UA125718C2 - Композиції антитіл до ror1 і пов'язані з ними способи - Google Patents

Композиції антитіл до ror1 і пов'язані з ними способи Download PDF

Info

Publication number
UA125718C2
UA125718C2 UAA201808044A UAA201808044A UA125718C2 UA 125718 C2 UA125718 C2 UA 125718C2 UA A201808044 A UAA201808044 A UA A201808044A UA A201808044 A UAA201808044 A UA A201808044A UA 125718 C2 UA125718 C2 UA 125718C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
shi
antibodies
zeo
still
Prior art date
Application number
UAA201808044A
Other languages
English (en)
Inventor
Крістоф Радер
Кристоф Радер
Хаійонг Пенг
Хаийонг Пенг
Роджер Беерлі
Роджер Беерли
Лоренц Валдмайер
Ульф Гравундер
Original Assignee
Зе Скріппс Ресеарч Інстітьют
Зе Скриппс Ресеарч Инститьют
Нбе-Терапеутікс Аг
Нбе-Терапеутикс Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Зе Скріппс Ресеарч Інстітьют, Зе Скриппс Ресеарч Инститьют, Нбе-Терапеутікс Аг, Нбе-Терапеутикс Аг filed Critical Зе Скріппс Ресеарч Інстітьют
Publication of UA125718C2 publication Critical patent/UA125718C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6903—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being semi-solid, e.g. an ointment, a gel, a hydrogel or a solidifying gel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/10—Protein-tyrosine kinases (2.7.10)
    • C12Y207/10001—Receptor protein-tyrosine kinase (2.7.10.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Винахід стосується антитіла, зв'язувального білка на основі антитіла або фрагмента антитіла, які зв'язуються з позаклітинним доменом орфанного рецептора 1, подібного рецепторній тирозинкіназі людини (ROR1), які містять послідовності CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга і послідовності CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга, відповідно викладені в SEQ ID NO:27-29 і SEQ ID NO:66-68. Також винахід стосується кон'югата антитіла з лікарським засобом (ADC) і химерного антигенного рецептора (CAR), фармацевтичної композиції та способу лікування із застосуванням таких антитіл.

Description

Посилання на родинну заявку
ІО0ОО1Ї Згідно з даною заявкою заявляється пріоритет за попередньою заявкою на видачу патенту
США Мо 62/280843 (яка подана 20 січня 2016 року). Повне розкриття пріоритетної заявки включено в даний документ за допомогою посилання в повному її обсязі й для будь-яких цілей.
Рівень техніки
І0002| Злоякісна пухлина є однією з головних причин смерті. Це клас захворювань, що викликається злоякісною трансформацією здорових клітин, зумовленою генетичними змінами, такими як хромосомні транслокації, мутації в генах-супресорах пухлин, транскрипційних факторах або рецепторах фактора росту, що призводить до імморталізації клітин. Якщо імморталізація поєднується з надмірною проліферацією, імморталізовані клітини утворюють пухлини з метастазами або без них (у разі солідних пухлин) або лейкози й лімфоми (злоякісні пухлини крові). Дефектний апоптоз або запрограмована загибель клітин можуть додатково сприяти злоякісній трансформації клітин, що призводить до розвитку злоякісної пухлини.
І0003| Представники сімейства мембраноасоційованих рецепторних тирозинкіназ, що складається з орфанних рецепторів 1 і 2 рецепторних тирозинкіназ (гесеріог їугозіпе Кіпазе огрпап гесеріог-КОКТІ і
КОН), були описані як специфічно пов'язані з конкретними злоякісними пухлинами (Кебадау еї аї. (2012) Егопі ОпсоїЇ. 2 (34)), при цьому їх експресія в основному відсутня на здоровій тканині за небагатьма винятками (Ваїакгізппап еї аї. (2016) Сіїп Сапсег Кев. аоі: 10.1158/1078-0432). Чи пов'язана експресія КОК функціонально з онкогенезом, чи ні, залишається неясним. Проте, через дуже пухлинновибіркову експресію представників сімейства КОК вони являють собою придатні мішені для цілеспрямованих терапій проти злоякісної пухлини. Орфанний рецептор 1 рецепторної тирозинкінази (гесеріог іугозіпе Кіпазе огрпап гесеріої/-1-КОКІ) представляє особливий інтерес як мішень злоякісної пухлини через його майже 100 95 зв'язок з хронічним лімфоцитарним лейкозом (СІ І) (Спиі еї аї. (2016)
Віоса 128(25), р. 2931) і спостереження, що він також експресується у деяких солідних пухлинах, таких як пухлина легені та молочної залози (Ваїакгізхппап еї аї. (2016) СіІіп Сапсег Кев. дої: 10.1158/1078- 0432). Представниками сімейства КОК є трансмембранні білки | типу, що містять три окремих позаклітинних домени: Ід, Кгіпдіє і домен НЕгі27Ієд, потім йде трансмембранна перекривальна ділянка й внутрішньоклітинна частина. У внутрішньоклітинній частині у КОКІ є тирозинкіназний домен, два багатих серином/треоніном домени й багатий проліном домен. КОК вивчають у контексті ембріонального моделювання та нейрогенезу за допомогою ряду гомологів. Дані фізіологічні функції дихотомічні, якщо походити з необхідності кіназного домену. У дедалі все більшій кількості літературних джерел КОКІ! добре відомий як маркер злоякісної пухлини, наприклад, під час хронічного лимфоцитарного лейкозу (СІ), за якого експресія КОК1 корелює майже на 100 95, деяких гострих лімфобластних лейкозах (АГ), лімфомах клітин мантійної зони й деяких інших злоякісних новоутвореннях крові. Крім того, КОКІ! має критично важливе значення в прогресуванні низки солідних пухлин, таких як нейробластома, саркома, нирково-клітинна карцинома, злоякісна пухлина молочної залози, злоякісна пухлина легені, злоякісна пухлина товстої кишки, злоякісна пухлина голови й шиї, меланома та інші види злоякісних пухлин. Було показано, що КОМ інгібує апоптоз, потенціює передачу сигналів ЕСЕК, індукує епітеліально-мезенхімальний перехід (ЕМТ) і сприяє утворенню кавеол. Важливо відзначити, що КОКІ в основному можна виявити в ембріональній тканині та зазвичай він відсутній у дорослій тканині, що робить даний білок ідеальною мішенню для лікарських засобів з метою лікування злоякісної пухлини. За цієї причини КОК1 раніше був визнаний мішенню для розробки специфічних до КОКТІ антитіл. Однак, через високу гомологію РОКІ серед різних видів ссавців, яка на 100 95 консервативна на амінокислотному рівні між людьми та яванськими макаками, становить 96,7 95 гомології між людиною та мишею і 96,3 95 гомології між людиною та кроликом, було важко індукувати вироблення високоафінних антитіл до цієї мішені за допомогою стандартних технологій, таких як імунізація тварин. 0004) У літературі було розглянуто кілька антитіл мишей і кроликів. Наприклад, у МО 2007/051077 розглянуті моноклональні антитіла, в тому числі гуманізовані антитіла, спрямовані проти нативного
КОКТ, який виявляється на лімфомах, в тому числі СІ, малій лімфоцитарній лімфомі, В-клітинній лімфомі маргінальної зони й лімфомі Беркетта. У МО 2007/146957 предметом розгляду є способи інгібування зростання пухлинної клітини за допомогою засобів, якими можуть бути КОК1-зв'язувальні антитіла, які інгібують активність КОКІ1-кінази. У ММО 2011/054007 розглянуто спосіб лікування або профілактики злоякісної пухлини, у якій експресується позаклітинний домен КОК!1, шляхом введення специфічних антитіл, націлених на КОКТ1.
ІЇООО5| Крім того, в УМО 2010/124188 розглянуті антитіла до КОКІ людини й, зокрема, моноклональні мишачі антитіла, зазначені під назвою 2А2, тоді як ММО 2012/075158 стосується моноклональних антитіл кролика під назвою К11 і К12. Конкретні антитіла, націлені на КОК'І, також згадані в УМО 2016/094873. У ММО 2011/079902 ії ММО 2012/076066 розглянуті біологічні інгібітори КОК'І, які здатні індукувати клітинну загибель і зв'язуються з обраними послідовностями позаклітинного домену КОК1. УМО 2014/031174 стосується антитіл до КОКІ1, що мають таку ж саму специфічність зв'язування, що й антитіло під назвою 99961. Епітопи зв'язування антитіл до КОКІ додатково згадуються в УМО 2016/187220. У УМО 2011/159847 розглянуті конкретні кон'югати з фрагментами 5сЕм- антитіла, які зв'язують КОКІ. У УМО 2014/167022, МО 2016/055592 і УМО 2016/055593 розглянуті біспецифічні антитіла, націлені на КОКІ, та їх застосування, а в М/О 2015/184203 розглянуті триспеціфічні зв'язувальні молекули. Найбільш нові документи, в яких розкрито гуманізовані моноклональні антитіла до КОКІ, грунтуються на таких первісно розкритих антитілах миші або кролика, як 2А2, К11, К12 або 010.
І0006)| Через невелику кількість доступних специфічних до КОК1 моноклональних антитіл у даній галузі техніки існує потреба в більш вдосконалених антитілах до КОК', які характеризуються більш високою афінністю або іншими функціональними властивостями, яких нема у відомих клонів антитіл.
Також необхідні додаткові діагностичні інструменти для виявлення експресії КОКІ під час пов'язаних з
КОМІ хворобливих станів, наприклад, вестерн-блот і/або імуногістохімія (ІНС). Даний винахід стосується задоволення цих та інших потреб.
Коротке розкриття даного винаходу
І0007| Згідно з одним аспектом, даний винахід стосується нових високоафінних зв'язувальних доменів кролячих антитіл, які специфічно зв'язуються з позаклітинним доменом орфанного рецептора 1, подібного рецепторній тирозинкіназі людини (ПКОКТ), і які були відібрані з високорізноманітних бібліотек фагового дисплея неімунізованих кроликів за допомогою людських позаклітинних доменів
КОМ1 (пКОК), що експресуються в клітинах ссавців як насадки. Варіабельні ділянки кролячих антитіл були відібрані шляхом скринінгу на зв'язування з ЕСО ПКОК1 як у формі рекомбінантних білків, так і на основі зв'язування НКОКТ, який надекспресується на поверхні клітин-хазяїв ссавців. За допомогою такої стратегії були виявлені нові антитіла до ПКОКІ! з безпрецедентною якістю і гарними функціональними властивостями. Крім того, даний винахід стосується химерних повнорозмірних антитіл з варіабельних доменів кролика, злитих з доменами константної ділянки антитіл ЇдС1 людини.
Крім того, даний винахід стосується нових високоафінних гуманізованих антитіл, які були отримані шляхом прищеплення СОК кролячих антитіл до КОКІ1, розкритих у даному документі, на каркас варіабельних важкого й легкого імуноглобулінових ланцюгів. Такі гуманізовані антитіла можна застосовувати для терапії захворювань людини завдяки високій гомології зазначених гуманізованих антитіл до ендогенних, повністю людських антитіл. Згідно з другим аспектом даного винаходу, даний винахід стосується кон'югатів сайт-специфічно кон'югованого антитіла з лікарським засобом (АС) на основі химерних кролячих - людських і гуманізованих антитіл до КОКІ людини (ПКОК1) з ультраактивним антрацикліновим токсином. Сайт-специфічну кон'югацію здійснюють ферментативним кон'югуванням зі застосуванням ферменту сортаза, фактично, як це описано в УМО2014140317, яка включена в даний документ за допомогою посилання. Ультраактивний антрацикліновий токсин, який привів до створення АОС проти ПКОМК1 з безпрецедентною активністю в різних моделях пухлин іп міго і іп мімо, був розкритий у УМО 2016102679, яка включена в даний документ за допомогою посилання.
І0008| Нарешті, даний винахід стосується химерних антигенних рецепторів (САК) та Т-клітин, сконструйованих за допомогою цих САКЕ, тобто так званих САК-Т-клітин, які використовують зазначені
НВО -зв'язувальні домени, що мають високу ефективність іп міїго.
І0009| Отже, даний винахід стосується антитіл до НКОКІ, зв'язувальних білків на основі таких антитіл, фрагментів таких антитіл, кон'югатів антитіла з лікарським засобом (АОС) або САКЕ, які мають таку ж специфічність зв'язування до ПКОКІ, що й у специфічних до ПКОК'1 антитіл, які містять послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну й послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга імуноглобуліну, які відповідно наведені в (1) 5ЕО ІЮ МО і БЕО ІЮ МО:14; (2)
ЗЕО ІЮ МО:2 і 5ЕБЕО ІЮО МО:15; (3) 5ЕО ІО МО:З і 5ЕО ІЮ МО:16; (4) 5ЕО ІЮО МО:4 і 5ЕБЕО ІЮО МО:17; (5)
ЗЕО ІЮО МО:5 ії 5ЕО ІЮО МО:18; (6) 5ЕО ІЮ МО:6 ї 5ЕО ІЮО МО:19; (7) 5ЕО ІЮО МО:7 ії БЕО ІЮ МО:20; (8)
ЗЕО ІЮО МО:8 ії ЗЕО ІЮ МО:21; (9) БЕО ІЮ МО:9 і БЕО ІЮ МО:22; (10) БЕО ІЮ МО 10 і БЕО ІЮ МО:23; (11)
ЗЕО ІЮ МО:11 і ЗЕО ІЮ МО:24; (12) БЕО ІЮ МО:12 і ЗЕО ІЮО МО:25; (13) 5БЕО ІО МО':13 ії ЗЕО ІЮ МО:26; (14) БЕО ІЮО МО:130 ї БЕО ІО МО:136; (15) 5ЕО ІЮО МО:131 і БЕО ІЮ МО:137; (16) 5ЕО ІО МО:132 і ЗЕО
ІО МО:138; (17) ЗЕО ІЮ МО:133 ії БЕО ІЮО МО:139; (18) ЗЕО ІЮ МО:134 і ЗЕО ІЮ МО:140; або (19) ЗЕО ІЮ
МО:135 ії БЕО І МО:141.
І0О010)| Даний винахід додатково стосується антитіл до НКОКТ, зв'язувальних білків на основі таких антитіл, фрагментів таких антитіл, кон'югатів антитіла з лікарським засобом (АОС) або САК, що містять послідовності СОК важкого ланцюга імуноглобуліну й послідовності СОК легкого ланцюга імуноглобуліну, які щонайменше на 90 95 або щонайменше на 95 95 або більше ніж на 95 95, але менше ніж на 100 95 ідентичні відповідно з (1) ЗЕО ІЮ МО:27-29 і ЗЕО ІЮ МО:66-68, (2) 5ЕО 10 МО:30- 32 і ЗЕО ІЮ МО:69-71, (3) БЕО ІЮ МО:33-35 і БЕО ІЮ МО:72-74, (43 5ЕО ІЮ МО:36-38 і ЗЕО ІЮ МО:75-77, (5) 5ЕО ІЮ МО:39-41 і БЕО ІЮ МО:78-80, (6) 5ЕО 10 МО:42-44 і 5ЕО І МО:81-83, (7) 5ЕО ІЮ МО:45-47 і
ЗЕО І МО:84-86, (8) 5ЕО ІЮ МО:48-50 і ЗЕО ІЮ МО:87-89, (93 БЕО ІЮО МО:51-53 і ЗЕО ІЮ МО:90-92, (10)
ЗЕО ІЮ МО: 54-56 і ЗЕО ІЮО МО: 93-95, (11) БЕО ІЮ МО:57-59 і БЕО ІЮ МО:96-98, (12) 5ЕО ІЮ МО:60-62 і
ЗЕО ІО МО:99-101 або (13) ЗЕО ІЮ МО:63-65 і ЗЕО ІЮ МО:102-104. 0011) Даний винахід додатково стосується антитіл до НКОНМ, зв'язувальних білків на основі таких антитіл, фрагментів таких антитіл, кон'югатів антитіла з лікарським засобом (АОС) або САК, що містять послідовності СОК важкого ланцюга імуноглобуліну й послідовності СОК легкого ланцюга імуноглобуліну, які ідентичні відповідно з (1) ЗЕО ІЮ МО:27-29 і ЗЕО ІЮ МО:66-68, (2) БЕО 10 МО:30-32 і ЗЕО ІЮ МО:69-71, (3) БЕО ІЮ МО:33-35 і ЗЕО ІЮ МО:72-74, (4) БЕО ІЮ МО:36-38 і ЗЕО ІЮ МО:75-77, (5)
ЗЕО Ір МО:39-41 і ЗЕО ІЮ МО:78-80, (6) 5ЕО 10 МО:42-44 і 5ЕО ІЮ МО:81-83, (7) 5ЕО ІЮ МО:45-47 і
ЗЕО І МО:84-86, (8) 5ЕО 10 МО:48-50 і ЗЕО ІЮ МО:87-89, (93 БЕО ІЮО МО:51-53 і ЗЕО ІЮ МО:90-92, (10)
ЗЕО ІЮ МО: 54-56 і ЗЕО ІЮО МО: 93-95, (11) БЕО ІЮ МО:57-59 і БЕО ІЮ МО:96-98, (12) 5ЕО ІЮ МО:60-62 і
ЗЕО ІО МО:99-101 або (13) ЗЕО ІЮ МО:63-65 і ЗЕО ІЮ МО:102-104.
І0012)| Даний винахід додатково стосується антитіл до НКОКТ, зв'язувальних білків на основі таких антитіл, фрагментів таких антитіл, кон'югатів антитіла з лікарським засобом (АОС) або САК, що містять або послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну, або послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга імуноглобуліну щонайменше з 90 956 або щонайменше з 95 95 або з більш за 9595, але менше 100 95 ідентичністю на амінокислотному рівні щодо відповідно послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну й послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга імуноглобуліну, які наведені в (1) 5ЕО ІЮ МО:1 ії 5ЕО ІЮ МО:14; (2) 5ЕО ІО
МО:2 ії 5ЕО ІО МО:15; (3) 5ЕО ІЮ МО:З і 5ЕО ІО МО:16; (4) 5ЕО ІЮ МО:4 ії 5ЕО ІЮО МО:17; (53 5ЕО ІЮ
МО:5 ї БЕО ІО МО:18; (6) 5ЕО ІЮ МО:6 їі БЕО ІО МО:19; (7) 5ЕО ІЮ МО:7 і 5ЕО ІЮ МО:20; (8) 5ЕО І
МО:8 ії БЕО ІО МО:21; (9) БЕО ІЮО МО:9 ї БЕО І МО:22; (10) БЕО ІЮО МО:10 ї БЕО ІЮ МО:23; (11) 5БЕО І
МО:11 і ЗЕО ІЮ МО:24; (12) БЕО ІЮ МО:12 і ЗЕО ІЮ МО:25; або (13) ЗЕО ІО МО:13 ії БЕО ІЮО МО:26.
ІО013)| Даний винахід додатково стосується антитіл до НКОКТ, зв'язувальних білків на основі таких антитіл, фрагментів таких антитіл, кон'югатів антитіла з лікарським засобом (АОС) або САКЕ, що містять послідовність СОК важкого ланцюга імуноглобуліну, обрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮ
МО:27-65. Даний винахід додатково стосується антитіл до ЯНКОКТІ, фрагментів таких антитіл, кон'югатів антитіла з лікарським засобом (АБС) або САК, що містять послідовність СОК легкого ланцюга імуноглобуліну, обрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО:66-104. Згідно з деякими варіантами здійснення, специфічні до НКОКІ антитіла, зв'язувальні білки на основі таких антитіл або фрагменти таких антитіл, кон'югати антитіла з лікарським засобом (АОС) або САК містять послідовності СОМ,
СОК2 ї СОКЗ важкого ланцюга, які відповідно ідентичні ЗЕО ІЮ МО:27-29, 5ЕО ІЮ МО:30-32, 5ЕО І
МО:33-35, БЕО І МО:36-38, 5ЕО 10 МО:39-41, БЕО ІЮ МО:42-44, 5ЕО 10 МО:45-47, 5ЕО ІЮ МО:48-50,
ЗЕО ІО МО:51-53, 5ЕО ІЮ МО:54-56, 5ЕО ІЮ МО:57-59, 5ЕО ІЮ МО:60-62 або 5ЕО ІО МО:63-65. 0014) Даний винахід додатково стосується антитіл до НКОКТ, зв'язувальних білків на основі таких антитіл, фрагментів таких антитіл, кон'югатів антитіла з лікарським засобом (А0С) або САК, що містять або послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну, або послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга імуноглобуліну, ідентичну (1) ЗЕО ІЮ МО і ЗЕО ІЮ МО:14; (2)
ЗЕО ІЮ МО:2 і 5ЕО ІЮО МО:15; (3) 5ЕО ІЮ МО:З і 5ЕО ІЮ МО:16; (4) 5ЕО ІЮО МО 4 і 5ЕО ІО МО:17; (5)
ЗЕО ІЮО МО:5 ії 5ЕО ІЮО МО:18; (6) 5ЕО ІЮ МО:6 ї 5ЕО ІЮО МО:19; (7) 5ЕО ІЮО МО:7 ії БЕО ІЮ МО:20; (8)
ЗЕО ІЮО МО:8 ії ЗЕО ІЮ МО:21; (9) БЕО ІЮ МО:9 і БЕО ІЮ МО:22; (10) БЕО ІЮ МО:10 і БЕО ІЮ МО: 23; (11)
ЗЕО ІЮ МО:11 і ЗЕО ІЮ МО:24; (12) БЕО ІЮ МО:12 і ЗЕО ІЮО МО:25; (13) 5БЕО ІО МО':13 ії ЗЕО ІЮ МО:26; (14) БЕО ІЮО МО:130 ї БЕО ІО МО:136; (15) 5ЕО ІЮО МО:131 і БЕО ІЮ МО:137; (16) 5ЕО ІО МО:132 і ЗЕО
ІО МО:138; (17) ЗЕО ІЮ МО:133 ії БЕО ІЮО МО:139; (18) ЗЕО ІЮО МО:134 і ЗЕО ІЮ МО:140; або (19) ЗЕО ІЮ
МО:135 ії БЕО ІОЮ МО:141 0015) Даний винахід додатково стосується антитіл до НКОКТ, зв'язувальних білків на основі таких антитіл, фрагментів таких антитіл, кон'югатів антитіла з лікарським засобом (АОС) або САК, що містять специфічні до ПКОК антитіла, зв'язувальні білки на основі таких антитіл або фрагменти таких антитіл, які містять послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну й послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга імуноглобуліну, які відповідно ідентичні (1) БЕО ІЮ
МО:1 ї БЕО ІО МО:14; (2) БЕО ІЮ МО:2 і БЕО ІО МО:15; (3) БЕО ІЮ МО:З і 5ЕО ІЮО МО:16; (4) 5ЕО ІЮ
МО:4 ії БЕО ІО МО:17; (5) 5ЕО ІЮ МО:5 і БЕО ІОЮО МО:18; (6) 5ЕО ІЮ МО:6 і 5ЕО ІЮО МО:19; (7) 5ЕО ІЮ
МО:7 ії БЕО ІО МО:20; (8) 5ЕО ІЮО МО:8 і БЕО ІЮ МО:21; (9 5ЕО ІЮО МО:9 їі БЕО ІЮО МО:22; (10) 5ЕО ІЮ
МО:10 і БЕО ІО МО:23; (11) БЕО ІЮО МО:11 і БЕО ІЮ МО:24; (12) БЕО ІЮ МО:12 і БЕО ІО МО:25; (13) ЗЕО
ІО МО:13 ї БЕО ІЮ МО:26; (14) 5ЕО ІЮ МО:130 ї ЗЕО ІЮ МО:136; (15) 5ЕО ІЮ МО:131 ї БЕО ІЮ МО:137; (16) БЕО ІО МО:132 ї БЕО ІО МО:138; (17) 5ЕО ІЮО МО:133 і БЕЕО ІЮ МО:139; (18) 5ЕО ІО МО:134 і ЗЕО
ІО МО:140; або (19) ЗЕО ІЮО МО:135 і ЗЕО ІЮ МО:141.
І0016) Згідно з деякими варіантами здійснення, антитіла до НКОКТ, зв'язувальні білки на основі таких антитіл, фрагменти таких антитіл, кон'югати антитіла з лікарським засобом (АОС) або САК містять послідовність СОК легкого ланцюга імуноглобуліну, обрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮ
МО:66-104. Деякі з цих молекул додатково несуть послідовність СОМ важкого ланцюга імуноглобуліну, обрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО:27-65. Деякі з цих молекул несуть послідовності СОК'І,
СОК2 ї СОКЗ легкого ланцюга імуноглобуліну, які відповідно ідентичні ЗЕ ІЮ МО:66-68, 5ЕО І
МО:69-71, ЕО ІЮ МО:72-74, 5ЕО ІЮ МО:75-77, 5ЕО ІЮ МО:78-80, 5ЕО 10 МО:81-83, 5ЕО ІЮ МО:84-86,
ЗЕО І МО:87-89, 5ЕО ІЮ МО:90-92, 5ЕО ІЮ МО:93-95, 5ЕО І МО:96-98, 5ЕО ІЮ МО:99-101 або 5ЕО
ІО МО:102-104. Згідно з деякими варіантами здійснення, антитіла до ПКОКТ, зв'язувальні білки на основі таких антитіл, фрагменти таких антитіл, кон'югати антитіла з лікарським засобом (АОС) або
СА містять послідовності СОМКІ, СОК2 ії СОКЗ важкого ланцюга імуноглобуліну та послідовності
СОКІ1, СОР і СОКЗ легкого ланцюга імуноглобуліну, які відповідно наведені в (1) 5ЕО ІЮ МО:27-29 і
ЗЕО Ір МО:66-68, (2) 5ЕО ІЮ МО:30-32 і ЗЕО ІЮ МО:69-71, (3) 5ЕО ІЮ МО:33-35 і БЕО ІЮ МО:72-74, (4)
ЗЕО Ір МО:36-38 і ЗЕО ІЮ МО:75-77, (5) 5ЕО ІЮ МО:39-41 і ЗЕО ІЮ МО:78-80, (6) 5ЕО ІЮ МО:42-44 і
ЗЕО Ір МО:81-83, (7) 5ЕО ІЮ МО:45-47 і ЗЕО ІЮ МО:84-86, (8) 5ЕО ІЮ МО:48-50 і БЕО ІЮ МО:87-89, (9)
ЗЕО ІЮ МО:С51-53 і ЗЕО ІЮ МО:90-92, (10) 5ЕО ІЮ МО:54-56 і ЗЕО ІЮО МО:93-95, (11) 5ЕО І МО:57-59 1
ЗЕО ІЮ МО:96-98, (12) 5ЕО ІЮО МО:60-62 і 5ЕО ІЮ МО:99-101 або (13) 5ЕО ІЮ МО: 63-65 і ЗЕО ІЮ
МО:102-104.
ІО0О17| Даний винахід додатково стосується ПКОК1-специфічних гуманізованих антитіл, зв'язувальних білків на основі таких антитіл, фрагментів таких антитіл, кон'югатів антитіла з лікарським засобом (АОС) або САК щонайменше з 90 95, або щонайменше з 95 95, або щонайменше з 95 95, але не менше ніж зі 100 95 гомології на амінокислотному рівні з важким і легким ланцюгом імуноглобуліну, наведеному під: (14) ЗЕО ІЮ МО:130 ії ЗЕО ІЮ МО:136; (15) ЗЕО ІЮ МО:131 і БЕО ІЮ МО:137; (16) ЗЕО
ІО МО:132 ії БЕО ІО МО:138; (17) БЕО ІЮО МО:133 ї БЕО ІЮ МО:139; (18) БЕО ІЮ МО:134 і БЕО ІЮ МО:140; або (19) ЗЕО ІЮ МО:135 і ЗЕО ІЮ МО:141.
ІОО18| Згідно з ще одними додатковими варіантами здійснення, ПКОК1-специфічні антитіла, зв'язувальні білки на основі таких антитіл або фрагменти таких антитіл є або ізотипами ІдАЇ, ІдАг, дО,
І9ЗЕ, 191, Ідс2, ІдСЗ Ідс4 або І9М, або їх К(ар)2, Ем, 5сЕм, ІДСАСН2, К(аб)2, зсЕмМ2СНЗ, Раб, мі, МН, 5сЕм4, всгЕм3, зсЕм2, азЕм, Ем, зсЕм-Ес, (5СЕмМ)2 фрагментами, або невиснажувальними дос, діатіламі або бівалентними антитілами. Деякі з таких молекул є Ідс, вибрані з групи, що складається з природних ізотипів ІДС, Ідс2, ІдеЗ, Ід04 або синтетичних до. Деякі такі молекули є Раб, зсЕм або азЕм. Згідно з деякими варіантами здійснення, специфічні до ПКОКІ антитіла, зв'язувальні білки на основі таких антитіл або фрагменти таких антитіл за даним винаходом кон'юговані з синтетичною молекулою. Синтетичною молекулою може бути, наприклад, мітка, цитотоксичний засіб, радіоіїзотопи або ліпосоми. Цитотоксичним засобом може бути, наприклад, низькомолекулярний токсин, пептидний токсин або білковий токсин. Згідно з деякими варіантами здійснення, специфічні до НКОКІ антитіла, зв'язувальні білки на основі таких антитіл або фрагменти таких антитіл кон'юговані з трансмембранною ділянкою та внутрішньоклітинним сигнальним доменом Т-клітинного рецептора (ТСЕК) з утворенням химерного антигенного рецептора (САК).
І0019| Даний винахід додатково стосується кон'югатів антитіла з лікарським засобом (АОС), що містять специфічне до ЯКОКІ1 гуманізоване або химерне антитіло, зв'язувальний білок на основі антитіла або фрагмент антитіла з корисним вантажем у формі токсину, які діють шляхом ефективного знищення ПКОК1-специфічних клітин. У зазначених АОС корисний вантаж у формі токсину може бути кон'югований не сайт-специфічним способом з антитілом, зв'язувальним білком на основі такого антитіла або фрагментом такого антитіла через бічні ланцюги амінокислот лізин або цистеїн з використанням класичних хімічних лінкерів з малеїмідною функціональною групою або з іншою відомою в даній галузі техніки хімічної групою, яка може опосередковувати кон'югацію з бічними ланцюгами амінокислот лізин або цистеїн. У зазначених АОС низькомолекулярний корисний вантаж також може бути кон'югований сайт-специфічним способом за допомогою будь-якої з хімічної, хемоферментативної або ферментативної кон'югації, які відомі в даній галузі техніки, такої як, наприклад, із застосуванням біфункціональних лінкерів, лінкерів, що забезпечують проходження реакції Пікте - Шпенглера на формілгліцині з утворенням модифікованих ферментом антитіл, за допомогою глікан-ремодельованих антитіл або за допомогою бактеріальних ферментів трансглутаміназа або сортаза.
І0020| Згідно з деякими родинними аспектами, даний винахід стосується фармацевтичних композицій або наборів, які містять терапевтично ефективну кількість антитіла до ПКОКІ1, зв'язувального білка на основі такого антитіла, фрагмента такого антитіла, кон'югата антитіла з лікарським засобом (АОС), які описані в даному документі, й фармацевтично прийнятний носій. Деякі набори за даним винаходом можуть додатково містити один або декілька буферів для імуноаналізу. У даному винаході також представлені полінуклеотиди, які кодують варіабельну ділянку важкого ланцюга імуноглобуліну або легкого ланцюга імуноглобуліну антитіл до НКОКТ, зв'язувальних білків на основі таких антитіла, фрагментів таких антитіл, кон'югатів антитіла з лікарським засобом (АОС) або САК, які розкриті в даному документі, а також вектори експресії, що несуть таку полінуклеотидну послідовність. 00211) Згідно з іншим аспектом, даний винахід стосується способів знищення або інгібування зростання клітини, що експресує ЯНКОК1. Способи передбачають введення терапевтично ефективної кількості антитіл до ПКОКТ, зв'язувального білка на основі такого антитіла, фрагмента такого антитіла, кон'югату антитіла з лікарським засобом (АОС) або САК за даним винаходом суб'єктові, який цього потребує, що забезпечує знищення або інгібування у суб'єкта зростання клітини, що експресує НКОКІ1.
Деякі з цих способів спрямовані конкретно на знищення або інгібування пухлинних клітин. Згідно з іншим аспектом, даний винахід стосується способів лікування у суб'єкта захворювання або стану, пов'язаного з підвищеною експресією ПКОКІ. Ці способи передбачають введення терапевтично ефективної кількості антитіл до ПКОКТ, зв'язувальних білків на основі таких антитіл, фрагментів таких антитіл, АОС або САК за даним винаходом суб'єктові, який страждає на захворювання або стан, що пов'язані з підвищеною експресією ПКОМК1, що забезпечує лікування у суб'єкта захворювання або стану, пов'язаного з підвищеною експресією ПКОКТ1. Деякі з цих терапевтичних способів спрямовані конкретно на лікування злоякісної пухлини. Наприклад, способи можна використовувати для лікування суб'єктів, які страждають різними видами злоякісної пухлини, включаючи, наприклад, СІ, АГ, лімфому клітин мантійної зони, нейробластому, саркому, нирково-клітинну карциному, злоякісну пухлину молочної залози, злоякісну пухлину легені, злоякісну пухлину товстої кишки, злоякісну пухлину голови й шиї та меланому. 00221 Згідно з ще одним аспектом, даний винахід стосується способів виявлення зміненого рівня
КОМІ у суб'єкта. Такі способи передбачають (а) отримання біологічного зразка від суб'єкта; (Б) приведення в контакт зразка з антитілами до ПЯКОКТ, зв'язувальними білками на основі таких антитіл або фрагментами таких антитіл за даним винаходом; (с) визначення рівня КОКІ у біологічному зразку; і (4) порівняння рівня КОКІ1 у біологічному зразку з контрольним рівнем КОК'І1, тим самим визначаючи, чи змінений рівень КОКІ1 у біологічному зразку відносно контрольного рівня КОК1. У деяких з цих способів підвищений рівень КОКІ у суб'єкта відносно контрольного рівня вказує на захворювання або стан, пов'язаний з підвищеною експресією КОКІ, у суб'єкта. Приклади конкретних захворювань або станів, для яких ці способи є придатними, включають, наприклад, СІ, АГ, лімфому клітин мантійної зони, нейробластому, саркому, нирково-клітинну карциному, злоякісну пухлину молочної залози, злоякісну пухлину легені, злоякісну пухлину товстої кишки, злоякісну пухлину голови й шиї або меланому. 00231 Згідно з іншим родинним аспектом, даний винахід стосується способів виявлення у суб'єкта пухлини, що експресує КОК1. Способи передбачають (а) введення антитіла до НКОКТ, зв'язувального білка на основі такого антитіла або фрагмента такого антитіла за даним винаходом суб'єктові, який має, ймовірно має або знаходиться в групі ризику розвитку пухлини, що експресує КОКТ; і (Б) візуалізацію у суб'єкта ділянки зміненої щільності або концентрації кон'югованої мітки, де щільність або концентрація взята відносно (ї) фону в сусідній тканині або (ії) щільності або концентрації, раніше виявленої в тій самій ділянці у суб'єкта, в результаті чого існування ділянки зміненої щільності або концентрації кон'югованої мітки вказує на наявність у суб'єкта пухлини, що експресує КОК'І1.
І0024| Подальше розуміння природи й переваг даного винаходу може бути реалізовано з посиланням на інші частини опису та формули винаходу.
Короткий опис креслень
Ї0025| На фіг.1 показані амінокислотні послідовності варіабельних важких і легких імуноглобулінових ланцюгів зазначених нових кролячих тАб до ПКОК1. Результати вирівнювання амінокислотних послідовностей кролячих варіабельних доменів (Мк, МА і МН) з каркасними ділянками (ЕК) і визначальними комплементарність ділянками (СОК) показані за допомогою нумерації за Кабаї.
На даній фігурі показані послідовності варіабельних доменів важкого ланцюга (відповідно ЗЕО ІЮ
МО:1-13) і послідовності варіабельних доменів легкого ланцюга (відповідно ЗЕО ІЮ МО:14-26) для 13 антитіл, позначених ХВК1-402, ЕННІ1-301, ЕННА1-306, ЕНА1-316, ЕНН1-324, ЕВАНІ1-403, ЕННА1-409,
ЕВА1-ТОР4, ЕВА1-ТОР15, ЕВА1-ТОР22, ЕВАВ1-ТОР4А0О, ЕВАВ1-ТОРАЗ і ЕКК1-ТОР54. Як показано на фігурі, клони ХВК1-402, ЕНН1-301, ЕНР1-306, ЕНР1-316, ЕНР1-403, ЕВРА1-409, ЕВА1-ТОРА, ЕВВ1-
ТОРІБ5, ЕВА1-ТОР22, ЕВНІ1І-ТОРАЗ і ЕКК1-ТОРБО4 є варіабельними доменами легких ланцюгів А імуноглобуліну, тоді як антитіла ЕКК1-324 і ЕЕК1-ТОР40 є варіабельними доменами легких ланцюгів к імуноглобуліну. 0026) На фіг. 2 показана зв'язувальна активність химерних Рар кролика/людини з людським КОК1 (пКОКІ) і мишачим КОКІ (птКкОКкК), що експресуються у формі злитих білків з позаклітинного домену (ЕСО) пКОКІ і ткКОК! з людським Есо-доменом з антитіла ДС1 людини. Зв'язування кожного химерного Раб кроликалулюдини з ПКОКІ і тптКОК1, злитим з Ес Іде1 людини (пПЕСс-ПКОКІ і пЕс- тТКО), аналізували за допомогою ІФА. пПРСо-КОКІ1 або пРо-ткоОмК1 захоплювали за допомогою Ес- антитіла до ЇДС1 людини, іммобілізованого на планшеті, а потім інкубували з ПКОК1-специфічними
Бар, що містять Ніб-мітку шляхом виявлення за допомогою мишачого антитіла до Нів-мітці.
Специфічність Бар підтверджували із застосуванням злитих білків позаклітинного домену (ЕС)
Кока з людським Ес-доменом антитіла ЇДе1 людини (пЕс-пПКОКг) як контролю.
І0027| На фіг. З показана зв'язувальна активність химерних Раб кролика/людини з нативним білком
КОК'І людини, що експресується на клітинній поверхні мишачої лінії В-клітин-попередників 63-12 (див. приклад 1). Зв'язування кожного химерного Бар кроликалулюдини з КОКІ людини, що ектопічно експресується на поверхні мишачих В-клітин-попередників (63-12), аналізували за допомогою проточної цитометрії. ЕКК2-ТОРЗ5 є тАб до ПКОК, яке було ізотипічним контролем.
І0028| На фіг.4 показані результати дослідження з картування епітопів химерних Еар кролика/людини на шести різних іммобілізованих злитих білках Ідс1-Ес, які містять різні частини позаклітинного домену людського КОМК1: пЕс-НВОВІ1-Ід (який містить імуноглобуліновий домен
НВО), пЕс-НА!ОВІ1-Ег (який містить Егіл7еєй домен ПКОК), пес-пвВОМВ1-Кг (який містить Кгіпдіе домен ПКОКТ), пеЕс-НВО1-Ід-Ег (який містить імуноглобуліновий домен і Егіг7Ієй домен пКОК), пЕс- пВОВ1-Рі-Кі (який містить Егі2лей і Кгіпдіє домени ЙКОКІ) і пЕс-НВОКІ (який містить весь позаклітинний домен (ЕСО) ПКОКТ).
І0029| На фіг. 5 показані результати дослідження зв'язування епітопів, виконаного за допомогою поверхневого плазмонного резонансу. Наведені сенсограми 5РЕ, отримані для зв'язування різних Бар з пРс-пвОК, захоплених антитілом до Есу людини, іммобілізованим на чипі СМ5. Раб вводили в різних порядках для ідентифікації незалежних епітопів і епітопів, що перекриваються. Збільшення резонансних одиниць (КИ, вісь у), які перевищували значення, виявлені для раніше введених Раб, свідчили про незалежні епітопи, оскільки вони забезпечують одночасне зв'язування. Наприклад, збільшення, виявлене для зв'язування Бар К11, перевищувало значення, виявлені для лише ХВК1- 402, що свідчило про те, що Бар К11 ії ХВК1-402 можуть одночасно зв'язуватися з КОКІТ людини.
Навпаки, епітоп Гарб ХВК1-402 перекривається з епітопами ЕКК1-301, ЕНН1-403 і К12 (лівий графік); епітоп Бар ЕКК1-ТОР43 перекривається з епітопом ЕКК1-306, ХВА1-402 і ЕКК1-ТОР40. На осі х відображений час в секундах (с).
ІООЗОЇ На фіг. 6 показані результати вимірювання афінності ПКОК1 -специфічних Раб з ЯНКОКІ ЕСО за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК). (А) Показані сенсограми Віасоге Х100, отримані для зв'язування кожного Бар з пЕС-пПКОКІ!, захопленим антитілом до Есу людини, іммобілізованим на чипі СМ5, після видалення поточного фонового сигналу. Бар вводили п'ятьма різними концентраціями з найвищою концентрацією, зазначеною в таблиці (В), одна з п'яти концентрацій була перевірена в двох повторностях. (В) У таблиці наведені моновалентні афінності кожного Бар. Рівноважна константа дисоціації (Ка) була розрахована з Копй/Ккоп (Коп - константа швидкості асоціації, Коїї - константа швидкості дисоціації).
ІООЗ1Ї На фіг. 7 показано ГАС5-фарбування клітин за ПКОК'І на різних лініях клітин злоякісної пухлини людини за допомогою антитіла 2А2 до КОКІ! людини, як описано в прикладі 9. До проаналізованих ліній клітин відносяться 697 (гострий лімфоцитарний лейкоз людини, АГ), Казиті-2 (гострий лімфоцитарний лейкоз В-клітин-попередників людини), тричі негативні лінії МОА-МВ-231,
МОА-МВ-468 і Н5З-5781Т клітин злоякісної пухлини молочної залози людини, а також лінія ТА47О клітин злоякісної пухлини молочної залози людини. За винятком лінії Т47О клітин злоякісної пухлини молочної залози людини, всі оцінювані клітини є позитивними за експресією ПКОК1.
І0032| На фіг. 8 показана зв'язувальна активність обраного химерного Їде1 кролика/людини з ендогенним ПКОКТ, що експресується на клітинах злоякісної пухлини молочної залози, виміряна за допомогою сортування флуоресцентно-активованих клітин (БАС5). Лінія МОА-МВ-231 клітин злоякісної пухлини молочної залози людини, як відомо, експресує ПКОКТ, лінія Т47О клітин злоякісної пухлини молочної залози людини, як відомо, є негативною за ПКОКТ. На відміну від цього, Т470О, як відомо, є КОК2-позитивною, тоді як МОА-МВ-231, як відомо, є негативною за експресією КОК-2.
ЕВА1-Торб54, ЕВА1-Тор43, ЕНН1-324, ХВА1-402 являли собою вибрані ПКОК1-специфічні тАб, ХВК2- 401 являло собою ПКОМК2-специфічне тАб, що використовується як контроль специфічності (А).
Експресію ендогенних ЯКОК'І і пКОКа на клітинах злоякісної пухлини молочної залози виявляли за допомогою проточної цитометрії з використанням комерційно доступних відповідно козячих поліклональних антитіл до КОК1 людини і козячих поліклональних антитіл до КОК2 людини (КО зузіетв), після чого вносили кон'юговані з АІеха Рішог 647 віслюкові поліклональні Е(аб)2 антитіла
АйіпіРиге до Ідс (Ня-Ї) кози (Часкбоп ІттипоКезеагсп Іарогаїогіе5). Контрольні фарбування проводили із застосуванням лише кон'югованих з АІеха РіІшог 647 віслюкових поліклональних Е(ар)2 антитіл АйіпіРиге до дос (Ні) кози. (В) Зв'язування химерного ІдсС1 кролика/людини обраних клонів
ЕВА1Т-Торб4, ЕВАІ1-Тор43, ЕНВНВ1-324, ХВА1-402 (усі пКОК1-специфічні) і ХВК2-401 (нВОрг- специфічний) до лінії МОА-МВ-231 клітин, які експресують КОКТ, злоякісної пухлини молочної залози людини і лінії Т47О клітин, які експресуть КОК2, злоякісної пухлини молочної залози людини аналізували за допомогою проточної цитометрії із застосуванням химерного ЇдсС1 кролика/людини як первинних антитіл і АРС-мічених козячих поліклональних антитіл, специфічних до Ес людини, як вторинного антитіла.
ІООЗ33| На фіг. 9 показана зв'язувальна активність химерних ІДС1 кролика/людини ХВК1-402 і
ЕВВ1-ТОР43З (обидва ПКОК1-специфічні) з денатурованим ЯКОКІ1 в експериментах вестерн-блоту.
КОНТ, який експресувався на клітинній поверхні клітин К562, або очищений білок денатуровали й детектували за допомогою вестерн-блоту. Вестерн-блоти містили такі зазначені зразки: доріжка 1: клітини К562, що ектопічно експресують повнорозмірну молекулу ПКОКІ1. Доріжка 2: нетрансфіковані клітини Кб2. Доріжка 3: очищений позаклітинний домен з ЯПКОКТ. Доріжка 4: очищений позаклітинний домен з ПКОК2.
І0034| На фіг.10 показано проаналізоване за допомогою ІФА зв'язування обраних пПКОМК1- специфічних химерних антитіл Ес кролика - людини для обраних клонів ЕКК1-301, ХВА1-402, ЕВВ1- 306, ЕВНІ-324, ЕНН1-403 і ЕККІ1-Тор43 з рекомбінантним очищеним ПЙКОКІ1 (секція А) і з рекомбінантним очищеним пПКОК2 як негативного контролю (секція В).
ІЇОО35| На фіг. 11 схематично показано, як були отримані сайт-специфічно кон'юговані АОС,
розкриті в даному винаході. (А) схематично показаний механізм опосередкованого ферментом сортаза кон'югування антитіла (зопавзе-епгуте теавдіаїєд апіїбоду сопідайоп-5МАС-технологія), який описано в М/О2014140317. Для отримання сайт-специфічно кон'югованих АОС рекомбінантні антитіла необхідно експресувати з С-кінцневим пентапептидним мотивом ГРХТО (5ЕБО ІЮ МО:144), який є сайтами розпізнавання для ферменту сортаза А з Зіарпуіососсиб5 ацйгеиб5 (ЗПА). Під час інкубації субстратного гліцин-модифікованого токсину з антитілом, що містить пентапептидний мотив І РХТО, і ферментом сортаза А фермент сортаза А каталізує реакцію транспептидації, за допомогою якої гліцин-модифікований токсин замінює С-кінцевий гліцин з мотиву І РХТО і ковалентно зв'язується з треоніном у решті послідовності І РХТ (ЗЕО ІО МО:147). Таким чином з високою ефективністю можна отримувати АОС, які кон'юговані з токсином на С-кінці. На (В) показана структура переважного токсину, похідного РМО-159682, що містить етилендіаміно (ЕСА) линкер, що зв'язує відрізок з 5х гліцинів з карбонільною групою на С13 антрациклінової структури, як описано в МО2016102697.
І0ООЗ6Ї На фіг. 12 показана ефективність аналізів знищення клітин іп міго, виконаних на (секція А) лінії МОА-МВ-468 імморталізованих клітин злоякісної пухлини молочної залози людини з відомими
НВОВ1-націленими АОС (2А2-(25-РМИ, В12-25-РМ) і новим АОС, представленим у даному винаході (ЕВАВ1-Тор43-С5-РМУ), ї (секція В) лінії Н5 5787 імморталізованих клітин злоякісної пухлини молочної залози людини з відомими ПКОК1-націленими АС (2А2-25-РМИО, НІТ12-25-РМО) і новими АОС, представленими в даному винаході (ХВК1-402-2355-РМИ і ЕКК1-Тор43-25-РМИ). В обох секціях СЮОЗ30О- націлений АОС Ас10-45-РМИ застосовували як АС ізотипічного контролю.
І0037| На фіг. 13 показана активність іп міго знищення клітин КОК1-позитивної клітинної лінії 697 гострого лімфоцитарного лейкозу за допомогою чотирьох АОС до КОК1-РМИ, включаючи АОС на основі клонів антитіл 2А2, К11 і К12 ї на основі клону ХВК1-402 антитіла до КОКТ, які розкриті в даному документі. Усі антитіла експресувалися у формі химерного Ідс1 кролика - людини (К11, К12, хХВА-402) або миші - людини (2А2). На (А) показано знищення клітин у діапазоні концентрацій АОС, сайт-специфічно кон'юЮгованих з корисним вантажем токсину СІУ5-ЕБА-РМИО (скорочено 55-РМИ) з кожним з АОС. На (В) показані числові значення ІС5О для знищення клітин, розраховані за кривими з (А) для кожного з АОС до КОКІ1.
І0ООЗ8І На фіг. 14 показано іп міго знищення клітин КОК1-позитивної лінії клітин АГ. Казиті-2 (А) і 697 (В) за допомогою обраних АОС до ПРООН, сайт-специфічно кон'югованих з корисним вантажем токсину СІУ5-ЕОА-РМИ (скорочено 55-РМИО). В основі АОС лежить клон 2А2 і К12 антитіла до КОК!1 і клон ХКК-402 антитіла до КОКТІ, як зазначено в даному документі. НЕК-2-специфічний трастузумаб, сайт-специфічно кон'югований з корисним вантажем токсину СІУ5-ЕВА-РМИ, застосовували як АОС ізотіпичного контролю. У секціях С і О показані рівні експресії КОК'Т, виміряні на клітинній поверхні
Казиті-2 і 697, які аналізували за допомогою БАС5 з використанням антитіла 2А2 як первинне антитіло відносно антитіла ізотипічного контролю.
ІООЗ9) Фіг. 15. На (А) показана ефективність іп мімо молекул АОС в дисемінованій мишачій моделі
ВОВ1-позитивної лінії 697 з молекулами АС ЕБА-СДІу5-РМО. Мишам (групи з 8 тварин) трансплантували внутрішньовенно 106 клітин АЇЇ людини лінії 697 і обробляли через 7 і 14 днів кожним з 1 мг/кг РМО-АЮС на основі антитіла 2А2 і нового антитіла ХВЕ1-402 або, як негативний контроль, за допомогою РМИО-АЮС на основі НЕК2-специфічного антитіла трастузумаб. Відсоток виживання в групах мишей наносили на графік відносно часу. На (В) наведена концентрація в плазмі
АОС, виміряна у мишей, які отримували 1 мг/кг через 12 і 19 днів, яку вимірювали за допомогою імуноаналізу ІФА шляхом захоплення за допомогою реагенту до людського Есд і виявлення або за допомогою детектувального антитіла до легкого ланцюга каппа для визначення концентрації антитіла, або детектувального антитіла до РМІО для визначення концентрації АОС. 0040) Фіг. 16. У секції (А) показано іп міго знищення клітин ПКОК1-трансфіковані лінії ЕМТ6- сіопе14 клітин злоякісної пухлини молочної залози миші (скорочено ЕМТ6-сІ14) за допомогою сайт- специфічно кон'югованих РМО-АЮС на основі антитіла К1І2 до КОК' і нового антитіла ХВК1-402, причому обидва вони експресувалися як химерні антитіла (91 людини. Трастузумаб-с255-РМО АОС, специфічний до НЕК2, застосовували як АОС ізотипічного контролю. (В) Як додатковий контроль також було проведено аналогічний експеримент зі знищення клітин з тими ж АОС на нетрансфікованих (і КОК1-негативних) батьківських клітинах ЕМТб. У секції (С) показана відносна експресія ПКОКІ у пПКОК1-трансфікованих у порівнянні з нетрансфікованими клітинами ЕМТб, за результатами виявлення за допомогою ЕАСЗ із застосуванням КОК-специфічного антитіла 2А2. 00411) Фіг. 17. Іп міго знищення клітин ПКОК1-трансфікованої лінії ЕМТ6-сіопе14 (скорочено ЕМТ6-
СІ.14) клітин злоякісної пухлини молочної залози миші за допомогою сайт-специфічно кон'югованих
РМИ-АОС на основі антитіла т5961 до КОК'І і нових антитіл ХВК1-402 і ЕКК1-324, причому кожне з них експресувалося як химерні антитіла (9051 людини. Трастузумаб-с55-РМО АОС, специфічний до
НЕК, застосовували як АОС ізотипічного контролю.
І0042| На фіг. 18 (А) показані результати дослідження ефективності іп мімо з ортотопічною мишачою моделлю злоякісної пухлини молочної залози із застосуванням ПКОК1-трансфікованої лінії
ЕМТЄ клітин злоякісної пухлини молочної залози миші, яка була імплантована в скопичення жирової тканини молочної залози ВаІр/с мишей дикого типу. У верхній секції показані криві виживання мишей, двічі оброблених контрольним АОС трастузумаб-(:5-РМИ. У середній секції показані криві виживання мишей, оброблених РМО-АЮС на основі антитіла К12 до КОКТ, а в нижній секції показані криві виживання мишей, оброблених РМО-АЮС на основі нового антитіла ХВК1-402 до КОК1. Маленькі трикутники нижче осі х вказують на дві обробки по 1 мг/кг кожна відповідним АОС на 14-й і 21-й день після трансплантації пухлин. На (В) показаний графік Каплана - Меєра для трьох експериментів, відображених на секції (А).
І0043| На фіг. 19 показана іп міго стабільність АОС ХВК1-402-245-РМО у сироватці МОЮ СІЮ миші (секція А) і в сироватці людини (секція В), яку аналізували імунологічним аналізом ІФА, що визначає або повне антитіло (безперервна лінія), або інтактний АОС (пунктирна лінія).
І0044| На фіг. 20 показана стабільність у плазмі іп мімо нового "голого" антитіла ХВК1-402 до
ЕОКІ, а також АОС ХВЕ1-402-45-РМИ, що оцінювали у самок СО-1 мишей. Показано стабільність у плазмі, виміряну за допомогою імунологічного аналізу ІФА загального дб, який виявляється за допомогою детектувального реагенту для Ес людини, а також інтактного АОС, який виявляється за допомогою РМИ-специфічного детектувального реагенту.
І0045) На фіг. 21 показаний аналіз лізатів отриманих від різних пацієнтів пухлин щодо експресії білка ЯНКОКІ методом вестерн-блоту, включаючи лізати з двох контрольних ліній клітин Казиті-2 (лінія клітин АГ. людини) і А549 (лінія клітин злоякісної пухлини легені людини). Лізати отриманих від пацієнтів пухлин мають наступне позначення й походження: РХЕ 1118: плевральна мезотеліома, ЕХЕ 486: гіпернефрома, РХЕ 541, плевральна мезотеліома, ЗХЕ5 1407: нейрофібросаркома, СХЕ 533: аденокарцинома.
І0046)| На фіг. 22показана ефективність сайт-специфічно кон'югованого РМО-АОС з АОС ХВК1-402 до КОК'І у моделях отриманих від різних пацієнтів пухлин (моделі РОХ), встановлених у самок ММКІ "голих" мишей, яким імплантували отриманий від пацієнтів пухлинний матеріал СХЕ533, ЕХЕ 486, РХЕ 1118, 5ХЕ5 1407 і РХЕ 541, в порівнянні з мишами, обробленими контрольним носієм.
І0047| На фіг. 23 показані амінокислотні послідовності МН і МІ. клонів гуманізованих антитіл, отриманих з нового антитіла ХВК1-402 до КОК1. Результати вирівнювання амінокислотних послідовностей гуманізованих варіабельних доменів (МА і МН) з каркасними ділянками (ЕК) і визначальними комплементарність ділянками (СОК) показані за допомогою нумерації за Кабаї. На даній фігурі показані послідовності варіабельних доменів важкого ланцюга (відповідно 5ЕО ІЮ МО:130- 135) і послідовності варіабельних доменів легкого ланцюга (відповідно ЗЕО ІЮ МО:136-141) для 6 антитіл, позначених НихВК1-402(3), НихвВА1Т-402(8), НихвВА1-402(15),, НихВА1-402(17),, НихвВА1- 402(19) і НихвкК1-402(26).
І0048| На фіг. 24 наведені дані вимірювання афінності з новими гуманізованими клонами батьківського таб ХВЕ1-402, включаючи наведені дані для Коп і Коїї.
І0049| На фіг. 25 показані (секція А) криві залежності доза-відповідь результатів аналізів щодо знищення клітин іп міго, проведених на лінії 697 клітин злоякісної пухлини АЇЇ людини з ХРОР1- націленим батьківським ХВК1-402-245-РМИ і з АОС на основі гуманізованих антитіл: пИХхХВЕ1-402-3-55-
РМ, пихХвА1-402-8-245-РМИО, пихХвВА1-402-15-205-РМИО, пихХвВА1-402-17-45-РМИО, пиХвВА1-402-19-(35-
РМ ї пихВК1-402-26-45-РМО. РМО-АОС, заснований на НЕК2-націленому антитілі трастузумаб, застосовували як АОС ізотипічного контролю (Тга5-45-РМУ). У секції В показані результати кількісного оцінювання ефективності знищення клітин іп міго (ІС50).
І0ОО50)| На фіг. 26 показані результати порівняння активностей іп міго КОК1-націленої ХВК1-402
САВ-Т і К12 САК-Т.
ІОО51| На фіг. 27 показані результати порівняння активностей іп міго КОК1-націленої ХВК1-402
САВ-Т з коротким і довгим спейсером.
І0052| На фіг. 28 представлений огляд аналізу специфічності химерного антитіла (91 ХВК1-402 кролика/людини до КОК'1 людини та, як контроль, химерного антитіла (3051 ХВК2-401 кролика/людини до КОК2 людини за допомогою платформи Кеїгодепіх Сеї! Місгоаітау Ріанопт.
І0О53| На фіг. 29 показані результати аналізу специфічності химерного антитіла їдс1 ХхВК1-402 кролика/людини до КОК'1 людини та, як контроль, химерного антитіла (39051 ХВК2-401 кролика/людини до КОК2 людини за допомогою платформи Кеїгодепіх Сеї! Місгоагтау Ріаногт. Первинні шукані зв'язувальні молекули за результатами великого скринінгу за участю 4336 білків плазматичної мембрани людини (див. фіг. 28) об'єднували на окремому мікроскопічному препараті та фарбували химерним Ідс1 ХВК1-402 кролика/людини до КОК'І1 людини та, як контроль, химерним 951 ХВК2-401 кролика/людини до КОКАа і біологічним аналогом ритуксимабу. Сигнали 250гееп!1 зліва вказують на рівні експресії різних мембранних білків людини. Крім своїх відповідних антигенів (КОКІ, КОКІ2 і
СО20) тестовані антитіла в форматі ІДдсС1, як і очікувалося, також зв'язуються з Есу-рецепторами
ЕСОКЗВ (СО168), ЕСОКТА (СО64А) і ЕСОК2А (СО32А). Фарбування лише вторинним антитілом, як і очікувалося, виявляє важкий ланцюг ІдеЗ людини (ІНОЗ).
Детальне розкриття даного винаходу
І. Огляд
І0054| Даний винахід частково грунтується на створенні авторами даного винаходу великої бібліотеки наївних химерних Раб кролика/людини і відборі щодо зв'язувальних молекул до КОК1 людини за допомогою фагового дисплея. Орфанні рецептори 1 і 2 рецепторної тирозинкінази, КОКТІ і
КОК2, є єдиними двома представникам сімейства, які визначають нове сімейство рецепторних тирозинкіназ, у основі якого полягають загальна структурна будова та деякі функціональні подібності.
Обидва білка КОК'І і КОК2 є однопрохідними трансмембранними рецепторами І типу з позаклітинним доменом (ЕСО), що складається з імуноглобулінового домену, багатого цистеїном домену їі27Іей і домену Кгіпдіє. За цими трьома позаклітинними доменами іде трансмембранний домен, що з'єднує
ЕСО з внутрішньоклітинною частиною білка, що містить кіназні домени (Кабадау еї аї. (2012) Егопіїєг5
Опсої. 2: 1-8). Білки КОК'І і КОК2 людини є на 58 95 гомологічними між собою, але кожен з білків КОК є дуже консервативним проміж видів. Найбільш консервативним фактично є білок КОК'І, білок довжиною 937 АК, який є на більш ніж 98,5 95 ідентичним у людей та всіх секвенованих видів приматів, що не відносяться до людини, й навіть на 96,7 і 96,3 95 гомологічним у випадку порівняння людського відповідно з мишачим і кролячим КОКІ (Вогспегадїіпод еї аї. (2014) Ргоївіп СеїІ 5: 496-502). Тому було проблематичним створення високоякісних антитіл до КОК1 шляхом імунізацій миші або кролика, та існує лише дуже мала кількість відомих антитіл з прийнятною афінністю. Див., наприклад, УМО 2010/124188 (мишаче моноклональне антитіло 2А2), УМО 2012/075158 (кролячі антитіла К11 і К12),
УМО 2012/097313 (мишаче моноклональне антитіло 010) ії УМО 2014/031174 (гуманізовані версії мишачого тА 99961, які зв'язують той самий епітоп, що й тАб 010).
ЇОО55| Для того, щоб не повторювати створення антитіл до КОК1! шляхом традиційної імунізації/скринінгу мишей/кроликів, які будуть направляти антитіла проти епітопів з найбільшою дивергенцією між мишачим/кролячим КОКІ1 і людським КОМІ (як це було у випадку виявлення таб 2А2, К11, К12, 010 ї 99961), автори даного винаходу створили дуже високоскладну експоновану фагом бібліотеку наївних кролячих Раб-антитіл і піддали скринінгу цю бібліотеку щодо зв'язування з нативним рекомбінантним ЕСО з КОКІ ссавця і з КОКІ людини, що ескпресується на клітинній поверхні, для відбору найбільш функціональних і дивергованих клонів антитіл, реактивних з нативним білююм КОКІ людини. Ця стратегія була обрана тому, що репертуар антитіл, який має бути отриманий, все ще одержують від натуральних кролячих В-лімфоцитів і, отже, обирається щодо попередньо відібраних імунною системою важких і легких ланцюгів антитіл. Однак завдяки застосовуваної стратегії скринінгу з використанням нативного рекомбінантного і КОК1, що експресується клітинами людини, була надія, що будуть виявлені ПКОК1-специфічні антитіла з високою здатністю до розробки й функціональними властивостями, а також вони будуть особливо корисні для терапії захворювань людини, пов'язаних з експресією КОК'І, таких як, зокрема, КОК1- позитивна злоякісна пухлина.
І0ОО56) У результаті обраної стратегії була виявлена низка нових кролячих високоафіних антитіл до
КОКІ1 людини з різними клонотипами СОКТ, 2 і З (фіг. 1) ії з високою селективністю зв'язування до
КОМ1 людини, але не з більшістю його споріднених "сестринських молекул", тобто КОК2 людини (фіг. 2, З і 10). Деякі з НКОК1-специфічних антитіл мали високу афінність (однорозрядні нМ афінності) до пПЕОМК1-мішені (фіг. 6). Як докладно описано в даному документі, були отримані тринадцять моноклональних антитіл (тАб) у химерному форматі Рар кролика/людини з різними послідовностями важких і легких ланцюгів. Ці тАб були умовно названі "ХВА1-402", "ЕВА1-301", "ЕНА1-306", "ЕВА1- 316", "ЕВН1-324", "ЕНН1-403", "ЕНН1-409", "ЕВА1-ТОРА", "ЕВА1-ТОР15", "ЕВАВ1-ТОР22", "ЕВВІ1-
ТОРА4А0О", "ЕВВІ-ТОРАЗ" і "ЕКК1-ТОРБ4А". Усі тринадцять антитіл зв'язуються з очищеним КОК!1 людини, як було проаналізовано за допомогою ІФА, та з КОКІ1 на поверхні клітин людини, як було проаналізовано за допомогою проточної цитометрії. Жодне з них не зв'язується з КОКО, який є найближчим родичем КОКІ і має 58 95 ідентичності амінокислотної послідовності 3 КОК1. Два таб ("ЕВАН1-306" ії "ЕКН1-ТОР22") зв'язуються з КОК!1 як людини, так і миші, тоді як інші одинадцять таб зв'язуються лише з КОКІТ людини.
І0057| Афінність усіх тринадцяти тАБб визначали за допомогою інферометрії шару біомолекул і поверхневого плазмонного резонансу. Крім того, кілька тАб ("ЄКК-301", "ЕННА-306", "ЕННА-403", "ХВН1- 402", "ЕННІ1-324", "ЕВВ1-ТОР4А3" і "ЕКК1І-ТОР54") були перетворені на химерний формат Ідс1 кролика/людини, що експресується в клітинах ссавців і очищується за допомогою афінної хроматографії на білку А. Зокрема, у клонів з найбільш високою афінністю, тобто ХВАК1-402 і ЕКК1-
ТОР43, у ході додаткового оцінювання спостерігали найбільш високі активності фарбування за допомогою ЕБАСЗ з клітинами ссавців, що надекспресують КОКІ! людини (фіг. 3) і нормально експресують ПКОКІ1 (фиг. 8). Два клони ХВК1-402 і ЕКК1-ТОР43 з найкращим зв'язуванням також були здатні виявляти денатурований білок КОКІ! під час вестерн-блоту (фіг. 9У, що дозволяло застосовувати ці клони для розробки супутньої діагностики злоякісних пухлин, що експресують ВОНІ1. 0058) Крім того, були експресовані кілька тАбБ у формі химерного дсС!1 кролика/людини з С- кінцевими мітками розпізнавання сортазою, що уможливлювало сайт-специфічну кон'югацію корисних вантажів з С-кінцями антитіла за допомогою технології опосередкованого ферментом сортаза кон'югування антитіла (зогпазе-епгуте тедіаїєд апіїроду сопійдайоп - технологія «зМАСТМ), фактично як описано в М/02014140317. Ці антитіла до ПКОКІ потім були сайт-специфічно кон'юговані з високоактивним антрацикліновим похідним токсину РМО-159682, СІУ5-ЕВСА-РМИ (фіг. 118) з метою отримання високоактивних кон'югатів антитіла з лікарським засобом (АБС), фактично, як це описано в
УМО 2016102679 (яка включена в цей документ за допомогою посилання і текст якої включено в дану заявку як додаток). Ці АОС були функціонально оцінені в різних іп міго і іп ммо моделях пухлин відносно АОС, створених на основі відомих антитіл до ПКОКІ1. Спостерігали, що один конкретний найбільш перспективний клон під назвою ХВК1-402 мав найвищу активність і ефективність в порівнянні з різними відомими антитілами (наприклад, 2А2 (з УМО 2010/124188), К11, К12 (обидва з
МО 2012/075158) або іт5961 (з УМО 2014/031174), яке являє собою основу гуманізованого тАр до
ЯКОКТ цирмтузумаб, що в даний час проходить клінічні випробування на СІ у формі "голого" тАБ
Іа.
