JP2024502479A - キメラ受容体療法 - Google Patents

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Abstract

免疫チェックポイントタンパク質の発現を阻害するｍｉＲＮＡをコードする天然に存在しないポリヌクレオチド。ポリヌクレオチドは、キメラ受容体、サイトカイン、及び／又は細胞タグを更にコードし得る。前述のポリヌクレオチドを含む、ベクター。前述のポリヌクレオチドを含む、修飾された免疫エフェクター細胞。前述のポリヌクレオチド及び／又は細胞を含む、組成物及びキット。疾患又は障害に罹患している対象を治療するための方法であって、その治療を必要とする対象に、前述の細胞を投与することを含む、方法。疾患又は障害の治療のための医薬の製造における前述の細胞の使用。対象における抗原の過剰発現と関連する疾患又は障害を検出するための方法。キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド又はそれを含む細胞の連続投与を含む、疾患又は障害を治療するための方法。【選択図】図１Ａ

Description

配列表の参照
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０２２年１月１０日に作成され、７５５９４－３４８５６８＿ＳＬ．ｔｘｔという名前であり、５７９，６２７バイトのサイズである。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ－Ｔ）細胞及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）療法は、近年急速な発展を遂げ、腫瘍細胞の殺傷を首尾よく指示することが示されている。このような療法は、例えば、自己免疫障害及びがんの治療に有用である。実際、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α－葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ－Ｆ、メソセリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、葉酸受容体α、ＭＵＣ１、ＭＵＣ４若しくはＭＵＣ１６などのムチン、ＭＡＧＥ－Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ－７２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、又はＶＥＧＦ－Ｒ２を含むが、これらに限定されない、このような療法に対するいくつかの標的がこれまでに特定されている。これらのうち、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、及びＲＯＲ１は、免疫療法に対する標的として特に有望であることを示している。
ＣＤ１９は、いくつかの要因のために免疫療法に対する魅力的な標的である。これは、様々なＢ細胞リンパ腫及び白血病、並びに正常なＢ細胞で発現するが、造血幹細胞、形質細胞、及び他の健康な組織では見出されない。加えて、ＣＤ１９は、リツキシマブなどのモノクローナル抗体療法の標的である、ＣＤ２０のものよりも広範な発現プロファイルを有し、非効率的な内在化が問題となるＣＤ２０と比較して、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）についてのより良い標的であると考えられる。ＣＤ１９はまた、モノクローナル抗体治療（例えば、リツキシマブ）が、ＣＤ２０下方調節又は他の因子のために無効である場合に発現することが示されている。加えて、ＣＤ１９標的化剤は、抗ＣＤ２０抗体とは異なる作用様式を有するため、それらは、既存のモノクローナル抗体レジメンを補完することができる。
ＣＤ３３は、がんにおけるその高発現及び健康な成人組織における最小発現のために、免疫療法に対する魅力的な標的である。ＣＤ３３は、骨髄性白血病及び白血病幹細胞上で過剰発現する。ＣＤ３３は、成人で最も一般的な急性白血病である、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）において過剰発現している。ＡＭＬ患者の８５～９０％は、芽細胞上でＣＤ３３の発現を示す。ＣＤ３３はまた、７０代の成人において一般的に見出される骨髄のがん性状態である、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）において過剰発現している。
ＭＵＣ１は、乳がんにおいて過剰発現しており、正常な乳腺において欠如しているか、又は低レベルで発現しているため、免疫療法に対する魅力的な標的である。加えて、ＭＵＣ１は、がんにおいてほとんどが異常にグリコシル化不十分であり、がん表面上の抗原は、正常細胞上の抗原とは異なる。したがって、がん免疫療法に対してＭＵＣ１を標的とすることは、がん細胞と正常細胞との間の差異を利用することができる。
ＭＵＣ１６は、がんにおけるその高発現及び健康な成人組織における最小発現のために、免疫療法に対する魅力的な標的である。ＭＵＣ１６は、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、吸熱がん、及び肺がんにおいて異常に発現する。例えば、ＭＵＣ１６は、卵巣腫瘍の８０％超で過剰発現し、これは、婦人科悪性腫瘍の中で最も致命的である。一方、ＭＵＣ１６の限定的な発現は、健康な組織上で見出されている。卵巣がんに対する現在の標準治療は手術であり、続いて白金剤及びタキサンの併用による化学療法である。しかしながら、この疾患の再発は、初期治療後にほとんどの患者で発生し、度重なる手術及び追加のラウンドの化学療法のサイクルをもたらす。
受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）は、がんにおけるその高発現及び健康な成人組織における最小発現のために、免疫療法に対する魅力的な標的である。ＲＯＲ１は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、及びびまん性Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を含む複数の血液腫瘍、並びにトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）を包含する乳腺がん、膵臓がん、卵巣がん、及び肺腺がんを含む固形腫瘍において異常に発現する。
多くの患者は、ＣＡＲ－Ｔ及びＴＣＲ療法で持続的な応答を有するが、一部の患者にとって、そのような療法の抗腫瘍効果は、長続きしないか、又は無効であるかのいずれかである。有望であることが示されている別の免疫療法は、免疫チェックポイント阻害であり、これは、Ｔ細胞のスイッチオフを防止し、これらの細胞の活性を促進することができる。チェックポイント阻害剤標的の例としては、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、４－１ＢＢ、ＰＩＫ３ＩＰ１、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、又はＶＩＳＴＡが挙げられるが、これらに限定されない。これらのうち、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、及び／又はＰＩＫ３ＩＰ１を標的とすることが最も有望であることが示されている。最も研究されているチェックポイント阻害経路のうちの１つは、ＰＤ－１／プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）経路であり、これは、腫瘍細胞が免疫応答を回避する方法において重要な役割を果たす。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断抗体を利用する免疫療法は、臨床で広く評価されており、特にＣＡＲ－Ｔ細胞と併せて投与される場合、複数の悪性腫瘍にわたる腫瘍退縮を改善することが示されている。しかしながら、チェックポイント阻害剤遮断抗体は、がんのタイプにわたって一貫して実施されておらず、腫瘍微小環境へのアクセスが制限されている可能性があり、反復投与を必要とし、経時的に有効性を失う可能性がある。ゲノム編集は、ＰＤ－１媒介性ＣＡＲ－Ｔ細胞の枯渇を排除するための代替アプローチであり、ＰＤ－１遮断を操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞のみに制限するという利点を有する。しかしながら、遺伝子編集は、製造プロセスを複雑にし、細胞療法のターンアラウンド時間及びコストを増加させる。
したがって、ＣＡＲ－Ｔ及び／又はＴＣＲ療法を全身チェックポイント阻害と組み合わせた治療を含む、抗原関連疾患及び状態に対する、より安全で、より効果的で、より安価な療法を得るための継続的な必要性が当該技術分野において存在する。
また、免疫学的監視の喪失、腫瘍抗原組成物の遺伝子変化、及び腫瘍の不均一性（がん細胞の表現型の差異を引き起こす）などの複雑なインビボ生物学的問題に対処するために、抗原の多面的標的化を提供するために、治療レジメンを多様化する方式を考案する必要性が存在する。
本発明は、部分的には、免疫チェックポイントタンパク質の発現を阻害するｍｉＲＮＡをコードする天然に存在しないポリヌクレオチドに関する。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＧＩＴＲ、又はＰＩＫ３ＩＰ１を標的とする。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ＰＤ－１を標的とする。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号７２～８７のうちのいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は配列番号７２～８７のうちのいずれか１つの相補体にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる、核酸配列を含む。特定のそのような実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、及び８６のうちのいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、７０４、７０５、７０９、及び７１０のうちのいずれか１つの相補体にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる、核酸配列を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１７９若しくは１８０と少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は配列番号１７９若しくは１８０の相補体にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる、核酸配列を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２６７と少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は配列番号２６７の相補体にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる、核酸配列を含む。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ａ）配列番号２９２と少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は配列番号２９１の相補体にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる、核酸配列と、ｂ）配列番号２９２と少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は配列番号２９２の相補体にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる、核酸配列と、を更に含む。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、キメラ受容体を更にコードする。特定の実施形態では、キメラ受容体は、Ｔ細胞受容体又はキメラ抗原受容体である。
特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、又はＲＯＲ１上のエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む。特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＲＯＲ１上のエピトープに結合する。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３４７、３５１、３５５、３５９、３６３、３６７、３７１、３７５、３７９、３８３、３８７、３９１、３９５、３９９、４０３、４０７、４１１、４１５、４１９、４２３、４２７、４３１、４３５、４３９、４４３、４４７、４５１、４５５、４５９、及び４６３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む、可変軽鎖ドメインを含む。特定のそのような実施形態では、可変軽鎖ドメインは、配列番号３８７のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３４９、３５３、３５７、３６１、３６５、３６９、３７３、３７７、３８１、３８５、３８９、３９３、３９７、４０１、４０５、４０９、４１３、４１７、４２１、４２５、４２９、４３３、４３７、４４１、４４５、４４９、４５３、４５７、及び４６１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む、可変重鎖ドメインを含む。特定のそのような実施形態では、可変重鎖ドメインは、配列番号３４９のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。
特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、スペーサーを含む。特定のそのような実施形態では、スペーサーは、ＣＤ８αヒンジドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントである、ストーク領域を含む。特定のそのような実施形態では、ストーク領域は、配列番号４６７のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、スペーサーは、ストーク伸長領域を含む。特定のそのような実施形態では、ストーク伸長領域は、配列番号４７３のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。
特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、膜貫通ドメインを更に含む。特定のそのような実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定のそのような実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号４７５のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。
特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインを更に含む。特定のそのような実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定のそのような実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４７９のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。
特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含む。特定のそのような実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４８１のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。
特定の実施形態では、サイトカインは、細胞タグを更にコードする。特定の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－１５、又はその機能的断片若しくはバリアントである。特定のそのような実施形態では、サイトカインは、配列番号５１９のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。
特定の実施形態では、ＩＬ－１５、又はその機能的断片若しくはバリアントは、膜結合型である。特定のそのような実施形態では、ＩＬ－１５、又はその機能的断片若しくはバリアントは、ＩＬ－１５Ｒα、又はその機能的断片若しくはバリアントも含む融合タンパク質の一部を形成する。特定のそのような実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５２３のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５２５のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞タグを更にコードする。特定の実施形態では、細胞タグは、切頭ＨＥＲ１、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、切頭ＨＥＲ１は、ＨＥＲ１ドメインＩＩＩ、又はその機能的断片若しくはバリアントと、切頭ＨＥＲ１ドメインＩＶ、又はその機能的断片若しくはバリアントと、を含む。特定のそのような実施形態では、切頭ＨＥＲ１は、配列番号５６５のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントと、配列番号５６７のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントと、を含む。
特定の実施形態では、細胞タグは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定のそのような実施形態では、細胞タグは、配列番号５７１のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。
本発明はまた、前述のポリヌクレオチドを含むベクターにも関する。ベクターは、ウイルスであってもよいか、又は非ウイルスであってもよい。特定の実施形態では、ベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンを含む。
本発明は、前述のポリヌクレオチドを含む修飾された免疫エフェクター細胞に更に関する。特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。
本発明は、前述のポリヌクレオチド及び／又は細胞を含む組成物及びキットに更に関する。
本発明の更なる態様は、疾患又は障害に罹患している対象を治療するための方法であり、前述の細胞を、その治療を必要とする対象に投与することを含む。本発明はまた、疾患又は障害の治療のための医薬の製造における前述の細胞の使用にも関する。疾患又は障害は、抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＲＯＲ１、ＭＵＣ１、又はＭＵＣ１６の過剰発現と関連するものであり得る。特定の実施形態では、疾患又は障害は、ＲＯＲ１の過剰発現と関連するものである。
特定の実施形態では、疾患又は障害は、がんである。特定の実施形態では、疾患又は障害は、慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、若しくはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、トリプルネガティブ乳がんを包含する乳腺腺がん、膵臓がん、卵巣がん、又は肺腺がんである。
本発明の別の態様は、対象における抗原の過剰発現と関連する疾患又は障害を検出するための方法であって、ａ）対象からの試料を、抗体、又はその抗原結合断片のうちの１つ以上と接触させることと、ｂ）疾患を欠く対照試料へのそのような結合と比較して、試料への抗体又はその断片の結合の増加したレベルを検出し、それによって対象における疾患を検出することと、を含む、方法である。
本発明のなお更なる態様は、抗原標的の配列に対して異なる構造組成及び結合特異性を有するキメラ抗原受容体の集合から選択されるキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む、細胞、核酸、ウイルスベクター、又は非ウイルスベクターの連続投与を含む、がん及び自己免疫疾患若しくは障害などの疾患又は障害を治療するための方法である。特定のそのような実施形態では、方法は、集合からの１つ以上のキメラ抗原受容体を発現する細胞の１回目の投与、続いて集合からの１つ以上のキメラ抗原受容体を発現する細胞の２回目の投与を含み、１回目の投与と２回目の投与との間に一定の期間が経過する。
１つ以上のチェックポイント阻害剤ｍｉＲＮＡとキメラ受容体との組み合わせを含むベクターの例示的な図である（ＳＤ＝スプライスドナー；ＳＡ＝スプライスアクセプター）。 様々な５’位又は３’位における標的ｍｉＲＮＡ及び相補配列を含む、様々なｐｒｉ－ｍｉＲＮＡのヘアピン及びループ設計の例示的な図である。 導入遺伝子カセット内のその位置を含む、様々なｐｒｉ－ｍｉＲＮＡのヘアピン及びループ設計の例示的な図である。 ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲの存在下又は不在下でのｍｉＲＮＡ構築物の様々な組み合わせのトランスフェクション後のＰＤ１相対ＲＮＡ発現を示すグラフである。Ｘ軸に示される構築物＃１～８は、表１０に概略的に提示される通りである。 ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ刺激ＣＤ３３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を有するＮａｎｏｓｔｒｉｎｇヒト遺伝子パネルコードセットを使用して７００超の遺伝子の遺伝子分析から得られた正規化された絶対転写物カウントを示すグラフである。図３Ａでは、Ｙ軸は、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴを標的とする２つのチェックポイント阻害剤ｍｉＲＮＡをコードするイントロンを含有するＣＡＲ－Ｔ細胞からの転写物カウント（ＣＤ３３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ＋ｍｉＲＮＡ（ＰＤ－１＋ＴＩＧＩＴ））をプロットし、Ｘ軸は、ＣＡＲ－Ｔ細胞からの転写物のみ（いずれのチェックポイント阻害ｍｉＲＮＡも含有しない）をプロットする。円は、目的の遺伝子を示す。図３Ｂでは、Ｙ軸は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を含有するＰＤ－１ｍｉＲＮＡからの転写物カウント（ＣＤ３３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ＋ｍｉＲＮＡ（ＰＤ－１＋ＰＤ－１））をプロットし、Ｘ軸は、ＣＡＲ－Ｔ細胞からの転写物のみをプロットする。図３Ｃは、Ｙ軸上に非標的化ｍｉＲＮＡ対照（ＣＤ３３ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ＋ｍｉＲＮＡスクランブル＊）をプロットし、Ｘ軸上にｍｉＲＮＡ含有イントロンを含まないＣＡＲ－Ｔ細胞をプロットする。円は、目的の遺伝子を示し、チェックポイント阻害剤ｍｉＲＮＡ設計のオンターゲット特異性を示すために使用される。３つのグラフは全て、１人のドナーに由来した。＊スクランブル対照は、非標的化ｍｉＲＮＡである。 ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ刺激ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞で設定されたＮａｎｏｓｔｒｉｎｇヒト遺伝子パネルコードを使用して７００超の遺伝子の遺伝子分から得られた正規化された絶対転写物カウントを示すグラフである。図４Ａでは、Ｙ軸は、ＰＤ－１内の２つの異なる配列を標的とするｍｉＲＮＡをコードするイントロン、及びＴＩＧＩＴについての配列を含有するＣＡＲ－Ｔ細胞からの転写産物カウント（ＭＵＣ１６ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ（「ＭＵＣ１６ＣＡＲ」とも総称される）＋ｍｉＲＮＡ（ＰＤ－１／ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ））をプロットし、Ｘ軸は、ｍｉＲＮＡ含有イントロンを含まないＣＡＲ－Ｔ細胞からの転写産物（ＭＵＣ１６ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ）をプロットする。黒丸は、目的の遺伝子を示す。図４Ｂでは、Ｘ軸は同じであり、Ｙ軸は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を含有するｍｉＲＮＡを標的とする二重ＰＤ－１からの転写物カウント（ＭＵＣ１６ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ＋ｍｉＲＮＡ（ＰＤ－１／ＰＤ－１））をプロットする。図４Ｃは、Ｙ軸上に非標的化ｍｉＲＮＡ対照（ＭＵＣ１６ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ＋ｍｉＲＮＡ（スクランブル））をプロットし、Ｘ軸上にｍｉＲＮＡ含有イントロンを含まないＣＡＲ－Ｔ細胞をプロットする。３つのグラフは全て、１人のドナーに由来する。 経時的にＭＵＣ１６を発現するＧＦＰ＋Ｋ５６２細胞の数を示すグラフである。各時点で黒丸で塗りつぶされた点を有する線は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を含まないウェル中のＧＦＰ＋標的細胞の数を示す。正方形の開口点を有する線は、ｍｉＲＮＡ含有イントロンを含まない（（「ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む」））、ＭＵＣ１６ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ ＣＡＲ－Ｔ細胞を有するウェル中の標的細胞カウントを示す。灰色の丸で塗りつぶされた点を有する線は、ｍｉＲＮＡを標的とする二重ＰＤ－１を有する合成イントロンを含有するＣＡＲ－Ｔ細胞（ＭＵＣ１６ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ＋ｍｉＲＮＡ（ＰＤ－１／ＰＤ－１）（「ＣＡＲ－Ｔ＋ｍｉＲＮＡ細胞を有する」）を有するウェル中の標的細胞カウントを示す。データは１人のドナー由来であり、プロットは、３連のウェルの平均＋ＳＤである。＊＊＊Ｐ＜０．００１は、ダネットの多重比較事後検定を用いる２元配置分散分析に基づいた。 経時的なＧＦＰ＋Ｋ５６２／ＭＵＣ１６＋／ＰＤ－Ｌ１＋／ＣＤ１５５＋細胞の数を示すグラフである。各時点で正方形の塗りつぶされた点を有する線は、ウェル中のＧＦＰ＋標的細胞のみの数を示す。白丸の点を有する線は、ｍｉＲＮＡ含有イントロンを含まないＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＭＵＣ１６ ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ（ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む））を有するウェル中の標的細胞カウントを示す。白丸で塗りつぶされた点を有する線は、二重ＰＤ－１を有する合成イントロン及びＴＩＧＩＴ標的化ｍｉＲＮＡを含有するＣＡＲ－Ｔ細胞（ＭＵＣ１６ＣＡＲ－ｍｂＩＬ１５－ＨＥＲ１ｔ＋ｍｉＲＮＡ（ＰＤ－１／ＰＤ－１／ＴＩＧＩＴ）（ＣＡＲ－Ｔ＋ｍｉＲＮＡ細胞を有する））を有するウェル中の標的細胞カウントを示す。データは１人のドナー由来であり、プロットは、３連のウェルの平均＋ＳＤである。 腫瘍標的細胞（Ｋ５６２／ＭＵＣ１６ｔ）と共培養後の１つ以上のチェックポイント阻害剤ｍｉＲＮＡの組み合わせを有する、ＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＩＦＮガンマ及びＧＭ－ＣＳＦのサイトカイン発現レベルを示す。 腫瘍標的細胞と共培養することなく、１つ以上のチェックポイント阻害剤ｍｉＲＮＡの組み合わせを有する、ＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＩＦＮガンマ及びＧＭ－ＣＳＦのサイトカイン発現レベルを示す。Ｘ軸に示される構築物＃１～１１は、表１１に概略的に提示される通りである。 様々なｍｉＲＮＡと組み合わせてＭＵＣ１６ ＣＡＲ＋ｍｂＩＬ－１５＋ＨＥＲ１ｔ（「ＭＵＣ１６ ＣＡＲ」として示される）で処置されたマウスにおける腫瘍量を示す。 ＭＵＣ１６ＣＡＲ＋ｍｂＩＬ１５＋ＨＥＲ１ｔ（ＣＡＲのみ）及びＭＵＣ１６ＣＡＲ＋ｍｂＩＬ１５＋ＨＥＲ１ｔ＋ｍｉＲＮＡ（ＰＤ１／ＰＤ－１）（ＣＡＲ＋ｍｉＲＮＡ（ＰＤ－１／ＰＤ－１））処置マウスの血液中のｈＣＤ４５／ＣＤ３＋／ＨＥＲ１ｔ＋発現のゲーティング後の細胞集団におけるＰＤ－１レベルを示す。 ＣＡＲ及びＣＡＲ＋ｍｉＲＮＡ（ＰＤ－１／ＰＤ－１）処置マウスにおける蛍光強度中央値（ＭＦＩ）によって測定した場合のＰＤ－１レベルを示す。 様々なＣＡＲ及びＣＡＲ＋ｍｉＲＮＡ処置マウスの血液中のｈＣＤ４５／ＣＤ３＋／ＨＥＲ１ｔ＋発現のゲーティング後の細胞集団におけるＰＤ－１及びＴＩＧＩＴ ＭＦＩレベルを示す。Ｘ軸に示される群＃１～９は、表１２に概略的に提示される通りである。 ＰＤ１サイレンサーモジュールが、ガイドｍｉＲＮＡを産生すること、及び５つのＴ細胞ドナーから生成されるＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＰＤ１ ｍＲＮＡ発現の対応する減少を示す。ＰＤ１標的化ガイドｍｉＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲ結果を示す。 ＰＤ１サイレンサーモジュールが、ガイドｍｉＲＮＡを産生すること、及び５つのＴ細胞ドナーから生成されるｕｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＰＤ１ ｍＲＮＡ発現の対応する減少を示す。ＰＤ１ ｍＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲ結果を示す。 ＰＤ１サイレンシングモジュールが、非標的化パッセンジャーｍｉＲＮＡよりもＰＤ１標的化ガイドｍｉＲＮＡを優先的に産生したことを示す。 ガイドｍｉＲＮＡが、ＰＤ１サイレンサーモジュールに由来する優勢な小さいＲＮＡ種であることを示す。 全ての小さいＲＮＡｓｅｑ読み取りのパーセンテージとしてのＰＤ１サイレンサーモジュールに対する成熟ｍｉＲＮＡマッピングの定量化を示す。 ＲＯＲ１ ＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ対照細胞と比較したＲＯＲ１＋ＰＤ１サイレンサー細胞における差次的遺伝子発現を示す。 転写産物の対数倍の変化に対する予測されるｍｉＲＮＡ結合強度の比較を示す。 本開示の遺伝子構築物についての例示的なスキームを提供する。 本開示の経路及びエレメントの概略図を提供する。 本開示の治療レジメンが進行し得る経路の例を提供する。 本開示の追加の実施形態の表示を提供する。 本開示の追加の実施形態の表示を提供する。
以下の説明及び実施例は、本開示の実施形態を詳細に例示する。
本開示は、本明細書に記載される特定の実施形態に限定されず、したがって変更可能であることを理解されたい。当業者は、本発明の範囲内に包含される、本開示の変形及び修正が存在することを認識するであろう。
別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成の目的のためにのみ使用され、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
本開示の様々な特徴を、単一の実施形態の文脈で説明することができるが、これらの特徴を別々に、又は任意の好適な組み合わせで提供することもできる。反対に、本開示は、明確にするために別個の実施形態に関して本明細書に記載され得るが、本開示はまた、単一の実施形態で実施されてもよい。
以下の定義は、当該技術分野のものを補完し、現在の出願に向けられており、任意の関連又は無関係の事例、例えば、任意の共同所有の特許又は出願に帰属するものではない。本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を記載する目的のためであり、限定することは意図されない。
Ｉ．定義
本出願では、特に断りのない限り、単数形の使用は、複数形を含む。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別段に明示されない限り、複数の参照物を含む。
本出願では、「又は」の使用は、別段明記されない限り、「及び／又は」を意味する。「及び／又は」及び「それらの任意の組み合わせ」という用語、並びに本明細書で使用されるそれらの文法的同義語は、互換的に使用され得る。これらの用語は、任意の組み合わせが具体的に企図されていることを伝えることができる。単に例示的な目的のために、以下の「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」又は「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はそれらの任意の組み合わせ」という語句は、「個別的にＡ、個別的にＢ、個別的にＣ、Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、Ａ及びＣ、並びにＡ、Ｂ、及びＣ」を意味することができる。「又は」という用語は、文脈が具体的に離接的使用を指す場合を除いて、接続的又は離接的に使用され得る。
更に、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、並びに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は、限定されない。
本明細書での、「いくつかの実施形態」、「実施形態」、「一実施形態」又は「他の実施形態」への言及は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、又は特性が、本開示の少なくともいくつかの実施形態に含まれるが、必ずしも全ての実施形態に含まれるわけではないことを意味する。
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（及び含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（及び有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態、例えば、「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（及び含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形態、例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」）、又は「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（及び含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形態、例えば、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」）という文言は、包括的又はオープンエンドであり、追加の、記載されていない、エレメント又は方法工程を除外しない。本明細書で考察される任意の実施形態は、本開示の任意の方法又は組成物に関して実施することができ、逆もまた同様であることが企図される。更に、本開示の組成物を使用して、本開示の方法を達成することができる。
「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値に対する許容可能な誤差範囲内であることを意味し、これは、その値が、どのように測定又は決定されるか、すなわち、測定システムの制限に一部依存する。例えば、「約」は、当該技術分野における慣例に従って、１以内又は１を超える標準偏差を意味し得る。代替的に、「約」は、所与の値の２０％まで、１０％まで、５％まで、又は１％までの範囲を意味し得る。別の例では、「約１０」の量は、１０及び９～１１の任意の量を含む。更に別の例では、参照数値に関連する「約」という用語は、その値からプラス又はマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％の範囲の値も含むことができる。代替的に、特に生体系又はプロセスに関して、「約」という用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内であることを意味し得る。本出願及び特許請求の範囲において特定の値が記載される場合、別段の記載がない限り、特定の値について許容可能な誤差範囲内であることを意味する「約」という用語が、想定されるべきである。
「治療有効量」又は「治療有効用量」は、所望される治療結果を達成するために、必要な期間、有効な量又は用量を指す。この量は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに個体において所望される応答を誘発する本発明の核酸配列の能力などの要因に応じて変動し得る。
「ポリヌクレオチド」又は「オリゴヌクレオチド」は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチド又は核酸のポリマー形態を指す。この用語は、分子の一次構造のみを指す。したがって、この用語には、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、三本鎖ＤＮＡ、並びに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡが含まれる。また、これには、例えば、メチル化及び／又はキャッピングによる修飾、並びにポリヌクレオチドの非修飾形態も含まれる。この用語はまた、非天然又は合成ヌクレオチド、並びにヌクレオチド類似体を含む、分子も含むことを意味する。
特に明記しない限り、本明細書の本文中の核酸配列は、左から右に読んだ場合、５’から３’の方向で与えられる。
本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」、「形質転換」、「ヌクレオフェクション」又は「形質導入」という用語は、物理的、化学的、及び／又は電気的方法を使用することによる、宿主細胞又は生物への１つ以上の外因性ポリヌクレオチドの導入を指す。本明細書に開示される核酸配列及びベクターは、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈殿、リン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈殿、リポソーム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、ポリカチオン媒介トランスフェクション、タングステン粒子促進微粒子衝撃、ウイルス、及び／又は非ウイルス媒介トランスフェクションを含む、任意のそのような方法によって細胞又は生物に導入することができる。いくつかの場合では、核酸を細胞又は生物に導入する方法は、ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、又はトランスポゾン、又は転位性エレメント媒介（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）ベクターの使用を伴う。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及びそれらの文法的同義語は、アミノ酸残基のポリマーを指す。ポリペプチドは、任意選択的に、所与の細胞環境における所与のタンパク質に典型的なグリコシル化又は他の修飾を含むことができる。本明細書に開示されるポリペプチド及びタンパク質（その機能的断片及び機能的バリアントを含む）は、１つ以上の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含むことができる。このような合成アミノ酸は、当該技術分野において既知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α－アミノｎ－デカン酸、ホモセリン、Ｓ－アセチルアミノメチル－システイン、トランス－３－及びトランス－４－ヒドロキシプロリン、４－アミノフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、４－カルボキシフェニルアラニン、β－フェニルセリン β－ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α－ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン－２－カルボン酸、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’－ベンジル－Ｎ’－メチル－リジン、Ｎ’，Ｎ’－ジベンジル－リジン、６－ヒドロキシ－リジン、オルニチン、α－アミノシクロペンタンカルボン酸、α－アミノシクロヘキサンカルボン酸、α－アミノシクロヘプタンカルボン酸、α－（２－アミノ－２－ノルボルナン）－カルボン酸、α，γ－ジアミノ酪酸、α，β－ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、及びα－ｔｅｒｔ－ブチルグリシンを含む。本開示は、操作された細胞における本明細書に記載されるポリペプチド又はタンパク質の発現が、ポリペプチド又はタンパク質の１つ以上のアミノ酸の翻訳後修飾と関連付けられ得ることを更に企図する。翻訳後修飾の非限定的な例には、リン酸化、アセチル化及びホルミル化を含むアシル化、グリコシル化（Ｎ結合型及びＯ結合型を含む）、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化及びエチル化を含むアルキル化、ユビキチン化、ピロリドンカルボン酸の付加、ジスルフィド架橋の形成、硫酸化、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、ファルネシル化、ゲラニル化、グリピエーション（ｇｌｙｐｉａｔｉｏｎ）、リポイル化、及びヨウ素化が挙げられる。
「保存的アミノ酸置換」又は「保存的変異」という用語は、共通の特性を有する別のアミノ酸による１つのアミノ酸の置換を指す。個々のアミノ酸間の共通の特性を定義する機能的方式は、相同生物の対応するタンパク質間のアミノ酸変化の正規化された頻度を分析することである（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．ａｎｄ Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，Ｒ．Ｈ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７９））。そのような分析によれば、アミノ酸の群は、群内のアミノ酸が互いに優先的に交換し、したがって、全体的なタンパク質構造への影響において互いに最も類似している場合に定義することができる（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．ａｎｄ Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，Ｒ．Ｈ．，上記）。保存的変異の例としては、以下のサブグループ内のアミノ酸のアミノ酸置換、例えば、正電荷を維持することができるように、アルギニンに対するリジン、及びその逆、負電荷を維持することができるように、アスパラギン酸に対するグルタミン酸、及びその逆、遊離－ＯＨを維持することができるように、スレオニンに対するセリン、並びに遊離－ＮＨ２を維持することができるように、アスパラギンに対するグルタミンが挙げられる。例示的な保存的アミノ酸置換を以下の表に示す。
Figure 2024502479000002

保存的アミノ酸置換のみによって参照アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列は、本明細書では、参照配列の「保存的に置換されたバリアント」と称される。
いくつかの実施形態では、機能的バリアントは、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を有する参照タンパク質のアミノ酸配列を含み得る。「非保存的変異」という用語は、異なる基、例えば、トリプトファンに対するリジン、又はセリンに対するフェニルアラニンなどの間のアミノ酸置換を伴う。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性を妨げないか、又は阻害しないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、相同親タンパク質と比較して機能的バリアントの生物学的活性が増加するように、機能的バリアントの生物学的活性を高めることができる。アミノ酸置換性は、例えば、Ｌ．Ｙ．Ｙａｍｐｏｌｓｋｙ ａｎｄ Ａ．Ｓｔｏｌｔｚｆｕｓ，“Ｔｈｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２００５ Ａｕｇ．；１７０（４）：１４５９－１４７２により詳細に考察される。
ポリペプチドの２つの核酸配列又はアミノ酸配列の文脈において、本明細書で使用される場合、「同一の」及びその文法的同義語、又は「配列同一性」という用語は、特定の比較ウィンドウにわたって最大一致について整列させたときに同じである２つの配列中の残基を指す。本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０の連続した位置、通常、約５０～約２００、より通常、約１００～約１５０のセグメントを指し、配列は、２つの配列が最適に整列された後に、同じ数の連続した位置の参照配列と比較され得る。比較のための配列のアラインメント方法は、当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３（１９７０）のアラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：２４４４（１９８８）の類似検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ ＣａｌｉｆによるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡを含むが、これらに限定されない）によって、行うことができ、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ，７３：２３７－２４４（１９８８）及びＨｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１－１５３（１９８９）、Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：１０８８１－１０８９０（１９８８）、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，８：１５５－１６５（１９９２）、並びにＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２４：３０７－３３１（１９９４）によって十分に説明されている。また、アライメントは、多くの場合、検査及び手動アライメントによって実施される。実施形態の１つのクラスでは、本明細書のポリペプチドは、例えば、デフォルトのパラメータを使用してＢＬＡＳＴＰ（又はＣＬＵＳＴＡＬ、若しくは任意の他の利用可能なアラインメントソフトウェア）によって測定した場合、参照ポリペプチド（すなわち、その全長）、又はその断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９８％、９９％、又は１００％同一である。同様に、核酸もまた、出発核酸を参照して記載することができ、例えば、それらは、例えば、デフォルトパラメータを使用して、ＢＬＡＳＴＮ（又はＣＬＵＳＴＡＬ、若しくは任意の他の利用可能なアラインメントソフトウェア）によって測定した場合、参照核酸（すなわち、その全長）、又はその断片と５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９８％、９９％又は１００％同一であり得る。１つの分子が、より大きな分子との配列同一性の一定の割合を有すると言われる場合、それは、２つの分子が最適に整列される場合、より小さな分子内の残基の割合が、２つの分子が最適に整列される順序に従って、より大きな分子内で一致する残基を見つけることを意味する。
本明細書及び特許請求の範囲の目的のために、参照配列「と少なくとも５０％の配列同一性を有する」という語句、又はその中の任意の範囲（例えば、「と少なくとも８０％の配列同一性」）を参照することは、参照配列自体を包含することが理解される。したがって、例えば、「配列番号０と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸」を記載する請求項は、配列番号０自体を包含する。
核酸又はアミノ酸配列に適用される「実質的に同一」という用語及びその文法的同義語は、核酸又はアミノ酸配列が、標準パラメータを使用して、上記のプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴを使用した参照配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。
「相同性」は、一般に、２つ以上の核酸又はタンパク質（又はそれらの配列）の間の配列同一性から推測される。相同性を確立するのに有用な配列間の同一性の正確な割合は、問題の核酸及びタンパク質により変化するが、相同性を確立するために通常使用される配列同一性はわずか２５％である。配列同一性のより高いレベル、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％以上も、相同性を確立するために使用することができる。配列同一性の割合を決定するための方法（例えば、デフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ）が本明細書に記載されており、一般に利用可能である。核酸及び／又は核酸配列は、それらが、天然又は人工的に、共通の祖先の核酸又は核酸配列に由来する場合、「相同」である。タンパク質及び／又はタンパク質配列は、それらのコードＤＮＡが、天然又は人工的に、共通の祖先の核酸又は核酸配列に由来する場合、「相同」である。相同分子は、相同体と称され得る。例えば、任意の天然に存在するタンパク質は、任意の利用可能な変異誘発法によって修飾することができる。発現した場合、この変異誘発核酸は、元の核酸によってコードされたタンパク質に相同であるポリペプチドをコードする。
本明細書では、開示される配列とハイブリダイズする核酸分子も企図され、含まれる。ハイブリダイゼーション条件は、保証されるように、軽度、中程度、又はストリンジェントであってもよい。
ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件、例えば、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続いて５０℃での２×ＳＳＣの洗浄が既知であるか、又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１－６．３．６に見出すことができる。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、３７℃の温度で４～１２時間、５０％ホルムアミド中の１．０ＭのＮａＣｌの塩濃度を含み、続いて６０～６５℃で０．１×ＳＳＣ中で洗浄する条件である。
当業者に理解されるように、核酸配列のわずかな変化は、必ずしもコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を変化させるわけではない。本開示は、当業者に理解されるように、コドン使用の縮重を包含する。例えば、当該技術分野で既知のように、異なるコドンは、以下の表に示されるように、同じアミノ酸をコードする。
Figure 2024502479000003

本明細書で使用される場合、「コドン縮重バリアント」という語句は、核酸配列を参照して使用される場合、参照配列とは異なるが、参照配列によってコードされるものと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を意味する。
加えて、部分的な配列が、多くの場合、全長型と同様に効果的に作用することが当業者には理解されるであろう。ヌクレオチド配列を変化又は短縮することができる方式は、当業者に周知であり、修飾された遺伝子の適合性又は有効性を試験する方式も同様である。特定の実施形態では、修飾された遺伝子の適合性及び／又は有効性は、例えば、従来のガスクロマトグラフィーによって容易に試験され得る。したがって、遺伝子のそのような変化は全て、本開示の一部として含まれる。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語及びその文法的同義語は、その天然環境からの核酸の除去を指す。しかしながら、核酸及びタンパク質は、希釈剤又はアジュバントと共に製剤化され得、依然として実用的な目的のために単離され得ることを理解されたい。
本明細書で使用される場合、「精製された」という用語及びその文法的同義語は、天然から除去された（ゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡを含む）か、又は合成された（ｃＤＮＡを含む）及び／又は実験室条件下で増幅されたかにかかわらず、純度が増加した分子又は組成物を指し、「純度」は、「絶対純度」ではない相対的な用語である。例えば、核酸は、細胞への導入に使用される場合、典型的には、許容される担体又は希釈剤と混合される。本明細書で使用される場合、「実質的に精製された」という用語、及びその文法的同義語は、核酸配列、ポリペプチド、タンパク質又は他の化合物を指し、これらは、核酸、ポリペプチド、タンパク質若しくは他の化合物が、天然に会合する、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、及び他の分子を本質的に含まない、すなわち、約５０％超含まない、約７０％超含まない、約９０％超含まない。
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」又は「Ｔリンパ球」は、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の一種である。それらは、細胞表面上にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が存在することによって、Ｂ細胞及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などの他のリンパ球と区別することができる。
「トランスポゾン」、「転位性エレメント」、又は「ＴＥ」は、ゲノム内でその位置を変化させることができ、時には変異を作製又は逆転させ、細胞のゲノムサイズを変化させることができるベクターＤＮＡ配列を指す。転位は、多くの場合、トランスポゾンの重複をもたらす。クラスＩトランスポゾンは、２つの段階でコピーされる：まず、それらは、ＤＮＡからＲＮＡに転写され、次いで、産生されるＲＮＡは、ＤＮＡに逆転写される。このコピーされたＤＮＡは、次いで、新しい位置でゲノムに挿入される。逆転写工程は、トランスポゾン自体によってコードされ得る逆転写酵素によって触媒される。レトロトランスポゾンの特徴は、ＨＩＶなどのレトロウイルスに類似している。クラスＩＩトランスポゾンのカットアンドペースト転位機構は、ＲＮＡ中間体を伴わない。転位はいくつかのトランスポザーゼ酵素によって触媒される。いくつかのトランスポザーゼは、ＤＮＡ内の任意の標的部位に非特異的に結合するが、他のトランスポザーゼは、特定のＤＮＡ配列標的に結合する。トランスポザーゼは、標的部位でずらして切断し、一本鎖５’又は３’ＤＮＡオーバーハング（付着末端）をもたらす。この工程は、ＤＮＡトランスポゾンを切り取り、次いで、それを新しい標的部位にライゲーションし、このプロセスは、ギャップを埋めるＤＮＡポリメラーゼ、及び糖－リン酸骨格を閉じるＤＮＡリガーゼの活性を伴う。これにより、標的部位の重複が生じる。ＤＮＡトランスポゾンの挿入部位は、標的ＤＮＡ内でずらして切断し、ＤＮＡポリメラーゼによって充填することによって作製することができる短い直接反復、続いてトランスポザーゼによるトランスポゾン切除に重要な一連の逆方向反復によって識別することができる。ドナー部位が既に複製されているが、標的部位がまだ複製されていない細胞周期のＳ期中に転位が起こる場合、カットアンドペーストトランスポゾンを複製することができる。転位は、クラスＩ及びクラスＩＩトランスポゾンの両方において、「自律性」又は「非自律性」のいずれかに分類することができる。非自律性トランスポゾンが移動するために別のトランスポゾンの存在を必要とする間、自律性トランスポゾンは、それ自体で移動することができる。これは、多くの場合、非自律性トランスポゾンが、トランスポザーゼ（クラスＩＩの場合）又は逆転写酵素（クラスＩの場合）を欠いているためである。
「トランスポザーゼ」は、トランスポゾンの末端に結合し、カットアンドペースト機構又は複製転位機構によって、ゲノムの別の部分へのトランスポゾンの移動を触媒する酵素を指す。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼの触媒活性を利用して、遺伝子をベクターからゲノムに移動させることができる。
「発現ベクター」又は「ベクター」は、細胞内のポリヌクレオチド複製の自律単位のいずれかとして機能する任意の遺伝子エレメント、例えば、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、染色体、ウイルス、トランスポゾンである。（すなわち、それ自体の制御下で複製することができる）、又は結合したセグメントの複製及び／若しくは発現をもたらすように、別のポリヌクレオチドセグメントを結合している宿主細胞染色体内に挿入することによって複製することができるようになる。好適なベクターとしては、プラスミド、トランスポゾン、バクテリオファージ及びコスミドが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、所望の宿主細胞内へのベクターのライゲーション又は挿入をもたらし、結合セグメントの発現をもたらすのに必要なポリヌクレオチド配列を含むことができる。そのような配列は、宿主生物に応じて異なり、それらは、転写をもたらすためのプロモーター配列、転写を増加させるためのエンハンサー配列、リボソーム結合部位配列、並びに転写及び翻訳終結配列を含む。代替的に、発現ベクターは、宿主細胞ＤＮＡ配列内へのベクターのライゲーション又は組み込みなしに、その中にコードされる核酸配列産物を直接発現することが可能であり得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主細胞内で複製することができ、適切な選択的圧力の存在下で宿主細胞内でＤＮＡの染色体外セグメントとして持続する「エピソーム発現ベクター」又は「エピソーム」である（例えば、Ｃｏｎｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１１：１７３５－１７４２（２００４）を参照されたい）。代表的な市販のエピソーム発現ベクターとしては、エプスタインバー核抗原１（ＥＢＮＡ１）及びエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）複製起点（ｏｒｉＰ）を利用するエピソームプラスミドが挙げられるが、これらに限定されない。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）製のベクターｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ７、及びｐｃＤＮＡ３．１、並びにＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐＢＫ－ＣＭＶは、ＥＢＮＡ１及びｏｒｉＰの代わりにＴ抗原及びＳＶ４０複製起点を使用するエピソームベクターの非限定的な例を表す。ベクターはまた、選択可能なマーカー遺伝子を含み得る。ナノプラスミドが利用される特定の実施形態では、アンチセンスＲＮＡ選択マーカー（例えば、スクロース耐性）を利用するＲ６Ｋなどの株を使用することができる。
「選択可能なマーカー遺伝子」という用語は、対応する選択的薬剤の存在下で、核酸配列を発現する細胞を、又はそれに対して特異的に選択することを可能にする核酸配列を指す。好適な選択可能なマーカー遺伝子は、当該技術分野において既知であり、例えば、国際特許出願公開第１９９２／０８７９６号及び同第１９９４／２８１４３号；Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：３５６７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１５２７（１９８１）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２（１９８１）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１（１９８１）；Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３０：１４７（１９８４）；Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３７：９０１－９０３（１９８７）；Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１：２２３（１９７７）；Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８：２０２６（１９６２）；Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２２：８１７（１９８０）；並びに米国特許第５，１２２，４６４号及び同第５，７７０，３５９号に記載されている。
「コード配列」という用語は、タンパク質又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのセグメントを指す。領域又は配列は、開始コドンによって５’末端に近接し、終止コドンで３’末端に近接して境界がある。コード配列はまた、オープンリーディングフレームと称されることもある。
「作動可能に連結された」という用語は、セグメントが意図された様式で機能することを可能にするような方式で、ＤＮＡセグメントの別のＤＮＡセグメントへの物理的及び／又は機能的連結を指すことを指す。遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列は、例えば、プロモーター、エンハンサー及び／又はサイレンサーなどの調節配列に連結されている場合、直接的又は間接的にＤＮＡ配列の転写の調節を可能にする様式で、調節配列に作動可能に連結される。例えば、ＤＮＡ配列は、転写伸長がＤＮＡ配列を通って進行することを可能にするように、プロモーターの転写開始部位に関してプロモーターの下流に、及び転写開始部位に関して正確なリーディングフレームにおいてプロモーターにライゲーションされるときに、プロモーターに作動可能に連結される。エンハンサー又はサイレンサーは、それぞれ、ＤＮＡ配列の転写を増加又は減少させるような様式でＤＮＡ配列にライゲーションされるとき、遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結される。エンハンサー及びサイレンサーは、ＤＮＡ配列のコード領域の上流若しくは下流に位置するか、又はＤＮＡ配列のコード領域内に組み込みことができる。シグナル配列が、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、シグナル配列についてのＤＮＡは、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。ＤＮＡ配列の調節配列への連結は、典型的には、好適な制限部位でのライゲーションによって、又は当業者に既知の制限エンドヌクレアーゼを使用して配列に挿入されたアダプター若しくはリンカーを介して達成される。
本明細書で使用される場合、「誘導する」、「誘導」という用語、及びそれらの文法的同義語は、転写のいくつかの基礎レベルと比較して、転写調節因子によってもたらされる核酸配列転写、プロモーター活性及び／又は発現の増加を指す。
「転写調節因子」という用語は、特定の環境条件下でプロモーターにより駆動されるＤＮＡ配列（例えば、リプレッサー又は核阻害タンパク質）の転写を阻止若しくは阻害するか、又は特定の環境条件下でプロモーターにより駆動されるＤＮＡ配列（例えば、誘導因子又はエンハンサー）の転写を許可若しくは刺激するように作用する生化学的エレメントを指す。
本明細書で使用される場合、「エンハンサー」という用語は、例えば、それが作動可能に連結している核酸配列の、転写を増加させるＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、核酸配列のコード領域から何キロベースも離れて位置し得、調節因子の結合、ＤＮＡメチル化のパターン、又はＤＮＡ構造の変化を媒介し得る。様々な異なる供給源からの多数のエンハンサーが、当該技術分野で周知であり、クローン化されたポリヌクレオチドとして、又はクローン化されたポリヌクレオチド内で（例えば、ＡＴＣＣなどの保管所、並びに他の商業的又は個々の供給源から）入手可能である。プロモーター（一般的に使用されるＣＭＶプロモーターなど）を含むいくつかのポリヌクレオチドは、エンハンサー配列もまた含む。エンハンサーは、コード配列の上流若しくは下流に、又はコード配列内に位置し得る。「Ｉｇエンハンサー」という用語は、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座内にマッピングされたエンハンサー領域に由来するエンハンサーエレメントを指す（そのようなエンハンサーとしては、例えば、重鎖（ミュー）５’エンハンサー、軽鎖（カッパ）５’エンハンサー、カッパ及びミューイントロンエンハンサー、並びに３’エンハンサーが挙げられる（概して、Ｐａｕｌ Ｗ．Ｅ．（ｅｄ），Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３），ｐａｇｅｓ ３５３－３６３；及び米国特許第５，８８５，８２７号を参照されたい）。
「プロモーター」という用語は、コード配列の転写を開始するポリヌクレオチドの領域を指す。プロモーターは、遺伝子の転写開始部位の近く、同じ鎖上、及びＤＮＡの上流（センス鎖の５’領域に向かって）に位置する。いくつかのプロモーターは、細胞内の全ての状況で活性であるため、構成的であるが、他のプロモーターは、特定の刺激、例えば、誘導性プロモーターに応答して活性になるように調節される。本明細書で使用される場合、「プロモーター活性」という用語及びその文法的同義語は、活性が測定されているプロモーターに作動可能に連結されているヌクレオチド配列の発現の程度を指す。プロモーター活性は、例えばノーザンブロット分析によって産生されるＲＮＡ転写産物の量を決定することによって直接、又はプロモーターに連結されたレポーター核酸配列などの連結された核酸配列によってコードされる生成物の量を決定することによって間接的に測定することができる。
「誘導性プロモーター」は、転写調節因子、例えば、生物学的又は非生物学的因子の存在又は不在によって活性に誘導されるプロモーターを指す。誘導性プロモーターは、それらに作動可能に連結された遺伝子の発現が、生物の特定の発達段階又は特定の組織内でオン又はオフにすることができるため、有用である。誘導性プロモーターの非限定的な例としては、アルコール調節プロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、病因調節プロモーター、温度調節プロモーター、及び光調節プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチ又は遺伝子スイッチの一部であり得る。
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」又は「Ｔリンパ球」は、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の一種である。それらは、細胞表面上にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が存在することによって、Ｂ細胞及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などの他のリンパ球と区別することができる。
本明細書で使用される場合、「機能的断片」という語句は、ポリペプチドを参照して使用される場合、参照ポリペプチドの主要な機能を有するこのようなポリペプチドの断片を指す。例えば、膜貫通ドメインとして機能するポリペプチドの機能的断片は、膜貫通ドメインとしても機能するそのポリペプチドの断片である。特定の実施形態では、ポリペプチドの機能的断片は、参照ポリペプチドよりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。核酸に関して使用される場合、「機能的断片」という語句は、参照核酸によってコードされるポリペプチドと同じ一次機能を有するポリペプチドをコードする参照核酸の断片を指す。
本明細書で使用される場合、「機能的バリアント」という語句は、ポリペプチドを参照して使用される場合、参照ポリペプチドとは異なるが、参照ポリペプチドの主要な機能を有するポリペプチドを指す。例えば、膜貫通ドメインとして機能するポリペプチドの機能的バリアントは、膜貫通ドメインとしても機能するそのポリペプチドの断片である。特定の実施形態では、機能的バリアントは、参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は参照配列の保存的に置換されたバリアントである。核酸を参照して使用される場合、「機能的バリアント」という語句は、参照核酸とは異なるが、参照核酸によってコードされるポリペプチドと同じ一次機能を有するポリペプチドをコードする核酸を指す。特定の実施形態では、機能的バリアントは、参照核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、参照核酸配列の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は核酸配列のコドン縮重バリアントである。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン（Ｉｇ）としても知られており、モノクローナル又はポリクローナル抗体を指すことができる。本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、Ｂ細胞の単一のクローンによって産生され、同じエピトープに結合する抗体を指す。対照的に、「ポリクローナル抗体」は、異なるＢ細胞によって産生され、同じ抗原の異なるエピトープに結合する抗体の集団を指す。抗体は、任意の動物由来であり得る。抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ、及びＩｇＹであり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、一本鎖全抗体であり得る。抗体は、典型的には、重（Ｈ）鎖ポリペプチドの２つの同一のコピー及び軽（Ｌ）鎖ポリペプチドの２つの同一のコピーの４つのポリペプチドからなる。重鎖の各々は、１つのＮ末端可変（ＶＨ）領域及び３つのＣ末端定常（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）領域を含み、各軽鎖は、１つのＮ末端可変（ＶＬ）領域及び１つのＣ末端定常（ＣＬ）領域を含む。軽鎖及び重鎖の各対の可変領域は、抗体の抗原結合部位を形成する。ＶＨ及びＶＬ領域は、類似の一般構造を有し、各領域は、配列が比較的保存されている４つのフレームワーク領域を含む。フレームワーク領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続される。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３として知られる３つのＣＤＲは、抗原結合に関与する抗体の「超可変領域」を形成する。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９－６６１６（１９７７）、及びＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）、並びにＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６）に記載されており、定義は、互いに比較した場合のアミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。好ましくは、「ＣＤＲ」という用語は、配列比較に基づいて、Ｋａｂａｔによって定義されるＣＤＲである。ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、重鎖ＣＤＲを示し、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、軽鎖ＣＤＲを示す。
「抗体の断片」、「抗体断片」、「抗体の断片」、「抗原結合部分」という用語、及びそれらの文法的同義語は、本明細書では、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片又は部分を意味するために同義的に使用される（一般に、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２３（９）：１１２６－１１２９（２００５）を参照されたい）。抗体断片は、例えば、１つ以上のＣＤＲ、可変領域（又はその部分）、定常領域（又はその部分）、又はそれらの組み合わせを含むことが望ましい。抗体断片の非限定的な例としては、以下が挙げられる（１）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片、（２）ストーク領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（３）抗体の単一のアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（４）Ｆｖ断片の２つのドメイン（すなわち、ＶＬ及びＶＨ）からなる一価の分子であり、２つのドメインを単一のポリペプチド鎖として合成することを可能にするリンカーによって結合された一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３－４２６（１９８８）、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９－５８８３（１９８８）、及びＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：７７８（１９９８）を参照されたい）、並びに（５）ポリペプチド鎖の二量体であるダイアボディであって、各ポリペプチド鎖は、同じポリペプチド鎖上のＶＨとＶＬとの間の対合を可能にするには短すぎるペプチドリンカーによってＶＬに接続されたＶＨを含み、それによって異なるＶＨ－ＶＬポリペプチド鎖上の相補ドメイン間の対合を駆動して、２つの機能的抗原結合部位を有する二量体分子を生成する、ダイアボディ。抗体断片は当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許第８，６０３，９５０号により詳細に記載されている。
「抗原認識部分」、「抗原認識ドメイン」、「抗原結合ドメイン」、及び「抗原結合領域」という用語は、抗原に特異的に結合する分子又は分子の一部分を指す。一実施形態では、抗原認識部分は、抗体、抗体様分子、又はその断片である。
「増殖性疾患」という用語は、細胞の過剰な増殖及び／又は細胞マトリックスのターンオーバーが、がんを含む疾患の病因に有意に寄与する統一概念を指す。いくつかの実施形態では、増殖性疾患は、がんである。
「患者」又は「対象」は、がんなどの増殖性障害を有するか、若しくは有する疑いがあると診断されたか、又はそれを発症している哺乳動物対象を指す。いくつかの実施形態では、「患者」という用語は、がんなどの増殖性障害を発症する可能性が平均よりも高い哺乳動物対象を指す。例示的な患者は、本明細書に開示される療法から利益を得ることができるヒト、類人猿、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類、及び他の哺乳動物であり得る。例示的なヒト患者は、男性及び／又は女性であり得る。「それを必要とする患者」又は「それを必要とする対象」とは、例えば、がんに限定されないが、疾患若しくは障害を有するか、又は有する疑いがあると診断された患者を意味する。
「投与すること」は、本明細書では、患者又は対象に本明細書に記載される１つ以上の組成物を提供することを指す。限定ではなく例として、組成物投与、例えば、注射は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、又は筋肉内（ｉ．ｍ．）注射によって行うことができる。１つ以上のそのような経路が用いられ得る。非経口投与は、例えば、ボーラス注射によって、又は経時的な漸進的灌流によって行うことができる。代替的に、又は同時に、投与は、経口経路によって行うことができる。加えて、投与は、細胞のボーラス若しくはペレットの外科的沈着、又は医療デバイスの位置決めによっても行うことができる。
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療すること」という用語、及びそれらの文法的同義語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。いくつかの実施形態では、効果は治療的であり、すなわち、効果は、疾患及び／又は疾患に起因する有害症状を部分的又は完全に治癒する。いくつかの実施形態では、「治療すること」という用語は、疾患又は状態を「予防すること」を含み得る。
本明細書で使用される場合、「治療間隔」は、治療サイクル、例えば、定期的なスケジュールで繰り返すことができる、例えば、治療剤の投与の経過を指す。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、治療間隔の間に治療剤の投与を行わない１つ以上の期間を有することができる。
本明細書で使用される場合、「併用投与」、「同時投与」、「同時投与する」、及び「同時提供する」という用語は、２つ（又はそれ以上）の異なる治療が、対象の障害罹患の過程中に対象に送達されることを意味し、例えば、２つ以上の治療が、対象が障害を有すると診断された後、及び障害が治癒若しくは排除されているか、又は他の理由で治療が中止される前に送達される。いくつかの実施形態では、１回の治療の送達は、第２の送達が開始されるときに依然として発生しているため、投与の観点から重複がある。これは、本明細書では「同時」又は「同時送達」と称されることがある。他の実施形態では、一回の治療の送達は、他の治療の送達が開始される前に終了する。いずれかの場合のいくつかの実施形態では、治療は、併用投与のためにより効果的である。例えば、第２の治療は、第２の治療が第１の治療の不在下で投与された場合、又は同様の状況が第１の治療で見られる場合よりも、より効果的であり、例えば、第２の治療の方が少ない場合に同等の効果が見られるか、又は第２の治療は、症状をより大きな程度に軽減する。いくつかの実施形態では、送達は、障害に関連する症状、又は他のパラメータの減少が、他の治療の不在下で送達された１回の治療で観察されるものよりも大きいようなものである。２つの治療の効果は、部分的に相加的、完全に相加的、又は相加的よりも大きくなり得る。送達は、第２の治療が送達されたときに、送達された第１の治療の効果が依然として検出可能であるようなものであり得る。
いくつかの実施形態では、第１の治療及び第２の治療は、同時に（例えば、同じ時間に）、同じ若しくは別個の組成物で、又は連続して投与することができる。連続投与とは、追加の、例えば、二次的な治療の投与の前（例えば、直前、５、１０、１５、３０、４５、６０分未満、１、２、３、４、６、８、１０、１２、１６、２０、２４、４８、７２、９６時間以上、４、５、６、７、８、９日以上、１、２、３、４、５、６、７、８週間以上前）の１回の治療の投与を指す。第１及び第２の治療の投与の順序も逆転させることができる。
「治療有効量」、「治療量」、「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」という用語、及びそれらの文法的同義語は、所望の治療結果を達成するために必要な用量及び期間で有効な量を指す。治療有効量は、固体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに１人以上の対象において所望される応答を誘発する本明細書に記載される組成物の能力などの要因に応じて変動し得る。投与される本開示の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染又は転移の程度、及び患者（対象）の状態における個々の差異を考慮して、医師によって決定することができる。
代替的に、本明細書に記載される１つ以上の組成物を患者若しくは対象に投与することの薬理学的及び／又は生理学的効果は、「予防的」であることができ、すなわち、その効果は、疾患又はその症状を完全に若しくは部分的に予防することができる。「予防有効量」は、所望される予防結果（例えば、疾患発症の予防）を達成するために、投薬量及び必要な期間で、有効な量を指す。
本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイントタンパク質」という用語は、抑制シグナルを伝達するか、又は免疫抑制機能を有する分子を指す。そのような免疫チェックポイントタンパク質の例としては、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１（プログラム細胞死リガンド１）、ＰＤ－Ｌ２（プログラム細胞死リガンド２）、ＬＡＧ－３（リンパ球活性化遺伝子３）、ＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチン－３）、ＢＴＬＡ（Ｂ及びＴリンパ球減衰剤）、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＣＤ１６０、ＣＤ３９、ＣＤ７０、ＣＤ７３、Ａ２ａＲ（アデノシンＡ２ａ受容体）、ＫＩＲ（キラー阻害性受容体）、ＶＩＳＴＡ（ＶドメインＩｇ含有のＴ細胞活性化抑制剤）、ＩＤＯ１（インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ）、アルギナーゼＩ、ＴＩＧＩＴ（Ｔ細胞免疫グロブリン及びＩＴＩＭドメイン）、ＣＤ１１５などが挙げられるが、これらに限定されない（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，１２，ｐ．２５２－２６４，２０１２、及びＣａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２７，ｐ．４５０－４６１，２０１５を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、生物学的部分の同定で使用される用語は、用語内のダッシュ「－」を含んでもよく、又は含まなくてもよい。ダッシュの有無は、生物学的部分の意図された意味又は同定を変更しない。例示のみを目的として、これらの生物学的部分に限定されないが、以下の対になった用語（ダッシュで示されている／ダッシュなしで示されている）の各々は、同じ生物学的実体を示し、識別する。ＣＣＲ－４／ＣＣＲ４、ＣＤ－３／ＣＤ３、ＣＤ－４／ＣＤ４、ＣＤ－３３／ＣＤ３３、ＥＧＦＲ－２／ＥＧＦＲ２、ＦＬＴ－１／ＦＬＴ１、ＨＥＲ－１／ＨＥＲ１、ＨＥＲ－１ｔ／ＨＥＲ１ｔ、ＩＬ－１２／ＩＬ１２、ＩＬ－１５／ＩＬ１５、ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ１５Ｒα ＭＵＣ－１／ＭＵＣ１、ＭＵＣ－１６／ＭＵＣ１６、ＲＯＲ－１／ＲＯＲ１、ＲＯＲ－１Ｒ／ＲＯＲ１Ｒ、ＴＧＦ－ベータ／ＴＧＦベータ、ＶＥＧＦ－１／ＶＥＧＦ１、ＶＥＧＦ－Ｒ２／ＶＥＧＦＲ２．”
ＩＩ．組み合わせ
特定の実施形態では、本明細書に記載されるｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、それぞれ、キメラ受容体と組み合わせて使用され得るか、又はキメラ受容体をコードする核酸配列を更に含むことができる。いくつかの場合、キメラ受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの例では、ＣＡＲは、パターン認識受容体を含む。他の場合、キメラ受容体は、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む。ｍｉＲＮＡは、特定のＣＡＲ、サイトカイン、及び細胞タグ、例えば、ＩＬ１５及びＩＬ－１５Ｒα（ｍｂＩＬ１５）並びに切頭ＨＥＲ１（ＨＥＲ１ｔ）を含む融合タンパク質を有するＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ、ｍｂＩＬ１５及びＨＥＲ１ｔを有するＭＵＣ１特異的ＣＡＲ、又はｍｂＩＬ１５及びＨＥＲ１ｔを有するＣＤ３３特異的ＣＡＲと組み合わせて使用され得る。
特定の実施形態では、遺伝子構築物は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）及び／又は３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含むことができる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡをコードする配列は、５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲに位置することができる。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲは、イントロンを含まない。
特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤ｍｉＲＮＡを有する合成イントロンをコードする核酸配列は、キメラ受容体をコードするものと同じ遺伝子構築物に挿入される（例えば、キメラ受容体をコードするｍＲＮＡの５’ＵＴＲに対応する構築物の部分において）。ポリヌクレオチド配列の順序の例示的な描写は、図１Ａに見出すことができる。一実施形態では、５’ＵＴＲは、１つ以上の成熟ｍｉＲＮＡを含有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の成熟ｍｉＲＮＡを、同じ免疫チェックポイントタンパク質標的、例えば、ＰＤ－１に向けてもよい。特定の他の実施形態では、成熟ｍｉＲＮＡを、複数の免疫チェックポイントタンパク質標的、例えば、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴ、ＰＤ１及びＣＴＬＡ４、又はＴＩＧＩＴ及びＣＴＬＡ４に向けてもよい。
ＩＩＩ．ｍｉＲＮＡ
本明細書で使用される場合、「ｍｉＲ」、「ｍｉｒ」、及び「ｍｉＲＮＡ」という用語は、ｍｉｃｒｏＲＮＡを指すために使用され、ｍｉｃｒｏＲＮＡは、遺伝子（「標的遺伝子」）から転写されたメッセンジャーＲＮＡの翻訳を調節する（遺伝子の発現を増加又は減少させるかのいずれか）、及び／又はそのようなメッセンジャーＲＮＡを不安定化することによって、遺伝子（「標的遺伝子」）の発現に影響を及ぼすことができる、小さな非コードＲＮＡ分子のクラスである。
ｍｉＲＮＡは、天然に存在しなくてもよい。本明細書では、ｍｉＲＮＡを説明するために使用される場合、「天然に存在しない」、「合成」、及び「人工」という用語は、互換的に使用され、天然に存在しない配列を有するｍｉＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、天然に存在しないｍｉＲＮＡは、天然に存在するｍｉＲＮＡを効果的に模倣する。天然に存在しないｍｉＲＮＡは、天然に存在する成熟ｍｉＲＮＡ配列が、特定の転写産物を標的とするように設計された合成配列に置き換えられたときに、対応する天然に存在するｍｉＲＮＡの所望のヘアピン又はループが維持されるように設計することができる。例えば、天然に存在しないｍｉＲＮＡは、天然に存在するｍｉＲＮＡと少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有することができ、及び／又は天然に存在するｍｉＲＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる。別段の指示がない限り、「ｍｉＲＮＡ」という用語は、一般的に、特定のｍｉｃｒｏＲＮＡ並びにその機能的断片及びバリアントの成熟型、ｐｒｉ型、及びｐｒｅ型を指す。
「ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ」という用語は、少なくとも１つのＲＮＡヘアピンを含有する一次ｍｉＲＮＡ転写産物を指す。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡの例示的な描写を図１Ｂに示す。ＲＮＡヘアピンは、細胞核内のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡから切断されて、１つ以上の前駆体ｍｉＲＮＡ（「プレｍｉＲＮＡ）を形成する。このプレｍｉＲＮＡを細胞質に輸出し、そこでステムループ構造を切断して、ヘアピンループの元の５’アームからのｍｉＲＮＡ－５ｐ鎖、及びヘアピンループの元の３’アームからのｍｉＲＮＡ－３ｐ鎖を含む二本鎖ｍｉＲＮＡを生成する。次いで、アルゴノートタンパク質は、二本鎖ｍｉＲＮＡに結合し、鎖の１つ（ｍｉＲＮＡ－５ｐ配列又はｍｉＲＮＡ－３ｐ配列のいずれか）が放出される。残りの結合した鎖は「ガイド鎖」になるが、放出された鎖は「パッセンジャー鎖」として知られており、好ましくは分解する。次いで、ガイド鎖は、標的遺伝子に由来するメッセンジャーＲＮＡと相互作用し、したがって、その翻訳に影響を及ぼす。
ｍｉＲＮＡ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－３ｐ鎖配列の両方は、本明細書では、「成熟ｍｉＲＮＡ」配列と称される。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡの残りの部分（ｍｉＲＮＡ－５ｐ配列に対するその５’の部分、ｍｉＲＮＡ－３ｐ配列に対するその３’の部分、及びｍｉＲＮＡ－５ｐとｍｉＲＮＡ－３ｐ配列との間のステムループ配列）は、まとめてｍｉＲＮＡ骨格配列と称される。「５’骨格配列」という用語は、本明細書では、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡにおいて、ｍｉＲＮＡ－５ｐ配列の５’である骨格配列を指すように使用される。「３’骨格配列」という用語は、本明細書では、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡにおいて、ｍｉＲＮＡ－３ｐ配列の３’である骨格配列を指すように使用される。「ステムループ配列」という用語は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡにおいて、ｍｉＲＮＡ－５ｐとｍｉＲＮＡ－３ｐ配列との間にある骨格配列を指す。
本発明のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、天然の成熟ｍｉＲＮＡ配列を除去し、それらを、非天然の成熟ｍｉＲＮＡ配列に置き換えることによって、天然に存在するｐｒｉ－ｍｉＲＮＡから産生され得、その配列のうちの１つは、目的の遺伝子を標的とするガイドｍｉＲＮＡとして機能することができる。天然に存在しないｐｒｉ－ｍｉＲＮＡの設計において、骨格ｍｉＲＮＡ核酸配列は、マウス、ラット、又はヒトｍｉＲＮＡ配列に由来し得る。非限定的な例として、骨格ｍｉＲＮＡ配列は、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ２０６、ｍｉＲ２０４、ｍｉＲ１７、ｍｉＲ１６、ｍｉＲ３０ａ、ｍｉＲ１２６、ｍｉＲ１２２、ｍｉＲ２１３、ｍｉＲ２９ｂ１又はｍｉＲ１３３ａ１に由来し得る。
本発明の実施において使用され得る骨格配列の例としては、限定されないが、以下の表１に列挙されるＤＮＡ配列によってコードされるものが挙げられる。表１の「Ｘ」及び「Ｙ」の記号は、それぞれ、ガイドｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ－５ｐ又はｍｉＲＮＡ－３ｐのいずれかであってもよい）及びパッセンジャーｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ－５ｐ又はｍｉＲＮＡ－３ｐのいずれかであってもよい）をコードする核酸配列を示し、「ｎ」の記号は、そのような配列におけるヌクレオチドの数、例えば、１６～３０、好ましくは１８～２５を示す。いくつかの実施形態では、ｎは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５ヌクレオチドであり得る。特定の実施形態では、骨格ｍｉＲＮＡ配列は、表１に列挙される配列のいずれか１つの相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする配列によってコードされるものである。
Figure 2024502479000004
ｍｉＲＮＡ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－３ｐ配列は、互いにハイブリダイズするが、それらは必ずしも正確に相補的であるとは限らない。天然に存在しないｍｉＲＮＡの設計において、天然ｍｉＲＮＡのＲＮＡ折り畳み及び自由エネルギーを維持するように、ｍｉＲＮＡ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－３ｐ配列において代償的変異を作製することができる。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３ｐ配列をコードする配列は、ｍｉＲＮＡ－５ｐ配列をコードする配列に対する相補体と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又はｍｉＲＮＡ－５ｐ配列をコードする配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる。
特定の実施形態では、標的遺伝子は、チェックポイント阻害タンパク質をコードする。したがって、本発明は、部分的には、免疫チェックポイントタンパク質の発現を阻害する天然に存在しないｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに関する。特定のそのような実施形態では、標的遺伝子は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＧＩＴＲ、又はＰＩＫ３ＩＰ１をコードする。このようなチェックポイント阻害剤をコードするガイドｍｉＲＮＡ標的化遺伝子をコードする核酸配列の非限定的な例を表２に列挙する。表２はまた、パッセンジャー鎖をコードする配列を列挙する。前に考察されたように、ガイド及びパッセンジャー鎖は必ずしも相補的ではない。パッセンジャー鎖はまた、標的遺伝子と関連付けられたメッセンジャーＲＮＡを標的とするのにも役立ち得ることが企図される。また、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、表２に列挙される配列の相補体とハイブリダイズする配列である配列も使用され得ることが企図される。使用される成熟ｍｉＲＮＡ配列は、特定のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格と組み合わされてもよい。表２はまた、そこに列挙されている成熟ガイド及びパッセンジャーｍｉＲＮＡと組み合わせることができる骨格を列挙している。
Figure 2024502479000005
Figure 2024502479000006

