JP2022517618A - 系統特異的抗原の阻害のための組成物および方法 - Google Patents

系統特異的抗原の阻害のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本明細書において、造血器悪性腫瘍の免疫療法のために、系統特異的細胞表面抗原、例えば、ＣＤ３３を標的にする物質、および系統特異的細胞表面抗原、例えば、ＣＤ３３を欠く造血細胞集団を投与する方法が開示される。ＣＤ３３中に変異を含む細胞、およびＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡも提供される。【選択図】なし

Description

本出願は、２０１９年１月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／７９３，２１０号および２０１９年５月２４日に出願された同第６２／８５２，５７３号の優先権を主張する。これらそれぞれの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子申請された配列表を含み、この配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２０年１月１６日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０１００１－００４９６５－ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、８３キロバイトのサイズである。
数十年の試みにも関わらず、癌に対する治癒的免疫学的療法は達成することが非常に困難であり、基本的原理は、抗体またはＴ細胞（Ｔ細胞受容体を介する）のいずれかによる抗原認識能力である（Ｃｏｕｓｉｎ－Ｆｒａｎｋｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）３４２：１４３２）。抗体ベース免疫療法は癌に対し、標的抗原が正常細胞と比べて腫瘍細胞で上方制御される場合（例えば、Ｈｅｒ－２増殖性乳癌におけるＨｅｒ－２）、または腫瘍細胞が抗体または抗体毒素複合体により認識され得る抗原を発現する場合（例えば、ＣＤ２０に対するリツキシマブ）、広範に使用されている（Ｂａｓｅｌｇａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２００１）１２：Ｓ３５）。抗体ベース免疫療法を用いた臨床試験は、限られた数の癌タイプにおける改善された患者生存を示しているが（通常、標準的な化学療法と併用されたとき）、これらの効果はしばしば、重大な安全性および有効性の懸念を伴う（Ｃｏｕｓｉｎ－Ｆｒａｎｋｅｌ Ｃａｎｃｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）３４２：１４３２）。
癌に対する効果的なＴ細胞療法を、臨床的に達成することはさらに困難である（Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００９）２０（１１）：１２４０）。癌に対する効果的なＴ細胞療法は、癌細胞上の抗原に対し高い親和性結合を有するＴ細胞に依存する。キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）は広く使用されており、細胞上の抗原を高い親和性と特異性の両方で認識し、ペプチドを「提示する」ＨＬＡ抗原などの補助認識分子を必要としない。ＣＡＲ Ｔ細胞のＴ細胞受容体は、抗原結合性重鎖および軽鎖と「交換」され、従って、ＨＬＡ補助分子の必要性を除く。組換えＣＡＲ Ｔ受容体は、標的抗原へのＣＡＲ Ｔ受容体の結合によりＴ細胞の活性化をもたらすシグナル領域に融合される。
ＣＡＲ Ｔ細胞の臨床的使用は、狭い範囲の細胞表面抗原の標的化に限定されており、癌の治療における改善された新規手法の必要性をさらに裏付ける。特に、新規手法は、現在の標準治療である強い化学療法を受けることができない高齢患者における転帰が、５～１０ヶ月の生存期間中央値にすぎない、極めて不十分のままである、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの疾患のために必要である（Ｄｏｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ（２０１５）３７３：１１３６）。
本明細書で記載されるのは、腫瘍細胞上の特定の種類の系統特異的細胞表面抗原を標的とする、癌免疫療法に対する新規手法である。ＣＡＲ Ｔ細胞治療は次に、系統特異的細胞表面抗原を欠く改変細胞集団の注入または再注入による非腫瘍細胞の置換と組み合わされる。腫瘍の再発は、ＣＡＲ Ｔ細胞によりインビボで患者の監視を維持することにより防止または低減される。
本開示は、系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメントを含む物質（例えば、ＣＤ３３を標的にするキメラ受容体を発現する免疫細胞）が、系統特異的細胞表面抗原を発現する細胞の細胞死を選択的にもたらし、一方、その抗原を欠く細胞（例えば、遺伝子操作された造血細胞）はこれにより生じる細胞死を逃れるという発見に、少なくとも部分的に基づいている。このような発見に基づき、系統特異的細胞表面抗原を標的にする物質、例えば、ＣＤ３３を標的にするＣＡＲ－Ｔ細胞と、系統特異的細胞抗原（例えば、ＣＤ３３）を欠く造血細胞との組み合わせを含む免疫療法が、造血器悪性腫瘍の有効な治療方法をもたらすことが期待される。
いくつかの態様では、本開示は、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を提供し、これは、内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含み、この遺伝子変異は、本明細書で記載の位置にある。本開示の一態様は、遺伝子操作された造血幹細胞および／または前駆細胞を提供し、これは、内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含み、この遺伝子変異は、ｇＲＮＡにより標的化される部位にあり、これは、ＡＵＣＣＣＵＧＧＣＡＣＵＣＵＡＧＡＡＣＣ（配列番号６７）、ＧＧＣＣＧＧＧＵＵＣＵＡＧＡＧＵＧＣＣＡ（配列番号６８）、またはＣＣＵＣＡＣＵＡＧＡＣＵＵＧＡＣＣＣＡＣ（配列番号７０）のヌクレオチド配列を含み、遺伝子操作された造血幹細胞および／または前駆細胞は、野生型の対応物に比べて低減した発現レベルのＣＤ３３を有する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された造血幹細胞および／または前駆細胞は、野性型の対応物により発現されるＣＤ３３の１０％未満のＣＤ３３を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された造血幹細胞および／または前駆細胞は、ＣＤ３３を発現しない。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された造血幹細胞および／または前駆細胞は、ＣＤ３４＋である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された造血幹細胞および／または前駆細胞は、対象（例えば、造血器悪性腫瘍を有するヒト患者、または健康なドナー）の骨髄細胞または末梢血単核球由来である。
いくつかの実施形態では、本開示はまた、本明細書で記載の複数の遺伝子操作された造血幹細胞および／または前駆細胞を含む細胞集団を提供する。
別の態様では、本開示は、遺伝子操作された造血幹細胞および／または前駆細胞を製造する方法を提供し、方法は、（ｉ）造血幹細胞および／または前駆細胞を用意すること、および（ｉｉ）その細胞中に（ａ）配列番号６７、配列番号６８、および／または配列番号７０に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、を導入し、それにより低減した発現レベルのＣＤ３３を有する遺伝子操作された造血幹細胞および／または前駆細胞を製造すること、を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、１つのベクター上にコードされ、それは、細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウィルスベクターである。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、あらかじめ形成されたリボ核タンパク質複合体として細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、リボ核タンパク質複合体は、電気穿孔法により細胞中に導入される。
本開示はまた、いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて造血幹細胞または前駆細胞試料中のＣＤ３３の発現を低減させるための本明細書で記載のｇＲＮＡの使用を提供する。
本開示はまた、いくつかの態様では、造血幹細胞または前駆細胞試料中のＣＤ３３の発現を低減させるためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用を提供し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのｇＲＮＡは、本明細書で記載のｇＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、修飾ｓｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、造血幹細胞および／または前駆細胞は、ＣＤ３４＋である。いくつかの実施形態では、造血幹細胞および／または前駆細胞は、骨髄細胞または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）由来である。いくつかの実施形態では、対象は、造血障害を有する。いくつかの実施形態では、対象は、健康なＨＬＡ適合ドナーである。
いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子操作された造血幹細胞および／または前駆細胞を提供し、これは、本明細書で記載の方法により製造される。
別の態様では、本開示は、造血障害を治療する方法を提供し、方法は、有効量の遺伝子操作された造血幹細胞および／または前駆細胞または本明細書で記載の細胞集団を、それを必要としている対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、造血障害は、造血器悪性腫瘍である。
いくつかの実施形態では、方法は、対象に有効量のＣＤ３３を標的にする物質を投与することを含み、物質は、ＣＤ３３を結合する抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３を標的にする物質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞であり、これはＣＤ３３を結合する抗原結合フラグメントを含む。
いくつかの態様では、本開示は、造血障害の治療での使用のための本明細書で記載の遺伝子操作された造血幹細胞および／または前駆細胞または本明細書で記載の細胞集団を提供し、治療は、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞または細胞集団の有効量をそれを必要としている対象に投与することを含み、およびＣＤ３３を標的にする物質の有効量を対象に投与することをさらに含み、物質は、ＣＤ３３を結合する抗原結合フラグメントを含む。
いくつかの態様では、本開示は、造血障害の治療での使用のための、ＣＤ３３を標的にする物質を提供し、物質は、ＣＤ３３を結合する抗原結合フラグメントを含み、治療は、ＣＤ３３を標的にする物質の有効量を、それを必要としている対象に投与することを含み、および本明細書で記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞または本明細書で記載の細胞集団の有効量を対象に投与することをさらに含む。
本明細書で記載の遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または本明細書で記載の細胞集団と、ＣＤ３３を標的にする物質との組み合わせは、造血障害の治療での使用のためであり、物質は、ＣＤ３３を結合する抗原結合フラグメントを含み、治療は、遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団、およびＣＤ３３を結合する物質の有効量をそれを必要としている対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団は、ＣＤ３３を標的にする物質と同時に投与される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団は、ＣＤ３３を標的にする物質の前に投与される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３を標的にする物質は、遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団の前に投与される。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞、遺伝子操作された造血幹細胞および／または前駆細胞、または両方は、同種である。いくつかの実施形態では、免疫細胞、遺伝子操作された造血幹細胞および／または前駆細胞、または両方は、自己である。いくつかの実施形態では、キメラ受容体中の抗原結合フラグメントは、ヒトＣＤ３３を特異的に結合する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である。
いくつかの実施形態では、対象は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、または多発性骨髄腫を有するヒト患者である。いくつかの実施形態では、対象は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、または慢性リンパ性白血病である白血病を有するヒト患者である。
別の態様では、本開示は、配列番号６７または配列番号６８、または配列番号７０に少なくとも約９０％同一であるスペーサー配列を含む、ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、単一分子ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、修飾される。特定の例では、スペーサー配列は、配列番号６７、配列番号６８、または配列番号７０である。
本明細書の組成物および方法の特徴はまた、次の列挙された実施形態でも記載される。
１．内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含み、この遺伝子変異が、下記から選択される配列を有する部位にある、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞：
ＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＣ（配列番号５０）、
ＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＣＣＧＧ（配列番号４９）、
ＧＧＣＣＧＧＧＴＴＣＴＡＧＡＧＴＧＣＣＡ（配列番号５１）、
ＧＧＣＣＧＧＧＴＴＣＴＡＧＡＧＴＧＣＣＡＧＧＧ（配列番号２９）、
ＣＣＴＣＡＣＴＡＧＡＣＴＴＧＡＣＣＣＡＣ（配列番号５８）；または
ＣＣＴＣＡＣＴＡＧＡＣＴＴＧＡＣＣＣＡＣＡＧＧ（配列番号４８）。
２．内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含み、この遺伝子変異が、ＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＣ（配列番号５０）の配列を有する部位にある、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
３．内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含み、この遺伝子変異が、ＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＣ（配列番号５０）の配列を有する部位にあり、この遺伝子変異が、野性型対応細胞に比べて低減した発現レベルのＣＤ３３をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
４．内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含み、この遺伝子変異が、ＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＣ（配列番号５０）の配列を有する部位にあり、この遺伝子変異が、野性型対応細胞中のＣＤ３３のレベルの２０％未満である、低減した発現レベルのＣＤ３３をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
５．内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含み、この遺伝子変異が、ＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＣＣＧＧ（配列番号４９）の配列を有する部位にある、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
６．内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含み、この遺伝子変異が、ＣＣＴＣＡＣＴＡＧＡＣＴＴＧＡＣＣＣＡＣ（配列番号５８）の配列を有する部位にある、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
７．内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含み、この遺伝子変異が、ＣＣＴＣＡＣＴＡＧＡＣＴＴＧＡＣＣＣＡＣ（配列番号５８）の配列を有する部位にあり、この遺伝子変異が、野性型対応細胞に比べて低減した発現レベルのＣＤ３３をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
８．内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含み、この遺伝子変異が、ＣＣＴＣＡＣＴＡＧＡＣＴＴＧＡＣＣＣＡＣ（配列番号５８）の配列を有する部位にあり、この遺伝子変異が、野性型対応細胞中のＣＤ３３のレベルの２０％未満である、低減した発現レベルのＣＤ３３をもたらす、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
９．内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含み、この遺伝子変異が、ＣＣＴＣＡＣＴＡＧＡＣＴＴＧＡＣＣＣＡＣＡＧＧ（配列番号４８）の配列を有する部位にある、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１０．内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含み、この遺伝子変異が、ｇＲＮＡにより標的化される部位にあり、ｇＲＮＡが、ＡＵＣＣＣＵＧＧＣＡＣＵＣＵＡＧＡＡＣＣ（配列番号６７）またはＣＣＵＣＡＣＵＡＧＡＣＵＵＧＡＣＣＣＡＣ（配列番号７０）のヌクレオチド配列を含み、遺伝子操作された造血幹細胞および／または前駆細胞が、野生型の対応物に比べて低減した発現レベルのＣＤ３３を有する、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１１．内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含み、この遺伝子変異が、ＣＣＵＣＡＣＵＡＧＡＣＵＵＧＡＣＣＣＡＣ（配列番号７０）のヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡにより標的化される部位にある、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１２．内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含み、この遺伝子変異が、ＡＵＣＣＣＵＧＧＣＡＣＵＣＵＡＧＡＡＣＣ（配列番号６７）のヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡにより標的化される部位にある、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１３．予測されるいずれのオフターゲット部位中にも、例えば、図３０に列挙されたいずれの部位にも、例えば、配列番号９９～１１２のいずれの部位にも、変異を含まない、実施形態１～１２のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１４．図２９に列挙された予測されるいずれのオフターゲット部位中にも、例えば、配列番号７９～９８のいずれの部位にも、変異を含まない、実施形態１～１３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１５．遺伝子変異が、置換（例えば、一塩基バリアント）、挿入、もしくは欠失、またはこれらの組み合わせである、実施形態１～１４のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１６．欠失が完全に、配列番号５０、配列番号５１、または配列番号５８内にある、実施形態１５に記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１７．欠失が、１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、または１７ヌクレオチド長である、実施形態１５または１６に記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１８．欠失が、配列番号５０、配列番号５１、または配列番号５８の外側に広がる、実施形態１５に記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１９．遺伝子変異が、フレームシフトをもたらす、実施形態１～１８のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２０．遺伝子変異が、野性型対応細胞に比べて低減した発現レベルの野性型ＣＤ３３（例えば、野性型対応細胞のレベルの５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％未満）をもたらす、実施形態１～１９のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２１．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞が、野性型対応細胞に比べて低減したレベルの野性型ＣＤ３３（例えば、野性型対応細胞のレベルの５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％未満）をもたらす、実施形態１～２０のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２２．遺伝子変異が、野性型対応細胞に比べて低減した発現レベルのＣＤ３３（例えば、野性型対応細胞のレベルの５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％未満）をもたらす、実施形態１～２１のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２３．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞が、野性型対応細胞に比べて低減したレベルのＣＤ３３（例えば、野性型対応細胞のレベルの５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％未満）をもたらす、実施形態１～２２のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２４．遺伝子変異が、ＣＤ３３の発現の欠乏をもたらす、実施形態１～２３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２５．野性型の対応物により発現されるＣＤ３３の２０％未満のＣＤ３３を発現する、実施形態１～２４のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２６．低減した発現レベルのＣＤ３３が、造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、最終分化した）細胞中にあり、および野性型の対応細胞が、野性型造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、最終分化した）細胞である、実施形態１～２５のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２７．造血幹細胞または前駆細胞から分化した細胞が、骨髄芽球、単芽球、単球、マクロファージ、またはナチュラルキラー細胞である、実施形態２６に記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２８．ＣＤ３３を発現しない、実施形態１～２７のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２９．ＣＤ３４＋である、実施形態１～２８のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
３０．対象の骨髄または末梢血単核球である、実施形態１～２９のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
３１．対象が、造血器悪性腫瘍を有するヒト患者である、実施形態３０に記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
３２．対象が、健康なヒトドナー（例えば、ＨＬＡ適合ドナー）である、実施形態３０に記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
３３．内在性ＣＤ３３遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターベースヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはメガヌクレアーゼから選択されるヌクレアーゼと接触させることを含む工程により（例えば、細胞を、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸と接触させることにより）作製された、実施形態１～３２のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
３４．実施形態１～３３のいずれかに記載の遺伝子操作された複数の造血幹細胞または前駆細胞を含む（例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞、またはこれらの組み合わせを含む）、細胞集団。
３５．内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含み、この遺伝子変異が、ＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＣ（配列番号５０）の配列を有する部位にある、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団。
３６．内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含み、この遺伝子変異が、ＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＣ（配列番号５０）の配列を有する部位にあり、この遺伝子変異が、野性型対応細胞集団に比べて低減した発現レベルのＣＤ３３をもたらす、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団。
３７．内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含み、この遺伝子変異が、ＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＣ（配列番号５０）の配列を有する部位にあり、この遺伝子変異が、野性型対応細胞中のＣＤ３３のレベルの２０％未満である、低減した発現レベルのＣＤ３３をもたらす、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団。
３８．内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含み、この遺伝子変異が、ＣＣＴＣＡＣＴＡＧＡＣＴＴＧＡＣＣＣＡＣ（配列番号５８）の配列を有する部位にある、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団。
３９．内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含み、この遺伝子変異が、ＣＣＴＣＡＣＴＡＧＡＣＴＴＧＡＣＣＣＡＣ（配列番号５８）の配列を有する部位にあり、この遺伝子変異が、野性型対応細胞集団に比べて低減した発現レベルのＣＤ３３をもたらす、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団。
４０．内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含み、この遺伝子変異が、ＣＣＴＣＡＣＴＡＧＡＣＴＴＧＡＣＣＣＡＣ（配列番号５８）の配列を有する部位にあり、この遺伝子変異が、野性型対応細胞中のＣＤ３３のレベルの２０％未満である、低減した発現レベルのＣＤ３３をもたらす、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団。
４１．１種または複数の遺伝子操作されていないＣＤ３３遺伝子を含む、１種または複数の細胞をさらに含む、実施形態３４～４０のいずれかに記載の細胞集団。
４２．ＣＤ３３に対しホモ接合の野性型である、１種または複数の細胞をさらに含む、実施形態３４～４１のいずれかに記載の細胞集団。
４３．ＣＤ３３に対しヘテロ接合の野性型である、１種または複数の細胞をさらに含む、実施形態３４～４２のいずれかに記載の細胞集団。
４４．集団中の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％の細胞が、２つのＣＤ３３のコピー中に遺伝子変異を含む、実施形態３４～４３のいずれかに記載の細胞集団。
４５．野性型の対応細胞集団により発現されるＣＤ３３の２０％未満のＣＤ３３を発現する、実施形態３４～４４のいずれかに記載の細胞集団。
４６．低減した発現レベルのＣＤ３３が、造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、最終分化した）細胞中にあり、および野性型の対応細胞が、野性型造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、最終分化した）細胞である、実施形態３４～４５のいずれかに記載の細胞集団。
４７．造血幹細胞または前駆細胞から分化した細胞が、骨髄芽球、単芽球、単球、マクロファージ、またはナチュラルキラー細胞である、実施形態４６に記載の細胞集団。
４８．造血幹細胞および造血前駆細胞を含む、実施形態３４～４７のいずれかに記載の細胞集団。
４９．実施形態１～３３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む医薬組成物。
５０．実施形態３４～４８のいずれかに記載の細胞集団を含む医薬組成物。
５１．実施形態１～３３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞、または実施形態３４～４８のいずれかに記載の細胞集団を製造する方法であって、
（ｉ）造血幹細胞または前駆細胞（例えば、野性型造血幹細胞または前駆細胞）を用意すること、および
（ｉｉ）その部位を切断するヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）を細胞中に導入すること、
を含み、それにより、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を製造する、方法。
５２．（ｉｉ）が、その部位を結合するｇＲＮＡおよびｇＲＮＡを結合するエンドヌクレアーゼを細胞中に導入することを含む、実施形態５１に記載の方法。
５３．エンドヌクレアーゼが、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、またはメガヌクレアーゼである、実施形態５１に記載の方法。
５４．ＡＵＣＣＣＵＧＧＣＡＣＵＣＵＡＧＡＡＣＣ（配列番号６７）、
ＧＧＣＣＧＧＧＵＵＣＵＡＧＡＧＵＧＣＣＡ（配列番号６８）、または
ＣＣＵＣＡＣＵＡＧＡＣＵＵＧＡＣＣＣＡＣ（配列番号７０）、
のいずれかの配列、またはその逆相補配列、または前述のいずれかに少なくとも９０％または９５％の同一性を有する配列、または前述のいずれかに対し１、２、または３個以下の変異を有する配列を含むガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）。
５５．配列番号７０に少なくとも約９０％同一である、スペーサー配列を含む、ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）。
５６．スペーサー配列が、配列番号７０を含む、実施形態５５に記載のｇＲＮＡ。
５７．配列番号６７に少なくとも約９０％同一である、スペーサー配列を含む、ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）。
５８．スペーサー配列が、配列番号６７を含む、実施形態５７に記載のｇＲＮＡ。
５９．ＣＣＵＣＡＵＣＣＣＵＧＧＣＡＣＵＣＵＡＧＡＡＣＣＣＧＧＣ（配列番号７１）、
ＧＡＧＵＧＧＣＣＧＧＧＵＵＣＵＡＧＡＧＵＧＣＣＡＧＧＧＡ（配列番号７２）、または
ＵＵＣＵＣＣＵＣＡＣＵＡＧＡＣＵＵＧＡＣＣＣＡＣＡＧＧＣ（配列番号７３）、
のいずれかの配列、またはその逆相補配列、または前述のいずれかに少なくとも９０％または９５％の同一性を有する配列、または前述のいずれかに対し１、２、または３個以下の変異を有する配列由来の少なくとも１８個（例えば、１９、２０、２１、または２２個）の連続ヌクレオチドを含むガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）。
６０．少なくとも１８、１９、２０、２１、または２２個の連続ヌクレオチドが、上記配列の位置１で始まる、実施形態５９に記載のｇＲＮＡ。
６１．少なくとも１８、１９、２０、２１、または２２個の連続ヌクレオチドが、上記配列の位置２で始まる、実施形態５９に記載のｇＲＮＡ。
６２．少なくとも１８、１９、２０、２１、または２２個の連続ヌクレオチドが、上記配列の位置３で始まる、実施形態５９に記載のｇＲＮＡ。
６３．少なくとも１８、１９、２０、２１、または２２個の連続ヌクレオチドが、上記配列の位置４で始まる、実施形態５９に記載のｇＲＮＡ。
６４．少なくとも１８、１９、２０、２１、または２２個の連続ヌクレオチドが、上記配列の位置５で始まる、実施形態５９に記載のｇＲＮＡ。
６５．少なくとも１８、１９、２０、２１、または２２個の連続ヌクレオチドが、上記配列の位置６で始まる、実施形態５９に記載のｇＲＮＡ。
６６．少なくとも１８、１９、２０、２１、または２２個の連続ヌクレオチドが、上記配列の位置７で始まる、実施形態５９に記載のｇＲＮＡ。
６７．少なくとも１８、１９、２０、または２１個の連続ヌクレオチドが、上記配列の位置８で始まる、実施形態５９に記載のｇＲＮＡ。
６８．少なくとも１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドが、上記配列の位置９で始まる、実施形態５９に記載のｇＲＮＡ。
６９．２個の変異が、相互に隣接していない、実施形態５４、または５９～６８のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
７０．３個の変異のいずれも、相互に隣接していない、実施形態５４、または５９～６８のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
７１．１、２、または３個の変異が、置換である、実施形態５４、または５９～７０のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
７２．１個または複数の変異が、挿入または欠失である、実施形態５４、または５９～７０のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
７３．スペーサー配列が、約１８～２３、例えば、２０ヌクレオチド長である、実施形態５４～７２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ。
７４．スペーサー配列が、４５％～６５％または５０～６０％、例えば、５５％のＧＣ含量を有する、実施形態５４～７３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ。
７５．１種または複数の化学修飾（例えば、核酸塩基、糖、または骨格部分に対する化学修飾）を含む、実施形態５４～７４のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
７６．例えば、本明細書で記載の位置で、１種または複数の２’Ｏ－メチルヌクレオチドを含む、実施形態５４～７５のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
７７．例えば、本明細書で記載の位置で、１種または複数のホスホロチオエートまたはｔｈｉｏＰＡＣＥ結合を含む、実施形態５４～７６のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
７８．単一分子ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、実施形態５４～７７のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
７９．Ｃａｓ９を結合する、実施形態５４～７８のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
８０．ｔｒａｃｒＲＮＡに結合する、実施形態５４～７９のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
８１．スキャホールド配列を含む、実施形態５４～７９のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
８２．ａ）実施形態５４～８１のいずれかに記載のｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸、および
ｂ）第２のｇＲＮＡ、または第２のｇＲＮＡをコードする核酸、
を含むキットまたは組成物。
８３．（ａ）のｇＲＮＡが、ＣＣＵＣＡＣＵＡＧＡＣＵＵＧＡＣＣＣＡＣ（配列番号７０）のスペーサー配列を含む、実施形態８２に記載のキットまたは組成物。
８４．（ａ）のｇＲＮＡが、ＡＵＣＣＣＵＧＧＣＡＣＵＣＵＡＧＡＡＣＣ（配列番号６７）のスペーサー配列を含む、実施形態８２に記載のキットまたは組成物。
８５．第２のｇＲＮＡが、系統特異的細胞表面抗原を標的にする、実施形態８２～８４のいずれかに記載のキットまたは組成物。
８６．第２のｇＲＮＡが、ＣＤ３３以外の系統特異的細胞表面抗原を標的にする、実施形態８２～８５のいずれかに記載のキットまたは組成物。
８７．第２のｇＲＮＡが、ＣＬＬ－１を標的にする、実施形態８２～８６のいずれかに記載のキットまたは組成物。
８８．第２のｇＲＮＡが、ＧＵＵＧＵＡＧＡＧＡＡＡＵＡＵＵＵＣＵＣ（配列番号１１５）、ＧＧＡＧＡＧＧＵＵＣＣＵＧＡＵＣＵＵＧＵ（配列番号１１６）、またはＵＧＡＡＵＡＵＣＵＣＣＡＡＣＡＡＧＡＵＣ（配列番号１１９）のスペーサー配列を含む、実施形態８２～８７のいずれかに記載のキットまたは組成物。
８９．（ａ）のｇＲＮＡが、配列番号７０によるスペーサー配列を含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号１１５によるスペーサー配列を含む、実施形態８２～８８のいずれかに記載のキットまたは組成物。
９０.（ａ）のｇＲＮＡが、配列番号７０によるスペーサー配列を含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号１１６によるスペーサー配列を含む、実施形態８２～８８のいずれかに記載のキットまたは組成物。
９１．（ａ）のｇＲＮＡが、配列番号６７によるスペーサー配列を含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号１１５によるスペーサー配列を含む、実施形態８２～８８のいずれかに記載のキットまたは組成物。
９２．（ａ）のｇＲＮＡが、配列番号６７によるスペーサー配列を含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号１１６によるスペーサー配列を含む、実施形態８２～８８のいずれかに記載のキットまたは組成物。
９３．（ａ）のｇＲＮＡが、配列番号６７によるスペーサー配列を含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号７０によるスペーサー配列を含む、実施形態８２～８８のいずれかに記載のキットまたは組成物。
９４．（ａ）のｇＲＮＡが、配列番号１１５によるスペーサー配列を含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号１１６によるスペーサー配列を含む、実施形態８２～８８のいずれかに記載のキットまたは組成物。
９５．第３のｇＲＮＡ、または第３のｇＲＮＡをコードする核酸をさらに含む、実施形態８２～９４のいずれかに記載のキットまたは組成物。
96．第３のｇＲＮＡが、系統特異的細胞表面抗原を標的にする、実施形態９５に記載のキットまたは組成物。
９７．第３のｇＲＮＡが、ＣＤ３３またはＣＬＬ－１を標的にする、実施形態９５に記載のキットまたは組成物。
９８．（ａ）のｇＲＮＡが、配列番号７０によるスペーサー配列を含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号１１５によるスペーサー配列を含み、第３のｇＲＮＡが、配列番号１１６によるスペーサー配列を含む、実施形態９５～９７のいずれかに記載のキットまたは組成物。
９９．（ａ）のｇＲＮＡが、配列番号６７によるスペーサー配列を含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号１１５によるスペーサー配列を含み、第３のｇＲＮＡが、配列番号１１６によるスペーサー配列を含む、実施形態９５～９７のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１００．（ａ）のｇＲＮＡが、配列番号６７によるスペーサー配列を含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号７０によるスペーサー配列を含み、第３のｇＲＮＡが、配列番号１１６によるスペーサー配列を含む、実施形態９５～９７のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１０１．（ａ）のｇＲＮＡが、配列番号６７によるスペーサー配列を含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号７０によるスペーサー配列を含み、第３のｇＲＮＡが、配列番号１１５によるスペーサー配列を含む、実施形態９５～９７のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１０２．第４のｇＲＮＡ、または第４のｇＲＮＡをコードする核酸をさらに含む、実施形態９５～１０１のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１０３．第４のｇＲＮＡが、系統特異的細胞表面抗原を標的にする、実施形態１０２に記載のキットまたは組成物。
１０４．第４のｇＲＮＡが、ＣＤ３３またはＣＬＬ－１を標的にする、実施形態１０２に記載のキットまたは組成物。
１０５．（ａ）のｇＲＮＡが、配列番号６７によるスペーサー配列を含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号７０によるスペーサー配列を含み、第３のｇＲＮＡが、配列番号１１５によるスペーサー配列を含み、第４のｇＲＮＡが、配列番号１１６によるスペーサー配列を含む、実施形態１０２に記載のキットまたは組成物。
１０６．（ａ）のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡ、および第４のｇＲＮＡが、混合される、実施形態１０２～１０５のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１０７．（ａ）のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡ、および第４のｇＲＮＡが、別々の容器中にある、実施形態１０２～１０５のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１０８．（ａ）および（ｂ）が、混合される、実施形態８２～１０５のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１０９．（ａ）および（ｂ）が、別々の容器中にある、実施形態８２～１０５のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１１０．（ａ）の核酸および（ｂ）の核酸が、同じ核酸の一部である、実施形態８２～１０９のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１１１．（ａ）の核酸および（ｂ）の核酸が、別々の核酸である、実施形態８２～１０９のいずれかに記載のキットまたは組成物。
１１２．（ａ）内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中の遺伝子変異であって、ＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＣ（配列番号５０）の配列を有する部位にある、遺伝子変異、
（ｂ）内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中の遺伝子変異であって、ＣＣＴＣＡＣＴＡＧＡＣＴＴＧＡＣＣＣＡＣ（配列番号５８）の配列を有する部位にある、遺伝子変異、
（ｃ）ＧＴＴＧＴＡＧＡＧＡＡＡＴＡＴＴＴＣＴＣ（配列番号１１７）の配列を有する部位にある、ＣＬＬ－１中の遺伝子変異、
（ｄ）ＧＧＡＧＡＧＧＴＴＣＣＴＧＡＴＣＴＴＧＴ（配列番号１１８）の配列を有する部位にある、ＣＬＬ－１中の遺伝子変異、
の１個または複数（例えば、２、３個、またはすべて）を含む、遺伝子操作された造血細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）。
１１３．（ａ）および（ｂ）を含む、実施形態１１２に記載の造血細胞。
１１４．（ａ）および（ｃ）を含む、実施形態１１２に記載の造血細胞。
１１５．（ａ）および（ｄ）を含む、実施形態１１２に記載の造血細胞。
