CN112153973A - 用于干细胞移植的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于制造基因修正的干细胞和使用所述基因修正的干细胞进行基因疗法的系统和方法。具体地，本文提供了用于治疗范可尼贫血的方法，其中通过高严格性CD34+选择和低严格性CD34+选择的组合来选择受试者的干细胞，使用对FANC蛋白进行编码的基因疗法载体或基因编辑系统对所述干细胞进行基因修饰，并且将其施用于所述受试者。

Description

用于干细胞移植的组合物和方法
技术领域
本发明总体上涉及制备用于造血干细胞(HSC)移植(包含用于治疗范可尼贫血(FA))的包括基因修饰的HSC的造血细胞群的方法。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年4月11日提交的美国临时申请第62/656,292号的优先权，所述美国临时申请以全文引用的方式并入本文中。
对以电子方式提交的文本文件的说明
与本申请一起以电子方式提交的文本文件的内容以全文引用的方式并入本文中：序列表的计算机可读格式副本(文件名：ROPA_008_01WO_SeqList_ST25，记录日期：2019年4月11日，文件大小：约52千字节)。
背景技术
离体介导的基因向靶细胞中的转移是用于细胞和基因疗法的临床应用方法。含有CD34富集群的HSC的分离和离体基因修饰提供了两个主要益处：减少向非靶细胞的基因转移；并且由此减少对基因修饰物(例如，基因疗法载体)的需求/数量，这又降低了与基因修饰的HSC的临床产生相关的成本。用于基因修饰的HSC的移植的模型系统为FA。在FA背景下开发的方法也适用于其它病症和病状。
FA是常染色体隐性疾病(除了互补群FA-B，其为X连锁)，其中患者的中位生存期为约24年(Butturini A等人,(1994)《血液(Blood)》84:1650-1655；Kutler DI等人,(2003)《血液》101:1249-1256)。出生时，这些病人的血细胞计数一般是正常的。巨红细胞症通常是在这些患者中检测到的第一个血液异常。这通常与血小板减少症、贫血和全血细胞减少症一起演进。通常在5-10年后在这些患者中观察到骨髓衰竭(BMF)，其中血液学疾病发作的平均年龄为7岁。约80％的FA患者会在生命的第一个十年发展出BMF的证据。基于迄今为止的流行病学研究，如果在发育不全之前未出现恶性发作，则几乎所有FA患者将在40岁时发展为BMF(Butturini A等人(1994)《血液(Blood)》84:1650-1655；Kutler DI等人,(2003)《血液》101:1249-1256)，这是这些患者死亡的主要原因。由于FA的临床表现复杂，对这些患者的管理主要集中于改善以下临床表现：骨髓衰竭(BMF)、髓性白血病和实体瘤。
FA和其它疾病的治疗依赖于基因修饰的HSC的有效植入。因此，在本领域中需要制备含有基因修饰的HSC的细胞群的方法，所述细胞群在患者(包含FA患者)中实现高水平的移植。本发明解决了此需要和更多。
发明内容
本发明总体上涉及恶性血液肿瘤和干细胞移植领域，并且具体地涉及制造富集CD34+细胞的干细胞群和使用所述干细胞群进行基因疗法，包含基因递送和基因修复两者。具体地，这些CD34富集细胞群在用于治疗哺乳动物以及具体地是与范可尼贫血互补群A(FANCA)、范可尼贫血互补群C(FANCC)或范可尼贫血互补群G(FANCG)基因产物失调相关的人类疾病、病症和功能障碍的基因疗法中是有用的。在某些实施例中，离体地而不是在人体本身上执行本公开的方法。
在一个实施例中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的范可尼贫血的方法，所述方法包括向所述受试者提供以下的组合：(i)高严格性CD34富集细胞群，其通过在高严格性条件下选择CD34+细胞来由从所述受试者获得的第一生物样品制备；以及(ii)低严格性CD34富集细胞群，其通过在低严格性条件下选择CD34+细胞来由从所述受试者获得的第二生物样品制备，其中已经用对FANC多肽进行编码的重组基因疗法载体转导所述高严格性CD34富集细胞群和/或所述低严格性CD34富集细胞群中的一个或两个，所述FANC多肽包含功能变体或片段或天然存在的FANC蛋白(例如，FANCA或FANCC或FANCG)，并且其中所述第一生物样品和所述第二生物样品任选地是相同的生物样品，由此治疗范可尼贫血。
在一个实施例中，所述方法包括通过以下治疗受试者的范可尼贫血：在高严格性条件下制备CD34富集细胞群；在低严格性条件下制备另一种CD34富集细胞群；使CD34富集细胞群中的一种或两种与重组基因疗法载体接触；以及顺序地或同时地向所述受试者施用两种CD34富集细胞群，由此治疗范可尼贫血。在特定实施例中，因此转导了与所述基因疗法载体接触的所述一种或多种细胞群，并且因此所述一种或多种细胞群包括对用于治疗范可尼贫血的治疗性核酸或多肽进行编码的多核苷酸。在一个实施例中，所述重组基因疗法载体包括对治疗性FANC(例如，FANCA或FANCC或FANCG)基因片段或蛋白质进行编码的自灭活慢病毒载体，如国际专利申请第PCT/US2017/050837号中描述的载体。在一个实施例中，所述重组基因疗法载体被配置成修复内源性FANC基因(例如，FANCA或FANCC或FANCG)，如通过递送CRISPR/Cas系统，所述CRISPR/Cas系统包括Cas蛋白或对Cas蛋白进行编码的核酸、gRNA或sgRNA以及修复模板，所述修复模板包括FANC基因或与所述内源性FANC基因的一个或多个突变重叠的FANC基因的片段。
在一个实施例中，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的范可尼贫血的方法，所述方法包括：通过在高严格性条件下选择CD34+细胞，由从所述受试者获得的第一生物样品制备高严格性CD34富集细胞群；通过在低严格性条件下选择CD34+细胞，由从所述受试者获得的第二生物样品制备低严格性CD34富集细胞群；使所述高严格性CD34富集细胞群或所述低严格性CD34富集细胞群中的一种或两种与针对范可尼贫血的重组基因疗法载体接触；以及向所述受试者施用所述高严格性CD34富集细胞群和所述低严格性CD34富集细胞群，其中所述高严格性CD34富集细胞群或所述低严格性CD34富集细胞群中的一个或两个与所述重组基因疗法载体接触或由所述重组基因疗法载体转导；从而治疗范可尼贫血。
在本发明的一方面，所述第一生物样品和所述第二生物样品各自独立地为外周血或骨髓。一方面，所述第一生物样品和所述第二生物样品是在已经用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(G-CSF)、plerifaxor或G-CSF和plerifaxor的组合治疗所述受试者之后获得的外周血。
在一个实施例中，所述方法中的任何方法进一步包括在高严格性条件下选择CD34+细胞，在高严格性条件下选择CD34+细胞可以包括：将所述第一生物样品应用于结合CD34+细胞的捕获基质；使用洗涤缓冲液洗涤所述捕获基质一次或多次；以及使用洗脱缓冲液从所述捕获基质中洗脱所述高严格性CD34富集细胞群。在一个实施例中，以5-10mL/min、5-15mL/min、15-20mL/min、20-25mL/min或25-30mL/min执行所述应用步骤。在一个实施例中，以5-10mL/min、5-15mL/min、15-20mL/min、20-25mL/min或25-30mL/min执行所述洗脱步骤。在一个实施例中，以10-20mL/min执行所述应用步骤。在一个实施例中，以20mL/min执行所述洗脱步骤。
在一个实施例中，所述方法中的任何方法进一步包括在低严格性条件下选择CD34+细胞，在低严格性条件下选择CD34+细胞可以包括：将所述第二生物样品应用于结合CD34+细胞的捕获基质；允许所述第二生物样品的未结合级分流过所述捕获基质；以及使用洗脱缓冲液从所述捕获基质中洗脱所述低严格性CD34富集细胞群。在一个实施例中，以5-10mL/min、5-15mL/min、15-20mL/min、20-25mL/min或25-30mL/min执行所述应用步骤。在一个实施例中，以5-10mL/min、5-15mL/min、15-20mL/min、20-25mL/min或25-30mL/min执行所述洗脱步骤。在一个实施例中，以10-20mL/min执行所述应用步骤。在一个实施例中，以20mL/min执行所述洗脱步骤。
在本发明的一方面，所述高严格性CD34富集细胞群和/或所述低严格性CD34富集细胞群中的一个或两个与所述重组基因疗法载体接触。在一些实施例中，所述高严格性CD34富集细胞群中CD34+细胞的百分比比所述低严格性CD34富集细胞群中CD34+细胞的百分比大两到四倍。在一个实施例中，所述高严格性CD34富集细胞群中CD34+细胞的百分比大于或为约60％，并且所述低严格性CD34富集细胞群中CD34+细胞的百分比小于60％或15-60％或介于15-30％之间。在一个实施例中，所述高严格性CD34富集细胞群中CD34+细胞的百分比大于或为约70％，并且所述低严格性CD34富集细胞群中CD34+细胞的百分比为17.5-35％。在一个实施例中，所述高严格性CD34富集细胞群中CD34+细胞的百分比大于或为约80％，并且所述低严格性CD34富集细胞群中CD34+细胞的百分比小于40％或20-40％。在一个实施例中，所述高严格性CD34富集细胞群中CD34+细胞的百分比大于或为约90％，并且所述低严格性CD34富集细胞群中CD34+细胞的百分比小于40％或22.5-40％。
在本发明的一个实施例中，用于治疗范可尼贫血的所述重组基因疗法载体包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列按以下5'到3'顺序包括：(a)真核活性启动子序列；和(b)对人FANC基因或多肽(包含其功能片段和变体)进行编码的序列；其中所述对所述人FANC基因或多肽或其功能片段或变体进行编码的序列与所述真核活性启动子序列可操作地连接；并且其中所述FANC基因或多肽选自FANCA、FANCC和FANCG，例如天然人FANCA、FANCC和FANCG或其功能片段或变体。在某些实施例中，天然FANC蛋白的功能片段或功能变体具有与所述天然FANC蛋白基本上相似的生物活性。
在本发明的一个实施例中，针对范可尼贫血的所述重组基因疗法载体包括能够定向修复内源性FANC基因的基因编辑系统，其中所述基因编辑系统包括：Cas蛋白或对Cas蛋白进行编码的多核苷酸；gRNA；以及修复模板，所述修复模板包括包含所述FANC基因或其片段的序列，所述FANC基因或其片段与所述内源性FANC基因中的一个或多个突变重叠；其中所述sgRNA被配置成将所述修复模板引导到所述FANC基因；并且其中所述FANC基因选自FANCA、FANCC和FANCG。
在一个实施例中，通过基于珠粒的磁性选择来执行所述选择方法。
在一个实施例中，本文所公开的方法进一步包括对所述外周血执行一次或多次单采血液成分术。
一方面，本文所公开的方法引起基因修饰的范可尼贫血细胞随时间推移而逐渐增加。
一方面，本文所公开的所述治疗方法抑制所述受试者的范可尼贫血的血液学表现的发展、停止所述血液学表现的进展和/或逆转所述血液学表现的进展，所述血液学表现的例如但不限于骨髓衰竭、血小板减少症、白细胞减少症、全血细胞减少症、中性粒细胞减少症和贫血中的一种或多种。
一方面，本文所公开的方法引起在向所述受试者施用所述高严格性CD34富集细胞群和所述低严格性CD34富集细胞群之前已经在所述受试者中下降的一种或多种造血谱系得到恢复，所述一种或多种造血谱系例如但不限于淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、红细胞和血小板中的一种或多种。在特定实施例中，所述方法引起一种或多种造血谱系的下降减缓或减少或一种或多种造血谱系群稳定，例如淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、红细胞和血小板中的一种或多种。
一方面，所述方法引起在向所述受试者施用所述高严格性CD34富集细胞群和所述低严格性CD34富集细胞群之前已经在所述受试者中下降的一种或多种血液学参数得到稳定或恢复，所述一种或多种血液学参数如血红蛋白。
在一个实施例中，本公开提供了一种用于制备用于治疗范可尼贫血的基因修饰细胞的方法，所述方法包括：通过在高严格性条件下选择CD34+细胞，由从受试者获得的第一生物样品制备高严格性CD34富集细胞群；通过在低严格性条件下选择CD34+细胞，由从受试者获得的第二生物样品制备低严格性CD34富集细胞群；以及使所述高严格性CD34富集细胞群或所述低严格性CD34富集细胞群中的一种或两种与针对范可尼贫血的重组基因疗法载体接触。在某些实施例中，通过所述基因疗法载体转导与所述基因疗法载体接触的一种或多种细胞群，从而产生包括经过转导的细胞的细胞群，所述经过转导的细胞包括对治疗性核酸或多肽(例如，FANC多肽，其可以是野生型或天然FANC多肽)或其功能片段或变体进行编码的核苷酸序列。
一方面，使用与CD34特异性结合的抗体或其功能片段来执行对低严格性CD34富集细胞群和高严格性CD34富集细胞群中的一种或两种的选择。一方面，使用10-20mL/min的流速来执行选择。
在一个实施例中，本发明提供了一种系统，所述系统包括：高严格性CD34富集细胞群，其通过在高严格性条件下选择CD34+细胞来由第一生物样品制备；以及低严格性CD34富集细胞群，其通过在低严格性条件下选择CD34+细胞来由第二生物样品制备，其中所述高严格性CD34富集细胞群或所述低严格性CD34富集细胞群中的一种或两种与针对范可尼贫血的重组基因疗法载体接触或已经被其转导。在某些实施例中，所述高严格性CD34富集细胞群存在于包括一种或多种药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂的第一药物组合物中，并且所述低严格性CD34富集细胞群存在于包括一种或多种药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂的第二药物组合物中。在一些实施例中，所述高严格性CD34富集细胞群和所述低严格性CD34富集细胞群两者均存在于包括一种或多种药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂的同一药物组合物中。在某些实施例中，所述高严格性CD34富集细胞群和所述低严格性CD34富集细胞群两者均已经被用于治疗范可尼贫血的所述基因疗法载体转导。在某些实施例中，所述基因疗法载体和/或所述经过转导的细胞包括对治疗性核酸或多肽(例如，FANC多肽，其可以是野生型或天然FANC多肽)或其功能片段或变体进行编码的核苷酸序列。
在另一个实施例中，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：高严格性CD34富集细胞群，其通过在高严格性条件下选择CD34+细胞来由第一生物样品制备；以及低严格性CD34富集细胞群，其通过在低严格性条件下选择CD34+细胞来由第二生物样品制备，其中所述高严格性CD34富集细胞群或所述低严格性CD34富集细胞群中的一种或两种已经用重组基因疗法载体转导。在特定实施例中，所述基因疗法载体为慢病毒。在某些实施例中，所述基因疗法载体对治疗性FANC(例如，FANCA或FANCC或FANCG)基因片段或蛋白质或其功能变体或片段进行编码。所述药物组合物可以包括一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。
根据以下详细描述和权利要求，本发明的其它特征和优点将变得显而易见并被其涵盖在内。
附图说明
图1示出了说明性重组基因疗法质粒载体pCCL-PGK-FANCAW-82-RO的图。
具体实施方式
范可尼贫血(FA)对药品生产提出了多个独特的挑战。对于FA，与其它离体基因疗法应用一样，用于基因转移的靶细胞群表达CD34细胞表面蛋白。当通过流式细胞术分析CD34+细胞时，FA患者的CD34+BM细胞的比例低于健康个体的CD34+BM细胞的比例，分别为0.1-1.5％和1-3％。考虑到FA患者中有限的CD34+细胞随年龄下降的公认特性，来自由FA患者的mPB起始材料生产的原料药的CD34+细胞的绝对值较低并不令人惊讶。然而，来自FA患者的较低CD34+产率和低纯度令人担忧，因为这直接影响了所生产的药品的潜在功效。
在标准CD34+细胞富集下，免疫磁珠结合低百分比的CD34+细胞(相对于总细胞)；因此，柱相对迅速地加载(mL/min)，并且洗涤很严格，因为纯度是首要目标。本发明的发明人认识到以下问题，即当使用来自FA患者的mPB时，该方法提供了低CD34产率的次优结果。
为了解决标准CD34+细胞富集方案对FA患者的限制，本发明的发明人开发了用于由FA患者制备CD34+细胞群的新方法，这产生更高的产率和有效的药品。这些方法涉及制备两种细胞群，一种在标准CD34+细胞富集条件(“高严格性”条件)下选择，而另一种在“低严格性”条件下选择。用合适的基因疗法载体转导这两种细胞群中的一种或两种，并施用于FA患者。如本文所示，新方法显示出有利的治疗效果。不受理论的束缚，据信在具有较低CD34+细胞纯度的细胞制剂中存在的较高数量的CD34+细胞或存在其它细胞或其它因素有助于根据本文所公开的方法制备的组合物的惊人功效。
因此，本公开提供了用于制造和使用基因修饰或基因修正的干细胞进行基因疗法的系统和方法。具体地，本文提供了用于治疗疾病或病症(例如，范可尼贫血)的方法，其中通过高严格性CD34+选择和低严格性CD34+选择的组合来选择受试者的干细胞，使用对治疗剂(例如，FANC蛋白)进行编码的载体转导，并且将其施用于所述受试者。出乎意料的是，用治疗载体转导的高严格性选择的CD34+细胞和低严格性选择的CD34+细胞的组合进行的治疗引起经过改善的治疗疗效，与常规高严格性制剂相比，所述高严格性选择的CD34+细胞和所述低严格性选择的CD34+细胞组合具有更低的CD34+细胞纯度。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明涉及的领域的普通技术人员通常理解的含义相同。虽然类似于或等同于本文所描述的那些方法和材料的方法和材料可以用于本发明的实践中，但是下面描述了合适的方法和材料。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用以其全部内容明确地并入。在发生冲突的情况下，应以本说明书(包含定义)为准。另外，本文所描述的材料、方法和实例仅是说明性的，而非限制性的。
一方面，提供了用于在高严格性条件下和/或在低严格性条件下由生物样品制造高严格性和低严格性CD34富集细胞群(例如，通过用与CD34特异性结合的抗体或其功能片段进行基于珠粒的磁性选择)；以及用于使用这些CD34富集细胞群制备可用于哺乳动物(以及具体地是人类)的疾病、病症和功能障碍的靶向基因疗法的药物的方法和系统。
另一方面，本发明提供了一种HSC移植方案，所述移植方案用于基于施用高严格性和低严格性CD34富集细胞群来治疗范可尼贫血和与FANC基因产物相关的病症，其中CD34富集细胞群中的一个或两个与(例如，用携带FANCA、FANCC或FANCG基因区段的慢病毒载体转导的)基因疗法载体接触，或与诱导FANC基因的位点特异性修复的基因疗法载体(例如，CRISP-Cas)接触。
在一些实施例中，生物样品是从受试者(例如，待治疗的受试者)获得的外周血或骨髓。在某些实施例中，生物样品是在已经用G-CSF、plerifaxor或G-CSF和plerifaxor的组合治疗受试者之后获得的外周血。在一个实施例中，通过对外周血执行一次或多次单采血液成分术来制备所述生物样品中的一种或两种。本公开将这些方法统称为“动员的白细胞清除术”。
在一些实施例中，在高严格性条件下选择CD34+细胞包括：将所述生物样品应用于结合CD34+细胞的捕获基质；使用洗涤缓冲液洗涤所述捕获基质一次或多次；以及使用洗脱缓冲液从所述捕获基质中洗脱所述高严格性CD34富集细胞群。在一些情况下，将生物样品再次应用于捕获基质一次或多次，如2次、3次、4次、5次或6次。在一个实施例中，以5-10mL/min、5-15mL/min、15-20mL/min、20-25mL/min或25-30mL/min执行所述应用步骤。在特定实施例中，以5-10mL/min、5-15mL/min、15-20mL/min、25-25mL/min或25-30mL/min执行所述洗脱步骤。在一个实施例中，以10-20mL/min执行所述应用步骤。在一个实施例中，以20mL/min执行所述洗脱步骤。在一些实施例中，洗涤步骤包括使用洗涤缓冲液洗涤捕获基质一次或多次。在一些情况下，洗涤缓冲液的体积为至少100mL、至少200mL、至少300mL、至少400mL、至少500mL或更多。在一个实施例中，以5-10mL/min、5-15mL/min、15-20mL/min、20-25mL/min或25-30mL/min执行所述洗涤步骤。在一个实施例中，以10-20mL/min执行所述洗涤步骤。在一些实施例中，洗涤缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其具有任选地例如浓度为约2.5％w/v的乙二胺四乙酸(EDTA)和/或任选地人血清白蛋白。在一些实施例中，洗脱缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其具有任选地例如浓度为约2.5％w/v的乙二胺四乙酸(EDTA)和/或任选地人血清白蛋白。在一些实施例中，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液是低渗的。
在一些实施例中，在低严格性条件下选择CD34+细胞包括：将所述生物样品应用于结合CD34+细胞的捕获基质；允许所述生物样品的未结合级分流过所述捕获基质；以及使用洗脱缓冲液从所述捕获基质中洗脱所述低严格性CD34富集细胞群。在一个实施例中，以1-2mL/min、2-3mL/min、1-2mL/min、1-2mL/min、5-10mL/min、5-15mL/min、15-20mL/min执行所述应用步骤。在一个实施例中，以5-10mL/min、5-15mL/min、15-20mL/min、25-25mL/min或25-30mL/min执行所述洗脱步骤。在一个实施例中，以10-20mL/min执行所述应用步骤。在一些实施例中，以约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或比高严格性条件下的流速低的流速(例如比高严格性条件下使用的流速低至少10％、低至少20％、低至少30％、低至少40％、低至少50％、低至少60％、低至少70％、低至少80％或低至少90％的流速)执行所述应用步骤。在一些实施例中，洗涤步骤包括使用洗涤缓冲液洗涤捕获基质一次或多次。在一些情况下，洗涤缓冲液的体积为500ml、400mL、300mL、200mL、100mL或更小，例如小于500mL、小于400mL、小于300mL、小于200mL或小于100mL。在一些情况下，省略了洗涤步骤。在一个实施例中，以5-10mL/min、5-15mL/min、15-20mL/min、20-25mL/min或25-30mL/min执行所述洗涤步骤。在一个实施例中，以10-20mL/min执行所述洗涤步骤。在一些实施例中，洗涤缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其具有任选地例如浓度为约2.5％w/v的乙二胺四乙酸(EDTA)和/或任选地人血清白蛋白。在一些实施例中，洗脱缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其具有任选地例如浓度为约2.5％w/v的乙二胺四乙酸(EDTA)和/或任选地人血清白蛋白。在一些实施例中，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液是低渗的。
在一些实施例中，通过基于珠粒的磁性选择来执行所述选择。在一个实施例中，与CD34特异性结合的抗体或其功能片段用于选择，例如基于珠粒的磁性选择。在一些情况下，使用10-20mL/min的流速来执行所述选择。在一些情况下，流速为1、5、10、15、20、25、30mL/min或更大或其间的任何值。
在实施例中，高严格性CD34富集细胞群与重组基因疗法载体接触；低严格性CD34富集细胞群与重组基因疗法载体接触；或者高严格性和低严格性CD34富集细胞群两者均与重组基因疗法载体接触。在特定实施例中，载体为病毒、脂质体或脂质或脂质样纳米颗粒。在一些情况下，病毒为慢病毒、腺相关病毒、腺病毒或泡沫病毒。
在一些实施例中，所述高严格性CD34富集细胞群中CD34+细胞的百分比比所述低严格性CD34富集细胞群中CD34+细胞的百分比大两到四倍。
在本发明的方法或系统的实施例中，所述重组基因疗法载体包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列按以下5'到3'顺序包括：(a)真核活性启动子序列；以及(b)对人FANC基因多肽或其功能片段或变体进行编码的序列；并且所述对所述人FANC基因多肽或其功能片段或变体进行编码的序列与所述真核活性启动子序列可操作地连接；在一些实施例中，所述FANC基因选自FANCA、FANCC和FANCG。
在一个实施例中，所述方法抑制所述受试者的疾病或病症(例如，范可尼贫血)的血液学表现的发展、停止所述血液学表现的进展和/或逆转所述血液学表现的进展；并且任选地，范可尼贫血的所述血液学表现选自以下中的一种或多种：骨髓衰竭(BMF)、血小板减少症、白细胞减少症、全血细胞减少症、中性粒细胞减少症和贫血。在一个实施例中，所述方法引起基因修饰的范可尼贫血细胞(或患有如骨髓增生性病症或免疫缺陷病症等另一种疾病或病症的受试者的细胞)随时间推移而逐渐增加。在一个实施例中，方法引起在向所述受试者施用所述高严格性CD34富集细胞群和所述低严格性CD34富集细胞群之前已经在所述受试者中下降的一种或多种血液学参数(例如，血红蛋白)得到恢复。
在一个实施例中，所述方法引起在向所述受试者施用所述高严格性CD34富集细胞群和所述低严格性CD34富集细胞群之前已经在所述受试者中下降的一种或多种造血谱系得到恢复；并且该一种或多种造血谱系可以包括以下中的一种或多种：淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、红细胞和血小板。在一些情况下，可以完成特定细胞群的恢复。可以通过本领域已知的各种方法来监测恢复，如流动辅助的细胞分选、血细胞计数或显微镜检查。
本发明进一步提供了用于这些方法的任何实施例的组合物和系统。本发明提供了用于药物中的CD34富集细胞群，包含但不限于用基因疗法载体(例如，包括对人FANC蛋白或其功能变体或片段进行编码的多核苷酸序列的基因疗法载体)转导的CD34富集细胞群。
如本文中使用的，“高严格性”或“高严格性条件”是指富集细胞群的方法，所述方法旨在引起对表达特定生物标志物(例如，CD34)的细胞进行大量细胞富集。例如，临床上使用的“高严格性”CD34富集导致平均值：61.6％和中值：CD34+细胞的65.7％产率和平均值：88.5％和中值：95.9％相对纯度(N＝166)(《临床实验室(Clin Lab.)》2016年7月1；62(7):1243-1248(PMID:28164638))。“高严格性”是指以大量富集相对少见的细胞类型CD34+为目标的过程，所述相对少见的细胞类型CD34+通常包括介于0.2-2％之间的动员的白细胞清除术或骨髓收集中的细胞产物。高严格性富集来自动员的白细胞清除术或骨髓收集中的CD34+细胞以百分比从0.2-2％增加到>80％的最终CD34+为靶标。为此，在初步将生物样品应用到捕获基质之后，以移除弱结合或非特异性结合到捕获基质的细胞为目标来执行在本文中称为“洗涤”的重复的缓冲液交换。通常，在每个洗涤周期中将细胞从捕获基质中移除并重新应用。移除和重新应用可以通过从试管中移液而手动地完成或使用泵和试管系统而自动化。例如，使用与
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磁性细胞分离系统耦接的Quad Technologies
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细胞磁性颗粒复合物在磁性支架上的试管中被分离并且手动完成洗涤。使用美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)
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系统，预设置的自动化程序将细胞磁性颗粒复合物应用到管组中的磁柱并且使用阀泵系统完成洗涤/重新应用。在某些实施例中，可以在各种器械上执行在高严格性条件下的选择，包含但不限于美天旎生物技术公司MACSQuant
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Quad Technologies
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GE
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细胞分离系统、Terumo
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细胞分离系统、COBE
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细胞分离器、SynGen
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或
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系统、Fresenius-Kabi
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美天旎生物技术公司
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系统或CliniMACS
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系统。可以在实验室中或定点照护时执行选择。例如在国际专利公开第WO/2016/118780号中描述了用于制备和富集细胞和细胞群的详细方法，包含用于在高严格性条件下选择CD34+细胞的示例性方法。美国专利第8,727,132号提供了对高严格性选择有用的说明性选择方法。
在高严格性富集方案中，包括CD34+细胞的生物样品标记有CD34标记试剂，例如直接缀合的免疫磁珠。生物样品可以悬浮在任何合适的流体中，如但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其具有任选地在与细胞活力相容的缓冲液pH和等渗性下的乙二胺四乙酸(EDTA)。在一些情况下，所使用的流体还含有适当浓度(如约2.5％)的人血清白蛋白。使用磁性活化细胞分选(MACS)技术，生物样品在被标记后应用于柱，所述柱包含磁敏感材料或铁磁材料。使用MACS系统，柱的磁敏感材料或铁磁材料保留靶细胞，而不影响非靶细胞流过并离开所述柱的能力。这种磁敏感材料或铁磁材料包含铁、钢、钴镍和其合金的其它铁磁稀土金属。本领域的技术人员将理解的是，这种材料可以容易地被磁化和消磁。在一些实施例中，生物样品在磁敏感材料或铁磁材料上再循环一次或多次。在柱装载后，将结合的细胞以低速洗涤、洗脱和/或重新装载到柱上，以增加富集级分的纯度。合适的洗涤缓冲液包含具有(任选地)EDTA和(任选地)人血清白蛋白的PBS。在洗涤步骤期间移除的标记的生物样品的任何组分都收集在废物或“非靶标”袋中。在合适的洗涤步骤后，高严格性富集的细胞被洗脱到靶细胞袋中。
如本文所使用的，“低严格性”或“低严格性条件”是指一种富集细胞群的方法，所述方法旨在以与通过高严格性选择实现的产率相比保持更高的富集细胞群产率的方式以富集与生物样品中的其它细胞相比表达生物标记物的细胞(即，减少的富集)为代价引起表达特定生物标记物(例如，CD34)的细胞富集。根据定义，高严格性条件下的富集倍数大于低严格性条件下的富集倍数。在一些情况下，高严格性(CD34或其它标志物)富集细胞群中的细胞(例如，CD34+细胞)的富集倍数是低严格性(CD34或其它标志物)富集细胞群中的CD34+细胞的富集倍数的2、2.25、2.5、2.75、3、3.25、3.5、3.75或4倍。在一个实施例中，高严格性(CD34或其它标志物)富集细胞群中的细胞(例如，CD34+细胞)的富集倍数是低严格性(CD34或其它标志物)富集细胞群中的CD34+细胞的富集倍数的2到4倍。在某些实施例中，可以在各种器械上执行在低严格性条件下的选择，包含但不限于美天旎生物技术公司MACSQuant
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Quad Technologies
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GE
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细胞分离系统、Terumo
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细胞分离系统、COBE
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细胞分离器、SynGen
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或
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系统、Fresenius-Kabi
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美天旎生物技术公司
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系统或CliniMACS
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系统。可以在实验室中或定点照护时执行选择。
在低严格性富集方案中，包括CD34+细胞的生物样品标记有CD34标记试剂，例如直接缀合的免疫磁珠。使用磁性活化细胞分选(MACS)技术，生物样品在被标记后以与在高严格性富集下相比更低的流速应用于含有磁敏感材料或铁磁材料的柱上。与高严格性富集一样，磁敏感材料或铁磁材料保留靶细胞，而不影响非靶细胞流过并离开所述柱的能力。在一些实施例中，生物样品在磁敏感材料或铁磁材料上再循环一次或多次。在柱装载后，对于低严格性富集，在低严格性下洗涤结合的细胞。然后将结合的细胞洗脱到收集袋中。
