BR112020020841A2

BR112020020841A2 - Composições e métodos para transplante de célulastronco

Info

Publication number: BR112020020841A2
Application number: BR112020020841-8A
Authority: BR
Inventors: Brian Beard; Julian Sevilla Navarro; Gaurav Shah; Kinnari Patel; Raj Prabhakar
Original assignee: Fundacion Para La Investigacion Biomedica Del Hospital Infantil Universitario Nino Jesus; Rocket Pharmaceuticals, Ltd.
Priority date: 2018-04-11
Filing date: 2019-04-11
Publication date: 2021-01-19
Also published as: MX2020010718A; KR20210003738A; SG11202008400SA; IL277878A; WO2019200167A1; JP2021521180A; AU2019252662A1; RU2020129103A; US20210154237A1; CA3093708A1; EP3773636A1; IL307996A; CN112153973A

Abstract

composições e métodos para transplante de célulastronco. a presente invenção fornece sistemas e métodos para fabricar e usar células-tronco corrigidas por genes para terapia genética. em particular, são fornecidos aqui métodos para tratar a anemia de fanconi, na qual as células-tronco de um paciente são selecionadas por uma combinação da seleção para cd34+ de alta estringência e seleção para cd34+ de baixa estringência, geneticamente modificadas usando um vetor de terapia genética que codifica uma proteína fanc ou um sistema de edição de genes, e administradas ao paciente.

Description

Nome: RAJ PRABHAKAR CPF: Nacionalidade: Norte Americana Qualificação Física: Pesquisador Endereço: c/o Rocket Pharmaceuticals, Ltd. The Empire State Building, 350 Fifth Avenue, Suite 7530, New York Cidade: New York 10118 Estado: CEP: País: ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA Telefone: Fax: Email: Documentos anexados Tipo Anexo Nome Comprovante de pagamento de GRU 200 206.488-0 GRU.pdf Relatório Descritivo 206.488-0 RELATÓRIO.pdf Reivindicação 206.488-0 REIVINDICAÇÕES.pdf Desenho 206.488-0 DESENHO.pdf Resumo 206.488-0 RESUMO.pdf Prioridade 206.488-0 PRIORIDADE 62.656.292.pdf Documento de Cessão 206.488-0 cessao_01.pdf Documento de Cessão 206.488-0 cessão_02.pdf Sequências Biológicas Declaro que a informação contida na 'Listagem de Sequências' apresentada em formato eletrônico está limitada ao conteúdo da matéria revelada pelas sequências de aminoácidos e/ou de nucleotídeos divulgadas no pedido de patente, conforme depositado Tipos de Sequências Biológicas Nome Listagem de Sequências Biológicas em formato 2064880 Listagem de Sequências.TXT

TXT Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 09/10/2020 às 15:38, Petição 870200128010

Acesso ao Patrimônio Genético Declaração Negativa de Acesso - Declaro que o objeto do presente pedido de patente de invenção não foi obtido em decorrência de acesso à amostra de componente do Patrimônio Genético Brasileiro, o acesso foi realizado antes de 30 de junho de 2000, ou não se aplica.

Declaração de veracidade Declaro, sob as penas da lei, que todas as informações acima prestadas são completas e verdadeiras.

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[bb.com.br] - Boleto gerado pelo sistema MPAG. 06/10/2020 09:01:38 INSTRUÇÕES: A data de vencimento não prevalece sobre o prazo legal. O pagamento deve ser efetuado antes do protocolo. Órgãos públicos que utilizam o sistema SIAFI devem utilizar o número da GRU no campo Número de Referência na emissão do pagamento. Serviço: 200-Pedido nacional de Invenção, Modelo de Utilidade, Certificado de Adição de Invenção e entrada na fase nacional do PCT Clique aqui e pague este boleto através do Auto Atendimento Pessoa Física. Clique aqui e pague este boleto através do Auto Atendimento Pessoa Jurídica.

00190.00009 02940.916196 24681.632170 6 84290000017500 DANIEL ADVOGADOS ALT DE DANIEL E CIA CPF/CNPJ: 33073800000191 AV REPUBLICA DO CHILE N 230 3 ANDAR CENTRO, RIO DE JANEIRO -RJ CEP:20031170 29409161924681632 29409161924681632 04/11/2020 175,00 INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUST CPF/CNPJ: 42.521.088/0001-37 RUA MAYRINK VEIGA 9 24 ANDAR ED WHITE MARTINS , RIO DE JANEIRO - RJ CEP: 20090910 2234-9 / 333028-1

00190.00009 02940.916196 24681.632170 6 84290000017500 04/11/2020 INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUST CPF/CNPJ: 42.521.088/0001-37 2234-9 / 333028-1 06/10/2020 29409161924681632 DS N 06/10/2020 29409161924681632 29409161924681632 17 R$ 175,00 A data de vencimento não prevalece sobre o prazo legal. O pagamento deve ser efetuado antes do protocolo. Órgãos públicos que utilizam o sistema SIAFI devem utilizar o número da GRU n o campo Número de Referência na emissão do pagamento. Serviço: 200-Pedido nacional de Invenção, Modelo de Utilidade, Certificado de Adição de Invenção e entrada na fase nacional do PCT DANIEL ADVOGADOS ALT DE DANIEL E CIA CPF/CNPJ: 33073800000191 AV REPUBLICA DO CHILE N 230 3 ANDAR CENTRO, RIO DE JANEIRO-RJ CEP:20031170

Comprovante de pagamento de boleto Dados da conta debitada / Pagador Final Agência/conta: 6014/26468-0 CPF/CNPJ: 33.073.800/0001-91 Empresa: Daniel Advogados Dados do pagamento Identificação no meu comprovante: 00190 00009 02940 916196 24681 632170 6 84290000017500 Beneficiário: INPI - INSTITUTO NACIONAL DA P CPF/CNPJ do beneficiário: Data de vencimento: Razão Social: 42.521.088/0001-37 04/11/2020 Valor do boleto (R$); 175,00 (-) Desconto (R$): 0,00 (+)Mora/Multa (R$): 0,00 Pagador: CPF/CNPJ do pagador: (=) Valor do pagamento (R$): Daniel Advogados 33.073.800/0001-91 175,00 Data de pagamento: 06/10/2020 Autenticação mecânica Pagamento realizado em espécie: 98D40753DCB6192291B14D2C88C9C12174A975DC Não Operação efetuada em 06/10/2020 às 13:18:01 via Sispag, CTRL 044456397000029.

Dúvidas, sugestões e reclamações: na sua agência. Se preferir, ligue para o SAC Itaú: 0800 728 0728 (todos os dias, 24h) ou acesse o Fale Conosco no www.itau.com.br. Se não ficar satisfeito com a solução apresentada, ligue para a Ouvidoria Corporativa Itaú: 0800 570 0011 (em dias úteis, das 9h às 18h) ou Caixa Postal 67.600, CEP Petição 870200128010, 03162-971. de 09/10/2020, Deficientes auditivos ou de pág. fala: 9/153 0800 722 1722 (todos os dias, 24h). 26

“COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA TRANSPLANTE DE CÉLULAS- TRONCO” CAMPO DE INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se geralmente a métodos para preparar populações de células hematopoiéticas compreendendo células-tronco hematopoiéticas (CTH) modificadas por gene para uso no transplante de CTH, incluindo para o tratamento da anemia de Fanconi (FA).

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[002] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório dos EUA de nº 62/656.292, depositado em 11 de abril de 2018, que é incorporado por referência neste documento em sua totalidade.

DESCRIÇÃO DO ARQUIVO DE TEXTO APRESENTADO ELETRONICAMENTE

[003] O conteúdo do arquivo de texto apresentado eletronicamente é incorporado neste documento por referência em sua totalidade: Uma cópia em formato legível por computador da Listagem de Sequências (nome do arquivo: ROPA_008_01WO_SeqList_ST25, data registrada: 11 de abril de 2019, tamanho do arquivo ~52 kilobytes).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] A transferência genética mediada ex vivo para células alvo é um método aplicado clinicamente para terapia celular e genética. O isolamento e a modificação genética ex vivo de populações enriquecidas para CD34 contendo CTH fornecem dois benefícios principais: redução da transferência genética para células não alvo; e, desse modo, redução da necessidade/quantidade de modificadores genéticos, por exemplo, vetores de terapia genética, que por sua vez reduzem os custos associados à produção clínica de CTHs modificadas por genes. Um sistema modelo para transplante de CTHs geneticamente modificadas é a FA. Os métodos desenvolvidos no contexto da FA também são aplicáveis a outros distúrbios e condições.

[005] A FA é uma doença autossômica recessiva (exceto para o grupo de complementação FA-B, que é ligado ao X), onde a sobrevida média dos pacientes é de cerca de 24 anos (Butturini A, et al., (1994) Blood 84: 1650-1655; Kutler DI, et al., (2003) Blood 101: 1249-1256). No nascimento, o hemograma desses pacientes geralmente é normal. A macrocitose é frequentemente a primeira anormalidade hematológica detectada nesses pacientes. Isso geralmente evolui com trombocitopenia, anemia e pancitopenia. A falência da medula óssea (FMO) é geralmente observada nesses pacientes após 5 a 10 anos, com uma idade média do início da doença hematológica de 7 anos. Cerca de 80% dos pacientes com FA desenvolverão evidências de FMO na primeira década de vida. Com base em estudos epidemiológicos até o momento, se episódios malignos não aparecerem antes da aplasia, praticamente todos os pacientes com FA desenvolverão FMO aos 40 anos de idade (Butturini A, et al., (1994) Blood 84: 1650-1655; Kutler DI, et al., (2003) Blood 101:1249-1256), sendo esta a principal causa de mortalidade nesses pacientes. Devido às complexas manifestações clínicas da FA, o tratamento desses pacientes concentra-se principalmente na melhora das seguintes manifestações clínicas: falência da medula óssea (FMO), leucemia mielóide e tumores sólidos.

[006] O tratamento da FA e de outras doenças depende do enxerto eficiente de CTHs geneticamente modificadas. Por conseguinte, existe uma necessidade na técnica de métodos para preparar populações de células contendo CTHs modificadas por genes que atinjam altos níveis de enxerto em pacientes, incluindo pacientes com FA. A presente invenção aborda essa necessidade e muito mais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] A presente invenção refere-se geralmente aos campos da malignidade hematológica e transplante de células-tronco e, em particular, à fabricação e uso de populações de células-tronco enriquecidas em células CD34+ para uso em terapia genética, incluindo liberação e reparo de genes. Em particular, essas populações de células enriquecidas para CD34 são úteis na terapia genética para o tratamento de mamíferos e, em particular, doenças, distúrbios e disfunções humanas relacionadas à desregulação do produto do gene do grupo de complementação A da anemia de Fanconi (FANCA), grupo C (FANCC) ou grupo G (FANCG). Em certas modalidades, os métodos da presente divulgação são realizados ex vivo e não no corpo humano per se.

[008] Em uma modalidade, a divulgação fornece um método de tratamento da anemia de Fanconi em um paciente em necessidade do mesmo, compreendendo fornecer ao paciente uma combinação de: (i) uma população de células enriquecida para CD34 de alta estringência, preparada a partir de uma primeira amostra biológica obtida a partir do paciente, selecionando para células CD34+ sob condições de alta estringência; e (ii) uma população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência, preparada a partir de uma segunda amostra biológica obtida a partir do paciente, selecionando para células CD34+ sob condições de baixa estringência, em que uma ou ambas a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência e/ou a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência foram transduzidas com um vetor de terapia genética recombinante que codifica um polipeptídeo FANC, incluindo variantes ou fragmentos funcionais ou proteínas FANC de ocorrência natural (por exemplo, FANCA ou FANCC ou FANCG), e em que a primeira amostra biológica e a segunda amostra biológica são opcionalmente a mesma amostra biológica, tratando assim a anemia de Fanconi.

[009] Em uma modalidade, o método compreende tratar a anemia de Fanconi em um paciente, preparando uma população de células enriquecida para CD34 sob condições de alta estringência, preparando outra população de células enriquecida para CD34 sob condições de baixa estringência, colocando uma ou ambas as populações de células enriquecidas para CD34 em contato com um vetor de terapia genética recombinante e administrando as duas populações de células enriquecidas para CD34, sequencialmente ou simultaneamente, ao paciente, tratando assim a anemia de Fanconi. Em modalidades particulares, a(s) população(ões) de células colocadas em contato com o vetor de terapia genética é/são transduzida(s) como um resultado e, portanto, compreende(m) um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico ou polipeptídeo terapêutico para o tratamento da anemia de Fanconi. Em uma modalidade, o vetor de terapia genética recombinante compreende um vetor lentiviral autoinativado que codifica um segmento de gene ou proteína FANC terapêuticos (por exemplo, FANCA, FANCC ou FANCG), tal como o vetor descrito no Pedido de Patente Internacional de nº PCT/US2017/050837. Em uma modalidade, o vetor de terapia genética recombinante é configurado para reparar um gene FANC endógeno (por exemplo, FANCA ou FANCC ou FANCG), tal como por meio da liberação de um sistema CRISPR/Cas compreendendo uma proteína Cas ou ácido nucleico que codifica uma proteína Cas, um gRNA ou sgRNA, e um modelo de reparo compreendendo um gene FANC ou um fragmento de um gene FANC que se sobrepõe a uma ou mais mutações no gene FANC endógeno.

[010] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece um método para tratar a anemia de Fanconi em um paciente em necessidade do mesmo, compreendendo: preparar uma população de células enriquecida para CD34 de alta estringência a partir de uma primeira amostra biológica obtida a partir do paciente, selecionando células CD34+ sob condições de alta estringência; preparar uma população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência a partir de uma segunda amostra biológica obtida a partir do paciente, selecionando células CD34+ sob condições de baixa estringência, colocando uma ou ambas a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência ou da população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência em contato com um vetor de terapia genética recombinante para anemia de Fanconi; e administrar a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência e a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência ao paciente, em que uma ou ambas a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência ou da população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência são colocadas em contato com ou transduzidas pelo vetor de terapia genética recombinante; tratando assim a anemia de Fanconi.

[011] Em um aspecto da presente invenção, a primeira amostra biológica e a segunda amostra biológica são cada uma independentemente sangue periférico ou medula óssea. Em um aspecto, a primeira amostra biológica e a segunda amostra biológica são sangue periférico obtido após o paciente ter sido tratado com fator estimulador de colônias granulócitos e macrófagos (G-CSF), plerifaxor ou uma combinação de G-CSF e plerifaxor.

[012] Em uma modalidade, qualquer um dos métodos compreende ainda selecionar para células CD34+ sob condições de alta estringência, que podem incluir aplicar a primeira amostra biológica a uma matriz de captura que liga células CD34+, lavar a matriz de captura uma ou mais vezes usando um tampão de lavagem e eluir a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência da matriz de captura usando um tampão de eluição. Em uma modalidade, a etapa de aplicação é realizada a 5 a 10 mL/min, 5 a 15 mL/min, 15 a 20 mL/min, 20 a 25 mL/min ou 25 a 30 mL/min. Em uma modalidade, a etapa de eluição é realizada a 5 a 10 mL/min, 5 a 15 mL/min, 15 a 20 mL/min, 20 a 25 mL/min ou 25 a 30 mL/min. Em uma modalidade, a etapa de aplicação é realizada a 10 a 20 mL/min. Em uma modalidade, a etapa de eluição é realizada a 20 mL/min.

[013] Em uma modalidade, qualquer um dos métodos compreende ainda selecionar para células CD34+ sob condições de baixa estringência, que podem compreender aplicar a segunda amostra biológica a uma matriz de captura que liga células CD34+, permitir que uma fração não ligada da segunda amostra biológica flua através da matriz de captura e eluir a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência da matriz de captura usando um tampão de eluição. Em uma modalidade, a etapa de aplicação é realizada a 5 a 10 mL/min, 5 a 15 mL/min, 15 a 20 mL/min, 20 a 25 mL/min ou 25 a 30 mL/min. Em uma modalidade, a etapa de eluição é realizada a 5 a 10 mL/min, 5 a 15 mL/min, 15 a 20 mL/min, 20 a 25 mL/min ou 25 a 30 mL/min. Em uma modalidade, a etapa de aplicação é realizada a 10 a 20 mL/min. Em uma modalidade, a etapa de eluição é realizada a 20 mL/min.

[014] Em um aspecto da presente invenção, a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência e/ou a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência são colocadas em contato com o vetor de terapia genética recombinante. Em algumas modalidades, a porcentagem de células CD34+ na população de células enriquecida para CD34 de alta estringência é entre duas e quatro vezes superior a a porcentagem de células CD34+ na população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência. Em uma modalidade, a porcentagem de células CD34+ na população de células enriquecida para CD34 de alta estringência é superior a ou cerca de 60%, e a porcentagem de células CD34+ na população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência é inferior a 60%, ou 15 a 60%, ou entre 15 a 30%. Em uma modalidade, a porcentagem de células CD34+ na população de células enriquecida para CD34 de alta estringência é superior a ou cerca de 70%, e a porcentagem de células CD34+ na população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência é de 17,5 a 35%. Em uma modalidade, a porcentagem de células CD34+ na população de células enriquecida para CD34 de alta estringência é superior a ou cerca de 80%, e a porcentagem de células CD34+ na população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência é inferior a 40% ou 20 a 40%. Em uma modalidade, a porcentagem de células CD34+ na população de células enriquecida para CD34 de alta estringência é superior a ou cerca de 90%, e a porcentagem de células CD34+ na população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência é inferior a 40% ou 22,5 a 40%.

[015] Em uma modalidade da presente invenção, o vetor de terapia genética recombinante para o tratamento da anemia de Fanconi compreende uma sequência de polinucleotídeo compreendendo na seguinte ordem 5' a 3': (a) uma sequência promotora eucarioticamente ativa; e (b) uma sequência que codifica um gene ou polipeptídeo FANC humano, incluindo fragmentos e variantes funcionais destes; em que a sequência que codifica o gene FANC humano ou polipeptídeo, ou fragmento ou variante funcional destes, está operacionalmente ligada à sequência promotora eucarioticamente ativa; e em que o gene FANC ou polipeptídeo é selecionado a partir de FANCA, FANCC e FANCG, por exemplo, FANCA, FANCC e FANCG humano nativo ou fragmentos ou variantes funcionais deste. Em certas modalidades, um fragmento funcional ou variante funcional de uma proteína FANC nativa tem atividade biológica substancialmente semelhante à proteína FANC nativa.

[016] Em uma modalidade da presente invenção, o vetor de terapia genética recombinante para anemia de Fanconi compreende um sistema de edição de genes capaz de reparar direcionamente um gene FANC endógeno, em que o sistema de edição de genes compreende: uma proteína Cas ou um polinucleotídeo que codifica uma proteína Cas; um gRNA; e um modelo de reparo compreendendo uma sequência que compreende o gene FANC, ou um fragmento do mesmo, que sobrepõe uma ou mais mutações no gene FANC endógeno; em que o sgRNA está configurado para guiar o modelo de reparo ao gene FANC; e em que o gene FANC é selecionado a partir de FANCA, FANCC e FANCG.

[017] Em uma modalidade, os métodos de seleção são realizados por seleção magnética baseada em esferas.

[018] Em uma modalidade, os métodos aqui divulgados compreendem ainda realizar aférese no sangue periférico uma ou mais vezes.

[019] Em um aspecto, os métodos aqui divulgados resultam em aumento progressivo das células de Anemia de Fanconi modificadas por genes ao longo do tempo.

[020] Em um aspecto, os métodos de tratamento aqui divulgados inibem o desenvolvimento de, interrompem a progressão e/ou progressão reversa de uma manifestação hematológica da anemia de Fanconi no paciente, por exemplo, sem limitação, uma ou mais de falências da medula óssea, trombocitopenia, leucopenia, pancitopenia, neutropenia e anemia.

[021] Em um aspecto, os métodos divulgados neste documento resultam na recuperação de uma ou mais linhagens hematopoiéticas que haviam declinado no paciente antes da administração da população de células enriquecida para CD34 de alta estringência e na população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência ao paciente, por exemplo, sem limitação, um ou mais de linfócitos, eosinófilos, neutrófilos, glóbulos vermelhos e plaquetas. Em modalidades particulares, os métodos resultam em uma diminuição ou redução no declínio de uma ou mais linhagens hematopoiéticas, ou uma estabilização nas populações de uma ou mais linhagens hematopoiéticas, por exemplo, um ou mais de linfócitos, eosinófilos, neutrófilos, glóbulos vermelhos e plaquetas.

[022] Em um aspecto, o método resulta na estabilização ou recuperação de um ou mais parâmetros hematológicos que haviam declinado no paciente antes da administração da população de células enriquecida para CD34 de alta estringência e na população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência ao paciente, tal como hemoglobina.

[023] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece um método para preparar células geneticamente modificadas para o tratamento da anemia de Fanconi, compreendendo: preparar uma população de células enriquecida para CD34 de alta estringência a partir de uma primeira amostra biológica obtida a partir de um paciente, selecionando para células CD34+ sob condições de alta estringência; preparar uma população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência a partir de uma segunda amostra biológica obtida a partir de um paciente, selecionando para células CD34+ sob condições de baixa estringência; e colocar uma ou ambas a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência ou a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência em contato com um vetor de terapia genética recombinante para anemia de Fanconi. Em certas modalidades, as populações de células colocados em contato com o vetor de terapia genética são transduzidas pelo vetor de terapia genética, resultando nas populações de células compreendendo células transduzidas que compreendem uma sequência de nucleotídeo que codifica um ácido nucleico ou polipeptídeo terapêutico, por exemplo, um polipeptídeo FANC, que pode ser um polipeptídeo FANC nativo ou do tipo selvagem, ou um fragmento ou variante funcional do mesmo.

[024] Em um aspecto, a seleção de uma ou ambas as populações de células enriquecidas para CD34 de alta e baixa estringência é realizada usando anticorpos, ou fragmentos funcionais destes, que se ligam especificamente a CD34. Em um aspecto, a seleção é realizada usando um quociente de vazão de 10 a 20 mL/min.

[025] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um sistema que compreende: uma população de células enriquecida para CD34 de alta estringência, preparada a partir de uma primeira amostra biológica, selecionando para células CD34+ sob condições de alta estringência; e uma população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência, preparada a partir de uma segunda amostra biológica, selecionando para células CD34+ sob condições de baixa estringência, em que uma ou ambas a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência ou a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência são colocadas em contato ou foram transduzidas por um vetor de terapia genética recombinante para anemia de Fanconi. Em certas modalidades, a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência está presente em uma primeira composição farmacêutica compreendendo um ou mais transportadores, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, e a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência está presente em uma segunda composição farmacêutica compreendendo um ou mais transportadores, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, tanto a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência quanto a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência estão presentes na mesma composição farmacêutica compreendendo um ou mais transportadores, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em certas modalidades, tanto a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência quanto a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência foram transduzidas pelo vetor de terapia genética para o tratamento da anemia de Fanconi. Em certas modalidades, o vetor de terapia genética e/ou as células transduzidas compreendem uma sequência de nucleotídeo que codifica um ácido nucleico ou polipeptídeo terapêutico, por exemplo, um polipeptídeo FANC, que pode ser um polipeptídeo FANC nativo ou do tipo selvagem, ou um fragmento ou variante funcional do mesmo.

[026] Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende: uma população de células enriquecida para CD34 de alta estringência, preparada a partir de uma primeira amostra biológica, selecionando para células CD34+ sob condições de alta estringência; e uma população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência, preparada a partir de uma segunda amostra biológica, selecionando para células CD34+ sob condições de baixa estringência, em que uma ou ambas a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência ou a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência foram transduzidas com um vetor de terapia genética recombinante. Em modalidades particulares, o vetor de terapia genética é um lentivírus. Em certas modalidades, o vetor de terapia genética codifica um segmento de gene ou proteína FANC terapêuticos (por exemplo, FANCA, FANCC ou FANCG) ou uma variante ou fragmento funcional destes. A composição farmacêutica pode compreender um ou mais transportadores, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[027] Outras características e vantagens da invenção serão evidentes e abrangidas pela seguinte descrição detalhada e reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[028] A Figura 1 mostra um mapa de um vetor plasmídeo ilustrativo de terapia genética recombinante, pCCL-PGK-FANCAW-82-RO.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[029] A anemia de Fanconi (FA) apresenta vários desafios únicos para a fabricação de fármacos. Para FA, como em outras aplicações de terapia genética ex vivo, a população de células alvo para transferência genética expressa a proteína da superfície de células CD34. Para pacientes com FA, quando as células CD34+ são analisadas por citometria de fluxo, uma proporção mais baixa de células da MO são CD34+ relativas a pacientes saudáveis, 0,1 a 1,5% em comparação a 1% a 3%, respectivamente. As células CD34+ absolutas mais baixas da fabricação de substâncias de fármacos a partir do material inicial do mPB do paciente com FA não foram surpreendentes, dada a característica bem estabelecida de células CD34+ limitadas em pacientes com FA que declinam com a idade. No entanto, os rendimentos mais baixos de CD34+ e a baixa pureza dos pacientes com FA eram preocupantes, porque isso afeta diretamente a eficácia potencial do fármaco fabricado.

[030] Sob o enriquecimento padrão de células CD34+, uma baixa porcentagem de células CD34+ (em relação ao total de células) é ligada por esferas imunomagnéticas; portanto, a coluna é carregada relativamente rapidamente (mL/min) e as lavagens são rigorosas, porque a pureza é o objetivo principal. Os presentes inventores reconheceram o problema de que, ao usar mPB de pacientes com FA, essa abordagem fornece resultados abaixo do ideal com baixo rendimento de CD34.