１１６．（ｂ）および（ｃ）を含む、実施形態１１２に記載の造血細胞。
１１７．（ｂ）および（ｄ）を含む、実施形態１１２に記載の造血細胞。
１１８．（ｃ）および（ｄ）を含む、実施形態１１２に記載の造血細胞。
１１９．（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、実施形態１１２に記載の造血細胞。
１２０．（ａ）、（ｂ）および（ｄ）を含む、実施形態１１２に記載の造血細胞。
１２１．（ａ）、（ｃ）および（ｄ）を含む、実施形態１１２に記載の造血細胞。
１２２．（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を含む、実施形態１１２に記載の造血細胞。
１２３．（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を含む、実施形態１１２に記載の造血細胞。
１２４．配列番号５０内の位置から配列番号５８内の位置にわたる欠失を含む、実施形態１１２～１２３のいずれかに記載の造血細胞。
１２５．配列番号１１７内の位置から配列番号１１８内の位置にわたる欠失を含む、実施形態１１２～１２４のいずれかに記載の造血細胞。
１２６．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて造血幹細胞または前駆細胞試料中のＣＤ３３の発現を低減させるための、実施形態５４～８１のいずれかに記載のｇＲＮＡの使用または実施形態８２～１１１のいずれかに記載の組成物またはキット。
１２７．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのｇＲＮＡが、実施形態５４～８１のいずれかに記載のｇＲＮＡまたは実施形態８２～１１１のいずれかに記載の組成物またはキットのｇＲＮＡである、造血細胞幹細胞または前駆細胞試料中のＣＤ３３の発現を低減させるためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用。
１２８．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を製造する方法であって、
（ｉ）造血幹細胞または前駆細胞（例えば、野性型造血幹細胞または前駆細胞）を用意すること、および
（ｉｉ）（ａ）実施形態２２～３９のいずれかに記載のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または実施形態８２～１１１のいずれかに記載の組成物またはキットのｇＲＮＡ；および（ｂ）ｇＲＮＡに結合するヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）を細胞中に導入すること、
を含み、それにより遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を製造する、方法。
１２９．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を製造する方法であって、
（ｉ）遺伝子操作された造血幹細胞および／または前駆細胞を用意すること、および
（ｉｉ）（ａ）配列番号６７または配列番号７０に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを細胞中に導入し、それにより低減した発現レベルのＣＤ３３を有する遺伝子操作された造血幹細胞および／または前駆細胞を製造すること、
を含む方法。
１３０．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を製造する方法であって、
（ｉ）造血幹細胞または前駆細胞を用意すること、および
（ｉｉ）（ａ）配列番号６７または配列番号７０に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを細胞中に導入し、それにより遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を製造すること、
を含む方法。
１３１．低減した発現レベルのＣＤ３３を有する遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を製造する方法であって、
（ｉ）造血幹細胞または前駆細胞を用意すること、および
（ｉｉ）（ａ）配列番号６７または配列番号７０に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを細胞中に導入し、それにより低減した発現レベルのＣＤ３３を有する遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を製造すること、
を含む方法。
１３２．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を製造する方法であって、
（ｉ）造血幹細胞または前駆細胞を用意すること、および
（ｉｉ）（ａ）配列番号６７によるヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを細胞中に導入し、それにより遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を製造すること、
を含む方法。
１３３．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を製造する方法であって、
（ｉ）造血幹細胞または前駆細胞を用意すること、および
（ｉｉ）（ａ）配列番号７０によるヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを細胞中に導入し、それにより遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を製造すること、
を含む方法。
１３４．野性型の対応細胞に比べて低減した発現レベルのＣＤ３３を有する遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞をもたらす、実施形態５１～５３または１２６～１３３のいずれかに記載の方法または使用。
１３５．野性型の対応細胞中のＣＤ３３のレベルの２０％未満であるＣＤ３３の発現レベルを有する遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞をもたらす、実施形態５１～５３または１２６～１３４のいずれかに記載の方法または使用。
１３６．複数の造血幹細胞または前駆細胞で実施される、実施形態５１～５３または１２６～１３５のいずれかに記載の方法または使用。
１３７．複数の造血幹細胞および複数の造血前駆細胞を含む細胞集団で実施される、実施形態５１～５３または１２６～１３６のいずれかに記載の方法または使用。
１３８．実施形態３４～４８のいずれかに記載の細胞集団を製造する、実施形態５１～５３または１２６～１３７のいずれかに記載の方法または使用。
１３９．（ａ）および（ｂ）の核酸が、細胞中に導入される、１つのベクターにコードされる、実施形態１２８～１３８のいずれかに記載の方法。
１４０．ベクターが、ウィルスベクターである、実施形態１３９に記載の方法。
１４１．（ａ）および（ｂ）が、予め形成されたリボ核タンパク質複合体として細胞中に導入される、実施形態１３９に記載の方法。
１４２．リボ核タンパク質複合体が、電気穿孔法により細胞中に導入される、実施形態１４１に記載の方法。
１４３．エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）が、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）を細胞中に送達することにより細胞中に導入される、実施形態１２８～１４２のいずれかに記載の方法。
１４４．ｇＲＮＡが、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、実施形態１２８～１４３のいずれかに記載の方法。
１４５．ｇＲＮＡが、修飾されたｓｇＲＮＡである、実施形態１２８～１４４のいずれかに記載の方法。
１４６．ｇＲＮＡが、化学的に修飾されたｓｇＲＮＡである、実施形態１２８～１４５のいずれかに記載の方法。
１４７．造血幹細胞または前駆細胞が、ＣＤ３４＋である、実施形態１２８～１４６のいずれかに記載の方法。
１４８．造血幹細胞または前駆細胞が、対象の骨髄細胞または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）由来である、実施形態１２８～１４７のいずれかに記載の方法。
１４９．対象が、造血障害を有する、実施形態１４８に記載の方法。
１５０．対象が、健康なドナーである、実施形態１４８に記載の方法。
１５１．野性型対応細胞に比べてＣＤ３３の低減した発現レベルを与える変異をもたらす、実施形態５１～５３または１２６～１５０のいずれかに記載の方法または使用。
１５２．野性型対応細胞に比べて野性型ＣＤ３３の低減した発現レベルを与える変異をもたらす、実施形態５１～５３または１２６～１５１のいずれかに記載の方法または使用。
１５３．野性型対応細胞に比べて低減した発現レベルのＣＤ３３を有する遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を製造する、実施形態５１～５３または１２６～１５２のいずれかに記載の方法または使用。
１５４．野性型対応細胞に比べて、低減した発現レベルの野性型ＣＤ３３を有する遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を製造する、実施形態５１～５３または１２６～１５３のいずれかに記載の方法または使用。
１５５．実施形態５１～５３または１２６～１５４のいずれかに記載の方法または使用により製造される、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１５６．実施形態１～３３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞、または実施形態３４～４８のいずれかに記載の細胞集団、または実施形態１１２～１２５のいずれかに記載の造血細胞の有効量を、それを必要としている対象に投与することを含む、造血障害を治療する方法。
１５７．治療が、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞または細胞集団の有効量をそれを必要としている対象に投与することを含み、およびＣＤ３３を標的にする物質の有効量を対象に投与することをさらに含み、物質が、ＣＤ３３を結合する抗原結合フラグメントを含む、造血障害の治療での使用のための、実施形態１～３３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞、実施形態３４～３８のいずれかに記載の細胞集団、または実施形態１１２～１２５のいずれかに記載の造血細胞。
１５８．物質が、ＣＤ３３に結合する抗原結合フラグメントを含み、治療が、ＣＤ３３を標的にする物質の有効量をそれを必要としている患者に投与することを含み、および実施形態１～３３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞、実施形態３４～３８のいずれかに記載の細胞集団、または実施形態１１２～１２５のいずれかに記載の造血細胞の有効量を患者に投与することをさらに含む、造血障害の治療での使用のためのＣＤ３３を標的にする物質。
１５９．物質が、ＣＤ３３に結合する抗原結合フラグメントを含み、治療が、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞または細胞集団、およびＣＤ３３を結合する物質の有効量をそれを必要としている患者に投与することを含む、造血障害の治療での使用のための、実施形態１～３３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞、実施形態３４～３８のいずれかに記載の細胞集団、または実施形態１１２～１２５のいずれかに記載の造血細胞、およびＣＤ３３を標的にする物質の組み合わせ。
１６０．癌免疫療法での使用のための、実施形態１～３３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞、または実施形態３４～３８のいずれかに記載の細胞集団、または実施形態１１２～１２５のいずれかに記載の造血細胞。
１６１．患者が造血障害を有する、癌免疫療法での使用のための、実施形態１～３３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞、または実施形態３４～３８のいずれかに記載の細胞集団、または実施形態１１２～１２５のいずれかに記載の造血細胞。
１６２．造血障害を有する患者の造血再増殖での使用のための、実施形態１～３３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞、または実施形態３４～３８のいずれかに記載の細胞集団、または実施形態１１２～１２５のいずれかに記載の造血細胞。
１６３．それにより本明細書で記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞または本明細書で記載の細胞集団が、患者を再増殖させる、造血障害を治療する方法での使用のための、実施形態１～３３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞、または実施形態３４～３８のいずれかに記載の細胞集団、または実施形態１１２～１２５のいずれかに記載の造血細胞。
１６４．免疫療法においてＣＤ３３を標的にする物質の細胞傷害性の低減での使用のための、実施形態１～３３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞、または実施形態３４～３８のいずれかに記載の細胞集団、または実施形態１１２～１２５のいずれかに記載の造血細胞。
１６５．それにより本明細書で記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞または本明細書で記載の細胞集団が、ＣＤ３３を標的にする物質の細胞傷害性効果を低減する、ＣＤ３３を標的にする物質を用いる免疫療法での使用のための、実施形態１～３３のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞、または実施形態３４～３８のいずれかに記載の細胞集団、または実施形態１１２～１２５のいずれかに記載の造血細胞。
１６６．遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団が、ＣＤ３３を標的にする物質と同時に投与される、実施形態１５６～１６５のいずれかに記載の方法、細胞、物質、または組み合わせ。
１６７．遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団が、ＣＤ３３を標的にする物質の前に投与される、実施形態１５６～１６５のいずれかに記載の方法、細胞、物質、または組み合わせ。
１６８．ＣＤ３３を標的にする物質が、遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団の前に投与される、実施形態１５６～１６５のいずれかに記載の方法、細胞、物質、または組み合わせ。
１６９．造血障害が、造血器悪性腫瘍である、実施形態１５６～１６８のいずれかに記載の方法、細胞、物質、使用、または組み合わせ。
１７０．対象にＣＤ３３を標的にする物質の有効量を投与することをさらに含み、物質が、ＣＤ３３を結合する抗原結合フラグメントを含む、実施形態１５６～１６９のいずれかに記載の方法、細胞、物質、使用、または組み合わせ。
１７１．ＣＤ３３を標的にする物質が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞であり、それが、ＣＤ３３を結合する抗原結合フラグメントを含む、実施形態１７０に記載の方法、細胞、物質、使用、または組み合わせ。
１７２．免疫細胞が、Ｔ細胞である、実施形態１７１に記載の方法、細胞、物質、使用、または組み合わせ。
１７３．免疫細胞、遺伝子操作された造血幹細胞および／または前駆細胞、または両方が、同種である、実施形態１７０～１７２のいずれかに記載の方法、細胞、物質、使用、または組み合わせ。
１７４．免疫細胞、遺伝子操作された造血幹細胞および／または前駆細胞、または両方が、自己である、実施形態１７０～１７３のいずれかに記載の方法、細胞、物質、使用、または組み合わせ。
１７５．キメラ受容体中の抗原結合フラグメントが、ヒトＣＤ３３を特異的に結合する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である、実施形態１７０～１７４のいずれかに記載の方法、細胞、物質、使用、または組み合わせ。
１７６．対象が、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、または多発性骨髄腫を有するヒト患者である、実施形態１７０～１７５のいずれかに記載の方法、細胞、物質、使用、または組み合わせ。
１７７．対象が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、または慢性リンパ性白血病である、白血病を有するヒト患者である、実施形態１７６に記載の方法、細胞、物質、使用、または組み合わせ。
本開示の１つまたは複数の本開示の実施形態の詳細が、以下の説明で示される。本開示の他の特徴または利点は、いくつかの実施形態の詳細な説明および添付の特許請求の範囲からも明らかである。
次の図は本明細書の一部を形成し、本開示の特定の態様をさらに実証するために含まれ、それは本明細書で提示される具体的な実施形態の詳細な説明とともにこれらの図の１つまたは複数を参照することによりよく理解できる。
０型、１型、２型、および３型系統特異的抗原の例示的な説明図である。 ０型系統特異的細胞表面抗原であるＣＤ３０７を標的にするキメラ受容体を発現している免疫細胞を模式的に示す。ＣＤ３０７を発現している多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞、加えて形質細胞などのＣＤ３０７を発現している他の細胞は、抗ＣＤ３０７キメラ受容体を発現している免疫細胞により標的にされる。 ２型系統特異的細胞表面抗原であるＣＤ３３を標的にするキメラ受容体を発現している免疫細胞を模式的に示す。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞は、ＣＤ３３を発現している。ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＣＤ３３を欠くように遺伝子操作され、従って抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現する免疫細胞により認識されない。ＨＳＣは、骨髄細胞を発生させることができる。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いるゲノム編集を模式的に示す。ｓｇＲＮＡは、系統特異的細胞表面抗原のエクソンの一部にハイブリダイズし、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（５’－ＮＧＧ－３’）の上流を切断する。配列は、上流から下流へ、配列番号４５および４６に相当する。 ＣＤ３３を破壊するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いるゲノム編集方法を模式的に示す。Ｃａｓ９タンパク質をコードするＰＸ４５８ベクターおよびＣＤ３３を標的にするガイドＲＮＡを、ヒト白血病細胞株であるＫ－５６２細胞中にヌクレオフェクションにより核酸導入した。フローサイトメトリーを、細胞へのＣａｓ９およびガイドＲＮＡの送達前（上段図）および送達後（下段図）に抗ＣＤ３３抗体を用いて細胞集団で実施した。ゲノム編集は、遺伝子のコード領域の欠失および細胞表面からのＣＤ３３の著しい低減をもたらした。 ＣＤ４５ＲＡを破壊するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いるゲノム編集方法を模式的に示す。Ｃａｓ９タンパク質をコードするＰＸ４５８ベクターおよびＣＤ４５ＲＡを標的にするガイドＲＮＡを、ＴＩＢ－６７細網肉腫マウスマクロファージ様細胞中にヌクレオフェクションにより核酸導入した。フローサイトメトリーを、細胞へのＣａｓ９およびガイドＲＮＡの送達前（上段図）および送達後（下段図）に抗ＣＤ４５ＲＡ抗体を用いて細胞集団で実施した。ゲノム編集は、遺伝子のコード領域の欠失および細胞表面からのＣＤ４５ＲＡの著しい低減をもたらした。 ＣＤ３３を標的とする抗原結合フラグメントを含む例示的なキメラ受容体の概略図を示す。図７Ａ：抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ、ヒンジ領域、膜貫通領域、共刺激領域、およびシグナル伝達領域を含む、ＣＤ３３を標的とする一般的なキメラ受容体。図７Ｂ：抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ、ＣＤ８由来ヒンジ領域、ＣＤ８由来膜貫通領域、ならびにＣＤ２８およびＣＤ３ζ由来細胞内領域を含む、ＣＤ３３を標的とするキメラ受容体。図７Ｃ：抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ、ＣＤ８由来ヒンジ領域、ＣＤ８由来膜貫通領域、ならびにＩＣＯＳ（またはＣＤ２７、４－１ＢＢ、またはＯＸ－４０）およびＣＤ３ζ由来細胞内領域を含む、ＣＤ３３を標的とするキメラ受容体。図７Ｄ：抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ、ＣＤ８由来ヒンジ領域、ＣＤ８由来膜貫通領域、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２８およびＣＤ３ζ由来細胞内領域を含む、ＣＤ３３を標的とするキメラ受容体。 免疫毒素の概略図である。 空ベクターまたは抗ＣＤ３３キメラ受容体をコードするベクターで形質導入されたＫ５６２細胞で発現される抗ＣＤ３３キメラ受容体の発現を示す。図９Ａ：ＣＤ３ζを認識する一次抗体を用いたウェスタンブロット。表は、試験したキメラ受容体それぞれの推定分子量を示す。図９Ｂ：抗ＣＤ３３キメラ受容体で陽性に染色される細胞集団の増加を示すフローサイトメトリー分析。 ＣＤ３３に結合する抗ＣＤ３３キメラ受容体を示す。図１０Ａ：ポンソー染色タンパク質ゲル。レーン１、３、５：ＣＤ３３分子。レーン２、４、６：ＣＤ３３分子＋ＡＰＣ複合体。図１０Ｂ：ＣＤ３ζを認識する一次抗体を用いたウェスタンブロット。レーン１、３、および５は、ＣＤ３３分子と共インキュベーションされたキメラ受容体を含み、レーン２、４、および６は、ＣＤ３３－ＡＰＣ複合体と共インキュベーションされたキメラ受容体を含む。図１０Ｃ：抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現しＣＤ３３を結合する細胞集団の増加を示すフローサイトメトリー分析。 示されたキメラ受容体を発現しているＮＫ９２細胞によるＫ５６２細胞の細胞毒性を示す。図１１Ａ：空ＨＩＶｚｓＧベクターと比較したＣＡＲＴ１およびＣＡＲＴ２。図１１Ｂ：空ＨＩＶｚｓＧベクターと比較したＣＡＲＴ３。 示されたキメラ受容体を発現しているＮＫ９２細胞によるＣＤ３３を欠くＫ５６２細胞の細胞毒性（ｙ軸で細胞毒性パーセントとして表示）を示す。図１２Ａ：ＣＤ３３標的化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ試薬で前処理されたＫ５６２細胞の無選別集団。図１２Ｂ：ＣＤ３３を欠くＫ５６２細胞の単独クローン。棒グラフは左から右に、空ＨＩＶｚｓＧベクター、ＣＡＲＴ１、ＣＡＲＴ２、およびＣＡＲＴ３に相当する。 一次Ｔ細胞集団のフローサイトメトリー分析を示す。図１３Ａ：Ｔ細胞マーカーＣ４＋、ＣＤ８＋、または両ＣＤ４＋ＣＤ８＋の発現に基づいた細胞の選別。図１３Ｂ：一次Ｔ細胞の示された集団におけるＣＤ３３の相対的発現。 示されたキメラ受容体を発現している一次Ｔ細胞によるＫ５６２細胞の細胞毒性を示す。図１４Ａ：ＣＤ４＋Ｔ細胞。図１４Ｂ：ＣＤ４＋／ＣＤ８＋（ＣＤ４／８）およびＣＤ８＋（ＣＤ８）。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムおよび２つの異なるｇＲＮＡを用いるＫ６５２細胞におけるＣＤ３３編集のフローサイトメトリー分析を示す（Ｃｒｉｓｐｒ３、右上パネル、およびＣｒｉｓｐｒ５、右下パネル）。 ＣＤ３３を欠くＫ５６２細胞が、正常な細胞増殖および赤血球生成分化を示すことを示す。図１６Ａ：示された細胞集団の１日目の＋５０μＭヘミンのフローサイトメトリー分析。図１６Ｂ：示された細胞集団の９日目のフローサイトメトリー分析。図１６Ｃ：ＭＴＴ細胞増殖アッセイ。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムおよび２種の異なるｇＲＮＡを用いるヒトＣＤ３４＋細胞におけるＣＤ３３編集のフローサイトメトリー分析を示す（ｃｒｉｓｐｒ３、左下パネル、およびｃｒｉｓｐｒ５、右下パネル）。図１７Ａ：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いるヒトＣＤ３４＋細胞におけるＣＤ３３編集のフローサイトメトリー分析。図１７Ｂ：ｃｒｉｓｐｒ３。図１７Ｃ：ｃｒｉｓｐｒ５。 ヒトＣＤ３４＋／ＣＤ３３－細胞のコロニー形成を、ヒトＣＤ３４＋／ＣＤ３３＋細胞と比較して示す。棒グラフは左から右に、レンチウィルス未感染、空ベクターコントロール、ｃｒｉｓｐｒ１、ｃｒｉｓｐｒ３、およびｃｒｉｓｐｒ５に相当する。 ＣＤ３３抗原のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子除去を示す。図１９Ａは手法を示す：幹細胞、ドナーから得た動員血液または臍帯血は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などの遺伝子編集技術を用いてＣＤ３３発現を除去するように遺伝子操作され、ＨＳＣＴ適格な再発性患者に移植される。移植の後に、同種ドナー由来のＴ細胞が、ＣＤ３３を標的とするキメラ抗原受容体を発現するように、ウィルス送達システムを用いて遺伝子操作され、レシピエントに注入される。あるいは、患者は、ＡＤＣ（ＧＯ）を単独で、またはＣＡＲ－Ｔと組み合わせて受けてよい。図１９Ｂ～１９Ｆは、ヒト細胞におけるＣＤ３３発現およびその除去を示す。図１９Ｂ：ヒトＡＭＬ細胞株ＨＬ－６０中、骨髄（ＢＭ）および臍帯血（ＣＢ）由来ヒト一次ＣＤ３４＋ＣＤ３３ＷＴ細胞中、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介除去後のヒト一次ＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞中のＣＤ３３の発現。図１９Ｃ：エクソン２～４を示すＣＤ３３ゲノムおよび座位ならびにＣＤ３３を標的にするｓｇＲＮＡの位置および配列（太字）の模式表現。配列は、上流から下流へ、配列番号５２～５３に相当する。図１９Ｄ：ＣＤ３４＋ＣＤ３３ＷＴ細胞およびＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ中での電気穿孔後のフローサイトメトリーによるＣＤ３３の表面発現。全ての細胞は、ＣＤ９０発現により評価される、それらの幹細胞表現型を維持する。図１９Ｅ：ＤＮＡ二本鎖切断部位周辺の領域を示すサンガー塩基配列決定法のクロマトグラム、上段図：ＣＤ３４＋ＣＤ３３ＷＴ細胞および下段図：ＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ。配列は、上流から下流へ、配列番号５４～５５に相当する。図１９Ｆ：電気穿孔後の５～７日に、ＣＤ３４＋培養細胞は、対照と比較して、一貫したＣＤ３３の欠失を示す。 ＣＤ３３の欠失は、ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスにおける生着および造血再増殖を損なわないことを示す。図２０Ａ：実験計画の概略図。図２０Ｂ～２０Ｃは、骨髄由来ＣＤ３４＋細胞生着および再増殖を示す：移植後末梢血（７週；図２０Ｂ）および全骨髄（２１週；図２０Ｃ）を、示されるように、種々の系統の細胞について分析した。ＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞は、対照細胞と同じ生着（ＣＤ４５＋）ならびに成熟骨髄およびリンパ系細胞と同等パーセンテージの生着を示す。骨髄ＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞は、骨髄（前駆細胞ＣＤ１２３＋、成熟ＣＤ１４＋）およびリンパ性（前駆細胞ＣＤ１０＋、成熟ＣＤ１９＋）、Ｔ細胞（ＣＤ３＋）および幹細胞ＣＤ３４＋３８－と同等のパーセンテージを示す。図２０Ｄ～２０Ｅは、骨髄由来ＣＤ３４＋細胞生着および再増殖を示す：移植後末梢血（９週；図２０Ｄ）および全骨髄（２１週；図２０Ｅ）を、示されるように、種々の系統の細胞について分析した。ＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞は、対照細胞と同じ生着（ＣＤ４５＋）ならびに成熟骨髄およびリンパ系細胞と同等パーセンテージの生着を示す。骨髄ＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞は、骨髄（前駆細胞ＣＤ１２３＋、成熟ＣＤ１４＋）およびリンパ性（前駆細胞ＣＤ１０＋、成熟ＣＤ１９＋）、Ｔ細胞（ＣＤ３＋）および幹細胞ＣＤ３４＋３８－と同等のパーセンテージを示す。データを、対応のないｔ検定を用いて解析し、検査した全群中で有意差は認められなかった（ｐ＞０．０５）。全データを、平均値±ＳＥＭとして表す。 左側に示されるように、Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡ（上段の図）およびＣａｓ９のみ（下段の図）の細胞中のガイドの周囲のＣＤ３３（図２１Ａ）およびシグレック９（図２１Ｂ）遺伝子のゲノム領域の統合ゲノムビューアー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｖｉｅｗｅｒ；ＩＧＶ）スクリーンショットを示す。カバレッジトラック（右側に示す）中の灰色バーは、各座位で示されたリードの深さを示す。一般に、カバレッジは均一である必要があり、従ってバーの高さは、同じであるべきであるが、欠失は高さの低下を生ずる。リードトラックは、この領域でマップされた全てのリード（灰色ボックス）を示す。欠失は、黒色実線により表され、挿入は、対角線ハッチボックスで表される。濃い境界線のリードは、マッピングする相手がないものである。各群中の１つのリードは、マッピングする相手がなかった。ミスマッチ塩基は、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴに対し、それぞれ、菱形、中空丸、中実丸、および白色で塗りつぶした。シグレック９ゲノム領域を、オフターゲット部位のインデルの非存在を示す例示的領域として選択した。理由は、１）それは、ＣＤ３３に対する相同性を有するシグレックファミリーに属する、および２）それは、任意の他のガイドに比べて、予測切断部位の１０ｂｐ内で最高の相同性を有する、ためである。下部の染色体座標は、ｈｇ３８に基づく。図２１Ｃ：ＣＤ３３と対照細胞間で、ＤＥＳｅｑ２法を用いて正規化された、ｌｏｇ１０平均正規化カウント間の相関を示す散布図。図２１Ｄ：ｅｄｇｅＲ法を用いて解析した遺伝子のｌｏｇ２（倍率変化）および－ｌｏｇ１０（ｐ値）を示すボルケーノプロットであり、有意に差次的発現した（ｐ＜０．０５）遺伝子は、赤色の中空丸として示され、ＣＤ３３遺伝子は、左矢印で示される。 ＣＤ３３欠失が、インビトロでＣＤ３４＋細胞をＣＡＲＴ３３細胞傷害性から保護することを示す。図２２Ａ：ＣＡＲＴ３３構築物の概略図。図２２Ｂ：対照（黒）またはＣＡＲＴ３３（緑または青）ウィルスでレンチウィルス形質導入後のヒト一次Ｔ細胞中のＣＡＲ発現を示す等高線図。各群のパーセンテージ形質導入は、等高線図の隣に示される。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞は、独立に形質導入され、実験の前に１：１に混合された。図２２Ｃ～２２Ｆ：細胞傷害性アッセイ。図２２Ｃ：ＣＡＲＴ３３細胞または対照Ｔを、ＨＬ－６０またはＣＤ３４＋ＣＤ３３ＷＴまたはＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌとインキュベートし、フローサイトメトリーにより評価した。図２２Ｄ～２２Ｆ：三重培養細胞傷害性アッセイ。ＣＡＲＴ３３細胞または対照Ｔ細胞をＨＬ－６０およびＣＤ３４＋ＣＤ３３ＷＴ（図２２Ｄ）細胞と、またはＨＬ－６０およびＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ（図２２Ｅ）細胞と、またはＣＤ３４＋ＣＤ３３ＷＴおよびＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ（図２２Ｆ）細胞と、共インキュベートした。 治療モデルを示す：ＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞は、ＣＤ３３標的化免疫療法に耐える。図２３Ａ：実験計画の概略図：５＊１０５個のＨＬ－６０および５＊１０５個のＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌを、０日目にＮＳＧＭ３マウスに注入した。１週後に、マウスを、ＰＢＳまたは同種ＣＡＲＴ３３または対照Ｔ細胞で治療した。３日後に、新しい群は、ＧＯのみを受け、一方、同種ＣＡＲＴ３３および対照Ｔ細胞注入マウスは、ＧＯまたはＰＢＳを受けた。治療を、３週目に繰り返した。白血病進行およびＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ生着をその後、連続的骨髄吸引により監視した。図２３Ｂ：骨髄吸引物中の白血病負荷量の監視。白血病細胞を、Ｔｅｒ１１９－ｄｔｏｍａｔｏ＋でゲーティングした。図２３Ｃ：３．５週（図２３Ｄ）および８週（図２３Ｅ）で示された画像の落射蛍光定量化による白血病負荷量測定。バックグラウンドを、未治療マウス（＊イメージング対照）を用いて除去した。図２３Ｆ：ＣＡＲＴ３３またはＧＯ白血病除去は、骨髄吸引物のフローサイトメトリーにより示されるように、ＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞の生着を損なわない（％ｈＣＤ４５＋細胞）。ＣＤ３４＋注入由来ヒト細胞を、Ｔｅｒ１１９－ｄｔｏｍａｔｏ－、Ｌｙ５－／Ｈ２ｋｄ－ヒトＣＤ４５＋ＣＡＲＴ－でゲーティングした。 ＣＤ３４＋ＣＤ３３ＤｅｌＨＳＰＣが、治療モデルで多系列生着および分化を示すことを示す。図２４Ａ：ＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞は、ＣＤ３３標的化免疫療法に耐え、骨髄造血およびリンパ球新生に寄与する。各条件の左の２つのパネルは、骨髄前駆細胞の再増殖の経時的監視であり、右の２つのパネルは、ＢＭ吸引物中のリンパ性前駆細胞および成熟細胞である。有意差は、全ての分析時点において、異なる治療群間で観察されなかった。図２４Ｂ～２４Ｄは、ＣＤ３４＋ＣＤ３３ＷＴ細胞が、ＣＤ３３標的化免疫療法に感受性であることを示す。図２４Ｂ：実験計画の概略図：５＊１０５個のＣＤ３４＋ＣＤ３３ＷＴを単独で、または５＊１０５個のＨＬ－６０と組み合わせて、０日目にＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスに注入した。１週後に、マウスを、ＰＢＳまたは同種ＣＡＲＴ３３細胞で治療した。白血病進行およびＣＤ３４＋ＣＤ３３ＷＴ生着をその後、ＣＡＲＴ３３について３週目に骨髄吸引により監視した。同じ日に、マウスの一群にＧＯを注入し、４日後に分析した。図２４Ｃ～２４Ｄ：ＢＭ吸引物は、ＰＢＳ単独に比べて、ＣＡＲＴ３３またはＧＯで治療したマウスで、ＣＤ３３ＷＴ白血病細胞（図２４Ｃ）およびＣＤ３３ＷＴ一次細胞（図２４Ｄ）の完全除去を示す。有意差が、ＰＢＳに比べて、ＣＡＲＴ３３とＧＯの間で観察された。ＣＤ３４＋注入由来ヒト細胞を、Ｔｅｒ１１９－ｄｔｏｍａｔｏ－、Ｌｙ５－／Ｈ２ｋｄ－ヒトＣＤ４５＋ＣＡＲＴ－でゲーティングした。全データを、平均値±ＳＥＭとして表す。 ＣＤ３３発現を除去するために試験した追加のｓｇＲＮＡが、高いレベルのインデルを示すことを示す。図２５Ａ～２５Ｂ：エクソン２～４を示すＣＤ３３ゲノムおよび座位ならびに２つの追加のＣＤ３３座位を標的にするｓｇＲＮＡの位置および配列の模式表現。下段のクロマトグラムは、ＤＮＡ二本鎖切断部位周辺の領域を示すサンガー塩基配列決定法のスクリーンショットである；左の図：ＣＤ３４＋ＣＤ３３ＷＴ細胞および右の図：ＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ。ガイド配列は、クロマトグラム上で青で強調され、インデルの出現は、赤色下矢印で示される。配列は、出現順に、配列番号５６～５７、７５～７６、１１３、５９および７７～７８にそれぞれ相当する。 ＣＤ３３の欠失は、ＮＳＧＭ３マウスにおける生着および造血再増殖を損なわないことを示す。図２６Ａ～２６Ｂは、骨髄由来ＣＤ３４＋細胞の生着および再増殖を示す。図２６Ａ：移植後の骨髄吸引物（１５週）を、示されるように、種々の系統の細胞について分析した。ＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞は、対照細胞と同じ生着（ＣＤ４５＋）ならびに成熟骨髄およびリンパ系細胞と同等パーセンテージの生着を示す。バーグラフは、個別のパネルの要約を表す。図２６Ｂ：図２０Ｃの主要部からのデータの要約。図２６Ｃ～２６Ｄは、臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞の生着および再増殖を示す。図２６Ｃ：移植後の骨髄吸引物（１６週）を、示されるように、種々の系統の細胞について分析した。ＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞は、対照細胞と同じ生着（ＣＤ４５＋）ならびに成熟骨髄およびリンパ系細胞と同等パーセンテージの生着を示す。バーグラフは、個別のパネルの要約を表す。図２６Ｄ：図２０Ｅからのデータの要約。有意差は、分析した全細胞型中の両群間で観察されなかった（ｐ＞０．０５）、対応のないｔ検定。全データを、平均値±ＳＥＭとして表す。 ＲＮＡシーケンシングデータのリードのカバレッジを示す。左側に示されるように、Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡ（ｎ＝５；下段の図）およびＣａｓ９のみ（ｎ＝５；上段の図）の細胞中のガイドの周囲のＣＤ３３ゲノム領域を示すカバレッジトラックの統合ゲノムビューアー（ＩＧＶ）スクリーンショット。カバレッジトラック（右側に示される）中の灰色バーは、各座位で示されたリードの深さを示す。一般に、カバレッジは均一である必要があり、従って、バーの高さは、同じであるべきであるが、下段のパネルの点線矩形によりマークされる欠失は、高さの低下を生ずる。図２７は、それぞれ、出現順に、配列番号１１４および１１４を開示する。 全ゲノム塩基配列決定で見つかったリードおよびバリアントの要約を示す。 ｓｇＲＮＡ８４６についてのオフターゲット部位を示す（ｓｇＲＮＡ：ＡＵＣＣＣＵＧＧＣＡＣＵＣＵＡＧＡＡＣＣ（配列番号６７）；ＰＡＭ：ＣＧＧ）。インデルは、全ゲノム配列解析における予測オフターゲット切断部位の１００ｂｐ以内に認められなかった。ガイド配列とのミスマッチは、太字で表される。図２９は、それぞれ、出現順に、配列番号７９～９８を開示する。 ｓｇＲＮＡ８１１についてのオフターゲット部位を示す（ｓｇＲＮＡ：ＣＣＵＣＡＣＵＡＧＡＣＵＵＧＡＣＣＣＡＣ（配列番号７０）；ＰＡＭ：ＡＧＧ）。インデルは、全ゲノム配列解析における予測オフターゲット切断部位の１００ｂｐ以内に認められなかった。ガイド配列とのミスマッチは、太字で表される。図３０は、それぞれ、出現順に、配列番号９９～１０７、１０６、１０７、１０７、１０７、１０７、１０７～１１２を開示する。 ＣＤ３３を欠失した細胞中で差次的に発現された遺伝子のリストを示す。その発現がＣＤ３３野生型細胞に比べてＣＤ３３欠失細胞中で小さい遺伝子は、マイナス符号により示される。 ＧＯ標的化免疫療法が、原発性ＡＭＬを除去し、ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞をレスキューすることを示す。図３２Ａ：実験計画の概略図：５０万個の原発性ＡＭＬ細胞を、１日目にＮＳＧＳマウスに注入した。微小残存病変が推定されると、治療マウス群は、ＧＯの長期投与（１０日毎に１μｇ）を受けた。治療群の１回目のＧＯの注入の１０日後に、マウスに５０万個のＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞を移植した。図３２Ｂ、左のパネル：治療前に骨髄吸引物のフローサイトメトリーにより評価されたＡＭＬ（微小残存病変）負荷量。白血病細胞を、Ｔｅｒ１１９－ｈＣＤ４５＋ｈＣＤ３３＋でゲーティングした。右のパネル：ＧＯ長期治療後のＢＭ吸引物中のＡＭＬ負荷量およびｈＣＤ４５＋ｈＣＤ３３Ｄｅｌの生着。図３２Ｂ（続き）：Ｔｅｒ１１９－、Ｌｙ５－／Ｈ２ｋｄ－、ｈＣＤ４５＋、ｈＣＤ３３－でゲートをかけたＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞の造血再増殖（骨髄／リンパ性前駆細胞および成熟細胞）。図３２Ｃ：死亡時の対照群の全骨髄（ＢＭ）、脾臓、および末梢血（ＰＢ）の生存曲線および分析（実線、未治療；点線、治療）。 ＣＤ３３およびＣＬＬ－１を欠乏させた細胞は、うまく移植できることを示す。図３３Ａは、ＣＤ３３およびＣＬＬ－１レベルを、個別にまたは組み合わせて低減できることを示す、一連のフローサイトメトリー図である。図３３Ｂは、細胞中のＣＤ３３およびＣＬＬ－１レベルが、マウスでの移植を可能にすることを示す、一連のフローサイトメトリー図である。図３３Ｃおよび３３Ｄは：全骨髄試料（図３３Ｃ）または脾臓試料（図３４Ｄ）中の示された細胞型のｈＣＤ４５＋細胞集団内での頻度。左から右へ、各セットの４つのバーは、次の細胞型を表す：ＣＤ３４＋ＷＴ（丸）；ＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ（四角）、ＣＤ３４＋ＣＬＬ１Ｄｅｌ（三角）およびＣＤ３４＋ＣＤ３３ＤｅｌＣＬＬ１Ｄｅｌ（逆三角）。
癌細胞の細胞表面に存在する抗原を標的にする癌免疫療法は、対象の発達および／または生存に必要とされるか大いに関与する正常な非癌細胞の表面にも標的抗原が存在するとき、特に困難である。これらの抗原を標的化することは、癌細胞に加えてこのような細胞に対する免疫療法の細胞毒性効果のため、対象において有害な効果をもたらす場合がある。
本明細書で記載される方法、核酸、および細胞は、癌細胞だけでなく対象の発達および／または生存に不可欠な細胞にも存在する抗原（例えば、１型または２型抗原）を標的することを可能にする。本方法は、（１）標的系統特異的細胞表面抗原を有する細胞の数を、当該抗原を標的とする物質を用いて低減させること、および（２）抗原を提示し、その結果、物質の投与により死滅させられ得る正常細胞（例えば、非癌細胞）の、系統特異的細胞表面抗原を欠く造血細胞との置換、を含む。本明細書で記載される方法は、目的の系統特異的細胞表面抗原を発現する癌細胞を含む、標的細胞の監視を維持でき、また、対象の発達および／または生存に重要であり得る系統特異的抗原を発現する非癌細胞集団を維持できる。
従って、造血器悪性腫瘍を治療するために、系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）を標的にする抗原結合フラグメントを含むキメラ受容体を発現する免疫細胞 、および系統特異的細胞表面抗原を欠く造血幹細胞（ＨＳＣ）または造血前駆細胞（ＨＰＣ）などの造血細胞の共使用が、本明細書で記載される。また、キメラ受容体、これをコードする核酸、これを含むベクター、およびそのようなキメラ受容体を発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）も、本明細書で提供される。本開示はまた、本明細書で記載されるような系統特異的抗原を欠く遺伝子操作された造血細胞、ならびにその作製方法（例えば、ゲノム編集方法）も提供する。
定義
用語「対象」、「個体」、および「患者」は、同じ意味で用いられ、脊椎動物、好ましくはヒトなどの哺乳動物を指す。哺乳動物は、限定されないが、ヒト霊長類、非ヒト霊長類、あるいはネズミ、ウシ、ウマ、イヌまたはネコ種を含む。本開示の場合、用語「対象」はまた、インビトロまたはエクスビボで培養できる、あるいはインビボで操作できる組織または細胞を包含する。用語「対象」は、用語「生物」と同じ意味で用いてよい。
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」は、同じ意味で用いられる。これらは、任意の長さのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、あるいはこれらの類似体であるヌクレオチドの重合型を指す。ポリヌクレオチドの例は、限定されないが、遺伝子または遺伝子フラグメントのコードまたは非コード領域、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の分離されたＤＮＡ、任意の配列の分離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーを含む。ポリヌクレオチド内の１つまたは複数のヌクレオチドは、さらに修飾されてよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断され得る。ポリヌクレオチドはまた、標識物質との複合化によるなど、重合化後に修飾され得る。
用語「ハイブリダイゼーション」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソンクリック塩基対形成、フーグステイン結合、またはいずれかの他の配列特異的様式により生じ得る。複合体は、二本鎖構造を形成する２本のストランド、多重鎖複合体を形成する３本以上のストランド、単一自己ハイブリダイゼーションストランド、またはこれらのいずれかの組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始、または酵素によるポリヌクレオチドの切断などの、さらに広範な工程におけるステップを構成し得る。所定の配列とハイブリダイズできる配列は、所定配列の「相補体」と呼ばれる。
用語「組換え発現ベクター」は、構築物が、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、かつベクターが、細胞内で発現されるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを有するのに十分な条件下で細胞と接触される場合に、ホスト細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの発現を可能にする遺伝子改変されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド構築物を意味する。本開示のベクターは、総じて天然起源ではない。ベクターの一部は天然起源であってよい。本開示の非天然起源組換え発現ベクターは、ヌクレオチドのいずれかのタイプを含んでよく、限定されないが、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、それは一本鎖または二本鎖であってよく、合成されるか一部には天然源から得られ、かつそれは、天然の、非天然の、または改変されたヌクレオチドを含んでよい。
本明細書で使用される「トランスフェクション」、「形質転換」、または「形質導入」は、物理的または化学的方法によるホスト細胞中への１個または複数の外因性ポリヌクレオチドの導入を指す。
