KR20210043562A - Ror-1 특이적 키메라 항원 수용체 및 그의 용도 - Google Patents

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루툴 알. 샤
창훙 첸
셰릴 지. 보링어
비노드바부 쿠렐라
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Abstract

본원에서는 암 요법을 위한 키메라 항원 수용체 (CAR), 및 더욱 특히, 항-ROR-1 모노클로날 항체로부터의 scFv를 함유하는 CAR을 제공한다. 상기 CAR을 함유하는 면역 이펙터 세포, 및 증식성 장애를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

ROR-1 특이적 키메라 항원 수용체 및 그의 용도
상호 참조
본 출원은 2018년 7월 10일 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/696,075의 이익을 주장하고, 상기 출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하고, 이는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 2019년 7월 8일 작성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 50471_716_601_SL.txt이며, 그 크기는 360,082 바이트이다.
본 개시내용의 배경
재조합 폴리펩티드 예컨대, 키메라 폴리펩티드는 연구, 진단, 제조, 및 치료 적용에 매우 가치있는 유용한 것이다. 항원 결합 폴리펩티드, 예컨대, CAR을 발현하는 변형된 이펙터 세포는 질환 및 장애, 예컨대, 감염성 질환, 자가면역 장애 및 암 치료에서 유용하다.
참고문헌 인용
본 명세서에서 언급된 모든 공개 문헌, 특허, 및 특허 출원은, 마치 각각의 개별 공개 문헌, 특허 및 특허 출원이 참조로 인용되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 명시된 것과 같은 정도로 본원에서 참조로 포함된다.
본 개시내용의 요약
특정 실시양태에서, 본원에서는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 단리된 핵산, 벡터, 면역 이펙터 세포, 방법 및 시스템을 개시한다.
본원에서는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 단리된 핵산으로서, 여기서, CAR은 (a) ROR-1 항원 결합 도메인; (b) 스페이서; (c) 막관통 도메인; (d) 4-1BB 또는 CD28, 또는 둘 다를 포함하는 공동자극성 신호전달 도메인; 및 (e) CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는 것인, 단리된 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, CAR은 (a) 서열번호: 3 내지 14에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드; 또는 (b) 서열번호: 75 내지 82에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 경우에서, ROR-1 항원 결합 도메인은 서열번호: 15 내지 74에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 경우에서, ROR-1 항원 결합 도메인은 서열번호: 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 및 73에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 예에서, ROR-1 항원 결합 도메인은 서열번호: 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 및 74에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 서열번호: 83의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드이다. 다른 실시양태에서, 스페이서는 서열번호: 84의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드이다. 일부 경우에서, 스페이서는 서열번호: 85의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드이다. 일부 예에서, 스페이서는 서열번호: 86의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드이다. 다른 실시양태에서, 막관통 도메인은 서열번호: 87 및 88에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드이다.
일부 경우에서, 공동자극성 신호전달 도메인은 4-1BB를 포함한다. 다른 실시양태에서, 4-1BB의 공동자극성 신호전달 도메인은 서열번호: 89의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 경우에서, 공동자극성 신호전달 도메인은 CD28을 포함한다. 일부 예에서, CD28의 공동자극성 신호전달 도메인은 서열번호: 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, CD3 제타 신호전달 도메인은 서열번호: 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 단리된 핵산은 서열번호: 94 내지 108의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
일부 예에서, 단리된 핵산은 세포 태그를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 태그는 말단절단된 표피 성장 인자 수용체이다. 일부 경우에서, 말단절단된 표피 성장 인자 수용체는 HER1t이고, 서열번호: 109의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 말단절단된 표피 성장 인자 수용체는 HER1t-1이고, 서열번호: 110의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 태그는 서열번호: 111의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 경우에서, 세포 태그는 서열번호: 112의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 예에서, 단리된 핵산은 이종성 유전자 발현의 리간드 유도성 제어를 위한 유전자 스위치 폴리펩티드를 코딩하는 추가의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 여기서, 유전자 스위치 폴리펩티드는 (a) 제1 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 DNA 결합 도메인을 포함하는 제1 유전자 스위치 폴리펩티드; 및 (b) 제2 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 전사활성화 도메인을 포함하는 제2 유전자 스위치 폴리펩티드를 포함하고; 여기서, 제1 유전자 스위치 폴리펩티드 및 제2 유전자 스위치 폴리펩티드는 링커에 의해 연결된다.
본원에서는 백본, 및 (1) 세포 태그; (2) 시토카인; 및 (3) 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로서, 여기서, CAR은 (a) ROR-1 항원 결합 도메인; (b) 스페이서; (c) 막관통 도메인; (d) 4-1BB 또는 CD28, 또는 둘 다를 포함하는 공동자극성 신호전달 도메인; 및 (e) CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는 것인, 벡터를 제공한다.
일부 실시양태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 또는 비-바이러스 벡터이다. 일부 경우에서, 세포 태그는 말단절단된 표피 성장 인자 수용체이다. 일부 실시양태에서, 말단절단된 표피 성장 인자 수용체는 HER1t, HER1t-1 또는 그의 기능성 변이체이다. 일부 예에서, 말단절단된 표피 성장 인자 수용체는 서열번호: 109 또는 서열번호: 110의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 예에서, 세포 태그는 서열번호: 111의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 예에서, 세포 태그는 서열번호: 112의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 경우에서, 시토카인은 IL-15이다. 일부 실시양태에서, IL-15는 막 결합 IL-15이다. 일부 실시양태에서, 막 결합 IL-15는 서열번호: 113의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 경우에서, 벡터는 자기 절단 토세아 아시그나 바이러스(Thosea asigna virus: T2A) 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 백본은 슬리핑 뷰티 트랜스포존 DNA 플라스미드이다. 일부 예에서, 벡터는 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 hEF1a1이다. 다른 실시양태에서, CAR은 (a) 서열번호: 3 내지 14에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 as; 또는 (b) 서열번호: 75 내지 82에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR-1 항원 결합 도메인은 서열번호: 15 내지 74에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 예에서, ROR-1 항원 결합 도메인은 서열번호: 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 및 73 에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 예에서, ROR-1 항원 결합 도메인은 서열번호: 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 및 74에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에서, 스페이서는 서열번호: 83의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드이다. 다른 경우에서, 스페이서는 서열번호: 84의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드이다.
일부 경우에서, 스페이서는 서열번호: 85의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드이다. 다른 경우에서, 스페이서는 서열번호: 86의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 서열번호: 87 및 88에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드이다.
일부 예에서, 공동자극성 신호전달 도메인은 4-1BB를 포함한다. 일부 실시양태에서, 4-1BB의 공동자극성 신호전달 도메인은 서열번호: 89의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, CD3 제타 신호전달 도메인은 서열번호: 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에서, 벡터는 서열번호: 94 내지 108의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
일부 경우에서, 벡터는 플라스미드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각 벡터는 발현 플라스미드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-바이러스 벡터는 슬리핑 뷰티 트랜스포존이다. 일부 예에서, 벡터는 이종성 유전자 발현의 리간드 유도성 제어를 위한 유전자 스위치 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 포함하는 추가 벡터를 추가로 포함하고, 여기서, 유전자 스위치 폴리펩티드는 (a) 제1 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 DNA 결합 도메인을 포함하는 제1 유전자 스위치 폴리펩티드; 및 (b) 제2 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 전사활성화 도메인을 포함하는 제2 유전자 스위치 폴리펩티드를 포함하고; 여기서, 제1 유전자 스위치 폴리펩티드 및 제2 유전자 스위치 폴리펩티드는 링커에 의해 연결된다.
본원에서는 단리된 핵산을 포함하는 면역 이펙터 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역 이펙터 세포는 벡터를 포함한다.
본원에서는 (1) 세포 태그; (2) 시토카인; 및 (3) 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 면역 이펙터 세포로서, 여기서, CAR은 (a) ROR-1 항원 결합 도메인; (b) 스페이서; (c) 막관통 도메인; (d) 4-1BB 또는 CD28, 또는 둘 다를 포함하는 공동자극성 신호전달 도메인; 및 (e) CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는 것인, 면역 이펙터 세포를 추가로 제공한다.
일부 실시양태에서, 시토카인은 IL-15이다. 일부 실시양태에서, IL-15는 막 결합 IL-15이다. 일부 경우에서, 막 결합 IL-15는 서열번호: 113의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 경우에서, 세포 태그는 말단절단된 표피 성장 인자 수용체이다. 일부 실시양태에서, 말단절단된 표피 성장 인자 수용체는 HER1t, HER1t-1 또는 그의 기능성 변이체이다. 일부 경우에서, 말단절단된 표피 성장 인자 수용체는 서열번호: 109 또는 서열번호: 110의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 예에서, 세포 태그는 서열번호: 111의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 세포 태그는 서열번호: 112의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 스페이서는 서열번호: 83의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드이다. 다른 실시양태에서, 스페이서는 서열번호: 84의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드이다. 일부 경우에서, 스페이서는 서열번호: 85의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드이다. 다른 경우에서, 스페이서는 서열번호: 86의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드이다.
일부 예에서, 세포는 T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 또는 조절 T 세포이다. 다른 예에서, CAR은 서열번호: 3 내지 14 또는 75 내지 82에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 경우에서, CAR은 서열번호: 15 내지 74에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 중 적어도 하나를 포함한다. 다른 경우에서, 면역 이펙터 세포는 이종성 유전자 발현의 리간드 유도성 제어를 위한 유전자 스위치 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 여기서, 유전자 스위치 폴리펩티드는 (a) 제1 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 DNA 결합 도메인을 포함하는 제1 유전자 스위치 폴리펩티드; 및 (b) 제2 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 전사활성화 도메인을 포함하는 제2 유전자 스위치 폴리펩티드를 포함하고; 여기서, 제1 유전자 스위치 폴리펩티드 및 제2 유전자 스위치 폴리펩티드는 링커에 의해 연결된다.
본원에서는 표적 세포 집단 또는 조직에 대한 T 세포-매개 면역 반응을 필요로 하는 인간 대상체에게 유효량의, CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, CAR은 (a) ROR-1 항원 결합 도메인; (b) 스페이서; (c) 막관통 도메인; (d) 4-1BB 또는 CD28, 또는 둘 다를 포함하는 공동자극성 신호전달 도메인; (e) CD3 제타 신호전달 도메인; 및 (f) 말단절단된 표피 성장 인자 수용체 (HER1t)를 포함하는 것인, 표적 세포 집단 또는 조직에 대한 T 세포-매개 면역 반응을 필요로 하는 인간 대상체에서 상기 T 세포-매개 면역 반응을 자극시키는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 인간은 폐암, 유방암, 췌장암, 난소암, 전립선암, 부신암, 흑색종, 자궁암, 고환암, 또는 방광암 중 적어도 하나의 진단을 받은 인간이다. 일부 경우에서, 인간은 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모발상 세포 백혈병 (HCL), 다발성 골수종 (MM), 급성 골수성 백혈병 (AML), 또는 만성 골수성 백혈병 (CML)의 진단을 받은 인간이다.
본원에서는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 단리된 핵산으로서, 여기서, CAR은 (a) 서열번호: 3 내지 14 , 75 내지 82, 또는 15 내지 74에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나를 갖는 ROR-1 항원 결합 도메인; (b) 서열번호: 83 내지 86의 아미노산 서열 중 적어도 하나를 갖는 스페이서; (c) 서열번호: 90의 아미노산 서열을 갖는 CD28을 포함하는 공동자극성 신호전달 도메인; (d) 서열번호: 109의 아미노산 서열을 갖는 HER1t 및 서열번호: 110의 아미노산 서열을 갖는 HER1t-1 중 적어도 하나를 포함하는 HER1 태그; 및 (e) 서열번호: 93의 아미노산 서열을 갖는 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는 것인, 단리된 핵산을 제공한다.
본원에서는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 단리된 핵산으로서, 여기서, CAR은 (a) 서열번호: 3 내지 14, 85 내지 82, 또는 15 내지 74에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나를 갖는 ROR-1 항원 결합 도메인; (b) 서열번호: 83 내지 86의 아미노산 서열 중 적어도 하나를 갖는 스페이서; (c) 서열번호: 89의 아미노산 서열을 갖는 4-1BB를 포함하는 공동자극성 신호전달 도메인; (d) 서열번호: 109의 아미노산 서열을 갖는 HER1t 및 서열번호: 110의 아미노산 서열을 갖는 HER1t-1 중 적어도 하나를 포함하는 HER1 태그; 및 (e) 서열번호: 93의 아미노산 서열을 갖는 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는 것인, 단리된 핵산을 제공한다.
일부 예에서, 벡터는 단리된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 하나 이상의 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 또는 비-바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 비-바이러스 벡터는 슬리핑 뷰티 트랜스포존이다. 다른 예에서, 벡터는 복수의 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 이종성 유전자 발현의 리간드 유도성 제어를 위한 유전자 스위치 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 포함하는 추가 벡터를 추가로 포함하고, 여기서, 유전자 스위치 폴리펩티드는 (a) 제1 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 DNA 결합 도메인을 포함하는 제1 유전자 스위치 폴리펩티드; 및 (b) 제2 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 전사활성화 도메인을 포함하는 제2 유전자 스위치 폴리펩티드를 포함하고; 여기서, 제1 유전자 스위치 폴리펩티드 및 제2 유전자 스위치 폴리펩티드는 링커에 의해 연결된다.
본원에서는 단리된 핵산을 코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 것인, 면역 이펙터 세포에서 CAR을 발현하기 위한 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역 이펙터 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 시스템은 적어도 하나의 추가 유전자를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가 유전자는 시토카인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 IL-2, IL-15, IL-12, IL-21, 및 IL-15 및 IL-15Rα의 융합체 중 적어도 하나를 포함한다. 다른 실시양태에서, 시토카인은 분비된 형태이다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 막 결합 형태이다. 일부 실시양태에서, 시스템은 적어도 하나의 벡터를 포함한다. 다른 경우에서, 적어도 하나의 벡터는 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 또는 비-바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 비-바이러스 벡터는 슬리핑 뷰티 트랜스포존이다. 일부 실시양태에서, 시스템은 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 추가로 포함한다다. 일부 예에서, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제는 SB11, SB100X 또는 SB110이다. 다른 예에서, 시스템은 이종성 유전자 발현의 리간드 유도성 제어를 위한 유전자 스위치 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 포함하는 추가 벡터를 추가로 포함하고, 여기서, 유전자 스위치 폴리펩티드는 (a) 제1 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 DNA 결합 도메인을 포함하는 제1 유전자 스위치 폴리펩티드; 및 (b) 제2 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 전사활성화 도메인을 포함하는 제2 유전자 스위치 폴리펩티드를 포함하고; 여기서, 제1 유전자 스위치 폴리펩티드 및 제2 유전자 스위치 폴리펩티드는 링커에 의해 연결된다. 일부 실시양태에서, 면역 이펙터 세포는 포유동물 세포이다.
본원에서는 면역 이펙터 세포에서 CAR을 발현하기 위한 시스템으로서, 시스템은 (1) 백본, 및 (a) 세포 태그; (b) 시토카인; 및 (c) 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터로서, 여기서, CAR은 (i) ROR-1 항원 결합 도메인; (ii) 스페이서; (iii) 막관통 도메인; (iv) 4-1BB 또는 CD28, 또는 둘 다를 포함하는 공동자극성 신호전달 도메인; 및 (v) CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는 것인 제1 벡터; 및 (2) 이종성 유전자 발현의 리간드 유도성 제어를 위한 유전자 스위치 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터로서, 여기서, 유전자 스위치 폴리펩티드는 (a) 제1 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 DNA 결합 도메인을 포함하는 제1 유전자 스위치 폴리펩티드; 및 (b) 제2 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 전사활성화 도메인을 포함하는 제2 유전자 스위치 폴리펩티드; 여기서, 제1 유전자 스위치 폴리펩티드 및 제2 유전자 스위치 폴리펩티드는 링커에 의해 연결된 것인 제2 벡터를 포함하는 것인, 시스템을 제공한다.
본원에서는 면역 이펙터 세포를 시스템과 접촉시키는 단계를 포함하는, 면역 이펙터 세포에서 CAR을 발현시키는 방법을 제공한다.
본원에서는 (a) 대상체로부터, T 세포 또는 T 세포 전구체를 포함하는 세포의 샘플을 수득하는 단계; (b) 세포를, 제1항 내지 제22항 및 제79항 내지 제80항 중 어느 한 항에서 제공된 바와 같은 단리된 핵산을 코딩하는 하나 이상의 벡터, 및 트랜스포사제를 코딩하는 벡터로 형질감염시켜 조작된 ROR-1 CAR-발현 T 세포 집단을 제공하는 단계; 및 임의적으로, (c) ROR-1 CAR T 세포 집단을 생체외에서 2일 이하 동안 배양하는 단계를 포함하는, 조작된 T 세포의 증식 및/또는 생존을 자극시키는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 벡터는 시토카인 및 세포 태그를 추가로 코딩한다. 일부 경우에서, 시토카인은 IL-15 및 IL-15Rα를 포함하는 융합 단백질이다. 다른 실시양태에서, 본 방법은 이종성 유전자 발현의 리간드 유도성 제어를 위한 유전자 스위치 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 포함하는 추가 벡터를 추가로 포함하고, 여기서, 유전자 스위치 폴리펩티드는 (a) 제1 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 DNA 결합 도메인을 포함하는 제1 유전자 스위치 폴리펩티드; 및 (b) 제2 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 전사활성화 도메인을 포함하는 제2 유전자 스위치 폴리펩티드를 포함하고; 여기서, 제1 유전자 스위치 폴리펩티드 및 제2 유전자 스위치 폴리펩티드는 링커에 의해 연결된다.
일부 예에서, DNA 결합 도메인은 GAL4 (GAL4 DBD), LexA DBD, 전사 인자 DBD, 스테로이드/갑상선 호르몬 핵 수용체 슈퍼패밀리 구성원 DBD, 박테리아 LacZ DBD, 및 효모 DBD 중 적어도 하나를 포함한다. 다른 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 서열번호: 134에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전사활성화 도메인은 VP16 전사활성화 도메인, 및 B42 산성 활성인자 전사활성화 도메인 중 적어도 하나를 포함한다. 다른 경우에서, 전사활성화 도메인은 서열번호: 131에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 핵 수용체 리간드 결합 도메인 및 제2 핵 수용체 리간드 결합 도메인 중 적어도 하나는 엑디손 수용체 (EcR), 편재 수용체, 희귀 수용체 1, NER-1, 스테로이드 호르몬 핵 수용체 1, 레티노이드 X 수용체 상호작용 단백질-15, 간 X 수용체 β, 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질, 간 X 수용체, 간 X 수용체 α, 파르네소이드 X 수용체, 수용체 상호작용 단백질 14, 및 파르네솔 수용체 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 경우에서, 제1 핵 수용체 리간드 결합 도메인 및 제2 핵 수용체 리간드 결합 도메인 중 적어도 하나는 서열번호: 135 및 136에 제시된 아미노산 서열들 중 어느 하나를 포함한다. 일부 예에서, 제1 유전자 스위치 폴리펩티드는 EcR 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 GAL4 DBD를 포함하고, 제2 유전자 스위치 폴리펩티드는 레티노이드 수용체 X (RXR) 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 VP16 전사활성화 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, EcR 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 Gal4 DBD는 서열번호: 137 및 138 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 레티노이드 수용체 X (RXR) 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 VP16 전사활성화 도메인은 서열번호: 133에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커는 절단가능한 링커, 리보솜 스키핑 링커 서열 또는 IRES 링커이다. 일부 예에서, 링커는 IRES 링커이고, 상기 IRES 링커는 서열번호: 146 및 147 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는다. 다른 실시양태에서, 링커는 절단가능한 링커 또는 리보솜 스키핑 링커 서열이다. 다른 경우에서, 절단가능한 링커 또는 리보솜 스키핑 링커 서열은 2A 링커, p2A 링커, T2A 링커, F2A 링커, E2A 링커, GSG-2A 링커, GSG 링커 (서열번호: 129), SGSG 링커 (서열번호: 130), 그의 퓨린링크(furinlink) 링커 변이체 및 유도체 중 하나 이상의 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단가능한 링커 또는 리보솜 스키핑 링커 서열은 서열번호: 116-126 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 벡터 및 추가 벡터 중 적어도 하나는 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 또는 비-바이러스 벡터이다. 일부 경우에서, 비-바이러스 벡터는 슬리핑 뷰티 트랜스포존이다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제는 SB11, SB100X 또는 SB110이다.
본원에서는 (a) 대상체로부터, T 세포 또는 T 세포 전구체를 포함하는 세포의 샘플을 수득하는 단계; (b) 세포를, 제1항 내지 제22항 및 제79항 내지 제80항 중 어느 한 항에서 제공된 바와 같은 단리된 핵산을 코딩하는 하나 이상의 벡터, 및 트랜스포사제를 코딩하는 벡터로 형질감염시켜 조작된 ROR1 CAR-발현 T 세포 집단을 제공하는 단계; 및 (c) 조작된 ROR1 CAR-발현 T 세포 집단을 생체외에서 조작된 ROR1 CAR-발현 T 세포의 증식을 선택적으로 증진시키는 배지 중에서 배양하는 단계로서, 여기서, 조작된 ROR1 CAR-발현 T 세포는 21일 이하 동안 배양하는 것인 단계를 포함하는, 조작된 T 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
일부 예에서, 조작된 ROR1 CAR-발현 T 세포는 14일 이하 동안 배양된다. 일부 경우에서, 하나 이상의 벡터는 시토카인 및 세포 태그를 추가로 코딩한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 이종성 유전자 발현의 리간드 유도성 제어를 위한 유전자 스위치 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 포함하는 추가 벡터를 추가로 포함하고, 여기서, 유전자 스위치 폴리펩티드는 (a) 제1 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 DNA 결합 도메인을 포함하는 제1 유전자 스위치 폴리펩티드; 및 (b) 제2 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 전사활성화 도메인을 포함하는 제2 유전자 스위치 폴리펩티드; 여기서, 제1 유전자 스위치 폴리펩티드 및 제2 유전자 스위치 폴리펩티드는 링커에 의해 연결된다. 다른 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 GAL4 (GAL4 DBD), LexA DBD, 전사 인자 DBD, 스테로이드/갑상선 호르몬 핵 수용체 슈퍼패밀리 구성원 DBD, 박테리아 LacZ DBD, 및 효모 DBD 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 서열번호: 134에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, 전사활성화 도메인은 VP16 전사활성화 도메인, 및 B42 산성 활성인자 전사활성화 도메인 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전사활성화 도메인은 서열번호: 131에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 제1 핵 수용체 리간드 결합 도메인 및 제2 핵 수용체 리간드 결합 도메인 중 적어도 하나는 엑디손 수용체 (EcR), 편재 수용체, 희귀 수용체 1, NER-1, 스테로이드 호르몬 핵 수용체 1, 레티노이드 X 수용체 상호작용 단백질-15, 간 X 수용체 β, 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질, 간 X 수용체, 간 X 수용체 α, 파르네소이드 X 수용체, 수용체 상호작용 단백질 14, 및 파르네솔 수용체 중 적어도 하나를 포함한다. 다른 경우에서, 제1 핵 수용체 리간드 결합 도메인 및 제2 핵 수용체 리간드 결합 도메인 중 적어도 하나는 서열번호: 135 및 136에 제시된 아미노산 서열들 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 유전자 스위치 폴리펩티드는 EcR 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 GAL4 DBD를 포함하고, 제2 유전자 스위치 폴리펩티드는 레티노이드 수용체 X (RXR) 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 VP16 전사활성화 도메인을 포함한다. 일부 예에서, EcR 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 Gal4 DBD는 서열번호: 137 및 138 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 레티노이드 수용체 X (RXR) 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 VP16 전사활성화 도메인은 서열번호: 133에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 링커는 절단가능한 링커, 리보솜 스키핑 링커 서열 또는 IRES 링커이다. 다른 실시양태에서, 링커는 IRES 링커이고, 상기 IRES 링커는 서열번호: 146 및 147 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단가능한 링커 또는 리보솜 스키핑 링커 서열이다. 일부 예에서, 절단가능한 링커 또는 리보솜 스키핑 링커 서열은 2A 링커, p2A 링커, T2A 링커, F2A 링커, E2A 링커, GSG-2A 링커, GSG 링커 (서열번호: 129), SGSG 링커 (서열번호: 130), 그의 퓨린링크 링커 변이체 및 유도체 중 하나 이상의 것을 포함한다. 다른 예에서, 절단가능한 링커 또는 리보솜 스키핑 링커 서열은 서열번호: 116-126 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 벡터들, 벡터, 및 추가 벡터 중 적어도 하나는 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 또는 비-바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 비-바이러스 벡터는 슬리핑 뷰티 트랜스포존이다. 다른 실시양태에서, 본 방법은 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제는 SB11, SB100X 또는 SB110이다. 일부 실시양태에서, (c)에서 조작된 ROR1 CAR-발현 T 세포를 배양하는 단계는 조작된 ROR1 CAR-T 발현 T 세포의 확장을 자극하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 존재하에서 조작된 ROR1 CAR-발현 T 세포를 배양하는 것을 포함한다. 다른 경우에서, aAPC는 조작된 K562 세포이다. 일부 실시양태에서, aAPC는 (i) 조작된 CAR 세포 상에 발현된 ROR1 항원; (ii) CD64; (ii) CD86; (iii) CD 137L; 및/또는 (v) aAPC의 표면 상에 발현된 막 결합 IL-15를 포함한다.
본원에서는 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 조작된 T 세포를 1회 이상의 용량으로 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 조작된 T 세포는 ROR-1 CAR 및 막 결합 IL-15를 포함하는 것인, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 제1 용량의 유효량의 조작된 T 세포는 복강내로 투여된다. 일부 실시양태에서, 제2 용량의 유효량의 조작된 T 세포는 정맥내로 투여된다. 일부 실시양태에서, 암은 비호지킨 림프종, 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모발상 세포 백혈병 (HCL), 다발성 골수종 (MM), 급성 골수성 백혈병 (AML), 또는 만성 골수성 백혈병 (CML)이다. 일부 경우에서, 암은 폐암, 유방암, 췌장암, 난소암, 전립선암, 부신암, 흑색종, 자궁암, 고환암, 또는 방광암이다. 일부 예에서, ROR-1 CAR은 서열번호: 3 내지 14, 75 내지 82, 또는 15 내지 74에 제시된 서열 중 어느 하나에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 막 결합 IL-15는 서열번호: 260에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 조작된 T 세포의 유효량은 적어도 102개의 세포/kg이다. 다른 실시양태에서, 조작된 T 세포의 유효량은 적어도 104개의 세포/kg이다. 일부 경우에서, 조작된 T 세포의 유효량은 적어도 105개의 세포/kg이다.
도면의 간단한 설명
본 개시내용의 특징은 특히 첨부된 청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 특징 및 이점은 본 개시내용의 원리가 이용되는 예시적인 실시양태를 기술하는 하기 상세한 설명, 및 하기 첨부된 도면을 참조로 더욱 잘 이해할 수 있을 것이다:
도 1a-e는 다양한 배열의ROR1 CAR 및 시토카인에 대한 예시적인 유전자 발현 카세트를 도시한 것이다. 특정 경우에, ROR1 CAR 및/또는 시토카인은 조건부 생체내 제거를 위해 세포 또는 사멸 태그와 함께 공동 발현될 수 있다. ROR1 CAR 및 mbIL-15의 구성적 발현을 위한 예시적인 유전자 발현 카세트 또는 그의 조합은 c + e 또는 d + e를 포함할 수 있다.
도 2a-e는 유전자 스위치 성분을 포함하는 상이한 배열의 ROR1 CAR 및 시토카인에 대한 예시적인 유전자 발현 카세트를 도시한 것이다. 유도성 발현을 위한 예시적인 유전자 발현 카세트 또는 그의 조합은 a + e, b + e, c + e, 또는 d + e를 포함할 수 있다.
도 3은 예시적인 ROR1 CAR 디자인을 도시한 것이다. 표준 CAR 디자인에 기초한 ROR1 CAR은 유전자 전달 후 어떤 ROR1 CAR 발현도 보이지 않았다. 실시예 1 에 기술된 바와 같은 다양한 최적화 전략법을 사용하여 표면 발현의, 기능적 ROR1 CAR을 개발하였다.
도 4는 상이한 길이의 스페이서를 갖는 ROR1 CAR의 도해를 도시한 것이다.
도 5는 종래 CD8α 스토크를 이용한 ROR1 CAR (뮤린 scFv) 구축물에서 시험된 신호 펩티드의 조합을 도시하고, 사이한 신호 펩티드를 갖는 ROR1 CAR (뮤린 scFv)의 발현을 보여주는 것이다. 뉴클레오펙션 후 1일째 트랜스진의 발현을 측정하였다. 세포를 생(live) CD3+ 세포에 대해 게이팅하였다. 짧은 CD8α (종래) 스토크는 사용된 신호 펩티드 (인간 또는 마우스의 것)와 상관 없이 표면 발현을 허용하지 않는다.
도 6은 신호 펩티드 및 상이한 스페이서 및 스페이서 길이의 상이한 조합을 갖는 ROR1 CAR (뮤린 scFv)의 발현을 보여주는 것이다. 3개의 상이한 더욱 긴 스페이서 길이를 이용한 ROR1 CAR이 강한 표면 발현을 보인 것을 확인하였다.
도 7은 상이한 신호 펩티드를 갖는 CD8α 3X 스토크를 포함하는 ROR1 CAR (뮤린 scFv)의 발현을 보여주는 것이다. 3X CD8α 스토크를 포함하는 뮤린 scFv 기반 ROR1 CAR의 발현은 특정 (mIgGVH, β2M 및 아주로시딘(Azurocidin)) 신호 펩티드의 경우 개선되었다.
도 8은 평가된 스토크, 세포내 도메인 및 VH/VL 쇄 배향의 다양한 조합을 갖는 상이한 ROR 1 CAR (뮤린 scFv), 및 스토크, 세포내 도메인 및 VH/VL 쇄 배향의 다양한 조합을 갖는 ROR 1 CAR (뮤린 scFv)의 발현을 보여주는 것이다. 관찰된 바와 같이, VL-VH에서 VH-VL로의 배향 역전이 hGMCSFR 및 hIGHV3-23 신호 펩티드로부터의 표면 발현을 가능하게 한다.
도 9a 및 도 9b는 CD107a 탈과립화 검정법 및 IFN-α 발현 검정법에서 측정된 바와 같이, 다양한 종양 세포주에서의 ROR1(뮤린 scFv)-CD8-3x 스토크.CD28z CAR-T 세포의 특이성을 보여주는 것이다.
도 10a는 CAR-T 처리 후 7일째 생체내 생체발광 (IVIS) 영상화에 의해 측정된 바와 같은 JeKo-1 종양 부담의 정량적 분석을 보여주는 것이다. 0일째 i.p. 주사를 통해 NSG 마우스 (N = 군당 5-7마리의 마우스)에 JeKo 종양 세포주를 투여하였다. 종양 세포 투여 후 7일째에 단일 i.p. 주사를 통한 상이한 hROR1 CAR-T 세포 처리로 종양을 보유하는 마우스를 처리하고, 처리를 진행하는 동안 IVIS를 통해 종양 부담을 정량화하였다. 제시된 데이터는 평군 ± SEM이다.
도 10b는 처리전 종양 부담을 보여주는 것이다.
도 11은 36일째의 (상기 기술된 바와 같은) 생체내 생체발광 (IVIS) 영상화에 의해 측정된 바와 같은 JeKo-1 종양 부담의 정량적 분석을 보여주는 것이다.
도 12는 다양한 hROR1 CAR-T 세포로 처리된, 종양을 보유하는 NSG 마우스의 말초 혈액 중 인간 CD3+ T 세포의 정량화를 보여주는 것이다. 15, 22, 29, 36, 43 및 50일째에 혈액 중 CD3+ T 세포 확장을 측정하였다.
도 13a 및 도 13b는 ROR1+ 종양 세포주가 시험관내에서 구성적 또는 RTS-mbIL-15를 공동 발현하는 hROR1 CAR T 세포에 의해 동일하게 사멸되었다는 것을 입증하는 것이다.
도 14는 hROR1 CAR RTS-mbIL-15-T 세포 + 벨레디멕스의 투여가 용량에 의존하는 방식으로 JeKo-1 이종이식 마우스 모델에서 항-종양 효과를 촉진시킨다는 것을 입증하는 것이다.
본 개시내용의 상세한 설명
하기 설명 및 실시예는 본 발명의 실시양태를 상세하게 설명한다. 본 발명은 본원에 기술된 특정 실시양태로 제한되지 않고, 따라서, 본 발명은 달라질 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 당업자라면, 본 발명에 대한 다수의 변형 및 수정이 이루어질 수 있고, 그러한 변형 및 수정도 본 발명의 범주 내에 포함된다는 것을 이해할 것이다.
모든 용어는 당업자가 이해하는 바와 같이 이해되는 것으로 의도된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 본 개시내용과 관련된 분야의 숙련가가 보편적으로 이해하는 것과 같은 의미를 갖는다.
본원에서 사용된 섹션 표제는 단지 조직화 목적이며, 기술된 대상을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 발명의 다양한 특징들이 단일 실시양태 맥락으로 기술될 수 있지만, 상기 특징 또한 별개로 또는 임의의 적합한 조합 방식으로 제공될 수 있다. 반대로, 본 발명이 명확성을 위해 개별 실시양태 맥락으로 본원에 기술될 수 있지만, 본 발명 또한 단일 실시양태로 실시될 수 있다.
하기 정의는 본 분야의 것을 보충하고, 본 출원에 대해 해당되는 것이며, 임의의 관련 또는 비관련 사례로, 예컨대, 임의의 공동 소유의 특허 또는 출원으로까지 귀속되지 않아야 한다. 본원에 기술된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 개시내용을 시험하는 데 사용될 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법이 본원에 기술된다. 따라서, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 기술하기 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 출원에서, 단수 형태 사용은 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 복수의 것을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바, "하나"("a," "an") 및 "그"라는 단수 형태는 문맥상 달리 명확하게 언급되지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다. 본 출원에서, "또는" 사용은 달리 언급되지 않는 한, "및/또는"을 의미한다. 추가로, "포함하는"이라는 용어 뿐만 아니라, 예컨대, "포함하다(include)," "포함하다(includes)" 및 "포함된"과 같은 다른 형태는 제한적인 것이 아니다.
본 명세서에서 "일부 실시양태," "한(an) 실시양태," "한(one) 실시양태," 또는 "다른 실시양태"라고 언급하는 것은 실시양태와 관련하여 기술되는 특정의 특성, 구조, 또는 특징이 본 발명의 적어도 일부 실시양태에 포함되지만, 그 모두의 실시양태에 포함될 필요는 없다는 것을 의미한다.
본 명세서 및 청구범위(들)에서 사용되는 바, "포함하는"이라는 단어 (및 예컨대, "포함하다(comprise)" 및 "포함하다(comprises)"와 같은, 포함하는이라는 단어의 임의 형태), "갖는"이라는 단어 (및 예컨대, "갖는다(have)" 및 "갖는다(has)"와 같은, 갖는이라는 단어의 임의 형태), "포함하는(including)"이라는 단어 (및 예컨대, "포함하다(includes)" 및 "포함하다(include)"와 같은, 포함하는이라는 단어의 임의 형태), 또는 "함유하는"이라는 단어 (및 예컨대, "함유한다(contains)" 및 "함유한다(contain)"와 같은, 함유하는이라는 단어의 임의 형태)는 포괄적 또는 확장 가능한 것이고, 추가의, 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에서 논의된 임의의 실시양태는 본 발명의 임의의 방법 또는 조성물과 관련하여, 실행될 수 있고, 그 반대의 경우로도 실행될 수 있다는 것이 고려된다. 추가로, 본 발명의 조성물은 본 발명의 방법을 달성하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 참조 수치와 관련하여 "약"이라는 용어 및 그의 문법상 동의 어구는 수치 그 자체 및 상기 수치의 + 또는 - 10% 값의 범위를 포함할 수 있다. 예를 들어, "약 10"이라는 양은 10 및 9 내지 11의 임의의 양을 포함한다. 예를 들어, 참조 수치와 관련하여 "약"이라는 용어는 또한 상기 값의 + 또는 - 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 값의 범위를 포함할 수 있다.
"단리된"이란, 그의 자연 환경으로부터 핵산의 제거를 의미한다. "정제된"이란, 주어진 핵산이, 자연으로부터 제거되었거나 (게놈 DNA 및 mRNA 포함), 또는 합성되었고/거나 (cDNA 포함), 실험실 조건하에서 증폭되었든지 간에, 순도가 증가했음을 의미하며, 여기서, "순도"는 "절대적인 순도"가 아닌 상대적인 용어이다. 그러나, 핵산 및 단백질을 희석제 또는 애주번트와 함께 제제화될 수 있고, 이들은 여전히 실용적인 목적을 위해 단리될 수 있음을 이해하여야 한다. 예를 들어, 세포 내로의 도입을 위해 사용될 때, 핵산은 전형적으로는 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 혼합된다.
본원에서 사용되는 바, "폴리뉴클레오티드" 또는 "올리고뉴클레오티드"는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태인, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다. 상기 용어는 단지 상기 분자의 1차 구조만을 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 이중 및 단일 가닥 DNA, 3중 DNA 뿐만 아니라, 이중 및 단일 가닥 RNA를 포함한다. 이는 또한 예를 들어, 메틸화 및/또는 캡핑에 의해 변형된, 및 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 용어는 또한 비-자연적으로 발생된 또는 합성 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 분자를 포함함을 의미한다.
"폴리펩티드"는 "폴리펩티드들" 및 "단백질(들)"이라는 용어와 상호교환적으로 사용되며, 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. "성숙한 단백질"은, 전장이고, 임의적으로, 글리코실화, 또는 주어진 세포 환경에서 상기 단백질에 전형적인 다른 변형을 포함하는 단백질이다.
핵산 및/또는 핵산 서열은 이들이 공통의 선조 핵산 또는 핵산 서열로부터 자연적으로 또는 인공적으로 유래될 때 "상동성"이다. 단백질 및/또는 단백질 서열은 이들의 코딩 DNA가 공통의 선조 핵산 또는 핵산 서열로부터 자연적으로 또는 인공적으로 유래될 때 상동성이다. 상기 상동성 분자를 상동체라 명명할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 임의의 자연적으로 발생된 단백질은 임의의 이용가능한 돌연변이유발 방법에 의해 변형될 수 있다. 상기 돌연변이화된 핵산은 발현시, 원래 핵산에 의해 코딩되는 단백질에 상동성인 폴리펩티드를 코딩한다. 상동성은 일반적으로 2개 이상의 핵산 또는 단백질 (또는 그의 서열) 간의 서열 동일성으로부터 추론된다. 상동성 확립에 유용한 서열들 간의 정확한 동일성(%)은 관심 핵산 및 단백질에 따라 변하지만, 25% 정도로 적은 서열 동일성이 상동성 확립에 통상적으로 사용된다. 더 높은 수준의 서열 동일성, 예컨대, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 또는 그 초과의 서열 동일성 또한 상동성 확립에 사용될 수 있다.
폴리펩티드의 두 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 관련하여 "동일한" 또는 "서열 동일성"이라는 용어는 명시된 비교창에 걸쳐 최대로 일치하도록 정렬되었을 때, 두 서열 중의 동일한 잔기들을 지칭한다. 한 부류의 실시양태에서, 본원의 폴리펩티드는 예컨대, 디폴드 파라미터를 사용하여 BLASTP (또는 CLUSTAL, 또는 임의의 다른 이용가능한 정렬 소프트웨어)에 의해 측정시, 참조 폴리펩티드 또는 그의 단편과 적어도 80%, 85%, 90%, 98% 99% 또는 100% 동일하다. 유사하게, 핵산은 또한 출발 핵산을 참조하여 기술될 수 있고, 예컨대, 상기 핵산은, 예컨대, 디폴드 파라미터를 사용하여 BLASTN (또는 CLUSTAL, 또는 임의의 다른 이용가능한 정렬 소프트웨어)에 의해 측정시, 참조 핵산 또는 그의 단편과 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다. 한 분자가 보다 큰 분자와 특정의 서열 동일성(%)을 갖는다고 할 때, 이는 상기 두 분자가 최적으로 정렬되었을 때, 보다 작은 분자 중의 잔기의 비율(%)은 상기 두 분자를 최적으로 정렬하는 순서에 따라 상기 보다 큰 분자 중의 매칭되는 잔기를 찾는다는 것을 의미한다.
"트랜스포존" 또는 "전위가능 요소" (TE)는 게놈 내에서 그의 위치가 변화하여, 때때로, 돌연변이를 생성시키거나, 역전시키고, 세포의 게놈 크기를 변경시킬 수 있는 벡터 DNA 서열이다. 전위는 종종 TE의 배가를 초래한다. 클래스 I TE는 2개의 단계로 카피된다: 처음에는 DNA로부터 RNA로 전사되고, 이어서, 상기 생성된 RNA는 DNA로 역전사된다. 이어서, 상기 카피된 DNA는 상기 게놈 내에 새로운 위치에 삽입된다. 상기 역전사 단계는 역전사효소 (이는 TE 자체에 의해 코딩될 수 있다)에 의해 촉매화된다. 레트로트랜스포존의 특징은 예컨대, HIV와 같은 레트로바이러스와 유사하다. 클래스 II TE의 잘라 붙이기(cut-and-paste) 전위 기전은 RNA 중간체를 수반하지 않는다. 상기 전위는 수개의 트랜스포사제 효소에 의해 촉매화된다. 일부 트랜스포사제는 DNA 중의 임의의 표적 부위에 비-특이적으로 결합하는 반면, 다른 것들은 특정 DNA 서열 표적에 결합한다. 상기 트랜스포사제는 표적 부위에서 엇갈린 절단을 만들어 단일-가닥 5' 또는 3' DNA 오버행 (접착성 단부)을 생성시킨다. 상기 단계는 상기 DNA 트랜스포존을 절단시키며, 이어서, 새로운 표적 부위에 라이게이션시키고; 이러한 프로세스는 갭을 충전시키는 DNA 폴리머라제 및 당-포스페이트 백본을 클로징하는 DNA 리가제의 활성을 수반한다. 이는 상기 표적 부위의 배가를 생성시킨다. 상기 DNA 트랜스포존의 삽입 부위는 상기 표적 DNA 중의 엇갈린 절단 및 DNA 폴리머라제에 의한 충전에 의해 생성될 수 있는 짧은 직접적인 반복부에 이어, 트랜스포사제에 의한 TE 절제에 중요한 일련의 역전된 반복부에 의해 식별될 수 있다. 잘라 붙이기 TE는, 공여자 부위는 이미 복제되었지만, 표적 부위가 아직 복제되지 않은 경우 세포 주기의 S기 동안 그의 전위가 일어나는 경우 배가될 수 있다. 전위를 클래스 I 및 클래스 II TE 둘 모두에서 "자율성" 또는 "비-자율성"으로 분류할 수 있다. 자율성 TE는 스스로 이동할 수 있는 반면, 비-자율성 TE는 이동을 위해 또 다른 TE의 존재를 필요로 한다. 이는 종종 비-자율성 TE가 트랜스포사제 (클래스 II의 경우) 또는 역전사효소 (클래스 I의 경우)가 없기 때문이다.
"트랜스포사제"는, 트랜스포존의 단부에 결합하고, 잘라 붙이기 기전 또는 복제성 전위 기전에 의해 상기 트랜스포존의, 게놈의 또 다른 부분으로의 이동을 촉매화하는 효소를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 트랜스포사제의 촉매 활성을 사용하여 유전자(들)를 벡터로부터 게놈으로 이동시킬 수 있다.
