CN105441481A - 一种sirtuin6基因缺失人类间充质干细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种SIRTUIN6基因缺失人类间充质干细胞的制备方法。本发明SIRTUIN6基因缺失人类间充质干细胞的制备方法的一种间充质干细胞的制备方法，包括：(1)取体外培养的人多能干细胞，突变所述人多能干细胞中的基因SIRTUIN6，使所述SIRTUIN6丧失功能，得到所述SIRTUIN6功能丧失的人多能干细胞；(2)对所述SIRTUIN6功能丧失的人多能干细胞进行定向诱导分化，获得所述SIRTUIN6功能丧失的间充质干细胞。本发明的方法能够用于建立筛选可调控成体干细胞氧化还原稳态维持，减缓细胞衰老的备选(天然)化合物的个性化药物筛选平台，同时也为延缓自然衰老提供了更多的线索。

Description

一种SIRTUIN6基因缺失人类间充质干细胞的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种SIRTUIN6基因缺失人类间充质干细胞的制备方法。
背景技术
人口老龄化是世界尤其是中国面临的日益严峻的社会问题。毋庸置疑，衰老及其相关疾病已成为国内外科研领域急需突破的热点问题。模式生物的局限性使其无法在理论和实践层面上应用于人类衰老的基础研究及临床转化，因此新的人类衰老研究模型亟待产生。成体干细胞的衰老及耗竭被认为是引发个体组织器官衰老以及衰老相关退行性疾病的重要因素。干细胞是指具有自我更新和分化能力的一类特殊细胞类型，为新的终末分化细胞提供重要来源。人类组织器官由少量成体干细胞及大量体细胞组成，成体干细胞能够对组织器官机体的损伤进行修复或再生，有效保持了组织器官及机体的稳态和健康。在衰老细胞中，干细胞出现功能性衰老或耗竭，干细胞稳态失衡，例如，随着年龄增大，造血干细胞(Hemopoieticstemcell,HSC)倾向于向髓系细胞分化，向骨髓的迁徙和归巢能力均出现缺陷，分化能力和效率受到影响，同时老年群体机体免疫力低下，多发粒系增生性疾病。在帕金森氏症(PD)患者脑内的海马区，神经干细胞在体外出现渐进性多能性消失。间充质干细胞的耗竭会导致成骨能力变差，骨折后修复困难。成黑素细胞(Melanoblast)的衰老是老年人头发变白的重要原因。成体干细胞功能衰退影响了骨骼与肌肉的功能。以上多种证据证实干细胞自我更新和分化潜能的紊乱，是组织器官丧失修复及再生能力的主要因素。
SIRTUIN是一类NAD+依赖性的、具有高度保守催化酶活性的蛋白家族。哺乳动物中存在七种SIRTUIN蛋白，分别为SIRTUIN1-7，各自具有不同的细胞亚定位及功能，其中SIRTUIN1-2广泛分布在细胞中，SIRTUIN3-5主要存在于线粒体，SIRTUIN6-7则仅存在于细胞核中。SIRTUIN6已经被证明与哺乳动物的衰老相关。在细胞水平，SIRTUIN6缺失导致葡萄糖及脂代谢、DNA损伤修复、端粒稳定性、基因组稳定性等紊乱而影响细胞稳态，被证明与细胞衰老、代谢或肿瘤发生相关。在机体水平，SIRTUIN6缺失的小鼠表现出渐进性组织、器官及机体的过早衰老。在出生后2周内，SIRTUIN6缺失的小鼠与野生型小鼠无显著区别，在出生后2-4周内，SIRTUIN6缺失的小鼠表现出、脾脏、淋巴系统、脂肪产生、骨骼及脑等内胚层和神经外胚层的退行性衰退，且于一个月内死亡，暗示了SIRTUIN6与内胚层稳态及衰老的重要相关性。在SIRTUIN6敲除小鼠的模型中，中胚层来源的组织如：血液、脾脏、骨骼、脂肪等会出现异常表型，但目前少有SIRTUIN6在人类组织细胞，尤其是多能干细胞及其衍生细胞中功能的相关报道，同时间充质干细胞(mesenchymalstemcell,MSC)又是中胚层中一种重要的成体干细胞，不仅作为造血细胞提供骨架和营养，还能够分化为脂肪、软骨、成骨等细胞类型对以上组织的损伤进行修复。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种间充质干细胞的制备方法。
本发明提供的间充质干细胞的制备方法包括如下步骤：
(1)取离体的人多能干细胞，突变所述人多能干细胞中的基因SIRTUIN6，使所述SIRTUIN6丧失功能，得到所述SIRTUIN6功能丧失的人多能干细胞；
(2)对所述SIRTUIN6功能丧失的人多能干细胞进行定向诱导分化，获得所述SIRTUIN6功能丧失的间充质干细胞。
上述方法中，步骤(1)中，所述突变人多能干细胞中的基因SIRTUIN6为缺失所述人多能干细胞中的SIRTUIN6的第1外显子。
上述方法中，所述缺失人多能干细胞中的SIRTUIN6的第1外显子为将所述人多能干细胞中的SIRTUIN6的第1外显子替换为筛选标记基因。
上述方法中，所述替换是通过同源重组的方式实现，所述同源重组中的上游同源臂为序列表中序列3；所述同源重组中的下游同源臂为序列表中序列4；
所述筛选标记基因为NEO基因。
上述方法中，步骤(1)中，缺失所述人多能干细胞中的所述SIRTUIN6的第1外显子是按照包括如下步骤的方法实现的：
(a1)将序列表中序列3的上游同源臂和序列4所示的下游同源臂构建到含有筛选基因的表达载体上，获得重组载体；所述筛选基因位于所述上游同源臂和所述下游同源臂之间；
(a2)用所述重组载体、SIRTUIN6左、右TALEN表达载体共转染人多能干细胞，使所述重组载体上的筛选基因替换人多能干细胞中的所述SIRTUIN6的第1外显子，从而获得所述SIRTUIN6的第1外显子缺失的人多能干细胞。