「抗体」、「抗体のフラグメント」、「抗体フラグメント」、「抗体の機能的フラグメント」、または「抗原結合部分」は、同じ意味で用いられ、特定抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数のフラグメントまたは部分を意味する（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００５）２３（９）：１１２６）。本発明の抗体は、抗体および／またはそのフラグメントであり得る。抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、Ｆｃ、または変異体、および／または混合物を含む。抗体は、キメラ、ヒト化、単鎖、または二重特異的であり得る。すべての抗体アイソタイプは、本開示によって包含され、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭを含む。適切なＩｇＧサブタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む。抗体軽鎖または重鎖可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの超可変領域により中断されるフレームワークからなる。本抗体または抗原結合部分のＣＤＲは、非ヒトまたはヒト起源由来であり得る。本発明の抗体または抗原結合部分のフレームワークは、ヒト、ヒト化、非ヒト（例えば、ヒトにおける抗原性を低下するように改変されたマウスフレームワーク）、または合成フレームワーク（例えば、コンセンサス配列）であってよい。
本発明の抗体または抗原結合部分は、約１０－７Ｍ未満、約１０－８Ｍ未満、約１０－９Ｍ未満、約１０－１０Ｍ未満、約１０－１１Ｍ未満、または約１０－１２Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で特異的に結合できる。本開示による抗体の親和性は、従来技術を用いて容易に測定できる（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９４９）５１：６６０、および米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号、または同等文献）。
用語「キメラ受容体」、「キメラ抗原受容体」、あるいは「ＣＡＲ」は、全体を通して同じ意味で用いられ、少なくとも細胞外抗原結合領域、膜貫通領域、および下記で定められる刺激分子由来の機能的シグナル伝達領域を含む細胞質シグナル伝達領域（本明細書では「細胞内シグナル伝達領域」ともいう）を含む組換えポリペプチド構築物を指す。Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１２）１８（１０）：２７８０、Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（２０１４）２５７（１）：１２７、ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ａｂｏｕｔ－ｃａｎｃｅｒ／ｔｒｅａｔｍｅｎｔ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｃａｒ－ｔ－ｃｅｌｌｓ。一実施形態では、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体に関連するゼータ鎖である。一態様では、細胞質シグナル伝達領域は、下記で定められる少なくとも１つの共刺激分子由来の１つまたは複数の機能的シグナル伝達領域をさらに含む。共刺激分子はまた、４－１ＢＢ（例えば、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、および／またはＣＤ２８、またはこれら分子のフラグメントであり得る。別の態様では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識領域、膜貫通領域、および刺激分子由来の機能的シグナル伝達領域を含む細胞内シグナル伝達領域を含む、キメラ融合タンパク質を含む。ＣＡＲは、細胞外抗原認識領域、膜貫通領域、ならびに共刺激分子由来の機能的シグナル伝達領域および刺激分子由来の機能的シグナル伝達領域を含む細胞内シグナル伝達領域を含む、キメラ融合タンパク質を含む。あるいは、ＣＡＲは、細胞外抗原認識領域、膜貫通領域、ならびに１個または複数の共刺激分子由来の２つの機能的シグナル伝達領域および刺激分子由来の機能的シグナル領域を含む細胞内シグナル伝達領域を含む、キメラ融合タンパク質を含む。ＣＡＲはまた、細胞外抗原認識領域、膜貫通領域、ならびに１つまたは複数の共刺激分子由来の少なくとも２つの機能的シグナル領域および刺激分子由来の機能的シグナル伝達領域を含む、キメラ融合タンパク質を含む。核酸配列によりコードされるＣＡＲの抗原認識部分は、いずれかの系統特異的抗原結合抗体フラグメントを含み得る。抗体フラグメントは、１つまたは複数のＣＤＲ、可変領域（またはこの一部）、定常領域（またはこの一部）、または上記のいずれかの組み合わせを含み得る。
用語「シグナル伝達領域」は、定められたシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するために細胞内で情報を伝達することにより、第２メッセンジャーを生じることにより、またはこのようなメッセンジャーに応答することによりエフェクターとして機能することにより、作用するタンパク質の機能的部分を指す。
用語「ゼータ」あるいは「ゼータ鎖」、「ＣＤ３－ゼータ」、または「ＴＣＲ－ゼータ」は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿９３２１７０、ＮＰ＿０００７２５、またはＸＰ＿０１１５０８４４７で示されるタンパク質、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、モンキー、類人猿などに由来する同等の残基として定められ、「ゼータ刺激領域」、あるいは「ＣＤ３－ゼータ刺激領域」、または「ＴＣＲ－ゼータ刺激領域」は、Ｔ細胞活性化のために必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに適しているゼータ鎖の細胞質領域由来のアミノ酸残基として定められる。
用語「遺伝子操作された」または「遺伝子改変された」は、遺伝子工学技術により、例えば、ゲノム編集により操作されている細胞を指す。すなわち、細胞は、この細胞に本来発生しない異種配列を含む。一般的に、異種配列は、ベクター系、またはリボソームを含む細胞に核酸分子を導入するための他の手段を介して導入される。異種核酸分子は、細胞のゲノムに統合され得、またはプラスミドの形態などで染色体外に存在し得る。この用語はまた、遺伝子操作され分離されたＣＡＲポリペプチドを細胞中に導入する実施形態も含む。
用語「自己」は、同じ個体中に後に再導入される、同じ個体由来の任意の物質を指す。
用語「同種異系」は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物由来の任意の物質を指す。２つ以上の個体は、１つまたは複数の遺伝子座の遺伝子が同一でないとき、互いに同種異系であると言われる。
用語「細胞系統」は、共通祖先を有し、同じタイプの識別可能な細胞から特定の識別可能な／機能性の細胞へと発達する細胞を指す。本明細書で使用される細胞系統は、限定されないが、呼吸器、前立腺、乳房、腎臓、腸、神経、骨格、血管、肝臓、造血、筋肉または心臓の細胞系統を含む。
用語「阻害」は、系統特異的抗原の遺伝子発現または機能に関連して使用される場合、系統特異的抗原の遺伝子発現の量または機能における低減を指し、ここで阻害は、遺伝子発現または機能に対する干渉の結果である。阻害は、完全であり得、その場合は検出可能な発現または機能がなく、または阻害は、部分的であり得る。部分的阻害は、ほとんど完全な阻害～ほとんど阻害がない範囲であり得る。特定の標的細胞を排除することにより、ＣＡＲ Ｔ細胞は、特定の細胞系統の全発現を効果的に阻害し得る。
「系統特異的抗原を欠く」造血細胞などの細胞は、それらの天然起源の対応物、例えば、同じタイプの内因性造血細胞と比べて系統特異的抗原の著しく低減した発現レベルを有する細胞、または系統特異的抗原を発現しない、すなわち、ＦＡＣＳなどの定型的測定によって検出できない細胞を指す。いくつかの例では、「抗原を欠く」細胞の系統特異的抗原の発現レベルは、天然起源対応物の同一系統特異的抗原の発現レベルの約４０％未満（例えば、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、またはそれより低い）であり得る。本明細書で使用される場合、用語「約」は、特定の値±５％を指す。例えば、約４０％の発現レベルは、３５～４５％の間のいずれかの任意量を含み得る。
系統特異的細胞表面抗原を標的にする物質
本開示の態様は、例えば標的癌細胞上の、系統特異的細胞表面抗原を標的とする物質（例えば、ＣＤ３３を標的にする物質、例えば、物質が、ＣＤ３３を結合する抗原結合フラグメントを含む）を提供する。このような物質は、系統特異的細胞表面抗原を結合し標的にする抗原結合フラグメントを含み得る。いくつかの事例では、抗原結合フラグメントは、系統特異的抗原に特異的に結合する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり得る。
Ａ．系統特異的細胞表面抗原
本明細書で使用される場合、用語「系統特異的細胞表面抗原」および「細胞表面系統特異的抗原」は、同じ意味で用いられ、細胞の表面に十分存在し、かつ細胞系統の１種または複数の集団と結合している任意の抗原を指す。例えば、抗原は、細胞系統の１種または複数の集団に存在し得、他の細胞集団の細胞表面では非存在であり得る（または低減した量で存在し得る）。
一般的に、系統特異的細胞表面抗原は、抗原および／または抗原を提示する細胞集団がホスト生物の生存および／または発達に必要とされるかどうかなどの多くの要因に基づいて分類できる。系統特異的抗原の例示的なタイプのまとめを、下表１に示す。図１も参照されたい。
Figure 2022517618000001
表１および図１に示すように、０型系統特異的細胞表面抗原は、組織恒常性および生存のために必要であり、０型系統特異的細胞表面抗原を有する細胞型も、対象の生存のために必要であり得る。このため、恒常性および生存における０型系統特異的細胞表面抗原、または０型系統特異的細胞表面抗原を有する細胞の重要性を考えると、このような抗原またはこのような抗原を有する細胞の阻害または除去は対象の生存に有害であり得るため、従来のＣＡＲ Ｔ細胞免疫療法を用いて、この範疇の抗原を標的にすることは困難であり得る。結果として、系統特異的細胞表面抗原（０型系統特異的抗原など）および／またはこのような抗原を有する細胞は、例えば、それが対象における生命の非冗長的機能を実施するため、生存のために必要とされ得、そのためこの型の系統特異的抗原は、ＣＡＲ Ｔ細胞をベースとした免疫療法には不十分な標的であり得る。
０型抗原と対照的に、１型細胞表面系統特異的抗原および１型細胞表面系統特異的抗原を有する細胞は、対象の組織恒常性または生存のために必要とされない。１型細胞表面系統特異的抗原を標的にすることは、対象に有害な結果をもたらさないであろう。例えば、正常形質細胞および多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞の両方で特異的に発現される１型抗原であるＣＤ３０７を標的にするように遺伝子操作されたＣＡＲ Ｔ細胞は、両細胞型の除去をもたらす（図２）（Ｅｌｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１０：２２２２（２０１２））。しかし、形質細胞系統は生物の生存のために犠牲にしてもよいため、ＣＤ３０７および他の１型系統特異的抗原は、ＣＡＲ Ｔ細胞をベースとした免疫療法に適する抗原である。１型クラスの系統特異的抗原は、卵巣、精巣、前立腺、乳房、子宮内膜、および膵臓を含む、幅広い様々な異なる組織で発現され得る。いくつかの実施形態では、物質は、１型抗原である細胞表面系統特異的抗原を標的にする。
２型抗原を標的にすることは、１型抗原と比べて著しい困難さを示す。２型抗原は、（１）この抗原は生物の生存のために重要でない（すなわち、生存のために必要とされない）、および（２）この抗原を有する細胞系統は生物の生存のために欠くことができない（すなわち、特定の細胞系統が生存のために必要とされる）ことにより特徴付けられる。例えば、ＣＤ３３は、正常骨髄細胞ならびに急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞の両方で発現される２型抗原である（Ｄｏｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ３７３：１１３６（２０１５））。結果として、ＣＤ３３抗原を標的にするように遺伝子操作されたＣＡＲ Ｔ細胞は、正常細胞ならびにＡＭＬ細胞の両方の死滅をもたらし得、これは対象の生存と両立し得ない（図３）。いくつかの実施形態では、物質は、２型抗原である細胞表面系統特異的抗原を標的にする。
多種多様な抗原が、本開示の方法および組成物により標的にされ得る。これらの抗原に対するモノクローナル抗体は、市販品を購入でき、または前述のように、目的の抗原による動物の免疫に続く標準的なモノクローナル抗体方法論、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、標準的な方法を用いて作製され得る。抗体または抗体をコードする核酸は、いずれかの標準的なＤＮＡまたはタンパク質塩基配列決定技術を用いて配列決定され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で記載される方法および細胞を用いて標的にされる細胞表面系統特異的抗原は、白血球または白血球の亜集団の細胞表面系統特異的抗原である。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原は、骨髄細胞に関連する抗原である。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原は、表面抗原分類抗原（ＣＤ）である。ＣＤ抗原の例としては、限定されないが、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、 ＣＤ１１ｄ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６０ａ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４ａ、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６Ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７５Ｓ、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｃ、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ８５Ｅ、ＣＤ８５Ｆ、ＣＤ８５Ｇ、ＣＤ８５Ｈ、ＣＤ８５Ｉ、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ９９Ｒ、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ１５２、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ｂ１、ＣＤ１５８ｂ２、ＣＤ１５８ｄ、ＣＤ１５８ｅ１／ｅ２、ＣＤ１５８ｆ、ＣＤ１５８ｇ、ＣＤ１５８ｈ、ＣＤ１５８ｉ、ＣＤ１５８ｊ、ＣＤ１５８ｋ、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１８６、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤｗ１９８、ＣＤｗ１９９、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０４、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤ２１０ａ、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２１５、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ２１８ｂ、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３６Ｒ、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５、ＣＤ２４６、ＣＤ２４７、ＣＤ２４８、ＣＤ２４９、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、ＣＤ２６４、ＣＤ２６５、ＣＤ２６６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７１、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８６、ＣＤ２８８、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｃ、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、３０６、ＣＤ３０７ａ、ＣＤ３０７ｂ、ＣＤ３０７ｃ、Ｄ３０７ｄ、ＣＤ３０７ｅ、ＣＤ３０９、ＣＤ３１２、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、ＣＤ３２０、ＣＤ３２１、ＣＤ３２２、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３２６、ＣＤ３２７、ＣＤ３２８、ＣＤ３２９、ＣＤ３３１、ＣＤ３３２、ＣＤ３３３、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤ３３８、ＣＤ３３９、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３４９、ＣＤ３５０、ＣＤ３５１、ＣＤ３５２、ＣＤ３５３、ＣＤ３５４、ＣＤ３５５、ＣＤ３５７、ＣＤ３５８、ＣＤ３５９、ＣＤ３６０、ＣＤ３６１、ＣＤ３６２、およびＣＤ３６３が挙げられる。ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ＢＤ＿Ｒｅａｇｅｎｔｓ＿ＣＤＭａｒｋｅｒＨｕｍａｎ＿Ｐｏｓｔｅｒ．ｐｄｆを参照されたい。
いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１１、ＣＤ１２３、ＣＤ５６、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ４１、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ３２６、ＬＭＰ２、ＣＤ２２、ＣＤ５２、ＣＤ１０、ＣＤ３／ＴＣＲ、ＣＤ７９／ＢＣＲ、およびＣＤ２６である。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原は、ＣＤ３３である。
代わりに、または追加して、細胞表面系統特異的抗原は、癌抗原、例えば、癌細胞に差次的に存在する細胞表面系統特異的抗原であり得る。いくつかの実施形態では、癌抗原は、組織または細胞系統に特異的な抗原である。癌の特定タイプと関連する細胞表面系統特異的抗原の例としては、限定されないが、ＣＤ２０、ＣＤ２２（非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ））、ＣＤ５２（Ｂ細胞ＣＬＬ）、ＣＤ３３（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））、ＣＤ１０（ｇｐ１００）（共通（前駆Ｂ細胞）急性リンパ性白血病および悪性骨髄腫）、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（Ｔ細胞リンパ腫および白血病）、ＣＤ７９／Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）（Ｂ細胞リンパ腫および白血病）、ＣＤ２６（上皮性およびリンパ性悪性腫瘍）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、およびＨＬＡ－ＤＱ（リンパ性悪性腫瘍）、ＲＣＡＳ１（婦人科癌、胆管腺癌、および膵臓の導管腺癌）、ならびに前立腺特異的膜抗原が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原ＣＤ３３は、ＡＭＬ細胞と関連する。
Ｂ．抗原結合フラグメント
任意の抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、ＣＤ３３に結合するもの）を、本明細書で記載される系統特異的細胞表面抗原を標的にする物質を構築するために使用できる。このような抗体または抗原結合フラグメントは、従来法、例えば、ハイブリドーマ技術または組換え技術により調製できる。
例えば、目的の系統特異的抗原に特異的な抗体は、従来のハイブリドーマ技術により作製できる。ＫＬＨなどの担体タンパク質に結合され得る系統特異的抗原を使用して、この複合体に結合する抗体を生成するためにホスト動物を免疫できる。ホスト動物の免疫接種の経路または計画は通常、本明細書でさらに記載されるように、抗体刺激および産生のために確立された従来技術に従う。マウス抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体の産生のための一般的技術は、当技術分野において既知であり、本明細書で記載される。ヒトを含む任意の哺乳動物対象またはそれに由来する抗体産生細胞を、ヒトを含む哺乳動物のハイブリドーマ細胞株の産生のためのベースとなるように操作できることが考えられる。通常、ホスト動物を、本明細書で記載されるようなものを含む、ある量の免疫原で腹腔内、筋肉内、経口、皮下、足底内、および／または皮内に接種する。
ハイブリドーマは、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７の、またはＢｕｃｋ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ，１８：３７７－３８１（１９８２）によって改良された一般的な体細胞ハイブリドーマ技術を用いて、リンパ球および不死化骨髄腫細胞から調製できる。利用可能な骨髄腫株は、限定されないが、Ｘ６３－Ａｇ８．６５３およびＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡから入手されるものを含み、ハイブリダイゼーションに使用され得る。一般に、本技術は、ポリエチレングリコールなどの融合因子を使用して、または当業者に良く知られている電気的方法により、骨髄腫細胞とリンパ球を融合することを含む。融合後に、細胞を、融合培地から分離し、ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン（ＨＡＴ）培地などの選択増殖培地中で増殖させて、ハイブリダイズされていない親細胞を取り除く。血清を補充したまたは無補充の本明細書で開示される培地のいずれかを、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するために使用できる。細胞融合技術とは別の選択肢として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を使用して本明細書で記載のＴＣＲ様モノクローナル抗体を産生し得る。ハイブリドーマを、増殖させ、および必要に応じてサブクローニングし、上清を従来の免疫アッセイ方法（例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、または蛍光イムノアッセイ）により抗免疫原活性についてアッセイする。
抗体源として使用され得るハイブリドーマは、系統特異的抗原に結合できるモノクローナル抗体を産生する親ハイブリドーマの子孫細胞である、すべての派生物を包含する。このような抗体を産生するハイブリドーマは、既知の方法を用いてインビトロまたはインビボで増殖され得る。モノクローナル抗体は、必要に応じて、硫酸アンモニウム沈殿法、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外ろ過などの従来の免疫グロブリン精製法により、培地または体液から分離され得る。望ましくない活性が存在する場合、例えば、調製物を、固相に結合した免疫原からなる吸着剤上を通し、所望の抗体を免疫原から溶出または放出させることにより、取り除くことができる。免疫される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシン抑制剤に、二官能剤または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介した複合体化）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介した）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ＲおよびＲ１が異なるアルキル基）を用いて複合体化された標的アミノ酸配列を含む標的抗原またはフラグメントを用いたホスト細胞の免疫は、抗体の集団（例えば、モノクローナル抗体）を生じ得る。
必要に応じて、目的の抗体（例えば、ハイブリドーマによって産生された）は、配列決定され、ポリヌクレオチド配列は次に、発現または増殖用ベクター中にクローン化され得る。目的の抗体をコードする配列は、ホスト細胞中のベクターに維持され、ホスト細胞は次に、増殖され将来の使用のために凍結され得る。あるいは、ポリヌクレオチド配列は、抗体を「ヒト化する」ための、あるいは抗体の親和性（親和性成熟）または他の特性を改善するための遺伝子操作に使用され得る。例えば、抗体が臨床試験またはヒトの治療で使用される場合、定常領域を、ヒト定常領域にさらに似るように遺伝子操作して免疫応答を回避し得る。抗体配列を遺伝子操作して系統特異的抗原に対する高い親和性を得ることが望ましい場合がある。１つまたは複数のポリヌクレオチド変化を、抗体に対し実行し、標的抗原に対するその結合特異性をなお維持することは、当業者に明らかであろう。
他の実施形態では、完全なヒト抗体は、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように遺伝子操作されている市販マウスを用いて得ることができる。より望ましい（例えば、完全なヒト抗体）またはより強い免疫応答を生じるように設計された遺伝子導入動物もまた、ヒト化抗体またはヒト抗体の生成のために使用され得る。このような技術の例は、Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）ならびにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）のＨｕＭＡｂ－Ｍｏｕｓｅ（商標）およびＴＣ Ｍｏｕｓｅ（商標）である。 別の選択肢では、抗体は、ファージディスプレイまたは酵母技術による組換えにより作製され得る。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号、同第５，５８０，７１７号、同第５，７３３，７４３号、および同第６，２６５，１５０号、ならびにＷｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３－４５５を参照されたい。あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５３）を使用して、未免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）領域遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体および抗体フラグメントを産生できる。
インタクト抗体（完全長抗体）の抗原結合フラグメントは、定型化された方法により調製できる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体分子のペプシン消化により産生でき、Ｆａｂは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成できる。
ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、および二重特異的抗体などの、遺伝子操作された抗体は、例えば従来の組換え技術により産生できる。一例では、標的抗原に特異的なモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の方法を用いて容易に分離および配列決定できる（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として機能する。単離されると、ＤＮＡは、１個または複数の発現ベクター中に配置され得、これは次いで大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはさもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などのホスト細胞中に遺伝子導入されて、組換えホスト細胞中でモノクローナル抗体が合成される。例えば、国際公開第８７／０４４６２号を参照されたい。ＤＮＡを次に、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常領域をコードする配列で置換することにより、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１、または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべてまたは一部を共有結合させることにより、改変できる。このようにして、標的抗原の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体などの、遺伝子操作された抗体を作製できる。
「キメラ抗体」の産生のために開発された技術は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１，６８５１；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２，６０４；およびＴａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２を参照されたい。
ヒト化抗体を構築するための方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９－１００３３（１９８９）を参照されたい。一例では、親の非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬの可変領域が、当該技術分野において既知の方法による三次元分子モデル分析に供される。次に、正確なＣＤＲ構造の形成に重要であると予測されるフレームワークアミノ酸残基を、同じ分子モデル分析を用いて特定する。並行して、親非ヒト抗体と相同であるアミノ酸配列を有するヒトＶＨおよびＶＬ鎖を、検索クエリとして親ＶＨおよびＶＬ配列を用いていずれかの抗体遺伝子データベースから特定する。ヒトＶＨおよびＶＬアクセプター遺伝子をその後、選択する。
選択されたヒトアクセプター遺伝子内のＣＤＲ領域を、親の非ヒト抗体由来のＣＤＲ領域またはその機能的バリアントで置換できる。必要に応じて、ＣＤＲ領域との相互作用において重要であると予測される親鎖のフレームワーク領域内の残基（上記記述を参照）を使用して、ヒトアクセプター遺伝子中の相当する残基と置換できる。
単鎖抗体は、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列と軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を連結することにより組換え技術を介して作製できる。好ましくは、フレキシブルリンカーが、２つの可変領域の間に組み込まれる。あるいは、単鎖抗体の産生のために報告されている技術（米国特許第４，９４６，７７８号および同第４，７０４，６９２号）を、ファージまたは酵母ｓｃＦｖライブラリーを作製するために適応でき、 系統特異的抗原に特異的なｓｃＦｖクローンを、定型的な手順に従いライブラリーから特定できる。陽性クローンを、さらなるスクリーニングに供して、系統特異的抗原を結合するものを特定できる。
いくつかの例では、目的の系統特異的抗原は、ＣＤ３３であり、抗原結合フラグメントは、ＣＤ３３、例えば、ヒトＣＤ３３を特異的に結合する。抗ヒトＣＤ３３抗体の例示的な重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸および核酸配列を、下記に示す。ＣＤＲ配列を、アミノ酸配列中で太字と下線で示す。
抗ＣＤ３３重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１２）
Figure 2022517618000002
 抗ＣＤ３３重鎖可変領域の核酸配列（配列番号２）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＧＣＧＴＧＡＴＣＴＡＣＣＣＣＧＧＣＡＡＣＧＡＣＧＡＣＡＴＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＧＡＧＧＴＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣ
抗ＣＤ３３軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１３）
Figure 2022517618000003
 抗ＣＤ３３重鎖可変領域の核酸配列（配列番号１）
ＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＴＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＡＧＧ
本明細書で記載されるＣＤ３３を標的にする物質を構築することにおける使用のための抗ＣＤ３３抗体結合フラグメントは、配列番号１２および配列番号１３と同じ重鎖および／または軽鎖ＣＤＲを含み得る。このような抗体は、１つまたは複数のフレームワーク領域にアミノ酸残基変異を含み得る。いくつかの例では、抗ＣＤ３３抗体フラグメントは、配列番号１２と少なくとも７０％配列同一性（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれを超える）を共有する重鎖可変領域を含み得、および／または配列番号１３と少なくとも７０％配列同一性（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれを超える）を共有する軽鎖可変領域を含み得る。
２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４－６８，１９９０の、改良されたＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３－７７，１９９３のアルゴリズムを用いて決定される。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施して、本開示のタンパク質分子と相同的なアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列の間にギャップが存在する場合、ギャップＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２，１９９７で報告されているように使用できる。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを、使用できる。
Ｃ．キメラ受容体を発現する免疫細胞
いくつの実施形態では、本明細書で記載される系統特異的細胞表面抗原を標的にする物質は、系統特異的抗原（例えば、ＣＤ３３）に結合できる抗原結合フラグメント（例えば、単鎖抗体）を含むキメラ受容体を発現する免疫細胞である。キメラ受容体の抗原結合フラグメントによる、細胞表面上の系統特異的抗原を有する標的細胞（例えば、癌細胞）の認識は、キメラ受容体のシグナル伝達領域（例えば、共刺激シグナル伝達領域および／または細胞質シグナル伝達領域）に活性化シグナルを伝達し、これは、キメラ受容体を発現している免疫細胞中のエフェクター機能を活性化し得る。
本明細書で使用される場合、キメラ受容体は、ホスト細胞の表面で発現され、かつ細胞表面系統特異的抗原に結合する抗原結合フラグメントを含む、非天然起源分子を指す。一般に、キメラ受容体は、異なる分子由来である少なくとも２つの領域を含む。本明細書で記載される抗原結合フラグメントに加え、キメラ受容体は、ヒンジ領域、膜貫通領域、少なくとも１つの共刺激領域、および細胞質シグナル伝達領域の１種または複数をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、Ｎ端からＣ端へ、細胞表面系統特異的抗原に結合する抗原結合フラグメント、ヒンジ領域、膜貫通領域、および細胞質シグナル伝達領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、少なくとも１つの共刺激領域をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で記載されるキメラ受容体は、ヒンジ領域を含み、これは、抗原結合フラグメントと膜貫通領域の間に位置し得る。ヒンジ領域は、一般的にタンパク質の２つの領域の間で認められ、かつタンパク質の可撓性および領域の片方または両方の相互の動きを可能にし得る、アミノ酸のセグメントである。このような可撓性およびキメラ受容体の別領域に対する抗原結合フラグメントの動きをもたらす、任意のアミノ酸配列を、使用できる。
ヒンジ領域は、約１０～２００個のアミノ酸、例えば、１５～１５０個のアミノ酸、２０～１００個のアミノ酸、または３０～６０個のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００個のアミノ酸長であり得る。
いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、天然起源タンパク質のヒンジ領域である。ヒンジ領域を含むことが当該技術分野において既知のいずれかのタンパク質のヒンジ領域は、本明細書で記載されるキメラ受容体における使用に適合する。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、天然起源タンパク質のヒンジ領域の少なくとも一部であり、キメラ受容体に可撓性を付与する。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＤ８αまたはＣＤ２８αのものである。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＤ８αのヒンジ領域の一部であり、例えば、ＣＤ８αまたはＣＤ２８αのヒンジ領域の少なくとも１５個（例えば、２０、２５、３０、３５、または４０個）の連続したアミノ酸を含むフラグメントである。
ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体などの、抗体のヒンジ領域もまた、本明細書で記載されるキメラ受容体における使用に適合する。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、抗体の定常領域ＣＨ１とＣＨ２をつなぐヒンジ領域である。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、抗体のものであり、抗体のヒンジ領域および抗体の１つまたは複数の定常領域のヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、抗体のヒンジ領域および抗体のＣＨ３定常領域のヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、抗体のヒンジ領域および抗体のＣＨ２およびＣＨ３定常領域のヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域およびＣＨ３定常領域を含む。
非天然起源ペプチドであるヒンジ領域を含むキメラ受容体も、本開示の範囲内である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合領域のＣ端と膜貫通領域のＮ端の間のヒンジ領域は、（ＧｌｙｘＳｅｒ）ｎリンカー（配列番号７４）などのペプチドリンカーであり、ここでｘおよびｎは独立に、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２を含む３～１２、またはそれを超える整数であってよい。
本明細書で記載されるキメラ受容体のヒンジ領域で使用され得る追加のペプチドリンカーは、当該技術分野において既知である。例えば、Ｗｒｉｇｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００５）８０（６）：７３６－７４６、および国際公開第２０１２／０８８４６１号を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本明細書で記載されるキメラ受容体は、膜貫通領域を含み得る。キメラ受容体における使用のための膜貫通領域は、当該技術分野において既知のいずれかの形態であってよい。本明細書で使用される場合、「膜貫通領域」は、細胞膜、好ましくは真核細胞膜中で熱力学的に安定である任意のタンパク質構造を指す。本明細書で使用されるキメラ受容体における使用に適合する膜貫通領域は、天然起源タンパク質から得られる。あるいは、膜貫通領域は、合成の、非天然起源タンパク質セグメント、例えば、細胞膜中で熱力学的に安定である疎水性タンパク質セグメントであり得る。
膜貫通領域は、膜貫通領域が膜を横断する通過回数およびタンパク質の配向を含む、膜貫通領域の位相に基づいて分類される。例えば、単回通過膜タンパク質は、細胞膜を１回横断し、多回通過膜タンパク質は、細胞膜を少なくとも２回（例えば、２、３、４、５、６、７回またはそれより多い回数）横断する。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、単回通過膜貫通領域である。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、キメラ受容体のＮ端が細胞の細胞外側に、キメラ受容体のＣ端が細胞の細胞内側に向いている単回通過膜貫通領域である。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、単回通過膜貫通タンパク質から得られる。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、ＣＤ８αのものである。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、ＣＤ２８のものである。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、ＩＣＯＳのものである。
いくつかの実施形態では、本明細書で記載されるキメラ受容体は、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達領域を含む。用語「共刺激シグナル伝達領域」は、本明細書で使用される場合、細胞内シグナル伝達を仲介してエフェクター機能などの免疫応答を誘発するタンパク質の少なくとも一部を指す。本明細書で記載されるキメラ受容体の共刺激シグナル伝達領域は、共刺激タンパク質由来の細胞質シグナル伝達領域であってよく、これは、シグナルを伝達してＴ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球などの免疫細胞によって仲介される応答を調節する。
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、２つ以上（少なくとも２つ、３つ、４つ、またはそれより多い）の共刺激シグナル伝達領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、異なる共刺激タンパク質から得られる２つ以上の共刺激シグナル伝達領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、共刺激シグナル伝達領域を含まない。
通常、多くの免疫細胞は、細胞増殖、分化および生存を促進するために、ならびに細胞のエフェクター機能を活性化するために、抗原特異的シグナルの刺激に加えて、共刺激を必要とする。ホスト細胞（例えば、免疫細胞）中の共刺激シグナル伝達領域の活性化は、細胞がサイトカインの産生および分泌、マクロファージ特性、増殖、分化、生存、および／または細胞毒性を増大させるまたは低減させるのを誘発し得る。任意の共刺激タンパク質の共刺激シグナル伝達領域は、本明細書で記載されるキメラ受容体における使用に適合し得る。共刺激シグナル伝達領域のタイプは、キメラ受容体が発現される免疫細胞のタイプ（例えば、一次Ｔ細胞、Ｔ細胞株、ＮＫ細胞株）および所望の免疫エフェクター機能（例えば、細胞毒性）などの要因に基づいて選択される。キメラ受容体における使用のための共刺激シグナル伝達領域の例は、共刺激タンパク質の細胞質シグナル伝達領域であってよく、限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、Ｃｄ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、共刺激領域は、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、またはＩＣＯＳ由来である。いくつかの実施形態では、共刺激領域は、ＣＤ２８由来であり、キメラ受容体は、４－１ＢＢまたはＩＣＯＳ由来の第２の共刺激領域を含む。
いくつかの実施形態では、共刺激領域は、２つ以上の共刺激領域または２つ以上の共刺激領域の部分を含む融合領域である。いくつかの実施形態では、共刺激領域は、ＣＤ２８およびＩＣＯＳ由来の共刺激領域の融合物である。
いくつかの実施形態では、本明細書で記載されるキメラ受容体は、細胞質シグナル伝達領域を含む。任意の細胞質シグナル伝達領域を、本明細書で記載されるキメラ受容体に使用できる。一般に、細胞質シグナル伝達領域は、細胞外リガンド結合領域とそのリガンドの相互作用などのシグナルを伝えて、細胞のエフェクター機能（例えば、細胞毒性）を誘発するなどの、細胞応答を刺激する。
当業者には明らかなように、Ｔ細胞活性化に含まれる因子は、細胞質シグナル伝達領域の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化である。当該技術分野において既知の任意のＩＴＡＭ含有領域を使用して、本明細書で記載されるキメラ受容体を構築し得る。一般的に、ＩＴＡＭモチーフは、６～８個のアミノ酸で分離されるアミノ酸配列ＹｘｘＬ／Ｉの２つの反復を含み、式中、各ｘは独立に任意のアミノ酸であり、保存モチーフＹｘｘＬ／Ｉｘ（６～８）ＹｘｘＬ／Ｉを生成し得る。いくつかの実施形態では、細胞質シグナル伝達領域は、ＣＤ３ζ由来である。
例示的なキメラ受容体を、次の表２および３に示す。
Figure 2022517618000004
キメラ受容体の構築のための例示的構成要素の核酸配列を、以下に提供する。
ＣＤ２８細胞内シグナル伝達領域－ＤＮＡ－ヒト（配列番号３）
ＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＣＣＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣ
ＩＣＯＳ細胞内シグナル伝達領域－ＤＮＡ－ヒト（配列番号４）
