ、およびＢｘｂ１リコンビナーゼからなる群から選択される。一実施形態では、組換えは、組込みを結果としてもたらす。
外因性核酸を、宿主細胞へと導入するのに使用される方法にかかわらず、宿主細胞内の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。このようなアッセイは、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲなどの、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）または本明細書で記載されるアッセイにより、特定のペプチドの有無を検出して、本開示の範囲内に収まるペプチドまたはタンパク質または核酸を同定するなどの「生化学的」アッセイを含む。
ウイルスベースの送達系
また、本明細書では、本発明の核酸が挿入されるウイルスベースの送達系も提供される。代表的なウイルス発現ベクターには、アデノウイルスベースのベクター（例えば、Ｃｒｕｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｌｅｉｄｅｎ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手可能なアデノウイルスベースのＰｅｒ．Ｃ６系）、レンチウイルスベースのベクター（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）からのレンチウイルスベースのｐＬＰＩ）、およびレトロウイルスベクター（例えば、ｐＦＢ−ＥＲＶ＋ｐＣＦＢ−ＥＧＳＨ）、ヘルペスウイルスが含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、トランス遺伝子の、娘細胞における、長期にわたる、安定的な組込みおよびその繁殖を可能とするので、長期にわたる遺伝子導入を達成するのに適するツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖性細胞に形質導入しうるという点で、マウス白血病ウイルスなど、がんレトロウイルスに由来するベクターに優る追加の利点を有する。レンチウイルスベクターはまた、低免疫原性という追加の利点も有する。一般に、かつ、複数の実施形態では、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１または複数の選択用マーカー（例えば、国際公開第０１／９６５８４号パンフレット、国際公開第０１／２９０５８号パンフレット、および米国特許第６，３２６，１９３号明細書）を含有する。
複数の実施形態では、骨格と、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列とを含むレンチウイルスベクターが提供され、ＣＡＲは、（ａ）ＲＯＲ−１抗原結合ドメイン；（ｂ）ストークドメイン；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはその両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。任意選択で、ベクターは、切断型上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ１）、ＣＤ２０ｔ−１、または全長ＣＤ２０をコードする核酸をさらに含む。
場合によって、骨格と、（１）切断型上皮増殖因子受容体、例えば、ＨＥＲ１ｔもしくはＨＥＲｔ−１またはその機能的変異体；および（２）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列とを含むベクターが提供され、ＣＡＲは、（ａ）ＲＯＲ−１抗原結合ドメイン；（ｂ）スペーサー；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはその両方を含む共刺激シグナル伝達ドメインドメイン；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。
場合によって、骨格と、（１）全長ＣＤ２０、切断型ＣＤ２０またはその機能的変異体、および（２）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列とを含むベクターが提供され、ＣＡＲは、（ａ）ＲＯＲ−１抗原結合ドメイン；（ｂ）スペーサー；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはその両方を含む共刺激シグナル伝達ドメインドメイン；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。
複数の実施形態では、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲをコードする核酸は、レンチウイルス骨格成分を含むベクターにクローニングされる。例示的な骨格成分としては、ｐＦＵＧＷ、およびｐＳＭＰＵＷが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＦＵＧＷレンチウイルスベクター骨格は、自己不活化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクター骨格であり、不必要なＨＩＶ−１ウイルス配列が除去され、その結果、新生物、有害な突然変異、および感染性粒子の再生の可能性が低下する。複数の実施形態では、ＲＯＲ−１ ＣＡＲをコードするベクターはまた、単一の構築物にｍｂＩＬ−１５をコードする。複数の実施形態では、ＲＯＲ−１ ＣＡＲおよびｍｂＩＬ−１５は、２つの別々のレンチウイルスベクターにコードされる。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、切断型上皮増殖因子受容体タグとともに発現される。複数の実施形態では、ＲＯＲ−１ ＣＡＲは、ｍｂＩＬ−１５、および単一のレンチウイルスベクター由来の細胞タグとともに発現されうる。さらなる実施形態では、ＲＯＲ−１ ＣＡＲは、誘導性プロモーターの制御下にありうる。別の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、誘導性プロモーターの制御下にありうる。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチリガンド誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなどの、低分子リガンド誘導性２ポリペプチドエクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。
一実施形態では、本明細書に記載されるＲＯＲ−１ ＣＡＲは、抗ＲＯＲ−１ ｓｃＦｖ、ヒトＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびにヒト４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態では、本発明のＲＯＲ−１ ＣＡＲは、抗ＲＯＲ−１ ｓｃＦｖ、ヒトＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ヒト４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、ならびに、任意選択で、切断型上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ−１）タグを含む。他の適切なベクターは、宿主細胞のＤＮＡへと、ランダムに組み込まれる場合もあり、または発現ベクターと、宿主細胞の染色体との特異的組換えを可能とする組換え部位を含む場合もある、組込み用発現ベクターを含む。このような組込み用発現ベクターは、宿主細胞の染色体の内因性発現制御配列を利用して、所望のタンパク質の発現を行うことができる。部位特異的に組み込むベクターの例は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）（例えば、ｐｃＤＮＡ（商標）５／ＦＲＴ）製のｆｌｐ−ｉｎ系、またはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐＥｘｃｈａｎｇｅ−６ Ｃｏｒｅ Ｖｅｃｔｏｒｓにおいて見出されうるｃｒｅ−ｌｏｘ系などのｃｒｅ−ｌｏｘ系の構成要素を含む。宿主細胞染色体へとランダムに組み込まれるベクターの例は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐｃＤＮＡ３．１（Ｔ抗原の非存在下で導入される場合）、およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）製のｐＣＩまたはｐＦＮ１０Ａ（ＡＣＴ）ＦＬＥＸＩ（商標）を含む。さらなるプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的に、プロモーターエレメントは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域内に位置するが、多数のプロモーターは、開始部位の下流にも、機能的なエレメントを含有することが近年示されている。エレメントが、互いに対して逆位であるか、または移動している場合にも、プロモーター機能が保存されるように、プロモーターエレメントの間のスペーシングは、柔軟であることが多い。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が減衰し始める前に、プロモーターエレメントの間のスペーシングが、５０ｂｐの距離まで増大する場合がある。個別のエレメントは、転写を活性化させるように、プロモーターに応じて、共作動的に機能する場合もあり、独立に機能する場合もあると考えられる。
適切なプロモーターの１つの例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即初期プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それへと作動的に連結された、任意のポリヌクレオチド配列の、高レベルの発現を駆動することが可能である、強力な構成的プロモーター配列である。
適切なプロモーターの別の例は、ヒト伸長成長因子１アルファ１（ｈＥＦ１ａ１）である。複数の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲを含むベクター構築物は、ｈＥＦ１ａ１機能的変異体を含む。
しかしながら、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルス即初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどであるがこれらに限定されない、ヒト遺伝子プロモーターを含むがこれらに限定されない、他の構成的プロモーター配列もまた、使用することができる。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されないものとする。誘導性プロモーターもまた、前述したように、本発明の一部として想定される。誘導性プロモーターの使用は、このような発現が所望される場合に、それが作動的に連結されたポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、または発現が所望されない場合に、発現をオフにすることが可能な分子スイッチをもたらす。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネイン（metallothionine）プロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターを含むがこれらに限定されない。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチリガンド誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなどの、低分子リガンド誘導性２ポリペプチドエクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。
本明細書に記載されるＣＡＲまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターはまた、選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子、またはその両方を含有し、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染されることが求められている細胞集団からの発現細胞の同定および選択を容易にすることができる。他の態様では、選択マーカーは、別個のＤＮＡ断片上に担持され得、共トランスフェクション手順において使用されうる。選択マーカーおよびレポーター遺伝子の両方を、宿主細胞における発現を可能にするために、適切な調節配列と隣接させることができる。有用な選択マーカーとしては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝（ｎｅｏ）およびアンピシリン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。一部の実施形態では、切断型上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ−１）タグを選択マーカー遺伝子として用いることができる。
レポーター遺伝子を、トランスフェクトされた可能性がある細胞を同定し、調節配列の機能性について査定するために使用することができる。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエントの生物または組織において存在しないか、またはこれらにより発現せず、その発現が、何らかの、容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により顕在化されるポリペプチドをコードする遺伝子である。ＤＮＡを、レシピエント細胞へと導入した後の適切な時点において、レポーター遺伝子の発現についてアッセイする。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子（例えば、Ui-Tei et al., FEBS Letters 479: 79-82 (2000)）を含むことができる。適切な発現系が周知であり、公知の技法を使用して調製することもでき、または市販品を購入することもできる。一般に、最高レベルのレポーター遺伝子の発現を示す、最小の５’側フランキング領域を伴う構築物は、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子へと連結することができ、薬剤を、プロモーター駆動型転写をモジュレートする能力について査定するのに使用することができる。
複数の実施形態では、本明細書に記載されるウイルスベクターは、トランス遺伝子の発現を駆動するｈＥＦ１ａ１プロモーター、転写を増強するウシ成長ホルモンポリＡ配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）のほか、ｐＦＵＧＷプラスミドに由来するＬＴＲ配列を含む。
遺伝子を細胞へと導入し発現させる方法が周知である。発現ベクターの文脈では、ベクターを、当技術分野における任意の方法により、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞へと、たやすく導入することができる。例えば、発現ベクターは、宿主細胞へと、物理的手段により導入することもでき、化学的手段により導入することもでき、生物学的手段により導入することもできる。
ポリヌクレオチドを、宿主細胞、例えば、免疫エフェクター細胞へと導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション法、遺伝子銃法、マイクロインジェクション法、電気穿孔法などを含む。当技術分野では、ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を作製するための方法が周知である。例えば、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001))を参照されたい。複数の実施形態では、ポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションまたはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクションである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを宿主細胞へと導入する方法は、電気穿孔である。
目的のポリヌクレオチドを、宿主細胞、例えば、免疫エフェクター細胞へと導入するための生物学的方法は、ＤＮＡベクターおよびＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクターと、とりわけ、レトロウイルスベクターとは、遺伝子を、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞へと挿入するための、最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどに由来しうる。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号明細書および同第５，５８５，３６２号明細書を参照されたい。
ポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための化学的手段は、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合型ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系などのコロイド分散系を含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける、送達媒体としての使用のための、例示的なコロイド状系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
ウイルス送達系を利用する場合、例示的な送達媒体は、リポソームである。核酸の、宿主細胞への導入（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける）のために、脂質製剤を使用することができる。別の態様では、核酸は脂質と会合していてもよい。脂質と会合させた核酸は、リポソームの脂質二重層内に散在する、水性のリポソーム内部に封入することもでき、リポソームおよびオリゴヌクレオチドのいずれとも会合する連結分子を介して、リポソームへと接合させることもでき、リポソーム内に取り込むこともでき、リポソームと複合体化させることもでき、脂質を含有する溶液中に分散させることもでき、脂質と混合することもでき、脂質と組み合わせることもでき、脂質中の懸濁液として含有することもでき、ミセルとともに含有するかもしくは複合体化させることもでき、または他の形で脂質と会合させることもできる。脂質、脂質／ＤＮＡ、または脂質／発現ベクターに関連する組成物は、溶液中の、任意の特定の構造に限定されない。例えば、組成物は、ミセルとしての二重層構造内に存在する場合もあり、「コラプシング」構造を伴う二重層構造内に存在する場合もある。組成物はまた、単に、溶液中に散在させることもでき、おそらく、サイズまたは形状が均質ではない凝集物を形成しうる。脂質とは、天然脂質の場合もあり、合成脂質の場合もある、脂肪性物質である。例えば、脂質は、天然では、細胞質内で発生する脂肪性液滴のほか、長鎖脂肪族炭化水素、ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドなどの、それらの誘導体を含有する化合物のクラスを含む。
使用に適する脂質は、市販元から購入することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．から購入することができ；ジセチルリン酸（「ＤＣＰ」）は、Ｋ＆Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）から購入することができ；コレステロール（「Ｃｈｏｌ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから購入することができ；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ａｌａ．）から購入することができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質原液は、約−２０℃で保存することができる。クロロホルムは、メタノールよりたやすく蒸発するため、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」とは、封入された脂質の二重層または脂凝集物の作出により形成される、様々な単一の脂質媒体および多層性脂質媒体を包含する、一般的な用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部の水性媒質を伴う小胞構造を有するものとして特徴付けることができる。多層性リポソームは、水性媒質により分離された複数の脂質層を有する。多層性リポソームは、リン脂質を、過剰量の水溶液中に懸濁させると、自発的に形成される。脂質成分は、閉止構造を形成する前に、自己転移を経、脂質二重層の間に、水および溶解させた溶質を取り込む（Ghosh et al., Glycobiology 5: 505-10 (1991)）。しかし、溶液中に通常の小胞構造と異なる構造を有する組成物もまた、包含される。例えば、脂質は、ミセル構造を取る場合もあり、または単に脂質分子による不均質の凝集物として存在する場合もある。また、リポフェクタミン−核酸複合体も想定される。
ＲＯＲ−１ ＣＡＲおよびベクターを含む細胞
