CN116157135A - 使用基于crispr的碱基编辑器系统抑制谱系特异性抗原的组合物和方法 - Google Patents

使用基于crispr的碱基编辑器系统抑制谱系特异性抗原的组合物和方法 Download PDF

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S·穆克吉
F·波拉特
A·M·艾力
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Abstract

本文公开了施用靶向谱系特异性细胞表面抗原例如CD33或EMR2的剂以及所述谱系特异性细胞表面抗原例如CD33或EMR2的表达发生改变的造血细胞群体以用于血液系统恶性肿瘤的免疫治疗的方法。本文还公开了施用靶向不止一种谱系特异性细胞表面抗原的剂以及不止一种谱系特异性细胞表面抗原的表达发生改变的造血细胞群体以用于血液系统恶性肿瘤的免疫治疗的方法。还提供了在CD33或EMR2或不止一种谱系特异性细胞表面抗原中包含突变的细胞，以及使用基于CRISPR的碱基编辑器系统产生此类细胞的方法。

Description

使用基于CRISPR的碱基编辑器系统抑制谱系特异性抗原的组 合物和方法
本申请要求2020年6月3日提交的美国序列号63/033,966、2020年6月3日提交的美国序列号63/033,970和2021年5月4日提交的美国序列号63/183,791的优先权，其各自的全部内容以引用的方式并入本文。
序列表
本申请包含以ASCII格式以电子方式提交并据此以引用的方式整体并入的序列表。
背景技术
靶向免疫疗法的出现开辟了新的可能性，为成淋巴细胞性白血病患者带来了巨大的成功。然而，嵌合抗原T细胞疗法(CAR-T)的临床研究显示，由于缺乏独特的可靶向细胞表面抗原，在CD19靶向免疫治疗之外成功有限。事实上，CD19免疫疗法的成功在于B细胞再生障碍，B细胞再生障碍可以通过免疫球蛋白补充剂来控制。
然而，任何靶向免疫治疗方法都需要在癌细胞上独特或优先表达的抗原。事实上，为了使抗原成为免疫疗法的理想候选者，它应该是癌细胞所独有的，对于癌细胞的存活必不可少，并且不在正常细胞上表达。迄今为止，尚未发现真正针对癌细胞的肿瘤特异性抗原。对于缺乏这种理想抗原的癌症，考虑了一种新颖方法，即将靶向具有谱系特异性且被恶性细胞过度表达的抗原与移植缺乏该谱系特异性抗原(LSA)的基因工程化干细胞相结合。
在之前发表的著作和专利(美国专利第10,137,155号)中，证明了使用CD33靶向CAR-T细胞和/或AD吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)(GO)的方法能够补救携带CD33+急性骨髓性白血病的小鼠，而不影响CD33敲除(KO)造血干细胞的植入和再增殖，这些细胞已使用CRISPR/Cas9技术进行工程化以使该谱系特异性抗原缺失。
然而，用CRISPR/WT Cas9进行基因组编辑会诱导DNA双链断裂(DSB)，DNA双链断裂一直与p53介导的DNA损伤应答和染色体易位相关联。
因此，需要一种不同的方法来产生不会引起脱靶效应并削弱免疫抑制副作用的靶向抗性造血干细胞。
发明内容
本公开至少部分地基于以下发现：包含结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段的剂(例如，表达靶向谱系特异性细胞表面抗原的嵌合受体的免疫细胞)选择性地导致表达所述谱系特异性细胞表面抗原的细胞的细胞死亡，而缺乏所述抗原的细胞(例如，基因工程化造血细胞)逃避由此引起的细胞死亡。基于此类发现，预期涉及靶向谱系特异性细胞表面抗原的剂(例如，靶向CD33的CAR-T细胞)与所述谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)缺乏或发生改变的造血细胞的组合的免疫疗法将提供治疗造血系统恶性肿瘤的有效方法。
本文描述了使用基于CRISPR的碱基编辑器来产生靶向抗性造血干细胞，这些造血干细胞是缺乏表位或含有被包括抗体和嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)在内的治疗剂靶向的修饰表位的HSC。这种方法将进一步允许通过将靶向免疫疗法与移植通过碱基编辑器产生的靶向抗性造血干细胞相结合来治疗患有血液系统恶性肿瘤的患者，并规避CRISPR/WTCas9基因组编辑的潜在基因毒性。这种新颖方法允许使用基于CRISPR的胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器(CBE和ABE)实现高HSC/HSPC编辑效率。CBE和ABE分别是与胞苷或腺苷脱氨酶融合的Cas9切口酶，使得能够在靶向区域进行精确的碱基取代而不产生DSB。因为避开了DSB，碱基编辑器被认为是更安全的编辑工具，可以消除由DSB导致的不合乎需要的插入缺失、易位或重排。
在一个方面，本公开提供了缺乏谱系特异性细胞表面抗原的基因工程化造血细胞(例如，HSC)，在基因工程化之前所述谱系特异性细胞表面抗原存在于所述造血细胞上。在一些实施方案中，使编码所述谱系特异性细胞表面抗原的内源性基因的全部或一部分缺失，例如通过使用碱基编辑器(例如，涉及基于CRISPR的碱基编辑器系统)进行基因组编辑。在一些实施方案中，所述基于CRISPR的碱基编辑器系统使编码所述谱系特异性细胞表面抗原的内源性基因的外显子缺失。在一些实施方案中，所述基于CRISPR的碱基编辑器系统引起编码所述谱系特异性细胞表面抗原的内源性基因中的核苷酸取代。在一些实施方案中，所述核苷酸取代在编码剪接元件的序列内，其中所述核苷酸取代引起由所述基因编码的转录物的可变剪接。在一些实施方案中，所述基于CRISPR的碱基编辑器系统靶向内源性基因中的剪接元件，其中所述基于CRISPR的碱基编辑器系统引起由所述基因编码的转录物的可变剪接。在一些实施方案中，所述可变剪接导致编码表位的外显子被跳过。在一些实施方案中，所述可变剪接导致编码表位的外显子被延伸。在一些实施方案中，所述可变剪接诱导早期密码子终止。在一些实施方案中，所述剪接元件是剪接供体、剪接受体、剪接增强子或剪接沉默子。在一些实施方案中，所述碱基编辑器是胞嘧啶碱基编辑器。在一些实施方案中，所述碱基编辑器是腺嘌呤碱基编辑器。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“C”到“T”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“G”到“A”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“A”到“G”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“T”到“C”。
在一些实施方案中，所述谱系特异性细胞表面抗原是CD33。在一些实施方案中，CD33的外显子2的剪接受体或外显子剪接增强子位点发生改变。在一些实施方案中，CD33的内含子1/外显子2接点的核苷酸序列发生改变。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“C”到“T”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“G”到“A”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“A”到“G”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“T”到“C”。在一些实施方案中，所述gRNA序列与编码CD33的核苷酸序列的一部分杂交。在一些实施方案中，所述gRNA序列靶向编码CD33的核苷酸序列的外显子2中的剪接受体或外显子剪接增强子位点。在一些实施方案中，所述gRNA序列靶向CD33的SNP，rs12459419。在一些实施方案中，所述gRNA序列靶向CD33的内含子1/外显子2接点。在一些实施方案中，所述gRNA序列靶向包含SEQ ID NO:37的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述gRNA具有包含SEQ ID NO:1-3中任一者的序列。
在一些实施方案中，所述谱系特异性细胞表面抗原是EMR2。在一些实施方案中，EMR2的外显子13中的剪接供体位点发生改变。在一些实施方案中，EMR2的内含子12/外显子13接点的核苷酸序列发生改变。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“C”到“T”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“G”到“A”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“A”到“G”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“T”到“C”。在一些实施方案中，所述gRNA序列与编码EMR2的核苷酸序列的一部分杂交。在一些实施方案中，所述gRNA序列靶向编码EMR2的核苷酸序列的外显子13中的剪接供体位点。在一些实施方案中，所述gRNA序列靶向EMR2的内含子12/外显子13接点。在一些实施方案中，所述gRNA序列靶向包含SEQ ID NO:40的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述gRNA具有包含SEQ ID NO:4或46-47中任一者的序列。
在一些实施方案中，所述造血细胞是造血干细胞(例如，CD34+/CD33Δ2细胞或CD34+/EMRΔ13)。
在一些实施方案中，所述造血干细胞可获自骨髓细胞或外周血单核细胞(PBMC)。
在一些方面，本公开提供了用于组合抑制第一谱系特异性细胞表面抗原和至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原，即第二谱系特异性细胞表面抗原、第三谱系特异性细胞表面抗原、第四谱系特异性细胞表面抗原等的组合物和方法。
在一些实施方案中，还使用基于CRISPR的碱基编辑器系统使造血细胞中的所述另外的谱系特异性细胞表面抗原缺失或抑制。在一些实施方案中，使编码所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的内源性基因的全部或一部分缺失，例如通过使用碱基编辑器(例如，涉及基于CRISPR的碱基编辑器系统)进行基因组编辑。在一些实施方案中，所述基于CRISPR的碱基编辑器系统使编码所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的内源性基因的外显子缺失。在一些实施方案中，所述基于CRISPR的碱基编辑器系统引起编码所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的内源性基因中的核苷酸取代。在一些实施方案中，所述核苷酸取代在编码剪接元件的序列内，其中所述核苷酸取代引起由所述一种或多种基因编码的转录物的可变剪接。在一些实施方案中，所述基于CRISPR的碱基编辑器系统靶向一种或多种内源性基因中的剪接元件，其中所述基于CRISPR的碱基编辑器系统引起由所述一种或多种基因编码的转录物的可变剪接。在一些实施方案中，所述可变剪接导致编码表位的外显子被跳过。在一些实施方案中，所述可变剪接导致编码表位的外显子被延伸。在一些实施方案中，所述可变剪接诱导早期密码子终止。在一些实施方案中，所述剪接元件是剪接供体、剪接受体、剪接增强子或剪接沉默子。在一些实施方案中，所述碱基编辑器是胞嘧啶碱基编辑器。在一些实施方案中，所述碱基编辑器是腺嘌呤碱基编辑器。在一些实施方案中，所述碱基编辑器是腺嘌呤碱基编辑器。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“C”到“T”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“G”到“A”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“A”到“G”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“T”到“C”。
在一些实施方案中，所述第一谱系特异性细胞表面抗原是CD33。在一些实施方案中，所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原或第二谱系特异性细胞表面抗原是EMR2。
在一些实施方案中，使用基于CRISPR的碱基编辑器系统使不止一种另外的谱系特异性细胞表面抗原缺失或抑制。在一些实施方案中，所述不止一种另外的谱系特异性细胞表面抗原不同于CD33和EMR2。
在一些实施方案中，所述造血细胞是造血干细胞(例如，CD34+/CD33Δ2/EMR2Δ13细胞)。
在一些实施方案中，所述造血干细胞可获自骨髓细胞或外周血单核细胞(PBMC)。
在一些方面，本公开提供了一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性CD33基因的外显子2中包含改变的剪接受体或外显子剪接增强子位点。本公开的一个方面提供了一种基因工程化造血干细胞和/或祖细胞，其中与野生型对应物相比，所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞的由CD33的外显子2编码的表位的表达水平降低。在一些实施方案中，所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞的CD33的表位的表达水平不到野生型对应物的表达水平的10％。在一些实施方案中，所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞不表达CD33的表位。在一些实施方案中，CD33的外显子2的剪接受体或外显子剪接增强子位点发生改变。在一些实施方案中，CD33的内含子1/外显子2接点的核苷酸序列发生改变。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“C”到“T”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“G”到“A”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“A”到“G”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“T”到“C”。在一些实施方案中，所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞为CD34+。在一些实施方案中，所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞来自受试者(例如，患有造血系统恶性肿瘤的人患者或健康供体)的骨髓细胞或外周血单核细胞。
在一些方面，本公开提供了一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性EMR2基因的外显子13中包含改变的剪接供体位点。本公开的一个方面提供了一种基因工程化造血干细胞和/或祖细胞，其中与野生型对应物相比，所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞的由EMR2的外显子13编码的表位的表达水平降低。本公开的一个方面提供了一种基因工程化造血干细胞和/或祖细胞，其中与野生型对应物相比，改变的剪接供体位点诱导早期密码子终止和突变或截短EMR2的产生。在一些实施方案中，所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞不表达EMR2的表位。在一些实施方案中，EMR2的外显子13中的剪接供体位点发生改变。在一些实施方案中，EMR2的内含子12/外显子13接点的核苷酸序列发生改变。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“C”到“T”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“G”到“A”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“A”到“G”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“T”到“C”。在一些实施方案中，所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞为CD34+。在一些实施方案中，所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞来自受试者(例如，患有造血系统恶性肿瘤的人患者或健康供体)的骨髓细胞或外周血单核细胞。
在一些方面，本公开提供了一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性CD33基因的外显子2中包含改变的剪接受体或外显子剪接增强子位点并且在至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的外显子中包含改变的剪接元件。本公开的一个方面提供了一种基因工程化造血干细胞和/或祖细胞，其中与野生型对应物相比，所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞的由CD33和/或所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的外显子编码的表位的表达水平降低。在一些实施方案中，所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞的由CD33和/或所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的外显子编码的表位的表达水平不到野生型对应物的表达水平的10％。在一些实施方案中，所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞为CD34+。在一些实施方案中，所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞来自受试者(例如，患有造血系统恶性肿瘤的人患者或健康供体)的骨髓细胞或外周血单核细胞。
在一些方面，本公开提供了一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性CD33基因的外显子2中包含改变的剪接受体或外显子剪接增强子位点并且在内源性EMR2基因的外显子13中包含改变的剪接供体位点。本公开的一个方面提供了一种基因工程化造血干细胞和/或祖细胞，其中与野生型对应物相比，所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞的由CD33的外显子2编码的表位和/或由EMR2的外显子13编码的表位的表达水平降低。在一些实施方案中，所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞的由CD33的外显子2编码的表位和/或由EMR2的外显子13编码的表位的表达水平不到野生型对应物的表达水平的10％。在一些实施方案中，与野生型对应物相比，可变剪接诱导EMR2中早期密码子终止，突变或截短EMR2产生。在一些实施方案中，所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞为CD34+。在一些实施方案中，所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞来自受试者(例如，患有造血系统恶性肿瘤的人患者或健康供体)的骨髓细胞或外周血单核细胞。
在一些实施方案中，本公开还提供了包含多个本文所述的基因工程化造血干细胞和/或祖细胞的细胞群体。
在另一方面，本公开提供了一种产生基因工程化造血干细胞和/或祖细胞的方法，所述方法包括(i)提供造血干细胞和/或祖细胞，以及(i i)向所述细胞中引入：(a)指导RNA(gRNA)，所述指导RNA(gRNA)靶向编码谱系特异性细胞表面抗原的核苷酸序列，和(b)与DNA修饰酶融合的催化受损的Cas蛋白，即与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的Cas9切口酶，从而产生基因工程化造血干细胞和/或祖细胞。
在另一方面，本公开提供了一种产生基因工程化造血干细胞和/或祖细胞的方法，所述方法包括(i)提供造血干细胞和/或祖细胞，以及(ii)向所述细胞中引入：(a)指导RNA(gRNA)，所述指导RNA(gRNA)包含靶向所述造血干细胞或祖细胞的基因组内包含剪接元件的核苷酸序列的靶向结构域；和(b)与DNA修饰酶融合的催化受损的Cas蛋白，即与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的Cas9切口酶，从而产生基因工程化造血干细胞和/或祖细胞。
在一些实施方案中，所述方法使编码所述谱系特异性细胞表面抗原的内源性基因的外显子缺失。在一些实施方案中，所述方法引起编码所述谱系特异性细胞表面抗原的内源性基因中的核苷酸取代。在一些实施方案中，所述核苷酸取代在编码剪接元件的序列内，其中所述核苷酸取代引起由所述基因编码的转录物的可变剪接。在一些实施方案中，所述方法靶向内源性基因中的剪接元件，其中所述方法引起由所述基因编码的转录物的可变剪接。在一些实施方案中，所述可变剪接导致编码表位的外显子被跳过。在一些实施方案中，所述可变剪接导致编码表位的外显子被延伸。在一些实施方案中，所述剪接元件是剪接供体、剪接受体、剪接增强子或剪接沉默子。在一些实施方案中，所述碱基编辑器是胞嘧啶碱基编辑器。在一些实施方案中，所述碱基编辑器是腺嘌呤碱基编辑器。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“C”到“T”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“G”到“A”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“A”到“G”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“T”到“C”。
在一些实施方案中，所述谱系特异性细胞表面抗原是CD33。在一些实施方案中，所述gRNA靶向CD33外显子2侧翼的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述gRNA包含与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3至少90％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述gRNA序列靶向CD33的内含子1/外显子2接点。在一些实施方案中，所述gRNA序列靶向包含SEQ ID NO:37的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述gRNA和与DNA修饰酶融合的催化受损的Cas蛋白在一个载体上编码，所述载体引入所述细胞中。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体。在一些实施方案中，所述gRNA和与DNA修饰酶融合的催化受损的Cas蛋白作为预先形成的核糖核蛋白复合物引入所述细胞中。在一些实施方案中，通过电穿孔将所述核糖核蛋白复合物引入所述细胞中。
在一些实施方案中，所述谱系特异性细胞表面抗原是EMR2。在一些实施方案中，所述gRNA靶向EMR2外显子13侧翼的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述gRNA包含与SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:46和/或SEQ ID NO:47至少90％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述gRNA序列靶向EMR2的内含子12/外显子13接点。在一些实施方案中，所述gRNA序列靶向包含SEQ ID NO:40的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述gRNA和与DNA修饰酶融合的催化受损的Cas蛋白在一个载体上编码，所述载体引入所述细胞中。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体。在一些实施方案中，所述gRNA和与DNA修饰酶融合的催化受损的Cas蛋白作为预先形成的核糖核蛋白复合物引入所述细胞中。在一些实施方案中，通过电穿孔将所述核糖核蛋白复合物引入所述细胞中。
在另一方面，本公开提供了一种产生基因工程化造血干细胞和/或祖细胞的方法，所述方法包括(i)提供造血干细胞和/或祖细胞，以及(ii)向所述细胞中引入：(a)指导RNA(gRNA)，所述指导RNA(gRNA)靶向编码第一谱系特异性细胞表面抗原的核苷酸序列，和(b)与DNA修饰酶融合的催化受损的Cas蛋白，即与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的Cas9切口酶；并且还包括向所述细胞中引入：第二指导RNA(gRNA)，所述第二指导RNA(gRNA)靶向至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原，和(b)与DNA修饰酶融合的催化受损的Cas蛋白，即与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的Cas9切口酶，从而产生基因工程化造血干细胞和/或祖细胞。
在另一方面，本公开提供了一种产生基因工程化造血干细胞和/或祖细胞的方法，所述方法包括(i)提供造血干细胞和/或祖细胞，以及(ii)向所述细胞中引入：(a)指导RNA(gRNA)，所述指导RNA(gRNA)包含靶向所述造血干细胞或祖细胞的基因组内包含第一谱系特异性细胞表面抗原的剪接元件的核苷酸序列的靶向结构域；和(b)与DNA修饰酶融合的催化受损的Cas蛋白，即与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的Cas9切口酶；并且还包括向所述细胞中引入：第二指导RNA(gRNA)，所述第二指导RNA(gRNA)靶向所述造血干细胞或祖细胞的基因组内至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的核苷酸序列的靶向结构域，和(b)与DNA修饰酶融合的催化受损的Cas蛋白，即与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的Cas9切口酶，从而产生基因工程化造血干细胞和/或祖细胞。
在一些实施方案中，所述谱系特异性细胞表面抗原是CD33。在一些实施方案中，所述gRNA靶向CD33外显子2侧翼的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述gRNA包含与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3至少90％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述gRNA序列靶向CD33的内含子1/外显子2接点。在一些实施方案中，所述gRNA序列靶向包含SEQ ID NO:37的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述gRNA和与DNA修饰酶融合的催化受损的Cas蛋白在一个载体上编码，所述载体引入所述细胞中。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体。在一些实施方案中，所述gRNA和与DNA修饰酶融合的催化受损的Cas蛋白作为预先形成的核糖核蛋白复合物引入所述细胞中。在一些实施方案中，通过电穿孔将所述核糖核蛋白复合物引入所述细胞中。
在一些实施方案中，所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原是EMR2。在一些实施方案中，所述gRNA靶向EMR2外显子13侧翼的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述gRNA包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:46和/或SEQ ID NO:47至少90％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述gRNA序列靶向EMR2的内含子12/外显子13接点。在一些实施方案中，所述gRNA序列靶向包含SEQ ID NO:40的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述gRNA和与DNA修饰酶融合的催化受损的Cas蛋白在一个载体上编码，所述载体引入所述细胞中。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体。在一些实施方案中，所述gRNA和与DNA修饰酶融合的催化受损的Cas蛋白作为预先形成的核糖核蛋白复合物引入所述细胞中。在一些实施方案中，通过电穿孔将所述核糖核蛋白复合物引入所述细胞中。
在一些方面，本公开还提供了本文所述的gRNA用于使用基于CRISPR的碱基编辑器系统减少造血细胞干细胞或祖细胞样本中谱系特异性细胞表面抗原的表位的表达的用途。
在一些方面，本公开还提供了基于CRISPR的碱基编辑器系统用于减少造血细胞干细胞或祖细胞样本中谱系特异性细胞表面抗原的表位的表达的用途。
在一些方面，本公开还提供了本文所述的gRNA用于使用基于CRISPR的碱基编辑器系统减少造血细胞干细胞或祖细胞样本中CD33的表位的表达的用途。
在一些方面，本公开还提供了基于CRISPR的碱基编辑器系统用于减少造血细胞干细胞或祖细胞样本中CD33的表位的表达的用途。
在一些方面，本公开还提供了本文所述的gRNA用于使用基于CRISPR的碱基编辑器系统减少造血细胞干细胞或祖细胞样本中EMR2的表位的表达的用途。
在一些方面，本公开还提供了基于CRISPR的碱基编辑器系统用于减少造血细胞干细胞或祖细胞样本中EMR2的表位的表达的用途。
在一些方面，本公开还提供了本文所述的gRNA用于使用基于CRISPR的碱基编辑器系统减少造血细胞干细胞或祖细胞样本中CD33和至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的表达的用途。
在一些方面，本公开还提供了基于CRISPR的碱基编辑器系统用于减少造血细胞干细胞或祖细胞样本中CD33和至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的表达的用途。
在一些实施方案中，所述至少一种另外的谱系特异性抗原是EMR2。
在一些实施方案中，所述gRNA是单分子指导RNA(sgRNA)。
在一些实施方案中，所述造血干细胞和/或祖细胞为CD34+。在一些实施方案中，所述造血干细胞和/或祖细胞来自受试者的骨髓细胞或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，所述受试者患有造血系统病症。在一些实施方案中，所述受试者是健康的HLA匹配供体。
在一些实施方案中，本公开提供了一种基因工程化造血干细胞和/或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞通过本文所述的方法产生。
在另一方面，本公开提供了一种治疗造血系统病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文所述的基因工程化造血干细胞和/或祖细胞，或细胞群体。在一些实施方案中，所述造血系统病症是造血系统恶性肿瘤。
在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用有效量的靶向CD33的剂，其中所述剂包含结合CD33的抗原结合片段。在一些实施方案中，所述靶向CD33的剂是表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)包含结合CD33的抗原结合片段。
在一些方面，本公开提供了本文所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞或本文所述的细胞群体，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或细胞群体用于治疗造血系统病症，其中所述治疗包括向有需要的受试者施用有效量的所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体，并且还包括向所述受试者施用有效量的靶向CD33的剂，其中所述剂包含结合CD33的抗原结合片段。
在一些方面，本公开提供了一种靶向CD33的剂，其中所述剂包含结合CD33的抗原结合片段，所述剂用于治疗造血系统病症，其中所述治疗包括向有需要的受试者施用有效量的靶向CD33的所述剂，并且还包括向所述受试者施用有效量的本文所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞或本文所述的细胞群体。
本文所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞或本文所述的细胞群体与靶向CD33的剂的组合，其中所述剂包含结合CD33的抗原结合片段，所述组合用于治疗造血系统病症，其中所述治疗包括向有需要的患者施用有效量的所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体，和结合CD33的所述剂。
在一些实施方案中，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体与靶向CD33的所述剂同时施用。在一些实施方案中，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体在靶向CD33的所述剂之前施用。在一些实施方案中，靶向CD33的所述剂在所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体之前施用。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞、所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞或两者是同种异体的。在一些实施方案中，所述免疫细胞、所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞或两者是自体的。在一些实施方案中，所述嵌合受体中的所述抗原结合片段是特异性地结合人CD33的单链抗体片段(scFv)。
在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用有效量的靶向EMR2的剂，其中所述剂包含结合EMR2的抗原结合片段。在一些实施方案中，所述靶向EMR2的剂是表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)包含结合EMR2的抗原结合片段。
在一些方面，本公开提供了本文所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞或本文所述的细胞群体，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或细胞群体用于治疗造血系统病症，其中所述治疗包括向有需要的受试者施用有效量的所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体，并且还包括向所述受试者施用有效量的靶向EMR2的剂，其中所述剂包含结合EMR2的抗原结合片段。
在一些方面，本公开提供了一种靶向EMR2的剂，其中所述剂包含结合EMR2的抗原结合片段，所述剂用于治疗造血系统病症，其中所述治疗包括向有需要的受试者施用有效量的靶向EMR2的所述剂，并且还包括向所述受试者施用有效量的本文所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞或本文所述的细胞群体。
本文所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞或本文所述的细胞群体与靶向EMR2的剂的组合，其中所述剂包含结合EMR2的抗原结合片段，所述组合用于治疗造血系统病症，其中所述治疗包括向有需要的患者施用有效量的所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体，和结合EMR2的所述剂。
在一些实施方案中，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体与靶向EMR2的所述剂同时施用。在一些实施方案中，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体在靶向EMR2的所述剂之前施用。在一些实施方案中，靶向EMR2的所述剂在所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体之前施用。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞、所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞或两者是同种异体的。在一些实施方案中，所述免疫细胞、所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞或两者是自体的。在一些实施方案中，所述嵌合受体中的所述抗原结合片段是特异性地结合人EMR2的单链抗体片段(scFv)。
在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用有效量的靶向CD33的剂，其中所述剂包含结合CD33的抗原结合片段，以及有效量的靶向至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的剂，其中所述剂包含结合所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段。在一些实施方案中，所述靶向CD33的剂是表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)包含结合CD33的抗原结合片段。在一些实施方案中，靶向至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的所述剂是表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)包含结合所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段。在一些实施方案中，靶向CD33的所述剂和靶向所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的所述剂是免疫细胞。在一些实施方案中，靶向CD33和至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的所述剂是表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)包含结合CD33和所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段。
在一些方面，本公开提供了本文所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞或本文所述的细胞群体，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或细胞群体用于治疗造血系统病症，其中所述治疗包括向有需要的受试者施用有效量的所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体，并且还包括向所述受试者施用有效量的靶向CD33的剂，其中所述剂包含结合CD33的抗原结合片段，以及有效量的靶向至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的剂，其中所述剂包含结合所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段。
在一些方面，本公开提供了一种靶向CD33的剂，其中所述剂包含结合CD33的抗原结合片段，以及一种靶向至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的剂，其中所述剂包含结合所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段，所述剂用于治疗造血系统病症，其中所述治疗包括向有需要的受试者施用有效量的靶向CD33的所述剂，以及有效量的靶向至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的剂，其中所述剂包含结合所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段，并且还包括向所述受试者施用有效量的本文所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞或本文所述的细胞群体。
本文所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞或本文所述的细胞群体与靶向CD33的剂和有效量的靶向至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的剂的组合，其中靶向CD33的所述剂包含结合CD33的抗原结合片段，其中靶向至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的所述剂包含结合所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段，所述组合用于治疗造血系统病症，其中所述治疗包括向有需要的患者施用有效量的所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体，以及结合CD33的所述剂和结合所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的所述剂。
在一些实施方案中，靶向CD33并包含结合CD33的抗原结合片段的剂，和靶向至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原并包含结合所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段的剂是相同的剂。在一些实施方案中，所述剂是靶向CD33和所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的免疫细胞。
在一些实施方案中，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体与靶向CD33的所述剂和靶向至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的所述剂同时施用。在一些实施方案中，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体在靶向CD33的所述剂和靶向所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的所述剂之前施用。在一些实施方案中，靶向CD33的所述剂和靶向至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的所述剂在所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体之前施用。在一些实施方案中，靶向CD33的所述剂在所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体之前施用，并且靶向所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的所述剂在所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体之后施用。在一些实施方案中，靶向所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的所述剂在所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体之前施用，并且靶向CD33的所述剂在所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体之后施用。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞、所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞或两者是同种异体的。在一些实施方案中，所述免疫细胞、所述基因工程化造血干细胞和/或祖细胞或两者是自体的。在一些实施方案中，所述嵌合受体中的所述抗原结合片段是特异性地结合人CD33和/或所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的单链抗体片段(scFv)。在一些实施方案中，所述嵌合受体中的所述抗原结合片段是特异性地结合人至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的单链抗体片段(scFv)。
在一些实施方案中，所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原是EMR2。
在一些实施方案中，靶向CD33和/或EMR2和/或另外的谱系特异性细胞表面抗原的剂靶向表位，所述表位在本文所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞或细胞群体中改变、表达减少或缺失，并与所述剂联合施用。
在一些实施方案中，所述受试者是患有霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病或多发性骨髓瘤的人患者。在一些实施方案中，所述受试者是患有白血病的人患者，所述白血病是急性骨髓性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病或慢性成淋巴细胞性白血病。
本文的组合物和方法的特征还在以下列举的实施方案中加以描述。
本文的组合物和方法的特征还在以下列举的实施方案中加以描述。
1.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在编码谱系特异性抗原的基因中包含至少一个核苷酸取代，其中所述核苷酸取代包含在编码剪接元件的序列内并且引起由所述基因编码的转录物的可变剪接，其中所述可变剪接导致与野生型对应细胞相比，由所述基因编码的表位的表达水平降低，并且其中所述表位被免疫治疗剂靶向。
2.如前述实施方案中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述剪接元件选自由以下组成的组：剪接受体、剪接供体、剪接增强子和剪接沉默子。
3.如实施方案1或2所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中可变剪接导致编码表位的外显子被跳过。
4.如前述实施方案中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中可变剪接导致编码表位的外显子被延伸。
5.如前述实施方案中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述核苷酸取代是“C”到“T”或“G”到“A”。
6.如前述实施方案中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述核苷酸取代是“A”到“G”或“T”到“C”。
7.如前述实施方案中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述核苷酸取代是使用基于CRISPR的碱基编辑器系统进行的。
8.如前述实施方案中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述表位的降低表达水平存在于从所述造血干细胞或祖细胞分化(例如，终末分化)的细胞中，并且所述野生型对应细胞是从野生型造血干细胞或祖细胞分化(例如，终末分化)的细胞。
9.如实施方案8所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中从所述造血干细胞或祖细胞分化的细胞是成髓细胞、成单核细胞、单核细胞、巨噬细胞或自然杀伤细胞。
10.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性CD33基因的外显子2中包含改变的剪接受体或外显子剪接增强子位点，其中所述改变导致与野生型对应细胞相比，由CD33的外显子2编码的表位的表达水平降低。
11.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性CD33基因的外显子2中包含改变的剪接受体或外显子剪接增强子位点，其中所述改变导致由CD33的外显子2编码的表位的表达水平降低，不到野生型对应细胞的水平的20％。
12.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性CD33基因的外显子2中包含改变的剪接受体或外显子剪接增强子位点，其中所述改变是CD33的外显子2中的所述剪接受体或外显子剪接增强子位点中的核苷酸取代。
13.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性CD33基因的外显子2中包含改变的剪接受体或外显子剪接增强子位点，其中所述改变是CD33的内含子1/外显子2接点的核苷酸序列中的核苷酸取代。
14.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性CD33基因的外显子2中包含改变的剪接受体或外显子剪接增强子位点，其中所述改变是使用包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的gRNA进行的。
15.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性CD33基因的外显子2中包含改变的剪接受体或外显子剪接增强子位点，其中所述改变是使用包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列的gRNA进行的。
16.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性CD33基因的外显子2中包含改变的剪接受体或外显子剪接增强子位点，其中所述改变是使用包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列的gRNA进行的。