본원에 개시되거나, 또는 고려되는 핵산 서열 및 벡터를 "형질감염," "형질전환," "뉴클레오펙션" 또는 "형질도입"에 의해 세포 내로 도입시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "형질감염," "형질전환," 또는 "형질도입"은 물리적 또는 화학적 방법을 사용함으로써 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입시킴을 지칭한다. 다수의 형질감염 기법이 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 인산칼슘 DNA 공동 침전 (예컨대, 문헌 [Murray E. J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)] 참조); DEAE-덱스트란; 전기천공; 양이온성 리포솜-매개 형질감염; 텅스텐 입자-촉진된 미세입자 충격 (문헌 [Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)]); 및 인산스트론튬 DNA 공동 침전 (문헌 [Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)]); 및 뉴클레오펙션 (문헌 [Trompeter et al., J. Immunol. Methods 274:245-256 (2003)])을 포함한다. 적합한 패키징 세포에서 감염성 입자의 성장 후에 파지 또는 바이러스 벡터를 숙주 세포내에 도입시킬 수 있으며, 상기 세포 중 다수는 상업적으로 이용가능하다.
"프로모터"는 코딩 서열의 전사를 개시하는 폴리뉴클레오티드의 영역을 지칭한다. 프로모터는 DNA 상의 동일한 가닥 및 상류 (센스 가닥의 5' 영역 방향으로) 상의 유전자들의 전사 개시 부위 부근에 위치한다. 일부 프로모터는 세포 중 모든 상황에서 활성이므로 구성적 프로모터인 반면, 다른 것들은 예컨대, 유도성 프로모터와 같이 특정한 자극에 반응하여 조절되어 활성을 띠게 된다.
"프로모터 활성"이라는 용어는 활성이 측정되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 지칭한다. 프로모터 활성은, 생성된 RNA 전사체의 양을, 예를 들어, 노던 블럿 분석에 의해 측정함으로써 직접적으로, 또는 연결된 핵산 서열, 예를 들어, 상기 프로모터에 연결된 리포터 핵산 서열에 의해 코딩된 생성물의 양을 측정함으로써 간접적으로 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "유도성 프로모터"는 전사 조절인자, 예컨대, 생물 또는 무생물 인자의 존재 또는 부재에 의해 활성으로 유도되는 프로모터를 지칭한다. 유도성 프로모터는 그에 작동가능하게 연결된 유전자의 발현이 유기체의 몇몇 발생 단계에서 또는 특정한 조직 중에서 작동이 시작되거나, 또는 종료되기 때문에 유용하다. 유도성 프로모터의 예로는 알콜-조절된 프로모터, 테트라시클린-조절된 프로모터, 스테로이드-조절된 프로모터, 금속-조절된 프로모터, 발병-조절된 프로모터, 온도-조절된 프로모터 및 광-조절된 프로모터이다. 한 실시양태에서, 유도성 프로모터는 유전자 스위치의 일부분이다.
본원에서 사용되는 바, "인핸서"라는 용어는 예를 들어, 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 증가시키는 DNA 서열을 지칭한다. 인핸서는 핵산 서열의 코딩 영역으로부터 수 킬로염기만큼 떨어져 위치할 수 있으며, 조절 인자의 결합, DNA 메틸화의 패턴 또는 DNA 구조의 변화를 매개할 수 있다. 다양한 상이한 공급원으로부터의 다수의 인핸서들이 당업계에 공지되어 있고, (예컨대, ATCC 뿐만 아니라, 다른 상업적 또는 개별적 공급원과 같은 기탁기관으로부터) 클로닝된 폴리뉴클레오티드로서 또는 상기 내에서 이용가능하다. 프로모터 (예컨대, 통상적으로 사용되는 CMV 프로모터)를 포함하는 다수의 폴리뉴클레오티드 또한 인핸서 서열을 포함한다. 인핸서는 코딩 서열의 상류, 상기 서열의 내부, 또는 상기 서열의 하류에 위치할 수 있다. "Ig 인핸서"라는 용어는 면역글로불린 (Ig) 유전자좌 내에 맵핑된 인핸서 영역으로부터 유래된 인핸서 요소를 지칭한다 (상기 인핸서는 예를 들어, 중쇄 (뮤) 5' 인핸서, 경쇄 (카파) 5' 인핸서, 카파 및 뮤 인트론 인핸서, 및 3' 인핸서를 포함한다) (일반적으로 문헌 [Paul W. E. (ed), Fundamental Immunology, 3rd Edition, Raven Press, New York (1993), pages 353-363]; 및 미국 특허 번호 5,885,827 참조).
본원에서 사용되는 바, "코딩 서열"은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세그먼트를 지칭한다. 상기 영역 또는 서열은 개시 코돈에 의해 5' 단부에 보다 가깝고, 정지 코돈으로 3' 단부에 보다 가까운 경계를 이룬다. 코딩 서열은 또한 오픈 리딩 프레임으로 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "작동가능하게 연결된"은 DNA 세그먼트와 또 다른 DNA 세그먼트들이 그들의 의도된 방식으로 작용할 수 있도록 하는 방식의 상기 DNA 세그먼트의 상기 또 다른 DNA 세그먼트에의 물리적 및/또는 기능적 연결을 지칭한다. 유전자 생성물을 코딩하는 DNA 서열은 상기가 조절 서열, 예를 들어, 프로모터, 인핸서 및/또는 사일렌서에, 상기 DNA 서열의 전사 조절을 직접적으로 또는 간접적으로 허용하는 방식으로 연결되는 경우, 상기 조절 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, DNA 서열은 프로모터의 전사 개시 부위에 관하여 정확한 리딩 프레임 중에서 상기 프로모터의 전사 개시 부위 기준으로 하류에 있는 프로모터에 라이게이션되고, 전사 신장이 상기 DNA 서열을 통해 진행되도록 하는 경우, 상기 프로모터에 작동가능하게 된 것이다. 인핸서 또는 사일렌서는 유전자 생성물을 코딩하는 DNA 서열의 전사를 각각 증가시키거나 감소시키는 것과 같은 방식으로 상기 DNA 서열에 라이게이션되는 경우, 상기 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 인핸서 및 사일렌서는 상기 DNA 서열의 코딩 영역의 상류, 하류에 위치하거나, 또는 상기 영역 내에 포매될 수 있다. 신호 서열의 DNA는 상기 신호 서열이 폴리펩티드의 분비에 관여하는 전구단백질로서 발현되는 경우, 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 것이다. 조절 서열에의 DNA 서열의 연결은 전형적으로 당업자에게 공지된 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 적합한 제한 부위에서 라이게이션에 의해 또는 서열 중에 삽입된 어댑터 또는 링커를 통해 수행된다.
"전사 조절인자"라는 용어는 특정 환경 조건하에서 프로모터-구동된 DNA 서열의 전사를 방지 또는 억제하거나 (예컨대, 리프레서 또는 핵 억제 단백질), 또는 특정 환경 조건하에서 프로모터-구동된 DNA 서열의 전사를 허용하거나, 또는 자극하는 (예컨대, 유도인자 또는 인핸서) 작용을 하는 생화학적 요소를 지칭한다.
"유도"라는 용어는 일부 기초 수준의 전사에 비해, 전사 조절인자에 의해 발생된 핵산 서열 전사, 프로모터 활성 및/또는 발현의 증가를 지칭한다.
"표적" 유전자 또는 "이종성" 유전자 또는 "관심 유전자 (GOI)"는 유전자 전달에 의해 숙주 세포내로 도입된 유전자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "재조합효소"는, 부위들이 단일 DNA 분자 상에서 물리적으로 분리되어 있거나, 또는 부위들이 별개의 DNA 분자 상에 있는 것인 한정된 부위들 간의 부위-특이적인 재조합을 촉매화시킬 수 있는 효소 군을 지칭한다. 한정된 재조합 부위의 DNA 서열들은 반드시 동일할 필요는 없다. 재조합의 개시는 단백질-DNA 상호작용에 의존하고, 효소 군에는 파지 통합 및 절제 (예컨대, λ 인테그라제, ΦC31), 고리형 플라스미드의 분해 (예컨대, Tn3, 감마 델타, Cre, Flp), 교번 유전자의 발현을 위한 DNA 역위 (예컨대, Hin, Gin, Pin), 발생 중인 유전자들의 어셈블리 (예컨대, 아나베나(Anabaena) 질소 고정 유전자), 및 전위 (예컨대, IS607 트랜스포존)을 촉매화하는 다수의 단백질들이 존재한다. 대부분의 부위-특이적 재조합효소는 진화론적 및 기계론적 관련성을 토대로, 2개의 패밀리 중 하나에 속한다. 이들은 λ 인테그라제 패밀리 또는 티로신 재조합효소 (예컨대, Cre, Flp, Xer D) 및 레솔바제/인테그라제 패밀리 또는 세린 재조합효소 패밀리 (예컨대, ΦC31, TP901-1, Tn3, 감마 델타)이다.
"재조합 부착 부위"는 본원에 기술된 재조합효소 효소에 의해 인식되는 특이적인 폴리뉴클레오티드 서열이다. 전형적으로, 하나는 표적 핵산 중에 존재하고 (예컨대, 진핵생물 또는 원핵생물의 염색체 또는 에피솜), 또 다른 하나는 표적 재조합 부위에 통합되는 핵산 중에 존재하는, 2개의 상이한 부위 ("상보성 부위"로 명명)가 수반된다. 각각 원래의 박테리아 표적 및 파지 공여자로부터의 부착 (또는 재조합) 부위를 지칭하는 "attB" 및 "attP"라는 용어가 본원에서 사용되지만, 특정 효소에 대한 재조합 부위들은 상이한 명칭들을 가질 수 있다. 재조합 부위는 전형적으로 코어 또는 스페이서 영역에 의해 분리되는 좌측 및 우측 아암을 포함한다. 따라서, attB 재조합 부위는 BOB'로 이루어지며, 여기서, B 및 B'는 각각 좌측 및 우측 아암이고, O는 코어 영역이다. 유사하게, attP는 POP'이고, 여기서, P 및 P'는 아암이고, O는 다시 코어 영역이다. attB와 attP 부위 간의 재조합, 및 표적에서 핵산의 동반 통합시, 통합된 DNA에 플랭킹되는 재조합 부위들은 "attL" 및 "attR"로 지칭된다. 따라서, attL 및 attR 부위는 상기 용어를 사용하여, 각각 BOP' 및 POB'로 이루어진다. 본원의 일부 표현에서, "O"는 생략되며, attB 및 attP는 예를 들어, 각각 BB'및 PP'로서 표시된다.
"발현 벡터" 또는 "벡터"는 세포내에서 폴리뉴클레오티드의 자율 단위로서 행동하거나 (즉, 자신의 제어하에서 복제할 수 있거나), 또는 숙주 세포 염색체내로의 삽입에 의해 복제가 가능해지거나, 부착된 세그먼트의 복제 및/또는 발현을 일으키기 위해서 또 다른 폴리뉴클레오티드 세그먼트에 부착되는 임의의 유전 요소, 예컨대, 플라스미드, 염색체, 바이러스, 트랜스포존이다. 적합한 벡터로는 플라스미드, 트랜스포존, 박테리오파지 및 코스미드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 벡터는 원하는 숙주 세포내로의 벡터의 라이게이션 또는 삽입을 수행하고, 부착된 세그먼트의 발현을 수행하는 데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 상기 서열은 숙주 유기체에 따라 상이하며; 전사를 수행하는 프로모터 서열, 전사를 증가시키는 인핸서 서열, 리보솜 결합 부위 서열 및 전사 및 번역 종결 서열을 포함한다. 대안적으로, 발현 벡터는 숙주 세포내로의 벡터의 라이게이션 또는 통합 없이 상기 중에서 코딩된 핵산 서열 생성물을 직접 발현할 수 있다.
벡터는 또한 "선별가능한 마커 유전자"를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "선별가능한 마커 유전자"라는 용어는 핵산 서열을 발현하는 세포가 상응하는 선택제의 존재하에서 상기 선택제를 특이적으로 선택되게 하는 핵산 서열을 지칭한다. 적합한 선별가능한 마커 유전자는 당업계에 공지되어 있고, 예컨대, 국제 특허 출원 공개 WO 1992/08796 및 WO 1994/28143; 문헌 [Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567 (1980)]; [O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527 (1981)]; [Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072 (1981)]; [Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1 (1981)]; [Santerre et al., Gene, 30: 147 (1984)]; [Kent et al., Science, 237: 901-903 (1987)]; [Wigler et al., Cell, 11: 223 (1977); Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026 (1962)]; [Lowy et al., Cell, 22: 817 (1980)]; 및 미국 특허 번호 5,122,464 및 5,770,359에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 벡터는 숙주 세포에서 복제할 수 있고, 적합한 선택압의 존재하에 숙주 세포내에서 DNA의 염색체외 세그먼트로서 지속되는 "에피솜 발현 벡터" 또는 "에피솜"이다 (문헌 [Conese et al., Gene Therapy, 11:1735-1742 (2004)] 참조). 상업적으로 이용가능한 대표적인 에피솜 발현 벡터로는 엡스타인 바 핵 항원 1(EBNA1: Epstein Barr Nuclear Antigen 1) 및 엡스타인 바 바이러스(EBV) 복제 기점(oriP)을 사용하는 에피솜 플라스미드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 인비트로겐(Invitrogen: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)의 벡터 pREP4, pCEP4, pREP7, 및 pcDNA3.1 및 스트라타진(Stratagene: 미국 캘리포니아주 라호야)의 pBK-CMV는 EBNA1 및 oriP 대신에 T-항원 및 SV40 복제 기점을 사용하는 에피솜 벡터의 비제한적인 예를 나타낸다.
"암 세포"란, 앞서 기술된 바와 같이, 다단계 신생물성 진행 중 조기, 중기 또는 진행성 단계를 거친 세포를 지칭한다 (문헌 [Pitot et al., Fundamentals of Oncology, 15-28 (1978)]). "전신생물성" 세포 (즉, "과형성" 세포 및 이형성 세포)를 비롯한 암 세포는 신생물성 진행 중 조기, 중기 또는 진행성 단계에 있는 세포, 및 이형성 세포의 신생물성 진행 중 진행성 단계에 있는 신생물성 세포를 포함한다.
"전이성" 암 세포란, 원발성 암 부위 (즉, 암 세포가 처음에 정상, 과형성 또는 이형성 세포로부터 형성된 위치)로부터, 옮겨간 암 세포가 머무르게 되고, 증식하게 되는 부위인, 원발성 부위 이외의 다른 부위로 옮겨간 암 세포를 지칭한다.
"암"은, 전이성일 수도 있고, 전이성이 아닐 수도 있는, 복수의 암 세포, 예컨대, 난소암, 유방암, 폐암, 전립선암, 자궁경부암, 췌장암, 결장암, 위암, 식도암, 구강암, 설암, 치육암, 피부암 (예컨대, 흑색종, 기저 세포 암종, 카포시 육종 등), 근육암, 심장암, 간암, 기관지암, 연골암, 골암, 고환암, 신장암, 자궁내막암, 자궁암, 방광암, 골수암, 림프종 암, 비장암, 흉선암, 갑상선암, 뇌암, 뉴런암신경세포 암(neuron cancer), 중피종, 담낭암, 안구암 (예컨대, 각막암, 포도막암, 맥락막암, 황반암, 유리체액암 등), 관절암 (예컨대, 활막암), 신경교아세포종, 림프종, 백혈병, 비호지킨 림프종, 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모발상 세포 백혈병 (HCL), 다발성 골수종 (MM), 급성 골수성 백혈병 (AML), 또는 만성 골수성 백혈병 (CML)을 지칭한다.
ROR -1
ROR1은 수용체 티로신 키나제 (RTK) 패밀리에 포함된 막관통 단백질이다. ROR1 유전자는 잘 정의된 두 이소폼: 짧은 393개 아미노산 (aa)의 세포내 단백질 (이소폼 2) 및 긴 937개 aa의 막관통 단백질 (이소폼 1)을 코딩한다. 긴 세포 표면 이소폼은 원발성 인간 B-만성 림프구성 백혈병 (B-CLL) 및 외투 세포 림프종, B-급성 림프구성 백혈병의 서브세트, 및 전이성 표현형과 연관된 것을 비롯한, 다수의 종양 상에서 발현된다.
ROR1은 주로 배아 발생 동안에 발현되지만, 태아 발생 동안 그의 발현은 약화된다. 그러나, ROR1은 일부 B 세포 악성종양, 예컨대, 제한하는 것인 아니지만, 림프종, LL, 및 B-ALL에 의해, 및 다수의 고형 종양 악성종양, 예컨대, 제한하는 것인 아니지만, 부신 악성종양, 방광 악성종양, 유방 악성종양, 결장 악성종양, 폐 악성종양, 췌장 악성종양, 전립선 악성종양, 난소 악성종양, 피부 악성종양, 고환 악성종양, 자궁 악성종양, 및 신경모세포종에 의해 비정상적으로 발현된다.
키메라 항원 수용체
본원에 기술된 실시양태에서, CAR은 표적 인식을 위한 세포외 항체 유래 단일 쇄 가변 도메인 (scFv)을 포함할 수 있고, 여기서, scFv는 가요성 링커에 의해 막관통 도메인 및/또는 예를 들어, T 세포 활성화를 위한 CD3ζ를 포함하는, 세포내 신호전달 도메인(들)에 연결될 수 있다. 일반적으로는 T 세포가 생체내에서 활성화되면, T 세포는 시토카인 (즉, IL-2 및 IL-21)의 생산을 유도하는 CD28로부터의 2차 공동자극성 신호전달과 함께 1차 항원 유도 TCR 신호를 받고, 이어서, 자가분비/주변분비 방식으로 신호전달 루프로 피드백한다. 따라서, CAR은 신호전달 도메인, 예를 들어, CD28 세포질 신호전달 도메인 또는 다른 공동자극성 분자 신호전달 도메인, 예컨대, 4-1BB 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 키메라 CD28 공동 자극은 항-아폽토시스 분자의 상향 조절 및 IL-2 생산 뿐만 아니라, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 유래되는 T 세포 확장에 의해 T 세포 지속을 개선시킨다.
한 실시양태에서, CAR은 예를 들어, 막관통 도메인 및 CD3-제타 엔도도메인에 융합된, ROR-1의 다양한 에피토프에 특이적인 모노클로날 항체로부터 유래된 단일 쇄 가변 단편 (scFv)의 융합체이다. 상기 분자는 그의 표적의 scFv에 의한 인식에 대한 반응으로 제타 신호를 전달을 일으킨다.
한 실시양태에서, CAR은 엑토도메인 (세포외), 막관통 도메인 및 엔도도메인 (세포내)을 가질 수 있다. CAR 엑토도메인의 한 실시양태에서, 신호 펩티드는 초기 단백질을 소포체로 인도한다. 이는 예를 들어, 수용체가 글리코실화되고, 세포막에 고정된 경우에 그러하다. 임의의 진핵성 펩티드 서열이 기능성인 것으로 구상된다. 일반적으로, 천연적으로 아미노-말단 대부분의 성분에 부착된 신호 펩티드가 사용된다 (예컨대, 배향이 경쇄 -링커-중쇄인 scFv에서, 경쇄의 천연 신호가 사용된다). 실시양태에서, 신호 펩티드는 GM-CSFRa (서열번호: 94) 또는 IgK (서열번호: 95)이다. 사용될 수 있는 다른 신호 펩티드는 CD8알파 (서열번호: 97) 및 CD28로부터의 신호 펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 신호 펩티드는 마우스 Ig VH 영역 3 (서열번호: 101), 아주로시딘 (서열번호: 103), IGHV3-23 (서열번호: 106), IGKV1-D33 (HuL1) (서열번호: 107) 또는 IGKV1-D33 (L14F) (HuH7) (서열번호: 108)이다.
항원 인식 도메인은 scFv일 수 있다. 그러나, 대안도 존재할 수 있다. 천연 T 세포 수용체 (TCR) 알파 및 베타 단일 쇄로부터의 항원 인식 도메인이 구상되는데, 그 이유는 상기 도메인이 간단한 엑토도메인 (예컨대, CD4 엑토도메인) 뿐만 아니라, 다른 인식 성분, 예컨대, 연결된 것, 예컨대, 시토카인 (시토카인 수용체를 보유하는 세포의 인식을 유도한다)을 갖고 있기 때문이다. 주어진 표적, 예컨대, 예로서, 바이러스 연관 항원에 높은 친화도 결합하는 거의 모든 것이 항원 인식 영역으로서 사용될 수 있다.
일반적으로, CAR은 이량체화된 형태로 존재하고, 세포외 scFv (VL에 연결된 VH) 영역, 스토크 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 모티프를 연결하는 융합 단백질로서 발현된다. 제1 세대 CAR의 엔도도메인은 단지 CD3-ζ 신호전달을 통해서만 T 세포를 유도한다. 제2 세대 CAR은 CD3-ζ 및 CD28, 또는 다른 엔도도메인, 예컨대, 4-1BB 또는 OX40을 통해 활성화 신호전달을 제공한다. 제3 세대 CAR은 CD3-ζ-함유의, 3개의 신호전달 모티프, 예컨대, CD28, 4-1BB, 또는 OX40의 조합을 통해 T 세포를 활성화시킨다.
실시양태에서, 본 발명은 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 제공한다. 실시양태에서, 세포외 도메인은 다르게는 항원 결합 모이어티 또는 scFv 및 스토크 도메인으로도 ㅈ칭되는 표적-특이적 결합 요소를 포함한다. 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인 또는 다르게는 세포질 신호전달 도메인은 공동자극성 신호전달 영역 및 제타 쇄 부분을 포함한다.
공동자극성 신호전달 영역은 공동자극성 분자의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR의 한 부분을 지칭한다. 공동자극성 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응을 위해 요구되는, 항원 수용체 또는 그의 리간드 이외의 다른 세포 표면 분자이다.
실시양태에서, CAR의 세포외 도메인과 막관통 도메인 사이에 스토크 도메인 또는 스토크 영역이 포함되어 있다. 본원에서 사용되는 바, "스토크 도메인" 또는 "스토크 영역"이라는 용어는 일반적으로 막관통 도메인을 scFv에, 또는 폴리펩티드 쇄에서 세포질 도메인에 연결하는 기능을 하는, 임의의 올리고뉴클레오티드- 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 스토크 도메인은 가요성 힌지, 예컨대, Fc 힌지 및 임의적으로, Fc의 1 또는 2개의 불변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 스토크 영역은 IgG1로부터의 힌지 영역을 포함한다. 대안적인 경우에, 스토크 영역은 면역글로불린의 CH2CH3 영역 및 임의적으로, CD3의 부분을 포함한다. 일부 경우에, 스토크 영역은 WO/2016/073755에 기술된 바와 같이, CD8α 힌지 영역 (서열번호: 83), IgG4-Fc 12 아미노산 힌지 영역 (ESKYGPPCPPCP (서열번호: 285)) 또는 IgG4 힌지 영역을 포함한다.
다른 실시양태에서, CAR의 세포외 도메인과 막관통 도메인 사이에 스페이서가 포함되어 있다. 스페이서는 도 3 및 4에 도시된 바와 같이, 스토크 영역 및 스토크 연장 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 키메라 폴리펩티드의 상이한 도메인 사이의 거리를 연장시켜, 그 결과, 스페이서는 없고, 나머지 다른 것은 동일한 폴리펩티드와 비교하였을 때, 폴리펩티드의 발현 또는 기능적 활성을 개선시킨다. 일부 경우에, 스페이서는 키메라 폴리펩티드에서 막관통 영역을 세포외 영역에, 또는 세포질 영역에 연결하는 작용을 하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서는, 항원 또는 리간드-결합 영역이 상이한 배향으로 정렬됨으로써 항원 또는 리간드 수용체 인식을 촉진시킬 수 있게 할 정도로 충분한 가요성을 띤다.
일부 실시양태에서, 스토크 영역은 길이가 약 20 내지 약 300개의 아미노산 길이일 수 있고, 적어도 하나의 이량체화 부위를 포함하고, 스토크 연장 영역은 아미노산 개수에 의해 측정된 바, 스토크 영역 길이의 약 1 내지 약 10배를 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 스토크 영역은 길이가 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60개 이상의 아미노산 길이일 수 있다. 다른 경우에서, 스토크 영역은 길이가 약 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 또는 300개의 아미노산 길이일 수 있다.
한 실시양태에서, 스페이서는 단일 스토크 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 스페이서는 스토크 영역 ("S"로 표시) 및 스토크 연장 영역(들) (이는 본원에서 "S'n"으로 표시된다)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 하나의 (1) 스토크 영역 및 S'n을 포함할 수 있고, 여기서, n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일 수 있다. 추가 실시양태에서, 스토크 영역은 링커를 통해 스토크 연장 영역 S'n에 연결될 수 있다. 한 실시양태에서, CAR이 ROR1 CAR일 ‹š, n은 0이 아니다.
일부 경우에서, 스토크 연장 영역은 아미노산 개수에 의해 측정된 바, 스토크 영역 길이의 약 1 내지 약 10배를 포함할 수 있다. 예를 들어, 스토크 연장 영역은 아미노산 개수에 의해 측정된 바, 스토크 영역 길이의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 스토크 연장 영역은 아미노산 개수에 의해 측정된 바, 스토크 영역 길이의 10배 초과를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 스토크 연장 영역은 아미노산 개수에 의해 측정된 바, 스토크 영역 길이의 최대 2배를 포함할 수 있지만, 스토크 영역보다 더 적은 개수의 이량체화 부위를 포함한다.
서브세트 항원-결합 폴리펩티드의 스토크 연장 영역은 스토크 영역과 비교하여 적어도 하나 더 적은 이량체화 부위를 함유할 수 있다. 예를 들어, 스토크 영역이 2개의 이량체화 부위를 포함한다면, 스토크 연장 영역은 1 또는 0개의 이량체화 부위를 포함유할 수 있다. 또 다른 예로서, 스토크 영역이 1개의 이량체화 부위를 포함한다면, 스토크 연장 영역은 0개의 이량체화 부위를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 스토크 연장 영역은 이량체화 부위를 함유하지 않는다. 일부 예에서, 스토크 연장 영역은 아미노산 개수에 의해 측정된 바, 스토크 영역 길이의 최대 2배를 포함할 수 있지만, 이량체화 부위를 포함하지 않는다. 일부 예에서, 스토크 연장 영역은 아미노산 개수에 의해 측정된 바, 스토크 영역 길이의 최대 3배를 포함할 수 있지만, 이량체화 부위를 포함하지 않는다. 일부 예에서, 스토크 연장 영역은 아미노산 개수에 의해 측정된 바, 스토크 영역 길이의 최대 4배를 포함할 수 있지만, 이량체화 부위를 포함하지 않는다. 일부 경우에서, 하나 이상의 이량체화 부위(들)는 막에 인접해 있을 수 있다. 다른 경우에서, 하나 이상의 이량체화 부위(들)는 막과 떨어진 원위부에 있을 수 있다.
일부 예에서, 각 스토크 연장 영역의 길이는 약 20 내지 약 60개의 아미노산 길이일 수 있다. 다른 예에서, 스토크 연장 영역 길이는 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65개 초과의 아미노산 길이, 또는 상기 범위 내의, 또는 그 밖의 임의의 정수인 길이일 수 있다. 일부 경우에서, 각 스토크 연장 영역은 스토크 영역과 적어도 약 60%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 예에서, 각 스토크 연장 영역은 스토크 영역과 적어도 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 서열을 갖는다.
막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 상기 도메인은 임의의 막-결합된 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 적합한 막관통 도메인은 T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄의 막관통 영역(들); 또는 CD28, CD3 엡실론, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8알파, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 또는 CD154로부터의 막관통 영역을 포함할 수 있다. 대안적으로, 막관통 도메인은 합성일 수 있으며, 소수성 잔기, 예컨대, 류신 및 발린을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플릿은 합성 막관통 도메인의 한쪽 또는 양쪽 말단에서 발견된다. 임의적으로, 일부 실시양태에서, 길이가 2 내지 10개의 아미노산 길이인 짧은 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 링커가 CAR의 막관통 도메인과 세포질 신호전달 도메인 사이에 연결을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 링커는 글리신-세린 링커이다. 일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 CD8α 막관통 도메인 또는 CD3ζ 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 CD8α 막관통 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, 막관통 도메인은 CD3ζ 막관통 도메인을 포함한다.
세포내 도메인은 하나 이상의 공동자극성 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 공동자극성 도메인은 CD8, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), ICOS, DAP10, DAP12, OX40 (CD134), CD3-제타 또는 그의 단편 또는 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 본원에 기술된 CAR은 CD8, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), ICOS, DAP10, DAP12, OX40 (CD134) 또는 그의 단편 또는 조합으로부터 선택되는 공동자극성 도메인 중 하나 이상, 또는 2개 이상의 것을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 CAR은 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), ICOS, OX40 (CD134) 또는 그의 단편 또는 조합으로부터 선택되는 공동자극성 도메인 중 하나 이상, 또는 2개 이상의 것을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 CAR은 CD8, CD28, 4-1BB (CD137), DAP10, DAP12 또는 그의 단편 또는 조합으로부터 선택되는 공동자극성 도메인 중 하나 이상, 또는 2개 이상의 것을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 CAR은 CD28, 4-1BB (CD137), 또는 그의 단편 또는 조합으로부터 선택되는 공동자극성 도메인 중 하나 이상, 또는 2개 이상의 것을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 CAR은 공동자극성 도메인 CD28 및 4-1BB (CD137) 또는 그의 그 각각의 단편을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 CAR은 공동자극성 도메인 CD28 및 OX40 (CD134) 또는 그의 그 각각의 단편을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 CAR은 공동자극성 도메인 CD8 및 CD28 또는 그의 그 각각의 단편을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 CAR은 공동자극성 도메인 CD28 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 CAR은 공동자극성 도메인 4-1BB (CD137) 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 CAR은 공동자극성 도메인 OX40 (CD134) 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 CAR은 공동자극성 도메인 CD8 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 CAR은 적어도 하나의 공동자극성 도메인 DAP10 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 CAR은 적어도 하나의 공동자극성 도메인 DAP12 또는 그의 단편을 포함한다.
본 개시내용의 CAR의 세포내 신호전달 도메인(이는 또한 세포질 도메인으로도 공지)은 CAR이 놓인 면역 세포의 정상 이펙터 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. "이펙터 기능"이라는 용어는 세포의 전문화된 기능을 지칭한다. T 세포의 이펙터 기능은 예를 들어, 세포용해 활성 또는 시토카인의 분비를 포함한 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서, "세포내 신호전달 도메인"이라는 용어는 이펙터 기능 신호를 전달하고, 세포가 전문화된 기능을 수행하도록 유도하는 단백질 부분을 지칭한다. 대개 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 다수의 경우에 전체 쇄를 사용할 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 말단절단된 부분을 사용하는 경우, 상기와 같은 말단절단된 부분은 그가 이펙터 기능 신호를 전달하는 한, 무손상 쇄 대신에 사용할 수 있다. 따라서, 세포내 신호전달 도메인이라는 용어는 이펙터 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 말단절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포내 도메인은 T 세포 활성화를 위한 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 일부 경우에, T 세포 활성화를 위한 신호전달 도메인은 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 또는 CD66d로부터 유래된 도메인을 포함한다. 일부 경우에, 상기 T 세포 활성화를 위한 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된 도메인을 포함한다.
실시양태에서, 본원에서는 (a) ROR-1 항원 결합 도메인; (b) 스토크 도메인; (c) 막관통 도메인; (d) 4-1BB 또는 CD28, 또는 둘 다를 포함하는 공동자극성 신호전달 도메인; (e) CD3 제타 신호전달 도메인; 및 임의적으로 (f) 말단절단된 표피 성장 인자 수용체 (HER1t 또는 HER1t1)를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
본원에 기술된 CAR의 기능성 부분을 코딩하는 핵산 서열이 본 발명의 범주 내에 포함된다. 기능성 부분은 예를 들어, 모체 CAR과 유사한 정도로, 동일한 정도로, 또는 그보다 더 높은 정도로 표적 세포를 인식할 수 있거나, 질환을 검출, 치료, 또는 예방할 수 있는 능력을 보유하는 CAR의 부분을 포함한다. 모체 CAR을 코딩하는 핵산 서열과 관련하여, CAR의 기능성 부분을 코딩하는 핵산 서열은 예를 들어, 모체 CAR의 약 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95%, 또는 그 초과를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
실시양태에서, CAR은 상기 부분의 아미노 또는 카르복시 말단, 또는 그 양쪽 말단 모두에 모체 CAR의 아미노산 서열에서는 발견되지 않는, 추가의 아미노산을 함유한다. 바람직하게, 추가의 아미노산은 예컨대, 표적 세포를 인식, 암을 검출, 암을 치료 또는 예방하는 등의, 기능성 부분의 생물학적 기능을 방해하지 않는다. 더욱 바람직하게, 추가의 아미노산은 모체 CAR의 생물학적 기능과 비교하여 CAR의 생물학적 기능을 증강시킨다.
본원에서 사용되는 바, "기능성 변이체"라는 용어는 참조 폴리펩티드와 상당한 또는 유의적인 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭하며, 상기 변이체의 참조 폴리펩티드의 생물학적 활성을 보유한다. 기능성 변이체는 예를 들어, 모체 CAR과 유사한 정도로, 동일한 정도로, 또는 그보다 더 높은 정도로 표적 세포를 인식할 수 있는 능력을 보유하는 본원에 기술된 CAR (모체 CAR)의 변이체들을 포함한다. 모체 CAR을 코딩하는 핵산 서열과 관련하여, CAR의 기능성 변이체를 코딩하는 핵산 서열은 모체 CAR을 코딩하는 핵산 서열과 예를 들어, 약 10% 동일, 약 25% 동일, 약 30% 동일, 약 50% 동일, 약 65% 동일, 약 80% 동일, 약 90% 동일, 약 95% 동일, 또는 약 99% 동일하다.
본원에 기술된 CAR (그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함)은 글리코실화, 아미드화, 카르복실화, 인산화, 에스테르화, N-아실화, 예컨대, 디술피드 브릿지를 통한 폐환화, 또는 산 부가 염으로 전환, 및/또는 임의적으로, 이량체화 또는 중합체화, 또는 접합화된 것을 포함한다.
항원 결합 모이어티
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 다르게는 항원 결합 모이어티로도 지칭되는 표적 특이적 결합 요소를 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 세포 상의 항원에 특이적으로 결합하는 원하는 항원 결합 모이어티를 조작함으로써 관심 항원을 표적화하도록 조작된다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR 항원 결합 모이어티는 ROR-1에 특이적이다 (ROR-1 CAR). ROR-1-특이적 CAR은 그가 세포 표면에 발현되었을 때, T 세포의 인간 ROR-1에의 특이성을 재유도한다. 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 가요성 링커, 예컨대, 글리신-세린 링커 또는 휘트로우(Whitlow) 링커에 의해 연결된 표적 항원 특이적 모노클로날 항-ROR-1 항체의 가변 도메인 경쇄 (VL) 및 가변 도메인 중쇄 (VH)를 포함하는 단일 쇄 항체 단편 (scFv)을 포함한다. 실시양태에서, scFv는 인간화된 mROR-1이다. 일부 실시양태에서, scFv는 hROR1(VH-VL)_14, hROR1(VL-VH)_05, hROR1(VH-VL)_14-3, hROR1(VH-VL)_14-4, hROR1(VH_5-VL_14), hROR1(VH_5-VL_16), hROR1(VH_18-VL_04), 또는 hROR1(VH_18-VL_14)이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 예를 들어, N 말단에서 C 말단으로, VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH와 같이, 방향성있게 연결된 VH 및 VL을 포함할 수 있다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 및 74 (hROR1 VL)에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 및 73 (hROR1 VH)에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 Gly-Ser 링커 (서열번호: 127, 129, 또는 130) 또는 링커의 기능성 변이체와 함께, 항원 결합 모이어티 VL (서열번호: 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 및 74) 및 VH (서열번호: 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 및 73)를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 3 내지 14 및 75 내지 82 (VH, VL 및 링커)에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 15 (hROR1 VH_04)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 16 (hROR1 VL_04)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 17 (hROR1 VH_05)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 18 (hROR1 VL_05)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 19 (hROR1 VH_06)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 20 (hROR1 VL_06)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 21 (hROR1 VH_07)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 22 (hROR1 VL_07)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 23 (hROR1 VH_08)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 24 (hROR1 VL_08)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 25 (hROR1 VH_09)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 26 (hROR1 VL_09)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 27 (hROR1 VH_10)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 28 (hROR1 VL_10)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 29 (hROR1 VH_11)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 30 (hROR1 VL_11)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 31 (hROR1 VH_12)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 32 (hROR1 VL_12)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 33 (hROR1 VH_13)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 34 (hROR1 VL_13)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 35 (hROR1 VH_14)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 36 (hROR1 VL_14)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 37 (hROR1 VH_14-1)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 38 (hROR1 VL_14-1)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 39 (hROR1 VH_14-2)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 40 (hROR1 VL_14-2)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 41 (hROR1 VH_14-3)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 42 (hROR1 VL_14-3)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 43 (hROR1 VH_14-4)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 44 (hROR1 VL_14-4)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 45 (hROR1 VH_14-5)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 46 (hROR1 VL_14-5)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 47 (hROR1 VH_15)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 48 (hROR1 VL_15)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 49 (hROR1 VH_16)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 50 (hROR1 VL_16)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 51 (hROR1 VH_17)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 52 (hROR1 VL_17)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 53 (hROR1 VH_18)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 54 (hROR1 VL_18)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 55 (hROR1 VH_19)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 56 (hROR1 VL_19)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 57 (hROR1 VH_20)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 58 (hROR1 VL_20)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 59 (hROR1 VH_21)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 60 (hROR1 VL_21)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 61 (hROR1 VH_22)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 62 (hROR1 VL_22)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 63 (hROR1 VH_23)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 64 (hROR1 VL_23)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 65 (hROR1 VH_24)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 66 (hROR1 VL_24)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 67 (hROR1 VH_25)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 68 (hROR1 VL_25)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 69 (hROR1 VH_26)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 70 (hROR1 VL_26)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 71 (hROR1 VH_27)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 72 (hROR1 VL_27)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 73 (hROR1 VH_28)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 74 (hROR1 VL_28)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 17 (hROR1 VH_5)의 아미노산 서열을 갖는 VH 폴리펩티드 및 서열번호: 18 (hROR1 VL_5)의 아미노산 서열을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 35 (hROR1 VH_14)의 아미노산 서열을 갖는 VH 폴리펩티드 및 서열번호: 36 (hROR1 VL_14)의 아미노산 서열을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 41 (hROR1 VH_14-3)의 아미노산 서열을 갖는 VH 폴리펩티드 및 서열번호: 42 (hROR1 VL_14-3)의 아미노산 서열을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 43 (hROR1 VH_14-4)의 아미노산 서열을 갖는 VH 폴리펩티드 및 서열번호: 44 (hROR1 VL_14-4)의 아미노산 서열을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 17 (hROR1 VH_5)의 아미노산 서열을 갖는 VH 폴리펩티드 및 서열번호: 36 (hROR1 VL_14)의 아미노산 서열을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 53 (hROR1 VH_18)의 아미노산 서열을 갖는 VH 폴리펩티드 및 서열번호: 16 (hROR1 VL_04)의 아미노산 서열을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 53 (hROR1 VH_18)의 아미노산 서열을 갖는 VH 폴리펩티드 및 서열번호: 36 (hROR1 VL_14)의 아미노산 서열을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 서열번호: 94의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 GM-CSFRa 신호 펩티드를 갖는다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 3의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 4의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 5의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 6의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 7의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 8의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 9의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 10의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 11의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 12의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 13의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 75의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 76의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 77의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 78의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 79의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 80의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 81의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 서열번호: 82의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
스페이서
실시양태에서, 본 개시내용의 ROR-1 CAR은 항원 결합 모이어티와 T 세포 막 사이를 이격시키는, 하나 이상의 스토크 영역 및 임의적으로 하나 이상의 스토크 연장 영역을 포함하는 스페이서를 포함한다. 실시양태에서, 스페이서는 최적의 이펙터-표적 막 간 거리를 확립한다. 실시양태에서, 스토크 도메인은 항원 결합 도메인이 그의 표적에 도달할 수 있도록 가요성을 제공한다. 한 실시양태에서, 스토크 도메인은 CD8알파 힌지 도메인이다. 일부 실시양태에서, "스페이서", "스토크 영역" 및 "스토크 도메인"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
실시양태에서, CD8알파 힌지 도메인은 서열번호: 88의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
다른 실시양태에서, CAR의 세포외 도메인과 막관통 도메인 사이에 스페이서가 포함되어 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 스페이서는 도 3 및 도 4에 도시된 바와 같이, 스토크 영역 및 스토크 연장 영역을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 스페이서는 단일 스토크 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 스페이서는 스토크 영역 ("S"로 표시) 및 스토크 연장 영역(들) (이는 본원에서 "S'n"으로 표시된다)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 하나의 (1) 스토크 영역 및 S'n을 포함할 수 있고, 여기서, n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일 수 있다. 한 실시양태에서, ROR1 CAR의 scFv가 mROR1 (서열번호: 3 내지 14) 또는 hROR1 (서열번호: 75 내지 82)일 때, 여기서, n은 0이 아니다.
추가 실시양태에서, 스토크 영역은 링커를 통해 스토크 연장 영역 S'n에 연결될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 링커는 예를 들어, GSG 링커 (서열번호: 129), SGSG 링커 (서열번호: 130), (G4S)3 링커 (서열번호: 127), (G4S)4 링커 (서열번호: 294) 및/또는 휘트로우 링커 (서열번호: 128)를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 스토크 영역 및 스토크 연장 영역(들)은 천연 또는 합성 기원의 폴리펩티드로부터 유래되거나, 또는 디자인될 수 있다. 스토크 영역 및/또는 스토크 연장 영역(들)은 세포 표면 단백질 또는 그의 유도체 또는 변이체로부터 유래된 힌지 도메인(들)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스토크 영역 및/또는 스토크 연장 영역(들)은 CD28 또는 CD8알파 (CD8α)로부터 유래된 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스토크 영역 및 스토크 연장 영역(들) 각각 CD8알파 힌지 도메인, CD28 힌지 도메인, CTLA-4 힌지 도메인, LNGFR 세포외 도메인, IgG1 힌지, IgG4 힌지 및 CH2-CH3 도메인 중 적어도 하나로부터 유래될 수 있다. 스토크 및 스토크 연장 영역(들)은 별개로 CD8알파 힌지 도메인, CD28 힌지 도메인, CTLA-4 힌지 도메인, LNGFR 세포외 도메인, IgG1 힌지, IgG4 힌지 또는 CH2-CH3 도메인의 임의 조합으로부터 유래될 수 있다. 한 예로서, 스토크 영역은 CD8알파 힌지 도메인으로부터 유래될 수 있고, 적어도 하나의 스토크 연장 영역은 CD28 힌지 도메인으로부터 유래될 수 있으며, 이로써, 하이브리드 스페이서를 생성할 수 있다. 또 다른 예로서, 스토크 영역은 IgG1 힌지 또는 IgG4 힌지로부터 유래될 수 있고, 적어도 하나의 스토크 연장 영역은 IgG의 CH2-CH3 도메인으로부터 유래될 수 있다.
특정 실시양태에서, 스토크 영역은 하나 이상의 이량체화 부위를 포함하여 동종 또는 이종 이량체화된 키메라 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 다른 실시양태에서, 스토크 영역 또는 하나 이상의 스토크 연장 영역은 함께 이량체화 부위를 제거하는 돌연변이를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스토크 연장 영역(들)은 스토크 영역과 비교하여 적어도 하나 더 적은 이량체화 부위를 함유할 수 있다. 예를 들어, 스토크 영역이 2개의 이량체화 부위를 포함한다면, 스토크 연장 영역은 1 또는 0개의 이량체화 부위를 함유할 수 있다. 또 다른 예로서, 스토크 영역이 1개의 이량체화 부위를 포함한다면, 스토크 연장 영역은 0개의 이량체화 부위를 함유할 수 있다. 일부 예에서, 스토크 연장 영역(들)은 이량체화 부위를 함유하지 않는다.