特定の実施形態では、本発明は、配列番号６４～８３、８５、８７～１７１、及び７０４～７１３のうちのいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号６４～８３、８５、８７～１７１、及び７０４～７１３のうちのいずれか１つの相補体とハイブリダイズすることができる核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。特定のそのような実施形態では、本発明は、配列番号６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、７０４、７０５、７０９、及び７１０のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、７０４、７０５、７０９、及び７１０のうちのいずれか１つの相補体とハイブリダイズすることができる核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ＰＤ－１を標的とする。特定のそのような実施形態では、本発明は、配列番号７２～８３、８５、８７、及び７０４～７１３のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号７２～８３、８５、８７、及び７０４～７１３のうちのいずれか１つの相補体とハイブリダイズすることができる核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。特定の実施形態では、本発明は、配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、７０４、７０５、７０９、及び７１０のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、７０４、７０５、７０９、及び７１０のうちのいずれか１つの相補体とハイブリダイズすることができる核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
特定の実施形態では、本発明は、配列番号７２～７５のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号７２～７５のうちのいずれか１つの相補体とハイブリダイズすることができる核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。特定のそのような実施形態では、本発明は、配列番号７２若しくは７４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号７２若しくは７４の相補体とハイブリダイズすることができる核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
特定の実施形態では、本発明は、以下を含むポリヌクレオチドに関する：
ａ）５’ｍｉＲＮＡ骨格配列をコードする配列、
ｂ）ガイドｍｉＲＮＡ配列をコードする配列、
ｃ）ステムループ配列をコードする配列、
ｄ）パッセンジャーｍｉＲＮＡ配列をコードする配列、及び
ｅ）３’骨格配列をコードする配列。
特定の実施形態では、ガイドｍｉＲＮＡ配列をコードする配列は、配列番号６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、７０４、７０５、７０９、及び７１０のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこのような配列のうちのいずれか１つの相補体とハイブリダイズすることができる。
特定の実施形態では、パッセンジャーｍｉＲＮＡ配列をコードする配列は、配列番号６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、７０６～７０８、及び７１１～７１３のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこのような配列のうちのいずれか１つの相補体とハイブリダイズすることができる。
特定の実施形態では、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、以下をコードする：
ａ）配列番号６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、７０４、７０５、７０９、及び７１０のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこのような配列のうちのいずれか１つの相補体とハイブリダイズすることができるガイドｍｉＲＮＡ配列、並びに
ｂ）配列番号６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、７０６～７０８、及び７１１～７１３のうちのいずれか１つと、それぞれ、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこのような配列のうちのいずれか１つの相補体とハイブリダイズすることができるパッセンジャー配列。
前述の実施形態のいずれにおいても、５’ｍｉＲＮＡ骨格配列、ステムループ配列、及び３’ｍｉＲＮＡ骨格配列をコードする配列は、各々、
それぞれ、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３、
それぞれ、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６、
それぞれ、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９、
それぞれ、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２、
それぞれ、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５、
それぞれ、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８、
それぞれ、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１、
それぞれ、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４、
それぞれ、配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７、
それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、及び配列番号３０、
それぞれ、配列番号３１、配列番号３２、及び配列番号３３、
それぞれ、配列番号３４、配列番号３５、及び配列番号３６、
それぞれ、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９、
それぞれ、配列番号４０、配列番号４１、及び配列番号４２、
それぞれ、配列番号４３、配列番号４４、及び配列番号４５、
それぞれ、配列番号４６、配列番号４７、及び配列番号４８、
それぞれ、配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１、
それぞれ、配列番号５２、配列番号５３、及び配列番号５４、
それぞれ、配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７、
それぞれ、配列番号５８、配列番号５９、及び配列番号６０、若しくは
それぞれ、配列番号６１、配列番号６２、及び配列番号６３、
又はそのような配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列、又はそのような配列の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる配列を含み得る。
特定のチェックポイント阻害剤を標的とする例示的な天然に存在しないｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列をコードする核酸を表３に記載する。特定の実施形態では、天然に存在しないｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列は、表３に列挙される配列のうちのいずれか１つの相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる配列であり得る。
Figure 2024502479000007
Figure 2024502479000008
Figure 2024502479000009

