CN116724109A - 用于cd34基因修饰的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了包括靶向CD34的靶向结构域的gRNA，所述gRNA可以用于例如在细胞中进行修饰。本文还提供了在CD34基因中具有修饰(例如，插入或缺失)的基因工程化细胞的方法，以及涉及将此类基因工程化细胞向如患有造血系统恶性肿瘤的受试者等受试者施用的方法。

Description

用于CD34基因修饰的组合物和方法
相关申请交叉引用
本申请根据35U.S.C.119(e)要求于2020年12月31日提交的美国临时申请第63/132,852号的权益，所述美国临时申请通过引用整体并入本文。
背景技术
当受试者被施用靶向与疾病或病状相关的抗原的免疫疗法，例如抗癌CAR-T疗法时，所述疗法不仅可以耗竭预期靶向的病理细胞，还可以耗竭可能表达靶向的抗原的非病理细胞。这种“在靶、脱疾病”效应已针对一些CAR-T治疗，例如靶向CD19或CD33的治疗进行了报道。如果靶向的抗原在存活或受试者所需的细胞的表面上表达，或在其耗竭对受试者健康有重大损害的细胞的表面上表达，则受试者可能无法接受所述免疫疗法，或一旦施用了此类疗法，可能不得不面临严重的副作用。
发明内容
本公开的方面描述了解决某些免疫治疗方法的有害在靶、脱疾病效应的组合物、方法、策略和治疗模式，例如，包括靶向有需要的受试者的特定抗原的淋巴细胞效应子细胞的免疫治疗，如CAR-T细胞或CAR-NK细胞。本公开部分涉及使用免疫治疗方法减少(例如，耗竭)受试者的干细胞群体(例如，表达CD34的造血干细胞(HSC))的组合物、方法、策略和治疗模式，所述免疫治疗方法例如包括靶向CD34的淋巴细胞效应子细胞，如CAR-T细胞或CAR-NK细胞。在一些方面，此类组合物、方法、策略和治疗模式用不表达CD34、表达降低水平的CD34(例如，相对于野生型细胞)或表达不被靶向CD34的免疫治疗剂识别的CD34的变体形式的基因工程化细胞(例如，基因工程化干细胞，例如，HSC)替代或补充细胞群体(例如，造血细胞，例如，造血干细胞(HSC))。不希望受理论束缚，不表达CD34、表达降低水平的CD34(例如，相对于野生型细胞)或表达不被靶向CD34的免疫治疗剂识别的CD34的变体形式的基因工程化细胞(例如，基因工程化干细胞，例如，HSC)被认为可以逃避靶向CD34的免疫治疗方法的杀伤，从而为有需要的受试者提供健康的细胞群体(例如，干细胞群体)以替代靶向的(例如，恶性)细胞群体。在一些实施例中，免疫治疗方法，例如包括靶向CD34的淋巴细胞效应子细胞，如CAR-T细胞或CAR-NK细胞，不表达CD34、表达降低水平的CD34(例如，相对于野生型细胞)或表达不被靶向CD34的免疫治疗剂识别的CD34的变体形式的基因工程化细胞(例如，基因工程化干细胞，例如，HSC)以组合方式向有需要的受试者施用。
因此，本公开的方面提供了包括编码CD34的经修饰的基因的基因工程化造血细胞或其后代。在一些实施例中，所述编码CD34的经修饰的基因包括INDEL突变。在一些实施例中，所述编码CD34的经修饰的基因被修饰，使得外显子被跳过。在一些实施例中，所述编码CD34的经修饰的基因的外显子1、外显子2或外显子3是基因工程化的。在一些实施例中，所述编码CD34的经修饰的基因包括与位点紧邻的插入或缺失，所述位点当与包括如由SEQ IDNO:11-15中的任一个所提供的靶向结构域的gRNA结合时被RNA引导的核酸酶切割。在一些实施例中，所述编码CD34的经修饰的基因包括由非同源末端连接(NHEJ)事件或由同源定向修复(HDR)事件产生的插入或缺失。
在一些实施例中，所述编码CD34的基因的修饰改变CD34的表达和/或改变所述造血细胞或其后代的特性。在一些实施例中，相对于不携带所述编码CD34的经修饰的基因的野生型对应物细胞，CD34的表达减少或消除。在一些实施例中，与不携带编码CD34的经修饰的基因的野生型对应物细胞中的CD34的表达水平相比，CD34的表达小于25％、小于20％、小于10％、小于5％、小于2％、小于1％、小于0.1％、小于0.01％或小于0.001％。在一些实施例中，所述造血细胞或其后代与包括抗CD34结合结构域的药剂的结合减少或不结合。在一些实施例中，与未基因工程化的造血细胞群体相比，所述造血细胞或其后代保持正常分化的能力。在一些实施例中，所述编码CD34的经修饰的基因导致所述基因工程化造血细胞或其后代中CD34的功能丧失。
在一些实施例中，所述基因工程化造血细胞或其后代进一步包括编码谱系特异性细胞表面抗原的经修饰的基因。在一些实施例中，所述谱系特异性细胞表面抗原是淋巴特异性细胞表面抗原。在一些实施例中，所述谱系特异性细胞表面抗原是髓系特异性细胞表面抗原。在一些实施例中，所述谱系特异性细胞表面抗原是造血干细胞特异性细胞表面抗原。在一些实施例中，所述谱系特异性细胞表面抗原是造血干细胞或祖细胞特异性细胞表面抗原。在一些实施例中，所述谱系特异性细胞表面抗原是T细胞特异性细胞表面抗原。在一些实施例中，所述谱系特异性细胞表面抗原是B细胞特异性细胞表面抗原。在一些实施例中，所述谱系特异性细胞表面抗原是NK细胞特异性细胞表面抗原。在一些实施例中，所述谱系特异性细胞表面抗原是嗜碱性粒细胞特异性细胞表面抗原。在一些实施例中，所述谱系特异性细胞表面抗原是嗜酸性粒细胞特异性细胞表面抗原。在一些实施例中，所述谱系特异性细胞表面抗原是嗜中性粒细胞特异性细胞表面抗原。在一些实施例中，所述谱系特异性细胞表面抗原是单核细胞特异性细胞表面抗原。在一些实施例中，所述谱系特异性细胞表面抗原是红细胞特异性细胞表面抗原。在一些实施例中，所述谱系特异性细胞表面抗原是CD33、CD123、CLL-1、CD19、CD30、CD5、CD6、CD7、CD38或BCMA。在一些实施例中，所述谱系特异性细胞表面抗原在恶性细胞的表面上表达。在一些实施例中，所述基因工程化造血细胞或其后代与包括靶向所述谱系特异性细胞表面抗原的结合结构域的药剂的结合减少或不结合。在一些实施例中，所述造血细胞或其后代缺乏CD34表位或具有经修饰的CD34表位。
本公开的方面提供了包括靶向结构域的向导RNA(gRNA)，所述靶向结构域包括表1和表2中所描述的序列。在一些方面，所述gRNA包括靶向结构域，其中所述靶向结构域包括SEQ ID NO:1-15中的任一个的序列。在一些实施例中，所述gRNA包括第一互补结构域、连接结构域、与所述第一互补结构域互补的第二互补结构域和近端结构域。在一些实施例中，所述gRNA是单向导RNA(sgRNA)。
在一些实施例中，所述gRNA包括一个或多个化学修饰的核苷酸残基。在一些实施例中，所述gRNA包括一个或多个包括2'O-甲基部分的核苷酸残基。在一些实施例中，所述gRNA包括一个或多个包括硫代磷酸酯的核苷酸残基。在一些实施例中，所述gRNA包括一个或多个包括硫代PACE部分的核苷酸残基。
本公开的方面提供了产生基因工程化细胞的方法，所述方法包括：提供细胞，并且使所述细胞与(i)本文描述的任何gRNA；以及(ii)与所述gRNA结合的RNA引导的核酸酶接触，从而在适合(i)的所述gRNA与(ii)的所述RNA引导的核酸酶形成和/或维持核糖核蛋白(RNP)复合物并且适合所述RNP复合物与所述细胞的基因组中的靶结构域结合的条件下形成所述RNP复合物。在一些实施例中，所述接触包括以预形成的核糖核蛋白(RNP)复合物的形式将(i)和(ii)引入所述细胞中。在一些实施例中，所述接触包括以编码(i)的所述gRNA和/或(ii)的所述RNA引导的核酸酶的核酸的形式将(i)和/或(ii)引入所述细胞中。在一些实施例中，编码(i)的所述gRNA和/或(ii)的所述RNA引导的核酸酶的所述核酸是RNA，优选地是mRNA或mRNA类似物。在一些实施例中，通过电穿孔将所述核糖核蛋白复合物引入所述细胞中。
在一些实施例中，所述RNA引导的核酸酶是CRISPR/Cas核酸酶。在一些实施例中，所述CRISPR/Cas核酸酶是Cas9核酸酶。在一些实施例中，所述CRISPR/Cas核酸酶是spCas核酸酶。在一些实施例中，所述Cas核酸酶是saCas核酸酶。在一些实施例中，所述CRISPR/Cas核酸酶是Cpf1核酸酶。
在一些实施例中，所述细胞是造血细胞。在一些实施例中，所述细胞是造血干细胞。在一些实施例中，所述细胞是造血祖细胞。在一些实施例中，所述细胞是免疫效应子细胞。在一些实施例中，所述细胞是淋巴细胞。在一些实施例中，所述细胞是T淋巴细胞。
本公开的方面提供了通过本文所描述的任何方法获得的基因工程化细胞。本公开的方面提供了包括本文所描述的基因工程化细胞的细胞群体。
本公开的方面提供了包括基因工程化细胞的细胞群体，其中所述基因工程化细胞包括基因组修饰，所述基因组修饰由当与包括如表1和表2中的任一个所描述的靶向结构域的gRNA结合时被RNA引导的核酸酶切割的位点紧邻的插入或缺失组成。在一些实施例中，其中所述基因组修饰是由非同源末端连接(NHEJ)事件产生的插入或缺失。在一些实施例中，其中所述基因组修饰是由同源定向修复(HDR)事件产生的插入或缺失。在一些实施例中，所述基因组修饰导致携带此类基因组修饰的基因工程化细胞中CD34的功能丧失。在一些实施例中，与不携带CD34的基因组修饰的相同细胞类型的野生型细胞中的CD34表达水平相比，所述基因组修饰导致CD34的表达降低到小于25％、小于20％、小于10％、小于5％、小于2％、小于1％、小于0.1％、小于0.01％或小于0.001％。在一些实施例中，所述基因工程化细胞是造血干细胞或祖细胞。在一些实施例中，所述基因工程化细胞是免疫效应子细胞。在一些实施例中，所述基因工程化细胞是T淋巴细胞。在一些实施例中，所述免疫效应子细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，所述CAR靶向CD34。
本公开的方面提供了包括向有需要的受试者施用本文所描述的任何基因工程化细胞(例如，本文所描述的基因工程化造血细胞或其后代)或本文所描述任何细胞群体的方法。在一些实施例中，所述受试者已经或已经被诊断患有造血系统恶性肿瘤。在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用有效量的靶向CD34的药剂，其中所述药剂包括与CD34结合的抗原结合片段。在一些实施例中，所述药剂是抗体-药物缀合物或表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应子细胞。在一些实施例中，所述受试者患有与恶性细胞上CD34的表达相关或以其为特征的恶性肿瘤。在一些实施例中，所述恶性细胞是癌症干细胞。在一些实施例中，所述受试者患有造血系统恶性肿瘤。在一些实施例中，所述受试者患有自身免疫性疾病。
本公开的方面提供了包括本文所描述的基因工程化造血细胞(例如，本文所描述的基因工程化HSC)的药物组合物。在一些实施例中，所述药物组合物进一步包括有效量的靶向CD34的药剂，例如，与CD34结合的抗原结合片段、抗体-药物缀合物或表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应子细胞。
本公开的方面提供了包括编码CD34的基因修饰的基因工程化造血干细胞。在一些实施例中，所述基因工程化造血干细胞不表达天然存在的CD34蛋白。在一些实施例中，所述基因工程化造血干细胞在与表达CD34的天然存在的造血干细胞在功能上不可区分。在一些实施例中，所述基因工程化造血干细胞表达一种或多种造血干细胞标志物。在一些实施例中，所述基因工程化造血干细胞表达以下中的一种或多种：CD49c、CD71、CD90、CD117、CD135、CD201、CD228、CD243、CD292、CDw293、CD309、CD318、CD325和CD349。在一些实施例中，所述基因工程化造血干细胞在其细胞表面上不表达CD34。在一些实施例中，所述基因工程化造血干细胞在其细胞表面上不表达被抗CD34抗体识别的CD34表位。在一些实施例中，所述基因工程化造血干细胞在其细胞表面上不表达CD34。在一些实施例中，所述基因工程化造血干细胞在其细胞表面上不表达CD34，并且表达以下中的一种或多种：CD71、CD90、CD201和CD49c。在一些实施例中，所述基因工程化造血干细胞在其细胞表面上不表达CD34，并且表达以下中的一种或多种：CD90、CD201和CD49c。在一些实施例中，所述基因工程化造血干细胞不表达分化的造血细胞(lin-)的谱系特异性表面标志物特征。在一些实施例中，所述基因工程化造血干细胞不表达CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123或CD235a，或其任何组合。在一些实施例中，所述基因工程化造血干细胞能够长期移植到人类受体中。在一些实施例中，所述基因工程化造血干细胞能够在移植后重建人类受体的造血系统。在一些实施例中，所述基因工程化造血干细胞在其细胞表面上不表达CD34，并且表达CD90、CD201和CD49c。在一些实施例中，所述基因工程化造血干细胞在其细胞表面上不表达CD34，表达CD90、CD201和CD49c中的一种或多种，并且对以下呈阴性：CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD45RA、CD56、CD123和CD235a。在一些实施例中，所述基因工程化造血干细胞在其细胞表面上不表达CD34，表达CD90、CD201和CD49c，并且对以下呈阴性：CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD45RA、CD56、CD123和CD235a。
以上发明内容旨在以非限制性的方式说明本文所公开的技术的一些实施例、优点、特征和用途。本文所公开的技术的其它实施例、优点、特征和用途将从具体实施方式、附图、实例和权利要求书中显而易见。
附图说明
图1是CD34基因的示意图，示出了人CD34的两个剪接变体(“CD34CDS”)的编码区。小图下部的短箭头指示了许多示例性Cas9 gRNA靶序列以及其在CD34基因内的相应的结合位点，并且小图中部的短暗箭头指示了命名gRNA CD34-1到CD34-5内的位置。
图2A-2C呈现了示出本文所描述的示例性向导RNA相对于CD34基因的位置的示意图。图2A是示出本文所描述的示例性向导RNA相对于编码CD34的外显子1的核酸序列的位置的示意图。图2B是示出本文所描述的示例性向导RNA相对于编码CD34的外显子2的核酸序列的位置的示意图。图2C是示出本文所描述的示例性向导RNA相对于编码CD34的外显子3的核酸序列的位置的示意图。
图3A-3D示出了CD34编辑的造血干细胞的存活率和编辑效率。图3A是示出实验工作流程的示意图。将CD34+细胞解冻并用Cas9蛋白和本文所描述的示例性靶向CD34的gRNA或靶向CD5的对照gRNA(“Ctrl”)电穿孔，然后通过测序分析细胞活力和编辑效率。图3B示出了在所示sgRNA条件下电穿孔后24小时和48小时测量的平均细胞计数。图3C示出了在所示sgRNA条件下电穿孔后24小时和48小时测量的细胞活力。图3D示出了通过测序分析确定的CD34基因座的编辑效率。
图4示出了用被称为向导CD34-2的示例性靶向CD34的gRNA编辑的HSC的INDEL(插入/缺失)分布。X轴表示INDEL的大小，并且Y轴表示混合物中特定INDEL的百分比。
图5A-5C示出了CD34编辑的供体造血干细胞的存活率和编辑效率。图5A是示出实验工作流程的示意图。将CD34+细胞解冻并用Cas9蛋白和本文所描述的示例性靶向CD34的gRNA电穿孔，然后通过测序分析细胞活力和编辑效率。图5B示出了在所示gRNA条件下电穿孔后24小时和96小时测量的平均细胞计数。图5C示出了在所示gRNA条件下电穿孔后24小时和96小时测量的细胞活力。
图6A和6B示出了按照图5A所呈现的工作流程，在电穿孔后96小时，CD34编辑的供体造血干细胞中CD34的表达被敲低。图6A呈现了示出CD34在供体造血干细胞中的表达的图，所述供体造血干细胞使用所示的示例性靶向CD34的gRNA、模拟编辑细胞(“模拟”)和未电穿孔的细胞(“无EP”)，通过使用抗CD34-PE抗体的流式细胞术分析进行编辑。X轴表示抗体染色(抗CD34-PE德克萨斯(anti-CD34-PE Texas))的强度，并且Y轴对应于细胞的数量。图6B呈现了示出CD34在供体造血干细胞中的表达的图，所述供体造血干细胞使用所示的示例性靶向CD34的gRNA、模拟编辑细胞(“模拟”)和未电穿孔的细胞(“无EP”)，基于通过流式细胞术分析的抗CD34-PE抗体的相对强度进行编辑。
图7A-7D呈现了电穿孔后96小时CD34编辑的供体造血干细胞的流式细胞术分析图。图7A示出了细胞的未编辑的对照群体。图7B示出了使用示例性靶向CD34的gRNA向导CD34-2编辑的供体造血干细胞。图7C示出了使用示例性靶向CD34的gRNA向导CD34-3编辑的供体造血干细胞。图7D示出了使用示例性靶向CD34的gRNA向导CD34-5编辑的供体造血干细胞。X轴示出基于抗CD34抗体(抗CD34(PE德克萨斯))的结合的CD34的表达，并且Y轴示出了活/死染色(L/D(APC Cy7))。
图8是示意图，示出了靶向HSC中CD34的大规模编辑实验的工作流程，并测量了编辑后48小时和168小时的编辑效果。将CD34+细胞解冻并用Cas9蛋白和本文所描述的示例性靶向CD34的gRNA电穿孔，然后在电穿孔后48小时和168小时采集细胞进行分析。在48小时和120小时的时间点之后更换培养基。
图9A和9B示出了按照图8所呈现的工作流程，在电穿孔后48小时，CD34编辑的供体造血干细胞中CD34的表达被敲低。图9A呈现了示出CD34在供体造血干细胞中的表达的图，所述供体造血干细胞使用所示的示例性靶向CD34的gRNA、模拟编辑细胞(“模拟”)和未电穿孔的细胞(“无EP”)，通过使用抗CD34-PE抗体的流式细胞术分析进行编辑。X轴表示抗体染色(抗CD34-PE德克萨斯)的强度，并且Y轴对应于细胞的数量。图9B呈现了示出CD34+细胞在供体造血干细胞中的百分比的图，所述供体造血干细胞使用所示的示例性靶向CD34的gRNA、模拟编辑细胞(“模拟”)和未电穿孔的细胞(“无EP”)，基于通过流式细胞术分析的抗CD34-PE抗体的相对强度进行编辑。
图10A和10B示出了按照图8所呈现的工作流程，在电穿孔后168小时，CD34编辑的供体造血干细胞中CD34的表达被敲低。图10A呈现了示出CD34在供体造血干细胞中的表达的图，所述供体造血干细胞使用所示的示例性靶向CD34的gRNA、模拟编辑细胞(“模拟”)和未电穿孔的细胞(“无EP”)，通过使用抗CD34-PE抗体的流式细胞术分析进行编辑。X轴表示抗体染色(抗CD34-PE德克萨斯)的强度，并且Y轴对应于细胞的数量。图10B呈现了示出CD34+细胞在供体造血干细胞中的百分比的图，所述供体造血干细胞使用所示的示例性靶向CD34的gRNA、模拟编辑细胞(“模拟”)和未电穿孔的细胞(“无EP”)，基于通过流式细胞术分析的抗CD34-PE抗体的相对强度进行编辑。
图11A-11Q示出了示出用于细胞谱系分化和集落基因分型的集落形成单位(CFU)测定的图表、图和表格，以及示出示例性向导RNA的INDEL大小、位置和等位基因分析的编辑频率测定。CFU-GEMM：集落形成单位——粒细胞、红细胞、巨噬细胞、巨核细胞；CFU-GM：集落形成单位——粒细胞、巨噬细胞；CFU-E：集落形成单位——红系；BFU-E：爆发形成单位——红系。图11A呈现了CD34编辑的造血干细胞中CFU测定的实验方法的概述。图11B-11C示出了CD34编辑的HSC的CFU测定数据，其中两种浓度的编辑的细胞被铺板，并且在使用CRISPR/Cas系统编辑后用于CFU分析，所述系统包括两种示例性靶向CD34的向导RNA中的任一种：CD34-2(本文中也称为向导2、g2或sgCD34_2)或CD34-3(本文中称为向导3、g3或sgCD34_3)。图11D和11E分别呈现了使用CD34-2和CD34-3工程化的各种HSC爆发形成单位(BFU)和集落形成单位(CFU)的编辑效率数据。图11F和11G分别呈现了CD34-2和CD34-3编辑的HSC集落的插入/缺失(INDEL)位置分布。图11H-11K分别示出了使用CD34-2或CD34-3对HSC的CD34编辑的等位基因分析。图11L和11M分别以热图形式示出了CD34-2和CD34-3编辑的HSC集落的分析的样品中的INDEL分布。图11N和11O分别示出了用CD34-2和CD34-3编辑的CD34编辑的HSC的INDEL分布的条形图表示。图11P和11Q示出了用CD34-2和CD34-3编辑的HSC中优势INDEL物种的核酸序列变化、氨基酸序列变化、频率和蛋白质后果，分别对应于图11N和11O所示的分布数据。
图12A-12W示出了来自三个不同供体的HSC样品中CD34编辑时间过程数据的图。图12A-12C示出了CD34 HSC的三个供体群体(分别为供体1、供体2和供体3)电穿孔后0小时、24小时、48小时、120小时、168小时和216小时的活力数据。图12D-12I示出了电穿孔后各种时间点HSC编辑效率的TIDE分析，以INDEL的优势物种相对于未进行电穿孔或用对照(CTRL)gRNA电穿孔的对照供体HSC样品的INDEL的％表示；图12D-12E示出了来自供体1HSC的编辑的数据，图12F-12G示出了来自供体2HSC的编辑的数据，并且图12H-12I示出了来自供体3HSC的编辑的数据。图12J-12V示出了在指定时间点编辑的HSC中CD34蛋白的表面表达的流式细胞术分析图；图12J-12N示出了来自供体1HSC的编辑的数据，图12O-12S示出了来自供体2HSC的编辑的数据，并且图12T-12V示出了来自供体3HSC的编辑的数据。图12W示出了使用示例性向导CD34-2或CD34-3编辑的两个供体HSC样品(供体1和供体2)的CD34+细胞随时间推移的平均百分比图；误差条表示标准偏差。
图13A-13L示出了评估CD34编辑的人造血干细胞(HSC)的髓系体外分化(IVD)的图。图13A示出了用于表征CD34编辑的HSC的IVD模式的实验方法。图13B示出了在电穿孔后48小时从使用CD34-2或CD34-3编辑的供体2HSC和IVD之前分离的PCR扩增的基因组DNA的凝胶电泳分析。图13C和13D分别示出了在电穿孔后48小时和IVD前使用CD34-2和CD34-3编辑的供体供体2HSC中INDEL的％的TIDE分析。图13E-13F示出了在IVD条件下电穿孔后0天、2天或9天，编辑的HSC中CD34蛋白表面表达的流式细胞术分析，以活群体中CD34几何平均荧光强度(图13E)和CD34阳性细胞的％(图13F)测量。图13G-13I示出了在IVD条件下电穿孔后0天、2天或9天编辑的HSC中细胞分化标志物(分别为单核细胞标志物CD11b、CD14和粒细胞标志物CD15)的表面表达的流式细胞术分析，表示为表面标志物阳性细胞的％。图13J-13L示出了在IVD条件下电穿孔后0天、2天或9天编辑的HSC中细胞分化标志物的表面表达的流式细胞术分析，表示为表面标志物几何平均荧光强度。
图14A-14B示出了CD34编辑的小鼠模型的体内表征。图14A示出了在NGS小鼠模型中对CD34编辑的HSC进行体内表征的实验方法。在不同时间点的读数包含，例如，获得的细胞的免疫表型。图14B示出了将编辑的细胞移植到小鼠的血液和骨髓后，表征NGS小鼠模型中CD34编辑的HSC的示例性观察结果。
具体实施方式
本公开的一些方面提供了与基因修饰的细胞(例如，造血细胞)相关的组合物、方法、策略和治疗模式，所述基因修饰的细胞在由治疗剂(例如，免疫治疗剂)靶向的抗原的表达方面存在缺陷。本文所提供的基因修饰的细胞可用于例如减轻或完全避免与某些免疫治疗剂相关的某些不期望的作用，例如任何在靶、脱疾病细胞毒性。
例如，当需要免疫治疗干预的受试者体内的健康细胞表达被免疫治疗剂靶向的抗原时，可能发生与某些免疫治疗剂相关的此类不期望的作用。例如，受试者可能被诊断患有与特异性抗原的表达水平升高相关的恶性肿瘤，所述特异性抗原通常不在健康细胞中表达，但可能在受试者体内的非恶性细胞亚群中以相对低的水平表达。可替代地或另外，受试者可能需要消融表达特定抗原(如CD34)的细胞。向受试者施用免疫治疗剂，例如CAR-T细胞治疗剂或靶向抗原的治疗抗体或抗体-药物缀合物(ADC)可以导致靶细胞的有效杀伤，但也可以导致受试者体内表达抗原的非靶细胞的消融。这种在靶、脱疾病的细胞毒性可能会导致显著的副作用，并且在一些情况下，会完全废除免疫治疗剂的使用。
本文所提供的组合物、方法、策略和治疗模式解决了某些免疫治疗剂的在靶、脱疾病细胞毒性问题。本文所提供的组合物、方法、策略和治疗模式也提供了消融表达CD34的细胞群体的常规方法的替代方法，如照射。例如，本公开的一些方面提供了在其基因组中携带修饰的基因工程化细胞，导致被免疫治疗剂靶向的抗原或该抗原的特定形式的表达缺乏。此类基因工程化细胞以及其后代不被免疫治疗剂靶向，并且因此不受被免疫治疗剂影响的任何细胞毒性的影响。可以将此类细胞向接受靶向抗原的免疫治疗剂的受试者施用，例如，为了替代可能已经被细胞治疗剂靶向和杀死的健康细胞，和/或为了提供对被细胞治疗剂靶向具有抗性的细胞群体。例如，如果受试者的健康造血细胞表达抗原，则本文所提供的基因工程化造血细胞，例如基因工程化造血干细胞或祖细胞可以向不表达所述抗原的受试者施用，并且因此不被细胞治疗剂靶向。此类造血干细胞或祖细胞能够在受试者体内重新填充造血小生境，并且其后代能够重建各种造血谱系，包含可能已经被细胞治疗剂消融的任何造血谱系。
CD34是一种115kDa跨膜糖蛋白受体，富含O-和N-聚糖，通常在人造血干祖细胞和内皮细胞的表面上表达。CD34的功能尚未得到很好的表征，但Cd34的表达被认为是由如TGF-β1和TNF-α等生长因子以及氧浓度调节的。据报道，CD34可以调节细胞粘附、细胞形状或参与细胞迁移(例如，T细胞迁移)。参见Tasev等人,《血管生成(Angiogenesis)》(2016)19:325–338。在一些实施例中，HSC表达CD34。在一些实施例中，CD34用作用于检测和/或分离干细胞或祖细胞(例如，HSC)的细胞表面标志物。编码人CD34的基因含有8个外显子，并且位于染色体1上。
除了在HSC上的表达外，CD34的表达也与一些造血系统恶性肿瘤相关。
由于CD34在正常、健康HSC两者上的共同表达以及在恶性细胞上的表达抗原，CD34的治疗靶向可能导致健康干细胞和/或祖细胞池的耗竭。
本文描述了gRNA，其已被开发用于特异性地指导编码CD34的基因的基因修饰。本文还提供了此类gRNA用于产生基因修饰的细胞，如造血细胞、免疫细胞、淋巴细胞和此类细胞的群体群的用途，所述细胞缺乏CD34或CD34的表达减少，使得经修饰的细胞不被CD34特异性免疫疗法识别。本文还提供了涉及向受试者施用此类细胞或其组合物以解决某些免疫治疗剂的在靶、脱疾病细胞毒性问题的方法。在一些实例中，如本文所描述的，基因修饰的细胞是缺乏CD34或CD34表达减少的造血细胞(例如，HSC)，所述细胞能够例如发育成祖细胞或谱系定向细胞。可替代地或另外，在一些实例中，如本文所描述的，基因修饰的细胞是免疫细胞，如CD34特异性CAR T细胞，其缺乏CD34或具有降低的CD34表达，并且因此对其它CD34特异性CAR T细胞的自相残杀具有抗性。
定义
抗体：如本文所使用的，术语“抗体”是指包含足以赋予特定靶抗原特异性结合的规范免疫球蛋白序列元件的多肽。如本领域已知的，天然产生的完整抗体通常是包括彼此缔合成通常被称为“Y形”结构的两个相同的重链多肽(各自约50kD)和两个相同的轻链多肽(各自约25kD)的大约150kD的四聚体药剂。每个重链包括至少四个结构域(各自长约110个氨基酸)——氨基末端可变(VH)结构域(定位于Y结构的尖端处)，随后是三个恒定结构域：CH1、CH2和羧基末端CH3(定位在Y的主干的基部处)。被称为“开关”的短区连接重链可变区和恒定区。“铰链”将CH2结构域和CH3结构域连接到抗体的其余部分。此铰链区中的两个二硫键将完整抗体中的两个重链多肽彼此连接。每个轻链包括通过另一个“开关”彼此分开的两个结构域——氨基末端可变(VL)结构域，随后是羧基末端恒定(CL)结构域。完整抗体四聚体包括两个重链-轻链二聚体，其中重链和轻链通过单个二硫键彼此连接，两个其它二硫键将重链铰接区彼此连接，使得二聚体彼此连接并且四聚体形成。天然产生的抗体通常在CH2结构域上也通常被糖基化。天然抗体中的每个结构域具有表征为由在压缩的反平行β桶中彼此压紧的两个β片层(例如，3链、4链或5链片层)形成的“免疫球蛋白折叠”的结构。每个可变结构域含有被称为“互补决定区”的三个高变环(CDR1、CDR2和CDR3)和四个稍微不变的“框架”区(FR1、FR2、FR3和FR4)。当天然抗体折叠时，FR区形成为结构域提供结构框架的β片层，并且将来自重链和轻链两者的CDR环区一起置于三维空间中，使得其形成位于Y结构的尖端处的单个高变抗原结合位点。天然存在的抗体的Fc区与互补系统的元件结合并且还与效应子细胞上的受体结合，所述效应子细胞例如包含介导细胞毒性的效应子细胞。可以通过糖基化或其它修饰来调节Fc受体的Fc区的亲和力和/或其它结合属性。在一些实施例中，根据本发明(例如，作为CAR的组分)产生和/或利用的抗体包含糖基化Fc结构域，包含具有经修饰的或经工程化的糖基化的Fc结构域。在一些实施例中，包含如在天然抗体中发现的足够的免疫球蛋白结构域序列的任何多肽或多肽复合物可以被称为和/或被用作“抗体”，无论此类多肽是天然产生的(例如，通过生物体与抗原反应产生的)还是通过重组工程化、化学合成或其它人工系统或方法产生的。在一些实施例中，抗体是多克隆的。在一些实施例中，抗体是单克隆的。在一些实施例中，抗体具有小鼠、兔、灵长类动物或人抗体所特有的恒定区序列。在一些实施例中，如本领域中已知的，抗体序列元件是人源化的、灵长化的、嵌合的等。此外，如本文所用，在适当的实施例中(除非另有说明或根据上下文清楚的)，术语“抗体”可以指用于在替代性呈现中利用抗体结构和功能特征的本领域已知的或开发的构造或格式中的任一种。例如，在一些实施例中，根据本发明利用的抗体药剂呈选自但不限于以下的形式：完整IgA抗体、IgG抗体、IgE抗体或IgM抗体；双特异性抗体或多特异性抗体(例如，等)；抗体片段以最广泛的含义在本文使用并且涵盖各种抗体结构，包含但不限于：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和/或抗体片段(优选地那些展现出期望的抗原结合活性的片段)。本文所描述的抗体可以是免疫球蛋白、重链抗体、轻链抗体、基于LRR的抗体或具有抗体样性质的其它蛋白质支架，以及本领域已知的其它免疫结合部分，包含例如Fab'、Fab'2、Fab2、Fab3、F(ab')2、Fd、Fv、Feb、scFv、SMIP、单结构域抗体、单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微型抗体、大抗体、单链抗体、DVD、BiTe、TandAb等，或其任何组合。不同类抗体的亚单位结构和三维构型是本领域已知的。在一些实施例中，抗体可能缺乏在天然产生时其将会具有的共价修饰(例如，多糖的附接)。在一些实施例中，抗体可以含有共价修饰(例如，多糖的附接)、有效载荷(例如，可检测部分、治疗部分、催化部分等)或其它侧基(例如，聚乙二醇等)。
抗原结合片段：“抗原结合片段”是指抗体中与抗体结合的抗原结合的部分。抗体的抗原结合片段包含特异性地结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或基因工程化的多肽或糖蛋白。示例性抗体片段包含但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；单结构域抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，仅scFv或VHH或VH或VL结构域)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在一些实施例中，本文所描述的抗体的抗原结合片段是scFv。在一些实施例中，本文所描述的抗体的抗原结合片段仅是VHH结构域。与完整抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段可以包括至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性地结合单独的抗原或同一抗原的不同表位。
抗体重链：如本文所使用的，术语“抗体重链”是指以其天然存在构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较大的一种。
抗体轻链：如本文所使用的，术语“抗体轻链”是指以其天然存在构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较小的一种。
合成抗体：如本文所使用的，术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如本文所描述的由噬菌体表达的抗体。所述术语还应被解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子而产生的抗体，并且所述DNA分子表达抗体蛋白，或指定抗体的氨基酸序列，其中所述DNA或氨基酸序列是使用本领域已知的合成DNA或氨基酸序列技术获得的。