[031] Para abordar os limites do protocolo de enriquecimento padrão de células CD34+ para pacientes com FA, os presentes inventores desenvolveram novos métodos para preparar populações de células CD34+ a partir de pacientes com FA, que resultam em um rendimento mais alto e um fármaco eficaz. Esses métodos envolvem preparar duas populações de células, uma selecionada sob condições de enriquecimento padrão de células CD34+ (condições de "alta estringência") e a outra selecionada sob condições de "baixa estringência". Uma ou ambas as duas populações de células são transduzidas com um vetor de terapia genética adequado e administradas ao paciente com FA. Como mostrado neste documento, o novo método exibe efeitos terapêuticos vantajosos. Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que o maior número de células CD34+ ou a presença de outras células ou outros fatores presentes nas preparações de células com menor pureza de células CD34+ contribuam para a surpreendente eficácia das composições preparadas de acordo com os métodos divulgados neste documento.

[032] Por conseguinte, a presente divulgação fornece sistemas e métodos para fabricar e usar células-tronco modificadas por genes ou corrigidas por genes para terapia genética. Em particular, são aqui fornecidos métodos para tratar uma doença ou distúrbio (por exemplo, anemia de Fanconi), na qual as células-tronco de um paciente são selecionadas por uma combinação da seleção para CD34+ de alta estringência e seleção para CD34+ de baixa estringência, transduzidas com um vetor que codifica um agente terapêutico (por exemplo, uma proteína FANC), e administradas ao paciente. Inesperadamente, o tratamento com uma combinação de células CD34+ selecionadas de alta estringência e com células CD34+ selecionadas de baixa estringência transduzidas com os vetores terapêuticos, que combinadas têm uma pureza de células CD34+ menor do que as preparações convencionais com alta estringência, resultou em maior eficácia terapêutica.

[033] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que é comumente entendido por um técnico no assunto a que esta invenção se refere. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos aqui possam ser usados na prática da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas neste documento são expressamente incorporadas por referência em sua totalidade. Em casos de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos descritos neste documento são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitativos.

[034] Em um aspecto, métodos e sistemas são fornecidos para a fabricação de populações de células enriquecidas para CD34 de alta estringência e baixa estringência (por exemplo, por seleção magnética baseada em esferas com anticorpos, ou fragmentos funcionais destes, que especificamente se ligam a CD34) a partir de amostras biológicas sob condições de alta estringência e/ou sob condições de baixa estringência; e para o uso dessas populações de células enriquecidas para CD34 na preparação de medicamentos úteis na terapia genética direcionada de doenças, distúrbios e disfunções em mamíferos e, em particular, seres humanos.

[035] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um regime de transplante de CTH para tratar anemia de Fanconia e distúrbios relacionados ao produto do gene FANC com base na administração de populações de células enriquecidas para CD34 de alta estringência e baixa estringência, em que uma ou ambas as populações de células enriquecidas para CD34 são colocadas em contato com um vetor de terapia genética (por exemplo, transduzidas com um vetor lentiviral que abriga o segmento do gene FANCA, FANCC ou FANCG) ou colocadas em contato com um vetor de terapia genética que induz reparo de locais específicos de genes FANC (por exemplo, CRISP-Cas).

[036] Em algumas modalidades, as amostras biológicas são sangue periférico ou medula óssea obtidos de um paciente, por exemplo, o paciente a ser tratado. Em certas modalidades, as amostras biológicas são sangue periférico obtido após o paciente ter sido tratado com G-CSF, plerifaxor ou uma combinação de G- CSF e plerifaxor. Em uma modalidade, uma ou ambas as amostras biológicas são preparadas realizando aférese no sangue periférico uma ou mais vezes. A presente divulgação refere-se a esses métodos coletivamente como "leucoférese mobilizada".

[037] Em algumas modalidades, a seleção para células CD34+ sob condições de alta estringência compreende aplicar uma amostra biológica a uma matriz de captura que liga células CD34+, lavando a matriz de captura uma ou mais vezes usando um tampão de lavagem e eluindo a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência da matriz de captura usando um tampão de eluição. Em alguns casos, a amostra biológica é reaplicada à matriz de captura uma ou mais vezes, tal como 2, 3, 4, 5 ou 6 vezes. Em uma modalidade, a etapa de aplicação é realizada a 5 a 10 mL/min, 5 a 15 mL/min, 15 a 20 mL/min, 20 a 25 mL/min ou 25 a 30 mL/min. Em modalidades particulares, a etapa de eluição é realizada a 5 a 10 mL/min, 5 a 15 mL/min, 15 a 20 mL/min, 25 a 25 mL/min ou 25 a 30 mL/min. Em uma modalidade, a etapa de aplicação é realizada a 10 a 20 mL/min. Em uma modalidade, a etapa de eluição é realizada a 20 mL/min. Em algumas modalidades, a etapa de lavagem compreende lavar a matriz de captura uma ou mais vezes usando um tampão de lavagem. Em alguns casos, o tampão de lavagem compreende um volume de pelo menos 100 mL, pelo menos 200 mL, pelo menos

300 mL, pelo menos 400 mL, pelo menos 500 mL ou mais. Em uma modalidade, a etapa de lavagem é realizada a 5 a 10 mL/min, 5 a 15 mL/min, 15 a 20 mL/min, 20 a 25 mL/min ou 25 a 30 mL/min. Em uma modalidade, a etapa de lavagem é realizada a 10 a 20 mL/min. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem é solução salina tamponada com fosfato (PBS) com, opcionalmente, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e/ou, opcionalmente, albumina sérica humana a, por exemplo, uma concentração de cerca de 2,5% p/v. Em algumas modalidades, o tampão de eluição é solução salina tamponada com fosfato (PBS) com, opcionalmente, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e/ou, opcionalmente, albumina sérica humana a, por exemplo, uma concentração de cerca de 2,5% p/v. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem e o tampão de eluição são hipotônicos.

[038] Em algumas modalidades, a seleção para células CD34+ sob condições de baixa estringência compreende aplicar uma amostra biológica a uma matriz de captura que liga células CD34+, permitir que uma fração não ligada da amostra biológica flua através da matriz de captura e eluir a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência da matriz de captura usando um tampão de eluição. Em uma modalidade, a etapa de aplicação é realizada em 1 a 2 mL/min, 2 a 3 mL/min, 1 a 2 mL/min, 1 a 2 mL/min, 5 a 10 mL/min, 5 a 15 mL/min, 15 a 20 mL/min. Em uma modalidade, a etapa de eluição é realizada a 5 a 10 mL/min, 5 a 15 mL/min, 15 a 20 mL/min, 25 a 25 mL/min ou 25 a 30 mL/min. Em uma modalidade, a etapa de aplicação é realizada a 10 a 20 mL/min. Em algumas modalidades, a etapa de aplicação é realizada a um quociente de vazão de cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% menor que a quociente de vazão sob condições de alta estringência, por exemplo, um quociente de vazão pelo menos 10% menor, pelo menos 20% menor, pelo menos 30% menor, pelo menos 40% menor, pelo menos 50% menor, pelo menos 60% menor, pelo menos 70% menor,

pelo menos 80% menor ou pelo menos 90% menor que o quociente de vazão usado sob condições de alta estringência. Em algumas modalidades, a etapa de lavagem compreende lavar a matriz de captura uma ou mais vezes usando um tampão de lavagem. Em alguns casos, o tampão de lavagem compreende um volume de 500 mL, 400 mL, 300 mL, 200 mL, 100 mL ou menos, por exemplo, menos que 500 mL, menos que 400 mL, menos que 300 mL, menos que 200 mL ou menos que 100 mL. Em alguns casos, a etapa de lavagem é omitida. Em uma modalidade, a etapa de lavagem é realizada a 5 a 10 mL/min, 5 a 15 mL/min, 15 a 20 mL/min, 20 a 25 mL/min ou 25 a 30 mL/min. Em uma modalidade, a etapa de lavagem é realizada a 10 a 20 mL/min. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem é solução salina tamponada com fosfato (PBS) com, opcionalmente, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e/ou, opcionalmente, albumina sérica humana a, por exemplo, uma concentração de cerca de 2,5% p/v. Em algumas modalidades, o tampão de eluição é solução salina tamponada com fosfato (PBS) com, opcionalmente, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e/ou, opcionalmente, albumina sérica humana a, por exemplo, uma concentração de cerca de 2,5% p/v. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem e o tampão de eluição são hipotônicos.

[039] Em algumas modalidades, a seleção é realizada por seleção magnética baseada em esferas. Em uma modalidade, os anticorpos, ou fragmentos funcionais destes, que especificamente se ligam a CD34, são usados para seleção, por exemplo, seleção magnética baseada em esferas. Em alguns casos, a seleção é realizada usando um quociente de vazão de 10 a 20 mL/min. Em alguns casos, o quociente de vazão é de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30 ou mais mL/min, ou qualquer valor entre eles.

[040] Em modalidades, a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência é colocada em contato com o vetor de terapia genética recombinante; a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência é colocada em contato com o vetor de terapia genética recombinante; ou as populações de células enriquecidas para CD34 de alta estringência e baixa estringência são colocada em contato com o vetor de terapia genética recombinante. Em modalidades particulares, o vetor é um vírus, um lipossomo ou uma nanopartícula lipídica ou do tipo lipídico. Em alguns casos, o vírus é um lentivírus, um vírus adeno-associado, um adenovírus ou um vírus espumoso.

[041] Em algumas modalidades, a porcentagem de células CD34+ na população de células enriquecida para CD34 de alta estringência é entre duas e quatro vezes superior a a porcentagem de células CD34+ na população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência.

[042] Em modalidades dos métodos ou sistemas da presente invenção, o vetor de terapia genética recombinante compreende uma sequência de polinucleotídeo compreendendo na seguinte ordem 5 'a 3': (a) uma sequência promotora eucarioticamente ativa, e (b) uma sequência que codifica um polipeptídeo de gene FANC humano, incluindo fragmentos e variantes funcionais deste; e a sequência que codifica o polipeptídeo de gene FANC humano, ou fragmento ou variante funcional deste, está operacionalmente ligada à sequência promotora eucarioticamente ativa. Em algumas modalidades, o gene FANC é selecionado a partir de FANCA, FANCC e FANCG.

[043] Em uma modalidade, o método inibe o desenvolvimento, interrompe a progressão e/ou reverte a progressão de uma manifestação hematológica de uma doença ou distúrbio (por exemplo, anemia de Fanconi) no paciente; e opcionalmente, a manifestação hematológica da anemia de Fanconi é selecionada a partir de uma ou mais falências da medula óssea (FMO), trombocitopenia, leucopenia, pancitopenia, neutropenia e anemia. Em uma modalidade, o método resulta em aumento progressivo das células de Anemia de Fanconi modificadas por genes (ou células de um paciente que sofre de outra doença ou distúrbio, tal como um distúrbio mieloproliferativo ou um distúrbio de imunodeficiência) ao longo do tempo. Em uma modalidade, o método resulta na recuperação de um ou mais parâmetros hematológicos (por exemplo, hemoglobina) que haviam declinado no paciente antes da administração da população de células enriquecida para CD34 de alta estringência e da população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência ao paciente.

[044] Em uma modalidade, o método resulta na recuperação de uma ou mais linhagens hematopoiéticas que declinaram no paciente antes da administração da população de células enriquecida para CD34 de alta estringência e da população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência ao paciente; e esta uma ou mais linhagens hematopoiéticas podem compreender um ou mais linfócitos, eosinófilos, neutrófilos, glóbulos vermelhos e plaquetas. A recuperação de populações específicas de células é alcançada em alguns casos. A recuperação pode ser monitorada por vários métodos conhecidos na técnica, tais como seleção de células assistida por fluxo, citometria ou microscopia.

[045] A presente invenção fornece ainda composições e sistemas para uso em qualquer uma das modalidades desses métodos. A presente invenção fornece populações de células enriquecidas para CD34 para uso em um medicamento, incluindo, mas não se limitando a, populações de células enriquecidas para CD34 transduzidas com um vetor de terapia genética, por exemplo, um vetor de terapia genética que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma proteína FANC humana, ou uma variante ou fragmento funcional da mesma.

[046] Como usado neste documento, "alta estringência" ou "condições de alta estringência" refere-se a um método de enriquecimento para uma população de células que visa resultar em enriquecimento substancial de células para células que expressam um marcador biológico específico, por exemplo, CD34. Por exemplo, o enriquecimento de CD34 de "alta estringência" usado clinicamente resulta em média:

61,6% e mediana: 65,7% de rendimento de células CD34+ e média: 88,5% e mediana: 95,9% de pureza relativa (N=166) (Clin Lab. 1 de julho de 2016; 62(7):1243-1248 (PMID: 28164638)). "Alta estringência" refere-se a um processo com o objetivo de enriquecimento substancialmente de um tipo de célula relativamente raro, CD34+, que geralmente compreende entre 0,2 a 2% do produto celular em uma coleção de leucoférese mobilizada ou medula óssea.

O enriquecimento de alta estringência das células CD34+ a partir de uma coleção de leucoférese mobilizada ou medula óssea tem como alvo as porcentagens finais de CD34+ que aumentaram de 0,2 a 2% para >80%. Para conseguir isso, após a aplicação inicial de uma amostra biológica a uma matriz de captura, são realizadas trocas repetidas de tampões, denominadas neste documento "lavagens", com o objetivo de remover células fracamente ou não especificamente ligadas à matriz de captura.

Geralmente, as células são removidas da matriz de captura e reaplicadas para cada ciclo de lavagem.

A remoção e a reaplicação podem ser realizadas manualmente com pipeta dos tubos ou automatizadas usando uma bomba e um sistema de tubulação.

Por exemplo, usando o Quad Technologies MagCloudz® acoplado ao sistema de separação magnética de células Dynabeads®, os complexos de partículas de células magnéticas são separados em tubos em um suporte magnético e as lavagens são feitas manualmente.

Usando o sistema Miltenyi Biotec CliniMACS®, um programa automatizado predefinido aplica os complexos de partículas de células magnéticas a uma coluna magnética em um conjunto de tubos e as lavagens/reaplicações são feitas usando um sistema de bomba de válvulas.

Em certas modalidades, a seleção sob condições de alta estringência pode ser realizada em vários instrumentos, incluindo, sem limitação, o MACSQuant Tyto® da Miltenyi Biotec, MagCloudz® da Quad Technologies, sistema de separação de células Sepax® da GE, sistema de separação de células Elutra® da Terumo, separador de células Spectra® da COBE, sistemas LAB® ou WASH® da SynGen, sistema Lovo® da Fresenius-Kabi, sistema CliniMACS® ou CliniMACS Prodigy® da Miltenyi Biotec. A seleção pode ser realizada em laboratório ou no local de atendimento. Métodos detalhados para preparação e enriquecimento de células e populações de células, incluindo métodos exemplares para seleção de células CD34+ sob condições de alta estringência, são descritos, por exemplo, na Publicação de Patente Internacional de nº WO 2016/118780. O método de seleção ilustrativo útil para a seleção de alta estringência é fornecido pela Patente dos EUA de nº 8.727.132.

[047] Em um protocolo de enriquecimento de alta estringência, uma amostra biológica compreendendo células CD34+ é marcada com um reagente de marcação CD34, por exemplo, esferas imunomagnéticas diretamente conjugadas. A amostra biológica pode ser suspensa em qualquer fluido adequado, tal como, sem limitação, solução salina tamponada com fosfato (PBS) com, opcionalmente, ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) a um pH do tampão e isotonicidade compatível com a viabilidade celular. Em alguns casos, o fluido usado também contém albumina sérica humana em uma concentração adequada, tal como cerca de 2,5%. Usando uma tecnologia de seleção de células ativadas magneticamente (MACS), a amostra biológica, após ter sido rotulada, é aplicada a uma coluna, a coluna contendo material magneticamente suscetível ou ferromagnético. Usando o sistema MACS, o material magneticamente suscetível ou ferromagnético da coluna retém as células alvo sem afetar a capacidade das células não alvo de fluir através e sair da coluna. Tais materiais magneticamente suscetíveis ou ferromagnéticos incluem ferro, aço, níquel, cobalto e outros metais de terras raras ferromagnéticos de suas ligas. Será apreciado por aqueles técnicos no assunto que tais materiais podem ser facilmente magnetizados e desmagnetizados. Em algumas modalidades, a amostra biológica é recirculada sobre o material magneticamente suscetível ou ferromagnético uma ou mais vezes. Após o carregamento da coluna, as células ligadas são lavadas, eluídas e/ou recarregadas na coluna em velocidade lenta para aumentar a pureza da fração enriquecida. Os tampões de lavagem adequados incluem PBS com (opcionalmente) EDTA e (opcionalmente) albumina sérica humana. Qualquer componente da amostra biológica marcada que é removida durante as etapas de lavagem é coletado na bolsa de resíduos ou “não alvo”. Após etapas de lavagem adequadas, as células enriquecidas de alta estringência são eluídas na bolsa de células alvo.

[048] Conforme usado neste documento, "baixa estringência" ou "condições de baixa estringência" refere-se a um método de enriquecimento para uma população de células que visa resultar no enriquecimento de células para células que expressam um marcador biológico específico, por exemplo, CD34, de maneira a preservar um maior rendimento da população de células enriquecida do que o alcançado pela seleção de alta estringência às custas do enriquecimento das células que expressam o marcador biológico em comparação a outras células da amostra biológica, isto é, enriquecimento reduzido. Por definição, o enriquecimento de vezes sob condições de alta estringência é superior ao enriquecimento de vezes sob condições de baixa estringência. O enriquecimento de vezes de células, por exemplo, células CD34+, na população de células enriquecida (CD34 ou outro marcador) de alta estringência é, em alguns casos, 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, 3,25, 3,5, 3,75 ou 4 vezes o enriquecimento de vezes das células CD34+ na população de células enriquecida (CD34 ou outro marcador) de baixa estringência. Em uma modalidade, o enriquecimento de vezes de células, por exemplo, células CD34+, na população de células enriquecida (CD34 ou outro marcador) de alta estringência é de 2 a 4 vezes o enriquecimento de vezes das células CD34+ na população de células enriquecida (CD34 ou outro marcador) de baixa estringência. Em certas modalidades, a seleção sob condições de baixa estringência pode ser realizada em vários instrumentos, incluindo, sem limitação, o MACSQuant Tyto® da Miltenyi Biotec, MagCloudz® da Quad Technologies, sistema de separação de células

Sepax® da GE, sistema de separação de células Elutra® da Terumo, separador de células Spectra® da COBE, sistemas LAB® ou WASH® da SynGen, sistema Lovo® da Fresenius-Kabi, sistema CliniMACS® ou CliniMACS Prodigy® da Miltenyi Biotec. A seleção pode ser realizada em laboratório ou no local de atendimento.

[049] Em um protocolo de enriquecimento de baixa estringência, uma amostra biológica compreendendo células CD34+ é marcada com um reagente de marcação CD34, por exemplo, esferas imunomagnéticas diretamente conjugadas. Usando uma tecnologia de seleção de células ativadas magneticamente (MACS), a amostra biológica, após ter sido marcada, é aplicada a uma coluna contendo material magneticamente suscetível ou ferromagnético a um quociente de vazão mais baixa do que sob enriquecimento de alta estringência. Como no enriquecimento de alta estringência, o material magneticamente suscetível ou ferromagnético retém as células alvo sem afetar a capacidade das células não alvo de fluir através e sair da coluna. Em algumas modalidades, a amostra biológica é recirculada sobre o material magneticamente suscetível ou ferromagnético uma ou mais vezes. Após o carregamento da coluna, para enriquecimento de baixa estringência, as células ligadas são lavadas a baixa estringência. As células ligadas são então eluídas em uma bolsa de coleta.

[050] Em uma modalidade exemplar, o enriquecimento de baixa estringência é realizado modificando o procedimento operacional padrão do sistema MACS, de modo que um programa de software em "modo de depleção" destinado a alcançar uma depleção de alta estringência (ou seja, remoção de células alvo) resulta em enriquecimento de baixa estringência. A operação de um sistema MACS no modo de depleção faz com que as células alvo na amostra biológica sejam ligadas ao material magneticamente suscetível ou ferromagnético na coluna usando carregamento lento da coluna e etapas de lavagem de baixa estringência do que a operação no modo de enriquecimento. As células não alvo são liberadas pelo sistema MACS na lavagem ou na chamada bolsa "alvo". O programa no modo de depleção alterna a válvula de saída para direcionar o fluido para a chamada bolsa “não alvo” e depois desmagnetiza a coluna. A aplicação contínua de fluido sobre a coluna desmagnetizada resulta na eluição de uma população de células enriquecida para CD34+, que foi enriquecida sob condições de baixa estringência, no chamada saco "não-alvo", que usando esse método coleta as células alvo.

[051] Os técnicos no assunto reconhecerão que esse método de enriquecimento de baixa estringência pode ser realizado em vários instrumentos, incluindo, sem limitação, o MACSQuant Tyto® da Miltenyi Biotec, MagCloudz® da Quad Technologies, sistema de separação de células Sepax® da GE, sistema de separação de células Elutra® da Terumo, separador de células Spectra® da COBE, sistemas LAB® ou WASH® da SynGen, sistema Lovo® da Fresenius-Kabi, sistema CliniMACS® ou CliniMACS Prodigy® da Miltenyi Biotec. Os técnicos no assunto serão capazes de, sem experimentação indevida, reprogramar o software de tal sistema MACS, de modo que a válvula de saída direcione o fluxo através da etapa de ligação inicial à bolsa de resíduos ou "não alvo" (em vez da bolsa alvo) e direcione a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência eluída à bolsa "alvo". Com efeito, o enriquecimento de baixa estringência é então executado no modo de separação sem as etapas de lavagem usuais dos programas MACs convencionais.

[052] Um "vetor", como aqui usado, refere-se a uma macromolécula ou associação de macromoléculas que compreende ou se associa a um polinucleotídeo e que pode ser usada para mediar a liberação do polinucleotídeo a uma célula. Os vetores ilustrativos incluem, por exemplo, plasmídeos, vetores virais (por exemplo, vetores retrovirais, tais como vetores lentivirais), lipossomas e outros veículos de liberação de genes.

[053] O termo "LV" é uma abreviação de lentivírus e pode ser usado para referir-se ao próprio vírus ou a derivados do mesmo. O termo abrange todos os subtipos e as ambas formas de ocorrência natural e recombinantes, exceto onde exigido em contrário.

[054] Como usado neste documento, o termo "gene" ou "sequência de codificação" refere-se a uma sequência de nucleotídeo in vitro ou in vivo que codifica um produto genético. Em alguns casos, o gene consiste ou consiste essencialmente em sequência de codificação, ou seja, sequência que codifica o produto genético. Em outros casos, o gene compreende uma sequência adicional não codificante. Por exemplo, o gene pode ou não incluir regiões que precedem e seguem a região de codificação, por exemplo, 5' não traduzidas (5' UTR) ou sequências "líder" e 3 'UTR ou sequências "trailer", bem como sequências intervenientes (íntrons) entre segmentos de codificação individuais (éxons).

[055] Como usado neste documento, um "gene terapêutico" refere-se a um gene que, quando expresso, confere um efeito benéfico à célula ou tecido em que está presente ou a um mamífero em que o gene é expresso. Exemplos de efeitos benéficos incluem a melhoria de um sinal ou sintoma de uma condição ou doença, prevenção ou inibição de uma condição ou doença ou atribuição de uma característica desejada. Genes terapêuticos incluem genes que corrigem uma deficiência genética em uma célula ou mamífero.

[056] Como aqui usado, um transgene é um gene que é liberado a uma célula por um vetor.

[057] Como usado neste documento, o termo "produto genético" refere-se ao produto da expressão desejada de uma sequência de polinucleotídeo, tal como um polipeptídeo, peptídeo, proteína ou RNA interferente, incluindo RNA interferente pequeno (siRNA), miRNA ou RNA curto de gancho de cabelo (shRNA). Em certas modalidades, o produto genético é um produto terapêutico, que quando expresso, confere um efeito benéfico à célula ou tecido em que está presente ou a um mamífero em que o gene é expresso.

[058] Como usado neste documento, os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" referem-se a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, peguilação, fosforilação ou conjugação com um componente de marcação.

[059] Por "compreender" significa que os elementos citados são necessários, por exemplo, na composição, método, kit etc., mas outros elementos podem ser incluídos para formar, por exemplo, a composição, método, kit etc. dentro do âmbito da reivindicação. Por exemplo, um cassete de expressão "compreendendo" um gene que codifica um polipeptídeo terapêutico operacionalmente ligado a um promotor é um cassete de expressão que pode incluir outros elementos além do gene e promotor, por exemplo, sequência de poliadenilação, elementos acentuadores, outros genes, domínios de ligação etc. Por exemplo, um método para preparar ou tratar "compreendendo" preparar uma população de células enriquecida para CD34 é um método que pode incluir outras etapas em outra para preparar uma população de células enriquecida para CD34, por exemplo, administrar um agente para mobilizar células-tronco, administrar uma terapia de indução ou coadministrar um fármaco como uma combinação.

[060] O termo "compreendendo" ou "compreende", conforme usado neste documento em referência a condições de baixa estringência, não deve ser interpretado para permitir que uma seleção adicional de alta estringência seja aplicada à mesma amostra durante a mesma etapa de seleção. Será entendido que realizar uma seleção sob ambas condições de alta estringência e condições de baixa estringência resultará em uma seleção de alta estringência, enquanto a seleção de baixa estringência é expressamente definida neste documento como excluindo a seleção sob condições de alta estringência. Preparar uma população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência pela seleção para células CD34+ sob condições de baixa estringência pode incluir outras etapas do método de maneira aberta, desde que, entre carregar a amostra biológica na coluna e eluir a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência, a coluna não seja lavada com sob condições de alta estringência.