特定のそのような実施形態では、本発明は、配列番号１７８～２６３のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１７８～２６３のうちのいずれか１つの相補体とハイブリダイズすることができる核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ＰＤ－１を標的とする。特定のそのような実施形態では、本発明は、配列番号１７９、１８０、及び２４１～２４９のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１７９、１８０、及び２４１～２４９のうちのいずれか１つの相補体とハイブリダイズすることができる核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。特定の実施形態では、本発明は、配列番号１７９若しくは１８０のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１７９若しくは１８０のうちのいずれか１つの相補体とハイブリダイズすることができる核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
本発明の特定の実施形態は、少なくとも２つのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。２つ以上のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、同じ標的遺伝子を標的とするガイドｍｉＲＮＡ配列を含み得るか、又は様々なガイドｍｉＲＮＡは、異なる遺伝子を標的とし得る。複数のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡの場合、各設計は、１つのｍｉＲＮＡが別のｍｉＲＮＡと誤って折り畳まれる可能性を低減するために、異なる天然ｍｉＲＮＡ骨格に基づいていてもよい。表４は、１つ以上のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列の例を提供する。
Figure 2024502479000010
特定のそのような実施形態では、本発明は、配列番号２６７～２９０のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号２６７～２９０のうちのいずれか１つの相補体とハイブリダイズすることができる核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
特定のそのような実施形態では、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、ＰＤ－１を標的とする少なくとも２つのｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを含む。特定の実施形態では、本発明は、配列番号２６７のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号２６７のいずれか１つの相補体とハイブリダイズすることができる核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
特定の実施形態では、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡをコードする核酸は、目的のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子（例えば、キメラ抗原受容体、サイトカイン、又は細胞タグ）を含むものと同じ遺伝子構築物に含まれる。特定の実施形態では、このような遺伝子構築物は、目的の遺伝子の直接上流にある５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）をコードする核酸配列を含み、ｍｉＲＮＡをコードする配列は、５’ＵＴＲに含まれる。特定の実施形態では、このような遺伝子構築物は、目的の遺伝子の直接下流にある３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）をコードする核酸配列を含み、ｍｉＲＮＡをコードする配列は、３’ＵＴＲに含まれる。
ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡをコードする配列が、５’ＵＴＲに対応する配列に含まれる実施形態では、転写ＲＮＡは、スプライスドナー、ブランチポイント、及び／又はアクセプター部位配列などの追加の配列を含むことができる。スプライスドナー、ブランチポイント、及びアクセプター部位の包含は、転写ＲＮＡからのｍｉＲＮＡのスプライシングにとって重要である。スプライシングがなければ、高度に構造化されたｍｉＲＮＡ配列は、目的の遺伝子に関連する翻訳開始配列へのリボソームスキャニングを妨げる可能性が高い。このようなスプライスドナー／アクセプター部位をコードする配列の例としては、配列番号２９１及び２９２、このような配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列、並びにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこのような配列の相補体とハイブリダイズすることができる配列が挙げられる。
したがって、特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ａ）配列番号２９１と少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は配列番号２９１の相補体にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる、核酸配列、及びｂ）配列番号２９２と少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は配列番号２９２の相補体にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる、核酸配列を更に含む。
ＩＶ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
前述の実施形態のいずれかにおいて、本開示のポリヌクレオチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などのキメラ受容体を更にコードすることができる。したがって、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、ｍｉＲＮＡ及びＣＡＲをコードすることができる。本開示の実施形態のいずれかにおいて、修飾された免疫エフェクター細胞は、本明細書に記載されるキメラ受容体を含むことができる。
ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞に外因的特異性を移植する操作された受容体である。いくつかの例では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内（エンドドメイン）ドメインを含む細胞外ドメイン（エクトドメイン）を含む。細胞内ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態では、細胞外ドメインは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサーを更に含む。
Ａ．抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片の相補的決定領域を含むことができる。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗原に結合し、したがって、その特定の抗原に対するその特異性を受容体に提供する抗原受容体（例えば、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体）タンパク質の可変ドメインに見出される短いアミノ酸配列である。抗原受容体の各ポリペプチド鎖は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含有することができる。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、標的抗原に結合する、抗体、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。機能的断片又はバリアントは、抗体の重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）及び／若しくは抗体の軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、又はその機能的断片若しくはバリアントを含み得る。特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦ（ａｂ’）３断片を含む。特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、又はそれらの結合断片を含む。特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体のＦｃ断片を更に含み、例えば、それはＦｃ断片と連結したｓｃＦｖを含み得る。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、がん細胞、自己免疫細胞、又はウイルス、細菌、若しくは寄生虫に感染した細胞で上昇する抗原を標的とする。標的とされ得る病原体としては、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、又はエボラ病原体が挙げられるが、これらに限定されない。自己免疫疾患としては、移植片対宿主病、関節リウマチ、狼瘡、セリアック病、クローン病、シェーグレン症候群、多発性筋痛性リウマチ、多発性硬化症、視神経脊髄炎、強直性脊椎炎、１型糖尿病、斑状脱毛症、血管炎、側頭動脈炎、水疱性天疱瘡、乾癬、尋常性天疱瘡、及び自己免疫性ブドウ膜炎を挙げることができる。
ＣＡＲによって認識される病原体は、本質的に任意の種類の病原体であり得るが、いくつかの実施形態では、病原体は、真菌、細菌、又はウイルスである。例示的なウイルス病原体としては、アデノウイルス科、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、ＨＰＶ、ＨＳＶ、ウイルスのＨＨＶファミリー、ウイルスの肝炎ファミリー、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、及びＴｏｇａｖｉｒｉｄａｅが挙げられる。例示的な病原性ウイルスは、天然痘、インフルエンザ、おたふく風邪、麻疹、水痘、エボラ、及び風疹を引き起こす。例示的な病原性真菌としては、Ｃａｎｄｉｄａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、及びＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓが挙げられる。例示的な病原性細菌としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａが挙げられる。いくつかの実施形態では、病原体受容体デクチン－１を使用して、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓなどの真菌の細胞壁上の炭水化物構造を認識するＣＡＲを生成してもよい。別の実施形態では、ＣＡＲは、ウイルス決定基（例えば、ＣＭＶ及びエボラ由来の糖タンパク質）を認識する抗体に基づいて作製して、ウイルス感染及び病理を中断することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、Ｂ７Ｈ４、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、ＣＡＩＸ、ＣＡ１２５、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／ｖ８、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１５１、ＣＤ１７１、ＣＤ１７４、ＣＤ２７６、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＬＬ－１、ｃ－ＭＥＴ、ＣＳ１、ＣＳＰＧ４、ＣＴＬＡ－４、ＤＬＬ３、ＥＤＢ－Ｆ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ＦＬＴ１、ＦＬＴ４、葉酸結合タンパク質、葉酸受容体、葉酸受容体α、α－葉酸受容体、フリズル（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＨＲ、ＧＨＲＨＲ、ＧＩＴＲ、ＧＰＣ３、Ｇｐ１００、ｇｐ１３０、ＨＢＶ抗原、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１／ＨＥＲ３、ｈ５Ｔ４、ＨＰＶ抗原、ＨＶＥＭ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩｇＫＡｐｐａ、ＩＬ－１－ＲＡＰ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、ＫＤＲ、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ、ＬｅｗｉｓＡ、ＬｅｗｉｓＹ、Ｌ１－ＣＡＭ、ＬＩＦＲＰ、ＬＲＰ５、ＬＴＰＲ、ＭＡＧＥ－Ａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥＡ３／Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＲＴ－１、ＭＣＡＭ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ムチン、例えば、ＭＵＣ１、ＭＵＣ－４若しくはＭＵＣ１６、ＮＧＦＲ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｎｏｔｃｈ－１－４、ＮＹ－ＥＳＯ－１、Ｏ－アセチルＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ３、ＯＸ４０、Ｐ５３、ＰＤ１、ＰＤＥ１０Ａ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＭＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＣＨ１、ＲＡＮＫ、Ｒｏｂｏｌ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ１Ｒ、ＲＯＲ－２、ＴＡＣＩ、ＴＡＧ－７２、ＴＣＲａ、ＴＣＲｐ、ＴＧＦ、ＴＧＦベータ、ＴＧＦベータ－ＩＩ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、Ｔｉｔｉｎ、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＲＢＣ１、ＴＷＥＡＫ－Ｒ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、又はＷＴ－１上のエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、又はＲＯＲ１上のエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む。いくつかの例では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＤ１９上のエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む。いくつかの場合、本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＤ３３上のエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む。いくつかの例では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＭＵＣ１上のエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む。いくつかの例では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＭＵＣ１６上のエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む。いくつかの例では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＲＯＲ１上のエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む。更なる実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ２、ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、ＭＡｄＣＡＭ１、ＳＤＦ１、又はＩＩ型コラーゲン上のエピトープに結合する自己抗原又は抗原結合ドメインを含む。
抗原結合は、フローサイトメトリー若しくは細胞ベースのアッセイ、又は任意の他の等価のアッセイによって評価することができる。細胞ベースのアッセイは、表面上の目的の抗原を発現する細胞型を利用して、抗原結合を評価することができる。可溶性タンパク質として発現される抗原又はその断片を利用して、フローサイトメトリー又は同様のアッセイを使用して抗原結合を評価することができる。抗原結合の改善は、抗原結合ドメイン又はキメラ受容体の機能的測定によって間接的に評価され得る。例えば、本明細書に記載されるキメラ受容体又はＣＡＲの改善された抗原結合は、抗原を発現する標的細胞に対する特異的細胞毒性の増加によって測定することができる。
本開示のポリペプチドの細胞表面発現レベルは、例えば、フローサイトメトリーベースのアッセイを使用して評価することができる。抗原結合ポリペプチドの改善された発現は、当該抗原結合ポリペプチドを発現する分析された細胞のパーセンテージとして、又は代替的に、細胞の表面上の当該抗原結合ポリペプチドの平均密度として測定することができる。本明細書に記載の抗原結合ポリペプチドの細胞表面発現を評価するために使用することができる追加の好適な方法には、ウエスタンブロッティング又は任意の他の等価のアッセイが含まれる。
１．ＣＤ１９特異的抗原結合ドメイン
ＣＤ１９は、免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面糖タンパク質であり、主に悪性Ｂ系統細胞に見出される。いくつかの例では、ＣＤ１９はまた、膵臓がん、肝臓がん、及び前立腺がんなどの固形腫瘍においても検出されている。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９特異的抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、又はｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＦＭＣ６３によっても認識されるＣＤ１９上のエピトープを認識する。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ及び／又はＶＨ／ＶＬドメインは、ＦＭＣ６３に由来する。ＦＭＣ６３は、一般的に、ヒト由来のＣＤ１９を発現するＮａｌｍ－１及び－１６細胞に対して惹起されたマウスモノクローナルＩｇＧｌ抗体を指す（Ｌｉｎｇ，Ｎ．Ｒ．，ｅｌ ａｌ．（１９８７）．Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ ｔｙｐｉｎｇ ＩＩＩ．３０２）。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＪＣＡＲ０１４、ＪＣＡＲ０１５、ＪＣＡＲ０１７、又は１９－２８ｚ ＣＡＲ（Ｊｕｎｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）によっても認識されるＣＤ１９上のエピトープを認識する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＪＣＡＲ０１４、ＪＣＡＲ０１５、ＪＣＡＲ０１７、又は１９－２８ｚ ＣＡＲ（Ｊｕｎｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）によっても認識されるＣＤ１９上のエピトープを認識するｓｃＦｖ抗原結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、米国特許出願公開第２０１６／０１５２７２３号に記載されている抗ＣＤ１９抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、国際特許出願公開第２０１５／１２３６４２号に記載されている抗ＣＤ１９抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、クローンＦＭＣ６３に由来する抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖを含む（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＣＤ１９ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｂ ｌｉｎｅａｇｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｍａ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：１１５７－１１６５（１９９７））。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＫＴＥ－Ｃ１９（Ｋｉｔｅ Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．）によっても認識されるＣＤ１９上のエピトープを認識する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、ＫＴＥ－Ｃ１９によっても認識されるＣＤ１９上のエピトープを認識する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、国際特許出願公開第２０１５／１８７５２８号に記載されている抗ＣＤ１９抗体、又はその断片若しくはバリアントを含む。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＴＬ０１９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）によっても認識されるＣＤ１９上のエピトープを認識する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、ＣＴＬ０１９によっても認識されるＣＤ１９上のエピトープを認識する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＵＣＡＲＴ１９（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ）によっても認識されるＣＤ１９上のエピトープを認識する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、ＵＣＡＲＴ１９によっても認識されるＣＤ１９上のエピトープを認識する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＢＰＸ－４０１（Ｂｅｌｌｉｃｕｍ）によっても認識されるＣＤ１９上のエピトープを認識する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、ＢＰＸ－４０１によっても認識されるＣＤ１９上のエピトープを認識する。
いくつかの場合、抗原結合ドメインは、ブリナツモマブ（Ａｍｇｅｎ）、コルツキシマブラブタンシン（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ Ｉｎｃ．／Ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ）、ＭＯＲ２０８（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ ＡＧ／Ｘｅｎｃｏｒ Ｉｎｃ．）、ＭＥＤＩ－５５１（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、デニンツズマブマホドチン（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、Ｂ４（又はＤＩ－Ｂ４）（Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ）、タプリツモマブパプトクス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＸｍＡｂ ５８７１（Ａｍｇｅｎ／Ｘｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．）、ＭＤＸ－１３４２（Ｍｅｄａｒｅｘ）又はＡＦＭ１１（Ａｆｆｉｍｅｄ）によっても認識されるＣＤ１９上のエピトープを認識する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、又はｓｃＦｖを含み、抗原結合ドメインは、ブリナツモマブ（Ａｍｇｅｎ）、コルツキシマブラブタンシン（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ Ｉｎｃ．／Ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ）、ＭＯＲ２０８（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ ＡＧ／Ｘｅｎｃｏｒ Ｉｎｃ．）、ＭＥＤＩ－５５１（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、デニンツズマブマホドチン（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、Ｂ４（又はＤＩ－Ｂ４）（Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ）、タプリツモマブパプトクス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＸｍＡｂ ５８７１（Ａｍｇｅｎ／Ｘｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．）、ＭＤＸ－１３４２（Ｍｅｄａｒｅｘ）又はＡＦＭ１１（Ａｆｆｉｍｅｄ）によっても認識されるＣＤ１９上のエピトープを認識する。
いくつかの場合、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、ＦＭＣ６３、ブリナツモマブ（Ａｍｇｅｎ）、コルツキシマブラブタンシン（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ Ｉｎｃ．／Ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ）、ＭＯＲ２０８（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ ＡＧ／Ｘｅｎｃｏｒ Ｉｎｃ．）、ＭＥＤＩ－５５１（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、デニンツズマブマホドチン（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、Ｂ４（又はＤＩ－Ｂ４）（Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ）、タプリツモマブパプトクス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＸｍＡｂ ５８７１（Ａｍｇｅｎ／Ｘｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．）、ＭＤＸ－１３４２（Ｍｅｄａｒｅｘ）又はＡＦＭ１１（Ａｆｆｉｍｅｄ）によっても認識されるＣＤ１９上のエピトープを認識する。
２．ＣＤ３３特異的抗原結合ドメイン
「ＣＤ３３，」は、６７ｋＤａの１回膜貫通糖タンパク質であり、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃｓ）スーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ３３は、シアル酸結合に関与するＶセットＩｇ様ドメイン、及びその細胞外ドメイン内のＣ２セットＩｇ様ドメインを特徴とする。ＣＤ３３は、骨髄系細胞において発現され、リンパ系細胞においても検出されている。ＣＤ３３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングは、ＶセットＩｇ様ドメイン並びにＶ及びＣ２セットＩｇ様ドメインを連結するジスルフィド結合を欠く、より短いアイソフォーム（ＣＤ３３ｍ）をもたらす。健康な対象において、ＣＤ３３は、主に、正常な多能性骨髄前駆体、単能性コロニー形成細胞、単球及び成熟顆粒球上に見出される骨髄分化抗原として発現される。ＣＤ３３は、骨髄性白血病細胞の８０％超で発現するが、正常造血幹細胞又は成熟顆粒球では発現しない。（Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｌ４Ｆ３ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｃｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｂｙ ｔｈｅｉｒ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，Ｂｌｏｏｄ，６８（５）：１０３０－５（１９８６））。ＣＤ３３は、悪性骨髄細胞、活性化Ｔ細胞、及び活性化ＮＫ細胞上で発現することが報告されており、ＡＭＬ患者の大部分において、少なくとも芽球のサブセットに見出される（Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ３３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｗｉｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ＡＭＬ，Ｂｌｏｏｄ，１１９（１６）：３７０５－１１（２０１２））。ＡＭＬ芽球上の広範な発現に加えて、ＣＤ３３は、ＡＭＬの基礎となる幹細胞上で発現され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ３３（ＣＤ３３ ＣＡＲ）に特異的である。ＣＤ３３特異的ＣＡＲは、細胞表面上で発現されると、Ｔ細胞の特異性をヒトＣＤ３３にリダイレクトする。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、グリシン－セリンリンカー又はＷｈｉｔｌｏｗリンカーなどの可撓性リンカーによって結合された標的抗原特異的モノクローナル抗ＣＤ３３抗体の可変ドメイン軽鎖（ＶＬ）及び可変ドメイン重鎖（ＶＨ）を含む一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｍ１９５、ｍ２Ｈ１２、ＤＲＢ２、及び／又はＭｙ９－６である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト化されており、例えば、ｈＭ１９５である。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、例えば、Ｎ末端からＣ末端、ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨに方向的に連結されるＶＨ及びＶＬを含み得る。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＤ３３に結合するＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、又はｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合領域は、リンツズマブ（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＢＩ ８３６８５８（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）によっても認識されるＣＤ３３上のエピトープを認識する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＶＬポリペプチドを含む抗原結合ドメインを含む。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号２９３（ｈＭ１９５ ＶＬドメイン）、配列番号２９６（Ｍ２Ｈ１２ ＶＬドメイン）、配列番号２９８（ＤＲＢ２ ＶＬドメイン）、配列番号３００（Ｍｙ９－６ ＶＬドメイン）のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含むＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、前述の配列のうちのいずれか１つよりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号２９３、２９６、２９８、及び３００のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又はこのような配列のうちのいずれか１つの保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３０１によってコードされたＶＬドメイン（ｈＭ１９５についてのＶＬドメインをコードする核酸）を含む。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３０１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号３０１の核酸配列の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号３０１のコドン縮重バリアントである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＶＨポリペプチドを含む抗原結合ドメインを含む。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号２９４（ｈＭ１９５ＶＨドメイン）、配列番号２９５（Ｍ２Ｈ１２ＶＨドメイン）、配列番号２９７（ＤＲＢ２ＶＨドメイン）、配列番号２９９（Ｍｙ９－６ＶＨドメイン）のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含むＶＨドメインを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、前述の配列のうちのいずれか１つよりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号２９４、２９５、２９７、若しくは２９９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号２９４、２９５、２９７、若しくは２９９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３０２によってコードされたＶＨドメイン（ｈＭ１９５についてのＶＨドメインをコードする核酸）、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３０２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号３０２の核酸配列の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号３０２のコドン縮重バリアントである。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、例えば、Ｎ末端からＣ末端、ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨに方向的に連結されるＶＨ及びＶＬを含み得る。本明細書に記載される任意のリンカーを使用して、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを連結することができる。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。特定のそのような実施形態では、ドメインは、配列番号３０３のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、前述の配列のうちのいずれか１つよりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３０３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号３０３のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３０４、又はその機能的断片若しくはバリアントによってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３０４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号３０４の核酸配列の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号３０４のコドン縮重バリアントである。
３．ＭＵＣ１特異的抗原結合ドメイン
一実施形態では、抗原結合ドメインは、ＭＵＣ１上のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＭＵＣ１抗体断片は、抗ＭＵＣ１のＦａｂ、Ｆａｂ２、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、（Ｆｖ）２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＦＣ、ＦＣ、ダイアボディ、トリアボディ、又はミニボディである。いくつかの実施形態では、抗ＭＵＣ１抗体断片は、抗ＭＵＣ１抗体の単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、抗ＭＵＣ１抗体のＶＮＡＲ又はＶＨＨ断片である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＭＵＣ１のＶＬポリペプチドを含む抗原結合ドメインを含む。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３１０～３１４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含むＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号３１０～３１４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３１０～３１４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号３１０～３１４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＭＵＣ１のＶＨポリペプチドを含む抗原結合ドメインを含む。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３０５～３０９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含むＶＨドメインを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号３０５～３０９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３０５～３０９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号３０５～３０９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、例えば、Ｎ末端からＣ末端、ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨに方向的に連結されるＶＨ及びＶＬを含み得る。本明細書に記載される任意のリンカーを使用して、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを連結することができる。
４．ＭＵＣ１６特異的抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲの抗原結合部分は、ＭＵＣ１６（ＭＵＣ１６ ＣＡＲ）に特異的である。ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲは、細胞表面上で発現されると、Ｔ細胞の特異性をヒトＭＵＣ１６にリダイレクトする。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、及び７００のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含むＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、前述の配列のうちのいずれか１つのアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、及び７００のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、並びに／又は配列番号３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、及び７００のうちのいずれか１つのアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、６６３、６６５、６６７、６６９、６７１、６８９、６９１、６９３、６９５、６９７、６９９、及び７０１のうちのいずれか１つ、又はその機能的断片若しくはバリアントによってコードされたＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、６６３、６６５、６６７、６６９、６７１、６８９、６９１、６９３、６９５、６９７、６９９、及び７０１のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又は配列番号３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、６６３、６６５、６６７、６６９、６７１、６８９、６９１、６９３、６９５、６９７、６９９、及び７０１のうちのいずれか１つの相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号６９２のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含むＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号６９２よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号６９２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号６９２のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号６９３によってコードされたＶＬドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号６９３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又は配列番号６９３の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、及び６８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含むＶＨドメインを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、前述の配列のうちのいずれか１つのアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、及び６８６のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、並びに／又は配列番号３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、及び６８６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、６４９、６５１、６５３、６５５、６５７、６５９、６６１、６７３、６７５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５、及び６８７のうちのいずれか１つ、又はその機能的断片若しくはバリアントによってコードされたＶＨドメインを含む。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、６４９、６５１、６５３、６５５、６５７、６５９、６６１、６７３、６７５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５、及び６８７のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又は配列番号３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、６４９、６５１、６５３、６５５、６５７、６５９、６６１、６７３、６７５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５、及び６８７のうちのいずれか１つの相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号６７６のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含むＶＨドメインを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号６７６よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号６７６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号６７６のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号６７７によってコードされたＶＨドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号６７７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又は配列番号６７７の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、例えば、Ｎ末端からＣ末端、ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨに方向的に連結されるＶＨ及びＶＬを含み得る。本明細書に記載される任意のリンカーを使用して、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを連結することができる。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、グリシン－セリンリンカー又はＷｈｉｔｌｏｗリンカーなどの可撓性リンカーによって結合された標的抗原特異的モノクローナル抗ＭＵＣ１６抗体の可変ドメイン軽鎖（ＶＬ）及び可変ドメイン重鎖（ＶＨ）を含む一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＭＵＣ１６－３由来のＶＨ及びＶＬ並びにリンカーを含む。特定のそのような実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３４３のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号３４３のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３４３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号３４３のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３４４、又はその機能的断片若しくはバリアントによってコードされたｓｃＦｖを含む。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又は配列番号３４４の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
５．ＲＯＲ１特異的抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、抗ＲＯＲ１抗体のＶＬドメインを含む抗原結合ドメインを含む。
特定のそのような実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３４７、３５１、３５５、３５９、３６３、３６７、３７１、３７５、３７９、３８３、３８７、３９１、３９５、３９９、４０３、４０７、４１１、４１５、４１９、４２３、４２７、４３１、４３５、４３９、４４３、４４７、４５１、４５５、４５９、及び４６３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含み得る。特定の実施形態では、機能的断片は、前述の配列のうちのいずれか１つよりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３４７、３５１、３５５、３５９、３６３、３６７、３７１、３７５、３７９、３８３、３８７、３９１、３９５、３９９、４０３、４０７、４１１、４１５、４１９、４２３、４２７、４３１、４３５、４３９、４４３、４４７、４５１、４５５、４５９、及び４６３のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、並びに／又は配列番号３４７、３５１、３５５、３５９、３６３、３６７、３７１、３７５、３７９、３８３、３８７、３９１、３９５、３９９、４０３、４０７、４１１、４１５、４１９、４２３、４２７、４３１、４３５、４３９、４４３、４４７、４５１、４５５、４５９、及び４６３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３４８、３５２、３５６、３６０、３６４、３６８、３７２、３７６、３８０、３８４、３８８、３９２、３９６、４００、４０４、４０８、４１２、４１６、４２０、４２４、４２８、４３２、４３６、４４０、４４４、４４８、４５２、４５６、４６０、及び４６４のうちのいずれか１つ、又はその機能的断片若しくはバリアントによってコードされたＶＬドメインを含み得る。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３４８、３５２、３５６、３６０、３６４、３６８、３７２、３７６、３８０、３８４、３８８、３９２、３９６、４００、４０４、４０８、４１２、４１６、４２０、４２４、４２８、４３２、４３６、４４０、４４４、４４８、４５２、４５６、４６０、及び４６４のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号３４８、３５２、３５６、３６０、３６４、３６８、３７２、３７６、３８０、３８４、３８８、３９２、３９６、４００、４０４、４０８、４１２、４１６、４２０、４２４、４２８、４３２、４３６、４４０、４４４、４４８、４５２、４５６、４６０、及び４６４のうちのいずれか１つの相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号３４８、３５２、３５６、３６０、３６４、３６８、３７２、３７６、３８０、３８４、３８８、３９２、３９６、４００、４０４、４０８、４１２、４１６、４２０、４２４、４２８、４３２、４３６、４４０、４４４、４４８、４５２、４５６、４６０、及び４６４のうちのいずれか１つのコドン縮重バリアントである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、抗ＲＯＲ１抗体のＶＨドメインを含む。
特定のそのような実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３４９、３５３、３５７、３６１、３６５、３６９、３７３、３７７、３８１、３８５、３８９、３９３、３９７、４０１、４０５、４０９、４１３、４１７、４２１、４２５、４２９、４３３、４３７、４４１、４４５、４４９、４５３、４５７、及び４６１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含み得る。特定の実施形態では、機能的断片は、前述の配列のうちのいずれか１つよりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３４９、３５３、３５７、３６１、３６５、３６９、３７３、３７７、３８１、３８５、３８９、３９３、３９７、４０１、４０５、４０９、４１３、４１７、４２１、４２５、４２９、４３３、４３７、４４１、４４５、４４９、４５３、４５７、及び４６１のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、並びに／又は配列番号３４９、３５３、３５７、３６１、３６５、３６９、３７３、３７７、３８１、３８５、３８９、３９３、３９７、４０１、４０５、４０９、４１３、４１７、４２１、４２５、４２９、４３３、４３７、４４１、４４５、４４９、４５３、４５７、及び４６１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３５０、３５４、３５８、３６２、３６６、３７０、３７４、３７８、３８２、３８６、３９０、３９４、３９８、４０２、４０６、４１０、４１４、４１８、４２２、４２６、４３０、４３４、４３８、４４２、４４６、４５０、４５４、４５８、及び４６２のうちのいずれか１つ、又はその機能的断片若しくはバリアントによってコードされたＶＨドメインを含む。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３５０、３５４、３５８、３６２、３６６、３７０、３７４、３７８、３８２、３８６、３９０、３９４、３９８、４０２、４０６、４１０、４１４、４１８、４２２、４２６、４３０、４３４、４３８、４４２、４４６、４５０、４５４、４５８、及び４６２のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号３５０、３５４、３５８、３６２、３６６、３７０、３７４、３７８、３８２、３８６、３９０、３９４、３９８、４０２、４０６、４１０、４１４、４１８、４２２、４２６、４３０、４３４、４３８、４４２、４４６、４５０、４５４、４５８、及び４６２のうちのいずれか１つの相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号３５０、３５４、３５８、３６２、３６６、３７０、３７４、３７８、３８２、３８６、３９０、３９４、３９８、４０２、４０６、４１０、４１４、４１８、４２２、４２６、４３０、４３４、４３８、４４２、４４６、４５０、４５４、４５８、及び４６２のうちのいずれか１つのコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＲＯＲ１に結合するＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含むものから選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号７１５～７２５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、上述の配列のうちのいずれか１つの配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号７１５～７２５のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号７１５～７２５のうちのいずれか１つの保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号７１５、配列番号７１６、及び配列番号７１７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号７１８、配列番号７１９、及び配列番号７２０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号７２１、配列番号７２２、及び配列番号７２３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号７２４、配列番号７２５、及び配列番号７２３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、前述のＶＨドメイン及びＶＬドメインの両方を含む。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３４９のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む可変重鎖ドメインを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号３４９よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３４９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号３４９のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３５０によってコードされたＶＨドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３５０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号３５０の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号３５０のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３８７のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む可変軽鎖ドメインを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号３８７よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３８７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号３８７のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３８８、又はその機能的断片若しくはバリアントによってコードされたＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３８８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号３８８の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号３８８のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３４９のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む可変重鎖ドメインを含み、可変重鎖ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順序で、配列番号７１５、配列番号７１６、及び配列番号７１７の配列を含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号３４９よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３４９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号３４９のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３４９のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む可変重鎖ドメインを含み、可変重鎖ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順序で、配列番号７１８、配列番号７１９、及び配列番号７２０の配列を含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号３４９よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３４９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号３４９のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３８７のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む可変軽鎖ドメインを含み、可変重鎖ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順序で、配列番号７２１、配列番号７２２、及び配列番号７２３の配列を含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号３８７よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３８７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号３８７のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３８７のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む可変軽鎖ドメインを含み、可変重鎖ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順序で、配列番号７２４、配列番号７２５、及び配列番号７２３の配列を含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号３８７よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号３８７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号３８７のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号７２６のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む可変重鎖ドメインを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号７２６よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号７２６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号７２６のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号７２７のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む可変軽鎖ドメインを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号７２７よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号７２７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号７２７のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号７２８のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む可変重鎖ドメインを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号７２８よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号７２８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号７２８のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号７２９のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む可変軽鎖ドメインを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号７２９よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号７２９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号７２９のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを連結するリンカーを含む。特定のそのような実施形態では、リンカーは、（ａ）配列番号４２４のアミノ酸配列（（Ｇ４Ｓ）３）若しくはその保存的に置換されたバリアント、又は（ｂ）配列番号４２４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定のそのような実施形態では、リンカーは、配列番号４２５によってコードされるか、ストリンジェントな条件下で配列番号４２５の相補体とハイブリダイズするか、又は配列番号４２５のコドン縮重型である。本明細書に記載される任意のリンカーを使用して、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを連結することができる。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。特定のそのような実施形態では、ドメインは、配列番号４６５のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号４６５よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４６５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号４６５のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号４６６、又はその機能的断片若しくはバリアントによってコードされたｓｃＦｖを含む。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４６６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号４６６の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号４６６のコドン縮重バリアントである。
６．ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的抗原結合ドメイン
別の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲである。「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」、「ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ」、「ＥＧＦＲＩＩＩ型変異体」、「ＥＧＦＲ．Ｄ２－７」又は「ｄｅ２－７ＥＧＦＲ」は、ヒト及び非ヒト対象における細胞外タンパク質リガンドの上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーのメンバーのための受容体である膜貫通タンパク質である、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；ＥｒｂＢ－１；ＨＥＲ１）の変異形態である。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、完全長野生型ＥＧＦＲタンパク質の細胞外ドメインにおける２６７個のアミノ酸のフレーム内欠失をもたらす、野生型ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２～７の欠失を特徴とする。ＥＧＦＲｖＩＩＩはまた、野生型ＥＧＦＲと比較して、融合接合部に挿入された新規のグリシン残基を含有する。切頭受容体ＥＧＦＲｖＩＩＩは、任意の既知のＥＧＦＲリガンドに結合することができないが、それは、構成的なチロシンキナーゼ活性を示す。この構成的活性化は、その発がん促進効果にとって重要である。キナーゼ欠損ＥＧＦＲｖＩＩＩは、同様の発がん性の利点を与えることができない。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、神経膠芽腫（ＧＢＭ）において高度に発現し、他のいくつかの固形腫瘍のタイプでは検出することができるが、正常組織では検出することができない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲの抗原結合部分は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ）に特異的である。ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲは、細胞表面上で発現すると、Ｔ細胞の特異性をヒトＥＧＦＲｖＩＩＩにリダイレクトする。実施形態では、抗原結合ドメインは、グリシン－セリンリンカー又はＷｈｉｔｌｏｗリンカーなどの可撓性リンカーによって結合された標的抗原特異的モノクローナル抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の可変ドメイン軽鎖（ＶＬ）及び可変ドメイン重鎖（ＶＨ）を含む一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、例えば、Ｎ末端からＣ末端、ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨに方向的に連結されるＶＨ及びＶＬを含み得る。
Ｂ．スペーサー
いくつかの実施形態では、本開示のキメラ抗原受容体は、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するために使用されるスペーサーを更に含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、抗原結合ドメインが抗原認識を容易にするために異なる方向に配向することを可能にするのに十分な可撓性を有する。
特定の実施形態では、スペーサーを含むキメラ抗原受容体は、スペーサーを欠く、他の点では同一の抗原結合ポリペプチドと比較して、改善された機能活性を有する。特定の実施形態では、スペーサーを含むキメラ抗原受容体は、スペーサーを欠く、他の点では同一のポリペプチドと比較して、細胞表面上で増加した発現を有する。一実施形態では、スペーサーを含むキメラ抗原受容体は、スペーサーがなければ、細胞膜表面上に発現しない、及び／又は近接性若しくは立体障害の欠如のためにその標的に結合することができないポリペプチドである。
特定の実施形態では、スペーサーは、ストーク領域、例えば、抗体からのヒンジ領域を含む。いくつかの例では、ストーク領域は、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１からのヒンジ領域を含む。代替的な例では、ストーク領域は、免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域、及び任意選択的に、ＣＤ３の部分を含む。いくつかの場合、ストーク領域は、ＷＯ２０１６／０７３７５５に記載される、ＣＤ８αヒンジ領域（配列番号４２６）、ＩｇＧ４－Ｆｃ１２アミノ酸ヒンジ領域（配列番号６３１）、又はＩｇＧ４ヒンジ領域を含む。ストーク領域は、抗原結合ドメインを細胞表面及び／又は膜貫通領域に連結するＣＡＲの細胞外部分であり得る。
いくつかの実施形態では、ストーク領域は、約２０～約３００個のアミノ酸の長さであり得る。いくつかの場合、ストーク領域は、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０個以上のアミノ酸の長さであり得る。他の場合、ストーク領域は、約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５又は３００個のアミノ酸の長さであり得る。いくつかの場合、ストーク領域は、２０個未満のアミノ酸の長さであり得る。
いくつかの実施形態では、ストーク領域は、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン若しくはＣＴＬＡ－４ヒンジドメイン、又はそれらの機能的断片若しくはバリアントを含む。
特定の実施形態では、ストーク領域は、ＣＤ８αヒンジ領域、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定のそのような実施形態では、スペーサーは、配列番号４２６のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号４６７のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４６７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号４６７のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＣＤ８αヒンジ領域、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号４６８、又はその機能的断片若しくはバリアントによってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４６８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号４６８の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号４６８のコドン縮重バリアントである。
いくつかの実施形態では、ストーク領域は、第２のＣＡＲの相同ストーク領域で二量体化することが可能であり得る。
特定の実施形態では、ストーク領域に加えて、スペーサーは、１つ以上のストーク伸長領域を含み得る。特定の実施形態では、ストーク伸長領域は、ストーク領域に相同であるポリペプチドである。例えば、それは、ストーク領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を含み得る。いくつかの実施形態では、ストーク領域は、ストーク領域と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を含み、そのストーク領域に、例えば、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、又はＣＴＬＡ－４ヒンジドメインが結合している。
いくつかの実施形態では、スペーサーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のストーク伸長領域を含む。
特定の実施形態では、ストーク領域は、リンカーを介してストーク伸長領域に連結され得る。
特定の実施形態では、ストーク伸長領域は、アミノ酸の数によって測定した場合、ストーク領域の長さの約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０倍を含み得る。
いくつかの実施形態では、ストーク領域は、少なくとも１つの二量体化部位を含む。特定の実施形態では、ストーク領域は、ホモ又はヘテロ二量体化キメラポリペプチドを形成するための１つ以上の二量体化部位を含み得る。他の実施形態では、ストーク領域又は１つ以上のストーク伸長領域は、二量体化部位を完全に排除する変異を含み得る。
特定の実施形態では、ストーク伸長領域は、ストーク領域と比較して少なくとも１つ少ない二量体化部位を有する。例えば、ストーク領域が２つの二量体化部位を含む場合、ストーク伸長領域は、１つ又はゼロの二量体化部位を含み得る。別の例として、ストーク領域が１つの二量体化部位を含む場合、ストーク伸長領域は、ゼロの二量体化部位を含み得る。いくつかの例では、ストーク伸長領域は、二量体化部位を欠く。いくつかの場合、１つ以上の二量体化部位は、膜近位であり得る。他の場合、１つ以上の二量体化部位は、膜遠位であり得る。
特定の実施形態では、二量体化部位は、ジスルフィド結合を形成することができるシステイン残基である。特定の実施形態では、ストーク伸長領域は、ストーク領域と比較して、より少ないジスルフィド結合を形成することができる。例えば、ストーク領域が２つのジスルフィド結合を形成することができる場合、ストーク伸長領域は、１つのジスルフィド結合を形成することができるか、又はジスルフィド結合を形成することができない場合がある。別の例として、ストーク領域が１つのジスルフィド結合を形成することができる場合、ストーク伸長領域は、そのような結合を形成することができない場合がある。
ストーク伸長領域の各々は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５個、又はそれ以上のアミノ酸の長さであり得る。
特定の実施形態では、ストーク伸長領域は、ＣＤ８αヒンジ領域と相同である。特定のそのような実施形態では、ストーク伸長領域は、配列番号４６９のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号４６９のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４６９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号４６９のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ストーク伸長領域は、配列番号４７０～４７２のうちのいずれか１つ、又はその機能的断片若しくはバリアントによってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４７０～４７２のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号４７０～４７２のうちのいずれか１つの相補体とハイブリダイズするか、又は配列番号４７０～４７２のうちのいずれか１つのコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、スペーサーは、ストーク領域及び１～３個のストーク伸長領域を含む。特定のそのような実施形態では、スペーサーは、ストーク領域及び２つのストーク伸長領域、例えば、ＣＤ８αヒンジ領域及び２つのストーク伸長領域を含み、各ストーク伸長領域は、ＣＤ８αヒンジ領域と相同である。
いくつかの実施形態では、ストーク領域及びストーク伸長領域の各々は、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＣＴＬＡ－４ヒンジドメイン、ＬＮＧＦＲ細胞外ドメイン、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ、及びＣＨ２－ＣＨ３ドメインのうちの少なくとも１つに由来し得る。ストーク及びストーク伸長領域は、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＣＴＬＡ－４ヒンジドメイン、ＬＮＧＦＲ細胞外ドメイン、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ又はＣＨ２－ＣＨ３ドメインの任意の組み合わせに別々に由来し得る。一例として、ストーク領域は、ＣＤ８αヒンジドメインに由来し得、少なくとも１つのストーク伸長領域は、ＣＤ２８ヒンジドメインに由来し得るため、ハイブリッドスペーサーを作製する。別の例として、ストーク領域は、ＩｇＧ１ヒンジ又はＩｇＧ４ヒンジに由来し得、少なくとも１つのストーク伸長領域は、ＩｇＧのＣＨ２－ＣＨ３ドメインに由来し得る。
特定のそのような実施形態では、スペーサーは、配列番号４７３のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号４７３のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４７３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号４７３のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、スペーサーは、配列番号４７４、又はその機能的断片若しくはバリアントによってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４７４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号４７４の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号４７４のコドン縮重バリアントである。
Ｃ．膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、天然又は合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、例えば、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来し得る。好適な膜貫通ドメインとしては、ＴＣＲ－アルファ鎖、ＴＣＲ－ベータ鎖、ＴＣＲ－γ１鎖、ＴＣＲ－δ鎖、ＴＣＲ－ゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ζ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ－４）、若しくはＣＤ１５４、又はそれらの機能的断片若しくはバリアントに由来する膜貫通ドメインが挙げられる。代替的に、膜貫通ドメインは合成であってもよく、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を含み得る。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットは、合成膜貫通ドメインの一方又は両方の末端に見出される。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ－４）、ＴＣＲγ１、ＴＣＲδ、又はＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む。
任意選択的に、いくつかの実施形態では、２～１０個のアミノ酸の長さの短いオリゴヌクレオチド又はポリペプチドリンカーが、膜貫通ドメインをＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインと連結することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン－セリンリンカーである。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメイン若しくはＣＤ３ζ膜貫通ドメイン、又はそれらの機能的断片若しくはバリアントを含む。
特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定のそのような実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号４７５のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号４７５のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４７５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号４７５のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号４７６、又はその機能的断片若しくはバリアントによってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４７６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号４７６の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号４７６のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定のそのような実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号４７７のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号４７７のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４７７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号４７７のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号４７８、又はその機能的断片若しくはバリアントによってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４７８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号４７８の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号４３８のコドン縮重バリアントである。
Ｄ．細胞内シグナル伝達ドメイン
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが配置されている免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化を担い得る。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊化された機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切頭部分が使用される範囲で、そのような切頭部分は、エフェクター機能シグナルを形質導入する限り、インタクトな鎖の代わりに使用されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、Ｔ細胞活性化のためのシグナル伝達ドメインを更に含む。
いくつかの実施形態では、細胞内細胞シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、又は調節性Ｔ細胞と相互作用する。
細胞内ドメインは、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＣＤ１９、ＣＤ４０、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＳＩＲＰＡ、ＦＣＲＬ１、ＦＣＲＬ２、ＦＣＲＬ３、ＦＣＲＬ４、ＦＣＲＬ５、ＦＣＲＬ６、ＦＣＧＲ１Ａ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＰＩＬＲＢ、ＮＣＲ１、ＮＣＲ２、ＮＣＲ３、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＡＰ１２、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＤＡＰ１０、ＣＤ８４、ＣＤ１９、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＳＩＲＰＡ、ＦＣＲＬ１、ＦＣＲＬ２、ＦＣＲＬ３、ＦＣＲＬ４、ＦＣＲＬ５、ＦＣＲＬ６、ＣＤ４、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＬＡＴ、ＦＣＧＲ１Ａ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＮＣＲ１、ＮＣＲ２、ＮＣＲ３、ＬＹ９、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ζ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ若しくはＣＤ６６ｄ、又はそれらの機能的断片若しくはバリアントに由来するアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの場合では、Ｔ細胞活性化のためのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来するドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。
特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定のそのような実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４７９のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号４７９よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４７９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号４７９のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＣＤ３ζドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号４８０、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４８０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号４８０の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号４８０のコドン縮重バリアントである。
細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ以上の共刺激ドメインを更に含むことができる。例示的な共刺激ドメインとしては、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、及びＣＤ３－ゼータ共刺激ドメイン、並びにそれらの機能的断片又はバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、及びＯＸ４０（ＣＤ１３４）共刺激ドメイン並びにそれらの機能的断片又はバリアントから選択される共刺激ドメインのうちの１つ以上、若しくは２つ以上を含む。いくつかの例では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、及びＯＸ４０（ＣＤ１３４）共刺激ドメイン並びにそれらの機能的断片又はバリアントから選択される共刺激ドメインのうちの１つ以上、若しくは２つ以上を含む。いくつかの例では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＤ８、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２共刺激ドメイン並びにそれらの機能的断片又はバリアントから選択される共刺激ドメインのうちの１つ以上、若しくは２つ以上を含む。いくつかの例では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＤ２８及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメイン並びにその機能的断片又はバリアントから選択される１つ以上、若しくは２つ以上の共刺激ドメインを含む。いくつかの例では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＤ２８及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメイン、又はそれらのそれぞれの機能的断片若しくはバリアントを含む。いくつかの例では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＤ２８及びＯＸ４０（ＣＤ１３４）共刺激ドメイン、又はそれらのそれぞれの機能的断片及びバリアントを含む。いくつかの例では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＤ８及びＣＤ２８共刺激ドメイン、又はそれらのそれぞれの機能的断片及びバリアントを含む。いくつかの例では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。いくつかの例では、本明細書に記載のＣＡＲは、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。いくつかの例では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）共刺激ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。いくつかの例では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＤ８共刺激ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。いくつかの例では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＤＡＰ１０共刺激ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。いくつかの例では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＤＡＰ１２共刺激ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。
特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定のそのような実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４８１のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号４８１のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４８１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号４８１のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＣＤ２８共刺激ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号４８２、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４８２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号４８２の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号４４２のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定のそのような実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４８３のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号４８３のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、番号４８３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号４８３の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号４８４、又はその機能的断片若しくはバリアントによってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４８４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号４８４の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号４８４のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１０共刺激ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４８５のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号４８５のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、番号４８５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号４８５の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＤＡＰ１０共刺激ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号４８６の配列、又はその機能的断片若しくはバリアントによってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４８６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号４８６の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号４８６のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１２共刺激ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４８７のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号４８７のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４８７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号４８７の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＤＡＰ１２共刺激ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号４８８の配列、又はその機能的断片若しくはバリアントによってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４８８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号４８８の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号４８８のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、上記のように、ＣＤ２８共シグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢ共シグナル伝達ドメイン、又はそれらのそれぞれの機能的断片若しくはバリアントの両方を含む。
Ｅ．シグナルペプチド
一実施形態では、シグナルペプチドは、新生ＣＡＲタンパク質を小胞体に誘導する。これは、例えば、受容体がグリコシル化され、細胞膜に固定される場合である。任意の真核生物シグナルペプチド配列は、機能的であることが想定される。一般に、タンパク質に天然に結合したシグナルペプチド、又は融合タンパク質の場合、Ｎ末端に最も近い成分が使用される（例えば、ＶＬ成分がＮ末端に最も近いｓｃＦｖでは、軽鎖の天然シグナルが使用される）。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＧＭ－ＣＳＦＲａ（配列番号４８９）若しくはＩｇＫ（配列番号４９１）、ＩｇＥ（配列番号４９３）、又はそれらの機能的断片若しくはバリアントに対して天然である。使用され得る他のシグナルペプチドとしては、ＣＤ８α（配列番号４９５）及びＣＤ２８に対して天然のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、マウスＩｇ ＶＨ領域３（配列番号４９７）、β２Ｍシグナルペプチド（配列番号４９９）、アズロシジン（配列番号５０１）、ヒト血清アルブミンシグナルペプチド（配列番号５０３）、Ａ２Ｍ受容体関連タンパク質シグナルペプチド（配列番号５０５）、ＩＧＨＶ３－２３（配列番号５０７）、ＩＧＫＶ１－Ｄ３３（ＨｕＬ１）（配列番号５０９）、ＩＧＫＶ１－Ｄ３３（Ｌ１４Ｆ）（ＨｕＨ７）（配列番号５１１）、又はそれらの機能的断片若しくはバリアントに対して天然である。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＧＭ－ＣＳＦＲａシグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントに連結している。特定のそのような実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦＲａシグナルペプチドは、配列番号４８９のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを有する。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号４８９よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４８９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号４８９の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦＲａシグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号４９０、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４９０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号４９０の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号４９０のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、Ｉｇκシグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントに連結している。特定のそのような実施形態では、Ｉｇκシグナルペプチドは、配列番号４９１のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを有する。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号４９１よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４９１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号４９１の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、Ｉｇκシグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号４９２、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４９２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号４９２の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号４９２のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＩｇＥに対して天然のＩｇＥシグナルペプチド（「ＩｇＥシグナルペプチド」）、又はその機能的断片若しくはバリアントに連結している。特定のそのような実施形態では、ＩｇＥシグナルペプチド 配列番号４９３のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアント。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号４９３よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４９３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号４９３の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＩｇＥシグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号４９４、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４９４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号４９４の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号４９４のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８αに対して天然のＣＤ８αシグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントに連結している。特定のそのような実施形態では、ＣＤ８αシグナルペプチドは、配列番号４９５のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号４９５よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４９５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号４９５の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＣＤ８αシグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号４９６、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４９６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号４９６の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号４９６のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、マウスＩｇ ＶＨ領域３シグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントに連結している。特定のそのような実施形態では、マウスＩｇ ＶＨ領域３シグナルペプチドは、配列番号４９７のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを有する。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号４９７よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４９７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号４９７の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、マウスＩｇ ＶＨ領域３シグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号４９８、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４９８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号４９８の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号４９８のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、β２Ｍシグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントに連結している。特定のそのような実施形態では、β２Ｍシグナルペプチドは、配列番号４９９のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを有する。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号４９９よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４９９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号４９９の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、β２Ｍシグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号５００、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５００と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５００の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５００のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、アズロシジンシグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントに連結している。特定のそのような実施形態では、アズロシジンシグナルペプチドは、配列番号５０１のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを有する。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５０１よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５０１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５０１の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、アズロシジンシグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号５０２、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５０２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５０２の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５０２のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ヒト血清アルブミンシグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントに連結している。特定のそのような実施形態では、ヒト血清アルブミンシグナルペプチドは、配列番号５０３のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを有する。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５０３よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５０３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５０３の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ヒト血清アルブミンシグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号５０４、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５０４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５０４の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５０４のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、Ａ２Ｍ受容体関連タンパク質シグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントに連結している。特定のそのような実施形態では、Ａ２Ｍ受容体関連タンパク質シグナルペプチドは、配列番号５０５のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを有する。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５０５よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５０５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５０５の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、Ａ２Ｍ受容体関連タンパク質シグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号５０６、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５０６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５０６の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５０６のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＩＧＨＶ３－２３シグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントに連結している。特定のそのような実施形態では、ＩＧＨＶ３－２３シグナルペプチドは、配列番号５０７のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを有する。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５０７よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５０７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５０７の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＩＧＨＶ３－２３シグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号５０８、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５０８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５０８の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５０８のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＩＧＫＶ１－Ｄ３３シグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントに連結している。特定のそのような実施形態では、ＩＧＫＶ１－Ｄ３３シグナルペプチドは、配列番号５０９のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを有する。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５０９よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５０９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５０９の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＩＧＫＶ１－Ｄ３３シグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号５１０、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５１０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５１０の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５１０のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＩＧＨＶ３－３３（Ｌ１４Ｆ）シグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントに連結している。特定のそのような実施形態では、ＩＧＨＶ３－３３（Ｌ１４Ｆ）シグナルペプチドは、配列番号５１１のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを有する。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５１１よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５１１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５１１の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＩＧＨＶ３－３３（Ｌ１４Ｆ）シグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号５１２、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５１２の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５１２のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＴＶＢ２（Ｔ２１Ａ）シグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントに連結している。特定のそのような実施形態では、ＴＶＢ２（Ｔ２１Ａ）シグナルペプチドは、配列番号５１３のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを有する。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５１３よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５１３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５１３の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＴＶＢ２（Ｔ２１Ａ）シグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号５１４、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５１４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５１４の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５１４のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ５２シグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントに連結している。特定のそのような実施形態では、ＣＤ５２シグナルペプチドは、配列番号５１５のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを有する。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５１５よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５１５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５１５の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＣＤ５２シグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号５１６、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５１６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５１６の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５１６のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＬＮＧＦＲシグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントに連結している。特定のそのような実施形態では、ＬＮＧＦＲシグナルペプチドは、配列番号５１７のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを有する。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５１７よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５１７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５１７の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＬＮＧＦＲシグナルペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号５１８、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５１８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５１８の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５１８のコドン縮重バリアントである。
Ｆ．例示的なＣＡＲ構築物
例として、限定ではないが、ＣＡＲは、配列番号５９１、５９３、５９５、５９７、５９９、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６１１、６１３、６１５、６１７、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、及び６２９のうちのいずれか１つ、又はその保存的に置換されたバリアントと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。更なる例として、限定ではないが、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５９２、５９４、５９６、５９８、６００、６０２、６０４、６０６、６０８、６１０、６１２、６１４、６１６、６１８、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、及び６３０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、そのような配列のうちのいずれか１つの相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする配列、又はそのような配列のうちのいずれか１つのコドン縮重バリアントを含み得る。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号６２３又はその保存的に置換されたバリアントと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。特定のそのような実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６２４の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、そのような配列のうちのいずれか１つの相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする配列、又はそのような配列のうちのいずれか１つのコドン縮重バリアントを含み得る。
ＣＡＲ及びＣＡＲ構造並びに組成物はまた、例えば、以下に記載されている。
● Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ：Ｄａｎｉｅｌ Ｗ．Ｌｅｅ ａｎｄ Ｎｉｒａｌｉ Ｎ．Ｓｈａｈ，２０２０（ＩＳＢＮ ９７８－０－３２３－６６１８１－２；ＤＯＩ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｃ２０１７－０－０４０６６－１）；
● Ｓｅｃｏｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｇｅｎｅ－ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｄｖａｎｃｅｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｐｉｔａｌｉｓａｔｉｏｎ，Ｅｄｉｔｏｒｓ－ｉｎ－Ｃｈｉｅｆ：Ａｌａｉｎ Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ，Ｄｅｖｙｎ Ｍ．Ｓｍｉｔｈ，Ｎａｔｈａｎ Ｊ．Ｄｏｗｄｅｎ，２０２０（ＩＳＢＮ ９７８－０－１２－８１２０３４－７；ＤＯＩ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｃ２０１６－０－０２０７０－３）；
● Ｂａｓｉｃｓ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ａｕｔｈｏｒ：Ｍｕｍｔａｚ Ｙａｓｅｅｎ Ｂａｌｋｈｉ，２０２０（ＩＳＢＮ ９７８－０－１２－８１９５７３－４，ＤＯＩ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｃ２０１８－０－０５３５６－６）；
● Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ａｕｔｈｏｒｓ：Ｓｏｎｉａ Ｇｕｅｄａｎ，Ｈｕｇｏ Ｃａｌｄｅｒｏｎ，Ａｖｅｒｙ Ｄ．Ｐｏｓｅｙ，Ｊｒ．，ａｎｄ Ｍａｒｃｅｌａ Ｖ．Ｍａｕｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２，Ｍａｒｃｈ（２０１９）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｔｈｅｒａｐｙ－ｆａｍｉｌｙ／ｍｅｔｈｏｄｓ／ｐｄｆ／Ｓ２３２９－０５０１（１８）３０１３３－５．ｐｄｆ）；
● Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｉｐｅｌｉｎｅ ａｔ ａ Ｇｌａｎｃｅ：Ａ Ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｒｏｍ Ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．Ｇｏｖ，Ａｕｔｈｏｒｓ：Ｅｉｄｅｒ Ｆ Ｍｏｒｅｎｏ Ｃｏｒｔｅｓ，Ｃａｌｅｂ Ｋ Ｓｔｅｉｎ，Ｐａｕｌａ Ａ Ｌｅｎｇｅｒｋｅ Ｄｉａｚ，Ｃｅｓａｒ Ａ Ｒａｍｉｒｅｚ－Ｓｅｇｕｒａ，Ｊａｎｕａｒｉｏ Ｅ．Ｃａｓｔｒｏ，ＭＤ，Ｂｌｏｏｄ（２０１９）１３４（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ＿１）：５６２９（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２０１９－１３２２７３）；
● ＷＯ２０２０２０９９３４（ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１７７９４）－Ｎｏｖｅｌ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（ＭＩＴ）；
● ＷＯ２０２００３７１４２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４６６９１）－Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｏ ｂｏｏｓｔ ｔ ｃｅｌｌ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｙａｌｅ）；
● ＷＯ２０１５１２３６４２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１６０５７）－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｍａｋｉｎｇ（Ｕｎｉｖ．ＴＸ）；
● ＷＯ２０２００１４３６６（ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４１２１３）－Ｒｏｒ－１ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ（Ｐｒｅｃｉｇｅｎ）；
● ＷＯ２０１９２３６５７７（ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３５３８４）－Ｍｕｃ１６ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ（Ｐｒｅｃｉｇｅｎ）
● ＷＯ２０１９０７９４８６（ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５６３３４）－Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｓｐａｃｅｒｓ（Ｐｒｅｃｉｇｅｎ）
● ＷＯ２０１７２１４３３３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３６４４０）－Ｃｄ３３ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（Ｐｒｅｃｉｇｅｎ）
Ｖ．サイトカイン
いくつかの実施形態では、本発明の修飾された免疫エフェクター細胞は、サイトカインを含み得る。サイトカインは、例えば、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。例えば、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ＣＡＲ及びサイトカイン、又はｍｉＲＮＡ及びサイトカインをコードし得る。
いくつかの場合、サイトカインは、少なくとも１つのケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、又はそれらのバリアント若しくは組み合わせを含む。特定の実施形態では、サイトカインは、インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＬＴ－ベータ、ＴＮＦ－アルファ、成長因子、ｈＧＨ、及び／又はヒトＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－ベータ、若しくはＩＦＮ－ガンマのリガンドである。
特定の実施形態では、サイトカインは、インターロイキンである。いくつかの場合、インターロイキンは、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３５、又はそれらの機能的バリアント若しくは断片である。
特定の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－１２、又はその機能的断片若しくはバリアントであり得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２は、一本鎖ＩＬ－１２（ｓｃＩＬ－１２）、プロテアーゼ感受性ＩＬ－１２、不安定化ＩＬ－１２、膜結合型ＩＬ－１２、インターカレート型ＩＬ－１２である。いくつかの例では、ＩＬ－１２バリアントは、ＷＯ２０１５／０９５２４９、ＷＯ２０１６／０４８９０３、ＷＯ２０１７／０６２９５３に記載されている通りである。
特定の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－１５、又はその機能的断片若しくはバリアントであり得る。特定の実施形態では、ＩＬ－１５、又はその機能的断片若しくはバリアントは、膜結合型である。このようなことは、ＩＬ－１５、又はその機能的断片若しくはバリアントが、膜結合型ＩＬ－１５Ｒα、又はその機能的断片若しくはバリアントに結合している場合に生じ得る。したがって、本発明の特定の実施形態は、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα、又はそれらのそれぞれの機能的断片若しくはバリアントを含む融合タンパク質を含み得る。
特定の実施形態では、ＩＬ－１５、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号５１９のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５１９のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５１９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５１９のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＩＬ－１５、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号５２０の配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５２０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５２０の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５２０のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒα、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号５２１のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５２１のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５２１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５２１のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒα、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号５２２、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５２２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５２２の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５２２のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、ＩＬ－１５、又はその機能的断片若しくはバリアントは、リンカーを介してＩＬ－１５Ｒα、又はその機能的断片に連結される。
特定の実施形態では、リンカーは、配列番号５２９のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５２９よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５２９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５２９の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、リンカーは、配列番号５３０、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５３０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５３０とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５３０のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαを含む融合タンパク質は、配列番号５２３のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５２３のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５２３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５２３のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαを含む融合タンパク質は、配列番号５２４、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５２４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５２４の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号６０３のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、サイトカインは、シグナルペプチドに連結している。ＣＡＲで使用するために上述されるものを含む、真核細胞で使用するための任意のシグナルは、サイトカインに連結され得る。特定の実施形態では、サイトカインは、ＩｇＥシグナルペプチドに連結している。
特定の実施形態では、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαを含む融合タンパク質は、配列番号５２５のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５２５のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５２５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５２５のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαを含む融合タンパク質は、配列番号５２６、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５２６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５２６の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５２６のコドン縮重バリアントである。
ＶＩ．細胞タグ
いくつかの実施形態では、本発明の修飾された免疫エフェクター細胞は、細胞タグを含み得る。細胞タグは、例えば、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。例えば、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のｍｉＲＮＡ、ＣＡＲ及び／又はサイトカイン並びに細胞タグをコードし得る。いくつかの態様では、細胞タグは、キルスイッチ、選択マーカー、バイオマーカー、又はそれらの組み合わせとして使用される。
特定の実施形態では、細胞タグは、所定の結合パートナーによって結合することができる。特定のそのような実施形態では、細胞タグは、非免疫原性である。特定のそのような実施形態では、細胞タグは、それが非免疫原性であるように切頭であるポリペプチドを含む。
特定の実施形態では、所定の結合パートナーの投与は、注入されたＣＡＲ－Ｔ細胞の枯渇を可能にする。例えば、セツキシマブ又はＨＥＲ１を認識する任意の抗体の投与は、切頭非免疫原性ＨＥＲ１を含む細胞タグを発現する細胞の除去を可能にする。ＨＥＲ１配列の切頭は、セツキシマブ結合能力をそのまま維持しながら、ＥＧＦリガンド結合、ＥＧＦＲのホモ及びヘテロ二量体化、並びに／又はＥＧＦＲ媒介シグナル伝達の可能性を排除する（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｋ．，２００８．Ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｖｉｅｗ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ３７，ｐｐ．３５３－３７３）。
特定の実施形態では、細胞タグは、切頭非免疫原性ＨＥＲ１ポリペプチド、切頭非免疫原性ＬＮＧＦＲポリペプチド、切頭非免疫原性ＣＤ２０ポリペプチド、あるいは切頭非免疫原性ＣＤ５２ポリペプチド、又はそれらの機能的断片若しくはバリアントのうちの少なくとも１つを含む。
特定の実施形態では、細胞タグは、ＨＥＲ１ドメインＩＩＩ及び切頭ＨＥＲ１ドメインＩＶを含む切頭非免疫原性ＨＥＲ１ポリペプチドを含む。このようなドメイン及びそれをコードする核酸配列としては、ＷＯ２０１８／２２６８９７に記載のものが挙げられる。
特定の実施形態では、ＨＥＲ１ドメインＩＩＩは、配列番号６０４のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５６５のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５６５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５６５の配列のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＨＥＲ１ドメインＩＩＩ、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号５６６、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５６６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５６６の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５６６のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、切頭ＨＥＲ１ドメインＩＶは、配列番号５６７のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５６７のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５６７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５６７の配列のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、切頭ＨＥＲ１ドメインＩＶ、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号５６８、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５６８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５６８の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５６８のコドン縮重バリアントである。
特定のそのような実施形態では、切頭非免疫原性ＨＥＲ１は、配列番号５６９のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５６９のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５６９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５６９の配列のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、切頭非免疫原性ＨＥＲ１、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号５７０、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５７０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５７０の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５７０のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、細胞タグは、切頭非免疫原性ＣＤ２０、若しくはＣＤ２０ｔ－１、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定のそのような実施形態では、細胞タグは、配列番号５７３、５７５のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５７３又は配列番号５７５のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５７３又は配列番号５７５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５７３若しくは配列番号５７５のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、切頭非免疫原性ＣＤ２０、若しくはＣＤ２０ｔ－１、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号５７４若しくは配列番号５７６、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５７４若しくは配列番号５７６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５７４若しくは配列番号５７６の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５７４若しくは配列番号５７６のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、細胞タグは、膜貫通ドメインを更に含む。膜貫通ドメインは、天然又は合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、例えば、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来し得る。好適な膜貫通ドメインとしては、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ若しくはゼータ鎖の膜貫通ドメイン、又はＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ζ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７若しくはＣＤ１５４からの膜貫通ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを挙げることができる。代替的に、膜貫通ドメインは合成であってもよく、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を含み得る。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットは、合成膜貫通ドメインの一方又は両方の末端に見出される。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定のそのような実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号４７７のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号４７７のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４７７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号４７７のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号４７８、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号４７８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号４７８の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号４７８のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、細胞タグは、切頭ＨＥＲ１、又はその機能的断片若しくはバリアント、及び膜貫通ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号５７１のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５７１のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５７１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５７１のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、細胞タグは、配列番号５７２、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５７２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５７２の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５７２のコドン縮重バリアントである。
特定の実施形態では、細胞タグは、シグナルペプチドと連結している。シグナルペプチドは、本明細書にＣＡＲに関して記載されるものを含む、真核細胞での使用に好適な任意のシグナルペプチドであり得る。特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号４９１のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含むＩｇκシグナルペプチドである。
ＶＩＩ．遺伝子構築物
図１６に示されるように、細胞内の様々な遺伝子及び他の調節エレメントの発現のための鋳型として使用することができる例示的なポリヌクレオチドが提供される。様々なエレメントが、ポリヌクレオチドに含まれ得るか、又は省略され得、ポリヌクレオチド内の様々な例示的な部位について異なる選択肢が示されることを理解されたい。
示されるように、ポリヌクレオチドは、細菌ゲノムへのポリヌクレオチドのａｔｔＰ／ａｔｔＢファージの組み込みのための組み込みシグナルを含むことができる。ポリヌクレオチドは、５’相同性アーム又は５’末端反復、及び３’相同性アーム又は３’末端反復を更に含み得る。ポリヌクレオチドは、５’相同性アーム又は５’末端反復に隣接して３’に位置付けられ、３’相同性アーム又は３’末端反復に隣接して５’に位置付けられる、インスレーター、境界エレメント、及びＳ／ＭＡＲを更に含み得る。インスレーター、境界エレメント、又はＳ／ＭＡＲの間に、ポリヌクレオチドは、５’から３’までに、サイレンサー、エンハンサー、ＴＦ結合モジュール及びコアプロモーターを含み得るプロモーター；安定性モジュール、翻訳制御エレメント、及びｍｉＲＮＡコード配列などのイントロン組み込みエレメントを含み得る５’非翻訳領域；シグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、シグナル伝達ドメイン、抗体ドメイン、ペプチドリンカー、インテイン及びエピトープタグを含み得る１つ以上の遺伝子；並びに安定性モジュール、翻訳制御、３’末端プロセシングシグナル及び転写終結因子を含み得る３’非翻訳領域を含み得る。発現される遺伝子は、ＩＲＥＳ、切断ペプチド、又はリボソームスキッピングペプチドによって分離され得ることを理解されたい。
ＣＡＲは、ｍｉＲＮＡ、サイトカイン、及び／又は細胞タグを有する同じ遺伝子構築物にコードされてもよい。１つの遺伝子構築物を使用して発現されるそのような成分のうちの２つ以上を有する利点は、そのような成分の化学量論的発現である。
Ａ．リンカー
特定の実施形態では、本発明のポリペプチド（例えば、ＣＡＲ、サイトカイン、及び細胞タグ）は、リンカーポリペプチドによって連結される。リンカーはまた、ポリペプチドのドメイン（例えば、ＣＡＲのＶＨドメイン及びＶＬドメイン、細胞タグの切頭ＨＥＲ１ドメイン及び膜貫通ドメイン、並びにＩＬ－１５ドメイン及びＩＬ－１５Ｒαドメイン）を連結するために使用され得る。
本発明に好適なリンカーとしては、可撓性リンカー、剛性リンカー、及びインビボで切断可能なリンカーが挙げられる。いくつかの場合、リンカーは、（可撓性及び剛性リンカーのように）機能的ドメインを一緒に連結するか、又はインビボで切断可能なリンカーのようにインビボで遊離機能的ドメインを放出するように作用する。
前述のように、いくつかの場合、リンカー配列は、可撓性リンカーを含み得る。結合ドメインがある程度の移動又は相互作用を必要とする場合、可撓性リンカーを適用することができる。可撓性リンカーは、小さい、非極性（例えば、Ｇｌｙ）又は極性（例えば、Ｓｅｒ又はＴｈｒ）アミノ酸から構成され得る。可撓性リンカーは、主にＧｌｙ及びＳｅｒ残基の伸長からなる配列（「ＧＳ」リンカー）を有することができる。可撓性リンカーの例は、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎの配列を有することができる。コピー数「ｎ」を調整することによって、この例示的なＧＳリンカーの長さを、機能的ドメインの適切な分離を達成するため、又は必要なドメイン間相互作用を維持するために最適化することができる。例えば、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは４である）は、配列番号６０８に示される（Ｇ４Ｓ）４リンカー又はその保存的に置換されたアミノ酸配列である。ＧＳリンカーの他に、他の可撓性リンカーを組換え融合タンパク質に利用することができる。いくつかの場合、可撓性リンカーは、可撓性を維持するために、Ｔｈｒ及びＡｌａなどの追加のアミノ酸を含有することができる。他の場合、Ｌｙｓ及びＧｌｕなどの極性アミノ酸を使用して、溶解度を改善することができる。
特定の移動又は相互作用が融合タンパク質ドメインに所望される場合、可撓性リンカーは好適な選択肢であり得る。加えて、可撓性リンカーは剛性構造を有していないが、いくつかの場合、それらは、機能的ドメイン間の距離を保つために受動的リンカーとして機能することができる。可撓性リンカーの長さは、適切な折り畳みを可能にするため、又は融合タンパク質の最適な生物学的活性を達成するために調整され得る。
剛性リンカーを利用して、ポリペプチドのドメイン間の固定距離を維持することができる。硬質リンカーの例としては、いくつか挙げると、アルファヘリックス形成リンカー、Ｐｒｏリッチ配列、（ＸＰ）ｎ、Ｘ－Ｐｒｏ骨格、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２～５）（配列番号５６３）、並びにそれらの機能的断片及びバリアントが挙げられる。剛性リンカーは、いくつかの場合、α－ヘリカル構造を採用することによって、又は複数のＰｒｏ残基を含有することによって、比較的硬い構造を示すことができる。
本発明に有用なリンカーは、いくつかの場合、切断可能であり得る。他の場合、リンカーは切断不可能である。切断不可能なリンカーは、機能的ドメインを共有結合して、インビボプロセス又はエクスビボプロセスを通して１つの分子として機能することができる。リンカーはまた、インビボで切断可能であり得る。切断可能なリンカーを導入して、インビボで遊離機能的ドメインを放出することができる。
切断可能なリンカーは、いくつか挙げると、還元試薬、プロテアーゼの存在によって切断することができる。例えば、ジスルフィド結合の還元を利用して、切断可能なリンカーを生成することができる。ジスルフィドリンカーの場合、グルタチオンなどのチオールとのジスルフィド交換による切断事象は、切断を生じ得る。いくつかの場合、切断可能なリンカーは、標的切断を可能にすることができる。例えば、組換え融合タンパク質中のリンカーのインビボでの切断はまた、病理条件（例えば、がん又は炎症）下で、特定の細胞若しくは組織内で、又は特定の細胞区画内で拘束されてインビボで発現することができるプロテアーゼによって行うことができる。切断可能なリンカーは、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、又はチオエステルを含み得る。例えば、ヒドラゾンは、血清の安定性を与えることができる。他の場合、ヒドラゾンは、酸性区画内での切断を可能にすることができる。酸性区画は、最大７までのｐＨを有することができる。リンカーはまた、チオエーテルを含み得る。チオエーテルは還元不可能であり得る チオエーテルは、細胞内タンパク質分解のために設計され得る。切断可能なリンカーの例としては、Ｆｕｒｉｎｌｉｎｋ、ｆｍｄｖ、及び２Ａリンカー（例えば、Ｐ２Ａ、ＧＳＧ－Ｐ２Ａ、ＦＰ２Ａ、Ｔ２Ａ、及びＦｕｒｉｎ－Ｔ２Ａ）、又はそれらの機能的断片若しくはバリアントが挙げられる。
ｆｍｄｖリンカーは、配列番号５３９のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含み得る。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５３９のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５３９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５３９のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ｆｍｄｖリンカーは、配列番号５４０、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５４０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５４０の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５４０のコドン縮重バリアントである。
Ｐ２Ａリンカーは、配列番号５４７のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含み得る。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５４７のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５４７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５４７のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、Ｐ２Ａリンカーは、配列番号５４８、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５４８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５４８の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５４８のコドン縮重バリアントである。
ＧＳＧ－Ｐ２Ａリンカーは、配列番号５４９のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含み得る。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５４９のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５４９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５４９のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＧＳＧ－Ｐ２Ａリンカーは、配列番号５５０、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５５０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５５０の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５５０のコドン縮重バリアントである。
ＦＰ２Ａリンカーは、配列番号５５５のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含み得る。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５５５のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５５５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５５５のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、ＦＰ２Ａリンカーは、配列番号５５６、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５５６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５５６の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５５６のコドン縮重バリアントである。
Ｔ２Ａリンカーは、配列番号５４１のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含み得る。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５４１のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５４１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５４１のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、Ｔ２Ａリンカーは、配列番号４７５４２８、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５４２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５４の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５４２のコドン縮重バリアントである。
いくつかの実施形態では、リンカーは、フリンポリペプチド及び２Ａポリペプチドを含み、フリンポリペプチド及び２Ａポリペプチドは、少なくとも３つの疎水性アミノ酸を含むポリペプチドリンカーによって接続される。そのようなリンカーは、「Ｆｕｒｉｎ－Ｔ２Ａ」リンカーと呼ばれる。いくつかの場合、少なくとも３つの疎水性アミノ酸は、グリシン（Ｇｌｙ）（Ｇ）、アラニン（Ａｌａ）（Ａ）、バリン（Ｖａｌ）（Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ）（Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）（Ｉ）、プロリン（Ｐｒｏ）（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）（Ｆ）、メチオニン（Ｍｅｔ）（Ｍ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）（Ｗ）からなるリストから選択される。いくつかの場合、ポリペプチドリンカーは、１つ以上のＧＳリンカー配列、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＳＧ）ｎ、及び（ＧＳＧ）ｎを含むことができ、式中、ｎは、０～３０の任意の数であり得る。
Ｆｕｒｉｎ－Ｔ２Ａリンカーは、配列番号５４３若しくは５４５のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含み得る。特定の実施形態では、機能的断片は、配列番号５４３又は５４５のアミノ酸配列よりも、Ｎ末端及び／又はＣ末端で最大でも２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基だけ短い。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５４３若しくは５４５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５４３若しくは５４５のアミノ酸配列の保存的に置換されたバリアントである。
特定の実施形態では、Ｆｕｒｉｎ－Ｔ２Ａリンカーは、配列番号５４４若しくは５４６、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５４４若しくは５４６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、配列番号５４４若しくは５４６の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、又は配列番号５４４若しくは５４６のコドン縮重バリアントである。
リンカーは、操作されたリンカーであり得る。例えば、リンカーは、疎水性などの化学的特徴を含むように設計することができる。リンカーを設計する方法は、計算的であり得る。いくつかの場合、計算方法は、グラフィック技術を含むことができる。計算方法は、データベースから導出された三次元ペプチド構造のライブラリから好適なペプチドを探索するために使用することができる。例えば、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）は、リンカーの選択されたアミノ酸間の空間における距離を測るために使用され得る。
更なる例示的なリンカーは、配列表に提供される。
いくつかの場合、少なくとも２つのリンカー配列を同じタンパク質に含めることができる。例えば、融合タンパク質内の目的のポリペプチドは、少なくとも２つのリンカーによって分離することができる。いくつかの場合、ポリペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、又は最大で１０個のリンカーによって分離することができる。
本発明のＣＡＲ、細胞タグ、及び／又はサイトカインは、融合タンパク質として発現され得る。そのような実施形態では、そのような成分は、自己切断ペプチド、例えば、２Ａペプチドを使用して一緒に連結され得る。
特定の実施形態では、自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントである。
特定の実施形態では、自己切断ペプチドは、Ｆｕｒｉｎ－Ｔ２Ａペプチド、又はその機能的断片若しくはバリアントである。
特定のそのような実施形態では、ＣＡＲ、サイトカイン、及び細胞タグは、自己切断リンカー、例えば、Ｆｕｒｉｎ－Ｔ２Ａを含むものによって連結されたＣＡＲ及びサイトカインと、自己切断リンカー、例えば、Ｔ２Ａを含むものによって連結されたサイトカイン及び細胞タグとの融合タンパク質として発現される。
Ｂ．プロモーター
本発明のポリヌクレオチドは、プロモーターと作動可能な結合で構築物中に存在し得る。宿主細胞及び求められる効果に基づいて、適切なプロモーターを選択することができる。好適なプロモーターとしては、構成的及び誘導的プロモーターが挙げられる。プロモーターは組織特異的であり得、そのようなプロモーターは当該技術分野で周知である。
本発明で使用するための構成プロモーターの例としては、初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ヒト伸長成長因子１アルファ１（ｈＥＦ１Ａ１）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン－バーウイルス初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、及びヒト遺伝子プロモーター、例えば、限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーター、並びにそれらの機能断片及びバリアントが挙げられる。
特定の実施形態では、プロモーターは、ｈＥＦ１Ａ１プロモーターである。ｈＥＦ１Ａ１プロモーターは、配列番号５７７の配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含み得る。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５７７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又は配列番号５７７の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。特定の実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。ＣＭＶプロモーターは、配列番号５７８の配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含み得る。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５７８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又は配列番号５７８の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
構成的プロモーターとは対照的に、誘導性プロモーターの使用は、そのような発現が所望される場合に、作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現をオンにすることができるか、又は発現が所望されない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、限定されないが、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチリガンド誘導性プロモーターであり得る。いくつかの場合、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなどの小分子リガンド誘導性の２つのポリペプチドエクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチであり得る。
ＶＩＩＩ．ベクター及び送達系
特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、非ウイルス及びウイルス送達系を含む、任意の好適な送達系によって標的細胞に送達され得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｍｉＲＮＡ、ＣＡＲ、サイトカイン、細胞タグ、又はそれらの任意の組み合わせをコードする本開示のポリヌクレオチドを含み得る。
特定の場合、ｍｉＲＮＡ、ＣＡＲ、サイトカイン、及び／又は細胞タグは、別個のベクターで発現される。他の態様では、ｍｉＲＮＡ、ＣＡＲ、サイトカイン、及び／又は細胞タグは、１つの単一のベクターから発現される。特定の場合、ＣＡＲ及びｍｉＲＮＡは、別個のベクターで発現される。他の態様では、ｍｉＲＮＡ、ＣＡＲ及びサイトカインは、１つの単一のベクターから発現される。特定の場合、ベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン、又はセリンリコンビナーゼ媒介組み込みのための配列を含有するベクターであり得る。いくつかの態様では、ベクターは、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、又はナノプラスミドである。
ベクターが、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ又はナノプラスミドである特定の実施形態では、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ又はナノプラスミドは、細菌の複製起点を更に含み得る。特定の実施形態では、細菌の複製起点は、ＣｏｌＥ１プラスミド由来であり得る。特定の実施形態では、細菌の複製起点は、配列番号５７９の配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５７９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又は配列番号５７９の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
本明細書に記載の１つ以上のｍｉＲＮＡ及びＣＡＲ又はそれらの部分の発現を評価するために、細胞内に導入される発現ベクターはまた、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターを介してトランスフェクト又は感染させようとする細胞集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にするために、選択可能なマーカー遺伝子若しくはレポーター遺伝子のいずれか又は両方を含有することができる。他の態様では、選択可能なマーカーは、別個のＤＮＡ片上に担持されてもよく、同時トランスフェクション手順で使用されてもよい。選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子の両方に、適切な調節配列を隣接させて、宿主細胞での発現を可能にすることができる。有用な選択可能なマーカーとしては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）及びアンピシリン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。いくつかの実施形態では、切頭上皮成長因子受容体（ＨＥＲ１ｔ又はＨＥＲ１ｔ－１）タグは、選択可能なマーカー遺伝子として使用され得る。
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞を同定し、調節配列の機能性を評価するために使用され得る。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物若しくは組織内に存在しないか、又はそれによって発現されず、かつその発現が、いくつかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性によって現れるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞内に導入された後の好適な時間にアッセイされる。好適なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が挙げられる（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２（２０００））。好適な発現系は周知であり、既知の技術を使用して調製することができるか、又は商業的に入手することができる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’隣接領域を有する構築物は、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結されてもよく、プロモーターにより駆動される転写を調節する能力について作用物質を評価するために使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、導入遺伝子の発現を駆動するｈＥＦ１Ａ１プロモーター、転写を増強するウシ成長ホルモンｐｏｌｙＡ配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、並びにｐＦＵＧＷプラスミドに由来するＬＴＲ配列を含み得る。
Ａ．核酸を細胞に導入するための方法
遺伝子を細胞内に導入及び発現する方法は周知である。発現ベクターの文脈において、ベクターは、当該技術分野における任意の方法によって、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、又は昆虫細胞内に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞内に移入することができる。
１．物理的方法
ポリヌクレオチドを宿主細胞、例えば、免疫エフェクター細胞内に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝突、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を産生するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１））を参照されたい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための方法は、リン酸カルシウムトランスフェクション又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクションである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための方法は、エレクトロポレーションである。
ａ．エレクトロポレーション（ＥＰ）緩衝液
様々な緩衝液をエレクトロポレーションに使用することができる。本明細書に開示される緩衝液は、これらの緩衝液が他の既知のエレクトロポレーション緩衝液と比較してより少ない成分を含むにもかかわらず、トランスフェクション能力の向上を含む、改善された特性を有することが見出された。
表４は、緩衝剤として使用される一塩基性リン酸塩及び二塩基性リン酸塩の異なる量を提供する。表５は、緩衝剤及びグルコースを含有する緩衝液１～２０を提供する。表Ｚは、緩衝剤及びマンニトールを含有する緩衝液２１～３７を提供する。表７は、対照緩衝液（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ（商標）Ｉｎｇｅｎｉｏ（商標）エレクトロポレーション溶液、カタログ番号ＭＩＲ－５０１１７；Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）（「対照１」）と比較した緩衝液１、２及び３のｐＨ、導電率、及び浸透圧濃度を提供する。
Figure 2024502479000011

