CN116744963A - 与表达嵌合抗原受体的经基因工程化的细胞有关的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本公开涉及与表达嵌合抗原受体的经基因工程化的细胞有关的方法和组合物，其中所述细胞是经动员淋巴细胞。

Description

与表达嵌合抗原受体的经基因工程化的细胞有关的方法和组 合物

相关申请

本申请根据35 U.S.C.119(e)要求于2020年11月13日提交的美国临时申请第63/113,739号和于2021年8月3日提交的美国临时申请第63/229,017号的权益，所述美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。

发明内容

本公开至少部分涉及经基因工程化的细胞，所述经基因工程化的细胞包括异源核酸，所述异源核酸编码嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR靶向与过度增殖性疾病相关的谱系特异性细胞表面抗原，其中所述细胞是在造血干细胞动员之后从受试者获得的淋巴细胞(或其后代)。一方面，所述经基因工程化的细胞是经动员淋巴细胞或经动员淋巴细胞的后代。本公开进一步部分涉及产生此类经基因工程化的细胞的方法，以及向有需要的受试者施用此类经基因工程化的细胞(或其后代)的方法。本公开部分基于这样的发现，即靶向与过度增殖性疾病相关的谱系特异性细胞表面抗原的本公开的经基因工程化的细胞(例如，表达CAR的细胞)可以从来自经历造血干细胞动员的受试者的单采术样品中产生。在一些实施例中，本文所描述的方法允许在受试者的造血干细胞动员之后从取自所述受试者的同一单采术样品中产生经基因工程化的淋巴细胞，例如表达CAR的淋巴细胞和经基因工程化的造血干细胞(HSC)，由此避免了多次单采术程序，并产生HSC，例如可以用于受试者的造血干细胞移植物的经基因工程化的HSC，以及与HSC基因匹配的淋巴细胞，例如表达CAR的经基因工程化的淋巴细胞，并且可以施用于接受造血干细胞移植物的同一受试者。

不希望受任何特定理论的束缚，造血干细胞通常是在造血干细胞动员之后从取自受试者的单采术样品中收获的。然而，只有单采术样品中的一部分细胞(例如，CD34+)是造血干细胞。此类单采术样品还包括包含例如淋巴细胞和其它细胞的外周血单核细胞(PBMC)。本公开部分涉及这样的发现，即来自未作为造血干细胞(例如，PBMC)收获的单采术样品的细胞可以用于制备经基因工程化的细胞，例如，表达嵌合抗原受体的淋巴细胞(例如，CAR细胞)。此类经基因工程化的细胞(例如，CAR细胞)可以用作免疫治疗剂并可用于治疗多种疾病。另外，本公开的细胞和方法可以提供资源高效的手段，以从来自单个供体受试者的单个单采术样品中产生本公开的造血干细胞和经基因工程化的细胞(例如，CAR细胞)。

本公开的方面提供了经基因工程化的细胞，所述经基因工程化的细胞包括异源核酸，所述异源核酸编码嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR靶向与过度增殖性疾病相关的谱系特异性细胞表面抗原，其中所述细胞是淋巴细胞，并且其中所述细胞或其亲本细胞是在造血干细胞动员之后从受试者获得的。本公开的方面涉及经基因工程化的细胞，所述经基因工程化的细胞包括异源核酸，所述异源核酸编码嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR靶向与过度增殖性疾病相关的谱系特异性细胞表面抗原，其中所述细胞是经动员淋巴细胞或其后代。

在一些实施例中，所述经基因工程化的细胞是淋巴细胞，并且其中所述细胞或其亲本细胞是在造血干细胞动员之后从受试者获得的。在一些实施例中，所述细胞是经动员淋巴细胞。

在一些实施例中，所述经基因工程化的细胞或经动员淋巴细胞是T淋巴细胞。在一些实施例中，所述T淋巴细胞表达CD3、CD4和/或CD8(例如，CD4和CD8)。在一些实施例中，所述T淋巴细胞表达PD1。在一些实施例中，所述T淋巴细胞是α/βT淋巴细胞、γ/δT淋巴细胞、原初T淋巴细胞、效应T淋巴细胞、记忆T淋巴细胞或调节性T淋巴细胞(Treg)。

在一些实施例中，所述经基因工程化的细胞或经动员淋巴细胞是B淋巴细胞。在一些实施例中，所述经基因工程化的细胞或经动员淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。

在一些实施例中，造血干细胞动员包括向受试者施用依托泊苷(etoposide)、普乐沙福(plerixafor)、环磷酰胺(cyclophosphamide)和/或粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。

在一些实施例中，所述嵌合抗原受体是第一代CAR、第二代CAR或第三代CAR。

在一些实施例中，所述谱系特异性细胞表面抗原是CD33、CD30、CD38、CD123、CLL-1、CD5、CD6、CD7、CD19或BCMA。

在一些实施例中，所述过度增殖性疾病是造血系统恶性肿瘤或髓细胞性恶性肿瘤。在一些实施例中，所述造血系统恶性肿瘤是霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、白血病或多发性骨髓瘤。在一些实施例中，所述白血病是急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、慢性髓细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病或慢性成淋巴细胞性白血病或慢性淋巴细胞性白血病。在一些实施例中，所述造血系统恶性肿瘤是急性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征或淋巴细胞性恶性肿瘤。

在一些实施例中，所述经基因工程化的细胞供施用于有需要的受试者，其中所述受试者患有或已被诊断为患有造血系统恶性肿瘤。在一些实施例中，所述受试者已接受包括经基因工程化的干细胞的造血干细胞移植物，所述经基因工程化的干细胞具有降低的对所述谱系特异性细胞表面抗原的表达或缺乏对所述谱系特异性细胞表面抗原的表达或表达所述谱系特异性细胞表面抗原的不会被所述CAR识别或以降低的水平被所述CAR识别的变体形式。

在一些实施例中，本公开提供了方法，所述方法包括使从第一受试者获得的经动员淋巴细胞与异源核酸接触，所述异源核酸编码嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR靶向与过度增殖性疾病相关的谱系特异性细胞表面抗原，由此产生表达所述CAR的经基因工程化的淋巴细胞。在一些实施例中，方法进一步包括向第二受试者施用所述经基因工程化的淋巴细胞或其后代，其中所述第二受试者需要所述施用。在一些实施例中，所述第二受试者患有或已被诊断为患有所述过度增殖性疾病。在一些实施例中，所述第一受试者与所述第二受试者不同。在一些实施例中，所述第一受试者与所述第二受试者相同。

在一些实施例中，需要施用所述经基因工程化的淋巴细胞或其后代的所述受试者已接受包括经基因工程化的造血干细胞的造血干细胞移植物，所述经基因工程化的造血干细胞具有降低的对所述谱系特异性细胞表面抗原的表达或缺乏对所述谱系特异性细胞表面抗原的表达或表达所述谱系特异性细胞表面抗原的不会被所述CAR识别或以降低的水平被所述CAR识别的变体形式。在一些实施例中，方法进一步包括在施用所述经基因工程化的淋巴细胞或其后代之后向所述有需要的受试者施用所述造血干细胞移植物。在一些实施例中，所述经基因工程化的淋巴细胞或其后代与包括经基因工程化的造血干细胞的所述造血干细胞移植物组合施用。

在一些实施例中，所述方法进一步包括使从所述第一受试者获得的造血干细胞与RNA引导的核酸酶和向导RNA或编码所述RNA引导的核酸酶和所述向导RNA的核酸接触，其中所述向导RNA靶向编码所述谱系特异性细胞表面抗原的基因，由此产生经基因工程化的造血干细胞，所述经基因工程化的造血干细胞具有降低的对所述谱系特异性细胞表面抗原的表达或缺乏对所述谱系特异性细胞表面抗原的表达或表达所述谱系特异性细胞表面抗原的变体形式。在一些实施例中，所述经基因工程化的造血干细胞不会被CAR，例如经基因工程化的淋巴细胞的CAR靶向。在一些实施例中，所述方法进一步包括向有需要的受试者施用所述经基因工程化的造血干细胞或其后代。

在一些实施例中，所述经基因工程化的细胞或经动员淋巴细胞是T淋巴细胞。在一些实施例中，所述T淋巴细胞表达CD3、CD4和/或CD8(例如，CD4和CD8)。在一些实施例中，所述T淋巴细胞表达PD1。在一些实施例中，所述T淋巴细胞是α/βT淋巴细胞、γ/δT淋巴细胞、原初T淋巴细胞、效应T淋巴细胞、记忆T淋巴细胞或调节性T淋巴细胞(Treg)。

在一些实施例中，所述经基因工程化的细胞或经动员淋巴细胞是B淋巴细胞。在一些实施例中，所述经基因工程化的细胞或经动员淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。

在一些实施例中，所述谱系特异性细胞表面抗原是CD33、CD30、CD38、CD123、CLL-1、CD5、CD6、CD7、CD19或BCMA。在一些实施例中，所述嵌合抗原受体是第一代CAR、第二代CAR或第三代CAR。

在一些实施例中，所述过度增殖性疾病是造血系统恶性肿瘤或髓细胞性恶性肿瘤。在一些实施例中，所述造血系统恶性肿瘤是霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、白血病或多发性骨髓瘤。在一些实施例中，所述白血病是急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、慢性髓细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病或慢性成淋巴细胞性白血病或慢性淋巴细胞性白血病。在一些实施例中，所述造血系统恶性肿瘤是急性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征或淋巴细胞性恶性肿瘤。

在一些实施例中，所述RNA引导的核酸酶是CRISPR/Cas核酸酶。在一些实施例中，所述CRISPR/Cas核酸酶是Cas9核酸酶、SpCas核酸酶、SaCas核酸酶或Cpf1核酸酶。在一些实施例中，编码所述向导RNA和/或所述RNA引导的核酸酶的核酸是RNA，优选地是mRNA或mRNA类似物。在一些实施例中，所述向导RNA包括经化学修饰的一个或多个核苷酸残基。在一些实施例中，所述向导RNA包括包含2'O-甲基部分的一个或多个核苷酸残基。在一些实施例中，所述向导RNA包括包含硫代磷酸酯的一个或多个核苷酸残基。在一些实施例中，所述向导RNA包括包含硫代PACE部分的一个或多个核苷酸残基。

在一些方面，本公开提供了一种细胞群体，所述细胞群体包括多个本文所公开的或通过本文所描述的方法产生、获得或能够通过所述方法获得的经基因工程化的细胞。在一些方面，本公开提供了包括向有需要的受试者施用本文所描述的任何细胞群体的方法。

附图说明

构成本说明书的一部分的附图展示了本发明的若干实施例，并且与本说明书一起用于解释本发明的原理。

图1是示出了从单个供体产生经编辑造血干细胞(eHSC)和表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞处理系统的示例性实施例的示意图。

图2是示出了其中从单个供体产生经编辑造血干细胞(eHSC)和表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞(CAR-T细胞)并施用于患者的示例性方法的示意。

图3A-3H示出了表征经动员外周血单核细胞(PBMC，在图2中被称为“非靶标部分”)的群体的图。图3A是示出了CD3+细胞(T细胞)群体的流式细胞术分析图。图3B是示出了CD14+细胞(单核细胞)群体的流式细胞术分析图。图3C是示出了CD56+细胞(NK细胞)群体的流式细胞术分析图。图3D是示出了CD19+细胞(B细胞)群体的流式细胞术分析图。图3E呈现了图表，所述图表示出了CD3+细胞(T细胞)、单核细胞、NK细胞和B细胞(稳态细胞部分(左图)或经动员细胞部分(右图))的相对丰度。图3F是示出了基于CCR7(y轴)和CD45RA(x轴)表达的图3A的CD3+细胞(T细胞)群体的另外的表征的流式细胞术分析图。图3G是示出了鉴定图3F的细胞类型的示意图。TCM：中央记忆T细胞，低CD45RA，高CCR7；原初：高CD45RA，高CCR7；TEM：效应记忆T细胞，低CD45RA，低CCR7；TEFF：效应T细胞，高CD45RA，低CCR7。图3H呈现了图表，所述图表示出了T细胞群体(稳态细胞部分(左图)或经动员细胞部分(右图))的相对丰度。

图4A-4D示出了经动员和非经动员PBMC群体的免疫表型表征。图4A：示出了CD3+细胞、单核细胞、NK细胞、NKT细胞和B细胞的免疫细胞分型。图4B：示出了CD8和CD4群体的T细胞表型比较。图4C：示出了原初T细胞、T效应细胞(Teff)、T效应记忆细胞(TEM)和中央记忆T细胞(TCM)群体的T细胞表型比较。图4D：稳态和经动员CD8+和CD4+亚群。对于图4A-4C中的每种细胞类型，数据点与稳态(左)和经动员(右)相对应。

图5示出了两个供体(D1和D2)的PBMC群体的CITEseq表征。在左图堆叠图中，从上到下的每列与B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、HSPC、巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤细胞和pDC群体相对应。在右图中，对于每种细胞类型，左列是指经动员细胞，而右列是指稳态细胞。

图6示出了两个供体(D1和D2)的T细胞亚群的CITEseq表征。在左图堆叠图中，从上到下的每列与CD4+T效应细胞、CD4+T原初、CD4+TCM、CD4+TEM、CD8+T效应细胞和CD8+T原初细胞群体相对应。在右图中，对于每种细胞类型，左列是指经动员细胞，而右列与稳态细胞相对应。

图7示出了从两个供体(D1和D2)的经动员和非经动员PBMC群体中获得的淋巴细胞中的T细胞激活的表征。对于每个标志物，各列从左到右分别是指稳态(SS)未经激活、经动员(Mob)未经激活、SS经激活和Mob经激活。

图8示出了跨较大供体队列从经动员和非经动员PBMC群体中获得的淋巴细胞中的T细胞激活的表征。

图9示出了使用用抗CD33 CAR转导的动员(mob)和非动员(ss)PBMC源性细胞的细胞毒性测定的结果。对于每种药剂，每列从上到下与死亡细胞、凋亡细胞和活细胞相对应。

图10示出了在存在和不存在表达CD33的靶细胞的情况下，在经动员和非经动员PBMC源性表达抗CD33 CAR的细胞群体中的TNFα(TNFa+)和IFNγ(IFNg+)表达的细胞内细胞因子染色(ICS)分析。对于每种情况，各列从左到右与无刺激(No Stim)、PMA/I、WT MOLM13、CD33KO MOLM13和Jurkat细胞相对应。

图11示出了在存在和不存在表达CD33的靶细胞的情况下，在经动员和非经动员PBMC源性表达抗CD33 CAR的细胞群体中的TNFα(TNFa)和IFNγ(IFNg)表达的LUMINEX^TM分析的结果。对于每种情况，各列从左到右与无刺激(No Stim)、PMA/I、WT MOLM13、CD33KOMOLM13和Jurkat细胞相对应。

图12示出了在体内小鼠模型中的经动员PBMC源性抗CD33 CAR T细胞和非经动员PBMC源性抗CD33 CAR T细胞的细胞毒性测定的结果。

具体实施方式

临床使用的造血干细胞(HSC)可以在通过单采术的造血干细胞动员之后从供体受试者中获得。从此类受试者获得的单采术样品通常包含HSC的部分，例如CD34+HSC，有时也被称为“靶标部分”，以及非干细胞的细胞的部分，例如外周血单核细胞(PBMC)和其它细胞，有时也被称为“非靶标部分”。一些治疗方法利用经基因工程化的HSC，例如与免疫治疗结合的缺乏谱系特异性抗原的表达的经编辑HSC，如表达靶向谱系特异性抗原的嵌合抗原受体(CAR)的淋巴细胞，以便特异性地根除与恶性疾病相关的细胞，同时保留非恶性造血细胞。参见，例如，Borot等人,经基因编辑干细胞使CD33定向免疫疗法治疗髓细胞性恶性肿瘤成为可能(Gene-edited stem cells enable CD33-directed immune therapy for myeloidmalignancies)《美国国家科学院院刊(PNAS)》2019,116(24):11978-11987；以及公开为WO2017/066760的国际专利申请PCT/US16/057339。在此类方法中，通常向受试者施用包括经基因工程化的HSC的造血细胞移植(HCT)，并且在成功地将HSC植入受试者体内之后，向所述受试者施用免疫治疗剂，例如CAR-T细胞。

本公开部分涉及经动员淋巴细胞可以用于产生经基因工程化的细胞(例如，CAR细胞)的发现。在一些实施例中，提供了组合物和方法，所述组合物和方法涉及从同一受试者，例如从来自受试者的同一血液(例如，单采术)样品中产生经基因工程化的造血干细胞和经基因工程化的淋巴细胞，例如CAR细胞，由此有效地从来自供体受试者的单一样品中提供两种不同的细胞群体用于治疗。本公开部分涉及经基因工程化的细胞，所述经基因工程化的细胞包括编码CAR的异源核酸，所述CAR靶向与过度增殖性疾病相关的谱系特异性细胞表面抗原，其中所述细胞是经动员淋巴细胞(或经动员淋巴细胞的后代)或者是在造血干细胞动员之后从受试者获得的淋巴细胞(或其后代)。本文还包含用于产生所述细胞(例如，经基因工程化的HSC，例如，缺乏谱系特异性抗原的表达，和经基因工程化的淋巴细胞，例如，表达靶向谱系特异性抗原的CAR，从来自造血干细胞动员之后的受试者的单个单采术样品获得)并将其施用于有需要的受试者的方法，所述受试者例如患有特征在于谱系特异性抗原表达的癌症的受试者，其中所述谱系特异性抗原也在一些非恶性细胞上表达。本公开还提供了产生和/或施用经基因工程化的造血干细胞的方法，其中所述经基因工程化的造血干细胞不会被CAR靶向。