[061] Por "consistindo essencialmente em", entende-se uma limitação do escopo de, por exemplo, composição, método, kit, etc., descrito para os materiais ou etapas especificados que não afetam materialmente as características básicas e novas da, por exemplo, composição, método, kit, etc. Por exemplo, um cassete de expressão "consistindo essencialmente em" um gene que codifica um polipeptídeo terapêutico operacionalmente ligado a um promotor e uma sequência de poliadenilação pode incluir sequências adicionais, por exemplo,sequências ligantes, desde que não afetem materialmente a transcrição ou tradução do gene. Como outro exemplo, um fragmento, uma variante ou mutante de polipeptídeo "consistindo essencialmente em" uma sequência recitada tem a sequência de aminoácido da sequência recitada mais ou menos cerca de 10 resíduos de aminoácidos nos limites da sequência com base no polipeptídeo virgem de comprimento total do qual foi derivado, por exemplo, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduo menos do que o resíduo de aminoácido delimitado recitado, ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos mais do que o resíduo de aminoácido delimitado recitado.

[062] Por "consistindo em", entende-se a exclusão da composição, método ou kit de qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especificado na reivindicação. Por exemplo, um cassete de expressão "que consiste em" um gene que codifica um polipeptídeo terapêutico operacionalmente ligado a um promotor e um elemento regulador pós-transcricional consiste apenas no promotor, na sequência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo terapêutico e no elemento regulador pós- transcricional. Como outro exemplo, um polipeptídeo "consistindo em" uma sequência recitada contém apenas a sequência recitada.

[063] Como usado neste documento, "células da medula óssea" ou "células- tronco da medula óssea" refere-se aqui às células obtidas diretamente da medula óssea, tal como por biópsia, e às células obtidas do sangue periférico que se originou na medula óssea, por exemplo, após mobilização.

[064] Um "vetor de expressão", como aqui usado, abrange um vetor, por exemplo, plasmídeo, minicírculo, vetor viral, lipossomo e similares, conforme discutido acima ou como conhecido na técnica, compreendendo um polinucleotídeo que codifica um produto genético de interesse, e é usado para efetuar a expressão de um produto genético em uma célula alvo pretendida. Um vetor de expressão também compreende elementos de controle operacionalmente ligados à região de codificação para facilitar a expressão do produto genético no alvo. A combinação de elementos de controle, por exemplo, promotores, acentuadores, UTRs, sequências de direcionamento de miRNA, etc., e de um gene ou genes aos quais eles estão operacionalmente ligados para expressão é às vezes chamada de "cassete de expressão". Muitos de tais elementos de controle são conhecidos e estão disponíveis na técnica ou podem ser facilmente construídos a partir de componentes que estão disponíveis na técnica.

[065] Um "promotor", como aqui usado, abrange uma sequência de DNA que direciona a ligação da RNA polimerase e, assim, promove a síntese de RNA, isto é, uma sequência mínima suficiente para direcionar a transcrição. Os promotores e a expressão correspondente de proteína ou polipeptídeo podem ser onipresentes, significando fortemente ativos em uma ampla faixa de células, tecidos e espécies ou específicos de tipos de células, específicos de tecidos ou específicos de espécies. Os promotores podem ser "constitutivos", significando continuamente ativos ou "induzíveis", o que significa que o promotor pode ser ativado ou desativado pela presença ou ausência de fatores bióticos ou abióticos. Também estão incluídas nas construções ou vetores de ácidos nucleicos da invenção as sequências acentuadoras que podem ou não ser contíguas à sequência promotora. As sequências acentuadoras influenciam a expressão genética dependente do promotor e podem estar localizadas nas regiões 5' ou 3' do gene nativo.

[066] Um "acentuador", como aqui usado, abrange um elemento de ação cis que estimula ou inibe a transcrição de genes adjacentes. Um acentuador que inibe a transcrição também é denominado "silenciador". Os acentuadores podem funcionar (isto é, podem ser associados a uma sequência de codificação) em qualquer orientação, em distâncias de até vários pares de kilobases (kb) da sequência de codificação e de uma posição a jusante de uma região transcrita.

[067] Uma "sequência sinal de terminação", conforme aqui usado, abrange qualquer elemento genético que faz com que a RNA polimerase termine a transcrição, tal como, por exemplo, uma sequência sinal de poliadenilação.

[068] Como usado neste documento, os termos "operacionalmente ligado" ou "operativamente ligado" referem-se a uma justaposição de elementos genéticos, por exemplo, promotor, acentuador, sequência sinal de terminação, sequência de poliadenilação, etc., em que os elementos estão em uma relação que lhes permite operar da maneira esperada. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma região de codificação se o promotor ajudar a iniciar a transcrição ou expressão da sequência de codificação. Pode haver resíduos intermediários entre o promotor e a região de codificação, desde que essa relação funcional seja mantida.

[069] Conforme usado neste documento, o termo "heterólogo" significa derivado de uma entidade genotipicamente distinta daquela do restante da entidade à qual está sendo comparado. Por exemplo, um polinucleotídeo introduzido por técnicas de engenharia genética em um plasmídeo ou vetor derivado de uma espécie diferente é um polinucleotídeo heterólogo. Como outro exemplo, um promotor removido de sua sequência de codificação nativa e operacionalmente ligado a uma sequência de codificação com a qual não é naturalmente encontrado ligado é um promotor heterólogo. Assim, por exemplo, um vetor LV que inclui um ácido nucleico heterólogo que codifica um produto genético heterólogo é um vetor LV que inclui um ácido nucleico que não está normalmente incluído em um LV de ocorrência natural, do tipo selvagem, e o produto genético heterólogo codificado é um produto genético normalmente não codificado por um LV de ocorrência natural, do tipo selvagem.

[070] O termo "endógeno", conforme aqui usado, com referência a uma molécula de nucleotídeo ou produto genético, refere-se a uma sequência de ácido nucleico, por exemplo, gene ou elemento genético, ou produto genético, por exemplo, RNA, proteína, que é de ocorrência natural ou está associado a um vírus ou célula hospedeira.

[071] O termo "nativo", conforme usado neste documento, refere-se a uma sequência de nucleotídeo, por exemplo, gene ou produto genético, por exemplo, RNA, proteína, que está presente em um vírus ou célula do tipo selvagem. O termo "variante", como aqui usado, refere-se a um mutante ou variante de uma sequência de polinucleotídeo ou polipeptídeo de referência, por exemplo, uma sequência de polinucleotídeo ou polipeptídeo nativa, ou seja, tendo menos de 100% de identidade de sequência com a sequência de polinucleotídeo ou polipeptídeo de referência. Em outras palavras, uma variante compreende pelo menos uma diferença de aminoácidos (por exemplo, substituição de aminoácidos, inserção de aminoácidos, exclusão de aminoácidos) em relação a uma sequência de polinucleotídeo de referência, por exemplo, uma sequência de polinucleotídeo ou polipeptídeo nativa. Por exemplo, uma variante pode ser um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequência de 70% ou mais com uma sequência de polinucleotídeo nativa de comprimento total, por exemplo, uma identidade de 75% ou 80% ou mais, tal como 85%, 90% ou 95% ou mais, por exemplo, 98% ou 99% de identidade com a sequência de polinucleotídeo nativa de comprimento total. Por exemplo, uma variante pode ser um polipetídeo tendo uma identidade de sequência de 70% ou mais com uma sequência de polipetídeo nativa de comprimento total, por exemplo, uma identidade de 75% ou 80% ou mais, tal como 85%, 90% ou 95% ou mais, por exemplo, 98% ou 99% de identidade com a sequência de polipetídeo nativa de comprimento total. As variantes também podem incluir fragmentos variantes de uma sequência de referência, por exemplo, nativa, compartilhando uma identidade de sequência de 70% ou mais com um fragmento da sequência de referência, por exemplo, nativa, por exemplo, uma identidade de 75% ou 80% ou mais, tal como 85%, 90% ou 95% ou mais, por exemplo, 98% ou 99% de identidade com a sequência nativa.

[072] Conforme usado neste documento, os termos "atividade biológica" e "biologicamente ativo" referem-se à atividade atribuída a um elemento biológico específico em uma célula. Por exemplo, a "atividade biológica" de uma "imunoglobulina", "anticorpo" ou fragmento ou variante do mesmo refere-se à capacidade de se ligar a um determinante antigênico e, assim, facilitar a função imunológica. Como outro exemplo, a atividade biológica de um polipeptídeo ou fragmento ou variante funcional do mesmo refere-se à capacidade do polipeptídeo ou fragmento ou variante funcional do mesmo de realizar suas funções nativas de, por exemplo, atividade enzimática de ligação, etc. Como um terceiro exemplo, a atividade biológica de um elemento regulador do gene, por exemplo, promotor, acentuador, sequência kozak e similares, refere-se à capacidade do elemento regulador ou fragmento ou variante funcional do mesmo de regular, ou seja, promover, acentuar ou ativar a tradução, respectivamente, da expressão do gene ao qual está operacionalmente ligado.

[073] Os termos "administrar" ou "introduzir", como aqui usados, referem-se à liberação de uma população de células a um paciente, por exemplo, transfundindo a população de células no sangue do paciente intra-arterialmente ou intravenosamente. A população de células pode ser administrada em várias soluções, tais como solução salina. Em algumas modalidades, a solução usada será isotônica ao sangue do paciente e tamponada com pH.

[074] "Transformação" é normalmente usado para referir-se ao processo de introduzir DNA heterólogo em bactérias ou outra célula, ou à células que expressam um oncogene e, portanto, foram convertidas em um modo de crescimento contínuo, tais como células tumorais. Um vetor usado para "transformar" uma célula pode ser um plasmídeo, vírus ou outro veículo.

[075] Normalmente, uma célula é referida como "transduzida", "infectada", "transfectada" ou "transformada" dependendo dos meios usados para administração, introdução ou inserção do DNA heterólogo (isto é, o vetor) na célula. Os termos "transduzido", "transfectado" e "transformado" podem ser usados de forma intercambiável neste documento, independentemente do método de introdução do DNA heterólogo.

[076] O termo "célula hospedeira", como aqui usado, refere-se a uma célula que foi transduzida, infectada, transfectada ou transformada com um vetor. O vetor pode ser um plasmídeo, uma partícula viral, um fago, etc. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e similares, são aquelas usadas anteriormente com a célula hospedeira selecionada para expressão e serão evidentes para os especialistas na técnica. Será apreciado que o termo "célula hospedeira" refere-se à célula original transduzida, infectada, transfectada ou transformada e progênie da mesma.

[077] Os termos "tratamento", "tratar" e similares são usados neste documento para geralmente significar obter um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de prevenção completa ou parcial de uma doença ou sintoma da mesma, por exemplo, reduzindo a probabilidade de que a doença ou sintoma da mesma ocorra no paciente, e/ou pode ser terapêutico em termos de cura parcial ou completa para uma doença e/ou efeito adverso atribuível à doença, retardando a progressão da doença. "Tratamento", conforme usado neste documento, abrange qualquer tratamento de uma doença em um mamífero e inclui: (a) prevenir que a doença ocorra em um paciente que pode estar predisposto à doença, mas ainda não foi diagnosticado como tendo ela; (b) inibir a doença, isto é, interromper seu desenvolvimento; ou (c) aliviar a doença, isto é, causar regressão da doença. O agente terapêutico pode ser administrado antes, durante ou após o início da doença ou lesão. O tratamento da doença em andamento, onde o tratamento estabiliza ou reduz os sintomas clínicos indesejáveis do paciente, é de particular interesse. É desejável que tal tratamento seja realizado antes da completa perda de função nos tecidos afetados. A terapia em questão pode ser administrada durante o estágio sintomático da doença e, em alguns casos, após o estágio sintomático da doença. Em certas modalidades, o tratamento é administrado ao paciente após um teste genético que identificou o paciente como tendo uma mutação associada ou causadora da doença, por exemplo, FA.

[078] Os termos "paciente", "hospedeiro(a)" são usados neste documento de forma intercambiável e referem-se a um mamífero, incluindo, mas não se limitando a, primatas humanos e não humanos, incluindo símios e humanos; animais esportivos mamíferos (por exemplo, cavalos); animais de fazenda mamíferos (por exemplo, ovelhas, cabras, etc.); animais de estimação mamíferos (cães, gatos, etc.); e roedores (por exemplo, camundongos, ratos, etc.).

[079] Como usado neste documento, "fragmento", conforme aplicado a um polipeptídeo, normalmente terá pelo menos 10 resíduos de aminoácidos, mais normalmente pelo menos 20 resíduos e, de preferência, pelo menos 30 (por exemplo, 50) resíduos de comprimento, mas menos que a sequência inteira e intacta. Os fragmentos podem ser gerados por métodos conhecidos pelos técnicos no assunto, por exemplo, por digestão enzimática da proteína de ocorrência natural ou recombinante, por técnicas de DNA recombinante, usando um vetor de expressão que codifica um fragmento definido, ou por síntese química. A capacidade de um fragmento candidato de se ligar a uma sequência de DNA específica pode ser avaliada pelos métodos aqui descritos. Fragmentos purificados ou fragmentos antigênicos podem ser usados para isolar regiões reguladoras ou para gerar novas enzimas reguladoras (por exemplo, usando múltiplos fragmentos funcionais de diferentes enzimas), bem como para gerar anticorpos, todos empregando protocolos padrão conhecidos pelos técnicos no assunto. Como usado neste documento, "fragmento funcional" pretende abranger não apenas os fragmentos de peptídeo que retêm a atividade biológica, mas também aqueles fragmentos de peptídeo que mantêm a especificidade de ligação a uma sequência de nucleotídeo específica.

[080] Um "fragmento funcional" de um anticorpo anti-CD34 é um fragmento capaz de se ligar a moléculas CD34 na superfície das células com afinidade e especificidade suficientes para permitir a seleção ou enriquecimento para células CD34+.

[081] Os termos "idêntico(a)" ou "porcentagem de identidade", no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências de polipeptídeo, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou que têm uma porcentagem especificada de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos que são os mesmos, quando comparadas e alinhadas para obter a máxima correspondência. Para determinar a porcentagem de identidade, as sequências são alinhadas para fins de comparação ideais (por exemplo, gaps podem ser introduzidos na sequência de uma primeira sequência de aminoácido ou de ácido nucleico para alinhamento ideal com uma segunda sequência de aminoácido ou ácido nucleico). Os resíduos de aminoácido ou nucleotídeos nas posições correspondentes de aminoácido ou nas posições de nucleotídeo são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo que a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição. A porcentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (ou seja, % de identidade = # de posições idênticas/# total de posições (por exemplo, posições sobrepostas)× 100). Em algumas modalidades, as duas sequências têm o mesmo comprimento.

[082] Um programa de computador ilustrativo para realizar o alinhamento ideal, levando em consideração as penalidades de gaps, é o pacote GCG Wisconsin Bestfit (Universidade de Wisconsin, EUA; Devereux et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387). Exemplos de outros softwares que podem executar comparações de sequências incluem, entre outros, o pacote BLAST (vide Ausubel et al., (1999) ibid - cap. 18), FASTA (Atschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 403-410), o conjunto de ferramentas de comparação GENEWORKS, o programa GCG Bestfit pode ser usado e as sequências BLAST 2 (vide FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50; FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8). Uma matriz de pontuação de similaridade em escala pode ser usada que atribui pontuações a cada comparação pareada com base na similaridade química ou na distância evolutiva. Um exemplo de tal matriz é a matriz BLOSUM62 - a matriz padrão para o conjunto de programas BLAST. Os programas GCG Wisconsin podem usar os valores padrão públicos ou uma tabela de comparação de símbolos personalizada, se fornecida (vide o manual do usuário para obter mais detalhes).

[083] O termo "substancialmente idêntico", no contexto de dois ácidos nucleicos ou polipeptídeos, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que têm pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% de identidade ou pelo menos 99% de identidade (por exemplo, conforme determinado usando um dos métodos estabelecidos abaixo).

[084] A menos que indicado de outra forma pelo contexto, uma "variante" é um polipeptídeo ou fragmento do mesmo tendo uma ou mais substituições de aminoácidos conservativas ou não conservativas em relação a um segundo polipeptídeo (também referido como "derivado"); ou um polipeptídeo ou fragmento do mesmo que é modificado pela ligação covalente de uma segunda molécula, tal como, por exemplo, pela ligação de um polipeptídeo heterólogo, ou por glicosilação, acetilação, fosforilação e similares. Ainda incluídos na definição de "variante" estão, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (por exemplo, aminoácidos não naturais e similares), polipeptídeos com ligações não substituídas, bem como outras modificações conhecidas na técnica, de ocorrência natural e não natural.

[085] As várias composições e métodos da invenção são descritos abaixo. Embora aqui sejam exemplificados exemplos de composições e métodos, entende- se que qualquer um dentre várias composições e métodos alternativos é aplicável e adequado para uso na prática da invenção. Deverá também ser entendido que uma avaliação das construções e métodos de expressão da invenção pode ser realizada usando procedimentos padrão na técnica.

[086] A prática da presente invenção emprega, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de biologia celular, biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, bioquímica e imunologia, que estão dentro do escopo dos técnicos no assunto. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura, tais como, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, segunda edição (Sambrook et al., 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait, ed., 1984); “Animal Cell Culture” (R. I. Freshney, ed., 1987); “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.); “Handbook of Experimental Immunology” (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987);

“Current Protocols in Molecular Biology” (F. M. Ausubel et al., eds., 1987); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis et al., Eds., 1994); e "Current Protocols in Immunology" (JE Coligan et al., eds., 1991), cada um dos quais é expressamente incorporado por referência aqui.

[087] Vários aspectos da invenção são descritos abaixo com referência a aplicações exemplares para ilustração. Deve ser entendido que vários detalhes, relações e métodos específicos são estabelecidos para fornecer um entendimento completo da invenção. Um técnico no assunto relevante, no entanto, reconhece prontamente que a invenção pode ser praticada sem um ou mais dos detalhes específicos ou com outros métodos. A presente invenção não é limitada pela ordem ilustrada de atos ou eventos, pois alguns atos podem ocorrer em ordens diferentes e/ou simultaneamente com outros atos ou eventos. Além disso, nem todos os atos ou eventos ilustrados são necessários para implementar uma metodologia de acordo com a presente invenção.

[088] A terminologia usada neste documento tem o objetivo de descrever apenas modalidades particulares e não se destina a ser limitativa da invenção. Conforme usado neste documento, as formas singulares "um(a)" e "o(a)" destinam- se a incluir também as formas plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Além disso, na medida em que os termos “incluindo”, “inclui”, “tem”, “tendo”, “com” ou variantes destes são usados na descrição detalhada e/ou nas reivindicações, tais termos devem ser inclusivos de maneira semelhante ao termo "compreendendo".

[089] O termo "cerca de" ou "aproximadamente" significa dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor específico conforme determinado por um técnico no assunto, o que dependerá em parte de como o valor é medido ou determinado, ou seja, as limitações do sistema de medida. Por exemplo, "cerca de" pode significar dentro de 1 ou mais de 1 desvio padrão, de acordo com a prática na técnica.

Alternativamente, "cerca de" pode significar uma faixa de até 20%, preferencialmente até 10%, mais preferencialmente até 5% e mais preferencialmente ainda até 1% de um determinado valor. Alternativamente, particularmente no que diz respeito a sistemas ou processos biológicos, o termo pode significar dentro de uma ordem de grandeza, preferencialmente dentro de 5 vezes, e mais preferencialmente dentro de 2 vezes, de um valor. Onde valores específicos são descritos no pedido e nas reivindicações, a menos que indicado de outra forma, o termo "cerca de", que significa uma faixa aceitável de erro para o valor específico, deve ser assumido.

[090] Todas as publicações mencionadas neste documento são incorporadas aqui por referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais relacionados aos quais as publicações são citadas. Entende-se que a presente divulgação substitui qualquer divulgação de uma publicação incorporada na medida em que haja uma contradição.

[091] Nota-se ainda que as reivindicações podem ser elaboradas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta declaração pretende servir como base antecedente para o uso de tal terminologia exclusiva como “exclusivamente”, “somente” e similares em conexão com a recitação de elementos da reivindicação, ou o uso de uma limitação “negativa”.

[092] As publicações discutidas neste documento são fornecidas somente para sua divulgação antes da data de apresentação do presente pedido. Além disso, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas de publicação reais, que talvez precisem ser confirmadas independentemente.

[093] Salvo indicação em contrário, todos os termos aqui usados têm o mesmo significado que teriam para um técnico no assunto e a prática da presente invenção empregará técnicas convencionais de microbiologia e tecnologia de DNA recombinante, que estão dentro do conhecimento dos técnicos no assunto.

MÉTODOS PARA PREPARAR, TRANSDUZIR E USAR POPULAÇÕES DE CÉLULAS ENRIQUECIDAS PARA CD34+

[094] Em um aspecto, a divulgação fornece métodos para preparar populações de células enriquecidas para células CD34+, incluindo células CD34+ modificadas por genes. Em certas modalidades, os métodos compreendem preparar duas populações de células enriquecidas para CD34, uma preparada usando condições de baixa estringência e a outra preparada usando condições de alta estringência. Como demonstrado aqui, o uso de uma combinação da população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência e da população de células enriquecida para CD34 de alta estringência resulta, de forma vantajosa, na reconstituição inesperadamente eficaz de células-tronco CD34+ em um paciente.

[095] Em outro aspecto, a divulgação fornece métodos para tratar um paciente tendo uma doença ou distúrbio, fornecendo ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou mais populações de células enriquecidas para células CD34+, incluindo células CD34+ modificadas por genes, em que as células C34+ modificadas por genes codificam um agente terapêutico eficaz para tratar a doença ou distúrbio. Em modalidades particulares, o agente terapêutico é um polipeptídeo ou um polinucleotídeo, por exemplo, um RNA. Em modalidades particulares, as populações de células enriquecidas para CD34 são preparadas a partir de células CD34 obtidas do paciente sendo tratado.

[096] Em certas modalidades dos métodos aqui divulgados, são produzidas duas populações de células enriquecidas para células CD34+, incluindo uma população de células enriquecida para CD34 de alta estringência e uma população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência. Estas duas populações de células podem ser mantidas separadas ou podem ser combinadas para produzir uma população mista de células compreendendo células enriquecidas para CD34 de alta estringência e células enriquecidas para CD34 de baixa estringência. Em modalidades particulares, uma ou ambas as duas populações de células são transduzidas com um vetor de terapia genética, por exemplo, um vetor LV que codifica FANCA ou um fragmento ou variante funcional do mesmo.

[097] Em modalidades particulares, as células podem ser de qualquer espécie de mamífero, por exemplo, roedor (por exemplo, camundongos, ratos, gerbos, esquilos), coelho, felino, canino, cabra, ovino, porco, equino, bovino, primata, humano. Em certas modalidades, as células podem ser de linhagens celulares estabelecidas ou podem ser células primárias, onde "células primárias", "linhagens celulares primárias" e "culturas primárias" são usadas de forma intercambiável aqui para se referirem a células e culturas de células que foram derivado de um paciente e permitidas crescer in vitro por um número limitado de passagens, isto é, fragmentações, da cultura. Por exemplo, culturas primárias são culturas que podem ter sido passadas 0 vezes, 1 vez, 2 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes ou 15 vezes, mas poucas vezes passam pelo estágio de crise. Normalmente, as linhagens celulares primárias da presente invenção são mantidas por menos de 10 passagens in vitro.

[098] Em certas modalidades, os métodos compreendem preparar populações de células enriquecidas para CD34 a partir de uma amostra biológica obtida de um paciente. Em uma modalidade, a amostra biológica é uma amostra de medula óssea. Em outra modalidade, a amostra biológica é sangue periférico.

[099] Em modalidades particulares, a amostra biológica, por exemplo, sangue periférico, é obtida a partir do paciente após a mobilização de células-tronco hematopoiéticas (CTHs). Em uma modalidade, CTHs e/ou células progenitoras são mobilizadas tratando o paciente com G-CSF ou um análogo do mesmo, por exemplo, em uma quantidade e por um tempo suficiente para causar a mobilização de CTHs no paciente. CTHs e células progenitoras (CTPH) no sangue periférico podem ser mobilizadas antes da coleta da amostra biológica. CTHs e CTPH do sangue periférico podem ser mobilizadas por qualquer método conhecido na técnica.

CTHs e CTPH do sangue periférico podem ser mobilizadas tratando o paciente com qualquer agente(s) aqui descrito(s) ou conhecido(s) na técnica, que aumenta(m) o número de CTH e/ou CTPH circulando no sangue periférico do paciente.

As referências feitas ao longo da CTH ou CTPH devem abranger tanto a CTH quanto a CTPH, a menos que indicado de outra forma.

Por exemplo, em modalidades particulares, o sangue periférico é mobilizado tratando o paciente com uma ou mais citocinas ou fatores de crescimento (por exemplo, G-CSF, kit ligante (KL), IL-I, IL-7, IL-8, IL-11, ligante Flt3, SCF, trombopoietina ou GM-CSF (tal como sargramostim)). Diferentes tipos de G-CSF que podem ser usados nos métodos para mobilização do sangue periférico incluem filgrastim e G-CSF de ação mais prolongada: pegfilgrastim.

