ES2962651T3 - Composiciones y métodos para la inhibición de antígenos específicos de linaje - Google Patents
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Abstract
En el presente documento se describen métodos para administrar un agente dirigido a un antígeno de superficie celular específico de linaje y una población de células hematopoyéticas que son deficientes en el antígeno de superficie celular específico de linaje para inmunoterapia de neoplasias malignas hematológicas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para la inhibición de antígenos específicos de linaje
Antecedentes de la divulgación
A pesar de intentos durante décadas, ha sido muy difícil lograr una terapia inmunológica curativa contra el cáncer, siendo la base fundamental la capacidad de reconocimiento de antígenos, ya sea a través de anticuerpos o a través de linfocitos T (a través del receptor de linfocitos T) (Cousin-Frankel,Science(2013) 342:1432). Las inmunoterapias basadas en anticuerpos se han utilizado ampliamente contra el cáncer en casos en los que el antígeno diana está regulado positivamente en las células tumorales, en comparación con las células normales (p. ej., Her-2 en el cáncer de mama con Her-2 amplificado) o en casos en los que las células tumorales expresan un antígeno que puede ser reconocido por el anticuerpo o por un conjugado anticuerpo-toxina (p. ej., Rituximab contra CD20) (Baselga et al.,Annals Oncology(2001) 12:S35). Si bien los ensayos clínicos que utilizan inmunoterapias basadas en anticuerpos han mostrado producir una mejor supervivencia de los pacientes en un número limitado de tipos de cáncer (generalmente cuando se combinan con quimioterapia estándar), estos efectos suelen ir acompañados de importantes problemas de seguridad y eficacia (Cousin-Frankel,Science(2013) 342:1432).
Las terapias eficaces con linfocitos T contra el cáncer han sido aún más difíciles de lograr de forma clínica (Schmitt et al.,Hum. Gene Ther.(2009) 20(11):1240). Una terapia eficaz con linfocitos T contra el cáncer se basa en un linfocito T con una unión de alta afinidad dirigido contra un antígeno sobre una célula cancerosa. Los linfocitos T con receptores de antígenos quiméricos (linfocitos CAR T, por sus siglas en inglés) se utilizan ampliamente para reconocer antígenos sobre células con alta afinidad y especificidad y sin el requisito de moléculas de reconocimiento accesorias, como los antígenos HLA, para "presentar" péptidos. El receptor de los linfocitos T de los linfocitos CAR T se "intercambia" con cadenas pesadas y ligeras que se unen a un antígeno, obviando así la necesidad de moléculas accesorias del HLA. El receptor de CAR T recombinante se fusiona con dominios de señalización que conducen a la activación del linfocito T tras la unión del receptor CAR T al antígeno diana.
El uso clínico de los linfocitos CAR T está limitado a dirigirlos contra una gama estrecha de antígenos de la superficie celular, lo que respalda aún más la necesidad de enfoques mejores y novedosos en el tratamiento del cáncer. En particular, se necesitan nuevos enfoques para enfermedades tales como la leucemia mieloide aguda (LMA), en la que los resultados en pacientes mayores que no pueden recibir quimioterapia intensiva, que es el estándar de atención actual, siguen siendo insuficientes con una mediana de supervivencia de solo 5 a 10 meses (Dohner et al.,NEJM(2015) 373:1136).
Taussig et al.,Blood(2005) 106(13):4086-92 informan de que la mayoría de las células de la sangre del cordón umbilical, la médula ósea y de AML Lin- CD38- CD34+ expresan CD13, CD33 y CD123 en sangre del cordón umbilical y médula ósea, e investigan una subpoblación CD33-.
Kerderian et al.,Leukemia(2015) 8:1637-47, describen una terapia con linfocitos CAR T específica de CD33 contra la LMA humana. Los autores desarrollaron un linfocito CAR T modificado con ARN expresado transitoriamente para mitigar la citotoxicidad no específica.
La solicitud de patente europea EP3025719, publicada el 1 de junio de 2016, describe una inmunoterapia que comprende células hematopoyéticas resistentes a ser reconocidas por un receptor que reconoce un antígeno presente en las células diana. Esta solicitud de patente anterior intermedia no describe que el antígeno podía ser CD33.
En el presente documento se describen enfoques novedosos para la inmunoterapia contra el cáncer que se dirigen a ciertas clases de antígenos de la superficie celular específicos de linaje, en células tumorales. El tratamiento con linfocitos CAR T se combina entonces con el reemplazo de las células no tumorales mediante la infusión o reinfusión de una población modificada de células que no tienen el antígeno de la superficie celular específico de linaje. La recurrencia del tumor se previene o disminuye, manteniendo la vigilancia del pacientein vivocon los linfocitos CAR T.
Compendio de la divulgación
La invención, tal y como se define en las reivindicaciones adjuntas, proporciona una célula madre hematopoyética humana con edición del genoma que carece de expresión de un antígeno de la superficie celular específico de linaje, que es CD33, y en donde la totalidad o una porción de un gen endógeno que codifica el antígeno de la superficie celular específico de linaje, se deleciona mediante edición del genoma. Según la invención, la célula se obtiene o se puede obtener mediante un método para inhibir CD33 en células madre hematopoyéticas humanas que comprende el uso de un sistema CRISPR/Cas que comprende una secuencia de ARN guía y una endonucleasa Cas, en donde la secuencia de ARN guía se hibrida con la secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno CD33.
La presente divulgación se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que los agentes que comprenden un fragmento de unión a antígeno que se une a un antígeno de la superficie celular específico de linaje (por ejemplo, las células inmunes expresan un receptor quimérico que se dirige a CD33) causan selectivamente la muerte celular de células que expresan el antígeno de la superficie celular específico de linaje, mientras que las células con insuficiente antígeno (es decir, células hematopoyéticas modificadas genéticamente) evitan la muerte celular causada de ese modo. Basándose en tales hallazgos, se habría esperado que las inmunoterapias que involucran la combinación de un agente dirigido a un antígeno de la superficie celular específico de linaje, por ejemplo, linfocitos CAR T dirigidos a CD33, y células hematopoyéticas con insuficientes antígenos de la superficie celular específicos de linaje (es decir, CD33), proporcionarían un método eficaz de tratamiento para las neoplasias malignas hematopoyéticas.
Un aspecto de la presente divulgación proporciona células madre para uso en métodos para tratar una neoplasia maligna hematológica, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita (i) una cantidad eficaz de un agente dirigido a un antígeno de la superficie celular específico de linaje, en donde el agente comprende un fragmento de unión a antígeno que se une al antígeno de la superficie celular específico de linaje; y (ii) una población de células hematopoyéticas con insuficiente antígeno de la superficie celular específico de linaje. El agente es un linfocito T que expresa un receptor quimérico que comprende el fragmento de unión a antígeno que se une al antígeno de la superficie celular específico de linaje. En algunas realizaciones, las células inmunes, las células hematopoyéticas o ambas, son alogénicas o autólogas. Las células hematopoyéticas son células madre hematopoyéticas (p. ej., HSCs CD34+/CD33-). En algunas realizaciones, las células madre hematopoyéticas se pueden obtener a partir de células de la médula ósea o células mononucleares de sangre periférica (PBMCs).
El fragmento de unión a antígeno se une a un antígeno de la superficie celular específico de linaje que es un antígeno de la superficie celular específico de linaje de tipo 2 (es decir, CD33).
En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno en el receptor quimérico es un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que se une específicamente al antígeno de la superficie celular específico de linaje, que puede ser una proteína humana, tal como CD33 humana. En algunas realizaciones, el scFv se une a CD33 humana y comprende una región variable de la cadena pesada, que tiene las mismas regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) que las de SEQ ID NO:12, y una región variable de la cadena ligera, que tiene las mismas CDRs que las de SEQ ID NO:13. En un ejemplo, el scFv comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
Los receptores quiméricos pueden comprender además (a) un dominio bisagra, (b) un dominio transmembranal, (c) al menos un dominio coestimulador, (d) un dominio de señalización citoplasmática o (e) una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el receptor quimérico comprende al menos un dominio de señalización coestimulador, que se puede obtener a partir de un receptor coestimulador de CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, un antígeno asociado a la función de linfocitos 1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, GITR, HVEM o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, al menos un dominio de señalización coestimulador es un dominio coestimulador híbrido que comprende un dominio de señalización de CD28 y un dominio de señalización de ICOS. En un ejemplo, el al menos un dominio de señalización coestimulador es de CD28 y el receptor quimérico comprende además un segundo dominio de señalización coestimulador de 4-1BB o ICOS.
En algunas realizaciones, el receptor quimérico comprende un dominio de señalización citoplásmico, que es de CD3Z. En algunas realizaciones, el receptor quimérico comprende un dominio bisagra, que es de CD8a o CD28a. En algunas realizaciones, el receptor quimérico comprende un dominio transmembranal, que es de CD8, CD28 o ICOS.
En algunas realizaciones, el receptor quimérico comprende, desde el extremo N al extremo C, (i) un scFv que se une al antígeno de la superficie celular específico de linaje (p. ej., CD33 o CD19), un dominio bisagra de CD8a, un dominio transmembranal de CD8, un dominio coestimulador de 4-1BB y un dominio de señalización citoplasmática de CD3Z; (ii) un scFv que se une al antígeno de la superficie celular específico de linaje (p. ej., CD33 o CD19), un dominio bisagra de CD8a, un dominio transmembranal de CD28, un dominio coestimulador de CD28 y un dominio de señalización citoplasmática de CD3Z; o (iii) un scFv que se une al antígeno de la superficie celular específico de linaje (p. ej., CD33 o CD19), un dominio bisagra de CD8a, un dominio transmembranal de CD28, un primer dominio coestimulador de CD28, un segundo dominio coestimulador de 4-1BB y un dominio de señalización citoplásmico de CD3Z.
En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, el sujeto puede tener linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, leucemia o mieloma múltiple. En algunos ejemplos, el sujeto tiene leucemia, que es leucemia mieloide aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia linfoblástica aguda o leucemia linfoblástica crónica.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los receptores quiméricos tal y como se describen en el presente documento. El receptor quimérico puede comprender un fragmento de unión a antígeno que se une a CD33, un dominio transmembranal y un dominio de señalización citoplásmico, tal como un dominio de señalización citoplásmico de CD3Z. El fragmento de unión a antígeno (p. ej., un fragmento scFv) comprende una región variable de la cadena pesada que tiene las mismas CDRs que las de SEQ ID NO: 12, y una región variable de la cadena ligera que tiene las mismas CDRs que las de SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones, el scFv comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
Otros aspectos de la presente divulgación proporcionan vectores que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos proporcionados en el presente documento. También se encuentran dentro del alcance de la presente divulgación receptores quiméricos codificados por los ácidos nucleicos descritos en el presente documento y células inmunes (p. ej., linfocitos T) que expresan ese receptor quimérico. En algunas realizaciones, las células inmunes se pueden obtener de un paciente que tiene una neoplasia maligna hematológica.
Otro aspecto de la presente divulgación proporciona células hematopoyéticas genéticamente modificadas (p. ej., HSCs) con insuficiente antígeno de la superficie celular específico de linaje (es decir, CD33), que estaba presente en la célula hematopoyética antes de la modificación genética. La totalidad o una porción de un gen endógeno que codifica el antígeno de la superficie celular específico de linaje se deleciona mediante edición del genoma (un sistema CRISPR-Cas). En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular específico de linaje es CD33 y una porción del dominio constante de la inmunoglobulina (IgC) de CD33 está delecionado. La célula hematopoyética es una célula madre hematopoyética (p. ej., una célula CD34+/CD33-).
En algunas realizaciones, las células madre hematopoyéticas se pueden obtener a partir de células de la médula ósea o células mononucleares de sangre periférica (PBMCs).
También se proporcionan en el presente documento métodos para producir una célula con insuficiente antígeno de la superficie celular específico de linaje tal y como se describe en el presente documento. Los métodos comprenden proporcionar una célula e introducir en la célula (i) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de un ARN guía del sistema CRISPR-Cas (ARNg), que se hibrida con una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno de la superficie celular específico de linaje (es decir, CD33) y (ii) una endonucleasa Cas (p. ej., Cas9 o Cpf1). El ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de un ARNg del sistema CRISPR-Cas y una nucleasa Cas se puede codificar, por ejemplo, en el mismo ácido nucleico o en diferentes ácidos nucleicos o se puede introducir en la célula como un complejo de ribonucleoproteína formado previamente. En algunas realizaciones, la porción de la secuencia de nucleótidos con la que se hibrida el ARNg consiste en 18-22 nucleótidos. En algunos ejemplos, el ARNg comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 11 o 28-31.
La célula es una célula madre hematopoyética (p. ej., CD34+).
También dentro del alcance de la presente divulgación y que sin formar parte de la invención, hay kits que comprenden (i) una célula inmune según la reivindicación B13, un agente que se dirige a un antígeno de la superficie celular específico de linaje, que comprende un fragmento de unión a antígeno que se une al antígeno de la superficie celular específico de linaje; y (ii) una población de células madre hematopoyéticas con insuficiente antígeno de la superficie celular específico de linaje. En algunas realizaciones, el agente que se dirige al antígeno de la superficie celular específico de linaje es una célula inmune que expresa un receptor quimérico, que comprende el fragmento de unión a antígeno para el antígeno de la superficie celular específico de linaje.
Además, la presente divulgación en el presente documento y sin formar parte de la invención, proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de las células inmunes que se dirigen a un antígeno de la superficie celular específico de linaje y/o cualquiera de las células hematopoyéticas con insuficiente antígeno de la superficie celular específico de linaje, para uso en el tratamiento de una neoplasia maligna hematológica; así como para usos de las células inmunes y células hematopoyéticas para producir un medicamento para uso en el tratamiento de una neoplasia maligna hematológica.
Los detalles de una o más realizaciones de la divulgación se establecen en la descripción que sigue a continuación. Otras características o ventajas de la presente divulgación serán evidentes a partir de la descripción detallada de varias realizaciones y también de las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para mostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente divulgación, que pueden entenderse mejor haciendo referencia a uno o más de esos dibujos, en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en el presente documento.
La FIGURA 1 presenta una ilustración ejemplar de antígenos específicos de linaje de tipo 0, tipo 1, tipo 2 y tipo 3.
La FIGURA 2 es un esquema que muestra una célula inmune que expresa un receptor quimérico que se dirige al antígeno de la superficie celular específico de linaje de tipo 0, CD307. Las células de mieloma múltiple (MM) que expresan CD307 así como a otras células que expresan CD307, como las células plasmáticas, son la diana de las células inmunes que expresan el receptor quimérico anti-CD307.
La FIGURA 3 es un esquema que muestra una célula inmune que expresa un receptor quimérico que se dirige al antígeno de la superficie celular específico de linaje de tipo 2, CD33. Células de leucemia mieloide aguda (LMA) que expresan CD33. Las células madre hematopoyéticas humanas (HSCs) están modificadas genéticamente para que tengan insuficiente CD33 y, por lo tanto, no sean reconocidas por las células inmunes que expresan el receptor quimérico anti-CD33. Las HSCs son capaces de dar lugar a células mieloides.
La FIGURA 4 es un esquema que muestra la edición del genoma utilizando un sistema CRISPR/Cas. Un ARNsg se hibrida con una porción de un exón de un antígeno de la superficie celular específico de linaje, y la endonucleasa Cas9 corta aguas arriba de la secuencia del motivo adyacente al protoespaciador (PAM) (5'-NGG-3'). Las secuencias, de arriba a abajo, corresponden a SEQ ID NOs: 45 y 46.
La FIGURA 5 es un esquema que muestra una estrategia de edición del genoma utilizando el sistema CRISPR/Cas9 para alterar CD33. Un vector PX458 que codifica una proteína Cas9 y un ARN guía dirigido a CD33, se ha nucleofectado en células K-562, una línea celular leucémica humana. La citometría de flujo se realizó en la población celular utilizando un anticuerpo anti-CD33 antes (gráfico superior) y después (gráfico inferior) de la administración de Cas9 y ARN guía a las células. La edición del genoma daba como resultado la deleción de una región codificante del gen y una reducción significativa de CD33 de la superficie celular.
La FIGURA 6 es un esquema que muestra una estrategia de edición del genoma utilizando el sistema CRISPR/Cas9 para alterar CD45RA. Un vector PX458 que codifica una proteína Cas9 y un ARN guía dirigido a CD45RA se ha nucleofectado en células similares a macrófagos de ratón con sarcoma de células del retículo TIB-67. La citometría de flujo se realizó en la población celular utilizando un anticuerpo anti-CD45RA antes (gráfico superior) y después (gráfico inferior) de la administración de Cas9 y ARN guía a las células. La edición del genoma daba como resultado la deleción de una región codificante del gen y una reducción significativa de CD45RA de la superficie celular.
La FIGURA 7 muestra esquemas de receptores quiméricos a modo de ejemplo que comprenden fragmentos de unión a antígeno que se dirigen a CD33. A: un receptor quimérico genérico dirigido a CD33 que comprende un scFv anti-CD33, un dominio bisagra, un dominio transmembranal, un dominio coestimulador y un dominio de señalización. B: un receptor quimérico dirigido a CD33 que comprende un scFv anti-CD33, un dominio bisagra de CD8, un dominio transmembranal de CD8 y dominios intracelulares de CD28 y CD3Z. C: un receptor quimérico dirigido a CD33 que comprende un scFv anti-CD33, un dominio bisagra de CD8, un dominio transmembranal de CD8 y dominios intracelulares de ICOS (o CD27, 4-1BB u OX-40) y CD3Z. D: un receptor quimérico dirigido a CD33 que comprende un scFv anti-CD33, un dominio bisagra de CD8, un dominio transmembranal de CD8 y dominios intracelulares de OX40, CD28 y CD3Z.
La FIGURA 8 es un esquema de una inmunotoxina.
La FIGURA 9 muestra la expresión de receptores quiméricos anti-CD33 expresados en células K562 transducidas con un vector vacío o un vector que codifica un receptor quimérico anti-CD33. A: Transferencia Western que emplea un anticuerpo primario que reconoce CD3Z. La tabla proporciona el peso molecular estimado de cada uno de los receptores quiméricos analizados. B: Análisis por citometría de flujo que muestra un aumento de la población de células que se tiñen positivamente para el receptor quimérico anti-CD33.
La FIGURA 10 muestra que los receptores quiméricos anti-CD33 se unen a CD33. A: Gel de proteínas teñidas con Ponceau. Carriles 1,3,5: molécula de CD33. Carriles 2,4,6: mol. de CD33 conjugado APC. B: Transferencia Western utilizando un anticuerpo primario que reconoce CD3Z. Los carriles 1, 3 y 5 contienen los receptores quiméricos coincubados con moléculas de CD33, y los carriles 2, 4 y 6 contienen los receptores quiméricos coincubados con un conjugado de CD33-APC. C: Análisis por citometría de flujo que muestra un aumento de la población de células que expresan receptores quiméricos anti-CD33 y se unen a CD33.
La FIGURA 11 muestra la citotoxicidad de células K562 a través de células NK92 que expresan los receptores quiméricos indicados. A: CART1 y CART2 en comparación con el vector HIVzsG vacío. B: CART3 en comparación con el vector HIVzsG vacío.
La FIGURA 12 muestra la citotoxicidad (expresada como porcentaje de citotoxicidad en el eje y) de células K562 con insuficiente CD33 a través de células NK92 que expresan los receptores quiméricos indicados. A: Población sin clasificar de células K562 tratadas previamente con reactivos CRISPR/Cas dirigidos a CD33. B: Clones únicos de células K562 con insuficiente CD33. Las columnas, de izquierda a derecha, corresponden al vector HIVzsG vacío, CART1, CART2 y CART3.
La FIGURA 13 muestra un análisis por citometría de flujo de poblaciones de linfocitos T primarios. A: Clasificación de las células basándose en la expresión de marcadores de linfocitos T CD4+, CD8+ o ambos CD4+CD8+. B: Expresión relativa de CD33 en las poblaciones indicadas de linfocitos T primarios.
La FIGURA 14 muestra citotoxicidad de las células K562 a través de linfocitos T primarios que expresan los receptores quiméricos indicados. A: Linfocitos T CD4+. B: CD4+/CD8+ (CD 4/8) y Cd 8+ (CD8).
La FIGURA 15 muestra un análisis por citometría de flujo de la edición de CD33 en células K562 utilizando el sistema CRISPR/Cas9 y dos ARNg diferentes (Crispr3, panel superior derecho y Crispr5, panel inferior derecho).
La FIGURA 16 muestra que las células K562 con insuficiente CD33 presentan una proliferación celular y diferenciación eritropoyética normales. A: Análisis por citometría de flujo de las poblaciones celulares indicadas el día 1 hemina 50 pM. B: Análisis por citometría de flujo de las poblaciones celulares indicadas el día 9. C: Ensayo de proliferación celular MTT.
La FIGURA 17 muestra un análisis por citometría de flujo de la edición de CD33 en células CD34+ humanas utilizando el sistema CRISPR/Cas9 y dos ARNg diferentes (crispr3, panel inferior izquierdo y crispr5, panel inferior derecho). A: Análisis por citometría de flujo de la edición de CD33 en células CD34+ humanas utilizando el sistema CRISPR/Cas9. B: Crispr3. C: Crispr5.
La FIGURA 18 muestra la formación de colonias para células humanas CD34+/CD33- en comparación con células humanas CD34+/CD33+. Las columnas, de izquierda a derecha, corresponden a ninguna infección con lentivirus, control de vector vacío, crispr1, crispr3 y crispr5.
Descripción detallada de la divulgación
Las inmunoterapias contra el cáncer dirigidas a antígenos presentes en la superficie celular de una célula cancerosa son particularmente un reto, cuando el antígeno diana también está presente en la superficie celular de células normales no cancerosas que son necesarias o están involucradas de manera decisiva en el desarrollo y/o supervivencia del sujeto. El uso como diana de esos antígenos puede provocar efectos nocivos en el sujeto debido a los efectos citotóxicos de la inmunoterapia frente a esas células además de hacia las células cancerosas.
Los métodos, los ácidos nucleicos y las células descritos en el presente documento permiten usar antígenos como diana (p. ej., antígenos de tipo 1 o tipo 2) que están presentes no solo en las células cancerosas sino también en células decisivas para el desarrollo y/o la supervivencia del sujeto. El método implica: (1) reducir el número de células que portan el antígeno de la superficie celular específico de linaje diana, utilizando un agente que se dirige a ese antígeno; y (2) reemplazar las células normales (p. ej., células no cancerosas) que presentan el antígeno y, por lo tanto, se pueden destruir debido a la administración del agente, por células hematopoyéticas con insuficiente antígeno de la superficie celular específico de linaje. Los métodos descritos en el presente documento pueden mantener una vigilancia de las células diana, incluidas las células cancerosas, que expresan un antígeno de la superficie celular de interés específico de linaje y también mantener la población de células no cancerosas que expresan el antígeno específico de linaje, lo que puede ser decisivo para el desarrollo y/o la supervivencia del sujeto.
Por consiguiente, en el presente documento se describe el uso conjunto de células inmunes que expresan receptores quiméricos que comprenden un fragmento de unión a antígeno que se dirige a un antígeno de la superficie celular específico de linaje que es CD33 y células madre hematopoyéticas (HSCs) con insuficiente antígeno de la superficie celular específico de linaje, para el tratamiento de una neoplasia maligna hematológica. También se proporcionan en el presente documento los receptores quiméricos, los ácidos nucleicos que los codifican, los vectores que los comprenden y las células inmunes (p. ej., linfocitos T) que expresan ese receptor quimérico. La presente divulgación también proporciona células hematopoyéticas modificadas genéticamente con insuficiente antígeno específico de linaje, como las descritas en el presente documento, así como métodos (p. ej., métodos de edición del genoma) para prepararlas.