І0О59| Потім, виходячи з кращих у своєму класі властивостях з точки зору функціональності зі знищення пухлинних клітин як АОС, був гуманізований найбільш перспективний клон ХВК1-402, що дало декілька гуманізованих клонів з додатково підвищеною афінністю до ПКОК, які мають назву "пихХвВА1-402-3", "нихХВА1-402-8", "нихВА1-402-15", "нихВА1-402-17", "пнихВА1-402-19" і "нихвВК1-402- 26". Ці гуманізовані версії найбільш перспективного клону ХВК1-402 також були оцінені в формі сайт- специфічно кон'югованих РМО-АЮС, і кожен з них демонстрував додатково покращене знищення пухлинних клітин у іп міго моделях пухлин ПКОКІ1.
ЇОО60О| Для додаткового дослідження терапевтичної корисності КОК1-націлених тАб були сконструйовані САК-Т-клітини на основі ХВК1-402 за допомогою способів, раніше описаних для відомих КОКІТ-націлених тАбБ КІ1 їі К12 (Нидесек, М., Гиро-еїапопеїйпі, М. Т., Козавзін, Р. Г.,
Зоттептеуєег, О., Уепзеп, М. С., Вадег, С., апа ВідаеїІ, 5. В. (2013). Весеріог аніппу апа ехігасеїїшаг дотаїп тодіїїсайоп5 апйесі Штог гесодпййоп бу ОН -5ресіїйс спітетгіс апіїдеп гесеріог Т сеїЇв. Сіїп.
Сапсег Вевз. 19, 3153-3164). Якщо коротко, ех мімо розмножені здорові донорські СО8-СО62І ж Т- клітини було трансдуковано за допомогою лентивірусів касетою експресії під керуванням промотора
ЕРта, що містить ХВК1-402 в форматі 5сЕм, за яким йшов короткий або довгий спейсер, трансмембранний домен СО28 людини, сигнальний домен 4-188, сигнальний домен СОЗсС і Т2А- розділений трансмембранний фрагмент ЕСЕК з укороченими ліганд-зв'язувальними (й тирозинкіназними доменами. ЕАС5-виділення ЕСЕК» трансдукованих Т-клітин дозволило виявити робастне розпізнавання КОКІ1 у »90 95 САВ-Т-клітин. Активність КОК1-націленої ХВК1-402 САВ-Т з коротким спейсером тестували щодо ліній МОА-МВ-231 (ВОНВ1--8ОН2-) і Т47О0 (КОК1-КОКО жк) клітин злоякісної пухлини молочної залози. За наявності КОК1-КОК2-, але не КОК1-КОК2-- клітин-мішеней хХВА1-402 САВ-Т швидко проліферували, масивно секретували ІЕМ-у і І/-2 і ефективно знищували клітини-мішені іп міїго (фіг. 26). Слід відзначити, що під час прямого порівняння було виявлено, що хХВА1-402 САВ-Т була еквівалентною або більш активною, ніж клінічно досліджена К12 САК-Т з тим самим коротким спейсером і тими самими сигнальними доменами.
ІЇОО6Є1)| Крім того, авторами даного винаходу була висунута гіпотеза, що оптимальна відстань між
Т-клітиною та клітиною-мішенню може бути досягнуто шляхом оснащення САК-Т-клітин, націлених на віддалені від мембрани епітопи, більш короткими спейсерами та навпаки. Походячи з цієї гіпотези, припустили, що ХВК1-402 САВ-Т, яка має епітоп, що перекривається з К12, буде більш активною, якщо буде оснащена коротким, а не довгим спейсером. Дійсно, було виявлено, що за наявності
ВОВ1-8ОН2- клітин-мішеней ХВК1-402 САВ-Т з коротким лінкером проліферували швидше, ніж хХВА1-402 САВ-Т з довгим спейсером (фіг. 27), а також секретували значно більше ІЕМ-у і 1-2. Однак було встановлено, що іп міго цитотоксичність була рівноцінною (фіг. 27).
І0062| Згідно з результатами цих досліджень, даний винахід стосується нових моноклональних кролячих і гуманізованих антитіл і споріднених зв'язувальних білків на основі таких антитіл і фрагментів таких антитіл, які специфічно розпізнають КОКТ, а також кон'югатів антитіла з лікарським засобом і САК зі специфічною протипухлинною активністю в іп міго і іп мімо моделях пухлин, що експресують ЯНКОКІ1. Також у даному винаході запропоновані способи застосування цих засобів на основі таких антитіл у терапевтичних і діагностичних цілях під час захворювань і станів, пов'язаних з аномальною або підвищеною експресією КОК'І, наприклад, злоякісної пухлини.
ЇОО63| У антитіл і споріднених композицій за даним винаходом були продемонстровані інші несподівано переважні властивості. Функціональне оцінювання нових клонів у формі сайт-специфічно кон'югованих АЮС з високоактивним РМО-антрацикліновим корисним вантажем з використанням різних іп міїго і іп мімо моделей показало, що, зокрема, новий клон ХВК1-402 мав вищі функціональні показники, ніж будь-яке з відомих антитіл. Наприклад, молекули АОС на основі К11 мали обмежену активність вже в іп міго моделях пухлини (фіг. 13). У порівнянні з клонами антитіл 99961 (т5961), 2А2 і
К1І2 новий ХВК1-402, описаний в даному документі, також узгоджено мав вищі функціональні показники в іп міго моделях пухлин (фіг. 13, 14, 17), що було ще більш очевидним в іп мімо моделях пухлин (фіг. 15 і 18). У поєднанні з переважними властивостями клону ХВК1-402 з точки зору його високоспецифічного розпізнавання КОКІ під час тестування відносно 4336 білків плазматичної мембрани людини (фіг. 29) і переважної стабільності АОС в мишачій плазмі крові та інших оцінюваних сироватках (фіг. 158, 19 ї 20), молекули АОС на основі ХВК1-402, напевно, мають потенціал стати кращими в своєму класі КОК1-націленими продуктами з високим потенціалом щодо АОс-терапії.
І0064| Крім того, у гуманізованих версій тар ХВК1-402 до КОКІ1 несподівано спостерігали ще більш високу афінність у порівнянні з батьківським кролячим клоном ХВК1-402 (фіг. 24), оскільки афінності часто знижуються під час гуманізації відмінних від людських антитіл (Магогейег еї аї. (2016)
У. Мої. Весодпії. 29: 266-275). Підвищена афінність також корелювала з поліпшеною ефективністю цих гуманізованих тАб під час оцінювання протипухлинної активності у формі АОС (фіг. 25). Ці дані свідчать про високий потенціал оцінюваного АОС до КОКІ на основі гуманізованих антитіл ХВК1-402 для терапії захворювань людини. Цей високий потенціал для ефективної протипухлинної терапії у
РМИ-АБС на основі ХВК1-402 і/або гуманізованого ХВК1-402 підтверджується високою ефективністю
АС на основі ХВК1-402 у декількох моделях отриманих від пацієнтів ксенотрансплантатів, що експресують ПКОК (фіг. 22).
І0065| У функціональних антитіл до ПКОКІ і споріднених композицій, описаних у даному документі, спостерігали чудові функціональні властивості для застосування як терапевтичні засоби під час лікування злоякісних пухлин людини, які пов'язані з експресією КОКТ. До них відносяться різні антитіла до ЯКОМКІ1, фрагменти таких антитіл, зв'язувальні білки на основі таких антитіл, АОС або
САРК, описані в даному документі, які мають такі ж самі або фактично такі ж самі зв'язувальні властивості, які спостерігали у специфічних антитіл, проілюстрованих в даному документі (наприклад, хХВА1-402). Отже, переважні властивості та високий терапевтичний потенціал, продемонстровані ілюстративними антитілами в даному документі, можна екстраполювати на гомологічні антитіла, фрагменти таких антитіл, зв'язувальні білки на основі таких антитіл, АОС, САК, які містять деякі або всі послідовності СОРЄ. варіабельних важких і/або легких ланцюгів, що розкриті в даному винаході, або фактично аналогічні послідовності СОК варіабельних важких і/або легких ланцюгів, що розкриті в даному винаході. Переважні властивості й/або високий терапевтичний потенціал також можна екстраполювати на антитіла, фрагменти таких антитіл, зв'язувальні білки на основі таких антитіл, АОС,
САРЕ, які містять лише один з двох імуноглобулінових ланцюгів розкритих антитіл (тобто або важкий, або легкий ланцюг) або один з двох імуноглобулінових ланцюгів (тобто важкий або легкий ланцюг), які є гомологичними проілюстрованим антитілам.
ІІ. Визначення 0066) Якщо не визначено інше, всі технічні та наукові терміни, які вживаються в даному документі, мають ті ж самі визначення, які зазвичай розуміються фахівцями в галузі техніки, до якої належить даний винахід. У матеріалах за наступними посиланнями фахівцеві наведене загальне визначення багатьох термінів, що застосовуються в даному винаході: Асадетіс Рге55 Біскнопагу ої Зсіепсе апа
Тесппоіоду, Могттіз (Еа.), Асадетіс Ргезз (15ії ейд., 1992); Охога бісііопагу ої Віоспетівігу апа МоІесшаг
Віоіоду, Зтіїй єї аїЇ. (Ед5.), Охота Опімегейу Ргевз5 (гемізед єй., 2000); Епсусіораєдіс Оісіопагу ої
Спетівігу, Китаг (Ед.), Аптої! Рибіїсайопе Рмі. Па. (2002); ОРісіопагу ої Місторіоюду апа Моїіесшіаг
Віоіоду, біпдієїоп сеї аї. (Едв5.), дуопп М/йеу б оп (За єд., 2002); Рісйопагу ої Спетівігу, Нипі (Еа.),
Вошієдає (151 єйд., 1999); Рісйопагу ої Ріпаптасецшііса! Меадісіпе, Маніег (Еа.), Зргіпдег-Мепаяд Теїов5 (1994); Сіспопагу ої Огдапіс Спетівігу, Китаг апа Апапаапа (Еа5.), Аптої Рибіїсайоп5 Рмі. Ца. (2002); і
А Рісіопагу ої Віоїоду (Охтога Рарегбаск Неїегепсе), Мапіп апа Ніпе (Едвз.), Охота Опімегейу Ргезв (4 ед., 2000). Крім того, наведені далі визначення представлені, щоб допомо!ти читачеві в здійсненні на практиці даного винаходу.
ІЇ0О67| Термін "антитіло" яке також синонімічно називають "імуноглобулінами" (Ід), або "антигензв'язувальний фрагмент" стосується поліпептидного ланцюга(ланцюгів), який характеризується сильним моновалентним, бівалентним або ополівалентним зв'язуванням (із зазначеним антигеном, епітопом або епітопами. Якщо не визначено інше, антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, в контексті даного винаходу, можуть мати послідовності, отримані від будь-яких видів хребетних. Вони можуть бути отримані за допомогою будь-якої зручної технології, наприклад, гібридомної технології, рибосомного дисплея, фагового дисплея, бібліотек, одержаних шляхом перетасовування генів, напівсинтетичних або повністю синтетичних бібліотек або їх комбінацій. Якщо не визначено інше, термін "антитіло", застосовуваний у даному винаході, включає інтактні антитіла, антигензв'язувальні поліпептидні фрагменти та інші сконструйовані антитіла, які описані нижче або добре відомі в даній галузі техніки (див., наприклад, 5егаїїпі, У Мисі. Мей. 34: 533-6, 1993).
І0068) Інтактне "антитіло" зазвичай містить щонайменше два важких (Н) ланцюга (приблизно 50-70 кДа) і два легких (І) ланцюги (приблизно 25 кДа), які зв'язані між собою дисульфідними зв'язками.
Розпізнані гени імуноглобуліну, що кодують ланцюги антитіл, включають гени константних ділянок каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, епсилон і мю, а також гени незліченної кількості варіабельних ділянок імуноглобулінів. Легкі ланцюги класифікують як або каппа, або лямбда. Важкі ланцюги класифікують як гамма, мю, альфа, дельта або епсилон, які, в свою чергу, визначають класи імуноглобулінів: відповідно дос, ІДМ, ІдА, дО і ДЕ. 0069) У кожному важкому ланцюзі антитіла міститься варіабельна ділянка важкого ланцюга (МН) і константна ділянка важкого ланцюга. У константній ділянці важкого ланцюга більшості ізотипів (підкласів) ЇДо міститься три домени: СНІ, СН2 і СНЗ, деякі ізотипи Ідс, такі як (ДМ або ІдЧЕ, містять четвертий домен константної ділянки - СН4. У кожному легкому ланцюзі міститься варіабельна ділянка легкого ланцюга (МІ) і константна ділянка легкого ланцюга. У константній ділянці легкого ланцюга міститься один домен Сі. Варіабельні ділянки важкого й легкого ланцюгів містять зв'язувальний домен, який взаємодіє 3 антигеном. Константні ділянки антитіл можуть опосередковувати зв'язування імуноглобуліну з тканинами або факторами хазяїна, включаючи різні клітини імунної системи і перший компонент (С14) класичної системи комплементу.
І0070)| МН і Мі. ділянки антитіла можуть бути додатково підрозділені на гіперваріабельні ділянки, також звані визначальними комплементарність ділянками (СОМ), які чергуються з більш консервативними каркасними ділянками (ЕК). Кожна УН і МІ. складається з трьох СОК і чотирьох ЕК, розташованих від амінокінця до карбоксильного кінця в такому порядку: ЕК, СОКІ1, ЕК2, СОК2, ЕКЗ,
СОКЗ, ЕК4. Розташування СОК і ЕЕ ділянок і система нумерації були визначені, наприклад, у Кабаї єї аі., Зедоепсевз ої Ргоївїп5 ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, 0.5. Оерайтенпі ої Неайй апа Нитап 5егмісев5, 0.5.
Сомегптепі Ргіпііпуд Ойісе (1987 і 1991).
ІЇ0071| Термін "зв'язувальний білок на основі антитіла", застосовуваний у контексті даного документа, може являти собою будь-який білок, який містить щонайменше один МН, Мі або СН імуноглобуліновий домен, який отримано з антитіла, в контексті інших компонентів, які не отримано з імуноглобулінів або антитіл. Такі білки на основі антитіл включають без обмеження (ї) Ес-злиті білки зв'язувальних білків, включаючи рецептори або рецепторні компоненти з усіма або частинами імуноглобулінових СН доменів, (ії) зв'язувальні білкию, в яких МН або Мі домени з'єднані з альтернативними молекулярними каркасами, або (ії) молекули, в яких імуноглобулінові МН і/або МІ. іабо СН домени об'єднані й/або зібрані так, як це зазвичай не зустрічається в природних антитілах або фрагментах антитіл. (00721 "Афінність зв'язування" зазвичай виражають на основі рівноважних констант асоціації або констант дисоціації (відповідно КА або КО), які, в свою чергу, є зворотними співвідношеннями констант швидкості дисоціації й асоціації (відповідно Кої і Коп). Отже, еквівалентні афінності можуть відповідати різним константам швидкості за умови, що співвідношення констант швидкості залишається незмінним. Афінність зв'язування антитіла зазвичай виражають як КО моновалентного фрагмента (наприклад, ЕРар-фрагмента) антитіла причому значення КО в однорозрядному наномолярному діапазоні або нижче (субнаномолярному або пікомолярному) розглядають як дуже високу і такую, що має терапевтичне й діагностичне значення. 0073) Застосовуваний у контексті даного документа термін "специфічність зв'язування" стосується селективної афінності однієї молекули до іншої, такої як зв'язування антитіл з антигенами (або епітопом, або його антигенною детермінантою), рецепторів до лігандів і ферментів до субстратів.
Отже, усі моноклональні антитіла, які зв'язуються з певною антигенною детермінантою молекули (наприклад, специфічним епітопом КОКІ або КОК2), вважаються тими, що мають однакову специфічність зв'язування до такої молекули.
І0074| Термін "кон'югат антитіла з лікарським засобом" або "АОС" стосується антитіла, з яким ковалентно з'єднана терапевтично активна речовина або активний фармацевтичний інгредієнт (АРІ) з тим, щоб терапевтично активна речовина або активний фармацевтичний інгредієнт (АРІ) могли бути націлені на мішень зв'язування антитілом для здійснення своєї фармакологічної Функції.
Терапевтично активною речовиною або активним фармацевтичним інгредієнтом може бути клітинний токсин, здатний знищувати клітини, на які націлений АОС, переважно злоякісні клітини або клітини злоякісної пухлини. Ковалентне з'єднання терапевтично активної речовини, активного фармацевтичного інгредієнта або клітинного токсину можна здійснити не сайт-специфічним способом із застосуванням стандартних хімічних лінкерів, які з'єднують корисний вантаж з лізиновими або цистеїновими залишками, або, переважно, кон'югацію проводять сайт-специфічним способом, який дозволяє повністю контролювати сайт кон'югації та співвідношення лікарського засобу до антитіла (БАК) у створюваному АОС.
І0075| Термін "консервативно модифікований варіант" стосується як амінокислотних послідовностей, так і послідовностей нуклеїнових кислот. Що стосується конкретних послідовностей нуклеїнових кислот, консервативно модифіковані варіанти стосуються тих нуклеїнових кислот, які кодують ідентичні або фактично ідентичні амінокислотні послідовності, або, якщо нуклеїнова кислота не кодує амінокислотну послідовність, фактично ідентичних послідовностей. Через виродженість генетичного коду будь-який заданий білок кодує велика кількість функціонально ідентичних нуклеїнових кислот. Наприклад, усі кодони СА, СС, СО та СИ кодують амінокислоту аланін.
Отже, в кожному положенні, де аланін вказано кодоном, кодон може бути змінений на будь-який з відповідних описаних кодонів без зміни кодованого поліпептиду. Такі варіації нуклеїнової кислоти є "мовчазними варіантами", які є одним 3 видів консервативно модифікованих варіантів. Кожна послідовність нуклеїнової кислоти в даному документі, яка кодує поліпептид, також описує всі можливі мовчазні варіанти нуклеїнової кислоти. Фахівець у даній галузі техніки зрозуміє, що кожен кодон у нуклеїновій кислоті (за винятком АОС, який зазвичай є єдиним кодоном для метіоніну, і То, який зазвичай є єдиним кодоном для триптофану), може бути модифіковано з отриманням функціонально ідентичною молекули. Відповідно, під кожною описаною послідовністю мається на увазі кожен мовчазний варіант нуклеїнової кислоти, який кодує такий поліпептид.
І0076) У разі поліпептидних послідовностей, "консервативно модифіковані варіанти" відносяться до варіанту, який має консервативні амінокислотні заміни, амінокислотні залишки, замінені іншим амінокислотним залишком, який має бічний ланцюг з аналогічним зарядом. Сімейства амінокислотних залишків, що мають бічні ланцюги з аналогічними зарядами, були визначені в рівні техніки. Ці сімейства включають амінокислоти з основними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотними бічними ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними бічними ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), неполярними бічними ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), бета-розгалуженими бічними ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) та ароматичними бічними ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланин, триптофан, гістидин).
І0077| Термін "приведення в контакт" має своє нормальне значення та стосується об'єднання двох або більше засобів (наприклад, поліпептидів або фага), об'єднання засобів і клітин або об'єднання двох популяцій різних клітин. Приведення в контакт може відбуватися іп міго, наприклад, змішування антитіла й клітини або змішування популяції антитіл з популяцією клітин в тестовій пробірці або в ростовому середовищі. Приведення в контакт може також відбуватися в клітині або іп 5йи, наприклад, приведення в контакт двох поліпептидів в клітині шляхом спільної експресії в клітині рекомбінантних полінуклеотидів, що кодують ці два поліпептиди, або в клітинному лізаті. Приведення в контакт може також відбуватися іп мімо всередині суб'єкта, наприклад, шляхом введення засобу суб'єкту для доставки засобу до клітини-мішені. (0078) "Гуманізоване антитіло" являє собою антитіло або фрагмент антитіла, антигензв'язувальний фрагмент або зв'язувальний білок на основі антитіла, що містить МН або Мі домени антитіла з гомологією до каркасних МН або Мі послідовностям антитіла людини, які мають показник 120, що перевищує 80, як визначено у Зао еї аї. (2013) ВМС Віоїтесппої. 13, рр. 55.
І0079| Терміни "ідентична" або відсоток "ідентичності" в контексті двох або більше нуклеїнових кислот або поліпептидних послідовностей стосується двох або більше послідовностей або підпослідовностей, які є однаковими. Дві послідовності є "практично ідентичними", якщо дві послідовності мають зазначений відсоток амінокислотних залишків або нуклеотидів, які Є однаковими (тобто на 60 95 ідентичними, необов'язково на 65 95, 70 95, 75 95, 80 95, 85 95, 90 95, 95 95 або 99 95 ідентичними в певній ділянці або, якщо не вказано, по всій послідовності) під час порівняння та вирівнювання за максимальної відповідності в порівнянні з відрізком порівняння або сконструйованою ділянкою, виміряною за допомогою одного з наведених далі алгоритмів порівняння послідовностей або шляхом ручного вирівнювання й візуального огляду. Необов'язково, ідентичність має місце протягом ділянки, яка становить в довжину щонайменше приблизно 50 нуклеотидів (або 10 амінокислот) або більше переважно протягом ділянки, яка становить в довжину від 100 до 500 або 1000 або більше нуклеотидів (або 20, 50, 200 або більше амінокислот).
І0080| Способи вирівнювання послідовностей для порівняння добре відомі в даній галузі техніки.
Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння може бути проведено, наприклад, за допомогою алгоритму пошуку локальної гомології Зтййп апа Умагегтап, Аду. Аррі. Май. 2:482с, 1970; за допомогою алгоритму гомологічного вирівнювання МееаІетап апа УМип5сп, у. Мої. Віої. 48:443, 1970; за допомогою методу пошуку подібності Реагзоп апа І іртап, Ргос. Маї). Асад. 5сі. США, 85:2444, 1988; за допомогою комп'ютеризованих реалізацій цих алгоритмів (САР, ВЕЗТРЇІТ, ЕАЗТА і ТЕАЗТА в програмному пакеті УМізсопвіп Сепеїїс5, Сепеїїс5 Сотршиїег Сгоцир, Мадізоп, УМ); або шляхом ручного вирівнювання та візуального огляду (див., наприклад, Вгепі еї аї., Сиггепі Ргоїосої5 іп МоїІесшіаг Віоіоду,
ЧУопп УМміеу 5 оп, Іпс. (гіпдрои ей., 2003)). Двома прикладами алгоритмів, які придатні для визначення відсотка ідентичності послідовностей й подібності послідовностей, є алгоритми ВІ АЗТ і ВІ АБ5Т 2.0, які описані відповідно в АйЙйб5спшці еї аїЇ., Мис. Асіаз Ке5. 25:3389-3402, 1977; і Айбспиці еї аї., 9. Мої. Віо!. 215:403-410, 1990. 0081) Термін "суб'єкт" стосується людей та інших тварин (особливо ссавців, які не є людиною).
Термін "суб'єкт" у даному документі застосовують, наприклад, у зв'язку з терапевтичними та діагностичними способами для позначення суб'єктів-людей або суб'єктів-тварин. До суб'єктів-тварин відносяться без обмеження модельні тварини, такі як ссавці для моделювання станів або порушень, пов'язаних з підвищеною експресією КОКІ, таких як СІ, АЇЇ, лімфома клітин мантійної зони, нейробластома, саркома, нирково-клітинна карцинома, злоякісна пухлина молочної залози, злоякісна пухлина легені, злоякісна пухлина товстої кишки, злоякісна пухлина голови та шиї, меланома й інші види злоякісних пухлин. Інші конкретні приклади суб'єктів, що не відносяться до людини, включають, наприклад, корів, коней, овець, свиней, кішок, собак, мишей, щурів, кроликів, морських свинок, мавп. (0082| Штучні Т-клітинні рецептори (також відомі як химерні Т-клітинні рецептори, химерні імунорецептори, химерні антигенні рецептори (САК) або Т-тільця) являють собою сконструйовані рецептори, які прищеплюють довільну специфічність на імунну ефекторну клітину. Зазвичай, ці рецептори застосовують для прищеплення специфічності моноклонального антитіла на Т-клітину; причому перенесення їх кодуючої послідовності полегшується ретровірусними або лентивірусними векторами або транспозонами. САК-сконструйовані Т-клітини (які також скорочено звуться САН-Т- клітинами) являють собою генетично сконструйовані Т-клітини, оснащені химерними рецепторами, позаклітинна одиниця розпізнавання яких складається з отриманого з антитіла домену розпізнавання, а внутрішньоклітинну ділянку яких отримано з однієї або декількох молекул, які стимулюють лімфоцит.
Структура прототипного САК є модульною, розробленою із врахуванням розміщення різних функціональних доменів і таким чином забезпечення вибору специфічності й контрольованої активації
Т-клітин. Переважною отриманою з антитіла одиницею розпізнавання є одноланцюговий варіабельний фрагмент (5сЕм), який поєднує у собі специфічність і зв'язувальні залишки варіабельних ділянок як важкого, так і легкого ланцюга моноклонального антитіла. До найбільш поширених молекул активації лімфоцитів відноситься Т-клітинний костимуляторний (наприклад, СО28) домен в тандемі з молекулою, яка активує Т-клітини (наприклад, СОЗ72ега). За оснащенням ефекторних лімфоцитів (таких як Т-клітини й натуральні клітини-кілери) такими химерними рецепторами сконструйована клітина перенаправляється з попередньо визначеною специфічності на будь-який необхідний цільовий антиген не рестриктованим за НГА чином. Конструкції САК вводять ех мімо у Т-клітини з периферичних лімфоцитів заданого пацієнта за допомогою ретровірусних або лентивірусних векторів або транспозонів. Після інфузії отриманих у результаті САК-сконструйованих Т-клітин назад пацієнтові вони рухаються, досягають свого цільового сайту, а за взаємодії зі своєю цільовою клітиною або тканиною вони піддаються активації та виконують свою призначену ефекторну функцію.
До терапевтичних мішеней для САК-підходу відносяться клітини злоякісної пухлини й ВІЛ-інфіковані клітини або аутоімунні ефекторні клітини.
І0О83| Терміни "лікувати", "здійснення лікування", "лікування" і "терапевтично ефективний", які вживаються в даному документі, не обов'язково означають проведення 100 95 або повного лікування.
Вірніше існують різні ступені лікування, визнані рядовим фахівцем у даній галузі техніки, які мають потенційний сприятливий результат або терапевтичний ефект. У цьому відношенні спосіб за даним винаходом може забезпечувати будь-яку величину будь-якого рівня лікування. Крім того, лікування, що забезпечується способом за даним винаходом, може включати лікування одного або декількох станів або симптомів захворювання, щодо якого здійснюють лікування. (0084) "Вектор" являє собою реплікон, такий як плазміда, фаг або косміда, до якого може бути приєднаний інший полінуклеотидний сегмент з тим, щоб здійснити реплікацію приєднаного сегмента.
Вектори, які здатні керувати експресією генів, що кодують один або кілька поліпептидів, називаються "векторами експресії".
ІП. Антитіла, зв'язувальні білки на основі таких антитіл, фрагменти таких антитіл, кон'югати антитіла з лікарським засобом (АОС) або САК, які специфічно зв'язуються з КОКТ, і споріднені похідні сполуки 0085) Згідно з одним аспектом, даний винахід стосується нових антитіл, зв'язувальних білків на основі таких антитіл, фрагментів таких антитіл, АОС або САК, які специфічно зв'язуються з КОК1 людини з тією ж специфічністю зв'язування, що й антитіло до КОКІ, проілюстроване в даному документі (фіг. 1 ії 23). До антитіл за даним винаходом відносяться інтактні антитіла (наприклад, антитіла ІдсС1, проілюстровані в даному документі), фрагменти антитіл або антигензв'язувальні фрагменти (наприклад, Рар-фрагменти, проілюстровані в даному документі), зв'язувальні білки на основі таких антитіл, АОС і САК, які містять антигензв'язувальні частини інтактного антитіла, що зберігають здатність зв'язувати родинний антиген КОКІ. Приклади таких фрагментів антитіл включають (ї) Рар-фрагмент, моновалентний фрагмент, що складається з МІ, МН, СІ ї СНІ доменів; (ї) Кар)2-фрагмент, бівалентний фрагмент, що містить два Габ-фрагмента, з'єднаних дисульфідним містком у шарнірній ділянці; (ії) Ба-фрагмент, що складається з МН їі СНІ доменів; (ім) Ем-фрагмент, що складається з МІ. і МН доменів одного плеча інтактного антитіла; (м) дисульфідні стабілізовані Ем (а5Ем), які мають межланцюговий дисульфидний зв'язок, сконструйований між структурно консервативними каркасними ділянками; (мі) однодоменне антитіло (дАБ), яке складається з МН або
МІ. домену (див., наприклад, Умага еї аїЇ., Маїшге 341:544-546, 1989); їі (мії) виділену визначальну комплементарність ділянку (СОМ) у вигляді лінійного або циклічного пептиду. Прикладами зв'язувальних білків на основі таких антитіл є поліпептиди, в яких зв'язувальні домени антитіл з'єднані
З іншими поліпептидами або поліпептидними доменами, наприклад, з альтернативними молекулярними каркасами, Ес-ділянками, іншими функціональними або зв'язувальними доменами інших поліпептидів або антитіл, що в результаті дає молекули з додатковими властивостями зв'язування, наприклад, бі- або мультиспецифічні білки або антитіла. Такі поліпептиди можуть утворювати схему зв'язувальних або функціональних доменів, яка в нормі не зустрічається у природних антитіл або фрагментів антитіл.
ЇОО8б6| Антитіла за даним винаходом також охоплюють фрагменти антитіл (або
"антигензв'язувальні фрагменти"), такі як одноланцюгові антитіла. Термін "одноланцюгове антитіло" стосується поліпептиду, який містить МН домен і Мі домен у поліпептидному зв'язку, зазвичай утвореним за допомогою спейсерного пептиду, та який може містити додаткові домени або амінокислотні послідовності на амінокінці й/або карбоксикінці. Наприклад, одноланцюгове антитіло може містити зв'язувальний сегмент для приєднання до кодуючого полінуклеотиду. Як приклад, одноланцюговий фрагмент варіабельної ділянки (5сЕм) являє собою одноланцюгове антитіло. У порівнянні з МІ ї МН доменами Емк-фрагмента, які кодуються окремими генами, 5сЕм має два домени, з'єднані (наприклад, за допомогою рекомбінантних способів) синтетичним лінкером. Це дозволяє отримати їх у вигляді одного білкового ланцюга, в якому МІ. і МН ділянки спаровуються з утворенням моновалентних молекул.
І0087| Антитіла за даним винаходом також охоплюють однодоменні антигензв'язувальні одиниці, які мають каркас верблюжих антитіл. До тварин в сімействі верблюжі відносяться верблюди, лами й альпаки. Верблюжі виробляють функціональні антитіла, позбавлені легких ланцюгів. Варіабельний (УН) домен важкого ланцюга автономно складається та незалежно функціонує як антигензв'язувальна одиниця. Її зв'язувальна поверхня включає лише три СОВ. у порівнянні з шістьма СОВ. в класичних антигензв'язувальних молекулах (Бар) або одноланцюгових варіабельних фрагментах (5сСЕм).
Верблюжі антитіла здатні досягати афінностей зв'язування, порівнянних з традиційними антитілами. 0088) Різні антитіла, зв'язувальні білки на основі таких антитіл і фрагменти антитіл, описані в даному документі, можна отримати шляхом ферментативної або хімічної модифікації інтактних антитіл, або синтезувати де помо за допомогою методик рекомбінантних ДНК, або виявити за допомогою бібліотек фагового дисплея. Способи отримання таких антитіл, зв'язувальних білків на основі таких антитіл і фрагментів таких антитіл добре відомі в даній галузі техніки. Наприклад, одноланцюгові антитіла можна виявити за допомогою бібліотек фагового дисплея або бібліотек рибосомного дисплея, бібліотек з перетасуванням генів (див., наприклад, МеСайепу еї аї., Майшге 348:552-554, 1990; і патент США Мо 4946778). Зокрема, 5сЕм-антитіла можна отримати за допомогою способів, описаних, наприклад, в Віга еї аї., 5сіепсе 242:423-426, 1988; і Них5іюоп еї аї., Ргос. Маї). Асад.
Зсі. ОБА 85:5879-5883, 1988. Ем-фрагменти антитіл можна отримати, як описано в 5Кега апа
Рійскійип, Зсіепсе 240:1038-41, 1988. Стабілізовані дисульфідними зв'язками Ем-фрагменти (азеЕм) можна отримати за допомогою способів, описаних, наприклад, в Кейег еї аї., Іпі. У. Сапсег 67:113-23, 1996. Аналогічно, однодоменні антитіла (4АБ) можна отримати за допомогою низки способів, описаних, наприклад, в Умага еї аї., Маїиге 341:544-546, 1989; і в Саї апа Сагеп, Ргос. Маї|. Асад. збі.
ИБА 93:6280-85, 1996. Верблюжі однодоменні антитіла можна отримати за допомогою способів, добре відомих в даній галузі, наприклад, з Оитоціїп еї аї., Маї. Бігисі. Віої. 11:500-515, 2002; СНнапгоцаї еї аї.,
ЕЕВ5 Іейегз 414:521-526, 1997; і Вопа сеї аї., 9. Мої. Віої. 332:643-55, 2003. Інші типи антигензв'язувальних фрагментів (наприклад, Раб, Е(абБ)2 або Ра-фрагменти) також можна легко отримати за допомогою загальноприйнятих на практиці імунологічних способів. Див., наприклад,
Напому 4 І апе, Овіпу Апііродієв, А І арогаїогу Мапиаї, Соїд Зргіпд Натотг І арогаїюгу Ргез5, Соїа 5рігіпа
Натог, Мем МогКк, 1998.
І0089| Антитіла за даним винаходом додатково включають гуманізовані антитіла з більш високою гомологією на амінокислотному рівні МН або Мі доменів гуманізованого антитіла з МН або МІ. доменами антитіла людини, ніж з МН або Мі доменами гризунів, переважно з показником Т20, що перевищує 80, як визначено у Зао еї аї. (2013) ВМС Віоїтесппої. 13, рр. 55.
І0О090І| Згідно з деякими варіантами здійснення, антитіла, фрагменти таких антитіл, зв'язувальні білки на основі таких антитіл, АОС або САКЕ згідно з даним винаходом мають послідовності СОР,
СОК2 ї СОКЗ важкого ланцюга й послідовності СОКІ, СОК2 і СОКЗ легкого ланцюга, які практично ідентичні послідовностям антитіл, показаним на фіг.17 або на фіг.23. На цій фігурі показані послідовності СОК легкого ланцюга й важкого ланцюга ілюстративних антитіл. Згідно з деякими з цих варіантів здійснення, антитіла, фрагменти таких антитіл, зв'язувальні білки на основі таких антитіл,
АС або САК мають (1) послідовності СОК1-3 важкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно
ЗЕО ІЮО МО:27-29; і послідовності СОМК1-3 легкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно ЗЕО ІЮ
МО:66-68; (2) послідовності СОК1-3 важкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно 5ЕО І
МО:30-32; і послідовності СОК1-3 легкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно ЗЕО ІЮ МО:69- 71; (3) послідовності СОК1-3 важкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно БЕО ІЮ МО:33-35; і послідовності СОМК1-3 легкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно 5ЕСО ІЮ МО:72-74; (4) послідовності СОМК1-3 важкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно 5ЕО ІЮ МО:36-38; і послідовності СОМК1-3 легкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно 5ЕСО ІЮ МО:75-77; (5) послідовності СОМК1-3 важкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно 5ЕО ІЮО МО:39-41; і послідовності СОВ1-3 легкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно ЗЕО ІЮ МО:78-80; (6) послідовності СОМК1-3 важкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно 5ЕО ІЮО МО:42-44: і послідовності СОМК1-3 легкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно 5ЕС ІЮ МО:81-83; (7) послідовності СОМК1-3 важкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно 5ЕО ІЮО МО:45-47; і послідовності СЮОК1-3 легкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно ЗЕО ІЮ МО:84-86; (8)
послідовності СОК1-3 важкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно ЗЕ І МО: 48-50; і послідовності СЮОК1-3 легкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно ЗЕО ІЮ МО:87-89; (9) послідовності СОМК1-3 важкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно 5ЕО ІЮО МО:51-53; і послідовності СЮОК1-3 легкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно 5ЕО ІЮ МО:90-92; (10) послідовності СОМК1-3 важкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно 5ЕО ІЮО МО:54-56; і послідовності СЮОК1-3 легкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно ЗЕО ІЮ МО:93-95; (11) послідовності СОМК1-3 важкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно 5ЕО ІЮО МО:57-59; і послідовності СЮОК1-3 легкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно ЗЕО ІЮ МО:96-98; (12) послідовності СОМ1-3 важкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно ЗЕО ІЮ МО: 60-62; і послідовності СОМ1-3 легкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно ЗЕО ІЮ МО:99-101; або (13) послідовності СОМК1-3 важкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно 5ЕО ІЮО МО:63-65; і послідовності СОК1-3 легкого ланцюга, які практично ідентичні відповідно 5ЕО 10 МО:102-104.
ІО091) Згідно з деякими варіантами здійснення, антитіла, фрагменти таких антитіл, зв'язувальні білки на основі таких антитіл, АОС або САЕ за даним винаходом містять послідовності СОМБ1-СОВЗ важкого ланцюга і СОК1-СОВЗ легкого ланцюга, ідентичні послідовностям, наведеним в (1) ЗЕО ІЮ
МО:27-29 і ЗЕО ІО МО:66-68 (антитіло ХВК1-402), (2) 5ЕО ІЮ МО:30-32 і ЗЕО ІЮ МО:69-71 (антитіло
ЕВА1-301), (3) БЕО ІЮ МО:33-35 ії ЗЕО ІЮ МО:72-74 (антитіло ЕКК1-306), (4) БЕО 10 МО:36-38 і БЕО І
МО:75-77 (антитіло ЕКК1-316), (5) 5ЕО ІЮ МО:39-41 і ЗЕО ІЮ МО:78-80 (антитіло ЕКК1-324), (6) 5ЕО
ІО МО:42-44 і ЗЕО ІЮО МО:81-83 (антитіло ЕКК1-403), (7) 5ЕО ІЮ МО: 45-47 і ЗЕО ІЮ МО:84-86 (антитіло
ЕВА1-409), (8) БЕО ІЮ МО:48-50 ії ЗЕО І МО:87-89 (антитіло ЕКК1-ТОРА), (9) БЕО І МО:51-53 і ЗЕО
ІО МО:90-92 (антитіло ЕКК1-ТОР15), (10) 5БЕО ІЮ МО:54-56 і ЗЕО ІЮ МО:93-95 (антитіло ЕКК1-ТОР2), (11) 5ЕО І МО:57-59 і 5ЕО ІЮ МО:96-98 (антитіло ЕКК1-ТОР40), (12) 5ЕО І МО:60-62 і 5ЕО І
МО:99-101 (антитіло ЕКА1-ТОР43) або (13) 5ЕО ІЮ МО:63-65 і 5ЕО ІЮ МО:102-104 (антитіло ЕКК1-
ТОРБА). 00921 Згідно з іншими варіантами здійснення, антитіла, фрагменти таких антитіл, зв'язувальні білки на основі таких антитіл, АОС або САК за даним винаходом, які специфічно зв'язуються з КОК1 людини, містять (а) варіабельний домен легкого ланцюга, який має послідовність, яка практично ідентична будь-якій з БЕО ІЮ МО:14-26 або 136-141, (б) варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність, яка практично ідентична будь-якій з БЕО ІЮ МО:1-13 або 130-135, або (с) як легкий ланцюг (а), так і важкий ланцюг (Б). Згідно з деякими варіантами здійснення, антитіло містить як легкий ланцюг (а), так і важкий ланцюг (Б). Згідно з деякими варіантами здійснення, антитіла, фрагменти таких антитіл, зв'язувальні білки на основі таких антитіл, АОС або САК за даним винаходом містять (а) варіабельний домен легкого ланцюга, який має щонайменше 90 95 ідентичності з будь-якою з ЗЕО ІЮ
МО:14-26 або 136-141, (5) варіабельний домен важкого ланцюга, який має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності з будь-якою з ЗЕО ІЮ МО:1-13 або 130-135 або (с) як легкий ланцюг (а), так і важкий ланцюг (Б). Згідно з деякими варіантами здійснення, відсоток ідентичності може становити щонайменше 91 95, щонайменше 92 95, щонайменше 93 96, щонайменше 94 95, щонайменше 95 95, щонайменше 96 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 або навіть 100 95.
Згідно з деякими варіантами здійснення, варіабельний домен легкого ланцюга має щонайменше 95 95 ідентичності з будь-якою з 5ЗЕО ІЮ МО:14-26 або 136-141. Згідно з деякими варіантами здійснення, варіабельний домен легкого ланцюга має 100 95 ідентичності з будь-якою з ЗЕО ІЮ МО:14-26 або 136- 141. Згідно з деякими варіантами здійснення, антитіло, фрагменти такого антитіла, зв'язувальні білки на основі такого антитіла, АОС або САК містять варіабельний домен важкого ланцюга, який має щонайменше 9095 ідентичності з будь-якою з ЗЕО ІЮ МО:1-13 або 130-135. Згідно з іншими варіантами здійснення, відсоток ідентичності може становити щонайменше 91 95, щонайменше 92 95, щонайменше 93 96, щонайменше 94 95, щонайменше 95 96, щонайменше 96 9565, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 або навіть 100 95. Згідно з деякими варіантами здійснення, варіабельний домен важкого ланцюга має щонайменше 95 95 ідентичності з будь-якою з 5ЕО ІЮ МО:1- 13 або 130-135. Згідно з деякими варіантами здійснення, варіабельний домен важкого ланцюга має 100 95 ідентичності з будь-якою з БЕО ІЮ МО:1-13 або 130-135.
І0093| Згідно з деякими варіантами здійснення, антитіла, фрагменти таких антитіл, зв'язувальні білки на основі таких антитіл, АОС або САК за даним винаходом можуть містити будь-який важкий ланцюг, який описано в даному документі (наприклад, важкі ланцюги, показані на фіг. 1 і 23), в комбінації з будь-яким придатним легким ланцюгом, наприклад, одним з проілюстрованих у даному документі. Аналогічно, антитіло може містити будь-який з легких ланцюгів, які описані вище (наприклад, легкі ланцюги, показані на фіг. 1 ії 23), в комбінації з будь-яким придатним важким ланцюгом, наприклад, одним з проілюстрованих у даному документі. Наприклад, згідно з переважними варіантами здійснення, антитіло містить легкий ланцюг, що має щонайменше 90 95 ідентичності з БЗЕО
ІО МО:14, і важкий ланцюг, що має щонайменше 90 95 ідентичності з «ЕО ІЮ МО:1 (антитіло ХВК1- 402), легкий ланцюг, що має щонайменше 90 95 ідентичності з «ЕО ІО МО:18, і важкий ланцюг, що має щонайменше 90905 ідентичності з 5ЕО ІО МО:5 (антитіло ЕКК1-324), легкий ланцюг, що має щонайменше 90 905 ідентичності з 5БЕО ІО МО:25, і важкий ланцюг, що має щонайменше 90 95 ідентичності з «ЕО ІЮ МО:12 (антитіло ЕЕК1-ТОРА43), або легкий ланцюг, що має щонайменше 90 95 ідентичності з БЕО ІО МО:26, і важкий ланцюг, що має щонайменше 90 95 ідентичності з БЕО ІЮ МО:13 (антитіло ЕКК1-ТОР5БА4). Згідно з деякими варіантами здійснення, антитіло може містити послідовності легкого ланцюга й важкого ланцюга, відповідно наведені в (1) ЗЕО ІЮ МО:14 ії ЗЕО ІЮ МО-1, (2) 5ЕО ІЮ
МО:18 ї ЗЕО ІО МО:5, (3) ЗЕО ІЮ МО:25 і БЕО ІО МО:12 або (4) 5ЕО ІО МО:26 і 5ЕО ІЮ МО:13. Згідно з різними варіантами здійснення, відсоток (90) ідентичності пептидних послідовностей може бути розрахований, наприклад, як 100 х Кідентичні положення)/хв. (ТОЗА, ТОВ)), де ТОА і ТОВ є сумою кількості залишків і положень внутрішніх гепів у пептидних послідовностях А і В під час вирівнювання, яке мінімізує ТОСА і ТОВ. Див., наприклад, КиззеїЇ єї аї., У. Мої. Віої., 244: 332-350 (1994). 0094) Антитіло за даним винаходом може бути будь-яким антитілом, включаючи повнорозмірне антитіло, фрагмент антитіла, зв'язувальний білок на основі антитіла, яке специфічно розпізнає або зв'язується з позаклітинним доменом КОКІ людини. Наприклад, антитіло, фрагмент антитіла або зв'язувальний білок на основі антитіла можуть бути поліклональними, моноклональними, рекомбінантними, химерними або гуманізованими. Крім того, антитіло може бути будь-якого ізотипу, включаючи без обмеження ІдА, ІдО, ІДЕ, Ідс або ІдМ. Так, наприклад, антитіло може бути будь-яким
ІДА, таким як ІдА1 або ІдАг, або будь-яким Ідс, таким як Ідс1, Ідс2, ІдсЗ, Ідс4 або синтетичний до.
Антитіло також може бути будь-яким фрагментом антитіла або зв'язувальним білком на основі антитіла, які мають специфічність до позаклітинного домену КОКІ1 людини, таким як ЕК(ар)2, Ем, зсЕм,
ІДаАСН2, Е(ар)2, зсЕМ2СНЗ, Раб, мі, МН, зсЕм4, зсЕм3, зсЕм2, авзЕм, Ем, зсЕм-Ес, (зсЕМм)2, діатіло, бівалентне, біспецифічне або мультиспецифічне антитіло. Антитіло може бути будь-яким модифікованим або синтетичним антитілом, включаючи без обмеження невиснажувальні антитіла Ідс,
САБРК або інші Ес- або Раб-варіанти антитіл.
І0095) На додаток до важкого ланцюга, який описано вище, антитіло, зв'язувальні білки на основі такого антитіла або фрагменти таких антитіл за даним винаходом можуть додатково містити легкий ланцюг, обраний з бібліотеки Бар за допомогою послідовної перетасовки наївних ланцюгів.
Аналогічно, на додаток до легкого ланцюга, який описано вище, антитіло за даним винаходом може додатково містити важкий ланцюг, обраний з бібліотеки Рар за допомогою послідовної перетасовки наївних ланцюгів.
Згідно з деякими варіантами здійснення, даний винахід стосується антитіл, зв'язувальних білків на основі таких антитіл або фрагментів таких антитіл, які є консервативно модифікованими варіантами антитіл до КОКІ, проілюстрованих в даному документі. Як правило, варіабельні ділянки таких варіантів мають амінокислотну послідовність, яка ідентична одній з таких проілюстрованих послідовностей, за винятком консервативних замін за одним або декількома амінокислотним залишкам. Згідно з деякими варіантами здійснення, антитіло, фрагменти такого антитіла, зв'язувальні білки на основі такого антитіла, АОС або САК за даним винаходом специфічно зв'язуються з КОК1 людини й містять щонайменше один СОК, що має послідовність, вибрану з групи, що складається з
ЗЕО ІЮ МО:27-104. Даний винахід також стосується виділеного антитіла зі специфічністю до РОКІ, яке містить один або кілька варіантів вищевказаних послідовностей СОК або практично ідентичних послідовностей СОК. Варіанти послідовностей СОМ у цих антитілах можуть включати 1, 2 або З заміни, вставки, делеції або їх комбінації в послідовності, обраної з групи, що складається з ЗЕО ІЮ
МО:27-104. Наприклад, рекомбінантне химерне або гуманізоване антитіло (або його фрагмент) може включати одну, дві, три, чотири, п'ять або шість з наведених вище послідовностей СОК. Проте, згідно з деякими варіантами здійснення, рекомбінантне химерне або гуманізоване антитіло (або його фрагмент) включає три послідовності СОК одного й того ж легкого або важкого ланцюга, наприклад
СОК легкого ланцюга, наведені в 5ЕО ІЮ МО:66-68, 5ЕО ІЮ МО:78-80, 5ЕО 10 МО:99-101 або 5ЕО ІЮ
МО:102-104; ії СОК важкого ланцюга, наведені в 5ЕО ІЮ МО:27-29, 5ЕО ІЮ МО:39-41, БЕО ІЮ МО:60-62 або 5ЕО ІЮ МО:63-65. Згідно з деякими варіантами здійснення, рекомбінантне химерне або гуманізоване антитіло (або його фрагмент) включає шість послідовностей СОК одного й того ж антитіла, наприклад: (а) ЗЕО ІЮ МО:66-68 і БЕО ІЮ МО:27-29 (антитіло ХВК1-402); (В) БЕО ІЮ МО:78-80 і ЗЕО ІЮ МО: 39-41 (антитіло ЕКК1-324); (с) 5ЕО ІЮ МО:99-101 ії 5ЕО ІО МО:60-62 (антитіло ЕКК1-
ТОРА4З) або (4) ЗЕО ІЮ МО:102-104 ії ЗЕО ІЮ МО:63-65 (антитіло ЕЕК1-ТОРБА).
І0096) Згідно з деякими варіантами здійснення, даний винахід стосується антитіл, зв'язувальних білків на основі таких антитіл або фрагментів таких антитіл з авідністю до КОК1 приблизно 10 мкм або менше, 5 мкМ або менше, 2 мкМ або менше, 1 мкМ або менше, 500 нМ або менше, 400 нМ або менше, 300 нМ або менше або 200 нМ або менше. Згідно з деякими варіантами здійснення, антитіла, фрагменти таких антитіл, зв'язувальні білки на основі таких антитіл, АОС або САК зв'язуються з КОК1 з авідністю приблизно 100 нМ або менше, приблизно 75 нМ або менше, приблизно 50 нМ або менше, приблизно 25 нМ або менше, приблизно 10 нМ або менше або приблизно 5 нМ або менше. Згідно з деякими варіантами здійснення, антитіла, фрагменти таких антитіл, зв'язувальні білки на основі таких антитіл, АОС або САК зв'язуються з КОКІ з авідністю приблизно 1 нМ або менше, приблизно 800 пМ або менше, приблизно 700 пМ або менше, приблизно 600 мМ або менше, приблизно 500 пМ або менше, приблизно 400 пМ або менше, приблизно 300 пМ або менше, приблизно 200 пМ або менше або приблизно 100 пМ або менше. Авідність можна виміряти за допомогою відомих у даній галузі техніки методик, таких як ІФА, інферометрія шару біомолекул або поверхневий плазмонний резонанс.
І0097| Антитіло, зв'язувальний білок на основі такого антитіла або фрагмент такого антитіла за даним винаходом можна отримати за допомогою будь-якої зручної методики, наприклад, за допомогою будь-якої зручної еукаріотичної або нееукаріотичної системи експресії. Згідно з деякими варіантами здійснення, антитіло отримують за допомогою системи експресії у ссавців. У даному документі проілюстровані деякі конкретні методики отримання антитіл, зв'язувальних білків на основі таких антитіл або фрагментів таких антитіл за даним винаходом. Згідно з деякими варіантами здійснення, антитіла, зв'язувальні білки на основі таких антитіл або фрагменти таких антитіл за даним винаходом можна отримати за допомогою відповідної нееукаріотичної системи експресії, такої як бактеріальна система експресії. Бактеріальні системи експресії можна застосовувати для отримання таких фрагментів, як Е(ар)2, Ем, 5сЕм, ІДСАСН2, Е(ар)2, зсЕм2СНЗ, Рар, мі, МН, 5сЕм4, 5сЕм3, зсЕма2, а5Ем, Ем, зсЕм-Ес, (5С0Ем)2 і діатіла. Методики зміни кодуючих послідовностей ДНК для отримання таких фрагментів відомі в даній галузі техніки. 0098) Антитіла, зв'язувальні білки на основі таких антитіл або фрагменти таких антитіл за даним винаходом можна кон'югувати з синтетичною молекулою за допомогою будь-якого придатного способу кон'югації. Для кон'югації синтетичної молекули можна застосовувати рекомбінантно сконструйований і включений селеноцистеїн (наприклад, як описано в патенті США Мо 8916159, виданому 23 грудня 2014 року). Інші способи кон'югації можуть передбачати ковалентне зв'язування з амінами бічних ланцюгів нативних або сконструйованих лізинів або тіолами бічних ланцюгів цистеїну. Див., наприклад, Уми еї аї., Маї. Віотесппої, 23: 1137-1146 (2005).
І0099| Згідно з переважним варіантом здійснення, антитіла, зв'язувальні білки на основі таких антитіл або фрагменти таких антитіл за даним винаходом, кон'юговані з синтетичною молекулою (так звані "АОС" у разі лікарського кон'югату антитіла з синтетичної молекулою, що є токсином), отримують за допомогою сайт-специфічного опосередкованого ферментом сортаза кон'югування антитіла. Як розкрито в М/О2014140317, сортази (також звані сортазами-транспептидазами) утворюють групу прокаріотичних ферментів, які модифікують поверхневі білки, розпізнаючи та розщеплюючи конкретний пептидний мотив, званий "міткою розпізнавання сортазою" або "міткою сортази". Зазвичай даний фермент сортаза розпізнає одну або декілька міток розпізнавання сортазою. Сортази можуть бути природними або можуть бути підданими генетичній інженерії (боїт еї аІ., РМАЗ 2014; 111, 13343- 8).
ІОО100| Згідно з переважним варіантом здійснення, кон'югат отримують за допомогою сайт- специфічного опосередкованого ферментом сортаза кон'югування (а) антитіла, зв'язувального білка на основі такого антитіла або фрагмента такого антитіла, які описані в даному документі, з однією або декількома мітками розпізнавання сортазою та (Б) однієї або декількох синтетичних молекул, що несуть гліцинову або олігогліцинову мітку, СІУ(п).
І00101) Переважно, мітка розпізнавання сортазою злита або кон'югована з С-кіннем щонайменше одного субдомену антитіла. Зазначена мітка розпізнавання сортазою переважно вибрана з групи, що складається з РХЗО (ЗЕО ІЮ МО:142), ГРХАС (ЗЕО ІЮО МО:143), І РХТа (5ЕО ІО МО: 144), АХТО (ЗЕО ІЮО МО:145) і МРОТО (5ЕО І МО:146).
І00102| Переважно, олігогліцинова мітка, СІу(п), має довжину від 1 до 21 залишків гліцину, де п є будь-яке число від 1 до 21), переважно з довжиною від З до 5 амінокислот (п від З до 5, тобто С1у(3),
СІу(4) або СІу(5)). 00103) Синтетична молекула може являти собою будь-яку молекулу, таку як молекула, націлена на пухлину. Згідно з деякими варіантами здійснення, синтетична молекула для кон'югування з антитілом є білком (наприклад, антитілом) або РНК- або ДНК-аптамером. 00104) Згідно з одним варіантом здійснення, антитіла, зв'язувальні білки на основі таких антитіл або фрагменти таких антитіл за даним винаходом, кон'юговані з синтетичною молекулою, мають загальну формулу А - (І - Р)п, де: А являє собою антитіло, зв'язувальний білок на основі антитіла або фрагмент такого антитіла, які описані в даному документі, Ї являє собою один або кілька лінкерів, Р являє собою один або кілька корисних вантажів, вибраних з групи, що складається з мітки й цитотоксичного або цитостатичного засобу, а п являє собою ціле число від 1 до 10. 00105) Згідно з цим варіантом здійснення, лінкер переважно містить щонайменше один, або складається з нього, який був обраний з групи, що складається з олігопептидного лінкера (включаючи розщеплювальні та нерозщеплювальні олігопептидні лінкери), гідразинового лінкера, тіосечового лінкера, самовідщеплювального лінкера, сукцинімідил-транс-4-(малеїмідилметил)циклогексан-1- карбоксилатного (ЗМСС) лінкера, малеїмідного лінкера, дисульфідного лінкера, тіоетерного лінкера й/або малеїмідного лінкера. 00106) Фахівець у даній галузі техніки розуміє, що можуть бути придатні додаткові лінкери. Такі лінкери можуть бути нерозщеплювальними або можуть розщеплюватися за зміни рН, окисно- відновлюваного потенціалу або за допомогою конкретних внутрішньоклітинних ферментів. До розщеплювальних олігопептидних лінкерів відносяться лінкери, що розщеплюються протеазами або матриксними металопротеазами. Зрозуміло, що лінкер може містити комбінації з перерахованого вище. Наприклад, лінкер може являти собою валін-цітруліновий РАВ лінкер.
І00107| Згідно з переважним варіантом здійснення, лінкер містить олігопептид з послідовністю, яка містить пентапептидний мотив І РХБО (ЗЕО ІЮ МО: 142), І РХАСЄ (ЗЕО І МО 143), І РХТОа (5ЕО ІО
МО:144), ГАХТО (5БО ІЮ МО:1455 або МРОТО (5ЗЕБЕО ІЮ МО:146), де Х являє собою будь-яку амінокислоту, за якою слідує олігогліцинова ділянка, Сіу(п), де п є цілим числом від 2-1 до -21. Згідно з переважним варіантом здійснення, лінкер кон'югований з С-кінцем щонайменше одного субдомена антитіла, зв'язувальних білків на основі такого антитіл або фрагментів такого антитіла.
І0О0О108) Згідно з різними варіантами здійснення, до придатних синтетичних молекул ("корисних вантажів") для кон'югації з антитілом відносяться, наприклад, терапевтичні засоби, такі як цитотоксичні, цитостатичні або антиангіогенні засоби, радіоїзотопи й ліпосоми. Цитотоксичний засіб може являти собою рослинну, грибну або бактеріальну молекулу. Згідно з деякими варіантами здійснення, цитотоксичний засіб для кон'юЮгування з оантитілом за даним винаходом є низькомолекулярним токсином (МУМ «2000 дальтон, переважно МУМ «1000 дальтон), пептидним токсином або білковим токсином. Багато конкретних прикладів цих токсинів добре відомо в даній галузі техніки. Див., наприклад, Буба еї аї., Си. Рпагт. Ое5. 10:2311-34, 2004; Киуисак еї а!., Ешиге
Мед. Спет. 6:1645-58, 2014; Вегаца еї аї., ІпПатт. Аїегду Огид Тагдеїв. 10:322-42, 2011; і МідаіергоокК еї аї., Містгобріої. Нєу. 48:199-221, 1984. Згідно з деякими варіантами здійснення, терапевтичний засіб кон'юговано з антитілом. Наприклад, терапевтичний засіб може являти собою майтанзиноїд (наприклад, майтанзинол або майтанзиноїд ЮОМ'), таксани, каліхеміцин, семадотин, монометилауристатин (наприклад, монометилауристатин Е або монометилауристатин ДК), піролобензодіазепін (РВО) або, переважно, антрациклін, більш переважно - похідне високоактивного антрацикліну РМО-159682. Особливо переважні похідні високоактивного антрацикліну РМО-159682 розкриті в УМО 2016102679 (яка включена в даний документ за допомогою посилання). До терапевтичних засобів також відносяться вінкристин і преднізон. Згідно з різними варіантами здійснення, терапевтичний засіб, який можна використовувати в даному винаході, може являти собою антиметаболіт (наприклад, антифолат, такий як метотрексат, фторпіримідин, такий як 5-фторурацил, цитозину арабінозид або аналог пурину або аденозину); інтеркалюючий засіб (наприклад, антрациклін, такий як доксорубіцин, неморубіцин або, переважно, похідне РМО-159682), дауноміцин, епірабіцин, ідарубіцин, мітоміцин-С, дактиноміцин або мітраміцин або інші інтеркалюючі засіби, такі як піролобензодіазепін; ДНК-реактивний засіб, такий як каліхеміцини, тіанциміцини й інші ендиїни; похідне платини (наприклад, цисплатин або карбоплатин); алкілюючий засіб (наприклад, азотистий іприт, мелфалан, хлорамбуцил, бусульфан, циклофосфамід, іфосфаміду нітрозосечовина або тіотепа); інгібітор РНК-полімерази, такий як с-аманітин; антимітотичний засіб (наприклад, алкалоїд барвінку, такий як вінкристин, або таксоїд, такий як паклітаксел або доцетаксел); інгібітор топоїзомерази (наприклад, етопозид, теніпозид, амсакрин, топотекан); інгібітор клітинного циклу (наприклад, флавопіридол); або засіб, що впливає на мікротрубочки (наприклад, епотилон, тубулізин, претубулізин, аналог дискодермоліду або аналог елеутеробіну). Терапевтичний засіб може являти собою інгібітор протеасом або інгібітор топоїзомераз, такий як бортезоміб, амсакрин, етопозид, етопозидфосфат, теніпозид або доксорубіцин. До терапевтичних радіоіїзотопів належать йод (1311), ітрій (90Х), лютецій (1771 и), актиній (225Ас), празеодим, астат (АЮ), реній (Ке), вісмут (Ві або Ві) і родій (КП). До антиангіогенних засобів належать ліномід, бевакузимаб, ангіостатин і разоксан. 001091 Згідно з переважним варіантом здійснення, молекула синтетичного токсину обрана з РМО- 159682, який описаний в Омпіпійегі еї а. (2005), і його похідних (див. формулу (ї) нижче), майтанзину, монометилауристатину ММАЕ і монометилауристатину ММА. Згідно з переважним варіантом здійснення, токсин, приєднаний до лінкера за його хвилястою лінією, має формулу (і), яку описано в
УМО 2016102679 (яка включена в даний документ за допомогою посилання): рути у ки ї о о она о чит 5-5 - формула (1)
І00110) Згідно з варіантом здійснення, де синтетична молекула має формулу (ї), переважно, щоб лінкер містив алкілдіаміногрупу форми МН2-(СН2)т-МН2, де т --1 і -11, переважно т-2, так щоб одна аміногрупа була безпосередньо зв'язана за хвилястою лінією формул и (ї) з утворенням амідного зв'язку. Крім того, переважно, щоб друга аміногрупа була з'єднана з олігопептидним лінкером, який більш переважно являє собою олігогліцин Сіу(п), причому п становить -21 і -21.
Найбільш переважний корисний вантаж показано на фіг. 11 (В). 00111) Згідно з деякими варіантами здійснення, синтетична молекула може бути кон'югованою з будь-яким антитілом, зв'язувальним білком на основі антитіла або фрагментом антитіла. Згідно з деякими варіантами здійснення, синтетична молекула може бути міткою. Мітки можуть бути корисні в діагностичних цілях і можуть включати, наприклад, контрастні засоби. Контрастним засобом може бути радіоїзотопна мітка, така як йод (1311 або 1251), індій (1111Іп), технецій (99Тс), фосфор (32Р), вуглець (14С), тритій (ЗН), інший радіоїзотоп (наприклад, радіоактивний іон) або терапевтичний радіоїзотоп, такий як один з перерахованих вище терапевтичних радіоізотопів. Крім того, до контрастних засобів можуть належати рентгеноконтрастні матеріали, засоби для магнітно-резонансної візуалізації (МРТ), засоби для ультразвукової візуалізації та будь-які інші контрастні речовини, які придатні для виявлення за допомогою пристрою, який візуалізує організм тварини. Синтетична молекула також може являти собою флуоресцентну мітку, біологічно активну ферментну мітку, люмінесцентну мітку або хромофорну мітку. 001121 Згідно з деякими іншими варіантами здійснення, синтетична молекула може являти собою ліпосому, як описано в Вепаавз, Віобгидв5, 15: 215-224, 2001. Згідно з такими варіантами здійснення, антитіло може бути кон'юЮговане з колоїдною частинкою, наприклад, ліпосомою, та його можна застосовувати для контрольованої доставки засобу до уражених захворюванням клітин. Під час отримання антитіла, кон'югованого з ліпосомою, наприклад, імуноліпосомою, засіб, такий як хіміотерапевтичний або інший лікарський засіб, може бути захопленим у ліпосому для доставки до клітини-мішені. Згідно з деякими варіантами здійснення, антитіла, зв'язувальні білки на основі такого антитіла або фрагменти такого антитіла за даним винаходом також можуть мати специфічність до одного або декількох антигенів на додаток до КОК1. Наприклад, антитіло за даним винаходом може бути сконструйовано так (наприклад, у вигляді бівалентного діатіла або кон'югованого РГар-димера або тримера), щоб воно мало специфічність до КОКІ1 та іншого пухлинного антигену, наприклад, антигену, пов'язаного з нейробластомою, нирково-клітинною карциномою, злоякісною пухлиною молочної залози, злоякісною пухлиною шлунка, злоякісною пухлиною передміхурової залози, злоякісною пухлиною товстої кишки (наприклад, аденокарциномою товстої кишки) або злоякісною пухлиною молочної залози (наприклад, аденокарциномою молочної залози). Антитіло може бути сконструйовано так, щоб воно мало специфічність до КОМІ і антигену, який сприяє активації цитотоксичних ефекторних клітин або націлюванню на них.