Em modalidades particulares, o sangue periférico é mobilizado tratando o paciente com uma ou mais quimiocinas (por exemplo, proteína-1a inflamatória do macrófago (MIP1a/CCL3)), ligantes do receptor de quimiocina (por exemplo, ligantes do receptor 2 de quimiocina GROl3 e GR013M), análogos do receptor de quimiocina (por exemplo, análogos da proteína do fator-1a derivado de célula estromal (SDF-1a), tais como CTCE-0021, CTCE-0214 ou SDF-1a, tal como Met-SDF-113) ou antagonistas dos receptores de quimiocinas (por exemplo, antagonistas do receptor 4 (CXCR4) de quimiocina (motivo C-X-C), tais como AMD3100). Em modalidades particulares, o sangue periférico é mobilizado tratando o paciente com um ou mais agentes de sinalização anti-integrina (por exemplo, anticorpo bloqueador de função anti-antígeno muito tardio 4 (VLA-4), ou molécula de adesão celular anti-vascular 1 (VCAM- 1)). Em modalidades particulares, o sangue periférico é mobilizado tratando o paciente com um ou mais fármacos citotóxicos, tais como ciclofosfamida, etoposídeo ou paclitaxel.

Em modalidades particulares, o sangue periférico pode ser mobilizado administrando a um paciente um ou mais dos agentes listados acima por um certo período de tempo.

Por exemplo, o paciente pode ser tratado com um ou mais agentes (por exemplo, G-CSF) por injeção (por exemplo, subcutânea, intravenosa ou intraperitoneal), uma vez ao dia ou duas vezes ao dia, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias antes da coleta da CTPH. Em modalidades específicas, a CTPH é coletada dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 14, 16, 18, 20 ou 24 horas após a última dose de um agente usado para mobilização da CTPH em sangue periférico. Em modalidades particulares, as CTHs e a CTPH são mobilizadas tratando o paciente com dois ou mais tipos diferentes de agentes descritos acima ou conhecidos na técnica, tais como um fator de crescimento (por exemplo, G-CSF) e um antagonista do receptor de quimiocina (por exemplo, antagonista do receptor CXCR4, tal como AMD3100), ou um fator de crescimento (por exemplo, G-CSF ou KL) e um agente anti-integrina (por exemplo, anticorpo bloqueador de função VLA-4). Em uma modalidade, CTHs e/ou células progenitoras são mobilizadas tratando o paciente com G-CSF ou um análogo do mesmo. Em uma modalidade, o G-CSF é filgrastim. Em uma modalidade, CTHs e/ou células progenitoras são mobilizadas tratando o paciente com plerixafor. Em uma certa modalidade, CTHs e/ou células progenitoras são mobilizadas usando uma combinação de filgrastim e plerixafor, somente com filgrastim ou somente com plerixafor. Em modalidades particulares, diferentes tipos de agentes de mobilização são administrados simultaneamente ou sequencialmente. Para informações adicionais sobre métodos de mobilização de sangue periférico, vide, por exemplo, Craddock et al., 1997, Blood 90 (12):4779-4788; Jin et al., 2008, Journal of Translational Medicine 6:39; Pelus, 2008, Curr. Opin. Hematol. 15 (4): 285-292; Papayannopoulou et al., 1998, Blood 91(7):2231-2239; Tricot et al., 2008, Haematologica 93(11):1739-1742; e Weaver et al., 2001, Bone Marrow Transplantation 27(2):S23-S29).

[0100] Em certas modalidades, o sangue periférico é obtido através de uma seringa ou cateter inserido na veia de um paciente. Por exemplo, o sangue periférico pode ser coletado usando uma máquina de aférese. O sangue flui da veia através do cateter para uma máquina de aférese, que separa os glóbulos brancos, incluindo CTPH do restante do sangue e, em seguida, devolve o restante do sangue ao corpo do paciente. A aférese pode ser realizada por vários dias (por exemplo, 1 a 5 dias) até que CTPH suficiente tenha sido coletada.

[0101] Em certas modalidades, a medula óssea é obtida a partir da crista ilíaca posterior do paciente por aspiração por agulha (vide, por exemplo, Koda et al., 1984, J. Clin Invest. 73:1377-1384).

[0102] Em certas modalidades, um nível de hematócrito da amostra biológica pode ser determinado. O nível de hematócrito pode ser determinado centrifugando a amostra dentro de uma câmara de tratamento para separar os glóbulos vermelhos de uma amostra em uma camada de tal modo que o volume celular empacotado possa ser determinado. Deve-se considerar que a amostra pode ser combinada com um anticoagulante para auxiliar na determinação do nível de hematócrito e que tal anticoagulante pode ser adicionado à câmara de tratamento antes ou durante a centrifugação. Alternativamente, o nível de hematócrito pode ser determinado medindo as propriedades ópticas da amostra. Por exemplo, um espectrômetro pode ser usado para analisar a amostra. Deve-se considerar que qualquer tipo de métodos espectroscópicos conhecidos para determinar o nível de hematócrito pode ser usado, tal como, por exemplo, espectroscopia Raman e/ou técnicas de espalhamento de luz.

[0103] Em certas modalidades, a amostra biológica é depletada de eritrócitos, por exemplo, antes de preparar uma ou mais populações de células enriquecidas para células CD34+ a partir da amostra biológica. Em algumas modalidades, as células restantes após técnicas de depleção são lavadas. Em outra modalidade, a IgG não específica é adicionada às células lavadas. Em algumas modalidades, a IgG não específica é flebogamma.

[0104] Duas populações de células enriquecidas para células CD34+ podem ser produzidas selecionando uma população de células para células CD34+ sob condições de alta estringência e selecionando outra população de células para células CD34+ sob condições de baixa estringência, produzindo assim duas populações de células, uma população de células enriquecida para CD34 de alta estringência e outra população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência. Os métodos usados para selecionar para células CD34+ podem ser seleção positiva, seleção negativa ou uma combinação das mesmas. Em certas modalidades, a amostra biológica obtida a partir do paciente é dividida em duas amostras, em que uma amostra é usada para preparar a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência e a outra amostra é usada para preparar a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência.

[0105] Em outras modalidades, a amostra biológica obtida a partir do paciente é primeiro submetida a uma seleção para CD34+ de baixa estringência para preparar uma população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência e, em seguida, uma porção da população enriquecida para CD34 de baixa estringência é submetida a uma seleção para CD34+ de alta estringência para preparar uma população de células enriquecida para CD34 de alta estringência. A seleção pode ser aplicada sequencialmente, por exemplo, uma seleção para células enriquecidas para CD34 sob condições de baixa estringência pode ser aplicada primeiro, seguida pela seleção da população resultante de outras células enriquecidas para CD34 sob condições de alta estringência.

[0106] Em outros casos, a seleção para células enriquecidas para CD34 sob condições de alta estringência pode ser aplicada primeiro, seguida pela seleção da população residual de células enriquecidas para CD34 sob condições de baixa estringência. Em alguns casos, as populações de células podem ser divididas de tal modo que uma seleção de baixa estringência ou alta estringência seja aplicada a uma fração das células sujeitas a seleção de alta estringência ou baixa estringência anteriormente. Em alguns casos, uma amostra biológica é dividida em duas ou mais amostras antes da seleção para células enriquecidas para CD34 sob condições de alta ou baixa estringência.

[0107] Em alguns casos, duas ou mais amostras biológicas são misturadas juntas antes da seleção, incluindo, por exemplo, amostras mobilizadas da medula óssea adquiridas em momentos diferentes, tais como 1, 2, 3, 4 ou mais dias de intervalo, ou 1, 2 ou 3 semanas de intervalo ou 1, 2 ou 3 meses de intervalo, ou anos de intervalo, incluindo outros incrementos de tempo. Nos casos, amostras biológicas de diferentes pacientes são misturadas, tais como, por exemplo, uma amostra biológica autóloga e uma amostra de um doador alogênico. Em todos os casos, é contemplada a seleção de alta ou baixa estringência, que precede ou segue a mistura ou divisão de amostras biológicas ou populações de células enriquecidas, em todas as permutações possíveis. Em certas modalidades, o método compreende preparar uma população de células enriquecida para CD34 de alta estringência a partir de uma primeira amostra biológica obtida a partir do paciente selecionando para células CD34+ sob condições de alta estringência; e preparar uma população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência a partir de uma segunda amostra biológica obtida a partir do paciente selecionando para células CD34+ sob condições de baixa estringência.

[0108] Em algumas modalidades, a porcentagem de células CD34+ na população de células enriquecida para CD34 de alta estringência está entre 1,5 vezes, 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 3,5 vezes, 4 vezes maior ou, em alguns casos, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes ou 8 vezes maior que a porcentagem de células CD34+ na população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência.

[0109] Vários rendimentos e pureza das células CD34+ podem ser alcançados pelos métodos divulgados. Em alguns casos, a seleção para células

CD34+ sob condições de alta estringência resulta em populações de células enriquecidas para CD34 de alta estringência com rendimentos de células CD34+, em comparação com a amostra biológica de entrada, de pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou mais, ou qualquer valor intermediário; e/ou pureza, em comparação com o número total de células na amostra enriquecida, de pelo menos cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais, ou qualquer valor intermediário. Em alguns casos, a seleção para células CD34+ sob condições de alta estringência resulta em populações de células enriquecidas para CD34 de alta estringência com rendimentos de células CD34+, em comparação com a amostra biológica de entrada, de cerca de 10% a 20%, 20% a 30% ou 30% a 40%, ou qualquer valor intermediário; e/ou pureza, em comparação com o número total de células na amostra enriquecida, de pelo menos cerca de 20%, 30%, 40%, 50% ou qualquer valor intermediário. Em modalidades particulares, a seleção para células CD34+ sob condições de alta estringência resulta em populações de células enriquecidas para CD34 de alta estringência com rendimentos de células CD34+, em comparação com a amostra biológica de entrada, de pelo menos cerca de 20%; e/ou pureza, em comparação com o número total de células na amostra enriquecida, de pelo menos cerca de 20% ou pelo menos cerca de > 30%.

[0110] Em alguns casos, a seleção para células CD34+ sob condições de baixa estringência resulta em populações de células enriquecidas para CD34 de baixa estringência com rendimentos de células CD34+, em comparação com a amostra biológica de entrada, de pelo menos cerca de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais, ou qualquer valor intermediário; e pureza, em comparação com o número total de células na amostra enriquecida, de pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 25%, 40%, 50% ou mais ou qualquer valor intermediário. Em alguns casos, a seleção para células CD34+ sob condições de baixa estringência resulta em populações de células enriquecidas para CD34 de baixa estringência com rendimentos de células CD34+, em comparação com a amostra biológica de entrada, de mais que 30%, cerca de 30% a 40%, 40% a 50%, ou 50% a 60%, ou qualquer valor intermediário; e pureza, em comparação com o número total de células na amostra enriquecida, de pelo menos cerca de 3%, 5%, 8%, 10% ou qualquer valor intermediário. Em modalidades particulares, a seleção para células CD34+ sob condições de baixa estringência resulta em populações de células enriquecidas para CD34 de alta estringência com rendimentos de células CD34+, em comparação com a amostra biológica de entrada, de mais que 35%; e/ou pureza, em comparação com o número total de células na amostra enriquecida, de menos que 30%, menos que 25%, menos que 20%, menos que 10% ou menos que 5%. Em modalidades particulares, a seleção para células CD34+ sob condições de baixa estringência resulta em populações de células enriquecidas para CD34 de baixa estringência com pureza, em comparação com o número total de células na amostra enriquecida, de 1 a 30%, 1 a 20%, 1 a 10%, 10 a 30%, 10 a 20% ou 20 a 30%. Em algumas modalidades, as populações de células enriquecidas para CD34 de baixa estringência compreendem ainda pelo menos neutrófilos e células B.

[0111] Em modalidades particulares, a seleção de alta e baixa estringência é realizada por seleção positiva, por exemplo, usando um agente que liga células CD34+. Em modalidades particulares, o agente está em solução, enquanto em outras modalidades, o agente é afixado a uma superfície sólida. Em certas modalidades, o agente é ligado à superfície de uma esfera magnética. Em algumas modalidades, o agente é um anticorpo anti-CD34 ou um fragmento funcional do mesmo.

[0112] Em certas modalidades, a seleção sob condições de alta estringência e/ou condições de baixa estringência pode ser realizada em vários instrumentos, incluindo, sem limitação, o MACSQuant Tyto® da Miltenyi Biotec, MagCloudz® da Quad Technologies, sistema de separação de células Sepax® da GE, sistema de separação de células Elutra® da Terumo, separador de células Spectra® da COBE, sistemas LAB® ou WASH® da SynGen, sistema Lovo® da Fresenius-Kabi, sistema CliniMACS® ou CliniMACS Prodigy® da Miltenyi Biotec. A seleção pode ser realizada em laboratório ou no local de atendimento. Métodos detalhados para preparação e enriquecimento de células e populações de células, incluindo métodos exemplares para seleção de células CD34+ sob condições de alta estringência, são descritos, por exemplo, na Publicação de Patente Internacional de n° WO 2016/118790. O método de seleção ilustrativo útil para a seleção de alta estringência é fornecido pela Patente dos EUA de nº 8.727.132.

[0113] Em uma modalidade, o instrumento é um dispositivo de sistema fechado que inclui entradas de material (por exemplo, amostra, tampões, gás), pelo menos uma câmara de tratamento com recursos de centrifugação e incubação de células, um conjunto de tubulação fechado, uma bomba e um seletor de célula alvo. O software de controle permite que o dispositivo isole, modifique geneticamente e formule células alvo ex vivo, em modalidades particulares, diretamente de uma amostra em questão. Em modalidades particulares, o processo de seleção pode ser concluído dentro de 30 horas, dentro de 25 horas ou dentro de 20 horas com uma entrada mínima ou nenhuma entrada do usuário. Em modalidades particulares, todo o processo é concluído dentro de 72 horas ou dentro de 64 horas. Em modalidades particulares, entrada mínima do usuário significa que, entre a entrada da amostra no dispositivo e a recuperação de células geneticamente modificadas formuladas para administração a um paciente, o usuário interage com o dispositivo não mais do que 20, 15, 10 ou 5 vezes e/ou interage com o dispositivo por não mais que 12 horas, 10 horas, 8 horas, 5 horas, 4 horas ou 3 horas. Interações exemplares de um usuário podem incluir um ou mais dos seguintes: conectar um conjunto de tubos estéril; verificar a manutenção de um sistema fechado e estéril; determinar que um estágio deve ser repetido (por exemplo, sedimentação); verificar a conclusão bem-sucedida de um estágio; permitir que uma nova etapa comece após uma verificação da qualidade do processo; fornecer reagentes para entrada do dispositivo; e determinar e/ou calcular volumes para adição ou remoção. As interações podem ser cronometradas, após o recebimento da amostra, pela quantidade de tempo que o usuário está preparando ou realmente interagindo com o dispositivo.

[0114] Em certas modalidades, uma ou ambas a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência e/ou a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência são preparadas usando um instrumento CliniMACS®, tal como o instrumento CliniMACS® plus, que é um instrumento controlado por software que processa a CTH, por aférese. O instrumento CliniMACS® plus e equipamentos e reagentes relacionados estão disponíveis comercialmente na Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemanha. Os equipamentos ou reagentes usados incluem o antígeno/reagente CliniMACS® CD34, que é uma solução que contém um conjugado de anticorpo que consiste em um anticorpo monoclonal de IgG murino, direcionado contra o epítopo de Classe II do antígeno CD34 humano, que é quimicamente conjugado com esferas de dextrano tendo um núcleo de óxido/hidróxido de ferro, que é usado para seleção ou enriquecimento de células CD34+; tubo CliniMACS®, que é um tubo descartável estéril e de uso único, com duas colunas de separação de células para processar até 0,6x109 células CD34+ a partir de um número total de células que não exceda 60x109 glóbulos brancos (escala padrão) ou até 1,2x109 células CD34+ de um número total de células que não exceda 120x109 glóbulos brancos (em larga escala); e tampão CliniMACS® PBS/EDTA, que é uma solução salina estéril, de 1 mM de EDTA, isotônica e tamponada com fosfato, usada como um fluido de lavagem e transporte externo para o processamento in vitro de CTH, por aférese. As lavagens podem ser realizadas usando o tampão CliniMACS compreendendo PBS e albumina sérica humana a 2,5%. Os procedimentos para usar o sistema CliniMACS® são fornecidos nos Manuais do usuário CliniMACS disponíveis no site da Miltenyi, incluindo, por exemplo, o Manual do usuário CliniMACS® do sistema de reagentes CliniMACS® CD34 obtido em 8 de abril de 2019 em https://www.miltenyibiotec.com/_Resources/Persistent/2c28c84939f4ce793b29c9f2e 897c0bb1a334c47/User%20Manual%20for%20the%20CliniMACS%20CD34%20Rea gent%20System.pdf. Em uma modalidade, a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência é preparada marcando as células usando o reagente CD34 e, em seguida, as células CD34+ são selecionadas usando um programa padrão de enriquecimento CliniMACS® CD34. Em uma modalidade, a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência é preparada usando uma versão modificada de um programa de depleção CliniMACS®. De acordo com esta modalidade, as células são marcadas usando o reagente CD34, mas um programa de depleção modificado é executado. Após o carregamento das células marcadas com o ímã LIGADO, a bolsa de Coleta de Células é removida e as células coletadas não são usadas para transplante. Em vez disso, o ímã é DESLIGADO e o tampão de eluição é aplicado ao instrumento, resultando na eluição das células CD34+, que são coletadas. Em certas modalidades, em comparação com o modo de seleção, no modo de depleção, o instrumento é carregado mais lentamente (mL/min) e as lavagens são mais rigorosas.

[0115] Em certas modalidades, uma ou ambas a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência e/ou a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência são transduzidas com um vetor, por exemplo, um vetor de terapia genética que codifica um agente terapêutico, por exemplo, colocando uma ou ambas a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência e/ou a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência em contato com o vetor. Em certas modalidades, as células são colocada em contato com o vetor por cerca de 30 minutos, cerca de 1 hora, cerca de

1,5 horas, cerca de 2 horas, cerca de 2,5 horas, cerca de 3 horas, cerca de 3,5 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, cerca de 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 12 horas, cerca de 16 horas, cerca de 18 horas, cerca de 20 horas, cerca de 24 horas, cerca de 36 horas, cerca de 48 horas ou cerca de 60 horas. Em algumas modalidades, as células são transduzidas por menos de 60 horas, menos de 48 horas, menos de 36 horas ou menos de 24 horas. Em certas modalidades, as células podem ser colocada em contato com o vetor uma ou mais vezes, por exemplo, uma vez, duas vezes, três vezes ou mais de três vezes, e as células podem incubar com o(s) agente(s) por algum tempo após cada evento de contato, por exemplo, 16 a 24 horas, depois do qual, o meio é substituído por um novo meio e as células são cultivadas ainda mais. O contato das células com o vetor pode ocorrer em qualquer meio de cultura e sob quaisquer condições de cultura que promovam a sobrevivência das células. A cultura pode conter fatores de crescimento aos quais as células respondem. Os fatores de crescimento, como a qui definidos, são moléculas capazes de promover a sobrevivência, crescimento e/ou diferenciação de células, seja em cultura ou no tecido intacto, por meio de efeitos específicos em um receptor transmembranar. Fatores de crescimento incluem polipeptídeos e fatores não polipeptídicos.

[0116] Em certas modalidades, as células são colocadas em contato com uma quantidade eficaz do vetor de terapia genética suficiente para atingir níveis detectáveis do agente terapêutico codificado. Em modalidades particulares, o agente terapêutico é um polipeptídeo ou polinucleotídeo útil ou eficaz para o tratamento de uma doença ou distúrbio. Em modalidades particulares, o agente terapêutico é um polipeptídeo desregulado ou mutado nas células obtidas a partir do paciente, por exemplo, um polipeptídeo FANC para o tratamento de FA. A quantidade eficaz pode ser prontamente determinada empiricamente, por exemplo, detectando a presença ou níveis do agente terapêutico, detectando um efeito na viabilidade ou função das células, etc. Normalmente, a expressão do agente terapêutico será acentuada 2 vezes ou mais, por exemplo, 3 vezes, 4 vezes ou 5 vezes ou mais, em alguns casos 10 vezes, 20 vezes ou 50 vezes ou mais, por exemplo, 100 vezes em células transduzidas, em comparação com células não transduzidas.

[0117] Qualquer vetor de terapia genética conveniente que considere útil liberar sequências de polinucleotídeo para células de mamíferos é abrangido pelos vetores de terapia genética da presente divulgação. Por exemplo, o vetor pode compreender ácido nucleico de fita simples ou dupla, por exemplo, DNA de fita simples ou dupla. Por exemplo, o vetor de terapia genética pode ser DNA, por exemplo, um DNA nu, por exemplo, um plasmídeo, um minicírculo, etc. O vetor pode compreender RNA de fita simples ou dupla, incluindo formas modificadas de RNA. Em outro exemplo, o vetor de terapia genética pode ser um RNA, por exemplo, um mRNA ou mRNA modificado.

[0118] Em modalidades particulares, o vetor de terapia genética pode ser um vetor viral derivado de um vírus, por exemplo, um adenovírus, um vírus adeno- associado, um lentivírus (LV), um vírus do herpes, um alfavírus ou um retrovírus, por exemplo, vírus da leucemia murina de Moloney (M-MuLV), vírus do sarcoma murino Moloney (MoMSV), vírus do sarcoma murino Harvey (HaMuSV), vírus do tumor mamário murino (MuMTV), vírus da leucemia do macaco gibão (GaLV), vírus da leucemia do gibão (GaLV), vírus da leucemia felina (FLV), espumavírus, vírus da leucemia murine de Friend, vírus das células-tronco murinas (MSCV) ou vírus do sarcoma de Rous (RSV). Embora as modalidades que englobam o uso do LV sejam descritas em mais detalhes abaixo, espera-se que o técnico no assunto aprecie que conhecimentos e habilidades semelhantes na técnica também possam ser usados em vetores de terapia genética que não sejam do LV. Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética é um LV autolimitado.

[0119] Em particular, certos métodos aqui divulgados referem-se à transdução de uma ou ambas as populações de células-tronco ou células progenitoras, por exemplo, células-tronco hematopoiéticas (CTHs) ou células progenitoras hematopoiéticas (também aqui referidas como "progenitoras hematopoiéticas") com um vetor de terapia genética que codifica e/ou expressa um polipeptídeo terapêutico, por exemplo, FANCA, em que uma população é preparada por seleção sob condições de alta estringência e a outra população é preparada por seleção sob condições de baixa estringência. Em uma modalidade, as populações de células são enriquecidas para células CD34+. Em uma modalidade, as CTHs ou as progenitoras hematopoiéticas são de um paciente com atividade proteica diminuída ou inexistente de uma ou mais proteínas codificadas por FANCA. Em uma modalidade, o paciente tem FA-A. Em uma modalidade, o gene FANCA endógeno das CTHs é suprimido e/ou mutado.

[0120] Em uma modalidade, a transdução de uma célula com um vetor de terapia genética resulta na integração no genoma celular de um cassete de expressão compreendendo um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de polinucleotídeo que codifica um agente terapêutico dentro do vetor de terapia genética. Em algumas modalidades, a transdução de uma célula com um vetor de terapia genética resulta na expressão do agente terapêutico, por exemplo, uma proteína FANCA biologicamente ativa.

[0121] Por exemplo, uma proteína FANCA biologicamente ativa faz parte do complexo principal da FA. Em certas modalidades, um gene FANCA é liberado por meio de um vetor viral. Em uma modalidade, um gene FANCA é liberado através de um vetor lentiviral. Em certas modalidades, o vetor lentiviral é PGK- FANCA.WPRE*LV. Está contemplado que após a transdução de células da medula óssea (MO) ou células-tronco ou células progenitoras de pacientes com FA-A com um vetor lentiviral (LV) FANCA, o vetor terapêutico é integrado no genoma das células. Uma vez integrada, a proteína terapêutica (por exemplo, proteína FANCA humana) é expressa pelas células. As células de FA transduzidas são geneticamente corrigidas e, portanto, capazes de ativar a via da FA pela monoubiquitinação de FANCD2 e FANCI. Essas proteínas poderão então migrar para áreas de dano ao DNA e, em cooperação com outras proteínas de reparo do DNA, promoverão o reparo do DNA nessas células, conforme ocorre em células saudáveis.

[0122] Como discutido aqui, os métodos e composições em questão são úteis na expressão de um transgene, por exemplo, FANCA, nas células de um animal. Por exemplo, as composições em questão podem ser usadas em pesquisa, por exemplo, para determinar o efeito que o gene tem na viabilidade e/ou função celular. Como outro exemplo, as composições em questão podem ser usadas na medicina, por exemplo, para tratar um distúrbio, tal como a FA.

[0123] Por conseguinte, a presente divulgação fornece métodos para tratar uma doença ou distúrbio em um paciente em necessidade destes, compreendendo fornecer ou administrar ao paciente uma combinação de uma população de células enriquecida para CD34 de alta estringência e uma população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência preparada conforme descrito neste documento, em que uma ou ambas a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência ou população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência são transduzidas com um vetor de terapia genética recombinante compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica um agente terapêutico ou compreendendo um cassete de expressão que expressa o agente terapêutico, em que o agente terapêutico é eficaz no tratamento da doença ou distúrbio. Em modalidades particulares, a doença é FA, e o agente terapêutico é um polipeptídeo do grupo de complementação A da anemia de Fanconi (FANCA), ou uma variante ou fragmento funcional deste.

[0124] Em modalidades particulares, o método compreende: (a) preparar uma população de células enriquecida para CD34 de alta estringência a partir de uma primeira amostra biológica obtida a partir do paciente selecionando para células CD34+ sob condições de alta estringência; (b) preparar uma população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência a partir de uma segunda amostra biológica obtida a partir do paciente selecionando para células CD34+ sob condições de baixa estringência, (c) transduzir uma ou ambas a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência ou população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência com o vetor de terapia genética recombinante compreendendo a sequência de polinucleotídeos que codifica o agente terapêutico; e (d) fornecer ou administrar a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência e a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência ao paciente, em que uma ou ambas a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência ou populão de células enriquecida para CD34 de baixa estringência são transduzidas com o vetor de terapia genética recombinante; em que o agente terapêutico é eficaz no tratamento da doença ou distúrbio.