Definiciones
Los términos "sujeto", "individuo" y "paciente" se usan indistintamente y se refieren a un vertebrado, preferiblemente un mamífero tal como un ser humano. Los mamíferos incluyen, sin limitarse a, primates humanos, primates no humanos o especies murinas, bovinas, equinas, caninas o felinas. En el contexto de la presente divulgación, el término "sujeto" también incluye tejidos y células que pueden cultivarsein vitrooex vivoo manipularsein vivo.El término "sujeto" puede usarse indistintamente con el término "organismo".
Los términos y expresiones "polinucleótido", "nucleótido", "secuencia de nucleótidos", "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se usan indistintamente. Se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos o análogos de los mismos. Ejemplos de polinucleótidos incluyen, sin limitarse a, regiones codificantes o no codificantes de un gen o fragmento de gen, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ARN de interferencia corto (ARNis), ARN de horquilla corta (ARNsh), micro-ARN (miARN), ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Se pueden modificar adicionalmente uno o más nucleótidos dentro de un polinucleótido. La secuencia de nucleótidos se puede interrumpir por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido también se puede modificar después de la polimerización, tal como mediante conjugación con un agente marcador.
El término "hibridación" se refiere a una reacción en la que uno o más polinucleótidos reaccionan para formar un complejo que se estabiliza mediante enlaces de hidrógeno entre las bases de los residuos de nucleótidos. El enlace de hidrógeno puede tener lugar mediante emparejamiento de bases de Watson Crick, unión de Hoogstein o de cualquier otra manera específica de secuencia. El complejo puede comprender dos hebras que forman una estructura doble, tres o más hebras que forman un complejo multicatenario, una única hebra autohibridante o cualquier combinación de las mismas. Una reacción de hibridación puede constituir un paso en un procedimiento más extenso, como el inicio de una PCR o la escisión de un polinucleótido mediante una enzima. Una secuencia capaz de hibridarse con una secuencia dada se denomina "complemento" de la secuencia dada.
La expresión "vector de expresión recombinante" significa una estructura artificial de oligonucleótido o polinucleótido genéticamente modificado que permite la expresión de un ARNm, proteína, polipéptido o péptido en una célula hospedadora, cuando la estructura artificial comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARNm, proteína, polipéptido o péptido, y el vector se pone en contacto con la célula en condiciones suficientes para que el ARNm, proteína, polipéptido o péptido se exprese dentro de la célula. Los vectores de la presente divulgación no se producen de forma natural en su totalidad. Partes de los vectores pueden estar presentes de forma natural. Los vectores de expresión recombinantes de origen no natural de la presente divulgación pueden comprender cualquier tipo de nucleótidos, incluidos, sin limitarse a, ADN y ARN, que pueden ser monocatenarios o bicatenarios, sintetizados u obtenidos en parte a partir de fuentes naturales, y que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados.
"Transfección", "transformación" o "transducción", tal y como se usan en el presente documento, se refieren a la introducción de uno o más polinucleótidos exógenos en una célula hospedadora mediante el uso de métodos físicos o químicos.
"Anticuerpo", "fragmento de un anticuerpo", "fragmento de anticuerpo", "fragmento funcional de un anticuerpo" o "porción de unión a antígeno" se usan indistintamente para referirse a uno o más fragmentos o porciones de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno específico (Holliger et al.,Nat. Biotech.(2005) 23(9): 1126). Los presentes anticuerpos pueden ser anticuerpos y/o fragmentos de los mismos. Los fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, F(ab')2, scFv, Fv con enlaces disulfuro, Fc o variantes y/o mezclas. Los anticuerpos pueden ser quiméricos, humanizados, de cadena sencilla o biespecíficos. Todos los isotipos de anticuerpos están incluidos en la presente divulgación, incluidos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Los subtipos de IgG adecuados incluyen IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Una región variable de la cadena ligera o pesada de un anticuerpo consiste en una región estructural interrumpida por tres regiones hipervariables, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDRs). Las CDRs de los presentes anticuerpos o porciones de unión a antígeno pueden proceder de una fuente humana o no humana. La estructura de los presentes anticuerpos o porciones de unión a antígeno puede ser humana, humanizada, no humana (por ejemplo, una estructura murina modificada para disminuir la antigenicidad en humanos) o una estructura sintética (p. ej., una secuencia de consenso).
Los presentes anticuerpos o porciones de unión a antígeno pueden unirse específicamente con una constante de disociación (K<d>) de menos de aproximadamente 10-7 M, menos de aproximadamente 10-8 M, menos de aproximadamente 10-9 M, menos de aproximadamente 10-10 M, menos de aproximadamente 10-11 M o menos de aproximadamente 10-12 M. Las afinidades de los anticuerpos según la presente divulgación se pueden determinar fácilmente usando técnicas convencionales (véase, p. ej., Scatchard et al.,Ann. N.Y. Acad. Sci.(1949) 51:660; y los documentos de patente de EE. UU. núm. 5.283.173, 5.468.614 o equivalentes).
Las expresiones "receptor quimérico", "receptor de antígeno quimérico" o, alternativamente, "CAR" se usan indistintamente en todo el documento y se refieren a una estructura artificial polipeptídica recombinante que comprende al menos un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembranal y un dominio de señalización citoplásmico (también denominado en el presente documento "un dominio de señalización intracelular") que comprende un dominio de señalización funcional obtenido a partir de una molécula estimuladora tal y como se define a continuación. Lee et al.,Clin. Cáncer Res.(2012) 18(10):2780; Jensen et al.,Immunol Rev.(2014) 257(1 ):127; www.cancer.gov/about-cancer/treatment/research/car-t-cells. En una realización, la molécula estimulante es la cadena zeta asociada con el complejo de receptor de linfocitos T. En un aspecto, el dominio de señalización citoplasmático comprende además uno o más dominios de señalización funcionales obtenidos a partir de al menos una molécula coestimuladora tal y como se define a continuación. La molécula coestimuladora también puede ser 4-1BB (es decir, CD137), CD27 y/o CD28 o fragmentos de esas moléculas. En otro aspecto, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular, un dominio transmembranal y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización funcional obtenido a partir de una molécula estimuladora. El CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular, un dominio transmembranal y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización funcional obtenido a partir de una molécula coestimuladora y un dominio de señalización funcional obtenido a partir de una molécula estimuladora. Alternativamente, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular, un dominio transmembranal y un dominio de señalización intracelular que comprende dos dominios de señalización funcionales obtenidos a partir de una o más moléculas coestimuladoras y un dominio de señalización funcional obtenido a partir de una molécula estimuladora. El CAR también puede comprender una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular, un dominio transmembranal y un dominio de señalización intracelular que comprende al menos dos dominios de señalización funcionales obtenidos a partir de una o más moléculas coestimuladoras y un dominio de señalización funcional obtenido a partir de una molécula estimulante. El resto para el reconocimiento de un antígeno del CAR codificado por la secuencia de ácido nucleico, puede contener cualquier fragmento de anticuerpo de unión a antígeno específico de linaje. El fragmento de anticuerpo puede comprender una o más CDRs, la región variable (o porciones de la misma), la región constante (o porciones de la misma) o combinaciones de cualquiera de las anteriores.
La expresión "dominio de señalización" se refiere a la porción funcional de una proteína que actúa transmitiendo información dentro de la célula para regular la actividad celular a través de vías de señalización definidas generando segundos mensajeros o actuando como efector respondiendo a esos mensajeros.
El término "zeta" o, alternativamente, "cadena zeta", "CD3-zeta" o "TCR-zeta" se define como la proteína proporcionada con los números de orden de GenBank NP_932170, NP_000725 o XP_011508447; o residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares, y un "dominio estimulador zeta" o, alternativamente, un "dominio estimulador zeta-CD3" o un "dominio estimulador zeta-TCR" se define como los residuos de aminoácidos procedentes del dominio citoplasmático de la cadena zeta que son suficientes para transmitir funcionalmente una señal inicial necesaria para la activación de los linfocitos T.
La expresión "diseñado genéticamente" o "modificado genéticamente" se refiere a células que se manipulan mediante ingeniería genética, por ejemplo, mediante edición del genoma. Es decir, las células contienen una secuencia heteróloga que no se produce de forma natural en dichas células. Normalmente, la secuencia heteróloga se introduce mediante un sistema de vector u otros medios para introducir moléculas de ácido nucleico en las células, incluidos los liposomas. La molécula de ácido nucleico heteróloga puede estar integrada en el genoma de las células o puede estar presente de forma extracromosómica, p. ej., en forma de plásmidos. La expresión también incluye realizaciones de cómo introducir en la célula polipéptidos CAR aislados genéticamente modificados.
El término "autólogo" se refiere a cualquier material obtenido a partir del mismo individuo en el cual se va a volver a introducir posteriormente.
El término "alogénico" se refiere a cualquier material obtenido a partir de un animal diferente de la misma especie que el individuo en el que se introduce el material. Se dice que dos o más individuos son alogénicos entre sí cuando los genes en uno o más loci no son idénticos.
La expresión "linaje celular" se refiere a células con un ancestro común y que se desarrollan a partir del mismo tipo de célula identificable hasta células específicas identificables/funcionales. Los linajes celulares utilizados en el presente documento incluyen, sin limitarse a, linajes de células respiratorias, prostáticas, pancreáticas, mamarias, renales, intestinales, neurales, esqueléticas, vasculares, hepáticas, hematopoyéticas, musculares o cardíacas.
El término "inhibición" cuando se usa haciendo referencia a la expresión o función génica de un antígeno específico de linaje, se refiere a una disminución en el nivel de expresión o función génica del antígeno específico de linaje, en donde la inhibición es un resultado de la interferencia con la expresión o función génica. La inhibición puede ser completa, en cuyo caso no hay una expresión o función detectable o puede ser parcial. La inhibición parcial puede variar desde una inhibición casi completa hasta casi una ausencia de inhibición. Al eliminar células diana particulares, los linfocitos CAR T pueden inhibir eficazmente la expresión general de un linaje celular particular.
Células tales como las células hematopoyéticas "con insuficiente antígeno específico de linaje" se refiere a células que tienen un nivel de expresión sustancialmente reducido del antígeno específico de linaje, en comparación con su homólogo natural, p. ej., células hematopoyéticas endógenas del mismo tipo o células que no expresan el antígeno específico de linaje, es decir, no detectables mediante un ensayo de rutina como FACS. En algunos casos, el nivel de expresión de un antígeno específico de linaje de células "con insuficiente antígeno" puede ser inferior a aproximadamente el 40% (por ejemplo, 30%, 20%, 15%, 10%, 5% o menos) del nivel de expresión del mismo antígeno específico de linaje del homólogo natural. Tal y como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" se refiere a un valor particular /- 5%. Por ejemplo, un nivel de expresión de aproximadamente el 40% puede incluir cualquier cantidad de expresión entre el 35% y el 45%.
Agentes dirigidos a antígenos de la superficie celular específicos de linaje
Unos aspectos de la divulgación proporcionan agentes dirigidos a un antígeno de la superficie celular específico de linaje, por ejemplo, en una célula cancerosa diana. Un agente de ese tipo puede comprender un fragmento de unión a antígeno que se une y se dirige al antígeno de la superficie celular específico de linaje. En algunos casos, el fragmento de unión a antígeno puede ser un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) que se une específicamente al antígeno específico de linaje.
A. Antígenos de la superficie celular específicos de linaje
Tal y como se usan en el presente documento, las expresiones "antígeno de la superficie celular específico de linaje" y "antígeno específico de linaje de la superficie celular" pueden usarse indistintamente y se refieren a cualquier antígeno que esté suficientemente presente en la superficie de una célula y esté asociado con una o más poblaciones de linajes celulares. Por ejemplo, el antígeno puede estar presente en una o más poblaciones de linaje(s) celular(es) y ausente (o a niveles reducidos) en la superficie celular de otras poblaciones celulares.
En general, los antígenos de la superficie celular específicos de linaje se pueden clasificar basándose en una serie de factores tales como si el antígeno y/o las poblaciones de células que presentan el antígeno son necesarios para la supervivencia y/o el desarrollo del organismo hospedador. En la Tabla 1 siguiente se proporciona un resumen de tipos ejemplares de antígenos específicos de linaje. Véase también la FIGURA 1.
Tabla 1. Clasificación de antígenos específicos de linaje
Como se muestra en la Tabla 1 y la FIGURA 1, los antígenos de la superficie celular específicos de linaje de tipo 0 son necesarios para la homeostasis tisular y la supervivencia, y los tipos de células que portan el antígeno de la superficie celular específico de linaje de tipo 0 también pueden ser necesarios para la supervivencia del sujeto. Por lo tanto, dada la importancia de los antígenos de la superficie celular específicos de linaje de tipo 0 o de las células que portan antígenos de superficie celular específicos de linaje de tipo 0 en la homeostasis y la supervivencia, hacer que esa categoría de antígenos sea una diana puede ser un reto utilizando inmunoterapias convencionales de linfocitos CAR T, ya que la inhibición o deleción de esos antígenos y de las células que portan esos antígenos puede ser perjudicial para la supervivencia del sujeto. En consecuencia, los antígenos de la superficie celular específicos de linaje (como los antígenos específicos de linaje de tipo 0) y/o los tipos de células que portan esos antígenos pueden ser necesarios para la supervivencia, por ejemplo, porque realizan una función vital no redundante en el sujeto, por ello, ese tipo de antígeno específico de linaje puede ser una diana poco deseada para la inmunoterapia basada en linfocitos CAR T.
A diferencia de los antígenos de tipo 0, los antígenos de la superficie celular específicos de linaje de tipo 1 y las células que portan antígenos de la superficie celular específicos de linaje de tipo 1 no son necesarios para la homeostasis tisular o la supervivencia del sujeto. No es probable que el uso como diana de los antígenos de la superficie celular específicos de linaje de tipo 1 tenga consecuencias perjudiciales en el sujeto. Por ejemplo, un linfocito T CAR modificado para dirigirse a CD307, un antígeno de tipo 1 expresado de forma única tanto en células plasmáticas normales como en células de mieloma múltiple (MM), conducirá a la eliminación de ambos tipos de células (FIGURA 2) (Elkins et al.,Mol Cáncer Ther.10:2222 (2012)). Sin embargo, dado que el linaje de células plasmáticas es reemplazable para la supervivencia del organismo, CD307 y otros antígenos específicos de linaje de tipo 1 son antígenos adecuados para la inmunoterapia basada en linfocitos CAR T. Los antígenos específicos de linaje de la clase tipo 1 pueden expresarse en una amplia variedad de tejidos diferentes, incluidos ovarios, testículos, próstata, mama, endometrio y páncreas. En algunas realizaciones, el agente se dirige a un antígeno de la superficie celular específico de linaje que es un antígeno de tipo 1.
Utilizar como diana los antígenos de tipo 2 presenta una dificultad significativa en comparación con los antígenos de tipo 1. Los antígenos de tipo 2 son aquellos caracterizados por que: (1) el antígeno es prescindible para la supervivencia de un organismo (es decir, no es necesario para la supervivencia), y (2) el linaje celular que porta el antígeno es indispensable para la supervivencia de un organismo (es decir, se requiere el linaje celular en particular para la supervivencia). Por ejemplo, CD33 es un antígeno de tipo 2 expresado tanto en células mieloides normales como en células de la leucemia mieloide aguda (LMA) (Dohner et al.,NEJM373:1136 (2015)). Como resultado, un linfocito CAR T diseñado para dirigirse al antígeno CD33 podría provocar la muerte tanto de células normales como de células de LMA, lo que puede ser incompatible con la supervivencia del sujeto (FIGURA 3). En algunas realizaciones, el agente se dirige a un antígeno de la superficie celular específico de linaje que es un antígeno de tipo 2.
Se puede utilizar como diana una amplia variedad de antígenos a través de los métodos y composiciones de la presente divulgación. Los anticuerpos monoclonales contra esos antígenos se pueden adquirir comercialmente o generar utilizando técnicas estándar, incluida la inmunización de un animal con el antígeno de interés seguida de metodologías convencionales de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la técnica estándar de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein,Nature(1975) 256: 495, como se ha descrito anteriormente. Los anticuerpos o ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos se pueden secuenciar usando cualquier técnica estándar de secuenciación de ADN o proteínas.
En la invención, el antígeno de la superficie celular específico de linaje es CD33.
El antígeno de la superficie celular CD33 está asociado con las células de LMA.
B. Fragmento de unión al antígeno
Se puede usar cualquier anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo para construir el agente que se dirige a un antígeno de la superficie celular específico de linaje, tal y como se describe en el presente documento. Ese anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se puede preparar mediante un método convencional, por ejemplo, la tecnología de hibridoma o la tecnología recombinante.
Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos específicos para un antígeno de interés específico de linaje mediante la tecnología de hibridoma convencional. El antígeno específico de linaje, que puede acoplarse a una proteína portadora tal como KLH, puede usarse para inmunizar a un animal hospedador para generar anticuerpos que se unen a ese complejo. La ruta y la pauta de inmunización del animal hospedador generalmente están de acuerdo con técnicas establecidas y convencionales para la estimulación y producción de anticuerpos, tal y como se describe con más detalle en el presente documento. Las técnicas generales para la producción de anticuerpos de ratón, humanizados y humanos se conocen en la técnica y se describen en el presente documento. Se contempla que cualquier sujeto mamífero, incluidos los seres humanos o sus células productoras de anticuerpos, pueda manipularse para que sirva como base para la producción de líneas celulares de hibridoma de mamífero, incluidas las humanas. Normalmente, se inocula al animal hospedador por vía intraperitoneal, intramuscular, oral, subcutánea, intraplantar y/o intradérmica una cantidad de inmunógeno, incluyendo tal y como se describe en el presente documento.
Los hibridomas se pueden preparar a partir de linfocitos y células de mieloma inmortalizadas usando la técnica general de hibridación de células somáticas de Kohler, B. y Milstein, C. (1975)Nature256:495-497 o modificada por Buck, DW, et al., In Vitro, 18:377-381 (1982). En la hibridación se pueden usar líneas de mieloma disponibles, incluidas, entre otras, X63-Ag8.653 y las del Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, California, EE. UU. Generalmente, la técnica implica fusionar células de mieloma y células linfoides utilizando un fusógeno tal como polietilenglicol o mediante medios eléctricos bien conocidos por los expertos en la técnica. Después de la fusión, las células se separan del medio de fusión y se cultivan en un medio de crecimiento selectivo, tal como medio de hipoxantina-aminopterinatimidina (HAT), para eliminar las células originales no hibridadas. Cualquiera de los medios descritos en el presente documento, complementados con o sin suero, puede usarse para cultivar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales. A modo de otra alternativa a la técnica de fusión celular, se pueden usar linfocitos B inmortalizados con EBV para producir los anticuerpos monoclonales similares a TCR descritos en el presente documento. Los hibridomas se expanden y se subclonan, si se desea, y se analiza la actividad antiinmunógena del material sobrenadante mediante procedimientos de inmunoensayo convencionales (por ejemplo, radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático o inmunoensayo de fluorescencia).
Los hibridomas que pueden usarse como fuente de anticuerpos incluyen todos los derivados, células de progenie de los hibridomas originales que producen anticuerpos monoclonales capaces de unirse a un antígeno específico de linaje. Los hibridomas que producen tales anticuerpos pueden cultivarsein vitrooin vivousando procedimientos conocidos. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse de los medios de cultivo o fluidos corporales mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales, tales como precipitación con sulfato de amonio, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía y ultrafiltración, si se desea. La actividad no deseada, si está presente, se puede eliminar, por ejemplo, haciendo pasar la preparación sobre materiales adsorbentes preparados a base del inmunógeno fijado a una fase sólida y eluyendo o liberando los anticuerpos deseados del inmunógeno. Una inmunización de un animal hospedador con un antígeno diana o un fragmento que contiene la secuencia de aminoácidos diana conjugada con una proteína que es inmunogénica en la especie que se va a inmunizar, p. ej., hemocianina de lapa californiana, albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor de la tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl o R1 N=C=NR, en donde R y R1 son grupos alquilo diferentes, puede dar lugar a una población de anticuerpos (p. ej., anticuerpos monoclonales).
Si se desea, un anticuerpo de interés (p. ej., producido por un hibridoma) puede secuenciarse y luego la secuencia de polinucleótidos puede clonarse en un vector para la expresión o propagación. La secuencia que codifica el anticuerpo de interés puede mantenerse en un vector en una célula hospedadora y luego la célula hospedadora puede expandirse y congelarse para un uso futuro. Como alternativa, la secuencia de polinucleótidos puede usarse para una manipulación genética para "humanizar" el anticuerpo o para mejorar la afinidad (maduración de la afinidad) u otras características del anticuerpo. Por ejemplo, la región constante puede diseñarse para que se parezca más a las regiones constantes humanas para evitar una respuesta inmune si el anticuerpo se usa en ensayos clínicos y tratamientos en humanos. Puede ser deseable manipular genéticamente la secuencia del anticuerpo para obtener una mayor afinidad hacia el antígeno específico de linaje. Para un experto en la técnica será evidente que se puede realizar uno o más cambios de polinucleótidos en el anticuerpo y seguir conservando su especificidad de unión con el antígeno diana.
En otras realizaciones, se pueden obtener anticuerpos completamente humanos usando ratones disponibles comercialmente que se han modificado para expresar proteínas específicas de inmunoglobulina humana. Los animales transgénicos que están diseñados para producir un producto más deseable (p. ej., anticuerpos completamente humanos) o una respuesta inmune más robusta, también se pueden usar para la generación de anticuerpos humanos o humanizados. Ejemplos de esa tecnología son XenomouseRTM de Amgen, Inc. (Fremont, California) y HuMAb-MouseRTM y TC MouseTM de Medarex, Inc. (Princeton, Nueva Jersey). En otra alternativa, los anticuerpos se pueden preparar de forma recombinante mediante presentación en fagos o tecnología de levadura. Véanse, por ejemplo, los documentos de patentes de EE. UU. núm. 5.565.332; 5.580.717; 5.733.743; y 6.265.150; y Winter et al., (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455. Alternativamente, la tecnología de visualización en fagos (McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-553) se puede utilizar para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerposin vitro,a partir de repertorios de genes del dominio variable (V) de inmunoglobulinas de donantes no inmunizados.
Los fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo intacto (anticuerpo de longitud completa) se pueden preparar mediante métodos de rutina. Por ejemplo, se pueden producir fragmentos F(ab')2 mediante digestión con pepsina de una molécula de anticuerpo, y fragmentos Fab que se pueden generar reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2.
Los anticuerpos modificados genéticamente, tales como anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos monocatenarios y anticuerpos biespecíficos, se pueden producir mediante, p. ej., tecnología recombinante convencional. En un ejemplo, el ADN que codifica anticuerpos monoclonales específicos de un antígeno diana se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (p. ej., mediante el uso de sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como fuente preferida de ese ADN. Una vez aislado, el ADN se puede introducir en uno o más vectores de expresión, que luego se transfectan en células hospedadoras tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen la proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. Véase, p. ej., el documento de publicación PCT núm. WO 87/04462. A continuación, el ADN se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera humanas en el lugar de las secuencias murinas homólogas. Morrison et al., (1984)Proc. Nat. Acad. Sci.81:6851 o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido que no es inmunoglobulina. De esa manera, se pueden preparar los anticuerpos modificados genéticamente, tales como anticuerpos "quiméricos" o "híbridos"; de modo que tengan la especificidad de unión de un antígeno diana.
Las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" son bien conocidas en la técnica. Véase, p. ej., Morrison et al. (1984)Proc. Nat. Acad. Sci. USA81, 6851; Neuberger et al. (1984)Nature312, 604; y Takeda et al. (1984)Nature314:452.
