JP2023540277A - Ｃｄ１２３改変のための組成物および方法 - Google Patents

Ｃｄ１２３改変のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、例えば、内在性ＣＤ１２３遺伝子に改変（例えば、挿入または欠失）を有する、新規な細胞を提供する。本開示はまた、かかる改変を生じさせるために使用することができる組成物、例えばｇＲＮＡも提供する。

Description

関連出願
本出願は、2020年8月28日出願の米国仮出願第63/071,993号の米国特許法第119(e)条に基づく利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる
背景
がん患者に抗ＣＤ１２３がん治療を施すと、その治療はＣＤ１２３＋がん細胞のみでなく、非がん性ＣＤ１２３＋細胞をも「on-target、off-tumor」効果で欠乏させる可能性がある。特定の造血細胞は通常はＣＤ１２３を発現するため、非がん性ＣＤ１２３＋細胞が失われると患者の造血系が欠乏する可能性がある。この欠乏に対処するために、対象には、ＣＤ１２３遺伝子の改変を含むレスキュー細胞（例えば、ＨＳＣおよび／またはＨＰＣ）を投与することができる。これらのＣＤ１２３改変細胞は抗ＣＤ１２３がん治療に耐性であることができ、したがって、抗ＣＤ１２３治療中または治療後に造血系を再増殖させることができる。
発明の概要
本明細書では、内在性ＣＤ１２３遺伝子の改変を含む治療法、ならびにその製造および使用のための戦略を提供する。本開示のいくつかの側面は、例えば、内在性ＣＤ１２３遺伝子に改変（例えば、置換、挿入または欠失）を有する、新規な細胞を提供する。本開示のいくつかの側面はまた、かかる改変を生じさせるために使用することができる組成物、例えばｇＲＮＡも提供する。本開示のいくつかの側面は、本明細書で提供される組成物を使用する方法、例えば、遺伝子操作された細胞、例えば内在性ＣＤ１２３遺伝子に改変を有する細胞を創造するために提供される、特定のｇＲＮＡを使用する方法を提供する。本開示のいくつかの側面は、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞、例えば、内在性ＣＤ１２３遺伝子に改変を有する細胞を、それを必要とする対象に投与する方法を提供する。本開示のいくつかの側面は、がんを有し、抗ＣＤ１２３がん療法を受けているかまたは受ける必要がある患者の処置のための、戦略、組成物、方法、および治療法を提供する。
列挙される態様
１．表１の標的ドメイン（例えば、配列番号１～２０または４０～４７のいずれかの標的ドメイン）に結合するターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡ。
２．表１の標的ドメイン（例えば、配列番号１～２０または４０～４７のいずれかの標的ドメイン）の切断または編集を指示することができるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡ。
３．配列番号１～８もしくは１０、または配列番号１１～１８もしくは２０のいずれかの標的ドメインに結合するターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡ。
４．配列番号９の標的ドメインに結合するターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡ。
５．配列番号１９の標的ドメインに結合するターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ターゲティングドメインが配列番号９を含まない、前記ｇＲＮＡ。
６．配列番号１９の標的ドメインに結合するターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ターゲティングドメインが少なくとも２１ヌクレオチド長である、前記ｇＲＮＡ。
７．配列番号２０の標的ドメインに結合するターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡ。
８．ターゲティングドメイン塩基対が、標的ドメインの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドと相補的である、態様５ａに記載のガイドＲＮＡ．
９．ターゲティングドメイン塩基対が、標的ドメインの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドと相補的であるか、またはターゲティングドメインが、標的ドメインとの０、１、２、または３つのミスマッチを含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
１０．ターゲティングドメインが、配列番号３１の少なくとも１６（例えば、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６）の連続したヌクレオチドを含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
１１．ターゲティングドメインが、配列番号３１の少なくとも１６（例えば、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６）の連続したヌクレオチドを含み、および塩基対が、標的ドメインの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドと相補的である、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
１２．ターゲティングドメインが、切断事象（例えば、一本鎖切断または二本鎖切断）を、標的ドメイン内に、例えば、標的ドメインのヌクレオチド位置１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の直後に提供するように構成される、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
１３．ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここでターゲティングドメインが配列番号２１の配列を含む、前記ＲＮＡ。
１４．ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここでターゲティングドメインが配列番号２２の配列を含む、前記ＲＮＡ。
１５．ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここでターゲティングドメインが配列番号２３の配列を含む、前記ＲＮＡ。
１６．ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここでターゲティングドメインが配列番号２４の配列を含む、前記ＲＮＡ。
１７．ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここでターゲティングドメインが配列番号２５の配列を含む、前記ＲＮＡ。
１８．ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここでターゲティングドメインが配列番号２６の配列を含む、前記ＲＮＡ。
１９．ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここでターゲティングドメインが配列番号２７の配列を含む、前記ＲＮＡ。
２０．ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここでターゲティングドメインが配列番号２８の配列を含む、前記ＲＮＡ。
２１．ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここでターゲティングドメインが配列番号２９の配列を含む、前記ＲＮＡ。
２２．ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここでターゲティングドメインが配列番号３０の配列を含む、前記ＲＮＡ。
２３．ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここでターゲティングドメインが配列番号４８の配列を含む、前記ＲＮＡ。
２４．ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここでターゲティングドメインが配列番号４９の配列を含む、前記ＲＮＡ。
２５．ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここでターゲティングドメインが配列番号５０の配列を含む、前記ＲＮＡ。
２６．ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここでターゲティングドメインが配列番号５１の配列を含む、前記ＲＮＡ。
２７．ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここでターゲティングドメインが表２または６の配列を含む、前記ＲＮＡ。
２８．ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここでターゲティングドメインが、表８の配列（例えば、配列番号１～１０、４０、４２、４４、４６、６６～７１、７３、７６、７７、７９～８２、８５、８７、８８、１２２、１３３、１３４、１３５、１４１～１４４、１５３、１５７、または１５８のいずれかのターゲティングドメイン）を含む、前記ＲＮＡ。
２９．表２の標的ドメイン（例えば、配列番号１～１０、４０、４２、４４，４６、４８のいずれかの標的ドメイン）の切断または編集を指示することができるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡ。
３０．表６の標的ドメイン（例えば、配列番号８、１１、１４、または６６～２５８のいずれかの標的ドメイン）の切断または編集を指示することができるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡ。
３１．表８の標的ドメイン（例えば、配列番号１～１０、４０、４２、４４、４６、６６～７１、７３、７６、７７、７９～８２、８５、８７、８８、１２２、１３３、１３４、１３５、１４１～１４４、１５３、１５７、または１５８のいずれかの標的ドメイン）の切断または編集を指示することができるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡ。
３２．標的ドメインが、配列番号３１のＣＤ１２３配列のエキソン１、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン６、エキソン７、エキソン８、エキソン９、またはエキソン１０にある、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
３３．標的ドメインが、配列番号５２のＣＤ１２３配列のエキソン１、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン６、エキソン７、エキソン８、エキソン９、エキソン１０、エキソン１１、またはエキソン１２にある、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
３４．単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
３５．ターゲティングドメインが、１６ヌクレオチド以上の長さである、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
３６．ターゲティングドメインが、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチドの長さである、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
３７．ターゲティングドメインが、配列番号１～１０、２１～３０、４０、４２、４４、４６、または４８～５１のいずれかの配列またはその逆補体、または前述のいずれかと少なくとも９０％または９５％の同一性を有する配列、または前述のいずれかと比較して１、２、または３未満の変異を有する配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
３８．２つの変異が互いに隣接していない、態様３７に記載のｇＲＮＡ。
３９．３つの変異のいずれもが互いに隣接していない、態様３７に記載のｇＲＮＡ。
４０．１、２、または３つの変異が置換である、態様３７～３９のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
４１．変異の１つ以上が挿入または欠失である、態様３７～３９のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
４２． ターゲティングドメインが、配列番号１～１０、４０、４２、４４，または４６のいずれかの配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
４３．ターゲティングドメインが配列番号１の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
４４．ターゲティングドメインが配列番号２の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
４５．ターゲティングドメインが配列番号３の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
４６．ターゲティングドメインが配列番号４の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
４７．ターゲティングドメインが配列番号５の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
４８．ターゲティングドメインが配列番号６の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
４９．ターゲティングドメインが配列番号７の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
５０．ターゲティングドメインが配列番号８の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
５１．ターゲティングドメインが配列番号９の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
５２．ターゲティングドメインが配列番号１０の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
５３．ターゲティングドメインが配列番号４０の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
５４．ターゲティングドメインが配列番号４２の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
５５．ターゲティングドメインが配列番号４４の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
５６．ターゲティングドメインが配列番号４６の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
５７．ターゲティングドメインが、配列番号１～１０、４０、４２、４４、４６、６６～７１、７３、７６、７７、７９～８２、８５、８７、８８、１２２、１３３、１３４、１３５、１４１～１４４、１５３、１５７、または１５８のいずれかの配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
５８．ターゲティングドメインが、配列番号１～１０、４０、４２、４４，または４６のいずれかの配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
５９．ターゲティングドメインが、配列番号８、１１、１４、または６６～２５８のいずれかの配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
６０．ターゲティングドメインが、配列番号２１～３０または４８～５１のいずれかの配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
６１．ターゲティングドメインが配列番号２１の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
６２．ターゲティングドメインが配列番号２２の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
６３．ターゲティングドメインが配列番号２３の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
６４．ターゲティングドメインが配列番号２４の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
６５．ターゲティングドメインが配列番号２５の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
６６．ターゲティングドメインが配列番号２６の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
６７．ターゲティングドメインが配列番号２７の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
６８．ターゲティングドメインが配列番号２８の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
６９．ターゲティングドメインが配列番号２９の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
７０．ターゲティングドメインが配列番号３０の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
７１．ターゲティングドメインが配列番号４８の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
７２．ターゲティングドメインが配列番号４９の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
７３．ターゲティングドメインが配列番号５０の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
７４．ターゲティングドメインが配列番号５１の配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
７５．ターゲティングドメインが配列番号２４７または２９７～４６１のいずれかの配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
７６．１つ以上の化学的改変（例えば、核酸塩基、糖、または骨格部分への化学的改変）を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
７７．１つ以上の２’Ｏ－メチルヌクレオチドを、例えば本明細書に記載の位置に含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
７８．１つ以上のホスホロチオアートまたはチオＰＡＣＥ結合を、例えば本明細書に記載の位置に含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
７９．Ｃａｓ９分子に結合する、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
８０．ターゲティングドメインが、約１８～２３、例えば２０ヌクレオチドの長さである、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
８１．ｔｒａｃｒＲＮＡに結合する、態様１～８０のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
８２．足場配列を含む、態様１～８０のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
８３．以下のうちの１つ以上（例えば、すべて）を含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ：
第１の相補性ドメイン；
連結ドメイン；
第１の相補性ドメインに相補的な第２の相補性ドメイン；
近位ドメイン；および
テールドメイン。
８４．第１の相補性ドメインを含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
８５．連結ドメインを含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
８６．第１の相補性ドメインに相補的な第２の相補性ドメインを含む、態様８４または８５に記載のｇＲＮＡ。
８７．近位ドメインを含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
８８．テールドメインを含む、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
８９．ターゲティングドメインが以下の１つ以上（例えば、すべて）に対して異種である、態様８３～８８のいずれかに記載のｇＲＮＡ：
第１の相補性ドメイン；
連結ドメイン；
第１の相補性ドメインに相補的な第２の相補性ドメイン；
近位ドメイン；および
テールドメイン。
９０．ｇＲＮＡが、ＩＣＥによって測定される編集頻度として、７０～１００、例えば７５～１００、８０～１００、８５～１００、９０～１００、９５～１００、または少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９９、もしくは少なくとも１００を有する、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
９１．ｇＲＮＡが、ＩＣＥによって測定される編集頻度として、２０～７０、例えば、少なくとも２５～７０、少なくとも３０～７０、少なくとも３５～７０、少なくとも４０～７０、少なくとも４５～７０、少なくとも５０～７０、少なくとも５５～７０、少なくとも６０～７０、少なくとも６５～７０、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、または少なくとも７０を有する、態様１～９０のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
９２．ｇＲＮＡが、ＩＣＥによって測定される編集頻度として少なくとも８０を有する、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
９３．ｇＲＮＡが、ＩＣＥによって測定される編集頻度のＲ２値として、０．８～１、例えば、０．８５～１、０．９～１、０．９５～１、または少なくとも０．８、少なくとも０．８５、少なくとも０．９、少なくとも０．９５、少なくとも０．９８、少なくとも０．９９、もしくは少なくとも１を有する、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
９４．ｇＲＮＡが、ＩＣＥによって測定される編集頻度のＲ２値として、少なくとも０．８５を有する、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
９５．ｇＲＮＡが、ＩＣＥによって測定される編集頻度として少なくとも８０を、およびＩＣＥによって測定される編集頻度のＲ２値として少なくとも０．８５を有する、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
９６．ｇＲＮＡが、編集頻度として、例えばサンガーシーケンシングとそれに続くＩＣＥまたはＴＩＤＥ分析によって測定された場合に、７０～１００、例えば７５～１００、８０～１００、８５～１００、９０～１００、９５～１００、または少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９９、もしくは少なくとも１００を有する、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
９７．ｇＲＮＡが、編集頻度として、例えば次世代標的アンプリコンシーケンシングによって測定された場合に、７０～１００、例えば、７５～１００、８０～１００、８５～１００、９０～１００、９５～１００、または少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９９、もしくは少なくとも１００を有する、前述の態様のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
９８．以下を含む、キットまたは組成物：
ａ）態様１～９７のいずれかに記載のｇＲＮＡ、または該ｇＲＮＡをコードする核酸、および
ｂ）第２のｇＲＮＡ、または第２のｇＲＮＡをコードする核酸。
９９．第１のｇＲＮＡが、ＴＴＴＣＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧ（配列番号７）の配列を含むターゲティングドメインを含む、態様９８に記載のキットまたは組成物。
１００．第１のｇＲＮＡが、ＡＧＴＴＣＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧＣＧ（配列番号９）の配列を含むターゲティングドメインを含む、態様９８に記載のキットまたは組成物。
１０１．第２のｇＲＮＡが、系統特異的細胞表面抗原を標的とする、態様９８～１００に記載のキットまたは組成物。
１０２．第２のｇＲＮＡが、ＣＤ１２３以外の系統特異的細胞表面抗原を標的とする、態様９８～１０１のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１０３．第２のｇＲＮＡが、ＣＤ３３を標的とする（例えば、第２のｇＲＮＡが、ＣＣＣＣＡＧＧＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴ（配列番号６４）の配列を含むターゲティングドメインを含む）、態様９８～１０２のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１０４．第２のｇＲＮＡが、ＣＬＬ－１を標的とする（例えば、第２のｇＲＮＡが、ＧＧＴＧＧＣＴＡＴＴＧＴＴＴＧＣＡＧＴＧ（配列番号６５）の配列を含むターゲティングドメインを含む）、態様９８～１０２のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１０５．第２のｇＲＮＡが、表Ａの配列を含むターゲティングドメインを含む、態様９８～１０４のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１０６．（ａ）のｇＲＮＡが、ＴＴＴＣＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧ（配列番号７）の配列を含むターゲティングドメインを含み、第２のｇＲＮＡが、ＡＧＴＴＣＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧＣＧ（配列番号９）の配列を含むターゲティングドメインを含む、態様９８～１０５のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１０７．（ａ）のｇＲＮＡが、ＴＴＴＣＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧ（配列番号７）の配列を含むターゲティングドメインを含み、第２のｇＲＮＡが、ＣＣＣＣＡＧＧＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴ（配列番号６４）の配列を含むターゲティングドメインを含む、態様９８～１０５のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１０８．（ａ）のｇＲＮＡが、ＴＴＴＣＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧ（配列番号７）の配列を含むターゲティングドメインを含み、第２のｇＲＮＡが、ＧＧＴＧＧＣＴＡＴＴＧＴＴＴＧＣＡＧＴＧ（配列番号６５）の配列を含むターゲティングドメインを含む、態様９８～１０５のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１０９．（ａ）のｇＲＮＡが、ＡＧＴＴＣＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧＣＧ（配列番号９）の配列を含むターゲティングドメインを含み、第２のｇＲＮＡが、ＣＣＣＣＡＧＧＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴ（配列番号６４）の配列を含むターゲティングドメインを含む、態様９８～１０５のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１１０．（ａ）のｇＲＮＡが、ＡＧＴＴＣＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧＣＧ（配列番号９）の配列を含むターゲティングドメインを含み、第２のｇＲＮＡが、ＧＧＴＧＧＣＴＡＴＴＧＴＴＴＧＣＡＧＴＧ（配列番号６５）の配列を含むターゲティングドメインを含む、態様９８～１０５のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１１１．第３のｇＲＮＡ、または第３のｇＲＮＡをコードする核酸をさらに含む、態様９８～１１０のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１１２．第３のｇＲＮＡが、系統特異的細胞表面抗原を標的とする、態様１１１に記載のキットまたは組成物。
１１３．第３のｇＲＮＡが、ＣＤ３３、ＣＬＬ－１、またはＣＤ１２３を標的とする、態様１１１に記載のキットまたは組成物。
１１４．（ａ）のｇＲＮＡが、ＴＴＴＣＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧ（配列番号７）の配列を含むターゲティングドメインを含み、第２のｇＲＮＡが、ＣＣＣＣＡＧＧＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴ（配列番号６４）の配列を含むターゲティングドメインを含み、および第３のｇＲＮＡが、ＧＧＴＧＧＣＴＡＴＴＧＴＴＴＧＣＡＧＴＧ（配列番号６５）の配列を含むターゲティングドメインを含む、態様１１１～１１３のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１１５．（ａ）のｇＲＮＡが、ＡＧＴＴＣＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧＣＧ（配列番号９）の配列を含むターゲティングドメインを含み、第２のｇＲＮＡが、ＣＣＣＣＡＧＧＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴ（配列番号６４）の配列を含むターゲティングドメインを含み、および第３のｇＲＮＡが、ＧＧＴＧＧＣＴＡＴＴＧＴＴＴＧＣＡＧＴＧ（配列番号６５）の配列を含むターゲティングドメインを含む、態様１１１～１１３のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１１６．（ａ）のｇＲＮＡが、ＴＴＴＣＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧ（配列番号７）の配列を含むターゲティングドメインを含み、第２のｇＲＮＡが、ＡＧＴＴＣＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧＣＧ（配列番号９）の配列を含むターゲティングドメインを含み、および第３のｇＲＮＡが、ＧＧＴＧＧＣＴＡＴＴＧＴＴＴＧＣＡＧＴＧ（配列番号６５）の配列を含むターゲティングドメインを含む、態様１１１～１１３のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１１７．（ａ）のｇＲＮＡが、ＴＴＴＣＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧ（配列番号７）の配列を含むターゲティングドメインを含み、第２のｇＲＮＡが、ＡＧＴＴＣＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧＣＧ（配列番号９）の配列を含むターゲティングドメインを含み、および第３のｇＲＮＡが、ＣＣＣＣＡＧＧＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴ（配列番号６４）の配列を含むターゲティングドメインを含む、態様１１１～１１３のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１１８．第４のｇＲＮＡ、または第４のｇＲＮＡをコードする核酸をさらに含む、態様１１１～１１７のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１１９．第４のｇＲＮＡが、系統特異的な細胞表面抗原を標的とする、態様１１８に記載のキットまたは組成物。
１２０．第４のｇＲＮＡが、ＣＤ３３、ＣＬＬ－１、またはＣＤ１２３を標的とする、態様１１８に記載のキットまたは組成物。
１２１．（ａ）のｇＲＮＡが、ＴＴＴＣＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧ（配列番号７）の配列を含むターゲティングドメインを含み、第２のｇＲＮＡが、ＡＧＴＴＣＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧＣＧ（配列番号９）の配列を含むターゲティングドメインを含み、第３のｇＲＮＡが、ＣＣＣＣＡＧＧＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴ（配列番号６４）の配列を含むターゲティングドメインを含み、および第４のｇＲＮＡが、ＧＧＴＧＧＣＴＡＴＴＧＴＴＴＧＣＡＧＴＧ（配列番号６５）の配列を含むターゲティングドメインを含む、態様１１８～１２０のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１２２．（ａ）のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡ、および第４のｇＲＮＡが混合されている、態様１１８～１２１のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１２３．（ａ）のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡ、および第４のｇＲＮＡが別個の容器に入っている、態様１１８～１２１のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１２４．（ａ）および（ｂ）が混合されている、態様９８～１２１のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１２５．（ａ）および（ｂ）が、別個の容器に入っている、態様９８～１２１のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１２６．（ａ）の核酸および（ｂ）の核酸が、同じ核酸の一部である、態様９８～１２５のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１２７．（ａ）の核酸および（ｂ）の核酸が、別個の核酸である、態様９８～１２５のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１２８．以下を含む、遺伝子操作された造血細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）：
（ａ）表１の標的ドメイン（例えば、配列番号１～１０、４０、４２、４４，または４６のいずれかの標的ドメイン）での変異；および
（ｂ）ＣＤ１２３以外の系統特異的細胞表面抗原をコードする遺伝子での、第２の変異。
１２９．（ａ）の変異が、配列番号１の標的ドメインにある、態様１２８に記載の遺伝子操作された造血細胞。
１３０．（ａ）の変異が、配列番号２の標的ドメインにある、態様１２８に記載の遺伝子操作された造血細胞。
１３１．（ａ）の変異が、配列番号３の標的ドメインにある、態様１２８に記載の遺伝子操作された造血細胞。
１３２．（ａ）の変異が、配列番号４の標的ドメインにある、態様１２８に記載の遺伝子操作された造血細胞。
１３３．（ａ）の変異が、配列番号５の標的ドメインにある、態様１２８に記載の遺伝子操作された造血細胞。
１３４．（ａ）の変異が、配列番号６の標的ドメインにある、態様１２８に記載の遺伝子操作された造血細胞。
１３５．（ａ）の変異が、配列番号７の標的ドメインにある、態様１２８に記載の遺伝子操作された造血細胞。
１３６．（ａ）の変異が、配列番号８の標的ドメインにある、態様１２８に記載の遺伝子操作された造血細胞。
１３７．（ａ）の変異が、配列番号９の標的ドメインにある、態様１２８に記載の遺伝子操作された造血細胞。
１３８．（ａ）の変異が、配列番号１０の標的ドメインにある、態様１２８に記載の遺伝子操作された造血細胞。
１３９．（ａ）の変異が、配列番号４０の標的ドメインにある、態様１２８に記載の遺伝子操作された造血細胞。
１４０．（ａ）の変異が、配列番号４２の標的ドメインにある、態様１２８に記載の遺伝子操作された造血細胞。
１４１．（ａ）の変異が、配列番号４４の標的ドメインにある、態様１２８に記載の遺伝子操作された造血細胞。
１４２．（ａ）の変異が、配列番号４６の標的ドメインにある、態様１２８に記載の遺伝子操作された造血細胞。
１４３．（ａ）の変異が、表２または６のいずれかの標的ドメインにある、態様１２８に記載の遺伝子操作された造血細胞。
１４４．（ａ）の変異が、表８の標的ドメイン（例えば、配列番号１～１０、４０、４２、４４、４６、６６～７１、７３、７６、７７、７９～８２、８５、８７、８８、１２２、１３３、１３４、１３５、１４１～１４４、１５３、１５７、または１５８のいずれかの標的ドメイン）にある、態様１２８に記載の遺伝子操作された造血細胞。
１４５．（ａ）の変異が、挿入、欠失、または置換（例えば、一塩基バリアント）を含む、態様１２８～１４４のいずれかに記載の遺伝子操作された造血細胞。
１４６．欠失が、完全に配列番号１～２０または４０～４７のいずれかの標的ドメイン内にある、態様１４５に記載の遺伝子操作された細胞。
１４７．欠失が、１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、または１７ヌクレオチドの長さである、態様１００に記載の遺伝子操作された細胞。
１４８．欠失が、配列番号１～２０または４０～４７のいずれかの標的ドメインの外側に一方または両方のエンドポイントを有する、態様１４５に記載の遺伝子操作された細胞。
１４９．変異がフレームシフトをもたらす、態様１４５～１４８のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
１５０．第２の変異が、挿入、欠失、または置換（例えば、一塩基バリアント）を含む、態様１４５～１４８のいずれかに記載の遺伝子操作された造血細胞。
１５１．ＣＤ１２３における１ｎｔもしくは２ｎｔの挿入、または１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、もしくは４ｎｔの欠失を含む、態様１４５～１４８のいずれかに記載の遺伝子操作された造血細胞。
１５２．本明細書に記載のインデル、例えば本明細書に記載のｇＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ Ａ、ｇＲＮＡ Ｇ、ｇＲＮＡ Ｉ、ｇＲＮＡ Ｎ３、ｇＲＮＡ Ｐ３、ｇＲＮＡ Ｓ３、またはｇＲＮＡ Ｄ１）によって生成されるかまたは生成可能なインデルを含む、態様１４５～１４８のいずれかに記載の遺伝子操作された造血細胞。
１５３．本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲシステム、例えば、例１、２、３、または４の方法によって生成されるかまたは生成可能なインデルを含む、態様１４５～１４８のいずれかに記載の遺伝子操作された造血細胞。
１５４．態様１～９７のいずれかに記載のｇＲＮＡ、態様１～９７のいずれかに記載のｇＲＮＡによって標的化されるターゲティングドメインを標的とするｇＲＮＡ、または態様９８～１２７のいずれかに記載の組成物またはキットの使用であって、造血細胞幹細胞または前駆細胞の試料におけるＣＤ１２３の発現をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して低下させるための、前記使用。
１５５．造血幹細胞または前駆細胞の試料におけるＣＤ１２３の発現を低下させるためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用であって、ここで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのｇＲＮＡが、態様１～９８のいずれかに記載のｇＲＮＡ、態様１～９８のいずれかに記載のｇＲＮＡによって標的化されるターゲティングドメインを標的とするｇＲＮＡ、または態様９８～１２７のいずれかに記載の組成物またはキットのｇＲＮＡである、前記使用。
１５６．遺伝子操作された細胞を生成する方法であって、以下：
（ｉ）細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞、例えば野生型造血幹細胞または前駆細胞）を提供すること、および