在一个示例性实施例中，通过修改MACS系统的标准操作程序来执行低严格性富集，使得旨在实现高严格性消耗(即移除靶细胞)的“消耗模式”软件程序反而导致低严格性富集。MACS系统在消耗模式下的操作使生物样品中的靶细胞使用与在富集模式下的操作相比更慢的柱加载和更低严格性洗涤步骤与柱中的磁敏感材料或铁磁材料结合。非靶细胞被MACS系统冲洗到洗涤或所谓的“靶标”袋中。消耗模式程序随后切换输出阀，以将流体引导到所谓的“非靶标”袋中，并且然后对柱进行消磁。在消磁柱上持续应用流体引起CD34+富集细胞群洗脱到所谓的“非靶标”袋中，所述CD34+富集细胞群已经在低严格性条件下被富集，所述“非靶标”袋使用该方法收集靶细胞。
本领域的技术人员将认识到，可以在各种器械上执行这种低严格性富集方法，包含但不限于美天旎生物技术公司MACSQuant
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Quad Technologies
Figure BDA0002672978790000124
GE
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细胞分离系统、Terumo
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细胞分离系统、COBE
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细胞分离器、SynGen
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或
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系统、Fresenius-Kabi
Figure BDA00026729787900001210
美天旎生物技术公司
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系统或CliniMACS
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系统。本领域的技术人员无需过多的实验就能够对这种MAC系统的软件进行重新编程，使得输出阀将初始结合步骤的流通引导到废物或“非靶标”袋(而不是靶标袋)，并将洗脱的低严格性CD34富集群引导到“靶标”袋。实际上，低严格性富集是在分离模式下进行的，而不需要常规MAC程序的常规洗涤步骤。
如本文所使用的，“载体”是指包括多核苷酸或与多核苷酸缔合并且可以用于介导多核苷酸到细胞的递送的大分子或大分子的缔合物。说明性载体包含例如质粒、病毒载体(例如，逆转录病毒载体，如慢病毒载体)、脂质体和其它基因递送媒剂。
术语“LV”是慢病毒的缩写，并且可以用于指病毒本身或其衍生物。除非另有要求，否则所述术语涵盖所有亚型以及天然存在的形式和重组形式两者。
如本文所使用的，术语“基因”或“编码序列”是指对基因产物进行编码的体外或体内核苷酸序列。在一些情况下，基因由编码序列组成或基本上由编码序列组成，所述编码序列即对基因产物进行编码的序列。在其它情况下，基因包括另外的非编码序列。例如，基因可以包含或可以不包含在编码区域之前和之后的区域，例如，5'非转译(5'UTR)或“前导”序列和3'UTR或“尾”序列，以及各个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
如本文所使用的，“治疗性基因”是指当表达时对所述治疗性基因所存在于的细胞或组织或对表达所述基因的哺乳动物赋予有益效果的基因。有益效果的实例包含改善病状或疾病的体征或症状、预防或抑制病状或疾病或者赋予期望的特性。治疗性基因包含修正细胞或哺乳动物中的遗传缺陷的基因。
如本文所使用的，转基因是由载体递送到细胞的基因。
如本文所使用的，术语“基因产物”是指多核苷酸序列的期望的表达产物，如多肽、肽、蛋白质或干扰RNA，包含短干扰RNA(siRNA)、miRNA或小发夹RNA(shRNA)。在某些实施例中，基因产物是治疗性基因产物，其当被表达时对所述治疗产物所存在于的细胞或组织或对表达所述基因的哺乳动物赋予有益效果。
如本文所使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指任何长度的氨基酸的聚合物。这些术语还涵盖已经修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、聚乙二醇化、磷酸化或与标记组分缀合。
“包括”意指所列元件是例如组合物、方法、试剂盒等中必需的，但是可以包含其它元件以在权利要求的范围内形成例如组合物、方法、试剂盒等。例如，“包括”对与启动子可操作地连接的治疗性多肽进行编码的基因的表达盒是除基因和启动子以外可以包含其它元件的表达盒，其它元件例如聚腺苷酸化序列、增强子元件、其它基因、连接子结构域等。例如，制备或治疗“包括”制备CD34富集细胞群的方法是可以包含制备CD34富集细胞群的其它步骤的方法，例如施用药剂以动员干细胞、施用诱导疗法或共同施用药物作为其组合。
如本文所使用的，关于低严格性条件的术语“包括(comprising)”或“包括(comprises)”不应被解释为允许在相同的选择步骤期间向同一样品应用另外的高严格性选择。应当理解，在低严格性条件和高严格性条件下进行选择将导致高严格性选择，而低严格性选择在本文中明确限定为不包含高严格性条件下的选择。通过在低严格性条件下选择CD34+细胞来制备低严格性CD34富集细胞群可以包含开放式的其它方法步骤，只要在将生物样品装载到柱上与从柱上洗脱低严格性CD34富集细胞群之间，就不在高严格性条件下洗涤柱。
“基本上由……组成”意指对实质上不影响例如组合物、方法、试剂盒等的一个或多个基本和新颖特征的特定材料或步骤所描述的例如组合物、方法、试剂盒等的范围的限制。例如，“基本上由”对可操作地连接到启动子和多腺苷酸化序列的治疗性多肽进行编码的基因“组成”的表达盒可以包含另外的序列，例如，连接子序列，只要所述另外的序列实质上不影响基因的转录或转译。作为另一个实例，“基本上由列举的序列组成”的变体或突变多肽片段具有列举的序列的、基于全长初始多肽在序列的边界处加上或减去约10个氨基酸残基的氨基酸序列，例如比列举的结合氨基酸残基少10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个残基或者比列举的结合氨基酸残基多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个残基，所述氨基酸序列源自全长初始多肽。
“由……组成”意味着不包含具有权利要求书中未指定的任何要素、步骤或成分的组合物、方法或试剂盒。例如，“由对与启动子可操作地连接的治疗性多肽进行编码的基因以及转录后调节元件组成”的表达盒仅由启动子、对治疗性多肽进行编码的多核苷酸序列和转录后调节元件组成。作为另一个实例，“由列举的序列组成”的多肽仅含有列举的序列。
如本文所使用的，“骨髓细胞”或“骨髓干细胞”在本文中是指直接从骨髓获得的细胞，如通过活组织检查获得的细胞以及从源自骨髓的外周血获得的细胞，如在动员后获得的细胞。
如本文所使用的，“表达载体”涵盖载体，例如如上文所讨论的或如本领域中已知的质粒、微环、病毒载体、脂质体等，并且用于在预期靶细胞中实现基因产物的表达，所述载体包括对关注的基因产物进行编码的多核苷酸。表达载体还包括与编码区域操作性地连接以促进基因产物在靶标中表达的控制元件。控制元件(例如，启动子、增强子、UTR、miRNA靶向序列等)和与其可操作地连接以供表达的一个或多个基因的组合有时被称为“表达盒”。许多这种控制元件在本领域中是已知且可获得的或者可以由本领域中可获得的组分容易地构建。
如本文所使用的，“启动子”涵盖引导RNA聚合酶的结合并且从而促进RNA合成的DNA序列，即足以直接转录的最小序列。启动子和对应的蛋白质或多肽表达可以是普遍存在的，这意味着在广泛范围的细胞、组织和物种中具有强活性或者细胞类型特异性、组织特异性或物种特异性。启动子可以是“组成型的”(意指持续活性)或“诱导型的”(意指启动子可以通过生物因子或非生物因子的存在或不存在而活化或失活)。还包含在本发明的核酸构建体或载体中的是增强子序列，所述增强子序列可以或可以不与启动子序列邻接。增强子序列影响启动子依赖性基因表达并且可以位于天然基因的5'区或3'区。
如本文所使用的，“增强子”涵盖刺激或抑制相邻基因的转录的顺式作用元件。抑制转录的增强子也被称为“沉默子”。增强子可以在任一朝向上在距编码序列和转录区下游的位置几千碱基对(kb)的距离上起作用(即，可以与编码序列缔合)。
如本文所使用的，“终止信号序列”涵盖使RNA聚合酶终止转录的任何遗传元件，如例如多腺苷酸化信号序列。
如本文所使用的，术语“操作性地连接”或“可操作地连接”是指遗传元件(例如，启动子、增强子、终止信号序列、多腺苷酸化序列等)的并列，其中元件处于允许其以预期方式操作的关系中。例如，如果启动子帮助启动对编码序列进行转录或表达，则启动子与编码区域可操作地连接。只要维持这种功能关系，启动子与编码区域之间就会存在插入残基。
如本文所使用的，术语“异源”意指源自与其所比较的实体的其余部分的基因型不同的实体。例如，通过基因工程技术引入到源自不同物种的质粒或载体中的多核苷酸是异源多核苷酸。作为另一个实例，从启动子的天然编码序列中移除并且与未发现与启动子有天然连接的编码序列操作性地连接的启动子是异源启动子。因此，例如，包含对异源基因产物进行编码的异源核酸的LV载体是包含通常不包含在天然存在的野生型LV中的核酸的LV载体，并且经过编码的异源基因产物是通常不由天然存在的野生型LV编码的基因产物。
如本文所使用的，关于核苷酸分子或基因产物的术语“内源性”是指核酸序列(例如，基因或遗传元件)或天然存在于宿主病毒或细胞中或与其相缀合的基因产物(例如，RNA、蛋白质)。
如本文所使用的，术语“天然的”是指核苷酸序列(例如，基因)或基因产物(例如，RNA、蛋白质)存在于野生型病毒或细胞中。如本文所使用的，术语“变体”是指参考多核苷酸或多肽序列的突变体或变体，例如天然多核苷酸或多肽序列，即与参考多核苷酸或多肽序列具有小于100％序列同一性。换句话说，变体相对于参考多核苷酸序列包括至少一个氨基酸差异(例如，氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失)，例如天然多核苷酸或多肽序列。例如，变体可以是与全长天然多核苷酸序列具有70％或更高序列同一性的多核苷酸，例如与全长天然多核苷酸序列具有75％、80％或更高同一性，如85％、90％或95％或更高，例如98％或99％同一性。作为另一个实例，变体可以是与全长天然多肽序列具有70％或更高序列同一性的多肽，例如与全长天然多肽序列具有75％、80％或更高同一性，如85％、90％、或95％或更高，例如98％或99％同一性。变体还可以包含与参考例如天然序列的片段共享70％或更高序列同一性的参考例如天然序列的变体片段，例如与天然序列共享75％、80％或更高同一性，如85％、90％、或95％或更高，例如98％或99％同一性。
如本文所使用的，术语“生物活性(biological activity)”和“生物活性(biologically active)”是指归因于细胞中的特定生物要素的活性。例如，“免疫球蛋白”、“抗体”或其片段或变体的“生物活性”是指结合抗原决定簇并且从而促进免疫功能的能力。作为另一个实例，多肽或其功能片段或变体的生物活性是指多肽或其功能片段或变体实现其例如结合、酶活性等的天然功能的能力。作为第三实例，基因调节元件(例如，启动子、增强子、Kozak序列等)的生物活性是指调节元件或其功能片段或变体分别调节(即，促进、增强或活化)其可操作地连接的基因的表达的转译的能力。
如本文所使用的，术语“施用”或“引入”是指将细胞群递送给受试者，例如通过动脉内或静脉内将细胞群输注到受试者的血液中。可以在如盐水等各种溶液中施用细胞群。在一些实施例中，所使用的溶液将与受试者的血液等渗，并进行pH缓冲。
“转化”通常用于指将异源DNA引入到细菌或其它细胞中，或引入表达致癌基因并且已经转换为连续生长模式的细胞，如肿瘤细胞。用于“转化”细胞的载体可以是质粒、病毒或其它媒剂。
根据用于将异源DNA(即载体)施用、引入或插入到细胞中的方式，细胞通常被称为“转导”、“感染”、“转染”或“转化”。术语“转导”、“转染”和“转化”可以在本文中可互换地使用，而不论引入异源DNA的方法如何。
如本文所使用的，术语“宿主细胞”是指已经用载体转导、感染、转染或转化的细胞。载体可以是质粒、病毒颗粒、噬菌体等。培养条件(如温度、pH等)是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。应当理解，术语“宿主细胞”是指原始转导、感染、转染或转化的细胞和其子代。
术语“治疗(treatment、treating)”等在本文中通常用于意指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果在完全或部分地预防疾病或其症状方面可以是预防性的，例如降低受试者体内发生疾病或其症状的可能性，和/或在部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的不良反应或减缓疾病进展方面可以是治疗性的。如本文所使用的，“治疗”覆盖对哺乳动物的疾病的任何治疗并且包含：(a)预防疾病在可能倾向于患有疾病但尚未被诊断为患有疾病的受试者身上发生；(b)抑制疾病，即，阻止其发展；或(c)减轻疾病，即，使疾病消退。可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用治疗剂。特别关注了对发展中的疾病的治疗，其中所述治疗稳定或减少了患者的不期望的临床症状。理想的是，在受影响组织的功能完全丧失之前执行这种治疗。可以在疾病的症状期期间并且在一些情况下在疾病的症状期之后施用主题疗法。在某些实施例中，在基因测试后对受试者施用治疗，所述基因测试将受试者鉴定为具有与疾病相关或导致疾病的突变，例如FA。
术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用并且是指哺乳动物，包含但不限于：人和非人灵长类动物，包含猿类和人类；哺乳类运动动物(例如，马)；哺乳类农场动物(例如，绵羊、山羊等)；哺乳类宠物(狗、猫等)；以及啮齿动物(例如，小鼠、大鼠等)。
如本文所使用的，应用于多肽的“片段”通常为至少10个氨基酸残基，更典型地为至少20个残基，并且其长度优选地为至少30个(例如50个)残基，但少于整个完整序列。可以通过本领域技术人员已知的方法来产生片段，例如通过天然存在的或重组的蛋白质的酶消化、通过使用对所限定片段进行编码的表达载体的重组DNA技术或通过化学合成。可以通过本文所描述的方法评估候选片段结合特定DNA序列的能力。纯化的片段或抗原片段可以用于分离调节区域或产生新的调节酶(例如，使用来自不同酶的多种功能片段)，并且产生抗体，所有这些都采用本领域技术人员已知的标准方案。如本文所使用的，“功能片段”意指不仅涵盖保留生物活性的那些肽片段，而且涵盖保留与特定核苷酸序列的结合特异性的那些肽片段。
抗CD34抗体的“功能片段”是能够以足够的亲和力和特异性与细胞表面的CD34分子结合以允许选择或富集CD34+细胞的片段。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同的”或百分比“同一性”是指当针对最大对应性进行比较和比对时，相同的或具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列。为了确定同一性百分比，对序列进行比对以用于最佳比较的目的(例如，可以在第一个氨基酸序列或核酸序列中引入空位，以与第二个氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。然后将对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一序列中的位置被与在第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在所述位置处是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数量的函数(即，同一性％＝相同位置的#/总位置(例如，重叠位置)#×100)。在一些实施例中，两个序列长度相同。
将空位罚分考虑在内，用于执行最佳比对的说明性计算机程序是GCG威斯康星州Bestfit包(美国威斯康星大学；Devereux等人(1984)《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》12:387)。可以执行序列比较的其它软件的实例包含但不限于BLAST包(参见Ausubel等人,(1999)同上-第18章),FASTA(Atschul等人,(1990)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》403-410)、GENEWORKS比较工具套件、可以使用的GCG Bestfit程序和BLAST2序列(参见《FEMS微生物学快报(FEMS Microbiol Lett)》(1999)174:247-50；《FEMS微生物学快报》(1999)177:187-8)。可以使用缩放的相似性分数矩阵，所述矩阵基于化学相似性或进化距离为每个成对比较分配分数。这种矩阵的实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序套件的默认矩阵。GCG威斯康辛程序可以使用公共默认值或自定义符号对照表(如有提供)(更多细节参见用户手册)。
在两种核酸或多肽的上下文中，术语“基本相同”是指两种或更多种序列或子序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性(例如，如使用下文所示方法中的一种方法所确定的)。
除非通过上下文另外说明，否则“变体”是相对于第二多肽(也称为“衍生物”)具有一个或多个非保守或保守氨基酸取代的多肽或其片段；或通过第二分子的共价连接修饰的多肽或其片段，例如通过连接异源多肽或通过糖基化、乙酰化、磷酸化等。“变体”的定义进一步包含例如含有一种或多种氨基酸类似物(例如，非天然氨基酸等)的多肽、具有未经取代的连接的多肽以及本领域已知的(天然的和非天然存在的)其它修饰。
以下描述了本发明的各种组合物和方法。尽管本文例示了特定的组合物和方法，但是应当理解，多个替代性组合物和方法中的任何替代性组合物和方法均是适用的并且适于用于实践本发明。还应当理解，可以使用本领域中标准的程序对本发明的表达构建体和方法进行评估。
除非另有指示，否则本发明的实践采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的技术范围内。此类技术在文献中进行了充分解释，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》,第二版(Sambrook等人,1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编,1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编,1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社公司(Academic Press,Inc.))；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987)；《分子生物学实验指南(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编,1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编,1994)；《免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编,1991)，上述文献中的每个文献通过引用的方式并入本文。
下文参考用于说明的示例应用描述了本发明的若干个方面。应当理解，阐述了许多特定细节、关系以及方法从而提供对本发明的充分理解。然而，相关领域普通技术人员很容易认识到，可以在没有具体细节中的一个或多个具体细节的情况下或用其它方法实践本发明。本发明不受所说明的动作或事件的排序的限制，因为一些动作可以以不同的顺序和/或与其它动作或事件同时发生。此外，实施根据本发明的方法不需要所有说明的动作或事件。
本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不旨在限制本发明。本文中所使用的单数形式“一个/一种(a、an)”和“所述(the)”旨在也包含复数形式，除非上下文另外明确指示。此外，在具体实施方式和/或权利要求书中使用术语“包含(including)”、“包含(include)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“具有(with)”或其变体的情况下，此类术语旨在以类似于术语“包括(comprising)”的方式是包含性的。
术语“约(about)”或“大约(approximately)”意指在如由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于所述值是如何测量或确定的，即，测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以意指在1个或大于1个标准偏差内。可替代地，“约”可以意指给定值的高达20％、优选地高达10％、更优选地高达5％并且还更优选地高达1％的范围。可替代地，特别是对于生物系统或过程，所述术语可以意指在值的数量级内，优选地在5倍内并且更优选地在2倍内。当在本申请和权利要求书中描述特定值时，除非另外指出，否则应当假设术语“约”意指在特定值的可接受误差范围内。
本文所提及的所有出版物均以引用的方式并入本文中，以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。应当理解，在存在矛盾的情况下，本公开代替所并入的出版物的任何公开内容。
应当进一步指出的是，权利要求书可以撰写为排除任何可选择的要素。因此，本声明旨在用作使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定型”限定的前提基础。
仅提供在本申请的提交日期之前的本文所讨论的出版物中的公开内容。进一步地，所提供的出版日期可能与实际的出版日期不同，实际的出版日期可能需要独立地确认。
除非另有指示，否则本文所使用的所有术语具有与本领域技术人员所知的含义相同的含义，并且实践本发明将采用微生物学的常规技术和重组DNA技术，所述技术在本领域技术人员的知识范围内。
用于制备、转导和使用CD34+富集细胞群的方法
一方面，本公开提供了制备CD34+细胞富集细胞群的方法，所述细胞群包含基因修饰的CD34+细胞。在某些实施例中，所述方法包括制备两种CD34富集细胞群，一种使用低严格性条件制备，而另一种使用高严格性条件制备。如本文所示，使用低严格性CD34富集细胞群和高严格性CD34富集细胞群的组合有利地引起受试者中CD34+干细胞出乎意料地有效重建。
另一方面，本公开提供了通过向受试者提供治疗有效量的一种或多种CD34+细胞富集的细胞群治疗患有疾病或病症的受试者的方法，所述细胞群包含基因修饰的CD34+细胞，其中所述基因修饰的C34+细胞对有效治疗疾病或病症的治疗剂进行编码。在特定实施例中，治疗剂是多肽或多核苷酸，例如RNA。在特定实施例中，CD34富集细胞群由从正在治疗的受试者获得的CD34细胞制备。
在本文所公开的方法的某些实施例中，产生了两种富集CD34+细胞的细胞群，所述细胞群包含高严格性CD34富集细胞群和低严格性CD34富集细胞群。这两种细胞群可以保持分离，或者其可以结合以产生包括高严格性CD34富集细胞和低严格性CD34富集细胞两者的混合细胞群。在特定实施例中，两种细胞群中的一种或两种用基因疗法载体转导，例如，对FANCA进行编码的LV载体或其功能片段或变体。
在特定实施例中，细胞可以来自任何哺乳动物物种，例如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、沙鼠、松鼠)、兔、猫科动物、犬科动物、山羊、绵羊、猪、马科动物、牛科动物、灵长类动物、人。在某些实施例中，细胞可以来自已建立的细胞系或者细胞可以是原代细胞，其中“原代细胞”、“原代细胞系”和“原代培养物”在本文中可互换使用来指代源自于受试者的细胞和细胞培养物并且允许在体外生长培养物的有限数量的传代，即分裂。例如，原代培养物是可能已经传代0次、1次、2次、4次、5次、10次或15次，但次数不足以渡过危机期的培养物。通常，本发明的原代细胞系在体外维持少于10代。
在某些实施例中，所述方法包括由从受试者获得的生物样品制备CD34富集细胞群。在一个实施例中，生物样品是骨髓样品。在另一个实施例中，生物样品是外周血。
在特定实施例中，生物样品(例如，外周血)是在造血干细胞(HSC)的动员之后从受试者中获得的。在一个实施例中，通过例如以足以在患者中引起HSC的动员的数量和时间用G-CSF或其类似物治疗受试者来动员HSC和/或祖细胞。可以在收集生物样品之前动员外周血中的HSC和祖细胞(HSPC)。可以通过本领域中已知的任何方法来动员外周血HSC和HSPC。可以通过用本文中描述的或本领域中已知的增加HSC和/或HSPC在受试者的外周血中循环的数量的任何一种或多种药剂治疗受试者来动员外周血HSC和HSPC。除非另有说明，否则贯穿本说明书参考的HSC或HSPC旨在涵盖HSC和HSPC两者。例如，在特定实施例中，通过用一个或多个细胞因子或生长因子(例如，G-CSF、试剂盒配体(KL)、IL-I、IL-7、IL-8、IL-11、Flt3配体、SCF、促血小板生成素或GM-CSF(如沙格司亭(sargramostim)))治疗受试者来动员外周血。可以在用于动员外周血的方法中使用的不同类型的G-CSF包含非格司亭(filgrastim)和更长效G-CSF：培非格司亭(pegfilgrastim)。在特定实施例中，通过用一个或多个趋化因子(例如，巨噬细胞炎性蛋白-1a(MIP1a/CCL3))、趋化因子受体配体(例如，趋化因子受体2配体GROl3和GR013M)、趋化因子受体类似物(例如，基质细胞源性因子-1a(SDF-1a)蛋白类似物，如CTCE-0021、CTCE-0214或SDF-1a，如Met-SDF-113)或趋化因子受体拮抗剂(例如，趋化因子(C-X-C基序)受体4(CXCR4)拮抗剂，如AMD3100)治疗受试者来动员外周血。在特定实施例中，通过用一个或多个抗整合素信号传导药剂(例如，功能阻断抗极迟抗原4(VLA-4)抗体或抗血管细胞粘附分子1(VCAM-1))治疗受试者来动员外周血。在特定实施例中，通过用如环磷酰胺、依托泊苷或紫杉醇等一种或多种细胞毒性药物治疗受试者来动员外周血。在特定实施例中，通过向受试者施用以上所列药剂中的一种或多种药剂持续一定时间段来动员外周血。例如，在收集HSPC之前，可以通过注射(例如，皮下、静脉内或腹膜内)用一种或多种药剂(例如，G-CSF)治疗受试者每天一次或每天两次持续1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在具体实施例中，在最后剂量的用于将HSPC动员到外周血中的药剂之后的1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时或24小时内收集HSPC。在特定实施例中，通过用上文描述的或本领域已知的两种或更多种不同类型的药剂(如生长因子(例如，G-CSF)和趋化因子受体拮抗剂(例如，CXCR4受体拮抗剂，如AMD3100)或生长因子(例如，G-CSF或KL)和抗整合素药剂(例如，功能阻断VLA-4抗体))治疗受试者来动员HSC和HSPC。在一个实施例中，通过用G-CSF或其类似物治疗受试者来动员HSC和/或祖细胞。在一个实施例中，G-CSF是非格司亭。在一个实施例中，通过用普乐沙福(plerixafor)治疗受试者来动员HSC和/或祖细胞。在某些实施例中，使用非格司亭和普乐沙福的组合、通过单独地非格司亭或通过单独地普乐沙福来动员HSC和/或祖细胞。在特定实施例中，同时地或顺序地施用不同类型的动员剂。对于关于动员外周血的方法的另外的信息，参加例如Craddock等人,1997,《血液(Blood)》90(12):4779-4788；Jin等人,2008,《转化医学杂志(Journal ofTranslational Medicine)》6:39；Pelus,2008,《血液学新见(Curr.Opin.Hematol.)》15(4):285-292；Papayannopoulou等人,1998,《血液》91(7):2231-2239；Tricot等人,2008,《血液病学(Haematologica)》93(11):1739-1742；以及Weaver等人,2001,《骨髓移植(BoneMarrow Transplantation)》27(2):S23-S29。
在某些实施例中，通过注射器或插入到受试者的血管中的导管来获得外周血。例如，可以使用单采血液成分机来收集外周血。血液从血管中流动穿过导管到分离白细胞(包含来自血液的剩余部分的HSPC)的单采血液成分机中，并且然后将血液的剩余部分返回到受试者的身体。可以在若干个天数内(例如，1到5天)执行单采血液成分术直到已收集到足够的HSPC。
在某些实施例中，通过细针抽吸从受试者的后髂嵴中获得骨髓(参加例如，Koda等人,1984,《临床研究杂志(J.Clin Invest.)》73:1377-1384)。
在某些实施例中，可以确定生物样品的血细胞比容水平。可以通过在处理室内将样品离心使样品的RBC分离成层来确定血细胞比容水平，使得可以确定血细胞压积。应当理解，样品可以与抗凝血剂组合以便帮助确定血细胞比容水平，并且此种抗凝血剂可以在离心之前或期间添加到处理室。可替代地，可以通过测量样品的光学性质来确定血细胞比容水平。例如，可以使用光谱仪来分析样品。应当理解，可以使用任何类型的确定血细胞比容水平的已知光谱法，如例如拉曼光谱法和/或光散射技术。
在某些实施例中，生物样品消耗红细胞，例如在制备针对来自生物样品的CD34+细胞而富集的一种或多种细胞群，在一些实施例中，对在消耗技术之后剩余的细胞进行洗涤。在另一个实施例中，将非特异性IgG添加到经过洗涤的细胞。在一些实施例中，非特异性IgG是flebogamma。
可以通过在高严格性条件下选择CD34+细胞的细胞群和在低严格性条件下选择CD34+细胞的另一个细胞群来产生富集CD34+细胞的两个细胞群，从而产生两个细胞群，一个是高严格性CD34富集细胞群，而另一个是低严格性CD34富集细胞群。用于选择CD34+细胞的方法可以是阳性选择、阴性选择或其组合。在某些实施例中，从受试者获得的生物样品被分成两个样品，其中一个样品用于制备高严格性CD34富集细胞群，而另一个样品用于制备低严格性CD34富集细胞群。
在其它实施例中，首先对从受试者获得的生物样品进行低严格性CD34+选择，以制备低严格性CD34富集细胞群，并且然后对低严格性CD34富集细胞群的一部分进行高严格性CD34+选择，以制备高严格性CD34富集细胞群。可以顺序地应用选择，例如，可以首先应用在低严格性条件下对CD34富集细胞的选择，随后在高严格性条件下从另外的CD34富集细胞的所得群中进行选择。
在其它情况下，可以首先应用在高严格性条件下对CD34富集细胞的选择，随后在低严格性条件下从CD34富集细胞的剩余群中进行选择。在一些情况下，细胞群可以被分裂，使得低严格性或高严格性选择被应用于先前进行高严格性或低严格性选择的细胞级分。在一些情况下，在低或高严格性条件下选择CD34富集细胞之前，将一个生物样品分成两个或更多个样品。
在一些情况下，在选择之前将两个或更多个生物样品混合在一起，包含例如在不同时间获取的动员的骨髓样品，如间隔1、2、3、4或更多天，或间隔1、2或3周，或间隔1、2或3个月，或间隔数年，包含其它时间增量。在某些情况下，混合来自不同受试者的生物样品，如自体生物样品和来自同种异体供体的样品。在每种情况下，在混合或分离生物样品或富集的细胞群之前或之后的高严格性或低严格性选择都被考虑在所有可能的排列中。在某些实施例中，所述方法包括：通过在高严格性条件下选择CD34+细胞，由从受试者获得的第一生物样品制备高严格性CD34富集细胞群；以及通过在低严格性条件下选择CD34+细胞，由从受试者获得的第二生物样品制备低严格性CD34富集细胞群。
在一些实施例中，高严格性CD34富集细胞群中CD34+细胞的百分比比低严格性CD34富集细胞群中CD34+细胞的百分比大1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍，或者在一些情况下大5倍、6倍、7倍或8倍。
可以通过所公开的方法实现CD34+细胞的各种产率和纯度。在一些情况下，在高严格性条件下选择CD34+细胞产生高严格性CD34富集细胞群，与输入生物样品相比，CD34+细胞的产率为至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更大或其间的任何值；和/或与富集样品中的细胞总数相比，纯度为至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更大或其间的任何值。在一些情况下，在高严格性条件下选择CD34+细胞产生高严格性CD34富集细胞群，与输入生物样品相比，CD34+细胞的产率为约10％到20％、20％到30％、或30％到40％或其间的任何值；和/或与富集样品中的细胞总数相比，纯度为至少约20％、30％、40％、50％或其间的任何值。在特定实施例中，在高严格性条件下选择CD34+细胞产生高严格性CD34富集细胞群，与输入生物样品相比，CD34+细胞的产率为至少约20％；和/或与富集样品中的细胞总数相比，纯度为至少约20％或至少约>30％。
在一些情况下，在低严格性条件下选择CD34+细胞产生低严格性CD34富集细胞群，与输入生物样品相比，CD34+细胞的产率为至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更大或其间的任何值；并且与富集样品中的细胞总数相比，纯度为至少约5％、10％、15％、25％、40％、50％或更大或其间的任何值。在一些情况下，在低严格性条件下选择CD34+细胞产生低严格性CD34富集细胞群，与输入生物样品相比，CD34+细胞的产率为大于30％、约30％到40％、40％到50％、或50％到60％、或其间的任何值；并且与富集样品中的细胞总数相比，纯度为至少约3％、5％、8％、10％或其间的任何值。在特定实施例中，在低严格性条件下选择CD34+细胞产生高严格性CD34富集细胞群，与输入生物样品相比，CD34+细胞的产率大于35％；和/或与富集样品中的细胞总数相比，纯度小于30％、小于25％、小于20％、小于10％或小于5％。在特定实施例中，在低严格性条件下选择CD34+细胞产生低严格性CD34富集细胞群，与富集样品中的细胞总数相比，纯度为1-30％、1-20％、1-10％、10-30％、10-20％或20-30％。在一些实施例中，低严格性CD34富集细胞群进一步至少包括嗜中性粒细胞和B细胞。