Los métodos para construir anticuerpos humanizados también son bien conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Queen et al.,Proc. Nat. Acad. Sci. USA,86:10029-10033 (1989). En un ejemplo, las regiones variables de<v>H y VL de un anticuerpo no humano original se someten a un análisis de modelado molecular tridimensional, siguiendo métodos conocidos en la técnica. A continuación, se identifican los residuos de aminoácidos de la región marco que se predice que son importantes para la formación de las estructuras de CDRs correctas utilizando el mismo análisis de modelado molecular. Paralelamente, las cadenas VH y VL humanas que tienen secuencias de aminoácidos que son homólogas a las del anticuerpo no humano original, se identifican a partir de cualquier base de datos de genes de anticuerpos utilizando las secuencias VH y VL originales como consultas de búsqueda. Luego se seleccionan los genes aceptores de VH y VL humanos.
Las regiones CDRs dentro de los genes aceptores humanos seleccionados se pueden reemplazar con las regiones CDRs del anticuerpo no humano original o variantes funcionales del mismo. Cuando sea necesario, se pueden usar residuos dentro de las regiones estructurales de la cadena original que se predice que son importantes en la interacción con las regiones CDRs (véase la descripción anterior) para sustituir los residuos correspondientes en los genes aceptores humanos.
Se puede preparar un anticuerpo monocatenario mediante tecnología recombinante uniendo una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de la cadena pesada y una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de la cadena ligera. Preferiblemente, se incorpora un enlazador flexible entre las dos regiones variables. Alternativamente, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (documentos de patente de EE. UU. núm. 4.946.778 y 4.704.692) se pueden adaptar para producir un banco de scFv de fago o de levadura y se pueden identificar clones de scFv específicos de un antígeno específico de linaje a partir del banco, siguiendo procedimientos de rutina. Los clones positivos pueden someterse a análisis adicionales para identificar aquellos que se unen a un antígeno específico de linaje.
En la invención, el antígeno de interés específico de linaje es CD33 y el fragmento de unión a antígeno se une específicamente a CD33, por ejemplo, CD33 humano. A continuación se proporcionan secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera a modo de ejemplo de un anticuerpo anti-CD33 humano. Las secuencias de CDRs se muestran en negrita y subrayadas en las secuencias de aminoácidos.
Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada anti-CD33 (SEQ ID NO: 12)
QVQLQQPGAEWKPGASVKMSCKASGYTFTSY Y IH WIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQ
KFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSS
Secuencia de ácidos nucleicos de la región variable de la cadena pesada anti-CD33 (SEQ ID NO: 2)
CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCCGGCGCCGAGGTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAG
CTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCACTGGATCAAGCAGACCCCCG
GCCAGGGCCTGGAGTGGGTGGGCGTGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCAG
AAGTTCCAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCACCACCGCCTACATGCAGCT
GAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGAGGTGAGGCTGAGGT
ACTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC
Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera anti-CD33 (SEQ ID NO: 13)
EIVLTQSPGSLAVSPGERVTM SCKSSQSVFFSSSQKNYLAW YQQIPGQSPRLLIYWASTRES
GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKR
Secuencia de ácidos nucleicos de la región variable de la cadena pesada anti-CD33 (SEQ ID NO: 1)
GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGGCAGCCTGGCCGTGAGCCCCGGCGAGAGGGTGACCAT
GAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCAGCCAGAAGAACTACCTGGCCTGGT
ACCAGCAGATCCCCGGCCAGAGCCCCAGGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGGGAGAGC
GGCGTGCCCGACAGGTTCACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAG
CGTGCAGCCCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCAGGACCTTCG
GCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGG
El fragmento de unión del anticuerpo anti-CD33 para uso en la construcción del agente que se dirige a CD33 como se describe en el presente documento, puede comprender las mismas regiones CDRs de la cadena pesada y/o la cadena ligera que las de SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:13. Esos anticuerpos pueden comprender variaciones de residuos de aminoácidos en una o más de las regiones estructurales. En algunos casos, el fragmento de anticuerpo anti-CD33 puede comprender una región variable de la cadena pesada que comparte al menos un 70% de identidad de secuencia (p. ej., 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o superior) con SEQ ID NO:12 y/o puede comprender una región variable de la cadena ligera que comparte al menos un 70% de identidad de secuencia (p. ej., 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o superior) con SEQ ID NO:13.
El "porcentaje de identidad" de dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Karlin y AltschulProc. Nat. Acad. Sci. USA87:2264-68, 1990, modificado como en Karlin y AltschulProc. Nat. Acad. Sci. USA90:5873-77, 1993. Ese algoritmo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al.J. Mol. Biol.215:403-10, 1990. Las búsquedas de proteínas en BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína de la presente divulgación. Cuando existen espacios entre dos secuencias, Gapped BLAST se puede utilizar como se describe en Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402, 1997. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST).
C. Células inmunes que expresan receptores quiméricos
En algunas realizaciones, el agente que se dirige a un antígeno de la superficie celular específico de linaje, tal y como se describe en el presente documento es una célula inmune que expresa un receptor quimérico, que comprende un fragmento de unión a antígeno (p. ej., un anticuerpo monocatenario) capaz de unirse al antígeno específico de linaje (es decir, CD33). El reconocimiento de una célula diana (p. ej., una célula cancerosa) que tiene el antígeno específico de linaje en su superficie celular mediante el fragmento de unión a antígeno del receptor quimérico, transduce una señal de activación al dominio o dominios de señalización (p. ej., el dominio de señalización coestimulador y/o el dominio de señalización citoplasmático) del receptor quimérico, lo que puede activar una función efectora en la célula inmune que expresa el receptor quimérico.
Tal y como se usa en el presente documento, un receptor quimérico se refiere a una molécula no natural que puede expresarse en la superficie de una célula hospedadora y comprende un fragmento de unión a antígeno que se une a un antígeno de la superficie celular específico de linaje. En general, los receptores quiméricos comprenden al menos dos dominios que se obtienen a partir de moléculas diferentes. Además del fragmento de unión a antígeno descrito en el presente documento, el receptor quimérico puede comprender además uno o más entre un dominio bisagra, un dominio transmembranal, al menos un dominio coestimulador y un dominio de señalización citoplasmática. En algunas realizaciones, el receptor quimérico comprende desde el extremo N al extremo C, un fragmento de unión a antígeno que se une a un antígeno de la superficie celular específico de linaje, un dominio bisagra, un dominio transmembranal y un dominio de señalización citoplásmico. En algunas realizaciones, el receptor quimérico comprende además al menos un dominio coestimulador.
En algunas realizaciones, los receptores quiméricos descritos en el presente documento comprenden un dominio bisagra, que puede estar ubicado entre el fragmento de unión a antígeno y un dominio transmembranal. Un dominio bisagra es un segmento de aminoácido que generalmente se encuentra entre dos dominios de una proteína y puede permitir la flexibilidad de la proteína y el movimiento de uno o ambos dominios entre sí. Puede usarse cualquier secuencia de aminoácidos que proporcione esa flexibilidad y movimiento del fragmento de unión a antígeno con respecto a otro dominio del receptor quimérico.
El dominio bisagra puede contener aproximadamente 10-200 aminoácidos, por ejemplo, 15-150 aminoácidos, 20-100 aminoácidos o 30-60 aminoácidos. En algunas realizaciones, el dominio bisagra puede tener aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones, el dominio bisagra es un dominio bisagra de una proteína presente en la naturaleza. Los dominios bisagra de cualquier proteína conocida en la técnica que comprende un dominio bisagra son compatibles para el uso en los receptores quiméricos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el dominio bisagra es al menos una porción de un dominio bisagra de una proteína natural y confiere flexibilidad al receptor quimérico. En algunas realizaciones, el dominio bisagra es de CD8a o CD28a. En algunas realizaciones, el dominio bisagra es una porción del dominio bisagra de CD8a, por ejemplo, un fragmento que contiene al menos 15 (p. ej., 20, 25, 30, 35 o 40) aminoácidos consecutivos del dominio bisagra de CD8a o CD28a.
Los dominios bisagra de anticuerpos, tales como un anticuerpo IgG, IgA, IgM, IgE o IgD, también son compatibles para el uso en los receptores quiméricos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el dominio bisagra es el dominio bisagra que une los dominios constantes CH1 y CH2 de un anticuerpo. En algunas realizaciones, el dominio bisagra es de un anticuerpo y comprende el dominio bisagra del anticuerpo y una o más regiones constantes del anticuerpo. En algunas realizaciones, el dominio bisagra comprende el dominio bisagra de un anticuerpo y la región constante CH3 del anticuerpo. En algunas realizaciones, el dominio bisagra comprende el dominio bisagra de un anticuerpo y las regiones constantes CH2 y CH3 del anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG, IgA, IgM, IgE o IgD. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En algunas realizaciones, la región bisagra comprende la región bisagra y las regiones constantes CH2 y CH3 de un anticuerpo IgG1. En algunas realizaciones, la región bisagra comprende la región bisagra y la región constante CH3 de un anticuerpo IgG 1.
También están dentro del alcance de la presente divulgación los receptores quiméricos que comprenden un dominio bisagra que es un péptido que no tiene origen natural. En algunas realizaciones, el dominio bisagra entre el extremo C del dominio de unión al ligando extracelular de un receptor Fc y el extremo N del dominio transmembranal es un enlazador peptídico, tal como un enlazador (GlyxSer)n, en donde x y n, pueden ser independientemente un número entero entre 3 y 12, incluidos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más.
Enlazadores peptídicos adicionales que pueden usarse en un dominio bisagra de los receptores quiméricos descritos en el presente documento se conocen en la técnica. Véase, p. ej., Wriggers et al.Current Trends in Peptide Science(2005) 80(6): 736-746 y el documento de publicación PCT de WO 2012/088461.
En algunas realizaciones, los receptores quiméricos descritos en el presente documento pueden comprender un dominio transmembranal. El dominio transmembranal para uso en los receptores quiméricos puede tener cualquier forma conocida en la técnica. Tal y como se usa en el presente documento, un "dominio transmembranal" se refiere a cualquier estructura proteica que es termodinámicamente estable en una membrana celular, preferiblemente una membrana de una célula eucariota. Los dominios transmembranales compatibles para uso en los receptores quiméricos utilizados en el presente documento, pueden obtenerse a partir de una proteína de origen natural. Alternativamente, el dominio transmembranal puede ser un segmento proteico sintético, de origen no natural, p. ej., un segmento de proteína hidrofóbica que es termodinámicamente estable en una membrana celular.
Los dominios transmembranales se clasifican según la topología del dominio transmembranal, incluida la cantidad de pases que realiza el dominio transmembranal a través de la membrana y la orientación de la proteína. Por ejemplo, las proteínas de una membrana de paso único cruzan la membrana celular una vez, y las proteínas de una membrana de paso múltiple cruzan la membrana celular al menos dos veces (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más veces). En algunas realizaciones, el dominio transmembranal es un dominio transmembranal de paso único. En algunas realizaciones, el dominio transmembranal es un dominio transmembranal de paso único que orienta el extremo N del receptor quimérico hacia el lado extracelular de la célula y el extremo C del receptor quimérico hacia el lado intracelular de la célula. En algunas realizaciones, el dominio transmembranal se obtiene a partir de una proteína transmembranal de paso único. En algunas realizaciones, el dominio transmembranal es de CD8a. En algunas realizaciones, el dominio transmembranal es de CD28. En algunas realizaciones, el dominio transmembranal es de ICOS.
En algunas realizaciones, los receptores quiméricos descritos en el presente documento comprenden uno o más dominios de señalización coestimuladores. La expresión "dominio de señalización coestimulador", tal y como se usa en el presente documento, se refiere a al menos una porción de una proteína que media en la transducción de señales dentro de una célula para inducir una respuesta inmune, tal como una función efectora. El dominio de señalización coestimulador del receptor quimérico descrito en el presente documento puede ser un dominio de señalización citoplasmático de una proteína coestimuladora, que transduce una señal y modula respuestas mediadas por células inmunes, tales como linfocitos T, células NK, macrófagos, neutrófilos o eosinófilos.
En algunas realizaciones, el receptor quimérico comprende más de un dominio (al menos 2, 3, 4 o más) de señalización coestimulador. En algunas realizaciones, el receptor quimérico comprende más de un dominio de señalización coestimulador obtenido a partir de diferentes proteínas coestimuladoras. En algunas realizaciones, el receptor quimérico no comprende un dominio de señalización coestimulador.
En general, muchas células inmunes requieren una coestimulación, además de la estimulación de una señal específica de antígeno, para causar una proliferación, diferenciación y supervivencia celulares, y para activar funciones efectoras de la célula. La activación de un dominio de señalización coestimulador en una célula hospedadora (p. ej., una célula inmune) puede inducir a la célula a aumentar o disminuir la producción y secreción de citocinas, propiedades fagocíticas, proliferación, diferenciación, supervivencia y/o citotoxicidad. El dominio de señalización coestimulador de cualquier proteína coestimuladora puede ser compatible para el uso en los receptores quiméricos descritos en el presente documento. Los tipos de dominios de señalización coestimuladores se seleccionan en función de factores como el tipo de células inmunes en las que se expresarían los receptores quiméricos (p. ej., linfocitos T primarios, líneas de linfocitos T, líneas de células NK) y la función efectora inmune deseada (p. ej., citotoxicidad). Ejemplos de dominios de señalización coestimuladores para uso en los receptores quiméricos pueden ser el dominio de señalización citoplasmático de proteínas coestimuladoras, incluyendo, sin limitación, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, Cd40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3. En algunas realizaciones, el dominio coestimulador se obtiene a partir de 4-1BB, CD28 o ICOS. En algunas realizaciones, el dominio coestimulador se obtiene a partir de CD28 y un receptor quimérico comprende un segundo dominio coestimulador de 4-1BB o ICOS.
En algunas realizaciones, el dominio coestimulador es un dominio de fusión que comprende más de un dominio coestimulador o porciones de más de un dominio coestimulador. En algunas realizaciones, el dominio coestimulador es una fusión de dominios coestimuladores de CD28 e ICOS.
En algunas realizaciones, los receptores quiméricos descritos en el presente documento comprenden un dominio de señalización citoplásmico. Puede usarse cualquier dominio de señalización citoplásmico en los receptores quiméricos descritos en el presente documento. En general, un dominio de señalización citoplasmático transmite una señal, como la interacción de un dominio de unión a ligando extracelular con su ligando, para estimular una respuesta celular, como la inducción de una función efectora de la célula (p. ej., citotoxicidad).
Como resultará evidente para un experto en la técnica, un factor implicado en la activación de los linfocitos T es la fosforilación del motivo de activación basado en tirosina del inmunorreceptor (ITAM) de un dominio de señalización citoplásmico. Puede usarse cualquier dominio que contenga un ITAM conocido en la técnica para construir los receptores quiméricos descritos en el presente documento. En general, un motivo ITAM puede comprender dos repeticiones de la secuencia de aminoácidos YxxL/I separadas por 6-8 aminoácidos, en donde cada x es independientemente cualquier aminoácido, produciendo el motivo conservado YxxL/Ix(6-8)YxxL/I. En algunas realizaciones, el dominio de señalización citoplásmico proviene de CD3Z.
En las Tablas 2 y 3 siguientes se proporcionan receptores quiméricos ejemplares.
Tabla 2: Componentes ejemplares de un receptor quimérico
A continuación se proporciona la secuencia de ácidos nucleicos de componentes ejemplares para la construcción de un receptor quimérico.
Dominio de señalización intracelular de CD28-ADN-Humano (SEQ ID NO: 3)
ATT GAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCA
TGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGG
TGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATT
ATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCC
CCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAG
CCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAG
AACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG
ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGT
ACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAG
CGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACAC
CTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
Dominio de señalización intracelular de ICOS-ADN-Humano (SEQ ID NO: 4)
CTATCAATTTTTGATCCTCCTCCTTTTAAAGTAACTCTTACAGGAGGATATTTGCATATTTA
TGAATCACAACTTTGTTGCCAGCTGAAGTTCTGGTTACCCATAGGATGTGCAGCCTTTGTTG
TAGTCTGCATTTTGGGATGCATACTTATTTGTTGGCTTACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGT
GTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCTAG
ACTCACAGATGTGACCCTAAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGC
AGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTG
GACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGA
AGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGA
AAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACC
AAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
Región de señalización coestimuladora de CD28/ICOS-ADN-Humano (SEQ ID NO: 5)
ATT GAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCA
TGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGG
TGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATT
ATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGTTCATGAGAGC
AGTGAACACAGCCAAAAAATCTAGACTCACAGATGTGACCCTAAGAGTGAAGTTCAGCAGGA
GCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGA
CGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAA
GCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGG
AGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTT
TACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCC
CCCTCGC
En algunas realizaciones, la secuencia de ácidos nucleicos codifica un fragmento de unión a antígeno que se une a CD33 y comprende una región variable de la cadena pesada que tiene las mismas CDRs que las CDRs en SEQ ID NO: 12 y una región variable de la cadena ligera que tiene las mismas CDRs que las CDRs en SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada como la proporcionada por SEQ ID NO: 12 y una región variable de la cadena ligera como la proporcionada por SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones, el receptor quimérico comprende además al menos un dominio transmembranal y un dominio de señalización citoplásmico. En algunas realizaciones, el receptor quimérico comprende además un dominio bisagra y/o un dominio de señalización coestimulador.
La Tabla 3 proporciona ejemplos de receptores quiméricos descritos en el presente documento. Las estructuras artificiales ejemplares tienen desde el extremo N hasta el extremo C, el fragmento de unión a antígeno, el dominio transmembranal y un dominio de señalización citoplasmática. En algunos ejemplos, el receptor quimérico comprende además un dominio bisagra ubicado entre el fragmento de unión a antígeno y el dominio transmembranal. En algún ejemplo, el receptor quimérico comprende además uno o más dominios coestimuladores, que pueden estar ubicados entre el dominio transmembranal y el dominio de señalización citoplasmática.