定义

抗体：如本文所使用的，术语“抗体”是指包含足以赋予特定靶抗原特异性结合的规范免疫球蛋白序列元件的多肽。如本领域已知的，天然产生的完整抗体通常是包括彼此缔合成通常被称为“Y形”结构的两个相同的重链多肽(各自约50kD)和两个相同的轻链多肽(各自约25kD)的大约150kD的四聚体药剂。每个重链包括至少四个结构域(各自长约110个氨基酸)—氨基末端可变(VH)结构域(定位于Y结构的尖端处)，随后是三个恒定结构域：CH1、CH2和羧基末端CH3(定位在Y的主干的基部处)。被称为“开关”的短区连接重链可变区和恒定区。“铰链”将CH2结构域和CH3结构域连接到抗体的其余部分。该铰链区中的两个二硫键将完整抗体中的两个重链多肽彼此连接。每个轻链包括通过另一个“开关”彼此分开的两个结构域—氨基末端可变(VL)结构域，随后是羧基末端恒定(CL)结构域。完整抗体四聚体包括两个重链-轻链二聚体，其中重链和轻链通过单个二硫键彼此连接，两个其它二硫键将重链铰接区彼此连接，使得二聚体彼此连接并且四聚体形成。天然产生的抗体通常在CH2结构域上通常也被糖基化。天然抗体中的每个结构域具有特征在于由在压缩的反平行β桶中彼此压紧的两个β片层(例如，3链、4链或5链片层)形成的“免疫球蛋白折叠”的结构。每个可变结构域含有被称为“互补决定区”的三个高变环(CDR1、CDR2和CDR3)和四个稍微不变的“框架”区(FR1、FR2、FR3和FR4)。当天然抗体折叠时，FR区形成为结构域提供结构框架的β片层，并且将来自重链和轻链两者的CDR环区一起置于三维空间中，使得其形成位于Y结构的尖端处的单个高变抗原结合位点。天然存在的抗体的Fc区与互补系统的元件结合并且还与效应细胞上的受体结合，所述效应细胞例如包括介导细胞毒性的效应细胞。可以通过糖基化或其它修饰来调节Fc受体的Fc区的亲和力和/或其它结合属性。在一些实施例中，根据本发明产生和/或利用的抗体(例如，作为CAR的组分)包含糖基化Fc结构域，包含具有经修饰的或经工程化的糖基化的Fc结构域。在一些实施例中，包含如在天然抗体中发现的足够的免疫球蛋白结构域序列的任何多肽或多肽复合物可以被称为和/或被用作“抗体”，无论此类多肽是天然产生的(例如，通过生物体与抗原反应产生的)还是通过重组工程化、化学合成或其它人工系统或方法产生的。在一些实施例中，抗体是多克隆的。在一些实施例中，抗体是单克隆的。在一些实施例中，抗体具有小鼠、兔、灵长类动物或人抗体所特有的恒定区序列。在一些实施例中，如本领域中已知的，抗体序列元件是人源化的、灵长化的、嵌合的等。此外，如本文所使用的，在适当的实施例中(除非另有说明或根据上下文清楚的)，术语“抗体”可以指用于在替代性呈现中利用抗体结构和功能特征的本领域已知的或开发的构造或格式中的任一种。例如，在一些实施例中，根据本发明利用的抗体呈选自但不限于以下的形式：完整IgA抗体、IgG抗体、IgE抗体或IgM抗体；双特异性抗体或多特异性抗体(例如，等)；如抗体片段以最广泛的含义在本文使用并且涵盖各种抗体结构，包含但不限于：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和/或抗体片段(优选地那些展现出期望的抗原结合活性的片段)。本文所描述的抗体可以是免疫球蛋白、重链抗体、轻链抗体、基于LRR的抗体或具有抗体样性质的其它蛋白质支架，以及本领域已知的其它免疫结合部分，包含例如Fab、Fab'、Fab'2、Fab2、Fab3、F(ab')2、Fd、Fv、Feb、scFv、SMIP、单结构域抗体、单链抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、微型抗体、大抗体、单链抗体、DVD、BiTe、TandAb等，或其任何组合。不同类抗体的亚单位结构和三维构型是本领域已知的。在一些实施例中，抗体可能缺乏在天然产生时其将会具有的共价修饰(例如，多糖的附接)。在一些实施例中，抗体可以含有共价修饰(例如，多糖的附接)、有效载荷(例如，可检测部分、治疗部分、催化部分等)或其它侧基(例如，聚乙二醇等)。

抗原结合片段：“抗原结合片段”是指抗体的与所述抗体所结合的抗原结合的部分。抗体的抗原结合片段包含与抗原特异性地结合以形成复合物的任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或经基因工程化的多肽或糖蛋白。示例性抗体片段包含但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；单结构域抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，仅scFv或VHH或VH或VL结构域)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在一些实施例中，本文所描述的抗体的抗原结合片段是scFv。在一些实施例中，本文所描述的抗体的抗原结合片段仅是VHH结构域。与完整抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段可以包括至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性地结合单独的抗原或同一抗原的不同表位。

抗体重链：如本文所使用的，术语“抗体重链”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较大的一种。

抗体轻链：如本文所使用的，术语“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较小的一种。

合成抗体：如本文所使用的，术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如由本文所描述的噬菌体表达的抗体。术语还应解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子而产生的抗体，并且所述DNA分子表达抗体蛋白质，或特定于所述抗体的氨基酸序列，其中所述DNA或氨基酸序列是使用本领域可用的和众所周知的合成DNA或氨基酸序列技术获得的。

抗原：如本文所使用的，术语“抗原”或“Ag”是指能够引发免疫应答的分子。该免疫应答可以涉及抗体产生、特异性免疫活性细胞的激活或两者。技术人员将理解，包含实际上所有的蛋白质或肽的任何大分子都可以用作抗原。此外，抗原可以源自重组或基因组DNA。本领域技术人员将理解，包括对引起免疫应答的蛋白质进行编码的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA对如本文所使用的所述术语一样的“抗原”进行编码。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包含但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发期望的免疫应答。此外，本领域技术人员将理解，抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见，抗原可以合成产生或者可以源自生物样品。此类生物样品可以包含但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。

自体：如本文所使用的，术语“自体”是指源自个体的任何材料，所述材料随后将被重新引入到同一个体中。

同种异体：如本文所使用的，术语“同种异体”是指源自同一物种的不同动物的任何材料(例如，细胞群体)。

过度增殖性疾病：如本文所使用的，术语“过度增殖性疾病”是指特征在于异常细胞的快速和不受控制的生长的疾病。过度增殖性疾病可以是良性或恶性疾病。恶性疾病的特征通常在于存在恶性细胞，例如癌细胞。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其它部分。各种癌症的实例包含但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。在某些实施例中，所述过度增殖性是造血系统恶性肿瘤，如髓细胞性恶性肿瘤或淋巴细胞性恶性肿瘤。在一些实施例中，所述造血系统恶性肿瘤是急性髓细胞性白血病。在一些实施例中，所述造血系统恶性肿瘤是骨髓增生异常综合征。

保守序列修饰：如本文所使用的，术语“保守序列修饰”是指不显著地影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。此类保守修饰包含氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，将修饰引入到与各种实施例相容的抗体中，如定点诱变和PCR介导的诱变。氨基酸取代是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的取代。在本领域中已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包含具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)，具有β支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替换，并且可以使用本文中所描述的功能性测定，测试改变的抗体与抗原结合的能力。

共刺激配体：如本文所使用的，术语“共刺激配体”是指与免疫细胞(例如，T淋巴细胞)上的同源共刺激分子特异性结合的抗原呈递细胞(例如，APC、树突细胞、B细胞等)上的分子，由此提供介导免疫细胞应答的信号，所述免疫细胞应答包含但不限于增殖、激活、分化等。共刺激配体可以包含但不限于，CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD28、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、与Toll配体受体结合的激动剂或抗体以及与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体还特别涵盖与免疫细胞(例如，T淋巴细胞)上存在的共刺激分子特异性结合的抗体，如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及与CD83特异性结合的配体。

细胞毒性：如本文所使用的，术语“细胞毒性(cytotoxic或cytotoxicity)”或是指杀伤或破坏细胞。在一个实施例中，代谢增强的细胞的细胞毒性得到改善，例如免疫细胞(例如，T淋巴细胞)的溶解活性增加。

有效量：如本文所使用的，本文所描述的“有效量”是指足以在个体中预防或治疗肿瘤疾病例如癌症的剂量。用于治疗或预防使用的有效量将取决于，例如，所治疗的疾病或病症的阶段和严重程度、患者的年龄、体重和一般健康状况，以及处方医生的判断。剂量的大小也将通过所选活性物质、施用方法、施用定时和频率、可能伴随特定活性物质施用的任何不利副作用和期望的生理作用的存在、性质和程度来确定。本领域技术人员将理解，各种疾病或病症可能需要涉及多次施用的长期治疗，可能在每一轮或多轮施用中使用本公开的经基因工程化的细胞(例如，CAR细胞)，例如在时间上接近经编辑造血干细胞，如本文所描述的。

为了本发明的目的，施用的包括包含本文所描述的CAR构建体的异源核酸的经基因工程化的细胞的量或剂量应足以在合理的时间范围内在受试者或动物中产生治疗或预防应答。例如，剂量应足以在从施用时间开始约2小时或更长时间，例如约12至约24小时或更长时间的时间段内与抗原结合，或检测、治疗或预防癌症。在某些实施例中，所述时间段甚至可以更长。剂量将由本公开的特定经基因工程化的细胞(例如，CAR细胞)的功效和动物(例如，人)的状况以及待治疗的动物(例如，人)的体重来确定。

效应子功能：如本文所施用的，“效应子功能”或“效应子活性”是指免疫细胞响应于免疫细胞的刺激而进行的特定活性。例如，T淋巴细胞的效应子功能包含识别抗原和杀伤表达抗原的细胞。

内源性：如本文所使用的，“内源性”是指来自或产生于特定生物体、细胞、组织或系统内部的任何物质。

外源性：如本文所使用的，术语“外源性”是指从特定生物体、细胞、组织或系统外部引入或产生的任何物质。

扩增：如本文所使用的，术语“扩增”是指数量的增加，如细胞数量的增加，例如免疫细胞，例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞和/或造血细胞。在一个实施例中，离体扩增的免疫细胞，例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞和/或造血细胞的数量相对于最初存在于培养物中的数量增加。在另一个实施例中，离体扩增的免疫细胞，例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞和/或造血细胞的数量相对于培养物中的其它细胞类型增加。在一些实施例中，扩增可以发生在体内。如本文所使用的术语“离体”是指已经从活生物体(例如，人)中去除并在生物体外繁殖的细胞(例如，在培养皿、试管或生物反应器中)。

功能部分：如本文所使用的，术语“功能部分”当用于提及CAR时是指本发明的CAR构建体的任何部分或片段，所述部分或片段保留了其是其中一部分的CAR构建体(亲本CAR构建体)的生物活性。功能部分涵盖例如CAR构建体的那些部分，其与亲本CAR构建体在类似程度、相同程度或更高程度上保留了识别靶细胞或检测、治疗或预防癌症的能力。关于亲本CAR构建体，功能部分可以包括例如亲本CAR的约10％、约25％、约30％、约50％、约68％、约80％、约90％、约95％或更多。

功能部分可以在部分的氨基或羧基末端或两个末端处包括另外的氨基酸，在亲本CAR构建体的氨基酸序列中没有发现所述另外的氨基酸。令人期望地，另外的氨基酸不干扰功能部分的生物功能，例如识别靶细胞、检测癌症、治疗或预防癌症等。更令人期望地，与亲本CAR构建体的生物活性相比，另外的氨基酸增强生物活性。

功能变体：如本文所使用的，如本文所使用的术语“功能变体”是指与亲本CAR构建体具有实质或显著序列同一性或相似性的CAR构建体、多肽或蛋白质，所述功能变体保留了其作为变体的CAR的生物活性。功能变体涵盖例如，本文所描述的CAR构建体(亲本CAR构建体)的那些变体，其与亲本CAR构建体在类似程度、相同程度或更高程度上保留了识别靶细胞的能力。关于亲本CAR构建体，功能变体可以例如在氨基酸序列上与亲本CAR构建体至少约30％、约50％、约75％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多相同。功能变体可以例如包括具有至少一个保守氨基酸取代的亲本CAR的氨基酸序列。可替代地或另外地，功能变体可以包括具有至少一个非保守氨基酸取代的亲本CAR构建体的氨基酸序列。在这种情况下，对非保守氨基酸取代来说优选的是不干扰或抑制功能变体的生物活性。非保守氨基酸取代可以增强功能变体的生物活性，使得与亲本CAR构建体相比，功能变体的生物活性增加。

gRNA：术语“gRNA”和“向导RNA”在全文中可互换使用并且是指促进gRNA/Cas9分子复合物特异性靶向或归巢靶核酸的核酸。gRNA可以是单分子的(具有单个RNA分子)，有时在本文中被称为sgRNA，或者是模块化的(包括多于一个，并且通常是两个独立的RNA分子)。gRNA可以与宿主细胞的基因组中的靶标结构域结合。gRNA(例如，其靶向结构域)可以与靶标结构域部分或完全互补。gRNA还可以包括“支架序列”(例如，tracrRNA序列)，其将Cas9分子募集到与gRNA序列结合的靶标结构域(例如，通过gRNA序列的靶向结构域)。支架序列可以包括至少一个茎环结构并募集核酸内切酶。示例性支架序列可以在例如Jinek等人I(2012)337(6096):816-821,Ran等人《自然实验手册(Nature Protocols)》(2013)8:2281-2308、PCT公开第WO2014/093694号和PCT公开第WO2013/176772号中找到。

异源：如本文所使用的，术语“异源”是指发生在活系统例如细胞中的现象，所述现象不天然存在于该系统中。例如，蛋白质在细胞中的表达将是蛋白质的异源表达，其中蛋白质不天然存在于所述细胞中(例如，细胞不天然编码所述蛋白质)。在一些实施例中，异源核酸编码嵌合抗原受体构建体。

免疫细胞：如本文所使用的，在本文中可与术语“免疫效应细胞”互换使用的术语“免疫细胞”是指参与免疫应答，例如促进免疫应答的细胞。免疫细胞的实例包含但不限于T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞(Langerhans'cell)或B淋巴细胞。免疫细胞源(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞)可以从受试者获得。

免疫应答：如本文所使用的，术语“免疫应答”是指当淋巴细胞将抗原分子鉴定为外来物并诱导抗体的形成和/或激活淋巴细胞以去除抗原时发生的对抗原的细胞和/或系统应答。

经动员细胞/淋巴细胞：如本文所使用的，术语“经动员细胞”是指从已经经历造血干细胞动员的受试者的血液样品(例如，单采术样品)中获得的细胞。相比之下，“稳态细胞”是指从还未经历造血干细胞动员的受试者的血液样品(例如，单采术样品)中获得的细胞。例如，如图3E和3H所示，细胞类型的相对群体和细胞的发育状态在稳态与经动员样品之间是不同的。在一些实施例中，与稳态细胞群体相比，经动员细胞群体包括更高比例的B细胞(B淋巴细胞)。在一些实施例中，经动员细胞群体包括比稳态细胞更低比例的T细胞(T淋巴细胞)。在一些实施例中，经动员细胞包括比稳态细胞更高比例的原初T细胞。在一些实施例中，经动员细胞包括比稳态细胞更低比例的中央记忆T细胞(TCM)、效应记忆T细胞(TEM)或T细胞效应子中的一种、两种或全部。如本文所使用的，术语“经动员淋巴细胞”是指从已经经历造血干细胞动员的受试者获得的淋巴细胞(或其后代)。造血干细胞动员技术和方案在临床中常规使用，并且根据本公开的各方面适合的示例性技术和方案包含利用依托泊苷、普乐沙佛、环磷酰胺和/或粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的方案。本文提供了一些示例性方案，并且另外的合适的方案对于本领域技术人员来说是显而易见的。一些示例性合适的方案包含在Albakri等人，造血干细胞动员和Notch2阻断的潜在作用的研究进展(A Review ofAdvances in Hematopoietic Stem Cell Mobilization and the Potential Role ofNotch2Blockade),《细胞移植(Cell Transplant)》2020,29:0963689720947146中所述的方案。

核酸：如本文所使用的，术语“核酸”是指至少三个核苷酸的聚合物。在一些实施例中，核酸包括DNA。在一些实施例中，核酸包括RNA。在一些实施例中，核酸是单链的。在一些实施例中，核酸是双链的。在一些实施例中，核酸包括单链部分和双链部分两者。在一些实施例中，核酸包括包含一个或多个磷酸二酯键的主链。在一些实施例中，核酸包括包含磷酸二酯键和非磷酸二酯键两者的主链。例如，在一些实施例中，核酸可以包括包含一个或多个硫代磷酸酯或5'-N-亚磷酰胺键和/或一个或多个肽键的主链，例如在“肽核酸”中。在一些实施例中，核酸包括一个或多个或全部天然残基(例如，腺嘌呤、胞嘧啶、脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶)。在一些实施例中，核酸包括一个或多个或全部非天然残基。在一些实施例中，非天然残基包括核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代嘧啶、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、插层碱基及其组合)。在一些实施例中，与天然残基中的残基相比，非天然残基包括一种或多种经修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施例中，核酸具有编码如RNA或多肽等功能基因产物的核苷酸序列。在一些实施例中，核酸具有包括一个或多个内含子的核苷酸序列。在一些实施例中，核酸可以通过从天然源分离、酶促合成(例如，通过基于互补模板的聚合，例如体内或体外、在重组细胞或系统中繁殖)或化学合成来制备。在一些实施例中，核酸是至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多的残基长度。