本明細書では、本明細書に記載されるＣＡＲを発現する操作細胞が提供される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される操作細胞は、免疫エフェクター細胞である。複数の実施形態では、本明細書では、骨格と、（１）切断型上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ１）および（２）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列とを含むベクターを含む免疫エフェクター細胞が提供され、ＣＡＲは、（ａ）ＲＯＲ−１抗原結合ドメイン；（ｂ）スペーサー；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはその両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。
ある特定の実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫エフェクター細胞であり、ＣＡＲは、（ａ）ＲＯＲ−１抗原結合ドメイン；（ｂ）スペーサー；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはその両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン；および（ｆ）切断型上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ１）を含む。
複数の実施形態では、本明細書では、（１）キルスイッチ、選択マーカー、バイオマーカー、またはそれらの組合せとして使用するための細胞タグ、および（２）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫エフェクター細胞が提供され、ＣＡＲは、（ａ）ＲＯＲ−１抗原結合ドメイン；（ｂ）スペーサー；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはその両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。複数の実施形態では、細胞タグは、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ１、ＣＤ２０ｔ−１またはＣＤ２０である。
複数の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、および調節性Ｔ細胞である。複数の実施形態では、ＲＯＲ−１抗原結合ドメインがＲＯＲ−１に結合した場合、細胞は、抗腫瘍活性を示す。
改変免疫エフェクター細胞
本明細書に記載される１または複数の異種遺伝子またはポリペプチドを発現するように改変された免疫エフェクター細胞が提供される。本明細書に記載されるＲＯＲ−１ ＣＡＲ、ならびにＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ１、ＣＤ２０およびＣＤ２０ｔ−１タグのうちの少なくとも１つを発現するように改変された免疫エフェクター細胞が提供される。場合によって、ＲＯＲ−１ ＣＡＲ、ｍｂＩＬ−１５、ならびに本明細書に開示されるＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ１、ＣＤ２０およびＣＤ２０ｔ−１タグのうちの少なくとも１つを発現するように改変された免疫エフェクター細胞が提供される。
本明細書で使用される「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」とは、細胞媒介性免疫において、中心的な役割を果たす、リンパ球の種類である。「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）など、他のリンパ球と区別されうる。
一部の実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー細胞を含む改変免疫細胞である。Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫に関与する白血球の亜型である。例示的なＴ細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ＴＨ１７細胞、ステムセルメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、調節性Ｔ細胞、またはナチュラルキラーＴ細胞を含む。
ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞の、血漿細胞およびメモリーＢ細胞への成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫過程において、他の白血球を支援する。場合によって、ＴＨ細胞は、細胞表面上のＣＤ４糖タンパク質の発現のために、ＣＤ４＋ Ｔ細胞として公知である。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上で発現する、ＭＨＣクラスＩＩ分子により、ペプチド抗原を提示されると、活性化する。活性化すると、ヘルパーＴ細胞は、急速に分裂し、活性の免疫応答を調節するか、またはこれらを支援する、サイトカインと呼ばれる、小型のタンパク質を分泌する。これらの細胞は、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨ９、またはＴＦＨを含む、いくつかの亜型であって、異なるサイトカインを分泌して、異なる種類の免疫応答を容易とする、いくつかの亜型のうちの１つへと分化しうる。ＡＰＣからのシグナル伝達は、Ｔ細胞を、特定の亜型へと方向付ける。
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また、移植片拒絶にも関与している。これらの細胞はまた、それらの表面上において、ＣＤ８糖タンパク質を発現するので、ＣＤ８＋ Ｔ細胞としても公知である。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在する、ＭＨＣクラスＩ分子と会合する抗原に結合することにより、それらの標的を認識する。調節性Ｔ細胞により分泌される、ＩＬ−１０、アデノシン、および他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞は、アネルギー状態へと不活化される場合があり、これにより、自己免疫疾患を防止する。
メモリーＴ細胞は、感染が消失した後で、長期にわたり存続する、抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。メモリーＴ細胞は、それらのコグネイト抗原へと再曝露されると、多数のエフェクターＴ細胞へと急速に拡大増殖し、これにより、免疫系に、過去の感染に対する「メモリー」をもたらす。メモリーＴ細胞は、亜型：ステムセルメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）および２種類のエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋細胞の場合もあり、ＣＤ８＋細胞の場合もある。メモリーＴ細胞は、細胞表面タンパク質である、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、および／またはＣＣＲ７を発現しうる。
かつては、サプレッサーＴ細胞として公知であった、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持において役割を果たす。調節性Ｔ細胞の主要な役割は、Ｔ細胞媒介性免疫を遮断して、免疫反応を終了させ、胸腺内の陰性選択過程を回避した自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）は、獲得免疫系を、自然免疫系と橋渡しする。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子により提示されるペプチド抗原を認識する従来のＴ細胞と異なり、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄと呼ばれる分子により提示される糖脂質抗原を認識する。活性化すると、これらの細胞は、Ｔｈ（ヘルパーＴ）細胞およびＴｃ（細胞傷害性Ｔ）細胞の両方に帰せられた機能（すなわち、サイトカインの産生および細胞溶解性／細胞殺滅分子の放出）を果たしうる。ＮＫＴ細胞はまた、一部の腫瘍細胞およびヘルペスウイルスに感染した細胞を認識し、これらを消失させることも可能である。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞とは、自然免疫系の、細胞傷害性リンパ球の種類である。場合によって、ＮＫ細胞は、ウイルス感染および／または腫瘍形成に対する、最前線の防御をもたらす。ＮＫ細胞は、感染細胞上またはがん性細胞上に提示されたＭＨＣを検出することが可能であり、サイトカイン放出を誘発し、その後、溶解およびアポトーシスを誘導する。ＮＫ細胞はさらに、抗体および／またはＭＨＣの非存在下で、ストレス細胞を検出することが可能であり、これにより、迅速な免疫応答を可能とする。
改変免疫エフェクター細胞の用量
一部の実施形態では、ある量の改変免疫エフェクター細胞の量を、それを必要とする対象に投与し、その量は、サイトカインと関連する傷害作用を誘導する有効性および潜在的可能性に基づき決定される。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０２〜約１０９個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０３〜約１０９個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０４〜約１０９個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０５〜約１０９個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０５〜約１０９個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０５〜約１０８個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０５〜約１０７個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０６〜約１０９個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０６〜約１０８個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０７〜約１０９個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０５〜約１０６個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０６〜約１０７個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０７〜約１０８個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０８〜約１０９個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０９個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０８個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０７個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０６個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０５個を含む。
一部の実施態様では、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞であるＣＡＲ−Ｔ細胞である。場合によって、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、約１０２〜約１０９ＣＡＲ−Ｔ細胞／ｋｇを含む。場合によって、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、約１０３〜約１０９ＣＡＲ−Ｔ細胞／ｋｇを含む。場合によって、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、約１０４〜約１０９ＣＡＲ−Ｔ細胞／ｋｇを含む。場合によって、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、約１０５〜約１０９ＣＡＲ−Ｔ細胞／ｋｇを含む。場合によって、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、約１０５〜約１０８ＣＡＲ−Ｔ細胞／ｋｇを含む。場合によって、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、約１０５〜約１０７ＡＲ−Ｔ細胞／ｋｇを含む。場合によって、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、約１０６〜約１０９ＣＡＲ−Ｔ細胞／ｋｇを含む。場合によって、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、約１０６〜約１０８ＣＡＲ−Ｔ細胞／ｋｇを含む。場合によって、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、約１０７〜約１０９ＣＡＲ−Ｔ細胞／ｋｇを含む。場合によって、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、約１０５〜約１０６ＣＡＲ−Ｔ細胞／ｋｇを含む。場合によって、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、約１０６〜約１０７ＣＡＲ−Ｔ細胞／ｋｇを含む。場合によって、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、約１０７〜約１０８ＣＡＲ−Ｔ細胞／ｋｇを含む。場合によって、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、約１０８〜約１０９ＣＡＲ−Ｔ細胞／ｋｇを含む。場合によって、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、約１０９ＣＡＲ−Ｔ細胞／ｋｇを含む。場合によって、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、約１０８ＣＡＲ−Ｔ細胞／ｋｇを含む。場合によって、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、約１０７ＣＡＲ−Ｔ細胞／ｋｇを含む。場合によって、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、約１０６ＣＡＲ−Ｔ細胞／ｋｇを含む。場合によって、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、約１０５ＣＡＲ−Ｔ細胞／ｋｇを含む。場合によって、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、約１０４ＣＡＲ−Ｔ細胞／ｋｇを含む。場合によって、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、約１０３ＣＡＲ−Ｔ細胞／ｋｇを含む。場合によって、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、約１０２ＣＡＲ−Ｔ細胞／ｋｇを含む。
免疫エフェクター細胞の供給源
ある特定の態様では、本明細書で記載される実施形態は、リダイレクトされた、抗原特異的免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、ＮＫ細胞、またはＮＫ Ｔ細胞）を作り出し、かつ／またはこれを拡大増殖させる方法であって、細胞に、ＣＡＲをコードするＤＮＡ（またはＲＮＡ）構築物を含有する発現ベクターによりトランスフェクトし、次いで、任意選択で、細胞を、フィーダー細胞、組換え抗原、または受容体に対する抗体で刺激して、細胞を増殖させるステップを含む方法を含む。ある特定の態様では、ＣＡＲを発現するように操作された細胞（または細胞集団）は、幹細胞、ｉＰＳ細胞、ｉＰＳ細胞から分化したＴ細胞、免疫エフェクター細胞、またはこれらの細胞の前駆細胞である。
免疫エフェクター細胞の供給源は、同種供給源および自家供給源の両方を含みうる。場合によって、免疫エフェクター細胞は、幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化させることもできる。したがって、実施形態に従い操作するための細胞は、臍帯血、末梢血、ヒト胚性幹細胞、またはｉＰＳＣから単離することができる。例えば、同種Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を含むように（そして、任意選択で、機能的なＴＣＲを欠くように）改変することができる。一部の態様では、免疫エフェクター細胞は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来するＴ細胞などの初代ヒトＴ細胞である。ＰＢＭＣは、末梢血から回収することもでき、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）による刺激の後で、骨髄または臍帯血から回収することもできる。一態様では、免疫エフェクター細胞は、汎Ｔ細胞である。トランスフェクションまたは形質導入（例えば、ＣＡＲ発現構築物を用いる）の後、細胞を、速やかに輸注することができ、または凍結保存することができる。ある特定の態様では、トランスフェクションまたは形質導入後、細胞は、輸注の準備ができるまで、ＩＬ−２および／またはＩＬ−２１を含むことができるサイトカイン浴中に保存することができる。ある特定の態様では、トランスフェクション後、細胞は、細胞への遺伝子導入後、約１、２、３、４、５日間またはこれを超える日数以内に、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、バルク集団として、数日間、数週間、または数カ月間にわたり繁殖させることができる。さらなる態様では、トランスフェクションの後、トランスフェクト細胞を、クローニングし、組み込まれるか、またはエピソーム内に維持された、単一の発現カセットまたはプラスミドの存在、およびキメラ抗原受容体の発現を裏付けるクローンを、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて拡大増殖させる。拡大増殖のために選択されたクローンは、抗原を発現する標的細胞を特異的に認識し、溶解させる能力を裏付ける。組換えＴ細胞は、ＩＬ−２または共通のガンマ鎖に結合する他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、および他のサイトカイン）を伴う刺激により拡大増殖させることができる。組換えＴ細胞は、人工抗原提示細胞を伴う刺激により拡大増殖させることができる。組換えＴ細胞は、人工抗原提示細胞に接する形で拡大増殖させることもでき、Ｔ細胞表面上のＣＤ３を架橋する、ＯＫＴ３などの抗体により拡大増殖させることもできる。組換えＴ細胞のサブセットは、磁気ビーズベースの単離法および／または蛍光活性化細胞分取技術の使用により、さらに選択することができ、ＡａＰＣと共にさらに培養することができる。さらなる態様では、遺伝子改変細胞は、凍結保存することができる。
Ｔ細胞はまた、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、多数の供給源からも得ることができる。本発明の、ある特定の実施形態では、当技術分野において入手可能な、任意の数のＴ細胞株を使用することができる。本発明の、ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）分離など、当業者に公知の、任意の数の技法を使用して、対象から回収された血液単位から得ることができる。複数の実施形態では、個体の循環血液に由来する細胞は、アフェレーシスにより得る。アフェレーシス生成物は、典型的に、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を含有する。一実施形態では、アフェレーシスにより回収された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、細胞を、その語における加工ステップのために、適切な緩衝液中または培地中に入れる。本発明の一実施形態では、細胞を、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄する。代替的な実施形態では、洗浄液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠く場合もあり、全てではないが、多くの二価カチオンを欠く場合もある。カルシウムの非存在下における初期活性化ステップは、活性化の強化をもたらす。当業者がたやすく理解する通り、洗浄ステップは、製造元の指示書に従い、半自動式「フロースルー」型遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞プロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を使用することなど、当業者に公知の方法により達することができる。洗浄の後、細胞を、例えば、Ｃａ２＋非含有ＰＢＳ、Ｍｇ２＋非含有ＰＢＳ、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ、または緩衝液を伴うかもしくは伴わない、他の生理食塩液溶液など、様々な生体適合性の緩衝液中に再懸濁させることができる。代替的に、アフェレーシス試料の、所望されない構成要素を除去し、細胞を、培養培地中に、直接再懸濁させることもできる。