在特定实施例中，高严格性选择和低严格性选择均通过阳性选择进行，例如使用结合CD34+细胞的药剂。在特定实施例中，药剂在溶液中，而在其它实施例中，药剂附着到固体表面。在某些实施例中，药剂与磁珠表面结合。在一些实施例中，药剂是抗CD34抗体或其功能片段。
在某些实施例中，可以在各种器械上执行在高严格性条件下和/或在低严格性条件下的选择，包含但不限于美天旎生物技术公司MACSQuant
Figure BDA0002672978790000241
Quad Technologies
Figure BDA0002672978790000242
GE
Figure BDA0002672978790000243
细胞分离系统、Terumo
Figure BDA0002672978790000244
细胞分离系统、COBE
Figure BDA0002672978790000245
细胞分离器、SynGen
Figure BDA0002672978790000246
或
Figure BDA0002672978790000247
系统、Fresenius-Kabi
Figure BDA0002672978790000248
美天旎生物技术公司
Figure BDA0002672978790000249
系统或CliniMACS
Figure BDA00026729787900002410
系统。可以在实验室中或定点照护时执行选择。例如在国际专利公开第WO/2016/118790号中描述了用于制备和富集细胞和细胞群的详细方法，包含用于在高严格性条件下选择CD34+细胞的示例性方法。美国专利第8,727,132号提供了对高严格性选择有用的说明性选择方法。
在一个实施例中，所述器械是封闭系统装置，其包含材料输入(例如，样品、缓冲液、气体)、至少一个具有离心和细胞培养能力的处理室、封闭管组、泵和靶细胞选择器。在特定实施例中，控制软件使所述装置能够直接从受试者样品中离体分离、基因修饰并调配靶细胞。在特定实施例中，选择过程可以在30小时内、25小时内或20小时内完成，其中用户输入最小或没有。在特定实施例中，整个过程在72小时内或64小时内完成。在特定实施例中，最小用户输入意指在将样品输入到装置中与恢复被调配用于施用于受试者的基因修饰细胞之间，用户与装置交互不超过20、15、10或5次和/或与装置交互不超过12小时、10小时、8小时、5小时、4小时或3小时。来自用户的示例性交互可以包含以下中的一个或多个：连接无菌管组；验证封闭无菌系统的维护；确定应该重复阶段(例如，沉降)；验证阶段的成功完成；允许在过程质量检查之后开始新阶段；为装置输入提供试剂；以及确定和/或计算添加或移除的体积。在接收样品后，可以根据用户准备或实际与装置交互的时间量来对交互进行定时。
在某些实施例中，高严格性CD34富集细胞群和/或低严格性CD34富集细胞群中的一个或两个是使用
Figure BDA0002672978790000251
器械制备的，如
Figure BDA0002672978790000252
plus器械，所述器械是处理HSC、单采血液成分术的软件控制器械。
Figure BDA0002672978790000253
plus器械以及相关设备和试剂可从德国格拉德巴赫美天旎生物技术公司商购获得。所使用的设备或试剂包含：
Figure BDA0002672978790000254
CD34抗原/试剂，所述抗原/试剂为含有抗体缀合物的溶液，所述抗体缀合物由鼠类IgG、针对人CD34抗原的II类表位的单克隆抗体组成，所述抗原/试剂与具有氧化铁/氢氧化物核的葡聚糖珠粒化学缀合，用于选择或富集CD34+细胞；
Figure BDA0002672978790000255
管，其是一次性、无菌、可任意使用的管组，所述管组具有两个细胞分离柱，以处理总细胞数不超过60×109个白血细胞(标准规模)中的最多6×109个CD34+细胞，或总细胞数不超过120×109个白血细胞(大规模)中最多1.2×109个CD34+细胞；以及
Figure BDA0002672978790000256
PBS/EDTA缓冲液，其是无菌、等渗磷酸盐缓冲的1mM EDTA盐水溶液，所述盐水溶液用作体外处理HSC、单采血液成分术的外部洗涤和运输流体。可以使用包括PBS和2.5％人血清白蛋白的CliniMACS缓冲液进行洗涤。可在美天旎网站上获得的CliniMACS用户手册中提供了用于使用
Figure BDA0002672978790000257
系统的程序，包含例如于2019年4月8日获得的
Figure BDA0002672978790000258
CD34试剂系统的
Figure BDA0002672978790000259
用户手册，网址为https://www.miltenyibiotec.com/_Resources/Persistent/2c28c84939f4ce793b29c9f2e897c0bb1a334c47/User％20Manual％20for％20the％20CliniMACS％20CD34％20Reagent％20System.pdf。在一个实施例中，通过使用CD34试剂标记细胞来制备高严格性CD34富集细胞群，并且然后使用标准
Figure BDA00026729787900002510
CD34富集程序来选择CD34+细胞。在一个实施例中，低严格性CD34富集细胞群是使用修改版本的
Figure BDA00026729787900002511
消耗程序制备的。根据该实施例，使用CD34试剂对细胞进行标记，但是运行了经过修改的消耗程序。在磁体接通(ON)的情况下装载标记细胞之后，移除细胞收集袋，并且所收集的细胞不用于移植。相反，关断(OFF)磁体，并且将洗脱缓冲液应用于器械上，从而导致收集的CD34+细胞被洗脱。在某些实施例中，与选择模式相比，在消耗模式下，器械装载更慢(mL/min)，并且洗涤的严格性更低。
在某些实施例中，用载体(例如，对治疗剂进行编码的基因疗法载体)转导高严格性CD34富集细胞群和/或低严格性CD34富集细胞群中的一个或两个，例如通过使高严格性CD34富集细胞群和/或低严格性CD34富集细胞群中的一个或两个与所述载体接触。在某些实施例中，细胞与载体接触持续约30分钟、约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时、约3.5小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约12小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时。在一些实施例中，细胞被转导少于60小时、少于48小时、少于36小时或少于24小时。在某些实施例中，细胞可以与载体接触一次或多次，例如一次、两次、三次或多于三次，并且细胞可以被允许在每个接触事件例如16-24小时之后与一种或多种药剂一起培育某个时间量，在所述时间量之后，用新鲜培养基替换培养基并且进一步培养细胞。使细胞与载体接触可以在任何培养基中和在促进细胞存活的任何培养条件下发生。培养物可以含有细胞对其有响应的生长因子。如本文所定义的，生长因子是能够通过对跨膜受体的特定作用促进细胞在培养物或完整组织中存活、生长和/或分化的分子。生长因子包含多肽和非多肽因子。
在某些实施例中，细胞与有效量的足以实现经过编码的治疗剂的可检测水平的基因疗法载体接触。在特定实施例中，治疗剂是用于或有效治疗疾病或病症的多肽或多核苷酸。在特定实施例中，治疗剂是在从受试者获得的细胞中失调或突变的多肽，例如用于治疗FA的FANC多肽。可以容易地根据经验确定有效量，例如通过检测治疗剂的存在或水平、通过检测对细胞活力或功能的影响等。通常，与未经转导细胞相比，转导细胞中治疗剂的表达将增强2倍或更多倍，例如3倍、4倍或5倍或更多倍，在一些情况下10倍、20倍或50倍或更多倍，例如100倍。
本公开的基因疗法载体涵盖了发现用于将多核苷酸序列递送到哺乳动物细胞的任何方便的基因疗法载体。例如，载体可以包括单链或双链核酸，例如单链或双链DNA。例如，基因疗法载体可以是DNA，例如裸DNA，例如质粒、微环等。载体可以包括单链或双链RNA，包含RNA的经过修饰的形式。在另一个实例中，基因疗法载体可以是RNA，例如mRNA或经过修饰的mRNA。
在特定实施例中，基因疗法载体可以是源自于病毒的病毒载体，例如腺病毒、腺相关病毒、慢病毒(LV)、疱疹病毒、α病毒或逆转录病毒，例如莫洛尼(Moloney)鼠类白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠类肉瘤病毒(MoMSV)、哈维(Harvey)鼠类肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠类乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗里德(Friend)鼠类白血病病毒、鼠类干细胞病毒(MSCV)或劳斯氏(Rous)肉瘤病毒(RSV)。虽然以下更详细地描述了涵盖LV的用途的实施例，但是期望本领域普通技术人员应了解，本领域中的类似知识和技术也可以用于非LV基因疗法载体。在一些实施例中，基因疗法载体为自限制LV。
具体地，本文所公开的某些方法涉及用编码和/或表达治疗性多肽的基因疗法载体(例如，FANCA)转导干细胞或祖细胞(例如，造血干细胞((HSC))或造血祖细胞(hematopoietic progenitor cells)(在本文中也称为“造血祖细胞(hematopoieticprogenitors)”)中的一个或两个群，其中一个群通过在高严格性条件下选择来制备，而另一个群通过在低严格性条件下选择来制备。在一个实施例中，细胞群富集CD34+细胞。在一个实施例中，HSC或造血祖细胞来自受试者，所述受试者具有来自一种或多种FANCA编码蛋白的降低的蛋白活性或无蛋白活性。在一个实施例中，受试者具有FA-A。在一个实施例中，HSC的内源性FANCA基因缺失和/或突变。
在一个实施例中，用基因疗法载体转导细胞引起整合到表达盒的细胞基因组中，所述表达盒包括与基因疗法载体内对治疗剂进行编码的多核苷酸序列可操作连接的启动子。在一些实施例中，用基因疗法载体转导细胞引起治疗剂的表达，例如生物活性FANCA蛋白。
例如，具有生物活性的FANCA蛋白形成FA核心复合物的部分。在某些实施例中，通过病毒载体递送FANCA基因。在一个实施例中，通过慢病毒载体递送FANCA基因。在某些实施例中，慢病毒载体是PGK-FANCA.WPRE*LV。可以设想的是，在用FANCA慢病毒载体(LV)转导来自FA-A患者的骨髓(BM)细胞或干细胞或祖细胞之后，治疗性载体被整合到细胞的基因组中。一旦经过整合，治疗性蛋白(例如，人FANCA蛋白)由细胞表达。对经过转导的FA细胞进行基因修正，并且因此能够通过FANCD2和FANCI的单泛素化来激活FA通路。然后，这些蛋白质将能够迁移到DNA损伤的区域，并与其它DNA修复蛋白合作，将促进这些细胞中的DNA修复，如在健康细胞中发生的那样。
如本文所讨论的，本发明的方法和组合物可以用于在动物细胞中表达转基因，例如FANCA。例如，主题组合物可以用于研究中，以例如确定基因对细胞活力和/或功能的影响。作为另一个实例，可以在医药中使用主题组合物以例如治疗如FA等病症。
因此，本公开提供了治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者提供或施用如本文所述制备的高严格性CD34富集细胞群和低严格性CD34富集细胞群的组合，其中用重组基因疗法载体转导高严格性CD34富集细胞群或低严格性CD34富集细胞群中的一个或两个，所述重组基因疗法载体包括对治疗剂进行编码的多核苷酸序列或包括表达治疗剂的表达盒，其中治疗剂在治疗疾病或病症中是有效的。在特定实施例中，所述疾病为FA，并且治疗剂为范可尼贫血互补群A(FANCA)多肽或其功能变体或片段。
在特定实施例中，所述方法包括：(a)通过在高严格性条件下选择CD34+细胞，由从所述受试者获得的第一生物样品制备高严格性CD34富集细胞群；(b)通过在低严格性条件下选择CD34+细胞，由从所述受试者获得的第二生物样品制备低严格性CD34富集细胞群，(c)用包括对所述治疗剂进行编码的所述多核苷酸序列的所述重组基因疗法载体转导所述高严格性CD34富集细胞群或所述低严格性CD34富集细胞群中的一个或两个；以及(d)向所述受试者提供或施用所述高严格性CD34富集细胞群和所述低严格性CD34富集细胞群，其中用所述重组基因疗法载体转导所述高严格性CD34富集细胞群或所述低严格性CD34富集细胞群中的一个或两个；其中所述治疗剂在治疗所述疾病或病症中是有效的。在特定实施例中，所述疾病为FA，并且治疗剂为范可尼贫血互补群A(FANCA)多肽或其功能变体或片段。在某些实施例中，向患者施用从所述两种细胞群中的每一种获得的所有细胞。所述两个细胞群中每一个的细胞剂量可以类似或不同，例如，其中更多的总细胞和更多的总CD34+细胞来自低严格性群。在某些实施例中，最初从患者获得的细胞被分成两个大致相等的群，一个群在高严格性CD34+选择条件下进行处理，并且一个群在低严格性CD34+选择条件下进行处理，这可能导致从低严格性选择过程产生约2倍多的CD34+细胞和5-10倍多的总细胞。
在本文所述的任何治疗方法的特定实施例中，第一生物样品和第二生物样品各自独立地为外周血或骨髓。在某些实施例中，所述第一生物样品和所述第二生物样品是在已经用G-CSF、plerifaxor或G-CSF和plerifaxor的组合治疗所述受试者之后获得的外周血。
在本文所述的治疗方法的特定实施例中，在高严格性条件下选择CD34+细胞包括：将第一生物样品装载到结合CD34+细胞的柱上；使用洗涤缓冲液洗涤装载的柱一次或多次；以及使用洗脱缓冲液从柱上洗脱高严格性CD34富集细胞群。在一个实施例中，以5-10mL/min、5-15mL/min、15-20mL/min、20-25mL/min或25-30mL/min执行所述应用步骤。在一个实施例中，以5-10mL/min、5-15mL/min、15-20mL/min、25-25mL/min或25-30mL/min执行所述洗脱步骤。在一个实施例中，以10-20mL/min执行所述应用步骤。在一个实施例中，以20mL/min执行所述洗脱步骤。
在本文所述的治疗方法的特定实施例中，在低严格性条件下选择CD34+细胞包括：将第二生物样品装载到结合CD34+细胞的柱上；允许第二生物样品流过柱；以及使用洗脱缓冲液从柱上洗脱低严格性CD34富集细胞群。在一个实施例中，以5-10mL/min、5-15mL/min、15-20mL/min、20-25mL/min或25-30mL/min执行所述应用步骤。在一个实施例中，以5-10mL/min、5-15mL/min、15-20mL/min、25-25mL/min或25-30mL/min执行所述洗脱步骤。在一个实施例中，以10-20mL/min执行所述应用步骤。在一个实施例中，以20mL/min执行所述洗脱步骤。
在本文所述的治疗方法的特定实施例中，转导高严格性CD34富集细胞群和/或转导低严格性CD34富集细胞群。
在一些实施例中，主题方法产生了治疗益处，例如预防病症的发展、停止病症的进展、逆转病症的进展等。例如，在一个实施例中，所述病症为FA。在另一个实施例中，所述疾病或病症为BMF。在一个实施例中，所述病症为血小板减少症。在另一个实施例中，所述病症为白细胞减少症。在一个实施例中，所述病症为全血细胞减少症。在一个实施例中，所述病症为中性粒细胞减少症。在另一个实施例中，所述病症为贫血。在一些实施例中，主题方法包括检测到治疗益处已经实现的步骤。普通技术人员应了解，治疗功效的这种量度将适用于正被修饰的特定疾病，并且应认识到用来测量治疗功效的适当检测方法。
如实例中进一步详细描述的，相对于通过现有技术方法移植的其它FA患者，将骨髓细胞动员到外周血生物样品中并根据本发明的方法施用的临床数据出乎意料地证明了更快的体内选择植入动力学。在特定实施例中，本公开的方法和组合物用于治疗FA。
因此，本发明提供了用于治疗FA或FA的一种或多种血液学表现的方法。在一个实施例中，FA的血液学表现选自以下中的一种或多种：骨髓衰竭(BMF)、血小板减少症、白细胞减少症、全血细胞减少症、中性粒细胞减少症和贫血。在一个特定实施例中，血液学表现为BMF，其出现在大多数FA患者的小儿年龄中。在一个实施例中，血液学表现为血小板减少症。在另一个实施例中，血液学表现为白细胞减少症。在一个实施例中，血液学表现为全血细胞减少症。在一个实施例中，血液学表现为中性粒细胞减少症。在另一个实施例中，血液学表现为贫血。在一个实施例中，血液学表现为BMF、血小板减少症、白细胞减少症、全血细胞减少症、中性粒细胞减少症和贫血中的两种或更多种的组合。
本发明的目的还是使用CRISPR/Cas基因编辑系统等修复内源性FANC基因(例如，FANCA、FANCC和/或FANCG)。已经在体外证明Cas9介导的与范可尼贫血相关的基因修复，如Obsorn等人,“由CRISPR/Cas9系统编辑的范可尼贫血基因(Fanconi anemia gene editingby the CRISPR/Cas9 system.)”《人类基因疗法(Hum Gene Ther)》2015年2月；26(2):114-26。本发明提供了用于治疗范可尼贫血的方法和制备基因修饰细胞的方法，所述方法引起改善的体内修复效率和改善的骨髓重建。在某些情况下，基因编辑系统修复单核苷酸多态性、缺失、插入、插入缺失或其它遗传缺陷。在某些情况下，修复指向基因的编码区、内含子或上游或下游区域，如邻近或远离与疾病或病症相关的基因的基因组的基因调节区域。
在本发明的一个实施例中，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的范可尼贫血的方法，所述方法包括：通过在高严格性条件下选择CD34+细胞，由从所述受试者获得的第一生物样品制备高严格性CD34富集细胞群；通过在低严格性条件下选择CD34+细胞，由从所述受试者获得的第二生物样品制备低严格性CD34富集细胞群；使所述高严格性CD34富集细胞群或所述低严格性CD34富集细胞群中的一个或两个与针对范可尼贫血的重组基因疗法载体接触；以及向所述受试者施用所述高严格性CD34富集细胞群和所述低严格性CD34富集细胞群，其中所述高严格性CD34富集细胞群或所述低严格性CD34富集细胞群中的一个或两个与所述重组基因疗法载体接触；并且其中所述基因疗法载体包括能够定向修复内源性基因的基因编辑系统，由此治疗范可尼贫血。在一些情况下，基因编辑系统是CRISPR-Cas系统(例如，CRISPR-Cas9)。
在一些实施例中，基因编辑系统包括与启动子可操作地连接的对Cas、Cas9或spCas基因产物(如mRNA、cDNA、质粒等)进行编码的核酸。在一些实施例中，基因编辑系统包括对Cas、Cas9或spCas蛋白进行编码的核酸。在一些情况下，基因疗法载体是脂质体或脂质纳米颗粒或其它基于脂质或脂质样的递送系统。在一些情况下，基因疗法载体是病毒，如慢病毒、腺病毒或腺相关病毒。在一些实施例中，基因编辑系统包括向导RNA，例如单个向导RNA(sgRNA)，以及任选地修复模板。修复模板和向导RNA在一些情况下是不同的分子，或在一些情况下是相同的分子。修复模板和向导RNA可以共价或非共价连接。在一些情况下，向导RNA被预先装载到Cas、Cas9或spCas蛋白中。在一些情况下，基因编辑系统的组分是在单个基因疗法载体中递送的。在一些情况下，基因编辑系统是在不同的基因疗法载体中递送的。可以使用多种基因疗法载体。例如但不限于，可以用相同或不同的基因疗法载体修复多个基因损伤。在一些情况下，两个或更多个FANC基因同时被修复。在一些情况下，一种基因疗法载体与高严格性CD34富集细胞群接触，并且另一种基因疗法载体与低严格性CD34富集细胞群接触。在一些情况下，两种基因疗法载体是相同的。在一些情况下，一种基因疗法载体包括用于与给定基因(例如，FANCA)相关的病症的转基因，并且另一种基因疗法载体包括基因编辑系统。
在一些情况下，基因疗法载体提供转基因给或修复与疾病或病症相关的基因以外的基因。例如但不限于，基因疗法载体可以上调或下调免疫效应基因，可以改变细胞表面标志物，可以提供替代性MHC分子或可以对免疫球蛋白基因进行编码。特别设想的是，在一些情况下，一种或多种基因疗法载体提供了同种异体或不匹配供体移植的使用，如通过改变免疫标志物(例如，HLA或MHC基因)或引起免疫效应基因的表达。
在一些实施例中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者提供高严格性CD34富集细胞群和低严格性CD34富集细胞群的组合，所述两种细胞群均由从受试者获得的一种或多种生物样品制备，其中从受试者获得的CD34细胞包括一种或多种与疾病或病症相关或导致疾病或病症的基因突变，并且其中高严格性CD34富集细胞群或低严格性CD34富集细胞群中的一个或两个在向受试者提供细胞群之前进行基因编辑以修复一个或多个基因突变。在某些实施例中，基因编辑是通过使一种或两种CD34富集细胞群与Cas(例如Cas9或spCas)蛋白；向导RNA(例如，单向导RNA，sgRNA)；以及修复模板接触来进行的。在特定实施例中，疾病为FA，并且被修复的基因突变是范可尼贫血互补群A(FANCA)基因中的突变。
在某些实施例中，本文公开的基因疗法载体包括多核苷酸，所述多核苷酸包括与对治疗剂进行编码的序列(即编码序列)可操作地连接的启动子。如在此所使用的，术语“可操作地连接”意指启动子能够驱动对治疗剂进行编码的序列的表达。
在一些实施例中，多核苷酸包括一种或多种增强子。增强子是本领域已知的增强转录的核酸元件，并且可以位于与其调节的基因相关联的任何地方，例如上游、下游、内含子内等。任何增强子元件都可以用于本公开的多核苷酸盒和基因疗法载体中，只要其在与启动子组合使用时增强基因的表达。
待在细胞中表达的编码序列可以是任何多核苷酸序列，例如，对基因产物进行编码的基因或cDNA，所述基因产物例如基于多肽或RNA的治疗剂(siRNA、反义、核酶、shRNA等)。编码序列可以与启动子序列异源，所述启动子序列与所述编码序列可操作地连接，即不与其天然可操作地缔合。可替代地，编码序列可以与启动子序列内源，所述启动子序列与所述编码序列可操作地连接，即本质上与所述启动子缔合。基因产物可以内在地作用于哺乳动物细胞，或者可以外在地起作用，例如，其可能被分泌。例如，当转基因是治疗性基因时，编码序列可以是对所期望的基因产物或其功能片段或变体进行编码的任何基因，所期望的基因产物或其功能片段或变体可以用作治疗疾病或病症的治疗剂。在各个实施例中，转基因对人FANCA进行编码。
在本发明的一个实施例中，对转基因编码序列进行修饰或“密码子优化”，以通过用更频繁表示的密码子替换不频繁表示的密码子来增强表达。编码序列是对用于转译的氨基酸进行编码的mRNA序列的一部分。在转译过程中，61个三核苷酸密码子中的每个三核苷酸密码子被转译成20个氨基酸中的一个氨基酸，从而导致遗传密码中的简并或冗余。然而，不同的细胞类型和不同的动物物种会利用在不同频率下对相同氨基酸进行编码的tRNA(各自携带反密码子)。当基因序列含有由对应tRNA不频繁表示的密码子时，核糖体转译机制可能会减慢，从而阻碍有效转译。可以通过特定物种的“密码子优化”来改进表达，其中改变编码序列以对相同的蛋白质序列进行编码，而利用高度表示和/或由高度表示的人蛋白质利用的密码子(Cid-Arregui等人,2003；《病毒学杂志》77:4928)。在本发明的一方面，对转基因的编码序列进行修饰以用灵长类动物中频繁表达的密码子替换哺乳动物或灵长类动物中不频繁表达的密码子。例如，在一些实施例中，由转基因编码的编码序列编码对多肽进行编码，所述多肽与由上文或在此所公开的序列编码的多肽具有至少85％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性、至少98％的同一性、至少99％的同一性，其中编码序列的至少一个密码子在人中具有比上文或在此所公开的序列中的对应密码子更高的tRNA频率。
在本发明的另外的实施例中，转基因编码序列被修饰以通过终止或移除不对所期望的转基因进行编码的开放阅读框(ORF)来增强表达。开放阅读框(ORF)是跟随起始密码子且不含有终止密码子的核酸序列。与所关注的基因相比，ORF可以处于正向或反向朝向，并且可以在“框内”或“框外”。这种开放阅读框有可能在所关注的基因旁边的表达盒中表达，并且可能引起不期望的副作用。在本发明的一方面，已经对转基因的编码序列进行修饰，以通过进一步改变密码子使用来移除开放阅读框。这可以通过以下来实现的：消除起始密码子(ATG)和引入反向朝向或ORF框外的终止密码子(TAG、TAA或TGA)，同时保留氨基酸序列并维持所关注的基因中高度利用的密码子(即，避免频率<20％的密码子)。在本公开中，转基因编码序列可以通过密码子优化和移除非转基因ORF或同时使用两种技术来优化。对于本领域普通技术人员而言将显而易见的是，优选在密码子优化后移除或最小化非转基因ORF，以便移除在密码子优化期间引入的ORF。
本公开包含包括本文所描述的表达盒或转移盒的质粒。在特定实施例中，质粒是pCCL-PGK-FANCA-WPRE*(SEQ ID NO:24)和/或质粒包括来自pCCL-PGK-FANCA-WPRE(SEQ IDNO:25)的表达盒。
在某些实施例中，其中的基因疗法载体或基因转移盒包括一种或多种另外的元件，例如选自以下中的一种或多种元件：5'LTR、3'LTR、cPPT、CTS、RRE、增强子序列和包装信号。在一些实施例中，基因疗法载体或基因转移盒是在国际专利公开第WO2018/049273A1号中所公开的任何载体或盒，其公开内容出于所有目的通过全文引用的方式并入本文。对范可尼贫血互补群(FANC)多肽进行编码的多核苷酸序列包含在美国专利第5,952,190号中公开的那些，其公开内容出于所有目的通过全文引用的方式并入本文。
RRE序列提高了基因转移的效率。在本文所述的表达盒和基因疗法载体中的任一个的特定实施例中，RRE序列包括以下序列中的任一个或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列(全部按5'到3'朝向显示)或由其组成：
AGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCT(SEQID NO:1)；
GATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATC(SEQ ID NO:26)；或
包括核苷酸2649-2882或SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的多核苷酸1296-2153或由其组成的序列。
逆转录病毒前导区含有包装信号(Ψ)，所述包装信号参与将逆转录病毒基因组包装到病毒衣壳中。LV载体被认为在此区需要大约300bp的Gag基因。目前，此Gag序列已经减少到只有40bp(图65)。在本文所述的表达盒和基因疗法载体中的任一个的特定实施例中，ψ序列是HIV-1ψ序列，或者ψ序列包括以下序列中的任一个或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
CTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTC(SEQ ID NO:2)；
TGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGA(SEQ ID NO:27)；或
包括SEQ ID NO:24的多核苷酸2031-2156或SEQ ID NO:25的多核苷酸889-933或由其组成的序列。
在本文所述的表达盒和基因疗法载体中的任一个的特定实施例中，截短的HIV-15'LTR包括以下序列中的任一个或与以下序列中的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
GGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCA(SEQ ID NO:3)；
GTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCC(SEQ ID NO:28)；或
包括SEQ ID NO:24的多核苷酸1586-9495或SEQ ID NO:25的多核苷酸934-1295或由其组成的序列。
在本文所述的表达盒和基因疗法载体中的任一个的特定实施例中，HIV-1自失活3'LTR包括以下序列中的任一个或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
TGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCA(SEQID NO:4)；
TGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCA(SEQID NO:29)；或
包括SEQ ID NO:24的多核苷酸9262-9495或SEQ ID NO:25的多核苷酸8056-8289或由其组成的序列。
在本文所述的表达盒和基因疗法载体中的任一个的特定实施例中，人巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子包括以下序列中的任一个、其功能片段或与以下序列中的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
GTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT(SEQ ID NO:5)；
ACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGC(SEQ ID NO:30)或
包括SEQ ID NO:24的多核苷酸1586-1789或SEQ ID NO:25的多核苷酸1-577或由其组成的序列。
在本文所述的表达盒和基因疗法载体中的任一个的特定实施例中，劳斯肉瘤病毒(RSV)立即早期启动子包括以下序列中的任一个、其功能片段或与以下序列中的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
TTAATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACG(SEQ IDNO:31)。
促进整合前复合物的核易位的cPPT与参与逆转录酶的分离的CTS一起被认为能改善病毒滴度(Zennou等人,2000；Follenzi等人,2000)。在本文所述的表达盒和基因疗法载体中的任一个的特定实施例中，HIV-1的中央聚嘌呤段和中央终止序列(cPPT/CTS)包括以下序列中的任一个、其功能片段或与以下序列中的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
TTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTT(SEQ ID NO:6)；
TTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGT(SEQ ID NO:12)；
AAAAGAAAAGGGGGGA(SEQ ID NO:32)；
TTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTATCGATCACGAGACTAGCCTCGA(SEQ ID NO:33)或
包括SEQ ID NO:24的核苷酸3378-3495或SEQ ID NO:25的核苷酸2176-2312或由其组成的序列。
在本文所述的表达盒和基因疗法载体中的任一个的特定实施例中，人磷酸甘油酸激酶1(hPGK)启动子包括以下序列中的任一个、其功能片段或与以下序列中的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
GGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTTTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCAGGGCGCGCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCAG(SEQ ID NO:7)；或
包括SEQ ID NO:24的核苷酸3541-4051或SEQ ID NO:25的核苷酸2335-2845或由其组成的序列。
在某些实施例中，本文公开的表达盒和基因疗法载体进一步包括一个或多个另外的元件，例如CMV启动子和/或增强子、SV40 polyA序列、复制起点，例如SV40 ori序列，或本文公开的元件中的任一个。
在本文所述的表达盒和基因疗法载体的特定实施例中，人CMV增强子包括以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATG(SEQ ID NO:9)。
在本文所述的表达盒和基因疗法载体中的任一个的特定实施例中，猿猴病毒40(SV40)poly(A)信号包括以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
AACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA(SEQ ID NO:10)；或
包括SEQ ID NO:25的核苷酸8361-8482或由其组成的序列。
在本文所述的表达盒和基因疗法载体中的任一个的特定实施例中，SV40复制起点包括以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
ATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCC(SEQ IDNO:11)；
GGCCTCCAAAAAAGCCTCCTCACTACTTCTGGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCTGCATAAATAAAAAAAATTAGTCAGCCATGGGGCGGAGAATGGGCGGAACTGGGCGGAGTTAGGGGCGGGATGGGCGGAGTTAGGGGCGGGA(SEQ ID NO:34)；或
包括SEQ ID NO:25的核苷酸8502-8657或由其组成的序列。
在本文所述的表达盒和基因疗法载体中的任一个的一些实施例中，存在于本文所述的表达盒或基因疗法载体中的任一个的dNEF信号包括以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
GAATTCGAGCTCGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGAC(SEQ ID NO:13)。
在本文所述的表达盒和基因疗法载体中的任一个的特定实施例中，存在于本文所述的表达盒或基因疗法载体中的任一个中的KanR序列包括以下序列或由其组成：
ATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCGGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGTCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCGACGACGGGCGTTCCTTGCGCGGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGTCTATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCACGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGTCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTTGTGCTTTACGGTATCGCCGCGCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGA(SEQ ID NO:14)。
在本文所述的表达盒和基因疗法载体中的任一个的特定实施例中，存在于本文所述的表达盒或基因疗法载体中的任一个中的RNA-OUT序列包括以下序列或由其组成：
GTAGAATTGGTAAAGAGAGTCGTGTAAAATATCGAGTTCGCACATCTTGTTGTCTGATTATTGATTTTTGGCGAAACCATTTGATCATATGACAAGATGTGTATCTACCTTAACTTAATGATTTTGATAAAAATCATTAGG(SEQID NO:35)；或
包括SEQ ID NO:25的核苷酸9731-9871或由其组成的序列。
在本文所述的表达盒和基因疗法载体中的任一个的一些实施例中，存在于本文所述的表达盒或基因疗法载体中的任一个中的rrnG终止子(来自大肠杆菌(E.coli)核糖体RNA rrnG操纵子的转录终止子(Albrechtsen等人，1991))包括以下序列或由其组成：
GCATTGGCGCAGAAAAAAATGCCTGATGCGACGCTGCGCGTCTTATACTCCCACATATGCCAGATTCAGCAACGGATACGGCTTCCCCAACTTGCCCACTTCCATACGTGTCCTCCTTACCAGAAATTTATCCTTAA(SEQ IDNO:15)
在本文所述的表达盒和基因疗法载体中的任一个的一些实施例中，存在于本文所述的表达盒或基因疗法载体中的任一个的ori(高拷贝数ColE1/pMB1/pBR322/pUC复制起点)包括以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
TTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAA(SEQ ID NO:16)
GGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGA(SEQID NO:37)；或
包括SEQ ID NO:24的核苷酸9731-9871或SEQ ID NO:25的核苷酸8700-9714或由其组成的序列。
在本文所述的表达盒和基因疗法载体中的任一个的一些实施例中，存在于本文所述的表达盒或基因疗法载体中的任一个的CAP结合位点包括以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：TAATGTGAGTTAGCTCACTCAT(SEQ ID NO:17)。
在本文所述的表达盒和基因疗法载体中的任一个的一些实施例中，存在于本文所述的表达盒或基因疗法载体中的任一个的大肠杆菌lac启动子包括以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：TTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTG(SEQ ID NO:18)。
在本文所述的表达盒和基因疗法载体中的任一个的一些实施例中，存在于本文所述的表达盒或基因疗法载体中的任一个的lac操纵子包括以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：TTGTGAGCGGATAACAA(SEQ ID NO:19)
在本文所述的表达盒和基因疗法载体中的任一个的一些实施例中，存在于本文所述的表达盒或基因疗法载体中的任一个的T3启动子(噬菌体T3 RNA聚合酶的启动子)包括以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：AATTAACCCTCACTAAAGG(SEQ ID NO:20)。
在本文所述的表达盒和基因疗法载体中的任一个的一些实施例中，存在于本文所述的表达盒或基因疗法载体中的任一个的T7启动子(噬菌体T7 RNA聚合酶的启动子)包括以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：CCTATAGTGAGTCGTATTA(SEQ ID NO:21)。
在本文所述的表达盒和基因疗法载体中的任一个的一些实施例中，存在于本文所述的表达盒或基因疗法载体中的任一个的f1 ori(f1噬菌体复制起点)包括以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
ACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCG
CTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCA
CGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTA
GTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGC
CATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTG
GACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTAT
AAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATT(SEQ ID NO:22)。
如本文所讨论的，本发明的表达盒和基因疗法载体可以包括RNA输出信号。示例性RNA输出信号包含但不限于WPRE。通过以转基因、启动子和载体非依赖性方式增加RNA稳定性，WPRE显著增加了靶细胞中的转基因表达(Zuffrey等人，1999)。然而，它可以表达来源于参与肝癌的WHV X基因的截短的60个氨基酸的蛋白质(Kingsman等人，2005)。因此，大多数临床前方案和临床试验包含突变WPRE元件版本(Zanta-Boussif等人，2009)。另一方面，在抑制转录通读中，在SIN-LV载体中使用两个SV40-USE元件被认为比WPRE序列更有效(Schambach等人，2007)。更确切地说，本文公开的WPRE是一种嵌合wPRE，所述嵌合WPRE携带589个来自由Axel Schambach进行的经过修饰的WPRE的核苷酸(核苷酸1-589)(WO2008136670A2)和88个来自之前WPRE的核苷酸(核苷酸590-677)(Zuffrey等人，1999)。本文公开的数据示出了这种嵌合WPRE比之前的wPRE效果更好。嵌合wPRE序列包括以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
CGAGCATCTTACCGCCATTTATTCCCATATTTGTTCTGTTTTTCTTGATTTGGGTATACATTTAAATGTTAATAAAACAAAATGGTGGGGCAATCATTTACATTTTTAGGGATATGTAATTACTAGTTCAGGTGTATTGCCACAAGACAAACATGTTAAGAAACTTTCCCGTTATTTACGCTCTGTTCCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGATATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTGTGTGGATATGCTGCTTTAATGCCTCTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCCGTCAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCGATCGCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTAGGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG(SEQ ID NO:23)。
在特定实施例中，突变WPRE序列包括WPRE*或由其组成，其对应于SEQ ID NO:24的核苷酸8502-9178或SEQ ID NO:25的核苷酸7293-7888或与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的此区域具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性。
本领域普通技术人员将容易理解如本文公开的或如本领域已知的元件的其它组合。
另外，如本领域普通技术人员将认识到的，表达盒和基因疗法载体可以任选地含有其它元件，包含但不限于促进克隆的限制性位点和用于特定基因疗法载体的调节元件。
在本发明的一些方面，主题多核苷酸盒用于将基因递送到细胞，例如以确定基因对细胞活力和/或功能的影响，以便治疗细胞病症等。在各个实施例中，通过转导将病毒载体递送到细胞可以在体外、离体或体外进行。因此，在本发明的一些方面，提供转基因在哺乳动物细胞中的表达的组合物是基因疗法载体，其中所述基因疗法载体包括本公开的多核苷酸盒，例如基因转移盒。
对来自FA患者的HSC进行基因修正，然后进行这些细胞的自体移植(造血基因疗法)，对于FA患者(尤其是那些缺乏HLA相同的兄弟姐妹的患者)来说是很好的替代性方案。在一个实施例中，造血基因疗法对于缺乏HLA相同的兄弟姐妹的患者来说是优选治疗方案。在另一个实施例中，造血基因疗法是针对具有HLA相同的兄弟姐妹的患者的治疗方案。
在本文公开的所述方法中的任一个的特定实施例中，基因疗法载体包括对FAC蛋白进行编码的多核苷酸序列，并且向受试者提供用载体转导的细胞以治疗FA。
由于大多数FA患者属于FA-A互补群(Casado等人,2007年,Levitus等人,2004,Taniguchi等人,2006年)，已经开发出了一种携带功能性FANCA基因的载体。包含突变的土拨鼠肝炎病毒的转录后调节元件(WPRE*)，所述元件缺乏任何残留的开放阅读框(Schambach A等人,《基因疗法(Gene Ther.)》2006；13:641-645)将用于改善治疗性基因的表达水平和稳定性。
在一些实施例中，多核苷酸盒包括：
(i)磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子序列或其功能变体或片段；
(ii)对人FANCA蛋白或其功能片段或变体进行编码的序列；以及
(iii)土拨鼠肝炎病毒(WPRE)序列的转录后调节元件。
在一些实施例中，多核苷酸盒包括：
(i)人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子序列；
(ii)对人FANCA蛋白进行编码的序列；以及
(iii)突变WPRE序列。
在一些实施例中，多核苷酸盒包括：
a)5'LTR，任选地经过修饰的5'LTR；
b)cPPT序列；
c)PGK启动子序列，任选地人PGK启动子序列；
d)对人FANCA蛋白进行编码的序列，任选地cDNA序列或密码子优化序列；
e)突变WPRE序列；以及
f)3'LTR，任选地经过修饰的3'LTR。
在一个实施例中，经过修饰的WPRE被称为WPRE*。WPRE*是缺乏开放阅读框的经过修饰的WPRE(参见例如Schambach等人,2006《基因疗法》13:641-645)。
由于大多数FA患者属于FA-A互补群(Casado等人,2007,Levitus等人,2004,Taniguchi等人,2006)，在特定实施例中，经过编码的治疗性基因产物是FANCA，尽管本公开预期也可以递送其它互补群的FA蛋白，并且因此在本文公开的表达盒中对其进行编码，例如代替FANCA。
在本文所述的表达盒和基因疗法载体中的任一个的特定实施例中，对经过密码子优化的FANCA进行编码的多核苷酸序列是人FANCA cDNA序列，其包括以下序列或其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
ATGTCCGACTCGTGGGTCCCGAACTCCGCCTCGGGCCAGGACCCAGGGGGCCGCCGGAGGGCCTGGGCCGAGCTGCTGGCGGGAAGGGTCAAGAGGGAAAAATATAATCCTGAAAGGGCACAGAAATTAAAGGAATCAGCTGTGCGCCTCCTGCGAAGCCATCAGGACCTGAATGCCCTTTTGCTTGAGGTAGAAGGTCCACTGTGTAAAAAATTGTCTCTCAGCAAAGTGATTGACTGTGACAGTTCTGAGGCCTATGCTAATCATTCTAGTTCATTTATAGGCTCTGCTTTGCAGGATCAAGCCTCAAGGCTGGGGGTTCCCGTGGGTATTCTCTCAGCCGGGATGGTTGCCTCTAGCGTGGGACAGATCTGCACGGCTCCAGCGGAGACCAGTCACCCTGTGCTGCTGACTGTGGAGCAGAGAAAGAAGCTGTCTTCCCTGTTAGAGTTTGCTCAGTATTTATTGGCACACAGTATGTTCTCCCGTCTTTCCTTCTGTCAAGAATTATGGAAAATACAGAGTTCTTTGTTGCTTGAAGCGGTGTGGCATCTTCACGTACAAGGCATTGTGAGCCTGCAAGAGCTGCTGGAAAGCCATCCCGACATGCATGCTGTGGGATCGTGGCTCTTCAGGAATCTGTGCTGCCTTTGTGAACAGATGGAAGCATCCTGCCAGCATGCTGACGTCGCCAGGGCCATGCTTTCTGATTTTGTTCAAATGTTTGTTTTGAGGGGATTTCAGAAAAACTCAGATCTGAGAAGAACTGTGGAGCCTGAAAAAATGCCGCAGGTCACGGTTGATGTACTGCAGAGAATGCTGATTTTTGCACTTGACGCTTTGGCTGCTGGAGTACAGGAGGAGTCCTCCACTCACAAGATCGTGAGGTGCTGGTTCGGAGTGTTCAGTGGACACACGCTTGGCAGTGTAATTTCCACAGATCCTCTGAAGAGGTTCTTCAGTCATACCCTGACTCAGATACTCACTCACAGCCCTGTGCTGAAAGCATCTGATGCTGTTCAGATGCAGAGAGAGTGGAGCTTTGCGCGGACACACCCTCTGCTCACCTCACTGTACCGCAGGCTCTTTGTGATGCTGAGTGCAGAGGAGTTGGTTGGCCATTTGCAAGAAGTTCTGGAAACGCAGGAGGTTCACTGGCAGAGAGTGCTCTCCTTTGTGTCTGCCCTGGTTGTCTGCTTTCCAGAAGCGCAGCAGCTGCTTGAAGACTGGGTGGCGCGTTTGATGGCCCAGGCATTCGAGAGCTGCCAGCTGGACAGCATGGTCACTGCGTTCCTGGTTGTGCGCCAGGCAGCACTGGAGGGCCCCTCTGCGTTCCTGTCATATGCAGACTGGTTCAAGGCCTCCTTTGGGAGCACACGAGGCTACCATGGCTGCAGCAAGAAGGCCCTGGTCTTCCTGTTTACGTTCTTGTCAGAACTCGTGCCTTTTGAGTCTCCCCGGTACCTGCAGGTGCACATTCTCCACCCACCCCTGGTTCCCAGCAAGTACCGCTCCCTCCTCACAGACTACATCTCATTGGCCAAGACACGGCTGGCCGACCTCAAGGTTTCTATAGAAAACATGGGACTCTACGAGGATTTGTCATCAGCTGGGGACATTACTGAGCCCCACAGCCAAGCTCTTCAGGATGTTGAAAAGGCCATCATGGTGTTTGAGCATACGGGGAACATCCCAGTCACCGTCATGGAGGCCAGCATATTCAGGAGGCCTTACTACGTGTCCCACTTCCTCCCCGCCCTGCTCACACCTCGAGTGCTCCCCAAAGTCCCTGACTCCCGTGTGGCGTTTATAGAGTCTCTGAAGAGAGCAGATAAAATCCCCCCATCTCTGTACTCCACCTACTGCCAGGCCTGCTCTGCTGCTGAAGAGAAGCCAGAAGATGCAGCCCTGGGAGTGAGGGCAGAACCCAACTCTGCTGAGGAGCCCCTGGGACAGCTCACAGCTGCACTGGGAGAGCTGAGAGCCTCCATGACAGACCCCAGCCAGCGTGATGTTATATCGGCACAGGTGGCAGTGATTTCTGAAAGACTGAGGGCTGTCCTGGGCCACAATGAGGATGACAGCAGCGTTGAGATATCAAAGATTCAGCTCAGCATCAACACGCCGAGACTGGAGCCACGGGAACACATTGCTGTGGACCTCCTGCTGACGTCTTTCTGTCAGAACCTGATGGCTGCCTCCAGTGTCGCTCCCCCGGAGAGGCAGGGTCCCTGGGCTGCCCTCTTCGTGAGGACCATGTGTGGACGTGTGCTCCCTGCAGTGCTCACCCGGCTCTGCCAGCTGCTCCGTCACCAGGGCCCGAGCCTGAGTGCCCCACATGTGCTGGGGTTGGCTGCCCTGGCCGTGCACCTGGGTGAGTCCAGGTCTGCGCTCCCAGAGGTGGATGTGGGTCCTCCTGCACCTGGTGCTGGCCTTCCTGTCCCTGCGCTCT TTGACAGCCTCCTGACCTGTAGGACGAGGGATTCCTTGTTCTTCTGCCTGAAATTTTGTACAGCAGCAATTTCTTACTCTCTCTGCAAGTTTTCTTCCCAGTCACGAGATACTTTGTGCAGCTGCTTATCTCCAGGCCTTATTAAAAAGTTTCAGTTCCTCATGTTCAGATTGTTCTCAGAGGCCCGACAGCCTCTTTCTGAGGAGGACGTAGCCAGCCTTTCCTGGAGACCCTTGCACCTTCCTTCTGCAGACTGGCAGAGAGCTGCCCTCTCTCTCTGGACACACAGAACCTTCCGAGAGGTGTTGAAAGAGGAAGATGTTCACTTAACTTACCAAGACTGGTTACACCTGGAGCTGGAAATTCAACCTGAAGCTGATGCTCTTTCAGATACTGAACGGCAGGACTTCCACCAGTGGGCGATCCATGAGCACTTTCTCCCTGAGTCCTCGGCTTCAGGGGGCTGTGACGGAGACCTGCAGGCTGCGTGTACCATTCTTGTCAACGCACTGATGGATTTCCACCAAAGCTCAAGGAGTTATGACCACTCAGAAAATTCTGATTTGGTCTTTGGTGGCCGCACAGGAAATGAGGATATTATTTCCAGATTGCAGGAGATGGTAGCTGACCTGGAGCTGCAGCAAGACCTCATAGTGCCTCTCGGCCACACCCCTTCCCAGGAGCACTTCCTCTTTGAGATTTTCCGCAGACGGCTCCAGGCTCTGACAAGCGGGTGGAGCGTGGCTGCCAGCCTTCAGAGACAGAGGGAGCTGCTAATGTACAAACGGATCCTCCTCCGCCTGCCTTCGTCTGTCCTCTGCGGCAGCAGCTTCCAGGCAGAACAGCCCATCACTGCCAGATGCGAGCAGTTCTTCCACTTGGTCAACTCTGAGATGAGAAACTTCTGCTCCCACGGAGGTGCCCTGACACAGGACATCACTGCCCACTTCTTCAGGGGCCTCCTGAACGCCTGTCTGCGGAGCAGAGACCCCTCCCTGATGGTCGACTTCATACTGGCCAAGTGCCAGACGAAATGCCCCTTAATTTTGACCTCTGCTCTGGTGTGGTGGCCGAGCCTGGAGCCTGTGCTGCTCTGCCGGTGGAGGAGACACTGCCAGAGCCCGCTGCCCCGGGAACTGCAGAAGCTACAAGAAGGCCGGCAGTTTGCCAGCGATTTCCTCTCCCCTGAGGCTGCCTCCCCAGCACCCAACCCGGACTGGCTCTCAGCTGCTGCACTGCACTTTGCGATTCAACAAGTCAGGGAAGAAAACATCAGGAAGCAGCTAAAGAAGCTGGACTGCGAGAGAGAGGAGCTATTGGTTTTCCTTTTCTTCTTCTCCTTGATGGGCCTGCTGTCGTCACATCTGACCTCAAATAGCACCACAGACCTGCCAAAGGCTTTCCACGTTTGTGCAGCAATCCTCGAGTGTTTAGAGAAGAGGAAGATATCCTGGCTGGCACTCTTTCAGTTGACAGAGAGTGACCTCAGGCTGGGGCGGCTCCTCCTCCGTGTGGCCCCGGATCAGCACACCAGGCTGCTGCCTTTCGCTTTTTACAGTCTTCTCTCCTACTTCCATGAAGACGCGGCCATCAGGGAAGAGGCCTTCCTGCATGTTGCTGTGGACATGTACTTGAAGCTGGTCCAGCTCTTCGTGGCTGGGGATACAAGCACAGTTTCACCTCCAGCTGGCAGGAGCCTGGAGCTCAAGGGTCAGGGCAACCCCGTGGAACTGATAACAAAAGCTCGTCTTTTTCTGCTGCAGTTAATACCTCGGTGCCCGAAAAAGAGCTTCTCACACGTGGCAGAGCTGCTGGCTGATCGTGGGGACTGCGACCCAGAGGTGAGCGCCGCCCTCCAGAGCAGACAGCAGGCTGCCCCTGACGCTGACCTGTCCCAGGAGCCTCATCTCTTCTGA(SEQ ID NO:8)；或
ATGTCCGACTCGTGGGTCCCGAACTCCGCCTCGGGCCAGGACCCAGGGGGCCGCCGGAGGGCCTGGGCCGAGCTGCTGGCGGGAAGGGTCAAGAGGGAAAAATATAATCCTGAAAGGGCACAGAAATTAAAGGAATCAGCTGTGCGCCTCCTGCGAAGCCATCAGGACCTGAATGCCCTTTTGCTTGAGGTAGAAGGTCCACTGTGTAAAAAATTGTCTCTCAGCAAAGTGATTGACTGTGACAGTTCTGAGGCCTATGCTAATCATTCTAGTTCATTTATAGGCTCTGCTTTGCAGGATCAAGCCTCAAGGCTGGGGGTTCCCGTGGGTATTCTCTCAGCCGGGATGGTTGCCTCTAGCGTGGGACAGATCTGCACGGCTCCAGCGGAGACCAGTCACCCTGTGCTGCTGACTGTGGAGCAGAGAAAGAAGCTGTCTTCCCTGTTAGAGTTTGCTCAGTATTTATTGGCACACAGTATGTTCTCCCGTCTTTCCTTCTGTCAAGAATTATGGAAAATACAGAGTTCTTTGTTGCTTGAAGCGGTGTGGCATCTTCACGTACAAGGCATTGTGAGCCTGCAAGAGCTGCTGGAAAGCCATCCCGACATGCATGCTGTGGGATCGTGGCTCTTCAGGAATCTGTGCTGCCTTTGTGAACAGATGGAAGCATCCTGCCAGCATGCTGACGTCGCCAGGGCCATGCTTTCTGATTTTGTTCAAATGTTTGTTTTGAGGGGATTTCAGAAAAACTCAGATCTGAGAAGAACTGTGGAGCCTGAAAAAATGCCGCAGGTCACGGTTGATGTACTGCAGAGAATGCTGATTTTTGCACTTGACGCTTTGGCTGCTGGAGTACAGGAGGAGTCCTCCACTCACAAGATCGTGAGGTGCTGGTTCGGAGTGTTCAGTGGACACACGCTTGGCAGTGTAATTTCCACAGATCCTCTGAAGAGGTTCTTCAGTCATACCCTGACTCAGATACTCACTCACAGCCCTGTGCTGAAAGCATCTGATGCTGTTCAGATGCAGAGAGAGTGGAGCTTTGCGCGGACACACCCTCTGCTCACCTCACTGTACCGCAGGCTCTTTGTGATGCTGAGTGCAGAGGAGTTGGTTGGCCATTTGCAAGAAGTTCTGGAAACGCAGGAGGTTCACTGGCAGAGAGTGCTCTCCTTTGTGTCTGCCCTGGTTGTCTGCTTTCCAGAAGCGCAGCAGCTGCTTGAAGACTGGGTGGCGCGTTTGATGGCCCAGGCATTCGAGAGCTGCCAGCTGGACAGCATGGTCACTGCGTTCCTGGTTGTGCGCCAGGCAGCACTGGAGGGCCCCTCTGCGTTCCTGTCATATGCAGACTGGTTCAAGGCCTCCTTTGGGAGCACACGAGGCTACCATGGCTGCAGCAAGAAGGCCCTGGTCTTCCTGTTTACGTTCTTGTCAGAACTCGTGCCTTTTGAGTCTCCCCGGTACCTGCAGGTGCACATTCTCCACCCACCCCTGGTTCCCAGCAAGTACCGCTCCCTCCTCACAGACTACATCTCATTGGCCAAGACACGGCTGGCCGACCTCAAGGTTTCTATAGAAAACATGGGACTCTACGAGGATTTGTCATCAGCTGGGGACATTACTGAGCCCCACAGCCAAGCTCTTCAGGATGTTGAAAAGGCCATCATGGTGTTTGAGCATACGGGGAACATCCCAGTCACCGTCATGGAGGCCAGCATATTCAGGAGGCCTTACTACGTGTCCCACTTCCTCCCCGCCCTGCTCACACCTCGAGTGCTCCCCAAAGTCCCTGACTCCCGTGTGGCGTTTATAGAGTCTCTGAAGAGAGCAGATAAAATCCCCCCATCTCTGTACTCCACCTACTGCCAGGCCTGCTCTGCTGCTGAAGAGAAGCCAGAAGATGCAGCCCTGGGAGTGAGGGCAGAACCCAACTCTGCTGAGGAGCCCCTGGGACAGCTCACAGCTGCACTGGGAGAGCTGAGAGCCTCCATGACAGACCCCAGCCAGCGTGATGTTATATCGGCACAGGTGGCAGTGATTTCTGAAAGACTGAGGGCTGTCCTGGGCCACAATGAGGATGACAGCAGCGTTGAGATATCAAAGATTCAGCTCAGCATCAACACGCCGAGACTGGAGCCACGGGAACACATTGCTGTGGACCTCCTGCTGACGTCTTTCTGTCAGAACCTGATGGCTGCCTCCAGTGTCGCTCCCCCGGAGAGGCAGGGTCCCTGGGCTGCCCTCTTCGTGAGGACCATGTGTGGACGTGTGCTCCCTGCAGTGCTCACCCGGCTCTGCCAGCTGCTCCGTCACCAGGGCCCGAGCCTGAGTGCCCCACATGTGCTGGGGTTGGCTGCCCTGGCCGTGCACCTGGGTGAGTCCAGGTCTGCGCTCCCAGAGGTGGATGTGGGTCCTCCTGCACCTGGTGCTGGCCTTCCTGTCCCTGCGCTCTTTGACAGCCTCCTGACCTGTAGGACGAGGGATTCCTTGTTCTTCTGCCTGAAATTTTGTACAGCAGCAATTTCTTACTCTCTCTGCAAGTTTTCTTCCCAGTCACGAGATACTTTGTGCAGCTGCTTATCTCCAGGCCTTATTAAAAAGTTTCAGTTCCTCATGTTCAGATTGTTCTCAGAGGCCCGACAGCCTCTTTCTGAGGAGGACGTAGCCAGCCTTTCCTGGAGACCCTTGCACCTTCCTTCTGCAGACTGGCAGAGAGCTGCCCTCTCTCTCTGGACACACAGAACCTTCCGAGAGGTGTTGAAAGAGGAAGATGTTCACTTAACTTACCAAGACTGGTTACACCTGGAGCTGGAAATTCAACCTGAAGCTGATGCTCTTTCAGATACTGAACGGCAGGACTTCCACCAGTGGGCGATCCATGAGCACTTTCTCCCTGAGTCCTCGGCTTCAGGGGGCTGTGACGGAGACCTGCAGGCTGCGTGTACCATTCTTGTCAACGCACTGATGGATTTCCACCAAAGCTCAAGGAGTTATGACCACTCAGAAAATTCTGATTTGGTCTTTGGTGGCCGCACAGGAAATGAGGATATTATTTCCAGATTGCAGGAGATGGTAGCTGACCTGGAGCTGCAGCAAGACCTCATAGTGCCTCTCGGCCACACCCCTTCCCAGGAGCACTTCCTCTTTGAGATTTTCCGCAGACGGCTCCAGGCTCTGACAAGCGGGTGGAGCGTGGCTGCCAGCCTTCAGAGACAGAGGGAGCTGCTAATGTACAAACGGATCCTCCTCCGCCTGCCTTCGTCTGTCCTCTGCGGCAGCAGCTTCCAGGCAGAACAGCCCATCACTGCCAGATGCGAGCAGTTCTTCCACTTGGTCAACTCTGAGATGAGAAACTTCTGCTCCCACGGAGGTGCCCTGACACAGGACATCACTGCCCACTTCTTCAGGGGCCTCCTGAACGCCTGTCTGCGGAGCAGAGACCCCTCCCTGATGGTCGACTTCATACTGGCCAAGTGCCAGACGAAATGCCCCTTAATTTTGACCTCTGCTCTGGTGTGGTGGCCGAGCCTGGAGCCTGTGCTGCTCTGCCGGTGGAGGAGACACTGCCAGAGCCCGCTGCCCCGGGAACTGCAGAAGCTACAAGAAGGCCGGCAGTTTGCCAGCGATTTCCTCTCCCCTGAGGCTGCCTCCCCAGCACCCAACCCGGACTGGCTCTCAGCTGCTGCACTGCACTTTGCGATTCAACAAGTCAGGGAAGAAAACATCAGGAAGCAGCTAAAGAAGCTGGACTGCGAGAGAGAGGAGCTATTGGTTTTCCTTTTCTTCTTCTCCTTGATGGGCCTGCTGTCGTCACATCTGACCTCAAATAGCACCACAGACCTGCCAAAGGCTTTCCACGTTTGTGCAGCAATCCTCGAGTGTTTAGAGAAGAGGAAGATATCCTGGCTGGCACTCTTTCAGTTGACAGAGAGTGACCTCAGGCTGGGGCGGCTCCTCCTCCGTGTGGCCCCGGATCAGCACACCAGGCTGCTGCCTTTCGCTTTTTACAGTCTTCTCTCCTACTTCCATGAAGACGCGGCCATCAGGGAAGAGGCCTTCCTGCATGTTGCTGTGGACATGTACTTGAAGCTGGTCCAGCTCTTCGTGGCTGGGGATACAAGCACAGTTTCACCTCCAGCTGGCAGGAGCCTGGAGCTCAAGGGTCAGGGCAACCCCGTGGAACTGATAACAAAAGCTCGTCTTTTTCTGCTGCAGTTAATACCTCGGTGCCCGAAAAAGAGCTTCTCACACGTGGCAGAGCTGCTGGCTGATCGTGGGGACTGCGACCCAGAGGTGAGCGCCGCCCTCCAGAGCAGACAGCAGGCTGCCCCTGACGCTGACCTGTCCCAGGAGCCTCATCTCTTCTGATGA(SEQ ID NO:36)。
本公开包含包括本文所描述的表达盒或转移盒的质粒。在特定实施例中，质粒是pCCL-PGK-FANCA-WPRE*或pCCL-PGK-FANCAW-82-RO(SEQ ID NO:25)。
在一些实施例中，基因疗法载体为自限制LV。在本文所述的表达盒和基因疗法载体中的任一个的具体实施例中，转移盒是本公开的pCCL-SIN-cPPT/CTS-hPGK-hFANCA-WPRE，其包括以下序列或与SEQ ID NO:24具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：SEQ ID NO:24对应于pCCL-PGK-FANCA-WPRE*质粒。SEQ ID NO:25对应于pCCL-PGK-FANCAW-82-RO质粒。
在一个实施例中，通过慢病毒载体(LV)递送FANCA基因。本文所述的FANCALV利用自失活慢病毒载体(LV)。在一个实施例中，FANCALV包括人磷酸甘油酸(PGK)基因的启动子。与已经用于临床的携带强病毒启动子的γ-逆转录病毒载体相比，这种载体的安全特性已经显著提高。
在某些实施例中，慢病毒载体是PGK-FANCA.WPRE*LV，其包括基因转移盒，所述基因转移盒包括在SEQ ID NO:24中公开的序列。PGK-FANCA-WPRE*LV基因表达盒部分包括人PGK启动子、用于FANCA cDNA的编码序列和WPRE*；并且对应于SEQ ID NO:24的核苷酸3541到9178。PGK-FANCA-WPRE*LV转移盒部分包括从序列的约5'LTR(U5)到约3'LTR(U5)。相对于SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:24的核苷酸1586-1789包括人CMV立即早期启动子。SEQ ID NO:24的核苷酸2031-2156包括HIV1 psi包装信号。SEQ ID NO:24的核苷酸2649-2882包括HIV1RRE元件。SEQ ID NO:24的核苷酸3378-3495包括HIV cPPT/CTS元件。SEQ ID NO:24的核苷酸3541-4051包括hPGK启动子。SEQ ID NO:24的核苷酸4078-8445包括人FANCA-A cDNA。SEQID NO:24的核苷酸8502-9178包括突变WPRE元件。SEQ ID NO:24的核苷酸9262-9495包括HIVδU3'LTR。