Tabla 3: Receptores quiméricos ejemplares
A continuación se proporcionan las secuencias de aminoácidos de los receptores quiméricos a modo de ejemplo indicados en la Tabla 3 anterior:
Secuencia de aminoácidos de CART1 (SEQ ID NO: 20)
MWLQSLLLLGTVACSISEIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQS
PRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKRGS
TSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQQPGAEWKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGV
IYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTV
SSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDIY
IWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFS
RSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY
SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
Secuencia de aminoácidos de CART2 (SEQ ID NO: 21)
MWLQSLLLLGTVACSISEIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQS
PRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKRGS
TSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQQPGAEWKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGV
IYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTV
SALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDKPF
WVLVWGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYR
SRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKD
KMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
Secuencia de aminoácidos de CART3 (SEQ ID NO: 22)
MWLQSLLLLGTVACSISEIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQS
PRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKRGS
TSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQQPGAEWKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGV
IYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTV
SSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDKP
FWVLWVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAY
RSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYN
ELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDG
LYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
Secuencia de aminoácidos de CART8 (SEQ ID NO: 23)
MWLQSLLLLGTVACSISEIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQS
PRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKRGS
TSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQQPGAEWKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGV
IYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTV
SSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDFW
LPIGCAAFWVCILGCILICWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTLTKRGRKKLL
YIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEY
DVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATK
DTYDALHMQALPPR
Secuencia de aminoácidos de CART4dual (SEQ ID NO: 24)
MWLQSLLLLGTVACSISIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYH
TSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIGSTSGSGKPG
SGEGSTKGLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNS
ALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSALSNSIMY
FSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDKPFWVLWVGGV
LACYSLLVTVAFIIFWVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKP
RRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
Secuencia de aminoácidos de CART5dual (SEQ ID NO: 25)
MWLQSLLLLGTVACSISEIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQS
PRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKRGS
TSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQQPGAEWKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGV
IYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTV
SSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDKP
FWVLWVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAY
RS
Secuencia de aminoácidos de CART6 (SEQ ID NO: 26)
MWLQSLLLLGTVACSISIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYH
TSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIGSTSGSGKPG
SGEGSTKGLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNS
ALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSALSNSIMY
FSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDKPFWVLWVGGV
LACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSA
DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEI
GMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
Secuencia de aminoácidos de CART7 (SEQ ID NO: 27)
MWLQSLLLLGTVACSISEIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQS
PRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKRGS
TSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQQPGAEWKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGV
IYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTV
SSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVWGGVLACYSLLVTVAFIIF
WVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNE
LNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMGERRRGKGHDGLY
QGLSTATKDTYDALHMQALPPR
A continuación se proporcionan secuencias de ácidos nucleicos de los receptores quiméricos a modo de ejemplo indicados en la Tabla 3 anterior:
Secuencia de ácidos nucleicos de CART1 (SEQ ID NO: 38)
GGTGTCGTGAGCGGCCGCTGAACTGGCCACCATGTGGCTGCAGTCTCTGCTGCTGCTGGGCACCGT
GGCCTGTAGCATCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGGCTCTCTGGCTGTGTCTCCTGGCGA
GCGCGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCTCCCAGAAGAACTACCT
GGCCTGGTATCAGCAGATCCCCGGCCAGAGCCCCAGACTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGA
AAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAG
CGTGCAGCCCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCCGGACCTTTGGCCA
GGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGGGCAGCACAAGCGGCAGCGGAAAGCCTGGATCTGGCGAGGG
CTCTACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGCGCCGAAGTCGTGAAACCTGGCGCCTCCGT
GAAGATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCACTGGATCAAGCAGAC
CCCTGGACAGGGCCTGGAATGGGTGGGAGTGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCA
GAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGTC
CAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTGCGGCTGCGGTACTTCGA
TGTGTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGTCTAGCGCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAG
CCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACCACAACCCCTGCCCCTAGACCTCCTACCCC
AGCCCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAGGCTTCTAGACCAGCTGCTGGCGG
AGCCGTGCACACCAGAGGCCTGGATATCTACATCTGGGCCCCACTGGCCGGCACCTGTGGCGTGCT
GCTGCTGTCTCTCGTGATCACCAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTT
CATGCGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAAGAGGACGGCTGTAGCTGCCGGTTCCCCGAGGAAGAAGA
AGGGGGCTGCGAGCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCA
GAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAG
AGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTATAACGA
ACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGG
CAAGGGCCACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCA
CATGCAGGCCCTGCCCCCCAGATGAAATTCATCGACGTTAACTATTCTAG
Secuencia de ácidos nucleicos de CART2 (SEQ ID NO: 39)
GGTGTCGTGAGCGGCCGCTGAACTGGCCACCATGTGGCTGCAGTCTCTGCTGCTGCTGGGCACCGT
GGCCTGTAGCATCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGGCTCTCTGGCTGTGTCTCCTGGCGA
GCGCGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCTCCCAGAAGAACTACCT
GGCCTGGTATCAGCAGATCCCCGGCCAGAGCCCCAGACTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGA
AAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAG
CGTGCAGCCCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCCGGACCTTTGGCCA
GGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGGGCAGCACAAGCGGCAGCGGAAAGCCTGGATCTGGCGAGGG
CTCTACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGCGCCGAAGTCGTGAAACCTGGCGCCTCCGT
GAAGATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCACTGGATCAAGCAGAC
CCCTGGACAGGGCCTGGAATGGGTGGGAGTGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCA
GAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGTC
CAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTGCGGCTGCGGTACTTCGA
TGTGTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGTCTGCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCA
CTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACCACAACCCCTGCCCCTAGACCTCCTACCCCAGC
CCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAGGCTTCTAGACCAGCTGCTGGCGGAGC
CGTGCACACCAGAGGACTGGACAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTG
TTACAGCCTGCTCGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGTCTAGACTGCT
GCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGAAGGCCAGGCCCCACCCGGAAGCACTATCAGCCTTA
CGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCC
TGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGA
CGTGCTGGACAAGAGAAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAACCCTCA
GGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGCATGAA
GGGCGAACGGCGGAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGA
CACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGATGAAATTCATCGACGTTAACTATTCT
AG
Secuencia de ácidos nucleicos de CART3 (SEQ ID NO: 40)
GGTGTCGTGAGCGGCCGCTGAACTGGCCACCATGTGGCTGCAGTCTCTGCTGCTGCTGGGCACCGT
GGCCTGTAGCATCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGGCTCTCTGGCTGTGTCTCCTGGCGA
GCGCGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCTCCCAGAAGAACTACCT
GGCCTGGTATCAGCAGATCCCCGGCCAGAGCCCCAGACTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGA
AAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAG
CGTGCAGCCCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCCGGACCTTTGGCCA
GGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGGGCAGCACAAGCGGCAGCGGAAAGCCTGGATCTGGCGAGGG
CTCTACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGCGCCGAAGTCGTGAAACCTGGCGCCTCCGT
GAAGATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCACTGGATCAAGCAGAC
CCCTGGACAGGGCCTGGAATGGGTGGGAGTGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCA
GAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGTC
CAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTGCGGCTGCGGTACTTCGA
TGTGTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGTCTAGCGCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAG
CCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACCACAACCCCTGCCCCTAGACCTCCTACCCC
AGCCCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAGGCTTCTAGACCAGCTGCTGGCGG
AGCCGTGCACACCAGAGGACTGGACAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGC
CTGTTACAGCCTGCTCGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGTCTAGACT
GCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGAAGGCCAGGCCCCACCCGGAAGCACTATCAGCC
TTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCCAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACAT
CTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAAGAGGACGGCTGTAGCTGCCGGTT
CCCCGAGGAAGAAGAAGGGGGCTGCGAGCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGC
CTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGT
GCTGGACAAGAGAAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAACCCTCAGGA
AGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGAATGAAGGG
CGAGCGGCGGAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACAC
CTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGATGAAATTCATCGACGTTAACTATTCTAG
Secuencia de ácidos nucleicos de CART4dual (SEQ ID NO: 41)
GGTGTCGTGAGCGGCCGCTGAACTGGCCACCATGTGGCTGCAGTCTCTGCTGCTGCTGGGCACCGT
GGCCTGCAGCATCAGCATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGATAG
AGTGACCATCAGCTGCAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACC
CGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCCTCTAGATT
TTCCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACAGGAAGATATCGC
TACCTACTTCTGTCAGCAAGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAAT
CGGCAGCACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGCTCTACCAAGGGCCTGCAGGAATC
TGGCCCTGGACTGGTGGCCCCTAGCCAGAGCCTGTCTGTGACCTGTACCGTGTCCGGCGTGTCCCT
GCCTGACTATGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCCCCCAGAAAGGGCCTGGAATGGCTGGGAGTGAT
CTGGGGCAGCGAGACAACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAA
CTCCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTG
CGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACAAGCGTGAC
CGTGTCTGCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAA
GCCTACCACAACCCCTGCCCCTAGACCTCCTACCCCAGCCCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTC
TCTGAGGCCCGAGGCTTCTAGACCAGCTGCTGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGACTGGACAAGCC
CTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACAGTGGCCTT
CATCATCTTTTGGGTGCGCGTGAAGTTCAGCCGCAGCGCCGATGCCCCTGCCTATCAGCAGGGACA
GAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGAAG
AGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGA
ACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAACGGCGGAGAGG
CAAGGGCCACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCA
CATGCAGGCTCTGCCCCCTCGCTGAAATTCATCGACGTTAACTATTCTAG
Secuencia de ácidos nucleicos de CART5dual (SEQ ID NO: 42)
GGTGTCGTGAGCGGCCGCTGAACTGGCCACCATGTGGCTGCAGTCTCTGCTGCTGCTGGGCACCGT
GGCCTGTAGCATCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGGCTCTCTGGCTGTGTCTCCTGGCGA
GCGCGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCTCCCAGAAGAACTACCT
GGCCTGGTATCAGCAGATCCCCGGCCAGAGCCCCAGACTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGA
AAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAG
CGTGCAGCCCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCCGGACCTTTGGCCA
GGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGGGCAGCACAAGCGGCAGCGGAAAGCCTGGATCTGGCGAGGG
CTCTACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGCGCCGAAGTCGTGAAACCTGGCGCCTCCGT
GAAGATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCACTGGATCAAGCAGAC
CCCTGGACAGGGCCTGGAATGGGTGGGAGTGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCA
GAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGTC
CAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTGCGGCTGCGGTACTTCGA
TGTGTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGTCTAGCGCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAG
CCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACCACAACCCCTGCCCCTAGACCTCCTACCCC
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AGCCGTGCACACCAGAGGACTGGACAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGC
CTGTTACAGCCTGCTCGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGTCTAGACT
GCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGAAGGCCAGGCCCCACCCGGAAGCACTATCAGCC
TTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGAAGCTGAAATTCATCGACGTTAACTATTCTAG
Secuencia de ácidos nucleicos de CART6 (SEQ ID NO: 43)
GGTGTCGTGAGCGGCCGCTGAACTGGCCACCATGTGGCTGCAGTCTCTGCTGCTGCTGGGCACCGT
GGCCTGCAGCATCAGCATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGATAG
AGTGACCATCAGCTGCAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACC
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GCCTGACTATGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCCCCCAGAAAGGGCCTGGAATGGCTGGGAGTGAT
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CGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACAAGCGTGAC
CGTGTCTGCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAA
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TCTGAGGCCCGAGGCTTCTAGACCAGCTGCTGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGACTGGACAAGCC
CTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACAGTGGCCTT
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CAGACGGCCAGGCCCCACCCGGAAACACTATCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTA
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CGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGC
TCTGCCCCCTCGCTGAAATTCATCGACGTTAACTATTCTAG
Secuencia de ácidos nucleicos de CART7 (SEQ ID NO: 44)
GGTGTCGTGAGCGGCCGCTGAACTGGCCACCATGTGGCTGCAGTCTCTGCTGCTGCTGGGCACCGT
GGCCTGTAGCATCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGGCTCTCTGGCTGTGTCTCCTGGCGA
GCGCGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCTCCCAGAAGAACTACCT
GGCCTGGTATCAGCAGATCCCCGGCCAGAGCCCCAGACTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGA
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GAAGATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCACTGGATCAAGCAGAC
CCCTGGACAGGGCCTGGAATGGGTGGGAGTGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCA
GAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGTC
CAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTGCGGCTGCGGTACTTCGA
TGTGTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGTCCAGCATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCT
GGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCT
GTTTCCTGGCCCTAGCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTACAG
CCTGCTCGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGTCTAGACTGCTGCACAG
CGACTACATGAACATGACCCCCAGAAGGCCAGGCCCCACCCGGAAGCACTATCAGCCTTACGCCCC
TCCCAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTA
TCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCT
GGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAACCCTCAGGAAGG
CCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGCGA
GCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTA
TGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGATGAAATTCATCGACGTTAACTATTCTAG Cualquiera de los receptores quiméricos descritos en el presente documento se puede preparar mediante métodos rutinarios, tales como tecnología recombinante. Los métodos para preparar los receptores quiméricos en el presente documento implican la generación de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende cada uno de los dominios de los receptores quiméricos, incluido el fragmento de unión a antígeno y, opcionalmente, el dominio bisagra, el dominio transmembranal, al menos un dominio de señalización coestimulador y el dominio de señalización citoplasmático. En algunas realizaciones, un ácido nucleico que codifica cada uno de los componentes del receptor quimérico se une usando tecnología recombinante.
Las secuencias de cada uno de los componentes de los receptores quiméricos se pueden obtener mediante tecnología de rutina, p. ej., amplificación con PCR a partir de una cualquiera entre una variedad de fuentes conocidas en la técnica. En algunas realizaciones, las secuencias de uno o más de los componentes de los receptores quiméricos se obtienen a partir de una célula humana. Alternativamente, se pueden sintetizar las secuencias de uno o más componentes de los receptores quiméricos. Las secuencias de cada uno de los componentes (p. ej., dominios) se pueden unir directa o indirectamente (p. ej., usando una secuencia de ácido nucleico que codifica un enlazador peptídico) para formar una secuencia de ácido nucleico que codifica el receptor quimérico, usando métodos tales como amplificación o ligación mediante PCR. Alternativamente, se puede sintetizar el ácido nucleico que codifica el receptor quimérico. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es ADN. En otras realizaciones, el ácido nucleico es ARN.
Mutación de uno o más residuos dentro de uno o más de los componentes del receptor quimérico (p. ej., el fragmento de unión a antígeno, etc.), antes o después de unir las secuencias de cada uno de los componentes. En algunas realizaciones, se pueden realizar una o más mutaciones en un componente del receptor quimérico para modular (aumentar o disminuir) la afinidad del componente hacia una diana (p. ej., el fragmento de unión a antígeno para el antígeno diana) y/o modular la actividad del componente.
Cualquiera de los receptores quiméricos descritos en el presente documento se puede introducir en una célula inmune adecuada para su expresión mediante tecnología convencional. En algunas realizaciones, las células inmunes son linfocitos T, tales como linfocitos T primarios o líneas de linfocitos T. Alternativamente, las células inmunes pueden ser células NK, como líneas celulares NK establecidas (p. ej., células NK-92). En algunas realizaciones, las células inmunes son linfocitos T que expresan CD8 (CD8+) o CD8 y CD4 (CD8+/CD4+). En algunas realizaciones, los linfocitos T son linfocitos T de una línea de linfocitos T establecida, por ejemplo, células 293T o células Jurkat.
Los linfocitos T primarios se pueden obtener a partir de cualquier fuente, como células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), médula ósea, tejidos como el bazo, los ganglios linfáticos, el timo o el tejido tumoral. Una fuente adecuada para obtener el tipo de células inmunes deseada será evidente para un experto en la técnica. En algunas realizaciones, la población de células inmunes se obtiene a partir de un paciente humano que tiene una neoplasia maligna hematológica, tal como de la médula ósea o a partir de PBMCs obtenidas del paciente. En algunas realizaciones, la población de células inmunes se obtiene a partir de un donante sano. En algunas realizaciones, las células inmunes se obtienen a partir del sujeto al que se administrarán posteriormente las células inmunes que expresan los receptores quiméricos. Las células inmunes que se administran al mismo sujeto a partir del cual se obtuvieron las células, se denominan células autólogas, mientras que las células inmunes que se obtienen de un sujeto que no es el sujeto al que se administrarán las células, se denominan células alogénicas.
El tipo de células hospedadoras deseado se puede expandir dentro de la población de células obtenida coincubando las células con moléculas estimuladoras, por ejemplo, se pueden usar anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 para la expansión de linfocitos T.
Para construir las células inmunes que expresan cualquiera de las estructuras artificiales de receptores quiméricos descritas en el presente documento, se pueden construir vectores de expresión para una expresión estable o transitoria de la estructura artificial del receptor quimérico, mediante métodos convencionales tal y como se describe en el presente documento, e introducirlos en células hospedadoras inmunes. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican los receptores quiméricos se pueden clonar en un vector de expresión adecuado, tal como un vector viral ligado funcionalmente con un promotor adecuado. Los ácidos nucleicos y el vector pueden ponerse en contacto, en condiciones adecuadas, con una enzima de restricción para crear extremos complementarios en cada molécula que se puedan emparejar entre sí y unirlos con una ligasa. Alternativamente, los enlazadores de ácido nucleico sintéticos se pueden ligar a los extremos del ácido nucleico que codifica los receptores quiméricos. Los enlazadores sintéticos pueden contener secuencias de ácido nucleico que corresponden a un sitio de restricción particular en el vector. La selección de los vectores de expresión/plásmidos/vectores virales dependerá del tipo de células hospedadoras para expresar los receptores quiméricos, pero debería ser adecuada para una integración y replicación en células eucariotas.
Se puede usar una variedad de promotores para la expresión de los receptores quiméricos descritos en el presente documento, incluyendo, sin limitación, el promotor temprano intermedio de citomegalovirus (CMV), una LTR viral tal como la LTR del virus del sarcoma de Rous, LTR de VIH, LTR de HTLV-1, LTR del virus de la leucemia murina de Maloney (MMLV), LTR del virus del sarcoma mieloproliferativo (MPSV), LTR del virus formador de focos del bazo (SFFV), promotor temprano del virus 40 de simio (SV40), promotor del virus del herpes simple tk, promotor del factor de elongación 1 -alfa (EF1-a) con o sin el intrón EF1-a. Promotores adicionales para la expresión de los receptores quiméricos incluyen cualquier promotor constitutivamente activo en una célula inmune. Alternativamente, se puede utilizar cualquier promotor regulable, de modo que su expresión pueda modularse dentro de una célula inmune.
Además, el vector puede contener, por ejemplo, algunos o todos los elementos siguientes: un gen marcador seleccionable, tal como el gen de la neomicina para la selección de transfectantes estables o transitorios en células hospedadoras; secuencias potenciadoras/promotoras procedentes del gen temprano inmediato del CMV humano para niveles elevados de transcripción; señales de terminación de la transcripción y procesamiento de ARN de SV40 para la estabilidad del ARNm; regiones no traducidas 5' y 3' para la estabilidad del ARNm y la eficiencia de la traducción de genes altamente expresados como a-globina o p-globina; orígenes de replicación del polioma SV40 y ColE1 para una replicación episomal adecuada; sitios de unión a ribosomas internos (IRES), sitios de clonación múltiples y versátiles; promotores de ARN T7 y SP6 para la transcripciónin vitrode ARN sentido y antisentido; un "interruptor suicida" o "gen suicida" que, cuando se activa, provoca la muerte de las células que portan el vector (p. ej., timidina cinasa del VHS, una caspasa inducible tal como iCasp9), y un gen indicador para evaluar la expresión del receptor quimérico. Véase la sección VI a continuación. Los vectores y métodos adecuados para producir vectores que contienen transgenes son bien conocidos y están disponibles en la técnica. Se pueden encontrar ejemplos de preparación de vectores para la expresión de receptores quiméricos, por ejemplo, en el documento US2014/0106449.
En algunas realizaciones, la estructura artificial del receptor quimérico o el ácido nucleico que codifica dicho receptor quimérico es una molécula de ADN. En algunas realizaciones, la estructura artificial del receptor quimérico o el ácido nucleico que codifica dicho receptor quimérico es un vector de ADN y se puede electroporar en células inmunes (véase, por ejemplo, Till, et al. Blood (2012) 119(17): 3940-3950). En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el receptor quimérico es una molécula de ARN, que se puede electroporar en células inmunes.
Cualquiera de los vectores que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una estructura artificial de receptor quimérico descrita en el presente documento, también está dentro del alcance de la presente divulgación. Un vector de ese tipo puede administrarse a células hospedadoras tales como células inmunes hospedadoras mediante un método adecuado. Los métodos para administrar vectores a células inmunes son bien conocidos en la técnica y pueden incluir la electroporación de ADN, ARN o transposones, reactivos de transfección tales como liposomas o nanopartículas para administrar ADN, ARN o transposones; administración de ADN, ARN o transposones o proteínas mediante deformación mecánica (véase, p. ej., Sharei et al.Proc. Nat. Acad. Sci. USA(2013) 110(6): 2082-2087); o transducción viral. En algunas realizaciones, los vectores para la expresión de los receptores quiméricos se administran a las células hospedadoras mediante transducción viral. Los métodos virales ejemplares para la administración incluyen, sin limitarse a, retrovirus recombinantes (véanse, p. ej., documentos de publicación PCT núm. WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; documentos de patente de EE. UU. núm. 5.219.740 y 4.777.127; documento de patente de GB núm. 2.200.651; y documento de patente EP núm. 0345242), vectores basados en alfavirus y vectores de virus adenoasociados (AAV) (véanse, p. ej., documentos de publicación PCT núm. WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655). En algunas realizaciones, los vectores para la expresión de los receptores quiméricos son retrovirus. En algunas realizaciones, los vectores para la expresión de los receptores quiméricos son lentivirus. En algunas realizaciones, los vectores para la expresión de los receptores quiméricos son virus adenoasociados.
En ejemplos en los que los vectores que codifican receptores quiméricos se introducen en las células hospedadoras usando un vector viral, las partículas virales que son capaces de infectar las células inmunes y portan el vector pueden producirse mediante cualquier método conocido en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo en los documentos de solicitud PCT núm. WO 1991/002805A2, WO 1998/009271 A 1 y documento de patente de e E. UU. núm. 6.194.191. Las partículas virales se recogen del material sobrenadante del cultivo celular y pueden aislarse y/o purificarse antes de poner en contacto las partículas virales con las células inmunes.
Los métodos para preparar células hospedadoras que expresan cualquiera de los receptores quiméricos descritos en el presente documento pueden comprender activar y/o expandir las células inmunesex vivo.Activar una célula hospedadora significa estimular una célula hospedadora hasta un estado de activación en el que la célula puede realizar funciones efectoras (p. ej., citotoxicidad). Los métodos para activar una célula hospedadora dependerán del tipo de célula hospedadora utilizada para la expresión de los receptores quiméricos. La expansión de las células hospedadoras puede implicar cualquier método que dé como resultado un aumento en el número de células que expresan receptores quiméricos, por ejemplo, permitiendo que las células hospedadoras proliferen o estimulando la proliferación de las células hospedadoras. Los métodos para estimular la expansión de las células hospedadoras dependerán del tipo de célula hospedadora utilizada para la expresión de los receptores quiméricos y serán evidentes para un experto en la técnica. En algunas realizaciones, las células hospedadoras que expresan cualquiera de los receptores quiméricos descritos en el presente documento, se activan y/o expandenex vivoantes de administrarlas a un sujeto.
En algunas realizaciones, los agentes que se dirigen a un antígeno de la superficie celular específico de linaje son un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC). Como resultará evidente para un experto en la técnica, la expresión "conjugado de anticuerpo-fármaco" se puede utilizar indistintamente con "inmunotoxina" y se refiere a una molécula de fusión que comprende un anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) conjugado con una toxina o molécula de fármaco. La unión del anticuerpo con el antígeno correspondiente permite la entrega de la toxina o la molécula del fármaco a una célula que presenta el antígeno en su superficie celular (p. ej., una célula diana), provocando de ese modo la muerte de la célula diana.
En algunas realizaciones, el agente es un conjugado de anticuerpo-fármaco. En algunas realizaciones, el conjugado de anticuerpo-fármaco comprende un fragmento de unión a antígeno y una toxina o un fármaco que induce citotoxicidad en una célula diana. En la invención, el conjugado de anticuerpo-fármaco se dirige a CD33.
En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno del conjugado de anticuerpo-fármaco tiene las mismas CDRs de cadena pesada que la región variable de la cadena pesada proporcionada por SEQ ID NO: 12 y las mismas CDRs de cadena ligera que la región variable de la cadena ligera proporcionada por SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno del conjugado de anticuerpo-fármaco tiene la región variable de la cadena pesada proporcionada por SEQ ID NO: 12 y la misma región variable de la cadena ligera proporcionada por SEQ ID NO: 13.
Las toxinas o fármacos compatibles para un uso en conjugados de anticuerpo-fármaco son bien conocidos en la técnica y serán evidentes para un experto en la técnica. Véase, p. ej., Peters et al.,Biosci. Rep.(2015) 35(4): e00225. En algunas realizaciones, el conjugado de anticuerpo-fármaco puede comprender además un enlazador (p. ej., un enlazador peptídico, tal como un enlazador escindible) que une el anticuerpo y la molécula de fármaco.
Un ADC descrito en el presente documento puede usarse como tratamiento de seguimiento para sujetos que se han sometido a la terapia combinada tal y como se describe en el presente documento.
Células hematopoyéticas con insuficiente antígeno de la superficie celular específico de linaje
La presente divulgación también proporciona células hematopoyéticas tales como HSCs que se han modificado genéticamente para que tengan insuficiente antígeno de la superficie celular específico de linaje. En la invención, las células hematopoyéticas son células madre hematopoyéticas. Las células madre hematopoyéticas (HSCs) son capaces de dar lugar a células progenitoras mieloides y linfoides que, a su vez, dan origen a células mieloides (p. ej., monocitos, macrófagos, neutrófilos, basófilos, células dendríticas, eritrocitos, plaquetas, etc.) y células linfoides (p. ej., linfocitos T, linfocitos B, células NK), respectivamente. Las HSCs se caracterizan por la expresión del marcador de superficie celular CD34 (p. ej., CD34+), que puede usarse para la identificación y/o aislamiento de las HSCs, y la ausencia de marcadores de la superficie celular asociados con un compromiso con un linaje celular.
En algunas realizaciones, las HSCs se obtienen a partir de un sujeto, tal como un sujeto mamífero. En algunas realizaciones, el sujeto mamífero es un primate no humano, un roedor (p. ej., ratón o rata), un animal bovino, porcino, equino o un animal doméstico. En algunas realizaciones, las HSCs se obtienen a partir de un paciente humano, tal como un paciente humano que tiene una neoplasia maligna hematológica. En algunas realizaciones, las HSCs se obtienen a partir de un donante sano. En algunas realizaciones, las HSCs se obtienen a partir del sujeto al que se administrarán posteriormente las células inmunes que expresan los receptores quiméricos. Las HSCs que se administran al mismo sujeto a partir del cual se obtuvieron las células, se denominan células autólogas, mientras que las HSCs que se obtienen de un sujeto que no es el sujeto al que se administrarán las células, se denominan células alogénicas.
Las HSCs pueden obtenerse a partir de cualquier fuente adecuada utilizando medios convencionales conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, las HSCs se obtienen a partir de una muestra de un sujeto, tal como una muestra de médula ósea o una muestra de sangre. Como alternativa o además, las HSCs pueden obtenerse a partir de un cordón umbilical. En algunas realizaciones, las HSCs provienen de células mononucleares de médula ósea o de sangre periférica (PBMCs). En general, las células de la médula ósea se pueden obtener de la cresta ilíaca, fémures, tibias, columna vertebral, costillas u otros espacios medulares de un sujeto. La médula ósea se puede extraer del paciente y aislar mediante diversas separaciones y procedimientos de lavado conocidos en la técnica. Un procedimiento ejemplar para el aislamiento de células de la médula ósea comprende los siguientes pasos: a) extracción de una muestra de médula ósea; b) separación centrífuga de la suspensión de médula ósea en tres fracciones y recogida de la fracción intermedia o capa leucocitaria; c) la capa leucocitaria de la etapa (b) se centrifuga una vez más en un fluido de separación, comúnmente Ficoll™, y se recoge una fracción intermedia que contiene las células de la médula ósea; y d) lavado de la fracción recogida en el paso (c) para recuperar células de la médula ósea que se pueden volver a transfundir.
Las HSCs normalmente residen en la médula ósea, pero pueden movilizarse hacia la sangre circulante administrando un agente movilizador para recoger HSCs de la sangre periférica. En algunas realizaciones, al sujeto a partir del cual se obtienen las HSCs, se le administra un agente movilizador, tal como factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF). El número de HSCs recogidas después de la movilización usando un agente movilizador es normalmente mayor que el número de células obtenidas sin el uso de un agente movilizador.
En algunas realizaciones, se obtiene una muestra de un sujeto y luego se enriquece para un tipo de célula deseado (p. ej., células CD34+/CD33-). Por ejemplo, las células hematopoyéticas PBMC y/o CD34+ se pueden aislar desde la sangre tal y como se describe en el presente documento. Las células también se pueden aislar separándolas de otras células, por ejemplo, mediante aislamiento y/o activación con un anticuerpo que se une a un epítopo en la superficie celular del tipo de célula deseado. Otro método que se puede usar incluye la selección negativa usando anticuerpos contra marcadores de la superficie celular para enriquecer selectivamente un tipo de célula específico sin activar la célula mediante un acoplamiento del receptor.