单链抗体：如本文所使用的，术语“单链抗体”是指通过重组DNA技术形成的抗体，其中免疫球蛋白重链和轻链片段通过经工程化的氨基酸跨度与Fv区连接。产生单链抗体的各种方法是已知的，包含在以下文献中所描述的方法：美国专利第4,694,778号；Bird(1988)《科学(Science)》242:423-442；Huston等人(1988)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》85:5879-5883；Ward等人(1989)《自然(Nature)》334:54454；Skerra等人(1988)《科学》242:1038-1041。

特异性结合：如本文所使用的，关于抗原结合结构域，如抗体试剂或嵌合抗原受体的一部分，术语“特异性结合”是指识别特定抗原，但基本上不识别或与样品中其它分子结合的抗原结合结构域或抗体试剂。例如，与来自一个物种的抗原特异性结合的抗原结合结构域或抗体试剂也可以与来自一个或多个物种的抗原结合。但是，此类跨物种反应性本身并不改变抗原结合结构域或抗体试剂的特异性分类。在另一个实例中，与抗原特异性结合的抗原结合结构域或抗体试剂也可以与抗原的不同等位基因形式结合。然而，此类跨反应性本身并不改变抗原结合结构域或抗体试剂的特异性分类。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可以用于指抗原结合结构域或抗体试剂、蛋白质或肽与第二化学物种的相互作用，以意指相互作用依赖于化学物种上的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗原结合结构域或抗体试剂识别特定蛋白质结构而非一般的蛋白质并与其结合。如果抗原结合结构域或抗体试剂对表位“A”具有特异性，则在含有标记的“A”和抗原结合结构域或抗体试剂的反应中，含有表位A(或游离、未标记的A)的分子的存在将减少与抗体结合的标记A的量。

受试者：如本文所使用的，术语“受试者”是指生物体，例如，哺乳动物(例如，人、非人哺乳动物、非人灵长类动物、灵长类动物、实验动物、小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、猫或狗)。在一些实施例中，人受试者是成人、青少年或儿科受试者。在一些实施例中，受试者患有疾病、病症或病状，例如可以如本文所提供的那样治疗的疾病、病症或病状，例如本文列出的癌症或肿瘤。在一些实施例中，受试者易患疾病、病症或病状；在一些实施例中，易感受试者易患和/或表现出发展疾病、病症或病状的风险增加(与在参考受试者或群体中观察到的平均风险相比)。在一些实施例中，受试者表现出疾病、病症或病状的一种或多种症状。在一些实施例中，受试者没有表现出疾病、病症或病状的特定症状(例如，疾病的临床表现)或特性。在一些实施例中，受试者没有表现出疾病、病症或病状的任何症状或特性。在一些实施例中，受试者是患者。在一些实施例中，受试者是正在和/或已经对其施用诊断和/或疗法的个体。

靶标：如本文所使用的，术语“靶标”是指作为所提供的方法、系统和/或组合物的受试者的体内的细胞、组织、器官或部位，例如需要治疗或优先通过例如本文所描述的CAR结合的体内的细胞、组织、器官或部位。

T细胞受体：如本文所使用的，术语“T细胞受体”或“TCR”是指参与响应于抗原呈递而激活T细胞(也可互换地称为T淋巴细胞)的膜蛋白的复合物。TCR负责识别与主要组织相容性复合物分子结合的抗原。TCR包括α(a)和β(β)链的异二聚体，尽管在一些细胞中TCR包括γ和δ(γ/δ)链。TCR可能以α/β和γ/δ形式存在，其在结构上类似，但具有不同的解剖位置和功能。每条链包括两个细胞外结构域，可变和恒定结构域。在一些实施例中，TCR可以在包括TCR的任何细胞上修饰，所述细胞包含例如辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆性T细胞、调节性T细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞。在一些实施例中，T淋巴细胞是α/βT淋巴细胞。在一些实施例中，T淋巴细胞是γ/δT淋巴细胞。

治疗的：如本文所使用的，术语“治疗的”是指治疗和/或预防。通过抑制、缓解或根除疾病状态来获得治疗效果。

经转染的：如本文所使用，术语“经转染的”或“经转换的”或“经转导的”是指将外源性核酸转移或引入到宿主细胞中的过程。“经转染的”或“经转换的”或“经转导的”细胞是用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包含原代受试者细胞和其后代。

转基因：如本文所使用的，术语“转基因”是指包括在细胞中，例如在细胞的基因组中的外源性核酸序列，其中所述核酸序列不是天然存在的。在一些实施例中，转基因可以包括编码基因产物，例如CAR的核酸序列或由其组成。在一些实施例中，转基因可以包括表达构建体，例如在调节元件，例如启动子控制下编码基因产物的核酸序列或由其组成。

治疗：如本文所使用的，术语“治疗(treat、treatment或treating)”是指疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征的发病率和/或严重程度的部分或完全减轻、改善、延迟发作、抑制、预防、缓解和/或降低。在一些实施例中，可以向未表现出疾病、病症和/或病状的迹象或特征的受试者施用治疗(例如，可以是预防性的)。在一些实施例中，可以向仅表现出疾病、病症和/或病状的早期或轻微迹象或特征的受试者施用治疗，例如以便降低患上与疾病、病症和/或病状相关的病理的风险。在一些实施例中，可以向表现出疾病、病症或病状的确定的、严重的和/或晚期迹象的受试者施用治疗。在一些实施例中，治疗可以包括向受试者施用包括表达CAR的经基因工程化的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞)的免疫细胞或向受试者施用包括经基因工程化的干细胞的造血干细胞移植物。

肿瘤：如本文所使用的，术语“肿瘤”是指细胞或组织的异常生长。在一些实施例中，肿瘤可以包括癌前(例如，良性)、恶性、转移前、转移性和/或非转移性的细胞。在一些实施例中，肿瘤与癌症相关，或者是癌症的表现。在一些实施例中，肿瘤可以是分散性肿瘤或液体瘤。在一些实施例中，肿瘤可以是实体瘤。

经基因工程化的细胞

本公开的一些方面提供了细胞，例如经动员淋巴细胞或其后代，例如包括包含编码CAR的转基因的异源核酸的T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞。在一些实施例中，所述细胞或其后代是在造血干细胞动员之后从受试者获得的淋巴细胞。

在一些实施例中，转基因编码嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体靶向与疾病或病症相关的人抗原，例如靶向与过度增殖性疾病相关的谱系特异性细胞表面抗原。在一些实施例中，所述CAR与细胞类型特异性启动子或组成型启动子可操作地连接。在一些实施例中，所述细胞类型特异性启动子是CD8启动子。在一些实施例中，所述细胞类型特异性启动子是CD3δ启动子。在一些实施例中，所述细胞类型特异性启动子是CD56启动子。在一些实施例中，所述细胞类型特异性启动子是CD244启动子。在一些实施例中，所述细胞类型特异性启动子是CD94启动子。在一些实施例中，所述细胞类型特异性启动子是NKG2D启动子。

在一些实施例中，转基因编码包括结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、至少一个共刺激结构域、细胞质信号传导结构域或其组合的嵌合抗原受体。在一些实施例中，所述结合结构域包括与抗原结合的抗体或抗原结合抗体片段。在一些实施例中，所述结合结构域包括与抗原结合的scFv或单结构域抗体。在一些实施例中，所述抗原是谱系特异性细胞表面抗原。在一些实施例中，所述抗原的表达与过度增殖性疾病相关。在一些实施例中，所述过度增殖性疾病是造血系统恶性肿瘤，如髓细胞性恶性肿瘤或淋巴细胞性恶性肿瘤。在一些实施例中，所述谱系特异性细胞表面抗原CD33、CD123、CD19、CLL-1、CD30、CD38、BCMA、CD5、CD6、CD7或任何其它谱系特异性细胞表面抗原，如本文所描述的谱系特异性细胞表面抗原。在一些实施例中，所述CAR的铰链结构域是CD8α(CD8α)铰链结构域。在一些实施例中，所述CAR的跨膜结构域是CD8或CD28跨膜结构域。在一些实施例中，所述CAR的共刺激结构域是4-1BB或CD28共刺激结构域，或其组合。在一些实施例中，所述CAR的细胞质信号传导结构域是CD3ζ(CD3zeta)细胞质信号传导结构域。

在一些实施例中，所述细胞是淋巴细胞。在一些实施例中，所述细胞是T细胞，也被称为T淋巴细胞。在一些实施例中，所述细胞是α/βT细胞。在一些实施例中，所述细胞是γ/δT细胞。在一些实施例中，所述细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施例中，所述细胞是自然杀伤T细胞(NKT细胞)。在一些实施例中，T淋巴细胞是原初T淋巴细胞、效应T淋巴细胞、记忆T淋巴细胞或调节性T淋巴细胞。在一些实施例中，所述细胞是B细胞，也被称为B淋巴细胞。

在一些实施例中，本文所提供的免疫效应细胞是特征可以在于CD3(即，CD3+)的表达的T淋巴细胞。在一些实施例中，所述T细胞表达所述T细胞受体(TCR)α和β链。在一些实施例中，所述T细胞表达所述TCRγ和δ链。T淋巴细胞可以基于其它细胞表面标志物，例如CD4或CD8的表达进一步分类。CD4或CD8的表达大致将T细胞分类为特征在于表达CD4(CD4+)的“T辅助细胞”或特征在于表达CD8(CD8+)的“细胞毒性T细胞”。如本领域普通技术人员所知，CD4+T细胞和CD8+T细胞具有不同的细胞功能。在一些实施例中，T细胞是可以进一步区分为Th1或Th2 CD4+细胞的CD4+T细胞。在一些实施例中，所述T细胞是CD8+T细胞(也被称为细胞毒性T淋巴细胞、CTL；CD8 T细胞)。

在一些实施例中，所述T细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施例中，所述T细胞是中央记忆T细胞(TCM)、干记忆T细胞(TSCM)、干细胞样记忆T细胞(或干样记忆T细胞)和效应记忆T细胞，例如TEM细胞和TEMRA(CD45RA+)细胞、效应T细胞或T辅助细胞，例如Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、Th22细胞、Tfh(滤泡辅助)细胞、T调节细胞(Treg、FoxP3+T细胞)、自然杀伤T细胞(NKT细胞)、粘膜相关不变T细胞(MAIT)和γδT细胞。在一些实施例中，所述T细胞表达如PD1等细胞死亡配体。在一些实施例中，如表达PD1的CD8+T细胞等T细胞被认为是“耗竭的”T细胞并促进免疫抑制。

在一些实施例中，本文所提供的免疫效应细胞是特征可以在于CD19(即，CD19+)的表达的T淋巴细胞。在一些实施例中，本文所提供的免疫效应细胞是特征可以在于CD56(即，CD56+)的表达的NK细胞。

在一些实施例中，本公开的细胞是经动员淋巴细胞。在一些实施例中，用于本公开的方法的细胞，例如经动员淋巴细胞，是从已经经历造血干细胞动员的受试者收集的。在一些实施例中，本公开的细胞是从已经经历造血干细胞动员的受试者中获得的外周血单核细胞(PBMC)，例如淋巴细胞。造血干细胞动员是受试者暴露于动员剂的过程，所述动员剂促进通常位于骨髓中的细胞(例如，造血干细胞)的动员，以迁移到外周循环系统中，允许通过采集血液样品，例如单采术样品来收获干细胞。参见例如Karpova D,Rettig MP,DiPersioJF.经动员外周血：更新的观点(Mobilized peripheral blood:an updatedperspective.)《F1000研究(F1000Res)》.2019；8:《F1000同行评议-2125(F1000 FacultyRev-2125)》.2019年12月20日发布.doi:10.12688/f1000research.21129.1。在一些实施例中，造血干细胞动员包括向受试者施用依托泊苷、普乐沙福、环磷酰胺和/或粒细胞集落刺激因子(G-CSF)中的一种或多种。在一些实施例中，造血干细胞动员包括受试者中的造血干细胞群体的扩增。在一些实施例中，与从尚未经历造血干细胞动员的稳态受试者收集的血液样品(例如，单采术样品)相比，从已经经历造血干细胞动员的受试者收集的血液样品(例如，单采术样品)包括不同相对比例的细胞类型(例如，相对于总细胞计数)。

在一些实施例中，来自已经经历造血干细胞动员的受试者的血液样品可以提供经动员淋巴细胞(例如，用于产生包括编码与过度增殖性疾病相关的CAR靶向谱系特异性细胞表面抗原的异源核酸的经基因工程化的细胞)和HSC(例如，用于产生如本文所描述的经基因工程化的HSC)。造血干细胞动员和获得HSC的方法描述于例如PCT申请第US2016/057339号中，所述申请以全文引用的方式并入本文中。

在一些实施例中，哺乳动物受试者是非人灵长类动物、啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)、牛、猪、马或家养动物。在一些实施例中，所述经动员淋巴细胞和/或HSC从如患有造血系统恶性肿瘤的人受试者等人受试者中获得。在一些实施例中，所述经动员淋巴细胞和/或HSC从健康供体中获得。在一些实施例中，所述经动员淋巴细胞和/或HSC从将随后施用表达嵌合受体的免疫细胞的受试者中获得。施用于从其获得细胞的同一受试者的经动员淋巴细胞被称为自体细胞，而从不是将要施用细胞的受试者的受试者获得的经动员淋巴细胞被称为同种异体细胞。

特定细胞群体或细胞类型可以从经动员淋巴细胞群体中分离出来。在一些实施例中，通过本领域众所周知的方法分离T细胞，包含可商购获得的分离方法(参见例如Rowland-Jones等人,《淋巴细胞：实用方法(Lymphocytes:A Practical Approach)》,纽约的牛津大学出版社(Oxford University Press,New York)(1999))。T细胞隔离和分离方法是本领域众所周知的，例如，根据期望的T细胞亚型，包含但不限于CD3、CD4、CD8、CD34(造血干细胞和祖细胞)等可以用于分离细胞，可以使用各种细胞表面标志物或标志物的组合(包含阳性和阴性选择)来分离T细胞，这是本领域众所周知的(参见Kearse,《T细胞方案：开发和激活(T Cell Protocols:Development and Activation)》,新泽西州托托瓦的人权出版社(Humana Press,Totowa N.J.)(2000)；De Libero,《T细胞实验室指南(T CellProtocols)》,《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》第514卷,新泽西州托托瓦的人权出版社(2009)；Su等人,《分子生物学方法》806:287-299(2012)；Bluestone等人,《科学转化医学(Sci.Transl.Med.)》7(315)(doi:10.1126/scitranslmed.aad4134)(2015)；Miyara等人,《风湿病自然评论(Nat.Rev.Rheumatol.)》10:543-551(2014)；Liu等人,《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》203:1701-1711(2006)；Seddiki等人,《实验医学杂志》203:1693-1700(2006)；Ukena等人,《实验血液学(Exp.Hematol.)》39:1152-1160(2011)；Chen等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》183:4094-4102(2009)；Putnam等人,《糖尿病(Diabetes)》58:652-662(2009)；Putnam等人,《美国移植杂志(Am.Tranplant.)》13:3010-3020(2013)；Lee等人,《癌症研究(Cancer Res.)》71:2871-2881(2011)；MacDonald等人,《临床研究杂志(J Clin.Invest.)》126:1413-1424(2016))。用于分离和扩增调节性T细胞的方法也是可商购获得的(参见例如加利福尼亚州圣何塞BD生物科学公司(BDBiosciences,San Jose,Calif.)；加拿大温哥华的干细胞技术有限公司(STEMCELLTechnologies Inc.,Vancouver,Canada)；加利福尼亚州圣地亚哥的e生物科学公司(eBioscience,San Diego,Calif.)；加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,Calif.))。

在一些实施例中，例如在与编码CAR的异源核酸接触之后，所述经基因工程化的细胞(或其后代)对于将其施用回的受试者来说是自体的。在一些实施例中，例如在与编码CAR的异源核酸接触之后，所述细胞是非自体的，例如对于将其施用于的受试者来说是同种异体的。

在一些实施例中，从受试者获得经动员细胞(例如，经动员淋巴细胞)，对其进行基因工程化以表达CAR，并且然后施用回同一受试者。在一些实施例中，从受试者获得经动员细胞(例如，经动员淋巴细胞)，对其进行基因工程化以表达CAR，并且然后施用于不同的受试者，例如HLA匹配的受试者。

可以使用用于从可以用于CAR重组表达的细胞群体(例如，经动员PBMC)中分离特定细胞类型(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞)的任何合适的方法，包含但不限于本领域已知的方法，例如描述于以下文献中的方法：Sadelain等人,《自然综述：癌症(Nat.Rev.Cancer)》3:35-45(2003)；Morgan等人,《科学》314:126-129(2006)；Panelli等人,《免疫学杂志(J Immunol.)》164:495-504(2000)；Panelli等人,《免疫学杂志》164:4382-4392(2000)；Dupont等人,《癌症研究》65:5417-5427(2005)；Papanicolaou等人,《血液(Blood)》102:2498-2505(2003)。

