CN108148807B - 生长因子诱导生成神经前体细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生长因子诱导生成神经前体细胞的方法。它是步骤是：A通过向基础培养基中添加特定生长因子，来调控细胞上下游的信号通路，细胞因子使用包括：LIF(白血病抑制因子)、B27(不含维他命A)、肝素、FGF‑2和EGF，通过这些因子的组合，可以将哺乳动物体细胞去分化到部分重编程状态；B接着采用神经类细胞维持传代的生长因子N2、B27(含维他命A)、FGF2、EGF等将这种部分重编程状态的细胞继续分化为功能性的神经前体细胞；C将诱导获得的神经前体细胞在神经干细胞培养基中进一步培养，可进行扩增和保存。本发明的方法一方面规避了传统病毒介导的诱导方法的外源基因插入，免疫原性；又通过使用生长因子降低了潜在的致瘤性；另一方面，又极大改善了已有的小分子化合物诱导方法中存在的效率偏低的问题。

Description

生长因子诱导生成神经前体细胞的方法

技术领域

本发明涉及体外从哺乳动物体细胞诱导获得有功能的神经前体细胞的方法，特别是一种生长因子诱导生成神经前体细胞的方法。

背景技术

作为一个世界性人口大国，并且面临日益严峻的人口老龄化，我国现有的药物和手术治疗手段已不足以满足我国逐年递增的因创伤、疾病、衰老以及遗传病变导致的器官缺损、衰竭、功能障碍等临床需求。因而，对于干细胞与再生医学的研究，得到包括众多科研单位，生物科技企业在内的社会各界的普遍关注。

干细胞泛指原始未分化细胞，具有分化为成体一种或多种类型细胞的潜能。干细胞存在于许多组织里，一方面能分化为成体细胞，另一方面可以通过自我更新来维持干细胞存在，或者在特定条件下扩增提供更多干细胞。在哺乳动物中，干细胞可以分为两大类：胚胎干细胞与成体干细胞。胚胎干细胞来源于囊胚里的内细胞团；而成体干细胞则来自特定的组织。由于干细胞的分化潜能，干细胞被认为具有极大的临床潜力，可应用于再生医学和组织移植。

神经退行性疾病是大脑或脊髓的神经细胞的结构和功能丧失导致的神经疾病。此类疾病，包括阿兹海默症、帕金森症、亨廷顿舞蹈症和肌萎缩性脊髓侧索硬化症等，对人类特别是老年人的健康构成了巨大的威胁。过去的临床研究中，人们试图通过化学药物治疗这些疾病，但都没有取得好的效果。然而，近年来再生医学的治疗手段，为这些疾病的治疗带来了曙光。再生医学的首要目标是生成可以替代受损组织的细胞。尽管之前的报道称可将胚胎干细胞分化为多种细胞类型进行细胞治疗，但是胚胎干细胞治疗却因伦理学问题被限制。直到2006年，诱导性多能干细胞的出现，才为再生医学的研究清除了多年来面临的伦理障碍，成为再生医学领域里程碑式的进步。

然而，诱导多能干细胞技术是将体细胞转变为胚胎干细胞样的状态，在实际应用中，还需将这类胚胎干细胞分化成为成体干细胞或成体细胞，因此操作繁琐，不利于临床应用的展开。但是，诱导多能干细胞技术也给了我们许多重要的提示，其中一项既是：既然转录因子可以将已经高度特化的细胞转变为多能性细胞，那么转录因子肯定在决定细胞类型方面起到关键性的作用，我们是否可以寻找一些谱系特异性转录因子，绕过多能性细胞状态而直接将终末分化细胞转变为另一细胞类型呢？