別の実施形態では、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）勾配を介する遠心分離、または対向流遠心溶出により、赤血球を溶解させ、単球を枯渇させることにより、Ｔ細胞を、末梢血リンパ球から単離する。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞など、Ｔ細胞の特異的亜集団も、陽性選択法または陰性選択法により、さらに単離することができる。別の実施形態では、ＣＤ１４＋細胞は、Ｔ細胞集団から枯渇される。例えば、一実施形態では、Ｔ細胞を、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔなどの、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）コンジュゲートビーズを伴う、所望のＴ細胞陽性選択に十分な時間にわたるインキュベーションにより単離する。一実施形態では、時間は、約３０分間である。さらなる実施形態では、時間は、３０分間〜３６時間、またはこれより長い時間、およびこれらの間の任意の整数値の時間の範囲である。さらなる実施形態では、時間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。さらに別の実施形態では、時間は、１０〜２４時間である。一実施形態では、インキュベーション時間は、２４時間である。白血病を伴う患者からのＴ細胞の単離ための、２４時間など、長いインキュベーション時間の使用は、細胞収率を増大させうる。腫瘍組織または免疫障害個体から、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する状況など、Ｔ細胞が、他の細胞型と比較して少数である、任意の状況においては、より長いインキュベーション時間を使用してＴ細胞を単離することができる。さらに、長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の捕捉効率も増加させうる。したがって、単に、時間を短くするかまたは長くすることにより、Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させることが可能となり、かつ／またはビーズの、Ｔ細胞に対する比（本明細書で、さらに記載される通り）を増加もしくは減少させることにより、Ｔ細胞の亜集団を、培養の開始時、もしくは工程中の他の時点において、優先的に、陽性もしくは陰性に選択することができる。加えて、ビーズ上または他の表面上の、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比を増加または減少させることにより、Ｔ細胞の亜集団を、培養の開始時、または他の所望の時点において、優先的に、陽性または陰性に選択することができる。当業者は、本発明の文脈では、複数ラウンドにわたる選択もまた、使用しうることを認識するであろう。ある特定の実施形態では、選択手順を実施し、「選択されなかった」細胞を、活性化工程および拡大増殖工程において使用することも所望でありうる。「選択されなかった」細胞はまた、さらなるラウンドにわたる選択にかけることもできる。
陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に固有の表面マーカーを指向する抗体の組合せにより達することができる。１つの方法は、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーを指向する、モノクローナル抗体のカクテルを使用する、細胞分取および／または陰性の磁気免疫接着もしくはフローサイトメトリーを介する選択である。例えば、ＣＤ４＋細胞を、陰性選択により濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的に、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。ある特定の実施形態では、典型的に、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、およびＦｏｘＰ３＋を発現する調節性Ｔ細胞を、濃縮または陽性選択することが所望でありうる。代替的に、ある特定の実施形態では、調節性Ｔ細胞を、抗ＣＤ２５コンジュゲートビーズまたは他の同様の選択法により枯渇させることができる。
陽性選択または陰性選択により、所望の細胞集団を単離するために、細胞の濃度および表面（例えば、ビーズなどの粒子）を変動させることができる。ある特定の実施形態では、ビーズと細胞とを、併せて混合する容量を著明に減少させて（すなわち、細胞の濃度を増加させて）、細胞とビーズとの最大の接触を確保することが所望でありうる。例えば、一実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞２０億個の濃度を使用する。一実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１０億個の濃度を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１億個を超える濃度を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万個の細胞濃度を使用する。さらに別の実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個の細胞濃度を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１億２５００万または１億５０００万個の濃度を使用しうる。高濃度の使用は、細胞の収量、細胞の活性化、および細胞の拡大増殖の増大を結果としてもたらしうる。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞、または多くの腫瘍細胞（すなわち、白血病性血液、腫瘍組織など）が存在する試料に由来する細胞など、目的の標的抗原の発現が低度でありうる細胞の、より効率的な捕捉を可能とする。このような細胞集団は、治療的価値を有する可能性があり、得ることが所望であろう。例えば、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８の発現が通常低度である、ＣＤ８＋Ｔ細胞の、より効率的な選択を可能とする。
関連する実施形態では、低濃度の細胞を使用することが所望でありうる。Ｔ細胞と表面（例えば、ビーズなどの粒子）との混合物を、著明に希釈することにより、粒子と細胞との相互作用を最小化する。これは、粒子に結合する、高量の所望の抗原を発現する細胞を選択する。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度のＣＤ８＋Ｔ細胞より効率的に捕捉される。一実施形態では、使用される細胞濃度は、１ｍｌ当たりの細胞５×１０６個である。他の実施形態では、使用される濃度は、１ｍｌ当たりの細胞約１×１０５個〜１ｍｌ当たりの細胞１×１０６個、およびこれらの間の任意の整数値でありうる。
他の実施形態では、細胞は、速度を変動させて、２〜１０℃または室温で、長さを変動させる時間にわたり、ロテーター上でインキュベートすることができる。
刺激されるＴ細胞はまた、洗浄ステップの後で、凍結させることもできる。血漿および血小板を除去する洗浄ステップの後で、細胞を、凍結用溶液中に懸濁させることができる。当技術分野では、多くの凍結用溶液および凍結パラメーターが公知であり、この文脈でも有用であろうが、１つの方法は、２０％のＤＭＳＯおよび８％のヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、もしくは１０％のデキストラン４０および５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン、ならびに７．５％のＤＭＳＯを含有する培養培地、もしくは３１．２５％のＰｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１．２５％の５％デキストロース、０．４５％のＮａＣｌ、１０％のデキストラン４０および５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン、ならびに７．５％のＤＭＳＯ、または例えば、ＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａを含有する、他の適切な細胞凍結用培地の使用を伴い、次いで、細胞を、１分間当たり１℃の速度で、−８０℃へと凍結させ、液体窒素保管タンクの蒸気相中で保存する。制御型凍結の他の方法を使用しうるほか、−２０℃または液体窒素中における速やかな非制御型凍結も使用しうる。ある特定の実施形態では、凍結保存された細胞を、本明細書で記載される通りに、融解させ、洗浄し、本発明の方法を使用する活性化の前に、室温で、１時間にわたり休眠させる。
ある特定の実施形態ではまた、本明細書で記載される、拡張細胞が必要とされうる時点より前の時期における、血液試料またはアフェレーシス生成物の、対象からの回収も提供される。したがって、拡大増殖させる細胞の供給源は、任意の必要な時点において回収することができ、Ｔ細胞など、所望の細胞を、本明細書で記載されるＴ細胞療法などのＴ細胞療法から利益を得る、任意の数の疾患または状態のためのＴ細胞療法におけるその後の使用のために、単離し、凍結させることができる。一実施形態では、血液試料またはアフェレーシスを、一般に、健常対象から採取する。ある特定の実施形態では、血液試料またはアフェレーシスを、一般に、疾患を発症する危険性があるが、疾患をいまだ発症していない健常対象から採取し、目的の細胞を、その後の使用のために単離し、凍結させる。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞を、その後の時点において、拡大増殖させ、凍結させ、使用することができる。ある特定の実施形態では、試料を、患者から、本明細書で記載される特定の疾患についての診断の直後であるが、任意の処置の前において回収する。さらなる実施形態では、細胞を、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸塩、およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、またはＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、および照射など、他の免疫除去剤などの薬剤による処置を含むがこれらに限定されない、任意の数の妥当な処置モダリティーの前に、対象に由来する血液試料またはアフェレーシスから単離する。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼである、カルシニューリン（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）を阻害するか、または、増殖因子誘導性シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Liu et al., Cell 66:807-815, (1991)、Henderson et al., Immun 73:316-321, (1991)、Bierer et al., Curr. Opin. Immun 5:763-773, (1993)）。さらなる実施形態では、細胞を、患者のために単離し、骨髄移植または幹細胞移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外部ビーム放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体を使用するＴ細胞除去療法を伴う（例えば、この前に、これと同時に、またはこの後で）その後の使用のために凍結させる。別の実施形態では、細胞を、あらかじめ単離し、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、ＲｉｔｕｘａｎなどのＢ細胞除去療法の後における処置のためのその後の使用のために凍結させることができる。
本発明の、さらなる実施形態では、Ｔ細胞を、処置後における患者から直接得る。この点で、ある特定のがん処置、特に、免疫系を損なう薬物による処置の後であって、患者が通常、処置から回復する期間中の、処置の直後である、処置の後において、得られるＴ細胞お品質は、最適でありうるか、またはｅｘ ｖｉｖｏにおいて拡大増殖するそれらの能力について改善されうることが観察されている。同様に、本明細書で記載される方法を使用する、ｅｘ ｖｉｖｏにおける操作の後、これらの細胞は、生着の延長、およびｉｎ ｖｉｖｏにおける拡大増殖に好ましい状態でありうる。したがって、本発明の文脈内では、この回復期において、Ｔ細胞、樹状細胞、または他の造血系列の細胞を含む血液細胞を回収することが想定される。さらに、ある特定の実施形態では、動員（例えば、ＧＭ−ＣＳＦによる動員）レジメンおよびコンディショニングレジメンを使用して、対象において、とりわけ、治療後における規定された時間窓において、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、および／またはぞうが好適となる条件を創出することができる。例示的な細胞型は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、および免疫系の他の細胞を含む。
Ｔ細胞の活性化および拡大増殖
本明細書で記載される、ＣＡＲを発現するようにＴ細胞を操作する前であれ後であれ、Ｔ細胞は、一般に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号明細書；同第６，５３４，０５５号明細書；同第６，９０５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同第５，８５８，３５８号明細書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６８１号明細書；同第７，１４４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同第７，１７２，８６９号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第５，８８３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同第６，７９７，５１４号明細書；同第６，８６７，０４１号明細書；および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号明細書において記載されている方法を使用して活性化させ、拡大増殖させることができる。
一般に、本明細書に記載されるＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤、およびＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドが接合している表面と接触させることによって拡大増殖される。特に、Ｔ細胞集団は、本明細書で記載される通り、表面上に固定化させた、抗ＣＤ３抗体、もしくはこの抗原結合性断片、または抗ＣＤ２抗体との接触、あるいはカルシウムイオノフォアを伴う、タンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触などにより刺激することができる。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子を共刺激するために、アクセサリー分子に結合するリガンドを使用する。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するために適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激するには、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。抗ＣＤ２８抗体の例は、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を含み、当技術分野で一般に公知の他の方法と同様に使用することができる（Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, (1998)、Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, (1999)、Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, (1999)）。
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞のための一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、異なるプロトコールによりもたらされる。例えば、各シグナルをもたらす薬剤は、溶液中とする場合もあり、表面へとカップリングさせる場合もある。表面へとカップリングさせる場合、薬剤は、同じ表面へとカップリングさせることもでき（すなわち、「シス」構成）、別個の表面へとカップリングさせることもできる（すなわち、「トランス」構成）。代替的に、１つの薬剤を、表面へとカップリングさせ、他の薬剤を、溶液中とすることもできる。一実施形態では、共刺激シグナルをもたらす薬剤を、細胞表面に結合させ、一次活性化シグナルをもたらす薬剤を、溶液とするか、または表面へとカップリングさせる。ある特定の実施形態では、いずれの薬剤も、溶液中とする。別の実施形態では、薬剤は、可溶性形態であることが可能であり、次いで、Ｆｃ受容体もしくは抗体、または薬剤に結合する他の結合剤を発現する細胞などの表面へと架橋される。この点で、本発明における、Ｔ細胞の活性化および拡大増殖における使用のために想定される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）については、例えば、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号明細書および同２００６００３４８１０号明細書を参照されたい。
一実施形態では、２つの薬剤を、同じビーズ上に、すなわち、「シス」であるか、または別個のビーズへと、すなわち、「トランス」である、ビーズ上に固定化させる。例を目的として述べると、一次活性化シグナルをもたらす薬剤は、抗ＣＤ３抗体またはこの抗原結合性断片であり、共刺激シグナルをもたらす薬剤は、抗ＣＤ２８抗体またはこの抗原結合性断片であり、両方の薬剤を、等分子量で、同じビーズへと、共固定化させる。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大増殖およびＴ細胞の増殖のために、ビーズへと結合させた各抗体の、１：１の比を使用する。本発明のある特定の態様では、ビーズへと結合させた抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比を、１：１の比を使用して観察される拡大増殖と比較した、Ｔ細胞の拡大増殖の増大が観察されるように使用する。特定の一実施形態では、１：１の比を使用して観察される拡大増殖と比較した、約１〜約３倍の増大が観察される。一実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１〜１：１００、およびこれらの間の全ての整数値の範囲である。本発明の一態様では、抗ＣＤ３抗体より多くの抗ＣＤ２８抗体を、粒子へと結合させる、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比は、１未満である。本発明のある特定の実施形態では、抗ＣＤ２８抗体の、ビーズへと結合させた抗ＣＤ３に対する比は、２：１を超える。特定の一実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：１００の比を使用する。別の実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：７５の比を使用する。さらなる実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：５０の比を使用する。別の実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：３０の比を使用する。複数の実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：１０の比を使用する。別の実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：３の比を使用する。さらに別の実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、３：１の比を使用する。
１：５００〜５００：１、およびこれらの間の任意の整数値である、粒子の、細胞に対する比を使用して、Ｔ細胞または他の標的細胞を刺激することができる。当業者がたやすく理解しうる通り、粒子の、細胞に対する比は、標的細胞と比べた粒子サイズに依存しうる。例えば、小型サイズのビーズが、少数の細胞だけに結合しうるのに対し、大型のビーズは、多くの細胞に結合しうるであろう。ある特定の実施形態では、細胞の、粒子に対する比は、１：１００〜１００：１、およびこれらの間の任意の整数値の範囲であり、さらなる実施形態では、比は、１：９〜９：１、およびこれらの間の任意の整数値を含み、これらもまた、Ｔ細胞を刺激するのに使用しうる。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８カップリング粒子の、Ｔ細胞に対する比であって、Ｔ細胞の刺激を結果としてもたらす比は、上記で言及した通り、変動しうるが、ある特定の値は、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、および１５：１を含み、１つの比は、少なくとも１：１のＴ細胞あたりの粒子（1:1 particles per T cells）である。一実施形態では、１：１またはこれ未満の、粒子の、細胞に対する比を使用する。特定の一実施形態では、粒子：細胞比は、１：５である。さらなる実施形態では、粒子の、細胞に対する比は、刺激日に応じて変動しうる。例えば、一実施形態では、粒子の、細胞に対する比は、１日目には、１：１〜１０：１であり、さらなる粒子を、細胞へと、その後、最長１０日間にわたり、毎日または隔日で追加し、最終的な比を１：１〜１：１０とする（追加日における細胞カウントに基づく）。特定の一実施形態では、粒子の、細胞に対する比は、第１の刺激日には、１：１であり、第３の刺激日および第５の刺激日には、１：５へと調整される。別の実施形態では、粒子を、１日目における、１：１の最終比、ならびに第３の刺激日および第５の刺激日における１：５へと、毎日または隔日で追加する。別の実施形態では、粒子の、細胞に対する比は、第１の刺激日には、２：１であり、第３の刺激日および第５の刺激日には、１：１０へと調整される。別の実施形態では、粒子を、１日目における、１：１の最終比、ならびに第３の刺激日および第５の刺激日における１：１０へと、毎日または隔日で追加する。当業者は、様々な他の比も、本発明における使用に適しうることを理解するであろう。特に、比は、粒子のサイズ、ならびに細胞のサイズおよび種類に応じて変動するであろう。