ЇМ. Полінуклеотиди, вектори й клітини-хазяєва для отримання антитіл до КОК1
ІЇ00113| Даний винахід стосується практично очищених полінуклеотидів (ДНК або РНК), які є ідентичними або комплементарними послідовностям, які кодують поліпептиди, що містять сегменти або домени ланцюгів антитіла, зв'язувального білка на основі такого антитіла або фрагментів таких антитіл, які описані в даному документі. Згідно з деякими варіантами здійснення, полінуклеотиди за даним винаходом кодують послідовності доменів важкого ланцюга або легкого ланцюга, які показані на фіг. 1 і 23. Під час експресії з відповідних векторів експресії поліпептиди, що кодуються цими полінуклеотидами, здатні виявляти здатність зв'язування антигену КОКІ. Також даний винахід стосується полінуклеотидів, які кодують щонайменше одну СОК-ділянку та зазвичай всі три СОК- ділянки з важкого або легкого ланцюга описаних в даному документі антитіл. Деякі інші полінуклеотиди кодують всю або майже всю послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга й/або легкого ланцюга ілюстративних антитіл. Наприклад, деякі з цих полінуклеотидів кодують амінокислотну послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, наведену в будь-якій з ЗЕО ІЮ
МО:1-13 або 130-135, і/або амінокислотну послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, наведену в будь-якій з ЗЕО ІЮ МО:14-26 або 136-141. Через виродженість коду кожну з амінокислотних послідовностей імуноглобуліну будуть кодувати різні послідовності нуклеїнових кислот. 00114) Полінуклеотиди за даним винаходом можуть кодувати лише послідовності варіабельних ділянок ілюстративних антитіл. Вони також можуть кодувати як варіабельну ділянку, так і константну ділянку антитіла. Деякі з полінуклеотидних послідовностей нуклеїнових кислот за даним винаходом кодують зрілу послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, яка практично ідентична (наприклад, щонайменше на 80 95, 90 95, 95 95 або 99 95) зрілій послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга, наведеній в будь-якій з 5ЕО ІЮ МО:1-13 або 130-135. Деякі інші полінуклеотидні послідовності кодують зрілу послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, яка практично ідентична (наприклад, щонайменше на 80 95, 90 95, 95 95 або 99 95) зрілій послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга, наведеній в будь-якій з ЗЕО ІЮ МО:14-26 або 136-141. Деякі з полінуклеотидних послідовностей кодують поліпептид, який містить варіабельні ділянки важкого ланцюга або легкого ланцюга одного з ілюстративних антитіл. Деякі інші полінуклеотіди кодують два поліпептидних сегменти, які практично ідентичні варіабельним ділянкам важкого ланцюга або легкого ланцюга одного з ілюстративних антитіл. 00115) Полінуклеотидні послідовності можна отримати шляхом твердофазного синтезу ДНК де помо або шляхом ПЛР-мутагенезу наявної послідовності (наприклад, послідовностей, які описані в наведених нижче прикладах), що кодує ілюстративне функціональне антитіло. Прямий хімічний синтез нуклеїнових кислот можна здійснювати способами, відомими в даній галузі, такими як фосфотриестерний спосіб за Магапо еї аї., Мей. Еплутої. 68:90, 1979; фосфодиестеррний спосіб за
Вгоулп еї аїІ., Мей. Еплутої. 68: 109, 1979; диетилфосфорамідитний спосіб за Веаисаде еї аї., Теїга.
Ген, 22: 1859, 1981; і твердофазний спосіб за патентом США Мо 4458066. Уведення мутацій в полінуклеотидну послідовність за допомогою ПЛР можна виконати, як описано, наприклад, у РСК
Тесппоіоду: Ргіпсірієє5 апа Арріїсайоп5 ог ОМА Атріїйісайоп, Н.А. Епісп (Еа.), Ргеетап Ргев5, МУ, МУ, 1992; РСВ Ргоюсої!в: А Спціде о Меїпосдз» апа Арріїсайопв, Іппів еї аї!. (Ед.), Асадетіс Ргевз5, Зап Оієдо,
СА, 1990; Маша еї аї., Мисієїс Асід5 Кев5. 19:967, 1991; і ЕсКеп еї аіІ., РОК Мештоавз апа Арріїсайоп5 1:17, 1991.
І00116| Також даний винахід стосується векторів експресії та клітин-хазяїв для отримання описаних у даному документі функціональних антитіл. Конкретні приклади векторів на основі плазмід і транспозонів для експресії антитіл описані в наведених нижче прикладах. Також можна використовувати різні інші вектори експресії для експресії полінуклеотидів, що кодують ланцюги функціональних антитіл або зв'язувальні фрагменти. Для отримання антитіл в клітині-хазяїні ссавця можна застосовувати як вірусні, так і невірусні вектори експресії. До невірусних векторів й систем належать плазміди, епісомальні вектори, зазвичай з касетою експресії для експресії білка або РНК, і штучні хромосоми людини (див., наприклад, Нагтіпдюп еї аї., Маї. Сепеї. 15:345, 1997). Наприклад, до невірусних векторів, придатних для експресії полінуклеотидів і поліпептидів антитіл в клітинах ссавців (наприклад, людини), належать рРСЕР4, рКЕРА4, ртТпіоНніз А, В 5 С, рсоОМАЗ.1/Ні5, РЕВУНіз А, ВІісС (Іпмігодеп, Сан-Дієго, Каліфорнія), вектори МРБМ і багато інших векторів, відомих у даній галузі техніки для експресії інших білків. До інших придатних невірусних векторів належать вектори, які містять касети експресії, які можуть переноситися транспозонними системами з5іееріпд Веашу,
РіддуВаск і іншими транспозонними системами. До придатних вірусних векторів належать вектори на основі лентивірусів або інших ретровірусів, аденовірусів, аденоасоційованих вірусів, вірусів герпесу, векторів на основі 5М40, вірусу папіломи, вірусу НВР Епштейна - Бара, векторів на основі вірусу коров'ячої віспи та вірусу лісу Семліки (ЗЕМ). Див. Вгепі еї а!І., раніше; Зтійй, Аппи. Нем. Містобіо!. 49:807, 1995; і Козептейй еї а!., Сеї! 68:143, 1992.
ІЇ00117| Вибір вектора експресії залежить від передбачуваних клітин-хазяїв, в яких повинен експресуватися вектор. Зазвичай вектори експресії містять промотор та інші регуляторні послідовності (наприклад, енхансери), які функціонально пов'язані з полінуклеотидами, що кодують ланцюг або фрагмент функціонального антитіла. Згідно з деякими варіантами здійснення, для запобігання експресії вставлених послідовностей, крім індукувальних умов, використовують індуцибельний промотор. До індуцибельних промоторів належать, наприклад, арабінозний, Іас/, металотіонеїновий промотор або промотор теплового шоку. Культури трансформованих організмів можна розмножувати в неіндукувальних умовах без зміщення популяції в бік кодуючих послідовностей, продукти експресії яких краще переносяться клітинами-хазяївами. Для ефективної експресії ланцюга або фрагмента функціональних антитіл крім промоторів також можуть знадобитися або бути необхідні інші регуляторні елементи. До таких елементів зазвичай належать кодон ініціації АТО і сусідній сайт зв'язування з рибосомою (консенсусна послідовність Козака) або інші послідовності. Крім того, ефективність експресії можна підвищити шляхом включення енхансерів, придатних для застосовуваної клітинної системи (див., наприклад, Зспагї еї аї., Кезийв5 Ргобрі. Се! ОШег. 20:125, 1994; і Війпег єї аїІ., Меп. Епгутої., 153:516, 1987). Наприклад, для збільшення експресії в клітинах-хазяївах ссавців можна застосовувати енхансер 5МУ40 або енхансер СМУМ.
ІЇО0118| Вектори експресії також можуть забезпечувати положення сигнальної послідовності секреції для утворення злитого білка з поліпептидами, кодованими вставленими послідовностями функціональних антитіл. Найчастіше вставлені послідовності функціональних антитіл з'єднують з сигнальними послідовностями перед включенням до вектора. Вектори, які необхідно використовувати для отримання послідовностей, що кодують варіабельні домени легкого й важкого ланцюга функціонального антитіла, іноді також кодують константні ділянки або їх частини. Такі вектори уможливлюють експресію варіабельних ділянок у формі злитих білків з константними ділянками, що приводить до отримання інтактних антитіл або їх фрагментів. Зазвичай такі константні ділянки є людськими та переважно з антитіл Ї(931 людини.
І00119) Клітини-хазяїва для утримання й експресії ланцюгів функціональних антитіл можуть бути або прокаріотичними, або еукаріотичними. Згідно з деякими варіантами здійснення, клітини-хазяїва ссавців застосовують для експресії та отримання поліпептидів антитіл за даним винаходом.
Наприклад, вони можуть бути або гібридомною клітинною лінією, що експресує ендогенні гени імуноглобуліну, або клітинною лінією ссавців, що містить екзогенний вектор експресії. До них належать будь-які нормальні смертні або нормальні або аномальні безсмертні клітини тварини або людини. На додаток до клітинних ліній, проїілюстрованих у даному документі, в даній галузі техніки також відомий ряд інших відповідних ліній клітин-хазяїв, здатних секретувати інтактні імуноглобуліни.
До них належать, наприклад, клітинні лінії СНО, різні клітинні лінії НЕК 293, різні клітинні лінії Со5, клітини Нег/ а, лінії мієломних клітин, трансформовані В-клітини та гібридоми. Застосування культури клітин ссавців для експресії поліпептидів в цілому розглянуто, наприклад, у публікації М/ппаскКег, Ггот
Сепев о Сіопе5, МСН Рибіївпегв, М.У., М.У., 1987. Вектори експресії для клітин-хазяїв ссавців можуть включати послідовності для контролю експресії, такі як точка початку реплікації, промотор і енхансер, і необхідні сайти процесування інформації, такі як сайти зв'язування рибосоми, сайти сплайсингу РНК, сайти поліаденілювання та послідовності закінчення транскрипції. Такі вектори експресії зазвичай містять промотори, отримані з генів ссавців або з вірусів ссавців. Придатні промотори можуть бути конститутивними, специфічними для конкретного типу клітин, специфічними для стадії та/або модульованими або регульованими. До придатних промоторів належать без обмеження ЕР1Та і промотори ШБС людини, наведені в даному документі як приклади, металотіонеїновий промотор, конститутивний аденовірусний основний пізній промотор, індуцибельний дексаметазоном промотор
ММТМУ, промотор 5М40, промотор рої ШІ МЕР, конститутивний промотор МРБУ, індуцибельний тетрацикліном промотор СММ (такий як передранній промотор СММ людини), конститутивний промотор СММУ і відомі з рівня техніки комбінації промотора - енхансера.
ІЇ00120| Способи введення векторів експресії, що містять полінуклеотидні послідовності, які становлять інтерес, розрізняються залежно від типу клітинного хазяїна. Наприклад, трансформацію із застосуванням хлориду кальцію зазвичай використовують у випадку прокаріотичних клітин, тоді як обробку фосфатом кальцію або електропорацію можна застосовувати у випадку інших клітинних хазяїв (див. в цілому БатбгооК еї аїЇ., раніше). Інші способи передбачають, наприклад, електропорацію, обробку фосфатом кальцію, опосередковану ліпосомами трансформацію, ін'єкцію та мікроін'єкцію, балістичні способи, віросоми, імуноліпосоми, кон'югати полікатіони:нуклеїнові кислоти, "голу" ДНК, штучні віріони, злиття зі структурним білком вірусу герпесу МР22 (БЕїої апа О'Наге, СеїЇ 88:223, 1997), посилене зовнішнім агентом поглинання ДНК і трансдукцію ех мімо. Для довготривалого високопродуктивного отримання рекомбінантних білків найчастіше потрібна стабільна експресія.
Наприклад, клітинні лінії, які стабільно експресують ланцюги антитіла або зв'язувальні фрагменти, можуть бути отримані за допомогою векторів експресії за даним винаходом, які містять вірусні точки початку реплікації або ендогенні елементи експресії та селективний маркерний ген. Після введення вектора клітинам можна дозволити зростати протягом 1-2 днів у збагаченому середовищі до того, як вони будуть переведені на селективні середовища. Мета селективного маркера полягає в наданні стійкості до відбору, а його наявність допускає зростання клітин, які успішно експресують введені послідовності, в селективних середовищах. Стійкі, стабільно трансфіковані клітини можна розмножувати за допомогою методик культивування тканин, придатних для типу клітин. 00121) Даний винахід додатково стосується еукаріотичних або нееукаріотичних клітин (наприклад,
Т-лімфоцитів), які були рекомбінантно сконструйовані для отримання антитіл, зв'язувальних білків на основі таких антитіл або фрагментів таких антитіл за даним винаходом. Для отримання антитіла за даним винаходом як системи експресії можна застосовувати еукаріотичні або нееукаріотичні клітини.
Згідно з деякими варіантами здійснення, даний винахід стосується націлених на КОК'І імуноцитів, які сконструйовані для рекомбінантної експресії специфічного до КОК1 антитіла за даним винаходом.
Наприклад, даний винахід стосується Т-клітини, сконструйованої для експресії антитіла за даним винаходом (наприклад, 5сЕм, 5сЕм-Ес або (5сЕм)2), яке зв'язане з синтетичною молекулою, що містить один або декілька з наступних доменів: спейсер або шарнірну ділянку (наприклад, послідовність СО28 або !дс4 шарнірну-Рс послідовність), трансмембранну ділянку (наприклад, трансмембранний канонічний домен) і внутрішньоклітинний Т-клітинний рецептор (ТСК), з отриманням таким чином химерного антигенного рецептора (САК) або Т-тіла. Внутрішньоклітинні сигнальні домени ТСК, які можуть бути включені в САК (або Т-тіло), включають без обмеження сигнальні домени СОЗсС, ЕсЕ-у і
ЗуК-РТ, а також косигнальні домени СО28, 4-188 і СО134. Способи конструювання Т-клітин, що експресують САК (або Т-тіло), відомі з рівня техніки. Див., наприклад, Магси-Маїїпа єї аї., Ехрей
Оріпіоп оп ВіоІодіса! Тпегару, Мої. 9, Мо. 5 (опубліковано онлайн 16 квітня 2009 року).
М. Терапевтичні та діагностичні застосування 00122) Антитіла до КОКТ, зв'язувальні білки на основі таких антитіл, фрагменти таких антитіл,
АС і САК, розкриті в даному документі, можна застосовувати для різних терапевтичних та діагностичних задач. КОКІ1 експресується та бере участь у розвитку різних пухлин. Див., наприклад,
Кебвадау еї аї., Егопі Опсої. 2, 34, 2012; ї 5пабапі еї аї!., Ехрегі Оріп. Тег. Тагудеї5 19, 941-955, 2015.
Наприклад, КОКІ1 експресується на поверхні пухлинних клітин у випадку СІ, АГ, лімфоми клітин мантійної зони, нейробластоми, саркоми, нирково-клітинної карциноми, злоякісної пухлини молочної залози, злоякісної пухлини легені, злоякісної пухлини товстої кишки, злоякісної пухлини голови та шиї,
меланоми й інших видів злоякісної пухлини. Важливо відзначити, що КОКІ! експресується в ембріогенезі, але в основному не експресується після народження. Дуже мало дорослих здорових тканин і клітин експресують КОКІ. Так само і САК-сконструйовані Т-клітини до КОКІ виявилися безпечними й активними у приматів, що не відносяться до людини, що підтверджує КОКІ як терапевтичну мішень під час розвитку злоякісної пухлини (Вегдег (2015) Сапсег Іттипо! Ке5. 3(2), раде 2016). Отже, тАр до КОКІ! мають високу терапевтичну та діагностичну цінність у випадку злоякісної пухлини. 00123) Згідно з деякими варіантами здійснення, даний винахід стосується способів пригнічення клітин, які експресують КОКІ (клітини КОК1), шляхом приведення в контакт клітин з антитілом, зв'язувальним білком на основі такого антитіла, фрагментом такого антитіла, АОС або САК за даним винаходом. Антитіло, зв'язувальний білок на основі антитіла або фрагмент такого антитіла може являти собою голу (некон'юговану) молекулу або антитіло, зв'язувальний білок на основі такого антитіла, фрагмент такого антитіла, які кон'юговані з синтетичною молекулою, наприклад цитотоксичним, цитостатичним або антиангіогенним засобом, радіоїзотопом або навіть ліпосомою.
Переважно клітини вводять у контакт з АОС, що містить кон'юговану цитотоксичну молекулу. Спосіб можна застосовувати для інгібування клітин КОКТІ іп міго або у суб'єкта (тобто іп мімо). Приведені у контакт клітини КОК1 можуть перебувати, наприклад, в культурі клітин або тваринної моделі розладу, пов'язаного з підвищеними рівнями КОК1. Способи придатні, наприклад, для вимірювання та/або ранжування (відносно іншого антитіла) інгібувальної активності антитіла щодо конкретного типу клітин
КОН. Інгібування клітин КОКІ може включати блокування або зниження активності або зростання клітин КОКТ. Інгібування також може включати знищення клітин КОК1. Хоча способи не пов'язані або не обмежені будь-яким конкретним механізмом дії, інгібувальна активність може опосередковуватись блокуванням КОК1-опосередкованої передачі сигналу або блокуванням передачі сигналу від КОК1- асоційованого рецептора. Інгібувальна активність також може бути опосередкована рекрутингом ефекторів імунної системи, які атакують клітини КОК1, наприклад, шляхом активації компонентів системи антитілозалежної клітиноопосередкованої цитотоксичності (АОСС) або системи комплементу. 00124) Згідно з деякими пов'язаними варіантами здійснення, даний винахід стосується способів лікування суб'єкта, у якого підозрюють наявність або який має ризик розвитку розладу, пов'язаного з експресією КОКТ1. Зазвичай, такі способи передбачають введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості виділеного антитіла, зв'язувального білка на основі такого антитіла, фрагмента такого антитіла, АОС або САК за даним винаходом. Антитіло може бути будь-яким антитілом до КОКІ1, фрагментом антитіла до КОКІ, зв'язувальним білком на основі антитіла до КОКІ! за даним винаходом, які описані в даному документі. Отже, антитіло може бути химерним, гуманізованим, синтетичним, К(ар)2, Ем, зсЕм, ІДСАСН2, К(ар)2, зсЕмМ2СНЗ, Бар, м, МН, 5сЕм4, 5сЕм3, 5сЕм2, азеЕм, Ем або (5СЕМ)2. Згідно з деякими варіантами здійснення, спосіб передбачає введення Ідс, 5сЕм, азеЕм,
К(ар)2, діатела або бівалентного антитіла. Антитіло, зв'язувальний білок на основі такого антитіла, фрагмент такого антитіла, які вводять, можуть бути кон'юговані з описаною вище синтетичною молекулою, наприклад, цитотоксичним, цитостатичним або антиангіогенним засобом, терапевтичним радіоїзотопом або ліпосомою. Типовим цитотоксичним засобом є екзотоксин синьогнійної палички А (РЕЗ8). До розладів, які можна лікувати, належать СІЇ, АЇЇ, лімфома клітин мантійної зони, нейробластома, саркома, нирково-клітинна карцинома, злоякісна пухлина молочної залози, злоякісна пухлина легені, злоякісна пухлина товстої кишки, злоякісна пухлина голови та шиї, меланома й інші розлади, пов'язані з підвищеною експресією КОКІ1. 00125) Згідно з деякими варіантами здійснення, даний винахід стосується способів лікування суб'єкта, у якого підозрюють наявність або який має ризик розвитку розладу, пов'язаного з підвищеними рівнями КОК1, шляхом адаптивного перенесення генетично сконструйованих Т-клітин, описаних у даному документі, які експресують антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за даним винаходом у формі химерного антигенного рецептора (САК), який вибірково зв'язує КОКІ1.
Рекомбінантну методику можна застосовувати для введення генетичного матеріалу, що кодує САК, у будь-які відповідні Т-клітини, наприклад, центральні Т-клітини пам'яті від суб'єкта, що підлягає лікуванню. Т-клітини, що несуть генетичний матеріал, можна розмножити (наприклад, у присутності цитокінів). Генетично сконструйовані Т-клітини переносять пацієнтові, як правило, шляхом інфузії.
Перенесені Т-клітини за даним винаходом потім можуть виробляти імунну відповідь на КОМК1- експресуючі клітини в суб'єкта. Спосіб адоптивного перенесення можна застосовувати, наприклад, для лікування суб'єктів, які мають або у якого підозрюють наявність будь-якої зі злоякісних пухлин, пов'язаних з КОКІ1, включаючи СІ, АГ, лімфому клітин мантійної зони, нейробластому, саркому, нирково-клітинну карциному, злоякісну пухлину молочної залози, злоякісну пухлину легені, злоякісну пухлину товстої кишки, злоякісну пухлину голови та шиї, меланому й інші види злоякісної пухлини.
Згідно з деякими варіантами здійснення, вищезгадані способи лікування можуть додатково передбачати сумісне введення другого терапевтичного засобу для лікування розладу, пов'язаного з підвищеним КОК1. Наприклад, якщо розлад, що підлягає лікуванню, включає злоякісну пухлину, що експресує КОМІ, спосіб може додатково передбачати сумісне введення цитотоксичного,
цистостатичного, або антиангіогенного, або імуностимулюючого засобу (наприклад, антитіл, що інгібують імунну контрольну точку, наприклад, без обмеження антитіл, які зв'язуються з РО1, РОІ1,
СТІ А4, ОХ40, ТІМ3З, СІТК, ГАСЗ і т. п.), який є придатним для лікування злоякісної пухлини. Якщо злоякісна пухлина є В-клітинним злоякісним новоутворенням, спосіб може додатково передбачати, наприклад, сумісне призначення ритуксимабу, алемтузумабу, офатумумабу, окрелізумабу або хіміотерапевтичного режиму СНОР.
Ї00126| Згідно з деякими іншими варіантами здійснення, даний винахід стосується способу виявлення в біологічному зразку зміненого рівня КОКІ (наприклад, КОКІ1 клітинної поверхні), наприклад, у порівнянні з контролем, або за допомогою ЕАСФ5, імуногістохімії (ІНС), або за допомогою вестерн-блоту. Як правило, спосіб передбачає приведення в контакт біологічного зразка з антитілом, зв'язувальним білком на основі такого антитіла, фрагментом такого антитіла за даним винаходом і визначення кількості антитіла, яке вибірково зв'язується з матеріалом (наприклад, клітинами) в зразку, тим самим визначаючи рівень КОМІ в біологічному зразку. Біологічний зразок може бути отриманий з культури клітин або від суб'єкта, який проходить тестування, наприклад, зі зразка плазми крові або тканини від суб'єкта, в якого передбачають наявність або який має ризик розвитку захворювання або стану, пов'язаного з підвищеним КОКІ. Контрольний рівень переважно відповідає рівню КОКІ, виявленому за допомогою того ж антитіла у відповідному зразку(зразках) з однієї або декількох контрольних культур або від здорових суб'єктів. Способи застосування антитіла за даним винаходом для визначення рівнів КОКІ можуть передбачати будь-який імуноаналіз, такий як імуно-(вестерн)- блот, твердофазний імуноферментний аналіз (ІФА), імуногістохімія (ІНС) і проточна цитометрія, наприклад, сортування флуоресцентно-активованих клітин (ЕАС5).
І00127| Способи виявлення можна застосовувати для скринінгу на наявність розладу, пов'язаного з підвищеним КОМК1. Способи передбачають отримання зразка від суб'єкта, що проходить тестування та який потребує на скринінг, наприклад, суб'єкта, у якого підозрюють наявність або який має ризик розвитку розладу, пов'язаного з підвищеним КОКІ. Рівень КОКІ (наприклад, кількість або концентрація) в зразку вимірюють за допомогою антитіла, зв'язувального білка на основі такого антитіла, фрагмента такого антитіла за даним винаходом і порівнюють рівень в зразку з контрольним рівнем КОКІ1. Контрольний рівень являє собою, наприклад, середній рівень (наприклад, кількість або концентрацію) в зразку(зразках) від одного або, переважно, кількох суб'єктів контрольної групи, які не мають розладу, пов'язаного з підвищеним КОКІ1. Альтернативно, контрольний рівень може відповідати рівню або середньому рівню КОК'І1 в одному або декількох зразках, взятих у суб'єкта, що проходить тестування, в одному або декількох попередніх моментах часу, наприклад, коли у суб'єкта, що проходить тестування, був відсутній або не виявлявся стан, пов'язаний з підвищеним КОКІ1.
Значно вищий рівень КОКТІ у біологічному зразку відносно контрольного рівня свідчить про наявність у суб'єкта розладу, пов'язаного з підвищеним КОКТІ. У суб'єктів, таких як люди, у яких експресія КОК1 на клітинній поверхні в значній мірі обмежена ембріональним розвитком, контрольний рівень КОК!1 може дорівнювати нулю або бути відсутнім. Отже, згідно з деякими варіантами здійснення способу виявлення, представленого в даному винаході, будь-яка значна й виявлена кількість КОКІ в біологічному зразку може свідчити про наявність у суб'єкта розладу, пов'язаного з підвищеним КОМІ.
Ї00128| Крім того, способи виявлення можна застосовувати для відстеження прогресування розладу, пов'язаного з підвищеним КОКІ. Спосіб передбачає отримання зразка від суб'єкта, що потребує на скринінг, наприклад, суб'єкта, у якого було діагностовано наявність або у якого передбачається наявність розладу, пов'язаного з підвищеним КОКТ. Рівень КОКІ в зразку вимірюють за допомогою антитіла, зв'язувального білка на основі такого антитіла, фрагмента такого антитіла за даним винаходом і порівнюють рівень у зразку з контрольним рівнем, що відповідає рівню або середньому рівню КОКІ в одному або декількох зразках, взятих у суб'єкта, що проходить тестування, в одному або кількох попередніх моментах часу. Рівні КОК'І, які значно підвищені або зменшені відносно контролю, свідчать про те, що розлад суб'єкта відповідно погіршується або поліпшується.
Вищевказані способи виявлення можна застосовувати для скринінгу на наявність або для відстеження прогресування розладів, включаючи, наприклад, СіїЇ, АГ, лімфому клітин мантійної зони, нейробластому, саркому, нирково-клітинну карциному, злоякісну пухлину молочної залози, злоякісну пухлину легкого, злоякісну пухлину товстої кишки, злоякісну пухлину голови та шиї, меланому й інші види злоякісної пухлини.
І00129| Згідно з деякими варіантами здійснення, даний винахід стосується способів скринінгу суб'єкта щодо зміненого рівня КОК1. Зазвичай, способи передбачають введення суб'єкту антитіла, зв'язувального білка на основі такого антитіла, фрагмента такого антитіла за даним винаходом, які кон'юговані з міткою (наприклад, контрастним засобом), візуалізацію суб'єкта способом, придатним для виявлення мітки, й визначення, чи має суб'єкт ділянку зі зміненою щільністю або концентрацію мітки в порівнянні з фоновим рівнем мітки в прилеглій тканині. Альтернативно, способи передбачають визначення того, чи змінена щільність або концентрація мітки в ділянці в порівнянні з щільністю або концентрацією мітки, раніше виявленої в тій же ділянці у суб'єкта. До способів візуалізації суб'єкта можуть належати рентгенівська візуалізація, рентгенівська візуалізація із застосуванням комп'ютерної томографії (СТ) (наприклад, ангіографічна візуалізація із застосуванням СТ (СТА)), магнітно- резонансна (МР) візуалізація, ,магнітно-резонансна ангіографія (МКА), медична радіологія, ультразвукова візуалізація (05), оптична візуалізація, еластографія, інфрачервона візуалізація, мікрохвильова візуалізація і тому подібні, в залежності від конкретного випадку для виявлення мітки, кон'югованої з антитілом. Згідно з переважним варіантом здійснення, у суб'єкта підозрюють наявність або він має ризик розвитку пухлини, що експресує КОКТ, такої як СІ, АГ, лімфома клітин мантійної зони, нейробластома, саркома, нирково-клітинна карцинома, злоякісна пухлина молочної залози, злоякісна пухлина легені, злоякісна пухлина товстої кишки, злоякісна пухлина голови та шиї, меланома й інші види злоякісної пухлини, та цей спосіб застосовують для скринінгу або виявлення наявності пухлини. Згідно з іншим варіантом здійснення, спосіб можна застосовувати для відстеження розміру або щільності пухлини, що експресує КОКТ, з плином часу, наприклад, під час проходження курсу лікування.
МІ. Фармацевтичні композиції та комбінації
І0О0О1301| Згідно з іншим аспектом, даний винахід стосується фармацевтичних композицій, які містять антитіло, фрагмент антитіла, зв'язувальний білок на основі антитіла або АОС, які описані в даному документі, та фармацевтично прийнятний носій. Фармацевтичні композиції можна отримати з будь- якого з описаних у даному документі антитіл. Ілюстративні композиції включають одне або декілька з химерного антитіла, що має ЗЕО ІЮ МО: 14 (легкий ланцюг) або 5ЕО ІЮО МО:1 (важкий ланцюг), химерного антитіла, що має ЗЕО ІЮ МО:18 (легкий ланцюг) і/або 5ЕО ІЮ МО:5 (важкий ланцюг), химерного антитіла, що має ЗЕО ІЮ МО:25 (легкий ланцюг) і/або ЗЕО ІЮ МО:12 (важкий ланцюг), і химерного антитіла, що має ЗЕО ІЮ МО:26 (легкий ланцюг) і/або ЗЕО ІЮ МО:13 (важкий ланцюг). Інші антитіла, фрагменти антитіл, зв'язувальні білки на основі антитіла або АОС, які придатні для фармацевтичних композицій за даним винаходом, включають ті, які мають послідовність легкого ланцюга, яка наведена в 5ЕО ІЮ МО:14-26 або 136-141, і/або важкого ланцюга, яка наведена в 5ЕО ІЮ
МО:1-13 або 130-135. Інші ілюстративні композиції за даним винаходом можуть містити гуманізоване антитіло, яке має один, два, три, чотири, п'ять або шість СОК, вибраних з групи, що складається з
ЗЕО 10 МО:27-104, як, наприклад, ілюстративні ЗЕО ІЮ МО: 130-141. Згідно з деякими варіантами здійснення, антитіло включає три послідовності СОК з тих самих ілюстративних легких або важких ланцюгів, які показані на фіг. 1. До них належать послідовності СОК1, СОК2 ї СОКЗ важкого ланцюга й послідовності СОКІ, СОК2 і СОКЗ легкого ланцюга, відповідно наведені в (1) БЕО ІЮ МО:27-29 і ЗЕО
ІО МО:66-68 (антитіло ХВК1-402), (2) 5ЕО ІЮ МО:30-32 ії 5ЕО ІЮО МО:69-71 (антитіло ЕКК1-301), (3)
ЗЕО Ір МО:33-35 і 5ЗЕО ІЮ МО:72-74 (антитіло ЕКК1-306), (4) 5ЕО ІЮ МО:36-38 і ЗЕО ІЮ МО:75-77 (антитіло ЕКК1-316), (5) 5ЕО 10 МО:39-41 і ЗЕО ІЮ МО:78-80 (антитіло ЕКК1-324), (6) 5ЕО ІЮ МО 42- 44 і 5ЕО ІЮ МО:81-83 (антитіло ЕКК1-403), (7) 5ЕО 10 МО:45-47 і ЗЕО ІЮ МО:84-86 (антитіло ЕКК1- 409), (8) 5ЕО ІЮ МО 48-50 і 5ЕО ІО МО:87-89 (антитіло ЕКК1-ТОРАУ), (9) 5ЕО ІЮ МО:51-53 ії 5ЕО І
МО:90-92 (антитіло ЕКК1-ТОРІ15), (10) 5ЕО ІЮ МО: 54-56 і ЗЕО ІЮ МО:93-95 (антитіло ЕКК1-ТОР22), (11) 5ЕО І МО:57-59 і 5ЕО ІЮ МО:96-98 (антитіло ЕКК1-ТОР40), (12) 5ЕО І МО:60-62 і 5ЕО І
МО:99-101 (антитіло ЕКК1-ТОР43) або (13) 5ЕО ІЮО МО:63-65 і 5ЕО ІЮ МО:102-104 (антитіло ЕКК1-
ТОРБА). Згідно з деякими варіантами здійснення, фармацевтична композиція містить антитіло, яке має шість послідовностей СОК з того ж самого антитіла, яке проілюстровано на фіг. 1, наприклад: (а)
ЗЕО Ір МО:66-68 і 5ЕО ІЮ МО:27-29 (антитіло ХВК1-402); (Б) 5ЕО ІЮ МО:78-80 і 5ЕО ІЮ МО:39-41 (антитіло ЕКК1-324); (с) БЕО ІЮ МО: 99-101 ї ЗЕО ІЮ МО:60-62 (антитіло ЕКК1-ТОРА43) або (4) ЗЕО І
МО:102-104 і 5ЕО ІЮ МО:63-65 (антитіло ЕКК1-ТОР5Б4). Ще одна ілюстративна фармацевтична композиція містить д5Ем-фрагмент, який може включати одну або кілька модифікацій амінокислотної послідовності, залежно від конкретного випадку та зрозумілі для фахівця в даній галузі техніки.
І0О0131) Згідно з деякими варіантами здійснення, композиції за даним винаходом містять носій для антитіла, фрагмента антитіла, зв'язувального білка на основі антитіла або АОС, бажано фармацевтично прийнятний носій. Фармацевтично прийнятний носій може являти собою будь-який придатний фармацевтично прийнятний носій. Це може бути один або кілька сумісних твердих або рідких наповнювачів, розріджувачів, інших допоміжних речовин або інкапсулюючих речовин, які придатні для введення хворій людині або тварині (наприклад, фізіологічно прийнятний носій або фармакологічно прийнятний носій). Термін "носій" означає органічний або неорганічний інгредієнт, натуральний або синтетичний, з яким активний інгредієнт поєднують для полегшення застосування активного інгредієнта, наприклад, введення активного інгредієнта суб'єкту. Фармацевтично прийнятний носій можна поєднувати з одним або декількома активними компонентами, наприклад гібридною молекулою, та один з одним, за наявності в композиції більше одного фармацевтично прийнятного носія, таким чином, щоб не було істотного погіршення необхідної фармацевтичної ефективності. Фармацевтично прийнятні матеріали зазвичай можна вводити суб'єкту, наприклад пацієнтові, без отримання значних небажаних фізіологічних ефектів, таких як нудота, запаморочення, висип або розлад шлунка. Наприклад, для композиції, що містить фармацевтично прийнятний носій, бажано, щоб вона не була імуногенною під час введення пацієнту-людині з терапевтичною метою.
І00132| Фармацевтичні композиції за даним винаходом можуть додатково містити придатні буферні засоби, включаючи, наприклад, оцтову кислоту в формі солі, лимонну кислоту в формі солі, борну кислоту в формі солі та фосфорну кислоту в формі солі. Композиції також можуть необов'язково містити придатні консерванти, такі як хлорид бензалконію, хлорбутанол, парабени й тимеросал.
Фармацевтичні композиції за даним винаходом можуть бути представлені в стандартній лікарській формі й можуть бути отримані будь-яким придатним способом, багато з яких добре відомі в галузі фармацевтики. Такі способи передбачають стадію приведення антитіла за даним винаходом в асоціацію з носієм, який являє собою один або декілька допоміжних інгредієнтів. Взагалі, композицію отримують шляхом рівномірного та ретельного приведення активного засобу в асоціацію з рідким носієм, тонкоподрібненим твердим носієм або і тим, і іншим, а потім, за необхідності, формування продукту. 00133) Композиція, придатна для парентерального введення, зазвичай являє собою стерильний водний препарат композиції за даним винаходом, який переважно є ізотонічним з кров'ю пацієнта, який його приймає. Цей водний препарат можна скласти згідно з відомими способами із застосуванням придатних диспергувальних або змочувальних засобів і суспендувальних засобів.
Стерильний препарат для ін'єкцій також може бути стерильним ін'єкційним розчином або суспензією в нетоксичному парентерально прийнятному розріджувачі або розчиннику, наприклад, у формі розчину в 1,3-бутандіолі. До прийнятних носіїв і розчинників, які можна використовувати, належать вода, розчин Рінгера та ізотонічний розчин хлориду натрію. Крім того, як розчинник або суспендувальне середовище зазвичай використовують стерильні нелеткі масла. Для цієї мети можна використовувати будь-яке помірно нелетке масло, таке як синтетичні моно- або дигліцериди. Крім того, під час отримання ін'єкційних лікарських засобів можна застосовувати такі жирні кислоти, як олеїнова кислота. Склад носія, придатного для перорального, підшкірного, внутрішньовенного, внутрішньом'язового і так далі введення, можна знайти в Кетіпдіоп'є Рпагтасеціїйса! Зсіепсе5, Маск
Рибіїзпіпду Со., Еавіюп, РА.
І00134| Отримання фармацевтичних композицій за даним винаходом і їх різні шляхи введення можна проводити згідно зі способами, добре відомими в даній галузі техніки. Див., наприклад,
Ветіпдіюоп: Тне 5сієпсе апа Ргасіїсе ої Рпаптасу, Маск Рибіїхпіпд Со., 201п ей., 2000; і Зи!ив5іаіпей апа
СопігоПед ВеїІєазе Огид ОеєїЇїмегу Зузіет5, У.А. Вобіпзоп, єд., Магсє! ОекКег, Іпс., Мем Мої, 1978.
Системи доставки, придатні в контексті даного винаходу, включають системи доставки з затримкою вивільнення, сповільненого вивільнення й пролонгованого вивільнення, так щоб доставка композиції за даним винаходом відбувалася до і з достатнім часом, щоб викликати сенсибілізацію ділянки, яка підлягає лікуванню. Композицію за даним винаходом можна застосовувати в поєднанні з іншими терапевтичними засобами або схемами лікування. Такі системи можуть дозволити уникнути повторних введень композиції за даним винаходом, тим самим збільшуючи зручність для суб'єкта та лікаря, й можуть бути особливо придатні у випадку деяких композицій за даним винаходом. 00135) Фахівцям у даній галузі техніки доступні й відомі багато типів систем доставки з різним вивільненням. До придатних систем доставки з різним вивільненням належать системи на полімерній основі, такі як полі(лактид-гліколід), сополіоксалати, полікапролактони, поліамідоестери, поліортоестери, полігідроксимасляна кислота та поліангідриди. Мікрокапсули з вищевказаних полімерів, що містять лікарські засоби, описані, наприклад, в патенті США Мо 5075109. Системи доставки також включають неполімерні системи, які представлені ліпідами, включаючи стерини, такі як холестерин, естери холестерину й жирні кислоти або нейтральні жири, такі як моно-, ди- й тригліцериди; гідрогелеві системи вивільнення; силікатні системи; пептидні системи; воскові покриття; пресовані таблетки із застосуванням звичайних сполучних і допоміжних речовин; частково злиті імплантати; і таке інше. Конкретні приклади включають без обмеження наступні: (а) ерозійні системи, в яких активна композиція міститься в деякій формі всередині матриці, такі як системи, які описані в патентах США Мо 4452775, Мо 4667014, Мо 4748034 і Мо 5239660 і (Б) дифузійні системи, в яких активний компонент проникає з контрольованою швидкістю із полімеру, такі як описані в патентах
США Мо 3832253 і Мо 3854480. Крім того, можна застосовувати системи доставки на основі помпи, деякі з яких адаптовані для імплантації.
І00136| Даний винахід також стосується наборів, придатних для здійснення способів за даним винаходом. Зазвичай, набори містять два або більше компонентів, необхідних для здійснення терапевтичних або діагностичних способів за даним винаходом. Компоненти набору включають без обмеження одне або кілька антитіл, зв'язувальних білків на основі таких антитіл, фрагментів таких антитіл або АЮС за даним винаходом, відповідні реагенти та/(або обладнання. Згідно з деякими варіантами здійснення, набори можуть містити антитіло, зв'язувальний білок на основі такого антитіла, фрагмент такого антитіла за даним винаходом і буфер для імуноаналізу, які придатні для виявлення
КОН (наприклад, за допомогою ІФА, проточної цитометрії, магнітного сортування або ЕГАС5). Набір також може містити один або кілька мікротитрувальних планшетів, стандартів, розріджувачів для аналізу, буферів для промивання, клейких покриттів для планшетів, магнітних мікроносіїв, магнітів і/або інструкцій зі здійснення способу за даним винаходом за допомогою набору. Набір може включати антитіло, зв'язувальні білки на основі таких антитіл, фрагменти таких антитіл за даним винаходом,
зв'язані з основою (наприклад, багатолунковим планшетом або чипом), які відповідним чином упаковані та придатні для виявлення КОКІ1. Згідно з деякими варіантами здійснення, набори включають антитіло, зв'язувальні білки на основі такого антитіла, фрагменти таких антитіл за даним винаходом, які кон'юговані з міткою, такою як флуоресцентна мітка, біологічно активна ферментативна мітка, люмінесцентна мітка або хромофорна мітка. Набори можуть додатково включати реагенти для візуалізації кон'югованого антитіла, зв'язувальних білків на основі такого антитіла, фрагментів таких антитіл, наприклад, субстрат для ферменту. Згідно з деякими варіантами здійснення, набори включають антитіло, зв'язувальні білки на основі такого антитіла, фрагменти таких антитіл за даним винаходом, які кон'юговані з контрастним засобом і необов'язково одним або декількома реагентами або частинами пристрою, придатними для візуалізації антитіла в суб'єкта.
І00137| Зазвичай, антитіло, зв'язувальні білки на основі такого антитіла, фрагменти таких антитіл за даним винаходом у наборі відповідним чином упаковані, наприклад, у флакон, пакет, ампулу й/або в будь-яку ємність, яка придатна для способу терапії або виявлення. Компоненти набору можуть бути представлені у формі концентратів (включаючи ліофілізовані композиції), які можуть бути додатково розведені перед застосуванням, або вони можуть бути представлені в необхідній для застосування концентрації. Для застосування антитіла за даним винаходом іп мімо окремі дози можуть бути представлені в стерилізованих ємностях, що мають необхідну кількість і концентрацію компонентів.
Приклади
І00138| Наступні приклади наведені для додаткової ілюстрації даного винаходу, але не для обмеження його обсягу. Інші варіанти даного винаходу будуть очевидні фахівцеві в даній галузі техніки й охоплюються доданою формулою винаходу.
Приклад 1
Клітинні лінії
ЇО0139| Клітинні лінії МОА-МВ-231, МОА-МВ-469, 697, Казиті-2, Т147О0, Н5З5Б78Т, 63-12 і трансфектанти 63-12/ЛКОКІ і 63-12/ЛКОК2, К562 і трансфектанти К562/ЛКОМКІ1, ЕМТ-6 і ЕМТ-6/ВОВ1 культивували в МЕМ (Іпмйгодеп, Карлобад, Каліфорнія), доповненому 1095 (об./0б.) термоіїнактивованим ЕВ5 (Тпепто зЗсієпіййс, Логан, Юта), 100 од./мл пеніциліну й 100 мг/мл стрептоміцину (Іпмігодеп). Клітини НЕК 293Е придбали в Іпмігодеп і тримали в середовищі Егее СіуїЄ, доповненому 1 95 (06./06.) термоінактивованим ЕВ5 (Тпепто Зсіепіййс) для підтримки прикріпленої до субстрату культури, або без ЕВ5 для суспензійної культури, 100 од./мл пеніциліну і 100 мг/мл стрептоміцину (Іпмийгодеп).
ІЇ00140| Клонування повнорозмірних векторів експресії ссавців РКОКІ і РКОК1: остови транспозувальних векторів (рРРВ-Риго) збирали з модульних частин з фланкувальними сайтами рестрикції, які були синтезовані або отримані з комерційно доступних векторів з перевіреною послідовністю та детально описані в патентній публікації М/О2014013026А1. Ці вихідні остови транспозувальних векторів були модифіковані шляхом заміни ІКЕ5-керованої системи експресії гена стійкості до пуроміцину в вихідному векторі на окрему систему експресії під керуванням фосфогліцераткіназного промотора (РОК). Це було зроблено шляхом заміни послідовності ІКЕ5 на послідовність 5У40-рА, розташовану на 3" від сайту множинного клонування, з подальшим введенням промоторної послідовності РОК 5" від гена стійкості до пуроміцину. Повнорозмірні відкриті рамки зчитування КОКІ1/2 були синтезовані шляхом синтезу всього гена (Сепбзогірі, Піскатавей) з фланкувальними сайтами рестрикції (5'МОП/З3'В5ІВІ), а потім їх клонували в сайт множинного клонування транспозувальних векторів за допомогою відповідних ферментів рестрикції. 00141) Конструювання клітинної лінії для ектопічної експресії ПКОКІ1 або пКОКа у лінії мишачих
В-клітин-попередників 63-12, трансформованої за допомогою А-МиЇ! М: лінію мишачих В-клітин- попередників 63-12 мишей лінії АбБеізоп (ЗНпіпКаії еї аі. (1992) Се! 68: 855-67) культивували в культуральному середовищі (17,7 г/л зірсоФ ІМОМ (І їе Тесппоїодіе5, 42200-030), 3,024 г/л МаНнСОЗ (бБідта-Айагіси, ч.д.а., » 99,7 95), 10 мл/л 100х неосновних амінокислот (І їе Тесппоіодіев5, 11140035), 5 мг/л інсуліну (Зідта-А|пагісн, І-5500), З мл/л 10 95 приматону КІ/ОЕ в Н2гО (Зпейіеїйа Віозсіепсе) і 1 мл/л мМ 2-меркаптоетанолу (Зідта-Аїагісн, М-3148) в Н2гО), доповненому 2 95 (об./06.) ЕС5, 100 МО/мл пеніциліну/стрептоміцину/фунгізону (Атітеа, 4-02Е00-Н), 200 мМ І-глутаміну (Атітеа, 5-10КО0-Н) і 50
МКМ 2-меркаптоетанолу (Атгеб5со, 0482) за 37 С і 7,595 СО2. Клітини були сконструйовані для надекспресії ЯПКОКІ1 і пКОК2 шляхом транспозиції наступним чином: клітини центрифугували (б хв, 1200 об./хв, 4 "С) і ресуспендували в середовищі КРМІ-1640 (5х106 клітин/мл). Потім 400 мкл клітинної суспензії додавали до 400 мкл КРМІ, що містить 10 мкг транспозувального вектора рРВ-
РОаК-Риго-КОКІ (що керує сумісною експресією повнорозмірного КОКІ (МР 005003.2) і гена стійкості до пуроміцину) або 10 мкг транспозувального вектора рРРВ-РаК-Рито-КОК2 (що керує сумісною експресією повнорозмірного КОК2 (МР 004551.2) і гена стійкості до пуроміцину) разом з 10 мкг транспозувального вектора рсОМАЗ.1 пу тптРВ. Суміші ДНК/клітин 63-12 переносили в електропораційні кювети (з щілиною 0,4 см, 165-2088, ВіоКайд, Кресьє, Швейцарія) і електропорували за допомогою Віогай Сепе Риїзег ІІ з ємнісним розширником на рівні 300 В і 950 мкФ. Потім клітини інкубували протягом 5-10 хвилин за кімнатної температури. Після інкубації клітини центрифугували на 1200 об./хв протягом б хвилин (4 С), промивали один раз і потім ресуспендували у водному середовищі для культивування (17,7 г/л ірсотб ІМОМ (Ііте Тесппоїодієв, 42200-030), 3,024 г/л мМДАНСОЗ (бБідта-Айагісй, ч.д.а., 299,7 95), 10 мл/л 100х неосновних амінокислот (І їе Тесппоіодіе5, 11140035), 5 мг/л інсуліну (Зідта-А|пагісн, І-5500), З мл/л 10 95 приматону КІ/ОЕ в Н2гО (Зпейіеїйа Віозсіепсе) і 1 мл/л мМ 2-меркаптоетанолу (Зідта-Аїагісн, М-3148) в Н2гО), доповненому 2 95 (об./06.), ЕС5, 100 МО/мл пеніциліну/стрептоміцину/фунгізону (Атітеа, 4-02Е00-Н), 200 мм І-глутаміну (Атітеа, 5-10КО0-Н) і 50
МКМ 2-меркаптоетанолу (Атгезсо, 0482). Після дводенної інкубації за 37 "С у зволоженому інкубаторі в атмосфері 5 95 СО2 пули клітин, які стабільно експресують ЯНКОКІ1 або пПКОК2, відбирали шляхом додавання 2 мкг/мл пуроміцину (Зідта-Аїагісн, Р8833). (00142) Через 4-5 днів експресію ЯНКОК1 або пКОКа на сконструйованих клітинах підтверджували проточною цитометрією. Якщо коротко, після трипсинізації 106 клітин центрифугували в пробірках для
ЕАС5; отримані осади ресуспендували в буфері (РВ5 з 2 965 (06б./06.) РС5). У випадку клітин з вбудованим методами генної інженерії ЯКОКТ, клітини потім інкубували з 2А2 (антитіло тАбрОбб, націлене на КОК1, кінцева концентрація 2 мкг/мл) протягом 30 хвилин за 4 "С з наступним центрифугуванням і промиванням. Клітини ресуспендували, як і раніше, й інкубували з антитілом до дО людини (специфічним до Ес-гамма) РЕ (еВіозсієпсе, Відень, Австрія, 12-4998-82) з розведенням 1:100 у темряві (30 хв, 4 "С), промивали один раз в буфері й зберігали на льоді до РЕАС5-сортування.
Для клітин лінії 63-12 з вбудованим методами генної інженерії пНгОК2 застосовували той же самий протокол, але із застосуванням ЕРКЗ779 (антитіло Абсат, націлене на КОК2, розведення 1:100) як первинне антитіло й кон'юговане з алофікоціаніном АйіпіРиге Е(аб)2 кози до Ідс (НІ) кролика (ЧасКвоп Іттипогезеаїгсни, 111-136-144) як вторинне антитіло. 00143) У випадку клітин лінії 63-12 з вбудованим методами генної інженерії ЯНКОКТ, клітини були розсортовані за допомогою ЕАСЗ Агіа ІЇ на окремі клітини в 96-лункові планшети з плоским дном, що містять 200 мкл доповненого культурального середовища на лунку. Планшети інкубували за 37 "С і клони перед аналізом розмножували до б-лункових планшетів. Цільову експресію підтверджували проточною цитометрією із застосуванням приладу БАСзЗСаїїриг (ВО Віозсіепсе5) і аналітичного програмного забезпечення Ріомло (Тгее 5іаг, Ашленд, Орегон). 00144) Розробка клітинної лінії для ектопічної експресії ПРОКІ в лінії мишачих клітин злоякісної пухлини молочної залози ЕМТ-6: мишачі клітини злоякісної пухлини молочної залози ЕМТ-6 (люб'язно надані професором, доктором медичних наук Айтей 2ірреїїйи5, Університетська клініка Базеля,
Швейцарія) культивували в повному ОМЕМ (середовище Ігла, модифіковане за способом Дульбекко (ОМЕМ), з високим вмістом глюкози (4,5 г/л)) з І-глутаміном з 10 95 (0б./06.) фетальної телячої сироватки (ЕС5), 100 МО/мл пеніциліну/стрептоміцину/фунгізону і 2 мМ І-глутаміну (все від
Віосопсері, Альшвіль, Швейцарія)) за 37 "С і 595 СО2. Клітини були сконструйовані для надекспресії
КОМІ шляхом транспозиції наступним чином: клітини центрифугували (б хв, 1200 об./хв, 4 С) і ресуспендували в середовищі КРМІ-1640 (5х106 клітин/мл). Потім 400 мкл цієї клітинної суспензії додавали до 400 мкл КРМІ, що містить 13,3 мкг транспозувального вектора РРВ-РОК-Риго-КОК1, що керує сумісною експресією повнорозмірного КОКІ (МР. 005003.2) і гена стійкості до пуроміцину, і 6,6 мкг вектора РСОМАЗ.1 пу тРВ, що містить транспозазу. Суміші ДНК/клітин ЕМТ-б6 переносили в електропораційні кювети (з щілиною 0,4 см, 165-2088, ВіоКайд, Кресьє, Швейцарія) і електропорували за допомогою Віогай Сепе Риїзег ІІ з ємнісним розширником на рівні 300 В і 950 мкФ. Потім клітини інкубували протягом 5-10 хвилин за кімнатної температури. Після інкубації клітини центрифугували на 1200 об./хвилина протягом 6 хвилин, один раз промивали та потім ресуспендували в повному ОМЕМ перед інкубацією за 37 "С у вологому інкубаторі в атмосфері з 595 СО2. Через один день після електропорації пули клітин, що стабільно експресують КОК1 людини, відбирали шляхом додавання З мкг/мл пуроміцину (Зідта-Аїагісн, РВ833).
І00145| Експресію КОКІ на відібраних клітинах ЕМТ-6-КОКІ підтверджували за допомогою проточної цитометрії. Якщо коротко, після трипсинізації 106 клітин центрифугували в пробірках для
ЕАС5; отримані осади ресуспендували в буфері (РВЗ з 2 95 (06./06.) ЕС5). Потім клітини інкубували з 2А2 (тАБОбб); 30 хвилин, за 4 "С, до кінцевої концентрації 2 мкг/мл з наступним центрифугуванням і промиванням. Клітини потім ресуспендували, як і раніше, та інкубували з антитілом до ДО людини (специфічним до Ес-гамма) РЕ (еВіозсіепсе, Відень, Австрія, 12-4998-82) з розведенням 1:250 в темряві (30 хв, 4 "С), промивали один раз у буфері та зберігали на льоді до РЕАСЗ-сортування. 00146) Клітини були розсортовані за допомогою ЕАС5 Агіа ІІ на окремі клітини в 96-лунковий планшет з плоским дном, що містить 200 мкл повного ОМЕМ на лунку. Цей планшет інкубували за 37 "С, а клони розмножували до б-лункових планшетів перед аналізом експресії КОК1 за допомогою проточної цитометрії, як описано вище, з використанням приладу ГАСзЗСаїїриг (ВО Віо5сіепсе5) й аналітичного програмного забезпечення Ріомліо (Тгее 5іаг, Ашленд, Орегон) для аналізу.
І00147| На фіг. 16С показані дані аналізу ЕАС5 клону 14 (з високим рівнем експресії КОКТ) і М/Т (негативного за КОКІ1) ЕМТ-6, виявлені за допомогою антитіла 2А2 до КОКІ1 (тАБОбб).
Приклад 2
Створення високоскладної бібліотеки кролячих Раб і реагенти для скринінгу
І00148| Побудова, експресія та очищування рекомбінантних білків КОКІ людини: побудова, експресія, очищування та біотинілювання злитих білків Пес, що містять різні домени КОКІ1 людини або
КОН миші (були описані у Мапа еї аї., Ріо5 Опе 6:е21018, 2011). У випадку злитого білка ПКОК1-АМІ- б6ХНІЗ позаклітинний домен КОКІ людини (24-403) був ампліфікований за допомогою ПЛР з праймерами рСЕР4-НР!ОНІ1-Е і рРСЕР4А-ПВОНІ1-Амі їад-К (зверніть увагу, що мітка АМІ була введена в
С-кінець КОКІ за допомогою праймера рСЕР4-НВОР1-Амі їад-К) з подальшою ПЛР-добудовою з праймерами рСЕРА4-зідпаІ-Е-Крпі ії рРСЕР4-6НІБЗ-В-Хпо! для додавання сигнального пептиду і б6ХНІЗ- мітки на М- ії С-кінець окремо перед клонуванням у рСЕР4 за допомогою Крпі/ХпоїЇ. Потім цю конструкцію тимчасово трансфікували в клітини НЕК 293Е (Іпмігодеп) за допомогою 293гТесііп (Іпмігодеп), а білок очищували за допомогою афінної хроматографії з іммобілізованим іоном металу із застосуванням колонки НіхТгар об'ємом 1 мл (СЕ Неайвсаге), як описано в Кимопд апа Кадег, Ситгг
Ргоїюос Ргоївїп 5сі Спаріег 6:Опії 6 10, 2009. Якість і кількість очищеного ПКОК1-АМІ-6ХНІ5 аналізували відповідно за допомогою 5О5-РАСЕ і поглинання А280. Потім злитий білок піддавали біотинілованню набором ферментів ВігА від Аміайу (Орора, Колорадо) згідно з протоколом. Якщо коротко, 2 мг КОМК1-
АМІ-Є6ХНІЗ з концентрацією 40 мкМ в 10 мМ Ттгі5-НСЇІ (рн 8) піддавали біотинілюванню в присутності біотину із застосуванням 10 мкг ВігА після інкубації протягом 30 хв за температури 37 "С, з подальшим повторним очищенням із застосуванням колонки НіхТгар об'ємом 1 мл (ЗЕ Неайсаге), як описано вище. рСЕР4-ПВОМВІ1-Е: 5'-аіїссідШшсісдіадсідсюдсаасіддадсасасіссдсссаддасдссдссасссад-3". (5ЕО І
МО:105); РСЕРА-ПРОНІ1-Амі-іад-В: 5'-ссасісодаїіснНсідадссісдаадащісдунсадасссіссаїснонснсіссн-3" (5ЕО
ІБ МО 106); рСЕРА4-5ідпаІ-Р-Крпі: 5" дсідддіассддсасдссассаддасіддаснададааіссідшсісаїаасідсі-3" (ЗЕО І МО:107); РрРСЕРА-6НІБ-В-ХНо!: 5'-дссддссісдадісадідацадаоаідсісаїдссасісдаіснсідадессіс-
З" (ЗЕО ІЮ МО:108).
І00149| Побудова, експресія та очищення рекомбінантних білків КОК1І (пПКОК1-Ніх) людини та вОовг (НВОгре-НІів) людини: ПКОК1-Ніх ампліфікували за допомогою ПЛР з праймерами ЗР-НВОВІ Е (5 дсдддіассддсодсдсесассаддасюдаснддаадааіссідшсісдіадсідсідсаасіддадсасасіссдсссдддадсоассдссдссса 9 33 (ЗЕО ІЮ МО:109) і пИКОК1-Нів В (5 садссісдадісадідадвідчагдадвдідсіссаіснонНснсісси 3") (ЗЕО Ір
МО:110) із застосуванням РСЕР4-НЕС-ПКОК (хапо еї аї., Ріо5 Опе 6:е21018, 2011) як матриці, тоді як пвОве-Ні5 ампліфікували за допомогою ПЛР З праймерами ЗР-ПВОН2 Е (асіддаїтассадсдсдссассаїдасіддасндадаадааіссідшсісоїадсідсідсаасіддадсасасіссдаадіддадайсіддаїссо) (ЗЕО ІЮ МО:111) ії пКОмО-Нів В (соадссісдадісааідадідчадададіассссаісносідсідісіса) (ЗЕО ІЮ МО 112) із застосуванням рРСЕР4-пПРо-пПКОКаО як матриці. Потім їх клонували в рСЕРА (Іпмігодеп) окремо за допомогою Крпі/Хпої. Потім ці конструкції окремо й тимчасово трансфікували в клітини НЕК 293Е (Іпмігодеп) з використанням 293гесіїіп (Іпмігодеп), а відповідні білюи очищували за допомогою афінної хроматографії з іммобілізованим іоном металу із застосуванням колонки НізТгар об'ємом 1 мл (СЕ
Неайсаге), як описано в Куопод апа Кадег, Сигг Ргоїос Ргоївеіп 5сі Спаріег 6:Опії 6 10, 2009. Якість і кількість очищених ПКОНІ1-Ніх і пПКОК2-Ніх аналізували відповідно за допомогою 5О5-РАСЕ і поглинання А280. 00150) Створення та відбір бібліотек наївних химерних Бар кролика/людини: усі маніпуляції з кроликами проводилися ветеринарним персоналом в Росопо Карбії Рагт «є. І арогагу (Канадензіс,
Пенсільванія) або К 8. К Кезеагс! (Станвуд, Вашингтон). У цілому були використані дев'ять кроликів (віком 3-4 місяці). П'ять з цих кроликів були породи новозеландського білого (М2АМ/), причому трьох отримували від Росопо Карбрбії Рапт «8. І арогаїгу (Канадензіс, Пенсільванія), а двох від К 85. К Кезеагсп (Станвуд, Вашингтон). Чотирьох кроликів 69 дикого типу отримували з окремої колонії К 5. К Кезеагсй, яка брала початок з племінної колонії, розробленої та охарактеризованої в Національному інституті алергії та інфекційних захворювань (Майопа! Іпбзійше ої АПегуду апа Іптесіби5 Оізеазез (МІАІВ)) (МеСаппеу-Нгапсів єї а!., Ргос. Маї). Асад. сі. ОА 81: 1794-1798, 1984; апа РоркКом еї аї., У. Мої. Віо1. 325:325-335, 2003. Селезінку та кістковий мозок від кожного кролика збирали та обробляли для отримання загальної РНК і ампліфікації за допомогою КТ-РСК послідовностей, що кодують Ук, МАі МН кролика, використовуючи загальновизнані протоколи (Кадег, Меїпоаз Мої Віої! 525: 101-128, хім 2009.
Мк кролика (гБ)/Ск людини (пшШ/ТЬМН і геМА/писСА/ ТрМН відповідно збирали за одну стадію злиття на основі ПЛР для добудови з З фрагментами, що перекриваються. Слід зазначити, що МІ., отриману від кроликів 69, також збирали з МН від кроликів МАМУ. Фрагменти, що кодують Бар, розщеплювали за допомогою 5ІЇ і лігували за допомогою 5ПІ-обробленого вектора реЗсС фагового дисплея (Ноїег еї аї.,
У Іттипо! Меїй 318: 75-87, 2007) за 16 "С протягом 24 годин. Потім 15 мкг очищених лігованих продуктів РСЗС-гоМк/пСк/гБМН трансформували в штам 5К320 Е. соїї (люб'язно наданий доктором заспаем 5. 5ідпи, Торонтський університет, Торонто, Онтаріо, Канада) за допомогою 30 окремих електропорацій (в кожній з яких застосовували 0,5 мкг ДНК в 50 мкл електрокомпетентних клітин) і отримували на виході 7,5х109 незалежних трансформантів для бібліотеки к. Для бібліотеки М, 4,8х109 незалежних трансформантів отримували за допомогою тієї ж самої процедури. За допомогою допоміжного фага МС5М13 (5ігаї(адепе, Ла-Хойя, Каліфорнія), фагмідні бібліотеки перетворювали на фагові бібліотеки й зберігали за -80 "С. Фагову бібліотеку к і бібліотеку А повторно ампліфікували з використанням ХІ 1-Віне (5ігаїадепе) або ЕК2738 (І исідеп) і рівномірно перемішували перед чотирма раундами пенінгу щодо біотинільованих ПЕС-пПКОМК1 або ПКОКІ1-АМІ-6НІ5. Під час пенінгу 5 мкг/мл антигену попередньо інкубували з магнітними мікроносіями, вкритими стрептавідином (Оупареайдз
МуОпе 5ігеріамідіп С1; Іпмігодеп) за 37 "С протягом 30 хвилин, а потім зв'язувальні молекули з фагової бібліотеки захоплювали в присутності 1 мг/мл неспецифічного поліклонального ЇД людини (Тпепто Зсіепійіс) застосовуючи ПЕс-КОКТ. Починаючи з третього раунду пенінгу, фаг, який вводили, піддавали негативному збідненню шляхом інкубації з порожніми мікроносіями перед відбором відносно заповнених антигеном мікроносіїв. Після відбору супернатанти бактеріальних клонів, індукованих ІРТО, аналізували за допомогою ІФА та проточної цитометрії. Повторні клони ідентифікували шляхом ДНК фінгерпринтингу зАїЇші, а послідовності Мії МН унікальних клонів визначали секвенуванням ДНК (фіг. 1).