可以通过任何合适的方法或技术将编码靶向本文所提供的谱系特异性细胞表面抗原的CAR的异源核酸递送至细胞。例如，病毒载体系统特别适用于将核酸导入成熟细胞，但也可以使用其它递送方式。产生靶向整合的其它方法是本领域已知的，并且包含但不限于使用转座子或病毒载体(例如，AAV载体)，其表现出用于整合到宿主细胞的基因组中的位点特异性或位点偏好。虽然本文提供了递送细胞类型特异性诱导型表达系统的一些示例性方法，但是基于本公开和本领域的知识，另外的合适的系统对技术人员来说是显而易见的。在这一方面，本公开不受限制。

表达构建体

适用于在效应淋巴细胞，例如在T淋巴细胞、B淋巴细胞或NK细胞中表达嵌合抗原受体的表达构建体是本领域众所周知的。本文提供了一些示例性表达构建体，并且本领域技术人员将知道另外的合适的构建体。通常，合适的表达构建体将包括在异源启动子控制下编码CAR的核酸序列。在一些实施例中，所述启动子是组成型活性启动子。在一些实施例中，所述启动子是细胞类型特异性启动子。在一些实施例中，所述启动子是诱导型启动子。在一些实施例中，所述表达构建体包括另外的元件，例如聚腺苷酸化信号、5'UTR和/或3'UTR序列、内含子序列。根据表达构建体到靶细胞，例如到淋巴细胞的递送途径，表达构建体可以包括另外的元件，例如在病毒递送的情况下的病毒包装和整合元件。

本公开的一些方面提供了用于在特定细胞类型中表达转基因，例如CAR的异源核酸及其表达构建体。例如，本公开的一些方面提供了仅在特定细胞类型或亚型(例如，T淋巴细胞、前T细胞、成熟T淋巴细胞、NK细胞、B淋巴细胞等)中具有活性的表达构建体。在一些实施例中，细胞类型特异性和诱导型表达通过以细胞类型特异性的方式表达诱导型表达系统，例如通过将诱导型系统的组分之一置于仅在相应细胞类型中具有活性的调节元件，例如启动子的控制下来实现。

在一些实施例中，用于表达CAR的启动子处于细胞类型特异性启动子的控制之下，所述细胞类型特异性启动子是在一种特定细胞类型中表达的启动子，例如在T淋巴细胞、B-淋巴细胞、NK细胞中或在细胞的特定亚群中，例如在淋巴细胞中，但不在除了特定细胞类型之外的细胞中表达。

在一些实施例中，所述CAR包括抗原结合结构域，所述抗原结合结构域和与疾病或病症相关的抗原，例如与过度增殖性疾病或病症相关的抗原结合。

在一些实施例中，所述CAR是第一代CAR。在一些实施例中，所述CAR是第二代CAR。在一些实施例中，所述CAR是第三代CAR。在一些实施例中，所述CAR是第四或第五代CAR或装甲的CAR。本文提供了示例性CAR构建体，并且基于本公开和本领域的知识，另外的合适的CAR构建体对本领域技术人员来说是显而易见的。对于适合与目前提供的表达系统组合使用的各种CAR主链或框架的说明，参见以下示例性和非限制性出版物：Sadelain等人,《癌症发现(Cancer Discov.)》3(4):388-398(2013)；Jensen等人,《免疫学评论(Immunol.Rev.)》257:127-133(2014)；Sharpe等人,《疾病模型与机制(Dis.Model Mech.)》8(4):337-350(2015)；Brentjens等人,《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》13:5426-5435(2007)；Gade等人,《癌症研究》65:9080-9088(2005)；Maher等人,《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》20:70-75(2002)；Kershaw等人,《免疫学杂志》173:2143-2150(2004)；Sadelain等人,《免疫学新见(Curr.Opin.Immunol.)》(2009)；Hollyman等人,《免疫治疗学杂志(J.Immunother.)》32:169-180(2009)。

第一代CAR通常由细胞外抗原结合结构域构成，所述细胞外抗原结合结构域例如单链可变片段(scFv)与跨膜结构域融合，所述跨膜结构域与T细胞受体链的细胞质/细胞内结构域融合。通常，第一代CAR包括传递来自内源性T细胞受体(TCR)的信号的CD3ζ的细胞内结构域。“第一代”CAR可以提供从头抗原识别，并通过单个融合分子中的CD3ζ链信号传导结构域激活CD4+和CD8+T细胞两者，而不依赖HLA介导的抗原呈递。

第二代CAR包括与能够激活T细胞的细胞内信号传导结构域融合的抗原结合结构域和设计用于增强T细胞效力和持久性的共刺激结构域。参见例如Sadelain等人,《癌症发现》3:388-398,2013。除了CD3ζ结构域之外，第二代CAR还包括细胞内共刺激结构域，例如CD28、4-1BB、ICOS、OX40或类似的共刺激结构域。因此，第二代CAR例如通过CD28或4-1BB结构域提供共刺激并且例如通过CD3ζ信号传导结构域提供激活。与第一代CAR相比，第二代CAR可以提高T细胞的抗肿瘤活性。

第三代CAR包括多于一个共刺激结构域，例如两个共刺激结构域，例如CD28和4-1BB结构域两者，以及激活结构域，例如通过包括CD3ζ激活结构域。

通常，CAR包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。通常，所述抗原结合结构域与所关注抗原结合，如与疾病或病症相关的抗原，例如与肿瘤性或恶性疾病或病症相关的抗原。在一些实施例中，所述抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，所述抗原结合结构域是单链抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，所述抗原结合结构域包括scFv。在一些实施例中，所述抗原结合结构域包括单结构域抗体，例如骆驼抗体或其人源化衍生物。在一些实施例中，所述抗原结合结构域包括受体或受体配体。

本文提供了用于本文所公开的表达系统的一些示例性CAR。鉴于本领域关于CAR的设计的知识，基于本公开的另外的CAR对于本领域技术人员将是显而易见的，例如，如以下文献中所示：Sadelain等人,《癌症发现》3(4):388-398(2013)；Jensen等人,《免疫学评论》257:127-133(2014)；Sharpe等人,《疾病模型与机制》8(4):337-350(2015)以及其中引用的参考文献。

在一些实施例中，用于本发明的CAR包括细胞外结构域，所述细胞外结构域包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域与谱系特异性细胞表面抗原结合，例如与过度增殖性疾病相关的抗原。在一些实施例中，所述抗原结合结构域与在肿瘤细胞或恶性细胞表面上表达的谱系特异性细胞表面抗原结合。在一些实施例中，所述抗原结合结构域与在致病性或病理性细胞表面上表达或存在的谱系特异性细胞表面抗原结合，例如已经被感染剂感染的细胞，或特征在于致病性或病理性状态的细胞。在一些实施例中，所述抗原结合结构域可以是scFv或Fab、单结构域抗体或抗体的任何合适的抗原结合片段(参见Sadelain等人,《癌症发现》3:38-398(2013))。

在一些实施例中，所述抗原结合结构域包括人、人源化、嵌合或CDR移植抗体或抗原结合抗体片段的序列。在一些实施例中，所述抗原结合结构域包括scFv。本文提供了示例性scFv，并且基于本公开和scFv相关领域的知识，另外的合适的scFv对本领域技术人员来说是显而易见的(参见例如Huston等人,《美国国家科学院院刊》85:5879-5883(1988)；Ahmad等人,《临床与发育免疫学(Clin.Dev.Immunol.)》2012:ID980250(2012)；美国专利第5,091,513号、第5,132,405号和第4,956,778号；以及美国专利公开第20050196754号和第20050196754号)。本公开不限于这一方面。

可替代地使用源自抗体的抗原结合结构，CAR细胞外结构域可以包括受体的配体或细胞外配体结合结构域(参见Sadelain等人,《癌症发现》3:388-398(2013)；Sharpe等人,《疾病模型与机制》8:337-350(2015))。

在一些实施例中，所述CAR与在恶性细胞上表达的抗原结合，所述抗原有时也被称为癌症抗原。任何靶向合适的癌症抗原的CAR可以用于本文所公开的表达系统的上下文。下文提供了示例性癌症抗原和示例性癌症：

在一些实施例中，所述谱系特异性细胞表面抗原选自：CD5、CD6、CD7、CD13、CD19、CD22、CD20、CD25、CD30、CD32、CD38、CD44、CD45、CD47、CD56、96、CD117、CD123、CD135、CD174、CLL-1、BCMA,叶酸受体β、IL1RAP、MUC1、NKG2D/NKG2DL、TIM-3或WT1。

在一些实施例中，所述谱系特异性细胞表面抗原选自：CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8a、CD8b、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD16、CD16b、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32a、CD32b、CD32c、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RO、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD60a、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64a、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、CD66c、CD66F、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD75S、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85A、CD85C、CD85D、CD85E、CD85F、CD85G、CD85H、CD85I、CD85J、CD85K、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD99R、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CD108、CD109、CD110、CD111、CD112、CD113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a、CD120b、CD121a、CD121b、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CD127、CD129、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CD137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD14、CDw145、CD146、CD147、CD148、CD150、CD152、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156a、CD156b、CD156c、CD157、CD158b1、CD158b2、CD158d、CD158e1/e2、CD158f、CD158g、CD158h、CD158i、CD158j、CD158k、CD159a、CD159c、CD160、CD161、CD163、CD164、CD165、CD166、CD167a、CD168、CD169、CD170、CD171、CD172a、CD172b、CD172g、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD177、CD178、CD179a、CD179b、CD180、CD181、CD182、CD183、CD184、CD185、CD186、CD191、CD192、CD193、CD194、CD195、CD196、CD197、CDw198、CDw199、CD200、CD201、CD202b、CD203c、CD204、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、CD210a、CDw210b、CD212、CD213a1、CD213a2、CD215、CD217、CD218a、CD218b、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD231、CD232、CD233、CD234、CD235a、CD235b、CD236、CD236R、CD238、CD239、CD240、CD241、CD242、CD243、CD244、CD245、CD246、CD247、CD248、CD249、CD252、CD253、CD254、CD256、CD257、CD258、CD261、CD262、CD263、CD264、CD265、CD266、CD267、CD268、CD269、CD270、CD272、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD277、CD278、CD279、CD280、CD281、CD282、CD283、CD284、CD286、CD288、CD289、CD290、CD292、CDw293、CD294、CD295、CD296、CD297、CD298、CD299、CD300a、CD300c、CD300e、CD301、CD302、CD303、CD304、CD305、CD306、CD307a、CD307b、CD307c、CD307d、CD307e、CD309、CD312、CD314、CD315、CD316、CD317、CD318、CD319、CD320、CD321、CD322、CD324、CD325、CD326、CD327、CD328、CD329、CD331、CD332、CD333、CD334、CD335、CD336、CD337、CD338、CD339、CD340、CD344、CD349、CD350、CD351、CD352、CD353、CD354、CD355、CD357、CD358、CD359、CD360、CD361、CD362或CD363。

在一些实施例中，所述谱系特异性细胞表面抗原选自以下所列抗原：CD5、CD6、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD123、CD133、CD138、间皮素(MSLN)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PCSA)、碳酸酐酶IX(CAIX)、癌胚抗原(CEA)、上皮糖蛋白2(EGP2)、上皮糖蛋白40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、叶酸结合蛋白(FBP)、胎儿乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体-α和β(FRα和β)、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、人表皮生长因子受体2(HER-2/ERB2)、表皮生长因子受体vIII(EGFRvIII)、ERB3、ERB4、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、κ-轻链、激酶插入结构域受体(KDR)、Lewis A(CA19.9)、Lewis Y(LeY)、L1细胞粘附分子(L1CAM)、黑色素瘤相关抗原1(黑色素瘤抗原家族A1、MAGE-A1)、粘蛋白16(Muc-16)、粘蛋白1(Muc-1)、NKG2D配体、癌睾丸抗原NY-ESO-1、癌胚抗原(h5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)、肾母细胞瘤蛋白(WT-1)、1型酪氨酸蛋白激酶跨膜受体(ROR1)、B7-H3(CD276)、B7-H6(Nkp30)、硫酸软骨素蛋白多糖-4(CSPG4)、DNAX辅助分子(DNAM-1)、蝶素A型受体2(EpHA2)、成纤维细胞相关蛋白(FAP)、Gp100/HLA-A2、磷脂酰肌醇聚糖3(GPC3)、HA-1H、HERK-V、IL-11Rα、潜伏膜蛋白1(LMP1)、神经细胞粘附分子(N-CAM/CD56)和Trail受体(TRAIL R)。应当理解，这些或其它癌抗原可以用于癌症抗原CAR的靶向。虽然本文公开了一些示例性合适的CAR和一些示例性合适的CAR靶抗原，但是鉴于本领域关于CAR和CAR抗原的知识，基于本公开，另外的合适的CAR和CAR靶抗原对技术人员来说是显而易见的。参见例如国际PCT申请PCT/US2017/027601，所述文献的全部内容通过引用并入本文。在一些实施例中，CAR与本文所公开的谱系特异性细胞表面抗原结合。

经基因工程化的造血干细胞

本公开的一些方面提供了经基因工程化的造血干细胞，所述经基因工程化的造血干细胞已经经基因编辑以减少谱系特异性细胞表面抗原的表达或丧失其表达，或减少谱系特异性细胞表面抗原的变体形式的表达，所述变体形式不被靶向谱系特异性细胞表面的CAR识别。在一些实施例中，经基因工程化的干细胞以造血干细胞移植物的形式施用于受试者。

在一些实施例中，本文所提供的经基因工程化的干细胞包括基因组修饰，其导致谱系特异性细胞表面抗原的表达丧失，或谱系特异性细胞表面抗原的变体形式的表达不被靶向谱系特异性细胞表面抗原的CAR识别，并且不包括编码外源蛋白的表达构建体，例如，不包括编码CAR的表达构建体。

在一些实施例中，本文所提供的经基因工程化的造血干细胞基本上不表达谱系特异性细胞表面抗原蛋白，例如，不表达可以用如免疫染色法等合适的方法测量的谱系特异性细胞表面抗原蛋白。在一些实施例中，本文所提供的经基因工程化的造血干细胞基本上不表达野生型谱系特异性细胞表面抗原蛋白，但表达突变的谱系特异性细胞表面抗原变体，例如不被靶向谱系特异性细胞表面抗原的免疫治疗剂识别的变体，例如表达CAR的细胞，或靶向谱系特异性细胞表面抗原的抗体、抗体片段或抗体-药物缀合物(ADC)。在一些实施例中，谱系特异性细胞表面抗原是本文所描述的谱系特异性细胞表面抗原中的任何一种。

在一些实施例中，本文所提供的经基因工程化的造血干细胞是造血细胞，例如造血干细胞。造血干细胞(HSC)通常能够产生骨髓祖细胞和淋巴祖细胞，进一步分别产生骨髓细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、红细胞、血小板等)和淋巴系细胞(例如，T细胞、B细胞、NK细胞)。HSC的特征在于表达可以用于HSC的鉴定和/或分离的细胞表面标志物CD34(例如，CD34+)，以及不存在与细胞谱系定型相关的细胞表面标记物。

在一些实施例中，本文所描述的经基因工程化的造血干细胞群体包括多种经基因工程化的造血干细胞。在一些实施例中，本文所描述的经基因工程化的造血干细胞群体包括多种经基因工程化的造血祖细胞。在一些实施例中，本文所描述的经基因工程化的干细胞群体包括多种经基因工程化的造血干细胞和多种经基因工程化的造血祖细胞。

在一些实施例中，经基因工程化的HSC从如人受试者等受试者中获得。获得HSC的方法描述于例如PCT申请第US2016/057339号中，所述申请以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，通过施用动员剂，例如依托泊苷、普乐沙福、环磷酰胺和/或粒细胞集落刺激因子(G-CSF)从受试者的骨髓中动员HSC。在一些实施例中，HSC从如患有造血系统恶性肿瘤的人受试者等人受试者中获得。在一些实施例中，HSC从健康供体中获得。在一些实施例中，HSC从获得经动员淋巴细胞的同一受试者中获得。在一些实施例中，HSC从将随后施用表达CAR的经基因工程化的细胞的受试者中获得。在一些实施例中，HSC从不是将随后施用表达CAR的经基因工程化的细胞的受试者的受试者中获得。施用于从其获得细胞的同一受试者的HSC被称为自体细胞，而从不是将要施用细胞的受试者的受试者获得的HSC被称为同种异体细胞。

在一些实施例中，经基因工程化的造血干细胞群体是异质细胞群体，例如在谱系特异性细胞表面抗原中含有不同突变的经基因工程化的造血干细胞异质群体。在一些实施例中，在经基因工程化的造血干细胞群体中编码谱系特异性细胞表面抗原的基因的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的拷贝包括由本文所描述的基因组编辑方法，例如通过使用本文所提供的gRNA的CRISPR/Cas系统实现的突变。

在一些实施例中，通过基因组编辑技术产生本文所描述的经基因工程化的造血细胞，例如经基因工程化的造血干细胞或祖细胞或经基因工程化的免疫效应细胞，所述基因组编辑技术包含能够将靶向改变(也被称为“编辑”)引入到细胞的基因组中的任何技术。

经基因工程化的造血干细胞和/或祖细胞以及免疫效应细胞的方法对本领域普通技术人员来说是显而易见的。例如，PCT公开第WO 2017/066760号和第WO 2020/047164号中提供了经基因工程化的造血干细胞和/或祖细胞的示例性方法。一种示例性合适的基因组编辑技术是“基因编辑”，包括使用RNA引导的核酸酶，例如CRISPR/Cas核酸酶，在细胞基因组中引入靶向单链或双链DNA断裂，其触发细胞修复机制，例如非同源末端连接(NHEJ)，微同源性介导的末端连接(MMEJ，有时也被称为“替代NHEJ”或“alt-NHEJ”)，或同源性定向修复(HDR)，其通常导致在核酸酶切割位点处或紧邻核酸酶切割位点的核酸序列改变(例如，通过核苷酸或核苷酸序列插入、缺失、倒置或取代)。参见Yeh等人《自然细胞生物学(Nat.Cell.Biol.)》(2019)21:1468-1478；例如Hsu等人《细胞(Cell)》(2014)157:1262-1278；Jasin等人《DNA修复(DNA Repair)》(2016)44:6-16；Sfeir等人《生物化学科学趋势(Trends Biochem.Sci.)》(2015)40:701-714。