抗原：如本文所使用的，术语“抗原”或“Ag”是指能够引发免疫应答的分子。此免疫应答可以涉及抗体的产生，特异性免疫活性细胞的激活或两者。技术人员将理解，任何大分子，包含实际上所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以源自重组或基因组DNA。本领域技术人员将理解，包括对引起免疫应答的蛋白质进行编码的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA对如本文所使用的所述术语一样的“抗原”进行编码。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见，本发明包含但不限于使用一个以上基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发期望的免疫应答。此外，本领域技术人员将理解，抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见，抗原可以由生物样品产生、合成或衍生。此类生物样品可以包含但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
自体：如本文所使用的，术语“自体”是指源自个体的任何材料，所述材料随后将被重新引入到同一个体中。
同种异体：如本文所使用的，术语“同种异体”是指源自同一物种的不同动物的任何材料(例如，细胞群体)。
过度增殖性疾病：如本文所使用的，术语“过度增殖性疾病”是指以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。过度增殖性疾病可以是良性或恶性疾病。恶性疾病的典型特征在于存在恶性细胞，例如癌细胞。癌细胞可以局部扩散，或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其它部位。各种癌症的实例包含但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。在某些实施例中，过度增殖性是造血系统恶性肿瘤，如髓系恶性肿瘤或淋巴恶性肿瘤。在一些实施例中，造血系统恶性肿瘤是急性髓系白血病。在一些实施例中，造血系统恶性肿瘤是骨髓增生异常综合征。
保守序列修饰：如本文所使用的，术语“保守序列修饰”是指不显著地影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。此类保守修饰包含氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，将修饰引入到与各种实施例相容的抗体中，如定点诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸取代是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的取代。在本领域中已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包含具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替换，并且可以使用本文所描述的功能测定来测试改变的抗体与抗原结合的能力。
共刺激配体：如本文所使用的，术语“共刺激配体”是指抗原呈递细胞(例如，APC、树突状细胞、B细胞等)上的分子，其与免疫细胞(例如，T淋巴细胞)上的同源共刺激分子特异性结合，由此提供介导免疫细胞应答的信号，包含但不限于增殖、激活、分化等。共刺激配体可以包含但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD28、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、与Toll配体受体结合的激动剂或抗体以及与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体还特别涵盖与免疫细胞(例如，T淋巴细胞)上存在的共刺激分子特异性结合的抗体，如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及与CD83特异性结合的配体。
细胞毒性：如本文所使用的，术语“细胞毒性”(“cytotoxic”或“cytotoxicity”)是指杀死或损伤细胞。在一个实施例中，代谢增强的细胞的细胞毒性得到改善，例如免疫细胞(例如，T淋巴细胞)的细胞溶解活性增加。
有效量：如本文所使用的，本文所描述的“有效量”是指足以预防或治疗个体的肿瘤疾病(例如，癌症)的剂量。用于治疗或预防用途的有效量将取决于例如，正在治疗的疾病或病症的阶段和严重程度、患者的年龄、体重和一般健康状况，以及处方医师的判断。剂量的大小也将由所选择的活性、施用方法、施用时间和频率、可能伴随施用特定活性的任何不良副作用的存在、性质和程度以及期望的生理效果来决定。本领域技术人员将理解，各种疾病或病症可能需要涉及多次施用的长期治疗，可能在每一轮或各种施用中使用本公开的基因工程化细胞(例如，CAR细胞)，例如在时间上接近编辑的造血干细胞，如本文所描述的。
为了本发明的目的，施用的包括异源核酸的基因工程化细胞的量或剂量应足以在合理的时间范围内在受试者或动物中产生治疗或预防应答，所述异源核酸包括本文所描述的CAR构建体。例如，剂量应足以在施用时间后约2小时或更长时间(例如，约12小时至约24小时或更多小时)内与抗原结合，或检测、治疗或预防癌症。在某些实施例中，时间段甚至可以更长。剂量将由本公开的特定基因工程化细胞(例如，CAR细胞)的功效和动物(例如，人)的病状以及待治疗的动物(例如，人)的体重来确定。
效应子功能：如本文所使用的，“效应子功能”或“效应子活性”是指免疫细胞响应免疫细胞的刺激而进行的特定活性。例如，T淋巴细胞的效应子功能包含识别抗原和杀死表达抗原的细胞。
内源性：如本文所使用的，“内源性”是指来自特定生物体、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何材料。
外源性：如本文所使用的，术语“外源性”是指从特定生物体、细胞、组织或系统引入或在其外部产生的任何材料。
扩增：如本文所使用的，术语“扩增”是指细胞数量的增加，例如免疫细胞，例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞和/或造血细胞的数量的增加。在一个实施例中，离体扩增的免疫细胞，例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞和/或造血细胞的数量相对于培养物中最初存在的数量增加。在另一个实施例中，离体扩增的免疫细胞，例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞和/或造血细胞的数量相对于培养物中的其它细胞类型增加。在一些实施例中，扩增可以在体内发生。如本文所使用的，术语“离体”是指从活生物体(例如，人)中移除并在生物体外(例如，在培养皿、试管或生物反应器中)繁殖的细胞。
功能部分：如本文所使用的，当用于提及CAR时，术语“功能部分”是指本发明的CAR构建体的任何部分或片段，所述部分或片段保留其作为部分的CAR构建体(亲本CAR构建体)的生物活性。例如，功能部分涵盖CAR构建体的那些部分，所述部分与亲本CAR构建体在类似程度、相同程度或更高程度上保留识别靶细胞或检测、治疗或预防癌症的能力。关于亲本CAR构建体，功能部分可以包括例如亲本CAR的约10％、约25％、约30％、约50％、约68％、约80％、约90％、约95％或更多。
功能部分可以在所述部分的氨基或羧基末端处，或在两个末端处包括另外的氨基酸，所述另外的氨基酸在亲本CAR构建体的氨基酸序列中没有发现。令人期望地，另外的氨基酸不会干扰功能部分的生物功能，例如识别靶细胞、检测癌症、治疗或预防癌症等。更令人期望地，与亲本CAR构建体的生物活性相比，另外的氨基酸增强了生物活性。
功能变体：如本文所使用的，如本文所使用的术语“功能变体”是指与亲本CAR构建体具有实质性或显著序列同一性或相似性的CAR构建体、多肽或蛋白质，所述功能变体保留其作为变体的CAR的生物活性。功能变体涵盖，例如本文所描述的CAR构建体(亲本CAR构建体)的那些变体，其保留了以与亲本CAR构建体相似程度、相同程度或更高程度的识别靶细胞的能力。关于亲本CAR构建体，功能变体可以例如在氨基酸序列上与亲本CAR构建体至少约30％、约50％、约75％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多相同。例如，功能变体可以包括具有至少一个保守氨基酸取代的亲本CAR的氨基酸序列。可替代地或另外，功能变体可以包括具有至少一个非保守氨基酸取代的亲本CAR构建体的氨基酸序列。在此情况下，优选的是非保守氨基酸取代不干扰或抑制功能变体的生物活性。非保守氨基酸取代可以增强功能变体的生物活性，使得与亲本CAR构建体相比，功能变体的生物活性增加。
gRNA：术语“gRNA”和“向导RNA”在全文中可互换使用，并且是指促进gRNA/Cas9分子复合物特异性靶向或归巢到靶核酸的核酸。gRNA可以是单分子的(具有单个RNA分子)，有时在本文中称为sgRNA，或是模块化的(包括一个以上，并且通常是两个独立的RNA分子)。gRNA可以与宿主细胞基因组中的靶结构域结合。gRNA(例如，其靶向结构域)可以与靶结构域部分或完全互补。gRNA还可以包括“支架序列”(例如，tracrRNA序列)，其将Cas9分子募集到与gRNA序列结合的靶结构域(例如，通过gRNA序列的靶向结构域)。支架序列可以包括至少一个茎环结构并募集核酸内切酶。示例性支架序列可以在例如以下中找到：Jinek等人,I(2012)337(6096):816-821，Ran等人,《自然实验手册(Nature Protocols)》(2013)8:2281-2308，PCT公开第WO2014/093694号和PCT公开第WO2013/176772号。
异源：如本文所使用的，术语“异源”是指发生在生命系统(例如，细胞)中的现象，所述现象不是在该系统中自然发生的。例如，蛋白质在细胞中的表达，其中所述蛋白质不是天然存在于该细胞中(例如，所述细胞不是天然编码该蛋白质)，将是所述蛋白质的异源表达。在一些实施例中，异源核酸编码嵌合抗原受体构建体。
免疫细胞：如本文所使用的，术语“免疫细胞”与术语“免疫效应子细胞”在本文中可互换使用，是指参与免疫应答的细胞，例如促进免疫应答。免疫细胞的实例包含但不限于T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞(Langerhans'cell)或B淋巴细胞。免疫细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞)的来源可以从受试者获得。
免疫应答：如本文所使用的，术语“免疫应答”是指当淋巴细胞识别抗原分子为外来分子并诱导抗体的形成和/或激活淋巴细胞以去除抗原时发生的对抗原的细胞和/或系统应答。
核酸：如本文所使用的，术语“核酸”是指至少三个核苷酸的聚合物。在一些实施例中，核酸包括DNA。在一些实施例中，核酸包括RNA。在一些实施例中，核酸是单链的。在一些实施例中，核酸是双链的。在一些实施例中，核酸包括单链部分和双链部分两者。在一些实施例中，核酸包括主链，所述主链包括一个或多个磷酸二酯键。在一些实施例中，核酸包括主链，所述主链包括磷酸二酯和非磷酸二酯键两者。例如，在一些实施例中，核酸可以包括主链，所述主链包括一个或多个硫代磷酸酯或5'-N-亚磷酰胺键和/或一个或多个肽键，例如在“肽核酸”中。在一些实施例中，核酸包括一个或多个或全部天然残基(例如，腺嘌呤、胞嘧啶、脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶)。在一些实施例中，核酸包括一个或多个或全部非天然残基。在一些实施例中，非天然残基包括核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代嘧啶、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、插层碱基以及其组合)。在一些实施例中，与天然残基中的那些糖相比，非天然残基包括一种或多种经修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施例中，核酸具有编码如RNA或多肽等功能性基因产物的核苷酸序列。在一些实施例中，核酸具有包括一个或多个内含子的核苷酸序列。在一些实施例中，核酸可以通过从天然来源分离、酶合成(例如，通过基于互补模板的聚合，例如，体内或体外，在重组细胞或系统中繁殖，或化学合成)来制备。在一些实施例中，核酸是至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、20个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1500个、2000个、2500个、3000个、3500个、4000个、4500个、5000个或更多个残基长。
单链抗体：如本文所使用的，术语“单链抗体”是指通过重组DNA技术形成的抗体，其中免疫球蛋白重链和轻链片段通过氨基酸的工程化跨度与Fv区连接。产生单链抗体的各种方法是已知的，包含在以下中描述的那些：美国专利第4,694,778号；Bird(1988)《科学(Science)》242:423-442；Huston等人,(1988)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》85:5879-5883；Ward等人,(1989)《自然(Nature)》334:54454；Skerra等人,(1988)《科学》242:1038-1041。
特异性结合：如本文所使用的，关于抗原结合结构域，如抗体剂或嵌合抗原受体的一部分，术语“特异性结合”是指识别特定抗原但基本上不识别或与样品中的其它分子结合的抗原结合结构域或抗体剂。例如，与来自一个物种的抗原特异性结合的抗原结合结构域或抗体剂也可以与来自一种或多种物种的抗原结合。但是，此类跨物种反应性本身并不改变抗原结合结构域或抗体剂的特异性分类。在另一个实例中，与抗原特异性结合的抗原结合结构域或抗体剂也可以与抗原的不同等位基因形式结合。然而，此类交叉反应性本身并不改变抗原结合结构域或抗体剂的特异性分类。在一些情况下，术语“特异性结合”(“specific binding”或“specifically binding”)可以用于指抗原结合结构域或抗体剂、蛋白质或肽与第二化学物种的相互作用，以意指所述相互作用取决于化学物种上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗原结合结构域或抗体剂识别并与特定的蛋白质结构结合，而不是一般地与蛋白质结合。如果抗原结合结构域或抗体剂对表位“A”具有特异性，则在含有标记的“A”和抗原结合结构域或抗体剂的反应中，含有表位A(或游离、未标记的A)的分子的存在将减少与抗体结合的标记的A的量。
受试者：如本文所使用的，术语“受试者”是指生物体，例如哺乳动物(例如，人、非人哺乳动物、非人灵长类动物、灵长类动物、实验室动物、小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、猫或狗)。在一些实施例中，人受试者是成人、青少年或儿科受试者。在一些实施例中，受试者患有疾病、病症或病状，例如，可以按照本文所提供的进行治疗的疾病、病症或病状，例如本文所列的癌症或肿瘤。在一些实施例中，受试者易受疾病、病症或病状；在一些实施例中，易感受试者倾向于和/或表现出发展疾病、病症或病状的风险增加(与在参考受试者或群体中观察到的平均风险相比)。在一些实施例中，受试者表现出疾病、病症或病状的一种或多种症状。在一些实施例中，受试者没有表现出特定症状(例如，疾病的临床表现)或疾病、病症或病状的特征。在一些实施例中，受试者没有表现出疾病、病症或病状的任何症状或特征。在一些实施例中，受试者是患者。在一些实施例中，受试者是正在和/或已经施用诊断和/或疗法的个体。
靶标：如本文所使用的，术语“靶标”是指作为所提供的方法、系统和/或组合物的受试者的体内的细胞、组织、器官或部位，例如，需要治疗或优选地被例如CAR结合的体内的细胞、组织、器官或部位，如本文所描述的。
治疗：如本文所使用的，术语“治疗”是指治疗和/或预防。通过抑制、缓解或根除疾病状态来获得治疗效果。
转染的：如本文所使用的，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入到宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包含受试者的原代细胞和其子代。
转基因：如本文所使用的，术语“转基因”是指包括在细胞中的外源性核酸序列，例如在细胞的基因组中，其中所述核酸序列不是天然存在的。在一些实施例中，转基因可以包括编码基因产物(例如，CAR)的核酸序列或由其组成。在一些实施例中，转基因可以包括表达构建体，例如编码在调控元件(例如，启动子)控制下的基因产物的核酸序列或由其组成。
治疗：如本文所使用的，术语“治疗”(“treat”、“treatment”或“treating”)是指疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征的部分或完全缓解、改善、延迟发作、抑制、预防、减轻和/或发病率和/或严重程度的降低。在一些实施例中，可以向未表现出疾病、病症和/或病状的迹象或特征的受试者施用治疗(例如，可以是预防性的)。在一些实施例中，可以向仅表现出疾病、病症和/或病状的早期或轻微迹象或特征的受试者施用治疗，例如以便降低患上与疾病、病症和/或病状相关的病理的风险。在一些实施例中，可以向表现出疾病、病症或病状的确定的、严重的和/或晚期迹象的受试者施用治疗。在一些实施例中，治疗可包括向受试者施用包括表达CAR的基因工程化细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞)的免疫细胞，或向受试者施用包括基因工程化干细胞的造血干细胞移植。
肿瘤：如本文所使用的，术语“肿瘤”是指细胞或组织的异常生长。在一些实施例中，肿瘤可以包括癌前(例如，良性)、恶性、转移前、转移性和/或非转移性的细胞。在一些实施例中，肿瘤与癌症相关或是癌症的表现。在一些实施例中，肿瘤可以是分散性肿瘤或液体肿瘤。在一些实施例中，肿瘤可以是实体瘤。
基因工程化细胞以及相关组合物和方法
本公开的一些方面提供了基因工程化细胞，其包括在其基因组中的导致CD34表达丧失，或CD34的变体形式的表达的修饰，所述变体形式不被靶向CD34的免疫治疗剂识别。在一些实施例中，细胞的基因组中的修饰是编码CD34的基因组序列中的突变。
如本文所使用的，术语“突变”是指核酸序列与参考序列(例如，不具有此类突变的细胞的对应序列或对应的野生型核酸序列)相比的变化(例如，插入、缺失、倒位或取代)。在本文提供的一些实施例中，编码CD34的基因中的突变导致携带突变的细胞中CD34的表达丧失。在一些实施例中，编码CD34的基因中的突变导致CD34的变体形式的表达，所述变体形式不被靶向CD34的免疫治疗剂结合，或以显著低于由所述基因编码的未突变的CD34形式的水平结合。在一些实施例中，如本文所提供的在CD34基因中携带基因组突变的细胞不被靶向CD34的免疫治疗剂，例如抗CD34抗体或嵌合抗原受体(CAR)结合，或以显著更低的水平被其结合。
本公开的一些方面提供了用于产生本文所描述的基因工程化细胞的组合物和方法，例如，包括在其基因组中的导致CD34表达丧失的修饰，或CD34的变体形式的表达的基因工程化细胞，所述变体形式不被靶向CD34的免疫治疗剂识别。本文所提供的此类组合物和方法包含但不限于用于基因工程化细胞的合适策略和方法，例如通过使用RNA引导的核酸酶，如CRISPR/Cas核酸酶，以及能够与此类RNA引导的核酸酶结合并将其靶向细胞的基因组内的合适靶位点以实现导致CD34的表达丧失或CD34的变体形式的表达的基因组修饰的合适RNA，所述变体形式不被靶向CD34的免疫治疗剂识别。
在一些实施例中，本文所描述的基因工程化细胞(例如，基因工程化造血细胞，例如基因工程化造血干细胞或祖细胞或基因工程化免疫效应子细胞)是通过基因组编辑技术产生的，所述基因组编辑技术包含能够引入靶向改变的任何技术，也被称为“编辑”到细胞的基因组中。
一种示例性合适的基因组编辑技术是“基因编辑”，其包括使用RNA引导的核酸酶，例如CRISPR/Cas核酸酶，在细胞的基因组中引入靶向的单链或双链DNA断裂，其触发细胞修复机制，例如非同源末端连接(NHEJ)、微同源性介导的末端连接(MMEJ，有时也被称为“替代性NHEJ”或“alt-NHEJ”)，或同源定向修复(HDR)，其通常导致在核酸酶切割位点处或紧邻核酸酶切割位点的核酸序列改变(例如，通过核苷酸或核苷酸序列插入、缺失、倒位或取代)。参见Yeh等人,《自然细胞生物学(Nat.Cell.Biol.)》(2019)21:1468-1478；例如，Hsu等人,《细胞(Cell)》(2014)157:1262-1278；Jasin等人,《DNA修复(DNA Repair)》(2016)44:6-16；Sfeir等人,《生物化学科学趋势(Trends Biochem.Sci.)》(2015)40:701-714。
另一种示例性合适的基因组编辑技术是“碱基编辑”，其包含使用碱基编辑器，例如核酸酶受损或部分核酸酶受损的RNA引导的CRISPR/Cas蛋白，所述蛋白与脱氨酶融合，所述脱氨酶靶向并脱氨特定的核碱基，例如C或A核苷酸的胞嘧啶或腺苷核碱基，导致从C到T核苷酸的变化或从A到G核苷酸的变化。参见例如，Komor等人,《自然》(2016)533:420-424；Rees等人,《自然评论：遗传学(Nat.Rev.Genet.)》(2018)19(12):770-788；Anzalone等人,《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》(2020)38:824-844；
又另一种示例性的合适的基因组编辑技术包含“引物编辑”，其包含使用催化受损或部分催化受损的RNA引导的核酸酶，例如CRISPR/Cas核酸酶将新的遗传信息，例如改变的核苷酸序列引入到特异性靶向的基因组位点，与工程化逆转录酶(RT)结构域融合。Cas/RT融合通过向导RNA靶向基因组内的靶位点，所述向导RNA还包括编码期望的编辑的核酸序列，并且可以用作RT的引物。参见例如，Anzalone等人,《自然》(2019)576(7785):149-157。
基因组编辑技术的使用通常以使用合适的RNA引导的核酸酶为特征，在一些实施例中，例如，对于碱基编辑或引物编辑，其可能催化受损或部分催化受损。合适的RNA引导的核酸酶的实例包含CRISPR/Cas核酸酶。例如，在一些实施例中，用于本文所提供的基因工程化细胞的方法的合适的RNA引导的核酸酶是Cas9核酸酶，例如spCas9或saCas9核酸酶。作为另一个实例，在一些实施例中，用于本文所提供的基因工程化细胞的方法的合适的RNA引导的核酸酶是Cas12核酸酶，例如Cas12a核酸酶。示例性合适的Cas12核酸酶包含但不限于AsCas12a、FnCas12a、其它Cas12a直系同源物和Cas12a衍生物，如MAD7系统(MAD7TM，Inscripta公司(Inscripta,Inc.))或Alt-R Cas12a(Cpf1)超核酸酶(Alt-Cas12aUltra；整合DNA技术公司(Integrated DNA Technologies,Inc.))。参见例如，Gill等人,LIPSCOMB 2017.美国(United States):Inscripta公司；Price等人,《生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)》(2020)117(60):1805-1816；
在一些实施例中，在适合于RNA引导的核酸酶与靶位点结合并切割细胞的基因组DNA的条件下，通过将RNA引导的核酸酶，例如CRISPR/Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶或Cas12a核酸酶靶向细胞基因组中的合适靶位点产生本文所描述的基因工程化细胞(例如，基因工程化造血细胞，例如基因工程化造血干细胞或祖细胞或基因工程化免疫效应子细胞)。合适的RNA引导的核酸酶可以通过合适的向导RNA(gRNA)靶向基因组内的特定靶位点。本文提供了根据本公开的方面的用于靶向CRISPR/Cas核酸酶的合适的gRNA，并且在本文其它地方更详细地描述了示例性合适的gRNA。
在一些实施例中，本文所描述的CD34 gRNA与CRISPR/Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶复合。根据本公开的方面，各种Cas9核酸酶适合与本文所提供的gRNA一起使用，以实现基因组编辑，例如，在CD34基因中产生基因组修饰。通常，Cas核酸酶和gRNA以适合形成Cas/gRNA复合物的形式和条件提供，所述复合物靶向细胞的基因组上的靶位点，例如CD34基因内的靶位点。在一些实施例中，使用表现出期望的PAM特异性的Cas核酸酶，以将Cas/gRNA复合物靶向CD34基因中期望的靶结构域。本文提供了合适的靶结构域和对应的gRNA靶向结构域序列。
在一些实施例中，例如在体外形成Cas/gRNA复合物，并且例如通过将Cas/gRNA复合体电穿孔到细胞中使靶细胞与Cas/gRNA复合物接触。在一些实施例中，细胞单独与Cas蛋白和gRNA接触，并且Cas/gRNA复合物在细胞内形成。在一些实施例中，细胞与编码Cas蛋白的核酸，例如DNA或RNA，和/或与编码gRNA的核酸或两者接触。
在一些实施例中，使用合适的基因组编辑技术产生如本文所提供的基因工程化细胞，其中基因组编辑技术的特征在于使用Cas9核酸酶。在一些实施例中，Cas9分子是或源自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(SpCas9)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(SaCas9)或嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)(stCas9)。另外的合适的Cas9分子包含或源自脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)(NmCas9)、燕麦食酸菌(Acidovorax avenae)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、猪放线杆菌(Actinobacillus suis)、放线菌(Actinomyces sp.)、反硝化环杆菌(Cycliphilus denitrificans)、普氏氨基酸杆菌(Aminomonas paucivorans)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、史氏芽孢杆菌(Bacillussmithii)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、拟杆菌(Bacteroides sp.)、海洋芽殖小梨形菌(Blastopirellula marina)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)、侧孢短芽胞杆菌(Brevibacillus laterosporus)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)(CjCas9)、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)、待定的微粉红螺菌属(Candidatus puniceispirillum)、解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、拥挤棒状杆菌(Corynebacterium accolens)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、马氏棒状杆菌(Corynebacterium matruchotii)、恒雄芝氏沟鞭藻玫瑰杆菌(Dinoroseobactershibae)、细长真杆菌(Eubacterium dolichum)、γ变形杆菌(gamma proteobacterium)、重氮葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)、副流感嗜血杆菌(Haemophilusparainfluenzae)、唾液嗜血杆菌(Haemophilus sputorum)、加拿大螺杆菌(Helicobactercanadensis)、同性恋螺杆菌(Helicobacter cinaedi)、雪貂螺杆菌(Helicobactermustelae)、多营养泥杆菌(Ilyobacter polytropus)、金氏杆菌(Kingella kingae)、弯曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)、斯氏利斯特菌(Listeria ivanovii)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、李斯特氏菌科细菌(Listeriaceae bacterium)、甲基孢囊菌(Methylocystis sp.)、甲烷氧化菌(Methylosinus trichosporium)、羞怯动弯杆菌(Mobiluncus mulieris)、杆状奈瑟菌(Neisseria bacilliformis)、灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea)、浅黄色奈瑟菌(Neisseria flavescens)、乳糖奈瑟菌(Neisserialactamica)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、奈瑟氏球菌(Neisseria sp.)、奈瑟氏沃斯沃军团菌(Neisseria wadsworthii)、亚硝化单胞菌(Nitrosomonas sp.)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、琥珀酸考拉杆菌(Phascolarctobacterium succinatutens)、蒲桃雷尔氏菌(Ralstoniasyzygii)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、小红卵菌(Rhodovulum sp.)、米氏西蒙斯氏菌(Simonsiella muelleri)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)、葡萄园芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus vineae)、金黄色葡萄球菌、表皮路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)、链球菌(Streptococcus sp.)、罕见小球菌(Subdoligranulum sp.)、运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)、密螺旋体(Treponemasp.)或爱胜蚓蚯蚓肾杆菌(Verminephrobacter eiseniae)。在一些实施例中，可以使用此类Cas9核酸酶的催化受损或部分受损的变体。基于本公开，另外的合适的Cas9核酸酶和核酸酶变体对于本领域技术人员来说是显而易见的。本公开在此方面不受限制。
在一些实施例中，Cas核酸酶是天然存在的Cas分子。在一些实施例中，Cas核酸酶是工程化、改变或经修饰的Cas分子，其与参考序列(例如，最相似的天然存在的Cas9分子或PCT公开第WO2015/157070号的表50的序列，所述文献通过全文引用的方式并入本文)相差例如至少一个氨基酸残基。
在一些实施例中，使用属于2类V型Cas核酸酶的Cas核酸酶。2类V型Cas核酸酶可以进一步分类为V-A型、V-B型、V-C型和V-U型，参见例如Stella等人,《自然结构与分子生物学(Nature Structural&Molecular Biology)》(2017)。在一些实施例中，Cas核酸酶是V-B型Cas核酸内切酶，如C2c1。参见例如，Shmakov等人,《分子细胞(Mol Cell)》(2015)60:385-397。在一些实施例中，本文所提供的基因组编辑方法中使用的Cas核酸酶是V-A型Cas核酸内切酶，如Cpf1(Cas12a)核酸酶。参见例如，Strohkendl等人,《分子细胞》(2018)71:1-9。在一些实施例中，在本文所提供的基因组编辑方法中使用的Cas核酸酶是源自以下的Cpf1核酸酶：普氏菌(Provetella spp.)或弗朗西斯菌(Francisella spp.)、氨基酸球菌(Acidaminococcus sp.)(AsCpf1)、毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)(LpCpf1)或直肠真杆菌(Eubacterium rectale)。在一些实施例中，Cas核酸酶是MAD7。