본원에 개시된 실시양태의 일부 측면에서, 대상 항원 결합 폴리펩티드의 스토크 영역은 CD8알파 힌지 도메인와 적어도 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과의 동일성을 가진 서열을 포함한다. CD8알파 힌지 도메인은 서열번호: 83에 제시된 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과의 동일성을 가진 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 스토크 연장 영역은 서열번호: 83에 제시된 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 초과의 동일성을 가진 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 경우에, 스토크 연장 영역은 서열번호: 230에 제시된 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 초과의 동일성을 가진 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 예에서, 스토크 영역 및 스토크 연장 영역은 함께 서열번호: 230-233에 제시된 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 초과의 동일성을 가진 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
막관통 도메인
실시양태에서, CAR은 CAR 스토크 도메인의 세포외 도메인에 융합된 막관통 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 천연적으로 CAR 중의 도메인들 중 하나와 회합되어 있는 막관통 도메인이 사용된다. 실시양태에서, 막관통 도메인은 막에 걸쳐 있는 소수성 알파 나선이다.
막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 상기 도메인은 임의의 막-결합된 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 본 발명에서 특히 유용한 막관통 도메인은 T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8알파, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154로부터 유래될 수 있다 (즉, 적어도 그의 막관통 영역(들)을 포함할 수 있다). 대안적으로, 막관통 도메인은 합성일 수 있으며, 이러한 경우, 주로 소수성 잔기, 예컨대, 류신 및 발린을 포함할 수 있다. 실시양태에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플릿은 합성 막관통 도메인의 각 말단에서 발견된다. 임의적으로, 실시양태에서, 길이가 2 내지 10개의 아미노산 길이인 짧은 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 링커가 CAR의 막관통 도메인과 세포질 신호전달 도메인 사이에 연결을 형성할 수 있다. 실시양태에서, 링커는 글리신-세린 링커이다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR에서 막관통 도메인은 CD8알파 막관통 도메인이다. 실시양태에서, CD8알파 막관통 도메인은 서열번호: 87의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR에서 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인이다. 실시양태에서, CD28 막관통 도메인 서열번호: 88의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
세포질 도메인 (공동자극성 도메인 및 신호전달 도메인)
본원에 기술된 CAR의 세포내 신호전달 도메인으로도 공지된, 세포질 도메인은 CAR이 놓인 면역 세포의 정상 이펙터 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. "이펙터 기능"이라는 용어는 세포의 전문화된 기능을 지칭한다. T 세포의 이펙터 기능은 예를 들어, 세포용해 활성 또는 시토카인의 분비를 포함한 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서, "세포내 신호전달 도메인"이라는 용어는 이펙터 기능 신호를 전달하고, 세포가 전문화된 기능을 수행하도록 유도하는 단백질 부분을 지칭한다. 대개 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 다수의 경우에 전체 쇄를 사용할 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 말단절단된 부분을 사용하는 경우, 상기와 같은 말단절단된 부분은 그가 이펙터 기능 신호를 전달하는 한, 무손상 쇄 대신에 사용할 수 있다. 따라서, 세포내 신호전달 도메인이라는 용어는 이펙터 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 말단절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다.
본원에 기술된 CAR에서 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 예로는 T 세포 수용체 (TCR), 및 함께 작용하여 항원 수용체 결합 후 신호 전달을 개시하는 공동 수용체의 세포질 서열 뿐만 아니라, 동일한 기능 능력을 가진, 상기 서열 및 임의의 합성 서열의 임의의 유도체 또는 변이체를 포함할 수 있다.
TCR을 통해 단독으로 생성된 신호는 일반적으로 T 세포를 완전히 활성화시키는 데 불충분하고, 따라서, 2차 또는 공동자극성 신호가 또한 요구된다. 따라서, T 세포 활성화는 2개의 상이한 부류의 세포질 신호전달 서열: TCR을 통해 항원-의존성 1차 활성화를 개시하는 것 (1차 세포질 신호전달 서열) 및 항원-비의존성 방식으로 작용하여 2차 또는 공동자극성 신호를 제공하는 것 (2차 세포질 신호전달 서열)에 의해 매개될 수 있다.
1차 세포질 신호전달 서열은 자극 방식으로, 또는 억제 방식으로 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.
본 발명에서 특히 유용한 ITAM-함유 1차 세포질 신호전달 서열의 예로는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR 중 세포질 신호전달 분자는 CD3 제타로부터 유래된 세포질 신호전달 서열을 포함한다.
실시양태에서, CAR의 세포질 도메인은 CD3-제타 신호전달 도메인을 단독으로, 또는 본원에 기술된 CAR과 관련하여 유용한 임의의 다른 원하는 세포질 도메인(들)과 조합하여 포함하도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포질 도메인은 CD3 제타 쇄 부분 및 공동자극성 신호전달 영역을 포함할 수 있다. 공동자극성 신호전달 영역이란, 공동자극성 분자의 세포내 도메인을 포함하는, CAR의 한 부분을 지칭한다. 공동자극성 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응을 위해 요구되는, 항원 수용체 또는 그의 리간드 이외의 다른 세포 표면 분자이다. 상기 분자의 예로는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관된 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, DAP10, DAP12 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 실시양태에서, 공동자극성 분자는 예컨대, CD28 및 4-1BB 또는 CD28 및 OX40과 같이 함께 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 주로 4-1BB 및 CD28을 공동자극성 신호전달 요소로서 예시하고 있지만, 다른 공동자극성 요소도 본 발명의 범주 내에 포함된다.
본원에 기술된 CAR의 세포질 신호전달 부분 내의 세포질 신호전달 서열은 무작위로, 또는 특정 순서로 서로 연결될 수 있다. 임의적으로, 길이가 2 내지 10개의 아미노산 길이인 짧은 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 링커는 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 더블릿이 특히 적합한 링커를 제공한다.
한 실시양태에서, 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD28 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR 중 세포질 도메인은 4-1BB의 신호전달 도메인 및 CD3-제타의 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서, 4-1BB의 신호전달 도메인은 서열번호: 89의 폴리펩티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하고, CD3-제타의 신호전달 도메인은 서열번호: 93의 핵산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR 중 세포질 도메인은 CD28의 신호전달 도메인 및 CD3-제타의 신호전달 도메인을 포함하도록 디자인되고, 여기서, CD28의 신호전달 도메인은 서열번호: 90의 폴리펩티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하고, CD3-제타의 신호전달 도메인은 서열번호: 93의 폴리펩티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR 중 세포질 도메인은 DNAX-활성화 단백질 10 (DAP10)의 신호전달 도메인을 포함하도록 디자인되고, 여기서, DAP10의 신호전달 도메인은 서열번호: 91의 폴리펩티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR 중 세포질 도메인은 DNAX-활성화 단백질 12 (DAP12)의 신호전달 도메인을 포함하도록 디자인되고, 여기서, DAP10의 신호전달 도메인은 서열번호: 92의 폴리펩티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR 중 세포질 도메인은 4-1BB의 신호전달 도메인 및 CD3-제타의 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서, 4-1BB의 신호전달 도메인은 서열번호: 89에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, CD3-제타의 신호전달 도메인은 서열번호: 93에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 유전 요소
비록 세포 요법이 인간 질환 치료에 큰 가능성을 가지고 있지만, 세포 그 자체로부터, 또는 그의 트랜스진 생성물로부터의 상당한 독성이 임상 연구를 방해해 왔다. 본원에 기술된 실시양태에서, 포유동물 대상체, 예컨대, 인간 내로 주입된 본원에 기술된 CAR을 포함하는 면역 이펙터 세포는 그의 사용으로부터 발생하는 독성인 상기 면역 이펙터 세포의 효과를 조절하기 위해 제거될 수 있다. 그러므로, 본원에 기술된 치료적 ROR-1-특이적 키메라 항원 수용체 이외에도, 제2 유전자 또한 본원에 기술된 조작된 면역 이펙터 세포 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 제2 유전자는 "세포 태그"이다. 일부 실시양태에서, 세포 태그는 "사멸 스위치"이다. 일부 실시양태에서, 제2 유전자는 사실상, ROR-1 CAR 또는 ROR-1 CAR/mbIL-15 함유 세포의 고갈을 허용하는 "사멸 스위치"이다. 특정 실시양태에서, "사멸 스위치"는, 적어도 HER1 또는 CD20의 항체 결합 에피토프 또는 그의 기능성 단편, 및 임의적으로, 신호 폴리펩티드 서열 또는 그의 단편을 포함하는 HER1 폴리펩티드 또는 CD20 폴리펩티드를 포함하는 HER1 태그 또는 CD20 태그이다.
특정 실시양태에서, 제2 유전자는 표피 성장 인자 수용체 (HER1) 또는 그의 단편 또는 변이체인 HER1 태그이다. 실시양태에서, 제2 유전자는 말단절단된 인간 표피 성장 인자 수용체 1인 HER1 태그이다 (예를 들어, HER1t 또는 HER1t1). 일부 경우에, 제2 유전자는 말단절단된 인간 표피 성장 인자 수용체 1의 변이체이다. 실시양태에서, HER1, HER1t 및 HER1t1 중 적어도 하나는 FDA 승인 세툭시맙, 또는 HER1, HER1t 및/또는 HER1t1을 인식하는 임의의 항체 투여를 통해 주입된 CAR-T 세포의 고갈을 허용함으로써 안전 기전을 제공한다. 실시양태에서, HER1t 유전자는 서열번호: 256의 핵산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 실시양태에서, HER1t1 유전자는 서열번호: 257의 핵산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 말단절단된 HER1 서열, 예를 들어, HER1t 및 HER1t1은 세툭시맙의 수용체에의 결합은 무손상 상태 그대로 유지시키면서, EGF 리간드 결합, EGFR의 동종 및 이종이량체화, 및 EGFR 매개 신호전달 가능성을 제거한다 (문헌 [Ferguson, K., 2008. A structure-based view of Epidermal Growth Factor Receptor regulation. Annu Rev Biophys , Volume 37, pp. 353-373]).
일부 실시양태에서, HER1t 태그는 서열번호: 109의 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, HER1t1 태그는 서열번호: 110의 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 갖는다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 치료적 ROR-1-특이적 키메라 항원 수용체 이외의 도입된 제2 유전자는 CD20 태그이다. 일부 경우에, CD20 태그는 전장의 CD20 폴리펩티드, 또는 말단절단된 CD20 폴리펩티드 (CD20t-1)이다. 일부 경우에, CD20 태그, 예를 들어, CD20 또는 CD20t-1 또한 FDA 승인 리툭시맙 요법 투여를 통해 주입된 CAR-T 세포의 고갈을 허용함으로써 안전 기전을 제공한다. 특정 실시양태에서, CD20 태그는 서열번호: 111의 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, CD20 태그는 CD20t-1 태그이고, 서열번호: 112의 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, CD20 태그는, 서열번호: 258의 핵산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CD20 유전자에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, CD20 태그는 서열번호: 259의 핵산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CD20t-1 유전자에 의해 코딩된다.
실시양태에서, 본원에 기술된 CAR을 포함하는 CAR 벡터는 서열번호: 258의 핵산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 전장의 CD20 태그를 추가로 포함한다.
실시양태에서, 사멸 태그, 예를 들어, HER1t, HER1t-1, CD20 또는 CD20t-1 태그를 코딩하는 유전자는 유전적으로 자기 절단 펩티드, 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 토세아 아시그나 바이러스 (T2A) 펩티드와 프레임 내에서 3' 단부에서 ROR-1 CAR에 융합된다. 실시양태에서, T2A 펩티드는 서열번호: 116의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
실시양태에서, 사멸 태그 유전자는 ROR-1 CAR 유전자와 프레임 내에서 렌티바이러스 플라스미드 백본으로 클로닝된다. 다른 실시양태에서, 사멸 태그는 별개의 렌티바이러스 벡터로 클로닝된다. 다른 실시양태에서, 두 유전자 모두 슬리핑 뷰티 트랜스포존 벡터로 클로닝된다. 추가의 다른 실시양태에서, 사멸 태그, 예컨대, HER1t, HER1t-1, CD20 또는 CD20t-1은 별개의 슬리핑 뷰티 트랜스포존 벡터로 클로닝된다. 특정 실시양태에서, 사멸 태그는 신호 펩티드, 예를 들어, GM-CSFRa 신호 펩티드를 갖고, 여기서, GM-CSFRa 신호 펩티드는 서열번호: 94의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 신호 펩티드는 서열번호: 95의 핵산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 갖는 IgK이다.
한 실시양태에서, 신호 펩티드는 마우스 Ig VH 영역 3 (서열번호: 101), 아주로시딘 (서열번호: 103), IGHV3-23 (서열번호: 106), IGKV1-D33 (HuL1) (서열번호: 107) 또는 IGKV1-D33 (L14F) (HuH7) (서열번호: 108)이다.
본원에 기술된 바와 같은 CAR 및 사멸 태그를 코딩하는 예시적인 유전자 발현 카세트는 도 1 및 2에 제시되어 있다.
예시적인 CAR 오픈 리딩 프레임
본원에 기술된 방법 및 조성물에 의해 포함되는 예시적인 CAR 및 인간 ROR-1 수용체 오픈 리딩 프레임이 하기 표 1에 있다:
Figure pct00001
실시양태에서, 본원에서는 서열번호: 3 내지 14 또는 서열번호: 75 내지 82의 아미노산과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 CAR를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
실시양태에서, CAR hROR1(VH-VL)_14.CD8a(3x).CD28z는 서열번호: 17 (hROR1 VH_5)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드 및 서열번호: 18 (hROR1 VL_5)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, CAR hROR1(VL-VH)_05.CD8a(3x).CD28z는 서열번호: 35 (hROR1 VH_14)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드 및 서열번호: 36 (hROR1 VL_14)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, CAR hROR1(VH-VL)_14-3.CD8a(3x).CD28z는 서열번호: 41 (hROR1 VH_14-3)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드 및 서열번호: 42 (hROR1 VL_14-3)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, CAR hROR1(VH-VL)_14-4.CD8a(3x).CD28z는 서열번호: 43 (hROR1 VH_14-4)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드 및 서열번호: 44 (hROR1 VL_14-4)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, CAR hROR1(VH_5-VL_14).CD8a(3x).CD28z는 서열번호: 17 (hROR1 VH_5)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드 및 서열번호: 36 (hROR1 VL_14)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, CAR hROR1(VH_5-VL_16).CD8a(3x).CD28z는 서열번호: 17 (hROR1 VH_05)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드 및 서열번호: 50 (hROR1 VL_16)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, CAR hROR1(VH_18-VL_04).CD8a(3x).CD28z는 서열번호: 53 (hROR1 VH_18)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드 및 서열번호: 16 (hROR1 VL_04)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
실시양태에서, CAR hROR1(VH_18-VL_14).CD8a(3x).CD28z는 서열번호: 53 (hROR1 VH_18)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드 및 서열번호: 36 (hROR1 VL_14)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
표 1의 각 실시양태에서, CAR의 신호 펩티드는 마우스 Ig VH 영역 3 (서열번호: 101), 아주로시딘 (서열번호: 103), IGHV3-23 (서열번호: 106), IGKV1-D33 (HuL1) (서열번호: 107) 또는 IGKV1-D33 (L14F) (HuH7) (서열번호: 108)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
"CD8a"를 포함하는, 표 1에 열거된 각 실시양태에서, CAR의 막관통 영역은 서열번호: 87의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 CD8알파 막관통 도메인을 포함하고, 스페이서는 서열번호: 83 내지 86에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 CD8a이다.
"CD28m"을 포함하는, 표 1에 열거된 각 실시양태에서, CAR의 세포내 도메인은 서열번호: 90의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CD28을 포함한다.
"T2A"를 포함하는, 표 1에 열거된 각 실시양태에서, CAR ORF는 단일 벡터로부터 다중 유전자 생성물의 생산을 가능하게 하는 자기 절단 토세아 아시그나 바이러스 (T2A) 펩티드를 포함한다. 실시양태에서, T2A 펩티드는 서열번호: 116의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
"HER1t"를 포함하는, 표 1의 실시양태에서, CAR ORF는, FDA 승인 세툭시맙 요법 투여를 통해 주입된 CAR-T 세포의 고갈을 허용함으로써 안전 기전을 제공하는, 말단절단된 인간 표피 성장 인자 수용체 1 (HER1t)을 포함한다. 본원에 기술된 바와 같은 HER1t 유전자는 서열번호: 65의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 표 1에서 달리 언급되지 않는 한, HER1t 태그는 GM-CSFRa 신호 펩티드 ("GM-CSFRsp") (서열번호: 94)를 갖는다. 한 실시양태에서, 신호 펩티드는 마우스 Ig VH 영역 3 (서열번호: 101), 아주로시딘 (서열번호: 103), IGHV3-23 (서열번호: 106), IGKV1-D33 (HuL1) (서열번호: 107) 또는 IGKV1-D33 (L14F) (HuH7) (서열번호: 108)이다. 특정 실시양태에서, HER1t는 또 다른 태그, 예를 들어, HER1t-1로 치환될 수 있다. 본원에 기술된 HER1t-1 유전자는 서열번호: 110의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. "IgKsp"를 포함하는, 표 1의 실시양태에서, 신호 펩티드는 서열번호: 95의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 IgK이다.
"4-1BB"를 포함하는, 표 1의 실시양태에서, CAR ORF는 서열번호: 89의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 갖는 공동자극성 분자를 포함한다.
"FL CD20"을 포함하는, 표 1의 실시양태에서, CAR ORF는 서열번호: 111의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 전장의 CD20 태그를 포함한다. CD20은 FDA 승인 리툭시맙 요법 투여를 통해 주입된 CAR-T 세포의 고갈을 허용함으로써 안전 기전을 제공한다. 다른 실시양태에서, FL CD20은 서열번호: 112의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 CD20t-1로 치환될 수 있다.
표 1의 특정 실시양태에서, CAR ORF는 유전자 전사를 위해 유도성 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 한 측면에서, 유도성 프로모터는 유전자 스위치 리간드 유도성 프로모터일 수 있다. 일부 경우에, 유도성 프로모터는 소분자 리간드-유도성 2 폴리펩티드 엑디손 수용체-기반 유전자 스위치, 예컨대, 레오스위치(RHEOSWITCH)® 유전자 스위치일 수 있다. 일부 실시양태에서, CAR ORF 및 유전자 스위치 성분은 도 1a-1e 및 도 2a-2e에 도시된 바와 같이 구성될 수 있다.
시토카인
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR은 시토카인을 포함하나, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, 시토카인은 적어도 하나의 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 림포카인, 종양 괴사 인자, 또는 그의 변이체 또는 조합을 포함한다. 일부 경우에, 시토카인은 인터류킨이다. 일부 경우에, 인터류킨은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33 및 그의 기능성 변이체 및 단편 중 적어도 하나의 것이다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 막 결합형 또는 분비형일 수 있다. 실시양태에서, 시토카인은 가용성 IL-15, 가용성 IL-15/IL-15Rα 복합체 (예컨대, ALT-803)이다. 특정 경우에, 인터류킨은 막 결합 IL-15 (mbIL-15) 또는 IL-15 및 IL-15Rα의 융합체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, mbIL-15는 본원에 기술된 변형된 면역 이펙터 세포와 함께 발현될 수 있는, 막 결합 키메라 IL-15이다. 일부 실시양태에서, mbIL-15는 전장의 IL-15Rα, 그의 기능성 단편 또는 변이체와 함께 프레임내에서 융합된, 전장의 IL-15 (예컨대, 천연 IL-15 폴리펩티드) 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부 경우에, IL-15는 링커를 통해 IL-15Rα에 간접적으로 연결된다. 일부 경우에, mbIL-15는 문헌 [Hurton et al., "Tethered IL-15 augments antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T cells," PNAS 2016]에 기술되어 있다. 일부 경우에, 시토카인은 CAR과 동일한 면역 이펙터 세포에서 발현된다.
추가 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR을 발현하는 면역 이펙터 세포는 막 결합 IL-15 ("mIL-15 또는 mbIL-15")를 발현한다. 본 발명의 측면에서, mbIL-15는 IL-15와 IL-15Rα 사이에 융합 단백질을 포함한다. 추가 실시양태에서, mbIL-15는 서열번호: 113의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 경우에, CAR 및 시토카인은 별개의 벡터에서 발현된다. 구체적인 경우에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 슬리핑 뷰티 트랜스포존일 수 있다.
일부 실시양태에서, mbIL-15는 본원에 기술된 세포 태그, 예컨대, HER1t, HER-1t-1, CD20t-1 또는 CD20과 함께 발현된다. mbIL-15는 HER1t, HER-1t-1, CD20t-1 또는 CD20과 함께 프레임내에서 발현될 수 있다.
일부 실시양태에서, mbIL-15는 유전자 전사를 위해 유도성 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 한 측면에서, 유도성 프로모터는 유전자 스위치 리간드 유도성 프로모터일 수 있다. 일부 경우에, 유도성 프로모터는 소분자 리간드-유도성 2 폴리펩티드 엑디손 수용체-기반 유전자 스위치, 예컨대, 레오스위치® 유전자 스위치일 수 있다.
또 다른 측면에서, 인터류킨은 IL-12를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, IL-12는 단일 쇄 IL-12 (scIL-12), 프로테아제 감수성 IL-12, 탈안정화된 IL-12, 막 결합 IL-12, 삽입된 IL-12이다. 일부 경우에, IL-12 변이체는 WO2015/095249, WO2016/048903, WO2017/062953 (이들은 모두 그 전문이 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 상기 기술된 시토카인은 유전자 전사를 위해 유도성 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 한 측면에서, 유도성 프로모터는 유전자 스위치 리간드 유도성 프로모터일 수 있다. 일부 경우에, 유도성 프로모터는 소분자 리간드-유도성 2 폴리펩티드 엑디손 수용체-기반 유전자 스위치, 예컨대, 레오스위치® 유전자 스위치일 수 있다.
유전자 스위치
본원에서는 유전자 스위치 폴리펩티드, 리간드-유도성 유전자 스위치 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 도입한 방법 및 시스템을 제공한다. "유전자 스위치"라는 용어는 프로모터와 결합된 반응 요소, 및 예를 들어, 엑디손 수용체 (EcR) 기반 시스템 (하나 이상의 리간드의 존재하에서 상기 반응 요소 및 프로모터가 통합되는 유전자의 발현을 조절한다)의 조합을 지칭한다. 엄격하게 조절된 유도성 유전자 발현 시스템 또는 유전자 스위치는 예컨대, 유전자 요법, 세포에서 단백질의 대규모 생산, 세포 기반 고처리량 스크리닝 검정법, 기능 게노믹스 및 트랜스제닉 식물 및 동물에서 특징의 조절과 같은 다양한 용도에 유용하다. 상기와 같은 유도성 유전자 발현 시스템은 리간드 유도성 이종 유전자 발현 시스템을 포함할 수 있다.
EcR-기반 유전자 스위치의 초기 버전은 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) EcR (DmEcR) 및 무스 무스쿨루스(Mus musculus) RXR (MmRXR) 폴리펩티드를 사용하였으며 스테로이드, 포나스테론A의 존재하에서 이들 수용체는 포유동물 세포주 및 트랜스제닉 마우스에서 리포터 유전자를 전사활성화시키는 것으로 나타났다 (문헌 [Christopherson et al., 1992]; [No et al., 1996]). 나중에, 문헌 [Suhr et al., 1998]에서는 비-스테로이드성 엑디손 효능제, 테부페노지드가 외인성 이종이량체 파트너의 부재하에서 봄빅스 모리(Bombyx mori) EcR (BmEcR)을 통해 포유동물 세포에서 리포터 유전자의 전사활성화를 높은 수준으로 유도하는 것으로 나타났다.
국제 특허 출원 번호 PCT/US97/05330 (WO 97/38117) 및 PCT/US99/08381 (WO99/58155)는 외인성 유전자 및 엑디손 반응 요소를 포함하는 DNA 구축물이, 리간드의 존재하에서 및 임의적으로, 침묵 파트너로서 작용할 수 있는 수용체의 존재하에서 엑디손 반응 요소에 결합하여 유전자 발현을 유도하는 엑디손 수용체를 포함하는 제2 DNA 구축물에 의해 활성화되는 외인성 유전자의 발현을 조절하는 방법을 개시한다. 상기 예에서, 엑디손 수용체는 드로소필라 멜라노가스터로부터 단리되었다. 전형적으로, 상기와 같은 시스템은 최적의 활성화를 제공하기 위해서, 침묵 파트너, 바람직하게는 레티노이드 X 수용체 (RXR)의 존재를 필요로 한다. 포유동물 세포에서, 곤충 엑디손 수용체 (EcR)는 포유동물 레티노이드 X 수용체 (RXR)와 이종이량체화할 수 있으며, 이에 의해 표적 유전자 또는 이종 유전자의 발현을 리간드에 의존하는 방식으로 조절하는 데 사용된다. 국제 특허 출원 번호 PCT/US98/14215 (WO 99/02683)는 누에 나방 봄빅스 모리로부터 단리된 엑디손 수용체가 외인성 이량체 파트너의 필요 없이 포유동물 시스템에서 기능성임을 개시한다.
미국 특허 번호 6,265,173은 수용체의 스테로이드/갑상선 슈퍼패밀리의 다양한 구성원을 유전자 발현 시스템에 사용하기 위해 적어도 울트라스피라클 수용체 (USP)의 이량체화 도메인을 포함하는 드로소필라 멜라노가스터 USP 또는 그의 단편과 조합할 수 있음을 개시한다. 미국 특허 번호 5,880,333은 2개의 상이한 하이브리드 단백질상에 전사활성화 도메인과 DNA 결합 도메인이 위치하는, 식물에 사용되는 드로소필라 멜라노가스터 EcR 및 울트라스피라클 (USP) 이종이량체 시스템을 개시한다. 이들 각각의 경우에서, 전사활성화 도메인 및 DNA 결합 도메인 (국제 특허 출원 번호 PCT/US98/14215에서와 같이 천연 EcR로서 또는 국제 특허 출원 번호 PCT/US97/05330에서와 같이 변형된 EcR로서)은 단일 분자에 도입되었고, 다른 이종이량체 파트너, USP 또는 RXR은 그의 천연 상태로 사용되었다.
국제 특허 출원 번호 PCT/US01/0905는 전사활성화 및 DNA 결합 도메인을 2개의 상이한 단백질상에 놓음으로써 이들을 서로로부터 분리시키는 엑디손 수용체-기반 유도성 유전자 발현 시스템이, 리간드의 부재하에서 크게 감소된 배경 활성 및 리간드 존재하에서의 배경에 비해 현저하게 증가된 활성을 생성시킴을 개시한다. 상기 2-하이브리드 시스템은 출원 PCT/US97/05330 및 PCT/US98/14215에 개시된 2개의 시스템에 비해 현저하게 개선된 유도성 유전자 발현 조절 시스템이다. 상기 2-하이브리드 시스템은 DNA 결합 도메인이 유전자상의 DNA 결합 부위에 결합할 때, 전사활성화 도메인이 프로모터를 더욱 효과적으로 활성화하도록 상기 DNA 결합 도메인에 비해 전사 활성화 도메인을 더 유리한 위치로 가져오는 한 쌍의 상호작용 단백질의 능력을 이용하는 것으로 여겨진다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,283,173 참조). 상기 2-하이브리드 유전자 발현 시스템은 2개의 유전자 발현 카세트를 포함한다; 첫 번째는 핵 수용체 폴리펩티드에 융합된 DNA 결합 도메인을 코딩하고, 두 번째는 상이한 핵 수용체 폴리펩티드에 융합된 전사활성화 도메인을 코딩한다. 리간드의 존재하에서, 상기 첫 번째 폴리펩티드와 두 번째 폴리펩티드와의 상호작용을 촉진하여 상기 DNA 결합 도메인 및 전사활성화 도메인의 이량체화를 생성시키는 입체형태적 변화가 유도되는 것으로 여겨진다. 상기 DNA 결합 및 전사활성화 도메인은 2개의 상이한 분자상에 있기 때문에, 리간드 부재하에서의 배경 활성이 크게 감소된다.
2-하이브리드 시스템의 특정 변형 또한 스테로이드성 리간드, 예를 들어, 포나스테론 A ("PonA") 또는 무리스테론 A ("MurA")와 비교하였을 때, 비-스테로이드성 리간드, 예를 들어, 디아실히드라진에 대하여 개선된 감수성을 제공할 수 있다. 즉, 스테로이드와 비교하였을 때, 비-스테로이드성 리간드는 더 낮은 리간드 농도에서 더 높은 유전자 전사 활성을 제공하였다. 추가로, 2-하이브리드 시스템은 비변형된 RXR이 스위칭 파트너로서 사용될 때 발생할 수 있는 RXR의 과다발현에 기인하는 일부 부작용을 막는다. 바람직한 2-하이브리드 시스템에서, EcR 또는r RXR의 천연 DNA 결합 및 전사활성화 도메인은 제거되고, 그 결과, 상기 하이브리드 분자는 세포에 존재하는 다른 스테로이드 호르몬 수용체와 상호작용할 수 있는 기회는 감소되어 있고, 그 결과로 부작용도 감소된다.
엑디손 수용체 (EcR)는 핵 수용체 슈퍼패밀리의 구성원이며, 서브패밀리 1, 그룹 H (본원에서 "그룹 H 핵 수용체"로서 지칭)로 분류된다. 각 그룹의 구성원들은 E (리간드 결합) 도메인에서 40 내지 60%의 아미노산 동일성을 공유한다 (문헌 [Laudet et al., A Unified Nomenclature System for the Nuclear Receptor Subfamily, 1999; Cell 97: 161-163]). 상기 엑디손 수용체 이외에도, 상기 핵 수용체 서브패밀리 1, 그룹 H의 다른 구성원으로 편재 수용체 (UR), 희귀 수용체 1 (OR-1), 스테로이드 호르몬 핵 수용체 1 (NER-1), RXR 상호작용 단백질-15 (RIP-15), 간 X 수용체 β (LXRβ), 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질 (RLD-1), 간 X 수용체 (LXR), 간 X 수용체α (LXRα), 파르네소이드 X 수용체 (FXR), 수용체 상호작용 단백질 14 (RIP-14), 및 파르네솔 수용체 (HRR-1)를 포함한다.
일부 경우에, 유도성 프로모터 ("IP")는 소분자 리간드-유도성 2 폴리펩티드 엑디손 수용체-기반 유전자 스위치, 예컨대, 인트렉손 코포레이션(Intrexon Corporation) 레오스위치® 유전자 스위치일 수 있다. 일부 경우에, 유전자 스위치는 제한 없이, PCT/US2001/009050 (WO 2001/070816); 미국 특허 번호 7,091,038; 7,776,587; 7,807,417; 8,202,718; PCT/US2001/030608 (WO 2002/029075); 미국 특허 번호 8,105,825; 8,168,426; PCT/1J52002/005235 (WO 2002/066613); 미국 출원 번호 10/468,200 (미국 공개 번호 20120167239); PCT/US2002/005706 (WO 2002/066614); 미국 특허 번호 7,531,326; 8,236,556; 8,598,409; PCT/U52002/005090 (WO 2002/066612); 미국 특허 번호 8,715,959 (미국 공개 번호 20060100416); PCT/US2002/005234 (WO 2003/027266); 미국 특허 번호 7,601,508; 7,829,676; 7,919,269; 8,030,067; PCT/U52002/005708 (WO 2002/066615); 미국 출원 번호 10/468,192 (미국 공개 번호 20110212528); PCT/US2002/005026 (WO 2003/027289); 미국 특허 번호 7,563,879; 8,021,878; 8,497,093; PCT/US2005/015089 (WO 2005/108617); 미국 특허 번호 7,935,510; 8,076,454; PCT/U52008/011270 (WO 2009/045370); 미국 출원 번호 12/241,018 (미국 공개 번호 20090136465); PCT/US2008/011563 (WO 2009/048560); 미국 출원 번호 12/247,738 (미국 공개 번호 20090123441); PCT/US2009/005510 (WO 2010/042189); 미국 출원 번호 13/123,129 (미국 공개 번호 20110268766); PCT/US2011/029682 (WO 2011/119773); 미국 출원 번호 13/636,473 (미국 공개 번호 20130195800); PCT/US2012/027515 (WO 2012/122025); 및 미국 특허 번호 9,402,919 (상기 특허들은 각각 그 전문이 참조로 포함된다)에 기술된 시스템 중 임의의 것에 기재된 엑디손-기반 수용체 성분으로부터 선택될 수 있다.
본원에 개시된 유전자 스위치 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 숙주 세포에서 CAR 및/또는 시토카인의 발현을 조절하는 시스템을 제공한다. 본원에서는 유전자 발현의 리간드-유도성 제어를 위한 유전자 스위치 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, 유전자 스위치 폴리펩티드는 (a) 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 DNA-결합 도메인 (DBD)을 포함하는 제1 유전자 스위치 폴리펩티드; 및 (b) 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 전사활성화 도메인을 포함하는 제2 유전자 스위치 폴리펩티드를 포함하고; 여기서, 제1 유전자 스위치 폴리펩티드 및 제2 유전자 스위치 폴리펩티드는 링커에 의해 연결된 것인, 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 링커는 2A, GSG-2A, GSG 링커 (서열번호: 129), SGSG 링커 (서열번호: 130), 그의 퓨린링크 변이체 및 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 절단가능한 또는 리보솜 스키핑 링커 서열이다. 특정 실시양태에서, 2A 링커는 p2A 링커, T2A 링커, F2A 링커, 또는 E2A 링커이다.
일부 실시양태에서, DNA 결합 도메인 (DBD)은 GAL4 (GAL4 DBD), LexA DBD, 전사 인자 DBD, 스테로이드/갑상선 호르몬 핵 수용체 슈퍼패밀리 구성원 DBD, 박테리아 LacZ DBD, 및 효모 DBD 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 경우에, 전사활성화 도메인은 VP16 전사활성화 도메인, 및 B42 산성 활성인자 전사활성화 도메인 중 적어도 하나를 포함한다. 다른 경우에, 핵 수용체 리간드 결합 도메인은 엑디손 수용체 (EcR), 편재 수용체, 희귀 수용체 1, NER-1, 스테로이드 호르몬 핵 수용체 1, 레티노이드 X 수용체 상호작용 단백질-15, 간 X 수용체 β, 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질, 간 X 수용체, 간 X 수용체 α, 파르네소이드 X 수용체, 수용체 상호작용 단백질 14, 및 파르네솔 수용체 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵 수용체 리간드 결합 도메인은 서열번호: 135 및 136의 엑디손 수용체 폴리펩티드 서열로부터 유래된 것이다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 제1 유전자 스위치 폴리펩티드는 EcR 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 GAL4 DBD를 포함하고, 제2 유전자 스위치 폴리펩티드는 레티노이드 수용체 X (RXR) 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 VP16 전사활성화 도메인을 포함한다. 일부 경우에, 제1 유전자 스위치 폴리펩티드 및 제2 유전자 스위치 폴리펩티드는 2A, GSG-2A, GSG 링커 (서열번호: 129), SGSG 링커 (서열번호: 130), 그의 퓨린링크 변이체 및 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 링커에 의해 연결된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 2개 이상의 폴리펩티드는 링커 폴리펩티드를 코딩하는 개재 서열에 의해 분리될 수 있다. 특정 경우에, 링커는 절단-감수성 링커이다. 일부 실시양태에서, 관심 폴리펩티드는 절단-감수성 링커 폴리펩티드에 의해 연결된 융합 단백질로서 발현된다. 특정 실시양태에서, 절단-감수성 링커 폴리펩티드(들)는 F/T2A, T2A, p2A, 2A, GSG-p2A, GSG 링커 (서열번호: 129), 및 퓨린링크 변이체 중 하나 이상의 것일 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커 폴리펩티드는 서열번호: 116-130에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함한다.
일부 경우에, 바이러스 2A 서열이 사용될 수 있다. 2A 요소는 5 내지 100개의 염기쌍을 갖는 것으로, IRES보다 더 짧을 수 있다. 일부 경우에, 2A 서열의 길이는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 100개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 2A 연결된 유전자는 하나의 단일 오픈 리딩 프레임으로 발현될 수 있고, "자기-절단"이 상기 2A 폴리펩티드의 C-말단에서, 최종 2개 아미노산, GP 사이에서 동시-번역에 의해 발생하여, 동량의 동시-발현된 단백질을 생성시킬 수 있다.
바이러스 2A 서열은 약 20개의 아미노산일 수 있다. 일부 경우에, 바이러스 2A 서열은 공통 모티프 Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro (서열번호: 286)를 함유할 수 있다. 공통 모티프 서열은 동시-번역에 의해 작용할 수 있다. 예를 들어, 글리신과 프롤린 잔기 사이의 정상적인 펩티드 결합의 형성이 방해받을 수 있으며, 이는 리보솜 스키핑 및 초기 폴리펩티드의 절단을 생성시킬 수 있다. 상기 효과는 다중 유전자를 동몰 수준으로 생성시킬 수 있다.
2A 펩티드는 단일 오픈 리딩 프레임에서 다중 단백질의 폴리펩티드로의 번역을 허용할 수 있으며, 상기 폴리펩티드는 이어서 리보솜-스키핑 기전을 통해 개별 폴리펩티드로 절단될 수 있다 (문헌 [Funston, Kallioinen et al 2008]). 일부 실시양태에서, 2A 서열은 F/T2A, T2A, p2A, 2A, T2A, E2A, F2A, 및 BmCPV2A, BmIFV2A, 및 그의 임의 조합을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 벡터는 IRES 서열 및 2A 링커 서열을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 2A 펩티드와 연결된 다중 유전자의 발현은 2A 펩티드 앞의 스페이서 서열 (GSG (서열번호: 129))에 의해 촉진할 수 있다. 일부의 경우에, 구축물은 스페이서, 링커, 어댑터, 프로모터, 또는 그들의 조합을 조합할 수 있다. 예를 들어, 구축물은 상이한 2A 펩티드와 함께 스페이서 (SGSG (서열번호: 130) 또는 GSG (서열번호: 129)) 및 퓨린 링커 (R-A-K-R (서열번호: 125)) 절단 부위를 가질 수 있다. 스페이서는 I-Ceui일 수 있다. 일부의 경우에, 링커는 조작될 수 있다. 예를 들어, 링커는 소수성과 같은 화학적 특징을 포함하도록 디자인될 수 있다. 일부 경우에, 적어도 2개의 링커 서열은 동일한 단백질을 생성시킬 수 있다. 다른 경우에, 다중의 링커가 하나의 벡터에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 관심 유전자는 적어도 2개의 링커에 의해 분리될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 2개 이상의 폴리펩티드는 링커 폴리펩티드를 코딩하는 개재 서열에 의해 분리될 수 있다. 특정 경우에, 링커는 절단-감수성 링커이다. 일부 실시양태에서, 관심 폴리펩티드는 절단-감수성 링커 폴리펩티드에 의해 연결된 융합 단백질로서 발현된다. 특정 실시양태에서, 절단-감수성 링커 폴리펩티드(들)는 서열번호: 119, 120, 121, 125, 및 128에 기술된 퓨린링크, fmdv, p2a, GSG-p2a, 및/또는 fp2a 중 임의의 1 또는 2개의 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커는 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드에서 사용될 수 있다. 링커는 가요성 링커, 강성 링커, 생체내 절단가능한 링커, 또는 그의 임의 조합일 수 있다. 일부의 경우에, 링커는 기능성 도메인들을 함께 연결하거나 (가요성 및 강성 링커에서와 같이) 또는 생체내 절단가능한 링커에서와 같이 생체내에서 기능성 도메인을 유리시킬 수 있다.
링커는 생물학적 활성을 개선시키고, 발현 수율을 증가시키고, 바람직한 약동학적 프로파일을 달성할 수 있다. 링커는 또한 히드라존, 펩티드, 디술피드, 또는 티오에스테르를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기술된 링커 서열은 가요성 링커를 포함할 수 있다. 가요성 링커는 결합된 도메인이 어느 정도의 이동 또는 상호작용을 필요로 하는 경우, 적용될 수 있다. 가요성 링커는 작은, 비-극성 (예컨대, Gly), 또는 극성 (예컨대, Ser 또는 Thr) 아미노산으로 구성될 수 있다. 가요성 링커는 주로 Gly 및 Ser 잔기의 스트레치로 이루어지는 서열 ("GS" 링커)을 가질 수 있다. 가요성 링커의 예로 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (서열번호: 287) 서열을 가질 수 있다. 카피수 "n"을 조정함으로써, 상기 예시적인 GS 링커의 길이를 최적화함으로써 기능성 도메인을 적절히 분리시킬 수 있거나, 또는 필요한 도메인 간의 상호작용을 유지할 수 있다. 예를 들어, (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (여기서, n은 3이다)은 서열번호: 127에 제시된 (G4S)3 링커이다. GS 링커 이외에도, 다른 가요성 링커들이 재조합 융합 단백질에 사용될 수 있다. 일부의 경우에, 가요성 링커에는 또한 작은 또는 극성 아미노산, 예컨대, Gly 및 Ser이 풍부할 수 있지만, 가요성을 유지하기 위해서 추가의 아미노산, 예컨대, Thr 및 Ala를 함유할 수 있다. 다른 경우에, 극성 아미노산, 예컨대, Lys 및 Glu를 사용하여 용해도를 개선시킬 수 있다.
우수한 가요성 및 용해도를 제공하기 위해 본원에 기술된 링커 서열에 포함된 가요성 링커에 작은 또는 극성 아미노산, 예컨대, Gly 및 Ser이 풍부할 수 있다. 가요성 링커는 특정 이동 또는 상호작용이 융합 단백질 도메인에 필요한 경우, 적합한 선택일 수 있다. 추가로, 가요성 링커는 강성 구조를 갖지 않을 수도 있지만, 일부 경우에, 기능성 도메인들 사이의 거리를 유지시키기 위해서 수동 링커로서 작용할 수 있다. 가요성 링커의 길이는 적합한 폴딩을 허용하거나, 또는 융합 단백질의 최적의 생물학적 활성을 달성하기 위해서 조정될 수 있다.
본원에 기술된 링커는 일부의 경우에 강성 링커를 추가로 포함할 수 있다. 강성 링커는 폴리펩티드의 도메인 사이의 고정된 거리를 유지시키기 위해 사용될 수 있다. 강성 링커의 예로는 몇 개를 언급하자면, 알파 나선-형성 링커, Pro-풍부한 서열, (XP)n, X-Pro 백본, A(EAAAK)nA (n = 2-5) (서열번호: 288)일 수 있다. 강성 링커는 일부의 경우에 α-나선 구조를 채택하거나, 다중의 Pro 잔기를 함유함으로써 비교적 경직성인 구조를 나타낼 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기술된 링커는 절단가능한 것일 수 있다. 다른 경우에, 링커는 절단가능한 것이 아니다. 절단가능한 것이 아닌 링커는 기능성 도메인과 함께 공유 결합하여 생체내 프로세스 또는 생체외 프로세스 전 기간 동안 하나의 분자로서 작용할 수 있다. 링커는 또한 생체내에서 절단가능한 것일 수 있다. 절단가능한 링커는 생체내에서 기능성 도메인을 유리시키기 위해 도입될 수 있다. 절단가능한 링커는 예를 들어, 환원 시약, 프로테아제의 존재에 의해 절단될 수 있다. 예를 들어, 디술피드 결합의 환원을 사용하여 절단가능한 링커를 생성시킬 수 있다. 디술피드 링커의 경우에, 티올, 예컨대, 글루타온과의 디술피드 교환을 통한 절단 이벤트가 절단을 생성시킬 수 있었다. 다른 경우에, 재조합 융합 단백질에서 링커의 생체내 절단은 또한, 특정한 세포 또는 조직 중에서 병적인 상태 (예컨대, 암 또는 염증)하에 생체내에서 발현될 수 있는 프로테아제에 의해 수행되거나, 또는 몇몇 세포 구획내에 제한될 수 있다. 일부의 경우에, 절단가능한 링커는 표적화된 절단을 허용할 수 있다. 예를 들어, 다수 프로테아제의 특이성은 제한된 구획에서 링커의 보다 느린 절단을 제공할 수 있다. 절단가능한 링커는 또한 히드라존, 펩티드, 디술피드, 또는 티오에스테르를 포함할 수 있다. 예를 들어, 히드라존은 혈청 안정성을 부여할 수 있다. 다른 경우에, 히드라존은 산성 구획에서 절단을 허용할 수 있다. 산성 구획의 pH는 최대 7일 수 있다. 링커는 또한 티오에테르를 포함할 수 있다. 티오에테르는 비환원성일 수 있다. 티오에테르는 세포내 단백질분해적 분해를 위해 디자인될될 수 있다.