Las poblaciones de HSCs se pueden expandir antes o después de modificar genéticamente las HSCs para que expresen una cantidad insuficiente de un antígeno de la superficie celular específico de linaje. Las células pueden cultivarse en condiciones que comprenden un medio de expansión que comprende una o más citocinas, tales como factor de células madre (SCF), ligando Flt-3 (Flt3L), trombopoyetina (TPO), interleucina 3 (IL-3) o interleucina 6 (IL-6). La célula se puede expandir durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 días o cualquier intervalo necesario. En algunas realizaciones, las HSCs se expanden después del aislamiento de una población celular deseada (p. ej., CD34+/CD33-) a partir de una muestra obtenida de un sujeto y antes de la modificación genética. En algunas realizaciones, las HSCs se expanden después de la modificación genética, expandiendo así selectivamente las células que han sufrido la modificación genética y con insuficiente antígeno de la superficie celular específico de linaje. En algunas realizaciones, una célula ("un clon") o varias células que tienen una característica deseada (p. ej., fenotipo o genotipo) se pueden seleccionar tras la modificación genética y expandir de forma independiente.
En la invención, las células hematopoyéticas se modifican genéticamente para que tengan insuficiente antígeno de la superficie celular específico de linaje. En algunas realizaciones, las células hematopoyéticas se modifican genéticamente para que expresen de forma insuficiente el mismo antígeno de la superficie celular específico de linaje al que se dirige el agente. Tal y como se usa en el presente documento, se considera que una célula hematopoyética tiene insuficiente antígeno de la superficie celular específico de linaje, si la célula hematopoyética tiene una expresión sustancialmente reducida del antígeno de la superficie celular específico de linaje, en comparación con una célula hematopoyética natural del mismo tipo que la célula hematopoyética modificada genéticamente (p. ej., se caracteriza por la presencia de los mismos marcadores de la superficie celular, como CD34). En algunas realizaciones, la célula hematopoyética no tiene una expresión detectable del antígeno de la superficie celular específico de linaje. El nivel de expresión de un antígeno de la superficie celular específico de linaje se puede evaluar mediante cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, el nivel de expresión de un antígeno de la superficie celular específico de linaje se puede evaluar detectando el antígeno con un anticuerpo específico de ese antígeno (p. ej., métodos de citometría de flujo, transferencia Western).
En algunas realizaciones, la expresión del antígeno de la superficie celular específico de linaje en la célula hematopoyética modificada genéticamente, se compara con la expresión del antígeno de la superficie celular específico de linaje en una célula hematopoyética de origen natural. En algunas realizaciones, la modificación genética da como resultado una reducción en el nivel de expresión del antígeno de la superficie celular específico de linaje en al menos aproximadamente un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% en comparación con la expresión del antígeno de la superficie celular específico de linaje en una célula hematopoyética de origen natural.
En algunas realizaciones, la célula hematopoyética tiene insuficiente gen endógeno completo que codifica el antígeno de la superficie celular específico de linaje. En algunas realizaciones, se ha delecionado todo el gen endógeno que codifica el antígeno de la superficie celular específico de linaje. En algunas realizaciones, la célula hematopoyética comprende una porción del gen endógeno que codifica el antígeno de la superficie celular específico de linaje. En algunas realizaciones, la célula hematopoyética expresa una porción (p. ej., una proteína truncada) del antígeno de la superficie celular específico de linaje. En otras realizaciones, se ha delecionado una porción del gen endógeno que codifica el antígeno de la superficie celular específico de linaje. En algunas realizaciones, se ha delecionado al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% o más del gen que codifica el antígeno de la superficie celular específico de linaje.
Como apreciará un experto en la técnica, se puede delecionar una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno de la superficie celular específico de linaje o una o más secuencias no codificantes, de modo que la célula hematopoyética tenga insuficiente antígeno (p. ej., ha reducido sustancialmente la expresión del antígeno).
En la invención, el antígeno de la superficie celular específico de linaje es CD33. La estructura prevista de CD33 incluye dos dominios de inmunoglobulina, un dominio IgV y un dominio IgC2. En algunas realizaciones, se deleciona una porción del dominio de inmunoglobulina C de CD33.
Cualquiera de las células hematopoyéticas modificadas genéticamente, tales como HSCs, con insuficiente antígeno de la superficie celular específico de linaje, se puede preparar mediante un método de rutina o mediante un método descrito en el presente documento. La modificación genética se realiza utilizando la edición del genoma. Tal y como se usa en el presente documento, "edición del genoma" se refiere a un método para modificar el genoma, incluida cualquier secuencia de nucleótidos codificante o no codificante de proteínas, de un organismo para desactivar la expresión de un gen diana. En general, los métodos de edición del genoma implican el uso de una endonucleasa que es capaz de escindir el ácido nucleico del genoma, por ejemplo, en una secuencia de nucleótidos diana. La reparación de las roturas de la doble cadena en el genoma se puede realizar introduciendo mutaciones y/o se puede insertar ácido nucleico exógeno en el sitio diana.
Los métodos de edición del genoma generalmente se clasifican según el tipo de endonucleasa que participa en la generación de roturas de la doble cadena en el ácido nucleico diana. Esos métodos incluyen el uso de nucleasas con dedos de zinc (ZFN), nucleasas basadas en efectores similares a activadores de la transcripción (TALEN), meganucleasas y sistemas CRISPR/Cas.
En un aspecto de la presente divulgación, la sustitución de las células tumorales por una población modificada de células normales se realiza utilizando células normales en las que se modifica un antígeno específico de linaje. Esa modificación puede incluir el agotamiento o la inhibición de cualquier antígeno específico de linaje utilizando un sistema CRISPR-Cas9, en donde el sistema CRISPR-Cas9 de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas, regularmente intercaladas (CRISPR) es un sistema CRISPR-Cas9 modificado que no se presenta en la naturaleza (FIGURA 4).
El sistema CRISPR-Cas se ha utilizado con éxito para editar los genomas de diversos organismos, incluidos, sin limitarse a, bacterias, seres humanos, moscas de la fruta, peces cebra y plantas. Véanse, p. ej., Jiang et al.,Nature Biotechnology(2013) 31 (3):233; Qi et al,Cell(2013) 5:1173; DiCarlo et al.,Nucleic Acids Res.(2013) 7:4336; Hwang et al.,Nat. Biotechnol(2013), 3:227); Gratz et al.,Genetics(2013) 194:1029; Cong et al.,Science(2013) 6121:819; Mali et al.,Science(2013) 6121:823; Cho et al.Nat. Biotechnol(2013) 3: 230; y Jiang et al.,Nucleic Acids Research(2013) 41 (20):el88.
La presente divulgación utiliza el sistema CRISPR/Cas9 que se hibrida con una secuencia diana en un polinucleótido de un antígeno específico de linaje, en donde el sistema CRISPR/Cas9 comprende una nucleasa Cas9 y un ARNcr/ARNtracr modificado (o ARN guía único). El complejo CRISPR/Cas9 puede unirse al polinucleótido del antígeno específico de linaje y permitir la escisión del polinucleótido del antígeno, modificando así el polinucleótido.
El sistema CRISPR/Cas de la presente divulgación se puede unir y/o escindir la región de interés dentro de un antígeno de la superficie celular específico de linaje, en una región codificante o no codificante, dentro del gen o adyacente al gen, tal como, por ejemplo, una secuencia líder, una secuencia terminal o un intrón o dentro de una región no transcrita, ya sea aguas arriba o aguas abajo de la región codificante. Los ARNs guía (ARNg) utilizados en la presente divulgación pueden diseñarse de manera que el ARNg dirija la unión de los complejos Cas9-ARNg a sitios de escisión predeterminados (sitios diana) en un genoma. Los sitios de escisión pueden elegirse para liberar un fragmento que contiene una región de secuencia desconocida o una región que contiene un SNP, inserción de nucleótidos, deleción de nucleótidos, reordenamiento, etc.
La escisión de una región génica puede comprender la escisión de una o dos cadenas en la ubicación de la secuencia diana mediante la enzima Cas. En una realización, esa escisión puede dar como resultado una transcripción reducida de un gen diana. En otra realización, la escisión puede comprender además la reparación del polinucleótido diana escindido mediante recombinación homóloga con un polinucleótido molde exógeno, en donde la reparación da como resultado una inserción, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos del polinucleótido diana.
Los términos y expresiones ''ARNg'', "ARN guía" y "secuencia guía de CRISPR" se pueden usar indistintamente en todo el documento y se refieren a un ácido nucleico que comprende una secuencia que determina la especificidad de una proteína de unión a ADN de Cas de un sistema CRISPR/Cas. Un ARNg se hibrida (de forma complementaria, parcial o completa) con una secuencia de ácido nucleico diana en el genoma de una célula hospedadora. El ARNg o una porción del mismo que se hibrida con el ácido nucleico diana, puede tener una longitud de entre 15 y 25 nucleótidos, de 18 a 22 nucleótidos o de 19 a 21 nucleótidos. En algunas realizaciones, la secuencia de ARNg que se hibrida con el ácido nucleico diana tiene una longitud de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos. En algunas realizaciones, la secuencia de ARNg que se hibrida con el ácido nucleico diana tiene una longitud entre 10 y 30 o entre 15 y 25 nucleótidos.
Además de una secuencia que se une a un ácido nucleico diana, en algunas realizaciones, el ARNg también comprende una secuencia de armazón. La expresión de un ARNg que codifica tanto una secuencia complementaria a un ácido nucleico diana como una secuencia de armazón tiene la doble función de unirse (hibridarse) al ácido nucleico diana y llevar la endonucleasa al ácido nucleico diana, lo que puede dar como resultado una actividad CRISPR específica del sitio. En algunas realizaciones, ese ARNg quimérico puede denominarse ARN guía único (ARNsg).
Tal y como se usa en el presente documento, una "secuencia de armazón", también denominada ARNtracr, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que recluta una endonucleasa Cas hasta un ácido nucleico diana unido (hibridado) a una secuencia de ARNg complementaria. Cualquier secuencia de armazón que comprenda al menos una estructura de bucle y tallo y reclute una endonucleasa puede usarse en los elementos genéticos y vectores descritos en el presente documento. Las secuencias de armazón ejemplares serán evidentes para un experto en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Jinek, et al.Science(2012) 337(6096):816-821, Ran, et al.Nature Protocols(2013) 8:2281-2308, documentos de solicitud PCT núm. WO2014/093694 y núm. WO2013/176772.
En algunas realizaciones, la secuencia de ARNg no comprende una secuencia de armazón y una secuencia de armazón se expresa como un transcrito por separado. En tales realizaciones, la secuencia de ARNg comprende además una secuencia adicional que es complementaria a una porción de la secuencia de armazón y su función es unir (hibridar) la secuencia de armazón y reclutar la endonucleasa al ácido nucleico diana.
En algunas realizaciones, la secuencia de ARNg es al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o al menos 100% complementaria a un ácido nucleico diana (véase también el documento de patente de EE. UU. núm. 8.697.359, por su descripción de la complementariedad de una secuencia de ARNg con una secuencia de polinucleótidos diana). Se ha demostrado que los errores en el apareamiento entre una secuencia guía de CRISPR y el ácido nucleico diana cerca del extremo 3' del ácido nucleico diana, pueden anular la actividad de escisión de la nucleasa (Upadhyay, et al.Genes Genome Genetics(2013) 3(12):2233-2238). En algunas realizaciones, la secuencia de ARNg es al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o al menos 100% complementaria al extremo 3' del ácido nucleico diana (p. ej., los últimos 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos del extremo 3' del ácido nucleico diana).
El ácido nucleico diana está flanqueado en el lado 3' por un motivo adyacente protoespaciador (PAM) que puede interactuar con la endonucleasa y participar adicionalmente para dirigir la actividad endonucleasa al ácido nucleico diana. Generalmente se piensa que la secuencia PAM que flanquea el ácido nucleico diana depende de la endonucleasa y de la fuente a partir de la cual se obtiene la endonucleasa. Por ejemplo, para las endonucleasas Cas9 que se obtienen a partir deStreptococcus pyogenes,la secuencia PAM es NGG. Para las endonucleasas Cas9 que se obtienen a partir deStaphylococcus aureus,la secuencia PAM es NNGRRT. Para las endonucleasas Cas9 que se obtienen a partir deNeisseria meningitidis,la secuencia PAM es NNNNGATT. Para las endonucleasas Cas9 que se obtienen a partir deStreptococcus thermophilus,la secuencia PAM es NNAGAA. Para la endonucleasa Cas9 que se obtiene a partir deTreponema denticola,la secuencia PAM es NAAAAC. Para una nucleasa Cpf1, la secuencia PAM es TTN.
En algunas realizaciones, la modificación genética de una célula también comprende introducir una endonucleasa Cas en la célula. En algunas realizaciones, la endonucleasa Cas y el ácido nucleico que codifica el ARNg se proporcionan en el mismo ácido nucleico (p. ej., un vector). En algunas realizaciones, la endonucleasa Cas y el ácido nucleico que codifica el ARNg se proporcionan en diferentes ácidos nucleicos (p. ej., diferentes vectores). Alternativamente o además, la endonucleasa Cas se puede proporcionar o introducir en la célula en forma de proteína.
En algunas realizaciones, la endonucleasa Cas es una enzima Cas9 o una variante de la misma. En algunas realizaciones, la endonucleasa Cas9 se obtiene a partir deStreptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis, Streptococcus thermophilus o Treponema denticola.En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica la endonucleasa Cas puede optimizarse con codones para su expresión en una célula hospedadora. En algunas realizaciones, la endonucleasa es un homólogo u ortólogo de Cas9.
En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica la endonucleasa Cas9 se modifica adicionalmente para alterar la actividad de la proteína. En algunas realizaciones, la endonucleasa Cas9 es una Cas9 catalíticamente inactiva. Por ejemplo, dCas9 contiene mutaciones de residuos catalíticamente activos (D10 y H840) y no tiene actividad nucleasa. Alternativamente o además, la endonucleasa Cas9 puede fusionarse con otra proteína o una porción de la misma. En algunas realizaciones, dCas9 está fusionada con un dominio represor, tal como un dominio KRAB. En algunas realizaciones, esas proteínas de fusión dCas9 se usan con las estructuras artificiales descritas en el presente documento para la represión génica multiplexada (por ejemplo, interferencia de CRISPR (CRISPRi)). En algunas realizaciones, dCas9 está fusionada con un dominio activador, como VP64 o VPR. En algunas realizaciones, esas proteínas de fusión dCas9 se usan con las estructuras artificiales descritas en el presente documento para la activación génica (p. ej., activación de CRISPR (CRISPRa)). En algunas realizaciones, dCas9 está fusionada con un dominio modulador epigenético, tal como un dominio de histona desmetilasa o un dominio de histona acetiltransferasa. En algunas realizaciones, dCas9 está fusionada con LSD1 o p300 o una porción de los mismos. En algunas realizaciones, la fusión dCas9 se usa para la modulación epigenética basada en CRISPR. En algunas realizaciones, dCas9 o Cas9 está fusionada con un dominio de nucleasa Fok1. En algunas realizaciones, se usa Cas9 o dCas9 fusionado a un dominio de nucleasa Fok1 para la edición del genoma. En algunas realizaciones, Cas9 o dCas9 está fusionada con una proteína fluorescente (p. ej., GFP, RFP, mCherry, etc.). En algunas realizaciones, las proteínas Cas9/dCas9 fusionadas con proteínas fluorescentes se usan para marcar y/o visualizar loci genómicos o identificar células que expresan la endonucleasa Cas.
Como alternativa o además, la endonucleasa Cas es una nucleasa Cpf1. En algunas realizaciones, la célula hospedadora expresa una nucleasa Cpf1 que se obtiene a partir deProvetella spp.oFrancisella spp.En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica la nucleasa Cpf1 puede optimizarse con codones para su expresión en una célula hospedadora.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona composiciones y métodos para inhibir un antígeno de la superficie celular específico de linaje en células hematopoyéticas usando un sistema CRISPR/Cas9, en donde la secuencia de ARN guía se hibrida con la secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno de la superficie celular específico de linaje. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular específico de linaje es CD33 y el ARNg se hibrida con una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica CD33 (FIGURA 5). En la Tabla 4 se proporcionan ejemplos de ARNg que se dirigen a CD33, aunque se pueden elaborar ARNg adicionales que se hibridan con CD33 y se pueden usar en los métodos descritos en el presente documento.
La Tabla 4 proporciona secuencias de ARN guía ejemplares que se hibridan o se prevé que se hibriden con una porción de CD33.
Tabla 4: Secuencias de ARN guía dirigidas a CD33
En algunas realizaciones, puede ser deseable modificar genéticamente las HSCs, en particular las HSCs alogénicas, para reducir los efectos de injerto contra hospedador. Por ejemplo, la terapia estándar para la leucemia mieloide aguda recurrente es el trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT, por sus siglas en inglés). Sin embargo, al menos uno de los factores limitantes para el éxito del HSCT es la enfermedad de injerto contra hospedador (EICH), en la que se ha implicado la expresión de la molécula CD45 de la superficie celular. Véase, p. ej., Van Besie,Hematology Am. Soc. Hematol Educ Program(2013)56; MawadCurr. Hematol. Malig. Rep.(2013) 8(2):132. CD45RA y CD45RO son isoformas de CD45 (que se encuentran en todas las células hematopoyéticas excepto en los eritrocitos). En los linfocitos T, CD45RA se expresa en células vírgenes, mientras que CD45RO se expresa en células de memoria. Los linfocitos T CD45RA tienen un alto potencial de reactividad contra antígenos específicos del receptor después del HSCT, lo que da lugar a una EICH. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de un tratamiento eficaz y seguro para la leucemia mieloide aguda que también reduzca la posibilidad de rechazo del trasplante o EICH. CD45 es un antígeno de linaje de tipo 1, ya que se requieren células portadoras de CD45 para sobrevivir, pero el antígeno puede eliminarse de las células madre mediante CRISPR.
Teniendo en cuenta las complicaciones que surgen debido al desarrollo de EICH después del HSCT, la presente divulgación también proporciona composiciones y métodos para el direccionamiento a CD45RA. Esas composiciones y métodos están destinados a prevenir y/o reducir la incidencia o extensión de la EICH.
Así, en el caso de EICH, el tratamiento del paciente puede implicar los siguientes pasos: (1) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un linfocito T al paciente, en donde el linfocito T comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido al antígeno específico de linaje CD45RA; y (2) infundir al paciente células madre hematopoyéticas, en donde las células hematopoyéticas tienen una expresión reducida del antígeno específico de linaje CD45RA.
Además, la presente divulgación proporciona composiciones y métodos para la inhibición combinada de antígenos específicos de linaje CD33 y CD45RA. Ese régimen de tratamiento puede implicar los siguientes pasos: (1) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un linfocito T al paciente, en donde el linfocito T comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) que se dirige a los antígenos específicos de linaje CD33 y CD45RA; y (2) infundir o reinfundir al paciente células madre hematopoyéticas, ya sean autólogas o alogénicas, en donde las células hematopoyéticas tienen una expresión reducida de los antígenos específicos de linaje CD33 y CD45RA.
En algunas realizaciones, el antígeno específico de linaje de la superficie celular CD45RA también se deleciona o se inhibe en las células hematopoyéticas usando un sistema CRISPR/Cas9. En algunas realizaciones, la secuencia de ARNg se hibrida con una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica CD45RA (FIGURA 6). En la Tabla 5 se proporcionan ejemplos de ARNg que se dirigen a CD45RA, aunque se pueden preparar ARNg adicionales que se hibridan con CD45RA y se pueden usar en los métodos descritos en el presente documento.
La Tabla 5 proporciona secuencias de ARN guía ejemplares que se hibridan o se prevé que se hibridarán con el exón 4 o el exón 5 de CD45 humano.
Tabla 5: Secuencias de ARN guía dirigidas a CD45
También se proporcionan en el presente documento métodos para producir una célula que tiene insuficiente antígeno de la superficie celular específico de linaje, que implican proporcionar una célula e introducir en la célula componentes de un sistema CRISPR Cas para la edición del genoma. En algunas realizaciones, se introduce en la célula un ácido nucleico que comprende un ARN guía de CRISPR-Cas (ARNg) que se hibrida o se prevé que se hibride con una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno de la superficie celular específico de linaje. En algunas realizaciones, el ARNg se introduce en la célula sobre un vector. En algunas realizaciones, se introduce una endonucleasa Cas en la célula. En algunas realizaciones, la endonucleasa Cas se introduce en la célula como un ácido nucleico que codifica una endonucleasa Cas. En algunas realizaciones, el ARNg y una secuencia de nucleótidos que codifica una endonucleasa Cas se introducen en la célula en el mismo ácido nucleico (p. ej., el mismo vector). En algunas realizaciones, la endonucleasa Cas se introduce en la célula en forma de una proteína. En algunas realizaciones, la endonucleasa Cas y el ARNg se han formado previamentein vitroy se introducen en la célula como un complejo.
La presente divulgación proporciona además vectores y sistemas de vectores modificados, de origen no natural, que pueden codificar uno o más componentes de un complejo CRISPR/Cas9, en donde el vector comprende un polinucleótido que codifica (i) un ARN guía del sistema (CRISPR)-Cas que se hibrida con la secuencia del antígeno específico de linaje y (ii) una endonucleasa Cas9.
Los vectores de la presente divulgación pueden impulsar la expresión de una o más secuencias en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed,Nature(1987) 329: 840) y pMT2PC (Kaufman et al.,EMBO J.(1987) 6:187). Cuando se utilizan en células de mamíferos, las funciones de control del vector de expresión normalmente las proporcionan uno o más elementos reguladores. Por ejemplo, los promotores comúnmente usados se obtienen a partir de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus, virus de simio 40 y otros descritos en el presente documento y conocidos en la técnica. Para conocer otros sistemas de expresión adecuados para células procariotas y eucariotas, véanse, p. ej., los Capítulos 16 y 17 de Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
Los vectores de la presente divulgación son capaces de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula particular (p. ej., para expresar el ácido nucleico se utilizan elementos reguladores específicos de tejido). Esos elementos reguladores incluyen promotores que pueden ser específicos de un tejido o específicos de una célula. La expresión "específico de un tejido" tal como se aplica a un promotor, se refiere a un promotor que es capaz de dirigir la expresión selectiva de una secuencia de nucleótidos de interés hacia un tipo específico de tejido (p. ej., semillas) en ausencia relativa de expresión de la misma secuencia de nucleótidos de interés en un tipo diferente de tejido. La expresión "específico de un tipo celular" aplicado a un promotor, se refiere a un promotor que es capaz de dirigir la expresión selectiva de una secuencia de nucleótidos de interés en un tipo específico de célula en ausencia relativa de expresión de la misma secuencia de nucleótidos de interés en un tipo de célula diferente dentro del mismo tejido. La expresión "específico de un tipo celular" cuando se aplica a un promotor, también significa un promotor capaz de promover la expresión selectiva de una secuencia de nucleótidos de interés en una región dentro de un único tejido. La especificidad del tipo celular de un promotor se puede evaluar usando métodos bien conocidos en la técnica, p. ej., tinción inmunohistoquímica.
Se pueden usar métodos convencionales de transferencia de genes basados en virus y no virus para introducir ácidos nucleicos que codifican CRISPR/Cas9 en células de mamíferos o tejidos diana. Esos métodos se pueden usar para administrar ácidos nucleicos que codifican componentes de un sistema CRISPR-Cas a células en cultivo o en un organismo hospedador. Los sistemas de administración de vectores no virales incluyen plásmidos de ADN, ARN (p. ej., un transcrito de un vector descrito en el presente documento), ácido nucleico desnudo y ácido nucleico que forma un complejo con un vehículo de administración. Los sistemas de administración de vectores virales incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas episomales o integrados después de su administración a la célula. Para una revisión de los procedimientos de terapia génica.