Figure 2024502479000012

Figure 2024502479000013

Figure 2024502479000014
いくつかの実施形態では、緩衝液は、水などの溶媒を含む。いくつかの実施形態では、水は、精製及び／又は滅菌されてもよい。例えば、水は、脱イオン化（例えば、容量性脱イオン化又は電気脱イオン化）、逆浸透、炭素濾過、精密濾過、限外濾過、及び／又は紫外線滅菌を受け得る。いくつかの実施形態では、水は、脱イオン化される。いくつかの実施形態では、水は、「注射用水」として指定された品質のものであり、「注射用滅菌水」としても知られている。注射用水は、一般に、蒸留又は逆浸透によって作製される。注射用水は、無菌、非発熱性、溶質を含まない水の調製物であり、化学的に「Ｈ２Ｏ」と指定され、約５．０～約７．０、好ましくは約５．５のｐＨを有する。
いくつかの実施形態では、溶媒は、全緩衝液体積の０．１体積％～９９．９体積％を占める。例えば、溶媒は、全緩衝液体積の少なくとも約０．１体積％、１体積％、５体積％、１０体積％、１５体積％、２０体積％、２５体積％、３０体積％、３５体積％、４０体積％、４５体積％、５０体積％、５５体積％、６０体積％、６５体積％、７０体積％、７５体積％、８０体積％、８５体積％、９０体積％、９５体積％、９９体積％、又は９９．１体積％を占め得る。
いくつかの実施形態では、緩衝液は、溶質、例えば、糖又は糖に由来する有機化合物、例えば、糖アルコールを含む。緩衝液が糖を含む実施形態では、糖は、単糖、二糖、及び／又は多糖を含み得る。いくつかの実施形態では、糖は、単糖、例えば、グルコース、フルクトース、及び／又はガラクトースを含む。いくつかの実施形態では、糖は、二糖、例えば、スクロース、ラクトース、及びマルトースを含む。いくつかの実施形態では、糖は、多糖、例えば、セルロース又はデンプンを含む。緩衝液が糖アルコールを含む実施形態では、糖アルコールは、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、ラクチトール、イソマルト、マルチトール、及び／又は水素化デンプン加水分解物（ＨＳＨ）を含み得る。
いくつかの実施形態では、糖は、約５０ミリモル（ｍＭ）未満の量で存在する。例えば、糖は、約４５ｍＭ、４０ｍＭ、３５ｍＭ、３０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、又は５ｍＭ未満の量で存在してもよい。いくつかの実施形態では、糖は、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、又は約２５ｍＭ～約３５ｍＭの範囲の量で存在する。いくつかの実施形態では、糖は、約２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、又は３５ｍＭの量で存在する。
いくつかの実施形態では、糖は、グルコースである。これらの実施形態では、グルコースは、約５０ミリモル（ｍＭ）未満の量で存在してもよい。例えば、グルコースは、約４５ｍＭ、４０ｍＭ、３５ｍＭ、３０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、又は５ｍＭ未満の量で存在してもよい。いくつかの実施形態では、グルコースは、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、又は約２５ｍＭ～約３５ｍＭの範囲の量で存在する。いくつかの実施形態では、グルコースは、約２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、又は３５ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、グルコースは、約３０ｍＭ又は３１ｍＭの量で存在する。
いくつかの実施形態では、糖は、マンニトールである。これらの実施形態では、マンニトールは、約５０ミリモル（ｍＭ）未満の量で存在してもよい。例えば、マンニトールは、約４５ｍＭ、４０ｍＭ、３５ｍＭ、３０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、又は５ｍＭ未満の量で存在してもよい。いくつかの実施形態では、マンニトールは、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、又は約２５ｍＭ～約３５ｍＭの範囲の量で存在する。いくつかの実施形態では、マンニトールは、約２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、又は３５ｍＭの量で存在する。
いくつかの実施形態では、ＥＰ緩衝液は、１つ以上の塩化物塩、例えば、塩化カリウム（ＫＣｌ）及び／又は塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、１つ以上の緩衝剤、例えば、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、又はＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４を更に含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＨＥＰＥＳ及び／又はＤＭＳＯのうちの１つ以上を更に含む。他の実施形態では、緩衝液は、市販のエレクトロポレーション（ＥＰ）緩衝液に一般的に見出される１つ以上の緩衝剤を特異的に除外する。例えば、いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＤＭＳＯ及び／又はＨＥＰＥＳの一方又は両方を除外する。
いくつかの実施形態では、緩衝液は、水（Ｈ２Ｏ）、グルコース、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、及びＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、水（Ｈ２Ｏ）、グルコース、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、及びＨＥＰＥＳを含む。他の実施形態では、緩衝液は、水（Ｈ２Ｏ）、グルコース、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、ＨＥＰＥＳ、及びＤＭＳＯを含む。
いくつかの実施形態では、緩衝液は、水（Ｈ２Ｏ）、グルコース、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、及びＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４から本質的になる。いくつかの実施形態では、緩衝液は、水（Ｈ２Ｏ）、グルコース、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、及びＨＥＰＥＳから本質的になる。他の実施形態では、緩衝液は、水（Ｈ２Ｏ）、グルコース、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、ＨＥＰＥＳ、及びＤＭＳＯから本質的になる。
いくつかの実施形態では、緩衝液は、水（Ｈ２Ｏ）、グルコース、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、及びＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４からなる。いくつかの実施形態では、緩衝液は、水（Ｈ２Ｏ）、グルコース、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、及びＨＥＰＥＳからなる。他の実施形態では、緩衝液は、水（Ｈ２Ｏ）、グルコース、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、ＨＥＰＥＳ、及びＤＭＳＯからなる。
いくつかの実施形態では、緩衝剤は、約６．０～８．０、６．５～８．０、７．０～８．０、７．５～８．０、６．０～７．５、６．０～７．０、６．０～６．５、６．５～７．５、又は６．５～７．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、又は８．０のｐＨを有する。
いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝剤を含む緩衝液は、約６．０～８．０、６．５～８．０、７．０～８．０、７．５～８．０、６．０～７．５、６．０～７．０、６．０～６．５、６．５～７．５、又は６．５～７．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、又は８．０のｐＨを有する。
いくつかの実施形態では、緩衝液は、Ｎａ２ＨＰＯ４及び／又はＮａＨ２ＰＯ４の一方又は両方を含む。緩衝液が両方の緩衝剤を含む実施形態では、２つの比（すなわち、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４）は、約１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、９：１、８：１、７：１、６：１ ５：１、４：１、３：１、２：１、又は２：３であり得る。いくつかの実施形態では、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４の比は、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、又は７．９のｐＨを有する。
いくつかの実施形態では、Ｎａ２ＨＰＯ４とＮａＨ２ＰＯ４の混合物（「Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４」又は「リン酸ナトリウム」とも称される）は、約５０ｍＭ～１６０ｍＭ、６０ｍＭ～１５０ｍＭ、７０ｍＭ～１４０ｍＭ、７５ｍＭ～１３０ｍＭ、８０ｍＭ～１２５ｍＭ、９０ｍＭ～１２５ｍＭ、９０ｍＭ～１２０ｍＭ、９０ｍＭ～１１５ｍＭ、又は９０ｍＭ～１０５ｍＭの範囲の量で緩衝液中に存在してもよい。いくつかの実施形態では、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４は、少なくとも５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、又は１００ｍＭの量で存在する。いくつかの実施形態では、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４は、８０ｍＭ、８１ｍＭ、８２ｍＭ、８３ｍＭ、８４ｍＭ、８５ｍＭ、８６ｍＭ、８７ｍＭ、８８ｍＭ、８９ｍＭ、９０ｍＭ、９１ｍＭ、９２ｍＭ、９３ｍＭ、９４ｍＭ、９５ｍＭ、９６ｍＭ、９７ｍＭ、９８ｍＭ、９９ｍＭ、１００ｍＭ、１０１ｍＭ、１０２ｍＭ、１０３ｍＭ、１０４ｍＭ、１０５ｍＭ、１０６ｍＭ、１０７ｍＭ、１０８ｍＭ、１０９ｍＭ、１１０ｍＭ、１１１ｍＭ、１１２ｍＭ、１１３ｍＭ、１１４ｍＭ、１１５ｍＭ、１１６ｍＭ、１１７ｍＭ、１１８ｍＭ、１１９ｍＭ、又は１２０ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４は、９０ｍＭ又は１０５ｍＭの量で存在する。
緩衝液がＫＣｌを含む実施形態では、ＫＣｌは、約３０ｍＭ未満の量で存在してもよい。例えば、ＫＣｌは、約２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、又は５ｍＭ未満の量で存在してもよい。いくつかの実施形態では、ＫＣｌは、約１ｍＭ～約３０ｍＭ、約２ｍＭ～約２５ｍＭ、約３ｍＭ～約２０ｍＭ、約４ｍＭ～約１５ｍＭ、約５ｍＭ～約１０ｍＭ、又は約５ｍＭ～約１５ｍＭの範囲の量で存在する。いくつかの実施形態では、ＫＣｌは、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、又は１５ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、ＫＣｌは、約５ｍＭ又は１０ｍＭの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＫＣｌは、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８又は７．９のｐＨを有する。
緩衝液がＭｇＣｌ２を含む実施形態では、ＭｇＣｌ２は、約５０ｍＭ未満の量で存在してもよい。例えば、ＭｇＣｌ２は、約４５ｍＭ、３５ｍＭ、３０ｍＭ ２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、又は５ｍＭ未満の量で存在してもよい。いくつかの実施形態では、ＭｇＣｌ２は、約５ｍＭ～約５０ｍＭ、約６ｍＭ～約４５ｍＭ、約７ｍＭ～約４０ｍＭ、約８ｍＭ～約３５ｍＭ、約９ｍＭ～約３０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ、又は約１５ｍＭ～約２５ｍＭの範囲の量で存在する。いくつかの実施形態では、ＭｇＣｌ２は、約５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、又は３０ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、ＭｇＣｌ２は、約１５ｍＭ又は２０ｍＭの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＭｇＣｌ２は、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、又は７．９のｐＨを有する。
緩衝液がＨＥＰＥＳを含む実施形態では、ＨＥＰＥＳは、約３０ｍＭ未満の量で存在してもよい。例えば、ＨＥＰＥＳは、約２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、又は０．１ｍＭ未満の量で存在してもよい。いくつかの実施形態では、ＨＥＰＥＳは、約１ｍＭ～約３０ｍＭ、約２ｍＭ～約２５ｍＭ、約３ｍＭ～約２０ｍＭ、約４ｍＭ～約１５ｍＭ、約５ｍＭ～約１０ｍＭの範囲の量で存在する。いくつかの実施形態では、ＨＥＰＥＳは、約０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、又は１５ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、ＨＥＰＥＳは、０ｍＭ、５ｍＭ、又は１０ｍＭの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＨＥＰＥＳは、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、又は７．９のｐＨを有する。
緩衝液がＤＭＳＯを含む実施形態では、ＤＭＳＯは、全緩衝液体積の５体積％、４体積％、３体積％、２体積％、１体積％、０．９体積％、０．８体積％、０．７体積％、０．６体積％、０．５体積％、０．４体積％、０．３体積％、０．２体積％、又は０．１体積％以下の量で存在してもよい。いくつかの実施形態では、ＤＭＳＯは、全緩衝液体積の約０体積％～約２．５体積％で存在する。いくつかの実施形態では、ＤＭＳＯは、全緩衝液体積の約０．１体積％～５体積％、１体積％～５体積％、２体積％～５体積％、３体積％～５体積％、又は４体積％～５体積％の範囲の量で存在する。いくつかの実施形態では、ＤＭＳＯは、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、又は７．９のｐＨを有する。他の実施形態では、ＤＭＳＯは、緩衝液中に全く含まれていない。
特定の実施形態では、緩衝液は、５０ｍＭ以下の量の糖、２５ｍＭ以下の量のＨＥＰＥＳ、１６０ｍＭ以下の量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ以下の量のＫＣｌ、２０ｍＭ以下の量のＭｇＣｌ２、及び全緩衝液体積の５体積％以下の量のＤＭＳＯを含む。これらの実施形態のうちのいくつかでは、糖は、単糖及び／又は糖アルコールを含み得る。これらの実施形態のうちのいくつかでは、糖は、マンニトール及び／又はグルコースである。これらの実施形態のうちのいくつかでは、糖は、グルコースである。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＤＭＳＯを含まない。
特定の実施形態では、緩衝液は、少なくとも約１５ｍＭの量の糖、２５ｍＭ以下の量のＨＥＰＥＳ、少なくとも約９０ｍＭの量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、少なくとも約２ｍＭの量のＫＣｌ、少なくとも１５ｍＭの量のＭｇＣｌ２、及び全緩衝液体積の５体積％以下の量のＤＭＳＯを含む。これらの実施形態のうちのいくつかでは、糖は、単糖及び／又は糖アルコールを含み得る。これらの実施形態のうちのいくつかでは、糖は、マンニトール及び／又はグルコースである。これらの実施形態のうちのいくつかでは、糖は、グルコースである。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＤＭＳＯを含まない。
特定の実施形態では、緩衝液は、約１５ｍＭ～約３５ｍＭの範囲の量の糖、約５ｍＭ～約１０ｍＭの範囲の量のＫＣｌ、約１０．５ｍＭ～約２０ｍＭの範囲の量のＭｇＣｌ２、約９０ｍＭ～約１０５ｍＭの範囲の量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ以下の量のＨＥＰＥＳ、及び全緩衝液体積の５体積％以下の量のＤＭＳＯを含む。これらの実施形態のうちのいくつかでは、糖は、単糖及び／又は糖アルコールを含み得る。これらの実施形態のうちのいくつかでは、糖は、マンニトール及び／又はグルコースである。これらの実施形態のうちのいくつかでは、糖は、グルコースである。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＤＭＳＯを含まない。
特定の実施形態では、緩衝液は、約１５ｍＭの量のグルコース、約６ｍＭの量のＫＣｌ、約１０．５ｍＭの量のＭｇＣｌ２ 約１０５ｍＭの量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、約１５ｍＭの範囲の量のＨＥＰＥＳ、及び全緩衝液体積の約２．５体積％の量のＤＭＳＯを含む。
特定の実施形態では、緩衝液は、約３０ｍＭの量のグルコース、約１０ｍＭの量のＫＣｌ、約２０ｍＭの量のＭｇＣｌ２、約１０５ｍＭの量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、及び約５ｍＭの量のＨＥＰＥＳを含む。いくつかの実施形態では、ＤＭＳＯは、緩衝液から特異的に除外される。
特定の実施形態では、緩衝液は、約３１ｍＭの量のグルコース、約５ｍＭの量のＫＣｌ、及び約１５ｍＭの量のＭｇＣｌ２、及び約９０ｍＭの量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＥＰＥＳ及びＤＭＳＯのうちの１つ以上は、緩衝液から特異的に除外される。
特定の実施形態では、緩衝液は、約３０ｍＭの量のグルコース、約５ｍＭの量のＫＣｌ、及び約１５ｍＭの量のＭｇＣｌ２、約９０ｍＭの量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、及び約１０ｍＭの量のＨＥＰＥＳを含む。いくつかの実施形態では、ＤＭＳＯは、緩衝液から特異的に除外される。
特定の実施形態では、緩衝液は、約２５ｍＭの量のグルコース、約１５ｍＭの量のＫＣｌ、及び約２５ｍＭの量のＭｇＣｌ２、約１２０ｍＭの量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、及び約１０ｍＭの量のＨＥＰＥＳを含む。いくつかの実施形態では、ＤＭＳＯは、緩衝液から特異的に除外される。
特定の実施形態では、緩衝液のｐＨは調整され得る。いくつかの実施形態では、緩衝液は、６．５～８のｐＨに調整される。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約７．０～７．６のｐＨに調整される。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約６．９～７．２、又は約７．０～７．１のｐＨに調整される。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、又は８．０のｐＨに調整される。特定の実施形態では、緩衝液は、約７．０又は７．１のｐＨに調整される。
特定の実施形態では、緩衝液の導電率は、約７．０ｍｓ／ｃｍ～約１６．０ｍｓ／ｃｍ、約９．０ｍｓ／ｃｍ～約１６．０ｍｓ／ｃｍ、約１１．０ｍｓ／ｃｍ～約１６．０ｍｓ／ｃｍ、又は約１３．０ｍｓ／ｃｍ～約１６．０ｍｓ／ｃｍである。いくつかの実施形態では、緩衝液の導電率は、約７．０ｍｓ／ｃｍ～約１５．０ｍｓ／ｃｍ、約９．０ｍｓ／ｃｍ～約１５．０ｍｓ／ｃｍ、約１１．０ｍｓ／ｃｍ～約１５．０ｍｓ／ｃｍ、又は約１３．０ｍｓ／ｃｍ～約１５．０ｍｓ／ｃｍである。いくつかの実施形態では、緩衝液の導電率は、約７．０ｍｓ／ｃｍ、約７．１ｍｓ／ｃｍ、約７．２ｍｓ／ｃｍ、約７．３ｍｓ／ｃｍ、約７．４ｍｓ／ｃｍ、約７．５ｍｓ／ｃｍ、約７．６ｍｓ／ｃｍ、約７．７ｍｓ／ｃｍ、約７．８ｍｓ／ｃｍ、約７．９ｍｓ／ｃｍ、約８．０ｍｓ／ｃｍ、約８．１ｍｓ／ｃｍ、約８．２ｍｓ／ｃｍ、約８．３ｍｓ／ｃｍ、約８．４ｍｓ／ｃｍ、約８．５ｍｓ／ｃｍ、約８．６ｍｓ／ｃｍ、約８．７ｍｓ／ｃｍ、約８．８ｍｓ／ｃｍ、約８．９ｍｓ／ｃｍ、約９．０ｍｓ／ｃｍ、約９．１ｍｓ／ｃｍ、約９．２ｍｓ／ｃｍ、約９．３ｍｓ／ｃｍ、約９．４ｍｓ／ｃｍ、約９．５ｍｓ／ｃｍ、約９．６ｍｓ／ｃｍ、約９．７ｍｓ／ｃｍ、約９．８ｍｓ／ｃｍ、約９．９ｍｓ／ｃｍ、約１０．０ｍｓ／ｃｍ、約１０．１ｍｓ／ｃｍ、約１０．２ｍｓ／ｃｍ、約１０．３ｍｓ／ｃｍ、約１０．４ｍｓ／ｃｍ、約１０．５ｍｓ／ｃｍ、約１０．６ｍｓ／ｃｍ、約１０．７ｍｓ／ｃｍ、約１０．８ｍｓ／ｃｍ、約１０．９ｍｓ／ｃｍ、約１１．０ｍｓ／ｃｍ、約１１．１ｍｓ／ｃｍ、約１１．２ｍｓ／ｃｍ、約１１．３ｍｓ／ｃｍ、約１１．４ｍｓ／ｃｍ、約１１．５ｍｓ／ｃｍ、約１１．６ｍｓ／ｃｍ、約１１．７ｍｓ／ｃｍ、約１１．８ｍｓ／ｃｍ、約１１．９ｍｓ／ｃｍ、約１２．０ｍｓ／ｃｍ、約１２．１ｍｓ／ｃｍ、約１２．２ｍｓ／ｃｍ、約１２．３ｍｓ／ｃｍ、約１２．４ｍｓ／ｃｍ、約１２．５ｍｓ／ｃｍ、約１２．６ｍｓ／ｃｍ、約１２．７ｍｓ／ｃｍ、約１２．８ｍｓ／ｃｍ、約１２．９ｍｓ／ｃｍ、約１３．０ｍｓ／ｃｍ、約１３．１ｍｓ／ｃｍ、約１３．２ｍｓ／ｃｍ、約１３．３ｍｓ／ｃｍ、約１３．４ｍｓ／ｃｍ、約１３．５ｍｓ／ｃｍ、約１３．６ｍｓ／ｃｍ、約１３．７ｍｓ／ｃｍ、約１３．８ｍｓ／ｃｍ、約１３．９ｍｓ／ｃｍ、約１４．０ｍｓ／ｃｍ、約１４．１ｍｓ／ｃｍ、約１４．２ｍｓ／ｃｍ、約１４．３ｍｓ／ｃｍ、約１４．４ｍｓ／ｃｍ、約１４．５ｍｓ／ｃｍ、約１４．６ｍｓ／ｃｍ、約１４．７ｍｓ／ｃｍ、約１４．８ｍｓ／ｃｍ、約１４．９ｍｓ／ｃｍ、約１５．０ｍｓ／ｃｍ、約１５．１ｍｓ／ｃｍ、約１５．２ｍｓ／ｃｍ、約１５．３ｍｓ／ｃｍ、約１５．４ｍｓ／ｃｍ、約１５．５ｍｓ／ｃｍ、約１５．６ｍｓ／ｃｍ、約１５．７ｍｓ／ｃｍ、約１５．８ｍｓ／ｃｍ、約１５．９ｍｓ／ｃｍ、又は約１６．０ｍｓ／ｃｍである。特定の実施形態では、緩衝液の導電率は、約１１．６、１２．８、又は１４．３である。
いくつかの実施形態では、緩衝液の浸透圧濃度は、トランスフェクトされる細胞の浸透圧濃度（すなわち、「細胞内浸透圧濃度」としても知られている）よりも低い。いくつかの実施形態では、緩衝液の浸透圧濃度は、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約１２５５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約１１００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約９００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約７００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、又は約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏの範囲である。いくつかの実施形態では、浸透圧濃度は、約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約１２５５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約１１００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約９００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約７００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏである。いくつかの実施形態では、浸透圧濃度は、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、２５５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、２６０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、２７０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３０５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３２５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３４５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３５５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３６５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３７０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３７５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３８５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３９０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３９５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、又は約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏである。特定の実施形態では、浸透圧濃度は、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、又は約３６２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏである。
いくつかの実施形態では、緩衝液は、表５及び６に示される例示的な緩衝液のうちの１つ以上から選択される。特定の実施形態では、緩衝液は、緩衝液１、緩衝液２、又は緩衝液３から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明の緩衝液は、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）エレクトロポレーション装置及びカートリッジ（又は、カセット）と併せて使用される。ＰＣＴ／ＵＳ２０／５９９８４（２０２０年１１月１１日に出願された）及び米国特許出願第１７／０９５，０２８号（２０２０年１１月１１日に出願された）を参照されたい。この装置は、様々な遺伝子及び細胞療法のための迅速な製造を可能にするように設計されている。ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）は、１回の操作で大量の細胞をエレクトロポレーションするためのハイスループット、半閉鎖型エレクトロポレーションシステムである。ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）システムは、処理時間及び汚染リスクを大幅に削減することにより、現在のエレクトロポレーションデバイスに比べて進歩している。例えば、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒは、インビボでがん抗原を標的とするように再プログラムされたＴ細胞のＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ（商標）製造などの、分散型キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞製造のためのスケールアップ及び商業化解決策として利用され得る。
本発明の緩衝液は、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）エレクトロポレーション装置及び／又はカートリッジ（又はカセット）内の緩衝液を使用してエレクトロポレーションを実施する場合、高い細胞トランスフェクション効率を生成するのに驚くほど効果的である。ＰＣＴ／ＵＳ２０／５９９８４（２０２０年１１月１１日に出願された）及び米国特許出願第１７／０９５，０２８号を参照されたい。
ｂ．それらの方法を使用して産生されたＥＰ緩衝液及び組換え細胞を利用する方法
本発明の別の態様では、本発明による緩衝液を利用して、電流（すなわち、エレクトロポレーション）を介して細胞内に生物学的に活性な物質（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を導入する方法が提供される。この方法は、ヒトから得られた細胞を、外因性生体物質と共に本発明の緩衝液中で合わせ、次いで、電圧パルスの形態の電流を懸濁液に適用し、それによって、生体物質を細胞内に導入することを容易にすることによって、懸濁液を形成することを含む。
特定の実施形態では、電圧パルスは、最大１～１０ｋＶ＊ｃｍ－１の電界強度、及び５～２５０μｓの持続時間、及び少なくとも２Ａ＊ｃｍ－２の電流密度を有し得る。特定の実施形態では、電圧パルスは、生物学的に活性な物質（例えば、ＤＮＡ）を動物及びヒト細胞の細胞核に直接トランスフェクトすることを可能にする。特定の実施形態では、中断することなく電圧パルスに続いて、２～１４Ａ＊ｃｍ－２、好ましくは最大５Ａ＊ｃｍ－２の電流密度、及び１～１００ｍｓの持続時間を有する電流も適用されてもよい。
本発明による方法を使用して、動物細胞の核を含む細胞への生物学的に活性な物質のトランスフェクションを最適化してもよい。この場合、生物学的に活性な物質（例えば、核酸、ポリペプチドなど）を、高効率で静止又は分裂動物細胞に導入することができる。
いくつかの実施形態では、細胞は、緩衝液に１０分未満曝露される。例えば、細胞は、９分未満、８分未満、７分未満、６分未満、５分未満、４分未満、３分未満、２分未満、又は１分未満、緩衝液に曝露され得る。
いくつかの実施形態では、この方法を使用して、生物学的に活性な物質を、一次ヒト血液細胞、ヒト血液の多能性前駆細胞、並びに一次ヒト線維芽細胞及び内皮細胞に導入する。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト血液細胞、例えば、免疫細胞である。特定の実施形態では、免疫細胞は、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、及びリンパ球（Ｂ細胞及びＴ細胞）、又はそれらのいくつかの組み合わせである。いくつかの実施形態では、リンパ球は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、患者から単離される。
いくつかの実施形態では、生体物質は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、ＲＮＰ、又はそれらのいくつかの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、生体物質は、細胞に対して異種である。いくつかの実施形態では、生体物質は、部分的又は完全に合成である。
いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡから選択される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、ｃＤＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓＲＮＡ、又はそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、核酸は、組換え核酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ポリペプチド、タンパク質、酵素、抗体、抗体断片、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、組換えである。
本発明の緩衝液を利用する方法は、特に、他のエレクトロポレーション緩衝液を利用する方法と比較して、所望の高いトランスフェクション収率をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明の緩衝液によるトランスフェクション収率は、対照（従来技術）緩衝液によるトランスフェクション収率の少なくとも約１．１倍である。例えば、本発明の緩衝液によるトランスフェクション収率は、対照（従来技術）緩衝液のトランスフェクション収率よりも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、２．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、又は５．０倍高くあり得る。いくつかの実施形態では、本発明の緩衝液によるトランスフェクション収率は、対照（従来技術）緩衝液のトランスフェクション収率よりも５倍超、例えば、６、７、８、９、又は１０倍高くあり得る。特定の実施形態では、本発明の緩衝液によるトランスフェクション収率は、対照（従来技術）の緩衝液のトランスフェクション収率よりも１．３５、１．４１、１．４６、１．９７、１．９８、２．０５、２．１２、２．４０、又は２．４４倍高い。
本発明の緩衝液を利用する方法は、特に、他のエレクトロポレーション緩衝液を利用する方法と比較して、所望の高いトランスフェクト細胞回収率をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明の緩衝液によるトランスフェクト細胞回収率は、対照（従来技術）緩衝液によるトランスフェクト細胞回収率の少なくとも約１．１倍である。例えば、本発明の緩衝液によるトランスフェクト細胞回収率は、対照（従来技術）緩衝液のトランスフェクト細胞回収率よりも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、２．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、又は５．０倍高くあり得る。いくつかの実施形態では、本発明の緩衝液によるトランスフェクト細胞回収率は、対照（従来技術）緩衝液のトランスフェクト細胞回収率よりも５倍超であり得る。特定の実施形態では、本発明の緩衝液によるトランスフェクト細胞回収率は、対照（従来技術）緩衝液のトランスフェクト細胞回収率よりも１．５３、１．６６、１．７２、１．８０、２．０６、２．１７、２．２３、２．３４、又は２．６１倍高い。
本発明の別の態様では、組換え細胞が提供される。いくつかの実施形態では、組換え免疫細胞は、本発明の方法を使用して産生される。特定の実施形態では、組換え免疫細胞は、修飾されたＴ細胞である。いくつかの実施形態では、修飾されたＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、治療目的のために患者に投与される。
ｃ．エレクトロポレーション装置及びそれらの使用方法
例示的なエレクトロポレーション装置は、エレクトロポレーションプロセス中に緩衝液及び細胞を保存するように構成された１つ以上のチャンバと、エレクトロポレーションプロセス中に１つ以上のチャンバ内に電界を生成するように構成された１つ以上の電極のペアであって、各電界は１つのチャンバに対応する、１つ以上の電極のペアと、エレクトロポレーションプロセス後の細胞収集プロセス中に細胞を輸送するように構成されたフローチャネルと、を備える。
いくつかの実施形態では、装置は、１つのチャンバ、２つのチャンバ、３つのチャンバ、４つのチャンバ、５つのチャンバ、６つのチャンバ、７つのチャンバ、８つのチャンバ、９つのチャンバ、１０個のチャンバ、又は１０個以上のチャンバを備える。特定の実施形態では、装置は、連続流又はマイクロ流体システムを利用する。
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置は、収集プロセス中にフローチャネルからチャンバの少なくとも１つに液体媒体をポンピングするためのポンプを更に備え、液体媒体は入口ポートで得られる。いくつかの実施形態では、ポンプは、１つ以上のチャンバをフローチャネルに接続する１つのバルブ又は複数のバルブを備える。いくつかの実施形態では、１つのバルブ又は複数のバルブは、一度に１つずつ開かれる。いくつかの実施形態では、１つのバルブ又は複数のバルブは、流体の一方向の流れのみを可能にする。いくつかの実施形態では、各バルブは、１つのチャンバに対応する。いくつかの実施形態では、チャンババルブに対応する各バルブは、ピンチバルブ又はピンチタイプバルブである。いくつかの実施形態では、バルブの各々は、ばね運動、レバー運動、又はピストン運動を使用して動作する。
いくつかの実施形態では、１つ以上のチャンバは、所与のチャンバを備え、電極のペアの各電極は、所与のチャンバの反対側に位置し、電極のペアの各電極は、所与のチャンバ内の内部部分と、所与のチャンバ外の外部部分との両方を備える。
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置は、入口ポートと、出口ポートと、入口ポート及び出口ポートをフローチャネルに接続する１つ以上の隣接フローチャネルと、を更に備える。
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置は、収集プロセス中にフローチャネルからチャンバの少なくとも１つに液体媒体をポンピングするためのポンプを更に備え、液体媒体は入口ポートで得られる。
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置は、１つ以上のチャンバに通じる１つ以上の開口部を含む表面と、開口部の下にあり、チャンバ間の空気流を接続する空気流チャネルと、を更に備える。
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置は、空気流チャネルをエレクトロポレーション装置の外部に接続するベント又はエアフィルタを更に備える。
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置は、１つ以上の開口部を覆うように構成されたシールを更に備える。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置における各チャンバは、それぞれのバルブに向かって狭くなる形状を備える。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置は、電極のペアを更に備え、電極ペアの各電極は、各チャンバの反対側に配置される。電極ペア内の２つの電極間の距離は、「ギャップ距離」又は「分離距離」と称される。この距離はチャンバの幅に及ぶ。
いくつかの実施形態では、１つ以上のチャンバの各々は、約０．１ｍｍ～約２０ｍｍ、約０．５ｍｍ～約１０ｍｍ、約１ｍｍ～約７ｍｍ、又は約１ｍｍ～約４ｍｍのギャップ距離を含む。いくつかの実施形態では、ギャップ距離は、約０．５ｍｍ、１．０ｍｍ、１．５ｍｍ、２．０ｍｍ、２．５ｍｍ、３．０ｍｍ、３．５ｍｍ、４．０ｍｍ、４．５ｍｍ、５．０ｍｍ、５．５ｍｍ、６．０ｍｍ、６．５ｍｍ、７．０ｍｍ、７．５ｍｍ、又は８．０ｍｍである。いくつかの実施形態では、約２．５ｍｍ、２．６ｍｍ、２．７ｍｍ、２．８ｍｍ、２．９ｍｍ、３．０ｍｍ、３．１ｍｍ、３．２ｍｍ、３．３ｍｍ、３．４ｍｍ、３．５ｍｍ、３．６ｍｍ、３．７ｍｍ、３．８ｍｍ、３．９ｍｍ、又は４．０ｍｍのギャップ距離。いくつかの実施形態では、ギャップ距離は、約４ｍｍ未満、約３．５ｍｍ未満、約３．０ｍｍ未満、約２．５ｍｍ未満、約２．０ｍｍ未満、約１．５ｍｍ未満、又は約１．０ｍｍ未満である。いくつかの実施形態では、約４．０ｍｍ未満のギャップ距離は、本明細書に提供される緩衝液のエレクトロポレーション性能を改善する。
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置の電極のペアの各電極は、所与のチャンバ内の内部部分と、所与のチャンバ外の外部部分とを備え、電極の各ペアは、電気回路に接続するように構成される。いくつかの実施形態では、所与のチャンバ内の内部部分は、楕円形の面を有し、金コーティングを含む。
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置の各チャンバは、少なくとも約５０μＬ、少なくとも約１００μＬ、少なくとも約１５０ 少なくとも約μＬ、少なくとも約２００μＬ、少なくとも約２５０μＬ、少なくとも約３００μＬ、少なくとも約３５０μＬ、少なくとも約４００μＬ、少なくとも約４５０μＬ、少なくとも約１５０μＬ、少なくとも約５００μＬ、少なくとも約５５０μＬ、少なくとも約６００μＬ、少なくとも約６５０μＬ、少なくとも約７００μＬ、少なくとも約７５０μＬ、少なくとも約８００μＬ、少なくとも約８５０μＬ、少なくとも約９００μＬ、少なくとも約９５０μＬ、又は少なくとも約１０００μＬ（１．０ｍＬ）の体積を保存するように構成される。
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置のチャンバは、組み合わせて、エレクトロポレーションのための液体懸濁液中の細胞の少なくとも約５００μＬ、少なくとも約１．０ｍＬ、少なくとも約１．２ｍＬ、少なくとも約１．４ｍＬ、少なくとも約１．６ｍＬ、少なくとも約１．８ｍＬ、少なくとも約２．０ｍＬ、少なくとも約２．２ｍＬ、少なくとも約２．４ｍＬ、少なくとも約２．６ｍＬ、少なくとも約２．８ｍＬ、少なくとも約３．０ｍＬ、少なくとも約３．２ｍＬ、少なくとも約３．４ｍＬ、少なくとも約３．６ｍＬ、少なくとも約３．８ｍＬ、少なくとも約４．０ｍＬ、少なくとも約４．２ｍＬ、少なくとも約４．４ｍＬ、少なくとも約４．６ｍＬ、少なくとも約４．８ｍＬ、少なくとも約５．０ｍＬ、少なくとも約５．２ｍＬ、少なくとも約５．４ｍＬ、少なくとも約５．６ｍＬ、少なくとも約５．８ｍＬ、少なくとも約６．０ｍＬ、少なくとも約６．２ｍＬ、少なくとも約６．４ｍＬ、少なくとも約６．６ｍＬ、少なくとも約６．８ｍＬ、又は少なくとも約７．０ｍＬを保存するように構成される。
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションプロセスに関与する細胞は、少なくとも１×１０８個の細胞、少なくとも２×１０８個の細胞、少なくとも３×１０８個の細胞、少なくとも４×１０８個の細胞、少なくとも５×１０８個の細胞、少なくとも６×１０８個の細胞、少なくとも７×１０８個の細胞、少なくとも８×１０８個の細胞、少なくとも９×１０８個の細胞、少なくとも１×１０９個の細胞、少なくとも２×１０９個の細胞、少なくとも３×１０９個の細胞、少なくとも４×１０９個の細胞、少なくとも５×１０９個の細胞、少なくとも６×１０９個の細胞、少なくとも７×１０９個の細胞、少なくとも８×１０９個の細胞、少なくとも９×１０９個の細胞、少なくとも１×１０１０個の細胞、少なくとも２×１０１０個の細胞、少なくとも３×１０１０個の細胞、少なくとも４×１０１０個の細胞、少なくとも５×１０１０個の細胞、少なくとも６×１０１０個の細胞、少なくとも７×１０１０個の細胞、少なくとも８×１０１０個の細胞、少なくとも９×１０１０個の細胞、少なくとも１×１０１１個の細胞、少なくとも２×１０１１個の細胞、少なくとも３×１０１１個の細胞、少なくとも４×１０１１個の細胞、少なくとも５×１０１１個の細胞、少なくとも６×１０１１個の細胞、少なくとも７×１０１１個の細胞、少なくとも８×１０１１個の細胞、少なくとも９×１０１１個の細胞、少なくとも１×１０１２個の細胞、少なくとも２×１０１２個の細胞、少なくとも３×１０１２個の細胞、少なくとも４×１０１２個の細胞、少なくとも５×１０１２個の細胞、少なくとも６×１０１２個の細胞、少なくとも７×１０１２個の細胞、少なくとも８×１０１２個の細胞、及び少なくとも９×１０１２個の細胞からなる群から選択される集団を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の装置は、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）エレクトロポレーション装置及びカートリッジを備える（ＰＣＴ／ＵＳ２０／５９９８４及び米国特許出願第１７／０９５，０２８号を参照されたい）。上述したように、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）エレクトロポレーション装置は、様々な遺伝子及び細胞療法のための迅速な製造を可能にするように設計されている。この装置は、インビボでがん抗原を標的とするように再プログラムされたＴ細胞のＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ（商標）製造などの、分散型ＣＡＲ Ｔ細胞製造のためのスケールアップ及び商業化解決策として利用され得る。
いくつかの実施形態では、本発明の装置は、エレクトロポレーションの方法で使用され、この方法は、電極のペアを使用してチャンバ内に電界を生成することによってエレクトロポレーションプロセスを実行することであって、チャンバは、エレクトロポレーションプロセス中に緩衝液及び細胞を保存するように構成される、エレクトロポレーションプロセスを実行することと、チャンバに接続されたバルブを開き、バルブに接続されたフローチャネルを使用して緩衝液及び細胞を出口ポートに輸送することによって細胞収集プロセスを実行することであって、チャンバ、電極ペア、バルブ、出口ポート、及びフローチャネルの各々は、エレクトロポレーション装置内に配置される、細胞収集プロセスを実行することと、を含む。
いくつかの実施形態では、細胞収集プロセスを実行する工程は、ポンプを使用して、フローチャネルからチャンバ内に液体媒体をポンピングすることを更に含み、液体媒体は入口ポートで得られ、入口ポート及び出口ポートは、エレクトロポレーション装置内の隣接するフローチャネルによってフローチャネルに接続される。
いくつかの実施形態では、細胞収集プロセスは、チャンバをフローチャネルに排出することを更に含み、チャンバ内の圧力は、チャンバと別のチャンバとの間を流れる空気フローチャネルに接続されたベント又はエアフィルタを介して維持される。
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションの方法は、緩衝液を保持するチャンバにつながる開口部に細胞を沈着させることと、開口部にシールを適用することと、例えば、エレクトロポレーション装置をドッキングステーションに挿入することによって、電極ペアを少なくとも１つの回路に接続することと、を更に含む。
いくつかの実施形態では、方法は、表５及び６に示される例示的な緩衝液のうちの１つ以上を利用する。特定の実施形態では、方法は、緩衝液１、緩衝液２、又は緩衝液３を利用する。
いくつかの実施形態では、方法は、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）エレクトロポレーション装置で実施される（ＰＣＴ／ＵＳ２０／５９９８４及び米国特許第１７／０９５，０２８号を参照されたい）。特定の実施形態では、方法は、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）エレクトロポレーション装置で実施され、表５及び６に示される例示的な緩衝液のうちの１つ以上を利用する。特定の実施形態では、方法は、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）エレクトロポレーション装置で実施され、緩衝液１、緩衝液２、又は緩衝液３（表５に示される）を利用する。
ｄ．エレクトロポレーションシステム
本発明の別の態様では、エレクトロポレーションのためのシステムが提供される。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションのためのシステムは、本明細書に記載のエレクトロポレーション装置と、本明細書に記載のエレクトロポレーション緩衝液と、を含む。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションシステムは、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）エレクトロポレーション装置及びカートリッジを備える（ＰＣＴ／ＵＳ２０／５９９８４及び米国特許第１７／０９５，０２８号を参照されたい）。上述したように、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）エレクトロポレーション装置は、様々な遺伝子及び細胞療法のための迅速な製造を可能にするように設計されている。このデバイスは、インビボでがん抗原を標的とするように再プログラムされたＴ細胞のＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ（商標）製造などの、分散型ＣＡＲ Ｔ細胞製造のためのスケールアップ及び商業化解決策として利用され得る。
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションのためのシステムは、緩衝液を更に含み、その緩衝液は、表５及び６に示される例示的な緩衝液のうちの１つ以上に由来する。特定の実施形態では、エレクトロポレーションのためのシステムは、緩衝液１、緩衝液２、又は緩衝液３から選択される緩衝液を含む。ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）デバイス及び緩衝液１、２、又は３のうちの１つを含むシステムは、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）デバイス及び対照緩衝液を含むシステムと比較して、驚くほど高い細胞トランスフェクション効率をもたらすことが見出されている。
ｅ．エレクトロポレーションのためのキット
本発明の別の態様では、エレクトロポレーションのためのキットが提供される。キットは、本明細書に記載される緩衝液のいずれかを含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、表５及び６に示される例示的な緩衝液のうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、キットは、緩衝液１、緩衝液２、又は緩衝液３から選択される緩衝液を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、本発明による緩衝液並びに他の好適な試薬及び／又はデバイスで満たされた１つ以上の容器を含む。例えば、キットは、目的の核酸を含むベクターを更に含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、ドロッパー、ピペット、及び／又はキュベットを含み得る。いくつかの実施形態では、緩衝液は、等分された容器中に、又はストック溶液としてパッケージングされ得る。
いくつかの実施形態では、キットは、緩衝液並びに任意の追加の試薬及び／又はデバイスを安全に輸送するためのパッケージを更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、緩衝液の内容物及び任意の追加の試薬に関する情報を含む。更に、キットは、書面の資料、例えば、ユーザマニュアル又はよくある質問への回答を含み得る。
２．化学的方法
ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための化学的方法には、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、並びに水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む、脂質ベースの系が含まれる。インビトロ及びインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
３．ウイルスベクター及び送達方法
ウイルス送達系が利用される場合、例示的な送達ビヒクルは、リポソームである。脂質製剤は、（インビトロ、エクスビボ、又はインビボで）宿主細胞への核酸の導入のために使用され得る。別の態様では、核酸は、脂質と会合し得る。脂質と会合する核酸は、リポソームの水性内部にカプセル化され得、リポソームの脂質二重層内に散在され得、リポソーム及びオリゴヌクレオチドの両方と会合する連結分子を介してリポソームに結合され得、リポソーム内に捕捉され得、リポソームと複合体化され得、脂質を含有する溶液中に分散され得、脂質と混合され得、脂質と組み合わされ得、脂質中に懸濁液として含有され得、ミセルを含有し得るか、若しくはミセルと複合体化され得るか、又はそれら以外の場合、脂質と会合され得る。脂質、脂質／ＤＮＡ又は脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液中の任意の特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造、ミセルとして、又は「崩壊した」構造で存在してもよい。それらはまた、単に溶液中に散在してもよく、場合によっては、サイズ又は形状が均一ではない凝集体を形成してもよい。脂質は、天然に存在する脂質又は合成脂質であり得る脂肪性物質である。例えば、脂質には、細胞質内に天然に存在する脂肪小滴、並びに長鎖脂肪族炭化水素及びその誘導体、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、及びアルデヒドを含有する化合物のクラスが含まれる。
使用に好適な脂質は、商業的な供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．から得ることができ、ジセチルホスフェート（「ＤＣＰ」）は、Ｋ ＆ Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）から得ることができ、コレステロール（「Ｃｈｏｌ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から得ることができる。クロロホルム又はクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約－２０℃で保存することができる。クロロホルムは、メタノールよりも容易に蒸発するため、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、封入された脂質二重層又は凝集体の生成によって形成された様々な単一及び多層脂質ビヒクルを包含する一般名称である。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内側水性媒体を有する小胞構造を有することを特徴とすることができる。多層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質を過剰の水溶液中に懸濁させると自発的に形成される。脂質成分は、閉鎖構造の形成前に自己再構成を行い、脂質二重層間の水及び溶解溶質を捕捉する（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：５０５－１０（１９９１））。しかしながら、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物もまた、包含される。例えば、脂質は、ミセル構造を想定し得るか、又は脂質分子の不均一な凝集体としてのみ存在し得る。リポフェクタミン－核酸複合体も企図される。
本明細書では、本発明の核酸が挿入される、ウイルスベースの送達系も提供される。代表的なウイルス発現ベクターとしては、アデノウイルスベースのベクター（例えば、Ｃｒｕｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手可能なアデノウイルスベースのＰｅｒ．Ｃ６系）、アデノ随伴ウイルスベースのベクター、レンチウイルスベースのベクター（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）からのレンチウイルスベースのｐＬＰＩ）、レトロウイルスベクター（例えば、ｐＦＢ－ＥＲＶ＋ｐＣＦＢ－ＥＧＳＨ）、及びヘルペスウイルスベースのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期的で安定的な組み込み、及び娘細胞におけるその増殖を可能にするため、長期的な遺伝子移入を達成するのに好適なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞を形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルスに由来するベクターよりも追加の利点を有する。これらはまた、低免疫原性という追加の利点も有する。一般に、及び実施形態では、好適なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択可能なマーカー（例えば、ＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；及び米国特許第６，３２６，１９３号）を含有する。
いくつかの実施形態では、骨格と、１つ以上のｍｉＲＮＡ及びＣＡＲをコードする核酸配列と、を含む、レンチウイルスベクターが提供される。任意選択的に、ベクターは、サイトカインをコードする核酸と、切頭ＨＥＲ１、ＣＤ２０ｔ－１又は全長ＣＤ２０などの細胞タグと、を更に含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ及びＣＡＲをコードする核酸は、レンチウイルス骨格成分を含むベクターにクローニングされる。例示的な骨格成分としては、ｐＦＵＧＷ、及びｐＳＭＰＵＷが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＦＵＧＷレンチウイルスベクター骨格は、自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクター骨格であり、不必要なＨＩＶ－１ウイルス配列が除去され、その結果、腫瘍形成、有害な変異、及び感染性粒子の再生の発達の可能性が低下する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ及びＣＡＲをコードするベクターはまた、単一の構築物中のサイトカインをコードする。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ及びＣＡＲ及びサイトカインは、２つの別個のレンチウイルスベクターにコードされている。いくつかの実施形態では、サイトカインは、細胞タグで発現される。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ及びＣＡＲは、単一のレンチウイルスベクターからのサイトカイン及び細胞タグと共発現させることができる。更なる実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ及びＣＡＲは、誘導性プロモーターの制御下にあり得る。別の実施形態では、サイトカインは、誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチリガンド誘導性プロモーターであり得る。いくつかの場合、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなどの小分子リガンド誘導性の２つのポリペプチドエクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチであり得る。
他の好適なベクターは、無作為に宿主細胞のＤＮＡに組み込むことができる発現ベクターを組み込むことを含むか、又は発現ベクターと宿主細胞の染色体との間の特異的な組換えを可能にする組換え部位を含むことができる。このような組み込み発現ベクターは、所望のタンパク質の発現をもたらすために、宿主細胞の染色体の内因性発現制御配列を利用することができる。部位特異的な様式で組み込むベクターの例としては、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）製のｆｌｐ－ｉｎ系の成分（例えば、ｐｃＤＮＡ（商標）５／ＦＲＴ）、又はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）製のｐＥｘｃｈａｎｇｅ－６コアベクターに見出すことができるものなどのｃｒｅ－ｌｏｘ系が挙げられる。宿主細胞染色体に無作為に組み込むベクターの例としては、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）製のｐｃＤＮＡ３．１（Ｔ－抗原の不在下で導入される場合）、及びＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）性のｐＣＩ又はｐＦＮ１０Ａ（ＡＣＴ）ＦＬＥＸＩ（商標）が挙げられる。追加のプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位の上流の領域３０～１１０ｂｐに位置するが、多くのプロモーターが、最近、開始部位の下流にも機能的エレメントを含有することが示されている。プロモーターエレメント間の間隔はしばしば柔軟性があり、その結果、エレメントが互いに対して反転又は移動するときに、プロモーター機能が保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が低下し始める前に、プロモーターエレメント間の間隔を５０ｂｐ離して増加させることができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、協調的又は独立してのいずれかで機能して、転写を活性化することができるように見える。
いくつかの実施形態では、細胞タグ遺伝子は、ＣＡＲ遺伝子と共にフレーム内のレンチウイルスプラスミド骨格にクローニングされる。他の実施形態では、細胞タグは、別個のレンチウイルスベクターにクローニングされる。
４．非ウイルスベクター及び送達系
ａ．Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系
本明細書に記載される、１つ以上のｍｉＲＮＡを単独でコードするポリヌクレオチド、又は１つ以上のｍｉＲＮＡ及びキメラ受容体、サイトカイン、並びに／又は細胞タグをコードするポリヌクレオチドは、脊椎動物の染色体内にＤＮＡ配列を導入するための合成ＤＮＡトランスポゾン系を指す、「Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾン系」などの非ウイルスベースの送達系を使用して、免疫エフェクター細胞内に導入され得る。例示的なＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系は、例えば、米国特許第６，４８９，４５８号及び同第８，２２７，４３２号に記載されている。本明細書で使用される場合、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼポリペプチド並びにその誘導体、機能的断片、及びバリアント、並びにＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンポリヌクレオチド、その誘導体、並びに機能的バリアント、及び断片を含み得る。特定の実施形態では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼは、ｍＲＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ＳＢ１０、ＳＢ１１、ＳＢ１００ｘ、又はＳＢ１１０トランスポザーゼをコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、キャップ及びポリＡ尾部を含む。
ＤＮＡトランスポゾンは、あるＤＮＡ部位から別のＤＮＡ部位に、単純なカットアンドペースト様式で転座する。転位は、定義されたＤＮＡセグメントが１つのＤＮＡ分子から切除され、同じ若しくは異なるＤＮＡ分子又はゲノム内の別の部位に移動する正確なプロセスである。他のＴｃ１／マリナー型トランスポザーゼと同様に、ＳＢトランスポザーゼは、レシピエントＤＮＡ配列中のＴＡジヌクレオチド塩基対にトランスポゾンを挿入する。挿入部位は、同じＤＮＡ分子内、又は別のＤＮＡ分子（又は染色体）内の他の場所にあり得る。ヒトを含む哺乳動物ゲノムには、約２億個のＴＡ部位がある。ＴＡ挿入部位は、トランスポゾン組み込みのプロセスで複製される。ＴＡ配列のこの重複は、転位の特徴であり、いくつかの実験でその機構を確認するために使用される。トランスポザーゼは、トランスポゾン内でコードされてもよく、又はトランスポザーゼは、別の供給源によって供給されてもよく、その場合、トランスポゾンは、非自律性エレメントになる。非自律性トランスポゾンは、挿入後に独立して切除及び再挿入を継続することができないため、遺伝子ツールとして最も有用である。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンは、脊椎動物のゲノムへの遺伝子導入及び遺伝子治療のための非ウイルスベクターとして使用されることが想定される。
簡潔に言えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ系（Ｈａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８：６７４－８３，（２０１０））を、免疫エフェクター細胞を遺伝的に修飾するように適合させた（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０５：１６２２－３１，（２００５））。一実施形態では、これは、２つの工程を伴う。（ｉ）Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンを発現するＤＮＡプラスミドの電気移動（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １８：８４９－５６，（２０１１）、Ｋｅｂｒｉａｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２３：４４４－５０，（２０１２））及びＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ、並びに（ｉｉ）Ｋ５６２細胞株（ＡａＰＣ（活性化及び増殖細胞）としても知られる、に由来するデザイナー人工抗原提示細胞（ＡａＰＣ）上で組み込み体を安定的に発現するＴ細胞の増殖及び拡大。別の実施形態では、第２の工程（ｉｉ）を排除し、遺伝子修飾されたＴ細胞を凍結保存するか、又は直ちに患者に注入する。
一実施形態では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系は、例えば、Ｈｕｄｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５２：４，３５５－３８０（２０１７），Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（８）：６８（２００８）．Ａｐｒｉｌ １５，２００８、及びＭａｉｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３６（２）：１１２－１２３（２０１３）に記載されている。
いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ、ＣＡＲ、サイトカイン、及び細胞タグは、単一のトランスポゾンＤＮＡプラスミドベクターによってコードされ得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ、ＣＡＲ、サイトカイン、及び細胞タグは、異なるトランスポゾンＤＮＡプラスミドベクターによってコードされ得る。更なる実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ及びＣＡＲは、誘導性プロモーターの制御下にあり得る。別の実施形態では、サイトカインは、誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチリガンド誘導性プロモーターであり得る。いくつかの場合、誘導性プロモーターは、以下に更に記載される、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなどの小分子リガンド誘導性の２つのポリペプチドエクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチであり得る。特定の実施形態では、ＣＡＲ、サイトカイン、及び細胞タグは、１つ、２つ以上のトランスポゾンに構成され得る。
いくつかの実施形態では、ＭＵＣ１６、ＣＤ３３、又はＲＯＲ１特異的ＣＡＲ及び他の遺伝子エレメントは、ＳＢ１１トランスポゾン系、ＳＢ１００Ｘトランスポゾン系、ＳＢ１１０トランスポゾン系、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系（例えば、米国特許第６，４８９，４５８号、同第８，２２７，４３２号、同第９，２２８，１８０号、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ，“ＰｉｇｇｙＢａｃ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １５：１３９－１４５（２００７）及びＷＯ２０１６／１４５１４６を参照されたい）、及び／又はｐｉｇｇｙＢａｔトランスポゾン系（例えば、Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｉｇｇｙＢａｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂａｔ Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ ｕｎｖｅｉｌｓ ａｎ ａｃｔｉｖｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＤＮＡ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ １１０：２３４－２３９（２０１３）を参照されたい、を使用して細胞に送達される。追加のトランスポザーゼ及びトランスポゾン系は、米国特許第７，１４８，２０３号、同第８，２２７，４３２号、米国特許公開第２０１１／０１１７０７２号、Ｍａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，４１（６）：７５３－６１（２００９）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ．３４３．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｍａｙ ３，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１８（９）：８４９－５６（２０１１）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２０１１．４０．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｍａｒ ３１、及びＩｖｉｃｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．９１（４）：５０１－１０，（１９９７）に提供される。
特定の実施形態では、ベクターは、左トランスポゾン反復領域及び右トランスポゾン反復領域を含むＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙプラスミドである。特定の実施形態では、左トランスポゾン反復領域は、配列番号５８０、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸を含む。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５８０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又は配列番号５８０の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。特定の実施形態では、右トランスポゾン反復領域は、配列番号５８１、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸を含む。特定の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号５８１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又は配列番号５８１の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
ｂ．リコンビナーゼベースの送達系
他の実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ、ＣＡＲ、サイトカイン、及び／又は細胞タグをコードする核酸は、リコンビナーゼ及び組み込み発現ベクターを介して免疫エフェクター細胞のＤＮＡに組み込むことができる。このようなベクターは、無作為に宿主細胞のＤＮＡに組み込むことができるか、又は発現ベクターと宿主細胞の染色体との間の特異的な組換えを可能にするために組換え部位を含むことができる。このような組み込み発現ベクターは、所望のタンパク質の発現をもたらすために、宿主細胞の染色体の内因性発現制御配列を利用することができる。いくつかの実施形態では、標的とされた組み込みは、組み込み部位に隣接する配列に相同であるドナーポリヌクレオチド上の配列の存在によって促進される。例えば、本明細書に記載されるドナーポリヌクレオチドを使用する標的とされた組み込みは、従来のトランスフェクション技術、例えば、相同組換えによって遺伝子ノックアウト又はノックインを作製するために使用される技術に従って達成され得る。他の実施形態では、標的とされた組み込みは、組み込み部位に隣接する配列に相同なドナーポリヌクレオチド上の配列の存在によって、及び部位特異的リコンビナーゼの存在下で細胞をドナーポリヌクレオチドと接触させることによって、両方とも促進される。部位特異的リコンビナーゼ、又は単にリコンビナーゼとは、その適合性組換え部位間の保存的部位特異的組換えを触媒するポリペプチドを意味する。本明細書で使用される場合、部位特異的リコンビナーゼは、活性を保持する天然ポリペプチド、並びに誘導体、バリアント及び／又は断片、並びに活性を保持するリコンビナーゼをコードする天然ポリヌクレオチド、誘導体、バリアント、及び／又は断片を含む。
リコンビナーゼは、標的化ベクターの導入前、導入と同時に、又は導入後に標的細胞に導入することができる。リコンビナーゼは、例えば、リポソーム、コーティングされた粒子、又はマイクロインジェクションを使用して、タンパク質として細胞に直接導入することができる。交互に、リコンビナーゼをコードするＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡのいずれかのポリヌクレオチドを、好適な発現ベクターを使用して細胞に導入することができる。上記の標的化ベクター成分は、目的のリコンビナーゼをコードする配列を含有する発現カセットの構築に有用である。しかしながら、リコンビナーゼの発現は、例えば、調節可能なプロモーター（すなわち、その発現が選択的に誘導又は抑制され得るプロモーター）の制御下にリコンビナーゼの発現を配置することによって、他の方式で調節され得る。
リコンビナーゼは、インテグラーゼ又はリゾルバーゼファミリーに由来し得る。リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーは、１００を超えるメンバーを有し、例えば、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、及びラムダインテグラーゼを含む。チロシンファミリー又はラムダインテグラーゼファミリーとも称されるインテグラーゼファミリーは、ＤＮＡのホスホジエステル結合に対する求核攻撃のために触媒チロシンのヒドロキシル基を使用する。典型的には、チロシンファミリーのメンバーは、最初にＤＮＡを切断し、その後に二本鎖切断を形成する。チロシンファミリーインテグラーゼの例としては、Ｃｒｅ、ＦＬＰ、ＳＳＶ１、及びラムダ（λ）インテグラーゼが挙げられる。セリンリコンビナーゼファミリーとしても知られるリゾルバーゼファミリーにおいて、保存されたセリン残基は、ＤＮＡ標的部位への共有結合を形成する（Ｇｒｉｎｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ １６：１６）。
一実施形態では、リコンビナーゼは、ＳＰβｃ２リコンビナーゼ、ＳＦ３７０．１リコンビナーゼ、Ｂｘｂ１リコンビナーゼ、Ａ１１８リコンビナーゼ、及びφＲｖ１リコンビナーゼからなる群から選択されるリコンビナーゼをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド配列である。セリンリコンビナーゼの例は、米国特許第９，０３４，６５２号に詳細に記載されている。
本発明の実施に使用するためのリコンビナーゼは、組換えで産生され得るか、又は前述のように精製され得る。所望のリコンビナーゼ活性を有するポリペプチドは、タンパク質硫酸アンモニウム沈殿、サイズ分画、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンアガロースアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｔｈｏｒｐｅ ＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：５５０５－５５１０，１９９８）を含むが、これらに限定されない精製の分野において既知の方法によって、所望の純度まで精製され得る。
一実施形態では、リコンビナーゼは、任意の好適な方法によって組換えが所望される組換え付着部位を含有する真核細胞に導入され得る。例えば、マイクロインジェクション又は他の方法によって、機能的タンパク質を細胞に導入する方法は、当該技術分野で周知である。精製リコンビナーゼタンパク質の導入は、多くの場合、好ましい実施形態である、タンパク質及びその機能の一過性の存在を確実にする。代替的に、リコンビナーゼをコードする遺伝子を、細胞を形質転換するために使用される発現ベクターに含めることができ、リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドは、真核細胞におけるポリヌクレオチドの発現を媒介するプロモーターに作動可能に連結される。リコンビナーゼポリペプチドは、リコンビナーゼポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡによって真核細胞に導入することもできる。一般に、リコンビナーゼは、修飾されているゲノムへの核酸断片の挿入に必要であるそのような時間のみの間、存在することが好ましい。したがって、ほとんどの発現ベクターと関連する永続性の欠如は、有害であると予測されない。目的の外因性ポリヌクレオチドの導入前、後、又は同時に、リコンビナーゼ遺伝子を細胞に導入することができる。一実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子は、挿入されるべきポリヌクレオチドを担持するベクター内に存在し、リコンビナーゼ遺伝子は、更にポリヌクレオチド内に含まれてもよい。
一実施形態では、部位特異的組換えのための方法は、第１の組換え部位及び第２の組換え部位を提供することと、第１の組換え部位及び第２の組換え部位を原核リコンビナーゼポリペプチドと接触させて、組換え部位間の組換えをもたらすことと、を含み、リコンビナーゼポリペプチドは、第１の組換え部位と第２の組換え部位との間の組換えを媒介することができ、第１の組換え部位は、ａｔｔＰ又はａｔｔＢであり、第２の組換え部位は、ａｔｔＢ又はａｔｔＰであり、リコンビナーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓファージリコンビナーゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓファージリコンビナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓファージリコンビナーゼ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓファージリコンビナーゼ、及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓファージリコンビナーゼからなる群から選択され、但し、第１の組換え付着部位がａｔｔＢである場合、第２の組換え付着部位はａｔｔＰであり、第１の組換え付着部位がａｔｔＰである場合、第２の組換え付着部位はａｔｔＢであることを条件とする
更なる実施形態は、ゲノムが修飾される細胞への部位特異的リコンビナーゼの導入を提供する。一実施形態は、真核細胞における部位特異的組換えを得るための方法に関し、その方法は、第１の組換え付着部位及び第２の組換え付着部位を含む真核細胞を提供することと、第１の組換え付着部位及び第２の組換え付着部位を原核リコンビナーゼポリペプチドと接触させて、組換え付着部位間の組換えをもたらすことと、を含み、リコンビナーゼポリペプチドは、第１の組換え付着部位と第２の組換え付着部位との間の組換えを媒介することができ、第１の組換え付着部位は、ファージゲノム組換え付着部位（ａｔｔＰ）又は細菌ゲノム組換え付着部位（ａｔｔＢ）であり、第２の組換え付着部位は、ａｔｔＢ又はａｔｔＰであり、リコンビナーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓファージリコンビナーゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓファージリコンビナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓファージリコンビナーゼ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓファージリコンビナーゼ、及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓファージリコンビナーゼからなる群から選択され、但し、第１の組換え付着部位がａｔｔＢである場合、第２の組換え付着部位はａｔｔＰであり、第１の組換え付着部位がａｔｔＰである場合、第２の組換え付着部位はａｔｔＢであることを条件とする。一実施形態では、リコンビナーゼは、Ａ１１８リコンビナーゼ、ＳＦ３７０．１リコンビナーゼ、ＳＰβｃ２リコンビナーゼ、φＲｖ１リコンビナーゼ、及びＢｘｂ１リコンビナーゼからなる群から選択される。一実施形態では、組換えは、組み込みをもたらす。
ｃ．他の非ウイルス送達系
他の実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ、ＣＡＲ、サイトカイン、及び／又は細胞タグをコードする核酸は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、又はジンクフィンガーヌクレアーゼを利用する遺伝子編集システムを介して、免疫エフェクター細胞のＤＮＡに組み込むことができる。
宿主細胞内に外因性核酸を導入するために使用される方法に関わらず、宿主細胞内の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。このようなアッセイには、例えば、サザン及びノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲなどの当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット）によって、又は本発明の範囲内に含まれるペプチド若しくはタンパク質若しくは核酸を同定するための本明細書に記載されるアッセイによって、特定のペプチドの存在又は不在を検出することなどの「生化学的」アッセイが含まれる。
ＩＸ．操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、操作されたＴ細胞受容体を含む。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞の表面上で対合してヘテロ二量体受容体を形成する２本の鎖（αβ又はγδ）から構成される。いくつかの例では、αβＴＣＲは、体内のほとんどのＴ細胞上で発現され、特定のＭＨＣ制限抗原の認識に関与することが知られている。各α及びβ鎖は、タンパク質を細胞膜に固定し、ＣＤ３シグナル伝達装置の不変サブユニットと会合する定常ドメイン（Ｃ）と、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される６つのループを介して抗原認識を付与する可変ドメイン（Ｖ）との２つのドメインから構成される。いくつかの例では、Ｖドメインの各々は、３つのＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を、超可変領域としてＣＤＲ３と共に含む。これらのＣＤＲは、主要組織適合性複合体（ｐｅｐＭＨＣ）（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、又はＨＬＡ－ＤＲＢ１複合体）によってコードされるタンパク質に結合した抗原ペプチド間で形成された複合体と相互作用する。いくつかの例では、定常ドメインは、定常ドメインを可変ドメインに接続する結合領域を更に含む。いくつかの場合、ベータ鎖は、結合領域の一部を構成する短い多様性領域を更に含む。
Ｔ細胞受容体α鎖は、定常（保存領域）、すなわち、Ｖａ２４－Ｊａ１８接合部（アミノ酸配列ＧＳＴＬＧＲ又はその保存的に置換されたアミノ酸配列）を含むが、α鎖及びβ鎖の両方は、非常に可変である。
いくつかの場合、そのようなＴＣＲは、特定の腫瘍抗原、例えば、ＮＹ－ＥＳＯ、Ｍａｇｅ Ａ３、Ｔｉｔｉｎ、ＭＡＲＴ－１、ＨＰＶ、ＨＢＶ、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ Ａ３／Ａ６、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ－Ａ１、又はＰＲＡＭＥに反応性である。他の場合、そのようなＴＣＲは、患者の腫瘍内で発現される特定の新生抗原（すなわち、腫瘍によって発現される患者特異的、体細胞性、非同義変異）に反応性である。いくつかの場合、操作されたＴＣＲは、親和性強化され得る。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）ＴＣＲ命名法、及びＴＣＲ配列のＩＭＧＴパブリックデータベースへのリンクを使用して記載される。例えば、いくつかの型のアルファ鎖可変（Ｖα）領域並びにそれらのフレームワーク、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列によって区別されるいくつかの型のベータ鎖可変（Ｖβ）領域が存在し得る。このように、Ｖα型は、独自のＴＲＡＶ番号によってＩＭＧＴ命名法で参照され得る。例えば、「ＴＲＡＶ２１」は、独自のフレームワーク並びにＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列を有するＴＣＲ Ｖα領域、並びにＴＣＲからＴＣＲまで保存されるが、ＴＣＲからＴＣＲまで変化するアミノ酸配列も含むアミノ酸配列によって部分的に定義されるＣＤＲ３配列を定義する。同様に、「ＴＲＢＶ５－１」は、独自のフレームワーク並びにＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列を有するが、部分的に定義されたＣＤＲ３配列のみを有するＴＣＲ Ｖβ領域を定義する。
いくつかの場合、ベータ鎖多様性領域は、略語ＴＲＢＤによってＩＭＧＴ命名法で参照される。
いくつかの例では、ＩＭＧＴ命名法によって定義される独自の配列は、ＴＣＲ分野で働く人々に広く知られており、アクセス可能である。例えば、それらは、ＩＭＧＴ公開データベース及び“Ｔ ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ”，（２００１）ＬｅＦｒａｎｃ ａｎｄ ＬｅＦｒａｎｃ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ ０－１２－４４１３５２－８に見出すことができる。
いくつかの実施形態では、αβヘテロ二量体ＴＣＲは、例えば、細胞質及び膜貫通ドメインの両方を有する完全長鎖としてトランスフェクトされる。いくつかの場合、ＴＣＲは、例えば、ＷＯ２００６／０００８３０に記載されるように、それぞれの定常ドメインの残基間に導入されたジスルフィド結合を含む。
いくつかの例では、本明細書に記載されるＴＣＲは、一本鎖フォーマットであり、例えば、ＷＯ２００４／０３３６８５を参照されたい。一本鎖フォーマットには、Ｖα－Ｌ－Ｖβ、Ｖβ－Ｌ－Ｖα、Ｖα－Ｃα－Ｌ－Ｖβ、Ｖα－Ｌ－Ｖβ－Ｃβ、Ｖα－Ｃα－Ｌ－Ｖβ－Ｃβ型のαβＴＣＲポリペプチドが含まれ、Ｖα及びＶβはそれぞれＴＣＲα及びβ可変領域であり、Ｃα及びＣβはそれぞれＴＣＲα及びβ定常領域であり、Ｌはリンカー配列である。特定の実施形態では、本発明の一本鎖ＴＣＲは、ＷＯ２００４／０３３６８５に記載されるように、それぞれの定常ドメインの残基間に導入されたジスルフィド結合を有し得る。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、αβＴＣＲであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、γδＴＣＲであり得る。本開示のＴＣＲは、本明細書に記載の抗原標的のうちのいずれかに結合することができることを理解されたい。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、Ｖδ１、Ｖδ２、及びＶδ１ｎｅｇＶδ２ｎｅｇＴＣＲサブセットのうちのいずれか１つであり得る。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、Ｖδ１、Ｖδ２、Ｖδ３、Ｖδ５、Ｖδ７、又はＶδ８ＴＣＲ鎖と、Ｖγ２、Ｖγ３、Ｖγ７、Ｖγ８、Ｖγ９、Ｖγ１０、又はＶγ１１ＴＣＲ鎖との任意の組み合わせを発現し得る。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、本質的に同一の遺伝物質を有し得る。一態様では、操作された細胞は、キメラ抗原受容体を含有しない場合がある。
本明細書に記載のＴＣＲは、検出可能な標識、治療剤又はＰＫ修飾部分と会合し得る。診断目的のための例示的な検出可能な標識としては、蛍光標識、放射性標識、酵素、核酸プローブ、及び造影試薬が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの場合、本明細書に開示されるＴＣＲの各鎖、例えば、αβ又はγδは、ＴＣＲ鎖の定常領域を膜貫通領域に接続する修飾スペーサー領域を含む。いくつかの場合、本明細書に開示されるＴＣＲの各鎖のスペーサー領域は、１）ストーク領域、及び当該ストーク領域に隣接する１つ以上のストーク伸長領域を含む。ストーク及びストーク伸長領域は、例えば、キメラ抗原受容体での使用について前述したものであってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＴＣＲの各鎖は、ストーク領域及び最大２０個のストーク伸長領域を含むスペーサーを組み込む。
いくつかの例では、ストーク領域は、ＴＣＲα若しくはＴＣＲβ鎖からの細胞外ヒンジ領域を含むか、又はストーク領域は、ＴＣＲα若しくはＴＣＲβ鎖からの細胞外ヒンジ領域と少なくとも８０％の相同性を有する配列を含む。代替の例では、ストーク領域は、それぞれ、ＴＣＲα又はＴＣＲβ定常領域の細胞外領域と少なくとも８０％の相同性を有する、ＴＣＲα又はＴＣＲβ定常領域の細胞外領域の任意の部分を含む。例えば、ストーク領域は、ＴＣＲα又はＴＣＲβ定常領域の細胞外領域の任意の部分に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％を超える相同性を有する配列を含み得る。
ＴＣＲ鎖ヘテロ二量体は、α及びβ鎖の細胞外ヒンジ領域における鎖間ジスルフィド結合によって形成される。いくつかの実施形態では、ストーク領域は、二量体化部位を含む。二量体化部位は、ジスルフィド結合形成部位を含み得る。二量体化部位は、システイン残基を含み得る。ストーク領域は、ジスルフィド結合を形成することを可能にし得る。このようなジスルフィド結合は、ジスルフィド結合形成部位又は二量体化部位で形成され得る。いくつかの例では、二量体化は、ＴＣＲのα鎖とβ鎖との間で生じる。
いくつかの実施形態では、ストーク伸長領域を使用して、ストーク領域を膜貫通領域ＴＣＲα及びβ鎖に連結する。特定の実施形態では、ストーク伸長領域を使用して、ストーク領域をＴＣＲα及びβ鎖の定常領域に連結する。特定の実施形態では、ストーク領域及びストーク伸長領域は、リンカーを介して接続され得る。
いくつかの例では、ストーク伸長ドメインは、ストーク領域に部分的に相同な配列を含む。いくつかの例では、ストーク伸長領域の各々は、ストーク伸長領域がストーク領域の二量体化部位を欠くことを除いて、ストーク領域に相同である配列を含む。いくつかの場合、ストーク伸長領域の各々は、ストーク領域と同一の配列を含む。他の場合、ストーク伸長領域の各々は、ストーク領域に対して少なくとも１つのアミノ酸残基置換を有するストーク領域と同一の配列を含む。いくつかの場合、ストーク伸長領域の各々は、ジスルフィド結合を形成することができないか、又は相同ストーク伸長領域と二量体化することができない。
他の実施形態では、１つのストーク伸長領域は、リンカーを介して別のストーク伸長領域に接続され得る。このようなリンカーの例としては、グリシン－セリンリッチリンカーを挙げることができる。
いくつかの実施形態では、ストーク伸長領域の付加は、遺伝子修飾されるＴ細胞によって発現される天然のＴＣＲα及びβ鎖とのトランスジェニックＴＣＲα及びβ鎖の誤対合を防止する。
いくつかの実施形態では、本開示の修飾された免疫エフェクター細胞は、本開示のＴＣＲ及び本開示のサイトカインを含み得る。特定の実施形態では、修飾された免疫エフェクター細胞は、ＴＣＲ並びにＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαを含む融合タンパク質、又はそのようなドメインの機能的断片若しくはバリアントを含む融合タンパク質を含み得る。
Ｘ．免疫チェックポイント阻害剤
いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、免疫チェックポイント阻害剤を含み得る。特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、免疫チェックポイント阻害剤を更にコードすることができる。特定の実施形態では、本開示の操作された細胞は、そのようなポリヌクレオチドを含み得る。
特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体又はその機能的断片若しくはバリアントであり得る。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、４－１ＢＢ、ＰＩＫ３ＩＰ１、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、又はＶＩＳＴＡなどの免疫チェックポイントタンパク質の活性を阻害することができる。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体であり得る。抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、イピリムマブ）は、進行性黒色腫を有する参加者において持続的な抗腫瘍活性及び生存期間の延長を示し、その結果、２０１１年に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の承認を得た。Ｈｏｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｗｉｔｈ ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．（２０１０）Ａｕｇ １９；３６３（８）：７１１－２３を参照されたい。いくつかの実施形態では、１つ以上のチェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、全長アテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１）、アベルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１）、デュルバルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１）、又はそれらの断片若しくはバリアントであり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のチェックポイント阻害剤は、ＣＤ２７阻害剤、ＣＤ２８阻害剤、ＣＤ４０阻害剤、ＣＤ１２２阻害剤、ＣＤ１３７阻害剤、ＯＸ４０（ＣＤ１３４としても知られる）阻害剤、ＧＩＴＲ阻害剤、ＩＣＯＳ阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上であり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のチェックポイント阻害剤は、Ａ２ＡＲ阻害剤、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６としても知られる）阻害剤、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１としても知られる）阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＫＩＲ阻害剤、ＬＡＧ３阻害剤、ＴＩＭ－３阻害剤、ＶＩＳＴＡ阻害剤、又はこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上であり得る。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗４－１ＢＢ抗体、又は抗ＯＸ－４０抗体である。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、抗ＴＩＧＩＴ抗体である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＢＭＳ９３５５５９（ＭＤＸ－１１０５）、アテキソリズマブ（ａｔｅｘｏｌｉｚｕｍａｂ）（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、及びアベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）からなる群から選択される抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ）及びトレメリムマブからなる群から選択される抗ＣＴＬＡ－４抗体である。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＢＭＳ－９８６０１６及びＬＡＧ５２５からなる群から選択される抗ＬＡＧ－３抗体である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ０５６２、及びＭＯＸＲ０９１６からなる群から選択される抗ＯＸ－４０抗体である。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＰＦ－０５０８２５６６からなる群から選択される抗４－１ＢＢ抗体である。
いくつかの実施形態では、操作された細胞は、ＰＤ１結合部分を含む免疫チェックポイント阻害剤を含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ１結合部分（本明細書では「抗ＰＤ－１」と称される）は、表８（以下）で特定される抗体、又はその機能的断片若しくはバリアントから選択される。
Figure 2024502479000015
Figure 2024502479000016
Figure 2024502479000017
Figure 2024502479000018
Figure 2024502479000019
ＸＩ．遺伝子スイッチ
本明細書に提供されるのは、遺伝子スイッチポリペプチド、リガンド誘導性遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにこれらのポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを組み込む方法及びシステムである。「遺伝子スイッチ」という用語は、プロモーターと関連する応答エレメントと、例えば、１つ以上のリガンドの存在下で、応答エレメント及びプロモーターが組み込まれる遺伝子の発現を調節する、エクジソン受容体（ＥｃＲ）ベースのシステムとの組み合わせを指す。緊密に調節された誘導性遺伝子発現系又は遺伝子スイッチは、遺伝子治療、細胞内のタンパク質の大規模な産生、細胞ベースのハイスループットスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクス、並びにトランスジェニック植物及び動物における形質の調節などの様々な用途に有用である。そのような誘導性遺伝子発現系は、リガンド誘導性異種遺伝子発現系を含むことができる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド又は追加のポリヌクレオチドは、異種遺伝子発現のリガンド誘導制御のための遺伝子スイッチ系のためのポリペプチドをコードし、遺伝子スイッチポリペプチドは、（ａ）第１の核受容体リガンド結合ドメインに融合したＤＮＡ結合ドメインを含む第１の遺伝子スイッチポリペプチド、及び（ｂ）第２の核受容体リガンド結合ドメインに融合したトランス活性化ドメインを含む第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、第１の遺伝子スイッチポリペプチド及び第２の遺伝子スイッチポリペプチドは、リンカーによって接続されている。
いくつかの実施形態では、遺伝子スイッチシステムは、（ａ）トランス活性化ドメインを含む第１の遺伝子スイッチポリペプチド、（ｂ）リガンド結合ドメインに融合したＤＮＡ結合ドメインを含む第２の遺伝子スイッチポリペプチド、及び（ｃ）少なくとも１つの異種ポリペプチドを含み、当該第１の遺伝子スイッチポリペプチド、当該第２の遺伝子スイッチポリペプチド、及び当該異種ポリペプチドのうちの１つが、リンカーによって、当該第１の遺伝子スイッチポリペプチド、当該第２の遺伝子スイッチポリペプチド、及び当該異種ポリペプチドのうちの別の１つに接続され、当該ポリペプチドリンカーが、切断可能なリンカー又はリボソームスキッピングリンカー配列を含む。
異種ポリペプチドは、例えば、本明細書に記載のキメラ受容体（例えば、ＣＡＲ）、細胞タグ、又はサイトカインであり得る。
特定の実施形態では、遺伝子スイッチ系は、ＷＯ２０１８／１３２４９４に記載されているタイプのものである。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＧＡＬ４（ＧＡＬ４ＤＢＤ）、ＬｅｘＡ ＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、細菌ＬａｃＺ ＤＢＤ、及び酵母ＤＢＤのうちの少なくとも１つを含む。他の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号６３８のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。いくつかの実施形態では、トランス活性化ドメインは、ＶＰ１６トランス活性化ドメイン及びＢ４２酸性活性化因子トランス活性化ドメインのうちの少なくとも１つを含む。他の場合、トランス活性化ドメインは、配列番号６３２に示されるアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。いくつかの実施形態では、第１の核受容体リガンド結合ドメイン及び第２の核受容体リガンド結合ドメインのうちの少なくとも１つは、エクジソン受容体（ＥｃＲ）、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ－１、ステロイドホルモン核受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用タンパク質－１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン様タンパク質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用タンパク質１４、及びファルネソル受容体、又はそれらの機能的断片若しくはバリアントのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、第１の核受容体リガンド結合ドメイン、第２の核受容体リガンド結合ドメイン、及びリガンド結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号６４０若しくは６４２のエクジソン受容体ポリペプチド配列、又はその機能的断片若しくはバリアントに由来する。いくつかの実施形態では、核受容体リガンド結合ドメインは、配列番号６３４又はその機能的断片若しくはバリアントのＲｘＲドメインである。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＧＡＬ４（ＧＡＬ４ ＤＢＤ）、ＬｅｘＡ ＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、細菌ＬａｃＺ ＤＢＤ、及び酵母ＤＢＤ、又はそれらの機能的断片若しくはバリアントのうちの少なくとも１つをコードする。他の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号６３９に示されるヌクレオチド配列、又はその機能的断片若しくはバリアントによってコードされる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＶＰ１６トランス活性化ドメイン及びＢ４２酸性活性化因子トランス活性化ドメインのうちの少なくとも１つをコードする。他の場合、トランス活性化ドメインは、配列番号６３３に示されるヌクレオチド配列、又はその機能的断片若しくはバリアントによってコードされる。いくつかの実施形態では、第１の核受容体リガンド結合ドメイン、第２の核受容体リガンド結合ドメイン、及びリガンド結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号６４１若しくは６４３、又はその機能的断片若しくはバリアントによってコードされる。いくつかの実施形態では、第１の核受容体リガンド結合ドメイン、第２の核受容体リガンド結合ドメイン、及びリガンド結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号６３５又はその機能的断片若しくはバリアントによってコードされる。
更に別の実施形態では、第１の遺伝子スイッチポリペプチドは、ＥｃＲ核受容体リガンド結合ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントに融合したＧＡＬ４ ＤＢＤ、又はその機能的断片若しくはバリアントを含み、第２の遺伝子スイッチポリペプチドは、レチノイド受容体Ｘ（ＲＸＲ）核受容体リガンド結合ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントに融合したＶＰ１６トランス活性化ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。いくつかの場合、第１の遺伝子スイッチポリペプチド及び第２の遺伝子スイッチポリペプチドは、２Ａ、ＧＳＧ－２Ａ、ＧＳＧリンカー（配列番号５３１）、ＳＧＳＧリンカー（配列番号５３３）、ｆｕｒｉｎｌｉｎｋバリアント及びそれらの誘導体からなる群から選択されるリンカーによって接続される。
いくつかの場合、第１の核受容体リガンド結合ドメイン及び第２の核受容体リガンド結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号６４０若しくは６４２に示されるアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントのうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子スイッチポリペプチドは、ＥｃＲ核受容体リガンド結合ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントに融合したＧＡＬ４ ＤＢＤ、又はその機能的断片若しくはバリアントを含み、第２の遺伝子スイッチポリペプチドは、レチノイド受容体Ｘ（ＲＸＲ）核受容体リガンド結合ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントに融合したＶＰ１６トランス活性化ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＥｃＲ核受容体リガンド結合ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントに融合したＧａｌ４ ＤＢＤ、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号６４４若しくは６４６に示されるアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含み、レチノイド受容体Ｘ（ＲＸＲ）核受容体リガンド結合ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントに融合したＶＰ１６トランス活性化ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号６３６に示されるアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。
いくつかの場合、第１の核受容体リガンド結合ドメイン及び第２の核受容体リガンド結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号６４１若しくは６４３に示されるアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントによってコードされる。いくつかの実施形態では、ＥｃＲ核受容体リガンド結合ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントに融合したＧａｌ４ ＤＢＤ、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号６４５若しくは６４７に示されるヌクレオチド配列、又はその機能的断片若しくはバリアントによってコードされ、レチノイド受容体Ｘ（ＲＸＲ）核受容体リガンド結合ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントに融合したＶＰ１６トランス活性化ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントは、配列番号６３７のヌクレオチド配列、又はその機能的断片若しくはバリアントによってコードされる。
前述の遺伝子スイッチ実施形態のいずれにおいても、リンカーは、切断可能なリンカー、リボソームスキッピングリンカー配列、又はＩＲＥＳリンカーであり得る。いくつかの場合、リンカーはＩＲＥＳリンカーであり、配列番号７０２若しくは７０３の配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む核酸によってコードされる。他の場合、リンカーは、切断可能なリンカー又はリボソームスキッピングリンカー配列である。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカー又はリボソームスキッピングリンカー配列は、２Ａリンカー、ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｆ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカー、ＧＳＧ－２Ａリンカー、ＧＳＧリンカー、ＳＧＳＧリンカー、ｆｕｒｉｎｌｉｎｋリンカーバリアント及びそれらの誘導体のうちの１つ以上を含む。他の実施形態では、切断可能なリンカー又は当該リボソームスキッピングリンカー配列は、配列番号５２７、５２９、５３１、５３３、５３５、５３７、５３９、５４１、５４３、５４５、５４７、５４９、５５１、５５３、５５５、５５７、及び５５９のうちのいずれか１つに示される配列を有するか、又は配列番号５２８、５３０、５３２、５３４、５３６、５３８、５４０、５４２、５４４、５４６、５４８、５５０、５５２、５５４、５５６、５５８、及び５６０のうちのいずれか１つに示される配列によってコードされる。
遺伝子スイッチ実施形態のいずれにおいても、本明細書に提供される組成物のうちのいずれかの第１の遺伝子スイッチポリペプチド、第２の遺伝子スイッチポリペプチド、抗原結合ポリペプチド、及び異種ポリペプチドのうちの少なくとも１つの発現は、プロモーターによって調節することができ、プロモーターは、組織特異的プロモーター、又はＥＦ１Ａプロモーター、又はその機能的断片若しくはバリアントである。いくつかの場合、プロモーターは、ＷＯ２０１８／１３２４９４の配列番号５８及び５９の配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。他の場合、プロモーターは、Ｔ細胞特異的応答エレメントを含む組織特異的プロモーターである。別の場合、組織特異的プロモーターは、１つ以上のＮＦＡＴ応答エレメントを含む。更に別の場合、ＮＦＡＴ応答エレメントは、ＷＯ２０１８／１３２４９４の配列番号５１～５７のうちのいずれか１つの配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを有する。
一実施形態では、少なくとも１つの異種ポリペプチドの発現は、誘導性プロモーターによって修飾される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、ＷＯ２０１８／１３２４９４の配列番号４０～６４のうちのいずれか１つの配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを有する。他の実施形態では、誘導性プロモーターは、第１の遺伝子スイッチポリペプチド及び第２の遺伝子スイッチポリペプチドのうちの少なくとも１つによって調節される。
前述のポリヌクレオチドのいずれも、本明細書に記載されるベクターに含まれ得ることを理解されたい。
また、本明細書では、エフェクター細胞における異種遺伝子の発現を調節する方法が提供され、その方法は、（ａ）本明細書に記載の第１及び第２の遺伝子スイッチポリペプチドのポリペプチド並びに異種ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドをエフェクター細胞に導入することと、（ｂ）エフェクター細胞を、異種ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を誘導するのに十分な量のリガンドと接触させることと、を含む。
特定の実施形態では、本明細書に提供されるエフェクター細胞における異種遺伝子の発現を調節する方法におけるリガンドは、（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，９Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１７－［（２Ｓ，３Ｒ）－３，６－ジヒドロキシ－６－メチルヘプタン－２－イル］－２，３，１４－トリヒドロキシ－１０，１３－ジメチル－２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７－デカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－６－オン；Ｎ’－（３，５－ジメチルベンゾイル）－Ｎ’－［（３Ｒ）－２，２－ジメチル－３－ヘキサニル］－２－エチル－３－メトキシベンゾヒドラジド；５－メチル－２，３－ジヒドロ－ベンゾ［１，４］ジオキシン－６－カルボン酸Ｎ’－（３，５－ジメチル－ベンゾイル）－Ｎ’－（１－エチル－２，２－ジメチル－プロピル））－ヒドラジド；５－メチル－２，３－ジヒドロ－ベンゾ［１，４］ジオキシン－６－カルボン酸Ｎ’－（３，５－ジメトキシ－４－メチル－ベンゾイル）－Ｎ’－（１－エチル－２，２）－ジメチル－プロピル）－ヒドラジド；５－メチル－２，３－ジヒドロ－ベンゾ［１，４］ジオキシン－６－カルボン酸Ｎ’－（１－ｔｅｒｔ－ブチル－ブチル）－Ｎ’－（３，５－ジメチル－ベンゾイル）－ヒドラジド；５－メチル－２，３－ジヒドロ－ベンゾ［１，４］ジオキシン－６－カルボン酸Ｎ’－（１－ｔｅｒｔ－ブチル－ブチル）－Ｎ’－（３，５－ジメトキシ－４－メチル－ベンゾイル）－ヒドラジド；５－エチル－２，３－ジヒドロ－ベンゾ［１，４］ジオキシン－６－カルボン酸Ｎ’－（３，５－ジメチル－ベンゾイル）－Ｎ’－（１－エチル－２，２－ジメチル－プロピル）－ヒドラジド；５－エチル－２，３－ジヒドロ－ベンゾ［１，４］ジオキシン－６－カルボン酸Ｎ’－（３，５－ジメトキシ－４－メチル－ベンゾイル）－Ｎ’－（１－エチル－２，２－ジメチル－プロピル）－ヒドラジド；５－エチル－２，３－ジヒドロ－ベンゾ［１，４］ジオキシン－６－カルボン酸Ｎ’－（１－ｔｅｒｔ－ブチル－ブチル）－Ｎ’－（３，５－ジメチル－ベンゾイル）－ヒドラジド；５－エチル－２，３－ジヒドロ－ベンゾ［１，４］ジオキシン－６－カルボン酸Ｎ’－（１－ｔｅｒｔ－ブチル－ブチル）－Ｎ’－（３，５－ジメトキシ－４－メチル－ベンゾイル）－ヒドラジド；３，５－ジメチル安息香酸Ｎ－（１－エチル－２，２－ジメチル－プロピル）－Ｎ’－（３－メトキシ－２－メチル－ベンゾイル）－ヒドラジド；３，５－ジメトキシ－４－メチル安息香酸Ｎ－（１－エチル－２，２－ジメチル－プロピル）－Ｎ’－（３－メトキシ－２－メチル－ベンゾイル）－ヒドラジド；３，５－ジメチル－安息香酸Ｎ－（１－ｔｅｒｔ－ブチル－ブチル）－Ｎ’－（３－メトキシ－２－メチル－ベンゾイル）－ヒドラジド；３，５－ジメトキシ－４－メチル安息香酸Ｎ－（１－ｔｅｒｔ－ブチル－ブチル）－Ｎ’－（３－メトキシ－２－メチル－ベンゾイル）－ヒドラジド；３，５－ジメチル－安息香酸Ｎ－（１－エチル－２，２－ジメチル－プロピル）－Ｎ’－（２－エチル－３－メトキシ－ベンゾイル）－ヒドラジド；３，５－ジメトキシ－４－メチル－安息香酸Ｎ－（１－エチル－２，２－ジメチル－プロピル）－Ｎ’－（２－エチル－３－メトキシ－ベンゾイル）－ヒドラジド；３，５－ジメチル－安息香酸Ｎ－（１－ｔｅｒｔ－ブチル－ブチル）－Ｎ’－（２－エチル－３－メトキシ－ベンゾイル）－ヒドラジド；３，５－ジメトキシ－４－メチル－安息香酸Ｎ－（１－ｔｅｒｔ－ブチル－ブチル）－Ｎ’－（２－エチル－３－メトキシ－ベンゾイル）－ヒドラジド；２－メトキシ－ニコチン酸Ｎ－（１－ｔｅｒｔ－ブチル－ペンチル）－Ｎ’－（４－エチル－ベンゾイル）－ヒドラジド；３，５－ジメチル－安息香酸Ｎ－（２，２－ジメチル－１－フェニル－プロピル）－Ｎ’－（４－エチル－ベンゾイル）－ヒドラジド；３，５－ジメチル－安息香酸Ｎ－（１－ｔｅｒｔ－ブチル－ペンチル）－Ｎ’－（３－メトキシ－２－メチル－ベンゾイル）－ヒドラジド；及び３，５－ジメトキシ－４－メチル－安息香酸Ｎ－（１－ｔｅｒｔ－ブチル－ペンチル）－Ｎ’－（３－メトキシ－２－メチル－ベンゾイル）－ヒドラジドのうちの少なくとも１つを含む。
いくつかの場合、本明細書に提供されるエフェクター細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、リガンドの存在下での発現と比較して、リガンドの不在下で減少又は排除される。特定の場合、当該異種ポリペプチドの発現は、追加の量のリガンドを提供することによって復元される。
いくつかの実施形態では、遺伝子スイッチ系の１つ以上の発現カセットは、以下のうちの１つ以上を更に含む：（ａ）１つ以上のリコンビナーゼ付着部位、及び（ｂ）セリンリコンビナーゼをコードする配列。他の実施形態では、１つ以上の発現カセットは、以下のうちの１つ以上を更に含む：（ａ）非誘導性プロモーター、及び（ｂ）誘導性プロモーター。
いくつかの実施形態では、第１及び第２の遺伝子スイッチポリペプチドのうちの１つは、リンカーによって異種ポリペプチドに接続されてもよい。
いくつかの実施形態では、第１及び第２の遺伝子スイッチポリペプチドは、ＩＲＥＳリンカーであるポリペプチドリンカーによって接続される。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、第２の異種ポリペプチドをコードする第２の遺伝子を更に含むことができる。
いくつかの実施形態では、提供される遺伝子スイッチ系は、宿主細胞内の異種遺伝子を組み込むためのものであり、セリンリコンビナーゼ及び１つ以上のリコンビナーゼ付着部位の存在下で１つ以上の発現カセットと宿主細胞を接触させると、異種遺伝子は宿主細胞内に組み込まれる。特定の実施形態では、遺伝子スイッチ系は、リガンドを更に含み、異種遺伝子は、リガンドによる宿主細胞の接触時に宿主細胞内で発現される。特定の実施形態では、１つ以上のリコンビナーゼ付着部位は、ファージゲノム組換え付着部位（ａｔｔＰ）又は細菌ゲノム組換え付着部位（ａｔｔＢ）を含むことができる。いくつかの場合、セリンリコンビナーゼは、ＳＦ３７０であり得る。
いくつかの場合、発現カセットは、ＷＯ２０１８／１３２４９４の配列番号１３１～１２６のうちのいずれか１つの配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを有する。
特定の実施形態では、遺伝子スイッチ系の誘導性プロモーターは、トランス活性化ドメインによって活性化され得る。遺伝子スイッチ系は、単一のベクター又は複数のベクターに含まれ得ることを理解されたい。
ＥｃＲベースの遺伝子スイッチの初期の型は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＥｃＲ（ＤｍＥｃＲ）及びＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＲＸＲ（ＭｍＲＸＲ）ポリペプチドを使用し、ステロイド、ポナステロンＡの存在下でこれらの受容体が、哺乳動物細胞株及びトランスジェニックマウスにおいてレポーター遺伝子をトランス活性化することを示した（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２、Ｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。後に、Ｓｕｈｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８は、非ステロイド性エクジソンアゴニスト、テブフェノジドが、外因性ヘテロ二量体パートナーの不在下で、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＥｃＲ（ＢｍＥｃＲ）を介して、哺乳動物細胞においてレポーター遺伝子の高レベルのトランス活性化を誘導したことを示した。
国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０号（ＷＯ９７／３８１１７）及びＰＣＴ／ＵＳ９９／０８３８１（ＷＯ９９／５８１５５）は、外因性遺伝子及びエクジソン応答エレメントを含むＤＮＡ構築物が、そのためのリガンドの存在下で、及び任意選択的に、サイレントパートナーとして機能することができる受容体の存在下で、エクジソン応答エレメントに結合して遺伝子発現を誘導するエクジソン受容体を含む第２のＤＮＡ構築物によって活性化される、外因性遺伝子の発現を調節するための方法を開示している。この例では、エクジソン受容体を、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから単離した。典型的には、このような系は、最適な活性化を提供するために、サイレントパートナー、好ましくはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の存在を必要とする。哺乳動物細胞において、昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）は、哺乳動物レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とヘテロ二量体化することが可能であり、それによって、リガンド依存的な様式で標的遺伝子又は異種遺伝子の発現を調節するために使用される。国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５号（ＷＯ９９／０２６８３）は、カイコＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉから単離されたエクジソン受容体が、外因性二量体パートナーを必要とせずに哺乳動物系において機能的であることを開示している。
米国特許第６，２６５，１７３号は、受容体のステロイド／甲状腺スーパーファミリーの様々なメンバーが、遺伝子発現系で使用するために少なくともＵＳＰの二量体化ドメインを含むＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒウルトラスピラクル受容体（ＵＳＰ）又はその断片と組み合わせることができることを開示している。米国特許第５，８８０，３３３号は、トランス活性化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインが２つの異なるハイブリッドタンパク質上に配置されている植物で使用されるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＥｃＲ及びウルトラスピラクル（ＵＳＰ）ヘテロ二量体系を開示している。これらの場合の各々において、トランス活性化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメイン（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５号のように天然のＥｃＲとして、又は国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０号のように修飾されたＥｃＲとしてのいずれか）を単一の分子に組み込み、ＵＳＰ又はＲＸＲのいずれかの他のヘテロ二量体パートナーをそれらの天然の状態で使用した。
国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９０５号は、トランス活性化及びＤＮＡ結合ドメインを２つの異なるタンパク質上に配置することによって互いから分離させることにより、リガンドの不在下でのバックグラウンド活性が大幅に低下し、リガンドの存在下でのバックグラウンド活性が有意に増加する、エクジソン受容体に基づく誘導性遺伝子発現系を開示している。この２つのハイブリッド系は、出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０及びＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５に開示されている２つの系と比較して、有意に改善された誘導性遺伝子発現調節系である。２つのハイブリッド系は、ＤＮＡ結合ドメインが遺伝子上のＤＮＡ結合部位に結合するとき、トランス活性化ドメインがプロモーターをより効果的に活性化するように、一対の相互作用タンパク質の能力を利用して、転写活性化ドメインをＤＮＡ結合ドメインに対してより好ましい位置にもたらすと考えられる（例えば、米国特許第５，２８３，１７３号を参照されたい）。２つのハイブリッド遺伝子発現系は、２つの遺伝子発現カセットを含み、第１のカセットは、核受容体ポリペプチドに融合したＤＮＡ結合ドメインをコードし、第２のカセットは、異なる核受容体ポリペプチドに融合したトランス活性化ドメインをコードする。リガンドの存在下では、抗体とＴＧＦ－βサイトカイントラップとの相互作用を促進し、それによってＤＮＡ結合ドメイン及びトランス活性化ドメインの二量体化をもたらすコンフォメーション変化が誘導されると考えられる。ＤＮＡ結合及びトランス活性化ドメインは２つの異なる分子上に存在するため、リガンドの不在下でのバックグラウンド活性は大幅に低下する。
２つのハイブリッド系の特定の修飾はまた、ステロイドリガンド、例えば、ポナステロンＡ（「ＰｏｎＡ」）又はムリステロンＡ（「ＭｕｒＡ」）と比較した場合、非ステロイドリガンド、例えば、ジアシルヒドラジンに対する改善された感受性を提供することができる。すなわち、ステロイドと比較した場合、非ステロイド性リガンドは、より低いリガンド濃度でより高い遺伝子転写活性を提供した。更に、２つのハイブリッド系は、未修飾のＲＸＲがスイッチングパートナーとして使用されるときに発生する可能性のあるＲＸＲの過剰発現によるいくらかの副作用を回避する。好ましい２つのハイブリッド系では、ＥｃＲ又はＲＸＲの天然ＤＮＡ結合及びトランス活性化ドメインが排除され、結果として、これらのハイブリッド分子は、細胞内に存在する他のステロイドホルモン受容体と相互作用する可能性が低く、それによって副作用が低減される。
エクジソン受容体（ＥｃＲ）は、核受容体スーパーファミリーのメンバーであり、サブファミリー１のグループＨ（本明細書では「グループＨ核受容体」と称される）に分類される。各グループのメンバーは、Ｅ（リガンド結合）ドメインにおいて４０～６０％のアミノ酸同一性を共有する（Ｌａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ，１９９９；Ｃｅｌｌ ９７：１６１－１６３）。エクジソン受容体に加えて、この核受容体サブファミリー１、グループＨの他のメンバーには、ユビキタス受容体（ＵＲ）、オーファン受容体１（ＯＲ－１）、ステロイドホルモン核受容体１（ＮＥＲ－１）、ＲＸＲ相互作用タンパク質－１５（ＲＩＰ－１５）、肝臓ｘ受容体β（ＬＸＲβ）、ステロイドホルモン受容体様タンパク質（ＲＬＤ－１）、肝臓ｘ受容体（ＬＸＲ）、肝臓ｘ受容体α（ＬＸＲα）、ファルネソイドｘ受容体（ＦＸＲ）、受容体相互作用タンパク質１４（ＲＩＰ－１４）、及びファルネソル受容体（ＨＲＲ－１）が含まれる。
いくつかの場合、誘導性プロモーター（「ＩＰ」）は、Ｉｎｔｒｅｘｏｎ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなどの小分子リガンド誘導性の２つのポリペプチドエクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチであり得る。いくつかの場合、遺伝子スイッチは、以下に記載されている系のうちのいずれかに記載されているエクジソンベースの受容体成分から選択され得るが、これらに限定されない。ＰＣＴ／ＵＳ２００１／００９０５０（ＷＯ２００１／０７０８１６）；米国特許第７，０９１，０３８号；同第７，７７６，５８７号；同第７，８０７，４１７号；同第８，２０２，７１８号；ＰＣＴ／ＵＳ２００１／０３０６０８（ＷＯ２００２／０２９０７５）；米国特許第８，１０５，８２５号；同第８，１６８，４２６号；ＰＣＴ／ＵＳ５２００２／００５２３５（ＷＯ２００２／０６６６１３）；米国出願第１０／４６８，２００号（米国公開第２０１２／０１６７２３９号）；ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５７０６（ＷＯ２００２／０６６６１４）；米国特許第７，５３１，３２６号；同第８，２３６，５５６号；同第８，５９８，４０９号；ＰＣＴ／Ｕ５２００２／００５０９０（ＷＯ２００２／０６６６１２）；米国特許第８，７１５，９５９号（米国公開第２００６／０１００４１６号）；ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５２３４（ＷＯ２００３／０２７２６６）；米国特許第７，６０１，５０８号；同第７，８２９，６７６号；同第７，９１９，２６９号；同第８，０３０，０６７号；ＰＣＴ／Ｕ５２００２／００５７０８（ＷＯ２００２／０６６６１５）；米国出願第１０／４６８，１９２号（米国公開第２０１１／０２１２５２８号）；ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５０２６（ＷＯ２００３／０２７２８９）；米国特許第７，５６３，８７９号；同第８，０２１，８７８号；同第８，４９７，０９３号；ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１５０８９（ＷＯ２００５／１０８６１７）；米国特許第７，９３５，５１０号；同第８，０７６，４５４号；ＰＣＴ／Ｕ５２００８／０１１２７０（ＷＯ２００９／０４５３７０）；米国出願第１２／２４１，０１８号（米国公開第２００９／０１３６４６５号）；ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１５６３（ＷＯ２００９／０４８５６０）；米国出願第１２／２４７，７３８号（米国公開第２００９／０１２３４４１号）；ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００５５１０（ＷＯ２０１０／０４２１８９）；米国出願第１３／１２３，１２９号（米国公開第２０１１／０２６８７６６号）；ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２９６８２（ＷＯ２０１１／１１９７７３）；米国出願第１３／６３６，４７３号（米国公開第２０１３／０１９５８００号）；ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２７５１５（ＷＯ２０１２／１２２０２５）；ＷＯ２０１８／１３２４９４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１３１９６）；及び米国特許第９，４０２，９１９号。
本明細書で使用される場合、「リガンド」という用語は、リガンド活性化エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチに適用される場合、遺伝子発現を刺激するために遺伝子スイッチを活性化する能力を有する（すなわち、その中で、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）及び／又はポリペプチドのリガンド誘導性発現を提供する）様々な溶解度の小分子（ジアシルヒドラジン化合物など）である。そのようなリガンドの例としては、ＷＯ２００４／０７２２５４（ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００３７７５）；ＷＯ２００４／００５４７８（ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２１１４９）；ＷＯ２００５／０１７１２６（ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００５１４９）；ＷＯ２００４／０７８９２４（ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００５９１２）；ＷＯ２００８／１５３８０１（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６７５７）；ＷＯ２００９／１１４２０１（ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００１６３９）；ＷＯ２０１３／０３６７５８（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５４１４１）；ＷＯ２０１４／１４４３８０（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２８７６８）；及びＷＯ２０１６／０４４３９０（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５０３７５）に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
また、リガンドの例としては、限定するものではないが、エクジステロイド、例えば、エクジソン、２０－ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ、ムリステロンＡなど、９－シス－レチノイン酸、レチノイン酸の合成類似体、Ｎ，Ｎ’－ジアシルヒドラジン、例えば、米国特許第６，２５８，６０３号、同第６，０１３，８３６号、同第５，１１７，０５７号、同第５，５３０，０２８号、同第５，３７８，７２６号、同第７，３０４，１６１号、同第７，８５１，２２０号、同第８，７４８，１２５号、同第９，２７２，９８６号、同第７，４５６，３１５号、同第７，５６３，９２８号、同第８，５２４，９４８号、同第９，１０２，６４８号、同第９，１６９，２１０号、同第９，２５５，２７３号及び同第９，３５９，２８９号に開示されているもの、米国特許第８，６６９，０７２号及び同第８，８９５，３０６号に記載されているオキサジアゾリン；欧州出願第２，４６１，８０９号に開示されているものなどのジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン；米国特許第５，２２５，４４３号に開示されているものなどのＮ－アルキル－Ｎ，Ｎ’－ジアロイルヒドラジン；欧州出願第２３４，９９４号に開示されているものなどのＮ－アシル－Ｎ－アルキルカルボニルヒドラジン；米国特許第４，９８５，４６１号に記載されているものなどのＮ－アロイル－Ｎ－アルキル－Ｎ’－アロイルヒドラジン；米国特許第７，３７５，０９３号、同第８，１２９，３５５号及び同第９，８０２，９３６号に記載されているものなどのアミドケトン；並びに３，５－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－４－ヒドロキシ－Ｎ－イソブチル－ベンズアミド、８－Ｏ－アセチルハルパギド、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５－エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５－アルファ－６－アルファ－エポキシコレステロール－３－硫酸塩（ＥＣＨＳ）、７－ケトコレステロール－３－硫酸塩、ファメゾール、胆汁酸、１，１－ビホスホネートエステル、幼若ホルモンＩＩＩなどを含む他の同様の物質が挙げられる。本発明で有用なジアシルヒドラジンリガンドの例としては、ＲＧ－１１５８１９（３，５－ジメチル－安息香酸Ｎ－（１－エチル－２，２－ジメチル－プロピル）－Ｎ’－（２－メチル－３－メトキシベンゾイル）－ヒドラジド）、ＲＧ－１１５９３２（（Ｒ）－３，５－ジメチル－安息香酸Ｎ－（１－ｔｅｒｔ－ブチル）Ｎ’－（２－エチル－３－メトキシ－ベンゾイル）－ヒドラジド）、及びＲＧ－１１５８３０（３，５－ジメチル－安息香酸Ｎ－（１－ｔｅｒｔ－ブチル－ブチル）－Ｎ’－（２－エチル－３－メトキシ－ベンゾイル）－ヒドラジド）が挙げられる。例えば、ＷＯ２００８／１５３８０１（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６７５７）、及びＷＯ２０１３／０３６７５８（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５４１４１）を参照されたい。
例えば、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチのためのリガンドは、任意の好適なリガンドから選択されてもよい。天然に存在するエクジソン又はエクジソン類似体（例えば、２０－ヒドロキシエクジソン、ムリステロンＡ、ポナステロンＡ、ポナステロンＢ、ポナステロンＣ、２６－ヨードポナステロンＡ、イノコステロン又は２６－メシルイノコステロン）及び非ステロイド誘導剤の両方が、本発明の遺伝子スイッチのためのリガンドとして使用され得る。米国特許第６，３７９，９４５号は、ステロイド及び特定の非ステロイド誘導剤の両方に応答する遺伝子スイッチとして機能することができる、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ（「ＨＥｃＲ」）から単離された昆虫ステロイド受容体を記載している。非ステロイド性誘発剤は、ステロイド性及び非ステロイド性誘導剤の両方に対して応答性であるこの系及び多くの他の系において、例えば、製造コストの低さ、代謝的安定性、昆虫、植物、又は哺乳動物に存在しないこと、及び環境的容認性を含むいくつかの理由から、ステロイドに対して明確な長所を有する。米国特許第６，３７９，９４５号は、エクジソンベースの遺伝子スイッチのためのリガンドとして、２つのジベンゾイルヒドラジン、１，２－ジベンゾイル－１－ｔｅｒｔ－ブチル－ヒドラジン及びテブフェノジド（Ｎ－（４－エチルベンゾイル）－Ｎ’－（３，５－ジメチルベンゾイル）－Ｎ’－ｔｅｒｔ－ブチル－ヒドラジン）の有用性を記載している。また、米国特許第５，１１７，０５７号において開示されているものなどの他のジベンゾイルヒドラジンも本発明においてリガンドとして含まれる。テブフェノジドを、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのエクジソン受容体に関する化学リガンドとして使用することもまた、米国特許第６，１４７，２８２号において開示されている。エクジソンリガンドの追加の非制限的な例は、３，５－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－４－ヒドロキシ－Ｎ－イソブチル－ベンズアミド、８－Ｏ－アセチルハルパジド、１，２－ジアシルヒドラジン、Ｎ’－置換－Ｎ，Ｎ’－ジ置換ヒドラジン、ジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン、Ｎ－置換－Ｎ－アルキル－Ｎ，Ｎ－ジアロイルヒドラジン、Ｎ－置換－Ｎ－アシル－Ｎ－アルキル、カルボニルヒドラジン、又はＮ－アロイル－Ｎ’－アルキルＮ’－アロイルヒドラジンである。（米国特許第６，７２３，５３１号を参照されたい）。
一実施形態では、エクジソンベースの遺伝子スイッチ系のためのリガンドは、ジアシルヒドラジンリガンド又はキラルジアシルヒドラジンリガンドである。遺伝子スイッチ系で使用されるリガンドは、式Ｉの化合物