특정 실시양태에서, fmdv 링커 폴리펩티드는 서열번호: 126과 적어도 약 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, fmdv 링커 폴리펩티드는 2개 이상의 융합 단백질을 연결하는 단일 벡터로 코딩되는 링커 중 하나 이상의 것이다. 특정 경우에, fmdv 링커 폴리펩티드는 폴리뉴클레오티드 오픈 리딩 프레임 (ORF) 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 일부 경우에, fmdv를 코딩하는 ORF는 서열번호: 272의 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다. 특정 실시양태에서, fmdv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 272와 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다.
특정 경우에, 링커 폴리펩티드는 "p2a" 링커일 수 있다. 특정 실시양태에서, p2a 폴리펩티드는 서열번호: 119와 적어도 약 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, p2a 링커 폴리펩티드는 2개 이상의 융합 단백질을 연결하는 단일 벡터로 코딩되는 링커 중 하나 이상의 것일 수 있다. 일부 경우에, p2a 링커 폴리펩티드는 폴리뉴클레오티드 오픈 리딩 프레임 (ORF) 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 특정 실시양태에서, p2a를 코딩하는 ORF는 서열번호: 266의 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다. 특정 경우에, p2a를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 266과 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일, 또는 약 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다.
일부 경우에, 링커 폴리펩티드는 "GSG-p2a" 링커일 수 있다. 특정 실시양태에서, GSG-p2a 링커 폴리펩티드는 서열번호: 120과 약 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, GSG-p2a 링커 폴리펩티드는 2개 이상의 융합 단백질을 연결하는 단일 벡터로 코딩되는 링커 중 하나 이상의 것일 수 있다. 일부 경우에, GSG-p2a 링커 폴리펩티드는 폴리뉴클레오티드 오픈 리딩 프레임 (ORF) 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. GSG p2a를 코딩하는 ORF는 서열번호: 267의 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, GSG-p2a를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 267과 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일, 또는 약 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다.
링커 폴리펩티드는 본원에 제공된 바와 같은 "fp2a" 링커일 수 있다. 특정 실시양태에서, fp2a 링커 폴리펩티드는 서열번호: 121과 약 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 특정 경우에, fp2a 링커 폴리펩티드는 2개 이상의 융합 단백질을 연결하는 단일 벡터로 코딩되는 링커 중 하나 이상의 것일 수 있다. 일부 경우에, fp2a 링커 폴리펩티드는 폴리뉴클레오티드 오픈 리딩 프레임 (ORF) 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 특정 실시양태에서, fp2a 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 268과 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일, 또는 약 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다.
일부 경우에, 링커는 조작될 수 있다. 예를 들어, 링커는 소수성과 같은 화학적 특징을 포함하도록 디자인될 수 있다. 일부 경우에, 적어도 2개의 링커 서열은 동일한 단백질을 생성시킬 수 있다. 서열은 서열번호: 116 내지 서열번호: 130의 서열과 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일, 또는 약 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 수 있다. 다른 경우에, 다중 링커가 벡터에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 관심 유전자, 및 하나 이상의 유전자 스위치 폴리펩티드 서열은 적어도 2개의 링커에 의해 분리될 수 있다. 일부 경우에, 유전자는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 최대 10개의 링커에 의해 분리될 수 있다.
링커는 조작될 수 있다. 링커의 디자인 방법은 컴퓨터에 의해 이루어질 수 있다. 일부의 경우에, 컴퓨터 방법은 그래픽 기법을 포함할 수 있다. 컴퓨터 방법을 사용하여 데이터베이스로부터 도출된 3차원 펩티드 구조의 라이브러리로부터 적합한 펩티드를 검색할 수 있다. 예를 들어, 브룩해븐 프로테인 데이터 뱅크(Brookhaven Protein Data Bank: PDB)를 사용하여 링커의 선택된 아미노산들 사이의 공간 거리를 목측할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 퓨린 폴리펩티드 및 2A 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 구축물을 코딩하며, 여기서, 퓨린 폴리펩티드 및 2A 폴리펩티드는 적어도 3개의 소수성 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 링커에 의해 연결된다. 일부의 경우에, 적어도 3개의 소수성 아미노산은 글리신 (Gly) (G), 알라닌 (Ala) (A), 발린 (Val) (V), 류신 (Leu) (L), 이소류신 (Ile) (I), 프롤린 (Pro) (P), 페닐알라닌 (Phe) (F), 메티오닌 (Met) (M), 트립토판 (Trp) (W)으로 구성된 목록으로부터 선택된다. 일부 경우에, 폴리펩티드 링커는 또한 하나 이상의 GS 링커 서열, 예를 들어, (GS)n (서열번호: 289), (SG)n (서열번호: 290), (GSG)n (서열번호: 291) 및 (SGSG)n (서열번호: 292) (여기서, n은 0 내지 15인 임의의 숫자일 수 있다)을 포함할 수 있다.
제1 기능성 폴리펩티드 및 제2 기능성 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 구축물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 여기서, 상기 제1 기능성 폴리펩티드 및 제2 기능성 폴리펩티드는 서열 APVKQ (서열번호: 293)와 적어도 60%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 링커 폴리펩티드에 의해 연결된 것인 단계; 및 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 발현 결과로, 서열 APVKQ (서열번호: 293)과 적어도 60%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 링커 폴리펩티드를 갖지 않는 상응하는 폴리펩티드 구축물과 비교하여 폴리펩티드 구축물의 발현이 개선되는 것인, 폴리펩티드 구축물의 개선된 발현을 수득하는 방법을 제공한다.
다른 경우에서, 링커는 IRES일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "내부 리보솜 진입 부위 (IRES)"라는 용어는 내부 리보솜 진입 부위를 의미하는 것으로 의도될 수 있다. IRES 서열을 포함하는 벡터에서, 제1 유전자는 그 자신의 5'-UTR에 의한 기전인 캡-의존성, 리보솜 스캐닝에 의해 번역될 수 있는 반면, 후속 유전자의 번역은 캡-비의존적인 방식으로 IRES로의 리보솜의 직접적인 동원에 의해 수행될 수 있다. IRES 서열은 진핵성 리보솜이 결합할 수 있게 하고, 5' 캡핑된 단부에의 결합 없이 번역을 시작할 수 있게 한다. IRES 서열은 하나의 전사체로부터 다중 유전자의 발현을 허용할 수 있다 (문헌 [Mountford and Smith 1995]).
예시적인 IRES 서열은 서열번호: 146 및 147에서 살펴볼 수 있다. 특정 경우에, 2xRbm3 IRES를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 146과 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일, 또는 약 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다. 특정 경우에, EMCV IRES를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 147과 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일, 또는 약 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다.
일부 실시양태는, 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 유전자 발현 카세트; 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 유전자 발현 카세트; 및 리간드를 포함하는 시스템으로서; 여기서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 (i) 전사활성화 도메인; (ii) DNA-결합 도메인; 및 (iii) 리간드 결합 도메인; (iv) CAR; (vi) 시토카인, 및/또는 (vii) 세포 태그 중 하나 이상의 것을 포함하고, 리간드의 존재하에서 숙주 세포와 제1 유전자 발현 카세트 및 제2 유전자 발현 카세트와의 접촉시, CAR 및 시토카인이 숙주 세포에서 발현되도록 하는 것인, 숙주 세포에서 CAR 및 시토카인의 발현을 조절하기 위한 시스템이다. 일부 경우에, CAR은 ROR-1 CAR이고, 시토카인은 mbIL-15이다. 일부 경우에, ROR-1CAR, mbIL-15는 한 세포 태그와 함께 공동 발현된다. 일부 경우에, ROR-1 CAR 및 mbIL-15는 각각 세포 태그와 함께 공동 발현된다. 다른 경우에, ROR-1 CAR은 세포 태그와 함께 발현되고, mbIL-15는 제2 세포 태그와 함께 발현된다. 유전자 발현 카세트의 예시적인 배열은 도 1 및 2에 도시되어 있다. 다른 경우에, CAR은 ROR-1 CAR이고, 시토카인은 IL-12이다. 일부 경우에, ROR-1CAR, IL-12는 한 세포 태그와 함께 공동 발현된다. 일부 경우에, ROR-1 CAR 및 IL-12는 각각 세포 태그와 함께 공동 발현된다. 다른 경우에, ROR-1 CAR은 세포 태그와 함께 발현되고, IL-12는 제2 세포 태그와 함께 발현된다.
일부 실시양태는, 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 유전자 발현 카세트; 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 유전자 발현 카세트; 및 리간드를 포함하는 시스템으로서; 여기서, 제1 폴리펩티드는 (i) 전사활성화 도메인; (ii) DNA-결합 도메인; 및 (iii) 리간드 결합 도메인 중 하나 이상의 것을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 (i) CAR; (ii) 시토카인, 및/또는 (iii) 세포 태그 중 하나 이상의 것을 포함하고, 리간드의 존재하에서 숙주 세포와 제1 유전자 발현 카세트 및 제2 유전자 발현 카세트와의 접촉시, CAR 및/또는 시토카인이 숙주 세포에서 발현되도록 하는 것인, 숙주 세포에서 CAR 및 시토카인의 발현을 조절하기 위한 시스템이다. 일부 경우에, CAR은 ROR-1 CAR이고, 시토카인은 mbIL-15이다. 일부 경우에, ROR-1 CAR 및 mbIL-15는 각각 세포 태그와 함께 공동 발현된다. 다른 경우에, ROR-1 CAR은 제1 세포 태그와 함께 발현되고, mbIL-15는 제2 세포 태그와 함께 발현된다.
숙주 세포에서 ROR-1 CAR 및 시토카인의 발현을 조절하기 위한 시스템의 예시적인 배열은 도 1a-1e 및 도 2a-2e에 도시되어 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 바이러스 또는 바이러스 기반 시스템을 사용하여 면역 이펙터 세포 내로 도입된다. 본원에 기술된 바와 같은 비-바이러스 기반 전달 시스템의 예로는 SB11 트랜스포존 시스템, SB100X 트랜스포존 시스템, SB110 트랜스포존 시스템, 피기백(piggyBac) 트랜스포존 시스템을 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 하나 이상의 슬리핑 뷰티 트랜스포존에서 면역 이펙터 세포 내로 도입된다.
ROR-1 CAR, 시토카인 (예컨대, mbIL-15 또는 IL-12) 및 세포 태그의 구성적 발현을 코딩하는 유전자 발현 카세트의 예시적인 실시양태가 도 1a-1e에 도시되어 있다. 도 1a-b는 다양한 배열의 ROR-1 CAR, mbIL-15 및 세포 태그에 대한 예시적인 유전자 발현 카세트 디자인을 도시한 것이다. 상기 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 한 슬리핑 뷰티 트랜스포존에서 면역 이펙터 세포 내로 도입된다. 도 1c-d는 ROR-1 CAR은 한 유전자 발현 카세트에 존재할 수 있고, mbIL-15 및 세포 태그는 제2 유전자 발현 카세트에 있는, 유전자 발현 카세트 배열을 도시한 것이다. 상기 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 하나 이상의 슬리핑 뷰티 트랜스포존에서 면역 이펙터 세포 내로 도입된다.
ROR-1 CAR, 시토카인 (예컨대, mbIL-15) 및/또는 세포 태그의 유도성 발현을 코딩하는 유전자 발현 카세트의 예시적인 실시양태가 도 2a-2e에 도시되어 있다. 도 2a-d는 유도성 프로모터의 제어하의, 다양한 배열의 ROR-1 CAR, mbIL-15 및 세포 태그에 대한 예시적인 유전자 발현 카세트 디자인을 도시한 것이다. 도 2e는 본원에 기술된 유전자 스위치 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 발현 카세트의 예시적인 실시양태이다. 상기 실시양태에서, 유전자 발현 카세트(들)는 하나 이상의 슬리핑 뷰티 트랜스포존에서 면역 이펙터 세포 내로 도입된다.
리간드
일부 실시양태에서, 유도성 유전자 스위치 조절을 위해 사용되는 리간드는 제한 없이, 하기: N-[(1R)-1-(1,1-디메틸에틸)부틸]-N'-(2-에틸-3-메톡시벤조일)-3,5-디메틸벤조히드라지드 (또한 벨레디멕스로도 지칭), (2S,3R,5R,9R,10R,13R,14S,17R)-17-[(2S,3R)-3,6-디히드록시-6-메틸헵탄-2-일]-2,3,14-트리히드록시-10,13-디메틸- 2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-6-온; N'-(3,5-디메틸벤조일)-N'-[(3R)-2,2-디메틸-3-헥사닐]-2-에틸-3-메톡시벤조히드라지드; 5-메틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르복실산 N'-(3,5-디메틸-벤조일)-N'-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-히드라지드; 5-메틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르복실산 N'-(3,5-디메톡시-4-메틸-벤조일)-N'-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-히드라지드; 5-메틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르복실산 N'-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라지드; 5-메틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르복실산 N'-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메톡시-4-메틸-벤조일)-히드라지드; 5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르복실산 N'-(3,5-디메틸-벤조일)-N'-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-히드라지드; 5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르복실산 N'-(3,5-디메톡시-4-메틸-벤조일)-N'-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-히드라지드; 5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르복실산 N'-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-히드라지드; 5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르복실산 N'-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메톡시-4-메틸-벤조일)-히드라지드; 3,5-디메틸-벤조산 N-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-히드라지드; 3,5-디메톡시-4-메틸-벤조산 N-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-히드라지드; 3,5-디메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-히드라지드; 3,5-디메톡시-4-메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-히드라지드; 3,5-디메틸-벤조산 N-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라지드; 3,5-디메톡시-4-메틸-벤조산 N-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라지드; 3,5-디메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라지드; 3,5-디메톡시-4-메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라지드; 2-메톡시-니코틴산 N-(1-tert-부틸-펜틸)-N'-(4-에틸-벤조일)-히드라지드; 3,5-디메틸-벤조산 N-(2,2-디메틸-1-페닐-프로필)-N'-(4-에틸-벤조일)-히드라지드; 3,5-디메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-펜틸)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-히드라지드; 및 3,5-디메톡시-4-메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-펜틸)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-히드라지드 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다.
일부 경우에, 엑디손 수용체-기반 유도성 유전자 스위치의 용량-조절 제어를 위해 사용되는 리간드는 제한 없이, 엑디스테로이드, 예컨대, 엑디손, 20-히드록시엑디손, 포나스테론 A, 무리스테론 A 등, 9-시스-레티노산, 레티노산의 합성 유사체, N,N'-디아실히드라진, 예컨대, 미국 특허 번호 6,013,836; 5,117,057; 5,530,028; 및 5,378,726, 및 미국 공개 출원 번호 2005/0209283 및 2006/0020146에 개시된 것; 미국 공개 출원 번호 2004/0171651에 기술된 옥사디아졸린; 디벤조일알킬 시아노히드라진, 예컨대, 유럽 출원 번호 461,809에 개시된 것; N-알킬-N,N'-디아로일히드라진, 예컨대, 미국 특허 번호 5,225,443에 개시된 것; N-아실-N-알킬카르보닐히드라진, 예컨대, 유럽 출원 번호 234,994에 개시된 것; N-아로일-N-알킬-N'-아로일히드라진, 예컨대, 미국 특허 번호 4,985,461에 기술된 것; 아르니도케톤, 예컨대, 미국 공개 출원 번호 2004/0049037에 기술된 것 (상기 출원들은 각각 본원에 참조로 포함된다) 및 3,5-디-tert-부틸-4-히드록시-N-이소부틸-벤즈아미드, 8-O-아세틸하르파지드, 옥시스테롤, 22(R) 히드록시콜레스테롤, 24(S) 히드록시콜레스테롤, 25-에폭시콜레스테롤, T0901317, 5-알파-6-알파-에폭시콜레스테롤-3-술페이트 (ECHS), 7-케토콜레스테롤-3-술페이트, 파르메솔, 담즙산, 1,1-비포스포네이트 에스테르, 유충 호르몬 III 등을 비롯한, 다른 유사 물질 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다. 본 개시내용에서 유용한 디아실히드라진 리간드의 예로는 RG-115819 (3,5-디메틸-벤조산 N-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-N'-(2-메틸-3-메톡시-벤조일)-히드라지드- ), RG-115932 ((R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라지드), 및 RG-115830 (3,5-디메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라지드)를 포함한다. 예컨대, 미국 특허 출원 시리얼 번호 12/155,111, 및 PCT 출원 번호 PCT/US2008/006757 (상기 두 출원 모두 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)을 참조한다.
비-바이러스 기반 전달 시스템
본 발명에 기술된 CAR을 코딩하는 핵산 또한 비-바이러스 기반 전달 시스템, 예컨대, "슬리핑 뷰티 (SB) 트랜스포존 시스템" (이는 DNA 서열을 척추동물의 염색체내에 도입시키기 위한 합성 DNA 트랜스포존 시스템을 지칭한다)을 사용하여 면역 이펙터 세포 내로 도입될 수 있다. 예시적인 SB 트랜스포존 시스템이 예를 들어, 미국 특허 번호 6,489,458 및 8,227,432에 기술되어 있다. 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템은 슬리핑 뷰티 (SB) 트랜스포사제 및 SB 트랜스포존(들)을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템은 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 폴리펩티드 뿐만 아니라, 활성을 보유하는 유도체, 변이체 및/또는 단편, 및 슬리핑 뷰티 트랜스포존 폴리뉴클레오티드, 활성을 보유하는 유도체, 변이체, 및/또는 단편을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제는 mRNA로서 제공된다. 일부 측면에서, mRNA는 SB10, SB11, SB100x 또는 SB110 트랜스포사제를 코딩한다. 일부 측면에서, mRNA는 캡 및 폴리-A 테일을 포함한다.
DNA 트랜스포존은 샘플 중 하나의 DNA 부위를 또 다른 부위로, 잘라 붙이기 방식으로 전위시킨다. 전위는 한정된 DNA 세그먼트를 하나의 DNA 분자로부터 절제하여 동일하거나 상이한 DNA 분자 또는 게놈 중의 또 다른 부위로 이동시키는 정밀한 프로세스이다. 다른 Tc1/마리너-유형 트랜스포사제와 같이, SB 트랜스포사제는 트랜스포존을 수용체 DNA 서열 중 TA 디뉴클레오티드 염기쌍 내로 삽입한다. 삽입 부위는 동일한 DNA 분자에 또는 또 다른 DNA 분자 (또는 염색체) 중의 다른 곳일 수 있다. 인간을 포함한 포유동물 게놈에서, 대략 2억 개의 TA 부위가 존재한다. TA 삽입 부위는 트랜스포존 통합 프로세스에서 배가된다. 상기 TA 서열의 배가는 전위의 특징이며, 일부 실험에서 상기 기전을 확인하는 데 사용된다. 트랜스포사제는 상기 트랜스포존 내에서 코딩되거나, 또는 또 다른 공급원에 의해 공급될 수 있으며, 이러한 경우, 트랜스포존은 비-자율적인 요소가 된다. 비-자율성 트랜스포존은 삽입 후 독립적으로 계속해서 절제 및 재-삽입을 할 수 없기 때문에, 유전학적 도구로서 가장 유용하다. SB 트랜스포존은 척추동물의 게놈내 유전자 도입 및 유전자 요법을 위한 비-바이러스 벡터로서 사용이 구상된다. 간략하면, 슬리핑 뷰티 (SB) 시스템 (문헌 [Hackett et al., Mol Ther 18:674-83, (2010)])은 면역 이펙터 세포를 유전적으로 변형시키기 위해 적합화되었다 (문헌 [Cooper et al., Blood 105:1622-31, (2005)]). 한 실시양태에서, 이는 2 단계: (i) SB 트랜스포존 [즉, T 세포 특이성을 재유도하기 위한 키메라 항원 수용체 (CAR) (문헌 [Jin et al., Gene Ther 18:849-56, (2011)]; [Kebriaei et al., Hum Gene Ther 23:444-50, (2012)]) 및 SB 트랜스포사제를 발현하는 DNA 플라스미드의 전기-전달 및 (ii) K562 세포주 (또한 AaPC (활성화 및 증식 세포)로도 공지)로부터 유래된 디자이너 인공 항원-제시 세포 (AaPC) 상에서 구성 요소를 안정하게 발현하는 T 세포의 증식 및 확대를 포함하였다. 또 다른 실시양태에서, 제2 단계 (ii)는 삭제되고, 유전적으로 변형된 T 세포는 저온보존되거나, 또는 환자 내로 즉시 주입된다.
한 실시양태에서, SB 트랜스포존 시스템은 예를 들어, 문헌 [Hudecek et al., Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 52:4, 355-380 (2017)], [Singh et al., Cancer Res (8):68 (2008). April 15, 2008] 및 [Maiti et al., J Immunother. 36(2): 112-123 (2013)] (상기 문헌들은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.
특정 실시양태에서, ROR-1 CAR 및 mbIL-15는 트랜스포존 DNA 플라스미드 벡터에서 코딩되고, SB 트랜스포사제는 별개의 벡터에서 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 ROR-1 CAR은 트랜스포존 DNA 플라스미드 벡터에서 코딩되고, mb-IL15는 제2 트랜스포존 DNA 플라스미드 벡터에서 코딩되고, SB 트랜스포사제는 제3 DNA 플라스미드 벡터에서 코딩된다. 일부 실시양태에서, CAR은 사멸 태그, 예를 들어, HER1t, HER1t1, CD20 또는 CD20t-1과 함께 코딩된다. 일부 실시양태에서, mbIL-15는 사멸 태그, 예를 들어, HER1t, HER1t1, CD20 또는 CD20t-1과 함께 코딩된다. ROR-1 CAR, 사멸 태그 및/또는 mbIL15의 예시적인 배열은 도 1에 도시되어 있다.
실시양태에서, ROR-1 CAR은 트랜스포존 DNA 플라스미드 벡터로부터 mbIL-15 및 세포 태그와 함께 공동 발현될 수 있다. 추가 실시양태에서, ROR-1 CAR은 유도성 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 또 다른 실시양태에서, mbIL-15는 유도성 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 한 측면에서, 유도성 프로모터는 유전자 스위치 리간드 유도성 프로모터일 수 있다. 일부 경우에, 유도성 프로모터는 소분자 리간드-유도성 2 폴리펩티드 엑디손 수용체-기반 유전자 스위치, 예컨대, 레오스위치® 유전자 스위치일 수 있다. 특정 실시양태에서, ROR-1 CAR, mbIL-15 및 사멸 태그는 하나, 2개 이상의 트랜스포존에 배열될 수 있다. 유도성 프로모터의 제어하의 ROR-1 CAR 또는 mbIL15의 예시적인 배열이 도 2에 도시되어 있다.
실시양태에서, ROR-1 CAR 및 다른 유전 요소는 SB11 트랜스포존 시스템, SB100X 트랜스포존 시스템, SB110 트랜스포존 시스템, 피기백 트랜스포존 시스템 (예컨대, 미국 특허 번호 9,228,180, 문헌 [Wilson et al, "PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells," Molecular Therapy 15:139-145 (2007)] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함) 참조)) 및/또는 피기배트(piggyBat) 트랜스포존 시스템 (예컨대, 문헌 [Mitra et al., "Functional characterization of piggyBat from the bat Myotis lucifugus unveils an active mammalian DNA transposon," Proc. Natl. Acad. Sci USA 110:234-239 (2013)] 참조)을 사용하여 세포로 전달된다. 추가의 트랜스포사제 및 트랜스포존 시스템은 미국 특허 번호 7,148,203; 8,227,432; 미국 특허 공개 번호 2011/0117072; 문헌 [Mates et al., Nat Genet, 41(6):753-61 (2009). doi: 10.1038/ng.343. Epub 2009 May 3], [Gene Ther., 18(9):849-56 (2011). doi: 10.1038/gt.2011.40. Epub 2011 Mar 31] 및 [Ivics et al., Cell. 91(4):501-10, (1997)](상기는 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 제공되어 있다.
다른 실시양태에서, ROR-1 CAR 및 다른 유전 요소, 예컨대, 시토카인, mbIL-15 및/또는 HER1t/HER1t1/CD20/CD20t-1 태그는 재조합효소 및 통합 발현 벡터를 통해 면역 이펙터 세포의 DNA 내로 통합될 수 있다. 상기 벡터는 숙주 세포의 DNA 내로 무작위로 통합될 수 있거나, 또는 발현 벡터와 숙주 세포 염색체 사이에 특이적인 재조합을 가능하게 하는 재조합 부위를 포함할 수 있다. 상기 통합 발현 벡터는 원하는 단백질의 발현을 수행하기 위해 숙주 세포 염색체의 내인성 발현 제어 서열을 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화된 통합은 통합 부위에 플랭킹된 서열에 상동성인 공여자 폴리뉴클레오티드 상의 서열의 존재에 의해 촉진된다. 예를 들어, 본원에 기술된 공여자 폴리뉴클레오티드를 사용하는 표적화된 통합은 통상적인 형질감염 기술, 예컨대, 상동성 재조합에 의한 유전자 넉아웃 또는 넉인의 생성에 사용되는 기술에 따라 달성될 수 있다. 다른 실시양태에서, 표적화된 통합은 통합 부위에 플랭킹된 서열에 상동성인 공여자 폴리뉴클레오티드 상의 서열의 존재에 의해, 및 부위-특이적 재조합효소의 존재하에서 세포를 공여자 폴리뉴클레오티드와 접촉시킴으로써 촉진된다. 부위-특이적 재조합효소, 또는 간단하게, 재조합효소란, 그의 양립성 재조합 부위 사이의 보존적 부위-특이적 재조합을 촉매화하는 폴리펩티드를 의미한다. 본원에서 사용되는 바, 부위-특이적 재조합효소는 천연 폴리펩티드 뿐만 아니라, 활성을 보유하는 유도체, 변이체 및/또는 단편, 및 천연 폴리뉴클레오티드, 활성을 유지하는 재조합효소를 코딩하는 유도체, 변이체, 및/또는 단편을 포함한다.
재조합효소는 표적화 벡터의 도입 이전에, 그와 동시에, 또는 그 이후에 표적 세포 내로 도입될 수 있다. 재조합효소는 단백질로서 예를 들어, 리포솜, 코팅된 입자, 또는 미세주사를 사용하여 세포 내로 직접 도입될 수 있다. 대안적으로, 재조합효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, DNA 또는 메신저 RNA가 적합한 발현 벡터를 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 기술된 표적화 벡터 성분은 관심 재조합효소를 코딩하는 서열을 함유하는 발현 카세트의 구축에 유용하다. 그러나, 재조합효소의 발현은 다른 방식으로, 예를 들어, 재조합효소의 발현을 조절가능한 프로모터 (즉, 발현이 선택적으로 유도되거나 억제될 수 있는 프로모터)의 제어하에 놓음으로써 조절될 수 있다.
재조합효소는 인테그라제 또는 레솔바제 패밀리로부터 유래할 수 있다. 재조합효소의 인테그라제 패밀리는 100개 초과의 구성원을 가지며, 예를 들어 FLP, Cre, 및 람다 인테그라제를 포함한다. 티로신 패밀리 또는 람다 인테그라제 패밀리로도 또한 지칭되는 인테그라제 패밀리는 DNA의 포스포디에스테르 결합에 대한 친핵성 공격을 위해 촉매성 티로신의 히드록실기를 사용한다. 전형적으로, 티로신 패밀리의 구성원들은 처음에 상기 DNA에 닉을 생성하고, 추후에 이중 가닥 파단을 형성한다. 티로신 패밀리 인테그라제의 예는 Cre, FLP, SSV1 및 람다(λ) 인테그라제를 포함한다. 세린 재조합효소 패밀리로도 또한 알려져 있는 레솔바제 패밀리에서, 보존된 세린 잔기는 DNA 표적 부위에 공유 연결을 형성한다 (문헌 [Grindley, et al., (2006) Ann Rev Biochem 16:16]).
한 실시양태에서, 재조합효소는 SPβc2 재조합효소, SF370.1 재조합효소, Bxb1 재조합효소, A118 재조합효소 및 ΦRv1 재조합효소로 구성된 군으로부터 선택되는 재조합효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열이다. 세린 재조합효소의 예는 미국 특허 번호 9,034,652 (상기 특허는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 상세히 기술되어 있다.
본 발명의 실시에 사용하기 위한 재조합효소는 재조합에 의해 제조되거나, 또는 앞서 기술된 바와 같이 정제될 수 있다. 원하는 재조합효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 단백질 황산암모늄 침전, 정제 분야에 공지된 방법, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 크기 분별, 친화성 크로마토그래피, HPLC, 이온 교환 크로마토그래피, 헤파린 아가로스 친화성 크로마토그래피 (예컨대, 문헌 [Thorpe & Smith, Proc. Nat. Acad. Sci. 95:5505-5510, 1998.])에 의해 원하는 정도의 순도로 정제될 수 있다.
한 실시양태에서, 재조합효소는 임의의 적합한 수단에 의해 재조합이 요구되는 재조합 부착 부위를 함유하는 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 기능성 단백질을 예컨대, 미세주사 또는 다른 방법에 의해 세포 내로 도입시키는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 정제된 재조합효소 단백질의 도입은 상기 단백질과 그의 기능의 일시적인 존재를 보장하며, 이는 종종 바람직한 실시양태이 된다. 대안적으로, 재조합효소를 코딩하는 유전자는 세포 형질전환에 사용되는 발현 벡터에 포함될 수 있으며, 여기서, 재조합효소-코딩 폴리뉴클레오티드는 진핵 세포에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 매개하는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 재조합효소 폴리펩티드는 또한 재조합효소 폴리펩티드를 코딩하는 메신저 RNA에 의해 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 일반적으로는 재조합효소는 변형되는 게놈 내로의 핵산 단편의 삽입이 필요한 시간에만 존재하는 것이 바람직하다. 따라서, 대부분의 발현 벡터와 관련된 성능 결여가 유해한 것으로 예상되지 않는다. 재조합효소 유전자를 관심 외인성 폴리뉴클레오티드의 도입 이전에, 그 후에, 또는 그와 동시에 세포내에 도입시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 재조합효소 유전자는 삽입하고자 하는 폴리뉴클레오티드를 보유하는 벡터내에 존재하며; 재조합효소 유전자는 심지어는 상기 폴리뉴클레오티드 내에 포함될 수 있다.
한 실시양태에서, 부위-특이적 재조합 방법은 제1 재조합 부위 및 제2 재조합 부위를 제공하는 단계; 제1 및 제2 재조합 부위를 원핵성 재조합효소 폴리펩티드와 접촉시켜 재조합 부위 사이의 재조합을 일으키는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 재조합효소 폴리펩티드는 제1 및 제2 재조합 부위 사이의 재조합을 매개할 수 있고, 상기 제1 재조합 부위는 attP 또는 attB이고, 상기 제2 재조합 부위는 attB 또는 attP이고, 재조합효소는 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 파지 재조합효소, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 파지 재조합효소, 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 파지 재조합효소, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 파지 재조합효소, 및 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) 파지 재조합효소로 구성된 군으로부터 선택되되, 단, 제1 재조합 부착 부위가 attB인 경우, 제2 재조합 부착 부위는 attP이고, 제1 재조합 부착 부위가 attP인 경우, 제2 재조합 부착 부위는 attB이다.
추가의 실시양태는 부위-특이적 재조합효소의, 게놈을 변형시키고자 하는 세포 내로의 도입을 제공한다. 한 실시양태는 진핵 세포에서 부위-특이적 재조합을 획득하기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 제1 재조합 부착 부위 및 제2 재조합 부착 부위를 포함하는 진핵 세포를 제공하는 단계; 제1 및 제2 재조합 부착 부위를 원핵성 재조합효소 폴리펩티드와 접촉시켜 재조합 부착 부위 사이의 재조합을 일으키는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 재조합효소 폴리펩티드는 제1 및 제2 재조합 부착 부위 사이의 재조합을 매개할 수 있고, 제1 재조합 부착 부위는 파지 게놈 재조합 부착 부위 (attP) 또는 박테리아 게놈 재조합 부착 부위 (attB)이고, 제2 재조합 부착 부위는 attB 또는 attP이고, 재조합효소는 리스테리아 모노사이토게네스 파지 재조합효소, 스트렙토코커스 피오게네스 파지 재조합효소, 바실러스 섭틸리스 파지 재조합효소, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 파지 재조합효소, 및 마이코박테리움 스메그마티스 파지 재조합효소 로 구성된 군으로부터 선택되되, 단, 제1 재조합 부착 부위가 attB일 때, 제2 재조합 부착 부위는 attP이고, 제1 재조합 부착 부위가 attP일 때, 제2 재조합 부착 부위는 attB이다. 한 실시양태에서, 재조합효소는 A118 재조합효소, SF370.1 재조합효소, SPβc2 재조합효소, ΦRv1 재조합효소, 및 Bxb1 재조합효소로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 재조합을 통해 통합이 이루어진다.
외인성 핵산의 숙주 세포 내로의 도입을 위해 사용되는 방법에는 상관 없이, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해 다양한 검정법이 수행될 수 있다. 상기 검정법은 예를 들어, 당업자에게 널리 공지된 "분자 생물학적" 검정법, 예컨대, 서던 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR; "생화학적" 검정법, 예컨대, 면역학적 수단 (ELISA 및 웨스턴 블럿) 또는 본 발명의 범주 내에 포함되는 펩티드 또는 단백질 또는 핵산을 식별하는, 본원에 기술된 검정법에 의한 특정 펩티드의 존재 또는 부재의 검출을 포함한다.
바이러스 기반 전달 시스템
본원에서는 또한 본 발명의 핵산이 삽입되는 바이러스 기반 전달 시스템을 제공한다. 대표적인 바이러스 발현 벡터로는 아데노바이러스 기반 벡터 (예컨대, 크루셀 인크.(Crucell, Inc.: 네덜란드 라이덴)로부터 이용가능한 아데노바이러스 기반 Per.C6 시스템), 렌티바이러스 기반 벡터 (예컨대, 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)로부터의 렌티바이러스 기반 pLPI) 및 레트로바이러스 벡터 (예컨대, pFB-ERV + pCFB-EGSH), 헤르페스 바이러스을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 예컨대, 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터가 트랜스진의 장기적이고, 안정한 통합 및 딸세포에서의 그의 증식을 허용하는 바, 이에, 장기간인 유전자 전달을 달성하는 데 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 비-증식성 세포, 예컨대, 간세포를 형질도입시킬 수 있다는 점에서, 뮤린 백혈병 바이러스와 같은 종양-레트로바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 추가의 이점을 갖는다. 이는 또한 면역원성이 낮다는 추가된 이점을 갖는다. 일반적으로, 및 실시양태에서, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능성인 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선별가능한 마커를 함유한다 (예컨대, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 번호 6,326,193).
실시양태에서, 백본, 및 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터로서, 여기서, CAR은 (a) ROR-1 항원 결합 도메인; (b) 스토크 도메인; (c) 막관통 도메인; (d) 4-1BB 또는 CD28, 또는 둘 다를 포함하는 공동자극성 신호전달 도메인; (e) CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는 것인 렌티바이러스 벡터를 제공한다. 임의적으로, 벡터는 말단절단된 표피 성장 인자 수용체 (HER1t 또는 HER1t1), CD20t-1 또는 전장의 CD20을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일부 경우에, 백본, 및 (1) 말단절단된 표피 성장 인자 수용체, 예를 들어, HER1t 또는 HERt-1 또는 그의 기능성 변이체; 및 (2) 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로서, 여기서, CAR은 (a) ROR-1 항원 결합 도메인; (b) 스페이서; (c) 막관통 도메인; (d) 4-1BB 또는 CD28, 또는 둘 다를 포함하는 공동자극성 신호전달 도메인; 및 (e) CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는 것인 벡터를 제공한다.
일부 경우에, 백본, 및 (1) 전장의 CD20, 말단절단된 CD20 또는 그의 기능성 변이체, 및 (2) 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로서, 여기서, CAR은 (a) ROR-1 항원 결합 도메인; (b) 스페이서; (c) 막관통 도메인; (d) 4-1BB 또는 CD28, 또는 둘 다를 포함하는 공동자극성 신호전달 도메인; 및 (e) CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는 것인 벡터를 제공한다.
실시양태에서, ROR-1 특이적 CAR을 코딩하는 핵산은 렌티바이러스 백본 성분을 포함하는 벡터로 클로닝된다. 예시적인 백본 성분으로는 pFUGW, 및 pSMPUW를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. pFUGW 렌티바이러스 벡터 백본은 자기-불활성화 (SIN) 렌티바이러스 벡터 백본이고, 불필요한 HIV-1 바이러스 서열은 제거되어 신생물 발생, 유해한 돌연변이, 감염성 입자 재생의 잠재성은 감소된다. 실시양태에서, ROR-1 CAR을 코딩하는 벡터는 또한 단일 구축물로 mbIL-15를 코딩한다. 실시양태에서, ROR-1 CAR 및 mbIL-15는 2개의 별개의 렌티바이러스 벡터 상에서 코딩된다. 일부 실시양태에서, mbIL-15는 말단절단된 표피 성장 인자 수용체 태그와 함께 발현된다. 실시양태에서, ROR-1 CAR은 단일 렌티바이러스 벡터로부터 mbIL-15 및 세포 태그와 함께 공동 발현될 수 있다. 추가 실시양태에서, ROR-1 CAR은 유도성 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 또 다른 실시양태에서, mbIL-15는 유도성 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 한 측면에서, 유도성 프로모터는 유전자 스위치 리간드 유도성 프로모터일 수 있다. 일부 경우에, 유도성 프로모터는 소분자 리간드-유도성 2 폴리펩티드 엑디손 수용체-기반 유전자 스위치, 예컨대, 레오스위치® 유전자 스위치일 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기술된 ROR-1 CAR은 항-ROR-1 scFv, 인간 CD8 힌지 및 막관통 도메인, 및 인간 4-1BB 및 CD3제타 신호전달 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 ROR-1 CAR은 항-ROR-1 scFv, 인간 CD8 힌지 및 막관통 도메인, 인간 4-1BB 및 CD3제타 신호전달 도메인 및 임의적으로, 말단절단된 표피 성장 인자 수용체 (HER1t 또는 HER1t-1) 태그를 포함한다. 다른 적합한 벡터는 숙주 세포의 DNA 내로 무작위로 통합될 수 있거나, 또는 발현 벡터와 숙주 세포 염색체 사이에 특이적인 재조합을 가능하게 하는 재조합 부위를 포함할 수 있는 통합 발현 벡터를 포함한다. 상기 통합 발현 벡터는 원하는 단백질의 발현을 수행하기 위해 숙주 세포 염색체의 내인성 발현 제어 서열을 사용할 수 있다. 부위 특이적인 방식으로 통합되는 벡터의 예는 예를 들어, 인비트로겐 (미국 캘리포니아주 칼즈배드)으로부터의 flp-in 시스템의 성분 (예컨대, pcDNA™5/FRT), 또는 스트라타진 (미국 캘리포니아주 라호야)으로부터의 pExchange-6 코어 벡터(pExchange-6 Core Vectors)에서 발견될 수 있는 것과 같은 cre-lox 시스템을 포함한다. 숙주 세포 염색체내로 무작위로 통합되는 벡터의 예로는 예를 들어, 인비트로겐 (미국 캘리포니아주 칼즈배드)으로부터의 pcDNA3.1 (T-항원 부재하에서 도입시), 및 프로메가(Promega) (미국 위스콘신주 매디슨)로부터의 pCI 또는 pFN10A (ACT) FLEXI™을 포함한다. 추가적인 프로모터 요소, 예컨대, 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 상기는 개시 부위의 30-110 bp 상류 영역에 위치하지만, 다수의 프로모터가 최근에 상기 개시 부위 하류의 기능성 요소들 또한 함유하는 것으로 나타났다. 프로모터 요소들 간의 거리는 흔히 유연적이며, 요소들이 서로 도치되거나 이동될 때 프로모터 기능이 보존된다. 티미딘 키나제 (tk) 프로모터에서, 프로모터 요소들 사이의 거리는 활성 감퇴가 시작되기 전에 50 bp까지 멀리 증가될 수 있다. 상기 프로모터에 따라, 개별적인 요소들은 협력하여 또는 독립적으로 기능하여 전사를 활성화시킬 수 있다.
적합한 프로모터의 일례는 전초기 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 서열이다. 상기 프로모터 서열은 상기에 작동적으로 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 높은 수준으로의 발현을 구동시킬 수 있는 강한 구성적 프로모터 서열이다.
적합한 프로모터의 또 다른 예는 인간 신장 성장 인자 1 알파 1 (hEF1a1)이다. 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR을 포함하는 벡터 구축물은 hEF1a1 기능성 변이체를 포함한다.
그러나, 시미안 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바 바이러스 초조기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터 뿐만 아니라, 인간 유전자 프로모터, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다른 구성적 프로모터 서열 또한 사용될 수 있다. 추가로, 본 발명은 구성적 프로모터의 사용으로 제한되어서는 안 된다. 유도성 프로모터가 또한 앞서 기술된 본 발명의 부분으로서 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 원하는 경우, 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현을 개시시키거나, 또는 발현을 원치않는 경우, 발현을 중단시키는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예로는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 한 측면에서, 유도성 프로모터는 유전자 스위치 리간드 유도성 프로모터일 수 있다. 일부 경우에, 유도성 프로모터는 소분자 리간드-유도성 2 폴리펩티드 엑디손 수용체-기반 유전자 스위치, 예컨대, 레오스위치® 유전자 스위치일 수 있다.
본원에 기술된 CAR 또는 그의 부분의 발현을 평가하기 위해서, 세포 내에 도입되는 발현 벡터는 또한 선별가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 모두를 함유하여, 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터를 통해 형질감염시키거나, 또는 감염시키고자 하는 세포의 집단으로부터 세포의 발현을 확인하고 선별하는 것을 용이하게 할 수 있다. 다른 측면에서, 선별가능한 마커는 별개의 DNA 조각 상에서 운반되며, 동시-형질감염 프로세스에 사용될 수 있다. 선별가능한 마커 및 리포터 유전자, 둘 모두 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 적합한 조절 서열과 플랭킹될 수 있다. 유용한 선별가능한 마커는 예를 들어, 항생제-내성 유전자, 예컨대, 네오마이신 내성 유전자 (neo) 및 암피실린 내성 유전자 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 말단절단된 표피 성장 인자 수용체 (HER1t 또는 HER1t-1) 태그가 선별가능한 마커 유전자로서 사용될 수 있다.
리포터 유전자가 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하고, 조절 서열의 기능성을 평가하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자는 일부 쉽게 검출 가능한 특성, 예컨재, 효소 활성에 의해 발현이 나타나는 폴리펩티드를 코딩하는, 수용체 유기체 또는 조직 중에 존재하지 않거나 발현되지 않는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포 내로 도입된 후 적합한 시점에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시페라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제를 코딩하는 유전자, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 포함할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Ui-Tei et al., FEBS Letters 479: 79-82 (2000)] 참조). 적합한 발현 시스템은 널리 공지되어 있으며, 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있거나, 또는 상업적으로 수득될 수 있다. 일반적으로, 최고 수준의 리포터 유전자 발현을 나타내는 최소 5' 플랭킹 영역을 갖는 구축물을 프로모터로서 식별한다. 상기 프로모터 영역을 리포터 유전자에 연결시킬 수 있고, 이를 사용하여 프로모터-구동된 전사를 조절하는 능력에 대해 작용제를 평가할 수 있다.
실시양태에서, 본원에 기술된 바이러스 벡터는 트랜스진의 발현을 구동하는 hEF1a1 프로모터, 전사를 증강시키는 소 성장 호르몬 폴리A 서열, 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE) 뿐만 아니라, pFUGW 플라스미드로부터 유래된 LTR 서열을 포함한다.
세포 내로의 유전자 도입 및 발현 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 발현 벡터와 관련하여, 벡터는 당업계의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예컨대, 포유동물, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포 내로 쉽게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포, 예를 들어, 면역 이펙터 세포 내로 도입시키기 위한 물리적 방법으로는 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주사, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포 제조 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001))]을 참조한다. 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입시키기 위한 방법은 인산칼슘 형질감염 또는 폴리에틸렌이민 (PEI) 형질감염이다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입시키기 위한 방법은 전기천공이다.
