CN104419683A - 制备范可尼贫血症患者自体诱导多能干细胞的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备范可尼贫血症患者自体诱导多能干细胞的方法，所述方法包括：利用附着体载体将重编程因子OCT4、SOX2、KLF4、cMYC和LIN28的编码核酸以及针对人p53基因的shRNA转入具有突变的范可尼贫血症相关基因的范可尼贫血症患者体细胞中；之后，在丁酸钠(NaBT)的存在下培养所述体细胞。本发明还涉及制备用于移植治疗范可尼贫血症的造血干细胞、间充质干细胞或神经干细胞的方法。另外，本发明还提供用于治疗范可尼贫血症的小分子化合物。

Description

制备范可尼贫血症患者自体诱导多能干细胞的方法及其应用

技术领域

本发明涉及制备范可尼贫血症患者自体诱导多能干细胞的方法，本发明还涉及制备用于移植治疗范可尼贫血症的造血干细胞、间充质干细胞或神经干细胞的方法，另外，本发明还提供用于治疗范可尼贫血症的小分子化合物。

背景技术

范可尼贫血症(Fanconi Anemia，FA)属于先天再生障碍性贫血，是一种严重的常染色体隐性遗传疾病，其致病突变基因携带率约为1/180～1/300，发病率约为10～50/10万，其临床特征性表现为进行性骨髓衰竭，多发性先天畸形以及恶性肿瘤易患性等重大致死性症状。FA在世界各人群中均有发现，在某些种族人群中发病率异常增高，例如德系犹太人和荷裔南非人中的FA基因携带率为1/90，而西班牙吉普赛人中的FA基因携带率高达1/64～1/70。近年来随着对FA临床表现和发病机理的深入了解，我国FA患者的检出率逐年增高，尤其是3-14岁儿童病例屡见报道，由于FA致残致死率极高，同时尚无便捷有效的治疗手段，给患儿及其家庭带来巨大的痛苦和经济负担，因此急需针对FA建立有效的诊断和治疗技术，以及高效的药物筛选平台。

目前已发现15个FA相关致病突变基因(分别为FANCA、B、C、D1、D2、E、F、G、I、J、L、M、N、O和P)，并且所有FA相关基因都参与一个重要的DNA修复途径(FA/BRCA途径)。已有研究表明，通过在FA/BRCA通路缺陷的细胞内过表达相应的正常FA基因，可以纠正基因缺陷，恢复细胞正常的生理功能，提示了未来可以通过基因治疗来治愈FA。然而，目前造血干细胞移植是临床治疗FA的唯一手段，但同时造血干细胞的来源以及免疫排斥反应限制了该治疗手段的临床应用。近年来，诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cell，iPSC)技术的出现和发展为疾病的药物筛选、基因治疗和细胞治疗提供了广阔前景。iPSC是通过将特定转录因子(如OCT4，SOX2，KLF4，cMYC等)导入体细胞，使其转变成为的具备胚胎干细胞特性的细胞，进一步定向分化为疾病累及细胞类型，为该类疾病药物筛选提供具有显著优势的基于人类细胞的药物筛选平台。事实上,许多公司已经开始致力于建立iPSC疾病模型用于药物发现研究。罗氏(Roche)与欧洲创新药物计划(IMI)2012年联合宣布推出StemBANCC，旨在以人诱导多能干细胞为研究工具，开发人类疾病模型，促进药物开发，该计划研究包括糖尿病和老年痴呆症在内的一系列疾病。此外，CellularDynamics和AstraZeneca公司也宣布将合作开发人类iPSC体外疾病模型，特别的是利用MyCell技术将特定病人的细胞转化为体外疾病模型进行药物筛选。这种突破性的新技术将为人类疾病机理研究和药物筛选实现新的跨越。另外，iPSC并非源于胚胎组织，不会受到伦理问题的限制，结合现有的基因打靶技术对患者自体来源的iPSC进行基因突变的基因组原位矫正，在基因水平清除内源性致病因素，为血液病的移植细胞治疗提供良好的移植材料，在个性化治疗和转化医学中巨大的应用前景。

针对FA，目前可用雄激素，糖皮质激素和造血生长因子进行治疗，但是只能改善症状，疗效难以持续，更无法根除。其原因在于目前范可尼病的疾病模型和药物筛选平台不能满足进行药物筛选的需求。利用iPSC这一前沿技术，对范可尼病人体细胞进行重编程，并定向分化为范可尼疾病累积的细胞类型，可建立新型范可尼药物筛选平台。另外，通过IPSC技术平台，利用基因打靶技术对患者自体iPSC中的致病基因突变进行基因矫正，再将其定向分化为无致病突变的正常造血干细胞，继而用于治疗血液系统疾病。因此，建立高效的范可尼患者体细胞重编程体系至关重要。然而与其他遗传性贫血症相比，范可尼贫血症患者的体细胞重编程研究具有更大的困难和挑战性。已有研究表明，FA涉及的FANC/BRCA信号通路在发育和DNA损伤修复中发挥至关重要的作用，患者体细胞本身存在DNA损伤和不稳定性，而重编程过程中又会进一步引发活性氧(ROS)增加、DNA断裂和细胞死亡(Senescence)等细胞事件严重阻碍体细胞重编程的过程，因此针对FA患者携带致病突变细胞的体细胞重编程研究困难重重，国内外鲜见成功实施的案例。