上述方法中，步骤(2)中，对所述SIRTUIN6功能丧失的人多能干细胞进行定向诱导分化，获得所述SIRTUIN6功能丧失的间充质干细胞，是按照包括如下步骤的方法实现的：
(b1)将所述SIRTUIN6功能丧失的人多能干细胞进行拟胚体分化，获得拟胚体；
(b2)将所述拟胚体接种于基质胶包被的培养板中进行培养，培养至纤维状细胞出现；再经过1-2次传代后，分选其中CD73、CD90、CD105均为阳性的细胞类群，即为所述SIRTUIN6功能丧失的间充质干细胞。
上述方法中，所述拟胚体分化为将所述SIRTUIN6功能丧失的人多能干细胞用TrypleExpress(Invitrogen公司，货号为12604021)37℃消化20-30min，待细胞形成球体后，用间充质干细胞培养基重悬，加到低粘附培养板(Corning公司，货号3471)中，37℃，5％CO2条件培养1-3天后，即形成拟胚体；
所述(b2)中培养的温度为37℃，培养的时间为10-14天。
上述方法中，所述人多能干细胞为人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞；
所述人胚胎干细胞具体为人胚胎干细胞H9细胞系。
本发明的另一个目的是提供一种利用上述方法制备获得的间充质干细胞。
本发明的还有一个目的是提供上述间充质干细胞的新用途。
本发明提供了上述间充质干细胞在制备筛选和/或鉴定用于治疗和/或维持和/或减缓动物或人衰老的临床药物和/或天然有机物和/或小分子化合物的产品中的应用；
所述衰老为由氧化还原稳态失衡所致。
本发明还提供了上述间充质干细胞在作为或制备衰老细胞模型中的应用；
所述衰老为由氧化还原稳态失衡所致。
本发明将利用TALEN介导的基因组靶向修饰技术制备了SIRTUIN6基因缺失的人类成体干细胞及其衍生细胞，能够产生细胞氧化还原稳态失衡和加速衰老的表型，利用这些细胞研究了SIRTUIN6在人类细胞衰老的重要作用，并探索了相关的衰老干预技术，并且在培养皿中建立SIRTUIN6功能缺失引起的氧化还原稳态失衡所致的细胞衰老研究模型。本发明探索了SIRTUIN6在调控人类间充质干细胞(hMSC)及其衍生细胞衰老中的重要作用，不仅有利于认识正常衰老过程，揭示延缓衰老或治疗衰老相关疾病的重要靶点，为衰老从基础研究向临床转化提供重要的理论基础，且本发明所含技术能够用于建立筛选可调控成体干细胞氧化还原稳态维持，减缓细胞衰老的备选(天然)化合物的个性化药物筛选平台，同时也为延缓自然衰老提供了更多的线索。
附图说明
图1为SIRTUIN6-/-ESC的构建流程和鉴定。图1A为人胚胎干细胞SIRTUIN6第一外显子基因打靶策略图；图1B为SIRTUIN6-/-ESC与SIRTUIN6+/+ESC(WT)的PCR检测结果，其中S6-61和S6-75为SIRTUIN6-/-ESC，WT为野生型人胚胎干细胞H9细胞系；图1C为细胞免疫荧光检测SIRTUIN6-/-ESC与SIRTUIN6+/+ESC中多能干细胞标志基因OCT4(绿色)、SOX2(黄色)、NANOG(红色)的表达；图1D为细胞免疫荧光检测SIRTUIN6+/+ESC及SIRTUIN6-/-ESC中SIRTUIN6蛋白表达及细胞内定位，其中，Phase为明场观察细胞形态，标尺长度：20mm；图1E为Westernblotting检测SIRTUIN6+/+ESC及SIRTUIN6-/-ESC中SIRTUIN6蛋白表达水平。其中，SIRTUIN6+/+ESC为野生型人胚胎干细胞H9细胞系
图2为SIRTUIN6-/-ESC衍生的SIRTUIN6-/-MSC具有加速衰老的表型。其中，图2A为SIRTUIN6+/+ESC和SIRTUIN6-/-ESC衍生的SIRTUIN6-/-MSC的细胞形态(Phase为明场观察细胞形态)及阳性表面标志蛋白CD105、CD73、CD90流式细胞术鉴定；图2B为细胞免疫荧光方法鉴定SIRTUIN6+/+MSC和SIRTUIN6-/-MSC中SIRTUIN6蛋白的表达与细胞亚定位；图2C为Westernblotting鉴定SIRTUIN6+/+MSC和SIRTUIN6-/-MSC中SIRTUIN6的蛋白表达量；图2D为SIRTUIN6-/-MSC和SIRTUIN6+/+MSC的生长能力曲线；图2E为SIRTUIN6-/-MSC和SIRTUIN6+/+MSC的衰老相关SA-beta-Gal染色结果，其中EP代表早代细胞，LP代表晚代细胞；图2F为SIRTUIN6-/-MSC和SIRTUIN6+/+MSC的体内生存能力检测结果。
图3为SIRTUIN6-/-MSC作为一种由氧化还原稳态失衡导致的成体干细胞衰老模型。图3A为不同浓度的PX-12刺激下SIRTUIN6+/+MSC及SIRTUIN6-/-MSC的细胞形态图；图3B为AnnexinV/PI双染色鉴定不同浓度的PX-12刺激下SIRTUIN6-/-MSC和SIRTUIN6+/+MSC的细胞凋亡，ns，无显著差异；*p<0.05；图3C为检测SIRTUIN6-/-MSC和SIRTUIN6+/+MSC内被氧化的带绿色荧光的H2DCFDA，反映了细胞内的总体活性氧水平，其中，#为空白对照，*为SIRTUIN6+/+MSC，&为SIRTUIN6-/-MSC；图3D为检测hMSC内8-氧鸟苷酸(8-氧鸟苷酸)水平，其中，#为空白对照，*为SIRTUIN6+/+MSC，&为SIRTUIN6-/-MSC。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的用于流式细胞术分选MSC的荧光标记抗体及出售公司如下：