관심 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포, 예를 들어, 면역 이펙터 세포 내로 도입시키기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 포유동물, 예컨대, 인간 세포 내로 유전자를 삽입하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스 단순 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-관련된 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,350,674 및 5,585,362를 참조한다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입시키기 위한 화학적 수단은 콜로이드 분산 시스템, 예컨대, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드, 및 수중유 에멀젼을 비롯한 지질 기반 시스템, 미셀, 혼합 미셀, 및 리포솜을 포함한다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포솜 (예컨대, 인공 막 소포체)이다.
바이러스 전달 시스템이 사용되는 경우, 예시적인 전달 비히클은 리포솜이다. 핵산을 숙주 세포 내로 도입시키는 데 (시험관내, 생체외에서, 또는 생체내) 지질 제제가 사용될 수 있다. 또 다른 측면에서, 핵산이 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 핵산을 리포솜의 수성 내부에 캡슐화하거나, 리포솜의 지질 이중층내에 배치시키거나, 리포솜과 올리고뉴클레오티드 모두와 회합된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착시키거나, 리포솜 중에 포획시키거나, 리포솜과 복합체를 형성시키거나, 지질을 함유하는 용액 중에 분산시키거나, 지질과 혼합하거나, 지질과 조합시키거나, 지질 중 현탁액으로서 함유하거나, 미셀과 함께 함유하거나 상기와 복합체를 형성시키거나, 또는 다르게는 지질과 회합시킬 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 회합된 조성물은 용액 중 임의의 특정한 구축물로 제한되지 않는다. 예를 들어, 이는 이중층 구축물 중에, 미셀로서, 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 상기는 또한 간단히 용액 중에 산재되어, 가능하게는 크기나 모양이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 자연적으로 발생된 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질 중에 자연적으로 존재하는 지방 소적 뿐만 아니라, 장쇄 지방족 탄화수소 및 그의 유도체, 예컨대, 지방산, 알콜, 아민, 아미노 알콜 및 알데히드를 함유하는 화합물 부류를 포함한다.
사용하기에 적합한 지질을 상업적인 공급원으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린 ("DMPC")을 시그마(Sigma: 미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 수득할 수 있고; 디세틸 포스페이트 ("DCP")를 K&K 라보라토리즈(K & K Laboratories: 미국 뉴욕주 플레인뷰)로부터 수득할 수 있고; 콜레스테롤 ("Choi")을 칼바이오켐 베링(Calbiochem-Behring)으로부터 수득할 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤 ("DMPG") 및 다른 지질을 아반티 폴라 리피즈 인크.(Avanti Polar Lipids, Inc.: 미국 앨라바마주 버밍햄)로부터 수득할 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 중 지질의 스톡 용액을 약 -20℃에서 보관할 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 더 쉽게 증발되므로 클로로포름이 유일한 용매로서 사용된다. "리포솜"은 폐쇄형 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성되는 다양한 단일 및 다중층 지질 비히클을 포함하는 일반적인 용어이다. 리포솜은 인지질 이중층 막과 내부 수성 매질을 갖는 소포체 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 다중층 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다수의 지질층을 갖는다. 이는 인지질이 과량의 수용액 중에 분산될 때 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄형 구조 형성 전에 자기-재배열되고, 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질을 포획한다 (문헌 [Ghosh et al., Glycobiology 5: 505-10 (1991)]). 그러나, 일반 소포체 구조와 상이한 용액 중의 구조를 갖는 조성물도 또한 고려된다. 예를 들어, 지질은 미셀 구조를 띠거나, 또는 단지 지질 분자의 불균일 응집체로서 존재할 수 있다. 리포펙타민-핵산 복합체 또한 고려된다.
ROR -1 CAR 및 벡터를 포함하는 세포
본원에서는 본원에 기술된 CAR을 발현하는 조작된 세포를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 조작된 세포는 면역 이펙터 세포이다. 실시양태에서, 본원에서는 백본, 및 (1) 말단절단된 표피 성장 인자 수용체 (HER1t 또는 HER1t1) 및 (2) 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 면역 이펙터 세포로서, 여기서, CAR은 (a) ROR-1 항원 결합 도메인; (b) 스페이서; (c) 막관통 도메인; (d) 4-1BB 또는 CD28, 또는 둘 다를 포함하는 공동자극성 신호전달 도메인; 및 e) CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는 것인, 면역 이펙터 세포를 제공한다.
특정 실시양태에서, 면역 이펙터 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하고, 여기서, CAR은 (a) ROR-1 항원 결합 도메인; (b) 스페이서; (c) 막관통 도메인; (d) 4-1BB 또는 CD28, 또는 둘 다를 포함하는 공동자극성 신호전달 도메인; e) CD3 제타 신호전달 도메인; 및 (f) 말단절단된 표피 성장 인자 수용체 (HER1t 또는 HER1t1)를 포함한다.
실시양태에서, 본원에서는 (1) 사멸 스위치, 선택 마커, 바이오마커, 또는 그의 조합으로서 사용하기 위한 세포 태그, 및 (2) 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 이펙터 세포로서, 여기서, CAR은 (a) ROR-1 항원 결합 도메인; (b) 스페이서; (c) 막관통 도메인; (d) 4-1BB 또는 CD28, 또는 둘 다를 포함하는 공동자극성 신호전달 도메인; 및 (e) CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는 것인, 이펙터 세포를 제공한다. 실시양태에서, 세포 태그는 HER1t, HER1t1, CD20t-1 또는 CD20이다.
실시양태에서, 면역 이펙터 세포는 T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 및 조절 T 세포이다. 실시양태에서, ROR-1 항원 결합 도메인이 ROR-1에 결합할 때, 세포는 항-종양 활성을 나타낸다.
변형된 면역 이펙터 세포
본원에 기술된 하나 이상의 이종성 유전자 또는 폴리펩티드를 발현하도록 변형된 면역 이펙터 세포를 제공한다. 본원에 기술된 ROR-1 CAR 및 HER1t, HER1t1, CD20 및 CD20t-1 태그 중 적어도 하나를 발현하도록 변형된 면역 이펙터 세포를 제공한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 ROR-1 CAR, mbIL-15 및 HER1t, HER1t1, CD20 및 CD20t-1 태그 중 적어도 하나를 발현하도록 변형된 면역 이펙터 세포를 제공한다.
본원에서 사용되는 바, "T 세포" 또는 "T 림프구"는 세포-매개 면역에서 중요한 역할을 하는 림프구의 한 유형이다. 이는 세포 표면상의 T 세포 수용체(TCR)의 존재에 의해, 다른 림프구, 예컨대, B 세포 및 자연 살해 세포 (NK 세포)와 구별될 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 면역 이펙터 세포는 T 세포 및/또는 자연 살해 세포를 포함하는 변형된 면역 세포이다. T 세포 또는 T 림프구는 세포-매개 면역에 관여하는 백혈구의 서브타입이다. 예시적인 T 세포로는 T 헬퍼 세포, 세포독성 T 세포, TH17 세포, 줄기 기억 T 세포 (TSCM), 나이브 T 세포, 기억 T 세포, 이펙터 T 세포, 조절 T 세포, 또는 자연 살해 T 세포를 포함한다.
T 헬퍼 세포 (TH 세포)는 B 세포의 형질 세포 및 기억 B 세포로의 성숙화, 및 세포독성 T 세포 및 대식세포의 활성화를 비롯한, 면역학적 프로세스에서 다른 백혈구를 지원한다. 일부 경우에, TH 세포는 세포 표면상의 CD4 당단백질의 발현으로 인해 CD4+ T 세포로서 공지된다. 헬퍼 T 세포는, 항원-제시 세포 (APC)의 표면상에서 발현되는 MHC 클래스 II 분자에 의해 펩티드 항원과 함께 제시될 때 활성화된다. 일단 활성화되면, 빠르게 분열하며, 활성 면역 반응을 조절하거나 지원하는 시토카인으로 불리는 작은 단백질을 분비한다. 상기 세포는 TH1, TH2, TH3, TH17, Th9, 또는 TFH (상이한 유형의 면역 반응을 촉진하기 위해 상이한 시토카인을 분비한다)를 비롯한, 여러 서브타입 중 하나로 분화될 수 있다. APC로부터의 신호전달은 T 세포를 특정 서브타입으로 유도한다.
세포독성 T 세포 (TC 세포 또는 CTL)는 바이러스-감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하고, 이식 거부에도 또한 관련된다. 상기 세포는 또한 그의 표면상에서 CD8 당단백질을 발현하므로 CD8+ T 세포로서 공지된다. 상기 세포는 모든 유핵 세포의 표면상에 존재하는 MHC 클래스 I 분자와 회합된 항원에 결합함으로써 그의 표적을 인식한다. IL-10, 아데노신, 및 조절 T 세포에 의해 분비된 다른 분자를 통해, 상기 CD8+ 세포는 아네르기 상태로 불활성화되어 자가면역 질병을 예방한다.
기억 T 세포는 감염 해소 후 장기간 지속되는 항원-특이적 T 세포의 서브세트이다. 이는 그의 동족 항원에의 재-노출시 빠르게 다수의 이펙터 T 세포로 확장되고, 이로써, 과거 감염에 대한 "기억"을 면역계에 제공한다. 기억 T 세포는 서브타입: 줄기 기억 T 세포 (TSCM), 중추 기억 T 세포 (TCM 세포) 및 2가지 유형의 이펙터 기억 T 세포 (TEM 세포 및 TEMRA 세포)를 포함한다. 기억 세포는 CD4+ 또는 CD8+일 수 있다. 기억 T 세포는 세포 표면 단백질 CD45RO, CD45RA 및/또는 CCR7을 발현할 수 있다.
이전에는 억제인자 T 세포로 공지되었던, 조절 T 세포 (Treg 세포)는 면역 관용의 유지에서 역할을 한다. 그의 주요 역할은 T 세포-매개 면역을 면역 반응이 끝나도록 멈추게 하고, 흉선에서 음의 선택 프로세스를 회피한 자가반응성 T 세포를 억제하는 것이다.
자연 살해 T 세포 (NKT 세포)는 적응 면역계를 선천 면역계와 연결한다. 주조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 의해 제시된 펩티드 항원을 인식하는 통상적인 T 세포와 달리, NKT 세포는 CD1d로 불리는 분자에 의해 제시되는 당지질 항원을 인식한다. 상기 세포는 일단 활성화되고 나면, Th (T 헬퍼) 및 Tc (세포독성 T) 세포 둘 모두에 주어진 기능 (즉, 시토카인 생산 및 세포용해/세포 사멸 분자의 방출)을 수행할 수 있다. 이는 또한 일부 종양 세포 및 헤르페스 바이러스로 감염된 세포를 인식하고, 제거할 수 있다.
자연 살해 (NK) 세포는 선천 면역계의 세포독성 림프구의 한 유형이다. 일부 경우에, NK 세포는 바이러스 감염 및/또는 종양 형성에 대한 제1선 방어를 제공한다. NK 세포는 감염된 세포 또는 암성 세포 상에 제시된 MHC를 검출하여, 시토카인 방출을 촉발하고, 이어서, 용해 및 아폽토시스를 유도한다. NK 세포는 항체 및/또는 MHC의 부재하에서 스트레스를 받은 세포를 추가로 검출하고, 이에 의해 빠른 면역 반응을 허용할 수 있다.
변형된 면역 이펙터 세포 용량
일부 실시양태에서, 일정량의 변형된 면역 이펙터 세포가 그를 필요로 하는 대상체에게 투여되고, 상기 양은 효능 및 시토카인 연관된 독성을 유도하는 잠재성에 기초하여 결정된다. 일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포의 양은 약 102 내지 약 109 변형된 면역 이펙터 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포의 양은 약 103 내지 약 109 변형된 면역 이펙터 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포의 양은 약 104 내지 약 109 변형된 면역 이펙터 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포의 양은 약 105 내지 약 109 변형된 면역 이펙터 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포의 양은 약 105 내지 약 108 변형된 면역 이펙터 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포의 양은 약 105 내지 약 107 변형된 면역 이펙터 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포의 양은 약 106 내지 약 109 변형된 면역 이펙터 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포의 양은 약 106 내지 약 108 변형된 면역 이펙터 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포의 양은 약 107 내지 약 109 변형된 면역 이펙터 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포의 양은 약 105 내지 약 106 변형된 면역 이펙터 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포의 양은 약 106 내지 약 107 변형된 면역 이펙터 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포의 양은 약 107 내지 약 108 변형된 면역 이펙터 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포의 양은 약 108 내지 약 109 변형된 면역 이펙터 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포의 양은 약 109 변형된 면역 이펙터 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포의 양은 약 108 변형된 면역 이펙터 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포의 양은 약 107 변형된 면역 이펙터 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포의 양은 약 106 변형된 면역 이펙터 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포의 양은 약 105 변형된 면역 이펙터 세포/kg을 포함한다.
일부 실시양태는 ROR-1-특이적 CAR-T 세포인 CAR-T 세포이다. 일부 경우에, ROR-1-특이적 CAR-T 세포의 양은 약 102 내지 약 109 CAR-T 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, ROR-1-특이적 CAR-T 세포의 양은 약 103 내지 약 109 CAR-T 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, ROR-1-특이적 CAR-T 세포의 양은 약 104 내지 약 109 CAR-T 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, ROR-1-특이적 CAR-T 세포의 양은 약 105 내지 약 109 CAR-T 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, ROR-1-특이적 CAR-T 세포의 양은 약 105 내지 약 108 CAR-T 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, ROR-1-특이적 CAR-T 세포의 양은 약 105 내지 약 107 CAR-T 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, ROR-1-특이적 CAR-T 세포의 양은 약 106 내지 약 109 CAR-T 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, ROR-1-특이적 CAR-T 세포의 양은 약 106 내지 약 108 CAR-T 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, ROR-1-특이적 CAR-T 세포의 양은 약 107 내지 약 109 CAR-T 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, ROR-1-특이적 CAR-T 세포의 양은 약 105 내지 약 106 CAR-T 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, ROR-1-특이적 CAR-T 세포의 양은 약 106 내지 약 107 CAR-T 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, ROR-1-특이적 CAR-T 세포의 양은 약 107 내지 약 108 CAR-T 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, ROR-1-특이적 CAR-T 세포의 양은 약 108 내지 약 109 CAR-T 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, ROR-1-특이적 CAR-T 세포의 양은 약 109 CAR-T 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, ROR-1-특이적 CAR-T 세포의 양은 약 108 CAR-T 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, ROR-1-특이적 CAR-T 세포의 양은 약 107 CAR-T 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, ROR-1-특이적 CAR-T 세포의 양은 약 106 CAR-T 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, ROR-1-특이적 CAR-T 세포의 양은 약 105 CAR-T 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, ROR-1-특이적 CAR-T 세포의 양은 약 104 CAR-T 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, ROR-1-특이적 CAR-T 세포의 양은 약 103 CAR-T 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, ROR-1-특이적 CAR-T 세포의 양은 약 102 CAR-T 세포/kg을 포함한다.
면역 이펙터 세포 공급원
특정 측면에서, 본원에 기술된 실시양태는 CAR을 코딩하는 DNA (또는 RNA) 구축물을 함유하는 발현 벡터로 세포를 형질감염시킨 후, 임의적으로, 상기 세포를 피더 세포, 재조합 항원, 또는 수용체에 대한 항체로 자극하여 세포를 증식시키는 것을 포함하는, 항원-특이성 재유도된 면역 이펙터 세포 (예컨대, T 세포, Treg, NK-세포 또는 NK T 세포를 제조 및/또는 확장시키는 방법을 포함한다. 특정 측면에서, CAR을 발현하도록 조작된 세포 (또는 세포 집단)는 줄기 세포, iPS 세포, iPS 세포로부터 분화된 T 세포, 면역 이펙터 세포 또는 상기 세포의 전구체이다.
면역 이펙터 세포의 공급원은 동종이계 및 자기유래 공급원 둘 모두를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 면역 이펙터 세포는 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 분화될 수 있다. 따라서, 상기 실시양태에 따라 조작하기 위한 세포는 제대혈, 말초 혈액, 인간 배아 줄기 세포, 또는 iPSC로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 동종이계 T 세포는 키메라 항원 수용체를 포함하도록 (및 임의적으로, 기능성 TCR이 결여되도록) 변형될 수 있다. 일부 측면에서, 면역 이펙터 세포는 1차 인간 T 세포, 예컨대, 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 유래된 T 세포이다. PBMC를 말초 혈액으로부터, 또는 골수로부터 G-CSF (과립구 콜로니 자극 인자)로 자극 후에, 또는 제대혈로부터 수집할 수 있다. 한 측면에서, 면역 이펙터 세포는 범용(Pan) T 세포이다. (예컨대, CAR 발현 구축물을 이용한) 형질감염 또는 형질도입 후, 세포를 즉시 주입하거나, 또는 저온-보존할 수 있다. 특정 측면에서, 형질감염 또는 형질도입 후, 세포를 주입 준비가 될 때까지 IL-2 및/또는 IL-21을 포함할 수 있는 시토카인 배쓰 중에서 보존할 수 있다. 특정 측면에서, 형질감염 후, 세포 내로의 유전자 전달 후, 약 1, 2, 3, 4, 5일 또는 그 초과의 기간 이내에 벌크 집단으로서 생체외에서 수 일, 수 주 또는 수 개월 동안 증식시킬 수 있다. 추가 측면에서, 형질감염 후, 형질감염체를 클로닝하고, 단일의 통합된 또는 에피솜에 의해 유지된 발현 카세트 또는 플라스미드의 존재, 또는 키메라 항원 수용체의 발현을 입증하는 클론을 생체외에서 확장시킨다. 확장을 위해 선택된 클론은 항원-발현 표적 세포를 특이적으로 인식하고, 용해하는 능력을 나타낸다. 재조합 T 세포를 IL-2, 또는 공통의 감마-쇄와 결합하는 다른 시토카인 (예컨대, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21 등)에 의한 자극에 의해 확장시킬 수 있다. 재조합 T 세포를 인공 항원 제시 세포에 의한 자극에 의해 확장시킬 수도 있다. 재조합 T 세포를 인공 항원 제시 세포 상에서, 또는 상기 T 세포 표면 상에 CD3를 교차 결합시키는 항체, 예컨대, OKT3으로 확장시킬 수 있다. 재조합 T 세포의 서브세트르 자기 비드 기반 단리 방법 및/또는 형광 활성화된 세포 분류 기술의 사용으로 추가로 선택하고, AaPC와 추가로 배양할 수 있다. 추가 측면에서, 유전적으로 변형된 세포를 저온보존할 수 있다.
T 세포는 또한 다수의 공급원, 예를 들어, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직, 및 종양으로부터 수득할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 당업계에서 이용가능한 임의의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, T 세포는 숙련가에게 공지된 임의의 수의 기술, 예컨대, 피콜(Ficoll)® 분리를 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 실시양태에서, 개체의 순환 혈액으로부터 세포를 성분채집술에 의해 수득한다. 성분채집술 생성물은 전형적으로 T 세포를 포함한 림프구, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 함유한다. 한 실시양태에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획을 제거하고, 세포를 후속 프로세싱 단계를 위해 적절한 완충제 또는 배지 중에 놓을 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 세포를 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS)로 세척한다. 대안적 실시양태에서, 세척액은 칼슘을 함유하지 않고, 마그네슘을 함유하지 않을 수 있거나, 또는 전부는 아니더라도 다수의 2가 양이온을 함유하지 않을 수 있다. 칼슘의 부재하에서 초기 활성화 단계는 확장된 활성화를 유도한다. 당업계의 숙련가들이 쉽게 이해하는 바와 같이, 세척 단계는 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예컨대, 제조사의 설명서에 따라 반-자동 "유체 통과" 원심분리기 (예를 들어, 코베(Cobe) 2991 세포 프로세서, 박스터 사이토메이트(Baxter CytoMate) 또는 헤모네틱스 셀 세이버(Haemonetics Cell Saver) 5)를 사용하여 수행될 수 있다. 세척 후, 세포를 다양한 생체적합성 완충제, 예컨대, 예를 들어, Ca2 +-무함유, Mg2 +-무함유 PBS, 플라스마라이트(PlasmaLyte) A, 또는 완충제를 함유 또는 함유하지 않는 다른 염수 용액 중에 재현탁시킬 수 있다. 대안적으로, 성분채집술 샘플의 바람직하지 못한 성분을 제거하고, 세포를 배양 배지에 직접 재현탁시킬 수 있다.
또 다른 실시양태에서, T 세포를, 적혈구를 용해시키고, 단핵구를 예를 들어, 퍼콜(PERCOLL)® 구배를 통한 원심분리에 의해, 또는 역류 원심분리 세정에 의해 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리시킨다. T 세포의 특정 하위집단, 예컨대, CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+ T 세포를 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, CD14+ 세포를 T 세포 집단으로부터 고갈시킨다. 예를 들어, 한 실시양태에서, T 세포를 항-CD3/항-CD28 (즉, 3x28)-접합된 비드, 예컨대, 다이나비즈(DYNABEADS)® M-450 CD3/CD28 T와 함께, 원하는 T 세포의 양성 선택에 충분한 기간 동안 배양함으로써 단리시킨다. 한 실시양태에서, 기간은 약 30분이다. 추가 실시양태에서, 기간은 30분 내지 36시간 또는 그 초과의 기간 및 그 사이의 모든 정수 값의 범위이다. 추가 실시양태에서, 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6시간이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 기간은 10 내지 24시간이다. 한 실시양태에서, 인큐베이션 기간은 24시간이다. 백혈병 환자로부터 T 세포를 단리시키기 위해, 더욱 긴 인큐베이션 시간, 예컨대, 24시간의 사용은 세포 수율을 증가시킬 수 있다. 더욱 긴 인큐베이션 시간을 사용하여, 종양 조직으로부터 또는 면역이 손상된 개체로부터 종양 침윤성 림프구 (TIL)를 단리시키는 것과 같이, 다른 세포 유형에 비해 T 세포가 적은 임의의 상황하에서 T 세포를 단리시킬 수 있다. 추가로, 더욱 긴 인큐베이션 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 간단하게는 T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합할 수 있도록 하는 시간을 단축시키거나, 연장시킴으로써, 및/또는 비드 대 T 세포의 비를 증가시키거나 감소시킴으로써 (본원에서 추가로 기술된 바와 같이) T 세포의 하위집단을 배양 개시시에 또는 상기 프로세스 중 다른 시점에서 우선적으로 선택할 수 있다. 추가로, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비를 증가시키거나 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단을 배양 개시시에 또는 다른 원하는 시점에서 우선적으로 선택할 수 있다. 당업자는 본 발명과 관련하여 수회 라운드의 선택 또한 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 특정 실시양태에서, 선택 과정을 수행하고, 활성화 및 확장 프로세스에서 "선택되지 않은" 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "선택되지 않은" 세포에 대해서 또한 추가 라운드의 선택이 수행될 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 농축은 음성적으로 선택된 세포 고유의 표면 마커에 대한 항체의 조합으로 수행될 수 있다. 한 가지 방법은 음성적으로 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 모노클로날 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유세포 분석법을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 농축시키기 위해서, 모노클로날 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 전형적으로 CD4+, CD25+, CD62L고, GITR+, 및 FoxP3+을 발현하는 조절 T 세포를 농축시키거나, 또는 상기 세포를 양성적으로 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 특정 실시양태에서, T 조절 세포를 항-CD25 접합된 비드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 고갈시킨다.
양성 또는 음성 선택에 의한 원하는 세포 집단의 단리를 위해서, 세포 및 표면 (예컨대, 입자, 예컨대, 비드)의 농도를 변화시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 비드 및 세포를 함께 혼합되는 부피를 현저하게 감소시켜 (즉, 세포의 농도를 증가시켜) 확실하게 세포와 비드가 최대로 접촉할 수 있도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 20억 세포/ml의 농도가 사용된다. 한 실시양태에서, 10억 세포/ml의 농도가 사용된다. 추가 실시양태에서, 100 x 106 세포/ml 초과가 사용된다. 추가 실시양태에서, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 x 106 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 x 106 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가 실시양태에서, 125 또는 150 x 106 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 사용함으로써 세포 수율 증가, 세포 활성화, 및 세포 확장을 일으킬 수 있다. 추가로, 높은 세포 농도를 사용함으로써 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포, 예컨대, CD28-음성 T 세포, 또는 다수의 종양 세포가 존재하는 샘플 (즉, 백혈병, 종양 조직 등)로부터 세포를 보다 효율적으로 포획할 수 있다. 상기 세포 집단은 치료학적 가치를 가질 수 있으며, 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 고농도 세포를 사용함으로써 보통 더 약한 CD28 발현을 보이는 CD8+ T 세포를 더욱 효율적으로 선택할 수 있다.
관련된 실시양태에서, 더 낮은 농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수도 있다. T 세포 및 표면 (예컨대, 입자, 예컨대, 비드)의 혼합물을 현저하게 희석함으로써, 입자와 세포간의 상호작용을 최소화한다. 이는 상기 입자에 결합되는 다량의 원하는 항원을 발현하는 세포를 선택한다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 더 높은 수준의 CD28을 발현하고, 희석 농도의 CD8+ T 세포보다 더 효율적으로 포획된다. 한 실시양태에서, 사용되는 세포의 농도는 5x106/ml이다. 다른 실시양태에서, 사용되는 농도는 약 1x105/ml 내지 1x106/ml, 및 그 사이의 임의의 정수 값일 수 있다.
다른 실시양태에서, 세포를 2 내지 10℃ 또는 실온에서 가변 속도로 다양한 길이의 시간 동안 회전기상에서 인큐베이션시킬 수 있다.
자극을 위한 T 세포를 또한 세척 단계 후에 동결시킬 수 있다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후에, 세포를 동결액 중에 현탁시킬 수 있다. 다수의 동결액 및 파라미터가 당업계에 공지되어 있고, 이와 관련하여 유용하겠지만, 한 가지 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% 플라스마라이트(Plasmalyte)-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO를 함유하는 배양 배지, 또는 예를 들어, 헤스판(Hespan) 및 플라스마라이트 A를 함유하는 다른 적합한 세포 동결 배지의 사용을 포함하고, 이어서, 세포를 -80℃에서 1°/분의 속도로 동결시키고, 액체질소 보관 탱크의 증기상 중에서 보관한다. 다른 제어식 동결 방법 뿐만 아니라, -20℃에서 또는 액체 질소 중에서 즉시 비제어된 방식으로 동결시키는 방법도 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 저온보존된 세포를 본원에 기술된 바와 같이해동하고, 세척하고, 본 발명의 방법을 사용하여 활성화 이전에 실온에서 1시간 동안 휴지시킨다.
또한, 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같이 확장된 세포가 필요할 수 있는 시점 이전의 기간에 대상체로부터 유래된 혈액 샘플 또는 성분채집술 생성물의 수집물을 제공한다. 따라서, 확장시키고자 하는 세포의 공급원을 임의의 필요한 시점에 수집하고, 원하는 세포, 예컨대, T 세포를, T 세포 요법이 이득이 되는 임의의 수의 질환 또는 병태, 예컨대, 본원에 기술된 것에 대한 T 세포 요법에서 추후에 사용하기 위해 단리 및 동결시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 혈액 샘플 또는 성분채집술을 일반적으로 건강한 대상체로부터 취한다. 특정 실시양태에서, 혈액 샘플 또는 성분채집술을, 질환의 발생 위험이 있지만, 아직 질환이 발생하지 않은 일반적으로 건강한 대상체로부터 취하고, 관심 세포를 추후 사용을 위해 단리 및 동결시킨다. 특정 실시양태에서, T 세포를 확장시키고, 동결시키고, 추후에 사용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 샘플을 본원에 기술된 바와 같은 특정 질환의 진단 직후이되, 임의의 치료 이전에, 환자로부터 수집한다. 추가 실시양태에서, 세포를, 작용제, 예컨대, 나탈리주맙, 에팔리주맙, 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역제거제, 예컨대, CAMPATH, 항-CD3 항체, 사이톡산, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 및 방사선조사를 이용한 치료 이전에 대상체로부터의 혈액 샘플 또는 성분채집술로부터 단리시킨다. 이들 약물은 칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린을 억제하거나 (사이클로스포린 및 FK506), 또는 성장인자 유도된 신호전달에 중요한 p70S6 키나제를 억제한다 (라파마이신) (문헌 [Liu et al., Cell 66:807-815, (1991)]; [Henderson et al., Immun 73:316-321, (1991)]; [Bierer et al., Curr. Opin. Immun 5:763-773, (1993)]). 추가 실시양태에서, 세포를 환자에 대해 단리시키고, 골수 또는 줄기 세포 이식, 화학요법제, 예컨대, 플루다라빈을 사용하는 T 세포 절제 요법, 외부-광선 방사선 요법 (XRT), 사이클로포스파미드, 또는 항체, 예컨대, OKT3 또는 CAMPATH와 함께 (예컨대, 그 이전에, 그와 동시에 또는 그 이후에) 추후 사용을 위해 동결시킨다. 또 다른 실시양태에서, 세포를 CD20과 반응하는 작용제, 예컨대, 리툭산과 같은 B 세포 절제 요법 이후의 치료를 위해 그 이전에 단리시키고, 추후 사용을 위해 동결시킬 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에서, T 세포를 치료 직후 환자로부터 수득한다. 이와 관련하여, 특정 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물에 의한 치료에 이어서, 치료 직후에, 환자가 상기 치료로부터 정상적으로 회복 중인 기간 동안, 수득된 T 세포의 질은 최적이거나, 또는 생체외에서 확장되는 그의 능력이 개선될 수 있는 것으로 관찰되었다. 유사하게, 본원에 기술된 방법을 사용하는 생체외 조작에 이어서, 상기 세포는 증대된 생착 및 생체내 확장에 바람직한 상태로 있을 수 있다. 따라서, 본 발명의 맥락 내에서 T 세포, 수지상 세포, 또는 조혈 계통의 다른 세포를 비롯한 혈액 세포를 상기 회복기 동안 수집하는 것이 고려된다. 추가로, 특정 실시양태에서, 동원 (예컨대, GM-CSF에 의한 동원) 및 조건부 요법을 사용하여 특정 세포 유형의 재증식, 재순환, 재생 및/또는 확장이 바람직한 대상체에서, 특히 요법 후 한정된 시간창 동안 조건을 생성할 수 있다. 예시적인 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 및 면역계의 다른 세포를 포함한다.
T 세포의 활성화 및 확장
본원에 기술된 CAR을 발현하도록 T 세포를 조작하기 전이든, 또는 그 이후이든 상관 없이, T 세포는 일반적으로 예를 들어, 미국 특허 번호 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 미국 특허 출원 공개 번호 20060121005에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화 및 확장될 수 있다.
일반적으로, 본원에 기술된 T 세포를, T 세포가 부착되어 있는 표면과 CD3/TCR 복합체 연관 신호를 자극하는 작용제 및 상기 T 세포 표면 상의 공동자극성 분자를 자극하는 리간드를 접촉시킴으로써 확장시킨다. 특히, T 세포 집단을, 예컨대, 항-CD3 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 표면 상에 고정화된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해 또는 칼슘 이온운반체와 함께 단백질 키나제 C 활성제(예컨대, 브리오스타틴)과의 접촉에 의해 본 명세서에 기술된 바와 같이 자극시킬 수 있다. 상기 T 세포 표면 상의 보조 분자의 공동 자극을 위해서, 보조 분자에 결합하는 리간드를 사용한다. 예를 들어, T 세포의 집단을 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건하에서, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉시킬 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위해서, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28 (디아클론(Diaclone: 프랑스 브장송))을 포함하며, 당업계에 통상적으로 공지된 다른 방법들과 같이 사용할 수 있다 (문헌 [Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, (1998)]; [Haanen et al., J. Exp. Med . 190(9):13191328, (1999)]; [Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, (1999)]).
특정 실시양태에서, T 세포에 대한 1차 자극 신호 및 공동자극성 신호를 상이한 프로토콜에 의해 제공할 수 있다. 예를 들어, 각각의 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 있거나, 표면에 커플링될 수 있다. 표면에 커플링되는 경우, 작용제를 동일한 표면에 (즉, "시스" 형태로) 또는 별개의 표면에 (즉, "트랜스" 형태로) 커플링시킬 수 있다. 대안적으로, 한 작용제는 표면에 커플링되고, 다른 작용제는 용액 중에 있을 수 있다. 한 실시양태에서, 공동자극성 신호를 제공하는 작용제는 세포 표면에 결합되고, 1차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 있거나, 표면에 커플링된다. 특정 실시양태에서, 두 작용제 모두 용액 중에 있을 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 작용제들은 가용성 형태로 존재하고, 이어서 표면, 예컨대, Fc 수용체를 발현하는 세포 또는 작용제에 결합하는 항체 또는 다른 결합제에 가교결합될 수 있다. 이와 관련하여, 예를 들어, 본 발명의 T 세포를 활성화시키고, 확장시키는 데 사용이 고려되는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)에 대해서 미국 특허 출원 공개 번호 20040101519 및 20060034810을 참조한다.
한 실시양태에서, 두 작용제를 동일한 비드상에, 즉, "시스"로, 또는 별개 비드상에, 즉 "트랜스"로 비드상에 고정화시킨다. 예로서, 1차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 항-CD3 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고, 공동자극성 신호를 제공하는 작용제는 항-CD28 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며; 이들 작용제는 모두 등가 분자량으로 동일한 비드에 함께 고정화된다. 한 실시양태에서, CD4+ T 세포 확장 및 T 세포 성장을 위해 비드에 결합된 각 항체는 1:1 비로 사용된다. 본 발명의 특정 측면에서, 1:1의 비를 사용하여 관찰된 확장에 비해 T 세포 확장의 증가가 관찰되도록 하는, 비드에 결합된 항 CD3:CD28 항체의 비가 사용된다. 한 특정한 실시양태에서, 1:1의 비를 사용하여 관찰된 확장에 비해 약 1 내지 약 3배의 증가가 관찰된다. 한 실시양태에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 비는 100:1 내지 1:100 및 그 사이의 모든 정수 값의 범위이다. 본 발명의 한 측면에서, 항-CD3 항체보다 더 많은 항-CD28 항체가 입자에 결합되고, 즉, CD3:CD28의 비가 1 미만이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 비드에 결합된 항 CD28 항체 대 항 CD3 항체의 비는 2:1 초과이다. 한 특정 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 비 1:100 CD3:CD28이 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 비 1:75 CD3:CD28이 사용된다. 추가 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 비 1:50 CD3:CD28이 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 비 1:30 CD3:CD28이 사용된다. 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 비 1:10 CD3:CD28이 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 비 1:3 CD3:CD28이 사용된다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 비 3:1 CD3:CD28이 사용된다.
1:500 내지 500:1 및 그 사이의 임의의 정수 값의 입자 대 세포의 비가 T 세포 또는 다른 표적 세포를 자극하는 데 사용될 수 있다. 당업계의 숙련가들이 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, 입자 대 세포의 비는 표적 세포에 대한 입자 크기에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 작은 크기의 비드는 단지 몇 개의 세포와 결합할 수 있는 반면, 보다 큰 비드는 많이 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서 세포 대 입자의 비는 1:100 내지 100:1 및 그 사이의 임의의 정수 값의 범위이고, 추가 실시양태에서, 비는 1:9 내지 9:1 및 그 사이의 임의의 정수 값을 포함하고, 또한 상기 비를 사용하여 T 세포를 자극시킬 수 있다. T 세포를 자극시키는 항-CD3- 및 항-CD28-커플링된 입자 대 T 세포의 비는 상기에 나타낸 바와 같이 달라질 수 있지만, 특정 값은 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 및 15:1을 포함하고, 여기서, 하나의 비는 T 세포당 적어도 1:1 입자이다. 한 실시양태에서, 1:1 이하의 입자 대 세포의 비가 사용된다. 한 특정 실시양태에서, 입자:세포 비는 1:5이다. 추가 실시양태에서, 입자 대 세포의 비는 자극일에 따라 변화할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 입자 대 세포의 비는 1일째에 1:1 내지 10:1이고, 그후 매일 또는 이틀마다 최대 10일까지 1:1 내지 1:10의 최종 비로 (첨가일에 세포수 기준으로) 추가 입자를 세포에 첨가한다. 한 특정 실시양태에서, 입자 대 세포의 비는 자극 1일째에 1:1이고 자극 3일째 및 자극 5일째에 1:5로 조정된다. 또 다른 실시양태에서, 입자를 자극 1일째에 1:1, 및 자극 3일째 및 자극 5일째에 1:5의 최종 비로 매일 또는 이틀 기준으로 첨가한다. 또 다른 실시양태에서, 입자 대 세포의 비는 자극 1일째에 2:1이고, 자극 3일째 및 자극 5일째에 1:10으로 조정된다. 또 다른 실시양태에서 입자를 1일째에 1:1, 및 자극 3일째 및 자극 5일째에 1:10의 최종 비로 매일 또는 이틀 기준으로 첨가한다. 당업계의 숙련가는 다양한 다른 비가 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 특히, 비는 입자 크기 및 세포 크기 및 유형에 따라 변화할 것이다.
본원에 기술된 추가 실시양태에서, 면역 이펙터 세포, 예컨대, T 세포를 작용제-코팅된 비드와 조합하고, 이어서, 비드 및 세포를 분리시키고, 이어서, 세포를 배양한다. 대안적 실시양태에서, 배양에 앞서, 작용제-코팅된 비드 및 세포를 분리시키지 않고, 함께 배양한다. 추가 실시양태에서, 비드 및 세포를 먼저 힘, 예컨대, 자기력을 가하여 농축시켜, 세포 표면 마커의 라이게이션을 증가시키고, 이로써, 세포 자극을 유도한다.
예로서, 세포 표면 단백질을, 항-CD3 및 항-CD28이 부착되는 상자성 비드 (3x28 비드)가 T 세포와 접촉되게 함으로써 라이게이션시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 세포 (예를 들어, 104 내지 109 T 세포) 및 비드 (예를 들어, 1:1 비의 다이나비즈® M-450 CD3/CD28 T 상자성 비드, 또는 밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec)으로부터의 MACS® 마이크로비즈)를 완충제, 예를 들어, PBS (2가 양이온, 예컨대, 칼슘 및 마그네슘 무함유) 중에서 조합한다. 다시, 당업계의 숙련가들은 임의의 세포 농도가 사용될 수 있다는 것을 쉽게 알 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 샘플 중에 극히 드물게 존재하고, 샘플의 단지 0.01%만을 차지하거나, 또는 전체 샘플 (즉, 100%)은 관심 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포수도 본 발명의 맥락에 포함된다. 특정 실시양태에서, 입자 및 세포의 최대 접촉을 보장하기 위해서 입자 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 현저하게 감소시키는 것 (즉, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 약 20억 세포/ml의 농도가 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 100 x 106 세포/ml 초과가 사용된다. 추가 실시양태에서, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 x 106 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 x 106 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가 실시양태에서, 125 또는 150 x 106 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 사용함으로써 세포 수율 증가, 세포 활성화, 및 세포 확장을 일으킬 수 있다. 추가로, 높은 세포 농도를 사용함으로써 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포, 예컨대, CD28-음성 T 세포를 보다 효율적으로 포획할 수 있다. 상기 세포 집단은 치료학적 가치를 가질 수 있으며, 특정 실시양태에서는 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 고농도 세포를 사용함으로써 보통 더 약한 CD28 발현을 보이는 CD8+ T 세포를 더욱 효율적으로 선택할 수 있다.
본원에 기술된 한 실시양태에서, 혼합물을 수시간 (약 3시간) 내지 약 14일 또는 그 사이의 임의의 매 정수 값의 시간 동안 배양할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 혼합물을 21일 동안 배양할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 비드 및 T 세포를 약 8일 동안 함께 배양한다. 또 다른 실시양태에서, 비드 및 T 세포를 2 내지 3일 동안 함께 배양한다. T 세포의 배양 시간이 60일 이상일 수 있도록 수회 주기의 자극이 또한 요구될 수 있다. T 세포 배양에 적합한 조건은 증식 및 생존능에 필요한 인자들, 예를 들어, 혈청 (우태아 혈청 또는 인간 혈청), 인터류킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-감마, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGF베타, 및 TNF-알파 또는 당업자에게 공지된 세포의 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 함유할 수 있는 적절한 배지 (예컨대, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는 X-비보 15(론자(Lonza))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제로는 계면활성제, 플라스마네이트, 및 환원제, 예컨대, N-아세틸-시스테인 및 2-메르캅토에탄올을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 배지는 아미노산, 피루브산나트륨, 및 비타민이 첨가되고, 혈청 무함유이거나, 또는 적절한 양의 혈청 (또는 혈장), 또는 한정된 호르몬 세트, 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 양의 시토카인(들)이 보충된, RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, 알파-MEM, F-12, X-Vivo 15 및 X-비보 20, 옵티마이저(Optimizer)를 포함할 수 있다. 항생제, 예컨대, 페니실린 및 스트렙토마이신을, 대상체에게 주입되는 세포의 배양물이 아닌, 오직 실험 배양물에만 포함시킨다. 표적 세포를 성장을 지지하는 데 필요한 조건하에서, 예를 들어, 적절한 온도 (예컨대, 37℃) 및 대기 (예컨대, 공기 + 5% CO2)에서 유지시킨다.
변화된 자극 시간에 노출된 T 세포는 상이한 특징을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 전형적인 혈액 또는 성분채집된 말초 혈액 단핵 세포는 세포독성 또는 억제인자 T 세포 집단 TC, CD8+)보다 큰 헬퍼 T 세포 집단 (TH, CD4+)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체의 자극에 의한 T 세포의 생체외 확장은, 약 8-9일째 전에는 우세하게 TH 세포로 이루어지는 반면, 약 8-9일째 이후에는 T 세포의 집단이 점점 더 커지는 TC 세포의 집단을 포함하는 T 세포의 집단을 생성시킨다. 따라서, 치료 목적에 따라, 대상체에게 TH 세포를 우세하게 포함하는 T 세포 집단을 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게, TC 세포의 항원-특이적인 서브세트가 단리되었다면, 서브세트를 더 큰 정도로 확장시키는 것이 이로울 수 있다.
추가로, CD4 및 CD8 마커 이외에, 다른 표현형 마커들이 세포 확장 프로세스 동안 현저하게, 그러나, 대부분 재현가능하게 변화한다. 따라서, 상기와 같은 재현가능성은 활성화된 T 세포 생성물을 특정한 용도에 맞게 적합화시키는 능력을 가능하게 한다.
일부 경우에, 실시양태의 면역 이펙터 세포 (예컨대, T 세포)를 활성화 및 증식 세포 (AaPC)와 공동 배양하여 세포 확장을 지원한다. AaPC는 또한 인공 항원 제시 세포 (aAPC)로도 지칭될 수 있다. 예를 들어, 항원 제시 세포 (APC)는 실시양태들의 치료 조성물 및 세포 요법 제품의 제조에 유용하다. 한 측면에서, AaPC는 유전적으로 변형된 K562 세포일 수 있다. 항원-제시 시스템의 제조 및 용도에 관한 일반적인 가이던스를 위해, 예컨대, 미국 특허 번호 6,225,042, 6,355,479, 6,362,001 및 6,790,662; 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0017000 및 2009/0004142; 및 국제 공개 번호 WO2007/103009 (상기 특허는 각각 참조로 포함된다)를 참조한다. 실시양태의 추가의 또 다른 측면에서, 유전적으로 변형된 CAR 세포를 배양하는 것은 유전적으로 변형된 CAR 세포를 수지상 세포 또는 CAR-발현 면역 이펙터 세포의 확장을 자극하는 활성화 및 증식 세포 (AaPC)의 존재하에서 배양하는 것을 포함한다. 추가의 다른 측면에서, AaPC는 AaPC의 표면 상에서 발현된 CAR-결합 항체 또는 그의 단편을 포함한다. AaPC는 일부 경우에, T 세포를 활성화시키거나, 공동 자극하는 추가 분자를 포함할 수 있다. 추가 분자는 일부 경우에, 막 결합 Cγ 시토카인을 포함할 수 있다. 추가의 또 다른 측면에서, AaPC는 불활성화되거나, 방사선 조사되거나, 또는 감염 물질의 부재에 대해 시험되고, 확인되었다. 추가의 다른 측면에서, AaPC의 존재하에서 유전적으로 변형된 CAR 세포를 배양하는 것은 유전적으로 변형된 CAR 세포를 가용성 시토카인, 예컨대, IL-15, IL-21 및/또는 IL-2를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 포함한다. 세포를 약 10:1 내지 약 1:10; 약 3:1 내지 약 1:5; 약 1:1 내지 약 1:3 (면역 이펙터 세포 대 AaPC); 또는 그 사이에서 도출될 수 있는 임의의 범위의 비로 배양할 수 있다. 예를 들어, T 세포 및 AaPC의 공동 배양물은 약 1:1, 약 1:2 또는 약 1:3의 비로 존재할 수 있다.