尽管近年来已有若干研究组利用不同策略获得FA患者来源的iPSC，但是仍然存在各种问题和不足。例如2009年本专利发明人在首先过表达野生型FANCA基因对患者体细胞系进行基因补偿之后，才利用慢病毒介导的体细胞重编程方法顺利对4例FANCA患者体细胞(上皮细胞和角质细胞)完成重编程过程并获得患者自体iPSC。然而慢病毒载体介导的重编程方法会导致外源基因发生不可控的基因组整合，不但会进一步加剧携带FA致病基因突变细胞的DNA不稳定性，而且也无法实现安全的临床应用。此外，经过基因补偿的细胞也无法作为疾病模型用于药物筛选。(A.Raya,I.Rodriguez-Piza,G.Guenechea,R.Vassena,S.Navarro,M.J.Barrero,A.Consiglio,M.Castella,P.Rio,E.Sleep,F.Gonzalez,G.Tiscornia,E.Garreta,T.Aasen,A.Veiga,I.M.Verma,J.Surralles,J.Bueren,J.C.Izpisua Belmonte,Disease-corrected haematopoietic progenitors from Fanconi anaemia inducedpluripotent stem cells,Nature.2009,460:53-59)。2012年美国哈佛医学院的Daley研究组改进了体细胞重编程技术，利用低氧条件(Hypoxia)诱导，同时结合慢病毒介导重编程因子表达，产生了FA-A和FA-C患者自体iPSC。然而，该研究同样利用慢病毒载体产生外源基因整合型iPSC，因而无法实现安全的临床应用。同时尽管获得了携带FA致病突变的iPSC，但是该研究并未利用其开展可能的FA药物筛选工作。(L.U.Muller,M.D.Milsom,C.E.Harris,R.Vyas,K.M.Brumme,K.Parmar,L.A.Moreau,A.Schambach,I.H.Park,W.B.London,K.Strait,T.Schlaeger,A.L.Devine,E.Grassman,A.D′Andrea,G.Q.Daley,D.A.Williams,Overcoming ReprogrammingResistance of Fanconi Anemia Cells.Blood.2012,119:5449-5457.)由此可见，现有报道产生的FA患者来源的iPSC存在重编程效率低下和宿主基因组随机整合等严重不足，无法满足临床应用的要求。同时，现有报道均未利用产生的FA-iPSC有效模拟疾病表型，建立药物筛选平台，因而未能开展高效的药物筛选工作。此外目前各研究机构和制药公司主要利用疾病的动物模型进行针对FA等重大疾病的药物筛选，但是动物模型存在与人的种属差异、无法完全重现疾病表现以及无法进行高通量药物筛选等无法克服的缺陷，因而无法实现真正意义的高效高通量药物筛选。综上所述，目前急需一种体外产生FA患者自体来源的iPSC的安全高效技术，以及利用该FA-iPSC及其衍生细胞产生安全的可移植材料和高效高通量的药物筛选平台。

发明内容

本发明涉及一种体外产生范可尼贫血症患者诱导多能干细胞(FA-iPSC)以及造血干细胞等衍生细胞的方法，并且在此基础上建立的高效高通量药物筛选平台以及利用该平台筛选出的一种针对FA疾病表型具有治疗效果的天然化合物。所述方法包括在化学小分子丁酸钠(NaBT)诱导下，利用非基因组整合的附着体载体(Episomal vector)将OCT4，SOX2，KLF4，cMYC，LIN28等因子以及shRNA-p53导入FA患者体细胞，将其重编程为无外源基因整合的诱导多能干细胞，再通过定向分化获得多种患者自体来源的细胞系来模拟FA疾病表型，继而建立针对FA的高通量药物筛选平台，以及利用其进行筛选出的具有治疗效果的天然小分子备选药物。

首先，本发明提出结合非基因组整合型附着体载体(Episomal vector)介导的体细胞重编程技术和非整合型腺病毒载体介导的基因矫正技术，产生FA患者自体来源的无致病基因突变的非基因组整合型iPSC，并进一步将其定向分化为造血干细胞。在重编程过程中，本发明在化学小分子NaBT诱导下，采用一种新型的非基因组整合附着体载体(Episomal vector)技术(附着体载体可以在细胞内长时间复制，但是并不整合到基因组中，在重编程过程中，随着细胞分裂，附着体逐渐被稀释掉，因此该方法避免了由于病毒载体整合入宿主细胞基因组而引起的潜在致癌性等应用风险)，将p53shRNA和经典的四种重编程因子共同导入体细胞，同时给予NaBT处理，使在正常氧压条件下获得FA-iPSC成为可能。由于附着体载体可以在宿主细胞内长期复制，但并不整合到宿主基因组中，并且随着宿主细胞分裂，附着体会被逐步稀释，因此该方法避免了由于病毒载体产生的外源基因整合所引起的潜在致癌性。此后，本发明采用新型第三代非整合型腺病毒载体(Helper-dependent Adenovirus，HDAdV)作为基因打靶工具对FA-iPSC进行基因矫正。该载体携带正常功能的野生型FANCA基因（Genbank登录号：NM_000135）组片段，通过与患者基因组进行同源重组，实现针对突变位点的原位基因矫正。HDAdV载体不具有病毒复制和基因组整合元件，无法整合到宿主基因组中，从而提高基因矫正的安全性，是目前最安全有效的基因矫正技术，同时超大片段同源重组方法保证了基因矫正的精确性，与其他基因打靶技术(如锌指核酶等)相比，无脱靶(Off-Target)和诱变效应。结合上述两种技术，本发明对FA-A患者成纤维细胞依次进行重编程和基因矫正，继而再定向分化为造血干细胞，从而为临床FA患者移植治疗提供了患者自体来源的、比现有方法更安全的造血干细胞。