根据本公开的方面，CRISPR/Cas核酸酶的天然存在的和经修饰的变体都适合使用。例如，dCas或镍酶变体、具有改变的PAM特异性的Cas变体和具有改进的核酸酶活性的Cas变体被本公开的一些实施例所接受。
本文更详细地描述了一些示例性的、非限制性的合适的Cas核酸酶的一些特征，不希望受任何特定理论的束缚。
天然存在的Cas9核酸酶通常包括两个叶：识别(REC)叶和核酸酶(NUC)叶；其中每一个进一步包括例如PCT公开第WO2015/157070号中描述的结构域，例如图9A-9B中的(所述申请通过全文引用的方式并入本文)。
REC叶包括富含精氨酸的桥螺旋(BH)、REC1结构域和REC2结构域。REC叶似乎是Cas9特异性功能结构域。BH结构域是长α螺旋和富含精氨酸的区域，并且包括化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9的序列的氨基酸60-93。REC1结构域参与识别重复:反重复双链体，例如gRNA或tracrRNA。REC1结构域在化脓性链球菌Cas9的序列的氨基酸94至179和308至717处包括两个REC1基序。这两个REC1结构域虽然在线性一级结构中被REC2结构域分开，但在三级结构中组装以形成REC1结构域。REC2结构域或其部分也可以在识别重复:反重复双链体中发挥作用。REC2结构域包括化脓性链球菌Cas9的序列的氨基酸180-307。
NUC叶包括RuvC结构域(本文中也称为RuvC样结构域)、HNH结构域(本文中也称为HNH样结构域)和PAM相互作用(PI)结构域。RuvC结构域与逆转录病毒整合酶超家族成员具有结构相似性，并且切割单链，例如靶核酸分子的非互补链。RuvC结构域由三个分裂的RuvC基序(RuvC I、RuvCII和RuvCIII，其在本领域中通常被称为RuvCI结构域，或N末端RuvC结构域、RuvCII结构域和RuvCIII结构域)分别在化脓性链球菌Cas9的序列的氨基酸1-59、718-769和909-1098处组装。与REC1结构域类似，三个RuvC基序在一级结构中被其它结构域线性分离，然而在三级结构中，三个RuvC基序组装并形成RuvC结构域。HNH结构域与HNH核酸内切酶共享结构相似性，并且切割单链，例如靶核酸分子的互补链。HNH结构域位于RuvC II-III基序之间，并且包括化脓性链球菌Cas9的序列的氨基酸775-908。PI结构域与靶核酸分子的PAM相互作用，并且包括化脓性链球菌Cas9的序列的氨基酸1099-1368。
已经确定了天然存在的细菌Cas9核酸酶(参见例如，Jinek等人,《科学》,343(6176):1247997,2014)和具有向导RNA(例如，crRNA和tracrRNA的合成融合)的化脓性链球菌Cas9(Nishimasu等人,《细胞》,156:935-949,2014；和Anders等人,《自然》，2014,doi:10.1038/naturel3579)的晶体结构。
在一些实施例中，本文所描述的Cas9分子表现出核酸酶活性，所述核酸酶活性导致在靶位点中或直接在靶位点附近引入双链DNA断裂。在一些实施例中，Cas9分子已被修饰以使核酸内切酶的催化残基之一失活。在一些实施例中，Cas9分子是镍酶，并且产生单链断裂。参见例如，Dabrowska等人,《神经科学前沿(Frontiers in Neuroscience)》(2018)12(75)。已经表明，酶的RuvC和HNH催化结构域中的一个或多个突变可以提高Cas9效率。参见例如，Sarai等人,《当前药物生物技术(Currently Pharma.Biotechnol.)》(2017)18(13)。在一些实施例中，Cas9分子与第二结构域融合，例如修饰DNA或染色质的结构域，例如脱氨酶或去甲基化酶结构域。在一些此类实施例中，对Cas9分子进行修饰以消除其核酸内切酶活性。
在一些实施例中，本文所描述的Cas核酸酶或Cas/gRNA复合物与同源定向修复(HDR)模板一起施用。在一些实施例中，本文所描述的Cas核酸酶或Cas/gRNA复合物在没有HDR模板的情况下施用。
在一些实施例中，使用经修饰以增强酶的特异性的Cas9核酸酶(例如，减少脱靶效应，维持稳健的靶上切割)。在一些实施例中，Cas9分子是特异性增强的Cas9变体(例如，eSPCas9)。参见例如，Slaymaker等人,《科学》(2016)351(6268):84-88。在一些实施例中，Cas9分子是高保真度Cas9变体(例如，SpCas9-HF1)。参见例如，Kleinstiver等人,《自然》(2016)529:490-495。
各种Cas核酸酶是本领域已知的，并且可以从各种来源获得和/或工程化/修饰以调节酶的一种或多种活性或特异性。合适的Cas核酸酶，例如合适的Cas9核酸酶，例如spCas9和saCas9的PAM序列偏好和特异性是本领域已知的。在一些实施例中，Cas核酸酶已被工程化/修饰以识别一个或多个PAM序列。在一些实施例中，Cas核酸酶已被工程化/修饰以识别一个或多个PAM序列，所述序列不同于在没有工程化/修改的情况下Cas核酸酶识别的PAM序列。在一些实施例中，Cas核酸酶已被工程化/修饰以降低酶的脱靶活性。
在一些实施例中，使用经进一步修饰以改变核酸内切酶活性的特异性的Cas核酸酶(例如，减少脱靶切割，降低核酸内切酶在细胞中的活性或寿命，增加同源定向重组以及减少非同源末端连接)。参见例如，Komor等人,《细胞》(2017)168:20-36。在一些实施例中，使用经修饰以改变核酸内切酶的PAM识别或偏好的Cas核酸酶。例如，SpCas9识别PAM序列NGG，而包括一个或多个修饰的SpCas9的一些变体(例如，VQR SpCas9、EQR SpCas9、VRERSpCas9)可以识别变体PAM序列，例如NGA、NGAG和/或NGCG。例如，SaCas9识别PAM序列NNGRRT，而包括一个或多个修饰(例如，KKH SaCas9)的SaCas9的一些变体可以识别PAM序列NNNRRT。在另一个实例中，FnCas9识别PAM序列NNG，而FnCas9的变体包括一个或多个修饰(例如，RHA FnCas9)可以识别PAM序列YG。在另一个实例中，包括取代突变S542R和K607R的Cas12a核酸酶识别PAM序列TYCV。在另一个实例中，包括取代突变S542R、K607R和N552R的Cpf1核酸内切酶识别PAM序列TATV。参见例如，Gao等人,《自然生物技术》(2017)35(8):789-792。
在一些实施例中，使用碱基编辑器来产生导致CD34的表达丧失，或导致不被免疫疗法靶向的CD34变体的表达的基因组修饰。碱基编辑器通常包括与功能结构域(例如，脱氨酶结构域)融合的无催化活性或部分无活性的Cas核酸酶。参见例如，Eid等人,《生物化学杂志(Biochem.J.)》(2018)475(11):1955-1964；Rees等人,《自然评论：遗传学(NatureReviews Genetics)》(2018)19:770-788。在一些实施例中，无催化活性的Cas核酸酶被称为“死Cas”或“dCas”。在一些实施例中，核酸内切酶包括与腺嘌呤碱基编辑器(ABE)融合的dCas，例如从RNA腺嘌呤脱氨酶TadA进化的ABE。在一些实施例中，核酸内切酶包括与胞苷脱氨酶融合的dCas(例如APOBEC脱氨酶、pmCDA1、激活诱导的胞苷脱氨酶(AID))。在一些实施例中，无催化活性的Cas分子具有降低的活性，并且是例如镍酶。
合适的碱基编辑器的实例包含但不限于BE1、BE2、BE3、HF-BE3、BE4、BE4max、BE4-Gam、YE1-BE3、EE-BE3、YE2-BE3、YEE-CE3、VQR-BE3、VRER-BE3、SaBE3、SaBE4、SaBE4-Gam、Sa(KKH)-BE3、Target-AID、Target-AID-NG、xBE3、eA3A-BE3、BE-PLUS、TAM、CRISPR-X、ABE7.9、ABE7.10、ABE7.10*、xABE、ABESa、VQR-ABE、VRER-ABE、Sa(KKH)-ABE和CRISPR-SKIP。碱基编辑器的另外的实例可以在例如以下中找到：美国公开第2018/0312825A1号、美国公开第2018/0312828A1号和PCT公开第WO 2018/165629A1号，所述文献通过全文引用的方式并入本文。
本公开的一些方面提供了适合靶向RNA引导的核酸酶的向导RNA，例如本文所提供的，靶向细胞基因组中的合适靶位点，以在细胞基因组中进行修饰，从而导致CD34的表达丧失，或CD34的变体形式的表达，所述变体形式不被靶向CD34的免疫治疗剂识别。
术语“向导RNA”和“gRNA”在本文中可互换使用，并且是指核酸，通常是RNA，所述核酸被RNA引导的核酸酶结合，并且促进RNA引导的核酸酶特异性靶向或归巢到靶核酸，例如细胞基因组内的靶位点。gRNA通常包括至少两个结构域：“结合结构域”，有时也称为“gRNA支架”或“gRNA主链”，其介导与RNA引导的核酸酶(也称为“结合结构域”)的结合，以及“靶向结构域”，其介导gRNA结合的RNA引导的核酸酶靶向靶位点。一些gRNA包括另外的结构域，例如互补结构域或茎环结构域。天然存在的gRNA结合结构域以及其工程化变体的结构和序列是本领域技术人员众所周知的。一些合适的gRNA是单分子的，包括单个核酸序列，而其它合适的gRNA包括两个序列(例如，crRNA和tracrRNA序列)。
本文提供了一些示例性合适的Cas9 gRNA支架序列，并且基于本公开，另外的合适的gRNA支架序列对于本领域技术人员来说将显而易见。此类另外的合适的支架序列包含但不限于在以下中描述的那些：Jinek等人,《科学》(2012)337(6096):816-821，Ran等人,《自然实验手册》(2013)8:2281-2308，PCT公开第WO2014/093694号和PCT公开第WO2013/176772号。
例如，天然存在的spCas9 gRNA的结合结构域通常包括两个RNA分子，crRNA(部分)和tracrRNA。仅包括单个RNA分子(包含crRNA和tracrRNA序列两者)的spCas9 gRNA的变体彼此共价结合(例如，通过四环或通过点击化学型共价键)，已被工程化并通常被称为“单向导RNA”或“sgRNA”。与其它Cas核酸酶，例如与Cas12a核酸酶一起使用的合适的gRNA通常仅包括单个RNA分子，因为天然存在的Cas12a向导RNA包括单个RNA分子。合适的gRNA可以因此是单分子的(具有单个RNA分子)，有时在本文中称为sgRNA，或是模块化的(包括一个以上，并且通常是两个独立的RNA分子)。
适合靶向CD34基因中靶位点的gRNA可以包括多个结构域。在一些实施例中，例如在使用Cas9核酸酶的一些实施例中，单分子sgRNA从5'至3'可以包括：
靶向结构域，所述靶向结构域对应于CD34基因中的靶位点序列；
第一互补结构域；
连接结构域；
第二互补结构域(其与第一互补结构域互补)；
近端结构域；以及
任选地，尾部结构域。
现在将更详细地描述这些结构域中的每一个。
如本文所提供的gRNA通常包括与细胞基因组中的靶位点结合的靶向结构域。靶位点通常是双链DNA序列，其包括PAM序列，以及在与所述PAM序列相同的链上且与其直接邻近的靶结构域。gRNA的靶向结构域通常包括与靶结构域序列相对应的RNA序列，其类似于靶结构域的序列，有时具有一个或多个错配，但通常包括RNA而不是DNA序列。因此，gRNA的靶向结构域与双链靶位点的序列碱基配对(完全或部分互补)，所述双链靶位点的序列与靶结构域的序列互补，并且因此与包括PAM序列的链互补的链碱基配对。应理解，gRNA的靶向结构域通常不包含PAM序列。应进一步理解的是，PAM的位置可以是靶结构域序列的5'或3'，这取决于所使用的核酸酶。例如，PAM通常是Cas9核酸酶的靶结构域序列的3'和Cas12a核酸酶的靶结构域序列的5'。关于PAM的位置和gRNA结合靶位点的机制的说明，参见例如以下中的图1：Vanegas等人,《真菌生物生物技术(Fungal Biol Biotechnol.)》,2019；6:6，所述文献通过引用并入本文。关于gRNA将RNA引导的核酸酶靶向靶位点的机制的另外的说明和描述，参见Fu Y等人,《自然生物技术》2014(doi:10.1038/nbt.2808)和Sternberg SH等人,《自然》2014(doi:10.1038/naturel3011)，两者均通过引用的方式并入本文。
靶向结构域可以包括与靶结构域的序列相对应的核苷酸序列，即与PAM序列直接邻近的DNA序列(例如，Cas9核酸酶的PAM序列的5'，或Cas12a核酸酶的PAM序列的3')。靶向结构域序列通常包括17个与30个之间的核苷酸，并且完全对应于靶结构域序列(即没有任何错配核苷酸)，或可以包括一个或多个，但通常不超过4个错配。由于靶向结构域是RNA分子gRNA的一部分，其通常将包括核糖核苷酸，而DNA靶向结构域将包括脱氧核糖核苷酸。
以下提供了包括22个核苷酸的靶结构域和NGG PAM序列的Cas9靶位点，以及包括完全对应于靶结构域的靶向结构域(并且因此与和包括靶结构域和PAM的链互补的DNA链的碱基对具有完全互补性)的gRNA的示例性说明。从上到下、从左到右，所述序列对应于SEQID NO 24-26：
以下提供了包括22个核苷酸的靶结构域和TTN PAM序列的Cas12a靶位点，以及包括完全对应于靶结构域的靶向结构域(并且因此与和包括靶结构域和PAM的链互补的DNA链的碱基对具有完全互补性)的gRNA的示例性说明。从上到下、从左到右，所述序列对应于SEQID NO 27、28和26：
在一些实施例中，Cas12a PAM序列是5'-T-T-T-V-3'。
虽然不希望被理论束缚，但至少在一些实施例中，据信靶向结构域与靶序列的长度和互补性有助于gRNA/Cas9分子复合物与靶核酸相互作用的特异性。在一些实施例中，本文所提供的gRNA的靶向结构域的长度为5个至50个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为15个至25个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为18个至22个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为19个至21个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为15个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为16个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为17个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为18个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为19个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为20个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为21个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为22个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为23个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为24个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为25个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域完全对应于本文所提供的靶结构域序列或其一部分，没有错配。在一些实施例中，本文所提供的gRNA的靶向结构域包括相对于本文所提供的靶结构域序列的1个错配。在一些实施例中，靶向结构域包括相对于靶结构域序列的2个错配。在一些实施例中，靶结构域包括相对于靶结构域序列的3个错配。
在一些实施例中，靶向结构域包括核心结构域和次级靶向结构域，例如，如PCT公开第WO2015/157070号中所描述的，所述文献通过全文引用的方式并入。在一些实施例中，核心结构域包括从靶向结构域的3'端起的约8个至约13个核苷酸(例如，靶向结构域的最多3'的8个至13个核苷酸)。在一些实施例中，次级结构域定位在核心结构域的5'处。在一些实施例中，核心结构域与靶结构域序列或其一部分完全对应。在其它实施例中，核心结构域可以包括与靶结构域序列的相应核苷酸错配的一个或多个核苷酸。
在一些实施例中，例如，在其中提供Cas9 gRNA的一些实施例中，gRNA包括第一互补结构域和第二互补结构域，其中所述第一互补结构域与所述第二互补结构域互补，并且至少在一些实施例中，与所述第二互补结构域具有足够的互补性以在至少一些生理条件下形成双链区。在一些实施例中，第一互补结构域的长度为5个至30个核苷酸。在一些实施例中，第一互补结构域包括3个亚结构域，其在5'至3'方向上为：5'亚结构域、中心亚结构域和3'亚结构域。在一些实施例中，5'亚结构域的长度为4个至9个，例如4个、5个、6个、7个、8个或9个核苷酸。在一些实施例中，中心亚结构域的长度为1个、2个或3个，例如1个核苷酸。在一些实施例中，3'亚结构域的长度为3个至25个，例如4个至22个、4个至18个或4个至10个，或3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核苷酸。第一互补结构域可以与天然存在的第一互补结构域共享同源性，或源自天然存在的第一互补结构域。在一个实施例中，其与化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌或嗜热链球菌第一互补结构域具有至少50％的同源性。
上述结构域的序列和位置在PCT公开第WO2015/157070号中进行了更详细的描述，所述文献通过全文引用的方式并入本文，包含其中的第88-112页。
连接结构域可以用于连接单分子gRNA的第一互补结构域和第二互补结构域。连接结构域可以共价或非共价连接第一和第二互补结构域。在一些实施例中，键是共价的。在一些实施例中，连接结构域是或包括插置于第一互补结构域与第二互补结构域之间的共价键。在一些实施例中，连接结构域包括一个或多个，例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。在一些实施例中，连接结构域包括至少一个非核苷酸键，例如，如PCT公开第WO2018/126176号中所公开的，所述文献的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施例中，第二互补结构域与第一互补结构域至少部分互补，并且在一个实施例中，与第二互补结构域具有足够的互补性，以在至少一些生理条件下形成双链区。在一些实施例中，第二互补结构域可以包含与第一互补结构域缺乏互补性的序列，例如，从双链区环出的序列。在一些实施例中，第二互补结构域的长度为5个至27个核苷酸。在一些实施例中，第二互补结构域比第一互补区域长。在一个实施例中，互补结构域的长度为5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核苷酸。在一些实施例中，第二互补结构域包括3个亚结构域，其在5'至3'方向上为：5'亚结构域、中心亚结构域和3'亚结构域。在一些实施例中，5'亚结构域的长度为3至25个，例如4至22个、4至18个或4至10个，或3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核苷酸。在一些实施例中，中心亚结构域的长度为1个、2个、3个、4个或5个，例如3个核苷酸。在一些实施例中，3'亚结构域的长度为4个至9个，例如4个、5个、6个、7个、8个或9个核苷酸。在一些实施例中，第一互补结构域的5'亚结构域和3'亚结构域分别与第二互补结构域的3'亚结构域和5'亚结构域互补，例如完全互补。
在一些实施例中，近端结构域的长度为5个至20个核苷酸。在一些实施例中，近端结构域可以与天然存在的近端结构域共享同源性，或源自天然存在的近端结构域。在一个实施例中，其与来自化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌或嗜热链球菌的近端结构域具有至少50％的同源性。
广谱的尾部结构域适用于gRNA。在一些实施例中，尾部结构域的长度为0个(不存在)、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。在一些实施例中，尾部结构域核苷酸来自天然存在的尾部结构域的5'端的序列或与其共享同源性。在一些实施例中，尾部结构域包含彼此互补的序列，并且在至少一些生理条件下形成双链区。在一些实施例中，尾部结构域不存在或长度为1个至50个核苷酸。在一些实施例中，尾部结构域可以与天然存在的近端尾部结构域共享同源性或源自所述结构域。在一些实施例中，尾部结构域与化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌或嗜热链球菌的尾部结构域具有至少50％的同源性/同一性。在一些实施例中，尾部结构域包含与体外或体内转录方法相关的3'端处的核苷酸。
在一些实施例中，本文提供的gRNA包括：
第一链，所述第一链包括，例如从5'至3'：
靶向结构域(所述靶向结构域对应于CD34基因中的靶结构域)；以及
第一互补结构域；以及
第二链，所述第二链包括，例如从5'至3'：
任选地，5'延伸结构域；
第二互补结构域；
近端结构域；以及
任选地，尾部结构域。
在一些实施例中，本文所提供的任何gRNA包括一个或多个化学修饰的核苷酸。先前已经描述了gRNA的化学修饰，并且合适的化学修饰包含对gRNA功能有益并且不会显著增加给定gRNA的任何不期望的特征(例如，脱靶效应)的任何修饰。合适的化学修饰包含，例如，那些使gRNA对核酸内切酶或核酸外切酶催化活性不太敏感的化学修饰，并且包含但不限于，硫代磷酸酯主链修饰、2'-O-Me修饰(例如，在3'和5'末端中的一个或两个处)、2'F修饰、用双环核苷酸cEt取代核糖糖，3'硫代PACE(MSP)修饰或其任何组合。基于本公开内容，另外的合适的gRNA修饰对本领域技术人员来说是显而易见的，并且此类合适的gRNA修饰包含但不限于，例如在以下中描述的那些：Rahdar等人,《美国国家科学院院刊(PNAS)》(2015)112(51)E7110-E7117和Hendel等人,《自然生物技术(Nat Biotechnol.)》(2015)；33(9):985–989，所述文献中的每一个通过全文引用的方式并入本文。
例如，本文所提供的gRNA可以包括一个或多个2'-O修饰的核苷酸，例如2'-O-甲基核苷酸。在一些实施例中，gRNA包括2'-O修饰的核苷酸，例如gRNA的5'端处的2'-O-甲基核苷酸。在一些实施例中，gRNA包括2'-O修饰的核苷酸，例如gRNA的3'端处的2'-O-甲基核苷酸。在一些实施例中，gRNA包括2'-O修饰的核苷酸，例如gRNA的5'端和3'端两者处的2'-O-甲基核苷酸。在一些实施例中，gRNA是2'-O修饰的，例如gRNA的5'端处的核苷酸、从gRNA的5'端起的第二核苷酸和从gRNA的5'端起的第三核苷酸处的2'-O-甲基修饰的。在一些实施例中，gRNA是2'-O修饰的，例如gRNA的3'端处的核苷酸、从gRNA的3'端起的第二核苷酸和从gRNA的3'端起的第三核苷酸处的2'-O-甲基修饰的。在一些实施例中，gRNA是2'-O修饰的，例如gRNA的5'端处的核苷酸、从gRNA的5'端起的第二核苷酸、从gRNA的5'端起的第三核苷酸、gRNA的3'端处的核苷酸、从gRNA的3'端起的第二核苷酸和从gRNA的3'端起的第三核苷酸处的2'-O-甲基修饰的。在一些实施例中，gRNA是2'-O修饰的，例如从gRNA的3'端起的第二核苷酸、从gRNA的3'端起的第三核苷酸和从gRNA的3'端起的第四核苷酸处的2'-O-甲基修饰的。在一些实施例中，gRNA的3'端处的核苷酸没有被化学修饰。在一些实施例中，gRNA的3'端的核苷酸不具有化学修饰的糖。在一些实施例中，gRNA是2'-O修饰的，例如gRNA的5'端处的核苷酸、从gRNA的5'端起的第二核苷酸、从gRNA的5'端起的第三核苷酸、从gRNA的3'端起的第二核苷酸、从gRNA的3'端起的第三核苷酸和从gRNA的3'端起的第四核苷酸处的2'-O-甲基修饰的。在一些实施例中，2'-O-甲基核苷酸包括与相邻核苷酸的磷酸酯键。在一些实施例中，2'-O-甲基核苷酸包括与相邻核苷酸的硫代磷酸酯键。在一些实施例中，2'-O-甲基核苷酸包括与相邻核苷酸的硫代PACE键。
在一些实施例中，本文所提供的gRNA可以包括一个或多个2'-O修饰的和3'磷酸修饰的核苷酸，例如3'硫代磷酸2'-O-甲酯核苷酸。在一些实施例中，gRNA包括2'-O修饰的和3'磷酸修饰的，例如gRNA的5'端处的3'硫代磷酸2'-O-甲酯核苷酸。在一些实施例中，gRNA包括2'-O修饰的和3'磷酸修饰的，例如gRNA的3'端处的3'硫代磷酸2'-O-甲酯核苷酸。在一些实施例中，gRNA包括2'-O修饰的和3'磷酸修饰的，例如gRNA的5'和3'端处的3'硫代磷酸2'-O-甲酯核苷酸。在一些实施例中，gRNA包括主链，其中一个或多个非桥接氧原子已被硫原子替换。在一些实施例中，gRNA是2'-O修饰的和3'磷酸修饰的，例如gRNA的5'端处的核苷酸、从gRNA的5'端起的第二核苷酸和从gRNA的5'端起的第三核苷酸处的3'硫代磷酸2'-O-甲酯修饰的。在一些实施例中，gRNA是2'-O修饰的和3'磷酸修饰的，例如gRNA的3'端处的核苷酸、从gRNA的3'端起的第二核苷酸和从gRNA的3'端起的第三核苷酸处的3'硫代磷酸2'-O-甲酯修饰的。在一些实施例中，gRNA是2'-O修饰的和3'磷酸修饰的，例如gRNA的5'端处的核苷酸、从gRNA的5'端起的第二核苷酸、从gRNA的5'端起的第三核苷酸、gRNA的3'端处的核苷酸、从gRNA的3'端起的第二核苷酸和从gRNA的3'端起的第三核苷酸处的3'硫代磷酸2'-O-甲酯修饰的。在一些实施例中，gRNA是2'-O修饰的和3'磷酸修饰的，例如从gRNA的3'端起的第二核苷酸、从gRNA的3'端起的第三核苷酸和从gRNA的3'端起的第四核苷酸处的3'硫代磷酸2'-O-甲酯修饰的。在一些实施例中，gRNA的3'端处的核苷酸没有被化学修饰。在一些实施例中，gRNA的3'端的核苷酸不具有化学修饰的糖。在一些实施例中，gRNA是2'-O修饰的和3'磷酸修饰的，例如gRNA的5'端处的核苷酸、从gRNA的5'端起的第二核苷酸、从gRNA的5'端起的第三核苷酸、从gRNA的3'端起的第二核苷酸、从gRNA的3'端起的第三核苷酸和从gRNA的3'端起的第四核苷酸处的3'硫代磷酸2'-O-甲酯修饰的。
在一些实施例中，本文所提供的gRNA可以包括一个或多个2'-O修饰的和3'磷酸修饰的，例如2'-O-甲基3'硫代PACE核苷酸。在一些实施例中，gRNA包括2'-O修饰的和3'磷酸修饰的，例如gRNA的5'端处的2'-O-甲基3'硫代PACE核苷酸。在一些实施例中，gRNA包括2'-O修饰的和3'磷酸修饰的，例如gRNA的3'端处的2'-O-甲基3'硫代PACE核苷酸。在一些实施例中，gRNA包括2'-O修饰的和3'磷酸修饰的，例如gRNA的5'和3'端处的2'-O-甲基3'硫代PACE核苷酸。在一些实施例中，gRNA包括主链，其中一个或多个非桥接氧原子已被硫原子替换，并且一个或多个非桥接氧原子已被乙酸酯基团替换。在一些实施例中，gRNA是2'-O修饰的和3'磷酸修饰的，例如gRNA的5'端处的核苷酸、从gRNA的5'端起的第二核苷酸和从gRNA的5'端起的第三核苷酸处的2'-O-甲基3'硫代PACE修饰的。在一些实施例中，gRNA是2'-O修饰的和3'磷酸修饰的，例如gRNA的3'端处的核苷酸、从gRNA的3'端起的第二核苷酸和从gRNA的3'端起的第三核苷酸处的2'-O-甲基3'硫代PACE修饰的。在一些实施例中，gRNA是2'-O修饰的和3'磷酸修饰的，例如gRNA的5'端处的核苷酸、从gRNA的5'端起的第二核苷酸、从gRNA的5'端起的第三核苷酸、gRNA的3'端处的核苷酸、从gRNA的3'端起的第二核苷酸和从gRNA的3'端起的第三核苷酸处的2'-O-甲基3'硫代PACE修饰的。在一些实施例中，gRNA是2'-O修饰的和3'磷酸修饰的，例如从gRNA的3'端起的第二核苷酸、从gRNA的3'端起的第三核苷酸和从gRNA的3'端起的第四核苷酸处的2'-O-甲基3'硫代PACE修饰的。在一些实施例中，gRNA的3'端处的核苷酸没有被化学修饰。在一些实施例中，gRNA的3'端的核苷酸不具有化学修饰的糖。在一些实施例中，gRNA是2'-O修饰的和3'磷酸修饰的，例如gRNA的5'端处的核苷酸、从gRNA的5'端起的第二核苷酸、从gRNA的5'端起的第三核苷酸、从gRNA的3'端起的第二核苷酸、从gRNA的3'端起的第三核苷酸和从gRNA的3'端起的第四核苷酸处的2'-O-甲基3'硫代PACE修饰的。
在一些实施例中，本文所提供的gRNA包括化学修饰的主链。在一些实施例中，gRNA包括硫代磷酸酯键。在一些实施例中，一个或多个非桥接氧原子已被硫原子替换。在一些实施例中，gRNA的5'端处的核苷酸、从gRNA的5'端起的第二核苷酸和从gRNA的5'端起的第三核苷酸各自包括硫代磷酸酯键。在一些实施例中，gRNA的3'端处的核苷酸、从gRNA的3'端起的第二核苷酸和从gRNA的3'端起的第三核苷酸各自包括硫代磷酸酯键。在一些实施例中，gRNA的5'端处的核苷酸、从gRNA的5'端起的第二核苷酸、从gRNA的5'端起的第三核苷酸、gRNA的3'端处的核苷酸、从gRNA的3'端起的第二核苷酸和从gRNA的3'端起的第三核苷酸各自包括硫代磷酸酯键。在一些实施例中，从gRNA的3'端起的第二核苷酸、从gRNA的3'端起的第三核苷酸和从gRNA的3'端起的第四核苷酸各自包括硫代磷酸酯键。在一些实施例中，gRNA的5'端处的核苷酸、从gRNA的5'端起的第二核苷酸、从5'端起的第三核苷酸、从gRNA的3'端起的第二核苷酸、从gRNA的3'端起的第三核苷酸和从gRNA的3'端起的第四核苷酸各自包括硫代磷酸酯键。
在一些实施例中，本文所提供的gRNA包括硫代PACE键。在一些实施例中，gRNA包括主链，其中一个或多个非桥接氧原子已被硫原子替换，并且一个或多个非桥接氧原子已被乙酸酯基团替换。在一些实施例中，gRNA的5'端处的核苷酸、从gRNA的5'端起的第二核苷酸和从gRNA的5'端起的第三核苷酸各自包括硫代PACE键。在一些实施例中，gRNA的3'端处的核苷酸、从gRNA的3'端起的第二核苷酸和从gRNA的3'端起的第三核苷酸各自包括硫代PACE键。在一些实施例中，gRNA的5'端处的核苷酸、从gRNA的5'端起的第二核苷酸、从gRNA的5'端起的第三核苷酸、gRNA的3'端处的核苷酸、从gRNA的3'端起的第二核苷酸和从gRNA的3'端起的第三核苷酸各自包括硫代PACE键。在一些实施例中，从gRNA的3'端起的第二核苷酸、从gRNA的3'端起的第三核苷酸和从gRNA的3'端起的第四核苷酸各自包括硫代PACE键。在一些实施例中，gRNA的5'端处的核苷酸、从gRNA的5'端起的第二核苷酸、从5'端起的第三核苷酸、从gRNA的3'端起的第二核苷酸、从gRNA的3'端起的第三核苷酸和从gRNA的3'端起的第四核苷酸各自包括硫代PACE键。
在一些实施例中，本文所描述的gRNA包括一个或多个2'-O-甲基-3'-硫代磷酸酯核苷酸，例如至少1个、2个、3个、4个、5个或6个2'-O-甲基-3'-硫代磷酸酯核苷酸。在一些实施例中，本文所描述的gRNA在三个末端位置和5'端中的一个或多个处和/或在三个末端位置和3'端中一个或更多个处包括经修饰的核苷酸(例如，2'-O-甲基-3'-硫代磷酸酯核苷酸)。在一些实施例中，gRNA可以包括一个或多个经修饰的核苷酸，例如，如PCT公开第WO2017/214460号、第WO2016/089433号和第WO2016/164356号中所描述的，所述公开通过全文引用的方式并入。
本文所提供的靶向CD34的gRNA可以以任何合适的方式递送到细胞。已经描述了用于递送CRISPR/Cas系统(例如，包括包含与RNA引导的核酸酶结合的gRNA的RNP)的各种合适的方法，并且示例性合适的方法包含但不限于将RNP电穿孔到细胞中，将编码Cas核酸酶和gRNA的mRNA电穿孔到细胞中、各种蛋白质或核酸转染方法，以及通过病毒载体，例如逆转录病毒(例如，慢病毒)载体递送编码RNA或DNA。本公开涵盖任何合适的递送方法，并且本公开在此方面不受限制。
本公开提供了许多CD34靶位点和对应的gRNA，其可用于将RNA引导的核酸酶靶向人CD34。下表1说明了人内源性CD34基因中可以被本文所描述gRNA结合的优选的靶结构域。在一些实施例中，表1中所示的人CD34的示例性靶序列用于Cas9核酸酶，例如SpCas9。