（ｉｉ）細胞に、（ａ）前述の態様１～９８のいずれかに記載のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、前述の態様１～９８のいずれかに記載のｇＲＮＡによって標的化されるターゲティングドメインを標的とするｇＲＮＡ、または態様９８～１２７のいずれかに記載の組成物またはキットのｇＲＮＡ；および（ｂ）ｇＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９分子）に結合するエンドヌクレアーゼを、導入すること、
を含み、これにより遺伝子操作された細胞を生成する、前記方法。
１５７．遺伝子操作された細胞を生成する方法であって、以下：
（ｉ）細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞、例えば野生型造血幹細胞または前駆細胞）を提供すること、および
（ｉｉ）細胞に、（ａ）態様１～９７のいずれかに記載のｇＲＮＡ、態様１～９７のいずれかに記載のｇＲＮＡによって標的化されるターゲティングドメインを標的とするｇＲＮＡ、または態様９８～１２７のいずれかに記載の組成物またはキットのｇＲＮＡ；および（ｂ）ｇＲＮＡに結合するＣａｓ９分子を、導入すること、
を含み、これにより遺伝子操作された細胞を生成する、前記方法。
１５８．野生型対応細胞と比較して、ＣＤ１２３の低下した発現レベルを有する遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞をもたらす、態様１５４～１５７のいずれかに記載の方法または使用。
１５９．野生型対応細胞におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満である、ＣＤ１２３の低下した発現レベルを有する遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞をもたらす、態様１５４～１５８のいずれかに記載の方法または使用。
１６０．複数の造血幹細胞または前駆細胞に対して実施される、態様１５４～１５９のいずれかに記載の方法または使用。
１６１．複数の造血幹細胞および複数の造血前駆細胞を含む細胞集団に対して実施される、態様１５４～１６０のいずれかに記載の方法または使用。
１６２．態様２８４～３８６または３８９～３９１のいずれかによる細胞集団を生成する、態様１５４～１６１のいずれかに記載の方法または使用。
１６３．（ａ）および（ｂ）の核酸が１つのベクター上にコードされて、これが細胞に導入される、態様１５６～１６２のいずれかに記載の方法。
１６４．ベクターがウイルスベクターである、態様１６３に記載の方法。
１６５．（ａ）および（ｂ）が、予め形成されたリボ核タンパク質複合体として細胞に導入される、態様１５６～１６３のいずれかに記載の方法。
１６６．リボ核タンパク質複合体が、エレクトロポレーションを介して細胞に導入される、態様１６５に記載の方法。
１６７．エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９分子）が、エンドヌクレアーゼをコードする核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ分子またはウイルスベクター、例えばＡＡＶ）を細胞に送達することによって、細胞に導入される、態様１５６～１６６のいずれかに記載の方法。
１６８．細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）が、ＣＤ３４＋である、態様１６２～１６７のいずれかに記載の方法。
１６９．細胞集団の細胞生存率が、ｇＲＮＡの細胞への導入の４８時間後に、対照細胞（例えば、モックエレクトロポレーション細胞）の細胞生存率の少なくとも８０％、９０％、９５％、または９８％である、態様１６２～１６８のいずれかに記載の方法。
１７０．集団中の細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％が、ｇＲＮＡの細胞への導入の４８時間後に生存可能である、態様１６２～１６９のいずれかに記載の方法。
１７１．造血幹細胞または前駆細胞が、対象の骨髄細胞または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からである、態様１６２～１７０のいずれかに記載の方法。
１７２．対象が、造血障害、例えば、造血器悪性腫瘍、例えば白血病（例えばＡＭＬ）、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、または有毛細胞白血病を有する、態様１６２～１７１のいずれかに記載の方法。
１７３．対象が、造血障害、例えば、造血器悪性腫瘍、例えば白血病、例えばＡＭＬを有する、態様１６２～１７２のいずれかに記載の方法。
１７４．対象が、血液学的疾患、例えば、前がん状態、例えば骨髄異形成、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、または前白血病を有する、態様１６２～１７２のいずれかに記載の方法。
１７５．対象ががんを有し、ここでがんの細胞がＣＤ１２３を発現する（例えば、少なくとも複数のがん細胞がＣＤ１２３を発現する）、態様１６２～１７４のいずれかに記載の方法。
１７６．野生型対応細胞と比較して、ＣＤ１２３の低下した発現レベルを引き起こす変異をもたらす、態様１５４～１７５のいずれかに記載の方法または使用。
１７７．野生型対応細胞と比較して、野生型ＣＤ１２３の低下した発現レベルを引き起こす変異をもたらす、態様１５４～１７６のいずれかに記載の方法または使用。
１７８．野生型対応細胞と比較して、ＣＤ１２３の低下した発現レベルを有する遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を生成する、態様１５４～１７７のいずれかに記載の方法または使用。
１７９．野生型対応細胞と比較して、野生型ＣＤ１２３の低下した発現レベルを有する遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を生成する、態様１５４～１７８のいずれかに記載の方法または使用。
１８０．態様１５４～１７９のいずれかに記載の方法によって生成される、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１８１．態様１～９７のいずれかに記載のｇＲＮＡをコードする、核酸（例えば、ＤＮＡ）。
１８２．表１の標的ドメイン（例えば、配列番号１～２０のいずれかの標的ドメイン）に変異を含み、例えばここで変異が、遺伝子操作の結果である、遺伝子操作された細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）。
１８３．表６の標的ドメイン（例えば、配列番号８、１１、１４、または６６～２５８のいずれかの標的ドメイン）に変異を含み、例えばここで変異が、遺伝子操作の結果である、遺伝子操作された細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）。
１８４．表８の標的ドメイン（例えば、配列番号１～１０、４０、４２、４４、４６、６６～７１、７３、７６、７７、７９～８２、８５、８７、８８、１２２、１３３、１３４、１３５、１４１～１４４、１５３、１５７、または１５８のいずれかの標的ドメイン）に変異を含み、例えばここで変異が、遺伝子操作の結果である、遺伝子操作された細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）。
１８５．表１の標的ドメイン（例えば、配列番号１～２０または４０～４７のいずれかの標的ドメイン）の１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０ヌクレオチド内（上流または下流）の変異を含む、遺伝子操作された細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）。
１８６．変異が、配列番号１、７、または９のいずれかの１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０ヌクレオチド内（上流または下流）にある、態様１８５に記載の遺伝子操作された細胞。
１８７．変異が、配列番号９の１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０ヌクレオチド下流にある、態様１８５に記載の遺伝子操作された細胞。
１８８．変異が、配列番号９の１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０ヌクレオチド上流にある、態様１８５に記載の遺伝子操作された細胞。
１８９．配列番号１の標的ドメインに変異を含む、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１９０．配列番号１の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１９１．配列番号１の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の、ＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１９２．配列番号２の標的ドメインに変異を含む、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１９３．配列番号２の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１９４．配列番号２の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の、ＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１９５．配列番号３の標的ドメインに変異を含む、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１９６．配列番号３の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１９７．配列番号３の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の、ＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１９８．配列番号４の標的ドメインに変異を含む、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１９９．配列番号４の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２００．配列番号４の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の、ＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２０１．配列番号５の標的ドメインに変異を含む、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２０２．配列番号５の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２０３．配列番号５の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の、ＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２０４．配列番号６の標的ドメインに変異を含む、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２０５．配列番号６の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２０６．配列番号６の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の、ＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２０７．配列番号７の標的ドメインに変異を含む、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２０８．配列番号７の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２０９．配列番号７の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の、ＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２１０．配列番号８の標的ドメインに変異を含む、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２１１．配列番号８の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２１２．配列番号８の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の、ＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２１３．配列番号９の標的ドメインに変異を含む、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２１４．配列番号９の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２１５．配列番号９の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の、ＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２１６．配列番号１０の標的ドメインに変異を含む、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２１７．配列番号１０の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２１８．配列番号１０の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の、ＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２１９．配列番号４０の標的ドメインに変異を含む、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２２０．配列番号４０の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２２１．配列番号４０の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の、ＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２２２．配列番号４２の標的ドメインに変異を含む、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２２３．配列番号４２の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２２４．配列番号４２の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の、ＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２２５．配列番号４４の標的ドメインに変異を含む、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２２６．配列番号４４の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２２７．配列番号４４の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の、ＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２２８．配列番号４６の標的ドメインに変異を含む、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２２９．配列番号４６の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２３０．配列番号４６の標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の、ＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２３１．配列番号６６～７１、７３、７６、７７、７９～８２、８５、８７、８８、１２２、１３３、１３４、１３５、１４１～１４４、１５３、１５７、または１５８のいずれかの標的ドメインに変異を含む、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２３２．配列番号６６～７１、７３、７６、７７、７９～８２、８５、８７、８８、１２２、１３３、１３４、１３５、１４１～１４４、１５３、１５７、または１５８のいずれかの標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２３３．配列番号６６～７１、７３、７６、７７、７９～８２、８５、８７、８８、１２２、１３３、１３４、１３５、１４１～１４４、１５３、１５７、または１５８のいずれかの標的ドメインに変異を含み、ここで変異が、野生型対応細胞におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の、ＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２３４．配列番号２０の標的ドメインに変異を含む、遺伝子操作された細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）。
２３５．配列番号２０の標的ドメインの２０ヌクレオチド内（上流または下流）に変異を含む、遺伝子操作された細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）。
２３６．ＣＤ１２３の遺伝子編集前の部位の配列に対する変異または配列変化を含まない予測オフターゲット部位を含む、態様１８２～２３５のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２３７．ＣＤ１２３の遺伝子編集前の部位の配列に対する変異または配列変化を含まない２つの予測オフターゲット部位を含む、態様１８２～２３６のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２３８．ＣＤ１２３の遺伝子編集前の部位の配列に対する変異または配列変化を含まない、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の予測オフターゲット部位を含む、態様１８２～２３７のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２３９．任意の予測オフターゲット部位に、例えば、標的ドメインに対して１、２、３、または４のミスマッチを有するヒトゲノムの任意の部位に、変異を含まない、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２３８のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２４０．標的ドメインに対して１つのミスマッチを有するヒトゲノムの任意の部位に変異を含まない、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２３９のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２４１．標的ドメインに対して１または２のミスマッチを有するヒトゲノムの任意の部位に変異を含まない、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２４０のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２４２．標的ドメインに対して１、２、または３のミスマッチを有するヒトゲノムの任意の部位に変異を含まない、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２４１のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２４３．標的ドメインに対して１、２、３、または４のミスマッチを有するヒトゲノムの任意の部位に変異を含まない、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２４２のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２４４．変異が、挿入、欠失、または置換（例えば、一塩基バリアント）を含む、態様２３９～２４３のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２４５．欠失が完全に、配列番号１～２０、４０～４７、６６～７１、７３、７６、７７、７９～８２、８５、８７、８８、１２２、１３３、１３４、１３５、１４１～１４４、１５３、１５７、または１５８のいずれかの標的ドメイン内にある、態様２４４に記載の遺伝子操作された細胞。
２４６．欠失が、１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、または１７ヌクレオチドの長さである、態様２４４～２４５に記載の遺伝子操作された細胞。
２４７．欠失が、配列番号１～２０、４０～４７、６６～７１、７３、７６、７７、７９～８２、８５、８７、８８、１２２、１３３、１３４、１３５、１４１～１４４、１５３、１５７、または１５８のいずれかの標的ドメインの外側に一方または両方のエンドポイントを有する、態様２４４に記載の遺伝子操作された細胞。
２４８．変異がフレームシフトをもたらす、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２４７のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２４９．変異が、野生型対応細胞と比較して、野生型ＣＤ１２３の発現レベルの低下（例えば、野生型対応細胞のレベルの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満）をもたらす、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２４８のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）。
２５０．細胞が、野生型対応細胞と比較して、野生型ＣＤ１２３タンパク質の低下したレベル（例えば、野生型対応細胞のレベルの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満）を有する、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２４９のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２５１．ＣＤ１２３を発現しない、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２５０のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２５２．変異が、ＣＤ１２３の発現の欠如をもたらす、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２５１のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）。
２５３．野生型対応細胞によって発現されるＣＤ１２３の２０％未満を発現する、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２５２のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）。
２５４．ＣＤ１２３の低下した発現レベルが、造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、最終的に分化した）細胞内にあり、および野生型対応細胞が、野生型造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、最終的に分化した）細胞である、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２５３のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）。
２５５．造血幹細胞または前駆細胞から分化した細胞が、骨髄芽球、単球、または骨髄樹状細胞である、態様２５４に記載の遺伝子操作された細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）。
２５６．ＣＤ３４＋である、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２５３のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２５７．対象の骨髄細胞または末梢血単核細胞に由来する、様１２８～１５３、１８０、または１８２～２５６のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２５８．対象が、造血器悪性腫瘍、例えばＡＭＬを有するヒト患者である、態様２５７に記載の遺伝子操作された細胞。
２５９．対象が、血液学的疾患、例えば、前がん状態、例えば骨髄異形成、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、または前白血病を有するヒト患者である、態様２５７に記載の遺伝子操作された細胞。
２６０．対象ががんを有し、がんの細胞がＣＤ１２３を発現する（例えば、少なくとも複数のがん細胞がＣＤ１２３を発現する）、態様２５７～２５９のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２６１．対象が、健康なヒトドナー（例えば、ＨＬＡ適合ドナー）である、態様２５７に記載の遺伝子操作された細胞。
２６２．ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはメガヌクレアーゼ、またはヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）をさらに含み、ここで任意に、ヌクレアーゼがＣＤ１２３に特異的である、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２６１のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２６３．ＣＤ１２３に特異的なｇＲＮＡ（例えば、単一ガイドＲＮＡ）、またはｇＲＮＡをコードする核酸をさらに含む、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２６２のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２６４．ｇＲＮＡが、本明細書に記載のｇＲＮＡ、例えば、態様１～９８のいずれかに記載のｇＲＮＡである、態様２６３に記載の遺伝子操作された細胞。
２６５．細胞を、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはメガヌクレアーゼから選択されたヌクレアーゼと接触させること（例えば、細胞をヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸と接触させることによる）を含むプロセスにより作製された、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２６４のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２６６．細胞を、例えば、機能ドメインに融合した、ニッカーゼまたは触媒的に不活性なＣａｓ９分子（ｄＣａｓ９）と接触させること（例えば、細胞をヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸と接触させることによる）を含むプロセスにより作製された、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２６４のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２６７．ＣＤ１２３の両方のコピーが、変異体である、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２６６のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２６８．ＣＤ１２３の両方のコピーが、同じ変異を有する、態様２６７に記載の遺伝子操作された細胞。
２６９．ＣＤ１２３のコピーが、異なる変異を有する、態様２６７に記載の遺伝子操作された細胞。
２７０．第１の変異を有するＣＤ１２３の第１のコピーおよび第２の変異を有するＣＤ１２３の第２のコピーを含み、ここで第１および第２の変異が異なる、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２６９のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２７１．ＣＤ１２３の第１のコピーが、第１の欠失を含む、態様２７０に記載の遺伝子操作された細胞。
２７２．ＣＤ１２３の第２のコピーが、第２の欠失を含む、態様２７０または２７１に記載の遺伝子操作された細胞。
２７３．第１および第２の欠失が重複する、態様２７０～２７２のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２７４．第１の欠失のエンドポイントが、第２の欠失内にある、態様２７０～２７３のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２７５．第１の欠失の両方のエンドポイントが、第２の欠失内にある、態様２７０～２７４のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２７６．第１および第２の欠失が、エンドポイントを共有する、態様２７０～２７２のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２７７．第１および第２の変異が、それぞれ独立して以下：１ｎｔもしくは２ｎｔの挿入、または１ｎｔ、３、２ｎｔ、もしくは４ｎｔの欠失、から選択される、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２７６のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２７８．ＢＦＵ－Ｅコロニー、ＣＦＵ－Ｇコロニー、ＣＦＵ－Ｍコロニー、ＣＦＵ－ＧＭコロニー、またはＣＦＵ－ＧＥＭＭコロニーを形成することができる、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２７７のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２７９．サイトカイン、例えば、炎症性サイトカイン、例えばＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、またはＭＩＰ－１αを産生可能な、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２７８のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２８０．サイトカイン、例えば、炎症性サイトカイン、例えばＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、またはＭＩＰ－１αを、ＣＤ１２３野生型の他の点では類似の細胞に匹敵するレベルで産生可能な、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２７９のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２８１．サイトカイン、例えば、炎症性サイトカイン、例えばＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、またはＭＩＰ－１αを、ＣＤ１２３野生型の他の点では類似の細胞によって産生されるレベルの少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％のレベルで産生可能な、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２８０のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２８２．例えば例５に記載されるとおり、ＴＬＲアゴニスト例えばＬＰＳまたはＲ８４８で刺激された場合に、サイトカインを産生可能な、態様２７９～２８１のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２８３．食作用が可能である、態様２７９～２８１のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
２８４．態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２８３のいずれかに記載の複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む（例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞、またはそれらの組み合わせを含む）、細胞集団。
２８５．配列番号１の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む、細胞集団。
２８６．配列番号１の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、野生型対応細胞集団と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、前記細胞集団。
２８７．配列番号１の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、ＣＤ１２３の発現レベルの、野生型対応細胞集団におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の低下をもたらす、前記細胞集団。
２８８．配列番号２の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む、細胞集団。
２８９．配列番号２の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、野生型対応細胞集団と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、前記細胞集団。
２９０．配列番号２の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、ＣＤ１２３の発現レベルの、野生型対応細胞集団におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の低下をもたらす、前記細胞集団。
２９１．配列番号３の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む、細胞集団。
２９２．配列番号３の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、野生型対応細胞集団と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、前記細胞集団。
２９３．配列番号３の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、ＣＤ１２３の発現レベルの、野生型対応細胞集団におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の低下をもたらす、前記細胞集団。
２９４．配列番号４の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む、細胞集団。
２９５．配列番号４の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、野生型対応細胞集団と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、前記細胞集団。
２９６．配列番号４の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、ＣＤ１２３の発現レベルの、野生型対応細胞集団におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の低下をもたらす、前記細胞集団。
２９７．配列番号５の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む、細胞集団。
２９８．配列番号５の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、野生型対応細胞集団と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、前記細胞集団。
２９９．配列番号５の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、ＣＤ１２３の発現レベルの、野生型対応細胞集団におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の低下をもたらす、前記細胞集団。
３００．配列番号６の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む、細胞集団。
３０１．配列番号６の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、野生型対応細胞集団と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、前記細胞集団。
３０２．配列番号６の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、ＣＤ１２３の発現レベルの、野生型対応細胞集団におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の低下をもたらす、前記細胞集団。
３０３．配列番号７の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む、細胞集団。
３０４．配列番号７の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、野生型対応細胞集団と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、前記細胞集団。
３０５．配列番号７の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、ＣＤ１２３の発現レベルの、野生型対応細胞集団におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の低下をもたらす、前記細胞集団。
３０６．配列番号８の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む、細胞集団。
３０７．配列番号８の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、野生型対応細胞集団と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、前記細胞集団。
３０８．配列番号８の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、ＣＤ１２３の発現レベルの、野生型対応細胞集団におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の低下をもたらす、前記細胞集団。
３０９．配列番号９の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む、細胞集団。
３１０．配列番号９の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、野生型対応細胞集団と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、前記細胞集団。
３１１．配列番号９の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、ＣＤ１２３の発現レベルの、野生型対応細胞集団におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の低下をもたらす、前記細胞集団。
３１２．配列番号１０の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む、細胞集団。
３１３．配列番号１０の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、野生型対応細胞集団と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、前記細胞集団。
３１４．配列番号１０の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、ＣＤ１２３の発現レベルの、野生型対応細胞集団におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の低下をもたらす、前記細胞集団。
３１５．配列番号４０の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む、細胞集団。