由此，细胞转分化技术应运而生。细胞转分化技术的出现打破了先前特化的细胞不可能逆转的传统观念，彻底改变了我们对细胞可塑性、分化以及干细胞等概念的认识。转分化是指将一种类型的分化细胞或组织在某些理化因素作用下，转变为另一种类型的分化细胞或组织的现象。与诱导多能干细胞技术相似，转分化技术作为另外一种可以改写原有细胞命运的方式，在基础研究及再生医学领域都具有潜在的应用价值，为人类带来了前所未有的机遇和挑战。然而，目前传统细胞体外转分化的技术存在效率低，机制不清楚的特点。尽管如此，细胞转分化仍然具有非常广泛的应用前景，在例如再生医学，疾病模型，药物筛选等领域都有着重要的作用。

目前，通过诱导多能干细胞技术和细胞转分化技术这两种技术均可获得神经退行性疾病病人病变或损伤神经组织的细胞类型，为修复受损的组织功能提供了强有力的手段和全新的治疗策略，在细胞治疗方面具有潜在的应用价值。在未来的应用中，甚至可能通过原位改变附近细胞的基因表达，来补充受损组织的细胞类型，达到个体化医疗的目的。

尽管诱导多能干细胞技术和传统由谱系特异性转录因子介导的转分化技术为细胞治疗带来了前所未有的曙光，但是它们在面临应用于临床治疗时，还有很多困难需要克服。其中一点，就是目前市面上细胞转分化诱导，通常借助于逆转录病毒、慢病毒等将外源基因导入细胞。虽然这种方式可以得到很高的基因转导效率，但是由于病毒序列整合到细胞的基因组中，会导致基因插入突变发生，甚至具有致瘤性，所以这种具有潜在危险性的基因导入方法，显然不利于细胞转分化技术在再生医学领域的应用。因此，急需发明一种安全、高效、又操作简便的细胞转分化方式，能将分化的成体细胞转变为神经前体细胞，以便更适合应用于临床治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种安全、非整合型的、高效的、以生长因子为基础的细胞转分化手段，体外从哺乳动物体细胞诱导获得有功能的神经前体细胞的方法。

为实现该目的，采用如下技术方案：

一种生长因子诱导生成神经前体细胞的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

A通过向基础培养基中添加特定生长因子，来调控细胞上下游的信号通路，细胞因子使用包括：LIF(白血病抑制因子)、B27(不含维他命A)、肝素、FGF-2和EGF，通过这些因子的组合，可以将哺乳动物体细胞去分化到部分重编程状态，该过程需要约2周时间；

B接着采用神经类细胞维持传代的生长因子N2、B27(含维他命A)、FGF2、EGF等将这种部分重编程状态的细胞继续分化为功能性的神经前体细胞；该过程需要约10天时间，即可最终获得有功能的神经前体细胞；

C将诱导获得的神经前体细胞在神经干细胞培养基中进一步培养，可进行扩增和保存。

通过上述方法获得的生长因子诱导生成的神经前体细胞，具有与普通神经前体细胞相似的分子特征，即均具有一定的自我更新能力，表达神经前体细胞的相关基因以及可以分化产生神经系统主要的细胞类型。

本发明方法可使用的细胞优选的是哺乳动物细胞，更优选小鼠胚胎成纤维细胞和小鼠成体成纤维细胞。

本发明的有益效果是通过利用特定生长因子来调控细胞上下游的信号通路，经过3-4周时间，实现了安全、非整合型的、高效的细胞转分化方法，成功在体外诱导生成神经前体细胞。相比于现有的诱导神经前体细胞的方法，本发明的方法一方面规避了传统病毒介导的诱导方法的外源基因插入，免疫原性；又通过使用生长因子降低了潜在的致瘤性；另一方面，又极大改善了已有的小分子化合物诱导方法中存在的效率偏低的问题。