17.如实施方案10-16所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述改变是使用基于CRISPR的碱基编辑器系统进行的。
18.如实施方案10-17所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述改变导致与野生型对应细胞相比，由CD33的外显子2编码的表位的表达水平降低(例如，不到所述野生型对应细胞中的水平的50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％)。
19.如实施方案10-18所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中CD33的表位的降低表达水平存在于从所述造血干细胞或祖细胞分化(例如，终末分化)的细胞中，并且所述野生型对应细胞是从野生型造血干细胞或祖细胞分化(例如，终末分化)的细胞。
20.如实施方案19所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中从所述造血干细胞或祖细胞分化的细胞是成髓细胞、成单核细胞、单核细胞、巨噬细胞或自然杀伤细胞。
21.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性EMR2基因的外显子13中包含改变的剪接供体位点，其中所述改变导致与野生型对应细胞相比，由EMR2的外显子13编码的表位的表达水平降低。
22.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性EMR2基因的外显子13中包含改变的剪接供体位点，其中与野生型对应物相比，改变的剪接供体位点诱导早期密码子终止和突变或截短EMR2的产生。
23.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性EMR2基因的外显子13中包含改变的剪接供体位点，其中所述改变是EMR2的外显子13中的所述剪接受体或外显子剪接增强子位点中的核苷酸取代。
24.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性EMR2基因的外显子13中包含改变的剪接供体位点，其中所述改变是EMR2的内含子12/外显子13接点的核苷酸序列中的核苷酸取代。
25.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性EMR2基因的外显子13中包含改变的剪接供体位点，其中所述改变是使用包含SEQID NO:4或46-47中任一者的核苷酸序列的gRNA进行的。
26.如实施方案21-25所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述改变是使用基于CRISPR的碱基编辑器系统进行的。
27.如实施方案21-25所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述改变导致与野生型对应细胞相比，由EMR2的外显子13编码的表位的表达水平降低(例如，不到所述野生型对应细胞中的水平的50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％)。
28.如实施方案21-26所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中EMR2的表位的降低表达水平存在于从所述造血干细胞或祖细胞分化(例如，终末分化)的细胞中，并且所述野生型对应细胞是从野生型造血干细胞或祖细胞分化(例如，终末分化)的细胞。
29.如实施方案29所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中从所述造血干细胞或祖细胞分化的细胞是成髓细胞、成单核细胞、单核细胞、巨噬细胞或自然杀伤细胞。
30.如前述实施方案中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞为CD34+。
31.如前述实施方案中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞来自受试者的骨髓细胞或外周血单核细胞。
32.如实施方案31所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述受试者是患有造血系统恶性肿瘤的人患者。
33.如实施方案31所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述受试者是健康人供体(例如，HLA匹配的供体)。
34.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在编码谱系特异性抗原的基因中包含至少一个核苷酸取代，其中所述核苷酸取代包含在编码剪接元件的序列内并且引起由所述基因编码的转录物的可变剪接，其中所述可变剪接导致与野生型对应细胞相比，由所述基因编码的表位的表达水平降低，并且其中所述表位被免疫治疗剂靶向，并且在编码至少一种另外的谱系特异性抗原的基因中包含至少一个核苷酸取代，其中所述核苷酸取代包含在编码剪接元件的序列内并且引起由所述基因编码的转录物的可变剪接，其中所述可变剪接导致与野生型对应物相比，由编码至少一种另外的谱系特异性抗原的所述基因编码的表位的表达水平降低，并且其中两个表位都被一种或多种免疫治疗剂靶向。
35.如实施方案34所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述剪接元件选自由以下组成的组：剪接受体、剪接供体、剪接增强子和剪接沉默子。
36.如实施方案34-35所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中可变剪接导致编码表位的外显子被跳过。
37.如实施方案34-35所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中可变剪接导致编码表位的外显子被延伸。
38.如实施方案34-37所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述核苷酸取代是“C”到“T”或“G”到“A”。
39.如实施方案34-37所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述核苷酸取代是“A”到“G”或“T”到“C”。
40.如实施方案34-39所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述核苷酸取代是使用基于CRISPR的碱基编辑器系统进行的。
41.如实施方案34-40所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述表位的降低表达水平存在于从所述造血干细胞或祖细胞分化(例如，终末分化)的细胞中，并且所述野生型对应细胞是从野生型造血干细胞或祖细胞分化(例如，终末分化)的细胞。
42.如实施方案41所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中从所述造血干细胞或祖细胞分化的细胞是成髓细胞、成单核细胞、单核细胞、巨噬细胞或自然杀伤细胞。
43.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性CD33基因的外显子2中包含改变的剪接受体或外显子剪接增强子位点，其中所述改变是CD33的外显子2中的所述剪接受体或外显子剪接增强子位点中的核苷酸取代，并且在编码至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的内源性基因的外显子中包含改变元件的改变。
44.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性CD33基因的外显子2中包含改变的剪接受体或外显子剪接增强子位点，其中所述改变是CD33的外显子2中的所述剪接受体或外显子剪接增强子位点中的核苷酸取代，并且在内源性EMR2基因的外显子13中包含改变的剪接供体位点，其中所述改变是EMR2的外显子13中的所述剪接供体位点的核苷酸取代。
45.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性CD33基因的外显子2中包含改变的剪接受体或外显子剪接增强子位点，其中所述改变是CD33的外显子2中的所述剪接受体或外显子剪接增强子位点中的核苷酸取代，并且导致与野生型对应细胞相比，由CD33的外显子2编码的表位的表达水平降低，并且还在内源性EMR2基因的外显子13中包含改变的剪接供体位点，其中所述改变是EMR2的外显子13中的所述剪接供体位点中的核苷酸取代，并且导致与野生型对应细胞相比，由EMR2的外显子13编码的表位表达水平降低，并且/或者诱导与野生型对应细胞相比，早期密码子终止和突变或截短EMR2的产生。
46.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性CD33基因的外显子2中包含改变的剪接受体或外显子剪接增强子位点，其中所述改变是CD33的外显子2中的所述剪接受体或外显子剪接增强子位点中的核苷酸取代并且是通过使用包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的gRNA进行的，并且还在内源性EMR2基因的外显子13中包含改变的剪接供体位点，其中所述改变是EMR2的外显子13中的所述剪接供体位点的核苷酸取代并且是通过使用包含SEQ ID NO:4或46-47中任一者的核苷酸序列的gRNA进行的。
47.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性CD33基因的外显子2中包含改变的剪接受体或外显子剪接增强子位点，其中所述改变是CD33的外显子2中的所述剪接受体或外显子剪接增强子位点中的核苷酸取代并且是通过使用包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列的gRNA进行的，并且还包含内源性EMR2基因的外显子13的改变的剪接供体位点，其中所述改变是EMR2的外显子13中的所述剪接供体位点的核苷酸取代并且是通过使用包含SEQ ID NO:4或46-47中任一者的核苷酸序列的gRNA进行的。
48.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性CD33基因的外显子2中包含改变的剪接受体或外显子剪接增强子位点，其中所述改变是CD33的外显子2中的所述剪接受体或外显子剪接增强子位点中的核苷酸取代并且是通过使用包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列的gRNA进行的，并且还包含内源性EMR2基因的外显子13的改变的剪接供体位点，其中所述改变是EMR2的外显子13中的所述剪接供体位点的核苷酸取代并且是通过使用包含SEQ ID NO:4或46-47中任一者的核苷酸序列的gRNA进行的。
49.如实施方案43-48所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述一种或多种改变是使用基于CRISPR的碱基编辑器系统进行的。
50.如实施方案43-49所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述改变导致与野生型对应细胞相比，由CD33的外显子2编码的表位的表达水平降低(例如，不到所述野生型对应细胞中的水平的50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％)，并且/或者与野生型对应细胞相比，由EMR2的外显子13编码的表位的表达水平降低(例如，不到所述野生型对应细胞中的水平的50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％)。
51.如实施方案43-50所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞的由CD33的外显子2编码的表位的表达水平不到所述野生型对应物的表达水平的20％并且/或者由EMR2的外显子13编码的表位的表达水平不到所述野生型对应物的表达水平的20％。
52.如实施方案43-51所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中CD33和/或EMR2的表位的降低表达水平存在于从所述造血干细胞或祖细胞分化(例如，终末分化)的细胞中，并且所述野生型对应细胞是从野生型造血干细胞或祖细胞分化(例如，终末分化)的细胞。
53.如实施方案52所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中从所述造血干细胞或祖细胞分化的细胞是成髓细胞、成单核细胞、单核细胞、巨噬细胞或自然杀伤细胞。
54.如实施方案34-53所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞为CD34+。
55.如实施方案34-53所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞来自受试者的骨髓细胞或外周血单核细胞。
56.如实施方案55所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述受试者是患有造血系统恶性肿瘤的人患者。
57.如实施方案55所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述受试者是健康人供体(例如，HLA匹配的供体)。
58.如实施方案43-57所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞是通过以下过程制备的，所述过程包括使所述内源性CD33基因与融合至胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)的催化受损的CRISPR核酸内切酶接触，以及使所述内源性EMR2基因与融合至胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)的催化受损的CRISPR核酸内切酶接触。
59.如前述实施方案中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在任何预测脱靶位点中不包含突变。
60.一种细胞群体，所述细胞群体包含多个前述实施方案中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞(例如，包含造血干细胞、造血祖细胞或它们的组合)。
61.一种细胞群，所述细胞群包含多个基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述多个基因工程化造血干细胞或祖细胞包含内源性CD33基因的外显子2的缺失或改变以及内源性EMR2基因的外显子13的缺失或改变。
62.如实施方案61所述的细胞群体，所述细胞群体还包含一种或多种细胞，所述一种或多种细胞包含一种或多种非工程化CD33基因和/或非工程化EMR2基因。
63.如实施方案61-62所述的细胞群体，所述细胞群体还包含为CD33的纯合野生型和/或为EMR2的纯合野生型的一种或多种细胞。
64.如实施方案61-63中任一项所述的细胞群体，所述细胞群体还包含为CD33的杂合野生型和/或为EMR2的杂合野生型的一种或多种细胞。
65.如实施方案61-64中任一项所述的细胞群体，其中CD33和/或EMR2的降低表达水平存在于从所述造血干细胞或祖细胞分化(例如，终末分化)的细胞中，并且所述野生型对应细胞是从野生型造血干细胞或祖细胞分化(例如，终末分化)的细胞。
66.如实施方案65所述的细胞群体，其中从所述造血干细胞或祖细胞分化的细胞是成髓细胞、成单核细胞、单核细胞、巨噬细胞或自然杀伤细胞。
67.如实施方案61-66中任一项所述的细胞群体，所述细胞群体包含造血干细胞和造血祖细胞。
68.一种药物组合物，所述药物组合物包含实施方案1-59中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞。
69.一种药物组合物，所述药物组合物包含实施方案60-67中任一项所述的细胞群体。
70.一种制备实施方案1-33中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞或实施方案60-67中任一项所述的细胞群体的方法，所述方法包括：
(i)提供造血干细胞或祖细胞(例如，野生型造血干细胞或祖细胞)，以及
(ii)向所述细胞中引入：(a)指导RNA(gRNA)，所述指导RNA(gRNA)包含靶向所述造血干细胞或祖细胞的基因组内包含剪接元件的核苷酸序列的靶向结构域；和(b)与DNA修饰酶融合与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的催化受损的Cas蛋白，从而产生基因工程化造血干细胞和/或祖细胞。
71.一种制备实施方案34-59中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞或实施方案60-67中任一项所述的细胞群体的方法，所述方法包括：
(i)提供造血干细胞或祖细胞，以及
(ii)向所述细胞中引入：(a)第一指导RNA(gRNA)，所述第一指导RNA(gRNA)包含靶向所述造血干细胞或祖细胞的基因组内包含剪接元件的第一核苷酸序列的靶向结构域；和(b)与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的第一催化受损的Cas9核酸内切酶，以及
(iii)进一步向所述细胞中引入：(a)第二指导RNA(gRNA)，所述第二指导RNA(gRNA)包含靶向所述造血干细胞或祖细胞的基因组内包含剪接元件的第二核苷酸序列的靶向结构域；和(b)与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的第二催化受损的Cas9核酸内切酶，从而产生基因工程化造血干细胞或祖细胞。
72.如实施方案70-71所述的方法，其中所述方法引起编码所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的一种或多种内源性基因中的核苷酸取代。
73.如实施方案70-72中任一项所述的方法，其中所述方法靶向一种或多种内源性基因中的剪接元件，其中所述方法引起由所述一种或多种基因编码的转录物的可变剪接。
74.如实施方案70-73中任一项所述的方法，其中所述可变剪接导致编码表位的外显子被跳过。
75.如实施方案70-73中任一项所述的方法，其中所述可变剪接导致编码表位的外显子被延伸。
76.如实施方案70-75中任一项所述的方法，其中所述一种或多种剪接元件是剪接供体、剪接受体、剪接增强子或剪接沉默子。
77.如实施方案70-76中任一项所述的方法，其中所述一种或多种碱基编辑器是胞嘧啶碱基编辑器。
78.如实施方案70-76中任一项所述的方法，其中所述一种或多种碱基编辑器是腺嘌呤碱基编辑器。
79.如实施方案70-78中任一项所述的方法，其中所述一种或多种核酸内切酶是Cas9切口酶。
80.如实施方案77所述的方法，其中所述一种或多种胞嘧啶碱基编辑器是BE4Max。
81.如实施方案78所述的方法，其中所述一种或多种腺苷碱基编辑器是ABE8e。
82.如实施方案70-81中任一项所述的方法，其中所述可变剪接导致由CD33的外显子2编码的表位的表达减少。
83.如实施方案70-81中任一项所述的方法，其中所述可变剪接导致与野生型对应细胞相比，由EMR2的外显子13编码的表位的表达减少并且/或者早期密码子终止和突变或截短EMR2产生。
84.一种指导核糖核酸(gRNA)，所述指导核糖核酸(gRNA)包含SEQ ID NO:1-4和46-47中任一者的序列或其反向互补序列，或与前述任一项具有至少90％或95％同一性的序列，或相对于前述任一项具有不超过1、2或3个突变的序列。
85.如实施方案84所述的gRNA，所述gRNA包含一个或多个化学修饰(例如，对核碱基、糖或主链部分的化学修饰)。
86.如实施例方案84和85中任一项所述的gRNA，所述gRNA结合Cas9。
87.一种药盒或组合物，所述药盒或组合物包含选自由包含SEQ ID NO:1-3的gRNA以及它们的组合组成的组的gRNA，或编码所述gRNA的核酸。
88.如实施方案87所述的药盒，所述药盒还包含第二gRNA或编码所述第二gRNA的核酸，其中所述第二gRNA靶向除CD33之外的谱系特异性细胞表面抗原。
89.如实施方案88所述的药盒或组合物，其中所述第二gRNA靶向EMR2。
90.如实施方案89和90中任一项所述的药盒或组合物，其中所述第二gRNA包含SEQID NO:4或46-47中任一者。
91.如实施方案88-90中任一项所述的药盒或组合物，所述gRNA还包含第三gRNA，或编码所述第三gRNA的核酸。
92.如实施方案91所述的药盒或组合物，其中所述第三gRNA靶向除CD33和EMR2之外的谱系特异性细胞表面抗原。
93.如实施方案87-92中任一项所述的药盒或组合物，所述药盒或组合物包含一种或多种与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的催化受损的CRISPR核酸内切酶。
94.基于CRISPR的碱基编辑器系统用于减少造血细胞干细胞或祖细胞样本中CD33表达的用途，其中gRNA包含SEQ ID NO:1-3。
95.基于CRISPR的碱基编辑器系统用于减少造血细胞干细胞或祖细胞样本中EMR2表达的用途，其中gRNA包含SEQ ID NO:4和46-47。
96.基于CRISPR的碱基编辑器系统用于减少造血细胞干细胞或祖细胞样本中CD33和/或EMRR2表达的用途，其中gRNA包含SEQ ID NO:1-4和46-47。
97.一种产生基因工程化造血干细胞或祖细胞的方法，所述方法包括：
(i)提供造血干细胞或祖细胞，以及
(ii)向所述细胞中引入：(a)包含SEQ ID NO:1-3的指导RNA(gRNA)；和(b)与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的结合所述gRNA的核酸酶(例如，核酸内切酶)，从而产生基因工程化造血干细胞或祖细胞。
98.一种产生基因工程化造血干细胞或祖细胞的方法，所述方法包括：
(i)提供造血干细胞或祖细胞，以及
(ii)向所述细胞中引入：(a)包含与SEQ ID NO:1-3至少90％同一的核苷酸序列的指导RNA(gRNA)；和(b)与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的Cas9核酸内切酶，从而产生所述基因工程化造血干细胞或祖细胞。
99.如实施方案97和98所述的方法，其中所述gRNA序列靶向CD33的内含子1/外显子2接点。
100.如实施方案97-99所述的方法，其中所述gRNA靶向包含SEQ ID NO:37的核苷酸序列。
101.如实施方案97-100中任一项所述的方法，其中所述方法引起编码CD33的外显子2的剪接元件的序列内的核苷酸取代，并且其中所述核苷酸取代引起由所述基因编码的转录物的可变剪接。
102.如实施方案101所述的方法，其中所述转录物的所述可变剪接导致由CD33的外显子2编码的表位的表达减少。
103.如实施方案97-102中任一项所述的方法，其中所述碱基编辑器是胞嘧啶碱基编辑器并且是BE4max。
104.如实施方案97-102中任一项所述的方法，其中所述碱基编辑器是腺苷碱基编辑器并且是ABE8e。
105.如实施方案97-104中任一项所述的方法，所述方法导致与野生型对应细胞相比，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞的CD33的外显子2的表位的表达水平降低。
106.如实施方案97-105中任一项所述的方法，所述方法对多个造血干细胞或祖细胞进行。
107.如实施方案97-106中任一项所述的方法，所述方法产生根据实施方案60-67中任一项所述的细胞群体。
108.一种产生基因工程化造血干细胞或祖细胞的方法，所述方法包括：
(i)提供造血干细胞或祖细胞，以及
(ii)向所述细胞中引入：(a)包含SEQ ID NO:4或46-47的指导RNA(gRNA)；和(b)与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的结合所述gRNA的核酸酶(例如，核酸内切酶)，从而产生基因工程化造血干细胞或祖细胞。
109.一种产生基因工程化造血干细胞或祖细胞的方法，所述方法包括：
(i)提供造血干细胞或祖细胞，以及
(ii)向所述细胞中引入：(a)包含与SEQ ID NO:4或46-47至少90％同一的核苷酸序列的指导RNA(gRNA)；和(b)与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的Cas9核酸内切酶，从而产生所述基因工程化造血干细胞或祖细胞。
110.如实施方案108和109所述的方法，其中所述gRNA序列靶向EMR2的内含子12/外显子13接点。
111.如实施方案108-110所述的方法，其中所述gRNA靶向包含SEQ ID NO:40的核苷酸序列。
112.如实施方案108-111中任一项所述的方法，其中所述方法引起编码EMR2的外显子13的剪接元件的序列内的核苷酸取代，并且其中所述核苷酸取代引起由所述基因编码的转录物的可变剪接。
113.如实施方案112所述的方法，其中所述转录物的所述可变剪接导致与野生型对应物相比，EMR2的外显子13的表位的表达减少并且/或者诱导早期密码子终止和突变或截短EMR2产生。
114.如实施方案108-112中任一项所述的方法，其中所述碱基编辑器是胞嘧啶碱基编辑器并且是BE4max。
115.如实施方案108-112中任一项所述的方法，其中所述碱基编辑器是腺苷碱基编辑器并且是ABE8e。
116.如实施方案108-115中任一项所述的方法，所述方法导致与野生型对应细胞相比，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞的EMR2的外显子13的表位的表达水平降低。
117.如实施方案108-116中任一项所述的方法，所述方法对多个造血干细胞或祖细胞进行。
118.如实施方案108-117中任一项所述的方法，所述方法产生根据实施方案60-67中任一项所述的细胞群体。
119.一种产生基因工程化造血干细胞或祖细胞的方法，所述方法包括：
(i)提供造血干细胞或祖细胞(例如，野生型造血干细胞或祖细胞)，
(ii)向所述细胞中引入：(a)包含SEQ ID NO:1-3的指导RNA(gRNA)；和(b)与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的结合所述gRNA的核酸酶(例如，核酸内切酶)(例如，Cas9核酸内切酶)，以及(iii)进一步向所述细胞中引入：(a)指导RNA(gRNA)，所述指导RNA(gRNA)靶向至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原；和(b)与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的结合所述gRNA的核酸酶(例如，核酸内切酶)(例如，Cas9核酸内切酶)，从而产生基因工程化造血干细胞或祖细胞。
120.一种产生基因工程化造血干细胞或祖细胞的方法，所述方法包括：
(i)提供基因工程化造血干细胞和/或祖细胞，
(ii)向所述细胞中引入：(a)包含与SEQ ID NO:1-3至少90％同一的核苷酸序列的指导RNA(gRNA)；和(b)与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的Cas9核酸内切酶，以及
(iii)进一步向所述细胞中引入：(a)指导RNA(gRNA)，所述指导RNA(gRNA)靶向至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原；和(b)与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的Cas9核酸内切酶，从而产生基因工程化造血干细胞和/或祖细胞。
121.如实施方案119-120中任一项所述的方法，所述方法导致与野生型对应细胞相比，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞的CD33的外显子2的表位的表达水平降低并且/或者所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的外显子的表位的表达水平降低。
122.如实施方案119-121中任一项所述的方法，所述方法对多个造血干细胞或祖细胞进行。
123.如实施方案119-122中任一项所述的方法或用途，所述方法或用途对包含多个造血干细胞和多个造血祖细胞的细胞群体进行。
124.如实施方案119-123中任一项所述的方法，所述方法产生根据实施方案60-67中任一项所述的细胞群体。
125.如实施方案119-123中任一项所述的方法，其中所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原是EMR2并且所述方法导致与野生型对应物相比，由EMR2的外显子13编码的表位的表达减少并且/或者诱导早期密码子终止和突变或截短EMR2产生。
126.如实施方案125所述的方法，其中所述gRNA是SEQ ID NO:4或46-47。
127.如实施方案97-126中任一项所述的方法，其中(a)和(b)的核酸在一个载体上编码，所述载体引入所述细胞中。
128.如实施方案127所述的方法，其中所述载体是病毒载体。
129.如实施方案97-126中任一项所述的方法，其中所述碱基编辑器呈蛋白质形式并且(a)和(b)作为预先形成的核糖核蛋白复合物引入所述细胞中。
130.如实施方案129所述的方法，其中通过电穿孔将所述核糖核蛋白复合物引入所述细胞中。
131.如实施方案97-130中任一项所述的方法，其中所述gRNA是单分子指导RNA(sgRNA)。
132.如实施方案97-131中任一项所述的方法，其中所述gRNA是修饰的sgRNA。
133.如实施方案97-132中任一项所述的方法，其中所述gRNA是化学修饰的sgRNA。
134.如实施方案97-133中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞或祖细胞为CD34+。
135.如实施方案97-133中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞或祖细胞来自受试者的骨髓细胞或外周血单核细胞(PBMC)。
136.如实施方案135所述的方法，其中所述受试者患有造血系统病症。
137.如实施方案135所述的方法，其中所述受试者是健康供体。
138.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞通过实施方案97-137中任一项所述的方法或用途产生。
139.一种细胞群体，所述细胞群体包含多个实施方案138所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞(例如，包含造血干细胞、造血祖细胞或它们的组合)。
140.一种治疗造血系统病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的实施方案1-43和138中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞或实施方案60-67和169中任一项所述的细胞群体。
141.如实施方案1-20和138中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞或如实施方案60-67和169中任一项所述的细胞群体，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或细胞群体用于治疗造血系统病症，其中所述治疗包括向有需要的受试者施用有效量的所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体，并且还包括向所述受试者施用有效量的靶向CD33的剂，其中所述剂包含结合CD33的抗原结合片段。
142.如实施方案1-20和138中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞或如实施方案60-67和169中任一项所述的细胞群体与靶向CD33的剂的组合，其中所述剂包含结合CD33的抗原结合片段，所述组合用于治疗造血系统病症，其中所述治疗包括向有需要的患者施用有效量的所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体，和结合CD33的所述剂。
143.如实施方案1-9、21-29和138中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞或如实施方案60-67和169中任一项所述的细胞群体，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或细胞群体用于治疗造血系统病症，其中所述治疗包括向有需要的受试者施用有效量的所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体，并且还包括向所述受试者施用有效量的靶向EMR2的剂，其中所述剂包含结合EMR2的抗原结合片段。
144.如实施方案1-9、21-29和138中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞或如实施方案60-67和169中任一项所述的细胞群体与靶向EMR2的剂的组合，其中所述剂包含结合EMR2的抗原结合片段，所述组合用于治疗造血系统病症，其中所述治疗包括向有需要的患者施用有效量的所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体，和结合EMR2的所述剂。
145.如实施方案1-9、43-59和138中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞或如实施方案60-67和169中任一项所述的细胞群体，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或细胞群体用于治疗造血系统病症，其中所述治疗包括向有需要的受试者施用有效量的所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体，并且还包括向所述受试者施用有效量的靶向CD33的剂，其中所述剂包含结合CD33的抗原结合片段，以及有效量的靶向至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的剂，其中所述剂包含结合所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段。
146.如实施方案1-9、43-59和138中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞或如实施方案60-67和169中任一项所述的细胞群体与靶向CD33的剂和靶向至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的剂的组合，其中靶向CD33的所述剂包含结合CD33的抗原结合片段，其中靶向至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的所述剂包含结合至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段，所述组合用于治疗造血系统病症，其中所述治疗包括向有需要的患者施用有效量的所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体，以及结合CD33和所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的所述剂。
147.如实施方案145所述的组合和如实施方案146所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原是EMR2。
148.如实施方案1-59和138中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，或如实施方案60-67和169中任一项所述的细胞群体，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体用于癌症免疫疗法中。
149.如实施方案1-59和138中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，或如实施方案60-67和169中任一项所述的细胞群体，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体用于癌症免疫疗法中，其中所述患者患有造血系统病症。
150.如实施方案1-59和138中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，或如实施方案60-67和169中任一项所述的细胞群体，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体用于患有造血系统病症的患者的造血系统再增殖。
151.如实施方案1-59和138中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，或如实施方案60-67和169中任一项所述的细胞群体，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体用于治疗造血系统病症的方法，由此本文所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞或本文所述的细胞群体使所述患者再增殖。
152.如实施方案1-59和138中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，或如实施方案60-67和169中任一项所述的细胞群体，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体用于降低免疫疗法中靶向CD33和/或至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的剂的细胞毒性作用。
153.如实施方案1-59和138中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，或如实施方案60-67和169中任一项所述的细胞群体，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体用于使用靶向CD33和/或至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的剂的免疫治疗方法中，由此本文所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞或本文所述的细胞群体降低靶向CD33和/或至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的所述剂的细胞毒性作用。
154.如实施方案140-153中任一项所述的方法、细胞、剂或组合，其中所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体与靶向CD33和/或至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的所述剂同时施用。
155.如实施方案140-153中任一项所述的方法、细胞、剂或组合，其中所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体在靶向CD33和/或至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的所述剂之前施用。
156.如实施方案140-153中任一项所述的方法、细胞、剂或组合，其中靶向CD33和/或至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的所述剂在所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或所述细胞群体之前施用。
157.如实施方案140-156中任一项所述的方法、细胞、剂、用途或组合，其中所述造血系统病症是造血系统恶性肿瘤。
158.如实施方案140-157中任一项所述的方法、细胞、剂、用途或组合，其还包括向所述受试者施用有效量的靶向CD33的剂并且其中所述剂包含结合CD33的抗原结合片段，和/或有效量的靶向至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的剂并且其中所述剂包含结合所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段。
159.如实施方案158所述的方法、细胞、剂、用途或组合，其中靶向CD33的所述剂是表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)包含结合CD33的抗原结合片段，并且靶向所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的所述剂是表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)包含结合所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段。
160.如实施方案152-159所述的方法、细胞、剂、用途或组合，其中所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原是EMR2。
161.如实施方案159所述的方法、细胞、剂、用途或组合，其中所述免疫细胞是T细胞。
162.如实施方案140-161中任一项所述的方法、细胞、剂、用途或组合，其中所述受试者是患有霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病或多发性骨髓瘤的人患者。
163.如实施方案163所述的方法、细胞、剂、用途或组合，其中所述受试者是患有白血病的人患者，所述白血病是急性骨髓性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病或慢性成淋巴细胞性白血病。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括来进一步展示本公开的某些方面，通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文呈现的具体实施方案的详细描述，可更好地理解所述方面。
图1呈现0型、1型、2型和3型谱系特异性抗原的示例性说明。
图2是示出表达靶向0型谱系特异性细胞表面抗原CD307的嵌合受体的免疫细胞的示意图。表达CD307的多发性骨髓瘤(MM)细胞以及其他表达CD307的细胞(如浆细胞)由表达抗CD307嵌合受体的免疫细胞靶向。
图3是示出表达靶向2型谱系特异性细胞表面抗原CD33的嵌合受体的免疫细胞的示意图。表达CD33的急性骨髓性白血病(AML)细胞。人造血干细胞(HSC)被基因工程化为缺乏CD33，因此不被表达抗CD33嵌合受体的免疫细胞识别。HSC能够产生骨髓细胞。
图4示出CD33的碱基编辑策略。图4A示出外显子1-3区域的细节和可能的剪接结果，ag：剪接受体位点(SA)。gt：剪接供体位点。虚线描绘可能的剪接事件。GO吉妥珠单抗奥佐米星(Ab图标)识别位于外显子2中的表位。图4B示出内含子1(小写字母)/外显子2(大写字母)接点DNA序列，突出显示外显子2SA(红色)和外显子剪接增强子位点(ESE，黄色)。图4C示出CD33mRNA全长(CD33FL)含有7个外显子。外显子2编码Ig样V型结构域。由于常见多态性(rs12459419)，CD33Δ2缺乏外显子2，其改变C>T，导致外显子剪接增强子(ESE)位点改变。
图5示出ABE在靶向位点处引入A>G转化，效率高达95％，插入缺失可忽略不计，并且诱导外显子2跳读。图5A是与野生型基因组序列(顶部)相比已编辑细胞的Sanger测序谱。使ESE或SA突变的胞嘧啶或腺嘌呤的编辑由箭头指示。图5B示出CRISPResso2的HTS分析结果，描绘了靶位点的编辑结果。从提取的基因组DNA中对靶核苷酸周围大约250bp进行PCR扩增，并在Illumina MiSeq上进行测序。这些结果表明，每个靶向碱基都获得了预期的突变。图5C示出在电穿孔后7天使用2个不同的抗体克隆WM53和P67.6(它们识别位于外显子2中的表位)通过FACS分析对已编辑细胞中CD33表达的评估。在BE4介导的编辑后，约30％的CD34+细胞显示CD33表达，而ABE介导的编辑后仅不到5％。图5D示出ESE或SA编辑诱导外显子2跳读。通过使用引物组对cDNA进行PCR来表征CD34+已编辑细胞中的外显子跳读，所述引物特异于CD33Δ2(跨越外显子接点1-3)，或是所有同种型共有的(在外显子1、5和7中)。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物，并通过SYBR-safe荧光进行可视化。在凝胶下方，对PCR产物的Sanger测序证实已编辑细胞中不存在外显子2，而所有其他外显子都完好无损。
图6示出体外分化的WT或CD33Δ2单核细胞展现正常的吞噬能力，而CD34+CD33Δ2细胞在体外对GO细胞毒性具有抗性。图6A示出体外分化的WT或CD33Δ2单核细胞显示出相当的吞噬能力，如由大肠杆菌生物颗粒内化所测量的。左侧是体外分化的WT或CD33Δ2单核细胞内化大肠杆菌生物颗粒的代表性FAC图。用肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素D进行处理可消除吞噬作用。右侧是显示吞噬作用定量的图表。图6B示出CD34+CD33Δ2细胞在体外抵抗GO细胞毒性。细胞与GO孵育48小时，并通过FACS分析细胞毒性。CD34+CD33Δ2示出与具有纯合rs12459419 A14V SNP的供体相同的GO细胞毒性。
图7示出CD34+CD33Δ2植入，概括了一个完整的造血系统，并且在体内对吉妥珠单抗奥佐米星(GO)具有抗性。图7A是描绘在移植后16周分析的来自骨髓(BM)和脾脏的人CD45+细胞的频率，以及骨髓祖细胞(CD123)和淋巴祖细胞(CD10)，及成熟骨髓细胞(CD14)和淋巴细胞(CD19)，以及人CD45群体内的T细胞(CD3)的频率的图表。图7B是对植入CD34+WT或CD34+CD33Δ2的小鼠的BM上的CD33的H&E染色和免疫细胞化学的代表性图像。图7C示出CD34+CD33Δ2细胞在体内对GO具有抗性。分析移植后12周小鼠的外周血(PB)是否存在CD33+CD14+细胞或CD33Δ2CD14+细胞。然后向小鼠注射2.5ugr GO，接着在GO治疗一周后放血并装袋，以评估人源化小鼠的PB和BM中骨髓细胞的存在。在GO治疗之前，CD34+WT或CD34+CD33Δ2移植小鼠的PB中展现相同频率的CD14+细胞(顶部FACS图)。GO注射后一周，在植入CD34+CD33Δ2细胞的小鼠的PB和BM中检测到CD33-CD14+细胞，而在CD34+WT植入小鼠的PB和BM中CD33+和CD14+细胞已根除。图7D是移植后16周来自骨髓样本的植入WT(未编辑)或已编辑细胞中的靶位点(A7)处的CD33中靶A-G编辑的图表。移植后16周，由小鼠骨髓的基因组DNA扩增CD33基因座。通过HTS对扩增子进行测序，并定量位置A7处的A到G编辑。
图8示出脱靶分析的结果。图8A是一个表格，总结了已鉴定的19个排名靠前的脱靶基因座。图8B是移植后16周来自骨髓的植入人WT(未编辑)或已编辑细胞中的已鉴定的19个排名靠前的脱靶基因座处位置A7处的A到G编辑的评估的图表。图8C是移植后16周来自骨髓的植入人WT(未编辑)或已编辑细胞中的已鉴定的19个排名靠前的脱靶基因座处的插入缺失评估的图表。
图9示出CD33和EMR2的碱基编辑策略并且ABE在靶位点处引入A>G转化，导致CD34+细胞的双重编辑。图9A(顶部)示出EMR2、外显子13、gtgagt的细节：剪接供体位点(SD)。图9A(底部)示出内含子12(小写字母)/外显子13(大写字母)接点DNA序列，突出显示了外显子13SD(红色)，并且原间隔区以粗体显示。图9B是与野生型基因组序列(顶部)相比已编辑细胞的Sanger测序谱。使CD33外显子2的SA或EMR2外显子13的SD突变的腺嘌呤的编辑由箭头指示。图9C示出核转染后一周对WT和已编辑细胞的FACS分析。
图10A至图10D示出包含靶向CD33的抗原结合片段的示例性嵌合受体的示意图。图10A：靶向CD33的通用嵌合受体，包含抗CD33scFv、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域。图10B：靶向CD33的嵌合受体，包含抗CD33 scFv、来自CD8的铰链结构域、来自CD8的跨膜结构域以及来自CD28和CD3ζ的细胞内结构域。图10C：靶向CD33的嵌合受体，包含抗CD33 scFv、来自CD8的铰链结构域、来自CD8的跨膜结构域以及来自ICOS(或CD27、4-1BB或OX-40)和CD3ζ的细胞内结构域。图10D：靶向CD33的嵌合受体，包含抗CD33scFv、来自CD8的铰链结构域、来自CD8的跨膜结构域以及来自OX40、CD28和CD3ζ的细胞内结构域。
图11是免疫毒素的示意图。
图12A至图12B示出在用空载体或编码抗CD33嵌合受体的载体转导的K562细胞中表达的抗CD33嵌合受体的表达。图12A：使用识别CD3ζ的第一抗体进行的蛋白质印迹。该表提供了所测试的每种嵌合受体的估计分子量。图12B：流式细胞术分析显示对抗CD33嵌合受体呈染色阳性的细胞群体的增加。
图13A至图13C示出抗CD33嵌合受体结合至CD33。图13A：丽春红(Ponceau)染色的蛋白质凝胶。泳道1、3、5：CD33分子。泳道2、4、6：CD33分子+APC缀合物。图13B：使用识别CD3ζ的第一抗体进行的蛋白质印迹。泳道1、3和5含有与CD33分子共孵育的嵌合受体，并且泳道2、4和6含有与CD33-APC缀合物共孵育的嵌合受体。图13C：流式细胞术分析显示表达抗CD33嵌合受体并结合CD33的细胞群体增加。
图14A至图14B示出表达所指示嵌合受体的NK92细胞对K562细胞的细胞毒性。图14A：CART1和CART2与空HIVzsG载体的比较。图14B：CART3与空HIVzsG载体的比较。
图15A至图15B示出表达所指示嵌合受体的NK92细胞对缺乏CD33的K562细胞的细胞毒性(表示为y轴上的细胞毒性百分比)。图15A：用靶向CD33的CRISPR/Cas试剂预处理的未分选的K562细胞群体。图15B：缺乏CD33的K562细胞的单个克隆。从左至右，这些列对应于空HIVzsG载体、CART1、CART2和CART3。
图16A至图16B示出原代T细胞群体的流式细胞术分析。图16A：基于T细胞标志物C4+、CD8+或CD4+CD8+两者的表达的细胞分选。图16B：所指示的原代T细胞群体上CD33的相对表达。