３１６．配列番号４０の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、野生型対応細胞集団と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、前記細胞集団。
３１７．配列番号４０の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、ＣＤ１２３の発現レベルの、野生型対応細胞集団におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の低下をもたらす、前記細胞集団。
３１８．配列番号４２の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む、細胞集団。
３１９．配列番号４２の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、野生型対応細胞集団と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、前記細胞集団。
３２０．配列番号４２の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、ＣＤ１２３の発現レベルの、野生型対応細胞集団におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の低下をもたらす、前記細胞集団。
３２１．配列番号４４の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む、細胞集団。
３２２．配列番号４４の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、野生型対応細胞集団と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、前記細胞集団。
３２３．配列番号４４の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、ＣＤ１２３の発現レベルの、野生型対応細胞集団におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の低下をもたらす、前記細胞集団。
３２４．配列番号４６の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む、細胞集団。
３２５．配列番号４６の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、野生型対応細胞集団と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、前記細胞集団。
３２６．配列番号４６の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、ＣＤ１２３の発現レベルの、野生型対応細胞集団におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の低下をもたらす、前記細胞集団。
３２７．配列番号６６～７１、７３、７６、７７、７９～８２、８５、８７、８８、１２２、１３３、１３４、１３５、１４１～１４４、１５３、１５７、または１５８の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む、細胞集団。
３２８．配列番号６６～７１、７３、７６、７７、７９～８２、８５、８７、８８、１２２、１３３、１３４、１３５、１４１～１４４、１５３、１５７、または１５８の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、野生型対応細胞集団と比較してＣＤ１２３の発現レベルの低下をもたらす、前記細胞集団。
３２９．配列番号６６～７１、７３、７６、７７、７９～８２、８５、８７、８８、１２２、１３３、１３４、１３５、１４１～１４４、１５３、１５７、または１５８の標的ドメインに変異を含む複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団であって、ここで変異が、ＣＤ１２３の発現レベルの、野生型対応細胞集団におけるＣＤ１２３のレベルの２０％未満の低下をもたらす、前記細胞集団。
３３０．細胞集団が、ＣＤ１２３野生型造血幹細胞または前駆細胞に由来する同じ分化細胞型によって発現されるＣＤ１２３のレベルに関して、ＣＤ１２３を低下したレベルで発現する細胞型に分化することができる、態様２８４～２２０のいずれかに記載の細胞集団。
３３１．造血幹細胞または前駆細胞が操作されて、これに由来する骨髄前駆細胞が、ＣＤ１２３野生型造血幹細胞または前駆細胞に由来する骨髄前駆細胞に比べて、ＣＤ１２３レベルが不十分であるようになっている、態様２８４～３３０のいずれかに記載の細胞集団。
３３２．造血幹細胞または前駆細胞が操作されて、これに由来する骨髄前駆細胞（例えば、最終分化した骨髄細胞）が、ＣＤ１２３野生型造血幹細胞または前駆細胞に由来する骨髄前駆細胞（例えば、最終分化した骨髄細胞）に比べて、ＣＤ１２３レベルが不十分であるようになっている、態様２８４～３３０のいずれかに記載の細胞集団。
３３３．１つ以上の非操作ＣＤ１２３遺伝子を含む１つ以上の細胞をさらに含む、態様２８４～３３２のいずれかに記載の細胞集団。
３３４．ＣＤ１２３のホモ接合性野生型である１つ以上の細胞をさらに含む、態様２８４～３３３のいずれかに記載の細胞集団。
３３５．集団中の細胞の約０～１％、１～２％、２～５％、５～１０％、１０～１５％、または１５～２０％が、ＣＤ１２３のホモ接合性野生型であり、例えば、ＣＤ１２３のホモ接合性野生型である造血幹細胞または前駆細胞である、態様２８４～３３４のいずれかに記載の細胞集団。
３３６．ＣＤ１２３のヘテロ接合性である１つ以上の細胞をさらに含む、例えば、ＣＤ１２３の１つの野生型コピーとＣＤ１２３の１つの変異型コピーを含む、態様２８４～３３４のいずれかに記載の細胞集団。
３３７．集団中の細胞の約０～１％、１～２％、２～５％、５～１０％、１０～１５％、または１５～２０％が、ＣＤ１２３のヘテロ接合性野生型であり、例えば、ＣＤ１２３の１つの野生型コピーとＣＤ１２３の１つの変異型コピーを含む造血幹細胞または前駆細胞である、態様２８４～３３６のいずれかに記載の細胞集団。
３３８．集団中のＣＤ１２３のコピーの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が変異体である、態様２８４～３３７のいずれかに記載の細胞集団。
３３９．複数の異なるＣＤ１２３変異を含む、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の異なる変異を含む、態様２８４～３３８のいずれかに記載の細胞集団。
３４０．少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の異なる変異を含む、態様２８４～３３９のいずれかに記載の細胞集団。
３４１．２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の異なる挿入を含む、態様２８４～３４０のいずれかに記載の細胞集団。
３４２．複数の挿入および複数の欠失を含む、態様２８４～３４１のいずれかに記載の細胞集団。
３４３．野生型対応細胞集団によって発現されるＣＤ１２３の２０％未満を発現する、態様２８４～３４２のいずれかに記載の細胞集団。
３４４．ＣＤ１２３の発現レベルの低下が、造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、最終的に分化した）細胞内にあり、野生型対応細胞が、野生型造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、最終的に分化した）細胞である、態様２８４～３４３のいずれかに記載の細胞集団。
３４５．造血幹細胞または前駆細胞から分化した細胞が、骨髄芽球、単球、または骨髄樹状細胞である、態様３４４に記載の細胞集団。
３４６．対象に投与された場合、例えば、投与後１６週間でアッセイされた場合に、対象においてｈＣＤ４５＋細胞を産生する、態様２８４～３４５のいずれかに記載の細胞集団。
３４７．他の点では類似のＣＤ１２３野生型である細胞集団で産生されるｈＣＤ４５＋細胞のレベルに匹敵するレベルのｈＣＤ４５＋細胞を産生する、態様３４６に記載の細胞集団。
３４８．他の点では類似のＣＤ１２３野生型である細胞集団により産生されるｈＣＤ４５＋細胞のレベルの少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％である、ｈＣＤ４５＋細胞のレベルを産生する、態様３４６または３４７に記載の細胞集団。
３４９．対象に投与された場合、例えば、投与後１６週間でアッセイされた場合に、対象においてＣＤ３４＋細胞を産生する、態様２８４～３４８のいずれかに記載の細胞集団。
３５０．他の点では類似のＣＤ１２３野生型である細胞集団で産生されるｈＣＤ３４＋細胞のレベルに匹敵するレベルのｈＣＤ３４＋細胞を産生する、態様３４９に記載の細胞集団。
３５１．他の点では類似のＣＤ１２３野生型である細胞集団により産生されるｈＣＤ３４＋細胞のレベルの少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％である、ｈＣＤ３４＋細胞のレベルを産生する、態様３４９または３５０に記載の細胞集団。
３５２．対象に投与された場合、例えば、投与後１６週間でアッセイされた場合に、対象において肥満細胞、好塩基球、好酸球、標準型樹状細胞（ｃＤＣ）、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、好中球、単球、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはそれらの任意の組み合わせを産生する、態様２８４～３５１のいずれかに記載の細胞集団。
３５３．肥満細胞、好塩基球、好酸球、標準型樹状細胞（ｃＤＣ）、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、好中球、単球、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはそれらの任意の組み合わせのレベルであって、他の点では類似のＣＤ１２３野生型である細胞集団で産生される前記細胞型のレベルに匹敵する前記レベルを産生する、態様３５２に記載の細胞集団。
３５４．肥満細胞、好塩基球、好酸球、標準型樹状細胞（ｃＤＣ）、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、好中球、単球、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはそれらの任意の組み合わせのレベルであって、他の点では類似のＣＤ１２３野生型である細胞集団で産生される前記細胞型のレベルの少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の前記レベルを産生する、態様３５２または３５３に記載細胞集団。
３５５．産生された細胞が、対象から得られた血液試料、骨髄試料、または脾臓試料で検出される、態様３５２～３５４のいずれかに記載の細胞集団。
３５６．対象に投与された場合、対象において少なくとも８、１２、または１６週間持続する、態様２８４～３５５のいずれかに記載の細胞集団。
３５７．対象に投与された場合、多系統の造血再構成を提供する、態様２８４～３５６のいずれかに記載の細胞集団。
３５８．例えば遺伝子操作の７日後または１４日後にアッセイされた場合に、ＣＤ１４＋細胞を産生する、態様２８４～３５７のいずれかに記載の細胞集団。
３５９．他の点では類似のＣＤ１２３野生型である細胞集団で産生されるＣＤ１４＋細胞のレベルに匹敵するレベルのＣＤ１４＋細胞を産生する、態様３５８に記載の細胞集団。
３６０．他の点では類似のＣＤ１２３野生型である細胞集団により産生されるＣＤ１４＋細胞のレベルの少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％である、ＣＤ１４＋細胞のレベルを産生する、態様３５８または３５９に記載の細胞集団。
３６１．ＣＤ１４＋レベルが、骨髄分化培地でin vitroで培養された後にアッセイされる、３５８～３６０のいずれかの態様に記載の細胞集団。
３６２．例えば遺伝子操作の７日後または１４日後にアッセイされた場合に、ＣＤ１１ｂ＋細胞を産生する、態様２８４～３６１のいずれかに記載の細胞集団。
３６３．他の点では類似のＣＤ１２３野生型である細胞集団で産生されるＣＤ１１ｂ＋細胞のレベルに匹敵するレベルのＣＤ１１ｂ＋細胞を産生する、態様３６２に記載の細胞集団。
３６４．他の点では類似のＣＤ１２３野生型である細胞集団により産生されるＣＤ１１ｂ＋細胞のレベルの少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％である、ＣＤ１１ｂ＋細胞のレベルを産生する、態様３６２または３６３に記載の細胞集団。
３６５．ＣＤ１１ｂ＋レベルが、骨髄分化培地でin vitroで培養された後にアッセイされる、３５８～３６４のいずれかの態様に記載の細胞集団。
３６６．例えば遺伝子操作の７日後または１４日後にアッセイされた場合に、ＣＤ１５＋細胞を産生する、態様２８４～３６５のいずれかに記載の細胞集団。
３６７．他の点では類似のＣＤ１２３野生型である細胞集団で産生されるＣＤ１１ｂ＋細胞のレベルに匹敵するレベルのＣＤ１５＋細胞を産生する、態様３６６に記載の細胞集団。
３６８．他の点では類似のＣＤ１２３野生型である細胞集団により産生されるＣＤ１５＋細胞のレベルの少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％である、ＣＤ１５＋細胞のレベルを産生する、態様３６６または３６７に記載の細胞集団。
３６９．ＣＤ１５＋レベルが、骨髄分化培地でin vitroで培養された後にアッセイされる、３５８～３６８のいずれかの態様に記載の細胞集団。
３７０．細胞集団におけるＣＤ１２３の最も豊富な変異が、挿入、例えば、１ｎｔ、２ｎｔ、または３ｎｔの挿入である、態様２８４～３６９のいずれかに記載の細胞集団。
３７１．細胞集団におけるＣＤ１２３の最も豊富な変異が、１ｎｔの挿入である、態様２８４～３７０のいずれかに記載の細胞集団。
３７２．ＣＤ１２３の配列番号１１の配列内の、細胞集団における最も豊富な変異が、挿入、例えば、１ｎｔの挿入である、態様２８４～３７０のいずれかに記載の細胞集団。
３７３．ＣＤ１２３のコピー中の配列番号１１の配列内に、１ｎｔの欠失をさらに含む、態様２８４～３７０または３７２に記載の細胞集団。
３７４．ＣＤ１２３の配列番号７の配列内の、細胞集団における最も豊富な変異が、挿入、例えば、１ｎｔの挿入である、態様２８４～３７０のいずれかに記載の細胞集団。
３７５．ＣＤ１２３のコピー中の配列番号７の配列内に、１ｎｔの欠失をさらに含む、態様２８４～３７０または３７４に記載の細胞集団。
３７６．ＣＤ１２３の配列番号９の配列内の、細胞集団における最も豊富な変異が、挿入、例えば、１ｎｔの挿入である、態様２８４～３７０のいずれかに記載の細胞集団。
３７７．ＣＤ１２３のコピー中の配列番号９の配列内に、１ｎｔの欠失をさらに含む、態様２８４～３７０または３７６に記載の細胞集団。
３７８．ＣＤ１２３の配列番号４１の配列内の、細胞集団における最も豊富な変異が、挿入、例えば１ｎｔの挿入である、態様２８４～３７０のいずれかに記載の細胞集団。
３７９．ＣＤ１２３のコピー中の配列番号４１の配列内に、２ｎｔの欠失をさらに含む、態様２８４～３７０または３７８に記載の細胞集団。
３８０．ＣＤ１２３の配列番号４３の配列内の、細胞集団における最も豊富な変異が、挿入、例えば、１ｎｔの挿入である、態様２８４～３７０のいずれかに記載の細胞集団。
３８１．ＣＤ１２３のコピー中の配列番号４３の配列内に、７ｎｔの欠失をさらに含む、態様２８４～３７０または３８０に記載の細胞集団。
３８２．ＣＤ１２３の配列番号４４の配列内の、細胞集団における最も豊富な変異が、挿入、例えば、１ｎｔの挿入である、態様２８４～３７０のいずれかに記載の細胞集団。
３８３．ＣＤ１２３のコピー中の配列番号４４の配列内に、２ｎｔの欠失をさらに含む、態様２８４～３７０または３８２のいずれかに記載の細胞集団。
３８４．ＣＤ１２３の配列番号４６の配列内の、細胞集団における最も豊富な変異が、挿入、例えば、１ｎｔの挿入である、態様２８４～３７０のいずれかに記載の細胞集団。
３８５．ＣＤ１２３のコピー中の配列番号４６の配列内に、５ｎｔの欠失をさらに含む、態様２８４～３７０または３８４のいずれかに記載の細胞集団。
３８６．造血幹細胞および造血前駆細胞を含む、態様２８４～３８５のいずれかに記載の細胞集団。
３８７．態様１２８～１５３または１８２～２８３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む、医薬組成物。
３８８．態様２８４～３８６のいずれかに記載の細胞集団を含む、医薬組成物。
３８９．集団中の細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％が生存可能である、態様２８４～３８６のいずれかに記載の細胞集団。
３９０．ＣＤ１２３のコピーの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、変異を含む、態様２８４～３８６または３８９のいずれかに記載の細胞集団。
３９１．集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が、例えばＣＤ１２３細胞表面発現用のフローサイトメトリーアッセイを、例えば例１に記載のとおり使用した場合、ＣＤ１２３の細胞表面発現について陰性である、態様２８４～３８６、３８９、または３９０のいずれかに記載の細胞集団。
３９２．以下を含む、混合物、例えば反応混合物：
ａ）態様１～９８のいずれかに記載のｇＲＮＡ、または態様９９～１２７のいずれかに記載の組成物またはキットのｇＲＮＡ；および
ｂ）細胞、例えば造血細胞、例えばＨＳＣまたはＨＰＣ、例えば、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２８３のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
３９３．細胞が、野生型細胞またはＣＤ１２３に変異を有する細胞である、態様３９２に記載の混合物。
３９４．次のいずれか２つ以上（例えば、３つまたはすべて）を含む、キット：
ａ）態様１～９７のいずれかに記載のｇＲＮＡ；
ｂ）細胞、例えば造血細胞、例えばＨＳＣまたはＨＰＣ、例えば、態様１２８～１５３、１８０、または１８２～２８３のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞；
ｃ）Ｃａｓ９分子；および
ｄ）ＣＤ１２３を標的とする薬剤、例えば本明細書に記載の薬剤。
３９５．（ａ）と（ｂ）、（ａ）と（ｃ）、（ａ）と（ｄ）、（ｂ）と（ｃ）、（ｂ）と（ｄ）、または（ｃ）と（ｄ）を含む、態様３９４に記載のキット。
３９６．態様１２６もしくは１２８～１５３、１８０、もしくは１８２～２８３のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）、または態様２８４～３８６、３８９～３９１のいずれかに記載の細胞集団を作製する方法であって、以下：
（ｉ）細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞、例えば野生型造血幹細胞または前駆細胞）を提供すること、および
（ｉｉ）細胞に、標的ドメインを切断するヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼを導入すること、
を含み、これにより、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を生成する、前記方法。
３９７．（ｉｉ）が、細胞に、標的ドメインに結合するｇＲＮＡ（例えば、態様１～９７のいずれかに記載のｇＲＮＡおよびｇＲＮＡに結合するエンドヌクレアーゼ）を導入することを含む、態様３９６に記載の方法。
３９８．エンドヌクレアーゼが、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、またはメガヌクレアーゼである、態様３９７に記載の方法。
３９９．ＨＳＣ、ＨＰＣ、またはＨＳＰＣを対象に供給する方法であって、態様１２６もしくは１２８～１５３、１８０、もしくは１８２～２８３のいずれかに記載の複数の細胞、または態様２８４～３８６もしくは３８９～３９１のいずれかに記載の細胞集団を、対象に投与することを含む、前記方法。
４００．態様１２６もしくは１２８～１５３、１８０、もしくは１８２～２８３のいずれかに記載の複数の細胞、または態様２８４～３８６もしくは３８９～３９１のいずれかに記載の細胞集団を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
４０１．対象ががんを有し、がんの細胞がＣＤ１２３を発現する（例えば、少なくとも複数のがん細胞がＣＤ１２３を発現する）、態様３９９または４００に記載の方法。
４０２．ＣＤ１２３を標的とする有効量の薬剤を対象に投与することをさらに含み、ここで薬剤が、ＣＤ１２３に結合する抗原結合フラグメントを含む、態様３９９～４０１のいずれかに記載の方法。
４０３．ＣＤ１２３を標的とする薬剤が、ＣＤ１２３に結合する抗原結合フラグメントを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞である、態様４０２に記載の方法。
４０４．造血障害の処置に使用するための、態様１２８～１５３、１８０、もしくは１８２～２８３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞、または態様２８４～３８６もしくは３８９～３９１のいずれかに記載の細胞集団であって、ここで処置が、それを必要とする対象に、有効量の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞または細胞集団を投与することを含み、さらに、対象にＣＤ１２３を標的とする有効量の薬剤を投与することを含み、ここで薬剤が、ＣＤ１２３に結合する抗原結合フラグメントを含む、前記の細胞または細胞集団。
４０５．ＣＤ１２３を標的とする薬剤であって、ここで薬剤が、造血障害の処置に使用するための、ＣＤ１２３に結合する抗原結合フラグメントを含み、ここで処置が、それを必要とする対象に、ＣＤ１２３を標的とする有効量の薬剤を投与することを含み、さらに、対象に対して有効量の態様１２８～１５３、１８０、もしくは１８２～２８３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞、または態様２８４～３８６もしくは３８９～３９１のいずれかに記載の細胞集団を投与することを含む、前記薬剤。
４０６．態様１２８～１５３、１８０、もしくは１８２～２８３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞、または態様２８４～３８６もしくは３８９～３９１のいずれかに記載の細胞集団と、ＣＤ１２３を標的とする薬剤との組み合わせであって、ここで薬剤が、造血障害の処置に使用するための、ＣＤ１２３に結合する抗原結合フラグメントを含み、ここで処置が、それを必要とする対象に、有効量の遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団、およびＣＤ１２３に結合する薬剤を投与することを含む、前記組み合わせ。
４０７．がん免疫療法で使用するための、態様１２８～１５３、１８０、もしくは１８２～２８３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞、または態様２８４～３８６もしくは３８９～３９１のいずれかに記載の細胞集団。
４０８．がん免疫療法で使用するための、態様１２８～１５３、１８０、もしくは１８２～２８３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞、または態様２８４～３８６もしくは３８９～３９１のいずれかに記載の細胞集団であって、ここで対象が、造血障害を有する、前記の細胞または細胞集団。
４０９．造血障害を有する対象の造血系再増殖に使用するための、態様１２８～１５３、１８０、もしくは１８２～２８３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞、または態様２８４～３８６もしくは３８９～３９１のいずれかに記載の細胞集団。
４１０．造血障害を処置する方法で使用するための、態様１２８～１５３、１８０、もしくは１８２～２８３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞、または態様２８４～３８６もしくは３８９～３９１のいずれかに記載の細胞集団であって、これにより、本明細書に記載の造血幹細胞もしくは前駆細胞または本明細書に記載の細胞集団が、対象を再増殖させる、前記の細胞または細胞集団。
４１１．免疫療法においてＣＤ１２３を標的とする薬剤の細胞障害効果を低減するのに使用するための、態様１２８～１５３、１８０、もしくは１８２～２８３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞、または態様２８４～３８６もしくは３８９～３９１のいずれかに記載の細胞集団。
４１２．ＣＤ１２３を標的とする薬剤を使用する免疫療法で使用するための、態様１２８～１５３、１８０、もしくは１８２～２８３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞、または態様２８４～３８６もしくは３８９～３９１のいずれかに記載の細胞集団であって、これにより、本明細書に記載の造血幹細胞もしくは前駆細胞または本明細書に記載の細胞集団が、ＣＤ１２３を標的とする薬剤の細胞障害効果を低減する、前記の細胞または細胞集団。
４１３．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞または細胞集団が、ＣＤ１２３を標的とする薬剤と同時に投与される、態様３９９～４１２のいずれかに記載の方法、細胞、薬剤、または組み合わせ。
４１４．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞または細胞集団が、ＣＤ１２３を標的とする薬剤の前に投与される、態様３９９～４１３のいずれかに記載の方法、細胞、薬剤、または組み合わせ。
４１５．ＣＤ１２３を標的とする薬剤が、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞または細胞集団の前に投与される、態様３９９～４１４のいずれかに記載の方法、細胞、薬剤、または組み合わせ。
４１６．免疫細胞がＴ細胞である、態様３９９～４１５のいずれかに記載の方法、細胞、薬剤、または組み合わせ。
４１７．免疫細胞、遺伝子操作された造血幹細胞および／もしくは前駆細胞、またはその両方が、同種異系である、態様３９９～４１６のいずれかに記載の方法、細胞、薬剤、または組み合わせ。
４１８．免疫細胞、遺伝子操作された造血幹細胞および／もしくは前駆細胞、またはその両方が、自己由来である、態様３９９～４１７のいずれかに記載の方法、細胞、薬剤、または組み合わせ。
４１９．キメラ受容体の抗原結合フラグメントが、ヒトＣＤ１２３に特異的に結合する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である、態様３９９～４１８のいずれかに記載の方法、細胞、薬剤、または組み合わせ。
４２０．造血障害ががんであり、がんの少なくとも複数のがん細胞がＣＤ１２３を発現する、態様３９９～４１９のいずれかに記載の方法、細胞、薬剤、または組み合わせ。
４２１．対象が、造血器悪性腫瘍、例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病または慢性リンパ芽球性白血病、および慢性リンパ性白血病）、または多発性骨髄腫から選択される造血器悪性腫瘍を有する、態様３９９～４２０のいずれかに記載の方法、細胞、薬剤、または組み合わせ。
４２２．対象が、血液学的疾患、例えば、前がん状態、例えば骨髄異形成、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、または前白血病を有する、態様３９９～４２０のいずれかに記載の方法、細胞、薬剤、または組み合わせ。
上記の要約は、非限定的な様式で、本明細書に開示される技術のいくつかの態様、利点、特徴、および使用を説明することを意図している。本明細書に開示される技術の他の態様、利点、特徴、および使用は、詳細な説明、図面、実施例、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
図１は、ＣＤ３４＋細胞でのＣＤ１２３ ｇＲＮＡスクリーニングを示すグラフである。ヒトＣＤ３４＋細胞に、Ｃａｓ９タンパク質およびＣＤ１２３を標的とするｇＲＮＡ（ｙ軸に列挙）をエレクトロポレーションした。ｘ軸に示すＩＬ３ＲＡ遺伝子座の編集効率は、サンガーシーケンシングおよびＴＩＤＥ分析により決定した。 図２Ａ～２Ｃは、ＴＨＰ－１細胞でのＣＤ１２３ ｇＲＮＡの遺伝子編集効率を示す一連のグラフである。（図２Ａ） ヒトＴＨＰ－１細胞にＣａｓ９タンパク質およびＣＤ１２３を標的とするｇＲＮＡをエレクトロポレーションした。ＩＬ３ＲＡ遺伝子座の編集効率は、サンガーシーケンシングおよびＴＩＤＥ分析により決定した。ＣＤ１２３の発現はフローサイトメトリーによって評価し（図２Ｂ）、ＣＤ１２３陰性細胞のパーセンテージをプロットした（図２Ｃ）。
図３Ａ～Ｄは、ＣＤ１２３で編集されたＣＤ３４＋細胞の生存と分化を示す一連の図である。（図３Ａ） 実験のワークフローを示す概略図。ヒトＣＤ３４＋細胞にＣａｓ９タンパク質およびＣＤ１２３を標的とするｇＲＮＡ Ｉをエレクトロポレーションした後、ＴＩＤＥおよびＣＦＵアッセイによる編集効率の分析を行い、in vitroでの分化を評価した。（図３Ｂ） 細胞生存率を、エレクトロポレーションの４８時間後に測定した。（図３Ｃ） ＩＬ３ＲＡ遺伝子座の編集効率は、サンガーシーケンシングおよびＴＩＤＥ分析により決定した。Ｃａｓ９ ＲＮＰ群は対照として使用しなかった。 （図３Ｄ） 対照またはＣＤ１２３で編集されたＣＤ３４＋細胞を、エレクトロポレーションの２日後にMethocultにプレーティングし、１４日後にコロニー形成のスコア付けを行った。ＢＦＵ－Ｅ：バースト形成単位－赤血球；ＣＦＵ－ＧＭ：コロニー形成単位－顆粒球／マクロファージ；ＣＦＵ－ＧＥＭＭ：多能性骨髄系前駆細胞のコロニー形成単位（顆粒球、赤血球、単球、巨核球を生成）。スチューデントのｔ検定を使用した。 図４は、ＡＭＬ細胞株での標的発現を示す。ＭＯＬＭ－１３およびＴＨＰ－１細胞および未染色の対照におけるＣＤ３３、ＣＤ１２３およびＣＬＬ１の発現は、フローサイトメトリー分析により決定した。 Ｘ軸は抗体染色の強度を示し、Ｙ軸は細胞数に対応する。
図５は、ＣＤ３３およびＣＤ１２３で改変されたＭＯＬＭＯ－１３細胞を示す。野生型（ＷＴ）、ＣＤ３３－／－、ＣＤ１２３－／－、およびＣＤ３３－／－ＣＤ１２３－／－ＭＯＬＭＯ－１３細胞におけるＣＤ３３およびＣＤ１２３の発現は、フローサイトメトリーにより評価した。ＣＤ３３－／－またはＣＤ１２３－／－ＭＯＬＭＯ－１３細胞を生成するために、ＷＴ ＭＯＬＭＯ－１３細胞にＣＤ３３またはＣＤ１２３を標的とするＲＮＰをエレクトロポレーションし、続いてＣＤ３３またはＣＤ１２３陰性細胞のフローサイトメトリーソーティングを行った。ＣＤ３３－／－ＣＤ１２３－／－ＭＯＬＭＯ－１３細胞は、ＣＤ３３－／－細胞にＣＤ１２３を標的とするＲＮＰをエレクトロポレーションし、ＣＤ１２３陰性集団を選別することによって生成した。Ｘ軸は抗体染色の強度を示し、Ｙ軸は細胞数に対応する。 図６は、ＣＤ３３およびＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔのin vitro細胞障害性アッセイを示す。抗ＣＤ３３ ＣＡＲ－Ｔおよび抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔを、野生型（ＷＴ）、ＣＤ３３－／－、ＣＤ１２３－／－、およびＣＤ３３－／－ＣＤ１２３－／－ＭＯＬＭＯ－１３細胞とインキュベートし、細胞障害性をフローサイトメトリーにより評価した。非形質導入Ｔ細胞を、モックＣＡＲ－Ｔ対照として使用した。ＣＡＲｐｏｏｌ群は、抗ＣＤ３３細胞と抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の１：１のプールされた組み合わせで構成されていた。スチューデントのｔ検定を使用した。ｎｓ＝有意性なし；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。Ｙ軸は、特異的殺傷のパーセンテージを示す。
図７は、ＣＤ３４＋細胞の遺伝子編集効率を示す。ヒトＣＤ３４＋細胞に、Ｃａｓ９タンパク質およびＣＤ３３、ＣＤ１２３、またはＣＬＬ１を標的とするｇＲＮＡを、単独または組み合わせてエレクトロポレーションした。ＣＤ３３、ＣＤ１２３、またはＣＬＬ１遺伝子座の編集効率は、サンガーシーケンシングおよびＴＩＤＥ分析により決定した。Ｙ軸は編集効率（ＴＩＤＥによる％）を示す。 図８Ａ～８Ｃは、遺伝子編集されたＣＤ３４＋細胞のin vitroコロニー形成を示す。対照またはＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＬＬ－１で改変されたＣＤ３４＋細胞を、エレクトロポレーションの２日後にMethocultにプレーティングし、１４日後にコロニー形成のスコア付けを行った。（図８Ａ） ＢＦＵ－Ｅ：バースト形成単位－赤血球；（図８Ｂ） ＣＦＵ－ＧＭ：コロニー形成単位－顆粒球／マクロファージ； （図８Ｃ） ＣＦＵ－ＧＥＭＭ：多能性骨髄系前駆細胞のコロニー形成単位（顆粒球、赤血球、単球、巨核球を生成）。スチューデントのｔ検定を使用した。
図９は、ＣＤ３４＋細胞の遺伝子編集頻度を示す。ヒトＣＤ３４＋細胞に、Ｃａｓ９タンパク質とＸ軸に示すＣＤ１２３を標的とするｇＲＮＡで構成されるリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体をエレクトロポレーションした；その配列を表８に示す。ＣＤ１２３遺伝子座の編集頻度は、サンガーシーケンシングにより決定した。Ｙ軸は編集頻度を示す。 図１０は、ＣＤ３４＋細胞の遺伝子編集頻度を示す。ヒトＣＤ３４＋細胞に、Ｃａｓ９タンパク質とＸ軸に示すＣＤ１２３を標的とするｇＲＮＡ、特に左から右へのｇＲＮＡ Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｎ３、Ｐ３、およびＳ３をエレクトロポレーションした。ＣＤ１２３遺伝子座の編集頻度は、サンガーシーケンシングにより決定した。Ｙ軸は編集頻度を示す。図１０のすべてのｇＲＮＡは、編集頻度≧８０％をもたらした。
図１１は、ＣＤ１２３を標的とするｇＲＮＡ、具体的にはｇＲＮＡ Ａ（左上）、ｇＲＮＡ Ｇ（左中）、ｇＲＮＡ Ｉ（左下）、ｇＲＮＡ Ｎ３（右上）、ｇＲＮＡ Ｐ３（右中）、およびｇＲＮＡ Ｓ３（右下）で編集されたヒトＣＤ３４＋細胞の、インデル（挿入／欠失）分布を示す。Ｘ軸はインデルのサイズを示し、Ｙ軸は混合物中の特定のインデルのパーセンテージを示す。 図１２は、ＣＤ１２３を標的とするｇＲＮＡ Ｄ１で編集されたヒトＣＤ３４＋細胞の、インデル（挿入／削除）分布を示す。Ｘ軸はインデルのサイズを示し、Ｙ軸は混合物中の特定のインデルのパーセンテージを示す。 図１３は、ＮＢＳＧＷマウスにおけるＣＤ１２３編集ＨＳＰＣのin vivo特性評価に使用する、プロトコルおよび実験手順／タイムラインの概略図および概要である。
図１４Ａ～１４Ｃは、非編集対照細胞またはＣＤ１２３ ＫＯ細胞の生着の１６週間後の、マウスの骨髄におけるＣＤ１２３編集細胞の長期系統生着を示す。図１４Ａは、対照細胞（EP ctrl）または示されたｇＲＮＡ（Ｘ軸上左から右へ、ｇＲＮＡ ＩまたはｇＲＮＡ Ｄ１）で編集されたＣＤ１２３ ＫＯ細胞の生着後１６週目の骨髄中の、ＣＤ４５＋細胞集団全体（ヒトおよびマウスのＣＤ４５＋細胞の合計）におけるヒトＣＤ４５＋（ｈＣＤ４５＋）細胞のパーセンテージとして計算された、ヒト白血球キメラ現象の割合を示す。図１４Ｂは、対照細胞（EP ctrl）または示されたｇＲＮＡ（Ｘ軸上左から右へ、ｇＲＮＡ ＩまたはｇＲＮＡ Ｄ１）で編集されたＣＤ１２３ ＫＯ細胞の生着後１６週目の骨髄中の、ヒトＣＤ３４（ｈＣＤ３４＋）に対しても陽性であったｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージを示す。図１４Ｃは、対照細胞（EP ctrl）または示されたｇＲＮＡ（Ｘ軸上左から右へ、ｇＲＮＡ ＩまたはｇＲＮＡ Ｄ１）で編集されたＣＤ１２３ ＫＯ細胞の生着後１６週目の骨髄中の、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、好中球、従来の樹状細胞（ｃＤＣ）、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、好酸球、好塩基球、および肥満細胞であったｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージを示す。
図１５は、対照細胞（EP ctrl）または示されたｇＲＮＡ（Ｘ軸上左から右へ、ｇＲＮＡ ＩまたはｇＲＮＡ Ｄ１）で編集されたＣＤ１２３ ＫＯ細胞の生着後１６週目に、骨髄中でＣＤ１２３＋が定量化されたｈＣＤ４５＋のパーセンテージを示す 図１６Ａ～１６Ｃは、顆粒球および単球細胞集団の編集効率および生存率を示す。図１６Ａは、ＦＡＣｓで測定したin vitroでのＣＤ１２３の細胞表面発現を、上から下に、非編集対照細胞、ｇＲＮＡ Ｉにより編集されたＣＤ１２３ ＫＯ細胞（ＴＩＤＥで測定した編集頻度７５．８％）、ｇＲＮＡ Ｄ１により編集されたＣＤ１２３ ＫＯ細胞（ＴＩＤＥで測定した編集頻度７１．１％）、およびＦＭＯ（蛍光マイナス１）対照において示す。 図１６Ｂは、非編集対照細胞（EP cntrl）またはｇＲＮＡ ＩもしくはｇＲＮＡ Ｄ１により編集されたＣＤ１２３ ＫＯ細胞のin vitro培養から経時的に産生された、定量化顆粒球を示す。図１６Ｃは、非編集対照細胞（EP cntrl）またはｇＲＮＡ ＩもしくはｇＲＮＡ Ｄ１により編集されたＣＤ１２３ ＫＯ細胞のin vitro培養から経時的に産生された、定量化単球を示す。
図１７は、非編集対照細胞（EP cntrl）またはｇＲＮＡ ＩもしくはｇＲＮＡ Ｄ１により編集されたＣＤ１２３ ＫＯ細胞のin vitro培養から経時的に産生された、ＣＤ１２３＋顆粒球（上）または単球（下）のパーセンテージを示す。 図１８は、非編集対照細胞またはｇＲＮＡ ＩもしくはｇＲＮＡ Ｄ１により編集されたＣＤ１２３ ＫＯ細胞の編集および培養後０、７、および１４日目に定量化された、ＣＤ１５＋（左上）もしくはＣＤ１１ｂ＋陽性顆粒球（右上）のパーセンテージ、またはＣＤ１４＋（左下）もしくはＣＤ１１ｂ＋陽性単球（右下）のパーセンテージを示す。 図１９Ａ～１９Ｃは、顆粒球および単球細胞集団の機能を示す。図１９Ａは、非編集対照細胞（EP ctrl）または示されたｇＲＮＡ（Ｘ軸上左から右へ、ｇＲＮＡ ＩまたはｇＲＮＡ Ｄ１）により編集されたＣＤ１２３ ＫＯ細胞から産生された顆粒球（上）または単球（下）で測定された、食作用のパーセンテージを示す。 図１９Ｂは、非編集対照細胞（EP ctrl）またはｇＲＮＡ ＩもしくはｇＲＮＡ Ｄ１により編集されたＣＤ１２３ ＫＯ細胞（刺激なし、ＬＰＳによる刺激、またはＲ８４８による刺激あり）から産生された顆粒球による、ＩＬ－６（ｐｇ／ｍＬ）（右）またはＴＮＦ－α（ｐｇ／ｍＬ）（左）の産生を示す。図１９Ｃは、非編集対照細胞（EP ctrl）またはｇＲＮＡ ＩもしくはｇＲＮＡ Ｄ１により編集されたＣＤ１２３ ＫＯ細胞（刺激なし、ＬＰＳによる刺激、またはＲ８４８による刺激あり）から産生された単球による、ＩＬ－６（ｐｇ／ｍＬ）（右）またはＴＮＦ－α（ｐｇ／ｍＬ）（左）の産生を示す。
図２０Ａ～２０Ｂは、遺伝子編集されたＣＤ３４＋細胞のin vitroコロニー形成を示す。対照またはＣＤ１２３改変ＣＤ３４＋細胞をエレクトロポレーション後にプレーティングし、１４日後にコロニー形成のスコア付けを行った。ＢＦＵ－Ｅ：バースト形成単位－赤血球；ＣＦＵ－ＧＭ：コロニー形成単位－顆粒球／マクロファージ；ＣＦＵ－ＧＥＭＭ：多能性骨髄系前駆細胞のコロニー形成単位（顆粒球、赤血球、単球、巨核球を生成）。図２０Ａは、非編集細胞（EP ctrl）またはｇＲＮＡ Ｉ（編集頻度７７．９％）もしくはｇＲＮＡ Ｄ１（編集頻度７２．５％）により編集されたＣＤ１２３ ＫＯ細胞から生じた、ＢＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－Ｇ／Ｍ／ＧＭ、またはＣＦＵ－ＧＥＭＭのコロニー数を示す。 図２０Ｂは、非編集細胞（EP ctrl）またはｇＲＮＡ ＩもしくはｇＲＮＡ Ｄ１により編集されたＣＤ１２３ ＫＯ細胞から生じた、ＢＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－Ｇ／Ｍ／ＧＭ、またはＣＦＵ－ＧＥＭＭのコロニー分布のパーセントを示す。
図２１Ａ～２１Ｃは、ＭＯＬＭ１３細胞株におけるＣＤ１２３編集、転写、およびタンパク質の動態を示す。細胞に、Ｃａｓ９タンパク質、およびｇＲＮＡ Ｐ３または対照ｇＲＮＡ（ｇＣｎｔｒｌ）を０日目（「ＥＰ」）にてエレクトロポレーションした。図２１Ａは、ＣＤ１２３編集効率を示す。ＣＤ１２３遺伝子座の編集頻度は、サンガーシーケンシングにより決定し、エレクトロポレーション後の示した日にて評価した。Ｙ軸は編集頻度を示す。図２１Ｂは、ＣＤ１２３ ｍＲＮＡ転写産物発現の動態を示す。Ｙ軸は、ｍＲＮＡ転写産物発現における変化率が０日目（「Ｄ０」）の発現と相対的であることを示す。図２１ＣはＦＡＣＳによって測定したＣＤ１２３の細胞表面発現の動態（生存するＣＤ１２３＋細胞％）を示す。Y軸は、エレクトロポレーション後の示した日のＣＤ１２３陽性細胞のパーセンテージを示す。