表1.提供了人CD34的示例性Cas9靶位点序列，作为可用于靶向此类位点的示例性gRNA靶向结构域序列。对于每个靶位点，第一序列表示DNA靶结构域序列，第二序列表示其反向补体，并且第三序列表示可以用于靶向相应的靶位点的gRNA的示例性靶向结构域序列。
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本公开提供了可用于将RNA引导的核酸酶靶向人CD34的示例性靶向CD34的gRNA。下表2说明了用于在gRNA中将Cas9核酸酶靶向人内源性CD34基因的优选的靶向结构域。在一些实施例中，表2中所示的人CD34的示例性靶序列用于Cas9核酸酶，例如SpCas9。
表2.提供了靶向人CD34的gRNA的示例性Cas9靶向结构域序列。
gRNA名称 靶向结构域序列
CD34-1 CAAAGCGCGGUCCAGCCCCG(SEQ ID NO:11)
CD34-2 CAAACUCAGCAAGCAAAGCG(SEQ ID NO:12)
CD34-3 GUGCAGGCUGGUACUUCCAA(SEQ ID NO:13)
CD34-4 CAUUGCCAUGUUGAGACACA(SEQ ID NO:14)
CD34-5 AUAAACUGAGGUUAUCACAG(SEQ ID NO:15)
CD34的代表性氨基酸序列由UniProtKB/Swiss-Prot登录号P28906-2提供，如下所示。
MLVRRGARAG PRMPRGWTAL CLLSLLPSGF MSLDNNGTAT PELPTQGTFS NVSTNVSYQETTTPSTLGST SLHPVSQHGN EATTNITETT VKFTSTSVIT SVYGNTNSSV QSQTSVISTV FTTPANVSTPETTLKPSLSP GNVSDLSTTS TSLATSPTKP YTSSSPILSD IKAEIKCSGI REVKLTQGIC LEQNKTSSCAEFKKDRGEGL ARVLCGEEQA DADAGAQVCS LLLAQSEVRP QCLLLVLANR TEISSKLQLM KKHQSDLKKLGILDFTEQDV ASHQSYSQKT LIALVTSGAL LAVLGITGYF LMNRRSWSPT GERLGEDPYY TENGGGQGYSSGPGTSPEAQ GKASVNRGAQ ENGTGQATSR NGHSARQHVV ADTEL(SEQ ID NO:16)
CD34的代表性DNA序列由NCBI参考序列第NM_001025109.2号提供，如下所示。
agtgtcttcc actcggtgcg tctctctagg agccgcgcgg gaaggatgct ggtccgcagg
ggcgcgcgcg cagggcccag gatgccgcgg ggctggaccg cgctttgctt gctgagtttg
ctgccttctg ggttcatgag tcttgacaac aacggtactg ctaccccaga gttacctacc
cagggaacat tttcaaatgt ttctacaaat gtatcctacc aagaaactac aacacctagt
acccttggaa gtaccagcct gcaccctgtg tctcaacatg gcaatgaggc cacaacaaac
atcacagaaa cgacagtcaa attcacatct acctctgtga taacctcagt ttatggaaac
acaaactctt ctgtccagtc acagacctct gtaatcagca cagtgttcac caccccagcc
aacgtttcaa ctccagagac aaccttgaag cctagcctgt cacctggaaa tgtttcagac
ctttcaacca ctagcactag ccttgcaaca tctcccacta aaccctatac atcatcttct
cctatcctaa gtgacatcaa ggcagaaatc aaatgttcag gcatcagaga agtgaaattg
actcagggca tctgcctgga gcaaaataag acctccagct gtgcggagtt taagaaggac
aggggagagg gcctggcccg agtgctgtgt ggggaggagc aggctgatgc tgatgctggg
gcccaggtat gctccctgct ccttgcccag tctgaggtga ggcctcagtg tctactgctg
gtcttggcca acagaacaga aatttccagc aaactccaac ttatgaaaaa gcaccaatct
gacctgaaaa agctggggat cctagatttc actgagcaag atgttgcaag ccaccagagc
tattcccaaa agaccctgat tgcactggtc acctcgggag ccctgctggc tgtcttgggc
atcactggct atttcctgat gaatcgccgc agctggagcc ccacaggaga aaggctgggc
gaagaccctt attacacgga aaacggtgga ggccagggct atagctcagg acctgggacc
tcccctgagg ctcagggaaa ggccagtgtg aaccgagggg ctcaggaaaa cgggaccggc
caggccacct ccagaaacgg ccattcagca agacaacacg tggtggctga taccgaattg
tgactcggct aggtggggca aggctgggca gtgtccgaga gagcacccct ctctgcatct
gaccacgtgc tacccccatg ctggaggtga catctcttac gcccaaccct tccccactgc
acacacctca gaggctgttc ttggggccct acaccttgag gaggggcagg taaactcctg
tcctttacac attcggctcc ctggagccag actctggtct tctttgggta aacgtgtgac
gggggaaagc caaggtctgg agaagctccc aggaacaatc gatggccttg cagcactcac
acaggacccc cttcccctac cccctcctct ctgccgcaat acaggaaccc ccaggggaaa
gatgagcttt tctaggctac aattttctcc caggaagctt tgatttttac cgtttcttcc
ctgtattttc tttctctact ttgaggaaac caaagtaacc ttttgcacct gctctcttgt
aatgatatag ccagaaaaac gtgttgcctt gaaccacttc cctcatctct cctccaagac
actgtggact tggtcaccag ctcctccctt gttctctaag ttccactgag ctccatgtgc
cccctctacc atttgcagag tcctgcacag ttttctggct ggagcctaga acaggcctcc
caagttttag gacaaacagc tcagttctag tctctctggg gccacacaga aactcttttt
gggctccttt ttctccctct ggatcaaagt aggcaggacc atgggaccag gtcttggagc
tgagcctctc acctgtactc ttccgaaaaa tcctcttcct ctgaggctgg atcctagcct
tatcctctga tctccatggc ttcctcctcc ctcctgccga ctcctgggtt gagctgttgc
ctcagtcccc caacagatgc ttttctgtct ctgcctccct caccctgagc cccttccttg
ctctgcaccc ccatatggtc atagcccaga tcagctccta acccttatca ccagctgcct
cttctgtggg tgacccaggt ccttgtttgc tgttgatttc tttccagagg ggttgagcag
ggatcctggt ttcaatgacg gttggaaata gaaatttcca gagaagagag tattgggtag
atattttttc tgaatacaaa gtgatgtgtt taaatactgc aattaaagtg atactgaaac
acatctgtta tgtgactctg tcttagctgg gtgtgtctgc atgcaagagt gacaccctcc
attagaccta gctagactgt gcagtgatgt ggtggggagg accagccagg gaagagggag
cacctcagca gacacaggca ccagccagga tgctaaggac ctttagccaa gtctgccaac
tattctcctc catggggaga ggaaacatcc atttccagtg gtagaaaggc agacccgaat
gtaccaggga gcttccaaat ggagggtggt atgttgggtt cttaggagct gtacccttca
tgaacaccct tctgagaaga ggagcatgct gatcactgct gcaaaatatg caaaacaaag
ggaaggggca atgtcctgtg caccctttat tatcaggcca cccccctccc cagcccccca
ggtcagagta gacacagtga aggactatgt ggggactgtt gttctagaga cctggcagcc
aactcaggga gggggctggt ttccaccctc aagattaaga cagcagccta attaaaaaaa
aaatctgtaa gcatgtacct ccccccagct tccaaaacaa cccccacccc acccctacca
ggccatagga agttggggag ggagtgctga ggagctccag gaaacactcc caagtgtgtc
gacagtggca gaggcagttg gggccaaaca aaggttgatt cttccattct tatctccata
aagccagacc tttcccttca gcactcctcc acccccatct ccttcttgct tttctccaac
tcctctaatc ataggttctt ccctaggaca gaggggaggc gaaatgatga ggttcagagt
cttccctcaa aggcgatggc tgccttgagg gttggagcaa aggatgatga gcaaaagacg
atggtaatca gtagggaagt ccagcccact tgcatctagt tgcacatctt gccttgagag
taatccagtg agggtctgtc ccagctagga catcaagtag gaggggtggg ttcagggttc
agattcctag gaaatatggg aggagaggaa aaggcaactt ggatgcacct ccagcttcag
gcctagcaac ctgcaatgca tctcaccctg agtttgctgg aatgtgtatg tatgctttgg
gaggaagggc tgtgtgtgta ttgcggggtg gggtggggca gctggttccc tctgacagct
ggacagcttg ccctgaagaa tttgcctgct ttctggaaaa atccaacttt cccaccgtgg
gcctgagcgt cctggtacag caatggcgcc acctgctggc cttattgagg tcctactgct
cagcctcagc tcaatcgcct ccatgttggg cttctctccc tggctgcccc accctctagt
ccaatttctc ttgtacacaa agctcatata actatagaac gtcactgttg aagagaactt
taaagataca tttaattaaa ctcccttatg gtatagttaa agacaaacta aggctcagag
aagggaggtg gcttgcccaa tcacccagaa ttccaaagtc ctgaatctgt agttttccct
tccatcatat catcctactc ttctgccgag tcctccgtgt tactccagtt ggatgtcatg
aagccagtgt ggcagtgtga agataggttt gggacttcac ttctggagca tttcatcaac
ataagctatc ctaggcctgg ccagccaagc aggtcctgga ggagccccag gacaaagatc
acaggaggcc atgaggttcg gcttcttcgg cgcccacagt gagcccagga aaattagctg
tagggtatta cactgttgac tatggagagc atatctggaa ttatcttcag ccagattttc
atctgaatgg ataaatggga ataccatcta agtccagata aatagatcac ttccatctca
tcccttctag gtagattaat cccacacttc ctcttcacac aaaaccagta ataggtcatc
gattttgtgc aacaggatgc tgcttctctt cctaaagccc ccatcgaaga ggcttccagc
caccattcaa tcattcatca agtcttatga tgtgccagac actgcgcgaa atgtgccaga
acatctgtta tgtgccagac actgttcttg agactgggga tacagcaaac actcatgaag
cttataattc tagcagaaga ggacagtaaa caatgtcatc tcagtaagta tatacatgtg
ttttcaggat tgagagctat gaaaaacata aaatatattg agaataatgg ttggtatttt
acatatggtg gttactttta gaaaaataac agtggagagc acagcttcac ttgaatgaag
tggagaagca ggttgtatgc caagctggga gagattatcc cacacagggg aaaggacaag
tgcaaagccc tatgatgaaa agctgccaag tgcagaaagc ctcagatggc agggggcaag
atggccatga ggttgtgtca gtgagtgggg gtggggagag gcaggaggtc agactacatg
gggccttttt agttgtagat tgggaagcca ctggagggtt ttgagcagag aagtcatatc
atctgcttta tgttttaaaa ggatcatgct ggctgctgag tagagaatag aggttgaggg
ataagaaagt agaaggagac cgtagcaaga agaacgatca tggctgggag caggtgatca
tattggcagt gatgagatca agcagaattc aaaaagtggt ttcaaagtag aggtaacagg
acttgctcag tctatttatt tcttcaaata ataatcatat ttacaatgat agtagctaac
agtttttgag tgcttactgt atgaaaattg agatatggtg ccaatattta aatagcatat
tttacttaac attcacagaa accctgtgaa gtaggttcta ttatctcaga aaaagaaact
gaaactcaga gaataacaag ggactgtgtt acgtgcacag tggcagaggc aaagatgaat
aggatgtgag tttatttgaa ccccaaatgt ttaaatcttg gggataatac aacacacatt
taaacaaaga agcaagaaaa aaaatgcaca acagaaagtg agaaataaca cgaggaaaga
ctaaatgaag tgctttgtat ctagatgtgg gcaggaccct ttccagctga gaagatctga
gactgggtca tgaacaggtg gtttctgagt gggtcctgta aaaatgaata cgattttgat
gatagtaatg agtaaggaca tttgagactg atagaagagt acatacaata tgtagtgatg
gggaaagata aggtactgtc aaaggacaat gtgttttctg gtatgacaga gaagtagaat
gtgttaaggg aagccgagta ccagaaagat ccgggtgtca cagtttgtgt agggtgttta
aagctaaacc acagagttta attttatcca atagaagagg agccacagaa gagtttccat
ttattcatta atttattcat ttattcaaaa aatatttgag tgcttattat aagccaggta
ctatgccagg cacctgggat aagacatagt cccttctgtc aagtctttac attgggtgga
tgtgggaggg acagatgaca gaacaatatg cattgagtgt aagtgctatg gtataggaag
ctctgagtgg gaggggcatg gaagccgtgg aagaccatgg aaggcttccc aggagaagtg
acgtctggac tgatcctttg gtcaagcagg agttaaagag gagaaaagga gagatatggg
tgttcccgag agaggaagaa gccttgtccc aggagcaaag tgagggtgat tgttccagaa
atgtgagtga ttcttttaag gctcaagcaa agcatgtgat tcttctttat accttctatt
tctttgctga gtgtttctgt tcttttgttt caagcatgct gcaattgctc attaaagcat
gtttatgatg gctgtctgtt ttaaaattct tgtcagatgg tttcaacatc tttatcatct
caatgttggc atctgttaat ggttttttct caatcaaatt gagattttcc tggttcttgg
tattaccagt gattttaatt gcatctggaa atttgggatt tatgttgaaa gactggatct
tattgaaaga ttctgtttag cacccctcct ttgataccac actggtgggt ccaggttccc
cattcagctg ttgacacctt cagggcagag aggtgggatg gggtgaaggg ggtacctcat
tattgctggc ccaggttaga agttcaggct tcccagtaga tctctgctga taccaccctg
gtgccatgtc attccttgag tccaaaagtc cctcccaatt ctgccttctt ctctctacat
atcggagtct ccctatgttt gacttatata taatgtccag ggtttttaga gttagttaac
aggaggcata agaaaaagtg tgtccactcc atcttgtctg gaactggaagttcaagtcgaatataagaga gaggagagga aattacaagc catgagactg gagagttagg caggttctacaccagctatt ctcaaagccc tcttacactc ttaaaaattt agaacttcaa agagcttttg attttgaaagttacatctat caattattac tgtttcaaaa attaaaattg agaaaatttt atttattaat ttgtttaaaaataacaataa ttattcaatt acatgataat gtaagtaatg cttttcttaa tgaaaaataa ttatattttccaaaacaaaa acaattagga aaaagagtgt cattgtttta gactttggta aatctctcta atatctggctgaagagaaga atgctgattc tttttttttt tttttttttt tgagacggag tctcgctctg tcacccaggctggagtgtag tggtgtgatc tcggctcact gcaagctctg cctcccgggt tcacgccatt ctcctgcctcagcctcccaa gtagctggga ctacaggcac ccgccaccac gcccggctaa tttttttgta tttttagtagagatggggtt tcaccgtgtt agccaggctg gtctcgatct cctgacctca tgatccaccc acctcagcctcccaaagcgc tgggattaca ggtgtgagac accgcgccca gcccccgaat gctgattctt ttatctgcttctgtattcaa tctgttgtga tatgatgggt agcctctgaa acactccact gtatacttgt gaaagaatgaatgtgaaaaa ggaaaataga tttgtagtat tattattcaa attgttttga cctcagagac cacttggaaatgttttaggg aacccccaga ggaccttgga tcatgctttg agaaccgcgg ctctagatat gttactatttcagtagcatc taagtacatg tggctgctga gcacttgtaa tgtggctagt gcaaatgaga gacaggacttccagctatat gtaatttaat aaactcaaat ttaaaaactg gaacctcata aaatgttttg ttgttgttgttaaacatgac cttatagttt tggtaggaa(SEQ ID NO:17)
CD34的另外的代表性DNA序列由NCBI参考序列第NM_001773.3号提供，如下所示。
agtgtcttcc actcggtgcg tctctctagg agccgcgcgg gaaggatgct ggtccgcaggggcgcgcgcg cagggcccag gatgccgcgg ggctggaccg cgctttgctt gctgagtttg ctgccttctgggttcatgag tcttgacaac aacggtactg ctaccccaga gttacctacc cagggaacat tttcaaatgtttctacaaat gtatcctacc aagaaactac aacacctagt acccttggaa gtaccagcct gcaccctgtgtctcaacatg gcaatgaggc cacaacaaac atcacagaaa cgacagtcaa attcacatct acctctgtgataacctcagt ttatggaaac acaaactctt ctgtccagtc acagacctct gtaatcagca cagtgttcaccaccccagcc aacgtttcaa ctccagagac aaccttgaag cctagcctgt cacctggaaa tgtttcagacctttcaacca ctagcactag ccttgcaaca tctcccacta aaccctatac atcatcttct cctatcctaagtgacatcaa ggcagaaatc aaatgttcag gcatcagaga agtgaaattg actcagggca tctgcctggagcaaaataag acctccagct gtgcggagtt taagaaggac aggggagagg gcctggcccg agtgctgtgtggggaggagc aggctgatgc tgatgctggg gcccaggtat gctccctgct ccttgcccag tctgaggtgaggcctcagtg tctactgctg gtcttggcca acagaacaga aatttccagc aaactccaac ttatgaaaaagcaccaatct gacctgaaaa agctggggat cctagatttc actgagcaag atgttgcaag ccaccagagctattcccaaa agaccctgat tgcactggtc acctcgggag ccctgctggc tgtcttgggc atcactggctatttcctgat gaatcgccgc agctggagcc ccacaggaga aaggctggag ctggaaccct gaccactcttcaggaagaaa ggagtctgca catgcagctg caccctccct ccgatccttc ctcccacctc cccctcccccttctcccacc cctgccccca cttcctgttt gggcccctct cccatccagt gtctcacagc cctgcttaccagataatgct actttattta tacactgtct agggcgaaga cccttattac acggaaaacg gtggaggccagggctatagc tcaggacctg ggacctcccc tgaggctcag ggaaaggcca gtgtgaaccg aggggctcaggaaaacggga ccggccaggc cacctccaga aacggccatt cagcaagaca acacgtggtg gctgataccgaattgtgact cggctaggtg gggcaaggct gggcagtgtc cgagagagca cccctctctg catctgaccacgtgctaccc ccatgctgga ggtgacatct cttacgccca acccttcccc actgcacaca cctcagaggctgttcttggg gccctacacc ttgaggaggg gcaggtaaac tcctgtcctt tacacattcg gctccctggagccagactct ggtcttcttt gggtaaacgt gtgacggggg aaagccaagg tctggagaag ctcccaggaacaatcgatgg ccttgcagca ctcacacagg acccccttcc cctaccccct cctctctgcc gcaatacaggaacccccagg ggaaagatga gcttttctag gctacaattt tctcccagga agctttgatt tttaccgtttcttccctgta ttttctttct ctactttgag gaaaccaaag taaccttttg cacctgctct cttgtaatgatatagccaga aaaacgtgtt gccttgaacc acttccctca tctctcctcc aagacactgt ggacttggtcaccagctcct cccttgttct ctaagttcca ctgagctcca tgtgccccct ctaccatttg cagagtcctgcacagttttc tggctggagc ctagaacagg cctcccaagt tttaggacaa acagctcagt tctagtctctctggggccacacagaaactc tttttgggct cctttttctc cctctggatc aaagtaggcaggaccatgggaccaggtctt ggagctgagc ctctcacctg tactcttccg aaaaatcctcttcctctgaggctggatcct agccttatcc tctgatctcc atggcttcct cctccctcctgccgactcctgggttgagct gttgcctcag tcccccaaca gatgcttttc tgtctctgcctccctcaccctgagcccctt ccttgctctg cacccccata tggtcatagc ccagatcagctcctaacccttatcaccagc tgcctcttct gtgggtgacc caggtccttg tttgctgttgatttctttccagaggggttg agcagggatc ctggtttcaa tgacggttgg aaatagaaatttccagagaagagagtattg ggtagatatt ttttctgaat acaaagtgat gtgtttaaat actgcaatta
aagtgatact gaaacaca(SEQ ID NO:18)
本公开的一些方面提供了基因工程化细胞，其包括在其基因组中的导致CD34表达丧失，或CD34的变体形式的表达的修饰，所述变体形式不被靶向CD34的免疫治疗剂识别。在一些实施例中，细胞的基因组中的修饰是编码CD34的基因组序列中的突变。在一些实施例中，修饰通过基因组编辑来实现，例如，使用靶向本文所提供的CD34靶位点或包括本文所提供的靶向结构域序列的Cas核酸酶和gRNA。
虽然本文所提供的组合物、方法、策略和治疗模式可以应用于任何细胞或细胞类型，但本文更详细地描述了根据本发明的方面特别适合CD34基因中基因组修饰的一些示例性细胞和细胞类型。然而，本领域技术人员将理解，提供此类实例是为了说明一些特定的实施例，并且基于本公开，另外的合适的细胞和细胞类型对于本领域的技术人员将是显而易见的，本公开在此方面不受限制。
本公开的一些方面提供了基因工程化造血细胞，其包括在其基因组中的导致CD34表达丧失的修饰，或CD34的变体形式的表达，所述变体形式不被靶向CD34的免疫治疗剂识别。在一些实施例中，与相同细胞类型但不包括基因组修饰的造血细胞(例如，HSC)相比，在其基因组中包括修饰的基因工程化细胞导致CD34的细胞表面表达减少和/或靶向CD34的免疫治疗剂的结合减少。在一些实施例中，造血细胞是造血干细胞(HSC)。在一些实施例中，造血细胞是造血祖细胞(HPC)。在一些实施例中，造血细胞是造血干细胞或祖细胞。如本文所使用的，HSC是指能够自我更新并可以产生和/或重建造血系统的所有谱系的细胞。在一些实施例中，HSC可以移植到受试者体内，其中HSC扩增并可以产生和/或重建造血系统的所有谱系。在一些实施例中，HSC表达一种或多种细胞表面标志物，例如CD34。在一些实施例中，本文所描述的基因工程化细胞(例如，基因工程化HSC)不表达通常与HSC鉴定或分离相关的一种或多种细胞表面标志物，表达减少量的细胞表面标志物，或表达不被靶向细胞表面标志物的免疫治疗剂识别的变体细胞表面标志物，但是能够自我更新并可以产生和/或重建造血系统的所有谱系。
在一些实施例中，使用如本文所描述的靶向人CD34的核酸酶和/或gRNA产生造血细胞(例如，HSC或HPC)，所述造血细胞在其基因组中包括导致CD34表达丧失，或不被靶向CD34的免疫治疗剂识别的CD34的变体形式的表达的修饰。应理解，此类细胞可以通过使细胞与核酸酶和/或gRNA接触来产生，或所述细胞可以是与核酸酶和/或gRNA接触的细胞的子细胞。在一些实施例中，本文所描述的细胞(例如，基因工程化HSC或HPC)能够填充HSC或HPC小生境和/或重建受试者的造血系统。在一些实施例中，本文所描述的细胞(例如，HSC或HPC)能够在人受试者中移植一种或多种(例如，全部)，产生髓系谱系细胞，以及产生和淋巴系细胞。在一些优选实施例中，本文所提供的基因工程化造血细胞或其后代可以分化为所有血细胞谱系，优选地与相同细胞类型的造血细胞相比没有任何分化偏向，但不包括导致CD34表达丧失，或不被靶向CD34的免疫治疗剂识别的CD34的变体形式的表达的基因组修饰。
在一些实施例中，本文所提供的基因工程化细胞仅包括一种基因组修饰，例如导致CD34表达丧失，或不被靶向CD34的免疫治疗剂识别的CD34的变体形式的表达的基因组修饰。应理解，本文所提供的基因编辑方法可以导致靶基因的一个或两个等位基因中的基因组修饰。在一些实施例中，在给定遗传基因座的两个等位基因中包括基因组修饰的基因工程化细胞是优选的。
在一些实施例中，本文所提供的基因工程化细胞包括两种或多种基因组修饰，例如，除了导致CD34表达丧失，或不被靶向CD34的免疫治疗剂识别的CD34的变体形式的表达的基因组修饰外的一种或多种基因组修饰。
在一些实施例中，本文所提供的基因工程化细胞包括导致CD34表达丧失，或不被靶向CD34的免疫治疗剂识别的CD34的变体形式的表达的基因组修饰，并且进一步包括编码嵌合抗原受体的表达构建体，例如以编码整合在细胞的基因组中的CAR的表达构建体的形式。在一些实施例中，CAR包括与CD34结合的结合结构域，例如抗体片段。