Em modalidades particulares, a doença é FA, e o agente terapêutico é um polipeptídeo do grupo de complementação A da anemia de Fanconi (FANCA), ou uma variante ou fragmento funcional deste.

Em certas modalidades, todas as células obtidas de cada uma das duas populações de células são administradas ao paciente.

As doses de células de cada uma das duas populações de células podem ser semelhantes ou diferentes, por exemplo, com mais células totais e mais células CD34+ totais provenientes da população de baixa estringência.

Em certas modalidades, as células originalmente obtidas do paciente são divididas em duas populações aproximadamente iguais, uma população sendo processada sob condições de seleção para CD34+ de alta estringência e uma sob condição de seleção para CD34+ de baixa estringência, o que pode resultar em ~2 vezes mais células CD34+ e 5 a 10 vezes mais células totais resultantes do processo de seleção de baixa estringência.

[0125] Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos de tratamento descritos neste documento, a primeira amostra biológica e a segunda amostra biológica são cada uma independentemente sangue periférico ou medula óssea. Em certas modalidades, a primeira amostra biológica e a segunda amostra biológica são sangue periférico obtido após o paciente ter sido tratado com G-CSF, plerifaxor ou uma combinação de G-CSF e plerifaxor.

[0126] Em modalidades particulares dos métodos de tratamento descritos aqui, a seleção para células CD34+ sob condições de alta estringência compreende carregar a primeira amostra biológica em uma coluna que liga células CD34+, lavar a coluna carregada uma ou mais vezes usando um tampão de lavagem e eluir a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência da coluna usando um tampão de eluição. Em uma modalidade, a etapa de aplicação é realizada a 5 a 10 mL/min, 5 a 15 mL/min, 15 a 20 mL/min, 20 a 25 mL/min ou 25 a 30 mL/min. Em uma modalidade, a etapa de eluição é realizada a 5 a 10 mL/min, 5 a 15 mL/min, 15 a 20 mL/min, 25 a 25 mL/min ou 25 a 30 mL/min. Em uma modalidade, a etapa de aplicação é realizada a 10 a 20 mL/min. Em uma modalidade, a etapa de eluição é realizada a 20 mL/min.

[0127] Em modalidades particulares dos métodos de tratamento descritos aqui, a seleção para células CD34+ sob condições de baixa estringência compreende carregar a segunda amostra biológica em uma coluna que liga células CD34+, permitir que a segunda amostra biológica flua através da coluna e eluir a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência da coluna usando um tampão de eluição. Em uma modalidade, a etapa de aplicação é realizada a 5 a 10 mL/min, 5 a 15 mL/min, 15 a 20 mL/min, 20 a 25 mL/min ou 25 a 30 mL/min. Em uma modalidade, a etapa de eluição é realizada a 5 a 10 mL/min, 5 a 15 mL/min, 15 a 20 mL/min, 25 a 25 mL/min ou 25 a 30 mL/min. Em uma modalidade, a etapa de aplicação é realizada a 10 a 20 mL/min. Em uma modalidade, a etapa de eluição é realizada a 20 mL/min.

[0128] Em modalidades particulares dos métodos de tratamento descritos neste documento, a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência é transduzida e/ou a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência é transduzida.

[0129] Em algumas modalidades, os métodos em questão resultam em um benefício terapêutico, por exemplo, impedindo o desenvolvimento de um distúrbio, interrompendo a progressão de um distúrbio, revertendo a progressão de um distúrbio, etc. Por exemplo, em uma modalidade, o distúrbio é FA. Em outra modalidade, a doença ou distúrbio é FMO. Em uma modalidade, o distúrbio é trombocitopenia. Em outra modalidade, o distúrbio é leucopenia. Em uma modalidade, o distúrbio é pancitopenia. Em uma modalidade, o distúrbio é neutropenia. Em outra modalidade, o distúrbio é anemia. Em algumas modalidades, o método em questão compreende a etapa de detectar que um benefício terapêutico foi alcançado. O técnico no assunto apreciará que tais medidas de eficácia terapêutica serão aplicáveis à doença específica sendo modificada e reconhecerá os métodos de detecção apropriados a serem usados para medir a eficácia terapêutica.

[0130] Como descrito em mais detalhes nos Exemplos, dados clínicos com células da medula óssea mobilizadas em amostras biológicas de sangue periférico e administradas de acordo com os métodos da presente invenção demonstraram, de maneira inesperada, cinética de enxerto de seleção in vivo mais rápida em relação aos outros pacientes com FA transplantados por métodos do estado da técnica. Em modalidades particulares, métodos e composição da presente divulgação são usados para tratar a FA.

[0131] Por conseguinte, a presente invenção fornece métodos para o tratamento da FA, ou uma ou mais das manifestações hematológicas da FA. Em uma modalidade, a manifestação hematológica da FA é selecionada a partir de uma ou mais de falência da medula óssea (FMO), trombocitopenia, leucopenia, pancitopenia, neutropenia e anemia. Em uma modalidade específica, a manifestação hematológica é FMO, que aparece em idades pediátricas na maioria dos pacientes com FA. Em uma modalidade, a manifestação hematológica é trombocitopenia. Em outra modalidade, a manifestação hematológica é leucopenia. Em uma modalidade, a manifestação hematológica é pancitopenia. Em uma modalidade, a manifestação hematológica é neutropenia. Em outra modalidade, a manifestação hematológica é anemia. Em uma modalidade, a manifestação hematológica é uma combinação de duas ou mais de FMO, trombocitopenia, leucopenia, pancitopenia, neutropenia e anemia.

[0132] Também é um objetivo da presente invenção reparar genes FANC endógenos (por exemplo, FANCA, FANCC e/ou FANCG) usando um sistema de edição de genes CRISPR/Cas ou similar. O reparo mediado por Cas9 de genes relacionados à anemia de Fanconi foi demonstrado in vitro, por exemplo, vide Obsorn et al. Fanconi anemia gene editing by the CRISPR/Cas9 system. Hum Gene Ther. Fevereiro de 2015; 26(2):114-26. A presente invenção fornece métodos para tratar a anemia de Fanconi e método para preparar células geneticamente modificadas que resultam em melhor eficiência in vivo de reparo e melhor reconstituição da medula óssea. Em alguns casos, o sistema de edição de genes repara um polimorfismo de nucleotídeo único, uma supressão, uma inserção, um indel ou outro defeito genético. O reparo é, em alguns casos, direcionado para uma região de codificação de um gene, um íntron ou uma região a montante ou a jusante, tal como uma região reguladora de genes do genoma proximal ou distante de um gene associado a uma doença ou distúrbio.

[0133] Em uma modalidade dos métodos da presente invenção, a divulgação fornece um método para tratar a anemia de Fanconi em um paciente em necessidade do mesmo, compreendendo preparar uma população de células enriquecida para CD34 de alta estringência a partir de uma primeira amostra biológica obtida a partir do paciente, selecionando para células CD34+ sob condições de alta estringência; preparar uma população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência a partir de uma segunda amostra biológica obtida a partir do paciente selecionando para células CD34+ sob condições de baixa estringência, colocar uma ou ambas a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência ou população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência em contato com um vetor de terapia genética recombinante para anemia de Fanconi; e administrar a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência e a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência ao paciente, em que uma ou ambas a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência ou população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência são colocadas em contato com o vetor de terapia genética recombinante; e em que o vetor de terapia genética compreende um sistema de edição de genes capaz de reparar diretamente um gene endógeno, tratando assim a anemia de Fanconi. Em alguns casos, o sistema de edição de genes é um sistema CRISPR-Cas (por exemplo, CRISPR-Cas9).

[0134] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genes compreende um ácido nucleico que codifica um produto de gene Cas, Cas9 ou spCas (tal como um mRNA, cDNA, plasmídeo ou similar) operacionalmente ligado a um promotor. Em algumas modalidades, o sistema de edição de genes compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína Cas, Cas9 ou spCas. Em alguns casos, o vetor de terapia genética é lipossomo ou nanopartícula lipídica ou outro sistema de administração baseado em lipídios ou similares a lipídios. Em alguns casos, o vetor de terapia genética é um vírus, tal como um lentivírus, adenovírus ou vírus adeno- associado. Em algumas modalidades, o sistema de edição de genes compreende um RNA guia, por exemplo, um RNA guia único (sgRNA) e, opcionalmente, um modelo de reparo. O modelo de reparo e o RNA guia são, em alguns casos, moléculas distintas ou, em alguns casos, a mesma molécula. O modelo de reparo e o RNA guia podem ser covalentemente ou não covalentemente ligados. O RNA guia é, em alguns casos, pré-carregado em uma proteína Cas, Cas9 ou spCas. Os componentes do sistema de edição de genes são, em alguns casos, liberados em um único vetor de terapia genética. Em alguns casos, o sistema de edição de genes é liberado em vetores distintos de terapia genética. Múltiplos vetores de terapia genética podem ser usados. Por exemplo, e sem limitação, várias lesões genéticas podem ser reparadas com o mesmo ou com diferentes vetores de terapia genética. Em alguns casos, dois ou mais genes FANC são reparados simultaneamente. Em alguns casos, um vetor de terapia genética é colocado em contato com as populações de células enriquecidas para CD34 de alta estringência e outro vetor de terapia genética é colocado em contato com as populações de células enriquecidas para CD34 de baixa estringência. Em alguns casos, os dois vetores de terapia genética são os mesmos. Em alguns casos, um vetor de terapia genética compreende um transgene para um distúrbio associado a um determinado gene (por exemplo, FANCA) e o outro vetor de terapia genética compreende um sistema de edição de genes.

[0135] Em alguns casos, o vetor de terapia genética fornece um transgene para, ou repara, um gene que não seja um gene associado a uma doença ou distúrbio. Por exemplo, sem limitação, o vetor de terapia genética pode regular negativamente ou positivamente genes efetores do sistema imunológico, pode alterar marcadores da superfície celular, pode fornecer moléculas de MHC alternativas ou pode codificar genes de imunoglobulina. É particularmente contemplado que, em alguns casos, o vetor ou vetores de terapia genética forneçam uso de transplantes alogênicos ou incomparáveis de doadores, tal como alterando marcadores imunes (por exemplo, genes HLA ou MHC) ou causando expressão de genes efetores imunes.

[0136] Em algumas modalidades, a divulgação fornece um método para tratar uma doença ou distúrbio em um paciente em necessidade do mesmo, compreendendo fornecer ao paciente uma combinação de uma população de células enriquecida para CD34 de alta estringência e uma população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência, ambas preparados a partir de uma ou mais amostras biológicas obtidas de um paciente em que as células CD34 obtidas do paciente compreendem uma ou mais mutações genéticas associadas ou causadoras da doença ou distúrbio, e em que uma ou ambas a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência ou população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência são submetidas à edição de genes para reparar a uma ou mais mutações genéticas antes de fornecer as populações de células ao paciente. Em certas modalidades, a edição de genes é realizada colocando uma ou ambas as populações de células enriquecidas para CD34 em contato com uma proteína Cas (por exemplo, Cas9 ou spCas); um RNA guia (por exemplo, RNA guia único, sgRNA); e um modelo de reparo. Em modalidades particulares, a doença é FA, e a mutação genética que é reparada é uma mutação no gene do grupo de complementação A da anemia de Fanconi (FANCA).

[0137] Em certas modalidades, o vetor de terapia genética divulgado neste documento compreende um polinucleotídeo compreendendo um promotor operacionalmente ligado a uma sequência que codifica um agente terapêutico, isto é, uma sequência de codificação. Como usado aqui, o termo "operacionalmente ligado" significa que o promotor é capaz de direcionar a expressão da sequência que codifica o agente terapêutico.

[0138] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende um ou mais acentuadores. Os acentuadores são elementos de ácido nucleico conhecidos na técnica para acentuar a transcrição e podem estar localizados em qualquer lugar em associação com o gene que eles regulam, por exemplo, a montante, a jusante, dentro de um íntron etc. Qualquer elemento acentuador pode ser usado nos cassetes de polinucleotídeos e nos vetores de terapia genética da presente divulgação, desde que ele acentue a expressão do gene quando usado em combinação com o promotor.

[0139] A sequência de codificação a ser expressa nas células pode ser qualquer sequência de polinucleotídeo, por exemplo, gene ou cDNA que codifica um produto genético, por exemplo, um polipeptídeo ou agente terapêutico baseada em RNA (siRNA, antissenso, ribozima, shRNA, etc.). A sequência de codificação pode ser heteróloga à sequência do promotor à qual está operacionalmente ligada, ou seja, não está naturalmente operacionalmente associada a ela. Alternativamente, a sequência de codificação pode ser endógena à sequência do promotor à qual está operacionalmente ligada, isto é, está associada na natureza a esse promotor. O produto genético pode atuar intrinsecamente na célula de mamífero ou pode atuar extrinsecamente, por exemplo, pode ser secretado. Por exemplo, quando o transgene é um gene terapêutico, a sequência de codificação pode ser qualquer gene que codifique um produto genético desejado ou fragmento ou variante funcional do mesmo que possa ser usado como um terapêutico para tratar uma doença ou distúrbio. Em várias modalidades, o transgene codifica o FANCA humano.

[0140] Em uma modalidade da invenção, a sequência de codificação do transgene é modificada ou "otimizada por códon" para acentuar a expressão substituindo os códons raramente representados por códons mais frequentemente representados. A sequência de codificação é a porção da sequência de mRNA que codifica os aminoácidos para tradução. Durante a tradução, cada um dos 61 códons de trinucleotídeos é traduzido para um dos 20 aminoácidos, levando a uma degenerescência ou redundância no código genético. No entanto, diferentes tipos de células e diferentes espécies animais usam tRNAs (cada um contendo um anticódon) que codificam os mesmos aminoácidos em diferentes frequências. Quando uma sequência de gene contém códons que raramente são representados pelo tRNA correspondente, a maquinaria de tradução do ribossomo pode diminuir, impedindo a tradução eficiente. A expressão pode ser melhorada por meio de "otimização de códons" para uma espécie específica, onde a sequência de codificação é alterada para codificar a mesma sequência de proteína, mas usando códons que são altamente representados e/ou usados por proteínas humanas altamente expressas (Cid-Arregui et al., 2003; J. Virol. 77: 4928). Em um aspecto da presente invenção, a sequência de codificação do transgene é modificada para substituir os códons raramente expressos em mamíferos ou em primatas por códons frequentemente expressos em primatas. Por exemplo, em algumas modalidades, a sequência de codificação codificada pelo transgene codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com um polipeptídeo codificado por uma sequência divulgada acima ou aqui, por exemplo, pelo menos 90% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 95% identidade de sequência, pelo menos 98% de identidade, pelo menos 99% de identidade, em que pelo menos um códon da sequência de codificação tem uma frequência de tRNA mais alta em humanos que o códon correspondente na sequência divulgada acima ou aqui.

[0141] Em uma modalidade adicional da invenção, a sequência de codificação do transgene é modificada para acentuar a expressão por terminação ou remoção de fases de leitura aberta (ORFs) que não codificam o transgene desejado. Uma fase de leitura aberta (ORF) é a sequência de ácido nucleico que segue um códon de início e não contém um códon de término. ORFs podem estar na orientação direta ou reversa e podem estar “dentro de fase” ou “fora de fase” em comparação com o gene de interesse. Tais fases de leitura aberta têm o potencial de serem expressas em um cassete de expressão ao lado do gene de interesse e podem levar a efeitos adversos indesejados. Em um aspecto da presente invenção, a sequência de codificação do transgene foi modificada para remover as fase de leitura aberta, alterando ainda mais o uso de códons. Isso pode ser feito eliminando os códons de início (ATG) e introduzindo os códons de término (TAG, TAA ou TGA) na orientação reversa ou ORFs fora de fase, preservando a sequência de aminoácido e mantendo os códons altamente usados no gene de interesse (ou seja, evitando códons com frequência < 20%). Na presente divulgação, a sequência de codificação do transgene pode ser otimizada tanto pela otimização do códon quanto pela remoção de ORFs não transgênicas ou usando ambas as técnicas. Como será evidente para um técnico no assunto, é preferível remover ou minimizar as ORFs não transgênicas após a otimização do códon a fim de remover ORFs introduzidas durante a otimização do códon.

[0142] A presente divulgação inclui plasmídeos compreendendo um cassete de expressão ou cassete de transferência descrito neste documento. Em modalidades particulares, o plasmídeo é pCCL-PGK-FANCA-WPRE * (SEQ ID NO: 24) e/ou o plasmídeo compreende o cassete de expressão de pCCL-PGK-FANCA- WPRE (SEQ ID NO: 25).

[0143] Em certas modalidades, um vetor de terapia genética ou um cassete de transferência genética no mesmo compreende um ou mais elementos adicionais, por exemplo, um ou mais elementos selecionados a partir dos seguintes: 5' LTR, 3'LTR, cPPT, CTS, RRE, sequências acentuadoras e sinais de empacotamento. Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética ou cassete de transferência genética é qualquer vetor ou cassete divulgado no Pedido de Patente Internacional de nº WO 2018/049273 A1, cuja divulgação é incorporada aqui em sua totalidade para todos os fins. As sequências de polinucleotídeo que codificam um polipeptídeo do grupo de complementação da anemia de Fanconi (FANC) incluem aquelas divulgadas na Patente dos EUA de nº 5.952.190, cuja divulgação é incorporada no presente documento em sua totalidade para todos os fins.

[0144] A sequência RRE melhora a eficiência da transferência genética. Em modalidades particulares de qualquer um dos cassetes de expressão e vetores de terapia genética descritos neste documento, a sequência RRE compreende ou consiste em qualquer uma das seguintes sequências ou sequências tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com as seguintes sequências (todas exibidas na orientação 5' a 3'):

AGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGG CGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGT GCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGC

AACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAA AGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCT (SEQ ID NO: 1);

GATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGA ATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAG GCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTT GTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGA CGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACA ATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGG GCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATC AACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTG TGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACAC GACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTC CTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAA TTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGT ATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTT GCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTC AGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGA

AGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATC (SEQ ID NO: 26); ou uma sequência compreendendo ou consistindo nos nucleotídeos 2649-2882 ou SEQ ID NO: 24 ou polinucleotídeos 1296-2153 da SEQ ID NO: 25.

[0145] A região líder retroviral contém o sinal de empacotamento (Ψ), que está envolvido no empacotamento do genoma retroviral no capsídeo viral. Pensa-se que os vetores LV requerem aproximadamente 300 pb do gene Gag nessa região. Atualmente, essa sequência Gag foi reduzida para apenas 40 pb (Figura 65). Em modalidades particulares de qualquer um dos cassetes de expressão e vetores de terapia genética descritos aqui, a sequência ψ é uma sequência ψ do HIV-1 or ou a sequência ψ compreende ou consiste em qualquer uma das seguintes sequências, ou sequências tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com as seguintes sequências:

CTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGG

CGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGA AGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTC (SEQ ID NO: 2); TGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGA (SEQ ID NO: 27); ou uma sequência compreendendo ou consistindo nos polinucleotídeos 2031- 2156 da SEQ ID NO: 24 ou polinucleotídeos 889-933 da SEQ ID NO: 25.

[0146] Em modalidades particulares de qualquer um dos cassetes de expressão e vetores de terapia genética descritos neste documento, a LTR 5' do HIV-1 truncada compreende ou consiste em qualquer uma das seguintes sequências, ou sequências tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com qualquer uma das seguintes sequências:

[0147] GGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGG

CTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCA

AGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACC CTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCA (SEQ ID NO: 3);

[0148] GTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCT

AACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAG

TAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCT TTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCC (SEQ ID NO: 28); ou uma sequência compreendendo ou consistindo nos polinucleotídeos 1586- 9495 da SEQ ID NO: 24 ou polinucleotídeos 934-1295 da SEQ ID NO: 25.

[0149] Em modalidades particulares de qualquer um dos cassetes de expressão e vetores de terapia genética descritos aqui, a LTR 3' do HIV-1 autoinativadora compreende ou consiste em qualquer uma das seguintes sequências ou sequências tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, em pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com as seguintes sequências: .

TGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTG TACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACT AGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGT

GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTA GTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCA (SEQ ID NO: 4);

GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTA GTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCA (SEQ ID NO: 29); ou uma sequência compreendendo ou consistindo nos polinucleotídeos 9262- 9495 da SEQ ID NO: 24 ou polinucleotídeos 8056-8289 da SEQ ID NO: 25.

[0150] Em modalidades particulares de qualquer um dos cassetes de expressão e vetores de terapia genética descritos aqui, o promotor precoce imediato do citomegalovírus humano (CMV) compreende ou consiste em qualquer uma das seguintes sequências, em um fragmento funcional do mesmo ou em uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com qualquer uma das seguintes sequências:

GTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACT CACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGC

ACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGC AAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT (SEQ ID NO: 5);

ACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGT TCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCC TGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCC CATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACG GTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCC TATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGAC CTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACC ATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCA CGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCAC

CAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAA ATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGC (SEQ ID NO: 30) ou uma sequência compreendendo ou consistindo nos polinucleotídeos 1586- 1789 da SEQ ID NO: 24 ou polinucleotídeos 1-577 da SEQ ID NO: 25.

[0151] Em modalidades particulares de qualquer um dos cassetes de expressão e vetores de terapia genética descritos aqui, o promotor do vírus do sarcoma de Rous (RSV) compreende ou consiste em qualquer uma das seguintes sequências, em um fragmento funcional do mesmo ou em uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com qualquer uma das seguintes sequências:

TTAATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGAT GAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGT GGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGA

CATGGATTGGACGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGT GCCTAGCTCGATACAATAAACG (SEQ ID NO: 31).

[0152] O cPPT, que facilita a translocação nuclear dos complexos de pré- integração, juntamente com a CTS envolvida na separação da transcriptase reversa, tem visto melhorar o título viral (Zennou, et al., 2000; Follenzi et al., 2000). Em modalidades particulares de qualquer um dos cassetes de expressão e vetores de terapia genética descritos aqui, o trato polipurino central e a sequência de terminação central do HIV-1 (cPPT/CTS) compreendem ou consistem em qualquer uma das seguintes sequências, em um fragmento funcional do mesmo ou em um sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com qualquer uma das seguintes sequências: .

TTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAAT

AGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACA AAAATTCAAAATTTT (SEQ ID NO: 6); TTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGT (SEQ ID NO:12); AAAAGAAAAGGGGGGA (SEQ ID NO: 32);

TTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAG

ACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTATCGAT CACGAGACTAGCCTCGA (SEQ ID NO: 33) ou uma sequência compreendendo ou consistindo nos nucleotídeos 3378-3495 da SEQ ID NO: 24 ou nucleotídeos 2176-2312 da SEQ ID NO: 25.

[0153] Em modalidades particulares de qualquer um dos cassetes de expressão e vetores de terapia genética descritos aqui, o promotor de fosfoglicerato quinase 1 humana (hPGK) compreende ou consiste em qualquer uma das seguintes sequências, em um fragmento funcional do mesmo ou em uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com qualquer uma das seguintes sequências:

GGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTTTGCGCAGG GACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGG GTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTAC CCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTT CCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACT AGTACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGC GATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCAGGGCGCGCCGAGAGCAGCGG CCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCT

GTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGG CAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCAG (SEQ ID NO: 7); ou uma sequência compreendendo ou consistindo nos nucleotídeos 3541-4051 da SEQ ID NO: 24 ou nucleotídeos 2335-2845 da SEQ ID NO: 25.

[0154] Em certas modalidades, os cassetes de expressão e os vetores de terapia genética divulgados neste documento compreendem ainda um ou mais elementos adicionais, por exemplo, um promotor e/ou acentuador de CMV, uma sequência de poliA SV40, uma origem de replicação, por exemplo, uma sequência

SV40 ori ou qualquer um dos elementos divulgados aqui.

[0155] Em modalidades particulares de cassetes de expressão e vetores de terapia genética descritos aqui, o acentuador de CMV humano compreende ou consiste na sequência a seguir, em um fragmento funcional do mesmo ou em uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a seguinte sequência:

GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTA GTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCG CCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTT CCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTA CGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCC CCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATG

ACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTA CCATG (SEQ ID NO: 9).

[0156] Em modalidades particulares de qualquer um dos cassetes de expressão e vetores de terapia genética descritos aqui, o sinal poli(A) do vírus símio 40 (SV40) compreende ou consiste na sequência a seguir, em um fragmento funcional do mesmo ou em uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a seguinte sequência:

AACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCAC

AAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAAC TCATCAATGTATCTTA (SEQ ID NO: 10); ou uma sequência compreendendo ou consistindo nos nucleotídeos 8361-8482 da SEQ ID NO: 25.

[0157] Em modalidades particulares de qualquer um dos cassetes de expressão e vetores de terapia genética descritos aqui, a origem da replicação do

SV40 compreende ou consiste na sequência a seguir, em um fragmento funcional da mesma ou na sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a seguinte sequência:

ATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGC

TGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTAT TCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCC (SEQ ID NO: 11);

GGCCTCCAAAAAAGCCTCCTCACTACTTCTGGAATAGCTCAGAGGCCGA GGCGGCCTCGGCCTCTGCATAAATAAAAAAAATTAGTCAGCCATGGGGCGGAG

AATGGGCGGAACTGGGCGGAGTTAGGGGCGGGATGGGCGGAGTTAGGGGCG GGA (SEQ ID NO: 34); ou uma sequência compreendendo ou consistindo nos nucleotídeos 8502-8657 da SEQ ID NO: 25.