한 측면에서, AaPC는 CD137L을 발현할 수 있다. 일부 측면에서, AaPC는 CAR 세포에 의해 표적화된 항원, 예를 들어, ROR-1 (전장의 것, 말단절단된 것, 또는 그의 임의의 변이체)을 추가로 발현할 수 있다. 다른 측면에서, AaPC는 CD64, CD86, 또는 mIL15를 추가로 발현할 수 있다. 특정 측면에서, AaPC는 적어도 하나의 항-CD3 항체 클론, 예컨대, 예를 들어, OKT3 및/또는 UCHT1을 발현할 수 있다. 한 측면에서, AaPC를 불활성화시킬 수 있다 (예컨대, 방사선 조사할 수 있다). 한 측면에서, AaPC를 감염성 물질의 부재에 대해 시험하고, 이를 확인할 수 있다. 상기와 같은 AaPC를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 한 측면에서, CAR-변형된 T 세포 집단을 AaPC와 함께 배양하는 것은 약 10:1 내지 약 1:10; 약 3:1 내지 약 1:5; 약 1:1 내지 약 1:3 (T 세포 대 AaPC); 또는 그 사이에서 도출될 수 있는 임의의 범위의 비로 배양하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, T 세포 및 AaPC의 공동 배양물은 약 1:1, 약 1:2 또는 약 1:3의 비로 존재할 수 있다. 한 측면에서, 배양 단계는 아미노비스포스포네이트 (예컨대, 졸레드론산)과 함께 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
한 측면에서, 유전적으로 변형된 CAR 세포 집단을 대상체 내로 즉시 주입하거나, 또는 저온보존시킨다. 또 다른 측면에서, 유전적으로 변형된 CAR 세포 집단을 대상체 내로 주입하기 이전에 시토카인 배쓰에 배치한다. 추가 측면에서, 유전적으로 변형된 CAR 세포 집단을 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 28, 35, 42일, 49, 56, 63 또는 70일 이하 동안 배양 및/또는 자극한다. 한 실시양태에서, 자극은 CAR 양성 T 세포의 성장을 촉진시키기 위해 유전적으로 변형된 CAR T 세포와 AaPC를 공동 배양하는 것을 포함한다. 또 다른 측면에서, 유전적으로 변형된 CAR 세포 집단은 1X 자극, 2X 자극, 3X 자극, 4X 자극, 5X 자극, 5X 자극, 6X 자극, 7X 자극, 8X 자극, 9X 자극 또는 10X 자극 이하로 자극받는다. 일부 경우에, 유전적으로 변형된 세포를 AaPC의 존재하에 생체외에서 배양하지 않는다. 일부의 구체적인 경우에, 실시양태의 방법은 형질감염 및/또는 배양 단계 후에 CAR-발현 면역 이펙터 세포 (예컨대, T 세포)에 대해 세포 집단을 농축시키는 것을 추가로 포함한다. 농축은 형광-활성화된 세포 분류 (FACS) 및 CAR-발현 세포에 대한 분류를 포함할 수 있다. 추가 측면에서, CAR-발현 세포의 분류는 CAR-결합 항체의 사용을 포함한다. 농축은 또한 CD56+ 세포의 고갈을 포함할 수 있다. 실시양태의 추가의 또 다른 측면에서, 방법은 유전적으로 변형된 CAR 세포 집단의 샘플을 저온보존하는 것을 추가로 포함한다.
일부 경우에, AaPC를 추가의 프로세싱 없이 MHC 분자에 대한 펩티드의 직접적인 결합을 허용하는 최적의 길이의 펩티드와 배양한다. 대안적으로, 세포는 관심 항원을 발현할 수 있다 (즉, MHC-비의존적인 항원 인식인 경우에). 추가로, 일부 경우에, APC는 특정한 CAR 폴리펩티드 또는 일반적인 CAR 폴리펩티드 (예컨대, 보편적인 활성화 및 증식 세포 (uAPC))에 결합하는 항체를 발현할 수 있다. 상기 방법은 WO/2014/190273 (이는 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다. 펩티드-MHC 분자 또는 관심 항원 이외에, AaPC 시스템은 또한 적어도 하나의 외인성 보조 분자를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 수 및 보조 분자의 조합이 사용될 수 있다. 보조 분자는 예컨대, 공동자극성 분자 및 부착 분자와 같은 보조 분자 중에서 선택될 수 있다. 예시적인 공동자극성 분자는 CD70 및 B7.1이며 (B7.1은 앞서 B7로서 및 또한 CD80으로도 공지), 이들은 특히 T 세포 표면상의 CD28 및/또는 CTLA-4 분자에 결합하고, 이로써, 예를 들어, T 세포 확장, Th1 분화, 단기간 T 세포 생존, 및 시토카인 분비, 예컨대, 인터류킨 (IL)-2에 영향을 미친다. 부착 분자는 탄수화물-결합 당단백질, 예컨대, 셀렉틴, 막관통 결합 당단백질, 예컨대, 인테그린, 칼슘-의존성 단백질, 예컨대, 카드헤린, 및 단일-통과 막관통 면역글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리 단백질, 예컨대, 세포간 부착 분자 (ICAM) (예를 들어, 세포-세포 또는 세포-기질 접촉을 촉진한다)를 포함할 수 있다. 예시적인 부착 분자는 LFA-3 및 ICAM, 예컨대, ICAM-1을 포함한다. 공동자극성 분자 및 부착 분자를 비롯한, 예시적인 보조 분자의 선택, 클로닝, 제조 및 발현에 유용한 기술, 방법 및 시약들이 예컨대, 미국 특허 번호 6,225,042, 6,355,479, 및 6,362,001(상기 특허들은 본원에 참고로 포함된다)에 예시되어 있다.
AaPC가 되도록 선택된 세포는 바람직하게는 세포내 항원-프로세싱, 세포내 펩티드 수송, 및/또는 세포내 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자-펩티드 로딩에 결함을 갖거나, 또는 변온성이거나 (즉, 포유동물 세포주보다 온도 공격에 덜 감수성이거나) 또는 결함과 변온성 특성 둘 모두 갖는다. 바람직하게, AaPC가 되도록 선택된 세포는 또한 외인성 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 대한 적어도 하나의 내인성 대응물 (예컨대, 상기 기술된 바와 같은 내인성 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자 및/또는 내인성 보조 분자) 및 세포 내로 도입되는 보조 분자 성분을 발현하는 능력이 없다. 추가로, AaPC는 바람직하게는 AaPC를 생성시키는 그의 변형에 앞서 세포가 갖는 결함 및 변온성 특성을 유지한다. 예시적인 AaPC는 항원 프로세싱과 연관된 수송체 (TAP)-결핍 세포주, 예컨대, 곤충 세포주를 구성하거나 또는 그로부터 유래된다. 예시적인 변온성 곤충 세포주는 드로소필라 세포주, 예컨대, 슈나이더(Schneider) 2 세포주이다 (예컨대, 슈나이더 2 세포의 제조, 생육 및 배양에 대한 슈나이더 1972 예시 방법이 미국 특허 번호 6,225,042, 6,355,479, 및 6,362,001에 제공되어 있다).
한 실시양태에서, AaPC에 대해 또한 동결-해동 사이클을 수행한다. 예시적인 동결-해동 사이클에서, AaPC를 함유하는 적합한 용기를 적합한 양의 액체 질소, 고체 이산화탄소 (즉, 드라이 아이스), 또는 동결을 빠르게 발생시키는 유사한 저온 물질과 접촉시킴으로써 AaPC를 동결시킬 수 있다. 이어서, 동결된 APC를, 저온 물질로부터 AaPC의 제거 및 주변 실온 조건에의 노출에 의해, 또는 미온 수욕 또는 따뜻한 손을 사용하여 보다 짧은 해동 시간을 촉진하는 촉진된 해동 프로세스에 의해 해동시킨다. 추가로, AaPC를 동결시키고, 해동에 앞서 연장된 시간 동안 보관할 수 있다. 동결된 AaPC를 또한 해동시킨 후, 이어서, 추가로 사용하기 전에 동결건조시킬 수 있다. 바람직하게, 동결-해동 과정에 해로운 영향을 미칠 수도 있는 보존제, 예컨대, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 및 다른 보존제는 동결-해동 사이클이 수행되는 AaPC 함유 배지에는 없거나, 또는 예컨대, 상기와 같은 보존제가 본질적으로 없는 배지로 AaPC를 이동시킴으로써 본질적으로 제거된다.
추가 실시양태에서, 외인성 핵산 및 AaPC에 내인성인 핵산을 가교결합에 의해 불활성화시킬 수 있으며, 이로써, 불활성화 후에 세포 성장, 복제 또는 핵산의 발현이 본질적으로 발생하지 않는다. 한 실시양태에서, AaPC를 외인성 MHC 및 보조 분자의 발현, AaPC 표면 상에서 상기와 같은 분자의 제시, 및 선택된 펩티드 또는 펩티드들과 함께 제시된 MHC 분자의 로딩에 후속되는 시점에서 불활성화시킨다. 따라서, 상기와 같이 불활성화되고, 선택된 펩티드 로딩된 AaPC는 증식 또는 복제는 본질적으로 불가능해진 반면, 선택된 펩티드 제시 기능은 유지한다. 바람직하게, 가교결합은 또한, AaPC의 항원-제시 세포 기능을 실질적으로 감소시키지 않으면서, 오염 미생물, 예컨대, 박테리아 및 바이러스는 본질적으로 없는 AaPC를 생성시킨다. 따라서, 가교결합은 AaPC를 사용하여 개발된 세포 요법 제품의 안전성에 대한 우려를 완화시키는 데 도움을 주면서, 중요한 AaPC 기능을 유지시킨다. 가교결합과 관련된 방법 및 AaPC에 대해, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 20090017000 (상기 특허는 본원에서 참조로 포함된다)을 참조한다.
특정 실시양태에서, 조작된 항원 제시 세포 (APC)를 추가로 제공한다. 상기와 같은 세포를, 예를 들어, 상기 기술된 바와 같이 사용하여 생체외에서 면역 이펙터 세포를 증식시킬 수 있다. 추가 측면에서, 조작된 APC 자체를 환자에게 투여하고, 이로써, 생체내에서 면역 이펙터 세포의 확장을 자극할 수 있다. 실시양태의 조작된 APC 자체를 치료제로서 사용할 수 있다. 다른 실시양태에서, 조작된 APC를 표적 항원에 특이적인 내인성 면역 이펙터 세포의 활성화를 자극하고/거나, 표적 항원에 특이적인 입양 전달된 면역 이펙터 세포의 활성 또는 지속성을 증가시킬 수 있는 치료제로서 사용할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "조작된 APC"라는 용어는 적어도 제1 트랜스진을 포함하는 세포(들)를 지칭하며, 여기서, 제1 트랜스진은 HLA를 코딩한다. 상기와 같은 조작된 APC는 항원의 발현을 위한 제2 트랜스진을 추가로 포함할 수 있으며, 이로써, 항원은 HLA와의 복합체로 APC 표면 상에 제시된다. 일부 측면에서, 조작된 APC는 항원 (예컨대, 수지상 세포)을 제시하는 세포 유형일 수 있다. 추가 측면에서, 조작된 APC는 T 세포 또는 T 세포 전구세포 ("T-APC"로서 지칭)와 같이, 보통은 항원을 제시하지 않는 세포 유형으로부터 생성될 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 실시양태의 조작된 APC는 표적 항원을 코딩하는 제1 트랜스진 및 인간 백혈구 항원 (HLA)을 코딩하는 제2 트랜스진을 포함하며, 이로써, HLA는 표적 항원의 에피토프와의 복합체로 조작된 APC의 표면 상에서 발현된다. 특정의 구체적인 측면에서, 조작된 APC에서 발현된 HLA는 HLA-A2이다.
일부 측면에서, 실시양태의 조작된 APC는 적어도, 공동자극성 분자를 코딩하는 제3 트랜스진을 추가로 포함할 수 있다. 공동자극성 분자는 막 결합 Cγ 시토카인일 수 있는 공동자극성 시토카인일 수 있다. 특정 측면에서, 공동자극성 시토카인은 IL-15, 예컨대, 막 결합 IL-15이다. 일부 추가 측면에서, 조작된 APC는 편집된 (또는 결실된) 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 억제 유전자, 예컨대, PD-1, LIM-3, CTLA-4 또는 TCR을 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하도록 편집할 수 있다. 실시양태의 조작된 APC는 임의의 관심 표적 항원을 코딩하는 트랜스진을 추가로 포함할 수 있다.
현장 진단 (point-of-care)
본 개시내용의 한 실시양태에서, 본원에 기술된 면역 이펙터 세포는 현장 진단 장소에서 변형된다. 일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포는 또한 조작된 T 세포로도 지칭된다. 일부 경우에, 현장 진단 장소는 병원이나 치료를 필요로 하는 대상체 근처의 시설 (예컨대, 의료 시설)에 있다. 대상체는 성분채집술을 받고, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 PBMC의 하위집단이 예를 들어, 세정 또는 피콜 분리에 의해 농축될 수 있다. 농축된 PBMC 또는 PBMC의 하위집단은 추가로 프로세싱되기 전에 임의의 적절한 저온보존액에서 저온보존될 수 있다. 한 경우에, 세정 프로세스는 인간 혈청 알부민을 함유하는 완충액을 사용하여 수행된다. 면역 이펙터 세포, 예컨대, T 세포는 본원에 기술된 선택 방법에 의해 단리될 수 있다. 한 예에서, T 세포에 대한 선택 방법은 T 세포상의 CD3에 특이적인 비드 및 CD4 및 CD8에 특이적인 비드를 포함한다. 한 경우에, 비드는 상자성 비드일 수 있다. 수확된 면역 이펙터 세포를 변형에 앞서 임의의 적절한 저온보존액 중에서 저온보존할 수 있다. 면역 이펙터 세포를 주입에 앞서 최대 24시간, 36시간, 48시간, 72시간 또는 96시간까지 해동시킬 수 있다. 해동된 세포를 변형에 앞서, 세포 배양 완충제, 예를 들어, 우태아 혈청 (FBS) 또는 인간 혈청 AB가 보충된 세포 배양 완충제 (예컨대, RPMI) 중에 배치하거나, 또는 예컨대, IL-2 및 IL-21과 같은 시토카인을 포함하는 완충제에 배치할 수 있다. 또 다른 측면에서, 수확된 면역 이펙터 세포를 저온보존의 필요 없이 바로 변형시킬 수 있다.
일부 경우에, 면역 이펙터 세포를, 키메라 수용체, 하나 이상의 세포 태그(들), 및/또는 시토카인(들)을 면역 이펙터 세포 내로 조작/도입하여 변형시킨 후, 이어서, 대상체 내로 신속히 주입한다. 일부 경우에, 면역 이펙터 세포의 공급원은 동종이계 및 자기유래 공급원 둘 모두를 포함할 수 있다. 한 경우에, 면역 이펙터 세포는 T 세포 또는 NK 세포일 수 있다. 한 경우에, 키메라 수용체는 ROR-1 CAR일 수 있다. 또 다른 경우에, 시토카인은 mbIL-15일 수 있다. 한 경우에, mbIL-15는 서열번호: 113의 것, 또는 그의 변이체 또는 단편이다. 추가의 또 다른 경우에, mbIL-15의 발현은 본원에 기술된 리간드 유도성 유전자 스위치 발현 시스템에 의해 조절된다. 예를 들어, 리간드, 예컨대, 벨레디멕스를 대상체에게 전달하여 mbIL-15의 발현을 조절할 수 있다. 또 다른 경우에, 시토카인은 IL-12일 수 있다. 추가의 또 다른 경우에, IL-12의 발현은 본원에 기술된 리간드 유도성 유전자 스위치 발현 시스템에 의해 조절된다. 예를 들어, 리간드, 예컨대, 벨레디멕스를 대상체에게 전달하여 IL-12의 발현을 조절할 수 있다.
또 다른 측면에서, 벨레디멕스는 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg 또는 100 mg으로 제공된다. 추가 측면에서, 더 낮은 저용량의 벨레디멕스, 예를 들어, 0.5 mg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg 또는 20 mg으로 제공된다. 한 실시양태에서, 벨레디멕스는 변형된 면역 이펙터 세포 주입 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21일 전 대상체에게 투여된다. 추가 실시양태에서, 벨레디멕스는 변형된 면역 이펙터 세포의 주입 후 대상체에게 유효 기간 동안 약 12시간마다 1회, 약 24시간마다 1회, 약 36시간마다 1회, 또는 약 48시간마다 1회 투여된다. 한 실시양태에서, 벨레디멕스 투여를 위한 유효 기간은 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30일이다. 다른 실시양태에서, 벨레디멕스는 휴지 기간 후, 휴약일 후, 또는 대상체가 재발을 경험할 때 재-투여될 수 있다.
특정 경우에, 대상체에 대한 부작용이 관찰되거나, 치료가 필요하지 않은 경우에, 본원에 기술된 바와 같은, 세포 태그, 예컨대, 말단절단된 표피 성장 인자 수용체 태그를 포함하는 변형된 면역 이펙터 세포의 조건부 생체내 제거를 위해 세포 태그를 예를 들어, 세툭시맵을 통해 활성화시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 면역 이펙터 세포는 도 1-2에 도시된 구축물에 의해 전기천공에 의해 변형된다. 한 경우에, 전기천공은 예컨대, 론자의 뉴클레오펙터(Nucleofector)™ 전기천공 장치를 이용하여 수행된다. 다른 실시양태에서, 상기 언급된 구축물을 포함하는 벡터는 비-바이러스 또는 바이러스 벡터이다. 한 경우에, 비-바이러스 벡터는 슬리핑 뷰티 트랜스포존-트랜스포사제 시스템을 포함한다. 한 경우에, 면역 이펙터 세포는 특이적인 서열을 사용하여 전기천공된다. 예를 들어, 면역 이펙터 세포는 한 트랜스포존으로 전기천공된 후, 트랜스포사제를 코딩하는 DNA로, 이어서, 제2 트랜스포존으로 전기천공될 수 있다. 또 다른 경우에, 면역 이펙터 세포는 모든 트랜스포존 및 트랜스포사제로 동시에 전기천공될 수 있다. 또 다른 경우에, 면역 이펙터 세포는 트랜스포사제로, 이어서, 두 트랜스포존 모두에 의해, 또는 한 번에 하나의 트랜스포존으로 전기천공될 수 있다. 순차적인 전기천공이 진행되면서, 면역 이펙터 세포는 다음 전기천공 이전에 일정 기간 동안 휴지될 수 있다.
일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포는 증식 및 활성화 단계를 거치지 않는다. 일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포는 인큐베이션 또는 배양 단계 (예컨대, 생체외 증식)을 거치지 않는다. 특정 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포는 주입에 앞서 IL-2 및 IL21을 포함하는 완충제 중에 배치된다. 다른 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포는 주입 이전에 세포 배양 완충제, 예를 들어, 우태아 혈청 (FBS)이 보충된 세포 배양 완충제 (예컨대, RPMI)에 배치되거나, 그 중에서 휴지된다. 주입에 앞서, 대상체에의 주입을 위한 제조에서 변형된 면역 이펙터 세포를 수확하고, 세척하고, 염수 완충제 중에서 제제화할 수 있다.
한 경우에, 대상체는 주입에 앞서 림프구가 고갈되었다. 다른 경우에, 림프구 고갈은 필요하지 않고, 변형된 면역 이펙터 세포가 대상체에게 신속히 주입된다. 예시적인 림프구고갈 요법은 하기 표 2 및 3에 열거되어 있다:
Figure pct00002
Figure pct00003
추가 경우에, 대상체에서 최소 림프구고갈이 이루어진다. 본원에서 최소 림프구고갈이란, 림프구고갈 요법 후 1일, 2일, 또는 3일 이내에 대상체가 주입받을 수 있도록 감소된 림프구고갈 프로토콜을 지칭한다. 한 경우에, 감소된 림프구고갈 프로토콜은 더 낮은 저용량의 플루다라빈 및/또는 사이클로포스파미드를 포함할 수 있다. 또 다른 경우에, 감소된 림프구고갈 프로토콜은 단축된 림프구고갈 기간, 예를 들어, 1일 또는 2일을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 면역 이펙터 세포를, 키메라 수용체 및 시토카인을 상기 면역 이펙터 세포 내로 조작/도입하여 변형시킨 후, 이어서, 대상체 내로 신속히 주입한다. 다른 경우에, 면역 이펙터 세포를, 키메라 수용체 및 시토카인을 상기 세포 내로 조작/도입하여 변형시킨 후, 이어서, 적어도 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50시간 이내에 대상체 내로 주입한다. 다른 경우에, 면역 이펙터 세포를, 키메라 수용체 및 시토카인을 면역 이펙터 세포 내로 조작/도입하여 변형시킨 후, 이어서, 0일, <1일, <2일, <3일, <4일, <5일, <6일 또는 <7일 이내에 대상체 내로 주입한다.
일부 실시양태에서, 일정량의 변형된 이펙터 세포가 그를 필요로 하는 대상체에게 투여되고, 상기 양은 효능 및 시토카인 연관된 독성을 유도하는 잠재성에 기초하여 결정된다. 또 다른 실시양태에서, 변형된 이펙터 세포는 CAR+ 및 CD3+ 세포이다. 일부 경우에, 변형된 이펙터 세포의 양은 약 104 내지 약 109 변형된 이펙터 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 이펙터 세포의 양은 약 104 내지 약 105 변형된 이펙터 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 이펙터 세포의 양은 약 105 내지 약 106 변형된 이펙터 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 이펙터 세포의 양은 약 106 내지 약 107 변형된 이펙터 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 이펙터 세포의 양은 >104 이되, ≤105 변형된 이펙터 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 이펙터 세포의 양은 >105 이되, ≤106 변형된 이펙터 세포/kg을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 이펙터 세포의 양은 >106 이되, ≤107 변형된 이펙터 세포/kg을 포함한다.
한 실시양태에서, 변형된 면역 이펙터 세포를 종양 조직에의 직접적인 국부 전달을 통해 암에 표적화한다. 예를 들어, 난소암에서, 변형된 면역 이펙터 세포를 복부 또는 복강에 복강내로 (IP) 전달할 수 있다. 상기와 같은 IP 전달을 화학요법 약물 전달용으로 배치된 포트 또는 기존의 포트를 통해 수행할 수 있다. 변형된 면역 이펙터 세포의 국부 전달의 다른 방법은 절제강 내로의 카테터 주입, 초음파 유도 종양내 주사, 간동맥 주입 또는 흉강내 전달을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 그를 필요로 하는 대상체는 IP를 통해 전달된 제1 용량의 변형된 면역 이펙터 세포에 이어서, IV를 통해 전달된 제2 용량의 변형된 면역 이펙터 세포로 요법을 시작할 수 있다. 추가 실시양태에서, 제2 용량의 변형된 면역 이펙터 세포에 이어서 IV 또는 IP를 통해 전달될 수 있는 후속 용량이 진행될 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 용량 또는 추가의 후속 용량 사이의 기간은 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30일일 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 또는 추가의 후속 용량 사이의 기간은 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 또는 36개월일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 또는 추가의 후속 용량 사이의 기간은 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10년일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 카테터를 변형된 면역 이펙터 세포의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 용량의 추가의 투여를 위해 종양 또는 전이 부위에 배치할 수 있다. 일부의 경우에, 변형된 이펙터 세포의 용량은 약 102 내지 약 109 변형된 이펙터 세포/kg을 포함할 수 있다. 독성이 관찰되는 경우, 변형된 이펙터 세포의 용량은 약 102 내지 약 105 변형된 이펙터 세포/kg을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 변형된 이펙터 세포의 용량은 약 102 변형된 이펙터 세포/kg으로 출발하여 후속 용량을 약 약: 104, 105, 106, 107, 108 또는 109 변형된 이펙터 세포/kg으로 증가시킬 수 있다.
다른 실시양태에서, 조작된 세포의 증식 및/또는 생존을 자극하는 방법은 대상체로부터 세포의 샘플을 수득하고, 세포 샘플의 세포를 하나 이상의 트랜스포존을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 형질감염시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 트랜스포존은 키메라 항원 수용체 (CAR), 시토카인, 하나 이상의 세포 태그, 및 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 상기 세포의 게놈 내로 통합시키는 데 효과적인 트랜스포사제를 코딩하여 조작된 세포의 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 트랜스포존은 키메라 항원 수용체 (CAR), 시토카인, 하나 이상의 세포 태그, 시토카인의 리간드-유도성 제어를 위한 유전자 스위치 폴리펩티드 및 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 상기 세포의 게놈 내로 통합시키는 데 효과적인 트랜스포사제를 코딩하여 조작된 세포의 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 유전자 스위치 폴리펩티드는 i) 제1 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 DNA 결합 도메인을 포함하는 제1 유전자 스위치 폴리펩티드, 및 ii) 제2 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 전사활성화 도메인을 포함하는 제2 유전자 스위치 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 유전자 스위치 폴리펩티드 및 제2 유전자 스위치 폴리펩티드는 링커에 의해 연결된다. 한 경우에, 림프구고갈은 대상체에게 조작된 세포를 투여하기 전에 요구되지 않는다.
한 경우에, 조작된 세포의 생체내 증식 방법은 대상체로부터 세포의 샘플을 수득하고, 세포 샘플의 세포를 하나 이상의 트랜스포존을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 형질감염시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 트랜스포존은 키메라 항원 수용체 (CAR), 시토카인, 하나 이상의 세포 태그, 및 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 상기 세포의 게놈 내로 통합시키는 데 효과적인 트랜스포사제를 코딩하여 조작된 세포의 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 트랜스포존은 키메라 항원 수용체 (CAR), 시토카인, 하나 이상의 세포 태그, 시토카인의 리간드-유도성 제어를 위한 유전자 스위치 폴리펩티드 및 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 상기 세포의 게놈 내로 통합시키는 데 효과적인 트랜스포사제를 코딩하여 조작된 세포의 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 유전자 스위치 폴리펩티드는 i) 제1 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 DNA 결합 도메인을 포함하는 제1 유전자 스위치 폴리펩티드, 및 ii) 제2 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 전사활성화 도메인을 포함하는 제2 유전자 스위치 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 유전자 스위치 폴리펩티드 및 제2 유전자 스위치 폴리펩티드는 링커에 의해 연결된다. 한 경우에, 림프구고갈은 대상체에게 조작된 세포를 투여하기 전에 요구되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 조작된 세포의 생체내 지속 증진을 필요로 하는 대상체에서 조작된 세포의 생체내 지속을 증진시키는 방법은 대상체로부터 세포의 샘플을 수득하고, 세포 샘플의 세포를 하나 이상의 트랜스포존을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 형질감염시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 트랜스포존은 키메라 항원 수용체 (CAR), 시토카인, 하나 이상의 세포 태그, 및 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 상기 세포의 게놈 내로 통합시키는 데 효과적인 트랜스포사제를 코딩하여 조작된 세포의 집단을 제공한다. 일부 경우에, 하나 이상의 트랜스포존은 키메라 항원 수용체 (CAR), 시토카인, 하나 이상의 세포 태그, 시토카인의 리간드-유도성 제어를 위한 유전자 스위치 폴리펩티드 및 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 상기 세포의 게놈 내로 통합시키는 데 효과적인 트랜스포사제를 코딩하여 조작된 세포의 집단을 제공한다. 일부 경우에, 유전자 스위치 폴리펩티드는 i) 제1 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 DNA 결합 도메인을 포함하는 제1 유전자 스위치 폴리펩티드, 및 ii) 제2 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 전사활성화 도메인을 포함하는 제2 유전자 스위치 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 유전자 스위치 폴리펩티드 및 제2 유전자 스위치 폴리펩티드는 링커에 의해 연결된다. 한 경우에, 림프구고갈은 대상체에게 조작된 세포를 투여하기 전에 요구되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 고형 종양을 앓는 대상체를 치료하는 방법은 대상체로부터 세포의 샘플을 수득하고, 샘플의 세포를 하나 이상의 트랜스포존을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 형질감염시키고, 조작된 세포 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 경우에, 림프구고갈은 대상체에게 조작된 세포를 투여하기 전에 요구되지 않는다. 일부 경우에, 하나 이상의 트랜스포존은 키메라 항원 수용체 (CAR), 시토카인, 하나 이상의 세포 태그, 및 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 상기 세포의 게놈 내로 통합시키는 데 효과적인 트랜스포사제를 코딩한다. 일부 경우에, 하나 이상의 트랜스포존은 키메라 항원 수용체 (CAR), 시토카인, 하나 이상의 세포 태그, 시토카인의 리간드-유도성 제어를 위한 유전자 스위치 폴리펩티드 및 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 상기 세포의 게놈 내로 통합시키는 데 효과적인 트랜스포사제를 코딩한다. 일부 경우에, 유전자 스위치 폴리펩티드는 는 i) 제1 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 DNA 결합 도메인을 포함하는 제1 유전자 스위치 폴리펩티드, 및 ii) 제2 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 전사활성화 도메인을 포함하는 제2 유전자 스위치 폴리펩티드를 포함하고, 여기서, 제1 유전자 스위치 폴리펩티드 및 제2 유전자 스위치 폴리펩티드는 링커에 의해 연결된다. 일부 경우에, 세포는 전기천공을 통해 형질감염된다. 일부 경우에, 유전자 스위치 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 의해 조절된다. 일부 경우에, 프로모터는 조직 특이적 프로모터 또는 EF1A 프로모터 또는 그의 기능성 변이체이다. 일부 경우에, 조직 특이적 프로모터는 T 세포 특이적 반응 요소 또는 NFAT 반응 요소를 포함한다. 일부 경우에, 시토카인은 IL-1, IL-2, IL-15, IL-12, IL-21, IL-15의 융합체, IL-15R 또는 IL-15 변이체 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 경우에, 시토카인은 분비된 형태이다. 일부 경우에, 시토카인은 막 결합된 형태이다. 일부 경우에, 세포는 NK 세포, NKT 세포, T 세포 또는 T 세포 전구체 세포이다. 일부 경우에, 세포는 (예컨대, 조작된 세포를 대상체에 주입함으로써) 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, 본 방법은 시토카인의 발현을 유도하기 위해 유효량의 리간드 (예컨대, 벨레디멕스)를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, CAR은 적어도 MUC-16에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스포사제는 연어과-유형의 Tc1-유사 트랜스포사제이다. 일부 경우에, 트랜스포사제는 SB11 또는 SB100x 트랜스포사제이다. 다른 경우에, 트랜스포사제는 피기백이다. 일부 경우에, 세포 태그는 HER1 말단절단된 변이체 또는 CD20 말단절단된 변이체 중 적어도 하나를 포함한다.
치료학적 적용
본원에 기술된 실시양태에서, 면역 이펙터 세포 (예컨대, T 세포)에 슬리핑 뷰티 트랜스포존(들) 및 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 형질도입시킨다. 예를 들어, 슬리핑 뷰티 트랜스포존 또는 트랜스포존들은 본원에 기술된 바와 같이, ROR-1의 항원 인식 도메인을, CD8 알파 힌지의 스페이서 및 그의 변이체, CD3-제타, CD28, 4-1BB, 또는 그의 임의 조합의 세포내 도메인 및 세포내 도메인 CD3제타, 하나 이상의 세포 태그, 하나 이상의 시토카인 및 임의적으로, 유전자 스위치 시스템의 성분과 조합한 CAR을 포함할 수 있다. 그러므로, 일부 경우에, 형질도입된 T 세포는 CAR 매개 T 세포 반응을 유도할 수 있다.
본원에 기술된 실시양태에서, 1차 T 세포의 ROR-1 표면 항원에의 특이성을 재유도하기 위한 CAR의 용도를 제공한다. 따라서, 본 발명은 포유동물에게 CAR을 발현하는 T 세포를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, CAR은 ROR-1과 특이적으로 상호작용하는 결합 모이어티, 스페이서, 예를 들어, 인간 CD3제타의 세포내 도메인을 포함하는 제타 쇄 부분, 및 공동자극성 신호전달 영역을 포함하는 것인, 포유동물에서 표적 세포 집단 또는 조직에 대한 T 세포-매개 면역 반응을 자극시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 T 세포가 본 발명의 ROR-1-특이적 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형되고, CAR T 세포가 그를 필요로 하는 수용자에게 주입되는 것인 세포 요법을 포함한다. 주입된 세포는 수용자에서 ROR-1을 과다발현하는 세포를 사멸시킬 수 있다. 항체 요법과 달리, 본원에 기술된 CAR T 세포는 생체내에서 복제가 가능하고, 그 결과, 장기간 지속될 수 있으며, 이로써, 종양 세포에 지속적으로 영향을 줄 수 있다.
본 발명은 a) i) 대상체로부터 샘플, 및 ii) 본원에 기술된, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편 중 임의의 하나 이상의 것을 제공하는 단계, b) 항체와 그의 항원이 특이적인 결합을 할 수 있도록 하는 조건하에서 샘플을 항체와 접촉시키는 단계, 및 c) 질환을 앓지 않는 대조군 샘플과 비교하여, 항체의 샘플에의 결합 수준이 증가된 것을 검출함으로써 대상체에서 질환을 검출하는 단계를 포함하는, 대상체에서 ROR-1의 과다발현을 포함하는 질환을 검출하는 방법을 추가로 제공한다. 한 실시양태에서, 질환은 암이다. 바람직한 실시양태에서, 암은 난소암 및 유방암으로부터 선택된다. 검출 방법을 제한하고자 하지 않으면서, 한 실시양태에서, 항체의 샘플에의 결합을 검출하는 것은 면역조직화학적, 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA), 형광-활성화 세포 분류 (FACS), 웨스턴 블롯, 면역침전, 및/또는 방사선 영상이다.
본원에서는 또한 ROR-1을 과다발현하는 질환을 앓는 대상체에게 치료 유효량의, 본원에 기술된, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편 중 임의의 하나 이상의 것을 투여하는 단계를 포함하는, ROR-1을 과다발현하는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 질환은 난소암 및 유방암에 의해 예시되는, 암이다.
한 실시양태에서, 본원에 기술된 ROR-1 CAR T 세포에서는 강건한 생체내 T 세포 확장이 이루어질 수 있고, 장기간 동안 지속될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 CAR T 세포는 재활성화될 수 있는 특이적 기억 T 세포로 진화할 수 있다.
본원에 기술된 CAR-변형된 T 세포는 또한 생체외 면역화 및/또는 포유동물에서 생체내 요법을 위한 백신 유형으로서 작용할 수 있다. 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 생체외 면역화와 관련하여, 하기: i) 세포 확장, ii) CAR을 코딩하는 핵산의 세포로의 도입, 및/또는 iii) 세포 저온보존 중 적어도 하나가 면역 이펙터 세포를 포유동물 내로 투여하기 이전에 시험관내에서 이루어진다.
생체외 방법은 널리 공지되어 있고, 하기에서 더욱 상세하게 논의된다. 간략하면, 세포를 포유동물 (예를 들어, 인간)로부터 단리시키고, 본원에 개시된 CAR을 발현하는 벡터로 유전적으로 변형시킨다 (즉, 시험관내에서 형질도입 또는 형질감염시킨다). CAR-변형된 세포를 포유동물 수용자에게 투여하여 치료적 이익을 제공할 수 있다. 포유동물 수용자는 인간일 수 있고, CAR-변형된 세포는 수용자와 관련하여 자기유래 세포일 수 있다. 대안적으로, 세포는 수용자와 관련하여 동종이계, 동계, 또는 이종 세포일 수 있다.
조혈 줄기 및 전구체 세포의 생체외 확장 방법은 미국 특허 번호 5,199,942 (상기 특허는 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있고, 본 발명의 세포에 적용될 수 있다. 다른 적합한 방법도 당업계에 공지되어 있고, 그러므로, 본 발명은 어느 특정의 생체외 세포 확장 방법으로 제한되지 않는다. 간략하면, T 세포의 생체외 배양 및 확장은 (1) 말초 혈액 수확물 또는 골수 외식편으로부터 포유동물로부터의 CD34+ 조혈 줄기 및 전구체 세포를 수집하고; (2) 상기 세포를 생체외에서 확장시키는 것을 포함한다. 미국 특허 번호 5,199,942에 기술된 세포 성장 인자 이외에도, 다른 인자, 예컨대, flt3-L, IL-1, IL-3 및 c-kit 리간드가 세포 배양 및 확장에 사용될 수 있다.
생체외 면역화에 의해 세포 기반 백신을 사용하는 것 이외에도, 본 발명은 또한 환자에서 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 생체내 면역화용 조성물 및 방법을 제공한다.
일반적으로, 본원에 기술된 바와 같이 활성화되고, 확장된 세포는 면역손상된 개체에서 발생하는 질환의 치료 및 예방에서 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 CAR-변형된 T 세포는 예컨대, 예를 들어, ROR-1과 같은, ROR-1 악성종양 치료에서 사용된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 세포는 ROR-1 발생 위험이 있는 환자의 치료에서 사용된다. 따라서, ROR-1의 치료 또는 예방 방법은 그를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 CAR-변형된 T 세포를 투여하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같이 활성화되고, 확장된 세포는 ROR-1 치료에서 사용될 수 있다.
간략하면, 본원에 기술된 제약 조성물은 하나 이상의 제약상 또는 생리학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 조합하여, 본원에 기술된 바와 같은 표적 세포 집단을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 완충제, 예컨대, 중성 완충처리된 염수, 포스페이트 완충처리된 염수 등; 탄수화물, 예컨대, 예컨대, 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란스, 만닛톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대, 글리신; 항산화제; 킬레이트제, 예컨대, EDTA 또는 글루타티온; 애주번트 (예컨대, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 정맥내 투여용으로 제제화된다.
본원에 기술된 제약 조성물은 치료 (예방)하고자 하는 질환에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있지만, 투여량 및 투여 빈도는 환자의 상태, 및 환자의 질환의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이다.
"면역학적 유효량" 또는 "치료량"으로 명시될 때, 투여되는 본원에 기술된 조성물의 정확한 양은 환자 (대상체)의 연력, 체중, 및 상태에 따른 개체간의 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 본원에 기술된 T 세포를 포함하는 제약 조성물은 104 내지 109 세포/kg (체중), 105 내지 106 세포/kg (체중) (상기 범위 내의 모든 정수 값 포함)인 투여량으로 투여될 수 있다고 말할 수 있다. T 세포 조성물은 또한 상기 투여량으로 다회에 걸쳐 투여될 수 있다. 세포는 면역요법에 보편적으로 공지되어 있는 주입 기술을 사용함으로써 투여될 수 있다 (예컨대, 문헌 [Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, (1988)] 참조). 특정 환자를 위한 최적의 투여량 및 치료 요법은 의학 분야의 당업자에 의해 질환 징후에 대해 환자를 모니터링하고, 그에 따라 치료를 조정함으로써 쉽게 결정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 활성화된 T 세포를 대상체에게 투여한 후, 이어서, 다시 채혈하고 (또는 성분채집술을 수행하고), 그로부터 T 세포를 활성화시키고, 상기 활성화되고, 확장된 T 세포를 환자에 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 프로세스는 몇 주마다 다회에 걸쳐 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, T 세포는 10 cc 내지 400 cc의 채혈된 혈액으로부터 활성화될 수 있다. 특정 실시양태에서, T 세포는 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc, 또는 100 cc의 채혈된 혈액으로부터 활성화된다. 이론으로 제한하고자 하지 않으면서, 상기 다회에 걸치 채혈/다회에 걸치 재주입 프로토콜을 사용하는 것이 특정 T 세포 집단을 선별하는 역할을 할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 방사선 또는 화학요법을 통해 환자의 림프구고갈을 수행한 후, 대상 조성물의 활성화된 T 세포를 투여하는 것이 바람직할 수 있다.
본원에 기술된 조성물 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 임플란트, 또는 이식을 비롯한, 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기술된 조성물은 피하로, 진피내로, 종양내로, 결절내로, 수내로, 근육내로, 정맥내 (i.v.) 주사에 의해, 또는 복간애로 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 조성물은 진피내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 ROR-1 CAR-T 세포 조성물은 i.v. 주사에 의해 투여된다. T 세포 조성물은 림프절 내로, 또는 원발성 종양 부위 또는 전이 부위로 직접 주사될 수 있다.
환자에게 투여되는 상기 치료의 투여량은 치료되는 병태의 정확한 성질 및 치료받은 수용자에 따라 달라질 것이다. 인간에게 투여하는 경우, 당업계에서 허용되는 관행에 따라 투여량은 조정될 수 있다. 예를 들어, 상기 치료의 용량 범위는 1Х104 CAR+ 세포/kg 내지 5Х106 CAR+ 세포/kg일 수 있다. 예시적인 용량은 1Х102 CAR+ 세포/kg, 1Х103 CAR+ 세포/kg, 1Х104 CAR+ 세포/kg, 1Х105 CAR+ 세포/kg, 3Х105 CAR+ 세포/kg, 1Х106 CAR+ 세포/kg, 5Х106 CAR+ 세포/kg, 1Х107 CAR+ 세포/kg, 1Х108 CAR+ 세포/kg 또는 1Х109 CAR+ 세포/kg일 수 있다. 적절한 용량은 성인 또는 소아 환자에 따라 그에 맞게 조정될 수 있다.
대안적으로, 포유동물 (예컨대, 인간)에게 투여되는 면역 이펙터 세포의 전형적인 양은 예를 들어, 100, 1,000, 10,000, 1 x 106 내지 100 x 109 세포 범위일 수 있지만; 상기 예시적인 범위 미만 또는 초과인 양도 본 발명의 범주 내에 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 숙주 세포의 용량은 약 1 x 106 내지 약 50 x 109 세포 (예컨대, 약 5 x 106 세포, 약 25 x 106 세포, 약 500 x 106 세포, 약 1 x 109 세포, 약 5 x 109 세포, 약 20 x 109 세포, 약 30 x 109 세포, 약 40 x 109 세포, 또는 상기 값들 중 임의의 두 값에 의해 정의되는 범위), 약 10 x 106 내지 약 100 x 109 세포 (예컨대, 약 20 x 106 세포, 약 30 x 106 세포, 약 40 x 106 세포, 약 60 x 106 세포, 약 70 x 106 세포, 약 80 x 106 세포, 약 90 x 106 세포, 약 10 x 109 세포, 약 25 x 109 세포, 약 50 x 109 세포, 약 75 x 109 세포, 약 90 x 109 세포, 또는 상기 값들 중 임의의 두 값에 의해 정의되는 범위), 약 100 x 106 세포 내지 약 50 x 109 세포 (예컨대, 약 120 x 106 세포, 약 250 x 106 세포, 약 350 x 106 세포, 약 450 x 106 세포, 약 650 x 106 세포, 약 800 x 106 세포, 약 900 x 106 세포, 약 3 x 109 세포, 약 30 x 109 세포, 약 45 x 109 세포,또는 상기 값들 중 임의의 두 값에 의해 정의되는 범위)일 수 있다.