本公开的一些方面提供了基因工程化免疫效应子细胞，其包括在其基因组中的导致CD34表达丧失的修饰，或CD34的变体形式的表达，所述变体形式不被靶向CD34的免疫治疗剂识别。在一些实施例中，免疫效应子细胞是淋巴细胞。在一些实施例中，免疫效应子细胞是T淋巴细胞。在一些实施例中，T淋巴细胞是α/βT淋巴细胞。在一些实施例中，T淋巴细胞是γ/δT淋巴细胞。在一些实施例中，免疫效应子细胞是自然杀伤T(NKT)细胞。在一些实施例中，免疫效应子细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施例中，免疫效应子细胞不表达内源性转基因，例如转基因蛋白。在一些实施例中，所述免疫效应子细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，免疫效应子细胞表达靶向CD34的CAR。在一些实施例中，免疫效应子细胞不表达靶向CD34的CAR。
在一些实施例中，本文所提供的基因工程化细胞包括导致CD34表达丧失，或不被靶向CD34的免疫治疗剂识别的CD34的变体形式的表达的基因组修饰，并且不包括编码外源蛋白的表达构建体，例如不包括编码CAR的表达构建体。
在一些实施例中，本文所提供的基因工程化细胞基本上不表达CD34蛋白，例如不表达可以通过合适的方法(如免疫染色方法)测量的CD34蛋白。在一些实施例中，本文所提供的基因工程化细胞基本上不表达野生型CD34蛋白，但表达突变体CD34蛋白变体，例如不被靶向CD34的免疫治疗剂识别的变体，例如CAR-T细胞治疗剂，或抗CD34抗体、抗体片段或抗体-药物缀合物(ADC)。
在一些实施例中，本文所提供的基因工程化细胞是造血细胞，例如造血干细胞。造血细胞通常以多能性、自我更新特性和/或产生造血系统细胞的能力为特征。在一些实施例中，造血干细胞(HSC)能够产生髓系和淋巴系祖细胞，其分别进一步产生髓系细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、红细胞、血小板等)和淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞、NK细胞)。在一些实施例中，HSC的特征在于细胞表面标志物CD34(例如，CD34+)的表达。在一些实施例中，CD34可以用于鉴定和/或分离HSC。在一些实施例中，一种或多种细胞表面标志物(例如，CD34)的缺失与对细胞谱系的定型相关。在一些实施例中，本文所描述的基因工程化细胞(例如，基因工程化HSC)不表达CD34、以降低的水平表达CD34或表达CD34变体(例如，不被靶向CD34的免疫治疗剂识别)。在一些此类实施例中，例如在其中基因工程化HSC以CD34的表达完全丧失为特征的实施例中，基因工程化细胞不能通过CD34的表达被鉴定或分离为HSC。在一些实施例中，基因工程化的HSC不表达CD34、以降低的水平表达CD34或表达CD34变体(例如，不被靶向CD34的免疫治疗剂识别)，但仍然是能够自我更新的HSC。
在一些实施例中，本文所公开的基因工程化HSC，例如不表达CD34、以降低的水平表达CD34或表达CD34变体的HSC不能通过CD34的表达被鉴定或分离为HSC，但仍然可以通过例如HSC的其它特征被鉴定为HSC。例如，在一些实施例中，如本文所公开的基因工程化HSC，例如不表达CD34、以降低的水平表达CD34或表达CD34变体的HSC可以通过其CD34启动子活性的状态或其基因组中CD34启动子的表观遗传状态来鉴定为HSC，例如通过由内源性CD34启动子驱动的异源报告构建体，或通过CD34启动子甲基化状态(或其它合适的表观遗传标志物)。在一些实施例中，如本文所公开的基因工程化HSC，例如不表达CD34、以降低的水平表达CD34或表达CD34变体的HSC可以通过其其它HSC标志物的表达谱来鉴定为HSC，例如由于此类表达谱与未编辑的HSC的表达谱匹配或非常相似。在一些实施例中，如本文所公开的基因工程化HSC，例如不表达CD34、以降低的水平表达CD34或表达CD34变体的HSC可以通过其移植到受体受试者(例如，有需要的人受试者)中并重新构成所有造血细胞谱系的能力来鉴定为HSC。
在一些实施例中，本文所描述的基因工程化细胞的群体包括多个基因工程化造血干细胞。在一些实施例中，本文所描述的基因工程化细胞的群体包括多个基因工程化造血祖细胞。在一些实施例中，本文所描述的基因工程化细胞群体包括多个基因工程化造血干细胞和多个基因工程化造血祖细胞。
在一些实施例中，基因工程化的HSC从受试者，如人受试者获得。获得HSC的方法在例如PCT申请第US2016/057339号中进行了描述，所述申请通过全文引用的方式并入本文。在一些实施例中，HSC是外周血HSC。在一些实施例中，哺乳动物受试者是非人灵长类动物、啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)、牛、猪、马或家畜。在一些实施例中，HSC是从人受试者获得的，如患有造血系统恶性肿瘤的人受试者。在一些实施例中，HSC是从健康供体获得的。在一些实施例中，HSC是从随后将被施用表达嵌合受体的免疫细胞的受试者获得的。向获得细胞的同一受试者施用的HSC被称为自体细胞，而从不是将要施用细胞的受试者获得的HSC则被称为同种异体细胞。
在一些实施例中，基因工程化细胞的群体是细胞的异质性群体，例如含有不同CD34突变的基因工程化细胞的异质性群体。在一些实施例中，基因工程化细胞的群体中编码CD34的基因的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的拷贝包括通过本文所描述的基因组编辑方法，例如通过使用本文所提供的gRNA的CRISPR/Cas系统所实现的突变。例如，基因工程化细胞的群体可以包括多个不同的CD34突变，并且所述多个中的每个突变可以贡献具有突变的细胞的群体中CD34拷贝的百分比。
在一些实施例中，将CD34在基因工程化造血细胞(例如，HSC)上的表达与CD34在天然存在的造血细胞(例如，野生型对应物)，例如天然存在的HSC上的表达进行比较。在一些实施例中，基因工程化导致与在天然存在的造血细胞(例如，野生型对应物)上的CD34的表达相比，CD34的表达水平降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。例如，在一些实施例中，与天然存在的造血细胞(例如，野生型对应物)相比，基因工程化造血细胞表达少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％或少于1％的CD34。
在一些实施例中，如本文所描述的基因工程化，例如使用如本文所描述靶向CD34的gRNA导致与天然存在的造血细胞(例如，野生型对应物)上野生型CD34的水平的表达相比，野生型CD34的表达水平降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或至少99％。例如，在一些实施例中，与天然存在的造血细胞(例如，野生型对应物)相比，基因工程化造血细胞表达少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％或少于1％的CD34。
在一些实施例中，如本文所描述的基因工程化，例如使用如本文所描述的靶向CD34的gRNA导致与合适的对照(例如，一个细胞或多个细胞)相比，野生型谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD34)的表达水平降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施例中，合适的对照包括在来自同一受试者的多个非工程化细胞中测量或预期的野生型谱系特异性细胞表面抗原的水平。在一些实施例中，合适的对照包括在来自健康受试者的多个细胞中测量的或预期的野生型谱系特异性细胞表面抗原的水平。在一些实施例中，合适的对照包括在来自健康个体池(例如，10个、20个、50个或100个个体)的细胞群体中测量的或预期的野生型谱系特异性细胞表面抗原的水平。在一些实施例中，合适的对照包括在需要本文所描述的治疗(例如，抗CD34疗法，例如其中所述受试者患有癌症，其中癌症的细胞表达CD34)的受试者中测量的或预期的野生型谱系特异性细胞表面抗原的水平。
在一些实施例中，本文所描述的基因工程细胞的方法包括提供野生型细胞，例如野生型造血干细胞或祖细胞的步骤。在一些实施例中，威利型细胞是未编辑的细胞，所述细胞包括(例如，表达)编码CD34的基因的两个功能拷贝。在一些实施例中，细胞包括根据SEQID NO:113的CD34基因序列。在一些实施例中，细胞包括编码在SEQ ID NO:17或18中编码的CD34蛋白的CD34基因序列，例如CD34基因序列可以包括相对于SEQ ID NO:17或18的一个或多个沉默突变。在一些实施例中，所述方法中使用的细胞是天然存在的细胞或非工程化细胞。在一些实施例中，野生型细胞表达CD34或产生更分化的细胞，所述更分化的细胞以与表达CD34的细胞系相当的水平(或在其90％至110％、80％至120％、70％至130％、60％至140％或50％至150％内)表达CD34。
在一些实施例中，野生型细胞与结合CD34的抗体(例如，抗CD34抗体)结合，或产生更分化的细胞，所述更分化的细胞以与抗体与表达CD34的细胞系(例如，L1236、L428、KM-H2和L591)的结合相当的水平(或在其90％至110％、80％至120％、70％至130％、60％至140％或50％至150％内)与此类抗体结合。抗体结合可以通过例如流式细胞术或免疫组织化学来测量。
在一些实施例中，本文所提供的CD34编辑的细胞是CD34编辑的造血干细胞(HSC)。在一些实施例中，此类CD34编辑的造血干细胞在功能上等同于未编辑的(例如，天然存在的)HSC，例如因为其能够长期移植受体，例如在临床环境中，分化为所有造血谱系，并且重建受体的造血系统，例如造血干细胞移植后。在一些实施例中，本文所提供的CD34编辑的HSC表达HSC的细胞表面标志物特征，CD34除外。本文提供了与造血干细胞相关的一些合适的细胞表面标志物，并且基于本公开，与造血干细胞相关的其它合适的表面标志物对本领域技术人员来说是显而易见的。例如，合适的HSC标志物包含《BD生物科学人类和小鼠CD标志物手册(BD Biosciences Human and Mouse CD Marker Handbook)》中公开的那些标志物，可在www.bd.com/documents/bd-legacy/catalogue/biosciences/DS_Human-Mouse-CD-Maker-Biosciences_CT_DE.pdf上访问，上次访问时间为2021年12月30日。其它合适的HSC标志物包含例如在Tomellini等人,《细胞报告(Cell Reports)》2019 28(4):1063-1073(PMID:31340144DOI:10.1016/j.celrep.2019.06.084)中公开的那些，所述文献中每一个的全部内容通过引用并入本文。一些示例性合适的HSC标志物包含但不限于CD49c、CD71、CD90、CD117、CD135、CD243、CD292、CDw293、CD318、CD325、CD349、CD201、CD228和CD309。在一些实施例中，合适的HSC表面标志物包含不存在分化的细胞特征的表面标志物。例如，在一些实施例中，如本文所提供的CD34编辑的HSC，例如功能上与未编辑的(例如，天然存在的)HSC不可区分的CD34编辑的HSC对CD34(CD34-)是阴性的，并且表达一种或多种具有天然存在的HSC特征或通常由其表达的表面标志物，例如，能够长期移植到合适受体中的天然存在的HSC。在一些实施例中，如本文所提供的此类CD34编辑的HSC是CD34-并且表达CD90(是CD90+)，例如，如通过免疫染色或任何其它合适的方法确定的。在一些实施例中，如本文所提供的此类CD34编辑的HSC对CD34(CD34-)是阴性的，并且是CD71+。在一些实施例中，如本文所提供的此类CD34编辑的HSC对CD34(CD34-)是阴性的，并且是CD117+。在一些实施例中，如本文所提供的此类CD34编辑的HSC对CD34(CD34-)是阴性的，并且是CD135+。在一些实施例中，如本文所提供的此类CD34编辑的HSC对CD34(CD34-)是阴性的，并且是CD243+。在一些实施例中，如本文所提供的此类CD34编辑的HSC对CD34(CD34-)是阴性的，并且是CD292+。在一些实施例中，如本文所提供的此类CD34编辑的HSC对CD34(CD34-)是阴性的，并且是CDw293+。在一些实施例中，如本文所提供的此类CD34编辑的HSC对CD34(CD34-)是阴性的，并且是CD318+。在一些实施例中，如本文所提供的此类CD34编辑的HSC对CD34(CD34-)是阴性的，并且是CD325+。在一些实施例中，如本文所提供的此类CD34编辑的HSC对CD34(CD34-)是阴性的，并且是CD349+。在一些实施例中，如本文所提供的此类CD34编辑的HSC对CD34(CD34-)是阴性的，并且是CD201+。在一些实施例中，如本文所提供的此类CD34编辑的HSC对CD34(CD34-)是阴性的，并且是CD228+。在一些实施例中，如本文所提供的此类CD34编辑的HSC对CD34(CD34-)是阴性的，并且是CD309+。在一些实施例中，如本文所提供的此类CD34编辑的HSC对CD34(CD34-)是阴性的，并且是CD71+。在一些实施例中，如本文所提供的此类CD34编辑的HSC对CD34(CD34-)是阴性的，并且是CD49c+。在一些实施例中，如本文所提供的此类CD34编辑的HSC对CD34(CD34-)是阴性的，并且是CD201+。在一些实施例中，如本文所提供的此类CD34编辑的HSC对CD34(CD34-)是阴性的，并且对与分化的造血细胞(lin-)相关的任何谱系标志物是阴性的。在一些实施例中，谱系标志物包含CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123或CD235a，或这些标志物中的两种或更多种的任何组合。因此，在一些实施例中，如本文所提供的此类CD34编辑的HSC对CD34(CD34-)是阴性的，并且对CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123或CD235a或这些标志物中的两种或更多种的任何组合是阴性的。在一些实施例中，如本文所提供的此类CD34编辑的HSC对CD34(CD34-)是阴性的，并且是CD45RA-。在一些实施例中，如本文所提供的此类CD34编辑的HSC满足上文提供的两个或更多个标准的组合。例如，在一些实施例中，此类CD34编辑的HSCS是CD34-、CD90+和CD71+。在一些实施例中，此类CD34编辑的HSC是CD34-、CD90+、CD71+和lin-。在一些实施例中，此类CD34编辑的HSC是CD34-、CD90+、CD45RA-。在一些实施例中，此类CD34编辑的HSC是CD34-、CD90+、CD45RA-和CD201+。在一些实施例中，此类CD34编辑的HSC是CD34-、CD90+、CD45RA-和CD49c+；在一些实施例中，此类CD34编辑的HSCCD34-、CD90+、CD45RA-、CD201+和CD49c+。在一些实施例中，此类CD34编辑的HSC CD34-、CD90+、CD45RA-、CD201+、CD49c+和lin-。在一些实施例中，所述基因工程化造血干细胞在其细胞表面上不表达CD34，并且表达CD90、CD201和CD49c。在一些实施例中，基因工程化造血干细胞在其细胞表面上不表达CD34，表达CD90、CD201和CD49c，并且不表达CD45c。在一些实施例中，所述基因工程化造血干细胞在其细胞表面上不表达CD34，并且表达CD90、CD201和CD49c中的一种或多种，并且对以下呈阴性：CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD45RA-、CD56、CD123和CD235a。
在一些实施例中，本文所提供的CD34编辑的HSC包括编码CD34的基因中的基因编辑，所述基因编辑导致编辑的基因不编码CD34基因产物，例如CD34蛋白，所述蛋白在CD34编辑的HSC的表面上表达，或导致编码不能被CD34靶向的抗体结合的CD34蛋白的编辑的基因(例如，在被CD34靶向的抗体结合的表位中具有修饰)。在一些实施例中，CD34基因编辑包括INDEL，其由编码CD34的基因中的双链切割的NHEJ介导的修复产生，例如由RNA引导的核酸酶产生，这又导致由CD34编码的基因产物的提前终止并因此被截短，或以其它方式在不编码CD34基因产物(例如，CD34蛋白)的编辑的CD34基因中产生，其在CD34编辑的HSC的表面上表达，或导致编码不能被CD34靶向的抗体结合的CD34蛋白的编辑的基因(例如，在被CD34靶向的抗体结合的表位中具有修饰)。在一些实施例中，CD34基因编辑包括单核苷酸改变，例如，由碱基编辑或引物编辑引起，或由编码CD34的基因中的双链切割的HDR介导的修复引起，这又导致由CD34编码的基因产物的提前终止并因此被截短，或以其它方式在不编码CD34基因产物(例如，CD34蛋白)的编辑的基因中产生，其在CD34编辑的HSC的表面上表达，或导致编码不能被CD34靶向的抗体结合的CD34蛋白的编辑的基因(例如，在被CD34靶向的抗体结合的表位中具有修饰)。在一些实施例中，CD34基因编辑导致移码或剪接变体。在一些实施例中，CD34基因编辑导致结合为CD34抗体的表位的全部或部分缺失或修饰。在一些实施例中，CD34编辑的HSC不被CD34靶向抗体、CD34结合抗体片段或其它免疫结合物识别，例如CD34结合scFv、CD34结合CAR或CD34结合抗体-药物缀合物。在一些实施例中，CD34编辑的HSC不被CD34靶向免疫治疗剂识别，例如被CD34靶向的CAR-T细胞或CD34靶向的CAR-NK细胞识别。
双gRNA组合物以及其用途
在一些实施例中，本文所提供的gRNA(例如，表1或2中提供的gRNA)可以与第二gRNA组合使用，例如用于将CRISPR/Cas核酸酶靶向基因组中的两个位点。例如，在一些实施例中，可能期望产生缺乏CD34和谱系特异性细胞表面抗原的造血细胞，例如CD33、CD123、CLL-1、CD19、CD30、CD5、CD6、CD7、CD38或BCMA，使得细胞可以对两种药剂具有抗性：抗CD34药剂和靶向谱系特异性细胞表面抗原的药剂。在一些实施例中，造血细胞缺乏CD34和淋巴特异性细胞表面抗原或髓系特异性细胞表抗原。在一些实施例中，期望使细胞与靶向CD34的不同位点的两种不同的gRNA接触，例如以便进行两次切割并在两个切割位点之间产生缺失或插入。因此，本公开提供了gRNA和相关CRISPR系统的各种组合，以及通过使用此类gRNA和相关CRISPR系统的组合的基因组编辑方法产生的细胞。在一些实施例中，CD34 gRNA与第二gRNA与不同的核酸酶结合。例如，在一些实施例中，CD34 gRNA可以与Cas9结合，并且第二gRNA可以与Cas12a结合，或反之亦然。
在一些实施例中，第一gRNA是本文所提供的CD34 gRNA(例如，表1或2中提供的gRNA或其变体)，并且第二gRNA靶向选自以下的谱系特异性细胞表面抗原：BCMA、CD19、CD20、CD30、ROR1、B7H6、B7H3、CD23、CD33、CD38、C型凝集素样分子-1、CS1、IL-5、L1-CAM、PSCA、PSMA、CD138、CD133、CD70、CD5、CD6、CD7、CD13、NKG2D、NKG2D配体、CLEC12A、CD11、CD123、CD56、CD30，CD14、CD66b、CD41、CD61、CD62、CD235a、CD146、CD326、LMP2、CD22、CD52、CD10、CD3/TCR、CD79/BCR和CD26。
在一些实施例中，第一gRNA是本文所提供的CD34 gRNA(例如，表1或2中提供的gRNA或其变体)，并且第二gRNA靶向淋巴特异性细胞表面抗原(例如，T细胞、B细胞或NK细胞特异性细胞表面抗原)。在一些实施例中，淋巴特异性细胞表面抗原是CD3、CD4、CD8、CD19、CD20或CD56。在一些实施例中，第一gRNA是本文所提供的CD34 gRNA(例如，表1或2中提供的gRNA或其变体)，并且第二gRNA靶向髓系特异性细胞表面抗原(例如，单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、红细胞或血小板特异性细胞表面抗原)。在一些实施例中，髓系特异性细胞表面抗原是CD11c、CD123、CD14、CD33、CD66b、CD41、CD61、CD62或CD235a。其它淋巴和髓系特异性细胞表面抗原以及其相关的细胞类型可以在《BD生物科学人类和小鼠CD标志物手册》中找到，可在www.bd.com/documents/bd-legacy/catalogue/biosciences/DS_Human-Mouse-CD-Maker-Biosciences_CT_DE.pdf上访问，上次访问时间为2021年12月30日，其列表通过引用并入本文。
在一些实施例中，第一gRNA是本文所提供的CD34 gRNA(例如，表1或2中提供的gRNA或其变体)，并且第二gRNA靶向与肿瘤或恶性疾病或病症相关的谱系特异性细胞表面抗原，例如与特定类型的癌症相关，如但不限于CD20、CD22(非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin's lymphoma)、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL))、CD52(B细胞CLL)、CD33(急性髓性白血病(AML))、CD10(gp100)(常见(前B期)急性淋巴细胞白血病和恶性黑色素瘤)、CD3/T细胞受体(TCR)(T细胞淋巴瘤和白血病)、CD79/B细胞受体(BCR)(B细胞淋巴瘤和白血病)、CD26(上皮和淋巴系统恶性肿瘤)、人白细胞抗原(HLA)-DR、HLA-DP和HLA-DQ(淋巴系统恶性肿瘤)、RCAS1(妇科癌、胆道腺癌和胰腺导管腺癌)以及前列腺特异性膜抗原。
在一些实施例中，第一gRNA是本文所提供的CD34 gRNA(例如，表1或2中提供的gRNA或其变体)，并且第二gRNA靶向选自以下的谱系特异性细胞表面抗原：CD1a,CD1b,CD1c,CD1d,CD1e,CD2,CD3,CD3d,CD3e,CD3g,CD4,CD5,CD6,CD7,CD8a,CD8b,CD9,CD10,CD11a,CD11b,CD11c,CD11d,CDw12,CD13,CD14,CD15,CD16,CD16b,CD17,CD18,CD19,CD20,CD21,CD22,CD23,CD24,CD25,CD26,CD27,CD28,CD29,CD30,CD31,CD32a,CD32b,CD32c,CD35,CD36,CD37,CD38,CD39,CD40,CD41,CD42a,CD42b,CD42c,CD42d,CD43,CD44,CD45,CD45RA,CD45RB,CD45RC,CD45RO,CD46,CD47,CD48,CD49a,CD49b,CD49c,CD49d,CD49e,CD49f,CD50,CD51,CD52,CD53,CD54,CD55,CD56,CD57,CD58,CD59,CD60a,CD61,CD62E,CD62L,CD62P,CD63,CD64a,CD65,CD65s,CD66a,CD66b,CD66c,CD66F,CD68,CD69,CD70,CD71,CD72,CD73,CD74,CD75,CD75S,CD77,CD79a,CD79b,CD80,CD81,CD82,CD83,CD84,CD85A,CD85C,CD85D,CD85E,CD85F,CD85G,CD85H,CD85I,CD85J,CD85K,CD86,CD87,CD88,CD89,CD90,CD91,CD92,CD93,CD94,CD95,CD96,CD97,CD98,CD99,CD99R,CD100,CD101,CD102,CD103,CD104,CD105,CD106,CD107a,CD107b,CD108,CD109,CD110,CD111,CD112,CD113,CD114,CD115,CD116,CD117,CD118,CD119,CD120a,CD120b,CD121a,CD121b,CD121a,CD121b,CD122,CD123,CD124,CD125,CD126,CD127,CD129,CD130,CD131,CD132,CD133,CD134,CD135,CD136,CD137,CD138,CD139,CD140a,CD140b,CD141,CD142,CD143,CD14,CDw145,CD146,CD147,CD148,CD150,CD152,CD152,CD153,CD154,CD155,CD156a,CD156b,CD156c,CD157,CD158b1,CD158b2,CD158d,CD158e1/e2,CD158f,CD158g,CD158h,CD158i,CD158j,CD158k,CD159a,CD159c,CD160,CD161,CD163,CD164,CD165,CD166,CD167a,CD168,CD169,CD170,CD171,CD172a,CD172b,CD172g,CD173,CD174,CD175,CD175s,CD176,CD177,CD178,CD179a,CD179b,CD180,CD181,CD182,CD183,CD184,CD185,CD186,CD191,CD192,CD193,CD194,CD195,CD196,CD197,CDw198,CDw199,CD200,CD201,CD202b,CD203c,CD204,CD205,CD206,CD207,CD208,CD209,CD210a,CDw210b,CD212,CD213a1,CD213a2,CD215,CD217,CD218a,CD218b,CD220,CD221,CD222,CD223,CD224,CD225,CD226,CD227,CD228,CD229,CD230,CD231,CD232,CD233,CD234,CD235a,CD235b,CD236,CD236R,CD238,CD239,CD240,CD241,CD242,CD243,CD244,CD245,CD246,CD247,CD248,CD249,CD252,CD253,CD254,CD256,CD257,CD258,CD261,CD262,CD263,CD264,CD265,CD266,CD267,CD268,CD269,CD270,CD272,CD272,CD273,CD274,CD275,CD276,CD277,CD278,CD279,CD280,CD281,CD282,CD283,CD284,CD286,CD288,CD289,CD290,CD292,CDw293,CD294,CD295,CD296,CD297,CD298,CD299,CD300a,CD300c,CD300e,CD301,CD302,CD303,CD304,CD305,CD306,CD307a,CD307b,CD307c,CD307d,CD307e,CD309,CD312,CD314,CD315,CD316,CD317,CD318,CD319,CD320,CD321,CD322,CD324,CD325,CD326,CD327,CD328,CD329,CD331,CD332,CD333,CD334,CD335,CD336,CD337,CD338,CD339,CD340,CD344,CD349,CD350,CD351,CD352,CD353,CD354,CD355,CD357,CD358,CD359,CD360,CD361,CD362或CD363。
在一些实施例中，第二gRNA是以下任一项中公开的gRNA：WO2017/066760、WO2019/046285、WO/2018/160768或Borot等人,《美国国家科学院院刊》(2019)116(24):11978-11987，所述文献中的每一个通过全文引用的方式并入本文。
向有需要的受试者施用的方法
本公开的一些方面提供了包括向有需要的受试者施用有效数量的如本文所描述的基因工程化细胞的方法，所述基因工程细胞包括在其基因组中的修饰，所述修饰导致CD34的表达丧失，或CD34的变体形式的表达的修饰，所述变体形式不被靶向CD34的免疫治疗剂识别。
在一些实施例中，有需要的受试者是正在或即将进行靶向CD34的免疫疗法的受试者。在一些实施例中，有需要的受试者是患有或已被诊断患有自身免疫性疾病的受试者，例如，其特征在于表达CD34的细胞的有害免疫活性。在一些实施例中，有需要的受试者是患有或已被诊断患有恶性肿瘤的受试者，所述恶性肿瘤的特征在于CD34在恶性细胞上的表达。在一些实施例中，患有此类恶性肿瘤或自身免疫性疾病的受试者可以是靶向CD34的免疫疗法的候选者，但有害的在靶、脱疾病效应的风险可能超过对受试者的预期的或观察到的益处。在一些此类实施例中，如本文所描述的基因工程化细胞的施用导致有害的在靶、脱疾病效应的改善，因为本文所提供的基因工程化细胞没有被靶向CD34的免疫治疗剂有效靶向。
本文所描述的细胞、组合物和方法可能有用的自身免疫性疾病的实例包含但不限于失弛症、阿狄森氏病(Addison's disease)、成人史提尔氏病(Adult Still's disease)、血中丙球蛋白贫乏、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征、自身免疫性血管水肿、自身免疫性家族性自主神经异常、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病、自身免疫性荨麻疹、轴突和神经元神经病(AMAN)、Baló病(Balódisease)、白塞病(Behcet's disease)、良性黏膜类天疱疮、大疱性类天疱疮、卡斯特曼病(Castleman disease，CD)、腹腔疾病、查加斯病(Chagas disease)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、变应性肉芽肿综合征(Churg-Strauss syndrome，CSS)或嗜酸性粒细胞肉芽肿病(EGPA)、瘢痕性天疱疮、科干综合征(Cogan's syndrome)、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇病毒性心肌炎(Coxsackie myocarditis)、CREST综合征、克罗恩氏病(Crohn's disease)、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克氏病(Devic's disease)(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德勒综合征(Dressler'ssyndrome)、子宫内膜异位、嗜酸性食管炎(EoE)、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、混合性冷凝球蛋白血症、伊文综合征(Evans syndrome)、纤维肌痛、纤维化性肺泡炎、巨细胞性动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞性心肌炎、血管球性肾炎、肺出血肾炎综合征(Goodpasture's syndrome)、肉芽肿合并多血管炎、格雷夫斯病(Graves'disease)、格林-巴利综合征(Guillain-Barresyndrome)、桥本甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、溶血性贫血、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura，HSP)、妊娠疱疹或妊娠性类天疱疮(PG)、化脓性汗腺炎(HS)(痤疮)、低丙球蛋白血症、IgA肾病、IgG4相关硬化性疾病、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、包涵体肌炎(IBM)、间质性膀胱炎(IC)、幼年型关节炎、幼年型糖尿病(1型糖尿病)、幼年型肌炎(JM)、川崎病(Kawasaki disease)、兰伯特-伊顿综合征(Lambert-Eaton syndrome)、白细胞碎裂性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔癣、木样结膜炎、线性IgA病(LAD)、狼疮、慢性莱姆病(Lyme disease chronic)、美尼尔氏病(Meniere's disease)、显微镜下多发性血管炎(MPA)、混合性结缔组织病(MCTD)、蚕蚀性角膜溃疡(Mooren's ulcer)、穆哈二氏病(Mucha-Habermann disease)、多灶性运动神经病变(MMN)或MMNCB、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、发作性嗜睡病、新生儿狼疮、视神经脊髓炎、中性粒细胞减少症、眼瘢痕性天疱疮、视神经炎、复发性风湿症(PR)、PANDAS、副肿瘤性小脑变性(PCD)、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、帕罗综合征(Parry Romberg syndrome)、睫状体扁平部炎(周边葡萄膜炎)、帕森那-特纳综合征(Parsonnage-Turner syndrome)、天疱疮、周围神经病变、静脉周围脑脊髓炎、恶性贫血(PA)、POEMS综合征、结节性多发性动脉炎、I、II、III型多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、孕酮皮炎、牛皮癣、银屑病关节炎、纯红细胞再生障碍性贫血(PRCA)、坏疽性脓皮病、雷诺现象(Raynaud's phenomenon)、反应性关节炎、反射性交感神经营养不良、复发性多软骨炎、多动腿综合征(RLS)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿关节炎、结节病、施密特综合征(Schmidt syndrome)、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征( syndrome)、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征(SPS)、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、苏萨克氏综合征(Susac'ssyndrome)、交感性眼炎(SO)、大动脉炎(Takayasu's arteritis)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、甲状腺眼病(TED)、痛性眼肌麻痹综合征(Tolosa-Huntsyndrome，THS)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎(UC)、未分化结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、白癜风或小柳原田病(Vogt-Koyanagi-Harada Disease)。