[0158] Em algumas modalidades de qualquer um dos cassetes de expressão e vetores de terapia genética descritos aqui, o sinal dNEF presente em qualquer um dos cassetes de expressão ou vetores de terapia genética descritos aqui compreende ou consiste na sequência a seguir, em um fragmento funcional do mesmo ou em uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a seguinte sequência:

GAATTCGAGCTCGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTA GATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGAC (SEQ ID NO: 13).

[0159] Em modalidades particulares de qualquer um dos cassetes de expressão e vetores de terapia genética descritos aqui, a sequência KanR presente em qualquer um dos cassetes de expressão ou vetores de terapia genética descritos aqui compreende ou consiste na seguinte sequência:

ATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCGGCTTGGGTG GAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGC CGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGTCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCG ACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGG CTGGCGACGACGGGCGTTCCTTGCGCGGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGC GGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCAT CTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGG CTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGC ATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCT GGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAG GCGTCTATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCACGGCGATGCCTGCTT GCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCG TCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTG CTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTTGTGCTTTACGGTATC

GCCGCGCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTC TGA (SEQ ID NO: 14).

[0160] Em modalidades particulares de qualquer um dos cassetes de expressão e vetores de terapia genética descritos aqui, a sequência RNA-OUT presente em qualquer um dos cassetes de expressão ou vetores de terapia genética descritos aqui compreende ou consiste na seguinte sequência:

GTAGAATTGGTAAAGAGAGTCGTGTAAAATATCGAGTTCGCACATCTTG

TTGTCTGATTATTGATTTTTGGCGAAACCATTTGATCATATGACAAGATGTGTATC TACCTTAACTTAATGATTTTGATAAAAATCATTAGG (SEQ ID NO: 35); ou uma sequência compreendendo ou consistindo nos nucleotídeos 9731-9871 da SEQ ID NO: 25.

[0161] Em algumas modalidades de qualquer um dos cassetes de expressão e vetores de terapia genética aqui, o terminador rrnG (terminador de transcrição do operon rrnG do RNA ribossômico da E. coli (Albrechtsen et al., 1991) presente em qualquer um dos cassetes ou gene de expressão os vetores de terapia aqui descritos compreende ou consiste na seguinte sequência:

GCATTGGCGCAGAAAAAAATGCCTGATGCGACGCTGCGCGTCTTATACT

CCCACATATGCCAGATTCAGCAACGGATACGGCTTCCCCAACTTGCCCACTTCC ATACGTGTCCTCCTTACCAGAAATTTATCCTTAA (SEQ ID NO: 15).

[0162] Em algumas modalidades de qualquer um dos cassetes de expressão e vetores de terapia genética descritos aqui, a ori (origem de replicação de número alto de cópias ColE1/pMB1/pBR322/pUC) presente em qualquer um dos cassetes de expressão ou vetores de terapia genética descritos aqui compreende ou consiste na sequência a seguir, em um fragmento funcional da mesma ou uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a sequência a seguir:

TTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAAC CACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTC CGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGT AGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCG CTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTA CCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGA ACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACT GAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAA AGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAG GGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCA

CCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTAT GGAAA (SEQ ID NO: 16),

GGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAG GTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACT TTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTT TGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCA GACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAA TCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGG ATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGA TACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTC TGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGC CAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGA TAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTG GAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAG CGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGG GTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATC TTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATG CTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTAC GGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCC

TGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCG CAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGA (SEQ ID NO: 37); ou uma sequência compreendendo ou consistindo nos nucleotídeos 9731-9871 da SEQ ID NO: 24 ou nucleotídeos 8700-9714 da SEQ ID NO: 25.

[0163] Em algumas modalidades de qualquer um dos cassetes de expressão e vetores de terapia genética descritos aqui, o local de ligação CAP presente em qualquer um dos cassetes de expressão ou vetores de terapia genética descritos aqui compreende ou consiste na sequência a seguir, em um fragmento funcional do mesmo ou em uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a seguinte sequência: TAATGTGAGTTAGCTCACTCAT (SEQ ID NO: 17).

[0164] Em algumas modalidades de qualquer um dos cassetes de expressão e vetores de terapia genética aqui descritos, o o promotor lac da E.coli presente em qualquer um dos cassetes de expressão ou vetores de terapia genética descritos aqui compreende ou consiste na sequência a seguir, em um fragmento funcional do mesmo ou em uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a seguinte sequência: TTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTG (SEQ ID NO: 18).

[0165] Em algumas modalidades de qualquer um dos cassetes de expressão e vetores de terapia genética descritos descritos aqui, o operador lac presente em qualquer um dos cassetes de expressão ou vetores de terapia genética descritos aqui compreende ou consiste na sequência a seguir, em um fragmento funcional do mesmo ou em uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a seguinte sequência: TTGTGAGCGGATAACAA (SEQ ID NO: 19).

[0166] Em algumas modalidades de qualquer um dos cassetes de expressão e vetores de terapia genética aqui descritos aqui descritos, o promotor T3 (promotor para a RNA polimerase do bacteriófago T3) presente em qualquer um dos cassetes de expressão ou vetores de terapia genética descritos aqui compreende ou consiste na seguinte sequência, em um fragmento funcional do mesmo, ou em uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a seguinte sequência: AATTAACCCTCACTAAAGG (SEQ ID NO: 20).

[0167] Em algumas modalidades de qualquer um dos cassetes de expressão e vetores de terapia genética descritos aqui, o promotor T7 (promotor para a RNA polimerase do bacteriófago T7) presente em qualquer um dos cassetes de expressão ou vetores de terapia genética descritos aqui compreende ou consiste na seguinte sequência, em um fragmento funcional do mesmo, ou em uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a seguinte sequência: CCTATAGTGAGTCGTATTA (SEQ ID NO: 21).

[0168] Em algumas modalidades de qualquer um dos cassetes de expressão e vetores de terapia genética aqui descritos, a f1 ori (origem de replicação do bacteriófago f1) presente em qualquer um dos cassetes de expressão ou vetores de terapia genética descritos aqui compreende ou consiste na seguinte sequência, em um fragmento funcional da mesma, ou em uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a seguinte sequência:

ACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACG CGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTT CTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCG GGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAA ACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTT TCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACT GGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGC

CGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAA TT (SEQ ID NO: 22).

[0169] Como discutido aqui, os cassetes de expressão e os vetores de terapia genética da presente invenção podem compreender um sinal de exportação de RNA. Sequências de exportação de RNA exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, WPRE. O WPRE aumenta significativamente a expressão do transgene nas células alvo, aumentando a estabilidade do RNA de maneira transgênica, promotora e independente do vetor (Zuffrey et al, 1999). No entanto, ele pode expressar uma proteína truncada de 60 aminoácidos derivada do gene WHV X envolvido no câncer de fígado (Kingsman et al, 2005). Portanto, a maioria dos protocolos pré-clínicos e ensaios clínicos inclui uma versão mutada do elemento WPRE (Zanta-Boussif et al, 2009). Por outro lado, o uso de dois elementos SV40- USE em vetores SIN-LV foi considerado mais eficiente que a sequência de WPRE na supressão da leitura transcricional (Schambach et al, 2007). Mais precisamente, o WPRE divulgado neste documento é um WPRE quimérico que transporta 589 nucleotídeos a partir do WPRE modificado realizado por Axel Schambach (nucleotídeos 1-589) (WO 2008136670 A2) e 88 a partir de um antigo WPRE (nucleotídeos 590-677) (Zuffrey et al., 1999). Os dados divulgados no presente documento mostram que esse WPRE quimérico funciona melhor que o antigo WPRE. A sequência de WPRE quimérico compreende a seguinte sequência, um fragmento funcional da mesma ou uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a seguinte sequência:

CGAGCATCTTACCGCCATTTATTCCCATATTTGTTCTGTTTTTCTTGATTT GGGTATACATTTAAATGTTAATAAAACAAAATGGTGGGGCAATCATTTACATTTTT AGGGATATGTAATTACTAGTTCAGGTGTATTGCCACAAGACAAACATGTTAAGAA ACTTTCCCGTTATTTACGCTCTGTTCCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTT GTGAAAGATTGACTGATATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTGTGTGGATA TGCTGCTTTAATGCCTCTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTC TCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTG TCCGTCAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGC TGGGGCATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTCCCCCTC CCGATCGCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGG GGCTAGGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGGGCCTGC TGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGG

ATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG (SEQ ID NO:23).

[0170] Em modalidades particulares, a sequência de WPRE mutado compreende ou consiste em WPRE*, que corresponde aos nucleotídeos 8502-9178 da SEQ ID NO: 24 ou nucleotídeos 7293-7888 da SEQ ID NO: 25, ou tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com esta região da SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 25.

[0171] Outras combinações de elementos, tanto divulgadas neste documento como conhecidas na técnica, serão prontamente apreciadas pelo técnico no assunto.

[0172] Além disso, como será reconhecido por um técnico no assunto, os cassetes de expressão e os vetores de terapia genética podem opcionalmente conter outros elementos, incluindo, mas não se limitando a, locais de restrição, para facilitar a clonagem e os elementos reguladores para um vetor específico de terapia genética.

[0173] Em alguns aspectos da presente invenção, os cassetes de polinucleotídeos em questão são usados para liberar um gene às células, por exemplo, para determinar o efeito que o gene tem na viabilidade e/ou função celular, para tratar um distúrbio celular, etc. Em várias modalidades, a liberação de um vetor viral às células por transdução pode ocorrer in vitro, ex vivo ou in vitro. Por conseguinte, em alguns aspectos da invenção, a composição que fornece a expressão de um transgene em células de mamíferos é um vetor de terapia genética, em que o vetor de terapia genética compreende um cassete de polinucleotídeo, por exemplo, um cassete de transferência genética, da presente divulgação.

[0174] A correção genética de CTHs de pacientes com FA, seguida pelo transplante autólogo dessas células (terapia genética hematopoiética), é uma boa alternativa para pacientes com FA, particularmente aqueles sem um irmão HLA- idêntico. Em uma modalidade, a terapia genética hematopoiética é o regime de tratamento preferido para um paciente sem um irmão HLA-idêntico. Em outra modalidade, a terapia genética hematopoiética é um regime de tratamento para um paciente que tem um irmão HLA-idêntico.

[0175] Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos divulgados neste documento, o vetor de terapia genética compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma proteína FAC, e as células transduzidas com o vetor são fornecidas a um paciente para tratar a FA.

[0176] Como a maioria dos pacientes com FA pertence ao grupo de complementação FA-A (Casado et al., 2007, Levitus et al., 2004, Taniguchi et al., 2006), um vetor que abriga o gene funcional FANCA foi desenvolvido. A inclusão de um elemento regulador pós-transcricional mutado do vírus da hepatite da marmota (WPRE*), que não possui qualquer fase de leitura aberta residual (Schambach A et al., Gene Ther. 2006; 13: 641-645) será usada para melhorar o nível de expressão e estabilidade do gene terapêutico.

[0177] Em algumas modalidades, um cassete de polinucleotídeo compreende: (i) uma sequência promotora de fosfoglicerato quinase (PGK) ou uma variante ou fragmento funcional da mesma; (ii) uma sequência que codifica uma proteína FANCA humana ou uma variante ou fragmento funcional da mesma; e: (iii) um elemento regulador pós-transcricional da sequência do vírus da hepatite da marmota (WPRE).

[0178] Em algumas modalidades, um cassete de polinucleotídeo compreende: (i) uma sequência promotora da fosfoglicerato quinase humana (PGK);

(ii) uma sequência que codifica uma proteína FANCA humana; e: (iii) uma sequência WPRE mutante.

[0179] Em algumas modalidades, um cassete de polinucleotídeo compreende: a) uma LTR 5', opcionalmente uma LTR 5' modificada; b) uma sequência cPPT; c) uma sequência promotora da PGK, opcionalmente uma sequência promotora da PGK humana; d) uma sequência que codifica uma proteína FANCA humana, opcionalmente uma sequência de cDNA ou uma sequência otimizada de códon; e) uma sequência WPRE mutante; e f) uma LTR 3', opcionalmente uma LTR 3' modificada.

[0180] Em uma modalidade, o WPRE modificado é referido como WPRE*. O WPRE* é um WPRE modificado que não possui uma fase de leitura aberta (vide, por exemplo, Schambach et al., 2006 Gene Ther. 13:641-645).

[0181] Como a maioria dos pacientes com FA pertence ao grupo de complementação FA-A (Casado et al., 2007, Levitus et al., 2004, Taniguchi et al., 2006), em modalidades particulares, o produto genético terapêutico codificado é FANCA, embora a divulgação contempla que as proteínas FA de outros grupos de complementação também possam ser liberadas e, assim, codificadas nos cassetes de expressão divulgados neste documento, por exemplo, em vez de FANCA.

[0182] Em modalidades particulares de qualquer um dos cassetes de expressão e vetores de terapia genética descritos aqui, a sequência de polinucleotídeo que codifica um FANCA otimizado por códon é uma sequência de cDNA FANCA humana que compreende ou consiste na sequência a seguir, ou em um fragmento funcional da mesma, ou em uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a seguinte sequência:

ATGTCCGACTCGTGGGTCCCGAACTCCGCCTCGGGCCAGGACCCAGG GGGCCGCCGGAGGGCCTGGGCCGAGCTGCTGGCGGGAAGGGTCAAGAGGGA AAAATATAATCCTGAAAGGGCACAGAAATTAAAGGAATCAGCTGTGCGCCTCCT GCGAAGCCATCAGGACCTGAATGCCCTTTTGCTTGAGGTAGAAGGTCCACTGTG TAAAAAATTGTCTCTCAGCAAAGTGATTGACTGTGACAGTTCTGAGGCCTATGCT AATCATTCTAGTTCATTTATAGGCTCTGCTTTGCAGGATCAAGCCTCAAGGCTGG GGGTTCCCGTGGGTATTCTCTCAGCCGGGATGGTTGCCTCTAGCGTGGGACAG ATCTGCACGGCTCCAGCGGAGACCAGTCACCCTGTGCTGCTGACTGTGGAGCA GAGAAAGAAGCTGTCTTCCCTGTTAGAGTTTGCTCAGTATTTATTGGCACACAGT ATGTTCTCCCGTCTTTCCTTCTGTCAAGAATTATGGAAAATACAGAGTTCTTTGTT GCTTGAAGCGGTGTGGCATCTTCACGTACAAGGCATTGTGAGCCTGCAAGAGC TGCTGGAAAGCCATCCCGACATGCATGCTGTGGGATCGTGGCTCTTCAGGAAT CTGTGCTGCCTTTGTGAACAGATGGAAGCATCCTGCCAGCATGCTGACGTCGC CAGGGCCATGCTTTCTGATTTTGTTCAAATGTTTGTTTTGAGGGGATTTCAGAAA AACTCAGATCTGAGAAGAACTGTGGAGCCTGAAAAAATGCCGCAGGTCACGGTT GATGTACTGCAGAGAATGCTGATTTTTGCACTTGACGCTTTGGCTGCTGGAGTA CAGGAGGAGTCCTCCACTCACAAGATCGTGAGGTGCTGGTTCGGAGTGTTCAG TGGACACACGCTTGGCAGTGTAATTTCCACAGATCCTCTGAAGAGGTTCTTCAG TCATACCCTGACTCAGATACTCACTCACAGCCCTGTGCTGAAAGCATCTGATGC TGTTCAGATGCAGAGAGAGTGGAGCTTTGCGCGGACACACCCTCTGCTCACCT CACTGTACCGCAGGCTCTTTGTGATGCTGAGTGCAGAGGAGTTGGTTGGCCATT TGCAAGAAGTTCTGGAAACGCAGGAGGTTCACTGGCAGAGAGTGCTCTCCTTTG TGTCTGCCCTGGTTGTCTGCTTTCCAGAAGCGCAGCAGCTGCTTGAAGACTGG GTGGCGCGTTTGATGGCCCAGGCATTCGAGAGCTGCCAGCTGGACAGCATGGT CACTGCGTTCCTGGTTGTGCGCCAGGCAGCACTGGAGGGCCCCTCTGCGTTCC TGTCATATGCAGACTGGTTCAAGGCCTCCTTTGGGAGCACACGAGGCTACCATG GCTGCAGCAAGAAGGCCCTGGTCTTCCTGTTTACGTTCTTGTCAGAACTCGTGC CTTTTGAGTCTCCCCGGTACCTGCAGGTGCACATTCTCCACCCACCCCTGGTTC CCAGCAAGTACCGCTCCCTCCTCACAGACTACATCTCATTGGCCAAGACACGGC TGGCCGACCTCAAGGTTTCTATAGAAAACATGGGACTCTACGAGGATTTGTCAT CAGCTGGGGACATTACTGAGCCCCACAGCCAAGCTCTTCAGGATGTTGAAAAG GCCATCATGGTGTTTGAGCATACGGGGAACATCCCAGTCACCGTCATGGAGGC CAGCATATTCAGGAGGCCTTACTACGTGTCCCACTTCCTCCCCGCCCTGCTCAC ACCTCGAGTGCTCCCCAAAGTCCCTGACTCCCGTGTGGCGTTTATAGAGTCTCT GAAGAGAGCAGATAAAATCCCCCCATCTCTGTACTCCACCTACTGCCAGGCCTG CTCTGCTGCTGAAGAGAAGCCAGAAGATGCAGCCCTGGGAGTGAGGGCAGAAC CCAACTCTGCTGAGGAGCCCCTGGGACAGCTCACAGCTGCACTGGGAGAGCTG AGAGCCTCCATGACAGACCCCAGCCAGCGTGATGTTATATCGGCACAGGTGGC AGTGATTTCTGAAAGACTGAGGGCTGTCCTGGGCCACAATGAGGATGACAGCA GCGTTGAGATATCAAAGATTCAGCTCAGCATCAACACGCCGAGACTGGAGCCAC GGGAACACATTGCTGTGGACCTCCTGCTGACGTCTTTCTGTCAGAACCTGATGG CTGCCTCCAGTGTCGCTCCCCCGGAGAGGCAGGGTCCCTGGGCTGCCCTCTTC GTGAGGACCATGTGTGGACGTGTGCTCCCTGCAGTGCTCACCCGGCTCTGCCA GCTGCTCCGTCACCAGGGCCCGAGCCTGAGTGCCCCACATGTGCTGGGGTTG GCTGCCCTGGCCGTGCACCTGGGTGAGTCCAGGTCTGCGCTCCCAGAGGTGG ATGTGGGTCCTCCTGCACCTGGTGCTGGCCTTCCTGTCCCTGCGCTCTTTGACA GCCTCCTGACCTGTAGGACGAGGGATTCCTTGTTCTTCTGCCTGAAATTTTGTA CAGCAGCAATTTCTTACTCTCTCTGCAAGTTTTCTTCCCAGTCACGAGATACTTT GTGCAGCTGCTTATCTCCAGGCCTTATTAAAAAGTTTCAGTTCCTCATGTTCAGA TTGTTCTCAGAGGCCCGACAGCCTCTTTCTGAGGAGGACGTAGCCAGCCTTTCC TGGAGACCCTTGCACCTTCCTTCTGCAGACTGGCAGAGAGCTGCCCTCTCTCTC TGGACACACAGAACCTTCCGAGAGGTGTTGAAAGAGGAAGATGTTCACTTAACT TACCAAGACTGGTTACACCTGGAGCTGGAAATTCAACCTGAAGCTGATGCTCTT TCAGATACTGAACGGCAGGACTTCCACCAGTGGGCGATCCATGAGCACTTTCTC CCTGAGTCCTCGGCTTCAGGGGGCTGTGACGGAGACCTGCAGGCTGCGTGTAC CATTCTTGTCAACGCACTGATGGATTTCCACCAAAGCTCAAGGAGTTATGACCA CTCAGAAAATTCTGATTTGGTCTTTGGTGGCCGCACAGGAAATGAGGATATTATT TCCAGATTGCAGGAGATGGTAGCTGACCTGGAGCTGCAGCAAGACCTCATAGT GCCTCTCGGCCACACCCCTTCCCAGGAGCACTTCCTCTTTGAGATTTTCCGCAG ACGGCTCCAGGCTCTGACAAGCGGGTGGAGCGTGGCTGCCAGCCTTCAGAGA CAGAGGGAGCTGCTAATGTACAAACGGATCCTCCTCCGCCTGCCTTCGTCTGTC CTCTGCGGCAGCAGCTTCCAGGCAGAACAGCCCATCACTGCCAGATGCGAGCA GTTCTTCCACTTGGTCAACTCTGAGATGAGAAACTTCTGCTCCCACGGAGGTGC CCTGACACAGGACATCACTGCCCACTTCTTCAGGGGCCTCCTGAACGCCTGTCT GCGGAGCAGAGACCCCTCCCTGATGGTCGACTTCATACTGGCCAAGTGCCAGA CGAAATGCCCCTTAATTTTGACCTCTGCTCTGGTGTGGTGGCCGAGCCTGGAGC CTGTGCTGCTCTGCCGGTGGAGGAGACACTGCCAGAGCCCGCTGCCCCGGGA ACTGCAGAAGCTACAAGAAGGCCGGCAGTTTGCCAGCGATTTCCTCTCCCCTGA GGCTGCCTCCCCAGCACCCAACCCGGACTGGCTCTCAGCTGCTGCACTGCACT TTGCGATTCAACAAGTCAGGGAAGAAAACATCAGGAAGCAGCTAAAGAAGCTGG ACTGCGAGAGAGAGGAGCTATTGGTTTTCCTTTTCTTCTTCTCCTTGATGGGCCT GCTGTCGTCACATCTGACCTCAAATAGCACCACAGACCTGCCAAAGGCTTTCCA CGTTTGTGCAGCAATCCTCGAGTGTTTAGAGAAGAGGAAGATATCCTGGCTGGC ACTCTTTCAGTTGACAGAGAGTGACCTCAGGCTGGGGCGGCTCCTCCTCCGTG TGGCCCCGGATCAGCACACCAGGCTGCTGCCTTTCGCTTTTTACAGTCTTCTCT CCTACTTCCATGAAGACGCGGCCATCAGGGAAGAGGCCTTCCTGCATGTTGCT GTGGACATGTACTTGAAGCTGGTCCAGCTCTTCGTGGCTGGGGATACAAGCAC AGTTTCACCTCCAGCTGGCAGGAGCCTGGAGCTCAAGGGTCAGGGCAACCCCG TGGAACTGATAACAAAAGCTCGTCTTTTTCTGCTGCAGTTAATACCTCGGTGCCC GAAAAAGAGCTTCTCACACGTGGCAGAGCTGCTGGCTGATCGTGGGGACTGCG

ACCCAGAGGTGAGCGCCGCCCTCCAGAGCAGACAGCAGGCTGCCCCTGACGC TGACCTGTCCCAGGAGCCTCATCTCTTCTGA(SEQ ID NO: 8); ou

ACCCAGAGGTGAGCGCCGCCCTCCAGAGCAGACAGCAGGCTGCCCCTGACGC TGACCTGTCCCAGGAGCCTCATCTCTTCTGATGA (SEQ ID NO: 36).

[0183] A presente divulgação inclui plasmídeos compreendendo um cassete de expressão ou cassete de transferência descrito neste documento. Em modalidades particulares, o plasmídeo é pCCL-PGK-FANCA-WPRE* ou pCCL-PGK- FANCAW-82-RO (SEQ ID NO: 25).

[0184] Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética é um LV autolimitado. Em uma modalidade específica de qualquer um dos cassetes de expressão e vetores de terapia genética descritos aqui, o cassete de transferência é um pCCL-SIN-cPPT/CTS-hPGK-hFANCA-WPRE da divulgação que compreende ou consiste na sequência a seguir, ou em uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 24. SEQ ID NO: 24 corresponde ao plasmídeo pCCL-PGK-FANCA-WPRE*. SEQ ID NO: 25 corresponde ao plasmídeo pCCL-PGK-FANCAW-82-RO.

[0185] Em uma modalidade, um gene FANCA é liberado por meio de um vetor lentiviral (LV). Os LVs FANCA descritos neste documento usam um vetor lentiviral (LV) autoinativador. Em uma modalidade, o LV FANCA compreende um promotor do gene da fosfoglicerato quinase humana (PGK). As propriedades de segurança desse vetor foram marcadamente melhoradas, em comparação com os vetores gama-retrovirais já usados nas clínicas, que abrigavam fortes promotores virais.

[0186] Em certas modalidades, o vetor lentiviral é PGK-FANCA.WPRE*LV, que compreende o cassete de transferência genética, compreendendo as sequências divulgadas na SEQ ID NO: 24. A porção do cassete de expressão genética PGK-FANCA-WPRE*LV compreende o promotor da PGK humana, a sequência de codificação para cDNA FANCA e o WPRE*; e corresponde aos nucleotídeos 3541 a 9178 da SEQ ID NO: 24. A porção do cassete de transferência PGK-FANCA-WPRE*LV compreende a partir de cerca da LTR 5' (U5) até cerca a LTR 3' (U5) da sequência. Com relação à SEQ ID NO: 24, os nucleotídeos 1586- 1789 da SEQ ID NO: 24 compreendem o promotor precoce imediato do CMV humano. Os nucleotídeos 2031-2156 da SEQ ID NO: 24 compreendem o sinal de empacotamento psi do HIV1. Os nucleotídeos 2649-2882 da SEQ ID NO: 24 compreendem o elemento RRE do HIV1. Os nucleotídeos 3378-3495 da SEQ ID NO: 24 compreendem o elemento cPPT/CTS do HIV. Os nucleotídeos 3541-4051 da SEQ ID NO: 24 compreendem o promotor de hPGK. Os nucleotídeos 4078-8445 da SEQ ID NO: 24 compreendem o cDNA FANCA-A humano. Nucleotídeos 8502-9178 da SEQ ID NO: 24 compreendem o elemento WPRE mutado. Nucleotídeos 9262- 9495 da SEQ ID NO: 24 compreendem a LTR 3' U delta do HIV.