荧光素FITC标记的抗人细胞表面识别分子CD90抗体(555595)，BDBiosciences。
荧光素PE标记的抗人细胞表面识别分子CD73抗体(550257)，BDBiosciences。
荧光素APC标记的抗人细胞表面识别分子CD105抗体(17-1057-42)，BDBiosciences。
荧光素APC标记同型对照抗体(555751)，BDBiosciences。
荧光素PE标记同型对照抗体(555749)，BDBiosciences。
荧光素FITC标记同型对照抗体(555742)，BDBiosciences。
下述实施例中的人胚胎干细胞H9细胞系，WiCell公司产品(货号：WA09(H9)-DL-7)。
下述实施例中的细胞培养基配方如下：
(1)CDF12培养基配方：
DMEM/F12培养基(Invitrogen，11320-033)；
0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen，11140-050)；
1mMGlutaMAXTM二肽(Invitrogen，35050-061)；
20％(体积百分含量)Knockout血清替代物(Invitrogen，N10828-028)；
1％(1g/100ml)青霉素/链霉素(Invitrogen，15070-063)；
55μMβ-巯基乙醇(Invitrogen，21985-023)；
10ng/ml人FGF2(JointProteinCentral)。
(2)间充质干细胞(MSC)培养基配方：
MEM培养基(Invitrogen，12571071)；
10％(体积百分含量)胎牛血清(Invitrogen，10091148)；
1％(1g/100ml)青霉素/链霉素(Invitrogen，15070-063)；
10ng/ml重组人成纤维细胞生长因子(JPC，bFGF)；
5ng/mlTGFβ(Humanzyme，HZ1131)。
下述实施例中的SA-beta-Gal染色方法：
1)6孔板中以合适密度种入细胞；
2)细胞密度达到60～80％时，PBS清洗两次细胞；
3)2％多聚甲醛+0.2％异戊醛固定，不超过5分钟；
4)PBS清洗2次；
5)加入染色液，37度避光过夜孵育。染色液配方如下：柠檬酸/磷酸钠缓冲液40mM、K4[Fe(CN)6].6H2O5mM、K3[Fe(CN)6]5mM、NaCl150mM、MgCl22mM、X-gal1mg/ml。
6)PBS清洗2次；
7)Hoechst33258(Invitrogen，货号：H3569)室温避光孵育5分钟；
8)PBS清洗一次；
9)显微镜下观察。
下述实施例中的pCR2.1-neo载体由美国Salk研究所JuanCarlosIzpisuaBelmonte教授馈赠，并由第一发明人保存在中国科学院生物物理研究所，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，公众可从中国科学院生物物理研究所获得。
下述实施例中的SIRTUIN6左、右TALEN表达载体均购自Addgene公司，商品名和货号分别为TAL2454(Plasmid#36843)和TAL2455(Plasmid#36844)。
下述实施例中的用过表达荧光素酶Luciferase的病毒载体由美国Salk研究所JuanCarlosIzpisuaBelmonte教授馈赠，并由第一发明人保存在中国科学院生物物理研究所，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，公众可从中国科学院生物物理研究所获得。
实施例1、SIRTUIN6-/-ESC的获得及鉴定
本发明涉及在人类胚胎干细胞(hESCs)中靶向失活人类SIRTUIN6基因(基因组序列为GenBank：NC_000019.10的第4174109-4182599位，updatedon12-Mar-2015；cDNA序列为GenBank：NM_001193285，updatedonPRI15-MAR-2015)。
本发明首先设计并通过分子克隆方法获得跨人类基因组中SIRTUIN6基因第1号外显子的基因片段，其中包含设计的突变位点和用于阳性克隆筛选的Neo抗性基因(图1A)，然后将其构建进入pCR2.1-neo载体上，获得SIRTUIN6同源臂载体(其全长序列如序列表中序列5所示)。用SIRTUIN6同源臂载体和SIRTUIN6左、右TALEN表达载体共同电转化人多能干细胞，使人多能干细胞的SIRTUIN6丧失功能，获得SIRTUIN6功能丧失的多能干细胞系，即SIRTUIN6第1外显子缺失的人多能干细胞。其中，用TALEN表达载体和SIRTUIN6同源臂载体电转化所述人多能干细胞后，还包括用G418进行克隆筛选的步骤；在克隆筛选之后还包括对挑选的克隆用基因组PCR的方法对其同源重组的情况进行确认的步骤。具体方法如下：
一、SIRTUIN6缺失hESC的获得
1、SIRTUIN6同源臂载体的构建
SIRTUIN6同源臂载体的构建的具体流程如图1A所示，具体步骤如下：
(1)人基因组提取
以基因组提取试剂盒(StarSpinAnimalDNAKit,GenStar公司，货号D111)提取人细胞中基因组DNA，得到人基因组DNA。具体步骤如下：
1)获得单细胞悬液，PBS清洗一次，弃上清；
2)先后加入200μlGTL、20μl蛋白酶K、200μlBufferGL，每次均以漩涡振荡器充分混合均匀；
3)将步骤2所得混合液加入到吸附柱中，套入收集管内；