在一些实施例中，患有此类恶性肿瘤或自身免疫性疾病的受试者是放射疗法的候选者，例如，消融恶性细胞(例如，表达CD34的恶性细胞)。在一些实施例中，有害的脱靶效应(例如，对邻近或周围的细胞或组织)和在靶脱疾病效应(例如，对非恶性表达CD34的细胞)的风险可能超过对受试者进行放射疗法的预期的或观察到的益处。在一些实施例中，本文所描述的基因工程化细胞(例如，基因工程化造血细胞，例如，HSC)在放射疗法后的施用导致有害的在靶、脱疾病效应的改善。不希望受理论束缚，免疫治疗方法的组合，例如包括靶向CD34的淋巴细胞效应子细胞，如CAR-T细胞或CAR-NK细胞，以及不表达CD34(例如，基因工程化干细胞，例如，HSC)、表达降低水平的CD34(例如，相对于野生型细胞)或表达不被靶向CD34的免疫治疗剂识别的CD34的变体形式的基因工程化细胞被认为是对患有表达CD34的恶性肿瘤或以表达CD34细胞的有害免疫活性为特征的自身免疫性疾病的受试者的放射疗法的替代方案。靶向CD34的免疫治疗方法被认为可以避免或显著降低脱靶效应(例如，对邻近或周围的细胞或组织)的风险。用不表达CD34、表达降低水平的CD34(例如，相对于野生型细胞)或表达不被靶向CD34的免疫治疗剂识别的CD34的变体形式的免疫疗法抗性基因工程化细胞(例如，基因工程化干细胞，例如，HSC)补充耗竭的干细胞群体被认为改善或消除了免疫治疗方法的在靶脱疾病效应。
在一些实施例中，恶性肿瘤是血液系统恶性肿瘤或血液癌症。在一些实施例中，恶性肿瘤是淋巴恶性肿瘤。通常，淋巴恶性肿瘤与淋巴细胞(如T谱系或B谱系的淋巴细胞)的不适当产生、发育和/或功能相关。在一些实施例中，恶性肿瘤的特征在于在细胞表面上表达CD34的细胞或与其相关。
在一些实施例中，恶性肿瘤与异常T淋巴细胞相关，如T谱系癌症，例如T细胞白血病或T细胞淋巴瘤。
T细胞白血病和T细胞淋巴瘤的实例包含但不限于，T谱系急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)或非霍奇金氏淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、大颗粒淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)、T细胞慢性淋巴细胞白血病、T幼淋巴细胞白血病、T细胞淋巴细胞白血病、未另行指定的外周T细胞淋巴瘤(PTCL-NOS)、肠病相关T细胞淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、间变性大细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤，血管免疫母细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾型γ-δT细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤或毛细胞白血病。
在一些实施例中，恶性肿瘤与异常B淋巴细胞相关，如B谱系癌症，例如B细胞白血病或B细胞淋巴瘤。在一些实施例中，恶性肿瘤是B谱系急性淋巴细胞白血病(B-ALL)或慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤。
在一些实施例中，恶性肿瘤的细胞例如在其表面上表达CD34。
在一些实施例中，恶性肿瘤包括以CD34的表达为特征的细胞群体。在一些实施例中，以CD34表达为特征的细胞群体是癌症干细胞。不希望受理论束缚，癌症干细胞理论表明，对于一些恶性肿瘤，癌症干细胞与正常健康干细胞共享许多特性。在一些实施例中，癌症干细胞例如在其表面上表达CD34。在一些实施例中，本文所描述的免疫治疗方法，例如包括靶向CD34的淋巴细胞效应子细胞(如CAR-T细胞或CAR-NK细胞)特异性靶向恶性肿瘤的癌症干细胞。在一些实施例中，本文所描述的靶向癌症干细胞的免疫治疗方法也具有有害的在靶脱疾病效应，例如对健康干细胞。在一些实施例中，不表达CD34(例如，基因工程化干细胞，例如，HSC)、表达降低水平的CD34(例如，相对于野生型细胞)或表达不被靶向CD34的免疫治疗剂识别的CD34的变体形式的基因工程化细胞用于补充或替换免疫治疗方法靶向的非癌症干细胞(例如，健康干细胞)。
在一些实施例中，恶性肿瘤是移植物抗宿主病。
同样在本公开的范围内的是被认为是复发和/或难治的恶性肿瘤，如复发或难治性血液恶性肿瘤。在一些实施例中，有需要的受试者是正在进行或将要进行靶向CD34的免疫效应子细胞疗法(例如，CAR-T细胞疗法)的受试者，其中所述免疫效应子细胞表达靶向CD34的CAR，并且其中所述免疫效应子细胞的至少一个子集也在其细胞表面上表达CD34，或接受疗法的受试者的健康干细胞(例如，HSC)在其细胞表面上表达CD34。如本文所使用的，术语“自相残杀”是指是自杀。例如，细胞群体的细胞杀死或诱导杀死相同群体的细胞。在一些实施例中，免疫效应子细胞疗法的细胞杀死或诱导杀死免疫效应子细胞疗法的其它细胞。在此类实施例中，自相残杀在可以实现期望的临床结果之前消融免疫效应子细胞的一部分或整个群体，例如消融受试者体内表达CD34的恶性细胞。在一些此类实施例中，使用如本文所提供的基因工程化免疫效应子细胞，例如不表达CD34或不表达CAR识别的CD34变体的免疫效应子细胞作为形成免疫效应子细胞疗法基础的免疫效应子细胞将避免此类自相残杀和对疗法结果的相关负面影响。在此类实施例中，如本文所提供的基因工程化免疫效应子细胞，例如不表达CD34或不表达CAR识别的CD34变体的免疫效应子细胞可以被进一步修饰以也表达靶向CD34的CAR。在一些实施例中，免疫效应子细胞可以是淋巴细胞，例如T淋巴细胞，例如α/βT淋巴细胞、γ/δT淋巴细胞或自然杀伤T细胞。在一些实施例中，免疫效应子细胞可以是自然杀伤(NK)细胞。
在一些实施例中，免疫效应子细胞疗法的细胞杀死或诱导杀死受试者的在其细胞表面上表达CD34的干细胞(例如，HSC)。在一些实施例中，本文所描述的方法导致受试者中靶干细胞小生境(例如，HSC小生境)的耗竭。在一些实施例中，本文所描述的方法不会改变或不会明显改变受试者的至少一个非靶向干细胞小生境中干细胞的水平或活力。在一些实施例中，本文所描述的方法靶向受试者的特定类型的所有干细胞小生境(例如，所有HSC小生境)。在一些实施例中，本文所描述的方法导致受试者的干细胞小生境(例如，HSC小生境)完全耗竭。如本文所使用的，干细胞小生境是指受试者的解剖区域，所述解剖区域包括特定的微环境，所述微环境包括处于未分化的和自我再生状态的干细胞群体。
在一些实施例中，向受试者施用不表达CD34或表达不被靶向CD34的免疫治疗剂识别的CD34变体形式的基因工程化干细胞补充了受试者的干细胞(例如，HSC)的供应。在一些实施例中，向受试者施用不表达CD34或不被靶向CD34的免疫治疗剂识别的CD34的变体形式的基因工程化干细胞与靶向CD34的免疫效应子细胞的组合(例如，本文所提供的基因工程化免疫效应子细胞，例如，不表达CD34或不表达CAR识别的CD34变体的免疫效应子细胞，其可以被进一步修饰以也表达靶向CD34的CAR)。
在一些实施例中，将有效数量的本文所描述的基因工程化细胞，包括其基因组中导致CD34的表达丧失的修饰，或不被靶向CD34的免疫治疗剂识别的CD34变体形式的表达向有需要的受试者施用，例如向正在或将要进行靶向CD34的免疫疗法的受试者施用，其中所述免疫疗法与有害的在靶、脱疾病效应相关或有相关风险，例如以对受试者的表达CD34的健康细胞的细胞毒性形式。在一些实施例中，可以将有效数量的此类基因工程化细胞与抗CD34免疫治疗剂组合施用于受试者。
应理解，当组合施用药剂(例如，CD34修饰的细胞和抗CD34免疫治疗剂)时，细胞和药剂可以同时或在不同时间施用，例如在时间上接近。此外，细胞和药剂可以混合或以单独的体积或剂型存在。例如，在一些实施例中，组合施用包含在相同的治疗过程中施用，例如在用抗CD34免疫疗法治疗受试者的过程中，可以同时或顺序向受试者施用有效数量的基因工程化CD34修饰的细胞，例如治疗之前、期间或之后，使用抗CD34免疫疗法。
在一些实施例中，如本文所描述的靶向CD34的免疫治疗剂是表达嵌合抗原受体的免疫细胞，所述嵌合抗原受体包括能够与CD34结合的抗原结合片段(例如，单链抗体)。免疫细胞可以是例如T细胞(例如，CD4+或CD8+T细胞)或NK细胞。
嵌合抗原受体(CAR)可以包括重组多肽，所述重组多肽至少包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域，所述细胞质信号传导结构域包括功能性信号传导结构域，例如源自刺激分子的功能性信号传导结构域。在一个一些实施例中，细胞质信号传导结构域进一步包括源自至少一种共刺激分子(如4-1BB(即CD137)、CD27和/或CD28，或这些分子的片段)的一个或多个功能性信号传导结构域。CAR的细胞外抗原结合结构域可以包括CD34结合抗体片段。抗体片段可以包括一个或多个CDR、可变区(或其部分)、恒定区(或其部分)或前述任一种的组合。
嵌合抗原受体(CAR)通常包括抗原结合结构域，例如包括与CAR框架融合的抗体片段，其可以包括铰链区(例如，来自CD8或CD28)、跨膜结构域(例如，来自CD8或CD28)、一个或多个共刺激结构域(例如，CD28或4-1BB)和信号传导结构域(例如，CD3ζ)。提供了CAR结构域和组分的示例性序列，例如在PCT公开第WO 2019/178382号中，以及在下表3中。
表3：嵌合抗原受体的示例性组分
在一些实施例中，本文所提供的基因工程化细胞的数量，例如向有需要的受试者施用的HSC、HPC或免疫效应子细胞的数量在106个至1011个的范围内。然而，低于或高于此示例性范围的量也在本公开的范围内。例如，在一些实施例中，本文所提供的基因工程化细胞，例如向有需要的受试者施用的HSC、HPC或免疫效应子细胞的数量为约106个、约107个、约108个、约109个、约1010个或约1011个。在一些实施例中，本文所提供的基因工程化细胞的数量，例如向有需要的受试者施用的HSC、HPC或免疫效应子细胞的数量在106个至109个的范围内、在106个至108个的范围内、在107个至109个的范围内、在约107个至1010个的范围内、在108个至1010个的范围内或在109个至1011个的范围内。
在一些实施例中，靶向CD34的免疫治疗剂是抗体-药物缀合物(ADC)。ADC可以是包括与毒素或药物分子缀合的抗体或其抗原结合片段的分子。抗体或其片段与对应的抗原的结合允许毒素或药物分子递送到在其细胞表面上呈递抗原的细胞(例如，靶细胞)，由此导致靶细胞死亡。
可以用于产生免疫治疗剂，例如嵌合抗原受体、表达此类嵌合受体的CAR-T细胞或用于产生抗体-药物缀合物的合适的与CD34结合的抗体和抗体片段对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。合适的抗CD34抗体的实例包含但不限于EP373Y(艾博抗公司(Abcam)(兔，未缀合))、克隆QBEnd-10(寿命生物科学公司(LifeSpan BioSciences)(小鼠))、克隆MEC14.7(寿命生物科学公司(大鼠))、克隆SI16-01(抗体名称ET1606-11；HUABIO(兔)、克隆HPCA1/2598R(博欧特公司(biorbyt)(兔))、4C8和人源化h4C8、4H11、cQBEND/10或QBEnd-10的hQBEND/10变体、27H2、CIRMA-K4、DS554AB、10C304、9C5、B-C34、RM300、AC136。
能够与人CD34结合的任何合适的抗体和抗原结合片段(mRNA NCBI参考序列：NM_001025109.1，蛋白质NCBI参考序列：NP_001020280.1)可以与本文所描述的组合物和方法结合使用。CD34有两种同种型，其细胞质尾部的长度不同(长和短)。最近，长同种型被用于产生表达CD34的稳定细胞系，所述细胞系可以用作免疫原(参见例如，《高级药学公告(Adv.Pharm.Bull.)》5:69-75,2015)。CD34，如CD34的长同种型可以用作免疫原，以鉴定能够与CD34结合的抗体以及其抗原结合片段，并且产生合适的CD34靶向免疫治疗剂，例如CD34靶向CAR和CAR-T细胞或抗体-药物缀合物，用于治疗癌症和自身免疫性疾病，以及在造血干细胞移植疗法之前用作调节剂。
本文描述了一些合适的CD34抗体、CD34结合抗体片段和CD34结合scFv，并且基于本公开，另外的合适的CD34抗体、CD34结合抗体片段和CD34结合scFv对于本领域技术人员将是显而易见的。这些包含但不限于从ATCC登录号AC133.1和HB 12346产生和释放的CD34结合抗体，如例如在美国专利第5,843,633号中描述的，所述美国专利通过引用并入本文。
可以与本文所描述的组合物和方法结合使用的合适的CD34结合抗体和CD34结合的抗体片段和scFv进一步包含CD34抗体的人源化变体、CD34结合性抗体片段、scFv以及与本文所描述的那些相同的CD34表位特异性结合的任何抗体、抗体片段和单链抗体，如所评估的，例如通过竞争性CD34结合测定。
与抗体-药物缀合物中使用相容的毒素或药物是本领域已知的，并且对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的。参见例如，Peters等人,《生物科学报告(Biosci.Rep.)》(2015)35(4):e00225；Beck等人,《自然评论：药物发现(Nature ReviewsDrug Discovery)》(2017)16:315-337；Marin-Acevedo等人,《血液学和肿瘤学杂志(J.Hematol.Oncol.)》(2018)11:8；Elgundi等人,《先进药物递送评论(Advanced DrugDelivery Reviews)》(2017)122:2-19。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物可以进一步包括连接抗体和药物分子的接头(例如，肽接头，如可切割接头)。
用于抗体-药物缀合物的合适毒素或药物的实例包含但不限于包括在以下中的毒素和药物：在本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、格利贝瑞他汀(glembatumumabvedotin)/CDX-011、莫福汀德帕妥昔组单抗(depatuxizumab mafodotin)/ABT-414、PSMAADC、泊洛妥珠单抗(polatuzumab vedotin)/RG7596/DCDS4501A、莫福汀德德宁单抗(denintuzumab mafodotin)/SGN-CD19A、AGS-16C3F、CDX-014、RG7841/DLYE5953A、RG7882/DMUC406A、RG7986/DCDS0780A、SGN-LIV1A、恩福单抗(enfortumab vedotin)/ASG-22ME、AG-15ME、AGS67E、特利索单抗(telisotuzumab vedotin)/ABBV-399、ABBV-221、ABBV-085、GSK-2857916、特兹单抗(tisotumab vedotin)/HuMax-TF-ADC、HuMax-Axl-ADC、维匹那妥单抗(pinatuzumab vedotin)/RG7593/DCDT2980S、利发单抗(lifastuzumab vedotin)/RG7599/DNIB0600A、因度沙单抗(indusatumab vedotin)/MLN-0264/TAK-264、凡多单抗(vandortuzumab vedotin)/RG7450/DSTP3086S、缩非单抗(sofituzumab vedotin)/RG7458/DMUC5754A、RG7600/DMOT4039A、RG7336/DEDN6526A、ME1547、PF-06263507/ADC5T4、恩美-曲妥珠单抗(trastuzumab emtansine)/T-DM1、索星-米妥昔单抗(mirvetuximabsoravtansine)/IMGN853、拉韦坦新-柯妥昔单抗/SAR3419、恩星-那妥昔单抗(naratuximabemtansine)/IMGN529、吲妥昔单抗拉坎珠(indatuximab ravtansine)/BT-062、雷星-阿奈妥单抗(anetumab ravtansine)/BAY 94–9343、SAR408701、SAR428926、AMG 224、PCA062、HKT288、LY3076226、SAR566658、洛沃妥珠单抗莫坦森(lorvotuzumab mertansine)/IMGN901、坎妥珠单抗美登素(cantuzumab mertansine)/SB-408075、康妥珠单抗-拉韦坦辛(cantuzumab ravtansine)/IMGN242、恩星拉妥昔单抗(laprituximab emtansine)/IMGN289、IMGN388、比伐妥珠单抗美登素(bivatuzumab mertansine)、AVE9633、BIIB015、MLN2704、AMG 172、AMG 595、LOP 628、瓦达斯图希单抗塔利林(vadastuximab talirine)/SGN-CD33A、SGN-CD70A、SGN-CD19B、SGN-CD123A、SGN-CD352A、罗伐尔匹珠单抗替西林(rovalpituzumab tesirine)/SC16LD6.5、SC-002、SC-003、ADCT-301/HuMax-TAC-PBD、ADCT-402、MEDI3726/ADC-401、IMGN779、IMGN632、吉妥单抗奥佐米星(gemtuzumabozogamicin)、伊珠单抗奥佐米星(inotuzumab ozogamicin)/CMC-544、PF-06647263、CMD-193、CMB-401、曲妥珠单抗双卡马嗪(trastuzumab duocarmazine)/SYD985、BMS-936561/MDX-1203、戈沙妥珠单抗(sacituzumab govitecan)/IMMU-132、拉贝珠单抗戈韦替康(labetuzumab govitecan)/IMMU-130、DS-8201a、U3-1402、米拉妥珠单抗阿霉素(milatuzumab doxorubicin)/IMMU-110/hLL1-DOX、BMS-986148、RC48-ADC/厄妥珠单抗(hertuzumab)-vc–MMAE、PF-06647020、PF-06650808、PF-06664178/RN927C、鲁伐他单抗阿马多汀(lupartumab amadotin)/BAY1129980、阿普单抗依沙多汀(aprutumab ixadotin)/BAY1187982、ARX788、AGS62P1、XMT-1522、AbGn-107、MEDI4276、DSTA4637S/RG7861。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物与细胞表面谱系特异性蛋白的表位的结合诱导抗体-药物缀合物的内化，并且药物(或毒素)可以在细胞内释放。在一些实施例中，抗体-药物缀合物与细胞表面谱系特异性蛋白的表位的结合诱导毒素或药物的内化，这允许毒素或药物杀死表达谱系特异性蛋白的细胞(靶细胞)。在一些实施例中，抗体-药物缀合物与细胞表面谱系特异性蛋白的表位的结合诱导毒素或药物的内化，这可以调节表达谱系特异性蛋白的细胞(靶细胞)的活性。本文所描述的抗体-药物缀合物中使用的毒素或药物的类型不限于任何特定类型。
一般技术
除非另有指示，否则本公开的实践将采用在本领域技术范围内的常规分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术。此类技术在如以下等文献中进行了充分解释：《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》第二版(Sambrook等人,1989)冷泉港出版社；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait,编辑1984)；《分子生物学方法(Methods in MolecularBiology)》,胡马纳出版社(Humana Press)；《细胞生物学：实验室手册(Cell Biology:ALaboratory Notebook)》(J.E.Cellis,编辑,1989)学术出版社(Academic Press)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney,编辑,1987)；《细胞和组织培养导论(Introduction to Cell and Tissue Culture)》(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998),普莱南出版社(Plenum Press)；《细胞和组织培养：实验室程序(Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures)》(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,1993-8)约翰·威利父子出版公司(J.Wiley and Sons)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社公司)：《实验免疫学手册(Handbook of experimental immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)：《哺乳动物细胞基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos,编辑,1987；《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人,编辑1987)；《PCR：聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人,编辑1994)；《当代免疫学指南(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人,编辑,1991)；《精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)》(约翰威利父子出版公司,1999)；《免疫生物学(Immunobiology)》(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；《抗体(Antibodies)》(P.Finch,1997)；《抗体：实用方法(Antibodies:a practical approach)》(D.Catty.,编辑,IRL出版社,1988-1989)；《单克隆抗体：实用方法(Monoclonalantibodies:a practical approach)》(P.Shepherd和C.Dean,编辑,牛津大学出版社(Oxford University Press),2000)；《使用抗体：实验室手册(Using antibodies:alaboratory manual)》(E.Harlow和D.Lane(冷泉港实验室出版社,1999)；《抗体》(M.Zanetti和J.D.Capra,编辑哈伍德学术出版社(Harwood Academic Publishers),1995)；《DNA克隆：实用方法(DNA Cloning:A practical Approach),第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑(1985)；《转录和翻译(Transcription and Translation)》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑,(1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编辑,(1986)；《固定化细胞和酶(Immobilized Cells and Enzymes)》(IRL出版社,(1986)；以及B.Perbal,《分子克隆实用性指南(A practical Guide To Molecular Cloning)》(1984)；F.M.Ausubel等人(编辑)。
无需进一步阐述，据信，基于以上描述，本领域技术人员可以最大程度地利用本公开。因此，以下具体实施例应被解释为仅是说明性的并且不以任何方式限制本公开的其余部分。出于本文所提及的目的或主题，本文所引用的所有出版物均通过引用并入。
本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考通过引用整体并入本文。另外，所述材料、方法和实例仅是说明性的并且不意在是限制性的。除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管类似或等效于本文所描述的方法和材料的方法和材料可以用于实践或测试本发明，但本文描述了合适的方法和材料。
在以下实例中对本公开进一步进行了说明。实例仅出于说明目的提供。所述实例不应被解释为以任何方式限制本公开的范围或内容。
实例
实例1：CD34在人细胞中的基因编辑
sgRNA构建体的设计
表1和2中所示的靶结构域和gRNA是通过手动检查适用核酸酶(例如，Cas9)的PAM序列来设计的，与靶区域非常接近，并且通过在线搜索算法(例如，Benchling算法，Doench等人,2016，Hsu等人,2013)最小化人类基因组中潜在的脱靶位点，根据预测的特异性进行优先排序。图1和2A-2C示出了示例性gRNA在CD34基因内的位置。所有设计的合成sgRNA都是在5'和3'端两者的三个末端位置处用化学修饰的核苷酸产生的。经修饰的核苷酸含有2'-O-甲基-3'-硫代磷酸酯(缩写为“ms”)，并且对ms-sgRNA进行了HPLC纯化。
编辑人CD34+HSC
根据制造商的说明对冷冻的CD34+HSC进行解冻。为了编辑HSC，在用RNP电穿孔之前，将～HSC解冻并在补充有StemSpan CC110混合物(干细胞技术公司(StemCellTechnologies))的StemSpan SFEM培养基中培养约48小时，如图3A所示。为了对HSC进行电穿孔，将大约2×105个细胞沉淀并重悬于电穿孔溶液中，并且以RNP的形式与3μg Cas9和3μg gRNA混合。使用标准电穿孔程序对CD34+HSC进行电穿孔。表4中提供了实验条件。
表4.
细胞数量 条件 Cas9 向导浓度
200K 模拟电穿孔(模拟) 0 0
200K 阳性对照 3ug 3ug
200K Cas9+gRNACD34-1 3ug 3ug
200K Cas9+gRNA CD34-2 3ug 3ug
200K Cas9+gRNA CD34-3 3ug 3ug
200K Cas9+gRNA CD34-4 3ug 3ug
200K Cas9+gRNA CD34-5 3ug 3ug
200K Cas9+gRNA CD34-1 3ug 3ug
200K Cas9+gRNA CD34-2 3ug 3ug
200K Cas9+gRNA CD34-3 3ug 3ug
200K Cas9+gRNA CD34-4 3ug 3ug
200K Cas9+gRNA CD34-5 3ug 3ug
200K 无电穿孔(无EP) 0 0
基因组DNA分析
电穿孔后约48小时，采集细胞进行细胞计数、活力分析、纯化和测序。对于所有基因组分析，从细胞中采集DNA，用靶区侧翼的引物扩增、纯化，并且使用TIDE(通过分解追踪INDEL)分析等位基因修饰频率。使用来自模拟转染的样品的参考序列进行分析。
如上文所描述的，用Cas9蛋白对人CD34+细胞进行电穿孔，并且指示靶向CD34的gRNA。编辑百分比由TIDE分析评估的INDEL的％确定。编辑效率由TIDE分析确定，如图3D和图4所示。
流式细胞术分析
CD34 gRNA编辑的细胞也可以例如通过流式细胞术分析(FACS)评估CD34蛋白的表面表达。使用抗CD34抗体对活HSC进行CD34染色，并且通过Attune NxT流式细胞仪(生命技术公司(Life Technologies))上的流式细胞术进行分析。其中CD34基因已被基因修饰的细胞显示CD34表达减少，如通过FACS检测的。
编辑的细胞的活力
在离体编辑后24小时和48小时，使用流式细胞术和7AAD活力染料定量活的、编辑的CD34KO细胞和对照细胞的平均细胞计数和百分比。如图3B和3C所示，使用本文所描述的CD34 gRNA编辑的CD34KO细胞是活的，并且在电穿孔和基因编辑后随着时间的推移保持存活，类似于在用靶向CD5的gRNA编辑的对照细胞、模拟编辑的细胞和未电穿孔的细胞中观察到的情况。
实例2：大规模电穿孔——96小时时间点
根据制造商的说明对冷冻的CD34+HSC进行解冻。为了编辑HSC，在用RNP电穿孔之前，将～HSC解冻并在补充有StemSpan CC110混合物(干细胞技术公司)的StemSpan SFEM培养基中培养约48小时，如图5A所示。为了对HSC进行电穿孔，将大约1×106个细胞沉淀并重悬于电穿孔溶液中，并且以RNP的形式与15μg Cas9和15μg gRNA混合。使用标准电穿孔程序对CD34+HSC进行电穿孔。表5中提供了实验条件。
表5.
细胞数量 条件 Cas9 向导浓度
1M Cas9+gRNA CD34-2 15ug 15ug
1M Cas9+gRNACD34-3 15ug 15ug
1M Cas9+gRNA CD34-5 15ug 15ug
1M 模拟电穿孔(模拟)
1M 无电穿孔(无EP)
在电穿孔后24小时和96小时，采集细胞进行细胞计数、活力分析、纯化和测序分析。发现使用指示的CD34 gRNA编辑的细胞的细胞计数和活力与模拟编辑的细胞(模拟)或未电穿孔的细胞(无EP)具有类似水平的活力，如图5B和5C所示。
还通过使用抗CD34抗体(抗CD34-PE德克萨斯红)的流式细胞术分析(FACS)评估CD34 gRNA编辑的细胞的CD34蛋白的表面表达。发现其中CD34基因已被基因修饰的细胞具有降低的CD34表达，如通过FACS检测的。参见图6A、6B和7A-7D。
实例3：大规模电穿孔——168小时时间点
根据制造商的说明对冷冻的CD34+HSC进行解冻。为了编辑HSC，在用RNP电穿孔之前，将～HSC解冻并在补充有StemSpan CC110混合物(干细胞技术公司)的StemSpan SFEM培养基中培养约48小时，如图8所示。为了对HSC进行电穿孔，将大约1×106个细胞沉淀并重悬于电穿孔溶液中，并且以RNP的形式与15μg Cas9和15μg gRNA混合，并且然后使用标准电穿孔程序进行电穿孔。表6中提供了实验条件。
表6.