另一种示例性合适的基因组编辑技术是“碱基编辑”，其包含使用碱基编辑器，例如核酸酶受损或部分核酸酶受损的RNA引导的CRISPR/Cas蛋白，其与靶向并脱氨基特定核碱基的脱氨酶融合，例如C或核苷酸的胞嘧啶或腺苷核碱基，其通过细胞错配修复机制导致从C到T核苷酸的改变，或从A到G核苷酸的改变。参见例如Komor等人《自然》(2016)533:420-424；Rees等人《自然遗传学评论(Nat.Rev.Genet.)》(2018)19(12):770-788；Anzalone等人《自然生物技术》(2020)38:824-844。

又另一种示例性合适的基因组编辑技术包含“引物编辑”，其包含使用催化受损的或部分催化受损的RNA引导的核酸酶，例如与工程逆转录酶(RT)结构域融合的CRISPR/Cas核酸酶，将新的基因信息，例如改变的核苷酸序列引入到特异性靶向的基因组位点。Cas/RT融合通过向导RNA靶向基因组内的靶位点，所述向导RNA还包括编码期望的经编辑核酸序列，并且可以用作RT的引物。参见例如Anzalone等人《自然》(2019)576(7785):149-157。

基因组编辑技术的使用通常以使用合适的RNA引导的核酸酶为特征，在一些实施例中，例如对于碱基编辑或引物编辑，所述核酸酶可能催化受损或部分催化受损。合适的RNA引导的核酸酶的实例包含CRISPR/Cas核酸酶。例如，在一些实施例中，用于本文所提供的经基因工程化的细胞的方法的合适的RNA引导的核酸酶是Cas9核酸酶，例如SpCas9或SaCas9核酸酶。对于另一个实例，在一些实施例中，用于本文所提供的经基因工程化的细胞的方法的合适的RNA引导的核酸酶是Cas12核酸酶，例如Cas12a核酸酶。示例性合适的Cas12核酸酶包含但不限于AsCas12a、FnCas12a、其它Cas12a直系同源物和Cas12a衍生物，如MAD7系统(MAD7TM，Inscripta公司(Inscripta,Inc.))，或Alt-R Cas12a(Cpf1)Ultra核酸酶(Cas12a Ultra；集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies,Inc.))。参见例如Gill等人LIPSCOMB 2017.美国：Inscripta公司；Price等人《生物技术和生物工程(Biotechnol.Bioeng.)》(2020)117(60):1805-1816。

在一些实施例中，本文所描述的经基因工程化的造血细胞，例如经基因工程化的造血干细胞或祖细胞或经基因工程化的免疫效应细胞，是通过在适于RNA引导的核酸酶与靶位点结合并切割细胞基因组DNA的条件下，将RNA引导的核酸酶，例如CRISPR/Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶或Cas12a核酸酶靶向细胞基因组中的合适靶位点而产生的。合适的RNA引导的核酸酶可以通过合适的向导RNA(gRNA)靶向基因组内的特定靶位点。根据本公开的方面，本文提供了用于靶向CRISPR/Cas核酸酶的合适的gRNA并且本文别处更详细地描述了示例性合适的gRNA。

在一些实施例中，本文所描述的谱系特异性细胞表面抗原gRNA与CRISPR/Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶复合。根据本公开的方面，多种Cas9核酸酶适用于本文所提供的gRNA以实现基因组编辑。通常，Cas核酸酶和gRNA以适于形成Cas/gRNA复合物的形式和条件提供，其靶向细胞基因组上的靶位点，例如编码谱系特异性细胞表面抗原的序列内的靶位点。在一些实施例中，使用Cas核酸酶，其表现出期望的PAM特异性，以将Cas/gRNA复合物靶向编码谱系特异性细胞表面抗原的序列中的期望的靶标结构域。本文提供了合适的靶标结构域和对应的gRNA靶向结构域序列。

在一些实施例中，例如在体外形成Cas/gRNA复合物，并且例如通过将Cas/gRNA复合物电穿孔到细胞中，使靶细胞与Cas/gRNA复合物接触。在一些实施例中，使细胞分别与Cas蛋白和gRNA接触，并且Cas/gRNA复合物在细胞内形成。在一些实施例中，使细胞与编码Cas蛋白的核酸，例如DNA或RNA，和/或编码gRNA的核酸，或两者接触。

在一些实施例中，使用合适的基因组编辑技术产生本文所提供的经基因工程化的细胞，其中基因组编辑技术的特征在于使用Cas9核酸酶。在一些实施例中，Cas9分子是或源自于酿脓链球菌(Streptococcus pyogene，SpCas9)、金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SaCas9)或嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus，stCas9)。另外的合适的Cas9分子包含或源自以下分子：脑膜炎奈瑟菌(NmCas9)、燕麦食酸菌(Acidovorax avenae)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、猪放线杆菌(Actinobacillus suis)、放线菌(Actinomyces sp.)、反硝化嗜环菌(cycliphilus denitrificans)、寡食氨基酸单胞菌(Aminomonas paucivorans)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、斯密氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、拟杆菌属(Bacteroidessp.)、海洋芽殖小小梨形菌(Blastopirellula marina)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)、侧孢短芽胞杆菌(Brevibacillus laterosporus)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni，CjCas9)、拉里弯曲杆菌(Campylobacter lari)、待定的微粉红螺菌属(Candidatus Puniceispirillum)、解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、拥挤棒杆菌(Corynebacterium accolens)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、马氏棒状杆菌(Corynebacterium matruchotii)、恒雄芝氏沟鞭藻玫瑰杆菌(Dinoroseobactershibae)、细长真杆菌(Eubacterium dolichum)、γ-变形杆菌(gamma proteobacterium)、重氮葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)、副流感嗜血杆菌(Haemophilusparainfluenzae)、唾液嗜血杆菌(Haemophilus sputorum)、加拿大螺杆菌(Helicobactercanadensis)、同性恋螺杆菌(Helicobacter cinaedi)、雪貂螺杆菌(Helicobactermustelae)、多营养泥杆菌(Ilyobacter polytropus)、金氏杆菌(Kingella kingae)、弯曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)、斯氏利斯特菌(Listeria ivanovii)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、李斯特氏菌科细菌(Listeriaceae bacterium)、甲基孢囊菌(Methylocystis sp.)、甲烷氧化菌(Methylosinus trichosporium)、羞怯动弯杆菌(Mobiluncus mulieris)、杆状奈瑟菌(Neisseria bacilliformis)、灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea)、浅黄色奈瑟菌(Neisseria flavescens)、乳糖奈瑟菌(Neisserialactamica)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、奈瑟氏球菌(Neisseria sp.)、奈瑟氏沃斯沃军团菌(Neisseria wadsworthii)、亚硝化单胞菌(Nitrosomonassp.)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、琥珀酸考拉杆菌(Phascolarctobacterium succinatutens)、蒲桃雷尔氏菌(Ralstoniasyzygii)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、小红卵菌(Rhodovulum sp.)、米氏西蒙斯氏菌(Simonsiella muelleri)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)、葡萄园芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus vineae)、表皮路邓葡萄球菌(Staphylococcuslugdunensis)、链球菌(Streptococcus sp.)、罕见小球菌(Subdoligranulum sp.)、运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)、密螺旋体(Treponema sp.)或爱胜蚓蚯蚓肾杆菌(Verminephrobacter eiseniae)。在一些实施例中，可以使用此类Cas9核酸酶的催化受损或部分受损的变体。基于本公开，另外的合适的Cas9核酸酶和核酸酶变体对本领域技术人员来说是显而易见的。在这一方面，本公开不受限制。

在一些实施例中，Cas核酸酶是天然存在的Cas分子。在一些实施例中，Cas核酸酶是工程化的、改变或经修饰的Cas分子，其不同于参考序列，例如最相似的天然存在的Cas9分子或PCT公开第WO2015/157070号的表50的序列不同例如至少一个氨基酸残基，所述公开通过引用整体并入本文。

在一些实施例中，使用属于Cas核酸酶的2类V型的Cas核酸酶。2类V型Cas核酸酶可以进一步分类为V-A型、V-B型、V-C型和V-U型。参见例如Stella等人《自然结构与分子生物学(Nature Structural&Molecular Biology)》(2017)。在一些实施例中，Cas核酸酶是V-B型Cas内切核酸酶，如C2c1。参见例如Shmakov等人《分子细胞(Mol Cell)》(2015)60:385-397。在一些实施例中，用于本文所提供的基因组编辑方法的Cas核酸酶是V-A型Cas核酸内切酶，如Cpf1(Cas12a)核酸酶。参见例如Strohkendl等人《分子细胞(Mol.Cell)》(2018)71:1-9。在一些实施例中，用于本文所提供的基因组编辑方法的Cas核酸酶是源自普雷沃菌属(Provetella spp.)或弗朗西斯菌属(Francisella spp.)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp.，AsCpf1)、毛螺菌科细菌(LpCpf1)或直肠真杆菌的Cpf1核酸酶。在一些实施例中，所述Cas核酸酶是MAD7。

根据本公开的方面，CRISPR/Cas核酸酶的天然存在的和经修饰的变体两者适用。例如，dCas或切口酶变体、具有改变的PAM特异性的Cas变体和具有提高的核酸酶活性的Cas变体被本公开的一些实施例所涵盖。

不希望受任何特定理论的束缚，本文更详细地描述了一些示例性、非限制性的合适Cas核酸酶的一些特征。

天然存在的Cas9核酸酶通常包含两个叶：识别(REC)叶和核酸酶(NUC)叶；其中每一个进一步包括例如PCT公开第WO2015/157070号，例如其中的图9A-9B中描述的结构域(所述申请通过引用整体并入本文)。

REC叶包括富含精氨酸的桥螺旋(BH)、REC1结构域和REC2结构域。REC叶似乎是Cas9特异性功能结构域。BH结构域是长α螺旋和富含精氨酸的区并且包括酿脓链球菌Cas9的序列的氨基酸60-93。REC1结构域参与重复:抗重复双链体，例如gRNA或tracrRNA的识别。REC1结构域包括酿脓链球菌Cas9的序列的氨基酸94至179和308至717处的两个REC1基序。这两个REC1结构域虽然在线性一级结构中被REC2结构域分开，但在三级结构中组装形成REC1结构域。REC2结构域或其部分也可以在重复:抗重复双链体的识别中发挥作用。REC2结构域包括酿脓链球菌Cas9的序列的氨基酸180-307。

NUC叶包括RuvC结构域(本文也被称为RuvC样结构域)、HNH结构域(本文也被称为HNH样结构域)和PAM相互作用(PI)结构域。RuvC结构域与逆转录病毒整合酶超家族成员共享类似的结构并切割单链，例如靶核酸分子的非互补链。RuvC结构域由分别位于酿脓链球菌Cas9的序列的氨基酸1-59、718-769和909-1098处的三个分开的RuvC基序(RuvC I、RuvCII和RuvCIII，其在本领域中通常被称为RuvCI结构域或N末端RuvC结构域、RuvCII结构域和RuvCIII结构域)组装而成。与REC1结构域类似，三个RuvC基序被一级结构中的其它结构域线性分离，然而在三级结构中，三个RuvC基序组装并形成RuvC结构域。HNH结构域与HNH核酸内切酶共享结构相似性，并且切割单链，例如靶核酸分子的互补链。HNH结构域位于RuvC II-III基序之间并且包括酿脓链球菌Cas9的序列的氨基酸775-908。PI结构域与靶核酸分子的PAM相互作用并且包括酿脓链球菌Cas9的序列的氨基酸1099-1368。

已经确定了天然存在的细菌Cas9核酸酶(参见例如Jinek等人,《科学》,343(6176):1247997,2014)和具有向导RNA的酿脓链球菌Cas9(例如，crRNA和tracrRNA的合成融合)(Nishimasu等人,《细胞》,156:935-949,2014；以及Anders等人,《自然》,2014,doi:10.1038/naturel3579)的晶体结构。

在一些实施例中，本文所描述的Cas9分子表现出导致在靶位点中或紧邻靶位点处引入双链DNA断裂的核酸酶活性。在一些实施例中，Cas9分子已经经修饰以使核酸内切酶的催化残基之一失活。在一些实施例中，Cas9分子是切口酶并产生单链断裂。参见例如Dabrowska等人《神经科学前沿(Frontiers in Neuroscience)》(2018)12(75)。已经表明，酶的RuvC和HNH催化结构域中的一个或多个突变可以提高Cas9效率。参见例如Sarai等人《当代制药生物技术(Currently Pharma.Biotechnol.)》(2017)18(13)。在一些实施例中，Cas9分子与第二结构域，例如修饰DNA或染色质的结构域，例如脱氨酶或脱甲基酶结构域融合。在一些此类实施例中，Cas9分子经修饰以消除其核酸内切酶活性。

在一些实施例中，本文所描述的Cas核酸酶或Cas/gRNA复合物与用于同源性定向修复(HDR)的模板一起施用。在一些实施例中，本文所描述的Cas核酸酶或Cas/gRNA复合物在没有HDR模板的情况下施用。

在一些实施例中，使用Cas9核酸酶，其经修饰以增强酶的特异性(例如，减少脱靶效应，维持稳健的靶上切割)。在一些实施例中，Cas9分子是增强特异性的Cas9变体(例如，eSPCas9)。参见例如Slaymaker等人《科学》(2016)351(6268):84-88。在一些实施例中，Cas9分子是高保真Cas9变体(例如，SpCas9-HF1)。参见例如Kleinstiver等人《自然》(2016)529:490-495。

各种Cas核酸酶是本领域已知的并且可以从各种来源获得和/或经工程化/修饰以调节酶的一种或多种活性或特异性。合适的Cas核酸酶，例如合适的Cas9核酸酶，例如SpCas9和SaCas9的PAM序列偏好和特异性是本领域已知的。在一些实施例中，Cas核酸酶已经经工程化/修饰以识别一个或多个PAM序列。在一些实施例中，Cas核酸酶已经经工程化/修饰以识别不同于未经工程化/修饰的Cas核酸酶识别的PAM序列的一个或多个PAM序列。在一些实施例中，Cas核酸酶已经经工程化/修饰以降低酶的脱靶活性。

在一些实施例中，使用Cas核酸酶，其被进一步修饰以改变核酸内切酶活性的特异性(例如，减少脱靶切割、减少核酸内切酶活性或在细胞中的寿命、增加同源性定向重组和减少非同源末端连接)。参见例如Komor等人《细胞》(2017)168:20-36。在一些实施例中，使用Cas核酸酶，其被修饰以改变内切核酸酶的PAM识别或偏好。例如，SpCas9识别PAM序列NGG，而包括一个或多个修饰的SpCas9的一些变体(例如，VQR SpCas9、EQR SpCas9、VRERSpCas9)可以识别变体PAM序列，例如NGA、NGAG和/或NGCG。对于另一个实例，SaCas9识别PAM序列NNGRRT，而包括一个或多个修饰的SaCas9的一些变体(例如，KKH SaCas9)可以识别PAM序列NNNRRT。在另一个实例中，FnCas9识别PAM序列NNG，而包括一个或多个修饰的FnCas9的变体(例如，RHA FnCas9)可以识别PAM序列YG。在另一个实例中，包括取代突变S542R和K607R的Cas12a核酸酶识别PAM序列TYCV。在另一个实例中，包括取代突变S542R、K607R和N552R的Cpf1核酸内切酶识别PAM序列TATV。参见例如Gao等人《自然生物技术》(2017)35(8):789-792。

在一些实施例中，碱基编辑器用于产生基因组修饰，导致谱系特异性细胞表面抗原的表达丧失，或免疫疗法未靶向的谱系特异性细胞表面抗原变体的表达丧失。碱基编辑通常包括与功能结构域，例如脱氨酶结构域融合的无催化活性或部分无催化活性的Cas核酸酶。参见例如Eid等人《生物化学杂志(Biochem.J.)》(2018)475(11):1955-1964；Rees等人《自然评论：遗传学(Nature Reviews Genetics)》(2018)19:770-788。在一些实施例中，无催化活性的Cas核酸酶被称为“死Cas”或“dCas”。在一些实施例中，核酸内切酶包括与腺嘌呤碱基编辑器(ABE)融合的dCas，例如从RNA腺嘌呤脱氨酶TadA进化而来的ABE。在一些实施例中，核酸内切酶包括与胞苷脱氨酶(例如，APOBEC脱氨酶、pmCDA1、激活诱导的胞苷脱氨酶(AID))融合的dCas。在一些实施例中，无催化活性的Cas分子具有降低的活性并且是例如切口酶。

合适的碱基编辑器的实例包含但不限于BE1、BE2、BE3、HF-BE3、BE4、BE4max、BE4-Gam、YE1-BE3、EE-BE3、YE2-BE3、YEE-CE3、VQR-BE3、VRER-BE3、SaBE3、SaBE4、SaBE4-Gam、Sa(KKH)-BE3、靶标-AID、靶标-AID-NG、xBE3、eA3A-BE3、BE-PLUS、TAM、CRISPR-X、ABE7.9、ABE7.10、ABE7.10*、xABE、ABESa、VQR-ABE、VRER-ABE、Sa(KKH)-ABE和CRISPR-SKIP。碱基编辑器的另外的实例可以在例如美国公开第2018/0312825A1号、美国公开第2018/0312828A1号和PCT公开第WO 2018/165629A1号中找到，所述公开的全部内容通过引用并入本文。