4)10,000转离心1分钟后，弃去收集管内废液；
5)加500μlBufferGW1清洗吸附柱，10,000转离心1分钟后，弃去收集管内废液；
6)加500μlBufferGW2清洗吸附柱，10,000转离心1分钟后，弃去收集管内废液；
7)12,000转离心2分钟，弃去废液，室温晾干；
8)加50-100μl去离子水洗脱吸附柱中基因组DNA。
(2)SIRTUIN6左、右同源重组臂的PCR
以步骤(1)获得的人基因组DNA为模板，采用引物对SIRTUIN6LeftArmPrimerF和SIRTUIN6LeftArmPrimerR进行PCR扩增，得到上游同源臂；以步骤(1)获得的人基因组DNA为模板，采用引物对SIRTUIN6RightArmPrimerF和SIRTUIN6RightArmPrimerR进行PCR扩增，得到下游同源臂。引物序列如下：SIRTUIN6LeftArmPrimerF：
ATAGGGCCCCCGGTGCCCATTCACTCACTACCTACCCTT；SIRTUIN6LeftArmPrimerR：CCGCTCGAGAGTTCTCCAGTCACCTCTAAAATGCGGGACA；SIRTUIN6RightArmPrimerF：CGCGGATCCGCCAACACGCCCAACTCTGTGGTCACCCT；SIRTUIN6RightArmPrimerR：CGGGGTACCCCTCCCACCTGCCTTGTCAAAGCCCTAGCC。
上述PCR反应体系如下：20ng～100ng基因组DNA、0.5μl正向引物(10μM)、0.5μl反向引物(10μM)、1μldNTP、10μl2×PrimerSTARGCbuffer、0.25μlPrimerSTARpolymerase、0.25μl补齐至20μl。
上述PCR反应程序：第一步：98℃1min，1个循环；第二步：98℃10s，68℃0.5-3min，35个循环；72℃7min，1个循环。
分别将获得的上游同源臂和下游同源臂分别克隆至pEASY-Blunt载体(全式金公司，货号CB101-01)中进行测序，测序结果表明：SIRTUIN6上游同源臂的核苷酸序列如序列3所示；SIRTUIN6下游同源臂的核苷酸序列如序列4所示。
(3)SIRTUIN6同源臂载体的获得
将步骤(2)获得的SIRTUIN6上游同源臂插入到pCR2.1-neo载体(含有neo基因)的ApaI和XhoI酶切位点间，且将步骤(2)获得的SIRTUIN6下游同源臂插入到pCR2.1-neo载体的BamHI和KpnI酶切位点间，且保持pCR2.1-neo载体的其他序列不变，得到SIRTUIN6同源臂载体。并对其进行测序。
测序结果表明：SIRTUIN6同源臂载体的核苷酸序列为序列5，其中，SIRTUIN6上游同源臂的序列如序列5的第5847-7789核苷酸所示，neo基因如序列5的第8789-9313位核苷酸所示，SIRTUIN6下游同源臂的序列如序列5的第9497-10729位核苷酸所示。将上述测序正确的质粒进行中提，获得高质量质粒进行下述SIRTUIN6打靶。
2、SIRTUIN6缺失hESC的获得
基于TALEN的基因打靶技术特异性敲除hESC细胞中的SIRTUIN6，具体为敲除人基因组中转录SIRTUIN6cDNA的第一个外显子。具体步骤如下：
(1)野生型人胚胎干细胞H9细胞系的培养
a.将人胚胎干细胞H9接种至预先培养了经过丝裂霉素(美国Sigma公司产品，货号：M0503)灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(美国Invitrogen公司产品，货号：S1520-100)的培养板中，使用人类胚胎干细胞培养基(CDF12培养基)与小鼠胚胎成纤维细胞共同培养；
b.将H9细胞接种至预先用细胞外基质(qualified-Matrigel，美国BDBiosciences产品，货号：354277)包被的培养板中，使用mTeSR培养基(美国StemCellTechnologies产品)培养。
(2)准备处于对数期增殖的hESC，PBS清洗一次，TrypleExpress(Invitrogen公司，货号为12604021)消化5-10分钟后，轻轻吹打成单细胞；
(3)准备1.5×106个H9hESC单细胞，依据Cologne_CoA_cGMPSolutionP3PrimaryCell4D-NucleofectorKit(Lonza公司，货号V4XPG-3024)说明书配置hESC细胞悬液，将SIRTUIN6同源臂载体和SIRTUIN6左、右TALEN表达载体加入hESC细胞悬液中，使用4D电转仪(Lonza公司，货号4D-NucleofectorTMSystem)进行电转，得到电转后的hESC。
(4)将电转后的hESC加入含MEF的培养板中。24小时后换新鲜CDF12培养基。
(5)7-10天后，待培养板中长出新的克隆，依据克隆数目及大小向hESC培养体系中加入G418(遗传霉素)，筛选neo阳性的hESC克隆，即为SIRTUIN6缺失hESC记作SIRTUIN6-/-ESC。选取neo阳性的hESC克隆S6-61和S6-75进行鉴定。
二、SIRTUIN6缺失hESC的鉴定
通过基因组PCR、westernblotting、细胞免疫荧光等手段检测SIRTUIN6缺失hESC中exon是否被替换、neo片段插入基因组位置是否正确、SIRTUIN6在mRNA及蛋白水平是否缺失和干细胞特性，以鉴定SIRTUIN6缺失hESC是否被正确打靶。
1、PCR鉴定