本明細書に記載されるさらなる実施形態では、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、薬剤コーティングビーズと組み合わせられ、その後、ビーズおよび細胞を分離し、次に、細胞を培養する。代替的な実施形態では、培養の前に、薬剤コーティングビーズと、細胞とを分離せず、併せて培養する。さらなる実施形態では、ビーズおよび細胞を、まず、磁力などの力を適用することにより濃縮する結果として、細胞表面マーカーのライゲーションの増加をもたらし、これにより、細胞の刺激を誘導する。
例を目的として述べると、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を接合させた常磁性ビーズ（３×２８ビーズ）を、Ｔ細胞に接触させることにより、細胞表面タンパク質をライゲーションさせることができる。一実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞１０４〜１０９個）と、ビーズ（例えば、比を１：１とする、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ常磁性ビーズ、またはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製のＭＡＣＳ（登録商標）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ）とを、緩衝液中、例えば、ＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムなどの二価カチオンを伴わない）中で組み合わせる。ここでもまた、当業者は、任意の細胞濃度を使用しうることをたやすく理解することができる。例えば、標的細胞は、試料中で極めて稀であり、試料のうちの０．０１％だけを含む場合もあり、全試料（すなわち、１００％）が、目的の標的細胞を含む場合もある。したがって、任意の細胞数が、本発明の文脈内にある。ある特定の実施形態では、粒子と細胞とを、併せて混合する容量を著明に減少させて（すなわち、細胞の濃度を増大させて）、細胞と粒子との最大の接触を確保することが所望でありうる。例えば、一実施形態では、約１ｍｌ当たりの細胞２０億個の濃度を使用する。別の実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１億個を超える濃度を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万個の細胞濃度を使用する。さらに別の実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個の細胞濃度を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１億２５００万または１億５０００万個の濃度を使用しうる。高濃度の使用は、細胞の収量、細胞の活性化、および細胞の拡大増殖の増大を結果としてもたらしうる。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞など、目的の標的抗原の発現が低度でありうる細胞の、より効率的な捕捉を可能とする。ある特定の実施形態では、このような細胞集団は、治療的価値を有する可能性があり、得ることが所望であろう。例えば、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８の発現が通常低度である、ＣＤ８＋Ｔ細胞の、より効率的な選択を可能とする。
本明細書で記載される、一実施形態では、混合物を、数時間（約３時間）〜約１４日間またはこれらの間の任意の整数値時間にわたり培養することができる。別の実施形態では、混合物を、２１日間にわたり培養することができる。本発明の一実施形態では、ビーズおよびＴ細胞を、併せて、約８日間にわたり培養する。別の実施形態では、ビーズおよびＴ細胞を、併せて、２〜３日間にわたり培養する。Ｔ細胞の培養期間が、６０日間またはこれを超えるように、数サイクルにわたる刺激もまた、所望でありうる。Ｔ細胞の培養に適切な条件は、増殖および生存に必要な因子であって、血清（例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ、およびＴＮＦ−アルファ、または当業者に公知である、細胞の増殖のための、他の任意の添加剤を含む因子を含有しうる、適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０、またはＸ−ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞の増殖のための、他の添加剤は、界面活性剤、プラズマネート、およびＮ−アセチルシステインおよび２−メルカプトエタノールなどの還元剤を含むがこれらに限定されない。培地は、ＲＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、アルファ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ １５およびＸ−Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ、アミノ酸の添加、ピルビン酸ナトリウム、ならびにビタミン、無血清もしくは適量の血清（または血漿）の補充、または規定されたセットのホルモン、ならびに／あるいはＴ細胞の増殖および拡大増殖に十分な量のサイトカインを含みうる。抗生剤、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養物に限り組み入れ、対象へと輸注される細胞培養物には組み入れない。標的細胞は、増殖を支援するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％のＣＯ２）下で維持する。
変動させる刺激時間へと曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を呈しうる。例えば、典型的な血液生成物またはアファレーシスされた末梢血単核細胞生成物は、細胞傷害性Ｔ細胞集団またはサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）より多くのヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３受容体およびＣＤ２８受容体を刺激することによる、ｅｘ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の拡大増殖は、約８〜９日目の前には、主にＴＨ細胞からなるが、約８〜９日目の後では、ますます多くのＴＣ細胞の集団を含むＴ細胞の集団をもたらす。したがって、処置の目的に応じて、対象に、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を輸注することも、有利でありうる。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットを単離した場合、このサブセットを、より大きな程度で拡大増殖させることが有益でありうる。
さらに、ＣＤ４マーカーおよびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーも、著明に変動するが、大部分は、細胞拡大増殖工程の経過中において、再現可能な形で変動する。したがって、このような再現性は、特殊な目的のためのＴ細胞生成物の活性化を調整する能力を可能とする。
場合によって、実施形態の免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を、ＡａＰＣ （ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）と共に共培養して、細胞の拡大増殖を支援する。ＡａＰＣはまた、人工抗原提示細胞（ＡａＰＣ）と称することもできる。例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、実施形態の治療用組成物および細胞療法用生成物の調製において有用である。一態様では、ＡａＰＣは、遺伝子改変Ｋ５６２細胞でありうる。抗原提示系の調製および使用に関する、一般的な指針については、例えば、それらの各々が参照により組み込まれる、米国特許第６，２２５，０４２号明細書、同第６，３５５，４７９号明細書、同第６，３６２，００１号明細書、および同第６，７９０，６６２号明細書、米国特許出願公開第２００９／００１７０００号明細書および同第２００９／０００４１４２号明細書、ならびに国際公開第２００７／１０３００９号パンフレットを参照されたい。実施形態についてのなおさらなる態様では、遺伝子改変ＣＡＲ細胞の培養は、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞の拡大増殖を刺激する、樹状細胞またはＡａＰＣ （ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）の存在下で、遺伝子改変ＣＡＲ細胞を培養することを含む。なおさらなる態様では、ＡａＰＣは、ＡａＰＣの表面上で発現したＣＡＲ結合性抗体またはこの断片を含む。ＡａＰＣは、場合によって、Ｔ細胞を活性化させるかまたは共刺激する、さらなる分子を含みうる。さらなる分子は、場合によって、膜結合型Ｃγサイトカインを含みうる。なおまださらなる態様では、ＡａＰＣは、不活化させているかもしくは照射されているか、または感染性物質について調べられ、これを含まないことが確認されている。なおさらなる態様では、ＡａＰＣの存在下における遺伝子改変ＣＡＲ細胞の培養は、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、および／またはＩＬ−２などの可溶性サイトカインを含む培地中で、遺伝子改変ＣＡＲ細胞を培養することを含む。細胞を、約１０：１〜約１：１０、約３：１〜約１：５、約１：１〜約１：３（免疫エフェクター細胞対ＡａＰＣ）、またはこの中で導出可能な任意の範囲の比で培養することができる。例えば、Ｔ細胞およびＡａＰＣの共培養は、約１：１、約１：２または約１：３の比でありうる。
一態様では、ＡａＰＣは、ＣＤ１３７Ｌを発現することができる。一部の実施形態では、ＡａＰＣは、さらに、ＣＡＲ細胞によってターゲティングされる抗原、例えば、ＲＯＲ−１（全長、切断型またはその任意の変異体）を発現することができる。他の態様では、ＡａＰＣは、ＣＤ６４、ＣＤ８６、またはｍＩＬ１５をさらに発現することができる。ある特定の態様では、ＡａＰＣは、少なくとも１つの抗ＣＤ３抗体クローン、例えば、ＯＫＴ３および／またはＵＣＨＴ１を発現することができる。一態様では、ＡａＰＣは、不活化され（例えば、照射され）うる。一態様では、ＡａＰＣは、感染性物質について調べられ、これを含まないことが確認されている場合がある。当技術分野では、このようなＡａＰＣを作製するための方法が公知である。一態様では、ＡａＰＣを伴うＣＡＲ改変Ｔ細胞集団の培養は、細胞を、約１０：１〜約１：１０、約３：１〜約１：５、約１：１〜約１：３（Ｔ細胞対ＡａＰＣ）、またはこの中で導出可能な任意の範囲の比で培養することを含みうる。例えば、Ｔ細胞およびＡａＰＣの共培養は、約１：１、約１：２または約１：３の比でありうる。一態様では、培養するステップは、アミノビスホスホネート（例えば、ゾレドロン酸）と共に培養することをさらに含みうる。
一態様では、遺伝子改変ＣＡＲ細胞の集団は、対象に速やかに輸注されるか、または凍結保存される。別の態様では、遺伝子改変ＣＡＲ細胞の集団は、対象に輸注する前にサイトカイン浴に置かれる。さらなる態様では、遺伝子改変ＣＡＲ細胞の集団は、１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８、３５、４２日、４９、５６、６３または７０日を超えない期間、培養および／または刺激される。ある実施形態では、刺激は、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の増殖を促進するために、遺伝子改変ＣＡＲ Ｔ細胞とＡａＰＣｓとの共培養を含む。別の態様では、遺伝子改変ＣＡＲ細胞の集団を、刺激１回、刺激２回、刺激３回、刺激４回、刺激５回、刺激５回、刺激６回、刺激７回、刺激８回、刺激９回、または刺激１０回を超えない回数にわたり刺激する。場合によって、遺伝子改変細胞を、ＡａＰＣの存在下にあるｅｘ ｖｉｖｏでは培養しない。一部の特殊な場合には、実施形態の方法は、トランスフェクションステップおよび／または培養するステップの後で、細胞集団を、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）について濃縮するステップをさらに含む。濃縮するステップは、ＣＡＲを発現する細胞について分取するための蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を含みうる。さらなる態様では、ＣＡＲを発現する細胞について分取することは、ＣＡＲ結合性抗体の使用を含む。濃縮するステップはまた、ＣＤ５６＋細胞の枯渇も含みうる。実施形態についての、なおまださらなる態様では、方法は、遺伝子改変ＣＡＲ細胞の集団についての凍結保存試料をさらに含む。
場合によって、ＡａＰＣを、さらなるプロセシングを伴わずに、ペプチドの、ＭＨＣ分子との直接的な結合を可能とする、最適な長さのペプチドと共にインキュベートする。代替的に、細胞は、目的の抗原（すなわち、ＭＨＣ非依存型の抗原認識の場合）を発現しうる。さらに、場合によって、ＡＰＣは、特異的なＣＡＲポリペプチドまたは一般的なＣＡＲポリペプチド（例えば、ｕＡａＰＣ（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）に結合する抗体を発現しうる。このような方法については、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／１９０２７３号パンフレットにおいて開示されている。ペプチド−ＭＨＣ分子または目的の抗原に加えて、ＡａＰＣ系はまた、少なくとも１つの外因性支援分子も含みうる。任意の適切な数および組合せの支援分子を利用することができる。支援分子は、共刺激分子および接着分子などの支援分子から選択することができる。例示的な共刺激分子は、ＣＤ７０およびＢ７．１（Ｂ７．１は、かつては、Ｂ７として公知であり、また、ＣＤ８０としても公知であった）を含み、これらは、とりわけ、Ｔ細胞の表面上のＣＤ２８分子および／またはＣＴＬＡ−４分子に結合し、これにより、例えば、Ｔ細胞の拡大増殖、Ｔｈ１の分化、短期的なＴ細胞の生存、およびインターロイキン（ＩＬ）２など、サイトカインの分泌に影響を及ぼす。接着分子は、セレクチンなどの炭水化物結合性糖タンパク質、インテグリンなどの膜貫通結合生糖タンパク質、カドヘリンなどのカルシウム依存性タンパク質、および例えば、細胞間または細胞−マトリックス間の接触を促進する、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）などの、１回膜貫通免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリータンパク質を含みうる。例示的な接着分子は、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１などのＩＣＡＭ、を含む。共刺激分子および接着分子を含む、例示的な支援分子の選択、クローニング、調製、および発現に有用な技法、方法、および試薬については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２２５，０４２号明細書、同第６，３５５，４７９号明細書、および同第６，３６２，００１号明細書において例示されている。
ＡａＰＣとなるように選択される細胞は、好ましくは、細胞内抗原プロセシング、細胞内ペプチドトラフィッキング、および／またはＭＨＣクラスＩ分子もしくはクラスＩＩ分子の細胞内ペプチドローディングを欠損させているか、あるいは。変温性（すなわち、哺乳動物細胞株より、温度刺激に対する感受性が小さい）であるか、あるいは欠損および変温特性の両方を有する。好ましくは、ＡａＰＣとなるように選択される細胞はまた、細胞へと導入される、外因性のＭＨＣクラスＩ分子またはクラスＩＩ分子、および支援分子の構成要素に対する、少なくとも１つの内因性対応物（例えば、内因性のＭＨＣクラスＩ分子もしくはクラスＩＩ分子、および／または上記で記載した内因性支援分子）を発現する能力も欠く。さらに、ＡａＰＣは、ＡａＰＣを作出するための、それらの改変の前に、細胞が保有していた欠損および変温特性を保持することが好ましい。例示的なＡａＰＣは、昆虫細胞株など、ＴＡＰ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）欠損細胞株を構成するか、またはこれに由来する。例示的な変温性昆虫細胞株は、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ２細胞株などのショウジョウバエ（Drosophila）属細胞株（例えば、Schneider 1972を参照されたい）である。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ２細胞の調製、増殖、および培養のための例示的な方法は、米国特許第６，２２５，０４２号明細書、同第６，３５５，４７９号明細書、および同第６，３６２，００１号明細書において提示されている。
一実施形態ではまた、ＡａＰＣを、凍結融解サイクルにもかける。例示的な凍結融解サイクルでは、凍結が、迅速に生じるように、ＡａＰＣを含有する、適切なレセプタクルを、適量の液体窒素、固体二酸化炭素（すなわち、ドライアイス）、または同様の低温材料と接触させることにより、ＡａＰＣを凍結させることができる。次いで、凍結させたＡＰＣを、ＡａＰＣの、低温材料からの摘出、および周囲の室温条件への曝露により、または微温水浴もしくは手の温熱を利用して、融解時間の短縮を促進する、促進融解工程により融解させる。加えて、融解の前に、ＡａＰＣを、凍結させ、長ｆ時間にわたり保存することができる。凍結させたＡａＰＣはまた、融解させ、次いで、さらなる使用の前に、凍結乾燥させることもできる。好ましくは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、および他の保存剤など、凍結融解手順に有害な影響を及ぼしうる保存剤は、凍結融解サイクルを経るＡａＰＣを含有する培地には非含有とするか、またはこのような保存剤を本質的に欠く培地へのＡａＰＣの導入などにより、本質的に除去する。
さらなる実施形態では、不活化の後で、細胞の増殖、複製、または核酸の発現が本質的に生じないように、異種核酸およびＡａＰＣに内因性の核酸を、架橋により不活化させることができる。一実施形態では、ＡａＰＣを、外因性ＭＨＣおよび支援分子の発現、このような分子の、ＡａＰＣ表面上の提示、ならびに提示されたＭＨＣ分子への、選択された、１または複数のペプチドのローディングの後の時点において不活化させる。したがって、このような、選択されたペプチドをロードした不活化ＡａＰＣは、増殖または複製が本質的に不可能とされているが、選択されたペプチドの提示機能は保持する。好ましくは、架橋はまた、ＡａＰＣの抗原提示細胞機能を、実質的に低下させずに、細菌およびウイルスなどの汚染微生物を本質的に含まない、ＡａＰＣももたらす。したがって、架橋は、ＡａＰＣを使用して開発される細胞療法製品の安全性に関する懸念を軽減する一助となる一方、重要なＡａＰＣ機能を維持する。架橋およびＡａＰＣに関する方法については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９００１７０００号明細書を参照されたい。
ある特定の実施形態では、操作抗原提示細胞（ＡＰＣ）がさらに提供される。ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、免疫エフェクター細胞を繁殖させるのに、このような細胞を、例えば、上記で記載した通りに使用することができる。さらなる態様では、操作ＡＰＣ自体を、患者へと投与し、これにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおける免疫エフェクター細胞の拡大増殖を刺激することができる。実施形態の操作ＡＰＣ自体を、治療剤として使用することができる。他の実施形態では、操作ＡＰＣを、標的抗原に特異的な内因性免疫エフェクター細胞の活性化を刺激し、かつ／または標的抗原に特異的な、養子導入された免疫エフェクター細胞の活性を増加させるか、もしくは存続を延長しうる治療剤として使用することができる。
本明細書で使用される「操作ＡＰＣ」という用語は、少なくとも第１のトランス遺伝子を含み、第１のトランス遺伝子が、ＨＬＡをコードする細胞を指す。このような操作ＡＰＣは、抗原が、ＨＬＡと複合したＡＰＣの表面上に提示されるように、抗原の発現のための第２のトランス遺伝子をさらに含みうる。一部の態様では、操作ＡＰＣは、抗原を提示した細胞型（例えば、樹状細胞）でありうる。さらなる態様では、操作ＡＰＣは、Ｔ細胞またはＴ細胞の前駆細胞など、通常、抗原を提示しない細胞型（「Ｔ−ＡＰＣ」と称する）から作製することができる。したがって、一部の態様では、実施形態の操作ＡＰＣは、ＨＬＡが、標的抗原のエピトープと複合した操作ＡＰＣの表面上で発現するように、標的抗原をコードする第１のトランス遺伝子と、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）をコードする第２のトランス遺伝子とを含む。ある特定の具体的な態様では、操作ＡＰＣ内で発現するＨＬＡは、ＨＬＡ−Ａ２である。