细胞数量 条件 Cas9 向导浓度
1M Cas9+gRNA CD34-2 15ug 15ug
1M Cas9+gRNA CD34-3 15ug 15ug
1M 模拟电穿孔(模拟)
1M 无电穿孔(无EP)
在电穿孔后24小时、48小时、120小时、144小时和168小时，采集细胞进行细胞计数、活力分析、纯化和测序分析。发现使用指示的CD34 gRNA编辑的细胞的细胞计数和活力与模拟编辑的细胞(模拟)或未电穿孔的细胞(无EP)具有类似水平的活力。
还通过使用抗CD34抗体(抗CD34-PE德克萨斯红)的流式细胞术分析(FACS)评估CD34 gRNA编辑的细胞的CD34蛋白的表面表达。在电穿孔后48小时，发现其中CD34基因已被基因修饰的细胞具有略微降低的CD34表达，如通过FACS检测的。参见图9A和9B。然而，在电穿孔后168小时，发现其中CD34基因已被基因修饰的细胞具有降低的CD34表达，如通过FACS检测的。参见图10A和10B。
实例4：CAR-T细胞毒性测定
使用表1或2中所示的gRNA产生的基因修饰的细胞可以评估CD34-CAR T细胞的杀伤。
CAR构建体和慢病毒产生
构建第二代CAR以靶向CD34。示例性CAR构建体由细胞外scFv抗原结合结构域组成，使用CD8α信号肽、CD8α铰链和跨膜区、4-1BB共刺激结构域和CD3ξ信号传导结构域。抗CD34 scFv序列可以从本领域已知的任何抗CD34抗体获得。将靶标的CAR cDNA序列亚克隆到pCDH-EF1α-MCS-T2A-GFP表达载体的多克隆位点中，并且按照制造商的方案(系统生物科学公司(System Biosciences))产生慢病毒。慢病毒可以通过使用Lipofectamine 3000(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))瞬时转染293TN细胞(系统生物科学公司)来产生。示例性CAR构建体是通过将抗CD34抗体的轻链和重链克隆到CD8α铰链结构域、ICOS跨膜结构域、ICOS信号传导结构域、4-1BB信号传导结构域以及CD3ξ信号传导结构域到慢病毒质粒pHIV-Zsgreen中而产生的。
CAR转导和扩增
根据制造商的方案(干细胞技术公司(Stem Cell Technologies))，使用抗CD4和抗CD8微珠通过磁珠分离从Leuko Pak(干细胞技术公司)分离人原代T细胞。将纯化的CD4+和CD8+T细胞以1:1混合，并且使用抗CD3/CD28偶联的动力珠(赛默飞世尔公司)以1:1的珠细胞比激活。所使用的T细胞培养基是补充有免疫细胞血清替代物、L-谷氨酰胺和GlutaMAX(均购自赛默飞世尔公司)和100IU/mL的IL-2(派普泰克公司(Peprotech))的CTSOptimizer T细胞扩增培养基。T细胞转导在激活后24小时在聚凝胺(西格玛公司(Sigma))存在下通过旋转接种进行。在冷冻保存之前将CAR-T细胞培养9天。在所有实验之前，将T细胞解冻并在37℃下放置4小时至6小时。
基于流式细胞术的CAR-T细胞毒性测定
靶细胞的细胞毒性是通过比较靶细胞的存活率相对于阴性对照细胞的存活来测量的。对于CD34细胞毒性测定，可以使用CD34+细胞作为靶细胞，并且可以如实例1至3中所描述的产生缺乏CD34或CD34表达降低的CD34+细胞。
根据制造商的说明，分别用CellTrace Violet(CTV)和CFSE(赛默飞世尔公司)对靶细胞和阴性对照细胞进行染色。染色后，将靶细胞和阴性对照细胞以1:1混合。
使用抗CD34 CAR-T细胞作为效应子T细胞。使用未转导的T细胞(模拟CAR-T)作为对照。效应子T细胞与靶细胞/阴性对照细胞混合物以1:1的效应子与靶细胞的比例共培养，一式两份。包含一组单独的没有效应子T细胞的靶细胞/阴性对照细胞混合物作为对照。在流式细胞术分析之前，将细胞在37℃下温育24小时。碘化丙啶(赛默飞世尔公司)被用作活力染料。为了计算特异性细胞裂解，使用活靶细胞与活阴性对照细胞的级分(称为靶级分)。特异性细胞裂解计算为((没有效应子细胞的靶级分-有效应子细胞的靶级分)/(没有效应子的靶级分))×100％。
实例5：抗CD34抗体药物缀合物对工程化HSC的影响
使用表X中所示的gRNA产生的基因修饰的细胞可以通过抗体-药物缀合物(如免疫毒素的抗CD34抗体)来评估杀伤。
将源自动员的外周血的冷冻CD34+HSPC解冻并培养72小时，然后用包括Cas9和sgRNA的核糖核蛋白进行电穿孔。样品在以下条件下进行电穿孔：
i.模拟(仅Cas9)，以及
ii.KO sgRNA(如表X中所示的CD34 gRNA中的任一种)。
使细胞恢复72小时并收集和分析基因组DNA。通过流式细胞术评估CD34阳性细胞的百分比，以证实用CD34 gRNA编辑在敲除或减少CD34表达方面是有效的。HSC中的编辑事件导致了各种INDEL序列。
具有CD34缺失的细胞对抗体-药物缀合物的敏感性
为了确定体外毒性，将细胞与抗体-药物缀合物在培养基中一起温育，并且随着时间的推移定量活细胞的数量。与表达全长CD34的细胞(模拟)相比，用本文所描述的CD34gRNA产生的缺乏CD34或CD34表达减少的工程化细胞对抗体-药物缀合物治疗更具抗性。
(ii)CD34编辑的细胞的富集
为了测定CD34修饰的细胞在用抗体-药物缀合物处理后是否富集，用50％的标准核酸酶(例如，Cas9、Cpf1)与gRNA的比率编辑HSPC。在用抗体-药物缀合物处理之前和之后分析细胞的大量群体。在用抗体-药物缀合物处理后，CD34编辑的细胞富集，使得CD34缺陷细胞的百分比增加。
(iii)CD34编辑的HSPC的体外分化
在分化后的不同天，在用抗体-药物缀合物治疗之前和之后评估细胞群体的淋巴分化。用本文所描述的CD34 gRNA产生的工程化CD34敲除细胞可以显示分化标志物的表达增加，而表达全长CD34(模拟)的细胞可能不分化。
实例6：CD34KO细胞在体内的持久性评价
编辑动员的外周血CD34+HSC(mPB CD34+HSPC)
gRNA(Synthego公司(Synthego))如实例1至3中所描述的进行设计。mPB CD34+HSPC从弗雷德哈钦森癌症中心(Fred Hutchinson Cancer Center)购买，并且根据制造商的说明进行解冻。然后，如实例1至3终所描述的，使用本文所描述的靶向CD34的gRNA以及设计为不靶向人或小鼠基因组中的任何区域的非CD34靶向对照gRNA(gCtrl)，通过CRISPR/Cas9编辑这些细胞。
在离体编辑后4小时、24小时和48小时，使用流式细胞术和7AAD活力染料定量活的、编辑的CD34KO细胞和对照细胞的百分比。使用本文所描述的CD34 gRNA编辑的高水平CD34KO细胞在电穿孔和基因编辑后可能是活的，并且随着时间的推移保持活的，与在用非CD34靶向对照gRNA gCtrl编辑的对照细胞中观察到的相当。
另外，在离体编辑后48小时，从细胞中采集基因组DNA，用靶区侧翼的引物进行PCR扩增、纯化，并且通过TIDE进行分析，以确定如通过INDEL(插入/缺失)评估的编辑百分比，如实例1至3中所描述的。
在TIDE分析之后，通过流式细胞术定量用本文所描述的CD34 gRNA编辑后的长期HSC(LT-HSC)的百分比。评估用指定的CD34 gRNA编辑后LT-HSC的百分比。此测定可以在例如编辑的细胞的冷冻保存时，在注射到小鼠中用于研究CD34KO细胞在体内的持久性之前进行。编辑的细胞在CS10培养基(干细胞技术公司)中以5×106个细胞/mL冷冻保存，每小瓶1mL体积的培养基。
CD34KO mPB HSPC在体内的移植效率和持久性研究
允许6周至8周龄的雌性NSG小鼠(JAX)适应2天至7天。适应之后，通过X射线照射器使用175cGy的全身照射来照射小鼠。这被视为调查的第0天。在照射后4小时至10小时，用本文所描述的任何CD34 gRNA期间产生的CD34KO细胞或用gCtrl编辑的对照细胞移植小鼠。冷冻保存的细胞被解冻并使用BioRad TC-20自动细胞计数器进行计数。在解冻的小瓶中定量活细胞的数量，其用于制备用于移植到小鼠中的细胞总数。对小鼠给与单次静脉内注射体积为100μL的1×106个编辑的细胞。四组中每只小鼠每周记录一次体重和临床观察结果。
在移植后第8周和第12周，通过眶后采血从每只小鼠收集50μL的血液，用于通过流式细胞术进行分析。在移植后的第16周，处死小鼠，收集血液、脾脏和骨髓，用于通过流式细胞术进行分析。骨髓是从股骨和胫骨中分离的。来自股骨的骨髓也用于在靶编辑分析。使用FACSCantoTM10色和BDFACSDivaTM软件进行流式细胞术。通常首先使用7AAD活力染料通过活力对细胞进行分选(活/死分析)，然后通过人CD45(hCD45)而不是小鼠CD45(mCD45)的表达对活细胞进行门控。为hCD45+的细胞然后被进一步门控用于人CD19(hCD19)(淋巴细胞，特别是B细胞)的表达。表达人CD45(hCD45)的细胞也被门控并分析髓系谱系的各种细胞标志物的存在。
表达每种分析的标志物的细胞数量在所有小鼠中都是相当的，无论其用哪种编辑的细胞移植，这表明用CD34 gRNA编辑的CD34KO细胞在小鼠血液中成功移植。
在移植后第8周、第12周和第16周，在接受用对照gRNA(gCtrl)编辑的对照细胞或CD34KO细胞的小鼠组(n＝15只小鼠/组)中，定量为hCD45+的有核血细胞的百分比。这是通过hCD45+绝对细胞计数除以小鼠CD45+(mCD45)绝对细胞计数来定量的。
在对照和CD34KO小鼠组中，也在移植后第8周定量血液中hCD34+细胞的百分比。在第8周、第12周和第16周，与用对照细胞移植的小鼠相比，用CD34KO细胞(用本文所描述的任何CD34 gRNA编辑)移植的小鼠预期具有显著更低水平的hCD34+细胞。
接下来，在用CD34KO细胞或对照细胞移植的小鼠中，在移植后第8周、第12周和第16周，定量血液中分化的细胞的特定群体的百分比，如CD19+淋巴细胞、hCD14+单核细胞和hCD11b+粒细胞/嗜中性粒细胞。血液中hCD19+细胞、hCD14+细胞和hCD11b+细胞的水平在对照与CD34KO组之间是相等的，并且这些细胞的水平从移植后第8周至第16周保持相等。血液中hCD19+、hCD14+和hCD11b+细胞的相当水平表明，在接受CD34KO细胞的小鼠和接受对照细胞的小鼠中存在相似水平的人髓系和淋巴系细胞群体。
最后，可以对移植后第16周分离的骨髓样品进行扩增子测序，以分析用编辑的CD34KO细胞移植的小鼠的在靶CD34编辑。
评估从移植的动物的脾脏中获得的细胞样品
在移植后第16周，还在用对照细胞或CD34KO细胞移植的小鼠的脾脏中定量hCD45+细胞的百分比和hCD34+细胞的百分比。小鼠组(用对照细胞或CD34KO细胞移植)之间hCD45+细胞的相当水平和hCD34+细胞的降低的水平可能表明CD34KO HSC在NSG小鼠的脾脏中长期持久性。
另外，在移植后第16周，定量脾脏中hCD14+单核细胞、hCD11b+粒细胞/嗜中性粒细胞、CD19+淋巴细胞和hCD3+T细胞的百分比。对照与CD34KO组之间脾脏中hCD14+细胞、hCD11b+细胞、hCD19+细胞和hCD3+的相当水平可能表明编辑的CD34KO细胞能够在NSG小鼠的脾脏中重建多谱系人造血细胞。
评估血液和骨髓嗜中性粒细胞
在移植后第16周，对用对照细胞或CD34KO细胞移植的小鼠的血液和骨髓中hCD11b+细胞的百分比进行定量。在用对照细胞和CD34KO细胞移植的NSG小鼠的血液和骨髓两者中观察到的CD11b+嗜中性粒细胞群体的相当水平表明移植和分化成功。
评估血液和骨髓髓系和淋巴祖细胞
此外，在第16周，在用对照细胞或CD34KO细胞移植的小鼠中，对血液中hCD123+细胞的百分比和骨髓中hCD123+细胞的百分比以及骨髓中hCD10+细胞的百分比进行定量。对照与CD34KO组之间髓系和淋巴祖细胞的相当水平可以表明移植和发育成功。
实例7：CD34编辑的HSC集落形成单位(CFU)的基因分型分析
此实例证明了在分化之前通过CFU分析和INDEL分析对示例性CD34编辑的HSC的表征。HSC使用以下示例性向导RNA编辑：CD34-2或CD34-3。
图11A示出了在此和后面的实例中用于HSC编辑的实验方法。简而言之，在用RNP电穿孔之前，将2×106个冷冻CD34+HSC解冻并在补充有StemSpan CC110混合物(干细胞技术公司)的StemSpan SFEM培养基中培养约48小时。将大约2×105个细胞沉淀并重悬于电穿孔溶液中，并且以RNP形式与3μg Cas9和3μg gRNA混合。使用标准电穿孔程序对CD34+HSC进行电穿孔。将2×105个细胞包含在用于编辑的样品中(用包括CD34-2和Cas9的RNP，或用包括CD34-3和Cas9的RNP进行电穿孔)，以及无电穿孔(无EP)对照，以及用对照向导进行电穿孔的样品(包括对照向导RNA的RNP，其被设计为不靶向人基因组中的任何区域)。
编辑的CD34 HSC CFU的评估
编辑的HSC和接受模拟治疗的HSC的CFU水平相似(图11B-11C)。这些结果表明CD34编辑不影响细胞分化。TIDE分析用于确定使用CD34-2(向导2)和CD34-3(向导3)获得的单个CD34编辑的BFU和CFU的编辑效率。在分析的大多数BFU和CFU中观察到合适的编辑效率(图11D和11E)。对CD34编辑的HSC中产生的编辑的分析表明，在使用CD34-2编辑的细胞中，+1INDEL是优势物种(72％)，导致移码，所述移码导致转录物提前终止(图11F、11L、11N和11P)。因此，通过使用CD34-2编辑产生的INDEL的优势物种导致截短蛋白的产生。CD34-3编辑的细胞显示，-12INDEL是优势物种(32％)，导致4个氨基酸缺失，随后是-1INDEL(24％)，导致移码，所述移码导致转录物提前终止(图11G、11O和11Q)。
进一步分析BFU和CFU以确定编辑是单等位基因或双等位基因。对使用向导CD34-2和CD34-3获得的CD34编辑的BFU和CFU中产生的编辑的分析显示，双等位基因编辑的百分比很高(图11H-11K)。在CFU和BFU两者中检查的两个向导均观察到双等位基因编辑(图11J和11K)。对单个集落的indel分析证实了向导CD34-2的优势+1INDEL和向导CD34-3的优势-12和-1INDELS(图11L-11O)。对两种向导的优势INDEL物种的分析表明，向导CD34-2的+1INDEL导致提前终止和截短(图11N)，而向导CD34-3的优势-12INDEL导致CD34细胞外结构域中4个氨基酸的缺失，并且此向导的次频繁-1INDEL导致提前终止和截短(图11Q)。
CD34敲除时间进程研究
使用向导RNA CD34-2或CD34-3进行CD34编辑后，评估三种不同供体HSC样品(供体1、供体2和供体3)的活力。如上文所描述的制备细胞并对其进行电穿孔。在离体编辑后24小时和48小时，定量活的、CD34编辑的细胞(使用向导CD34-2和CD34-3)和对照细胞(未电穿孔的(无EP)或使用不靶向CD34的对照向导电穿孔的(sgCTRL))的平均细胞计数和百分比。CD34编辑的细胞是活的，并且在电穿孔和基因编辑后随着时间的推移保持为活的，与用对照gRNA进行电穿孔的对照细胞和未电穿孔的细胞相比，在CD34编辑的细胞中没有观察到活力的显著差异(图12A-12C)。
对于所有基因组分析，从细胞中采集DNA，用靶区侧翼的引物扩增、纯化，并且使用TIDE(通过分解追踪Indel)分析等位基因修饰频率。使用“无EP”和“sgCTRL”数据集作为参考对编辑的细胞进行的ICE分析表明，在用CD34-2(图12D、12F和12H)或CD34-3向导(图12E、12G和12I)编辑的所有三个编辑的供体HSC样品中，INDEL产生在48小时时间点可检测到，并且在216小时时间点保持存在。在编辑的供体HSC中存在的INDEL的优势物种对应于在实例的前面部分中观察到的那些。
在一些情况下，早在电穿孔后48小时，以及在所有供体样品中电穿孔后120小时，通过流式细胞术检测到编辑的HSC中表面CD34表达的减少(图12J-12V)。这些结果证实了使用示例性向导CD34-2或CD34-3中的任一种成功地破坏了HSC的三个供体样品中的CD34。对于使用向导CD34-2或CD34-3编辑的样品以及“无EP”和“sgCTRL”对照样品，计算不同时间点的CD34+细胞百分比，将两个不同供体平均在一起(图12W)。结果和计算的标准偏差表明，在供体之间，通过两个示例性向导的编辑显著降低了CD34+细胞的频率，产生了具有约85％细胞的群体，在用CD34-2进行电穿孔后216小时没有显示出可检测的CD34表达，并且具有70％以上细胞的细胞群体在用CD34-3进行电穿孔后216小时没有显示出可检测的CD34表达。
实例8：CD34髓细胞的体外分化(IVD)
此实例证明了CD34编辑的人HSPC在使用本文所提供的示例性向导RNA编辑后的体外分化能力的表征。通过在粒细胞和单核细胞诱导培养基条件下培养细胞，在分化后的不同天使用向导CD34-2或CD34-3对CD34进行CRISPR/Cas9编辑，评估细胞群体的髓系分化。所遵循的实验方法在图13A中示出。
体外分化的HSC的编辑结果的评估
电穿孔后48小时，PCR扩增后凝胶电泳证实在IVD培养基中培养的细胞中存在编辑的基因组DNA(图13B)。电穿孔后48小时从编辑的HSC中采集的DNA的TIDE分析确定了CD34-2处理的细胞中+1位置处以及CD34-3处理的细胞的-1和-12位置处的INDEL产生的编辑效率，证实了成功的编辑结果(图13C和13D)。来自CD34编辑的HSC的分化的细胞的免疫表型分析表明，与无EP和gCTRL对照HSC相比，CD34编辑不影响CD34编辑的细胞的分化潜力(图13E-13L)。在CD34编辑的与对照细胞群体之间没有观察到分化标志物的表达的显著差异。例如，单核细胞表面标志物CD11b或CD14或CD15粒细胞标志物的随时间推移的表达，评估为表面标志物阳性细胞％或通过几何平均荧光强度，在CD34编辑的细胞群体中与对照细胞群体相比没有显著差异。这些结果表明，CD34编辑不会破坏编辑的HSC分化为髓系谱系或诱导分化偏向的分化能力。
实例9：CD34编辑的小鼠的体内表征
此实例描述了在小鼠模型中表征体内CD34编辑的HSC的体内实验。示例性的实验设置在图14A中示出。
简而言之，如本文所描述的，使用示例性靶向CD34的向导RNA(CD34-2和CD34-3)以及非CD34靶向对照gRNA(gCtrl)，通过CRISPR/Cas9编辑人CD34+HSC。在离体编辑后24小时和48小时，对活的、CD34编辑的细胞和对照细胞的百分比进行定量，并且证实合适的活力(>80％)和编辑(>60％)水平，如本文其它地方更详细描述的。编辑的细胞在CS10培养基(干细胞技术公司)中以5×106个细胞/mL冷冻保存，每小瓶1mL体积的培养基。
冷冻保存的细胞被解冻并使用BioRad TC-20自动细胞计数器进行计数。在解冻的小瓶中定量活细胞的数量，并且用于制备用于移植到小鼠中的细胞总数。在实验的第0天，使用175cGy全身照射对6周至8周龄的雌性NSG小鼠(JAX)进行照射，并且在照射后4小时至10小时，用如本文所描述的产生的CD34编辑的细胞或用gCtrl进行电穿孔的对照细胞移植小鼠。对小鼠给与单次静脉注射体积为100μL的1×106个编辑的细胞。三组中每只小鼠每周记录一次体重和临床观察结果。
在移植后第8周、第9周和第12周，通过眶后采血从每只小鼠收集50μL的血液，用于通过流式细胞术进行分析。在移植后的第16周，处死小鼠，收集血液、脾脏、骨髓和胸腺，用于通过流式细胞术进行分析。骨髓是从股骨和胫骨中分离的。来自股骨的骨髓也用于在靶编辑分析。使用Beckman Coulter CytoFLEX LX软件进行流式细胞术。通常首先(例如，使用7AAD活力染料(活/死分析))对细胞进行活力分选，然后通过人CD45(hCD45)而不是小鼠CD45(mCD45)的表达对活细胞进行门控。然后对为hCD45+的细胞进行进一步门控，以表达人淋巴或髓系细胞表面标志物，以证明源自人HSC的细胞对血液系统的移植和再增殖。例如，分析表达人CD45的细胞的CD19(hCD19)的表达，以检测淋巴细胞，特别是B细胞，或其它淋巴细胞标志物，例如T细胞标志物或NK细胞标志物的表达。表达人CD45(hCD45)的细胞也被分析髓系谱系的各种细胞标志物的存在。
在移植后第8周、第12周和第16周，在接受用对照gRNA(gCtrl)编辑的对照细胞或CD34编辑的细胞的小鼠组(n＝10只小鼠/组)中，定量为hCD45+的有核血细胞的百分比。此值是通过hCD45+绝对细胞计数除以小鼠CD45+(mCD45)绝对细胞计数来计算的。
血液中hCD34+细胞的百分比也在对照组和CD34编辑的小鼠组中移植后第8周进行定量，作为对人和小鼠细胞嵌合的评估。在第8周、第12周和第16周，与用对照细胞(不是CD34编辑的，例如无电穿孔或使用不靶向CD34的对照向导编辑的)移植的小鼠相比，用CD34编辑的细胞(例如，如本文所描述的用CD34-2编辑的)移植的小鼠具有相似水平的hCD34+细胞。
接下来，分析分化的细胞的特定群体的百分比。例如，在用CD34编辑的细胞或对照细胞移植的小鼠中，在移植后第8周、第12周和第16周，定量血液中的CD19+淋巴细胞、hCD14+单核细胞和hCD11b+粒细胞/嗜中性粒细胞的百分比。血液中hCD19+细胞、hCD14+细胞和hCD11b+细胞的水平在对照与CD34编辑的组之间是相等的，并且这些细胞的水平从移植后第8周至第16周保持相等。在血液中观察到hCD19+、hCD14+和hCD11b+细胞的相当水平，表明CD34编辑的HSC在照射的NSG小鼠中成功移植和分化，并且表明在接受CD34编辑的细胞的小鼠和接受对照细胞的小鼠中存在相似水平的人髓系和淋巴系细胞群体。
CD34编辑的存在和频率在接受CD34编辑的细胞群体的NSG动物的移植的细胞中得到证实。对移植后第16周分离的骨髓样品进行扩增子测序，以分析用编辑的CD34编辑的细胞移植的小鼠中的CD34编辑。骨髓中CD34编辑的细胞的存在得到证实，证明了CD34编辑的细胞成功移植的能力。CD34编辑的HSC的存在通过骨髓源性细胞或循环PBMC细胞的免疫表型和鉴定为CD34-、CD45RA-、CD49c+、CD90+、CD201+和lin-的CD34编辑的细胞来证实。
在移植后第16周，对用对照细胞或CD34编辑的细胞移植的小鼠的血液和骨髓中hCD11b+细胞的百分比进行定量。在用对照细胞和CD34编辑的细胞移植的NSG小鼠的血液和骨髓两者中观察到的CD11b+嗜中性粒细胞群体的相当水平表明移植和分化成功。
在移植后第16周，还在用对照细胞或CD34编辑的细胞移植的小鼠的脾脏中定量hCD45+细胞的百分比和hCD34+细胞的百分比。小鼠组(用对照细胞或CD34编辑的细胞移植)之间hCD45+细胞的相当水平和hCD34+细胞的降低的水平可能表明CD34编辑的HSC在NSG小鼠的脾脏中长期持久性。另外，在移植后第16周，定量脾脏中hCD14+单核细胞、hCD11b+粒细胞/嗜中性粒细胞、CD19+淋巴细胞和hCD3+T细胞的百分比。对照与CD34编辑的组之间脾脏中hCD14+细胞、hCD11b+细胞、hCD19+细胞和hCD3+的相当水平可能表明CD34编辑的细胞能够在NSG小鼠的脾脏中重建多谱系人造血细胞。
在移植后第16周，还在用对照细胞或CD34编辑的细胞移植的小鼠的胸腺中定量hCD45+细胞的百分比和hCD34+细胞的百分比。另外，在移植后第16周，对胸腺中CD3+细胞的百分比(作为hCD45+细胞的百分比)进行定量。对照与CD34编辑的组之间胸腺中hCD3+的相当水平可能表明CD34编辑的细胞能够在NSG小鼠的胸腺中重建多谱系人造血细胞。
实例10：患有造血病症的受试者的CD34+HSC的消融
使用包括CD34修饰的HSC的同种异体造血细胞移植(HCT)和抗CD34免疫治疗(例如，使用与卡奇霉素(calicheamicin)部分结合的CD34抗体)治疗患有造血病症(例如，血液恶性肿瘤，其中恶性细胞(例如，癌症干细胞)表达CD34)的受试者。
对于HCT，根据本文所描述的方法获得包括CD34编辑的造血干细胞的细胞群体，例如通过从健康供体获得在8/8基因座(HLA-a、-B、-C、DRB1)处与受试者HLA匹配的HSC，并且使用向导CD34-2或CD34-3编辑HSC。
HSC是在G-CSF/普乐沙福(plerixafor)动员至多两次单采程序后从供体获得的。通过单采从供体获得至少10×106个活细胞/kg(其中kg是指受体受试者体重)，用于处理、编辑和随后向受体受试者施用。从这种单采产物中，至少3.0×106个活细胞/kg(受体体重)经过最小的操作，并且被冷冻保存以用作备用干细胞源，例如用作救援剂量。单采产物的剩余部分用于处理和制备用于HCT的CD34编辑的HSC群体。
如上文所描述的，通过富集CD34+细胞的单采产物，然后电穿孔和用CD34 gRNA/Cas9复合物编辑，使用本文所描述的CD34向导CD34-2或CD34-3制备用于HCT的CD34编辑的HSC群体。
随后将CD34编辑的细胞置于培养物中约48小时。采集后，在培养持续时间结束后，洗涤细胞，重悬于最终调配物中，并且冷冻保存。使用代表性样品确认细胞活力和编辑效率，并且将CD34编辑的HSC群体用于HCT，所述群体被证实包括至少70％的活细胞和至少45％的CD34编辑效率。用于向受试者施用的CD34编辑的细胞群体包括满足这些活力和编辑效率标准并包括至少3×106个细胞/kg受体受试者体重的CD34编辑的HSC群体，并且优选地包括至少4×106个细胞/kg、5×106个细胞/kg、6×106个细胞/kg或7×106个细胞/kg受体受试者。
使用常规临床程序对受试者进行调节，以消融受试者的造血干细胞，包含表达CD34的任何恶性细胞。在调节方案完成后，受试者通过静脉内(IV)输注接受包括解冻的CD34编辑的HSC的HCT。HCT的日期是治疗方案的第0天。
在第28天，通过测量受试者的CD34编辑的(CD34-，例如截短的CD34或表位编辑的CD34)嗜中性粒细胞的绝对外周嗜中性粒细胞计数(ANC)来评估受试者的CD34编辑的HSC移植。如果受试者在HCT后28天表现出绝对外周CD34编辑的嗜中性粒细胞计数≥1000/dLCD33-ANC，则视为受试者被认为表现出嗜中性粒细胞恢复(也称为成功的CD34编辑的嗜中性粒细胞移植)。
如果受试者在第28天表现出嗜中性粒细胞恢复，则在第60天从受试者获得骨髓活检，以评估疾病状态和造血恢复。另外，此时从外周血中确定供体嵌合百分比和CD34编辑的髓系造血。如果受试者在第60天表现出成功的CD34编辑的HSC移植和CD34编辑的造血，则随后向受试者施用CD34抗体-药物缀合物。CD34靶向的免疫治疗，例如抗CD34抗体-药物缀合物的施用优选地在第60天骨髓活检的30天内开始，即优选地在第90天开始。然而，如果受试者的临床状态，例如，考虑到合并症，包含例如HCT相关的合并症，需要此类延迟，或为了使受试者达到≥1000/dL CD33-ANC，CD34靶向的免疫治疗的开始可能会延迟到至多第120天。如果CD34靶向的免疫治疗在第60天骨髓活检后超过30天开始，则在开始CD34靶向的免疫治疗之前完成重复的骨髓活检。
CD34靶向的免疫治疗以其推荐剂量施用，以消融受试者的所有表达CD34的造血细胞。然而，一些受试者可能会被施用较低剂量，例如在出现治疗相关不良反应的情况下，例如，剂量限制毒性(DLT)，或考虑到个体受试者的健康状况、合并症或病史。
可替代地，在HCT之前，不对受试者进行常规的调节方案以消融受试者自身表达CD34的血细胞，但通过施用CD34靶向的免疫治疗(如靶向CD34的抗体-药物缀合物或靶向CD34的CAR-T细胞群体)靶向受试者的表达CD34的细胞。在此类情况下，受试者可以在CD34编辑的HSC的HCT之前被施用一个免疫治疗循环，并且在HCT之后施用免疫治疗循环。可替代地，受试者可以在HCT之后以一个或多个循环施用免疫治疗，从而完全放弃HCT前的调节方案。
在施用免疫治疗后，评估受试者是否存在恶性细胞。在受试者中观察到恶性细胞，特别是表达CD34的恶性细胞的数量显著减少，或表达CD34的恶性细胞完全消融。另外，在受试者中观察到CD34编辑的HSC的长期移植和CD34编辑的HSC的所有细胞谱系的重建。
等效物和范围
本领域的技术人员仅使用常规实验将认识到或者能够确定本文描述的实施例的许多等效形式。本公开的范围不旨在限于以上描述，而是如所附权利要求书中所阐述的。
冠词如“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”可以意指一个或多个，除非指明与上下文相反或另外根据上下文是显而易见的。如果组成员中的一个、多于一个或全部存在，则在所述组的两个或多个成员之间包含“或”的权利要求或描述被认为是满意的，除非指明与上下文相反或另外地根据上下文是显而易见的。在两个或多个组成员之间包含“或”的组的公开提供了其中恰好存在所述组的一个成员的实施例、其中存在所述组的一个以上成员的实施例以及其中存在所述组的所有成员的实施例。为了简洁的目的，这些实施例在本文中没有单独阐述，但应理解，这些实施例中的每一个都在本文中提供，并且可以被特别要求保护或否认。
应理解，本发明涵盖所有变体、组合和排列，其中将来自一个或多个权利要求或来自说明书的一个或多个相关部分的一个或者多个限制、元素、从句或描述性术语引入到另一个权利要求中。例如，从属于另一项权利要求的权利要求可以修改为包含在从属于同一基本权利要求的任何其它权利要求中发现的一个或多个限制。此外，在权利要求列举组合物的情况下，应理解，除非另外指示或者除非对于本领域的普通技术人员来说明显将出现矛盾或不一致，否则包含根据本文公开的任何制备或使用方法或根据本领域已知的方法(如果有的话)制备或使用组合物的方法。
在元素是以例如马库什基团(Markush group)格式等列表形式呈现的情况下，应理解，也公开了所述元素的每个可能的亚基团，并且可以从所述基团中去除任何元素或元素的亚基团。还应注意，术语“包括”意图是开放的，并且允许包含另外的要素或步骤。应理解，通常在实施例、产品或方法被称为包括特定元件、特征或步骤的情况下，也提供了由此类元件、特征或步骤组成或基本上由其组成的实施例、产品或方法。为了简洁的目的，这些实施例在本文中没有单独阐述，但应理解，这些实施例中的每一个都在本文中提供，并且可以被特别要求保护或否认。
在给定范围的情况下，包含端点。此外，应当理解，除非从本领域的普通技术人员的上下文和/或理解中另外指示或以其它方式显而易见，否则表达为范围的值可以假定在一些实施例中到范围下限的单位的十分之一的任何特定值，除非上下文另外明确指出。为了简洁的目的，每个范围中的值在本文中没有单独阐述，但应理解，这些值中的每一个都在本文中提供，并且可以被特别要求保护或否认。还应理解，除非另有指示或从上下文和/或本领域普通技术人员的理解中明显可见，否则表示为范围的值可以假定给定范围内的任何子范围，其中子范围的端点以与所述范围的下限的单位的十分之一相同的精度表示。
另外，应当理解的是，本发明的任何特定实施例都可以明确地从权利要求中的任何一个或多个中排除。在给定范围的情况下，所述范围内的任何值都可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。本文所描述的组合物和/或方法的任何实施例、元件、特征、应用或方面可以从任何一个或多个权利要求中排除。为了简洁的目的，本文没有明确地阐述排除了一个或多个元件、特征、目的或方面的所有实施例。
序列表
<110> VOR生物制药股份有限公司
<120> 用于CD34修饰的组合物和方法
<130> V0291.70020WO00
<140> 尚未分配
<141> 与此同时
<150> US 63/132,852
<151> 2020-12-31
<160> 64
<170> PatentIn 3.5版
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Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr
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Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu Thr Thr Thr Pro
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Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser Ser Val Gln Ser
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Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro Ala Asn Val Ser
115 120 125
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Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser Pro Thr Lys Pro
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Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys Ala Glu Ile Lys
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195 200 205
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210 215 220
Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser Glu Val Arg Pro
225 230 235 240
Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu Ile Ser Ser Lys
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Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln Ser Tyr Ser Gln
275 280 285
Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu Leu Ala Val Leu
290 295 300
Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser Trp Ser Pro Thr
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Gly Glu Arg Leu Gly Glu Asp Pro Tyr Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Gly
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340 345 350
Ala Ser Val Asn Arg Gly Ala Gln Glu Asn Gly Thr Gly Gln Ala Thr
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Ser Arg Asn Gly His Ser Ala Arg Gln His Val Val Ala Asp Thr Glu
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<400> 17
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cagggaacat tttcaaatgt ttctacaaat gtatcctacc aagaaactac aacacctagt 240
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atcacagaaa cgacagtcaa attcacatct acctctgtga taacctcagt ttatggaaac 360
acaaactctt ctgtccagtc acagacctct gtaatcagca cagtgttcac caccccagcc 420
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ctttcaacca ctagcactag ccttgcaaca tctcccacta aaccctatac atcatcttct 540
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aggggagagg gcctggcccg agtgctgtgt ggggaggagc aggctgatgc tgatgctggg 720
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gtcttggcca acagaacaga aatttccagc aaactccaac ttatgaaaaa gcaccaatct 840
gacctgaaaa agctggggat cctagatttc actgagcaag atgttgcaag ccaccagagc 900
tattcccaaa agaccctgat tgcactggtc acctcgggag ccctgctggc tgtcttgggc 960
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aagggaggtg gcttgcccaa tcacccagaa ttccaaagtc ctgaatctgt agttttccct 3960
tccatcatat catcctactc ttctgccgag tcctccgtgt tactccagtt ggatgtcatg 4020
aagccagtgt ggcagtgtga agataggttt gggacttcac ttctggagca tttcatcaac 4080
ataagctatc ctaggcctgg ccagccaagc aggtcctgga ggagccccag gacaaagatc 4140
acaggaggcc atgaggttcg gcttcttcgg cgcccacagt gagcccagga aaattagctg 4200
tagggtatta cactgttgac tatggagagc atatctggaa ttatcttcag ccagattttc 4260
atctgaatgg ataaatggga ataccatcta agtccagata aatagatcac ttccatctca 4320
tcccttctag gtagattaat cccacacttc ctcttcacac aaaaccagta ataggtcatc 4380
gattttgtgc aacaggatgc tgcttctctt cctaaagccc ccatcgaaga ggcttccagc 4440
caccattcaa tcattcatca agtcttatga tgtgccagac actgcgcgaa atgtgccaga 4500
acatctgtta tgtgccagac actgttcttg agactgggga tacagcaaac actcatgaag 4560
cttataattc tagcagaaga ggacagtaaa caatgtcatc tcagtaagta tatacatgtg 4620
ttttcaggat tgagagctat gaaaaacata aaatatattg agaataatgg ttggtatttt 4680
acatatggtg gttactttta gaaaaataac agtggagagc acagcttcac ttgaatgaag 4740
tggagaagca ggttgtatgc caagctggga gagattatcc cacacagggg aaaggacaag 4800
tgcaaagccc tatgatgaaa agctgccaag tgcagaaagc ctcagatggc agggggcaag 4860
atggccatga ggttgtgtca gtgagtgggg gtggggagag gcaggaggtc agactacatg 4920
gggccttttt agttgtagat tgggaagcca ctggagggtt ttgagcagag aagtcatatc 4980
atctgcttta tgttttaaaa ggatcatgct ggctgctgag tagagaatag aggttgaggg 5040
ataagaaagt agaaggagac cgtagcaaga agaacgatca tggctgggag caggtgatca 5100
tattggcagt gatgagatca agcagaattc aaaaagtggt ttcaaagtag aggtaacagg 5160
acttgctcag tctatttatt tcttcaaata ataatcatat ttacaatgat agtagctaac 5220
agtttttgag tgcttactgt atgaaaattg agatatggtg ccaatattta aatagcatat 5280
tttacttaac attcacagaa accctgtgaa gtaggttcta ttatctcaga aaaagaaact 5340
gaaactcaga gaataacaag ggactgtgtt acgtgcacag tggcagaggc aaagatgaat 5400
aggatgtgag tttatttgaa ccccaaatgt ttaaatcttg gggataatac aacacacatt 5460
taaacaaaga agcaagaaaa aaaatgcaca acagaaagtg agaaataaca cgaggaaaga 5520
ctaaatgaag tgctttgtat ctagatgtgg gcaggaccct ttccagctga gaagatctga 5580
gactgggtca tgaacaggtg gtttctgagt gggtcctgta aaaatgaata cgattttgat 5640
gatagtaatg agtaaggaca tttgagactg atagaagagt acatacaata tgtagtgatg 5700
gggaaagata aggtactgtc aaaggacaat gtgttttctg gtatgacaga gaagtagaat 5760