Приклад З
Експресія та очищення химерних Раб і повнорозмірних антитіл Їд1 кролика/людини 00151) Побудова, експресія та очищення химерних Раб і Їдс1 кролика/улюдини: МАБ ХВК1-402 у химерному ЕРар-форматі кроликаллюдини клонували в плазміду експресії роЗС-Ніб БЕ. соїї й експресували та очищували, як описано в Кугопд апа Кадег, Сигг Ргоїос Ргоївїіп 5сі Спаріег 6:Опії 6 10, 2009. Для експресії таб ХВК1-402 у химерному форматі Ідсе1 кролика/людини застосовували раніше описаний вектор РІСО-К11 (Уапо еї аї., Ріо5 Опе 6:е21018, 2011). Послідовність, що кодує МН, з Бар
ХВА1-402 ампліфікували за допомогою ПЛР із застосуванням праймерів 4-2 МНЕ ї42 УНК клонували за допомогою Араї/засі у РІО-К11. Потім послідовність, що кодує легкий ланцюг, з ХВК1- 402 ампліфікували за допомогою ПЛР із застосуванням праймерів 4-2 А Е і ГЕАО-В їі клонували за допомогою Ніпапш/Хра! у Рішс-К11 з відповідною послідовністю, що кодує важкий ланцюг. Слід зазначити, що внутрішній сайт Араї у ЕК4 з послідовностей, що кодують МН Бар ХВК1-402, видаляли за допомогою мовчазної мутації в праймері 4-2 МН К. Крім того, заміняли стоп-кодон ТАС, який був супресований під час відбору штаму ХІ1-Віце Е. соїї на САС (глутаміновий), що кодує першу амінокислоту нативної МН (фіг. 1) з праймером 4-2 МН РЕ. Отриману в результаті плазміду РІБО-
ХВА1-402 тимчасово трансфікували в клітини НЕК 293Е (Іпмігодеп) з використанням 293т7Тесііп (Іпмігодеп), а білок очищували за допомогою колонки з рекомбінантним білком А НіТгар об'ємом 1 мл (СЕ Неасаге, Піскатавей, Нью-Джерсі), як описано в (ХУапо еї аї., Ріо5 Опе 6:е21018, 2011; апа Мапд апа Вадег, МеїШойз Мо! Віо! 901:209-232, 2012). Якість і кількість очищеного ІдДОС1 аналізували відповідно за допомогою 505-РАСЕ і поглинання А280. 001521) Усі інші тАБб у химерному форматі Бар кролика/людини клонували в плазміду експресії рЕТІТа Е. соїї й експресували та очищували, як описано в (Уапад еї аї., Ріо5 Опе 6:е21018, 2011). Для експресії тАр ЕКК1-324, ЕННІ-ТОР4АЗ ії ЕКК1-ТОРБ4 у химерному форматі 951 кролика/людини застосовували рСЕРА (Іпмігодеп) для клонування окремо важкого ланцюга й легкого ланцюга. Для важкого ланцюга оВіоскК, що містить послідовність, яка кодує сигнальний пептид важкого ланцюга, МН з ЕКК2-302 (тАб до пКОКг) і СНІ (1-49) І(Д01 людини синтезували ІСТ (Сан-Хосе, Каліфорнія), і ампліфікували з праймерами Крпі/Авсі-5ідпа! і СНІ-іпіегпаІ/омепар-К, і зливали з СНІ (50-88)-СН2-
СНЗ, ампліфікованим з РІСО з праймерами СНІ1-іпіетпа|/омепар-Е і НС-СНЗ-В-Хпої за допомогою ПЛР для добудови ділянок, що перекриваються, з праймерами Крпі/Авзсі-5ідпа! і НС-СНЗ-В-ХпоЇї, а потім клонували в рСЕРА за допомогою Азсі/Хпої. Слід зазначити, що сайт Епеї! вносили в СНІ за Аїа12 за допомогою синонімічної мутації під час синтезу ОВІосК. Отже, ця конструкція являла собою вектор для клонування важких ланцюгів інших тАбБ шляхом заміни МН за допомогою Авсі/Епе!І: МН ЕКК1-324,
ЕВА1-ТОРАЗ ії ЕКК1-ТОР5Б4 ампліфікували за допомогою прямого праймера ЕКК1-324 НО-Е, ЕВВ1-
ТОРАЗ НО-Е і ЕКК1-ТОРБА НО-Е їі зворотного праймера МН-СНІ-В-Епе! окремо, з подальшою ПЛР для добудови ланцюгів з додаванням сигнального пептиду з праймером Крпі/Азсі-зідпа! і МН-СНІ-В-
ЕпеІ. Потім кожний МН вставляли в вектор за допомогою Аз5сі/ЕпеІ. У разі клонування легкого ланцюга, в той час як легкі ланцюги лямбда ЕКК1-ТОР4АЗ і ЕКК1-ТОР54 ампліфікували за допомогою праймерів ЕКК1-ТОРАЗ І С-Е ї ЕКК1-ТОРБА І С-Е окремо в поєднанні з І С-В-ХпоЇї, легкі ланцюги каппа
ЕВНА1-324 ампліфікували за допомогою праймерів ЕКК1-324 КО-Е і КО-В-Хпої. Потім послідовність, що кодує сигнальний пептид, додавали за допомогою ПЛР для добудови ланцюга за допомогою прямого праймера Крпі/Авсі-Зідпаї! і зворотного праймера І С-В-Хпої або КО-В-Хпої. Потім кожен ПЛР- продукт легкого ланцюга клонували в рСЕР4 за допомогою А5бсі/ХпоЇ. Отримані в результаті конструкції, що містять важкий ланцюг або легкий ланцюг, у випадку кожного дО тимчасово котрансфікували в клітини НЕК 293Е (Іпмігодеп) з використанням 293гесііп (Іпмйгодеп), а відповідні білки очищували за допомогою колонки з рекомбінантним білком А НіТтар об'ємом 1 мл (СЕ
Неайсаге, Піскатавей, Нью-Джерсі), як описано в (Уапо еї аї., Ріо5 Опе 6б:е21018, 2011; апа Мапд апа
Вадег, МеїШтоа5 Мої! Віо! 901:209-232, 2012). Якість і кількість очищеного ІдДо1 аналізували відповідно за допомогою 505-РАСЕ і поглинання А280.
Таблиця 1
Послідовності праймерів для клонування послідовностей антитіл
ЗЕ
Праймер Послідовність в
МО: 42 МН Є удо аСАОсСТСАСТСТСАОСАОСАССАСААОсАсТосаса с,сАТаОСОсСсСсСсСТОИатасАас,СасСТаААдаАдаАаСа,аатаассАа,асаатооСтааСССССА 42 ун СсАССТС 114 сдададасттатасттасАатттаатасстАсасватосСтТАТаАДасСтТаАСАСАС 42 ХЕ стосс 115
ІГЕАО-В вОоссСАТОсСсТасттавасАос
Крпі/Авсі- сатТАсСссасасаССАССАТасАСстасАСсТТасвсАсаААТОСТатттотоатАасСтас 117 зЗідпа! ТтТасСААД
СНІ- іптета|/омепа| сСССсОаСстаатоА,СааСТосСта 118 р-В
СНІ- іптета|/омепа| САапАаа,аСссСстаАсСАа,Ссаис 119
О-Е
МОГУТНІ |восстооАСТСАТТТАСССОСАСАСАСОСА
ЕСНТИМ |ТТТотТоотТАОСТОСТОСААСТОСАССАСАСТОС САСТООСТОСАССАСТОСССС
ОН ТТОРИВ тттотоотТАОСТОСТОСААСТОСАССАСАСТОС САСТОСТТОСАССАСТоСССс с "ТОРБА | Те ж саме, що й ЕВВ1-ТОРАЗ НО-Е
Ун-СНІ1-В-
Енеї савалассасбасСсАа,сасасвААсСАсСаАатадчасостастТ 124
ЕВА1-ТОРАЗ
Іб-Е тптсетсатааста|астасСААСстТапАаСАСАСТОС ТССТАТаАдаСТаАСАСАЯ!СтТа 1125
ВАТ ТОРВА Те ж саме, що й ЕВР1-ТОРАЗ (О-Е
СОМ |ТТтотТоотТАОСТОСТОСААСТОСАССАСАСТОС САССТОСТОСТОАСССАСАСТ
І0-В-Хпої |СОССТСОАатТАТОААСАТТСТОТАСОСОС
КОо-В-Хпої. |СОССТСОАСТТААСАСТСТОСССТаТттТадд
Приклад 4
Вивчення зв'язувальної активності в антитіл (00153) ІФА: для ІФА (фіг. 2) кожну лунку 96-лункового планшета Совхіаг 3690 (Согпіпо, Корнінг,
Нью-Йорк) покривали 100 нг Ес до ї(ДС1 людини в 25 мкл буфера для нанесення покриття (0,1 М
Ма2СО3, 0,1 М мансоз, рн 9,6) протягом 1 години за 37 "С. Після блокування за допомогою 150 мкл
З 95 (мас./о0б.) ВБА/ТВ5 протягом 1 години за 37 "С пгс-пКОК1 або пЕс-ткоОкК1 захоплювали після інкубації в кількості 100 нг/50 мкл протягом 1 години за 37 "С. Потім в кожну лунку вносили 100 нг/50 мкл ЕРар за 37 "С. Через 2 години 50 мкл 1:1000 розведення мишачого тАБ до Нів-мітці, кон'югованого з пероксидазою хрону (НКР) (К850 бБузіет5, Міннеаполіс, Міннесота) в 1 95 (мас./об.) ВЗА/ТВ5 застосовували для виявлення Раб. Для визначення епітопів (фіг. 4) на злиті білки пЕс, що містять різні домени ПКОК1, безпосередньо наносили покриття, з подальшою інкубацією, молекул Бар перед виявленням за допомогою мишачого тАбБ до Нів-мітці, кон'югованого з НКР. Промивання за допомогою РВ5 повторювали й проводили колориметричне виявлення із застосуванням 2,2'-азино- біс-(З-етилбензтіазолін)-6-сульфонової кислоти (Коспе) як субстрату згідно з вказівками виробника.
Поглинання вимірювали за 405 нм за допомогою мікропланшетного рідера 5ресігаМах М5 (МоїІесшіаг
Ремісе5, Саннівейл, Каліфорнія) і програмного забезпечення ЗойМах Рго (МоіІесшціаг ЮОемісев). 00154) Проточна цитометрія: клітини фарбували за допомогою стандартної методики проточної цитометрії. Якщо коротко, у випадку очищеного Раб до КОКТІ (фіг. 3) 0,1-1х106 клітин фарбували за допомогою 1000 нг/100 мкл Раб на льоді протягом 1 години. Після подвійного промивання крижаним буфером для проточної цитометрії (РВ5, що містить 1 95 (об./06.) В5А, 0,1 95 азиду натрію та 1 мМ
ЕОТА) клітини інкубували з 1:1000 розведенням мишачого тАБб до Нівб-мітки, кон'югованого з АЇеха
Рісог 488 (Оіадеп), в 100 мкл буфера для проточної цитометрії на льоді протягом 30 хв У випадку очищеного ЇдДС1 до КОКТІ (фіг. 8) 0,1-1х106 клітин блокували 4 95 козячою сироваткою протягом 15 хвилин за кімнатної температури, а потім інкубували з 100 нг/100 мкл Ідс на льоді протягом 1 години.
Після подвійного промивання крижаним буфером для проточної цитометрії клітини фарбували 1:500 розведенням козячого антитіла до ІдсС людини, Есу рАБ, кон'югованого з АРС (аскзоп
ІтітипоКезеагсії), в 100 мкл буфера для проточної цитометрії на льоді протягом 30 хвилин. У разі комерційного козячого поліклонального антитіла до КОК1 людини (фіг. 8) 0,1-1х106 клітин фарбували за допомогою 200 нг/100 мкл АБ на льоді протягом 1 години. Після подвійного промивання крижаним буфером для проточної цитометрії (РВ5, що містить 1 95 (06./06.) В5А, 0,1 95 азиду натрію та 1 мМ
ЕОТА) клітини інкубували з 1:1000 розведенням кон'югованого з АІеха Рійог 647 ослячого Е(аб)2
АйіпіРиге до козячого дос (НГ) у 100 мкл буфера для проточної цитометрії на льоді протягом 30 хвилин. Нарешті, додавали 4",б-діамідино-2-феніліндол (САРІ) до кінцевої концентрації 100 нг/мл для виключення мертвих клітин з аналізу. Клітини аналізували із застосуванням приладу ЕАСзСаїїриг (ВО
Віозсіепсев) і аналітичного програмного забезпечення Ріомліо (Тгее 5іаг, Ашленд, Орегон). 00155) Поверхневий плазмонний резонанс: поверхневий плазмонний резонанс для вимірювання значень афінності всіх Габ до ПЕс-пКОК і для досліджень картування епітопів проводили на приладі
Віасоге Х100 із застосуванням реактивів і програмного забезпечення Віасоге (СЕ Неайнсаге,
Піскатавей, Нью-Джерсі). Антитіло до Іде (Ес) людини іммобілізували на сенсорному чипі СМ5 згідно з інструкцією набору для захоплення антитіл людини (Нитап Апіїбоду Саріиге Кі) (СЕ Неайвсаге,
Піскатавей, Нью-Джерсі). Потім злиті білюи ПЕС-пПКОКІ1 захоплювали з певною щільністю (як показано на фіг. 5 і фіг. 6). Сенсорний чип включав порожню проточну камеру для видалення поточних фонових значень. У всіх аналізах зв'язування застосовували 1х НВЗ-ЕР «т рухливий буфер (10 мМ НЕРЕ5, 150
ММ масі, З мМ ЕОТА (рн 7,4) ї 0,05 95 (об./06.) поверхневої речовини Р20) і зі швидкістю потоку 30 мл/хв. Для вимірювань афінності всі бар вводили в п'яти різних концентраціях (фактор розведення становив 2), а найбільш низьку концентрацію тестували в двох повторностях (найбільш високі концентрації для кожної Раб вказані на фіг. 68). Сенсорний чип регенерували за допомогою З МОСІ2 з набору для захоплення антитіл людини (Нитап Апіїроду Сарішиге Кі) без будь-якої втрати здатності зв'язування. Розрахунок констант швидкості асоціації (Коп) і дисоціації (Кої) грунтувався на моделі зв'язування Ленгмюра 1:1. Рівноважну константу дисоціації (Ка) розраховували з Коп/коп. Для досліджень картування епітопів кожен Раб готували лише в кількості 500 нМ в 1х буфері НВЗ-ЕР ж, а потім вводили в порядку, зазначеному на фіг. 5. 00156) Вестерн-блот: клітини або білки лізували за допомогою 1х буфера для зразків (що містить 195 В-меркаптоетанолу) і кип'ятили перед прогоном на 4-1295 Вібв-Ггіз гелях МИРАСЕ Момех (Іпмігодеп). Після перенесення на мембрану та блокування за допомогою 5 95 молока вносили 2 мкг/мл химерного Їде1 кроликалулюдини ХВК1-402 або ЕКК1-ТОР43 для визначення денатурованих білків з подальшою інкубацією з 1/1000 антитілом до Есу людини, кон'югованим з НЕР, перед проявом за допомогою реагенту ЕСГ. Ргіте УМезієгп Віочіпу Оєїесійоп (СЕ Неайпсаге) (фіг. 9).
Приклад 5
Експресія очищеного, рекомбінантного, міченого міткою 5ігер КОМКІ людини та двічі міченого міткою 5ігер КОК2 людини
Ї00157| Бігері-мічений позаклітинний домен КОКІ! людини отримували наступним чином: нуклеотидну послідовність, що кодує позаклітинний домен людини КОКІ (МР 005003.2), зливали на
М-кінці з сигнальною послідовністю (ММС КОСЕСМСТІ КОМОС) і зливали на С-кінці з послідовністю, що кодує мітку 5ігерії! (ЗМУЗНРОРЕЕК). Усі нуклеотидні послідовності з фланкувальними сайтами 5'Мої!) і З'Ніпа!! отримували шляхом синтезу повного гена (Сепзогірі, Піскатавей, Нью-Джерсі), збирали в патентованому векторі експресії у ссавців рЕмі5 від Емігіа АС (шлірен, Швейцарія) і перевіряли секвенуванням ДНК. 00158) Експресію білків проводили в суспензійно-адаптованих клітинах СНО КІ від Емігіа АС (Шлірен, Швейцарія). Супернатанти з пулів трансфікованих клітин СНО К1 збирали центрифугуванням і піддавали стерилізуючому фільтруванню (0,2 мкм) перед афінним очищенням на основі ЕРІ С із застосуванням колонок 5ігертТасіїп (ІВА СтрбН, Геттінген, Німеччина). 00159) Рекомбінантний двічі мічений міткою зігер КОК2 людини (МР. 004551.2) експресували й очищували у власній лабораторії згідно з наступним протоколом: вектор експресії ЕВМА роеВвВ14р- вВОВ2-ЕСО-Ту/пбігер, що керує експресією позаклітинного домену КОК2 (ЕСО), мічений на С-кінці міткою Тміпеїтер, трансфікували в НЕК293Т за допомогою Ііроїтесіатіпе? І ТХ з реагентом Р ОБ ТМ (Тнегто РізНег Зсієпійіс, 15388100). Після 1-денної інкубації (37 "С, 595 СО2, ростове середовище: середовище Ігла, модифіковане за способом Дульбекко (ОМЕМ), з високим вмістом глюкози (4,5 г/л) з
ЇІ-глутаміном з 1095 (0б. /06.) фетальної телячої сироватки (БС5), 100 Мо/мл пеніциліну/стрептоміцину/фунгізону й 2 мМ Г-глутаміну (всі від Віосопсер))), клітини розмножували в умовах добору (2 мкг/мл пуроміцину (Зідта-АїІагісн, РЗВ833-25 мг вихідний розчин з концентрацією 2 мг/мл)). Клітини розділяли й додатково розмножували (37 "С, 595 СО2); після досягнення стану конфлюентності чашки для культивування тканин покривали 20 мкл/мл полі-І -лізину (Зідта-Апагісн,
Р1524) на 2 години за 37 "С і двічі промивали РВ5. Потім клітини трипсинізували, промивали РВ:5 і поділяли 1:3 на планшети, покриті полі-І -лізином. Знову ж таки, після досягнення конфлюентності клітини промивали за допомогою РВ5 з наступною заміною середовища на середовище для продукування (ОМЕМ/Р-12, Сірсо/ГНегто Рівпег Зсієпійіс, 31330-03), доповнене 1 мкг/мл пуроміцину (бБідта-Аїйагісн, Рб8833), 100 МО/мл пеніциліну/стрептоміцину/фунгізону (Віосопсері, 4-02Е00-Н), 161 мкг/мл М-ацетил-їі -цистеїну (5ідта-Айагісн, А8199) і 10 мкг/мл відновленого І -глутатіону (5ідта-Аанси, 6529). Супернатант, що збирали два рази на тиждень і відфільтровували (0,22 мкм) для видалення клітин, зберігали за 4 "С до очищення. Для очищення відфільтрований супернатант завантажували в колонку з картриджем з високою місткістю Бігеріасіпе Зирепомив (ІВА, Геттінген, Німеччина, 2-1238- 001); очищення й елюювання проводили згідно з протоколом виробника на чистому АЕКТА (СЕ
Неайсаге). Фракції аналізували щодо чистоти й цілісності білка за допомогою 5О5-РАСЕ. Фракції, які містили біло, змішували й піддавали буферному обміну за допомогою фільтрувальних приладів
Атісоп (Мійіроге, Шаффхаузен, Швейцарія) для досягнення розведення -1:100 у РВ5, а потім піддавали стерилизуючій фільтрації з використанням фільтра з низьким утримуванням (0,20 мкм, Саг!і
Коїй, Карлесрує, Німеччина, РА49.1).
Приклад 6
Експресія очищених, рекомбінантних гуманізованих антитіл до КОКІ! людини й антитіл ізотипічного контролю
І00160) Вектори експресії: ділянки, які кодують варіабельну ділянку антитіла, отримували шляхом синтезу повного гена (Сепзсегір) з використанням ММЕСІ КСІЕСМІ ТІ КОМОоСсС як лідерної послідовності й збирали з константними ділянками Ідн-у1 ії Іді-к або Ід -А людини, в залежності від обставин, у векторі експресії рСВ14. Цей вектор, похідний епісомального вектора експресії ерСр4 (Іпмігодеп) у ссавця, несе точку початку реплікації ЕВМ, кодує ядерний антиген ЕВМ (ЕВМА-1), що забезпечує позахромосомну реплікацію, й містить маркер відбору пуроміціном замість вихідного гена стійкості до гігроміцину В.
ІЇО0161| Експресія й очищення у власній лабораторії: вектори експресії на основі рСВ14 трансфікували в клітини НЕК293Т з використанням реагенту І іротесіатіпефб І ТХ з реагентом РІ 5 М (Тпепто Ріх5пег Зсіепійіс, Райнах, Швейцарія, 15388100); після 1-денної інкубації (37 С, 595 СО2, ростове середовище: середовище Ігла, модифіковане за способом Дульбекко (ОМЕМ), з високим вмістом глюкози (4,5 г/л) з І-глутаміном з 10 95 (об. /06.) фетальної телячої сироватки (ЕС5), 100
МО/мл пеніциліну/стрептоміцину/фунгізону й 2 мМ Г-глутаміну (всі від Віосопсері, Альшвіль,
Швейцарія)), клітини розмножували в умовах добору (2 мкг/мл пуроміцину (Зідта-Аїагіс!, Букс,
Швейцарія, РЗ8833-25 мг вихідний розчин з концентрацією 2 мг/мл)). Клітини розділяли й додатково розмножували (37 "С, 5595 СО2); після досягнення стану конфлюентності чашки для культивування тканин покривали 20 мкл/мл полі-І -лізину (Зідта-Аїагісп, Р1524) на 2 години за 37 "С і двічі промивали
РВ5. Потім клітини трипсинізували й поділяли 1:3 на планшети, покриті полі-І -лізином. Знову ж таки, після досягнення конфлюентності клітини промивали за допомогою РВ5 з наступною заміною середовища на середовище для продукування (ОМЕМ/Е-12, Сірсо/ГНегто Рівпег 5сіепійіс, 31330-03), доповнене 1 мкг/мл пуроміцину (Зідта, Р8Ф833), 100 МО/мл пеніциліну/стрептоміцину/фунгізону (Віосопсер), 161 мкг/мл М-ацетил-ї! -цистеїну (Зідпта-АїІдгіси, А8199) ії 10 мкг/мл відновленого І - глутатіону (бідта-Аїагісп, 6529). Супернатант, що збирали два рази на тиждень і відфільтровували (0,22 мкм) для видалення клітин, зберігали за 4 "С до очищення.
І00162| Для очищення відфільтрований супернатант завантажували в колонку НіТгар з врівноваженим за допомогою РВ5 білком А (СЕ Неайвсаге, Франкфурт-на-Майні, Німеччина, 17-0405- 01) або колонку У5К Ат5рпеге"Мм з білком А (5К І їе Зсіепсе5, Левен, Бельгія, УММТ20ОЗСЕ) і промивали за допомогою РВ5; елюювання проводили з використанням 0,1 М гліцину (рН 2,5) на чистому АЕКТА (СЕ Неайсаге). Фракції відразу нейтралізували за допомогою 1 М буфера Тгтгів-НОЇ (рН 8,0) й аналізували на чистоту й цілісність білка за допомогою 505-РАСЕ. Фракції, які містили біло, змішували й піддавали буферному обміну за допомогою фільтрувальних приладів Атісоп (МійПіроге,
ШафюФфхаузен, Швейцарія, ОЕС901008) для досягнення розведення 1:100 у буфері, який наведено в таблиці 2, а потім піддавали стерилизуючій фільтрації з використанням фільтра з низьким утримуванням (0,20 мкм, Сагі Коїй, Карлерує, Німеччина, РА49.1). 00163) Антитіла тимчасово експресували в клітинах СНО способами, відомими в даній галузі техніки, а рекомбінантні антитіла очищували стандартним очищенням із застосуванням білка А з супернатантів клітин СНО, як відомо в даній галузі техніки. Чистоту і цілісність рекомбінантних антитіл аналізували за допомогою 5О5-РАСЕ. 00164) У таблиці 2 наведені антитіла, що застосовуються в наступних прикладах, а також їх кінцева концентрація й буфер.
Таблиця 2
Перелік антитіл, що застосовуються в прикладах . . С-кінцеві мітки Кінцева
ІС: легкий ланцюг мг/мл тАБОЗ1 9 ІС: ЗЕОІО МО.14 | С: Сб55І РЕТОа-ЗІгер ' тАрОг27 9 ІС: ЗЕОІО МО.15 | С: б55І РЕТОа-ЗІгер ' тАБОЗЗ 9 ІС:5ЕОІ0 МО. 16 |: 551 РЕТО-5ігер ' тАрОЗа4 9 ІС: ЗЕОІО МО.18 | С: б55І РЕТОа-ЗІгер " тАБОЗБ 9 ІС:5ЕОІ0 МО.19 |: С55І РЕТО-5ігер ' тАЬОЗб 9 ІС:5ЕОІ0 МО.25 | С: С55І РЕТО-5ігер ' тАр1і86 9 ІС: ЗЕОІО МО.14 | С: Сб55І РЕТОа-ЗІгер " тАр188 9 ІС: ЗЕОІО МО.18 | С: б55І РЕТОа-ЗІгер " тАБІ89 9 ІС:5ЕОІ0 МО.25 | С: С55І РЕТО-5ігер ' тАргог 9 ІС: ЗЕОІО МО.14 | С: Сб55І РЕТОа-ЗІгер " тАр190 9 ІС: ЗЕОІО МО. 149 | С: с55І РЕТОа-5 (гер "
НО: 5ЕО ІО МО. 150 НС: ГРЕТа-5 гер еаоітьОСЮ во | своюМмо і сгсевіРЕТа ее ВВ тАБОЗВ 9 ІС: 5ЕО 0 МО. 153 1 С: С55І РЕТО-5ігер '
НС:ЗЕОІО МО. 154 | НС: ГРЕТа-5Гер овмтчвові ово | озвоіюмо ев (сгсевіРЕтояиееІ ПРЄ
НО: 5ЕО ІО МО. 156 НС: ГРЕТа-5 гер "Тгаз" тАрО42 9 ІС: ЗЕО ІО МО. 159 | С: С55І РЕТа-5 (гер "
НС: 5ЕО ІО МО. 160 НС: ГРЕТа-5 гер 00165) М5961 відповідає антитілу до КОК1 з важким ланцюгом, що відповідає ЗЕО ІЮО МО. 1, і легким ланцюгом, що відповідає 5ЕО ІЮ МО. З з УМО 2014/031174. 2А2 позначає антитіло до КОКІ1, яке описано в УМО 2010/124188, тоді як пи2А2 означає гуманізоване 2А2, яке описано в неопублікованій РСТ/ЕР2016/076244. К11 і К12 є антитілами до КОК1, описаними в МО 2012/075158.
Антитіла ізотипічного контролю, тобто трастузумаб і Ас10, націлені відповідно на НЕК-2 і СОЗ30.
Послідовності варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів моноклонального антитіла брентуксимаб (клон сАс10), специфічні до СОЗО-мішені людини, були отримані, походячи з розкриття патенту О52008213289А1, послідовності таких ділянок антитіла трастузумаб, яке є специфічним до
НЕВ-2 людини, що містяться в комерційному антитілі герцептин (трастузумаб), або отриманому з нього АОС Кайдсуїа Ф, були отримані з онлайн-бази даних ІМТ (МН: пер:/Лумлму. ітд ога/З3О5ігистиге- рВ/соді/дегайї5.сді?рабсоде- 76375Рагп-СпаіпаСпаіп-7637Н і М: пер:/Лумлми та ого/3О5ігисіиге - ОВ/саді/ деїаї5.саі?рарсоде-76378аРап-СпаіпаСНаіп- 76371).
Приклад 7
Зв'язування КОКТІ і КОК2 за допомогою тА - характеристика за допомогою ІФА
І00166| Кожну лунку 96-лункового планшета покривали 100 мкл 2 мкг/мл міченого міткою 5ігер
КОМІ людини (з прикладу 5) у 0,1 М бікарбонатному буфері для нанесення покриття (рН 9,6) й інкубували протягом 12 годин за 4 "С. Другий 96-лунковий планшет готували аналогічним чином із застосуванням двічі міченого міткою 5ігер КОК2 людини (з прикладу 5).
І00167| Після блокування за допомогою 150 мкл 395 (мас./0б.) альбуміну бичачої сироватки (В5А)/ТВ5 протягом 1 години за 37 "С в лунку в кожному планшеті додавали зазначені далі антитіла в концентрації 0,5 мкг/мл і серійно розводили (фактор розведення 4) з 1 95 (мас./о0б.) ВБА/ТВ5 перед інкубацією протягом 1 години за 37 "С: ЕКК1-301 (тАБрОог27), ХВА1-402 (тАБОЗІ1), ЕНР1-306 (тАБОЗЗ),
ЕВА1-324 (тАБОЗ4), ЕНА1-403 (тАБОЗ5) і ЕКК1-Тор43 (птАбБОЗ6). Кон'югований з НКР К(ар)2 до ЕС- гамма людини (Часкзоп Іттипогезеагсії, 109-036-008) потім додавали з розведенням 1:20000, 100 мкл на лунку, й інкубували протягом 1 години за 37 "С перед виявленням за допомогою планшетного рідера рак 10М (Тесап). Як показано на фіг. 10, антитіла до КОКІ! людини зв'язуються з КОКІ1 людини (секція А) і не є перехресно-реактивними з КОК2 людини (секція В).
Приклад 8
Гуманізація специфічного до ПКОКІ1 антитіла ХВК1-402 00168) Гуманізовані послідовності варіабельної ділянки (сім варіантів МН пПи4-2 і 4 варіанти МІ. пи4-2) були розроблені Ривзіоп Апіїбодіез (Белфаст, Ірландія). Якщо коротко, каркасні ділянки в кролячих варіабельних ділянках замінювали каркасними ділянками людини (згідно з підходом щеплення СОК за допомогою розрахунків іп-5іїсо на основі патентованих алгоритмів) з отриманням 28 можливих пар важкого ланцюга/легкого ланцюга.
І00169| Експресію антитіл, які представляють усі 28 можливих пар важкого ланцюга/легкого ланцюга, здійснювали шляхом короткочасної трансфекції конструкцій експресії на основі рСВ14 в клітини НЕК-2931 і збирання супернатантів.
І00170| Для тимчасової експресії антитіл клітини трансфікували в 24-лункових планшетах із застосуванням реагенту для трансфекції Амапії Тгапетесіюп Кеадепі І (Амапії Роїаг І ірід5, Алабастер,
США). На лунку трансфікували 0,5 мкг загальної ДНК, а на наступний день додавали свіже ростове середовище та кондиціювали протягом 4 днів. Супернатанти стерилізували фільтрацією й зберігали за -20 "С до аналізу.
Ї00171| Потім виконували скринінг афінності для відбору найкращих зв'язувальних молекул.
Значення афінності визначали за допомогою приладу Віасоге 71200 (СЕ Неайсаге, Бакінгемшир,
Великобританія), а дані оцінювали за допомогою програмного забезпечення Віасоге ЕмаїЇцайоп Т200
М2.0. Для захоплення тАр специфічний до а«-людського Ес-гамма до кози (даскзоп ІттипокКезеагсй,
Мо 109-005-098) ковалентно іммобілізували на чипі СМ5 (СЕ Неаййсаге, Ж ВК-1005-30).
І00172| Якщо коротко, для захоплення тАб в супернатантах НЕК293Т неразведені супернатанти захоплювали з потоком 30 мкл/хв протягом 120 с. КОК1-5ігер розводили в рухомому буфері (НВ5-
ЕР'рН 7,4 (10 мМ НЕРЕФЗ, 150 мМ Масі, З мм ЕОТА, 0,05 95 твін 20) до 20 нМ. Асоціацію вимірювали за швидкості потоку 30 мкл/хв протягом 120 с, а дисоціацію відстежували протягом 200 с за швидкості потоку 30 мкл/хв. Рівні захоплення варіювали від 31,8 КИ до 59,4 КО.
І001731| Відібрані антитіла експресували й очищували, як описано в прикладі 6, згідно з умовами з наведеної нижче таблиці 3.
Таблиця З
Протоколи й концентрації гуманізованих тАб, що застосовуються в прикладах . . С-кінцеві мітки .
Антитіло Антитіло БЕО , - Кінцева конц.
Формат (НС: важкий ланцюг,| Буфер КО (нм) у ее МЕЛЕ шви ЕЛ кого
НО: 5ЕО ІЮ НС: ГГ РЕТО-
НихХВвА1- .
МО. 130 Тміпокер п
МО. 136 Тм/іпоігер
Можеи ід Мов тміпвнор, РВ5 0,48 2714 (т дрова) 9 ІС:8ЕОІЮ 0 1С: 581 РЕТО-
МО. 137 Тм/іпоігер
НО: 5ЕО ІЮ НС: ГГ РЕТО-
НихХВвА1- .
МО. 132 Тміпокер піл
МО. 138 Тм/іпоігер
НО: 5ЕО ІЮ НС: ГГ РЕТО-
НихХВвА1- .
МО. 133 Тміпокер ще
МО. 139 Тм/іпоігер
НО: 5ЕО ІЮ НС: ГГ РЕТО-
НихХВвА1- .
МО. 134 Тміпегер іль
МО. 140 Тм/іпоігер
НО: 5ЕО ІЮ НС: ГГ РЕТО-
НихХВвА1- .
МО. 135 Тміпокер що
МО. 141 Тм/іпоігер
Приклад 9
ЕАС5-фарбування клітин за експресією ПЕОМ 00174) 5х105 кожного типу клітин додавали в кожну лунку в 9б6-лункових планшетах. Планшети центрифугували (3 хв, 1300 об./хв) з ресуспендуванням в буфері (РВ5 з додаванням 2 95 (об./об.)
ЕС5). 2А2 (тАБОбб) додавали в кожну лунку до досягнення концентрації 2 мкг/мл. Потім планшети інкубували на льоді протягом 30 хвилин і промивали за допомогою 200 мкл буфера перед ресуспендуванням у 200 мкл буфера, доповненого антитілом до (9 людини (специфічним до Ес- гамма) РЕ (еВіозсіепсе 12-4998-82) в розведенні 1:250. Після 30 хвилин інкубації на льоді й одного промивання клітини аналізували із застосуванням приладу ГАСзсСаїїриг (ВО Віозсіепсе5), а дані аналізували за допомогою аналітичного програмного забезпечення Ріомл)о (Тгее аг, Ашленд,
Орегон).
І00175) На фіг. 7 показані дані ЕАС5-аналізу для КОК1-позитивних ліній клітин АГ. людини 697 і
Казиті-2, тричі негативних ліній клітин злоякісної пухлини молочної залози людини МОА-МВ-231,
МОА-МВ-468 і Н5З-578Т і КОК1-негативної лінії клітин злоякісної пухлини молочної залози людини
Т470 як негативного контролю.
Приклад 10
Створення сайт-специфічно кон'югованих АОС за допомогою методики ЗМАС
ІЇ00176| Фермент сортаза А. Рекомбінантний і афінно очищений фермент сортаза А з егїарпуіососси5 аийгеи5 продукували в Е. соїї, як описано в ММО2014140317А1.
І00177| Створення гліцин-модифікованих токсинів. Для отримання за методикою 5МАСТМ кон'югованих АОС з модифікованим пентагліцином похідним РМО-159682 був отриманий сіІу5-ЕБА-
РМИШ (фіг. 118), як це описано в МО2016102697. Ідентичність і чистоту модифікованого пентагліцином токсину РІО підтверджували за допомогою мас-спектрометрії та ВЕРХ. СіІуб5-модифікований токсин мав ступінь чистоти 295 95 за результатами визначення для окремого піка на хроматограмі ВЕРХ.
І00178| Опосередкована сортазою кон'югація антитіл. Вищезгаданий токсин кон'югували з антитілами до КОКТ згідно з таблицею З шляхом інкубування ГРЕТО-міченого тАБ (10 мкМі з гліцин- модифікованим токсином (200 мкМіІ і З мкМ сортази А в зазначеному буфері для кон'югації протягом 3,5 год. за 25 "С. Реакцію зупиняли шляхом пропускання реакційної суміші через колонку гРгоївіп А
СгаміТгар (ВіоКай). Зв'язаний кон'юЮгат елюювали за допомогою 5 колоночних об'ємів буфера для елюювання (0,1 М гліцину, рН 2,5, 50 нМ Масі), при цьому фракції 1 колоночного об'єму збирали в пробірки, що містили 25 95 об./06. 1 М НЕРЕФ5, рН 8, для нейтралізації кислоти. Фракції, що містили білки, об'єднували й складали в буферній суміші з таблиці 7 із застосуванням колонки для знесолення 7еразріп.
І00179| Аналітика АОС. БАК оцінювали за допомогою хроматографії з оберненою фазою, яку проводили на 5 мкм колонці РІ КР РоїЇутег Гаре5 розміром 2,1 мм х 5 см, через яку пропускали зі швидкістю 1 мкл/хв/80 "С з 25-хвилинним лінійним градієнтом від 0,05 до 0,1 956 ТЕА/Н2О і від 0,04 до 01 96 ТЕА/СНЗСМ. Зразки спочатку відновлювали шляхом інкубації з ОТТ за рН 8,0 за 37 "С протягом хвилин. Значення БАК, що визначаються методом хроматографії з оберненою фазою, підсумовано у наведеній нижче таблиці 4.
Таблиця 4
Умови отримання й аналітичне зведення для АОС, отриманих у даному дослідженні БАК - співвідношення лікарського засобу до антитіла. МО - не визначено хвВА1-402- 50 мМ НЕРЕЗ (рН 7,5), 21: Кляоі діс135 Сасі» р
ЕВН1-301- . 50 мМ НЕРЕЗ (рН 7,5), 24 МЛ. доісг00 Сасі» й
ЕВН1-306- 50 мМ НЕРЕЗ (рН 7,5), 21: Кляоі дасгої Сасі» й
Таблиця 4
Умови отримання й аналітичне зведення для АОС, отриманих у даному дослідженні БАК - співвідношення лікарського засобу до антитіла. МО - не визначено
АОС (номер) |тАБ (номер) Буфер для кон'югації Буферна суміш с5-РМО (тАБОЗа) 150 мМ масі, 1 мм (Атітеа-Віосопсері)
Аасгог Сасіг
ЕВВ1-403- . 50 мМ НЕРЕЗ (рН 7,5), 21: 21
С5-РМИ вне 403 |сБРМУ |150 мМ Масі, 1 ММ ча без са і Мо 37 дасгоз (тАбБОЗ5) сасі» (Атітеа-Віосопсері)
Тор43-С5- . 50 ММ НЕРЕЗ (рН 75), орі кл
РМ вне ТораЗІЗБРМ | 150 мМ Масі, 1 ММ ча без са і Мо 3,6 дасгої (тАБОЗб) сасі» (Атітеа-Віосопсері)
ХхвА1-402- І 50 ММ НЕРЕЗ (рН 7,5), орі кто
С5-РМИ вв 402 |св-Ргму | 150мМ Масі, 5 ММ ча без са і Мо 37 дасов2 (тАб186) сасі» (Атітеа-Віосопсері)
ХхвА1-402- І 50 ММ НЕРЕЗ (рН 7,5), орі кто
С5-РМИ вв 402 |св-Ргму | 150мМ Масі, 1 ММ ча без са і Мо 37 дасо88 (тАб186) сасі» (Атітеа-Віосопсері)
ХВАТ-402- | ХВНі 402 50 ММ НЕРЕЗ (рН 7,5), | яв без Са»: і Му" са5-РМИ дьго? а5-РМИ 10 95 (об./об.) Аті ві 3,9
Аасз394 (т ) гліцерину, 1 мМ Сасіг (Атітей-Віосопсері)
ЕВВ1-324- . 50 ММ НЕРЕЗ (рН 7,5), 21: 21
С5-РМ ж як СБ-РМИ | 10 96 (об./0б.) го без само 38
Аас395 т гліцерину, 1 мМ Сасі» (Атітед-Віосопсері)
ХвВА1-402- І 50 ММ НЕРЕЗ (рН 7,5), орі кл
С5-РМ поро СБ-РМИ | 10 96 (об./0б.) го без само в
Аас409 (т ) гліцерину, 1 мМ Сасіг (Атітед-Віосопсері) 2д2-05-РМИЦ| 2А2 сБ-РМИ вом т Сольовий буферний зв (адс165) (тАБОбб) сасі» ' розчин НЕРЕЗ5, рН 6,8 " поигА2-с5- 50 ММ НЕРЕЗ (рН 7,5), орі кто
РМ уч С5-РМО /|150 мМ Масі, 1 ММ ча без са і Мо 37 адс287 (тАбБОЗВ) сасі» (Атітеа-Віосопсері)
В11-05-РМИ) ВІ сБ-РМИ вом т РВ5 без Са?» і Мо МО (адсо41) (тАБОбг) ' (Атітеа-Віосопсері)
Сасі»
В12-05-РМИ ВІ12 сБ-РМИ вом т РВ5 без Са?» і Мо зв (адс263) (тАбБОб7) ' (Атітеа-Віосопсері) "
Сасі» 25 ММ НЕРЕЗ (рН 75), мМ сукцинату, рН
В812-а5-РМИ! 812 150 мМ масі, 1 мм (адсге2) | (тдьоб7) 99 РМО | сась, 10 95 (об./об.) оо 5 мМ цукрози, 3,8 гліцерину бе ТВІН
ММ НЕРЕЗ (рН 75), 10 мМ сукцинату, рН
В812-а5-РМИ! 812 150 мМ масі, 1 мм (адс327) (тдьоб7) |У РМО |сась, 10 95 (об./об.) оо 5 мМ цукрози, 3,8 гліцерину " о ТВІН
М5961-45- М5о9ві 50 ММ НЕРЕЗ (рН 7,5), | 10 мМ сукцинату, рн
РМО а5-РМ 1 мМ Сасі», 10 95 5,0, 175 мМ цукрози, МО (тАБІт90) адс396 (об./06.) гліцерину 0,02 95 твін 20
Тгав5-С5- 50 ММ НЕРЕЗ (рН 7,5), орі кто
РМ грастузумає О5-РМО | 150 мМ Масі, 1 мМ сов без та і Мо 3,6 адс196 (т ) сасі» (Атітеа-Віосопсері)
Тга5з-с5- 50 мМ НЕРЕЗ (рН 7,5), | 25 мМ НЕРЕЗ рН 6,8,
РМО Ар С5-РМИ | 150 мМ Масі, 1 мМ 15 мМ Масі 3,7 адс286 Сасіг
Ас10-С5- 50 ММ НЕРЕЗ (рН 7,5), орі кто
РМ пе АБЗ С5-РМО /|150 мМ Масі, 1 ММ ча без са і Мо 3,8 адс159 (т ) сасі» (Атітеа-Віосопсері)
Таблиця 4
Умови отримання й аналітичне зведення для АОС, отриманих у даному дослідженні БАК - співвідношення лікарського засобу до антитіла. МО - не визначено мМ НЕРЕЗ (рН 7,5),
НохвНт 402 НихВНт- 150МмММ МасіІ,! мМ |РВЗ без Са» і Мо? (3)-65-РМО |402(3) б5РМО сасі»,2 96 (мас./об.) | (Атітей-Віосопсері) МО (Адс456) (тАБ288) пи ши гліцерину 50 мМ НЕРЕЗ (рН 7,5),
НохвНт 402 НихВНт- 150МмММ МасіІ,! мМ |РВЗ без Са» і Мо? (8)-65-РМО |402(8) б5РМО сасі»,2 96 (мас./об.) | (Атітей-Віосопсері) МО (Адс457) (тАБ289) пи ши гліцерину
Нихвв1-402| нихвВВ1-402 50 мМ НЕРЕЗ (РН 7,5), 150 мМ масі, 1 мм РВЗ без Саг: і Мд-- (15)-65-РМО| (15) б5РМО сасі»,2 96 (мас./об.) | (Атітей-Віосопсері) МО (Адс458) (тАБ290) пи ши гліцерину
Нихвв1-402| нихвВВ1-402 50 мМ НЕРЕЗ (РН 7,5), 150 мМ масі, 1 мм РВЗ без Саг: і Мд-- 765 РМОЦЯ б5РМО сасі»,2 96 (мас./об.) | (Атітей-Віосопсері) МО (Адс459) | (тАБ291) Ач 2, 709. р гліцерину 50 мМ НЕРЕЗ (рН 7,5),
НихвАт 402) НихВНТ-402 150МмММ МасіІ,! мМ |РВЗ без Са» і Мо? (19)-65-РМО| (19) б5РМО сасі»,2 96 (мас./об.) | (Атітей-Віосопсері) МО (Аас460) (тАБ295) пи ши гліцерину 50 мМ НЕРЕЗ (рН 7,5),
НихвНт лова НихВНтя02 150ММ масі, ММ |РВБ5 без Са?» і Мо?» (26)-65-РМО| (26) б5РМО сасі»,2 96 (мас./об.) | (Атітей-Віосопсері) МО (Аас461) (тАБ2г96) пи ши гліцерину
І0О0180) З цих результатів аналізів можна зробити висновок про те, що кон'югація за методикою
ЗМАСТМ була проведена з високою ефективністю, що в результаті давало загальні середні значення рАК у діапазоні приблизно від 3,5 до 4,0 для комбінацій токсину-антитіла до КОК1 в Ідо-форматі.
Приклад 11
Іп міго стабільність у сироватці для КОК1-націлених АОС ХВК1-402-25-РМО
ЇО0181| Іп мйго стабільність в сироватці для ХВЕК1-402-245-РМО оцінювали в ІФА-аналізі стабільності в сироватці. Якщо коротко, АОС розводили до концентрації 100 мкг/мл в сироватці МОЮ
СІЮ миші (люб'язно наданій професором, доктором медичних наук Аїтеай 2ірреїїи5, Університетська клініка Базеля, Швейцарія) і людини (з центру донорства крові 5КК, Базель, Швейцарія, 50:50 суміш чоловічої й жіночої крові, центрифуговані 15 хвилин за 2000 д для отримання сироватки) й інкубували за 37 "С. Зразки піддавали швидкому заморожуванню в рідкому азоті у дні 0, 3, 7 і 14 і зберігали за - 80 "С до проведення ІФА-аналізу. У разі мишачої сироватки серію розведень зразків сироватки АОС (фактор розведення 3,5, від 5 до 0,0008 мкг/мл) захоплювали на планшетах для ІФА, покритих 2 мкг/мл мишачим тАр власної розробки до РМИО (створеному шляхом імунізації мишей кон'югатом
РМИ-Ідо людини й скринінгу з кон'югатом ВЗА-РМИ) для зв'язування АОС або козячим К(аб)2 до Ес людини (Часквоп Іттипогезеагсі, 109-006-098) для зв'язування загального Ідс, і здійснювали виявлення з розведенням 1:2500 НЕР-кон'югованого антитіла віслюка до дб людини (даск5оп
Іттипогезеагсі, 709-035-149). У випадку людської сироватки 2 мкг/мл рекомбінантного КОК1 людини (міченого міткою 5ігер, приклад 5) наносили покриттям на планшети для ІФА та розведення 1:2500
НАР-кон'югованого антитіла віслюка до (ДО людини (Часкбоп Іттипогезеагсі, 709-035-149) або 2 мкг/мл мишачого дО до РМО (одержаного у власній лабораторії) з подальшим розведенням 1:5000
НАР -кон'югованим К(абр)2 кози до Есу миші (даскзоп Іттипогезеагсі, 115-036-071) застосовували для виявлення відповідно загального ІдбС і АОС. Сироваткові концентрації АОС і загальних Ід розраховували з половини максимальних значень результатів титрування зразків шляхом порівняння зі зразком того ж АОС з відомою концентрацією. Як показано на фіг. 19, ХВА1-402-45-РМИ фактично залишався стабільним в обох сироватках.
Приклад 12
Аналізи цитотоксичності іп міго для АСС на основі антитіл до КОКТІ на клітинах злоякісної пухлини молочної залози ЕМТ-6 дикого типу й тих, що експресують КОК1
І00182| Цитотоксичність АЮС антитіла ХВК1-402-45-РМИО (адс262) до КОКІ досліджували за допомогою клітин ЕМТ-6 дикого типу (М/Т) і ЕМТ-6, сконструйованих для надекспресії КОКІ1 людини (з прикладу 2). Тгаз-0 05-РМИ (адс286) включали як ізотипічний контроль.
І0О0183) Для цього 1х103 клітин ЕМТ-6 М/П і клітин ЕМТ-б6, що надекспресували ПНКОК, на лунку висівали на 96-лункові планшети (за винятком крайніх лунок, що містять воду) в 75 мкл ОМЕМ, доповненому 1095 об. ЕС5, 100 МО/мл пеніциліну/стрептоміцину/фунгізону та 2 мМ І-глутаміну й вирощували за 37 "С у вологому інкубаторі в атмосфері 7,5 96 СО2. Після 1-денної інкубації кожен
АрС додавали до відповідних лунок у кількості 25 мкл 3,5-разових серійних розведень у ростовому середовищі (що в результаті давало кінцеві концентрації АОС від 20 мкг/мл до 0,88 нг/мл). Через 4 додаткових дні планшети забирали з інкубатора й врівноважували до кімнатної температури.
Приблизно через 30 хвилин з кожної лунки забирали 50 мкл, а потім в кожну лунку додавали 50 мкл люмінесцентного розчину Сей Тйег-сіІоФ 2.0 (Рготеда, 59243). Після струшування планшетів на 450 об./хв протягом 5 хвилин з подальшою інкубацією протягом 10 хв без струшування вимірювали люмінесценцію на планшетному рідері Тесап Брак 10М з часом для акумулювання заряду світлодіодом 250 мс на лунку. Криві люмінесценції відносно концентрації АОС (нг/мл) будували за допомогою програмного забезпечення Сгарпрай Ргібт. У таблиці 5 наведені значення ІС50О, що визначаються за допомогою вбудованої в Ргізт БЗоймаге функції визначення ІС50О "шІод(інгібітору) відносно відповіді - змінна крутість (чотири параметри)".
Таблиця 5
Клітинна загибель іп міго клітин ЕМТ-6 (МЛ і сконструйованого клону 14) під дією АОС до
ЕОР! або АБС ізотипічного контролю (ІСзхо, нг/мл)
І00184| На фіг. 16 показані криві залежності доза-відповідь результатів аналізу клітинної загибелі іп міго на клітинах ЕМТ6 УЛ і клітинах ЕМТб6, що надекспресують ПНКОКТ, з АОС з таблиці 5. Згідно з наведеної вище таблиці та фіг. 16, ХВА1-402-245-РМО викликає специфічну загибель, що залежить від статусу експресії КОКІ1.
Приклад 13
Аналізи цитотоксичності іп міго нових і відомих АОС на основі антитіла до КОКІ1 на клітинах ЕМТ- 6, що надекспресують КОК!1 00185) Цитотоксичність АОС ХВЕ1-402-45-РМИ (адс409) до КОКІ1 досліджували за допомогою клітин ЕМТ-6 людини, сконструйованих для надекспресії КОКІ1 людини (з прикладу 2), і порівнювали з
АС М5961 (адс396) на основі антитіла до КОК1. Тга5з-245-РМИ (адс394) включали як ізотипічний контроль.
І00186)| Для цього 1х103 клітин ЕМТ-б6, що надекспресували ПКОК'1, на лунку висівали на 96- лункові планшети (за винятком крайніх лунок, що містять воду) в 75 мкл ОМЕМ, доповненому 10 95 об.
ЕС5, 100 МО/мл пеніциліну/стрептоміцину/фунгізону та 2 мМ Г-глутаміну й вирощували за 37 "С у вологому інкубаторі в атмосфері 7,595 СО2. Після 1-денної інкубації кожен АЮС додавали до відповідних лунок у кількості 25 мкл 3,5-разових серійних розведень у ростовому середовищі (що в результаті давало кінцеві концентрації АОС від 20 мкг/мл до 0,88 нг/мл). Через 4 додаткових дні планшети забирали з інкубатора й врівноважували до кімнатної температури. Приблизно через 30 хвилин з кожної лунки забирали 50 мкл, а потім в кожну лунку додавали 50 мкл люмінесцентного розчину СеїЇПіег-сіоФ 2.0 (Рготеда, 59243). Після струшування планшетів на 450 об./хв протягом 5 хвилин з подальшою інкубацією протягом 10 хв без струшування вимірювали люмінесценцію на планшетному рідері Тесап 5рагКк 10М з часом для акумулювання заряду світлодіодом 250 мс на лунку.
Криві люмінесценції відносно концентрації АОС (нг/мл) будували за допомогою програмного забезпечення Сгарпраай Ргіхт. У таблиці 6 наведені значення ІС50, що визначаються за допомогою вбудованої в Ргізт Зоймаге функції визначення ІС50 "Іод(інгібітору) відносно відповіді - змінна крутість (чотири параметри)".
Таблиця 6
Клітинна загибель іп міго сконструйованих клітин ЕМТ-6 під дією представленого даним винаходом або відомого АОС до КОК!І або АОС ізотипічного контролю (ІСво, нг/мл)
ЕМТ-6, що
АрС надекспресують
ВО адс409 '
І00187| На фіг. 17 показані криві залежності доза-відповідь результатів аналізу клітинної загибелі іп міго на клітинах ЕМТб6, що надекспресують ЯКОК', з АОС з таблиці 6. Згідно з наведеною вище таблицею і фіг. 17, ХВА1-402-45-РМИ забезпечує більш ефективну загибель, ніж порівнюваний АОС на основі антитіла М5961.
Приклад 14
Аналізи цитотоксичності іп міго нових і відомих АОС на основі антитіла до КОК'І на клітинах АГ. людини ліній 697 і Казиті-2 (00188) Цитотоксичність АОС ХВЕ1-402-45-РМО (адс262) до КОКІ1 досліджували за допомогою лінії 697 клітин людини й порівнювали з молекулами АОС до КОКТІ на основі відомих антитіл 2А2, К11 і К12 (фіг. 13) або шляхом постановки окремого експерименту із застосуванням знову клітин АГ Ї. ліній 697 і Казиті-2 для 2А2 і К12.
І00189)| Для цього 2,5х103 клітин лінії 697 або Казиті-2 на лунку висівали на 96-лункові планшети (за винятком крайніх лунок, що містять воду) в 75 мкл КРМ, доповненому 10 95 об. ЕС5, 100 МО/мл пеніциліну/стрептоміцину/фунгізону та 2 мМ І-глутаміну й вирощували за 37 "С у вологому інкубаторі в атмосфері 7,5 95 СО2. Після 1-денної інкубації кожен АОС додавали до відповідних лунок у кількості мкл 3,5-разових серійних розведень у ростовому середовищі (що в результаті давало кінцеві концентрації АЮС від 20 мкг/мл до 0,88 нг/мл). Через 4 додаткових дні планшети забирали з інкубатора й врівноважували до кімнатної температури. Приблизно через 30 хвилин з кожної лунки забирали 50 мкл, а потім в кожну лунку додавали 50 мкл люмінесцентного розчину Сей Піег-сСіоФ (Рготеда, 57570). Після струшування планшетів на 750 об./хв протягом 5 хвилин з подальшою інкубацією протягом 20 хвилин без струшування вимірювали люмінесценцію на планшетному рідері
Тесап Іпіпйу Е200 з часом для акумулювання заряду світлодіодом 1 секунда на лунку. Криві люмінесценції відносно концентрації АОС (нг/мл) будували за допомогою програмного забезпечення
Сгарпраа Ргіхт. У таблиці 7 наведені значення ІС5О, що визначаються за допомогою вбудованої в
Рігієт Зоїм/аге функції визначення ІС5О "Іод(інгібітору) відносно відповіді - змінна крутість (чотири параметри)".
Таблиця 7
Клітинна загибель іп міїго клітин лінії 697 під дією АОС до БОР або АОС ізотипічного контролю (ІСво, нг/мл)
І001901| На фіг. 13 показані криві залежності доза-відповідь результатів аналізу клітинної загибелі іп міго на клітинах лінії 697 з АОС з таблиці 7. Згідно з наведеної вище таблиці та фіг. 13, АОС за даним винаходом забезпечують загибель лейкозних В-клітин-попередників людини лінії 697, яка перевершує АОС на основі відомих антитіл до КОК1.
Приклад 15
Аналізи цитотоксичності іп міго АОС на основі антитіла до КОК'І на клітинах злоякісної пухлини ліній МОА-МВ-468 і НЗ5 5787
І00191| Цитотоксичність АВС 2А2-(235-РМИО (адс165), ХВА1-402-245-РМО (адс135), В12-05-РМО (адс292), ЕВВ1-Тор43-245-РМИ (адс204) і 50:50 за вагою сумішей ЕКК1-324-245-РМИ (адс202) і 2А2-
С25-РМО (адс165), ЕВА1-324-245-РМИО (адс202) і ХВЕ1-402-45-РМИО (адс135), ЕВНА1-324-45-РМО (адс202) і К12-25-РМИ (адс292) і ЕКК1-324-45-РМИ (адс202) і ЕКК1-Тор43-25-РМИ (адс204) до КОК!1 досліджували із застосуванням таких ліній клітин людини: МОА-МВ-468, Не 578Т. Ас10-245-РМИ (адс159) включали як ізотипічний контроль. 00192) З цією метою наведені далі клітини на лунку висівали в 96-лункові планшети (виключаючи крайні лунки, які містили воду) й вирощували за 37 "С у вологому інкубаторі в атмосфері 7,5 95 СО2 в ростовому середовищі (ОМЕМ З додаванням 10 об. 95 ЕС5, 100 МО/мл пеніциліну/стрептоміцину/фунгізону і 2 мМ І --глутаміну).
Таблиця 8
Висівання клітин з прикладу 17
І00193) Після 1-денної інкубації кожен АОС додавали до відповідних лунок у кількості 25 мкл 3,5- разових серійних розведень у ростовому середовищі (що в результаті давало кінцеві концентрації
АОС від 20 мкг/мл до 0,88 нг/мл). Через 4 додаткових дні планшети забирали з інкубатора й врівноважували до кімнатної температури. Приблизно через 30 хвилин з кожної лунки забирали 50 мкл, а потім в кожну лунку додавали 50 мкл люмінесцентного розчину СеїПйег-сіІоФ 2.0 (Рготеда, 059423). Після струшування планшетів на 750 об./хв протягом 5 хвилин з подальшою інкубацією протягом 20 хвилин без струшування вимірювали люмінесценцію на планшетному рідері Тесап Іпіпйу
Е200 з часом для акумулювання заряду світлодіодом 1 секунда на лунку. Криві люмінесценції відносно концентрації АОС (нг/мл) будували за допомогою програмного забезпечення Сгарпрай Ргієт. У таблиці 9 наведені значення ІС5О, що визначаються за допомогою вбудованої в Ргізт Зоймаге функції визначення ІС5О "Іод(інгібітору) відносно відповіді - змінна крутість (чотири параметри)".
Таблиця 9
Клітинна загибель іп міїго клітин різних злоякісних пухлин людини під дією АЮС до КОНТ, а також ізотипічного контролю (значення ІСвхо наведені в нг/мл) 00194) На фіг. 12 показані криві залежності доза-відповідь результатів аналізу клітинної загибелі іп міго на клітинах Н5 57871 і МОА-МВ-468 з АОС з таблиці 9. Згідно з наведеної вище таблиці та фіг. 12, обрані АОС за даним винаходом забезпечують загибель клітин деяких злоякісних пухлин людини, що перевершує загибель під дією відомих антитіл 2А2 і К12 до КОКІ1.
Приклад 16
Аналізи цитотоксичності іп міго для гуманізованих АОС на основі антитіл до КОК'І на клітинах 697 00195) Цитотоксичність гуманізованих АОС пихХВК1-402-3-45-РМИО (адс456), пихвВА1-402-8-45-
РМ (адс457), пихВА1-402-15-45-РМО (адс458), пиХхВА1-402-17-45-РМИ (адс459), пиХхВА1-402-19-(35-
РМ (адс460) ії пихВвА1-402-26-45-РМО (адс461) до КОКІ1 досліджували із застосуванням клітин лінії 697 людини. Тга5-45-РМИ (адс286) включали як ізотипічний контроль. 00196) Для цього 5х104 клітин лінії 697 на лунку висівали на 96-лункові планшети (за винятком крайніх лунок, що містять воду) в 75 мкл КРМ, доповненому 1095 06. ЕС5, 100 МО/мл пеніциліну/стрептоміцину/фунгізону та 2 мМ І-глутаміну й вирощували за 37 "С у вологому інкубаторі в атмосфері 7,595 СО2. Після 1-денної інкубації кожен АЮС додавали у двох повторностях до відповідних лунок у кількості 25 мкл 3,5-разових серійних розведень у ростовому середовищі (що в результаті давало кінцеві концентрації АОС від 20 мкг/мл до 0,88 нг/мл). Через 4 додаткових дні планшети забирали з інкубатора й врівноважували до кімнатної температури. Приблизно через 30 хвилин з кожної лунки забирали 50 мкл, а потім в кожну лунку додавали 50 мкл люмінесцентного розчину СеїЇПіег-сіоФ 2.0 (Рготеда, 59243). Після струшування планшетів на 450 об./хв протягом 5 хвилин з подальшою інкубацією протягом 10 хв без струшування вимірювали люмінесценцію на планшетному рідері Тесап 5рагКк 10М з часом для акумулювання заряду світлодіодом 250 мс на лунку.
Криві люмінесценції відносно концентрації АОС (нг/мл) будували за допомогою програмного забезпечення Ссгарпрай Ргіхт. У таблиці 10 наведені значення ІС5О, що визначаються за допомогою вбудованої в Ргізт Зоймаге функції визначення ІС50 "Іод(інгібітору) відносно відповіді - змінна крутість
(чотири параметри)".
Таблиця 10
Клітинна загибель іп міїго клітин лінії 697 під дією негуманізованих і гуманізованих АОС до
КОМ або АБС ізотипічного контролю (ІСво, нг/мл)
Значення ІСво на хвА1-402-45-РМО
Адс456 '
НихХвА1-402 (8)-105-РМО
НихХвА1-402 (15)-с25-
РМ (Адс459 '
РМ (Адс460 "
РМ (Адс461 '
І00197| На фіг. 25 показані криві залежності доза-відповідь результатів аналізу клітинної загибелі іп міго на клітинах лінії 697 з гуманізованими АОС з таблиці 10. Згідно з наведеної вище таблиці та фіг. 25, гуманізовані АОС більш ефективні в порівнянні з АОС, отриманими за допомогою вихідного, негуманізованого іттАб.
Приклад 17
Фармакокінетичне дослідження іп мімо антитіла ХВК1-402 до КОКІ1 і АОС ХВК1-402-245-РМО до
КОКІ на лінії мишей дикого типу СО-1 00198) Описане далі дослідження було проведено в АВРКО (Берлінгтон, Массачусетс, США).
Самок мишей лінії СО-1 (віком щонайменше 6 тижнів на початку дослідження, від Тасопіс Віобсіепсев,
Джермантуан, Нью-Йорк, США), розміщені в групи до 5 тварин на клітину, рандомізували за масою на дві групи по 9 тварин кожна. Одна група отримувала, шляхом внутрішньовенного введення, одноразову дозу 1 мг/кг ХВК1-402 (тАБрг02), тоді як друга група отримувала одноразову дозу 1 мг/кг хвВА1-402-45-РМО (адс409). Зразки крові після введення дози збирали згідно з протоколом з таблиці 11 у підгруп, кожна з яких складалася з З тварин. Забір зразків крові проходив шляхом пункції скальпелем підщелепної вени (збираючи приблизно 200 мкл), за винятком забору зразків на 21-й день, який проводили шляхом серцевої пункції (збираючи приблизно 600 мкл). Зразки з підгруп об'єднували для кожного моменту часу. Плазму виділяли шляхом центрифугування крові за 1500 д протягом 10 хвилин і зберігали в стерильних кріопробірках за -80 "С до проведення ІФА-аналізу у власній лабораторії.
Таблиця 11
Протокол забору зразків крові для фармакокінетичного дослідження (кількість тварин) (кількість тварин) введення дози 1 мг/кг ХВА1-402 (9) 1 мг/кг ХВА1-402-25-РМИ (8)
І00199| Плазму виділяли шляхом центрифугування крові за 1500 д протягом 10 хвилин і переносили в стерильні кріопробірки для зберігання за -80 "С до проведення ІФА-аналізу. Стабільність іп мімо для тАр ХВК1-402 і АрС хХВК1-402-205-РМО оцінювали за допомогою ІФА-аналізу. Серію розведень сироваткових зразків АЮС захоплювали на планшетах для ІФА, покритих 2 мкг/мл мишачого тАбр до РМО (отриманого у власній лабораторії шляхом імунізації мишей кон'югатом РМО- дО людини й скринінгу з кон'юЮгатом ВБА-РМІО) для зв'язування АОС або Е(абв)2 до Ес людини (дЧаскбзоп Іттипогезеагсії) для зв'язування загального Ідс, і здійснювали виявлення з розведенням 1:2500 НАР-кон'югованого антитіла до Е(авБ)2 дос людини (Часкбоп Іттипогезеагс!п). Сироваткові концентрації АОС і загальних ЇДО розраховували з половини максимальних значень результатів титрування зразків шляхом порівняння зі зразком того ж АОС з відомою концентрацією. 00200) З даних, наведених на фіг. 20, видно високу стабільність АОС за даним винаходом.