一部の態様では、実施形態の操作ＡＰＣは、共刺激分子をコードする、少なくとも第３のトランス遺伝子をさらに含みうる。共刺激分子は、膜結合型Ｃγサイトカインでありうる、共刺激サイトカインでありうる。ある特定の態様では、共刺激サイトカインは、膜結合型ＩＬ−１５などのＩＬ−１５である。一部のさらなる態様では、操作ＡＰＣは、編集（または欠失）遺伝子を含みうる。例えば、ＰＤ−１、ＬＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、またはＴＣＲなどの阻害性遺伝子は、遺伝子の発現を低減するかまたは消失させるように編集することができる。実施形態の操作ＡＰＣは、任意の目的の標的抗原をコードするトランス遺伝子をさらに含みうる。
ＰＯＣ（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）
本開示の一実施形態では、本明細書で記載される免疫エフェクター細胞を、ＰＯＣ（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）施設で改変する。場合によって、改変免疫エフェクター細胞は、操作Ｔ細胞とも呼ばれる。場合によって、ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ施設は、処置を必要とする対象の近隣の病院または機関（例えば、医療機関）にある。対象は、アフェレーシスおよび末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を受けるか、またはＰＢＭＣのサブ集団を、例えば、湿式分級またはフィコール分離によって濃縮することができる。濃縮されたＰＢＭＣまたはＰＢＭＣの亜集団は、さらなる処理の前に、任意の適切な凍結保存溶液中で凍結保存されうる。１つの場合には、ヒト血清アルブミンを含有する緩衝液を使用して、湿式分級工程を実施する。Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、本明細書で記載される選択法により単離することができる。１つの場合には、Ｔ細胞についての選択法は、Ｔ細胞上のＣＤ３に特異的なビーズまたはＣＤ４およびＣＤ８に特異的なビーズを含む。１つの場合には、ビーズは、常磁性ビーズでありうる。採取された免疫エフェクター細胞は、改変の前に、任意の適切な低温保存用溶液中で低温保存することができる。免疫エフェクター細胞は、輸注に先立ち、最大で２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、または９６時間にわたり融解させることができる。融解された細胞は、改変の前に、細胞培養緩衝液、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）もしくはヒト血清ＡＢを補充した細胞培養緩衝液（例えば、ＲＰＭＩ）に入れるか、またはＩＬ−２およびＩＬ−２１などのサイトカインを含む緩衝液に入れることができる。別の態様では、採取された免疫エフェクター細胞は、低温保存を必要とせずに、速やかに改変することができる。
場合によって、キメラ受容体、１もしくは複数の細胞タグ、および／またはサイトカインを、免疫エフェクター細胞へと操作／導入することにより、免疫エフェクター細胞を改変し、次いで、対象へと、迅速に輸注する。場合によって、免疫エフェクター細胞の供給源は、同種供給源および自家供給源の両方を含みうる。１つの場合には、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞でありうる。１つの場合には、キメラ受容体は、ＲＯＲ−１ ＣＡＲでありうる。別の場合には、サイトカインは、ｍｂＩＬ−１５でありうる。１つの場合には、ｍｂＩＬ−１５は、配列番号１１３のｍｂＩＬ−１５、またはこの変異体もしくは断片である。さらに別の場合には、ｍｂＩＬ−１５の発現は、本明細書で記載される、リガンド誘導性遺伝子スイッチ発現系によりモジュレートされる。例えば、ベレジメクスなどのリガンドを、対象へと送達して、ｍｂＩＬ−１５の発現をモジュレートすることができる。別の例では、サイトカインはＩＬ−１２でありうる。さらに別の場合では、ＩＬ−１２の発現は、本明細書に記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチ発現系によってモジュレートされる。例えば、ベレジメクスなどのリガンドを対象に送達して、ＩＬ−１２の発現をモジュレートすることができる。
別の態様では、ベレジメクスを、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、または１００ｍｇで施す。さらなる態様では、低用量のベレジメクスを、例えば、０．５ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、または２０ｍｇで施す。一実施形態では、ベレジメクスを、改変免疫エフェクター細胞を輸注する０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１日前に、対象へと投与する。さらなる実施形態では、ベレジメクスを、改変免疫エフェクター細胞の輸注後、有効期間にわたり、約１２時間ごとに１回、約２４時間ごとに１回、約３６時間ごとに１回、または約４８時間ごとに１回、対象へと投与する。一実施形態では、ベレジメクス投与のための有効期間は、約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日間である。他の実施形態では、休薬期間後の休眠期間の後、または対象が、再発を被る場合に、ベレジメクスを再投与することができる。
対象に対する副作用が観察されるか、または処置が必要とされない、ある特定の場合には、例えば、セツキシマブを介して、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、改変免疫エフェクター細胞の、条件付けアブレーションのために、本明細書で記載される切断型上皮増殖因子受容体タグなどの細胞タグを含む細胞タグを活性化させることができる。
一部の実施形態では、このような免疫エフェクター細胞を、図１〜２に記載される構築物により、電気穿孔を介して改変する。１つの場合には、電気穿孔を、Ｌｏｎｚａ製のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）電気穿孔器などの電気穿孔器により実施する。他の実施形態では、上述の構築物を含むベクターは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターである。１つの場合には、非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン−トランスポザーゼ系を含む。１つの場合には、特異的配列を使用して、免疫エフェクター細胞に電気穿孔する。例えば、免疫エフェクター細胞に、１つのトランスポゾンに続く、トランスポザーゼをコードするＤＮＡに続く、第２のトランスポゾンを電気穿孔することができる。別の場合には、免疫エフェクター細胞に、全てのトランスポゾンと、トランスポザーゼとを、同時に電気穿孔することができる。別の場合には、免疫エフェクター細胞に、トランスポザーゼに続き、両方のトランスポゾンまたは１つのトランスポゾンを、同時に電気穿孔することができる。逐次的な電気穿孔を経ながら、免疫エフェクター細胞を、次の電気穿孔ステップの前に、ある時間にわたり、休眠させることができる。
場合によって、改変免疫エフェクター細胞は、繁殖ステップおよび活性化ステップを経ない。場合によって、改変免疫エフェクター細胞は、インキュベーションステップまたは培養ステップ（例えば、ｅｘ ｖｉｖｏにおける繁殖）を経ない。ある特定の場合には、輸注の前に、改変免疫エフェクター細胞を、ＩＬ−２およびＩＬ２１を含む緩衝液に入れる。他の場合には、輸注の前に、改変免疫エフェクター細胞を、細胞培養緩衝液、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充した細胞培養緩衝液（例えば、ＲＰＭＩ）に入れるか、またはこの中で休眠させる。輸注の前に、改変免疫エフェクター細胞を、採取し、洗浄し、生理食塩緩衝液中で、対象への輸注のための調製物に製剤化することができる。
１つの場合には、輸注の前に、対象を、リンパ枯渇させている。他の場合には、リンパ枯渇は、必要とされず、改変免疫エフェクター細胞は、対象へと、迅速に、輸注される。例示的なリンパ枯渇レジメンを、下記の表２および３に一覧する。
Figure 2021530217
Figure 2021530217
さらなる場合には、対象は、最小リンパ枯渇を受ける。本明細書における最小リンパ枯渇とは、リンパ枯渇レジメン後１日、２日、または３日以内に対象に輸注しうるような、低減型リンパ枯渇プロトコールを指す。１つの場合には、低減型リンパ枯渇プロトコールは、低用量のフルダラビンおよび／またはシクロホスファミドを含みうる。別の場合には、低減型リンパ枯渇プロトコールは、短期間、例えば、１日間または２日間にわたるリンパ枯渇を含みうる。
一実施形態では、キメラ受容体およびサイトカインを、免疫エフェクター細胞へと操作／導入することにより、免疫エフェクター細胞を改変し、次いで、対象へと、迅速に輸注する。他の場合には、キメラ受容体およびサイトカインを、細胞へと操作／導入することにより、免疫エフェクター細胞を改変し、次いで、少なくとも０、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３，２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０時間以内に、対象へと輸注する。他の場合には、キメラ受容体およびサイトカインを、免疫エフェクター細胞へと操作／導入することにより、免疫エフェクター細胞を改変し、次いで、０日間、＜１日間、＜２日間、＜３日間、＜４日間、＜５日間、＜６日間、または＜７日間以内に、対象へと輸注する。
一部の実施形態では、ある量の改変エフェクター細胞を、それを必要とする対象へと投与し、その量を、有効性およびサイトカイン関連毒性を誘導する潜在的可能性に基づき決定する。別の実施形態では、改変エフェクター細胞は、ＣＡＲ＋細胞およびＣＤ３＋細胞である。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０４〜約１０９個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０４〜約１０５個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０５〜約１０６個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０６〜約１０７個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞＞１０４個、かつ、≦約１０５個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞＞１０５個、かつ、≦約１０６個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞＞１０６個、かつ、≦約１０７個を含む。
一実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、腫瘍組織への直接的な局所送達を介してがんにターゲティングされる。例えば、卵巣がんでは、改変免疫エフェクター細胞を、腹膜腔内（ＩＰ）経路で腹腔内に、または腹膜腔内に送達することができる。このようなＩＰ送達は、化学療法剤の送達のために配置されたポートまたは既存のポートを介して行うことができる。改変免疫エフェクター細胞の局所送達の他の方法には、切除腔内へのカテーテル注入、超音波ガイド下腫瘍内注入、肝動脈注入または胸膜内送達が含まれうる。
一実施形態では、それを必要とする対象は、ＩＰを介して送達された改変免疫エフェクター細胞の第１の用量で治療を開始し、ＩＶを介して送達された改変免疫エフェクター細胞の第２の用量を続けることができる。さらなる実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の第２の用量の後に、ＩＶまたはＩＰを介して送達することができる次の用量を続けることができる。一実施形態では、第１の投与量と第２の投与量またはさらにその後の投与量との間の期間は、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日間でありうる。一実施形態では、第１の投与量と第２の投与量またはさらにその後の投与量との間の期間は、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６カ月でありうる。別の実施形態では、第１の投与量と第２の投与量またはさらにその後の投与量との間の期間は、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０年間でありうる。
別の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０用量の改変免疫エフェクター細胞をさらに投与するために、カテーテルを腫瘍または転移部位に配置することができる。場合によって、改変エフェクター細胞の用量は、約１０２〜約１０９の改変エフェクター細胞／ｋｇを含むことができる。毒性が観察される場合、改変エフェクター細胞の用量は、約１０２〜約１０５の改変エフェクター細胞／ｋｇを含むことができる。場合によって、改変エフェクター細胞の用量は、約１０２の改変エフェクター細胞／ｋｇで開始することができ、その後の用量は、約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８または１０９の改変エフェクター細胞／ｋｇまで増加させることができる。
他の実施形態では、操作細胞の増殖および／または生存を刺激する方法は、細胞試料を、対象から得るステップと、細胞試料の細胞に、１または複数のトランスポゾンを含む、１または複数のポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップとを含む。一実施形態では、トランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、および前記１または複数のポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムへと組み込んで、操作細胞の集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼをコードする。ある実施形態では、トランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、および前記１または複数のポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムへと組み込んで、操作細胞の集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼをコードする。ある実施形態では、遺伝子スイッチポリペプチドは、ｉ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｉｉ）第２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、第２の遺伝子スイッチポリペプチドとは、リンカーにより接続されている。１つの場合には、操作細胞の、対象への投与の前に、リンパ枯渇が必要とされない。
１つの場合には、操作細胞をｉｎ ｖｉｖｏで繁殖させる方法は、対象から細胞の試料を得、および１または複数のトランスポゾンを含む１または複数のポリヌクレオチドを、細胞の試料の細胞にトランスフェクトすることを含む。一実施形態では、トランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、および前記１または複数のポリヌクレオチドを前記細胞のゲノムに統合するのに有効なトランスポザーゼをコードし、操作細胞の集団を提供する。ある実施形態では、トランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、および前記１または複数のポリヌクレオチドを前記細胞のゲノムに統合するのに有効なトランスポザーゼをコードし、操作細胞の集団を提供する。ある実施形態では、遺伝子スイッチポリペプチドは、ｉ）第１の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたＤＮＡ結合ドメインを含む第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｉｉ）第２の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の遺伝子スイッチポリペプチドおよび第２の遺伝子スイッチポリペプチドは、リンカーによって接続される。１つの場合には、対象への操作細胞の投与前にリンパ球枯渇は必要とされない。
別の実施形態では、それを必要とする対象の、ｉｎ ｖｉｖｏにおける操作細胞の存続を増強する方法は、細胞試料を、対象から得るステップと、細胞試料の細胞に、１または複数のトランスポゾンを含む、１または複数のポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップとを含む。場合によって、１または複数のトランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、およびＤＮＡを前記細胞のゲノムに組み込むのに有効なトランスポザーゼをコードし、操作細胞の集団を提供する。場合によって、１または複数のトランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、およびＤＮＡを前記細胞のゲノムに組み込むのに有効なトランスポザーゼをコードし、操作細胞の集団を提供する。場合によって、遺伝子スイッチポリペプチドは、ｉ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｉｉ）第２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、第２の遺伝子スイッチポリペプチドとは、リンカーにより接続されている。１つの場合には、操作細胞の、対象への投与の前に、リンパ枯渇が必要とされない。
別の実施形態では、充実性腫瘍を伴う対象を処置する方法は、細胞試料を、対象から得るステップと、試料の細胞に、１または複数のトランスポゾンを含む、１または複数のポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップと、操作細胞の集団を、対象へと投与するステップとを含む。１つの場合には、操作細胞の、対象への投与の前に、リンパ枯渇が必要とされない。場合によって、１または複数のトランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、およびＤＮＡを細胞のゲノムに組み込むのに有効なトランスポザーゼをコードする。場合によって、１または複数のトランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、およびＤＮＡを細胞のゲノムに組み込むのに有効なトランスポザーゼをコードする。場合によって、遺伝子スイッチポリペプチドは、ｉ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｉｉ）第２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、第２の遺伝子スイッチポリペプチドとは、リンカーにより接続されている。場合によって、細胞は、電気穿孔を介してトランスフェクトされる。場合によって、遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターによりモジュレートされる。場合によって、プロモーターは、組織特異的プロモーターもしくはＥＦ１Ａプロモーター、またはこれらの機能的な変異体である。場合によって、組織特異的プロモーターは、Ｔ細胞特異的応答エレメントまたはＮＦＡＴ応答エレメントを含む。場合によって、サイトカインは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒ、またはＩＬ−１５変異体の融合体のうちの少なくとも１つを含む。場合によって、サイトカインは、分泌形態にある。場合によって、サイトカインは、膜結合形態にある。場合によって、細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞、またはＴ細胞前駆細胞である。場合によって、細胞は、対象へと（例えば、対象に、操作細胞を輸注することにより）投与される。場合によって、方法は、有効量のリガンド（例えば、ベレジメクス）を投与して、サイトカインの発現を誘導するステップをさらに含む。場合によって、ＣＡＲは、少なくともＲＯＲ１に結合することが可能である。場合によって、トランスポザーゼは、サケ科型Ｔｃ１様トランスポザーゼである。場合によって、トランスポザーゼは、ＳＢ１１またはＳＢ１００ｘトランスポザーゼである。他の場合には、トランスポザーゼはＰｉｇｇｙＢａｃである。場合によって、細胞タグは、ＨＥＲ１切断型変異体またはＣＤ２０切断型変異体のうちの少なくとも１つを含む。
治療適用
本明細書に記載される実施形態では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンおよびＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼで形質導入された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）である。例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンまたは複数のトランスポゾンは、ＲＯＲ−１の抗原認識ドメインと、ＣＤ８アルファヒンジおよびその変異体のスペーサー、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ２８、４−１ＢＢの細胞内ドメイン、またはそれらの任意の組合せ、および細胞内ドメインＣＤ３ゼータ、１または複数の細胞タグ、１または複数のサイトカイン、および任意選択で、本明細書に記載される遺伝子スイッチシステムの構成要素を組み合わせるＣＡＲを含むことができる。したがって、場合によって、形質導入されたＴ細胞は、ＣＡＲを媒介するＴ細胞応答を誘発することができる。