图17A至图17B示出表达所指示嵌合受体的原代T细胞对K562细胞的细胞毒性。图17A：CD4+T细胞。图17B：CD4+/CD8+(CD 4/8)和CD8+(CD8)。
具体实施方式
当靶抗原也存在于受试者的发育和/或存活所必需的或关键涉及的正常细胞、非癌细胞的细胞表面上时，靶向存在于癌细胞的细胞表面上的抗原的癌症免疫疗法特别具有挑战性。由于免疫疗法对除癌细胞以外的此类细胞的细胞毒性作用，靶向这些抗原可能在受试者中导致有害作用。
本文所述的方法、核酸和细胞允许靶向不仅存在于癌细胞上、而且存在于对受试者的发育和/或存活至关重要的细胞上的抗原(例如，1型或2型抗原)。所述方法包括：(1)使用靶向这种抗原的剂减少携带靶谱系特异性细胞表面抗原的细胞的数量；以及(2)用缺乏谱系特异性细胞表面抗原的造血细胞替代呈递所述抗原并且因此可因施用所述剂而被杀死的正常细胞(例如，非癌细胞)。本文所述的方法可维持对表达目标谱系特异性细胞表面抗原的靶细胞(包括癌细胞)的监视，并且还维持对于受试者的发育和/或存活可能是至关重要的表达所述谱系特异性抗原的非癌细胞群体。
因此，本文描述了共同使用表达嵌合受体的免疫细胞和造血细胞(如造血干细胞(HSC)或造血祖细胞(HPC))以用于治疗造血系统恶性肿瘤，所述嵌合受体包含靶向谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)的抗原结合片段，所述造血细胞缺乏谱系特异性细胞表面抗原。本文还提供了嵌合受体、编码这种嵌合受体的核酸、包含这种嵌合受体的载体和表达这种嵌合受体的免疫细胞(例如，T细胞)。
本公开还提供了缺乏谱系特异性抗原(如本文所述的那些)的基因工程化造血细胞，以及用于制备此类基因工程化造血细胞的方法(例如，基因组编辑方法)。
本文还描述了共同使用表达嵌合受体的免疫细胞和造血细胞(如造血干细胞(HSC)或造血祖细胞(HPC))以用于治疗造血系统恶性肿瘤，所述嵌合受体包含靶向谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)和至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原(例如，EMR2)的抗原结合片段，所述造血细胞缺乏所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原。本文还提供了嵌合受体、编码这种嵌合受体的核酸、包含这种嵌合受体的载体和表达这种嵌合受体的免疫细胞(例如，T细胞)。本公开还提供了缺乏谱系特异性抗原(如本文所述的那些)的基因工程化造血细胞，以及用于制备此类基因工程化造血细胞的方法(例如，基因组编辑方法)。
本文还描述了一种使用基于CRISPR的碱基编辑器系统对造血细胞进行基因组编辑的方法。使用所述基于CIRSPR的碱基编辑器系统允许使用基于CRISPR的胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器(CBE和ABE)实现高HSC/HSPC编辑效率。CBE和ABE分别是与胞苷或腺苷脱氨酶融合的Cas9切口酶，使得能够在靶向区域进行精确的碱基取代而不产生DSB。因为避开了DSB，碱基编辑器被认为是更安全的编辑工具，可以消除由DSB导致的不合乎需要的插入缺失、易位或重排。
本文展示了碱基编辑器，尤其是腺苷碱基编辑器ABE8e通过特异性地改变剪接元件的核苷酸序列来修饰造血细胞的高效使用。剪接元件的改变导致由所述基因编码的转录物的可变剪接，所述可变剪接进一步导致由所述基因编码(例如，由所述基因的外显子编码)的表位的表达水平降低。本文展示了使用碱基编辑器和gRNA来改变CD33的外显子2中的剪接受体或外显子增强子位点。特别地是，使用ABE8e碱基编辑器和专门设计用于靶向接点DNA序列的指导RNA进行的基因组编辑显示出高达95％的效率，并且没有插入缺失。
本文还展示了使用碱基编辑器来改变EMR2的外显子13的剪接供体位点。
此外，本文所述的与胞苷或腺苷脱氨酶融合的Cas9切口酶可以mRNA或蛋白质形式使用。后一种形式比前一种形式产生更少的脱靶效应，并成功用于编辑能够在体内植入并赋予CD34细胞GO抗性的HSC。
参见例如，实施方案1-5。
定义
术语“受试者”、“个体”和“患者”可互换使用，并且是指脊椎动物，优选哺乳动物，如人。哺乳动物包括但不限于人灵长类动物、非人灵长类动物或鼠、牛、马、犬或猫物种。在本公开的上下文中，术语“受试者”还涵盖可在体外或离体培养或在体内操纵的组织和细胞。术语“受试者”可与术语“生物体”互换使用。
术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。这些术语是指具有任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物)的聚合物形式。多核苷酸的实例包括但不限于基因或基因片段的编码或非编码区、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(s iRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。可进一步修饰多核苷酸中的一个或多个核苷酸。核苷酸序列可被非核苷酸组分间断。还可在聚合后，如通过与标记剂缀合来修饰多核苷酸。
术语“杂交”是指其中一个或多个多核苷酸反应形成通过核苷酸残基碱基之间的氢键合而稳定的复合物的反应。氢键合可通过沃尔森-克里克碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他序列特异性方式发生。复合物可包含形成双链体结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单个自杂交链或这些的任何组合。杂交反应可构成更广泛过程(如PCR的起始或酶对多核苷酸的裂解)中的步骤。能够与给定序列杂交的序列被称为给定序列的“互补序列”。
术语“重组表达载体”是指允许宿主细胞表达mRNA、蛋白质、多肽或肽的基因修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，条件是所述构建体包含编码所述mRNA、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列时，并且使所述载体在足以在所述细胞内表达所述mRNA、蛋白质、多肽或肽的条件下与所述细胞接触。本公开的载体整体上不是天然存在的。载体的部分可以是天然存在的。本公开的非天然存在的重组表达载体可包含任何类型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，所述核苷酸可以是单链或双链的，合成的或部分从天然来源获得的，并且可含有天然的、非天然的或改变的核苷酸。
如本文所用，“转染”、“转化”或“转导”是指通过使用物理或化学方法将一种或多种外源多核苷酸引入宿主细胞中。
“抗体”、“抗体的片段”、“抗体片段”、“抗体的功能片段”或“抗原结合部分”可互换使用来表示抗体的保留特异性地结合至特定抗原的能力的一个或多个片段或部分(Hol liger等人,Nat.Biotech.(2005)23(9):1126)。本发明的抗体可以是抗体和/或其片段。抗体片段包括Fab、F(ab')2、scFv、二硫键连接的Fv、Fc或变体和/或混合物。抗体可以是嵌合的、人源化的、单链的或双特异性的。本公开涵盖所有抗体同种型，包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。合适的IgG亚型包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。抗体轻链或重链可变区由被三个称为互补决定区(CDR)的高变区间断的“框架”区组成。本发明的抗体或抗原结合部分的CDR可来自非人或人来源。本发明的抗体或抗原结合部分的框架可以是人的、人源化的、非人的(例如，经修饰以降低人中的抗原性的鼠框架)或合成的框架(例如，共有序列)。
本发明的抗体或抗原结合部分可以小于约10-7M、小于约10-8M、小于约10-9M、小于约10-10M、小于约10-11M或小于约10-12M的解离常数(KD)特异性地结合。。根据本公开的抗体的亲和力可使用常规技术容易地确定(参见例如，Scatchard等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.(1949)51:660；和美国专利第5,283,173号、第5,468,614号或等效物)。
术语“嵌合受体”、“嵌合抗原受体”或可替代地“CAR”可在全文中互换使用，并且是指至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(本文中也称为“细胞内信号传导结构域”)的重组多肽构建体，所述细胞质信号传导结构域包含源自如下文定义的刺激分子的功能性信号传导结构域。Lee等人,Clin.Cancer Res.(2012)18(10):2780；Jensen等人,Immunol Rev.(2014)257(1):127。在一个实施方案中，刺激分子是与T细胞受体复合物相关的ζ链。在一个方面，细胞质信号传导结构域还包含一个或多个源自至少一种如下文定义的共刺激分子的功能性信号传导结构域。共刺激分子也可以是4-1BB(即，CD137)、CD27和/或CD28或这些分子的片段。在另一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包含源自刺激分子的功能性信号传导结构域。CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包含源自共刺激分子的功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域。或者，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包含源自一种或多种共刺激分子的两个功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域。CAR还可包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包含源自一种或多种共刺激分子的至少两个功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域。由核酸序列编码的CAR的抗原识别部分可含有任何谱系特异性的抗原结合抗体片段。所述抗体片段可包含一个或多个CDR、可变区(或其部分)、恒定区(或其部分)、或前述任一者的组合。
术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能性部分，其通过在细胞内传递信息以通过产生第二信使或通过响应于此类信使而用作效应子，经由定义的信号传导途径调控细胞活性而起作用。
术语“ζ”或“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”被定义为以GenBank登录号NP_932170、NP_000725或XP_011508447提供的蛋白质；或来自非人物种，例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等效残基，并且“ζ刺激结构域”或可替代地“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”被定义为来自ζ链的细胞质结构域的氨基酸残基，所述氨基酸残基足以在功能上传递T细胞活化所必需的初始信号。
术语“基因工程化的”或“基因修饰的”是指通过基因工程化，例如通过基因组编辑来操纵的细胞。也就是说，所述细胞含有在所述细胞中不天然存在的异源序列。通常，异源序列通过载体系统或用于将核酸分子引入细胞中的其他方式(包括脂质体)引入。异源核酸分子可整合到细胞的基因组中或可存在于染色体外，例如以质粒的形式。所述术语还包括将基因工程化的、分离的CAR多肽引入细胞中的实施方案。
术语“自体的”是指源自同一个体的任何材料，所述材料随后将被重新引入该同一个体。
术语“同种异体的”是指任何材料，所述材料源自与向其引入该材料的个体相同的物种的不同动物。当一个或多个基因座处的基因不相同时，两个或更多个个体被称为彼此同种异体。
术语“细胞谱系”是指具有共同祖先并且从相同类型的可识别细胞发育成特定可识别/功能细胞的细胞。本文使用的细胞谱系包括但不限于呼吸系统、前列腺、胰腺、乳腺、肾、肠、神经、骨骼、血管、肝、造血、肌肉或心脏细胞谱系。
当用于提及谱系特异性抗原的基因表达或功能时，术语“抑制”是指谱系特异性抗原的基因表达或功能水平的降低，其中抑制是对基因表达或功能的干扰的结果。抑制可以是完全的，在这种情况下没有可检测的表达或功能，或者可以是部分的。部分抑制的范围可从接近完全抑制到几乎没有抑制。通过消除特定靶细胞，CAR T细胞可有效地抑制特定细胞谱系的总体表达。
“缺乏谱系特异性抗原”的细胞如造血细胞是指与其天然存在的对应物(例如，相同类型的内源性造血细胞)或不表达谱系特异性抗原(即，通过常规测定如FACS不可检测)的细胞相比具有显著降低的谱系特异性抗原表达水平的细胞。在一些情况下，“缺乏抗原”的细胞的谱系特异性抗原的表达水平可低于天然存在的对应物的同一谱系特异性抗原的表达水平的约40％(例如，30％、20％、15％、10％、5％或更低)。
如本文所用，术语“剪接元件”包括剪接受体位点、剪接供体位点、剪接增强子位点和剪接沉默子位点。
如本文所用，术语“约”是指特定值+/-5％。例如，约40％的表达水平可包括介于35％-45％之间的任何表达量。
靶向谱系特异性细胞表面抗原的剂
本公开的方面提供了靶向例如靶癌细胞上的一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的剂(例如，靶向CD33的剂，例如，其中所述剂包含结合CD33的抗原结合片段，和靶向至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的剂，例如，其中所述剂包含结合至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段)。这种剂可包含结合并靶向所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段可以是与谱系特异性抗原特异性结合的单链抗体(scFv)。
A.谱系特异性细胞表面抗原
如本文所用，术语“谱系特异性”、“谱系特异性细胞表面抗原”和“细胞表面谱系特异性抗原”可互换使用，并且是指充分存在于细胞表面上并与一个或多个细胞谱系群体相关的任何抗原。例如，抗原可存在于一个或多个细胞谱系群体上，而在其他细胞群体的细胞表面上不存在(或处于降低的水平)。
一般而言，谱系特异性细胞表面抗原可基于多种因素进行分类，所述因素如抗原和/或呈递所述抗原的细胞群体是否是宿主生物体的存活和/或发育所需的。以下表1中提供了示例性类型的谱系特异性抗原的总结。还参见图1。
表1.谱系特异性抗原的分类
Figure BDA0004113798400000541
如表1和图1所示，0型谱系特异性细胞表面抗原是组织稳态和存活所必需的，并且携带0型谱系特异性细胞表面抗原的细胞类型可能也是受试者的存活所必需的。因此，鉴于0型谱系特异性细胞表面抗原或携带0型谱系特异性细胞表面抗原的细胞在稳态和存活中的重要性，使用常规CAR T细胞免疫疗法靶向此类抗原可能具有挑战性，因为抑制或去除此类抗原和携带此类抗原的细胞可能对受试者的存活有害。因此，谱系特异性细胞表面抗原(如0型谱系特异性抗原)和/或携带此类抗原的细胞类型可能是存活所需的，例如因为它在受试者中执行重要的非冗余功能，因此这种类型的谱系特异性抗原可能是基于CAR T细胞的免疫疗法的不良靶标。
与0型抗原相反，1型谱系特异性细胞表面抗原和携带1型谱系特异性细胞表面抗原的细胞不是受试者的组织稳态或存活所需的。靶向1型谱系特异性细胞表面抗原不太可能对受试者造成有害后果。例如，经工程化以靶向CD307(一种在正常浆细胞和多发性骨髓瘤(MM)细胞上独特表达的1型抗原)的CAR T细胞将导致两种细胞类型的消除(图2)(Elkins等人,Mol Cancer Ther.(2012)10:2222)。然而，由于浆细胞谱系对于生物体的存活是消耗性的，所以CD307和其他1型谱系特异性抗原是适用于基于CAR T细胞的免疫疗法的抗原。1型类别的谱系特异性抗原可在多种不同的组织，包括卵巢、睾丸、前列腺、乳腺、子宫内膜和胰腺中表达。在一些实施方案中，所述剂靶向为1型抗原的谱系特异性细胞表面抗原。
与1型抗原相比，靶向2型抗原存在重大困难。2型抗原的特征在于：(1)抗原对于生物体的存活是非必要的(即，不是存活所需的)；以及(2)携带所述抗原的细胞谱系对于生物体的存活是必不可少的(即，特定细胞谱系是存活所需的)。例如，CD33是在正常骨髓细胞以及急性骨髓性白血病(AML)细胞中表达的2型抗原(Dohner等人,(2015)NEJM 373:1136)。因此，经工程化以靶向CD33抗原的CAR T细胞可导致杀死正常细胞以及AML细胞，这可能与受试者的存活不相容(图3)。在一些实施方案中，所述剂靶向为2型抗原的细胞表面谱系特异性抗原。
本公开的方法和组合物可靶向多种抗原。针对这些抗原的单克隆抗体可商购或使用标准技术产生，包括用目标抗原对动物进行免疫，然后是常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Mi lstein,Nature(1975)256:495的标准体细胞杂交技术，如上文所论述。可使用任何标准DNA或蛋白质测序技术对抗体或编码所述抗体的核酸进行测序。
在一些实施方案中，使用本文所述的方法和细胞靶向的谱系特异性细胞表面抗原是白细胞或白细胞亚群的谱系特异性细胞表面抗原。在一些实施方案中，细胞表面谱系特异性抗原是与骨髓细胞相关的抗原。在一些实施方案中，谱系特异性细胞表面抗原是分化抗原(CD)簇。CD抗原的实例包括但不限于CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、C D2、CD3、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8a、CD8b、C D9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD16、CD16b、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、C D24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32a、CD32b、CD32c、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45RA、CD45R B、CD45RC、CD45RO、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、C D49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD60a、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64a、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、CD66c、CD66F、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD75S、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85A、CD85C、CD85D、CD85E、CD85F、CD85G、CD85H、CD85I、CD85J、CD85K、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD99R、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CD108、CD109、CD110、CD111、CD112、CD113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a、CD120b、CD121a、CD121b、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CD127、CD129、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CD137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145、CD146、CD147、CD148、CD150、CD152、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156a、CD156b、CD156c、CD157、CD158b1、CD158b2、CD158d、CD158e1/e2、CD158f、CD158g、CD158h、CD158i、CD158j、CD158k、CD159a、CD159c、CD160、CD161、CD163、CD164、CD165、CD166、CD167a、CD168、CD169、CD170、CD171、CD172a、CD172b、CD172g、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD177、CD178、CD179a、CD179b、CD180、CD181、CD182、CD183、CD184、CD185、CD186、CD191、CD192、CD193、CD194、CD195、CD196、CD197、CDw198、CDw199、CD200、CD201、CD202b、CD203c、CD204、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、CD210a、CDw210b、CD212、CD213a1、CD213a2、CD215、CD217、CD218a、CD218b、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD231、CD232、CD233、CD234、CD235a、CD235b、CD236、CD236R、CD238、CD239、CD240、CD241、CD242、CD243、CD244、CD245、CD246、CD247、CD248、CD249、CD252、CD253、CD254、CD256、CD257、CD258、CD261、CD262、CD263、CD264、CD265、CD266、CD267、CD268、CD269、CD270、CD271、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD277、CD278、CD279、CD280、CD281、CD282、CD283、CD284、CD286、CD288、CD289、CD290、CD292、CDw293、CD294、CD295、CD296、CD297、CD298、CD299、CD300a、CD300c、CD300e、CD301、CD302、CD303、CD304、CD305、306、CD307a、CD307b、CD307c、D307d、CD307e、CD309、CD312、CD314、CD315、CD316、CD317、CD318、CD319、CD320、CD321、CD322、CD324、CD325、CD326、CD327、CD328、CD329、CD331、CD332、CD333、CD334、CD335、CD336、CD337、CD338、CD339、CD340、CD344、CD349、CD350、CD351、CD352、CD353、CD354、CD355、CD357、CD358、CD359、CD360、CD361、CD362和CD363。参见www.bdbiosciences.com/documents/BD_Reagents_CDMarkerHuman_Poster.pdf。
在一些实施方案中，谱系特异性细胞表面抗原是CD19、CD20、CD11、CD123、CD56、CD34、CD14、CD33、CD66b、CD41、CD61、CD62、CD235a、CD146、CD326、LMP2、CD22、CD52、CD10、CD3/TCR、CD79/BCR和CD26。
在一些实施方案中，所述谱系特异性细胞表面抗原是CD33。
或者或此外，谱系特异性细胞表面抗原可以是癌抗原，例如差异存在于癌细胞上的谱系特异性细胞表面抗原。在一些实施方案中，癌抗原是对组织或细胞谱系具有特异性的抗原。与特定类型的癌症相关的谱系特异性细胞表面抗原的实例包括但不限于CD20、CD22(非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL))、CD52(B细胞CLL)、CD33(急性髓细胞性白血病(AML))、CD10(gp100)(普通(前B型)急性淋巴细胞性白血病和恶性黑素瘤)、CD3/T细胞受体(TCR)(T细胞淋巴瘤和白血病)、CD79/B细胞受体(BCR)(B细胞淋巴瘤和白血病)、CD26(上皮和淋巴恶性肿瘤)、人白细胞抗原(HLA)-DR、HLA-DP和HLA-DQ(淋巴恶性肿瘤)、RCAS1(妇科癌、胆管腺癌和胰腺导管腺癌)以及前列腺特异性膜抗原。
在一些实施方案中，谱系特异性细胞表面抗原CD33与AML细胞相关。在一些实施方案中，谱系特异性细胞表面抗原EMR2与AML细胞相关。
B.抗原结合片段
任何抗体或其抗原结合片段(例如，其结合CD33或至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原，例如EMR2)可用于构建靶向如本文所述的谱系特异性细胞表面抗原的剂。这种抗体或抗原结合片段可通过常规方法，例如使用杂交瘤技术或重组技术制备。
例如，可通过常规杂交瘤技术制备对目标谱系特异性抗原具有特异性的抗体。细胞表面谱系特异性抗原(其可与载体蛋白如KLH偶联)可用于对宿主动物进行免疫以产生与该复合物结合的抗体。宿主动物的免疫途径和时间表通常与用于抗体刺激和产生的已确立且常规的技术一致，如本文进一步描述的。用于产生小鼠抗体、人源化抗体和人抗体的一般技术是本领域已知的并且在本文中进行了描述。预期可对包括人的任何哺乳动物受试者或来自其的产生抗体的细胞进行操纵以充当产生哺乳动物，包括人杂交瘤细胞系的基础。通常，将宿主动物腹膜内、肌肉内、口服、皮下、足底和/或皮内接种一定量的免疫原，包括如本文所述的。
可使用Kohler和Milstein Nature(1975)256:495-497的一般体细胞杂交技术或如Buck等人,In Vitro(1982)18:377-381所修改的一般体细胞杂交技术从淋巴细胞和永生化骨髓瘤细胞制备杂交瘤。可用的骨髓瘤系，包括但不限于X63-Ag8.653和来自SalkInstitute,Cell Distribution Center,San Diego,Calif.,USA的那些，可用于杂交。一般而言，所述技术包括使用融合剂如聚乙二醇或通过本领域技术人员熟知的电手段融合骨髓瘤细胞和淋巴细胞。融合后，将细胞从融合培养基中分离并在选择性生长培养基，如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培养基中生长，以消除未杂交的亲代细胞。补充有或没有血清的本文所述的任何培养基均可用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。作为细胞融合技术的另一种替代方法，EBV永生化B细胞可用于产生本文所述的TCR样单克隆抗体。如果需要，将杂交瘤扩增并亚克隆，并且通过常规免疫测定程序(例如，放射免疫测定、酶免疫测定或荧光免疫测定)测定上清液的抗免疫原活性。
可用作抗体来源的杂交瘤包括产生能够结合至谱系特异性抗原的单克隆抗体的亲代杂交瘤的所有衍生物、后代细胞。可使用已知程序在体外或体内生长产生此类抗体的杂交瘤。如果需要，可通过常规免疫球蛋白纯化程序如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、色谱和超滤从培养基或体液中分离单克隆抗体。不合乎需要的活性(如果存在)可例如通过使制剂在由附着至固相上的免疫原制成的吸附剂上运行并使所需抗体从所述免疫原洗脱或释放来去除。用靶抗原或含有靶氨基酸序列的片段对宿主动物进行免疫可产生抗体(例如，单克隆抗体)群体，所述靶抗原或片段使用双功能或衍生剂，例如马来酰亚胺苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烷基)缀合至在待免疫物种中具有免疫原性的蛋白质，例如钥孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。
如果需要，可对目标抗体(例如，由杂交瘤产生)进行测序，并且然后可将多核苷酸序列克隆至用于表达或繁殖的载体中。编码目标抗体的序列可在宿主细胞中的载体中保持，然后可使宿主细胞扩增和冷冻以备将来使用。在替代方案中，多核苷酸序列可用于基因操纵以使抗体“人源化”或提高抗体的亲和力(亲和力成熟)或其他特性。例如，如果抗体用于人的临床试验和治疗，则恒定区可被设计成更类似于人恒定区以避免免疫应答。可能需要对抗体序列进行基因操纵以获得对谱系特异性抗原的更大亲和力。对本领域技术人员来说显而易见的是，可对抗体进行一种或多种多核苷酸改变并且仍然保持其对靶抗原的结合特异性。
在其他实施方案中，可通过使用已被工程化为表达特定人免疫球蛋白蛋白质的市售小鼠来获得完全人抗体。被设计用于产生更合乎需要的(例如，完全人抗体)或更稳健的免疫应答的转基因动物也可用于产生人源化或人抗体。这种技术的实例是来自Amgen,Inc.(Fremont,Calif.)的XenomouseTM以及来自Medarex,Inc.(Princeton,N.J.)的HuMAb-MouseTM和TC MouseTM。在另一个替代方案中，可通过噬菌体展示或酵母技术以重组方式制备抗体。参见例如，美国专利第5,565,332号；第5,580,717号；第5,733,743号；和第6,265,150号；以及Winter等人,Annu.Rev.Immunol.(1994)12:433-455。或者，噬菌体展示技术(McCafferty等人,Nature(1990)348:552-553)可用于从未免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库在体外产生人抗体和抗体片段。
可通过常规方法制备完整抗体(全长抗体)的抗原结合片段。例如，F(ab')2片段可通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生，并且Fab片段可通过还原F(ab')2片段的二硫键桥产生。
基因工程化的抗体，如人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体和双特异性抗体可通过例如常规重组技术产生。在一个实例中，编码对靶抗原具有特异性的单克隆抗体的DNA可使用常规程序容易地分离和测序(例如，通过使用能够特异性地结合至编码所述单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞充当这种DNA的优选来源。一旦分离，就可将DNA置于一种或多种表达载体中，然后转染至不另外产生免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞(如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以获得单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。参见例如，PCT公布第WO 87/04462号。然后可对DNA进行修饰，例如，通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列，Morrison等人,Proc.Nat.Acad.Sci.(1984)81:6851，或者通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或一部分共价连接至免疫球蛋白编码序列。以该方式，可制备具有靶抗原的结合特异性的基因工程化的抗体，如“嵌合”或“杂合”抗体。
经开发用于产生“嵌合抗体”的技术是本领域众所周知的。参见例如，Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(1984)81,6851；Neuberger等人,Nature(1984)312,604；以及Takeda等人,Nature(1984)314:452。
用于构建人源化抗体的方法也是本领域众所周知的。参见例如，Queen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(1989)86:10029-10033。在一个实例中，按照本领域已知的方法，对亲本非人抗体的VH和VL的可变区进行三维分子建模分析。接下来，使用相同的分子建模分析鉴定据预测对形成正确的CDR结构重要的框架氨基酸残基。并行地，使用亲本VH和VL序列作为搜索查询从任何抗体基因数据库中鉴定具有与亲本非人抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列的人VH和VL链。然后选择人VH和VL受体基因。
所选人受体基因内的CDR区可用来自亲本非人抗体或其功能变体的CDR区替代。必要时，可使用亲本链的框架区内据预测在与CDR区相互作用中重要的残基(参见上文描述)来取代人受体基因中的相应残基。
单链抗体可通过重组技术通过连接编码重链可变区的核苷酸序列和编码轻链可变区的核苷酸序列来制备。优选地，在两个可变区之间并入柔性接头。或者，描述用于产生单链抗体的技术(美国专利第4,946,778号和第4,704,692号)可适于产生噬菌体或酵母scFv文库，并且可按照常规程序从文库中鉴定对谱系特异性抗原具有特异性的scFv克隆。可对阳性克隆进行进一步筛选以鉴定结合谱系特异性细胞表面抗原的那些克隆。
在一些情况下，目标谱系特异性细胞表面抗原是CD33并且抗原结合片段特异性地结合CD33，例如人CD33。下文提供了抗人CD33抗体的示例性重链可变区和轻链可变区的氨基酸和核酸序列。CDR序列以粗体显示并在氨基酸序列中加下划线。
抗CD33重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)
Figure BDA0004113798400000621
/>
抗CD33重链可变区的核酸序列(SEQ ID NO:6)
CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCCGGCGCCGAGGTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCACTGGATCAAGCAGACCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGGTGGGCGTGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCAGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGAGGTGAGGCTGAGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC
抗CD33轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)
Figure BDA0004113798400000622
抗CD33重链可变区的核酸序列(SEQ ID NO:8)
GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGGCAGCCTGGCCGTGAGCCCCGGCGAGAGGGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCAGCCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGATCCCCGGCCAGAGCCCCAGGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGCCCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGG
用于构建如本文所述的靶向CD33的剂的抗CD33抗体结合片段可包含与SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:7中的那些相同的重链和/或轻链CDR区。此类抗体可在一个或多个框架区中包含氨基酸残基变异。在一些情况下，抗CD33抗体片段可包含与SEQ ID NO:5共有至少70％序列同一性(例如，75％、80％、85％、90％、95％或更高)的重链可变区，和/或可包含与SEQ ID NO:7共有至少70％序列同一性(例如，75％、80％、85％、90％、95％或更高)的轻链可变区。
两个氨基酸序列的“同一性百分比”是使用Karlin和AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87:2264-68的算法，如Karlin和AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:5873-77中所修改的算法确定的。这种算法被并入Altschul等人J.Mol.Biol.(1990)215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。BLAST蛋白搜索可用XBLAST程序(得分＝50，字长＝3)来进行，以获得与本公开的蛋白质分子同源的氨基酸序列。在两个序列之间存在空位的情况下，可利用如Altschul等人,Nucleic AcidsRes.(1997)25(17):3389-3402中所描述的空位BLAST。当利用BLAST和空位BLAST程序时，可使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
C.表达嵌合受体的免疫细胞
在一些实施方案中，如本文所述的靶向谱系特异性细胞表面抗原的剂是表达嵌合受体的免疫细胞，所述剂包含能够结合至谱系特异性抗原(例如，CD33、EMR2)的抗原结合片段(例如，单链抗体)。通过嵌合受体的抗原结合片段识别在其细胞表面上具有谱系特异性抗原的靶细胞(例如，癌细胞)将活化信号转导至所述嵌合受体的一个或多个信号传导结构域(例如，共刺激信号传导结构域和/或细胞质信号传导结构域)，其可活化表达所述嵌合受体的免疫细胞中的效应子功能。
如本文所用，嵌合受体是指可在宿主细胞的表面上表达并包含与细胞表面谱系特异性抗原结合的抗原结合片段的非天然存在的分子。一般而言，嵌合受体包含至少两个源自不同分子的结构域。除本文所述的抗原结合片段以外，嵌合受体还可包含铰链结构域、跨膜结构域、至少一个共刺激结构域和细胞质信号传导结构域中的一者或多者。在一些实施方案中，嵌合受体从N末端至C末端包含结合至细胞表面谱系特异性抗原的抗原结合片段、铰链结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合受体还包含至少一个共刺激结构域。
在一些实施方案中，本文所述的嵌合受体包含铰链结构域，所述铰链结构域可位于抗原结合片段与跨膜结构域之间。铰链结构域是通常在蛋白质的两个结构域之间发现的氨基酸区段，并且可允许蛋白质的柔性和一个或两个结构域相对于彼此的移动。可使用提供这种柔性和抗原结合片段相对于嵌合受体的另一个结构域的移动的任何氨基酸序列。
铰链结构域可含有约10-200个氨基酸，例如15-150个氨基酸、20-100个氨基酸或30-60个氨基酸。在一些实施方案中，铰链结构域的长度可以是约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200个氨基酸。
在一些实施方案中，铰链结构域是天然存在的蛋白质的铰链结构域。本领域已知的包含铰链结构域的任何蛋白质的铰链结构域适用于本文所述的嵌合受体中。在一些实施方案中，铰链结构域是天然存在的蛋白质的铰链结构域的至少一部分并且赋予嵌合受体柔性。在一些实施方案中，铰链结构域是CD8α或CD28α的铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域是CD8α的铰链结构域的一部分，例如，含有CD8α或CD28α的铰链结构域的至少15(例如，20、25、30、35或40)个连续氨基酸的片段。
抗体(如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体)的铰链结构域也适用于本文所述的嵌合受体中。在一些实施方案中，铰链结构域是连接抗体的恒定结构域CH1和CH2的铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域是抗体的铰链结构域并且包含所述抗体的铰链结构域和所述抗体的一个或多个恒定区。在一些实施方案中，铰链结构域包含抗体的铰链结构域和所述抗体的CH3恒定区。在一些实施方案中，铰链结构域包含抗体的铰链结构域和所述抗体的CH2和CH3恒定区。在一些实施方案中，抗体是IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施方案中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区以及CH2和CH3恒定区。在一些实施方案中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区和CH3恒定区。
同样在本公开范围内的是包含铰链结构域的嵌合受体，所述铰链结构域是非天然存在的肽。在一些实施方案中，Fc受体的细胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域是肽接头，如(GlyxSer)n接头，其中x和n可独立地为3与12之间的整数，包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多。
可用于本文所述的嵌合受体的铰链结构域中的另外肽接头是本领域已知的。参见例如，Wriggers等人Current Trends in Peptide Science(2005)80(6):736-746和PCT公布WO 2012/088461。
在一些实施方案中，本文所述的嵌合受体可包含跨膜结构域。用于嵌合受体中的跨膜结构域可呈本领域已知的任何形式。如本文所用，“跨膜结构域”是指在细胞膜，优选真核细胞膜中热力学稳定的任何蛋白质结构。适用于本文所用的嵌合受体中的跨膜结构域可从天然存在的蛋白质获得。或者，跨膜结构域可以是合成的、非天然存在的蛋白质区段，例如在细胞膜中热力学稳定的疏水性蛋白质区段。
跨膜结构域基于跨膜结构域拓扑学，包括跨膜结构域穿过膜的通过次数和蛋白质的取向进行分类。例如，单程膜蛋白穿过细胞膜一次，而多程膜蛋白穿过细胞膜至少两次(例如，2、3、4、5、6、7次或更多次)。在一些实施方案中，跨膜结构域是单程跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域是将嵌合受体的N末端定向至细胞的细胞外侧并且将嵌合受体的C末端定向至细胞的细胞内侧的单程跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域从单程跨膜蛋白获得。在一些实施方案中，跨膜结构域是CD8α的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域是CD28的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域是ICOS的跨膜结构域。
在一些实施方案中，本文所述的嵌合受体包含一个或多个共刺激信号传导结构域。如本文所用，术语“共刺激信号传导结构域”是指在细胞内介导信号转导以诱导免疫应答(如效应子功能)的蛋白质的至少一部分。本文所述的嵌合受体的共刺激信号传导结构域可以是来自共刺激蛋白的细胞质信号传导结构域，其转导信号并调节由免疫细胞(如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞)介导的应答。
在一些实施方案中，嵌合受体包含不止一个(至少2个、3个、4个或更多个)共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合受体包含从不同共刺激蛋白获得的不止一个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合受体不包含共刺激信号传导结构域。
一般而言，许多免疫细胞除刺激抗原特异性信号以外，还需要共刺激，以促进细胞增殖、分化和存活并活化细胞的效应子功能。宿主细胞(例如，免疫细胞)中共刺激信号传导结构域的活化可诱导细胞增加或减少细胞因子的产生和分泌、吞噬性质、增殖、分化、存活和/或细胞毒性。任何共刺激蛋白的共刺激信号传导结构域可适用于本文所述的嵌合受体中。共刺激信号传导结构域的类型是基于如嵌合受体将在其中表达的免疫细胞的类型(例如，原代T细胞、T细胞系、NK细胞系)和所需的免疫效应子功能(例如，细胞毒性)的因素加以选择。用于嵌合受体中的共刺激信号传导结构域的实例可以是共刺激蛋白的细胞质信号传导结构域，包括但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、Cd40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3。在一些实施方案中，共刺激结构域源自4-1BB、CD28或ICOS。在一些实施方案中，共刺激结构域源自CD28，并且嵌合受体包含来自4-1BB或ICOS的第二共刺激结构域。
在一些实施方案中，共刺激结构域是包含不止一个共刺激结构域或不止一个共刺激结构域的部分的融合结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域是来自CD28和ICOS的共刺激结构域的融合体。
在一些实施方案中，本文所述的嵌合受体包含细胞质信号传导结构域。任何细胞质信号传导结构域均可用于本文所述的嵌合受体中。一般而言，细胞质信号传导结构域传递信号，如细胞外配体结合结构域与其配体的相互作用，以刺激细胞应答，如诱导细胞的效应子功能(例如，细胞毒性)。
对本领域普通技术人员显而易见的是，T细胞活化中涉及的因素是细胞质信号传导结构域的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的磷酸化。本领域已知的任何含ITAM结构域均可用于构建本文所述的嵌合受体。一般而言，ITAM基序可包含被6-8个氨基酸隔开的氨基酸序列YxxL/I的两个重复序列，其中每个x独立地为任何氨基酸，从而产生保守基序YxxL/Ix(6-8)YxxL/I。在一些实施方案中，细胞质信号传导结构域来自CD3ζ。
示例性嵌合受体在以下表2和表3中提供。
表2：嵌合受体的示例性组分
Figure BDA0004113798400000681
下文提供了用于构建嵌合受体的示例性组分的核酸序列。
CD28细胞内信号传导结构域-DNA-人(SEQ ID NO:15)
ATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
ICOS细胞内信号传导结构域-DNA-人(SEQ ID NO:16)
CTATCAATTTTTGATCCTCCTCCTTTTAAAGTAACTCTTACAGGAGGATATTTGCATATTTATGAATCACAACTTTGTTGCCAGCTGAAGTTCTGGTTACCCATAGGATGTGCAGCCTTTGTTGTAGTCTGCATTTTGGGATGCATACTTATTTGTTGGCTTACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCTAGACTCACAGATGTGACCCTAAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
CD28/ICOS共刺激信号传导区-DNA-人(SEQ ID NO:17)
ATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCTAGACTCACAGATGTGACCCTAAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
在一些实施方案中，核酸序列编码抗原结合片段，所述抗原结合片段结合至CD33并且包含具有与SEQ ID NO:5中的CDR相同的CDR的重链可变区和具有与SEQ ID NO:7中的CDR相同的CDR的轻链可变区。在一些实施方案中，抗原结合片段包含由SEQ ID NO:5提供的重链可变区和由SEQ ID NO:7提供的轻链可变区。在一些实施方案中，嵌合受体还包含至少一个跨膜结构域和细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合受体还包含铰链结构域和/或共刺激信号传导结构域。
表3提供了本文所述的示例性嵌合受体。示例性构建体从N末端至C末端具有抗原结合片段、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域。在一些实例中，嵌合受体还包含位于抗原结合片段与跨膜结构域之间的铰链结构域。在一些实例中，嵌合受体还包含一个或多个共刺激结构域，所述一个或多个共刺激结构域可位于跨膜结构域与细胞质信号传导结构域之间。
表3：示例性嵌合受体
Figure BDA0004113798400000701
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Figure BDA0004113798400000711
以上表3中列出的示例嵌合受体的氨基酸序列在下文提供：
CART1氨基酸序列(SEQ ID NO:18)
MWLQSLLLLGTVACSISEIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKRGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CART2氨基酸序列(SEQ ID NO:19)
MWLQSLLLLGTVACSISEIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKRGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFI IFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CART3氨基酸序列(SEQ ID NO:20)
MWLQSLLLLGTVACSISEIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKRGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFI IFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CART8氨基酸序列(SEQ ID NO:21)
MWLQSLLLLGTVACSISEIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKRGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDFWLPIGCAAFVVVCILGCILICWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTLTKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CART4双重氨基酸序列(SEQ ID NO:22)
MWLQSLLLLGTVACSISIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIGSTSGSGKPGSGEGSTKGLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CART5双重氨基酸序列(SEQ ID NO:23)
MWLQSLLLLGTVACSISEIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKRGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
CART6氨基酸序列(SEQ ID NO:24)
MWLQSLLLLGTVACSISIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIGSTSGSGKPGSGEGSTKGLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CART7氨基酸序列(SEQ ID NO:25)
MWLQSLLLLGTVACSISEIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKRGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
以上表3中列出的示例嵌合受体的核酸序列在下文提供：
CART1核酸序列(SEQ ID NO:26)
GGTGTCGTGAGCGGCCGCTGAACTGGCCACCATGTGGCTGCAGTCTCTGCTGCTGCTGGGCACCGTGGCCTGTAGCATCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGGCTCTCTGGCTGTGTCTCCTGGCGAGCGCGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCTCCCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGATCCCCGGCCAGAGCCCCAGACTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGCGTGCAGCCCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCCGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGGGCAGCACAAGCGGCAGCGGAAAGCCTGGATCTGGCGAGGGCTCTACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGCGCCGAAGTCGTGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCACTGGATCAAGCAGACCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGGTGGGAGTGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCAGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTGCGGCTGCGGTACTTCGATGTGTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGTCTAGCGCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACCACAACCCCTGCCCCTAGACCTCCTACCCCAGCCCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAGGCTTCTAGACCAGCTGCTGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGCCTGGATATCTACATCTGGGCCCCACTGGCCGGCACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGTCTCTCGTGATCACCAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAAGAGGACGGCTGTAGCTGCCGGTTCCCCGAGGAAGAAGAAGGGGGCTGCGAGCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGATGAAATTCATCGACGTTAACTATTCTAG
CART2核酸序列(SEQ ID NO:27)
GGTGTCGTGAGCGGCCGCTGAACTGGCCACCATGTGGCTGCAGTCTCTGCTGCTGCTGGGCACCGTGGCCTGTAGCATCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGGCTCTCTGGCTGTGTCTCCTGGCGAGCGCGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCTCCCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGATCCCCGGCCAGAGCCCCAGACTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGCGTGCAGCCCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCCGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGGGCAGCACAAGCGGCAGCGGAAAGCCTGGATCTGGCGAGGGCTCTACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGCGCCGAAGTCGTGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCACTGGATCAAGCAGACCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGGTGGGAGTGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCAGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTGCGGCTGCGGTACTTCGATGTGTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGTCTGCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACCACAACCCCTGCCCCTAGACCTCCTACCCCAGCCCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAGGCTTCTAGACCAGCTGCTGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGACTGGACAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTACAGCCTGCTCGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGTCTAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGAAGGCCAGGCCCCACCCGGAAGCACTATCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGAAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGCGAACGGCGGAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGATGAAATTCATCGACGTTAACTATTCTAG
CART3核酸序列(SEQ ID NO:28)
GGTGTCGTGAGCGGCCGCTGAACTGGCCACCATGTGGCTGCAGTCTCTGCTGCTGCTGGGCACCGTGGCCTGTAGCATCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGGCTCTCTGGCTGTGTCTCCTGGCGAGCGCGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCTCCCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGATCCCCGGCCAGAGCCCCAGACTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGCGTGCAGCCCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCCGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGGGCAGCACAAGCGGCAGCGGAAAGCCTGGATCTGGCGAGGGCTCTACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGCGCCGAAGTCGTGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCACTGGATCAAGCAGACCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGGTGGGAGTGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCAGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTGCGGCTGCGGTACTTCGATGTGTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGTCTAGCGCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACCACAACCCCTGCCCCTAGACCTCCTACCCCAGCCCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAGGCTTCTAGACCAGCTGCTGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGACTGGACAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTACAGCCTGCTCGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGTCTAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGAAGGCCAGGCCCCACCCGGAAGCACTATCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCCAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAAGAGGACGGCTGTAGCTGCCGGTTCCCCGAGGAAGAAGAAGGGGGCTGCGAGCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGAAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGGCGGAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGATGAAATTCATCGACGTTAACTATTCTAG
CART4双重核酸序列(SEQ ID NO:29)
GGTGTCGTGAGCGGCCGCTGAACTGGCCACCATGTGGCTGCAGTCTCTGCTGCTGCTGGGCACCGTGGCCTGCAGCATCAGCATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGATAGAGTGACCATCAGCTGCAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCCTCTAGATTTTCCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACAGGAAGATATCGCTACCTACTTCTGTCAGCAAGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCGGCAGCACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGCTCTACCAAGGGCCTGCAGGAATCTGGCCCTGGACTGGTGGCCCCTAGCCAGAGCCTGTCTGTGACCTGTACCGTGTCCGGCGTGTCCCTGCCTGACTATGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCCCCCAGAAAGGGCCTGGAATGGCTGGGAGTGATCTGGGGCAGCGAGACAACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACAAGCGTGACCGTGTCTGCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACCACAACCCCTGCCCCTAGACCTCCTACCCCAGCCCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAGGCTTCTAGACCAGCTGCTGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGACTGGACAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCGTGAAGTTCAGCCGCAGCGCCGATGCCCCTGCCTATCAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGAAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAACGGCGGAGAGGCAAGGGCCACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCTCTGCCCCCTCGCTGAAATTCATCGACGTTAACTATTCTAG
CART5双重核酸序列(SEQ ID NO:30)
GGTGTCGTGAGCGGCCGCTGAACTGGCCACCATGTGGCTGCAGTCTCTGCTGCTGCTGGGCACCGTGGCCTGTAGCATCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGGCTCTCTGGCTGTGTCTCCTGGCGAGCGCGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCTCCCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGATCCCCGGCCAGAGCCCCAGACTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGCGTGCAGCCCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCCGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGGGCAGCACAAGCGGCAGCGGAAAGCCTGGATCTGGCGAGGGCTCTACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGCGCCGAAGTCGTGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCACTGGATCAAGCAGACCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGGTGGGAGTGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCAGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTGCGGCTGCGGTACTTCGATGTGTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGTCTAGCGCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACCACAACCCCTGCCCCTAGACCTCCTACCCCAGCCCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAGGCTTCTAGACCAGCTGCTGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGACTGGACAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTACAGCCTGCTCGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGTCTAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGAAGGCCAGGCCCCACCCGGAAGCACTATCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGAAGCTGAAATTCATCGACGTTAACTATTCTAG
CART6核酸序列(SEQ ID NO:31)
GGTGTCGTGAGCGGCCGCTGAACTGGCCACCATGTGGCTGCAGTCTCTGCTGCTGCTGGGCACCGTGGCCTGCAGCATCAGCATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGATAGAGTGACCATCAGCTGCAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCCTCTAGATTTTCCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACAGGAAGATATCGCTACCTACTTCTGTCAGCAAGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCGGCAGCACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGCTCTACCAAGGGCCTGCAGGAATCTGGCCCTGGACTGGTGGCCCCTAGCCAGAGCCTGTCTGTGACCTGTACCGTGTCCGGCGTGTCCCTGCCTGACTATGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCCCCCAGAAAGGGCCTGGAATGGCTGGGAGTGATCTGGGGCAGCGAGACAACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACAAGCGTGACCGTGTCTGCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACCACAACCCCTGCCCCTAGACCTCCTACCCCAGCCCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAGGCTTCTAGACCAGCTGCTGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGACTGGACAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCAGGCCCCACCCGGAAACACTATCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGAAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAACGGCGGAGAGGCAAGGGCCACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCTCTGCCCCCTCGCTGAAATTCATCGACGTTAACTATTCTAG
CART7核酸序列(SEQ ID NO:32)
GGTGTCGTGAGCGGCCGCTGAACTGGCCACCATGTGGCTGCAGTCTCTGCTGCTGCTGGGCACCGTGGCCTGTAGCATCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGGCTCTCTGGCTGTGTCTCCTGGCGAGCGCGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCTCCCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGATCCCCGGCCAGAGCCCCAGACTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGCGTGCAGCCCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCCGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGGGCAGCACAAGCGGCAGCGGAAAGCCTGGATCTGGCGAGGGCTCTACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGCGCCGAAGTCGTGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCACTGGATCAAGCAGACCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGGTGGGAGTGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCAGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTGCGGCTGCGGTACTTCGATGTGTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGTCCAGCATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTTCCTGGCCCTAGCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTACAGCCTGCTCGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGTCTAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGAAGGCCAGGCCCCACCCGGAAGCACTATCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGATGAAATTCATCGACGTTAACTATTCTAG
此外，除在AML患者中靶向CD33的嵌合受体以外，本文还考虑了表达靶向EMR2的嵌合受体的免疫细胞。这可以通过两种不同的方法来实现：1)分别产生表达抗CD33嵌合受体的免疫细胞和表达抗EMR2嵌合受体的免疫细胞，并分别向患者输注这两种类型的免疫细胞；或2)产生同时靶向CD33和EMR2的免疫细胞(Kakarla等人,Cancer(2014)2:151)。
本文所述的任何嵌合受体均可通过常规方法(如重组技术)制备。用于制备本文的嵌合受体的方法包括产生编码多肽的核酸，所述多肽包含嵌合受体的每个结构域，包括抗原结合片段和任选的铰链结构域、跨膜结构域、至少一个共刺激信号传导结构域和细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，使用重组技术将编码嵌合受体的每种组分的核酸连接在一起。
嵌合受体的每种组分的序列可通过常规技术(例如，PCR扩增)从本领域已知的多种来源中的任一种获得。在一些实施方案中，嵌合受体的一种或多种组分的序列获自人细胞。或者，可合成嵌合受体的一种或多种组分的序列。可使用如PCR扩增或连接的方法直接或间接地(例如，使用编码肽接头的核酸序列)连接每种组分(例如，结构域)的序列以形成编码嵌合受体的核酸序列。或者，可合成编码嵌合受体的核酸。在一些实施方案中，核酸是DNA。在其他实施方案中，核酸是RNA。
在连接每种组分的序列之前或之后，嵌合受体的一种或多种组分(例如，抗原结合片段等)内的一个或多个残基的突变。在一些实施方案中，可在嵌合受体的组分中进行一个或多个突变以调节(增加或降低)所述组分对靶标(例如，靶抗原的抗原结合片段)的亲和力和/或调节所述组分的活性。
可通过常规技术将本文所述的任何嵌合受体引入合适的免疫细胞中以表达。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，如原代T细胞或T细胞系。或者，免疫细胞可以是NK细胞，如已建立的NK细胞系(例如，NK-92细胞)。在一些实施方案中，免疫细胞是表达CD8(CD8+)或CD8和CD4(CD8+/CD4+)的T细胞。在一些实施方案中，T细胞是已建立的T细胞系的T细胞，例如293T细胞或Jurkat细胞。
原代T细胞可从任何来源，如外周血单核细胞(PBMC)、骨髓、组织(如脾脏、淋巴结、胸腺或肿瘤组织)获得。适用于获得所需类型的免疫细胞的来源对于本领域技术人员来说将是显而易见的。在一些实施方案中，免疫细胞群体源自患有造血系统恶性肿瘤的人患者，如源自从患者获得的骨髓或PBMC。在一些实施方案中，免疫细胞群体源自健康供体。在一些实施方案中，免疫细胞获自随后将向其施用表达嵌合受体的免疫细胞的受试者。向从其获得细胞的同一受试者施用的免疫细胞被称为自体细胞，而从不是将向其施用细胞的受试者的受试者获得的免疫细胞被称为同种异体细胞。
所需宿主细胞的类型可在通过将细胞与刺激性分子共同孵育而获得的细胞群体中扩增，例如，抗CD3和抗CD28抗体可用于扩增T细胞。
为了构建表达本文所述的任何嵌合受体构建体的免疫细胞，可通过如本文所述的常规方法构建用于稳定或瞬时表达所述嵌合受体构建体的表达载体并将其引入免疫宿主细胞中。例如，可将编码嵌合受体的核酸克隆到合适的表达载体中，如与合适的启动子可操作连接的病毒载体中。可在合适的条件下使核酸和载体与限制性酶接触以在每个分子上产生互补末端，所述互补末端可彼此配对并用连接酶连接。或者，合成核酸接头可连接至编码嵌合受体的核酸的末端。合成接头可含有对应于载体中的特定限制性位点的核酸序列。表达载体/质粒/病毒载体的选择将取决于用于表达嵌合受体的宿主细胞的类型，但应适合在真核细胞中整合和复制。
多种启动子可用于表达本文所述的嵌合受体，包括但不限于巨细胞病毒(CMV)中早期启动子、病毒LTR(如劳斯肉瘤病毒LTR、HIV-LTR、HTLV-1LTR、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)LTR、骨髓增殖性肉瘤病毒(MPSV)LTR、脾病灶形成病毒(SFFV)LTR)、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、单纯疱疹tk病毒启动子、有或无EF1-α内含子的延伸因子1-α(EF1-α)启动子。用于表达嵌合受体的另外启动子包括免疫细胞中的任何组成型活性启动子。或者，可使用任何可调控的启动子，以使得可在免疫细胞内调节其表达。
此外，载体可含有例如以下中的一些或全部：选择性标记基因，如用于选择宿主细胞中的稳定或瞬时转染子的新霉素基因；用于高水平转录的来自人CMV立即早期基因的增强子/启动子序列；用于mRNA稳定性的来自SV40的转录终止和RNA加工信号；用于mRNA稳定性和翻译效率的来自如α-珠蛋白或β-珠蛋白的高表达基因的5'和3'非翻译区；用于正确游离复制的SV40多瘤复制起点和ColE1；内部核糖体结合位点(IRES)，多功能多克隆位点；用于有义和反义RNA的体外转录的T7和SP6RNA启动子；在触发时导致携带载体的细胞死亡的“自杀开关”或“自杀基因”(例如，HSV胸苷激酶、诱导型半胱天冬酶如iCasp9)，以及用于评估嵌合受体表达的报告基因。合适的载体和用于产生含有转基因的载体的方法是本领域众所周知的和可获得的。制备用于表达嵌合受体的载体的实例可见于例如US2014/0106449，其以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，嵌合受体构建体或编码所述嵌合受体的核酸是DNA分子。在一些实施方案中，嵌合受体构建体或编码所述嵌合受体的核酸是DNA载体并且可电穿孔至免疫细胞(参见例如，Till等人,Blood(2012)119(17):3940-3950)。在一些实施方案中，编码嵌合受体的核酸是RNA分子，其可被电穿孔至免疫细胞。
包含编码本文所述的嵌合受体构建体的核酸序列的任何载体也在本公开的范围内。这种载体可通过合适的方法递送至宿主细胞如宿主免疫细胞中。将载体递送至免疫细胞的方法是本领域众所周知的并且可包括DNA、RNA或转座子电穿孔、转染试剂如脂质体或纳米颗粒以递送DNA、RNA或转座子；通过机械变形递送DNA、RNA或转座子或蛋白质(参见例如，Sharei等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2013)110(6):2082-2087)；或病毒转导。在一些实施方案中，用于表达嵌合受体的载体通过病毒转导递送至宿主细胞。用于递送的示例性病毒方法包括但不限于重组逆转录病毒(参见例如，PCT公布第WO 90/07936号；第WO 94/03622号；第WO 93/25698号；第WO 93/25234号；第WO 93/11230号；第WO 93/10218号；第WO91/02805号；美国专利第5,219,740号和第4,777,127号；GB专利第2,200,651号；和EP专利第0 345 242号)、基于甲病毒的载体和腺相关病毒(AAV)载体(参见例如，PCT公布第WO 94/12649号；第WO 93/03769号；第WO 93/19191号；第WO 94/28938号；第WO 95/11984号和第WO95/00655号)。在一些实施方案中，用于表达嵌合受体的载体是逆转录病毒。在一些实施方案中，用于表达嵌合受体的载体是慢病毒。在一些实施方案中，用于表达嵌合受体的载体是腺相关病毒。
在使用病毒载体将编码嵌合受体的载体引入宿主细胞的实例中，能够感染免疫细胞并携带载体的病毒颗粒可通过本领域已知的任何方法产生并且可例如在PCT申请第WO1991/002805A2号、第WO 1998/009271A1号和美国专利6,194,191中找到。病毒颗粒从细胞培养物上清液中收获并且可在使所述病毒颗粒与免疫细胞接触之前分离和/或纯化。
制备表达本文所述的任何嵌合受体的宿主细胞的方法可包括离体活化和/或扩增免疫细胞。活化宿主细胞是指刺激宿主细胞进入活化状态，在该状态中细胞可能能够执行效应子功能(例如，细胞毒性)。活化宿主细胞的方法将取决于用于表达嵌合受体的宿主细胞的类型。扩增宿主细胞可涉及使得表达嵌合受体的细胞数量增加的任何方法，例如，允许宿主细胞增殖或刺激所述宿主细胞增殖。用于刺激宿主细胞扩增的方法将取决于用于表达嵌合受体的宿主细胞的类型，并且对本领域技术人员来说将是显而易见的。在一些实施方案中，表达本文所述的任何嵌合受体的宿主细胞在施用于受试者之前离体活化和/或扩增。
在一些实施方案中，靶向一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的剂是抗体-药物缀合物(ADC)。对本领域普通技术人员来说显而易见的是，术语“抗体-药物缀合物”可与“免疫毒素”互换使用，并且是指包含与毒素或药物分子缀合的抗体(或其抗原结合片段)的融合分子。抗体与相应抗原的结合允许将毒素或药物分子递送至在其细胞表面上呈递所述抗原的细胞(例如，靶细胞)，从而导致靶细胞死亡。
在一些实施方案中，所述剂是抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，抗体-药物缀合物包含抗原结合片段和在靶细胞中诱导细胞毒性的毒素或药物。在一些实施方案中，抗体-药物缀合物靶向2型抗原。在一些实施方案中，抗体-药物缀合物靶向CD33或EMR2。
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物的抗原结合片段具有与由SEQ ID NO:5提供的重链可变区相同的重链CDR和与由SEQ ID NO:5提供的轻链可变区相同的轻链CDR。在一些实施方案中，抗体-药物缀合物的抗原结合片段具有由SEQ ID NO:7提供的重链可变区和由SEQ ID NO:7提供的相同轻链可变区。
适用于抗体-药物缀合物中的毒素或药物是本领域众所周知的，并且对本领域普通技术人员来说将是显而易见的。参见例如，Peters等人,Biosci.Rep.(2015)35(4):e00225；Beck等人,Nature Reviews Drug Discovery(2017)16:315-337；Marin-Acevedo等人,J.Hematol.Oncol.(2018)11:8；Elgundi等人,Advanced DrugDelivery Reviews(2017)122:2-19。
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物还可包含连接抗体和药物分子的接头(例如，肽接头，如可裂解接头)。抗体-药物缀合物的实例包括但不限于贝伦妥单抗维多汀、格列姆巴妥木单抗维多汀/CDX-011、达妥昔单抗马佛多汀/ABT-414、PSMA ADC、泊拉妥珠单抗维多汀/RG7596/DCDS4501A、地宁妥珠单抗马佛多汀/SGN-CD19A、AGS-16C3F、CDX-014、RG7841/DLYE5953A、RG7882/DMUC406A、RG7986/DCDS0780A、SGN-LIV1A、恩弗妥单抗维多汀/ASG-22ME、AG-15ME、AGS67E、特立妥珠单抗维多汀/ABBV-399、ABBV-221、ABBV-085、GSK-2857916、替索妥单抗维多汀/HuMax-TF-ADC、HuMax-Axl-ADC、皮那妥珠单抗维多汀/RG7593/DCDT2980S、利法妥珠单抗维多汀/RG7599/DNIB0600A、英度妥单抗维多汀/MLN-0264/TAK-264、万多妥珠单抗维多汀/RG7450/DSTP3086S、索非妥珠单抗维多汀/RG7458/DMUC5754A、RG7600/DMOT4039A、RG7336/DEDN6526A、ME1547、PF-06263507/ADC 5T4、曲妥珠单抗恩他新/T-DM1、米妥昔单抗索他新/IMGN853、科鲁昔单抗拉夫坦辛/SAR3419、那妥昔单抗恩他新/IMGN529、英达西单抗拉夫坦辛/BT-062、阿奈妥单抗拉夫坦辛/BAY 94–9343、SAR408701、SAR428926、AMG 224、PCA062、HKT288、LY3076226、SAR566658、洛伏珠单抗默坦辛/IMGN901、坎妥珠单抗默坦辛/SB-408075、坎妥珠单抗拉夫坦辛/IMGN242、拉普利妥昔单抗恩他新/IMGN289、IMGN388、比伐珠单抗默坦辛、AVE9633、BIIB015、MLN2704、AMG 172、AMG595、LOP 628、伐达妥昔单抗他立林/SGN-CD33A、SGN-CD70A、SGN-CD19B、SGN-CD123A、SGN-CD352A、伐妥珠单抗特司林/SC16LD6.5、SC-002、SC-003、ADCT-301/HuMax-TAC-PBD、ADCT-402、MEDI3726/ADC-401、IMGN779、IMGN632、吉妥珠单抗奥佐米星、依托珠单抗奥佐米星/CMC-544、PF-06647263、CMD-193、CMB-401、曲妥珠单抗duocarmazine/SYD985、BMS-936561/MDX-1203、沙西妥珠单抗戈维替康/IMMU-132、拉贝妥珠单抗戈维替康/IMMU-130、DS-8201a、U3-1402、米拉妥珠单抗阿霉素/IMMU-110/hLL1-DOX、BMS-986148、RC48-ADC/赫妥珠单抗-vc–MMAE、PF-06647020、PF-06650808、PF-06664178/RN927C、鲁帕妥单抗阿多汀/BAY1129980、阿普卢妥单抗伊多汀/BAY1187982、ARX788、AGS62P1、XMT-1522、AbGn-107、MEDI4276、DSTA4637S/RG7861。在一个实例中，抗体-药物缀合物是吉妥珠单抗奥佐米星。
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物与谱系特异性细胞表面蛋白的表位的结合诱导抗体-药物缀合物的内化，并且药物(或毒素)可在细胞内释放。在一些实施方案中，抗体-药物缀合物与谱系特异性细胞表面蛋白的表位的结合诱导毒素或药物的内化，其允许毒素或药物杀死表达谱系特异性蛋白的细胞(靶细胞)。在一些实施方案中，抗体-药物缀合物与谱系特异性细胞表面蛋白的表位的结合诱导毒素或药物的内化，其可调控表达谱系特异性蛋白的细胞(靶细胞)的活性。在本文所述的抗体-药物缀合物中使用的毒素或药物的类型不限于任何特定类型。
本文所述的ADC可用作对已经历如本文所述的组合疗法的受试者的后续治疗。
缺乏一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的造血细胞
本公开还提供了造血细胞，如造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞(HPC)，它们已被基因修饰为缺乏谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)。在一些实施方案中，造血细胞如造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞(HPC)已被基因修饰为缺乏谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)和至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原(例如，EMR2)。
在一些实施方案中，基于CRISPR的碱基编辑器系统已被用于对细胞进行基因修饰并减少不合需要的脱靶效应以及削弱免疫抑制副作用。在一些实施方案中，一个基于CRISPR的碱基编辑器系统用于将细胞修饰为缺乏谱系特异性细胞表面抗原，并且第二个基于CRISPR的碱基编辑器系统用于将细胞修饰为缺乏至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原。本文展示了成功使用基于CRISPR的碱基编辑器系统将细胞修饰为缺乏超过一种谱系特异性细胞表面抗原。在一些实施方案中，可使用多个基于CRISPR的碱基编辑器系统使同一细胞中的超过一种另外的谱系特异性细胞表面抗原缺失或抑制。
本文展示了基于CRISPR的碱基编辑器系统的使用，所述基于CRISPR的碱基编辑器系统引起编码所述谱系特异性细胞表面抗原的内源性基因中的特定核苷酸取代。在一些实施方案中，所述核苷酸取代在编码剪接元件的序列内，其中所述核苷酸取代引起由所述基因编码的转录物的可变剪接。在一些实施方案中，所述基于CRISPR的碱基编辑器系统靶向内源性基因中的剪接元件，其中所述基于CRISPR的碱基编辑器系统引起由所述基因编码的转录物的可变剪接。在一些实施方案中，所述可变剪接导致编码表位的外显子被跳过。在一些实施方案中，所述可变剪接导致编码表位的外显子被延伸。在一些实施方案中，所述可变剪接诱导早期密码子终止。在一些实施方案中，所述剪接元件是剪接供体、剪接受体、剪接增强子或剪接受体。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“C”到“T”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“G”到“A”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“A”到“G”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“T”到“C”。在一些实施方案中，所述表位被治疗剂或免疫治疗剂靶向。
本文所述的基于CRISPR的碱基编辑器系统包含与DNA修饰酶融合的催化受损的Cas蛋白(即，与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的Cas9切口酶)和单指导RNA。每一基于CRISPR的碱基编辑器复合物可结合至谱系特异性抗原多核苷酸并允许取代一个或多个核苷酸，从而修饰所述多核苷酸。可以使用不止一个基于CRISPR的碱基编辑器系统来修饰不止一种谱系特异性细胞表面抗原。
在一些实施方案中，所述基于CRISPR的碱基编辑器系统包含与胞嘧啶碱基编辑器融合的Cas切口酶。在一些实施方案中，所述基于CRISPR的碱基编辑器是胞嘧啶碱基编辑器。在一些实施方案中，所述胞嘧啶碱基编辑器是BE4max。在一些实施方案中，所述基于CRISPR的碱基编辑器系统靶向CD33，并且所述gRNA选自由SEQ ID NO:1和2组成的组。
在一些实施方案中，所述基于CRISPR的碱基编辑器是腺苷碱基编辑器。在一些实施方案中，所述胞嘧啶碱基编辑器是ABE8e。在一些实施方案中，所述基于CRISPR的碱基编辑器系统靶向CD33，并且所述gRNA是SEQ ID NO:3。
在一些实施方案中，CD33的外显子2的剪接受体或外显子剪接增强子位点发生改变。在一些实施方案中，CD33的内含子1/外显子2接点的核苷酸序列发生改变。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“C”到“T”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“G”到“A”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“A”到“G”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“T”到“C”。在一些实施方案中，所述gRNA序列与编码CD33的核苷酸序列的一部分杂交。在一些实施方案中，所述gRNA序列靶向编码CD33的核苷酸序列的外显子2中的剪接受体或外显子剪接增强子位点。在一些实施方案中，所述gRNA序列靶向CD33的SNP，rs12459419。在一些实施方案中，所述gRNA序列靶向CD33的内含子1/外显子2接点。在一些实施方案中，所述gRNA序列靶向包含SEQ ID NO:37的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述基于CRISPR的碱基编辑器是腺苷碱基编辑器。在一些实施方案中，所述胞嘧啶碱基编辑器是ABE8e。在一些实施方案中，所述基于CRISPR的碱基编辑器系统靶向EMR2，并且所述gRNA是SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，所述基于CRISPR的碱基编辑器系统靶向EMR2，并且所述gRNA是SEQ ID NO:46。在一些实施方案中，所述基于CRISPR的碱基编辑器系统靶向EMR2，并且所述gRNA是SEQ ID NO:47。
在一些实施方案中，EMR2的外显子13中的剪接供体位点发生改变。在一些实施方案中，EMR2的内含子12/外显子13接点的核苷酸序列发生改变。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“C”到“T”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“G”到“A”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“A”到“G”。在一些实施方案中，所述核苷酸取代是“T”到“C”。在一些实施方案中，所述gRNA序列与编码EMR2的核苷酸序列的一部分杂交。在一些实施方案中，所述gRNA序列靶向编码EMR2的核苷酸序列的外显子13中的剪接供体位点。在一些实施方案中，所述gRNA序列靶向EMR2的内含子12/外显子13接点。在一些实施方案中，所述gRNA序列靶向包含SEQ ID NO:40的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所有前述基于CRISPR的碱基编辑器系统可在基于核糖核蛋白(RNP)的递送系统中包含碱基编辑器蛋白和gRNA。
在一些实施方案中，造血细胞是HSC、HPC或它们的组合，在本文中称为“HSPC”(“造血干细胞和/或祖细胞”)。在一些实施方案中，本文所述的细胞群体包含多个造血干细胞；在一些实施方案中，本文所述的细胞群体包含多个造血祖细胞；并且在一些实施方案中，本文所述的细胞群体包含多个造血干细胞和多个造血祖细胞。HSC能够产生骨髓和淋巴祖细胞，所述骨髓和淋巴祖细胞分别进一步产生骨髓细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、红细胞、血小板等)和淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞、NK细胞)。HSC的特征在于表达细胞表面标志物CD34(例如，CD34+)，其可用于鉴定和/或分离HSC；以及不存在与定型至细胞谱系相关的细胞表面标志物。因此，在一些实施方案中，HSC为CD34+。
在一些实施方案中，HSC获自受试者，如哺乳动物受试者。在一些实施方案中，哺乳动物受试者是非人灵长类动物、啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)、牛、猪、马或家养动物。在一些实施方案中，HSC获自人患者，如患有造血系统恶性肿瘤的人患者。在一些实施方案中，HSC获自健康供体。在一些实施方案中，HSC获自随后将向其施用表达嵌合受体的免疫细胞的受试者。向从其获得细胞的同一受试者施用的HSC被称为自体细胞，而从不是将向其施用细胞的受试者的受试者获得的HSC被称为同种异体细胞。
HSC可使用本领域已知的常规方法从任何合适的来源获得。在一些实施方案中，HSC从来自受试者的样本(如骨髓样本或血液样本)获得。或者或此外，HSC可从脐带获得。在一些实施方案中，HSC来自骨髓或外周血单核细胞(PBMC)。一般而言，骨髓细胞可从受试者的髂嵴、股骨、胫骨、脊柱、肋骨或其他骨髓腔获得。可从患者体内取出骨髓并通过本领域已知的各种分离和洗涤程序进行分离。用于分离骨髓细胞的示例性程序包括以下步骤：a)提取骨髓样本；b)将骨髓悬浮液离心分离成三种级分并收集中间级分或血沉棕黄层；c)将来自步骤(b)的血沉棕黄层级分在分离液(通常为Ficoll(TM))中再离心一次，并收集含有骨髓细胞的中间级分；以及d)洗涤来自步骤(c)的收集级分以回收可重新输注的骨髓细胞。
HSC通常驻留于骨髓中，但可通过施用动员剂将其动员至循环血液中，以便从外周血中收获HSC。在一些实施方案中，向从其获得HSC的受试者施用动员剂，如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。使用动员剂动员后收集的HSC的数量通常大于未使用动员剂的情况下获得的细胞的数量。在一些实施方案中，HSC是外周血HSC。
在一些实施方案中，从受试者获得样本，然后富集所需细胞类型。例如，可如本文所述从血液中分离PBMC和/或CD34+造血细胞。也可从其他细胞中分离细胞，例如通过分离和/或用与所需细胞类型的细胞表面上的表位结合的抗体活化。可使用的另一种方法包括使用针对细胞表面标志物的抗体进行负选择，以选择性地富集特定细胞类型，而无需通过受体接合活化细胞。
可在对HSC群体进行基因工程化以使其缺乏谱系特异性细胞表面抗原之前或之后扩增所述HSC。可在包含扩增培养基的条件下培养细胞，所述扩增培养基包含一种或多种细胞因子，如干细胞因子(SCF)、Flt-3配体(Flt3L)、促血小板生成素(TPO)、白细胞介素3(IL-3)或白细胞介素6(IL-6)。可使细胞扩增约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25天或任何必要的范围。在一些实施方案中，在从受试者获得的样本分离所需细胞群体(例如，CD34+/CD33-)之后并且在基因工程化之前扩增HSC。在一些实施方案中，在基因工程化后扩增HSC，从而选择性地扩增已经历基因修饰并且缺乏谱系特异性细胞表面抗原的细胞。在一些实施方案中，可选择并独立地扩增在基因修饰后具有所需特征(例如，表型或基因型)的细胞(“克隆”)或数个细胞。
在一些实施方案中，造血细胞被基因工程化为缺乏(例如，不表达)细胞表面谱系特异性抗原(例如，CD33)。在一些实施方案中，造血细胞被基因工程化为缺乏(例如，不表达)谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)和至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原。在一些实施方案中，造血细胞被基因工程化为缺乏所述一种或多种剂所靶向的一种或多种相同谱系特异性细胞表面抗原。如本文所用，如果与同基因工程化的造血细胞(例如，特征在于存在相同的细胞表面标志物，如CD34)相同类型的天然存在的造血细胞相比，造血细胞的一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的表达显著减少，则认为造血细胞缺乏所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原。在一些实施方案中，造血细胞没有可检测的一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的表达(例如，不表达所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原)。谱系特异性细胞表面抗原的表达水平可通过本领域已知的任何方式进行评估。例如，谱系特异性细胞表面抗原的表达水平可通过用抗原特异性抗体检测抗原来评估(例如，流式细胞术方法、蛋白质印迹法)。