Приклад 18
Оцінювання іп мімо ефективності молекул АОС в моделі дисемінованого ксенотрансплантата лінії 697 клітин гострого лімфоцитарного лейкозу (АГ І) людини у мишей МОЮ-5СІЮ 00201) Описане далі дослідження було проведено в Ріреїїпе Віоїесі (Триге, Данія). Ефективність хвВА1-402-05-РМО (адс288) і гуманізованого пи2А2-25-РМО (адс287 на основі неопублікованої
РСТ/ЕР2016/076244) порівнювали в моделі дисемінованого ксенотрансплантата в самок мишей МОЮ-
ЗСІЮ, яким були введені ін'єкцією ПКОК1-позитивні клітини АЇЇ. лінії 697. АОС на основі НЕК2- специфічного антитіла трастузумаб, Тга5-245-РМИО (адс286), був негативним контролем АОС відповідного ізотипу. (00202) 9У-тижневих мишей, кожна масою щонайменше 20 г, інокулювали пухлинними клітинами лінії 697 (5х106 клітин/тварина в 200 мкл РВ5) у 0-й день дослідження. Кожен АОС, складений в РВ5, вводили (внутрішньовенно) групі з б мишей в кількості 1,0 мг/кг на дні 7, 14 і 21 з введенням дО миші (ЧасКкзоп ІттипоНезеагси, 015-000-003), 30 мг/кг) за 20 годин до кожного введення АОС. Будь-яка тварина, у якої спостерігали клінічні ознаки помірного болю, помірні відхилення в стані здоров'я, будь- якого ступеня страждання або будь-які клінічні ознаки, що виходять за межі досліджуваних конкретних гуманних кінцевих точок, згідно з європейським і данським законодавством про тварин в експериментальних дослідженнях, піддавали евтаназії. Кров (90 мкл у флаконах з ЕОТА) збирали з хвостової вени кожної тварини на дні 12 і 19. Плазму виділяли шляхом центрифугування крові згідно зі стандартними процедурами. Зразки з груп обробки об'єднували для кожного моменту часу.
І00203| Серію розведень плазмових зразків АОС захоплювали на планшетах для ІФА, покритих 2 мкг/мл мишачого тАБб до РМ (отриманого у власній лабораторії шляхом імунізації мишей кон'югатом
РМИ-Ідо людини й скринінгу з кон'югатом ВЗА-РМИ) для зв'язування АОС або Е(абБ)2 до Ес людини (ЧасКвоп Іттипогезеагсі, 109-006-098) для зв'язування загального Ідс, і здійснювали виявлення з розведенням 1:2500 НЕР-кон'югованого антитіла до К(аф)2 ІЇдо людини (Часкзоп Іттипогезеагсі, 709- 035-149). Сироваткові концентрації АОС і загальних (Дб розраховували з половини максимальних значень результатів титрування зразків шляхом порівняння зі зразком того ж АОС з відомою концентрацією.
І00204| Аналіз даних проводили за допомогою програмного забезпечення РКІ5М. У мишей, оброблених АЮС ХВЕ1-402-45-РМО за даним винаходом, спостерігали пролонговане дожиття в порівнянні з тими, які були оброблені таким самим КОК1-націленим АОС пи2А2-25-РМИО або АОС ізотипічного контролю (фіг. 15, секція А). Більш того, концентрація АС о хХвВе1-402-45-РМИО залишається вище в плазмі, ніж у відомого АОС або АОС ізотипічного контролю (фіг. 15, секція В).
Приклад 19
Оцінювання ефективності іп мімо АЮС до КОКІ в ортотопічних моделях злоякісної пухлини молочної залози, створених за допомогою клітин ЕМТ-б, що надекспресують ПКОК1 00205) АрС на основі нового антитіла ХВК1-402-45-РМИ (адс262) до КОК1 порівнювали з К12-
С25-РМО (адс327), АОС на основі відомого антитіла К12, і АОС ізотипічного контролю Тга5-245-РМУ (адс286) в описаній далі мишачій моделі згідно з протоколу дослідження таблиці 13.
Таблиця 12
Ортотопічні моделі злоякісної пухлини молочної залози, що застосовуються для оцінювання АОС
ЕМТ-6, що надекспресують Ін'єкція 1 х105 клітин в скупчення й Сингенні самки ВАЇ В/с мишей, | жирової тканини молочної залози.
КОНТ, клон 14 (з прикладу |. . ші 4-8 : Об'єм пухпини під час 2) імплантація у віці тижнів. ухлини під рандомізації від 100 до 150 мм3
Таблиця 13
Протоколи, які застосовуються для оцінювання АЮС ХВ 1-402-45-РМО до КОК'І в ортотопічних моделях злоякісної пухлини молочної залози з ортотопічними імплантованими клітинами ЕМТб, що надекспресують КОК' (клон (сі 14))
Кількість Дні введення доз 1 (Ттаз-5-РМИ, 1 мг/кг/день Тгаз-С5-РМО оопжуаво | Внутрішньовенно адс?86 в (в РВ5) 14, 21, 28 Внутрішньовенно 2 (ХВА1-402-55- 1 мг/кг/ідень ХВК1-402- . бмиасяюю | 6 | с5еМо (ве) т в
З (812-25-РМИ, 1 мг/кг/день Е12-245-РМИ . аде327 в (в РВ5) 14, 21, 28 Внутрішньовенно (00206) На фіг. 18 показаний об'єм пухлини, що розвивається в ході дослідження у кожної з 6 окремих мишей. Ортотопічні моделі злоякісної пухлини молочної залози, створені за допомогою клітин злоякісної пухлини молочної залози, що мають високу експресію ПКОК, значуще відповідали на обробку за допомогою АОС за даним винаходом, на відміну від КОК1-негативної моделі ЕМТ-6 М/Т, у якій не спостерігали таку відповідь. Значна відповідь АОС за даним винаходом ще більше демонструє значне поліпшення в порівнянні з порівнянними АОС на основі відомого антитіла К12, націленого на
ВОНВІ1.
Приклад 20
Аналіз експресії ПКОКІ в лізатах отриманих від пацієнта-людини пухлини за допомогою вестерн- блоту
І00207| За допомогою вестерн-блоту здійснювали аналіз щодо експресії білка НКОКІ1 на лізатах пухлин моделей отриманого від пацієнта-людини ксенотрансплантата (РОХ) (Спагез Кімег, Фрайбург,
Німеччина) і лізаті високо КОК1-позитивної імморталізованої лінії клітин (Казиті-2) як контролю, а також лізаті з імморталізованих клітин злоякісної пухлини лінії А549. Для цього лізати денатурували шляхом змішування з 5х завантажувальним буфером для 5О5-РАСЕ (250 мМ Ттгі5-НСЇ, рН 6,8, 10 95
ЗО5, 30 95 гліцерину, 595 н-меркаптоетанолу) і нагрівання до 99"С протягом 5 хвилин. Після розділення за допомогою 5О5-РАСЕ білки переносили на мембрани з РМОЕ за допомогою системи для перенесення евВіої (Сепзсогір). Потім мембрани інкубували за 4 "С протягом ночі з комерційно доступним поліклональним антитілом 4102 кролика до КОК'І (СеїЇ Зідпаїпу Тесппоіоду, Денверс,
США), розведеним 1:200 в ТВ5Т (20 мМ Тріс-НСІ, 150 мм масі, рН 7,6, 0,1 95 твін-20), що містить 10 95 кінської сироватки (Атітеа, Віосопсері, Швейцарія). Після двох промивань за допомогою ТВ5Т мембрани інкубували з НЕР-зв'язаними вторинними антитілами до антитіл кролика (зв'язане з НКР антитіло кози до ДС кролика У/езїегпзиге, ГіСог, Лінкольн, США) протягом 1 години за кімнатної температури. Сигнали виявляли шляхом інкубації мембран у люмінесцентному субстраті (Зирегбідпаї!
УМебі Ретіо (34094, Тпегто Рі5пег) і візуалізації за допомогою пристрою зчитування результатів вестерн-блоту сОрідії (ГіСог, Лінкольн, США). Виявлення конститутивного гена ЗАРОН було контролем завантаження.
Таблиця 14
Статус лізату пухлини щодо ПКОК у прикладі 22
Статус ПВОВІ
РХЕ 1118
ВХЕ 486 пухлина нирки, гіпернефрома
РХЕ 541 саркома м'яких тканин, кишки, аденокарцинома
АБЗ
(00208) На фіг. 21 показані результати вестерн-блоту лізатів пухлин людини, а також лізатів з імморталізованих клітин злоякісної пухлини.
Приклад 21
Аналіз ефективності іп мімо АОС ХВК1-402-245-РМО у моделях ксенотрансплантата отриманої від пацієнтів пухлини
00209) Описане далі дослідження було проведено в Спагієз Кімег (в Опсоїе5і ОТЬН, Фрайбург,
Німеччина).
Таблиця 15
Моделі ксенотрансплантата отриманої від пацієнта пухлини, що застосовуються для оцінювання
Ар хвА1-402-45-РМО до КОК1
Лінія та стать мишей Підтвердження пухлини
РХЕ 1118 (легені, мезотеліома плеври), одностороння гіпернефрома) Самки безтимусних мишей Імплантація пухлин одностороння
МІМВІ. імплантаці ші 5-7 або двостороння й підшкірна. . , ція у віці ; . мезотеліома плеври) тижнів Об'єм пухлини під час рандомізації від 50 до 250 мм3 тканин, нейрофібросаркома)
СХ 533 (злоякісна пухлина товстої кишки, аденокарцинома) (00210)! АОС ХВА1-402-25-РМИ (адс409), раніше підтверджений як такий, що не має ендотоксину, досліджували в кожній моделі згідно з наведеним далі протоколом дослідження.
Таблиця 16
Протоколи, які застосовуються для оцінювання АОС ХВК1-402-245-РМО до КОКІ в моделях ксенотрансплантата одержаної від пацієнта пухлини мишей доза дози 1 мг/кг/ день ХВК1- 2 (ХВН1-402-05-РМО, З 402-05-РМИ (в 0, 8, 15 Внутрішньовенно адс409) Р.В (00211) Мишам підшкірно імплантували матеріал РОХ (або односторонньо (РХЕ 111, ЕХЕ 486, СХ 533), або двосторонньо (ЗХЕ5 1407, РХЕ 541). Мишей рандомізували, коли пухлини досягали розміру 100 см3, й обробляли за допомогою АОС в кількості 1 мг/кг або наповнювачем в цілому З рази. Об'єми пухлин визначали шляхом вимірювання штангенциркулем, а масу тіла реєстрували два рази на тиждень. Мишей піддавали евтаназії за досягнення пухлинного навантаження 2000 мм3 (одностороннього) або 1700 мм3 (двостороннього) або за значної втрати маси тіла (в цілому більше
ЗО 95 або більше 20 95 за два дні).
І002121| На фіг. 22 показано розвиток об'єму пухлини в ході дослідження. Ксенотрансплантати пухлини, створені за допомогою отриманого від пацієнта пухлинного матеріалу, що має високий рівень експресії ПЕОМ, значуще відповідали на обробку за допомогою АОС за даним винаходом.
Приклад 22
Активність іп міго ХВА1-402 САВ-Т (00213) САВ-Т-клітини на основі ХВК1-402 були сконструйовані за допомогою способів, раніше описаних для КОК1-націлених тАб К11 і К12 (Нидесек, М., І иро-єгапоНеїпі, М. Т., Козавін, Р. Ї.,
Зоттептеуєег, О., Уепзеп, М. С., Вадетг, С., апа Відаеєї!, 5. А. (2013). Весеріог аніпйу апа ехігасеїІшміаг дотаїп тодіїїсайоп5 апйесі Штог гесодпййоп бу ОН -5ресіїйс спітетгіс апіїдеп гесеріог Т сеїЇв. Сіїп.
Сапсег Веб. 19, 3153-3164). Розмножені ех мімо первинні СО8-С2062Іж- Т-клітини людини трансдукували лентивірусом з ХВК1-402 або К12-похідних САК, що містять СОЗсС і 4-188 сигнальні домени та короткий спейсер. Трансдукувані Т-клітини очищували за допомогою ТЕСЕК методом ЕАС5, а їх фенотип оцінювали за день до проведення функціональних аналізів. Чистота СО8-- варіювала від 97 95 до 99 95, експресія С(ЕСЕК варіювала від 95 95 до 99 95. Після 72 годин сумісного культивування з
ВОВІ1-позитивними або КОКІ1-негативними клітинами злоякісної пухлини молочної залози людини, забарвлені СЕБЕ клітини СО8-СО621І ї- аналізували за допомогою проточної цитометрії, виявляючи мішень-залежну проліферацію ХВК1-402 і К12 САК-Т (фіг. 26, верхня ліва секція). Концентрації ІЄМУ ії
І/2 в супернатанті, взяті після 24 годин сумісного культивування, вимірювали за допомогою ЕГІЗА (фіг. 26, верхня права секція). Селективну цитотоксичність вимірювали за допомогою люциферазного аналізу цитотоксичності через 11 годин сумісного культивування з КОК1-позитивними та КОК1- негативними клітинами (фіг. 26, нижня секція). (00214) Ті ж експерименти повторювали для порівняння ХВК1-402 САВ-Т з коротким спейсером з хХВА1-402 САВ-Т з довгим спейсером. Після 72 годин сумісного культивування з КОК1-позитивними або КОК1-негативними клітинами злоякісної пухлини молочної залози людини, забарвлені СЕЗЕ клітини СО8-С062І- аналізували за допомогою проточної цитометрії, виявляючи більш сильну проліферацію ХВК1-402 САВ-Т з коротким спейсером (фіг. 27; верхня секція). Селективна цитотоксичність в люциферазному аналізі цитотоксичності протягом 11 годин сумісного культивування з КОВ1-позитивними та КОК1-негативними клітинами була як у ХВК1-402 САВ-Т5 з коротким, такі з довгим спейсером (фіг. 27, нижня секція).
Приклад 23
Аналіз специфічності ХВК1-402
І0О0215) На фіг. 28 представлений огляд платформи Кеїгодепіх Сеї!І Місгоаггау Ріаногт. Первинний скринінг: очищений химерний ІдДс1 ХВК1-402 кролика/людини й очищений химерний ІдД51 ХВК2-401 кролика/людини об'єднували до концентрації 2 мкг/мл кожного. Пул піддавали скринінгу щодо зв'язування відносно фіксованих клітин НЕК293/мікроскопічних препаратів, що експресують 4336 окремих людських білків плазматичної мембрани (13 наборів мікроскопічних препаратів, п-2 мікроскопічні препарати на набір мікроскопічних препаратів). Усі значення ефективності трансфекції перевищували мінімальний поріг. Застосовували детекторне антитіло до Ес ІдсС людини з
АІехагБіногб647. Первинні шукані молекули (дубльовані точки) ідентифікували шляхом аналізу флуоресценції (АІехагРіногб47 і 75Огееп!) на ІтадеОмчапі. Вектори, що кодують усі шукані молекули, секвенували для підтвердження їх правильних ідентифікаторів. Скринінг для підтвердження: вектори, які кодують усі шукані молекули, а також контрольні вектори наносили плямами у двох примірниках на нові мікроскопічні препарати й застосовували для зворотної трансфекції клітин НЕК293 людини як і раніше. Усі значення ефективності трансфекції перевищували мінімальний поріг. Ідентичні фіксовані мікроскопічні препарати обробляли індивідуально кожним з двох тестових антитіл (ХВК1-402 і ХВА2- 401), плюс позитивний і негативний контролі (п-2 мікроскопічні препарати на обробку). Мікроскопічні препарати аналізували як і раніше (фіг. 29). (00216) Хоча для ясності розуміння вищенаведений винахід був описаний в деяких подробицях за допомогою ілюстрації та прикладу, фахівцеві в даній галузі техніки в світлі ідей даного винаходу буде зрозуміло, що в нього можуть бути внесені деякі зміни й модифікації без відхилення від суті або обсягу доданої формули винаходу. 00217) Усі публікації, бази даних, послідовності з сепВапкК, патенти й патентні заявки, згадані в даному описі, включені в даний опис за допомогою посилання, як якби кожне з цих джерел спеціально й окремо було вказане як включене за допомогою посилання.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 МвВЕ-Тіегареит1іс5 до
Те 5сгірр5 Кезеасгсі Іп5Зтітите «1205 Композиції антитіл до КОКІ ї пов'язані з ними способи «1305 1713.1РС «140» «1415 2017-01-20 «1505 62/280,843 «1515 2016-01-20 «1605 161 «1705 РакепсІп мег5іоп 3.5 «2105 1 «2115 117 «2125 РЕТ
«2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 1 сіп сій сіп сіп Гуз сі б5ег сіу сіу сіу Гей Ре Гуз Рго Тйг А5р 1 5 10 15
ТИгоСеи тигогеи тег оСуз Тс АЇїа б5ег сіу Ре А5р ІІе 5ег 5ег туг туг Мет 5ег Тгр ма! Агуд сп АЇа Рго сіу Ап с1у гГеи сіи Тер Іе
СсСІУ АїЇа ІЇе сіу ІІе 5ег сІу Азп АЇа туг туг АїЇа 5ег Тгр АїЇа Гуз 60 зег Агд бег Типг о ІЇе ТИйг о Агуд Ап о Тиг доп Гей АЗп ТтигоМма! тс геи 65 70 75 80
Гуз Мет Тиг о 5ег гей Тйг АТа АїЇа А5р тТйг АЇїа тийг о туг РНПе сСуз АїЇа 85 90 95
Аг А5р Ні Рго Тйг оТуг сіу Мет А5р Геи Тер сіу Рго су ТЕИг Геи 100 105 110 ма! Тк ма! 5ег 5ег 115 «2105» 2 «2115 118 «2125 РЕТ «2135 огустоїади5х сипіси1и5 «4005» 2 сіп сій сіп ге сій сі б5ег сіу сіу сіу Гей мМмаї тйг Рго сІу сі1у хі омй мож ЖЕ ЖК ЖК жо мх Мо 0 МО ж же дою зих фл ту Ул Хя у КО м ЩО хї я Ще ТЮЄ ке о щЖ уж же 79 Ж же ЇХ Фо юк
Ши ї- Ше Бе ва М. Же Я фе Х. Ж. ф. як бк од Де Лю а Я» Я» Хе бж Мо МО їю ОТ
ЕЕ В отпопт да УМ У 3 с: с 1 м х ме ще фе Ще дя ее ще 2: дж де дя ше їх : ткож ЖК б Ху бе Кр ї5 к.г ок МК бо КИ Ж тд МК У . и . . у МО ЗО Ше КА жо Ям хе БУ пе ОЇМ її ГКУ БО ЩІ вва: и ОК я Ах оз Лоу АТОМИ зе МО МОВ МО ва мо МО Ух ж ких ж ЖЕ Ж ж ВХ Ух ще її шоб же МО о ую ди ую ри у ик ло ка КО Ж м ту ж ех . як, М -к - м у М : коемоя : хх 5 чав хе -3 85 - їх УВО ХХ ХУ С я ЛЕ З ол с Ци тої ко і ОО її ; оно ХХ пої: їх їх І: Ж Хе Зо ЇХ г ща ово 1 Ко 10:03: і тро сх ; Ра РО ТЕО їх їх ЗХ Їх Об 5 Ох тод. шої о: 5 0: 1 їх о ну З бок Б їх М МОВО КОХ тт БЕ щЩк 1
Що офі Ех З Мои АМКУ ОКО 5 М і ОО ГЕ ї х х 3 жк к мі М еко МА Оук що е щУ УХ ме ЇХ ОК ЯК ем хо че ву пт Ж пня жо ХА. Же ЇМО У Ще їм м 022 Му й НК ною Ви 3 - зй ТЕ Е ПЕ Мох УЮ ОХ Мох ще ща ОК і мок ки ОО І Ж жо дя м пу зх У щи Вс и осо вої 4 це х В ТОЖ ж УДО фо жх Лю слу уко щх че Ятевоть Еш. ша Ма ЕЕ сх мМ ЖЕ ж - оо Б у ІМ ее Ж пох МО ШК ож ОО ОО ах т кокер МОЖ У; б Оу З вот Ме КО МО МО Ж мих, м УКОЖХ ох «ТОЖ ЗИ ЖК КК Б х Ж де ще дО жа, дО БУ. Ж Ж ОЦ х ху ух ; т о Е 1 ОК М У КО щу ож м Ж. БОМ. їв Ов ово оВОом о бо Во М Кок АОЩМОВВХ ТО Ж тів ОХ - МоОоше З Мом Же ймостю Мі МУ Ят ЛУ дя В я чиї. Ку дж ОК» ож Ж ог хх що од . : ве код 7 ПО Ж жи як оо й УМ хо шж їм мо ах, МО ж ащО що хо ду ХО ду з Б ЦО АВ ШО КМ го СХ ММ О МЕ ле ошх мон г Уе ром му хе Ж шко Ох М ща пеолх Ах а ку ія а г ях оС кю аю м якостях жк хх хо . й МО Хек й 0. МУ ЩО 2. МІ а У ої пе ши й Бе зд кл Яа о са у ОКО МО Б и МО БО УМО че ше Мо ж У В ЖОВ я їх уко А 0 Уж ВА З ех фо В Ба ню
Є ХХ лат ба ж ДХ дже дю сх ІМю лля см Зе ме шов жом ах о Ж оку ж ОО, вище хи Мк оду Ха са де а га р Ж Ме о до» ж боже ях Ще щи жо ля як СМ ЖЖ Ж п ОКО ми ож нот ЖЖ ТУ Ж ЇМ бе Ж г ЖІ - 4 42 З ог щи КЕ о І оф ВО под МО А ОО ЩЕ ОЗ пк ще мо Чл мк А ода МОЖ о ща моО о ОК р Ок Мо М шум 16 о оо сок пРойЗ бе оси ТИ ДУ Же ОТО) ТЕОлі ож Ко я ДЖ ХК лес фе Ж Же М хе МІ хіх Пов окт пе В І Я ЕК 6 БОС Б ож» Ждокл Жах мі с В 4 Ж КО
Ох Я КО но ВО ж оно КО М ох Я ОКО о Ку п а СМ то мжЖ МУ Ж Мх сх ме У. их дол хх ие МУК М УЖ о НИ ок де ОМ бує й УМО УУ те фе» ух - пот ТРОЇ ку об Ж г ОЇ Сх Ср СУЯ НУ жу КК т по ГО КОМУ мож Кб ге В що у Я Ж тв якої я ож М М ої ОХ УМХ» т во ко й ху М БОМ Ж Же Ко я г якому жи - мої з зу ж ех М г --ї се в с. - х. тал щи Я тво А ЖЕО УК ЕК УЖ орто У як Ж М Ж ЖЖ УМО ож мі жпосж мк
Оля та ож Моїх Ж Бш обо жо от фо Зя її Же. МУ и що ше З ЗИ ВИ Ак акоже ох ою? ох ка мк осі ук ож АЯ К- Хе дво о Мо Шк Пе Зж 5 ос ол вх 5 пх що г Фе Ще ох ВХ ДІ о Зм фе я З ж КОРОК Бе або м оф б ВОК. ж х ОО Ком КІ М У МА Ох нов У р: Ще ЖЕ фе їе Же ще ххх дя лока о КЮВЕТ М щОжЖ Кт ц Кк х з 1 п 1: ОЕМ М Мо кощою ох
КОМУ к: й м М : з : т: Ж Що нж ЩО, УК КИ ж ом ходу З зо ше ЖЖ ФАО бе СПО щу вм Же й» жо ЖЖ їх - х « х т г Бе оїв Ж би ок ТУ о Же ХЗ гл 3 ТО Баш я ноже зом» Мт ук ща о Кх ШО АМ ОО Ж Що М Же 1 фе те де їн до жо їх
Свої Та ФАХ (5 з 3 ВІ ОУМ МОХ що пд Ж ОК и МОВО ря моїх ц РИНКУ ож я ж хх «щк сх, ОО скж о зу жи ОК жир йо о І и А що МО м Ж оо Ж В я ножа фе ма АМО МІ й мо в І В
СУЯ Ко м стю ку ме жі МІ У; МОХ Ме ор ля М ат вх Фа т у є. кх
ТЕО пок ВЕ ОКУ жу ЗО Хо ОО шІ ФМ МУ УМ ше дж од ха Мо вм ж жо ду пеоОмк хто Я ОМ Род ут Оща сл У Лю ду КОМУ мол ХХХ бо се Хосе ТАЮ ОО З пе М
ЕОМ пе М: ЛЬ Ло ОМ тю Же по се ох «Ро ФО Ж ж М ЖОВ ОМ МОХ МО (х ох МОМ ОВ а М ІМ кОм по МОЖ 0 СОЯ й ТО пок, о мя КО к. І ЩО ою в око цю. Ко ої «о
ЛУ о чо Лж лю дк йьЬоОсе пх ЩЖЕ дх їМОх сю зе ШОЕ зЖЕ Мб Ж дк ПО ак У КМ
ОО пох 1 Ух Їх ох Ух ОХ г ТА 15 їх й о еоз :М о У мо мо ще МО МО шахи о -НЖ ок І ХОМ КИ ЕІ АВ ОКО жк ух ше дж о 1Ж су ше Ж -2о МОМ ох ох з. Ж В о М шо 8 МОМ ОХ БО І Ох могу З, г ; ОБО ОВО Ж ов о МОЖ кт Хот же - х Н і ї її: пк. ту ЖЕ ож: їт «КМ я КК мЕ ож ІЛОЖУ т: їх їх кох ох : мо мошок КО М Ж МОЮ є оон : ток : х 58 : чЕ х Же у ж ОК ях ум АКОТ ОО КО:
ОКОМ от з Ме в МУ Ом МОВАХ у и В яМролду х: ОН: : ох: тої У Уойеяю бе опе є Фе Ж. хо и дж Ме ня жк їх охш р: ВЕЖА йо блю се Шу лою ле жу пров виде дж ВО по сб де ЗА Ж ме с їн
ЕзКІ ге оси ВЖЕ те Ж БО бе Я Бі ЖМ Му Шк Б де Я жу й м Ж ОБУ КЕ Ж МО А І М КУ ож
ВО ОЖЕ 02 М о щоб ж й мк КО МО " хх ЕМО ЗЕ МОРС ді о Бо : ВО ЖОВ ОХ ЖІ ПО си Же се БЕ оч ПОМ б щи ЖІ ОКе Ж ІВ до КОМУ КО Оу - хх а Х От їж о ли В оЩо й АБО МОВАХ ие б см ми и Удо Ж ЯИТ КИ АТХ ОСЛЕ я
З яОТЕ ЩОБ ки ох ОКУ КК І ОКХ г ШО БОЛІ Ж ТА сля М2ОХЬ хвохя ші ХА Ок С ск пло т тю жо жа ее хм уко хх шо «Ж змо н їн Ж ШН ЩЯ ну чех. мое же зо НО шо дю шк мух тро кота ке Мох ую Шк хо М ока т що ще ме ЩА Що ТО С г оз у ово я ен ДЖ інею ре А м т м о М а хи во ТЕЖ ОЖИ ше мо ут ню У Й я пу й о Б ж Ж жо що жк яю щ Мох 3 їн Хо Я к т У ож оком оз КЕ р В хх їж х щі ле Ще ож 5 шк Хм обо АЮ ММ Д.О ФО А. -х -ї «о Хо н з ЖЖ ОА Хо ж Що о и Ок зо 19 п шм й І Ех. 1х як 3
ОК чо яко у у в Б пе І МОМ ОМм о си ще МЕ МОМ ОХ і це во шоТЕ ж 7 Мов дО Ке ся т ; ВТК мок Мов Ж З Ж ХО
С г ОЇ зх О озм Моск у УМО з Уж М ШО ЙО МО дя
Ж МОЖ бо ща м ух ше й» бе ФУ їх с ї бою об а Ме де 0 Ж 0 бе й ОХ
Ток ЖЖ мож М В Ж Ж, В Оу Я ж жк ОО Ж У и 17 Ж ле тий ож ие МЕ ще КК МВ цк Ох щу (м Зх бл ст В а о У М ях хе йх ж сх св Та С ле ХХ Ж щОЇМ Во КО ЖЖ ВА ЖК ОХ мож Ж ож ме Р «ДК Ж Же ж ож жо хаб бю хжюоя жю МУ зб їж М бе їх лю Її й 06 сх о0е У їм ох хі Ми Хв б ї5 Ж ж З Б ож Моз в в в М НН НЕ У ско, о жо з ! хо ї ху : ї я шток и УТ ой В дО па Ж ОМВО ко що вк ді ої, А Ж ЖІ жо оса ЖОВ Ж ОО:
РУ дже ЖЖ 0 ал о ме У МОЖ с Ко Ковка Ох
І Пе ОТХ ше УЖ ОКО жк Ух тя ТК ОТО Б м В ХХ Мк 1 ДОЗ Ж МО хе мо Уа п ж А тохщобе ЖИ ож лі КД КМ щі ож ДЖ ом ОМ гою. ше КУ де хо, є еко до ж ви ож «М Ж А МІ Ух. їх Іо -- тб ЧОМ НК ою уко де мих х «ДИ А 75 хи 15 ТМ МОХ сов «у шок ржюти ою я
Каку мох ВК с ошЕ Х3 І о М КИ У, ТУ ялота ковкой Ж у р мих рого а
Ж мЖОх ще по и А а у бот сх й ХК и й ву Ак м В хх -е піхота і ота Ті БИ се Фо У ДО пл оф МУ уко по МУ МО ШК ЗМ У» мжоуу
ЕОМ не Може М) ож лок ХО БИ МО Пбоїж Ме їх Фк б їм ух бк Мі Ме ОМ
ХЕ ХХ хо З Ж у ВО ІК у МАЙ ОМ МЖК АТО ЖХ МУ у жо ст рого
ЩО ОМ ж ЗВ Ж сло їх їх ЗО Ж жу ше мл вх у ЦО Уя мр
Сховд ої М г. ші . ож БОЖІ В ЖЖ БІ ул я г фя жо - МОЖ, пи в Ух МО МК мол тя жу що ИЙ Ки АЙ ОА би дом дя Ми жо й їз бж Еф дж їз юх Фе ує ШУ 4 о шх ше дм сю Ж їмо у же ке жо Ж б хе Фа под таожня 04 дн дО АМОо мм м АК т шо ярий гий шк ожмх м їм Домі ВА
ГО ОЦ З обре я во ВОМ ков в іі тот ОО ті М хх Є ЖХО ЖК ХЕ хо Но м кю кл ев й сви очи АХ ож а ок я бок Жи їх Же Же Бе Же БУ Ме - Шах ля ХМ Ве бо М лю Ще 1 сб Й ої» «х
Ош бек о і Кк о єкх Кд я КВ хх Де ее Но и че а У р З іх ОО пт (3 ЗМ 05 МВ о М М Х са Б ОКО ОМ ж Б МмОМОТОМОМ
Од ям БЖ КО АЖ ЖК чо х ЕТО УуЄ Мо жх ху КО Кох ек ця ОКХ о -оФу . ож А т мі у мя МОМ ня як Шо Ж хе Ме Хм ше ли ШУ лю де МОЇ р можу ж ПОЛО Ж б м тю ше Ж дк Й ща ой бу бе обкл дж Фе де де йо ще ше їБ Тож х Ж еАО МВ ЖК уж Тк Ти дохо 0 ТА ДЮ ТВ Ом ОО тю
ГУ ШВожши и т ло Мі Мі ше ж ож Ото у бу т йо ех - еще лох: ти пу їх хиб ит Я тм о жх ДЖ Ж їх ще ФШео Ла ж 03 ЛУ МД щу МО М ж ох соя шоу М. Це МУ ЖЕ де ше ОД м Ід ТО СТЕ Орг ху УМО ЩО ее ті ож ої; ТТ Мол ит хх. ши т АМКУ ща ва щЕОМ ОАУО ЗО О ХАТк
От пе У ж ЗО йо нх в ок мо Ж Ж У М оф моб и ля, я да
Ох ша М т т УТ ге у ООП МОВ Кр І ВрОжЖ К ю ою зв СБК ких ах ТЗ Щи т й Ве жу т хе я ря НЕ ТОМ МО х пІООВЮ МО
ОЕ Чом уж перо? ві мі ока жа скі ен ох, фомг, змо, МЕ ЇХ зо! ді ян ут Сх пошу а Ж од й Му їх дО сх сх я Ж у шт ее Же Ім. КЕ Я Ти Один т Ме ОКО ФЛ Од жо ук Ж бю ЗАТ ІЖж ЩО БО отр тт о Ж Ал. ЖМхОо ЩА Ом Ок ее ДОТИ Ж М сти тк Ж У Хе СМ ХВ ОТ що стеж, мА шо ож те
ОТ с о око . - яд ОТ ЖЖ МОЮ ож зт ж м ХУ ЕМО г МО Мо кх шафок АЮ ОА Ж ММ ЯМ іх ше. ВИХ
Ухох яЕолю Уопе шк ли в ЖЕ щи лу ТУ ОД МЕ КК и щи ут Мою їх мох ох жу ж ву жо ху же Ж пк фе ую І І жк мі УЖ ЯК Ж У фе ле пе ох ях ож 3: Кох : ої - х : 85: І
Жим у ше «об ЩА Ше щу АЮ ре яХ, М; Є ПК Що ку ямок Му му су ємо ВХА КО ІЖ
Хе ех ОК оо птоз сх ща мм ДО дю ЩХМ ОМА ях МУ хх ЩО ІМ. лк Яку їх жк де 03 б Ми й й Ох 7 ХОМ МОЖ ІМ ТюЖОпЯ од ша Мал мі Я Ом ІІ кт ММ ОЦ ХІМ жд 2-х МОУ Ось
: : ї Н : : ! : . КТК : : ? ї і : : їде Щ3 : ї х 1 : : : ї беж і : 3 ! ї ї : : І МЕЖ ї - : ї ї : : ї Ку М 3 : ї Її : Ду ти ужуюуя ух фючюю куююк дееоккиююкм о юієки м ї : : х і тоБаН НК оно ново нн і й ши : ї ї ї : ї ' х ЇХ дує Ей » : : ! : : ; і : ДЕК же : і ! ! : ї Воевн ї-я і У : ; х . і і : ККУ і т : ї ї ! У ! я Ба я а 1 У вівв вові о пород ооо ооо ооо ооо ооо вдаоооввосовоп олово ї ї Мити и ТИЛ МОЛІ ШИМІ ПНЯ КеНиНеН Не: Ба ї ї : : Н ї і ї ї ї нак : ї ї : ї : є : зххекоо м . ї 1 і : і ! : і : ДЕК ї я їх : і : ї І ї : ї ке ї КЕ : : : і і : ! : : що ие ОА : 5 : : і : : : В де а
Н х Її ї ї Н мае ікла м нене же го ч ї ї ї ї : : У ВЕМОВНИН В вив ва опік век ооо ав с. ї ї " : ї Н ПМК АНЯ ї ; . : ї : : й : : хі
Ї ї : : : : ; : і Ж дохо М з г : ї ї І : Н : ф І ЕИКХХХИ й : Н : і г ! : : З кр Ті ку : і : і ї : ї Н : ХК ї і : ї : : Ї І джмвеююу ше СК 5 ї ї : ! ї і Ї ї бух : : і : : А мої і т : ї ї : 7 ВВВВОВОЮ ВВ ооо о ові і : ! х . КН КЕ: г ї 3 І : : 1 І ї їх « і : : : : : жууулняи ув як ши ! ши кави і 5 ї . : ї 3 ! : : : : : : Занвю. М
Ї ї : і Її : ' З ККУ - х ї і : - ї ї і : ї Ка чі кі ї 3 : : іон: а осі Ж о «й ї ї ї т ТВВодо ооо ооо ов сова порів , м 1 х : : ЗК | о о ри ни г 5 -ннх ї ї : ї ї : ; фени ча
Тр ої ! і і і Ша я
Мей : ї 4 т ! ! Я ї ж ск й ее і 1 : : : ї : ї ї озняю че т ї т : : Н ї вн х « : і : ; ї ' і ; ІЧ Кс ще : : : ї ї х Кк жжи кт кін жикн ох і
Мк ї : т : х ; х : ВООЗ з г : і х ї ї : У ООН м с щ Н ї з ї Її : : ній : Мч ча хо ї : : : х 1 : Н : 1 мм 1 : ї І ї 7 : ї 1 ку М о Ї : з : : ! : : : і рі й яке ї : : : ї . ї : : Тех ті т : : ї : ї : і НЕ т ої ! : : ї : : ! : Штук хо
Мо : : : і і | і : й Яке ї - : і ї ї : дою нм х офолони мл ню ЗК : : І : : ї 5 НВ нн х з : : : ї 7 1 х ї ще і ! : : ! ї : Ї дн» р; ї : і : : : : : і ух з м яко і : : : : : : : й М КК ; ї : ї х ї : ї Н ТІЕЖУЮУЮХКХ н жа ї 1 : : : ї 1 ї меш ме ї : 7 : Н х 1 ! доку з 4
РК : : . : ії : ї АРМ МАМУ я кс АХ Я
Хай : : : : : : І У х с
МЕ н Я : : ї ї г Вова вав вве аця З Бе їх
Хан Н : 1 І Н х х ИНА ин хх: ак х : : ' : : ; ; Екнсвнння: заамнннни знання Ж я
Є ! : : : : і : : : вошноА їх г ї : ї ї ї ї т З і ТИСК о : ї ї ї х ї ї : х
Мк : ! : : : і : ї З реуруюно а : : : ; : - ; я Н сх . , : ' ріст Кто совет ежооетснмн К й щУх : 3 і : яви нн: жк і і і ; : ї Ї ї " гі ех : : : ; : і : : : дою, З х дея Я 3 : : Ї : ї : Ду т
Ух : і і : : : ; : У у: в
Ж : : : ! і : : гуру з
Си : : : : : : : ; Її Ве с з хх й : : І : ї до Кт конк нн 4 бе м с ї ї : ї : ТИВ ооо ооо в в . - Б хх : ї ! т : ї ї і : 1 де в : о ї ' ї І і : Ї дунххкккн у бе с : : І : й й : 3 : : НИ п сег 5
НЯ у - ї : : : , ї : 7 тХ : ях : ї : ї Н ї і ї : : У ери чі : х нн ке з ї у Кук ОХ КК : ЗВО ооо оо вн Во оВоНх а і КО ОН Он о ОД ПК ОННН М, і є я ЕН я Є Е нний. Ж 7 ї ; х Н 1 і ; : Ж дух М х ї і Н Н : ї ї 7 : І ВИМ М ! : : ! : : Ї " і ІХ МЕ о : і : і ї ї ! Ї Чееужух; : : : Ії : ї : - і ща : : : І : ї ; : о Ії МАХ: х : х : : й алкани, онко нен нн че я : : І : х ДК вив нив о вир пр ово вано ЕХ т ї ї : : ОДНО ОМ А МОДНА ї У : і : ! : : ї г ї ' г є. : : і ї і х : Н і ЗМ м ! : й і : : і ї ! Ї денне В Ех х ї : : : У Н ї ї ї ми ї 1 : 3 ї ї : 1 їз з : : ; Ї З ; і : 5 : У : і : : 5 : : : У
І ї : ї 1 ї : ї : я ї ня 7 фехлумикн Ку «КККУКУ ЗЖККККНЕ КВК КК КК КК чл КУ Є ок - "ВН вв ов зв в вв В В :
ВН т й 7 ї тя ї х : ї і Ж : : : : : : і в З : : : : : і : ОДА ше : : : ї : 1 і же чай 7 : і у МО пух ую ня оон ов х се : задні КУ о АК » 5 ї ї ЗОВ НН в ин ке ї СеоУНи ОО Се р ФУККАУККАННКНКЯ ОККО ООН ї : : : : ї т ї ї 4 : : : : З і І : : Ї денннннннм, М ї : 1 ї ї : ! ї ; Де ту : ! і : і : і ПЕ : : ; Н і 1 Тому ю : : і ; : ; : ОА» : : , : ; І і і і КН : : : : і і ї ії ; З: ХУ ї : : 1 і 1 Її х ї т : . х . х У з Я п - ПЕ уусооокойроотохо фо риселнннно Врооннннх Дрнкннннінк вон ренні рнннннн Ді ск ху сх х с А си : с си пе
Ка БУ М Ж ж хо У с 8; Сг КО ще Ук ще ж кЕ хх а хх лені рр рень і і І ї ТУ нн нан ще плити з : і ! Ї Н Н і і : пу евутн юних Я ї ; : ; ї ї і х : і х і ї х м
ЕЕ Бр. ря |і 1 х р БО БО. 1.
З 1 З і і: : ї і х і ї : ї : ; рі пиши нн и і Рі нишишшиши рі Р Б
З : 3 Ї І : 1 і : і з ! і Ї Н Н : : і Н : 1 1 ; : і ї і ї З : і і Е з ; : і : і : і і ЕЕ ; ; ее . ! ; : Н і і ї і : З ! їн ії чо їж : і З З : і Н І Н : 7 х ЕД дк і : і ї і і Ї « і 5 ї х ї ' Ха а. ши ши ни п и шишка ! ! Фе м Її . ї Н ; ї ї І ; їх : : ще
Ше ши Ша Я м п ше ши ше а! і Ор БЕ з і Ї Б : ; і її ; і к ШЕ
Її ї ; : ; : : і І -. : і м | З х : ї і і з ; З | і К ї і : -- її ра і рі і : І І Її що; і ї : і і : з : : : ; : дО; наши ши ши ши ши ше р р є» і і ї : х ї ; шо ТІ ши ше же
В: і БЕ. и Брі і : і Ше: : : : Ї : і : Н І ! і уж р Ой НЕ їн 7 я Кі З ! ! ї І : ї й т : :
Мо дет ше я КЗ 4 5 Ї Ї і : х ї
Е Ї - У жи я М ж мА х Я Її е : ; ї
Ко « к ж" -- ав Ж етх є ще я 87 Ка З ; ! с хх хо ї х щей ней а ки и о ще ; 1 що чи чу. Му я 7 - мне У ух Сов м х
М. чі ік Кк а х х К ФУ «7 « «7 . т с рю ох о " х з їх ше ж 3 з : У з я вч я - х як в З ху ою Хо, ї хх Са ОМ ке -у : х Ах що МК х Ж Ми що р КУ ех Кі : : у ; , я : З пиши ши ши АЮ АХ І 1 : і 3 з х т З ї Ж ї і і і : і х ! 1 . 1 3 ї і ї З х с шани хів Ах ні 1 і і 1 : І і З З і: Н ; і Є «3 і і І і З що: " порно ; ; ! | : : і ї з ї ї : ї 1 х м в х рі ро: Ї - мсфуеснв о сноокефожееніннннях У, і : х ' : 1 1 Ї ї х : ї і ; і т
З ї г Н З і І Ї 1 ; : че ! : ї і і і і і : : і У і : рі ук
І : 3 ї : ї ії 1 : : ! « і 3 ї ! і ї і: : ї ї ї є їх і : ї 1 ї і і : х Н 3 3 І ї 1 : ; і і ф : ! і і: х З ї і : 3 Н х і ї і з ц 7 4 ї ї і З Н і ї і 3 ї : і і х . ! ; : З : ї Ї : І і :
Я тої її Бр: і БОБ. ; б І і і : я З ; : ї ; З ї ; рак і і і Е Н є і : Ї ; : Н чек де ї й ї : -? ї : ї і « ' Н : р щи сл ще ей рі Беж КЗ ; т, ? с дет ще Як сит : : : корот я 7 й чех я ро у ! : | : я
Ух ДН жує і те ( і і :
М дин Му ій ЖЕ, БО с и зх йбрии і ще киш і ; см нт зу ой бро вд й. х : : ж шк: ії з й ад т ї : : їнк се Ї КО х М Є. ТУ їжи Ух ї ! : «а хек ї їх ше а ох я У ї : г
З. ї пе ї ем во | З у ї ї Її 3 х і і і Ж Н що т з Ск фе З І ; а її: і ро і у ч ; ро Кох : і і деко ду і і і ї з КК У ї НИ і х ї 3 3 Я х : і 1 і : : ;. х З і х і ї ї Ї і: ї ; че ! ' Її у і 5 у ї : : Ї ї ї Ко Я х : , у З х їх Ії ! х ї ж х . і ! ї ї : зх ; ї ; ї 2 Ту и З : ши ши нин и пиши ши еана в ! пиши шишиши ши ; ЕК СН
І : ; ї З ; ї . ; : ї ї р, КУ і і Ї ї ї ї : ї й і ; : і : м че КК :
Її і і ї 1 : 1 ! ї ї є УК. : і : 1 ї | 5 і і Її х : 1 З о Км с : : г . Ї х 1 т Н : З і ї ро» еле : і БЕ. р і і ч і шини ши ши шини р : ! ; і ; і : і ; : і : і У ОО Моне их і : і ; і : ; ; Ї ; І Її ? ї 5 жі же ? ря ; і : Кр | і я- і ї і | ї І З Я : І і : і і : нн нн и : і Бо; їі і і : : : : і ! : : ; 1 : : ї і і 3 : ї і ї З і і У фони р фелхкучяиі учня І ! і Її ї : і і ї з: жа і Я. лико пкхмемулкюдок ооо : : ! : Ї 3 : і т : і фнниодтв и оомне нетен інн нин нн ни АН ; І : ! і і ) : 5 : фунти етткрнтех ут Я : і «о
Н : : : 1 ! : і т ї І «оон арьткю нн см м ; з р. ер ї : і Р і і : : : : ; і : і ; НН: я а і і ; ! : і : : : | ї ; НИ : і з рій 4 ; ! ; ї у і і Ї ; : і і де | КЗ я Е : 3 і : : і і ї і | Ї ї '
ЮК якжин 7 у з ! з : : хіх я пк ие ж є й 7 Е 2 З У : : щЗ 1 ї сх с сх -х м ж я ще х Є ке ; :
Кок АХ й 7 я ща Кай кожне к й і лм б жк «то я шви - хм : в я КА 5 є я в
У Зо ях з ше че їду Ж Кк т з - що й що КО . се ; . у х : х те т Кк в ж м Ук те, х зх б, З Ох Оз гемя
А АКТА я. ке і пиши І: р КМ АК і
Ї і х : і : і ї Ії у ї 3 3 | З і
Хуєткичиіея ї : : і ? ! ії і : ї і і і з їнх на с нникснкченокі кт І : : і ; х ї Ваее о СХ м еко . ! і з у з - А З
У У х я ГУК я бинта Вав « 25 ко Я МЮ М ж ОО 5 Ке «че» у Фу Км З з с Фе є я ї ХО» пз с ро хх о
Зк ве Кк рек Гой ку и З 4 і че» Фе я ї т ра
Ен «А зх й У х «і її т ї- ; ее ай пре З Я Мікс ; Ше «жо з що КЕ п КВ я я М ж ше їй пі ож ОВ шщ- ЩО ЦО В Б Мо ко.
Іст ХВА2-401 кролика/людини об'єднували до концентрації 2 мкг/мл кожного. Пул піддавали скринінгу щодо зв'язування відносно фіксованих клітин НЕК293З/мікроскопічних препаратів, що експресують 4336 окремих людських білків плазматичної мембрани (13 наборів мікроскопічних препаратів, п-2 мікроскопічні препарати на набір мікроскопічних препаратів). Усі значення ефективності трансфекції перевищували мінімальний поріг. Застосовували детекторне антитіло до Ес дО людини з АІехаРіцогб47. Первинні шукані молекули (дубльовані точки) ідентифікували шляхом аналізу флуоресценції (АІехагіногб47 і 750гееп!1) на ІтадеОмцапі. Вектори, що кодують усі шукані молекули, секвенували для підтвердження їх правильних ідентифікаторів. Скринінг для підтвердження: вектори, які кодують усі шукані молекули, а також контрольні вектори наносили плямами у двох примірниках на нові мікроскопічні препарати й застосовували для зворотної трансфекції клітин НЕК293 людини як і раніше. Усі значення ефективності трансфекції перевищували мінімальний поріг. Ідентичні фіксовані мікроскопічні препарати обробляли індивідуально кожним з двох тестових антитіл (ХВК1-402 і ХВК2-401), плюс позитивний і негативний контролі (п-2 мікроскопічні препарати на обробку). Мікроскопічні препарати аналізували як і раніше (фіг. 29).