本明細書中に記載される複数の実施形態では、初代Ｔ細胞の特異性を、ＲＯＲ−１表面抗原にリダイレクトするためのＣＡＲの使用が提供される。したがって、本発明はまた、哺乳動物において標的細胞集団または組織に対するＴ細胞媒介性免疫応答を刺激する方法を提供し、ＣＡＲを発現するＴ細胞を哺乳動物に投与する工程を含み、ＣＡＲは、ＲＯＲ−１と特異的に相互作用する結合部分、スペーサー、例えば、ヒトＣＤ３ゼータの細胞内ドメインを含むゼータ鎖部分、および共刺激性シグナル伝達領域を含む。
一実施形態では、本開示は、本発明のＲＯＲ−１特異的ＣＡＲを発現するようにＴ細胞を遺伝子改変し、ＣＡＲ Ｔ細胞を、それを必要とするレシピエントに輸注する細胞治療を含む。輸注された細胞は、レシピエントにおいてＲＯＲ−１を過剰発現する細胞を殺滅することができる。抗体療法とは異なり、本明細書に記載されるＣＡＲ Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで複製することができ、その結果、腫瘍細胞に持続的な効果をもたらすことができる長期持続性をもたらす。
本発明は、さらに、対象におけるＲＯＲ−１の過剰発現を含む疾患を検出する方法を提供し、ａ）対象からの試料、およびｉｉ）本明細書に記載される抗体、またはその抗原結合断片のうちのいずれか１または複数を用意する工程、ｂ）抗体とその抗原との特異的結合の条件下で、試料を抗体と接触させる工程、およびｃ）疾患を欠く対照試料と比較して、試料への抗体の結合の増加したレベルを検出し、それによって対象における疾患を検出する工程を含む。一実施形態では、疾患はがんである。好ましい実施形態では、がんは、卵巣がんおよび乳がんの群から選択される。検出方法を限定する意図はないが、一実施形態では、試料への抗体の結合を検出することは、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、および／または放射線イメージングである。
また、本明細書では、ＲＯＲ−１の過剰発現を含む疾患を治療するための方法が提供され、本明細書に記載される、治療有効量の、抗体、またはその抗原結合断片のうちのいずれか１または複数を、疾患を有する対象に投与することを含む。一実施形態では、疾患は、卵巣がんおよび乳がんに例示されるように、がんである。
一実施形態では、本明細書に記載されるＲＯＲ−１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで頑強なＴ細胞拡大増殖を受けることができ、長期間持続することができる。別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ Ｔ細胞は、再活性化されうる特異的なメモリーＴ細胞に進化しうる。
本明細書に記載されるＣＡＲ改変Ｔ細胞はまた、哺乳動物におけるｅｘ ｖｉｖｏ免疫化および／またはｉｎ ｖｉｖｏ療法のためのワクチンの種類として役立つことができる。複数の実施形態では、哺乳動物はヒトである。ｅｘ ｖｉｖｏ免疫化に関して、免疫エフェクター細胞を哺乳動物に投与する前に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、以下：ｉ）細胞の拡大増殖、ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸の細胞への導入、および／またはｉｉｉ）細胞の凍結保存のうちの少なくとも１つが起こる。
ｅｘ ｖｉｖｏ法は周知であり、以下に詳細に検討する。略述すると、細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト）から単離され、本明細書に開示されるＣＡＲを発現するベクターで遺伝子改変される（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入またはトランスフェクションされる）。ＣＡＲ改変細胞は、治療的利益を提供するために哺乳動物レシピエントに投与することができる。哺乳動物レシピエントはヒトであり得、ＣＡＲ改変細胞は、レシピエントに対して自家でありうる。あるいは、細胞は、レシピエントに対して、同種、同系または異種でありうる。
造血幹細胞および前駆細胞のｅｘ ｖｉｖｏ拡大増殖のための手法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，１９９，９４２号明細書に記載され、本発明の細胞に適用することができる。他の適切な方法が当該技術分野において公知であり、したがって、本発明は、細胞のｅｘ ｖｉｖｏ拡大増殖の任意の特定の方法に限定されない。略述すると、ｅｘ ｖｉｖｏ培養およびＴ細胞の拡大増殖は、（１）末梢血採取または骨髄外移植片から、哺乳動物由来のＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞を回収する工程と、（２）このような細胞をｅｘ ｖｉｖｏで拡大増殖させる工程とを含む。米国特許第５，１９９，９４２号明細書に記載される細胞増殖因子に加えて、ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３およびｃ−ｋｉｔリガンドなどの他の因子を、細胞の培養および拡大増殖のために使用することができる。
ｅｘ ｖｉｖｏ免疫化に関して細胞ベースのワクチンを使用することに加えて、本発明はまた、患者において抗原に対して指向される免疫応答を誘発するためのｉｎ ｖｉｖｏ免疫化のための組成物および方法を提供する。
一般に、本明細書に記載されるように活性化され、拡大増殖された細胞は、免疫不全状態にある個体に生じる疾患の治療および予防に利用することができる。特に、本発明のＣＡＲ改変Ｔ細胞は、例えばＲＯＲ−１などのＲＯＲ−１悪性腫瘍の治療に使用される。ある特定の実施形態では、本発明の細胞は、ＲＯＲ−１を発症するリスクのある患者の治療に使用される。したがって、ＲＯＲ−１の治療または予防のための方法は、それを必要とする対象に、本発明の治療有効量のＣＡＲ改変Ｔ細胞を投与することを含む。複数の実施形態では、本明細書に記載されているように活性化され、拡大増殖された細胞は、ＲＯＲ−１の治療に利用することができる。
略述すると、本明細書に記載される医薬組成物は、１または複数の薬学的もしくは生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載される標的細胞集団を含むことができる。このような組成物は、中性緩衝生理食塩液、リン酸緩衝生理食塩液などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含みうる。複数の実施形態では、本発明の組成物は、静脈内投与のために製剤化される。
本明細書に記載される医薬組成物は、治療される（または予防される）疾患に適した方法で投与することができる。臨床試験により適切な投与量を決定することができるが、投与量および投与頻度は、患者の状態、患者の疾患の種類および重症度などの要因によって決定される。
「免疫学的に有効な量」または「治療量」が示される場合、投与される、本明細書に記載される組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、および状態における個人差を考慮して、医師によって決定されうる。一般に、本明細書に記載されたＴ細胞を含む医薬組成物は、１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重、１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重の投与量で投与することができ、これらの範囲内の全ての整数値を含むことが言明されうる。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投与量で複数回投与することができる。細胞は、免疫療法において一般に公知である輸注技術を用いて投与することができる（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, (1988)を参照されたい）。特定の患者に対する最適な投与量および治療体制は、疾患の徴候について患者をモニターし、それに応じて治療を調整することによって、医学の当業者によって容易に決定されうる。
ある特定の実施形態では、活性化Ｔ細胞を対象に投与し、次に、その後、血液を抜き出し（またはアフェレーシスを実施し）、そこからＴ細胞を活性化し、これらの活性化され、拡大増殖されたＴ細胞を患者に再輸注することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間ごとに複数回行うことができる。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血から活性化されうる。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、または１００ｃｃの採血から活性化される。理論に拘束されることなく、この複数回の採血／複数回の再輸注プロトコールを用いることが、Ｔ細胞のある特定の集団を選択するために役立つ場合がある。別の実施形態では、放射線または化学療法のいずれかを介して患者のリンパ枯渇後に、本組成物の活性化Ｔ細胞を投与することが望ましい場合がある。
本明細書に記載される組成物の投与は、エアゾール吸入、注射、経口摂取、輸血、インプランテーションまたは移植を含む任意の好都合な方法で行うことができる。本明細書に記載される組成物は患者に、皮下、皮内、腫瘍内、リンパ節内、髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、または腹膜腔内に投与することができる。一実施形態では、本発明のＴ細胞組成物は、皮内または皮下注射によって患者に投与される。別の実施形態では、本発明のＲＯＲ−１ ＣＡＲ−Ｔ細胞組成物をｉ．ｖ．注射によって投与する。Ｔ細胞の組成物は、リンパ節、または原発腫瘍もしくは転移の部位に直接注入することができる。
患者に投与される上記治療の投与量は、治療される状態の正確な性質および治療のレシピエントによって変化する。ヒト投与のための投与量のスケーリングは、技術的に許与された慣行に従って行うことができる。例えば、上記治療の用量は、１×１０４ＣＡＲ＋細胞／ｋｇ〜５×１０６ＣＡＲ＋細胞／ｋｇの範囲でありうる。例示的な用量は、１×１０２ＣＡＲ＋細胞／ｋｇ、１×１０３ＣＡＲ＋細胞／ｋｇ、１×１０４ＣＡＲ＋細胞／ｋｇ、１×１０５ＣＡＲ＋細胞／ｋｇ、３×１０５ＣＡＲ＋細胞／ｋｇ、１×１０６ＣＡＲ＋細胞／ｋｇ、５×１０６ＣＡＲ＋細胞／ｋｇ、１×１０７ＣＡＲ＋細胞／ｋｇ、１×１０８ＣＡＲ＋細胞／ｋｇまたは１×１０９ＣＡＲ＋細胞／ｋｇでありうる。適切な用量は、成人または小児患者に対して適宜調整することができる。
あるいは、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与される免疫エフェクター細胞の典型的な量は、例えば、１００、１，０００、１０，０００、１００万〜１，０００億個の細胞の範囲でありうるが；しかしながら、この例示的な範囲を下回るか、または上回る量は、本発明の範囲内である。例えば、本発明の宿主細胞の用量は、約１００万〜約５００億個の細胞（例えば、約５００万細胞、約２５００万細胞、約５億細胞、約１０億細胞、約５０億細胞、約２００億細胞、約３００億細胞、約４００億細胞、または前述の値のうちのいずれか２つで定義される範囲）、約１０００万〜約１０００億細胞（例えば、約２０００万細胞、約３０００万細胞、約４０００万細胞、約６０００万細胞、約７０００万細胞、約８０００万細胞、約９０００万細胞、約１００億細胞、約２５０億細胞、約５００億細胞、約７５０億細胞、約９００億細胞、または前述の値のうちのいずれか２つで定義される範囲）、約１億個〜約５００億個（例えば、約１億２，０００万細胞、約２億５，０００万細胞、約３億５，０００万細胞、約４億５，０００万細胞、約６億５，０００万細胞、約８億細胞、約９億細胞、約３０億細胞、約３００億細胞、約４５０億細胞、または前述の値のうちのいずれか２つで定義される範囲）でありうる。
治療効果または予防効果は、治療された患者の定期的評価によってモニターすることができる。症状に応じて、数日間またはそれより長く反復投与する場合は、疾患症状の所望の抑制が生じるまで処置を繰り返す。しかしながら、他の投与レジメンもまた有用であり、本発明の範囲内である。所望の投与量は、組成物の単回ボーラス投与により、組成物の複数回ボーラス投与により、または組成物の連続輸注投与により送達することができる。
開示される核酸配列を発現する免疫エフェクター細胞、またはそれらの核酸配列を含むベクターを含む組成物は、哺乳動物に同時投与することができる１または複数のさらなる治療剤とともに投与することができる。「同時投与」とは、１または複数のさらなる治療剤および本発明の宿主細胞または本発明のベクターを含む組成物を、１または複数のさらなる治療剤の効果を増強するのに、またはその逆を達成するのに十分に時間的に近くで投与することを意味する。この点で、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞または本明細書に記載されるベクターを含む組成物は、１または複数のさらなる治療剤と同時に投与することができ、または該組成物を１番目に投与し、１または複数のさらなる治療剤を２番目に、もしくはその逆で投与することができる。あるいは、開示される免疫エフェクター細胞または本明細書に記載されるベクターを含む組成物、および１または複数のさらなる治療剤を同時に投与することができる。
本発明の宿主細胞および／または本発明のベクターを含む組成物（またはキットに含まれる）に含まれうるかまたは同時投与されうる治療剤の例は、インターロイキン、サイトカイン、インターフェロン、アジュバントおよび化学療法剤である。複数の実施形態では、さらなる治療剤は、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＴ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、増殖因子、およびｈＧＨ、ヒトＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、およびＴＬＲ１０のリガンドである。
「消泡剤」は、加工時における発泡であって、水性分散液の凝固、薄膜完成品中の気泡を結果としてもたらすか、または、一般に、加工を損なう発泡を低減する。例示的な抗発泡剤は、シリコンエマルジョン（silicon emulsion）またはセスキオレイン酸（sesquoleate）ソルビタンを含む。
「抗酸化剤」は、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびトコフェロールを含む。ある特定の実施形態では、抗酸化剤は、必要とされる場合、化学的安定性を増強する。
本明細書で記載される製剤は、抗酸化剤、金属キレート化剤、チオールを含有する化合物、および他の一般的な安定化剤から利益を得る場合がある。このような安定化剤の例は、（ａ）約０．５％〜約２％ｗ／ｖのグリセロール、（ｂ）約０．１％〜約１％ｗ／ｖのメチオニン、（ｃ）約０．１％〜約２％ｗ／ｖのモノチオグリセロール、（ｄ）約１ｍＭ〜約１０ｍＭのＥＤＴＡ、（ｅ）約０．０１％〜約２％ｗ／ｖのアスコルビン酸、（ｆ）０．００３％〜約０．０２％ｗ／ｖのポリソルベート８０、（ｇ）０．００１％〜約０．０５％ｗ／ｖのポリソルベート２０、（ｈ）アルギニン、（ｉ）ヘパリン、（ｊ）硫酸デキストラン、（ｋ）シクロデキストリン、（ｌ）ポリ硫酸ペントサン、および他のヘパリノイド、（ｍ）マグネシウムおよび亜鉛などの二価カチオン、または（ｎ）これらの組合せを含むがこれらに限定されない。
「結合剤」は、凝集性の性質を付与し、例えば、アルギン酸およびその塩；カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース（例えば、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標））、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、Ｋｌｕｃｅｌ（登録商標））、エチルセルロース（例えば、Ｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標））、および結晶セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標））などのセルロース誘導体；微晶質デキストロース；アミロース；ケイ酸マグネシウムアルミニウム；多糖酸；ベントナイト；ゼラチン；ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー；クロスポビドン；ポビドン；デンプン；アルファデンプン；トラガント、デキストリン、スクロース（例えば、Ｄｉｐａｃ（登録商標））、グルコース、デキストロース、糖蜜、マンニトール、ソルビトール、キシリトール（例えば、Ｘｙｌｉｔａｂ（登録商標））、およびラクトースなどの糖；アカシア、トラガント、ガッティガム、イサポールハスクの粘液、ポリビニルピロリドン（例えば、Ｐｏｌｙｖｉｄｏｎｅ（登録商標）ＣＬ、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）ＣＬ、Ｐｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標）ＸＬ−１０）、カラマツ由来のアラビノガラクタン（arabogalactan）、Ｖｅｅｇｕｍ商標）、ポリエチレングリコール、蝋、アルギン酸ナトリウムなどの天然ガムまたは合成ガムを含む。
「担体」または「担体材料」は、医薬中で一般に使用される任意の賦形剤を含み、イブルチニブおよび抗がん剤の化合物など、本明細書で開示される化合物との適合性、ならびに所望の剤形の放出プロファイル特性に基づき選択されるものとする。例示的な担体材料は、例えば、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、滑沢剤、保湿剤、希釈剤などを含む。「薬学的に適合性の担体材料」は、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、カルシウム乳酸、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コレステロール、コレステロールエステル、カゼイン酸ナトリウム、ダイズレシチン、タウロコール酸、ホスファチジルコリン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、セルロースおよびセルロースコンジュゲート、糖、ステアロイル乳酸ナトリウム、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、アルファデンプンなどを含みうるがこれらに限定されない。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995)、Hoover, John E., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975、Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980、およびPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins1999)を参照されたい。
「分散剤」および／または「粘性モジュレーティング剤」は、液体培地または顆粒化法またブレンド法を介して、薬物の拡散および均質性を制御する材料を含む。一部の実施形態では、これらの薬剤はまた、コーティングマトリックスまたはエローディングマトリックスの有効性も促進する。例示的な拡散促進剤／分散剤は、例えば、親水性ポリマー、電解質、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ；市販品では、Ｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標）として公知である）、ａｎｄ例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、ＨＰＣ、ＨＰＣ−ＳＬ、およびＨＰＣ−Ｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば、ＨＰＭＣ Ｋ１００、ＨＰＭＣ Ｋ４Ｍ、ＨＰＭＣ Ｋ１５Ｍ、およびＨＰＭＣ Ｋ１００Ｍ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（carboxymethylcellulose sodium）、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＡＳ）、非晶質セルロースなど、炭水化物ベースの分散剤、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、酸化エチレンおよびホルムアルデヒドを伴う、４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノールポリマー（チロキサポールとしてもまた公知である）、ポロキサマー（例えば、酸化エチレンと、酸化プロピレンとのブロックコポリマーである、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ６８（登録商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ８８（登録商標）、およびＰｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ１０８（登録商標））；およびポロキサミン（例えば、酸化プロピレンおよび酸化エチレンの、エチレンジアミンへの逐次的付加から導出される四官能性ブロックコポリマーである、Ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ ９０８（登録商標）（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）としてもまた公知のＴｅｔｒｏｎｉｃ ９０８（登録商標））、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、またはポリビニルピロリドンＫ３０、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ−６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは、約３００〜約６０００、または約３３５０〜約４０００、または約７０００〜約５４００の分子量を有しうる）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、例えば、トラガントガムおよびアカシアガム、グアルガムなどのガム、キサンタンガムを含むキサンタン、糖、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース誘導体、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、ポビドン、カルボマー、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アルギン酸塩、キトサン、およびこれらの組合せを含む。セルロースまたはトリエチルセルロースなどの可塑化剤もまた、分散剤として使用することができる。特に、リポソーム分散液中および自己乳化分散液中で有用な分散剤は、ジミリストイルホスファチジルコリン、鶏卵に由来する天然ホスファチジルコリン、鶏卵に由来する天然ホスファチジルグリセロール、コレステロール、およびイソプロピルミリスチン酸である。