在某些实施例中，慢病毒载体是pCCL-PGK-FANCAW-82-RO，其包括基因转移盒，所述基因转移盒包括SEQ ID NO:25中公开的序列。pCCL-PGK-FANCAW-82-RO基因表达盒部分包括人PGK启动子、用于FANCA cDNA的编码序列和WPRE*；并且对应于SEQ ID NO:25的核苷酸2335到7888。pCCL-PGK-FANCAW-82-RO转移盒部分包括从序列的约5'LTR(U5)到约3'LTR(U5)。相对于SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:25的核苷酸1-577包括人CMV立即早期启动子。SEQID NO:25的核苷酸889-933其包括HIV1psi包装信号。SEQ ID NO:25的核苷酸1296-253包括HIV1 RRE元件。SEQ ID NO:25的核苷酸2176-2191包括HIV cPPT/CTS元件。SEQ ID NO:25的核苷酸2335-2845包括hPGK启动子。SEQ ID NO:25的核苷酸2872-7242包括人FANCA-AcDNA。SEQ ID NO:25的核苷酸7293-7888包括突变WPRE元件。SEQ ID NO:25的核苷酸8056-8289包括HIVδU3'LTR。
在又另一个实施例中，慢病毒载体含有以下元件：(i)源自初始pCCLsin-cppt-hPGK-eGFP-WPRE(Dull等人,1998；《病毒学杂志(J.Virol.)》72(11),9873-9880)的慢病毒载体的主链。pCCL主链利用异源CMV-HIV 5'LTR以在生产细胞中获得高水平的病毒RNA转录。这种异源LTR使构建体不需要使用HIV Tat蛋白来生产rHIV颗粒，并且这因此是安全特征。3'LTR的U3区含有400bp的缺失，如在Zufferey等人《病毒学杂志》,1998中所述的，其赋予载体自失活特性；(ii)经过人类密码子优化的FANCA基因的cDNA(4368bp基因库登录号：X_99226或如本文所公开的)，其在人PGK启动子的控制下对FANCA蛋白(1455AA)进行编码。与已经用于基因疗法的其它启动子相比，已经通过其体内的稳定活性和通过改善的安全特性来表征所述启动子；以及(iii)土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)的突变版本，所述突变版本在对X蛋白进行编码的序列的3'区域中以及由Schambach等人(《基因疗法》,2006；13,641-645)描述的任何残留ORF或WPRE*中被缺失。
在某些实施例中，本文所述的FANCALV利用自失活慢病毒载体(LV)。在一个实施例中，FANCA LV包括人磷酸甘油酸(PGK)基因的启动子。与已经用于临床的携带强病毒启动子的γ-逆转录病毒载体相比，这种载体的安全特性已经显著提高。在一个实施例中，通过慢病毒载体递送FANCA基因。在某些实施例中，慢病毒载体是PGK-FANCA.WPRE*LV。
可以使用标准方法来产生使本公开的多核苷酸盒衣壳化的基因疗法载体。例如，在LV病毒粒子的情况下，根据本发明的LV表达载体可以引入到生产细胞中，然后引入LV辅助构建体，其中辅助构建体包含能够在生产细胞中进行表达的LV编码区并且所述LV编码区可对LV载体中不存在的LV辅助功能进行补充。随后将辅助病毒和/或另外的载体引入到生产细胞中，其中辅助病毒和/或另外的载体提供了能够支持高效LV病毒生产的辅助功能。然后培养生产细胞以产生LV。这些步骤是使用标准方法进行的。在特定实施例中，图38-41中描绘的质粒用于产生基因疗法载体。
可以使用任何合适的用于产生用于递送主题多核苷酸盒的病毒载体颗粒的方法，包含但不限于以下实例中描述的那些。可以制备适合于对哺乳动物细胞进行有效转导的任何浓度的感染病毒载体颗粒，以在体外或体内接触哺乳动物细胞。例如，可以将病毒颗粒调配成每ml 108个感染单位或更多，例如每mL 5×108个感染单位；每mL 109个传染单位；每mL5×109个感染单位，每mL 1010个感染单位，每mL 5×1010个感染单位；每mL 1011个感染单位；每mL 5×1011个感染单位；每mL 1012个感染单位；每mL 5×1012个感染单位；每mL 1013个感染单位；每mL 1.5×1013个感染单位；每mL 3×1013个感染单位；每mL 5×1013个感染单位；每mL 7.5×1013个感染单位；每mL 9×1013个感染单位；每mL 1×1014个感染单位，每mL5×1014个感染单位或更多的浓度，但通常不超过每mL 1×1015个感染单位。
在制备主题LV基因疗法载体时，可以采用用于产生LV病毒粒子的任何宿主细胞，包含但不限于例如哺乳动物细胞(例如，293个细胞)、昆虫细胞(例如，SF9细胞)、微生物和酵母。宿主细胞也可以是包装细胞或生产细胞，在所述包装细胞中，LV rep和cap基因稳定地维持在宿主细胞中，在所述生产细胞中，LV载体基因组稳定地维持和包装。示例性包装和生产细胞源自于SF-9、293、A549或HeLa细胞。LV载体使用本领域已知的标准技术进行纯化和调配。
在某些实施例中，本发明包含一种细胞，所述细胞包括本文公开的基因表达盒、基因转移盒或基因疗法载体。在相关的实施例中，用包括本文公开的表达盒或具有本文公开的整合到细胞基因组中的表达盒的基因疗法载体转导细胞。在某些实施例中，细胞是用于产生病毒基因疗法载体的细胞，例如包装细胞。
在其它实施例中，细胞是待递送给受试者以向受试者提供由表达盒编码的基因产物的细胞。因此，在某些实施例中，细胞对待治疗的受试者是自体的，或者从待治疗的受试者获得。在其它实施例中，细胞对待治疗的受试者是同种异体的，或者从不同于待治疗的受试者的供体获得。在特定实施例中，细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞。在某些实施例中，细胞是血细胞、红细胞、造血祖细胞、骨髓细胞，例如谱系耗竭骨髓细胞、造血干细胞(例如，CD34+)或定向造血红系祖细胞。在特定实施例中，所述细胞是从受试者获得的CD34+细胞，所述受试者待用通过本文公开的基因疗法载体转导后的细胞治疗。在特定实施例中，所述细胞是从被诊断患有FA的受试者获得的CD34+FA细胞。
在一些实施例中，本文公开的方法产生了治疗益处，例如预防病症的发展、停止病症的进展、逆转病症的进展等。例如，在一个实施例中，所述病症为BMF。在一个实施例中，所述病症为血小板减少症。在另一个实施例中，所述病症为白细胞减少症。在一个实施例中，所述病症为全血细胞减少症。在一个实施例中，所述病症为中性粒细胞减少症。在另一个实施例中，所述病症为贫血。在一些实施例中，主题方法包括检测到治疗益处已经实现的步骤。普通技术人员应了解，治疗功效的这种量度将适用于正被修饰的特定疾病，并且应认识到用来测量治疗功效的适当检测方法。
在另一个实施例中，本发明包含一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括向受试者提供有效量的高严格性CD34富集细胞群和低严格性CD34富集细胞群中的任一种或两种，所述两种细胞群中的任一种或两种都已经与在细胞中表达治疗性基因产物的基因疗法载体(例如，病毒载体)接触。在特定实施例中，高严格性CD34富集细胞群和低严格性CD34富集细胞群中的一种或两种对受试者是自体的。在某些实施例中，细胞是红系细胞，例如造血干细胞或定向造血红系祖细胞。在一些实施例中，所述细胞是骨髓细胞，例如谱系耗竭骨髓细胞。在特定实施例中，所述方法用于治疗FA，并且病毒载体是包括本文中公开的表达构建体的LV，所述表达构建体包括与FANCA基因cDNA或编码序列可操作地连接的人PGK启动子和本文中公开的突变wPRE。在特定实施例中，细胞经肠胃外提供给受试者，例如通过静脉内注射。
在另一个实施例中，本发明包含一种治疗有需要的受试者的FA的方法，所述方法包括向受试者提供有效量的用LV载体转导的干细胞的自体高严格性CD34富集细胞群和/或低严格性CD34富集细胞群，所述LV载体在细胞中表达FANCA cDNA，其中所述LV载体包括与FANCA cDNA或编码序列可操作地连接的人PGK启动子和本文中公开的突变wPRE序列。在特定实施例中，细胞是造血干细胞或定向造血红系祖细胞，例如骨髓细胞。在特定实施例中，细胞经肠胃外提供给受试者，例如通过静脉内注射。
期望使用主题转基因获得的转基因的表达是稳健的。因此，在一些情况下，例如如通过测量基因产物的水平、通过测量治疗功效等检测到的转基因的表达可以在施用后两个月或更短时间观察到，例如在施用后4周、3周或2周或更短时间，例如在施用主题组合物后1周。也期望转基因的表达随着时间的推移而持续。因此，在一些情况下，例如如通过测量基因产物的水平、通过测量治疗功效等检测到的转基因的表达可以在施用主题组合物后2个月或更长时间观察到，例如4个月、6个月、8个月或10个月或更长时间，在一些情况下1年或更长时间，例如2年、3年、4年或5年，在某些情况下超过5年。
在某些实施例中，所述方法包括检测细胞中或受试者中转基因的表达的步骤，其中表达相对于来自不包括本公开的一个或多个经过改进的元件的多核苷酸盒的表达有所增强。通常，如通过例如早期检测、更高水平的基因产物、对细胞更强的功能性影响等证实的，相对于来自例如本领域已知的参照(即，对照多核苷酸盒)的表达，表达将增强2倍或更多倍，例如3倍、4倍或5倍或更多倍，在一些情况下，10倍、20倍或50倍或更多倍，例如100倍。
在一些实施例中，患者通过输注接收的细胞剂量将是从转导过程中获得的剂量。在各个优选实施例中，将至少约1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108或更多的高严格性CD34富集细胞/KG患者体重输注到患者体内。在各个优选实施例中，将至少约1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108或更多的高严格性CD34富集细胞/KG患者体重输注到患者体内。在一些实施例中，将介于1×106与4×106之间的高严格性CD34富集细胞/Kg患者体重输注到患者体内。在其它实施例中，将3×105和4×106的高严格性CD34富集细胞/Kg患者体重输注到患者体内。在一些实施例中，将介于1×106与4×106之间的高严格性CD34富集细胞/Kg患者体重输注到患者体内。在其它实施例中，将3×105和4×106的高严格性CD34富集细胞/Kg患者体重输注到患者体内。在一些实施例中，细胞将以单剂量输注到患者体内。在其它实施例中，细胞将以多剂量输注到患者体内(例如，顺序施用高严格性和低严格性CD34富集细胞群一次或多次)。可以在转导过程完成后立即输注经过转导的细胞。在特定实施例中，经过转导的细胞在使用前被储存或冷冻，而在某些实施例中，其在被转导后立即或不久被提供给受试者，例如在一小时、两小时、四小时或八小时内。
一旦经过整合，治疗性蛋白(例如，人FANCA蛋白)由细胞表达。对经过转导的FA细胞进行基因修正，并且因此能够通过FANCD2和FANCI的单泛素化来激活FA通路。这些蛋白质迁移到DNA损伤的区域，并与其它DNA修复蛋白合作，促进这些细胞中的DNA修复，如在健康细胞中发生的那样。
如在实例中进一步详细描述的，来自人FA患者的BM样品的临床前体外数据已经显示FANCA LV修正这些细胞的表型的疗效。
在一个实施例中，施用至少1到4×106CD34+经过修正细胞每千克患者体重(例如，FANCA转导的HSC)，例如以恢复非条件性FA患者的造血功能。在一些实施例中，经过转导的细胞在转导后立即输注或施用到患者中。在其它实施例中，经过转导的细胞在输注或施用给患者之前被冷冻。
对来自FA患者的HSC进行基因修正，然后进行这些细胞的自体移植(造血基因疗法)，对于FA患者(尤其是那些缺乏HLA相同的兄弟姐妹的患者)来说是很好的替代性方案。在一个实施例中，造血基因疗法对于缺乏HLA相同的兄弟姐妹的患者来说是优选治疗方案。在另一个实施例中，造血基因疗法是针对具有HLA相同的兄弟姐妹的患者的优选治疗方案。
组合物和调配物
本公开的某些方面涉及高严格性CD34富集细胞群和低严格性CD34富集细胞群的系统或组合，已经用基因疗法载体对所述两种细胞群中的一个或两个进行转导。一些实施例包括高严格性CD34富集细胞群和低严格性CD34富集细胞群的组合，已经用含有人FANC基因(例如FANCA、FANCC或FANCG，或对FANC蛋白进行编码的核酸序列，包含其功能变体和片段)的慢病毒载体对所述两种细胞群中的一个或两个进行转导。一些实施例包括高严格性CD34富集细胞群和低严格性CD34富集细胞群的组合，所述两种细胞群中的一个或两个已经进行基因编辑或基因修复，如用CRISPR、TALEN、锌指或大范围核酸酶基因编辑系统。一些实施例包括高严格性CD34富集细胞群和低严格性CD34富集细胞群的组合，所述细胞群已经用含有与疾病或病状(如免疫缺陷病症)相关的转基因的慢病毒(或其它病毒)载体进行转导。
在本公开的一些方面，提供了用于治疗疾病或病状的调配物。调配物可以包括一个或多个高严格性CD34富集细胞群或一个或多个低严格性CD34富集细胞群或两者，以及如本文所述的生理上可接受的载剂或药学上可接受的载剂。调配物可以包括一个或多个高严格性CD34富集细胞群或一个或多个低严格性CD34富集细胞群或两者，所述两种细胞群中的一个或两个细胞群用基因疗法载体转导并表达或能够表达治疗剂以及如本文所述的生理上可接受的载剂或药学上可接受的载剂。
本发明包含药物组合物和调配物，所述药物组合物和调配物包括如本文所述的高严格性CD34富集细胞群和低严格性CD34富集细胞群基因疗法载体中的一种或两种以及药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。主题高严格性CD34富集细胞群和/或低严格性CD34富集细胞群可以与可用于制备调配物的药学上可接受的载剂、稀释剂和试剂进行组合，所述调配物通常是安全、无毒且期望的并且包含供灵长类动物使用的可接受的赋形剂。此类赋形剂、载剂或稀释剂的实例包含但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。补充性活性化合物也可以并入调配物中。用于调配物的溶液或悬浮液可以包含：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、二甲亚砜(DMSO)、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌化合物，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；清洁剂，如用于防止聚合的吐温20；以及用于调节渗透压的化合物，如氯化钠或右旋糖。可以用如盐酸或氢氧化钠等酸或碱调整pH。在特定实施例中，调配物是无菌的。
在一些实施例中，根据当前良好生产规范制造CD34富集细胞群。根据当前良好生产规范制造意味着，为施用而制备的调配物足够安全以允许在控制法规和政府授权下将其施用于人类受试者。一般地，控制法规和授权将指示调配物符合预先批准的关于同一性、强度、质量和纯度的验收标准。验收标准包含用于确定调配物是否符合当前良好生产规范的数值限值、范围或其它合适的测试结果的量度。说明书示出了用于测试是否符合验收标准的分析程序。可以分批评估调配物。批是经过测试以确保符合验收标准的调配物的特定数量。
调配物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器(例如，注射器，例如载药注射器)中。
在必要或有益的情况下，调配物可以包含如利多卡因等局部麻醉剂，以减轻注射部位处的疼痛。
调配物内细胞的治疗有效量可以大于102个细胞、大于103个细胞、大于104个细胞、大于105个细胞、大于106个细胞、大于107个细胞、大于108个细胞、大于109个细胞、大于1010个细胞或大于1011个细胞。
在本文公开的调配物中，细胞的体积通常为一升或更少、500ml或更少、250ml或更少或100ml或更少。因此，施用细胞的密度通常大于104个细胞/ml、107个细胞/ml或108个细胞/ml。
本文公开的调配物可以通过例如注射、输注、灌注或灌洗来制备以便施用。施用的治疗有效量可以包含大于102个细胞、大于103个细胞、大于104个细胞、大于105个细胞、大于106个细胞、大于107个细胞、大于108个细胞、大于109个细胞、大于1010个细胞或大于1011个细胞。在特定实施例中，最小剂量为2×106个细胞/kg受试者体重。
在一些实施例中，本文所提供的药物组合物包括与药学上可接受的载剂和/或赋形剂混合的本文公开的治疗有效量的高严格性CD34富集细胞群和低严格性CD34富集细胞群基因疗法载体中的一种或两种，所述药学上可接受的载剂和/或赋形剂例如盐水、磷酸盐缓冲盐水、磷酸盐和氨基酸、聚合物、多元醇、糖、缓冲剂、防腐剂和其它蛋白质。示例性氨基酸、聚合物和糖等是辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、聚乙二醇单硬脂酸酯化合物、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、蔗糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇、右旋糖酐、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、木糖醇、乳糖、海藻糖、牛或人血清白蛋白、柠檬酸盐、乙酸盐、林格氏溶液和汉克氏溶液、半胱氨酸、精氨酸、肉毒碱、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯和乙二醇。优选地，这一调配物在4℃下在至少六个月内是稳定的。
在一些实施例中，本文所提供的药物组合物包括缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或磷酸钠/硫酸钠、tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、无菌水和普通技术人员已知的其它缓冲液，如Good等人(1966)《生物化学(Biochemistry)》5:467所描述的那些缓冲液。包括腺病毒载体递送系统中含有的肿瘤抑制基因的药物组合物的缓冲液的pH可以在6.5到7.75的范围内，优选地7到7.5，并且最优选地7.2到7.4。
本文所提及的所有出版物均以引用的方式并入本文中，以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。应当理解，在存在矛盾的情况下，本公开代替所并入的出版物的任何公开内容。
应当进一步指出的是，权利要求书可以撰写为排除任何可选择的要素。因此，本声明旨在用作使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定型”限定的前提基础。
仅提供在本申请的提交日期之前的本文所讨论的出版物中的公开内容。进一步地，所提供的出版日期可能与实际的出版日期不同，实际的出版日期可能需要独立地确认。
因为FA-A是FA患者中最常见的互补群(Casado等人,2007,Taniguchi等人,2006)，因此表达FANCA基因和/或EGFP标志物基因的载体是实例的焦点；然而，也可以利用其它FANCA基因来类似地处理其它互补群。
本公开在以下实例中进一步描述，所述实例不限制权利要求中所描述的本公开的范围。
实例
实例1
用高严格性和低严格性CD34富集细胞群治疗患者
患者1表现为范可尼贫血。此后，患者1经历了使用G-CSF和plerixafor的动员，随后连续几天进行了两次单采血液成分术采集。由对循环CD34细胞的外周血分析指示的，相对于同一临床试验中的其它FA患者，患者1具有CD34细胞的中度动员，其动员动力学与其它患者类似。在两次单采血液成分术采集后，收集到的HSPC被分成两个外周血生物样品。
高严格性CD34选择：如美国专利第8,727,132号中所述，通过使用用于富集的美天旎生物技术CD34试剂以富集模式使用美天旎生物技术
Figure BDA0002672978790000523
系统在高严格性条件下选择CD34+细胞来富集第一生物样品。高严格性CD34选择导致CD34+细胞的产率为29.0％，并且相对纯度为36％。
低严格性CD34选择：通过使用美天旎生物技术
Figure BDA0002672978790000524
系统的消耗模式的修改在低严格性条件下选择CD34+细胞来富集第二生物样品。简而言之，第二生物样品使用美天旎生物技术CD34试剂进行标记。然后，使用器械的消耗模式程序将样品装载到柱上。在磁体“接通”的情况下分批装载样品后，细胞收集袋(用于器械的正常操作以收集靶细胞)被移除，并且不用于干细胞移植。连接“非靶细胞袋”，然后“关断”磁体，并且然后将洗脱缓冲液应用于器械，从而引起将CD34+细胞洗脱到非靶细胞袋中。保留在非靶细胞袋中收集的细胞群，并将其指定为低严格性CD34富集细胞群。低严格性CD34选择导致CD34+细胞的产率为54.5％，相对纯度为5.8％。低纯度是由于在选择期间未从CD34+细胞中纯化出来的其它造血细胞类型造成的。结果总结于表1A和1B中。
表1A：CD34富集前
Figure BDA0002672978790000521
表1B：CD34富集后
Figure BDA0002672978790000522
Figure BDA0002672978790000531
来自范可尼贫血A患者的起始细胞数和CD34+细胞纯度以及最终细胞群
Aph：单采血液成分术
TNC：总有核细胞计数
低：改进的CliniMACS消耗计划
高：标准CliniMACS CD34富集程序
随后，高严格性CD34富集细胞群和低严格性CD34富集细胞群各自独立地用对FANCA基因产物进行编码的重组基因疗法载体(PGK-FANCA-WPRE*)(SEQ ID NO:25)进行转导，并且所得基因修饰细胞被分别指定为产物1.1和产物1.2。
将产物1.1和产物1.2混合在一起，并且然后在监测临床指标的同时，通过持续静脉内输注10-30分钟将其施用于患者1。
患者1示出了在参与机构中移植的所有FA患者的最快速或几乎最快速的体内选择植入动力学。使在移植前已经在该FA患者体内下降的造血谱系出现早期稳定趋势是令人信服的临床成功的终点，这是通过这种治疗方法意外实现的。五位其它FA患者已经用标准CD34选择方法进行移植，并且没有患者示出与患者1相当的植入动力学。
不受理论的约束，据信高严格性(产物1.1)和低严格性(产物1.2)CD34富集细胞群的混合物赋予基因修饰的FA造血细胞体内选择性优势，并导致基因修饰细胞随着时间推移而逐渐增加。产物1.1(高严格性CD34富集细胞群)被认为提供了大多数有助于造血功能的基因修饰细胞，并且产物1.2(低严格性CD34富集细胞群)被认为通过产物1.1促进了稳健的植入和造血再增殖。
实例2
用谱系消耗细胞群治疗的比较疗效
患者2表现为范可尼贫血。通过使用与实例1中那些程序等效的程序的动员的单采血液成分术从患者2获得外周血生物样品。通过用CD3/CD14/CD16/CD19试剂标记生物样品并使用美天旎生物技术
Figure BDA0002672978790000532
系统在消耗模式下消耗标记细胞的样品来制备谱系消耗细胞群。谱系消耗CD34选择导致CD34+细胞的产率为56％，相对纯度为1.6％。低纯度是由于在选择期间未从CD34+细胞中纯化出来的其它造血细胞类型造成的。CD34细胞的产率和纯度与患者1在低严格性CD34富集细胞群中实现的产率和纯度相当。未制备高严格性CD34富集细胞群。用对FANCA基因产物进行编码的重组基因疗法载体转导谱系消耗细胞群，并将其指定为产物2.1。
通过持续静脉内输注10-30分钟将产物2.1施用于患者2，同时监测与患者1一起使用的细胞数量临床指标相当的临床指标。与患者1相比，在移植后六个月，在患者2的血液中未检测到基因修饰细胞。因此，据信仅与产物1.2类似的产物2.1不会导致可检测的造血恢复。
实例3
修改低严格性条件以获得更高产率并用所得细胞群进行处理
患者3表现为范可尼贫血。通过使用与实例1中那些程序等效的程序的动员的单采血液成分术从患者3获得外周血生物样品。在单采血液成分术采集后，收集到的HSPC被分成两个外周血生物样品。
高严格性CD34选择：如实例1中所述，通过使用用于富集的美天旎生物技术CD34试剂以富集模式使用美天旎生物技术
Figure BDA0002672978790000542
系统在高严格性条件下选择CD34+细胞来富集第一生物样品。高严格性CD34选择导致CD34+细胞的产率大于20％，并且相对纯度大于20％。使用上述样品运行
Figure BDA0002672978790000543
系统上的CD34选择程序，其中参数如表2所指示的。所述过程持续大约20-30分钟。
Figure BDA0002672978790000544
系统的“靶细胞袋”含有高严格性CD34富集细胞群。
表2
Figure BDA0002672978790000541
Figure BDA0002672978790000551
低严格性CD34选择：通过使用如实例1中所述的美天旎生物技术
Figure BDA0002672978790000552
系统的消耗模式的修改在低严格性条件下选择CD34+细胞来富集第二生物样品，所述修改旨在提供相对于应用于患者1的低严格性富集的更高产率的CD34+细胞。
在总细胞数为60×109到6×108(在使用一小瓶CD34标记试剂时)或总细胞数为120×109到12×108(在使用两小瓶CD34标记试剂时)时提供用柠檬酸葡萄糖抗凝液(ACD-A)抗凝的外周血单采产物。在无菌条件下的层流罩中，测量细胞计数、细胞活力和CD3+、CD19+或CD34+细胞亚群的计数。将单采产物转移到转移袋中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将所述转移袋的总体积填充为600ml。将内容物以230G离心15分钟，并且除去上清液，留下90ml，向其中添加5ml免疫球蛋白，然后将其在室温下混合10分钟。将一个或两个7.5ml小瓶的
Figure BDA0002672978790000553
CD34试剂注射到袋中，将其混合并在室温下搅拌温育30分钟。细胞以230G离心15分钟，并重新悬浮在150ml的PBS中。
使用上述样品运行
Figure BDA0002672978790000554
系统上的CD34选择程序，其中参数如表2所指示的。所述过程持续大约20-30分钟。在所述洗涤步骤中的任一个发生之前中止程序，并且将CD34富集细胞和其它非特异性细胞冲洗到“靶细胞袋”中。
Figure BDA0002672978790000555
系统的“靶细胞袋”含有低严格性CD34富集细胞群。
Figure BDA0002672978790000556
系统的“非靶细胞袋”含有非靶细胞。
低严格性CD34选择导致CD34+细胞的产率为约35％到60％，并且相对纯度为约10％到30％。
随后，高严格性CD34富集细胞群和低严格性CD34富集细胞群均被各自单独转导或与对如实例1中所述的FANCA基因产物进行编码的重组基因疗法载体组合并用其转导，并且所得基因修饰细胞被分别指定为产物3.1和产物3.2。
如果将单独转导的产物3.1和产物3.2混合在一起，并且此后通过静脉内推注施用于患者3。
患者3示出快速的体内选择植入动力学。该治疗方案导致造血功能、中性粒细胞、红细胞和血小板的多向稳定。使在移植前已经在患者3体内下降的造血谱系得到稳定是令人信服的临床成功的终点。
实例4
使用具有高严格性和低严格性CD34富集细胞群的CRISPR-Cas进行基因疗法
从另外的患者中获取生物样品，并如实例3中所述制备高严格性和低严格性CD34富集细胞群。产生了一种重组基因疗法，其被设计成递送能够定向修复内源性FANC基因的基因编辑系统。基因编辑系统包含Cas蛋白或对Cas蛋白进行编码的多核苷酸；gRNA；以及修复模板。修复模板包括与另外的患者中的FANC基因(例如，FANCA)的已知一种或多种突变重叠的序列片段。将高严格性和低严格性CD34富集群中的一个或两个与重组基因疗法载体接触，并且然后将两个CD34富集细胞群的混合物自体移植到所述患者中的每个患者体内。患者示出快速的体内选择植入动力学。该治疗方案导致造血功能、中性粒细胞、红细胞和血小板的多向增加。使在移植前已经在患者体内下降的造血谱系得到恢复是令人信服的临床成功的终点。
序列表
<110> 火箭制药有限公司（Rocket Pharmaceuticals, Ltd.）
Fundacion para la Investigacion Biomedica del Hospital
Infantil Universitario Nino Jesus
<120> 用于干细胞移植的组合物和方法
<130> ROPA-008/01WO 326219-2068
<150> US 62/656,292
<151> 2018-04-11
<160> 37
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 234
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组Rev响应元件
<400> 1
aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat 60
gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt 120
gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca 180
gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcct 234
<210> 2
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组包装信号序列
<400> 2
ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg caagaggcga ggggcggcga 60
ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga aggagagaga tgggtgcgag 120
agcgtc 126
<210> 3
<211> 181
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组截短的HIV-1 5' LTR序列
<400> 3
gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca 60
ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg 120
tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc 180
a 181
<210> 4
<211> 234
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组HIV-1自灭活3' LTR序列
<400> 4
tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc 60
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 120
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 180
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agca 234
<210> 5
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组人巨细胞病毒立即早期启动子
<400> 5
gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60
ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120
tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180
tgggaggtct atataagcag agct 204
<210> 6
<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组HIV-1中央聚嘌呤段和中央终止序列
<400> 6
ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat 60
agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaatttt 118
<210> 7
<211> 511
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组人磷酸甘油酸激酶1启动子序列
<400> 7
ggggttgggg ttgcgccttt tccaaggcag ccctgggttt gcgcagggac gcggctgctc 60
tgggcgtggt tccgggaaac gcagcggcgc cgaccctggg tctcgcacat tcttcacgtc 120
cgttcgcagc gtcacccgga tcttcgccgc tacccttgtg ggccccccgg cgacgcttcc 180
tgctccgccc ctaagtcggg aaggttcctt gcggttcgcg gcgtgccgga cgtgacaaac 240
ggaagccgca cgtctcacta gtaccctcgc agacggacag cgccagggag caatggcagc 300
gcgccgaccg cgatgggctg tggccaatag cggctgctca gcagggcgcg ccgagagcag 360
cggccgggaa ggggcggtgc gggaggcggg gtgtggggcg gtagtgtggg ccctgttcct 420
gcccgcgcgg tgttccgcat tctgcaagcc tccggagcgc acgtcggcag tcggctccct 480
cgttgaccga atcaccgacc tctctcccca g 511
<210> 8
<211> 4368
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 经过密码子优化的FANCA序列
<400> 8
atgtccgact cgtgggtccc gaactccgcc tcgggccagg acccaggggg ccgccggagg 60
gcctgggccg agctgctggc gggaagggtc aagagggaaa aatataatcc tgaaagggca 120