提取SIRTUIN6+/+ESC(即为野生型人胚胎干细胞H9细胞系)、SIRTUIN6-/-ESC克隆S6-61和S6-75的基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，分别采用引物对(P1+P2)、引物对(P3+P4)、引物对(P5+P6)、引物对(P7+P7)进行PCR扩增，鉴定第一外显子是否被neo基因替换。引物对(P1+P2)检测基因组中是否存在第一个外显子(外显子扩增产物382bp)、引物对(P3+P4)检测neo是否替换第一外显子(SIRTUIN6上游同源臂、第一外显子及SIRTUIN6下游同源臂的扩增产物3649bp；SIRTUIN6上游同源臂、neo及SIRTUIN6下游同源臂的扩增产物5053bp)、引物对(P5+P6)检测SIRTUIN6上游同源臂是否插入到基因组(SIRTUIN6上游同源臂扩增产物2921bp)，引物对(P7+P8)检测SIRTUIN6下游同源臂是否插入到基因组(SIRTUIN6下游同源臂扩增产物1564bp)，同时以GAPDH为内参，其扩增引物序列如下：
P1：5’-AAGGCCTCCTGGGACTCAGCAGAAAGCTC-3’；
P2：5’-CCCCAAAGGCCTACCCGCTTCCATTGCTCA-3’；
P3：5’-CTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATC-3’；
P4：5’-AGGTACGCCATCCCCAGCTACCCTGA-3’；
P5：5’-AGATAATGTTGCTGTCATGG-3’；
P6：5’-TTAAGCTGTAGCACTTGGTC-3’；
P7：5’-CCAACATCCCAGCTTGCTT-3’；
P8：5’-GAGCAGGCCCATGTTACCTGA-3’；
GAPDH-F：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’；
GAPDH-R：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。
PCR鉴定结果如图1B所示，结果显示S6-61和S6-75中的SIRTUIN6第一外显子均已被neo基因替换。
2、免疫荧光检测干细胞特性
以SIRTUIN6+/+ESC(野生型人胚胎干细胞H9细胞系)和SIRTUIN6-/-ESC(S6-61克隆)作为供试细胞，采用免疫荧光技术对人胚胎干细胞的干性维持情况相关的分子标记物Oct4，Sox2和Nanog进行检测。具体步骤如下：
将培养于盖玻片上的供试细胞用4％的多聚甲醛室温固定30分钟，PBS漂洗(3次，5分钟/次)后，使用含有0.4％(体积百分含量)TritonX-100的PBS室温孵育30分钟，继而换用10％(体积百分含量)驴血清(JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.货号：017-000-121)室温封闭1小时。之后换用添加一抗的封闭液于4摄氏度孵育过夜。PBS漂洗(3次，5分钟/次)后，然后加入对应二抗(Alexa555标记的驴抗兔抗体，Invitrogen公司，货号为A-31572)，室温孵育1小时。PBS漂洗(3次，5分钟/次)后，用工作浓度为2g/ml的Hoechst33258(Invitrogen，货号：H3569)室温孵育15分钟，最后封片和观察。
结果如图1C所示，与SIRTUIN6+/+ESC相似，SIRTUIN6-/-ESC能够表达Oct4，Sox2和Nanog三种分子标记物。说明SIRTUIN6缺失不影响干细胞干性基因的表达。
3、免疫荧光验证经过改造的人胚胎干细胞缺失SIRTUIN6
以SIRTUIN6+/+ESC(野生型人胚胎干细胞H9细胞系)和SIRTUIN6-/-ESC作为供试细胞，采用免疫荧光技术对人胚胎干细胞中SIRTUIN6蛋白的表达进行检测。具体步骤如下：
将培养于盖玻片上的供试细胞用4％的多聚甲醛室温固定30分钟，PBS漂洗(3次，5分钟/次)后，使用含有0.4％(体积百分含量)TritonX-100的PBS室温孵育30分钟，继而换用10％(体积百分含量)驴血清(JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.货号：017-000-121)室温封闭1小时。之后换用添加一抗(anti-SIRTUIN6，兔源，抗SIRTUIN6蛋白N端的抗体来源abcam公司(ab200))的封闭液于4摄氏度孵育过夜。PBS漂洗(3次，5分钟/次)后，然后加入对应二抗(Alexa555标记的驴抗兔抗体，Invitrogen公司，货号为A-31572)，室温孵育1小时。PBS漂洗(3次，5分钟/次)后，用工作浓度为2g/ml的Hoechst33258(Invitrogen，货号：H3569)室温孵育15分钟，最后封片和观察。
结果如图1D所示，SIRTUIN6+/+ESC中，SIRTUIN6蛋白表达并定位于细胞核内，而SIRTUIN6-/-ESC不表达SIRTUIN6。以上结果表明，SIRTUIN6-/-ESC中SIRTUIN6第一外显子缺失成功。
4、Westernblot鉴定SIRTUIN6蛋白