其次，本发明产生的范可尼贫血症患者自体来源的非整合型iPSC，可以体外定向分化为携带致病基因突变的血液细胞，神经细胞以及间充质细胞等衍生细胞，能够有效模拟各种疾病相关表型，因此本发明利用上述FA相关iPSC及其衍生细胞建立高效高通量的个性化药物筛选平台，并在此基础上已筛选出一种天然化合物，可有效改善FA疾病表型。

综上所述，本发明所含技术既能够为临床治疗FA提供大量安全的移植材料，还能够用于建立筛选FA治疗药物的个性化药物筛选平台，同时也为其他人类重大疾病和罕见病的治疗、诊断和药物筛选等提供了参考模式。

更具体地，本发明提供以下各项：

1.一种制备范可尼贫血症患者自体诱导多能干细胞的方法，所述方法包括：利用附着体载体将重编程因子OCT4、SOX2、KLF4、cMYC和LIN28的编码核酸以及针对人p53基因的shRNA转入具有突变的范可尼贫血症相关基因的范可尼贫血症患者体细胞中；之后，在丁酸钠(NaBT)的存在下培养所述体细胞。

2.根据1所述的方法，其中所述范可尼贫血症患者体细胞是范可尼贫血症患者成纤维细胞。

3.根据1所述的方法，其中所述重编程因子OCT4、SOX2、KLF4、cMYC和LIN28的编码核酸以及所述针对人p53基因的shRNA的核酸序列如SEQ.ID.NO:1-6所示。

4.根据1所述的方法，其中丁酸钠的工作浓度为50-200μM。

5.根据1所述的方法，其中所述附着体载体是Episomal质粒载体。

6.根据1所述的方法，其中所述突变的范可尼贫血症相关基因是FANCA基因。

7.利用根据1-6中任一项所述的方法制备的范可尼贫血症患者自体诱导多能干细胞。

8.一种制备用于药物筛选或移植治疗范可尼贫血症的造血干细胞、间充质干细胞或神经干细胞的方法，所述方法包括：

对根据7所述的范可尼贫血症患者自体诱导多能干细胞中的突变的范可尼贫血症相关基因进行基因矫正，优选采用非整合型腺病毒载体作为基因打靶载体；

将所述经基因矫正的范可尼贫血症患者自体诱导多能干细胞定向诱导为造血干细胞、间充质干细胞或神经干细胞。

9.Doramapimod在制备用于治疗范可尼贫血症的药物中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述范可尼贫血症是由范可尼贫血症相关基因FANCA基因的突变引起的。