[0187] Em certas modalidades, o vetor lentiviral é pCCL-PGK-FANCAW-82- RO, que compreende o cassete de transferência genética, compreendendo as sequências divulgadas na SEQ ID NO: 25. A porção do cassete de expressão genética pCCL-PGK-FANCAW-82-RO compreende o promotor da PGK humana, a sequência de codificação do cDNA FANCA e o WPRE*; e corresponde aos nucleotídeos 2335 a 7888 da SEQ ID NO: 25. A porção do cassete de transferência pCCL-PGK-FANCAW-82-RO compreende de cerca da LTR 5' (U5) até cerca a LTR 3' (U5) da sequência. Com relação à SEQ ID NO: 25, nucleotídeos 1-577 da SEQ ID NO: 25 compreendem o promotor precoce imediato do CMV humano. Nucleotídeos 889-933 da SEQ ID NO: 25 compreendem o sinal de empacotamento psi do HIV1. Nucleotídeos 1296-253 da SEQ ID NO: 25 compreendem o elemento RRE do HIV1. Nucleotídeos 2176-2191 da SEQ ID NO: 25 compreendem o elemento cPPT/CTS do HIV. Nucleotídeos 2335-2845 da SEQ ID NO: 25 compreendem o promotor da hPGK. Nucleotídeos 2872-7242 da SEQ ID NO: 25 compreendem o cDNA FANCA-A humano. Nucleotídeos 7293-7888 da SEQ ID NO: 25 compreendem elemento WPRE mutado. Nucleotídeos 8056-8289 da SEQ ID NO: 25 compreendem a LTR 3' U delta do HIV.

[0188] Em ainda outra modalidade, o vetor lentiviral contém os seguintes elementos: (i) a espinha dorsal do vetor lentiviral derivada do pCCLsin-cppt-hPGK- eGFP-WPRE inicial (Dull et al., 1998; J.Virol 72 (11), 9873-9880). A espinha dorsal de pCCL usa uma LTR 5' heteróloga do CMV-HIV para obter altos níveis de transcrição de RNA viral nas células produtoras. Tal LTR heteróloga torna a construção independente da necessidade de usar a proteína Tat do HIV para a produção das partículas de rHIV e, portanto, é um recurso de segurança. A região U3 da LTR 3' contém uma supressão de 400 pb, como descrito em (Zufferey et al., J Virol, 1998), que confere propriedades de autoinativação ao vetor; (ii) o cDNA do gene FANCA humano otimizado por códon (número de acesso ao GenBank de 4368 pb: X_99226 ou conforme divulgado neste documento) que codifica a proteína FANCA (1455 AA) sob controle do promotor da PGK humana. O promotor já foi distinguido por sua atividade estável in vivo e por melhores propriedades de segurança, em comparação com outros promotores já usados na terapia genética; e (iii) uma versão mutada do elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite da marmota (WPRE) que é suprimida na região 3' de uma sequência que codifica a proteína X e qualquer ORF residual da descrita por Schambach et al., (Gene therapy, 2006; 13, 641-645) ou WPRE*.

[0189] Em certas modalidades, os LVs FANCA descritos no presente documento usam um vetor lentiviral (LV) autoinativador. Em uma modalidade, o LV FANCA compreende um promotor do gene da fosfoglicerato quinase humana (PGK). As propriedades de segurança desse vetor foram marcadamente melhoradas, em comparação com os vetores gama-retrovirais já usados nas clínicas, que abrigavam fortes promotores virais. Em uma modalidade, um gene FANCA é liberado através de um vetor lentiviral. Em certas modalidades, o vetor lentiviral é PGK- FANCA.WPRE*LV.

[0190] Os vetores de terapia genética que encapsulam as cassetes de polinucleotídeo da presente divulgação podem ser produzidos usando metodologia padrão. Por exemplo, no caso de vírions LV, um vetor de expressão de LV de acordo com a invenção pode ser introduzido em uma célula produtora, seguido pela introdução de uma construção auxiliar de LV, em que a construção auxiliar inclui regiões codificadoras de LV capazes de serem expressas na célula produtora e que complementam as funções auxiliares de LV ausentes no vetor LV. Isto é seguido pela introdução de vírus auxiliar e/ou vetores adicionais na célula produtora, em que o vírus auxiliar e/ou vetores adicionais fornecem funções acessórias capazes de suportar a produção eficiente do vírus LV. As células produtoras são então cultivadas para produzir LV. Essas etapas são realizadas usando metodologia padrão. Em modalidades particulares, os plasmídeos representados nas Figuras 38 a 41 são usados para produzir os vetores de terapia genética.

[0191] Qualquer método adequado para a produção de partículas de vetores virais para liberação das cassetes de polinucleotídeos em questão pode ser usado, incluindo, mas não se limitando, aos descritos nos exemplos a seguir. Qualquer concentração de partículas de vetores virais infecciosos adequadas para efetivamente transduzir células de mamíferos pode ser preparada para colocar células de mamíferos em contato in vitro ou in vivo. Por exemplo, as partículas virais pode ser formulado a uma concentração de 108 unidades infecciosas por ml ou mais, por exemplo, 5x108 unidades infecciosas por ml; 109 unidades infecciosas por mL; 5x109 unidades infecciosas por mL, 1010 unidades infecciosas por mL, 5x1010 unidades infecciosas por mL; 1011 unidades infecciosas por mL; 5x1011 unidades infecciosas por mL; 1012 unidades infecciosas por mL; 5x1012 unidades infecciosas por mL; 1013 unidades infecciosas por mL; 1,5x1013 unidades infecciosas por mL;

3x1013 unidades infecciosas por mL; 5x1013 unidades infecciosas por mL; 7,5 x1013 unidades infecciosas por mL; 9x1013 unidades infecciosas por mL; 1x1014 unidades infecciosas por mL, 5x1014 unidades infecciosas por mL ou mais, mas normalmente não mais do que 1x1015 unidades infecciosas por mL.

[0192] Na preparação dos vetores de terapia genética LV em questão, quaisquer células hospedeiras para a produção de vírions LV podem ser empregues, incluindo, por exemplo, células de mamífero (por exemplo, 293 células), células de inseto (por exemplo, células SF9), micro-organismos e leveduras. As células hospedeiras também podem ser células de empacotamento nas quais os genes rep e cap LV são mantidos de maneira estável na célula hospedeira ou células produtoras nas quais o genoma do vetor LV é mantido e empacotado de forma estável. As células de empacotamento e produtoras exemplares são derivadas de células SF-9, 293, A549 ou HeLa. Os vetores LV são purificados e formulados usando técnicas padrão conhecidas na técnica.

[0193] Em certas modalidades, a presente invenção inclui uma célula compreendendo um cassete de expressão genética, cassete de transferência genética ou vetor de terapia genética divulgado neste documento. Em modalidades relacionadas, a célula é transduzida com um vetor de terapia genética compreendendo um cassete de expressão divulgado aqui ou tem um cassete de expressão divulgado no presente documento integrado ao genoma da célula. Em certas modalidades, a célula é uma célula usada para produzir um vetor de terapia genética viral, por exemplo, uma célula de empacotamento.

[0194] Em outras modalidades, a célula é uma célula a ser liberada a um paciente, a fim de fornecer ao paciente o produto genético codificado pelo cassete de expressão. Assim, em certas modalidades, a célula é autóloga ao paciente a ser tratado ou foi obtida a partir do paciente a ser tratado. Em outras modalidades, a célula é alogenética ao paciente a ser tratado ou foi obtida de um doador diferente do paciente a ser tratado. Em modalidades particulares, a célula é uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula humana. Em certas modalidades, a célula é uma célula sanguínea, um eritrócito, uma célula progenitora hematopoiética, uma célula da medula óssea, por exemplo, uma célula da medula óssea depletada por linhagem, uma célula-tronco hematopoiética (por exemplo, CD34+) ou uma célula progenitora eritróide hematopoiética comprometida. Em modalidades particulares, a célula é uma célula CD34+ obtida de um paciente a ser tratado com a célula após ser transduzida por um vetor de terapia genética divulgado aqui. Em uma modalidade particular, a célula é uma célula CD34+ FA obtida de um paciente diagnosticado com FA.

[0195] Em algumas modalidades, os métodos divulgados aqui resultam em um benefício terapêutico, por exemplo, impedindo o desenvolvimento de um distúrbio, interrompendo a progressão de um distúrbio, revertendo a progressão de um distúrbio, etc. Por exemplo, em uma modalidade, o distúrbio é FMO. Em uma modalidade, o distúrbio é trombocitopenia. Em outra modalidade, o distúrbio é leucopenia. Em uma modalidade, o distúrbio é pancitopenia. Em uma modalidade, o distúrbio é neutropenia. Em outra modalidade, o distúrbio é anemia. Em algumas modalidades, o método em questão compreende a etapa de detectar que um benefício terapêutico foi alcançado. O técnico no assunto apreciará que tais medidas de eficácia terapêutica serão aplicáveis à doença específica sendo modificada e reconhecerá os métodos de detecção apropriados a serem usados para medir a eficácia terapêutica.

[0196] Em outra modalidade, a presente invenção inclui um método para tratar uma doença em um paciente em necessidade do mesmo, compreendendo fornecer ao paciente uma quantidade eficaz de uma ou ambas a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência e a população enriquecida para CD34 de baixa estringência, uma ou ambas as quais foram colocada em contato com um vetor de terapia genética, por exemplo, um vetor viral, que expressa um produto genético terapêutico nas células. Em modalidades particulares, uma ou ambas a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência ou a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência são autólogas ao paciente. Em certas modalidades, as células são células eritróides, por exemplo, células-tronco hematopoiéticas ou células progenitoras eritróides hematopoiéticas comprometidas. Em algumas modalidades, a célula é uma célula da medula óssea, por exemplo, uma célula da medula óssea depletada. Em modalidades particulares, o método é usado para tratar a FA, e o vetor viral é um LV compreendendo uma construção de expressão divulgada aqui que compreende um promotor da PGK humana operacionalmente ligado a um cDNA ou sequência de codificação do gene FANCA e um wPRE mutado divulgado neste documento. Em modalidades particulares, as células são fornecidas ao paciente de forma parenteral, por exemplo, por injeção intravenosa.

[0197] Em outra modalidade, a presente invenção inclui um método para tratar a FA em um paciente em necessidade do mesmo, compreendendo fornecer ao paciente uma quantidade eficaz da população de células enriquecida para CD34 de alta estringência autóloga e/ou da população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência de células-tronco transduzidas com um vetor LV que expressa um cDNA FANCA nas células, em que o vetor LV compreende um promotor da PGK humana, operacionalmente ligado ao cDNA FANCA ou sequência de codificação, e uma sequência wPRE mutada divulgada neste documento. Em modalidades particulares, as células são células-tronco hematopoiéticas ou células progenitoras eritróides hematopoiéticas comprometidas, por exemplo, células da medula óssea. Em modalidades particulares, as células são fornecidas ao paciente de forma parenteral, por exemplo, por injeção intravenosa.

[0198] Espera-se que a expressão do transgene usando transgene em questão seja robusta. Por conseguinte, em alguns casos, a expressão do transgene, por exemplo, como detectada pela medição dos níveis do produto genético, pela eficácia terapêutica etc., pode ser observada dois meses ou menos após a administração, por exemplo, 4, 3 ou 2 semanas ou menos após a administração, por exemplo, 1 semana após a administração da composição em questão. Também é esperado que a expressão do transgene persista ao longo do tempo. Por conseguinte, em alguns casos, a expressão do transgene, por exemplo, como detectada pela medição dos níveis do produto genético, pela eficácia terapêutica etc., pode ser observada 2 meses ou mais após a administração da composição em questão, por exemplo, 4, 6, 8 ou 10 meses ou mais, em alguns casos 1 ano ou mais, por exemplo, 2, 3, 4 ou 5 anos, em certos casos, mais de 5 anos.

[0199] Em certas modalidades, o método compreende a etapa de detectar a expressão do transgene nas células ou no paciente, em que a expressão é acentuada em relação à expressão de um cassete de polinucleotídeo que não compreende os um ou mais elementos aprimorados da presente divulgação. Normalmente, a expressão será acentuada 2 vezes ou mais em relação à expressão de uma referência, ou seja, um cassete de polinucleotídeo de controle, por exemplo, como conhecido na técnica, por exemplo, 3 vezes, 4 vezes ou 5 vezes ou mais, em alguns casos 10 vezes, 20 vezes ou 50 vezes ou mais, por exemplo, 100 vezes, como evidenciado, por exemplo, pela detecção precoce, níveis mais altos de produto genético, um forte impacto funcional nas células, etc.

[0200] Em algumas modalidades, a dose de células que os pacientes recebem por infusão será aquela que é obtida a partir do processo de transdução. Em várias modalidades preferidas, pelo menos cerca de 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108 ou mais células enriquecidas para CD34 de alta estringência/KG do peso do paciente são infundidas no paciente. Em várias modalidades preferidas, são infundidas pelo menos cerca de 1x101, 1x102, 1x103,

1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108 mais células enriquecidas para CD34 de baixa estringência/KG do peso do paciente são infundidas no paciente. Em algumas modalidades, entre 1x106 e 4x106 células enriquecidas para CD34 de alta estringência/KG do peso do paciente são infundidas no paciente. Em outras modalidades, 3x105 e 4x106 células enriquecidas para CD34 de alta estringência/KG do peso do paciente são infundidas no paciente. Em algumas modalidades, entre 1x106 e 4x106 células enriquecidas para CD34 de alta estringência/KG do peso do paciente são infundidas no paciente. Em outras modalidades, 3x105 e 4x106 células enriquecidas para CD34 de alta estringência/KG do peso do paciente são infundidas no paciente. Em algumas modalidades, as células serão infundidas no paciente em uma dose única. Em outras modalidades, as células serão infundidas no paciente em várias doses (por exemplo, as populações de células enriquecidas para CD34 de alta estringência e baixa estringência são administradas sequencialmente uma vez ou várias vezes). As células transduzidas podem ser infundidas imediatamente após a conclusão do processo de transdução. Em modalidades particulares, as células transduzidas são armazenadas ou congeladas antes do uso, enquanto que em certas modalidades, elas são fornecidas ao paciente imediatamente ou logo após serem transduzidas, por exemplo, dentro de uma hora, duas horas, quatro horas ou oito horas.

[0201] Uma vez integrada, a proteína terapêutica (por exemplo, proteína FANCA humana) é expressa pelas células. As células de FA transduzidas são geneticamente corrigidas e, portanto, capazes de ativar a via da FA pela monoubiquitinação de FANCD2 e FANCI. Essas proteínas migram para áreas de dano ao DNA e, em cooperação com outras proteínas de reparo do DNA, promovem o reparo do DNA nessas células, como ocorre em células saudáveis

[0202] Como descrito em mais detalhes nos Exemplos, os dados pré-clínicos in vitro com amostras de MO de pacientes com FA humanos já demonstraram a eficácia de um LV FANCA para corrigir o fenótipo dessas células.

[0203] Em uma modalidade, pelo menos 1 a 4 x 106 células CD34+ corrigidas são administradas (por exemplo, CTHs transduzidas por FANCA) por quilograma do peso do paciente, por exemplo, para restaurar a hematopoiese em um paciente com FA não condicionado. Em algumas modalidades, as células transduzidas são infundidas ou administradas no paciente imediatamente após a transdução. Em outras modalidades, as células transduzidas são congeladas antes da infusão ou administração no paciente.

[0204] A correção genética de CTHs de pacientes com FA, seguida pelo transplante autólogo dessas células (terapia genética hematopoiética), é uma boa alternativa para pacientes com FA, particularmente aqueles sem um irmão HLA- idêntico. Em uma modalidade, a terapia genética hematopoiética é o regime de tratamento preferido para um paciente sem um irmão HLA-idêntico. Em outra modalidade, a terapia genética hematopoiética é o regime de tratamento preferido para um paciente que tem um irmão HLA-idêntico.

COMPOSIÇÕES E FORMULAÇÕES

[0205] Certos aspectos da divulgação referem-se a um sistema ou combinação de uma população de células enriquecida para CD34 de alta estringência e uma população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência, uma ou ambas as quais foram transduzidas com um vetor de terapia genética. Algumas modalidades compreendem uma combinação de populações de células enriquecidas para CD34 de alta estringência e de baixa estringência, uma ou ambas as quais foram transduzidas com um vetor lentiviral contendo um gene FANC humano, por exemplo, FANCA, FANCC ou FANCG, ou uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína FANC, incluindo variantes e fragmentos funcionais destes. Algumas modalidades compreendem uma combinação de populações de células enriquecidas para CD34 de alta estringência e de baixa estringência, uma ou ambas as quais foram sujeitas a edição ou reparo de genes, tal como com um sistema de edição de genes CRISPR, TALEN, dedo de zinco ou meganuclease. Algumas modalidades compreendem uma combinação de populações de células enriquecidas para CD34 de alta estringência e de baixa estringência que foram transduzidas com um vetor lentiviral (ou outro viral) contendo um transgene associado a uma doença ou condição, tal como um distúrbio de imunodeficiência.

[0206] Em alguns aspectos da divulgação, são fornecidas formulações para o tratamento de uma doença ou condição. As formulações podem compreender populações de células enriquecidas para CD34 de alta estringência ou populações de células enriquecidas para CD34 de baixa estringência ou ambas, juntamente com um transportador fisiologicamente aceitável ou transportador farmaceuticamente aceitável, conforme descrito aqui. As formulações podem compreender populações de células enriquecidas para CD34 de alta estringência ou populações de células enriquecidas para CD34 de baixa estringência ou ambas, em que uma ou ambas as populações de células foram transduzidas com um vetor de terapia genética e expressam ou são capazes de expressar um agente terapêutico, juntamente com um transportador fisiologicamente aceitável ou transportador farmaceuticamente aceitável, conforme descrito aqui.

[0207] A presente invenção inclui composições e formulações farmacêuticas compreendendo uma ou ambas a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência e a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência, um vetor de terapia genética, conforme descrito aqui, e um transportador farmaceuticamente aceitável, diluente ou excipiente. A população de células enriquecida para CD34 de alta estringência e/ou a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência podem ser combinadas com transportadores farmaceuticamente aceitáveis, diluentes e reagentes úteis na preparação de uma formulação geralmente segura, não tóxica e desejável, e incluem excipientes aceitáveis para uso em primatas. Exemplos de tais excipientes, transportadores ou diluentes incluem, mas não estão limitados a, água, solução salina, soluções de Ringer, solução de dextrose e albumina sérica humana a 5%. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas formulações. As soluções ou suspensões usadas para as formulações podem incluir um diluente estéril, tal como água para injeção, solução salina, dimetilsulfóxido (DMSO), óleos fixos, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; compostos antibacterianos, tais como álcool benzílico ou metilparabenos; antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; compostos quelantes, tais como ácido etilenodiaminotetracético (EDTA); tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos; detergentes, tais como o Tween 20 para impedir agregação; e compostos para o ajuste de tonicidade, tais como cloreto de sódio ou dextrose. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. Em modalidades particulares, as formulações são estéreis.

[0208] Em algumas modalidades, as populações de células enriquecidas para CD34 são fabricadas de acordo com as Boas Práticas de Fabricação Atuais. Fabricado de acordo com as Boas Práticas de Fabricação Atuais, significa que a formulação preparada para administração é suficientemente segura para permitir a administração a pacientes humanos sob regulamentos de controle e autorizações governamentais. Geralmente, os regulamentos e autorizações de controle determinam que a formulação atenda aos critérios de aceitação pré-aprovados em relação à identidade, força, qualidade e pureza. Os critérios de aceitação incluem limites numéricos, faixas ou outras medidas adequadas dos resultados dos testes usados para determinar se uma formulação atende às Boas Práticas de Fabricação Atuais. Uma especificação estabelece os procedimentos analíticos usados para testar a conformidade com os critérios de aceitação. As formulações podem ser avaliadas em lotes. Um lote é uma quantidade específica de uma formulação testada para garantir a conformidade com os critérios de aceitação.

[0209] As formulações podem ser incluídas em um recipiente, embalagem ou dispensador, por exemplo, seringa, por exemplo, uma seringa pré-cheia, juntamente com instruções para administração.

[0210] Onde necessário ou benéfico, as formulações podem incluir um anestésico local, tal como lidocaína, para aliviar a dor no local da injeção.

[0211] Quantidades terapeuticamente eficazes de células dentro de formulações podem ser maiores que 102 células, maiores que 103 células, maiores que 104 células, maiores que 105 células, maiores que 106 células, maiores que 107 células e maiores que 108 células, maiores que 109 células, maiores que 1010 células ou maiores que 1011 células.

[0212] Nas formulações aqui divulgadas, as células estão geralmente em um volume de um litro ou menos, 500 ml ou menos, 250 ml ou menos ou 100 ml ou menos. Portanto, a densidade das células administradas é normalmente maior que 104 células/ml, 107 células/ml ou 108 células/ml.

[0213] As formulações divulgadas neste documento podem ser preparadas para administração, por exemplo, por injeção, infusão, perfusão ou lavagem. Quantidades terapeuticamente eficazes para administração podem incluir mais que 102 células, mais que 103 células, mais que 104 células, mais que 105 células, mais que 106 células, mais que 107 células, mais que 108 células, mais que 109 células, mais que 1010 células ou mais que 1011. Em modalidades particulares, uma dose mínima é de 2 x 106 células/kg do peso corporal do paciente.

[0214] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica fornecida neste documento compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou ambas a população de células enriquecidas para CD34 de alta estringência e a população de células enriquecidas para CD34 de baixa estringência, como aqui divulgado, em mistura com um transportador farmaceuticamente aceitável e/ou excipiente, por exemplo solução salina, solução salina tamponada com fosfato, fosfato e aminoácidos, polímeros, polióis, açúcar, tampões, conservantes e outras proteínas. Exemplos de aminoácidos, polímeros e açúcares e similares são compostos de octilfenoxi-polietoxi-etanol, compostos de monoestearato de polietilenoglicol, ésteres de ácidos graxos de polioxietileno-sorbitano, sacarose, frutose, dextrose, maltose, glicose, manitol, dextrano, sorbitol, inositol, galactitol, lactose, trealose, albumina sérica bovina ou humana, citrato, acetato, soluções de Ringer e Hank, cisteína, arginina, carnitina, alanina, glicina, lisina, valina, leucina, polivinilpirrolidona, polietileno e glicol. De preferência, esta formulação é estável por pelo menos seis meses a 4º C.

[0215] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica fornecida aqui compreende um tampão, tal como solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou fosfato de sódio/sulfato de sódio, tampão tris, tampão de glicina, água estéril e outros tampões conhecidos pelo técnico no assunto, tais como os descritos por Good et al., (1966) Biochemistry 5:467. O pH do tampão no qual a composição farmacêutica compreendendo o gene supressor de tumor contido no sistema de liberação de vetores adenovirais pode estar na faixa de 6,5 a 7,75, preferencialmente, 7 a 7,5 e, mais preferencialmente, 7,2 a 7,4.

[0216] Todas as publicações mencionadas neste documento são incorporadas aqui por referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais relacionados aos quais as publicações são citadas. Entende-se que a presente divulgação substitui qualquer divulgação de uma publicação incorporada na medida em que haja uma contradição.

[0217] Nota-se ainda que as reivindicações podem ser elaboradas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta declaração pretende servir como base antecedente para o uso de tal terminologia exclusiva como “exclusivamente”,

“somente” e similares em conexão com a recitação de elementos da reivindicação, ou o uso de uma limitação “negativa”.

[0218] As publicações discutidas neste documento são fornecidas somente para sua divulgação antes da data de apresentação do presente pedido. Além disso, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas de publicação reais, que talvez precisem ser confirmadas independentemente.

[0219] Como FA-A é o grupo de complementação mais frequente em pacientes com FA (Casado et al., 2007, Taniguchi et al., 2006), os vetores que expressam o gene FANCA e/ou o gene marcador EGFP são o foco dos Exemplos; no entanto, outros genes FANCA podem ser usados para tratar similarmente outros grupos de complementação.

[0220] A divulgação é descrita adicionalmente nos Exemplos a seguir, que não limitam o escopo da divulgação descrita nas reivindicações.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

TRATAMENTO DE PACIENTES COM POPULAÇÕES DE CÉLULAS ENRIQUECIDAS PARA CD34 DE ALTA E BAIXA ESTRINGÊNCIA

[0221] O paciente 1 apresentou anemia de Fanconi. Em seguida, o paciente 1 foi mobilizado com G-CSF e plerixafor, seguido de duas coletas de aférese em dias sucessivos. Em relação a outros pacientes com FA no mesmo ensaio clínico, o paciente 1 teve mobilização moderada de células CD34, indicada pela análise do sangue periférico das células CD34 circulantes, com cinética de mobilização semelhante a outros pacientes. Após duas coletas de aférese, as CTPHs coletados foram divididas em duas amostras biológicas de sangue periférico.

[0222] Seleção para CD34 de alta estringência: A primeira amostra biológica foi enriquecida pela seleção para células CD34+ sob condições de alta estringência usando o sistema CliniMACS® da Miltenyi Biotec no modo de enriquecimento com o reagente de CD34 da Miltenyi Biotec para enriquecimento, conforme descrito na Patente dos EUA de nº 8.727.132. A seleção para CD34 de alta estringência resultou em 29,0% de rendimento de células CD34+ e 36% de pureza relativa.