本公开的一些方面提供了向导RNA，其适于将例如，如本文所提供的RNA引导的核酸酶靶向细胞基因组中的合适靶位点，以便实现细胞基因组中的修饰，从而导致谱系特异性细胞表面抗原的表达减少、谱系特异性细胞表面抗原的表达丧失或谱系特异性细胞表面抗原的变体形式的表达，所述变体形式不被靶向谱系特异性细胞表面抗原的免疫治疗剂识别。

本文提供了一些示例性合适的Cas9 gRNA支架序列，并且基于本公开，另外的合适的gRNA支架序列对技术人员来说是显而易见的。此类另外的合适支架序列包含但不限于Jinek等人《科学》(2012)337(6096):816-821；Ran等人《自然实验手册》(2013)8:2281-2308；PCT公开第WO2014/093694号和PCT公开第WO2013/176772号中所述的序列。

例如，天然存在的SpCas9 gRNA的结合结构域通常包括两个RNA分子，crRNA(部分)和tracrRNA。SpCas9 gRNA的变体已经经工程化并且通常被称为“单向导RNA”或“sgRNA”，所述变体仅包括包含crRNA和tracrRNA序列两者的单个RNA分子，例如通过四环或通过点击化学型共价键彼此共价结合。与其它Cas核酸酶，例如与Cas12a核酸酶一起使用的合适的gRNA通常仅包括单个RNA分子，因为天然存在的Cas12a向导RNA包括单个RNA分子的RNA。合适的gRNA因此可以是单分子的(具有单个RNA分子)，有时在本文中被称为sgRNA，或者是模块化的(包括多于一个，并且通常是两个独立的RNA分子)。

适于靶向谱系特异性细胞表面抗原中的靶位点的gRNA可以包括多个结构域。在一些实施例中，例如，在使用Cas9核酸酶的一些实施例中，单分子sgRNA可以从5'至3'包括：

与谱系特异性细胞表面抗原编码基因中的靶位点序列相对应的靶向结构域；

第一互补结构域；

连接结构域；

第二互补结构域(其与第一互补结构域互补)；

近侧结构域；以及

任选地尾部结构域。

现在更详细地描述这些结构域中的每个结构域。

如本文所提供的gRNA通常包括与细胞基因组中的靶位点结合的靶向结构域。靶位点通常是包括PAM序列的双链DNA序列以及在与PAM序列相同的链上并且直接邻近其的链上的靶标结构域。gRNA的靶向结构域通常包括与靶标结构域序列相对应的RNA序列，因为其类似于靶标结构域的序列，有时具有一个或多个错配，但通常包括RNA而不是DNA序列。因此，gRNA的靶向结构域与和靶标结构域的序列互补的双链靶位点的序列碱基配对(完全或部分互补)，并且因此与和包括PAM序列的链互补的链碱基配对。应当理解，gRNA的靶向结构域通常不包含PAM序列。还应理解，根据所用的核酸酶，PAM的位置可以是靶标结构域序列的5'或3'。例如，PAM通常是Cas9核酸酶的靶标结构域序列的3'和Cas12a核酸酶的靶标结构域序列的5'。关于PAM的位置和gRNA结合靶位点的机制的说明，参见例如Vanegas等人,《真菌生物技术(Fungal Biol Biotechnol.)》2019；6:6的图1，所述文献通过引用并入本文。关于gRNA将RNA引导的核酸酶靶向靶位点的机制的另外的说明和描述，参见Fu Y等人,《自然生物技术(Nat Biotechnol)》2014(doi:10.1038/nbt.2808)和Sternberg SH等人,《自然》2014(doi:10.1038/naturel3011)，这两篇文献通过引用并入本文。

靶向结构域可以包括与靶标结构域的序列相对应的核苷酸序列，即直接邻近PAM序列的DNA序列(例如，对于Cas9核酸酶，PAM序列的5'末端，或者对于Cas12a核酸酶，PAM序列的3'末端)。靶向结构域序列通常包括17至30个核苷酸并且与靶标结构域序列完全相对应(即，没有任何错配核苷酸)，或者可以包括一个或多个，但通常不超过4个错配。由于靶向结构域是RNA分子gRNA的一部分，其将通常包括核糖核苷酸，而DNA靶向结构域将包括脱氧核糖核苷酸。

以下提供了包括22个核苷酸靶标结构域和NGG-PAM序列的Cas9靶位点以及包括与靶标结构域完全相对应的靶向结构域的gRNA(并且因此和与包括靶标结构域和PAM的链互补的DNA链具有完全互补性的碱基对)的示例性说明：

以下提供了包括22个核苷酸靶标结构域和TTN-PAM序列的Cas12a靶位点以及包括与靶标结构域完全相对应的靶向结构域的gRNA(并且因此和与包括靶标结构域和PAM的链互补的DNA链具有完全互补性的碱基对)的示例性说明：

在一些实施例中，Cas12a PAM序列是5'-T-T-T-V-3'。

虽然不希望受理论的束缚，但至少在一些实施例中，据信靶向结构域与靶序列的长度和互补性有助于gRNA/Cas9分子复合物与靶核酸相互作用的特异性。在一些实施例中，本文所提供的gRNA的靶向结构域的长度为5至50个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为15至25个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为18至22个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为19-21个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为15个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为16个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为17个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为18个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为19个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为20个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为21个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为22个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为23个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为24个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域的长度为25个核苷酸。在一些实施例中，靶向结构域与本文所提供的靶标结构域序列或其部分完全相对应，没有错配。在一些实施例中，本文所提供的gRNA的靶向结构域相对于本文所提供的靶标结构域序列包括1个错配。在一些实施例中，靶向结构域相对于靶标结构域序列包括2个错配。在一些实施例中，靶标结构域相对于靶标结构域序列包括3个错配。

在一些实施例中，靶向结构域包括核心结构域和二级靶向结构域，例如，如PCT公开第WO2015/157070号中所描述的，所述公开通过引用整体并入本文。在一些实施例中，核心结构域包括从靶向结构域的3'末端起约8至约13个核苷酸(例如，靶向结构域的最接近3'的8至13个核苷酸)。在一些实施例中，二级结构域位于核心结构域的5'。在一些实施例中，核心结构域与靶标结构域序列或其部分完全相对应。在其它实施例中，核心结构域可以包括与靶标结构域序列的对应的核苷酸错配的一个或多个核苷酸。

在一些实施例中，例如，在提供了Cas9 gRNA的一些实施例中，gRNA包括第一互补结构域和第二互补结构域，其中第一互补结构域与第二互补结构域互补，并且至少在一些实施例中，与第二互补结构域具有足够的互补性，以在至少一些生理条件下形成双链区。在一些实施例中，第一互补结构域的长度为5至30个核苷酸。在一些实施例中，第一互补结构域包括3个亚结构域，所述亚结构域在5'至3'方向为：5'亚结构域、中心亚结构域和3'亚结构域。在一些实施例中，5'亚结构域的长度为4至9，例如4、5、6、7、8或9个核苷酸。在一些实施例中，中心亚结构域的长度为1、2或3，例如1个核苷酸。在一些实施例中，3'亚结构域的长度为3至25，例如4至22、4至18、或4至10、或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。第一互补结构域可以与天然存在的第一互补结构域共享同源性或者源自天然存在的第一互补结构域。在实施例中，其与酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌或嗜热链球菌第一互补结构域具有至少50％同源性。

上述结构域的序列和位置在PCT公开第WO2015/157070号中有更详细的描述，所述公开的全部内容通过引用并入本文，包含其中的第88-112页。

连接结构域可用于连接单分子gRNA的第一互补结构域和第二互补结构域。连接结构域可以共价或非共价连接第一和第二互补结构域。在一些实施例中，连接是共价的。在一些实施例中，连接结构域是或包括插入在第一互补结构域与第二互补结构域之间的共价键。在一些实施例中，连接结构域包括一个或多个，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施例中，连接结构域包括至少一个非核苷酸键，例如，如PCT公开第WO2018/126176号中所公开的，所述公开的全部内容通过引用并入本文。

在一些实施例中，第二互补结构域与第一互补结构域至少部分互补，并且在实施例中，与第二互补结构域具有足够的互补性，以在至少一些生理条件下形成双链区。在一些实施例中，第二互补结构域可以包含与第一互补结构域缺乏互补性的序列，例如，从双链区环出的序列。在一些实施例中，第二互补结构域的长度为5至27个核苷酸。在一些实施例中，第二互补结构域比第一互补区长。在一些实施例中，互补结构域的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸。在一些实施例中，第二互补结构域包括3个亚结构域，所述亚结构域在5'至3'方向为：5'亚结构域、中心亚结构域和3'亚结构域。在一些实施例中，5'亚结构域的长度为3至25，例如4至22、4至18、或4至10、或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸。在一些实施例中，中心亚结构域的长度为1、2、3、4或5，例如3个核苷酸。在一些实施例中，3'亚结构域的长度为4至9，例如4、5、6、7、8或9个核苷酸。在一些实施例中，第一互补结构域的5'亚结构域和3'亚结构域分别与第二互补结构域的3'亚结构域和5'亚结构域互补，例如完全互补。

在一些实施例中，近侧结构域的长度为5至20个核苷酸。在一些实施例中，近侧结构域可以与天然存在的近侧结构域共享同源性或者源自天然存在的近侧结构域。在实施例中，其与来自酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌或嗜热链球菌的近侧结构域具有至少50％同源性。

尾部结构域的广谱适用于gRNA。在一些实施例中，尾部结构域的长度为0(不存在)、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施例中，尾部结构域核苷酸来自天然存在的尾部结构域的5'末端的序列或与其共享同源性。在一些实施例中，尾部结构域包含彼此互补的序列，并且在至少一些生理条件下形成双链区。在一些实施例中，尾部结构域不存在或长度为1至50个核苷酸。在一些实施例中，尾部结构域可以与天然存在的近侧尾部结构域共享同源性或者可以源自天然存在的近侧尾部结构域。在一些实施例中，尾部结构域与来自酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌或嗜热链球菌的尾部结构域具有至少50％同源性/同一性。在一些实施例中，尾部结构域包含与体外或体内转录方法相关的3'末端处的核苷酸。

在一些实施例中，本文所提供的gRNA包括：

第一链，所述第一链例如从5'至3'包括：

靶向结构域(其与CD30基因中的靶标结构域相对应)；以及

第一互补结构域；以及

第二链，所述第二链例如从5'至3'包括：

任选地5'延长结构域；

第二互补结构域；

近侧结构域；以及

任选地尾部结构域。

在一些实施例中，本文所提供的任何gRNA包括一个或多个经化学修饰的核苷酸。gRNA的化学修饰先前已有描述，并且合适的化学修饰包含有益于gRNA功能并且不会显著增加给定gRNA的任何不期望的特性，例如脱靶效应的任何修饰。合适的化学修饰包含例如使gRNA对核酸内切酶或核酸外切酶催化活性不太敏感的化学修饰，并且包含但不限于，硫代磷酸酯主链修饰、2'-O-Me修饰(例如，在3'和5'末端两者中的一个或两个)、2'F-修饰、用双环核苷酸-cEt取代核糖、3'硫代PACE(MSP)修饰或其任何组合。基于本公开，另外的合适的gRNA修饰对本领域技术人员来说将是显而易见的，并且此类合适的gRNA修饰包含但不限于，例如在Rahdar等人,《美国国家科学院院刊》(2015)112(51)E7110-E7117和Hendel等人,《自然生物技术》(2015)；33(9):985-989中描述的修饰，所述文献中的每个文献通过引用整体并入本文。

例如，本文所提供的gRNA可以包括一个或多个2'-O修饰的核苷酸，例如2'-O-甲基核苷酸。在一些实施例中，所述gRNA在所述gRNA的5'末端处包括2'-O修饰的核苷酸，例如2'-O-甲基核苷酸。在一些实施例中，所述gRNA在所述gRNA的3'末端处包括2'-O修饰的核苷酸，例如2'-O-甲基核苷酸。在一些实施例中，所述gRNA在所述gRNA的5'末端处和3'末端处两者包括2'-O修饰的核苷酸，例如2'-O-甲基核苷酸。在一些实施例中，所述gRNA是2'-O修饰的，例如在所述gRNA的5'末端处的核苷酸、所述gRNA的5'末端的第二核苷酸和所述gRNA的5'末端的第三核苷酸处是经2'-O-甲基修饰的。在一些实施例中，所述gRNA是2'-O修饰的，例如在所述gRNA的3'末端处的核苷酸、所述gRNA的3'末端的第二核苷酸和所述gRNA的3'末端的第三核苷酸处是经2'-O-甲基修饰的。在一些实施例中，所述gRNA是2'-O修饰的，例如在所述gRNA的5'末端处的核苷酸、所述gRNA的5'末端的第二核苷酸、所述gRNA的5'末端的第三核苷酸、所述gRNA的3'末端处的核苷酸、所述gRNA的3'末端的第二核苷酸和所述gRNA的3'末端的第三核苷酸处是经2'-O-甲基修饰的。在一些实施例中，所述gRNA是2'-O修饰的，例如在所述gRNA的3'末端的第二核苷酸、所述gRNA的3'末端的第三核苷酸和所述gRNA的3'末端的第四核苷酸处是经2'-O-甲基修饰的。在一些实施例中，在所述gRNA的3'末端处的核苷酸不是经化学修饰的。在一些实施例中，在所述gRNA的3'末端处的核苷酸不具有经化学修饰的糖。在一些实施例中，所述gRNA是2'-O修饰的，例如在所述gRNA的5'末端处的核苷酸、所述gRNA的5'末端的第二核苷酸、所述gRNA的5'末端的第三核苷酸、所述gRNA的3'末端的第二核苷酸、所述gRNA的3'末端的第三核苷酸和所述gRNA的3'末端的第四核苷酸处是经2'-O-甲基修饰的。在一些实施例中，所述2'-O-甲基核苷酸包括与相邻核苷酸的磷酸键。在一些实施例中，所述2'-O-甲基核苷酸包括与相邻核苷酸的硫代磷酸酯键。在一些实施例中，所述2'-O-甲基核苷酸包括与相邻核苷酸的硫代PACE键。

在一些实施例中，本文所提供的gRNA可以包括一个或多个2'-O修饰的和3'磷修饰的核苷酸，例如2'-O-甲基3'硫代磷酸酯核苷酸。在一些实施例中，所述gRNA在所述gRNA的5'末端处包括2'-O修饰的和3'磷修饰的，例如2'-O-甲基3'硫代磷酸酯核苷酸。在一些实施例中，所述gRNA在所述gRNA的3'末端处包括2'-O修饰的和3'磷修饰的，例如2'-O-甲基3'硫代磷酸酯核苷酸。在一些实施例中，所述gRNA在所述gRNA的5'末端处和3'末端处包括2'-O修饰的和3'磷修饰的，例如2'-O-甲基3'硫代磷酸酯核苷酸。在一些实施例中，所述gRNA包括主链，其中一个或多个非桥接氧原子被硫原子替代。在一些实施例中，所述gRNA是2'-O修饰的和3'磷修饰的，例如在所述gRNA的5'末端处的核苷酸、所述gRNA的5'末端的第二核苷酸和所述gRNA的5'末端的第三核苷酸处是2'-O-甲基3'硫代磷酸酯修饰的。在一些实施例中，所述gRNA是2'-O修饰的和3'磷修饰的，例如在所述gRNA的3'末端处的核苷酸、所述gRNA的3'末端的第二核苷酸和所述gRNA的3'末端的第三核苷酸处是2'-O-甲基3'硫代磷酸酯修饰的。在一些实施例中，所述gRNA是2'-O修饰的和3'磷修饰的，例如在所述gRNA的5'末端处的核苷酸、所述gRNA的5'末端的第二核苷酸、所述gRNA的5'末端的第三核苷酸、所述gRNA的3'末端处的核苷酸、所述gRNA的3'末端的第二核苷酸和所述gRNA的3'末端的第三核苷酸处是2'-O-甲基3'硫代磷酸酯修饰的。在一些实施例中，所述gRNA是2'-O修饰的和3'磷修饰的，例如在所述gRNA的3'末端的第二核苷酸、所述gRNA的3'末端的第三核苷酸和所述gRNA的3'末端的第四核苷酸处是2'-O-甲基3'硫代磷酸酯修饰的。在一些实施例中，在所述gRNA的3'末端处的核苷酸不是经化学修饰的。在一些实施例中，在所述gRNA的3'末端处的核苷酸不具有经化学修饰的糖。在一些实施例中，所述gRNA是2'-O修饰的和3'磷修饰的，例如在所述gRNA的5'末端处的核苷酸、所述gRNA的5'末端的第二核苷酸、所述gRNA的5'末端的第三核苷酸、所述gRNA的3'末端的第二核苷酸、所述gRNA的3'末端的第三核苷酸和所述gRNA的3'末端的第四核苷酸处是2'-O-甲基3'硫代磷酸酯修饰的。