（式中、Ａは、アルコキシ、アリールアルキルオキシ又はアリールオキシであり、Ｂは、任意選択的に置換されたアリール又は任意選択的に置換されたヘテロアリールであり、Ｒ１及びＲ２は、独立して、任意選択的に置換されたアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、任意選択的に置換されたシクロアルキル、任意選択的に置換されたアルケニル、任意選択的に置換されたアルキニル、任意選択的に置換されたヘテロシクロ、任意選択的に置換されたアリール又は任意選択的に置換されたヘテロアリールである）、又はその薬学的に許容される塩、水和物、結晶形態若しくは非晶質形態であり得る。
別の実施形態では、リガンドは、式ＩＩの鏡像異性体濃縮化合物

（式中、Ａは、アルコキシ、アリールアルキルオキシ、アリールオキシ、アリールアルキル、任意選択的に置換されたアリール又は任意選択的に置換されたヘテロアリールであり、Ｂは、任意選択的に置換されたアリール又は任意選択的に置換されたヘテロアリールであり、Ｒ１及びＲ２は、独立して、任意選択的に置換されたアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、任意選択的に置換されたシクロアルキル、任意選択的に置換されたアルケニル、任意選択的に置換されたアルキニル、任意選択的に置換されたヘテロシクロ、任意選択的に置換されたアリール又は任意選択的に置換されたヘテロアリールであり、但し、Ｒ１がＲ２に等しくないことを条件とし、Ｒ１及びＲ２を有する不斉炭素原子における絶対立体配置は、主にＳである）、又はその薬学的に許容される塩、水和物、結晶形態若しくは非晶形態であり得る。
特定の実施形態では、リガンドは、式ＩＩＩの鏡像異性体濃縮化合物