ІЇ00216| Хоча для ясності розуміння вищенаведений винахід був описаний в деяких подробицях за допомогою ілюстрації та прикладу, фахівцеві в даній галузі техніки в світлі ідей даного винаходу буде зрозуміло, що в нього можуть бути внесені деякі зміни й модифікації без відхилення від суті або обсягу доданої формули винаходу. (00217) Усі публікації, бази даних, послідовності з бепВапК, патенти й патентні заявки, згадані в даному описі, включені в даний опис за допомогою посилання, як якби кожне з цих джерел спеціально й окремо було вказане як включене за допомогою посилання.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 МвВЕ-Тпегареитісв5 дО
Те 5сгтірро5 Кезеагс!й Іпбтітите «1205 Композиції антитіл до КОКІ ї пов'язані з ними способи «1305 1713.1РС «140» «1415 2017-01-20 «1505 62/280,843 «1515 2016-01-20 «1605 161 «1705 РакепсІп мег5іоп 3.5 «2105 1 «2115 117 «2125 РЕТ «2135 ОгустоІЇади5 сипісци!и5 «4005 1 сіп сій сіп сіп Гуз сій б5ег сіу сіу сіу Ге Ре Гуз Рго ТЕИг д5р 1 5 10 15
ТИг Се тс огеи тс о Суз Тс Аїа б5ег сіу Ре Азр ІІе 5ег 5ег туг 20 25 30
Туг мес 5ег Тгр маїЇ Агуд сіп АїЇа Рго сіу Азп сІЇу Геи сіЇи Тегр Пе 35 40 45
СсСІУ АїЇа ІІе сіу ІІе 5ег сІ1у Азп АЇа Ттуг туг АЇа 5ег Тер АїЇа Гуз 50 55 60 зег Агд б5ег Тийг о ІЇе ТИйг Агуд Ап Тйг о АбЗп гей АЗп Ттиг ма! Тег гей 65 70 75 80
Гуз Мет Тийг бек Гей Тийг Аїа Аїа А5р тТиг Аїа тийг о туг РНе су АїЇа 85 90 95
Аг А5р Ні Рго Тйг оТуг сіу мет А5р ем Тгр су Рго сІу ТЕг гГеи 100 105 110 ма! тик ма! 5ег 5ег 115 «2105» 2 «2115» 118 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005» 2 сіп сій сіп ге сій сій б5ег сіу сіу сіу Ге ма! тйг Рго сІу СсС1У 1 5 10 15 зег Гей ТийгоГеи Тйг о Суз Тийг АТа б5екг сіу Ре Тйг ІЇе 5ег тТиг туг 20 25 30
Ні меж 5ег Тгр ма! Агуд сіп Аїа Рго сІу Гуз ОЇУу Геи сЇіи Тер Іе 35 40 45 сіу б5ег ІчІІе туг Аїа сіу б5ег сіу бек Тийг туг туг АЇа 5ег Тгр ма! 50 55 60
АЗзп сіу Агу Ре Тйг о ІЇе бек 5ег д5п ТИг о Тийг о сіп АЗп Тс ма! 5ег 65 70 75 80
Гей сіп Мес А5п б5ег о їеи Тийг омаї Аїа Азр Ттйг АТа тйг о туг РПе су 85 90 95
АТа Агд А5р Ні Рго бег Туг соІу Мет А5р гей Тгр су Рго сІу тпг 100 105 110
Ге ма! Тиг ма! 5ег 5ег 115 «210» З «2115 125 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005» З сіп сій сіп ге Гу5 сій 5ег сіу сіу сіу Ге маї сіп Рго сіу су 1 5 10 15 5зег їеи Гуз Ге 5ег Суз Гуз АЇїа б5ег сіу Ре А5Зр Ге 5ег А5Зп туг 20 25 30 с1у ма! 5ег Тгр ма! Агд сіп АїЇа Рго с1у Гуз с1іу гГеи сЇи Тер Пе
35 40 45 сіу туг ІчІІе Ад5р Рго ТИйг о РПе Азр Туг Тиг о тТуг туг АЇа 5ег Тгр ма! 50 55 60
АЗзп сіу Агу Ре 5ег ІЇе б5ег Агуд сі Аб5п Тийг о сіп АЗп Тс маї 5ег 65 70 75 80
Гей сіп ІЇе А5п 5ег о їеи ТИг о РгГо АЇа Азр Тйг АТа тйг отуг РВе су 85 90 95
АТїа Агд тгр ма! туг сіу ма! А5р д5р Туг с1у А5р оту А5п Тер гей 100 105 110
А5зр'їєеи Тгр сіу сіп сіу Ттийг о Ге ма! Тиг ІЇе 5ег 5ег 115 120 125 «210» 4 «2115 117 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «400» 4 сп сої сіп Ге сі сій б5ег сіу сіу Агд Гей Ма! тТйг Рго сіу тНг 1 5 10 15
Рго Ге ТийгогГеи Тиг о Суз Тиг о АЇїа 5ег сіу Ре Ре Ге 5ег 5ег туг 20 25 30
Зо туг ма! 5ег Тгр ма! Агу сп АїЇа Рго сіу Гуз сІу гГеи сЇи Тгр Пе сСІУ АїЇа ІІе сіу Ттийг сіу сІу 5ег АЇа туг туг АЇа 5ег Тер АїЇа Гуз 35 50 55 60 зег Агд б5ег Тийг о ІЇе ТИйг Агуд Ап Тйг о АбЗп гей б5ег Тиг ма! тег геи 65 70 75 80 40 Гуз Мет Тийг бек Гей Тийг Аїа Аїа А5р тТиг Аїа тийг о туг РНе су АїЇа 85 90 95
Аг А5р Ні РгО Аб5п о Туг сіу Мет А5р Геи Тгр су Рго сІу ТЕг гГеи 100 105 110 45 ма! тик ма! 5ег 5ег 115 «2105». 5 «2115» 113 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «А005 5 сіп 5ег гей сіи сій 5ег сІу сіу сіу Гей ма! сіп Рго сІу сіи 5ег 1 5 10 15
Гей Ттийг огГеи Тк о сСуз Тийг Ма! бек с1у РМНе 5ег їеи 5ег Агд А5п су 20 25 30 мес тиг тер маї Агу сіп Аїа Рго сТу Гуз сС1у гГеи сЇи Ттгтр Пе сту 35 40 45 че ІІе тийг 5ег 5ег сіу Азр Гуз Туг Ттуг АЇа тиг Тер АїЇа Гуз сі1у 50 55 60
Агуд Ре тТиг ІЇе 5ег губ ТИг о 5ег бек Типг о тиг ма! А5р геи уз мет 65 70 75 80
Тк об5ег огеи Тис о тйг си АЗр тс Аїа тс о туг Рве суз АїЇа Аг с1уУ 85 90 95
Тиг ма! бек б5ег А5р Іч1Їе Тгр сіу Рго сіу Тийг Ге ма! тик Пе 5ег 100 105 110 зег «2105» 6 «2115 115 «2125 РКЕТ «2135 ОгустоІадиз сипісци!и5 «А00» 6 сп сім сіп гей Гуз сіи 5ег сіу Агд су Геи ма! сіп Рго сТу сІу з30 1 5 10 15 5ег їеи Гуз Ге 5ег Су5 Гуз АЇа 5ег с1у Ре А5р Ре 5ег су Тгр 20 25 30
Туг мес тиг Тер маї Агу сіп Аїа Рго сіу Гуз сІЇу гГеи сіЇи Тер Пе 35 40 45 с1у тйг Іїе сіу тийг о тиг огуз с1іу Агу тиг тус туг Аїа 5ег Тгр маї 50 55 60
АЗзп сіу Агу Ре Тийг ІЇе бег 5ег д5п АЇа сіп А5п тиг ма! д5р геи 65 70 75 80 сіп Мет А5п 5ег ге Тийг АЇїа Аїа А5р Аг АЇїа тийг о туг Ріе су маї 85 90 95
Агд сіу 5ег А5р Туг Ре Ар Ге Тгр сІіу Рго сЇу тиг Геи ма! тиг 100 105 110
ІІе 5ег 5ег 115 «2105 7 «2115 120 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 7 сп сій сіп гей ма!ї сіи 5ег сіу с1у Агд Геи ма! тис Рго ОсТу Сс1У 1 5 10 15 5ег Гей Тийг о Гей Тийг о Суз Тк АТа 5ег сіу Ре 5ег Геу 5ег 5ег туг 20 25 30 туг мес су Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу Гуз сІу гГеи сЇи Тгр Пе 35 40 45 сіу тйг ІІе туг сІіу сіу б5ег сіу 5ег Тиг Тер туг АЇа 5ег Тгр ма! 50 55 60
Гуз с1у Агуд Рпе тТийг ІЇе 5ег уз Тиг 5ег Тиг Аїа ма! А5р гГеи Гуз 65 70 75 80
ІІе тийг об5ег ге Тис тис си А5р Тс Аїа тготуг РВе сСу5 Аїа Ага 85 90 95 5зег о Туг Рго соЇу Тер Тк Тиск си Рго Туг Ре А5р ІЇе Тегр сІу РгО 100 105 110 сіу тйг Ге ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 «210» 8 «2115 121 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5
Зо «А00» 8 сіп б5ег ма! сій сій б5ег сіу сіу Агд Ге ма! Тийг о Рго су тНг Рго 1 5 10 15
Гей Ттийг огГеи Ттипг сСуз ТИг Аа бек су ІЇе д5р Геи 5ег Аго туг АїЇа 20 25 30 ма! Азп тгр ма! Агд сіп Аїа Рго сІу Гуз су Гей сЇи Тер те с1у 35 40 45 ма! ІчІІе 5ег сіу 5ег сІіу тйг тиг туг туг Аїа 5ег Ттгр АЇа Гуз су 50 55 60
Агд Ре ТиПг ІЇе бек губ ТиИг об5ег Тис о Ттийг ма! д5р геи уз Іе тНг 65 70 75 80 5зег о Рго Тийг о тТийг осі Азр Тс АТа тс тус Ре суз АїТа Агд су тгр 85 90 95
АТїа тиПг Ар сіу ч1іе РПе д5р Туг Азр АЗр ТИйг Ре Ап Геи Тгр су 100 105 110
Рго сіу Тийг Ге ма! тис маї 5ег 5ег 115 120 «2105» 9 «2115 115
«2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «А00» 9 сп сій сіп гей ма!ї сіи 5ег сіу с1у Агд Геи ма! тис Рго ОсТу Сс1У 1 5 10 15 зег Гей Тийг оГеи Ттийг о Суз АЇїа АЇїа б5екг сІіу Ре 5ег Рго 5ег 5ег Туг 20 25 30
Тер Ме 5ег Тгр ма! Агу сп АїЇа Рго сіу Гуз сІу гГеи сЇи Тгр Пе 35 40 45 су Аїа ІІе туг маї Азр 5ег сіу 5ег АЇа туг туг АЇа 5ег Тгр АїЇа 50 55 60
Гуз 5ег Агуд Рпе Тийг ІЇе б5ег їу5 ТиПг 5ег о б5ег Тиг о Ттиг маї А5р гГеи 65 70 75 80
Гуз Мет Тиг об5ег гей Тийг о тиг сій А5р Тс АЇїа ч11е тТуг Ріе су АїЇа 85 90 95
Аг А5р с1у Тер сіу бек Азр ма! Тер сІіу Рго сЇу тНг Геи ма! тиг 100 105 110
ІІе 5ег 5ег 115 «2105» 10 «2115 113 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 10 сп 5ег їеи сій сій б5ег сіу сіу Агд Ге ма! Тийг о Рго су тНг Рго 1 5 10 15
Гей Ттийгогеи Тк о Суз Тийг Ома! бек с1у Ре 5ег їеи бег 5ег Туг туг 20 25 30
Ме 5ег Тгр ма! Агу сіп АїЇа Рго сТу Гуз сС1у гГеи сЇи Ттгтр Пе сту 35 40 45
Тиг о ІІе б5ег б5ег о б5ег сіу 5ег Тиг о Туг туг АТа 5ег Тер маї Гуз с1у 60
Аг Рпе тТийг о ІЇе б5ег їу5 ТИг о5ег о Тийг о тийг ма! А5р Ге Гуз Мет тпг 50 65 70 75 80 зег Гей Тийг о тийг сій Азр Тс АТа тис тус РБе су АїТа Аг А5р геи 85 90 95 55 А5зр Ттуг А5р Мет А5р Гей Тгр сіу Рго сіу тТийг Ге ма! тик ма! 5ег 100 105 110 зег
«2105 11 «2115 117 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 11 сіп сії сіп ге сій сій бег сіу сіу Агд Гей Ма! тТйг Рго сіу тНг 1 5 10 15
Рго Ге ТийгогГеи Тиг о Су5 Тиг о АЇїа 5ег сіу Ре 5ег Ге б5ег А5Зп туг 20 25 30 туг Мет 5ег Тгр ма! Агу сп АїЇа Рго сіу Гуз сІу гГеи сіи туг Пе 35 40 45 сіу ч1іе ІІе 5ег 5ег 5ег сІіу 5ег Тиг Ттуг туг АТа 5ег Тер АїЇа Гуз 50 55 60
О1Уу Аг Рпе Тис о ІЇе б5ег Гуз ТИг о5ег б5ег ТИг о тиг ма! А5р гГеи Гуз 65 70 75 80
ІІе тийгоб5ег о Рго Тис о тТйг оси А5р Тс Аїа тг отуг РВе сСу5 Аїа Ага 85 90 95
Ге туг ма! 5ег А5Зр 5ег Тг АїЇа Ап гей Тгр сС1у Рго сІіу тег Гей 100 105 110
Зо ма! тик ма! 5ег 5ег 115 «2105 12 «2115» 114 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 12 сп 5ег їеи сій сій б5ег сіу сіу Агд Ге ма! Тийг о Рго су тНг Рго 1 5 10 15
Гей ТтйгоГеи тиг оСуз Тис ома! бек сіу Ре 5ег Гей 5ег б5ег Туг тТгр 20 25 30
Ме 5ег Тгр ма! Агу сіп АїЇа Рго сТу Гуз сС1у гГеи сЇи Ттгтр Пе сту 35 40 45
Аїа ІІе туг сіу 5ег с1у Азп Тиг Туг Ттуг АТа 5ег Тер АїЇа Гуз О1У 50 55 60
Аг Рпе тТийг ІЇе б5ег їу5 ТИг о5ег о Тийг о тиг ма! А5Зр геи Гуз ІІе тпг 65 70 75 80 5зег о Рго Тийг о тТийг осі Азр Тс АТа тс тус Ре су АїТа Аг А5р ма! 85 90 95
Ні б5ег Тийг АЇїа Ттйг А5Зрогеи Тер сіу Рго сіу Тйг Гей ма! тк Пе 100 105 110 зег 5ег «2105» 13 «2115 115 «2125 РКЕТ «2135 ОгустоІЇадиз сипіси!и5 «4005» 13 сп 5ег їеи сій сій б5ег сіу сіу Агд Ге ма! Тийг о Рго су тНг Рго 1 5 10 15
Гей ТтйгоГеи тТйг оСуз Тйг АТа б5ег сіу Ре 5ег Гей 5ег А5р Туг туг 20 Меє 5ег Тгр ма! Агуд сіп Аїа Рго сіу сіи су Гей сіи Тер ІЇе Ос1У
Тиг тІе тукг сІу сіу 5ег с1у А5Зп Тиг Тгр туг АЇїа тиг тгр Аїа Гуз 60 25
О1Уу Аг Рпе Тис о ІЇе б5ег Гуз ТИг о5ег о тТиг о тиг ма! Азр Геи Гуз Пе 65 70 75 80
Тк обег оРго Тйг Тс сій АЗр Тс Аїа тс отуг РВе су5 АїЇа Аг А5р 30 85 90 95
Рпе сіу Гей 5ег ТИг сіу сІу Гей Тер сіу Рго сіу тТйг Гей ма! тНг 100 105 110 35 ІІе 5ег 5ег 115 «2105» 14 «2115 107 40 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «400» 14 45 5зег Ттуг сої Ге Тйг о сіп гей Рго 5ег ма! 5ег ма! 5ег Геи су сіп 1 5 10 15
Тк АТа Аг ІІе тик сСу5з си сіу Ап Ап ІЇе сІу 5ег Гуз АїЇа маї 20 25 30 50
Ні5 Тер туг сіп сіп Гу5 Рго су Гей АїЇа Рго сСіу Гей їеи ІЇе туг 35 40 45
А5р Ар Ар сЇи Агу Рго бег сіу ма! Рго А5зр Агу Ре 5ег су 5ег 55 50 55 60
Азп б5ег сіу Азр Тйг АЇїа тйг Гей тйг Пе 5ег с1у АїЇа сіп АїЇа сіу 65 70 75 80
Азр сій Аїа Азр Туг Туг Суз сіп ма! Тер Азр 5ег 5ег АЇа тТтуг ма! 85 90 95
Ре сіу сіу сіу тйг сіп Ге Тк ма! тиг с1у 100 105 «2105» 15 «2115 109 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «400» 15 5зег Ттуг сої Ге Тйг о сіп гей Рго 5ег ма! 5ег ма! 5ег Геи су сіп 1 5 10 15
Тк АТа Аг ІІїе тик сСуз су сіу Азп 5ег ІЇІе сІу 5ег Гуз АїЇа маї 20
Азп Тер Ттуг сіп сіп Гу5 Рго су Гей АЇа Рго сіу Гей їеи ІЇе туг
А5р Ар Ар сЇи Агу Рго бег сЇу ма! Рго Азр Агу Ре 5ег АїЇа 5ег 25 50 55 60
Азп б5ег сіу Азр Тйг АЇїа тйг Гей тйг Пе 5ег Сс1у АїЇа сіп АїЇа сіим 65 70 75 80 30 А5р сій Аїа А5р туго туг Суб сіп Гей Тер А5Зр 5ег 5ег АїЇа ма! Аїа 85 90 95 туг ма! Ре сІу сіу сіу тйг сіп Гей тйг ма! тик с1Уу 100 105 35 «2105» 16 «2115 112 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 40 «400» 16 сіп Ре маїЇ ге тТиг о сіп 5ег Рго 5ег Ма! 5ег АЇа АЇа гей сІу АїЇа 1 5 10 15 45 5зег АЇа Гуз Гей Тиг о Суз ТИг оГеи б5ег о б5ег АЇа Ні Гуз Тиг о туг тег 20 25 30 че А5р Тгр туг сіп сп сп сіп сіу сій АТа Рго Агдуд Ттуг Геи мет 35 40 45 сій Ге Гуз 5ег Ар сіу б5ег Туг ТИйг Гуз сіу Тиг сіу ма!ї Рго дор 50 55 60
Агд Ре 5ег сіу 5ег 5ег 5ег с1у Аїа А5р Агуд Туг Ге ІЇе ІЇе Рго 65 70 75 80 5зег ма! сіп АЇїа Ад5р А5р сі Аїа Ар Туг туго Суб с1у ТВг А5р туг
85 90 95 5ег сіу сіу туг ма! Ре сіу сІу сіу Ттйг сіп Гей тис ма! тик сіу 100 105 110 «2105 17 «2115 109 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 17 5зег Ттуг сі Ге Тйг о сіп Ге Рго 5ег ма! 5ег ма! 5ег гей с1у сп 1 5 10 15
Тк АТа Аг ІІїе тик сСуз су сіу Азп 5ег ІЇІе сІу 5ег Гуз АїЇа маї
Азп Тер Ттуг сіп сіп Гуз Рго су Ге Аїа Рго СсІУу Гей Гей ІЇе туг 20 35 40 45
А5р Ар Ар сЇи Агу Рго бег сіу ма! Рго А5зр Агу Ре 5ег су 5ег 50 55 60 25 А5зп бег с1у А5р ТПг Аїа тиг Ге тиг ІЇе 5екг с1у АїЇа сіп АїЇа с1У 65 70 75 80
Азр сі АЇїа Азр Туг Туг Суз сіп Гей Тер Азр 5ег 5ег Ттиг с1у АїЇа 85 90 95
Зо туг АТа Ре сІу сіу сіу тйг сіп Ге тТйг омаї тйг с1у 100 105 «2105» 18 «2115» 112 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «400» 18 сій Ге маї ге Ттийг о сіп Тиг о Рго 5ег Рго ма! 5ег АЇа АЇа ма! с1У 1 5 10 15 сіу тйг ма! тйг о ІТе Ап Суб сіп АЇа 5ег сіп 5ег ма! Туг сС1УуУ А5П 20 25 30
А5зп сЇи Ге АїЇа Тер Ттуг сіп сіп Гу5 Рго сіу сіп Рго Рго Гуз Ге 35 40 45
Ге ІІе туг Агд Аїа 5ег ІІе Гей Тс бег сіу ма! Рго 5ег Аг РПе 50 55 60
Гуз сіу 5ег сіу б5ег сіу Ттийг о сіп Ре тийг о їеи Тиг ІЇе 5ег А5п маї 65 70 75 80 сп Аг сій А5р Аїа діа тТйг отує туг Суз Ге сіу сіу туг ма! 5ег 85 90 95 сп 5ег Ттуг Агуд Аїа Аїа Ре сіу сІу сІу тйг сіи гей сЇи Іе Ге 100 105 110 «210» 19 «211» 109 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «400» 19 5зег Туг сі Ге Тйг о сіп Ге Рго 5ег ма! 5ег ма! 5ег їеи сІ1у сіп 1 5 10 15
Тк АТа Аг ІІїе тик сСуз су сіу Азп 5ег ІЇІе сІу 5ег Гуз АїЇа маї
Азп Тер Ттуг сіп сіп Гу5 Рго су Гей АЇа Рго сіу Гей їеи ІЇе туг 20 А5р А5р др с1и Агуд Рго б5ег сіу ма! Рго Аїа Аг Ре 5ег су 5ег 60
Азп б5ег сіу Азр Тйг АЇїа тйг Гей тйг Пе 5ег с1у АїЇа сіп АїЇа сіу 65 70 75 80 25
Азр сім АЇїа Азр Туг Туг Суз сіп Гей Тер Азр 5ег 5ег АЇа сіу АїЇа 85 90 95 туг ма! Ре сІу сіу сіу тйг сіп Гей тйг ма! тик с1Уу 30 100 105 «2105» 20 «2115 111 «2125 РКЕТ 35 «2135 ОгустоІЇадиз сипісци!и5 «4005» 20 сіп Ре маїЇ ге тТиг о сіп Рго сіп 5ег ма!ї 5ег с1у 5ег Гей су сп 44 1 5 10 15
Тк ма! б5ег ІЇе бек су5з АЗзп Агу Ар бег О1у А5Зп ІЇе си А5р туг 20 25 30 45 Туг ма! ніх Тер Тукг сіп сіп ніх Рго сіу Гуз АЇїа Рго Тийг ТЕг ма! 35 40 45
ІІе туг А5п дор А5р о сіп Агу Рго бег сіу ма! Рго А5р Агдуд Ре 5ег 50 55 60 50 сіу 5ег ІІе А5р б5ег ТИг о б5ег Ап 5ег АЇа 5ег Гей Тйг ІІе тЕйг с1Уу 65 70 75 80 ей Ге АЇїа сі А5зр сі Аїа Азр Туг Туг Суз Гей 5ег 5ег А5р 5ег 55 85 90 95 5зег АЇа туг ма! Ре сіу сіу сіу тйг сіп Гей Ттйг о маї тйг сі1у 100 105 110 бо
«210» 21 «2115 107 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5х сипіси1и5 «400» 21 5зег Туг сі Ге Тйг о сіп Ге Рго 5ег ма! 5ег ма! 5ег їеи сІ1у сіп 1 5 10 15
Тк АТа Аг ІІе тик сСуз су сіу Азр 5ег ІЇе сіи 5ег Гуз АїЇа маї 20 25 30
Ні Тер туг соЇп сіп Гуз Рго оЇу Ге АЇїа Рго сЇУу Ге Геи ма! туг 35 40 45
А5п Ар Ар сЇи Агу Рго бег сіу ма! Рго Азр Агу Ре 5ег су 5ег 50 55 60
Азп б5ег сіу Азр Тйг АЇїа тйг Гей тйг Пе 5ег с1у АїЇа сіп АїЇа сіу 65 70 75 80
Азр сій Аїа Азр Туг Туг Суз сіп Гей Тер Азр сіу 5ег АЇа тТтуг ма! 85 90 95
Рпе сіу сіу сіу Ттйг сіп Гей тис ма! тик с1у 100 105
Зо «2105» 22 «2115 109 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005» 22 5зег Ттуг сі Ге Тйг о сіп Ге Рго 5ег ма! 5ег ма! 5ег гей с1у сп 1 5 10 15
Тс Аїа Ага ІІе тик сСу5 су с1іу А5зп б5ег ІЇе сІу 5ег Гуз АїЇа ма! 20 25 30
Ні5 Тер туг сіп сіп губ Рго су Гей АїЇа Рго СсІу Гей Гей ІЇе туг 35 40 45
А5р Ар Ар сЇи Агу Рго бег сіу ма! Рго А5зр Агу Ре 5ег су 5ег 60
Азп б5ег сіу Азр Тйг АЇїа тйг Гей тйг Пе 5ег С1уУ АїЇа сіп Аїа Сс1У 50 65 70 75 80
Азр сім АЇїа Азр Туг Туг Суз сіп Гей Тер Азр 5ег 5ег АЇа сіу АїЇа 85 90 95 55 Туг ма! Рпе сіу сіу сіу тТийг о сіп Ге Тк ма! тиг с1у 100 105 «2105» 23
«2115 107 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005» 23 5зег Туг сі Ге Тйг о сіп Ге Рго 5ег ма! 5ег ма! 5ег їеи сІ1у сіп 1 5 10 15
Тс Аїа Ага ІІе тик сСу5 су с1у А5зп 5ег ІЇе сІу 5ег Гуз Аїа ма! 20 25 30
Ні5 Тер туг сіп сіп Гу5 Рго су Гей АїЇа Рго сСіу Гей їеи ІЇе туг 35 40 45
А5п Ар Ар сЇи Агу Рго бег сіу ма! Рго Азр Агу Ре 5ег су 5ег 50 55 60
Азп б5ег сіу Азр Тйг АЇїа тйг Гей тйг Пе 5ег с1у АїЇа сіп АїЇа сіу 65 70 75 80
Азр сім Аїа Азр Туг Туг Суз сп Гей Тер Аз5р А5ЗпП А5п АЇа Аїа ма! 85 90 95
Ре сіу сіу сіу тйг сіп Ге Тк ма! тиг с1у 100 105 «2105» 24 «2115 110
Зо «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005» 24
А5р ІчІЇе ма!їЇ Геи Тиск о сіп Тиг о РгОо б5ег 5ег Тиг 5ег АЇа АЇа ма! с1Уу 1 5 10 15 сіу тйг ма! тйг ІІе Гуз Су5 сіп АЇїа 5екг сіп 5ег ІЇе Азр 5ег тТуг 20 25 30
Гей АЇїа Тер туг сіп сіп Гу5 Рго сіу сіп Рго Рго Гуз Гей їГеи Пе 35 40 45 тукг о1у Аїа 5ег А5п Ге АЇїа б5ег сіу ма! Рго 5ег Агуд Ре 5ег су 60 зег Агуд б5ег со1у Ттйг сіи Ттукг Іїе Ге Тйг ІЇе 5ег су ма! сіп Агд 65 70 75 80 50 сій Азр АЇїа АЇа Ттйг отуг туг Суз Гей сіу сіу туг Рго А5п Туг РПе 85 90 95
Ні Агуд Тг АТа Ре сіу сіу сЇу тйг Гуз Гей си Іе Гуз 100 105 110 55 «2105» 25 «2115 109 «2125 РКЕТ
«2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005» 25 5ег Туг соЇи Ге Тйг о сіп Гей Рго 5ег ма! 5ег ма! 5ег Геи су сіп 1 5 10 15
Тк АТа Аг ІІе тик сСуз су сІіу Ап Ап ІЇе сІу 5ег Гуз АїЇа маї 20 25 30
Азп Тер Ттуг сіп сіп Гу5 Рго су Гей АЇа Рго сіу Гей їеи ІЇе туг 35 40 45
А5п Ар Ар сЇи Агу Рго бег сіу ма! Рго Азр Агу Ре 5ег су 5ег 50 55 60
Азп б5ег сіу Азр Тйг АЇїа тйг Гей тйг Пе 5ег с1у АїЇа сіп АїЇа сіу 65 70 75 80
А5зр сій Аїа А5р Туг туг сСу5 сіп Гей Тер А5Зр 5ег 5ег АїЇа сіу Аїа 85 90 95 туг ма! Ре сІу сіу сіу тйг сіп Гей тйг ма! тик с1Уу 100 105 «210» 26 «2115 109 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5
Зо «400» 26 5зег Ттуг сі Ге Тйг о сіп Ге Рго 5ег ма! 5ег ма! 5ег гей с1у сіп 1 5 10 15
Тк АТа Аг ІІїе тик сСуз су сіу Азп 5ег ІЇІе сІу 5ег Гуз АїЇа маї 20 25 30
Азп Тер Ттуг сіп сіп губ Рго сІЇу Ге АЇа Рго СсІУу Гей Гей ІЇе туг 35 40 45
А5р Ар Ар сЇи Агу Рго бег сіу ма! Рго А5зр Агу Ре 5ег су 5ег 50 55 60
А5зп б5ег с1у А5р ТПг Аїа тиг Ге тиг ІЇе 5екг Ос1у АЇа сіп АїЇа с1У 65 70 75 80
Азр сій АТа А5р Ттуг Туг Су5з оп Геи Тер Азр 5ег 5ег АїЇа Агд АїЇа 85 90 95
Рпе ма! Ре сіу сіу сіу Ттйг сіп Гей тис ма! тик с1у 100 105 «2105 27 «2115 5 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5
«4005 27 зег Туг туг мет 5ег 1 5 «210» 28 «2115 16 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «400» 28
АЇа Іїе сіу ІЇе 5ег СсІу А5п АЇїа туг туг АЇа 5ег Тгр АЇа Гуз 5ег 1 5 10 15 «2105» 29 «2115 9 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «А00» 29
Азр Ніб Рго Тийг Туг сІу мет д5р 'гГеи 1 5 «2105» 30 «2115 5 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5
Зо «4005 30
ТВг отукг Ні Мет 5ег 1 5 «210» 31 «2115 17 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «400» 31 5ег ІІе туг АїЇа сіу б5ег сіу б5ег Тийг о Туг туг АЇТа 5ег Тгр маї д5п 1 5 10 15 «у «2105» 32 «2115 9 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005» 32
Азр Ні Рго 5ег Туг сІу мет д5р 'геи 1 5
«2105 33 «2115 5 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 33
Азп туг сіу ма! 5ег 1 5 «2105» 34 «2115 17 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «А00» 34 тукг пІІе А5р Рго ТИйг Ре Азр Туг Тиг о туг туг Аїа 5ег Тгр маї А5Пп 1 5 10 15 «у «2105 35 «2115 16 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 35
Зо
Тер ма! туг сІу маїЇ дор Азр Туг су А5зр су Ап Тер гГеи Аз5ргеи 1 5 10 15 «2105» 36 «2115 5 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 36 5ег Туг Ттуг маї 5ег 1 5 «2105» 37 «2115 16 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005» 37
Аїа Іїе сіу тик сіу сІіу 5ег АЇїа туг туг АїЇа 5ег Тгр АЇа Гуз 5ег 1 5 10 15 «2105» 38 «2115 9 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5
«4005 38
Азр Ні Рго Азп Туг сіу мет д5р 'геи 1 5 «2105» 39 «2115 5 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 39
Аг Азп с1у мет тег 1 5 «2105» 40 «2115 16 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «400» 40 че ІІе тийг 5ег 5ег сіу Азр Гуз Туг Ттуг АЇа тиг Тер АїЇа Гуз сі1у 1 5 10 15 «210» 41 «2115 7 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5
Зо «400» 41 сіу тиг ма! 5ег 5ег Ар Пе 1 5 «2105» 42 «2115 5 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005» 42 сіу Тер туг мет тНг 1 5 «2105» 43 «2115 17 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «400» 43
Тк о ІТе сіу тйг тик Гуз о1у Агуд Тйг о туго туг Аїа 5ег Тгр маї Ап 1 5 10 15 «у
«2105» 44 «2115 7 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005» 44 сіу 5ег А5Зр Туг Ре А5р Геи 1 5 «2105» 45 «2115 5 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «А00» 45 5зег Ттуг туг Меє сіу 1 5 «2105» 46 «2115 17 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «А00» 46
Тиг о тІІе туг сІу сіу 5ег сіу 5ег Тиг Тгр туг АЇїа 5ег Тгр маї Гуз 1 5 10 15
Зо «у «2105» 47 «2115 13 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «400» 47 5ег Туг Рго сіу Тер Тийг тс си Рго Туг Ре А5р ІїЇе 1 5 10 «210» 48 «2115 5 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «400» 48
Агд туг Аа маї дп 1 5 «210» 49 «2115 16 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипісиш1и5
«400» 49 ма! ІчІІе 5ег сіу 5ег сІіу тйг тиг туг туг Аїа 5ег Ттгр АЇа Гуз су 1 5 10 15 «2105 50 «2115 16 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 150 сіу Тер АТа тйг А5р о сіу ч1Їе Ре А5р Туг Азр Азр ТИг РБе А5бП гей 1 5 10 15 «210» 51 «2115 5 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «400» 51 зег Туг тгр Мет 5ег 1 5 «2105 ч1352 «2115 17 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5
Зо «А005» 52
АІїа ІІе туг маїЇ А5р 5ег сіу 5ег АЇа туг туг АЇа 5ег Тгр АїЇа Гуз 1 5 10 15 зег «2105 53 «2115 7 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 53
Азр сіу Тгр сіу 5ег дор маї 1 5 «2105» 54 «2115 5 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «А00» 54 зег Туг туг мет 5ег 1 5
«2105 55 «2115 16 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 155
Тиг о ІІе б5ег б5ег о б5ег сіу 5ег Тиг о Туг туг АТа 5ег Тер маї Гуз с1у 1 5 10 15 «2105 56 «2115 10 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 156
Ге туг ма! 5ег А5Зр 5ег Тг АїЇа Абп ге 1 5 10 «2105 57 «2115 5 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «400» 57
АЗзп Туг туг Мет 5ег 1 5
Зо «2105. 58 «2115 16 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 58
ІІе ІІе 5ег 5ег 5ег сіу 5ег Тиг Ттуг туг АЇа 5ег Тгр АїЇа Гуз сіІу 1 5 10 15 «2105» 59 «2115 10 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 159
Ге туг ма! 5ег А5Зр 5ег Тг АїЇа Абп ге 1 5 10 «210» 60 «2115 5 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 60 зег Туг тгр Мет 5ег
1 5 «210» 61 «2115 16 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «400» 61
Аїа ІЇе туг сіу 5ег с1у Азп Тиг Туг Ттуг АТа 5ег Тер АїЇа Гуз О1У 1 5 10 15 «2105» 62 «2115 9 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «400» 62
Азр ма! нНі5 5ег ТИйг Аїа тпг А5р гГеи 1 5 «2105» 63 «2115 5 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 63
Зо Азр Туг ТтТуг мМмеє 5ег 1 5 «2105» 64 «2115 17 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «А00» 64
Тс ІІе туг сІу сіу 5ег су А5п Тийг Тгр туг АЇїа тиг тгр Аїа Гуз 1 5 10 15 с1у «2105» 65 «2115 9 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 65
Азр Ре СсСІіу Гей 5ег ТтИг сіу СТУ Геи 1 5 «210» 66 «2115 11 «2125 РКЕТ
«2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 66 соми сіу А5п Абп ІЇе сіу бек Гуз АЇа ма! нів 1 5 10 «2105» 67 «2115 7 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «400» 67
А5р А5р А5р си Агу РгОо 5ег 1 5 «2105» 68 «2115 9 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 68 сп ма! тер А5р 5ег 5ег АїЇа туг маї 1 5 «2105» 69 «2115 11
Зо «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 69 сіу с1у А5п 5ег ІЇе сіу 5ег Гуз АЇа ма! А5п 1 5 10 «2105 70 «2115 7 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 70
А5р А5р А5р сім Агу Рго 5ег 1 5 «2105 71 «2115 11 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 7/1 сп 'їеи Тер А5Зр 5ег 5ег АїЇа ма! Аїа тТтуг ма! 1 5 10 «2105 72
«2115 12 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 72
ТИг Ге б5ег о б5ег АЇа Ні Гуз Тйг о тТуг тТйг Пе А5р 1 5 10 «2105 73 «2115 11 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 73
Гей Гуз 5ег Ар сіу б5ег Туг ТиПг Гуз су тег 1 5 10 «2105 74 «2115 9 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 74 с1іу Тйг о А5р туг б5ег сіу су туг ма! 1 5 «2105 (75 «2115 11 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 75 сіу сіу Азп 5ег ІЇе сіу 5ег Гу5 АЇа маїЇ д5п 1 5 10 «2105 76 «2115 7 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «А005» 76
А5р А5р Ар си Агу РгОо 5ег 1 5 «2105 77 «2115 11 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 77 сіп ге Тер А5р 5ег 5ег Тг с1у АЇа туг АїЇа 1 5 10
«2105 78 «2115 13 «2125 РКЕТ «2135 огустоїЇади5 сипісиши5 «4005 78 сіп Аїа б5ег сіп 5ег маї Туг с1у А5п АЗп Ссіи Гей АїЇа 1 5 10 «2105 79 «2115 7 «2125 РКЕТ «2135 ОгустоІЇадиз сипіси!и5 «4005» 79
Аг Аїа 5ег Іїе Геи Тиг 5ег 1 5 «210» 80 «2115 12 «2125 РКЕТ «2135 ОгустоІадиз сипісци!и5 «4005 80
Ге сіу сіу Туг ма! 5ег сіп 5ег туг Аг АїЇа Аїа з30 1 5 10 «2105» 81 «2115 11 «2125 РКЕТ «2135 ОгустоІЇадиз сипісци!и5 «400» 81 сіу сіу Азп 5ег ІЇе сіу 5ег Гу5 АЇа маїЇ Абп 44 1 5 10 «2105» 82 «2115 7 «2125 РКЕТ «2135 ОгустоІЇадиз сипісци!и5 «4005» 82
А5зр Ар дор сій Агду Рго 5ег 1 5 «2105» 83 «2115 11 «2125 РКЕТ «2135 ОгустоІадиз сипісци!и5 «4005 83 сіп Ге Тер А5р 5ег 5ег АїЇа сіу АЇа туг ма! 1 5 10 «2105» 84 «2115 13 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «А00» 84
А5п о Агу АЗр б5ег с1іу Азп ІЇе сім А5р Туг Ттуг ма! нНі5 1 5 10 «2105» 85 «2115 7 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 85
А5п о А5р Ар сп Агд РгОо 5ег 1 5 «210» 86 «2115 9 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 86
Зо
Ге 5ег 5ег А5р 5ег 5ег АїЇа тТтуг ма! 1 5 «2105» 87 «2115 11 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «400» 87 сіу сіу А5зр 5ег ІЇе сіи 5ег Гу5 АЇа маї ні 1 5 10 «2105» 88 «2115 7 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 88
А5п о А5р Ар си Агд РгОо 5ег 1 5 «2105» 89 «2115 9 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5
«4005 89 сіп Геи Тер А5зр су 5ег АїЇа туг ма! 1 5 «2105» 90 «2115 11 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 90 сіу сіу Азп 5ег ІЇе сіу 5ег Гу5 АЇа маї ні 1 5 10 «210» 91 «2115 7 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «400» 91
А5р А5р Ар си Агу РгОо 5ег 1 5 «2105» 92 «2115 11 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5
Зо «А005» 92 сіп Ге Тер А5р 5ег 5ег АїЇа сіу АЇа туг ма! 1 5 10 «2105» 93 «2115 11 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 93 сіу сіу Азп 5ег ІІе сіу 5ег Гу5 АЇа маї ні 1 5 10 «2105» 94 «2115 7 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «А00» 94
А5п о А5р Ар си Агд РгОо 5ег 1 5 «2105 95 «2115 9 «2125 РКЕТ
«2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 95 сп Гей Тер А5Зр доп Ап АїЇа Аа маї 1 5 «2105» 96 «2115 11 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 96 сіп АїЇа 5ег сіп 5ег ІЇе Азр 5ег Туг Геи Аїа 1 5 10 «2105» 97 «2115 7 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «400» 97 «су АїЇа 5ег А5п Геи АїЇа 5ег 1 5 «2105» 98 «2115 12
Зо «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 98
Ге сіу сіу Туг Рго А5зп Туг Ре Ні5 Агд Ттиг Аїа 1 5 10 «2105» 99 «2115 11 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005 99 су с1у А5п Ап ІчІЇе сіу 5ег Гуз АЇа ма! А5п 1 5 10 «2105» 100 «2115 7 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «400» 100
А5пП А5р А5р сім Агу Рго 5ег 1 5 «2105 101
«2115 11 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «400» 101 сіп Ге Тер А5р 5ег 5ег АїЇа сіу АЇа туг ма! 1 5 10 «2105» 102 «2115 11 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «4005» 102 сіу сіу Азп 5ег ІЇе сіу 5ег Гу5 АЇа маїЇ д5п 1 5 10 «2105» 103 «2115 7 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «400» 103
А5р А5р Ар си Агу Рго 5ег 1 5 «210» 104 «2115 11 «2125 РКЕТ «2135 огустоїади5 сипіси1и5 «400» 104 сп Ге Тер Азр 5ег 5ег АЇа Агуд АЇїа РНе маї 1 5 10 «2105» 105 «2115 60 «2125 ОМА «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005» 105 акссстІднтс сасадстдс тодсаастдда дсасастссд сссддддсдс сдссдсссад 60 «210» 106 «2115 60 «2125 ОМА «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність
«400» 106 ссастсдаєс ЕСсСтуддссе сдаадатаєс дЕссаддссс тссаєсттдє ссесстсст 60 «210» 107 «2115 60 «212» ОМА «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «400» 107 дстдддкасс ддсдсдссас састдудастдд асттддадаа ссстдесЕст сдтадстдст 60 «210» 108 «2115 60 «212» ОМА «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «400» 108 дссаддсстса адссадсдає дасдаєдаєд адасдсесЯдатдс састсдаєст сстдддсстс 60 «210» 109 «2115 99 «212» ОМА «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Синтетична послідовність «400» 109 дстдддкасс ддсдсдссас састдудастдд асттддадаа ссстдесЕст сдтадстдст 60 дсаасстддад сасастссдс ссддддсдес дссдсссад 99 «210» 110 «2115 52 «212» ОМА «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «400» 110 сддсстсдад хсадсдатад сдасддтадеі дстссасстє деЕсстстсс т 52 5О0 «2105 111 «2115 99 «212» ОМА «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «400» 111 дстдддкасс ддсдсдссас састдудастдд асттддадаа ссстдесЕст сдтадстдст 60 дсаасстддад сасастссда адсддаддаєє стддаєссд 99 «2105» 112 «2115 52 «212» ОМА «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005» 112 сддсстісдад хсадсдатад сдасддтаде дссссаєсстє дстдстаєст сд 52
«2105» 113 «211» 41 «212» ОМА «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Синтетична послідовність «400» 113 даддаддадс хсасістсад дадсадсада аддадсссда а 41 «210» 114 «2115 60 «212» ОМА «2135» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «400» 114 сдасдддссс тадсддадд стдаададас ддасдасдадда дЕссстддсс сссададдтс 60 «2105» 115 «2115 60 «212» ОМА «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність
«4005» 115 дадаадсета стастстдда сєсІстддсдс стасдддаєсс таєдадстда сасадстдсс 60 «210» 116 «211» 21 «212» ОМА «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «400» 116 ддассасддсї даєссдоддсад с 21
«2105 117 «2115 60 «2125 ОМА «213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005» 117 ддасассддсад сдссассатд дастддастє ддадаассст дЕсеЕстсдта дстдстдсаа 60 «2105 118 «2115 20 «2125 ОМА «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність
«4005 118 дссдстддес адддастсста 20 «2105 119 «2115 20 «2125 ОМА «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 119 саддадссстї дассадсддс 20 «2105» 120 «2115 30 «2125 ОМА «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 120 дасстсдаді сасетассса дадасадада 30
«2105 121 «2115 54 «2125 ОМА «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Синтетична послідовність «4005 121 те ЕсСтсутад стдстдсаас хддадсасас хсссадісдс тададдадес сада 54 «2105 122 «2115 54
«2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 122
Тег оте оте сСуз те о Суз с1іу Тс АТа сіу Суз тпг сІу Суз Ттиг с1у 1 5 10 15 су5з АЇа Аїа Суз ТИг сіу сІу Аїа сіу Суб АЇїа сСу5 АЇа Су5 Тиг су 20 25 30 сСуз сСу5з АЇїа сіу Тк сСу5 сі1у тийг тк сіу с1у Аїа сіу сіу АїЇа с1У 35 40 45
Тиг сСуз Ссуз су сіу сіу 50 «2105 123 «2115 54 «2125 ОМА «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 123 ке ЕсСтсутад стдстдсаас хддадсасас хсссадесує тададдадес сада 54 «2105 124 «2115 36 «2125 РКЕТ «2135» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005» 124 сіу сіу АїТа сіу сіу сіу Су5 сіу Суз сСу5 АЇа сІу сіу сІу сіу с1Уу 1 5 10 15
АїЇа Аїа сіу АЇа Суб Су5 с1у Аїа тк сіу сІ1у сіу Суз Суз Су5з ТНг 20 25 30
Тис су сіу тНг 35 «2105 125 «2115 54 «2125 ОМА «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність
«4005 125 тЕЕстсдсад стдстдсаас туддадсасас тсстсстатд адстдасаса дста 54 «2105 126 «2115 54 «2125 ОМА «2135 Штучна послідовністье «220» «223» Синтетична послідовність «4005 126 тЕЕстсдсад стдстдсаас туддадсасас тсстсстатд адстдасаса дста 54 «2105» 127 «2115 54 «2125 ОМА «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 127 тЕЕстсдсад стдстдсаас туддадсасас сссдадстсд хдстдассса даст 54
«2105 128 «2115 30 «2125 ОМА «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Синтетична послідовність «4005 128 дасстсдаді хтасдаасаєс стдасаддадс 30 «2105 129 «2115 30 «2125 ОМА «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «400» 129 дасстсдаді хаасастстс ссстастдаа 30 «210» 130 «2115 117 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність
«400» 130 сп ма! сіп гей Агуд сій б5ег сіу Рго сІу Геи ма! Гу5 Рго 5ег СсЇи
1 5 10 15
ТИг Се бек гей Тк о Суз Тигома! бек сіу Ре А5зр ІІе 5ег 5ег туг 20 25 30 тукг Мет 5ег Тгр ма! Агду сп Рго Рго сІіу Гуз сІу гГеи сЇи Тгр Пе 35 40 45 сСІУ АїЇа ІІе сіу ІІе 5ег сІ1у А5зп АЇа Ттуг туг АЇа 5ег Тер АїЇа Гуз 50 55 60 зег Агуд ма! тТиг ІЇе б5ег Агуд А5зр ТИг 5ег їу5 АЗп сп РВе 5ег геи 65 70 75 80
Гуз Ге б5ег бек ма! Ттийг Аїа Аїа А5р тТиг АЇїа ма! туг туг суз АїЇа 85 90 95
Аг А5р Ні Рго Тйг оТуг сіу мет А5р ем Тгр су Рго сІу ТЕг гГеи 100 105 110 ма! тик ма! 5ег 5ег 115 «2105 131 «2115» 117 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «2235» Синтетична послідовність «4005 131 сіп ма! сіп ге сіп сій б5ег сіу Рго сіу Ге ма!Ї Гуз Рго 5ег Си 1 5 10 15
ТИг Се бек гей Тийг о Суз Тиг ома! 5ег сіу Ре Азр ІІе 5ег 5ег туг 20 25 30
Туг мех 5ег Тгр маїЇ Агуд сіп Рго Рго сіу Гуз сІЇу Геи сЇи Тегр Пе 35 40 45
СсСІУ АїЇа ІІе сіу ІІе 5ег сІ1у Азп АЇа Ттуг туг АЇа 5ег Тер АїЇа Гуз 50 55 60 зег Агуд ма! тТиг ІЇе б5ег Агуд А5зр ТИг 5ег їу5 АЗп сп РВе 5ег геи 65 70 75 80
Гуз Ге б5ег 5ег ма! Тйг АТа АїЇа А5р тТийг АЇїа ма! туг туг сСуз АїЇа 85 90 95
Аг А5р Ні Рго Тйг оТуг сіу мет А5р ем Тгр су Рго сІу ТЕг гГеи 100 105 110
Ма! тик ма! 5ег 5ег 115 «2105 132
«2115 117 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 132 сіп ма! сіп Ге сіп сій б5ег сіу Рго сіу Ге ма! Гуз Рго 5ег СїЇи 1 5 10 15
ТИг Се бек гей Тийг о Суз Тиг ома! 5ег сіу Ре Азр ІІе 5ег 5ег туг 20 25 30 тукг Мет 5ег Тгр ма! Агду сп Рго Рго сІіу Гуз сІ1у гГеи сіи Тер те 35 40 45
СсСІУ АїЇа ІІе сіу ІІе 5ег сІ1у Азп АЇа Ттуг туг АЇа 5ег Тер АїЇа Гуз 50 55 60 зег Агуд ма! тТиг ІЇе 5ег Агуд А5зр ТИг б5ег уз АЗзп сЇп Ре 5ег гГеи 65 70 75 80
Гуз Ге б5ег бек ма! Ттийг Аїа Аїа А5р тТиг АЇїа ма! туг туг суз АїЇа 85 90 95
Аг А5р Ні Рго Тйг оТуг сіу Мет А5р ем Тер сіу Рго су ТЕИг гГеи 100 105 110
Зо ма! тик ма! 5ег 5ег 115 «210» 133 «2115 117 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «400» 133 сп ма! сіп гей Агуд сій б5ег сіу Рго сІу Геи ма! Гу5 Рго 5ег СсЇи 1 5 10 15
ТИг Се бек гей Тийг о Суз Тиг ома! 5ег сіу Ре Азр ІІе 5ег 5ег туг 20 25 30
Туг мес 5ег Тгр маїЇ Агуд сіп Рго Рго сіу Гуз сІЇу Геи сЇи Тегр Пе 35 40 45
СсСІУ АїЇа ІІе сіу ІІе 5ег сІ1у Азп АЇа Ттуг туг АЇа 5ег Тер АїЇа Гуз 50 55 60 зег Агуд ма! тТиг ІЇе б5ег Агуд А5зр ТИг 5ег їу5 АЗп сп РВе 5ег геи 65 70 75 80
Гуз Ге б5ег 5ег ма! Тйг АТа АїЇа А5р тТийг АЇїа ма! туг туг сСуз АїЇа 85 90 95
Аг А5р Ні Рго Тйг оТуг сіу мет А5р ем Тгр су Рго сІу ТЕг гГеи 100 105 110 ма! тик ма! 5ег 5ег 115 «210» 134 «2115 117 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 134 сіп ма! сіп Ге сіп сій б5ег сіу Рго сіу Гей ма! Гуз Рго 5ег Оси 1 5 10 15
ТИг Се бек гей Тийг о Суз Тиг ома! 5ег сіу Ре Азр ІІе 5ег 5ег туг 20 25 30 тукг Мет 5ег Тгр ма! Агду сп Рго Рго сІу Азп сІу гГеи сЇи Тгр Пе 35 40 45
СсСІУ АїЇа ІІе сіу ІІе 5ег сІ1у Азп АЇа Ттуг туг АЇа 5ег Тер АїЇа Гуз 50 55 60 зег Агуд ма! тТиг ІЇе б5ег Агуд А5зр ТИг 5ег їу5 АЗп сп РВе 5ег геи 65 70 75 80
Гуз Ге б5ег бек ма! Ттийг Аїа Аїа А5р тТиг АЇїа ма! туг туг суз АїЇа 85 90 95
Аг А5р Ні Рго Тйг оТуг сіу мет А5р ем Тгр су Рго сІу ТЕг гГеи 100 105 110 ма! тик ма! 5ег 5ег 115 «2105» 135 «2115» 117 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «400» 135 сіп ма! сіп ге сіп сій б5ег сіу Рго сіу Ге ма!Ї Гуз Рго 5ег Си
Б 1 5 10 15
ТИг Се бек гей Тк о Суз Тиг ома! бек сіу Ре А5р ІІе 5ег 5ег туг 20 25 30 тукг Мет 5ег Тгр ма! Агду сп Рго Рго сІу Азп сІу гГеи сЇи Тгр Пе 35 40 45 о1у Аїа Іїе с1у ІЇїе 5екг сіу АЗзп АЇа Ттуг туг АїЇа 5ег Тгр АїЇа Гуз 50 55 60 зег Агуд ма! тТиг ІЇе б5ег Агуд А5зр ТИг 5ег їу5 АЗп сп РВе 5ег геи 65 70 75 80
Гуз Ге б5ег 5ег ма! Тйг АТа АїЇа А5р тийг АЇїа маї туг туг сСуз АїЇа 85 90 95
Аг А5р Ні Рго Тйг оТуг сіу мет А5р ем Тгр су Рго сІу ТЕг гГеи 100 105 110 ма! тик ма! 5ег 5ег 115 «210» 136 «2115 107 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «400» 136 5зег Ттуг сої Ге Тйг о сіп Рго Ге 5ег ма! 5ег ма! АТа геи су сіп 1 5 10 15
Тк АТа Аг ІІе тик сСу5з си сіу Ап Ап ІЇе сІу 5ег Гуз АїЇа маї 20 25 30
Ні5 Тер туг сіп сіп губ Рго сІу сіп АЇїа Рго ма! Гей ма! ІїЇе туг 35 40 45
Ар А5р Ар сої Агу Рго бег с1Їу ІЇІе Рго сій Агу Ре 5ег сІу 5ег 50 55 60
А5п о бег с1у Азп Тйг Аїа тТийг Ге тйг ІЇе 5ег Агу АїТа сіп АїЇа сі1у 65 70 75 80
А5зр сій Аїа д5р Туг туг Суб сіп ма! Тер А5Зр 5ег 5ег АїЇа туг ма! 85 90 95
Рпе сіу сІіу сіу Тиг Гуз Ге тиг ма! гей сіу 100 105 «2105 137 «2115 107 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність
«4005 137 5зег Ттуг сі Ге Тйг сій Рго Рго 5ег ма! 5ег ма! 5ег Рго сІ1у сіп 1 5 10 15
Тиг АТа чІЇїе те тик сСу5 сіи сіу А5зп А5Зп ІЇе сСІіу 5ег Гуз АїЇа маї 20 25 30
Ні5 Тер туг сіп сіп Гуз Рго сіу Гей 5ег Рго ма! Гей ма! ІЇе туг 35 40 45
Ар А5р Ар сЇи Агу Рго бег с1Їу ІЇІе Рго сій Агу Ре 5ег сІу 5ег 50 55 60
А5зп б5ег с1у А5п Тйг Аїа ТийгоГеи Тс ма! 5ег сіу тйг сіп Азр мет 65 70 75 80
Азр сій Аїа Азр Туг Туг Суз сіп ма! Тер Азр 5ег 5ег АЇа тТтуг ма! 85 90 95
Рпе сіу сІіу сіу Тиг Гуз Ге тиг ма! гей сіу 100 105 «210» 138 «211» 107 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «2235» Синтетична послідовність «400» 138 5зег Ттуг сі Ге Тйг сій Рго Рго 5ег ма! 5ег ма! АїЇа Рго СУ Гуз 1 5 10 15
Тк АТа Аг ІЇе тик сСу5з си сіу А5зп Ап ІЇе сІу 5ег Гуз АїЇа ма! 20 25 30
Ні Тер туг соЇп сіп Гуз Рго сЇу сіп Аїа Рго Ма! Ге ма! те туг 35 40 45
Ар Ар Ар сЇи Агу Рго бег с1у ІІе Рго сій Агу Ре 5ег сІу 5ег 50 55 60
А5п о бег с1у Азп Тйг Аїа Тийг Ге Ттйг ІЇе 5ег Агд ма! сім Аїа сі1у 65 70 75 80
Азр сій АЇїа Ар Туг Туг Суз сіп ма! Тер А5р 5ег 5ег АїЇа тТтуг ма! 85 90 95
Рпе сіу сІіу сіу Тиг Гуз Ге тиг ма! гей сіу 100 105 «210» 139 «2115 107 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність
«223» Синтетична послідовність «400» 139 5зег Ттуг сі Ге Тйг сій Рго Рго 5ег ма! 5ег ма! АїЇа Рго СУ Гуз 1 5 10 15
Тс Аїа Ага ІІе тик сСу5 си с1у Ап Ап ІЇе сІу 5ег Гуз Аїа ма! 20 25 30
Ні5 Тер туг сіп сіп губ Рго сІу сіп АЇїа Рго ма! Гей ма! ІїЇе туг 35 40 45
Ар А5р Ар сої Агу Рго бег с1Їу ІЇІе Рго сій Агу Ре 5ег сІу 5ег 50 55 60
А5п о бег с1у Азп Тйг Аїа Тийг Ге Ттйг ІЇе 5ег Агд ма! сім Аїа сі1у 65 70 75 80
Азр сій Аїа Азр Туг Туг Суз сіп ма! Тер Азр 5ег 5ег АЇа тТтуг ма! 85 90 95
Ре сіу сіу сіу тийг Гуз Ге Ттиг маї гГеи с1у 100 105 «2105 140 «2115 107
Зо «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 140 5зег Ттуг сі Ге Тйг сій Рго Рго 5ег ма! 5ег ма! АїЇа Рго СУ Гуз 1 5 10 15
Тк АТа Аг ІІе тик сСу5з си сіу Ап Ап ІЇе сІу 5ег Гуз АїЇа маї 20 25 30
Ні5 Тер туг сіп сіп губ Рго сІу сіп АЇїа Рго ма! Гей ма! ІїЇе туг 35 40 45
Ар А5р Ар сої Агу Рго бег с1Їу ІЇІе Рго сій Агу Ре 5ег сІу 5ег 60 50 А5зп бег с1у А5п ТПг Аїа тиг Ге Тпг ІЇе 5ег Агд ма! си АїЇа с1У 65 70 75 80
Азр сій Аїа Азр Туг Туг Суз сіп ма! Тер Азр 5ег 5ег АЇа тТтуг ма! 85 90 95 55
Рпе сіу сІіу сіу Тиг Гуз Ге тиг ма! гей сіу 100 105
«2105 141 «2115 107 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 141 5зег Туг сі Ге Тйг о сіп Рго Гей 5ег ма! 5ег ма! АїЇа гей с1у сіп 1 5 10 15
Тк АТа Аг ІІе тик сСу5з си сіу Ап Ап ІЇе сІу 5ег Гуз АїЇа маї
Ні5 Тер туг сіп сіп губ Рго сіу Ге АЇїа Рго ма! Гей ма! ІїЇе туг 20 А5р А5р Ар си Агуд Рго 5ег сіу ІЇе Рго сЇи Аг Ре 5ег су 5ег 60
А5п о бег с1у Азп Тйг АЇїа Тийг ге тиг че 5ег Агу АїТа сіп АїЇа сі1у 65 70 75 80 25
Азр сій Аїа Азр Туг Туг Суз сіп ма! Тер Азр 5ег 5ег АЇа тТтуг ма! 85 90 95
Рпе сіу сІіу сіу Ттиг сіп Гей тег маї гей сіу 30 100 105 «2105 142 «2115 5 «2125 РКЕТ 35 «2135» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність 40 «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (33)..(3) «223» Х являє собою будь-який амінокислотний залишок 45 «4005» 142
Ге Рго Хаа 5ег СсС1У 1 5 50 «210» 143 «2115 5 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність 55 «220» «223» Синтетична послідовність «220»
«221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (33)..(3) «223» Х являє собою будь-який амінокислотний залишок «400» 143 ем Рго Хаа АЇа СсС1У 1 5 «2105» 144 «2115 5 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (3)..(3) «223» Х являє собою будь-який амінокислотний залишок «4005 144
Гей Рго Хаа тиг Ос1У 1 5 «2105 145 «2115 5
Зо «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (33)..(3) «223» Х являє собою будь-який амінокислотний залишок «4005 145
Ге Аїа Хаа тйг Сс1У 1 5 «2105 146 «2115 5 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 146
Азп РгГО сіп Тис су 1 5
«2105 147 «2115 4 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (33)..(3) «223» Х являє собою будь-який амінокислотний залишок «4005 147
Ге Рго Хаа тиг 1 «2105 148 «2115» 460 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 148 сій т1Їе сіп ге сіп сіп б5ег сіу Рго маЇ Ге ма!Ї Гуз Рго сІу АїЇа з30 1 5 10 15 5зег ма! Гуз маЇ 5ег Су5 Гуз АЇа 5ег сіу туг АЇїа Ре Ттйг АїЇа туг 20 25 30
А5п ІЇе Ні Тгр маїЇ Агуд сіп 5ег Ні5 сіу Гуз Агд Геи сіи Тер Пе 35 40 45 сіу 5ег Ре А5р Рго Туг А5Зр сіу сіу б5ег 5ег Туг А5Зп сіп Гуз РНе 50 55 60
Гуз А5р Гуз АЇа Тийг гей тТигомаї А5р Гуз 5ег о б5ег Тиг тиг АїЇа туг 65 70 75 80 мес Ні Гей А5Зп б5ег о їеи ТИг о б5ег сі Азр 5ег АЇїа ма! Туг туг су 85 90 95
АТїа Агд сіу тер туг тукг Ре А5р Туг Тегр сіу нНі5 су тйг тег ге 100 105 110
ТАиг ма! 5ег 5ег Аїа б5ег Тиг оГуз сіу Рго 5ег ма! Ре Рго Гей Аїа 115 120 125
Рго 5ег б5ег Гуз 5ег ТИг 5ег сіу сіу ТНПг Аїа АТїа ге сіу сСуз Гей 130 135 140 ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сі Рго Ма! тТиг маїЇ 5ег Тер Азп 5ег Ос1У 145 150 155 160
АТїа гей тТийг о5ег сіу ма! Ні тТиг РМПе Рго АїЇа ма! Гей сіп 5ег 5ег 165 170 175 с1іу їеи туг 5ег Ге б5ег б5ег ма! ма! тис маїЇ Рго 5ег 5ег 5ег гей 180 185 190 сіу тйг сій тс тує ч1Їе Су5 Азп ма! Ап Ніз губ Рго 5ег А5Зп тег 195 200 205
Гуз ма! Азр Гуз Гуз ма! сім Рго Гуз 5ег Суз А5зр Гуз ТИг Ні ТЕГ 210 215 220
Суз Рго Рго Суз Рго АЇа Рго сій Ге Гей сіу сІіу Рго 5ег ма! РНе 225 230 235 240
Гей Ре Рго Рго Гуз Рго Гуз Азр ТИг Ге Мет ІЇе б5ег Агу тТНг РгОо 245 250 255 сіи ма! тийг о сСуз ма! маїЇ ма! Азр ма! 5ек Ні си А5р Рго сім маї 260 265 270
Гуз Ре Азп Тгр Туг ма! Азр сіу ма! сіи ма! Ні5 А5пП АЇа Гуз ТЕГ 275 280 285
Гуз Рго Агд сій сій сбіп Туг Азп б5ег Тиг о туг Агдуд ма! маї 5ег маї 290 295 300
Ге тйг маїЇ ге ні5 сіп А5р Тер Ге Ап сіу Гуз сіи туг Гуз су 305 310 315 320
Зо
Гуз ма! 5ег А5зп Гуз АЇа Гей Рго АЇа Рго ІЇе сій Гуз ТНг ІЇе 5ег 325 330 335
Гуз Аїа Гуз сіу сЇп Рго Агуд сій Рго сіп ма! Туг Тис о Ге Рго РгОо 340 345 350 зег Агд Ар сі Геи Тис о їуз Азп сіп Ма! бег Гей тНг су Геим ма! 355 360 365
Гуз с1у Рпе Туг Рго 5ег А5р ІЇе Аїа ма! сіи Тер сіи 5ег А5Зп су 370 375 380 сій Рго сій Аб5п о АЗп о Туг губ Тс Тс Рго Рго маЇ Геи А5зр 5ег дьр 385 390 395 400 со1у б5ег РПпе РПе Геи Туг 5ег уз Ге Тиг ма! Азр Гуз 5ег Ага Тгр 405 410 415 сіп сіп с1у А5п ма! Ре 5ег Суб5 5ег Ма! мет нНі5 сім АїЇа Геи НІ15 420 425 430
Азп Ні Туг Тйг сіп Гуз б5ег їеи б5ег ей б5ег Рго сіу Гуз Гей Рго 435 440 445 сіи тйг с1у сіу Тер 5ег Ні5 Рго сіп РПе си Гуз 450 455 460 «2105 149
«2115 233 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 149
Ар ма! сіп ІЇе Тпйг сіп 5ег Рго 5ег Туг Геи АЇїа АЇа 5ег Рго Ос1У 1 5 10 15 сіи тис отче тик о ІЇе А5п сСуз Агуд АЇа б5ег Гуз 5ег ІЇе 5ег Гуз Туг 20 25 30
Гей АЇїа Тер туг сіп сіи Гу5 Рго сІіу Гу5 ТИг Ап Гуз Гей їГеи Пе 35 40 45 туг 5ег сіу 5ег Тк Гей сЇп 5ег сіу ІЇе Рго 5ег Агуд Ре Агд с1у 50 55 60 5ег сіу 5ег сіу Тйг А5р Ре Тиг Гей Тиг ІЇе 5ег 5ег їеи си Рго 65 70 75 80 си Азр Ре Аіа Меє Туг туг Су5з сіп сіп Ні5 А5р сім бег Рго Ттуг 85 90 95
Тис Ре сІу сіи сіу тиг Гуз Ге сій ІчІЇе Гуз Агд тиг ма! Аїа Аїа 100 105 110
Зо
Рго 5ег ма! Ре ІІе РПе Рго Рго 5ег А5р сіи сіп Ге Гуз 5ег С1У 115 120 125
Тк АТа 5ег ма! ма! суз Ге Ге А5п АЗп РіПе Туг Рго Аг сіи Аїа 130 135 140
Гуз ма! сіп Тер Гуз маїЇ А5Зр А5п АЇа Гей сіп 5ег сіу Азп 5ег сп 145 150 155 160 сі б5ег ма! тиг сім сіп А5р б5ег Гуз А5р б5ег ТиИг Туг 5ег їеи 5ег 165 170 175 5ег ТИг Ге Тийг Ге б5ег уз АЇа Азр Туг сій Гу5 Ні Гуз ма! туг 180 185 190
АТїа Суб сіи ма! тис о нНі5 сіп сіу Гей б5ег б5ег Рго Ма! Ттиг Гуз 5ег 195 200 205
Рпе А5п Аг сіу сЇи Суз сіу сіу сЇу су 5ег їеи Рго сЇи тНг с1у 210 215 220 сіу Тер 5ег Ні Рго сп Ре си Гуз 225 230 «210» 150 «2115 462 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність
«223» Синтетична послідовність «4005» 150 сп ма! сіп гей сп сіп 5ег сіу АТа сЇи Ге ма! Агуд Рго Ос1у АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! тТиг Ге б5ег сСуз Гуз АЇїа б5ег сіу Туг ТНг РМНе 5ег д5р туг 20 25 30 сіи мет ні5 Тер ма! ІчІЇе сіп тс Рго маї ніх сІу Ге сій Тер Пе 35 40 45 сСІУ АЇїа ІЇе д5р Рго сіи Тйг сіу сіу Тйг АЇїа туг А5Зп сіп Гуз Ре 50 55 60
Гуз сІіу Гуз АЇа ІІе Гей Тиг АЇїа А5р Гуз 5ег 5ег 5ег ТТГ АїЇа туг 65 70 75 80 мес сіи Геи Агдуд б5ег Ге Тйг бек сі А5р 5ег АЇїа ма! Туг туг су 85 90 95
ТПВиг о сіу туг туг А5зр Ттуг Азр 5ег Рпе Тиг туг Тгр сІ1у сіп су тНг 100 105 110
Гей ма! тТийг о ма! 5ег АїЇа Аїа б5екг тТийг оГу5 сІу Рго 5ег Ма! Ріе РгО 115 120 125
Зо
Гей АЇїа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег ТИг 5ег сіу сіу Тг АїЇа АЇа гГеи СсС1У 130 135 140 сСуз Ге маї Гуз Азр Туг Ре Рго сій Рго ма! Ттийг ма! 5ег Тер доп 145 150 155 160 5ег с1у Аїа Гей Тйг об5ег сіу ма! Ні тиг РНе Рго АїЇа маї геи сіп 165 170 175 5зег бег с1у Ге Туг бег Гей б5ег 5ег ма! ма! тиг мМмаї Рго 5ег 5ег 180 185 190 5зег Гей сіу Тйг сіп Тийготуг ІІе Суб Азп мМаїЇ Абзп Ні Гуз Рго 5ег 195 200 205
Азп о ТйгогГуз маїЇ А5Зр Гуз Гуз ма! сі Рго Гуз 5ег Суб А5Зри' Гуз Тег 210 215 220
Ні Тс оСуз Рго Рго Су5 Рго АЇа Рго сій Гей їеи сіу сіу Рго 5ег 225 230 235 240 ма! Ре Ге Ре Рго Рго їу5 Рго Гуз Азр ТИг Гей Мет ІЇе 5ег Агд 245 250 255
Тс оРго сіи Ма! тТйг о сСуз ма! ма! маї А5зр ма! 5ег ніх сіи А5р Рго 260 265 270 сіи ма! Гуз Ре АЗп Тгр Туг маї Азр сіу ма! сіи ма! нНі5 А5п АїЇа
275 280 285