Los vectores virales se pueden administrar directamente a los pacientes(in vivo)o pueden usarse para manipular célulasin vitrooex vivo,en donde las células modificadas pueden administrarse a los pacientes. En una realización, la presente divulgación utiliza sistemas basados en virus que incluyen, sin limitarse a, vectores retrovirales, de lentivirus, adenovirus, adenoasociados y de virus del herpes simple para la transferencia de genes. Además, la presente divulgación proporciona vectores capaces de integrarse en el genoma del hospedador, tales como retrovirus o lentivirus. Preferiblemente, el vector usado para la expresión de un sistema CRISPR-Cas de la presente divulgación es un vector de lentivirus.
En una realización, la divulgación proporciona la introducción de uno o más vectores que codifican CRISPR-Cas en células eucariotas. La célula puede ser una célula cancerosa. Alternativamente, la célula es una célula hematopoyética, tal como una célula madre hematopoyética. Ejemplos de células madre incluyen células madre pluripotentes, multipotentes y unipotentes. Ejemplos de células madre pluripotentes incluyen células madre embrionarias, células germinales embrionarias, células de carcinoma embrionario y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). En una realización preferida, la divulgación proporciona la introducción de CRISPR-Cas9 en una célula madre hematopoyética.
Los vectores de la presente divulgación se administran a la célula eucariota de un sujeto. La modificación de las células eucariotas mediante el sistema CRISPR/Cas9 puede tener lugar en un cultivo celular, en donde el método comprende aislar la célula eucariota procedente de un sujeto antes de la modificación. En algunas realizaciones, el método comprende además devolver al sujeto dicha célula eucariota y/o células obtenidas a partir de la misma.
Terapia combinada
Tal y como se describe en el presente documento, los agentes que comprenden un fragmento de unión a antígeno que se une a un antígeno de la superficie celular específico de linaje se pueden administrar a un sujeto en combinación con células hematopoyéticas que tienen insuficiente antígeno de la superficie celular específico de linaje. Tal y como se usa en el presente documento, "sujeto", "individuo" y "paciente" se usan indistintamente y se refieren a un vertebrado, preferiblemente un mamífero tal como un ser humano. Los mamíferos incluyen, sin limitarse a, primates humanos, primates no humanos o especies murinas, bovinas, equinas, caninas o felinas. En algunas realizaciones, el sujeto es un paciente humano que tiene una neoplasia maligna hematológica.
En algunas realizaciones, los agentes y/o las células hematopoyéticas se pueden mezclar con un vehículo farmacéuticamente aceptable para formar una composición farmacéutica, que también está dentro del alcance de la presente divulgación.
Para llevar a cabo los métodos descritos en el presente documento, se puede coadministrar una cantidad eficaz del agente que comprende un fragmento de unión a antígeno que se une a un antígeno de la superficie celular específico de linaje y una cantidad eficaz de células hematopoyéticas, a un sujeto que necesita el tratamiento. Tal y como se utiliza en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz" se puede utilizar indistintamente con la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" y se refiere a esa cantidad de un agente, población celular o composición farmacéutica (p. ej., una composición que comprende agentes y/o células hematopoyéticas) que es suficiente para dar como resultado una actividad deseada tras la administración a un sujeto que lo necesita. Dentro del contexto de la presente divulgación, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a esa cantidad de un compuesto, población celular o composición farmacéutica que es suficiente para retrasar la manifestación, detener la progresión, paliar o aliviar al menos un síntoma de un trastorno tratado mediante los métodos de la presente divulgación. Se debe tener en cuenta que cuando se administra una combinación de ingredientes activos, la cantidad eficaz de la combinación puede incluir o no cantidades de cada ingrediente que habrían sido eficaces si se hubieran administrado individualmente.
Las cantidades efectivas varían, como reconocen los expertos en la técnica, dependiendo de la afección particular que se esté tratando, la gravedad de la afección, los parámetros individuales del paciente, incluidos la edad, la condición física, el tamaño, el sexo y el peso, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si la hay), la vía específica de administración y factores similares dentro del conocimiento y experiencia del profesional de la salud. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz alivia, palia, mejora, aumenta, reduce los síntomas o retrasa la progresión de cualquier enfermedad o trastorno en el sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un paciente humano que tiene una neoplasia maligna hematológica.
Tal y como se describe en el presente documento, las células hematopoyéticas y/o las células inmunes que expresan receptores quiméricos pueden ser autólogas para el sujeto, es decir, las células se obtienen a partir del sujeto que necesita el tratamiento, se modifican genéticamente para que carezcan de expresión de un antígeno de la superficie celular específico de linaje o para la expresión de las estructuras artificiales del receptor quimérico, y luego se administran al mismo sujeto. La administración de células autólogas a un sujeto puede dar como resultado un rechazo reducido por parte de las células del hospedador, en comparación con la administración de células no autólogas. Alternativamente, las células del hospedador son células alogénicas, es decir, las células se obtienen a partir de un primer sujeto, se modifican genéticamente para que carezcan de expresión del antígeno de la superficie celular específico de linaje o para la expresión de las estructuras artificiales del receptor quimérico, y se administran a un segundo sujeto diferente del primero pero de la misma especie. Por ejemplo, las células inmunes alogénicas se pueden obtener de un donante humano y administrar a un receptor humano que sea diferente del donante.
En algunas realizaciones, las células inmunes y/o las células hematopoyéticas son células alogénicas y además se han modificado genéticamente para reducir la enfermedad de injerto contra hospedador. Por ejemplo, como se describe en el presente documento, las células madre hematopoyéticas pueden modificarse genéticamente (p. ej., usando edición del genoma) para tener una expresión reducida de CD45RA.
En algunas realizaciones, las células inmunes que expresan cualquiera de los receptores quiméricos descritos en el presente documento, se administran a un sujeto en una cantidad eficaz para reducir el número de células diana (p. ej., células cancerosas) en al menos un 20%, p. ej., 50%, 80%, 100%, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces o más.
Una cantidad típica de células, es decir, células inmunes o células hematopoyéticas, administradas a un mamífero (p. ej., un ser humano) puede estar, por ejemplo, en el intervalo de un millón a 100 mil millones de células; sin embargo, cantidades por debajo o por encima de ese intervalo ejemplar también están dentro del alcance de la presente divulgación. Por ejemplo, la dosis diaria de células puede ser de aproximadamente 1 millón a aproximadamente 50 mil millones de células (p. ej., aproximadamente 5 millones de células, aproximadamente 25 millones de células, aproximadamente 500 millones de células, aproximadamente mil millones de células, aproximadamente 5 mil millones de células, aproximadamente 20 mil millones de células, aproximadamente 30 mil millones de células, aproximadamente 40 mil millones de células o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores), preferiblemente de aproximadamente 10 millones a aproximadamente 100 mil millones de células (p. ej., aproximadamente 20 millones de células, aproximadamente 30 millones de células, aproximadamente 40 millones de células, aproximadamente 60 millones de células, aproximadamente 70 millones de células, aproximadamente 80 millones de células, aproximadamente 90 millones de células, aproximadamente 10 mil millones de células, aproximadamente 25 mil millones de células, aproximadamente 50 mil millones de células, aproximadamente 75 mil millones de células, aproximadamente 90 mil millones de células o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores), más preferiblemente de aproximadamente 100 millones de células a aproximadamente 50 mil millones de células (p. ej., aproximadamente 120 millones de células, aproximadamente 250 millones de células, aproximadamente 350 millones de células, aproximadamente 450 millones de células, aproximadamente 650 millones de células, aproximadamente 800 millones de células, aproximadamente 900 millones de células, aproximadamente 3 mil millones de células, aproximadamente 30 mil millones de células, aproximadamente 45 mil millones de células o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores).
En una realización, el receptor quimérico (p. ej., un ácido nucleico que codifica el receptor quimérico) se introduce en una célula inmune, y el sujeto (p. ej., un paciente humano) recibe una administración o dosis inicial de las células inmunes que expresan el receptor quimérico. Se pueden proporcionar al paciente una o más administraciones posteriores del agente (p. ej., células inmunes que expresan el receptor quimérico) a intervalos de 15 días, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 días después de la administración anterior. Se puede administrar al sujeto más de una dosis del agente por semana, p. ej., 2, 3, 4 o más administraciones del agente. El sujeto puede recibir más de una dosis del agente (p. ej., una célula inmune que expresa un receptor quimérico) por semana, seguida de una semana sin administración del agente y, finalmente, seguida de una o más dosis adicionales del agente (p. ej., más de una administración de células inmunes que expresan un receptor quimérico por semana). Las células inmunes que expresan un receptor quimérico pueden administrarse en días alternos con 3 administraciones por semana durante dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más semanas.
En el contexto de la presente divulgación, en la medida en que se relaciona con cualquiera de las enfermedades enumeradas en el presente documento, los términos "tratar", "tratamiento" y similares significan paliar o aliviar al menos un síntoma asociado con esa afección o retardar o revertir la progresión de esa afección. Dentro del significado de la presente divulgación, el término "tratar" también indica detener, retrasar la aparición (es decir, el período previo a la manifestación clínica de una enfermedad) y/o reducir el riesgo de desarrollar o empeorar una enfermedad. Por ejemplo, en relación con el cáncer, el término "tratar" puede significar eliminar o reducir la carga tumoral de un paciente o prevenir, retrasar o inhibir la metástasis, etc.
En algunas realizaciones, un agente comprende un fragmento de unión a antígeno que se une a un antígeno de la superficie celular específico de linaje y una población de células hematopoyéticas tiene insuficiente antígeno de la superficie celular específico de linaje. Por consiguiente, en esos métodos terapéuticos, el agente reconoce (se une) a una célula diana que expresa el antígeno de la superficie celular específico de linaje para dirigir la destrucción. Las células hematopoyéticas que tienen insuficiente antígeno permiten la repoblación de un tipo de célula al que se dirige el agente. En algunas realizaciones, el tratamiento del paciente puede implicar los siguientes pasos: (1) administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente dirigido a un antígeno de la superficie celular específico de linaje y (2) infundir o reinfundir al paciente células madre hematopoyéticas, ya sean autólogas o alogénicas, en donde las células hematopoyéticas tienen una expresión reducida de un antígeno asociado a una enfermedad específica de linaje. En algunas realizaciones, el tratamiento del paciente puede implicar los siguientes pasos: (1) administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una célula inmune que expresa un receptor quimérico, en donde la célula inmune comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor quimérico que se une un antígeno asociado a una enfermedad, específico de linaje de la superficie celular; y (2) infundir o reinfundir al paciente células hematopoyéticas (p. ej., células madre hematopoyéticas), ya sean autólogas o alogénicas, en donde las células hematopoyéticas tienen una expresión reducida de un antígeno asociado a la enfermedad, específico de linaje.
La eficacia de los métodos terapéuticos que utilizan un agente que comprende un fragmento de unión a antígeno que se une a un antígeno de la superficie celular específico de linaje y una población de células hematopoyéticas con insuficiente antígeno de la superficie celular específico de linaje, se puede evaluar mediante cualquier método conocido en la técnica y será evidente para un profesional experto en medicina. Por ejemplo, la eficacia de la terapia puede evaluarse por la supervivencia del sujeto o la carga del cáncer en el sujeto o tejido o muestra del mismo. En algunas realizaciones, la eficacia de la terapia se evalúa cuantificando el número de células que pertenecen a una población o linaje de células en particular. En algunas realizaciones, la eficacia de la terapia se evalúa cuantificando el número de células que presentan el antígeno de la superficie celular específico de linaje.
En algunas realizaciones, el agente que comprende un fragmento de unión a antígeno que se une al antígeno de la superficie celular específico de linaje y a la población de células hematopoyéticas, se administra de forma concomitante.
En algunas realizaciones, el agente que comprende un fragmento de unión a antígeno que se une a un antígeno de la superficie celular específico de linaje (p. ej., células inmunes que expresan un receptor quimérico como se describe en el presente documento), se administra antes de la administración de las células hematopoyéticas. En algunas realizaciones, el agente que comprende un fragmento de unión a antígeno que se une a un antígeno de la superficie celular específico de linaje (p. ej., células inmunes que expresan un receptor quimérico como se describe en el presente documento), se administra al menos aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses o más antes de la administración de las células hematopoyéticas.
En algunas realizaciones, las células hematopoyéticas se administran antes que el agente que comprende un fragmento de unión a antígeno que se une a un antígeno de la superficie celular específico de linaje (p. ej., células inmunes que expresan un receptor quimérico como se describe en el presente documento). En algunas realizaciones, la población de células hematopoyéticas se administra al menos aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses o más antes de la administración del agente que comprende un fragmento de unión a antígeno que se une a un antígeno de la superficie celular específico de linaje.
En algunas realizaciones, el agente dirigido al antígeno de la superficie celular específico de linaje y la población de células hematopoyéticas, se administran sustancialmente al mismo tiempo. En algunas realizaciones, se administra un agente dirigido al antígeno de la superficie celular específico de linaje y se evalúa al paciente durante un período de tiempo, después del cual se administra la población de células hematopoyéticas. En algunas realizaciones, se administra la población de células hematopoyéticas y se evalúa al paciente durante un período de tiempo, después del cual se administra el agente dirigido al antígeno de la superficie celular específico de linaje.
También dentro del alcance de la presente divulgación se encuentran las administraciones múltiples (p. ej., dosis) de los agentes y/o poblaciones de células hematopoyéticas. En algunas realizaciones, los agentes y/o las poblaciones de células hematopoyéticas se administran al sujeto una vez. En algunas realizaciones, los agentes y/o las poblaciones de células hematopoyéticas se administran al sujeto más de una vez (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5 o más veces). En algunas realizaciones, los agentes y/o las poblaciones de células hematopoyéticas se administran al sujeto a intervalos regulares, por ejemplo, cada seis meses.
En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto humano que tiene una neoplasia maligna hematológica. Tal y como se usa en el presente documento, una neoplasia maligna hematológica se refiere a una anomalía maligna que involucra células hematopoyéticas.(p.ej., células sanguíneas, incluidas las células progenitoras y madre). Ejemplos de neoplasias malignas hematopoyéticas incluyen, sin limitación, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, leucemia o mieloma múltiple. Las leucemias incluyen leucemia mieloide aguda, leucemia linfoide aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia linfoblástica aguda o leucemia linfoblástica crónica y leucemia linfoide crónica.
En algunas realizaciones, la leucemia es leucemia mieloide aguda (LMA). La leucemia mieloide aguda se caracteriza por ser una enfermedad neoplásica, clonal y heterogénea que se origina a partir de células transformadas que han adquirido progresivamente cambios genéticos decisivos que alteran las vías clave de diferenciación y regulación del crecimiento. (Dohner et al.,NEJM,(2015) 373:1136). La glicoproteína CD33 se expresa en la mayoría de las células de leucemia mieloide, así como en precursores mieloides y monocíticos normales, y se ha considerado un objetivo atractivo para la terapia de LMA (Laszlo et al.,Blood Rev.(2014) 28(4):143-53). Si bien los ensayos clínicos que utilizan terapia basada en anticuerpos monoclonales anti-CD33 han mostrado una mejor supervivencia en un subconjunto de pacientes con leucemia mieloide aguda cuando se combina con quimioterapia estándar, esos efectos también estaban acompañados de problemas de seguridad y eficacia.
Otros esfuerzos destinados a llegar a la diana de células de LMA han implicado la generación de linfocitos T que expresan receptores de antígenos quiméricos (CARs) que se dirigen selectivamente a CD33 en la LMA. Buckley et al.,Curr. Hematol. Malig. Rep.(2):65 (2015). Sin embargo, los datos son limitados y existen incertidumbres sobre la eficacia de ese enfoque (si se eliminan todas las células diana) en el tratamiento del paciente. Además, dado que las células de linaje mieloide son indispensables para la vida, agotar las células de linaje mieloide de un sujeto podría tener efectos perjudiciales en la supervivencia del paciente. La presente divulgación tiene como objetivo, al menos en parte, resolver esos problemas asociados con el tratamiento de la LMA.
Alternativamente o además, los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para tratar cánceres no hematopoyéticos, incluidos, sin limitarse a, cáncer de pulmón, cáncer de oído, nariz y garganta, cáncer de colon, melanoma, cáncer de páncreas, cáncer de glándula mamaria, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario, carcinoma de células basales, cáncer de tracto biliar; cáncer de vejiga; cáncer de hueso; cáncer de mama; cáncer de cuello uterino; coriocarcinoma; cáncer de colon y recto; cáncer de tejido conectivo; cáncer del sistema digestivo; cáncer endometrial; cáncer de esófago; cáncer de ojo; cáncer de cabeza y cuello; cáncer gástrico; neoplasia intraepitelial; cáncer de riñón; cáncer de laringe; cáncer de hígado; fibroma, neuroblastoma; cáncer de cavidad oral (por ejemplo, labio, lengua, boca y faringe); cáncer de ovario; cáncer de páncreas; cáncer de próstata; retinoblastoma; rabdomiosarcoma; cáncer de recto; cáncer de riñón; cáncer del sistema respiratorio; sarcoma; cáncer de piel; cáncer de estómago; cáncer testicular; cáncer de tiroides; cáncer uterino; cáncer del sistema urinario, así como otros carcinomas y sarcomas.
Los carcinomas son cánceres de origen epitelial. Los carcinomas destinados al tratamiento con los métodos de la presente divulgación incluyen, sin limitarse a, carcinoma acinar, carcinoma acinoso, adenocarcinoma alveolar (también denominado carcinoma adenoquístico, adenomioepitelioína, carcinoma cribiforme y cilindroma), carcinoma adenomatoso, adenocarcinoma, carcinoma de la corteza suprarrenal, carcinoma alveolar, carcinoma de células alveolares (también llamado carcinoma bronquiolar, tumor de células alveolares y adenomatosis pulmonar), carcinoma de células basales, carcinoma basocelular (también llamado basaloma o basiloma y carcinoma de matriz pilosa), carcinoma basaloide, carcinoma de células basoescamosas, carcinoma de mama, carcinoma bronquioalveolar, carcinoma bronquiolar, carcinoma broncogénico, carcinoma cerebriforme, carcinoma colangiocelular (también llamado colangioma y colangiocarcinoma), carcinoma coriónico, carcinoma coloide, carcinoma comedón, carcinoma de cuerpo, carcinoma cribiforme, carcinoma en coraza, carcinoma cutáneo, carcinoma cilíndrico, carcinoma de células cilíndricas, carcinoma de conductos, carcinoma duro, carcinoma embrionario, carcinoma encefaloide, carcinoma epibulbar, carcinoma epidermoide, carcinoma epitelial adenoide, carcinoma ex úlcera, carcinoma fibroso, carcinoma gelatiniforme, carcinoma gelatinoso, carcinoma de células gigantes, carcinoma gigantocelular, carcinoma glandular, carcinoma de células de la granulosa, carcinoma de la matriz pilosa, carcinoma hematoide, carcinoma hepatocelular (también llamado hepatoma, hepatoma maligno y hepatocarcinoma), carcinoma de células de Huirthle, carcinoma hialino, carcinoma hipernefroide, carcinoma embrionario infantil, carcinoma in situ, carcinoma intraepidérmico, carcinoma intraepitelial, carcinoma de Krompecher, carcinoma de células de Kulchitzky, carcinoma lenticular, carcinoma lenticular, carcinoma lipomatoso, carcinoma linfoepitelial, carcinoma mastitoides, carcinoma medular, carcinoma de la médula, carcinoma melanodes, carcinoma melanótico, carcinoma mucinoso, carcinoma muciparum, carcinoma mucocelular, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma mucoso, carcinoma mucoso, carcinoma mixomatodes, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma nigrum, carcinoma de células de avena, carcinoma osificante, carcinoma osteoide, carcinoma de ovario, carcinoma papilar, carcinoma periportal, carcinoma preinvasivo, carcinoma de próstata, carcinoma de células renales de riñón (también llamado adenocarcinoma de riñón y carcinoma hipermeforoide), carcinoma de células de reserva, carcinoma sarcomatoide, carcinoma de Scheinderian, carcinoma escirro, carcinoma escrotal, carcinoma de células en anillo de sello, carcinoma simple, carcinoma de células pequeñas, carcinoma solanoide, carcinoma de células esferoidales, carcinoma de células fusiformes, carcinoma esponjoso, carcinoma escamoso, carcinoma de células escamosas, carcinoma en collar, carcinoma telangiectatico, carcinoma telangiectoide, carcinoma de células transicionales, carcinoma tuberoso, carcinoma tuberoso, carcinoma verrugoso, carcinoma velloso. En realizaciones preferidas, los métodos de la presente divulgación se usan para tratar sujetos que tienen cáncer de mama, cuello uterino, ovario, próstata, pulmón, colon y recto, páncreas, estómago o riñón.
Los sarcomas son neoplasias mesenquimales que surgen en huesos y tejidos blandos. Se reconocen diferentes tipos de sarcomas, que incluyen: liposarcomas (incluidos liposarcomas mixoides y liposarcomas pleiomórficos), leiomiosarcomas, rabdomiosarcomas, tumores malignos de la vaina del nervio periférico (también llamados schwannomas malignos, neurofibrosarcomas o sarcomas neurogénicos), tumores de Ewing (incluido el sarcoma óseo de Ewing), sarcoma de Ewing extraesquelético (es decir, no óseo) y tumor neuroectodérmico primitivo [PNET]), sarcoma sinovial, angiosarcomas, hemangiosarcomas, linfangiosarcomas, sarcoma de Kaposi, hemangioendotelioma, fibrosarcoma, tumor desmoide (también llamado fibromatosis agresiva), dermatofibrosarcoma protuberante (DFSP), histiocitoma fibroso maligno (MFH), hemangiopericitoma, mesenquimoma maligno, sarcoma alveolar de partes blandas, sarcoma epitelioide, sarcoma de células claras, tumor desmoplásico de células pequeñas, tumor del estroma gastrointestinal (GIST) (también conocido como sarcoma del estroma gastrointestinal), osteosarcoma (también conocido como sarcoma osteogénico) esquelético y extraesquelético, y condrosarcoma.
En algunas realizaciones, el cáncer que se va a tratar puede ser un cáncer refractario. Un "cáncer refractario", tal y como se utiliza en el presente documento, es un cáncer que es resistente al estándar de atención prescrito. Esos cánceres pueden parecer que responden inicialmente a un tratamiento (y luego reaparecer) o pueden no responder en absoluto al tratamiento. El estándar de atención habitual variará según el tipo de cáncer y el grado de progresión del sujeto. Puede ser quimioterapia, cirugía, radiación o una combinación de ambas. Los expertos en la técnica conocen tales estándares de atención. Por lo tanto, es posible que los sujetos que reciben tratamiento según la presente divulgación para un cáncer refractario, ya hayan estado expuestos a otro tratamiento para su cáncer. Alternativamente, si es probable que el cáncer sea refractario (p. ej., dado un análisis de las células cancerosas o la historia del sujeto), entonces es posible que el sujeto no haya estado expuesto ya a otro tratamiento. Los ejemplos de cánceres refractarios incluyen, sin limitarse a, leucemia, melanomas, carcinomas de células renales, cáncer de colon, cánceres de hígado (hepático), cáncer de páncreas, linfoma no Hodgkin y cáncer de pulmón.
Cualquiera de las células inmunes que expresan receptores quiméricos descritos en el presente documento se puede administrar en un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable como una composición farmacéutica.