（式中、Ａは、アルコキシ、アリールアルキルオキシ、アリールオキシ、アリールアルキル、任意選択的に置換されたアリール又は任意選択的に置換されたヘテロアリールであり、Ｂは、任意選択的に置換されたアリール又は任意選択的に置換されたヘテロアリールであり、Ｒ１及びＲ２は、独立して、任意選択的に置換されたアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、任意選択的に置換されたシクロアルキル、任意選択的に置換されたアルケニル、任意選択的に置換されたアルキニル、任意選択的に置換されたヘテロシクロ、任意選択的に置換されたアリール又は任意選択的に置換されたヘテロアリールであり、但し、Ｒ１がＲ２に等しくないことを条件とし、Ｒ１及びＲ２を有する不斉炭素原子における絶対立体配置は、主にＲである）、又はその薬学的に許容される塩、水和物、結晶形態若しくは非晶形態であり得る。
一実施形態では、リガンドは、少なくとも９５％の鏡像異性過剰を有する（Ｒ）－３，５－ジメチル－安息香酸Ｎ－（１－ｔｅｒｔブチル－ブチル）－Ｎ’－（２－エチル－３－メトキシ－ベンゾイル）－ヒドラジド、又はその薬学的に許容される塩、水和物、結晶形態若しくは非晶形態であり得る。
式Ｉのジアシルヒドラジンリガンド及び式ＩＩ又はＩＩＩのキラルジアシルヒドラジンリガンドは、エクジソンベースの遺伝子スイッチ系と共に使用される場合、本発明の治療用ポリペプチド又は治療用ポリヌクレオチドの発現の外部時間的調節のための手段を提供する。米国特許第８，０７６，５１７号、同第８，８８４，０６０号及び同第９，５９８，３５５号を参照されたい。
本発明で使用されるリガンドは、塩を形成し得る。本明細書で使用される場合、「塩」という用語は、無機及び／又は有機の酸及び塩基と共に形成される酸性及び／又は塩基性の塩を示す。加えて、式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩの化合物が塩基性部分及び酸性部分の両方を含有する場合、両性イオン（「内塩」）が形成され得、本明細書で使用される場合、「塩」という用語内に含まれる。薬学的に許容される（すなわち、非毒性、生理学的に許容される）塩が使用されるが、他の塩も、例えば、調製中に利用され得る単離又は精製工程において有用である。式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩの化合物の塩は、例えば、化合物を、その中で塩が沈殿する媒体又はその後に凍結乾燥を行う水性媒体などの媒体において等量などの酸又は塩基の量と反応させることによって形成され得る。
塩基性部分を含有するリガンドは、様々な有機及び無機酸と塩を形成し得る。例示的な酸付加塩としては、酢酸塩（酢酸又はトリハロ酢酸、例えば、トリフルオロ酢酸によって形成された塩など）、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、カンフル酸塩、カンフルスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩（塩酸によって形成される）、臭化水素酸塩（臭化水素によって形成される）、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩（マレイン酸によって形成される）、メタンスルホン酸塩（メタンスルホン酸によって形成される）、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩（硫酸によって形成された塩など）、スルホン酸塩（本明細書において言及された塩など）、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシレートなどのトルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩などが挙げられる。
酸性部分を含有するリガンドは、様々な有機及び無機塩基と塩を形成し得る。例示的な塩基性塩としては、アンモニウム塩、ナトリウム、リチウム、及びカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム及びマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ベンザチン、ジシクロヘキシルアミン、ヒドラバミン（Ｎ，Ｎ－ビス（デヒドロアビエチル）エチレンジアミンによって形成される）、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミド、ｔ－ブチルアミンなどの有機塩基（例えば、有機アミン）との塩、並びにアルギニン、リジンなどのアミノ酸との塩が挙げられる。
また、誘導性遺伝子発現系についてのリガンドの非限定的な例としては、ＦＫ５０６結合ドメインを利用するものも挙げられ、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡ、又はラパマイシンである。ＦＫ５０６、ラパマイシン、及びそれらの類似体は、米国特許第６，６４９，５９５号、同第６，１８７，７５７号、同第７，２７６，４９８号及び同第７，２７３，８７４号に開示されている。
いくつかの実施形態では、誘導性遺伝子発現についてのジアシルヒドラジンリガンドは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は１２０ｍｇの単位１日用量で投与される。いくつかの実施形態では、ジアシルヒドラジンリガンドは、約５ｍｇの単位１日用量で投与される。いくつかの実施形態では、ジアシルヒドラジンリガンドは、約１０ｍｇの単位１日用量で投与される。いくつかの実施形態では、ジアシルヒドラジンリガンドは、約１５ｍｇの単位１日用量で投与される。いくつかの実施形態では、ジアシルヒドラジンリガンドは、約２０ｍｇの単位１日用量で毎日投与される。
いくつかの実施形態では、サイトカイン、細胞タグ及び／又はＣＡＲは、遺伝子転写のための誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチリガンド誘導性プロモーターであり得る。いくつかの場合、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなどの小分子リガンド誘導性の２つのポリペプチドエクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチであり得る。いくつかの場合、使用される遺伝子スイッチ系は、ＷＯ２０１８／１３２４９４に記載されているものであってもよい。
いくつかの実施形態では、上記サイトカインは、遺伝子転写のための誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチリガンド誘導性プロモーターであり得る。いくつかの場合、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなどの小分子リガンド誘導性の２つのポリペプチドエクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチであり得る。いくつかの場合、使用される遺伝子スイッチ系は、ＷＯ２０１８／１３２４９４に記載されているものであってもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾された免疫エフェクター細胞は、遺伝子転写のための誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチリガンド誘導性プロモーターであり得る。いくつかの場合、誘導性プロモーターは、ＷＯ２０１８／１３２４９４に記載されるようなＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなどの小分子リガンド誘導性の２つのポリペプチドエクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチであり得る。
ＸＩＩ．修飾された免疫エフェクター細胞
本明細書に提供するのは、本明細書に記載するように、１つ以上のｍｉＲＮＡ、ＣＡＲ、サイトカイン、及び／又は細胞タグを発現する修飾された免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、修飾された免疫エフェクター細胞は、修飾されたＴ細胞及び／又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。Ｔ細胞又はＴリンパ球は、細胞媒介性免疫に関与する白血球のサブタイプである。例示的なＴ細胞としては、Ｔヘルパー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ＴＨ１７細胞、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、調節性Ｔ細胞、又はナチュラルキラーＴ細胞が挙げられる。特定の態様では、本明細書に記載される実施形態は、修飾された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞）を作製及び／又は拡張することを含む。このようなものは、本明細書に記載されるように、１つ以上のｍｉＲＮＡ、ＣＡＲ、サイトカイン、及び／又は細胞タグをコードするＤＮＡ（又はＲＮＡ）構築物を含有する発現ベクターで細胞をトランスフェクトすることによって達成することができる。本開示の細胞は、ヒト細胞又は動物細胞であり得ることを理解されたい。
Ｔヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞の形質細胞及びメモリーＢ細胞への成熟、並びに細胞傷害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化を含む、免疫学的プロセスにおいて他の白血球を支援する。いくつかの例では、ＴＨ細胞は、細胞表面上のＣＤ４糖タンパク質の発現に起因して、ＣＤ４＋Ｔ細胞として知られている。Ｔヘルパー細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上で発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原を提示されるときに活性化される。活性化されると、それらは急速に分裂し、活性免疫応答を調節又は支援するサイトカインと呼ばれる小さなタンパク質を分泌する。これらの細胞は、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、又はＴＦＨを含む、いくつかのサブタイプのうちの１つに分化することができ、これらは、異なるタイプの免疫応答を促進するために異なるサイトカインを分泌する。ＡＰＣからのシグナル伝達は、Ｔ細胞を特定のサブタイプに誘導する。
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞又はＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊し、また、移植拒絶に関与する。これらの細胞は、表面上にＣＤ８糖タンパク質を発現するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られている。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩ分子と関連する抗原に結合することによって、それらの標的を認識する。ＩＬ－１０、アデノシン、及び調節性Ｔ細胞によって分泌される他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞は、自己免疫疾患を予防するアネルギー状態に不活性化され得る。
メモリーＴ細胞は、感染が解消した後も長期間持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、それらの同族抗原に再曝露するとすぐに多数のエフェクターＴ細胞に拡大し、したがって、免疫系に過去の感染に対する「記憶」を提供する。メモリーＴ細胞は、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）、中枢メモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）、及び２タイプのエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞及びＴＥＭＲＡ細胞）のサブタイプを含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋のいずれかであり得る。メモリーＴ細胞は、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、及び／又はＣＣＲ７を発現することができる。
以前はサプレッサーＴ細胞として知られていた調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持において役割を果たす。それらの主な役割は、免疫反応の終わりに向かってＴ細胞媒介性免疫をシャットダウンし、胸腺における陰性選択のプロセスを逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）は、適応免疫系と先天性免疫系とを橋渡しする。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子によって提示されるペプチド抗原を認識する従来のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄと呼ばれる分子によって提示される糖脂質抗原を認識する。活性化されると、これらの細胞は、Ｔｈ細胞及びＴｃ細胞の両方に起因する機能（すなわち、サイトカイン産生及び細胞溶解性／細胞殺傷分子の放出）を行うことができる。それらはまた、ヘルペスウイルスに感染したいくつかの腫瘍細胞及び細胞を認識し、除去することができる。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、先天性免疫系の細胞傷害性リンパ球の一種である。いくつかの例では、ＮＫ細胞は、ウイルス感染及び／又は腫瘍形成に対する第一選択防御を提供する。ＮＫ細胞は、感染した細胞又はがん性細胞に提示されるＭＨＣを検出し、サイトカイン放出を誘発し、続いて、溶解及びアポトーシスを誘導することができる。ＮＫ細胞は、抗体及び／又はＭＨＣの不在下でストレス細胞を更に検出することができ、それによって迅速な免疫応答を可能にする。
Ａ．免疫エフェクター細胞源
特定の態様では、本明細書に記載される実施形態は、修飾（抗原特異的リダイレクト）免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、ＮＫ細胞又はＮＫ Ｔ細胞）を作製する方法、及び／又は拡張する方法を含み、この方法は、細胞を、ＣＡＲをコードするＤＮＡ（又はＲＮＡ）構築物を含有する発現ベクターでトランスフェクトすることと、次いで、任意選択的に、フィーダー細胞、組換え抗原、又は受容体に対する抗体で細胞を刺激して、細胞を増殖させることと、を含む。特定の態様では、ＣＡＲを発現するように操作された細胞（又は細胞集団）は、幹細胞、ＣＤ３４＋臍帯血細胞、ｉＰＳ細胞、ｉＰＳ細胞から分化したＴ細胞、免疫エフェクター細胞、又はこれらの細胞の前駆体である。
免疫エフェクター細胞の供給源には、同種異系源及び自己由来源の両方を含めることができる。いくつかの場合、免疫エフェクター細胞は、幹細胞又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化させることができる。したがって、実施形態による操作のための細胞は、臍帯血、末梢血、ヒト胚性幹細胞、又はｉＰＳＣから単離することができる。例えば、同種異系Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を含むように（及び任意選択的に、機能的ＴＣＲを欠くように）修飾することができる。いくつかの態様では、免疫エフェクター細胞は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来するＴ細胞などの一次ヒトＴ細胞である。ＰＢＭＣは、末梢血から、又は骨髄若しくは臍帯血からのＧ－ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）による刺激後に採取することができる。一態様では、免疫エフェクター細胞は、Ｐａｎ Ｔ細胞である。トランスフェクション又は形質導入後（例えば、ＣＡＲ発現構築物を用いて）、細胞を直ちに注入することができるか、又は凍結保存することができる。特定の態様では、トランスフェクション又は形質導入後、細胞は、注入の準備が整うまで、ＩＬ－２及び／又はＩＬ－２１を含むことができるサイトカイン浴中で保存することができる。特定の態様では、トランスフェクション後、細胞は、細胞への遺伝子移入後、約１、２、３、４、５日以上以内に、バルク集団として、エクスビボで数日間、数週間、又は数ヶ月増殖させることができる。更なる態様では、トランスフェクション後、形質転換体をクローニングし、クローンは、単一の組み込まれた又はエピソームで維持された発現カセット又はプラスミドの存在を示し、キメラ抗原受容体の発現をエクスビボで拡大する。拡大のために選択されたクローンは、抗原発現標的細胞を特異的に認識及び溶解する能力を示す。組換えＴ細胞は、ＩＬ－２、又は共通のガンマ鎖に結合する他のサイトカイン（例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、及びその他）による刺激によって拡大させることができる。組換えＴ細胞は、人工抗原提示細胞による刺激によって拡大させることができる。組換えＴ細胞は、人工抗原提示細胞上で、又はＴ細胞表面上でＣＤ３を架橋するＯＫＴ３などの抗体を用いて拡大させることができる。組換えＴ細胞のサブセットは、磁気ビーズベースの単離方法及び／又は蛍光活性化細胞選別技術を使用して更に選択し、ＡａＰＣで更に培養することができる。更なる態様では、遺伝子修飾細胞は、凍結保存することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾細胞は、凍結保存されない。
Ｔ細胞はまた、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む、多数の供給源から得ることができる。本開示の特定の実施形態では、当該技術分野で利用可能な任意の数のＴ細胞株が使用され得る。本開示の特定の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）分離などの当業者に既知の任意の数の技術を使用して、対象から収集された血液の単位から得ることができる。いくつかの実施形態において、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス生成物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含む、リンパ球を含有する。一実施形態では、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、その後の処理工程のために細胞を適切な緩衝液又は培地中に入れてもよい。本発明の一実施形態では、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替的な実施形態では、洗浄液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠いてもよいか、又は全てではないが多くの二価カチオンを欠いてもよい。カルシウムの不在下での最初の活性化工程は、増幅された活性化につながる。当業者であれば容易に理解するであろうが、洗浄工程は、製造業者の指示に従って、半自動化「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞プロセッサ、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、又はＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を使用することなどによって、当業者に既知の方法によって達成され得る。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ２＋不含ＰＢＳ、Ｍｇ２＋不含ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａなど、又は緩衝液を伴うか、若しくは伴わない他の生理食塩水中で再懸濁され得る。代替的に、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地中に直接再懸濁させてもよい。
別の実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）勾配を介した遠心分離によって、又は向流遠心分離によって、末梢血リンパ球から単離される。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などのＴ細胞の特定のサブ集団は、正又は負の選択技術によって更に単離され得る。別の実施形態では、ＣＤ１４＋細胞は、Ｔ細胞集団から枯渇する。例えば、一実施形態では、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な期間、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）コンジュゲートビーズとのインキュベーションによって単離される。一実施形態では、期間は約３０分である。更なる実施形態では、期間は、３０分～３６時間以上及びそれらの間の全ての整数値の範囲である。更なる実施形態では、期間は、少なくとも１、２、３、４、５、又は６時間である。更に別の実施形態では、期間は、１０～２４時間である。一実施形態では、インキュベーション時間は、２４時間である。白血病を有する患者からのＴ細胞の単離のために、２４時間などのより長いインキュベーション時間の使用は、細胞収率を増加させることができる。より長いインキュベーション時間を使用して、腫瘍組織又は免疫が損なわれた個体からの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の単離など、他の細胞型と比較してＴ細胞が少ない任意の状況でＴ細胞を単離することができる。更に、より長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉の効率を増加させることができる。したがって、Ｔ細胞がＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合する時間を単純に短縮若しくは延長することによって、及び／又はＴ細胞に対するビーズの比を増加若しくは減少させることによって（本明細書に更に記載されるように）、Ｔ細胞のサブ集団を、培養開始時又はプロセス中の他の時点で、それらを又はそれらに対して優先的に選択することができる。加えて、ビーズ又は他の表面上の抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体の比を増加又は減少させることによって、Ｔ細胞のサブ集団は、培養開始時又は他の所望の時点で、それらを又はそれらに対して優先的に選択することができる。当業者は、本発明の文脈において複数の選択ラウンドを使用することもできることを認識するであろう。特定の実施形態では、選択手順を実施し、活性化及び拡大プロセスにおいて「選択されていない」細胞を使用することが望ましい場合がある。「選択されていない」細胞も、更なる選択ラウンドに供され得る。
陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に固有の表面マーカーを対象とする抗体の組み合わせによって達成され得る。１つの方法は、陰性磁気免疫接着又はフローサイトメトリーによる細胞の選別及び／又は選択であり、これは、陰性に選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーを対象とするモノクローナル抗体のカクテルを使用する。例えば、陰性選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体を含む。特定の実施形態では、典型的には、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、及びＦｏｘＰ３＋を発現する調節性Ｔ細胞を濃縮するか、又は陽性に選択することが望ましい場合がある。代替的に、特定の実施形態では、Ｔ調節性細胞は、抗ＣＤ２５コンジュゲートビーズ又は他の同様の選択方法によって枯渇される。
陽性又は陰性選択による細胞の所望の集団の単離のために、細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変化させることができる。特定の実施形態では、ビーズ及び細胞が一緒に混合される体積を著しく減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましく、細胞及びビーズの最大限の接触を確保することができる。例えば、一実施形態では、２０億個の細胞／ｍｌの濃度が使用される。一実施形態では、１０億個の細胞／ｍｌの濃度が使用される。更なる実施形態では、１億個を超える細胞／ｍｌが使用される。更なる実施形態において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、又は５０００万個の細胞／ｍｌの細胞の濃度が使用される。更に別の実施形態において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、又は１億個の細胞／ｍｌからの細胞の濃度が使用される。更なる実施形態において、１億２５００万個又は１億５０００万個の細胞／ｍｌの濃度が使用され得る。高濃度を使用すると、細胞収率、細胞活性化、及び細胞拡大が増加する可能性がある。更に、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの目的の標的抗原を弱く発現することができる細胞、又は多くの腫瘍細胞（すなわち、白血病性血液、腫瘍組織など）が存在する試料からの細胞のより効率的な捕捉を可能にする。そのような細胞集団は、治療価値を有し得、得ることが望ましいであろう。例えば、高濃度の細胞を使用することで、通常は、より弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択が可能になる。
関連する実施形態では、より低い濃度の細胞を使用することが望ましい場合がある。Ｔ細胞と表面（例えば、ビーズなどの粒子）の混合物を大幅に希釈することによって、粒子と細胞との間の相互作用が最小限に抑えられる。これは、多量の所望の抗原を発現する細胞が粒子に結合することを選択する。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、より高いレベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度でＣＤ８＋Ｔ細胞よりも効率的に捕捉される。一実施形態では、使用される細胞の濃度は、５×１０６／ｍｌである。他の実施形態では、使用される濃度は、約１×１０５／ｍｌ～１×１０６／ｍｌ、及びそれらの間の任意の整数値であり得る。
他の実施形態では、細胞は、２～１０℃又は室温のいずれかで様々な速度で、様々な長さの時間、回転子上でインキュベートされてもよい。
刺激のためのＴ細胞も、洗浄工程の後に凍結させることができる。血漿及び血小板を除去する洗浄工程の後、細胞を凍結溶液中に懸濁させることができる。多くの凍結溶液及びパラメータが当該技術分野で既知であり、この文脈において有用であるが、１つの方法は、２０％のＤＭＳＯ及び８％のヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、あるいは１０％のデキストラン４０及び５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン及び７．５％のＤＭＳＯ、若しくは３１．２５％のＰｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％のデキストロース５％、０．４５％のＮａＣｌ、１０％のデキストラン４０及び５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン、及び７．５％のＤＭＳＯを含有する培養培地、又は例えば、Ｈｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含有する他の好適な細胞凍結培地を使用することを含み、次いで、細胞は、毎分１℃の速度で－８０℃まで凍結され、液体窒素貯蔵タンクの気相に保存される。制御凍結の他の方法、及び－２０℃又は液体窒素中での制御されていない即座の凍結を使用してもよい。特定の実施形態では、本明細書に記載されるように凍結保存された細胞を解凍して洗浄し、本発明の方法を使用して活性化する前に室温で１時間静止させる。
特定の実施形態では、本明細書に記載される拡大細胞が必要とされ得る前の期間に、対象からの血液試料又はアフェレーシス生成物の収集も提供される。このように、拡大される細胞の供給源は、必要な任意の時点で収集することができ、Ｔ細胞などの所望の細胞は、本明細書に記載されているものなどの、Ｔ細胞療法の恩恵を受けるであろう任意の数の疾患又は状態のＴ細胞療法での後の使用のために単離され、凍結される。一実施形態では、血液試料又はアフェレーシスは、全体的に健康な対象から採取される。特定の実施形態では、血液試料又はアフェレーシスは、疾患を発症するリスクがあるが、まだ疾患を発症していない、全体的に健康な対象から採取され、目的の細胞が単離され、後で使用するために凍結される。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、拡大、凍結、及び後の時間で使用することができる。特定の実施形態では、試料は、本明細書に記載されるような特定の疾患の診断の直後に、任意の治療の前に患者から採取される。更なる実施形態では、細胞は、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線などの薬剤、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、及びＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、又はＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、及び照射などの他の免疫消去剤による治療を含むが、これらに限定されない、任意の数の関連する治療様式の前に、対象からの血液試料又はアフェレーシスから単離される。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリン（シクロスポリン及びＦＫ５０６）を阻害するか、又は成長因子誘導シグナル伝達（ラパマイシン）に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６６：８０７－８１５，（１９９１）、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎ ７３：３１６－３２１，（１９９１）、Ｂｉｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ ５：７６３－７７３，（１９９３））。更なる実施形態では、細胞が患者について単離され、骨髄又は幹細胞移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、又はＯＫＴ３若しくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体を使用したＴ細胞除去療法と併せて（例えば、その前、それと同時に、又はそれに続いて）、後で使用するために凍結される別の実施形態では、細胞は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンなどのＢ細胞除去療法後の治療のために、事前に単離され、後で使用するために凍結され得る。
本発明の更なる実施形態では、Ｔ細胞は、治療の直後に患者から得られる。これに関連して、特定のがん治療、特に免疫系を損傷する薬物による治療の後、患者が通常治療から回復している期間中の治療直後に、得られるＴ細胞の品質は、エキソビボで拡大する能力に対して最適又は改善することができることが観察されている。同様に、本明細書に記載される方法を使用したエキソビボでの操作に続いて、これらの細胞は、強化された生着及びインビボでの拡大のための好ましい状態にあり得る。したがって、本発明の文脈では、この回復段階で、Ｔ細胞、樹状細胞、又は造血系統の他の細胞を含む血液細胞を収集することが企図される。更に、特定の実施形態では、動員（例えば、ＧＭ－ＣＳＦによる動員）及びコンディショニングレジメンを使用して、特定の細胞型の再集団化、再循環、再生、及び／又は拡大が、特に治療後の定義された時間ウィンドウ中に好ましい状態を対象に作り出すことができる。例示的な細胞型としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及び免疫系の他の細胞が挙げられる。
Ｂ．免疫エフェクター細胞の活性化及び拡大
本明細書に記載されるＣＡＲを発現するための免疫エフェクター細胞の操作の前又は後に関わらず、細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、及び米国特許出願公開第２００６／０１２１００５号に記載されている方法を一般的に使用して活性化され、拡大され得る。
一般に、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する作用物質及び細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを、それに付着させている表面との接触によって拡大される。特に、細胞集団は、本明細書に記載されるように、例えば、抗ＣＤ３抗体、若しくはその抗原結合断片、又は表面に固定化された抗ＣＤ２抗体と接触することによって、あるいはカルシウムイオノフォアと併せてプロテインキナーゼＣ活性化剤（例えば、ブリオスタチン）と接触することによって、刺激され得る。細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激には、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、当該技術分野で一般的に知られている他の方法として使用することができる（Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５－３９７７，（１９９８）、Ｈａａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，（１９９９）、Ｇａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．２２７（１－２）：５３－６３，（１９９９））。
特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞についての一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供され得る。例えば、各シグナルを提供する作用物質は、溶液中にあってもよいか、又は表面に結合していてもよい。表面に結合されたとき、作用物質は、同じ表面に結合されてもよく（すなわち、「シス」形成において）、又は別々の表面に結合されてもよい（すなわち、「トランス」形成において）。代替的に、一方の作用物質は表面に結合してもよく、他方の作用物質は溶液中にあってもよい。一実施形態では、共刺激シグナルを提供する作用物質は細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する作用物質は溶液中にあるか、又は表面に結合している。特定の実施形態では、両方の作用物質は、溶液中にあってもよい。別の実施形態では、作用物質は、可溶性形態であってもよく、次いで、Ｆｃ受容体を発現する細胞、又は作用物質に結合する抗体若しくは他の結合剤などの表面に架橋されてもよい。これに関して、例えば、本発明におけるＴ細胞の活性化及び拡大に使用するために企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）については、米国特許出願公開第２００４／０１０１５１９号及び同第２００６／００３４８１０号を参照されたい。
一実施形態では、２つの作用物質は、同じビーズ上に固定化されるか、すなわち「シス」、又は別個のビーズに固定化される、すなわち「トランス」のいずれかで、ビーズ上に固定化される。例として、一次活性化シグナルを提供する作用物質は、抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であり、共刺激シグナルを提供する作用物質は、抗ＣＤ２８抗体又はその抗原結合断片であり、両方の作用物質は、同等の分子量で同じビーズに共固定化される。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞拡大及びＴ細胞増殖のためのビーズに結合した各抗体の１：１の比が使用される。本発明の特定の態様では、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１：１の比を使用して観察された拡大と比較して、Ｔ細胞の拡大の増加が観察されるように使用される。１つの特定の実施形態では、１：１の比を使用して観察される拡大と比較して、約１～約３倍の増加が観察される。一実施形態では、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１～１：１００及びその間にある全ての整数値の範囲である。本発明の一態様では、抗ＣＤ３抗体よりも多くの抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合し、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比が１未満である。本発明の特定の実施形態では、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ３抗体の比は、２：１を超える。１つの特定の実施形態では、ビーズに結合した抗体の１：１００のＣＤ３：ＣＤ２８の比が使用される。別の実施形態では、ビーズに結合した抗体の１：７５のＣＤ３：ＣＤ２８の比が使用される。更なる実施形態では、ビーズに結合した抗体の１：５０のＣＤ３：ＣＤ２８の比が使用される。別の実施形態では、ビーズに結合した抗体の１：３０のＣＤ３：ＣＤ２８の比が使用される。いくつかの実施形態では、ビーズに結合した抗体の１：１０のＣＤ３：ＣＤ２８の比が使用される。別の実施形態では、ビーズに結合した抗体の１：３のＣＤ３：ＣＤ２８の比が使用される。更に別の実施形態では、ビーズに結合した抗体の３：１のＣＤ３：ＣＤ２８の比が使用される。
Ｔ細胞又は他の標的細胞を刺激するために、１：５００～５００：１及びそれらの間の任意の整数値の粒子対細胞の比が使用され得る。当業者であれば容易に理解することができるように、粒子対細胞の比は、標的細胞に対する粒径に依存し得る。例えば、小さなサイズのビーズは、少しの細胞にのみ結合することができ、一方、より大きなビーズは、多くの細胞に結合することができる。特定の実施形態では、細胞対粒子の比は、１：１００～１００：１及びそれらの間の任意の整数値の範囲であり、更なる実施形態において、その比は、１：９～９：１及びそれらの間の任意の整数値を含み、また、Ｔ細胞を刺激するために使用することもできる。Ｔ細胞刺激をもたらす抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８結合粒子対Ｔ細胞の比は、上記のように変化し得るが、特定の値は、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、及び１５：１を含み、１つの比は、Ｔ細胞当たり少なくとも１：１の粒子である。一実施形態では、１：１以下の粒子対細胞の比が使用される。１つの特定の実施形態では、粒子：細胞の比は、１：５である。更なる実施形態では、粒子対細胞の比は、刺激の日に応じて変化させることができる。例えば、一実施形態では、粒子対細胞の比は、初日に１：１～１０：１であり、追加の粒子を、１：１～１：１０の最終比率で、毎日又はその後１日おきに最大１０日間、細胞に添加する（添加日の細胞カウントに基づく）。１つの特定の実施形態では、粒子対細胞の比は、刺激の最初の日に１：１であり、刺激の３日目及び５日目に１：５に調節される。別の実施形態では、粒子は、刺激の最初の日に１：１、並びに刺激の３日目及び５日目に１：５の最終比に基づいて毎日又は１日おきに添加される。別の実施形態では、粒子対細胞の比は、刺激の最初の日に２：１であり、刺激の３日目及び５日目に１：１０に調節される。別の実施形態では、粒子は、刺激の最初の日に１：１、並びに刺激の３日目及び５日目に１：１０の最終比に基づいて毎日又は１日おきに添加される。当業者は、様々な他の比が、本発明での使用に好適であり得ることを理解するであろう。特に、比は、粒径、並びに細胞のサイズ及びタイプに応じて変動することになる。
本明細書に記載される更なる実施形態では、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞を、作用物質をコーティングしたビーズと合わせ、続いてビーズ及び細胞を分離し、次いで細胞を培養する。代替的な実施形態において、培養前に、作用物質をコーティングしたビーズ及び細胞を分離しないが、一緒に培養する。更なる実施形態において、ビーズ及び細胞を、最初に、磁力などの力を加えることによって濃縮し、その結果、細胞表面マーカーのライゲーションが増加し、それによって細胞刺激が誘導される。
例として、細胞表面タンパク質は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８が結合して（３×２８ビーズ）、Ｔ細胞に接触する、常磁性ビーズを可能にすることによってライゲーションされ得る。一実施形態では、細胞（例えば、１０４～１０９個のＴ細胞）及びビーズ（例えば、１：１の比でＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ常磁性ビーズ、又はＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製のＭＡＣＳ（登録商標）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ）は、緩衝液、例えば、ＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムなどの二価カチオンを含まない）中で合わせられる。ここでも、当業者は、任意の細胞濃度が使用され得ることを容易に理解することができる。例えば、標的細胞は、試料中で非常にまれであり得、試料の０．０１％のみを含むか、又は試料全体（すなわち、１００％）が目的の標的細胞を含むことができる。したがって、任意の細胞数は、本発明の文脈の範囲内である。特定の実施形態では、粒子及び細胞が一緒に混合される体積を著しく減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましく、細胞及び粒子の最大限の接触を確保することができる。例えば、一実施形態において、約２０億個の細胞／ｍｌの濃度が使用される。別の実施形態において、１億個を超える細胞／ｍｌが使用される。更なる実施形態において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、又は５０００万個の細胞／ｍｌの細胞の濃度が使用される。更に別の実施形態において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、又は１億個の細胞／ｍｌからの細胞の濃度が使用される。更なる実施形態において、１億２５００万個又は１億５０００万個の細胞／ｍｌの濃度が使用され得る。高濃度を使用すると、細胞収率、細胞活性化、及び細胞拡大が増加する可能性がある。更に、高い細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの目的の標的抗原を弱く発現することができる細胞のより効率的な捕捉を可能にする。そのような細胞集団は、治療価値を有し得、特定の実施形態では得ることが望ましいであろう。例えば、高濃度の細胞を使用することで、通常はより弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択が可能になる。
本明細書に記載される一実施形態では、混合物は、数時間（約３時間）～約１４日間、又はその間の任意の時間単位の整数値で培養されてもよい。別の実施形態では、この混合物は、２１日間培養することができる。本発明の一実施形態では、ビーズ及びＴ細胞は、約８日間一緒に培養される。別の実施形態において、ビーズ及びＴ細胞は、２～３日間一緒に培養される。Ｔ細胞の培養時間が６０日以上であり得るように、刺激のいくつかのサイクルも所望され得る。Ｔ細胞培養に適切な条件は、血清（例えば、ウシ胎仔又はヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦベータ、及びＴＮＦ－アルファ、又は当業者に既知の細胞の増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖及び生存に必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地又はＲＰＭＩ培地１６４０又はＸ－ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞の増殖のための他の添加剤には、界面活性剤、プラスマネート、並びに還元剤、例えば、Ｎ－アセチル－システイン及び２－メルカプトエタノールが含まれるが、これらに限定されない。培地には、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、アルファ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ１５、及びＸ－Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが含まれてもよく、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンが添加されており、血清を含まないか、あるいは適切な量の血清（若しくは血漿）若しくは規定のセットのホルモン、並びに／又はＴ細胞の増殖及び拡大に十分な量のサイトカインが補充されている。抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンは、実験培養物にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するために必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）及び雰囲気（例えば、空気＋５％のＣＯ２）で維持される。
エキソビボ手順は周知であり、以下でより完全に考察される。簡潔に述べると、細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト）から単離され、本明細書に開示されるＣＡＲを発現するベクターを用いて遺伝子修飾（すなわち、インビトロで形質導入又はトランスフェクト）される。ＣＡＲ修飾細胞は、治療的利益を提供するために哺乳動物レシピエントに投与され得る。哺乳動物レシピエントは、ヒトであってもよく、ＣＡＲ修飾細胞は、レシピエントに関して自己由来であってもよい。代替的に、細胞は、レシピエントに対して同種異系、同系、又は異種異系であってもよい。
造血幹細胞及び前駆細胞のエクスビボ拡大についての手順は、米国特許第５，１９９，９４２号に記載されており、本発明の細胞に適用することができる。他の好適な方法は当該技術分野で既知であるため、本発明は、細胞のエクスビボ拡大の任意の特定の方法に限定されない。簡潔に述べると、エフェクター細胞のエクスビボ培養及び拡大は、（１）末梢血採取又は骨髄外植体からの哺乳動物由来のＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞を収集することと、（２）そのような細胞をエクスビボで拡大させることと、を含む。米国特許第５，１９９，９４２号に記載される細胞成長因子に加えて、ｆｌｔ３－Ｌ、ＩＬ－１、ＩＬ－３、及びｃ－キットリガンドなどの他の因子を、細胞の培養及び拡大に使用することができる。
様々な刺激時間に曝露されたエフェクター細胞は、異なる特徴を示すことができる。例えば、典型的な血液又はアフェレーシスされた末梢血単核細胞産物は、細胞傷害性又はサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）よりも大きいヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３及びＣＤ２８受容体を刺激することによるＴ細胞のエクスビボ拡大は、約８～９日目の前に主にＴＨ細胞からなるＴ細胞の集団を産生するが、約８～９日目の後に、Ｔ細胞の集団は、ますます大きなＴＣ細胞の集団を含む。したがって、治療の目的に応じて、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することが有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されている場合、このサブセットをより大きな程度まで拡大することが有益であり得る。
更に、ＣＤ４及びＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーは著しく異なるが、大部分は、細胞拡大プロセスの過程中に再現可能に変化する。このように、このような再現性は、特定の目的のために活性化Ｔ細胞産物を調整する能力を可能にする。
いくつかの場合、実施形態の免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を、細胞拡大を補助するために、活性化及び増殖細胞（ＡａＰＣ）と共培養する。ＡａＰＣはまた、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と称されることもある。例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、実施形態の治療用組成物及び細胞療法製品の調製に有用である。一態様では、ＡａＰＣは、遺伝子修飾されたＫ５６２細胞であり得る。抗原提示系の調製及び使用に関する一般的なガイダンスについては、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、同第６，３６２，００１号及び同第６，７９０，６６２号、米国特許出願公開第２００９／００１７０００号及び同第２００９／０００４１４２号、並びに国際公開第ＷＯ２００７／１０３００９号を参照されたい。実施形態のなお更なる態様では、遺伝子修飾されたＣＡＲ細胞を培養することは、樹状細胞の存在下で遺伝子修飾されたＣＡＲ細胞を培養すること、又はＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の拡大を刺激する細胞（ＡａＰＣ）を活性化及び増殖させることを含む。なお更なる態様では、ＡａＰＣは、ＡａＰＣの表面上に発現されるＣＡＲ結合抗体又はその断片を含む。ＡａＰＣは、いくつかの場合、Ｔ細胞を活性化又は共刺激する追加の分子を含むことができる。追加の分子は、いくつかの場合、膜結合型Ｃγサイトカインを含むことができる。別のなお更なる態様では、ＡａＰＣは、不活性化若しくは照射されるか、又は感染性物質を含まないことが試験され、確認されている。なお更なる態様では、ＡａＰＣの存在下で遺伝子修飾されたＣＡＲ細胞を培養することは、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、及び／又はＩＬ－２などの可溶性サイトカインを含む培地中で遺伝子修飾されたＣＡＲ細胞を培養することを含む。細胞は、約１０：１～約１：１０、約３：１～約１：５、約１：１～約１：３（ＡａＰＣに対する免疫エフェクター細胞）、又はその中で誘導可能な任意の範囲の比で培養することができる。例えば、Ｔ細胞及びＡａＰＣの共培養は、約１：１、約１：２、又は約１：３の比であり得る。
一態様では、ＡａＰＣはＣＤ１３７Ｌを発現することができる。いくつかの態様では、ＡａＰＣは、ＣＡＲ細胞によって標的化される抗原、例えば、ＭＵＣ１６、ＣＤ３３、又はＲＯＲ１（全長、切頭、又はそれらの任意のバリアント）を更に発現することができる。他の態様では、ＡａＰＣは、ＣＤ６４、ＣＤ８６、又はｍＩＬ１５を更に発現することができる。特定の態様では、ＡａＰＣは、例えば、ＯＫＴ３及び／又はＵＣＨＴ１などの少なくとも１つの抗ＣＤ３抗体クローンを発現することができる。一態様では、ＡａＰＣは不活性化（例えば、照射）され得る。一態様では、ＡａＰＣは、感染性物質を含まないことが試験され、確認されている。このようなＡａＰＣを産生するための方法は、当該技術分野で既知である。一態様では、ＣＡＲ修飾されたＴ細胞集団をＡａＰＣと培養することは、約１０：１～約１：１０、約３：１～約１：５、約１：１～約１：３（Ｔ細胞対ＡａＰＣ）、又はその中で誘導可能な任意の範囲の比で細胞を培養することを含み得る。例えば、Ｔ細胞及びＡａＰＣの共培養は、約１：１、約１：２、又は約１：３の比であり得る。一態様では、培養する工程は、アミノビスホスホネート（例えば、ゾレドロン酸）と培養することを更に含み得る。
一態様では、遺伝子修飾されたＣＡＲ細胞の集団は、直ちに対象に注入されるか、又は凍結保存される。別の態様では、遺伝子修飾されたＣＡＲ細胞の集団は、対象に注入する前にサイトカイン浴に入れられる。更なる態様では、遺伝子修飾されたＣＡＲ細胞の集団は、１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８、３５、４２日、４９、５６、６３又は７０日以下の間、培養及び／又は刺激される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団は、少なくとも０、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０日以上の間、培養及び／又は刺激される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞集団は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０日以上の間、培養及び／又は刺激される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現エフェクター細胞の集団は、少なくとも７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３日以上の間、培養及び／又は刺激される。一実施形態では、刺激は、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の増殖を促進するために、遺伝子修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞とＡａＰＣとの共培養を含む。別の態様では、遺伝子修飾されたＣＡＲ細胞の集団は、１回の刺激、２回の刺激、３回の刺激、４回の刺激、５回の刺激、５回の刺激、６回の刺激、７回の刺激、８回の刺激、９回の刺激、又は１０回の刺激以下で刺激される。いくつかの例では、遺伝子修飾細胞は、ＡａＰＣの存在下でエクスビボで培養されない。いくつかの特定の例では、実施形態の方法は、トランスフェクション及び／又は培養工程の後に、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の細胞集団を濃縮することを更に含む。この濃縮は、ＣＡＲ発現細胞を選別するための蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含むことができる。更なる態様では、ＣＡＲ発現細胞の選別は、ＣＡＲ結合抗体の使用を含む。濃縮は、ＣＤ５６＋細胞の枯渇も含むことができる。実施形態の別のなお更なる態様では、方法は、遺伝子修飾されたＣＡＲ細胞の集団の試料を凍結保存することを更に含む。
いくつかの場合、ＡａＰＣは、追加の処理なしにペプチドをＭＨＣ分子に直接結合させることを可能にする最適な長さのペプチドとインキュベートされる。代替的に、細胞は、目的の抗原を発現することができる（すなわち、ＭＨＣ非依存性抗原認識の場合）。更に、いくつかの場合、ＡＰＣは、特定のＣＡＲポリペプチド又は一般的にＣＡＲポリペプチドのいずれかに結合する抗体（例えば、ユニバーサル活性化及び増殖細胞（ｕＡＰＣ）を発現することができる。そのような方法は、ＷＯ２０１４／１９０２７３に開示されている。目的のペプチド－ＭＨＣ分子又は抗原に加えて、ＡａＰＣ系はまた、少なくとも１つの外因性補助分子を含むことができる。補助分子の任意の好適な数及び組み合わせを用いることができる。補助分子は、共刺激分子及び接着分子などの補助分子から選択することができる。例示的な共刺激分子としては、ＣＤ７０及びＢ７．１（Ｂ７．１は、以前はＢ７として知られており、ＣＤ８０としても知られていた）が挙げられ、これらは、とりわけ、Ｔ細胞の表面上のＣＤ２８及び／又はＣＴＬＡ－４分子に結合し、それによって、例えば、Ｔ細胞の拡大、Ｔｈ１分化、短期Ｔ細胞生存、及びインターロイキン（ＩＬ）－２などのサイトカイン分泌に影響を与える。接着分子は、セレクチンなどの炭水化物結合糖タンパク質、インテグリンなどの膜貫通結合糖タンパク質、カドヘリンなどのカルシウム依存性タンパク質、及び例えば、細胞間又は細胞対マトリックス接触を促進する細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）などの１回膜貫通免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリータンパク質を含むことができる。例示的な接着分子としては、ＬＦＡ－３及びＩＣＡＭ－１などのＩＣＡＭが挙げられる。共刺激分子及び接着分子を含む、例示的な補助分子の選択、クローニング、調製、及び発現に有用な技術、方法、及び試薬は、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、及び同第６，３６２，００１号に例示される。
ＡａＰＣになるように選択された細胞は、好ましくは、細胞内抗原プロセシング、細胞内ペプチド輸送、及び／又は細胞内ＭＨＣクラスＩ若しくはクラスＩＩ分子－ペプチドローディングにおいて欠損を有するか、又は変温（すなわち、哺乳動物細胞株よりも温度チャレンジに感受性が低い）であるか、又は欠損及び変温特性の両方を有する。好ましくは、ＡａＰＣになるように選択された細胞はまた、少なくとも１つの内因性対応物（例えば、上述の内因性ＭＨＣクラスＩ若しくはクラスＩＩ分子及び／又は内因性補助分子）を外因性ＭＨＣクラスＩ若しくはクラスＩＩ分子に発現し、細胞に導入される補助分子成分を発現する能力を欠いている。更に、ＡａＰＣは、好ましくは、ＡａＰＣを生成するための修飾前に細胞によって所持されていた欠損及び変温特性を保持する。例示的なＡａＰＣは、昆虫細胞株などの抗原プロセシング（ＴＡＰ）欠損細胞株と関連するトランスポーターを構成するか、又はそれに由来する。例示的な変温昆虫細胞株は、シュナイダー２細胞株などのショウジョウバエ細胞株である（例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ １９７２を参照されたい シュナイダー２細胞の調製、増殖、及び培養のための例示的な方法は、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、及び同第６，３６２，００１号に提供されている。
一実施形態では、ＡａＰＣも、凍結融解サイクルに供される。例示的な凍結融解サイクルにおいて、ＡａＰＣは、凍結が急速に生じるように、ＡａＰＣを含む好適なレセプタクルを、適切な量の液体窒素、固体二酸化炭素（すなわち、ドライアイス）、又は同様の低温材料と接触させることによって凍結され得る。次いで、低温材料からのＡａＰＣの除去及び周囲の室温条件への曝露のいずれかによって、又はより短い解凍時間を容易にするためにぬるま湯浴若しくは暖かい手を用いる促進された解凍プロセスによって、凍結したＡＰＣを解凍する。加えて、ＡａＰＣを凍結し、解凍前に長期間保存することができる。凍結されたＡａＰＣも解凍され、その後、更なる使用前に凍結乾燥させることができる。好ましくは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び他の保存剤などの、凍結融解手順に有害な影響を与える可能性のある保存剤は、凍結融解サイクルを受けるＡａＰＣを含有する培地には存在しないか、又はそのような保存剤を本質的に欠いている培地へのＡａＰＣの移送などによって本質的に除去される。
更なる実施形態では、異種核酸及びＡａＰＣに内因性の核酸は、架橋によって不活性化されてもよく、その結果、不活性化の後に核酸の細胞増殖、複製、又は発現は本質的に生じない。一実施形態では、ＡａＰＣは、外因性ＭＨＣ及び補助分子の発現、ＡａＰＣの表面上のこのような分子の提示、並びに提示されたＭＨＣ分子の選択されたペプチド又は複数のペプチドとの負荷の後の時点で不活性化される。したがって、そのような不活性化され、選択されたペプチドが負荷されたＡａＰＣは、増殖又は複製することを本質的に不可能にするが、選択されたペプチド提示機能を保持する。好ましくは、架橋はまた、ＡａＰＣの抗原提示細胞機能を実質的に低下させることなく、細菌及びウイルスなどの汚染微生物を本質的に含まないＡａＰＣをもたらす。したがって、架橋は、ＡａＰＣを使用して開発された細胞療法製品の安全性に関する懸念を緩和するのを助けながら、重要なＡａＰＣ機能を維持する。架橋及びＡａＰＣに関する方法については、例えば、米国特許出願公開第２００９／００１７０００号を参照されたい。
特定の実施形態では、操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）が更に提供される。このような細胞は、例えば、上述したように、エクスビボで免疫エフェクター細胞を増殖させるために使用することができる。更なる態様では、操作されたＡＰＣは、それ自体が患者に投与され、それによってインビボで免疫エフェクター細胞の拡大を刺激することができる。実施形態の操作されたＡＰＣは、それ自体、治療剤として使用され得る。他の実施形態では、操作されたＡＰＣは、標的抗原に特異的な内因性免疫エフェクター細胞の活性化を刺激し、及び／又は標的抗原に特異的な養子移入された免疫エフェクター細胞の活性又は持続性を増加させることができる治療剤として使用することができる。
本明細書で使用される場合、「操作されたＡＰＣ」という用語は、少なくとも第１の導入遺伝子を含む細胞を指し、第１の導入遺伝子は、ＨＬＡをコードする。そのような操作されたＡＰＣは、抗原がＨＬＡと複合体でＡＰＣの表面に提示されるように、抗原の発現のための第２の導入遺伝子を更に含むことができる。いくつかの態様では、操作されたＡＰＣは、抗原を提示する細胞型（例えば、樹状細胞）であり得る。更なる態様では、操作されたＡＰＣは、通常抗原を提示しない細胞型、例えば、Ｔ細胞又はＴ細胞前駆体（「Ｔ－ＡＰＣ」と称される）から産生され得る。したがって、いくつかの態様では、実施形態の操作されたＡＰＣは、標的抗原をコードする第１の導入遺伝子及びヒト白血球抗原（ＨＬＡ）をコードする第２の導入遺伝子を含み、その結果、ＨＬＡは、標的抗原のエピトープとの複合体において操作されたＡＰＣの表面上で発現される。特定の具体的な態様では、操作されたＡＰＣで発現されるＨＬＡは、ＨＬＡ－Ａ２である。
いくつかの態様では、実施形態の操作されたＡＰＣは、共刺激分子をコードする少なくとも第３の導入遺伝子を更に含むことができる。共刺激分子は、膜結合型Ｃγサイトカインであり得る共刺激サイトカインであり得る。特定の態様では、共刺激サイトカインは、膜結合型ＩＬ－１５などのＩＬ－１５である。いくつかの更なる態様では、操作されたＡＰＣは、編集された（又は欠失された）遺伝子を含むことができる。例えば、ＰＤ－１、ＬＩＭ－３、ＣＴＬＡ－４、又はＴＣＲなどの阻害遺伝子を編集して、遺伝子の発現を低減又は除去することができる。実施形態の操作されたＡＰＣは、目的の任意の標的抗原をコードする導入遺伝子を更に含むことができる。例えば、標的抗原は、感染症抗原又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり得る。
Ｃ．迅速な製造
本開示の一実施形態では、本明細書に記載の免疫エフェクター細胞は、ポイントオブケア部位で修飾される。本開示の一実施形態では、本明細書に記載の免疫エフェクター細胞は、ポイントオブケア部位において、又はその付近で修飾される。いくつかの場合、修飾された免疫エフェクター細胞は、操作されたＴ細胞とも称される。いくつかの場合、施設又は治療部位は、病院、施設（例えば、医療施設）、又は治療を必要とする対象の近くの治療部位である。対象は、アフェレーシスを受け、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又はＰＢＭＣのサブ集団は、例えば、溶出又はＦｉｃｏｌｌ分離によって濃縮することができる。濃縮されたＰＢＭＣ又はＰＢＭＣのサブ集団は、更なる処理の前に、任意の適切な凍結保存溶液中で凍結保存することができる。一例では、溶出プロセスは、ヒト血清アルブミンを含有する緩衝液を使用して実施される。Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、本明細書に記載される選択方法によって単離され得る。一例では、Ｔ細胞の選択方法は、ＣＤ３に特異的なビーズ、又はＴ細胞上のＣＤ４及びＣＤ８に特異的なビーズを含む。１つの場合、ビーズは、常磁性ビーズであってもよい。採取した免疫エフェクター細胞は、修飾前に任意の適切な凍結保存溶液中で凍結保存することができる。免疫エフェクター細胞は、注入の２４時間、３６時間、４８時間、７２時間又は９６時間前まで解凍することができる。解凍された細胞は、修飾前に、細胞培養緩衝液、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）若しくはヒト血清ＡＢを補充した細胞培養緩衝液（例えば、ＲＰＭＩ）中に入れることができるか、又はＩＬ－２及びＩＬ－２１などのサイトカインを含む緩衝液中に入れることができる。別の態様では、採取された免疫エフェクター細胞は、凍結保存を必要とせずに直ちに修飾することができる。一態様では、洗浄工程は完全に排除される。
いくつかの場合、免疫エフェクター細胞は、１つ以上のｍｉＲＮＡ、キメラ受容体、１つ以上の細胞タグ、及び／又はサイトカインを免疫エフェクター細胞に操作／導入することによって修飾され、次いで、対象に迅速に注入される。いくつかの場合、免疫エフェクター細胞の供給源には、同種異系源及び自己由来源の両方が含まれ得る。１つの場合、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞であり得る。１つの場合、キメラ受容体は、ＣＡＲであり得る。別の場合、サイトカインは、ＩＬ－１５（例えば、ＩＬ－１５Ｒαを有する融合タンパク質の一部として）又はＩＬ－１２であり得る。更に別の場合、サイトカインの発現は、本明細書に記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチ発現系によって調節される。例えば、ベレディメックス（ｖｅｌｅｄｉｍｅｘ）などのリガンドを対象に送達して、サイトカインの発現を調節することができる。
別の態様では、ベレディメックスは、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、又は１００ｍｇで提供される。更なる態様では、より低用量のベレディメックス、例えば、０．５ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、又は２０ｍｇが提供される。一実施形態では、ベレディメックスは、修飾された免疫エフェクター細胞の注入の０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１日前に対象に投与される。更なる実施形態では、ベレディメックスは、修飾された免疫エフェクター細胞の注入後の対象に、約１２時間に１回、約２４時間に１回、約３６時間に１回又は約４８時間に１回、有効期間投与される。一実施形態では、ベレディメックス投与の有効期間は、約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日である。他の実施形態では、ベレディメックスは、休薬期間の後、薬物休薬の後、又は対象が再発を経験したときに再投与することができる。
特定の場合、対象に対する有害作用が観察されるか、又は治療が必要でない場合、細胞タグは、例えば、セツキシマブを介して、本明細書に記載されるような切頭上皮成長因子受容体タグなどの細胞タグを含む修飾された免疫エフェクター細胞の条件付きインビボアブレーションのために活性化することができる。
いくつかの実施形態では、そのような免疫エフェクター細胞は、本明細書に記載される構築物によってエレクトロポレーションによって修飾される。一例では、エレクトロポレーションは、ＬｏｎｚａのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）エレクトロポレーターなどのエレクトロポレーターを用いて実施される。他の実施形態では、上記構築物を含むベクターは、非ウイルス又はウイルスベクターである。１つの場合、非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン－トランスポザーゼ系を含む。一例では、免疫エフェクター細胞は、特定の配列を使用してエレクトロポレーションされる。例えば、免疫エフェクター細胞は、１つのトランスポゾン、続いてトランスポザーゼをコードするＤＮＡ、続いて第２のトランスポゾンでエレクトロポレーションすることができる。別の例では、免疫エフェクター細胞は、全てのトランスポゾン及びトランスポザーゼと同時にエレクトロポレーションすることができる。別の例では、免疫エフェクター細胞は、トランスポザーゼ、続いて一度に両方のトランスポゾン又は１つのトランスポゾンでエレクトロポレーションすることができる。連続的なエレクトロポレーションを受けている間、免疫エフェクター細胞は、次のエレクトロポレーション工程の前に一定期間休止することができる。
いくつかの場合、修飾された免疫エフェクター細胞は、増殖及び活性化工程を受けない。いくつかの場合、修飾された免疫エフェクター細胞は、インキュベーション又は培養工程（例えば、エクスビボ増殖）を受けない。いくつかの場合、修飾された免疫エフェクター細胞は、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液中に入れられる。特定の場合、修飾された免疫エフェクター細胞は、注入前に、ＩＬ－２及びＩＬ－２１を含む緩衝液中に入れられる。他の例では、修飾された免疫エフェクター細胞は、注入前に、細胞培養緩衝液、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充した細胞培養緩衝液（例えば、ＲＰＭＩ）中に入れられるか、又は休止させられる。注入前に、修飾された免疫エフェクター細胞を回収し、洗浄し、対象への注入の準備として生理食塩水緩衝液中で製剤化することができる。
一例では、対象は注入前にリンパ球が枯渇されている。他の例では、リンパ球枯渇は必要とされず、修飾された免疫エフェクター細胞は、対象に迅速に注入される。
更なる例では、対象は最小限のリンパ球枯渇を受ける。本明細書における最小限のリンパ球枯渇は、対象がリンパ球枯渇レジメンの後１日、２日、又は３日以内に注入され得るように、低減されたリンパ球枯渇プロトコルを指す。一例では、低減されたリンパ球枯渇プロトコルは、低用量のフルダラビン及び／又はシクロホスファミドを含むことができる。別の例では、低減されたリンパ球枯渇プロトコルは、短縮されたリンパ球枯渇期間、例えば、１日又は２日を含むことができる。
いくつかの実施形態では、対象は、注入前にリンパ球が枯渇されていない。
一実施形態では、免疫エフェクター細胞は、１つ以上のｍｉＲＮＡ、キメラ受容体、及びサイトカインを当該免疫エフェクター細胞に操作／導入することによって修飾され、次いで、対象に迅速に注入される。他の場合、免疫エフェクター細胞は、１つ以上のｍｉＲＮＡ、キメラ受容体及びサイトカインを当該細胞に操作／導入することによって修飾され、次いで、少なくとも０、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０時間以内に対象に注入される。他の場合、免疫エフェクター細胞は、１つ以上のｍｉＲＮＡ、キメラ受容体、及びサイトカインを免疫エフェクター細胞に操作／導入することによって修飾され、次いで、対象に０日、１日未満、２日未満、３日未満、４日未満、５日未満、６日未満、又は７日未満で注入される。
他の実施形態では、操作された細胞の増殖及び／又は生存を刺激する方法は、対象から細胞の試料を得ることと、細胞の試料の細胞を、１つ以上のトランスポゾンを含む１つ以上のポリヌクレオチドでトランスフェクトすることと、を含む。一実施形態では、トランスポゾンは、１つ以上のｍｉＲＮＡ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１つ以上の細胞タグ、及び当該１つ以上のポリヌクレオチドを当該細胞のゲノムに組み込むのに有効なトランスポザーゼをコードして、操作された細胞の集団を提供する。一実施形態では、トランスポゾンは、１つ以上のｍｉＲＮＡ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１つ以上の細胞タグ、サイトカインのリガンド誘導制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、及び当該１つ以上のポリヌクレオチドを当該細胞のゲノムに組み込むのに有効なトランスポザーゼをコードして、操作された細胞の集団を提供する。一実施形態では、遺伝子スイッチポリペプチドは、ｉ）第１の核受容体リガンド結合ドメインに融合したＤＮＡ結合ドメインを含む第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、ｉｉ）第２の核受容体リガンド結合ドメインに融合したトランス活性化ドメインを含む第２の遺伝子スイッチポリペプチドと、を含む。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子スイッチポリペプチド及び第２の遺伝子スイッチポリペプチドは、リンカーによって接続されている。一例では、操作された細胞を対象に投与する前に、リンパ球枯渇は必要ではない。
一例では、操作された細胞のインビボ増殖方法は、対象から細胞の試料を得ることと、細胞の試料の細胞を、１つ以上のトランスポゾンを含む１つ以上のポリヌクレオチドでトランスフェクトすることと、を含む。一実施形態では、トランスポゾンは、１つ以上のｍｉＲＮＡ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１つ以上の細胞タグ、及び当該１つ以上のポリヌクレオチドを当該細胞のゲノムに組み込むのに有効なトランスポザーゼをコードして、操作された細胞の集団を提供する。一実施形態では、トランスポゾンは、１つ以上のｍｉＲＮＡ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１つ以上の細胞タグ、サイトカインのリガンド誘導制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、及び当該１つ以上のポリヌクレオチドを当該細胞のゲノムに組み込むのに有効なトランスポザーゼをコードして、操作された細胞の集団を提供する。一実施形態では、遺伝子スイッチポリペプチドは、ｉ）第１の核受容体リガンド結合ドメインに融合したＤＮＡ結合ドメインを含む第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、ｉｉ）第２の核受容体リガンド結合ドメインに融合したトランス活性化ドメインを含む第２の遺伝子スイッチポリペプチドと、を含む。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子スイッチポリペプチド及び第２の遺伝子スイッチポリペプチドは、リンカーによって接続されている。一例では、操作された細胞を対象に投与する前に、リンパ球枯渇は必要ではない。
別の実施形態では、操作された細胞のインビボ持続性を増強することを必要とする対象における操作された細胞のインビボ持続性を増強する方法は、対象から細胞の試料を得ることと、細胞の試料の細胞を、１つ以上のトランスポゾンを含む１つ以上のポリヌクレオチドでトランスフェクションすることと、を含む。いくつかの場合、１つ以上のトランスポゾンは、１つ以上のｍｉＲＮＡ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１つ以上の細胞タグ、及びＤＮＡを当該細胞のゲノムに組み込むのに有効なトランスポザーゼをコードして、操作された細胞の集団を提供する。いくつかの場合、１つ以上のトランスポゾンは、１つ以上のｍｉＲＮＡ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１つ以上の細胞タグ、サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、及びＤＮＡを当該細胞のゲノムに組み込むのに有効なトランスポザーゼをコードして、操作された細胞の集団を提供する。いくつかの場合、遺伝子スイッチポリペプチドは、ｉ）第１の核受容体リガンド結合ドメインに融合したＤＮＡ結合ドメインを含む第１の遺伝子スイッチポリペプチド、及びｉｉ）第２の核受容体リガンド結合ドメインに融合したトランス活性化ドメインを含む第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、第１の遺伝子スイッチポリペプチド及び第２の遺伝子スイッチポリペプチドは、リンカーによって接続されている。一例では、操作された細胞を対象に投与する前に、リンパ球枯渇は必要ではない。
ＸＩＩＩ．キット及び組成物
本開示の一態様は、ＣＡＲ、サイトカイン、細胞タグ、及び／若しくは前述の１つ以上のｍｉＲＮＡ、又はそれをコードする核酸を含むキット及び組成物に関する。別の態様では、キット及び組成物は、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチ成分を含むことができる。これらのキット及び組成物は、異なるタンパク質又はタンパク質のサブセットを各々コードする複数のベクターを含むことができる。これらのベクターは、ウイルス、非ウイルス、エピソーム、又は組み込みであり得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、トランスポゾン、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。他の実施形態では、ベクターは、セリンリコンビナーゼ媒介性組み込みのための配列を含むことができる。
いくつかの実施形態では、キット及び組成物は、ベクターだけではなく、インターロイキン、サイトカイン、インターロイキン及び化学療法剤、アジュバント、湿潤剤、又は乳化剤などの細胞及び薬剤も含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。一実施形態では、キット及び組成物は、ＩＬ－２を含む。一実施形態では、キット及び組成物は、ＩＬ－２１を含む。一実施形態では、キット及び組成物は、Ｂｃｌ－２、ＳＴＡＴ３又はＳＴＡＴ５阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、キットは、例えば、ＩＬ－１５Ｒαとの融合タンパク質の一部として、ＩＬ－１５を含む。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載される１つ以上の方法と共に使用するためのキット及び製造物品である。このようなキットは、１つ以上の容器、例えば、バイアル、チューブなどを受けるように区画化された担体、包装、又は容器も含み、容器の各々は、本明細書に記載される方法において使用される、別々のエレメントのうちの１つを含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。一実施形態では、容器は、様々な材料、例えば、ガラス又はプラスチックから形成される。
本明細書で提供される製造品は、包装材料を含む。医薬品包装材料の例には、ブリスターパック、ボトル、チューブ、バッグ、容器、ボトル、並びに選択された製剤並びに意図した投与及び治療の様式のために好適な任意の包装材料が含まれるが、これらに限定されない。
例えば、容器は、ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、本明細書に記載のＭＵＣ１６－、ＣＤ３３－、及びＲＯＲ１－特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞）、並びに任意選択的に、本明細書に開示されるサイトカイン及び／又は化学療法剤に加えて、ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。このようなキットは、任意選択的に、本明細書に記載される方法におけるその使用に関連する特定の説明又はラベル又は使用説明書を含む。
キットは、典型的には、内容物を列挙するラベル及び／又は使用のための使用説明書、並びに使用のための使用説明書を有する添付文書を含む。使用説明書のセットもまた、典型的には含められる。
いくつかの実施形態では、ラベルは、容器上にあるか、又は容器と関連付けられている。一実施形態では、ラベルは、ラベルを形成する文字、数字、又は他の特徴が、容器自体に貼り付けられ、成形され、又はエッチングされるとき、容器上にあり、ラベルは、例えば、添付文書として、また、容器を保持するレセプタクル又はキャリア内に存在するとき、容器と関連付けられる。一実施形態では、ラベルは、内容物が特定の治療用途のために使用されることを示すために使用される。ラベルはまた、本明細書に記載される方法のように、内容物の使用のための指示を示す。
本発明はまた、上記のような修飾された免疫エフェクター細胞を含む医薬組成物に関する。特定の実施形態では、組成物は、１つ以上のｍｉＲＮＡ、ＣＡＲ、１つ以上の細胞タグ、及び／又は１つ以上のサイトカイン、並びに任意選択的に、本明細書に記載の遺伝子スイッチ系の成分を含む配列で修飾された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む。特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン及びＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼで修飾される。例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン又はトランスポゾンは、１つ以上のｍｉＲＮＡ、ＣＡＲ、１つ以上の細胞タグ、１つ以上のサイトカイン、及び任意選択的に、本明細書に記載の遺伝子スイッチ系の成分を含むことができる。したがって、いくつかの例では、修飾されたＴ細胞は、ＣＡＲ媒介性Ｔ細胞応答を誘発することができる。
本明細書に記載されるように活性化及び拡大された細胞は、免疫不全の個体に生じる疾患の治療及び予防に利用され得る。特に、本発明の修飾されたＴ細胞は、悪性腫瘍の治療に使用される。特定の実施形態では、本発明の細胞は、悪性腫瘍を発症するリスクのある患者の治療に使用される。したがって、悪性腫瘍の治療又は予防のための方法は、その治療又は予防を必要とする対象に、治療有効量の本発明の修飾されたＴ細胞を投与することを含む。実施形態では、本明細書に記載されるように活性化及び拡大された細胞は、悪性腫瘍の治療に利用され得る。
エクスビボ免疫化の観点から細胞ベースのワクチンを使用することに加えて、本発明はまた、患者の抗原に対して指向される免疫応答を誘発するためのインビボ免疫化のための組成物及び方法を提供する。
簡潔に述べると、本明細書に記載される医薬組成物は、１つ以上の薬学的又は生理学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載される修飾された免疫エフェクター細胞を含む集団を含むことができる。このような組成物は、中性緩衝食塩水、ホスフェート緩衝食塩水などの緩衝液、グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物、タンパク質、ポリペプチド又はグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、及び防腐剤を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、静脈内投与のために製剤化される。
本明細書に記載される医薬組成物は、治療される（又は予防される）疾患に適切な様式で投与され得る。投与の量及び頻度は、患者の状態、並びに患者の疾患のタイプ及び重症度などの要因によって決定される。
「免疫学的に有効な量」又は「治療量」が示される場合、投与される本明細書に記載の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、及び状態の個々の差異を考慮して医師によって決定され得る。本明細書に記載されるＴ細胞を含む医薬組成物は、それらの範囲内の全ての整数値を含む、１０４～１０９個の細胞／ｋｇ体重、１０５～１０６個の細胞／ｋｇ体重の用量で投与され得ると一般に述べることができる。Ｔ細胞組成物はまた、これらの用量で複数回投与されてもよい。細胞は、免疫療法において一般的に知られている注入技術を使用することによって投与され得る（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６，（１９８８）を参照されたい）。特定の患者のための最適な投与量及び治療レジームは、疾患の徴候について患者を監視し、それに応じて治療を調整することによって、医学の当業者によって容易に決定され得る。
特定の実施形態では、活性化されたＴ細胞を対象に投与し、その後、血液を再採取し（又はアフェレーシスを実施し）、そこからＴ細胞を活性化し、これらの活性化され、拡大されたＴ細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間ごとに複数回実行され得る。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、１０ｃｃ～４００ｃｃの採血から活性化され得る。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、又は１００ｃｃの採血から活性化される。理論に拘束されないために、この複数回の採血／複数回の再注入プロトコルを使用することは、Ｔ細胞の特定の集団を選択するのに役立つことができる。別の実施形態では、放射線療法又は化学療法のいずれかにより、患者のリンパ球枯渇後に、対象組成物の活性化されたＴ細胞を投与することが所望され得る。
本明細書に記載される製剤は、酸化防止剤、金属キレート剤、チオール含有化合物、及び他の一般的な安定化剤から利益を得ることができる。このような安定化剤の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ａ）約０．５％～約２％ｗ／ｖのグリセロール、（ｂ）約０．１％～約１％ｗ／ｖのメチオニン、（ｃ）約０．１％～約２％ｗ／ｖのモノチオグリセロール、（ｄ）約１ｍＭ～約１０ｍＭのＥＤＴＡ、（ｅ）約０．０１％～約２％ｗ／ｖのアスコルビン酸、（ｆ）０．００３％～約０．０２％ｗ／ｖのポリソルベート８０、（ｇ）０．００１％～約０．０５％ｗ／ｖのポリソルベート２０、（ｈ）アルギニン、（ｉ）ヘパリン、（ｊ）デキストラン硫酸塩、（ｋ）シクロデキストリン、（ｌ）ペントサンポリサルフェート及び他のヘパリノイド、（ｍ）マグネシウム及び亜鉛などの二価カチオン、又は（ｎ）それらの組み合わせ。
「担体」又は「担体材料」は、薬学における任意の一般的に使用される賦形剤を含み、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、ベクター、及び／又は細胞との適合性、並びに所望の剤形の放出プロファイル特性に基づいて選択されるべきである。例示的な担体材料としては、例えば、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定剤、潤滑剤、湿潤剤、希釈剤などが挙げられる。「薬学的に適合する担体材料」としては、アカシア、ゼラチン、コロイド状の二酸化ケイ素、グリセロホスフェートカルシウム、乳酸カルシウム、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コレステロール、コレステロールエステル、カゼインナトリウム、大豆レシチン、タウロコール酸、ホスホチジルコリン、塩化ナトリウム、リン酸トリカルシウム、リン酸二カリウム、セルロース及びセルロースコンジュゲート、ステアロイルラクチル酸ナトリウム、カラゲナン、モノグリセリド、ジグリセリド、アルファ化デンプンなどが挙げられ得るが、これらに限定されない。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ Ｅｄ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）、Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １９７５、Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０、及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ １９９９）を参照されたい。
「分散剤」及び／又は「粘度調整剤」は、液体媒体又は造粒法若しくはブレンド法を介して薬物の拡散及び均一性を制御する材料を含む。いくつかの実施形態では、これらの薬剤はまた、コーティング又は侵食マトリックスの有効性を促進する。例示的な拡散促進剤／分散剤としては、例えば、親水性ポリマー、電解質、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０又は８０、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ；市販のＰｌａｓｄｏｎｅ（登録商標）として知られている）、並びに炭水化物ベースの分散剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、ＨＰＣ、ＨＰＣ－ＳＬ、及びＨＰＣ－Ｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば、ＨＰＭＣ Ｋ１００、ＨＰＭＣ Ｋ４Ｍ、ＨＰＭＣ Ｋ１５Ｍ、及びＨＰＭＣ Ｋ１００Ｍ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルプロピルメチルセルロースフタル酸塩、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート（ＨＰＭＣＡＳ）、非結晶性セルロース、アルミニウムケイ酸マグネシウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、エチレンオキシドとの４－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）－フェノールポリマー、及びホルムアルデヒド（チロキサポールとしても知られる）、ポロキサマー（例えば、エチレンオキシド及びプロピレンオキシドのブロックコポリマーであるＰｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ６８（登録商標）、Ｆ８８（登録商標）、及びＦ１０８（登録商標））、並びにポロキサミン（例えば、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ ９０８（登録商標）、Ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ ９０８（登録商標）としても知られており、これは、プロピレンオキシド及びエチレンオキシドをエチレンジアミンに連続的に添加することから誘導されるテトラ官能性ブロックコポリマー（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）である）、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、又はポリビニルピロリドンＫ３０、ポリビニルピロリドン／ビニルアセテートコポリマー（Ｓ－６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは、約３００～約６０００、又は約３３５０～約４０００、又は約７０００～約５４００の分子量を有することができる）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリソルベート－８０、アルギン酸ナトリウム、例えば、トラガカントガム及びアカシアガムなどのガム、グアーガム、キサンタンガムを含むキサンタン、糖、セルロース、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート－８０、アルギン酸ナトリウム、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポビドン、カルボマー、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アルギン酸塩、キトサン、並びにそれらの組み合わせなどが挙げられる。セルロース又はトリエチルセルロースなどの可塑剤も分散剤として使用することができる。リポソーム分散液及び自己乳化分散液に特に有用な分散剤は、ジミリストイルホスファチジルコリン、卵由来の天然ホスファチジルコリン、卵由来の天然ホスファチジルグリセロール、コレステロール、及びミリスチン酸イソプロピルである。
１つ以上の侵食促進剤と１つ以上の拡散促進剤との組み合わせも、本組成物で使用することができる。
「希釈剤」という用語は、送達前に目的の化合物を希釈するために使用される化合物を指す。希釈剤は、より安定した環境を提供することができるため、化合物を安定させるために使用することもできる。緩衝溶液中に溶解された塩（ｐＨ制御又は維持を提供することもできる）は、リン酸緩衝生理食塩水溶液を含むが、これらに限定されない当該技術分野における希釈剤として利用される。特定の実施形態では、希釈剤は、圧縮を容易にするために組成物のバルクを増加させるか、又はカプセル充填のための均質ブレンドのために十分なバルクを生成する。そのような化合物としては、例えば、ラクトース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）などの微結晶性セルロース；リン酸二塩基カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物；リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム；無水乳糖、噴霧乾燥ラクトース；アルファ化デンプン、圧縮糖、例えば、Ｄｉ－Ｐａｃ（登録商標）（Ａｍｓｔａｒ）；マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート、スクロース系希釈剤、製菓子糖；一塩基性硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物；乳酸カルシウム三水和物、デキストレート；加水分解シリアル固形物、アミロース；粉末セルロース、炭酸カルシウム；グリシン、カオリン；マンニトール、塩化ナトリウム；イノシトール、ベントナイトなどが挙げられる。
「充填剤」としては、ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸二塩基カルシウム、硫酸カルシウム、微結晶セルロース、セルロース粉末、デキストロース、デキストラート、デキストラン、デンプン、アルファ化デンプン、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコールなどの化合物が挙げられる。
「滑沢剤」及び「流動促進剤」は、材料の接着又は摩擦を防止、低減又は阻害する化合物である。例示的な滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、水酸化カルシウム、タルク、ステアリルフュメレート（ｆｕｍｅｒａｔｅ）ナトリウム、鉱油などの炭化水素、又は水素化大豆油（Ｓｔｅｒｏｔｅｘ（登録商標））などの水素化植物油、高脂肪酸並びにそれらのアルカリ金属及びアルカリ土類金属塩、例えば、アルミニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール、タルク、ワックス、Ｓｔｅａｒｏｗｅｔ（登録商標）、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ－４０００）、又はＣａｒｂｏｗａｘ（商標）などのメトキシポリエチレングリコール、オレイン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ベヘン酸グリセリル、ポリエチレングリコール、マグネシウム又はラウリル硫酸ナトリウム、Ｓｙｌｏｉｄ（商標）などのコロイドシリカ、Ｃａｂ－Ｏ－Ｓｉｌ（登録商標）、コーンスターチなどのデンプン、シリコーン油、界面活性剤などが挙げられる。
「可塑剤」は、マイクロカプセル化材料又はフィルムコーティングを軟化させて脆性を低下させるために使用される化合物である。好適な可塑剤としては、例えば、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３３５０、及びＰＥＧ８００などのポリエチレングリコール、ステアリン酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロース、並びにトリアセチンが挙げられる。いくつかの実施形態では、可塑剤は、分散剤又は湿潤剤としても機能することができる。
「可溶化剤」としては、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ドキュセートナトリウム、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン、Ｎ－ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ｎ－ブタノール、イソプロピルアルコール、コレステロール、胆汁塩、ポリエチレングリコール２００－６００、グリコフロール、トランスキュトール、プロピレングリコール、及びジメチルイソルビドなどの化合物が挙げられる。
「安定剤」としては、任意の抗酸化剤、緩衝液、酸、保存剤などの化合物が挙げられる。
「懸濁剤」としては、ポリビニルピロリドン、例えば、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、又はポリビニルピロリドンＫ３０、ビニルピロリドン／ビニルアセテートコポリマー（Ｓ６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは、約３００～約６０００、又は約３３５０～約４０００、又は約７０００～約５４００の分子量を有し得る）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースアセテートステアレート、ポリソルベート－８０、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、例えば、トラガカントガム及びアカシアガムなどのガム、グアーガム、キサンタンガムを含むキサンタン、糖、セルロース、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリソルベート－８０、アルギン酸ナトリウム、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポビドンなどの化合物が挙げられる。
「界面活性剤」としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ドキュセートナトリウム、Ｔｗｅｅｎ ６０又は８０、トリアセチン、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート、ポラキソマー、胆汁塩、グリセリルモノステアレート、エチレンオキシドとプロピレンオキシドのコポリマー、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＢＡＳＦ）などの化合物が挙げられる。他のいくつかの界面活性剤としては、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリド及び植物油、例えば、ポリオキシエチレン（６０）水素化ヒマシ油、並びにポリオキシエチレンアルキルエーテル及びアルキルフェニルエーテル、例えば、オクトキシノール１０、オクトキシノール４０が挙げられる。いくつかの実施形態では、物理的安定性を向上させるため、又は他の目的のために、界面活性剤を含むことができる。
「粘度増強剤」としては、例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、カルボマー、ポリビニルアルコール、アルギン酸塩、アカシア、キトサン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
「湿潤剤」としては、オレイン酸、モノステアリン酸グリセリル、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ドクセートナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ドキュセートナトリウム、トリアセチン、Ｔｗｅｅｎ ８０、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、アンモニウム塩などの化合物が挙げられる。
ＸＩＶ．治療方法
本発明はまた、疾患又は障害を治療する方法であって、本開示の修飾された免疫エフェクター細胞を、その治療を必要とする対象に投与することを含む、方法に関する。特定の態様では、細胞は、治療有効量で投与される。
本発明はまた、疾患又は障害の治療のための医薬品の製造における、本開示の修飾された免疫エフェクター細胞の使用に関する。
いくつかの実施形態では、疾患は、がんであり得る。特定の態様では、がんは、血液学的腫瘍又は固形腫瘍であり得る。他の場合、がんは、血液学的悪性腫瘍である。いくつかの場合、がんは、転移性がんである。いくつかの場合、がんは、再発がん又は難治性がんである。特定の態様では、がんは、Ｂ細胞がん、例えば、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、例えば、アルファ鎖病、ガンマ鎖病、及びミュー鎖病など、良性単クローン性ガンマグロブリン血症、並びに免疫球性アミロイドーシス、黒色腫、乳がん、肺がん、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん（例えば、転移性、ホルモン不応性前立腺がん）、膵がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳又は中枢神経系がん、末梢神経系がん、食道がん、子宮頸がん、子宮又は子宮内膜がん、口腔又は咽頭のがん、肝臓がん、腎臓がん、精巣がん、胆道がん、小腸又は虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液学的組織のがんなどから選択される。本開示の方法によって治療され得るがんの型の他の非限定的な例には、ヒトの肉腫及びがん腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、結腸直腸がん、膵がん、乳がん、ビースト腺がん、例えば、トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、扁平上皮細胞がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、ヘパトーマ、胆管がん、肝臓がん、肝細胞がん（ＨＣＣ）、絨毛がん、精上皮腫、胎児性がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、骨がん、脳腫瘍、精巣がん、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫；白血病、例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、及び急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性及び赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ球性白血病）；びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫；並びに真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、及び重鎖病が挙げられる。
いくつかの例では、がんは、固形腫瘍である。例示的な固形腫瘍としては、肛門がん、虫垂がん、胆管がん（すなわち、胆管細胞がん）、膀胱がん、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、未知の原発がん（ＣＵＰ）、食道がん、眼がん、卵管がん、胃腸がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、髄芽腫、黒色腫、口腔がん、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、直腸がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、咽頭がん、甲状腺がん、子宮がん、膣がん、又は外陰がんが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの例では、がんは、血液学的悪性腫瘍である。いくつかの場合、血液学的悪性腫瘍は、リンパ腫、白血病、骨髄腫、又はＢ細胞悪性腫瘍を含む。いくつかの場合、血液学的悪性腫瘍は、リンパ腫、白血病又は骨髄腫を含む。いくつかの例では、例示的な血液学的悪性腫瘍としては、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、高リスクＣＬＬ、非ＣＬＬ／ＳＬＬリンパ腫、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ヴァルデンストロームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、結節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、非バーキット高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾性辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、又はリンパ腫様肉芽腫症が挙げられる。いくつかの実施形態では、血液学的悪性腫瘍は、骨髄性白血病を含む。いくつかの実施形態では、血液学的悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む。
いくつかの例では、本明細書に開示されるのは、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、高リスクＣＬＬ、非ＣＬＬ／ＳＬＬリンパ腫、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ヴァルデンストロームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、結節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、非バーキット高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾性辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、又はリンパ腫様肉芽腫症から選択される血液学的悪性腫瘍を有する対象に、本明細書に記載される修飾されたエフェクター細胞を投与する方法である。いくつかの例では、本明細書に開示されるのは、ＡＭＬ又はＣＭＬから選択される血液学的悪性腫瘍を有する対象に、修飾されたエフェクター細胞を対象に投与する方法である。
なお他の実施形態では、上皮がんは、非小細胞肺がん、非乳頭状腎細胞がん、子宮頸がん、卵巣がん（例えば、漿液性卵巣がん）、又は乳がんである。漿液性、類内膜、粘液性、明細胞、ブレンナー、又は未分化型が含まれるが、これらに限定されない、上皮がんは、様々な他の方式で特徴付けられ得る。いくつかの実施形態では、本開示の方法及び組成物は、リンパ腫、又はマントル細胞リンパ腫が含まれるが、これに限定されない、そのサブタイプの治療、診断、及び／又は予後において使用される。
いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、抗原の過剰発現と関連している。特定の実施形態では、抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＲＯＲ１、ＭＵＣ１、又はＭＵＣ１６である。いくつかの実施形態では、疾患は、卵巣がん、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、障害、例えば、がんを有する対象に、本明細書に記載のポリペプチドを含む修飾されたエフェクター細胞を投与する方法である。いくつかの場合、がんは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、α－葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ－Ｆ、メソセリン、ＧＰＣ３、ＣＳＰＧ４、ＨＥＲ１／ＨＥＲ３、ＨＥＲ２、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／ｖ８、ＣＤ２０、ＣＤ１７４、ＣＤ１３８、Ｌ１－ＣＡＭ、ＦＡＰ、ｃ－ＭＥＴ、ＰＳＣＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＩＬ－１１Ｒα、ＥｐｈＡ２、ＣＬＬ－１、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、葉酸受容体α、ＭＵＣ１若しくはＭＵＣ１６などのムチン、ＭＡＧＥ－Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＣＳＰＧ４、ＴＡＧ－７２又はＶＥＧＦ－Ｒ２の発現と関連するがんである。
いくつかの実施形態では、疾患は、ＭＵＣ１６の過剰発現と関連している。特定のそのような実施形態では、疾患は、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、子宮内膜がん、又は肺がんである。
いくつかの実施形態では、疾患は、ＣＤ３３の過剰発現と関連している。特定のそのような実施形態では、疾患は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）又は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）である。
いくつかの実施形態では、疾患は、ＲＯＲ１の過剰発現と関連している。特定のそのような実施形態では、疾患は、血液学的腫瘍、例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を伴う。特定のそのような実施形態では、疾患は、固形腫瘍、例えば、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）、膵臓がん、卵巣がん、及び肺腺がんを包含する乳腺がんを伴う。
別の実施形態では、固形腫瘍を有する対象を治療する方法は、対象から細胞の試料を得ることと、試料の細胞を、１つ以上のトランスポゾンを含む１つ以上のポリヌクレオチドでトランスフェクトすることと、操作された細胞の集団を対象に投与することと、を含む。一例では、操作された細胞を対象に投与する前に、リンパ球枯渇は必要ではない。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾されたＴ細胞を拡大させ、周知のプロトコルに従って、事前調整リンパ球枯渇の有無にかかわらず治療された患者に移入することができる。いくつかの場合、１つ以上のトランスポゾンは、１つ以上のｍｉＲＮＡ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１つ以上の細胞タグ、及びＤＮＡを細胞のゲノムに組み込むのに有効なトランスポザーゼをコードする。いくつかの場合、１つ以上のトランスポゾンは、１つ以上のｍｉＲＮＡ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１つ以上の細胞タグ、サイトカインのリガンド誘導制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、及びＤＮＡを細胞のゲノムに組み込むのに有効なトランスポザーゼをコードする。いくつかの場合、遺伝子スイッチポリペプチドは、ｉ）第１の核受容体リガンド結合ドメインに融合したＤＮＡ結合ドメインを含む第１の遺伝子スイッチポリペプチド、及びｉｉ）第２の核受容体リガンド結合ドメインに融合したトランス活性化ドメインを含む第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、第１の遺伝子スイッチポリペプチド及び第２の遺伝子スイッチポリペプチドは、リンカーによって接続されている。いくつかの場合、細胞は、エレクトロポレーションを介してトランスフェクトされる。いくつかの場合、遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターによって調節される。いくつかの場合、プロモーターは、組織特異的プロモーター若しくはＥＦ１Ａプロモーター、又はその機能的バリアントである。いくつかの場合、組織特異的プロモーターは、Ｔ細胞特異的応答エレメント又はＮＦＡＴ応答エレメントを含む。いくつかの場合、サイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒ又はＩＬ－１５バリアントの融合体のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの場合、サイトカインは分泌形態である。いくつかの場合、サイトカインは膜結合形態である。いくつかの場合、細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞又はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの場合、細胞は対象に投与される（例えば、対象に操作された細胞を注入することによって）。いくつかの場合、方法は、サイトカインの発現を誘導するために、有効量のリガンド（例えば、ベレディメックス）を投与することを更に含む。いくつかの場合、トランスポザーゼは、サルモニド型Ｔｃ１様トランスポザーゼである。いくつかの場合、トランスポザーゼは、ＳＢ１１又はＳＢ１００ｘトランスポザーゼである。他の場合、トランスポザーゼは、ＰｉｇｇｙＢａｃである。いくつかの場合、細胞タグは、ＨＥＲ１切頭バリアント又はＣＤ２０切頭バリアントのうちの少なくとも１つを含む。
転移性黒色腫を有する患者で実施された研究は、養子細胞移植前のリンパ球枯渇が、インビトロ拡大腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）を用いた療法の有効性を劇的に改善することを実証した。Ｍｕｒａｎｓｋｉ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ－ｈｏｗ ｆａｒ ｃａｎ ｗｅ ｇｏ？”Ｎａｔ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ Ｏｎｃｏｌ．２００６；３（１２）：６６８－６８１。リンパ球枯渇は、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、ＩＬ－７、及びＩＬ－１５などの恒常性サイトカインのシンクを排除すること、調節性Ｔ細胞及び骨髄由来のサプレッサー細胞などの免疫抑制エレメントを根絶すること、共刺激分子を誘導すること、並びに腫瘍細胞におけるインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼを下方調節すること、並びに養子移入Ｔ細胞の拡大、機能、及び持続を促進することを含む、複数の機構によって機能する可能性がある。これらの経験は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法による臨床試験におけるリンパ球枯渇の使用につながった。Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒらは、リンパ球枯渇後の血清ＩＬ－１５レベルの増加と、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞療法後の臨床応答との間の関連性を示した。Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ＪＮ，ｅｔ ａｌ．，“Ｌｙｍｐｈｏｍａ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｅｒｕｍ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１５ ｌｅｖｅｌｓ，” Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１７；３５（１６）：１８０３－１８１３。Ｔｕｒｔｌｅらは、リンパ球枯渇レジメンにおけるシクロホスファミド（Ｃｙ／Ｆｌｕ）へのフルダラビンの添加が、非ホジキンリンパ腫を有する患者における非Ｆｌｕリンパ球枯渇レジメンと比較して、改善された抗ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞の拡大及び持続、並びにより良い臨床転帰と関連することを示した。Ｔｕｒｔｌｅ ＣＪ， ｅｔ ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｗｉｔｈ ａ ｄｅｆｉｎｅｄ ｒａｔｉｏ ｏｆ ＣＤ８＋ ａｎｄ ＣＤ４＋ ＣＤ１９－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ，” Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１６；（８）３５５－３５５ｒａ１１６。他の研究は、最初の１ヶ月間のピーク及び曲線下面積の両方に対するインビボでのＣＡＲ Ｔ細胞の拡大の大きさが、応答及び／又は耐久性と関連付けられ得ることを示した。Ｎｅｅｌａｐｕ ＳＳ，ｅｔ ａｌ．，“Ａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅ ｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌ ＣＡＲ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｌａｒｇｅ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ，”Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１７；３７７（２６）：２５３１－２５４４。
いくつかの実施形態では、対象は、修飾された免疫エフェクター細胞を対象に投与する工程の前に、リンパ球枯渇を受ける。本明細書で使用される場合、「リンパ球枯渇」は、例えば、リンパ球枯渇剤の投与によって、対象におけるリンパ球の数を減少させる方法を含む。リンパ球枯渇の例としては、骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法、骨髄破壊的リンパ球枯渇化学療法が挙げられる。リンパ球枯渇はまた、部分的な身体又は全身分画放射線療法によって達成することもできる。リンパ球枯渇剤は、哺乳動物に投与されたときに哺乳動物の機能的リンパ球の数を減少させることができる化合物又は組成物であり得る。このような薬剤の一例は、１つ以上の化学療法剤である。このような薬剤及び投薬量は既知であり、治療される対象に応じて治療医師によって選択され得る。リンパ球枯渇剤の例としては、フルダラビン、シクロホスファミド、クラドリビン、デニロイキンジフチトクス、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、対象は、修飾された免疫エフェクター細胞を対象に投与する工程の前に、リンパ球枯渇を受けない。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、約１０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約４０ｍｇ／ｋｇ～約８０ｍｇ／ｋｇ、例えば約６０ｍｇ／ｋｇの用量でシクロホスファミドを投与することによって実施される。このような実施形態では、シクロホスファミドは、約１０ｍｇ／ｍ２～約５０ｍｇ／ｍ２、好ましくは約２０ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、例えば約３０ｍｇ／ｍ２の用量でフルダラビンと同時に投与することができる。いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、約１０ｍｇ／ｍ２～約５０ｍｇ／ｍ２、好ましくは約２０ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、例えば、約３０ｍｇ／ｍ２の用量でフルダラビンを投与することによって実施される。このような実施形態では、フルダラビンは、約２００ｍｇ／ｍ２～約９００ｍｇ／ｍ２、好ましくは約４００～約６００ｍｇ／ｍ２、例えば、５００ｍｇ／ｍ２の用量でシクロホスファミドと同時に投与することができる。
いくつかの実施形態では、患者又は対象は、自己修飾された免疫エフェクター細胞を産生するために血液が採取される前にリンパ球枯渇されない。
いくつかの実施形態では、修飾された免疫エフェクター細胞は、対象に対して自己由来である。いくつかの実施形態では、修飾された免疫エフェクター細胞は、対象に対して同種異系である。
いくつかの実施形態では、投与を必要とする対象に投与される修飾された免疫エフェクター細胞の量、及びその量は、サイトカイン関連毒性を誘導する有効性及び可能性に基づいて判定される。
本明細書に記載される組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、インプラント、又は移植を含む、任意の都合の良い様式で行うことができる。本明細書に記載される組成物は、患者に、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、又は腹腔内で投与され得る。一実施形態では、本発明のＴ細胞組成物は、皮内又は皮下注射によって患者に投与される。別の実施形態では、本発明の免疫エフェクター細胞組成物は、ｉ．ｖ．注射によって投与される。Ｔ細胞の組成物は、リンパ節、又は原発腫瘍又は転移の部位に直接注射することができる。
患者に投与される上記治療の投薬量は、治療される状態の正確な性質及び治療のレシピエントによって変化する。ヒト投与のための投薬量のスケーリングは、当該技術分野で受け入れられている慣行に従って行うことができる。例えば、上記治療の用量は、１×１０４ＣＡＲ＋細胞／ｋｇ～５×１０６ＣＡＲ＋細胞／ｋｇの範囲であってもよい。例示的な用量は、１×１０２ＣＡＲ＋細胞／ｋｇ、１×１０３ＣＡＲ＋細胞／ｋｇ、１×１０４ＣＡＲ＋細胞／ｋｇ、１×１０５ＣＡＲ＋細胞／ｋｇ、３×１０５ＣＡＲ＋細胞／ｋｇ、１×１０６ＣＡＲ＋細胞／ｋｇ、５×１０６ＣＡＲ＋細胞／ｋｇ、１×１０７ＣＡＲ＋細胞／ｋｇ、１×１０８ＣＡＲ＋細胞／ｋｇ、又は１×１０９ＣＡＲ＋細胞／ｋｇであり得る。成人又は小児患者について、適切な用量をそれに応じて調整することができる。
代替的に、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与される免疫エフェクター細胞の典型的な量は、例えば、１００、１０００、１万、１００万～１０００億個の細胞の範囲内であり得るが、この例示的な範囲を下回るか、又は上回る量は、本発明の範囲内である。例えば、本発明の宿主細胞の用量は、約１００万～約５００億個の細胞（例えば、約５００万個の細胞、約２５００万個の細胞、約５億個の細胞、約１０億個の細胞、約５０億個の細胞、約２００億個の細胞、約３００億個の細胞、約４００億個の細胞、又は前述の値のうちのいずれか２つによって定義される範囲）、約１０００万～約１０００億個の細胞（例えば、約２０００万個の細胞、約３０００万個の細胞、約４０００万個の細胞、約６０００万個の細胞、約７０００万個の細胞、約８０００万個の細胞、約９０００万個の細胞、約１００億個の細胞、約２５０億個の細胞、約５００億個の細胞、約７５０億個の細胞、約９００億個の細胞、又は前述の値のうちのいずれか２つによって定義される範囲）、約１億個の細胞～約５００億個の細胞（例えば、約１億２０００万個の細胞、約２億５０００万個の細胞、約３億５０００万個の細胞、約４億５０００万個の細胞、約６億５０００万個の細胞、約８億個の細胞、約９億個の細胞、約３０億個の細胞、約３００億個の細胞、約４５０億個の細胞、又は前述の値のうちのいずれか２つによって定義される範囲）であり得る。
治療的又は予防的有効性は、治療された患者の定期的評価によって監視され得る。数日間以上にわたる反復投与については、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで治療は反復される。しかしながら、他の投与レジメンも有用であり得、本発明の範囲内である。所望の投薬量は、組成物の単回ボーラス投与、組成物の複数回ボーラス投与、又は組成物の連続注入投与によって送達することができる。
いくつかの実施形態では、修飾されたエフェクター細胞の量は、それを必要とする対象に投与され、その量は、サイトカイン関連毒性を誘導する有効性及び可能性に基づいて判定される。別の実施形態では、修飾されたエフェクター細胞は、ＣＡＲ＋及びＣＤ３＋細胞である。いくつかの場合、ある量の修飾されたエフェクター細胞は、約１０４～約１０９個の修飾されたエフェクター細胞／ｋｇを含む。いくつかの場合、ある量の修飾されたエフェクター細胞は、約１０４～約１０５個の修飾されたエフェクター細胞／ｋｇを含む。いくつかの場合、ある量の修飾されたエフェクター細胞は、約１０５～約１０６個の修飾されたエフェクター細胞／ｋｇを含む。いくつかの場合、ある量の修飾されたエフェクター細胞は、約１０６～約１０７個の修飾されたエフェクター細胞／ｋｇを含む。いくつかの場合では、ある量の修飾されたエフェクター細胞は、１０４超であるが、１０５以下の修飾されたエフェクター細胞／ｋｇを含む。いくつかの場合では、ある量の修飾されたエフェクター細胞は、１０５超であるが、１０６以下の修飾されたエフェクター細胞／ｋｇを含む。いくつかの場合では、ある量の修飾されたエフェクター細胞は、１０６超であるが、１０７以下の修飾されたエフェクター細胞／ｋｇを含む。
一実施形態では、修飾された免疫エフェクター細胞は、腫瘍組織への直接的な局所送達を介してがんを標的とする。例えば、卵巣がんでは、修飾された免疫エフェクター細胞を腹部又は腹腔に腹腔内（ＩＰ）送達することができる。そのようなＩＰ送達は、化学療法薬の送達のために配置されたポート又は既存のポートを介して行うことができる。修飾された免疫エフェクター細胞の局所送達の他の方法は、切除空洞へのカテーテル注入、超音波誘導腫瘍内注入、肝動脈注入又は胸膜内送達を含むことができる。
一実施形態では、治療を必要とする対象は、ＩＰを介して送達された修飾された免疫エフェクター細胞の１回目の用量、続いてＩＶを介して送達された修飾された免疫エフェクター細胞の２回目の用量で治療を開始することができる。更なる実施形態では、修飾された免疫エフェクター細胞の２回目の用量の後に、ＩＶ又はＩＰを介して送達され得る後続の用量が続くことができる。一実施形態では、１回目の用量と、２回目の用量又は更なる後続の用量との間の持続時間は、約：０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日であり得る。一実施形態では、１回目の用量と、２回目の用量又は更なる後続の用量との間の持続時間は、約：０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６ヶ月であり得る。別の実施形態では、１回目の用量と、２回目の用量又は更なる後続の用量との間の持続時間は、約：０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０年であり得る。
別の実施形態では、カテーテルを、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回用量の修飾された免疫エフェクター細胞の更なる投与のために、腫瘍又は転移部位に配置することができる。いくつかの場合、修飾されたエフェクター細胞の用量は、約１０２～約１０９個の修飾されたエフェクター細胞／ｋｇを含むことができる。毒性が観察される場合、修飾されたエフェクター細胞の用量は、約１０２～約１０５個の修飾されたエフェクター細胞／ｋｇを含むことができる。いくつかの場合、修飾されたエフェクター細胞の用量は、約１０２修飾されたエフェクター細胞／ｋｇで開始することができ、その後の用量は、約：１０４、１０５、１０６、１０７、１０８又は１０９個の修飾されたエフェクター細胞／ｋｇに増加させることができる。
開示された核酸配列を発現する免疫エフェクター細胞、又はそれらの核酸配列を含むベクターは、哺乳動物に同時投与することができる１つ以上の追加の治療剤と共に投与することができる。「同時投与すること」とは、１つ以上の追加の治療剤及び本発明の宿主細胞又は本発明のベクターを、１つ以上の追加の治療剤の効果を増強するのに十分に近い時間で投与すること、又はその逆を意味する。この点に関して、本明細書に記載の免疫エフェクター細胞又は本明細書に記載のベクターは、１つ以上の追加の治療剤と同時に投与することができるか、又は最初に投与して、１つ以上の追加の治療剤を次に投与することができ、又はその逆であってもよい。代替的に、本明細書に記載の開示された免疫エフェクター細胞又はベクター及び１つ以上の追加の治療剤を同時に投与することができる。
本発明の宿主細胞及び／又は本発明のベクターに含まれてもよく、又はそれと同時投与されてもよい治療剤の例は、インターロイキン、サイトカイン、インターフェロン、アジュバント、及び化学療法剤である。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－ベータ、ＩＦＮ－ガンマ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＬＴ－ベータ、ＴＮＦ－アルファ、成長因子、並びにｈＧＨ、ヒトＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、及びＴＬＲ１０のリガンドである。
Ａ．修飾された免疫エフェクター細胞の用量
いくつかの実施形態では、投与される修飾された免疫エフェクター細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０２～約１０９個の修飾されたエフェクター細胞を含む。いくつかの実施形態では、投与される修飾された免疫エフェクター細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０３～約１０９個の修飾されたエフェクター細胞を含む。いくつかの実施形態では、投与される修飾された免疫エフェクター細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０４～約１０９個の修飾されたエフェクター細胞を含む。いくつかの場合では、修飾されたエフェクター細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０９個の修飾されたエフェクター細胞を含む。いくつかの場合では、修飾されたエフェクター細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０８個の修飾されたエフェクター細胞を含む。いくつかの場合では、修飾されたエフェクター細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０７個の修飾されたエフェクター細胞を含む。いくつかの場合では、修飾されたエフェクター細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０９個の修飾されたエフェクター細胞を含む。いくつかの場合では、修飾されたエフェクター細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０８個の修飾されたエフェクター細胞を含む。いくつかの場合では、修飾されたエフェクター細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７～約１０９個の修飾されたエフェクター細胞を含む。いくつかの場合では、修飾されたエフェクター細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０６個の修飾されたエフェクター細胞を含む。いくつかの場合では、修飾されたエフェクター細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０７個の修飾されたエフェクター細胞を含む。いくつかの場合では、修飾されたエフェクター細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７～約１０８個の修飾されたエフェクター細胞を含む。いくつかの場合では、修飾されたエフェクター細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０８～約１０９個の修飾されたエフェクター細胞を含む。いくつかの例では、修飾されたエフェクター細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０９個の修飾されたエフェクター細胞を含む。いくつかの例では、修飾されたエフェクター細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０８個の修飾されたエフェクター細胞を含む。いくつかの例では、修飾されたエフェクター細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７個の修飾されたエフェクター細胞を含む。いくつかの例では、修飾されたエフェクター細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６個の修飾されたエフェクター細胞を含む。いくつかの例では、修飾されたエフェクター細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５個の修飾されたエフェクター細胞を含む。いくつかの例では、修飾されたエフェクター細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０４個の修飾されたエフェクター細胞を含む。いくつかの例では、修飾されたエフェクター細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０３個の修飾されたエフェクター細胞を含む。いくつかの例では、修飾されたエフェクター細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０２個の修飾されたエフェクター細胞を含む。
いくつかの実施形態では、修飾された免疫エフェクター細胞は、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞である。いくつかの例では、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、本明細書に記載される１つ以上のｍｉＲＮＡを更に含む。いくつかの場合では、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０４～約１０９個の修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０９個の修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０８個の修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０７個の修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０９個の修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０８個の修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７～約１０９個の修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０６個の修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０７個の修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７～約１０８個の修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０８～約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０９個の修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０８個の修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７個の修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６個の修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５個の修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。
いくつかの実施形態では、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞である。いくつかの場合では、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０８個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０７個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０８個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７～約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０７個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７～約１０８個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０８～約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０８個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。
いくつかの実施形態では、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞である。いくつかの場合では、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０８個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０７個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０８個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７～約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０７個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７～約１０８個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０８～約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０８個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。
いくつかの実施形態では、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＭＵＣ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞である。いくつかの場合では、ＭＵＣ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＭＵＣ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０８個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＭＵＣ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０７個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＭＵＣ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＭＵＣ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０８個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＭＵＣ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７～約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＭＵＣ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＭＵＣ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０７個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＭＵＣ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７～約１０８個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＭＵＣ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０８～約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＭＵＣ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＭＵＣ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０８個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＭＵＣ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＭＵＣ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＭＵＣ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。
いくつかの実施形態では、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞である。いくつかの場合では、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０８個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０７個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０８個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７～約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０７個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７～約１０８個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０８～約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０８個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。
いくつかの実施形態では、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞である。いくつかの場合では、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０８個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０７個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０８個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７～約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０７個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７～約１０８個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの場合では、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０８～約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０９個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０８個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。いくつかの例では、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５個のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。
いくつかの実施形態では、修飾されたＴ細胞は、操作されたＴＣＲ Ｔ細胞である。いくつかの場合では、操作されたＴＣＲ Ｔ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０９個のＴＣＲ細胞を含む。いくつかの場合では、操作されたＴＣＲ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０８個のＴＣＲ細胞を含む。いくつかの場合では、操作されたＴＣＲ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０７個のＴＣＲ細胞を含む。いくつかの場合では、操作されたＴＣＲ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０９個のＴＣＲ細胞を含む。いくつかの場合では、操作されたＴＣＲ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０８個のＴＣＲ細胞を含む。いくつかの場合では、操作されたＴＣＲ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７～約１０９個のＴＣＲ細胞を含む。いくつかの場合では、操作されたＴＣＲ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５～約１０６個のＴＣＲ細胞を含む。いくつかの場合では、操作されたＴＣＲ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６～約１０７個のＴＣＲ細胞を含む。いくつかの場合では、操作されたＴＣＲ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７～約１０８個のＴＣＲ細胞を含む。いくつかの場合では、操作されたＴＣＲ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０８～約１０９個のＴＣＲ細胞を含む。いくつかの例では、操作されたＴＣＲ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０９個のＴＣＲ細胞を含む。いくつかの例では、操作されたＴＣＲ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０８個のＴＣＲ細胞を含む。いくつかの例では、操作されたＴＣＲ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０７個のＴＣＲ細胞を含む。いくつかの例では、操作されたＴＣＲ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０６個のＴＣＲ細胞を含む。いくつかの例では、操作されたＴＣＲ細胞の量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０５個のＴＣＲ細胞を含む。
用量値もまた、緩和される状態のタイプ及び重症度によって変化する場合があることに留意されたい。任意の特定の対象に対する特定の投与レジメンは、個々のニーズ及び組成物の投与を投与又は監督する人の専門的判断に従って経時的に調整されるべきであり、本明細書に記載される投与範囲は例示的なものに過ぎず、特許請求される組成物の範囲又は実施を制限することを意図するものではないことを更に理解されたい。
いくつかの実施形態では、その表現型が本開示の方法によって決定されるがんは、上皮がん、例えば、限定されないが、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、婦人科がん、腎がん、喉頭がん、肺がん、口腔がん、頭頸部がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、又は皮膚がんである。他の実施形態では、がんは、乳がん、前立腺がん、肺がん、又は結腸がんである。
Ｂ．併用療法
特定の実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫エフェクター細胞及びその組成物は、単独で又は他の療法と共に、標準療法（化学療法、化学療法及び現在の臨床試験療法を含むが、これらに限定されない）に対して約０、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の平均奏効率を有するがんを治療するために使用され得る。そのようながんとしては、ホジキンリンパ腫、黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）高修復又はミスマッチ修復（ＭＭＲ）欠損固形腫瘍、ＣＳＣＣ、ＲＣＣ、ＣＲＣ、黒色腫、メルケル細胞がん、膀胱がん、ＲＣＣ、肝細胞がん（ＨＣＣ）、頭頸部がん（Ｈ＆Ｎ）、子宮頸がん、胃がん、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、子宮内膜がん、中皮腫、卵巣がん、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）、乳がん、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、膵臓がん、前立腺がんが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、追加の治療剤との併用療法として投与することができる。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、抗体などの生体分子を含む。例えば、治療は、本明細書に記載される修飾された免疫エフェクター細胞と、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、及び／又はＶＥＧＦに結合する抗体が含まれるが、これらに限定されない、腫瘍関連抗原に対する抗体との併用投与を含み得る。特定の実施形態では、追加の治療剤は、がん幹細胞マーカーに対して特異的な抗体である。特定の実施形態では、追加の治療剤は、血管新生阻害剤である抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体抗体）である。特定の実施形態では、追加の治療剤は、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、ラムシルマブ、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）、ペルツズマブ（ＯＭＮＩＴＡＲＧ）、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ）、ニモツズマブ、ザルツムマブ、又はセツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ）である。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、小分子などの薬剤を含む。例えば、治療は、本明細書に記載される修飾された免疫エフェクター細胞と、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、及び／又はＶＥＧＦが含まれるが、これらに限定されない、腫瘍関連抗原に対する阻害剤として作用する小分子との併用投与を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫エフェクター細胞は、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ）、ラパタニブ（ｌａｐａｔａｎｉｂ）、バンデタニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ）、ＡＥＥ７８８、ＣＩ－１０３３、セジラニブ（ＲＥＣＥＮＴＩＮ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ）、及びパゾパニブ（ＧＷ７８６０３４Ｂ）からなる群から選択されるタンパク質キナーゼ阻害剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ｍＴＯＲ阻害剤を含む。別の実施形態では、追加の治療剤は、化学療法又はＴＲＥＧ細胞の数を低減させる他の阻害剤である。特定の実施形態では、治療剤は、シクロホスファミド又は抗ＣＴＬＡ４抗体である。別の実施形態では、追加の治療は、骨髄由来サプレッサー細胞の存在を低減させる。更なる実施形態では、追加の治療は、カルボタキソール（ｃａｒｂｏｔａｘｏｌ）である。更なる実施形態では、追加の治療剤は、イブルチニブである。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、抗ＰＤ－１又は抗ＰＤＬ１阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上のチェックポイント阻害剤を、本明細書に記載の修飾された免疫エフェクター細胞と組み合わせて更に含むことができる。いくつかの実施形態では、追加のチェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体であり得る。抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、イピリムマブ）は、進行性黒色腫を有する参加者において持続的な抗腫瘍活性及び生存期間の延長を示し、その結果、２０１１年に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の承認を得た。Ｈｏｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｗｉｔｈ ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．（２０１０）Ａｕｇ １９；３６３（８）：７１１－２３を参照されたい。いくつかの実施形態では、１つ以上のチェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、全長アテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１）、アベルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１）、デュルバルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１）、又はそれらの断片若しくはバリアントであり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のチェックポイント阻害剤は、ＣＤ２７阻害剤、ＣＤ２８阻害剤、ＣＤ４０阻害剤、ＣＤ１２２阻害剤、ＣＤ１３７阻害剤、ＯＸ４０（ＣＤ１３４としても知られる）阻害剤、ＧＩＴＲ阻害剤、ＩＣＯＳ阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上であり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のチェックポイント阻害剤は、Ａ２ＡＲ阻害剤、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６としても知られる）阻害剤、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１としても知られる）阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＫＩＲ阻害剤、ＬＡＧ３阻害剤、ＴＩＭ－３阻害剤、ＶＩＳＴＡ阻害剤、又はこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上であり得る。
特定の実施形態では、追加の治療剤は、第２の免疫療法剤を含む。いくつかの実施形態では、追加の免疫療法剤には、コロニー刺激因子、インターロイキン、免疫抑制機能を遮断する抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体）、免疫細胞機能を増強する抗体（例えば、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ－４０抗体、抗ＣＤ４０抗体、又は抗４－１ＢＢ抗体）、ｔｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ４ ＴＬＲ７、ＴＬＲ９）、可溶性リガンド（例えば、ＧＩＴＲＬ、ＧＩＴＲＬ－Ｆｃ、ＯＸ－４０Ｌ、ＯＸ－４０Ｌ－Ｆｃ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ－Ｆｃ、４－１ＢＢリガンド、又は４－１ＢＢリガンド－Ｆｃ）、又はＢ７ファミリーのメンバー（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、追加の免疫療法剤は、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ、ＯＸ－４０、ＣＤ－４０、又は４ー１ＢＢを標的化する。
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、追加の免疫チェックポイント阻害剤である。本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント阻害剤」は、免疫チェックポイントタンパク質の活性を阻害する薬剤である。いくつかの実施形態では、追加の免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗４－１ＢＢ抗体、又は抗ＯＸ－４０抗体である。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、抗ＴＩＧＩＴ抗体である。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＢＭＳ９３５５５９（ＭＤＸ－１１０５）、アテキソリズマブ（ａｔｅｘｏｌｉｚｕｍａｂ）（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、及びアベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）からなる群から選択される抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ）及びトレメリムマブからなる群から選択される抗ＣＴＬＡ－４抗体である。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＢＭＳ－９８６０１６及びＬＡＧ５２５からなる群から選択される抗ＬＡＧ－３抗体である。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ０５６２、及びＭＯＸＲ０９１６からなる群から選択される抗ＯＸ－４０抗体である。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＰＦ－０５０８２５６６からなる群から選択される抗４－１ＢＢ抗体である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾された免疫エフェクター細胞は、サイトカイン、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、ＢＭＰ、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＧＤＦ９、ＨＧＦ、ＨＤＧＦ、ＩＧＦ、遊走刺激因子、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、ＮＧＦ、ニューロトロフィン、ＰＤＧＦ、トロンボポエチン、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、ガンマ－ＩＦＮ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８からなる群から選択される生物学的分子と組み合わせて投与することができる。
ＸＶＩ．個別療法
一実施形態では、本発明は、対象における抗原の過剰発現と関連する疾患又は障害の検出を伴う。検出方法は、ａ）対象からの試料を、本明細書に記載される１つ以上の抗体、又はその抗原結合断片と接触させることと、ｂ）疾患を欠く対照試料へのそのような結合と比較して、試料への抗体又はその断片の結合の増加したレベルを検出し、それによって対象における疾患を検出することと、を含む。特定の実施形態では、疾患は、がんである。特定のそのような実施形態では、がんは、卵巣がん及び乳がんの群から選択される。検出方法を限定する意図はないが、一実施形態では、結合の検出は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、及び／又は放射線画像法による免疫組織化学的である。
本発明の一実施形態では、集合アプローチを使用して、がん患者を含む患者のための個別細胞療法ランドスケープを変換する。このアプローチは、腫瘍関連抗原を標的とするための非ウイルスプラスミドの開発及び検証された集合の使用を含む。これらの設計及び製造上の利点には、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）エレクトロポレーションシステムの機能と相まって、遺伝子修飾細胞を生成するためのＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ（商標）技術の使用が含まれる。これらの方法、化合物、及び組成物は、がんセンターを支援するための療法及び治療選択肢を可能にし、医師は、一晩の製造を伴う個別化された自己遺伝子修飾細胞治療をがん患者に送達する。患者のがん適応症及び／又はバイオマーカープロファイルに基づいて、１つ以上の非ウイルスプラスミドをライブラリーから選択して、個別化されたＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ細胞治療を構築することができる。初回治療後、このアプローチは、治療応答及び患者の腫瘍の抗原発現の変化に基づいて、同じ又は新しい腫瘍抗原を標的とするＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ細胞の再投与を可能にする可能性を有する。高度なＵｌｔｒａＶｅｃｔｏｒ（商標）ＤＮＡ構築プラットフォームと、一晩の製造の容易さの組み合わせにより、このライブラリーアプローチは従来のＴ細胞療法よりも利点がある。
本明細書に提供されるのは、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド又はそれを含む細胞の連続投与を含む、疾患又は障害を治療するための方法である。疾患又は障害は、例えば、がん又は自己免疫疾患若しくは障害であり得る。ポリヌクレオチドは、ウイルス又は非ウイルスベクターに存在し得る。異なる構造組成及び抗原標的のアレイに対する結合特異性を有するキメラ抗原受容体の集合から選択されるキメラ抗原受容体。
特定の実施形態では、キメラ抗原受容体の集合は、以下の抗原のうちの少なくとも１つを標的とするキメラ抗原受容体を含む：ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、ＣＡ１２５、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／ｖ８、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１５１、ＣＤ１７１、ＣＤ１７４、ＣＤ２７６、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＬＬ－１、ｃ－ＭＥＴ、ＣＳ１、ＣＳＰＧ４、ＣＴＬＡ－４、ＤＬＬ３、ＥＤＢ－Ｆ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ＦＬＴ１、ＦＬＴ４、葉酸結合タンパク質、葉酸受容体、葉酸受容体α、α－葉酸受容体、フリズル、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＨＲ、ＧＨＲＨＲ、ＧＩＴＲ、ＧＰＣ３、Ｇｐ１００、ｇｐ１３０、ＨＢＶ抗原、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ｈ５Ｔ４、ＨＶＥＭ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩｇＫＡｐｐａ、ＩＬ－１－ＲＡＰ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、ＫＤＲ、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ、ＬｅｗｉｓＡ、ＬｅｗｉｓＹ、Ｌ１－ＣＡＭ、ＬＩＦＲＰ、ＬＲＰ５、ＬＴＰＲ、ＭＡＧＥ－Ａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥＡ３／Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＲＴ－１、ＭＣＡＭ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ムチン、例えば、ＭＵＣ１、ＭＵＣ４若しくはＭＵＣ１６、ＮＧＦＲ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｎｏｔｃｈ－１－４、ＮＹ－ＥＳＯ－１、Ｏ－アセチルＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ３、ＯＸ４０、Ｐ５３、ＰＤ１、ＰＤＥ１０Ａ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰＴＣＨ１、ＲＡＮＫ、Ｒｏｂｏｌ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ１Ｒ、ＲＯＲ－２、ＴＡＣＩ、ＴＡＧ－７２、ＴＣＲａ、ＴＣＲｐ、ＴＧＦ、ＴＧＦベータ、ＴＧＦベータ－ＩＩ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、Ｔｉｔｉｎ、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＲＢＣ１、ＴＷＥＡＫ－Ｒ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、及びＷＴ－１。特定の実施形態では、キメラ抗原受容体の集合は、以下の抗原のうちの少なくとも１つを標的とするキメラ抗原受容体を含む。Ｂ７Ｈ４、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、ＣＡ１２５、ＣＡＩＸ、ＣＣＲ４、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１５１、ＣＤ１６、ＣＤ１７１、ＣＤ１７４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７６、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／ｖ８、ＣＤ４７、ＣＤ５、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７、ＣＤ７０、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＬＬ－１、ｃ－ＭＥＴ、ＣＳ１、ＣＳＰＧ４、ＣＴＬＡ－４、ＤＬＬ３、ＥＤＢ－Ｆ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＦＡＰ、ＦＬＴ１、ＦＬＴ４、葉酸受容体α、葉酸結合タンパク質、葉酸受容体、フリズル、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＨＲ、ＧＨＲＨＲ、ＧＩＴＲ、Ｇｐ１００、ｇｐ１３０、ＧＰＣ３、ｈ５Ｔ４、ＨＢＶ抗原、ＨＥＲ１／ＨＥＲ３、ＨＰＶ抗原、ＨＶＥＭ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩｇＫＡｐｐａ、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒ－α２、ＩＬ－１－ＲＡＰ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ＫＤＲ、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ、Ｌ１－ＣＡＭ、ＬｅｗｉｓＡ、ＬｅｗｉｓＹ、ＬＩＦＲＰ、ＬＲＰ５、ＬＴＰＲ、ＭＡＧＥ－Ａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥＡ３／Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＲＴ－１、ＭＣＡＭ、メソセリン、ムチン、例えば、ＭＵＣ１及びＭＵＣ１６、ＮＧＦＲ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｎｏｔｃｈ１－４、ＮＹ－ＥＳＯ－１、Ｏ－アセチルＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ３、ＯＸ４０、Ｐ５３、ＰＤ１、ＰＤＥ１０Ａ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＭＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＣＨ１、ＲＡＮＫ、Ｒｏｂｏｌ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ１Ｒ、ＲＯＲ－２、ＴＡＣＩ、ＴＡＧ－７２、ＴＣＲα、ＴＣＲｐ、ＴＧＦ、ＴＧＦβ、ＴＧＦβ－ＩＩ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、Ｔｉｔｉｎ、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＲＢＣ１、ＴＷＥＡＫ－Ｒ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、及びＷＴ－１。
特定の実施形態では、方法は、集合からの１つ以上のキメラ抗原受容体を発現する細胞の１回目の投与、続いて集合からの１つ以上のキメラ抗原受容体を発現する細胞の２回目の投与を含み、１回目の投与と２回目の投与との間に一定の期間が経過する。特定の実施形態では、１回目の投与において同じ１つ以上のＣＡＲを再度投与する。特定の他の実施形態では、２回目の投与における細胞によって発現されるＣＡＲのうちの少なくとも１つは、１回目の投与におけるＣＡＲとは異なる。特定の実施形態では、本発明は、集合から選択されるＣＡＲを発現する細胞の３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、又は任意の追加の回数のラウンドの投与を含み、その後の各投与ラウンドにおいて、前の治療ラウンドでは投与されなかった異なるＣＡＲが投与される。
特定の実施形態では、細胞の用量は、自己由来である。特定の実施形態では、細胞の用量は、同種異系である。特定の実施形態では、細胞の１回用量は自己由来であり、別の用量は同種異系である。
特定の実施形態では、ＣＡＲ又はＣＡＲの２回目又はその後の投与の前に、前の投与における１つ以上のＣＡＲの生物学的又は治療的活性が、ピークの生物学的又は治療的活性から減少する、無視できるようになる、又は検出できないようになるのに十分な期間が経過することを可能にする。特定の実施形態では、ＣＡＲの後続投与は、ＣＡＲの前回の投与の少なくとも１日後に行われる。
ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、ウイルス形質導入、非ウイルストランスフェクション、又はエレクトロポレーション送達方法を介して、対象の細胞に導入され得る。
特定の実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるものなどのベクターの一部として投与され得る。本発明の特定の実施形態では、ＣＡＲをコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、前述のように、サイトカイン、細胞タグ、及び／又は遺伝子スイッチをコードするヌクレオチド配列を更に含む。特定の実施形態では、ベクターは、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、並びにサイトカイン、細胞タグ、及び／又は遺伝子スイッチをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、ベクターは、「規制当局が承認したベクター」であり、これは、規制当局、国、超国家（例えば、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）、欧州委員会、又はＥＵ理事会）、地域、州、若しくは地方の規制機関、部門、局、委員会、評議会、又は他の政府機関によって承認されており、そのような承認は、規制管轄区域におけるベクターの製造、流通、使用、又は販売に必要又は十分であることを意味する。特定の実施形態では、そのような「規制当局が承認したベクター」とは、規制管轄区域におけるヒト臨床安全性試験（「第１相臨床試験」と称されることもある）での使用が少なくとも承認されているベクターを意味する。「臨床安全性」又は「第１相」試験とは、試験物と関連する副作用の分析のために、任意選択的に安全性及び投与量を評価するために、少なくとも安全性を評価し、任意選択的に様々な投与量と併せて副作用を評価するための試験を意味する。特定の実施形態では、「規制当局が承認したベクター」とは、少なくとも「第２相」試験での使用が承認されているベクターを意味する。「第２相」試験は、試験物が開発されている疾患、障害又は状態を有するより大きな患者群（典型的には最大数百人）の評価のために、（より小規模な第１相対象群と比較して）試験物がより大きな群のヒト対象に投与され、その有効性を最初に評価し、その安全性を更に研究するものである。特定の実施形態では、第２相試験は、リスクを最小限に抑えながら、利益を最大化するために、試験物の最適な用量（単数又は複数）を評価することである。特定の実施形態では、「規制当局が承認したベクター」とは、少なくとも「第３相」試験での使用が承認されているベクターを意味する。第３相試験（「極めて重要な試験」と称されることもある）は、典型的には、試験物が使用されることが意図されている患者集団から約３００～３，０００人の参加者を含む。第３相試験の参加者は、典型的には、試験物又はプラセボ（治療効果のない物質）のいずれかを受けるように割り当てられる。第３相試験は、試験物が特定の集団に治療効果を提供するかどうかを実証し、より詳細な安全性データを提供し、試験物が使用され得る疾患又は状態に関する製品ラベルの基礎として機能することを意図している。特定の実施形態では、「規制当局が承認したベクター」とは、規制管轄区域内の規制当局によって、ヒトにおける疾患、障害又は状態の治療のための商業的製造、使用又は販売のために承認されているベクターを意味する（例えば、米国での製造、使用又は販売のための米国ＦＤＡによる承認）。特定の実施形態では、「規制当局が承認したベクター」は、規制当局が承認したレンチウイルスベクター、規制当局が承認したレトロウイルスベクター、又は規制当局が承認した非ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、規制当局が承認したベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙベクターである非ウイルスベクターである。
特定の実施形態では、規制当局は、アラブ首長国連邦、アンティグア・バーブーダ、アルバニア、アルメニア、アンゴラ、オーストリア、オーストラリア、アゼルバイジャン、ボスニア・ヘルツェゴビナ、バルバドス、ベルギー、ブルキナファソ、ブルガリア、バーレーン、ベナン、ブルネイ・ダルサラーム国、ブラジル、ボツワナ、ベラルーシ、ベリーズ、カナダ、中央アフリカ共和国、コンゴ、スイス、コートジボワール、チリ、カメルーン、中国（中華人民共和国（ＰＣＲ））、コロンビア、コスタリカ、キューバ、キプロス、チェコ、ドイツ、ジブチ、デンマーク、ドミニカ、ドミニカ共和国、アルジェリア、エクアドル、エストニア、エジプト、スペイン、フィンランド、フランス、ガボン、英国、グレナダ、ジョージア、ガーナ、ガンビア、ギニア、赤道ギニア、ギリシャ、グアテマラ、ギニアビサウ、ホンジュラス、クロアチア、ハンガリー、インドネシア、アイルランド、イスラエル、インド、イラン（イスラム共和国）、アイスランド、イタリア、ヨルダン、日本、ケニア、キルギス、カンボジア、コモロ、セントクリストファー・ネイビス、朝鮮民主主義人民共和国、大韓民国、クウェート、カザフスタン、ラオス人民民主共和国、セントルシア、リヒテンシュタイン、スリランカ、リベリア、レソト、リトアニア、ルクセンブルク、ラトビア、リビア、モロッコ、モナコ、モルドバ共和国、モンテネグロ、マダガスカル、北マケドニア、マリ、モンゴル、モーリタニア、マルタ、マラウイ、メキシコ、マレーシア、モザンビーク、ナミビア、ニジェール、ナイジェリア、ニカラグア、オランダ、ノルウェー、ニュージーランド、オマーン、パナマ、ペルー、パプアニューギニア、フィリピン、ポーランド、ポルトガル、カタール、ルーマニア、セルビア、ロシア連邦、ルワンダ、サウジアラビア、セーシェル、スーダン、スウェーデン、シンガポール、スロベニア、スロバキア、シエラレオネ、サンマリノ、セネガル、サントメ・プリンシペ、エルサルバドル、シリア・アラブ共和国、エスワティニ、チャド、トーゴ、タイ、タジキスタン、トルクメニスタン、チュニジア、トルコ、トリニダード・トバゴ、タンザニア連合共和国、ウクライナ、ウガンダ、アメリカ合衆国、ウズベキスタン、セントビンセント・ジェナディーン、ベトナム、サモア、南アフリカ、ザンビア、ジンバブエ、アフガニスタン、アンドラ、ＡＲＩＰＯ、バングラデシュ、ボリビア、ケイマン諸島、エチオピア、フィジー、ジブラルタル、グアム、ハイチ、イラク、レバノン、マルティニーク、ミクロネシア、連邦、ナウル、ＯＡＰＩ、パレスチナ自治区、占領された（ガザ）、ピトケアン、セントバーツ、ソマリア、台湾、トンガ、バヌアツ、イエメン、ウーランド諸島、アンギラ、アルバ、バミューダ、ブルンジ、コンゴ（民主共和国）、ユーラシア特許庁、フランス領ギアナ、グリーンランド、ガーンジー、教皇庁（バチカン）、ジャマイカ、マカオ、モーリシャス、モントセラト、ネパール、パキスタン、パレスチナ自治区、占領された（ヨルダン川西岸）、プエルトリコ、セントヘレナ、南スーダン、東ティモール、ツバル、ベネズエラ、アメリカ領サモア、アルゼンチン、バハマ、ブータン、カーボベルデ、エリトリア、欧州連合、フランス領ポリネシア、グアドループ、ガイアナ、香港、キリバス、モルディブ、メイヨット、ミャンマー、ニューカレドニア、パラオ、パラグアイ、レユニオン、サンピエール島・ミクロン島、スリナム、トケラウ、ウルグアイ、及び西サハラから選択される国において、医薬品、生物製剤、又は他の薬若しくは医学的処置の承認を管理する。
特定の実施形態では、規制当局は、世界保健機関、汎米保健機関、世界貿易機関（ＷＴＯ）、国際調和会議（ＩＣＨ）、及び世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）などの多国籍機関；並びに国立保健当局、例えば、アジア及び太平洋では、オーストラリア政府：保健省、オーストラリア政府：治療製品局（ＴＧＡ）、ブルネイ：保健省、中華人民共和国：中国国家食品薬品監督管理局、中華人民共和国：保健省、中華人民共和国：中国国家薬品監督管理局、中華人民共和国：中国葯品生物制品検定所、中華人民共和国：農林省、フィジー：保健省、香港：保健局、インド：消費者問題・食料・公共配給省、インド：中央医薬品基準管理機構（ＣＤＳＣＯ）、インド：食料・消費者問題省、インドネシア：保健省、日本：厚生労働省、日本：医薬品医療機器総合機構、韓国：食品医薬品局、マレーシア：保健省、マレーシア：国家医薬品規制庁、ニュージーランド：保健省、ニュージーランド：医薬品及び医療機器安全機関、ニュージーランド：食品安全機関、パプアニューギニア：保健局、フィリピン：保健局、フィリピン：国家食糧局、シンガポール：保健省、シンガポール：健康科学庁、スリランカ：保健省、台湾：保健局、台湾：国立食品医薬品研究所、タイ：保健省、タイ：食品医薬品局、タイ：農業協同組合省、欧州では、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）、欧州委員会総局：動物用医薬品、アンドラ：保健福祉省、アルメニア：保健省、アルメニア：医薬品医療技術庁、オーストリア：保健相、ベルギー：健康、フードチェーンの安全性及び環境局、ベルギー：医薬品査察当局、ベルギー：連邦フードチェーン安全庁、ブルガリア：保健省、ブルガリア：医薬品局、クロアチア：保健社会福祉省、チェコ共和国：保健省、チェコ共和国：国立薬物管理研究所、デンマーク：保健省、デンマーク：医薬品庁、デンマーク：獣医・食品管理局、エストニア：国立医薬品庁、フィンランド：社会福祉保健省、フィンランド医薬品庁、フランス：保健省、フランス：国立動物医薬品局、ジョージア：労働・保健・社会福祉省、ドイツ：保健省、ドイツ：連邦医薬品医療機器研究所、ドイツ：ロベルト・コッホ研究所、ドイツ：ポール・エールリッヒ研究所、ドイツ：ドイツ連邦リスク評価研究所、ドイツ：消費者保護・食料・農業省、ギリシャ：保健社会連帯省、ギリシャ：国立医薬品機関、ハンガリー：保健社会家族省、ハンガリー：国立薬局研究所、アイスランド：保健社会保障省、アイスランド医薬品庁、アイスランド：環境庁、アイルランド：保健児童省、アイルランド医薬品委員会、イタリア：保健省、イタリア：国立衛生研究所、ラトビア：国立医薬品庁、リトアニア：保健省、リトアニア：国立医薬品規制庁、ルクセンブルク：保健省、マルタ：保健・高齢者・地域ケア省、オランダ：保健福祉スポーツ省、オランダ：医薬品評価委員会、オランダ：健康保護及び獣医公衆衛生検査官、ノルウェー：保健ケアサービス省、ノルウェー：ノルウェー保健監査委員会、ノルウェー：ノルウェー医薬品庁、ノルウェー：農業食糧省、ポーランド：保健社会保障省、ポーランド：薬物研究所、ポルトガル：保健省、ポルトガル：国立医薬品・健康製品庁、ルーマニア：保健家族省、ロシア連邦：医薬品の専門家評価のための科学センター、ロシア連邦：州立医薬品及び適正慣行研究所、サン・マリノ、保健社会保障省、国民保険・男女共同参画（イタリア）、スロバキア共和国：保健省、スロバキア共和国：国立薬物管理研究所、スロバキア共和国：国家獣医食品局、スロベニア：保健省、スロベニア：公衆衛生研究所、スペイン：保健消費省；スペイン医薬品保健製品庁、スウェーデン：医薬品庁、スウェーデン：国立保健福祉委員会、スウェーデン：国家食品局、スイス：連邦公衆衛生局、スイス：医薬品局、スイス：連邦獣医局、トルコ：保健省（トルコ）、ウクライナ：保健省、英国：保健局、英国：健康保護庁、英国：医薬品及びヘルスケア製品規制庁（ＭＨＲＡ）、英国：国立生物学的製剤研究所、英国：中東における動物用医薬品局、バーレーン：保健省、イスラエル：保健省、イスラエル：工業貿易労働省、ヨルダン：保健省、レバノン：保健省、パレスチナ自治政府：保健省、サウジアラビア：保健省、アラブ首長国連邦：保健省、アラブ首長国連邦：連邦薬局省、イエメン：アフリカにおける公衆衛生・人口省、ベナン：保健省、ボツワナ：保健省、エジプト：農林水産省、ガーナ：保健省、ガーナ：食糧農業省、ケニア：保健省、モルディブ：保健省、モーリシャス：保健・生活の質省、モーリシャス：農業工業・食料安全保障省、モロッコ：保健省、ナミビア：保健社会福祉省、セネガル：保健予防省、南アフリカ：保健省、スワジランド：保健社会福祉省、タンザニア：保健省、チュニジア：公衆衛生省、チュニジア：薬局及び医薬品局、ウガンダ：保健省、ジンバブエ：保健児童福祉省、及び南北アメリカにおいて、アルゼンチン：保健省、アルゼンチン：国家医薬品食品医療技術管理局、ベリーズ：保健省、ボリビア：保健社会福祉省、ブラジル：保健省、ブラジル：国家衛生監督庁、ブラジル：オズワルド・クルーズ財団、カナダ：カナダ保健省、カナダ：健康製品食品局、チリ：保健省、チリ：公衆衛生研究所、コロンビア：保健省、コロンビア：ＩＮＶＩＭＡ 国立医療監視研究所、コスタリカ：保健省、ドミニカ共和国：農業省、エクアドル：保健省、エルサルバドル：公衆衛生・社会援助省、エルサルバドル：農業省、グアテマラ：保健省、ガイアナ：保健省、ガイアナ：国家標準局、ジャマイカ：保健省、メキシコ：保健省、メキシコ：衛生リスクに対する保護のための連邦委員会、オランダ領アンティル：公衆衛生・環境保護省、ニカラグア：保健省、パナマ：保健省、ペルー：保健省、ペルー：医薬品総局、セントルシア：農林水産省、トリニダード・トバゴ：保健省、トリニダード・トバゴ：標準局、米国（ＵＳＡ／Ｕ．Ｓ．）：食品医薬品局（ＦＤＡ）、ウルグアイ：保健省、並びにベネズエラ：保健社会開発省から選択される。また、他の例示的な規制当局は、ｈｔｔｐｓ：／／ｉａｏｃｒ．ｃｏｍ／ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｒｅｓｅａｒｃｈ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ／ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ－ａｕｔｈｏｒｉｔｙ－ｌｉｎｋｓ／及びｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｄａ．ｏｒｇ／ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－ａｎｄ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｇｌｏｂａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ－ａｕｔｈｏｒｉｔｙ－ｗｅｂｓｉｔｅｓで見出すことができる。
特定の実施形態では、１つ以上のＣＡＲを発現する細胞は、継続的なエクスビボ拡大のために単離され、及び／又は将来の使用のために凍結保存される。
本発明はまた、上述のキメラ抗原受容体を含む組成物にも関する。
本発明は、上述のようにＣＡＲをコードする第１のベクターと、上述のようにＣＡＲをコードする第２のベクターと、を含む、キットに更に関する。
これらの実施例は、例示的な目的のためにのみ提供され、本明細書に提供される特許請求の範囲の範囲を限定するものではない。以下の表には、実施例にのみ適用される略語及び特別用語が含まれる。これらの略語及び特別用語は、別段の制限ではなく、特許請求の範囲に引き続き適用されるものである、上記のより広い定義を置き換えるものでも、絞り込むものでもない。
Figure 2024502479000023
実施例１．ＰＤ１モジュール設計
ｍｉＲＮＡ発現ＲＯＲ１ ＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ細胞のＰＤ１サイレンシングモジュールは、他の内因性転写産物のオフターゲットサイレンシングを回避しながら、ＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ細胞内のＰＤ－１ ｍＲＮＡの発現を特異的に低減するように設計された２つの人工ｍｉＲＮＡをコードする。ｍｉＲＮＡ発現ＲＯＲ１ ＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ細胞の２つの人工ｍｉＲＮＡは、ＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ導入遺伝子カセットの５’ＵＴＲスプライスユニット内に配置された二重一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）配列内にコードされる（図１Ｂ）。二重ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、細胞複合体によって認識及び処理されるステムループ構造を形成し、ＰＤ１標的転写産物内の特定の配列に相同である２つの独自の２１～２４ヌクレオチド成熟ガイドｍｉＲＮＡを生成する。ガイドｍｉＲＮＡとＰＤ１標的配列との相互作用は、ＲＮＡ分解又は翻訳阻害の誘導によってＰＤ１のサイレンシングを誘発すると予想される（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ，２０１０）。
ｍｉＲＮＡ発現ＲＯＲ１ ＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ細胞内でコードされるガイドｍｉＲＮＡは、３つの検証済みのルールベースのｓｉＲＮＡ予測アルゴリズム（Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ ａｎｄ Ｐｒｙｄｚ，２００４、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ，２００４、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ，２００４）に基づく２１個のランキングパラメータの組み合わせを使用して、内部設計の計算ワークフローを実装することによって、ＰＤ１標的転写産物ＮＭ＿００５０１８．３に対して非常に特異的であるように設計された。成熟ｍｉＲＮＡがＰＤ１標的遺伝子に対して非常に特異的であることを確実にするために、ヒト参照エクソーム（ＲｅｆＳｅｑ）及び活性化Ｔ細胞トランスクリプトーム（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ，２０１４）に対してマルチレベル特異性プロファイリングを行った。非ＰＤ１標的化パッセンジャー鎖ｍｉＲＮＡによるオフターゲットサイレンシングのリスクを更に低減するために、ガイド：パッセンジャーｍｉＲＮＡの高い比を生じるｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ足場を選択した（Ｍｉｎｉａｒｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ，２０１６）。ＰＤ１標的化ガイドｍｉＲＮＡ ＰＤ１＿１８４３を、ヒトｍｉＲＮＡ ｈｓａ－ｍｉＲ－２０４（受託番号ＭＩ００００２８４）に基づくｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ足場に組み込み、一方、ＰＤ１＿２０６１ガイドｍｉＲＮＡを、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０６（受託番号ＭＩ００００４９０）足場に組み込んだ。特異的なｍｉＲＮＡ構造が維持され、熱力学的安定性が実質的に変化しないことを保証するために、各ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖側に変異を作製した。ＲＮＡ構造は、ＣＬＣ Ｍａｉｎ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェアを使用して予測した。ＰＤ１サイレンシングモジュールは、ＣＡＲ－Ｔ導入遺伝子発現カセットの５’ＵＴＲ内の合成スプライスユニット内のｍｉＲ２０６ＰＤ１＿２０６１ ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡの直接上流に配置されたｍｉＲ２０４ ＰＤ１＿１８４３ ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡを含む。スプライスユニットは、ＩＤＴからｇＢｌｏｃｋとして注文され、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ ＣＡＲベクターにクローニングすることができ、任意の他のＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ ＣＡＲベクターの５’ＵＴＲにクローニングするためにＣｌａＩ／ＮｈｅＩを使用して切断することができる。
実施例２．ｍｉＲＮＡによるＰＤ１転写産物発現の低下
一次ヒトＴ細胞を、表１０に列挙されている構築物でトランスフェクトし、大量に増殖させ、次いでアリコートに凍結したコグネイト抗原を発現するＡａＰＣ細胞を使用してインビトロで拡大させた。次いで、生成したＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＲＮＡ単離のために細胞を収集する前に、１：１のビーズ：Ｔ細胞比及び１×１０６Ｔ細胞／ｍＬの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを使用して４８時間、更に活性化した。ＲＮＡ単離を、製造業者の推奨プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）に従って実施し、次いで、ｅｚＤＮａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ及びｑＰＣＲのためのＴａｑＭａｎ ＦＡＳＴ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを使用してＲＴ－ｑＰＣＲ分析に供して、特定のプライマー／プローブ（ヒトＰＤ１：Ｈｓ００１６９４７２＿ｍ１；ヒトＴＩＧＩＴ：Ｈｓ００５４５０８７＿ｍ１；及びヒトＡＣＴｂ：Ｈｓ９９９９９９０３＿ｍ１）を使用してＰＤ－１発現レベルを評価した。全ての試料も、ベータ－アクチン発現レベルに正規化した。相対発現値は、構築物＃１（ＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞のみ）に正規化することによって、ΔΔＣＴ法に基づいている。結果を図２に示す。示されるのは、３人のドナーからの平均±ＳＤである。
Figure 2024502479000024
データは、意図された配列を標的とするＰＤ－１チェックポイント阻害剤ｍｉＲＮＡの特異性を示す。ｍｂＩＬ－１５を発現しなかったＣＡＲ構築物（構築物＃８）と共にスクランブルｍｉＲＮＡを発現したＣＡＲ構築物（構築物２及び３）は、ＰＤ－１発現の減少を示さなかったが、ＰＤ－１ ｍｉＲＮＡ（構築物４）又はＰＤ－１とＴＩＧＩＴ ｍｉＲＮＡの組み合わせを含むＣＡＲ構築物（構築物６及び７）は、ＰＤ－１発現の減少を示した。他方で、ＴＩＧＩＴ ｍｉＲＮＡ配列のみを含むＣＡＲ構築物（構築物５）は、標的化の特異性を更に示すＰＤ－１ ｍＲＮＡ発現レベルの減少を示さなかった。
実施例３．標的化ｍＲＮＡの下方調節
一次ヒトＴ細胞を、ＣＤ３３特異的ＣＡＲをコードするベクター又はＭＵＣ１６特異的ＣＡＲをコードするベクターでトランスフェクトした。ベクターは、ＰＤ－１、ＰＤ－１及び／又はＴＩＧＩＴを標的とするｍｉＲＮＡ配列を含有する合成イントロン、又は非標的化スクランブル対照ｍｉＲＮＡを含む。Ｔ細胞培養物を、ＣＤ３３又はＭＵＣ１６のいずれかに加えて他の共刺激分子（「クローン１」に基づく）を発現するように修飾されたＫ５６２細胞であった、同族の腫瘍抗原を有する抗原提示細胞を使用して、インビトロで１：１の比（ＡａＰＣ：Ｔ細胞）で拡大させた。次いで、生成されたＣＡＲ＋細胞を、サイトカインの不在下で４８時間、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（１：１のビーズ：Ｔ細胞比）で刺激した。ＲＮＡは、製造業者のプロトコルに従って、Ｑｉａｇｅｎキット（ＡｌｌＰｒｅｐユニバーサルＤＮＡ／ＲＮＡ／ｍｉＲＮＡキット＃８０２２４）を使用して単離し、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ製のヒト汎がん免疫遺伝子セットパネルキットに利用した。簡潔に述べると、ＲＮＡを、キャプチャプローブセット及びレポータープローブセットとハイブリダイズし、試料を処理した後、ｎＣｏｕｎｔｅｒ Ｐｒｅｐ Ｓｔａｔｉｏｎを使用してスライドにハイブリダイズし、転写産物カウントを、製造業者のプロトコルに従って、ｎＣｏｕｎｔｅｒデジタルアナライザーによって生成した。データ検証、ＱＣ及び正規化は、ｎＳｏｌｖｅｒソフトウェア（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって実施した。
グラフ上の転写産物カウントデータの分布は、試料が同一である場合、傾きが１である線（左下から右上隅まで）である。この線から落ちるデータ点は、２つの試料間の転写産物カウントの変動を表す。主要な線の下に見出されたカウントは、減少した発現を表し、一方、主要な線の上のカウントは、比較される試料に対する増加した発現を表す。ＣＡＲ－Ｔ細胞で発現されるＰＤ－１又はＴＩＧＩＴのいずれかのｍｉＲＮＡによって標的化された転写産物は、ｍｉＲＮＡを含まないＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、それぞれの標的化遺伝子の転写産物の低発現を特異的に示した。図３Ａ～Ｂを参照されたい。加えて、標的化の特異性を更に実証するために、スクランブル対照ｍｉＲＮＡを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、このグラフのデータ分布が対角線に近いままであったため、ＰＤ－１又はＴＩＧＩＴのいずれの転写産物レベルにも変化がなく、転写産物レベルの変動がほとんどないことを示した。図３Ｃを参照されたい。同様の結果が、ＰＤ－１、ＰＤ－１及び／又はＴＩＧＩＴを標的とするｍｉＲＮＡ配列を含有する合成イントロンを含むＭＵＣ１６ ＣＡＲベクターでトランスフェクトしたＴ細胞において観察された（図４Ａ～Ｃを参照されたい）。
実施例４．ｍｉＲＮＡ ＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍細胞毒性効果の増強
一次ヒトＴ細胞を、ＰＤ－１転写産物内の２つの配列を標的とするＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ及びｍｉＲＮＡ配列をコードするベクター、又はＭＵＣ１６特異的ＣＡＲをコードするが、ｍｉＲＮＡをコードしないベクターでトランスフェクトした。このアッセイで使用したＣＡＲ－Ｔ細胞を、インビボで拡大させ、ＣＡＲ発現のために正規化した後、ＭＵＣ１６を発現するＧＦＰ＋Ｋ５６２細胞（「腫瘍細胞」）を３：１のＥ：Ｔ比で９６ウェルプレートに３回播種した。プレートを、ＩｎｃｕＣｙｔｅＳ３器具に装填し、ウェル当たり４つの画像を２時間ごとに７日間撮影した。ＩｎｃｕＣｙｔｅソフトウェアを使用して、データを分析し、ＧＦＰ＋細胞カウント／画像を０時間の時点に正規化した。
増殖アッセイは、培養物中の７日間にわたるＣＡＲ－Ｔ細胞の存在又は不在下での標的細胞増殖の速度を決定する。ＣＡＲ－Ｔ細胞を含有する培養物におけるより低い標的細胞カウントは、ＣＡＲ－Ｔ細胞溶解活性を示す。図５Ａは、腫瘍標的細胞のみ（黒丸、塗りつぶした）と、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲのみを発現する細胞（白抜きの四角）との間の差を示し、ＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷能力を示す。ＰＤ－１を標的とするｍｉＲＮＡを更に発現する細胞（塗りつぶした灰色の円）は、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲのみを発現する細胞（白抜きの四角）と比較して、経過評価にわたる持続的な低いＧＦＰ＋カウントに基づいて、改善された細胞溶解活性を更に示す。このデータは、ｍｉＲＮＡを標的とするＰＤ－１を含有するＣＡＲ－Ｔ細胞の増強された細胞溶解活性を実証する。
ＭＵＣ１６、ＰＤ－Ｌ１、及びＣＤ１５５を発現するＧＦＰ＋Ｋ５６２細胞を利用して、同様の実験を行った。図５Ｂに示されるように、腫瘍標的細胞のみ（塗りつぶした正方形）と、ＣＡＲのみを発現する細胞（白抜きの丸）との間の差は、ＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷能力を示す。ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴの両方を標的とするｍｉＲＮＡを組み込んだＣＡＲ－Ｔ細胞（塗りつぶした丸）は、ＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞のみ（塗りつぶした丸）と比較して、経過評価にわたる持続的な低いＧＦＰ＋カウントに基づいて、改善された細胞溶解活性を更に示す。このデータは、単一の構築物において、３つの標的化ｍｉＲＮＡ（ＰＤ－１については２つ、ＴＩＧＩＴについては１つ）を含有するＣＡＲ－Ｔ細胞の増強された細胞溶解活性を実証する。
実施例５．サイトカイン発現の改善
一次ヒトＴ細胞を、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲをコードするが、ｍｉＲＮＡ標的化配列をコードしないベクター、及びＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ並びにＰＤ－１及びＴＩＧＩＴのｍｉＲＮＡ標的化配列の単一又は組み合わせをコードするベクターでトランスフェクトした（表１１を参照されたい）。インビトロで拡大させたＣＡＲ－Ｔ細胞を、インビトロで拡大させ、ＣＡＲ発現のために正規化した後、１：１のエフェクター対標的比で切頭ＭＵＣ１６ ９ＭＵＣ１６ｔ）を発現するＫ５６２腫瘍標的細胞を有する９６ウェルプレート中に３連で播種したか、又はＣＡＲ－Ｔ細胞を培地単独で培養した。３日間の共培養後、培養上清を回収した。培養上清を収集し、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）及び顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を、製造業者のプロトコルに従って、多重サイトカイン分析（Ｌｕｍｉｎｅｘ）によって評価した。重複ウェルからの平均±ＳＤを図６に示す。
培地のみで培養されたＣＡＲ－Ｔ細胞構築物について、基底レベルのＩＦＮγ及びＧＭ－ＣＳＦが検出された。標的細胞又は培地のみの使用からサイトカインは観察されなかった。ＭＵＣ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞のみ（ベクター１）と腫瘍細胞との共培養後の上清は、ＩＦＮγ及びＧＭ－ＣＳＦの発現レベルについてのベースライン値を提供した。チェックポイント阻害剤ｍｉＲＮＡをＣＡＲ構築物に含めることで、特にＰＤ－１経路を介した阻害を通じて、改善されたサイトカイン発現が観察され得る。二重ＰＤ－１（構築物＃３）又は単一のＰＤ－１及びＴＩＧＩＴ ｍｉＲＮＡ（構築物＃６）又は二重ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴ ｍｉＲＮＡ（構築物＃１０及び１１）の組み合わせを含有した構築物では、より高いレベルのサイトカイン発現を提供した。
Figure 2024502479000025
実施例６．処置マウスにおける腫瘍量
非肥満糖尿病性／重度複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）ガンママウス（ＮＳＧ）マウスに、０日目にＭＵＣｔを発現するｆＬＵＣ－ＧＦＰ＋ＳＫ－ＯＶ－３腫瘍細胞を腹腔内に移植した。インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）を使用して、ＩＶＩＳスペクトル機器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いた発光によって、試験を通してこれらのマウスの腫瘍量をモニタリングした。ＩＶＩＳデータを、定義された関心領域に基づいてリビングイメージソフトウェア（バージョン４．１）を使用して分析して、総フラックス値（光子／秒）を得た。ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与前に、マウスを腫瘍量及び体重に基づいて異なる群に無作為化し、次いで６日目に試験試料を投与した 試験した全てのＣＡＲは、ｍｂＩＬ１５及びＨＥＲ１ｔと共にＭＵＣ１６特異的ＣＡＲを発現し、ＭＵＣ１６ ＣＡＲと称される。全ての試験試料を、０．５×１０６ＣＡＲ－Ｔ細胞／マウスに正規化し、腹腔内に投与した。ＩＶＩＳイメージングを１週間に２回実施して、マウスにおける全体的な腫瘍量をモニタリングした。示されるデータは、ｎ＝４～８匹のマウス／群からの平均±ＳＥＭである。
図７に示されるように、生理食塩水のみ（灰色で塗りつぶした丸）を投与されたマウスは、研究の過程を通して観察された総フラックスレベルの増加によって証明されるように、連続的な腫瘍成長を有した。最終的に、これらのマウスは、腫瘍量に屈し、安楽死させられた。ＭＵＣ１６ ＣＡＲのみ（黒色で塗りつぶした正方形）を投与されたマウスは、腫瘍量を制御することができた。構築物内のＰＤ－１及びＴＩＧＩＴに対するチェックポイント阻害剤ｍｉＲＮＡを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞（白抜きの四角及び丸）は、バックグラウンドレベルへの腫瘍フラックス値の減少に基づいて、抗腫瘍活性を維持することが見出された。加えて、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴに対するチェックポイント阻害剤ｍｉＲＮＡを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＭＵＣ１６ ＣＡＲのみの構築物と比較して、より速い時間枠及び腫瘍量減少速度を示した。
実施例７．インビボ表現型実験
ＳＫＯＶ－３／ＭＵＣ１６腫瘍保有マウスに、ＣＡＲのみ又はＰＤ－１／ＰＤ－１ ｍｉＲＮＡを伴うＣＡＲのいずれかのＣＡＲ－Ｔ細胞（ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ、ｍｂＩＬ１５及びＨＥＲ１ｔを発現する）を研究６日目に投与した。投与したＣＡＲ－Ｔ細胞のフローサイトメトリーによる表現型評価のために、研究３１日目にマウスから全血を採取した。簡潔に述べると、蛍光コンジュゲート抗体のカクテルを使用して、全血試料を染色した後、ワンステップのＦｉｘ／Ｌｙｓｅ緩衝液を使用して赤血球溶解と共に同時に固定した。固定した試料をフローサイトメーター（ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＸ－２０）機器で読み取った。ｈＣＤ４５／ＣＤ３＋／ＨＥＲ１ｔ＋発現のゲーティングに基づいて、ＣＡＲ－Ｔ細胞を同定した。図８Ａにおいて、ＣＡＲのみの試料（点線）は、高いＰＤ－１発現を示す一方で、ＰＤ－１／ＰＤ－１ ｍｉＲＮＡを伴うＣＡＲ（実線）は、検出されたＰＤ－１発現のレベルの有意な低下を示す。ＣＡＲ＋ｍｉＲＮＡ（ＰＤ－１／ＰＤ－１）群で検出されたＰＤ－１の低下した発現を更に定量化するために、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を調べた（図８Ｂ）。ＣＡＲ－Ｔ細胞（ストライプのバー）のみを与えられたマウスにおけるＰＤ１発現の平均ＭＦＩは、約７０９であったが、ＰＤ－１／ＰＤ－１ ｍｉＲＮＡを伴うＣＡＲ－Ｔ細胞（黒塗りのバー）の平均ＭＦＩは、約２３６まで減少した。５～８匹のマウスからの平均±ＳＥＭを示す。
実施例８．特異的ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴ下方調節
ＳＫＯＶ－３腫瘍保有マウスに、ＣＡＲのみ又は異なるチェックポイントｍｉＲＮＡ阻害剤（ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴ）を伴うＣＡＲのいずれかのＣＡＲ－Ｔ細胞（ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ（「ＭＵＣ１６ ＣＡＲ」）、ｍｂＩＬ１５及びＨＥＲ１ｔを発現する）を研究６日目に投与した。表１２を参照されたい。
Figure 2024502479000026
投与したＣＡＲ－Ｔ細胞のフローサイトメトリーによる表現型評価のために、研究４５日目（Ｄ４５）にマウスから全血を採取した。簡潔に述べると、ヒトＰＤ－１及びヒトＴＩＧＩＴに対する特異的抗体を含んだ蛍光コンジュゲート抗体のカクテルを使用して、次いでワンステップＦｉｘ／Ｌｙｓｅ緩衝液を使用して固定された全血試料を染色した。固定した試料をフローサイトメーター（ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＸ－２０）機器で読み取った。ｈＣＤ４５／ＣＤ３＋／ＨＥＲ１ｔ＋発現のゲーティングに基づいて、ＣＡＲ－Ｔ細胞をマウスにおいて同定した。チェックポイント阻害剤のためのＣＡＲベクターで使用されるｍｉＲＮＡの特異性を更に評価するために、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴの発現についての蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を分析した（図９Ａ及びＢ）。同じベクターのセットについての発現レベルの定量的評価のために、ＰＤ－１についてのＭＦＩを左に示し、ＴＩＧＩＴについてのＭＦＩを右に示す。図９Ａに示されるように、ＣＡＲベクターのみと比較して、ＰＤ－１ ｍｉＲＮＡ（単一、二重、及び別のｍｉＲＮＡチェックポイント阻害剤と組み合わせて）を伴う構築物である下向き矢印（ＰＤ－１の実線）で示される群について、ＣＡＲ－Ｔ細胞上でＰＤ－１の低下した発現が見られた。右側（下向きの破線矢印）は、ＣＡＲ－Ｔ細胞で見られるＴＩＧＩＴ発現の低下した発現を有する細胞集団を強調する。ＴＩＧＩＴの下方調節された発現は、ＴＩＧＩＴについてのｍｉＲＮＡを含有した試料に対応した（単一として、又は他のチェックポイントｍｉＲＮＡ阻害剤と組み合わせて）。５～８匹のマウスからの平均±ＳＥＭを示す。
実施例９．ＲＯＲ１標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＰＤ１標的化ｍｉＲＮＡの発現。
簡潔に述べると、ｍｉＲＮＡ発現ＲＯＲ１ ＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ細胞又は対照ＲＯＲ１ ＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ細胞を、５人のドナー由来のＴ細胞から生成した。５人の健康なドナー由来のＰａｎＴ細胞を、示されたトランスポゾンベクター（ＶＶＮ－５３５５又はＶＶＮ－５３５１）＋ＳＢ１１トランスポザーゼベクターでトランスフェクトし、ＲＯＲ１抗原提示細胞を用いて４週間（ビーズを添加する前に約３５日間）毎週刺激することによって拡大させた。７～８日間の休止期間の後、ＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ（１：１のビーズ：Ｔ細胞の比、１×１０６個の細胞／ｍＬのＴ細胞）で、ＲＮＡ収集の４８時間前、最後のＡａＰＣ刺激の７～８日後に活性化した。ＰＤ１標的化ガイドｍｉＲＮＡの発現及びＰＤ１ ｍＲＮＡ発現への影響は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって検証した。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡから生じ得る予測及び代替ｍｉＲＮＡ配列を同定するための確立された方法である小さいＲＮＡｓｅｑ（Ｂｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ，２０１８、Ｍｉｎｉａｒｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ，２０１６）を実施して、ＰＤ１標的化ガイドｍｉＲＮＡの発現レベルを、ＰＤ１サイレンサーモジュールから生成され得るパッセンジャーｍｉＲＮＡなどの追加の小さいＲＮＡ種と比較した。小さいＲＮＡｓｅｑはまた、全体的な内因性ｍｉＲＮＡ発現に対する潜在的な変化を評価するためにも使用した（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１２）。全体的な転写産物発現を評価し、ＰＤ１サイレンサーに起因する分子経路シグナル伝達又はオフターゲット遺伝子サイレンシングの変化を同定するために、ＲＮＡｓｅｑ分析を実施した。ＰＤ１サイレンサモジュールから生成されたｍｉＲＮＡの最も可能性の高い標的を同定するために、ｍｉＲａｎｄａアルゴリズムを使用して、インシリコでのｍｉＲＮＡ標的予測を実施した。予測される標的遺伝子の発現は、ＲＮＡｓｅｑによって評価した。各方法の詳細は、以下のセクションに含まれる。
ＰＤ１サイレンサーによってコードされるｍｉＲＮＡの発現及びＰＤ１転写レベルへの影響を特徴付けるために、ＲＴ－ｑＰＣＲ及び小さいＲＮＡｓｅｑを実施した。特定の遺伝子又は細胞経路における変化を特徴付けるために、ＲＮＡｓｅｑを実施した。
ＱｉａｇｅｎのＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ／ｍｉＲＮＡユニバーサルキット（カタログ番号８０２２４）を使用して、製造業者のプロトコルに従って細胞ペレットから核酸を精製した。全ＲＮＡを、５０μＬのヌクレアーゼを含まない水中で溶出し、濃度をＮａｎｏｄｒｏｐＴＭ ２０００分光光度計で測定した。
ＰＤ１ガイド及びパッセンジャーｍｉＲＮＡの発現を定量化するために、ＱｉａｇｅｎのｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ＲＴキット（＃３３９３４０）を使用して、ｃＤＮＡ合成のための入力として総ＲＮＡを使用した。製造業者のプロトコルに従って、ｃＤＮＡを、ヌクレアーゼを含まない水で１：６０に希釈し、希釈したｃＤＮＡの３μＬを、２つのＰＤ１ガイドｍｉＲＮＡに特異的なカスタムｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡプライマーを用いたｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ＃３３９３４５）を使用してｑＰＣＲの入力として使用した。入力の正規化を可能にするために、内因性ｍｉＲＮＡ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐを参照小ＲＮＡとして定量化した（カスタム＃ＹＰ００２０５７２７のＱｉａｇｅｎ製品＃３３９３０６）。試料は、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｆｌｅｘ機器で３８４ウェルフォーマットで実行した。相対定量化（ｄＣＴ）計算をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで実施し、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９でグラフ化した。ｄＣＴについての計算は、以下のように各技術的複製物に対して実施した。
ｄＣＴ＝ＣＴ（ガイドｍｉＲＮＡ）－ＣＴ（ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ）
ｄｄＣＴ＝ｄＣＴ（ｍｉＲＮＡＣＡＲＴ複製）－ｄＣＴ（ＶＶＮ－５３５５技術的複製の平均）
倍率変化＝２＾－ｄｄＣＴ
ＶＶＮ－５３５５ ＲＯＲ１ ＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ対照試料は、各ドナーセット内のｍｉＲＮＡ発現ＲＯＲ１ ＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ細胞との比較のための参照対照試料として機能する。技術的複製の平均倍率変化及び標準偏差を計算し、図１０Ａに報告した。
ＰＤ１サイレンシングモジュールに由来するガイド及びパッセンジャーｍｉＲＮＡの産生を定量化及び比較するために、上記のようにＲＴ－ｑＰＣＲを実施し、ただし、この第２の実験には、パッセンジャーｍｉＲＮＡ及び追加の内因性参照小ＲＮＡ、ＲＮＵ１Ａ１を検出するためのプライマーアッセイが含まれていた。以下のように、内因性対照小ＲＮＡの平均と比較して、各ガイド又はパッセンジャー鎖成熟ｍｉＲＮＡの発現を比較するために発現計算を実施した。
ｄＣＴ＝ＣＴ（成熟ｍｉＲＮＡ）－ＣＴ（ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ及びＲＮＵ１Ａ１の平均）
倍率変化＝２＾－ｄＣＴ
平均倍率変化は、３回の技術的複製から計算した。これらの値を図１１にプロットし、試験したドナー試料セットについて平均及び標準偏差を示す。
内因性ＰＤ１ ｍＲＮＡの発現を定量化するために、ｅｚＤＮａｓｅ酵素キット（＃１１７６６０５０）と共にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ＶＩＬＯ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、５ｎｇ／μＬの最終ＲＮＡ濃度を使用してｃＤＮＡ合成を実施した。多重Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲは、１マイクロリットルのｃＤＮＡ及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）Ｔａｑｍａｎアッセイと共にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴａｑＭａｎ ＭａｓｔＡｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（＃４４４４９６３）を使用して実施した。ヒトＰＤ１ Ｔａｑｍａｎアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃ Ｈｓ００１６９４７２＿ｍ１）をＦＡＭ標識し、内部正規化遺伝子であるＡＣＴｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃ Ｈｓ９９９９９９０３＿ｍ１）をＶＩＣ標識した。試料は、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｆｌｅｘ機器で３８４ウェルフォーマットで実行した。相対定量化（ｄＣＴ）計算を、上述のようにＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで実施し、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９でグラフ化した。
Figure 2024502479000027
ＰＤ１サイレンサーモジュールは、ＰＤ１転写産物に結合してＰＤ１発現をサイレンシングする２つの成熟ガイドｍｉＲＮＡを産生するように設計されている。ＰＤ１＿１８４３及びＰＤ１＿２０６１と称される２つのＰＤ１標的化ガイドｍｉＲＮＡの発現は、複数のドナーから生成されたＲＯＲ１ ＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ細胞を発現するｍｉＲＮＡにおいて確認された（図１０Ａ）。試験した全てのドナーからのｍｉＲＮＡ発現ＲＯＲ１ ＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ細胞において、ＰＤ１ ｍＲＮＡ発現の対応する減少が確認された（図１０Ｂ）。この結果は、ＰＤ１サイレンサーモジュールが意図されたガイドｍｉＲＮＡを産生し、設計された通りに機能することを実証した。
ＰＤ１以外の遺伝子をサイレンシングするリスクを低減するために、ＰＤ１サイレンサーモジュールを、非標的化パッセンジャーｍｉＲＮＡよりも優先的にＰＤ１標的化ガイドｍｉＲＮＡを産生するｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ足場を使用して設計した。ガイド及びパッセンジャー成熟ｍｉＲＮＡの両方を、ＲＯＲ１ ＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ細胞を発現するｍｉＲＮＡからＲＴ－ｑＰＣＲにより定量化し、これを、非標的化パッセンジャー鎖ｍｉＲＮＡと比較して、ＰＤ１標的化ガイドｍｉＲＮＡを優勢な種として検証した（図４）。ＰＤ１標的化ガイドｍｉＲＮＡに対する強力な処理の優先は、小さいＲＮＡｓｅｑによって確認され、９９．７％の読み取りがＰＤ１サイレンサーモジュールにマッピングされ、意図されたＰＤ１標的化ガイドｍｉＲＮＡと一致した（図１２Ａ～Ｅ）。更に、ｍｉＲＮＡの開始位置及び停止位置は予想通りであり、２１～２３ヌクレオチドのｍｉＲＮＡが検出され、３’末端に同じ５’末端及び可変長を有した（図１２Ａ～Ｅ）。異常なＲＮＡ処理によって生成されるパッセンジャー鎖ｍｉＲＮＡの非常に低い発生率及び予期しない小さいＲＮＡの欠如は、オフターゲット遺伝子サイレンシングのリスクを実質的に低減した。
ＰＤ１サイレンサーモジュールの発現が内部細胞ＲＮＡｉ機構を圧倒しないことを確実にするために、ＲＯＲ１ ＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ細胞を発現するｍｉＲＮＡからの内因性ｍｉＲＮＡカウントを、対照ＲＯＲ１ ＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した。上位２０個の発現された内因性ｍｉＲＮＡの検査は、試料にわたって発現の統計的に有意な変化を示さなかった（表１５）。更に、ＰＤ１サイレンサーモジュールから生成された成熟ｍｉＲＮＡは、全ての定量化された小さいＲＮＡの約４％を占めた（図１３）。データは、ＰＤ１サイレンサーモジュールからのｍｉＲＮＡの発現が細胞ＲＮＡｉ機構を飽和させず、全般的な内因性ｍｉＲＮＡの発現に検出可能な影響を及ぼさなかったことを示した。
Figure 2024502479000028