ＣＴＡＴＣＡＡＴＴＴＴＴＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＧＴＡＡＣＴＣＴＴＡＣＡＧＧＡＧＧＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴＴＴＡＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＣＴＴＴＧＴＴＧＣＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＣＣＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＡＧＴＣＴＧＣＡＴＴＴＴＧＧＧＡＴＧＣＡＴＡＣＴＴＡＴＴＴＧＴＴＧＧＣＴＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＴＡＴＴＣＡＴＣＣＡＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＣＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＡＧＡＧＣＡＧＴＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＣＴＣＡＣＡＧＡＴＧＴＧＡＣＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣ
ＣＤ２８／ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域－ＤＮＡ－ヒト（配列番号５）
ＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＡＧＡＧＣＡＧＴＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＣＴＣＡＣＡＧＡＴＧＴＧＡＣＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣ
いくつかの実施形態では、核酸は、ＣＤ３３に結合する抗原結合フラグメントをコードし、配列番号１２中のＣＤＲと同一のＣＤＲを有する重鎖可変領域および配列番号１３中のＣＤＲと同一のＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、配列番号１２により示される重鎖可変領域および配列番号１３により示される軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、少なくとも膜貫通領域および細胞質シグナル伝達領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ヒンジ領域および／または共刺激シグナル伝達領域をさらに含む。
表３は、本明細書で記載される例示的なキメラ受容体を提供する。例示的構築物は、Ｎ端からＣ端へ、抗原結合フラグメント、膜貫通領域、および細胞質シグナル伝達領域を有する。いくつかの例では、キメラ受容体は、抗原結合フラグメントと膜貫通領域の間に位置するヒンジ領域をさらに含む。いくつかの例では、キメラ受容体は、１つまたは複数の共刺激領域をさらに含み、これは、膜貫通領域と細胞質シグナル伝達領域の間に位置し得る。
Figure 2022517618000005
上記表３に記載のキメラ受容体例のアミノ酸配列を、以下に提供する：
ＣＡＲＴ１アミノ酸配列（配列番号２０）
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＥＩＶＬＴＱＳＰＧＳＬＡＶＳＰＧＥＲＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＩＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＬＡＩＹＹＣＨＱＹＬＳＳＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＩＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＶＧＶＩＹＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＶＲＬＲＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
ＣＡＲＴ２アミノ酸配列（配列番号２１）
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＥＩＶＬＴＱＳＰＧＳＬＡＶＳＰＧＥＲＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＩＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＬＡＩＹＹＣＨＱＹＬＳＳＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＩＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＶＧＶＩＹＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＶＲＬＲＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
ＣＡＲＴ３アミノ酸配列（配列番号２２）
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＥＩＶＬＴＱＳＰＧＳＬＡＶＳＰＧＥＲＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＩＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＬＡＩＹＹＣＨＱＹＬＳＳＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＩＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＶＧＶＩＹＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＶＲＬＲＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
ＣＡＲＴ８アミノ酸配列（配列番号２３）
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ＣＡＲＴ４ｄｕａｌアミノ酸配列（配列番号２４）
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ＣＡＲＴ５ｄｕａｌアミノ酸配列（配列番号２５）
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ＣＡＲＴ６アミノ酸配列（配列番号２６）
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ＣＡＲＴ７アミノ酸配列（配列番号２７）
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上記表３に記載のキメラ受容体例の核酸配列を、以下に提供する：
ＣＡＲＴ１核酸配列（配列番号３８）
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ＣＡＲＴ２核酸配列（配列番号３９）
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ＣＡＲＴ３核酸配列（配列番号４０）
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ＣＡＲＴ４ｄｕａｌ核酸配列（配列番号４１）
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ＣＡＲＴ５ｄｕａｌ核酸配列（配列番号４２）
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ＣＡＲＴ６核酸配列（配列番号４３）
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ＣＡＲＴ７核酸配列（配列番号４４）
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本明細書で記載されるキメラ受容体のいずれかは、組換え技術などの定型的方法により調製できる。本明細書におけるキメラ受容体を調製する方法は、抗原結合フラグメント、ならびに任意選択で、ヒンジ領域、膜貫通領域、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域、および細胞質シグナル伝達領域を含む、キメラ受容体のそれぞれの領域を含むポリペプチドをコードする核酸の生成を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の構成要素のそれぞれをコードする核酸は、組換え技術を用いて互いに連結される。
キメラ受容体の構成要素のそれぞれの配列は、定型的な技術、例えば、当該技術分野において既知の様々な供給源のいずれか１つからＰＣＲ増幅により得ることができる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の構成要素の１つまたは複数の配列は、ヒト細胞から得られる。あるいは、キメラ受容体の１つまたは複数の構成要素の配列は、合成できる。それぞれの構成要素の配列（例えば、領域）を、ＰＣＲ増幅またはライゲーションなどの方法を用いて、直接的にまたは間接的に（例えば、ペプチドリンカーをコードする核酸を用いて）連結してキメラ受容体をコードする核酸配列を形成できる。あるいは、キメラ受容体をコードする核酸は、合成され得る。いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡである。他の実施形態では、核酸は、ＲＮＡである。
構成要素それぞれの配列を連結する前または後における、キメラ受容体の１つまたは複数の構成要素（例えば、抗原結合フラグメントなど）内の１個または複数の残基の変異。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の構成要素における１つまたは複数の変異が、標的に対する構成要素（例えば、標的抗原に対する抗原結合フラグメント）の親和性を調節する（増大させるまたは低下させる）および／または構成要素の活性を調節するために作製され得る。
本明細書で記載されるいずれのキメラ受容体も、従来技術により発現のため適切な免疫細胞中に導入できる。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、一次Ｔ細胞またはＴ細胞株などのＴ細胞である。あるいは、免疫細胞は、確立されたＮＫ細胞株（例えば、ＮＫ－９２細胞）などのＮＫ細胞であってよい。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＣＤ８（ＣＤ８＋）またはＣＤ８およびＣＤ４（ＣＤ８＋／ＣＤ４＋）を発現するＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、確立されたＴ細胞株のＴ細胞、例えば、２９３Ｔ細胞またはジャーカット細胞である。
一次Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、脾臓などの組織、リンパ節、胸腺、または腫瘍組織などの任意の供給源から得ることができる。所望される免疫細胞型を得るのに適した供給源は、当業者に明らかであろう。いくつかの実施形態では、免疫細胞集団は、患者から得られる骨髄またはＰＢＭＣ由来などの、造血器悪性腫瘍を有するヒト患者由来である。いくつかの実施形態では、免疫細胞集団は、健康なドナー由来である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、キメラ受容体を発現する免疫細胞が後で投与される対象から得られる。そこから細胞を得た同じ対象に投与される免疫細胞は、自己細胞と呼ばれ、一方、細胞が投与される対象ではない対象から得られる免疫細胞は、同種細胞と呼ばれる。
所望されるホスト細胞のタイプは、細胞を刺激分子と共培養することによって得られる細胞集団内で増殖され得、例えば、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体が、Ｔ細胞の増殖のために使用され得る。
本明細書で記載されるキメラ受容体構築物のいずれかを発現する免疫細胞を構築するために、キメラ受容体の安定的または一時的な発現のためのベクターを、本明細書で記載される従来方法によって構築し、免疫ホスト細胞中に導入し得る。例えば、キメラ受容体をコードする核酸は、適切なプロモーターに操作可能な連結状態にあるウィルスベクターなどの、適切な発現ベクター中にクローニングされ得る。核酸およびベクターを、適切な条件下で、制限酵素と接触させて、互いに対を形成しリガーゼで連結され得る各分子上の相補端を形成し得る。あるいは、合成核酸リンカーを、キメラ受容体をコードする核酸の末端に連結できる。合成リンカーは、ベクター中の特定の制限部位に相当する核酸配列を含み得る。発現ベクター／プラスミド／ウィルスベクターの選択は、キメラ受容体発現のためのホスト細胞のタイプに依存するが、真核細胞中での統合および複製に適しているべきである。
様々なプロモーターを、本明細書で記載されるキメラ受容体の発現のために使用でき、これらは、限定されないが、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）中初期プロモーター、ウィルスＬＴＲでラウス肉腫ＬＴＲ、ＨＩＶ－ＬＴＲ、ＨＴＬＶ－１ ＬＴＲ、モロニーマウス白血病ウィルス（ＭＭＬＶ）ＬＴＲ、骨髄増殖性肉腫ウィルス（ＭＰＳＶ）ＬＴＲ、脾限局巣形成ウィルス（ＳＦＦＶ）ＬＴＲなど、サルウィルス４０（ＳＶ４０）中初期プロモーター、単純ヘルペスｔｋウィルスプロモーター、ＥＦ１－αイントロンを含有または非含有伸長因子１－α（ＥＦ１－α）プロモーターを含む。キメラ受容体の発現用の追加プロモーターは、免疫細胞で構成的に活性な任意のプロモーターを含む。あるいは、その発現が免疫細胞内で調節され得るような、任意の調節可能プロモーターが使用され得る。
さらに、ベクターは、例えば、以下のいくつかまたはすべてを含み得る：ホスト細胞における安定なまたは一時的な形質移入体の選択のためのネオマイシン遺伝子などの、選択可能マーカー遺伝子；高量転写のためのヒトＣＭＶ中初期遺伝子由来のエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０由来の転写終結およびＲＮＡ処理シグナル；α－グロビンまたはβ－グロビンのような高発現される遺伝子由来のｍＲＮＡ安定性および翻訳効率のための５’－および３’－非翻訳領域；複製のＳＶ４０ポリオーマ起点および適切なエピソーム複製のためのＣｏｌＥ１；内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）、多用途複数クローニング部位；センスおよびアンチセンスＲＮＡのインビトロ転写のためのＴ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモーター；誘発されたときにベクターを有する細胞に死を生じる「自殺スイッチ」または「自殺遺伝子」（例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ｉＣａｓｐ９などの誘導性カスパーゼ）、ならびにキメラ受容体の発現を評価するためのレポーター遺伝子。以下のセクションＶＩを参照されたい。適切なベクターおよび導入遺伝子を含むベクターを作製するための方法は、当該技術分野において良く知られており、利用可能である。キメラ受容体の発現のためのベクターの調製の例は、例えば、米国出願公開第２０１４／０１０６４４９号で見つけることができ、その全体が参考によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、キメラ受容体構築物またはそのキメラ受容体をコードする核酸は、ＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、キメラ受容体構築物またはそのキメラ受容体をコードする核酸は、ＤＮＡベクターであり、免疫細胞に電気穿孔により導入され得る（例えば、Ｔｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１２）１１９（１７）：３９４０－３９５０を参照）。いくつかの実施形態では、キメラ受容体をコードする核酸は、ＲＮＡ分子であり、これは、免疫細胞に電気穿孔により導入され得る。
本明細書で記載されるキメラ受容体構築物をコードする核酸配列を含むベクターのいずれも、本開示の範囲内に入る。このようなベクターは、適切な方法によりホスト免疫細胞などのホスト細胞中に送達され得る。ベクターを免疫細胞に送達する方法は、当該技術分野において周知であり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはトランスポゾンエレクトロポレーション、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはトランスポゾンを送達するリポソームまたはナノ粒子などの遺伝子導入試薬；機械的変形によるＤＮＡ、ＲＮＡ、またはトランスポゾンあるいはタンパク質の送達（例えば、Ｓｈａｒｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０１３）１１０（６）：２０８２－２０８７を参照）；あるいはウィルス形質導入を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の発現のためのベクターは、ウィルス形質導入によりホスト細胞に送達される。送達のための例示的なウィルス法は、限定されないが、組換えレトロウィルス（例えば、国際公開第９０／０７９３６号、同９４／０３６２２号、同９３／２５６９８号、同９３／２５２３４号、同９３／１１２３０号、同９３／１０２１８号、同９１／０２８０５号、米国特許第５，２１９，７４０号および同第４，７７７，１２７号、ＧＢ特許第２，２００，６５１号、および欧州特許第０３４５２４２号を参照）、アリファウィルスをベースとするベクター、およびアデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、国際公開第９４／１２６４９号、同９３／０３７６９号、同９３／１９１９１号、同９４／２８９３８号、同９５／１１９８４号および同９５／００６５５号を参照）を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の発現用ベクターは、レトロウィルスである。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の発現用ベクターは、レンチウィルスである。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の発現用ベクターは、アデノ関連ウィルスである。
キメラ受容体をコードするベクターがウィルスベクターを用いてホスト細胞に導入される例では、免疫細胞に感染できるベクターを運ぶウィルス粒子が、当該技術分野において知られており、例えば、国際公開第１９９１／００２８０５Ａ２号、同１９９８／００９２７１Ａ１号、および米国特許第６，１９４，１９１号で見つけることができるいずれかの方法により産生され得る。ウィルス粒子は、細胞培養上清から収集され、ウィルス粒子を免疫細胞と接触させる前に分離および／または精製され得る。
本明細書で記載されるキメラ受容体のいずれかを発現するホスト細胞を調製する方法は、生体外で免疫細胞を活性化することおよび／または拡張することを含み得る。ホスト細胞を活性化することは、細胞がエフェクター機能（例えば、細胞毒性）を実施できる活性化状態へとホスト細胞を刺激することを意味する。ホスト細胞を活性化する方法は、キメラ受容体の発現のために使用されるホスト細胞のタイプに依存する。ホスト細胞を拡張することは、キメラ受容体を発現する細胞数の増加をもたらす任意の方法を含み得、例えば、ホスト細胞を増殖させる、またはホスト細胞を刺激して増殖させる。ホスト細胞の拡張を刺激する方法は、キメラ受容体の発現のために使用されるホスト細胞のタイプに依存し、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態では、本明細書で記載されるキメラ受容体のいずれかを発現するホスト細胞は、対象への投与前に体外で活性化および／または拡張される。
いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原を標的にする物質は、抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）である。当業者に明らかなように、用語「抗体－薬物複合体」は、「免疫毒素」と同じ意味で用いられ、毒素または薬物分子に複合体化された抗体（または、その抗原結合フラグメント）を含む融合分子を指す。対応する抗原への抗体の結合は、その細胞表面（例えば、標的細胞）に抗原を提示する細胞への毒素または薬物分子の送達を可能にし、これにより標的細胞の死をもたらす。
いくつかの実施形態では、物質は、抗体－薬物複合体である。いくつかの実施形態では、抗体－薬物複合体は、抗原結合フラグメントおよび標的細胞中で細胞毒性を誘発する毒素または薬物を含む。いくつかの実施形態では、抗体－薬物複合体は、２型抗原を標的にする。いくつかの実施形態では、抗体－薬物複合体は、ＣＤ３３またはＣＤ１９を標的にする。
いくつかの実施形態では、抗体－薬物複合体の抗原結合フラグメントは、配列番号１２により示される重鎖可変領域と同じ重鎖ＣＤＲ、および配列番号１３により示される軽鎖可変領域と同じ軽鎖ＣＤＲを有する。いくつかの実施形態では、抗体－薬物複合体の抗原結合フラグメントは、配列番号１２により示される重鎖可変領域、および配列番号１３により示される同じ軽鎖可変領域を有する。
抗体－薬物複合体における使用に適合する毒素または薬物は、当該技術分野において良く知られており、当業者に明らかであろう。例えば、Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．（２０１５）３５（４）：ｅ００２２５；Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２０１７）１６：３１５－３３７；Ｍａｒｉｎ－Ａｃｅｖｅｄｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１８）１１：８；Ｅｌｇｕｎｄｉ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０１７）１２２：２－１９を参照されたい。
いくつかの実施形態では、抗体－薬物複合体は、抗体と薬物分子を結合するリンカー（例えば、切断可能なリンカーなどのペプチドリンカー）をさらに含み得る。抗体－薬物複合体の例としては、限定されないが、次記が挙げられる：ブレンツキシマブベドチン、グレムバツムマブベドチン／ＣＤＸ－０１１、デパツキシズマブマホドチン／ＡＢＴ－４１４、ＰＳＭＡ ＡＤＣ、ポラツズマブベドチン／ＲＧ７５９６／ＤＣＤＳ４５０１Ａ、デニンツズマブマホドチン／ＳＧＮ－ＣＤ１９Ａ、ＡＧＳ－１６Ｃ３Ｆ、ＣＤＸ－０１４、ＲＧ７８４１／ＤＬＹＥ５９５３Ａ、ＲＧ７８８２／ＤＭＵＣ４０６Ａ、ＲＧ７９８６／ＤＣＤＳ０７８０Ａ、ＳＧＮ－ＬＩＶ１Ａ、エンホルツマブベドチン／ＡＳＧ－２２ＭＥ、ＡＧ－１５ＭＥ、ＡＧＳ６７Ｅ、テリソツズマブベドチン／ＡＢＢＶ－３９９、ＡＢＢＶ－２２１、ＡＢＢＶ－０８５、ＧＳＫ－２８５７９１６、チソツマブベドチン／ＨｕＭａｘ－ＴＦ－ＡＤＣ、ＨｕＭａｘ－Ａｘｌ－ＡＤＣ、ポラツズマブベドチン／ＲＧ７５９３／ＤＣＤＴ２９８０Ｓ、リファスツズマブベドチン／ＲＧ７５９９／ＤＮＩＢ０６００Ａ、インデュサツマブベドチン／ＭＬＮ－０２６４／ＴＡＫ－２６４、バンドルツズマブベドチン／ＲＧ７４５０／ＤＳＴＰ３０８６Ｓ、ソフィツズマブベドチン／ＲＧ７４５８／ＤＭＵＣ５７５４Ａ、ＲＧ７６００／ＤＭＯＴ４０３９Ａ、ＲＧ７３３６／ＤＥＤＮ６５２６Ａ、ＭＥ１５４７、ＰＦ－０６２６３５０７／ＡＤＣ ５Ｔ４、トラスツズマブエムタンシン／Ｔ－ＤＭ１、ミルベツキシマブソラブタンシン／ＩＭＧＮ８５３、コルツキシマブラブタンシン／ＳＡＲ３４１９、ナラツキシマブエムタンシン／ＩＭＧＮ５２９、インダツキシマブラブタンシン／ＢＴ－０６２、アネツマブラブタンシン／ＢＡＹ ９４－９３４３、ＳＡＲ４０８７０１、ＳＡＲ４２８９２６、ＡＭＧ ２２４、ＰＣＡ０６２、ＨＫＴ２８８、ＬＹ３０７６２２６、ＳＡＲ５６６６５８、ロルボツズマブメルタンシン／ＩＭＧＮ９０１、カンツズマブメルタンシン／ＳＢ－４０８０７５、カンツズマブラブタンシン／ＩＭＧＮ２４２、ラプリツキシマブエムタンシン／ＩＭＧＮ２８９、ＩＭＧＮ３８８、ビバツズマブメルタンシン、ＡＶＥ９６３３、ＢＩＩＢ０１５、ＭＬＮ２７０４、ＡＭＧ １７２、ＡＭＧ ５９５、ＬＯＰ ６２８、バダスツキシマブタリリン／ＳＧＮ－ＣＤ３３Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ７０Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ１９Ｂ、ＳＧＮ－ＣＤ１２３Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ３５２Ａ、ロバルピツズマブテシリン／ＳＣ１６ＬＤ６．５、ＳＣ－００２、ＳＣ－００３、ＡＤＣＴ－３０１／ＨｕＭａｘ－ＴＡＣ－ＰＢＤ、ＡＤＣＴ－４０２、ＭＥＤＩ３７２６／ＡＤＣ－４０１、ＩＭＧＮ７７９、ＩＭＧＮ６３２、ゲムツズマブオゾガマイシン、イノツズマブオゾガマイシン／ＣＭＣ－５４４、ＰＦ－０６６４７２６３、ＣＭＤ－１９３、ＣＭＢ－４０１、トラスツズマブデュオカルマジン／ＳＹＤ９８５、ＢＭＳ－９３６５６１／ＭＤＸ－１２０３、サシツズマブゴビテカン／ＩＭＭＵ－１３２、ラベツズマブゴビテカン／ＩＭＭＵ－１３０、ＤＳ－８２０１ａ、Ｕ３－１４０２、ミラツズマブドキソルビシン／ＩＭＭＵ－１１０／ｈＬＬ１－ＤＯＸ、ＢＭＳ－９８６１４８、ＲＣ４８－ＡＤＣ／ペルツズマブ－ｖｃ－ＭＭＡＥ、ＰＦ－０６６４７０２０、ＰＦ－０６６５０８０８、ＰＦ－０６６６４１７８／ＲＮ９２７Ｃ、ｌｕｐａｒｔｕｍａｂ ａｍａｄｏｔｉｎ／ ＢＡＹ１１２９９８０、アプルツマブイキサドチン（ａｐｒｕｔｕｍａｂ ｉｘａｄｏｔｉｎ）／ＢＡＹ１１８７９８２、ＡＲＸ７８８、ＡＧＳ６２Ｐ１、ＸＭＴ－１５２２、ＡｂＧｎ－１０７、ＭＥＤＩ４２７６、ＤＳＴＡ４６３７Ｓ／ＲＧ７８６１。一例では、抗体－薬物複合体は、ゲムツズマブオゾガマイシンである。
いくつかの実施形態では、抗体－薬物複合体の細胞表面系統特異的タンパク質への結合は、抗体－薬物複合体の内部移行を誘導し、薬物（または毒素）が、放出され得る。いくつかの実施形態では、抗体－薬物複合体の細胞表面系統特異的タンパク質への結合は、毒素または薬物の内部移行を誘導し、これは、毒素または薬物が系統特異的タンパク質（標的細胞）を発現している細胞を死滅させ得る。いくつかの実施形態では、抗体－薬物複合体の細胞表面系統特異的タンパク質への結合は、毒素または薬物の内部移行を誘導し、これは、系統特異的タンパク質（標的細胞）を発現している細胞の活性を調節し得る。本明細書で記載の抗体－薬物複合体に使用される毒素または薬物のタイプは、いずれかの特定のタイプに限定されない。
本明細書で記載されるＡＤＣは、本明細書で記載される併用療法を受けた対象に後続治療として使用され得る。
系統特異的細胞表面抗原を欠く造血細胞
本開示はまた、系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３、例えば、本明細書で記載のｇＲＮＡを用いて、例えば、ｇＲＮＡが、ＡＵＣＣＣＵＧＧＣＡＣＵＣＵＡＧＡＡＣＣ（配列番号６７）またはＣＣＵＣＡＣＵＡＧＡＣＵＵＧＡＣＣＣＡＣ（配列番号７０）のヌクレオチド配列を含む）を欠くように遺伝子改変されている造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞（ＨＰＣ）などの造血細胞も提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＣ（配列番号５０）またはＣＣＴＣＡＣＴＡＧＡＣＴＴＧＡＣＣＣＡＣ（配列番号５８）の配列を有する部位で遺伝子変異を含む。いくつかの実施形態では、造血細胞は、ＨＳＣ、ＨＰＣ、またはこれらの組み合わせであり、本明細書においては、「ＨＳＰＣ」（「造血幹細胞および／または前駆細胞」）と称する。いくつかの実施形態では、本明細書で記載の細胞集団は、複数の造血幹細胞を含み、いくつかの実施形態では、本明細書で記載の細胞集団は、複数の造血前駆細胞を含み、およびいくつかの実施形態では、本明細書で記載の細胞集団は、複数の造血幹細胞および複数の造血前駆細胞を含む。造血幹細胞（ＨＳＣ）は、骨髄およびリンパ系の前駆細胞の両方を生じさせることができ、これらはそれぞれ骨髄細胞（例えば、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、樹状細胞、赤血球、血小板など）およびリンパ系細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）をさらに生成する。ＨＳＣは、ＨＳＣの特定および／または単離のために使用できる細胞表面マーカーＣＤ３４（例えば、ＣＤ３４＋）の発現、および細胞系統への関与と関連する細胞表面マーカーの非存在により特徴付けられる。従って、いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋である。
いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、哺乳動物対象などの対象から得られる。いくつかの実施形態では、哺乳動物対象は、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、ウシ、ブタ、ウマ、または飼育動物である。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは 造血器悪性腫瘍を有するヒト患者などの、ヒト患者から得られる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、健康なドナーから得られる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、キメラ受容体を発現する免疫細胞が後で投与される対象から得られる。そこから細胞が得られた同じ対象に投与されるＨＳＣは、自己細胞と呼ばれ、一方、細胞が投与される対象ではない対象から得られるＨＳＣは、同種細胞と呼ばれる。
ＨＳＣは、当該技術分野において既知の従来の手段を用いていずれかの適切な供給源から得ることができる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、骨髄試料または血液試料などの対象由来の試料から得られる。代わりに、または追加して、ＨＳＣは、臍帯から得ることができる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、骨髄または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得られる。一般的に、骨髄細胞は、対象の腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊柱骨、肋骨または他の骨髄腔から得ることができる。骨髄は、患者から採取され、当該技術分野において既知の様々な分離および洗浄手順により単離され得る。骨髄細胞の単離のための例示的な方法は、以下のステップを含む：ａ）骨髄試料の抽出、ｂ）骨髄懸濁液の３画分での遠心分離ならびに中間画分およびバフィーコートの収集、ｃ）ステップ（ｂ）からのバフィーコート画分を、分離溶液、通常はＦｉｃｏｌｌ（商標）中でもう１回遠心分離し、骨髄細胞を含む中間画分を、収集する、ｄ）再注入可能な骨髄細胞の回収のためのステップ（ｃ）から収集した画分の洗浄。
ＨＳＣは通常、骨髄中に存在するが、末梢血液からＨＳＣを採取するために、動員剤を投与することにより循環血液中に動員できる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣが採取される対象は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）などの動員剤を投与される。動員剤を用いる動員により収集されるＨＳＣの数は、動員剤を使用せずに得られる細胞の数より通常多い。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、末梢血ＨＳＣである。
いくつかの実施形態では、試料は、対象から得られ、その後、所望の細胞型（例えば、ＣＤ３４＋／ＣＤ３３－細胞）が濃縮される。例えば、ＰＢＭＣおよび／またはＣＤ３４＋造血細胞は、本明細書で記載されるように血液から単離できる。細胞はまた、他の細胞から、例えば、所望の細胞型の細胞表面のエピトープに結合する抗体を用いる単離および／または活性化により単離できる。使用できる別の方法は、受容体関与による細胞活性化を伴わずに特定細胞型を選択的に濃縮するために細胞表面マーカーに対する抗体を用いるネガティブ選択を含む。
ＨＳＣ集団は、ＨＳＣを遺伝子操作して系統特異的細胞表面抗原を欠如させる前または後に拡張されてよい。細胞は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ－３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ－３）、またはインターロイキン６（ＩＬ－６）などの、１種類以上のサイトカインを含有する増殖培地を含む条件下で培養され得る。細胞は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５日またはいずれかの必要な範囲の期間にわたり、拡張され得る。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、対象から得られた試料からの所望の細胞集団（例えば、ＣＤ３４＋／ＣＤ３３－）の単離後で、遺伝子操作前に拡張される。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは遺伝子操作後に拡張され、これにより遺伝子改変を受けて系統特異的細胞表面抗原を欠く細胞を選択的に拡張する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変の後で所望の特性（例えば、表現型または遺伝型）を有する１つの細胞（「１つのクローン」）またはいくつかの細胞が、選択され独立して拡張され得る。
いくつかの実施形態では、造血細胞は、細胞表面系統特異的抗原（例えばＣＤ３３）を欠く（例えば、発現しない）ように遺伝子操作される。いくつかの実施形態では、造血細胞は、物質により標的化されるものと同じ細胞表面系統特異的抗原を欠くように遺伝子操作される。本明細書で使用される場合、造血細胞が、遺伝子操作された造血細胞と同じタイプの天然起源造血細胞（例えば、ＣＤ３４などの同一細胞表面マーカーの存在により特徴付けられる）と比べて細胞表面系統特異的抗原の著しく低減した発現を有する場合、造血細胞は、細胞表面系統特異的抗原を欠いているとみなされる。いくつかの実施形態では、造血細胞は、細胞表面系統特異的抗原の検出可能な発現を有しない（例えば、細胞表面系統特異的抗原を発現しない）。細胞表面系統特異的抗原の発現レベルは、当該技術分野において既知の任意の手段により評価できる。例えば、細胞表面系統特異的抗原の発現レベルは、抗原特異的抗体を用いて抗原を検出することにより評価できる（例えば、フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング法）。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された造血細胞上の細胞表面系統特異的抗原の発現は、天然起源造血細胞（例えば、野性型対応物）上の細胞表面系統特異的抗原の発現と比べられる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作は、天然起源造血細胞上の細胞表面系統特異的抗原の発現と比べて、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の細胞表面系統特異的抗原の発現レベルにおける低減をもたらす。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された造血細胞は、天然起源造血細胞（例えば、野性型対応物）と比較して、約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満の細胞表面系統特異的抗原（例えば、ＣＤ３３）を発現する。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作は、天然起源造血細胞上の細胞表面系統特異的抗原の発現レベルと比べて、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、野性型細胞表面系統特異的抗原（例えば、ＣＤ３３）の発現レベルの低減をもたらす。すなわち、いくつかの実施形態では、遺伝子操作された造血細胞は、天然起源造血細胞（例えば、野性型対応物）と比較して、約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満の野性型細胞表面系統特異的抗原（例えば、ＣＤ３３）を発現する。
いくつかの実施形態では、造血細胞は、細胞表面系統特異的抗原をコードする全内因性遺伝子を欠く。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原をコードする全内因性遺伝子が、除去されている。いくつかの実施形態では、造血細胞は、細胞表面系統特異的抗原をコードする内因性遺伝子の一部を含む。いくつかの実施形態では、造血細胞は、細胞表面系統特異的抗原の一部（例えば、短縮タンパク質）を発現する。他の実施形態では、細胞表面系統特異的抗原をコードする内因性遺伝子の一部が、除去されている。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原をコードする遺伝子の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれより多くが、除去されている。
当業者により理解されるように、造血細胞が抗原を欠く（例えば、著しく低減した抗原の発現を有する）ように、細胞表面系統特異的抗原をコードするヌクレオチド配列の一部は、除去されているか、または１つまたは複数の非コード配列であり得る。
いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原は、ＣＤ３３である。ＣＤ３３の予測される構造は、２つの免疫グロブリン領域であるＩｇＶ領域およびＩｇＣ２領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３の免疫グロブリンＣ領域の一部が、除去される。
細胞表面系統特異的抗原を欠く、ＨＳＣなどの遺伝子操作された造血細胞のいずれかは、定型的な方法によりまたは本明細書で記載される方法により調製できる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作は、ゲノム編集を用いて実施される。本明細書で使用される場合、「ゲノム編集」は、生物の、任意のタンパク質コードまたは非コードヌクレオチド配列を含む、ゲノムを改変して標的遺伝子の発現をノックアウトする方法を指す。一般に、ゲノム編集法は、ゲノムの核酸を、例えば、標的とされるヌクレオチド配列で切断できるエンドヌクレアーゼの使用を含む。ゲノム中の二本鎖切断の修復は、変異を導入して修復され得、および／または外来の核酸が、標的化部位に挿入され得る。
ゲノム編集法は一般的に、標的核酸中で二本鎖切断を生じることに関与するエンドヌクレアーゼのタイプに基づいて分類される。これらの方法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターをベースとしたヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用を含む。
本開示の一態様では、改変された正常細胞集団による腫瘍細胞の置換は、系統特異的抗原が改変される正常細胞を用いて実施される。このような改変は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を用いる任意の系統特異的抗原の枯渇または阻害を含み得、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ９系は、遺伝子操作された非天然起源ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系である（図４）。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、限定されないが、細菌、ヒト、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュおよび植物を含む様々な生物のゲノムを編集するためにうまく使用されている。例えば、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１３）３１（３）：２３３；Ｑｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ（２０１３）５：１１７３；ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１３）７：４３３６；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１３），３：２２７）；Ｇｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１３）１９４：１０２９；Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）６１２１：８１９；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）６１２１：８２３；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１３）３：２３０；およびＪｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１３）４１（２０）：ｅｌ８８、を参照されたい。
本開示は、系統特異的抗原ポリヌクレオチド中の標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよび遺伝子操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（または単鎖ガイドＲＮＡ）を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体は、系統特異的抗原ポリヌクレオチドに結合でき、抗原ポリヌクレオチドの切断を可能にし、これによりポリヌクレオチドを改変する。
本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、コードまたは非コード領域中の細胞表面系統特異的抗原内で、遺伝子内またはその付近で、例えばリーダー配列、トレーラー配列、またはイントロンなど、あるいは非転写領域内で、コード領域の上流または下流のいずれかにおいて、目的の領域に結合する／または目的の領域を切断し得る。本開示で使用されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ｇＲＮＡがゲノム中の所定の切断部位（標的部位）へのＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体の結合を指示するように設計され得る。切断部位は、未知配列領域を、またはＳＮＰ、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、再配列などを含む領域を含むフラグメントを放出するように選択され得る。
遺伝子領域の切断は、Ｃａｓ酵素により標的配列の位置で一本鎖または二本鎖を切断することを含み得る。一実施形態では、このような切断は、標的遺伝子の転写の低下をもたらし得る。別の実施形態では、切断は、外来の鋳型ポリヌクレオチドを用いる相同組換えにより、切断された標的ポリヌクレオチドを修復することをさらに含み、修復は、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を生じる。
用語「ｇＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、および「ＣＲＩＳＰＲガイド配列」は、全体を通して同じ意味で用いられ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣａｓ ＤＮＡ結合タンパク質の特異性を決定する配列を含む核酸を指す。ｇＲＮＡは、ホスト細胞のゲノム中の標的核酸配列に（相補的、部分的、または完全に）ハイブリダイズする。標的核酸にハイブリダイズするｇＲＮＡまたはその一部は、長さが１５～２５個のヌクレオチド、１８～２２個のヌクレオチド、または１９～２１個のヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、標的核酸にハイブリダイズするｇＲＮＡ配列は、長さが１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的核酸配列にハイブリダイズするｇＲＮＡ配列は、長さが１０～３０個、または１５～２５個のヌクレオチドである。