図２２Ａ～２２Ｄは、ＣＤ１２３編集が赤血球増殖に影響しないことを示す。図２２Ａは、ＣＤ３４＋ ＨＳＰＣにおいてＣＤ１２３編集を行い、例えばマーカーの増殖、発現、および脱核によって、in vitroでの赤血球分化を評価する、実験手順の概略図および概要である。図２２Ｂは、ｇＲＮＡ ＩでのＣＤ１２３編集効率を示す。ＣＤ１２３遺伝子座の編集頻度は、サンガーシーケンシングにより決定し、エレクトロポレーション後の示した日にて評価した。Ｙ軸は編集頻度を示す。 図２２Cは、ＦＡＣＳによって測定したＣＤ１２３の細胞表面発現を示す。エレクトロポレーション前の未編集ＣＤ３４＋細胞におけるＣＤ１２３発現をも示す。図22Dは、非編集対照細胞（Ｍｏｃｋ ＥＰ）、対照ｇＲＮＡ（ｇＣＴＲＬ）でエレクトロポレーションした細胞、またはｇＲＮＡ Ｉによって編集したＣＤ１２３ＫＯ細胞の細胞生存率として、赤血球増殖を示す。細胞は、エレクトロポレーション後２～９日目の間のＩ期（「Ｉ」）の間の第一相赤血球分化培地、エレクトロポレーション後９～１３日目の間のＩＩ期（「ＩＩ」）の間の第二相赤血球分化培地、エレクトロポレーション後１３～２３日目の間のＩＩＩ期（「ＩＩＩ」）の間の第三相赤血球分化培地で培養される。
図２３Ａ～２３Ｅは、ＣＤ１２３編集が赤血球の分化および成熟に影響しないことを示す。細胞を、Ｃａｓ９タンパク質、および対照ｇＲＮＡ（gCntrl）、ｇＲＮＡ Ｉまたはエレクトロポレーションしたモックで０日目（「ＥＰ」）にてエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション前の未編集ＣＤ３４＋細胞におけるマーカーの各々の発現をも示す。図２３Ａは、ＣＤ７１陽性細胞の割合（生存する細胞から）を示す。図２３Ｂは、ＧｌｙＡ陽性細胞の割合（生存するシングレットから）を示す。図２３Ｃは、α４インテグリン陽性細胞の割合（生存する細胞から）を示す。図２３Ｄは、ＢＡＮＤ３陽性細胞の割合（生存するシングレットから）を示す。 図２３Ｅは、エレクトロポレーション後の示した日における、脱核した細胞の割合を示す図である。
図２４Ａ～２４Ｃは、ＣＤ１２３編集ＨＳＰＣ、およびそれからの子孫細胞／派生細胞が、生着後に維持されることを示す。図２４Ａは、ＣＤ１２３ＫＯ ＨＳＰＣの生着後１６週のマウスから骨髄を得る実験手順の概略図および概要である。アンプリコン次世代シーケンス（ＮＳＧ）を行い、編集頻度およびインデルスペクトルを評価する。図２4Ｂは、対照骨髄（Ｃｔｒｌ ＢＭ）、ＣＤ１２３ＫＯ ＨＳＰＣを生着したマウスの骨髄（ｇＲＮＡ Ｉ ＢＭ）、およびマウスに生着するのに使用したインプット（ＣＤ１２３ＫＯ ＨＳＰＣ）のＣＤ１２３編集効率を示す。図２４Ｃは、ＣＤ１２３ＫＯ ＨＳＰＣを生着したマウスからの骨髄（ｇＲＮＡ Ｉ ＢＭ）、およびマウスに生着するのに使用したインプット（ＣＤ１２３ＫＯ ＨＳＰＣ）についてのインデル（挿入／欠失）分布を示す。
図２５Ａ～２５Ｃは、ＣＤ１２３編集が骨髄系の細胞のサブセットにおいて長期的に維持されることを示す。図２５Ａおよび２５Ｂは、ＣＤ１２３ＫＯ ＨＳＰＣの生着後１６週のマウスから骨髄を得る実験手順の概略図を示す。ＦＡＣＳを使用して、骨髄系の細胞のサブセット（例えば、古典的樹状細胞、好酸球、単球、好中球）を精製し、シークエンスによって編集頻度を評価する。 図２５Ｃは、ＣＤ１２３ＫＯ ＨＳＰＣを生着したマウスからの骨髄（ｇＲＮＡ Ｉ ＢＭ ＃１およびｇＲＮＡ Ｉ ＢＭ＃２）、および対照骨髄（対照ＢＭ＃１および対照ＢＭ＃２）から得られた細胞における、各々示した細胞タイプのＣＤ１２３編集効率を示す。各骨髄サンプルについて、カラムは左から右へ、バルク細胞、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、好酸球、肥満細胞、および好塩基球に対応する。
発明の詳細な説明
定義
ｇＲＮＡの標的ドメインとの相互作用に関して本明細書で使用する「結合する」という用語は、ｇＲＮＡ分子と標的ドメインが複合体を形成することを指す。複合体は、二本鎖構造を形成する２本の鎖、または多本鎖複合体を形成する３本以上の鎖を含み得る。結合は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによる標的ドメインの切断などの、より広範なプロセスでのステップを構成し得る。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、完全な相補性で標的ドメインに結合し、他の態様において、ｇＲＮＡは、部分的な相補性で、例えば１つ以上のミスマッチで、標的ドメインに結合する。いくつかの態様において、ｇＲＮＡが標的ドメインに結合する場合、ｇＲＮＡ塩基の完全なターゲティングドメインが、ターゲティングドメインと対になる。他の態様において、標的ドメインの一部のみ、および／またはターゲティングドメイン塩基の一部のみが、他と対になる。一態様において、相互作用は、標的ドメインを介した切断事象を媒介するのに十分である。
本明細書で使用する用語「Ｃａｓ９分子」は、ｇＲＮＡと相互作用することができ、ｇＲＮＡと協調して標的ドメインを含む部位にホーミングするまたは局在化することができる、分子またはポリペプチドを指す。Ｃａｓ９分子には、天然に存在するＣａｓ９分子および、例えば、天然に存在するＣａｓ９分子とは少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる、操作され、変更され、または改変されたＣａｓ９分子が含まれる。
「ｇＲＮＡ」および「ガイドＲＮＡ」という用語は、全体を通して交換可能に使用され、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９分子複合体の標的核酸への特異的標的化またはホーミングを促進する核酸を指す。ｇＲＮＡは、単分子（単一のＲＮＡ分子を有する）であり得、本明細書ではｓｇＲＮＡと呼ばれることもあり、またはモジュール式（２つ以上、典型的には２つの別個のＲＮＡ分子を含む）であり得る。ｇＲＮＡは、宿主細胞のゲノム内の標的ドメインに結合し得る。ｇＲＮＡは、標的ドメインに部分的または完全に相補的であり得るターゲティングドメインを含み得る。ｇＲＮＡはまた、Ｃａｓ９分子をｇＲＮＡ配列に（例えば、ｇＲＮＡ配列のターゲティングドメインにより）結合した標的ドメインに動員する「足場配列」（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）を含み得る。足場配列は、少なくとも１つのステムループ構造を含み得、エンドヌクレアーゼを動員する。例示的な足場配列は、例えば以下に見出すことができる：Jinek, et al. Science (2012) 337(6096):816-821、Ran, et al. Nature Protocols (2013) 8:2281-2308、ＰＣＴ公開番号WO2014/093694、およびＰＣＴ公開番号WO2013/176772。
「変異」という用語は、本明細書において、参照配列、例えばかかる変異を有しない細胞の対応配列、または対応する野生型核酸配列と比較した、核酸における遺伝的変化（例えば、挿入、欠失、反転、または置換）を指すために使用される。本明細書で提供されるいくつかの態様において、ＣＤ１２３をコードする遺伝子における変異は、変異を担持している細胞においてＣＤ１２３の発現の喪失をもたらす。いくつかの態様において、遺伝子の変異は、遺伝子により産生されたタンパク質を脱標的化する。いくつかの態様において、脱標的化されたＣＤ１２３タンパク質は、ＣＤ１２３を標的とする薬剤によっては結合されないか、またはより低いレベルで結合される。いくつかの態様において、ＣＤ１２３をコードする遺伝子における変異は、ＣＤ１２３を標的とする免疫療法剤によって結合されないか、またはその遺伝子によってコードされる非変異ＣＤ１２３形態よりも有意に低いレベルにて結合されるＣＤ１２３のバリアント形態の発現をもたらす。いくつかの態様において、本明細書で提供されるようなＣＤ１２３遺伝子におけるゲノム変異を担持している細胞は、ＣＤ１２３を標的とする免疫療法剤、例えば、抗ＣＤ１２３抗体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）によって結合されないか、または有意に低いレベルにて結合される。
ｇＲＮＡの「ターゲティングドメイン」は、標的核酸の「標的ドメイン」と相補的である。ｇＲＮＡのコアドメインに相補的なヌクレオチド配列を含む標的核酸の鎖は、本明細書では、標的核酸の「相補鎖」と呼ばれる。ターゲティングドメインは、ｇＲＮＡ結合のＲＮＡガイド型のヌクレアーゼの標的化を標的部位へ媒介する。ターゲティングドメインの選択に関するガイダンスは、例えば以下に記載されている：Fu Y et al, Nat Biotechnol 2014 (doi:10.1038/nbt.2808)およびSternberg SH et al., Nature 2014 (doi:10.1038/naturel3011)。
ヌクレアーゼ
いくつかの態様において、本明細書に記載の細胞（例えば、ＨＳＣまたはＨＰＣ）は、本明細書に記載のヌクレアーゼを使用して作製される。例示的なヌクレアーゼには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９とも呼ばれる）、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、およびメガヌクレアーゼが含まれる。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは、本明細書に記載のＣＤ１２３ ｇＲＮＡと組み合わせて使用される（例えば、表２、６、または８による）。本開示のいくつかの側面は、本明細書に記載の遺伝子操作された細胞、例えば、ＣＤ１２３の発現の喪失、またはＣＤ１２３を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ１２３のバリアント形態の発現をもたらす、そのゲノムにおける改変を含む遺伝子操作された細胞を生成する組成物および方法を提供する。本明細書で提供されるかかる組成物および方法には、限定はされないが、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼなどのヌクレアーゼ、およびかかるヌクレアーゼと結合して細胞のゲノム内の好適な標的部位へそれらを標的化できる好適なＲＮＡを使用することによって、ＣＤ１２３の発現の喪失、またはＣＤ１２３を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ１２３のバリアント形態の発現をもたらすゲノム改変に影響する遺伝子操作された細胞のための好適な戦略およびアプローチが含まれる。
いくつかの態様において、本明細書に記載の遺伝子操作された細胞（例えば、例えば、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞、もしくは遺伝子操作された免疫エフェクター細胞などの遺伝子操作された造血細胞）は、本明細書に記載のいずれかのヌクレアーゼなどのヌクレアーゼを使用して、細胞のゲノム内に「編集」とも呼ばれる標的化された変化を導入可能な任意の技術を含むゲノム編集技術を介して生成される。
例示的な好適なゲノム編集技術の１つは「遺伝子編集」であり、ヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼなどのＲＮＡ－ ＲＮＡガイド型のヌクレアーゼの使用を含み、細胞のゲノム中に標的化された一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断を導入し、それが、ヌクレアーゼ切断の部位にて、またはすぐ近傍で核酸配列の変更（例えば、ヌクレオチドまたはヌクレオチド配列の挿入、欠失、反転、または置換を介して）を典型的にもたらす、例えば非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ、時には「ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ＮＨＥＪ」または「ａｌｔ－ＮＨＥＪ」とも呼ばれることがある）、または相同性指向性修復（ＨＤＲ）などの細胞修復メカニズムを誘発する。Yeh et al. Nat. Cell. Biol. (2019) 21: 1468-1478；例えば、Hsu et al. Cell (2014) 157: 1262-1278; Jasin et al. DNA Repair (2016) 44: 6-16; Sfeir et al. Trends Biochem. Sci. (2015) 40: 701-714を参照。
別の例示的な好適なゲノム編集技術は「塩基編集」であり、これは、塩基エディター（base editor）、例えば、特定の核酸塩基、例えば、ＣまたはＡヌクレオチドのシトシンまたはアデノシン核酸塩基を標的にして脱アミノ化するデアミナーゼへ融合したヌクレアーゼが損なわれた酵素または部分的にヌクレアーゼが損なわれた酵素（例えば、ＲＮＡガイド型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質）の使用を含み、細胞のミスマッチ修復メカニズムを介して、ＣからＴヌクレオチドへの変化、またはＡからＧヌクレオチドへの変化をもたらす。例えば、Komor et al. Nature (2016) 533: 420-424; Rees et al. Nat. Rev. Genet. (2018) 19(12): 770-788; Anzalone et al. Nat. Biotechnol. (2020) 38: 824-844を参照。
さらに別の例示的な好適なゲノム編集技術には、「プライム編集」が含まれ、これは、操作された逆転写酵素（ＲＴ）ドメインへ融合した、触媒的に損なわれたヌクレアーゼまたは部分的に触媒的に損なわれたヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡにガイドされたヌクレアーゼ（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ））を使用して、新しい遺伝子情報、例えば変更されたヌクレオチド配列を、特異的に標的化されたゲノム部位の中へ導入することを含む。Ｃａｓ／ＲＴ融合体は、所望の編集をコードする核酸配列をも含み、ＲＴのプライマーとして機能し得るガイドＲＮＡによって、ゲノム内の標的部位へ標的化される。例えば、Anzalone et al. Nature (2019) 576 (7785): 149-157を参照。
Ｃａｓ９分子
いくつかの態様において、ゲノム編集技術の使用は、好適なＲＮＡガイド型のヌクレアーゼの使用を特徴とし、このヌクレアーゼは、いくつかの態様において、例えば、塩基編集またはプライム編集のために、触媒的に損なわれているか、または部分的に触媒的に損なわれていてもよい。好適なＲＮＡガイド型のヌクレアーゼの例には、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、またはＣａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１などの他のＣａｓヌクレアーゼが含まれる。
いくつかの態様において、本明細書に記載のＣＤ１２３ ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９分子と複合体を形成する。さまざまなＣａｓ９分子を使用することができる。いくつかの態様において、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９分子複合体をＣＤ１２３の標的ドメインに標的化するための、所望のＰＡＭ特異性を有するＣａｓ９分子が選択される。いくつかの態様において、細胞を遺伝子操作することはまた、１つ以上（例えば、１、２、３またはそれ以上）のＣａｓ９分子を細胞に導入することを含む。
様々な種のＣａｓ９分子を、本明細書に記載の方法および組成物で使用することができる。態様において、Ｃａｓ９分子は、Streptococcus pyogenes (SpCas9)、Staphylococcus aureus (SaCas9)、、またはStreptococcus thermophilus (StCas9)であるか、またはこれに由来する。追加の好適なＣａｓ９分子には、以下のもの、または以下に由来するものが含まれる：Staphylococcus aureus、Neisseria meningitidis（ＮｍＣａｓ９）、Acidovorax avenae、Actinobacillus pleuropneumoniae、Actinobacillus succinogenes、Actinobacillus suis、Actinomyces sp.、Cycliphilus denitrificans、Aminomonas paucivorans、Bacillus cereus、Bacillus smithii、Bacillus thuringiensis、Bacteroides sp.、Blastopirellula marina、Bradyrhizobium sp.、Brevibacillus laterosporus、Campylobacter coli、Campylobacter jejuni（ＣｊＣａｓ９）、Campylobacter lari、Candidatus puniceispirillum、Clostridium cellulolyticum、Clostridium perfringens、Corynebacterium accolens、Corynebacterium diphtheria、Corynebacterium matruchotii、Dinoroseobacter shibae、Eubacterium dolichum、gamma proteobacterium、Gluconacetobacter diazotrophicus、Haemophilus parainfluenzae、Haemophilus sputorum、Helicobacter canadensis、Helicobacter cinaedi、Helicobacter mustelae、Ilyobacter polytropus、Kingella kingae、Lactobacillus crispatus、Listeria ivanovii、Listeria monocytogenes、Listeriaceae bacterium、Methylocystis sp.、Methylosinus trichosporium、Mobiluncus mulieris、Neisseria bacilliformis、Neisseria cinerea、Neisseria flavescens、Neisseria lactamica、Neisseria sp.、Neisseria wadsworthii、Nitrosomonas sp.、Parvibaculum lavamentivorans、Pasteurella multocida、Phascolarctobacterium succinatutens、Ralstonia syzygii、Rhodopseudomonas palustris、Rhodovulum sp.、Simonsiella muelleri、Sphingomonas sp.、Sporolactobacillus vineae、Staphylococcus lugdunensis、Streptococcus sp.、Subdoligranulum sp.、Tistrella mobilis、Treponema sp.、またはVerminephrobacter eiseniae。いくつかの態様において、かかるＣａｓ９ヌクレアーゼの触媒的に損なわれた、または部分的に損なわれたバリアントが使用されることもある。追加の好適なＣａｓ９ヌクレアーゼ、およびヌクレアーゼバリアントは、本開示に基づいて当業者に明らかであろう。本開示は、この点に関して限定されない。
いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子は、天然に存在するＣａｓ９分子である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子は、例えば、少なくとも１つのアミノ酸残基が例えば参照配列から異なる、操作、変更、または改変されたＣａｓ９分子であり、ここで参照配列は例えば、最も類似した天然に存在するＣａｓ９分子またはＰＣＴ公開番号 WO 2015/157070の表５０の配列であり、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子は、Ｃｐｆ１またはそのフラグメントもしくはバリアントを含む。
天然に存在するＣａｓ９分子は、典型的には、２つのローブ：認識（ＲＥＣ）ローブおよびヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブで構成され、これらのそれぞれはさらに、例えばＰＣＴ公開番号 WO 2015/157070の例えば図９Ａ～９Ｂに記載されているドメインを含む（この出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ＲＥＣローブは、アルギニンに富むブリッジヘリックス（ＢＨ）、ＲＥＣ１ドメイン、およびＲＥＣ２ドメインを含む。ＲＥＣローブは、Ｃａｓ９特異的な機能ドメインと見受けられる。ＢＨドメインは、長いアルファヘリックスとアルギニンに富む領域であり、S. pyogenesＣａｓ９の配列のアミノ酸６０～９３を含む。ＲＥＣ１ドメインは、ｇＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡなどの、リピート：アンチリピート二重鎖の認識に関与する。ＲＥＣ１ドメインは、２つのＲＥＣ１モチーフを、S. pyogenesＣａｓ９の配列のアミノ酸９４～１７９および３０８～７１７に含む。これらの２つのＲＥＣ１ドメインは、線形の一次構造ではＲＥＣ２ドメインによって分離されているが、三次構造に組み立てられてＲＥＣ１ドメインを形成する。ＲＥＣ２ドメインまたはその一部は、リピート：アンチリピート二重鎖の認識にも役割を果たす可能性がある。ＲＥＣ２ドメインは、S. pyogenesＣａｓ９の配列のアミノ酸１８０～３０７を含む。
ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣドメイン（本明細書ではＲｕｖＣ様ドメインとも呼ばれる）、ＨＮＨドメイン（本明細書ではＨＮＨ様ドメインとも呼ばれる）、およびＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含む。ＲｕｖＣドメインは、レトロウイルスインテグラーゼスーパーファミリーメンバーと構造的類似性を共有し、一本鎖、例えば、標的核酸分子の非相補鎖を切断する。ＲｕｖＣドメインは、S. pyogenesＣａｓ９の配列のそれぞれアミノ酸１～５９、７１８～７６９、および９０９～１０９８における、３つの分割ＲｕｖＣモチーフ（ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、およびＲｕｖＣＩＩＩ、これらは当技術分野ではしばしば、ＲｕｖＣＩドメインまたはＮ末端ＲｕｖＣドメイン、ＲｕｖＣＩＩドメイン、およびＲｕｖＣＩＩＩドメインと呼ばれる）から組み立てられる。ＲＥＣ１ドメインと同様に、３つのＲｕｖＣモチーフは、一次構造では他のドメインによって線形に分離されているが、三次構造では、３つのＲｕｖＣモチーフが集まってＲｕｖＣドメインを形成する。ＨＮＨドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼと構造的類似性を共有し、一本鎖、例えば標的核酸分子の相補鎖を切断する。ＨＮＨドメインはＲｕｖＣＩＩ－ＩＩＩモチーフの間にあり、S. pyogenesＣａｓ９の配列のアミノ酸７７５～９０８を含む。ＰＩドメインは、標的核酸分子のＰＡＭと相互作用し、S. pyogenesＣａｓ９の配列のアミノ酸１０９９～１３６８を含む。
結晶構造は、天然に存在する細菌のＣａｓ９分子（Jinek et al., Science, 343(6176): 1247997, 2014）、およびガイドＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの合成融合）を伴うS. pyogenesＣａｓ９について決定されている（Nishimasu et al., Cell, 156:935-949, 2014; and Anders et al., Nature, 2014, doi: 10.1038/naturel3579）。
いくつかの態様において、本明細書に記載のＣａｓ９分子は、標的部位において、またはその直接近傍でヌクレアーゼ活性、例えば二本鎖切断活性を有する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子は、エンドヌクレアーゼの触媒残基の１つを不活性化するように改変されている。いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子はニッカーゼであり、一本鎖切断を生成する。例えばDabrowska et al. Frontiers in Neuroscience (2018) 12(75)を参照。酵素のＲｕｖＣおよびＨＮＨ触媒ドメインにおける１つ以上の変異が、Ｃａｓ９の効率を改善する可能性があることが示されている。例えばSarai et al. Currently Pharma. Biotechnol. (2017) 18(13)を参照。いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子は、第２のドメイン、例えば、ＤＮＡまたはクロマチンを修飾するドメイン、例えばデアミナーゼまたはデメチラーゼドメインに融合される。いくつかのかかる態様において、Ｃａｓ９分子は、そのエンドヌクレアーゼ活性を排除するように改変される。
いくつかの態様において、本明細書に記載のＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ／ｇＲＮＡ複合体）は、相同組換え修復（homology-directed repair）（ＨＤＲ）のためのテンプレートと共に投与される。いくつかの態様において、本明細書に記載のＣａｓ９分子は、ＨＤＲテンプレートなしで投与される。
いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子は、酵素の特異性を増強するように改変される（例えば、オフターゲット効果を低減し、強いオンターゲット切断を維持する）。いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子は、増強された特異性Ｃａｓ９バリアント（例えば、ｅＳＰＣａｓ９）である。例えばSlaymaker et al. Science (2016) 351 (6268): 84-88を参照。いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子は、高忠実度のＣａｓ９バリアント（例えば、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１）である。例えばKleinstiver et al. Nature (2016) 529:490-495を参照。
様々なＣａｓ９分子が当技術分野で知られており、様々な供給源から入手することができ、および／または酵素の１つ以上の活性または特異性を調節するように操作／改変することができる。いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子は、１つ以上のＰＡＭ配列を認識するように操作／改変されている。いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子が操作／改変なしで認識するＰＡＭ配列とは異なる１つ以上のＰＡＭ配列を認識するように、操作／改変されている。いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子は、酵素のオフターゲット活性を低下させるように、操作／改変されている。
いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子をコードするヌクレオチド配列はさらに改変されて、エンドヌクレアーゼ活性の特異性を変更する（例えば、オフターゲット切断を減少させ、細胞内のエンドヌクレアーゼ活性または寿命を減少させ、相同指向性組換え（homology-directed recombination）を増加させ、および非相同末端結合を減少させる）。例えばKomor et al. Cell (2017) 168:20-36を参照。いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子をコードするヌクレオチド配列は、エンドヌクレアーゼのＰＡＭ認識を変更するように改変される。例えば、Ｃａｓ９分子ＳｐＣａｓ９はＰＡＭ配列ＮＧＧを認識するが、エンドヌクレアーゼの１つ以上の改変を含むＳｐＣａｓ９の緩和バリアント（例えば、ＶＱＲ ＳｐＣａｓ９、ＥＱＲ ＳｐＣａｓ９、ＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９）は、ＰＡＭ配列ＮＧＡ、ＮＧＡＧ、ＮＧＣＧを認識し得る。改変されたＣａｓ９分子のＰＡＭ認識は、改変されていないＣａｓ９分子と比較してＣａｓ９分子がより多くの潜在的なＰＡＭ配列を認識する場合に、「緩和された」とみなされる。例えば、Ｃａｓ９分子ＳａＣａｓ９は、ＰＡＭ配列ＮＮＧＲＲＴを認識するが、１つ以上の改変を含むＳａＣａｓ９の緩和バリアント（例えば、ＫＫＨ ＳａＣａｓ９）は、ＰＡＭ配列ＮＮＮＲＲＴを認識し得る。一例において、Ｃａｓ９分子ＦｎＣａｓ９は、ＰＡＭ配列ＮＮＧを認識するが、エンドヌクレアーゼの１つ以上の改変を含むＦｎＣａｓ９の緩和バリアント（例えば、ＲＨＡ ＦｎＣａｓ９）は、ＰＡＭ配列ＹＧを認識し得る。一例において、Ｃａｓ９分子は、置換変異Ｓ５４２ＲおよびＫ６０７Ｒを含むＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、ＰＡＭ配列ＴＹＣＶを認識する。一例において、Ｃａｓ９分子は、置換変異Ｓ５４２Ｒ、Ｋ６０７Ｒ、およびＮ５５２Ｒを含むＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、ＰＡＭ配列ＴＡＴＶを認識する。例えばGao et al. Nat. Biotechnol. (2017) 35(8): 789-792を参照。
いくつかの態様において、１より多くの（例えば、２、３、またはそれ以上の）Ｃａｓ９分子が使用される。いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子の少なくとも１つは、Ｃａｓ９酵素である。いくつかの態様において、Ｃａｓ分子の少なくとも１つは、Ｃｐｆ１酵素である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子の少なくとも１つは、Streptococcus pyogenesに由来する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子の少なくとも１つはStreptococcus pyogenesに由来し、Ｃａｓ９分子の少なくとも１つはStreptococcus pyogenesではない生物に由来する。
いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子は、塩基エディター（base editor）である。いくつかの態様において、塩基エディターは、ＣＤ１２３の発現の喪失、免疫療法によって標的とされないＣＤ１２３バリアントの発現をもたらすゲノム改変を生成するために使用される。塩基エディターエンドヌクレアーゼは一般に、機能ドメイン、例えばデアミナーゼドメイン、に融合した触媒的に不活性なＣａｓ９分子を含む。例えばEid et al. Biochem. J. (2018) 475(11): 1955-1964；Rees et al. Nature Reviews Genetics (2018) 19:770-788を参照。いくつかの態様において、触媒的に不活性なＣａｓ９分子は、「ｄｅａｄ Ｃａｓ」または「ｄＣａｓ９」と呼ばれる。いくつかの態様において、触媒的に不活性なＣａｓ分子は低下した活性を有し、例えば、ニッカーゼ（「ｎＣａｓ」と呼ばれる）である。いくつかの態様において、エンドヌクレアーゼは、１つ以上のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインに融合したｄＣａｓ９を含む。いくつかの態様において、エンドヌクレアーゼは、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、例えば、ＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡから進化したＡＢＥに融合した、ｄＣａｓ９を含む。いくつかの態様において、エンドヌクレアーゼは、シチジンデアミナーゼ酵素（例えば、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ、ｐｍＣＤＡ１、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ））に融合した、ｄＣａｓ９を含む。いくつかの態様において、触媒的に不活性なＣａｓ９分子は低下した活性を有し、ｎＣａｓ９である。いくつかの態様において、触媒的に不活性なＣａｓ９分子（ｄＣａｓ９）は、１つ以上のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインに融合される。いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子は、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、例えば、ＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡから進化したＡＢＥに融合した、不活性なＣａｓ９分子（ｄＣａｓ９）を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子は、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、例えば、ＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡから進化したＡＢＥに融合した、ｎＣａｓ９を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子は、シチジンデアミナーゼ酵素（例えば、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ、ｐｍＣＤＡ１、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ））に融合したdCas9を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子は、シチジンデアミナーゼ酵素（例えば、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ、ｐｍＣＤＡ１、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ））に融合したｎＣａｓ９を含む。
塩基エディターの例としては、限定はされないが、ＢＥ１、ＢＥ２、ＢＥ３、ＨＦ－ＢＥ３、ＢＥ４、ＢＥ４ｍａｘ、ＢＥ４－Ｇａｍ、ＹＥ１－ＢＥ３、ＥＥ－ＢＥ３、ＹＥ２－ＢＥ３、ＹＥＥ－ＣＥ３、ＶＱＲ－ＢＥ３、ＶＲＥＲ－ＢＥ３、ＳａＢＥ３、ＳａＢＥ４、ＳａＢＥ４－Ｇａｍ、Ｓａ（ＫＫＨ）－ＢＥ３、標的－ＡＩＤ、標的－ＡＩＤ－ＮＧ、ｘＢＥ３、ｅＡ３Ａ－ＢＥ３、ＢＥ－ＰＬＵＳ、ＴＡＭ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｘ、ＡＢＥ７．９、ＡＢＥ７．１０、ＡＢＥ７．１０＊、ｘＡＢＥ、ＡＢＥＳａ、ＶＱＲ－ＡＢＥ、ＶＲＥＲ－ＡＢＥ、Ｓａ（ＫＫＨ）－ＡＢＥ、およびＣＲＩＳＰＲ－ＳＫＩＰが含まれる。塩基エディターの追加の例は、例えば、米国公開番号2018/0312825A1、米国公開番号2018/0312828A1、およびＰＣＴ公開番号WO 2018/165629A1に記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、塩基エディターはさらに、標的部位での塩基除去修復を阻害し、細胞のミスマッチ修復を誘導するように改変されている。本明細書に記載のＣａｓ９分子のいずれかを、Ｇａｍドメイン（バクテリオファージＭｕタンパク質）に融合させて、Ｃａｓ９分子を分解およびエキソヌクレアーゼ活性から保護することができる。例えば、Eid et al. Biochem. J. (2018) 475(11): 1955-1964を参照。
いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼのクラス２のＶ型に属する。クラス２のＶ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼはさらに、Ｖ－Ａ型、Ｖ－Ｂ型、Ｖ－Ｃ型、およびＶ－Ｕ型に分類できる。例えばStella et al. Nature Structural & Molecular Biology (2017) 24: 882-892を参照。いくつかの態様において、Ｃａｓ分子は、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）ヌクレアーゼなどのＶ－Ａ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子は、Ｃ２ｃ１エンドヌクレアーゼなどのＶ－Ｂ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。例えばShmakov et al. Mol Cell (2015) 60:385-397を参照。いくつかの態様において、Ｃａｓ分子はＭＡＤ７（商標）である。代替的にまたはさらに、Ｃａｓ９分子は、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼまたはそのバリアントである。当業者によって理解されるように、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼはＣａｓ１２ａとも呼ばれ得る。例えばStrohkendl et al. Mol. Cell (2018) 71:1-9を参照。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物または方法には、Provetella spp.またはFrancisella spp.、Acidaminococcus sp.（ＡｓＣｐｆ１）、Lachnospiraceae bacterium（ＬｐＣｐｆ１）、またはEubacterium rectaleに由来するＣｐｆ１ヌクレアーゼを発現する宿主細胞が関連する。いくつかの態様において、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化され得る。いくつかの態様において、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列はさらに、タンパク質の活性を変化させるために改変される。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの、天然に存在するバリアントおよび改変されたバリアントの両方が、本開示の側面に従った使用に好適である。例えば、ｄＣａｓまたはニッカーゼバリアント、変化したＰＡＭ特異性を有するＣａｓバリアント、および改善されたヌクレアーゼ活性を有するＣａｓバリアントが、本開示のいくつかの態様によって抱持される。いくつかの態様において、Ｃａｓ分子（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａ）の触媒的に不活性なバリアントが、本明細書に記載の方法に従って使用される。Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）の触媒的に不活性なバリアントは、ｄＣａｓ１２ａと呼ばれることがある。本明細書に記載されるとおり、Ｃｐｆ１の触媒的に不活性なバリアントは、機能ドメインに融合されて塩基エディターを形成し得る。例えばRees et al. Nature Reviews Genetics (2018) 19:770-788を参照。いくつかの態様において、触媒的に不活性なＣａｓ９分子は、ｄＣａｓ９である。いくつかの態様において、エンドヌクレアーゼは、１つ以上のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインに融合したｄＣａｓ１２ａを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子は、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、例えば、ＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡから進化したＡＢＥに融合した、ｄＣａｓ１２ａを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ分子は、シチジンデアミナーゼ酵素（例えば、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ、ｐｍＣＤＡ１、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ））に融合したｄＣａｓ１２ａを含む。
代替的にまたはさらに、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼまたはそのバリアントであり得る。Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼは古細菌に由来し、サイズが小さくなる傾向がある（例えば、４００～７００アミノ酸）。さらに、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼはＰＡＭ配列を必要としない。例えばHarrington et al. Science (2018)を参照。