Figure 2024502479000029
実施例１０：ＰＤ１サイレンサーモジュールは、ＰＤ－１の発現を特異的に低減させる。
インシリコｍｉＲＮＡ標的予測アルゴリズムであるｍｉＲａｎｄａ（Ｂｅｔｅｌ ｅｔ ａｌ，２００８、Ｂｅｔｅｌ ｅｔ ａｌ，２０１０）を使用して、ＰＤ１サイレンサーモジュールから生成されたガイド及びパッセンジャーｍｉＲＮＡの最も可能性の高い標的転写産物を予測した。アルゴリズムは、各潜在的なｍｉＲＮＡ標的遺伝子についてスコアを割り当て、より高いスコアは、入力ｍｉＲＮＡ配列によるサイレンシングのより高い可能性を示す。ＰＤ１サイレンシングモジュールから生成された各成熟ｍｉＲＮＡについての上位１０ヒットの要約を表１６に列挙する。ＰＤ１は、ガイドｍｉＲＮＡ及びパッセンジャーｍｉＲＮＡのいずれかと完全な相同性を有する唯一の遺伝子であり、任意の潜在的な標的遺伝子の中で最も高い予測ｍｉＲａｎｄａスコアを有する。各予測標的遺伝子の発現を、ＲＮＡｓｅｑ差次的発現データセットから特徴付けた。ＰＤ１は、全ての予測標的遺伝子の中で最も下方調節され、ｌｏｇ２倍率変化（ＬＦＣ）は－２．６３（対照ＲＯＲ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ＲＯＲ１ ＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ細胞を発現するｍｉＲＮＡの約８４％ＰＤ１減少）であり、非常に有意な調整ｐ値であった。他の予測標的遺伝子の発現は変化しなかった。０．０５未満の調整ｐ値を有するこれらの遺伝子は、－０．３３～０．２２の範囲のＬＦＣを有し、これは、２０％未満の発現の減少又は増加である。１つの例外は、－１．５１のＬＦＣを有するＰＤ１＿２０６１ガイドｍｉＲＮＡ、ＨＤＡＣ９の弱い予測標的遺伝子である。ＨＤＡＣ９は、ＢＣＬ６を介してＰＤ１発現に機械的に連結される転写抑制因子である（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ，２０１７、Ｇｉｌ ｅｔ ａｌ，２０１６）。ＨＤＡＣ９がＰＤ１＿２０６１ガイドｍｉＲＮＡによって直接標的化されておらず、ＨＤＡＣ９の減少がＰＤ１発現の減少の間接効果である可能性が高い。
Figure 2024502479000030
ＰＤ１発現の変化が、下流経路における他の遺伝子の発現に影響を与えることが予想される。予想通り、ＲＮＡｓｅｑデータの分析により、ＲＯＲ１ ＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ細胞を発現するｍｉＲＮＡにおいて、対照ＲＯＲ１ ＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、いくつかの遺伝子の差次的発現が確認された（図１４Ａ及びＢ、表１７）。遺伝子発現の直接的な変化と間接的な変化を解明するために、対照のＲＯＲ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較したＲＯＲ１ ＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ細胞を発現するｍｉＲＮＡにおける差次的発現（ＬＦＣ）を、潜在的なＰＤ１ ｍｉＲＮＡ標的としてインシリコで予測された遺伝子についてのＰＤ１ ｍｉＲＮＡの予測された結合ポテンシャル（予測された自由エネルギー）に対してプロットした（図１５Ａ～Ｄ）。非常に負の自由エネルギー及び統計的に有意な発現低下を有する遺伝子は、ｍｉＲＮＡによって直接標的とされる可能性が高いが、弱い自由エネルギーを有する下方調節された遺伝子は、ｍｉＲＮＡによって間接的に影響を受ける可能性が高い。ＰＤ１は、発現の強い減少及び高いｍｉＲＮＡ結合ポテンシャルを有するプロット内の他の全ての遺伝子から明確に分離されており、これは、ＰＤ１サイレンサーｍｉＲＮＡによるＰＤ１の強力かつ優先的な直接標的化を示唆しているが、他の遺伝子の直接標的化は示唆していない。
Figure 2024502479000031
実施例１１
一例では、患者は特定のがんを有すると診断される。この例では、患者は乳がんを有すると診断される。患者は、特定のキメラ抗原受容体療法を受けることが特定される。患者は、所望の細胞型を単離するための最初の血液試料を提供する。この例では、単離された細胞型は、Ｔ細胞である。この例では、単離されたＴ細胞の一部分のみが、ＣＡＲの集合から選択された所望の初期のＣＡＲでトランスフェクトされる。残りのＴ細胞は、患者による将来の使用の可能性のために、コード化され、適切な状態で保存される。残りのＴ細胞は、適切な手段を介してトランスフェクトされる。この例では、トランスフェクションは、非ウイルス手段を介して行われる。特に、非ウイルス手段は、少なくとも選択されたＣＡＲ、Ｔ細胞拡大サイトカイン、及び終結スイッチをコードする単一のｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙベクターを利用する。患者は、最初のＴ細胞単離から４８時間以内に治療される。
上記の治療ラウンドが完了すると、患者はモニタリングプロトコルに従って追跡される。がんの拡大がある事象では、この例では乳がんであり、患者を再評価する。患者は、初期のＣＡＲを再投与され得るが、評価が、初期又は潜在的な再投与後に抗原エスケープがあることを示す事象では、プロトコルは、ＣＡＲ集合からの新しいＣＡＲの投与を要求する。この例では、患者の保存されたＴ細胞は、新たに選択されたＣＡＲのトランスフェクションに使用するために選択される。患者は、適時に再投与されることができるようになるであろう。更に、患者は、新たに選択されたＣＡＲを除くフォローアップ療法の各部分を既に受けているため、毒性及び又は有害事象のリスクが低減される。更に、この患者についての以前のＴ細胞拡大の知識は、初期のＣＡＲ選択からの拡大のレベルによって通知される。これは更に、初期用量よりも多いか少ないかにかかわらず、用量サイズの潜在的な変化を可能にする。
実施例１２
一例では、患者は特定のがんを有すると診断されておらず、むしろ特定の抗原が、細胞の望ましくない増殖又は感染因子の拡大を引き起こすものとして特定されている。初期のＣＡＲは、患者に提示されている抗原に基づいて選択される。患者は、所望の細胞型を単離するための最初の血液試料を提供する。この例では、単離された細胞型は、Ｔ細胞である。この例では、単離されたＴ細胞の全てが、ＣＡＲの集合から選択された所望の初期のＣＡＲでトランスフェクトされる。Ｔ細胞は、適切な手段を介してトランスフェクトされる。この例では、トランスフェクションは、非ウイルス手段を介して行われる。特に、非ウイルス手段は、少なくとも選択されたＣＡＲ、Ｔ細胞拡大サイトカイン、及び死滅スイッチをコードする単一のｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙベクターを利用する。患者は、最初のＴ細胞単離から４８時間以内に治療される。
上記の治療ラウンドが完了すると、患者はモニタリングプロトコルに従って追跡される。更なる評価に続いて、患者は抗原エスケープがあることを示す。次いで、患者は、新しいＴ細胞の収集後、ＣＡＲ集合からの新しいＣＡＲを投与される。更に、患者は、新たに選択されたＣＡＲを除くフォローアップ療法の各部分を既に受けているため、毒性及び又は有害事象のリスクが低減される。更に、この患者についての以前のＴ細胞拡大の知識は、初期のＣＡＲ選択からの拡大のレベルによって通知される。これは更に、初期用量よりも多いか少ないかにかかわらず、用量サイズの潜在的な変化を可能にする。
実施例１３
臨床医は、ＣＡＲ集合からの初期のＣＡＲの使用を伴う患者の治療計画を開発する。治療計画には、抗原エスケープを防ぐために、集合からの異なるＣＡＲを連続的に投与することが含まれる。
実施例１４
一例では、患者は特定のがんを有すると診断される。この例では、患者は膵臓がんを有すると診断される。患者は、特定のキメラ抗原受容体療法を受けることが特定される。患者は、所望の細胞型を単離するための最初の血液試料を提供する。この例では、単離された細胞型は、Ｔ細胞である。この例では、単離されたＴ細胞は、ＣＡＲの集合から選択された所望の初期のＣＡＲでトランスフェクトされる。Ｔ細胞は、少なくとも選択されたＣＡＲ、Ｔ細胞拡大サイトカイン、及び死滅スイッチをコードする単一のｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙベクターを利用する非ウイルス手段を介してトランスフェクトされる。患者は、最初のＴ細胞単離から４８時間以内に治療される。
上記の治療ラウンドが完了すると、患者はモニタリングプロトコルに従って追跡される。この例では、再評価を経験した患者は、抗原エスケープを被ることが注目される。この例では、患者は新しいＣＡＲでの投与を必要とする。しかしながら、患者の状態により、自己Ｔ細胞の十分な試料が得られない場合がある。結果として、この方法は、同種異系Ｔ細胞を治療に組み込むことを可能にする。ライブラリーからのＣＡＲを同種異系Ｔ細胞に形質導入し、患者に適時に投与する。更に、患者がフォローアップ療法の各部分を既に受けているため、毒性及び又は有害事象のリスクが低減される。
実施例１５
一例では、患者は特定のがんを有すると診断されておらず、むしろ特定の抗原が、細胞の望ましくない増殖又は感染因子の拡大を引き起こすものとして特定されている。初期のＣＡＲは、患者に提示されている抗原に基づいて選択される。患者は、患者の現在の健康状態のために、所望の細胞型の単離のための初期血液試料を提供することができない。したがって、同種異系Ｔ細胞が、ＣＡＲの集合から選択される所望の初期のＣＡＲでトランスフェクトされる。Ｔ細胞は、少なくとも選択されたＣＡＲ、Ｔ細胞拡大サイトカイン、及び終結スイッチをコードする単一のアットサイト（ａｔｔｓｉｔｅ）ベクターを利用する適切な手段を介してトランスフェクトされる。
上記の治療ラウンドが完了すると、患者はモニタリングプロトコルに従って追跡される。更なる評価に続いて、患者は抗原エスケープがあることを示す。次いで、患者は、同じ同種異系Ｔ細胞源を使用して新しいＣＡＲを投与される。更に、患者は、新たに選択されたＣＡＲを除くフォローアップ療法の各部分を既に受けているため、毒性及び又は有害事象のリスクが低減される。更に、この患者についての以前のＴ細胞拡大の知識は、初期のＣＡＲ選択からの拡大のレベルによって通知される。これは更に、初期用量よりも多いか少ないかにかかわらず、用量サイズの潜在的な変化を可能にする。
実施例１６
臨床医は、ＣＡＲ集合からの初期のＣＡＲの使用を伴う患者の治療計画を開発する。治療計画には、抗原エスケープを防ぐために、集合からの異なるＣＡＲを連続的に投与することが含まれる。この治療計画には、自己由来細胞及び同種異系細胞の両方の使用が含まれ得る。
実施例１７
一例では、患者が特定の抗原を有すると診断され、細胞の望ましくない増殖又は感染因子の拡大を引き起こすものとして特定されている。初期のＣＡＲは、患者に提示されている抗原に基づいて選択される。患者は、患者の現在の健康状態のために、所望の細胞型の単離のための初期血液試料を提供することができない。したがって、同種異系細胞が、ＣＡＲの集合から選択される所望の初期のＣＡＲでトランスフェクトされる。細胞は、少なくとも選択されたＣＡＲ及び終結スイッチをコードする単一のｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙベクターを利用する適切な手段を介してトランスフェクトされる。
上記の治療ラウンドが完了すると、患者はモニタリングプロトコルに従って追跡される。更なる評価に続いて、患者は抗原エスケープがあることを示す。次いで、患者は、同種異系Ｔ細胞の供給源を使用して、又は患者が十分に改善した自己由来Ｔ細胞を示す場合、新しいＣＡＲを投与される。
実施例１８
一例では、患者は特定のがんを有すると診断されておらず、むしろ特定の抗原が、細胞の望ましくない増殖又は感染因子の拡大を引き起こすものとして特定されている。初期のＣＡＲは、患者に提示されている抗原に基づいて選択される。患者は、Ｔ細胞の単離のために最初の血液試料を提供する。Ｔ細胞は、選択されたＣＡＲ、Ｔ細胞拡大サイトカイン、及び死滅スイッチをコードする単一のｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙベクターを利用して、ＣＡＲの集合から選択された所望の初期のＣＡＲでトランスフェクトされる。患者は、最初のＴ細胞単離から４８時間以内に治療される。
上記の治療ラウンドが完了すると、患者はモニタリングプロトコルに従って追跡される。更なる評価に続いて、患者は抗原エスケープがあることを示す。次いで、患者は、ＣＡＲ集合からの同じＣＡＲ及び新しいＣＡＲを投与される。
実施例１９
一例では、患者は特定のがんを有すると診断される。この例では、患者は、ＡＭＬを有すると診断される。患者は、特定のキメラ抗原受容体療法を受けることが特定される。患者は、所望の細胞型を単離するための最初の血液試料を提供する。細胞は、ＣＡＲの集合から選択された所望の２つの異なるＣＡＲでトランスフェクトされる。細胞は、選択されたＣＡＲ及び死滅スイッチの両方をコードする単一のベクターを利用する非ウイルス手段を介してトランスフェクトされる。
上記の治療ラウンドが完了すると、患者はモニタリングプロトコルに従って追跡される。この例では、再評価を経験した患者は、抗原エスケープを被ることが注目される。この例では、患者は新しいＣＡＲでの投与を必要とする。しかしながら、患者の状態により、自己細胞の十分な試料が得られない場合がある。結果として、この方法は、同種異系Ｔ細胞を治療に組み込むことを可能にする。ライブラリーからのＣＡＲを同種異系細胞に形質導入し、患者に適時に投与する。
Figure 2024502479000032
Figure 2024502479000033
Figure 2024502479000034