以SIRTUIN6+/+ESC(野生型人胚胎干细胞H9细胞系)和SIRTUIN6-/-ESC作为供试细胞，使用RIPA裂解液对其进行裂解，提取总蛋白后以BCA蛋白浓度测定方法定量蛋白浓度。在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内。用Bio-Rad的标准电泳装置进行电泳，预计目的蛋白已经被适当分离后停止电泳。使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置进行转膜。转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的脱脂奶粉封闭液中，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟，按照适当比例稀释一抗(anti-SIRTUIN6，兔源，抗SIRTUIN6蛋白N端的抗体来源abcam公司(ab200))，4℃缓慢摇动孵育过夜。再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。按照适当比例用二抗(HRP标记的羊抗兔抗体，Santacruz公司，货号为sc-2004)，再用洗涤液(0.01MTBST)洗涤5-10分钟，共洗涤3次。最后使用显色剂(购自Millipore，货号为407207-1KITCN)显色。实验以β-actin为内参，一抗为鼠源抗β-actin抗体(购自Santacruz公司，货号为sc-8432)，二抗为HRP标记的羊抗鼠抗体，Santacruz公司(货号为sc-2005)。
Westernblot检测SIRTUIN6蛋白结果如图1E所示，用SIRTUIN6抗体无法检测到SIRTUIN6-/-ESC中SIRTUIN6蛋白的表达；而用SIRTUIN6抗体可检测到SIRTUIN6+/+ESC中SIRTUIN6蛋白的表达(分子量约39KD)。
综上所述，本发明成功建立了SIRTUIN6缺失人类多能干细胞，即SIRTUIN6缺失hESC(SIRTUIN6-/-ESC)，使SIRTUIN6基因第一外显子缺失，且SIRTUIN6基因第一外显子的缺失不影响干细胞干性基因的表达。SIRTUIN6缺失hESC为将hESC基因组的第4174236-4174363位所示的SIRTUIN6基因的第一外显子替换为neo基因，且保持hESC基因组的其他序列不变，得到的细胞。
实施例2、SIRTUIN6-/-MSC的获得及其表型鉴定
本发明将实施例1中获得的SIRTUIN6缺失hESC(SIRTUIN6-/-ESC)，进一步体外定向分化为间充质干细胞(SIRTUIN6-/-MSC)，并发现SIRTUIN6-/-MSC表现出典型的细胞衰老症状。具体方法如下：
一、SIRTUIN6-/-ESC经体外定向分化产生SIRTUIN6-/-MSC
1、将实施例1获得的SIRTUIN6-/-ESC(SIRTUIN6-/-ESC克隆S6-61)进行拟胚体(EB)分化，具体步骤如下：准备含有300-500个细胞、大小均一的SIRTUIN6-/-ESC克隆，用室温PBS清洗一次，用TrypleExpress(Invitrogen公司，货号为12604021)37℃消化20-30min。待ESC克隆形成球体后，用间充质干细胞培养基重悬后，加到低粘附培养板(Corning公司，货号3471)中，37℃，5％CO2条件培养1-3天后即形成拟胚体。
2、将步骤1获得的拟胚体接种于基质胶(matrigel)(Invitrogen公司)包被的6孔板中进行培养，继续培养10-14天至纤维状细胞出现。再经过1-2次传代后，利用流式细胞术分选其中的CD73、CD90和CD105均为阳性的细胞类群，即为SIRTUIN6缺失的间充质干细胞，将其记作SIRTUIN6-/-MSC。
将上述步骤中的SIRTUIN6-/-ESC替换为SIRTUIN6+/+ESC，其他步骤不变，定向诱导分化得到间充质细胞记作SIRTUIN6+/+MSC。
流式细胞术鉴定结果如图2A所示：SIRTUIN6+/+MSC及SIRTUIN6-/-MSC均呈现90％以上阳性细胞比例。
二、SIRTUIN6-/-MSC的表型鉴定
1、免疫荧光验证定向分化所得MSC中的SIRTUIN6的表达情况
以步骤1获得的SIRTUIN6+/+MSC和SIRTUIN6-/-MSC作为供试细胞，采用免疫荧光技术对SIRTUIN6+/+MSC和SIRTUIN6-/-MSC中SIRTUIN6蛋白的表达情况进行检测。具体方法同上所述。
结果如图2B所示，SIRTUIN6+/+MSC中，SIRTUIN6蛋白表达并定位于细胞核内，而SIRTUIN6-/-MSC不表达SIRTUIN6蛋白。
2、Westernblot检测SIRTUIN6-/-MSC中的SIRTUIN6蛋白的表达情况
以SIRTUIN6+/+MSC和SIRTUIN6-/-MSC作为供试细胞，利用前述方法进行检测。Westernblot检测SIRTUIN6蛋白的表达情况。
检测结果如图2C所示，SIRTUIN6-/-MSC细胞用SIRTUIN6蛋白抗体无法检测到SIRTUIN6蛋白蛋白的表达；而SIRTUIN6+/+MSC细胞用SIRTUIN6蛋白抗体可检测到SIRTUIN6蛋白的表达(分子量约39KD)。
3、生长抑制测定
利用细胞计数统计连续传代的SIRTUIN6-/-MSC和SIRTUIN6+/+MSC的生长能力。
统计结果如图2D所示，图中的p1、p2、p3、p4、p5、p6、p7、p8、p9、p10分别代表传代数。结果表明：与SIRTUIN6+/+MSC细胞相比，在连续传代培养6代后，SIRTUIN6-/-MSC表现出明显的生长抑制。
4、SA-beta-Gal染色