本明細書に記載のＣａｓ９分子のいずれも、所望の時間にＣａｓ９分子の発現および／または活性のレベルを調節するように、調整することができる。例えば、Ｃａｓ９分子の発現および／または活性のレベルを、細胞周期の特定の段階の間に増加させることが有利であり得る。相同組換え修復のレベルは細胞周期のＧ１期の間に低下するため、Ｓ期、Ｇ２期、および／またはＭ期の間のＣａｓ９分子の発現および／または活性レベルの上昇が、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ編集後の相同組換え修復を増加させ得ることが実証されている。いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子の発現および／または活性のレベルは、細胞周期のＳ期、Ｇ２期、および／またはＭ期の間に増加する。一例において、Ｃａｓ９分子は、ヒトジェミニンのＮ末端領域に融合した。例えばGutschner et al. Cell Rep. (2016) 14(6): 1555-1566を参照。いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子の発現および／または活性のレベルは、Ｇ１期の間に低下する。一例において、Ｃａｓ９分子は、低下した活性をＧ１期の間に有するように改変される。例えばLomova et al. Stem Cells (2018)を参照。
代替的にまたはさらに、本明細書に記載のＣａｓ９分子のいずれかを、エピジェネティック修飾因子（例えば、クロマチン修飾酵素、例えばＤＮＡメチラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ）に融合させることができる。例えばKungulovski et al. Trends Genet. (2016) 32(2):101-113を参照。エピジェネティック修飾因子に融合したＣａｓ９分子は、「エピエフェクター」と呼ばれる場合があり、一時的および／または一過性のエンドヌクレアーゼ活性を可能し得る。いくつかの態様において、Ｃａｓ９分子は、クロマチン修飾酵素に融合したｄＣａｓ９である。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
いくつかの態様において、本明細書に記載の細胞または細胞集団は、ジンクフィンガー（ＺＦＮ）技術を使用して生成される。いくつかの態様において、ＺＦＮは、本明細書の例えば表１に記載される標的ドメインを認識する。一般に、ジンクフィンガー媒介ゲノム編集にはジンクフィンガーヌクレアーゼの使用が関係し、これは典型的には、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む。ジンクフィンガー結合ドメインは、目的の任意の標的ドメインを認識して結合するように操作することができ、例えば、長さが約３ヌクレオチドから約２１ヌクレオチド、または約８から約１９ヌクレオチドの範囲のＤＮＡ配列を認識するように設計することができる。ジンクフィンガー結合ドメインは、典型的には、少なくとも３つのジンクフィンガー認識領域（例えば、ジンクフィンガー）を含む。
ＤＮＡに（認識部位で）配列特異的に結合し、ＤＮＡを結合部位またはその近くで切断することができる制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は当技術分野で知られており、ゲノム編集で使用するためのＺＦＮを形成するために使用することができる。例えば、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡを認識部位から離れた部位で切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。一例において、ＤＮＡ切断ドメインは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼに由来し得る。
ＴＡＬＥＮ
いくつかの態様において、本明細書に記載の細胞または細胞集団は、ＴＡＬＥＮ技術を使用して生成される。いくつかの態様において、TALENは、本明細書の例えば表１に記載される標的ドメインを認識する。一般に、ＴＡＬＥＮは、所望の標的ＤＮＡ分子に特異的に結合および切断することができる、操作された制限酵素である。ＴＡＬＥＮは典型的には、ＤＮＡ切断ドメインに融合した転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを含有する。ＤＮＡ結合ドメインは、１２位と１３位に分岐した２アミノ酸のＲＶＤ（反復可変ジペプチドモチーフ）を有する高度に保存された３３～３４アミノ酸配列を含有し得る。ＲＶＤモチーフは、核酸配列への結合特異性を決定し、所望のＤＮＡ配列に特異的に結合するように、操作することができる。一例において、ＤＮＡ切断ドメインは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼに由来し得る。いくつかの態様において、ＦｏｋＩドメインは、適切な配向および間隔を有する標的ゲノム中の部位に対して固有のＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を用いて、二量体として機能する。
目的の標的遺伝子に特異的なＴＡＬＥＮを細胞内で使用して、二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成することができる。修復メカニズムが、非相同末端結合を介して切断を不適切に修復する場合、切断部位に変異が導入される可能性がある。例えば、不適切な修復は、フレームシフト変異を導入し得る。代替的に、所望の配列を有する外来ＤＮＡ分子を、ＴＡＬＥＮと共に細胞に導入することができる。外来ＤＮＡの配列および染色体配列に応じて、このプロセスを使用して、欠陥を修正し、またはＤＮＡフラグメントを目的の標的遺伝子に導入し、またはかかる欠陥を内在性遺伝子に導入して、標的遺伝子の発現を低下させることができる。
本明細書で提供されるガイドＲＮＡおよび遺伝子操作方法に関連して使用するのに適した、エンドヌクレアーゼおよびヌクレアーゼバリアントのいくつかの例示的な非限定的態様は、上に記載されている。追加の適切なヌクレアーゼおよびヌクレアーゼバリアントは、本開示および当業者の知識に基づいて当業者には明らかであろう。本開示は、この点に関して限定されない。
ｇＲＮＡ配列および構成
一般的なｇＲＮＡ構成
ｇＲＮＡは、いくつかのドメインを含むことができる。一態様において、単分子のｓｇＲＮＡ、またはキメラのｇＲＮＡは、例えば５’から３’に以下を含む：
ターゲティングドメイン（これは、標的遺伝子、例えばＣＤ１２３遺伝子における標的核酸配列に、相補的または部分的に相補的である）；
第１の相補性ドメイン；
連結ドメイン；
第２の相補性ドメイン（これは第１の相補性ドメインに相補的である）；
近位ドメイン；および
任意に、テールドメイン。
これらの各ドメインについて、さらに詳しく説明する。
ターゲティングドメインは、標的核酸上の標的配列に対して相補的な、例えば少なくとも８０、８５、９０、または９５％相補的な、例えば完全に相補的な、ヌクレオチド配列を含み得る。ターゲティングドメインはＲＮＡ分子の一部であり、したがって典型的には塩基ウラシル（Ｕ）を含み、一方ｇＲＮＡ分子をコードする任意のＤＮＡは、塩基チミン（Ｔ）を含む。理論に束縛されることを望まないが、一態様において、ターゲティングドメインと標的配列の相補性は、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９分子複合体と標的核酸の相互作用の特異性に寄与すると考えられている。ターゲティングドメインと標的配列の対では、ターゲティングドメインのウラシル塩基が標的配列のアデニン塩基と対になることが理解される。一態様において、標的ドメイン自体は、５’から３’方向に、任意の二次ドメイン、およびコアドメインを含む。一態様において、コアドメインは、標的配列と完全に相補的である。一態様において、ターゲティングドメインは、５～５０ヌクレオチドの長さである。ターゲティングドメインは、１５と３０ヌクレオチドの間、１５～２５ヌクレオチド、１８～２２ヌクレオチド、または１９～２１ヌクレオチドの長さであり得る。いくつかの態様において、ターゲティングドメインは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、ターゲティングドメインは、１０～３０ヌクレオチド、または１５～２５ヌクレオチドの長さである。ターゲティングドメインは、標的ドメイン配列と完全に対応する（すなわち、いかなるミスマッチのヌクレオチドもない）、または１つ以上、典型的には４つ以下のミスマッチを含んでよい。ターゲティングドメインはＲＮＡ分子の一部であるｇＲＮＡであるため、それは典型的にリボヌクレオチドを含み、一方、ＤＮＡターゲティングドメインはデオキシリボヌクレオチドを含むであろう。
したがって、ｇＲＮＡのターゲティングドメインは、標的ドメインの配列に相補的な二本鎖の標的部位の配列、ひいてはＰＡＭ配列を含む鎖に相補的な鎖と（完全に、または部分的に相補的に）塩基対を成す。ｇＲＮＡのターゲティングドメインは、典型的にＰＡＭ配列を含まないことが理解されよう。採用されたヌクレアーゼによって、ＰＡＭの位置は標的ドメイン配列の５’または３’であってよいことがさらに理解されよう。例えば、ＰＡＭは、典型的に、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの標的ドメイン配列の３’、およびＣａｓ１２ａヌクレアーゼの標的ドメイン配列の５’である。ＰＡＭの位置およびｇＲＮＡが標的部位を結合するメカニズムの例証については、例えば、Vanegas et al., Fungal Biol Biotechnol. 2019; 6: 6の図１を参照。これは参照により本明細書に組み込まれる。ｇＲＮＡがＲＮＡガイド型のヌクレアーゼを標的部位へ標的化するメカニズムの追加の例証および説明については、Fu Y et al, Nat Biotechnol 2014 (doi: 10.1038/nbt.2808)、およびSternberg SH et al., Nature 2014 (doi: 10.1038/naturel3011)を見よ。両者は参照により本明細書に組み込まれる。
２２ヌクレオチドの標的ドメイン、およびＮＧＧ ＰＡＭ配列を含むＣａｓ９標的部位、ならびに、標的ドメインへ完全に対応する（したがって、標的ドメインおよびＰＡＭを含む鎖へ相補的なＤＮＡ鎖と完全な相補性をもって塩基対を成す）ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡの例示的例証を以下に提供する：
２２ヌクレオチドの標的ドメイン、およびＴＴＮ ＰＡＭ配列を含むＣａｓ１２ａ標的部位、ならびに、標的ドメインへ完全に対応する（したがって、標的ドメインおよびＰＡＭを含む鎖へ相補的なＤＮＡ鎖と完全な相補性をもって塩基対を成す）ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡの例示的例証を以下に提供する：
いくつかの態様において、Ｃａｓ１２ａ ＰＡＭ配列は、5’-T-T-T-V-3’である。
理論に束縛されることを望まないが、少なくともいくつかの態様において、ターゲティングドメインと標的配列の長さおよび相補性は、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９分子複合体と標的核酸の相互作用の特異性に寄与すると考えられている。いくつかの態様において、本明細書で提供されるｇＲＮＡのターゲティングドメインは、５～５０ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、ターゲティングドメインは、１５～２５ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、ターゲティングドメインは、１８～２２ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、ターゲティングドメインは、１９～２１ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、ターゲティングドメインは１５ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、ターゲティングドメインは１６ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、ターゲティングドメインは１７ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、ターゲティングドメインは1１８ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、ターゲティングドメインは１９ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、ターゲティングドメインは２０ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、ターゲティングドメインは２１ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、ターゲティングドメインは２２ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、ターゲティングドメインは２３ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、ターゲティングドメインは２４ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、ターゲティングドメインは２５ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、ターゲティングドメインは、本明細書で提供される標的ドメイン配列、またはその一部に、ミスマッチなく完全に対応する。いくつかの態様において、本明細書で提供されるｇＲＮＡのターゲティングドメインは、本明細書で提供される標的ドメイン配列に対して１つのミスマッチを含む。いくつかの態様において、ターゲティングドメインは、標的ドメイン配列に対して２つのミスマッチを含む。いくつかの態様において、標的ドメイン（target domain）は、標的ドメイン配列に対して３つのミスマッチを含む。
いくつかの態様において、ターゲティングドメインは、例えば、参照によりその全体が組み込まれるＰＣＴ公開番号 WO 2015/157070に記載されているとおり、コアドメインおよび二次ターゲティングドメインを含む。いくつかの態様において、コアドメインは、ターゲティングドメインの３’末端から約８～約１３ヌクレオチド（例えば、ターゲティングドメインの最も３’に近い８～１３ヌクレオチド）を含む。一態様において、二次ドメインは、コアドメインに対して５’に配置される。多くの態様において、コアドメインは、標的配列の対応する領域またはその一部との正確な相補性を有する（完全に対応する）。他の態様において、コアドメインは、標的ドメイン配列の対応するヌクレオチドと相補的ではない（ミスマッチしている）１つ以上のヌクレオチドを、有することができる。
第１の相補性ドメインは、第２の相補性ドメインと相補的であり、一態様において、少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成するために、第２の相補性ドメインに対して十分な相補性を有する。一態様において、第１の相補性ドメインは、５～３０ヌクレオチドの長さである。一態様において、第１の相補性ドメインは３つのサブドメインを含み、これらは５’から３’の方向において、５’サブドメイン、中央サブドメイン、および３’サブドメインである。一態様において、５’サブドメインは、４～９、例えば、４、５、６、７、８または９ヌクレオチドの長さである。一態様において、中央サブドメインは、１、２、または３、例えば１ヌクレオチド長である。一態様において、３’サブドメインは、３～２５、例えば、４～２２、４～１８、または４～１０、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの長さである。第１の相補性ドメインは、天然に存在する第１の相補性ドメインと相同性を共有するか、またはそれに由来することができる。一態様において、これは、S. pyogenes、S. aureusまたはS. thermophilusの第１の相補性ドメインと、少なくとも５０％の相同性を有する。
上記のドメインの配列および配置は、ＰＣＴ公開番号 WO2015/157070にさらに詳細に記載されており、これは参照により８８～１１２頁を含むその全体が本明細書に組み込まれる。
連結ドメインは、単分子ｇＲＮＡの第１の相補性ドメインを第２の相補性ドメインに連結するのに役立つ。連結ドメインは、第１および第２の相補性ドメインを、共有結合または非共有結合で連結することができる。一態様において、結合は共有結合である。一態様において、連結ドメインは、第１の相補性ドメインと第２の相補性ドメインとの間に挿入された共有結合であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、連結ドメインは、１つ以上、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、連結ドメインは、例えば、ＰＣＴ公開番号 WO2018/126176に開示されるとおり少なくとも１つの非ヌクレオチド結合を含み、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
第２の相補性ドメインは、少なくとも部分的に第１の相補性ドメインと相補的であり、一態様において、少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成するために、第２の相補性ドメインに対して十分な相補性を有する。一態様において、第２の相補性ドメインは、第１の相補性ドメインとの相補性を欠く配列、例えば二本鎖領域からループアウトする配列を、含むことができる。一態様において、第２の相補性ドメインは、５～２７ヌクレオチドの長さである。一態様において、第２の相補性ドメインは、第１の相補性領域よりも長い。一態様において、相補的ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドの長さである。一態様において、第２の相補性ドメインは３つのサブドメインを含み、これらは５’から３’の方向に、５’サブドメイン、中央サブドメイン、および３’サブドメインである。一態様において、５’サブドメインは、３～２５、例えば、４～２２、４～１８、または４～１０、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの長さである。一態様において、中央サブドメインは、１、２、３、４または５、例えば、３ヌクレオチドの長さである。一態様において、３’サブドメインは、４～９、例えば４、５、６、７、８または９ヌクレオチドの長さである。一態様において、第１の相補性ドメインの５’サブドメインおよび３’サブドメインは、それぞれ第２の相補性ドメインの３’サブドメインおよび５’サブドメインと相補的であり、例えば完全に相補的である。
一態様において、近位ドメインは、５～２０ヌクレオチドの長さである。一態様において、近位ドメインは、天然に存在する近位ドメインと相同性を共有するか、またはそれに由来することができる。一態様において、これは、S. pyogenes、S. aureusまたはS. thermophilusの近位ドメインと少なくとも５０％の相同性を有する。
テールドメインの広いスペクトルは、ｇＲＮＡでの使用に適する。一態様において、テールドメインは、長さが０（存在しない）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドである。いくつかの態様において、テールドメインヌクレオチドは、天然に存在するテールドメインの５’末端からの配列に由来するか、またはそれと相同性を共有する。いくつかの態様において、テールドメインは、互いに相補的であり少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成する配列を含む。いくつかの態様において、テールドメインは、存在しないか、または１から５０ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、テールドメインは、天然に存在する近位テールドメインと相同性を共有するか、またはそれに由来することができる。いくつかの態様において、これは、S. pyogenes、S. aureusまたはS. thermophilusのテールドメインと少なくとも５０％の相同性を有する。一態様において、テールドメインは、in vitroまたはin vivo転写の方法に関連する３’末端のヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、モジュラーｇＲＮＡは、以下を含む：
第１の鎖であって、以下を、例えば５’から３’に含むもの：
ターゲティングドメイン（これはＣＤ１２３遺伝子の標的核酸に相補的である）および
第１の相補性ドメイン；および
第２の鎖であって、以下を、好ましくは５’から３’に含むもの：
任意に、５’拡張ドメイン；
第２の相補性ドメイン；
近位ドメイン；および
任意に、テールドメイン。
いくつかの態様において、ｇＲＮＡは化学的に修飾（改変）されている。いくつかの態様において、本明細書で提供されるｇＲＮＡのいずれかは、化学的に改変された１つ以上のヌクレオチドを含む。ｇＲＮＡの化学的改変は以前に記載されており、好適な化学的改変には、ｇＲＮＡの機能にとって有益であり、所定のｇＲＮＡの望ましくない特性、例えばオフターゲット効果を測定できるほどに増加させない任意の改変が含まれる。好適な化学的改変には、例えば、ｇＲＮＡをエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼの触媒活性に対して感受性が低くなるようにするもの、ならびに、限定はされないが、ｇＲＮＡが、以下から選択される１つ以上の修飾を含み得る：ホスホロチオアート骨格修飾、２’－Ｏ－Ｍｅ修飾糖（例えば３’および５’末端の一方または両方において）、２’Ｆ－修飾糖、リボース糖の二環式ヌクレオチド－ｃＥｔによる置換、３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。追加の好適なｇＲＮＡ改変は、本開示に基づいて当業者に明らかになるであろうし、かかる好適なｇＲＮＡ改変には、限定されないが、例えば、Rahdar et al. PNAS December 22, 2015 112 (51) E7110-E7117、およびHendel et al., Nat Biotechnol. 2015 Sep; 33(9): 985-989において記載されていることを含み、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、本明細書に記載のｇＲＮＡは、１つ以上の２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオアートヌクレオチド、例えば、少なくとも２、３、４、５、または６つの２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオアートヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のｇＲＮＡは、３つの末端位置および５’末端および／または３つの末端位置および３’末端に、修飾ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオアートヌクレオチド）を含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを、例えば参照によりそれらの全体が組み込まれるＰＣＴ公開番号 ＷO2017/214460、WO2016/089433、および WO2016/164356に記載されているとおり、含み得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載のｇＲＮＡは、化学的に修飾されている。例えば、ｇＲＮＡは、１つ以上の２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含み得る。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを、ｇＲＮＡの５’末端に含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを、ｇＲＮＡの３’末端に含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを、ｇＲＮＡの５’および３’末端の両方に含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは２’－Ｏ修飾されており、例えば、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾されている。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは２’－Ｏ修飾されており、例えば、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾されている。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは２’－Ｏ修飾されており、例えば、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾されている。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは２’－Ｏ修飾されており、例えば、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾されている。いくつかの態様において、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチドは、化学的に修飾されていない。いくつかの態様において、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチドは、化学的に修飾された糖を有さない。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは２’－Ｏ修飾されており、例えば、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾されている。いくつかの態様において、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのリン酸結合を含む。いくつかの態様において、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのホスホロチオアート結合を含む。いくつかの態様において、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのチオＰＡＣＥ結合を含む。
いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、１つ以上の２’－Ｏ修飾および３’リン修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオアートヌクレオチドを含み得る。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾、例えば２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオアートヌクレオチドを、ｇＲＮＡの５’末端に含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾、例えば２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオアートヌクレオチドを、ｇＲＮＡの３’末端に含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾、例えば２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオアートヌクレオチドを、ｇＲＮＡの５’および３’末端に含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、１つ以上の非架橋酸素原子が硫黄原子で置き換えられた骨格を含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾されており、例えば、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオアート修飾されている。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾されており、例えば、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオアート修飾されている。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾されており、例えば、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオアート修飾されている。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾されており、例えば、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオアート修飾されている。いくつかの態様において、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチドは、化学的に修飾されていない。いくつかの態様において、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチドは、化学的に修飾された糖を有さない。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾されており、例えば、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオアート修飾されている。
いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、１つ以上の２’－Ｏ修飾および３’－リン修飾を、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを含み得る。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾、例えば２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを、ｇＲＮＡの５’末端に含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾、例えば２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを、ｇＲＮＡの３’末端に含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾、例えば２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを、ｇＲＮＡの５’および３’末端に含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、１つ以上の非架橋酸素原子が硫黄原子で置き換えられ、かつ１つ以上の非架橋酸素原子がアセテート基で置き換えられた骨格を含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾されており、例えば、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾されている。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾されており、例えば、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾されている。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾されており、例えば、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾されている。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾されており、例えば、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾されている。いくつかの態様において、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチドは、化学的に修飾されていない。いくつかの態様において、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチドは、化学的に修飾された糖を有さない。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾されており、例えば、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾されている。
いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、化学的に修飾された骨格を含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、ホスホロチオアート結合を含む。いくつかの態様において、１つ以上の非架橋酸素原子は硫黄原子で置き換えられている。いくつかの態様において、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチドは、それぞれホスホロチオアート結合を含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドは、それぞれホスホロチオアート結合を含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドは、それぞれホスホロチオアート結合を含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドは、それぞれホスホロチオアート結合を含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドは、それぞれホスホロチオアート結合を含む。
いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、１つ以上の非架橋酸素原子が硫黄原子で置き換えられ、かつ１つ以上の非架橋酸素原子がアセテート基で置き換えられた骨格を含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチドは、それぞれチオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドは、それぞれチオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドは、それぞれチオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドは、それぞれチオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドは、それぞれチオＰＡＣＥ結合を含む。
本明細書で提供されるガイドＲＮＡおよび遺伝子操作方法に関連して使用するのに適した改変、例えば化学的改変の、いくつかの例示的で非限定的な態様は、上に記載されている。追加の適切な改変、例えば化学的改変は、本開示および当技術分野の知識に基づいて当業者には明らかであり、これには、限定はされないが、Hendel, A. et al., Nature Biotech., 2015, Vol 33, No. 9；ＰＣＴ公開番号WO2017/214460；WO2016/089433；およびWO2016/164356に記載されているものが含まれる；これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で提供されるＣＤ１２３ターゲティングｇＲＮＡは、任意の好適な方法で細胞へ送達されることができる。例えば、ＲＮＡガイド型のヌクレアーゼへ結合したｇＲＮＡを包むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの送達のためのさまざまな好適な方法は記載されており、例示的な好適な方法には、限定されないが、細胞中へのＲＮＰのエレクトロポレーション、細胞中へのＣａｓヌクレアーゼおよびｇＲＮＡをコードするｍＲＮＡのエレクトロポレーション、さまざまなタンパク質または核酸トランスフェクション法、および例えばレトロウイルス（例えばレンチウイルス）ベクターなどのウイルスベクターを介するコード化ＲＮＡまたはＤＮＡの送達が含まれる。任意の好適な送達方法が本開示によって抱持され、本開示はこの点において限定されない。
ＣＤ１２３を標的とするｇＲＮＡ
本開示は、エンドヌクレアーゼをヒトＣＤ１２３に標的化することができる、いくつかの有用なｇＲＮＡを提供する。以下の表１は、本明細書に記載のｇＲＮＡが結合できる、ヒト内在性ＣＤ１２３の標的ドメインを示す。
表１．様々なｇＲＮＡにより結合されるヒトＣＤ１２３の例示的な標的ドメインが、本明細書に記載されている。各標的ドメインについて、第１の配列は、適切なｇＲＮＡによって標的化され得る標的ドメイン配列に対応する２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を表し、これは、同等のＲＮＡターゲティングドメイン配列（ＤＮＡヌクレオチドの代わりにＲＮＡヌクレオチドを含む）を含み得、および第２の配列はその逆補体である。太字は、その配列が、配列番号３１として以下に示されるヒトＣＤ１２３ ｃＤＮＡ配列中に存在することを示す。
表２．様々なｇＲＮＡにより結合されるヒトＣＤ１２３の例示的な標的ドメイン配列が、本明細書に提供されている。各標的ドメインについて、第１の配列は、ヒトＣＤ１２３ゲノム配列中の適切なＰＡＭに隣接する、ＤＮＡ標的配列を表し、第２の配列は、例示的な同等のｇＲＮＡターゲティングドメイン配列を表す。
表６．様々なｇＲＮＡにより結合されるヒトＣＤ１２３の例示的な標的ドメイン配列が、本明細書に提供されている。各標的ドメインについて、ヒトＣＤ１２３ゲノム配列中の適切なＰＡＭに隣接するＤＮＡ標的配列が提供される。本明細書で提供される標的ドメインを標的とするｇＲＮＡは、そのターゲティングドメイン内に同等のＲＮＡ配列を含み得る。
代表的なＣＤ１２３（NM_001267713.1）ｃＤＮＡ配列は、以下に配列番号３１として提供される。下線または太字は、ｇＲＮＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｐ３、またはＳ３に相補的な領域（またはその逆補体）を示す。太字は、２つのかかる領域の間に重なりがある場合に使用される。
（配列番号：３１）
追加のＣＤ１２３アイソフォーム（NM_002183.4）ｃＤＮＡは、次のとおりに提供される：
CTTCGGTTTCTCTTCGGGGAAAGCTGCTTTCAGCGCACACGGGAAGATATCAGAAACATCCTAGGATCAGGACACCCCAGATCTTCTCAACTGGAACCACGAAGGCTGTTTCTTCCACACAGTACTTTGATCTCCATTTAAGCAGGCACCTCTGTCCTGCGTTCCGGAGCTGCGTTCCCGATGGTCCTCCTTTGGCTCACGCTGCTCCTGATCGCCCTGCCCTGTCTCCTGCAAACGAAGGAAGATCCAAACCCACCAATCACGAACCTAAGGATGAAAGCAAAGGCTCAGCAGTTGACCTGGGACCTTAACAGAAATGTGACCGATATCGAGTGTGTTAAAGACGCCGACTATTCTATGCCGGCAGTGAACAATAGCTATTGCCAGTTTGGAGCAATTTCCTTATGTGAAGTGACCAACTACACCGTCCGAGTGGCCAACCCACCATTCTCCACGTGGATCCTCTTCCCTGAGAACAGTGGGAAGCCTTGGGCAGGTGCGGAGAATCTGACCTGCTGGATTCATGACGTGGATTTCTTGAGCTGCAGCTGGGCGGTAGGCCCGGGGGCCCCCGCGGACGTCCAGTACGACCTGTACTTGAACGTTGCCAACAGGCGTCAACAGTACGAGTGTCTTCACTACAAAACGGATGCTCAGGGAACACGTATCGGGTGTCGTTTCGATGACATCTCTCGACTCTCCAGCGGTTCTCAAAGTTCCCACATCCTGGTGCGGGGCAGGAGCGCAGCCTTCGGTATCCCCTGCACAGATAAGTTTGTCGTCTTTTCACAGATTGAGATATTAACTCCACCCAACATGACTGCAAAGTGTAATAAGACACATTCCTTTATGCACTGGAAAATGAGAAGTCATTTCAATCGCAAATTTCGCTATGAGCTTCAGATACAAAAGAGAATGCAGCCTGTAATCACAGAACAGGTCAGAGACAGAACCTCCTTCCAGCTACTCAATCCTGGAACGTACACAGTACAAATAAGAGCCCGGGAAAGAGTGTATGAATTCTTGAGCGCCTGGAGCACCCCCCAGCGCTTCGAGTGCGACCAGGAGGAGGGCGCAAACACACGTGCCTGGCGGACGTCGCTGCTGATCGCGCTGGGGACGCTGCTGGCCCTGGTCTGTGTCTTCGTGATCTGCAGAAGGTATCTGGTGATGCAGAGACTCTTTCCCCGCATCCCTCACATGAAAGACCCCATCGGTGACAGCTTCCAAAACGACAAGCTGGTGGTCTGGGAGGCGGGCAAAGCCGGCCTGGAGGAGTGTCTGGTGACTGAAGTACAGGTCGTGCAGAAAACTTGAGACTGGGGTTCAGGGCTTGTGGGGGTCTGCCTCAATCTCCCTGGCCGGGCCAGGCGCCTGCACAGACTGGCTGCTGGACCTGCGCACGCAGCCCAGGAATGGACATTCCTAACGGGTGGTGGGCATGGGAGATGCCTGTGTAATTTCGTCCGAAGCTGCCAGGAAGAAGAACAGAACTTTGTGTGTTTATTTCATGATAAAGTGATTTTTTTTTTTTTAACCCA（配列番号：５２）