Гуз Тийг огГуз Рго Агуд сій сій сіп туг Азп 5ег о Твг о туг Ага маї маї 290 295 300 5зег ма! Ге тиг ма! Гей ні сіп Азр Тер Гей А5Зп сіу Гуз сіЇи туг 305 310 315 320
Гуз Суз Гуз ма! 5ег Азп Гуз АЇа Ге Рго АЇа Рго ІЇе си Гуз ТНг 325 330 335
ІІе 5ег Гуз АЇїа Гуз с1у сп Рго Агуд сій Рго сіп ма! Туг Тиг Ге 340 345 350
Рго Рго б5ег Агд Ар сіи Геи Тиск Гуз Азп сіп ма! бег Ге тТНг су 355 360 365
Гей ма! Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5р ІЇе АЇа ма! сіи Тер сіи 5ег 370 375 380
АЗзп сіу сіп Рго сі АЗп АбЗп о Туг Гуз ТВг Тс Рго Рго маї Геи др 385 390 395 400 5зег Азр сіу б5ег Ре Ре їеи Туг б5ег Гуз Ге Тиг маїЇ А5р Гуз 5ег 405 410 415
Агд Тер сп сЇп сіу А5п ма! Ре 5ег Суз б5ег ма! мет ніх сіи Аїа 420 425 430
Гей Ні Азп Ні Ттуг Тйг о сіп уз 5ег Геу 5ег їеи б5ег Рго су Гуз 435 440 445
Гей Рго сій Тйг сІу сіу Тер 5ег Ні Рго сіп Ре сіи Гуз 450 455 460 «2105 151 «2115 233 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 151
Азр ІчІІе ма! мес тийг о сіп 5ег сіп Гуз ІІе Меє 5ег Ттиг тиг маї сіу 1 5 10 15
А5Зр Агуд ма! 5ег ІЇе тик сСу5з Гуз АЇа 5ег сіп Азп маї д5р АїЇа АїЇа 20 25 30 ма! Аїа тер туг сіп сіп Гуз Рго сіу сіп 5ег Рго Гуз Ге Гей ІїЇє 35 40 45
Туг б5ег АЇїа 5ег А5п Агуд Туг Тиг о сіу маї Рго А5р Аг Ре тиг с1У 50 55 60 5зег сіу 5ег сіу Тйг о А5р Ре Тиг огГеи Тиг о ІЇе 5ег Ап Мет сіп 5ег
65 70 75 80 сій А5р гей АЇа А5р ТтТуг Ре Суб сіп сіп туг А5зр Іч1Їе Туг Рго туг 85 90 95
Тис Ре сіу сіу сіу тиг Гуз Ге сій ІчІЇе Гуз Агд тиг ма! Аїа Аїа 100 105 110
Рго 5ег ма! Ре ІЇІе РПе Рго Рго 5ег А5р сіи сіп Ге Гуз 5ег С1У 115 120 125
Тк АТа 5ег ма! ма! суз Ге Ге А5п АЗп РіПе Туг Рго Аг сіи Аїа 130 135 140
Гуз ма! сіп Тер Гуз ма! дор А5п АЇа ге сіп б5ег с1іу Азп 5ег сп 145 150 155 160 сій 5ег ма! тйг сій сіп др б5ег уз Азр 5ег Тиг Туг 5ег ем 5ег 165 170 175 5ег ТИг Ге Тийг Ге б5ег уз АЇа Азр Туг сій Гу5 Ні Гуз ма! туг 180 185 190
АТїа Суб сіи ма! тис о нНі5 сіп сіу Гей б5ег б5ег Рго Ма! Ттиг Гуз 5ег 195 200 205
Рпе А5п Аг сіу сЇи Суз сіу сіу сЇу су 5ег їеи Рго сЇи тНг с1у 210 215 220 сіу тер 5ег Ні5 Рго сіп Ріе си Гуз 225 230 «2105 152 «2115 462 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 152 сіи ма! сіп ге ма! сіп 5ег сіу АЇа сіи ма!Ї Гу5 Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз маЇ 5ег Су5 Гуз АЇа 5ег сіу Туг Тиг Ре 5ег А5р тТуг 20 25 30 сіи мес ні Тер ма! Агуд сіп АїЇа Рго сЇу сіп сіу гей сЇи Тер Гей 35 40 45
СсСІУ АЇїа ІЇе д5р Рго сіи Тйг сіу сіу Тйг Аїа Туг А5Зп о сіп Гуз РНе 50 55 60
Гуз сіу Агд ма! тТийг Мет тийг о сіу А5р тиг 5ег ІЇе 5ег тНг Аїа туг 65 70 75 80 мес сіи їеи бек Агуд Ге ТИйг о бег А5р Ар ТИг АЇа ма! туг туг су
85 90 95
Тег осІіу туг туг Азр Туг Азр 5ег Ре Ттиг Туг тгр су сіп су тиг 100 105 110
Ге ма! 5ег ма! 5ег б5ег АЇа бек Тиг оГуз сіу Рго 5ег ма! Ре РгО 115 120 125
Гей АЇїа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег ТИг 5ег сіу сіу Тг АїЇа АЇа гГеи СсС1У 130 135 140 сСуз Ге маї Гуз Азр Туг Ре Рго сіи Рго ма! Тиг ма! 5ег Тер доп 145 150 155 160 5зег сіу АїТа Ге Тийг бек сіу ма! ніх тйг РНе Рго Аїа маї! гГеим сіп 165 170 175 5зег бег сіу Ге Туг 5ег Ге б5ег б5ег ма! ма! тиг о мМаї Рго 5ег 5ег 180 185 190 5зег Гей сіу Тйг сіп Тийготуг ІІе Суб Азп мМаїЇ Абзп Ні Гуз Рго 5ег 195 200 205
Азп о ТйгогГуз маїЇ А5зр Гуз Гуз ма! сі Рго Гуз 5ег Суб А5Зри' Гуз Тег 210 215 220
Ні Тс оСуз Рго Рго Су5 Рго АЇа Рго сій Гей їеи сіу сіу Рго 5ег 225 230 235 240 ма! Рійе Геи РМБе Рго Рго Гу5 Рго Гуз Ар ТИг Геи Мет ІЇе 5ег Ага 245 250 255
ТВг оРго сій ма! тис о Суз ма!ї ма! ма! А5р ма! 5ег нНі5 си А5Зр Рго 260 265 270 сіи ма! Гуз Ре АЗп Тгр туго маї Азр сіу ма! сіи ма! нНі5 А5п АїЇа 275 280 285
Гуз Тийг огГуз Рго Агуд сій сій сіп туг Азп 5ег о Твг о туг Ага маї маї 290 295 з00 5зег ма! Ге тиг ма! Гей ні сіп Азр Тер Гей А5Зп сіу Гуз сіЇи туг 305 310 315 320
Гуз Суз Гуз ма! 5ег А5п Гуз АЇа гГеи Рго АЇа Рго ІЇе сЇи Гуз ТЕг 325 330 335
ІІе 5ег Гуз АЇїа Гуз с1у сп Рго Агуд сій Рго сіп ма! Туг Тиг Ге 340 345 350
Рго Рго б5ег Агд Ар сіи Геи Тиск Гуз Азп сіп ма! бег Ге тТНг су 355 360 365
Гей ма! Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5р ІЇе АЇа ма! сіи Тер сіи 5ег 370 375 380
АЗзп сіу сіп Рго сі АЗп АбЗп о Туг Гуз ТВг Тс Рго Рго маї Геи др 385 390 395 400
5зег Азр сіу б5ег Ре Ре їеи Туг б5ег Гуз Ге Тиг маїЇ А5р Гуз 5ег 405 410 415
Агд Тер сп сЇп сіу А5п ма! Ре 5ег Суз б5ег ма! мес ніх сіи Аїа 420 425 430
Ге Ні Азп Ні Туг Тийг о сіп Гуз 5ег їеи 5ег гей 5ег Рго сіІу Гуз 435 440 445
Гей Рго сій Тйг сІу сіу Тер 5ег Ні Рго сіп Ре сіи Гуз 450 455 460 «210» 153 «211» 233 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «400» 153
Азр ІчІІе сіп Меє тТийг осіп 5ег Рго 5ег 5ег Ге 5ег ТИг 5ег маї сіу 1 5 10 15
А5Зр Агуд ма! тийг оче тик сСу5з Гуз АЇа 5ег сіп Азп маї д5р АїЇа АїЇа 20 25 30 ма! Аїа тер туг сіп сіп Гуз Рго сіу Гу5 АїТа Рго Гуз Гей їеи Пе туг 5ег Аїа 5ег А5п Аг тТуг Тийг сіу ма! АТа 5ег Агуд Ре 5ег О1У 60 35 5зег сіу 5ег сіу Тйг о А5р Ре Тиг РПе тТиг ІЇе 5ег 5ег їеи сіп 5ег 65 70 75 80 сій А5р гей АЇа А5р ТтТуг Ре Суб сіп сіп туг А5зр Іч1Їе Туг Рго туг 40 85 90 95
Тис Ре сІу сіп сіу тиг Гуз Ге сій ІчІЇе Гуз Агд тиг ма! Аїа Аїа 100 105 110 45 Рго б5ег ма! Рпе ІЇїе Ре Рго Рго 5ег А5зр сім сіп Гей Гуз 5ег Сс1у 115 120 125
Тк АТа 5ег ма! ма! суз Ге Ге А5п АЗп РіПе Туг Рго Аг сіи Аїа 130 135 140 50
Гуз ма! сіп Тер Гуз маїЇ А5Зр А5п АЇа Гей сіп 5ег сіу Азп 5ег сп 145 150 155 160 сій 5ег ма! тйг сій сіп др б5ег уз Азр 5ег Тиг Туг 5ег ем 5ег 55 165 170 175 5ег ТИг Ге Тийг Ге б5ег уз АЇа Азр Туг сій Гу5 Ні Гуз ма! туг 180 185 190
АТїа Суб сіи ма! тис о нНі5 сіп сіу Гей б5ег б5ег Рго Ма! Ттиг Гуз 5ег 195 200 205
Рпе А5п Аг сіу сЇи Суз сіу сіу сЇу су 5ег їеи Рго сЇи тНг с1у 210 215 220 сіу Тер 5ег Ні Рго сп Ре си Гуз 225 230 «2105 154 «2115 460 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 154 сіп 5ег ма! Гуз сій 5ег си сіу А5р Гей ма! ТНг Рго АїЇа СсІУу А5П 1 5 10 15
Гей Ттйг оГеи тТиг оСуз Тс АТа б5ег сіу 5ег А5Зр ІЇе А5п о А5Зр Туг РГгГО 20 25 30
І1е 5ег Тгр ма! Агу сп Аїа Рго сіу їу5 оТ1у гГеи сіи Тер Іе Ос1У 35 40 45
Ре Іїе Азп бек сІу сіу 5ег Тк Тгр туг АЇїа б5ег Тгр маї Гуз с1у 50 55 60
Аг Рпе тТийг ІЇе 5ег Агуд Тийг об5ег о Тийг тис омаї А5р Ге Гуз Мет тпг 65 70 75 80 зег Гей Тийг о тиг дор Ар Тс АТа тс тус Ре су5 АТа Агд сіу туг 85 90 95 5ег Тийг туго туг с1у А5р Ре А5Зп ІЇе Тер сіу Рго сіу тЕиг Геи ма! 100 105 110
Тиг о ІІе б5ег б5ег АЇа 5ег ТИг оГуз сІу Рго 5ег ма! Ріе Рго Гецй АїЇа 115 120 125
Рго 5ег бег Гуз 5ег ТиИг 5ег сіу о1у ТтНг Аїа Аїа геи су су Геи 130 135 140 ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сі Рго ма! тТиг маїЇ 5ег Тер Азп 5ег су 145 150 155 160
АТїа гей тТийг о5ег сіу ма! Ні тТиг РМПе Рго АїЇа ма! Гей сіп 5ег 5ег 165 170 175 с1Уу їеи туг 5ег Ге б5ег б5ег ма! ма! тис ма! Рго 5ег 5ег 5ег гей 180 185 190 сіу тйг сій тс тує ч1Їе Су5 Азп ма! Ап Ніз губ Рго 5ег А5Зп тег 195 200 205
Гуз ма! АЗр Гуз Гуз маї сі Рго Гуз 5ег Суз А5Зр Гуз Тиг Ні тНг 210 215 220 сСуз Рго Рго Су5 Рго АЇа Рго сій Геи Ге сіу с1у Рго 5ег ма! РПе 225 230 235 240
Гей Ре Рго Рго Гуз Рго Гуз Ар ТИг Ге Мет ІчІЇе б5ег Ага тТНг РгОо 245 250 255 сіи ма! тийг о сСуз ма! маїЇ ма! Азр ма! 5ек Ні си А5р Рго сім маї 260 265 270
Гуз Ре Азп Тгр Туг маЇ Азр сіу ма! сіи ма!Ї нНі5 А5пП АЇа Гуз ТЕГ 275 280 285
Гуз Рго Агд сій сій сбіп Туг Азп б5ег Тиг о туг Агдуд ма! маї 5ег маї 290 295 300
Гей тиг о маї гей Ні сіп А5р Тер Геи Азп сіу Гуз сіи туг Гуз сСуз 305 310 315 320
Гуз ма! 5ег А5зп Гуз АЇа Гей Рго АЇа Рго ІЇе сій Гуз ТНг ІЇе 5ег 325 330 335
Гуз Аїа Гуз сіу сЇп Рго Агуд сій Рго сіп ма! Туг Тис о Ге Рго РгОо 340 345 350 зег Агд Ар сі Геи Тис оїуз Азп сіп Ма! бег Гей тТНг су Геим маї 355 360 365
Гуз с1іу Ре Туг Рго 5ег А5Зр ІЇе АЇа ма! сіи Тер сіи 5ег А5Зп су 370 375 380 сіп Рго сій Аб5п о А5п о Туг губ ТВг Тс о Рго Рго Ма! Геи А5р 5ег др 385 390 395 400 со1у б5ег РПпе РПе Геи Туг 5ег уз Ге Тиг ма! Азр Гуз 5ег Ага Тгр 405 410 415 сіп сіп с1у А5п ма! Ре 5ег Су5 5ег Ма! мет ні5 сім АїЇа гГеи Ні 420 425 430
Азп Ні Туг Тйг сіп Гуз б5ег їеи б5ег ей б5ег Рго сіу Гуз Гей Рго 435 440 445 сіи тег сіу сіу Тер 5ег НІі5 Рго сіп Ре Си Гуз 450 455 460 «210» 155 «2115 236 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005» 155 сій їеи ма! мет тийг осіп Тиг оРго 5ег о 5ег Тиг 5ег сіу АЇа ма! с1У 1 5 10 15 су тк ма! тиг ІЇе Ап Су5 сп АЇїа 5ег сіп 5ег ІЇе д5р 5ег двп 20 25 30
Гей АЇїа Тер Ре сіп сіп Гу5 Рго сіу сіп Рго Рго Тйг Гей їГеи Пе 35 40 45 туг Агуд Аїа 5ег А5п Ге АЇїа б5ег сіу ма! Рго 5ег Агуд Ре 5ег О1У 50 55 60 зег Агд б5ег с1у Ттйг сіи Тукг тТийгогеи Ттйг ІТе 5ег су ма! сіп Агд 65 70 75 80 сій А5р Аїа АЇїа тТийготуг туг Суб Ге сіу сіу ма! сіу Азп ма! 5ег 85 90 95
Туг Агуд Тиг об5ег Рпе сіу сіу сіу Тк сіи ма! ма! ма! Гуз Агд тЕНг 100 105 110 ма! Аїа АЇїа Рго 5ег ма! Ре ІІе РПе Рго Рго 5ег Аз5р сім сіп Ге 115 120 125
Гуз 5ег сіу Тйг АЇїа 5ег ма! маї Суз Гей Ге А5п АбЗп Ре Туг РГгО 130 135 140
Агуд сій АТа Гуз ма! сіп тер Гуз ма! д5р А5Зп Аа геи сіп 5ег су 145 150 155 160
Азп 5ег сіп сій 5ег ма! тйг сій сіп др б5ег уз Азр 5ег Ттиг туг 165 170 175 зег Гей б5ег б5ег ТИг оїеи Тийг о Геи 5ег Гуз АЇа А5р туг сіи Гуз Ні 180 185 190
Гуз ма! туг Аїа Су5х сіи ма! тийг ніх сіп сіу Гей 5ег 5ег Рго маї 195 200 205
Тк Гуз 5ег Ре Ап Агу соЇу сіи Суз сіу сІ1у сіу сіу 5ег геи Рго 210 215 220 сіи тег сі1у сіу Тер 5ег НІі5 Рго сіп Ре Сіи Гуз (225 230 235 «2105» 156 «2115 465 «2125 РКЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 156 сп сій сіп гей ма!ї сіи 5ег сіу с1у Агд Геи ма! тис Рго ОсТу Сс1У 1 5 10 15 зег Геи ТИг Гей 5ег о Су5 Гуз АЇа 5ег сІ1у Ре А5р Ре 5ег АїЇа туг 20 25 30
Туг меє 5ег Тгр ма! Агуд сіп АїТа Рго сІу Гуз О1Уу Ге сЇіи Тер Пе 35 40 45
АТїа тик о ІЇе Ттуг Рго 5ег 5ег сІу Гуз Тиг о туг туг АЇа тиг тер ма! 50 55 60
Азп сіу Агу Ре Тийг о ІЇе бег 5ег д5р доп АЇа сіп А5п ТАг ма! А5р 65 70 75 80
Гей сіп Меє А5п 5ег Ге Тйг Аїа АТа А5р Аг АїЇа тийг о туг РНе су 85 90 95
Аїа Агуд Азр 5ег Туг АЇа Азр Азр сІ1у АїЇа гей Ріе А5п ІЇе Тер су 100 105 110
Рго сіу Тйг о їеи ма! тТийг о ІЇе бек 5ег АТїа б5ег Тийг о їу5з о1у Рго 5ег 115 120 125 ма! Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег ТИг 5ег сіу сіу тНг АїЇа 130 135 140
Аїа гей сіу Суб Ге ма! Гуз Азр тТуг Ре Рго сіи Рго ма! тТиг ма! 145 150 155 160 5зег Тер А5п б5ег сіу АЇїЇа Ге Тиг об5екг сІіу маїЇ Ні Тис РМПе Рго АїЇа 165 170 175 ма! Ге сіп 5ег 5ег сіу їеи Ттуг б5ег Ге б5ег 5ег мМаї ма! тег ма! 180 185 190
Рго 5ег бег бег Ге сіу Тйг о сіп тийг отуг І1Іе Су5 Азп ма! А5п НІ1і5 195 200 205
Гуз Рго 5ег А5Зп ТИг огГуз ма! Азр Гуз Гуз ма! сіи Рго Гуз 5ег су 210 215 220
Азр Гуз Тйг Ні Тс Суб Рго Рго Су5 Рго АїЇа Рго сЇіи Гей Гей СсС1У 225 230 235 240 с1Уу Рго 5ег ма! Ре Ге Ре Рго Рго Гуз Рго Гу5 А5зр ТИг Геи мет 245 250 255
ІІе 5ег Аг Тйг оРго сіи Ма! тйг Суз ма! ма! ма! А5р ма! 5ег Ні 260 265 270 сій А5зр Рго сіи маЇ Гуз Ре А5п Тгр Туг ма! А5р су ма! сіи ма! 275 280 285
Ні А5п АЇїа Гуз ТИйг огГу5 Рго Агуд сої сій сбіп туг АЗп 5ег Тс туг 290 295 300
Агд ма! ма! 5ег ма! Гей тик маї геи ніх сіп А5р Тер Геи А5Зп су 305 310 315 320
Гуз сім туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег А5Зп Гуз АЇа Гей Рго АЇа Рго Пе 325 330 335 си Гуз Тк ІЇе 5ег Гуз АЇа уз ОТу сп Рго Агд си Рго сп маї 340 345 350
Ттук Ттиг оГеи Рго Рго бег Агд Азр сіи Гей Тийг Гуз Азп сіп ма! 5ег 355 360 365
Гей Ттийг о Суз Гей ма! Гуз сіу Ре туг Рго 5ег А5р ІЇе АїЇа маї си 370 375 380
Тер си 5ег Ап сіу сій Рго сі АЗп о АбЗп о Туг Гуз ТВг Тс РгОо РгГО 385 390 395 400 ма! Гей А5р 5ег А5Зр сіу 5ег Ре Ре Ге Туг 5ег Гуз Ге Тиг ма! 405 410 415
А5зр Гуз б5ег Агуд Тгр сіп сіп с1у Аб5п ма! Ре 5ег Су 5ег ма! мес 420 425 430
НІі5 сій АЇїа Гей Ні А5п Ні Туг Тйг о сіп Гуз 5ег Гей 5ег геи 5ег 435 440 445
Рго сІЇу Гуз Гей Рго сіи Тйг сіу сІу тер 5ег Ні Рго сп Ре си 450 455 460
Гуз 465
Зо «2105 157 «2115 236 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 157 сій їеи маї Ге Ттийг о сіп 5ег Рго 5ег Ма! 5ег АЇа АЇа гей сіу 5ег 1 5 10 15
Рго АЇїа Гуз ІІе Тиг Су5 ТИг Гей 5ег 5ег АЇа НІі5 Гуз ТИг А5р Отег 20 25 30 че А5р Тгр туг сіп сіп гГеи сіп сіу сій АТа Рго Агд Ттуг Геи мет 35 40 45 сіп ма! сіп 5ег д5р сіу б5ег Туг ТИпг Гуз Агуд Рго сіу ма! Рго дор 50 55 60
Аг Рпе б5ег сІу 5ег 5ег 5ег су АЇїа А5р Агуд туг Ге ІІе ІЇе Рго 65 70 75 80 5ег ма! сіп АЇїа д5р А5р сі Аїа Ар Туг Ттуг Суб с1у АЇа Азр туг 85 90 95
ІІе сІу сіу туг ма! Ре сіу сіу сіу тйг сіп Ге тТиг маї тег сі1у 100 105 110 сіп Рго Гуз АЇїа АЇїа Рго 5ег ма! Тийг Гей Ре Рго Рго 5ег 5ег Си 115 120 125 сій Ге сіп АЇа А5п о Гу5 АЇа тТийг оїеи маї Суз Гей ІІе 5ег А5р РНе 130 135 140
Туг Рго с1у Аїа маї тиг ма! Аїа тер Гуз АїТа д5р 5ег 5ег Рго Ммаї 145 150 155 160
Гуз АЇїа сіу ма! сіи тТийг о тиг оте Рго 5ег уз сіп 5ег А5ЗП А5Пп Гу 165 170 175 туг АТа Аїа 5ег 5ег Туг Ге 5ег Ге Тйг Рго сім сіп Тер Гуз 5ег 180 185 190
Ні Гуз 5ег о Туг 5ег Суз сіп ма! тик ні5 сі сіу 5ег Ттиг маї сіим 195 200 205
Гуз Тйгомаї Аїа Рго Тийг сіи Суб 5ег сіу сіу сіу сіу 5ег Геи РгОо 210 215 220 сім тйг с1у сіу Тер 5ег Ні5 Рго сіп РПе си Гуз 225 230 235 «210» 158 «2115 450
Зо «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «400» 158 сіи ма! сіп гГеи ма! сіи 5ег сіу сіу сіу Ге маї сіп Рго сіу су 1 5 10 15 зег їеи Агуд Гей 5ег Су5з АЇа Аїа б5ег сіу Ре А5п ІЇе Гуз А5р тиг 20 25 30 тукг Пе ніх Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу Гуз су Геи сіи тТгр ма! 35 40 45
АТїа Агуд ІЇїе туг Рго Тийг Ап сЇу Туг Тйг Агуд туг Аїа А5р 5ег ма! 60 50 Гуз с1у Агуд Рпе Ттийг ІЇе 5ег АЇа А5р тТиг 5ег уз Ап Тиг Аїа туг 65 70 75 80
Гей сіп Меє А5п 5ег Ге Аг АїЇа сі Азр Тйг АЇїа ма! туг туг суз 85 90 95 55 зег Агд Тгр соїу сіу Азр сіу Ре Ттуг АЇїа мес Азр туг Тгр су сіп 100 105 110 сіу тйг Гей ма! тиг омаї 5ег б5ег АЇа б5ег Тиг Гуз сіу Рго 5ег ма! 115 120 125
Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег ТИг 5ег су сіу ТНг АїЇа Аїа 130 135 140
Гей сіу Суз Ге ма! Гуз А5р Туг Ре Рго сі Рго ма! тТиг ма! 5ег 145 150 155 160
Тер Азп 5ег с1іу АїЇа Гей Тийг о б5ег сіу ма! Ні Тийг РПпе Рго Аїа ма! 165 170 175
Гей сіп 5ег 5ег сіу Гей Ттуг б5ег Ге б5ег 5ег ма! ма! тик ма! рРго 180 185 190 5зег б5ег 5ег ее сіу Тийг о сіп Тийготуг те сСу5 А5зп маї А5тп Ні уз 195 200 205
Рго 5ег АЗп ТИг Гуз маЇ А5Зр Гуз Гуз маЇ сі Рго Гуз 5ег сСуз дер 210 215 220
Гуз ТВг ні Тс Суб Рго Рго Су5 Рго АїЇа Рго сіи Гей Гей сіу су 225 230 235 240
Рго б5ег ма! РПпе Гей Ре Рго Рго Гуз Рго Гуз Азр ТИг Ге Мет Пе 245 250 255 зег Агуд ТийгоРгГо сіи ма! Тк сСуз ма! ма! ма! Азр маї 5ег ні си 260 265 270
Зо
Азр Рго сіи МмаЇ Гуз Ре А5п Тгр туг ма! Азр сіу ма!Ї сіи маї ні 275 280 285
А5п АЇа Гуз Тиг о Гуз Рго Агуд сої сій сбіп Ттуг АЗп о 5ег о ТАйг туг Агд 290 295 300 ма! ма! 5ег маїЇ Ге тиг маї Гей Ні сіп Азр Тер Гей А5п су Гуз 305 310 315 320 сі туг Гуз Су5з Гуз ма! 5ег А5п уз АїЇа Гей Рго АїЇа Рго ІЇе СсЇи 325 330 335
Гуз Тийг ІЇе б5ег Гуз АЇа Гуз сіу сп Рго Агд сіи Рго сп ма! туг 340 345 350
Тк Ге Рго Рго бег Агуд Азр сіи Гей Тийг Гуз Азп сіп ма! 5ег Геи 355 360 365
Тиг осСуз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5Зр ІЇе АїЇа ма! си тер 370 375 380 сій 5ег АЗп сіу сіп Рго сій Ап АбЗп о Туг Гуз Тс о тТВг Рго Рго маї 385 390 395 400
Гей А5р б5ег Ар с1у б5ег Ре РПе Геи Ттуг 5ег уз Гей Тиг маї др 405 410 415
Гуз 5ег Агуд Тер сп сіп сіу Азп Ма! Ре 5ег Су5 б5ег ма! мет нів
420 425 430 сій АЇїа Гей Ні А5п Ні Туг Тйг о сіп Гуз 5ег їеи 5ег гей 5ег рРгО 435 440 445 с1у Гуз 450 «210» 159 «2115» 214 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «400» 159
Азр ІчІІе сіп Меє тийг осіп 5ег Рго 5ег 5ег Ге 5ег АЇа 5ег маї с1У го 1 5 10 15
А5Зр Агуд ма! тийг от1Те Тиск сСу5 Агуд АЇїа 5ег сіп Азр ма! Ап тиг Аїа 25 ма! Аїа тер туг сіп сіп Гу5 Рго сіу Гу5 АїЇа Рго Гуз Гей Гей Іїе туг 5ег АЇїа 5ег РПе Ге Ттуг 5ег сіу ма! Рго 5ег Агд Ре 5ег О1У 60
Зо зег Агуд бег с1у ТИйг Ар Ре ТтиПг Ге Тйг ІЇе б5ег 5ег Ге сіп Рго 65 70 75 80 сій А5р Ре АЇїа Ттийг отуг туго Су5 сіп сіп Ні тує Тс Тег Рго РгГО 35 85 90 95
Тк Ре сІіу сіп сіу тийг Гуз ма! сім чІІе Гуз Агуд тйг ма! АїЇа Аїа 100 105 110 40 Рго б5ег ма! Рпе ІЇїе Ре Рго Рго 5ег А5зр сім сіп Гей Гуз 5ег Сс1у 115 120 125
Тк АТа 5ег ма! ма! Суб5з Ге Ге А5п АЗп Ре Туг Рго Агд сіи Аїа 130 135 140 45
Гуз ма! сіп Тер Гуз маїЇ А5Зр А5п АЇа Гей сіп 5ег сіу Азп 5ег сп 145 150 155 160 сій 5ег ма! тйг сій сіп д5р б5ег їу5 Азр 5ег ТИг Ттуг 5ег Геи 5ег 50 165 170 175 5ег ТИг Ге Тийг Ге б5ег уз АЇа Азр Туг сій Гу5 Ні Гуз ма! туг 180 185 190 55 АЇа Су5 сіи Ма! тТйг Ні сіп сіу Гей бек б5ег Рго Ма! Тиг Гуз 5ег 195 200 205
Ре А5Зп Агу сіу сЇи сСуз
«210» 160 «2115 461 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «400» 160 сіп т1Їе сіп ге сіп сіп б5ег сіу Рго сіи ма! ма!Ї Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз ІІе 5ег сСу5 Гуз АЇа бек сіу тТуг Тйг РМПе Тиг А5р туг туг Ше тис тер маїЇ Гуз сіп Гуз Рго сІу сіп сіу Гей сіи Тер Іе 20 35 40 45 сіу Тер тІІе Туг Рго сіу 5ег с1у А5п ТИг Гуз Туг А5Зп си Гуз Ре 50 55 60 25 Гуз сіу Гуз АїЇа тТийг Ге Тйг о ма! А5р тиг 5ег б5ег б5ег Тиг АТа РПе 65 70 75 80
Ммеє сіп Гей 5ег б5ег о гей Тиг о б5ег сі Азр Тйг АТа ма! туг РНе су 85 90 95
Зо
АТїа Азп Туг сіу Азп Туг Тер Ре АїЇа туг тгр сіу сіп сіу тег сіп 100 105 110 ма! тик ма! 5ег АЇїа АЇїа 5ег Тиг оГу5 сІ1у Рго 5ег Мма!Ї Ре РГгГО Ге 115 120 125
АЇїа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег ТИг 5ег сіу сІ1у ТНг Аїа АїЇа ге сіу сСуз 130 135 140
Ге ма! Гуз Азр Ттуг Ре Рго сій Рго Ма! тТйг ма! б5ег тгр Азп 5ег 145 150 155 160 с1Уу Аїа Гей Тйг об5ег сіу ма! Ні тйг РНе Рго АїЇа маї!Ї Гей сіп 5ег 165 170 175 5зег сіу Ге Туг 5ег Ге 5ег б5ег ма! ма! тис ма! Рго 5ег 5ег 5ег 180 185 190
Гей сіу Тийг о сіп тТийготубг ІІе Суб АЗзп МмаЇ А5Зп НІі5 Гуз Рго 5ег дзп 195 200 205
Тиг Гуз маїЇ А5р Гуз Гуз маЇї сі Рго Гуз 5ег Суз А5Зр Гуз Тиг Ні 210 215 220
Тс сСу5 Рго Рго Су5 Рго АЇа Рго сій Гей Ге сіу сіу Рго 5ег маї 225 230 235 240
Ре Геи РПе Рго Рго Гуз Рго Гуз Азр ТИг Геи мет ІЇе 5ег Ага тНг
245 250 255
Рго сім ма! тйг Суз ма!їЇ ма! маї А5р маїЇ 5ег нНі5 си А5Зр Рго сій 260 265 270 ма! Гуз Ре Азп Тгр Туг ма! Азр сіу ма! сіи ма! Ні5 А5п АїЇа Гуз 275 280 285
Тк Гуз Рго Агд сій сій сій Туг Ап о бег Тиг о туг Агдуд ма! ма! 5ег 290 295 300 ма! Гей тиг маї ге ніх сіп А5р Тер Гей Ап су губ сі Ттуг Гуз 305 310 315 320 сСуз Гуз ма! 5ег Азп Гу5 АїЇа Геи Рго АїЇа Рго ІЇе сіи Гуз Тйг Пе 325 330 335 5ег Гуз АЇїа Гуз сіу сіп Рго Агд сій Рго сіп ма! туг тНг Геи Рго 340 345 350
Рго 5ег Агд Ар сі Геи Тйг оГуз Ап сЇп Ма! бег о їеи тНг су Геи 355 360 365 ма! Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5Зр ІЇе АЇа ма! сіи тер си 5ег деп 370 375 380 сіу сіп Рго сій АЗп Ап о Туг Гуз Тс Тс Рго Рго ма! Гей А5р 5ег 385 390 395 400
А5р сіу б5ег Ре РпПе Геи Туг б5ег Гуз Гей Тиск Ма! дор Гуз 5ег Ага 405 410 415
Тер сп сіп сіу А5п ма! Ре 5ег Суб 5ег ма! Мет ні5 сЇи Аїа гГеи 420 425 430
Ні Ап Ні Туг ТВйг сп Гуз 5ег їеу б5ег ге б5ег Рго СсІу Гуз Ге 435 440 445
Рго сім Тйг сіу сіу Тер 5ег Ні Рго сіп Ре Си Гуз 450 455 460 «2105 161 «2115 237 «2125 РКЕТ «2135» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «400» 161
Азр ІчІІе ма! Гей тйг сіп 5ег Рго АЇа 5ег Геий АЇа ма! 5ег Гей сІу 1 5 10 15 сіп Агуд Аїа Тис ої11е б5ег о сСу5 Гуз Аїа б5ег сіп 5ег ма! А5р РПе дор 20 25 30 с1Уу А5р б5ег Туг Мет Ап Тгр Туг сіп сіп Гуз Рго сіу сіп Рго РгО
35 40 45
Гуз ма! Гей ІІе туг АЇа АЇа 5ег А5п Гей сіи 5ег СсІіу ІЇе Рго АїЇа 50 55 60
Аг Рпе б5ег сІу б5ег сіу бек сІу Тйг Ар Ре тНг Геи А5п ІЇе Ні 65 70 75 80
Рго ма! сій сіи сій Ар Аїа АїЇа тйг отуг туг Су5 сіп сіп 5ег Ап 85 90 95 сій А5р о Рго Тер Ттиг РВе сіу сіу су тиг Гуз їеи сіи ІЇе Гуз Ага 100 105 110
ТВйг ма! АТа діа Рго 5ег ма! Ре ІЇе РПе Рго РгГо 5ег А5р сіЇи сп 115 120 125
Гей Гуз 5ег сіу Тийг АїЇа б5ег маї ма! Суб5з Ге Гей А5Зп АЗп Ре Ттуг 130 135 140
Рго Агд сій Аїа Гуз ма! сіп Тер Гуз маї А5р д5п АїЇа гей сп 5ег 145 150 155 160 с1у А5п о б5ег сіп сій б5ег ма! тик сіи сіп д5р б5ег Гуз А5Зр 5ег Тиг 165 170 175 туг 5ег Ге б5ег б5ег ТИг Гей Тийг Гей 5ег Гу5 АЇа А5Зр Туг Си Гуз 180 185 190
Ні Гуз ма! туг Аїа Су5з сіи ма! тйг ніх сіп сЇ1у Ге 5ег 5ег РгГОо 195 200 205 ма! Тиск Гуз 5ег Ре д5п Агуд соЇу сім Суз сіу сЇу сІу сІу 5ег геи 210 215 220
Рго сім Тйг сіу сіу Тер 5ег Ні Рго сіп Ре Си Гуз

Claims (5)

225 230 235 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Антитіло, зв'язувальний білок на основі антитіла або фрагмент антитіла, які зв'язуються з позаклітинним доменом орфанного рецептора 1, подібного рецепторній тирозинкіназі людини (КОКТ), які містять послідовності СОМКІ, СОМК2 і СОКЗ важкого ланцюга і послідовності СОВ'І, СсО2 і СОКЗ легкого ланцюга, відповідно викладені в ЗЕО ІЮ МО:27-29 і БЕО ІЮ МО:66-68.
2. Антитіло, зв'язувальний білок на основі антитіла або фрагмент антитіла за п. 1, що містять послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга й послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, відповідно наведені в: (1) 5ЕО ІЮ МО:1 і БЕО ІЮО МО:14; (2) 5ЕО ІЮ МО:130 і ЗЕО ІЮ МО:136; (3) 5ЕО ІО МО:131 ї 5ЕО ІЮО МО:137; (4) 5ЕО ІЮ МО:132 ї БЕО ІЮО МО:138; (5) ЗЕО ІЮО МО:133 ї ЗЕО ІЮ МО:139; (6) 5ЕО ІЮО МО:134 і ЗЕО ІЮО МО:140; або (7) ЗЕО ІЮ МО:135 і ЗЕО ІЮ МО:141.
3. Антитіло, зв'язувальний білок на основі антитіла або фрагмент антитіла за п. 1, причому антитіло являє собою химерне антитіло або гуманізоване антитіло.
4. Антитіло, зв'язувальний білок на основі антитіла або фрагмент антитіла за п. 1, причому послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга й послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга містять 5ЕО ІЮ МО:133 ї БЕО ІЮО МО:139, відповідно.
5. Антитіло, зв'язувальний білок на основі антитіла або фрагмент антитіла за п. 1, причому антитіло являє собою ІдА1, ІдАг, дО, ІДЧЕ, Іде, Ідса2, доз, Ідс4, синтетичний Ідс або ІМ.
6. Антитіло, зв'язувальний білок на основі антитіла або фрагмент антитіла за п. 1, причому фрагмент антитіла вибраний з групи, що складається з: Е(аб)г, Ем, зсЕм, К(аб)», зсЕМм2СНВЗ, Раб, 5сЕма4, всЕм3, зсЕмМ2, азЕм, Ем, зсЕм-Ес, діатіла й (5СЕМ)».
7. Антитіло, зв'язувальний білок на основі антитіла або фрагмент антитіла за п. 1, причому антитіло, зв'язувальний білок на основі антитіла або фрагмент антитіла кон'юговані із синтетичною молекулою.
8. Антитіло, зв'язувальний білок на основі антитіла або фрагмент антитіла за п. 7, причому синтетична молекула являє собою мітку, цитотоксичний засіб, терапевтичний радіоіїзотоп або ліпосому.
9. Антитіло, зв'язувальний білок на основі антитіла або фрагмент антитіла за п. 8, причому цитотоксичний засіб являє собою низькомолекулярний токсин або пептидний токсин, або білковий токсин.
10. Кон'югат антитіла з лікарським засобом (АОС), що містить антитіло або фрагмент антитіла за п. 1 і щонайменше один цитотоксичний засіб.
11. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за п. 10, причому цитотоксичний засіб являє собою низькомолекулярний токсин, пептидний токсин або білковий токсин.
12. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за п. 10, причому антитіло, або фрагмент антитіла, кон'юговано з цитотоксичним засобом за допомогою кон'югації антитіла, опосередкованої ферментом сортаза (ЗМАС).
13. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за п. 10, причому цитотоксичний засіб являє собою похідне антрациклінового (РМ) токсину СІуспЕОВА-РМИ, де п є будь-яким числом від 1 до 21.
14. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за п. 10, причому антитіло, або фрагмент антитіла, є химерним або гуманізованим.
15. Кон'югат антитіла з лікарським засобом за п. 10, причому антитіло, або фрагмент антитіла, містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга й послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, відповідно наведені в: (1) БЕО ІЮ МО:130 ії 5ЕО ІЮ МО:136; (2) ЗЕО І МО:131 ї 5БЕО ІЮ МО:137; (3) 5ЕО ІЮ МО:132 і 5ЕОЇІЮ МО:138; (4) 5ЕО ІЮ МО:133 і 5ЕО ІЮ МО:139; (5) БЕО ІЮ МО:134 і БЕО ІЮ МО:140; (6) БЕО ІЮ МО:135 і ЗЕО ІЮ МО:141; або (7) ЗЕО ІЮ МО 1 і ЗЕО ІЮ МО:14. Зо 16. Химерний антигенний рецептор (САК), що містить антитіло, або фрагмент антитіла за п. 1, злите з трансмембранною ділянкою та внутрішньоклітинним сигнальним доменом Т-клітинного рецептора (ТОК).
17. Химерний антигенний рецептор за п. 16, причому антитіло, або фрагмент антитіла, є химерним або гуманізованим.
18. Химерний антигенний рецептор за п. 16, причому антитіло, або фрагмент антитіла, містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга й послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, відповідно наведені в: (1) БЕО ІЮ МО:130 і БЕО ІЮ МО:136; (2) 5ЕО ІЮО МО:131 ї ЗЕО ІЮ МО:137; (3) ЗЕО ІЮ МО:132 ії ЗЕО ІЮ МО:138; (43 5ЗЕО ІЮ МО:133 і 5ЗЕО ІЮ МО:139; (5) ЗЕО ІЮ МО:134 і БЕО ІЮО МО:140; (6) ЗЕО ІЮО МО:135 і БЕО ІЮО МО:141; або (7) БЕО ІО МО:1 і ЗЕО ІО МО:14.
19. Фармацевтична композиція, яка містить: (1) терапевтично ефективну кількість (а) антитіла, зв'язувального білка на основі антитіла або фрагмента антитіла за п. 1, або (Б) кон'югат антитіла з лікарським засобом (АОС) за п. 11, і (2) фармацевтично прийнятний носій.
20. Набір для лікування раку, пов'язаного з підвищеною експресією КОКІ1, що містить: (1) антитіло, зв'язувальний білок на основі антитіла або фрагмент антитіла за п. 1, або (2) кон'югат антитіла з лікарським засобом (АОС) за п. 10.
21. Полінуклеотид, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга та легкого ланцюга антитіла, зв'язувального білка на основі антитіла або фрагмента антитіла за п. 1.
22. Вектор, що містить полінуклеотид за п. 21.
23. Спосіб лікування раку у суб'єкта, що потребує цього, який передбачає введення суб'єкту антитіла, зв'язувального білка на основі антитіла або фрагмента антитіла за п. 1.
24. Спосіб за п. 23, який передбачає, що антитіло, зв'язувальний білок на основі антитіла або фрагмент антитіла за п. 1 кон'юговані з цитотоксичним засобом.
25. Спосіб за п. 24, який передбачає, що цитотоксичний засіб являє собою низькомолекулярний токсин, пептидний токсин або білковий токсин.
26. Спосіб за п. 25, який передбачає, що рак вибраний з групи, що складається з хронічного лімфоцитарного лейкозу (СІ), гострого лімфобластного лейкозу (АГ/Ї), лімфоми з клітин мантійної зони, нейробластоми, саркоми, карциноми нирок, злоякісної пухлини молочної залози, злоякісної пухлини легені, злоякісної пухлини товстої кишки, злоякісної пухлини голови та шиї й бо меланоми.
ЖОМУ т ЖІ АК ЖЖ ЕХ ку Же де Ме міо ЮЖ МІ ях и У фл ях М. Зх жу Ще ща ШКО ОМ же М У ж ба жом Міо ж А О ХО мм Ноя В я де о їх о фу її є Ше Хкотх М. Лю ХА ОЗ бу ге ОХ ЕЕ а холи дО Ух А О.М п ТА що ми чи и а а М В їв іх Ж Б Б ХУ ВО УЮ ВХ ФО ОО ОА У МИМО УЙ ше УЖ опе о цк Й у ве ож її сла Хе ме о фжЖ ж Ах ЯМ 0 Ох У . ізо ц8 ж шт оф їж 04 о Юсх з мор т 0 у 2 0 ОМ пнкк их око ап о вк ато а ші їлоїз ув тож ож ОО ОЕМ тло фе ДЕ ЛО сж лю фо йо бе БО Ой де хож Б ж ж Ж ЖОВ ОЖ ХХ Ж хх кає ходою шк ЩА Шк М пе дк де ук ОА док фа Те Ж Ше 53 хе Хо дк де МО Же ши о пово, м с ой, В ом і кож я ща З - є ЧЕ а йЖ фе пу сх пу ху а ж ДУ ІК Ой ку її а шої: о, Зеє ОЕМ Ж МОБ ЕК Б БК ою о ше я ух ож ве КЕ З чик Б пак ЕсЕВВБО БЖ 3 - ТЕ ТЕ Ох ії зх у ІЙ й Же ЇВ Ж з Ж 1 м їі х їж ко А А В АНЯ Зх ж М ж М ох ою: 3 ще - ДЖ жо Б МО жо Ж Ж ОО сок Ж її ож х о 3 303 раси де кої меж йМО Кк пе ЇК. ЖЖ БМ Лю ж МОХ. о і я в І ЕКщі ххх - 5 І А щрощ ХО яті м. ою хи сб і» ух . З дк ут Ми сок код рою м їх ге ОМ ОТОЖ мо «й ож ск Сх же М ІК ки якою ля вок вк ТОВ М оф БУ ОІВ ЕІ ОО ма тю ЕТ У мо: аж 01 5 її 2 Я омж ж МО ще ОЗ ЖИ Же БІ же ОЇ По пе жо бе щоб ЇХ 0 5 2 ож дя де ТЗ ОДУ БУ ОО ТЕ мок Е «ОО щи МЕ М и и КК ; шоб й сж (Ж Ж ЗО МО ТК че - МОЖ У и Ос ОК я щи зе М ок 4 с ЕЕ КО МК Да бе хо ЇЖУ КОХА 0 Ж Кз ха оо МУ у іч вже ща й хо Ж Де мк дж ЩО ОВ Я Я ли паж по. МОМ Оу У У Х їж пог хЖ ШО ЖЯ І Об Ж СЖ Ос АКОоїю КОГО Ж ЕХ ЇМ ОА ЖОУТ ЛІЖКО ке мо Ж О щою во (ог ов БОжО ТО р 2 М ЗО у СУ КО см о ЖО дк її Ж сх Ов Ош . . . . й шо Ба пох ев зе ТЕ щ М в ке х ямок оо шх ок ж. УРО с ожу 5. щошво Ж. Ж пох ХУ м ота йЖМ БОЦІ Ж й Оу пу СУ пе ОК УМ 0 хі м Ох Я ох ЩЕ ЖИ МЕ ЇХ Ж у ХК ож Х бк їУ то ІІ ОМ МОМ ЖОЖОК геох і с а В В Є г. що ШОЮ Моск ФО У. ХО ше 5 Ом; ММ іх тощо и ціх а їй 35 52 ща р дОоже же у ше МО МІ ем А й пок па оо ще МОМ БОБ У ВОЮ Хо Во Бе БУ хе би МОБ ех в ві ЇХ ТОВ ко Мод бж о е с сю же бю се бе ї» тк ЮК КО УТ йод Ж М ояж хх ОО нс ОКО щі МОМ В ОО чом жи же й ЦО умов ЗИ ОО шя А оте о хк ЛУ хи зм ФОКЖ сх кВ я Ж тт Ж б УЮ МО Ж ВО КЕ ж шк дО МК ОО ОО Мом ОщІ ях йо оМмОоо щиМ ІК МТО МОЖ ок Р Моя МО БОМ» ОМА Ж що ож МОЖ 0 ОА ТО ха хе Одх фмОо ХВО фчоУб де ях БУД р х пода ре їЖ УК от Ще ОЇ (5 15 їх Ж да фо й АЖ ОМ М ЖИ Оля сш З МОм а щока ху ОК СК КО о Кий по й ож с св МО пот «ВВ ДЖ В КО У У го га Я пе дО У Ж ЖЕО сек хАОМу 0 фя ох ой хро й око а о кож ве оф 8 2 ЮК х що МО Ка 45 ЦИ: 5 5 5 я - Ж е к ве м ОТ В ля лколох ож Мао зжо УР Ж УК У КО то С оф Жди От по їй ПО (МОХ ОТ КЕ ром та М га їн МУ БОЖКО ОО ЖОЖ Ркоконй как оч м м Уж МЖК У дя Ул оожхх х ом Ж Я ще ягоди як де я Ох мож пал Е шишки хо зам Хоми уЯ хі уж змо ж АЯХ ОЮ - В в І ан оди У вв БсЕпошВесо ско КЕг МОХ ЧОЖ ос хх яко ку МЕ Кя вх МО їх ЕК, що КЗ МК й Ко ши Щодо. М сх КУ 1 Й щу ний виш кивок БИК: У хо ХОТЬ ку тЬольоже З проб с І Кошового іо ПОІКОЇЛ 5 ЦІ І ІБ ОЇ кл 1 ЛИ ХО що ОБО ож доку фе їз» охо МОЖ Фе МУ Ж ОК ос КОХ, ож лОІМ Е тм М мох дош У ОМ У й о хе Б бе що Кк Ж ІДОЖІ б ЖІ МЕ ОХ; ЗІ Ж ож 13 Х Оу ча му сто ту то Ж шу М лм Луї Хм мо тю АК Жх ги У т. 2 пок їв о Оки ОК ТА ха СМ ОКА о фе ук фе Фе фо фе орх ох оде фе їх їх пяО ОО ЗК ОА ЖИ МОХ О хх їройх п КОВО 0 ОА МК йо: 1 ОТО У Й с дол жо хе Ж Ж як Лю бю. М.О по МкОож' КО МЬ Ж ж С т й ОЇ бе же Ж їх де б 09 ЗО ТУ ТО ще От пою -о їв, Ж М. ВУ дм меж ж о фероя ме «Ж оше я. ЖОВ ЖЖ Ж ДОК КО шо хо оо км ось ОО щ--оМ пот ЯМ МО ши ух Ус 1 тот о я чи . сх хол ТОМ ХІМ ДО. Ж ол. бе й щи ОК ЕІ, зх І щодо т-о ЗХ Кя АХ ще МО до М ве ті Ж ом са Ов Ж хх М ох 2. ЩЕ ОЇ ОЇ їв Їх БО Ї5 ІЗ йде 83 їх пт бх Шк о с йе оди З «КОВО Модко У нн нама що ох ох Ж Ж Ж ре ож ух як КОЛУ ок: ой Ж ОЖ дій оп оС: Ох Ж гр з ож доп щи КО дю МОЖ Ох вок: 10:11: о ЖИ ХК ЖІ Ки Ж Ку МОЖ у Я Я ай ши їх юю 110101 т кох ох Кі Ко м КІМ КИ хв БЖ ЕЕ: Ух мова Мом ОА Ж М Ха ж ім о М ххх БІ Жї:11 1 я мой 86 оМРоМОої Ж. 0 умо ММ ОО ж Ті ХЕ 2:осув ЛЮ. хол Ж Фо ІЖх КО ШЙКощх Га. Кос ге ож бохо фе КУ ОБО подо Ж Я г В ДОЩОК ОЩУ ОЩОХ; бе б Сх МОЖ КО у В МО М хви ве ок Я лу Ж М й Зб Я обкому МО вх ? ОЗ Б Ж МОЯ осмос ж ак с й : де Ба їх зве М же жо у ш 2 КОМ Ого от що ЩО Ох сої М ах УК О пу ту їж ДО ст о щпж КА Ко УЖ Ж ОЇ Фі де фи ос» Зк аю ЕЙ ОР У я їх З МОЖ ОКО ОКО БОГУ сх З ХУ Бо СХ хх ТУ ВШ о жх 0 жо ФО КО ОЇ дООхх ще п ж ж То ка Ше ЗМО ОС ОК пОЖОСОСВ ОС Мод ОО «Ов и МОЖ пе АХ Ж вно я» товх я . як ока т. ФК ю лее ффоМм фе Ве феокею дКояя мошвогх цуоцй (у 1 флоту таз тт ух . сп в ек У А о МОУ Б ух м КОАТУУ ГИ у ху три од МО ОР оЖ ТО ІХ пою Що мом Мо хол ка мі й МО ех Роде ШІ МОП ЩІ КО МО ТЕ ІП ОМ) ї5 поп що що о о мо; ож Ох де що ток ово дО АВ ІН У М С НобЕок з: з5 БЕОМу ЗрОМЮ Ох Ох хх Що Я п. Те 8-5 ОО пЕокж о кі 1 ові я б ок стопи у и ке пу 7ь їч кою жо хм б хм ж ко ме де ХООБЖ ТУ ХРОЗх РОЮ ЗУ М С ЕХ хе 1 я яті і оо хи У й Е де ВІ ОО Я Ох сх дм Ох Уч х «о ТІ до хи 5 ЩЕ 4 3 ом І Кого Ж МОМ ОР М АК зе Ко пров 5 о ме АЙ ОО УЮ У ув й їх Може щу їдОАТ ОМА УуХ ОК М ; хх х ХОЛ хх ЗШ ОО Же М) йк Мою . КО ОК ОМ що а М ОО, ща тк ща Кб Їж ще ої ФО ТОЖ і тож хе хв ЩО ЩО до и Ж МО пе оно а не АН НО Профі с ТУ ДреМ я КВ В ж іі Ух М ОК УК КК ОО М що МОЖ ом вою МОБ Е ти Кк КЕ їх ТУЮ ЛЬ УЖ ОМХ СУ ль су «БЕЖ м б бе ОВО Мо де Ух Ух в фо ху м У Ко ж ШО де о ше ше до М ре шк 7 зх Ж об їх хх Ж Ж Б ож шо я МОЖ М їв б в ож ох о мож мМ ж ОО : ; ск: - моя ж уж Ма. Же лоді ой шк че 3 Моє я ох 1 я шк У й ох МІ КО у й мк ше КК МУ водо 3 Ах Я ЖЖ с с ОКО Я МО В о Мод ен ж У іп о М ВО жк од БО Ми МОБ ОМ ж йкоох - ЇМ де ЇМО ок Ж ЖЖ Ж Тс: з ве МОЖ об Ж ом х лох ж ХА жожуроле Ж й СО КК Кох Я ож ЩО Ж Ти РО ТВ ду ул Ук их я Ку т. и М ку : тек ге яко фе Мо ск ої м о Му ЖІ У В пкт х па ОМ ЖК У у Я МОЖЕТЕ и и и и и НК Ач т- шо її я АМОЖІ АХ ОХИх т ОА ТИ що от ха КЕ І є М Ор холу а Ех Ом ло ак Й ОХ ІД а тов ЇМО Фю ЗО: БУ ЕКО ОМ є (ОА ох Щорс; Мо Ів ому му ОТ киш шипа зе вача зі; щі щих І СХ тота о ще Ж С ТИ ІІ мМ ЖК ОО ВЗ са СЕ МУ ! БЕЛЯ БОБОХ БО КОЖ дКОЇХ пуб м с т ДУ дО ши 7 ох у вк Ех М ОМА ОО Ше ХХ ФК Уход и . У 7 я Кк т Ме оф о їх ОВ. хх їх гу еф а за з ката пт хх кого ше и а а о КАМ о МО в Би Мк тої. бу дх їз бу й ОО Од Ох Шу Оле з да У фе ше (да МОХОО мя хе Ж їж Ма фж оф в ДАО МО Ше ХО ще Ка ВО ож у я БК о ох М ех -конж п тк кя хх еколо ку поміг аб они мо у Я у А ві їх хи ВОК ІК З о я кро Утохї ше і ще х, т Кт Ні їх т КІ мож що кв кох - Ж х Бк нм - хі Ох хі кі 21 хх ема х о о с КУ А а ім Й ОЕМ 0 1 Ко БОШ СО ФО» по ОКОМ їх ПОЖЕЖ М ще Я ж ЗхкЕБЕЕКБиКИККЕ Ж х я в ОО ХО ВЕОлх ха СЕ 5 МОЖ ММК М яко жо «ой м я ВІ шою неї й фе о Же Ж» УА бе фе Шном Хе їз Ж г де ЇМ «- ЗИ я 2 дО УК ух ШЕ «оф 7 ХА хе хе 4 Ж оже че оч я їх оди МУ ПОМ ОК) м т ки вій ох вок и МКК МОм Оожш ЛОТ К: твоя 0 уж ДОЛ тю я Олю Ох п що ОВ УЖ ІМ г ох се МОХ г ЦО пі ох ВОІВ де фі мом у М 3 опа 05 пу 5 173 571 ЛУ ОХ, МЕ хм як МОТО и Мо М х д ООІА Я ж ямок КО 1 у ТА ШТ Й Чим ноу їж Зо М ж Б Ба Лю ІМ ТОЖ ож жо ОО фу 3 Ух по Те йо ЗВ ЇМО СО ШОМУ ду т А, м т Р ої їх З МЕЗО МОУ Ох у ее Ме і ово км ФІ ОЩр ОБУ ле ФС дО ооо єв Ух ІМ ЄМ ОЖХ У КВ ОЙ СТЮ М; сх їх ЇХ шини виникв боб б БРоЖя У її б її зр й Кі ХО Про 1 ОР ОЖк МО фу Ол я Мр ОМ ТЕ пото са п ща х ЕОМ ші школи дО і ща, м Ж смій но це пом їх МЕМ Ж сю М Ж СК ШУ Ем Її Ок ої Ох ПАК и хо Кох 5 і Ох ОМ МО зяб сої ІД ВОМУ
1. ша Хо мох б ОК ХА ою щож ВОВК сю у І Б МУ ТО ей т ом МК тА М КУ ди Юк цкОїч ямАОТДК 1 уж хи дк тя уж жо Лв ос ух дю хх т шоб. хх шодж м тоже к якою я кож ко. ос МОЯ Ж т ХО дк СК УМ М оба ХО бо Оу х ПО 5 0 же ло го (Е ке Ох ех У оже АМОЯ ЩИ Ж Су ЩОДО сто ЖІ и Ух дО У У їх хх Ох Ще ОМ: сек ост зу Ж ЛА У Ма Оце ШКОЗУг МУ ек мі УКОЖК ЩО М ОО Мох поря Тр гм " Кок КТ тю й й МКМ п бфооййяо хо кто і МУ шию у хол ; тро г дО: ше о мі і п. ЩО ТЕ Ук моя МО є у т и Во ж цІК ОЇБ - пк ЕЕ ЗІ шеиви я Мох МОМ О ЩО їх де МУ ПбоКи уе Кі М хеЯооожосх о Мт ДМ зд см о їмо Ше МОЮ МОЛ
. : ї : ї ї : : ї М : : 2 ї : ! : ї днини Ж : : Ї Н : ї : юне і і : : і : : Її ун : : й : : : : : : М : Я : : : ї і : КО : ї : : доню НН ни о зв Н ї ї ї «УМОВНО и она ва воваввво вва ва вав ооо ооо о. з : : 1 ї КОКО НК: : : ї і У СА УК є : ї ї ї ї : ї т : 5 х ни ' їі : ! шаг ж, : ї і ї ї : : У ї т. і : ! ' ! : . Ж т, і і ; | | ! і і і. ЖК я щи 7 сення ї ї "УМО ие: ї 5 3 ї : ї ї х 7 сх : І Ї : | ; : : : она ма ! і Ї : і : : ї : ОВ лих чі «і 1 ї І : : : : ; : соки к : 0 Оу чу і ї і ! І НМ а : ї й ; : : : : і у 5 Ж же у : 1 : З : ! Ї : ще : и Ї Ї ї : Н ї : 3 Ж бод шожукі : ї : ї : : : Ї дня ша цу х : ї ї ї ; Ву 1 Яж» МУ з с КО рою ВК В сь : ; ї : ! 5 БОВВввв нов вн ванн і і : : : і І ї й я : ; : : ї : : З фун у З ' і : : . ! З - Ж 1 3 : І У і Її я м З ше 0 бо) Б і І х ї ії ; : кА ех се СІЙ ! х ї , : па ан и и пло КВ я ї Я КеЯ : ї : й т МВВ воно водо во овоооде созів ово во ов і я шх І 1 : 7 ЖОВ ОК НИВИ ще т і у : : свй 7 м і ї : . : : і і і х що р з : де Х 4 : ї ї . : 1 і і ж й ; НИ | пиши ше : Пружні ее ! ! ї : : ! і і : ІК в іх них : і : : : 100 днідунстктн М і Є МЕ : і 7 ї : : ї УМИВ МОВ оовв ово 5 ех : ї . ї : ї ї жк р пи ви ї НЕ г ще х ї : І : : : ї т 13 зх ІК : ! : : : : : : : ока Е в, як : і : : ! : : ! і РЕК ; «: х і Її : ї : ї і ї Нумо ще : : ї : : : у 1 1 ІАСКекх у ; -3 : ; : : 1 : 1 Ї Її ТЕ Ж : ї : : : мое есте теки те КК З ся м . : ї ї : : ооо ооо ою ооо ово 5 це : " ; : . ! ЗВ р і : : : ; : З ; : же : : ї : : : : : ІВ, БО че і ї х : : : З їх М : о те : : : : ї і : : пло 24 її ; : : - : : : Ї І я ту : : ! ї Ї 5 7 Я Х зни ни 10000 ід ЖД « хх і : х ї : і ї ІНН св інж гЯ ; : : : : : і і 7 ї 7 «ак ха - і ї : : : ! їх Н : Я нини м : : : : : ; ї і І ких х Кк Н і і : : : : з ї цу чу 2 БА : ; : : : і 5000 рижую дУ ї : и : Н - СВК ЗЕ х ка : , Ї : у однин іа кн клі кл Док я що я : ї ї : : БОМ ооо в М. : ї : и : ї . ї Її ї ї ; Ж : 3 : ; : 1 5 : ту. чех : : : : Я т З ї дит пе 7х Н с х Б | ! : пи и ШЕ БІ Ж овен бу Ж І : : і : ОН Ми СЯ «г : : : " : ї і Н : : ; ще х : . : : : : ї з ркенех сх м : : і : : : ! : : ЦЕ Фо я Я : і і : і і : 15 зт ча : : ше за АКТ сту офетья худ як уукує у муки ук уюьютюююья Дукюкучтьх тики МУ і : УВО вн вв в Знов вові наві св звана івана ав авва 7 ' "ВН А ИН КУ ОВО Во ху і ї : ї : ! З З : ; | Я І ї : х ї : З ї ї Р думаю У : ї ї : І ї і ї їх : Твен : : І : : : Н : і з У : : і й : : і : оч " : ї ї ї : : : ї . : Я КУ : : Ї : осока од ки юю тканеві у : : : : . З Задора паоваівовов ої 5 : : ; : : ІОНИ ИН: З хх : ї ї : і : ї : й ї т Ж, : х ї х ї ї х ї І : ди : : : І ї ЕІ Т ї : РАМ с. 7 : : : ї : : : Н АХ ще : І : І х І ! х Я : : : і : : : че : : : і х у : і с : футів ков вх еодов фо ока ве вм т куму ку А щі с нн в нн нн В ж, ях : я уоя 7 ? : ї : а у : : : : ; : ів «р ;
: . ! : і І і І Моно че : ! нн з фено оо з нь що І НЯ Не инНк ОБУВНЕНЯ ВИВИХ о ОН ВИевВе я ПИ і " : : ї ї ї 1 : 1 ! НЯ ї ! ! ї ї : и 1 : К ПУХУ : : : М і і : 1 : : : і ї ? : : : ОД : ві : ОЕ : : : і і ; ї : Щі 8 ї х ї І : х ї х я "ун ропи Дракон дракон ро оно роногосоммі косами Думала ідрнлнлнн В Я ве що - се я їх ГУ ЕЕ Се - ж же «х ее яке У я- У
Н і ї : і і ї урну ; ще Стритет зр рон тнтнннння чо і ! НИ ГЕ, р - й ШЕ | ши ни ши нн ши 1 і хе 1 ; : Б: Її з їі і і і ! ! : і ! ' ? Б і : Бі і і 3 ' . і : : Ї ' : ; Е | : : і ! : : ; , : ; І і і шшшш ше | г. щі і : 2 : : і й ї 1 ї ; : рр НЕ Б Б Ко : в фо БР. ; : : | ше і я ше: пи и БОР: є Ор шо ши ни НЕ рю Р. кт Б шик ши ще у ШИ ШИ ! р ше ше Зі і ; і | : і х : ї і і " че. ! : ! Фі , ши ши шк ни чн м! і : . і : : : Ї і і : у і ії : з: : ; і і і : : й з і Я і їі с Б р, | НИ: ! ГО ооофннносю ЦЗ: 1 Її : : і : ї і и : о і і і - їх : ; ї З З : : і : : Н ї і : ще й ОК 4 ти ши прин ше шешини : : Є ши ше ий у ше а ше ооо : : ; і " й : їі т 7 є 7 т ій дей й Мо ж и Я ї / і ! УК х Ж « кт шт Де най режи Ж й ; і КМ мА, сур бо хх є «7 їй де ж шк Ко -й ,7 т о ! у Кия КОХ кю сей «5 з Н х я х. я ж Кк що жк час Я З х. с «СУ х Дружккеюю зд КАТА АТ і ща : ? і і ї х у т і КУ У сх Ху в о я що 7 шишишишини | А ЩО : і У М і т ї ; : ї і ї : і фл ; тт ' ПК: і і і ! : і і З | і : і : т перекееннях ефірне ЕЕ нин ни и її ГІ і - ря її ж ни ши НН нн ши ни ще и Кок їі Бої р в! рої. : : х ї ї 3 : | : З і і і у і : ! : І , 7 ї 1 ї х і 7 х : ї і : і : шшшни шишиши шше пиши ши ши шини : : КІ і ї Ї х ї Ї і : : І і З : і : Ро 7 і ро ЕЕ ії ж ше НИ я фенди ой ! Го ; : і І : ! Брі де коги и? КО уУЄ і ОО . ча я і х й К Бу о ; й і й і «7 ; 7 і ря ще не ! тю ж Ж Шо Г ! ж ре ре й ! і ! я у ж їж гяй З те 7 / «й і : : ОБО АК ок с ж ої : : ШК Ми - -К ре ШЕ г т ко ех Ки - с ч рої ! -х У ше ОХ 1 т з рові - леккх х. х » о х З Ух Е : : : Кі ; ОЗ о і У , і : іх , ак, Зх їх і БО. б В: 1 ОЇ о Р БОРУ а Б їх ро | : я шишиши шиншН А ий ши рі пиши шин БОБ ант КО в. У РІК р ШЕ рт рр Ко ШЕ : : і х : : : ! і і ї ох ро : ! БО ОР БОЮ М: і 5: нини ши шини КК і : Н ї : у : і 1 Е ; х я р р А шиши ши ши ше шшшшши ши ш шишщ со пише ши ши шин ши шшшшш ши нишшишшшшшш р Уучтенннвчнчяяя їх їх і 1 ї : : і 3 ї 3 які ех рення пох нек понести рннння, и НИ: Ин: ! ' " : : : І : | вого Т сок опр со сот сатин, ф-- кекктю і х 3 і : 3 сту : ' і : . т ї : ' кетуотсю ою ссср б оклккув кюсосовИ і ши ши ши ши шин принт пиши шшшшшшшн ши ши шй се БЕ а : : | рі КОРОБ зи й, ши ши іх оо яти той о й о ; ; Я Ге «єї 7 «є ї дет и лк у их є Я у й й Ку у вт Ан и ев нь : ши ее щих 2 м. те т, Х ок й Ох нах ж М з Ту Тх ко ж ь й ху ОО ж . «а Її х. у у Кк юю ух т», то Лю з Кк ох З хо г м і у А: Сх жу оч з, МК ше і й х 1 ї х х У У хх х ке ше зх ом м : в і і : і З ї і ; х З ; ше х я їі пиши ши ши ше ше ше ши ши ши КО, чани шшишиши. рр Е пасе дкетеркас оо кодове кн длогосі отого, : її й Е « - не зм Фе пковоеокапкиданкнтнгосевдивранее ндвовова еенокі ж з у м; х Ї Бути Ж Кок 5. Бь в. її У с-м а ще БЕБІ 55 і : ; ' х х. х » не й Є же ще . У ковку 3 ет юки З У ОТ м ж ХЕ ср я , В се хочу де Ж т ех ЇХ її М Ж -к - х гей , Ук ж їх у : ту г оо м раї шо щ Ю щі во іс пі мі Бі щі й ут ж. щі
: : ; ЩЕ. : : ї Клум нути : і : НО
: . 1 : : МОНО : і й : Кука : : : Бе . : : ї п Же : : : : Ди хе : : : : й м У : : і : : бі че . . їх ; : к Кк : СОХКСУК юю Ходи у хх у тук єси УКННМАКАНАМАММК КІ : і М а Й з Н АНА А ВМ КК ех ПИТАННІ ЕКО ОД НВ щи в и МЕЖ КМАНМАКАИ НЯ ПАМ МО МАХ я ї : : Її М Як т : ї : ї ЄС Ж ї ; : ї х Хе му : ї ! ї 15 ж : : і : : поко я у : Ї ни : ї : ї БІ З хе ї : ї ТЯ з : : : Ї НК: ке : З : : КУ : і : : до я УА : ї : : -к З ; : : І : ї хх х ще ї : : ї : 15. че : : : : : ООН сх . : ! | : ШЕ. в : : : : : : ВО й . : ї і : ос М : : : і : : ДОВ не 3 : : : ї й і ОВ М : : І: і : М.Х х с, Мо : . і Її вка" У й : : : І ! УБІК с, й : : : ї яп чо т : « : : КО у : . : : , : що ж З : : . : : Б А же : Н : : І Як хх ж : ! і ' : У 7 : : : 5 АХ жу я ї Е ї - і с т о, . . : . ! : : мим ЯН че : : Н ї : Крровомнння А ту ; : : ї МО Фі. п : : : : хе ве КУ : : : ЕВ ; : : : ї ЩІ їх ; : : і : МК Як ІМ : : : : : З Ба : : ї Же їх є : : : з : х ке Ук : : : : Її ух х 5 о І : : : хо дози мцим ле х АХ І : ї : її БОБ т, ти : : ; : ВУХ у. т : : ї пови Я ож хх : : : : З ОДА ММА зах : й : : | З З п, : : : ! В: ще с хо : : : : яхоВ ре: ЕЙ мих : ; . : кв зи їз
Мт . : ї : " Ух СУК тк ех : " : . 15. си . : : : аа З ще - ве : : : : УВУ че їх : ; УТА гхх : : : : : ХОАНІНИВ М : - : ї : З ях ТЕ : : Її Н І: х і : : їх 8 ок ж я ї ї ї : Бк не М : : ії : : ; КИ жи г ! і : : хо МЯ щк : . : У духу муку мам ли мої кекучх т кжхух чем ХЕ : 7 : кОм «У 7 ї : : Тек Х . : Н : ПЕКИ Ж : : 1 : ПАН . а : : : : : : Чо г : : : : : мУшхе ; їх : і : : : і КО Є Ск ТУ : : . ; . ї в х и : : : : : ї . ж. г: : : : ї : 1 хх : ! : : : ЗБЕ с : : : ї ! : КАН е : : : І : І ЖК КЯ : : ї ї : КЕКВ : : : Її ! : м : : ' х ї т ж : : : хх С : ! : го ж Ах
: . : : Ще щи ї . : Хо Баки : " " : : ЕІ УС У ХУ У У У У У У УМ УК МТ КУЄ У УЧ У ХУ МУ У У УМ МУ лили дих ек. Д ,ІюврфюфЕр0БЕІМЦІЧОООВВЛДВВООАОООДОДЮОЮЮДЮЮЮДОВММВМООМММНМНМНМОМНОННВНОНОНННОВВНННООВООНО М НО ОООН що І дяки и КК М Кмин пили Кол мА АМКУММУМИММІ ММ я : ШИ АКА І КМ ПЕК КК КК ВО» З : А М а НН ННЯ: ї МАК АМІ МАК АМІАК ТЕ МІН АХТНА ШИ. ЛАММАЦМ М ААМАММ М М г свв ї : . : : ї р: хВу Є їх : : : - : З КУ і і : : ; : що З : : : : : : ще » їх І : І : : і ще Зк : : : : зна З . ! і ем ик нм Кон мовив у. І й : ВИН КО
І . : : : МУКИ і : : МОМ МАХуАЯ В пе 4 : : т Ки 2 : : : дах я . : : : : п же : : : : : ще ще ! і : : : Ек ху, : їх Я : х ж я Фу, : ! о У і ї РОБ КОВКИ - : Ходіння дян АК ЦІ ДДМА МУКА ЕМ : і : ВЕБ є З : ї і й МКК с : : -- де ї с і лий жо, : і: 0 В ви а а а и ж : т т Бо Ї що ха МУ се м я 5 У У я и 2 ран х «7
Я зе ща ТУ ї : Фе чі З ї т я Ек фону ши Ж до зачх т : Ту мк : нн КО ШО по --у з я ММ Др окон урн 5 де в й і ІА х Ще : ік ях М і і мк бе Ес те ї їожх ще м ї ; Зедю Худккивюемг у: св а ? МЕ хм А : Ко КК, З Ох відн; Ко ; і х со 3. Беекя тео хо ої іо у : ме ва я МК 0 ее оч г ка і : Ух ух яті Її ку» У Мо в ж м зх Ж чех з ОО жЕ я як р х о 1 ХО г У пух сх ЩА А і ще її ух» : ре ще ли 7 роз те жи Т 5 ЕК хо гм ок, і: В ща ! ще ше їн Є Храм ння кккняннлнначнх дн і йо : Ї : пе і хм ще ДА Кн ур у фут т т й ве о фот воттуітся реє екю БУ х т У К ТЕ : ї ї ї і уЕ їх сх 5-х - Ку со «3 їж Кз с ї я т - їй У ї м ху Ту ех. З ж г З і що ШУ : сх ; ме он У дих в я ож 4 є У: х ї тя жк 5 1 ке нс Ко в де Її фє ї Бк» Ї їз і Кук СХ ї УУМК. 0 Тклуююю ую учня ння ижих чн уалну, зе ї 7 ше З у і ! х й 1 о. ї У і ж і МВ - кн їКх Ум УК М уонжееюютттєеттетмх с ії - й ай ек ЕК їх ж (Я Ко КО ще Ем ше те ї - Те 1 не В ДИ о жениттєтннтя тля мудде, щи х , лю ях т т - х ще ве щУх - і м, ще - я ва 7
- Ж. ення он чук х є ве й з ше Б» х ка ве Бо М Що ше і пе Ух. де : : т З т : їж? ХХ х і М ща і ін хх ще и те СЯ Ух и дя І ! ще і ок 3 ї у ї : Ї т 5 7 Ех 7 ще єв де Б хе бе бро ха З ж ко М ж ж м ГУ Ж хво ве Ж у піноцищ КПК г псжеск офертою тет атаки режи режжююютю З я В: : У : І 1 К : ї ї Ж ех у, в кіно В дю 5 х іа ТІ ЗОЗ кі 2 155 ВІНКІВ М це їж і Н їх щ БОКІВ ЕК КК Б
КЕ. ме УМ МОЗМ 1 : Іі і У Ж пер р р ВГ Е7 НІ . дек ефе ктмюфєчм ЩЕ : учнем ф рони Ї З - т 7 ! : : Во тв ще ВОК фе ЩЕру їі ну дк до ІК ЕІ сх ї Їх ТОМІ І ЛІ ІК ст і мі ЩІ Ж: БОКІВ и мі І В -Е ТД ОК ІЕМ ТИ феї КН ЕЕ їх З ЯКЕ хК ех КЕ ЕНЕУ КОКО Я тий КО ех Ж х ї «б ї 5 их не оре фену Я В ше Те Що Хо хх МОЖ и дк ех ВХ ОТ, ях зт усні Ед З ко хх р З КВ 1; щі ФІ Х МЕ хі оо М х во Мі х їх ЗКУ 3 т Болі Юу ту Ух с 3 се . ІТ 32 щ БІ" хо ної МІВ о ПЕ тих НК в ої ші З хи т Ек ко ох В М 5. 1 1 І їх ї г : с Туди хи ж " хх жк ежюкі я Шашнн ГЕ КЕ і перев тег осерді її т ЕЕ в. З ї : їі З и о 1 бло Б Меч ка і. ім вк І курсу хо і ее ів В 1 г ще т ултяиту м вк КК між с КК І «І икрумклууу ро во зе МК ОЗ хе ПК ше БУ З Ко Мо У хо мо Ж ХУ ех й мо ВЕ КО У 8: НО ЗЕ Оу х ще ку жі КЕ І ї 8 3 і
: М. осн оннифня нов ето фена : Її пах Денні нн У ї 7 і із з їх - у 5 33 її Е.:
31. Еж ОХ МОЇ сх Ще ї спвів а Гш Тех ОВ ня м і рот» Ве 5: Баки В: Оті с і і . ом ІІ В КО Її 11 Хе Я і ВЕ СОКІВ М ть. Оті Кі З Уа В БЕК роті : ор ОЦЕ З Я їх жо рмМЕ КАТІ 3 І : Кох І "же ї їі келих : Б Гж Я: З і ; рення Тней : ОБЕ і! я хх 5 1: к хі ОБЕ Ї їх Я е ї 3 Хе НИ НЕ Іс Ж хх З З сімї НК : ВНУ СМ В ОБО і В 1 ро ВИ БЖ ЕІ ЖЕ РО Бебі І Б РОКІ : ЗК пщі МІ ВН НМ ї тях ей ЖК ТК ОКІрМІВ ХУ та КІ НН готи пу З ше Я слу пе РОБКИ ВРОЖАЇ 148 х ХІМ КІТ МЕ БО і ї нев Аа ЕК РР КО ренннянфннфреюве фенів о. ІВ З ВИ ДЕН ВЕ. ровер : т.