在一些实施例中，本文所提供的gRNA可以包括一个或多个2'-O修饰的和3'磷修饰的，例如2'-O-甲基3'硫代PACE核苷酸。在一些实施例中，所述gRNA在所述gRNA的5'末端处包括2'-O修饰的和3'磷修饰的，例如2'-O-甲基3'硫代PACE核苷酸。在一些实施例中，所述gRNA在所述gRNA的3'末端处包括2'-O修饰的和3'磷修饰的，例如2'-O-甲基3'硫代PACE核苷酸。在一些实施例中，所述gRNA在所述gRNA的5'末端处和3'末端处包括2'-O修饰的和3'磷修饰的，例如2'-O-甲基3'硫代PACE核苷酸。在一些实施例中，所述gRNA包括主链，其中一个或多个非桥接氧原子已经被硫原子取代并且一个或多个非桥接氧原子已经被乙酸酯基团取代。在一些实施例中，所述gRNA是2'-O修饰的和3'磷修饰的，例如在所述gRNA的5'末端处的核苷酸、所述gRNA的5'末端的第二核苷酸和所述gRNA的5'末端的第三核苷酸处是2'-O-甲基3'硫代PACE修饰的。在一些实施例中，所述gRNA是2'-O修饰的和3'磷修饰的，例如在所述gRNA的3'末端处的核苷酸、所述gRNA的3'末端的第二核苷酸和所述gRNA的3'末端的第三核苷酸处是2'-O-甲基3'硫代PACE修饰的。在一些实施例中，所述gRNA是2'-O修饰的和3'磷修饰的，例如在所述gRNA的5'末端处的核苷酸、所述gRNA的5'末端的第二核苷酸、所述gRNA的5'末端的第三核苷酸、所述gRNA的3'末端处的核苷酸、所述gRNA的3'末端的第二核苷酸和所述gRNA的3'末端的第三核苷酸处是2'-O-甲基3'硫代PACE修饰的。在一些实施例中，所述gRNA是2'-O修饰的和3'磷修饰的，例如在所述gRNA的3'末端的第二核苷酸、所述gRNA的3'末端的第三核苷酸和所述gRNA的3'末端的第四核苷酸处是2'-O-甲基3'硫代PACE修饰的。在一些实施例中，在所述gRNA的3'末端处的核苷酸不是经化学修饰的。在一些实施例中，在所述gRNA的3'末端处的核苷酸不具有经化学修饰的糖。在一些实施例中，所述gRNA是2'-O修饰的和3'磷修饰的，例如在所述gRNA的5'末端处的核苷酸、所述gRNA的5'末端的第二核苷酸、所述gRNA的5'末端的第三核苷酸、所述gRNA的3'末端的第二核苷酸、所述gRNA的3'末端的第三核苷酸和所述gRNA的3'末端的第四核苷酸处是2'-O-甲基3'硫代PACE修饰的。

在一些实施例中，本文所提供的gRNA包括经化学修饰的主链。在一些实施例中，所述gRNA包括硫代磷酸酯键。在一些实施例中，一个或多个非桥接氧原子已经被硫原子替代。在一些实施例中，在所述gRNA的5'末端处的核苷酸、从所述gRNA的5'末端起的第二核苷酸和从所述gRNA的5'末端起的第三核苷酸各自包括硫代磷酸酯键。在一些实施例中，在所述gRNA的3'末端处的核苷酸、从所述gRNA的3'末端起的第二核苷酸和从所述gRNA的3'末端起的第三核苷酸各自包括硫代磷酸酯键。在一些实施例中，在所述gRNA的5'末端处的核苷酸、从所述gRNA的5'末端起的第二核苷酸、从所述gRNA的5'末端起的第三核苷酸、在所述gRNA的3'末端处的核苷酸、从所述gRNA的3'末端起的第二核苷酸和从所述gRNA的3'末端起的第三核苷酸各自包括硫代磷酸酯键。在一些实施例中，从所述gRNA的3'末端起的第二核苷酸、从所述gRNA的3'末端起的第三核苷酸和从所述gRNA的3'末端起的第四核苷酸各自包括硫代磷酸酯键。在一些实施例中，在所述gRNA的5'末端处的核苷酸、从所述gRNA的5'末端起的第二核苷酸、从5'末端起的第三核苷酸、从所述gRNA的3'末端起的第二核苷酸、从所述gRNA的3'末端起的第三核苷酸和从所述gRNA的3'末端起的第四核苷酸各自包括硫代磷酸酯键。

在一些实施例中，本文所提供的gRNA包括硫代PACE键。在一些实施例中，所述gRNA包括主链，其中一个或多个非桥接氧原子已经被硫原子取代并且一个或多个非桥接氧原子已经被乙酸酯基团取代。在一些实施例中，在所述gRNA的5'末端处的核苷酸、从所述gRNA的5'末端起的第二核苷酸和从所述gRNA的5'末端起的第三核苷酸各自包括硫代PACE键。在一些实施例中，在所述gRNA的3'末端处的核苷酸、从所述gRNA的3'末端起的第二核苷酸和从所述gRNA的3'末端起的第三核苷酸各自包括硫代PACE键。在一些实施例中，在所述gRNA的5'末端处的核苷酸、从所述gRNA的5'末端起的第二核苷酸、从所述gRNA的5'末端起的第三核苷酸、在所述gRNA的3'末端处的核苷酸、从所述gRNA的3'末端起的第二核苷酸和从所述gRNA的3'末端起的第三核苷酸各自包括硫代PACE键。在一些实施例中，从所述gRNA的3'末端起的第二核苷酸、从所述gRNA的3'末端起的第三核苷酸和从所述gRNA的3'末端起的第四核苷酸各自包括硫代PACE键。在一些实施例中，在所述gRNA的5'末端处的核苷酸、从所述gRNA的5'末端起的第二核苷酸、从5'末端起的第三核苷酸、从所述gRNA的3'末端起的第二核苷酸、从所述gRNA的3'末端起的第三核苷酸和从所述gRNA的3'末端起的第四核苷酸各自包括硫代PACE键。

在一些实施例中，本文所描述的gRNA包括一种或多种2'-O-甲基-3'-硫代磷酸酯核苷酸，例如至少1、2、3、4、5或6种2'-O-甲基-3'-硫代磷酸酯核苷酸。在一些实施例中，本文所描述的gRNA在三个末端位置和5'末端中的一个或多个和/或三个末端位置和3'末端中一个或多个处包括经修饰的核苷酸(例如，2'-O-甲基-3'-硫代磷酸酯核苷酸)。在一些实施例中，所述gRNA可以包括一个或多个经修饰的核苷酸，例如，如PCT公开第WO2017/214460号、第WO2016/089433号和第WO2016/164356号中所描述的，所述公开通过引用整体并入本文。

使用方法

本公开的一些方面提供了包括向有需要的受试者施用本文所提供的多个细胞的方法。例如，本公开的一些方面提供了包括向有需要的受试者施用多个、并且优选有效数量的本文所提供的细胞的方法，所述细胞例如包括编码靶向与过度增殖性/肿瘤性/恶性疾病相关的谱系特异性细胞表面抗原的转基因(例如，CAR)的异源核酸的经基因工程化的细胞(其中所述细胞是经动员淋巴细胞)。在一些实施例中，表达CAR的经基因工程化的淋巴细胞是T淋巴细胞。在一些实施例中，表达CAR的经基因工程化的淋巴细胞是B淋巴细胞。在一些实施例中，表达CAR的经基因工程化的淋巴细胞是NK细胞。

在一些实施例中，还向受试者施用多个、并且优选有效数量的经基因工程化的造血干细胞，其中所述经基因工程化的造血干细胞的特征在于：谱系特异性细胞表面抗原的表达降低或缺乏表达，或表达不被CAR识别或以降低的水平识别的谱系特异性细胞表面抗原的变体形式。在一些实施例中，所述细胞是HSC或HPC。

在一些实施例中，所述方法进一步包括监测所述过度增殖性疾病的至少一种症状。

本公开的一些方面提供了将本文所提供的细胞，例如表达靶向谱系特异性细胞表面抗原的CAR的经基因工程化的淋巴细胞施用于患有过度增殖性疾病，例如，造血系统恶性肿瘤，如髓细胞性恶性肿瘤或淋巴细胞性恶性肿瘤的受试者的方法。在一些实施例中，所述受试者患有所述过度增殖性疾病或已被诊断为患有所述过度增殖性疾病。在一些实施例中，所述受试者患有所述过度增殖性疾病或已被诊断为患有所述过度增殖性疾病，但所述疾病尚未进入恶性状态，如所述疾病的恶性前期。

在一些实施例中，向受试者施用细胞改善了与过度增殖性疾病相关的迹象或症状，其可以包含例如减少赘生性或恶性细胞的数量，减少肿瘤负荷，包含抑制肿瘤的生长，减缓肿瘤的生长速率，减小肿瘤的大小，减少肿瘤的数量，消除肿瘤，或减少或改善与赘生性疾病或病症相关的症状，例如疲劳、疼痛、体重减轻，以及其它临床措施。

在一些实施例中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施例中，所述受试者是人受试者。

在一些实施例中，所述受试者患有或已被诊断为患有过度增殖性疾病。在一些实施例中，所述过度增殖性疾病是造血系统恶性肿瘤。在一些实施例中，所述造血系统恶性肿瘤是髓细胞性恶性肿瘤。在一些实施例中，所述造血系统恶性肿瘤是淋巴细胞性恶性肿瘤。在一些实施例中，所述造血系统恶性肿瘤是霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、白血病或多发性骨髓瘤。在一些实施例中，所述白血病是急性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、急性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病或慢性成淋巴细胞性白血病或慢性淋巴细胞性白血病。在一些实施例中，所述癌症是急性髓细胞性白血病(AML)。在一些实施例中，所述肿瘤疾病是骨髓增生异常综合征。

在一些实施例中，所述过度增殖性疾病是肉瘤。在一些实施例中，所述过度增殖性疾病是黑色素瘤。在一些实施例中，所述过度增殖性疾病是脑或脊髓肿瘤。在一些实施例中，所述过度增殖性疾病是生殖细胞肿瘤。在一些实施例中，所述过度增殖性疾病是神经内分泌肿瘤。在一些实施例中，所述过度增殖性疾病是类癌瘤。在一些实施例中，所述过度增殖性疾病是造血谱系的癌症。在一些实施例中，所述过度增殖性疾病是转移性癌症。

根据所采用的CAR和本文所提供的细胞，可以治疗各种疾病或恶性肿瘤，包含但不限于骨癌、肠癌、肝癌、皮肤癌、头颈癌、黑色素瘤(皮肤或眼内恶性黑色素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、喉癌、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、血癌(例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、子宫癌、直肠癌、肛门区癌、膀胱癌、脑癌、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、急性粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性髓单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、非霍奇金氏病、沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia))、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、淋巴细胞型淋巴瘤、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境因素诱发的癌症包含由以下诱导的那些癌症：石棉、重链疾病和实体瘤如肉瘤和癌，例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肝癌、胆管癌、绒膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤(Wilm'stumor)、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、恶性胸膜疾病、间皮瘤、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌(例如，转移性乳腺癌、转移性三阴性乳腺癌)、结肠癌、胸膜肿瘤、胶质母细胞瘤、食道癌、胃癌和滑膜肉瘤。实体瘤可以是原发性肿瘤或处于转移状态的肿瘤。

在一些实施例中，如本文所提供的经基因工程化的细胞，例如表达CAR的经基因工程化的淋巴细胞、经基因工程化的造血干细胞以约10⁴至约10¹⁰个细胞/kg受试者体重的剂量，例如约10⁵至约10⁹、约10⁵至约10⁸、约10⁵至约10⁷或约10⁵至10⁶施用于有需要的受试者。通常，在全身施用的情况下，使用的剂量高于局部施用。还可以调整本文所描述的任何细胞的剂量以考虑是否以单剂量施用还是以多剂量施用。如上文所描述的，对将被视为有效剂量的剂量的精确测定可以基于每个受试者的个体因素，包含其大小、年龄、性别、体重和特定受试者的病状。本领域技术人员可以基于本公开和本领域知识容易地测定剂量。

本文所提供的经基因工程化的细胞可以通过本领域已知的任何方法施用，包含但不限于胸膜施用、静脉内施用、皮下施用、结内施用、瘤内施用、鞘内施用、胸膜内施用、腹膜内施用、颅内施用和直接施用于胸腺。

实例

实例1：

如图1和2所示的示例性示意图所示，经编辑造血干细胞和经基因工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞可以由单一起始材料产生。

简而言之，向供体(例如，健康的HLA匹配的供体)施用动员剂，如本文所描述的动员剂中的任何动员剂，其促进通常位于受试者骨髓中的细胞的动员。从含有包含造血干细胞和PMBC的异源经动员细胞群体的供体受试者中获得单采产品。CD34+细胞(HSC，可被称为“靶细胞”)从起始材料中分离并用于产生经编辑造血干细胞(eHSC)药物产品。例如，造血干细胞可以经基因工程化以降低如CD33(CD34+/CD33^neg eHSC)等谱系特异性细胞表面抗原的表达或缺乏表达。

通过转导编码CAR的异源核酸以产生CAR药物产品，例如CAR-T细胞，对通常可以被丢弃的剩余细胞群替(被称为“非靶标部分”)进行基因工程化。可以储存CAR药物产品细胞，用于在植入eHSC之后对患者进行施用。

实例2：G-CSF/普乐沙福双经动员供体源性CD33 CAR-T细胞在临床前模型中作为有力且有效的AML疗法

目前没有急性髓细胞性白血病(AML)特异性抗原。使用用于移植的造血干细胞(HSC)的CRISPR/Cas9工程的CD33的基因消融表示在移植受体中产生白血病特异性抗原的合成生物学方法。CD33KO HSC的移植允许CD33靶向的免疫治疗(例如，抗CD33 CAR-T细胞介导的)杀伤AML细胞，同时保留经编辑CD33KO HSC，并且因此，例如，由这些CD33KO-HSC维持的持续的骨髓发育和功能，由此减轻CD33靶向的免疫治疗的靶上离癌毒性。

经动员白细胞去除术表示有吸引力的起始材料，用于产生用于移植的经编辑CD33无效(CD33^-或CD33KO)HSC和互补的免疫治疗剂，例如CD33 CAR-T细胞产物。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和普利沙福(Mozobil)的双重动员对免疫细胞组合物、T细胞表型和这些T细胞在嵌合抗原受体(CAR)转导后控制AML肿瘤生长的功能的影响如下文所描述。

从注射有G-CSF(10μg/kg/天，连续5天)和普利沙福(240μg/kg，在第4天和第5天)的健康供体收集经动员(“mob”)PBMC。从相同供体收集的非经动员(“非mob”，在本文和附图中有时也称为“稳态”或“ss”)PBMC用作对照。通过流式细胞术分析细胞的免疫分型和T细胞表征，包含分化和骨髓归巢标志物，以及对具有抗CD3(OKT3)和IL-2的T细胞激活的应答。

为了评估构成动员细胞群体的细胞类型，使用流式细胞术分析进行整体免疫分型。发现经动员细胞群体含有T细胞、单核细胞、NK细胞和B细胞的群体。参见图3A-3D。如图3E所示，经动员细胞群体中存在的特定细胞类型的相对丰度不同于稳态细胞群体中的细胞类型的丰度。例如，与稳态相比，经动员细胞群体中的CD3+细胞(T细胞)的相对丰度降低，而与稳态相比，经动员细胞群体中的B细胞的相对丰度增加。

进一步评估经动员细胞群体中的T细胞的表型。如图3F-3H所示，经动员细胞群体中存在原初、效应和记忆T细胞，然而与稳态相比，经动员细胞群体中的原初T细胞的相对丰度增加。另外，与稳态相比，经动员细胞群体中的效应和记忆T细胞的相对丰度降低。

对来自多个供体的非经动员和经动员PBMC群体进行如上文所描述的免疫细胞和T细胞分型。参见图4A-4C。还分析了从非经动员和经动员PBMC群体中获得的不同T细胞亚群(CD8⁺或CD4⁺)，如图4D所示。来自总共30名健康供体的PBMC的离体免疫分型显示，动员减少了CD3⁺T细胞的总数，但增加了原初T细胞(CD45RA⁺/CCR7⁺)的数量，这是以T效应记忆(CD45RA^-/CCR7^-)和中央-记忆(CD45RA^-/CCR7⁺)群体为代价的。

非经动员和经动员PBMC群体也使用127种免疫细胞表型标志物结合广泛的转录组和T细胞受体库分析通过单细胞下一代测序(CITEseq)进行分析。两个供体(D1和D2)的CITEseq结果在图5(PBMC群体分析)和图6(T细胞亚群分析)中示出。单细胞测序分析证实了动员诱导的T原初细胞的增加以及单核细胞/巨噬细胞、CD4⁺T细胞和NK细胞百分比的变化。

另外，观察到与非经动员T细胞样品相比，经动员T细胞样品中的骨髓归巢因子(例如：唾液酰-路易斯^X，CXCR4)有所减少。

在非经动员和经动员PBMC群体中，T细胞激活(使用标准抗CD3和IL-2方案)导致CD25、CD69和CD137表达类似增加以及CD62L表达减少。图7展示了从两个供体(D1和D2)中获得的非经动员和经动员PBMC群体的蛋白质表达的变化，并且图8展示了较大供体队列的标志物表达的激活诱导变化。与非经动员供体样品相比，经动员供体样品中检测到更多数量的单核细胞(CD14⁺)，但在T细胞激活条件下培养之后消失。