標的核酸に結合する配列に加え、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、スキャホールド配列も含む。標的核酸に相補的な配列およびスキャホールド配列の両方をコードするｇＲＮＡの発現は、標的核酸に結合する（ハイブリダイズする）機能および標的核酸にエンドヌクレアーゼを動員する機能の二重機能を有し、これは、部位特異的なＣＲＩＳＰＲ活性を生じ得る。いくつかの実施形態では、このようなキメラｇＲＮＡは、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれる。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、修飾、例えば、化学的に修飾される。修飾ｇＲＮＡは、核酸塩基、糖、およびリン酸ジエステル結合または骨格部分（例えば、ヌクレオチドホスフェート）の少なくとも１つの化学構造に修飾を有する少なくとも１種のヌクレオチドを含む。例示的なｇＲＮＡ修飾は、当業者に明らかであり、例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ａｎｄ ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ ａｒｅ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｅｌｉｆｅ．２０１７ Ｍａｙ ２；６．ｐｉｉ：ｅ２５３１２．ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．２５３１２ ａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ２０１６／０２８９６７５、で見つけることができる。 追加の好適な修飾は、ホスホロチオエート骨格修飾、２’－Ｏ－Ｍｅ修飾糖、２’Ｆ－修飾糖、リボース糖の二環式ヌクレオチド－ｃＥｔによる置換、３’ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、またはこれらの組み合わせ、を含む。好適なｇＲＮＡ修飾は、例えば、Ｒａｈｄａｒ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２２，２０１５ １１２（５１）Ｅ７１１０－Ｅ７１１７ ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５ Ｓｅｐ；３３（９）：９８５－９８９に記載されている。この文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書で記載のｇＲＮＡは、化学的に修飾される。例えば、ｇＲＮＡは、１種または複数の２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、ｇＲＮＡの５’末端に２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、ｇＲＮＡの３’末端に２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、ｇＲＮＡの５’末端および３’末端の両方に、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－修飾、例えば、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－修飾、例えば、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－修飾、例えば、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－修飾、例えば、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチドは、化学的に修飾されない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチドは、化学的に修飾された糖を有しない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－メチル修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－修飾される。いくつかの実施形態では、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのリン酸結合を含む。いくつかの実施形態では、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのｔｈｉｏＰＡＣＥ結合を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１種または複数の２’－Ｏ修飾ヌクレオチドおよび３’リン修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエートヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾、例えば、ｇＲＮＡの５’末端に、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエートヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾、例えば、ｇＲＮＡの３’末端に、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエートヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾および３’リン修飾、例えば、ｇＲＮＡの５’末端および３’末端に、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエートヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１個または複数の非架橋酸素原子がイオウ原子で置換される骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－修飾および３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－修飾および３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－修飾および３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－修飾および３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチドは、化学的に修飾されない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチドは、化学的に修飾された糖を有しない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－修飾および３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾される。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１種または複数の２’－Ｏ修飾および３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ｔｈｉｏＰＡＣＥヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－修飾および３’リン修飾、例えば、ｇＲＮＡの５’末端に２’－Ｏ－メチル３’ｔｈｉｏＰＡＣＥヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－修飾および３’リン修飾、例えば、ｇＲＮＡの３’末端に２’－Ｏ－メチル３’ｔｈｉｏＰＡＣＥヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－修飾および３’リン修飾、例えば、ｇＲＮＡの５’末端および３’末端に２’－Ｏ－メチル３’ｔｈｉｏＰＡＣＥヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１個または複数の非架橋酸素原子がイオウ原子で置換され、１個または複数の非架橋酸素原子がアセテート基で置換されている骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－修飾および３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ｔｈｉｏＰＡＣＥ修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－修飾および３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ｔｈｉｏＰＡＣＥ修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは２’－Ｏ－修飾および３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－修飾および３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ｔｈｉｏＰＡＣＥ修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチドは、化学的に修飾されない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチドは、化学的に修飾された糖を有しない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－修飾および３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目ヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ｔｈｉｏＰＡＣＥ修飾される。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、化学的に修飾された骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、１個または複数の非架橋酸素原子が、イオウ原子で置換されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチドはそれぞれ、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドはそれぞれ、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドはそれぞれ、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドはそれぞれ、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドはそれぞれ、ホスホロチオエート結合を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｔｈｉｏＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１個または複数の非架橋酸素原子がイオウ原子で置換され、１個または複数の非架橋酸素原子がアセテート基で置換されている骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチドはそれぞれ、ｔｈｉｏＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドはそれぞれ、ｔｈｉｏＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドはそれぞれ、ｔｈｉｏＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドはそれぞれ、ｔｈｉｏＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、およびｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドはそれぞれ、ｔｈｉｏＰＡＣＥ結合を含む。
ｇＲＮＡの化学修飾は、例えば、Ｈｅｎｄｅｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０１５，Ｖｏｌ ３３，Ｎｏ．９に記載され、この文献の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「スキャホールド配列」は、ｔｒａｃｒＲＮＡとも呼ばれ、相補的ｇＲＮＡ配列に結合された（ハイブリダイズした）標的核酸にＣａｓエンドヌクレアーゼを動員する核酸配列を指す。少なくとも１つのステムループ構造を含み、エンドヌクレアーゼを動員する任意のスキャホールド配列は、本明細書で記載される遺伝子エレメントおよびベクターで使用され得る。例示的なスキャホールド配列は、当業者に明らかであり、例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７（６０９６）：８１６－８２１、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２０１３）８：２２８１－２３０８、国際公開第２０１４／０９３６９４号、および同第２０１３／１７６７７２号に見出される。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、スキャホールド配列を含まず、スキャホールド配列は、別の転写として発現される。このような実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、スキャホールド配列の一部に相補的であり、かつスキャホールド配列を結合（ハイブリダイズ）し標的核酸にエンドヌクレアーゼを動員するように機能する、追加の配列をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、標的核酸に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または少なくとも１００％相補的である（標的ポリヌクレオチド配列とのｇＲＮＡ配列の相補性の教示のために、参照により組み込まれる米国特許第８，６９７，３５９号も参照されたい）。ＣＲＩＳＰＲガイド配列と標的核酸の３’端付近の標的核酸との間のミスマッチは、ヌクレアーゼ切断活性を消滅させ得ることが実証されている（Ｕｐａｄｈｙａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１３）３（１２）：２２３３－２２３８）。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、標的核酸の３’末端（例えば、標的核酸の３’末端の最後の５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチド）に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または少なくとも１００％相補的である。
標的核酸は、エンドヌクレアーゼと相互作用し標的核酸にエンドヌクレアーゼ活性を標的化することにさらに関与し得るプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に３’側で隣接される。一般に、標的核酸配列に隣接するＰＡＭ配列は、エンドヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼが由来する起源に依存すると考えられる。例えば、化膿性連鎖球菌由来であるＣａｓ９エンドヌクレアーゼでは、ＰＡＭ配列は、ＮＧＧである。黄色ブドウ球菌由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼでは、ＰＡＭ配列は、ＮＮＧＲＲＴである。髄膜炎菌由来であるＣａｓ９エンドヌクレアーゼでは、ＰＡＭ配列は、ＮＮＮＮＧＡＴＴである。スタフィロコックス・サーモフィルス由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼでは、ＰＡＭ配列は、ＮＮＡＧＡＡである。トレポネーマ・デンティコラ由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼでは、ＰＡＭ配列は、ＮＡＡＡＡＣである。Ｃｐｆ１ヌクレアーゼでは、ＰＡＭ配列は、ＴＴＮである。
いくつかの実施形態では、細胞を遺伝子操作することは、１種または複数の（例えば、１、２、３またはそれを超える）Ｃａｓエンドヌクレアーゼを細胞中に導入することも含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡをコードする核酸は、同じ核酸（例えば、ベクター）上で提供される。いくつかの実施形態では、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡをコードする核酸は、異なる核酸（例えば、異なるベクター）上で提供される。これに代えて、または追加で、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、細胞中にタンパク質形態で提供または導入され得る。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９酵素またはそのバリアントである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、化膿性連鎖球菌（ＳｐＣａｓ９）、黄色ブドウ球菌（ＳａＣａｓ９）、髄膜炎菌（ＮｍＣａｓ９）、ストレプトコッカス・サーモフィルス、カンピロバクター・ジェジュニ（ＣｊＣａｓ９）、またはトレポネーマ・デンティコラ由来である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、ホスト細胞中での発現のためにコドン最適化され得る。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、タンパク質の活性を変えるためにさらに改変される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、「ニッカーゼ」または「Ｃａｓ９ｎ」と呼ばれる、エンドヌクレアーゼの触媒的残基の１つを不活化するように改変されている。Ｃａｓ９ニッカーゼエンドヌクレアーゼは、標的核酸の１つのＤＮＡストランドを切断する。例えば、Ｄａｂｒｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０１８）１２（７５）を参照されたい。酵素のＲｕｖＣおよびＨＮＨ触媒領域中の１個または複数の変異は、Ｃａｓ９効率を改善し得ることが示された。例えば、Ｓａｒａｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ Ｐｈａｒｍａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１７）１８（１３）を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣａｓ９である。例えば、ｄＣａｓ９は、触媒的に活性な残基（Ｄ１０およびＨ８４０）の変異を含み、ヌクレアーゼ活性を有しない。これに代えて、または追加で、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、別のタンパク質またはその一部に融合され得る。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９は、ＫＲＡＢ領域などのリプレッサー領域に融合される。いくつかの実施形態では、このようなｄＣａｓ９融合タンパク質は、多重遺伝子抑制（例えば、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ））のために本明細書で記載される構築物で使用される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９は、ＶＰ６４またはＶＰＲなどのアクチベーター領域に融合される。いくつかの実施形態では、このようなｄＣａｓ９融合タンパク質は、遺伝子活性化（例えば、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ））のために本明細書で記載される構築物で使用される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９は、ヒストンデメチラーゼ領域またはヒストンアセチルトランスフェラーゼ領域などのエピジェネティック調節領域に融合される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９は、ＬＳＤ１またはｐ３００、あるいはこれらの一部に融合される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９融合は、ＣＲＩＳＰＲをベースとするエピジェネティック調節のために使用される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９またはＣａｓ９は、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼ領域に融合される。いくつかの実施形態では、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼ領域に融合されたＣａｓ９またはｄＣａｓ９は、ゲノム編集のために使用される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９は、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙなど）に融合される。いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質に融合されたＣａｓ９／ｄＣａｓ９タンパク質は、ゲノム遺伝子座の標識および／または可視化、あるいはＣａｓエンドヌクレアーゼを発現する細胞を特定するために使用される。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、酵素の特異性を高めるように改変される（例えば、オフターゲット効果を低減させる、強いオンターゲット切断を維持する）。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、特異性強化Ｃａｓ９バリアント（例えば、ｅＳＰＣａｓ９）である。例えば、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１６）３５１（６２６８）：８４－８８を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、高忠実度Ｃａｓ９バリアント（例えば、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１）である。例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）５２９：４９０－４９５を参照されたい。
ＣａｓエンドヌクレアーゼなどのＣａｓ酵素は、当技術分野において既知であり、種々の供給源から得られ、および／または遺伝子操作／遺伝子改変されて、酵素の１種または複数の活性または特異性を調節し得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ酵素は、１種または複数のＰＡＭ配列を認識するように遺伝子操作／遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ酵素が遺伝子操作／遺伝子改変なしに認識するＰＡＭ配列とは異なる１種または複数のＰＡＭ配列を認識するように遺伝子操作／遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ酵素は、酵素のオフターゲット活性を低減するように遺伝子操作／遺伝子改変されている。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、エンドヌクレアーゼの特異性を変えるようにさらに改変される（例えば、オフターゲット切断を減らす、細胞中でのＣａｓエンドヌクレアーゼ活性または寿命を減らす、相同組み換えを高める、および非相同末端結合を減らす）。例えば、Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ（２０１７）１６８：２０－３６を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、エンドヌクレアーゼのＰＡＭ認識を変えるように改変される。例えば、ＣａｓエンドヌクレアーゼＳｐＣａｓ９は、ＰＡＭ配列ＮＧＧを認識し、一方、１個または複数のエンドヌクレアーゼの改変を含むＳｐＣａｓ９の緩和バリアント（例えば、ＶＱＲ ＳｐＣａｓ９、ＥＱＲ ＳｐＣａｓ９、ＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９）は、ＰＡＭ配列ＮＧＡ、ＮＧＡＧ、ＮＧＣＧを認識し得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、改変されていないＣａｓエンドヌクレアーゼに比べて、より潜在性の高いＰＡＭ配列を認識する場合、改変ＣａｓエンドヌクレアーゼのＰＡＭ認識は、「緩和されている」と考えられる。例えば、ＣａｓエンドヌクレアーゼＳａＣａｓ９は、ＰＡＭ配列ＮＮＧＲＲＴを認識し、一方、１個または複数のエンドヌクレアーゼの改変を含むＳａＣａｓ９の緩和バリアント（例えば、ＫＫＨ ＳａＣａｓ９）は、ＰＡＭ配列ＮＮＮＲＲＴを認識し得る。一例では、ＣａｓエンドヌクレアーゼＦｎＣａｓ９は、ＰＡＭ配列ＮＮＧを認識し、一方、１個または複数のエンドヌクレアーゼの改変を含むＦｎＣａｓ９の緩和バリアント（例えば、ＲＨＡ ＦｎＣａｓ９）は、ＰＡＭ配列ＹＧを認識し得る。一例では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、置換変異Ｓ５４２ＲおよびＫ６０７Ｒを含むＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、ＰＡＭ配列ＴＹＣＶを認識する。一例では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、置換変異Ｓ５４２Ｒ、Ｋ６０７Ｒ、およびＮ５５２Ｒを含むＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、ＰＡＭ配列ＴＡＴＶを認識する。例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１７）３５（８）：７８９－７９２を参照されたい。
いくつかの実施形態では、２種以上の（例えば、２、３またはそれを超える）Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、使用される。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９酵素である。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１酵素である。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、化膿性連鎖球菌由来である。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、化膿性連鎖球菌由来であり、少なくとも１種のＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、化膿性連鎖球菌ではない生物由来である。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、塩基エディターである。塩基エディターエンドヌクレアーゼは通常、機能領域に融合された触媒的に不活性なＣａｓエンドヌクレアーゼを含む。例えば、Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２０１８）４７５（１１）：１９５５－１９６４；Ｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１８）１９：７７０－７８８を参照されたい。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓエンドヌクレアーゼは、ｄＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、１個または複数のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）領域に融合されたｄＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、例えば、ＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡから進化したＡＢＥに融合されたｄＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、シチジンデアミナーゼ酵素（例えば、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ、ｐｍＣＤＡ１、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ））に融合されたｄＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓエンドヌクレアーゼは、低減された活性を有し、ｎＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、１個または複数のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）領域に融合されたｎＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、例えば、ＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡから進化したＡＢＥに融合されたｎＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、シチジン（ｃｙｔｏｄｉｎｅ）デアミナーゼ酵素（例えば、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ、ｐｍＣＤＡ１、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ））に融合されたｎＣａｓ９を含む。
塩基エディターの例としては、限定されないが、ＢＥ１、ＢＥ２、ＢＥ３、ＨＦ－ＢＥ３、ＢＥ４、ＢＥ４ｍａｘ、ＢＥ４－Ｇａｍ、ＹＥ１－ＢＥ３、ＥＥ－ＢＥ３、ＹＥ２－ＢＥ３、ＹＥＥ－ＣＥ３、ＶＱＲ－ＢＥ３、ＶＲＥＲ－ＢＥ３、ＳａＢＥ３、ＳａＢＥ４、ＳａＢＥ４－Ｇａｍ、Ｓａ（ＫＫＨ）－ＢＥ３、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ－ＮＧ、ｘＢＥ３、ｅＡ３Ａ－ＢＥ３、ＢＥ－ＰＬＵＳ、ＴＡＭ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｘ、ＡＢＥ７．９、ＡＢＥ７．１０、ＡＢＥ７．１０＊、ｘＡＢＥ、ＡＢＥＳａ、ＶＱＲ－ＡＢＥ、ＶＲＥＲ－ＡＢＥ、Ｓａ（ＫＫＨ）－ＡＢＥ、およびＣＲＩＳＰＲ－ＳＫＩＰが挙げられる。塩基エディターの追加の例は、例えば、米国特許公報第２０１８／０３１２８２５Ａ１号、同２０１８／０３１２８２８Ａ１号、およびＰＣＴ国際公開第２０１８／１６５６２９Ａ１で見つけることができる。これらの特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、塩基エディターは、標的部位で塩基除去修復を阻害し細胞ミスマッチ修復を誘導するようにさらに改変されている。本明細書で記載のいずれかのＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｇａｍ領域（バクテリオファージＭｕタンパク質）に融合され、劣化およびエキソヌクレアーゼ活性からＣａｓエンドヌクレアーゼを保護する。例えば、Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２０１８）４７５（１１）：１９５５－１９６４を参照されたい。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼのクラス２タイプＶに属する。クラス２タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼはさらに、タイプＶ－Ａ、タイプＶ－Ｂ、タイプＶ－Ｃ、およびタイプＶ－Ｕに分類される。例えば、Ｓｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１７）を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、タイプＶ－Ａ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、タイプＶ－Ｂ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃ２ｃ１エンドヌクレアーゼである。例えば、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ（２０１５）６０：３８５－３９７を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＣａｓエンドヌクレアーゼはＭａｄ７である。
これに代えて、または追加で、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼまたはそのバリアントである。当業者なら理解するように、ＣａｓエンドヌクレアーゼＣｐｆ１ヌクレアーゼはまた、Ｃａｓ１２ａとも呼ばれる。例えば、Ｓｔｒｏｈｋｅｎｄｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ（２０１８）７１：１－９を参照されたい。 いくつかの実施形態では、ホスト細胞は、プレボテラ種またはフランシセラ種、アシドアミノコッカス属（ＡｓＣｐｆ１）、ラクノスピラ菌（ＬｐＣｐｆ１）またはユーバクテリウムレクタレ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼを発現する。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、ホスト細胞における発現のためにコドン最適化され得る。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、タンパク質の活性を変えるようにさらに改変される。
触媒的に不活性なＣｐｆ１のバリアント（Ｃａｓ１２ａ）は、ｄＣａｓ１２ａと呼ばれ得る。本明細書に記載されるように、触媒的に不活性なＣｐｆ１のバリアントは、機能領域に融合されて、塩基エディターを形成し得る。例えば、Ｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１８）１９：７７０－７８８を参照されたい。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓエンドヌクレアーゼは、ｄＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、１個または複数のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）領域に融合されたｄＣａｓ１２ａを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、例えば、ＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡから進化したＡＢＥに融合されたｄＣａｓ１２ａを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、シチジン（ｃｙｔｏｄｉｎｅ）デアミナーゼ酵素（例えば、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ、ｐｍＣＤＡ１、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ））に融合されたｄＣａｓ１２ａを含む。
これに代えて、または追加で、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼまたはそのバリアントであり得る。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼとは対照的に、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼは、古細菌由来であり、サイズが小さい傾向がある（例えば、４００～７００個のアミノ酸）。さらに、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼは、ＰＡＭ配列を必要としない。例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１８）を参照されたい。
本明細書で記載のいずれかのＣａｓエンドヌクレアーゼは、所望の時間に、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの発現レベルおよび／または活性を制御するように調節され得る。例えば、細胞周期の特定の期の間にＣａｓエンドヌクレアーゼの発現および／または活性レベルを高めることが好都合な場合がある。相同組替え修復のレベルは、細胞周期のＧ１期中に低減され、そのためＳ期、Ｇ２期、および／またはＭ期中にＣａｓエンドヌクレアーゼの発現および／または活性レベルを高めることは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ編集後に相同組替え修復を高め得ることが示された。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの発現および／または活性レベルは、細胞周期のＳ期、Ｇ２期、および／またはＭ期中に高められる。一例では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ヒトジェミニンのＮ末端領域に融合される。例えば、Ｇｕｔｓｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．（２０１６）１４（６）：１５５５－１５６６を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの発現および／または活性レベルは、Ｇ１期に中に低減される。一例では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｇ１期中に活性が低減されているように調節される。例えば、Ｌｏｍｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（２０１８）を参照されたい。
代わりに、または追加して、本明細書で記載のＣａｓエンドヌクレアーゼのいずれかは、エピジェネティックモディファイアー（例えば、クロマチン修飾酵素、例えば、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素）に融合され得る。例えば、Ｋｕｎｇｕｌｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．（２０１６）３２（２）：１０１－１１３を参照されたい。エピジェネティックモディファイアーに融合されたＣａｓエンドヌクレアーゼは、「エピジェネティックエフェクター（ｅｐｉｅｆｆｅｃｔｏｒ）」と呼ばれ、一時的なおよび／または一過的なエンドヌクレアーゼ活性を可能にする。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、クロマチン修飾酵素に融合されたｄＣａｓ９である。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いる造血細胞中の細胞表面系統特異的抗原を阻害するための組成物および方法を提供し、ガイドＲＮＡ配列は、細胞表面系統特異的抗原をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原は、ＣＤ３３であり、ｇＲＮＡはＣＤ３３をコードするヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズする（図５）。ＣＤ３３を標的にするｇＲＮＡの例を、表４に示すが、ＣＤ３３にハイブリダイズし本明細書で記載される方法で使用できる追加のｇＲＮＡが、開発され得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号５０または配列番号５１を含む。
表４は、ＣＤ３３の一部にハイブリダイズする、またはハイブリダイズすることが予測される例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。例示的ガイドＲＮＡ配列のＲＮＡおよびＤＮＡ両方の配列が提供され、当業者は、特に断りのない限り、本出願中で記載されるポリヌクレオチド配列は、代表的ＤＮＡ配列中では「Ｔ」を用いるが、ＲＮＡを表す配列場合は、「Ｔ」は「Ｕ」で置換されることを理解するであろう。
Figure 2022517618000006
いくつかの事例では、本開示で使用するためのｇＲＮＡは、上記表４の例示的ガイドＲＮＡ配列のいずれか、例えば、配列番号６７、配列番号６８または配列番号７０に少なくとも９０％（少なくとも９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一であるスペーサー配列を含み得る。
２つの核酸の「パーセント同一性」は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４－６８，１９９０の、改良されたＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３－７７，１９９３のアルゴリズムを用いて決定される。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長－１２で実施して、本発明の核酸分子と相同的なヌクレオチド配列を得ることができる。２つの配列の間にギャップが存在する場合、ギャップＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２，１９９７で報告されているように使用できる。 ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを、使用できる。
いくつかの実施形態では、ＨＳＣ、特に同種異系ＨＳＣをさらに遺伝子操作して移植片対宿主効果を低減することが望まれ得る。例えば、再発したＡＭＬの標準的治療は、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）である。しかしＨＳＣＴの成功を制約する要因の少なくとも１つは、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）であり、これには細胞表面分子ＣＤ４５の発現が関与している。例えば、Ｖａｎ Ｂｅｓｉｅ，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｈｅｍａｔｏｌ Ｅｄｕｃ Ｐｒｏｇｒａｍ（２０１３）５６；Ｍａｗａｄ Ｃｕｒｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｍａｌｉｇ．Ｒｅｐ．（２０１３）８（２）：１３２を参照されたい。ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯは、ＣＤ４５（赤血球以外のすべての造血細胞で認められる）のアイソフォームである。Ｔリンパ球では、ＣＤ４５ＲＡは、ナイーブ細胞上で発現され、一方、ＣＤ４５ＲＯは、記憶細胞上で発現される。ＣＤ４５ＲＡ Ｔ細胞は、ＨＳＣＴ後のレシピエント特異的抗原に対して反応性である可能性が高く、ＧＶＨＤをもたらす。このため、移植拒絶またはＧＶＨＤの可能性も低減する、効率的で安全なＡＭＬ治療の必要性が残されている。ＣＤ４５を有する細胞は生存のために必要とされるが抗原はＣＲＩＳＰＲを用いて幹細胞から除去され得るため、ＣＤ４５は、１型系統抗原である。
ＨＳＣＴ後のＧＶＨＤの進行に起因して合併症が生じることを考慮して、本開示は、ＣＤ４５ＲＡを標的にする組成物および方法も提供する。このような組成物および方法は、ＧＶＨＤの発生または程度を防止および／または低減することが意図される。
このため、ＧＶＨＤの場合、患者の治療は、次のステップを含み得る：（１）患者に治療有効量のＴ細胞を投与するステップであって、Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＡ系統特異的抗原を標的にするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む、ステップ、および（２）患者に造血幹細胞を注入するステップであって、造血細胞がＣＤ４５ＲＡ系統特異的抗原の発現を低減させている、ステップ。
さらに、本開示は、ＣＤ３３およびＣＤ４５ＲＡ両方の系統特異的抗原の組み合わせ阻害のための組成物および方法を提供する。このような治療レジメンは、次のステップを含み得る：（１）患者に治療有効量のＴ細胞を投与するステップであって、Ｔ細胞がＣＤ３３およびＣＤ４５ＲＡ系統特異的抗原を標的にするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む、ステップ、および（２）患者に自己または同種異系のどちらかで造血幹細胞を注入または再注入するステップであって、造血細胞がＣＤ３３およびＣＤ４５ＲＡ系統特異的抗原の発現を低減させている、ステップ。
いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原ＣＤ４５ＲＡはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて造血細胞中で除去または阻害される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ＣＤ４５ＲＡをコードするヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズする（図６）。ＣＤ４５ＲＡを標的にするｇＲＮＡの例を、表５に示すが、ＣＤ４５ＲＡにハイブリダイズして本明細書で記載の方法で使用できる追加のｇＲＮＡが、開発され得る。
表５は、ヒトＣＤ４５のエクソン４またはエクソン５にハイブリダイズする、またはハイブリダイズすることが予測される例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
Figure 2022517618000007
本明細書において、細胞表面系統特異的抗原を欠く細胞を製造する方法も提供され、細胞を用意することおよびゲノム編集のためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素を細胞中に導入することを含む。いくつかの実施形態では、系統特異的細胞表面抗原をコードするヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズする、またはハイブリダイズすることが予測されるＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む核酸が、細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡはベクターで細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする核酸として細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、同じ核酸（例えば、同じベクター）で細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、タンパク質の形態で細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡは、インビトロで予め形成され、複合体として細胞中に導入される。
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体の１つまたは複数の構成要素をコードできる、遺伝子操作された非天然起源ベクターおよびベクター系をさらに提供し、ベクターは、（ｉ）系統特異的抗原配列にハイブリダイズする（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣａｓシステムガイドＲＮＡ、および（ｉｉ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、を含む。
本開示のベクターは、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞中で１つまたは複数の配列の発現を誘導できる。哺乳動物発現ベクターの例は、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２９：８４０）、およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８７）６：１８７）を含む。哺乳動物細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は通常、１つまたは複数の調節エレメントによってもたらされる。例えば、よく使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウィルス２、サイトメガロウィルス、サルウィルス４０、ならびに本明細書で開示される、および当該技術分野において既知の他のもの由来である。原核細胞および真核細胞の両方に適した他の発現系に関しては 、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章と第１７章、を参照されたい。
本開示のベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指示できる（例えば、組織特異的調節エレメントが核酸を発現させるために使用される）。このような調節エレメントは、組織特異的または細胞特異的であり得るプロモーターを含む。用語「組織特異的」は、プロモーターに適用される場合、目的のヌクレオチド配列の選択的発現を特定タイプの組織（例えば、種子）に指示でき、異なるタイプの組織では目的の同じヌクレオチド配列の発現を相対的に欠く、プロモーターを指す。用語「細胞型特異的」は、プロモーターに適用される場合、目的のヌクレオチド配列の選択的発現を特定の細胞型に指示でき、同じ組織内の異なる型の細胞では目的の同一ヌクレオチド配列の発現を相対的に欠く、プロモーターを指す。用語「細胞型特異的」は、プロモーターに適用される場合、単一組織内の領域で目的のヌクレオチド配列の選択的発現を促進できるプロモーターも意味する。プロモーターの細胞型特異性は、当該技術分野において良く知られた方法、例えば、免疫組織化学染色を用いて評価され得る。