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Claims (25)

  1. （ａ）免疫チェックポイントタンパク質の発現を阻害するｍｉＲＮＡと、（ｂ）キメラ受容体と、をコードする、天然に存在しないポリヌクレオチド。
  2. 前記ｍｉＲＮＡが、ＰＤ－１の発現を阻害する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 配列番号２６７と少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号２６７の相補体とハイブリダイズすることができる核酸配列を含む、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
  4. 前記キメラ受容体が、Ｔ細胞受容体である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  5. 前記キメラ受容体が、キメラ抗原受容体である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  6. 前記キメラ抗原受容体が、ＲＯＲ１上のエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
  7. 前記キメラ抗原受容体が、配列番号４６５のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
  8. 前記キメラ抗原受容体が、配列番号４６７のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含むストーク領域と、配列番号４７３のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含むストーク伸長領域と、を含む、スペーサーを含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
  9. サイトカインを更にコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  10. 前記サイトカインが、ＩＬ－１５、又はその機能的断片若しくはバリアントであり、かつ膜結合型である、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
  11. ＩＬ－１５、又はその機能的断片若しくはバリアントと、ＩＬ－１５Ｒα、又はその機能的断片若しくはバリアントと、を含む、融合タンパク質をコードする、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
  12. 前記融合タンパク質が、配列番号５２３のアミノ酸配列、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
  13. 細胞タグを更にコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  14. 切頭ＨＥＲ１が、ＨＥＲ１ドメインＩＩＩ、又はその機能的断片若しくはバリアントと、切頭ＨＥＲ１ドメインＩＶ、又はその機能的断片若しくはバリアントと、を含む、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
  15. 前記細胞タグが、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、又はその機能的断片若しくはバリアントを更に含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
  16. 請求項１～１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  17. Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンを含む、請求項１６に記載のベクター。
  18. 請求項１～１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、修飾された免疫エフェクター細胞。
  19. 請求項１～１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１８に記載の細胞を含む、組成物。
  20. 請求項１～１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１８に記載の細胞を含む、キット。
  21. 疾患又は障害に罹患している対象を治療する方法であって、その治療を必要とする対象に、請求項１８に記載の細胞を投与することを含む、方法。
  22. 疾患又は障害の治療のための医薬の製造における、請求項１８に記載の修飾された免疫エフェクター細胞の使用。
  23. 対象における抗原の過剰発現と関連する疾患又は障害を検出するための方法であって、前記方法が、ａ）前記対象からの試料を、抗体、又はその抗原結合断片のうちの１つ以上と接触させることと、ｂ）前記疾患を欠く対照試料へのそのような結合と比較して、前記試料への前記抗体又はその断片の結合の増加したレベルを検出し、それによって前記対象における前記疾患を検出することと、を含む、方法。
  24. キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド又はそれを含む細胞の連続投与を含む、疾患又は障害を治療するための方法であって、前記コードされたキメラ抗原受容体が、抗原標的のアレイに対して異なる構造組成及び結合特異性を有するキメラ抗原受容体の集合から選択される、方法。
  25. 前記集合からの１つ以上のキメラ抗原受容体を発現する細胞の１回目の投与、続いて前記集合からの１つ以上のキメラ抗原受容体を発現する細胞の２回目の投与を含み、前記１回目の投与と前記２回目の投与との間に一定の期間が経過する、請求項２３に記載の方法。
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