[0223] Seleção para CD34 de baixa estringência: A segunda amostra biológica foi enriquecida pela seleção para células CD34+ sob condições de baixa estringência usando uma modificação no modo de depleção, usando o sistema CliniMACS® da Miltenyi Biotec. Em suma, a segunda amostra biológica foi marcada usando o reagente de CD34 da Miltenyi Biotec. A amostra foi carregada na coluna usando o programa no modo de depleção para o instrumento. Após o carregamento em massa da amostra com o ímã “LIGADO”, a bolsa de Coleta de Células (usada na operação normal do instrumento para coletar células-alvo) foi removida e não usada para transplante de células-tronco. A “bolsa de Células Não Alvo” foi anexada, o ímã foi "DESLIGADO" e o tampão de eluição foi aplicado ao instrumento, resultando na eluição de células CD34+ na bolsa de células não alvo. A população de células coletadas na bolsa de Células Não Alvo foi mantida e designada como a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência. A seleção par CD34 de baixa estringência resultou em 54,5% de rendimento de células CD34+ a 5,8% de pureza relativa. A baixa pureza é devida a outros tipos de células hematopoiéticas que não foram purificadas longe das células CD34+ durante o processo de seleção. Os resultados estão sumarizados nas Tabelas 1A e 1B. TABELA 1A: ANTES DO ENRIQUECIMENTO PARA CD34 Total de FA Afé CTC % de CD34 CD34/kg CD34 1 1.36E+10 0,15 2.04E+07 1.46E+06 Pt #1 2 2.30E+10 0,1 2.30E+07 1.64E+06 TABELA 1B:

APÓS O ENRIQUECIMENTO PARA CD34 Após o Enriquecimento para CD34 Enriquec. % de Total de Rendimento FA Afé CTC CD34/kg CD34 CD34 CD34 de CD34 Pt 1 Baixo 1.92E+08 5,8 1.11E+07 7.95E+05 54,5 #1 2 Alto 1.85E+07 36 6.66E+06 4.76E+05 29,0 Números de células iniciais e pureza das células CD34+ e populações de células resultantes de um paciente com Anemia-A de Fanconi Afé: Aférese CTC: Contagem Total de Células Nucleadas Baixo: Programa de depleção CliniMACS modificado Alto: Programa padrão de enriquecimento para CD34 CliniMACS

[0224] Posteriormente, tanto a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência quanto a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência foram transduzidas individualmente com um vetor de terapia genética recombinante (PGK-FANCA-WPRE*) (SEQ ID NO: 25) que codifica o produto do gene FANCA, e as células geneticamente modificadas resultantes foram designadas como Produto 1.1 e Produto 1.2, respectivamente.

[0225] O Produto 1.1 e o Produto 1.2 foram misturados e posteriormente administrados ao Paciente 1 por infusão intravenosa contínua por 10 a 30 minutos enquanto se monitorava os indicadores clínicos.

[0226] O Paciente 1 mostrou a cinética de enxerto de seleção in vivo mais rápida, ou quase mais rápida, de todos os pacientes com FA transplantados nas instituições participantes. As tendências iniciais de estabilização das linhagens hematopoiéticas que haviam declinado neste paciente com FA antes do transplante são um desfecho convincente para o sucesso clínico, que foi inesperadamente alcançado por esse método de tratamento. Cinco outros pacientes com FA foram transplantados com abordagens padrão de seleção para CD34 e nenhum mostrou cinética de enxerto comparável à do Paciente 1.

[0227] Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que a mistura de populações de células enriquecidas para CD34 de alta estringência (Produto 1.1) e baixa estringência (Produto 1.2) confere uma vantagem seletiva in vivo às células de FA hematopoiéticas modificadas por genes e resulta em uma aumento progressivo das células modificadas por genes ao longo do tempo. Acredita-se que o Produto 1.1 (população de células enriquecida para CD34 de alta estringência) esteja fornecendo a maioria das células modificadas por genes que contribuem para a hematopoiese e acredita-se que o Produto 1.2 (população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência) tenha facilitado o enxerto robusto e o repovoamento hematopoiético pelo Produto 1.1. EXEMPLO 2

EFICÁCIA COMPARATIVA DO TRATAMENTO COM A POPULAÇÃO DE CÉLULAS COM DEPLEÇÃO DE LINHAGEM

[0228] O Paciente 2 apresentou anemia de Fanconi. Uma amostra biológica de sangue periférico foi obtida a partir do Paciente 2 por aférese mobilizada usando procedimentos equivalentes aos do Exemplo 1. Uma população de células com depleção de linhagem foi preparada marcando a amostra biológica com reagente CD3/CD14/CD16/CD19 e depletando a amostra de células marcadas usando o sistema CliniMACS® da Miltenyi Biotec no modo de depleção. A seleção para CD34 com depleção de linhagem resulta em 56% de rendimento de células CD34+ a 1,6% de pureza relativa. A baixa pureza é devida a outros tipos de células hematopoiéticas que não foram purificadas longe das células CD34+ durante o processo de seleção. O rendimento e a pureza das células CD34 foram comparáveis aos alcançados com o Paciente 1 na população de células enriquecidas para CD34 de baixa estringência. Nenhuma população de células enriquecida para CD34 de alta estringência foi preparada. A população de células com depleção de linhagem foi transduzida com um vetor de terapia genética recombinante que codifica o produto do gene FANCA e foi designada como Produto 2.1.

[0229] O Produto 2.1 foi administrado ao Paciente 2 por infusão intravenosa contínua por 10 a 30 minutos enquanto se monitorava indicadores clínicos em números de células comparáveis aos usados no Paciente 1. Ao contrário do Paciente 1, nenhuma célula modificada por genes pôde ser detectada no sangue do Paciente 2 seis meses após o transplante. Assim, o Produto 2.1, que se acredita ser semelhante somente ao Produto 1.2, não resulta em recuperação hematopoiética detectável. EXEMPLO 3

MODIFICAÇÃO DE CONDIÇÕES DE BAIXA ESTRINGÊNCIA PARA MAIOR RENDIMENTO E TRATAMENTO COM POPULAÇÕES DE CÉLULAS RESULTANTES

[0230] O Paciente 3 apresentou anemia de Fanconi. Uma amostra biológica do sangue periférico foi obtida a partir do Paciente 3 por aférese mobilizada usando procedimentos equivalentes aos do Exemplo 1. Após a coleta de aférese, as CTPHs coletadas forma divididas em duas amostras biológicas de sangue periférico.

[0231] Seleção para CD34 de alta estringência: Uma primeira amostra biológica é enriquecida pela seleção para células CD34+ sob condições de alta estringência, usando o sistema CliniMACS® da Miltenyi Biotec no modo de enriquecimento com o Reagente de CD34 da Miltenyi Biotec para enriquecimento, conforme descrito no Exemplo 1. A seleção CD34 de alta estringência resultou em um rendimento maior que 20% de células CD34+ e maior que 20% de pureza relativa. O Programa de Seleção para CD34 em um sistema CliniMACS® foi executado usando a amostra conforme descrita acima com os parâmetros indicados na Tabela 2. O processo durou aproximadamente 20 a 30 minutos. A “bolsa de células alvo” do sistema CliniMACS® continha a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência. TABELA 2 Programa de entrada e parâmetros de amostra Programa de Separação ENRIQUECIMENTO 1.1 Conjunto de tubos CliniMACS LS REF Conjunto de tubos (selecionados da lista) 162-01 Concentração Celular [*10º/mL] 180 | Mín: 20, Máx: 400 Frequência de células marcadas [%] 1 | Mín: 1, Máx: 80 Volume de carregamento da amostra 150 | Mín: 60, Máx: 400 [mL] Parâmetros de processo calculados Tempo de Processamento Máx. [min] 29 Células marcadas a serem processadas

2.7E+08 [-] Número de estágios [-] 1 Especificações do processo Especificações internas Parâmetros do processo calculados - Saída de tela Tampão necessário para o processo 1000 [mL] Tamanho da Bolsa; Bolsa de Coleta de 150 Células [mL]

Tamanho da bolsa: Bolsa de Frações Negativas [mL] ou Bolsa de Células Não 500 Alvo [mL] Tamanho da bolsa: Bolsa de Resíduos 500 de Tampões [mL] Tamanho da bolsa: Bolsa de resíduos de preparação (priming) [mL] ou Bolsa de inalterado Reaplicação [mL] Parâmetros adicionais do processo Duração do estágio em segundos 511 Comprimento do estágio em mL 85

[0232] Seleção para CD34 de baixa estringência: Uma segunda amostra biológica foi enriquecida pela seleção para células CD34+ sob condições de baixa estringência, usando uma modificação no modo de depleção, usando o sistema CliniMACS® da Miltenyi Biotec, conforme descrito no Exemplo 1, com modificação para proporcionar maior rendimento de células CD34+ relativas ao enriquecimento de baixa estringência aplicado ao Paciente 1.

[0233] O produto de aférese do sangue periférico, anticoagulado com Solução Anticoagulante de Citrato Dextrose (ACD-A), foi fornecido em 60x109 para 6x108 células totais (ao usar um frasco de reagente de marcação de CD34) ou 120x109 para 12x108 células totais (ao usar dois frascos de reagente de marcação de CD34). Em uma cobertura de fluxo laminar sob condições estéreis, a contagem de células, a viabilidade celular e a contagem de subpopulações de células CD3+, CD19+ ou CD34+ foram medidas. O produto de aférese foi transferido para uma bolsa de transferência que estava cheia até 600 ml do volume total com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Os conteúdos foram centrifugado a 230 G durante 15 minutos e o sobrenadante foi removido, deixando 90 ml aos quais foram adicionados 5 ml de imunoglobulina, seguido de mistura à temperatura ambiente por 10 minutos. Um ou dois frascos de 7,5 ml do reagente CliniMACS® de CD34 foram injetados na bolsa, a qual foi misturada e incubada sob agitação por 30 minutos à temperatura ambiente. As células foram centrifugadas a 230 G por 15 minutos e ressuspensas em 150 ml de PBS.

[0234] O Programa de Seleção para CD34 em um sistema CliniMACS® foi executado usando a amostra conforme descrita acima com os parâmetros indicados na Tabela 2. O processo durou aproximadamente 20 a 30 minutos. O programa foi interrompido antes que qualquer uma das etapas de lavagem ocorressem e as células enriquecidas para CD34 e outras células não específicas foram descarregadas na "bolsa de células alvo". A "bolsa de células alvo" do sistema CliniMACS® continha a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência. A "bolsa de células não alvo" do sistema CliniMACS® continha células não alvo.

[0235] A seleção para CD34 de baixa estringência resultou em cerca de 35% a 60% de rendimento de células CD34+ e cerca de 10% a 30% de pureza relativa.

[0236] Posteriormente, tanto a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência quanto a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência foram transduzidas ou combinadas individualmente e transduzidas com um vetor de terapia genética recombinante que codifica o produto do gene FANCA, como descrito no Exemplo 1, e as células geneticamente modificadas resultantes foram designadas como Produto 3.1 e Produto 3.2, respectivamente.

[0237] O Produto 3.1 e Produto 3.2 transduzidos individualmente foram misturados e posteriormente administrados ao Paciente 3 por bolus intravenoso.

[0238] O Paciente 3 mostrou uma cinética de enxerto de seleção in vivo rápida. Este protocolo de tratamento resultou na estabilização de várias linhagens em hematopoiese, neutrófilos, glóbulos vermelhos e plaquetas. A estabilização de linhagens hematopoiéticas que haviam declinado no Paciente 3 antes do transplante foi um desfecho convincente para o sucesso clínico. EXEMPLO 4 TERAPIA GENÉTICA USANDO CRISPR-CAS COM POPULAÇÕES DE CÉLULAS ENRIQUECIDAS PARA CD34 DE ALTA E BAIXA ESTRINGÊNCIA

[0239] As amostras biológicas foram coletadas de pacientes adicionais e as populações de células enriquecidas para CD34 de alta e baixa estringência foram preparadas como descrito no Exemplo 3. Foi criada uma terapia genética recombinante, projetada para fornecer um sistema de edição de genes capaz de reparar diretamente um gene FANC endógeno. O sistema de edição de genes inclui uma proteína Cas ou um polinucleotídeo que codifica uma proteína Cas; um gRNA; e um modelo de reparo. O modelo de reparo compreende um fragmento de sequência sobrepondo mutação(s) conhecida(s) a um gene FANC (por exemplo, FANCA) nos pacientes adicionais. Uma ou ambas as populações de enriquecimento para CD34 de alta e baixa estringência foram colocadas em contato com o vetor de terapia genética recombinante e, em seguida, as misturas das duas populações de células enriquecidas para CD34 foram transplantadas autologicamente em cada um dos pacientes. Os pacientes mostraram uma cinética de enxerto de seleção in vivo rápida. Este protocolo de tratamento resultou em aumentos de várias linhagens na hematopoiese, neutrófilos, glóbulos vermelhos e plaquetas. A recuperação de linhagens hematopoiéticas que haviam declinado nos pacientes antes do transplante foi um desfecho convincente para o sucesso clínico.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para tratar anemia de Fanconi em um paciente em necessidade do mesmo, CARACTERIZADO por compreender fornecer ao paciente: (i) uma população de células enriquecida para CD34 de alta estringência, preparada a partir de uma primeira amostra biológica obtida a partir do paciente, selecionando para células CD34+ sob condições de alta estringência; e (ii) uma população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência, preparada a partir de uma segunda amostra biológica obtida a partir do paciente, selecionando para células CD34+ sob condições de baixa estringência, em que uma ou ambas da população de células enriquecida para CD34 de alta estringência e/ou da população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência foram geneticamente modificadas por: (i) um vetor de terapia genética recombinante compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo do grupo de complementação da anemia de Fanconi (FANC), ou uma variante ou fragmento funcional do mesmo; ou (ii) um sistema de edição de gene que direciona o reparo direto de um gene FANC mutado endógeno, e em que a primeira amostra biológica e a segunda amostra biológica são opcionalmente a mesma amostra biológica.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por compreender ainda: (a) preparar uma população de células enriquecida para CD34 de alta estringência a partir de uma primeira amostra biológica obtida a partir do paciente selecionando para CD34+ células sob condições de alta estringência; (b) preparar uma população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência a partir de uma segunda amostra biológica obtida a partir do paciente selecionando para células CD34+ sob condições de baixa estringência, (c) modificar geneticamente uma ou ambas a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência ou população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência com: (i) o vetor de terapia genética recombinante compreendendo a sequência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo do grupo de complementação A da anemia de Fanconi (FANCA), ou uma variante ou fragmento funcional do mesmo; ou (ii) o sistema de edição de genes que tem como alvo o reparo direto do gene FANC mutado endógeno, e (d) fornecer a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência e a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência ao paciente, tratando, assim, a anemia de Fanconi.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pela primeira amostra biológica e a segunda amostra biológica serem, cada uma, independentemente sangue periférico ou medula óssea.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pela primeira amostra biológica e a segunda amostra biológica serem sangue periférico obtido após o paciente ter sido tratado com G-CSF, plerifaxor ou uma combinação de G-CSF e plerifaxor.

5. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pela seleção para células CD34+ sob condições de alta estringência compreender aplicar a primeira amostra biológica a uma matriz de captura que liga células CD34+, lavar a matriz de captura uma ou mais vezes usando um tampão de lavagem e eluir a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência da matriz de captura usando um tampão de eluição.

6. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pela seleção para células CD34+ sob condições de baixa estringência compreender aplicar a segunda amostra biológica a uma matriz de captura que liga células CD34+, permitir que uma fração não ligada da segunda amostra biológica flua através da matriz de captura e eluir a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência da matriz de captura usando um tampão de eluição.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pela população de células enriquecida para CD34 de alta estringência ser geneticamente modificada.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 6 ou 7, CARACTERIZADO pela população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência ser modificada geneticamente.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pela porcentagem de células CD34+ na população de células enriquecida para CD34 de alta estringência estar entre duas e quatro vezes maior que a porcentagem de células CD34+ na população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pela população de células enriquecida para CD34 de alta estringência compreender células CD34+ a uma pureza de > 20% ou > 30%.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pela população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência compreender células CD34+ a uma pureza de < 30%.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADO pela população de células enriquecida para CD34 de alta estringência compreender células CD34+ a um rendimento de > 20%.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pela população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência compreende células CD34+ a um rendimento de >35%.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo vetor de terapia genética recombinante compreender uma sequência de polinucleotídeo compreendendo na seguinte ordem 5' a 3': (a) uma sequência promotora eucarioticamente ativa; e (b) uma sequência que codifica um polipeptídeo de gene FANC humano, ou um fragmento ou variante funcional deste; em que a sequência que codifica o polipeptídeo de gene FANC humano, ou fragmento ou variante funcional deste, está operacionalmente ligada à sequência promotora eucarioticamente ativa; e em que o gene FANC é selecionado a partir de FANCA, FANCC e FANCG.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo sistema de edição de genes compreender: (a) uma proteína Cas ou um polinucleotídeo que codifica uma proteína Cas; (b) um gRNA; e (c) um modelo de reparo compreendendo uma sequência que compreende o gene FANC ou um fragmento do mesmo que se sobrepõe a uma ou mais mutações no gene FANC endógeno, em que o sgRNA está configurado para guiar o modelo de reparo ao gene FANC, em que o gene FANC é selecionado a partir de FANCA, FANCC e FANCG, e em que o sistema de edição de genes é capaz de reparar diretamente um gene FANC endógeno.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, CARACTERIZADO pelo método inibir o desenvolvimento de, interromper a progressão de e/ou reverter a progressão de uma manifestação hematológica da anemia de Fanconi no paciente, em que a manifestação hematológica da anemia de Fanconi é opcionalmente selecionada a partir de uma ou mais de: falência da medula óssea, trombocitopenia, leucopenia, pancitopenia, neutropenia e anemia.

17. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pela seleção ser realizada por seleção magnética baseada em esferas.

18. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO por compreender ainda realizar aférese no sangue periférico uma ou mais vezes.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, CARACTERIZADO pelo método resultar em aumento progressivo das células de Anemia de Franconia modificadas por genes ao longo do tempo.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, CARACTERIZADO pelo método resultar na recuperação de uma ou mais linhagens hematopoiéticas que haviam declinado no paciente antes da administração da população de células enriquecidas para CD34 de alta estringência e da população de células enriquecidas para CD34 de baixa estringência ao paciente.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelas uma ou mais linhagens hematopoiéticas compreenderem um ou mais linfócitos, eosinófilos, neutrófilos, glóbulos vermelhos e plaquetas.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, CARACTERIZADO pelo método resultar na recuperação de um ou mais parâmetros hematológicos que haviam declinado no paciente antes da administração da população de células enriquecidas para CD34 de alta estringência e da população de células enriquecidas para CD34 de baixa estringência ao paciente.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo parâmetro hematológico ser hemoglobina.

24. Método para preparar células geneticamente modificadas para o tratamento da anemia de Fanconi, CARACTERIZADO por compreender: (a) preparar uma população de células enriquecida para CD34 de alta estringência a partir de uma primeira amostra biológica obtida de um paciente selecionando para células CD34+ sob condições de alta estringência; (b) preparar uma população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência a partir de uma segunda amostra biológica obtida de um paciente, selecionando para células CD34+ sob condições de baixa estringência; e (c) modificar geneticamente uma ou ambas a população de células enriquecidas para CD34 de alta estringência ou a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência com um vetor de terapia genética recombinante para anemia de Fanconi, em que o vetor de terapia genética opcionalmente compreende um polinucleotídeo que codifica um grupo de complementação A da anemia de Fanconi (FANC), ou uma variante ou fragmento funcional deste.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pela primeira amostra biológica e a segunda amostra biológica serem cada uma independentemente sangue periférico ou medula óssea.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pela primeira amostra biológica e a segunda amostra biológica serem sangue periférico obtido após o paciente ter sido tratado com G-CSF, plerifaxor ou uma combinação de G-CSF e plerifaxor.

27. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pela seleção para células CD34+ sob condições de alta estringência compreender aplicar a primeira amostra biológica a uma matriz de captura que liga células CD34+, lavar a matriz de captura uma ou mais vezes usando um tampão de lavagem e eluir a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência da matriz de captura usando um tampão de eluição.

28. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pela seleção para células CD34+ sob condições de baixa estringência compreender aplicar a segunda amostra biológica a uma matriz de captura que liga células CD34+,

permitir que uma fração não ligada da segunda amostra biológica flua através da matriz de captura e eluir a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência da matriz de captura usando um tampão de eluição.

29. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pela população de células enriquecida para CD34 de alta estringência ser colocada em contato com o vetor de terapia genética recombinante.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 29, CARACTERIZADO pela população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência ser colocada em contato com o vetor de terapia genética recombinante.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 30, CARACTERIZADO pela porcentagem de células CD34+ na população de células enriquecida para CD34 de alta estringência estar entre duas e quatro vezes maior que a porcentagem de células CD34+ na população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 31, CARACTERIZADO pela população de células enriquecida para CD34 de alta estringência compreender células CD34+ a uma pureza de > 20% ou > 30%.

33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 32, CARACTERIZADO pela população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência compreender células CD34+ a uma pureza de > 30%.

34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 33, CARACTERIZADO pela população de células enriquecida para CD34 de alta estringência compreender células CD34+ a um rendimento de > 20%.

35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 34, CARACTERIZADO pela população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência compreendet células CD34+ a um rendimento de >35%.

36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a

35, CARACTERIZADO pelo vetor de terapia genética recombinante para anemia de Fanconi compreender uma sequência de polinucleotídeo compreendendo na seguinte ordem 5' a 3': (a) uma sequência promotora eucarioticamente ativa; e (b) uma sequência que codifica um gene polipeptídeo de FANC humano, ou um fragmento ou variante funcional deste; em que a sequência que codifica o polipeptídeo de gene FANC humano, ou fragmento ou variante funcional deste, está operacionalmente ligada à sequência promotora eucarioticamente ativa; e em que o gene FANC é selecionado a partir de FANCA, FANCC e FANCG.

37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 35, CARACTERIZADO pelo vetor de terapia genética recombinante para anemia de Fanconi compreender um sistema de edição de genes capaz de reparar diretamente um gene FANC endógeno, em que o sistema de edição de genes compreende: (a) uma proteína Cas ou um polinucleotídeo que codifica uma proteína Cas; (b) um gRNA; e (c) um modelo de reparo compreendendo uma sequência que compreende o gene FANC ou fragmento do mesmo que se sobrepõe a uma ou mais mutações no gene FANC endógeno; em que o sgRNA está configurado para guiar o modelo de reparo ao gene FANC; e em que o gene FANC é selecionado a partir de FANCA, FANCC e FANCG.

38. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pela seleção de (a) e/ou (b) ser realizada por seleção magnética baseada em esferas.

39. Método, de acordo com a reivindicação 24 ou 38, CARACTERIZADO pela seleção de (a) e/ou (b) ser realizada usando anticorpos ou fragmentos funcionais destes que especificamente se ligam a CD34.

40. Método, de acordo com a reivindicação 24 ou 38, CARACTERIZADO pela seleção de (a) e/ou (b) ser realizada usando-se um quociente de vazão de 10 a 20 mL/min.

41. Composição CARACTERIZADA por compreender: (a) uma população de células enriquecida para CD34 de alta estringência, preparada a partir de uma primeira amostra biológica, selecionando para células CD34+ sob condições de alta estringência; e (b) uma população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência, preparada a partir de uma segunda amostra biológica, selecionando para células CD34+ sob condições de baixa estringência, em que uma ou ambas a população de células enriquecida para CD34 de alta estringência ou a população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência são colocadas em contato com um vetor de terapia genética recombinante para anemia de Fanconi.

42. Composição, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADA pela primeira amostra biológica e a segunda amostra biológica são cada uma independentemente sangue periférico ou medula óssea.

43. Composição, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADA pela primeira amostra biológica e a segunda amostra biológica serem sangue periférico obtido de um paciente após o paciente ter sido tratado com G-CSF, plerifaxor ou uma composição de G-CSF e plerifaxor.

44. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 43, CARACTERIZADA pela porcentagem de células CD34+ na população de células enriquecida para CD34 de alta estringência estar entre duas e quatro vezes maior que a porcentagem de células CD34+ na população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência.

45. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações

41 a 44, CARACTERIZADA pela população de células enriquecida para CD34 de alta estringência compreender células CD34+ a uma pureza de > 20% ou > 30%.

46. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 45, CARACTERIZADA pela população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência compreender células CD34+ a uma pureza de > 30%.

47. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, CARACTERIZADA pela população de células enriquecida para CD34 de alta estringência compreender células CD34+ a um rendimento de > 20%.

48. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 47, CARACTERIZADA pela população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência compreender células CD34+ a um rendimento de >35%.

49. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 48, CARACTERIZADA pela população de células enriquecida para CD34 de alta estringência ser colocada em contato com o vetor de terapia genética recombinante.

50. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 49, CARACTERIZADA pela população de células enriquecida para CD34 de baixa estringência ser colocada em contato com o vetor de terapia genética recombinante.

51. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 50, CARACTERIZADA pelo vetor de liberação de genes recombinante compreender uma sequência de polinucleotídeo compreendendo na seguinte ordem 5' a 3': (a) uma sequência promotora eucarioticamente ativa; e (b) uma sequência que codifica um gene FANC humano ou polipeptídeo, ou um fragmento ou variante funcional destes;

em que a sequência que codifica o gene ou polipeptídeo FANC humano, ou fragmento ou variante funcional destes, está operacionalmente ligada à sequência promotora eucarioticamente ativa; e em que o gene FANC é selecionado a partir de FANCA, FANCC e FANCG.

52. Composição farmacêutica CARACTERIZADA por compreender a composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 41 a 51, e um transportador farmaceuticamente aceitável.