细胞衰老β-半乳糖苷酶染色是一种基于衰老时SA-beta-Gal(senescence-associatedbeta-galactosidase)活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的方法。
分别以SIRTUIN6-/-MSC和SIRTUIN6+/+MSC为供试细胞(分别设置早代(第1代)和晚代(第5代)实验组)，吸去6孔板中培养的供试细胞的细胞培养液，用PBS洗涤1次，再加入染色固定液(4％多聚甲醛)，室温固定15分钟。弃去固定液，用PBS洗涤1次，每孔加入1ml染色工作液。以X-Gal为底物，在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下会生成深蓝色产物。在普通的光学显微镜下就可以观测到细胞或组织的衰老情况，并进一步对两组细胞中的SA-beta-Gal染色阳性细胞比率进行定量统计分析。
结果如图2E所示，EP时SIRTUIN6-/-MSC和SIRTUIN6+/+MSC中阳性细胞数一致，LP时SIRTUIN6+/+MSC中阳性细胞数出现微弱提升，SIRTUIN6-/-MSC阳性细胞数出现大幅度提升，SIRTUIN6-/-MSC有明显的蓝色，而SIRTUIN6+/+MSC细胞基本上没有蓝色。进一步的定量分析结果显示，SIRTUIN6-/-MSC的SA-beta-Gal染色阳性细胞比率极显著高于SIRTUIN6+/+MSC组(P<0.01)。可见，SIRTUIN6-/-MSC表现出严重衰老的症状。
5、SIRTUIN6-/-MSC细胞小鼠体内增殖和整合能力测定
为了验证SIRTUIN6-/-MSC和SIRTUIN6+/+MSC的体内生存能力，首先用过表达荧光素酶Luciferase的病毒载体感染SIRTUIN6+/+MSC与SIRTUIN6-/-MSC，感染3天后，将两种细胞分别消化为单细胞状态，随后分别注射入小鼠左、右胫骨前肌，7-10天后通过利用小动物活体成像系统(XenogenIVISspectrum,PE公司)检测小鼠左、右胫骨前肌中luciferase活性，并统计4组生物学重复的荧光强度大小，来反映MSC的存活及体内整合能力。MSC细胞胫骨前肌移植以及鉴定的具体步骤如下：
1)选取生长状态良好、细胞密度为60～80％的SIRTUIN6-/-MSC和SIRTUIN6+/+MSC，感染Luciferase表达病毒；
2)感染后72小时，TrypLExpress消化为单细胞；
3)细胞计数，每1×106个细胞以100μlPBS重悬；
4)取100μl细胞悬液注射入小鼠胫骨前肌；
5)每日观察小鼠状态；
6)7-10天后，取出小鼠，腹腔注射Luciferase底物(D-LuciferinFirefly,potassiumsalt,GOLDBIO公司)，麻醉后以小动物活体成像系统进行分析；
结果如图2F所示，SIRTUIN6-/-MSC(右腿)在胫骨前肌中的luciferase活性仅为野生型(左腿)在胫骨前肌中的活性的10％，与SIRTUIN6+/+MSC相比，SIRTUIN6-/-MSC在体内退行速度更快，存活并整合的细胞数目更少。
实施例3、SIRTUIN6-/-MSC在刺激剂诱导下产生的氧化还原稳态失衡所致的细胞表型
一、诱导剂下制备SIRTUIN6-/-MSC
本实施例在培养前述源于SIRTUIN6-/-ESC产生的SIRTUIN6-/-MSC过程中，添加硫氧还蛋白抑制剂PX-12(硫氧还蛋白是一种12KD大小的氧化还原酶，具有将双巯基转化为二硫键的活性，参与了活性氧水平的调控、维持细胞内氧化还原稳态)，可诱导产生更为明显的氧化还原稳态失衡所致的细胞表型。具体步骤如下：
1、分组
在间充质干细胞培养基中分别培养SIRTUIN6-/-MSC和SIRTUIN6+/+MSC，按照是否添加抑制剂，分成如下四组：
第一组：SIRTUIN6-/-MSC细胞在含有硫氧还蛋白抑制剂PX-12的间充质干细胞培养基培养3天，PX-12在间充质干细胞培养基中的浓度为0μM。
第二组：SIRTUIN6-/-MSC细胞在含有硫氧还蛋白抑制剂PX-12的间充质干细胞培养基培养3天，PX-12在间充质干细胞培养基中的浓度为50μM。
第三组：SIRTUIN6+/+MSC细胞在含有硫氧还蛋白抑制剂PX-12的间充质干细胞培养基培养3天，PX-12在间充质干细胞培养基中的浓度为0μM。
第四组：SIRTUIN6+/+MSC细胞在含有硫氧还蛋白抑制剂PX-12的间充质干细胞培养基培养3天，PX-12在间充质干细胞培养基中的浓度为50μM。
2、细胞凋亡水平检测
培养上述步骤1中的4组间充质干细胞3天后，用AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒(购自威格拉斯公司，货号A002)分别检测步骤1中的各组细胞凋亡水平，将0μMPX-12刺激下SIRTUIN6+/+MSC细胞凋亡比率定义为1。具体实验步骤如下：
1)吸去培养基，PBS清洗一次，TrypleExpress(Invitrogen公司，货号为12604021)消化5-10分钟后，吹打成单细胞。
2)收集1×106个细胞，用预冷的PBS清洗一次。
3)依照试剂盒说明书，配制AnnexinV染液，每个样品中加入100μlAnnexinV染液室温染色15分钟。
4)再加入500μlPI染液，室温染色5分钟。
5)使用流式细胞仪检测FITC和PI荧光染色。