11.一种用于治疗范可尼贫血症的组合物，所述组合物包含Doramapimod作为活性成分。

12.Doramapimod用于治疗范可尼贫血症的用途。

13.Tremulacin在制备用于治疗范可尼贫血症的药物中的用途。

14.根据权利要求13所述的用途，其中所述范可尼贫血症是由范可尼贫血症相关基因FANCA基因的突变引起的。

15.一种用于治疗范可尼贫血症的组合物，所述组合物包含Tremulacin作为活性成分。

16.Tremulacin用于治疗范可尼贫血症的用途。

附图说明

图1显示本发明的总体技术方案。

图2显示非基因组整合的FA-iPSC的产生。

图3显示针对FA-iPSC的原位靶向基因矫正。

图4显示FA-iPSC造血前体细胞的定向分化以及疾病表型模拟。

图5显示FA-iPSC间充质干细胞细胞的定向分化以及疾病表型模拟。

图6显示FA-iPSC神经干细胞的定向分化以及疾病表型模拟。

图7显示利用针对FA的个性化药物筛选平台进行高效高通量药物筛选。

具体实施方式

材料：

1）用于流式细胞术的荧光标记抗体：

荧光素APC标记抗人细胞表面识别分子CD45抗体(555485)，BDBiosciences

荧光素APC标记抗人细胞表面识别分子CD43抗体(560198)，BDBiosciences

荧光素FITC标记抗人细胞表面识别分子CD43抗体(555475)，BDBiosciences

荧光素PE标记抗人细胞表面识别分子CD34抗体(555822)，BDBiosciences

荧光素FITC标记抗人细胞表面识别分子CD31抗体(555445)，BDBiosciences

荧光素FITC标记抗人细胞表面识别分子CD90抗体(555595)，BDBiosciences

荧光素PE标记抗人细胞表面识别分子CD73抗体(550257)，BDBiosciences

荧光素APC标记同型对照抗体(555751)，BD Biosciences

荧光素PE标记同型对照抗体(555749)，BD Biosciences

荧光素FITC同型对照抗体(555742)，BD Biosciences

荧光素APC标记抗人细胞表面识别分子CD34抗体(130-090-954)，Miltenyi Biotec

荧光素APC标记抗人细胞表面识别分子CD105抗体(17-1057-42)，eBioscience

荧光素APC标记抗人Tra-1-85抗体(FAB3195A)，R&D Systems

2）用于免疫荧光的抗体：

抗人OCT-3/4抗体(sc-5279)，Santa Cruz Biotechnology

抗人SOX2抗体(sc-17320)，Santa Cruz Biotechnology

抗人Lamin B1抗体(sc-6217)，Santa Cruz Biotechnology

抗人FANCD2抗体(sc-20022)，Santa Cruz Biotechnology

抗人WRN抗体(sc-5629)，Santa Cruz Biotechnology

抗人GAPDH抗体(sc-25778)，Santa Cruz Biotechnology

抗人NANOG抗体(ab21624)，Abcam

抗人Emerin抗体(ab14208)，Abcam

抗人Ki67抗体(ab16667)，Abcam

抗人FANCD2抗体(ab2187)，Abcam

抗人NESTIN抗体(MAB5326)，Millipore

抗人Tra-1-60抗体(MAB4360)，Millipore

抗人β-Tubulin III/Tuj1抗体(T2200)，Sigma

抗人PAX6抗体(PRB-278P)，Covance

抗人Ku80抗体(2753)，Cell Signaling Technology

抗人FANCA抗体(A301-980A)，Bethyl Laboratories

本发明涉及的质粒：

pCXLE-hOCT3/4、pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL和pCXLE-EGFP均购自Addgene(货号分别为：27076、27077、27078、27080和27082)。

本发明涉及培养基配方：

CDF12培养基：

DMEM/F12培养基(Invitrogen，11320-033)

0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen，11140-050)

1mM GlutaMAXTM二肽(Invitrogen，35050-061)

20%Knockout血清替代物(Invitrogen，N10828-028)

1%青霉素/链霉素(Invitrogen，15070-063)

55μM β-巯基乙醇(Invitrogen，21985-023)

10ng/ml Human FGF2(Joint Protein Central)

成纤维细胞培养基配方如下：

DMEM培养基(Invitrogen，11965118)，

15%胎牛血清(Invitrogen，10091148)，

0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen，11140-050)，

1mM GlutaMAX^TM二肽(Invitrogen，35050-061)

1%青霉素/链霉素(Invitrogen，15070-063)。

间充质干细胞培养基成分：

αMEM培养基(Invitrogen，12571071)，

10%胎牛血清(Invitrogen，10091148)，

1%青霉素/链霉素(Invitrogen，15070-063)，

10ng/ml重组人成纤维细胞生长因子(JPC,bFGF)，

5ng/ml TGFβ(Humanzyme，HZ1131)。

MSC细胞成骨分化培养基：

αMEM培养基(Invitrogen，12571071)，

10%胎牛血清(Invitrogen，10091148)，

1%青霉素/链霉素(Invitrogen，15070-063)，

10M β-glycerolphosphate(Santa Cruz Biotech.，CAS 13408-09-8)，0.2mM ascorbate-2-phosphate(Sigma，A4034)，

0.01mM dexamethasone(Sigma，D4902)。

MSC细胞软骨分化培养基：

DMEM培养基(Invitrogen，11965118)，

1%青霉素/链霉素(Invitrogen，15070-063)，

10ng/ml TGF-β3(R&D Systems，AB-100-NA)

50mg/ml ITS+Premix(BD，354351)

50g/ml proline(Sigma，P5607)

50g/ml ascorbate-2-phosphate(Sigma，A4034)

0.1M dexamethasone(Sigma，D4902)。

MSC脂肪分化培养基：

α-MEM培养基(Invitrogen，12571071)，

10%胎牛血清(Invitrogen，10091148)，

1%青霉素/链霉素(Invitrogen，15070-063)，

50μM indomethacin(Sigma，I7378)

0.5mM IBMX(Sigma，I7018)

1μM dexamethasone(Sigma，D4902)

造血分化培养基：

90%α-MEM培养基(Invitrogen，12571071)

10%胎牛血清(Invitrogen，10091148)

神经诱导分化培养基-1：

50%Advanced DMEM/F12培养基(Invitrogen，12634)

50%Neurobasal培养基添加剂(Invitrogen，21103049)

1%N-2添加剂(Invitrogen，17502-048)

2%B-27添加剂(Invitrogen，0080085-SA)

2mM GlutaMAX^TM二肽(Invitrogen，35050-061)

10ng/mL重组人白血病抑制因子（hLIF，Millipore，LIF1050)

4μM CHIR99021(Cellagen tech，C2447)

3μM SB431542(Cellagentech，C7243)

2μM Dorsomorphin(Sigma，P5499)