１または複数のエロージョン促進剤の、１または複数の拡散促進剤との組合せもまた、本組成物中で使用することができる。
「希釈剤」という用語は、送達の前に、目的の化合物を希釈するのに使用される化合物を指す。希釈剤はまた、より安定的な環境をもたらしうるため、化合物を安定化させるのにも使用することができる。当技術分野では、緩衝液中に溶解させた塩（これはまた、ｐＨの制御または維持ももたらしうる）を、リン酸緩衝生理食塩液溶液を含むがこれらに限定されない希釈剤として用いる。ある特定の実施形態では、希釈剤は、組成物のバルクを増大させて、圧縮を容易とするか、またはカプセルの充填のための均質なブレンドに十分なバルクを創出する。このような化合物は、例えば、ラクトース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）などの結晶セルロース；二塩基性リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物；リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム；無水ラクトース、噴霧乾燥ラクトース；アルファデンプン、Ｄｉ−Ｐａｃ（登録商標）（Ａｍｓｔａｒ）などの圧縮糖；マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースベースの希釈剤、粉砂糖；一塩基性硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物；乳酸カルシウム三水和物、デキストレート（dextrate）；加水分解シリアル固形、アミロース；粉末セルロース、炭酸カルシウム；グリシン、カオリン；マンニトール、塩化ナトリウム；イノシトール、ベントナイトなどを含む。
「充填剤」は、ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、セルロース 粉末、デキストロース、デキストレート（dextrate）、デキストラン、デンプン、アルファデンプン、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコールなどの化合物を含む。
「滑沢剤」および「流動促進剤」とは、材料の接着または摩擦を防止、低減、または阻害する化合物である。例示的な滑沢剤は、例えば、ステアリン酸、水酸化カルシウム、滑石、フマル酸ステアリルナトリウム、鉱物油などの炭化水素、または水素化ダイズ油（Ｓｔｅｒｏｔｅｘ（登録商標））などの水素化植物油、高脂肪酸、ならびにアルミニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛など、それらのアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール、滑石、蝋、Ｓｔｅａｒｏｗｅｔ（登録商標）、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、ナトリウム酢酸、塩化ナトリウム、ロイシン、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ−４０００）、またはＣａｒｂｏｗａｘ（商標）などのメトキシポリエチレングリコール、ナトリウムオレイン酸、安息香酸ナトリウム、ベヘン酸グリセリル、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウムまたはラウリル硫酸ナトリウム、Ｓｙｌｏｉｄ（商標）、Ｃａｂ−Ｏ−Ｓｉｌ（登録商標）などのコロイド状シリカ、トウモロコシデンプンなどのデンプン、シリコーン油、界面活性剤などを含む。
「可塑化剤」とは、マイクロカプセル化材料を軟化させるのに使用される化合物、またはマイクロカプセル化材料の脆性を低下させるフィルムコーティングである。適切な可塑化剤は、例えば、ＰＥＧ ３００、ＰＥＧ ４００、ＰＥＧ ６００、ＰＥＧ １４５０、ＰＥＧ ３３５０、およびＰＥＧ ８００などのポリエチレングリコール、ステアリン酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロース、およびトリアセチンを含む。一部の実施形態では、可塑化剤はまた、分散剤または保湿剤としても機能しうる。
「可溶化剤」は、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート（doccusate）、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ｎ−ブタノール、イソプロピルアルコール、コレステロール、胆汁塩、ポリエチレングリコール２００〜６００、グリコフロール、トランスクトール、プロピレングリコール、およびジメチルイソソルビドなどの化合物を含む。
「安定化剤」は、任意の抗酸化薬剤、緩衝液、酸、保存剤などの化合物を含む。
「懸濁剤」は、ポリビニルピロリドン、例えば、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、またはポリビニルピロリドンＫ３０、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは、約３００〜約６０００、または約３３５０〜約４０００、または約７０００〜約５４００の分子量を有しうる）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシメチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、例えば、トラガントガムおよびアカシアガム、グアルガムなどのガム、キサンタンガムを含むキサンタン、糖、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなどのセルロース誘導体、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、ポビドンなどの化合物を含む。
「界面活性剤」は、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート（docusate）、Ｔｗｅｅｎ ６０またはＴｗｅｅｎ ８０、トリアセチン、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、モノオレイン酸ソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリソルベート（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）、ポロキサマー、胆汁塩、モノステアリン酸グリセリン、酸化エチレンと酸化プロピレンとのコポリマー、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＢＡＳＦ）などの化合物を含む。他の一部の界面活性剤は、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルおよび植物油、例えば、ポリオキシエチレン（６０）水素化ヒマシ油；ならびにポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびアルキルフェニルエーテル、例えば、オクトキシノール１０、オクトキシノール４０を含む。一部の実施形態では、界面活性剤は、物理的安定性を増強するか、または他の目的で、組み入れることができる。
「粘性増強剤」は、例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボマー、ポリビニルアルコール、アルギン酸塩、アカシア、キトサン、およびこれらの組合せを含む。
「保湿剤」は、オレイン酸、モノステアリン酸グリセリン、ソルビタンモノオレイン酸、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ナトリウムドクセート（docusate）、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート（doccusate）、トリアセチン、Ｔｗｅｅｎ ８０、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、アンモニウム塩などの化合物を含む。
キットおよび組成物
本開示の１つの態様は、本発明のＲＯＲ−１特異的ＣＡＲをコードするコード領域を含む第１のベクター、および任意選択で、安全性の理由のために含まれる遺伝子、例えば、ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ−１およびその機能性変異体、またはＣＤ２０もしくはＣＤ２０ｔ−１、およびそれらの機能性変異体を含むキットおよび組成物に関する。キットおよび組成物は、サイトカインをさらに含むことができる。別の態様では、キットおよび組成物は、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチ構成要素を含むことができる。これらのキットおよび組成物は、それぞれ異なるタンパク質またはタンパク質のサブセットをコードする複数のベクターを含むことができる。これらのベクターは、ウイルス性、非ウイルス性、エピソーム性、または組込み性でありうる。一部の実施形態では、ベクターは、トランスポゾン、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。
一部の実施形態では、キットおよび組成物は、ベクターだけでなく、細胞および物質、例えば、インターロイキン、サイトカイン、インターロイキンと化学療法剤、アジュバント、湿潤剤、または乳化剤を含む。一実施形態では、細胞はＴ細胞である。一実施形態では、キットおよび組成物は、ＩＬ−２を含む。一実施形態では、キットおよび組成物は、ＩＬ−２１を含む。一実施形態では、キットおよび組成物は、Ｂｃｌ−２、ＳＴＡＴ３またはＳＴＡＴ５阻害剤を含む。複数の実施形態では、キットは、ＩＬ−１５、またはｍｂＩＬ−１５を含む。
本明細書の、ある特定の実施形態では、本明細書で記載される、１または複数の方法による使用のためのキットおよび製品が開示される。このようなキットは、バイアル、試験管など、１または複数の容器であって、容器の各々が、本明細書で記載される方法において使用される個別のエレメントのうち１つを含む容器を受容するように区画化されたキャリングケース、パッケージ、または容器を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含む。一実施形態では、容器は、ガラスまたはプラスチックなど、様々な材料から形成されている。
本明細書で提示される製品は、パッケージング材料を含有する。医薬パッケージング材料の例は、ブリスターパック、ボトル、試験管、バッグ、容器、ボトル、ならびに選択される製剤と、意図される投与方式および処置方式とに適する、任意のパッケージング材料を含むがこれらに限定されない。
例えば、容器は、ＣＡＲ−Ｔ細胞（例えば、本明細書で記載されるＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞）と、任意選択で、加えて、本明細書で開示されるサイトカインおよび／または化学療法剤とを含む。このようなキットは、任意選択で、本明細書で記載される方法におけるその使用に関する記載または表示または指示書の内容確認を含む。
キットは、典型的に、内容物を列挙する表示、および／または使用のための指示書、ならびに使用のための指示書を伴う添付文書を含む。典型的に、指示書のセットもまた、組み入れられると予想される。
一部の実施形態では、表示は、容器上に貼付されているか、または容器に付随する。一実施形態では、表示を形成する文字、数、または他の記号が、容器自体へと接着されているか、鋳造されているか、またはエッチングされている場合、表示は容器上に貼付されており、表示はまた、容器を保持する、レセプタクルまたはキャリングケース内に、例えば、パッケージ添付文書として存在する場合、容器に付随する。一実施形態では、表示は、内容物が、具体的な治療適用に使用されるものであることを指し示すのに使用される。表示はまた、内容物の、本明細書で記載される方法などにおける使用のための指示も指し示す。
これらの例は、例示的な目的だけで提示されるものであり、本明細書で提示される特許請求の範囲を限定しようとするものではない。
[実施例１]
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙシステムを用いたＴ細胞のヌクレオフェクション
遺伝子改変Ｔ細胞を作出するために、凍結保存された汎Ｔ細胞を融解し、洗浄し、ＦＢＳおよびＧｌｕｔａｍａｘ（Ｒ２０培地）を補充したあらかじめ温めたフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０培地で再懸濁し、５％ＣＯ２を添加した３７℃の加湿インキュベーター中に置いた。細胞をカウントし、遠心分離し、ヌクレオフェクション緩衝液に再懸濁した。ＣＡＲ−Ｔ細胞を作出するために、ＣＡＲ構築物を含む合計１５μｇのトランスポゾンプラスミドは、各ヌクレオフェクションキュベット反応についてＳＢトランスポザーゼをコードする５μｇのプラスミドと組み合わせられた。Ｔ細胞の電気穿孔は、Ａｍａｘａ ２ｂヌクレオフェクションデバイスまたは４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を用いて達成された。電気穿孔後、各キュベットからの内容物をあらかじめ加温したＲ２０培地に移し、３７℃のインキュベーター内に置いた。各Ｔ細胞培養物の試料をフローサイトメトリー分析のために採取し、所定の時点で適用可能であれば、ＣＡＲ発現を特徴付けた。ＣＡＲ＋Ｔ細胞数を、さらなる特徴付けのために、ｅｘ ｖｉｖｏで拡大増殖させた。作出されたＣＡＲ＋ Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの数的な拡大増殖のために、Ｔ細胞をさらに活性化繁殖細胞（ＡａＰＣ）と共培養した。略述すると、ＲＯＲ１抗原とともにＣＤ８６、４１ＢＢＬ、ｍｂＩＬ１５を発現するように操作されたＫ５６２細胞系由来の照射されたＡａＰＣは、その後の週１回のＡａＰＣ添加のために、ＩＬ−２１およびＩＬ−２を含む完全培地中でＣＡＲ＋Ｔ細胞と共培養された。
ＣＡＲ発現のためのフローサイトメトリー分析は、電気穿孔後１日目に、蛍光標識組換えＲＯＲ１−Ｆｃ融合タンパク質、ビオチン標識したＲＯＲ１の可溶性細胞外ドメイン、またはＡＦ６４７で標識したプロテイン−Ｌを用いて、各ＡａＰＣ刺激前に行われた。細胞を生ＣＤ３＋細胞についてゲートをかけた。
Figure 2021530217
上記のＣＡＲを構築した。図５は、短いＣＤ８ａストークが、利用されるシグナルペプチドにかかわらず、ＲＯＲ１ ＣＡＲの表面発現を可能にしないことを裏付ける。試験された他のシグナルペプチドには、ＧＭ−ＣＳＦＲα、β２Ｍ、アズロシジン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、Ａ２Ｍ受容体関連タンパク質、ＩｇＨＶ３−２３、ＩｇＨＶ３−３３、およびＩｇＫＶ１−Ｄ３３が含まれた。
[実施例２]
ＲＯＲ１ ＣＡＲの最適化
全ての約１２０個のＣＡＲベクターは、シグナルペプチドの多様な再配列、抗ＲＯＲ１抗体のＶＬおよびＶＨ鎖の配向、種々の長さのスペーサー、膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインに基づいてデザインおよび構築された。例えば、１５個のシグナルペプチド、２個の配向、および異なる長さの７個のスペーサー、２個の異なる膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインは、多様な組合せで試験された。ＲＯＲ１ ＣＡＲの発現は、シグナルペプチド、配向およびストーク型長に依存することが見出された。これらから、３個のＣＡＲ構築物は、強力な表面発現を有するものとして同定された。
異なるスペーサー長、シグナルペプチド、およびＶＨ−ＶＬ配向のＲＯＲ１ ＣＡＲを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞は、実施例１に記載されるように、健常ドナーＰＢＭＣにおけるＳＢ系プラスミドの電気穿孔によって作出された。ＣＡＲ−Ｔ細胞数は、実施例１に記載されるように、ＡａＰＣを発現するＲＯＲ１との共培養により、週１回の刺激により、ｅｘ ｖｉｖｏで拡大増殖された。ＣＡＲの発現は、ヌクレオフェクション後１日目および８日目に、マルチパラメーターのフローサイトメトリーにより測定された。査定されたＣＡＲ−Ｔ被験物質を表５に列挙する。
図６は、異なるＲＯＲ１ ＣＡＲ（マウスｓｃＦｖ）−Ｔ細胞のＲＯＲ１ ＣＡＲ発現に関するフローサイトメトリーデータを示す。細胞を生ＣＤ３＋細胞についてゲートをかけた。図６に示すように、ＣＡＲ分子の構築に利用されるスペーサーに依存して、様々な程度のマウスＲＯＲ１ ＣＡＲ発現が、遺伝子導入の１日後に観察された。ＣＡＲ＋Ｔ細胞の濃縮は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＡＲ＋Ｔ細胞とＲＯＲ１＋ＡａＰＣ系との共培養で観察された。マウスＲＯＲ１ ＣＡＲ−Ｔについては、より長いスペーサーを用いて、Ｔ細胞上のＣＡＲのより良好な表面発現が観察された。
Figure 2021530217
図７は、ＣＤ８ａ−３Ｘスペーサー、およびシグナルペプチドの異なる組合せを用いて、様々な程度のＲＯＲ１ ＣＡＲ発現を裏付ける。図７に示されるように、ｍＩｇＶＨ、ＣＤ８ａ、β２Ｍおよびアズロシジンなどのシグナルペプチドは、Ｔ細胞上のＣＡＲのより良好な表面発現を可能にした。ＣＤ８ａ−１Ｘスペーサーを用いた場合、異なるシグナルペプチドを用いても、ＲＯＲ１ ＣＡＲの表面発現に影響はなかった。
Figure 2021530217
図８は、ＶＬ−ＶＨからＶＨ−ＶＬへの逆配向が、ＧＭＣＳＦＲおよびＩＧＨＶ３−２３シグナルペプチドからのマウスＲＯＲ１ＣＡＲの表面発現を可能にすることを裏付ける。上述のデータに基づいて、ＣＤ８ａ−３Ｘストークをスペーサーとして選択し、ＩｇＨＶ３−２３をシグナルペプチドとして選択し、好ましい配向としてＶＬ−ＶＨ、およびマウスＲＯＲ１ ＣＡＲにおけるＣＤ８ＴＭ−ＣＤ２８ｚシグナル伝達ドメインを含んだ。
[実施例３]
ＣＤ８ａ−３ｘストークを有するマウスＲＯＲ１ ＣＡＲ
マウスＲＯＲ１ ＣＡＲ−Ｔ細胞の機能的能力をｉｎ ｖｉｔｒｏモデルで試験した。マウスＥＬ４細胞系を形質導入して、細胞表面上にヒトＲＯＲ１を発現させ（ＥＬ４−ＲＯＲ１）、ＩＦＮ−γの分泌は、マウスＲＯＲ１ ｓｃＦｖ−ＣＤ８−３ｘ−ＣＤ２８ｚ（ＣＡＲ）＋Ｔ細胞とＲＯＲ１＋標的細胞との共培養時に測定された。図９は、ＣＤ８−３ｘストークを有するマウスＲＯＲ１ ＣＡＲが、ＲＯＲ＋標的細胞との共培養時に抗原特異的ＩＦＮ−γ発現を裏付けることを示す。
さらに、ＲＯＲ１発現の有無にかかわらず標的細胞を認識するＲＯＲ１ ＣＡＲ−Ｔの能力は、ＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイにおいて評価された。ＣＤ１０７ａは、リソソーム関連膜タンパク質−１（ＬＡＭＰ−１）としても公知であり、細胞の後期エンドソーム−リソソームで構成的に発現されるが、脱顆粒細胞上の細胞表面で一過性に発現される。図９Ａ−９Ｂに示されるように、ＣＤ１０７ａ脱顆粒の有意な発現は、ＥＬ４−ＲＯＲ１細胞系との共培養で観察されたが、エフェクター細胞のみおよびＥＬ４細胞系との共培養では、最小限の脱顆粒が観察された。
[実施例４]
ＲＯＲ１ ｓｃＦｖのヒト化
マウスＲＯＲ１ ｓｃＦｖの免疫原性を低減させ、ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫媒介性ＣＡＲ Ｔ細胞欠失を防止するために、マウスＲＯＲ１ ｓｃＦｖをヒト化するための努力が行われた。
合計１６８個のヒト化ＲＯＲ１ ｓｃＦｖｓは、マウスＲＯＲ１ ｓｃＦｖの配列に基づいてデザインされ、試験された。ヒト化抗体クローンの７７個を発現させることに成功した。７７個のヒト化クローンのうち、４２個は、ＲＯＲ１抗原に結合する能力を保持した。２１個のクローンを親和性成熟のためにさらに選択した。１０個のヒト化抗体は、ＩｇＧフォーマットで２．０ｎＭ以下の結合親和性を示した。異なるヒト化ＶＨおよびＶＬ鎖の組合せに基づくさらなるｓｃＦｖ変異体もまたデザインおよび試験された。
多様なヒト化ＲＯＲ１ ｓｃＦｖクローンの結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイにより評価された。ヒト化ＲＯＲ１抗体の可変領域をマウス定常鎖領域へと融合させて、キメラマウスＩｇＧ１ ｍＡｂを産生した。ヒトＦｃ領域へと融合させたＲＯＲ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をセンサチップＣＭ５上に固定化した。異なる濃度のヒト化抗体を溶液相に注入し、抗体のＫｄを計算するためにＢＩＡ査定を用いてデータを分析した。