La expresión "farmacéuticamente aceptable", tal y como se usa en relación con las composiciones y/o células de la presente divulgación, se refiere a entidades moleculares y otros ingredientes de esas composiciones que son fisiológicamente tolerables y normalmente no producen reacciones adversas cuando se administran a un mamífero (p. ej., un ser humano). Preferiblemente, tal y como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal, o incluido en la Farmacopea de los EE. UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en mamíferos, y más particularmente en los seres humanos. "Aceptable" significa que el vehículo es compatible con el ingrediente activo de la composición (p. ej., los ácidos nucleicos, vectores, células o anticuerpos terapéuticos) y no afecta negativamente al sujeto al que se administra la(s) composición(es). Cualquiera de las composiciones farmacéuticas y/o células que se van a usar en los presentes métodos puede comprender vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables en forma de formaciones liofilizadas o soluciones acuosas.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables, incluidos los tampones, son bien conocidos en la técnica y pueden comprender fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes; polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; aminoácidos; polímeros hidrófobos; monosacáridos; disacáridos; y otros carbohidratos; complejos metálicos; y/o tensioactivos no iónicos. Véase, p. ej., Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20a edición. (2000) Lippincott Williams y Wilkins, Ed. KE Hoover.
Kits para usos terapéuticos
También están dentro del alcance de la presente divulgación los kits para uso de los agentes dirigidos a antígenos de la superficie celular específicos de linaje en combinación con poblaciones de células hematopoyéticas con insuficiente antígeno de la superficie celular específico de linaje. Esos kits pueden incluir uno o más recipientes que comprenden una primera composición farmacéutica que comprende cualquier agente que comprende un fragmento de unión a antígeno que se une a un antígeno de la superficie celular específico de linaje (p. ej., células inmunes que expresan receptores quiméricos descritos en el presente documento), y un vehículo farmacéuticamente aceptable, y una segunda composición farmacéutica que comprende una población de células hematopoyéticas con insuficiente antígeno de la superficie celular específico de linaje (p. ej., una célula madre hematopoyética) y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, el kit puede comprender instrucciones para el uso en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. Las instrucciones incluidas pueden comprender una descripción de la administración de la primera y la segunda composiciones farmacéuticas a un sujeto para lograr la actividad deseada en un sujeto. El kit puede comprender además una descripción de la selección de un sujeto adecuado para el tratamiento, basándose en la identificación de si el sujeto necesita el tratamiento. En algunas realizaciones, las instrucciones comprenden una descripción de la administración de la primera y la segunda composiciones farmacéuticas a un sujeto que necesita el tratamiento.
Las instrucciones relacionadas con el uso de los agentes dirigidos a antígenos de la superficie celular específicos de linaje y la primera y la segunda composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento, generalmente incluyen información sobre la dosificación, la pauta de dosificación y la vía de administración para el tratamiento previsto. Los envases pueden ser dosis unitarias, paquetes a granel (p. ej., paquetes multidosis) o dosis subunitarias. Las instrucciones proporcionadas en los kits de la divulgación suelen ser instrucciones escritas en una etiqueta o un prospecto. La etiqueta o el prospecto indica que las composiciones farmacéuticas se usan para tratar, retrasar la aparición y/o aliviar una enfermedad o un trastorno en un sujeto.
Los kits proporcionados en este documento se encuentran en envases adecuados. Los envases adecuados incluyen, sin limitarse a, viales, botellas, frascos, envases flexibles y similares. También se contemplan envases para uso en combinación con un dispositivo específico, tal como un inhalador, un dispositivo de administración nasal o un dispositivo de infusión. Un kit puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). El recipiente también puede tener un puerto de acceso estéril. Al menos un agente activo en la composición farmacéutica es una variante de receptor quimérico tal y como se describe en el presente documento.
Opcionalmente, los kits pueden proporcionar componentes adicionales, como tampones e información interpretativa. Normalmente, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o uno o varios prospecto(s) en el recipiente o asociados con el recipiente. En alguna realización, la divulgación proporciona artículos de fabricación que comprenden contenidos de los kits descritos anteriormente.
Técnicas generales
La puesta en práctica de la presente divulgación empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluidas técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de los conocimientos de la técnica. Esas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía, como por ejemplo,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,segunda edición (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press;Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait, ed. 1984);Methods in Molecular Biology,Humana Press;Cell Biology: A Laboratory Notebook(J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds. 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds. 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995);DNA Cloning: A practical Approach,Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985);Nucleic Acid Hybridization(B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985»; Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984»;Animal Cell Culture(R.I. Freshney, ed. (1986»;Immobilized Cells and Enzymes(lRL Press, (1986»; and B. Perbal,A practical Guide To Molecular Cloning(1984); F.M. Ausubel et al. (eds.).
Sin ahondar en detalles, se cree que un experto en la técnica puede, basándose en la descripción anterior, utilizar la presente divulgación en toda su extensión. Por lo tanto, las siguientes realizaciones específicas deben interpretarse como meramente ilustrativas y no se limitan al resto de la divulgación de ningún modo.
EJEMPLO 1: Deleciónin vitrode CD33 en una línea celular leucémica humana
Para someter a ensayo la capacidad del sistema CRSPR-Cas9 para dirigirse a CD33in vitro,se cotransfectaron células leucémicas humanas K-562 utilizando Neon™ (Thermo Fisher Scientific) con Cas9-GFP (PX458, S.pyogenes)y un ARN guía que contenía la secuencia NGG PAM (FIGURA 4), en donde se diseñó el ARN guía para que se dirigiera a la secuencia genómica de hCD33. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células que expresaban Cas9 se identificaron y se aislaron mediante clasificación FACS para GFP. Luego, las células se incubaron durante 96 horas y se analizó la expresión de CD33 mediante citometría de flujo (FIGURA 5). Los gráficos de la citometría de flujo que utilizaban un anticuerpo anti-CD33, muestran la expresión de CD33 a través de las células K-562 antes (gráfico superior) y después (gráfico inferior) de la administración del vector Cas9 y el ARN guía. Como se muestra en la FIGURA 5, el 98% de las células carecía de expresión de CD33 después de la transfección.
Este ejemplo demuestra la deleción eficaz de CD33 utilizando el sistema CRISPR-Cas9 en células leucémicas humanas.
EJEMPLO 2: Deleciónin vitrode CD45 en líneas celulares leucémicas humanas
El sistema CRISPR-Cas9 se utilizó para dirigir a la diana CD45RAin vitro.Brevemente, se cotransfectaron células similares a macrófagos de ratón de sarcoma de células de retículo, TIB-67, utilizando el reactivo Neon™ (Thermo Fisher Scientific) con Cas9-GFP (PX458, S.pyogenes)y ARNg de CRISPRs (que contenían la secuencia "N<g>G" PAM) que se dirigían a la secuencia genómica de hCD45RA. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células que expresaban el sistema CRISPR-Cas9 se identificaron y se aislaron mediante clasificación FACS para GFP. Luego, las células se incubaron durante 96 horas y se analizaron para determinar la expresión de CD45RA (FIGURA 6). Los gráficos de la citometría de flujo que utilizaba el anticuerpo CD45RA muestran la expresión de CD45RA antes (gráfico superior) y después (gráfico inferior) de la administración del vector Cas9 y el ARN guía.
De manera similar al Ejemplo 1, en donde la expresión de CD33 se había reducido con éxito en las células leucémicas, los hallazgos en este Ejemplo indican un direccionamiento eficaz hacia CD45RA utilizando el sistema CRISPR-Cas9.
EJEMPLO 3: Direccionamiento hacia CD33 específico de linaje de la superficie celular en leucemia mieloide aguda (LMA)
El presente ejemplo incluye el direccionamiento hacia el antígeno CD33 en LMA. Los pasos específicos del ejemplo se describen en la Tabla 6.
Tabla 6. Esquema del diseño experimental
I. Terapia con linfocitos T con receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigidos a CD33
A. Generación de estructuras artificiales CAR anti-CD33
Los receptores de antígeno quimérico dirigidos a CD33 descritos en el presente documento pueden consistir en los siguientes componentes ordenados de 5' a 3': estructura principal de lentivirus pHIV-Zsgreen (www.addgene.org/18121/), señal peptídica, el scFv de CD33, la bisagra, las regiones transmembranales de la molécula CD28, el dominio intracelular de CD28 y el dominio de señalización de la molécula TCR-Z.
Inicialmente, la señal peptídica, la cadena ligera anti-CD33 (SEQ ID NO: 1), el enlazador flexible y la cadena pesada anti-CD33 (SEQ ID NO. 2) se clonan en el sitio EcoRI de pHIV-Zsgreen, con una secuencia de Kozak óptima.
A continuación se proporcionan las secuencias de ácido nucleico de un receptor quimérico ejemplar que se une a CD33 con la estructura básica de cadena ligera-enlazador-cadena pesada-bisagra-CD28/ICOS-CD3Z.
Parte 1: Cadena ligera-enlazador-cadena pesada (SEQ ID NO: 16): El sitio de inicio de Kozak se muestra en negrita. La señal peptídica L1 se muestra en cursiva. La cadena ligera y la cadena pesada anti-CD33 se muestran en negrita y cursiva, separadas por un enlazador.
g g t g t c g t g a g c g g c c g c t g a a c t g G C C A C C ATGGACATGAGGGTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCTCAGGTGCCAGATGTGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCC CGGCAGCCTGGCCGTGAGCCCCGGCAAGAGGGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAG CGTGTTCTTCAGCAGCAGCCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGATCCCCGGCCA GAGCCCCAGGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCCGACAGGTT CACCGGCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGCC CGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCAGGACCTTCGGCCAGGG CACCAAGCTGGAGATCAAGAGGGGCAGCACCAGCGGCAGCGGCAAGCCCGGCAGCGGCGA GGGCAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCCGGCGCCGAGGTGGTGAAGCCCGG CGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCA CTGGATCAAGCAGACCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGGTGGGCGTGATCTACCCCGGCAA CGACGACATCAGCTACAACCAGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAG CAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTA CTGCGCCAGGGAGGTGAGGCTGAGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGAC CGTGAGCAGC
Parte 2: Bisagra-CD28/ICOS-CD3Z Los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción NotI se muestran en mayúsculas. El sitio de parada de la traducción está en negrita. El sitio de escisión de la enzima de restricción BamHI se muestra subrayado.
Dominio coestimulador de CD28 (SEQ ID NO: 17)
G C G G C C G C A a t t g a a g t t a t g t a t c c t c c t c c t t a c c t a g a c a a t g a g a a g a g c a a t g g a a c c a t t a t c c a t g t g a a a g g g a a a c a c c t t t g t c c a a g t c c c c t a t t t c c c g g a c c t t c t a a g c c c t t t t g g g t g c t g g t g g t g g t t g g t g g a g t c c t g g c t t g c t a t a g c t t g c t a g t a a c a g t g g c c t t t a t t a t t t t c t g g g t g a g g a g t a a g a g g a g c a g g c t c c t g c a c a g t g a c t a c a t g a a c a t g a c t c c c c g c c g c c c c g g g c c c A c c c g c a a g c a t t a c c a g c c c t a t g c c c c a c c a c g c g a c t t c g c a g c c t a t c g c t c c a g a g t g a a g t t c a g c a g g a g c g c a g a c g c c c c c g c g t a c c a g c a g g g c c a g a a c c a g c t c t a t a a c g a g c t c a a t c t a g g a c g a a g a g a g g a g t a c g a t g t t t t g g a c a a g a g a c g t g g c c g g g a c c c t g a g a t g g g g g g a a a g c c g a g a a g g a a g a a c c c t c a g g a a g g c c t g t a c a a t g a a c t g c a g a a a g a t a a g a t g g c g g a g g c c t a c a g t g a g a t t g g g a t g a a a g g c g a g c g c c g g a g g g g c a a g g g g c a c g a t g g c c t t t a c c a g g g t c t c a g t a c a g c c a c c a a g g a c a c c t a c g a c g c c c t t c a c a t g c a g g c c c t g c c c c c t c g c T A A c g c c c c t c t c c c t c c c c c c c c c c t a a
Dominio coestimulador de ICOS (SEQ ID NO: 18)
G C G G C C G C A c t a t c a a t t t t t g a t c c t c c t c c t t t t a a a g t a a c t c t t a c a g g a g g a t a t t t g c a t a t t t a t g a a t c a c a a c t t t g t t g c c a g c t g a a g t t c t g g t t a c c c a t a g g a t g t g c a g c c t t t g t t g t a g t c t g c a t t t t g g g a t g c a t a c t t a t t t g t t g g c t t a c a a a a a a g a a g t a t t c a t c c a g t g t g c a c g a c c c t a a c g g t g a a t a c a t g t t c a t g a g a g c a g t g a a c a c a g c c a a a a a a t c t a g a c t c a c a g a t g t g a c c c t a a g a g t g a a g t t c a g c a g g a g c g c a g a c g c c c c c g c g t a c c a g c a g g g c c a g a a c c a g c t c t a t a a c g a g c t c a a t c t a g g a c g a a g a g a g g a g t a c g a t g t t t t g g a c a a g a g a c g t g g c c g g g a c c c t g a g a t g g g g g g a a a g c c g a g a a g g a a g a a c c c t c a g g a a g g c c t g t a c a a t g a a c t g c a g a a a g a t a a g a t g g c ggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcc t t t a c c a g g g t c t c a g t a c a g c c a c c a a g g a c a c c t a c g a c g c c c t t c a c a t g c a g g c c c t g c c c c c t c g c T A A c g c c c c t c t c c c t c c c c c c c c c c t a a
Dominio coestimulador de CD28 e ICOS (SEQ ID NO: 19) fusión (híbrido)
G C G G C C G C A a t t g a a g t t a t g t a t c c t c c t c c t t a c c t a g a c a a t g a g a a g a g c a a t g g a a c c a t t a t c c a t g t g a a a g g g a a a c a c c t t t g t c c a a g t c c c c t a t t t c c c g g a c c t t c t a a g c c c t t t t g g g t g c t g g t g g t g g t t g g t g g a g t c c t g g c t t g c t a t a g c t t g c t a g t a a c a g t g g c c t t t a t t a t t t t c t g g g t g a g g a g t a a g a g g a g c a g g c t c c t g c a c a g t g a c t a c a t g t t c a t g a g a g c a g t g a a c a c a g c c a a a a a a t c t a g a c t c a c a g a t g t g a c c c t a a g a g t g a a g t t c a g c a g g a g c g c a g a c g c c c c c g c g t a c c a g c a g g g c c a g a a c c a g c t c t a t a a c g a g c t c a a t c t a g g a c g a a g a g a g g a g t a c g a t g t t t t g g a c a a g a g a c g t g g c c g g g a c c c t g a g a t g g g g g g a a a g c c g a g a a g g a a g a a c c c t c a g g a a g g c c t g t a c a a t g a a c t g c a g a a a g a t a a g a t g g c g g a g g c c t a c a g t g a g a t t g g g a t g a a a g g c g a g c g c c g g a g g g g c a a g g g g c a c g a t g g c c t t t a c c a g g g t c t c a g t a c a g c c a c c a a g g a c a c c t a c g a c g c c c t t c a c a t g c a g g c c c t g c c c c c t c g c T A A c g c c c c t c t c c c t c c c c c c c c c c t a a
En el siguiente paso, la región bisagra, el dominio CD28 (SEQ ID NO: 3) y un componente citoplásmico de TCR-Z se clonan en los sitios NotI y BamHI de pHIV-Zsgreen (que ya contienen la señal peptídica y el scFv de CD33). Alternativamente, el dominio CD28 puede sustituirse por el dominio ICOS (SEQ ID NO: 4).
Además de los dominios CD28 e ICOS, se diseñará un dominio de fusión que comprende fragmentos de dominios de señalización intracelular de CD28 e ICOS (SEQ ID NO: 5) y se usará para generar receptores quiméricos adicionales. Esa configuración, en la que el receptor quimérico comprende un fragmento de unión a antígeno, una región variable de la cadena ligera anti-CD33, un enlazador, una región variable de la cadena pesada anti-CD33, una región híbrida CD28/ICOS (que incluye una región TM de CD28) y un dominio de señalización de la molécula TCR-Z.
En el presente documento se proporcionan ejemplos de secuencias de aminoácidos de componentes que pueden usarse para generar los receptores quiméricos, tales como el dominio CD28 (SEQ ID NO: 6), el dominio ICOS (SEQ ID NO: 7), el dominio híbrido CD28/ICOS (SEQ ID NO: 8) y TCR-Z. Alternativamente, también se puede generar el receptor quimérico (Sección B).
B. Método alternativo para la generación de estructuras artificiales de CAR anti-CD33
En la FIGURA 7, en los paneles A-D, se presentan esquemas de receptores quiméricos a modo de ejemplo. El receptor quimérico se generará utilizando un scFv humanizado extracelular que reconoce el antígeno CD33, unido a una región bisagra CD8 extracelular, un dominio de señalización transmembranal y citoplásmico y una cadena de señalización de CD3Z (FIGURA 7, panel B). El ADN que codifica el receptor quimérico anti-CD33 se generará utilizando un scFv humanizado (Essand et al.,J Intern Med.(2013) 273(2):166). Las alternativas incluyen un linfocito CAR T que contiene OX-1 o 4-1<b>B en lugar de CD28 o los híbridos CD28/OX1 o CD28/4-1BB (FIGURA 7, paneles C y D).
Para generar la secuencia scFV anti-CD33, las regiones codificantes de las cadenas pesada y ligera de las regiones variables del anticuerpo anti-CD33 descritas anteriormente (SEQ ID NO: 1 y 2) se amplificarán con cebadores específicos y se clonarán en un vector pHIV-Zsgreen para la expresión en células. Para evaluar la fuerza de la unión del scFv (fragmentos variables de cadena sencilla) al antígeno diana, el scFv se expresará en células Hek293T. Para ello, el vector (pHIV-Zsgreen que contiene las áreas codificantes) se transformará en bacterias Top10F deE. co liy los plásmidos preparados. Los vectores de expresión obtenidos que codifican los anticuerpos de scFv se introducirán mediante transfección en las células Hek293T. Después de cultivar las células transfectadas durante cinco días, se eliminará el material sobrenadante y se purificarán los anticuerpos.
Los anticuerpos resultantes pueden humanizarse usando sustituciones estructurales mediante protocolos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, uno de esos protocolos lo proporciona BioAtla (San Diego), en donde bancos de fragmentos codificantes de CDRs sintéticas obtenidas a partir de un anticuerpo molde, se ligan a una región estructural humana que codifica fragmentos procedentes de un grupo de estructuras humanas, limitado a secuencias de la línea germinal procedentes de anticuerpos expresados funcionalmente (bioatla.com/applications/express-humanization/).
Puede realizarse una maduración por afinidad para mejorar la afinidad de unión al antígeno. Esto se puede lograr usando técnicas generales conocidas en la técnica, como la presentación en fagos (Schier R.,J. Mol. Biol(1996), 263:551). Las variantes pueden ser analizadas por su actividad biológica (p. ej., afinidad de la unión) usando, por ejemplo, un análisis Biacore. Para identificar residuos de la región hipervariable que serían buenos candidatos para la modificación, se puede realizar una mutagénesis por barrido con alanina para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión al antígeno. Además, los bancos combinatorios descritos también se pueden usar para mejorar la afinidad de los anticuerpos (Rajpal et al.,PNAS(2005) 102(24): 8466). Alternativamente, BioAtla ha desarrollado una plataforma para la maduración por afinidad rápida y eficiente de anticuerpos, que también se puede utilizar con fines de optimización de anticuerpos (bioatla.com/applications/functional-maturation/).
(C) Ensamblaje de la estructura artificial CAR
A continuación, el scFv anti-CD33 se unirá a una región bisagra de CD8 extracelular, un dominio de señalización de CD28 transmembranal y citoplásmico y una cadena de señalización de CD3Z. Brevemente, se usarán cebadores específicos para la secuencia de scFv anti-CD33 para amplificar el scFv como se ha descrito anteriormente. El plásmido (pUN1-CD8) (www.invivogen.com/puno-cd8a) que es portador de la secuencia codificante de CD8 humana completa se utilizará para amplificar los dominios transmembranales y de bisagra de CD8 (aminoácidos 135-205). El fragmento de CD3Z se amplificará a partir del plásmido pORF9-hCD247a de Invivogen (http://www.invivogen.com/PDF/pORF9-hCD247a_10E26v06.pdf) que es portador de la secuencia codificante de CD3Z humana completa. Finalmente, CD28 (aminoácidos 153-220, correspondientes a TM y dominios de señalización de CD28) se amplificará a partir de un ADNc generado utilizando ARN recogido de linfocitos T activados mediante el método de Trizol. Los fragmentos que contienen anti-CD33-scFv-CD8-bisagra+TM-CD28-CD3Z se ensamblarán mediante PCR de extensión con solapamiento y corte (SOE). El fragmento de PCR resultante se clonará luego en el vector de lentivirus pELPS. pELPS es un derivado del vector de lentivirus de tercera generación pRRL-SIN-CMV-eGFP-WPRE en el que el promotor CMV ha sido reemplazado por el promotor EF-1a y el tracto polipurínico central de VIH se ha insertado en 5' del promotor (Milone et al.,Mol Ther.(2009) (8): 1453, Porter et al.,NEJM(2011) (8):725). Todas las estructuras artificiales se verificarán mediante secuenciación.
Alternativamente, se generarán CARs que contienen el dominio de señalización de ICOS, CD27, 41BB u OX-40 en lugar del dominio CD28, se introducirán en los linfocitos T y se analizará su capacidad para erradicar células positivas para CD33 (FIGURA 7, panel C). También se contempla la generación de receptores quiméricos de "tercera generación" (FIGURA 7, panel D), que combinan múltiples dominios de señalización, tales como CD3z-CD28-41 BB o CD3z-CD28-OX40, para aumentar aún más la potencia (Sadelain et al.,Cancer Discov.(2013) 4:388).
(D) Preparación de linfocitos CAR T anti-CD33
Linfocitos T CD8+ humanos primarios se aislarán de sangre periférica de pacientes mediante separación inmunomagnética (Miltenyi Biotec). Los linfocitos T se cultivarán en medio completo (RPMI 1640 complementado con FBS al 10% inactivado por calor, 100 U/ml de penicilina, 100 gg/ml de sulfato de estreptomicina, HEPES 10 mM) y se estimularán con perlas recubiertas con AcMo anti-CD3 y anti-CD28 (Invitrogen) como se ha descrito anteriormente (Levine et al.,J. Immunol.(1997) 159(12):5921).
Se utilizará una línea celular empaquetadora para generar el vector viral, que es capaz de transducir células diana y contiene receptores quiméricos anti-CD33. Para generar partículas de lentivirus, los CARs generados en la sección (1) de este Ejemplo se transfectarán en células empaquetadoras 293T renales fetales normales, inmortalizadas junto con células, se cultivarán con DMEM con alto contenido en glucosa, incluido FBS al 10%, 100 U/ml de penicilina y 100 gg/ml de estreptomicina. De 48-72 horas después de la transfección, se recogerá el material sobrenadante y se concentrará el lentivirus recombinante en DMEM sin FBS. Los linfocitos T CD8+ primarios se transducirán a continuación, con una multiplicidad de infección (MOI) de ~5-10 en presencia de polibreno. Se agregará IL-2 humana recombinante (R&D Systems) cada dos días (50 UI/ml). Los linfocitos T se cultivarán durante aproximadamente 14 días después de la estimulación. La eficacia de la transducción de los linfocitos T primarios humanos se evaluará mediante la expresión de un gen informador ZsGreen (Clontech, Mountain View, CA).