0.1μM Compound E(EMD Chemicals Inc.，565790)

神经诱导分化培养基-2：

50%Advanced DMEM/F12培养基(Invitrogen，12634)

50%Neurobasal培养基添加剂(Invitrogen，21103049)

1%N-2添加剂(Invitrogen，17502-048)

2%B-27添加剂(Invitrogen，0080085-SA)

2mM GlutaMAX^TM二肽(Invitrogen，35050-061)

10ng/mL重组人白血病抑制因子（hLIF，Millipore，LIF1050)

4μM CHIR99021(Cellagen tech，C2447)

3μM SB431542(Cellagentech，C7243)

0.1μM Compound E(EMD Chemicals Inc.，565790)

NSMM培养基：

50%Advanced DMEM/F12培养基(Invitrogen，12634)

50%Neurobasal培养基添加剂(Invitrogen，21103049)

1%N-2添加剂(Invitrogen，17502-048)

2%B-27添加剂(Invitrogen，0080085-SA)

2mM GlutaMAX^TM二肽(Invitrogen，35050-061)

10ng/mL重组人白血病抑制因子（hLIF，Millipore，LIF1050)

4μM CHIR99021(Cellagen tech，C2447)

3μM SB431542(Cellagentech，C7243)

2μM Dorsomorphin(Sigma，P5499)

神经元自发分化培养基SDNM：

DMEM/F12(Invitrogen，11320-033)

1%N-2添加剂(Invitrogen，17502-048)

2%B-27添加剂(Invitrogen，0080085-SA)

400μM N6,2′-O-二丁酰基腺苷3′,5′-环磷酸钠盐（dbcAMP，Sigma，D0260）

200μM L-抗坏血酸（Ascorbic acid，Sigma，A5960）

10ng/ml重组人神经营养因子BDNF(Peprotech，450-20)

10ng/ml重组人神经营养因子GDNF(Peprotech，450-10)

本发明涉及的细胞系：

人范可尼成纤维细胞(FA123)(来自携带FANCA C295T纯合子突变的19岁男性患者，具体见Callén E,et al.,A common founder mutation inFANCA underlies the world′s highest prevalence of Fanconi anemia inGypsy families from Spain.Blood.2005.105(5):1946-1949，并由第一发明人所在实验室妥善保藏。

人胚胎干细胞H9细胞系，购自WiCell公司。

实施例1：FA患者自体诱导多能干细胞系的建立及鉴定

本发明涉及的FA患者成纤维细胞FA123可利用人类成纤维细胞培养基在37摄氏度和5%二氧化碳条件下进行培养。

本发明针对基因组不稳定的FA患者体细胞优化了实现重编程条件。通过哺乳动物细胞电转仪将表达重编程因子的Episomal质粒载体pCXLE-hOCT3/4-shp53-F（含重编程因子OCT3/4(其也被称为OCT4)，shp53(针对人p53基因的shRNA)可以消除重编程过程中细胞死亡的障碍），pCXLE-hSK（含重编程因子SOX2，KLF4），pCXLE-hUL（含重编程因子cMyc和Lin28）和pCXLE-EGFP（含报告基因EGFP）各1.5μg共同电转导入FA患者体细胞。电转后将细胞在成纤维细胞培养基中培养4天。将细胞用胰蛋白酶（美国Invitrogen公司，货号：25200056）消化，随后接种至预先培养了经过丝裂霉素(购自美国Sigma公司，货号：M0503)灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs，购自美国Invitrogen公司，货号：S1520-100)的培养板中，次日换用添加了丁酸钠（NaBT，为组蛋白去乙酰化抑制剂，工作浓度为50-200μM）的CDF12培养基继续培养4天后，将培养基更换为无NaBT的CDF12培养基继续培养至克隆样细胞出现。40天后成功实现范可尼贫血症患者成纤维细胞FA123细胞的重编程，获得FA患者自体来源的诱导多能干细胞系(FA-iPSC)(图2A-C)。如图2所示，本发明对产生的克隆样细胞进行干细胞标志物Nanog染色鉴定，证明FA成纤维细胞可以有效地被重编程成为表达干细胞标志物Nanog阳性的细胞，即诱导多能干细胞。将范可尼诱导多能干细胞FA-iPSC进行连续传代后，仍可保持良好的克隆样形态（图2A）。本发明确定只有通过导入p53基因的shRNA使p53基因沉默后，FA体细胞才可实现高效重编程，产生FA-iPSC（图2B），同时重编程生成的FA-iPSC仍然携带体细胞突变C253T(图2C)。

利用免疫荧光技术可以确认FA-iPSC能够表达干细胞特异性分子标记物OCT4和NANOG(图2D)，同时FA-iPSC已能够表现出FA信号通路缺陷的疾病特征，例如G2/M周期停滞(图3C)以及对DNA交联剂敏感和染色体的不稳定性等(图3D)。