在一些实施方案中，将基因工程化造血细胞上的一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的表达与天然存在的造血细胞(例如，野生型对应物)上的一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的表达进行比较。在一些实施方案中，基因工程化导致所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的表达水平与天然存在的造血细胞上的一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的表达相比降低至少约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。也就是说，在一些实施方案中，与天然存在的造血细胞(例如，野生型对应物)相比，基因工程化造血细胞表达少于约20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)。
在一些实施方案中，基因工程化导致一种或多种野生型谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)的表达水平与天然存在的造血细胞上的一种或多种野生型谱系特异性细胞表面抗原的表达水平相比降低至少约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。也就是说，在一些实施方案中，与天然存在的造血细胞(例如，野生型对应物)相比，基因工程化造血细胞表达少于约20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的一种或多种野生型谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)。
在一些实施方案中，造血细胞缺乏编码所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的整个内源性基因。在一些实施方案中，编码所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的整个内源性基因已缺失。在一些实施方案中，造血细胞包含编码所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的内源性基因的一部分。在一些实施方案中，造血细胞表达所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的一部分(例如，截短的蛋白质)。在其他实施方案中，编码所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的内源性基因的一部分已缺失。在一些实施方案中，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多的编码所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的基因已缺失。
在一些实施方案中，将由基因工程化造血细胞上的所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的外显子编码的表位的表达与天然存在的造血细胞(例如，野生型对应物)上的所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的表位的表达进行比较。在一些实施方案中，基因工程化导致所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的表位的表达水平与天然存在的造血细胞上的所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的表位的表达相比降低至少约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。也就是说，在一些实施方案中，与天然存在的造血细胞(例如，野生型对应物)相比，基因工程化造血细胞表达少于约20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)的表位。
在一些实施方案中，在由内源性基因的外显子编码的表位中进行一个或多个核苷酸的取代。
如本领域普通技术人员将理解的，编码所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的核苷酸序列的一部分可缺失或可以是一个或多个非编码序列，以使得造血细胞缺乏所述一种或多种抗原(例如，所述一种或多种抗原的表达显著减少)。
在一些实施方案中，所述谱系特异性细胞表面抗原是CD33。CD33的预测结构包括两个免疫球蛋白结构域，IgV结构域和IgC2结构域。在一些实施方案中，CD33的外显子2缺失。在一些实施方案中，内源性CD33基因的外显子2中改变的剪接受体或外显子剪接增强子发生改变，并且所述改变导致由CD33的外显子2编码的表位的表达水平与野生型对应细胞相比降低。
在一些实施方案中，所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原是EMR2。在一些实施方案中，EMR2的外显子13缺失。在一些实施方案中，内源性EMR2基因的外显子13中改变的剪接供体发生改变，并且所述改变导致由EMR2的外显子13编码的表位的表达水平与野生型对应细胞相比降低。在一些实施方案中，与野生型对应细胞相比，可变剪接诱导早期密码子终止和突变或截短的EMR2的产生。
一种或多种细胞表面谱系特异性抗原缺乏或发生改变的任何基因工程化造血细胞如HSC可通过常规方法或通过本文所述的方法来制备。在一些实施方案中，使用基因组编辑进行基因工程化。如本文所用，“基因组编辑”是指修饰生物体的基因组(包括任何蛋白质编码或非编码核苷酸序列)以敲除靶基因的表达的方法。
在本公开的一个方面，使用其中谱系特异性抗原被修饰的正常细胞进行用修饰的正常细胞群体替代肿瘤细胞。这种修饰可包括使用基于成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)的碱基编辑器系统耗尽或抑制任何谱系特异性抗原。
CRISPR-Cas系统已成功用于编辑各种生物体(包括但不限于细菌、人、果蝇、斑马鱼和植物)的基因组。参见例如，Jiang等人,Nature Biotechnology(2013)31(3):233；Qi等人,Cell(2013)5:1173；DiCarlo等人,Nucleic Acids Res.(2013)7:4336；Hwang等人,Nat.Biotechnol(2013),3:227)；Gratz等人,Genetics(2013)194:1029；Cong等人,Science(2013)6121:819；Mali等人,Science(2013)6121:823；Cho等人Nat.Biotechnol(2013)3:230；以及Jiang等人,Nucleic Acids Research(2013)41(20):el88。
本公开利用与谱系特异性抗原多核苷酸中的靶序列杂交的基于CRISPR的碱基编辑器系统，其中所述基于CRISPR的碱基编辑器系统包含与DNA修饰酶融合的催化受损的Cas蛋白(即，与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的Cas9切口酶)和单指导RNA。所述基于CRISPR的碱基编辑器复合物可结合至谱系特异性抗原多核苷酸并允许取代一个或多个核苷酸，从而修饰所述多核苷酸。
本公开的基于CRISPR的碱基编辑器系统可结合至和/或裂解细胞表面谱系特异性抗原内的以下目标区：在编码区或非编码区中，在基因内或在基因附近，例如，前导序列、尾随序列或内含子，或在编码区上游或下游的非转录区内。本公开中使用的指导RNA(gRNA)可被设计为使得gRNA引导碱基编辑器蛋白-gRNA复合物与基因组中的预定裂解位点(靶位点)的结合。可选择裂解位点以释放含有未知序列的区域或含有SNP、核苷酸插入、核苷酸缺失、重排等的区域的片段。
本公开中使用的指导RNA(gRNA)可被设计为使得gRNA引导碱基编辑器蛋白-gRNA复合物与基因组中的预定靶位点的结合。靶位点可以是含有SNP、核苷酸插入、核苷酸缺失、重排等的区域。
术语“gRNA”、“指导RNA”和“CRISPR指导序列”可在全文中互换使用，并且是指包含确定基于CRISPR的碱基编辑器系统的碱基编辑器蛋白的特异性的序列的核酸。gRNA与宿主细胞的基因组中的靶核酸序列(互补、部分或完全)杂交。与靶核酸杂交的gRNA或其部分的长度可介于15-25个核苷酸、18-22个核苷酸或19-21个核苷酸之间。在一些实施方案中，与靶核酸杂交的gRNA序列的长度是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施方案中，与靶核酸杂交的gRNA序列的长度介于10-30个或15-25个核苷酸之间。
除结合至靶核酸的序列以外，在一些实施方案中，gRNA还包含支架序列。编码与靶核酸互补的序列和支架序列的gRNA的表达具有与靶核酸结合(杂交)和将核酸内切酶募集至靶核酸的双重功能，这可产生位点特异性CRISPR活性。在一些实施方案中，这种嵌合gRNA可被称为单指导RNA(sgRNA)。
在一些实施方案中，对gRNA进行修饰，例如进行化学修饰。修饰的gRNA包含至少一个核苷酸，所述核苷酸具有对以下中的至少一者的化学结构的修饰：核碱基、糖和磷酸二酯键联或主链部分(例如，核苷酸磷酸)。示例性gRNA修饰对本领域技术人员来说将是显而易见的，并且可在例如Lee等人,Elife(2017)5月2日；6和美国公布2016/0289675中找到。另外合适的修饰包括硫代磷酸酯主链修饰、2'-O-Me修饰的糖、2’F修饰的糖、用双环核苷酸-cEt替代核糖、3'硫代PACE(MSP)或它们的任何组合。合适的gRNA修饰描述于例如Rahdar等人PNAS(2015)112(51):E7110-E7117以及Hendel等人,Nat Biotechnol.(2015Sep)33(9):985–989，所述文献各自以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，对本文所述的gRNA进行化学修饰。例如，gRNA可包含一个或多个2’-O修饰的核苷酸，例如2’-O-甲基核苷酸。在一些实施方案中，gRNA在gRNA的5’端包含2’-O修饰的核苷酸，例如2’-O-甲基核苷酸。在一些实施方案中，gRNA在gRNA的3’端包含2’-O修饰的核苷酸，例如2’-O-甲基核苷酸。在一些实施方案中，gRNA在gRNA的5’端和3’端均包含2’-O修饰的核苷酸，例如2’-O-甲基核苷酸。在一些实施方案中，gRNA在gRNA的5’端处的核苷酸、从gRNA的5’端的第二个核苷酸和从gRNA的5’端的第三个核苷酸处是2’-O修饰的，例如2’-O-甲基修饰的。在一些实施方案中，gRNA在gRNA的3’端处的核苷酸、从gRNA的3’端的第二个核苷酸和从gRNA的3’端的第三个核苷酸处是2’-O修饰的，例如2’-O-甲基修饰的。在一些实施方案中，gRNA在gRNA的5’端处的核苷酸、从gRNA的5’端的第二个核苷酸、从gRNA的5’端的第三个核苷酸、gRNA的3’端处的核苷酸、从gRNA的3’端的第二个核苷酸和从gRNA的3’端的第三个核苷酸处是2’-O修饰的，例如2’-O-甲基修饰的。在一些实施方案中，gRNA在从gRNA的3’端的第二个核苷酸、从gRNA的3’端的第三个核苷酸和从gRNA的3’端的第四个核苷酸处是2’-O修饰的，例如2’-O-甲基修饰的。在一些实施方案中，在gRNA的3’端处的核苷酸未进行化学修饰。在一些实施方案中，在gRNA的3’端处的核苷酸不具有化学修饰的糖。在一些实施方案中，gRNA在gRNA的5’端处的核苷酸、从gRNA的5’端的第二个核苷酸、从gRNA的5’端的第三个核苷酸、从gRNA的3’端的第二个核苷酸、从gRNA的3’端的第三个核苷酸和从gRNA的3’端的第四个核苷酸处是2’-O修饰的，例如2’-O-甲基修饰的。在一些实施方案中，2’-O-甲基核苷酸包含与相邻核苷酸的磷酸酯键联。在一些实施方案中，2’-O-甲基核苷酸包含与相邻核苷酸的硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，2’-O-甲基核苷酸包含与相邻核苷酸的硫代PACE键联。
在一些实施方案中，gRNA可包含一个或多个2’-O-修饰的和3’磷修饰的核苷酸，例如2’-O-甲基3’硫代磷酸酯核苷酸。在一些实施方案中，gRNA在gRNA的5’端包含2’-O-修饰的和3’磷修饰的，例如2’-O-甲基3’硫代磷酸酯核苷酸。在一些实施方案中，gRNA在gRNA的3’端包含2’-O-修饰的和3’磷修饰的，例如2’-O-甲基3’硫代磷酸酯核苷酸。在一些实施方案中，gRNA在gRNA的5’端和3’端包含2’-O-修饰的和3’磷修饰的，例如2’-O-甲基3’硫代磷酸酯核苷酸。在一些实施方案中，gRNA包含主链，其中一个或多个非桥接氧原子已被硫原子替代。在一些实施方案中，gRNA在gRNA的5’端处的核苷酸、从gRNA的5’端的第二个核苷酸和从gRNA的5’端的第三个核苷酸处是2’-O-修饰的和3’磷修饰的，例如2’-O-甲基3’硫代磷酸酯修饰的。在一些实施方案中，gRNA在gRNA的3’端处的核苷酸、从gRNA的3’端的第二个核苷酸和从gRNA的3'端的第三个核苷酸处是2’-O-修饰的和3’磷修饰的，例如2’-O-甲基3’硫代磷酸酯修饰的。在一些实施方案中，gRNA在gRNA的5’端处的核苷酸、从gRNA的5’端的第二个核苷酸、从gRNA的5’端的第三个核苷酸、gRNA的3’端处的核苷酸、从gRNA的3’端的第二个核苷酸和从gRNA的3’端的第三个核苷酸处是2’-O-修饰的和3’磷修饰的，例如2’-O-甲基3’硫代磷酸酯修饰的。在一些实施方案中，gRNA在从gRNA的3’端的第二个核苷酸、从gRNA的3’端的第三个核苷酸和从gRNA的3’端的第四个核苷酸处是2’-O-修饰的和3’磷修饰的，例如2’-O-甲基3’硫代磷酸酯修饰的。在一些实施方案中，在gRNA的3’端处的核苷酸未进行化学修饰。在一些实施方案中，在gRNA的3’端处的核苷酸不具有化学修饰的糖。在一些实施方案中，gRNA在gRNA的5’端处的核苷酸、从gRNA的5’端的第二个核苷酸、从gRNA的5’端的第三个核苷酸、从gRNA的3’端的第二个核苷酸、从gRNA的3’端的第三个核苷酸和从gRNA的3’端的第四个核苷酸处是2’-O-修饰的和3’磷修饰的，例如2’-O-甲基3’硫代磷酸酯修饰的。
在一些实施方案中，gRNA可包含一个或多个2’-O-修饰的和3’-磷修饰的，例如2’-O-甲基3’硫代PACE核苷酸。在一些实施方案中，gRNA在gRNA的5’端包含2’-O-修饰的和3’磷修饰的，例如2’-O-甲基3’硫代PACE核苷酸。在一些实施方案中，gRNA在gRNA的3’端包含2’-O-修饰的和3’磷修饰的，例如2’-O-甲基3’硫代PACE核苷酸。在一些实施方案中，gRNA在gRNA的5’端和3’端包含2’-O-修饰的和3’磷修饰的，例如2’-O-甲基3’硫代PACE核苷酸。在一些实施方案中，gRNA包含主链，其中一个或多个非桥接氧原子已被硫原子替代，并且一个或多个非桥接氧原子已被乙酸酯基团替代。在一些实施方案中，gRNA在gRNA的5’端处的核苷酸、从gRNA的5’端的第二个核苷酸和从gRNA的5’端的第三个核苷酸处是2’-O-修饰的和3’磷修饰的，例如2’-O-甲基3’硫代PACE修饰的。在一些实施方案中，gRNA在gRNA的3’端处的核苷酸、从gRNA的3’端的第二个核苷酸和从gRNA的3’端的第三个核苷酸处是2’-O-修饰的和3’磷修饰的，例如2’-O-甲基3’硫代PACE修饰的。在一些实施方案中，gRNA在gRNA的5’端处的核苷酸、从gRNA的5’端的第二个核苷酸、从gRNA的5’端的第三个核苷酸、gRNA的3’端处的核苷酸、从gRNA的3’端的第二个核苷酸和从gRNA的3’端的第三个核苷酸处是2’-O-修饰的和3’磷修饰的，例如2’-O-甲基3’硫代PACE修饰的。在一些实施方案中，gRNA在从gRNA的3’端的第二个核苷酸、从gRNA的3’端的第三个核苷酸和从gRNA的3’端的第四个核苷酸处是2’-O-修饰的和3’磷修饰的，例如2’-O-甲基3’硫代PACE修饰的。在一些实施方案中，在gRNA的3’端处的核苷酸未进行化学修饰。在一些实施方案中，在gRNA的3’端处的核苷酸不具有化学修饰的糖。在一些实施方案中，gRNA在gRNA的5’端处的核苷酸、从gRNA的5’端的第二个核苷酸、从gRNA的5’端的第三个核苷酸、从gRNA的3’端的第二个核苷酸、从gRNA的3’端的第三个核苷酸和从gRNA的3’端的第四个核苷酸处是2’-O-修饰的和3’磷修饰的，例如2’-O-甲基3’硫代PACE修饰的。
在一些实施方案中，gRNA包含化学修饰的主链。在一些实施方案中，gRNA包含硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，一个或多个非桥接氧原子已被硫原子替代。在一些实施方案中，gRNA的5’端处的核苷酸、从gRNA的5’端的第二个核苷酸和从gRNA的5’端的第三个核苷酸各自包含硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，gRNA的3’端处的核苷酸、从gRNA的3’端的第二个核苷酸和从gRNA的3’端的第三个核苷酸各自包含硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，gRNA的5’端处的核苷酸、从gRNA的5’端的第二个核苷酸、从gRNA的5’端的第三个核苷酸、gRNA的3’端处的核苷酸、从gRNA的3’端的第二个核苷酸和从gRNA的3’端的第三个核苷酸各自包含硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，从gRNA的3’端的第二个核苷酸、从gRNA的3’端的第三个核苷酸和从gRNA的3’端的第四个核苷酸各自包含硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，gRNA的5’端处的核苷酸、从gRNA的5’端的第二个核苷酸、从gRNA的5’端的第三个核苷酸、从gRNA的3’端的第二个核苷酸、从gRNA的3’端的第三个核苷酸和从gRNA的3’端的第四个核苷酸各自包含硫代磷酸酯键联。
在一些实施方案中，gRNA包含硫代PACE键联。在一些实施方案中，gRNA包含主链，其中一个或多个非桥接氧原子已被硫原子替代，并且一个或多个非桥接氧原子已被乙酸酯基团替代。在一些实施方案中，gRNA的5’端处的核苷酸、从gRNA的5’端的第二个核苷酸和从gRNA的5’端的第三个核苷酸各自包含硫代PACE键联。在一些实施方案中，gRNA的3’端处的核苷酸、从gRNA的3’端的第二个核苷酸和从gRNA的3’端的第三个核苷酸各自包含硫代PACE键联。在一些实施方案中，gRNA的5’端处的核苷酸、从gRNA的5’端的第二个核苷酸、从gRNA的5’端的第三个核苷酸、gRNA的3’端处的核苷酸、从gRNA的3’端的第二个核苷酸和从gRNA的3’端的第三个核苷酸各自包含硫代PACE键联。在一些实施方案中，从gRNA的3’端的第二个核苷酸、从gRNA的3’端的第三个核苷酸和从gRNA的3’端的第四个核苷酸各自包含硫代PACE键联。在一些实施方案中，gRNA的5’端处的核苷酸、从gRNA的5’端的第二个核苷酸、从gRNA的5’端的第三个核苷酸、从gRNA的3’端的第二个核苷酸、从gRNA的3’端的第三个核苷酸和从gRNA的3’端的第四个核苷酸各自包含硫代PACE键联。
gRNA的化学修饰描述于例如Hendel等人,Nature Biotech.(2015)33(9)中，所述文献以引用的方式整体并入本文。
如本文所用，“支架序列”(也称为tracrRNA)是指将Cas核酸内切酶募集至与互补gRNA序列结合(杂交)的靶核酸的核酸序列。包含至少一个茎环结构并募集核酸内切酶的任何支架序列均可用于本文所述的遗传元件和载体中。示例性支架序列对本领域技术人员来说将是显而易见的，并且可在例如Jinek等人Science(2012)337(6096):816-821；Ran等人.Nature Protocols(2013)8:2281-2308；PCT申请第WO2014/093694号和PCT申请第WO2013/176772号中找到。
在一些实施方案中，gRNA序列不包含支架序列，并且支架序列被表达为单独的转录物。在此类实施方案中，gRNA序列还包含与支架序列的一部分互补并起到结合(杂交)支架序列并将核酸内切酶募集至靶核酸的作用的另外序列。
在一些实施方案中，gRNA序列与靶核酸至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少100％互补(还参见美国专利8,697,359，其关于gRNA序列与靶多核苷酸序列的互补性的教导内容以引用的方式并入)。已经证明，CRISPR指导序列与靶核酸的3’端附近的靶核酸之间的错配可消除核酸酶裂解活性(Upadhyay等人Genes Genome Genetics(2013)3(12):2233-2238)。在一些实施方案中，gRNA序列与靶核酸的3’端(例如，靶核酸的3’端的最后5、6、7、8、9或10个核苷酸)至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少100％互补。
靶核酸在3’侧由原间隔区相邻基序(PAM)侧接，所述原间隔区相邻基序可与核酸内切酶相互作用并且进一步参与将核酸内切酶活性靶向至靶核酸。一般认为靶核酸侧翼的PAM序列取决于核酸内切酶和核酸内切酶所来自的来源。例如，对于源自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9核酸内切酶，PAM序列是NGG。对于源自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Cas9核酸内切酶，PAM序列是NNGRRT。对于源自脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的Cas9核酸内切酶，PAM序列是NNNNGATT。对于源自嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的Cas9核酸内切酶，PAM序列是NNAGAA。对于源自齿垢密螺旋体(Treponema denticola)的Cas9核酸内切酶，PAM序列是NAAAAC。对于Cpf1核酸酶，PAM序列是TTN。
在一些实施方案中，对细胞进行基因工程化还包括将基于CRISPR的碱基编辑器蛋白引入细胞中。在一些实施方案中，基于CRISPR的碱基编辑器和编码gRNA的核酸被提供在同一核酸(例如，载体)上。在一些实施方案中，基于CRISPR的碱基编辑器蛋白和编码gRNA的核酸被提供在不同的核酸(例如，不同的载体)上。或者或此外，基于CRISPR的碱基编辑器可以蛋白质形式提供或引入到细胞中。在一些实施方案中，gRNA以蛋白质形式与基于CRISPR的碱基编辑器复合。
在一些实施方案中，Cas核酸内切酶是Cas9酶或其变体。在一些实施方案中，Cas9核酸内切酶源自酿脓链球菌(SpCas9)、金黄色葡萄球菌(SaCas9)、脑膜炎奈瑟氏菌(NmCas9)、嗜热链球菌、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)(CjCas9)或齿垢密螺旋体。在一些实施方案中，编码Cas核酸内切酶的核苷酸序列可进行密码子优化以在宿主细胞中表达。在一些实施方案中，核酸内切酶是Cas9同系物或直系同源物。在一些实施方案中，对编码Cas9核酸内切酶的核苷酸序列进行进一步修饰以改变蛋白质的活性。在一些实施方案中，已对Cas9核酸内切酶进行修饰以使核酸内切酶的催化残基之一失活，称为“切口酶”或“Cas9n”。Cas9切口酶核酸内切酶裂解靶核酸的一条DNA链。参见例如，Dabrowska等人Frontiers in Neuroscience(2018)12(75)。已经表明，所述酶的RuvC和HNH催化结构域中的一个或多个突变可提高Cas9效率。参见例如，Sarai等人Currently Pharma.Biotechnol.(2017)18(13)。在一些实施方案中，Cas9核酸内切酶是催化失活的Cas9。例如，dCas9包含催化活性残基(D10和H840)的突变，并且不具有核酸酶活性。或者或此外，Cas9核酸内切酶可融合至另一种蛋白质或其部分。在一些实施方案中，dCas9与阻遏物结构域，如KRAB结构域融合。在一些实施方案中，此类dCas9融合蛋白与本文所述的构建体一起用于多重基因阻遏(例如，CRISPR干扰(CRISPRi))。在一些实施方案中，dCas9与活化物结构域，如VP64或VPR融合。在一些实施方案中，此类dCas9融合蛋白与本文所述的构建体一起用于基因活化(例如，CRISPR活化(CRISPRa))。在一些实施方案中，dCas9与表观遗传调节结构域如组蛋白去甲基化酶结构域或组蛋白乙酰转移酶结构域融合。在一些实施方案中，dCas9与LSD1或p300或其一部分融合。在一些实施方案中，dCas9融合用于基于CRISPR的表观遗传调节。在一些实施方案中，dCas9或Cas9与Fok1核酸酶结构域融合。在一些实施方案中，与Fok1核酸酶结构域融合的Cas9或dCas9用于基因组编辑。在一些实施方案中，Cas9或dCas9与荧光蛋白(例如，GFP、RFP、mCherry等)融合。在一些实施方案中，与荧光蛋白融合的Cas9/dCas9蛋白用于基因组基因座的标记和/或可视化或者鉴定表达Cas核酸内切酶的细胞。
在一些实施方案中，对Cas核酸内切酶进行修饰以增强酶的特异性(例如，减少脱靶效应，保持稳健中靶裂解)。在一些实施方案中，Cas核酸内切酶是特异性增强的Cas9变体(例如，eSPCas9)。参见例如，Slaymaker等人Science(2016)351(6268):84-88。在一些实施方案中，Cas核酸内切酶是高保真Cas9变体(例如，SpCas9-HF1)。参见例如，Kleinstiver等人Nature(2016)529:490-495。
Cas酶(如Cas核酸内切酶)是本领域已知的并且可从各种来源获得和/或进行工程化/修饰以调节酶的一种或多种活性或特异性。在一些实施方案中，已对Cas酶进行工程化/修饰以识别一个或多个PAM序列。在一些实施方案中，已对Cas酶进行工程化/修饰以识别一个或多个PAM序列，所述一个或多个PAM序列不同于在没有工程化/修饰的情况下Cas酶所识别的PAM序列。在一些实施方案中，已对Cas酶进行工程化/修饰以降低酶的脱靶活性。
在一些实施方案中，对编码Cas核酸内切酶的核苷酸序列进行进一步修饰以改变核酸内切酶活性的特异性(例如，减少脱靶裂解、降低细胞中的Cas核酸内切酶活性或寿命、增加同源定向重组和减少非同源末端连接)。参见例如，Komor等人Cell(2017)168:20-36。在一些实施方案中，对编码Cas核酸内切酶的核苷酸序列进行修饰以改变核酸内切酶的PAM识别。例如，Cas核酸内切酶SpCas9识别PAM序列NGG，而包含核酸内切酶的一种或多种修饰的SpCas9的松弛变体(例如，VQR SpCas9、EQR SpCas9、VRER SpCas9)可识别PAM序列NGA、NGAG、NGCG。如果与未修饰的Cas核酸内切酶相比，修饰的Cas核酸内切酶识别更多潜在PAM序列，则所述Cas核酸内切酶的PAM识别被认为是“松弛的”。例如，Cas核酸内切酶SaCas9识别PAM序列NNGRRT，而包含核酸内切酶的一种或多种修饰的SaCas9的松弛变体(例如，KKHSaCas9)可识别PAM序列NNNRRT。在一个实例中，Cas核酸内切酶FnCas9识别PAM序列NNG，而包含核酸内切酶的一种或多种修饰的FnCas9的松弛变体(例如，RHA FnCas9)可识别PAM序列YG。在一个实例中，Cas核酸内切酶是包含取代突变S542R和K607R的Cpf1核酸内切酶并识别PAM序列TYCV。在一个实例中，Cas核酸内切酶是包含取代突变S542R、K607R和N552R的Cpf1核酸内切酶并识别PAM序列TATV。参见例如，，Gao等人Nat.Biotechnol.(2017)35(8):789-792。
在一些实施方案中，使用不止一种(例如，2种、3种或更多种)Cas核酸内切酶。在一些实施方案中，所述Cas核酸内切酶中的至少一种是Cas9酶。在一些实施方案中，所述Cas核酸内切酶中的至少一种是Cpf1酶。在一些实施方案中，所述Cas9核酸内切酶中的至少一种源自酿脓链球菌酶。在一些实施方案中，所述Cas9核酸内切酶中的至少一种源自酿脓链球菌，并且所述Cas9核酸内切酶中的至少一种源自非酿脓链球菌的生物体。
在一些实施方案中，所述核酸内切酶是碱基编辑器。碱基编辑器核酸内切酶通常包含与功能结构域融合的催化失活的Cas核酸内切酶。参见例如，Eid等人Biochem.J.(2018)475(11):1955-1964；Rees等人Nature Reviews Genetics(2018)19:770-788。
基于CRISPR的碱基编辑系统通常包含：与进行编辑的脱氨酶融合的Cas切口酶或Cas；将Cas靶向特定基因座的gRNA；以及用于在Cas蛋白指定的编辑窗口内进行编辑的靶碱基。
目前有两类碱基编辑器，胞嘧啶(CBE)和腺嘌呤(ABE)。CBE介导C到T的变化(或相反链上G到A的变化)。ABE导致A到G的变化(或相反链上T到C的变化)。这仅占12种可能变化中的4种。
第一个胞嘧啶碱基编辑器是通过将胞苷脱氨酶与失活的dCas9偶联而成的(Komor等人,Nature(2016)533:420–424)。这些融合将胞嘧啶转化为尿嘧啶而不切割DNA。尿嘧啶随后通过DNA复制或修复转化为胸腺嘧啶。将尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)与dCas9融合可防止碱基切除修复，其改变U变回C突变。为了提高碱基编辑效率，使用Cas切口酶代替dCas9。所得编辑器BE3切割未修饰的DNA链，使其在细胞看来是“新合成的”。因此，细胞使用含U链作为模板修复DNA，复制碱基编辑。
第四代碱基编辑器BE4减少了早前BE可能发生的不合乎需要的C->G或C->A转化。这些副产物可能是在碱基切除修复过程中由尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)切除产生的。添加UNG抑制剂的第二个副本UGI可提高碱基编辑产物纯度。扩展了APOBEC1-Cas9n和Cas9n-UGI接头以提高产物纯度，这三项改进代表了第四代碱基编辑器。与BE3相比，BE4使C->G和C->A产物减少2.3倍并且插入缺失形成减少2.3倍。
提高哺乳动物编辑的碱基编辑效率，就是要保证编辑器进入细胞核中并得到良好的表达。改进BE4的核定位信号和密码子使用以创建BE4max和AncBE4max，编辑效率提高了4.2-6倍(Koblan等人,Nat Biotechnol(2018)36:843–846)。
腺嘌呤碱基编辑器将腺嘌呤转化为肌苷，导致A到G变化(Gaudelli等人,Nature(2017)551:464–471)。创建腺嘌呤碱基编辑器需要一个额外的步骤，因为没有已知的DNA腺嘌呤脱氨酶。他们使用定向进化从RNA腺嘌呤脱氨酶TadA中创造出一种。
通过改进核定位和表达，腺嘌呤碱基编辑器也得到了改进。2020年，发表了两篇论文，描述了从ABE7.10进化而来的另外ABE，这些ABE提高了碱基编辑器靶向的灵活性和特异性。在此产生第一个ABE8e，其编辑速度比来自ABE7.10的TadA快约590倍，而不增加脱靶活性(Richter等人,Nat Biotechnol(2020)38:883–891)。
此外，Gaudelli以ABE7.10为起点，将碱基编辑器进化为40个新的ABE8变体(Gaudelli等人,Nat Biotechnol(2020)38:892–900)。与ABE7.10相比，ABE8使NGG PAM的原间隔区位置A5-A7处的编辑增加了1.5倍，位置A3-A4和A8-A10处的编辑增加了3.2倍，与ABE7.10相比使非NGG PAM变体处的编辑效率提高了4.2倍。ABE8具有改进的碱基编辑能力，即使在以前难以靶向的位点也是如此。ABE8可以在原代T细胞中实现98％-99％的靶标修饰，使其成为细胞治疗应用的有前景的工具。
在一些实施方案中，催化失活的Cas核酸内切酶是dCas9。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与一个或多个尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)结构域融合的dCas9。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，例如从RNA腺嘌呤脱氨酶TadA进化而来的ABE融合的dCas9。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与ABE8e融合的dCas9。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与胞苷脱氨酶(例如，APOBEC脱氨酶、pmCDA1、活化诱导的胞苷脱氨酶(AID))融合的dCas9。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与BE4max融合的dCas9。
在一些实施方案中，催化失活的Cas核酸内切酶是Cas9切口酶或Cas9n。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与一个或多个尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)结构域融合的Cas9切口酶。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，例如从RNA腺嘌呤脱氨酶TadA进化而来的ABE融合的Cas9切口酶。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与ABE8e融合的Cas9切口酶。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与胞苷脱氨酶(例如，APOBEC脱氨酶、pmCDA1、活化诱导的胞苷脱氨酶(AID))融合的Cas9切口酶。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与BE4max融合的Cas9切口酶。
碱基编辑器的实例包括但不限于BE1、BE2、BE3、HF-BE3、BE4、BE4max、AncBE4max、BE4-Gam、YE1-BE3、EE-BE3、YE2-BE3、YEE-CE3、VQR-BE3、VRER-BE3、SaBE3、SaBE4、SaBE4-Gam、Sa(KKH)-BE3、靶-AID、靶-AID-NG、xBE3、eA3A-BE3、BE-PLUS、TAM、CRISPR-X、ABE7.9、ABE7.10、ABE7.10*、xABE、ABESa、ABE8e、VQR-ABE、VRER-ABE、Sa(KKH)-ABE和CRISPR-SKIP。碱基编辑器的另外实例可例如在美国公布第2018/0312825A1号、美国公布第2018/0312828A1号和PCT公布第WO 2018/165629A1号中找到，所述公布以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，已对碱基编辑器进行进一步修饰以抑制靶位点处的碱基切除修复并诱导细胞错配修复。本文所述的任何Cas核酸内切酶可与Gam结构域(噬菌体Mu蛋白)融合以保护Cas核酸内切酶免于降解和核酸外切酶活性。参见例如，Eid等人Biochem.J.(2018)475(11):1955-1964。
在一些实施方案中，Cas核酸内切酶属于Cas核酸内切酶的2类V型。2类V型Cas核酸内切酶可进一步分类为V-A型、V-B型、V-C型和V-U型。参见例如，Stella等人NatureStructural&Molecular Biology(2017)。在一些实施方案中，Cas核酸内切酶是V-A型Cas核酸内切酶，如Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸内切酶是V-B型Cas核酸内切酶，如C2c1核酸内切酶。参见例如，Shmakov等人Mol Cell(2015)60:385-397。在一些实施方案中，Cas核酸内切酶是Mad7。
或者或此外，Cas核酸内切酶是Cpf1核酸酶或其变体。如本领域技术人员将理解的，Cas核酸内切酶Cpf1核酸酶也可称为Cas12a。参见例如，Strohkendl等人Mol.Cell(2018)71:1-9。在一些实施方案中，宿主细胞表达源自普氏菌属(Provetella spp.)或弗朗西斯氏菌属(Francisella spp.)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp.)(AsCpf1)、毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)(LpCpf1)或直肠真杆菌(Eubacterium rectale)的Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，编码Cpf1核酸酶的核苷酸序列可进行密码子优化以在宿主细胞中表达。在一些实施方案中，对编码Cpf1核酸内切酶的核苷酸序列进行进一步修饰以改变蛋白质的活性。
Cpf1(Cas12a)的催化失活变体可称为dCas12a。如本文所述，Cpf1的催化失活变体可融合至功能结构域以形成碱基编辑器。参见例如，Rees等人Nature Reviews Genetics(2018)19:770-788。在一些实施方案中，催化失活的Cas核酸内切酶是dCas12a。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与一个或多个尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)结构域融合的dCas12a。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，例如从RNA腺嘌呤脱氨酶TadA进化而来的ABE融合的dCas12a。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与ABE8e融合的dCas12a。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与胞苷脱氨酶(例如，APOBEC脱氨酶、pmCDA1、活化诱导的胞苷脱氨酶(AID))融合的dCas12a。在一些实施方案中，核酸内切酶包含与BE4max融合的dCas12a。
或者或此外，Cas核酸内切酶可以是Cas14核酸内切酶或其变体。与Cas9核酸内切酶相比，Cas14核酸内切酶源自古细菌，并且尺寸往往更小(例如，400-700个氨基酸)。核酸内切酶不需要PAM序列。参见例如，Harrington等人Science(2018)。
可调节本文所述的任何Cas核酸内切酶以在所需时间调控Cas核酸内切酶的表达水平和/或活性。例如，在细胞周期的一个或多个特定阶段增加Cas核酸内切酶的表达水平和/或活性可能是有利的。已经证明，在细胞周期的G1期，同源定向修复的水平降低，因此在S期、G2期和/或M期期间增加Cas核酸内切酶的表达水平和/或活性可增加Cas核酸内切酶编辑后的同源定向修复。在一些实施方案中，Cas核酸内切酶的表达水平和/或活性在细胞周期的S期、G2期和/或M期期间增加。在一个实例中，Cas核酸内切酶融合至人双能蛋白(Geminin)的N末端区域。参见例如，Gutschner等人Cell Rep.(2016)14(6):1555-1566。在一些实施方案中，Cas核酸内切酶的表达水平和/或活性在G1期期间降低。在一个实例中，对Cas核酸内切酶进行修饰以使其在G1期期间具有降低的活性。参见例如，Lomova等人StemCells(2018)。
或者或此外，本文所述的任何Cas核酸内切酶可与表观遗传修饰剂(例如，染色质修饰酶，例如DNA甲基化酶、组蛋白脱乙酰酶)融合。参见例如，Kungulovski等人TrendsGenet.(2016)32(2):101-113。与表观遗传修饰剂融合的Cas核酸内切酶可被称为“表观效应子”并且可允许暂时和/或瞬时核酸内切酶活性。在一些实施方案中，Cas核酸内切酶是与染色质修饰酶融合的dCas9。
此外，本文所述的组合物和方法可用于CRISPR的先导编辑方法中。基于CRISPR的先导编辑器系统可以包含与M-MLV逆转录酶(RT)融合的Cas9切口酶。先导编辑器系统还使用先导编辑指导RNA(pegRNA)。与基于CRISPR的碱基编辑器相比，先导编辑允许进行更多的碱基取代，并且可用于产生本文所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中核苷酸取代位于编码剪接元件的序列内，其中核苷酸取代导致由基因编码的转录物的可变剪接。
在另外的实施方案中，同源定向修复用于产生本文所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中核苷酸取代位于编码剪接元件的序列内，其中核苷酸取代导致由基因编码的转录物的可变剪接。
在一些实施方案中，本公开提供了使用基于CRISPR的碱基编辑器系统抑制造血细胞中的谱系特异性细胞表面抗原的组合物和方法，其中指导RNA序列与编码所述谱系特异性细胞表面抗原的核苷酸序列杂交。在一些实施方案中，本公开提供了使用基于CRISPR的碱基编辑器系统抑制造血细胞中的不止一种谱系特异性细胞表面抗原的组合物和方法，其中指导RNA序列与编码所述谱系特异性细胞表面抗原的核苷酸序列杂交。
在一些实施方案中，本公开提供了使用基于CRISPR的碱基编辑器系统改变造血细胞中的谱系特异性细胞表面抗原的组合物和方法，其中指导RNA序列与编码所述谱系特异性细胞表面抗原的核苷酸序列杂交。在一些实施方案中，本公开提供了使用基于CRISPR的碱基编辑器系统改变造血细胞中的不止一种谱系特异性细胞表面抗原的组合物和方法，其中指导RNA序列与编码所述谱系特异性细胞表面抗原的核苷酸序列杂交。
在一些实施方案中，谱系特异性细胞表面抗原是CD33，并且gRNA与编码CD33的核苷酸序列的一部分杂交。在一些实施方案中，gRNA与CD33外显子2侧翼的序列杂交(图4)。表4中提供了靶向CD33的gRNA的实例，但是可开发与CD33的相关核苷酸序列杂交的另外gRNA并且可在本文所述的方法中使用。
在一些情况下，用于本公开中的gRNA可包含与表4中的示例性指导RNA序列中任一者至少90％(例如，至少93％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的间隔区序列。
在一些实施方案中，谱系特异性细胞表面抗原是EMR2，并且gRNA与编码EMR2的核苷酸序列的一部分杂交。在一些实施方案中，gRNA与编码EMR2的核苷酸序列的外显子13侧翼的序列杂交(图9B)。下文提供了靶向EMR2的gRNA的实例，但是可开发与EMR2的相关核苷酸序列杂交的另外gRNA并且可在本文所述的方法中使用。
在一些情况下，用于本公开中的gRNA可包含与SEQ ID NO:4和46-47中任一者至少90％(例如，至少93％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的间隔区序列。
表4-用于碱基编辑CD33和EMR2的示例性指导RNA
Figure BDA0004113798400001111
Figure BDA0004113798400001121
另外，本公开提供了用于组合抑制第一谱系特异性细胞表面抗原和至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原(即，第一谱系特异性抗原、第二谱系特异性抗原、第三谱系特异性抗原、第四谱系特异性抗原等)的组合物和方法。
另外，本公开提供了用于改变第一谱系特异性细胞表面抗原和至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原(即，第一谱系特异性抗原、第二谱系特异性抗原、第三谱系特异性抗原、第四谱系特异性抗原等)的组合物和方法。
在一些实施方案中，第一谱系特异性抗原是CD33。在一些实施方案中，第二谱系特异性抗原是EMR2。
两种核酸的“同一性百分比”是使用Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87:2264-68，如Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:5873-77中修改的算法确定的。这种算法被并入Altschul等人J.Mol.Biol.(1990)215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST程序(得分＝100，字长-12)来进行，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。在两个序列之间存在空位的情况下，可利用如Altschul等人,Nucleic Acids Res.(1997)25(17):3389-3402中所描述的空位BLAST。当利用BLAST和空位BLAST程序时，可使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
本文还提供了产生谱系特异性细胞表面抗原缺乏或发生改变的细胞的方法，所述方法包括提供细胞并将用于基因组编辑的基于CRISPR的碱基编辑器系统的组分引入所述细胞中。在一些实施方案中，将包含与编码谱系特异性细胞表面抗原的核苷酸序列的一部分杂交或预计与其杂交的指导RNA(gRNA)的核酸引入所述细胞中。在一些实施方案中，gRNA在载体上引入所述细胞中。在一些实施方案中，将基于CRISPR的碱基编辑器引入所述细胞中。在一些实施方案中，将基于CRISPR的碱基编辑器作为编码基于CRISPR的碱基编辑器的核酸引入所述细胞中。在一些实施方案中，将gRNA和编码基于CRISPR的碱基编辑器的核苷酸序列在同一核酸(例如，同一载体)上引入所述细胞中。在一些实施方案中，将基于CRISPR的碱基编辑器以蛋白质的形式引入所述细胞中。在一些实施方案中，基于CRISPR的碱基编辑器和gRNA在体外预先形成并且作为复合物引入所述细胞中。在一些实施方案中，使用电穿孔引入复合物(例如，核糖核蛋白复合物)。
本文还提供了产生不止一种谱系特异性细胞表面抗原缺乏或发生改变的细胞的方法，所述方法包括提供细胞并将不止一种用于基因组编辑的基于CRISPR的碱基编辑器系统(即，用于对谱系特异性细胞表面抗原进行基因组编辑的基于CRISPR的编辑器系统，和用于对至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原进行基因组编辑的基于CRISPR的编辑器系统，例如第一和第二基于CRISPR的碱基编辑器系统)的组分引入所述细胞中。在一些实施方案中，将不止一种基于CRISPR的碱基编辑器系统的组分引入所述细胞中。在一些实施方案中，将包含与编码至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的核苷酸序列的一部分杂交或预计与其杂交的指导RNA(gRNA)的核酸引入所述细胞中。在一些实施方案中，gRNA在载体上引入所述细胞中。在一些实施方案中，将基于CRISPR的碱基编辑器引入所述细胞中。在一些实施方案中，将基于CRISPR的碱基编辑器作为编码基于CRISPR的碱基编辑器的核酸引入所述细胞中。在一些实施方案中，将gRNA和编码基于CRISPR的碱基编辑器的核苷酸序列在同一核酸(例如，同一载体)上引入所述细胞中。在一些实施方案中，将基于CRISPR的碱基编辑器以蛋白质的形式引入所述细胞中。在一些实施方案中，基于CRISPR的碱基编辑器和gRNA在体外预先形成并且作为复合物引入所述细胞中。在一些实施方案中，使用电穿孔引入复合物(例如，核糖核蛋白复合物)。
在一些实施方案中，第一基于CRISPR的碱基编辑器系统通过与随后的基于CRISPR的碱基编辑器系统不同的方法引入所述细胞中。在一些实施方案中，所有基于CRISPR的碱基编辑器系统使用相同的方法引入所述细胞中。
本公开进一步提供了工程化的、非天然存在的载体和载体系统，所述载体和载体系统可编码基于CRISPR的碱基编辑器系统的一种或多种组分，其中所述载体包含编码(i)与谱系特异性抗原序列杂交的(CRISPR)-Cas系统指导RNA和(i i)基于CRISPR的碱基编辑器的多核苷酸。
本公开的载体可使用哺乳动物表达载体驱动一种或多种序列在哺乳动物细胞中的表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed,Nature(1987)329:840)和pMT2PC(Kaufman等人,EMBO J.(1987)6:187)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能通常由一种或多种调控元件提供。例如，通常使用的启动子源自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒、猿猴病毒40以及本文公开和本领域已知的其他启动子。对于用于原核和真核细胞的其他合适的表达系统，参见例如，Sambrook等人,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL.第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1989的第16和17章。
本公开的载体能够引导核酸优先在特定细胞类型中表达(例如，使用组织特异性调控元件来表达核酸)。这种调控元件包括可以是组织特异性或细胞特异性的启动子。如应用于启动子的术语“组织特异性”是指在不同类型的组织中相对不存在相同的目标核苷酸序列的表达的情况下，能够指导目标核苷酸序列针对特定组织类型(例如，种子)的选择性表达的启动子。如应用于启动子的术语“细胞类型特异性”是指在相同组织中的不同细胞类型中相对不存在相同的目标核苷酸序列的表达的情况下，能够指导目标核苷酸序列在特定细胞类型中的选择性表达的启动子。当应用于启动子时“细胞类型特异性”也意指能够促进目标核苷酸序列在单个组织中的区域内的选择性表达的启动子。启动子的细胞类型特异性可使用本领域中众所周知的方法，例如免疫组织化学染色来评估。
常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法可用于将编码基于CRISPR的碱基编辑器的核酸引入哺乳动物细胞或靶组织中。此类方法可用于向培养物中或宿主生物体中的细胞施用编码基于CRISPR的碱基编辑器系统的组分的核酸。
非病毒载体递送系统包括DNA质粒、RNA(例如，本文所述的载体的转录物)、裸核酸以及与递送媒介物复合的核酸。在一个实施方案中，所使用的非病毒载体递送系统是预先形成的核糖核蛋白复合物(例如，包含与靶向gRNA复合的基于CRISPR的碱基编辑器蛋白的复合物)。然后可通过电穿孔、基因枪轰击或其他物理递送方法将预先形成的核糖核蛋白复合物引入细胞中。在一个实施方案中，电穿孔用于将预先形成的核糖核蛋白复合物引入细胞中。参见例如，实施例1。
病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，所述病毒在递送至细胞后具有游离型或整合型基因组。病毒载体可直接施用于患者(体内)，或者它们可用于在体外或离体操纵细胞，其中可将修饰的细胞施用于患者。在一个实施方案中，本公开利用基于病毒的系统，包括但不限于用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒载体。此外，本公开提供了能够整合到宿主基因组中的载体，如逆转录病毒或慢病毒。优选地，用于表达本公开的基于CRISPR的碱基编辑器系统的载体是慢病毒载体。