치료적 또는 예방적 효능은 치료받는 환자의 주기적인 평가에 의해 모니터링될 수 있다. 수일 이상 동안 반복 투여되는 경우, 상태에 따라, 치료는 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 반복된다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있도, 이는 본 발명의 범주 내에 포함된다. 원하는 투여량이 조성물의 단일 볼루스 투여에 의해, 조성물의 다회 볼루스 투여에 의해, 또는 조성물의 연속 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
개시된 핵산 서열을 발현하는 면역 이펙터 세포, 또는 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물은 포유동물에게 공동 투여될 수 있는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 투여될 수 있다. "공동 투여하는"이란, 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 증가시킬 수 있을 정도로 시간상으로 충분히 가깝게, 또는 그 반대로 하나 이상의 추가 치료제 및 본 발명의 숙주 세포 또는 본 발명의 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 의미한다. 이와 관련하여, 본원에 기술된 면역 이펙터 세포, 또는 본원에 기술된 벡터를 포함하는 조성물은 하나 이상의 추가 치료제와 함께 동시에 투여될 수 있거나, 또는 그를 먼저 투여할 수 있고, 하나 이상의 추가 치료제를 두 번째로, 또는 그 반대로 투여할 수 있다. 대안적으로, 개시된 면역 이펙터 세포 또는 본원에 기술된 벡터를 포함하는 조성물 및 하나 이상의 추가 치료제는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명의 숙주 세포 및/또는 본 발명의 벡터를 포함하는 조성물 (또는 키트에 포함된 조성물)에 포함될 수 있거나, 또는 그와 함께 공동 투여될 수 있는 치료제의 예로는 인터류킨, 시토카인, 인터페론, 애주번트 및 화학요법제가 있다. 실시양태에서, 추가 치료제는 IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-베타, TNF-알파, 성장 인자, 및 hGH, 인간 톨-유사 수용체 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, 및 TLR10의 리간드가 있다.
"소포제"는 프로세싱 동안에 수성 분산액을 응고시킬 수 있거나, 완성된 필름 중에 기포를 발생시킬 수 있거나, 또는 일반적으로 프로세싱을 손상시킬 수 있는 기포 발생을 감소시킨다. 예시적인 소포제는 실리콘 에멀젼 또는 소르비탄 세스쿠올레이트를 포함한다.
"항산화제"는 예를 들어, 부틸화된 히드록시톨루엔 (BHT), 아스코르브산 나트륨, 아스코르브산, 소듐 메타비술피트 및 토코페롤을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항산화제는 필요한 경우 화학 안정성을 증진시킨다.
본원에 기술된 제제는 항산화제, 금속 킬레이트제, 티올 함유 화합물 및 다른 일반 안정화제로부터 이득을 얻을 수 있다. 상기와 같은 안정화제의 예로는 (a) 약 0.5% w/v 내지 약 2% w/v 글리세롤, (b) 약 0.1% w/v 내지 약 1% w/v 메티오닌, (c) 약 0.1% w/v 내지 약 2% w/v 모노티오글리세롤, (d) 약 1 mM 내지 약 10 mM EDTA, (e) 약 0.01% w/v 내지 약 2% w/v 아스코르브산, (f) 0.003% w/v 내지 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, (g) 0.001% w/v 내지 약 0.05% w/v. 폴리소르베이트 20, (h) 아르기닌, (i) 헤파린, (j) 덱스트란 술페이트, (k) 시클로덱스트린, (l) 펜토산 폴리술페이트 및 다른 헤파리노이드, (m) 2가 양이온, 예컨대, 마그네슘 및 아연; 또는 (n) 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"결합제"는 응집 성질을 부여하고, 예컨대, 알긴산 및 그의 염; 셀룰로스 유도체, 예컨대, 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스 (예컨대, 메토셀(Methocel)®), 히드록시프로필메틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스 (예컨대, 클루셀(Klucel)®), 에틸셀룰로스 (예컨대, 에토셀(Ethocel)®), 및 미정질 셀룰로스 (예컨대, 아비셀(Avicel)®); 미정질 덱스트로스; 아밀로스; 마그네슘 알루미늄 실리케이트; 다당류 산; 벤토나이트; 젤라틴; 폴리비닐피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체; 크로스포비돈; 포비돈; 전분; 예비젤라틴화된 전분; 트라가칸트, 덱스트린, 당, 예컨대, 수크로스 (예컨대, 디팩(Dipac)®), 글루코스, 덱스트로스, 당밀, 만닛톨, 소르비톨, 크실리톨 (예컨대, 크실리탭(Xylitab)®), 및 락토스; 천연 또는 합성 검, 예컨대, 아카시아, 트라가칸트, 가티 검, 이사폴 겉껍질의 점액, 폴리비닐피롤리돈 (예컨대, 폴리비돈(Polyvidone)® CL, 콜리돈(Kollidon)® CL, 폴리플라스돈(Polyplasdone)® XL-10), 라치 아라보갈락탄, 비검(Veegum)®, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스, 알긴산 나트륨 등을 포함한다.
"담체" 또는 "담체 물질"은 제약학에서 보편적으로 사용되는 임의의 부형제를 포함하며, 본원에 개시된 화합물, 예컨대, 이브루티니브의 화합물 및 항암제와의 양립성, 및 원하는 투여 투여 형태의 방출 프로파일 특성에 기초하여 선택되어야 한다. 예시적인 담체 물질은 예컨대, 결합제, 현탁화제, 붕해제, 충전제, 계면활성제, 가용화제, 안정화제, 활택제, 습윤화제, 희석제 등을 포함한다. "제약상 상용성인 담체 물질"은 아카시아, 젤라틴, 콜로이드성 이산화규소, 칼슘 글리세로포스페이트, 락트산 칼슘, 말토덱스트린, 글리세린, 마그네슘 실리케이트, 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 소듐 카제이네이트, 대두 레시틴, 타우로콜산, 포스포티딜콜린, 염화나트륨, 인산삼칼슘, 인산이칼륨, 셀룰로스 및 셀룰로스 접합체, 당 소듐 스테아로일 락틸레이트, 카라기난, 모노글리세리드, 디글리세리드, 예비젤라틴화된 전분 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995)]; [Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975]; [Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980]; 및 [Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins1999)]를 참조한다.
"붕해제" 및/또는 "점도 조절제"는 액체 매질 또는 과립화 방법 또는 블렌드 방법을 통해 약물의 확산 및 균질성을 조절하는 물질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이들 작용제는 또한 코팅 또는 부식 매트릭스의 효과를 촉진시킨다. 예시적인 확산 촉진제/분산제는 예컨대, 친수성 중합체, 전해질, 트윈® 60 또는 80, PEG, 폴리비닐피롤리돈 (PVP; 플라스돈(Plasdone)®으로서 상업적으로 공지), 및 탄수화물 기반 분산제, 예컨대, 예를 들어, 히드록시프로필셀룰로스 (예컨대, HPC, HPC-SL, 및 HPC-L), 히드록시프로필 메틸셀룰로스 (예컨대, HPMC K100, HPMC K4M, HPMC K15M, 및 HPMC K100M), 카르복시메틸셀룰로스 소듐, 메틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로스 아세테이트 스테아레이트 (HPMCAS), 비결정질 셀룰로스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 트리에탄올아민, 폴리비닐 알콜 (PVA), 비닐 피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체 (S630), 에틸렌 옥시드 및 포름알데히드를 갖는 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페놀 중합체 (또한 타일록사폴로도 공지), 폴록사머 (예컨대, 플루로닉스(Pluronics) F68®, F88®, 및 F108®, 이들은 에틸렌 옥시드와 프로필렌 옥시드의 블록 공중합체들이다); 및 폴록사민 (예컨대, 프로필렌 옥시드 및 에틸렌 옥시드의 에틸렌디아민에의 연속 첨가로부터 유도된 사작용성 블록 공중합체인 테트로틱(Tetronic) 908® (또한 폴록사민 908®로도 공지) (BASF 코포레이션(BASF Corporation: 미국 뉴저지주 파시퍼니)), 폴리비닐피롤리돈 K12, 폴리비닐피롤리돈 K17, 폴리비닐피롤리돈 K25, 또는 폴리비닐피롤리돈 K30, 폴리비닐피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체 (S-630), 폴리에틸렌 글리콜 (예컨대, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 약 300 내지 약 6000, 또는 약 3350 내지 약 4000, 또는 약 7000 내지 약 5400의 분자량을 가질 수 있다), 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 폴리소르베이트-80, 알긴산나트륨, 검, 예컨대, 예컨대, 트라가칸트 검 및 아카시아 검, 구아 검, 크산탄, (크산탄 검 포함), 당, 셀룰로스, 예컨대, 예컨대, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 폴리소르베이트-80, 알긴산나트륨, 폴리에톡실화된 소르비탄 모노라우레이트, 폴리에톡실화된 소르비탄 모노라우레이트, 포비돈, 카르보머, 폴리비닐 알콜 (PVA), 알기네이트, 키토산 및 그의 조합을 포함한다. 가소제, 예컨대, 셀룰로스 또는 트리에틸 셀룰로스 또한 분산제로서 사용될 수 있다. 리포솜 분산액 및 자기-유화 분산액에 특히 유용한 분산화제는 디미리스토일 포스파티딜 콜린, 계란으로부터의 천연 포스파티딜 콜린, 계란으로부터의 천연 포스파티딜 글리세롤, 콜레스테롤 및 이소프로필 미리스테이트이다.
하나 이상의 부식 촉진제와 하나 이상의 확산 촉진제와의 조합 또한 본 조성물에 사용될 수 있다.
"희석제"라는 용어는 전달에 앞서 관심 화합물을 희석시키는 데 사용되는 화학적 화합물을 지칭한다. 희석제는 또한 보다 안정한 환경을 제공할 수 있는 바, 화합물의 안정화에 사용될 수 있다. 완충처리된 용액 중에 용해된 염 (또한 pH를 조절하거나, 또는 유지시킬 수 있다)은 당업계에서 포스페이트 완충처리된 염수 용액을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 희석제로서 사용된다. 특정 실시양태에서, 희석제는 조성물의 벌크를 증가시켜 압착을 용이하게 하거나, 캡슐 충전을 위한 균질 블렌드에 충분한 벌크를 생성한다. 상기와 같은 화합물은 예컨대, 락토스, 전분, 만닛톨, 소르비톨, 덱스트로스, 미정질 셀룰로스, 예컨대, 아비셀(Avicel)®; 이염기성 인산칼륨, 인산이칼슘 이수화물, 인산삼칼슘, 인산칼슘; 무수 락토스, 분무-건조된 락토스; 예비젤라틴화된 전분, 압착성 당, 예컨대, 디-팩(Di-Pac)® (암스타(Amstar)); 만닛톨, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스 아세테이트 스테아레이트, 수크로스 기반 희석제, 정제당; 일염기성 황산칼슘 일수화물, 황산칼슘 이수화물; 락트산칼슘 삼수화물, 덱스트레이트; 가수분해된 시리얼 고체, 아밀로스; 분말형 셀룰로스, 탄산칼슘; 글리신, 카올린; 만닛톨, 염화 나트륨; 이노시톨, 벤토나이트 등을 포함한다.
"충전제"는 예컨대, 락토스, 탄산칼슘, 인산칼슘, 이염기성 인산칼슘, 황산칼슘, 미정질 셀룰로스, 셀룰로스 분말, 덱스트로스, 덱스트레이트, 덱스트란, 전분, 예비젤라틴화된 전분, 수크로스, 크실리톨, 락티톨, 만닛톨, 소르비톨, 염화나트륨, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 화합물을 포함한다.
"활택제" 및 "유동화제"는 물질의 부착 또는 마찰을 방지하거나, 감소시키거나 또는 억제하는 화합물이다. 예시적인 활택제는 예컨대, 스테아르산, 수산화칼슘, 활석, 소듐 스테아릴 퓨마레이트, 탄화수소, 예컨대, 미네랄 오일, 또는 수소화된 식물성 오일, 예컨대, 수소화된 대두유 (스테로텍스(Sterotex)®), 고급 지방산 및 그의 알칼리-금속 및 알칼리 토금속 염, 예컨대, 알루미늄, 칼슘, 마그네슘, 아연, 스테아르산, 스테아르산나트륨, 글리세롤, 활석, 왁스, 스테아로웨트(Stearowet)®, 붕산, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 류신, 폴리에틸렌 글리콜 (예컨대, PEG-4000) 또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 예컨대, 카르보왁스(Carbowax)™, 소듐 올레이트, 벤조산나트륨, 글리세릴 베헤네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 마그네슘 또는 나트륨 라우릴 술페이트, 콜로이드성 실리카, 예컨대, 실로이드(Syloid)™, Cab-O-Sil®, , 전분, 예컨대, 옥수수 전분, 실리콘 오일, 계면활성제 등을 포함한다.
"가소제"는 미세캡슐화 물질 또는 필름 코팅을 연화시켜 덜 무르게 만드는 데 사용되는 화합물이다. 적합한 가소제는 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 예컨대, PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 1450, PEG 3350, 및 PEG 800, 스테아르산, 프로필렌 글리콜, 올레산, 트리에틸 셀룰로스 및 트리아세틴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가소제는 또한 분산제 또는 습윤화제로서 작용할 수 있다.
"가용화제"는 트리아세틴, 트리에틸시트레이트, 에틸 올레이트, 에틸 카프릴레이트, 소듐 라우릴 술페이트, 소듐 도큐세이트, 비타민 E TPGS, 디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, N-히드록시에틸피롤리돈, 폴리비닐 피롤리돈, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 시클로덱스트린, 에탄올, n-부탄올, 이소프로필 알콜, 콜레스테롤, 담즙염, 폴리에틸렌 글리콜 200-600, 글리코퓨롤, 트랜스큐톨, 프로필렌 글리콜, 및 디메틸이소솔바이드 등과 같은 화합물을 포함한다.
"안정화제"는 예컨대, 임의의 항산화제, 완충제, 산, 보존제 등과 같은 화합물을 포함한다.
"현탁화제"는 예컨대, 폴리비닐피롤리돈, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈 K12, 폴리비닐피롤리돈 K17, 폴리비닐피롤리돈 K25, 또는 폴리비닐피롤리돈 K30, 비닐 피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체 (S630), 폴리에틸렌 글리콜 (예컨대, 폴리에틸렌 글리콜은 약 300 내지 약 6000, 또는 약 3350 내지 약 4000, 또는 약 7000 내지 약 5400의 분자량을 가질 수 있다), 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 히드록시메틸셀룰로스 아세테이트 스테아레이트, 폴리소르베이트-80, 히드록시에틸셀룰로스, 알기산나트륨, 검, 예컨대, 예컨대, 트라가칸트 검 및 아카시아 검, 구아 검, 크산탄, (크산탄 검 포함), 당, 셀룰로스, 예컨대, 예컨대, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 폴리소르베이트-80, 알기산나트륨, 폴리에톡실화된 소르비탄 모노라우레이트, 폴리에톡실화된 소르비탄 모노라우레이트, 포비돈 등과 같은 화합물을 포함한다.
"계면활성제"는 소듐 라우릴 술페이트, 소듐 도큐세이트, 트윈 60 또는 80, 트리아세틴, 비타민 E PTGS, 소르비탄 모노올레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트, 폴리소르베이트, 폴락소머, 담즙염, 글리세릴 모노스테아레이트, 에틸렌 옥시드와 프로필렌 옥시드의 공중합체, 예컨대, 플루로닉® (BASF) 등과 같은 화합물을 포함한다. 일부 다른 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 지방산 글리세리드 및 식물성 오일, 예컨대, 폴리옥시에틸렌 (60) 수소화된 피마자유; 및 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 및 알킬페닐 에테르, 예컨대, 옥톡시놀 10, 옥톡시놀 40을 포함한다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 물리적 안정성을 증진시키거나, 또는 다른 목적을 위해 포함될 수 있다.
"증점제"는 예컨대, 메틸 셀룰로스, 크산탄 검, 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스 아세테이트 스테아레이트, 히드록시프로필메틸 셀룰로스 프탈레이트, 카르보머, 폴리비닐 알콜, 알기네이트, 아카시아, 키토산, 및 그의 조합을 포함한다.
"습윤화제"는 예컨대, 올레산, 글리세릴 모노스테아레이트, 소르비탄 모노올레이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 소듐 도큐세이트, 트리아세틴, 트윈 80, 비타민 E TPGS, 암모늄 염 등과 같은 화합물을 포함한다.
키트 및 조성물
본 개시내용의 한 측면은 본 발명의 ROR-1-특이적 CAR을 코딩하는 코딩 영역 및 임의적으로, 안전성의 이유로 포함되는 유전자, 예컨대, HER1t 또는 HER1t-1 및 그의 기능성 변이체, 또는 CD20 또는 CD20t-1, 및 그의 기능성 변이체를 포함하는 제1 벡터를 포함하는 키트 및 조성물에 관한 것이다. 키트 및 조성물은 시토카인을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 키트 및 조성물은 레오스위치® 유전자 스위치 성분을 포함할 수 있다. 상기 키트 및 조성물은 각각이 상이한 단백질 또는 단백질의 서브세트를 코딩하는 것인 다중 벡터를 포함할 수 있다. 이들 벡터는 바이러스, 비-바이러스, 에피솜 또는 통합 벡터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 트랜스포존, 예컨대, 슬리핑 뷰티 트랜스포존이다.
일부 실시양태에서, 키트 및 조성물은 벡터 뿐만 아니라, 세포 및 작용제, 예컨대, 인터류킨, 시토카인, 인터류킨 및 화학요법제, 애주번트, 습윤화제 또는 유화제를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포는 T 세포이다. 한 실시양태에서, 키트 및 조성물은 IL-2를 포함한다. 한 실시양태에서, 키트 및 조성물은 IL-21을 포함한다. 한 실시양태에서, 키트 및 조성물은 Bcl-2, STAT3 또는 STAT5 억제제를 포함한다. 실시양태에서, 키트는 IL-15, 또는 mbIL-15를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에서는 본원에 기술된 하나 이상의 방법과 함께 사용하기 위한 키트 및 제조 물품을 개시한다. 상기 키트는 하나 이상의 용기, 예컨대, 바이알, 튜브 등을 수용하도록 구획화된 캐리어, 패키지, 또는 용기를 포함하며, 상기 각각의 용기(들)는 본원에 기술된 방법에 사용되는 별개의 요소들 중 하나를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지 및 시험관을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 용기는 다양한 물질, 예컨대, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성된다.
본원에 제공된 제조 물품은 패키징 물질을 함유한다. 제약 패키징 물질의 예로는 블리스터 팩, 병, 튜브, 백, 용기, 병, 및 선택된 제제 및 의도된 투여 및 치료 방식에 적합한 임의의 패키징 물질을 포함한다.
예를 들어, 용기(들)는 CAR-T 세포 (예컨대, 본원에 기술된 ROR-1-특이적 CAR-T 세포), 및 임의적으로, 추가로, 본원에 개시된 시토카인 및/또는 화학요법제를 함께 포함한다. 상기 키트는 임의적으로 본원에 기술된 방법에서의 그의 사용과 관련된 식별 기재 또는 라벨 또는 설명서를 포함한다.
키트는 전형적으로 내용물을 열거하는 라벨 및/또는 사용 설명서, 및 사용 설명서와 함께 패키지 인서트를 포함한다. 설명서 세트 또한 전형적으로 포함될 것이다.
일부 실시양태에서, 라벨은 상기 용기상에 또는 상기 용기와 결합되어 있다. 한 실시양태에서, 라벨은 문자, 숫자 또는 상기 라벨을 형성하는 다른 활자가 상기 용기 자체에 부착되어 있거나, 몰딩되어 있거나, 에칭되는 경우 용기 상에 있고; 상기 용기를 또한 수용하는 용기 또는 캐리어 내에, 예컨대, 패키지 인서트로서 존재하는 경우, 용기와 결합된다. 한 실시양태에서, 라벨은 내용물이 특정 치료학적 적용에 사용되어야 한다는 것을 명시하기 위해 사용된다. 상기 라벨은 또한 예컨대, 본원에 기술된 방법에서와 같이, 내용물의 사용 지침을 명시한다.
실시예
본 실시예는 단지 예시 목적으로 제공되며, 이는 본원에 제공된 청구범위의 범주를 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1. 슬리핑 뷰티 시스템을 이용한 T 세포의 뉴클레오펙션
유전적으로 변형된 T 세포를 생성하기 위해, 저온보존된 범용 T 세포를 해동시키고, 세척하고, FBS 및 글루타맥스로 보충된, 미리 가온된 페놀 레드 무함유 RPMI 1640 배지 (R20 배지)로 재현탁시키고, 5% CO2하에 37℃ 습윤화된 인큐베이터에 배치하였다. 세포를 계수하고, 원심분리하고, 뉴클레오펙션 완충제 중에 재현탁시켰다. CAR-T 세포를 생성하기 위해, 각 뉴클레오펙션 큐벳 반응을 위해, 총 15 ㎍의 CAR 구축물을 포함하는 트랜스포존 플라스미드(들)를 5 ㎍의, SB 트랜스포사제를 코딩하는 플라스미드와 조합하였다. 아막사(Amaxa) 2b 뉴클레오펙션 장치 또는 4D 뉴클레오펙터 (론자: 미국 메릴랜드주 워커스빌)를 사용하여 T 세포의 전기천공을 달성하였다. 전기천공 후, 각 큐벳으로부터의 내용물을 미리 가온된 R20 배지로 옮기고, 37℃ 인큐베이터에 배치하였다. 적용가능한 경우, 유세포 분석법에 의해 분석하여 CAR 발현을 특징화하기 위해 명시된 시점에 각 T 세포 배양물의 샘플을 채취하였다. 추가로 특징화하기 위하여 CAR+ T 세포를 생체외에서 수적으로 확장시켰다. 생성된 CAR+ T 세포를 생체외에서 수적으로 확장시키기 위해, T 세포를 추가로 활성화 및 증식 세포 (AaPC)와 함께 공동 배양하였다. 간략하면, ROR1 항원과 함께 CD86, 41BBL, mbIL15를 발현하도록 조작된 K562 세포주로부터 유래된 방사선 조사된 AaPC를, 이후 매주 AaPC를 추가하기 위해 IL-21 및 IL-2를 포함하는 완전 배지 중에서 CAR+ T 세포와 함께 공동 배양하였다.
전기천공 후 1일째 및 각 AaPC 자극 이전에, 형광 표지된 재조합 ROR1-Fc 융합 단백질, 비오틴 표지된, ROR1의 가용성 세포외 도메인, 또는 AF647로 표지된 프로테인-L(Protein-L)을 이용하여 CAR 발현에 대한 유세포 분석법에 의한 분석을 수행하였다. 세포를 생 CD3+ 세포에 대해 게이팅하였다.
Figure pct00004
상기 언급된 CAR을 구축하였다. 도 5는 짧은 CD8스토크는 사용된 신호 펩티드와 상관 없이 ROR1 CAR의 표면 발현을 허용하지 않는다는 것을 입증한다. 시험된 다른 신호 펩티드로는 GM-CSFRα, β2M, 아주로시딘, 인간 혈청 알부민 (HSA), A2M 수용체 연관 단백질, IgHV3-23, IgHV3-33, 및 IgKV1-D33을 포함하였다.
실시예 2: ROR1 CAR의 최적화
모두에서 신호 펩티드, 항-ROR1 항체의 VL 및 VH 쇄의 배향, 다양한 길이의 스페이서, 막관통 및 신호전달 도메인의 다양한 순열에 기초하여 대략 120개의 CAR 벡터를 디자인하고, 구축하였다. 예를 들어, 15개의 신호 펩티드, 2개의 배향, 및 7개의, 다양한 길이의 상이한 스페이서, 2개의 상이한 막관통 및 신호전달 도메인을 다양한 조합으로 시험하였다. ROR1 CAR의 발현은 신호 펩티드, 배향 및 스토크 타입 길이에 의존하는 것으로 나타났다. 이로부터 강한 표면 발현을 보이는 3개의 CAR 구축물을 확인할 수 있었다.
상이한 스페이서 길이, 신호 펩티드, 및 VH-VL 배향을 갖는 ROR1 CAR을 발현하는 CAR-T 세포를 실시예 1에 기술된 바와 같이 건강한 공여자 PBMC에서 SB 시스템 플라스미드의 전기천공에 의해 생성하였다. 실시예 1에 기술된 바와 같이 주 1회 자극에 의해 ROR1 발현 AaPC와 공동 배양하여 CAR-T 세포를 수적으로 확장시켰다. 뉴클레오펙션 후 1일 및 8일째에 다중 파라미터 유세포 분석법에 의하여 CAR 발현을 측정하였다. 평가된 CAR-T 시험 물품은 하기 표 5에 열거되어 있다.
도 6은 상이한 ROR1 CAR (뮤린 scFv)-T 세포의 ROR1 CAR 발현에 관한 유세포 분석법 데이터를 보여주는 것이다. 세포를 생 CD3+ 세포에 대해 게이팅하였다. 도 6에 제시된 바와 같이, 유전자 전달 후 1일째, CAR 분자의 구축을 위해 사용된 스페이서에 의존하여 다양한 정도의 뮤린 ROR1 CAR 발현이 관찰되었다. 시험관내에서 ROR1+ AaPC 세포주와 CAR+T 세포의 공동 배양시 CAR+T 세포의 농축이 관찰되었다. 뮤린 ROR1 CAR-T의 경우, 더욱 긴 스페이서 사용시, T 세포 상에서 CAR의 더욱 우수한 표면 발현이 관찰되었다.
Figure pct00005
도 7은 CD8a-3X 스페이서 및 신호 펩티드의 상이한 조합을 이용한 다양한 정도의 ROR1 CAR 발현을 입증한다. 도 7에 제시된 바와 같이, 신호 펩티드, 예컨대, mIgVH, CD8a, β2M 및 아주로시딘을 통해 T 세포 상에서 CAR의 더욱 우수한 표면 발현을 얻을 수 있었다. CD8a-1X 스페이서 사용시, 상이한 신호 펩티드는 ROR1 CAR의 표면 발현에 대해서는 어떤 영향도 미치지 않았다.
Figure pct00006
도 8은 VL-VH에서 VH-VL로의 배향 역전이 GMCSFR 및 IGHV3-23 신호 펩티드로부터의 뮤린 ROR1CAR의 표면 발현을 가능하게 한다는 것을 입증한다. 상기 기술된 데이터에 기초하여, 뮤린 ROR1 CAR에서 스페이서로서 CD8a-3X 스토크를 선택하였고, 신호 펩티드로서 IgHV3-23을 선택하였고, 바람직한 배향으로는 VL-VH, 및 CD8TM-CD28z 신호전달 도메인을 선택하였다.
실시예 3 CD8a -3x 스토크를 포함하는 뮤린 ROR1 CAR
시험관내 모델에서 뮤린 ROR1 CAR-T 세포의 기능적 능력에 대해 시험하였다. 마우스 EL4 세포주를 형질도입시켜 세포 표면 상에서 인간 ROR1을 발현시키고 (EL4-ROR1), ROR1+ 표적 세포와 뮤린 ROR1 scFv-CD8-3x-CD28z (CAR)+ T 세포의 공동 배양시 IFN-γ 분비를 측정하였다. 도 9는 CD8-3x 스토크를 포함하는 뮤린 ROR1 CAR이 ROR+ 표적 세포와의 공동 배양시 항원 특이적 IFN-γ 발현을 입증한다는 것을 보여준다.
추가로, ROR1을 발현하거나, 또는 발현하지 않는 표적 세포를 인식할 수 있는 ROR1 CAR-T의 능력을 CD107a 탈과립화 검정법에서 평가하였다. 리소좀-연관 막 단백질-1 (LAMP-1)로도 공지된 CD107a는 세포의 후기 엔도솜-리소좀에서 구성적으로 발현되지만, 탈과립화 세포 상의 세포 표면 상에서 일시적으로 발현된다. 도 9a-9b에 제시된 바와 같이, EL4-ROR1 세포주와의 공동 배양시, CD107a 탈과립화의 유의적인 발현이 관찰된 반면, 이펙터 세포 단독 및 EL4 세포주와의 공동 배양시에는 최소의 탈과립화가 관찰되었다.
실시예 4 ROR1 scFv의 인간화
뮤린 ROR1 scFv의 면역원성을 감소시키기 위해, 및 생체내에서 면역-매개 CAR T 세포 결실을 방지하기 위해, 뮤린 ROR1 scFv를 인간화하는 노력에 착수하였다.
뮤린 ROR1 scFv 서열에 기초하여 총 168개의 인간화 ROR1 scFv를 디자인하고, 시험하였다. 인간화 항체 클론 중 77개가 성공적으로 발현되었다. 77개의 인간화 클론 중 42개가 ROR1 항원에 결합할 수 있는 능력을 보유하였다. 21개의 클론을 친화도 성숙에 대해 추가로 선별하였다. 10개의 인간화 항체가 IgG 포맷으로 결합 친화도 ≤ 2.0 nM을 보였다. 상이한 인간화 VH 및 VL 쇄의 조합에 기초한 추가의 scFv 변이체 또한 디자인하고, 시험하였다.
비아코어(Biacore) 3000을 이용하여 표면 플라스몬 공명 (SPR) 검정법에 의해 다양한 인간화 ROR1 scFv 클론의 결합 친화도를 평가하였다. 인간화 ROR1 항체의 가변 영역을 마우스 불변 쇄 영역에 융합시켜 키메라 마우스 IgG1 mAb를 생성하였다. 인간 Fc 영역에 융합된 ROR1의 세포외 도메인 (ECD)을 센서 칩 CM5 상에 고정화시켰다. 상이한 농도의 인간화 항체를 용액상으로 주사하고, BIA이벨류에이션(BIAevaluation)을 이용하여 데이터를 분석하여 항체의 Kd를 계산하였다.
Figure pct00007
인간화 캠페인으로부터의 후보물질에 기초하여, 하기 CAR 구축물을 디자인하고, 시험하였다.
Figure pct00008
fFLUC를 발현하는 JeKo-1 종양 세포 (0.5x106개의 세포)를 0일째 NSG 마우스에 IP 투여하였다. 8일째, (IVIS 영상화에 의해 확인된 바) 종양 부담이 확립된 마우스를 무작위하여 염수 (HBSS), 또는 상기 기술된 바와 같은 CAR 구축물로 형질감염된 T 세포의 단일 IV 주사를 받도록 하였다. ROR1+ AaPC와 공동 배양하여 생체외에서 매주 2x로 자극하여 CAR-T 세포를 수적으로 확장시켰다. CAR-T 세포 투약 후 매 7일 및 37일마다 수행된 생체내 생체발광 (IVIS) 영상화에 의해 종양 성장에 대한 효과를 평가함으로써 종양 부담을 사정하였다 (도 10a, 10b 및 11). 주 1회로 EDTA 중 전혈 샘플을 수집하고, 상이한 T 세포 서브세트의 인간화 ROR1 CAR T 세포 지속 (도 12), 확장 및 결정에 대해 평가하기 위해 다중 파라미터 유세포 분석법을 수행하였다.
scFv 친화도, ROR1-Fc 결합, CAR 발현, CAR T 세포 발현, 시험관내 ROR-1 특이적 시토카인 생산, 시험관내 ROR-1 특이적 세포독성 및 생체내 ROR-1 항-종양 활성에서의 뮤린 ROR1 CAR과의 유사성에 기초하여 리드 인간화 ROR1 CAR (hROR1(VH_5-VL_14).CD8a(3x).CD28z)을 선택하였다.
데이터 요약은 하기 표 9에 제공되어 있다.
Figure pct00009
상대적인 성능 점수 0 내지 3 (여기서, 0은 최하의 성능이고, 3은 가장 우수한 성능이다).
실시예 5 시험관내 및 생체내 실험
SB 트랜스포존 시스템, 즉, SB11, 막 결합 IL-15 (mbIL-15), 세포 태그 및 리드 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 다양한 DNA 플라스미드를 뉴클레오펙션을 통해 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 내로 형질감염시켜 T 세포 특이성을 재지정하였다. 하기 표 10에 기술된 바와 같이, 리드 ROR1 CAR의 구성적 발현과 조합하여, mbIL-15의 구성적 발현 또는 mbIL-15의 리간드 유도성 발현을 조사하였다.
Figure pct00010
Figure pct00011
상대적인 성능 점수 - 내지 +++이고, '-'는 검출불가능한 성능이고, +++는 가장 우수한 성능이다.
hROR1 CAR과 조합된 RTS-mbIL-15를 SKOV3_fLUC (도 13a) 및 JeKo1_fLUC (도 13b) 종양 세포주를 이용하여 시험관내에서 추가로 시험하였다. 상기와 같이, hROR1 CAR 및 mbIL-15를 코딩하는 SB 트랜스포존의 3가지 조합을 건강한 공여자 T 세포에서 전기천공하였다. 앞서 기술된 바와 같이 2X 자극을 위해 주 1회 자극에 의해 ROR1 발현 AaPC와의 공동 발현에 의해 CAR+T 세포를 수적으로 확장시켰다. 리간드 유도성 mbIL-15 hROR1 CAR의 경우, T 세포를 세포의 2X 자극 후에 IL-21 및 IL-2를 함유하는 완전 배지 중에서 인큐베이션시켰다. 2일 후, hROR1 CAR T 세포를 시토카인 무함유 완전 배지 중에서 인큐베이션시키고, 벨레디멕스 또는 DMSO로 밤새도록 처리하였다. 다음날, 세포를 계수하고, ROR1 발현 T 세포의 빈도를 추정하였다. 이어서, T 세포를 CAR 발현에 대하여 정규화하였다.
hROR1 CAR 및 mbIL-15를 구성적으로 발현하는 T 세포의 경우, AaPC와의 공동 배양 후, 주 2회의 자극을 이용한 생체외 확장 후에 세포를 추가로 3일 동안 배양하고, 계수하였다. 상기와 같이, T 세포를 CAR 발현에 대하여 정규화하였다.
이어서, hROR1 CAR T 세포를 4:1, 2:1, 0.5:1 및 0.25:1의 상이한 비로 각각의 종양 세포주와 혼합하였다. 72시간 경과 후, 세포를 인큐베이터에서 제거하고, 펠릿화하였다. 상청액을 수집하여 시토카인 생산에 대해 측정하고, 루시페라제 검정법을 위해 세포 펠릿을 원글로(OneGlo) 시약으로 처리하였다. 도 13a-13b는 ROR1+ 종양 세포주가 시험관내에서 구성적 또는 RTS-mbIL-15를 갖는 hROR1 CAR T 세포에 의해 동일하게 사멸되었다는 것을 입증한다.
RTS-mbIL-15를 갖는 hROR-1 CAR T 세포로 처리된 마우스에서 생체내 연구를 수행하였다. 상기와 같이, JeKo-1 종양 세포 (10x106개의 세포)를 0일째 NSG 마우스에 IP 투여하였다. 8일째, (IVIS 영상화에 의해 확인된 바) 종양 부담이 확립된 마우스를 무작위하여 염수 (HBSS), 또는 RTS-mbIL-15 (+/- 벨레디멕스)를 갖는 hROR-1 CAR T 세포의 단일 IV 주사를 받도록 하였다. CAR-T 세포 투약 후 특정 시점에 수행된 생체내 생체발광 (IVIS) 영상화에 의해 종양 성장에 대한 효과를 평가함으로써 종양 부담을 사정하였다 (도 14). 주 1회로 EDTA 중 전혈 샘플을 수집하고, 상이한 T 세포 서브세트의 인간화 ROR1 CAR T 세포 지속, 확장 및 결정에 대해 평가하기 위해 다중 파라미터 유세포 분석법을 수행하였다.
도 14는 huROR1 RTS CART가 용량에 의존하는 방식으로 JeKo-1 이종이식 마우스 모델에서 항-종양 효과를 촉진시킨다는 것을 입증한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어 및 임의의 동의어는 본 발명의 분야에서 통상의 숙련가가 보편적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 개시내용의 바람직한 실시양태가 본원에서 제시되고, 기술되었지만, 상기 실시양태는 단지 예로서 제공된 것이라는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 이에 당업자는 본 개시내용으로부터 벗어남 없이 다수의 변형, 변경, 및 치환을 착안할 수 있을 것이다. 본원에 기술된 실시양태, 또는 그 안에서 기술된 이들 실시양태 또는 측면들의 하나 이상의 것의 조합에 대한 다양한 대안이 본 개시내용을 실시하는 데 사용될 수 있음을 이해하여야 한다. 하기 청구범위가 본 개시내용의 범주는 정의하고, 이들 청구범위의 범주 내에 있는 방법 및 구조 및 그의 등가물이 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
서열
본원에 제공된 실시양태에 포함되는 특정 서열의 대표적인 목록이 하기 표 12에서 제공된다.