Ж т. не Б . ОК ті: ї і і ї у сі оо їкчі се ов я «МІ о Код вк КЕ РУХ й акіс іа що Б У: сх ря ж ТІ ОН мНІІ щ п ї ге і ШЕ ЕН НН КУ Т хх фо ї ж ї ОРЕ : с ОТ хх хо ЦІ се пед уч в. і їх 3 ї , її їі КО щ о ЗУ у юки тих . ї ї кл кефік как Анн т мує 0 уучуєхртв ЗБ НА и КА 00 Муддннчнчеднмну ом в р я няно пінні оче ни ОН їі і : БА р в ИН ІК ен В БОБ Бе тіше її п Ж су Я ВІКАХ же з їх Ух мі 5 : «а ш цех ї7 о 3 вк т : 3 ща мі КМ і-ї з - ї 3 ВУЖ ВІК МІВ Ко М МІ: І і їж МІ БЮ Жих З Ж І г З ве ОВ що НН че іх Кр х : сх 3 ГОР Ж що. НИ ЕН т в їх ЕЕ ІЗ ІОКш шо 7 ї 3 сегесфоюлеееттекуюьяї їх У КЗ Е І: Жодних рр Н р ЖЕ Тех Жіхві і і БК зве 3 МАХ ОК шу ІВОТ фОоОКАх іх ІШОТІ всі а їжу : ; Це ОВ Ох Б ж ме Вк в В, в Ж І БАТОГОМ я Не Ж мі М Ух ЕІ В: І ' РКОМИМеІК 1 ї і 7 а: НЕ ЗМННЯ од РІО фі фе: І ї і ЖЕ хх НЕО І Краї ії М ха ІК 1 Н ! ї х Н ї х, чок ОН ТІ КЕ Про» Я Кир ГЕ 5 ся З: х . сі ї її : З і : ХОРІ 4: с Ж те Ж ех 51 іх тузі ї перен у ХЕ ревно ДК ее Ох ші І су ТЕСТ РшОМІ РО РЕ ІКІ НМ З ВХ ор іьфное щі От РО БОРТОМ: Брю ВиВиІРе ре рі же 3 КО ой. У : ВІ 135: 5 кто хе ї : Вір ІМТ Ух ї ї ї ї ЧУ КО Е 1 : ку з : ої до Ж.. У же. тм, М: її 13 І . Н ї о. БЕК і ЖК ї Кй содою МЕЖ ХО У г ! їх ої дднхке ук Кук кл т 5 лем Ми т ме дамімесодвх мех Щщ " і І" 1 : дона ша: 5 я полк, ЖЕО их вн 1 ї- тА ї ї : ї : ї ї ї хх, : х ії й ; У ї ї. її х іш. 18 їх і щ 0, Ж тікав Я Бета ЖІ Ім; тім що зву мусу їв Міші МТ КЗ 15 печуть Ежен Кух пи і 1 МІВ: БЖ ЗМК ії дека ухнркх й Оу ка З вом Ух ОМ: БК МЗНКІШшІ є БЖ іє ММ бю хе ох МН УМ Я : НЯ вті і 4 ї 5 ї ПКУ ХО ОХ ФаТИ ЖЕЖр БОЖОГО рр ОКО де сх ща м т То Рі у рококо фен нлакіколккі ння т - жо : ї докум з т У ї : : « таж: їі ЩЕ: : : їз Таж ї ї я їх ле 8. КІ . ІІ ісві стоки зак ЗК ! ві о Ні: ЖД в: ЖЖ Я ОКХ Я т 1: ЖІ УК КЕ КІ ж Ох. і ОМ ДО МЕ Мі: 1 : ї ва ОХ ТК і х ФГ їж ХО: КІ В І І їі іо З : ії і ЖІ: І ї КЕ З зх 51: На І їх Е з : ї Її і хі: І х її З г 1: , ж ї ї т ї 1 3 кий оте Мі ОО: РРО ух сефееюфннрння їм ххх і КЕ ОКО Ні: І і фени ЕН: Й : НИ: ст Туш НУ НЕ Ко 15: : х : її : І іі ОТ ВІ: БЕ КЕ: іт І ко ше хх іх БЖ І : х , ге їх Ек г І а сечі БКі Зх ех є. шк і: їх Ві єх Ки М КАШЕШНИ вк Бе ЕЕ МЕЖ, У ЗМ М і ку І с ку ми Я, 4 і щі ХК і яхіже і іх» іш СИНИ КО хи кі ВО т ї ї НК КАХ у : : ї ФК КЕ пе як ЯК СН ії хх РКО Ч ро і хі І: 7 ії Ат пе ХХ з ї 5 1 І 1 що ВК: Й НЕ шк в ЦК Кох А Молоннннй дифе ї ТЕ Х 2 їх У т ів З Ж х і їй шо о ОМ Кі З В т ї : : а Я х ОО хх я ОК : ? Р ; КАХ кі ії Бі М і шеьоМ -ї і КЩш іш РОЇ ї хщІ: ох п А АНІ ее о Ж КУ Млюмжюьни З : р БЕ щТХ Бо у Ач І хх . : ПОВ : ВК РАІ: : ЖК с. ' Но БК КЕ г та Кох ОКУ ї їж: ТІ ! : Н ху аа з і г шк Мах щ я От І і : : Вк і : З я, ве НЕ У І а тіж і ші хі і Я БІЛ І Я їн Ії у і ЕЕ зі : ЩІ Хр ій і хх СКК М оо р ОК і У і М ОБЕщх ДЖ пу о З ки ОО: ж. ЖІ жі і 7 ММ уеруедутуєтуєю в гом міни кер сКя Ж. й Божа Ж3 Ж Ї «З : редут семи еф ОВУ Мі ЗИЖІ М: Кі фо кое Ку СОМ тк МНК Кк ВЛ шк хх «Ж ща ОК : ннтнчкччкнкх Ром 5 КОЖ гі МІЖ Мекка КУКИ АХА КА АлИ тн рах ол ож щі пе пк пи ЖУК КАХ ки плАХКАУАТНЯ КК ї Ії ЗИ шо чі поет лк і М ХХ. Ки Ех сек дит ї СВК ож Її ЗЕ 7 Ї с ї їо- докт АжУ дю жан МНЕ МЕ КО щ ооо МЖК АК Акт ЖК у худею ше тк ще «й ще ре ка ЕЕ о М ог т ЗЕ 5 тою МА М фену Х в і і УМ ! і т і : уки фооанннкий оинкм п Ох лу АТ ВВА Ул РОЙ РТВ Ж» я сх В бо руєтетнняя о Не 7 і поккостоххесекесвчятеткукхосккетк косе В, ї1бче 7 Н жу У і Кока Зх х і Є ок АК : і ще БЕ, й ! Ме У 15 у ! Ех |В г. : КЕ КЗ у Ж ї Н і» фоже ї У Ї їх. і Ж : ї ; ік Бех і де ве Есе б ! Ух жу КК ІЕЕ Ко ол ХК їх : х м Ток дк І1К- : : еежіжку бики с Ії 7 і змететлурюкя че 1 с В і петкнчни бе : дя І - аа Е ї жив у їх з еКуХ ще . х, у Ох М Б дних тех і Мн, ях й хокуєтухю риму титр Шк честю см кн ей ща хе Ге; що А т фетру уми і ЖИ ЖИй ге ЇВ Ко 3 «З лох мк рих уужут ех ще кто 7 хе 0 сх ик ско тс 5 «м т ума че в т Те х ! песен кууттжті нео одркут тт яхт сетвге сор же : фемегеумютхтя несе совет мк х та ї педохуухую ій лмухихтнемежахесвпе я в БО) Ж з Е о Е --
в. ЕІ у й Ен жк : хо г і М є ку я ї я і «5 м х їж в У ХХ МК Е ще 1 ! и: г ін -ч Же Е я ех -- 3 ем дужку х о Ії : ї- я й : ше КК і 4 че їж ; - жи не : де. з ! ее ще у ве М зе : сх ни : т ХК Вч ше щи і 3 Ки : в шо ї м ЕК : сю ій Ах і он ке і «МТ, мк кореня зу х У ? седан тв Я я ряпутеттитх «й Мережа хна А Ку ї шу - шт фержеся ренту титрах У т 8 В щ пу чер Ся ще х 3 хх с є т п Ще в В шо жк цжкуку те совок у хикуссюст Зк зе Мк У Їжу лях сет евекнвнючктіккненкй , ХКАКККАКК, ох Що ! сект ее осо еЧАК КАК НюМ ко на ож 1 п те І - Н хх : у - В Ос : К А: Кот 1 ету 14 М Н спе Р г : мс 1 неу і Ж ок і щ і і 5 15 Ю і чу - КМ жа ї ок З ут У х я ях ЗХ . ет дм. ї Мей ну их, з і о З пекла КМ Н з че ї Жди М ОМ оояеу і УК ; яю че і і УМХ хоч КЕ З . і У ; бр ча і г : Ку ї гор ї 5 і єю. че і і ОМ 3 дк не Кк і Зх ТЕ і У мувкужветттю кт нт. г ; дн У п-е і окт ОО ь ! пні схехих ; феднмелалтуууууухтуя ОК : як тегхужх ЖІ ж ме орндурчожухкуто пепддрнуожнн КК. Же : пуску тр р ей «5 ге в х Мерхунеет опе ртуттю я ко -- ко кож У ех сіє "т редуктор Я «Ж Я че Фе щх Як? а т жк хх КУ т «З хх хе в У Й Є -Е т
БАЗ і і ВАТА ДА 5 : У І : ОА ИО ; : х й ї А : : ща М і : ї г, кісчичя : Ей 8 ї : Є оголячжккнтожктєсхяя ВАТ ЕК І ! Ба | ї од ВО ї І її і і Ве 1 : : я 5 слу вно : о НИ шекодожик ї ПУ. оон ЛІКА : ЖК уекенд інт БАК СЗЕШИ У : пух ї х м 11 Її КА ї ї ТеМАТ а Ї ДІ : : їм : - 5 Її Бл 5 пусти : Б у : : І ; : ї: 51. фктементжнтоє мі щ й : : де отит ре хтовефеттужеесєтсстя КОТІВ Ь Ї х 1 1 у : х и М : т ї Бі й ; ОК і
Ї М. ДЕ фе ютннчевннясн Кувмтурать ; ї виє ї : х Ї 1 поту У : : ши: ї ї : Мо І Ї і ї 733. : : Коли ї і ; Ки : : ї І У ї : Ї К за: х 7 ОТ коУх ; : їй -ем. ; : 1 Пи и х : : Б и ; ї ї на х 1 і 8. ко: ї І х трі З ї : Ми А ї : їх ЗИ У : і х и У ї ї г ТАЗ х : 1 Ми Ж, : Її 2 Кт я х : КО А, : ї : СИНКУ ще : ї Жити тс У 7 У Їжу До . м г. ря г. щн У М до Бод ЕК нний нерв пехжедрнтятянтя хіннтянкй ке Кок ант ст утекти тику тин тях тятн тини Ко Е ! і і і 5 і : й я З КУ в «у т . - тї я т з М «Ух - «и ої сх й хіх моли це Ти жи очах Бу за» вих ей і : сх ПОД ЕК ит ее . НАШ явну ча Ж КІ ї и х «А Кк я У Га У НА ПЛАН г х ! ї Є х В ї У : ЧИ КА В є х ї КВН де я коту й 7 5 і КАХ й «ОКХ ! ж ях Є и: я : А КЕ дже Ко НІ й : КВІТОК й не ШЕ ; о Ею ВІ ких у : че 23 х ЖК. х . . ери веяхюх піятюннто . я й х КИ: Її яз її т ах Н ЕВНМА ох г - гх : : х й шшьн В р и 3 Ем а: є х Тк - ди ї х ї ЖИ «ап : я х Ех й Кк х щі у З й в В я АТ х : Мн пхкфоних Хоннинння елітами. Пд тих етежачнтя ше КЕ о: тт Ї х : ях х Н ХНА ЗІ Мк 3 х х й Кк х : дич слив ння Кр соку Мотя Й йо Е рення феннтю хни пеня У ї пхтакужя КАНА інтен дж ов у ! ОК я І БК я их В ДЕ і У: Мой тю В ро я ї з жк у Ж кдд жлннянх АЖ ТАЖ чухехихня ткжн юю я ббжюіюжийняжиі панна, Х : УК Ку Кт 2 хх Вії в А ї вбитих : Без ів тя, ї бити 0 денних Ж Є вне мент ТРК Ж афдяю тет соспкхддннкх ти хкенямох Я лужну хви ух тех уже КАЖУ ту Ж ТЯ Куй АЖ уже зткружннм, плн т ііі нина ан зони знай я х їх У х ж ше : ! ! НЕ: ! і і о Ж їх з ї- я іа жк с. попе здо «ча 4» пане чен за зп З мо М з м Ме 1 чи т
Фіг. 5 ж " 1 еВ
МК а
0. з пики жу ММ 1 їак ка КЕ еО ох ОО ОКУ ККУ КАК ЖАКАНААААНТК АЛ АКТ В КК КАТ діду пок мА КК АКА А ААЖ ЛК ЛІ Є Я КОЮ Жю ти: АК АКА ЛАМАТИ і ї м З У хх Ко а 4 З З : ! їх : Що . тт куту ! Ж 7 дя ня Лу оуккнньк уж Ту Кутя кгс тощо 7 а и ня Жовте ПТ див її. ї. : : піци СЕ ЛЕВІ Мем шепіт ПОМ дев тр ТОК: пт ПО ТЕ ЦИ КУА : о и ППД СІМ ду ти ВШ ЛІ ОХ яЯ ше Пил С КМ МЕККА 8 где ук ПИ КЕ доми у МП НИ КАК ПИ бий п ШО ЕК ВИКО Я дуутмувткя ТКУ І ФЕПИТИДТИЮ МУ ПОТ УМИ Пт ї пр ЩЕ, ТМ ол І Пп Кияни опе З Та ОШОЕ МЕ ЕОМ Му Ми лиш ЖЕ що хі От, Я по. пек ший Ов ЕЕ ВЕ си ЖИВ 1 ФО ОТ ПОМ п? МІХ лох В: Я Бо сша тий ПІМІ пі по й ш пад и пошопнв в НТ В ДЕ ПКЕЕ ВШ ШИН НД ОТ ДЛ МЕНТИ ТО що о МН УА Ше, ПОРО Про кита В КОЗИ КО ВІК ММ п ПИЛИ о М В І ОКА ми Мій ЦЕ На ХТК Я . вах пою а нн п он ЗЕКВУ МО ПЕН ши ЗІ ТКОИМ: ПЛИТИ ОЕМ ин ПУ ИЯ ПЕН Попднин я Под ЕОМ це В : ОО Шик КК п и ДІ КИЗКОВЕКА о ФМ п КК им ди ПИТИ с ВІ; КИ МІК МХ МКК У ПІК ПЕКТИ. ная ПЕ СКК ЗХ Кт о А ООН ї гу МУ ПОКИ ВА тя СТЕ ет их ї ПІК ПЛИЖЖШИМІД НИ М КОНЯ по ОЕМ, ЕЙ ХХ КОНЯ ШО Й ти я НЕ ЕДЛНМН ВЕК В КК ПОЛЕ ОК ОККО 3 ех ЕХ МНЕ ПІ МИ КЕНЕ Б, Еш ши І 7 даннжжкснякя Мк Б ЕНН ШИ ПЕК ВКК Ко ІТ МК Я 2 МУ ГОМ и ШИ коки СЕМИ НЕ ДЕЙ ТЕ ДІШИОЖМИММХ солити ПЕКИ о ОВ ЕМ у ніш Ов ока ПЕН Кн я а С о шия З ав НН пи ел вен ко с ОО що ПОВЕ Мол Пен 2 о ОО о шия - тако Мр ДК Я и ОКО о дя У тиме ОО ЕК Кі о В 5 ях ІБ ТЕО і: ТВ ЕЕ ЕК еданнй ОО Хе ши. : с п н ГЕ пн. о пк ТЕ с ПЕПКИМКИКИМХ ТИХ Ж Хе ОА КИ ПІ ІОМЩЕМЕУ НКИ СИ МИТ я Мит, ПпОКВ ДНУ ОО ПЕТ ОК Ії ХЕ КВК ПЕКИ НЕ Ки ПАНИ ПІЛОЛИ : пл ех Зх я ші І ПА Ми В ПОТОКИ ЛИМЕ АВВ Б пи о ПОВ ох на КК КК ПК ТОНЕ ПЕД Тит т Й Ен пет АСВ ММ еВ ПК ВИС и ПИШНЕ со клю рий Пдомии МО ККВКО СКК ОКХ ке фчк ке с дом МЕТ о ППКДиА пок ее о ЕКО Ат вш и и Кот ЕЕ МОЖ Ж МИНЕ ПОВЕ М ня КК, ШОК ПЕ ши ВО п НЕ ЕВ о що ши п в ни пВи о Ве с ПЕК пише о ЛИ ЛК ПІК В пе у т о шоп Он ЕЕ ее в нн пп о шухя п ї и ЕЕ КВ дру и НЕ : пит ПЕ з по од нн шу ВІВ БО полин е Ве ПОЕМ жов а ВН ях екшн ВЖК Я п Пн етику пи Й ПиДЕИ т ЛИ ШИМИ ШК Зо МЕЖІ ППФ Же КК ПИТ ОН ни ДОМЕН МК и ре КУ п МИ ПОМ жВИко а в ПОМ в в В ши" : Ще пише ой: ВП ПИ И М ЕІ М ЕИНИМ, ДІ Кеш о ПЕЖО и ОН оп Я ве я о песо ШЕЛЛІ Е ЗЕ КИ, ЕХ Ст; ЗЕ: КЛ ех о, помшоюк ек ти ко долкино зохг ВО ою ПИ соте пр ЕН віти г МКК Пт СА о МЕЖ ПИТ. ШО МЕ ТУю, МЕ ой Ки: т ТІЙ КЮМЬ ЕК В Ко А І их ПК КО до БОТИ ДЖ т ТЕ хм ДТ Ед ЕК ТІЛІ ПОС шо ес у шок о еп я ЗО ся сх сно ІН пос МЕ яю поли ди Пе зем ПАН пд ТИТА ФМ ІХ й Зх шо мен ше ша СВ АЮ МК Ж, слсонюяю ФК ВИТ КУНА КХ т ОЗ КОТИ ЕСЕ ЗМК ВОІВ УК ОО пиши ше пл ІОВ БК ОВУ ЕОЕВ, Ше я ОО НО полив ВЕ с ВВ нет Р ЕВ С Мних ших ПІНКИ Тит т ММК шт ПЕ ДЕН Й МИ ДА : ! х ШОМУ А М тан зн пн ЕІ ВК КИ Я ц че зач «еКимжкв : КОБЕЛНСІ зичнжка 2: КОВО
5. ЖЖ хх дк з и оріжка 3: ВВОВЕСОчНІВ Кннжка З: ВЕК СТЬ Зоржжа З: КО з 34 юешогепне Межа й щЕ КК ЕВ 3 М І ІТ У ІК Я,
ПеКриття: денну яз й - ; --а- СБК «ЖЖ і о в се хаєх - -5 ТЯ а Я . їх цк 5 хе ї м нь -- ЕМНКілюо ря з ЗУ че Я річ хх сй х, 8 ав | . 5 -е АВНЯЮЄ т КК бем схе о х й т | 5 «жу. ЇЗОТВИ. з ! кое ре У контроль и до т осв С 5 1-й в 1 по Кониєнтрашія | гамі бах пк Покритиє КОКО -е- ЕНВІ-НИ че ї оф ж ех щія - ко ЕННТАЮЮ КУ | ей ННІ. ОУЄ -у Я гей Щек о їх с жу БМ суши х , ї 1 - ЕКВ 43 ї а в- -о- ХВНІ-Ю Те ж МОтТНИ. зе | Щ конце ль тай З 1 КІВ Концентрація ! нгомлі
Чиг. 10
А КОМ ой Токовм х угзувевсж А ер моб М ой МОЛОКО Ве ах чі я ШК; я з їх я он ів чи З Во Ж ча км Я КОХ р іа бонеренажно Я дю ті о Можу ж, їз я АЙ - СИ ве «А и км як тя - ОКО Ух екон щі їх - ку Я ща й З 0 ХІЖ - З ОО їз х Ж: Х поояж. ЖІ ро 1 ля 1 ВО ОЛМ ЩЕ ЩЕ ФАХ їх Фа дуття : і 7 ї їх У должннжнтнтвкют тий. ОЇ ся НЕ в х І х що їі й Ж Малифікація б ів ге мае 5 а од с Ж я Бе жу ее и У ШЕ хі їх ; ї Чкрменх сорказа дати з СУ КІмоєвонІ ВУКеме ЗИ і ЕТ "о Сх яКТЗн СВЯ всих ВІчн сх З пух КІ Я 7 кон'югровання ДОС В з сю ГОЖеНЧНВИ ой КОДОВИХ вантаж ш У КА Оу; он Зі ЩІ 25 а ! ГУ В в й М її й ї я Я А мк М шк «В дек ийХ, КУ ке Не щ ук : м а и уки а и кова сна и о ОаЬ ща чех. рт р м т т рив . І і х іс К ! Х ЕІ КК 4 І т и и ех у ІЮ о о у Кк г Турок ет ет т квт : Б : з х У є Ос о ду Зк, те С з З і 4 ех т чих шви. бо цит РМО-ЕВО-Оу, БУ т 7 сх п-й уче З уневкое ци т І з ле ж КГ. З ей УзБ Ме цехи ЯТЬ - я ш ву хе шЕОВЛЮЦЕЯ ов, . я хі хх х МА АН Кк косому кра у у, зх ї я ТУ ди Х пиїї ї ше УЕ Ме І в. сек шоку БУ «а ХА ЮМИЇ хамайч ЖЖ. Як ДЦ ВКО кома В Ж 00 ПІДЕМ ж кі БАЧ зе ВТСАКУРНе ж З А, ї Як МЕМ СК ВМе кожних «З іх ее КК У ВКИ ЧАСІ: ше я- СКК Тора юему Ж дві Ко ЯМ АШНЬЕМЕ(тхими. ОТ У 00 Але НЬЕМе пев ОК ВУ. кеКЕуКаю х і ще ї куту М МЕТ му ую юну х ПОД тн кулетривкі х чиї сабо ові зай зу ва й Е ОО т ВХ ай водо щ Кинномурая КК мух Ж Кенпхнукиня БМК, мима фік техн ви пси іх замки В Мт Мед Ул етос пн ув нний МК я СБ І ТЕО ПКЕЕ 1 БА
У. са сек юит кни ВИ ІК кни ООН ЬЯМу ої ЗК : хх о чн
- ВЕН Глен їх ей ї «ке хе : її і . заз в зві Єва, я Ач чен хе Б м 7 х є Ї ко ЗК Ж т яд ят-о5еМи КЕ і ру ре х З г і Е ї Хв, 1 -а МІЯ до КУ Же в ХВО ОБРКО 3 ок і: М і а в п м 0 їхЄ чо їх ; т ол у ев я В п рт трон оИВВ ее У дотик ку ще Ох 5 і с НИ ОЯО0 ЯЗ зо 905 Яд 305 Концентрація АБС. нг/мл г гу т х : АЮ звнтнтунмМм о БСзвіве м . ? до БЖ Е юн няних Аню тнжтетенннююсттю нн ! туї те і. : 2 мВ.) : ; Вт | аква нити чуччттетиткттнети ск пкототитнсноктектненнкно : в п : ВЕ У : ре плете АК Ж КК ОО АЛАХ кит АМАТВ х птн Го хавняю но ї 3 У донна В оооосектттнснолчячесснтьнсого Ффіг.15 а КМХ ШО ма БО ! су. тиж с ту ж й скор юку ї т отут Б сові доня че ДАЖОБЕНИ і ка за Я ЖК ОХ : хм ' ман Є як і х з ж себую КД УК МИ ж і і : е : х В й зу стю У я х ї » і А -е- ХВКоЯБА ОВ ЕВ Б в КЕ : В і З х плннтюнстккнку 5 й ії і г ях дждажиєтію юю У 4 их 1 : Ж зе : і Кезикх і й г ! і « І мо Кк ОКА їз : К ' х ЕВ а шою В З ВОК НН : т і во х ШОК : Яка ГІ : М ; аж вх ех -- І ИН НИ і. : М ОЇ ні БУ три х І. ї у ї : Е Во Боннідн нут ЗАВ бінсодннвві У ММ І 4 в В ї ї я он ай ЗК ния Ко : ж ши мо о За3 яд об рення , ОМ оду ; : Ом: жа - їе ЩА а : їди їх ї омневчранія АТО, ме ВО роб Ж ут тд ння ві я пл А УАЛАДАЛІ КА АТ : У с є ОТ, Ух їх у : ЕМ щі ой а УТ осн Мине ВОК в щх вв От я З І з роя НК Ен Як во Му їй ж я. сер «кож, ; ї ; ХУ: я АТХ Ж ж ВІЙОК щої і Ме х х 2: хи ати ток ки т . х : в с Х яко ХВНТ ЖЕО Бій д : Кк ша х фею юю ження ння - З 13 21 : - щи ЛК: ї ми шк Мо: 11 5 Я сив ох х ме о і ло І і Кк Ж зе зведе во їх її : й мя їж вико! З щи ра ; х В х дл ут Ой га : В 54-- м рев Я ОДБ її і х У Тут Мр пенні що Ко г Н о я й - . у 7 зх Кох : : 3 шо 000 оо ою? ме юЗ як ов с ння ВК Умови : Киниентювів АС, Что Ху КО беркут тортик пизди АС, мем їі я КО ї «хи ту и З я ВУ сао уд Н ПУ ІМС їде чо і хвв-еже З : Що х пеня ту га 54 Б «ріг. 14 Киживанить мищей є дисеміязнаній . чт, дей у лнссміновавів зидев 4. ни МУ сту Каплзна- Ме по жжУку ТКУ хЗ? стран Каплана я Мебра! ПК я Я х ї Ко: Ж і ї І Кен З що : Мини пня ТІНИ і у ї сеху ї с зу пух сх ж : ї : ї У КВІТОК Ю І і Ж: с і : з І ді : і : хх Др юну «Кох : щ сх 7Е фунт ери я Її В зу хк Лав ніслх | хо вв не да ваклантами Козпавитквіів я плазмі АХ х мух ТКАНІ я пон А У сухих ме хол дівевж пувхміжКі щОІНЕля ДеВаВХ Мріє чВКХ Х Ву КК кі КЗ ше З М 3 тях, - У ЕХ З зх я і сш Я Вр що КУ техн яке? «Ж М ож ї ВТ, МОБ нездз еей Б ЩЕ М Мод ро роя НВОАД урюНові же х З нежх КО. зва Нр Ссдо гл КО ке ожвеіа що М Кона Моду ЗХ ж що Ї ТЛІХ ння ха ХМ Нама : СВ п с фо ов Б вда БЕ БОВКЕ ЕК оброблені вання я В т | ОХ о М т ГО В КПГОЗ в сь ІЩЕ 2-2 КА ЗБ ЩО ОщЩВ 5 З см МОЇ КхО щ В С В х "І Б ІО7ЛЮ ВО п що ОБ ВО 5 ОБ СС В с м ЦЯ Кос пов ВН Ен 55 А Цщ КК Кк ЗЕ фун тетерет кре нктеня ни лання 7 од ТРА ово кА З І КЗ Її Нав» 13 5 1 шен теоре ВАК МВ «еко ул» ТОМ їв 13 2 Лор» Її і Ї те ТУ нт Коіеннтнях КО : Лювьії її сн ІЗ : У, ддяпляянанак кн нн у тААКААНКК АН і я зх чне 15 йо по. 4 і Ж: з асяяя -ж ї з їй дові ХА х ЕМ хх Ж КУ м х - єм їм і ух х же пава КнО З дії ту х . й й од уч і М ХК апЯ МИ ї ї й ї сік код ШЕ М ; св ВТОЕМО А лані В У Її а 3 ї ху х ї ща х ї з с й прю Ж вав кб Я ді В зв ой; С Кониентрація вом фору хни тленкюнх ння, І ВІЧІ хх хі Фе В ц Ток М Ж ТО: Коле вВтеж сія ва В ором що в: В БОР ОВВВ сем ДМК у « хи ВВ І ВВ АТ " точ я а І Бий 1 КТ ж: ВЕ ин і З 1 В ШИК «у ; 2 5 В «ДА : зх Б хо ї руб, сну ка і А ЯКЕ: ВЕ а ї Йоан ян с о дмй ї ї звшж ані Яд про гр щей х чен Пор Ві : ОТ ОК а п ЕКО Те Кк ж ї сок че Кк г, В ВА ге Я ХВ ОР О вн: у чирунуч ки хі сао КІЗ МЕРКу іч Я ї і : - Др утт у ууютуях т ЗОВ зу ах зах ро зах Кована, нем
Фіг. 16 МВ пол НЯ МП КОМВіВія яютпй --у мч 3 -- : У 1 є ще м ж 5 2 і ее Кф лайн т Зуз до ї сх З З С я шко х я ж х чик аг ж ста Її : що Х у сен ХВВІЯВЕБЕМИО т Є с У х х х у, х й . ШЕ леза зе МІ 8 сови 2 ме і кю КВК ДМ х Я Я ді ке -Е Ач ї Скай 3 й Ї 2 Є ї ІЗ У 4 х . чи умі ре ко же АК з 3 фе ї -й- 0 БУВ Я а : А - 3 х ії З : сення Тв ВВ Юм Я хв ї х і ' Тае СРМИ я З чу х 5 й : ах . уд гт5 3 х ще З пф, ВК з49 со зу; діях й м знан зон зни осо пес фо ин шк м 5 ху « х - ягел ча» пі Зх. 3 ЗІху а то ще ще цк зе це що Кевиевтрнції АБ ема їі Ж я а г 1 т Мові сх а : : Х Бен пам що ЗІ ж
З. ї Ї КН ще ій й х я ве і м : ВЖЕ жу» г Тука КТК МВ «ікрі» ооо нку умах диучю пу г я Ж «5 ЕВ Ж че ра ж х г к в МІ А в В шив ук х не нш -е ЕМПЕВОВЕ НЯ К Жкі вижили х : 1 мелена вювкю. я і я МЕщА в, у ДОК еютруї ї : жі й 7 ре РК й В і і? жк же З : Вртрите тижня У 1 й Ж х 1 ВОМ днк ї- ЩІ Ко ї х х І Мня ї БО а В З А й і в ; о Ж : 000 і ЖОВ нов х ; ! че Іран У НВ УВА дак ам м г ! х щ т х ХЕ їй Б їй хх і Ї 7 ОО зу ще їх В х Х дюеннююєтиниттнналитттнмх а ка ї . зала й пфусняуюу утекти ен ракю улян и СН: КМТ ста 2 0 ж З 30 Ба Же б ва ж і і мір ХК Х СВК Чак няних ВО 7 Я вам ж й - ВРХ МУ 5 дерен» «ень З хокеу дм това» «вкюдаю. МК їх КУ - в «ріг. 18 п свіжа снровака МОБ є -й пк, ТА ше . пддихятаохютеють м хек В Здаю МИХ В я. пекакдкжжжллинтя тя се пи В а в ї рок х Ж ЗО тами хи 8 1 ча Хі КЕ им МК ї Еш -- ХЕВеДОМОКО (загальний 60) КК х
ШЕ. Ж і о4 ШИЯ френч рр ур унррнтрння хг т 4 щ тузі Мові І х Авів шкубУВання В хх т. з с ху Уж У пе р. - Свока сироватка одини У - В «в Ж І ут ом и ффрооохуєсееголсотототнкянакн пнклюння ВВ З З пспттсерреттттт "г їх ся 2 «чу я бо Хе АС 5 ту ї «і --- ХВЕІЯОрВРНО (загальний ІЕС) з У -5 ве ; ШЕ я ій офорт ж рт уття дттртрятярттрнннфт кун Ге а т ї4 я ів Зіка В Анів вкубування в що пе й
Фіг. 19
ФК й іде ак т іх З М чу вд: -е за 7- УВУ мебаю ВХ Таж дя зо ї чн КК ТО юки с. Ок ееррать Х ; а о ДН т р у ша а дол Се хекк ху. лей чедх Ко лей в я де Пекун и МЕЖ кю жк. злл учить жхжжи «кл я ак - ММ кклните ох Нео "в ДЕ шжеоя з ТАКУ А кВ. Е : З Пон, ВВ З Я З Ух с я он дню чт не Я у їх З Ат жук З ЗВ мех і ж, кл ля х ща с т-й х х т є скжнння же ек к - а БУ ; й о с г дхкк «кккх шк За Я вн ї дон В хВВі-е що щ я дк . : хх Та дулю сук Х деекетеєхух, моб а : нн ВВ 0000 ХВ -ЯО ОБ ВУ загзьний р Й Ж 3 ех ДО знкиккнкллакоіоомоснннжттот Хвильові В -е АН М А : її т НЯ : пф ет т де тунік Кук кап КУ ЗА КУКА ЛАК УТУьюх ЖЖ Кт ккн, І ї гя 7 Н У ї кі кхї см ре ці й НІ її жа я її їв Ше щ
«ну. 20 й» Ах -4 се щ но ие -Е р В жо ще ща , Б зок як мує а - щи З - й щи Мои У г ща ик 54 Щі Е У в: 5 сх Е ТВ й м. М їй. ЯК м. А У ц Кк х с ех ох с що Ма як де як як зе с » зх Ж «В М їЬ. НЕ КАХ а ДлиИ свт иси и у ТИСИ Си у уми и пи ЛИ ди М и и Види гани Пил и туту или и ЕЛЕ у М МЕ ВИ АД ВИК ПИЩИК, В ЕМ ди ПТМ ОТ КИЕВу К И КЕ КЖиИИ ИИ А ИКККАККИКИКХ КОЛЕ інулін М СЕ МАЕ А до. Ве ОСЗДИ Коен оо о ОН ЗК Я УК ЕВ
І. од ми Ми ни МЕМ ОМ я с СИМ шИи Ту ОМ Он В ; ИН КВ УМ КО Ми МЕ УК оЕУ СоЖЕ МАКИ. г гаї хз ВТО и и В я ПОМ ОО ге ЕК ІА МО а А Хе ТИМИ МИ я Мк ММК, МОКМИТуИ Ин К хх ЖИМ МИ МАМАМИ МИ ПИ ВИМИ КАМИ УМХ я Я ут и От. ДИСК МЕ МИТИ М С М ММ ІС МІК ТО. шия М хх, міт зккдекктінттютднюя сх пожатівн тнжанЙяя тав, т іт інет. со от кит Пт жатки т Ат жа жахи х лоном Енн. ПИ Ким млини ПРАВКА : п У Око. ПОВИ ох У: и БЖ па ї Й : ше ОСБОДОМ. що ПО ие С Же 3 о дже, Ж г ПЕКИ СЛ ОКИ СЕАНСІ ЕМКОН ШК КЕ, ДК ке ї 35. я мг. і
СЕК БА вхв У вхКи меш зх ях о акля. сво зокій ли дез Є х хх сажу - їм ух ва їх х ХЕ. певповвювач ж ХО 9503 з. наподмювах Ми мя сени - тучаі шч. му св м хх х Їеччумти і 2 ждтух дути ке ск Мдхх, о МІШКА льиВИ Фета ВВЕ и, о ТК о ХВ ЗЕМ З КЖУХУ фмиеюия вд КОзбмукк Де Е і брижі ок я меш ж сх і кидА що о я Ж аку ХЕ, ож ДК: У Ще МЯЙ яву ще ная кати я 5 зм я зх : Вояж - : що и: п з жк Ж фен ок з чук ж в з Є І В В МЖК жо дк о пе ЗИ Ж па ж ЕЕ Же -е СЯ ов ак ценший КЕ, ща диня Шо ТЕ ща шо. - ков их их 58 в а тя офоодухф яви вен ВАВ нут учня Я ВЖК у оонннчннчянтумттння - БЖ ЖЖ юусоікодлоувквнет и - г оо 033 00«в х в т 2 г 5 жо оо Твіт ниськіз се пи оя севкілууніх - и є Б зх дв пжля ранлемевані Дн після рандемізвнй ДВ яцеля ренломін х ВУЖ коу ВЕК де ВН БІВНКУВаХ КУ фея вав ниваЗ. сн 5 ою: 22 що х; к. «ект х ЗИ юс» ХВАЖ ОМА х їжу ЕМ ДІ ННІ Й -- 0 0 РріРрмикг)У бо ще В ї ЕН «ї - як ж К ще ї ж : хю 5 ЩЕ Же ох . я ет дк Кх ьо 7 ж кет З й 5. Ще п и о ков їв пово я ШОЖЯЯ око дви ве ХК да кв во м фев Ех у Ж я ко « З ок ОВ Ноя З КОВО В щ Є Я. нен в ов ов жо но г шо оз Де вкл рамлевух дні паля вандаменниї фіг. 22 тА ля ЯКІ У, каз сок ке срях зва ска жа і . гу х щ а я чт г ДК ЛІБІТММІТУШУУМТМКІТ. ОВК МАБИХ Жим дажІ ІВАНО ОПЗКЖНОЖУ ЛАТ ТІ НАМЕТИ ОГуУДаІАТЕ ОБЕСТЦОТЖТИ заЕ С ят2 я ВІДУМОІЗУЖУА УУТЬКИМ. БЯКНОЯУЄ ОЖУХЕУДІМІХТЕ СерЕЖРУ одіБТВТМІ ЖУКОВА ОЕЖИІВЄ КОМУ пижщеревиОО В БОМЛИВЖМЕАУЮМТВТИМ ЖОЯЕІІКАМЕ ЖЖ МІ:Т ФУЖНУЗ ОНІЗФВЕ МОВ ОВТ ОУЖРВІВТІ МИНА МоЖНИТеХуо ІВ БІКДРОВИХУ НИНІ. СОНЕТ ЛІЖУХ КМУ: ОПЖОШКМ: СТРЕЖТОХДИКТВУЛ ЗКУ МОМ ЛІТ. УЖ ІАТх МОКЛюУ СЕЛІ ВТІ ГІ ЕТКУК ЕИсУЮУИ ОВУ ОШИХМИЗІУРЯ ХУСТОК ОПЛОІлИЗ опіБКЕКІВІ ВКА ІЕЕ ІВАНУ СЕЛІ МИШКИ ЗиЕШОЇ ЯТІ. 110 ШПЕМТОФКВЖТАРОКІКВАТІ ОДИЗХИКАВИ ОБШУКИ УМХ ВІС СДОШЖНКІ ОЛІРУДЕЕМАВИ ВАТ ТІВ МММАВТК ХМЯКЕУАТУ МУЛ вожфизн сі ШКЕУСДИЛХТ КО КМЖР ОМВКММЕХМИ СМ НОТЮУТ ОСЯЖЕКНУ УДК ву БАЗА ЖАСтМ КН? пуф
; . . М теї . КОМІ. я: ср на сив --е : з з в ж м Ме пт ЗЕМ ЖЕ ПММ ТА ЕНІ ВІТ ОЖЕДДАТОЖЕРКВІ: ОВІКІЛЗМКУУВЖНКМЕ ОДЖЛІВВІКТ УВА КЕтеИАх саРУМИ. ЗКлІЕМАХ кІЖВЖІНАИНХ УМА ЕЄКЖКЕТЛУ ХУ хто ОІЖМУ ОУЖАЕЕОУЕІ ОДІБІТИЖМУТАХАМАХ ДУБІВ КА МТВ КАМ ОСНО ВОДІ МОЖАНІСЯФІЮ УАНМ А КЕР ЖУПТЕ БТІ ВОК ЖМОЕВИХ КІБЖАТУВІКАЮХ окосттфРІ ВАЖКИМ МУКАВ КИ ВЕМТМИХ Вичакіуєеіщі. Р ДОМДКЖ МИ КЕТІ ЗК: ОКУВОФУЄТЕВУЇ ЛІУВСЯХУАИНМК: ЗУБ ВУ ВКМ ВАНТМОХИ АВ НФУ. Же, МадАвіені КУЦИК МИКИТА ЗРМЮ СКК ОМ ЕВІХ ОАХОІЗОЖМЕЗАМВАК ЗК ОКО КВЕСТУ ТА КОТ Іа. ЕЛЕ МОЗКОВОЇ ДАТІ КУТИКИ УИЗУКІ ХТУМИ ОбУЖМНЄЮЮЕВІМ АЗС ВОУАКНУХИ ЗМІ ЗДУ ВУАН ТЕ ей ОУММІЕМІ. ВШРИМ Тео РУЖЕНЕ-КН» ОКИС КР ЖУ СВІ ЕЖЖНЕ ОЖУЖОИТИЦ УЮ. ОАІДІЖИАТУМЖАЖЕ ОЕМ ВІД ЛИТКИ В АТТУТИК МИР. ЖЖ ИК «ріг. 23 і і : і і : , : зва кат | . і сала дви: 0 МеКаннк о о Пехважх І Кез НИ МОС КО кКоани є Кар : Клонп АЮ ОБ Не і тя і і ; ; " ; і 5 ї і . 1 ї ї х джек юю інже жакет яке и и в І теж еткжююю куту х тм. пефнеттетня ук кююжюююю ють ні ет кт кжтвкккт тк я 1 зекетекнт же кю і хання ! пів | тя ! НЕ ! ях ; ві і . 2 хеннетоннесттттттттстетто нет спветеровістеосичестееттусгоснк стос дент сосок кокс гсеесосексюос» ут В неті я зоні кісоесн ге У . хх ле м Кк - зок я хана" вд і ма! не зав | кі і З і ; і фени ки мене сотки тих жи чіл АЛ г Глюк пре южт т я МОЮ КЛЮЄ тес Т ІІІ ТЕ Ру юс КА ЩА Ж я ян ххх цк як кт р : ши ! с ї чахвн-япо а | з і вв і ча ; ла і ЗХ птн фе нн ет тт питне Гвхнніяода дод : Вл. те їв з нн нен ння соках Ач АКАЧя АК ня ча коая попід оехввтом | що і віл5 ! щі ї Зк | 35 ! ПУ я 5 пунк дракон кіоски Ди нн пнюп сно есте пеукккжкжтсюкоєке І Ї ї ; Ї інахдва яп І гм ! Фі5 і ще : це ! з4 івихвнияоам т | ве зе : щі 35 і и і з | 32 ря пп ренні нн нету нтнвункнннннненнн» ще і І и ж ям і «жа 1 зх : з Я 3 І уоекесееюсєттчюуєтн уч чачечконоенетіндеовеют жккестестсвоссооогесесдееесекеттттвтвоюкюсооонускось сосодх ттстснтен тонічні жк ужжКж КК КАС еКитнл Додати чинни, 231: Два пезенжних. вмре ання З я ріг, 24 А Її Кліинни АВ БОВО? ; Б див. же ХНА АСК ЕМИ Ж І «в пюре ЗЯН ЮА вМу Е і о бобейшіь о о -- о ВВА ОБ МИ х и Ск. В х жк. оо З воло ще сон ухю юю й ' у й. - ей ВДОВЗДО ВУ З і я т -жр афекти
В . й хх, м, В сокий й х нарн о ВИХВНО-ВОО ОВО МОЯ Яке А к : Ж. У, -е ВахИНе ов ІВАЬНЯО Кк ї м х, ж і |: ян, яд ее Зам « пн и иа В ння і о ХЕ Ковцентранія АВС нг/мл З 5 Кров АЮ шк і ї7 пам ання о кжллю пилу жу жжалттжт нят ХВнІ Ого екМ мА і НИХ ВМ ЯЗ За: падненннянвсннчаччнннннс тонни. пе Езея Я За МеВ) з Дт я вія дк тет ст пет тов теттетх пеня ютеннндянжюннняня Й Еезухвв орному вне і Генетично інею 1 УР та : лклялієтя няття нути я корал тент ння зеесккх со ттсодіжинтлюучяннянй гехВи зов оче РМу В З нн похо пюнкитєжежнттнкннню ахвв 1-2 ов Мен я і Дно ое несе ТЕ ст кю сю юю якіх сі а ї і грастузумав КИ «в ЩЕ Однак чтение « -к
Фіг. 25
МІУ у ш ЖК ж плете Кк кавомекя У унюх МКК І ЩІ г: ххх : шк їн ек них Не зимі 1: 11 пу: І КЕ Ше пкт РОВУ ти мі дих ії ФК 1: БОМ ен я РОМенвфннняоя і й БЕ ТБ : ї: щі КІ ТЕ Ро Ї пощеже яко аю : г КН ІІ: В БЕІАХ ОЇ І ОХНЕЗХ АХ р Ом и чик і: Я: ВК: Ко КБ РОБ і щі Іі КО іц щі Гек рення о Не : ней роди БЕ Рух БОБ К їі ває г ОЖі КЕ І ІІ Бод В фік х Не КОРКА. Ї їжі САК НТ аккаунту ТК булевих Кдчодюбі тенту енд дао Вк ди скляні м ово Мом Ку ння я я «М я я ка ОБОВ о ОА ще КЕ щк ее МАЕ Кк Кам М Ір ж нк те р ї і які ж ве Кк «яв хр ПАХ що я 1 я, і сф АВ ро» Е 1 І "у і і х «ОЗ тю СНУ г. х о хи ! 1 Мох х 1 Я 1 Її ох я ще А у я і і : з ОКОМ птн ря ДВ дрон з фено. .- Тіамониння БТ
Фіг. зе МОДА еВ : ча А : оно Б Ей, : Во їси : : і НИ і дутенк сх сп 3 о. іди НЕ ши р ТО ХЕНієОо»сАЮ «ДОВТНЙ рі у и Б ОО Ео ; ї пря ЗО Венері дної У: й | її : ї та А З я Ж ЩЕ. |і 55 1 ХВ САК «корозкийв з. ОЇ ЕЕ, Бо А рі орд р. А ; Кі : БОБ За і ї : І 3: : їх ня ї ї 0273 З хе их і : БР : : рівня Без САК Н 5 ї АСУ і і ї ОН ї ! : іх Ух З ; РОБ рогом З еротахю ут стик дян ту сети м Дена ЗХ дреєвучх тдестеюсе т «Акрортт нію -4 ек кВА ААВАВАТЮЯСЯ Е РОТ КАК Кн я -Же СЕБЕ и ГМх. хна НАХ шк і ; м І д Кк СУ УВІ їх
Є. ва ав о АВК САМ «деВЕНИ» І им ї мм - сть ч ме здчеак Тут х і ж і сйе ХК КАН «КОрокніИя т Н й ї тлу ж що 80 Ка 0 -- їз САН ке і 5 Х як Я са я 5 З ; й У ї д гу Ж тег М М кі" ж є и Ма вона і. ай У Дня ТИ фхеетенноетгофрфестся 00 Февалення Фоненннння нн я офухотоглтекя ефе ке БА Ка ке Ту о Відношення КІТ -
Фіг. 37
Матриця з ЗЛЕ КДНК дюн: зно каже їМакв ялин Ума ни.: КК ик раму ке ьоя х канви НЕКОТУ ЗО У В с її коки ДОН щої ще ОО о о ОО пра НИХ Мімеома прю яті С В нення нен З ах Хе ВУ ЕН ОО мошокухи В с оохенкюгчоосокинюкиннітннмї ОО : З ЩЕ ща кеатнвя перзвхних з ТЕЗ ЗМК ТОХ Ї іїукаких ві азувалиних З У молоку кяма ВУ В що НЕ НЕННМ Ева ННМЯ МО: Бе контуМктями ЗОЗ: ЩІ МКК Ж г Вірусвауииммі зукиАці Кк ахукалию Е мом кулю Я удннлннаоосояатсклоносое «Чу, ЯК Ма жмриж мя УЖ хе ЗЕ мер г ко ЖАЛА КВ ОА КА КА КВ ВОК пи М пі ул КМ КМ РК І КУКИ КК ЖУК жА літе ківі тю кю тю нні ж же ЖЖ ВВ В т ЖАКА ль ТА ов тт ту екв миски квота? Аівхак нина? Жвстекий Дівзакілотвау Я хе . 5 а «У СЕ зва Яадючрюююк МНС ВИ ще я щі Модне КСЗКЗВ Же? За ення НІНО ех і косо я З ряект МЕНЕ М ск КСОНЗА бе хукоуютькою КЕ Зк ке їх З КО ехо - Кок ШК ЗМІ А ме СУЩЕ ром КІЗ А ко беж» ДОВ 5 а і З БЕЗ: зе зе ТО свв то овещх ее дяк В їх . дих муха, ВОДНИЙ рутуюснаяцу : Февкн вторинних антитіло Ясен дівка вия х Жатеонуї арюхаєвимоЯї що дея свго тест ож ; ся хе «БЕ зфрегоюх ХХІХ ї а «ЕК піфососоюсх наз що ще Сярже БОСКЗА се од фююме СВІ В ад ЕСОМІА ем кое І п р Я Я хх зи Де де м у пери из пох 5 З са їх З т зе ках чт ії ле Хе Я зріг. 39
UAA201808044A 2016-01-20 2017-01-20 Композиції антитіл до ror1 і пов'язані з ними способи UA125718C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662280843P 2016-01-20 2016-01-20
PCT/US2017/014311 WO2017127664A1 (en) 2016-01-20 2017-01-20 Ror1 antibody compositions and related methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA125718C2 true UA125718C2 (uk) 2022-05-25

Family

ID=57966152

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201808044A UA125718C2 (uk) 2016-01-20 2017-01-20 Композиції антитіл до ror1 і пов'язані з ними способи

Country Status (16)

Country Link
US (3) US10618959B2 (uk)
EP (1) EP3405496B1 (uk)
JP (1) JP7000660B2 (uk)
KR (1) KR20180101554A (uk)
CN (1) CN108848669B (uk)
AU (1) AU2017210327A1 (uk)
BR (1) BR112018014615A2 (uk)
CA (1) CA3011815A1 (uk)
CL (1) CL2018001971A1 (uk)
IL (1) IL260689B2 (uk)
MX (1) MX2018008926A (uk)
PH (1) PH12018501554A1 (uk)
RU (1) RU2766190C2 (uk)
SG (1) SG11201806120WA (uk)
UA (1) UA125718C2 (uk)
WO (1) WO2017127664A1 (uk)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201803098VA (en) 2015-10-30 2018-05-30 Nbe Therapeutics Ag Anti-ror1 antibodies
CN113599533A (zh) 2015-11-25 2021-11-05 乐高化学生物科学股份有限公司 包含分支接头的抗体-药物缀合物及其相关方法
CA3011815A1 (en) 2016-01-20 2017-07-27 The Scripps Research Institute Ror1 antibody compositions and related methods
CA3061546C (en) * 2017-04-28 2023-09-19 Julius-Maximilians-Universitat Wurzburg Ror1-specific chimeric antigen receptors (car) with humanized targeting domains
WO2018237335A1 (en) * 2017-06-23 2018-12-27 VelosBio Inc. IMMUNOCONJUGUATED ROR1 ANTIBODIES
GB201710835D0 (en) 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc ROR1 Antibodies
GB201710838D0 (en) 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc Bispecific antibodies
GB201710836D0 (en) 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc ROR1 Car T-Cells
AU2018315127B2 (en) * 2017-08-07 2021-12-23 Nbe-Therapeutics Ag Anthracycline-based antibody drug conjugates having high in vivo tolerability
JP7448903B2 (ja) 2017-11-03 2024-03-13 レンティジェン・テクノロジー・インコーポレイテッド 抗ｒｏｒ１免疫療法によってがんを処置するための組成物および方法
GB201721802D0 (en) 2017-12-22 2018-02-07 Almac Discovery Ltd Ror1-specific antigen binding molecules
WO2020018964A1 (en) 2018-07-20 2020-01-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for controlled expression of antigen-specific receptors
EP3636284A1 (en) * 2018-10-11 2020-04-15 NBE Therapeutics AG Binding protein-toxin conjugates comprising anthracyclines, and use thereof in immune-oncological applications
JP2022514702A (ja) 2018-12-21 2022-02-14 オーエスイー・イミュノセラピューティクス 二機能性抗ｐｄ－１／ｉｌ－７分子
BR112021011982A2 (pt) 2018-12-21 2021-09-14 Ose Immunotherapeutics Anticorpo anti-humano-pd-1 humanizado
AU2019409805A1 (en) 2018-12-21 2021-07-22 Ose Immunotherapeutics Bifunctional anti-PD-1/SIRPA molecule
CA3122899A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecule directed against human pd-1
US20220089758A1 (en) * 2019-01-22 2022-03-24 Revmab Biosciences Usa, Inc. Novel anti-cd40 antibodies
WO2020165374A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecule comprising il-15ra
CN111286512A (zh) * 2019-06-05 2020-06-16 南京艾德免疫治疗研究院有限公司 靶向人源化酪氨酸激酶孤儿受体1的嵌合抗原受体及其用途
KR20210028544A (ko) * 2019-09-04 2021-03-12 주식회사 레고켐 바이오사이언스 인간 ror1에 대한 항체를 포함하는 항체 약물 접합체 및 이의 용도
US20220356246A1 (en) * 2019-09-27 2022-11-10 Nanjing Immunophage Biotech Co.,Ltd. Anti-ROR1 antibodies and preparation method and uses thereof
GB202020154D0 (en) 2020-12-18 2021-02-03 Almac Discovery Ltd ROR1-specific variant antigen binding molecules
JP2024508736A (ja) * 2021-02-12 2024-02-28 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 補体ｃ３抗原結合タンパク質
US11806405B1 (en) 2021-07-19 2023-11-07 Zeno Management, Inc. Immunoconjugates and methods
WO2023037372A1 (en) * 2021-09-12 2023-03-16 Immunorizon Ltd. Anti-ror1 antibodies and uses thereof
KR20240109617A (ko) 2021-10-28 2024-07-11 라이엘 이뮤노파마, 인크. Ror1-결합 단백질을 발현하는 세포를 배양하는 방법
WO2023183950A2 (en) * 2022-03-25 2023-09-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-ror1 antibody and chimeric antigen receptor and methods of use thereof
WO2024025343A1 (ko) * 2022-07-26 2024-02-01 (주)에임드바이오 항-ror1 항체 및 이의 용도
TW202417054A (zh) * 2022-08-11 2024-05-01 美商翰森生物有限責任公司 配體－細胞毒性藥物偶聯物及其藥物用途
WO2024064958A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
WO2024064952A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells overexpressing c-jun
WO2024077174A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3854480A (en) 1969-04-01 1974-12-17 Alza Corp Drug-delivery system
US3832253A (en) 1973-03-21 1974-08-27 Baxter Laboratories Inc Method of making an inflatable balloon catheter
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4667014A (en) 1983-03-07 1987-05-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Nonapeptide and decapeptide analogs of LHRH, useful as LHRH antagonists
US4452775A (en) 1982-12-03 1984-06-05 Syntex (U.S.A.) Inc. Cholesterol matrix delivery system for sustained release of macromolecules
CA1200416A (en) 1983-05-13 1986-02-11 Societe Des Produits Nestle S.A. Food process
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
JPH04167172A (ja) 1990-10-31 1992-06-15 Nec Corp ベクトルプロセッサ
WO2003016484A2 (en) 2001-08-17 2003-02-27 Affymetrix, Inc. Gleason grade 4/5 prostate cancer genes
NZ600121A (en) 2001-11-13 2013-12-20 Univ Pennsylvania A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby
ATE367394T1 (de) 2002-04-26 2007-08-15 Gilead Sciences Inc Anreicherung in der zelle an phosphonat analoga von hiv protease inhibitor verbindungen und die verbindungen selbst
AU2003263964C1 (en) 2002-07-31 2010-08-19 Seagen Inc. Drug conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease
EP1735461A4 (en) 2004-04-06 2008-10-29 Univ California ORPHANIC RECEPTOR TYROSINE KINASE AS A TARGET IN BREAST CANCER
WO2010080538A1 (en) * 2008-12-19 2010-07-15 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
WO2008103849A2 (en) 2007-02-21 2008-08-28 The Regents Of The University Of California Methods and compounds for lymphoma cell detection and isolation
EP1948680A4 (en) 2005-10-28 2010-01-13 Univ California METHOD AND COMPOUNDS FOR DETECTING AND ISOLATING LYMPHOMA CELLS
WO2007146957A2 (en) 2006-06-13 2007-12-21 Irm Llc Ror1 as a therapeutic target for lung cancer
EP2094850B1 (en) 2006-12-01 2013-06-12 Agency for Science, Technology And Research Cancer-related protein kinases
WO2008076868A2 (en) 2006-12-18 2008-06-26 Abbott Laboratories Methods and compositions related to modulation of receptor tyrosine kinase orphan receptor-1 (ror-1)
WO2008122039A2 (en) 2007-04-02 2008-10-09 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Selenocysteine mediated hybrid antibody molecules
ES2547552T3 (es) 2008-02-01 2015-10-07 Genentech, Inc. Metabolito de nemorrubicina y reactivos análogos, conjugados anticuerpo-fármaco y métodos
KR100994996B1 (ko) 2008-08-06 2010-11-18 한국과학기술연구원 페난트렌 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한확인 방법
WO2010124188A1 (en) * 2009-04-23 2010-10-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-human ror1 antibodies
US20120282177A1 (en) 2009-11-02 2012-11-08 Christian Rohlff ROR1 as Therapeutic and Diagnostic Target
AU2010315057B2 (en) 2009-11-05 2015-05-14 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Catenae: serosal cancer stem cells
WO2011071849A2 (en) 2009-12-07 2011-06-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Pyridinone hydroxycyclopentyl carboxamides: hiv integrase inhibitors with therapeutic applications
CN102712695B (zh) * 2009-12-18 2015-01-21 堪瑟拉公司 能够诱导细胞死亡的ror1生物抑制剂
US9242014B2 (en) 2010-06-15 2016-01-26 The Regents Of The University Of California Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 (ROR1) single chain Fv antibody fragment conjugates and methods of use thereof
US9163258B2 (en) 2010-07-23 2015-10-20 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method for the treatment of obesity
EP3828205A1 (en) 2010-10-01 2021-06-02 Oxford BioTherapeutics Ltd Anti-ror1 antibodies
ES2657970T3 (es) 2010-12-01 2018-03-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anticuerpos contra ROR1 de conejo/ser humano quiméricos
CA2818713C (en) 2010-12-02 2019-03-26 Nerviano Medical Sciences S.R.L. Process for the preparation of morpholinyl anthracycline derivatives
EP2649098B1 (en) 2010-12-10 2017-11-22 Kancera AB Antibodies against ror1 and their uses
GB201020995D0 (en) 2010-12-10 2011-01-26 Bioinvent Int Ab Biological materials and uses thereof
HUE053720T2 (hu) 2011-01-14 2021-07-28 Univ California ROR-1 fehérje elleni terápiás antitestek és eljárások alkalmazásukra
US20130131139A1 (en) 2011-11-17 2013-05-23 Oregon Health & Science University Ror1 as a gene target in acute lymphoblastic leukemia
DK2692865T3 (en) 2012-07-30 2015-02-16 Nbe Therapeutics Llc Transponeringsmedieret identification of specific binding proteins, or functional
SG10201701339RA (en) 2012-08-20 2017-03-30 Seattle Children S Hospital Dba Seattle Children S Res Inst Method and compositions for cellular immunotherapy
JP6479660B2 (ja) * 2012-08-24 2019-03-06 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア Ｒｏｒ１癌の治療および転移の阻害に使用するための抗体およびワクチン
WO2014055413A2 (en) 2012-10-02 2014-04-10 Bloodcenter Research Foundation A method of providing cellular therapy using modified natural killer cells or t lymphocytes
EP2777714A1 (en) 2013-03-15 2014-09-17 NBE-Therapeutics LLC Method of producing an immunoligand/payload conjugate by means of a sequence-specific transpeptidase enzyme
EP2789630A1 (en) 2013-04-09 2014-10-15 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3e and ROR1
WO2015113110A1 (en) 2014-01-29 2015-08-06 University Of Western Sydney A method for the purification of eye lens cells
EP3593812A3 (en) 2014-03-15 2020-05-27 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
MX2016013149A (es) 2014-04-10 2017-04-27 Seattle Children's Hospital (Dba Seattle Children's Res Institute) Produccion de celulas t modificadas, mediante transposon bella durmiente, acoplada con seleccion por metotrexato.
JP6817069B2 (ja) 2014-04-25 2021-01-20 ブルーバード バイオ， インコーポレイテッド 養子細胞療法薬を製造するための改善された方法
EA035419B9 (ru) 2014-05-29 2020-08-07 Мэкроудженикс, Инк. Триспецифичные связывающие молекулы и способы их применения
DK3453406T3 (da) 2014-07-29 2021-07-12 Cellectis ROR1(NTRKR1)-specifikke kimære antigenreceptorer til cancerimmunterapi
JP2017522893A (ja) 2014-07-31 2017-08-17 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ Ｒｏｒ１特異的多重鎖キメラ抗原受容体
JP6810685B2 (ja) 2014-09-04 2021-01-06 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ 癌免疫療法のための栄養膜糖タンパク質（５ｔ４、ｔｐｂｇ）特異的キメラ抗原受容体
JP2017536341A (ja) 2014-10-09 2017-12-07 エンクマフ アーゲー 卵巣がんの処置における使用のためのＣＤ３εおよびＲＯＲ１に対する二特異性抗体
US11952421B2 (en) 2014-10-09 2024-04-09 Bristol-Myers Squibb Company Bispecific antibodies against CD3EPSILON and ROR1
AU2015339402B2 (en) 2014-10-27 2021-08-26 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for boosting the efficacy of adoptive cellular immunotherapy
US10690672B2 (en) 2014-12-08 2020-06-23 George Mason Research Foundation, Inc. Methods for breast cancer treatment
WO2016094873A2 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Emergent Product Development Seattle, Llc Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 binding proteins and related compositions and methods
KR102556153B1 (ko) 2014-12-23 2023-07-14 엔비이-테라퓨틱스 아게 안트라사이클린 유도체를 포함하는 결합단백질 약물 접합체
FR3030807B1 (fr) 2014-12-23 2018-02-02 Thales Procede non lineaire d'estimation d'un melange de signaux
US11673957B2 (en) 2015-03-10 2023-06-13 Eureka Therapeutics, Inc. Anti-ROR2 antibodies
ES2923894T3 (es) 2015-04-08 2022-10-03 Novartis Ag Combinación de terapia con receptor de antígeno quimérico y derivados de amino pirimidina
CN107709359A (zh) 2015-04-24 2018-02-16 加利福尼亚大学董事会 Ror1‑ror2结合的调节剂
WO2016187216A1 (en) 2015-05-18 2016-11-24 Bluebird Bio, Inc. Anti-ror1 chimeric antigen receptors
EP3297671A4 (en) 2015-05-18 2019-02-06 Eureka Therapeutics, Inc. ANTI-ROR1 ANTIBODY
EA201890613A1 (ru) 2015-09-21 2018-10-31 Аптево Рисёрч Энд Девелопмент Ллс Полипептиды, связывающие cd3
SG11201803098VA (en) 2015-10-30 2018-05-30 Nbe Therapeutics Ag Anti-ror1 antibodies
CN106918698B (zh) 2015-12-25 2019-11-22 广州瑞博奥生物科技有限公司 一种检测人受体酪氨酸激酶的磷酸化抗体芯片试剂盒
CA3011815A1 (en) 2016-01-20 2017-07-27 The Scripps Research Institute Ror1 antibody compositions and related methods
AU2017209099A1 (en) 2016-01-22 2018-08-02 Janssen Biotech, Inc. Anti-ROR1 antibodies, ROR1 x CD3 bispecific antibodies, and methods of using the same
EP3411408B1 (en) 2016-02-02 2021-12-08 Fred Hutchinson Cancer Research Center Anti-ror1 antibodies and uses thereof
US20170233472A1 (en) 2016-02-17 2017-08-17 Macrogenics, Inc. ROR1-Binding Molecules, and Methods of Use Thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20180340026A1 (en) 2018-11-29
SG11201806120WA (en) 2018-08-30
MX2018008926A (es) 2019-01-10
EP3405496A1 (en) 2018-11-28
PH12018501554A1 (en) 2019-05-20
IL260689A (en) 2022-12-01
EP3405496B1 (en) 2023-10-25
IL260689B2 (en) 2023-04-01
CN108848669A (zh) 2018-11-20
CL2018001971A1 (es) 2018-12-21
US11242388B2 (en) 2022-02-08
AU2017210327A1 (en) 2018-08-09
RU2018129962A (ru) 2020-02-20
JP7000660B2 (ja) 2022-02-04
CN108848669B (zh) 2022-06-07
KR20180101554A (ko) 2018-09-12
US10618959B2 (en) 2020-04-14
RU2766190C2 (ru) 2022-02-09
US20200299381A1 (en) 2020-09-24
BR112018014615A2 (pt) 2018-12-11
WO2017127664A1 (en) 2017-07-27
RU2018129962A3 (uk) 2020-06-22
US20220153839A1 (en) 2022-05-19
JP2019509021A (ja) 2019-04-04
CA3011815A1 (en) 2017-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA125718C2 (uk) Композиції антитіл до ror1 і пов'язані з ними способи
ES2900233T3 (es) Moléculas que se unen a CD70 y métodos de uso de las mismas
ES2962651T3 (es) Composiciones y métodos para la inhibición de antígenos específicos de linaje
CN110248669A (zh) 工程化天然杀伤细胞及其用途
UA125577C2 (uk) Антигензв'язуюча молекула, які містить тримерний ліганд сімейства tnf
CN112004823A (zh) 表达嵌合抗原受体的修饰的单核细胞/巨噬细胞/树突细胞和在蛋白质聚集体相关的疾病和失调中的用途
UA127450C2 (uk) Рекомбінантний поліпептид, що зв'язується з cd123
UA125898C2 (uk) Антитіла до tigit
UA123257C2 (uk) Виділений поліпептид, що кодує антитіло до рецептора фолієвої кислоти 1
UA125611C2 (uk) Біспецифічні молекули, що мають імунореактивність відносно pd-1 і ctla-4, і способи їх застосування
UA124615C2 (uk) АНТИТІЛО ПРОТИ ПОДІБНОГО ДО Fc-РЕЦЕПТОРА БІЛКА 5 (FcRH5)
JP5848737B2 (ja) 放射性金属標識抗カドヘリン抗体
UA120753C2 (uk) Біспецифічне антитіло до сd3 та cd20
UA125501C2 (uk) Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, яке здатне специфічно зв'язуватися з альфа-синуклеїном людини, його застосування та спосіб лікування синуклеопатії
UA118950C2 (uk) Поліпептид, який зв'язує специфічний мембранний антиген простати та комплекс т-клітинного рецептора
WO2016023001A1 (en) Multispecific high affinity pd-1 agents and methods of use
CN108430498A (zh) 用于治疗自身免疫疾病和癌症的组合物及方法
CA2518944A1 (en) Inhibitors of extracellular hsp90
JP6628290B2 (ja) 阻害剤
CN110121506A (zh) 条件活性多肽及产生它们的方法
JPWO2012176765A1 (ja) 抗ヒトｐ−カドへリン（ｃｄｈ３）遺伝子組み換え抗体
CN107427550A (zh) 细胞穿透抗体
CN112105382A (zh) 用于car t细胞疗法的顺序方法
KR101741898B1 (ko) Claudin 7을 포함하는 방사선 반응성 위암 진단용 바이오마커 조성물
KR20180135028A (ko) 제어성 t 세포의 활성화제 및 그의 사용