在一个实施方案中，本公开提供了将一种或多种编码基于CRISPR的碱基编辑器的载体引入真核细胞中。细胞可以是癌细胞。或者，细胞是造血细胞，如造血干细胞。干细胞的实例包括多潜能、多能和单能干细胞。多潜能干细胞的实例包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胚胎癌细胞和诱导型多潜能干细胞(iPSC)。在一个优选的实施方案中，本公开提供将基于CRISPR的碱基编辑器引入造血干细胞中。
将本公开的载体递送至受试者的真核细胞中。通过基于CRISPR的碱基编辑器系统修饰真核细胞可在细胞培养物中进行，其中所述方法包括在修饰之前从受试者分离真核细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括将所述真核细胞和/或源自其的细胞返回至所述受试者。
组合疗法
如本文所述，包含结合至谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)的抗原结合片段的剂可以与缺乏谱系特异性细胞表面抗原或其表位的造血细胞(例如，使用本文所述的基于CRISPR的碱基编辑器系统和gRNA产生的造血干细胞或祖细胞)组合施用于受试者，例如，其中所述gRNA包含以下核苷酸序列：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；或SEQ ID NO:3。
如本文所述，包含结合至谱系特异性细胞表面抗原(例如，EMR2)的抗原结合片段的剂可以与缺乏谱系特异性细胞表面抗原或其表位的造血细胞(例如，使用本文所述的基于CRISPR的碱基编辑器系统和gRNA产生的造血干细胞或祖细胞)组合施用于受试者，例如，其中所述gRNA包含以下核苷酸序列：SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:46；和SEQ ID NO:47。
还如本文所述，包含结合至谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)的抗原结合片段的剂和包含结合至至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段的剂可以与缺乏谱系特异性细胞表面抗原或其表位的造血细胞(例如，使用本文所述的基于CRISPR的碱基编辑器系统和gRNA产生的造血干细胞或祖细胞)组合施用于受试者，例如，其中所述gRNA包含以下核苷酸序列：
(SEQ ID NO:1)；
(SEQ ID NO:2)；或
(SEQ ID NO:3)；和
(SEQ ID NO:4)；
(SEQ ID NO:46)；或
(SEQ ID NO:47)。
如本文所用，术语“受试者”、“个体”和“患者”可互换使用，并且是指脊椎动物，优选哺乳动物，如人。哺乳动物包括但不限于人灵长类动物、非人灵长类动物或鼠、牛、马、犬或猫物种。在一些实施方案中，受试者是患有造血系统恶性肿瘤的人患者。
在一些实施方案中，所述剂和/或造血细胞可与药学上可接受的载体混合以形成药物组合物，这也在本公开的范围内。
为了实施本文所述的方法，可向需要治疗的受试者共同施用有效量的包含结合至一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段的所述一种或多种剂和有效量的造血细胞。如本文所用，术语“有效量”可与术语“治疗有效量”互换使用，并且是指剂、细胞群体或药物组合物(例如，包含剂和/或造血细胞的组合物)在施用于有需要的受试者后足以产生所需活性的量。在本公开的上下文中，术语“有效量”是指化合物、细胞群体或药物组合物的足以延迟通过本公开的方法治疗的病症的表现、阻止所述病症的进展、缓解或缓和所述病症的至少一种症状的量。注意，当施用活性成分的组合时，所述组合的有效量可包括或者可不包括在单独施用的情况下将有效的每种成分的量。
如本领域技术人员所认识到的，有效量取决于所治疗的特定疾患、疾患的严重程度、个体患者参数(包括年龄、身体状况、体型、性别和体重)、治疗的持续时间、同步疗法(如果有的话)的性质、具体的施用途径以及健康从业者知识和专业技能范围内的类似因素而变化。在一些实施方案中，有效量缓和、缓解、减轻、改善、减少受试者的任何疾病或病症的症状或延迟所述疾病或病症的进展。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是患有造血系统恶性肿瘤的人患者。
如本文所述，表达嵌合受体的造血细胞和/或免疫细胞可以是受试者自体的，即，细胞获自需要治疗的受试者，被基因工程化为缺乏或改变细胞表面谱系特异性抗原的表达或嵌合受体构建体的表达，然后施用于同一受试者。与施用非自体细胞相比，向受试者施用自体细胞可使得宿主细胞的排斥减少。或者，宿主细胞是同种异体细胞，即，细胞获自第一受试者，被基因工程化为缺乏或改变细胞表面谱系特异性抗原的表达或嵌合受体构建体的表达，并施用于与所述第一受试者不同但属于同一物种的第二受试者。例如，同种异体免疫细胞可源自人供体并施用于与供体不同的人受体。
在一些实施方案中，将表达本文所述的任何嵌合受体的免疫细胞以有效使靶细胞(例如，癌细胞)的数量减少至少20％，例如50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多倍的量施用于受试者。
施用于哺乳动物(例如，人)的细胞，即免疫细胞或造血细胞的典型量可在例如100万至1000亿个细胞的范围内；然而，低于或高于这种示例性范围的量也在本公开的范围内。例如，细胞的每日剂量可以是约100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞，或由前述值中的任何两个限定的范围)，优选约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞，或由前述值中的任何两个限定的范围)，更优选约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞，或由前述值中的任何两个限定的范围)。
在一个实施方案中，将嵌合受体(例如，编码嵌合受体的核酸)引入免疫细胞中，并且受试者(例如，人患者)接受表达所述嵌合受体的免疫细胞的初始施用或剂量。可在前一次施用后以15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天的间隔向患者提供所述剂(例如，表达嵌合受体的免疫细胞)的一次或多次后续施用。每周可向受试者施用超过一个剂量的所述剂，例如，所述剂的2、3、4或更多次施用。受试者每周可接受超过一个剂量的剂(例如，表达嵌合受体的免疫细胞)，随后一周不施用所述剂，并且最后接着是一个或多个另外剂量的所述剂(例如，每周施用表达嵌合受体的免疫细胞超过一次)。表达嵌合受体的免疫细胞可每隔一天施用一次，每周施用3次，持续两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周或更多周。
在本公开的上下文中，就其涉及本文所述的任何疾病疾患而言，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”等意指缓解或缓和与这种疾患相关的至少一种症状，或减缓或逆转这种疾患的进展。在本公开的含义内，术语“治疗”还表示停止、延迟的发作(即，疾病的临床表现之前的时期)和/或降低疾病发展或恶化的风险。例如，与癌症有关的术语“治疗”可意味着消除或降低患者的肿瘤负荷，或预防、延迟或抑制转移等。
在一些实施方案中，包含结合一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段的一种或多种剂和所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原缺乏或发生改变的造血细胞群体。因此，在此类治疗方法中，所述一种或多种剂识别(结合)表达所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的靶细胞，所述一种或多种剂所靶向的细胞类型再增殖。在一些实施方案中，患者的治疗可包括以下步骤：(1)向所述患者施用治疗有效量的靶向一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的一种或多种剂；以及(2)向所述患者输注或再输注自体或同种异体的造血干细胞，其中所述造血细胞的一种或多种谱系特异性疾病相关抗原的表达减少或改变。在一些实施方案中，患者的治疗可包括以下步骤：(1)向所述患者施用治疗有效量的表达嵌合受体的免疫细胞，其中所述免疫细胞包含编码嵌合受体的核酸序列，所述嵌合受体结合一种或多种谱系特异性细胞表面疾病相关抗原；以及(2)向所述患者输注或再输注自体或同种异体的造血细胞(例如，造血干细胞)，其中所述造血细胞的一种或多种谱系特异性疾病相关抗原的表达的减少或改变。
使用包含结合一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段的一种或多种剂和所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原缺乏或发生改变的造血细胞群体的治疗方法的功效可通过本领域已知的任何方法来评估并且对于熟练的医疗专业人员来说将是显而易见的。例如，可通过受试者的存活率或受试者或其组织或样本中的癌症负荷来评估所述疗法的功效。在一些实施方案中，通过定量属于特定细胞群体或谱系的细胞的数量来评估所述疗法的功效。在一些实施方案中，通过定量呈递细胞表面谱系特异性抗原的细胞的数量来评估所述疗法的功效。
在一些实施方案中，包含结合至细胞表面谱系特异性抗原的抗原结合片段的剂和造血细胞群体同时施用。
在一些实施方案中，在施用造血细胞之前施用包含结合一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段的所述一种或多种剂(例如，如本文所述的表达嵌合受体的免疫细胞)。在一些实施方案中，包含结合一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段的所述一种或多种剂(例如，如本文所述的表达嵌合受体的免疫细胞)在施用造血细胞之前至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、3个月、4个月、5个月、6个月或更长时间施用。在一些实施方案中，在施用造血细胞之前向受试者多次施用包含结合一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段的所述一种或多种剂(例如，如本文所述的表达嵌合受体的免疫细胞)。
在一些实施方案中，在包含结合一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段的所述一种或多种剂(例如，如本文所述的表达嵌合受体的免疫细胞)之前施用造血细胞。在一些实施方案中，在施用包含结合至所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段的所述一种或多种剂之前至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、3个月、4个月、5个月、6个月或更长时间施用造血细胞群体。
在一些实施方案中，靶向所述谱系特异性细胞表面抗原的所述一种或多种剂和造血细胞群体基本上同时施用。在一些实施方案中，施用靶向所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的所述一种或多种剂并评估患者一段时间，之后施用造血细胞群体。在一些实施方案中，施用造血细胞群体并且评估患者一段时间，之后施用靶向所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的一种或多种剂。
所述剂和/或造血细胞群体的多次施用(例如，剂量)也在本公开的范围内。在一些实施方案中，向受试者施用所述剂和/或造血细胞群体一次。在一些实施方案中，向受试者施用所述剂和/或造血细胞群体超过一次(例如，至少2次、3次、4次、5次或更多次)。在一些实施方案中，所述剂和/或造血细胞群体以规则的间隔时间，例如每六个月施用于受试者。
在一些实施方案中，受试者是患有造血系统恶性肿瘤的人受试者。如本文所用，造血系统恶性肿瘤是指涉及造血细胞(例如，血细胞，包括祖细胞和干细胞)的恶性异常。造血系统恶性肿瘤的实例包括但不限于霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病或多发性骨髓瘤。白血病包括急性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病或慢性成淋巴细胞性白血病和慢性淋巴细胞性白血病。
在一些实施方案中，白血病是急性骨髓性白血病(AML)。AML被表征为异质性、克隆性、肿瘤性疾病，其起源于转化细胞，所述转化细胞逐渐获得了破坏关键分化和生长调控途径的关键遗传变化。(Dohner等人,NEJM,(2015)373:1136)。CD33糖蛋白在大多数骨髓性白血病细胞以及正常骨髓细胞和单核细胞前体上表达，并且一直被认为是AML治疗的有吸引力的靶标(Laszlo等人,Blood Rev.(2014)28(4):143-53)。虽然使用基于抗CD33单克隆抗体的疗法的临床试验表明，当与标准化学疗法组合时，一部分AML患者的存活率有所提高，但这些效果也伴随着安全性和功效问题。
旨在靶向AML细胞的其他努力包括产生表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，所述嵌合抗原受体选择性地靶向AML中的CD33。Buckley等人,Curr.Hematol.Malig.Rep.(2015)2:65。然而，数据是有限的，并且这种方法可能在治疗患者方面的效果如何(是否消除了所有靶向细胞)存在不确定性。此外，由于髓系细胞对于生命是不可或缺的，因此耗尽受试者的髓系细胞可能对患者的存活具有不利影响。本公开旨在至少部分地解决与AML治疗相关的此类问题。
或者或此外，本文所述的方法可用于治疗非造血系统癌症，包括但不限于肺癌、耳鼻喉癌、结肠癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌和直肠癌；结缔组织癌症；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌；上皮内赘生物；肾癌；喉癌；肝癌；纤维瘤，成神经细胞瘤；口腔癌(例如，唇、舌、口和咽)；成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤；肾癌；呼吸系统癌症；肉瘤；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌；泌尿系统癌症，以及其他癌和肉瘤。
癌是上皮起源的癌症。意图用本公开的方法治疗的癌包括但不限于腺泡癌、腺泡状癌、肺泡腺癌(也称为腺样囊性癌、腺上皮癌、筛状癌和圆柱瘤)、腺瘤癌、腺癌(adenocarcinoma)、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌(也称为细支气管癌、肺泡细胞肿瘤和肺腺瘤病)、基底细胞癌、基底上皮细胞癌(也称为基底细胞瘤或基底细胞癌和发母质癌)、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、乳腺癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、脑样癌、胆管细胞癌(也称为胆管瘤和胆管癌)、绒毛膜癌、胶样癌(colloid carcinoma)、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、圆柱细胞癌(cylindrical carcinoma)、柱状细胞癌(cylindrical cell carcinoma)、导管癌、硬膜癌、胚胎性癌、髓样癌、眼球上癌、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、溃疡性癌、纤维癌、胶样癌(gelatiniform carcinoma)、胶状癌(gelatinous carcinoma)、巨大细胞癌(giant cell carcinoma)、巨细胞癌(gigantocellulare)、腺癌(gland ular carcinoma)、粒层细胞癌、发母质癌、多血癌、肝细胞癌(也称为肝细胞瘤、恶性肝细胞瘤和肝癌)、许特耳细胞癌、透明细胞癌、肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、侵蚀性溃疡癌(Krompecher’s carcinoma)、库尔契茨基细胞癌(Kulchitzky-cell carcinoma)、豆状癌(lenticular carcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticul are)、脂瘤样癌、淋巴上皮癌、乳腺炎性癌、髓样癌(carcinomamedullare)、髓样癌(medullary carcinoma)、黑色素癌(carcinoma melanodes)、黑色素癌(melanotic carcinoma)、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinoma muciparum)、粘液细胞癌(carcinoma mucocellulare)、粘液表皮样癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌、鼻咽癌、黑色素癌(carcinoma nigrum)、燕麦细胞癌、骨化性癌、骨样癌、卵巢癌、乳头状癌、门静脉周癌、浸润前期癌、前列腺癌、肾的肾细胞癌(也称为肾腺癌和hypemephoroid癌)、储备细胞癌、肉瘤样癌、施耐德氏癌(scheinderiancarcinoma)、硬癌(scirr hous carcinoma)、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌(solanoid carcinoma)、球状细胞癌、梭形细胞癌、髓样癌(carcinomaspongiosum)、鳞癌、鳞状细胞癌、串癌(string carcinoma)、血管扩张性癌(carcinomatelangiectaticum)、血管扩张性癌(carcinoma telan giectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌、绒毛状癌。在优选的实施方案中，本公开的方法用于治疗患有乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌和直肠癌、胰腺癌、胃癌或肾癌的受试者。
肉瘤是发生在骨和软组织中的间充质肿瘤。已识别了不同类型的肉瘤，并且这些包括：脂肪肉瘤(包括粘液样脂肪肉瘤和多形性脂肪肉瘤)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、恶性周围神经鞘膜瘤(也称为恶性神经鞘瘤、神经纤维肉瘤或神经源性肉瘤)、尤文氏肿瘤(包括尤文氏骨肉瘤、骨外(即非骨)尤文氏肉瘤和原始神经外胚层肿瘤[PNET])、滑膜肉瘤、血管肉瘤、血管瘤、淋巴管肉瘤、卡波济氏肉瘤、血管内皮瘤、纤维肉瘤、硬纤维瘤(也称为侵袭性纤维瘤病)、隆突性皮肤纤维肉瘤(DFSP)、恶性纤维组织细胞瘤(MFH)、血管外皮细胞瘤、恶性间质瘤、腺泡状软组织肉瘤、上皮样肉瘤、透明细胞肉瘤、促结缔组织增生性小细胞瘤、胃肠道间质瘤(GIST)(也称为胃肠道间质肉瘤)、骨肉瘤(称为骨源性肉瘤)-骨骼和骨骼外以及软骨肉瘤。
在一些实施方案中，待治疗的癌症可以是难治性癌症。如本文所用，“难治性癌症”是对指定的护理标准具有抗性的癌症。这些癌症可能最初对治疗有应答(然后复发)，或者它们可能对治疗完全无应答。普通护理标准将根据癌症类型和受试者的进展程度而有所不同。它可以是化学疗法、或手术、或放射或它们的组合。本领域普通技术人员了解此类护理标准。因此，根据本公开针对难治性癌症治疗的受试者可能已经暴露于针对他们的癌症的另一种治疗。或者，如果癌症可能是难治性的(例如，鉴于对受试者的癌细胞或病史的分析)，则受试者可能尚未暴露于另一种治疗。难治性癌症的实例包括但不限于白血病、黑素瘤、肾细胞癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、非霍奇金淋巴瘤和肺癌。
本文所述的表达嵌合受体的任何免疫细胞可在药学上可接受的载体或赋形剂中作为药物组合物施用。
如与本公开的组合物和/或细胞结合使用的短语“药学上可接受的”是指此类组合物的分子实体和其他成分在生理上是可耐受的并且当施用于哺乳动物(例如，人)时通常不会产生不良反应。优选地，如本文所用，术语“药学上可接受的”意指由联邦监管机构或州政府批准的或者在美国药典或其他通常认可的药典上列出，以用于哺乳动物动物并且更具体地为用于人。“可接受”是指载体与组合物的活性成分(例如，核酸、载体、细胞或治疗性抗体)相容，并且不会对施用所述一种或多种组合物的受试者产生不利影响。待用于本发明方法中的任何药物组合物和/或细胞可包含呈冻干制剂或水溶液形式的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。
药学上可接受的载体(包括缓冲剂)是本领域众所周知的，并且可包括磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；氨基酸；疏水性聚合物；单糖；双糖；和其他碳水化合物；金属络合物；和/或非离子表面活性剂。参见例如，Remington:The Science andPractice of Pharmacy第20版(2000)Lippincott Williams and Wilkins编辑K.E.Hoover。
用于治疗性用途的药盒
在本公开的范围内还有用于将靶向谱系特异性细胞表面抗原的剂与缺乏所述一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的造血细胞群体组合使用的药盒。此类药盒可包括一个或多个容器，所述一个或多个容器包含第一药物组合物，所述第一药物组合物包含含有结合一种或多种谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段的任何一种或多种剂(例如，本文所述的表达嵌合受体的免疫细胞)和药学上可接受的载体；以及包含缺乏一种或多种细胞表面谱系特异性抗原的造血细胞群体(例如，造血干细胞)和药学上可接受的载体的第二药物组合物。
在一些实施方案中，本文所述的药盒包含具有SEQ ID NO:1-3的序列的gRNA。在一些实施方案中，本文所述的药盒包含具有SEQ ID NO:4和46-47的序列的gRNA。在另外的实施方案中，所述药盒还可包含具有SEQ ID NO:1-4和46-47中任一者的序列的gRNA。在一些实施方案中，药盒还可包含基于CRISPR的碱基编辑器系统的试剂，所述基于CRISPR的碱基编辑器系统包含与DNA修饰酶融合的催化受损的Cas蛋白(即，与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的Cas9切口酶)。
在一些实施方案中，所述药盒可包含用于本文所述的任何方法中的使用说明书。所包括的说明书可包括向受试者施用第一和第二药物组合物以在受试者中实现预期活性的描述。药盒还可包括基于鉴定受试者是否需要治疗来选择适合治疗的受试者的描述。在一些实施方案中，说明书包括向需要治疗的受试者施用第一和第二药物组合物的描述。
与使用本文所述的靶向细胞表面谱系特异性抗原的剂以及第一和第二药物组合物有关的说明书通常包括关于用于预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本公开的药盒中提供的说明书通常是标签或包装插页上的书面说明书。标签或包装插页指示药物组合物用于治疗受试者的疾病或病症、延迟所述疾病或病症的发作和/或缓和所述疾病或病症。
本文提供的药盒处于合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、软包装等。还考虑了用于与特定装置(如吸入器、经鼻施用装置或输注装置)组合使用的包装。药盒可具有无菌入口(例如，容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内注射溶液袋或小瓶)。容器还可具有无菌入口。药物组合物中的至少一种活性剂是如本文所述的嵌合受体变体。
药盒可任选地提供另外的组分，如缓冲剂和解释性信息。通常，药盒包括容器和在容器上或与容器相关的标签或一张或多张包装插页。在一些实施方案中，本公开提供了包含上述药盒的内容物的制品。
一般技术
除非另有说明，否则本公开的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述技术在本领域技术人员的能力范围内。此类技术在文献中充分阐明，如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等人,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:ALaboratory Notebook(J.E.Cellis编辑,1989)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑1987)；Introuction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑1993-8)J.Wiley and Sons；Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑):Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编辑1994)；CurrentProtocols in Immunology(J.E.Coligan等人编辑,1991)；Short Protocols inMolecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:a practice approach(D.Catty.编辑,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd和C.Dean编辑,Oxford University Press,2000)；Using antibodies:a laboratory manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编辑Harwood Academic Publishers,1995)；DNA Cloning:Apractical Approach,第I卷和第II卷(D.N.Glover编辑1985)；Nucleic AcidHybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑(1985》；Transcription and Translation(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑(1984》；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑(1986》；Immobilized Cells and Enzymes(lRL Press,(1986》；以及B.Perbal,A practical GuideTo Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等人(编辑)。
无需进一步详细描述，据信本领域技术人员可基于以上描述在最大程度上利用本公开。因此，以下具体实施方案仅视为说明性的，而不以任何方式限制本公开的其余部分。出于本文引用的目的或主题，本文引用的所有出版物均以引用的方式并入。
实施例
实施例1：用碱基编辑器高效编辑HSC/HSPC
材料和方法
将人脐带血CD34+干细胞保存在含有1％青霉素链霉素以及下列人细胞因子100ng/mL TPO、100ng/mL SCF、100ng/mL IL6和100ng/mL FLT3L和UM171 0.35nM(Xcessbio,San Diego,CA,USA)的StemSpan SFEM II(STEMCELL Technologies Inc)中。所有人细胞因子均购自Biolegend(San Diego,CA,USA)。
将ABE蛋白和sgRNA在P3缓冲液(Lonza,Amaxa P3Primary Cell 4D-Nucleofector试剂盒)中混合并孵育10分钟。然后将细胞用PBS洗涤，重悬于P3缓冲液中，与Cas9/sgRNARNP复合物混合，然后用4D-Nucleofector进行电穿孔。电穿孔后，将细胞在37℃下培养直至分析或注射。
用ABE8e蛋白编辑HSC/HSPC
使用Lonza 4D nucleofector和程序DZ100将100万个HSC/HSPC用11ugr ABE8e蛋白+1.5ugr sgRNA(化学修饰的(SEQ ID NO:3))核转染。
用BE4max蛋白编辑HSC/HSPC
使用Lonza 4D nucleofector和程序DZ100将500 000个HSC/HSPC用8ugr BE4max蛋白+1.5ugr sgRNA(化学修饰的(SEQ ID NO:1或2))核转染。
电穿孔后，将细胞在37℃下培养直至分析。
编辑结果和脱靶评估：
经由CRISPResso2的HTS分析
设计了围绕原间隔区sgRNA 208或sgRNA SA的350bp区域的引物。每个引物都附有适当的ILLUMINA衔接子。然后使用ILLUMINA正向和反向索引引物对产生的PCR产物进行再扩增，以产生250-300bp的单端Illumina测序。然后使用CRISPResso2将每个读段与参考扩增子对齐，并在原间隔区周围的窗口中鉴定相对于该参考物的插入缺失或碱基变化。这些由软件定量。参见Clement等人Nature Biotechnology(2019)37:224-26；Huang等人NatureProtocols(2021)16(2):1089-1128。
PCR
使用RNA to cDNA EcoDry混合物(Takara)从细胞的100ng总RNA中制备cDNA。使用特异于CD33Δ2的引物(跨越外显子接点1-3)、特异于CD33FL的引物(跨越外显子接点2-3或外显子2)或所有同种型共有的引物(在外显子1、5和7中)进行三十个PCR循环。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物，并通过Sanger测序进行分析。
流式细胞术
人CD34+干细胞在电穿孔后7天使用以下抗CD33抗体克隆M53和P67.6进行分析，这些抗体克隆识别位于外显子2中的表位。
统计数据
所有统计数据均使用Graphpad Prism 9.1.1进行。对于连续变量，进行了未配对的双尾t检验。当p值<0.05时，平均值之间的差异被认为是显著的，否则不显著(ns；p>0.05)。
结果
三个sgRNA被设计为使用BE或ABE碱基编辑器诱导外显子2跳读(图4)。CD33mRNA全长(CD33FL)含有7个外显子，并且外显子2编码Ig样V型结构域。由于常见多态性(rs12459419，A14VSNP)，CD33Δ2缺乏外显子2，其改变C>T，导致外显子剪接增强子(ESE)位点改变。
对基于mRNA和核糖核蛋白(RNP)的递送系统进行了测试，以检查原代细胞的效率。用各自这些gRNA和碱基编辑器(BE)或腺嘌呤碱基编辑器(ABE)蛋白对CD34细胞进行电穿孔。具体而言，用ABE8e和具有SEQ ID NO:3的sgRNA，或BE4max和具有SEQ ID NO:1的sgRNA，或BE4max和具有SEQ ID NO:2的sgRNA对CD34细胞进行电穿孔(表4)。
如Sanger测序所示，BE和ABE在靶向核苷酸处引入了C>T或A>G转化(图5A)。
还使用PCR和Illumina MiSeq分析已编辑细胞。这些结果表明，每个靶向碱基都获得了预期的突变。用SEQ ID NO:3和ABE8e编辑的细胞显示出仅4％野生型读段。用SEQ IDNO:1或2和BE4max编辑的细胞显示出约9％-12％的野生型读段(图5B)。使用识别位于CD33外显子2中的表位的两种抗体对已编辑细胞进行流式细胞术分析，证实已编辑细胞中不存在CD33外显子2(图5C)。
使用cDNA和PCR以及特异于CD33Δ2的引物(跨越外显子接点1-3)、特异于CD33FL的引物(跨越外显子接点2-3或外显子2)或所有同种型共有的引物(在外显子3中，跨越外显子接点3-5或4-5)进一步分析已编辑细胞的编辑结果。结果表明，ESE或SA的编辑诱导外显子2跳读而不影响其他外显子(图5D)。
实施例2：CD33Δ2细胞在体外展现正常的吞噬能力并且对GO具有抗性
对如实施例1中所述的CD34+CD33Δ2细胞进行进一步分析。
吞噬作用
测试体外分化的CD34+CD33WT和CD33Δ2单核细胞在体外吞噬大肠杆菌生物颗粒的能力。体外分化的WT或CD33Δ2单核细胞显示出相当的吞噬能力，如由大肠杆菌生物颗粒内化所测量的。参见图6A。
GO细胞毒性
此外，CD34+CD33Δ2在体外抵抗GO细胞毒性。将细胞与GO一起孵育48小时，然后使用Sytox Blue或7AAD作为存活力染料通过FACS进行分析。CD34+CD33Δ2显示出与具有纯合rs12459419(TT)A14V SNP的供体相同的GO细胞毒性(图6B)。
实施例3：CD34+CD33Δ2在体内能够长期多系植入并且对CD33靶向免疫疗法(GO)具有抗性
材料和方法
体内实验
由于本发明方法可能涉及移植CD33基因编辑的干细胞(CD34+CD33Δ2)作为靶向CD33抗原的CAR-T和ADC递送(GO)的平台，重要的是要测试CD34+CD33Δ2细胞植入并促进骨髓细胞生成和淋巴细胞生成的能力。
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)或NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl Tg(CMV-IL3,CSF2,KITLG)1Eav/MloySzJ(NSG-SGM3)小鼠(The Jackson Laboratory,Bar Harbor,Maine,USA)用亚致死(100cGy)全身照射(TBI)调理。通过尾静脉注射将CD34+WT或CD34+CD33Δ2HSPC(如实施例1中所述使用ABE8e和SEQ ID NO:3编辑的细胞)注射到亚致死照射的小鼠中。
使用来自Biolegend(San Diego,CA,USA)或BD Biosciences(San Jose,CA,USA)的以下后续抗体通过分析外周血(PB)、脾脏和全骨髓(BM)来评估随时间推移造血系统的植入和再增殖(图7A)：Ter119-PeCy5、Ly5-BV711、H2kd-BV711、hCD45-BV510、hCD3-PacificBlue、hCD123-BV605、hCD33-APC、hCD14-APC/Cy7、hCD10-BUV395、hCD19-BV650、CD34-BV421、CD90-PeCy7、hCD38-BUV661和hCD45RA-BUV737。使用碘化丙啶排除死亡细胞。将注射CD34+的来源的人细胞在Ter119-、Ly5-/H2kd-人CD45+上门控。
为了显示CD34+CD33Δ2细胞在体内对GO具有抗性，分析移植后12周小鼠的PB是否存在CD33+CD14+细胞或CD33Δ2CD14+细胞。然后向小鼠注射2.5ugr GO，接着在治疗一周后放血并装袋，以评估人源化小鼠的PB和骨髓中骨髓细胞的存在。在GO治疗之前，CD34+WT或CD34+CD33Δ2移植小鼠的PB中展现相同频率的CD14+细胞(图7D，顶部FACS图)。GO注射后一周，在植入CD34+CD33Δ2细胞的小鼠的PB和BM中检测到CD33-CD14+细胞，而在CD34+WT植入小鼠的PB和BM中CD33+和CD14+细胞已根除。
移植后16周，由小鼠骨髓的基因组DNA扩增CD33基因座。通过HTS对扩增子进行测序，并定量位置A7处的A到G编辑。
按照哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Careand Use Committee of Columbia University)批准的方案执行所有实验。
结果
移植后16周的骨髓和脾脏揭示存在人CD45+细胞，及骨髓祖细胞(CD123)和淋巴祖细胞(CD10)，以及成熟骨髓细胞(CD14)和淋巴细胞(CD19)，以及人CD45内的T细胞(CD3)(图7B)。所有细胞保持CD33阴性(图7A)。
GO治疗后，在植入CD34+CD33Δ2细胞的小鼠的外周血和骨髓中检测到CD33-CD14+，而CD33+细胞检测不到，导致CD14+CD34+WT植入小鼠的根除。因此，CD33WT细胞对GO仍然敏感，而CD34+CD33Δ2细胞不敏感。图7B和图7C。
在移植后16周分析来自骨髓样本的植入WT(未编辑)或已编辑细胞中的靶位点(A7)处的中靶编辑。移植后16周，由小鼠骨髓的基因组DNA扩增CD33基因座。图7D。
实施例4：脱靶评估
材料和方法
CIRCLEseq
为了鉴定碱基编辑脱靶位点，使用QIAgen Gentra PureGene试剂盒(目录号158445)从去识别化人供体的CD34+富集细胞群体中提取基因组DNA。如先前所述进行CIRCLE-seq(Tsai等人,Nature Methods(2017)14:607-14)。简言之，用Covaris S2仪器将纯化的基因组DNA剪切至平均长度为300bp。使用KAPA HTP文库制备试剂盒PCR Free(KAPABiosystems)对片段化的DNA进行末端修复、A加尾并连接至含尿嘧啶的茎-环衔接子。将衔接子连接的DNA用λ核酸外切酶(NEB)和大肠杆菌核酸外切酶I(NEB)处理，然后用USER酶(NEB)和T4多核苷酸激酶(NEB)处理。用T4DNA连接酶(NEB)进行DNA的分子内环化，并将残留的线性DNA用Plasmid-Safe ATP依赖性DNase(Lucigen)降解。用250ng Plasmid-Safe处理的环化DNA、90nM Cas9核酸酶(NEB)、Cas9核酸酶缓冲液(NEB)和90nM合成化学修饰的sgRNA(Synthego)以100μl体积进行体外裂解反应。对裂解的产物进行A加尾，与发夹衔接子(NEB)连接，用USER酶(NEB)处理，并用条形码化通用引物NEBNext Multiplex Oligos forIllumina(NEB)使用Kapa HiFi聚合酶(KAPA Biosystems)通过PCR扩增。在Illumina MiSeq仪器上用150bp的双端读段对文库进行测序。使用开源CIRCLE-seq分析软件(https://github.com/tsailabSJ/circleseq)利用默认参数进行CIRCLE-seq数据分析。人基因组GRCh37用于比对。
为了评估脱靶编辑，在移植后16周对来自骨髓的植入人WT(未编辑细胞)或已编辑细胞中由CIRCLE-seq指定的19个排名靠前的脱靶位点进行测序。
对于每个脱靶位点，设计引物以产生250-300bp的产物，包括用于指导RNA的对齐脱靶结合位点，以及用于Illumina测序的附加衔接子。在对每个样本进行二次PCR条形码化后，使用300循环v2Illumina MiSeq试剂盒对产物进行汇集和测序。通过HTS对扩增子进行测序，并定量位置A7处的A到G编辑。
为了分析生成的fastq文件的编辑结果，使用CRISPResso2将每个读段与参考扩增子对齐并定量插入缺失或碱基变化。
对如实施例1中所述使用ABE8e和SEQ ID NO:3编辑的CD34+CD33Δ2细胞进行进一步分析。
结果
使用CIRCLE-seq，鉴定了19个排名靠前的脱靶基因座。图8A。
如上文所述，进行测序以评估位置A7处的A到G编辑，即植入人WT(未编辑)或已编辑细胞中的已鉴定的19个排名靠前的脱靶基因座处的A7靶向核苷酸处的编辑。如图8B所示，对于大多数靶标，WT和已编辑细胞中的A7编辑是相似的。
如图8C所示，对于WT和已编辑细胞，靶标的插入缺失百分比也是相似的。
实施例5：多重碱基编辑
设计了两种sgRNA。一种是使用ABE编辑器诱导CD33中的外显子跳读(SEQ ID NO:3)。第二种是使用ABE编辑器诱导EMR2中的外显子13的跳读(SEQ ID NO:4)。图4A和图9A。
使用5ugr AB8e+1.5ugr sgRNA(化学修饰的)分别制备两个RNP(每个靶向基因各一个)。孵育后，将RNP与500,000个HSC/HSPC共混合并使用Lonza 4D nucleofector和程序DZ100进行核转染。
分析已编辑细胞以引入核苷酸转化。如Sanger测序所示，ABE碱基编辑器在两个基因座中均引入A>G转化，从而编辑CD33基因座中的SA和EMR2基因座中的SD(图9B)。已编辑细胞的流式细胞术分析证实，所述编辑消除了已编辑细胞中的CD33和EMR2抗体结合(图9C)。
实施例6：在急性骨髓性白血病(AML)中靶向细胞表面谱系特异性CD33
本实施例涵盖在AML中靶向CD33抗原。该实施例的具体步骤如表5中所概述。
表5.实验设计的概要
I.自体CD33靶向(CAR)T细 1.抗CD33 CAR构建体的产生
胞疗法 2.从患者分离CD8+T细胞
3.抗CD33 CAR T细胞的制备
4.将CD33 CAR T细胞再输注至患者体内
II.使用CD34+CD33Δ2细胞进 1.造血干细胞的分离
行自体造血干细胞移植 2.靶向CD33的CRISPR碱基编辑质粒
3.通过基于CRISPR的碱基编辑器系统产生CD34+CD33Δ2细胞
4.将CD34+CD33Δ2细胞再输注至患者体内
III.用附着至毒素(免疫毒
素)的CD33抗体继续治疗患者
I.CD33靶向嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法
A.抗CD33 CAR构建体的产生
本文所述的靶向CD33的嵌合抗原受体可按5’至3’的顺序由以下组分组成：pHIV-Zsgreen慢病毒主链(www.addgene.org/18121/)、肽信号、CD33 scFv、铰链、CD28分子的跨膜区、CD28的细胞内结构域和TCR-ζ分子的信号传导结构域。
最初，将肽信号、抗CD33轻链(SEQ ID NO:8)、柔性接头和抗CD33重链(SEQID.NO.6)克隆到pHIV-Zsgreen的EcoRI位点中，具有最佳Kozak序列。
结合CD33的具有轻链-接头-重链-铰链-CD28/ICOS-CD3ζ的基本结构的示例性嵌合受体的核酸序列在下文提供。
第1部分：轻链-接头-重链(SEQ ID NO:33)：Kozak起始位点以粗体显示。肽信号L1以斜体显示。抗CD33轻链和重链以粗体和斜体显示，通过接头分隔。
Figure BDA0004113798400001371
第2部分：铰链-CD28/ICOS–CD3ζNotI限制性酶识别位点以大写字母显示。翻译终止位点以粗体显示。BamHI限制性裂解位点以下划线显示。
CD28共刺激结构域(SEQ ID NO:34)
Figure BDA0004113798400001372
Figure BDA0004113798400001381
ICOS共刺激结构域(SEQ ID NO:35)
Figure BDA0004113798400001382
融合(杂合)CD28和ICOS共刺激结构域(SEQ ID NO:36)
Figure BDA0004113798400001383
Figure BDA0004113798400001391
在下一步中，将铰链区、CD28结构域(SEQ ID NO:15)和TCR-ζ的细胞质组分克隆到pHIV-Zsgreen(已含有肽信号和CD33 scFv)的NotI和BamHI位点中。或者，CD28结构域可被ICOS结构域(SEQ ID NO:16)取代。
除CD28和ICOS结构域以外，将对包含CD28和ICOS细胞内信号传导结构域的片段的融合结构域进行工程化(SEQ ID NO:17)并用于产生另外的嵌合受体。这种构型，其中嵌合受体包含抗原结合片段、抗CD33轻链可变区、接头、抗CD33重链可变区、CD28/ICOS杂合区(包括CD28的TM区)和TCR-ζ分子的信号传导结构域。
本文提供了可用于产生嵌合受体的组分的示例性氨基酸序列，本文提供了如CD28结构域(SEQ ID NO:10)、ICOS结构域(SEQ ID NO:11)、CD28/ICOS杂合结构域(SEQ ID NO:13)和TCR-ζ。或者，也可产生嵌合受体(B部分)。
B.用于产生抗CD33 CAR构建体的替代方法
示例性嵌合受体的示意图呈现在图10，图A-D中。嵌合受体将使用识别CD33抗原的细胞外人源化scFv产生，细胞外人源化scFv连接至细胞外CD8铰链区、跨膜和细胞质信号传导结构域以及CD3ζ信号传导链(图10，图B)。将通过使用人源化scFv产生编码抗CD33嵌合受体的DNA(Essand等人,J Intern Med.(2013)273(2):166)。替代方案包括含有OX-1或41-BB代替CD28或CD28/OX1或CD28/4-1-B-B杂合体的CAR T细胞(图10，图C和D)。
为了产生抗CD33 scFV序列，将上述抗CD33抗体的可变区的重链和轻链的编码区(SEQ ID NO:6和8)用特异性引物扩增并克隆到用于在细胞中表达的pHIV-Zsgreen载体中。为了评价scFv(单链可变片段)与靶抗原的结合强度，将在Hek293T细胞中表达scFv。为此，将载体(含有编码区的pHIV-Zsgreen)转化到大肠杆菌Top10F细菌中并制备质粒。将获得的编码scFv抗体的表达载体通过转染引入Hek293T细胞中。将转染的细胞培养五天后，除去上清液并纯化抗体。
可通过本领域已知的方案使用框架取代将所得抗体人源化。参见例如，BioAtla(San Diego)提供了一种这样的方案，其中将源自模板抗体的合成CDR编码片段文库连接至来自限于来自功能表达抗体的种系序列的人框架库的人框架区编码片段(bioatla.com/applications/express-humanization/)。
可进行亲和力成熟以提高抗原结合亲和力。这可使用本领域已知的一般技术，如噬菌体展示来实现(Schier R.,J.Mol.Biol(1996),263:551)。可使用例如Biacore分析来筛选变体的生物活性(例如，结合亲和力)。为了鉴定作为修饰的良好候选物的高变区残基，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。此外，所描述的组合文库也可用于提高抗体的亲和力(Rajpal等人,PNAS(2005)102(24):8466)。或者，BioAtla开发了用于抗体的快速且有效的亲和力成熟的平台，所述平台也可用于抗体优化的目的(bioatla.com/applications/functional-maturation/)。
C.CAR构建体的组装
接下来，将抗CD33 scFv连接至细胞外CD8铰链区、跨膜和细胞质CD28信号传导结构域以及CD3ζ信号传导链。简言之，将对抗CD33 scFv序列具有特异性的引物用于扩增如上所述的scFv。携带完整人CD8编码序列的质粒(pUN1-CD8).(www.invivogen.com/puno-cd8a)将用于扩增CD8铰链和跨膜结构域(氨基酸135-205)。将从携带完整人CD3ζ编码序列的Invivogen质粒pORF9-hCD247a(http://www.invivogen.com/PDF/pORF9-hCD247a_10E26v06.pdf)扩增CD3ζ片段。最后，从使用通过Trizol方法从活化的T细胞收集的RNA产生的cDNA扩增CD28(氨基酸153-220，对应于CD28的TM和信号传导结构域)。使用剪接重叠延伸(SOE)PCR组装含有抗CD33-scFv-CD8-铰链+TM-CD28-CD3ζ的片段。将所得PCR片段克隆到pELPS慢病毒载体中。pELPS是第三代慢病毒载体pRRL-SIN-CMV-eGFP-WPRE的衍生物，其中CMV启动子被EF-1α启动子替代，并且将HIV的中心多嘌呤束插入所述启动子的5’(Milone等人,Mol Ther.(2009)(8):1453；Porter等人,NEJM(2011)(8):725)。通过测序对所有构建体进行验证。
或者，将产生含有ICOS、CD27、41BB或OX-40信号传导结构域而不是CD28结构域的CAR，将其引入T细胞中并测试其根除CD33阳性细胞的能力(图10，图C)。还考虑了产生“第三代”嵌合受体(图10，图D)，其组合多个信号传导结构域，如CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40，以进一步增强效力(Sadelain等人,Cancer Discov.(2013)4:388)。
D.抗CD33 CAR T细胞制备
通过免疫磁性分离(Miltenyi Biotec)从患者的外周血分离原代人CD8+T细胞。将T细胞在完全培养基(补充有10％热灭活FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL硫酸链霉素、10mMHEPES的RPMI 1640)中培养并如先前所述用抗CD3和抗CD28mAb包被的珠(Invitrogen)刺激(Levine等人,J.Immunol.(1997)159(12):5921)。
包装细胞系用于产生病毒载体，所述病毒载体能够转导靶细胞并含有抗CD33嵌合受体。为了产生慢病毒颗粒，将此实施例第(1)部分中产生的CAR转染到永生化正常胎儿肾脏293T包装细胞中。用包括10％FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的高葡萄糖DMEM培养细胞。转染后48-72小时，收集上清液，并将重组慢病毒浓缩在不含FBS的DMEM中。接下来在聚凝胺存在下以约5-10的感染复数(MOI)转导原代CD8+T细胞。每隔一天添加人重组IL-2(R&D Systems)(50IU/mL)。将T细胞在刺激后培养约14天。通过ZsGreen报告基因(Clontech,Mountain View,CA)的表达评估人原代T细胞的转导效率。
E.将CAR T细胞输注至患者体内
在将抗CD33 CAR T细胞静脉内输注至患者体内之前，用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞并进行浓缩。将提供封闭且无菌的系统的细胞加工器，如Haemonetics CellSaver(Haemonetics Corporation,Braintree,MA)用于配制前的洗涤和浓缩步骤。将表达抗CD33嵌合受体的最终T细胞配制成100ml补充有人血清白蛋白的无菌生理盐水。最后，在1-3天的时间内向患者输注1-10X107个T细胞/kg(Maude等人,NEJM(2014)371(16):1507)。所输注的表达抗CD33嵌合受体的T细胞的数量将取决于多种因素，如癌症患者的状态、患者的年龄、既往治疗等。
此外，除在AML患者中靶向CD33的嵌合受体以外，本文还考虑了表达靶向EMR2的嵌合受体的免疫细胞。这可以通过两种不同的方法来实现：1)分别产生表达抗CD33嵌合受体的免疫细胞和表达抗EMR2嵌合受体的免疫细胞，并分别向患者输注这两种类型的免疫细胞；或2)产生同时靶向CD33和EMR2的免疫细胞(Kakarla等人,Cancer(2014)2:151)。
II.使用CD34+CD33Δ2细胞进行自体造血干细胞移植
据了解，根据患者的年龄、疾患、治疗史和进行治疗的机构，有关从患者分离干细胞、调理方案以及向患者输注干细胞的方案存在很大差异。因此，下文描述的方案仅仅是一个实例，并且由本领域普通技术人员进行常规优化。