cagaaattaa aggaatcagc tgtgcgcctc ctgcgaagcc atcaggacct gaatgccctt 180
ttgcttgagg tagaaggtcc actgtgtaaa aaattgtctc tcagcaaagt gattgactgt 240
gacagttctg aggcctatgc taatcattct agttcattta taggctctgc tttgcaggat 300
caagcctcaa ggctgggggt tcccgtgggt attctctcag ccgggatggt tgcctctagc 360
gtgggacaga tctgcacggc tccagcggag accagtcacc ctgtgctgct gactgtggag 420
cagagaaaga agctgtcttc cctgttagag tttgctcagt atttattggc acacagtatg 480
ttctcccgtc tttccttctg tcaagaatta tggaaaatac agagttcttt gttgcttgaa 540
gcggtgtggc atcttcacgt acaaggcatt gtgagcctgc aagagctgct ggaaagccat 600
cccgacatgc atgctgtggg atcgtggctc ttcaggaatc tgtgctgcct ttgtgaacag 660
atggaagcat cctgccagca tgctgacgtc gccagggcca tgctttctga ttttgttcaa 720
atgtttgttt tgaggggatt tcagaaaaac tcagatctga gaagaactgt ggagcctgaa 780
aaaatgccgc aggtcacggt tgatgtactg cagagaatgc tgatttttgc acttgacgct 840
ttggctgctg gagtacagga ggagtcctcc actcacaaga tcgtgaggtg ctggttcgga 900
gtgttcagtg gacacacgct tggcagtgta atttccacag atcctctgaa gaggttcttc 960
agtcataccc tgactcagat actcactcac agccctgtgc tgaaagcatc tgatgctgtt 1020
cagatgcaga gagagtggag ctttgcgcgg acacaccctc tgctcacctc actgtaccgc 1080
aggctctttg tgatgctgag tgcagaggag ttggttggcc atttgcaaga agttctggaa 1140
acgcaggagg ttcactggca gagagtgctc tcctttgtgt ctgccctggt tgtctgcttt 1200
ccagaagcgc agcagctgct tgaagactgg gtggcgcgtt tgatggccca ggcattcgag 1260
agctgccagc tggacagcat ggtcactgcg ttcctggttg tgcgccaggc agcactggag 1320
ggcccctctg cgttcctgtc atatgcagac tggttcaagg cctcctttgg gagcacacga 1380
ggctaccatg gctgcagcaa gaaggccctg gtcttcctgt ttacgttctt gtcagaactc 1440
gtgccttttg agtctccccg gtacctgcag gtgcacattc tccacccacc cctggttccc 1500
agcaagtacc gctccctcct cacagactac atctcattgg ccaagacacg gctggccgac 1560
ctcaaggttt ctatagaaaa catgggactc tacgaggatt tgtcatcagc tggggacatt 1620
actgagcccc acagccaagc tcttcaggat gttgaaaagg ccatcatggt gtttgagcat 1680
acggggaaca tcccagtcac cgtcatggag gccagcatat tcaggaggcc ttactacgtg 1740
tcccacttcc tccccgccct gctcacacct cgagtgctcc ccaaagtccc tgactcccgt 1800
gtggcgttta tagagtctct gaagagagca gataaaatcc ccccatctct gtactccacc 1860
tactgccagg cctgctctgc tgctgaagag aagccagaag atgcagccct gggagtgagg 1920
gcagaaccca actctgctga ggagcccctg ggacagctca cagctgcact gggagagctg 1980
agagcctcca tgacagaccc cagccagcgt gatgttatat cggcacaggt ggcagtgatt 2040
tctgaaagac tgagggctgt cctgggccac aatgaggatg acagcagcgt tgagatatca 2100
aagattcagc tcagcatcaa cacgccgaga ctggagccac gggaacacat tgctgtggac 2160
ctcctgctga cgtctttctg tcagaacctg atggctgcct ccagtgtcgc tcccccggag 2220
aggcagggtc cctgggctgc cctcttcgtg aggaccatgt gtggacgtgt gctccctgca 2280
gtgctcaccc ggctctgcca gctgctccgt caccagggcc cgagcctgag tgccccacat 2340
gtgctggggt tggctgccct ggccgtgcac ctgggtgagt ccaggtctgc gctcccagag 2400
gtggatgtgg gtcctcctgc acctggtgct ggccttcctg tccctgcgct ctttgacagc 2460
ctcctgacct gtaggacgag ggattccttg ttcttctgcc tgaaattttg tacagcagca 2520
atttcttact ctctctgcaa gttttcttcc cagtcacgag atactttgtg cagctgctta 2580
tctccaggcc ttattaaaaa gtttcagttc ctcatgttca gattgttctc agaggcccga 2640
cagcctcttt ctgaggagga cgtagccagc ctttcctgga gacccttgca ccttccttct 2700
gcagactggc agagagctgc cctctctctc tggacacaca gaaccttccg agaggtgttg 2760
aaagaggaag atgttcactt aacttaccaa gactggttac acctggagct ggaaattcaa 2820
cctgaagctg atgctctttc agatactgaa cggcaggact tccaccagtg ggcgatccat 2880
gagcactttc tccctgagtc ctcggcttca gggggctgtg acggagacct gcaggctgcg 2940
tgtaccattc ttgtcaacgc actgatggat ttccaccaaa gctcaaggag ttatgaccac 3000
tcagaaaatt ctgatttggt ctttggtggc cgcacaggaa atgaggatat tatttccaga 3060
ttgcaggaga tggtagctga cctggagctg cagcaagacc tcatagtgcc tctcggccac 3120
accccttccc aggagcactt cctctttgag attttccgca gacggctcca ggctctgaca 3180
agcgggtgga gcgtggctgc cagccttcag agacagaggg agctgctaat gtacaaacgg 3240
atcctcctcc gcctgccttc gtctgtcctc tgcggcagca gcttccaggc agaacagccc 3300
atcactgcca gatgcgagca gttcttccac ttggtcaact ctgagatgag aaacttctgc 3360
tcccacggag gtgccctgac acaggacatc actgcccact tcttcagggg cctcctgaac 3420
gcctgtctgc ggagcagaga cccctccctg atggtcgact tcatactggc caagtgccag 3480
acgaaatgcc ccttaatttt gacctctgct ctggtgtggt ggccgagcct ggagcctgtg 3540
ctgctctgcc ggtggaggag acactgccag agcccgctgc cccgggaact gcagaagcta 3600
caagaaggcc ggcagtttgc cagcgatttc ctctcccctg aggctgcctc cccagcaccc 3660
aacccggact ggctctcagc tgctgcactg cactttgcga ttcaacaagt cagggaagaa 3720
aacatcagga agcagctaaa gaagctggac tgcgagagag aggagctatt ggttttcctt 3780
ttcttcttct ccttgatggg cctgctgtcg tcacatctga cctcaaatag caccacagac 3840
ctgccaaagg ctttccacgt ttgtgcagca atcctcgagt gtttagagaa gaggaagata 3900
tcctggctgg cactctttca gttgacagag agtgacctca ggctggggcg gctcctcctc 3960
cgtgtggccc cggatcagca caccaggctg ctgcctttcg ctttttacag tcttctctcc 4020
tacttccatg aagacgcggc catcagggaa gaggccttcc tgcatgttgc tgtggacatg 4080
tacttgaagc tggtccagct cttcgtggct ggggatacaa gcacagtttc acctccagct 4140
ggcaggagcc tggagctcaa gggtcagggc aaccccgtgg aactgataac aaaagctcgt 4200
ctttttctgc tgcagttaat acctcggtgc ccgaaaaaga gcttctcaca cgtggcagag 4260
ctgctggctg atcgtgggga ctgcgaccca gaggtgagcg ccgccctcca gagcagacag 4320
caggctgccc ctgacgctga cctgtcccag gagcctcatc tcttctga 4368
<210> 9
<211> 380
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组人CMV增强子序列
<400> 9
gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360
tagtcatcgc tattaccatg 380
<210> 10
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组猿猴病毒40 polyA信号序列
<400> 10
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120
ta 122
<210> 11
<211> 136
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组猿猴病毒40复制起点序列
<400> 11
atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt 60
tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga 120
ggcttttttg gaggcc 136
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组HIV-1中央聚嘌呤段和中央终止序列
<400> 12
tttaaaagaa aaggggggat tggggggt 28
<210> 13
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组dNEF信号序列
<400> 13
gaattcgagc tcggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag atcttagcca 60
ctttttaaaa gaaaaggggg gac 83
<210> 14
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组KanR序列
<400> 14
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggcgg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gtccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gcgacgacgg gcgttccttg cgcggctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgtc tatgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccacggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cgtctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
cttgtgcttt acggtatcgc cgcgcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga 795
<210> 15
<211> 137
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组rrnG终止子序列
<400> 15
gcattggcgc agaaaaaaat gcctgatgcg acgctgcgcg tcttatactc ccacatatgc 60
cagattcagc aacggatacg gcttccccaa cttgcccact tccatacgtg tcctccttac 120
cagaaattta tccttaa 137
<210> 16
<211> 589
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组高拷贝数ColE1、pMB1、pBR322、pUC复制起点
<400> 16
ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 60
agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 120
cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 180
caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 240
tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 300
ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 360
ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 420
gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 480
gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 540
tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaa 589
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组CAP结合位点
<400> 17
taatgtgagt tagctcactc at 22
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组lac启动子序列
<400> 18
tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt g 31
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组lac操作子序列
<400> 19
ttgtgagcgg ataacaa 17
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组T3启动子序列
<400> 20
aattaaccct cactaaagg 19
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组T7启动子序列
<400> 21
cctatagtga gtcgtatta 19
<210> 22
<211> 429
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组f1噬菌体复制起点序列
<400> 22
acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg 60
ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca 120
cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta 180
gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc 240
catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg 300
gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat 360
aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta 420
acgcgaatt 429
<210> 23
<211> 677
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 嵌合wPRE序列
<400> 23
cgagcatctt accgccattt attcccatat ttgttctgtt tttcttgatt tgggtataca 60
tttaaatgtt aataaaacaa aatggtgggg caatcattta catttttagg gatatgtaat 120
tactagttca ggtgtattgc cacaagacaa acatgttaag aaactttccc gttatttacg 180
ctctgttcct gttaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctgatattct 240
taactatgtt gctcctttta cgctgtgtgg atatgctgct ttaatgcctc tgtatcatgc 300
tattgcttcc cgtacggctt tcgttttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct 360
ttatgaggag ttgtggcccg ttgtccgtca acgtggcgtg gtgtgctctg tgtttgctga 420
cgcaaccccc actggctggg gcattgccac cacctgtcaa ctcctttctg ggactttcgc 480
tttccccctc ccgatcgcca cggcagaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac 540
aggggctagg ttgctgggca ctgataattc cgtggtgttg tcggggaagg gcctgctgcc 600
ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg 660
ggccgcctcc ccgcctg 677
<210> 24
<211> 11433
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> pCCL-PGK-FANCA-WPRE或pCCL-SIN-cPPT CTS-hPGK-hFANCA-WPRE
<400> 24
catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa 60
gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 120
aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 180
gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta 240
gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct 300
gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 360
atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 420
cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 480
cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 540
agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 600
tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 660
gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca 720
catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg 780
agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 840
ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 900
ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag 960
ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg 1020
tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa 1080
gcgcgcaatt aaccctcact aaagggaaca aaagctggag ctgcaagctt ggccattgca 1140
tacgttgtat ccatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa cattaccgcc 1200
atgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca 1260
tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc 1320
gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat 1380
agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt 1440
acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc 1500
cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta 1560
cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg 1620
atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt 1680
gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac 1740
gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa 1800
ccggggtctc tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac 1860
ccactgctta agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg 1920
ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct 1980
agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac 2040
gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta 2100
cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta 2160
ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga 2220
aaaaatataa attaaaacat atagtatggg caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta 2280
atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct gtagacaaat actgggacag ctacaaccat 2340
cccttcagac aggatcagaa gaacttagat cattatataa tacagtagca accctctatt 2400
gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag 2460
agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc aagcggccgc tgatcttcag acctggagga 2520
ggagatatga gggacaattg gagaagtgaa ttatataaat ataaagtagt aaaaattgaa 2580
ccattaggag tagcacccac caaggcaaag agaagagtgg tgcagagaga aaaaagagca 2640
gtgggaatag gagctttgtt ccttgggttc ttgggagcag caggaagcac tatgggcgca 2700
gcgtcaatga cgctgacggt acaggccaga caattattgt ctggtatagt gcagcagcag 2760
aacaatttgc tgagggctat tgaggcgcaa cagcatctgt tgcaactcac agtctggggc 2820
atcaagcagc tccaggcaag aatcctggct gtggaaagat acctaaagga tcaacagctc 2880
ctggggattt ggggttgctc tggaaaactc atttgcacca ctgctgtgcc ttggaatgct 2940
agttggagta ataaatctct ggaacagatt tggaatcaca cgacctggat ggagtgggac 3000
agagaaatta acaattacac aagcttaata cactccttaa ttgaagaatc gcaaaaccag 3060
caagaaaaga atgaacaaga attattggaa ttagataaat gggcaagttt gtggaattgg 3120
tttaacataa caaattggct gtggtatata aaattattca taatgatagt aggaggcttg 3180
gtaggtttaa gaatagtttt tgctgtactt tctatagtga atagagttag gcagggatat 3240
tcaccattat cgtttcagac ccacctccca accccgaggg gacccgacag gcccgaagga 3300
atagaagaag aaggtggaga gagagacaga gacagatcca ttcgattagt gaacggatct 3360
cgacggtatc ggttaacttt taaaagaaaa ggggggattg gggggtacag tgcaggggaa 3420
agaatagtag acataatagc aacagacata caaactaaag aattacaaaa acaaattaca 3480
aaaattcaaa attttatcga tcacgagact agcctcgaga agcttgatat cgaattccac 3540
ggggttgggg ttgcgccttt tccaaggcag ccctgggttt gcgcagggac gcggctgctc 3600
tgggcgtggt tccgggaaac gcagcggcgc cgaccctggg tctcgcacat tcttcacgtc 3660
cgttcgcagc gtcacccgga tcttcgccgc tacccttgtg ggccccccgg cgacgcttcc 3720
tgctccgccc ctaagtcggg aaggttcctt gcggttcgcg gcgtgccgga cgtgacaaac 3780
ggaagccgca cgtctcacta gtaccctcgc agacggacag cgccagggag caatggcagc 3840
gcgccgaccg cgatgggctg tggccaatag cggctgctca gcagggcgcg ccgagagcag 3900
cggccgggaa ggggcggtgc gggaggcggg gtgtggggcg gtagtgtggg ccctgttcct 3960
gcccgcgcgg tgttccgcat tctgcaagcc tccggagcgc acgtcggcag tcggctccct 4020
cgttgaccga atcaccgacc tctctcccca gggggatccc ccgggctgca ggaattcatg 4080
tccgactcgt gggtcccgaa ctccgcctcg ggccaggacc cagggggccg ccggagggcc 4140
tgggccgagc tgctggcggg aagggtcaag agggaaaaat ataatcctga aagggcacag 4200
aaattaaagg aatcagctgt gcgcctcctg cgaagccatc aggacctgaa tgcccttttg 4260
cttgaggtag aaggtccact gtgtaaaaaa ttgtctctca gcaaagtgat tgactgtgac 4320
agttctgagg cctatgctaa tcattctagt tcatttatag gctctgcttt gcaggatcaa 4380
gcctcaaggc tgggggttcc cgtgggtatt ctctcagccg ggatggttgc ctctagcgtg 4440
ggacagatct gcacggctcc agcggagacc agtcaccctg tgctgctgac tgtggagcag 4500
agaaagaagc tgtcttccct gttagagttt gctcagtatt tattggcaca cagtatgttc 4560
tcccgtcttt ccttctgtca agaattatgg aaaatacaga gttctttgtt gcttgaagcg 4620
gtgtggcatc ttcacgtaca aggcattgtg agcctgcaag agctgctgga aagccatccc 4680
gacatgcatg ctgtgggatc gtggctcttc aggaatctgt gctgcctttg tgaacagatg 4740
gaagcatcct gccagcatgc tgacgtcgcc agggccatgc tttctgattt tgttcaaatg 4800
tttgttttga ggggatttca gaaaaactca gatctgagaa gaactgtgga gcctgaaaaa 4860
atgccgcagg tcacggttga tgtactgcag agaatgctga tttttgcact tgacgctttg 4920
gctgctggag tacaggagga gtcctccact cacaagatcg tgaggtgctg gttcggagtg 4980