E. Infusión de linfocitos CAR T a un paciente
Antes de la infusión i.v. de los linfocitos CAR T anti-CD33 al paciente, las células se lavarán con solución salina tamponada con fosfato y se concentrarán. Para los pasos de lavado y concentración antes de la formulación se utilizará un procesador celular tal como Haemonetics CellSaver (Haemonetics Corporation, Braintree, MA), que proporciona un sistema cerrado y estéril. Los linfocitos T finales que expresan los receptores quiméricos anti-CD33 se formularán en 100 ml de solución salina normal estéril complementada con albúmina sérica humana. Finalmente, se infundirán a los pacientes 1-10x107 linfocitos T/kg durante un período de 1 a 3 días (Maude et al.,NEJM(2014) 371 (16):1507). El número de linfocitos T que expresan receptores quiméricos anti-CD33 infundidos dependerá de numerosos factores como el estado del paciente con cáncer, la edad del paciente, el tratamiento previo, etc.
Además, también se contemplan en el presente documento células inmunes que expresan receptores quiméricos que se dirigen a CD45RA además de receptores quiméricos que se dirigen a CD33 en pacientes con LMA. Esto se puede lograr mediante dos enfoques diferentes: 1) generar por separado células inmunes que expresan receptores quiméricos anti-CD33 y células inmunes que expresan receptores quiméricos anti-CD47RA e infundir al paciente ambos tipos de células inmunes por separado o 2) generar células inmunes que se dirijan a CD33 y CD45RA simultáneamente (Kakarla et al.,Cancer(2): 151 (2014)).
II. Trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) autólogas utilizando células CD34+CD33-
Se entiende que los protocolos relacionados con el aislamiento de células madre desde los pacientes, los regímenes de acondicionamiento y la infusión de células madre de pacientes, varían mucho dependiendo de la edad, la afección, el historial de tratamiento y la institución en donde se realiza el tratamiento. Por tanto, el protocolo que se describe a continuación es simplemente un ejemplo y está sujeto a una optimización rutinaria por parte de una persona con conocimientos habituales en la técnica.
A. Aislamiento de células madre hematopoyéticas mediante movilización de células madre de sangre periférica (PBSC) después de una transferencia adoptiva de linfocitos CAR T anti-CD33
El paciente con LMA será estimulado mediante administración por vía i.v. de 10 mg/kg por día de factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF). La selección positiva de células CD34+ se realizará utilizando perlas inmunomagnéticas y un dispositivo de enriquecimiento inmunomagnético. Se espera que un mínimo de 2 x 106 células CD34+/kg de peso corporal se recojan utilizando un separador de células Fenwall CS 3000+ (Park et al.,Bone Marrow Transplantation(2003) 32:889).
B. Régimen de acondicionamiento de un paciente
El régimen de acondicionamiento para el trasplante de células madre de sangre periférica (PBSCT) autólogas se llevará a cabo utilizando etopósido (VP-16) ciclofosfamida (CY) radiación corporal total (TBI). Brevemente, el régimen consistirá en etopósido (VP-16) a 1,8 g/m2 con infusión i.v. constante (c.i.v.) durante 26 h como dosis única, seguida de ciclofosfamida (CY) a 60 mg/kg por día por vía i.v. durante 2 h durante 3 días, seguida de radiación corporal total (TBI) a 300 cGy por día durante los siguientes 3 días.
Para calcular la dosis se utilizará el peso corporal ideal o el peso corporal real, el que sea menor. Como se ha mencionado anteriormente, al determinar el régimen de acondicionamiento preciso se tendrán en cuenta factores como el estado del paciente con cáncer, la edad del paciente, el tratamiento previo y el tipo de institución donde se realiza el procedimiento.
C.Construcción de plásmidos del sistema CRISPR-Cas9 dirigidos a CD33
El lentiCRISPR v2 que contiene insertos de Cas9 y resistencia a puromicina se obtendrá en Addgene (plásmido núm.
52961) (Sanjana et al.,Nat Methods(2014) (8):783). Para clonar la secuencia guía de CD33 del ARN guía único (ARNsg), el lentiCRISPR v2 se cortará y desfosforilará con FastDigest BsmBI y FastAP (Fermentas) a 37°C durante 2 horas. El ARNg dirigido a CD33 se diseñará utilizando la herramienta de diseño optimizada en línea crispr.mit.edu. Alternativamente, el ARNg tendrá una secuencia representada en la FIGURA 12 (SEQ ID NO:11). Los oligonucleótidos del ARNg de CD33 se obtendrán en Integrated DNA Technologies (IDT), se fosforilarán utilizando una polinucleótido cinasa (Fermentas) a 37°C durante 30 minutos y se volverán a aparear a 95°C durante 5 minutos y se enfriarán a 25°C a 1,5°C/ minuto. Se utilizará la ligasa T7 para hibridar los oligos, después de lo cual los oligos apareados se ligan en un vector purificado en gel (Qiagen) a 25°C durante 5 minutos. El plásmido resultante se puede amplificar utilizando un kit de mini-prep sin endotoxinas (Qiagen) (Sanjana et al.,Nat Methods(2014) (8):783).
Alternativamente, se puede utilizar un sistema de dos vectores (en donde ARNg y Cas se expresan a partir de vectores distintos), el protocolo se ha descrito anteriormente (Mandal et al.,Cell Stem Cell(2014) 15(5):643). En ese caso, Mandal et al. lograron una ablación eficiente de los genes en células madre hematopoyéticas humanas, utilizando el sistema CRISPR-Cas expresado a partir de vectores no virales.
Brevemente, el gen de Cas9 optimizado con codones humanos que contiene una señal de localización nuclear de SV40 C-terminal, se clonará en un plásmido de expresión de CAG con 2A-GFP. Para dirigir Cas9 para que escinda las secuencias de CD33 de interés, el ARN guía (ARNg (SEQ ID NO: 11)) se expresará por separado a partir de un plásmido que contiene el promotor de la polimerasa III U6 humana. Los oligonucleótidos de la secuencia de ARNg se obtendrán en Integrated DNA Technologies (IDT), se hibridarán y se introducirán en el plásmido, utilizando los sitios de restricción BbsI. Debido al requisito para iniciar una transcripción de una base 'G' para el promotor U6 humano, así como al requisito de una secuencia PAM (motivo adyacente al protoespaciador), el genoma diana comprenderá la secuencia de nucleótidos GN20GG.
Además de infundir a los pacientes HSCs de células madre hematopoyéticas agotadas para CD33, se desarrollará un protocolo en el que posteriormente se infundirá a los pacientes HSCs agotadas para CD45RA. Alternativamente, los inventores generarán células CD34+CD33-CD45RA- utilizando el sistema CRISPR-Cas9 para reducir los genes CD33 y CD45RA simultáneamente. En las Tablas 4 y 5 se muestran ejemplos de secuencias de ARN guía para CD45RA y CD33.
D. Transfección de células HSCs CD34+ para generar células CD34+CD33-
Células CD34+ obtenidas a partir de sangre periférica recién aisladas (en el paso 4) se sembrarán a 1 x 106 células/ml en medio CellGro SCGM sin suero, en presencia de 300 ng/ml de factor de células madre (SCF) de grado de cultivo, 300 ng/ml de FLT3-L, 100 ng/ml de trombopoyetina (TPO) y 60 ng/ml de IL-3. Después de 24 horas de estimulación previa, las HSCs CD34+ se transfectarán con LentiCRISPR v2 que contiene Cas9 y ARNg de CD33 utilizando el kit Nucleofector de células CD34 humanas Amaxa (U-008) (#VPA-1003) (Mandal et al.,Cell Stem Cell(2014) 15(5):643). Después de 24-48 horas de la transfección, las células CD34+CD33- se seleccionan con 1,2 pg/ml de puromicina. Tras la selección con puromicina, las células CD34+CD33- se mantendrán en medios exentos de puromicina durante un par de días.
E. Reinfusión de las células CD34+CD33- en el paciente
Las células CD34+ transfectadasex vivocon CRISPR-Cas9-CD33 (células CD34+CD33-) se reinfunden inmediatamente a través de un catéter de Hickman, utilizando un equipo de administración de sangre estándar sin filtro (Hacein-Bey Abina et al.JAMA(2015) 313(15):1550.
Generalmente, los pacientes que se han sometido al protocolo de tratamiento descrito anteriormente serán vigilados para detectar la reaparición de blastos circulantes y citopenias. Además, dependiendo del mecanismo subyacente de la LMA en un paciente específico, el éxito del tratamiento se controlará mediante pruebas de reaparición de un marcador molecular o citogenético informativo o un patrón de citometría de flujo informativo. Por ejemplo, la reaparición de una señal BCR-ABL en la LMA con cromosoma Filadelfia positivo, se detectará mediante hibridación fluorescentein situ(FISH) con sondas para BCR (en el cromosoma 22) y ABL (en el cromosoma 9).
Para evaluar el éxito de la deleción de CD33 mediante el sistema CRISPR-Cas9, se aislarán células CD34+ de sangre periférica de los pacientes (después del trasplante) y se evaluarán para determinar la expresión de CD33, por ejemplo mediante citometría de flujo, transferencia Western o inmunohistoquímica.
Como se describe en el presente documento, el HSCT descrito en este ejemplo puede ser autólogo o alogénico, y ambos enfoques son adecuados y pueden incorporarse en los métodos descritos en la presente divulgación.
III. Paso opcional: Tratamiento continuado de un paciente con un anticuerpo CD33 fijado a una toxina
A. Tratamiento de pacientes con inmunotoxina de CD33, Gemtuzumab Ozogamicina (GO)
Los pacientes serán tratados con 9 mg/m2 del anticuerpo anti-CD33, gemtuzumab ozogamicina (GO) en infusión intravenosa de 2 horas en 2 dosis separadas por 2 semanas (Larson et al.,Cancer(2005), 104(7): 1442-52). GO está compuesta por un anticuerpo monoclonal humanizado contra CD33 que está conjugado con un agente citostático, la caliqueamicina (FIGURA 8).
Alternativamente, los anticuerpos anti-CD33 se pueden conjugar con diferentes toxinas, como la toxina diftérica, la exotoxina A de Pseudomonas (PE) o la cadena A de la toxina del ricino (RTA). Wayne et al.,Blood(2014) 123(16): 2470). De manera similar, los anticuerpos anti-CD45RA pueden fijarse a una toxina e incluirlos en el régimen de tratamiento.
EJEMPLO 4: Los linfocitos T y las líneas de células NK que expresan un receptor quimérico anti-CD33 inducen la muerte celular de las células diana que expresan CD33
Unión de receptores quiméricos a CD33
Los receptores quiméricos que se unen a CD33 (p. ej., CART1, CART2, CART3) se generaron utilizando tecnologías de ADN recombinante convencionales y se insertaron en un vector pHIV-Zsgreen (Addgene; Cambridge, MA). Los vectores que contenían los receptores quiméricos se utilizaron para generar partículas de lentivirus, que se utilizaron para transducir diferentes tipos de células, por ejemplo líneas de linfocitos T (p. ej., células 293T) y líneas celulares de NK (p. ej., células NK92). La expresión de los receptores quiméricos se detectó mediante transferencia Western (FIGURA 9, panel A) y citometría de flujo (FIGURA 9, panel B).
Las células que expresaban los receptores quiméricos se seleccionaron mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y se evaluó su capacidad para unirse a CD33. Brevemente, los lisados de células 293T que expresaban los receptores quiméricos se coincubaron con CD33 o conjugado de CD33-aloficocianina (APC). Las muestras se sometieron a electroforesis de proteínas y se tiñeron con tinción de proteína de Ponceau (FIGURA 10, panel A) o se transfirieron a una membrana y se sometieron a ensayo con un anticuerpo primario anti-CD3Z (FIGURA 10, panel B). En ambos casos se produce la unión entre los receptores quiméricos y su diana, CD33.
También se evaluó la unión a CD33 de las células K562 que expresaban los receptores quiméricos mediante citometría de flujo usando CD33 como sonda (FIGURA 10, panel C). Había un aumento en el número de células positivas para la expresión del receptor quimérico (CART1, CART2 o CART3) y la unión de CD33, en comparación con las células que contenían un control de vector vacío, lo que indicaba que los receptores quiméricos se unen a CD33.
Citotoxicidad inducida por células que expresan los receptores quiméricos
Las células NK92 que expresaban los receptores quiméricos se caracterizaron funcionalmente por su capacidad de inducir citotoxicidad de las células diana que presentan CD33 en la superficie celular (p. ej., K562 es una línea celular de leucemia mielógena crónica humana que es CD33+). Para realizar los ensayos de citotoxicidad, se infectaron células efectoras (células inmunes, como las células NK-92) con partículas de lentivirus que codificaban los receptores quiméricos y se expandieron. Siete días después de la infección, las células que expresaban los receptores quiméricos se seleccionaron mediante análisis FACS, seleccionando con marcadores fluorescentes también codificados por el vector que codificaba el receptor quimérico (p. ej., GFP+ o Red+). Las células seleccionadas que expresaban los receptores quiméricos se expandieron durante una semana. Catorce días después de la infección, se realizó el ensayo de citotoxicidad que implicaba teñir las células diana (células que expresaban el antígeno diana de la superficie celular específico de linaje, CD33) con éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) y hacer un recuento tanto de las células diana como de las células que expresaban los receptores quiméricos. Se coincubaron diferentes relaciones entre células diana y células que expresaban los receptores quiméricos en placas de 96 pocillos de fondo redondo durante 4,5 horas, después de lo cual se añadió 7-aminoactinomicina D (7-AAD) para teñir las células no viables. Se realizó una citometría de flujo para identificar la población de células diana viables y no viables. Como se muestra en la FIGURA 11, paneles A y B, las células NK92 que expresaban receptores quiméricos CART1, CART2 o CART3 inducían una cantidad sustancial de muerte celular en las células K562 diana en cada una de las relaciones celulares evaluadas.
Para determinar que la muerte celular de las células K562 dependía del direccionamiento específico del receptor quimérico hacia CD33, se modificó genéticamente K562 para que tuviera insuficiente CD33, utilizando un sistema CRISPR/Cas. Brevemente, una endonucleasa Cas9 con codones humanos optimizados y un ARNg dirigido a una porción del dominio IgC de CD33, se expresaban en las células K562, lo que daba como resultado poblaciones de células K562 con insuficiente CD33. Las células se expandieron y se incubaron junto con células NK92 que expresaban los receptores quiméricos y el ensayo de citotoxicidad se realizó como se ha descrito anteriormente. Como se muestra en el panel A de la FIGURA 12, las células K562 con insuficiente CD33 agrupadas mostraban una ligera reducción de la muerte celular al coincubarse con las células NK92 que expresaban los receptores quiméricos. Sin embargo, cuando se aislaron, se expandieron y se usaron clones individuales de células K562 con insuficiente CD33 para realizar los ensayos de citotoxicidad, se observó una reducción más significativa de la citotoxicidad (FIGURA 12, panel B).
Expresión de receptores quiméricos en linfocitos T primarios
Se aislaron poblaciones de linfocitos T primarios a partir de PMBCs obtenidas de donantes mediante FACS, seleccionando positivamente células CD4+, CD8+ o CD4+/CD8+, lo que daba como resultado poblaciones muy puras (FIGURA 13, paneles A y B). Cada una de las poblaciones de linfocitos T primarios (células CD4+, CD8+ o CD4+/CD8+) se transdujeron con un vector de lentivirus que contenía los receptores quiméricos (p. ej., CART1 y CART8) y los linfocitos T primarios resultantes que expresaban receptores quiméricos se usaron para realizar ensayos de citotoxicidad, como se ha descrito anteriormente. La coincubación de la población de linfocitos T CD4+ que expresaba los receptores quiméricos con K562 (1000 células K562 diana) no daba como resultado una citotoxicidad de las células K562 (FIGURA 14, panel A). Por el contrario, en un ensayo de citotoxicidad utilizando células CD8+ o CD4+/CD8+ que expresaban los receptores quiméricos y 1000 células K562 diana, las células CD8+ o CD4+/CD8+ eran capaces de inducir la muerte celular de las células K562 en una relación celular baja (FIGURA 14, panel B).
Modificación genética de células madre hematopoyéticas humanas
Se diseñaron varios ARNg para hibridar con el dominio IgC de CD33 (véase, por ejemplo, la Tabla 4, SEQ ID NO: 11 o 28-31). Cada uno de los ARNg se expresaba junto con una endonucleasa Cas9 en las células K562. La expresión de CD33 se evaluó mediante citometría de flujo (FIGURA 15). Como se muestra para Crispr 3 (SEQ ID NO: 28) y Crispr5 (SEQ ID NO: 29), se encontró una reducción significativa de CD33 en las células que expresaban el sistema CRISPR/Cas dirigido a CD33, en comparación con las células de control que expresaban CD33.
También se evaluaron diversas características de las células madre hematopoyéticas con insuficiente CD33, incluida la proliferación, la diferenciación eritopoyética y la formación de colonias. Brevemente, se indujo la diferenciación de células madre hematopoyéticas con insuficiente CD33 y células de control exponiendo las células a hemina, y se evaluó CD71, un marcador de precursores eritroides, mediante citometría de flujo en diferentes puntos temporales (FIGURA 16, paneles A y B). Las células madre hematopoyéticas con insuficiente CD33 se sometieron a una diferenciación eritopoyética y los perfiles de la citometría de flujo parecían similares a las células de control (CD33+). Las células también se sometieron a un ensayo MTT para medir la actividad metabólica de las células madre hematopoyéticas con insuficiente CD33. Como se muestra en la FIGURA 16, panel C, las células madre hematopoyéticas con insuficiente CD33 se comportaban de manera comparable a las células de control. Finalmente, se observó la capacidad de las células para proliferar y formar colonias de células mediante un ensayo microscópico de formación de colonias. Nuevamente, las células madre hematopoyéticas con insuficiente CD33 podían formar colonias en un grado similar a las células de control (FIGURA 18). Estos resultados indican que la deleción con CRISPR/Cas de una porción de CD33 no afecta significativamente a la capacidad de las células para proliferar, diferenciarse o formar colonias.
Se debe entender que todas las definiciones, tal y como se definen y utilizan en este documento, rigen respecto a las definiciones de un diccionario, las definiciones en los documentos y/o los significados comunes de los términos definidos.
Los artículos indefinidos "un" y "una", tal y como se utilizan en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, deben entenderse como "al menos uno, una".
La expresión "y/o", tal y como se utiliza en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, debe entenderse como "cualquiera o ambos" de los elementos en conjunto, es decir, elementos que están presentes de manera conjuntiva en algunos casos y presentes de manera disyuntiva en otros casos. Diversos elementos enumerados con "y/o" deben interpretarse de la misma manera, es decir, "uno o más" de los elementos en conjunto. Opcionalmente, pueden estar presentes otros elementos además de los elementos específicamente identificados por la cláusula "y/o", bien relacionados o no con esos elementos específicamente identificados. Por lo tanto, a modo de ejemplo no limitante, una referencia a "A y/o B", cuando se usa junto con un lenguaje abierto tal como "que comprende", puede referirse, en una realización, a A únicamente (incluyendo opcionalmente elementos distintos de B); en otra realización, solo a B (incluyendo opcionalmente elementos distintos de A); en otra realización más, tanto a A como a B (incluyendo opcionalmente otros elementos); etc.
Tal y como se utiliza en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, se debe entender que "o" tiene el mismo significado que "y/o" como se ha definido anteriormente. Por ejemplo, al separar elementos en una lista, "o" o "y/o" se interpretará como inclusivo, es decir, la inclusión de al menos uno, pero también de más de uno, de una cantidad o lista de elementos y, opcionalmente, artículos adicionales no listados. Solo los términos que indiquen claramente lo contrario, tales como "solo uno de" o "exactamente uno de" o, cuando se utilizan en las reivindicaciones, "que consiste en", se referirán a la inclusión de exactamente un elemento de una cantidad o lista de elementos. En general, el término "o" tal y como se utiliza en este documento, solo se interpretará como una indicación de alternativas exclusivas (es decir, "uno o el otro, pero no ambos") cuando esté precedido por términos de exclusividad, como "cualquiera", "uno de", " solo uno de" o "exactamente uno de". "Que consiste esencialmente en", cuando se utiliza en las reivindicaciones, tendrá su significado habitual tal como se utiliza en el campo del derecho de patentes.
Tal y como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, la expresión "al menos uno", haciendo referencia a una lista de uno o más elementos, debe entenderse como al menos un elemento seleccionado entre uno cualquiera o más de los elementos en la lista de elementos, pero no incluye necesariamente al menos uno de todos y cada uno de los elementos específicamente enumerados dentro de la lista de elementos y no excluye ninguna combinación de elementos en la lista de elementos. Esta definición también permite que opcionalmente puedan estar presentes elementos distintos de los elementos específicamente identificados dentro de la lista de elementos a la que se refiere la expresión "al menos uno", bien relacionados o no con esos elementos específicamente identificados. Así, a modo de ejemplo no limitante, "al menos uno de A y B" (o, de manera equivalente, "al menos uno de A o B", o, de manera equivalente, "al menos uno de A y/o B") se puede referir, en una realización, a al menos uno, incluyendo opcionalmente más de uno, A, sin B presente (y opcionalmente incluyendo elementos distintos de B); en otra realización, a al menos uno, incluyendo opcionalmente más de uno, B, sin A presente (y opcionalmente incluyendo elementos distintos de A); en otra realización más, a al menos uno, que incluye opcionalmente más de uno, A, y a al menos uno, que incluye opcionalmente más de uno, B (y que incluye opcionalmente otros elementos); etc.
También debe entenderse que, a menos que se indique claramente lo contrario, en cualquier método reivindicado en el presente documento que incluye más de un paso o función, el orden de los pasos o funciones del método no se limita necesariamente al orden en el que se realizan los pasos o funciones del método.
Claims (9)
1. Una célula madre hematopoyética humana con genoma editado que carece de la expresión de un antígeno de la superficie celular específico de linaje, en donde:
(i) el antígeno de la superficie celular específico de linaje es CD33, y
(ii) la totalidad o una porción de un gen endógeno que codifica el antígeno de la superficie celular específico de linaje se deleciona mediante edición del genoma,
en donde la célula se obtiene o se puede obtener mediante un método para inhibir CD33 en células madre hematopoyéticas humanas que comprende el uso de un sistema CRISPR/Cas que comprende una secuencia de ARN guía y una endonucleasa Cas, en donde la secuencia del ARN guía se hibrida con la secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno CD33.
2. La célula madre hematopoyética humana según la reivindicación 1, en donde la endonucleasa Cas es Cas9 o Cpf1.
3. La célula madre hematopoyética humana según la reivindicación 1 o 2, en donde el sistema CRISPR/Cas se une y escinde una región codificante en una región transcrita de la secuencia de nucleótidos que codifica CD33.
4. La célula madre hematopoyética humana según la reivindicación 1 o 2, en donde el sistema CRISPR/Cas se une y escinde una región no codificante en una región transcrita de la secuencia de nucleótidos que codifica CD33.
5. La célula madre hematopoyética humana según la reivindicación 1 o 2, en donde el sistema CRISPR/Cas se une y escinde una región no transcrita aguas arriba de una región codificante.
6. La célula madre hematopoyética humana según la reivindicación 1 o 2, donde el sistema CRISPR/Cas se une y escinde una región no transcrita aguas abajo de una región codificante.
7. La célula madre hematopoyética humana según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la célula madre hematopoyética no es reconocida por un linfocito T con CAR específico de CD33.
8. La célula madre hematopoyética humana según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para uso en un método para tratar una neoplasia maligna hematológica en un paciente, en donde el método implica los siguientes pasos:
(1) administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un linfocito T que expresa un receptor de antígeno quimérico que se dirige a CD33, en donde el linfocito T comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el receptor de antígeno quimérico; y
(2) infundir o reinfundir al paciente la célula madre hematopoyética según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
9. La célula madre hematopoyética humana para uso según la reivindicación 8, en donde la célula madre hematopoyética humana es autóloga o alogénica.
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