下線は、ｇＲＮＡ Ｄ１に相補的な領域（またはその逆補体）を示す。
デュアルｇＲＮＡ組成物およびその使用
いくつかの態様において、本明細書に記載のｇＲＮＡ（例えば、表２、６または８のｇＲＮＡ）は、第２のｇＲＮＡと組み合わせて、例えばヌクレアーゼをゲノム中の２つの部位に指向させるために使用することができる。例えば、いくつかの態様においては、ＣＤ１２３および第２の系統特異的細胞表面抗原（例えば、系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３、ＣＬＬ１、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ３４、ＣＤ３８、またはＢＣＭＡ））が欠損している造血細胞を生成して、例えば、細胞が２つの薬剤、すなわち抗ＣＤ１２３剤および第２の系統特異的細胞表面抗原を標的とする薬剤に耐性であり得るようにすることが望ましい。いくつかの態様において、細胞を、ＣＤ１２３の異なる領域を標的とする２つの異なるｇＲＮＡと接触させて、２つの切断を作製し２つの切断部位の間に欠失を生成することが望ましい。したがって、本開示は、ｇＲＮＡおよび関連するＣＲＩＳＰＲシステムの様々な組み合わせ、ならびに、ｇＲＮＡおよび関連するＣＲＩＳＰＲシステムのかかる組み合わせを使用したゲノム編集方法によって生成された細胞を提供する。いくつかの態様において、ＣＤ１２３ ｇＲＮＡは、第２のｇＲＮＡとは異なるヌクレアーゼを結合する。例えば、いくつかの態様において、ＣＤ１２３ ｇＲＮＡはＣａｓ９を結合し、第２のｇＲＮＡはＣａｓ１２ａを結合してもよく、またはその逆もよい。
いくつかの態様において、本明細書に記載の２つ以上（例えば、３、４、またはそれ以上）のｇＲＮＡが混合される。いくつかの態様において、各ｇＲＮＡは、別個の容器内にある。いくつかの態様において、本明細書に記載のキット（例えば、表２、６、または８による１つ以上のｇＲＮＡを含むキット）はまた、Ｃａｓ９分子、またはＣａｓ９分子をコードする核酸も含む。
いくつかの態様において、細胞を、ＣＤ１２３の異なる部位を標的とする２つの異なるｇＲＮＡと接触させて、例えば、２つの切断を作製し２つの切断部位の間に欠失または挿入を生成することが望ましい。
いくつかの態様において、第１および第２のｇＲＮＡは、表２、表６、表８によるｇＲＮＡまたはそのバリアントである。
いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡは、本明細書に記載のＣＤ１２３ ｇＲＮＡ（例えば、表２、６、８によるｇＲＮＡまたはそのバリアント）であり、第２のｇＲＮＡは、以下から選択される系統特異的細胞表面抗原を標的とする：ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３８、Ｃ型レクチン様分子１、ＣＳ１、ＩＬ－５、Ｌ１－ＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１３８、ＣＤ１３３、ＣＤ７０、ＣＤ７、ＣＤ１３、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ１１、ＣＤ１２３、ＣＤ５６、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ４１、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ３２６、ＬＭＰ２、ＣＤ２２、ＣＤ５２、ＣＤ１０、ＣＤ３／ＴＣＲ、ＣＤ７９／ＢＣＲ、およびＣＤ２６。
いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡは、本明細書に記載のＣＤ１２３ ｇＲＮＡ（例えば、表２、６、８によるｇＲＮＡまたはそのバリアント）であり、第２のｇＲＮＡは、限定することなく、以下のものなどの特定タイプのがんに関連する系統特異的細胞表面抗原を標的とする：ＣＤ２０、ＣＤ２２（非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ））、ＣＤ５２（Ｂ細胞ＣＬＬ）、ＣＤ３３（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））、ＣＤ１０（ｇｐ１００）（一般的な（ｐｒｅ－Ｂ）急性リンパ球性白血病および悪性メラノーマ）、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（Ｔ細胞リンパ腫および白血病）、ＣＤ７９／Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）（Ｂ細胞リンパ腫および白血病）、ＣＤ２６（上皮性およびリンパ性悪性腫瘍）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、およびＨＬＡ－ＤＱ（リンパ性悪性腫瘍）、ＲＣＡＳ１（婦人科の癌腫、胆管腺癌、膵臓の導管腺癌）、ならびに前立腺特異的膜抗原。
いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡは、本明細書に記載のＣＤ１２３ ｇＲＮＡ（例えば、表２、６、８によるｇＲＮＡまたはそのバリアント）であり、第２のｇＲＮＡは、以下から選択される系統特異的細胞表面抗原を標的とする：ＣＤ７、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３２、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４７、ＣＤ５６、９６、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３５、ＣＤ１７４、ＣＬＬ－１、葉酸受容体β、ＩＬ１ＲＡＰ、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄ／ＮＫＧ２ＤＬ、ＴＩＭ－３、またはＷＴ１。
いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡは、本明細書に記載のＣＤ１２３ ｇＲＮＡ（例えば、表２、６、８によるｇＲＮＡまたはそのバリアント）であり、第２のｇＲＮＡは、以下から選択される系統特異的細胞表面抗原を標的とする：ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６０ａ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４ａ、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６Ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７５Ｓ、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｃ、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ８５Ｅ、ＣＤ８５Ｆ、ＣＤ８５Ｇ、ＣＤ８５Ｈ、ＣＤ８５Ｉ、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ９９Ｒ、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ１５２、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ｂ１、ＣＤ１５８ｂ２、ＣＤ１５８ｄ、ＣＤ１５８ｅ１／ｅ２、ＣＤ１５８ｆ、ＣＤ１５８ｇ、ＣＤ１５８ｈ、ＣＤ１５８ｉ、ＣＤ１５８ｊ、ＣＤ１５８ｋ、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１８６、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤｗ１９８、ＣＤｗ１９９、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０４、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤ２１０ａ、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２１５、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ２１８ｂ、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３６Ｒ、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５、ＣＤ２４６、ＣＤ２４７、ＣＤ２４８、ＣＤ２４９、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、ＣＤ２６４、ＣＤ２６５、ＣＤ２６６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７２、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８６、ＣＤ２８８、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｃ、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、ＣＤ３０６、ＣＤ３０７ａ、ＣＤ３０７ｂ、ＣＤ３０７ｃ、ＣＤ３０７ｄ、ＣＤ３０７ｅ、ＣＤ３０９、ＣＤ３１２、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、ＣＤ３２０、ＣＤ３２１、ＣＤ３２２、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３２６、ＣＤ３２７、ＣＤ３２８、ＣＤ３２９、ＣＤ３３１、ＣＤ３３２、ＣＤ３３３、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤ３３８、ＣＤ３３９、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３４９、ＣＤ３５０、ＣＤ３５１、ＣＤ３５２、ＣＤ３５３、ＣＤ３５４、ＣＤ３５５、ＣＤ３５７、ＣＤ３５８、ＣＤ３５９、ＣＤ３６０、ＣＤ３６１、ＣＤ３６２またはＣＤ３６３。
いくつかの態様において、第２のｇＲＮＡは、ＰＣＴ公開番号 WO2017/066760、WO2019/046285、WO/2018/160768のいずれか、またはBorot et al. PNAS June 11, 2019 116 (24) 11978-11987に記載のｇＲＮＡであり、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡは、本明細書に記載のＣＤ１２３ ｇＲＮＡ（例えば、表２、６、８によるｇＲＮＡまたはそのバリアント）であり、第２のｇＲＮＡは、以下から選択される系統特異的細胞表面抗原を標的とする：ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ－１（ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９、および１９Ａ２４とも呼ばれる）；Ｃ型レクチン様分子１（ＣＬＥＣＬ１）；上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＣＤ２）；ガングリオシドＧＤ３（aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlep(1-1)Cer）；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）、Ｔｎ抗原（（Ｔｎ Ａｇ）または（ＧａｌＮＡｃα－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；がん胎児性抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒａ２またはＣＤ２１３Ａ２）；メソテリン；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ－１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１（テスティシンまたはＰＲＳＳ２１）；血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲβ）；ステージ特異的胎児性抗原４（ＳＳＥＡ－４）；ＣＤ２０；葉酸受容体α；受容体チロシン－プロテインキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２変異型（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰ）；インスリン様成長因子Ｉ受容体（ＩＧＦ－Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、βタイプ９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；ブレークポイントクラスター領域（ＢＣＲ）とアベルソンマウス白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）からなるがん遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ－ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３（aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer）；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体β；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（placenta-specific 1）（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミドの六糖部分（ＧｌｏｂｏＨ）；乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体β３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役型受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体；遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）；がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）；メラノーマ関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＥＴＳ転座バリアント遺伝子６、染色体１２ｐに位置する（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ２）；メラノーマがん精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）；メラノーマがん精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３変異体；プロステイン（prostein）；サバイビング（surviving）；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１またはガレクチン８）、Ｔ細胞により認識されるメラノーマ抗原１（ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴ１）；ラット肉腫（Ｒａｓ）変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座ブレークポイント；アポトーシスのメラノーマ阻害剤（ＭＬ－１ＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ－ｍｙｃ鳥類骨髄球腫症ウイルス腫瘍遺伝子神経芽細胞腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）；シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳまたはBrother of the Regulator of Imprinted Sites）、Ｔ細胞３により認識される扁平上皮癌抗原（ＳＡＲＴ３）；ペアボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳ１）；リンパ球特異的プロテインチロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；キナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－４）；滑膜肉腫、Ｘブレークポイント２（ＳＳＸ２）；高度な糖化最終産物の受容体（ＲＡＧＥ－１）；腎臓ユビキタス１（ＲＵ１）；腎臓ユビキタス２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）；腸のカルボキシエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０－２変異（ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）、リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン－３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）。
いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡは、本明細書に記載のＣＤ１２３ ｇＲＮＡ（例えば、表２、６、８によるｇＲＮＡまたはそのバリアント）であり、第２のｇＲＮＡは、以下から選択される系統特異的細胞表面抗原を標的とする：ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４７、ＣＤ５１、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６３、ＣＤ９７、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５、ＣＤ１５７、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ２１７、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３０５、ＣＤ３１７、ＣＤ３２１、およびＣＬＬ１。
いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡは、本明細書に記載のＣＤ１２３ ｇＲＮＡ（例えば、表２、６、８によるｇＲＮＡまたはそのバリアント）であり、第２のｇＲＮＡは、以下から選択される系統特異的細胞表面抗原を標的とする：ＣＤ１２３、ＣＬＬ１、ＣＤ３８、ＣＤ１３５（ＦＬＴ３）、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ１）、ＣＤ１１７（ｃ－ＫＩＴ）、ＦＲβ（ＦＯＬＲ２）、ＣＤ４７、ＣＤ８２、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＣＤ１２０Ｂ）、ＣＤ１９１、ＣＤ９６、ＰＴＰＲＪ（ＣＤ１４８）、ＣＤ７０、ＬＩＬＲＢ２（ＣＤ８５Ｄ）、ＣＤ２５（ＩＬ２Ｒα）、ＣＤ４４、ＣＤ９６、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４５、ＣＤ７、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、およびＣＤ８２。
いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡは、本明細書に記載のＣＤ１２３ ｇＲＮＡ（例えば、表２、６、８によるｇＲＮＡまたはそのバリアント）であり、第２のｇＲＮＡは、以下から選択される系統特異的細胞表面抗原を標的とする：ＣＤ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１５、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４７、ＣＤ５１、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６３、ＣＤ７０、ＣＤ８２、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１１７、ＣＤ１２０Ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５、ＣＤ１４８、ＣＤ１５７、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１９１、ＣＤ２１７、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３０５、ＣＤ３１７、ＣＤ３２１、ＣＬＬ１、ＦＲβ（ＦＯＬＲ２）、またはＮＫＧ２Ｄリガンド。
いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡは、本明細書に記載のＣＤ１２３ ｇＲＮＡ（例えば、表２、６、８によるｇＲＮＡまたはそのバリアント）であり、第２のｇＲＮＡは、ＣＤ３３を標的とする。いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡは、本明細書に記載のＣＤ１２３ ｇＲＮＡ（例えば、表２、６、８によるｇＲＮＡまたはそのバリアント）であり、第２のｇＲＮＡは、ＣＬＬ１を標的とする。
いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡは、本明細書に記載のＣＤ１２３ ｇＲＮＡ（例えば、表２、６、８によるｇＲＮＡまたはそのバリアント）であり、第２のｇＲＮＡは、表Ａからの配列を含む。いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡは、ターゲティングドメインを含むＣＤ１２３ ｇＲＮＡであり、ここでターゲティングドメインは、配列番号１～１０、４０、４２、４４、４６のいずれかの配列を含み、および第２のｇＲＮＡは、表Ａの配列に対応するターゲティングドメインを含む。いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡは、ターゲティングドメインを含むＣＤ１２３ ｇＲＮＡであり、ここでターゲティングドメインは、配列番号9の配列を含み、および第２のｇＲＮＡは、表Ａの配列に対応するターゲティングドメインを含む。いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡは、ターゲティングドメインを含むＣＤ１２３ ｇＲＮＡであり、ここでターゲティングドメインは、配列番号１０の配列を含み、および第２のｇＲＮＡは、表Ａの配列に対応するターゲティングドメインを含む。いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡは、ターゲティングドメインを含むＣＤ１２３ ｇＲＮＡであり、ここでターゲティングドメインは、配列番号１１の配列を含み、および第２のｇＲＮＡは、表Ａの配列に対応するターゲティングドメインを含む。いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡは、ターゲティングドメインを含むＣＤ１２３ ｇＲＮＡであり、ここでターゲティングドメインは、配列番号１２の配列を含み、および第２のｇＲＮＡは、表Ａの配列に対応するターゲティングドメインを含む。いくつかの態様において、第２のｇＲＮＡは、WO2017/066760、WO2019/046285、WO/2018/160768、またはBorot et al. PNAS June 11, 2019 116 (24) 11978-11987のいずれかに記載のｇＲＮＡであり、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
表Ａ．例示的なヒトＣＤ３３標的配列。特定の標的配列には、テキスト内のスペースの後にＰＡＭ配列が続く。提供される標的配列に結合する適切なｇＲＮＡは典型的には、それぞれの標的配列（およびＰＡＭを除く）と同等のＲＮＡヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含むであろう。
２つ以上の変異を含む細胞
いくつかの態様において、本明細書に記載の操作された細胞は、２つ以上の変異を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の操作された細胞は２つの変異を含み、第１の変異はＣＤ１２３にあり、第２の変異は第２の系統特異的細胞表面抗原にある。かかる細胞は、いくつかの態様において、２つの薬剤、すなわち、抗ＣＤ１２３剤および第２の系統特異的細胞表面抗原を標的とする薬剤に対して、耐性であることができる。いくつかの態様において、かかる細胞は、本明細書に記載の２つ以上のｇＲＮＡ、例えば表２のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを使用して生成することができる。いくつかの態様において、かかる細胞は、本明細書に記載の２つ以上のｇＲＮＡ、例えば表６のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを使用して生成することができる。いくつかの態様において、かかる細胞は、本明細書に記載の２つ以上のｇＲＮＡ、例えば表８のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを使用して生成することができる。いくつかの態様において、細胞は、例えばＺＦＮまたはＴＡＬＥＮを使用して生成することができる。本開示はまた、本明細書に記載の細胞を含む集団も提供する。
いくつかの態様において、第２の変異は、系統特異的細胞表面抗原をコードする遺伝子に、例えば前の節にリストされたものにある。いくつかの態様において、第２の変異は、表Ａにリストされた部位にある。
典型的には、本明細書で提供される方法および組成物によってもたらされる変異、例えば、標的遺伝子、例えばＣＤ１２３および／または本開示で言及される他の任意の標的遺伝子などにおける変異は、標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物における機能の喪失をもたらし、例えばＣＤ１２３遺伝子の変異の場合、ＣＤ１２３タンパク質の機能の喪失をもたらす。いくつかの態様において、機能の喪失は、遺伝子産物の発現レベルの低下、例えばより低い発現レベルへの低下、または遺伝子産物の発現の完全な破壊である。いくつかの態様において、変異は、遺伝子産物の非機能的バリアントの発現をもたらす。例えば、コード化配列に未成熟の停止コドンを生成する変異の場合、短縮された遺伝子産物を、またはナンセンスもしくはミスセンス変異を生成する変異の場合、変更されたアミノ酸配列を特徴とする遺伝子産物をもたらし、これにより、遺伝子産物が機能しなくなる。いくつかの態様において、遺伝子産物の機能は、結合パートナーの結合または認識である。いくつかの態様において、遺伝子産物、例えばＣＤ１２３、第２の系統特異的細胞表面抗原、またはその両方の発現の低下は、野生型または非操作の対応する細胞のレベルの５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、２％以下、または１％以下への低下である。
いくつかの態様において、本明細書で提供される方法および／または組成物を使用して生成された細胞の集団におけるＣＤ１２３のコピーの、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、変異を有する。いくつかの態様において、細胞集団の第２の系統特異的細胞表面抗原のコピーの、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、変異を有する。いくつかの態様において、細胞集団におけるＣＤ１２３および第２の系統特異的細胞表面抗原のコピーの、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、変異を有する。いくつかの態様において、集団は、１つ以上の野生型細胞を含む。いくつかの態様において、集団は、ＣＤ１２３の１つの野生型コピーを含む１つ以上の細胞を含む。いくつかの態様において、集団は、第２の系統特異的細胞表面抗原の１つの野生型コピーを含む１つ以上の細胞を含む。
細胞
本開示のいくつかの側面は、遺伝子操作された細胞であって、ＣＤ１２３の発現の喪失、またはＣＤ１２３を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ１２３のバリアント形態の発現をもたらすそのゲノムにおける改変を含むものを提供する。いくつかの態様において、ＣＤ１２３の改変を有する細胞（例えば、ＨＳＣまたはＨＰＣ）は、本明細書に記載のヌクレアーゼおよび／またはｇＲＮＡを使用して作製される。いくつかの態様において、ＣＤ１２３の改変および第２の系統特異的細胞表面抗原の改変を有する細胞（例えば、ＨＳＣまたはＨＰＣ）は、本明細書に記載のヌクレアーゼおよび／またはｇＲＮＡを使用して作製される。いくつかの態様において、細胞のゲノムにおける改変は、ＣＤ１２３をコードするゲノム配列における変異である。いくつかの態様において、改変は、ゲノム編集を介して、例えば、本明細書で提供されるＣＤ１２３標的部位を標的とする、または本明細書で提供されるターゲティングドメイン配列を含むＣａｓヌクレアーゼおよびｇＲＮＡを使用してもたらされる。細胞は、細胞自体をヌクレアーゼおよび／またはｇＲＮＡと接触させることによって作製することができ、または細胞は、ヌクレアーゼおよび／またはｇＲＮＡと接触させた細胞の娘細胞であり得ることが、理解される。いくつかの態様において、本明細書に記載の細胞（例えば、ＨＳＣ）は、対象の造血系を再構成することができる。いくつかの態様において、本明細書に記載の細胞（例えば、ＨＳＣ）は、ヒト対象への生着、骨髄系細胞の産生、およびリンパ系細胞の産生の１つ以上（例えば、すべて）が可能である。
本明細書で提供される組成物、方法、戦略、および治療法は、任意の細胞または細胞型に適用されてよいが、本発明の側面によるＣＤ１２３遺伝子におけるゲノム改変に特に好適であるいくつかの例示的な細胞および細胞型が、本明細書でより詳細に記載される。しかしながら、当業者は、かかる例の提供は、いくつかの特定の態様を例証する目的のためであり、追加の好適な細胞および細胞型が、本開示に基づいて当業者に明らかであろうことを理解するであろうし、これはこの点において限定されない。
いくつかの態様において、本明細書に記載の細胞は、ＣＤ１２３のエキソン２に変異を有するヒト細胞である。いくつかの態様において、本明細書に記載の細胞は、ＣＤ１２３のエキソン5に変異を有するヒト細胞である。いくつかの態様において、本明細書に記載の細胞は、ＣＤ１２３のエキソン６に変異を有するヒト細胞である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の細胞の集団は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、または両方（ＨＳＰＣ）を含む。いくつかの態様において、細胞はＣＤ３４＋である。いくつかの態様において、細胞は造血細胞である。いくつかの態様において、細胞は造血幹細胞である。いくつかの態様において、細胞は造血前駆細胞である。いくつかの態様において、細胞は免疫エフェクター細胞である。いくつかの態様において、細胞はリンパ球である。いくつかの態様において、細胞はＴリンパ球である。いくつかの態様において、細胞はＮＫ細胞である。いくつかの態様において、細胞は幹細胞である。いくつかの態様において、幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞、または組織特異的幹細胞からなる群から選択される。
いくつかの態様において、細胞は、ＣＤ１２３編集造血幹細胞をレシピエントの骨髄中に生着させ、レシピエント内で全ての血液系統細胞型の分化した子孫を生成する能力によって特徴付けられる細胞集団中に含まれる。いくつかの態様において、細胞集団は、ＣＤ１２３編集造血幹細胞をレシピエントの骨髄中に、少なくとも５０％の効率にて生着させる能力によって特徴付けられる。いくつかの態様において、細胞集団は、ＣＤ１２３編集造血幹細胞をレシピエントの骨髄中に、少なくとも６０％の効率にて生着させる能力によって特徴付けられる。いくつかの態様において、細胞集団は、ＣＤ１２３編集造血幹細胞をレシピエントの骨髄中に、少なくとも７０％の効率にて生着させる能力によって特徴付けられる。いくつかの態様において、細胞集団は、ＣＤ１２３編集造血幹細胞をレシピエントの骨髄中に、少なくとも８０％の効率にて生着させる能力によって特徴付けられる。いくつかの態様において、細胞集団は、ＣＤ１２３編集造血幹細胞をレシピエントの骨髄中に、少なくとも９０％の効率にて生着させる能力によって特徴付けられる。いくつかの態様において、細胞集団は、非編集造血幹細胞の分化能と同等の分化能によって特徴付けられるＣＤ１２３編集造血幹細胞を含む。
いくつかの態様において、細胞は、１つのみの遺伝子改変を含む。いくつかの態様において、細胞は、ＣＤ１２３遺伝子座でのみ遺伝子改変されている。いくつかの態様において、細胞は、第２の遺伝子座で遺伝子改変されている。いくつかの態様において、細胞は、トランスジェニックタンパク質を含まず、例えばＣＡＲを含まない。
本開示のいくつかの側面は、遺伝子操作された造血細胞を提供し、そのゲノムにおける改変を含み、ＣＤ１２３の発現の喪失、またはＣＤ１２３を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ１２３のバリアント形態の発現をもたらす。いくつかの態様において、本明細書に記載の改変細胞は、実質的にＣＤ１２３タンパク質を含まない。いくつかの態様において、本明細書に記載の改変細胞は、野生型ＣＤ１２３タンパク質を実質的に含まないが、変異体ＣＤ１２３タンパク質を含む。いくつかの態様において、変異体ＣＤ１２３タンパク質は、治療目的のためにＣＤ１２３を標的とする薬剤によって結合されない。いくつかの態様において、そのゲノム中に改変を含む遺伝子操作された細胞は、例えば、同じ細胞型であるがゲノム改変を含まない造血細胞（例えば、ＨＳＣ）と比較して、ＣＤ１２３の細胞表面発現の低減、および／またはＣＤ１２３を標的とする免疫療法剤による結合の低減をもたらす。
いくつかの態様において、細胞は造血細胞、例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、造血幹または前駆細胞である。造血幹細胞（ＨＳＣ）は、多能性、自己再生性、および／または造血系の全系統を生成および／または再構成する能力を特徴とする細胞であり、骨髄細胞（例えば、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、樹状細胞、赤血球、血小板など）およびリンパ系細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）それぞれをさらに生じさせる、骨髄性およびリンパ性前駆細胞の両方を含む。ＨＳＣは、ＨＳＣの同定および／または単離に使用できる１つ以上の細胞表面マーカー、例えばＣＤ３４（例えば、ＣＤ３４＋）の発現、および細胞系統への関与に関連する細胞表面マーカーの欠如によって特徴付けられる。いくつかの態様において、本明細書に記載の遺伝子操作された細胞（例えば、遺伝子操作されたＨＳＣ）は、ＨＳＣの同定または単離に典型的に関連する１つ以上の細胞表面マーカーを発現せず、低減された量の細胞表面マーカーを発現するか、または細胞表面マーカーを標的とする免疫療法剤によって認識されないバリアント細胞表面マーカーを発現するが、しかしそれにもかかわらず、自己再生が可能であり、造血系の全ての系統を生成および／または再構成し得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載の細胞の集団は、複数の造血幹細胞を含み；いくつかの態様において、本明細書に記載の細胞の集団は、複数の造血前駆細胞を含み；およびいくつかの態様において、本明細書に記載の細胞の集団は、複数の造血幹細胞および複数の造血前駆細胞を含む。
いくつかの態様において、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞は、２つ以上のゲノム改変、例えば、ＣＤ１２３の発現の喪失、またはＣＤ１２３を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ１２３のバリアント形態の発現をもたらすゲノム改変に加えて、１つ以上のゲノム改変を含む。
いくつかの態様において、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞は、ＣＤ１２３の発現の喪失、またはＣＤ１２３を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ１２３のバリアント形態の発現をもたらすゲノム改変を含み、例えば、細胞のゲノム中に組み込まれたＣＡＲをコードする発現コンストラクトの形において、キメラ抗原受容体をコードする発現コンストラクトをさらに含む。いくつかの態様において、ＣＡＲは、ＣＤ１２３に結合する結合ドメイン、例えば、抗体フラグメントを含む。
本開示のいくつかの側面は、遺伝子操作された免疫エフェクター細胞であって、ＣＤ１２３の発現の喪失、またはＣＤ１２３を標的とする免疫療法剤によって認識されないＣＤ１２３のバリアント形態の発現をもたらすそのゲノムにおける改変を含むものを提供する。いくつかの態様において、免疫エフェクター細胞はリンパ球である。いくつかの態様において、免疫エフェクター細胞はＴリンパ球である。いくつかの態様において、Ｔリンパ球はアルファ・ベータＴリンパ球である。いくつかの態様において、Ｔリンパ球はガンマ・デルタＴリンパ球である。いくつかの態様において、免疫エフェクター細胞はナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。いくつかの態様において、免疫エフェクター細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの態様において、免疫エフェクター細胞は、内在性トランスジーン、例えば、トランスジェニックタンパク質を発現しない。いくつかの態様において、免疫エフェクター細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。いくつかの態様において、免疫エフェクター細胞はＣＤ１２３を標的とするＣＡＲを発現する。いくつかの態様において、免疫エフェクター細胞はＣＤ１２３を標的とするＣＡＲを発現しない。
いくつかの態様において、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞は、ＣＤ１２３タンパク質を実質的に発現せず、例えば、免疫染色方法などの好適な方法によって測定され得るＣＤ１２３タンパク質を発現しない。いくつかの態様において、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞は、野生型ＣＤ１２３タンパク質を実質的に発現しないが、変異型ＣＤ１２３タンパク質バリアント、例えば、ＣＤ１２３を標的とする免疫療法剤、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法剤または抗ＣＤ１２３抗体、抗体フラグメントもしくは抗体-薬物抱合体（ＡＤＣ）によって認識されない、バリアントを発現する。
いくつかの態様において、ＨＳＣは、ヒト対象などの対象から得られる。ＨＳＣを取得する方法は、例えばPCT/US2016/057339に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、ＨＳＣは、末梢血ＨＳＣである。いくつかの態様において、哺乳動物対象は、非ヒト霊長類、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、ウシ、ブタ、ウマ、または家畜である。いくつかの態様において、ＨＳＣは、ヒト対象から、例えば造血器悪性腫瘍を有するヒト対象から得られる。いくつかの態様において、ＨＳＣは、健康なドナーから得られる。いくつかの態様において、ＨＳＣは、キメラ受容体を発現する免疫細胞をその後に投与する対象から得られる。細胞を得たのと同じ対象に投与されるＨＳＣは、自家細胞と呼ばれ、一方、細胞が投与される対象ではない対象から得たＨＳＣは、同種異系細胞と呼ばれる。
いくつかの態様において、遺伝子操作された細胞集団のＣＤ１２３のコピーの、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、変異を有する。いくつかの態様において、遺伝子操作された細胞集団のＣＤ１２３のコピーの、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、本明細書に記載のゲノム編集アプローチ、例えば、本明細書で提供されるｇＲＮＡを使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによってもたらされる変異を有する。例として、集団は、複数の異なるＣＤ１２３変異を含むことができ、複数の各変異は、変異を有する細胞の集団におけるＣＤ１２３のコピーのパーセントに寄与する。
いくつかの態様において、遺伝子操作された造血細胞におけるＣＤ１２３の発現を、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型対応物）におけるＣＤ１２３の発現と比較する。いくつかの態様において、遺伝子操作は、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型の対応物）でのＣＤ１２３の発現と比較して、ＣＤ１２３の発現レベルの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の低下をもたらす。例えば、いくつかの態様において、遺伝子操作された造血細胞は、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型の対応物）と比較して、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満のＣＤ１２３を発現する。