gtgttaaggg aagccgagta ccagaaagat ccgggtgtca cagtttgtgt agggtgttta 5820
aagctaaacc acagagttta attttatcca atagaagagg agccacagaa gagtttccat 5880
ttattcatta atttattcat ttattcaaaa aatatttgag tgcttattat aagccaggta 5940
ctatgccagg cacctgggat aagacatagt cccttctgtc aagtctttac attgggtgga 6000
tgtgggaggg acagatgaca gaacaatatg cattgagtgt aagtgctatg gtataggaag 6060
ctctgagtgg gaggggcatg gaagccgtgg aagaccatgg aaggcttccc aggagaagtg 6120
acgtctggac tgatcctttg gtcaagcagg agttaaagag gagaaaagga gagatatggg 6180
tgttcccgag agaggaagaa gccttgtccc aggagcaaag tgagggtgat tgttccagaa 6240
atgtgagtga ttcttttaag gctcaagcaa agcatgtgat tcttctttat accttctatt 6300
tctttgctga gtgtttctgt tcttttgttt caagcatgct gcaattgctc attaaagcat 6360
gtttatgatg gctgtctgtt ttaaaattct tgtcagatgg tttcaacatc tttatcatct 6420
caatgttggc atctgttaat ggttttttct caatcaaatt gagattttcc tggttcttgg 6480
tattaccagt gattttaatt gcatctggaa atttgggatt tatgttgaaa gactggatct 6540
tattgaaaga ttctgtttag cacccctcct ttgataccac actggtgggt ccaggttccc 6600
cattcagctg ttgacacctt cagggcagag aggtgggatg gggtgaaggg ggtacctcat 6660
tattgctggc ccaggttaga agttcaggct tcccagtaga tctctgctga taccaccctg 6720
gtgccatgtc attccttgag tccaaaagtc cctcccaatt ctgccttctt ctctctacat 6780
atcggagtct ccctatgttt gacttatata taatgtccag ggtttttaga gttagttaac 6840
aggaggcata agaaaaagtg tgtccactcc atcttgtctg gaactggaag ttcaagtcga 6900
atataagaga gaggagagga aattacaagc catgagactg gagagttagg caggttctac 6960
accagctatt ctcaaagccc tcttacactc ttaaaaattt agaacttcaa agagcttttg 7020
attttgaaag ttacatctat caattattac tgtttcaaaa attaaaattg agaaaatttt 7080
atttattaat ttgtttaaaa ataacaataa ttattcaatt acatgataat gtaagtaatg 7140
cttttcttaa tgaaaaataa ttatattttc caaaacaaaa acaattagga aaaagagtgt 7200
cattgtttta gactttggta aatctctcta atatctggct gaagagaaga atgctgattc 7260
tttttttttt tttttttttt tgagacggag tctcgctctg tcacccaggc tggagtgtag 7320
tggtgtgatc tcggctcact gcaagctctg cctcccgggt tcacgccatt ctcctgcctc 7380
agcctcccaa gtagctggga ctacaggcac ccgccaccac gcccggctaa tttttttgta 7440
tttttagtag agatggggtt tcaccgtgtt agccaggctg gtctcgatct cctgacctca 7500
tgatccaccc acctcagcct cccaaagcgc tgggattaca ggtgtgagac accgcgccca 7560
gcccccgaat gctgattctt ttatctgctt ctgtattcaa tctgttgtga tatgatgggt 7620
agcctctgaa acactccact gtatacttgt gaaagaatga atgtgaaaaa ggaaaataga 7680
tttgtagtat tattattcaa attgttttga cctcagagac cacttggaaa tgttttaggg 7740
aacccccaga ggaccttgga tcatgctttg agaaccgcgg ctctagatat gttactattt 7800
cagtagcatc taagtacatg tggctgctga gcacttgtaa tgtggctagt gcaaatgaga 7860
gacaggactt ccagctatat gtaatttaat aaactcaaat ttaaaaactg gaacctcata 7920
aaatgttttg ttgttgttgt taaacatgac cttatagttt tggtaggaa 7969
<210> 18
<211> 2598
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 18
agtgtcttcc actcggtgcg tctctctagg agccgcgcgg gaaggatgct ggtccgcagg 60
ggcgcgcgcg cagggcccag gatgccgcgg ggctggaccg cgctttgctt gctgagtttg 120
ctgccttctg ggttcatgag tcttgacaac aacggtactg ctaccccaga gttacctacc 180
cagggaacat tttcaaatgt ttctacaaat gtatcctacc aagaaactac aacacctagt 240
acccttggaa gtaccagcct gcaccctgtg tctcaacatg gcaatgaggc cacaacaaac 300
atcacagaaa cgacagtcaa attcacatct acctctgtga taacctcagt ttatggaaac 360
acaaactctt ctgtccagtc acagacctct gtaatcagca cagtgttcac caccccagcc 420
aacgtttcaa ctccagagac aaccttgaag cctagcctgt cacctggaaa tgtttcagac 480
ctttcaacca ctagcactag ccttgcaaca tctcccacta aaccctatac atcatcttct 540
cctatcctaa gtgacatcaa ggcagaaatc aaatgttcag gcatcagaga agtgaaattg 600
actcagggca tctgcctgga gcaaaataag acctccagct gtgcggagtt taagaaggac 660
aggggagagg gcctggcccg agtgctgtgt ggggaggagc aggctgatgc tgatgctggg 720
gcccaggtat gctccctgct ccttgcccag tctgaggtga ggcctcagtg tctactgctg 780
gtcttggcca acagaacaga aatttccagc aaactccaac ttatgaaaaa gcaccaatct 840
gacctgaaaa agctggggat cctagatttc actgagcaag atgttgcaag ccaccagagc 900
tattcccaaa agaccctgat tgcactggtc acctcgggag ccctgctggc tgtcttgggc 960
atcactggct atttcctgat gaatcgccgc agctggagcc ccacaggaga aaggctggag 1020
ctggaaccct gaccactctt caggaagaaa ggagtctgca catgcagctg caccctccct 1080
ccgatccttc ctcccacctc cccctccccc ttctcccacc cctgccccca cttcctgttt 1140
gggcccctct cccatccagt gtctcacagc cctgcttacc agataatgct actttattta 1200
tacactgtct agggcgaaga cccttattac acggaaaacg gtggaggcca gggctatagc 1260
tcaggacctg ggacctcccc tgaggctcag ggaaaggcca gtgtgaaccg aggggctcag 1320
gaaaacggga ccggccaggc cacctccaga aacggccatt cagcaagaca acacgtggtg 1380
gctgataccg aattgtgact cggctaggtg gggcaaggct gggcagtgtc cgagagagca 1440
cccctctctg catctgacca cgtgctaccc ccatgctgga ggtgacatct cttacgccca 1500
acccttcccc actgcacaca cctcagaggc tgttcttggg gccctacacc ttgaggaggg 1560
gcaggtaaac tcctgtcctt tacacattcg gctccctgga gccagactct ggtcttcttt 1620
gggtaaacgt gtgacggggg aaagccaagg tctggagaag ctcccaggaa caatcgatgg 1680
ccttgcagca ctcacacagg acccccttcc cctaccccct cctctctgcc gcaatacagg 1740
aacccccagg ggaaagatga gcttttctag gctacaattt tctcccagga agctttgatt 1800
tttaccgttt cttccctgta ttttctttct ctactttgag gaaaccaaag taaccttttg 1860
cacctgctct cttgtaatga tatagccaga aaaacgtgtt gccttgaacc acttccctca 1920
tctctcctcc aagacactgt ggacttggtc accagctcct cccttgttct ctaagttcca 1980
ctgagctcca tgtgccccct ctaccatttg cagagtcctg cacagttttc tggctggagc 2040
ctagaacagg cctcccaagt tttaggacaa acagctcagt tctagtctct ctggggccac 2100
acagaaactc tttttgggct cctttttctc cctctggatc aaagtaggca ggaccatggg 2160
accaggtctt ggagctgagc ctctcacctg tactcttccg aaaaatcctc ttcctctgag 2220
gctggatcct agccttatcc tctgatctcc atggcttcct cctccctcct gccgactcct 2280
gggttgagct gttgcctcag tcccccaaca gatgcttttc tgtctctgcc tccctcaccc 2340
tgagcccctt ccttgctctg cacccccata tggtcatagc ccagatcagc tcctaaccct 2400
tatcaccagc tgcctcttct gtgggtgacc caggtccttg tttgctgttg atttctttcc 2460
agaggggttg agcagggatc ctggtttcaa tgacggttgg aaatagaaat ttccagagaa 2520
gagagtattg ggtagatatt ttttctgaat acaaagtgat gtgtttaaat actgcaatta 2580
aagtgatact gaaacaca 2598
<210> 19
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 19
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
65 70 75 80
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
85 90 95
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
100 105
<210> 20
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 20
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 21
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 21
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser
65
<210> 22
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 22
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
20 25 30
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 23
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 23
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> n是a、c、g或t
<400> 24
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngg 25
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(25)
<223> n是a、c、g或t
<400> 25
ccnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 25
<210> 26
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> n是a、c、g或u
<400> 26
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nn 22
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> n是a、c、g或t
<400> 27
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnntt 25
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(25)
<223> n是a、c、g或t
<400> 28
aannnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 25
<210> 29
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 29
tcccccaccc ctctcccggg cggagggggc gggaagagcg cgtcctggcc aagccgagta 60
gtgtcttcca ctcggtgcgt ctctctagga gccgcgcggg aaggatgct 109
<210> 30
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 30
agggggtggg gagagggccc gcctcccccg cccttctcgc gcaggaccgg ttcggctcat 60
cacagaaggt gagccacgca gagagatcct cggcgcgccc ttcctacga 109
<210> 31
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 31
ggtccgcagg ggcgcgcgcg cagggcccag gatgccgcgg ggctggaccg cgctttgctt 60
gctgagtttg ctgcgtgagt accgcccgcg cgccgcggcc gcttggctt 109
<210> 32
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 32
ccaggcgtcc ccgcgcgcgc gtcccgggtc ctacggcgcc ccgacctggc gcgaaacgaa 60
cgactcaaac gacgcactca tggcgggcgc gcggcgccgg cgaaccgaa 109
<210> 33
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 33
Val Arg Arg Gly Ala Arg Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Gly Trp Thr
1 5 10 15
Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu
20
<210> 34
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 34
cgtctcacgg agggaaggga cccctgccca acccacgcac tgccgcccac agctgcttcc 60
ccccggggcc agcgcctcac ctgggagctg acgggggtgg gaggggaag 109
<210> 35
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 35
gcagagtgcc tcccttccct ggggacgggt tgggtgcgtg acggcgggtg tcgacgaagg 60
ggggccccgg tcgcggagtg gaccctcgac tgcccccacc ctccccttc 109
<210> 36
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 36
ctgccaacaa ggggcagcag ggaatgttct agacgaattc tacctgaagt caggaaattg 60
catcaggtga tatcaccagg ctgatatctt taggttctga ttcttcctc 109
<210> 37
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 37
gacggttgtt ccccgtcgtc ccttacaaga tctgcttaag atggacttca gtcctttaac 60
gtagtccact atagtggtcc gactatagaa atccaagact aagaaggag 109
<210> 38
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 38
ctcgtttccc tatagcttct gggttcatga gtcttgacaa caacggtact gctaccccag 60
agttacctac ccagggaaca ttttcaaatg tttctacaaa tgtatccta 109
<210> 39
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 39
gagcaaaggg atatcgaaga cccaagtact cagaactgtt gttgccatga cgatggggtc 60
tcaatggatg ggtcccttgt aaaagtttac aaagatgttt acataggat 109
<210> 40
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 40
Pro Ser Gly Phe Met Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu
1 5 10 15
Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr
20 25 30
<210> 41
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 41
ccaagaaact acaacaccta gtacccttgg aagtaccagc ctgcaccctg tgtctcaaca 60
tggcaatgag gccacaacaa acatcacagg taaaaacagc atttgtgtc 109
<210> 42
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 42
ggttctttga tgttgtggat catgggaacc ttcatggtcg gacgtgggac acagagttgt 60
accgttactc cggtgttgtt tgtagtgtcc atttttgtcg taaacacag 109
<210> 43
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 43
Gln Glu Thr Thr Thr Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro
1 5 10 15
Val Ser Gln His Gly Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr
20 25
<210> 44
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 44
agatcccgga gagatgctgg tgatgcttgg gtaaagcatt taggatgttt tcagaccgct 60
cccctctcca cagaggaaat tatacaagtc cctagtatta atgacttga 109
<210> 45
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 45
tctagggcct ctctacgacc actacgaacc catttcgtaa atcctacaaa agtctggcga 60
ggggagaggt gtctccttta atatgttcag ggatcataat tactgaact 109
<210> 46
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 46
ccccagaaac cgaagagatt ccatctggtc gtagataaag tcaaagtcct gtggagatta 60
tgtaagatct aagatcgaga acaaggttgt cgaactttac tcaaaccag 109
<210> 47
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 47
agggatggga cacgaagtaa ctgttaactc cccaaactcc cttttctgtg ttgaagtgca 60
tgcccatatc atgacctgag attttgtgta tctatgagca catgcacac 109
<210> 48
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 48
tccctaccct gtgcttcatt gacaattgag gggtttgagg gaaaagacac aacttcacgt 60
acgggtatag tactggactc taaaacacat agatactcgt gtacgtgtg 109
<210> 49
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 49
atgcacaccc atgttttggt ctcttccaga aacgacagtc aaattcacat ctacctctgt 60
gataacctca gtttatggaa acacaaactc ttctgtccag tcacagacc 109
<210> 50
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 50
tacgtgtggg tacaaaacca gagaaggtct ttgctgtcag tttaagtgta gatggagaca 60
ctattggagt caaatacctt tgtgtttgag aagacaggtc agtgtctgg 109
<210> 51
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 51
Glu Thr Thr Val Lys Phe Thr Ser Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr
1 5 10 15
Gly Asn Thr Asn Ser Ser Val Gln Ser Gln Thr
20 25
<210> 52
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 52
tctgtaatca gcacagtgtt caccacccca gccaacgttt caactccaga gacaaccttg 60
aagcctagcc tgtcacctgg aaatgtttca gacctttcaa ccactagca 109
<210> 53
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 53
agacattagt cgtgtcacaa gtggtggggt cggttgcaaa gttgaggtct ctgttggaac 60
ttcggatcgg acagtggacc tttacaaagt ctggaaagtt ggtgatcgt 109
<210> 54
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 54
Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro Ala Asn Val Ser Thr Pro
1 5 10 15
Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro Gly Asn Val Ser Asp Leu
20 25 30
Ser Thr Thr Ser
35
<210> 55
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 55
ctagccttgc aacatctccc actaaaccct atacatcatc ttctcctatc ctaagtgaca 60
tcaaggtggg tgaattgggc caaaaatggc agattgcccc tcacttcat 109
<210> 56
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 56
gatcggaacg ttgtagaggg tgatttggga tatgtagtag aagaggatag gattcactgt 60
agttccaccc acttaacccg gtttttaccg tctaacgggg agtgaagta 109
<210> 57
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 57
Thr Ser Leu Ala Thr Ser Pro Thr Lys Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro
1 5 10 15
Ile Leu Ser Asp Ile Lys
20
<210> 58
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 58
caaactcagc aagcaaagcg cggtccag 28
<210> 59
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n是a、c、g或t
<400> 59
caaactcagc aagcaaangc gcggtccag 29
<210> 60
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 60
gtgcaggctg gtacttccaa gggtacta 28
<210> 61
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 61
gtgcaggctg gtacttcaag ggtacta 27
<210> 62
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 62
gtgcacaagg gtacta 16
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 63
caaactcagc aagcaaagcg 20
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 64
gtgcaggctg gtagtaccaa 20

Claims (61)

1.一种基因工程化造血细胞或其后代，其包括编码CD34的经修饰的基因。
2.根据权利要求1所述的造血细胞或其后代，其中所述编码CD34的经修饰的基因包括INDEL突变。
3.根据权利要求1或2所述的造血细胞或其后代，其中所述编码CD34的经修饰的基因被修饰成使得跳过外显子。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的造血细胞或其后代，其中所述编码CD34的经修饰的基因的外显子1、外显子2或外显子3是基因工程化的。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的造血细胞或其后代，其中所述编码CD34的经修饰的基因包括与位点紧邻的插入或缺失，所述位点当与包括如由SEQ ID NO:11-15中的任一个所提供的靶向结构域的gRNA结合时被RNA引导的核酸酶切割。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的造血细胞或其后代，其中所述编码CD34的经修饰的基因包括由非同源末端连接(NHEJ)事件产生的插入或缺失。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的造血细胞或其后代，其中所述编码CD34的经修饰的基因包括由同源定向修复(HDR)事件产生的插入或缺失。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的造血细胞或其后代，其中相对于不携带所述编码CD34的经修饰的基因的野生型对应物细胞，CD34的表达减少或消除。
9.根据权利要求8所述的造血细胞或其后代，与所述不携带编码CD34的经修饰的基因的野生型对应物细胞中的CD34的表达水平相比，CD34的表达小于25％、小于20％、小于10％、小于5％、小于2％、小于1％、小于0.1％、小于0.01％或小于0.001％。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的造血细胞或其后代，其中所述造血细胞或其后代与包括抗CD34结合结构域的药剂的结合减少或不结合。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的造血细胞或其后代，其中与未基因工程化的造血细胞群体相比，所述造血细胞或其后代保持正常分化的能力。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的造血细胞或其后代，其中所述编码CD34的经修饰的基因导致所述基因工程化造血细胞或其后代中CD34的功能丧失。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的造血细胞或其后代，其进一步包括编码谱系特异性细胞表面抗原的经修饰的基因。
14.根据权利要求13所述的造血细胞或其后代，其中所述谱系特异性细胞表面抗原是CD33、CD123、CLL-1、CD19、CD30、CD5、CD6、CD7、CD38或BCMA。
15.根据权利要求13或14所述的造血细胞或其后代，其中所述造血细胞或其后代与包括靶向所述谱系特异性细胞表面抗原的结合结构域的药剂的结合减少或不结合。
16.一种方法，其包括向有需要的受试者施用
根据权利要求1至15中任一项所述的基因工程化造血细胞或其后代。
17.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的靶向CD34的至少一种药剂，其中所述药剂包括与CD34结合的抗原结合片段。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述药剂是抗体-药物缀合物或表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应子细胞。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述受试者患有与表达CD34的细胞相关的疾病。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述受试者患有与恶性细胞上CD34的表达相关或以其为特征的恶性肿瘤，任选地其中所述恶性细胞是癌症干细胞。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，其中所述受试者患有造血系统恶性肿瘤。
22.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，其中所述受试者患有自身免疫性疾病。
23.一种包括靶向结构域的gRNA，其中所述靶向结构域包括选自由SEQ ID NO:11-15组成的组的序列。
24.根据权利要求23所述的gRNA，其中所述gRNA包括第一互补结构域、连接结构域、与所述第一互补结构域互补的第二互补结构域和近端结构域。
25.根据权利要求23或24所述的gRNA，其中所述gRNA是单向导RNA(sgRNA)。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的gRNA，其中所述gRNA包括一个或多个经化学修饰的核苷酸残基。
27.根据权利要求23至26中任一项所述的gRNA，其中所述gRNA包括一个或多个包括2'O-甲基部分的核苷酸残基。
28.根据权利要求23至27中任一项所述的gRNA，其中所述gRNA包括一个或多个包括硫代磷酸酯的核苷酸残基。
29.根据权利要求23至28中任一项所述的gRNA，其中所述gRNA包括一个或多个包括硫代PACE部分的核苷酸残基。
30.一种产生基因工程化细胞的方法，所述方法包括：
a.提供细胞，以及
b.使所述细胞与(i)根据权利要求23至29中任一项所述的gRNA；以及(ii)与所述gRNA结合的RNA引导的核酸酶接触，从而在适合(i)的所述gRNA与(ii)的所述RNA引导的核酸酶形成和/或维持核糖核蛋白(RNP)复合物并且适合所述RNP复合物与所述细胞的基因组中的靶结构域结合的条件下形成所述RNP复合物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述RNA引导的核酸酶是CRISPR/Cas核酸酶。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述CRISPR/Cas核酸酶是Cas9核酸酶。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述CRISPR/Cas核酸酶是spCas核酸酶。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述CRISPR/Cas核酸酶是saCas核酸酶。
35.根据权利要求31所述的方法，其中所述CRISPR/Cas核酸酶是Cpf1核酸酶。
36.根据权利要求30至35中任一项所述的方法，其中所述接触包括以预形成的核糖核蛋白(RNP)复合物的形式将(i)和(ii)引入所述细胞中。
37.根据权利要求30至36中任一项所述的方法，其中所述接触包括以编码(i)的所述gRNA和/或(ii)的所述RNA引导的核酸酶的核酸的形式将(i)和/或(ii)引入所述细胞中。
38.根据权利要求37所述的方法，其中编码(i)的所述gRNA和/或(ii)的所述RNA引导的核酸酶的所述核酸是RNA，优选地是mRNA或mRNA类似物。
39.根据权利要求30至38中任一项所述的方法，其中所述核糖核蛋白复合物通过电穿孔引入所述细胞中。
40.根据权利要求30至39中任一项所述的方法，其中所述细胞是造血细胞。
41.根据权利要求30至40中任一项所述的方法，其中所述细胞是造血干细胞。
42.根据权利要求30至41中任一项所述的方法，其中所述细胞是造血祖细胞。
43.根据权利要求30至39中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫效应子细胞。
44.根据权利要求30至39或43中任一项所述的方法，其中所述细胞是淋巴细胞。
45.根据权利要求30至39、43或44中任一项所述的方法，其中所述细胞是T淋巴细胞。
46.一种基因工程化细胞，其中所述细胞是通过根据权利要求30至45中任一项所述的方法获得的或能够通过所述方法获得。
47.一种细胞群体，其包括根据权利要求1至15或46中任一项所述的基因工程化细胞。
48.一种药物组合物，其包括根据权利要求1至15中任一项所述的基因工程化造血细胞或其后代、根据权利要求46所述的基因工程化细胞或根据权利要求47所述的细胞群体。
49.一种基因工程化造血干细胞，其包括编码CD34的基因中的修饰，其中所述基因工程化造血干细胞不表达天然存在的CD34蛋白，并且其中所述基因工程化造血干细胞与表达CD34的天然存在的造血干细胞在功能上不可区分。
50.根据权利要求49所述的基因工程化造血干细胞，其中所述基因工程化造血干细胞表达一种或多种造血干细胞标志物。
51.根据权利要求49或50中任一项所述的基因工程化造血干细胞，其中所述基因工程化造血干细胞表达以下中的一种或多种：CD49c、CD71、CD90、CD117、CD135、CD201、CD228、CD243、CD292、CDw293、CD309、CD318、CD325和CD349。
52.根据权利要求49至51中任一项所述的基因工程化造血干细胞，其中所述基因工程化造血干细胞在其细胞表面上不表达CD34。
53.根据权利要求49至52中任一项所述的基因工程化造血干细胞，其中所述基因工程化造血干细胞在其细胞表面上不表达被抗CD34抗体识别的CD34表位。
54.根据权利要求49至52中任一项所述的基因工程化造血干细胞，其中所述基因工程化造血干细胞在其细胞表面上不表达CD34。
55.根据权利要求49至54中任一项所述的基因工程化造血干细胞，其中所述基因工程化造血干细胞在其细胞表面上不表达CD34，并且表达以下中的一种或多种：CD49c、CD71、CD90和CD201。
56.根据权利要求49至55中任一项所述的基因工程化造血干细胞，其中所述基因工程化造血干细胞在其细胞表面上不表达CD34，并且表达以下中的一种或多种：CD49c、CD90和CD201。
57.根据权利要求49至56中任一项所述的基因工程化造血干细胞，其中所述基因工程化造血干细胞不表达分化的造血细胞特有的谱系特异性表面标志物(lin-)。
58.根据权利要求49至57中任一项所述的基因工程化造血干细胞，其中所述基因工程化造血干细胞不表达CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123或CD235a，或其任何组合。
59.根据权利要求49至58中任一项所述的基因工程化造血干细胞，其中所述基因工程化造血干细胞能够长期移植到人受体中。
60.根据权利要求49至58中任一项所述的基因工程化造血干细胞，其中所述基因工程化造血干细胞能够在移植后重建人受体的造血系统。
61.根据权利要求1至9或10至15中任一项所述的造血细胞或其后代，其中所述造血细胞或其后代缺乏CD34表位或具有经修饰的CD34表位。
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