A.在过继转移抗CD33 CAR T细胞后，使用外周血干细胞(PBSC)动员分离造血干细胞
将通过静脉内施用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)10mg/kg/天对AML患者进行刺激。将使用免疫磁珠和免疫磁性富集装置进行CD34+细胞阳性选择。预期使用Fenwall CS 3000+细胞分离器收集至少2x106个CD34+细胞/kg体重(Park等人,Bone MarrowTransplantation(2003)32:889)。
B.患者的调理方案
用于自体外周血干细胞移植(PBSCT)的调理方案将使用依托泊苷(VP-16)+环磷酰胺(CY)+全身照射(TBI)来进行。简言之，所述方案将包括在26小时内作为单次剂量静脉内持续输注(c.i.v.)1.8g/m2的依托泊苷(VP-16)，然后每天在2小时内静脉内输注60mg/kg的环磷酰胺(CY)持续3天，然后在接下来的3天内每天以300cGy进行全身照射(TBI)。
为了计算剂量，将使用理想体重或实际体重，以较小者为准。如先前所述，在确定精确调理方案时，将考虑如癌症患者的状态、患者的年龄、既往治疗以及进行手术的机构类型等因素。
C.靶向CD33的基于CRISPR的碱基编辑器系统的质粒构建
获得含有与腺苷碱基编辑器(例如，ABE8e)融合的Cas切口酶的慢病毒载体，并将靶向CD33的gRNA(例如，SEQ ID NO:3)克隆到所述载体中。CD33 gRNA寡核苷酸将从Integrated DNA Technologies(IDT)获得，使用多核苷酸激酶(Fermentas)在37℃下磷酸化30分钟，然后通过加热至95℃持续5分钟并以1.5℃/分钟冷却至25℃进行退火。T7连接酶将用于使寡核苷酸退火，然后将退火的寡核苷酸在25℃下连接至凝胶纯化载体(Qiagen)中保持5分钟。然后可使用无内毒素的midi-prep试剂盒(Qiagen)扩增所得质粒(Sanjana等人,Nat Methods(2014)(8):783)。
或者，可使用先前描述的双载体系统(其中gRNA和Cas从单独的载体表达)方案(Mandal等人,Cell Stem Cell(2014)15(5):643)。在此，Mandal等人使用从非病毒载体表达的CRISPR-Cas系统实现了人造血干细胞中基因的有效消除。
又或者，使用基于核糖核蛋白(RNP)的递送系统，将呈蛋白质形式的与腺苷碱基编辑器(例如，ABE8e)融合的Cas切口酶以及gRNA递送至细胞。
除向患者输注CD33耗尽的造血干细胞HSC以外，使用实施例5的方法进行输注CD34+CD33Δ2EMRΔ13的方案。
D.转染CD34+细胞HSC以产生CD34+CD33Δ2或CD34+CD33Δ2EMRΔ13-细胞
在细胞培养级干细胞因子(SCF)300ng/ml、FLT3-L 300ng/ml、促血小板生成素(TPO)100ng/ml和IL-3 60ng/ml存在下，将新鲜分离的外周血来源的CD34+细胞(来自步骤4)以1×106个细胞/ml接种到无血清CellGro SCGM培养基中。预刺激24小时后，将使用Amaxa人CD34细胞Nucleofector试剂盒(U-008)(#VPA-1003)(Mandal等人,Cell Stem Cell(2014)15(5):643)或使用基于核糖核蛋白(RNP)的递送系统，用含有Cas9和CD33gRNA的LentiCRISPR v2转染CD34+HSC。转染后24-48小时，用1.2μg/ml嘌呤霉素选择CD34+CD33Δ2或CD34+CD33Δ2EMRΔ13细胞。选择嘌呤霉素后，将细胞在不含嘌呤霉素的培养基中维持数日。
E.将CD34+ CD33Δ2细胞再输注至患者体内
将用基于CRISPR的碱基编辑器系统离体转染的CD34+细胞(CD34+CD33Δ2或CD34+CD33Δ2EMRΔ13细胞)立即使用没有过滤器的标准血液施用设置通过Hickman导管再输注(Hacein-Bey Abina等人JAMA(2015)313(15):1550)。
一般而言，将监测已经历上述治疗方案的患者循环原始细胞和血细胞减少症的重现。此外，根据具体患者中AML的潜在机制，将通过测试信息分子或细胞遗传标志物或信息流式细胞术模式的重现来监测治疗的成功。例如，将使用荧光原位杂交(FISH)与BCR(22号染色体上)和ABL(9号染色体上)的探针检测费城染色体阳性AML中BCR-ABL信号的再现。
为了通过基于CRISPR的碱基编辑器系统评估CD33缺失的成功，将从患者(移植后)分离外周血CD34+细胞并例如使用流式细胞术、蛋白质印迹或免疫组织化学评价CD33表达。
如本文所述，此实施例中描述的HSCT可以是自体的或同种异体的，并且两种方法都是合适的并且可并入本公开中描述的方法中。
III.任选的步骤：用附着至毒素的CD33抗体继续治疗患者
A.用CD33免疫毒素吉妥珠单抗奥佐米星(GO)治疗患者
患者将用9mg/m2的抗CD33抗体吉妥珠单抗奥佐米星(GO)作为2小时静脉内输注间隔2周的2个剂量进行治疗(Larson等人,Cancer(2005)104(7):1442-52)。GO由针对CD33的人源化单克隆抗体组成，所述抗体与细胞生长抑制剂卡奇霉素缀合(图11)。
或者，可将抗CD33抗体与不同的毒素，如白喉毒素、假单胞菌外毒素A(PE)或蓖麻毒素A链(RTA)缀合(Wayne等人,Blood(2014)123(16):2470)。类似地，抗EMR2抗体可附着至毒素并包括在治疗方案中。
实施例7：表达抗CD33嵌合受体的T细胞和NK细胞系诱导表达CD33的靶细胞的细胞死亡
嵌合受体与CD33的结合
使用常规重组DNA技术产生结合CD33的嵌合受体(例如，CART1、CART2、CART3)，并将其插入pHIV-Zsgreen载体(Addgene；Cambridge,MA)中。将含有嵌合受体的载体用于产生慢病毒颗粒，其用于转导不同的细胞类型，例如T细胞系(例如，293T细胞)和NK细胞系(例如，NK92细胞)。通过蛋白质印迹(图12，图A)和流式细胞术(图12，图B)检测嵌合受体的表达。
通过荧光活化细胞分选(FACS)选择表达嵌合受体的细胞，并评估它们结合CD33的能力。简言之，将表达嵌合受体的293T细胞的裂解物与CD33或CD33-别藻蓝蛋白(APC)缀合物共同培养。对样本进行蛋白质电泳，并用丽春红蛋白质染料染色(图13，图A)或转移到膜上并用抗CD3ζ第一抗体进行探测(图13，图B)。在两种情况下，嵌合受体与其靶标CD33之间的结合。
还使用CD33作为探针通过流式细胞术评估表达嵌合受体的K562细胞与CD33的结合(图13，图C)。与含有空载体对照的细胞相比，对嵌合受体(CART1、CART2或CART3)的表达和CD33结合呈阳性的细胞的数量增加，从而表明嵌合受体与CD33结合。
由表达嵌合受体的细胞诱导的细胞毒性
将表达嵌合受体的NK-92细胞针对诱导在细胞表面上呈递CD33的靶细胞的细胞毒性的能力在功能上进行表征(例如，K562是CD33+的人慢性髓细胞性白血病细胞系)。为了进行细胞毒性测定，将效应细胞(免疫细胞，如NK-92细胞)用编码嵌合受体的慢病毒颗粒感染并扩增。感染后7天，经由FACS分析通过选择也由嵌合受体编码载体编码的荧光标志物(例如，GFP+或Red+)来选择表达嵌合受体的细胞。将选择的表达嵌合受体的细胞扩增一周。感染后14天，进行细胞毒性测定，包括用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)对靶细胞(表达靶细胞表面谱系特异性抗原CD33的细胞)进行染色，并对靶细胞和表达嵌合受体的细胞进行计数。将不同比例的靶细胞和表达嵌合受体的细胞在圆底96孔板中共孵育4.5小时，然后添加7-氨基放线菌素D(7-AAD)以对非存活细胞进行染色。进行流式细胞术以计数存活和非存活靶细胞的群体。如图14的图A和图B所示，表达嵌合受体CART1、CART2或CART3的NK92细胞在所评估的每一细胞比率下诱导靶K562细胞的大量细胞死亡。
为了确定K562细胞的细胞死亡依赖于嵌合受体对CD33的特异性靶向，使用CRISPR/Cas系统将K562基因工程化为缺乏CD33。简言之，在K562细胞中表达了人密码子优化的Cas9核酸内切酶和靶向CD33的IgC结构域的一部分的gRNA，从而产生CD33缺陷型K562细胞群体。将细胞扩增并与表达嵌合受体的NK92细胞共孵育，并且如上所述进行细胞毒性测定。如图15图A所示，在与表达嵌合受体的NK92细胞共孵育的情况下，合并的CD33缺陷型K562细胞显示细胞死亡适度减少。然而，当分离、扩增CD33缺陷型K562细胞的单个克隆并用于进行细胞毒性测定时，观察到细胞毒性的更显著降低(图15，图B)。
原代T细胞中嵌合受体的表达
通过正向选择CD4+、CD8+或CD4+/CD8+细胞，通过FACS从获自供体的PMBC分离原代T细胞群体，从而产生高纯群体(图16，图A和图B)。用含有嵌合受体(例如，CART1和CART8)的慢病毒载体转导每个原代T细胞群体(CD4+、CD8+或CD4+/CD8+细胞)，并使用所得表达嵌合受体的原代T细胞进行细胞毒性测定，如上所述。表达嵌合受体的CD4+T细胞群体与K562(1000个靶K562细胞)共孵育不会导致K562细胞的细胞毒性(图17，图A)。相比之下，在使用表达嵌合受体的CD8+或CD4+/CD8+细胞和1000个靶K562细胞的细胞毒性测定中，CD8+或CD4+/CD8+细胞能够在低细胞比率下诱导K562细胞的细胞死亡(图17，图B)。
其他实施方案
本说明书中公开的所有特征可以任何组合结合。本说明书中公开的每个特征可被替换为用于相同、等同或相似目的的替代特征。因此，除非另有明确规定，否则所公开的每个特征仅是一系列通用等同或相似特征的实例。
从以上描述中，本领域技术人员可容易地确定本公开的基本特征，并且在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可对本公开进行各种变化和修改以使其适于各种用法和条件。因此，其他实施方案也在权利要求书内。
等效方案
虽然已经在本文描述和说明了若干发明实施方案，但本领域普通技术人员将容易地预想多种其他手段和/或结构以用于执行本文所述的功能和/或获得结果和/或一个或多个优点，并且此类改变和/或修改中的每一者被视为在本文所述的发明实施方案的范围内。更一般而言，本领域技术人员将容易理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和构型都是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或构型将取决于使用本发明教导内容的具体一项或多项应用。本领域的技术人员将认识到，或者仅仅使用常规实验就能够确知本文所述的具体发明实施方案的许多等效方案。因此，应当理解，前述实施方案仅以举例的方式呈现，并且在所附权利要求书及其等效物的范围内，发明实施方案可以除具体描述和要求保护的方式之外的方式来实践。本公开的发明实施方案涉及本文所述的每个单独的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果此类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法并不互相矛盾，那么两个或更多个此类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合都包括在本公开的发明范围内。
如本文所定义和使用的所有定义应理解为凌驾于字典的定义、以引用方式并入的文献中的定义和/或所定义术语的普通含义。
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请都关于每个被引用的主题以引用的方式并入，这在一些情况下可涵盖文件的全部内容。
如本文在说明书和权利要求书中所用，不定冠词“一个(种)”应理解为意指“至少一个(种)”，除非相反地明确指示。
如本文在说明书和权利要求书中所用，短语“和/或”应理解为意指如此联合的要素中的“一者或两者”，即要素在一些情况下结合存在而在其他情况下分开存在。用“和/或”列出的多个要素应以相同的方式理解，即，如此联合的要素中的“一者或多者”。除由“和/或”从句所具体标识的要素之外，其他要素可任选地存在，无论是否与所具体标识的那些要素相关。因此，作为非限制性实例，当与开放式语言如“包含”结合使用时，对“A和/或B”的提及在一个实施方案中可仅指代A(任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，仅指代B(任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施方案中，指代A和B两者(任选地包括其他要素)；等。
如在本说明书和权利要求书中所用，“或”应理解为具有与如上述定义的“和/或”相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或“和/或”应解释为包括性的，即包括多个要素或要素列表中的至少一个要素，但是也包括其中的不止一个要素，以及任选地包括另外未列出的项目。只有如“仅仅之一”或“恰好之一”的术语明确地相反地指出，否则当在权利要求书中使用“由……组成”时，将指代包括多个要素或要素列表中的恰好一个要素。一般而言，当前面有如“任一”、“之一”、“仅仅之一”或“恰好之一”等排他性术语时，如本文所用的术语“或”应仅解释为表明排他性的替代方案(即，“一个或另一个但不是两者”)。当“基本上由……组成”用于权利要求书中时，应具有其在专利法领域中所使用的通常含义。
如本文在说明书和权利要求书中所用，关于具有一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应理解为意指选自所述要素列表中的任一个或多个要素的至少一个要素，但未必包括在所述要素列表内具体地列出的每一个要素中的至少一个，并且不排除所述要素列表中多个要素的任何组合。此定义还允许除了短语“至少一个(种)”指代的要素列表内所具体标识的要素之外，无论是否与所具体标识的那些要素相关，要素可任选地存在。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或者等效地，“A或B中的至少一个”，或者等效地，“A和/或B中的至少一个”)可在一个实施方案中指代至少一个A，任选地包括不止一个A，但不存在B(并且任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，指代至少一个B，任选地包括不止一个B，但不存在A(并且任选地包括除A之外的要素)；在又一实施方案中，指代至少一个A，任选地包括不止一个A，以及至少一个B，任选地包括不止一个B(并且任选地包括其他要素)；等等。
还应理解，除非明确相反地指出，否则在包括不止一个步骤或动作的本文所要求保护的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不一定限于叙述方法的步骤或动作时的顺序。
序列表
<110> 纽约市哥伦比亚大学(Columbia University in the City of New York)
<120> 使用基于CRISPR的碱基编辑器系统抑制谱系特异性抗原的组合物和方法
<130> 01001/006850-WO)
<140> 随同提交
<141> 2021-06-03
<150> 63/033,966
<151> 2020-03-06
<150> 63/033,970
<151> 2020-03-06
<150> 63/183,791
<151> 2021-04-05
<160> 47
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1
gggcccctgt ggggaaacga ggg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 2
agggcccctg tggggaaacg agg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 3
ccccacaggg gccctggcta tgg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 4
agcactcaca cggtgggaga agg 23
<210> 5
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Ile Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Glu Val Arg Leu Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 6
caggtgcagc tgcagcagcc cggcgccgag gtggtgaagc ccggcgccag cgtgaagatg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctactaca tccactggat caagcagacc 120
cccggccagg gcctggagtg ggtgggcgtg atctaccccg gcaacgacga catcagctac 180
aaccagaagt tccagggcaa ggccaccctg accgccgaca agagcagcac caccgcctac 240
atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc cagggaggtg 300
aggctgaggt acttcgacgt gtggggccag ggcaccaccg tgaccgtgag cagc 354
<210> 7
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 7
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Ser
20 25 30
Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Leu Ser Ser Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 8
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 8
gagatcgtgc tgacccagag ccccggcagc ctggccgtga gccccggcga gagggtgacc 60
atgagctgca agagcagcca gagcgtgttc ttcagcagca gccagaagaa ctacctggcc 120
tggtaccagc agatccccgg ccagagcccc aggctgctga tctactgggc cagcaccagg 180
gagagcggcg tgcccgacag gttcaccggc agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc 240
atcagcagcg tgcagcccga ggacctggcc atctactact gccaccagta cctgagcagc 300
aggaccttcg gccagggcac caagctggag atcaagagg 339
<210> 9
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 9
Gly Ser Thr Ser Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
1 5 10 15
Thr Lys Gly
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 10
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
65 70 75 80
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
85 90 95
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
100 105
<210> 11
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 11
Leu Ser Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly
1 5 10 15
Tyr Leu His Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys Phe Trp
20 25 30
Leu Pro Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys
35 40 45
Ile Leu Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His
50 55 60
Asp Pro Asn Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys
65 70 75 80
Lys Ser Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu
85
<210> 12
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 12
Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn
1 5 10 15
Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg
20 25 30
Leu Thr Asp Val Thr Leu
35
<210> 13
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 13
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Phe
65 70 75 80
Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp Val Thr
85 90 95
Leu
<210> 14
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 14
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 15
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 15
attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60
catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 120
tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 180
tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 240
atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 300
gacttcgcag cctatcgctc cagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac 360
cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat 420
gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac 480
cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag 540
attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc 600
agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 657
<210> 16
<211> 603
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 16
ctatcaattt ttgatcctcc tccttttaaa gtaactctta caggaggata tttgcatatt 60
tatgaatcac aactttgttg ccagctgaag ttctggttac ccataggatg tgcagccttt 120
gttgtagtct gcattttggg atgcatactt atttgttggc ttacaaaaaa gaagtattca 180
tccagtgtgc acgaccctaa cggtgaatac atgttcatga gagcagtgaa cacagccaaa 240
aaatctagac tcacagatgt gaccctaaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc 300
gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag 360
tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg 420
aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac 480
agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag 540
ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct 600
cgc 603
<210> 17
<211> 627
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 17
attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60
catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 120
tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 180
tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgttc 240
atgagagcag tgaacacagc caaaaaatct agactcacag atgtgaccct aagagtgaag 300
ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 360
ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 420
gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 480
aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 540
aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 600
cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 627
<210> 18
<211> 503
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 18
Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
1 5 10 15
Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Pro
20 25 30
Gly Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe
35 40 45
Ser Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly
50 55 60
Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys His
100 105 110
Gln Tyr Leu Ser Ser Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val
145 150 155 160
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
165 170 175
Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile His Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Val Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Ile Ser Tyr
195 200 205
Asn Gln Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser
210 215 220
Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Arg Leu Arg Tyr Phe Asp Val Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile
260 265 270
Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr
275 280 285
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
290 295 300
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly
305 310 315 320
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
325 330 335
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly
340 345 350
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
355 360 365
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
370 375 380
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
385 390 395 400
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
405 410 415
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
420 425 430
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
435 440 445
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
450 455 460
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
465 470 475 480
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
485 490 495
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500
<210> 19
<211> 509
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 19
Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
1 5 10 15
Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Pro
20 25 30
Gly Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe
35 40 45
Ser Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly
50 55 60
Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys His
100 105 110
Gln Tyr Leu Ser Ser Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val
145 150 155 160
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
165 170 175
Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile His Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Val Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Ile Ser Tyr
195 200 205
Asn Gln Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser
210 215 220
Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Arg Leu Arg Tyr Phe Asp Val Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met
260 265 270
Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr
275 280 285
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
290 295 300
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
305 310 315 320
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val
325 330 335
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
340 345 350
Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr
355 360 365
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln
370 375 380
Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys
385 390 395 400
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
420 425 430
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
435 440 445
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
450 455 460
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
465 470 475 480
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
485 490 495
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505
<210> 20
<211> 552
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 20
Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
1 5 10 15
Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Pro
20 25 30
Gly Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe
35 40 45
Ser Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly
50 55 60
Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys His
100 105 110
Gln Tyr Leu Ser Ser Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val
145 150 155 160
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
165 170 175
Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile His Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Val Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Ile Ser Tyr
195 200 205
Asn Gln Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser
210 215 220
Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Arg Leu Arg Tyr Phe Asp Val Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile
260 265 270
Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr
275 280 285
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
290 295 300
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly
305 310 315 320
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val
325 330 335
Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe
340 345 350
Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp
355 360 365
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr
370 375 380
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg
385 390 395 400
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
405 410 415
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
420 425 430
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
435 440 445
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
450 455 460
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
465 470 475 480
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
485 490 495
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
500 505 510
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
515 520 525
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
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His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
545 550
<210> 21
<211> 542
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 21
Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
1 5 10 15
Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Pro
20 25 30
Gly Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe
35 40 45
Ser Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly
50 55 60
Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys His
100 105 110
Gln Tyr Leu Ser Ser Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val
145 150 155 160
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
165 170 175
Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile His Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Val Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Ile Ser Tyr
195 200 205
Asn Gln Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser
210 215 220
Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Arg Leu Arg Tyr Phe Asp Val Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile
260 265 270
Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr
275 280 285
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
290 295 300
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly
305 310 315 320
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Trp Leu Pro Ile Gly Cys Ala
325 330 335
Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu Ile Cys Trp Leu
340 345 350
Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr
355 360 365
Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp
370 375 380
Val Thr Leu Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
385 390 395 400
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
405 410 415
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
420 425 430
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
435 440 445
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
450 455 460
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
465 470 475 480
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
485 490 495
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
500 505 510
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
515 520 525
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
530 535 540
<210> 22
<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 22
Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
1 5 10 15
Ser Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
20 25 30
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
35 40 45
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
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65 70 75 80
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100 105 110
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Gly Ser Thr Ser Gly Ser
115 120 125
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Leu Gln Glu Ser
130 135 140
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr
145 150 155 160
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln
165 170 175
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu
180 185 190
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys
195 200 205
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr
210 215 220
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly
225 230 235 240
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
245 250 255
Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe
260 265 270
Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
275 280 285
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser
290 295 300
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Lys Pro
305 310 315 320
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
325 330 335
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Val Lys Phe Ser
340 345 350
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
355 360 365
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
370 375 380
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
385 390 395 400
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
405 410 415
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
420 425 430
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
435 440 445
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450 455
<210> 23
<211> 398
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 23
Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
1 5 10 15
Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Pro