附图说明

图1显示了生长因子诱导小鼠胚胎成纤维细胞生成神经前体细胞的时间周期和所添加的生长因子的类型。

图2显示了生长因子诱导小鼠胚胎成纤维细胞生成神经前体细胞各时期的形态照片。

图3显示了生长因子诱导Nestin-GFP小鼠胚胎成纤维细胞生成神经前体细胞若干时间点的荧光显微照片。

图4显示了生长因子诱导Nestin-GFP小鼠胚胎成纤维细胞生成神经前体细胞的效率统计图。

图5显示了实时定量PCR结果，表明生长因子诱导生成的神经前体细胞表达神经干细胞特异性基因。

图6显示了RNA-Seq二代测序结果，表明生长因子诱导生成的神经前体细胞的整体表达谱与神经干细胞非常相似。

图7显示了免疫荧光的结果，表明生长因子诱导生成的神经前体细胞表达神经干细胞特异性基因Nestin，Sox1和Sox2。

图8显示了诱导性神经前体细胞做分化处理后的免疫荧光的结果，表明生长因子诱导生成的神经前体细胞可以分化产生神经系统主要的细胞。

图9显示了诱导性神经前体细胞做分化处理后的免疫荧光的结果，表明生长因子诱导生成的神经前体细胞可以分化产生谷氨酰胺能神经元。

图10显示了诱导性神经前体细胞做分化处理后的电生理结果，表明生长因子诱导生成的神经前体细胞可以分化产生有功能的神经元。

图11显示了生长因子诱导Nestin-GFP小鼠成体成纤维细胞生成神经前体细胞若干时间点的荧光显微照片。

图12显示了实时定量PCR结果，表明生长因子诱导Nestin-GFP小鼠成体成纤维细胞生成的神经前体细胞表达神经干细胞特异性基因。

图13显示了免疫荧光的结果，表明生长因子诱导Nestin-GFP小鼠成体成纤维细胞生成的神经前体细胞表达神经干细胞特异性基因Nestin，Sox1和Sox2。

具体实施方式

本发公开了一种生长因子诱导生成神经前体细胞的方法，它包括如下步骤：

A通过向基础培养基中添加特定生长因子，来调控细胞上下游的信号通路，细胞因子使用包括：LIF(白血病抑制因子)、B27(不含维他命A)、肝素、FGF-2和EGF，通过这些因子的组合，可以将哺乳动物体细胞去分化到部分重编程状态，该过程需要约2周时间；

B接着采用神经类细胞维持传代的生长因子N2、B27(含维他命A)、FGF2、EGF等将这种部分重编程状态的细胞继续分化为功能性的神经前体细胞；该过程需要约10天时间，即可最终获得有功能的神经前体细胞；

C将诱导获得的神经前体细胞在神经干细胞培养基中进一步培养，可进行扩增和保存。

以下通过具体实施例来进一步介绍本发明方法。

1、培养基

(1)胚胎成纤维(MEF)细胞和成纤维(Fibroblast)细胞的培养基组成为：基础培养基DMEM(Gibco)，外加10％胎牛血清(FBS；Gibco)和1％L-谷氨酰胺(Glutamax；Gibco)。

(2)诱导起始培养基组成为：DMEM/F12培养基(Gibco)，外加1％GlutaMAX(Gibco)，2％B27 minus vitamin A(Gibco)，1μg/mL heparin(Stem Cell Technologies)，1000units/mL LIF(Merck Millipore)，20ng/mL basic fibroblast growth factor(bFGF；R&D Systems)和20ng/mL epidermal growth factor(EGF；Peprotech)。

(3)神经干细胞培养基组成为：DMEM/F12培养基(Gibco)，外加1％N2(Invitrogen)，2％B27(Invitrogen),20ng/mL basic fibroblast growth factor(bFGF；R&D Systems)和10ng/mL epidermal growth factor(EGF；Peprotech)。

2、用于转分化诱导的细胞

转分化诱导采用的体细胞类型分别为小鼠胚胎成纤维细胞和小鼠成体成纤维细胞(自行制备)。特别地，优选出一种Nestin-GFP小鼠的体细胞，该细胞带有Nestin-GFP转基因。Nestin-GFP神经前体细胞可特异表达绿色荧光蛋白(GFP)，而成纤维细胞中该绿色荧光蛋白不表达。在诱导过程中，当Nestin-GFP成纤维细胞内源Nestin被激活时，绿色荧光蛋白伴随表达，在荧光显微镜下，可见成功实现转分化的细胞或克隆团块呈现绿色，通过流式细胞仪分析绿色荧光细胞的比例，可以提示本发明方法的诱导效率。