实施例2：FA-iPSC的基因矫正

产生非基因组整合型FA-iPSC后，本发明继续利用非整合型腺病毒载体介导的基因矫正技术，原位修复了FA-iPSC基因组中的致病基因突变位点。本发明涉及的FA患者，其致病基因突变为位于FANCA4号外显子的点突变(图2C)。本发明首先设计并通过分子克隆方法获得跨FANCA基因1-8号外显子的正常野生型基因片段，然后将其构建成为非整合型腺病毒载体并感染FA-iPSC，利用同源重组原理将正常FANCA基因导入FA-iPSC中并替换突变基因，从而完成原位修复。后续经过抗性筛选，最终获得经过基因矫正的FA-iPSC，即cFA-iPSC。具体方法如下：

1、基因矫正辅助腺病毒载体构建：

将BAC文库中的人FANCA locus克隆(CTD-2327D14，Invitrogen)通过同源重组构建入辅助腺病毒载体pCIHDAdGT8-4(关于该腺病毒载体，详见An HSV amplicon-based helper system for helper-dependent adenoviralvectors.Shuji Kubo,et al.BBRC.2003.307(4):826-830)，产生的FANCA-c-HDAdV质粒用PI-SceI(NEB)酶切并纯化后，转染116细胞(人胚胎肾细胞（293细胞）的衍生细胞系，既能贴壁生长也能悬浮生长，详见Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.PalmerD.and Ng P.Molecular Therapy.2003.8(5):846-52.)，同时用辅助病毒AdHPBGF35(详见Genome Size and Structure Determine Efficiency ofPostinternalization Steps and Gene Transfer of Capsid-Modified AdenovirusVectors in a Cell-Type-Specific Manner.Dmitry M.Shayakhmetov,et al.,Journal of Virology.2004.78(18):10009-10022.)感染细胞以便包装非基因组整合的辅助腺病毒载体FANCA-c-HDAdV。收集培养上清，并通过超高速离心纯化病毒颗粒。

2、FA-iPSC的原位基因矫正：

利用FANCA-c-HDAdV病毒载体感染FA-iPSC(1×10⁷个细胞)。感染后第2-4天，加入G418(25-450μg/ml，Invitrogen)进行阳性筛选。感染后第10-13天，加入4μM Ganciclovir(GANC，Invitrogen)进行阴性筛选。将所得细胞克隆挑入96孔板备用，并进行基因组鉴定。

基因组鉴定所需引物序列为：

P1，5’-GGAACCCACTGGTCATGTTTGCTTTTGCCCAT-3’;

P2，5’-CCCCAAAGGCCTACCCGCTTCCATTGCTCA-3’;

P3，5’-CTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATC-3’;

P4，5’-TACCAGGTTATAGTAGCTCAGGAATGCTAAGTCGCTCA-3’;

构建成功克隆的测序引物为：

5’-TTGCCCACCGTTTCTCACTTTATTGAATGCAGACC-3’

5’-AGGCAACCATCCCGGCTGAGAGAATACCCA-3’

3、移除基因组中用于筛选的Neo抗性基因表达盒：

将pCAG-Flpo-2A-puro质粒（购自美国Addgene公司，货号：20733）用FuGENE HD(美国Promega公司，货号：E2311)转染至cFA-iPSC。因为该质粒携带表达Flpo重组酶，所以可将基因组中整合的外源片段携带的Neo基因切除。转染2天后，加入Puromycin(1μg/ml；Invitrogen，货号：1113803)进行筛选以富集阳性细胞。Puromycin筛选两天后，加入未添加Puromycin的CDF12培养基继续培养10天。将细胞消化成单细胞后，接种至预先培养了经过丝裂霉素(购自美国Sigma公司，货号：M0503)灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs，购自美国Invitrogen公司，货号：S1520-100)的培养板中。继续培养14天后挑取单克隆并扩增培养，同时用PCR方法鉴定是否成功移除Neo抗性基因。

DNA测序引物为：

5’-GCCCACCGTTTCTCACTTTATTGAATGCAGACCA-3’

5’-TGCCTCCATCCAGATCAACAGAACATTGCC-3’.

经鉴定后发现，基因矫正不影响干细胞干性基因的表达和细胞的核型，同时并且基因矫正能够有效改善细胞在细胞周期、染色体DNA断裂和DNA损伤修复功能等方面的缺陷(图3C-E)。

实施例3：FA-iPSC定向分化以及疾病表型模拟

人类诱导多能干细胞已被证实可在体外定向分化为造血干细胞及前体细胞。本发明利用实施例2中获得的FA-iPSC，进行了造血干细胞和前体细胞的体外定向分化，我们发现FA-iPSC定向分化形成的造血干细胞、神经干细胞以及间充质干细胞等都能够表现出典型的FA症状。

1.FA-iPSC的造血细胞定向分化及疾病模拟

挑取FA-iPSC单克隆至OP9滋养层细胞（购自美国ATCC公司,货号：CRL-2749）上，利用造血分化培养基诱导共培养12-14天。分化的细胞用Accutase(购自美国Innovative Cell Technologies公司,货号：01-0006)消化后经流式细胞术分选获得造血前体细胞，用于下一步实验分析。

定向分化效率检测：

利用流式细胞术，我们发现FA-iPSC分化为造血前体细胞的效率大大低于野生型，尤其是可以产生粒细胞，B细胞，NK细胞以及T细胞等重要血液细胞的CD34hi/CD43low的细胞类群。而经过基因矫正的cFA-iPSC则有明显改善(图4A-C)。