いくつかの態様において、遺伝子操作は、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型の対応物）での野生型ＣＤ１２３の発現レベルと比較して、野生型ＣＤ１２３の発現レベルの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の低下をもたらす。すなわち、いくつかの態様において、遺伝子操作された造血細胞は、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型の対応物）と比較して、２０％未満、１９％、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満のＣＤ１２３を発現する。
いくつかの態様において、遺伝子操作は、適切な対照（例えば、１つの細胞または複数の細胞）と比較して、野生型系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ１２３）の発現レベルの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の低下をもたらす。いくつかの態様において、適切な対照は、同じ対象からの複数の非操作細胞において測定または予想される、野生型系統特異的細胞表面抗原のレベルを含む。いくつかの態様において、適切な対照は、健康な対象からの複数の細胞において測定または予想される、野生型系統特異的細胞表面抗原のレベルを含む。いくつかの態様において、適切な対照は、健康な個体のプール（例えば、１０、２０、５０、または１００個体）からの細胞の集団において測定または予想される、野生型系統特異的細胞表面抗原のレベルを含む。いくつかの態様において、適切な対照は、本明細書に記載の処置、例えば抗ＣＤ１２３療法を必要とする対象において測定または予想される、野生型系統特異的細胞表面抗原のレベルを含み、ここで該対象はがんを有し、このがんの細胞はＣＤ１２３を発現する。
いくつかの態様において、本明細書に記載の細胞を遺伝子操作する方法は、野生型細胞、例えば、野生型造血幹細胞又は前駆細胞を提供するステップを含む。いくつかの態様において、野生型細胞は、ＣＤ１２３をコードする遺伝子の２つの機能的コピーを含む（例えば、発現する）編集されていない細胞である。いくつかの態様において、細胞は、配列番号３１、または５２によるＣＤ１２３遺伝子配列を含む。いくつかの態様において、細胞は、配列番号３１、または５２にコードされるＣＤ１２３タンパク質をコードするＣＤ１２３遺伝子配列を含んでおり、例えば、ＣＤ１２３遺伝子配列は、配列番号３１、または５２と比べて１つ以上の沈黙変異を含んでもよい。いくつかの態様において、本方法において使用される細胞は、天然に存在する細胞又は非操作細胞である。いくつかの態様において、野生型細胞は、ＣＤ１２３を発現するか、またはＣＤ１２３を発現する細胞株と同等のレベル（または、その９０％～１１０％、８０％～１２０％、７０％～１３０％、６０～１４０％、または５０％～１５０％以内）にてＣＤ１２３を発現する、より分化した細胞を生じる。
いくつかの態様において、野生型細胞は、ＣＤ１２３を結合する抗体（例えば、抗ＣＤ１２３抗体）を結合するか、またはＣＤ１２３を発現する細胞株（例えば、ＫＧ１ａ、Ｋ５６２、ＨＬ－６０、およびＭｏｌｍ１３）への抗体の結合と同等のレベル（または、その９０％～１１０％、８０％～１２０％、７０％～１３０％、６０～１４０％、または５０％～１５０％以内）にてかかる抗体を結合する、より分化した細胞を生じる。抗体結合は、例えばフローサイトメトリー、または免疫組織化学的検査によって測定されてよい。
処置および投与の方法
いくつかの態様において、本明細書に記載の有効数のＣＤ１２３改変細胞は、抗ＣＤ１２３療法、例えば抗ＣＤ１２３がん療法と組み合わせて対象に投与される。いくつかの態様において、改変されたＣＤ１２３および改変された第２の系統特異的細胞表面抗原を含む有効数の細胞は、抗ＣＤ１２３療法、例えば抗ＣＤ１２３がん療法と組み合わせて投与される。いくつかの態様において、抗ＣＤ１２３療法は、抗体、二重特異性Ｔ細胞誘導剤（T cell engager）、ＡＤＣ、またはＣＡＲを発現する免疫細胞を含む。
いくつかの態様において、それを必要とする対象へ投与される本明細書で提供される遺伝子操作された細胞の数は、１０６～１０１１の範囲内である。しかしながら、この例示的範囲を下回るまたは上回る量もまた、本開示の範囲内である。例えば、いくつかの態様において、それを必要とする対象へ投与される本明細書で提供される遺伝子操作された細胞、例えば、ＨＳＣ、ＨＰＣ、または免疫エフェクター細胞の数は、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、または約１０１１である。いくつかの態様において、それを必要とする対象へ投与される本明細書で提供される遺伝子操作された細胞の数は、１０６～１０９の範囲内、１０６～１０８の範囲内、１０７～１０９の範囲内、約１０７～１０１０の範囲内、１０８～１０１０の範囲内、または１０９～１０１１の範囲内である。
薬剤（例えば、ＣＤ１２３改変細胞および抗ＣＤ１２３療法）を組み合わせて投与する場合、薬剤は、同時にまたは異なる時間に時間的に近接して投与され得ることが理解される。さらに、薬剤は混合されていてもよく、別々の体積であってもよい。例えばいくつかの態様において、組み合わせ投与は、同じ処置過程での投与を含み、例えば、抗ＣＤ１２３療法でがんを処置する過程において、対象は、有効数のＣＤ１２３改変細胞を同時に、または順番に、例えば抗ＣＤ１２３療法による処置の前、処置の間、もしくは処置後に、投与され得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載のＣＤ１２３を標的とする薬剤は、ＣＤ１２３に結合することができる抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）を含むキメラ受容体を発現する、免疫細胞である。免疫細胞は、例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞）またはＮＫ細胞であり得る。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および機能的シグナル伝達ドメイン（例えば刺激分子に由来するもの）を含む細胞質シグナル伝達ドメインを含む、組換えポリペプチドを含むことができる。いくつかの態様において、細胞質シグナル伝達ドメインはさらに、４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７および／またはＣＤ２８またはそれらの分子のフラグメントなどの少なくとも１つの共刺激分子に由来する、１つ以上の機能的シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤ１２３結合抗体フラグメントを含み得る。抗体フラグメントは、１つ以上のＣＤＲ、可変領域（またはその一部）、定常領域（またはその一部）、または前述のいずれかの組み合わせを含むことができる。
抗ヒトＣＤ１２３抗体の例示的な重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸および核酸配列を、以下に提供する。ＣＤＲ配列は、アミノ酸配列に太字で示す。
抗ＣＤ１２３重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３２）
抗ＣＤ１２３軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３３）
追加の抗ＣＤ１２３配列は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号 WO2015/140268A1に見出される。
本明細書に記載の、ＣＤ１２３を標的とする薬剤の構築に使用するための抗ＣＤ１２３抗体結合フラグメントは、配列番号３２および配列番号３３のものと同じ重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ領域を含み得る。かかる抗体は、１つ以上のフレームワーク領域にアミノ酸残基のバリエーションを含み得る。いくつかの例において、抗ＣＤ１２３抗体フラグメントは、配列番号３２と少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）を共有する重鎖可変領域を含み得、および／または配列番号３３と少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）を共有する軽鎖可変領域を含み得る。
例示的なキメラ受容体コンポーネント配列を、以下の表３に提供する。
表３：キメラ受容体の例示的なコンポーネント
いくつかの態様において、ＣＡＲは、４－１ＢＢ共刺激ドメイン（例えば、表３に示す）、ＣＤ８α膜貫通ドメインおよびＣＤ８αの細胞外ドメインの一部（例えば、表３に示す）、およびＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン（例えば、表３に示す）を含む。
哺乳動物（例えば、ヒト）に投与される細胞、例えば免疫細胞または造血細胞の数は、例えば、１００万から１０００億細胞の範囲であり得る；しかしながら、この例示的な範囲より下または上の量もまた、本開示の範囲内である。
いくつかの態様において、ＣＤ１２３を標的とする薬剤は、抗体薬物抱合体（ＡＤＣ）である。ＡＤＣは、毒素または薬物分子に抱合した抗体またはその抗原結合フラグメントを含む分子であり得る。抗体またはそのフラグメントの、対応する抗原への結合は、その細胞表面上に抗原を提示する細胞（例えば、標的細胞）への毒素または薬物分子の送達を可能にし、これにより標的細胞の死をもたらす。
ＣＤ１２３へ結合する好適な抗体および抗体フラグメントは、当業者には明らかであろう。いくつかの態様において、抗体薬物抱合体の抗原結合フラグメントは、配列番号３２によって提供される重鎖可変領域と同一の重鎖ＣＤＲ、および配列番号３３によって提供される軽鎖可変領域と同一の軽鎖ＣＤＲを有する。いくつかの態様において、抗体薬物抱合体の抗原結合フラグメントは、配列番号３２によって提供される重鎖可変領域、および配列番号３３によって提供される同じ軽鎖可変領域を有する。
当分野で知られている抗体薬物抱合体での使用に適合した毒素または薬物は、当業者には明らかであろう。例えば以下を参照：Peters et al. Biosci. Rep.(2015) 35(4): e00225；Beck et al. Nature Reviews Drug Discovery (2017) 16:315-337；Marin-Acevedo et al. J. Hematol. Oncol.(2018)11:8；Elgundi et al. Advanced Drug Delivery Reviews (2017) 122:2-19。
いくつかの態様において、抗体薬物抱合体はさらに、抗体と薬物分子を結合するリンカー（例えば、切断可能なリンカーなどのペプチドリンカー）を含み得る。
抗体薬物抱合体の例には、限定はされないが、以下が含まれる；ブレンツキシマブベドチン、グレンツズマブベドチン／ＣＤＸ－０１１、デパツキシズマブマフォドチン／ＡＢＴ－４１４、ＰＳＭＡ ＡＤＣ、ポラツズマブベドチン／ＲＧ７５９６／ＤＣＤＳ４５０１Ａ、デニンツズマブマフォドチン／ＳＧＮ－ＣＤ１９Ａ、ＡＧＳ－１６Ｃ３Ｆ、ＣＤＸ－０１４、ＲＧ７８４１／ＤＬＹＥ５９５３Ａ、ＲＧ７８８２／ＤＭＵＣ４０６Ａ、ＲＧ７９８６／ＤＣＤＳ０７８０Ａ、ＳＧＮ－ＬＩＶ１Ａ、エンフォルツマブベドチン／ＡＳＧ－２２ＭＥ、ＡＧ－１５ＭＥ、ＡＧＳ６７Ｅ、テリソツズマブベドチン／ＡＢＢＶ－３９９、ＡＢＢＶ－２２１、ＡＢＢＶ－０８５、ＧＳＫ－２８５７９１６、チソツマブベドチン／ＨｕＭａｘ－ＴＦ－ＡＤＣ、ＨｕＭａｘ－Ａｘｌ－ＡＤＣ、ピナツズマブベドチン／ＲＧ７５９３／ＤＣＤＴ２９８０Ｓ、リファスツズマブベドチン／ＲＧ７５９９／ＤＮＩＢ０６００Ａ、インデュサツズマブベドチン／ＭＬＮ－０２６４／ＴＡＫ－２６４、バンドルツズマブベドチン／ＲＧ７４５０／ＤＳＴＰ３０８６Ｓ、ソフィツズマブベドチン／ＲＧ７４５８／ＤＭＵＣ５７５４Ａ、ＲＧ７６００／ＤＭＯＴ４０３９Ａ、ＲＧ７３３６／ＤＥＤＮ６５２６Ａ、ＭＥ１５４７、ＰＦ－０６２６３５０７／ＡＤＣ ５Ｔ４、トラスツズマブエムタンシン／Ｔ－ＤＭ１、ミルベツキシマブソラブタンシン／ＩＭＧＮ８５３、コルツキシマブラブタンシン／ＳＡＲ３４１９、ナラツキシマブエムタンシン／ＩＭＧＮ５２９、インダツキシマブラブタンシン／ＢＴ－０６２、アネツマブラブタンシン／ＢＡＹ ９４－９３４３、ＳＡＲ４０８７０１、ＳＡＲ４２８９２６、ＡＭＧ ２２４、ＰＣＡ０６２、ＨＫＴ２８８、ＬＹ３０７６２２６、ＳＡＲ５６６６５８、ロルボツズマブメルタンシン／ＩＭＧＮ９０１、カンツズマブメルタンシン／ＳＢ－４０８０７５、カンツズマブラブタンシン／ＩＭＧＮ２４２、ラプリツキシマブエムタンシン／ＩＭＧＮ２８９、ＩＭＧＮ３８８、ビバツズマブメルタンシン、ＡＶＥ９６３３、ＢＩＩＢ０１５、ＭＬＮ２７０４、ＡＭＧ １７２、ＡＭＧ ５９５、ＬＯＰ ６２８、バダスツキシマブタリリン／ＳＧＮ－ＣＤ１２３Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ７０Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ１９Ｂ、ＳＧＮ－ＣＤ１２３Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ３５２Ａ、ロバルピツズマブテシリン／ＳＣ１６ＬＤ６．５、ＳＣ－００２、ＳＣ－００３、ＡＤＣＴ－３０１／ＨｕＭａｘ－ＴＡＣ－ＰＢＤ、ＡＤＣＴ－４０２、ＭＥＤＩ３７２６／ＡＤＣ－４０１、ＩＭＧＮ７７９、ＩＭＧＮ６３２、ゲムツズマブオゾガマイシン、イノツズマブオゾガマイシン／ＣＭＣ－５４４、ＰＦ－０６６４７２６３、ＣＭＤ－１９３、ＣＭＢ－４０１、トラスツズマブデュオカルマジン／ＳＹＤ９８５、ＢＭＳ－９３６５６１／ＭＤＸ－１２０３、サシツズマブゴビテカン／ＩＭＭＵ－１３２、ラベツズマブゴブテカン／ＩＭＭＵ－１３０、ＤＳ－８２０１ａ、Ｕ３－１４０２、ミラツズマブドキソルビシン／ＩＭＭＵ－１１０／ｈＬＬ１－ＤＯＸ、ＢＭＳ－９８６１４８、ＲＣ４８－ＡＤＣ／ヘルツズマブ－ｖｃ－ＭＭＡＥ、ＰＦ－０６６４７０２０、ＰＦ－０６６５０８０８、ＰＦ－０６６６４１７８／ＲＮ９２７Ｃ、ルパルツマブアマドチン／ＢＡＹ１１２９９８０、アプルツマブイキサドチン／ＢＡＹ１１８７９８２、ＡＲＸ７８８、ＡＧＳ６２Ｐ１、ＸＭＴ－１５２２、ＡｂＧｎ－１０７、ＭＥＤＩ４２７６、ＤＳＴＡ４６３７Ｓ／ＲＧ７８６１。一例において、抗体薬物抱合体はゲムツズマブオゾガマイシンである。
いくつかの態様において、抗体薬物抱合体の、細胞表面系統特異的タンパク質のエピトープへの結合は、抗体薬物抱合体の内在化を誘導し、および薬物（または毒素）が細胞内に放出され得る。いくつかの態様において、抗体薬物抱合体の、細胞表面系統特異的タンパク質のエピトープへの結合は、毒素または薬物の内在化を誘導し、これにより毒素または薬物は、系統特異的タンパク質を発現する細胞（標的細胞）を殺傷することが可能となる。いくつかの態様において、抗体薬物抱合体の、細胞表面系統特異的タンパク質のエピトープへの結合は、毒素または薬物の内在化を誘導し、これは、系統特異的タンパク質を発現する細胞（標的細胞）の活性を調節し得る。本明細書に記載の抗体薬物抱合体で使用される毒素または薬物の種類は、特定の種類に限定されない。
ＣＤ１２３関連疾患および／または障害
本開示は、とりわけ、ＣＤ１２３の発現に関連する疾患またはＣＤ１２３を発現する細胞に関連する状態を処置するための組成物および方法を提供し、例えば、がんもしくは悪性腫瘍（例えば、造血器悪性腫瘍）などの増殖性疾患、または骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病などの前がん状態を含む。
いくつかの態様において、造血器悪性腫瘍または血液学的疾患は、ＣＤ１２３発現に関連する。造血器悪性腫瘍は、造血細胞（例えば、前駆細胞および幹細胞を含む血液細胞）が関与する悪性疾患として説明されてきた。造血器悪性腫瘍の例には、限定はされないが、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、または多発性骨髄腫が含まれる。例示的な白血病には、限定はされないが、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病または慢性リンパ芽球性白血病、および慢性リンパ性白血病が含まれる。
いくつかの態様において、造血器悪性腫瘍に関与する細胞は、悪性腫瘍を処置するために使用される従来のまたは標準的な治療法に耐性である。例えば、細胞（例えば、がん細胞）は、悪性腫瘍を処置するために使用される化学療法剤および／またはＣＡＲ Ｔ細胞に対して耐性であり得る。
いくつかの態様において、白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。ＡＭＬは、重要な分化および成長調節経路を破壊する重大な遺伝的変化を徐々に獲得した形質転換細胞に起因する、不均一なクローン性の腫瘍性疾患として特徴付けられる（Dohner et al., NEJM, (2015) 373:1136）。理論に束縛されることを望まないが、いくつかの態様において、ＣＤ１２３は、骨髄性白血病細胞ならびに正常な骨髄性および単球前駆体で発現され、ＡＭＬ療法の魅力的な標的であると考えられている。
いくつかの例において、対象は、最初は治療（例えば、造血器悪性腫瘍のための）に反応し、その後再発を経験する可能性がある。本明細書に記載の遺伝子操作された造血細胞の方法または集団のいずれかを使用して、造血器悪性腫瘍の再発を低減または防止することができる。代替的にまたはさらに、本明細書に記載の方法のいずれかは、本明細書に記載の遺伝子操作された造血細胞の集団のいずれか、および造血器悪性腫瘍に関連する細胞を標的とする免疫療法剤（例えば、細胞毒性薬）を投与し、さらに、造血器悪性腫瘍が再発した場合には１つ以上の追加の免疫療法剤を投与することを含み得る。いくつかの態様において、対象は、１つ以上の以前の治療の投与後の造血器悪性腫瘍（例えば、ＡＭＬ）の再発を有するか、または再発しやすい。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、対象の再発のリスクまたは再発の重症度を低減する。
いくつかの態様において、ＣＤ１２３に関連する造血器悪性腫瘍または血液学的疾患は、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、または前白血病などの前がん状態である。骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、無秩序かつ効果的でない造血または血液産生を特徴とする、血液学的な病状である。したがって、造血細胞の数および質は不可逆的に低下する。ＭＤＳの患者の中には、重度の貧血を発症する人もいれば、無症候性の人もいる。ＭＤＳの分類スキームは当技術分野で知られており、特定の血球タイプ、例えば、骨髄芽球、単球、および赤血球前駆体の比率または頻度を指定する基準を用いる。ＭＤＳには、不応性貧血、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、芽球増加を伴う不応性貧血、移行期の芽球増加を伴う不応性貧血、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＬ）が含まれる。いくつかの態様において、ＭＤＳは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に進行する可能性がある。
例１：ヒト細胞におけるＣＤ１２３の遺伝子編集
ｓｇＲＮＡ構築物の設計
表４に示すｓｇＲＮＡは、標的領域に近接したＳｐＣａｓ９ ＰＡＭ（５’－ＮＧＧ－３’）の手動検査により設計し、予測された特異性に従ってヒトゲノムの潜在的オフターゲット部位をオンライン検索アルゴリズム（例：Benchlingアルゴリズム、Doench et al 2016, Hsu et al 2013）で最小化することにより優先順位付けした。すべての設計した合成ｓｇＲＮＡは、５’末端および３’末端の両方の３つの末端位置に化学的に改変されたヌクレオチドを使用して生成した。改変ヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオアート（「ｍｓ」と略記）を含んでおり、ｍｓ－ｓｇＲＮＡはＨＰＬＣ精製した。Ｃａｓ９タンパク質はAldervonから購入した。
表４：適切なｇＲＮＡが結合可能なヒトＣＤ１２３の標的ドメインの配列。対応するｇＲＮＡは典型的には、同等のＲＮＡ配列を含み得るターゲティングドメインを含むであろう。
ヒトＣＤ３４＋細胞培養およびエレクトロポレーション
凍結保存されたヒトＣＤ３４＋細胞はHemacareから購入し、製造業者の指示に従って解凍した。ヒトＣＤ３４＋細胞は、ヒトサイトカイン（Ｆｌｔ３、ＳＣＦ、およびＴＰＯ、すべてPeprotechから購入）を添加したGMP SCGM培地（CellGenix）で２日間培養した。Ｃａｓ９タンパク質とｍｓ－ｓｇＲＮＡ（１：１の重量比）を混合し、室温で１０分間、エレクトロポレーションの前にインキュベートした。ＣＤ３４＋細胞に、Lonza 4D-NucleofectorおよびP3 Primary Cell Kitを使用して、Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）をエレクトロポレーションした。細胞を３７℃で分析まで培養した。細胞生存率は、Cellometer and ViaStain AOPI Staining（NexcelomBiosciences）により測定した。
細胞株の培養およびエレクトロポレーション
ヒトＡＭＬ細胞株ＴＨＰ－１は、American Type Culture Collection（ATCC）から入手した。ＴＨＰ－１細胞を、１０％熱不活化HyCloneウシ胎児血清（GE Healthcare）および０．０５ｍＭの２－メルカプトエタノール（Gibco）を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地（ATCC）で培養した。Ｃａｓ９タンパク質とｍｓ－ｓｇＲＮＡ（１：１の重量比）を混合し、室温で１０分間、エレクトロポレーションの前にインキュベートした。ＴＨＰ－１細胞に、Lonza 4D-NucleofectorおよびSG Cell Line Nucleofector Kit（Program FF-100）を使用して、Ｃａｓ９ ＲＮＰをエレクトロポレーションした。細胞は、フローサイトメトリー分析まで、３７℃で４日間インキュベートした。
ゲノムＤＮＡ分析
ゲノムＤＮＡを細胞から、エレクトロポレーションの２日後にprepGEM ＤＮＡ抽出キット（ZyGEM）を使用して抽出した。目的のゲノム領域は、ＰＣＲにより増幅した。
ＰＣＲアンプリコンをサンガーシーケンシング（Genewiz）によって分析し、アレルの修飾頻度を、ＴＩＤＥ（分解によるインデルの追跡（Tracking of Indels by Decomposition））を使用して算出した。
in vitroコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイ
エレクトロポレーションの２日後、５００個のＣＤ３４＋細胞を、６ウェルプレート上の１．１ｍＬのメチルセルロース（MethoCult H4034 Optimum、Stem Cell Technologies）にデュプリケートでプレーティングし、２週間培養した。次にコロニーを、StemVision（Stem Cell Technologies）を使用してカウントおよびスコア付けした。
フローサイトメトリー分析
ヒトＣＤ１２３（９Ｆ５）に対する蛍光色素結合抗体は、BD Biosciencesから購入し、それぞれのアイソタイプ対照と共に試験した。細胞表面染色は、細胞を、特異抗体と共に氷上で３０分間、ヒトTruStain FcXの存在下でインキュベートすることにより実施した。すべての染色について、死滅した細胞はＤＡＰＩ（Biolegend）染色による分析から除外した。すべての試料を取得し、Attune NxTフローサイトメーター（ThermoFisher Scientific）およびFlowJoソフトウェア（TreeStar）で分析した。
結果
ヒトＣＤ３４＋細胞に、Ｃａｓ９タンパク質および示されたＣＤ１２３を標的とするｇＲＮＡを、上記のとおりにエレクトロポレーションした。
編集率は、ＴＩＤＥで評価したインデル％（図１、２Ａ、および３Ｃ）またはフローサイトメトリーによる表面ＣＤ１２３タンパク質発現により決定した。
図１および図２Ａに示すとおり、ｇＲＮＡ Ａ、Ｇ、およびＩは、細胞の約６０～１００％の範囲の高い割合のインデルを示した。比較すると、ｇＲＮＡ Ｃ、Ｅ、Ｈ、およびJは、細胞の約２０～４０％の範囲のはるかに低い割合のインデルを与えた。ｇＲＮＡ Ｂ、Ｄ、およびＦは、細胞の約５０～６０％の範囲の中間の割合のインデルを示した。
図２Ｂ～２Ｃに示すとおり、ＦＡＣＳによって検出されたｇＲＮＡ Ａ、Ｇ、およびＩは、ＣＤ１２３発現の著しい減少を示した。
ＣＤ１２３ ｇＲＮＡ Ｉをさらに、細胞生存率およびin vitro分化について評価した（図３Ａ）。図３Ｂに示すとおり、ｇＲＮＡ Ｉでエレクトロポレーションした細胞は、陰性対照細胞と同等の生存率をエレクトロポレーションの４８時間後に示した。これらの細胞はまた、ＣＤ１２３／ＩＬ３ＲＡ遺伝子座の強力な編集効率を示し、インデルの割合は約６０％であった（図３Ｃ）。さらに、図３Ｄに示すとおり、ｇＲＮＡ Ｉでエレクトロポレーションした細胞はin vitroで分化することができた。特に、かなりの数のＢＦＵ－ＥおよびＣＦＵ－Ｇ／Ｍ／ＧＭコロニーが、ｇＲＮＡ Ｉを受け取った細胞から形成された。低レベルのＣＦＵ－ＧＥＭＭコロニー形成が、ｇＲＮＡ Ｉでエレクトロポレーションした細胞でも観察された。
例２：２つの細胞表面抗原について編集された細胞の生成および評価
結果
ＣＤ３３、ＣＤ１２３およびＣＬＬ１（ＣＬＥＣ１２Ａ）の細胞表面レベルを、未編集のＭＯＬＭ－１３細胞およびＴＨＰ－１細胞（両方ともヒトＡＭＬ細胞株）においてフローサイトメトリーにより測定した。ＭＯＬＭ－１３細胞は、高レベルのＣＤ３３とＣＤ１２３、および中から低レベルのＣＬＬ１を有していた。ＨＬ－６０細胞は、高レベルのＣＤ３３とＣＬＬ１、および低レベルのＣＤ１２３を有していた（図４）。
ＣＤ３３およびＣＤ１２３は、本明細書に記載のとおりにｇＲＮＡとＣａｓ９を使用してＭＯＬＭ－１３細胞において変異させ、ＣＤ３３およびＣＤ１２３改変細胞をフローサイトメトリーソーティングによって精製し、ＣＤ３３とＣＤ１２３の細胞表面レベルを測定した。ＣＤ３３とＣＤ１２３のレベルは、野生型ＭＯＬＭ－１３細胞で高かった；ＣＤ３３のみの編集は、低いＣＤ３３レベルをもたらす；ＣＤ１２３のみの編集は、低いＣＤ１２３レベルをもたらし、ＣＤ３３とＣＤ１２３の両方の編集は、ＣＤ３３とＣＤ１２３の両方の低レベルをもたらした（図５）。次に、編集された細胞を、ＣＡＲＴエフェクター細胞に対する耐性について、本明細書に記載のとおりにin vitro細胞障害性アッセイを使用して試験した。４つの細胞型（野生型、ＣＤ３３－／－、ＣＤ１２３－／－、およびＣＤ３３－／－ＣＤ１２３－／－）はすべて、モックＣＡＲ制御条件において低レベルの特異的死滅を経験した（図６、左端のバーセット）。ＣＤ３３ ＣＡＲ細胞は野生型およびＣＤ１２３－／－細胞を効果的に死滅させたが、一方ＣＤ３３－／－およびＣＤ３３－／－ＣＤ１２３－／－細胞は、ＣＤ３３ ＣＡＲに対して統計的に有意な耐性を示した（図６、２番目のバーセット）。ＣＤ１２３ ＣＡＲ細胞は、野生型およびＣＤ３３－／－細胞を効果的に死滅させ、一方ＣＤ１２３－／－およびＣＤ３３－／－ＣＤ１２３－／－細胞は、ＣＤ１２３ ＣＡＲに対して統計的に有意な耐性を示した（図６、３番目のバーセット）。ＣＤ３３ ＣＡＲおよびＣＤ１２３ ＣＡＲ細胞のプールは、野生型細胞、ＣＤ３３－／－細胞、およびＣＤ１２３－／－細胞を効果的に死滅させたが、一方ＣＤ３３－／－ＣＤ１２３－／－細胞は、ＣＡＲ細胞のプールに対して統計的に有意な耐性を示した（図６、右端のバーセット）。この実験は、２つの抗原（ＣＤ３３とＣＤ１２３）のノックアウトが、両方の抗原を標的とするＣＡＲ細胞から細胞を保護したことを示す。さらに、編集された細胞の集団は、両方の抗原の両方のアレルで編集された細胞の十分に高い割合を含有し、十分低い細胞表面抗原の細胞表面レベルを有し、両方のタイプのＣＡＲ細胞に対する統計的に有意な耐性が達成された。
ヒトＣＤ３４＋細胞における遺伝子編集の効率を、本明細書に記載のとおりにＴＩＤＥ分析を使用して定量化した。内在性ＣＤ３３遺伝子座において、ＣＤ３３を単独で、またはＣＤ１２３もしくはＣＬＬ１と組み合わせて標的とした場合、約７０～９０％の編集効率が観察された（図７、左のグラフ）。内在性ＣＤ１２３遺伝子座において、ＣＤ１２３を単独で、またはＣＤ３３もしくはＣＬＬ１と組み合わせて標的とした場合、約６０％の編集効率が観察された（図７、中央のグラフ）。内在性ＣＬＬ１遺伝子座において、ＣＬＬ１を単独で、またはＣＤ３３もしくはＣＤ１２３と組み合わせて標的とした場合、約４０～７０％の編集効率が観察された（図７、右のグラフ）。この実験は、ヒトＣＤ３４＋細胞が、２つの細胞表面抗原遺伝子座において高頻度で編集できることを示す。
遺伝子編集されたヒトＣＤ３４＋細胞の分化能を、本明細書に記載のコロニー形成アッセイにより測定した。ＣＤ３３、ＣＤ１２３、またはＣＬＬ１について編集された細胞は、個別にまたはすべてのペアワイズの組み合わせでＢＦＵ－Ｅコロニーを産生し、細胞が有意な分化能を保持していることをこのアッセイで示す（図８Ａ）。編集された細胞はまた、ＣＦＵ－Ｇ／Ｍ／ＧＭコロニーも産生し、細胞が分化能（これは非編集対照と統計的に区別できない）を保持していることをこのアッセイで示す（図８Ｂ）。編集された細胞はまた、検出可能なＣＦＵ－ＧＥＭＭコロニーも産生した（図８Ｃ）。コロニー形成単位（ＣＦＵ）－Ｇ／Ｍ／ＧＭコロニーとは、ＣＦＵ－Ｇ（顆粒球）、ＣＦＵ－Ｍ（マクロファージ）、およびＣＦＵ－ＧＭ（顆粒球／マクロファージ）コロニーを指す。ＣＦＵ－ＧＥＭＭ（顆粒球／赤血球／マクロファージ／巨核球）コロニーは、ＣＦＵ－ＧＭコロニーを生じさせる細胞の前駆体である低分化細胞から生じる。まとめると、分化アッセイは、２つの遺伝子座で編集されたヒトＣＤ３４＋細胞が、さまざまな細胞型に分化する能力を保持していることを示す。
材料および方法
ＡＭＬ細胞株
ヒトＡＭＬ細胞株ＨＬ－６０は、American Type Culture Collection（ATCC）から入手した。ＨＬ－６０細胞は、２０％熱不活化HyCloneウシ胎児血清（GE Healthcare）を添加したIscoveの改変ダルベッコ培地（IMDM、Gibco）で培養した。ヒトＡＭＬ細胞株ＭＯＬＭ－１３は、AddexBio Technologiesから入手した。ＭＯＬＭ－１３細胞は、１０％熱不活化HyCloneウシ胎児血清（GE Healthcare）を添加したRPMI-1640培地（ATCC）で培養した。
ガイドＲＮＡの設計
すべてのｓｇＲＮＡは、標的領域に近接したＳｐＣａｓ９ ＰＡＭ（５’－ＮＧＧ－３’）の手動検査により設計し、予測された特異性に従ってヒトゲノムの潜在的オフターゲット部位をオンライン検索アルゴリズム（例：Benchlingアルゴリズム、Doench et al 2016, Hsu et al 2013）で最小化することにより優先順位付けした。すべての設計した合成ｓｇＲＮＡは、５’末端および３’末端の両方の３つの末端位置に化学的に改変されたヌクレオチドを有してSynthegoから購入した。改変ヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオアート（「ｍｓ」と略記）を含んでおり、ｍｓ－ｓｇＲＮＡはＨＰＬＣ精製した。Ｃａｓ９タンパク質はAldervonから購入した。典型的には、本明細書の実施例に記載されるｇＲＮＡは、２０ヌクレオチド（ｎｔ）ターゲティングドメイン配列、１２ｎｔのｃｒＲＮＡ反復配列、４ｎｔテトラループ配列、および６４ｎｔのｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む、ｓｇＲＮＡである。
表５：適切なｇＲＮＡが結合できるヒトＣＤ３３、ＣＤ１２３、またはＣＬＬ－１の標的ドメインの配列。隣接するＰＡＭ配列も提供される。適切なｇＲＮＡは、典型的には、標的ドメイン配列と同等のＲＮＡ配列を含み得るターゲティングドメインを含む。
ＡＭＬ細胞株エレクトロポレーション
Ｃａｓ９タンパク質とｍｓ－ｓｇＲＮＡ（１：１の重量比）を混合し、室温で１０分間、エレクトロポレーションの前にインキュベートした。ＭＯＬＭ－１３およびＨＬ－６０細胞に、それぞれプログラムＴＨＰ－１およびＯｐｔ－３を備えたMaxCyte ATxエレクトロポレーターシステムを使用して、Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）をエレクトロポレーションした。細胞を３７℃で５～７日間、フローサイトメトリーソーティングまでインキュベートした。
ヒトＣＤ３４＋細胞培養およびエレクトロポレーション
凍結保存されたヒトＣＤ３４＋細胞はHemacareから購入し、製造業者の指示に従って解凍した。ヒトＣＤ３４＋細胞を、ヒトサイトカイン（Ｆｌｔ３、ＳＣＦ、およびＴＰＯ、すべてPeprotechから購入）を添加したGMP SCGM培地（CellGenix）で２日間培養した。ＣＤ３４＋細胞に、Lonza 4D-NucleofectorおよびP3 Primary Cell Kitを使用して、Ｃａｓ９ ＲＮＰ（Ｃａｓ９タンパク質とｍｓ－ｓｇＲＮＡを１：１の重量比で）をエレクトロポレーションした。デュアルｍｓ－ｓｇＲＮＡを用いたエレクトロポレーションでは、等量の各ｍｓ－ｓｇＲＮＡを添加した。細胞を３７℃で分析まで培養した。
ゲノムＤＮＡ分析
ゲノムＤＮＡを細胞から、エレクトロポレーションの２日後にprepGEMＤＮＡ抽出キット（ZyGEM）を使用して抽出した。目的のゲノム領域を、ＰＣＲにより増幅した。
ＰＣＲアンプリコンをサンガーシーケンシング（Genewiz）により分析し、アレルの修飾頻度を、World Wide Web（tide.deskgen.com）で入手可能なＴＩＤＥ（分解によるインデルの追跡）ソフトウェアを使用して算出した。
in vitroコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイ
エレクトロポレーションの２日後、５００個のＣＤ３４＋細胞を、６ウェルプレート上の１．１ｍＬのメチルセルロース（MethoCult H4034 Optimum、Stem Cell Technologies）にデュプリケートでプレーティングし、２週間培養した。次にコロニーを、StemVision（Stem Cell Technologies）を使用してカウントおよびスコア付けした。
フローサイトメトリー分析およびソーティング
ヒトＣＤ３３（Ｐ６７．６）、ＣＤ１２３（９Ｆ５）、およびＣＬＬ１（ＲＥＡ４３１）に対する蛍光色素結合抗体は、それぞれBiolegend、BD Biosciences、およびMiltenyi Biotecから購入した。すべての抗体は、それぞれのアイソタイプ対照で試験した。細胞表面染色は、細胞を、特異抗体と共に氷上で３０分間、ヒトTruStainFcXの存在下でインキュベートすることにより実施した。すべての染色について、死滅した細胞はＤＡＰＩ（Biolegend）染色による分析から除外した。すべての試料を取得し、Attune NxTフローサイトメーター（ThermoFisher Scientific）およびFlowJoソフトウェア（TreeStar）で分析した。
フローサイトメトリーソーティングでは、細胞を蛍光色素結合抗体で染色した後、Moflow Astrios Cell Sorter（Beckman Coulter）でソーティングした。
ＣＡＲ構築物およびレンチウイルス生成
第２世代のＣＡＲを、ＣＤ３３およびＣＤ１２３を標的とするように構築したが、ただし、ＣＤ３３／ＣＬＬ－１多重細胞障害性実験で使用した抗ＣＤ３３ＣＡＲ－Ｔは除く。各ＣＡＲは、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通領域を使用した、細胞外ｓｃＦｖ抗原結合ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３シグナル伝達ドメインからなっていた。抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ配列はクローンＰ６７．６（Mylotarg）から得、抗ＣＤ１２３ ｓｃＦｖ配列はクローン３２７１６から得た。抗ＣＤ３３および抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ構築物は、ｓｃＦｖの重から軽の配向を使用する。重鎖と軽鎖は、（ＧＧＧＳ）３リンカー（配列番号６３）によって接続されていた。各標的のＣＡＲ ｃＤＮＡ配列を、ｐＣＤＨ－ＥＦ１α－ＭＣＳ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ発現ベクターのマルチクローニング部位にサブクローニングし、レンチウイルスを、製造業者のプロトコル（System Biosciences）に従って生成した。レンチウイルスは、２９３ＴＮ細胞（System Biosciences）の一過性トランスフェクションにより、Lipofectamine 3000（ThermoFisher）を使用して生成することができる。抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ（クローンＭｙ９６）の軽鎖および重鎖、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＩＣＯＳ膜貫通ドメイン、ＩＣＯＳシグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３シグナル伝達ドメインを、レンチウイルスプラスミドｐＨＩＶ－Zsgreen中にクローニングすることにより、ＣＡＲ構築物を生成した。
ＣＡＲの形質導入および増殖
ヒト初代Ｔ細胞を、Leuko Pak（Stem Cell Technologies）から、抗ＣＤ４および抗ＣＤ８マイクロビーズを使用した磁気ビーズ分離により、製造業者のプロトコル（Stem Cell Technologies）に従って分離した。精製したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を１：１で混合し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８結合Dynabeads（Thermo Fisher）をビーズと細胞の比率１：１で使用して活性化した。使用したＴ細胞培養培地は、免疫細胞血清置換、Ｌ－グルタミンおよびGlutaMAX（すべてThermo Fisherから購入）および１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（Peprotech）を添加した、CTS OptimizerＴ細胞増殖培地であった。Ｔ細胞形質導入を、活性化の２４時間後に、ポリブレン（Sigma）の存在下でのスピノキュレーション（spinoculation）により実施した。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、凍結保存の前に９日間培養した。すべての実験の前にＴ細胞を解凍し、３７℃で４～６時間静置した。
フローサイトメトリーベースのＣＡＲ－Ｔ細胞障害性アッセイ
標的細胞の細胞障害性を、陰性対照細胞の生存と標的細胞の生存を比較することにより測定した。ＣＤ３３／ＣＤ１２３多重細胞障害性アッセイでは、野生型およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集ＭＯＬＭ－１３細胞を、標的細胞として使用した。野生型Ｒａｊｉ細胞株（ATCC）を、両方の実験の陰性対照として使用した。標的細胞と陰性対照細胞は、それぞれCellTrace Violet（ＣＴＶ）とCFSE（Thermo Fisher）で、製造業者の指示に従って染色した。染色後、標的細胞と陰性対照細胞を１：１で混合した。
抗ＣＤ３３またはＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、エフェクターＴ細胞として使用した。非形質導入Ｔ細胞（モックＣＡＲ－Ｔ）を対照として使用した。ＣＡＲｐｏｏｌ群では、適切なＣＡＲ－Ｔ細胞を１：１で混合した。エフェクターＴ細胞は、標的細胞／陰性対照細胞混合物と共に、１：１のエフェクター対標的比でデュプリケートで共培養した。エフェクターＴ細胞を含まない標的細胞／陰性対照細胞混合物の群のみを、対照として含めた。細胞を３７℃で２４時間、フローサイトメトリー分析の前にインキュベートした。ヨウ化プロピジウム（Thermo Fisher）を、生存率色素として使用した。特異的細胞溶解の算出には、生存する陰性対照細胞に対する生存する標的細胞の割合（標的割合と呼ぶ）を使用した。特異的細胞溶解は、（（エフェクター細胞なしの標的割合－エフェクター細胞を含む標的割合）／（エフェクターなしの標的割合））×１００％として算出した。
例３：ヒト細胞においてＣＤ１２３を編集するためのｇＲＮＡの設計およびスクリーニング
ｓｇＲＮＡ構築物の設計
この例で調査したｇＲＮＡは、標的領域に近接したＳｐＣａｓ９ ＰＡＭ（５’－ＮＧＧ－３’）の検査により設計した。３’末端にＳｐＣａｓ９ ＰＡＭ（５’－ＮＧＧ－３’）を有するコード領域のすべての２０ｂｐ配列を抽出した。これらの方法を使用して、表２および６に記載されているヒトＣＤ１２３の標的ドメインを標的とする２０９個の全ｇＲＮＡを設計した。
ＴＨＰ－１細胞におけるｇＲＮＡのスクリーニング