实施例1

准备普通小鼠胚胎成纤维细胞，采用胚胎成纤维细胞培养基进行培养。此后，以150000个细胞/孔的密度种植细胞于24孔细胞培养板内，采用诱导起始培养基。诱导起始的7天内，每天一次轻轻吹打细胞，目的是使成团块聚集的细胞悬浮起来，形成较好的细胞球形。其后7天，不再吹打细胞，使细胞从贴壁的团块中迅速扩增起来，可观察到细胞呈区域性增殖。诱导起始14天后，用trypsin/EDTA(Invitrogen)将24孔培养板中每一个孔的细胞分别消化下来，铺到对应的一个35mm细胞培养皿中，此时将培养体系更换为新鲜的神经干细胞培养基。继续培养7天后，可观察到贴壁的细胞会呈现区域性的增殖，并在其边缘爬出很多类似神经上皮样细胞，形成神经网络状结构。这些神经球样细胞经消化后，接种于普通的细胞培养皿或者超低吸附培养皿中，在神经干细胞培养基中经历3-4轮的扩增，最终可形成成熟的神经前体细胞，具有典型神经前体细胞形态。总结如图1和图2所示。

实施例2

准备Nestin-GFP小鼠胚胎成纤维细胞，采用胚胎成纤维细胞培养基进行培养。

(1)以150000个细胞/孔的密度种植细胞于24孔细胞培养板内，将培养体系更换为新鲜的诱导起始培养基。诱导起始的7天内，每天一次轻轻吹打细胞，目的是使成团块聚集的细胞悬浮起来，形成较好的细胞球形。其后7天，不再吹打细胞，使细胞从贴壁的团块中迅速扩增起来，可观察到细胞呈区域性增殖。诱导起始14天后，用trypsin/EDTA(Invitrogen)将24孔培养板中每一个孔的细胞分别消化下来，铺到对应的一个35mm细胞培养皿中，此时将培养体系更换为新鲜的神经干细胞培养基。继续培养7天后，可观察到贴壁的细胞会呈现区域性的增殖，并在其边缘爬出很多类似神经上皮样细胞，形成神经网络状结构。这些神经球样细胞经消化后，接种于普通的细胞培养皿或者超低吸附培养皿中，在神经干细胞培养基中经历3-4轮的贴壁或者悬浮培养以及扩增，最终形成成熟的神经前体细胞。操作流程见图1所示，细胞形态变化如图3所示。

(2)由于选用Nestin-GFP小鼠胚胎成纤维细胞作为转分化诱导的起始细胞，在荧光显微镜下，可见成功实现转分化的细胞或团块逐渐形成神经球样的形态以及呈现绿色荧光的表达，如图3所示。在整个操作过程中的不同时间点，采用流式细胞分析技术对表达绿色荧光细胞的比例进行分析，可见在操作21天时，比例到达80％左右，提示该方法具有较高的细胞转分化效率，如图4所示。

实施例3

对实施例1和2所得的由生长因子诱导方法获得的神经前体细胞进行分子和功能鉴定：

(1)提取实施例1和2获得的神经前体细胞的RNA，并进行实时定量PCR检测，发现细胞1#和2#已经高表达神经前体细胞分子标志如Nestin，Pax6和Sox2，而不再表达原先成纤维细胞的标志Thy1以及Col3a1，证明实施例1和2获得的神经前体细胞确实具有神经前体细胞特性。图5所示。

(2)提取实施例1和2获得的神经前体细胞的RNA，并通过二代测序技术-RNA-seq，对细胞1#和2#进行基因表达谱分析，证明了这些细胞从全局基因表达角度与体内的获得的神经前体细胞已非常相似，而完全不同于来源的成纤维细胞了。图6所示。

(3)对实施例1和2获得的1#和2#神经前体细胞进行蛋白标志染色分析，证实其从蛋白水平，已高表达神经前体标志蛋白Nestin和Sox2。图7所示.