Figure 2021530217
ヒト化キャンペーンの上位候補に基づいて、次のＣＡＲ構造をデザインし、試験した。
Figure 2021530217
ｆＦＬＵＣ（０．５×１０６細胞）を発現するＪｅＫｏ−１腫瘍細胞を０日目にＮＳＧマウスにＩＰ投与した。８日目に、腫瘍量が確定した（ＩＶＩＳイメージングにより確認された）マウスを、上述のように、生理食塩水（ＨＢＳＳ）またはＣＡＲ構築物をトランスフェクトしたＴ細胞のいずれかで単回ＩＶ注射を受けように無作為化した。ＣＡＲ−Ｔ細胞数は、ＲＯＲ１＋ＡａＰＣとの共培養により、ｅｘ ｖｉｖｏで週２回の刺激によって拡大増殖された。腫瘍増殖に対する有効性は、腫瘍負荷を評価するためにＣＡＲ−Ｔ細胞投与の７日後および３６日後ごとに実施したｉｎ ｖｉｖｏ生物発光（ＩＶＩＳ）イメージングによって査定された（図１０Ａ、１０Ｂおよび１１）。ＥＤＴＡ中の全血試料を週１回回収し、ヒト化ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞持続性の査定（図１２）、異なるＴ細胞サブセットの拡大増殖および決定についてマルチパラメーターフローサイトメトリーに供した。
リードヒト化ＲＯＲ１ ＣＡＲ（ｈＲＯＲ１（ＶＨ＿５−ＶＬ＿１４）ＣＤ８ａ（３ｘ）．ＣＤ２８ｚ）は、ｓｃＦｖ親和性、ＲＯＲ１−Ｆｃ結合、ＣＡＲ発現、ＣＡＲ Ｔ細胞発現、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＯＲ−１特異的サイトカイン産生、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＯＲ−１特異的細胞傷害作用およびｉｎ ｖｉｖｏ ＲＯＲ−１抗腫瘍活性におけるマウスＲＯＲ１ ＣＡＲに対する類似性に基づいて選択された。
データの概要を以下の表９に示す。
Figure 2021530217
 相対的性能スコア０〜３、０が最悪、３が最良の性能
[実施例５]
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ実験
ＳＢトランスポゾン系、すなわちＳＢ１１を発現する多様なＤＮＡプラスミド、膜結合型ＩＬ−１５（ｍｂＩＬ−１５）、細胞タグおよびリードキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞特異性をリダイレクトするためにヌクレオフェクションを介して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）にトランスフェクトされた。リードＲＯＲ１ ＣＡＲの構成的発現と組み合わせたｍｂＩＬ−１５の構成的発現またはｍｂＩＬ−１５のリガンド誘導性発現を表１０に記載されているように調べた。
Figure 2021530217
Figure 2021530217
相対的性能スコアは−から＋＋＋であり、「−」は検出不可能な性能であり、＋＋＋は最良の性能である。
ｈＲＯＲ１ ＣＡＲと組み合わせたＲＴＳ−ｍｂＩＬ−１５は、ＳＫＯＶ３＿ｆＬＵＣ（図１３Ａ）およびＪｅＫｏ１＿ｆＬＵＣ（図１３Ｂ）腫瘍細胞系を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでさらに試験された。前述のように、ｈＲＯＲ１ ＣＡＲおよびｍｂＩＬ−１５をコードするＳＢトランスポゾンの３つの組合せを健常ドナーＴ細胞に電気穿孔した。ＣＡＲ＋Ｔ細胞数は、２×刺激について前述したように、週１回の刺激による、ＡａＰＣを発現するＲＯＲ１との共培養によって、ｅｘ ｖｉｖｏで拡大増殖された。リガンド誘導性ｍｂＩＬ−１５ ｈＲＯＲ１ ＣＡＲについて、Ｔ細胞は、細胞の２×刺激後に、ＩＬ−２１およびＩＬ−２を含有する完全培地中でインキュベートされた。２日後、ｈＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、サイトカインを含まない完全培地中でインキュベートされ、一晩、ベレジメクスまたはＤＭＳＯで処理された。翌日、細胞をカウントし、ＲＯＲ１発現Ｔ細胞の頻度を推定した。次に、Ｔ細胞をＣＡＲ発現について標準化した。
ｈＲＯＲ１ ＣＡＲおよびｍｂＩＬ−１５を構成的に発現するＴ細胞について、ＡａＰＣとの共培養による週２回の刺激を用いたｅｘ ｖｉｖｏでの拡大増殖後、細胞は、さらに３日間培養され、カウントされた。前述のように、Ｔ細胞は、ＣＡＲ発現について標準化された。
次に、ｈＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、異なる比の４：１、２：１、０．５：１および０．２５：１で各腫瘍細胞系と混合された。７２時間後、細胞をインキュベーターから取り出し、ペレット化した。上清を回収して、サイトカインの産生を測定し、細胞ペレットをルシフェラーゼアッセイのためのＯＮＥＧｌｏ試薬で処理した。図１３Ａ−１３Ｂは、ＲＯＲ１＋腫瘍細胞系が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで構成的またはＲＴＳ−ｍｂＩＬ−１５を有するｈＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によって等しく殺滅されたことを裏付ける。
ｉｎ ｖｉｖｏ研究は、ｈＲＯＲ−１ ＣＡＲ Ｔ細胞をＲＴＳ−ｍｂＩＬ−１５で処理したマウスで行われた。以前と同様に、ＪｅＫｏ−１腫瘍細胞（１０×１０６細胞）を０日目にＮＳＧマウスにＩＰ投与した。８日目に、腫瘍量が確定した（ＩＶＩＳイメージングにより確認された）マウスは、無作為化されて、生理食塩水（ＨＢＳＳ）、またはＲＴＳ−ｍｂＩＬ−１５を有するｈＲＯＲ−１ ＣＡＲ Ｔ細胞（±ベレジメクス）のいずれかで単回ＩＰ注射を受けた。腫瘍増殖に対する有効性は、腫瘍量を評価するためにＣＡＲ−Ｔ細胞投薬後の特定の時点で実施されたｉｎ ｖｉｖｏ生物発光（ＩＶＩＳ）イメージングによって査定された（図１４）。全血試料をＥＤＴＡ中に週１回、回収し、異なるＴ細胞サブセットのヒト化ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞持続性、拡大増殖および決定の査定のために、マルチパラメーターのフローサイトメトリーに供した。
図１４は、ｈｕＲＯＲ１ ＲＴＳ ＣＡＲＴが、ＪＥＫＯ−１異種移植マウスモデルにおいて用量依存的に抗腫瘍効果を促進することを裏付ける。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語およびあらゆる頭文字は、本発明の技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。
本明細書では、本開示の好ましい実施形態を示し、それらについて記載してきたが、当業者には、このような実施形態が、例だけを目的として提示されていることが明らかであろう。今や、本開示から逸脱しない限りにおいて、当業者は、多数の変更、変化、および代用に想到するであろう。本明細書で記載される実施形態、またはこれらの実施形態、もしくはその中で記載される態様のうちの１または複数の組合せに対する、多様な代替物を、本開示の実施において利用しうることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本開示の範囲を規定するものであり、これらの特許請求の範囲の範囲内にある方法および構造、ならびにそれらの均等物は、その対象となることが意図される。
配列
表１２には、本明細書に提供される実施形態に含まれる、ある特定の配列の代表的なリストが提供される。
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Claims (48)

  1. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離された核酸であって、前記ＣＡＲが、
    （ａ）ＲＯＲ−１抗原結合ドメイン；
    （ｂ）スペーサー；
    （ｃ）膜貫通ドメイン；
    （ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはその両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；および
    （ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン
    を含む、単離された核酸。
  2. 前記ＣＡＲが、
    （ａ）配列番号３〜１４に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するポリペプチド；または
    （ｂ）配列番号７５〜８２に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するポリペプチド
    のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の単離された核酸。
  3. 前記ＲＯＲ−１抗原結合ドメインが、配列番号１５〜７４に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載の単離された核酸。
  4. 前記ＲＯＲ−１抗原結合ドメインが、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、および７３に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載の単離された核酸。
  5. 前記ＲＯＲ−１抗原結合ドメインが、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、および７４に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載の単離された核酸。
  6. 前記共刺激シグナル伝達ドメインが４−１ＢＢを含む、請求項１に記載の単離された核酸。
  7. 前記共刺激シグナル伝達ドメインがＣＤ２８を含む、請求項１に記載の単離された核酸。
  8. 前記ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインが、配列番号９３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載の単離された核酸。
  9. 配列番号９４〜１０８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドをさらに含む、請求項１に記載の単離された核酸。
  10. 細胞タグをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  11. 前記細胞タグが切断型上皮増殖因子受容体である、請求項１０に記載の単離された核酸。
  12. 前記切断型上皮増殖因子受容体がＨＥＲ１ｔであり、配列番号１０９のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１１に記載の単離された核酸。
  13. 前記切断型上皮増殖因子受容体がＨＥＲ１ｔ−１であり、配列番号１１０のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１１に記載の単離された核酸。
  14. 異種遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチドをコードするさらなるポリヌクレオチドをさらに含み、前記遺伝子スイッチポリペプチドが、（ａ）第１の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたＤＮＡ結合ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド；および（ｂ）第２の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドおよび前記第２の遺伝子スイッチポリペプチドが、リンカーにより接続されている、請求項１に記載の単離された核酸。
  15. 骨格と、
    （１）細胞タグ；
    （２）サイトカイン；ならびに
    （３）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
    （ａ）ＲＯＲ−１抗原結合ドメイン；
    （ｂ）スペーサー；
    （ｃ）膜貫通ドメイン；
    （ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはその両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；および
    （ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン
    を含むＣＡＲ
    をコードする核酸配列とを含むベクター。
  16. 前記ベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである、請求項１５に記載のベクター。
  17. 前記細胞タグが、切断型上皮増殖因子受容体である、請求項１５に記載のベクター。
  18. 前記切断型上皮増殖因子受容体が、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ−１またはその機能的変異体である、請求項１７に記載のベクター。
  19. 前記サイトカインがＩＬ−１５である、請求項１５に記載のベクター。
  20. 前記ＩＬ−１５が膜結合型ＩＬ−１５である、請求項１９に記載のベクター。
  21. 自己切断型トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス（Ｔ２Ａ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載のベクター。
  22. 前記骨格が、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンＤＮＡプラスミドである、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載のベクター。
  23. 前記ＣＡＲが、
    （ａ）配列番号３〜１４に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するポリペプチド；または
    （ｂ）配列番号７５〜８２に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するポリペプチド
    のうちの少なくとも１つを含む、請求項１５に記載のベクター。
  24. 前記ＲＯＲ−１抗原結合ドメインが、配列番号１５〜７４に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１５に記載のベクター。
  25. 前記ＲＯＲ−１抗原結合ドメインが、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、および７３に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１５に記載のベクター。
  26. 前記ＲＯＲ−１抗原結合ドメインが、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、および７４に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１５に記載のベクター。
  27. 前記非ウイルスベクターが、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである、請求項１６に記載のベクター。
  28. 異種遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むさらなるベクターをさらに含み、前記遺伝子スイッチポリペプチドが、（ａ）第１の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたＤＮＡ結合ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド；および（ｂ）第２の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドおよび前記第２の遺伝子スイッチポリペプチドが、リンカーにより接続されている、請求項１５に記載のベクター。
  29. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離された核酸を含む免疫エフェクター細胞。
  30. 請求項１５〜２８のいずれか一項に記載のベクターを含む免疫エフェクター細胞。
  31. （１）細胞タグ；（２）サイトカイン；ならびに（３）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、（ａ）ＲＯＲ−１抗原結合ドメイン；（ｂ）スペーサー；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはその両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン含むＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞。
  32. 前記サイトカインがＩＬ−１５である、請求項３１に記載の免疫エフェクター細胞。
  33. 前記ＩＬ−１５が膜結合型ＩＬ−１５である、請求項３２に記載の免疫エフェクター細胞。
  34. 前記細胞タグが、切断型上皮増殖因子受容体である、請求項３１に記載の免疫エフェクター細胞。
  35. 前記切断型上皮増殖因子受容体が、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ−１またはその機能的変異体である、請求項３４に記載の免疫エフェクター細胞。
  36. 前記細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、または調節性Ｔ細胞である、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞。
  37. 前記ＣＡＲが、配列番号３〜１４または７５〜８２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む、請求項３１に記載の免疫エフェクター細胞。
  38. 前記ＣＡＲが、配列番号１５〜７４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む、請求項３１に記載の免疫エフェクター細胞。
  39. 異種遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチドをさらに含み、前記遺伝子スイッチポリペプチドが、（ａ）第１の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたＤＮＡ結合ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド；および（ｂ）第２の核受容体リガンド結合ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドおよび前記第２の遺伝子スイッチポリペプチドが、リンカーにより接続されている、請求項３１に記載の免疫エフェクター細胞。
  40. ＣＡＲを発現するために遺伝子改変された有効量の細胞をヒト対象に投与することを含む、それを必要とするヒト対象における、標的細胞集団または組織に対するＴ細胞媒介性免疫応答を刺激する方法であって、前記ＣＡＲが
    （ａ）ＲＯＲ−１抗原結合ドメイン；
    （ｂ）スペーサー；
    （ｃ）膜貫通ドメイン；
    （ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはその両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン；
    （ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン；および
    （ｆ）切断型上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔ）
    を含む、方法。
  41. 前記ヒトが、肺がん、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、副腎がん、黒色腫、子宮がん、精巣がん、または膀胱がんのうちの少なくとも１つと診断されている、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記ヒトが、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）と診断されている、請求項４０に記載の方法。
  43. 有効量の操作Ｔ細胞の１または複数の用量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、前記操作Ｔ細胞が、ＲＯＲ−１ ＣＡＲおよび膜結合型ＩＬ−１５を含む、方法。
  44. 有効量の操作Ｔ細胞の第１の用量が、腹膜腔内または静脈内に投与される、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記がんが、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である、請求項４３に記載の方法。
  46. 前記がんが、肺がん、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、副腎がん、黒色腫、子宮がん、精巣がん、または膀胱がんである、請求項４３に記載の方法。
  47. 前記ＲＯＲ−１ ＣＡＲが、配列番号３〜１４、７５〜８２、または１５〜７４に示される配列のうちのいずれか１つによってコードされる、請求項４３に記載の方法。
  48. 操作Ｔ細胞の前記有効量が、少なくとも１０２細胞／ｋｇ、１０４細胞／ｋｇ、または１０５細胞／ｋｇである、請求項４３に記載の方法。
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