ttcagtggac acacgcttgg cagtgtaatt tccacagatc ctctgaagag gttcttcagt 5040
cataccctga ctcagatact cactcacagc cctgtgctga aagcatctga tgctgttcag 5100
atgcagagag agtggagctt tgcgcggaca caccctctgc tcacctcact gtaccgcagg 5160
ctctttgtga tgctgagtgc agaggagttg gttggccatt tgcaagaagt tctggaaacg 5220
caggaggttc actggcagag agtgctctcc tttgtgtctg ccctggttgt ctgctttcca 5280
gaagcgcagc agctgcttga agactgggtg gcgcgtttga tggcccaggc attcgagagc 5340
tgccagctgg acagcatggt cactgcgttc ctggttgtgc gccaggcagc actggagggc 5400
ccctctgcgt tcctgtcata tgcagactgg ttcaaggcct cctttgggag cacacgaggc 5460
taccatggct gcagcaagaa ggccctggtc ttcctgttta cgttcttgtc agaactcgtg 5520
ccttttgagt ctccccggta cctgcaggtg cacattctcc acccacccct ggttcccagc 5580
aagtaccgct ccctcctcac agactacatc tcattggcca agacacggct ggccgacctc 5640
aaggtttcta tagaaaacat gggactctac gaggatttgt catcagctgg ggacattact 5700
gagccccaca gccaagctct tcaggatgtt gaaaaggcca tcatggtgtt tgagcatacg 5760
gggaacatcc cagtcaccgt catggaggcc agcatattca ggaggcctta ctacgtgtcc 5820
cacttcctcc ccgccctgct cacacctcga gtgctcccca aagtccctga ctcccgtgtg 5880
gcgtttatag agtctctgaa gagagcagat aaaatccccc catctctgta ctccacctac 5940
tgccaggcct gctctgctgc tgaagagaag ccagaagatg cagccctggg agtgagggca 6000
gaacccaact ctgctgagga gcccctggga cagctcacag ctgcactggg agagctgaga 6060
gcctccatga cagaccccag ccagcgtgat gttatatcgg cacaggtggc agtgatttct 6120
gaaagactga gggctgtcct gggccacaat gaggatgaca gcagcgttga gatatcaaag 6180
attcagctca gcatcaacac gccgagactg gagccacggg aacacattgc tgtggacctc 6240
ctgctgacgt ctttctgtca gaacctgatg gctgcctcca gtgtcgctcc cccggagagg 6300
cagggtccct gggctgccct cttcgtgagg accatgtgtg gacgtgtgct ccctgcagtg 6360
ctcacccggc tctgccagct gctccgtcac cagggcccga gcctgagtgc cccacatgtg 6420
ctggggttgg ctgccctggc cgtgcacctg ggtgagtcca ggtctgcgct cccagaggtg 6480
gatgtgggtc ctcctgcacc tggtgctggc cttcctgtcc ctgcgctctt tgacagcctc 6540
ctgacctgta ggacgaggga ttccttgttc ttctgcctga aattttgtac agcagcaatt 6600
tcttactctc tctgcaagtt ttcttcccag tcacgagata ctttgtgcag ctgcttatct 6660
ccaggcctta ttaaaaagtt tcagttcctc atgttcagat tgttctcaga ggcccgacag 6720
cctctttctg aggaggacgt agccagcctt tcctggagac ccttgcacct tccttctgca 6780
gactggcaga gagctgccct ctctctctgg acacacagaa ccttccgaga ggtgttgaaa 6840
gaggaagatg ttcacttaac ttaccaagac tggttacacc tggagctgga aattcaacct 6900
gaagctgatg ctctttcaga tactgaacgg caggacttcc accagtgggc gatccatgag 6960
cactttctcc ctgagtcctc ggcttcaggg ggctgtgacg gagacctgca ggctgcgtgt 7020
accattcttg tcaacgcact gatggatttc caccaaagct caaggagtta tgaccactca 7080
gaaaattctg atttggtctt tggtggccgc acaggaaatg aggatattat ttccagattg 7140
caggagatgg tagctgacct ggagctgcag caagacctca tagtgcctct cggccacacc 7200
ccttcccagg agcacttcct ctttgagatt ttccgcagac ggctccaggc tctgacaagc 7260
gggtggagcg tggctgccag ccttcagaga cagagggagc tgctaatgta caaacggatc 7320
ctcctccgcc tgccttcgtc tgtcctctgc ggcagcagct tccaggcaga acagcccatc 7380
actgccagat gcgagcagtt cttccacttg gtcaactctg agatgagaaa cttctgctcc 7440
cacggaggtg ccctgacaca ggacatcact gcccacttct tcaggggcct cctgaacgcc 7500
tgtctgcgga gcagagaccc ctccctgatg gtcgacttca tactggccaa gtgccagacg 7560
aaatgcccct taattttgac ctctgctctg gtgtggtggc cgagcctgga gcctgtgctg 7620
ctctgccggt ggaggagaca ctgccagagc ccgctgcccc gggaactgca gaagctacaa 7680
gaaggccggc agtttgccag cgatttcctc tcccctgagg ctgcctcccc agcacccaac 7740
ccggactggc tctcagctgc tgcactgcac tttgcgattc aacaagtcag ggaagaaaac 7800
atcaggaagc agctaaagaa gctggactgc gagagagagg agctattggt tttccttttc 7860
ttcttctcct tgatgggcct gctgtcgtca catctgacct caaatagcac cacagacctg 7920
ccaaaggctt tccacgtttg tgcagcaatc ctcgagtgtt tagagaagag gaagatatcc 7980
tggctggcac tctttcagtt gacagagagt gacctcaggc tggggcggct cctcctccgt 8040
gtggccccgg atcagcacac caggctgctg cctttcgctt tttacagtct tctctcctac 8100
ttccatgaag acgcggccat cagggaagag gccttcctgc atgttgctgt ggacatgtac 8160
ttgaagctgg tccagctctt cgtggctggg gatacaagca cagtttcacc tccagctggc 8220
aggagcctgg agctcaaggg tcagggcaac cccgtggaac tgataacaaa agctcgtctt 8280
tttctgctgc agttaatacc tcggtgcccg aaaaagagct tctcacacgt ggcagagctg 8340
ctggctgatc gtggggactg cgacccagag gtgagcgccg ccctccagag cagacagcag 8400
gctgcccctg acgctgacct gtcccaggag cctcatctct tctgatgaga attcgatatc 8460
aagcttatcg ataccgtcga atcccccggg ctgcaggaat tcgagcatct taccgccatt 8520
tattcccata tttgttctgt ttttcttgat ttgggtatac atttaaatgt taataaaaca 8580
aaatggtggg gcaatcattt acatttttag ggatatgtaa ttactagttc aggtgtattg 8640
ccacaagaca aacatgttaa gaaactttcc cgttatttac gctctgttcc tgttaatcaa 8700
cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actgatattc ttaactatgt tgctcctttt 8760
acgctgtgtg gatatgctgc tttaatgcct ctgtatcatg ctattgcttc ccgtacggct 8820
ttcgttttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc 8880
gttgtccgtc aacgtggcgt ggtgtgctct gtgtttgctg acgcaacccc cactggctgg 8940
ggcattgcca ccacctgtca actcctttct gggactttcg ctttccccct cccgatcgcc 9000
acggcagaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctag gttgctgggc 9060
actgataatt ccgtggtgtt gtcggggaag ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg 9120
cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgcctgga 9180
attcgagctc ggtaccttta agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact 9240
ttttaaaaga aaagggggga ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatctgc 9300
tttttgcttg tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct 9360
aactagggaa cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt 9420
gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt 9480
ggaaaatctc tagcagtagt agttcatgtc atcttattat tcagtattta taacttgcaa 9540
agaaatgaat atcagagagt gagaggaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat 9600
aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg 9660
gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggct ctagctatcc cgcccctaac 9720
tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact 9780
aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta 9840
gtgaggaggc ttttttggag gcctagggac gtacccaatt cgccctatag tgagtcgtat 9900
tacgcgcgct cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc 9960
caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc 10020
cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggga cgcgccctgt 10080
agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc 10140
agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc 10200
tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg 10260
cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga 10320
tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc 10380
caaactggaa caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg 10440
ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt 10500
aacaaaatat taacgcttac aatttaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 10560
ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 10620
gataaatgct tcaataatag cacctagatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga 10680
ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct 10740
atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc 10800
aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcaag 10860
acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg 10920
acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc 10980
tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc 11040
ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg 11100
agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc 11160
atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgagcatg cccgacggcg 11220
aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc 11280
gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag 11340
cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg 11400
tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agc 11433
<210> 25
<211> 5554
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> pCCL-PGK-FANCAW-82-RO
<400> 25
ggggttgggg ttgcgccttt tccaaggcag ccctgggttt gcgcagggac gcggctgctc 60
tgggcgtggt tccgggaaac gcagcggcgc cgaccctggg tctcgcacat tcttcacgtc 120
cgttcgcagc gtcacccgga tcttcgccgc tacccttgtg ggccccccgg cgacgcttcc 180
tgctccgccc ctaagtcggg aaggttcctt gcggttcgcg gcgtgccgga cgtgacaaac 240
ggaagccgca cgtctcacta gtaccctcgc agacggacag cgccagggag caatggcagc 300
gcgccgaccg cgatgggctg tggccaatag cggctgctca gcagggcgcg ccgagagcag 360
cggccgggaa ggggcggtgc gggaggcggg gtgtggggcg gtagtgtggg ccctgttcct 420
gcccgcgcgg tgttccgcat tctgcaagcc tccggagcgc acgtcggcag tcggctccct 480
cgttgaccga atcaccgacc tctctcccca gggggatccc ccgggctgca ggaattcatg 540
tccgactcgt gggtcccgaa ctccgcctcg ggccaggacc cagggggccg ccggagggcc 600
tgggccgagc tgctggcggg aagggtcaag agggaaaaat ataatcctga aagggcacag 660
aaattaaagg aatcagctgt gcgcctcctg cgaagccatc aggacctgaa tgcccttttg 720
cttgaggtag aaggtccact gtgtaaaaaa ttgtctctca gcaaagtgat tgactgtgac 780
agttctgagg cctatgctaa tcattctagt tcatttatag gctctgcttt gcaggatcaa 840
gcctcaaggc tgggggttcc cgtgggtatt ctctcagccg ggatggttgc ctctagcgtg 900
ggacagatct gcacggctcc agcggagacc agtcaccctg tgctgctgac tgtggagcag 960
agaaagaagc tgtcttccct gttagagttt gctcagtatt tattggcaca cagtatgttc 1020
tcccgtcttt ccttctgtca agaattatgg aaaatacaga gttctttgtt gcttgaagcg 1080
gtgtggcatc ttcacgtaca aggcattgtg agcctgcaag agctgctgga aagccatccc 1140
gacatgcatg ctgtgggatc gtggctcttc aggaatctgt gctgcctttg tgaacagatg 1200
gaagcatcct gccagcatgc tgacgtcgcc agggccatgc tttctgattt tgttcaaatg 1260
tttgttttga ggggatttca gaaaaactca gatctgagaa gaactgtgga gcctgaaaaa 1320
atgccgcagg tcacggttga tgtactgcag agaatgctga tttttgcact tgacgctttg 1380
gctgctggag tacaggagga gtcctccact cacaagatcg tgaggtgctg gttcggagtg 1440
ttcagtggac acacgcttgg cagtgtaatt tccacagatc ctctgaagag gttcttcagt 1500
cataccctga ctcagatact cactcacagc cctgtgctga aagcatctga tgctgttcag 1560
atgcagagag agtggagctt tgcgcggaca caccctctgc tcacctcact gtaccgcagg 1620
ctctttgtga tgctgagtgc agaggagttg gttggccatt tgcaagaagt tctggaaacg 1680
caggaggttc actggcagag agtgctctcc tttgtgtctg ccctggttgt ctgctttcca 1740
gaagcgcagc agctgcttga agactgggtg gcgcgtttga tggcccaggc attcgagagc 1800
tgccagctgg acagcatggt cactgcgttc ctggttgtgc gccaggcagc actggagggc 1860
ccctctgcgt tcctgtcata tgcagactgg ttcaaggcct cctttgggag cacacgaggc 1920
taccatggct gcagcaagaa ggccctggtc ttcctgttta cgttcttgtc agaactcgtg 1980
ccttttgagt ctccccggta cctgcaggtg cacattctcc acccacccct ggttcccagc 2040
aagtaccgct ccctcctcac agactacatc tcattggcca agacacggct ggccgacctc 2100
aaggtttcta tagaaaacat gggactctac gaggatttgt catcagctgg ggacattact 2160
gagccccaca gccaagctct tcaggatgtt gaaaaggcca tcatggtgtt tgagcatacg 2220
gggaacatcc cagtcaccgt catggaggcc agcatattca ggaggcctta ctacgtgtcc 2280
cacttcctcc ccgccctgct cacacctcga gtgctcccca aagtccctga ctcccgtgtg 2340
gcgtttatag agtctctgaa gagagcagat aaaatccccc catctctgta ctccacctac 2400
tgccaggcct gctctgctgc tgaagagaag ccagaagatg cagccctggg agtgagggca 2460
gaacccaact ctgctgagga gcccctggga cagctcacag ctgcactggg agagctgaga 2520
gcctccatga cagaccccag ccagcgtgat gttatatcgg cacaggtggc agtgatttct 2580
gaaagactga gggctgtcct gggccacaat gaggatgaca gcagcgttga gatatcaaag 2640
attcagctca gcatcaacac gccgagactg gagccacggg aacacattgc tgtggacctc 2700
ctgctgacgt ctttctgtca gaacctgatg gctgcctcca gtgtcgctcc cccggagagg 2760
cagggtccct gggctgccct cttcgtgagg accatgtgtg gacgtgtgct ccctgcagtg 2820
ctcacccggc tctgccagct gctccgtcac cagggcccga gcctgagtgc cccacatgtg 2880
ctggggttgg ctgccctggc cgtgcacctg ggtgagtcca ggtctgcgct cccagaggtg 2940
gatgtgggtc ctcctgcacc tggtgctggc cttcctgtcc ctgcgctctt tgacagcctc 3000
ctgacctgta ggacgaggga ttccttgttc ttctgcctga aattttgtac agcagcaatt 3060
tcttactctc tctgcaagtt ttcttcccag tcacgagata ctttgtgcag ctgcttatct 3120
ccaggcctta ttaaaaagtt tcagttcctc atgttcagat tgttctcaga ggcccgacag 3180
cctctttctg aggaggacgt agccagcctt tcctggagac ccttgcacct tccttctgca 3240
gactggcaga gagctgccct ctctctctgg acacacagaa ccttccgaga ggtgttgaaa 3300
gaggaagatg ttcacttaac ttaccaagac tggttacacc tggagctgga aattcaacct 3360
gaagctgatg ctctttcaga tactgaacgg caggacttcc accagtgggc gatccatgag 3420
cactttctcc ctgagtcctc ggcttcaggg ggctgtgacg gagacctgca ggctgcgtgt 3480
accattcttg tcaacgcact gatggatttc caccaaagct caaggagtta tgaccactca 3540
gaaaattctg atttggtctt tggtggccgc acaggaaatg aggatattat ttccagattg 3600
caggagatgg tagctgacct ggagctgcag caagacctca tagtgcctct cggccacacc 3660
ccttcccagg agcacttcct ctttgagatt ttccgcagac ggctccaggc tctgacaagc 3720
gggtggagcg tggctgccag ccttcagaga cagagggagc tgctaatgta caaacggatc 3780
ctcctccgcc tgccttcgtc tgtcctctgc ggcagcagct tccaggcaga acagcccatc 3840
actgccagat gcgagcagtt cttccacttg gtcaactctg agatgagaaa cttctgctcc 3900
cacggaggtg ccctgacaca ggacatcact gcccacttct tcaggggcct cctgaacgcc 3960
tgtctgcgga gcagagaccc ctccctgatg gtcgacttca tactggccaa gtgccagacg 4020
aaatgcccct taattttgac ctctgctctg gtgtggtggc cgagcctgga gcctgtgctg 4080
ctctgccggt ggaggagaca ctgccagagc ccgctgcccc gggaactgca gaagctacaa 4140
gaaggccggc agtttgccag cgatttcctc tcccctgagg ctgcctcccc agcacccaac 4200
ccggactggc tctcagctgc tgcactgcac tttgcgattc aacaagtcag ggaagaaaac 4260
atcaggaagc agctaaagaa gctggactgc gagagagagg agctattggt tttccttttc 4320
ttcttctcct tgatgggcct gctgtcgtca catctgacct caaatagcac cacagacctg 4380
ccaaaggctt tccacgtttg tgcagcaatc ctcgagtgtt tagagaagag gaagatatcc 4440
tggctggcac tctttcagtt gacagagagt gacctcaggc tggggcggct cctcctccgt 4500
gtggccccgg atcagcacac caggctgctg cctttcgctt tttacagtct tctctcctac 4560
ttccatgaag acgcggccat cagggaagag gccttcctgc atgttgctgt ggacatgtac 4620
ttgaagctgg tccagctctt cgtggctggg gatacaagca cagtttcacc tccagctggc 4680
aggagcctgg agctcaaggg tcagggcaac cccgtggaac tgataacaaa agctcgtctt 4740
tttctgctgc agttaatacc tcggtgcccg aaaaagagct tctcacacgt ggcagagctg 4800
ctggctgatc gtggggactg cgacccagag gtgagcgccg ccctccagag cagacagcag 4860
gctgcccctg acgctgacct gtcccaggag cctcatctct tctgatgaga attcgatatc 4920
aagcttatcg ataccgtcga atcccccggg ctgcaggaat tcgagcatct taccgccatt 4980
tattcccata tttgttctgt ttttcttgat ttgggtatac atttaaatgt taataaaaca 5040
aaatggtggg gcaatcattt acatttttag ggatatgtaa ttactagttc aggtgtattg 5100
ccacaagaca aacatgttaa gaaactttcc cgttatttac gctctgttcc tgttaatcaa 5160
cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actgatattc ttaactatgt tgctcctttt 5220
acgctgtgtg gatatgctgc tttaatgcct ctgtatcatg ctattgcttc ccgtacggct 5280
ttcgttttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc 5340
gttgtccgtc aacgtggcgt ggtgtgctct gtgtttgctg acgcaacccc cactggctgg 5400
ggcattgcca ccacctgtca actcctttct gggactttcg ctttccccct cccgatcgcc 5460
acggcagaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctag gttgctgggc 5520
actgataatt ccgtggtgtt gtcggggaag ggcc 5554
<210> 26
<211> 858
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组Rev响应元件
<400> 26
gatcttcaga cctggaggag gagatatgag ggacaattgg agaagtgaat tatataaata 60
taaagtagta aaaattgaac cattaggagt agcacccacc aaggcaaaga gaagagtggt 120
gcagagagaa aaaagagcag tgggaatagg agctttgttc cttgggttct tgggagcagc 180
aggaagcact atgggcgcag cgtcaatgac gctgacggta caggccagac aattattgtc 240
tggtatagtg cagcagcaga acaatttgct gagggctatt gaggcgcaac agcatctgtt 300
gcaactcaca gtctggggca tcaagcagct ccaggcaaga atcctggctg tggaaagata 360
cctaaaggat caacagctcc tggggatttg gggttgctct ggaaaactca tttgcaccac 420
tgctgtgcct tggaatgcta gttggagtaa taaatctctg gaacagattt ggaatcacac 480
gacctggatg gagtgggaca gagaaattaa caattacaca agcttaatac actccttaat 540
tgaagaatcg caaaaccagc aagaaaagaa tgaacaagaa ttattggaat tagataaatg 600
ggcaagtttg tggaattggt ttaacataac aaattggctg tggtatataa aattattcat 660
aatgatagta ggaggcttgg taggtttaag aatagttttt gctgtacttt ctatagtgaa 720