20 25 30
Gly Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe
35 40 45
Ser Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly
50 55 60
Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys His
100 105 110
Gln Tyr Leu Ser Ser Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val
145 150 155 160
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
165 170 175
Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile His Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly
180 185 190
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195 200 205
Asn Gln Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser
210 215 220
Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Arg Leu Arg Tyr Phe Asp Val Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly
305 310 315 320
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val
325 330 335
Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe
340 345 350
Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395
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<211> 500
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 24
Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
1 5 10 15
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35 40 45
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100 105 110
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115 120 125
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Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln
165 170 175
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu
180 185 190
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys
195 200 205
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210 215 220
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly
225 230 235 240
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
245 250 255
Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe
260 265 270
Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
275 280 285
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser
290 295 300
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Lys Pro
305 310 315 320
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
325 330 335
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
340 345 350
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
355 360 365
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
370 375 380
Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
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Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
405 410 415
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420 425 430
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485 490 495
Leu Pro Pro Arg
500
<210> 25
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 25
Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
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165 170 175
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180 185 190
Leu Glu Trp Val Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Ile Ser Tyr
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Arg Leu Arg Tyr Phe Asp Val Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro
260 265 270
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275 280 285
Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys
290 295 300
Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
305 310 315 320
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
325 330 335
Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
340 345 350
Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
355 360 365
Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
370 375 380
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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Leu Pro Pro Arg
<210> 26
<211> 1568
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 26
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ctcccagaag aactacctgg cctggtatca gcagatcccc ggccagagcc ccagactgct 240
gatctactgg gccagcacca gagaaagcgg cgtgcccgat agattcaccg gcagcggctc 300
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ctgccaccag tacctgagca gccggacctt tggccagggc accaagctgg aaatcaagcg 420
gggcagcaca agcggcagcg gaaagcctgg atctggcgag ggctctacca agggccaggt 480
gcagctgcag cagcctggcg ccgaagtcgt gaaacctggc gcctccgtga agatgtcctg 540
caaggccagc ggctacacct tcaccagcta ctacatccac tggatcaagc agacccctgg 600
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gaagttccag ggcaaggcca ccctgaccgc cgacaagtct agcaccaccg cctacatgca 720
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ccctgcccct agacctccta ccccagcccc tacaatcgcc agccagcctc tgtctctgag 960
gcccgaggct tctagaccag ctgctggcgg agccgtgcac accagaggcc tggatatcta 1020
catctgggcc ccactggccg gcacctgtgg cgtgctgctg ctgtctctcg tgatcaccaa 1080
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tattctag 1568
<210> 27
<211> 1586
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 27
ggtgtcgtga gcggccgctg aactggccac catgtggctg cagtctctgc tgctgctggg 60
caccgtggcc tgtagcatca gcgagatcgt gctgacccag agccctggct ctctggctgt 120
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aaattcatcg acgttaacta ttctag 1586
<210> 28
<211> 1715
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 28
ggtgtcgtga gcggccgctg aactggccac catgtggctg cagtctctgc tgctgctggg 60
caccgtggcc tgtagcatca gcgagatcgt gctgacccag agccctggct ctctggctgt 120
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tggcaccgac ttcaccctga caatcagcag cgtgcagccc gaggacctgg ccatctacta 360
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caaggccagc ggctacacct tcaccagcta ctacatccac tggatcaagc agacccctgg 600
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ccctgcccct agacctccta ccccagcccc tacaatcgcc agccagcctc tgtctctgag 960
gcccgaggct tctagaccag ctgctggcgg agccgtgcac accagaggac tggacaagcc 1020
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<210> 29
<211> 1436
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 29
ggtgtcgtga gcggccgctg aactggccac catgtggctg cagtctctgc tgctgctggg 60
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cctgggcgat agagtgacca tcagctgcag agccagccag gacatcagca agtacctgaa 180
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ctccaagagc caggtgttcc tgaagatgaa cagcctgcag accgacgaca ccgccatcta 720
ctactgcgcc aagcactact actacggcgg cagctacgcc atggactact ggggccaggg 780
cacaagcgtg accgtgtctg ccctgagcaa cagcatcatg tacttcagcc acttcgtgcc 840
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gctggcctgt tatagcctgc tcgtgacagt ggccttcatc atcttttggg tgcgcgtgaa 1080
gttcagccgc agcgccgatg cccctgccta tcagcaggga cagaaccagc tgtacaacga 1140
gctgaacctg ggcagacggg aagagtacga cgtgctggac aagagaagag gccgggaccc 1200
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caagggccac gatggactgt atcagggcct gagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc 1380
cctgcacatg caggctctgc cccctcgctg aaattcatcg acgttaacta ttctag 1436
<210> 30
<211> 1253
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 30
ggtgtcgtga gcggccgctg aactggccac catgtggctg cagtctctgc tgctgctggg 60
caccgtggcc tgtagcatca gcgagatcgt gctgacccag agccctggct ctctggctgt 120
gtctcctggc gagcgcgtga ccatgagctg caagagcagc cagagcgtgt tcttcagcag 180
ctcccagaag aactacctgg cctggtatca gcagatcccc ggccagagcc ccagactgct 240
gatctactgg gccagcacca gagaaagcgg cgtgcccgat agattcaccg gcagcggctc 300
tggcaccgac ttcaccctga caatcagcag cgtgcagccc gaggacctgg ccatctacta 360
ctgccaccag tacctgagca gccggacctt tggccagggc accaagctgg aaatcaagcg 420
gggcagcaca agcggcagcg gaaagcctgg atctggcgag ggctctacca agggccaggt 480
gcagctgcag cagcctggcg ccgaagtcgt gaaacctggc gcctccgtga agatgtcctg 540
caaggccagc ggctacacct tcaccagcta ctacatccac tggatcaagc agacccctgg 600
acagggcctg gaatgggtgg gagtgatcta ccccggcaac gacgacatca gctacaacca 660
gaagttccag ggcaaggcca ccctgaccgc cgacaagtct agcaccaccg cctacatgca 720
gctgtccagc ctgaccagcg aggacagcgc cgtgtactac tgcgccagag aagtgcggct 780
gcggtacttc gatgtgtggg gccagggaac caccgtgacc gtgtctagcg ccctgagcaa 840
cagcatcatg tacttcagcc acttcgtgcc cgtgtttctg cccgccaagc ctaccacaac 900
ccctgcccct agacctccta ccccagcccc tacaatcgcc agccagcctc tgtctctgag 960
gcccgaggct tctagaccag ctgctggcgg agccgtgcac accagaggac tggacaagcc 1020
cttctgggtg ctggtggtcg tgggcggagt gctggcctgt tacagcctgc tcgtgacagt 1080
ggccttcatc atcttttggg tgcgcagcaa gcggtctaga ctgctgcaca gcgactacat 1140
gaacatgacc cccagaaggc caggccccac ccggaagcac tatcagcctt acgcccctcc 1200
cagagacttc gccgcctaca gaagctgaaa ttcatcgacg ttaactattc tag 1253
<210> 31
<211> 1559
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 31
ggtgtcgtga gcggccgctg aactggccac catgtggctg cagtctctgc tgctgctggg 60
caccgtggcc tgcagcatca gcatccagat gacccagacc accagcagcc tgagcgccag 120
cctgggcgat agagtgacca tcagctgcag agccagccag gacatcagca agtacctgaa 180
ctggtatcag cagaaacccg acggcaccgt gaagctgctg atctaccaca ccagcagact 240
gcacagcggc gtgccctcta gattttccgg cagcggctcc ggcaccgact acagcctgac 300
catctccaac ctggaacagg aagatatcgc tacctacttc tgtcagcaag gcaacaccct 360
gccctacacc ttcggcggag gcaccaagct ggaaatcggc agcacaagcg gctctggcaa 420
gcctggatct ggcgagggct ctaccaaggg cctgcaggaa tctggccctg gactggtggc 480
ccctagccag agcctgtctg tgacctgtac cgtgtccggc gtgtccctgc ctgactatgg 540
cgtgtcctgg atcagacagc cccccagaaa gggcctggaa tggctgggag tgatctgggg 600
cagcgagaca acctactaca acagcgccct gaagtcccgg ctgaccatca tcaaggacaa 660
ctccaagagc caggtgttcc tgaagatgaa cagcctgcag accgacgaca ccgccatcta 720
ctactgcgcc aagcactact actacggcgg cagctacgcc atggactact ggggccaggg 780
cacaagcgtg accgtgtctg ccctgagcaa cagcatcatg tacttcagcc acttcgtgcc 840
cgtgtttctg cccgccaagc ctaccacaac ccctgcccct agacctccta ccccagcccc 900
tacaatcgcc agccagcctc tgtctctgag gcccgaggct tctagaccag ctgctggcgg 960
agccgtgcac accagaggac tggacaagcc cttctgggtg ctggtggtcg tgggcggagt 1020
gctggcctgt tatagcctgc tcgtgacagt ggccttcatc atcttttggg tgcgcagcaa 1080
gcggagccgg ctgctgcact ccgactacat gaacatgacc cccagacggc caggccccac 1140
ccggaaacac tatcagcctt acgcccctcc cagagacttc gccgcctacc ggtccagagt 1200
gaagttcagc agatccgccg acgcccctgc ctatcagcag ggacagaacc agctgtacaa 1260
cgagctgaac ctgggcagac gggaagagta cgacgtgctg gacaagagaa gaggccggga 1320
ccctgagatg ggcggcaagc ccagaagaaa gaacccccag gaaggcctgt ataacgaact 1380
gcagaaagac aagatggccg aggcctacag cgagatcggc atgaagggcg aacggcggag 1440
aggcaagggc cacgatggac tgtatcaggg cctgagcacc gccaccaagg acacctatga 1500
cgccctgcac atgcaggctc tgccccctcg ctgaaattca tcgacgttaa ctattctag 1559
<210> 32
<211> 1514
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 32
ggtgtcgtga gcggccgctg aactggccac catgtggctg cagtctctgc tgctgctggg 60
caccgtggcc tgtagcatca gcgagatcgt gctgacccag agccctggct ctctggctgt 120
gtctcctggc gagcgcgtga ccatgagctg caagagcagc cagagcgtgt tcttcagcag 180
ctcccagaag aactacctgg cctggtatca gcagatcccc ggccagagcc ccagactgct 240
gatctactgg gccagcacca gagaaagcgg cgtgcccgat agattcaccg gcagcggctc 300
tggcaccgac ttcaccctga caatcagcag cgtgcagccc gaggacctgg ccatctacta 360
ctgccaccag tacctgagca gccggacctt tggccagggc accaagctgg aaatcaagcg 420
gggcagcaca agcggcagcg gaaagcctgg atctggcgag ggctctacca agggccaggt 480
gcagctgcag cagcctggcg ccgaagtcgt gaaacctggc gcctccgtga agatgtcctg 540
caaggccagc ggctacacct tcaccagcta ctacatccac tggatcaagc agacccctgg 600
acagggcctg gaatgggtgg gagtgatcta ccccggcaac gacgacatca gctacaacca 660
gaagttccag ggcaaggcca ccctgaccgc cgacaagtct agcaccaccg cctacatgca 720
gctgtccagc ctgaccagcg aggacagcgc cgtgtactac tgcgccagag aagtgcggct 780
gcggtacttc gatgtgtggg gccagggaac caccgtgacc gtgtccagca tcgaagtgat 840
gtacccccct ccctacctgg acaacgagaa gtccaacggc accatcatcc acgtgaaggg 900
caagcacctg tgccccagcc ctctgtttcc tggccctagc aagcccttct gggtgctggt 960
ggtcgtgggc ggagtgctgg cctgttacag cctgctcgtg acagtggcct tcatcatctt 1020
ttgggtgcgc agcaagcggt ctagactgct gcacagcgac tacatgaaca tgacccccag 1080
aaggccaggc cccacccgga agcactatca gccttacgcc cctcccagag acttcgccgc 1140
ctaccggtcc agagtgaagt tcagcagaag cgccgacgcc cctgcctatc agcagggcca 1200
gaaccagctg tacaacgagc tgaacctggg cagacgggaa gagtacgacg tgctggacaa 1260
gcggagaggc agggaccctg agatgggcgg caagcccaga cggaagaacc ctcaggaagg 1320
cctgtataac gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tactccgaga tcggcatgaa 1380
gggcgagcgg agaagaggca agggccacga tggactgtac cagggcctga gcaccgccac 1440
caaggacacc tatgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccagatgaa attcatcgac 1500
gttaactatt ctag 1514
<210> 33
<211> 850
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 33
ggtgtcgtga gcggccgctg aactggccac catggacatg agggtccctg ctcagctcct 60
ggggctcctg ctgctctggc tctcaggtgc cagatgtgag atcgtgctga cccagagccc 120
cggcagcctg gccgtgagcc ccggcaagag ggtgaccatg agctgcaaga gcagccagag 180
cgtgttcttc agcagcagcc agaagaacta cctggcctgg taccagcaga tccccggcca 240
gagccccagg ctgctgatct actgggccag caccagggag agcggcgtgc ccgacaggtt 300
caccggcagc ggcagcggca gcggcaccga cttcaccctg accatcagca gcgtgcagcc 360
cgaggacctg gccatctact actgccacca gtacctgagc agcaggacct tcggccaggg 420
caccaagctg gagatcaaga ggggcagcac cagcggcagc ggcaagcccg gcagcggcga 480
gggcagcacc aagggccagg tgcagctgca gcagcccggc gccgaggtgg tgaagcccgg 540
cgccagcgtg aagatgagct gcaaggccag cggctacacc ttcaccagct actacatcca 600
ctggatcaag cagacccccg gccagggcct ggagtgggtg ggcgtgatct accccggcaa 660
cgacgacatc agctacaacc agaagttcca gggcaaggcc accctgaccg ccgacaagag 720
cagcaccacc gcctacatgc agctgagcag cctgaccagc gaggacagcg ccgtgtacta 780
ctgcgccagg gaggtgaggc tgaggtactt cgacgtgtgg ggccagggca ccaccgtgac 840
cgtgagcagc 850
<210> 34
<211> 695
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 34
gcggccgcaa ttgaagttat gtatcctcct ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga 60
accattatcc atgtgaaagg gaaacacctt tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct 120
aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta 180
acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac 240
tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg cccacccgca agcattacca gccctatgcc 300
ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 360
cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 420
gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 480
aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 540
tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 600
cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 660
cctcgctaac gcccctctcc ctcccccccc cctaa 695
<210> 35
<211> 641
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 35
gcggccgcac tatcaatttt tgatcctcct ccttttaaag taactcttac aggaggatat 60
ttgcatattt atgaatcaca actttgttgc cagctgaagt tctggttacc cataggatgt 120
gcagcctttg ttgtagtctg cattttggga tgcatactta tttgttggct tacaaaaaag 180
aagtattcat ccagtgtgca cgaccctaac ggtgaataca tgttcatgag agcagtgaac 240
acagccaaaa aatctagact cacagatgtg accctaagag tgaagttcag caggagcgca 300
gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga 360
agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag 420
ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 480
gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc 540
ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 600
ctgccccctc gctaacgccc ctctccctcc ccccccccta a 641
<210> 36
<211> 665
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 36
gcggccgcaa ttgaagttat gtatcctcct ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga 60
accattatcc atgtgaaagg gaaacacctt tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct 120
aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta 180
acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac 240
tacatgttca tgagagcagt gaacacagcc aaaaaatcta gactcacaga tgtgacccta 300
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 360
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 420
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 480
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 540
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 600
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaac gcccctctcc ctcccccccc 660
cctaa 665
<210> 37
<211> 32
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 37
ccctcgtttc cccacagggg ccctggctat gg 32
<210> 38
<211> 32
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 38
gggagcaaag gggtgtcccc gggaccgata cc 32
<210> 39
<211> 17
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 39
ccccacaggg gccctgg 17
<210> 40
<211> 32
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 40
tcaccttctc ccaccgtgtg agtgctggtg ga 32
<210> 41
<211> 32
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 41
agtggaagag ggtggcacac tcacgaccac ct 32
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 42
gggcttttct ccccaaacga ggg 23
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 43
agggctttgt ggggaaacga gg 22
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 44
ccccgcgggg gccctggcta tgg 23
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 45
agcgctcgca cggtgggaga agg 23
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 46
atcttacctt gtgttccgga ggg 23
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工寡核苷酸
<400> 47
gtggtacctg ctggctgagg agg 23

Claims (59)

1.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性CD33基因的外显子2中包含改变的剪接受体或外显子剪接增强子位点，并且其中所述改变导致与野生型对应细胞相比，由CD33的外显子2编码的表位的表达水平降低。
2.如权利要求1所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述改变是CD33的外显子2中的所述剪接受体或外显子剪接增强子位点中的核苷酸取代。
3.如权利要求1所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述改变是CD33的内含子1/外显子2接点的核苷酸序列中的核苷酸取代。
4.如权利要求3所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述改变是选自由以下组成的组的核苷酸取代：C到T；G到A；A到G；和T到C。
5.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在内源性EMR2基因的外显子13中包含改变的剪接供体位点，并且其中所述改变导致与野生型对应细胞相比，由EMR2的外显子13编码的表位的表达水平降低。
6.如权利要求5所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述改变是EMR2的外显子13中的所述剪接供体位点中的核苷酸取代。
7.如权利要求5所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述改变是EMR2的内含子12/外显子13接点的核苷酸序列中的核苷酸取代。
8.如权利要求7所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述改变是选自由以下组成的组的核苷酸取代：C到T；G到A；A到G；和T到C。
9.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在编码谱系特异性抗原的第一内源性基因的外显子中包含改变的剪接受体或外显子剪接增强子位点并且在编码谱系特异性抗原的第二内源性基因的外显子中包含改变的剪接受体或外显子剪接增强子位点，其中所述改变导致与野生型对应细胞相比，由所述第一内源性基因的所述外显子编码的表位的表达水平降低并且/或者由所述第二内源性基因的所述外显子编码的表位的表达降低。
10.如权利要求9所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述第一内源性基因是CD33且所述外显子是外显子2，并且所述第二内源性基因是EMR2且所述外显子是外显子13。
11.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在编码谱系特异性抗原的基因中包含至少一个核苷酸取代，其中所述核苷酸取代包含在编码剪接元件的序列内，其中所述核苷酸取代引起由所述基因编码的转录物的可变剪接，并且其中所述可变剪接导致与野生型对应细胞相比，由所述基因编码的表位的表达水平降低，并且其中所述表位被免疫治疗剂靶向。
12.如权利要求11所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述剪接元件选自由以下组成的组：剪接受体、剪接供体、剪接增强子和剪接沉默子。
13.如权利要求11所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中可变剪接导致编码表位的外显子被跳过。
14.如权利要求11所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中可变剪接导致编码表位的外显子被延伸。
15.如权利要求11所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述核苷酸取代选自由以下组成的组：C到T；G到A；A到G；和T到C。
16.如权利要求1-15中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞为CD34+。
17.如权利要求1-16中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞来自受试者的骨髓细胞或外周血单核细胞。
18.如权利要求17所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述受试者是患有造血系统恶性肿瘤的人患者。
19.如权利要求17所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，其中所述受试者是健康人供体。
20.如权利要求1-19中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在任何预测脱靶位点中不包含突变。
21.一种细胞群体，所述细胞群体包含多个权利要求1-21中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞。
22.一种产生基因工程化造血干细胞或祖细胞的方法，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在编码谱系特异性抗原的基因中包含至少一个核苷酸取代，所述方法包括：
(i)提供造血干细胞或祖细胞，以及
(ii)向所述细胞中引入：(a)指导RNA(gRNA)，所述指导RNA(gRNA)包含靶向所述造血干细胞或祖细胞的基因组内包含剪接元件的核苷酸序列的靶向结构域；和(b)与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的催化受损的Cas9核酸内切酶，从而产生基因工程化造血干细胞或祖细胞。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述剪接元件选自由以下组成的组：剪接受体、剪接供体、剪接增强子和剪接沉默子。
24.如权利要求22所述的方法，其中基因中的所述至少一个核苷酸取代导致可变剪接。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述可变剪接导致编码表位的外显子被跳过。
26.如权利要求24所述的方法，其中基因中的所述至少一个核苷酸取代导致可变剪接，所述可变剪接导致编码表位的外显子被延伸。
27.如权利要求24所述的方法，其中所述核苷酸取代选自由以下组成的组：C到T；G到A；A到G；和T到C。
28.如权利要求22所述的方法，其中所述gRNA包含选自由SEQ ID NO:1-4和46-47组成的组的序列。
29.如权利要求22所述的方法，其中所述谱系特异性抗原是CD33。
30.如权利要求22所述的方法，其中所述谱系特异性抗原是EMR2。
31.一种产生基因工程化造血干细胞或祖细胞的方法，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞在编码第一谱系特异性抗原和第二谱系特异性抗原的基因中包含至少一个核苷酸取代，所述方法包括：
(i)提供造血干细胞或祖细胞，以及
(ii)向所述细胞中引入：(a)第一指导RNA(gRNA)，所述第一指导RNA(gRNA)包含靶向所述造血干细胞或祖细胞的基因组内包含剪接元件的第一核苷酸序列的靶向结构域；和(b)与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的第一催化受损的Cas9核酸内切酶，以及
(iii)进一步向所述细胞中引入：(a)第二指导RNA(gRNA)，所述第二指导RNA(gRNA)包含靶向所述造血干细胞或祖细胞的基因组内包含剪接元件的第二核苷酸序列的靶向结构域；和(b)与胞嘧啶或腺苷脱氨酶(碱基编辑器)融合的第二催化受损的Cas9核酸内切酶，从而产生基因工程化造血干细胞或祖细胞。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述剪接元件选自由以下组成的组：剪接受体、剪接供体、剪接增强子和剪接沉默子。
33.如权利要求31所述的方法，其中基因中的所述至少一个核苷酸取代导致可变剪接。
34.如权利要求31所述的方法，其中所述可变剪接导致编码表位的外显子被跳过。
35.如权利要求31所述的方法，其中基因中的所述至少一个核苷酸取代导致可变剪接，所述可变剪接导致编码表位的外显子被延伸。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述核苷酸取代选自由以下组成的组：C到T；G到A；A到G；和T到C。
37.如权利要求31所述的方法，其中所述第一gRNA包含选自由SEQ ID NO:1-3组成的组的序列并且所述第二gRNA包含选自由SEQ IDNO:4和46-47组成的组的序列。
38.如权利要求31所述的方法，其中所述第一谱系特异性抗原是CD33并且所述第二谱系特异性抗原是EMR2。
39.如权利要求22-38中任一项所述的方法，其中所述碱基编辑器是胞嘧啶碱基编辑器。
40.如权利要求22-38中任一项所述的方法，其中所述碱基编辑器是腺苷碱基编辑器。
41.如权利要求22-40中任一项所述的方法，其中(a)和(b)在一个载体上编码，所述载体引入所述细胞中。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述载体是病毒载体。
43.如权利要求22-40中任一项所述的方法，其中(b)呈蛋白质形式并且(a)和(b)作为预先形成的核糖核蛋白复合物引入所述细胞中。
44.如权利要求43所述的方法，其中通过电穿孔将所述核糖核蛋白复合物引入所述细胞中。
45.如权利要求22-44中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞或祖细胞为CD34+。
46.如权利要求22-45中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞或祖细胞来自受试者的骨髓细胞或外周血单核细胞(PBMC)。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述受试者患有造血系统病症。
48.一种基因工程化造血干细胞或祖细胞，所述基因工程化造血干细胞或祖细胞通过权利要求22-47中任一项所述的方法产生。
49.一种治疗造血系统病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求1-20和48中任一项所述的基因工程化造血干细胞或祖细胞，或权利要求21所述的细胞群体。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述造血系统病症是造血系统恶性肿瘤。
51.如权利要求49或权利要求50所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用有效量的靶向谱系特异性抗原的剂，并且其中所述剂包含结合所述谱系特异性抗原的抗原结合片段。
52.如权利要求51所述的方法，其中靶向所述谱系特异性抗原的所述剂是表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)包含结合所述谱系特异性抗原的所述抗原结合片段。
53.如权利要求51和52所述的方法，其中所述谱系特异性抗原是CD33或EMR2。
54.如权利要求51-53所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用有效量的靶向至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的剂，并且其中所述剂包含结合所述至少一种另外的谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段。
55.如权利要求52所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。
56.如权利要求49-55中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞、所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或两者是同种异体的。
57.如权利要求49-55中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞、所述基因工程化造血干细胞或祖细胞或两者是自体的。
58.如权利要求49-57中任一项所述的方法，其中所述受试者是患有霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病或多发性骨髓瘤的人患者。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述受试者是患有白血病的人患者，所述白血病是急性骨髓性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病或慢性成淋巴细胞性白血病。
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