抗CD33 CAR构建体的慢病毒转导使得能够在AML细胞共培养物以及AML小鼠模型中比较mob-CAR T细胞和非mob-CAR T细胞的功能。

慢病毒构建体编码包括M195(抗CD33)结合物、CD28铰链和跨膜结构域以及CD3ζ信号传导结构域的抗CD33 CAR，并且CAR-T细胞通过标准慢病毒转导方案从经动员和非经动员PBMC部分中获得(参见例如PCT/US2020/022309作为参考)。CAR的序列提供如下：MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIKSGAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGS(SEQ ID NO:1)

功能性体外细胞毒性测定表明，mob-CD33-CAR T细胞在杀伤CD33⁺AML细胞方面与非mob-CD33-CAR T细胞一样有效，对未经转导的T细胞的‘旁观者’激活减少(图9-11)。非经动员PBMC群体产生约28％的CAR表达频率，而经动员PBMC群体产生约27％的表达CAR的细胞。靶细胞包含表达CD33的MOLM13细胞(wt MOLM)、CD33无效MOLM13细胞(CD33KO MOLM)和Jurkat细胞(无CD33表达)。将CAR-T细胞和靶细胞共培养24小时。对照条件包含无刺激的细胞(阴性对照)和有标准PMA/离子霉素刺激的细胞(PMA/I，阳性对照)。在一些情况下，MYLOTARG^TM用作另外的阳性对照。测定至少一式两份地进行。

图9证明了经动员PBMC源性CAR-T细胞的细胞毒性潜力等于非经动员PBMC源性CAR-T细胞的细胞毒性潜力。

图10证明了在经动员和非经动员PBMC源性CAR-T细胞中，细胞内激活标志物以类似的方式上调，具有最小的“旁观者”激活，并且CD8+和CD8-T细胞两者被激活来以CAR和抗原依赖性方式产生IFNγ和TNFα。

图11示出了上清液细胞因子的LUMINEX^TM分析，证实了非经动员和经动员PBMC源性CAR-T细胞的等效细胞毒性潜力的结果。

体内AML小鼠模型中的非经动员和经动员PBMC源性CAR-T细胞的细胞毒性潜力的评估在图12中示出，证明了经动员CD33-CAR T细胞在清除CD33⁺肿瘤方面与非经动员CD33-CAR T细胞同样有效。

本文所示的数据证明了mob和非mob PBMC之间的表型离体差异，所述差异在激活后基本消失，表明对T细胞特异性刺激的类似应答。这些发现被类似的非/mob-CAR T细胞的体外细胞毒性特征所证实。mob-CAR T细胞群体中的未经转导的T细胞显示出有限的‘旁观者’激活，表明潜在有利的临床毒性特征。对mob-CAR T细胞功能的另外的体内评估显示了有效的肿瘤清除，这支持进一步努力将其与经工程化的HSC组合用于AML患者的临床治疗。

参考文献

本文提及的，例如在背景技术、发明内容、具体实施方式、实例和/或参考文献部分中提及的所有出版物、专利、专利申请、出版物和数据库条目(例如，序列数据库条目)通过引用整体并入本文，如同每个单独的出版物、专利、专利申请、出版物和数据库条目通过引用具体且单独地并入本文。在冲突的情况下，以本申请(包含本文中的任何定义)为准。

等效物和范围

本领域的技术人员仅使用常规实验将认识到或者能够确定本文描述的实施例的许多等效形式。本公开的范围不旨在限于以上描述，而是如所附权利要求书中所阐述的。

冠词如“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”可以意指一个或多个，除非指明与上下文相反或另外根据上下文是显而易见的。如果组成员中的一个、多于一个或全部存在，则在所述组的两个或更多个成员之间包含“或”的权利要求或描述被认为是满意的，除非指明与上下文相反或另外地根据上下文是显而易见的。在两个或更多个组成员之间包含“或”的组的公开提供了恰好存在一个组成员的实施例、存在多于一个组成员的实施例以及存在所有组成员的实施例。为了简洁起见，这些实施例没有在本文中单独阐述，但是应该理解，这些实施例中的每一个在本文中提供并且可以具体要求保护或不要求保护。

应当理解，本发明涵盖将来自权利要求中的一个或多个或来自说明书的相关部分中的一个或多个的一个或多个限制、元素、条款或描述性术语引入到另一权利要求中的所有变化、组合和排列。例如，从属于另一项权利要求的权利要求可以修改为包含在从属于同一基本权利要求的任何其它权利要求中发现的一个或多个限制。此外，在权利要求叙述组合物的情况下，应当理解，除非另外指示或者除非对于本领域的普通技术人员来说明显将出现矛盾或不一致，否则包含根据本文所公开的任何制备或使用方法或根据本领域已知的方法(如果有的话)制备或使用组合物的方法。

在元素是以例如马库什组(Markush group)格式等列表形式呈现的情况下，应当理解，还公开了元素的每个可能的子组，并且可以从组中去除任何元素或元素的子组。还应注意，术语“包括”旨在是开放的并且允许包含另外的要素或步骤。应当理解，通常，当实施例、产物或方法被称为包括特定的元素、特征或步骤时，也提供了由此类元素、特征或步骤组成或基本上由其组成的实施例、产物或方法。为了简洁起见，这些实施例没有在本文中单独阐述，但是应该理解，这些实施例中的每一个在本文中提供并且可以具体要求保护或不要求保护。

在给出范围的情况下，包含端点。此外，应当理解，除非从本领域的普通技术人员的上下文和/或理解中另外指示或以其它方式显而易见，否则表达为范围的值可以假定在一些实施例中到范围下限的单位的十分之一的任何特定值，除非上下文另外明确指出。为了简洁起见，每个范围中的值没有在本文中单独阐述，但是应该理解，这些值中的每一个在本文中提供并且可以具体要求保护或不要求保护。还应理解，除非从本领域的普通技术人员的上下文和/或理解中另外指示或以其它方式显而易见，否则表达为范围的值可以假定给定范围内的任何子范围，其中子范围的端点表达为与范围下限的单位的十分之一相同的准确度。

另外，应当理解，本发明的任何特定实施例都可以明确地从权利要求中的任何一个或多个中排除。在给出范围的情况下，范围内的任何值可以明确排除在权利要求中的任何一项或多项之外。本文所描述的组合物和/或方法的任何实施例、元素、特征、应用或方面可以排除在任何一项或多项权利要求之外。为了简洁起见，本文没有明确阐述排除了一个或多个元素、特征、目的或方面的所有实施例。

序列表

<110> VOR生物制药股份有限公司

<120> 与表达嵌合抗原受体的经基因工程化的细胞有关的方法和组合物

<130> V0291.70019WO00

<140> 尚未分配

<141> 与此同时

<150> US 63/229,017

<151> 2021-08-03

<150> US 63/113,739

<151> 2020-11-13

<160> 1

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 489

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

20 25 30

Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly

65 70 75 80

Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser

85 90 95

Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro

145 150 155 160

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg

165 170 175

Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe

180 185 190

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser

195 200 205

Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala

225 230 235 240

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln

245 250 255

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Gly Ala Ala Ala Ile Glu Val Met

260 265 270

Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile

275 280 285

His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro

290 295 300

Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys

305 310 315 320

Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser

325 330 335

Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg

340 345 350

Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg

355 360 365

Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

370 375 380

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

385 390 395 400

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

405 410 415

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

420 425 430

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

435 440 445

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

450 455 460

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

465 470 475 480

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser

485

Claims (71)

1.一种经基因工程化的细胞，其包括

异源核酸，所述异源核酸编码嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR靶向与过度增殖性疾病相关的谱系特异性细胞表面抗原，

其中所述细胞是经动员淋巴细胞或其后代。

2.根据权利要求1所述的经基因工程化的细胞，其中所述细胞是T淋巴细胞。

3.根据权利要求2所述的经基因工程化的细胞，其中所述T淋巴细胞表达CD3、CD4和/或CD8。

4.根据权利要求2或3所述的经基因工程化的细胞，其中所述T淋巴细胞表达CD4和CD8。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的经基因工程化的细胞，其中所述T淋巴细胞表达PD1。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的经基因工程化的细胞，其中所述T淋巴细胞是α/βT淋巴细胞。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的经基因工程化的细胞，其中所述T淋巴细胞是γ/δT淋巴细胞。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的经基因工程化的细胞，其中所述T淋巴细胞是原初T淋巴细胞。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的经基因工程化的细胞，其中所述T淋巴细胞是效应T淋巴细胞。

10.根据权利要求1至7中任一项所述的经基因工程化的细胞，其中所述T淋巴细胞是记忆T淋巴细胞。

11.根据权利要求1至7中任一项所述的经基因工程化的细胞，其中所述T淋巴细胞是调节性T淋巴细胞(Treg)。

12.根据权利要求1所述的经基因工程化的细胞，其中所述细胞是B淋巴细胞。

13.根据权利要求1所述的经基因工程化的细胞，其中所述细胞是自然杀伤(NK)细胞。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的经基因工程化的细胞，其中造血干细胞动员包括向受试者施用依托泊苷(etoposide)、普乐沙福(plerixafor)、环磷酰胺(cyclophosphamide)和/或粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的经基因工程化的细胞，其中所述嵌合抗原受体是第一代CAR。

16.根据权利要求1至14中任一项所述的经基因工程化的细胞，其中所述嵌合抗原受体是第二代CAR。

17.根据权利要求1至14中任一项所述的经基因工程化的细胞，其中所述嵌合抗原受体是第三代CAR。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的经基因工程化的细胞，其中所述谱系特异性细胞表面抗原是CD33、CD30、CD38、CD123、CLL-1、CD5、CD6、CD7、CD19或BCMA。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的经基因工程化的细胞，其中所述过度增殖性疾病是造血系统恶性肿瘤。

20.根据权利要求19所述的经基因工程化的细胞，其中所述造血系统恶性肿瘤是髓细胞性恶性肿瘤。

21.根据权利要求19或20所述的经基因工程化的细胞，其中所述造血系统恶性肿瘤是霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、白血病或多发性骨髓瘤。

22.根据权利要求21所述的经基因工程化的细胞，其中所述白血病是急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、慢性髓细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病或慢性成淋巴细胞性白血病或慢性淋巴细胞性白血病。

23.根据权利要求19至22中任一项所述的经基因工程化的细胞，其中所述造血系统恶性肿瘤是急性髓细胞性白血病。

24.根据权利要求19至22中任一项所述的经基因工程化的细胞，其中所述造血系统恶性肿瘤是骨髓增生异常综合征。

25.根据权利要求19所述的经基因工程化的细胞，其中所述造血系统恶性肿瘤是淋巴细胞性恶性肿瘤。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的经基因工程化的细胞，其供施用于有需要的受试者，其中所述受试者患有或已被诊断为患有造血系统恶性肿瘤，并且已接受包括经基因工程化的干细胞的造血干细胞移植物，所述经基因工程化的干细胞具有降低的对所述谱系特异性细胞表面抗原的表达或缺乏对所述谱系特异性细胞表面抗原的表达或表达所述谱系特异性细胞表面抗原的不会被所述CAR识别或以降低的水平被所述CAR识别的变体形式。

27.一种方法，其包括：

使从第一受试者获得的经动员淋巴细胞与异源核酸接触，所述异源核酸编码嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR靶向与过度增殖性疾病相关的谱系特异性细胞表面抗原，由此产生表达所述CAR的经基因工程化的淋巴细胞。

28.根据权利要求27所述的方法，其进一步包括向第二受试者施用所述经基因工程化的淋巴细胞或其后代，

其中所述第二受试者需要所述施用。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述第二受试者患有或已被诊断为患有所述过度增殖性疾病。

30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述第一受试者与所述第二受试者不同。

31.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述第一受试者与所述第二受试者相同。

32.根据权利要求28至31中任一项所述的方法，其中需要施用所述经基因工程化的淋巴细胞或其后代的所述受试者已接受包括经基因工程化的造血干细胞的造血干细胞移植物，所述经基因工程化的造血干细胞具有降低的对所述谱系特异性细胞表面抗原的表达或缺乏对所述谱系特异性细胞表面抗原的表达或表达所述谱系特异性细胞表面抗原的不会被所述CAR识别或以降低的水平被所述CAR识别的变体形式。

33.根据权利要求28至31中任一项所述的方法，其进一步包括在施用所述经基因工程化的淋巴细胞或其后代之后向所述有需要的受试者施用造血干细胞移植物；

其中所述移植物包括经基因工程化的造血干细胞，所述经基因工程化的造血干细胞具有降低的对所述谱系特异性细胞表面抗原的表达或缺乏对所述谱系特异性细胞表面抗原的表达或表达所述谱系特异性细胞表面抗原的不会被所述CAR识别或以降低的水平被所述CAR识别的变体形式。

34.根据权利要求28至31中任一项所述的方法，其中所述经基因工程化的淋巴细胞或其后代与包括经基因工程化的造血干细胞的造血干细胞移植物组合施用，所述经基因工程化的造血干细胞具有降低的对所述谱系特异性细胞表面抗原的表达或缺乏对所述谱系特异性细胞表面抗原的表达或表达所述谱系特异性细胞表面抗原的不会被所述CAR识别或以降低的水平被所述CAR识别的变体形式。

35.根据权利要求27至34中任一项所述的方法，其进一步包括使从所述第一受试者获得的造血干细胞与RNA引导的核酸酶和向导RNA或编码所述RNA引导的核酸酶和所述向导RNA的核酸接触，其中所述向导RNA靶向编码所述谱系特异性细胞表面抗原的基因，

由此产生经基因工程化的造血干细胞，所述经基因工程化的造血干细胞具有降低的对所述谱系特异性细胞表面抗原的表达或缺乏对所述谱系特异性细胞表面抗原的表达或表达所述谱系特异性细胞表面抗原的变体形式，

其中所述经基因工程化的造血干细胞不会被所述CAR靶向。

36.根据权利要求35所述的方法，其进一步包括向有需要的受试者施用所述经基因工程化的造血干细胞或其后代。

37.根据权利要求27至36中任一项所述的方法，其中所述经动员淋巴细胞是T淋巴细胞。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述T淋巴细胞表达CD3、CD4和/或CD8。

39.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述T淋巴细胞表达CD4和CD8。

40.根据权利要求37至39中任一项所述的方法，其中所述T淋巴细胞表达PD1。

41.根据权利要求37至40中任一项所述的方法，其中所述T淋巴细胞是α/βT淋巴细胞。

42.根据权利要求37至40中任一项所述的方法，其中所述T淋巴细胞是γ/δT淋巴细胞。

43.根据权利要求37至42中任一项所述的方法，其中所述T淋巴细胞是原初T淋巴细胞。

44.根据权利要求37至42中任一项所述的方法，其中所述T淋巴细胞是效应T淋巴细胞。

45.根据权利要求37至42中任一项所述的方法，其中所述T淋巴细胞是记忆T淋巴细胞。

46.根据权利要求37至42中任一项所述的方法，其中所述T淋巴细胞是调节性T淋巴细胞(Treg)。

47.根据权利要求27至36中任一项所述的方法，其中所述经动员淋巴细胞是B淋巴细胞。

48.根据权利要求27至36中任一项所述的方法，其中所述经动员淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。

49.根据权利要求27至48中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体是第一代CAR。

50.根据权利要求27至48中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体是第二代CAR。

51.根据权利要求27至48中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体是第三代CAR。

52.根据权利要求27至51中任一项所述的方法，其中所述谱系特异性细胞表面抗原是CD33、CD30、CD38、CD123、CLL-1、CD5、CD6、CD7、CD19或BCMA。

53.根据权利要求27至52中任一项所述的方法，其中所述过度增殖性疾病是造血系统恶性肿瘤。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述造血系统恶性肿瘤是髓细胞性恶性肿瘤。

55.根据权利要求53或54所述的方法，其中所述造血系统恶性肿瘤是霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、白血病或多发性骨髓瘤。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述白血病是急性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、急性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病或慢性成淋巴细胞性白血病或慢性淋巴细胞性白血病。

57.根据权利要求53至56中任一项所述的经基因工程化的细胞，其中所述造血系统恶性肿瘤是急性髓细胞性白血病。

58.根据权利要求53至56中任一项所述的经基因工程化的细胞，其中所述造血系统恶性肿瘤是骨髓增生异常综合征。

59.根据权利要求27至52中任一项所述的方法，其中所述造血系统恶性肿瘤是淋巴细胞性恶性肿瘤。

60.根据权利要求35至59中任一项所述的方法，其中所述RNA引导的核酸酶是CRISPR/Cas核酸酶。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述CRISPR/Cas核酸酶是Cas9核酸酶。

62.根据权利要求60所述的方法，其中所述CRISPR/Cas核酸酶是SpCas核酸酶。

63.根据权利要求60所述的方法，其中所述CRISPR/Cas核酸酶是SaCas核酸酶。

64.根据权利要求60所述的方法，其中所述CRISPR/Cas核酸酶是Cpf1核酸酶。

65.根据权利要求35至64中任一项所述的方法，其中编码所述向导RNA和/或所述RNA引导的核酸酶的核酸是RNA，优选地是mRNA或mRNA类似物。

66.根据权利要求35至65中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包括经化学修饰的一个或多个核苷酸残基。

67.根据权利要求35至66中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包括包含2'O-甲基部分的一个或多个核苷酸残基。

68.根据权利要求35至67中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包括包含硫代磷酸酯的一个或多个核苷酸残基。

69.根据权利要求35至68中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包括包含硫代PACE部分的一个或多个核苷酸残基。

70.一种细胞群体，其包括多个根据权利要求1至26中任一项所述的或通过根据权利要求27至69中任一项所述的方法产生、获得或能够通过所述方法获得的经基因工程化的细胞。

71.一种方法，其包括向有需要的受试者施用根据权利要求70所述的细胞群体。