克隆集落形成实验模拟FA血液疾病表型：

将分选的CD34+细胞接种于半固体培养基MethoCult GF+H4435(Stem Cell Technologies)。培养15天后即可见集落出现，并进行计数。选取相应集落，用Wright stain(Millipore)染色鉴定细胞类型。

FA-iPSC分化的造血干细胞只能产生CFU-GM(粒细胞，巨噬细胞的前体细胞)，却不能产生红系细胞和巨核细胞。而经过基因矫正的cFA-iPSC分化的造血干细胞则能产生全部类型的细胞(图4D，E)。

体内移植实验检验基因矫正FA细胞用于移植治疗：

将5×10⁵个造血前体细胞注射入半致死剂量(325cGy)照射的NSG小鼠（NOD scid gamma(NSG)小鼠，购自美国Jackson Lab公司，货号：005557）股骨，分别在注射4周和7周后通过眼眶采血检测干细胞的体内分化情况，并于7周后处死小鼠，收集其骨髓样品用于移植效率的杂合性分析。

移植效率杂合性分析：

分离小鼠的骨髓细胞，用Qiagen DNeasy blood and tissue kit提取DNA样品。利用qPCR鉴定其中的人基因组比例。

经过基因矫正的cFA-iPSC分化的造血干细胞可以用于移植治疗，将细胞移植进入辐射照射过的免疫缺陷鼠，细胞可以成功定植，并开始发挥正常的造血分化功能，提示以此细胞类群进行对FA进行造血干细胞治疗的可能性(图4F)。

2.利用间充质干细胞模拟范可尼病中胚层缺陷

研究表明FA患者中普遍存在中胚层细胞缺陷，本发明可以利用FA-iPSC定向分化模拟中胚层的病理损伤：

1)间充质干细胞的产生和鉴定。

首先将FA-iPSC进行拟胚体(EB)分化，分化14天，将EB接种于matrigel包被的6孔板中进行培养，继续培养2周至纤维状细胞出现。再经过一次传代后，利用流式细胞术分选其中的CD73，CD90，CD105阳性细胞类群，即为间充质干细胞(图5A)，继续传代培养。FA-iPSC可定向分化为间充质干细胞，并发现其在分化效率上与野生型iPSC存在明显的差异。

2)FA间充质干细胞表现提前衰老症状。

FA-iPSC衍生的间充质干细胞提前出现了衰老症状。利用细胞计数发现FA-iPSC衍生的间充质细胞只能在体外扩增3代(图5B)；利用Beta-gal染色显示FA-iPSC衍生的间充质细胞严重衰老(图5C)；利用qPCR检测到细胞提前表达衰老基因p16和p21(图5D)。

3)FA-iPSC衍生的间充质干细胞模拟FA患者的间充质干细胞分化能力的缺陷

FA-iPSC衍生的间充质干细胞丧失了分化的能力，无法进一步分化为脂肪、成骨、和软骨细胞。

成骨分化：MSC细胞培养于成骨分化培养基中，von Kossa(IHC world)染色鉴定

软骨分化：MSC细胞培养与软骨分化培养基中，Alcian blue(IHCworld)染色鉴定。

脂肪分化：MSC加入脂肪分化培养基，Oil red O(IHC world)染色鉴定。

4)经过基因矫正的cFA-iPSC细胞可消除上述由于FA通路缺陷带来的间充质干细胞损伤(图5B-E)。提示基因矫正的FA间充质干细胞可用于移植间充质细胞治疗。

3.定向分化模拟FA患者神经系统疾病症状

研究表明FA患者会并发神经系统异常，例如脑围过小和智力障碍等。然而由于神经组织取材技术的限制，针对FA对于神经系统的影响机制无法开展。本发明创造的FA-iPSC体外定向分化技术，首次建立了范可尼神经系统疾病模拟体系：

1)FA-iPSC衍生神经干细胞的产生和鉴定：

将FA-iPSC接种于MEF滋养层细胞，加入“神经诱导分化培养基-1”培养2天，再换用“神经诱导分化培养基-2”继续培养5天。将细胞消化为单细胞后接种于Matrigel包被的平板上，培养于NSMM培养基中。经过鉴定发现：FA-iPSC可成功定向分化为神经干细胞，并且与基因矫正的cFA-iPSC细胞相比，其神经干细胞标志物表达无明显差异。然而FA-iPSC衍生神经干细胞能够明显表现出FA信号通路的缺陷，如招募FANCD因子能力(图6C)以及对MMC敏感性(图6D，E)等疾病相关表型。

2)FA-iPSC衍生神经干细胞的定向分化：

将FA-iPSC衍生神经干细胞接种于Matrigel包被的6孔板中，用神经干细胞培养基NSMM维持培养3-5天。换为自发分化培养基SDNM继续培养14天后，进行神经元特异标记物Tuj1的染色鉴定，发现FA-iPSC衍生神经干细胞分化为神经元的能力大幅降低(图6F)。