従来のウィルスおよび非ウィルスに基づく遺伝子移入方法を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をコードする核酸を哺乳動物細胞または標的組織に導入できる。このよう方法を使用して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの構成要素をコードする核酸を培養下の細胞に、またはホスト生物に投与できる。
非ウィルス送達系は、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書で記載されるベクターの転写物）、ネイキッド核酸、および送達担体と複合体化された核酸を含む。一実施形態では、非ウィルスベクター送達システムは、予め形成されたリボ核タンパク質複合体（例えば、標的化ｇＲＮＡと複合化したＣａｓ９タンパク質を含む複合体）である。予め形成されたリボ核タンパク質複合体は次に、電気穿孔、微粒子銃照射、または他の物理的送達方法により細胞中に導入され得る。一実施形態では、電気穿孔を用いて、予め形成されたリボ核タンパク質複合体を細胞中に導入する。
ウィルスベクター送達システムは、ＤＮＡおよびＲＮＡウィルスを含み、これらは、細胞に送達後、エピソームまたは統合されたゲノムを有する。ウィルスベクターは、患者に直接的に投与され得る（インビボ）か、それらは、インビトロまたはエクスビボで細胞を操作するために使用でき、改変された細胞が患者に投与され得る。一実施形態では、本開示は、限定されないが、遺伝子移送のためにレトロウィルス、レンチウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルスおよび単純ヘルペスウィルスを含むウィルスをベースとした系を利用する。さらに、本開示は、レトロウィルスまたはレンチウィルスなどの、ホストゲノム中で統合が可能なベクターを提供する。好ましくは、本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの発現のために使用されるベクターは、レンチウィルスベクターである。
一実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓをコードする１つまたは複数のベクターの真核細胞への導入を提供する。細胞は、癌細胞であってよい。あるいは、細胞は、造血幹細胞などの造血細胞である。幹細胞の例は、多能性、複数能性および単能性幹細胞を含む。多能性幹細胞の例は、胚幹細胞、胚性生殖細胞、胚性癌細胞および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む。好ましい実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を造血幹細胞中に導入することを提供する。
本開示のベクターは、対象中の真核細胞に送達される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを介した真核細胞の改変は、細胞培養中に実施でき、本方法は、改変前に対象から真核細胞を分離することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、当該真核細胞および／またはそれから派生した細胞を対象に戻すことをさらに含む。
併用療法
本明細書で記載されるように、細胞表面系統特異的抗原（例えば、ＣＤ３３）に結合する抗原結合フラグメントを含む物質は、細胞表面系統特異的抗原を欠く造血細胞、例えば、本明細書で記載のｇＲＮＡ（例えば、ＡＵＣＣＣＵＧＧＣＡＣＵＣＵＡＧＡＡＣＣ（配列番号６７）またはＣＣＵＣＡＣＵＡＧＡＣＵＵＧＡＣＣＣＡＣ（配列番号７０）のヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡ）を用いて製造された造血幹細胞または前駆細胞と組み合わせて患者に投与され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＣ（配列番号５０）またはＣＣＴＣＡＣＴＡＧＡＣＴＴＧＡＣＣＣＡＣ（配列番号５８）の配列を有する部位に遺伝子変異を含む。本明細書で使用される場合、「対象」、「個体」、および「患者」は、同じ意味で用いられ、脊椎動物、好ましくはヒトなどの哺乳動物を指す。哺乳動物は、限定されないが、ヒト霊長類、非ヒト霊長類、あるいはネズミ、ウシ、ウマ、イヌまたはネコ種を含む。いくつかの実施形態では、対象は、造血器悪性腫瘍を有するヒト患者である。
いくつかの実施形態では、物質および／または造血細胞は、薬学的に許容可能な担体と混合されて医薬組成物を形成し得、これもまた、本開示の範囲内である。
本明細書で記載される方法を実施するため、細胞表面系統特異的抗原に結合する抗原結合フラグメントを含む有効量の物質と、有効量の造血細胞とを、治療を必要とする対象に共投与できる。本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、用語「治療有効量」と同じ意味で用いられ、それを必要とする対象への投与で所望の活性をもたらすのに十分な物質、細胞集団、または医薬組成物（例えば、物質および／または造血細胞を含む組成物）の量を指す。本開示の文脈では、用語「有効量」は、本開示の方法により治療される障害の出現を遅延する、進行を停止する、少なくとも１つの症状を軽減または緩和するために十分である、化合物、細胞集団、または医薬組成物の量を指す。有効成分の組み合わせが投与される場合、組み合わせの有効量は、個別に投与される場合の有効量である各成分の量を含み得る、または含み得ないことに留意すべきである。
有効量は、当業者によって認識されるように、治療される特定の症状、症状の重篤度、個別患者の年齢、身体的状態、身長、性別および体重を含むパラメータ、治療期間、併用療法（実施される場合）の性質、投与の特定経路ならびに医療関係者の知識および見解における要因などに依存して変化する。いくつかの実施形態では、有効量は、対象におけるいずれかの疾患または障害の症状を緩和し、軽減し、回復し、改善し、低減し、または進行を遅延させる。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、造血器悪性腫瘍を有するヒト患者である。
本明細書で記載される場合、キメラ受容体を発現する造血細胞および／または免疫細胞は、対象に対して自己であり得、すなわち、細胞は、治療を必要とする対象から得られ、細胞表面系統特異的抗原の発現またはキメラ受容体構築物の発現を欠くように遺伝子操作され、次いで同じ対象に投与される。対象への自己細胞の投与は、非自己細胞の投与と比べて、ホスト細胞の拒絶低下をもたらし得る。あるいは、ホスト細胞は、同種細胞であり、すなわち、細胞は、第１の対象から得られ、細胞表面系統特異的抗原の発現またはキメラ受容体構築物の発現を欠くように遺伝子操作され、かつ第１の対象とは異なるが同種である第２の対象に投与される。例えば、同種免疫細胞は、ヒトドナー由来であり得、このドナーとは異なるヒトレシピエントに投与される。
いくつかの実施形態では、免疫細胞および／または造血細胞は、同種細胞であり、移植片対宿主病を低減するようにさらに遺伝子操作されている。例えば、本明細書で記載されるように、造血幹細胞は、ＣＤ４５ＲＡの低減された発現を有するように遺伝子操作され得る（例えば、ゲノム編集を用いて）。
いくつかの実施形態では、本明細書で記載されるキメラ受容体のいずれかを発現する免疫細胞は、対象に標的細胞（例えば、癌細胞）の数を少なくとも２０％、例えば、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍またはそれより多く低減するのに有効な量で投与される。
哺乳動物（例えば、ヒト）に投与される、細胞、すなわち免疫細胞または造血細胞の典型的な量は、例えば、１００万～１０００億個の細胞の範囲であってよいが、この例示的な範囲を下回るまたは超える量も、本開示の範囲内である。例えば、細胞の１日量は、約１００万～約５００億個の細胞（例えば、約５００万個、約２５００万個、約５億個、約１０億個、約５０億個、約２００億個、約３００億個、約４００億個、または上記の値のいずれか２つにより定められる範囲）、好ましくは約１０００万～約１０００億個（例えば、約２０００万個、約３０００万個、約４０００万個、約６０００万個、約７０００万個、約８０００万個、約９０００万個、約１００億個、約２５０億個、約５００億個、約７５０億個、約９００億個、または上記の値のいずれか２つにより定められる範囲）、より好ましくは約１億～約５００億個（例えば、約１億２０００万個、約２億５０００万個、約３億５０００万個、約４億５０００万個、約６億５０００万個、約８億個、約９億個、約３０億個、約３００億個、約４５０億個、または上記の値のいずれか２つにより定められる範囲）であってよい。
一実施形態では、キメラ受容体（例えば、キメラ受容体をコードする核酸）は、免疫細胞中に導入され、対象（例えば、ヒト患者）は、キメラ受容体を発現する免疫細胞の初回投与または用量を受ける。物質（例えば、キメラ受容体を発現する免疫細胞）の１回または複数回のその後の投与は、前回の投与後、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２日の間隔で患者に実施され得る。物質の１回を超える投与量は、週あたり、例えば、２回、３回、４回、またはそれより多くの物質の投与で対象に投与されてよい。対象は、週あたり１回を超える物質（例えば、キメラ受容体を発現する免疫細胞）の投与、続いて物質の投与のない１週、かつ最後に１回を超える物質の追加投与（例えば、キメラ受容体を発現する免疫細胞の週あたり１回を超える投与）を受け得る。キメラ受容体を発現する免疫細胞は、２、３、４、５、６、７、８週、またはそれより多い週の間、週あたり３回投与のために１日おきに投与され得る。
本開示の場合、本明細書で記述される疾患症状のいずれかに関する限りにおいて、用語「治療する」、「治療」、および同様の用語は、このような状態と関連する少なくとも１つの徴候を緩和または軽減する、あるいはこのような状態の進行を遅延または回復させることを意味する。本開示の意味では、用語「治療する」は、発症（すなわち、疾患の臨床症状の前の期間）を停止、遅延させる、および／または疾患を発症または悪化するリスクを低減することも意味する。例えば、癌との関連では、用語「治療する」は、患者の腫瘍負荷量を除去または低減する、あるいは転移を防止、遅延、または阻害することなどを意味し得る。
いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原を結合する抗原結合フラグメントを含む物質および細胞表面系統特異的抗原を欠く造血細胞集団。従って、このような治療方法では、物質は、死滅を標的とするために細胞表面系統特異的抗原を発現する標的細胞を認識（結合）する。抗原を欠く造血細胞は、物質により標的にされる細胞型の再増殖を可能にする。いくつかの実施形態では、患者の治療は、以下のステップを含み得る：（１）細胞表面系統特異的抗原を標的にする物質の治療有効量を患者に投与するステップ、および（２）自己または同種のいずれかの造血幹細胞を患者に注入または再注入するステップであって、造血細胞は低減された系統特異的な疾患関連抗原の発現を有する、ステップ。いくつかの実施形態では、患者の治療は、以下のステップを含み得る：（１）キメラ受容体を発現する免疫細胞の治療有効量を患者に投与するステップであって、免疫細胞は細胞表面系統特異的な疾患関連抗原を結合するキメラ受容体をコードする核酸配列を含む、ステップ、および（２）自己または同種のいずれかの造血細胞（例えば、造血幹細胞）を患者に注入または再注入するステップであって、造血細胞は低減された系統特異的疾患関連抗原の発現を有する、ステップ。
細胞表面系統特異的抗原を結合する抗原結合フラグメントを含む物質および細胞表面系統特異的抗原を欠く造血細胞集団を用いる治療方法の有効性は、当該技術分野におけるいずれか既知の方法によって評価され得、これは、熟練医療専門家には自明であろう。例えば、治療の有効性は、対象の生存により、または対象あるいはその組織もしくは試料中の癌負荷量により評価され得る。いくつかの実施形態では、治療の有効性は、細胞の特定の集団または系統に属する細胞の数を定量することにより評価される。いくつかの実施形態では、治療の効能は、細胞表面系統特異的抗原を提示する細胞の数を定量することにより評価される。
いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原に結合する抗原結合フラグメントを含む物質および造血細胞集団が、同時に投与される。
いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原を結合する抗原結合フラグメントを含む物質（例えば、本明細書で記載されるキメラ受容体を発現する免疫細胞）は、造血細胞の投与前に投与される。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原を結合する抗原結合フラグメントを含む物質（例えば、本明細書で記載されるキメラ受容体を発現する免疫細胞）は、造血細胞の投与の少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月またはそれより前に投与される。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原を結合する抗原結合フラグメントを含む物質（例えば、本明細書で記載されるキメラ受容体を発現する免疫細胞）は、造血細胞の投与前に複数回対象に投与される。
いくつかの実施形態では、造血細胞は、細胞表面系統特異的抗原を結合する抗原結合フラグメントを含む物質（例えば、本明細書で記載されるキメラ受容体を発現する免疫細胞）の前に投与される。いくつかの実施形態では、造血細胞集団は、細胞表面系統特異的抗原に結合する抗原結合フラグメントを含む物質の投与の少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月またはそれより前に投与される。
いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原を標的にする物質および造血細胞集団は、実質的に同時に投与される。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原を標的にする物質が投与され、患者は一定期間評価され、その後に造血細胞集団が投与される。いくつかの実施形態では、造血細胞集団が投与され、患者は一定期間評価され、その後、細胞表面系統特異的抗原を標的にする物質が投与される。
物質および／または造血細胞集団の複数回投与（例えば、投与量）も、本開示の範囲内に入る。いくつかの実施形態では、物質および／または造血細胞集団は、対象に一回投与される。いくつかの実施形態では、物質および／または造血細胞集団は、１回より多く（例えば、少なくとも２、３、４、５回、またはそれより多い回数）対象に投与される。いくつかの実施形態では、物質および／または造血細胞集団は、定期的間隔で、例えば、６ヶ月ごとに、対象に投与される。
いくつかの実施形態では、対象は、造血器悪性腫瘍を有するヒト対象である。本明細書で使用される場合、造血器悪性腫瘍は、造血細胞（例えば、前駆体および幹細胞を含む血液細胞）を含む悪性異常を指す。造血器悪性腫瘍の例としては、限定されないが、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、または多発性骨髄腫が挙げられる。白血病としては、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病または慢性リンパ性白血病、および慢性リンパ性白血病が挙げられる。
いくつかの実施形態では、白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。ＡＭＬは、主要な分化および増殖制御経路を中断させる継続的に獲得された重大な遺伝子変化を有する形質転換細胞を起源とする、異質でクローン性の腫瘍疾患として特徴付けられる（Ｄｏｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ，（２０１５）３７３：１１３６）。ＣＤ３３糖タンパク質は、大部分の骨髄性白血病細胞で、ならびに正常骨髄および単球前駆体で発現され、ＡＭＬ療法の魅力的な標的であると考えられている（Ｌａｓｚｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．（２０１４）２８（４）：１４３－５３）。抗ＣＤ３３モノクローナル抗体ベース治療法を用いた臨床試験は、標準的な化学療法と併用されたときに、ＡＭＬ患者のサブセットにおける生存の改善を示しているが、これらの効果は、安全性および効能の問題も伴った。
ＡＭＬ細胞を標的にすることを目的とした他の試みは、ＡＭＬにおいて選択的にＣＤ３３を標的にするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の生成を必要とした。Ｂｕｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｍａｌｉｇ．Ｒｅｐ．（２）：６５（２０１５）。しかし、データは限定的であり、患者の治療において、この手法がどれほど効果的か（すべての標的化細胞が除去されるかどうか）不確かである。さらに、骨髄系統細胞は生存に必須であるため、対象から骨髄系統細胞を枯渇させることは、患者の生存に有害な効果を有し得る。本開示は、少なくとも部分的に、ＡＭＬ治療に関連するこのような問題を解決することを目的とする。
これに代えて、または追加で、本明細書で記載される方法は、限定されないが、肺癌、耳、鼻、および咽頭癌、結腸癌、メラノーマ、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織癌、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、眼の癌、頭頸部癌、胃癌、上皮内新生物、腎臓癌、咽頭癌、肝臓癌、線維腫、神経芽細胞腫、口腔癌（例えば、唇、舌、口、および咽頭）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、腎臓癌、呼吸器系の癌、肉腫、皮膚癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、泌尿器系の癌、ならびに他の癌腫および肉腫を含む、非造血性癌を治療するために使用され得る。
癌腫は、上皮由来の癌である。本開示の方法による治療が意図される癌腫としては、限定されないが、腺房癌腫、小葉癌腫、濾胞状腺癌腫（腺嚢癌腫、腺筋上皮腫、篩状癌腫および円柱腫とも呼ばれる）、腺腫性癌腫、腺癌腫、副腎皮質癌腫、肺胞癌腫、肺胞細胞癌腫（細気管支癌腫、肺胞細胞腫瘍および肺腺腫症とも呼ばれる）、基底細胞癌腫（ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、基底細胞癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）（バサローマ、またはバシローマ、および毛母癌腫とも呼ばれる）、類基底細胞癌腫、基底扁平上皮癌腫、乳癌腫、気管支肺胞上皮癌腫、細気管支癌腫、気管支原性癌腫、大脳様癌腫、胆管細胞癌腫（胆管癌腫および胆管細胞癌腫とも呼ばれる）、絨毛癌腫、膠様癌腫、面皰癌腫、子宮体部癌腫、篩状癌腫、鎧状癌腫、皮膚癌腫、円柱上皮癌腫、円柱細胞癌腫、腺管癌腫、硬性癌腫、胚性癌腫、脳様癌腫、上眼球癌腫、類表皮癌腫、腺様上皮癌腫、繊維癌腫、膠様癌腫、膠様癌腫、巨細胞癌腫、巨細胞癌腫、腺癌腫、顆粒膜細胞癌腫、毛母癌腫、血様癌腫、肝細胞癌腫（肝細胞腫、悪性肝細胞癌腫および肝臓癌腫とも呼ばれる）、ヒュルトレ細胞癌腫、硝子様癌腫、副腎様癌腫、乳児胎児性癌腫、上皮内癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ）、表皮内癌腫、上皮内癌腫（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クロムペッヘル癌腫、クルチツキー細胞癌腫、レンズ状癌腫（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンズ状癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪性癌腫、リンパ上皮癌腫、乳腺癌腫、髄様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌腫（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｌａｎｏｄｅｓ）、黒色癌腫（ｍｅｌａｎｏｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液性癌腫、粘液分泌癌腫、粘液細胞癌、粘表皮癌腫、粘液癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液性癌腫（ｍｕｃｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液腫様癌腫、上咽頭癌腫、黒色癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｎｉｇｒｕｍ）、燕麦細胞癌腫、骨化性癌腫、類骨癌腫、卵巣癌腫、乳頭癌腫、門脈周囲癌腫、前浸潤癌腫、前立腺癌腫、腎臓の腎細胞癌腫（腎臓腺癌腫および副腎様癌腫とも呼ばれる）、予備細胞癌腫、肉腫様癌腫、シュナイダー癌腫（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、硬性癌腫、陰嚢癌腫、印環細胞癌腫、単純癌腫、小細胞癌腫、ソラノイド癌腫、回転楕円面細胞癌腫、紡錘細胞癌腫、海綿様癌腫、扁平上皮癌腫（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、扁平上皮細胞癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、紐癌腫、毛細管拡張性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｔｉｃｕｍ）、毛細管拡張性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔｏｄｅｓ）、移行上皮癌腫、結節癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、結節癌腫（ｔｕｂｅｒｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、疣状癌腫、絨毛癌腫が挙げられる。好ましい実施形態では、本開示の方法は、乳房、子宮頸部、卵巣、前立腺、肺、結腸または直腸、膵臓、胃あるいは腎臓の癌を有する対象を治療するために使用される。
肉腫は、骨および軟組織に生じる間葉性新生物である。種々の型の肉腫が認められており、これらは、脂肪肉腫（粘液様脂肪肉腫および多形性脂肪肉腫など）、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（悪性神経鞘腫、神経線維肉腫、または神経原性肉腫とも呼ばれる）、ユーイング腫瘍（骨のユーイング肉腫、骨外（すなわち、非骨）ユーイング肉腫、および原始神経外胚葉性腫瘍［ＰＮＥＴ］を含む）、滑膜肉腫、血管肉腫（ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａｓ）、血管肉腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、カポジ肉腫、血管内皮腫、線維肉腫、類腱腫（侵襲性線維腫症とも呼ばれる）、隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）、悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）、血管外皮細胞腫、悪性間葉腫、胞状軟部肉腫、類上皮肉腫、明細胞肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）（ＧＩ間質肉腫としても知られている）、骨肉腫（骨原性肉腫としても知られている）－骨格および骨外、ならびに軟骨肉腫を含む。
いくつかの実施形態では、治療される癌は、難治性癌であり得る。「難治性癌」は、本明細書で使用される場合、処方される標準治療に対して抵抗性である癌である。これらの癌は、最初は治療に応答性であるように見え（その後再発する）、または治療に完全に非応答性の場合もある。通常の標準治療は、癌型、および対象における進行度合いに応じて変わる。それは、化学療法、または手術、または放射線照射、あるいはこれらの併用であり得る。当業者は、このような標準治療を承知している。難治性癌が本開示に従って治療される対象は、従って、これらの癌に対し別の治療を既に受けたことがあり得る。あるいは、癌が難治性である可能性がある場合（例えば、癌細胞の分析または対象の病歴を考慮すると）、対象は、別の治療を以前に受けていない場合がある。難治性癌の例は、限定されないが、白血病、メラノーマ、腎細胞癌腫、結腸癌、肝臓癌（肝癌）、膵臓癌、非ホジキンリンパ腫および肺癌を含む。
本明細書で記載されるキメラ受容体を発現する免疫細胞のいずれかは、医薬組成物として、薬学的に許容可能な担体または賦形剤中で投与され得る。
本開示の組成物および／または細胞と関連して使用される表現「薬学的に許容可能な」は、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与される場合、生理学的に耐容性であり、不都合な反応を一般的に生じないような組成物の分子実体または他の原料を指す。好ましくは、本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容可能な」は、哺乳動物、より好ましくはヒトで使用するために、連邦または州政府の規制当局により承認されている、あるいは米国薬局方または他の一般的に認められている薬局方にリストされていることを意味する。「許容可能な」は、担体が、組成物の有効成分（例えば、核酸、ベクター、細胞、または治療用抗体）と適合性であり、組成物が投与される被検体に負の影響を及ぼさないことを意味する。本方法で使用される医薬組成物および／または細胞のいずれも、凍結乾燥配合物または水溶液の形態で薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤を含み得る。
緩衝剤を含む、薬学的に許容可能な担体は、当該技術分野において良く知られており、リン酸、クエン酸、および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；アミノ酸；疎水性ポリマー；モノサッカライド；ジサッカライド；他の炭水化物；金属錯体；および／または非イオン性界面活性剤を含み得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒを参照されたい。
治療使用のためのキット
細胞表面系統特異的抗原を欠く造血細胞集団と組み合わせた細胞表面系統特異的抗原を標的にする物質の使用のためのキットも、本開示の範囲内に入る。このようなキットは、細胞表面系統特異的抗原を結合する抗原結合フラグメントを含む任意の物質（例えば、本明細書で記載されるキメラ受容体を発現する免疫細胞）および薬学的に許容可能な担体を含む第１の医薬組成物と、細胞表面系統特異的抗原を欠く造血細胞（例えば、造血幹細胞）集団および薬学的に許容可能な担体を含む第２の医薬組成物とを含む、１つまたは複数の容器を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で記載のキットは、ＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＣ（配列番号５０）またはＣＣＴＣＡＣＴＡＧＡＣＴＴＧＡＣＣＣＡＣ（配列番号５８）の配列を有する部位に結合するｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＣＵＣＡＣＵＡＧＡＣＵＵＧＡＣＣＣＡＣ（配列番号７０）またはＡＵＣＣＣＵＧＧＣＡＣＵＣＵＡＧＡＡＣＣ（配列番号６７）を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書で記載される方法のいずれかでの使用のための使用説明書を含み得る。含まれる使用説明書は、対象における目的の活性を達成するための対象への第１および第２の医薬組成物の投与の説明を含み得る。キットは、対象が本治療を必要とするかどうかを特定することに基づく治療に適した対象の選択についての説明をさらに含む。いくつかの実施形態では、使用説明書は、本治療を必要とする対象に第１および第２の医薬組成物を投与することの説明を含む。
本明細書で記載される細胞表面系統特異的抗原を標的にする物質ならびに第１および第２の医薬組成物の使用に関する使用説明書は通常、目的の治療のための投与量、投与計画、および投与経路についての情報を含む。容器は、単位用量、大量包装（例えば、複数回投与用包装）または分割単位用量であり得る。本開示のキットに添付される使用説明書は一般的には、ラベルまたは添付文書に記載された説明である。ラベルまたは添付文書は、医薬組成物が対象における疾患または障害を治療する、発症を遅延させる、および／または緩和するために使用されることを示す。
本明細書で提供されるキットは、適切に包装されている。適切な包装は、限定されないが、バイアル、ボトル、ジャー、フレキシブルパッケージングなどを含む。吸入器、鼻腔投与デバイス、または注入容器などの特定のデバイスと併せて使用するための包装もまた、考えられる。キットは、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針によって穿刺可能な栓を有する静脈用溶液バッグまたはバイアルであり得る）。容器も、無菌アクセスポートを有し得る。医薬組成物における少なくとも１種類の有効成分は、本明細書で記載されるキメラ受容体バリアントである。
キットは任意選択で、緩衝剤などの追加成分および判断情報を提供し得る。通常、キットは、容器および、その容器上にもしくは容器と関連づけてラベルまたは添付文書を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、上記キットの内容物を含む製品を提供する。
一般的方法
本開示の実施は、他に指示がない限り、当該技術の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生物化学、および免疫学の従来技術を使用する。このような技術は、文献で十分に説明されており、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）；Ｉｎｔｒｏｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４＞＞；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；およびＢ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）などで説明される。
さらなる詳細がなくとも、当業者なら、前述に基づき、本開示をその最大限の範囲まで利用できると考えられる。従って、以下の具体的な実施形態は、単に例示と解釈されるべきであり、いかなるものであれ、本開示の残りの部分を制限するものではない。本明細書に引用されるすべての刊行物は、本明細書で参照される目的または主題のために参照により本明細書に組み込まれる。
実施例１：ヒト白血病細胞株におけるＣＤ３３のインビトロ除去
インビトロでＣＤ３３を標的とするＣＲＳＰＲ－Ｃａｓ９系の能力を試験するため、ヒト白血病細胞Ｋ－５６２を、Ｎｅｏｎ（商標）（Ｔｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、Ｃａｓ９－ＧＦＰ（ＰＸ４５８、化膿レンサ球菌）およびＮＧＧ ＰＡＭ配列を含むガイドＲＮＡで共遺伝子導入した（図４）。ガイドＲＮＡは、ｈＣＤ３３ゲノム配列を標的にするように設計された。遺伝子導入の４８時間後に、Ｃａｓ９を発現する細胞を、ＧＦＰのＦＡＣＳ選別を用いて特定し単離した。細胞を次に、９６時間インキュベーションし、フローサイトメトリーによりＣＤ３３発現について試験した（図５）。抗ＣＤ３３抗体を用いたフローサイトメトリープロットは、Ｃａｓ９ベクターおよびガイドＲＮＡの送達前（上段グラフ）および後（下段グラフ）のＫ－５６２細胞によるＣＤ３３発現を示す。図５に示されるように、細胞の９８％が、遺伝子導入後にＣＤ３３発現を欠いた。
この実施例は、ヒト白血病細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いるＣＤ３３の効率的な除去を示す。
実施例２：ヒト白血病細胞株におけるＣＤ４５のインビトロ除去
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用してインビトロでＣＤ４５ＲＡを標的にした。簡単に説明すると、ＴＩＢ－６７細網肉腫マウスマクロファージ様細胞を、Ｎｅｏｎ（商標）試薬（Ｔｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、Ｃａｓ９－ＧＦＰ（ＰＸ４５８、化膿レンサ球菌）およびｈＣＤ４５ＲＡゲノム配列を標的にするＣＲＩＳＰＲｓ ｇＲＮＡ（「ＮＧＧ」ＰＡＭ配列を含む）で共遺伝子導入した。遺伝子導入の４８時間後に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを発現する細胞を、ＧＦＰのＦＡＣＳ選別を用いて特定し、単離した。細胞をその後、９６時間インキュベーションし、ＣＤ４５ＲＡ発現について試験した（図６）。ＣＤ４５ＲＡ抗体を用いたフローサイトメトリープロットは、Ｃａｓ９ベクターおよびガイドＲＮＡの送達前（上段グラフ）および後（下段グラフ）のＣＤ４５ＲＡ発現を示す。
白血病細胞においてＣＤ３３発現がうまく低減された実施例１と同様に、本実施例の結果は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いるＣＤ４５ＲＡの効率的な標的化を示す。
実施例３：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）における細胞表面系統特異的ＣＤ３３の標的化
本実施例は、ＡＭＬにおけるＣＤ３３抗原の標的化を包含する。本実施例の具体的なステップを、表６に概説する。
Figure 2022517618000008
Ｉ．ＣＤ３３標的化キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法
Ａ．抗ＣＤ３３ ＣＡＲ構築物の生成
本明細書で記載されるＣＤ３３標的化キメラ抗原受容体は、５’から３’への順で、ｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎレンチウィルス骨格（ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／１８１２１／）、ペプチドシグナル、ＣＤ３３ ｓｃＦｖ、ヒンジ、ＣＤ２８分子の膜貫通領域、ＣＤ２８の細胞内領域、およびＴＣＲ－ζ分子のシグナル伝達領域からなり得る。
最初に、ペプチドシグナル、抗ＣＤ３３軽鎖（配列番号１）、フレキシブルリンカーおよび抗ＣＤ３３重鎖（配列番号２）を、任意のコザック配列とともに、ｐＨＩＶ－ＺｓｇｒｅｅｎのＥｃｏＲＩ部位にクローニングする。
軽鎖－リンカー－重鎖－ヒンジ－ＣＤ２８／ＩＣＯＳ－ＣＤ３ζの基本的構造を有する、ＣＤ３３を結合する例示的なキメラ受容体の核酸構造を、下記に示す。
パート１：軽鎖－リンカー－重鎖（配列番号１６）：コザック開始部位を、太字で示す。ペプチドシグナルＬ１を、イタリック体で示す。抗ＣＤ３３軽鎖および重鎖を、太字のイタリック体で示し、それらはリンカーにより分けられる。
Figure 2022517618000009
パート２：ヒンジ－ＣＤ２８／ＩＣＯＳ－ＣＤ３ζ ＮｏｔＩ制限酵素認識部位を、大文字で示す。翻訳停止部位を、太字で示す。ＢａｍＨＩ制限切断部位を、下線で示す。
ＣＤ２８共刺激領域（配列番号１７）
Figure 2022517618000010
 ＩＣＯＳ共刺激領域（配列番号１８）
Figure 2022517618000011
 融合（ハイブリッド）ＣＤ２８およびＩＣＯＳ共刺激領域（配列番号１９）
Figure 2022517618000012
次のステップで、ヒンジ領域、ＣＤ２８領域（配列番号３）、およびＴＣＲ－ζの細胞質構成要素を、ｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎ（既にペプチドシグナルおよびＣＤ３３ ｓｃＦｖを含む）のＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングする。あるいは、ＣＤ２８領域を、ＩＣＯＳ領域（配列番号４）で置換してよい。
ＣＤ２８およびＩＣＯＳ領域に加えて、ＣＤ２８およびＩＣＯＳ細胞内シグナル伝達領域のフラグメントを含む融合領域を、遺伝子操作し（配列番号５）、追加のキメラ受容体を作製するために使用する。このような構成では、キメラ受容体は、抗原結合フラグメント、抗ＣＤ３３軽鎖可変領域、リンカー、抗ＣＤ３３重鎖可変領域、ＣＤ２８／ＩＣＯＳハイブリッド領域（ＣＤ２８のＴＭ領域を含む）、およびＴＣＲ－ζ分子のシグナル伝達領域を含む。
キメラ受容体を作製するために使用され得る構成要素の例示的なアミノ酸配列が、本明細書で提供され、ＣＤ２８領域（配列番号６）、ＩＣＯＳ領域（配列番号７）、ＣＤ２８／ＩＣＯＳハイブリッド領域（配列番号８）、およびＴＣＲ－ζなどが、本明細書で提供される。あるいは、キメラ受容体もまた、作製され得る（セクションＢ）。
Ｂ．抗ＣＤ３３ ＣＡＲ構築物の生成のための代替法
例示的なキメラ受容体の概略を、図７、パネルＡ～Ｄに示す。キメラ受容体は、細胞外ＣＤ８ヒンジ領域、膜貫通および細胞質シグナル伝達領域、ならびにＣＤ３ζシグナル伝達鎖に連結された、ＣＤ３３抗原を認識する細胞外ヒト化ｓｃＦｖを用いて作製される（図７、パネルＢ）。抗ＣＤ３３キメラ受容体をコードするＤＮＡは、ヒト化ｓｃＦｖを用いることにより生成される（Ｅｓｓａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．（２０１３）２７３（２）：１６６）。代替物は、ＣＤ２８またはＣＤ２８／ＯＸ１またはＣＤ２８／４－１－Ｂ－Ｂハイブリッドの代わりにＯＸ－１または４１－ＢＢを含むＣＡＲ Ｔ細胞を含む（図７、パネルＣおよびＤ）。
抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ配列を生成するために、前述の抗ＣＤ３３抗体の可変領域の重鎖および軽鎖のコード領域（配列番号１および２）を、特異的プライマーにより増幅し、細胞での発現用にｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎベクター中にクローニングする。標的抗原に対するｓｃＦｖ（単鎖可変フラグメント）の結合強度を評価するため、ｓｃＦｖを、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞で発現させる。この目的のため、ベクター（コード領域を含むｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎ）を大腸菌Ｔｏｐ１０Ｆ中に形質転換し、プラスミドを調製する。ｓｃＦｖ抗体をコードする得られた発現ベクターを、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞中に遺伝子導入により導入する。遺伝子導入細胞を５日間培養した後、上清を取り出し、抗体を精製する。
得られた抗体を、当該技術分野において既知のプロトコルによりフレームワーク置換を用いてヒト化できる。例えば、鋳型抗体に由来する合成ＣＤＲをコードするフラグメントライブラリーを、機能的に発現された抗体由来の生殖系列配列に限定されたヒトフレームワークのプールからのヒトフレームワーク領域をコードするフラグメントに連結する、ＢｉｏＡｔｌａ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）により提供されるプロトコルを参照されたい（ｂｉｏａｔｌａ．ｃｏｍ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｅｘｐｒｅｓｓ－ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ／）。
抗原結合親和性を改善するために、親和性成熟を実施し得る。これは、ファージ提示法などの、当該技術分野において既知の一般的な技術を用いて実施できる（Ｓｃｈｉｅｒ Ｒ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ（１９９６），２６３：５５１）。バリアントは、例えばＢｉａｃｏｒｅ分析を用いて、それらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされ得る。改変の優れた候補であり得る超可変領域残基を特定するために、アラニン系統的変異導入法を実施して、抗原結合に大きく関与する超可変領域残基を特定できる。さらに、抗体の親和性を改善するために、上記の組み合わせライブラリーを使用できる（Ｒａｊｐａｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（２００５）１０２（２４）：８４６６）。あるいは、ＢｉｏＡｔｌａは、抗体の迅速で効率的な親和性変異のためのプラットフォームを開発しており、これもまた、抗体の最適化の目的のために使用されてよい（ｂｉｏａｔｌａ．ｃｏｍ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ－ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ／）。
（Ｃ）ＣＡＲ構築物の組み立て
次に、抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖを、細胞外ＣＤ８ヒンジ領域、膜貫通および細胞質ＣＤ２８シグナル伝達領域、ならびにＣＤ３ζシグナル伝達鎖に連結する。簡単に説明すると、抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ配列に特異的なプライマーを使用して、前述のようにｓｃＦｖを増幅する。完全なヒトＣＤ８コード配列を有するプラスミド（ｐＵＮ１－ＣＤ８）（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｐｕｎｏ－ｃｄ８ａ）を使用して、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通領域（アミノ酸１３５～２０５位）を増幅する。ＣＤ３ζフラグメントを、完全なヒトＣＤ３ζコード配列を有するＩｎｖｉｖｏｇｅｎプラスミドｐＯＲＦ９－ｈＣＤ２４７ａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ＰＤＦ／ｐＯＲＦ９－ｈＣＤ２４７ａ＿１０Ｅ２６ｖ０６．ｐｄｆ）から増幅する。最後に、ＣＤ２８（アミノ酸１５３～２２０、ＣＤ２８のＴＭおよびシグナル伝達領域に相当する）を、活性化Ｔ細胞からトリゾール法により収集したＲＮＡを用いて生成されたｃＤＮＡから増幅する。抗ＣＤ３３－ｓｃＦｖ－ＣＤ８－ヒンジ＋ＴＭ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζを含むフラグメントを、スプライス重複伸長（ＳＯＥ）ＰＣＲを用いて組み立てる。次に、得られるＰＣＲフラグメントを、ｐＥＬＰＳレンチウィルスベクター中にクローニングする。ｐＥＬＰＳは、第三世代レンチウィルスベクターｐＲＲＬ－ＳＩＮ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ－ＷＰＲＥの派生物であり、その中で、ＣＭＶプロモーターがＥＦ－１αプロモーターで交換され、ＨＩＶの中央ポリプリントラクトがプロモーターの５’に挿入された（Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．（２００９）（８）：１４５３，Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ（２０１１）（８）：７２５）。すべての構築物は、塩基配列決定法により検証される。
あるいは、ＣＤ２８領域の代わりにＩＣＯＳ、ＣＤ２７、４１ＢＢ、またはＯＸ－４０シグナル伝達領域を含むＣＡＲを作製し、Ｔ細胞中に導入し、ＣＤ３３陽性細胞を除去する能力について試験する（図７、パネルＣ）。「第三世代」キメラ受容体の生成も検討され（図７、パネルＤ）、これは、ＣＤ３ｚ－ＣＤ２８－４１ＢＢまたはＣＤ３ｚ－ＣＤ２８－ＯＸ４０などの複数のシグナル伝達領域を組み合わせて、さらに能力を高める（Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．（２０１３）４：３８８）。
（Ｄ）抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞調製
一次ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、免疫磁気分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）により患者の末梢血液から単離する。Ｔ細胞を、完全培地（１０％熱不活性化ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを補充したＲＰＭＩ１６４０）中で培養し、既に報告されているように（Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）１５９（１２）：５９２１）抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ ｍＡｂでコートされたビーズ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）により刺激する。
パッケージング細胞株を使用してウィルスベクターを生成し、これは、標的細胞に形質導入でき、抗ＣＤ３３キメラ受容体を含む。レンチウィルス粒子を生成するために、本実施例のセクション（１）で作製されたＣＡＲを、不死化正常胎児腎２９３Ｔパッケージング細胞中に一緒に遺伝子導入する。細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含む高グルコースＤＭＥＭで培養する。遺伝子導入の４８～７２時間後に、上清を収集し、組換えレンチウィルスをＦＢＳ無添加ＤＭＥＭ中で濃縮する。次に、一次ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ポリブレンの存在下で、約５～１０の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入する。ヒト組換えＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、１日おきに加える（５０ＩＵ／ｍＬ）。Ｔ細胞を、刺激後約１４日間培養する。ヒト一次Ｔ細胞の形質導入効率を、ＺｓＧｒｅｅｎレポーター遺伝子（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）の発現により評価する。
Ｅ．患者へのＣＡＲ Ｔ細胞の注入