２０９個のｇＲＮＡを、オフターゲット予測アルゴリズム（ミスマッチの数に基づく）に従ってフィルタリングして、１７８個のｇＲＮＡをＴＨＰ－１細胞でさらに調査するために特定した。ヒトＡＭＬ細胞株THP-1は、American Type Culture Collection（ATCC）から入手した。ＴＨＰ－１細胞を培養し、Ｃａｓ９タンパク質とｇＲＮＡ（１：１の重量比で混合）で構成されるリボ核タンパク質ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションした。ゲノムＤＮＡを細胞から抽出し、目的のゲノム領域をＰＣＲにより増幅した。目的のゲノム領域のＰＣＲによる増幅は、調査した１７８個のｇＲＮＡのうち１４８個から得た。次に、ＰＣＲアンプリコンをサンガーシーケンシングで分析し、編集頻度（ＩＣＥ、またはＣＲＩＳＰＲ編集の干渉）を２つの複製で計算した；これを表７に示す。最初の複製では、増幅および配列決定された１４８個のｇＲＮＡのうちの１４６個の編集頻度を取得した。第２の複製では９６／１４６個のｇＲＮＡについて編集頻度が得られ、各ｇＲＮＡの結果は２つの複製で同等であった。表７に示すとおり、調査したｇＲＮＡの５９個は、８０以上のＩＣＥ値または編集頻度を有していた。
表７．ＴＨＰ－１細胞においてヒトＣＤ１２３を標的とするように設計されたｇＲＮＡの編集頻度
初代ＣＤ３４＋ヒト幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）におけるｇＲＮＡのスクリーニング
初代ヒトＣＤ３４＋ ＨＳＰＣを培養し、Ｃａｓ９タンパク質と表８にリストされている４４個のｇＲＮＡの１つで構成されるリボ核タンパク質ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションした。スクリーニングされたこれら４４個のｇＲＮＡには、ＴＨＰ－１細胞で実施されたスクリーニングから選択されたもの、および／または好ましいオフターゲットプロファイルを有したｇＲＮＡが含まれる。
表８．ヒトＣＤ３４＋細胞においてスクリーニングされたＣＤ１２３ ｇＲＮＡの標的ドメインの配列。対応するｇＲＮＡは、同等のＲＮＡ配列からなるターゲティングドメインを含んでいた。
初代ヒトＣＤ３４＋ ＨＳＰＣにおけるこれらのｇＲＮＡの編集頻度を算出し、図９および図１０に示す。試験した４４個のｇＲＮＡのうち、７個が８０％を超える編集効率を示した（図９および図１０）。これらのｇＲＮＡには、ｇＲＮＡ Ａ、ｇＲＮＡ Ｇ、ｇＲＮＡ Ｉ、ｇＲＮＡ Ｎ３、ｇＲＮＡ Ｐ３、およびｇＲＮＡ Ｓ２が含まれ、それらの算出された平均編集効率を表９に示す。
表９．初代ヒトＣＤ３４＋ ＨＳＰＣでスクリーニングされたｇＲＮＡの平均編集効率
初代ヒトＣＤ３４＋細胞において評価したｇＲＮＡ Ａ、ｇＲＮＡ Ｇ、ｇＲＮＡ Ｉ、ｇＲＮＡ Ｎ３、ｇＲＮＡ Ｐ３、およびｇＲＮＡ Ｓ３のインデル（挿入／削除）分布を定量化して、図１１に示す。各ｇＲＮＡは、－１４から＋２の範囲のインデルをもたらした。試験したすべてのｇＲＮＡについて最大の割合で発生したインデルは、＋１であった。ｇＲＮＡ Ｎ、Ｇ、Ｉ、およびＰ３は、最大－１４のインデルをもたらしたｇＲＮＡ Ｐ３およびＳ３と比較して、小さいサイズのインデルをもたらした。初代ヒトＣＤ３４＋細胞において評価されたｇＲＮＡ Ｄ１のインデル分布も、図１２に示す。ｇＲＮＡ Ｄ１は、－１５、－１１、－７、－６、－２、０、＋１、および＋２のインデルをもたらし、＋１のＩＮＤＥＬが最大の頻度で発生した。
ｇＲＮＡ Ａ、ｇＲＮＡ Ｇ、ｇＲＮＡ Ｉ、ｇＲＮＡ Ｎ３、ｇＲＮＡ Ｐ３、およびｇＲＮＡ Ｓ３のオフターゲット効果も、表１０に示すとおり予測した。ｇＲＮＡは、オフターゲット効果の最小化に基づいて優先順位付けした。これらのオフターゲット予測は、ＰＡＭと標的の間で最大１ヌクレオチドのミスマッチまたはギャップ、またはガイドと標的の間で最大３ヌクレオチドのミスマッチまたはギャップが許容されるという、配列の相補性に基づいていた。
表１０．ヒトＣＤ１２３を標的とするｇＲＮＡのオフターゲット予測
この例で調査したヒトＣＤ１２３を標的とする他のｇＲＮＡの中で、３つのｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ Ａ、ｇＲＮＡ Ｉ、およびｇＲＮＡ Ｐ３）が、初代ヒトＣＤ３４＋ ＨＳＰＣにおいて特に効率的なオンターゲット編集、予測オフターゲット効果がわずかであるかまたは全くないこと、および望ましいインデル分布を実証したとして選択された。
例４：in vivoでのＣＤ１２３ ＫＯ ＣＤ３４＋細胞の評価
ＣＤ３４＋ヒトＨＳＰＣにおける編集
ｇＲＮＡ（Synthego）は、例１および例３に記載のとおりに設計した。次にヒトＣＤ３４＋ ＨＳＰＣを、例１に記載のとおりにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介して、ＣＤ１２３を標的とするガイドＲＮＡ：ｇＲＮＡ Ｉ、ｇＲＮＡ Ｄ１を使用して編集した。非編集のエレクトロポレーションした対照（EP Ctrl）ＨＳＰＣも生成した。
ex vivo編集の後、ゲノムＤＮＡを細胞から収集し、標的領域に隣接するプライマーでＰＣＲ増幅し、精製し、ＴＩＤＥ（ｇＲＮＡ Ｉ）またはアンプリコンシーケンシング（ｇＲＮＡ Ｄ１）で分析して、ＣＤ３４＋ ＨＳＰＣでのそれらの編集効率を決定した。表１１に示すとおり、ｇＲＮＡ ＩおよびｇＲＮＡ Ｄ１は高い編集効率を有し、具体的にはそれぞれ７７．２％および７６．５％であった。
表１１．ＣＤ１２３ ｇＲＮＡの遺伝子編集効率
ＣＤ１２３ ＫＯ ＣＤ３４＋ ＨＳＰＣのin vivoでの生着効率および持続性の調査
雌の非照射NOD,B6.SCIDIl2rganma-/-Kit(W41/W41)（ＮＢＳＧＷ）マウス（ｎ＝１５）に、ｇＲＮＡ ＩまたはｇＲＮＡ Ｄ１で編集されたＣＤ１２３ ＫＯ ＨＳＰＣまたは非編集（EP Ctrl）を生着した（図１３）。生着後８週目と１２週目に、生着測定のためのＦＡＣｓによる分析用に、各マウスから末梢血を採取した。生着後１６週目にマウスを犠牲にし、多系統分化のＦＡＣＳによる分析用に、血液、脾臓、および骨髄を収集した（図１３）。
生着された動物の骨髄から得られた細胞試料の結果
生着後１６週目に、マウスのヒト白血球キメラ現象の割合を、３つのマウス群、すなわち非編集の対照細胞（EP Ctrl）またはＣＤ１２３ ＫＯ細胞（Ｘ軸に示すとおり、ｇＲＮＡ ＩもしくはｇＲＮＡ Ｄ１により編集されたもの）を受け取ったマウス（ｎ＝１５マウス／群）の総ＣＤ４５＋細胞集団（ヒトとマウスのＣＤ４５＋細胞の合計）における、ヒトＣＤ４５＋（ｈＣＤ４５＋）細胞のパーセンテージとして計算した。（図１４Ａ）。図１４Ａに示すとおり、骨髄キメラ現象およびｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージは、対照群とＣＤ１２３ ＫＯ群で同等であり、有核骨髄頻度の喪失がないことを示す。
さらに、生着後１６週目に、骨髄中のヒトＣＤ３４にも陽性（ｈＣＤ３４＋）であったｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージを定量化した（図１４Ｂ）。図１４Ｂに示すとおり、ｈＣＤ３４＋も発現しているｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージは、対照群およｇびＣＤ１２３ ＫＯ群で同等であった。
生着後１６週目に、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、好中球、従来の樹状細胞（ｃＤＣ）、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、好酸球、好塩基球、および肥満細胞であるｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージを、骨髄で定量化した（図１４Ｃ）。これらのさまざまな免疫細胞サブタイプのパーセンテージは、対照群とＣＤ１２３ ＫＯ群の間で同等であった。これらのデータは、マウスにおける編集されたＣＤ１２３ ＫＯ細胞からの多系統のヒト造血再構成を示す。
ｈＣＤ４５＋であったＣＤ１２３ ＫＯ細胞のパーセンテージを、対照およびＣＤ１２３ ＫＯ細胞生着マウスの骨髄で、生着後１６週目に定量化した（図１５）。ｈＣＤ１２３＋ ｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージは、対照群と比較してＣＤ１２３ ＫＯ細胞（ｇＲＮＡ Ｉで編集）で有意に低く、これらの群の有核血液細胞からのＣＤ１２３の喪失を示す。これらのデータはまた、ＮＢＳＧＷマウスの骨髄におけるＣＤ１２３ ＫＯ ＨＳＣの長期持続性も実証する。
例５：ＣＤ１２３ ＫＯ ＣＤ３４＋細胞のin vitroでの評価
ＣＤ３４＋ヒトＨＳＰＣにおける編集
ｇＲＮＡ（Synthego）は、例１および例３に記載のとおりに設計した。次にヒトＣＤ３４＋ ＨＳＰＣを、例１に記載のとおりにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介して編集し、ＣＤ１２３を標的とするガイドＲＮＡ：ｇＲＮＡ Ｉ、ｇＲＮＡ Ｄ１、ならびに非編集のエレクトロポレーション対照（EP ctrl）を使用した。
ex vivo編集の後、ゲノムＤＮＡを細胞から収集し、標的領域に隣接するプライマーでＰＣＲ増幅し、精製し、ＴＩＤＥ（ｇＲＮＡ Ｉ）またはアンプリコンシーケンシング（ｇＲＮＡ Ｄ１）で分析して、それらのＣＤ３４＋ ＨＳＰＣでの編集頻度を決定した。図１６Ａに示すとおり、ｇＲＮＡ ＩおよびｇＲＮＡ Ｄ１はそれぞれ７５．８％および７１．１％の編集頻度を示した。ＣＤ１２３の細胞表面発現を、ＦＡＣｓにより、ＣＤ１２３ ＫＯ細胞（ｇＲＮＡ ＩまたはｇＲＮＡ ＤＩで編集）、非編集対照（EP ctrl）、またはＦＭＯ（蛍光マイナス１）対照において定量化した。ｇＲＮＡ ＩまたはｇＲＮＡ ＤＩで編集されたＣＤ３４＋ ＨＳＰＣは、非編集対照（EP Ctrl）と比較して、低いＣＤ１２３の発現を示した（図１６Ａ）。
非編集対照細胞（EP Ctrl）またはｇＲＮＡ ＩもしくはｇＲＮＡ ＤＩで編集されたＣＤ１２３ ＫＯ細胞を、骨髄分化培地で培養し、顆粒球（図１６Ｂ）または単球（図１６Ｃ）系統のいずれかを誘導し、細胞数を経時的に定量化した。ＣＤ１２３ ＫＯ細胞は、顆粒球（図１６Ｂ）および単球（図１６Ｃ）の両方の分化培養において、非編集対照細胞と同等の細胞増殖を示した。
さらに、顆粒球分化においてＣＬＬ＋であった細胞（図１７Ａ、上）または単球分化においてＣＤ１２３＋であった細胞（図１７、下）のパーセンテージを、非編集対照細胞またはｇＲＮＡ ＩもしくはｇＲＮＡ ＤＩで編集されたＣＤ１２３ ＫＯ細胞の、編集および培養後の０、７、および１４日目に定量化した。ＣＤ１２３ ＫＯ細胞から生成された顆粒球および単球は、非編集対照細胞と比較して、経時的にＣＤ１２３発現の持続的喪失を示した（図１７）。ＣＤ１２３ ＫＯ細胞がin vitroで骨髄細胞に分化する能力も評価した。ＣＤ１５＋（図１８、左上）またはＣＤ１１ｂ＋陽性の顆粒球（図１８、右上）のパーセンテージを、非編集対照細胞またはｇＲＮＡ ＩもしくはｇＲＮＡ ＤＩで編集されたＣＤ１２３ ＫＯ細胞の、編集および培養後の０、７、および１４日目に定量化した。これらの顆粒球マーカーの発現は、ＣＤ１２３の喪失による影響を受けなかった。ＣＤ１４＋（図１８、左下）またはＣＤ１１ｂ＋陽性の単球（図１８、右下）のパーセンテージも、非編集対照細胞またはｇＲＮＡ ＩもしくはｇＲＮＡ ＤＩで編集されたＣＤ１２３ ＫＯ細胞の編集および培養後の０、７、および１４日目に定量化した。顆粒球マーカーと同様に、これらの単球マーカーの発現は、ＣＤ１２３の喪失による影響を受けなかった。ＣＤ３３（骨髄細胞のマーカー）およびＨＬＡ－ＤＲ（抗原提示）の発現も、ＣＤ１２３破壊によって変化しなかった。これらのデータは、ＣＤ１２３の喪失がin vitroでの骨髄分化に影響を与えなかったことを示す。
ＣＤ１２３ ＫＯ細胞の機能もまたin vitroで評価した。顆粒球（図１９Ａ、上）および単球（図１９Ａ、下）により実施した食作用のパーセンテージを、対照細胞集団およびＣＤ１２３ ＫＯ細胞集団で定量化した。食作用活性は、顆粒球および単球の両方について、対照細胞とＣＤ１２３ ＫＯ細胞の間で同等であり、ＣＤ１２３ ＫＯ細胞が食作用活性を保持していることを実証する（図１９）。ＣＤ１２３ ＫＯ細胞の、刺激時に炎症性サイトカインを産生する能力も評価した。非編集対照細胞またはｇＲＮＡ ＩもしくはｇＲＮＡ ＤＩで編集されたＣＤ１２３ ＫＯ細胞から産生された顆粒球（図１９Ａ）および単球（図１９Ｂ）は、刺激されていないか、ＬＰＳまたはＲ８４８で刺激された。続いて、ＩＬ－６（図１９Ａまたは１９Ｂ、左）およびＴＮＦ－α（図１９Ａまたは１９Ｂ、右）のレベルを定量化した。ＣＤ１２３ ＫＯ顆粒球および単球は、ＴＬＲアゴニスト刺激時に無傷の炎症性サイトカイン産生を示し、サイトカイン産生は非編集対照細胞と同等であった。ＩＬ－１βおよびＭＩＰ－１αを含む他のサイトカインの産生も、ＣＤ１２３の破壊によって変化しなかった。まとめると、これらのデータは、ＣＤ１２３の喪失がin vitroで骨髄細胞機能に影響を与えなかったことを示す。
遺伝子編集ＣＤ３４＋ＣＤ１２３ ＫＯ細胞（ｇＲＮＡ ＩまたはｇＲＮＡ ＤＩで編集）の分化能を、コロニー形成アッセイによっても測定した。エレクトロポレーション後、ＣＤ３４＋編集細胞をプレーティングし、２週間培養した。次にコロニーを、StemVision（Stem Cell Technologies）を使用してカウントおよびスコア付けした。ＣＤ１２３についてｇＲＮＡ Ｉで編集された細胞（編集頻度７７．９％）またはｇＲＮＡ Ｄ１で編集された細胞（編集頻度７２．５％）は、非編集対照細胞と比較して、ＢＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－Ｇ／Ｍ／ＧＭ、およびＣＦＵ－ＧＥＭＭコロニーの産生が少なかった（図２０Ａ）。しかし、ＣＤ１２３について編集された細胞は、非編集対照細胞と（比較？）して、ＢＦＵ－Ｅコロニー（バースト形成単位－赤血球）、ＣＦＵ－Ｇ／Ｍ／ＧＭコロニー、およびＣＦＵ－ＧＥＭＭコロニーの同様の分布とパーセンテージを産生し、ＣＤ１２３編集細胞が、このアッセイで有意な分化能を保持することを示す（図２０Ｂ）。コロニー形成単位（ＣＦＵ）－Ｇ／Ｍ／ＧＭコロニーとは、ＣＦＵ－Ｇ（顆粒球）、ＣＦＵ－Ｍ（マクロファージ）、およびＣＦＵ－ＧＭ（顆粒球／マクロファージ）コロニーを指す。ＣＦＵ－ＧＥＭＭ（顆粒球／赤血球／マクロファージ／巨核球）コロニーは、ＣＦＵ－ＧＭコロニーを生じさせる細胞の前駆体である低分化細胞から生じる。まとめると、分化アッセイは、ＣＤ１２３遺伝子座で編集されたヒトＣＤ３４＋細胞が、さまざまな細胞型に分化する能力を保持していることを示す。
例６：ＣＤ１２３編集細胞のＣＡＲＴエフェクター細胞に対する耐性の評価
この例では、ＣＤ１２３編集細胞の、ＣＤ１２３を標的とするＣＡＲＴエフェクター細胞に対する耐性の評価について記載する。ＣＤ１２３発現を欠くＣＤ１２３ ＫＯ細胞は、野生型ＣＤ１２３＋細胞と比較して、本明細書に記載のアッセイによって測定されたとおり、ＣＤ１２３ ＣＡＲ殺傷に耐性である。
ＣＤ３４＋ヒトＨＳＰＣにおける編集
ｇＲＮＡ（Synthego）を、例３に記載のとおりに設計する。次にヒトＣＤ３４＋ ＨＳＰＣを、例１に記載のとおりにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介し、ＣＤ１２３を標的とするｇＲＮＡ、例えば表２、６、または８のＣＤ１２３を標的とするｇＲＮＡを使用して編集する。
ＣＡＲ構築物およびレンチウイルス生成
第２世代のＣＡＲを、ＣＤ１２３を標的とするように構築する。ＣＡＲは、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通領域を使用した、細胞外ｓｃＦｖ抗原結合ドメイン、４－１ＢＢまたはＣＤ２８共刺激ドメイン、およびＣＤ３シグナル伝達ドメインからなる。抗ＣＤ１２３ ｓｃＦｖ配列を、クローン３２７１６からｓｃＦｖの軽鎖から重鎖の配向で得る。重鎖と軽鎖は、（ＧＧＧＳ）３リンカー（配列番号６３）によって接続される。ＣＤ１２３ ＣＡＲ ｃＤＮＡ配列を、ｐＣＤＨ－ＥＦ１α－ＭＣＳ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ発現ベクターのマルチクローニング部位にサブクローニングし、レンチウイルスを製造業者のプロトコル（System Biosciences）に従って生成する。レンチウイルスは、２９３ＴＮ細胞（System Biosciences）の一過性トランスフェクションにより、Lipofectamine 3000（ThermoFisher）を使用して生成することができる。
ＣＡＲの形質導入および増殖
ヒト初代Ｔ細胞を、Leuko Pak（Stem Cell Technologies）から磁気ビーズ分離により、抗ＣＤ４および抗ＣＤ８マイクロビーズを使用し、製造業者のプロトコル（Stem Cell Technologies）に従って単離する。精製されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞を１：１で混合し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８結合Dynabeads（Thermo Fisher）をビーズと細胞の比率１：１で使用して活性化する。Ｔ細胞培養培地は、免疫細胞血清置換、Ｌ－グルタミンおよびGlutaMAX（すべてThermo Fisherから購入）および１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（Peprotech）を添加したCTS OptimizerＴ細胞増殖培地である。Ｔ細胞形質導入は、ポリブレン（Sigma）の存在下でのスピノキュレーションによる活性化の２４時間後に実施する。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、凍結保存の前に９日間培養する。すべての実験の前にＴ細胞を解凍し、３７℃で４～６時間静置する。
フローサイトメトリーベースのＣＡＲ－Ｔ細胞障害性アッセイ
標的細胞の細胞障害性を、陰性対照細胞の生存に対する標的細胞の生存を比較することにより測定する。ＣＤ１２３アッセイでは、野生型およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で編集されたヒトＣＤ３４＋ ＨＳＰＣ細胞を、標的細胞として使用する。野生型Ｒａｊｉ細胞株（ATCC）を、陰性対照として使用する。標的細胞と陰性対照細胞を、それぞれCellTrace Violet（CTV）およびCFSE（Thermo Fisher）で製造業者の指示に従って染色する。染色後、標的細胞と陰性対照細胞を１：１で混合する。
抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、エフェクターＴ細胞として使用する。非形質導入Ｔ細胞（モックＣＡＲ－Ｔ）を対照として使用する。エフェクターＴ細胞を、標的細胞／陰性対照細胞混合物と、１：１のエフェクター対ターゲット比でデュプリケートで共培養する。エフェクターＴ細胞を含まない標的細胞／陰性対照細胞混合物のみの群を、対照として含める。細胞を３７℃で２４時間、フローサイトメトリー分析の前にインキュベートする。ヨウ化プロピジウム（Thermo Fisher）を、生存率色素として使用する。特異的細胞溶解の算出には、生存する陰性対照細胞に対する生存する標的細胞の割合（標的割合と呼ぶ）を使用する。特異的細胞溶解は、（（エフェクター細胞なしの標的割合－エフェクター細胞を含む標的割合）／（エフェクターなしの標的割合））×１００％として算出する。
上記の分析は、ＣＤ１２３ ＫＯ ＨＰＳＣ（およびその子孫）が、抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔ媒介性の殺傷に耐性があるのに対し、非編集対照ＨＰＳＣ（およびその子孫）は、抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔを介した殺傷に感受性であることを示す。
例７：造血系疾患の処置
急性骨髄性白血病またはＭＤＳに対する、本明細書に記載の方法、細胞、および薬剤を使用した例示的な処置計画が提供される。簡単に言えば、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受ける候補であるＡＭＬまたはＭＤＳを有する対象を同定する。適切なＨＳＣドナー、例えばＨＬＡ適合ドナーを同定し、ＨＳＣをドナーから得るか、または適切な場合、対象からの自家ＨＳＣを得る。
こうして得たＨＳＣを、プロトコルに従って、本明細書で提供される戦略および組成物、例えば、表２、６、または８のいずれかに記載のＣＤ１２３標的ドメインを標的とする適切なガイドＲＮＡを使用して、編集する。一つの例示の態様において、編集は、ｇＲＮＡ Ａ、ｇＲＮＡ Ｉ、およびｇＲＮＡ Ｐ３について本明細書に記載のターゲティングドメインを含むｇＲＮＡを使用して実施する。簡単に述べると、ＣＤ１２３の標的化された改変（欠失、切断、置換）を、適切なガイドＲＮＡと適切なＲＮＡガイド型のヌクレアーゼ（Ｃａｓ９ヌクレアーゼなど）を使用したＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集によって導入し、その結果編集されたＨＳＣ集団の少なくとも８０％で、ＣＤ１２３発現が失われる。
ＡＭＬまたはＭＤＳを有する対象は、例えば、化学療法剤（例えば、エトポシド、シクロホスファミド）の注入および／または照射を含み得る臨床標準治療に従って前処置されてもよい。しかしながら、対象の健康状態および対象の疾患進行の状態に応じて、かかる前処置は省略され得る。
ＣＤ１２３を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞療法などの、ＣＤ１２３を標的とする免疫療法を、対象に投与する。ドナーからの編集されたＨＳＣまたは対象からの編集されたＨＳＣを対象に投与し、ＨＳＣの、対象の造血系統の成熟細胞への生着、生存、および／または分化を監視する。ＣＤ１２３を標的とする免疫療法は、ＣＤ１２３を発現する悪性または前悪性の細胞を選択的に標的化して殺傷し、また対象においてＣＤ１２３を発現する一部の健康な細胞をも標的にし得るが、対象における編集されたＨＳＣまたはその子孫は標的としない；何故ならば、これらの細胞は、ＣＤ１２３を標的とした免疫療法による標的化および殺傷に対して耐性であるからである。
対象の健康状態および疾患の進行を、免疫療法および編集されたＨＳＣの投与後に定期的に監視して、ＣＤ１２３を発現する悪性または前悪性細胞の負荷の軽減を確認し、編集されたＨＳＣおよびその子孫の生着が成功したことを確認する。
例８：ＣＤ１２３転写産物およびタンパク質の安定性の評価
ＣＤ１２３発現細胞株、ＨＬ－６０において、ＣＤ１２３の編集および発現の動態を評価した。ｇＲＮＡは、例１および例３に記載のとおりに設計した。次に、細胞、例えばＨＬ－６０細胞を、０日目（「ＥＰ」）に例示的ＣＤ１２３標的化ガイド、ｇＲＮＡ Ｐ３、または対照ｇＲＮＡ（ｇＣｎｔｒｌ）を使用して、例１に記載のとおりにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介して編集した。
ex vivo編集の後、ゲノムＤＮＡを細胞から収集し、標的領域に隣接するプライマーでＰＣＲ増幅し、精製し、ＴＩＤＥで分析して、ＣＤ３４＋ ＨＳＰＣでの編集頻度を決定した。編集効率を、エレクトロポレーション後１日目から７日目までの各日に評価し、変異の維持率を査定した。図２１Ａに示すとおり、ｇＲＮＡ Ｐ３は約７０％の編集頻度を示し、これは評価した時間にわたり一貫していた。
ＣＤ１２３ ｍＲＮＡ転写物の発現も定量化し、編集前のＣＤ１２３ ｍＲＮＡの発現と比較した。ｇＲＮＡ Ｐ３によって編集した細胞は、評価した時間にわたり、対照ｇＲＮＡで編集した細胞と比較して、より低いＣＤ１２３ ｍＲＮＡ転写物の発現を示した（図２１Ｂ）。
ＣＤ１２３の細胞表面発現を、ＦＡＣによって、ｇＲＮＡ Ｐ３によって編集したＣＤ１２３ ＫＯ細胞、または対照ｇＲＮＡ（ｇＣｎｔｒｌ）において定量化した。ｇＲＮＡ Ｐ３によって編集した細胞は、評価した時間にわたり、対照ｇＲＮＡで編集した細胞と比較して、より低いＣＤ１２３の発現を示した（図２１Ｃ）。
これらの結果は、ＣＤ１２３編集が効率的であり（エレクトロポレーション後１日目までに約９０％）、評価期間中にわたり維持されたことを示す。遺伝子編集の結果、ＣＤ１２３ ｍＲＮＡ発現とＣＤ１２３タンパク質の表面発現との両方が大幅に減少し、それは評価期間中維持もされた。
例９：ＣＤ１２３ＫＯ細胞の増殖、分化、および成熟の評価
ｇＲＮＡは、例１および例３に記載のとおりに設計した。次に、ヒトＣＤ３４＋ ＨＳＰＣを、例１に記載のとおりにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介して編集し、ＣＤ１２３を標的とするガイドＲＮＡ Ｉ、対照ｇＲＮＡ（ｇＣＴＲＬ）、ならびに非編集のエレクトロポレーション対照（Ｍｏｃｋ ＥＰ）を使用した。

ex vivo編集の後、細胞を培養培地においてインキュベートした。細胞を、解凍時とエレクトロポレーション後２日目の間に、造血幹細胞培地において培養する。細胞は、エレクトロポレーション後２～９日目の間のＩ期（「Ｉ」）の間の第一相赤血球分化培地、エレクトロポレーション後９～１３日目の間のＩＩ期（「ＩＩ」）の間の第二相赤血球分化培地、エレクトロポレーション後１３～２３日目の間のＩＩＩ期（「ＩＩＩ」）の間の第三相赤血球分化培地で培養される。
エレクトロポレーション後のさまざまな時点にて、ゲノムＤＮＡを細胞から収集し、標的領域に隣接するプライマーでＰＣＲ増幅し、精製し、ＴＩＤＥで分析して、ＣＤ３４＋ ＨＳＰＣでの編集頻度を決定した。図２２Ｂに示すとおり、ｇＲＮＡ Ｉは約８５％の編集頻度を示し、これは評価した時間にわたり一貫していた。また、ｇＲＮＡ Ｉ、対照ｇＲＮＡ（ｇＣＴＲＬ）、ならびに非編集のエレクトロポレーションした対照（Ｍｏｃｋ ＥＰ）によって編集したＣＤ１２３ ＫＯ細胞において、ＦＡＣによってＣＤ１２３の細胞表面発現をも定量化し、エレクトロポレーションしていないＣＤ３４＋細胞と比較した。ｇＲＮＡ Ｉによって編集したＣＤ３４＋ ＨＳＰＣは、対照ｇＲＮＡで編集した細胞と比較して、より低いＣＤ１２３の発現（より少ないＣＤ１２３＋細胞）を示した（図２２Ｃ）。また、生存可能細胞の数を経時的に定量化した。ＣＤ１２３ ＫＯ細胞は、対照編集細胞（ｇＣＴＲＬ）とモックエレクトロポレーション細胞（Ｍｏｃｋ ＥＰ）との両方に対して同等の細胞増殖を示した（図２２Ｄ）。
また、ｇＲＮＡ Ｉ、対照編集細胞（ｇＣＴＲＬ）、およびモックエレクトロポレーション細胞（Ｍｏｃｋ ＥＰ）によって編集したＣＤ３４＋ ＨＳＰＣについて、エレクトロポレーションしていないＣＤ３４＋細胞と比較して、赤血球の分化および成熟を評価した。赤血球分化マーカーを発現する細胞の割合を、エレクトロポレーション後のさまざまな日に定量化した。図２３Ａ～２３Ｄに示すとおり、ＣＤ１２３ ＫＯ細胞は、対照編集細胞（ｇＣＴＲＬ）とモックエレクトロポレーション細胞（Ｍｏｃｋ ＥＰ）との両方と比較して、ＣＤ７１、ＧｌｙＡ、α４－インテグリン、およびＢａｎｄ３に対して同等の発現を示した。赤血球成熟の尺度である赤血球細胞の脱核も、ＣＤ１２３破壊によって変化しなかった（図２３Ｅ）。
要約すれば、これらの結果により、ＣＤ１２３タンパク質の持続的喪失が、赤血球の増殖、分化、および成熟に影響しないことが示された。
例１０：in vivoでのＣＤ１２３ＫＯ細胞の造血細胞機能の維持
ＣＤ３４＋ヒトＨＳＰＣにおける編集
ｇＲＮＡは、例１および例３に記載のとおりに設計した。次にヒトＣＤ３４＋ ＨＳＰＣを、例１に記載のとおりにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介し、ＣＤ１２３を標的とするガイドＲＮＡ Ｉを使用して編集した。編集した細胞を、照射したマウスに生着させた。生着後１６週にて、マウスから骨髄を得て、細胞からゲノムＤＮＡを収集した（図２４Ａ）。ゲノムＤＮＡを標的領域に隣接するプライマーでＰＣＲ増幅し、精製し、分析して、ＣＤ３４＋ ＨＳＰＣでのそれらの編集効率を決定した。図２４Ｂに示すとおり、ｇＲＮＡ Ｉで編集したＣＤ１２３ＫＯ細胞を生着させた動物からの骨髄は、対照動物の骨髄（対照ＢＭ）と比較して、高い編集効率を有した。ｇＲＮＡ Ｉで編集したＣＤ１２３ＫＯ細胞を生着させた動物からの骨髄における編集効率を、インプット細胞（生着前にｇＲＮＡ Ｉで編集したＣＤ１２３ＫＯ細胞）における効率と同等で、約７０～８０％であった。
ＣＤ１２３ＫＯ細胞を生着させた動物からの骨髄において評価された、ｇＲＮＡ Ｉに対するインデル（挿入／欠失）分布は、定量化し、インプット細胞（生着前にｇＲＮＡ Ｉで編集したＣＤ１２３ＫＯ細胞）と比較して、図２４Ｃに示されている。
これらの結果により、生着の１６週後に、ＣＤ１２３で編集したＨＳＰＣおよびその子孫、ならびにＣＤ１２３編集種の持続性が示された。
また、骨髄系の細胞のサブセットを、ＣＤ１２３編集の持続性に対して評価した。生着後１６週にて、ｇＲＮＡ Ｉで編集したＣＤ１２３ＫＯ細胞を生着させたマウスからのプールされた骨髄を得た。骨髄系細胞のサブセットをＦＡＣＳ（例えば、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、好酸球、肥満細胞球、および好塩基球）を使用して精製した(図２５Ａおよび２５Ｂ)。ＤＮＡを細胞から収集し、標的領域に隣接するプライマーでＰＣＲ増幅し、精製し、分析して、骨髄系細胞の各サブセットにおけるそれらの編集効率を決定した。
図２５Ｃに示すとおり、ＣＤ１２３編集効率は、各骨髄系サブセットにおいて生着１６週後も持続し、細胞サブセット間で同等のレベルであることが見出された。
均等物および範囲
当業者は、本明細書に記載の例示的な態様の多くの均等物を認識し、または通常の実験のみを使用して確認することができるであろう。本開示の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではない。
「a」、「an」、「the」などの冠詞は、逆の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、１つまたは２つ以上を意味し得る。グループの２つ以上のメンバーの間に「または」を含むクレームまたは説明は、逆の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、グループメンバーの１つ、２つ以上、またはすべてが存在する場合に、満たされているとみなされる。２つ以上のグループメンバー間に「または」を含むグループの開示は、グループの正確に１つのメンバーが存在する態様、グループの２つ以上のメンバーが存在する態様、およびグループのすべてのメンバーが存在する態様を提供する。簡潔にするために、これらの態様は本明細書で個別に説明されていないが、これらの態様のそれぞれが本明細書で提供され、具体的に特許請求または放棄され得ることが理解される。
本発明は、１つ以上のクレームまたは説明の１つ以上の関連部分からの１つ以上の限定、要素、節、または記述用語が別のクレームに導入される、すべての変形、組み合わせ、および順列を包含することを理解されたい。例えば、別のクレームに従属するクレームは、同じ基本クレームに従属する任意の他のクレームに見出される１つ以上の限定を含むように変更できる。さらに、クレームが組成物を記載している場合、別様に示されるかまたは当業者に矛盾または不一致が生じることが明らかでない限り、本明細書に開示される製造または使用の方法のいずれかに従って、またはもしあれば当分野で知られている方法に従って、組成物を製造または使用する方法も含まれることが、理解されるべきである。
要素がリストとして提示される場合、すべての可能な個々の要素または要素のサブグループも開示され、任意の要素または要素のサブグループをグループから除外できることが、理解されるべきである。「含む」という用語はオープンであることを意図しており、追加の要素、特徴、またはステップを含めることも許容されることに注意すべきである。一般に、態様が特定の要素、特徴、またはステップを含むとされる場合、かかる要素、特徴、またはステップからなる、または本質的にそれからなる態様も提供されることを理解されたい。簡潔にするために、これらの態様は本明細書で個別に説明されていないが、これらの態様のそれぞれが本明細書で提供され、具体的に特許請求または放棄され得ることが理解される。
範囲が示されている場合、エンドポイントが含まれる。さらに、別段の指示がない限り、または文脈および／または当業者の理解から別様が明らかでない限り、範囲として表される値は、いくつかの態様において、記載された範囲内の任意の特定の値を、文脈が明確に別段を指示しない限り範囲の下限の単位の１０分の１までとることができることを理解されたい。簡潔にするために、各範囲の値は本明細書では個別に説明されないが、これらの値のそれぞれが本明細書で提供され、具体的に特許請求または放棄され得ることを理解されたい。別段の指示がない限り、または文脈および／または当業者の理解から別様が明らかでない限り、範囲として表される値は、所与の範囲内の任意のサブ範囲をとることができ、ここでサブ範囲のエンドポイントは、範囲の下限単位の１０分の１と同程度の精度で表現される。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献（例えば、配列データベース参照番号）は、それらの全体が参照により組み込まれる。例えば、本明細書で、例えば、本明細書の任意の表で言及されているすべてのGenBank、Unigene、およびEntrez配列は、参照により組み込まれる。特に明記しない限り、本明細書の任意の表を含む本明細書で特定される配列アクセッション番号は、２０１９年８月２８日現在のデータベースエントリを参照する。１つの遺伝子またはタンパク質が複数の配列アクセッション番号を参照する場合、すべての配列バリアントが含まれる。
さらに、本発明の任意の特定の態様は、任意の１つ以上のクレームから明示的に除外され得ることが理解されるべきである。範囲が示されている場合、範囲内の任意の値は、任意の１つ以上のクレームから明示的に除外し得る。簡潔にするために、１つ以上の要素、特徴、目的、または側面が除外される態様のすべてが、本明細書で明示的に示されているわけではない。

Claims (41)

  1. ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここで該ターゲティングドメインが配列番号２１の配列を含む、前記ｇＲＮＡ。
  2. ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここで該ターゲティングドメインが配列番号２２の配列を含む、前記ｇＲＮＡ。
  3. ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここで該ターゲティングドメインが配列番号２３の配列を含む、前記ｇＲＮＡ。
  4. ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここで該ターゲティングドメインが配列番号２４の配列を含む、前記ｇＲＮＡ。
  5. ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここで該ターゲティングドメインが配列番号２５の配列を含む、前記ｇＲＮＡ。
  6. ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここで該ターゲティングドメインが配列番号２６の配列を含む、前記ｇＲＮＡ。
  7. ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここで該ターゲティングドメインが配列番号２７の配列を含む、前記ｇＲＮＡ。
  8. ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここで該ターゲティングドメインが配列番号２８の配列を含む、前記ｇＲＮＡ。
  9. ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここで該ターゲティングドメインが配列番号２９の配列を含む、前記ｇＲＮＡ。
  10. ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここで該ターゲティングドメインが配列番号３０の配列を含む、前記ｇＲＮＡ。
  11. ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここで該ターゲティングドメインが配列番号４８の配列を含む、前記ｇＲＮＡ。
  12. ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここで該ターゲティングドメインが配列番号４９の配列を含む、前記ｇＲＮＡ。
  13. ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここで該ターゲティングドメインが配列番号５０の配列を含む、前記ｇＲＮＡ。
  14. ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡであって、ここで該ターゲティングドメインが配列番号５１の配列を含む、前記ｇＲＮＡ。
  15. 表１、２、６、または８の標的ドメインに結合するターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡ。
  16. 表１、２、６、または８の標的ドメインの切断または編集を指示することができるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡ。
  17. 第１の相補性ドメイン、連結ドメイン、第１の相補性ドメインに相補的な第２の相補性ドメイン、および近位ドメインを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  18. 単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１～１７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  19. １つ以上の２’Ｏ-メチルヌクレオチドを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  20. １つ以上のホスホロチオアートまたはチオＰＡＣＥ結合を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  21. 遺伝子操作された細胞を生成する方法であって、以下：
    （ｉ）細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞、例えば野生型造血幹細胞または前駆細胞）を提供すること、および
    （ｉｉ）細胞中に、（ａ）請求項１～２０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ、または請求項１～２０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡによって標的化されるターゲティングドメインを標的とするｇＲＮＡ、または（ｂ）ｇＲＮＡに結合するＣａｓ９分子を、導入すること、
    を含み、これにより遺伝子操作された細胞を生成する、前記方法。
  22. Ｃａｓ分子が、ＳｐＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼを含む、請求項２１に記載の方法。
  23. （ｉ）および（ｉｉ）が、予め形成されたリボ核タンパク質複合体として細胞に導入される、請求項２１または２２に記載の方法。
  24. リボ核タンパク質複合体が、エレクトロポレーションを介して細胞に導入される、請求項２１または２２に記載の方法。
  25. 請求項２１～２４のいずれか一項に記載の方法によって生成される、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
  26. 請求項２５に記載の複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む、細胞集団。
  27. ＣＤ１２３編集造血幹細胞をレシピエントの骨髄中に生着させ、レシピエント内で全ての血液系統細胞型の分化した子孫を生成する能力によって特徴付けられる、請求項２６に記載の細胞集団。
  28. ＣＤ１２３編集造血幹細胞をレシピエントの骨髄中に、少なくとも５０％の効率にて生着させる能力によって特徴付けられる、請求項２６または２７に記載の細胞集団。
  29. ＣＤ１２３編集造血幹細胞をレシピエントの骨髄中に、少なくとも６０％の効率にて生着させる能力によって特徴付けられる、請求項２６または２７に記載の細胞集団。
  30. ＣＤ１２３編集造血幹細胞をレシピエントの骨髄中に、少なくとも７０％の効率にて生着させる能力によって特徴付けられる、請求項２６または２７に記載の細胞集団。
  31. ＣＤ１２３編集造血幹細胞をレシピエントの骨髄中に、少なくとも８０％の効率にて生着させる能力によって特徴付けられる、請求項２６または２７に記載の細胞集団。
  32. ＣＤ１２３編集造血幹細胞をレシピエントの骨髄中に、少なくとも９０％の効率にて生着させる能力によって特徴付けられる、請求項２６または２７に記載の細胞集団。
  33. 細胞集団が、非編集造血幹細胞の分化能と同等の分化能によって特徴付けられるＣＤ１２３編集造血幹細胞を含む、請求項２６～３２のいずれか一項に記載の細胞集団。
  34. １つ以上の非操作ＣＤ１２３遺伝子を含む１つ以上の細胞をさらに含む、請求項２６～３３のいずれか一項に記載の細胞集団。
  35. 野生型対応細胞集団によって発現されるＣＤ１２３の２０％未満を発現する、請求項２６～３４のいずれか一項に記載の細胞集団。
  36. 造血幹細胞および造血前駆細胞の両方を含む、請求項２６～３５のいずれか一項に記載の細胞集団。
  37. ＣＤ１２３以外の系統特異的細胞表面抗原をコードする遺伝子における第２の変異をさらに含む、請求項２６～３６のいずれか一項に記載の細胞集団。
  38. ＣＤ１２３以外の系統特異的細胞表面抗原をコードする遺伝子が、ＣＤ３３またはＣＬＬ１である、請求項３７に記載の細胞集団。
  39. それを必要とする対象に、請求項２６～３７のいずれか一項に記載の細胞集団を投与することを含む、方法。
  40. 対象が、造血器悪性腫瘍を有する、請求項３９に記載の方法。
  41. ＣＤ１２３を標的とする有効量の薬剤を対象に投与することをさらに含み、ここで薬剤が、ＣＤ１２３に結合する抗原結合フラグメントを含む、請求項３９または４０に記載の方法。
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