3)FA-iPSC衍生神经干细胞显示明显的肿瘤发生倾向，通过microarray和qPCR检测发现FA-iPSC衍生神经干细胞中的抑癌基因和神经分化基因大幅下调，而原癌基因的表达则大幅上调(图6G，I)。

4)cFA-iPSC衍生神经干细胞的基因表达和细胞表型均得到一定程度的纠正(图6)。

实施例4：针对FA的个性化药物筛选平台的建立以及备选药物的筛选

目前市场上还没有针对FA的特效药物。本发明首创的高效FA-iPSC产生技术以及FA-iPSC定向分化产生的各种衍生细胞为针对FA的个性化药物筛选提供了最佳的细胞模型。基于此平台，本发明筛选了多种信号通路的作用分子，如Sirt1通路激动剂、P38激酶抑制剂、抗炎性分子以及激素受体激动剂等涉及造血机能的小分子化合物库。

FA-iPSC进行造血定向分化的第6天，向培养基中分别添加待筛选小分子：1μM白藜芦醇(购自美国Sigma公司，货号：R5010-100MG)，50ng/mlDanazol(购自美国Sigma公司，货号：D8399-100MG)，5μM Doramapimod(分别购自美国BIRB公司，货号：796以及美国LC Laboratories公司，货号：D-2444)，5μM Dasatinib(美国LC Laboratories公司，货号：D-3307)和5nMtremulacin(购自美国Santa Cruz Biotech公司，货号：sc-237233)。隔天换液。分化完成后，对产生的细胞进行流式细胞术分析(荧光素PE标记的抗人细胞表面抗原分子CD34抗体，荧光素FITC标记的抗人细胞表面抗原分子CD43抗体以及荧光素APC标记的抗人细胞表面抗原分子Tra-1-85抗体)，比较其分化效率。

对于集落形成实验，将分选的CD34+细胞接种于含待测药物（相同体积待测药物的工作浓度分别为：50ng/ml danazol，5μM doramapimod,5μM dasatinib，5nM tremulacin，并以相同体积的DMSO作为处理对照组）的Methocult(Stem Cell Technologies，H4435)培养基上，培养至集落出现。比较小分子处理组与对照组的差异。

本发明通过在FA-iPSC造血分化的过程中分别添加各种小分子，并且利用流式细胞术检测分化形成的造血前体细胞中CD34和CD43双阳性细胞的比例，来衡量小分子待测药物对携带致病基因突变的FA-iPSC造血分化过程的治疗效果（如图7A，B所示）。研究发现：1)参与Sirt信号通路的白藜芦醇对造血干细胞生成没有促进作用；2)一种用于血液病广谱治疗的一线药物，Dazazol，针对FA-iPSC衍生细胞，cFA-iPSC衍生细胞以及正常的血液细胞均能够表现出一定的改善作用，说明其对FA没有特异性的治疗效果；3)一种特异性p38抑制剂，Doramapimod，能够显著提高FA-iPSC衍生细胞中CD34+/CD43+细胞类群分化效率，尤其是对于提高CD34high/CD43low类群的细胞分化效率的作用更为突出。更重要的是，由Doramapimod处理的FA-iPSC细胞分化形成的CD34+造血前体细胞，开始具有进一步分化为CFU-GM的能力，说明对Doramapimod对FA疾病表型的明显的治疗效果（图7C）。此外，发明人利用该药筛平台还筛选出一种新型抗炎性天然小分子化合物，tremulacin，该分子能够通过抑制INFγ、TNF和IL6等细胞因子，特异性提高FA-iPSC衍生的造血干细胞进一步分化的能力（图7D）。

Claims (10)

1.一种制备范可尼贫血症患者自体诱导多能干细胞的方法，所述方法包括：利用附着体载体将重编程因子OCT4、SOX2、KLF4、cMYC和LIN28的编码核酸以及针对人p53基因的shRNA转入具有突变的范可尼贫血症相关基因的范可尼贫血症患者体细胞中；之后，在丁酸钠(NaBT)的存在下培养所述体细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述范可尼贫血症患者体细胞是范可尼贫血症患者成纤维细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述重编程因子OCT4、SOX2、KLF4、cMYC和LIN28的编码核酸以及所述针对人p53基因的shRNA的核酸序列如SEQ.ID.NO:1-6所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其中丁酸钠的工作浓度为50-200μM。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述附着体载体是Episomal质粒载体。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变的范可尼贫血症相关基因是FANCA基因。

7.利用根据权利要求1-6中任一项所述的方法制备的范可尼贫血症患者自体诱导多能干细胞。

8.一种制备用于移植治疗范可尼贫血症的造血干细胞、间充质干细胞或神经干细胞的方法，所述方法包括：

对根据权利要求7所述的范可尼贫血症患者自体诱导多能干细胞中的突变的范可尼贫血症相关基因进行基因矫正，优选采用非整合型腺病毒载体作为基因打靶载体；

将所述经基因矫正的范可尼贫血症患者自体诱导多能干细胞定向诱导为造血干细胞、间充质干细胞或神经干细胞。

9.Doramapimod在制备用于治疗范可尼贫血症的药物中的用途。

10.Tremulacin在制备用于治疗范可尼贫血症的药物中的用途。