患者への抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞の静脈内注入前に、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、濃縮する。閉じた無菌系を与えるＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ ＣｅｌｌＳａｖｅｒ（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ，ＭＡ）などのセルプロセッサーを、配合前に洗浄および濃縮ステップのために使用する。抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現する最終Ｔ細胞を、ヒト血清アルブミンを補充した無菌生理食塩水１００ｍＬに配合する。最後に、患者は、１～３日間かけてＴ細胞を１～１０ｘ１０７個／ｋｇを注入される（Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ（２０１４）３７１（１６）：１５０７）。注入される抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現するＴ細胞の数は、癌患者の状態、患者の年齢、前治療などの多くの要因に依存する。
さらに、本明細書では、ＡＭＬ患者のＣＤ３３を標的にするキメラ受容体に加えて、ＣＤ４５ＲＡを標的にするキメラ受容体を発現する免疫細胞も意図される。これは、２つの異なる方法：１）抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現する免疫細胞および抗ＣＤ４７ＲＡキメラ受容体を発現する免疫細胞を別々に作製すること、および患者に両タイプの免疫細胞を別々に注入すること、または２）ＣＤ３３およびＣＤ４５ＲＡの両方を同時に標的にする免疫細胞を作製すること、により達成できる（Ｋａｋａｒｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ（２）：１５１（２０１４））。
ＩＩ．ＣＤ３４＋ＣＤ３３－細胞を用いる自己造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）
患者からの幹細胞単離、移植前処置、ならびに幹細胞の患者への注入に関するプロトコルは、患者の年齢、状態、治療歴、および治療が実施される施設に大きく依存して変動することが理解される。そのため、後述のプロトコルは、単なる一例であり、当業者により定期的な最適化がなされる。
Ａ．抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞の養子移入に続く末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）動員を用いる造血幹細胞の単離
ＡＭＬ患者を、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）の１日あたり１０ｍｇ／ｋｇの静脈投与により刺激する。ＣＤ３４＋細胞陽性選択を、免疫磁気ビーズおよび免疫磁気濃縮デバイスを用いて実施する。ＣＤ３４＋細胞の２ｘ１０６個／ｋｇ体重の最小量が、Ｆｅｎｗａｌｌ ＣＳ ３０００＋細胞セパレーターを用いて収集されることが予測される（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２００３）３２：８８９）。
Ｂ．患者の移植前処置
自己末梢血幹細胞移植（ＰＢＳＣＴ）のための移植前処置を、エトポシド（ＶＰ－１６）＋シクロホスファミド（ＣＹ）＋全身放射線照射（ＴＢＩ）を用いて実施する。簡単に説明すると、投与計画は、単回投与として２６時間にわたる１．８ｇ／ｍ２持続静脈注射（ｃ．ｉ．ｖ）でのエトポシド（ＶＰ－１６）、続いて３日間の２時間にわたる一日あたり６０ｍｇ／ｋｇ体重でのシクロホスファミド（ＣＹ）静注、続いて次の３日間にわたる一日あたり３００ｃＧｙでの全身放射線照射（ＴＢＩ）からなる。
投与量を計算するため、理想体重または実際の体重のいずれか小さい方を使用する。以前に述べたように、癌患者の状態、患者の年齢、前治療、ならびに処置が実施される施設のタイプなどの因子を、正確な移植前処置を決定するときにすべて考慮する。
Ｃ．ＣＤ３３を標的にするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムのプラスミド構築
インサートＣａｓ９およびピューロマイシン耐性を含むレンチＣＲＩＳＰＲｖ２を、Ａｄｄｇｅｎｅ（プラスミド＃５２９６１）から得る（Ｓａｎｊａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１４）（８）：７８３）。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ＣＤ３３ガイド配列をクローニングするため、レンチＣＲＩＳＰＲｖ２を、ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ ＢｓｍＢＩおよびＦａｓｔＡＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）により３７℃、２時間で切断し脱リン酸化する。ＣＤ３３を標的にするｇＲＮＡを、ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕのオンライン最適化設計ツールを用いて設計する。あるいは、ｇＲＮＡは図１２に示す配列を有する（配列番号１１）。ＣＤ３３ ｇＲＮＡオリゴヌクレオチドを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から得、ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて３７℃で３０分間リン酸化し、９５℃で５分間の加熱および１．５℃／分で２５℃への冷却によりアニーリングする。Ｔ７リガーゼを使用してオリゴヌクレオチドをアニーリングし、その後アニーリングしたオリゴヌクレオチドを、２５℃で５分間ゲル精製したベクター（Ｑｉａｇｅｎ）中に連結する。得られるプラスミドを次に、エンドトキシン不含ｍｉｄｉ－ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて増幅できる（Ｓａｎｊａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１４）（８）：７８３）。
あるいは、２つのベクター系を、既に報告されているプロトコル（Ｍａｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（２０１４）１５（５）：６４３）に従い使用し得る（ｇＲＮＡおよびＣａｓが別々のベクターから発現される場合）。ここで、Ｍａｎｄａｌらは、非ウィルスベクターから発現されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いてヒト造血幹細胞中の遺伝子の効率的な除去を達成した。
簡単に説明すると、Ｃ端ＳＶ４０核局在化シグナルを含むヒトコドン最適化Ｃａｓ９遺伝子を、２Ａ－ＧＦＰを有するＣＡＧ発現プラスミドにクローニングする。目的のＣＤ３３配列を切断するようにＣａｓ９を指示するため、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ（配列番号１１））は、ヒトＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含むプラスミドから別々に発現される。ｇＲＮＡ配列オリゴヌクレオチドを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から得、アニーリングし、ＢｂｓＩ制限部位を用いてプラスミド中に導入する。ヒトＵ６プロモーターでの「Ｇ」塩基の転写開始の必要条件、ならびにＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）の必要条件のため、ゲノム標的は、ＧＮ２０ＧＧヌクレオチド配列を含む。
患者にＣＤ３３枯渇造血幹細胞ＨＳＣを注入することに加え、患者がＣＤ４５ＲＡ枯渇ＨＳＣを続いて注入されるプロトコルが、開発される。あるいは、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いてＣＤ３４＋ＣＤ３３－ＣＤ４５ＲＡ－細胞を作製して、ＣＤ３３およびＣＤ４５ＲＡ遺伝子の両方を同時に低減する。ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ３３のためのガイドＲＮＡ配列例を、表４および５に示す。
Ｄ．ＣＤ３４＋ＣＤ３３－細胞を生成するためのＣＤ３４＋細胞ＨＳＣの遺伝子導入
新たに単離した末梢血由来ＣＤ３４＋細胞（ステップ４より）を、細胞培養グレードの幹細胞因子（ＳＣＦ）３００ｎｇ／ｍｌ、ＦＬＴ３－Ｌ ３００ｎｇ／ｍｌ、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）１００ｎｇ／ｍｌ、およびＩＬ－３６０ｎｇ／ｍｌの存在下で、無血清ＣｅｌｌＧｒｏ ＳＣＧＭ培地中にて細胞１ｘ１０６個／ｍｌで播種する。前刺激の２４時間後、ＣＤ３４＋ＨＳＣを、Ｃａｓ９およびＣＤ３３ ｇＲＮＡを含むレンチＣＲＩＳＰＲｖ２で、Ａｍａｘａ Ｈｕｍａｎ ＣＤ３４ ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｋｉｔ（Ｕ－００８）（＃ＶＰＡ－１００３）を用いて遺伝子導入する（Ｍａｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（２０１４）１５（５）：６４３）。遺伝子導入の２４～４８時間後に、ＣＤ３４＋ＣＤ３３－を、１．２μｇ／ｍｌピューロマイシンで選択する。ピューロマイシン選択後に、ＣＤ３４＋ＣＤ３３－細胞を、２～３日間、ピューロマイシン不含培地中で維持する。
Ｅ．患者へのＣＤ３４＋ＣＤ３３－細胞の再注入
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ＣＤ３３によりｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子導入されたＣＤ３４＋細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３３－細胞）を直ちに、フィルターなしに標準的な血液投与セットを用いて、ヒックマンカテーテルを通して再注入する（Ｈａｃｅｉｎ－Ｂｅｙ Ａｂｉｎａ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ（２０１５）３１３（１５）：１５５０）。
一般的に、上で概要を述べた治療プロトコルを受けた患者は、循環性芽球および血球減少の再出現について監視される。さらに、特定患者におけるＡＭＬの潜在的なメカニズムに応じて、治療の達成は、情報をもたらす分子または細胞遺伝学的マーカーの再出現、あるいは情報をもたらすフローサイトメトリーパターンを試験することにより監視される。例えば、フィラデルフィア染色体陽性ＡＭＬにおけるＢＣＲ－ＡＢＬシグナルの再出現は、ＢＣＲ（染色体２２上）およびＡＢＬ（染色体９上）に対するプローブによる蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて検出される。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを介したＣＤ３３除去の達成を評価するため、末梢血ＣＤ３４＋細胞を、患者から単離し（移植後）、例えば、フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、または免疫組織化学を用いて、ＣＤ３３発現について評価する。
本明細書で記載されるように、本例で報告されるＨＳＣＴは、自己または同種のいずれかであってよく、両方の手段は、適切であり、本開示で記載される方法に組み込まれてよい。
ＩＩＩ．随意ステップ：毒素に結合されたＣＤ３３抗体による患者の継続治療
Ａ．ＣＤ３３免疫毒素ゲムツズマブオゾガマイシン（ＧＯ）による患者の治療
患者を、２週間隔てた２回投与による時間静脈注入として９ｍｇ／ｍ２の抗ＣＤ３３抗体ゲムツズマブオゾガマイシン（ＧＯ）で治療する（Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ（２００５），１０４（７）：１４４２－５２）。ＧＯは、細胞分裂阻害剤カリケアマイシンと複合体化されたＣＤ３３に対するヒト化モノクローナル抗体からなる（図８）。
あるいは、抗ＣＤ３３抗体を、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素Ａ（ＰＥ）、またはリシン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ）などの種々の毒素と複合体化し、生成できる（Ｗａｙｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１４）１２３（１６）：２４７０）。同様に、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体を、毒素に結合し、治療レジメンに含み得る。
実施例４：抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現するＴ細胞およびＮＫ細胞株は、ＣＤ３３を発現する標的細胞の細胞死を誘発する
ＣＤ３３へのキメラ受容体の結合
ＣＤ３３を結合するキメラ受容体（例えば、ＣＡＲＴ１、ＣＡＲＴ２、ＣＡＲＴ３）を、従来の組換えＤＮＡ技術を用いて作製し、ｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）中に挿入した。キメラ受容体を含むベクターを使用して、レンチウィルス粒子を作製し、これを、異なる細胞型、例えばＴ細胞株（例えば、２９３Ｔ細胞）およびＮＫ細胞株（例えば、ＮＫ９２細胞）を形質導入するために使用した。キメラ受容体の発現を、ウェスタンブロッティング（図９、パネルＡ）およびフローサイトメトリー（図９、パネルＢ）により検出した。
キメラ受容体を発現する細胞を、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）により選択し、ＣＤ３３を結合するこれらの能力について評価した。簡単に説明すると、キメラ受容体を発現する２９３Ｔ細胞の溶解物を、ＣＤ３３またはＣＤ３３－アロフィコシアニン（ＡＰＣ）複合体と共インキュベーションした。試料を、タンパク質電気泳動にかけ、ポンソータンパク質染色で染色する（図１０、パネルＡ）か、または膜に移し抗ＣＤ３ζ一次抗体により探査した（図１０、パネルＢ）。どちらの場合も、キメラ受容体とそれらの標的ＣＤ３３の間で結合する。
キメラ受容体を発現するＫ５６２細胞も、プローブとしてＣＤ３３を用いるフローサイトメトリーによりＣＤ３３への結合について評価した（図１０、パネルＣ）。キメラ受容体（ＣＡＲＴ１、ＣＡＲＴ２、またはＣＡＲＴ３）の発現について陽性である細胞の数およびＣＤ３３結合が、空ベクター対照を含む細胞と比べて増加し、キメラ受容体がＣＤ３３に結合することを示した。
キメラ受容体を発現する細胞により誘発される細胞毒性
キメラ受容体を発現するＮＫ－９２細胞を、細胞表面にＣＤ３３を提示する標的細胞（例えば、Ｋ５６２細胞はＣＤ３３＋であるヒト慢性骨髄性白血病株である）の細胞毒性を誘発する能力について機能的に特徴付けした。細胞毒性アッセイを実施するため、エフェクター細胞（ＮＫ－９２細胞などの免疫細胞）を、キメラ受容体をコードするレンチウィルス粒子に感染させ増殖させた。感染数日後に、キメラ受容体を発現する細胞を、ＦＡＣＳ分析を用いて、キメラ受容体コードベクターによってもコードされる蛍光マーカー（例えば、ＧＦＰ＋、またはＲｅｄ＋）を選別することにより選択した。キメラ受容体を発現する選択された細胞を、１週間増殖させた。感染１４日後に、細胞毒性アッセイを、標的細胞（標的細胞表面系統特異的抗原であるＣＤ３３を発現する細胞）をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で染色することおよび標的細胞およびキメラ受容体を発現する細胞の両方を計数することを含んで実施した。種々の比率の標的細胞とキメラ受容体を発現する細胞を、丸底９６ウェルプレート中で４．５時間共インキュベーションし、その後７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）を加えて非生存細胞を染色した。フローサイトメトリーを実施して、生存および非生存の標的細胞集団を数えた。図１１のパネルＡおよびＢに示すように、キメラ受容体ＣＡＲＴ１、ＣＡＲＴ２、またはＣＡＲＴ３を発現するＮＫ９２細胞は、評価した細胞比率のそれぞれで、かなりの量の標的Ｋ５６２細胞の細胞死を誘発した。
Ｋ５６２細胞の細胞死がＣＤ３３へのキメラ受容体の特異的標的化に依存したことを決定するため、Ｋ５６２細胞を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いてＣＤ３３を欠くよう遺伝子操作した。簡単に説明すると、ヒトコドン最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよびＣＤ３３のＩｇＣ領域の一部を標的にするｇＲＮＡを、Ｋ５６２細胞で発現させ、ＣＤ３３欠損Ｋ５６２細胞集団を得た。細胞を、増殖させ、キメラ受容体を発現するＮＫ９２細胞と共インキュベーションし、細胞毒性アッセイを、前述のように実施した。図１２のパネルＡに示すように、プールしたＣＤ３３欠損Ｋ５６２細胞は、キメラ受容体を発現するＮＫ９２細胞と共インキュベーションすることにより細胞死のわずかな低減を示した。しかし、ＣＤ３３欠損Ｋ５６２細胞の単一クローンを、単離し、増殖させ、細胞毒性アッセイを実施するために使用した場合、細胞毒性のさらに顕著な低減が認められた（図１２、パネルＢ）。
一次Ｔ細胞におけるキメラ受容体の発現
一次Ｔ細胞集団を、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞を陽性選択することによるＦＡＣＳによりドナーから得られたＰＭＢＣから分離し、高純度集団を得た（図１３、パネルＡおよびＢ）。一次Ｔ細胞集団（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞）のそれぞれを、キメラ受容体（例えば、ＣＡＲＴ１およびＣＡＲＴ８）を含むレンチウィルスベクターで形質導入し、得られたキメラ受容体を発現する一次Ｔ細胞を使用して、前述のように細胞毒性アッセイを実施した。キメラ受容体を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞集団とＫ５６２細胞（１０００個の標的Ｋ５６２細胞）の共インキュベーションは、Ｋ５６２細胞の細胞毒性をもたらさなかった（図１４、パネルＡ）。これに反し、キメラ受容体を発現するＣＤ８＋またはＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞のいずれか、および１０００個の標的Ｋ５６２細胞を用いた細胞毒性アッセイでは、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞は、Ｋ５６２細胞の細胞死を低い細胞比率で誘発できた（図１４、パネルＢ）。
ヒト造血幹細胞の遺伝子操作
いくつかのｇＲＮＡを、ＣＤ３３のＩｇＣ領域にハイブリダイズするように設計した（例えば、表４、配列番号１１または２８～３１を参照）。ｇＲＮＡのそれぞれを、Ｋ５６２細胞中でＣａｓ９エンドヌクレアーゼとともに発現させた。ＣＤ３３の発現を、フローサイトメトリーにより評価した（図１５）。Ｃｒｉｓｐｒ３（配列番号２８）およびＣｒｉｓｐｒ５（配列番号２９）について示されるように、ＣＤ３３の顕著な低減が、ＣＤ３３を発現する対照細胞と比べて、ＣＤ３３標的化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を発現する細胞で認められた。
ＣＤ３３欠如造血幹細胞の、増殖、赤血球形成分化、およびコロニー形成を含む、様々な特性についても評価した。簡単に説明すると、ＣＤ３３欠損造血幹細胞および対照細胞を、ヘミンに細胞を暴露することにより分化するよう誘導し、赤血球前駆体のマーカーであるＣＤ７１を、種々の時点でフローサイトメトリーにより評価した（図１６、パネルＡおよびＢ）。ＣＤ３３欠損造血幹細胞は、赤血球形成分化を起こし、フローサイトメトリープロファイルは、コントロール細胞（ＣＤ３３＋）と類似しているように見えた。細胞を、ＭＴＴアッセイにも供して、ＣＤ３３欠損造血幹細胞の代謝活性を測定した。図１６のパネルＣに示されるように、ＣＤ３３欠損造血幹細胞は、対照細胞細部と同等に機能した。最後に、増殖および細胞コロニーを形成する細胞の能力を、顕微鏡コロニー形成アッセイにより観察した。再度、ＣＤ３３欠損造血幹細胞は、対照細胞と同様の程度にコロニーを形成できた（図１８）。これらの結果は、ＣＤ３３の一部のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ除去が増殖、分化、またはコロニー形成する細胞の能力に顕著な影響を及ぼさないことを示す。
実施例５：遺伝子編集幹細胞は、骨髄性悪性腫瘍のためのＣＤ３３指向性免疫療法を可能にする。
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）または抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）などの、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）のための抗原指向性免疫療法は、白血病細胞と、通常の骨髄細胞または骨髄前駆細胞とを区別できる特有の標的化可能抗原を欠くために、重度毒性と関連する。ここで、系統特異的骨髄抗原ＣＤ３３を標的にすることによる、ＡＭＬを治療するための新規方法が提供される。本方法は、ＣＤ３３標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞および／またはＡＤＣ、ゲムツズマブオゾガマイシンを、ゲノム工学法を用いてＣＤ３３発現を除去するように遺伝子操作された造血幹細胞（ＨＳＣ）の移植と組み合わせる。ヒト幹細胞／前駆細胞（ＨＳＰＣ）においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いたＣＤ３３抗原の極めて効果的な遺伝子除去が示され、ＨＳＰＣ中のＣＤ３３の欠失が生着能力および多系列造血系をインビボで再増殖させる能力を損なわないという証拠が得られている。全ゲノム塩基配列決定およびＲＮＡ配列解析は、検出可能なオフターゲット変異誘発および機能的ｐ５３経路の低下を示さなかった。ヒトＡＭＬ細胞株（ＨＬ－６０）を用いて、微小残存病変を有する寛解後骨髄がモデル化され、ＣＤ３３除去ＨＳＰＣの多系列子孫の生着と回復により示されるように、ＣＤ３３標的化免疫療法によるＣＤ３３除去ＨＳＰＣの移植は、骨髄抑制なしに、白血病除去に繋がることが示された。従って、本研究は、標的化免疫療法の進展に寄与し、他の悪性腫瘍で容易に再現できるであろう。
急性骨髄性白血病は、特に寛解後の患者において、効果的治療法のニーズがまだ満たされない疾患である。ＣＤ３３などの系統特異的（ＬＡＳ）に対する免疫療法は、オンターゲット効果を示すが、正常骨髄細胞および造血前駆細胞もＣＤ３３を発現するため、毒性により限定される。ここで、ＣＲＩＳＰＲ法を用いたＨＳＰＣ中のＣＤ３３の遺伝的除去が、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ－Ｔまたは抗体療法を用いる白血病に対する免疫療法を可能にすることが示される。マウスにおいて最小限の白血病を有する寛解後のヒト骨髄がモデル化され、ＡＭＬの効果的除去およびＣＤ３３欠失ヒト移植片の再構成が、示される。この研究は、骨髄性白血病を治療する新規方法を提供し、他の癌および他の抗原へ拡張できるであろう。
材料と方法
細胞株および一次ヒト細胞
不死化ヒト急性骨髄細胞株、ＨＬ－６０を、ＡＴＣＣから得て、２０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリンストレプトマイシン含有ＩＭＤＭＥＭ中で培養した。白血病生着および経時的進行を追跡するために、ＨＬ－６０細胞を、ＥＦ１αプロモーター下でｄＴｏｍａｔｏ蛍光タンパク質を発現するレンチウィルス粒子で形質導入した。レンチウィルスベクターおよび粒子は、Ｖｅｃｔａｌｙｓ（Ｔｏｕｌｏｕｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）により作製された。
ヒト骨髄または臍帯血ＣＤ３４＋幹細胞を、ＳｔｅｍＥｘｐｒｅｓｓ（Ｆｏｌｓｏｍ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入し、１％ペニシリンストレプトマイシン、１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ６および１００ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３ＬならびにＵＭ１７１の０．３５ｎＭ（Ｘｃｅｓｓｂｉｏ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含むＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ ＩＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎｃ）中で維持した。全てのヒトサイトカインを、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。
ヒトＴ細胞を、ニューヨーク血液センターから購入した新しい末梢血正常ドナーｌｅｕｋｏｐａｋから精製した。簡単に説明すると、ｌｅｕｋｏｐａｋを、２ｍＭのＥＤＴＡを補充した２～４倍量のリン酸緩衝食塩水（１Ｘ）で希釈し、４℃で保存した。３５ｍＬの希釈したｌｅｕｋｏｐａｋを、１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（商標）Ｐｒｅｍｉｕｍ（ＧＥ）上に注意深く層形成させ、２５℃、４００ｇで３０分間、スイングローターバケットで遠心分離した。単核球の層をその後、新しいチューブに移し、２ｍＭのＥＤＴＡ含有ＰＢＳ（１Ｘ）で１：１に希釈し、４００ｇ、２５℃で１５分間遠心分離した。赤血球ペレットを次に、１Ｘ ＡＣＫリシスバッファー（Ｇｉｂｃｏ）で取り出し、室温で５～８分間インキュベートし、２ｍＭのＥＤＴＡ含有ＰＢＳ（１Ｘ）で洗浄し、４００ｇ、２５℃で１０分間、再度遠心分離した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を次に、製造業者プロトコルに従い、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＣＤ４＋およびＣＤ８＋マイクロビーズで単核球ペレットから陽性選択した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をその後、ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ（１：１のビード：細胞比）（Ｇｉｂｃｏ）を用いて同日に活性化し、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ７および５ｎｇ／ｍＬのＩＬ１５含有Ｇｉｂｃｏ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）ＣＴＳ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ培地中で別々に拡張した。
ＣＡＲ構築物、レンチウィルス産生、および形質導入
抗ＣＤ３キメラ抗原受容体を、ヒレンチウィルスプラスミドｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎ（Ｂｒｙａｎ Ｗｅｌｍ ＆ Ｚｅｎａ Ｗｅｒｂから譲り受けた（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃ １８１２１）（Ｗｅｌｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００８；２（１）：９０－１０２））中にＣＤ８アルファヒンジ領域、ＣＤ８膜貫通領域、４－１ＢＢシグナル伝達領域およびＣＤ３ζ細胞内領域に、インフレームで融合したト化抗ヒトＣＤ３３ ｓｃＦｖの軽鎖および重鎖（クローンＭｙ９６）をクローニングすることにより生成した。全てのｃＤＮＡ素片を、コドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成した。レンチウィルス粒子を、Ｖｅｃｔａｌｙｓ（Ｔｏｕｌｏｕｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）により作製した。活性化の２４時間後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＭＯＩ＝３０にてレンチウィルス粒子で形質導入し、および並行してＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＭＯＩ＝４０にてレンチウィルス粒子で形質導入した。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＣＤ３３ゲノム標的化
ヒト骨髄または臍帯血ＣＤ３４＋幹細胞を、１％ペニシリンストレプトマイシンを含むＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ ＩＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎｃ）、および次のヒトサイトカイン１００ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ６および１００ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ３ＬならびにＵＭ１７１の０．３５ｎＭ（Ｘｃｅｓｓｂｉｏ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）中で維持した。全てのヒトサイトカインを、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。
ＴｒｕｅＣｕｔ Ｃａｓ９タンパク質Ｖ２を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。化学的に修飾されたＣＤ３３標的化ｓｇＲＮＡを、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＣＲＩＳＰＲ Ｇｅｎｅ ＫＯデザインツールを用いてデザインし、Ｓｙｎｔｈｅｇｏから購入した。３μｇのＴｒｕｅＣｕｔ Ｃａｓ９プロテインＡおよび２００，０００個のＣＤ３４＋細胞のための１．５μｇのｓｇＲＮＡを、Ｐ３緩衝液（Ｌｏｎｚａ，Ａｍａｘａ Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ）中で混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。細胞を次に、ＰＢＳで洗浄し、Ｐ３緩衝液中に再懸濁し、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体と混合した後、４Ｄ－ヌクレオフェクターで電気穿孔処理した。電気穿孔後に、細胞を、分析まで３７℃で培養した。
欠失効率を、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄからの以下の抗体：ｈＣＤ３４－ＰｅｒＣｐ／Ｃｙ５．５およびｈＣＤ３３－ＦＩＴＣ、を用いて電気穿孔の７日後に評価した。
全ゲノムおよびＲＮＡ塩基配列決定
Ｃａｓ９のみ、またはＲＮＰ複合体Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡでの電気穿孔後に、ＣＤ３４＋細胞を、インビトロで１０日間保持し、それらのＤＮＡまたはＲＮＡを、次のように単離した。ＤＮＡを、製造業者のプロトコルに従いＱＩＡＡｍｐ ＤＮＡミニキットで精製した後、３０ｕｌで溶出し、ＤＮＡ濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐおよびＱｕＢｉｔ ｄｓＤＮＡ ＢＲアッセイを用いて測定した。ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従いｍｉＲＮｅａｓｙマイクロキットで精製した後、１８ｕｌで溶出した。ＮａｎｏＤｒｏｐおよびＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｐｉｃｏ ｃｈｉｐアッセイを実施して、濃度および品質を測定した。
全ゲノム塩基配列決定のために、ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）ＩＩ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、クラスタリング、および塩基配列決定用試薬に使用した。簡単に説明すると、ゲノムＤＮＡを、音響切断（ａｃｏｕｓｔｉｃ ｓｈｅａｒｉｎｇ）、精製および末端修復によりフラグメント化した。アダプターを連結し、ＤＮＡライブラリーを作製した。ＤＮＡライブラリーをまた、製造業者説明書に従い、リアルタイムＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）により定量化し、フローセルの２つのレーン上でクラスター形成し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ測定器にロードした。試料を、２ｘ１５０ペアードエンド（ＰＥ）構成を用いて配列決定した。画像解析およびベースコーリングを、ＨｉＳｅｑ測定器のＨｉＳｅｑ Ｃｏｎｔｒｏｌソフトウェア（ＨＣＳ）により実施した。ＤＮＡ配列を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ２．１（ＨＡＳ ２．１）で、デフォルトパラメーターを用いて処理した。
ＲＮＡ塩基配列決定のために、ｃＤＮＡ合成および増幅を、塩基配列決定のためのＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ ｖ４ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて実施した。シーケンシングライブラリーを、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて作成した。試料を、２ｘ１５０ペアードエンド（ＰＥ）構成を用いて配列決定した。生データの品質を調査後に、トリムされたリードを、ＳＴＡＲアライナーｖ．２．５．２ｂを用いて、ＥＮＳＥＭＢＬ上で利用可能なホモサピエンス参照ゲノムにマップした。ＢＡＭファイルを、このステップの結果として生成した。特有の遺伝子ヒットカウントを、Ｓｕｂｒｅａｄパッケージｖ．１．５．２からのフィーチャーカウントを用いて計算した。エクソン領域内に入る特有のリードのみをカウントした。遺伝子ヒットカウントの抽出後に、遺伝子ヒットカウント表を、ＳＡＲＴｏｏｌパッケージ（Ｖａｒｅｔ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１６；１１（６）：ｅ０１５７０２２）中のｅｄｇｅＲパッケージを用いる下流の発現差異分析のために使用した。遺伝子は、ｐ値が＞０．０５である場合、有意に異なって発現されると見なした。
フローサイトメトリーおよび選別
インビトロ
形質導入後に、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、１５日間まで拡張した後、ＢｉｏＲａｄ Ｓ３ｅソーターを用いてＧＦＰ＋で選別し（死細胞を、ヨウ化プロピジウムを用いて除外した）、インビトロおよびインビボ実験のために１：１で混合した。ＣＡＲ発現およびＣＤ３３を認識し結合するそれらの能力を、４℃で２０分間ＣＡＲ－Ｔ細胞をビオチン化ヒトＣＤ３３タンパク質（ＡＣＲＯ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）とインキュベートし、その後、蛍光色素標識ストレプトアビジンで染色することにより評価した。
ＣＤ３４＋幹細胞を、ｈＣＤ３４－ＰｅｒＣｐ／Ｃｙ５．５およびｈＣＤ３３－ＦＩＴＣ抗体を用いて電気穿孔の５～７日後に分析した。
インビボ
造血系の経時的な生着および再増殖を、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）またはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）からの、その結果として生ずる下記抗体を用いて、末梢血、骨髄吸引物、全骨髄（麻酔マウス由来）の分析により評価した：Ｔｅｒ１１９－ＰｅＣｙ５、Ｌｙ５－ＢＶ７１１、Ｈ２ｋｄ－ＢＶ７１１、ｈＣＤ４５－ＢＶ５１０、ｈＣＤ３－ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ、ｈＣＤ１２３－ＢＶ６０５、ｈＣＤ３３－ＡＰＣ、ｈＣＤ１４－ＡＰＣ／Ｃｙ７、ｈＣＤ１０－ＢＵＶ３９５、ｈＣＤ１９－ＢＶ６５０、ＣＤ３４－ＢＶ４２１、ＣＤ９０－ＰｅＣｙ７、ｈＣＤ３８－ＢＵＶ６６１、およびｈＣＤ４５ＲＡ－ＢＵＶ７３７。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、蛍光タンパク質ｚｓＧｒｅｅｎを安定に発現し、白血病細胞は、ｄＴｏｍａｔｏを安定に発現し、かつ死細胞は、ヨウ化プロピジウムを用いて除去された。白血病細胞を、Ｔｅｒ１１９－ｄｔｏｍａｔｏ＋でゲーティングした。ＣＤ３４＋注入由来ヒト細胞を、Ｔｅｒ１１９－ｄｔｏｍａｔｏ－、Ｌｙ５－／Ｈ２ｋｄ－ヒトＣＤ４５＋ＣＡＲＴ－でゲーティングした。全てのデータを、ＢｉｏＲａｄ ＺＥ５フローサイトメトリー分析装置により高スループットモードで取得し、分析を、ＦｌｏｗＪｏ１０．４．２を用いて実施した。同時に、白血病進行も、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＩＶＩＳ スペクトル光学イメージングシステムを用いて、蛍光イメージングにより評価された。画像を取得し、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ４．４ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅで分析した。
インビトロ細胞傷害性アッセイ
ｚｓＧｒｅｅｎを安定に発現しているエフェクター選別ＣＡＲ－Ｔ細胞を、次の標的細胞：ｄＴｏｍａｔｏを安定に発現するＨＬ－６０細胞および／またはＣｅｌｌｔｒａｃｅ ｂｌｕｅで染色されたＣＤ３４＋ＣＤ３３ＷＴ細胞および／またはＣｅｌｌｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色されたＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞と種々の比率で混合した。インキュベーションの１６～２４時間後に、細胞生存率測定用試薬として７ＡＡＤまたはＳｙｔｏｘを用いて、データを、細胞傷害性を評価するために、高スループットモードでＢｉｏＲａｄ ＺＥ５フローサイトメトリー分析装置により取得した。陰性対照中の自然発生的溶解を減算した後、ＣＡＲＴ３３細胞の特異的細胞毒性（％）を、ＣＦＳＥおよび７－ＡＡＤまたはＳｙｔｏｘ Ｒｅｄの両方に対する陽性細胞として、次の式：（（ＣＡＲＴ３３を有する陽性細胞％）－（対照Ｔ細胞を有する陽性細胞％））／（１００－（対照Ｔ細胞を有する陽性細胞％））ｘ１００、により計算した。
インビボ実験
ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ＷｊｌＴｇ（ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪ（ＮＳＧ－ＳＧＭ３）マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡ）を、亜致死量（１．２Ｇｙ）の全身照射（ＴＢＩ）で前処置した。ヒトＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ骨髄または臍帯血幹細胞（５＊１０５～１＊１０６個）を、５＊１０５個のｄＴｏｍａｔｏ－ＨＬ－６０細胞と共に、ＴＢＩの８～２４時間以内にマウスの静脈内に注射した。１～２週後に、マウスを、静脈内注射による２～３＊１０６個の抗ＣＤ３または対照ＣＡＲ－Ｔ細胞（予混合ＣＤ４：ＣＤ８＝１：１）または６μｇのＧＯ（ゲムツズマブオゾガマイシン）またはＰＢＳで治療した。
造血系の経時的な生着および再増殖を、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）またはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）からの、その結果として生ずる下記抗体を用いて、末梢血、骨髄吸引物、および全骨髄（麻酔マウス由来）の分析により評価した：Ｔｅｒ１１９－ＰｅＣｙ５、Ｌｙ５－ＢＶ７１１、Ｈ２ｋｄ－ＢＶ７１１、ｈＣＤ４５－ＢＶ５１０、ｈＣＤ３－ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ、ｈＣＤ１２３－ＢＶ６０５、ｈＣＤ３３－ＡＰＣ、ｈＣＤ１４－ＡＰＣ／Ｃｙ７、ｈＣＤ１０－ＢＵＶ３９５、ｈＣＤ１９－ＢＶ６５０、ＣＤ３４－ＢＶ４２１、ＣＤ９０－ＰｅＣｙ７、ｈＣＤ３８－ＢＵＶ６６１、およびｈＣＤ４５ＲＡ－ＢＵＶ７３７。死細胞を、ヨウ化プロピジウムを用いて除去した。ＣＤ３４＋注入由来ヒト細胞を、Ｔｅｒ１１９－、Ｌｙ５－／Ｈ２ｋｄ－ヒトＣＤ４５＋でゲーティングした。
すべての実験を、Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの実験動物委員会により承認されたプロトコルに基づいて実施した。
統計
全ての統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７を用いて行った。連続的な変数に対しては、対応のない両側ｔ検定を行った。手段間の差異を、ｐ値＜０．０５である場合に有意と見なし、その他の場合は、有意でないと見なした（有意でない；ｐ＞０．０５）
結果
ＣＤ３３抗原のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子除去
ＣＤ３３を発現しているＨＬ－６０を使って、ドナー造血幹前駆細胞（ＨＰＳＣ）として、臍帯血（ＣＢ）からまたは成体骨髄（ＢＭ）からのいずれかで、骨髄性白血病および一次ＣＤ３４＋細胞をモデル化した。ＣＤ３３の表面発現を、以前に記載されたように（Ｔａｕｓｓｉｇ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００５；１０６（１３）：４０８６－４０９２；Ｈａｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１８；３３（１）：６４－７４；Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．２０１１；１（９）：ｅ３６；Ｋｒｕｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２３（３）：３５６－３６５）、フローサイトメトリーを使ってＨＬ－６０細胞およびＣＤ３４＋細胞の両方で確証した（図１９Ｂ）。最近開発された汎用ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ編集技術である、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（Ｈａｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１８；３３（１）：６４－７４）を用いて、ＣＤ３３のゲノム座位を遺伝子編集して、その発現を除去した。ガイドを、エクソン３ゲノム座位を標的にするようにデザインし（図１９Ｃは配列番号５８のｓｇＲＮＡ８１１スペーサー配列を示し、図２５Ａは配列番号２９のスペーサー配列を示し、図２５Ｂは配列番号５０のｓｇＲＮＡ８４６スペーサー配列を示す）、理由は、エクソン３が全てのＣＤ３３転写物に共通であり、ＣＤ３３がメンバーであるシグレックファミリー偽遺伝子とほとんど乃至全く類似性がないためである。プラスミド、レンチウィルス、およびリボ核タンパク質（ＲＮＰ）ベース送達システムを試験して、細胞株および一次細胞中のいくつかのガイドの効率を調べ、化学的に修飾されたガイドと組み合わせたＲＮＰシステムが、一次細胞中で最も効率的であることが明らかになった（図１９Ｂおよび１９Ｄ）。最適条件では、ＣＤ３３発現の喪失が、全てのＣＤ３３アイソフォームに共通のＣ２領域中に位置するエピトープを認識する、抗ＣＤ３３クローンＨＩＭ３４を用いてフローサイトメーターで測定して、以降、ＣＤ３３Ｄｅｌと呼ばれる、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの８０％より多くで認められた（図１９Ｂおよび１９Ｄ）。このＣＤ３３発現の減少は、ＤＮＡのサンガー塩基配列決定法により測定される、ＤＮＡ上のＣａｓ９の予測切断部位での挿入／欠失（インデル）の存在が付随した（図１９Ｅ、下段クロマトグラム）。同様にエクソン３を標的にする、２つの他のｓｇＲＮＡを、試験し、それらは同じ効率を示した（図２５Ａおよび２５Ｂ）。予想通り、ｓｇＲＮＡの非存在下のＣａｓ９単独での電気穿孔は、標的部位でなんらのインデルも誘発しなかった（図１９Ｅ、上段クロマトグラム）。ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞は、ＣＤ３４およびＣＤ９０の高発現を維持した（図１９Ｄ、下段パネル）。一貫して高い欠失効率が、いくつかの独立した実験で観察され（図１９Ｆ）、ＣＤ３３ＷＴ細胞中の平均８５％のＣＤ３３発現が、ＲＮＰ電気穿孔後５～７日に、１０％未満のＣＤ３３発現に低下した。加えて、ＣＤ３３発現を欠くＢ細胞を、陰性対照として使用して、Ｃａｓ９媒介欠失後の発現の減少を確証した。観察された残りの１０％のＣＤ３３発現は、編集されていない（両アレルが野生型）か、または部分的に編集されている（１個のみのアレルがインデルを有する）細胞由来であろう。
ＣＤ３４＋ＣＤ３３ＤｅｌＨＳＰＣは、インビボで生着および多系列分化を示す。
本方法は、ＣＤ３３抗原（ＣＡＲＴ３３）を標的とするＣＡＲ－ＴおよびＡＤＣの送達（ＧＯ）のための基盤としてＣＤ３３遺伝子編集幹細胞（ＣＤ３３Ｄｅｌ）の移植を含み得るので、生着ならびに骨髄造血およびリンパ球新生に寄与するＣＤ３３Ｄｅｌ細胞の能力を試験することが重要である。骨髄および臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞の両方を、試験した（図２０）。ＣＤ３３ＤｅｌＨＳＰＣを、亜致死量照射ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスに尾静脈注射し、骨髄および血液を、分析した（図２０Ａ）。骨髄由来細胞を注射したマウスでは、移植後７週での末梢血分析は、ヒトＣＤ４５＋細胞および骨髄（ＣＤ１４＋細胞）ならびにリンパ性（ＣＤ１９＋細胞）起源の存在を示した（図２０Ｂ）。図２６Ｂに要約を示す、１５週の骨髄吸引物の分析（図２６Ａ）および２１週の麻酔マウス由来の全骨髄（図２０Ｃ）は、ヒトＣＤ４５＋細胞の経時的な持続的寄与を含むキメラ現象を示した。検査した全ての組織で、骨髄（単球）およびリンパ性（Ｂ細胞）両方の起源の前駆細胞および成熟細胞の存在を伴う、多系列生着が存在した。全ての細胞は、ＣＤ３３陰性のままであった（図２６Ａおよび２６Ｃ）。ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞の多系列移植における有意差は、野生型細胞と比較した場合、観察されなかった。
同時に、ＣＤ３４＋細胞由来の臍帯血を用いて類似の方法を実施し、類似の結果を得た。多系列生着が、移植後９週の末梢血中（図２０Ｄ）、移植後１６週の骨髄吸引物中（図２６Ｃ）および移植後２１週の全骨髄中（図２０Ｅ）で観察された。上の結果は、ＣＤ３３が、臍帯血（ＣＢ）または骨髄（ＢＭ）ＣＤ３４＋細胞の生着にとって、または動物モデルにおける完全ヒト造血系の持続的再増殖にとって、必須ではないことを示唆する。
ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞は、骨髄分化および機能に関して能力を有する。