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
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Figure pct00066
Figure pct00067
SEQUENCE LISTING <110> INTREXON CORPORATION <120> ROR-1 SPECIFIC CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS AND USES THEREOF <130> IPA201793-US <140> PCT/US2019/041213 <141> 2019-07-10 <150> 62/696,075 <151> 2018-07-10 <160> 294 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 926 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Arg Gly Ala 1 5 10 15 Ala Ala Gln Glu Thr Glu Leu Ser Val Ser Ala Glu Leu Val Pro Thr 20 25 30 Ser Ser Trp Asn Ile Ser Ser Glu Leu Asn Lys Asp Ser Tyr Leu Thr 35 40 45 Leu Asp Glu Pro Met Asn Asn Ile Thr Thr Ser Leu Gly Gln Thr Ala 50 55 60 Glu Leu His Cys Lys Val Ser Gly Asn Pro Pro Pro Thr Ile Arg Trp 65 70 75 80 Phe Lys Asn Asp Ala Pro Val Val Gln Glu Pro Arg Arg Leu Ser Phe 85 90 95 Arg Ser Thr Ile Tyr Gly Ser Arg Leu Arg Ile Arg Asn Leu Asp Thr 100 105 110 Thr Asp Thr Gly Tyr Phe Gln Cys Val Ala Thr Asn Gly Lys Glu Val 115 120 125 Val Ser Ser Thr Gly Val Leu Phe Val Lys Phe Gly Pro Pro Pro Thr 130 135 140 Ala Ser Pro Gly Tyr Ser Asp Glu Tyr Glu Glu Asp Gly Phe Cys Gln 145 150 155 160 Pro Tyr Arg Gly Ile Ala Cys Ala Arg Phe Ile Gly Asn Arg Thr Val 165 170 175 Tyr Met Glu Ser Leu His Met Gln Gly Glu Ile Glu Asn Gln Ile Thr 180 185 190 Ala Ala Phe Thr Met Ile Gly Thr Ser Ser His Leu Ser Asp Lys Cys 195 200 205 Ser Gln Phe Ala Ile Pro Ser Leu Cys His Tyr Ala Phe Pro Tyr Cys 210 215 220 Asp Glu Thr Ser Ser Val Pro Lys Pro Arg Asp Leu Cys Arg Asp Glu 225 230 235 240 Cys Glu Ile Leu Glu Asn Val Leu Cys Gln Thr Glu Tyr Ile Phe Ala 245 250 255 Arg Ser Asn Pro Met Ile Leu Met Arg Leu Lys Leu Pro Asn Cys Glu 260 265 270 Asp Leu Pro Gln Pro Glu Ser Pro Glu Ala Ala Asn Cys Ile Arg Ile 275 280 285 Gly Ile Pro Met Ala Asp Pro Ile Asn Lys Asn His Lys Cys Tyr Asn 290 295 300 Ser Thr Gly Val Asp Tyr Arg Gly Thr Val Ser Val Thr Lys Ser Gly 305 310 315 320 Arg Gln Cys Gln Pro Trp Asn Ser Gln Tyr Pro His Thr His Thr Phe 325 330 335 Thr Ala Leu Arg Phe Pro Glu Leu 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 47 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly 85 90 95 Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 48 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 48 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Pro Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ala Arg Phe 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 77 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly 85 90 95 Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 130 135 140 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 145 150 155 160 Pro Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 165 170 175 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val 180 185 190 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 92 Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala 1 5 10 15 Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu 20 25 30 Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg 35 40 45 Pro Tyr Tyr Lys 50 <210> 93 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 93 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 94 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Synthetic polypeptide <400> 112 Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro 1 5 10 15 Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg 20 25 30 Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu 35 40 45 Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile 50 55 60 Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile 65 70 75 80 Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile 85 90 95 Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu 100 105 110 Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile 115 120 125 Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser 130 135 140 His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro 145 150 155 160 Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn 165 170 175 Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly 180 185 190 Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 115 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val 65 70 75 80 Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly 85 90 95 Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr 100 105 110 Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro 115 120 125 Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr 130 135 140 Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser 145 150 155 160 His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Val 165 170 175 Ala Ile Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val Ser 180 185 190 Leu Leu 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4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 130 Ser Gly Ser Gly 1 <210> 131 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 131 Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu 1 5 10 15 Gly Asp Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala 20 25 30 Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser 35 40 45 Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu 50 55 60 Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly 65 70 75 80 Ile Asp Glu Tyr Gly Gly 85 <210> 132 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 132 Glu Met Pro Val Asp Arg Ile Leu Glu Ala Glu Leu Ala Val Glu Gln 1 5 10 15 Lys Ser Asp Gln Gly Val Glu Gly Pro Gly Gly Thr Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Ser Ser Pro Asn Asp Pro Val Thr Asn Ile Cys Gln Ala 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 133 Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu 1 5 10 15 Gly Asp Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala 20 25 30 Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser 35 40 45 Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu 50 55 60 Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly 65 70 75 80 Ile Asp Glu Tyr Gly Gly Glu Phe Glu Met Pro Val Asp Arg Ile Leu 85 90 95 Glu Ala Glu Leu Ala Val Glu Gln Lys Ser Asp Gln Gly Val Glu Gly 100 105 110 Pro Gly Gly Thr Gly Gly Ser Gly Ser Ser Pro Asn Asp Pro Val Thr 115 120 125 Asn Ile Cys Gln Ala Ala Asp Lys Gln Leu Phe Thr Leu Val Glu Trp 130 135 140 Ala Lys Arg Ile Pro His Phe Ser Ser Leu Pro Leu Asp Asp Gln Val 145 150 155 160 Ile Leu Leu Arg Ala Gly Trp Asn Glu Leu Leu Ile Ala Ser Phe Ser 165 170 175 His Arg Ser Ile Asp Val Arg Asp Gly Ile Leu Leu Ala Thr Gly Leu 180 185 190 His Val His Arg Asn Ser Ala His Ser Ala Gly 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Unknown: 6 site GAL4-inducible proximal factor binding element (PFB) sequence <400> 141 attgttcgga gcagtgcggc gcgtttagcg gagtactgtc ctccgatatt aatcggggca 60 gactattccg gggtttaccg gcgcactctc gcccgaactt caccggcggt ctttcgtccg 120 tgctttatcg gggcggatca ctccgaac 148 <210> 142 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 142 aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accctcattc tggagacgga tcccgagccg 60 agtgttttga cctccataga a 81 <210> 143 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 143 cagccgctaa atccaaggta aggtcagaag a 31 <210> 144 <211> 132 <212> DNA <213> Simian virus 40 <400> 144 aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60 aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120 tatcatgtct gg 132 <210> 145 <211> 275 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Bidirectional aCA polyA 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900 attcccatgg cagatcctat aaataaaaat cacaagtgtt ataacagcac aggtgtggac 960 taccggggga ccgtcagtgt gaccaaatca gggcgccagt gccagccatg gaattcccag 1020 tatccccaca cacacacttt caccgccctt cgtttcccag agctgaatgg aggccattcc 1080 tactgccgca acccagggaa tcaaaaggaa gctccctggt gcttcacctt ggatgaaaac 1140 tttaagtctg atctgtgtga catcccagcg tgcgattcaa aggattccaa ggagaagaat 1200 aaaatggaaa tcctgtacat actagtgcca agtgtggcca ttcccctggc cattgcttta 1260 ctcttcttct tcatttgcgt ctgtcggaat aaccagaagt catcgtcggc a 1311 <210> 150 <211> 1962 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 150 gacatcaaga tgacccagag ccccagctct atgtacgcca gcctgggcga gcgcgtgacc 60 atcacatgca aggccagccc cgacatcaac agctacctgt cctggttcca gcagaagccc 120 ggcaagagcc ccaagaccct gatctaccgg gccaaccggc tggtggacgg cgtgccaagc 180 agattttccg gcggaggcag cggccaggac tacagcctga ccatcaacag cctggaatac 240 gaggacatgg gcatctacta ctgcctgcag tacgacgagt tcccctacac cttcggaggc 300 ggcaccaagc 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tcaggtgtcc ctgacctgcc tggtgaaggg cttctacccc 1200 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac ggccagcccg agaacaacta caagaccacc 1260 ccccctgtgc tggacagcga cggcagcttc ttcctgtaca gcaggctgac cgtggacaag 1320 agccggtggc aggagggcaa cgtctttagc tgctccgtga tgcacgaggc cctgcacaac 1380 cactacaccc agaagagcct gtccctgagc ctgggcaaga tgttctgggt gctggtcgtg 1440 gtgggtggcg tgctggcctg ctacagcctg ctggtgacag tggccttcat catcttttgg 1500 gtgaggagca agcggagcag aggcggccac agcgactaca tgaacatgac cccccggagg 1560 cctggcccca cccggaagca ctaccagccc tacgcccctc ccagggactt cgccgcctac 1620 cggagccggg tgaagttcag ccggagcgcc gacgcccctg cctaccagca gggccagaac 1680 cagctgtaca acgagctgaa cctgggccgg agggaggagt acgacgtgct ggacaagcgg 1740 agaggccggg accctgagat gggcggcaag ccccggagaa agaaccctca ggagggcctg 1800 tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc 1860 gagcggcgga ggggcaaggg ccacgacggc ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag 1920 gatacctacg acgccctgca catgcaggcc ctgcccccca ga 1962 <210> 151 <211> 1989 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 151 gacatcaaga tgacccagag ccccagctct atgtacgcca gcctgggcga gcgcgtgacc 60 atcacatgca aggccagccc cgacatcaac agctacctgt cctggttcca gcagaagccc 120 ggcaagagcc ccaagaccct gatctaccgg gccaaccggc tggtggacgg cgtgccaagc 180 agattttccg gcggaggcag cggccaggac tacagcctga ccatcaacag cctggaatac 240 gaggacatgg gcatctacta ctgcctgcag tacgacgagt tcccctacac cttcggaggc 300 ggcaccaagc tggaaatgaa gggcagcacc agcggcagcg gcaagcctgg aagcggcgag 360 ggctccacca agggcgaagt gaagctggtg gaaagcggcg gaggcctggt gaaacctggc 420 ggcagcctga agctgagctg cgccgccagc ggcttcacct tcagcagcta cgccatgagc 480 tgggtccgac agatccccga gaagcggctg gaatgggtgg ccagcatcag caggggcggc 540 accacctact accccgacag cgtgaagggc cggttcacca tcagccggga caacgtgcgg 600 aacatcctgt acctgcagat gagcagcctg cggagcgagg acaccgccat gtactactgc 660 ggcagatacg actacgacgg ctactacgcc atggattact ggggccaggg caccagcgtg 720 accgtgtcta gccagggaac ctccgtgaca gtgtccagcg agtccaaata tggtccccca 780 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gcccctccca gggacttcgc cgcctaccgg agccgggtga agttcagccg gagcgccgac 1680 gcccctgcct accagcaggg ccagaaccag ctgtacaacg agctgaacct gggccggagg 1740 gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga ggccgggacc ctgagatggg cggcaagccc 1800 cggagaaaga accctcagga gggcctgtat aacgaactgc agaaagacaa gatggccgag 1860 gcctacagcg agatcggcat gaagggcgag cggcggaggg gcaagggcca cgacggcctg 1920 taccagggcc tgagcaccgc caccaaggat acctacgacg ccctgcacat gcaggccctg 1980 ccccccaga 1989 <210> 152 <211> 1416 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 152 gacatcaaga tgacccagag ccccagctct atgtacgcca gcctgggcga gcgcgtgacc 60 atcacatgca aggccagccc cgacatcaac agctacctgt cctggttcca gcagaagccc 120 ggcaagagcc ccaagaccct gatctaccgg gccaaccggc tggtggacgg cgtgccaagc 180 agattttccg gcggaggcag cggccaggac tacagcctga ccatcaacag cctggaatac 240 gaggacatgg gcatctacta ctgcctgcag tacgacgagt tcccctacac cttcggaggc 300 ggcaccaagc tggaaatgaa gggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360 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1500 ggcggcaagc cccggagaaa gaaccctcag gagggcctgt ataacgaact gcagaaagac 1560 aagatggccg aggcctacag cgagatcggc atgaagggcg agcggcggag gggcaagggc 1620 cacgacggcc tgtaccaggg cctgagcacc gccaccaagg atacctacga cgccctgcac 1680 atgcaggccc tgccccccag a 1701 <210> 158 <211> 1968 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 158 gaagtgaagc tggtggaaag cggcggaggc ctggtgaaac ctggcggcag cctgaagctg 60 agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgacagatc 120 cccgagaagc ggctggaatg ggtggccagc atcagcaggg gcggcaccac ctactacccc 180 gacagcgtga agggccggtt caccatcagc cgggacaacg tgcggaacat cctgtacctg 240 cagatgagca gcctgcggag cgaggacacc gccatgtact actgcggcag atacgactac 300 gacggctact acgccatgga ttactggggc cagggcacca gcgtgaccgt gtctagcggc 360 agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc ggcgagggca gcaccaaggg cgacatcaag 420 atgacccaga gccccagctc tatgtacgcc agcctgggcg agcgcgtgac catcacatgc 480 aaggccagcc ccgacatcaa cagctacctg tcctggttcc agcagaagcc 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1380 cactacaccc agaagagcct gtccctgagc ctgggcaaga tgatctacat ctgggcccct 1440 ctggccggca cctgtggcgt gctgctgctg agcctggtca tcaccctgta ctgcaaccac 1500 cggaataaga gaggccggaa gaaactgctg tacatcttca agcagccctt catgcggccc 1560 gtgcagacca cccaggaaga ggacggctgc agctgccggt tccccgagga agaggaaggc 1620 ggctgcgaac tgcgggtgaa gttcagccgg agcgccgacg cccctgccta ccagcagggc 1680 cagaaccagc tgtacaacga gctgaacctg ggccggaggg aggagtacga cgtgctggac 1740 aagcggagag gccgggaccc tgagatgggc ggcaagcccc ggagaaagaa ccctcaggag 1800 ggcctgtata acgaactgca gaaagacaag atggccgagg cctacagcga gatcggcatg 1860 aagggcgagc ggcggagggg caagggccac gacggcctgt accagggcct gagcaccgcc 1920 accaaggata cctacgacgc cctgcacatg caggccctgc cccccaga 1968 <210> 159 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 159 gacgtgcaga tcacccagag ccccagcagc ctgtatgcca gcctgggcga gagagtgacc 60 attacctgca aggccagccc cgacatcaac agctacctga gctggttcca gcagaagccc 120 ggcaagagcc ccaagaccct gatctaccgg gccaacagac tggtggatgg cgtgcccagc 180 agattcagcg gcggaggctc tggccaggac tacagcctga ccatcaactc cctggaatac 240 gaggacatgg gcatctacta ctgcctgcag tacgacgagt tcccctacac cttcggaggc 300 ggcaccaagc tggaaatgaa g 321 <210> 160 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 160 gaagtgaagc tggtggaatc tggcggcgga ctcgtgaagc ctggcggctc tctgaagctg 60 tcttgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt gcggcagatc 120 cccgagaagc ggctggaatg ggtggccagc atcagcagag gcggaaccac ctactacccc 180 gactctgtga agggccggtt caccatcagc cgggacaacg tgcggaacat cctgtacctg 240 cagatgagca gcctgcggag cgaggacacc gccatgtact actgtggcag atacgactac 300 gacggctact atgccatgga ttactggggc cagggcacca gcgtgaccgt gtcatct 357 <210> 161 <211> 1698 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 161 gacgtgcaga tcacccagag ccccagcagc ctgtatgcca gcctgggcga gagagtgacc 60 attacctgca aggccagccc cgacatcaac agctacctga gctggttcca gcagaagccc 120 ggcaagagcc ccaagaccct gatctaccgg gccaacagac tggtggatgg cgtgcccagc 180 agattcagcg gcggaggctc tggccaggac tacagcctga ccatcaactc cctggaatac 240 gaggacatgg gcatctacta ctgcctgcag tacgacgagt tcccctacac cttcggaggc 300 ggcaccaagc tggaaatgaa gggcagcaca agcggcagcg gcaagcctgg atctggcgag 360 ggaagcacca agggcgaagt gaagctggtg gaatctggcg gcggactcgt gaagcctggc 420 ggctctctga agctgtcttg tgccgccagc ggcttcacct tcagcagcta cgccatgagc 480 tgggtgcggc agatccccga gaagcggctg gaatgggtgg ccagcatcag cagaggcgga 540 accacctact accccgactc tgtgaagggc cggttcacca tcagccggga caacgtgcgg 600 aacatcctgt acctgcagat gagcagcctg cggagcgagg acaccgccat gtactactgt 660 ggcagatacg actacgacgg ctactatgcc atggattact ggggccaggg caccagcgtg 720 accgtgtcat ctaagcctac caccaccccc gcacctcgtc ctccaacccc tgcacctacg 780 attgccagtc agcctctttc actgcggcct gaggccagca gaccagctgc cggcggtgcc 840 gtccatacaa gaggactgga cttcgcgtcc gataaaccta ctaccactcc agccccaagg 900 cccccaaccc 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 162 gaggtgcagc tcgtggaatc cggcggtggc ctggtgcagc cgggcggcag tcttcgactc 60 tcctgtgcgg cgtcaggctt tacgttcagt tcttatgcca tgagctgggt gaggcaagct 120 cccggtaagg gactggagtg ggtctctgct atcagccggg gaggtacgac ctactacgct 180 gactccgtaa aaggaagatt taccataagt cgtgacaatt ccaaaaacac tctatactta 240 cagatgaact cgctcagggc cgaagatacc gcagtctact attgtgggag atacgattac 300 gacggctact atgctatgga ttattggggt cagggtacgc tcgtgacggt gtcctcc 357 <210> 163 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 163 gatattcaaa tgacgcaaag tcccagcagc ctctccgcct ccgttggaga cagggtgact 60 attacatgcc aagccagccc cgatattaat agctacttaa attggtatca gcagaaacct 120 gggaaggcac ctaaacttct catctaccgc gctaacaatc tggagaccgg cgtgccgtct 180 agattttccg gctctggatc agggaccgat tttactctga caattagttc cctgcaaccc 240 gaagacatcg ccacttatta ttgcctgcaa tatgatgagt ttccttacac atttggtcag 300 ggaactaaac 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gatatcgtga tgacacagtc acctagctcc ctgagcgcaa gcgtggggga tagggttacc 60 ataacttgca gggccagtcc cgacatcaat agttatttgg cctggtatca acagaagcct 120 gggaaggcac ctaagttgct tatttatagg gctaactcgt tacagagcgg tgtgccaagt 180 cggttctcag gctcagggtc cgggaccgag ttcaccctga ccatcagtag cttgcagcca 240 gaagattttg ccacctacta ctgtcttcaa tacgatgagt ttccttacac ttttggacag 300 ggcaccaaac tagagatgaa g 321 <210> 174 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 174 caggttcaac tggtagaatc cggcggaggt gtagtgcagc ctggaaggtc attacggtta 60 agttgcgccg cctccgggtt cacatttagc agctatgcta tgaactgggt gcgccaggcc 120 cctgcgaaag gactcgaatg ggttgccatc atcagccgag gaggcacaca gtattatgcc 180 gattctgtga agggtcgttt tactatttcc agagacaaca gtaaaaatac gctgtacctg 240 caaatgaacg gattgagggc tgaggatacc gccgtgtact actgtggacg ctacgactat 300 gatgggtact acgcgatgga ctattggggg caaggaaccc ttgtaaccgt tagttca 357 <210> 175 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 175 gagatcgttt tgacacagag ccccgatttc cagagcgtca cgcccaagga gaaggtcacc 60 atcacctgcc gagccagccc cgacatcaac agttatcttt catggtatca acagaaacct 120 gatcagagcc ctaagctgct gattaagcgc gccaaccaga gcttctcagg ggttccttca 180 cggttttccg ggtcaggcag cgggactgac ttcacgttga ccattaactc tttggaggct 240 gaggatgctg ctgcctatta ctgccttcag tacgacgagt tcccctatac atttggtcct 300 ggaacaaaag tggatataaa g 321 <210> 176 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 176 caggtgcagc tcgtccagag cggagccgaa gtgaagaagc cgggagcatc agtgaaagtt 60 tcctgcaaag caagtggctt cactttcagc agttacgcga tgcactgggt gcggcaggca 120 ccaggtcagg gactggaatg gatggggaac atctctcgcg gcggaacaac caattacgca 180 gagaagttta agaatcgcgt tacgatgacc agagacactt ctattagtac agcctatatg 240 gagttgtcgc gtctgagaag cgacgatacc gctgtctact attgcggccg gtacgattat 300 gacggctact atgcaatgga ttactgggga cagggcacac ttgtgacagt gtctagt 357 <210> 177 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 177 gacattgtga tgactcagtc tccactcagc ctgcctgtca cgcccggcga acccgcttct 60 atctcttgta ggagtagccc tgatatcaac agctacctcg aatggtatct ccagaaacct 120 ggtcagagcc cccagctctt gatctataga gcaaacgaca ggttctctgg cgtgcctgat 180 aggttttccg gtagtggcag cggaaccgac ttcacactta agatttcaag ggtcgaggcc 240 gaggacgtgg gggtgtatta ctgcttacag tacgatgagt ttccgtatac attcgggcaa 300 ggcacaaagg tggaaattaa g 321 <210> 178 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 178 gaagtgcaac tggtcgaaag tggaggggga ctagtgcagc ccggagggtc actgaggcta 60 tcatgcaccg gctctggttt tactttttcc agctatgcca tgcactggct cagacaggtt 120 ccgggggaag gactggagtg ggttagcgga atctccagag gcggaactat tgactacgca 180 gacagcgtga aaggtaggtt taccatcagc agggacgatg ctaaaaagac cctgtcactt 240 caaatgaata gcctgagagc tgaggatacg gccgtgtatt actgtggacg 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cctctatcta 240 cagatgaatg gcttgcgagc tgaagacacg gctgtgtatt attgcgggcg ctatgactat 300 gatggttact acgctatgga ttactggggc cagggcaccc tggttactgt ttcatca 357 <210> 181 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 181 gaaatagtcc tgacccagag cccagacttc cagtccgtga cccctaagga gaaggttact 60 atcacttgca gggcaagccc tgacataaat tcatacctgc catggtatca gcagaagcca 120 gaccagtcgc cgaagctatt aatcaaacgc gccaaccagt cttttagcgg cgtaccatcc 180 cgattctcag gttcggggtc cgggaccgat ttcacactca cgataaactc ccttgaggca 240 gaggatgcag cggcttacta ctgtttacag tacgacgagt ttccatatac gttcggcccc 300 ggcacgaagg tagatatcaa g 321 <210> 182 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 182 gaagtgcagc tggtggagtc tggcggcggt ctggtgcagc ccggcggctc tctgcgcctc 60 tcctgtgcca cctctggttt tacattctcc tcctacgcta tgtcctggat gcggcaagcc 120 cccggcaagg gcctagagtg ggtcgcctca atcagcaggg gcgggacgac 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ctggcgggtc tctccgcctc 60 tcttgtgcct cctccggctt taccttcagc agctatgcta tgtcatgggt gcggcaggca 120 ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgctggg atcagtagag gcggcacaac ctcctatgcc 180 gacagcgtta aggggaggtt cacaatctcg gctgatacaa gcaagaacac tctgtatctc 240 caaatgaaca gtctccgggc agaggacacc gcggtctatt actgcggccg gtacgactac 300 gacgggtact acgcaatgga ctattgggga cagggaactc tggttactgt cagctct 357 <210> 187 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 187 gatatccaga tgactcaaag cccatcttct ctcagcgcaa gcgtgggtga ccgagtgacc 60 atcacctgcc gggcgtctcc tgatatcaac tcatacctgt cctggtatca gcagaagccc 120 ggaaaggccc ctaagctgct gatctaccgc gcaaatacac tggagagcgg ggtcccaagc 180 agattcagtg ggtccggcag tggtacggac tttactctga ccatcagctc cctgcaaccg 240 gaggactttg ctacttatta ctgtctccag tacgacgagt tcccatacac tttcggaaca 300 ggcactaagc tggagatcaa a 321 <210> 188 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 188 gaggttcaac ttgtggaatc cggcggcggg ttagtccagc ccggcgggag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctctggatt cacttttagc tcctatgcta tgtcttgggt aaggcaggcc 120 cctggtaaag gactagagtg ggtggcctcg atctcccgtg gtggcactac atactacgcc 180 gactccgtta aaggccggtt taccatctcc cgtgacaact ctaaaaatac tttgtacctg 240 caaatgaact ccctgcgggc agaagacaca gccgtgtact attgcgggcg ttacgattac 300 gacggatatt acgcaatgga ctactggggc cagggcacac tggtcaccgt gagcagc 357 <210> 189 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 189 gatatacaaa tgactcagtc ccctagtagc cttagtgcta gtgtgggaga cagagtgacc 60 atcacctgca aagcatctcc tgatatcaat tcctacctta actggtatca acagaagcct 120 ggcaaagctc caaagctcct gatttatcgc gcgaacagat tggtcgatgg ggtcccttcc 180 agattcagcg gctcagggtc agggaccgat ttcaccctca caattagttc acttcagccc 240 gaggacatcg ccacgtatta ttgccttcag tacgatgagt tcccttacac ctttggcggg 300 ggaactaaag tcgaaattaa g 321 <210> 190 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 190 gaagtgcagc ttgtggagtc aggaggaggg ctagttcagc caggcggctc tctgagacta 60 tcttgtgctg cctccggctt cacatttagc tcttatgcaa tgtcctgggt ccgccaggcc 120 cctggtaaag gcctggaatg ggttgcttct atctctagag gcggaaccac ttactaccct 180 gattcagtga aggggagatt cacaattagt agggacaacg tgcggaacat cctctaccta 240 cagatgtcaa gtttacgcag tgaggacact gcgatgtatt actgcggtcg atacgattat 300 gatggatatt atgcaatgga ttattggggc cagggcactc tggtcacagt atcttcc 357 <210> 191 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 191 gacatccaga tgacccaatc accatcgagt cttagtgcat ccgttgggga tagagtgaca 60 atcacttgta aggcatcccc ggacatcaac tcatatctta attggtatca gcaaaagccg 120 ggcaaggccc ctaagctcct gatttatagg gccaaccgcc ttgtggatgg agtcccctcc 180 cgctttagtg gaagcggctc tggcacagac tacaccctga ctatcagctc cttgcagcct 240 gaggattttg ctacctacta ctgtcttcag tacgatgaat ttccatacac 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cccccggaga gcgcgctact 60 ctgagctgca aagccagccc ggacattaat tcctaccttg cctggtatca gcagaagcct 120 ggacaggccc caagattgct cttttcacgc gccaaccgcc tggtagatgg tattccagct 180 aggtttacgg gctcaggcag cggaacagac ttcactctca ctattagctc attggagcct 240 gaggactttg caatttacta ttgtcttcag tacgacgagt tcccatatac tttcggccag 300 ggcacaaaag tagagatcaa g 321 <210> 200 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 200 gaggttcaac tcgtggagtc tggaggcggg ctagtgcagc ctggcggctc cctgcgactg 60 tcttgcagcg catcaggctt tacattcagt tcttatgcca tgagctgggt gaggcaggtg 120 cccggcaagg gtctggtgtg gatcagctca atctccaggg gcgggactac atattacgcc 180 gattcggtca ggggtcgttt tatcattagc agggataatg ccaagaacac cttgtatttg 240 gagatgaaca acctaagagg cgaagacacc gctgtgtact attgtgcccg ttacgactac 300 gatgggtact acgccatgga ctattggggc cagggaacct tggtgactgt gtcaagt 357 <210> 201 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 203 gacattcaga tgactcaatc gccgagttct cttagcgctt ctgttgggga ccgggtgaca 60 atcacatgca aggcctctcc cgatataaac tcctatctaa gctggtatca gcagaagcca 120 gggaaggccc ccaagttgtt aatctatcgc gccaacagac tggtggatgg ggtgccctct 180 cgattctccg ggagtggcag tgggactgat tttacactga ccatttcctc attgcagccc 240 gaagacttcg ctacctatta ctgcttgcag tacgatgagt tcccatatac attcggtcag 300 gggactaaag tggagataaa a 321 <210> 204 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 204 gaggtacagc tgctggaatc tggtgggggg ctggtccagc caggggggtc actacgactg 60 agctgcgctg cctccggttt tacattcagc agctatgcaa tgtcatgggt cagacaggca 120 ccaggtaaag gcctcgaatg ggtatcctcc atctcacgtg gtgggaccac ttactatgcc 180 gatagtgtga agggcaggtt cacgatctca agagataatt caaagaatac actctatcta 240 caaatgaaca gtttaagggc cgaggacacc gctgtttact attgtgccag atatgactac 300 gacggttatt atgctatgga 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cactttcagc agctatgcca tgagttgggt tagacaagct 120 cccggcaagg ggctggaatg ggttagtgct attagccggg gagggacaac atattacgct 180 gactctgtca aaggccgatt caccatctct gctgacacga gcaaagaaac cgcctacctc 240 caaatgaaca gcctgcgagc tgaggacact gccgtctact attgtggtcg atatgattat 300 gatgggtact atgcaatgga ctattggggg cagggcacac tggtgaccgt gagctct 357 <210> 213 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 213 gatattcaga tgacgcagag tccctcctcc ctatctgcct ctgttggaga tcgagtcacc 60 attacgtgta aagcgtctcc cgatatcaac agctacctct cttggtatca gcagaaacca 120 gggaaggccc ccaagctgct gatctataga gctaatcgct tagtggatgg agtgccaagc 180 aggttctccg ggtccggcag tggaaccgat ttcaccttga caataagtag cttgcaacct 240 gaggatattg caacatacta ctgtctacag tacgacgagt tcccctacac cttcggccaa 300 gggacaaagc tggagattaa g 321 <210> 214 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 214 gaagtgcagc 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 216 gaggtccagc tcgtcgagtc gggtgggggc ttggtgcaac ccggtggcag tttgcgcctg 60 agctgcgccg cgagcgggtt cactttcagt tcgtatgcca tgagttgggt gcgacaagcg 120 cccggcaaag gactggagtg ggtgtcagcc attagccggg gcggtactac ctactatgcg 180 gactcggtca agggaagatt caccatcagc gctgatacca gtaaggaaac cgcttatctt 240 cagatgaact ccctgcgtgc cgaggataca gcagtctact attgcgggcg ctacgattat 300 gacggatatt atgccatgga ttactggggg cagggcactc tggtcacagt cagctct 357 <210> 217 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 217 gatattcaga tgacgcagtc tccctcttcc ctgagcgcct ccgtcggcga tagagttacg 60 atcacctgtc aggccagccc agatatcaac tcctatctga attggtatca gcaaaagcct 120 gggaaggctc ccaagttgct gatctacaga gccaataact tagagactgg cgtgccgtct 180 cggttcagcg ggtccggcag tggaaccgac tttacactga ccatttccag cctccaacct 240 gaggatatcg ccacatatta ttgtctccag tatgacgagt tcccttacac atttggtcaa 300 ggaactaaac tggaaatcaa a 321 <210> 218 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 218 gaggtgcagc tggtcgaaag tggaggcgga ctcgtgcagc ccggcggtag tctgcgattg 60 agctgtgccg cgtccggctt tactttctca tcttacgcta tgagttgggt ccgccaggcc 120 ccaggcaaag gactggagtg ggtatcagcc atcagtaggg ggggaactac ctattacgca 180 gattctgtga agggacgctt caccatcagc gcggacacta gcaaggagac tgcctacctg 240 caaatgaata gtctgagagc cgaggatacc gccgtgtact attgtggcag gtatgactac 300 gatggctatt atgctatgga ttactggggc caggggacgt tagtgacagt aagctct 357 <210> 219 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 219 gatattcaga tgacccaatc cccttcttct ctgagcgctt ctgtgggcga tagagttaca 60 ataacctgtc gggcgtcccc agacattaac tcttatgtag catggtatca gcaaaagcct 120 ggaaaggcac caaagttact gatctaccgg gccaattttc tggagtcggg cgtgccctca 180 cgatttagcg gtagcagatc aggcacagac tttactctga ccattagctc tctgcaaccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgtttgcag 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 228 gaggttcaac tcgtggagtc tggaggcggg ctagtgcagc ctggcggctc cctgcgactg 60 tcttgcagcg catcaggctt tacattcagt tcttatgcca tgagctgggt gaggcaggtg 120 cccggcaagg gtctggtgtg gatcagctca atctccaggg gcgggactac atattacgcc 180 gattcggtca ggggtcgttt tatcattagc agggataatg ccaagaacac cttgtatttg 240 gagatgaaca acctaagagg cgaagacacc gctgtgtact attgtgcccg ttacgactac 300 gatgggtact acgccatgga ctattggggc cagggaacct tggtgactgt gtcaagtggc 360 gggggcggca gcggaggcgg tggcagcgga ggcggcggtt ctgatattca aatgacgcaa 420 agtcccagca gcctctccgc ctccgttgga gacagggtga ctattacatg ccaagccagc 480 cccgatatta atagctactt aaattggtat cagcagaaac ctgggaaggc acctaaactt 540 ctcatctacc gcgctaacaa tctggagacc ggcgtgccgt ctagattttc cggctctgga 600 tcagggaccg attttactct gacaattagt tccctgcaac ccgaagacat cgccacttat 660 tattgcctgc aatatgatga gtttccttac acatttggtc agggaactaa actagagatt 720 aagaagccta ccaccacccc cgcacctcgt cctccaaccc ctgcacctac gattgccagt 780 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Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 236 aagagaggcc ggaagaaact gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 60 accacccagg aagaggacgg ctgcagctgc cggttccccg aggaagagga aggcggctgc 120 gaactg 126 <210> 237 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 237 aggagcaagc ggagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc ccggaggcct 60 ggccccaccc ggaagcacta ccagccctac gcccctccca gggacttcgc cgcctaccgg 120 agc 123 <210> 238 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 238 ctgtgcgcac gcccacgccg cagccccgcc caagaagatg gcaaagtcta catcaacatg 60 ccaggcaggg gc 72 <210> 239 <211> 156 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 239 tacttcctgg gccggctggt ccctcggggg cgaggggctg cggaggcagc gacccggaaa 60 cagcgtatca ctgagaccga gtcgccttat caggagctcc agggtcagag gtcggatgtc 120 tacagcgacc 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 252 atggggaaga acaaactcct tcatccaagt ctggttcttc tcctcttggt cctcctgccc 60 acagacgcc 69 <210> 253 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 253 atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgt 57 <210> 254 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 254 atggacatga gggtccctgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctggct ctcaggtgcc 60 agatgt 66 <210> 255 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 255 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgt 57 <210> 256 <211> 1005 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 256 cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60 acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc 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261 aactgggtga atgtgatcag cgacctgaag aagatcgagg atctgatcca gagcatgcac 60 attgatgcca ccctgtacac agaatctgat gtgcacccta gctgtaaagt gaccgccatg 120 aagtgttttc tgctggagct gcaggtgatt tctctggaaa gcggagatgc ctctatccac 180 gacacagtgg agaatctgat catcctggcc aacaatagcc tgagcagcaa tggcaatgtg 240 acagagtctg gctgtaagga gtgtgaggag ctggaggaga agaacatcaa ggagtttctg 300 cagagctttg tgcacatcgt gcagatgttc atcaatacaa gc 342 <210> 262 <211> 711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 262 attacatgcc ctcctccaat gtctgtggag cacgccgata tttgggtgaa gtcctacagc 60 ctgtacagca gagagagata catctgcaac agcggcttta agagaaaggc cggcacctct 120 tctctgacag agtgcgtgct gaataaggcc acaaatgtgg cccactggac aacacctagc 180 ctgaagtgca ttagagatcc tgccctggtc caccagaggc ctgcccctcc atctacagtg 240 acaacagccg gagtgacacc tcagcctgaa tctctgagcc cttctggaaa agaacctgcc 300 gccagctctc ctagctctaa taataccgcc gccacaacag ccgccattgt gcctggatct 360 cagctgatgc ctagcaagtc tcctagcaca 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Porcine teschovirus 1 <400> 266 gcaacgaact tctctctcct aaaacaggct ggtgatgtgg aggagaatcc tggtcca 57 <210> 267 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 267 ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60 ggacct 66 <210> 268 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 268 cgtgcaaagc gtgcaccggt gaaacaggga agcggagcta ctaacttcag cctgctgaag 60 caggctggag acgtggagga gaaccctgga cct 93 <210> 269 <211> 60 <212> DNA <213> Equine rhinitis A virus <400> 269 cagtgtacta attatgctct cttgaaattg gctggagatg ttgagagcaa ccctggacct 60 <210> 270 <211> 66 <212> DNA <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 270 gtcaaacaga ccctaaactt tgatctgcta aaactggccg gggatgtgga aagtaatccc 60 ggcccc 66 <210> 271 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 271 cgtgcaaagc gt 12 <210> 272 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 272 agagccaaga gggcaccggt gaaacagact ttgaattttg accttctgaa gttggcagga 60 gacgttgagt ccaaccctgg gccc 84 <210> 273 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 273 ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatct 45 <210> 274 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 274 ggcagcacct ccggcagcgg caagcctggc agcggcgagg gcagcaccaa gggc 54 <210> 275 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 275 ggaagcgga 9 <210> 276 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 276 agtggcagcg gc 12 <210> 277 <211> 258 <212> DNA <213> 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ccagatcacc 480 ctgctgaagg cttgcagcag cgaggtgatg atgctgaggg tggccaggag gtacgacgcc 540 gccagcgaca gcatcctgtt cgccaacaac caggcttaca ccagggacaa ctacaggaag 600 gctggcatgg ccgaggtgat cgaggacctc ctgcacttct gcagatgtat gtacagcatg 660 gccctggaca acatccacta cgccctgctg accgccgtgg tgatcttcag cgacaggccc 720 ggcctggagc agccccagct ggtggaggag atccagaggt actacctgaa caccctgagg 780 atctacatcc tgaaccagct gagcggcagc gccaggagca gcgtgatcta cggcaagatc 840 ctgagcatcc tgagcgagct gaggaccctg ggaatgcaga acagcaatat gtgtatcagc 900 ctgaagctga agaacaggaa gctgcccccc ttcctggagg agatttggga cgtggccgac 960 atgagccaca cccagccccc ccccatcctg gagagcccca ccaacctg 1008 <210> 282 <211> 1008 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 282 cggcctgagt gcgtagtacc cgagactcag tgcgccatga agcggaaaga gaagaaagca 60 cagaaggaga aggacaaact gcctgtcagc acgacgacgg tggacgacca catgccgccc 120 attatgcagt gtgaacctcc acctcctgaa gcagcaagga ttcacgaagt ggtcccaagg 180 tttctctccg 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 283 atgaagctac tgtcttctat cgaacaagca tgcgatattt gccgacttaa aaagctcaag 60 tgctccaaag aaaaaccgaa gtgcgccaag tgtctgaaga acaactggga gtgtcgctac 120 tctcccaaaa ccaaaaggtc tccgctgact agggcacatc tgacagaagt ggaatcaagg 180 ctagaaagac tggaacagct atttctactg atttttcctc gagaagacct tgacatgatt 240 ttgaaaatgg attctttaca ggatataaaa gcattgttaa caggattatt tgtacaagat 300 aatgtgaata aagatgccgt cacagataga ttggcttcag tggagactga tatgcctcta 360 acattgagac agcatagaat aagtgcgaca tcatcatcgg aagagagtag taacaaaggt 420 caaagacagt tgactgtatc gccggaattc ccggggatcc ggcctgagtg cgtagtaccc 480 gagactcagt gcgccatgaa gcggaaagag aagaaagcac agaaggagaa ggacaaactg 540 cctgtcagca cgacgacggt ggacgaccac atgccgccca ttatgcagtg tgaacctcca 600 cctcctgaag cagcaaggat tcacgaagtg gtcccaaggt ttctctccga caagctgttg 660 gtgacaaacc ggcagaaaaa catcccccag ttgacagcca accagcagtt ccttatcgcc 720 aggctcatct ggtaccagga cgggtacgag cagccttctg atgaagattt 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tgcgacatct gcaggctgaa gaagctgaag 60 tgcagcaagg agaagcccaa gtgcgccaag tgcctgaaga acaactggga gtgcagatac 120 agccccaaga ccaagaggag ccccctgacc agggcccacc tgaccgaggt ggagagcagg 180 ctggagaggc tggagcagct gttcctgctg atcttcccca gggaggacct ggacatgatc 240 ctgaagatgg acagcctgca agacatcaag gccctgctga ccggcctgtt cgtgcaggac 300 aacgtgaaca aggacgccgt gaccgacagg ctggccagcg tggagaccga catgcccctg 360 accctgaggc agcacaggat cagcgccacc agcagcagcg aggagagcag caacaagggc 420 cagaggcagc tgaccgtgag ccccgagttt cccgggcggc ctgagtgcgt agtacccgag 480 actcagtgcg ccatgaagcg gaaagagaag aaagcacaga aggagaagga caaactgcct 540 gtcagcacga cgacggtgga cgaccacatg ccgcccatta tgcagtgtga acctccacct 600 cctgaagcag caaggattca cgaagtggtc ccaaggtttc tctccgacaa gctgttggtg 660 acaaaccggc agaaaaacat cccccagttg acagccaacc agcagttcct tatcgccagg 720 ctcatctggt accaggacgg gtacgagcag ccttctgatg aagatttgaa gaggattacg 780 cagacgtggc agcaagcgga cgatgaaaac gaagagtcgg acactccctt ccgccagatc 840 acagagatga ctatcctcac ggtccaactt atcgtggagt tcgcgaaggg 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<221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Val or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Any amino acid <400> 286 Asp Xaa Glu Xaa Asn Pro Gly Pro 1 5 <210> 287 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 287 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 288 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(26) <223> This region may encompass 2-5 "Glu Ala Ala Ala Lys" repeating units <400> 288 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala 20 25 <210> 289 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> This sequence may encompass 0-15 "Gly Ser" repeating units <400> 289 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 20 25 30 <210> 290 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> This sequence may encompass 0-15 "Ser Gly" repeating units <400> 290 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly 20 25 30 <210> 291 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(45) <223> This sequence may encompass 0-15 "Gly Ser Gly" repeating units <400> 291 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 35 40 45 <210> 292 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(60) <223> This sequence may encompass 0-15 "Ser Gly Ser Gly" repeating units <400> 292 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly 20 25 30 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly 50 55 60 <210> 293 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 293 Ala Pro Val Lys Gln 1 5 <210> 294 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 294 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20

Claims (48)

  1. 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 단리된 핵산으로서, 여기서, CAR이
    (a) ROR-1 항원 결합 도메인;
    (b) 스페이서;
    (c) 막관통 도메인;
    (d) 4-1BB 또는 CD28, 또는 둘 다를 포함하는 공동자극성 (costimulatory) 신호전달 도메인; 및
    (e) CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는, 단리된 핵산.
  2. 제1항에 있어서, CAR이
    (a) 서열번호: 3 내지 14에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드; 또는
    (b) 서열번호: 75 내지 82에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 중 적어도 하나를 포함하는, 단리된 핵산.
  3. 제1항에 있어서, ROR-1 항원 결합 도메인이 서열번호: 15 내지 74에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 단리된 핵산.
  4. 제1항에 있어서, ROR-1 항원 결합 도메인이 서열번호: 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 및 73에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 단리된 핵산.
  5. 제1항에 있어서, ROR-1 항원 결합 도메인이 서열번호: 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 및 74에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 단리된 핵산.
  6. 제1항에 있어서, 공동자극성 신호전달 도메인이 4-1BB를 포함하는, 단리된 핵산.
  7. 제1항에 있어서, 공동자극성 신호전달 도메인이 CD28을 포함하는, 단리된 핵산.
  8. 제1항에 있어서, CD3 제타 신호전달 도메인이 서열번호: 93의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 단리된 핵산.
  9. 제1항에 있어서, 서열번호: 94 내지 108의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 단리된 핵산.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 태그를 추가로 포함하는, 단리된 핵산.
  11. 제10항에 있어서, 세포 태그가 말단절단된 (truncated) 표피 성장 인자 수용체인, 단리된 핵산.
  12. 제11항에 있어서, 말단절단된 표피 성장 인자 수용체가 HER1t이고, 서열번호: 109의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 단리된 핵산.
  13. 제11항에 있어서, 말단절단된 표피 성장 인자 수용체가 HER1t-1이고, 서열번호: 110의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 단리된 핵산.
  14. 제1항에 있어서, 이종성 유전자 발현의 리간드 유도성 제어를 위한 유전자 스위치 폴리펩티드를 코딩하는 추가의 폴리뉴클레오티드를 더 포함하고, 여기서 유전자 스위치 폴리펩티드가 (a) 제1 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 DNA 결합 도메인을 포함하는 제1 유전자 스위치 폴리펩티드; 및 (b) 제2 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 전사활성화 도메인을 포함하는 제2 유전자 스위치 폴리펩티드를 포함하고; 상기 제1 유전자 스위치 폴리펩티드 및 제2 유전자 스위치 폴리펩티드는 링커에 의해 연결되는, 단리된 핵산.
  15. (1) 세포 태그;
    (2) 시토카인; 및
    (3) 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산 서열, 및 백본을 포함하는 벡터로서, 여기서 CAR이
    (a) ROR-1 항원 결합 도메인;
    (b) 스페이서;
    (c) 막관통 도메인;
    (d) 4-1BB 또는 CD28, 또는 둘 다를 포함하는 공동자극성 신호전달 도메인; 및
    (e) CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는 , 벡터.
  16. 제15항에 있어서, 벡터가 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 또는 비-바이러스 벡터인, 벡터.
  17. 제15항에 있어서, 세포 태그가 말단절단된 표피 성장 인자 수용체인, 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 말단절단된 표피 성장 인자 수용체가 HER1t, HER1t-1 또는 그의 기능성 변이체인, 벡터.
  19. 제15항에 있어서, 시토카인이 IL-15인, 벡터.
  20. 제19항에 있어서, IL-15가 막 결합 IL-15인, 벡터.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 자기 절단 (self-cleaving) 토세아 아시그나 (Thosea asigna) 바이러스 (T2A) 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 벡터.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 백본이 슬리핑 뷰티 (Sleeping Beauty) 트랜스포존 DNA 플라스미드인, 벡터.
  23. 제15항에 있어서, CAR이
    (a) 서열번호: 3 내지 14에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드; 또는
    (b) 서열번호: 75 내지 82에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 중 적어도 하나를 포함하는, 벡터.
  24. 제15항에 있어서, ROR-1 항원 결합 도메인이 서열번호: 15 내지 74에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 벡터.
  25. 제15항에 있어서, ROR-1 항원 결합 도메인이 서열번호: 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 및 73에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 벡터.
  26. 제15항에 있어서, ROR-1 항원 결합 도메인이 서열번호: 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 및 74에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 벡터.
  27. 제16항에 있어서, 비-바이러스 벡터가 슬리핑 뷰티 트랜스포존인, 벡터.
  28. 제15항에 있어서, 이종성 유전자 발현의 리간드 유도성 제어를 위한 유전자 스위치 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 포함하는 추가 벡터를 더 포함하고, 여기서 유전자 스위치 폴리펩티드가 (a) 제1 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 DNA 결합 도메인을 포함하는 제1 유전자 스위치 폴리펩티드; 및 (b) 제2 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 전사활성화 도메인을 포함하는 제2 유전자 스위치 폴리펩티드를 포함하고; 상기 제1 유전자 스위치 폴리펩티드 및 제2 유전자 스위치 폴리펩티드는 링커에 의해 연결되는, 벡터.
  29. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단리된 핵산을 포함하는 면역 이펙터 세포.
  30. 제15항 내지 제28항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 면역 이펙터 세포.
  31. (1) 세포 태그; (2) 시토카인; 및 (3) 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 면역 이펙터 세포로서,
    여기서 CAR이 (a) ROR-1 항원 결합 도메인; (b) 스페이서; (c) 막관통 도메인; (d) 4-1BB 또는 CD28, 또는 둘 다를 포함하는 공동자극성 신호전달 도메인; 및 (e) CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는, 면역 이펙터 세포.
  32. 제31항에 있어서, 시토카인이 IL-15인, 면역 이펙터 세포.
  33. 제32항에 있어서, IL-15가 막 결합 IL-15인, 면역 이펙터 세포.
  34. 제31항에 있어서, 세포 태그가 말단절단된 표피 성장 인자 수용체인, 면역 이펙터 세포.
  35. 제34항에 있어서, 말단절단된 표피 성장 인자 수용체가 HER1t, HER1t-1 또는 그의 기능성 변이체인, 면역 이펙터 세포.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 또는 조절 T 세포인, 면역 이펙터 세포.
  37. 제31항에 있어서, CAR이 서열번호: 3 내지 14 또는 서열번호: 75 내지 82에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 중 적어도 하나를 포함하는, 면역 이펙터 세포.
  38. 제31항에 있어서, CAR이 서열번호: 15 내지 74에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 중 적어도 하나를 포함하는, 면역 이펙터 세포.
  39. 제31항에 있어서, 이종성 유전자 발현의 리간드 유도성 제어를 위한 유전자 스위치 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 여기서 유전자 스위치 폴리펩티드가 (a) 제1 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 DNA 결합 도메인을 포함하는 제1 유전자 스위치 폴리펩티드; 및 (b) 제2 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 전사활성화 도메인을 포함하는 제2 유전자 스위치 폴리펩티드를 포함하고; 상기 제1 유전자 스위치 폴리펩티드 및 제2 유전자 스위치 폴리펩티드는 링커에 의해 연결되는, 면역 이펙터 세포.
  40. 표적 세포 집단 또는 조직에 대한 T 세포-매개 면역 반응을 필요로 하는 인간 대상체에서 상기 T 세포-매개 면역 반응을 자극시키는 방법으로서, 인간 대상체에게 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 CAR이
    (a) ROR-1 항원 결합 도메인;
    (b) 스페이서;
    (c) 막관통 도메인;
    (d) 4-1BB 또는 CD28, 또는 둘 다를 포함하는 공동자극성 신호전달 도메인;
    (e) CD3 제타 신호전달 도메인; 및
    (f) 말단절단된 표피 성장 인자 수용체 (HER1t)를 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 인간이 폐암, 유방암, 췌장암, 난소암, 전립선암, 부신암, 흑색종, 자궁암, 고환암, 또는 방광암 중 적어도 하나를 갖는 것으로 진단된, 방법.
  42. 제40항에 있어서, 인간이 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin's lymphoma), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모발상 세포 백혈병 (HCL), 다발성 골수종 (MM), 급성 골수성 백혈병 (AML), 또는 만성 골수성 백혈병 (CML)으로 진단된, 방법.
  43. 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 유효량의 조작된 T 세포를 1회 이상의 용량으로 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 조작된 T 세포가 ROR-1 CAR 및 막 결합 IL-15를 포함하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 제1 용량의 유효량의 조작된 T 세포가 복강내로 또는 정맥내로 투여되는. 방법.
  45. 제43항에 있어서, 암이 비호지킨 림프종, 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모발상 세포 백혈병 (HCL), 다발성 골수종 (MM), 급성 골수성 백혈병 (AML), 또는 만성 골수성 백혈병 (CML), 방법.
  46. 제43항에 있어서, 암이 폐암, 유방암, 췌장암, 난소암, 전립선암, 부신암, 흑색종, 자궁암, 고환암, 또는 방광암인, 방법.
  47. 제43항에 있어서, ROR-1 CAR이 서열번호: 3 내지 14, 서열번호: 75 내지 82, 또는 서열번호: 15 내지 74에 제시된 서열 중 어느 하나에 의해 코딩되는, 방법.
  48. 제43항에 있어서, 조작된 T 세포의 유효량이 적어도 102개의 세포/kg, 104개의 세포/kg, 또는 105개의 세포/kg인, 방법.
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