(4)对实施例1获得的1#神经前体进行进一步的分化功能检测，证明1#神经前体细胞可以分化形成主要的神经元细胞，细胞高表达Tuj1和Map2标志。1#神经前体细胞可以分化形成星形胶质细胞，高表达Gfap标志。1#神经前体细胞可以分化形成少突胶质细胞，高表达Olig2标志。

(5)对实施例1和2获得的1#和2#神经前体细胞进行谷氨酰胺能神经元的分化，证明两者均表达标志蛋白vGlut1。图9所示。

(6)对实施例1和2获得的1#和2#神经前体细胞分化后的神经元细胞进行神经电生理检测，证明神经元细胞具有钠钾电流和动作电位。图10所示。

实施例4

准备Nestin-GFP小鼠成体成纤维细胞，采用成纤维细胞培养基进行培养。

(1)以200000个细胞/孔的密度种植细胞于24孔培养板中，将培养体系更换为新鲜的诱导起始培养基。诱导起始的7天内，每天一次轻轻吹打细胞，目的是使成团块聚集的细胞悬浮起来，形成较好的细胞球形。其后14天，不再吹打细胞，使细胞从贴壁的团块中迅速扩增起来，可观察到细胞呈区域性增殖。诱导起始21天后，用trypsin/EDTA(Invitrogen)将24孔培养板中每一个孔的细胞分别消化下来，铺到对应12孔培养板的一个孔中，此时将培养体系更换为新鲜的神经干细胞培养基。继续培养7天后，可观察到贴壁的细胞会呈现区域性的增殖，并在其边缘爬出很多类似神经上皮样细胞。这些神经球样细胞经消化后，接种于超低吸附培养皿中，在神经干细胞培养基中经历5-6轮的悬浮培养以及扩增，最终形成成熟的神经前体细胞。

(2)在荧光显微镜下，可见成功实现转分化的细胞或团块逐渐形成神经前体细胞样的形态以及呈现绿色荧光的表达。图11所示。

对实施例2所得生长因子诱导性神经前体细胞的鉴定：

如图8至图9所示，对诱导性神经前体细胞进行一系列鉴定实验，包括实时定量PCR、免疫荧光分析其表面标志物等，证明其为神经前体细胞。

因此，本发明得出，通过特定生长因子的组合和对应的操作方法，可以安全、高效地在体外环境下，将哺乳动物体细胞诱导获得有功能的神经前体细胞。该方法在保持较高诱导效率的同时，极大降低了因外源基因的插入导致的突变的积累，减少其致癌的可能性。另外，本发明方法也提高了转分化技术的可操作性，降低了操作的难度，很大程度上提高了临床应用的潜能。

这里本发明的描述和应用是说明性的，并非想将本发明的范围限制在上述实施例中。这里所披露的实施例的变形和改变是可能的，对于那些本领域的普通技术人员来说实施例的替换和等效的各种部件是公知的。本领域技术人员应该清楚的是，在不脱离本发明的精神或本质特征的情况下，本发明可以以其它形式、结构、布置、比例，以及用其它组件、材料和部件来实现。在不脱离本发明范围和精神的情况下，可以对这里所披露的实施例进行其它变形和改变。

Claims (1)

1.一种生长因子诱导生成神经前体细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：

A利用诱导起始培养基将哺乳动物体细胞去分化到部分重编程状态，该过程需要约2周时间；所述的诱导起始培养基组成为：DMEM/F12培养基，外加1％ GlutaMAX，2％B27 minusvitamin A，1μg/mL 肝素，1000units/mL LIF，20ng/mL bFGF和20ng/mL EGF；

B接着采用神经干细胞培养基将上述部分重编程状态的细胞继续分化为功能性的神经前体细胞；该过程需要约10天时间；所述神经干细胞培养基的组成为：DMEM/F12培养基，外加1％N2，2％B27,20ng/mL bFGF和10ng/mL EGF；

C将诱导获得的神经前体细胞在神经干细胞培养基中进一步培养，进行扩增和保存。

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