この方法の目的は、臨床へのその移転であるので、骨髄ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞の機能的能力を、インビトロおよびインビボで評価した。最初に、骨髄細胞系列の多様性を、ＣＤ３４＋ＣＤ３３ＷＴヒト化マウスと比較して、ＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ中で分析し、顕著な差異は、骨髄サブセットの間で認められなかった。単球分化ＣＤ３４＋ＣＤ３３ＷＴおよびＣＤ３４＋ＣＤ３３ＷＴの大腸菌生体粒子貪食能力を、インビトロで試験した。有意差は、認められなかった。ＣＤ３４＋ＣＤ３３ＷＴまたはＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞を移植したＮＳＧＳマウス中の単球／マクロファージによるＬＰＳ誘導サイトカイン産生も同様に分析し、誘導後のＴＮＦα、ＩＬ６およびＩＬ８の血漿中濃度は同等であった。最後に、インビボでのＣＤ３３欠失細胞の食細胞機能を評価するために、ヒト化マウスの腹膜腔を、大腸菌生体粒子の腹腔内注入の２時間後に分析した。フローサイトメトリー分析は、ＣＤ３４＋ＣＤ３３ＷＴまたはＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌヒト化マウス両方でのｈＣＤ４５＋ｈＣＤ１１ｂ＋ｈＣＤ１４－ｈＣＤ１６－サブセットによる類似の食細胞取込みを示した。全てのこれらの知見は、ＣＤ３３Ｄｅｌ骨髄細胞の損なわれない機能を示す。
遺伝子編集細胞において検出可能なオフターゲット変異誘発または機能的ｐ５３経路の喪失は、観察されなかった。
この試験で使用した２つのガイドが、ＨＳＰ細胞中のオフターゲット部位にインデルを導入するかどうかを評価するために、インデルを、Ｃａｓ９タンパク質のみ（ＣＤ３３ＷＴ）で電気穿孔処理した細胞と比較して、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体（ＣＤ３３Ｄｅｌ）で電気穿孔処理したヒト臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＰ細胞の全ゲノム塩基配列決定データで評価した。６．２９億個を越えるパスフィルタリードを、９３％超のリードでＱ３０を越える塩基品質で得た（図２８）。平均読み深度は、２６Ｘ超であった。一塩基バリアント（ＳＮＶ）および小さいインデルを特定するために、リードをヒトｈｇ３８参照ゲノムに整列させた。
両試料で検出されたバリアントの要約を、図２８に示す。強いオンターゲット活性が、予測切断部位ｃｈｒ１９：５１２２５８１１およびｃｈｒ１９：５１２２５８４６に整列させたリードの９０％超で観察された（図２１Ａ）。重要なことに、全てのインデルは、使用した２つのｓｇＲＮＡの予測切断部位内に位置していた。全体ＣＤ３３座位中の標的化領域の外側に観察されたわずかな小さいインデルは、電気穿孔処理ＣＤ３３Ｄｅｌに特有ではなく、Ｃａｓ９のみで電気穿孔処理した細胞中にも存在した。データを次に、使用したｓｇＲＮＡと４個までのミスマッチを有する高度の類似性を示した予測オフターゲット部位中のインデルについて検査した（図２１Ｂ、２９、および３０）。この場合も、インデルは、検査したいずれのオフターゲット座位にも認められなかった（図２９および３０）。インデルを、ＴＰ５３座位でも検査し、ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞に特有のものは何も認められなかった。
ＣＤ３３発現の減少が他の遺伝子の発現の変化をもたらすかどうかを評価するために、４種の異なるドナーから得たＣＤ３３欠失（ｎ＝５）および対照（ｎ＝５）ＣＤ３４＋細胞の遺伝子発現プロファイルを、比較した。各試料の遺伝子発現プロファイルを、ＲＮＡ塩基配列決定を用いて得て、群間の比較を、ｅｄｇｅＲを用いて実施した。同等の遺伝子発現プロファイルが、２つの群間で観察され、０．９９４８のピアソン相関係数を有し（図２１Ｃ）、有意差は、調節されたｐ値に基づき観察されなかった（図３１）。１４個の遺伝子が、ｐ値に基づき有意に異なると認められ、最も大きい有意差は、対照と比較してＣＤ３３Ｄｅｌ試料中のＣＤ３３の発現低下であった（図２１Ｄおよび３１）。これらの結果は、インビトロでのＣＤ３４＋細胞中のＣＤ３３の非存在が、下流の遺伝子発現に大きな影響を与えないことを確証する。ｐ値に基づき発現の変化を示した１３個の遺伝子の中で、いずれか１つの経路または細胞プロセスでの濃縮はなかった。注目すべきことに、遺伝子発現特性は、ＨＳＣ機能を損なうまたは長期潜在力を漸減させ得るＴＰ５３経路、または他のＤＮＡ損傷経路が活性化されていることを示唆しなかった。従って、本明細書で記載の遺伝子編集技術を用いた臍帯血および成体ＨＳＣ中のＣＤ３３除去は、それらのその後の機能を損なうようではないと結論される。
データを、統合ゲノムビューアー（ＩＧＶ）を用いて、ＣＤ３３のエクソン３にマッピングしたリードのインデルおよびＲＮＡシーケンシングデータ中のＴＰ５３転写物の全てのコードエクソンについてマニュアルでも検査した。予想通り、ＣＤ３３エクソン３中の９５％を越えるリードでインデルが存在した（図２７）。インデルを有する少数のリードがＴＰ５３で見つかったが、それらは、反復配列内にあり、対照試料中にも存在し、シークエンシングアーティファクトであることを示唆する。まとめると、これらのデータは、本研究で使用されるガイドを用いたＣＤ３３座位でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ゲノム編集は、幹細胞系で検出可能なオフターゲットインデルをもたらさないことを示唆する。
Ｔ細胞中でのＣＤ３３特異的ＣＡＲの発現
ＣＡＲは、共刺激領域の数に基づき種々の世代に分類される。ＣＤ２８膜貫通領域と対になった抗ＣＤ３３（クローンＭｙ９６）の単鎖可変領域、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激領域、および細胞内領域としてＣＤ３ ＴＣＲ由来のＣＤ３ゼータ鎖を含む、第二世代ＣＡＲが設計された（図２２Ａ）。ＣＡＲ ｃＤＮＡを、ＥＦ１－αプロモーターの制御下でｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎレンチウィルスベクター中に挿入し、ＺＳ－ｇｒｅｅｎとのバイシストロニック発現を可能にする。通常のドナーからから得られた末梢血を分画して、ＰＢＭＣを得て、ベクターのみ、またはＣＡＲ構築物を有するレンチウィルス粒子で形質導入した（図２２Ｂ）。ＰＢＭＣ内のＣＤ４およびＣＤ８細胞の形質導入効率は、同じではなく、ＣＤ８細胞に比べてＣＤ４のより高い形質導入が観察され、類似の観察は、他の研究でも観察された（Ｂｌａｅｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１８；６７（７）：１０５３－１０６６）。ＰＢＭＣ中のＣＤ４およびＣＤ８細胞の不均等な形質導入を考慮し、かつより明確な組成のＣＤ４およびＣＤ８細胞を得るために、精製ＣＤ４およびＣＤ８細胞を、別々に形質導入し、下流のＩＲＥＳ要素からのＧＦＰ発現に基づき選別し、等モル比で混合した。ＣＡＲ発現を、表面発現およびＣＡＲのストレプトアビジン蛍光色素に結合した精製ビオチン化ＣＤ３３タンパク質へのＣＡＲの結合を測定することにより確認した。ＣＡＲの強い発現およびＣＤ３３分子とのその結合を、観察した（図２２Ｂ）。
ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、インビトロでＣＤ３３依存性細胞傷害性を示す
ＣＡＲＴ３３細胞の細胞傷害性を最初に、様々なＣＤ３３発現を有する標的に対し評価した。ＣＤ３３骨髄性白血病細胞ＨＬ－６０の高い死滅を確証し、低減したレベルでＣＤ３３を発現するＣＤ３３ＷＴ幹細胞のより低い死滅を観察された。特に、ＣＡＲＴ３３の細胞傷害性はＣＤ３３ＤｅｌＣＤ３４＋細胞とインキュベートした場合観察されなかったので、ＣＤ３３発現の非存在（Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ媒介欠失による）は、ＣＤ３４＋細胞を死滅から保護した。この最初の実験（図２２Ｃ）はまた、ＣＡＲＴ３３細胞傷害性レベルと、標的細胞上のＣＤ３３発現レベルとの間の相関を、すなわちＣＡＲＴ３３細胞傷害性は標的細胞上のＣＤ３３の発現レベルに比例することを、確証した。
種々のＣＤ３３発現の標的と共に同時インキュベートした場合の、ＣＡＲＴ３３細胞殺作用を評価するための三重培養アッセイを次に、設計した。ＣＤ３３ＷＴＨＬ－６０細胞およびＣＤ３４＋ＣＤ３３ＷＴ細胞をＣＡＲＴ３３と共インキュベートした場合、ＣＡＲＴ３３細胞の相関する細胞傷害性が、両細胞型で観察された（図２２Ｄ）が、ＣＤ３３ＷＴＨＬ－６０細胞およびＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞をＣＡＲＴ３３細胞と共インキュベートした場合、ＨＬ－６０細胞のみが死滅した（図２２Ｅ）。同様に、３種全ての細胞型、ＣＤ３４＋ＣＤ３３ＷＴ、ＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ、およびＣＡＲＴ３３細胞（図２２Ｆ）の共インキュベーションは、そのＣＤ３３発現に比例したレベルでの、ＣＤ３３ＷＴＣＤ３４＋の死滅のみを示した。さらに、ＣＡＲＴ３３細胞傷害性を、別の急性骨髄細胞株、ＫＧ１で試験し、類似のＣＡＲＴ３３のＣＤ３３依存細胞傷害性を、インビトロで認めた。
抗ＣＤ３３免疫療法は、細胞株由来異種移植片（ＣＤＸ）マウスモデルでＣＤ３３依存性白血病除去を示す。
インビボ実験のために、微小残存病変の場合のヒト治療環境を表す方法を設計した（図２３Ａ）。このモデルでは、白血病を最初に、５００，０００個のＨＬ－６０細胞を亜致死量照射マウスに注入することにより開始させる。マウスに、同時に５００，０００個のＣＤ３３ＤｅｌＣＤ３４＋細胞を注入して、ＡＭＬ再発モデルを模倣した。予備実験は、１００％のマウスが追加の２週間後に白血病になったので、１週間の期間が、ＡＭＬ細胞のホーミングおよび生着を可能にするのに十分であることを示唆した。これは、ＡＭＬ細胞はまだ残っているが臨床的には検出不能である、寛解後骨髄を再現する。白血病およびＣＤ３４＋幹細胞の同時注入の１週後に、マウスを、各種の群に分割し、記載した物質で治療した（図２３Ａ）。白血病負荷量およびＣＤ３４＋細胞生着を、イメージングおよびフローサイトメトリーを用いて経時的に監視した（図２３Ｂ～２３Ｆ）３週目までに、高腫瘍負荷量が、ＰＢＳおよび対照ＣＡＲ－Ｔ細胞治療マウス（すなわち、ＣＡＲ－Ｔ構築物を欠くベクター単独形質導入Ｔ細胞）の骨髄吸引物中で観察され、３および４週目までに、これらの２つの群中の全てのマウスが、それらの疾患で死亡した（図２３Ａ）。２匹の対照Ｔ治療マウスは、３週で比較的低い白血病負荷量を有したが、死亡時には、極めて高いＢＭ中の白血病負荷量に進行した。これに対して、１２週にわたり、ＣＤ３３ＷＴ白血病細胞は、ＣＡＲＴ３３細胞、抗ＣＤ３３ＡＤＣ ＧＯ、またはＧＯとＣＡＲＴ３３の組み合わせで治療されたマウスの骨髄吸引物中（図２３Ｂ）、または３．５週または８週のイメージング上（図２３Ｃ～２３Ｅを参照）には認められなかった。これらの結果は、ＣＡＲＴ３３およびＧＯが、本モデルにおいて、ＣＤ３３を発現している白血病に対し効力の高い物質であることを示唆する。
ＣＤ３４＋ＣＤ３３ＤｅｌＨＳＰＣは、治療モデルで多系列生着および分化を示す。
同時に、マウスを、上記の治療モデルでＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞の多系列生着について監視した。生着が、全ての群の骨髄吸引物中でＣＡＲ－ＴおよびＣＤ３３陰性であるヒトＣＤ４５＋細胞の存在により示されるように、観察され（図２３Ｆ）、ＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞もまた、本治療モデルで移植できることを示唆する。興味深いことに、ＣＤ３３ＤｅｌヒトＣＤ４５＋細胞のパーセンテージの低下が、ＣＡＲＴ３３治療群（ＣＡＲＴ３３＋ＰＢＳおよびＣＡＲＴ３３＋ＧＯ）中の３週目の初期時点に対し６週目の時点で観察されたが、これらのレベルは、９週目までにそれらの初期レベルまで回復され、最後の１２週目の時点まで維持された。２つのマウス群における比較的低い生着および続いて生じる低下は、治療関連ストレス（骨髄中のＣＡＲ－Ｔ細胞による抗白血病応答を含む）を反映している可能性があり、これは、ＣＡＲ－Ｔ群においてより顕著であり、ＧＯ群でよりも長く持続した。あるいは、異なるＣＤ３４＋およびＴ細胞ドナーの使用は、ＣＡＲＴ３３細胞を注入したマウスで観察された再増殖の遅延を説明し得る、アロ応答を誘発したかもしれない。特に、この現象は、生着レベルが８週を越えて回復されたので、可逆的であった。
移植細胞の多能性を次に、骨髄造血およびリンパ球新生を分析することにより調査した（図２４Ａ）。ＣＤ３３陰性骨髄およびリンパ性前駆細胞、ならびに成熟骨髄およびリンパ系細胞が、分析した全ての時点で認められた（図２４Ａ）。完全な造血系の再増殖が、全ての治療マウスで経時的に観察された一方で、リンパ性再増殖の遅延が、ＣＡＲ－Ｔ細胞注入マウスで観察された。これは、リンパ性前駆細胞はアロ特異的効果により高感受性であることが知られているので、アロ応答の結果であろう。
同時に、ＣＤ３４＋ＣＤ３３ＷＴ一次ＨＳＰＣに対するＣＡＲＴ３３およびＧＯの特異性を示すために、亜致死量照射ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスに、５００，０００個のＨＬ－６０細胞および５００，０００個のＣＤ３４＋ＣＤ３３ＷＴ細胞を共注入した（図２４Ｂ）。１週後に、マウス群を、ＣＡＲＴ３３細胞で治療し、３週目にＢＭ吸引し、同じ日に別の群のマウスにＧＯを注入し、それらのＢＭ吸引物を、４日後に分析した。治療モデルで観察されたように、完全白血病除去が、治療後に確認された（図２４Ｃ）。さらに、ＣＤ３３ＷＴ細胞の完全除去が、観察された（図２４Ｄ）。従って、ＣＤ３３ＷＴ細胞は、ＧＯおよびＣＡＲＴ３３治療法に対し感受性のままであり、一方でＣＤ３３除去細胞は、非感受性である。
考察
ＣＡＲ－ＴまたはｍＡｂのような物質を用いる何らかの抗原依存性免疫療法の成功は、癌細胞表面上にあり、かつ身体の正常細胞または他の細胞上にはない、特有の抗原の存在に依存する。都合の悪いことに、このような抗原は、癌では希である。１つの可能な結果は、幹細胞でゲノム操作法を用いてＬＳＡを除去することにより、抗原依存性免疫療法に耐性である幹細胞／前駆細胞を生成でき、それにより最大限の免疫療法を可能にすることであろう。このような抗原枯渇細胞が野生型細胞に機能的に類似であることを実証した後、それらを、疾患細胞と置き換えるために使用できる。その系統の正常機能に必要とされない系統特異的抗原の注意深い選択が、この方法には重要である。代替方法では、ＬＳＡが不可欠な場合、ＬＳＡの発現を完全に除去する代わりに、ＬＳＡ機能を維持しながら、遺伝子編集技術を使用して、ＬＳＡ上の抗原依存性免疫療法剤により認識されるエピトープを修飾できる（「機能的重複エピトープスイッチング（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｅｐｉｔｏｐｅ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）」、またはＦＲＥＳと呼ぶ）。
本研究では、系統抗原、ＣＤ３３を欠く幹細胞を、同種遺伝子操作されたＴ細胞またはＡＤＣと組み合わせることが、白血病除去および完全造血再増殖を可能にできることを示した。療法の領域で未充足のニーズがある疾患である急性骨髄性白血病を用い、このような方法が可能であることが示された。ＣＤ３３は、ＬＳＡであり、ＣＡＲ－ＴまたはＣＤ３３ ｍＡｂを用いるＡＭＬ中のＣＤ３３の標的化は、幹細胞／前駆細胞ならびに骨髄細胞系列細胞の除去による重度骨髄抑制およびリンパ枯渇をもたらすので、ＡＭＬを治療するために提案される方法は、ＣＤ３３を欠く細胞による造血系を再構築することである。ＣＲＩＳＰＲベース方法を用いて、臍帯血または骨髄ＣＤ３４＋細胞のいずれかの、ドナー幹細胞中のＣＤ３３発現を妨害して、それらにＣＡＲ－Ｔ細胞攻撃に対する「抵抗性」を与えた。
近年、２つのグループが、類似の観察を行い、この研究で記載の方法を独立に報告した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１８；１７３（６）：１４３９－１４５３ ｅ１４１９；Ｈｕｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１９；３３（３）：７６２－８０８）。本データは、これらの研究でなされた観察を強化し、相補的な手法を用いて新規洞察も付与する。マウスが最初にＣＤ３３遺伝子編集ＣＤ３４＋細胞を注入されて、白血病導入および治療の前に完全生着を可能にするＫｉｍらの研究とは異なり、本方法は、白血病細胞および遺伝子編集幹細胞が共注入され、それにＣＡＲ－ＴまたはＡＤＣ療法が続くので、微小残存病変を有するＡＭＬ再発の状況をより厳密に模倣する。さらに、高いオンターゲットおよび低いオフターゲット活性を有するＣＤ３３ガイドＲＮＡを厳密に選択することにより、極めて効率的なＣＤ３３発現の除去が、他の遺伝子で観察されるオフターゲットインデルなしに、ＨＳＣ中で観察され、従って、ヒト試験におけるこの方法の安全性に対する信頼を可能にする（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１８；１７３（６）：１４３９－１４５３ ｅ１４１９）。実際に、インデルは、検査したいずれの遺伝子および偽遺伝子シグレックファミリー内にも認められなかった。Ｋｉｍらは、１４ｋｂのフラグメントの欠失を含む、シグレック２２Ｐ中のオフターゲット活性を観察したが、これは、おそらく、ＣＤ３３のために設計したｓｇＲＮＡのシグレック２２Ｐとの１００％の相同性による（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１８；１７３（６）：１４３９－１４５３ ｅ１４１９）。エクソン３内の場所の選択、および選択したｓｇＲＮＡの他の遺伝子との相同性の欠如の確認は、ＣＤ３３のみの除去の特異性を可能にした。ＴＰ５３遺伝子中のインデルまたは他のゲノム再配列の非存在（全ゲノム塩基配列決定を用いて分析して）、およびｐ５３経路またはｐ５３それ自体に関連するいずれかの調節解除された遺伝子の存在は、本明細書で開発された方法が、ＨＳＣ機能を損なうことなく、高い特異性を有する効率的ゲノム編集を提供する可能性があることを示唆する。最終的に、Ｃａｓ９ ＲＮＰ（これは、それらのエクスビボ操作中のＨＳＣ中で一過的に存在するのみである）の使用は、インビボでＨＳＣ中にて構成的で連続的であるＣａｓ９のウィルス媒介発現とは対照的に、５０％を越える集団に存在することがわかっているＣａｓ９に対する既存の免疫に伴う将来の問題を回避する（Ｃｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１９；２５（２）：２４９－２５４；Ｃｒｕｄｅｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１８；９（１）：３４９７）。
さらに、Ｋｉｍらとは対照的に、本手法は、ＣＤ３３編集ＨＳＣ（臍帯血または成体骨髄由来の）を用いるアロＢＭＴと、それに続く、同種ドナー由来のＴ細胞によるＡＤＣ治療またはＣＡＲ－Ｔ治療を含む。この方法は、臨床現場でより実用的である。細胞傷害性化学療法剤で重度に前治療された血液系腫瘍の患者は多くの場合、芳しくない自己Ｔ細胞収率をもたらし、自己ＣＡＲ－Ｔの効率および有効性を制限する。この問題は、アロＢＭＴおよびアロＴ細胞を用いることにより回避され、この場合、収率と品質は問題にならない。より重要なことに、疾患を標的にするためにＡＤＣ（ＣＡＲ－Ｔではなく）を使用することにより、体液性療法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞と呼応して、またはＣＡＲ－Ｔ細胞の代替物として、作用でき、体液性方法を使用する抗白血病療法に対する方法をさらに拡張できる。
ＧＯ薬物（抗ＣＤ３３抗体クローンＰ６７．６からなる）がエクソン２中のエピトープを認識することも、注目に値する。ＣＤ３３の２つのアイソフォームが、ヒトで見つかっている。より一般的なアイソフォームは、ＧＯに感受性があるエクソン２を含む完全長タンパク質である。あまり一般的でないのは、エクソン２を欠くアイソフォームである。集団の約３０％が、ホモ接合体一塩基多型（ＳＮＰ、Ｔ／Ｔ）を有し、エクソン２を欠くより一般的でないＣＤ３３バリアントの排他的発現を生じる。この集団はまた、この仕事で記載される標的化ＣＤ３３免疫療法と組み合わせたＨＳＣＴドナーの潜在的プールとも考えられ、それによりＣａｓ９指向性除去の必要性をなくし得る。しかし、これは、ドナープールを劇的に制限し、この方法をヒト試験で実際に実行不可能にする可能性がある。これについて、Ｈｕｍｂｅｒｔら（Ｈｕｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１９；３３（３）：７６２－８０８）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を使用して、エクソン２を欠失させるために２つの異なるｓｇＲＮＡを用いて隣接イントロンを標的にした。全ＣＤ３３の除去による生着または機能欠損がマウスまたはサル（アカゲザル）で観察されなかったので、Ｖ領域の選択的除去が、全ＣＤ３３の破壊よりも何らかの利点を有するかどうかは、確かではない（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１８；１７３（６）：１４３９－１４５３ ｅ１４１９）。さらに、複数ガイドの使用は、潜在的なオフターゲットを増加させ、ガイドの効率はおそらく、プール中の最小効率のガイドにより制限されるであろう。
本研究では、ヒトＣＤ３４＋ＢＭおよびＣＢ中のＣＤ３３の欠失は、何らかの顕著な副作用を生じなかった。移植の２１週超後に、ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスは、何らかの異常な表現型を示さなかった。観察可能なＣＤ３３欠失関連表現型の非存在は、機能的冗長性またはシグレックメンバー中の補償により説明され得る。
改変免疫細胞を含む臨床試験の数が次第に増加しているにもかかわらず、主に正常組織でのオンターゲット／オフ組織毒性の理由で、患者にとって改善された成果はほとんど得られていない。ＣＡＲ－Ｔは、その長期的効果が十分に確立されていない、最近の方法であるが、ｍＡｂおよびＡＤＣの使用は、癌治療では日常的であり、通常は安全である。ＣＡＲＴ細胞および／またはＧＯなどのＡＤＣと、遺伝子操作された幹細胞の組み合わせは、オンターゲット／オフ組織毒性から正常組織を保護し、動物モデルにおいて完全寛解および完全造血再構成をもたらすことができることが示されている。実証された利益にもかかわらず、実質上全てのＧＯで治療された患者は、通常の骨髄細胞系列統細胞のかなりの減少を経験し、これは、ＧＯ誘導骨髄抑制による致死性発熱性好中球減少症および異常出血障害をもたらす可能性がある（Ａｍａｄｏｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１６；３４（９）：９７２－９７９）。これらの重度有害事象は、化学療法の誘導中のＧＯの使用を短時間の曝露に制限し、その長期使用を実質的に妨げる。この研究はまた、より低いＧＯ投与量と、ＣＡＲＴ３３注入のある場合とない場合の組み合わせが、ＡＭＬ患者を治療するための根本的に新しい手法になり得ることを示唆する。最終的に、最近のＧＯの再認可、および現在の新規ＣＤ３３指向性試薬（新規抗ＣＤ３３ ＣＡＲ－Ｔ、抗ＣＤ３３ ＡＤＣおよびＣＤ３３二重特異的Ｔ細胞エンゲージャーまたはＢｉＴＥを含む）の臨床試験は、近い将来に、この方法の臨床への移転を可能にするであろう。
容易に使用可能なパイプラインもまた、ＣＤ３３を魅力的な標的、すなわち造血細胞により厳密に発現されかつ癌細胞によっても発現される標的、にする、機能的に冗長な系統マーカーにする特性を共有する、新規の潜在的な標的（例えば、ＣＤ１２３、ＣＬＬ－１またはＣＤ２４４）を試験するために設計されている。この抗原は、ＨＳＣ由来抗原のＣＲＩＳＰＲ媒介除去により「癌特異的」になる（Ｈａｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１８；３３（１）：６４－７４）。この戦略はまた、固形腫瘍でも再現され得、この場合、機能的オルガノイドが、発現を除去するように編集されている胚性または誘導多能性幹細胞から生成され得るか、または原発性臓器が既に除去されている（すなわち、根治的前立腺摘出術後の患者において正常な前立腺系統抗原を標的にするために）。最後に、ＤＮＡ塩基編集法を使用する特異的抗原の「エピトープ修飾」の可能性が、提案される。「エピトープ修飾」は、タンパク質がその機能を維持するが、小さい抗原決定基を切り変えることを可能にし得る。この戦略では、幹細胞は、機能的タンパク質を保持するが、最早、免疫療法のための結合部位を有さず、一方で非修飾タンパク質を有する癌細胞は、免疫療法に対し特異的に感受性のままである。
実施例６：ゲムツズマブオゾガマイシン（ＧＯ）標的化免疫療法は、原発性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を除去し、ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞をレスキューした
ＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞を、ＣＤ３４＋細胞集団をｇＲＮＡ ｓｇＲＮＡ８１１（ガイド領域：５’ ＣＣＵＣＡＣＵＡＧＡＣＵＵＧＡＣＣＣＡＣ ３’；配列番号７０を有する）およびｓｇＲＮＡ８４６（ガイド領域：５’ ＡＵＣＣＣＵＧＧＣＡＣＵＣＵＡＧＡＡＣＣ ３’；配列番号６７を有する）と接触させることにより生成した。
ＧＯ治療時のＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞生着および造血再増殖を評価するために、０．５ｘ１０６個の一次ヒトＡＭＬ細胞を、１日目に尾静脈経由でＮＳＧ－ＳＧＭ３（ＮＳＧＳ）マウスに静脈内注入した。ＡＭＬ細胞注入の２ヶ月後に、ＡＭＬ負荷量（微小残存病変）を、骨髄（ＢＭ）吸引物のフローサイトメトリーにより評価した。コホートをその後、次の２つの同等の群（図３２Ａのグラフ：治療前）に分割した。対照群（丸）－この群ではマウスは治療を受けない、および治療群（三角）－この群ではマウスは長期ＧＯ投与を受ける。白血病細胞を、次の抗体を用いて、Ｔｅｒ１１９－Ｈ２ｋｄ／Ｌｙ５－ｈＣＤ４５＋ｈＣＤ３３＋ｃＫｉｔでゲーティングした：Ｔｅｒ１１９ Ｐｅｃｙ５、Ｌｙ５／Ｈ２ｋｄ ＢＶ７１１、ｈＣＤ４５ ＢＶ５１０、ｈＣＤ３３ ＡＰＣ、ｃＫｉｔ ＢＶ６５０。微小残存病変を評価したら、治療群由来のマウスは、１μｇのＧＯの第１の注入を受けた。第１のＧＯ注入の１０日後に、両マウス群（未治療および治療）に、０．５ｘ１０６個のＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞を移植した。ＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞移植の１０日後に、治療群は、長期ＧＯ投与（１μｇのＧＯの１０日毎の注入）を受け始めた。ＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ移植の３週後に、両マウス群のＢＭ吸引物のＡＭＬ負荷量およびＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞生着評価を、フローサイトメトリーにより分析した。対照マウスでは、ＡＭＬレベルは、７０％より大きく、一方、治療マウスでは、ＡＭＬレベルは、５％未満であった。対照マウスでは、ｈＣＤ３３Ｄｅｌ細胞のパーセンテージは、２０％未満であったが、一方、治療マウスでは、ｈＣＤ３３Ｄｅｌ細胞は、７０％超であり、生着の成功を示す。（図３２Ｂ、上段グラフ）。次に、注射ＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ細胞の造血再増殖能力を、図３２の（続き）で示されるようにフローサイトメトリーにより骨髄／リンパ性前駆細胞および成熟細胞を分析することにより評価した。ｈＣＤ４５＋ＣＤ３３Ｄｅｌ集団（細胞を、Ｔｅｒ１１９－、Ｌｙ５－／Ｈ２ｋｄ－、ｈＣＤ４５＋、ｈＣＤ３３－でゲーティングした）内のＣＤ１２３＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ１０＋細胞、およびＣＤ１９＋細胞のレベルは、対照および治療コホート間で有意差がなかった。図３２Ｃ、左上段のパネルで示されるように、どの対照マウスも、１５０日間生存しなかったが、全ての治療マウスは、少なくとも１５０日間生存した。ＡＭＬ負荷量は、死亡時には、対照マウスのＢＭ、脾臓および末梢血間で同等であった（左下段パネル）。さらに、ＣＤ３３発現は、それぞれの臓器または組織由来のゲートをかけたＣＤ３３＋細胞により示されるように、ＢＭおよび脾臓中で最も顕著であった（右パネル）。
実施例７：ＣＤ３４＋ＣＤ３３ＤｅｌＣＬＬ１Ｄｅｌ細胞の生成
ＣＤ３４＋ＣＤ３３ＤｅｌＣＬＬＤｅｌ二重欠失細胞を、ＣＤ３４＋細胞を、ｓｇＲＮＡ ８１１（ＣＤ３３に対して、５’ ＣＣＵＣＡＣＵＡＧＡＣＵＵＧＡＣＣＣＡＣ ３’（配列番号７０）のスペーサー配列を有する）、ｓｇＲＮＡ ８４６（ＣＤ３３に対して、５’ ＡＵＣＣＣＵＧＧＣＡＣＵＣＵＡＧＡＡＣＣ ３’（配列番号６７）のスペーサー配列を有する）、ＣＬＬ－１ ｇＲＮＡ（５’ ＧＵＵＧＵＡＧＡＧＡＡＡＵＡＵＵＵＣＵＣ ３’（配列番号１１５）のスペーサー配列を有する）および第２のＣＬＬ－１ ｇＲＮＡ（５’ ＧＧＡＧＡＧＧＵＵＣＣＵＧＡＵＣＵＵＧＵ ３’（配列番号１１６）のスペーサー配列を有する）を含むｇＲＮＡの種々の組み合わせで遺伝子導入することにより生成した。１日目に、細胞を、標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介除去後に得るために、ヌクレオフェクションを用いてｓｇＲＮＡで遺伝子導入した。遺伝子導入の４日後に、ＣＤ３３およびＣＬＬ１の発現を、フローサイトメトリーで評価した。５日目に、ＣＤ３４＋ＷＴ、ＣＤ３４＋ＣＤ３３Ｄｅｌ、ＣＤ３４＋ＣＬＬ１ＤｅｌまたはＣＤ３４＋ＣＤ３３ＤｅｌＣＬＬ１Ｄｅｌ細胞を、ＮＳＧＳマウスに静脈内注入した。図３３Ａに示されように、ＣＤ３３および／またはＣＬＬ１レベルは、これらのｇＲＮＡを用いて、個別におよび組み合わせて、うまく低減された。所望の座位での変異を、サンガー塩基配列決定法により確認した（データは示さず）。
注入の４週後に、注入マウスの骨髄（ＢＭ）吸引物を、フローサイトメトリーにより分析し、Ｔｅｒ１１９－、Ｌｙ５－／Ｈ２ｋｄ－、ｈＣＤ４５＋でゲートをかけたＣＤ３４＋細胞中のＣＤ３３および／またはＣＬＬ１の存在を決定した（図３３Ｂ）。単一およびダブル欠失細胞は、骨髄試料中でうまく検出された。さらに、ＣＤ１２３＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１０＋、およびＣＤ１９＋細胞が、全骨髄試料（図３３Ｃ）および脾臓試料（図３３Ｄ）の両方で、ｈＣＤ４５＋集団中で検出された。この分析は、ＣＤ３３および／またはＣＬＬ１の減少が、造血多系列生着を損なわなかったことを示す。
Figure 2022517618000013
その他の実施形態
本明細書で開示される特徴のすべては、任意の組み合わせで組み合わされ得る。本明細書で開示されるそれぞれの特徴は、同じ、同等の、または類似の目的をもたらす代替えの特徴により交換され得る。このため、他に明確な記載がない限り、開示されるそれぞれの特徴は、包括的な一連の同等または類似の特徴の例にすぎない。
上の記載から、当業者は本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、この精神および範囲から逸脱せずに、本開示の様々な変更および改良を実施して、様々な使用および条件にこれを適応することができる。そのため、他の実施形態も特許請求の範囲内に入る。
等価物
いくつかの発明の実施形態が本明細書で記載され例証されており、当業者は本明細書で記載される機能を実施する、および／または結果および／または１つまたは複数の利点を得るために、様々な他の手段および構造を容易に想起するが、このような変更および／または改善のそれぞれは本明細書で記載される発明の実施形態の範囲内に入ると見なされる。より一般的には、当業者は、本明細書で記載されるすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成は例示的であることが意味され、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は具体的な適用、または本発明の教示が使用される適用に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、少ない定型的な実験を用いて、本明細書で記載される具体的な本発明の実施形態との多くの均等物を認識し、あるいは確認することができる。従って、前述の実施形態は例としてのみ提示され、添付の特許請求の範囲およびこの均等物の範囲内では、本発明の実施形態は具体的に記載および請求されるもの以外の方法で実施され得る。本開示の発明による実施形態は、本明細書で記載されるそれぞれの個別の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法に関するものである。さらに、このような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の２つ以上の任意の組み合わせは、このような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が 相互に不整合でない場合、本開示の発明の範囲内に含まれる。
本明細書で定められ使用されるすべての定義は、定められた用語の辞書による定義、参照によって組み込まれている文書における定義、および／または通常の意味を網羅して管理すると理解されるべきである。
本明細書で開示されるすべての参考文献、特許、および特許出願は、それぞれが引用される主題に関連して参照によって組み込まれ、いくつかの場合には、文書全体が包含され得る。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、特に明示的に示されない限り、不定冠詞の「ａ」および「ａｎ」は、「少なくとも１つの」を意味するものと理解されるべきである。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、語句の「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」は、このように結合された要素の「一方または両方」、すなわち、いくつかの事例では接続的に存在する要素、その他の事例では離接的に存在する要素を意味すると理解されるべきである。「および／または」を用いて列挙された複数の要素は、同様に、すなわち、そのように結合された「１つまたは複数」の要素と解釈されるべきである。「および／または」節により具体的に特定された要素以外の、その他の要素は、特に特定されたこれらの要素に関連してもまたは非関連であっても、任意に存在してよい。したがって、非限定的例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む」などのオープンエンド用語と共に使用される場合、一実施形態では、Ａのみ（任意選択で、Ｂ以外の要素を含む）；別の実施形態では、Ｂのみ（任意選択で、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（任意選択で、その他の要素を含む）；などを意味してよい。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または（ｏｒ）」は、上記で定義の「および／または」と同じを意味するものと理解されるべきである。例えば、リスト中の項目を分離する場合、「または（ｏｒ）」または「および／または」は、包括的であると解釈されるべきである、すなわち、少なくとも１つの数の要素またはリストの要素を含むと解釈されるべきであるが、また２つ以上の数の要素またはリストの要素、および任意選択で、追加の非リスト項目を含むと解釈されるべきである。それと反対に、「ただ１つの」または「正確に１つの」などの明確に示された「唯一（ｏｎｌｙ）」、または請求項で使用される場合の「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、正確に１つの要素の数またはリストの要素を意味するであろう。一般に、本明細書で使用される場合、用語の「または（ｏｒ）」は、「どちらか」、「～の１つ」、「～の１つのみ」、または「正確に１つの」などの排他的用語が先行する場合、排他的選択肢（すなわち、「１つまたはもう一方であるが両方ではない」）を示すとのみ解釈されるものとする。特許請求の範囲で使われる場合、「本質的になる」は、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、１つまたはそれを超える要素のリストに関連して、語句の「少なくとも１つの」は、要素のリスト中のいずれか１つまたはそれを超える要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、少なくとも１つのそれぞれのおよびすべての、要素のリスト内に具体的にリストされた要素を必ずしも含むとは限らず、要素のリスト中の要素の任意の組み合わせを排除しないと理解されるべきである。この定義はまた、語句の「少なくとも１つの」が指す要素リスト内で具体的に特定された要素以外の、これらの具体的に特定された要素に関連した、または関連していない要素が、任意選択で存在してもよいことを許容する。したがって、非限定的例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同じ意味で、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同じ意味で、「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つの、任意選択で、２つ以上のＡを含みＢが存在しない（および任意選択でＢ以外の要素を含む）を意味し；別の実施形態では、少なくとも１つの、任意選択で２つ以上のＢを含みＡが存在しない（および任意選択でＡ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態では、少なくとも１つの、任意選択で２つ以上の、Ａを含み、および少なくとも１つの、任意選択で、２つ以上のＢ（および任意選択でその他の要素を含む）を含む；などを意味してよい。
別義が明確に指示されない限り、１つを超えるステップまたは行動を含む本明細書において請求されるいずれかの方法において、本方法のステップまたは行動の順序は必ずしも引用される方法のステップまたは行動の順序に限定されないことも理解されるべきである。

Claims (40)

  1. 内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含み、前記遺伝子変異が、ＣＣＵＣＡＣＵＡＧＡＣＵＵＧＡＣＣＣＡＣ（配列番号７０）のヌクレオチド配列を含む、ｇＲＮＡにより標的にされる部位にあり、前記遺伝子変異が、野生型の対応細胞に比べて低減した発現レベルのＣＤ３３を生じさせる、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
  2. 前記野性型の対応物により発現されるＣＤ３３の２０％未満のＣＤ３３を発現する、請求項１に記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
  3. ＣＤ３３を発現しない、請求項２に記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
  4. ＣＤ３４＋である、請求項１～３のいずれか１項に記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
  5. 対象の骨髄細胞または末梢血単核球由来である、請求項１～４のいずれか１項に記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
  6. 前記対象が、造血器悪性腫瘍を有するヒト患者である、請求項５に記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
  7. 前記対象が、健康なヒトドナーである、請求項５に記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
  8. 予測されるいずれのオフターゲット部位中にも、例えば、図３０に列挙されたいずれの部位にも変異を含まない、請求項１～７のいずれかに記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
  9. 請求項１～８のいずれか１項に記載の複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む、細胞集団。
  10. 遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を製造する方法であって、
    （ｉ）造血幹細胞または前駆細胞を用意すること、および
    （ｉｉ）（ａ）配列番号７０に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；および（ｂ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを前記細胞中に導入し、それにより遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を製造すること、
    を含む、方法。
  11. 前記遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞が、前記野性型の対応物により発現されるＣＤ３３の２０％未満を発現する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞が、ＣＤ３３を発現しない、請求項１１に記載の方法。
  13. （ａ）および（ｂ）が、前記細胞中に導入される、１つのベクターにコードされる、請求項１０～１２のいずれかに記載の方法。
  14. 前記ベクターが、ウィルスベクターである、請求項１３に記載の方法。
  15. （ａ）および（ｂ）が、予め形成されたリボ核タンパク質複合体として前記細胞中に導入される、請求項１０～１２のいずれかに記載の方法。
  16. 前記リボ核タンパク質複合体が、電気穿孔法により前記細胞中に導入される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ分子を細胞中に送達することにより前記細胞中に導入される、請求項１０～１２のいずれかに記載の方法。
  18. 前記ｇＲＮＡが、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１０～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記ｇＲＮＡが、化学的に修飾されたｓｇＲＮＡである、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記造血幹細胞または前駆細胞が、ＣＤ３４＋である、請求項１０～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記造血幹細胞または前駆細胞が、対象の骨髄細胞または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）由来である、請求項１０～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記対象が、造血障害を有する、請求項２１に記載の方法。
  23. 請求項１２～２２のいずれか１項に記載の方法により製造される、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
  24. 造血障害を治療する方法であって、前記請求項１～８および２３のいずれか１項に記載の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞、または請求項９に記載の細胞集団の有効量をそれを必要としている対象に投与することを含む、方法。
  25. 前記造血障害が、造血器悪性腫瘍である、請求項２４に記載の方法。
  26. ＣＤ３３を標的にする物質の有効量を前記対象に投与することをさらに含み、かつ前記物質が、ＣＤ３３を結合する抗原結合フラグメントを含む、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
  27. 前記ＣＤ３３を標的にする物質が、ＣＤ３３を結合する抗原結合フラグメントを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記免疫細胞、前記遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞、または両方が、同種である、請求項２４～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記免疫細胞、前記遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞、または両方が、自己である、請求項２４～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記キメラ受容体中の抗原結合フラグメントが、ヒトＣＤ３３を特異的に結合する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項２７～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記対象が、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、または多発性骨髄腫を有するヒト患者である、請求項２４～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記対象が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、または慢性リンパ性白血病である白血病を有するヒト患者である、請求項３２に記載の方法。
  34. 配列番号７０に少なくとも約９０％同一であるスペーサー配列を含む、ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）。
  35. 前記ｇＲＮＡが、単一分子ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項３４に記載のｇＲＮＡ。
  36. 前記ｇＲＮＡが、化学的に修飾される、請求項３４または請求項３５に記載のｇＲＮＡ。
  37. 前記スペーサー配列が、配列番号７０である、請求項３４～３６のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ。
  38. 標的細胞中の予測されるいずれのオフターゲット部位への遺伝子編集も指示しない、例えば、標的細胞中の図３０中に列挙されたいずれの部位にも遺伝子編集を指示しない、請求項３４～３７のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ。
  39. 内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含み、前記遺伝子変異が、ＡＵＣＣＣＵＧＧＣＡＣＵＣＵＡＧＡＡＣＣ（配列番号６７）のヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡにより標的にされる部位にある、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
  40. 配列番号６７に少なくとも約９０％同一であるスペーサー配列を含む、ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）。
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