tagagttagg cagggatatt caccattatc gtttcagacc cacctcccaa ccccgagggg 780
acccgacagg cccgaaggaa tagaagaaga aggtggagag agagacagag acagatccat 840
tcgattagtg aacggatc 858
<210> 27
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组包装信号序列
<400> 27
tgagtacgcc aaaaattttg actagcggag gctagaagga gaga 44
<210> 28
<211> 188
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组截短的HIV-1 5' LTR序列
<400> 28
gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact 60
gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg 120
tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag 180
tggcgccc 188
<210> 29
<211> 234
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组HIV-1自灭活3' LTR序列
<400> 29
tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc 60
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 120
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 180
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agca 234
<210> 30
<211> 577
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组人巨细胞病毒立即早期启动子序列
<400> 30
acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 60
atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 120
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 180
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 240
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 300
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 360
agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg 420
gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg 480
gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat 540
gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagc 577
<210> 31
<211> 233
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组劳斯肉瘤病毒启动子序列
<400> 31
ttaatgtagt cttatgcaat actcttgtag tcttgcaaca tggtaacgat gagttagcaa 60
catgccttac aaggagagaa aaagcaccgt gcatgccgat tggtggaagt aaggtggtac 120
gatcgtgcct tattaggaag gcaacagacg ggtctgacat ggattggacg aaccactgaa 180
ttgccgcatt gcagagatat tgtatttaag tgcctagctc gatacaataa acg 233
<210> 32
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组HIV-1中央聚嘌呤段和中央终止序列
<400> 32
aaaagaaaag ggggga 16
<210> 33
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组HIV-1中央聚嘌呤段和中央终止序列
<400> 33
ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat agcaacagac atacaaacta 60
aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaattttat cgatcacgag actagcctcg 120
a 121
<210> 34
<211> 156
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组猿猴病毒40复制起点序列
<400> 34
ggcctccaaa aaagcctcct cactacttct ggaatagctc agaggccgag gcggcctcgg 60
cctctgcata aataaaaaaa attagtcagc catggggcgg agaatgggcg gaactgggcg 120
gagttagggg cgggatgggc ggagttaggg gcggga 156
<210> 35
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组RNA-OUT序列
<400> 35
gtagaattgg taaagagagt cgtgtaaaat atcgagttcg cacatcttgt tgtctgatta 60
ttgatttttg gcgaaaccat ttgatcatat gacaagatgt gtatctacct taacttaatg 120
attttgataa aaatcattag g 141
<210> 36
<211> 4371
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 经过密码子优化的FANCA序列
<400> 36
atgtccgact cgtgggtccc gaactccgcc tcgggccagg acccaggggg ccgccggagg 60
gcctgggccg agctgctggc gggaagggtc aagagggaaa aatataatcc tgaaagggca 120
cagaaattaa aggaatcagc tgtgcgcctc ctgcgaagcc atcaggacct gaatgccctt 180
ttgcttgagg tagaaggtcc actgtgtaaa aaattgtctc tcagcaaagt gattgactgt 240
gacagttctg aggcctatgc taatcattct agttcattta taggctctgc tttgcaggat 300
caagcctcaa ggctgggggt tcccgtgggt attctctcag ccgggatggt tgcctctagc 360
gtgggacaga tctgcacggc tccagcggag accagtcacc ctgtgctgct gactgtggag 420
cagagaaaga agctgtcttc cctgttagag tttgctcagt atttattggc acacagtatg 480
ttctcccgtc tttccttctg tcaagaatta tggaaaatac agagttcttt gttgcttgaa 540
gcggtgtggc atcttcacgt acaaggcatt gtgagcctgc aagagctgct ggaaagccat 600
cccgacatgc atgctgtggg atcgtggctc ttcaggaatc tgtgctgcct ttgtgaacag 660
atggaagcat cctgccagca tgctgacgtc gccagggcca tgctttctga ttttgttcaa 720
atgtttgttt tgaggggatt tcagaaaaac tcagatctga gaagaactgt ggagcctgaa 780
aaaatgccgc aggtcacggt tgatgtactg cagagaatgc tgatttttgc acttgacgct 840
ttggctgctg gagtacagga ggagtcctcc actcacaaga tcgtgaggtg ctggttcgga 900
gtgttcagtg gacacacgct tggcagtgta atttccacag atcctctgaa gaggttcttc 960
agtcataccc tgactcagat actcactcac agccctgtgc tgaaagcatc tgatgctgtt 1020
cagatgcaga gagagtggag ctttgcgcgg acacaccctc tgctcacctc actgtaccgc 1080
aggctctttg tgatgctgag tgcagaggag ttggttggcc atttgcaaga agttctggaa 1140
acgcaggagg ttcactggca gagagtgctc tcctttgtgt ctgccctggt tgtctgcttt 1200
ccagaagcgc agcagctgct tgaagactgg gtggcgcgtt tgatggccca ggcattcgag 1260
agctgccagc tggacagcat ggtcactgcg ttcctggttg tgcgccaggc agcactggag 1320
ggcccctctg cgttcctgtc atatgcagac tggttcaagg cctcctttgg gagcacacga 1380
ggctaccatg gctgcagcaa gaaggccctg gtcttcctgt ttacgttctt gtcagaactc 1440
gtgccttttg agtctccccg gtacctgcag gtgcacattc tccacccacc cctggttccc 1500
agcaagtacc gctccctcct cacagactac atctcattgg ccaagacacg gctggccgac 1560
ctcaaggttt ctatagaaaa catgggactc tacgaggatt tgtcatcagc tggggacatt 1620
actgagcccc acagccaagc tcttcaggat gttgaaaagg ccatcatggt gtttgagcat 1680
acggggaaca tcccagtcac cgtcatggag gccagcatat tcaggaggcc ttactacgtg 1740
tcccacttcc tccccgccct gctcacacct cgagtgctcc ccaaagtccc tgactcccgt 1800
gtggcgttta tagagtctct gaagagagca gataaaatcc ccccatctct gtactccacc 1860
tactgccagg cctgctctgc tgctgaagag aagccagaag atgcagccct gggagtgagg 1920
gcagaaccca actctgctga ggagcccctg ggacagctca cagctgcact gggagagctg 1980
agagcctcca tgacagaccc cagccagcgt gatgttatat cggcacaggt ggcagtgatt 2040
tctgaaagac tgagggctgt cctgggccac aatgaggatg acagcagcgt tgagatatca 2100
aagattcagc tcagcatcaa cacgccgaga ctggagccac gggaacacat tgctgtggac 2160
ctcctgctga cgtctttctg tcagaacctg atggctgcct ccagtgtcgc tcccccggag 2220
aggcagggtc cctgggctgc cctcttcgtg aggaccatgt gtggacgtgt gctccctgca 2280
gtgctcaccc ggctctgcca gctgctccgt caccagggcc cgagcctgag tgccccacat 2340
gtgctggggt tggctgccct ggccgtgcac ctgggtgagt ccaggtctgc gctcccagag 2400
gtggatgtgg gtcctcctgc acctggtgct ggccttcctg tccctgcgct ctttgacagc 2460
ctcctgacct gtaggacgag ggattccttg ttcttctgcc tgaaattttg tacagcagca 2520
atttcttact ctctctgcaa gttttcttcc cagtcacgag atactttgtg cagctgctta 2580
tctccaggcc ttattaaaaa gtttcagttc ctcatgttca gattgttctc agaggcccga 2640
cagcctcttt ctgaggagga cgtagccagc ctttcctgga gacccttgca ccttccttct 2700
gcagactggc agagagctgc cctctctctc tggacacaca gaaccttccg agaggtgttg 2760
aaagaggaag atgttcactt aacttaccaa gactggttac acctggagct ggaaattcaa 2820
cctgaagctg atgctctttc agatactgaa cggcaggact tccaccagtg ggcgatccat 2880
gagcactttc tccctgagtc ctcggcttca gggggctgtg acggagacct gcaggctgcg 2940
tgtaccattc ttgtcaacgc actgatggat ttccaccaaa gctcaaggag ttatgaccac 3000
tcagaaaatt ctgatttggt ctttggtggc cgcacaggaa atgaggatat tatttccaga 3060
ttgcaggaga tggtagctga cctggagctg cagcaagacc tcatagtgcc tctcggccac 3120
accccttccc aggagcactt cctctttgag attttccgca gacggctcca ggctctgaca 3180
agcgggtgga gcgtggctgc cagccttcag agacagaggg agctgctaat gtacaaacgg 3240
atcctcctcc gcctgccttc gtctgtcctc tgcggcagca gcttccaggc agaacagccc 3300
atcactgcca gatgcgagca gttcttccac ttggtcaact ctgagatgag aaacttctgc 3360
tcccacggag gtgccctgac acaggacatc actgcccact tcttcagggg cctcctgaac 3420
gcctgtctgc ggagcagaga cccctccctg atggtcgact tcatactggc caagtgccag 3480
acgaaatgcc ccttaatttt gacctctgct ctggtgtggt ggccgagcct ggagcctgtg 3540
ctgctctgcc ggtggaggag acactgccag agcccgctgc cccgggaact gcagaagcta 3600
caagaaggcc ggcagtttgc cagcgatttc ctctcccctg aggctgcctc cccagcaccc 3660
aacccggact ggctctcagc tgctgcactg cactttgcga ttcaacaagt cagggaagaa 3720
aacatcagga agcagctaaa gaagctggac tgcgagagag aggagctatt ggttttcctt 3780
ttcttcttct ccttgatggg cctgctgtcg tcacatctga cctcaaatag caccacagac 3840
ctgccaaagg ctttccacgt ttgtgcagca atcctcgagt gtttagagaa gaggaagata 3900
tcctggctgg cactctttca gttgacagag agtgacctca ggctggggcg gctcctcctc 3960
cgtgtggccc cggatcagca caccaggctg ctgcctttcg ctttttacag tcttctctcc 4020
tacttccatg aagacgcggc catcagggaa gaggccttcc tgcatgttgc tgtggacatg 4080
tacttgaagc tggtccagct cttcgtggct ggggatacaa gcacagtttc acctccagct 4140
ggcaggagcc tggagctcaa gggtcagggc aaccccgtgg aactgataac aaaagctcgt 4200
ctttttctgc tgcagttaat acctcggtgc ccgaaaaaga gcttctcaca cgtggcagag 4260
ctgctggctg atcgtgggga ctgcgaccca gaggtgagcg ccgccctcca gagcagacag 4320
caggctgccc ctgacgctga cctgtcccag gagcctcatc tcttctgatg a 4371
<210> 37
<211> 1015
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组高拷贝数ColE1、pMB1、pBR322、pUC复制起点序列
<400> 37
ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga 60
ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac 120
ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 180
tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 240
cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 300
taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 360
gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc 420
acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 480
ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 540
ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 600
cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 660
aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 720
gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 780
gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 840
gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc 900
ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg 960
ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaaga 1015

Claims (52)

1.一种治疗有需要的受试者的范可尼贫血的方法，其包括向所述受试者提供以下：
(i)高严格性CD34富集细胞群，其通过在高严格性条件下选择CD34+细胞来由从所述受试者获得的第一生物样品制备；和
(ii)低严格性CD34富集细胞群，其通过在低严格性条件下选择CD34+细胞来由从所述受试者获得的第二生物样品制备，
其中所述高严格性CD34富集细胞群和/或所述低严格性CD34富集细胞群中的一个或两个通过以下进行基因修饰：
(i)重组基因疗法载体，所述重组基因疗法载体包括对范可尼贫血互补群(FANC)多肽或其功能变体或片段进行编码的多核苷酸序列；或
(ii)基因编辑系统，所述基因编辑系统靶向内源性突变FANC基因的直接修复，并且其中所述第一生物样品和所述第二生物样品任选地是相同的生物样品。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：
(a)通过在高严格性条件下选择CD34+细胞，由从所述受试者获得的第一生物样品制备高严格性CD34富集细胞群；
(b)通过在低严格性条件下选择CD34+细胞，由从所述受试者获得的第二生物样品制备低严格性CD34富集细胞群，
(c)用以下对所述高严格性CD34富集细胞群和/或所述低严格性CD34富集细胞群中的一个或两个进行基因修饰：
(i)所述重组基因疗法载体，所述重组基因疗法载体包括对所述范可尼贫血互补群A(FANCA)多肽或其功能变体或片段进行编码的所述多核苷酸序列；或
(ii)所述基因编辑系统，所述基因编辑系统靶向所述内源性突变FANC基因的直接修复；以及
(d)向所述受试者提供所述高严格性CD34富集细胞群和所述低严格性CD34富集细胞群，
由此治疗所述范可尼贫血。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述第一生物样品和所述第二生物样品各自独立地为外周血或骨髓。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述第一生物样品和所述第二生物样品是在已经用G-CSF、plerifaxor或G-CSF和plerifaxor的组合治疗所述受试者之后获得的外周血。
5.根据权利要求2所述的方法，其中在高严格性条件下选择CD34+细胞包括：将所述第一生物样品应用于结合CD34+细胞的捕获基质；使用洗涤缓冲液洗涤所述捕获基质一次或多次；以及使用洗脱缓冲液从所述捕获基质中洗脱所述高严格性CD34富集细胞群。
6.根据权利要求2所述的方法，其中在低严格性条件下选择CD34+细胞包括：将所述第二生物样品应用于结合CD34+细胞的捕获基质；允许所述第二生物样品的未结合级分流过所述捕获基质；以及使用洗脱缓冲液从所述捕获基质中洗脱所述低严格性CD34富集细胞群。
7.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述高严格性CD34富集细胞群是经过基因修饰的。
8.根据权利要求1、2、6或7中任一项所述的方法，其中所述低严格性CD34富集细胞群是经过基因修饰的。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的方法，其中所述高严格性CD34富集细胞群中CD34+细胞的百分比是所述低严格性CD34富集细胞群中CD34+细胞的百分比的两到四倍。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其中所述高严格性CD34富集细胞群包括纯度>20％或>30％的CD34+细胞。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的方法，其中所述低严格性CD34富集细胞群包括纯度<30％的CD34+细胞。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的方法，其中所述高严格性CD34富集细胞群包括产率>20％的CD34+细胞。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的方法，其中所述低严格性CD34富集细胞群包括产率>35％的CD34+细胞。
14.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述重组基因疗法载体包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列按以下5'到3'顺序包括：
(a)真核活性启动子序列；以及
(b)对人FANC基因多肽或其功能片段或变体进行编码的序列；
其中所述对所述人FANC基因多肽或其功能片段或变体进行编码的序列与所述真核活性启动子序列可操作地连接；并且其中所述FANC基因选自FANCA、FANCC和FANCG。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因编辑系统包括：
(a)Cas蛋白或对Cas蛋白进行编码的多核苷酸；
(b)gRNA；以及
(c)修复模板，所述修复模板包括包含所述FANC基因或其片段的序列，所述FANC基因或其片段与所述内源性FANC基因中的一个或多个突变重叠。
其中sgRNA被配置成将所述修复模板引导到所述FANC基因，其中所述FANC基因选自FANCA、FANCC和FANCG，并且其中所述基因编辑系统能够定向修复内源性FANC基因。
16.根据权利要求1到15中任一项所述的方法，其中所述方法抑制所述受试者的范可尼贫血的血液学表现的发展、停止所述血液学表现的进展和/或逆转所述血液学表现的进展，其中范可尼贫血的所述血液学表现任选地选自以下中的一种或多种：骨髓衰竭、血小板减少症、白细胞减少症、全血细胞减少症、中性粒细胞减少症和贫血。
17.根据权利要求2所述的方法，其中所述选择是通过基于珠粒的磁性选择执行的。
18.根据权利要求4所述的方法，其进一步包括对所述外周血执行一次或多次单采血液成分术。
19.根据权利要求1到18中任一项所述的方法，其中所述方法引起基因修饰的范可尼贫血细胞随时间推移而逐渐增加。
20.根据权利要求1到19中任一项所述的方法，其中所述方法引起在向所述受试者施用所述高严格性CD34富集细胞群和所述低严格性CD34富集细胞群之前已经在所述受试者中下降的一种或多种造血谱系得到恢复。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述一种或多种造血谱系包括淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、红细胞和血小板中的一种或多种。
22.根据权利要求1到19中任一项所述的方法，其中所述方法引起在向所述受试者施用所述高严格性CD34富集细胞群和所述低严格性CD34富集细胞群之前已经在所述受试者中下降的一个或多个血液学参数得到恢复。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述血液学参数为血红蛋白。
24.一种用于制备用于治疗范可尼贫血的基因修饰细胞的方法，其包括：
(a)通过在高严格性条件下选择CD34+细胞，由从受试者获得的第一生物样品制备高严格性CD34富集细胞群；
(b)通过在低严格性条件下选择CD34+细胞，由从受试者获得的第二生物样品制备低严格性CD34富集细胞群；以及
(c)用针对范可尼贫血的重组基因疗法载体对所述高严格性CD34富集细胞群或所述低严格性CD34富集细胞群中的一个或两个进行基因修饰，其中所述基因疗法载体任选地包括对范可尼贫血互补群(FANC)多肽或其功能变体或片段进行编码的多核苷酸。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述第一生物样品和所述第二生物样品各自独立地为外周血或骨髓。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述第一生物样品和所述第二生物样品是在已经用G-CSF、plerifaxor或G-CSF和plerifaxor的组合治疗所述受试者之后获得的外周血。
27.根据权利要求24所述的方法，其中在高严格性条件下选择CD34+细胞包括：将所述第一生物样品应用于结合CD34+细胞的捕获基质；使用洗涤缓冲液洗涤所述捕获基质一次或多次；以及使用洗脱缓冲液从所述捕获基质中洗脱所述高严格性CD34富集细胞群。
28.根据权利要求24所述的方法，其中在低严格性条件下选择CD34+细胞包括：将所述第二生物样品应用于结合CD34+细胞的捕获基质；允许所述第二生物样品的未结合级分流过所述捕获基质；以及使用洗脱缓冲液从所述捕获基质中洗脱所述低严格性CD34富集细胞群。
29.根据权利要求24所述的方法，其中所述高严格性CD34富集细胞群与所述重组基因疗法载体接触。
30.根据权利要求24到29中任一项所述的方法，其中所述低严格性CD34富集细胞群与所述重组基因疗法载体接触。
31.根据权利要求240到30中任一项所述的方法，其中所述高严格性CD34富集细胞群中CD34+细胞的百分比是所述低严格性CD34富集细胞群中CD34+细胞的百分比的两到四倍。
32.根据权利要求24到31中任一项所述的方法，其中所述高严格性CD34富集细胞群包括纯度>20％或>30％的CD34+细胞。
33.根据权利要求24到32中任一项所述的方法，其中所述低严格性CD34富集细胞群包括纯度<30％的CD34+细胞。
34.根据权利要求24到33中任一项所述的方法，其中所述高严格性CD34富集细胞群包括产率>20％的CD34+细胞。
35.根据权利要求24到34中任一项所述的方法，其中所述低严格性CD34富集细胞群包括产率>35％的CD34+细胞。
36.根据权利要求24到35中任一项所述的方法，其中针对范可尼贫血的所述重组基因疗法载体包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列按以下5'到3'顺序包括：
(a)真核活性启动子序列；以及
(b)对人FANC基因多肽或其功能片段或变体进行编码的序列；
其中所述对所述人FANC基因多肽或其功能片段或变体进行编码的序列与所述真核活性启动子序列可操作地连接；并且其中所述FANC基因选自FANCA、FANCC和FANCG。
37.根据权利要求24到35中任一项所述的方法，其中针对范可尼贫血的所述重组基因疗法载体包括能够定向修复内源性FANC基因的基因编辑系统，其中所述基因编辑系统包括：
(a)Cas蛋白或对Cas蛋白进行编码的多核苷酸；
(b)gRNA；以及
(c)修复模板，所述修复模板包括包含所述FANC基因或其片段的序列，所述FANC基因或其片段与所述内源性FANC基因中的一个或多个突变重叠；
其中sgRNA被配置成将所述修复模板引导到所述FANC基因；并且其中所述FANC基因选自FANCA、FANCC和FANCG。
38.根据权利要求24所述的方法，其中(a)和/或(b)的选择是通过基于珠粒的磁性选择执行的。
39.根据权利要求24或权利要求38所述的方法，其中(a)和/或(b)的所述选择是使用与CD34特异性结合的抗体或其功能片段来执行的。
40.根据权利要求24或38所述的方法，其中(a)和/或(b)的所述选择是使用10-20mL/min的流速来执行的。
41.一种组合物，其包括：
(a)高严格性CD34富集细胞群，其通过在高严格性条件下选择CD34+细胞来由第一生物样品制备；以及
(b)低严格性CD34富集细胞群，其通过在低严格性条件下选择CD34+细胞来由第二生物样品制备，
其中所述高严格性CD34富集细胞群或所述低严格性CD34富集细胞群中的一个或两个与针对范可尼贫血的重组基因疗法载体接触。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述第一生物样品和所述第二生物样品各自独立地为外周血或骨髓。
43.根据权利要求41所述的组合物，其中所述第一生物样品和所述第二生物样品是在已经用G-CSF、plerifaxor或G-CSF和plerifaxor的组合物治疗受试者之后从所述受试者获得的外周血。
44.根据权利要求41到43中任一项所述的组合物，其中所述高严格性CD34富集细胞群中CD34+细胞的百分比是所述低严格性CD34富集细胞群中CD34+细胞的百分比的两到四倍。
45.根据权利要求41到44中任一项所述的组合物，其中所述高严格性CD34富集细胞群包括纯度>20％或>30％的CD34+细胞。
46.根据权利要求41到45中任一项所述的组合物，其中所述低严格性CD34富集细胞群包括纯度<30％的CD34+细胞。
47.根据权利要求41到46中任一项所述的组合物，其中所述高严格性CD34富集细胞群包括产率>20％的CD34+细胞。
48.根据权利要求41到47中任一项所述的组合物，其中所述低严格性CD34富集细胞群包括产率>35％的CD34+细胞。
49.根据权利要求41到48中任一项所述的组合物，其中所述高严格性CD34富集细胞群与所述重组基因疗法载体接触。
50.根据权利要求41到49中任一项所述的组合物，其中所述低严格性CD34富集细胞群与所述重组基因疗法载体接触。
51.根据权利要求41到50中任一项所述的组合物，其中所述重组基因递送载体包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列按以下5'到3'顺序包括：
(a)真核活性启动子序列；以及
(b)对人FANCA多肽或其功能片段或变体进行编码的序列；
其中所述对所述人FANC多肽或其功能片段或变体进行编码的序列与所述真核活性启动子序列可操作地连接；并且其中所述FANC基因选自FANCA、FANCC和FANCG。
52.一种药物组合物，其包括根据权利要求41到51中任一项所述的组合物以及药学上可接受的载剂。
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