结果如图3A和图3B所示，在PX12的浓度为0μM的处理条件下，SIRTUIN6-/-MSC细胞中凋亡细胞比率与SIRTUIN6+/+MSC细胞无明显差异(第一组和第三组细胞之间比较)；而在PX-12的浓度为50μM的处理条件下，SIRTUIN6-/-MSC细胞凋亡比率为SIRTUIN6+/+MSC细胞的2-3倍，说明在PX-12刺激下SIRTUIN6-/-MSC细胞的凋亡水平显著高于SIRTUIN6+/+MSC细胞。
3、活性氧水平检测
培养上述4组间充质干细胞3天后，用H2DCFDA细胞周期染色试剂盒(购自Lifetechnology公司，货号C6827)分别检测步骤1中的第二组和第四组细胞的活性氧水平，以未用H2DCFDA染液孵育的间充质干细胞为空白对照(Black)。具体实验步骤如下：
1)吸去培养基，PBS清洗一次，TrypleExpress(Invitrogen公司，货号为12604021)消化5-10分钟后，吹打成单细胞。
2)收集1×106个细胞，用预冷的PBS清洗一次。
3)依照试剂盒说明书，配制H2DCFDA染液，每个样品中加入500μlH2DCFDA染液，37度染色10-30分钟。
4)用预冷的PBS清洗一次后，再用500μlPBS重悬细胞。
5)使用流式细胞仪检测FITC荧光染色。
结果如图3C所示：在PX-12的浓度为50μM的处理条件下，SIRTUIN6-/-MSC细胞内的活性氧(ROS)水平显著高于SIRTUIN6+/+MSC细胞，证明由于缺失了SIRTUIN6，使得SIRTUIN6-/-MSC细胞内的氧化还原平衡遭到破坏。
4、8-氧鸟苷酸水平检测
培养上述4组间充质干细胞3天后，用8-氧鸟苷酸抗体(购自Abcam公司，货号ab64548，小鼠源单克隆抗体)分别检测步骤1中的第二组和第四组细胞中的8-氧鸟苷酸水平，以未用8-氧鸟苷酸抗体孵育液孵育的间充质干细胞为空白对照(Black)。具体实验步骤如下：
1)吸去培养基，PBS清洗一次，TrypleExpress(Invitrogen公司，货号为12604021)消化5-10分钟后，吹打成单细胞。
2)收集1×106个细胞，用预冷的PBS清洗一次。
3)配制8-氧鸟苷酸抗体孵育液(抗体按1：100用PBS稀释)，每个样品中加入100μl8-氧鸟苷酸抗体孵育液，室温孵育30分钟。
4)用预冷的PBS清洗一次后，配制二抗孵育液(Alexa488标记的驴抗小鼠IgG，按1：200用PBS稀释)，每个样品中加入100μl二抗孵育液，室温孵育15分钟。
5)用预冷的PBS清洗一次后，再用500μlPBS重悬细胞。
6)使用流式细胞仪检测FITC荧光染色。
结果如图3D所示，在PX-12的浓度为50μM的处理条件下，SIRTUIN6-/-MSC细胞内的氧化DNA损伤标志分子8-氧鸟苷酸水平显著高于SIRTUIN6+/+MSC细胞，从另一方面证明SIRTUIN6缺失导致SIRTUIN6-/-MSC细胞内氧化还原失衡。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：
(1)取离体的人多能干细胞，突变所述人多能干细胞中的基因SIRTUIN6，使所述SIRTUIN6丧失功能，得到所述SIRTUIN6功能丧失的人多能干细胞；
(2)对所述SIRTUIN6功能丧失的人多能干细胞进行定向诱导分化，获得所述SIRTUIN6功能丧失的间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述突变人多能干细胞中的基因SIRTUIN6为缺失所述人多能干细胞中的SIRTUIN6的第1外显子。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述缺失人多能干细胞中的SIRTUIN6的第1外显子为将所述人多能干细胞中的SIRTUIN6的第1外显子替换为筛选标记基因。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述替换是通过同源重组的方式实现，
所述同源重组中的上游同源臂为序列表中序列3；
所述同源重组中的下游同源臂为序列表中序列4；
所述筛选标记基因为NEO基因。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，对所述SIRTUIN6功能丧失的人多能干细胞进行定向诱导分化，获得所述SIRTUIN6功能丧失的间充质干细胞，是按照包括如下步骤的方法实现的：
(b1)将所述SIRTUIN6功能丧失的人多能干细胞进行拟胚体分化，获得拟胚体；
(b2)将所述拟胚体接种于基质胶包被的培养板中进行培养，培养至纤维状细胞出现；再经过1-2次传代后，分选其中CD73、CD90、CD105均为阳性的细胞类群，即为所述SIRTUIN6功能丧失的间充质干细胞。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述人多能干细胞为人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞；
所述人胚胎干细胞具体为人胚胎干细胞H9细胞系。
7.利用权利要求1-6中任一所述方法制备获得的间充质干细胞。
8.权利要求7所述的间充质干细胞在制备筛选和/或鉴定用于治疗和/或维持和/或减缓动物或人衰老的临床药物和/或天然有机物和/或小分子化合物的产品中的应用。
9.权利要求7所述的间充质干细胞在作为或制备衰老细胞模型中的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述衰老为由氧化还原稳态失衡所致。
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